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SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ......................................................................................................................... 17
2. REVISÃO DE LITERATURA ............................................................................................ 26
2.2. O dogma central da biologia molecular ............................................................. 26
2.3. O genoma humano ....................................................................................................... 27
2.3.1. Estrutura e propriedades do DNA ............................................................... 29
2.3.2. Replicação do DNA ............................................................................................. 33
2.3.3. Organização dos genes .................................................................................... 36
2.3.4. Transcrição do DNA e tradução do RNA ................................................. 40
2.4. Reação em cadeia da polimerase (PCR) ......................................................... 48
2.5. As bases genéticas da variação humana ......................................................... 52
2.5.1. Mutação vs. Polimorfismo ................................................................................ 57
2.6. Herdabilidade de variáveis associadas ao desempenho esportivo .... 58
2.7. Polimorfismos associados à aptidão física e ao desempenho
esportivo .......................................................................................................................................... 61
2.7.1. Enzima conversora de angiotensina .......................................................... 61
2.7.2. ACTN-3 ...................................................................................................................... 67
2.8. O gene PDLIM3 como candidato a associação com o desempenho
esportivo .......................................................................................................................................... 75
3. OBJETIVOS ............................................................................................................................. 82
3.1. Objetivo geral ...................................................................................................................... 82
3.2. Objetivos específicos .................................................................................................. 82
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4. MÉTODOS ................................................................................................................................ 83
4.1. Construção do banco de DNA de atletas e controles não atletas .......... 83
4.1.1. Participantes ............................................................................................................... 83
4.1.2. Coleta de material biológico para extração do DNA genômico ....... 84
4.1.3. Extração de DNA genômico das amostras de sangue ........................ 84
4.1.4. Extração de DNA genômico das amostras de lavagem bucal ......... 85
4.2. Estudo de associação do polimorfismo CNV do gene PDLIM3 com o
desempenho esportivo ............................................................................................................ 86
4.2.1. Participantes ........................................................................................................... 86
4.2.2. Determinação do genótipo relativo ao polimorfismo CNV do gene
PDLIM3 ....................................................................................................................................... 89
4.2.3. Validação da reação de PCR ......................................................................... 91
4.2.4. Determinação do impacto do polimorfismo CNV do gene PDLIM3
sobre a expressão proteica da proteína ALP ......................................................... 91
4.2.5. Análises estatísticas ........................................................................................... 93
5. RESULTADOS ....................................................................................................................... 94
6. DISCUSSÃO ............................................................................................................................ 98
7. REFERÊNCIAS ................................................................................................................... 106
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1. INTRODUÇÃO A busca pelo entendimento dos inúmeros fatores que determinam o
desempenho esportivo e o sucesso competitivo tem sido uma constante nas
áreas de educação física e ciências do esporte. Inúmeros estudos vêm
observando a relação entre variáveis morfológicas, fisiológicas, metabólicas e
psicológicas, entre outras, e o desempenho nas mais diversas modalidades
esportivas (ARTIOLI, GUALANO, FRANCHINI, BATISTA, POLACOW e
LANCHA, 2009; CHAOUACHI, BRUGHELLI, LEVIN, BOUDHINA, CRONIN e
CHAMARI, 2009; GIRARD e MILLET, 2009; NEVILL, ALLEN e INGHAM,
2009; STOGGL, ENQVIST, MULLER e HOLMBERG, 2010; ALVES,
PASQUA, ARTIOLI, ROSCHEL, SOLIS, TOBIAS, KLANSENER, BERTUZZI,
FRANCHINI, LANCHA JUNIOR e GUALANO, 2012). De fato, muitos estudos
propõem que variáveis antropométricas e/ou fisiológicas podem, de certa
forma, predizer o sucesso em uma dada modalidade (IZQUIERDO-
GABARREN, EXPOSITO, DE VILLARREAL e IZQUIERDO; FRANCHINI,
DEL VECCHIO, MATSUSHIGUE e ARTIOLI, 2011).
A excelência competitiva no esporte é um fenômeno complexo,
multidimensional e extremamente dinâmico, o qual sofre influências
constantes de inúmeros aspectos que permeiam o ambiente específico de
uma dada modalidade esportiva. A natureza dinâmica do (in)sucesso
competitivo expressa-se pela relativa incapacidade que a maior parte dos
atletas de alta-elite têm em manter constantes suas conquistas ao longo de
suas carreiras. É comum, portanto, que atletas de sucesso intercalem
momentos de vitória com outros de fracasso. Assim, Kiss e colaboradores
(KISS, BÖHME, MANSOLDO, DEGAKI e REGAZZINI, 2004) pontuam que o
desempenho esportivo deve ser entendido como um sistema aberto que
expressa, em um determinado ponto do tempo, a condição global do atleta.
