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Sumario

1 EpistasiaEnfoque MendelianoEnfoque Genetico-EstatısticoMapeamento de QTL’s Considerando Epistasia

2 Epistasia e Expressao GenicaConsideracoesMicroarranjos de DNAPotencial para a Reconstrucao de Rotas Metabolicas

3 Redes GenicasRepresentacao das Redes GenicasModelos de Redes GenicasReconstrucao de Redes Genicas: AlgoritmosReconstrucao de Redes Genicas: Resultados

4 Consideracoes Finais

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Epistasia

EpistasiaIntroducao

A palavra Epistasia tem origem grega:epi: sobrestasia: parada, inibicao

Termo proposto por Bateson (1909), com objetivo de descrever distorcoes dassegregacoes mendelianas (crista de galinhas).

Fisher (1918) tambem definiu o termo epistasia, porem sob enfoque estatıstico:Desvios do modelo linear aditivo.

Mesmo com duas definicoes distintas nota-se que o termo epistasia trata deinteracoes genicas, isto e, o efeito fenotıpico que e obtido atraves da interacaoentre alelos de multiplos locos (Cheverud e Routman, 1995).

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Epistasia Enfoque Mendeliano

EpistasiaEnfoque Mendeliano

Bateson e Punnett (1905) ao estudarem cristas de galos notaram que crista tiposimples raramente era obtido nos cruzamentos, entre aves com crista tipo noz.

Utilizando o ”Quadrado de Punnett ”, demonstraram que o carater era controladopor dois genes.

RP Rp rP rp

RP

Rp

rP

rp

Crista Noz (R-P-)

Crista Rosa (R-pp)

Crista Ervilha (rrP-)

Crista Simples (rrpp)

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Por volta dos anos 30, varios tipos de segregacoes ja eram conhecidas e o termoepistasia era utilizado para explicar padroes de heranca distintos da 2a lei deMendel (Phillips, 1998):

A distorcao na segregacao ocorre pois um loco influencia a expressao de outro loco.

Tipo de Interacao A-B- A-bb aaB- aabb

Segregacao ”classica” 9 3 3 1

Epistasia Dominante 12 3 1

Epistasia Recessiva 9 3 4

Gene duplicado com efeito cumulativo 9 6 1

Gene Dominante Duplicado 15 1

Gene Recessivo Duplicado 9 7

Interacao Dominante e Recessiva 13 3

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EPISTASIA RECESSIVA:Coloracao da pelagem de labrador, segregacao 9:3:4 (Griffiths et al., 2002).

AB Ab aB ab

AB

Ab

aB

ab

A- B-

A- bb

aa - -

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EPISTASIA GENE RECESSIVO DUPLICADO:Producao de Cianeto em Trevo, segregacao 9:7 (Griffiths et al., 2002)

AB Ab aB ab

AB Alto Teor Alto Teor Alto Teor Alto TeorAb Alto Teor Baixo Teor Alto Teor Baixo TeoraB Alto Teor Alto Teor Baixo Teor Baixo Teorab Alto Teor Baixo Teor Baixo Teor Baixo Teor

Genotipo Fenotipo

A-B- Alto TeoraaB- Baixo TeorA-bb Baixo Teoraabb Baixo Teor

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Epistasia Enfoque Genetico-Estatıstico

EpistasiaEnfoque Genetico-Estatıstico

Fisher (1918) tambem definiu o termo epistasia como Bateson, mas com enfoquedistinto, isto e, como desvios do modelo linear.

Para diferenciar ambas as terminologias, Fisher propos uma grafia diferente(”epistacy”). No entanto, este termo caiu em desuso com o passar dos anos eassumiu-se a mesma grafia proposta por Bateson.

Ao considerar n locos segregando conjuntamente, um fenotipo pode nao ser asoma dos genotipos individuais para cada loco. Estes desvios Fisher denominouDesvios Epistaticos.

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EpistasiaExemplo de carater controlado por dois genes

F = A+B +Desvios

(15) (10) (5)AA Aa aa

AABB AaBB aaBBfe = 45 fe = 40 fe = 35

(30) BB fo = 55 fo = 45 fo = 30ep = +10 ep = +5 ep = −5

AABb AaBb aaBbfe = 40 fe = 35 fe = 30

(25) Bb fo = 45 fo = 30 fo = 30ep = +5 ep = −5 ep = 0

AAbb Aabb aabbfe = 35 fe = 30 fe = 25

(20) bb fo = 30 fo = 30 fo = 10ep = −5 ep = 0 ep = −15

Entre parenteses: Valor Genotıpicopara os locos A e B.