Tal condição refere-se a fatores internos ao atleta (isto é, genética, estado de
treinamento, estado nutricional e estado psicológico, entre outros), embora
fatores externos também contribuam de forma dinâmica nesse sistema (isto
é, fatores ambientais, condições de seus colegas de time e de seus
adversários, entre outros) (KISS, BÖHME, MANSOLDO et al., 2004).
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A quantidade de fatores que determinam o sucesso individual em
competições de alto nível é surpreendentemente grande. Numerosos são
também os modelos que se propõem a enumerar e classificar tais fatores. De
forma simplificada, pode-se categorizar os fatores determinantes do
desempenho competitivo em dois grandes grupos: os fatores genéticos e os
não genéticos (BOUCHARD, MALINA e PÉRUSSE, 1997).
Em relação aos fatores não genéticos, é possível elencar uma
complexa gama de aspectos que envolvem o domínio esportivo e o não
esportivo, com base nos trabalhos de Henriksen et al. (HENRIKSEN,
STAMBULOVA e ROESSLER, 2010) e Vaeyens et al. (VAEYENS, LENOIR,
WILLIAMS e PHILIPPAERTS, 2008). Dentro do domínio esportivo, destacam-
se a cultura esportiva geral do ambiente onde o indivíduo se encontra, o
papel da mídia nesse contexto, os esportes mais populares, os principais
ídolos esportivos e outros ícones nos quais os jovens atletas possam se
espelhar. Ainda no domínio esportivo encontram-se aspectos como o
treinamento nas diferentes etapas de maturação, as relações com técnicos,
colegas de treino, gerentes esportivos e etc. No domínio não esportivo,
figuram fatores como a cultura familiar, educação formal, além de
oportunidades de desenvolvimento e de engajamento em atividades
desportivas.
Já os fatores genéticos que contribuem para o fenótipo do
desempenho esportivo excelente, segundo Bouchard et al. (BOUCHARD,
MALINA e PÉRUSSE, 1997), dividem-se entre os chamados “genes
necessários” e “genes de susceptibilidade”, ou “genes predisponentes”, além
das interações entre os diferentes genes de um mesmo indivíduo (isto é,
interações gene-gene no sentido de compor um “genótipo ideal” para um
esporte específico) e as interações gene-ambiente (no sentido de que
indivíduos com “genótipos ideais” obrigatoriamente precisam ser expostos a
um ambiente ótimo que lhes permita o pleno desenvolvimento de suas
aptidões).
“Genes necessários” referem-se a um grupo de genes ou, de forma
mais precisa, um grupo de variantes gênicas sem as quais não seria possível
a qualquer pessoa atingir a excelência esportiva. Exemplificando, uma
pessoa com um quadro de distrofia muscular grave de origem genética, como
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é o caso da Distrofia Muscular de Duchenne (causada por mutação no gene
DMD, que codifica para a proteína muscular chamada distrofina) certamente
não se tornaria atleta ou teria sucesso em qualquer esporte.
“Genes de susceptibilidade”, por sua vez, referem-se a um grupo de
variantes gênicas que são capazes de potencializar/maximizar as respostas
ao treinamento, o aprendizado e execução de gestos desportivos ou o
desempenho competitivo em sua manifestação final. Tais genes serão
abordados adiante neste documento de forma aprofundada, em tópico
específico na revisão de literatura. Cada gene de susceptibilidade contribui,
de forma isolada, com uma parcela muito pequena, ainda que inegavelmente
relevante, da variação observada em um dado fenótipo (no caso em questão,
o desempenho em um esporte qualquer). Portanto, tais genes não são
necessários, tampouco suficientes para que um dado fenótipo se expresse
(BOUCHARD, MALINA e PÉRUSSE, 1997). De fato, dados recentes de
corredores de longa distância que atingiram os mais elevados níveis
competitivos confirmam que, embora muitas das variações que
conhecidamente melhoram o desempenho de endurance estejam presentes
em muitos desses atletas, nem todos eles apresentam todas as variações
que poderiam constituir um “genótipo ideal” para a excelência em esportes de
endurance (GONZALEZ-FREIRE, SANTIAGO, VERDE, LAO, OIIVAN,
GOMEZ-GALLEGO e LUCIA, 2009). Em outras palavras, muitos atletas
atingem os maiores níveis competitivos a despeito de não serem
necessariamente “ideais” do ponto de vista genético. A figura 1 apresenta um
modelo que se propõe a delimitar os aspectos mais relevantes para o
sucesso competitivo.
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Figura 1. Modelo teórico com algumas das principais variáveis que contribuem para o
surgimento de atletas de alta-elite (construído com base nos trabalhos de Henriksen et al.
(HENRIKSEN, STAMBULOVA e ROESSLER, 2010), Vaeyens et al. (VAEYENS, LENOIR,
WILLIAMS et al., 2008) e Bouchard et al. (BOUCHARD, MALINA e PÉRUSSE, 1997)).
Embora o papel dos aspectos ambientais no desempenho esportivo
tenha sido amplamente debatido nas últimas décadas, é bem estabelecido
que os fatores ambientais por si só não são suficientes para explicar o
sucesso de um grupo tão seleto de atletas no esporte de alto nível (DIAS,
PEREIRA, NEGRÃO e KRIEGER, 2007). Obviamente, a genética favorável
desses atletas extraordinários ajuda a explicar seu sucesso. Ainda que a
importância da genética no contexto do esporte de competição tenha sido,
por muito tempo, amplamente reconhecida (BOUCHARD, MALINA e
PÉRUSSE, 1997), somente no final da década de 1990 foram publicados os
primeiros estudos que objetivaram identificar variações gênicas capazes de
explicar, mesmo que parcialmente, o sucesso competitivo (GAYAGAY, YU,
HAMBLY, BOSTON, HAHN, CELERMAJER e TRENT, 1998;
MONTGOMERY, MARSHALL, HEMINGWAY, MYERSON, CLARKSON,
DOLLERY, HAYWARD, HOLLIMAN, JUBB, WORLD, THOMAS, BRYNES,
SAEED, BARNARD, BELL, PRASAD, RAYSON, TALMUD e HUMPHRIES,
1998). Atualmente, já foram identificados mais de 200 genes capazes de
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influenciar de alguma forma o desempenho esportivo ou a aptidão física
(RANKINEN, ROTH, BRAY, LOOS, PERUSSE, WOLFARTH, HAGBERG e
BOUCHARD, 2010). O desenvolvimento rápido da genética e o constante
aperfeiçoamento das técnicas de biologia molecular têm contribuído
sobremaneira para esse acelerado avanço no conhecimento sobre as bases
das diferenças individuais no desempenho e aptidão física (BOUCHARD,
MALINA e PÉRUSSE, 1997).
A conclusão do projeto genoma em 2001 permitiu o sequenciamento
completo do genoma humano. Sabe-se que cerca de 99,9% do genoma é
idêntico entre todos os seres humanos e, portanto, a clara diferença entre
cada indivíduo é explicada pelos ~0,1% restantes. Evidentemente, a ciência
tem dedicado grandes esforços para compreender esses 0,1% do genoma
que englobam as bases da variação humana, pois é nele que estão
respostas para questões como susceptibilidade a doenças, respostas a
tratamentos, diversidade fenotípica (DOLGIN, 2008a) e o talento. Embora a
maior parte da variação até hoje conhecida seja constituída por trocas de um
único par de bases (ou SNP, do inglês single nucleotide polymorphism)
(SHARP, 2008), estudos relativamente recentes identificaram que a inserção
ou deleção de um número grande de pares de base em determinadas regiões
do genoma (fenômeno conhecido por variação no número de cópias ou CNV,
do inglês copy number variation) é característica comum do genoma humano
(MILLS, LUTTIG, LARKINS, BEAUCHAMP, TSUI, PITTARD e DEVINE,
2006). Esse tipo de variação, embora menos frequente do que os SNPs, é
responsável por uma maior parte da variação no genoma do que os SNPs, se
considerado o número absoluto de pares de base (JAKOBSSON, SCHOLZ,
SCHEET, GIBBS, VANLIERE, FUNG, SZPIECH, DEGNAN, WANG,
GUERREIRO, BRAS, SCHYMICK, HERNANDEZ, TRAYNOR, SIMON-
SANCHEZ, MATARIN, BRITTON, VAN DE LEEMPUT, RAFFERTY, BUCAN,
CANN, HARDY, ROSENBERG e SINGLETON, 2008). Isso significa que os
polimorfismos do tipo CNV são, no mínimo, tão importantes quanto os SNPs
para a variação no genoma humano (DOLGIN, 2008a; JAKOBSSON,
SCHOLZ, SCHEET et al., 2008).