Considera-se ausencia do efeitoambiental.

fe: Fenotipo Esperado

fo: Fenotipo Observado

ep: Desvio Epistatico(ep = fo− fe)

ep = 0: Ausencia de epistasia

ep < 0: Epistasia negativa

ep > 0: Epistasia positiva

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EpistasiaCausas

Produtos genicos podem estar relacionados biologicamente, em rotas metabolicas.

Estudos em levedura indicam mecanismos de compensacao (Boone et al., 2007):

A nao-expressao conjunta de alguns genes, nao pode ser prevista pelanao-expressao dos genes separadamente.

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EpistasiaCausas

O enfoque dado por Fisher permite expandir o conceito de epistasia parapopulacao, isto e, considera-se a epistasia como fonte de variabilidade genetica.

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EpistasiaAbordagem proposta por Cockerham (1954)

Fisher (1918) foi o primeiro pesquisador que particionou a variancia genetica emefeito aditivo, dominancia e epistasia, utilizando o princıpio de mınimos quadrados.

Cockerham (1954) avancou estas consideracoes, particionando a variancia geneticade um carater controlado por dois genes e dois alelos, atraves de 8 contrastesortogonais (independentes).

Os efeitos principais de cada gene foram decompostos em efeito aditivo (regressaolinear) e efeito de dominancia (regressao quadratica).

As interacoes epistaticas foram decompostas em interacoes do tipo aditivo xaditivo, aditivo x dominancia, dominancia x aditivo e dominancia x dominancia

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EpistasiaAbordagem proposta por Cockerham (1954)

Modelo de Cockerham:

Gij = µ+ a1x1 + d1z1 + a2x2 + d2z2 + iaawaa + iadwad + iadwad + iddwdd

Gij e o valor genotıpico considerando os locos A e B.

µ e a constante do modelo.

a1 e a2: efeitos lineares (aditivos) para os locos A e B.

d1 e d2: efeitos quadratico (dominancia) para os locos A e B.

iaa, iad, iad e idd: interacao entre os efeito lineares e aditivos para ambos locos(epistasia).

x, z, w: sao observacoes obtidas de acordo com o genotipo dos locos e obtidas deforma a gerar contrastes ortogonais.

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Epistasia Mapeamento de QTL’s Considerando Epistasia

EpistasiaMapeamento de QTL Considerando Epistasia

Marcadores moleculares: Mapeamento de QTL’s.

Kao et al. (1999) desenvolveram o mapeamento por multiplos intervalos (MIM)que permite detectar multiplos QTL’s e suas interacoes simultaneamente.

Kao e Zeng (2002) mostraram que o modelo de Cockerham (1954) e o mais

adequado para estudos de epistasia em estudos envolvendo QTL’s.

As medias marginais de um loco nao contem parametros de outroslocos nem epistasia, o que torna o modelo interpretavel.

Ortogonalidade: a estimacao de cada efeito nao e afetado por outrosefeitos.

Quando ha epistasia e ela e ignorada, as estimativas dos efeitosmarginais (e de posicao) continuam nao viesadas.

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Epistasia Mapeamento de QTL’s Considerando Epistasia

EpistasiaMapeamento de QTL Considerando Epistasia. Fonte: Kao et al., (1999)

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Epistasia e Expressao Genica Consideracoes

Epistasia e Expressao GenicaConsideracoes

Novo enfoque para estudos de epistasia pode ser verificado atraves de estudos deBiologia de Sistemas.

Desafio: reconstruir redes e rotas metabolicas funcionais, unindo genes e seusprodutos (Brazhnik et al., 2002).

Principal contribuicao: descricao de sistemas biologicos em detalhes, utilizando ainformacao genetica e bioquımica disponıvel (Moore, 2005).

No presente momento ha apenas trabalhos com organismos modelos, devido a altacomplexidade deste tipo de estudo (Moore, 2005).

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Mendoza et al., (1999) apresentam rede genica envolvida no controle genetico doflorescimento de Arabidopsis thaliana.