Dentre os polimorfismos que já foram associados ao desempenho
esportivo até o presente momento, o do gene da alfa-actinina 3 é, sem
22
dúvidas, o mais bem documentado e com as mais fortes evidências. Em
humanos, estão presentes no músculo esquelético duas isoformas de alfa
actinina: alfa-actinina 2 e alfa-actinina 3, codificadas pelos respectivos genes
ACTN2 e ACTN3 (PASQUA, ARTIOLI, PIRES e BERTUZZI, 2011). Enquanto
a ACTN2 é expressa em todas as fibras musculares, ACTN3 é expressa
somente nas fibras do tipo IIb, com menor função oxidativa e maior função
glicolítica (NORTH, YANG, WATTANASIRICHAIGOON, MILLS, EASTEAL e
BEGGS, 1999; NORMAN, ESBJORNSSON, RUNDQVIST, OSTERLUND,
VON WALDEN e TESCH, 2009).
Um polimorfismo comum do tipo SNP no gene ACTN3, o qual consiste
na troca de uma citosina por uma timina (polimorfismo nonsense denominado
R577X), resulta na conversão do códon do aminoácido arginina (R) na
posição 577 da cadeia polipeptídica a um stop codon prematuro (X). Essa
variação faz com que exista um alelo R (funcional) e um alelo X (nulo).
Indivíduos homozigotos para o alelo não funcional (indivíduos X/X) possuem
deficiência na proteína alfa-actinina-3 (NORTH, YANG,
WATTANASIRICHAIGOON et al., 1999).
Como alfa-actinina-3 está presente nas fibras do tipo IIb, de contração
rápida, Van Damme et al. (VAN DAMME, WILSON, VANHOOYDONCK e
AERTS, 2002) observaram que a frequência do polimorfismo R577X em
atletas de endurance é significantemente maior em comparação a indivíduos
não atletas, o que sugere que a falta dessa proteína favorece o metabolismo
aeróbio. Similarmente, Yang et al. (YANG, MACARTHUR, GULBIN, HAHN,
BEGGS, EASTEAL e NORTH, 2003) genotiparam 301 atletas australianos
caucasianos de elite e compararam com 436 indivíduos australianos
caucasianos controles. Os autores observaram que todos os atletas de sprint
possuíam genótipos semelhantes, com uma baixa frequência do genótipo XX.
Esses dados também suportam a ideia de que a ausência da proteína alfa-
actinina-3 favorece o desempenho aeróbio e que sua presença, por outro
lado, favorece o desempenho de força/velocidade/potência.
Posteriormente, estudos com camundongos nocaute (KO) para
ACTN3 foram realizados com o intuito de mimetizar o genótipo R577X e a
falta da proteína no músculo esquelético (MACARTHUR, SETO, RAFTERY,
QUINLAN, HUTTLEY, HOOK, LEMCKERT, KEE, EDWARDS, BERMAN,
23
HARDEMAN, GUNNING, EASTEAL, YANG e NORTH, 2007; MACARTHUR,
SETO, CHAN, QUINLAN, RAFTERY, TURNER, NICHOLSON, KEE,
HARDEMAN, GUNNING, COONEY, HEAD, YANG e NORTH, 2008). Os
camundongos KO não demonstraram alterações estruturais no sarcômero e
também não apresentaram perda de fibras do tipo IIb. Logo, o polimorfismo
provavelmente não resulta em alguma alteração fenotípica da ultraestrutura
sarcomérica porque a presença da alfa-actinina 2 é capaz de compensar a
falta da alfa-actinina 3 (MACARTHUR, SETO, RAFTERY et al., 2007). Em
relação ao metabolismo, fibras de camundongos KO apresentaram maior
atividade de enzimas oxidativas (mitocondriais, citrato sintase, succinato
desidrogenase e citocromo c oxidase), corroborando a ideia de que o
genótipo R577X favorece o metabolismo aeróbio. Similarmente, enzimas
relacionadas à oxidação de ácidos graxos também foram detectadas em
maiores concentrações. Por outro lado, foi observada menor produção de
força e desenvolvimento de massa muscular nos camundongos KO quando
comparados ao grupo controle. Essa perda de massa muscular está
relacionada à diminuição do diâmetro das fibras rápidas do tipo IIb
(MACARTHUR, SETO, RAFTERY et al., 2007).
Uma característica importante das alfa-actininas é a capacidade de
ligar-se a diversas outras proteínas estruturais do sarcômero, em especial às
que compõe a linha Z (LEK, MACARTHUR, YANG e NORTH; LEK e
NORTH). Dentre elas, destaca-se a proteína ALP (do inglês, Actinin-
associated LIM Protein), uma das quatro proteínas da família PDZ-LIM e
também conhecida como PDLIM3 (ZHENG, CHENG, BANERJEE e CHEN,
2010).
A proteína ALP é expressa no músculo esquelético e sua isoforma um
pouco menor, codificada pelo mesmo gene e resultante em de um splicing
alternativo (POMIES, MACALMA e BECKERLE, 1999), é expressa no
músculo cardíaco (POMIES, PASHMFOROUSH, VEGEZZI, CHIEN,
AUFFRAY e BECKERLE, 2007). Estudos in vitro demonstraram que ALP
purificada aumenta a capacidade das alfa-actininas de se ancorarem nos
filamentos de actina, o que indica que a ALP pode ter um papel importante na
organização estrutural do sarcômero (PASHMFOROUSH, POMIES,
PETERSON, KUBALAK, ROSS, HEFTI, AEBI, BECKERLE e CHIEN, 2001).
24
O estudo de Pashmforoush et al. (PASHMFOROUSH, POMIES, PETERSON
et al., 2001) demonstrou que a superexpressão de ALP induz a formação de
arranjos de actina altamente robustos e organizados. Ainda, sabe-se que a
ALP apresenta uma regulação positiva muito forte durante o desenvolvimento
embrionário do tecido muscular estriado, tanto o cardíaco quanto o
esquelético (POMIES, MACALMA e BECKERLE, 1999). Estudos com
camundongos KO para ALP demonstraram prejuízo na função cardíaca,
alterações na câmara ventricular direita e cardiomiopatia no ventrículo direito
(PASHMFOROUSH, POMIES, PETERSON et al., 2001), mas nenhuma
alteração evidente no tecido muscular esquelético foi observada (JO,
RUTTEN, BUNN e BREDT, 2001).
Existem descritos, atualmente, cerca de 400 loci que apresentam
variações no número de cópias (JAKOBSSON, SCHOLZ, SCHEET et al.,
2008). Um dos genes descritos nesse banco de dados é o ALP. Uma análise
in silico realizada por nosso grupo de pesquisa no banco de dados do site
UCSC genome browser constatou que existe um polimorfismo do tipo CNV
no gene ALP que consiste na inserção ou deleção de ~2,6 Kb em uma região
não codificadora. Embora nosso grupo não tenha encontrado nenhum dado
na literatura a respeito dos efeitos desse CNV sobre a estrutura, função ou
regulação da expressão da proteína, dados não publicados do Sanger
Institute (Daniel McArthur, comunicação pessoal) demonstraram, em um
estudo piloto, que a frequência do polimorfismo foi de 100% em uma
população da Etiópia (20 polimorfismos em 20 sujeitos avaliados) e de
apenas 10% em uma população caucasiana europeia (2 polimorfismos em 20
sujeitos). Considerando sua importante função no desenvolvimento do tecido
muscular estriado, na regulação da estrutura sarcomérica, sua importante
relação com as alfa-actininas e sua provável frequência diferencial entre
etnias, o polimorfismo de variação no número de cópias do gene ALP torna-
se um importante gene candidato para apresentar relação com a função da
musculatura esquelética e/ou cardíaca e, por consequência, com o
desempenho esportivo.
Assim sendo, o presente projeto de pesquisa terá como objetivos
avaliar a associação entre o CNV do gene ALP e o sucesso competitivo e
25
avaliar o impacto do polimorfismo na expressão proteica de ALP (PDLIM3) no
músculo esquelético.