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Para a conducao deste tipo de estudo 2 fatores sao importantes: Perturbacaogenetica e avaliacao do desenvolvimento dos indivıduos.

Perturbacao genetica pode ser produzida atraves da inibicao da expressao genica(’knockout’) ou ainda atraves da obtencao de uma populacao segregante (F2).

A avaliacao da expressao genica pode ser conduzido de maneira direta atraves demicroarranjos de DNA ou por medidas de desenvolvimento, como tamanho decolonia (St Onge et al., 2007), quantificacao de metabolismo (Segre et al., 2005).

Microarranjo: tecnica experimental que busca medir os nıveis de expressao detranscritos em larga escala.

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Epistasia e Expressao Genica Microarranjos de DNA

Epistasia e Expressao GenicaMicroarranjos de DNA

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Epistasia e Expressao Genica Potencial para a Reconstrucao de Rotas Metabolicas

Epistasia e Expressao GenicaPotencial para a Reconstrucao de Rotas Metabolicas

As ’Redes Biologicas’ poderiam ser pensadas em 4 nıveis (Brazhnik et al., 2002):

1 Redes Genicas: Relacoes estabelecidas entre genes, como a expressaode um gene influencia os demais.

2 Redes Proteicas: Interacoes proteicas, como formacoes de complexose modificacoes proteicas por enzimas de sinalizacao.

3 Redes Metabolicas: Transformacoes quımicas entre produtosmetabolicos.

4 Rede Global: Utilizacao em conjunto destas metodologias parareconstrucao de redes metabolicas permitindo o conhecimentodetalhado de interacoes genicas.

”Resultados satisfatorios sao obtidos estudando Redes Genicas com dados deTranscriptoma”(Brazhnik et al., 2002).

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Epistasia e Expressao Genica Potencial para a Reconstrucao de Rotas Metabolicas

Epistasia e Expressao GenicaPotencial para a Reconstrucao de Rotas Metabolicas

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Redes Genicas Representacao das Redes Genicas

Redes GenicasRepresentacao das Redes Genicas

Definicao:

Redes Genicas sao grupos de genes interdependentes que ao se expressarem contribuempara a ocorrencia de uma funcao biologica especıfica (Cumiskey et al., 2003)

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Redes Genicas Representacao das Redes Genicas

Redes GenicasRepresentacao das Redes Genicas Fonte:Cumiskey et al., (2003)

Forma Grafica Forma Matricial

Sequencia de Caracteres (string)

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Redes Genicas Modelos de Redes Genicas

Redes GenicasModelos de Redes Genicas

Modelos de redes sao importantes para o conhecimento correto das relacoes entregenes e entendimento de caracterısticas das redes. Dentre os principais modelosdestacam-se (Barabasi e Oltvai, 2004):

Redes Aleatorias

Redes de Distribuicao (Conexao) - ’Scale Free Networks’

Redes Hierarquicas

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Redes GenicasRedes Aleatorias

Redes Aleatorias assumem que a probabilidade de 2 vertices (genes) estaremconectados e uniforme.

Esquema com 15 genes (Barabasi e Oltvai, 2004):

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Redes GenicasRedes de Distribuicao

Redes de Distribuicao sao caracterizadas por terem distribuicao de potencia.

A probabilidade de observar genes com elevado numero de conexao com outrosgenes e maior do que em Redes Aletorias, conhecidos por ’hubs’.

A maioria das redes de distribuicao sao resultados de processos de crescimento,nos quais novos genes sao alocados ao longo do tempo e atraves de ’conexaopreferencial’ (preferencialmente novos nos tendem a ligar-se a nos maisdensamente conectados).

Por este modelo, genes que surgiram antes em termos evolutivos tendem a

apresentar mais conexoes com outros genes.

Estudos mostram que enzimas remanescentes do ”Mundo do RNA”, como Coezima

A, NAD, GTP sao os substratos que apresentam mais conexoes entre as rotas

metabolicas, assim como genes envolvidos na glicolise (Barabasi e Oltvai, 2004).

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Redes GenicasRedes de Distribuicao

Esquema com 27 genes (Barabasi e Oltvai, 2004):

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Redes GenicasRedes Hierarquicas

Redes Hierarquicas sao caracterizadaspela existencia de modulos,agrupamento entre genes e atributosde redes de distribuicao.