26
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.2. O dogma central da biologia molecular O dogma central da biologia molecular é um conceito desenvolvido por
Francis Crick em 1973 (CRICK, 1970) e trata do fluxo de informações
genéticas que ocorre na natureza. Segundo esse conceito, as informações
necessárias para a síntese de todas as proteínas de um indivíduo encontram-
se no genoma, ou no conjunto total de DNA desse indivíduo. Para que seja
formada uma proteína, o DNA é inicialmente convertido em RNA, o qual é
responsável por transmitir a mensagem ou a informação necessária para que
essa proteína seja sintetizada. Portanto, o fluxo primário das informações é
DNAàRNAàProteína (figura 2). Adicionalmente, deve-se mencionar a
capacidade das células em se multiplicarem, ou dos organismos em se
reproduzirem. Isso pressupõe a realização de cópias de sua informação
genética, para que seja possível passá-las às novas células ou às novas
gerações de indivíduos. Portanto, nesse fluxo de informações, também deve
ser considerado que o DNA é capaz de gerar DNA (figura 2). Entretanto,
existem espécies que lidam com essas informações de modo diferente. Por
exemplo, algumas espécies de vírus não são constituídas de DNA, mas sim
de RNA e, durante seu processo proliferativo, convertem RNA em DNA.
Igualmente, existem casos raros na natureza de organismos que produzem
proteína diretamente a partir de DNA e que produzem cópias de moléculas
de RNA (figura 2). De qualquer modo, é importante destacar que, no caso da
espécie humana, o único fluxo possível de informações é
DNAàRNAàProteína e DNAàDNA.
27
Figura 2. Representação esquemática do dogma central da biologia molecular. As setas
destacadas em vermelhos representam os fluxos de informação que são relevantes à
espécie humana. As setas pretas pontilhadas representam fluxos alternativos que ocorrem
com frequência muito menor na natureza, especialmente em micro-organismos (adaptado de
Crick, 1970 (CRICK, 1970).
2.3. O genoma humano Genoma refere-se ao conjunto total de informações genéticas de uma
espécie, ou a tudo aquilo que é passado para a geração seguinte (WEAVER,
2011). Toda a informação genética é armazenada sob a forma de código, o
qual é constituído por quatro nucleotídeos. Esses nucleotídeos são capazes
de se ligar entre si, formando um polímero extremamente extenso que, em
última análise, forma uma molécula de ácido desoxirribonucleico, ou DNA
(NELSON e COX, 2005).
Toda a informação genética necessária para constituir um indivíduo
está armazenada nas sequências de bases, no DNA. O material genético
encontra-se nos núcleos das células, embora exista uma pequena
quantidade de DNA nas matrizes mitocondriais (NELSON e COX, 2005).
Dentro do núcleo, o DNA organiza-se sob a forma de cromossomos, os quais
podem apresentar diferentes estados de condensação, a depender da fase
do ciclo celular que a célula se encontra. Em todas as células, com exceção
das hemácias que não possuem núcleo e dos gametas, os cromossomos
apresentam-se em pares.
Nos seres humanos, o número de pares de cromossomos é 23,
formando um total de 46 cromossomos. Portanto, os seres humanos têm
28
duas formas semelhantes, mas não idênticas, de cada cromossomo. Embora
os genes que cada um dos membros de um par de cromossomos contém
sejam absolutamente os mesmos, eles apresentam algumas pequenas
diferenças nas sequências das bases (LODISH, BERK, KAISER, KRIEGER,
SCOTT, BRETSCHER, PLOEGH e MATSUDAIRA, 2007). Isso porque um
dos alelos é herdado do pai, ao passo que o outro alelo é herdado da mãe
(para cada cópia dos genes que se encontram em um membro de um par de
cromossomos dá-se o nome de alelo). Logo, todos possuem dois alelos, ou
duas variantes, de cada gene, um deles herdado do pai e o outro, da mãe.
Os cromossomos podem ser classificados como cromossomos
somáticos (também chamados de autossomos) ou cromossomos sexuais
(também chamados de alossomos). Os seres humanos possuem 22 pares de
autossomos homólogos (isto é, cromossomos não sexuais que contêm genes
equivalentes, sendo um deles materno e o outro, paterno) no núcleo de cada
célula, além de um par de cromossomos sexuais. Enquanto os autossomos
são numerados de 1 a 23, os alossomos são denominados X e Y
(STRACHAN e READ, 2010). Os cromossomos sexuais são os que conferem
as características sexuais do indivíduo, sendo que o indivíduo que possui um
par de cromossomos X é do sexo feminino e aquele que possui um
cromossomo X e um Y é do sexo masculino. A figura 3 ilustra um par de
cromossomos.