Modulo: grupo de genes que temfuncao semelhante, altamenteconectado entre grupos de nos e queestao relativamente isolados dosistema.

A presenca de ’hubs’ tambem eobservada neste tipo de rede.

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Redes GenicasRedes Hierarquicas

Segre et al. (2005): reconstrucao de uma rede genica atraves de interacoesepistaticas. A direita, mesma rede genica apresentada por Alberts (2002).

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Redes Genicas Reconstrucao de Redes Genicas: Algoritmos

Reconstrucao de Redes GenicasAlgoritmos Utilizados

Objetivo: reconstruir redes atraves de engenharia reversa, isto e, procura-seestabelecer relacoes de entre genes, baseado em dados de expressao genica. Logo,algumas abordagens podem ser utilizadas (Brazhnik et al., 2002):

Redes Bayesianas: Permitem reconstrucao de redes genicas, atraves de medidasde correlacao e tem por vantagem insercao de informacao a priori. No entanto,devido a qualidade dos dados, podem fornecer multiplas redes genicas queexplicam os dados de forma equivalente.

’Culpado por Associacao’ (Guilt by Association - GBA):

Abordagem Booleana:

Funcoes Contınuas:

Redes Neurais:

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Redes Genicas Reconstrucao de Redes Genicas: Resultados

Reconstrucao de Redes GenicasZhu et al., (2004)

Redes Bayesianas com auxılio de eQTL’s:

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Objetivo: propor um algoritmo para reconstrucao de redes genicas baseado emredes bayesianas integrando mapeamento de eQTL’s em populacoes segregantes.

Para tanto, utilizou-se uma populacao F2 composta por 111 indivıduos docruzamento das linhagens C57BL/6J e DBA/2J de camundongos.

A analise de microarranjo foi realizada com amostras do tecido hepatico.

O chip de DNA disponıvel para camundongos continha (23574 genes), porem parao presente trabalho foram utilizados 1088 genes diferencialmente expressos;

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ALGORITMO DE RECONSTRUCAO

A busca pela ’melhor’ rede genica quando utilizado um moderado numero de genes

e computacionalmente inviavel (”NP Hard Problem”). Algumas restricoes foram

assumidas:

1 Um gene pode controlar varios genes, mas este pode ser controlado nomaximo por 3 genes.

2 Inicialmente, apenas uma subamostra destes genes foi consideradacomo controladoras da rede genica.

3 Foram calculadas as probabilidades a posteriori para cada possıvel redegenica. A rede com a maior probabilidade e selecionada.

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Discussao

Os autores demonstraram que a rede genica e eficiente para associar e permitirordenacao das rotas metabolicas.

Vantagem: Processo de construcao de possıveis redes genicas pode serautomatizado.

Mais estudos sao necessarios para conhecer os mecanismos de interacao entregenes, mas os resultados preliminares sao promissores.

Esta abordagem permite caminhar em direcao a caracterizacao dos genes einteracoes envolvidos para a expressao de caracteres quantitativos.

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Reconstrucao de Redes GenicasVan Driessche et al., (2005)

Utilizacao de Algoritmos de Agrupamento para construcao de rotas genicas.

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Objetivo: estudar relacoes epistaticas entre 6 genes envolvidos na rota metabolicada proteına kinase A.

Para tanto, 10 linhagens mutantes de ameba (Dictyostelium discoideum) foramutilizadas.

O chip de DNA continha 5624 genes.

Reconstruiu-se a rota metabolica com base nos dados obtidos.

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Reconstrucao de Redes GenicasVan Driessche et al., (2005): Reconstrucao de uma relacao epistatica conhecida

Sabe-se que a pufA e epistatico em relacao ayakA.

Desenvolveu celulas mutantes: pufA−,yakA− e duplo mutante.

Avaliacao com microarranjos de DNA

Se 2 genes tem fenotipos distintos paramutacao e o duplo mutante se parece comum destes. O gene que apresenta fenotiposemelhante e dito epistatico.

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Reconstrucao de Redes GenicasVan Driessche et al., (2005): Reconstrucao de uma relacao epistatica desconhecida

PufA e pkaC

pkaC e epistatico em relacao a PufA

regA e pkaR

pkaR e epistatico em relacao a regA

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Etapa seguinte: analisou robustez da analise para 10 linhagens mutantes.

Considerou-se: acaA− acaA−pkaCO/E , conjuntamente com as 8 linhagensapresentadas.

Duplos mutantes com acaA nao ocorrem, mas a presenca de pkaC compensariaesse quadro: Logo, pkaC e epistatico a acaA

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1 yakA e epistatico em relacao a pufA

2 pufA e epistatico em relacao a pkaCs

3 regA e epistatico em relacao a pkaR

4 yakA tem relacao linear com pufA e pkaC

5 inferiu-se que acaA e epistatico em relacao a pkaC

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Reconstrucao de Redes Genicasde la Fuente et al., (2002)

Objetivo: Propor um metodo baseado em coeficiente de co-controle visandoquantificar a interacao genica, devido a nao expressao de um dado gene.

Diferencial: Considera a expressao genica como variavel contınua.

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Coeficientes de co-controle expressam mudancas concomitantes entre genes i e jquando um determinado sistema e perturbado por um fator (gene) m:

Oij =

∆[mRNAi]/[mRNAi]

∆[mRNAj ]/[mRNAj ]

A concentracao de mRNA pode ser indicada pela taxa de fluorescencia:

∆mRNA

mRNA0=mRNA−mRNA0

mRNA= FR− 1

Este tipo de alteracoes por analise de controle metabolico (MCA) esta baseado emmudancas infinitesimais:

O coeficiente de co-controle pode ser expresso utilizando aproximacao numerica:

Oij =

(FRi − 1)(FRj + 1)

(FRj − 1)(FRi + 1)

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PROCEDIMENTO

1 Inicialmente, defini-se um estado de referencia (nao perturbado), para n genes.

2 Perturba-se a transcricao de um unico gene e faz a mensuracao do mRNA commicroarranjos de DNA

3 Repete-se este princıpio para os outros genes em estudo.

4 Calcula-se os coeficientes de co-controle, formando uma matriz O.

5 A inversao da matriz O fornece a matriz indicadora da interacao entre genes.

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Modelo foi testado em experimento insilico, sendo eficiente para reconstrucaode uma rota metabolica.

Considerar dados como variaveiscontınuas fornecem redes mais precisas,do que abordagem Booleana.

Autores concluem que parareconstrucao de redes genicas, uso demicroarranjos e promissor.

No entanto, modelo nao e capaz detratar redes genicas cıclicas (feedback).

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Consideracoes Finais


Ao longo dos anos, muitos estudos envolvendo epistasia foram realizados.

Os primeiros estudos envolveram distorcoes de segregacao mendeliana e estudospara caracteres quantitativos.

Atualmente, o desenvolvimento de metodologias para estudo da expressao genicaao longo do genoma permite estudos para reconstrucao de redes genicas.

Espera-se que no futuro, os caracteres agronomicos possam ser melhoresentendidos em nıvel genico.

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Para o melhoramento genetico estas informacoes poderao fornecer subsıdios pararealizar selecao assistida de forma mais precisa, alem de permitir o melhorconhecimento da arquitetura genetica e passos metabolicos envolvidos para aexpressao de um carater quantitativo.

Brazhnik et al., (2002)

”Alguns estudos apontam que o genoma humano contem apenas o dobro do numero degenes presentes em ’Caenorhabditis elegans’. Esta situacao pode ocorrer, pois acomplexidade de um genoma nao seria condicionada ao numero de genes, mas sim pelonumero de interacoes que estes apresentam para formar uma rede biologica”.

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Para o melhoramento genetico estas informacoes poderao fornecer subsıdios pararealizar selecao assistida de forma mais precisa, alem de permitir o melhorconhecimento da arquitetura genetica e passos metabolicos envolvidos para aexpressao de um carater quantitativo.

Brazhnik et al., (2002)

”Alguns estudos apontam que o genoma humano contem apenas o dobro do numero degenes presentes em ’Caenorhabditis elegans’. Esta situacao pode ocorrer, pois acomplexidade de um genoma nao seria condicionada ao numero de genes, mas sim pelonumero de interacoes que estes apresentam para formar uma rede biologica”.

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Zhu et al. An integrative genomics approach to the reconstruction of gene networks in segregating populations.Cytogenetic and Genome Research, v.105, p.363-374, (2004). 48 / 48

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