Figura 3. Representação ilustrativa de um par de cromossomos homólogos. Um dos
cromossomos corresponde ao de origem maternal enquanto o outro corresponde ao de
origem paternal. A ilustração mostra o padrão típico de diferenciação de cores das bandas
claras e escuras, os braços longo e curto (cujas bandas são classificadas como “q” e “p”,
respectivamente) e o centrômero, que une seus braços.
29
Além dos milhões de pares de bases e dos milhares de genes que são
encontrados nos 46 cromossomos em cada célula que contém núcleo, as
células humanas também possuem uma pequena molécula de DNA em suas
cristas mitocondriais. Cada mitocôndria apresenta uma única cópia do DNA
mitocondrial (STRACHAN e READ, 2010). Isso significa que uma célula pode
possuir de 100 a mais de 10000 cópias do DNA mitocondrial, a depender do
número de mitocôndrias presentes nessa célula. Diferente do DNA nuclear, o
DNA mitocondrial apresenta-se sob a forma circular, sendo composto por,
aproximadamente, 15 mil pares de bases, cujas sequências totalizam 37
genes (NELSON e COX, 2005). Apenas uma parte desses genes resulta em
proteínas, já que muitos deles codificam diferentes classes de RNA. Tais
genes são expressos ou transcritos na própria matriz mitocondrial, de tal
forma que as proteínas sintetizadas na mitocôndria exercerão suas funções
na própria mitocôndria (NELSON e COX, 2005). Não surpreendentemente,
esses genes mitocondriais codificam proteínas da cadeia de transporte de
elétrons e da fosforilação oxidativa.
A conclusão do projeto genoma, em 2001, finalizou o trabalho de
sequenciamento completo dos mais de 3 bilhões de pares de bases que
compõem o genoma humano. Estima-se que, desse total, apenas 5%
contenha sequências com informações para formação de proteínas,
formando cerca de 20 a 25 mil genes, espalhados pelos 23 cromossomos e
pelo DNA circular mitocondrial (ALBERTS, JOHNSON, LEWIS, RAFI,
ROBERTS e WALTER, 2007). Interessantemente, ainda que a sequência
completa do genoma esteja descrita há 10 anos, muitos desses genes ainda
são praticamente desconhecidos, de forma que pouco ou nada se sabe sobre
suas funções (http://ghr.nlm.nih.gov/handbook/basics/gene).
2.3.1. Estrutura e propriedades do DNA
Em 1953, James Watson e Francis Crick publicaram um dos trabalhos
mais importantes da história da ciência moderna, descrevendo a estrutura do
DNA (WATSON e CRICK, 1953). As moléculas de DNA são longas cadeias
de nucleotídeos. Cada nucleotídeo que forma o DNA é composto por uma
molécula de desoxirribose, um grupo fosfato e uma de quatro possíveis
30
bases nitrogenadas: adenina, citosina, timina e guanina, ou simplesmente A,
C, T e G (figura 4). As bases timina e citosina pertencem ao grupo das
pirimidinas, enquanto que as bases adenina e guanina pertencem ao grupo
das purinas, isto é, um grupamento pirimidina conjugado a um anel
imidazólico (figura 5) (NELSON e COX, 2005).
Figura 4. Painel A: ilustração esquemática de um nucleotídeo com seus três componentes,
uma base nitrogenada, uma pentose e um fosfato. No caso representado, a molécula é um
nucleotídeo de DNA, já que a pentose é, em específico, uma desoxirribose. Painel B:
ilustração esquemática da estrutura molecular de um nucleotídeo de adenina. Nesse caso,
também está sendo representado um nucleotídeo de DNA. Os números menores marcados
em cinza indicam a numeração dos carbonos da ribose que são utilizadas como referência
para o sentido da fita de DNA (isto é, 5’ e 3’).
Figura 5. Ilustração esquemática das nucleobases, ou bases nitrogenadas, que compõe os
ácidos nucleicos, de acordo com sua classificação química. Note que as purinas possuem
estrutura molecular semelhante às pirimidinas, com a fusão de um grupamento químico
denominado anel imidazólico.
Para formar os longos polímeros de nucleotídeos, cada um desses
nucleotídeos liga-se a um outro por meio de uma ligação fosfo-diéster,
conforme ilustra a figura 6. Uma quantidade grande de nucleotídeos contendo
diferentes bases nitrogenadas ligados de forma linear dá origem a uma fita
31
simples de DNA. A sequência das bases nitrogenadas de uma fita simples
linear de DNA contém toda a informação necessária para a produção de
proteínas com estruturas tridimensionais (NELSON e COX, 2005). Mais
especificamente, o genoma completo contém a informação para a síntese de
todas as proteínas do organismo, mas a sequência de nucleotídeos
necessária para a produção de uma única proteína está contida em um gene.
Figura 6. Ilustração demonstrando esquematicamente (à esquerda) e estruturalmente (à
direita) como os nucleotídeos ligam-se por meio de ligação fosfodiéster para formar a
molécula de DNA.
Além de serem capazes de se ligar através de ligações fosfodiéster, os
nucleotídeos possuem outra importante característica, a complementaridade.
Por meio de interações denominadas ponte de hidrogênio, as bases
nitrogenadas dos nucleotídeos permitem que dois deles se estabilizem,
formando um par de bases. As bases adenina e timina possuem maior
probabilidade de interagir entre si, pois suas estruturas químicas possibilitam
a formação de duas pontes de hidrogênio (figura 7). Portanto a base timina é
complementar à base adenina, e vice-versa. Já as bases guanina e citosina
possuem maior probabilidade de interagir entre si porque suas estruturas
possibilitam a formação de três pontes de hidrogênio (figura 7). Logo,
guanina é complementar a citosina, e vice-versa. Obviamente, a ligação C-G
32
é mais estável do que a ligação A-T. Em função dessa complementaridade
entre as bases, uma fita simples de DNA apresenta uma fita complementar
antiparalela (figura 8). Isto é, as ligações fosfodiéster se encontram no
sentido 5’à3’ em uma das fitas e no sentido 3’à5’ em sua fita complementar.
Ambas as fitas mantêm-se unidas pelas pontes de hidrogênio. As forças
exercidas pelas pontes de hidrogênio e pelas ligações fosfodiéster conferem
a uma molécula de DNA de dupla fita sua característica estrutura
tridimensional de dupla-hélice (figura 9) (WEAVER, 2011).
Figura 7. Ilustração demonstrando as ligações por pontes de hidrogênio entre as bases A-T
(parte superior) e C-G (parte inferior), o que confere complementaridade às bases e permite
que uma fita simples de DNA tenha uma fita complementar, formando uma dupla fita.
Figura 8. Representação esquemática de uma molécula dupla-fita de DNA, com sua fita
complementar antiparalela.
33
Figura 9. Representação esquemática da estrutura tridimensional da molécula de DNA, em
sua dupla-hélice antiparalela formada pela ligação fosfodiéster de seus nucleotídeos, e
mantida por quatro diferentes bases que, por complementaridade, ligam-se por pontes de
hidrogênio.
2.3.2. Replicação do DNA
Em função da complementaridade entre as bases nitrogenadas que
compõem os nucleotídeos, cópias virtualmente idênticas podem ser feitas a
partir das longas moléculas de DNA, num processo denominado replicação.
A replicação ocorre sempre que uma célula vai entrar em divisão, seja para
dar origem a uma célula idêntica (o que se dá pela mitose), seja para passar
a informação genética para a próxima geração, dando origem a uma célula
com apenas 50% de identidade da célula “mãe” (o que se dá pela meiose)
(STRACHAN e READ, 2010).
A função primordial da replicação é, portanto, sintetizar uma nova
dupla-fita de DNA que seja idêntica à fita que precisa ser duplicada, a qual
também é chamada de fita molde. Tal processo ocorre no núcleo das células
e sua fina regulação faz com que ele somente seja iniciado quando houver
real necessidade de divisão celular, o que evita a proliferação celular
descontrolada (STRACHAN e READ, 2010). Foge aos objetivos desta revisão
discutir tal regulação.
34
Além de ser bem regulada, a replicação é um processo complexo que
envolve uma série de enzimas e outros elementos, cujos nomes e funções
estão destacados na tabela 1. No início da replicação, a enzima
topoisomerase atua sobre a dupla hélice de DNA, desfazendo sua estrutura
tridimensional, o que torna a dupla hélice uma dupla fita linearizada. Outra
importante função da topoisomerase é manter a estabilidade da molécula de
DNA durante toda a replicação (ALBERTS, JOHNSON, LEWIS et al., 2007).
Em seguida, a dupla fita, agora em formato linear, sofre a ação da enzima
helicase, que age sobre as pontes de hidrogênio entre as nucleobases,
rompendo-as. O resultado do rompimento das pontes de hidrogênio que
mantém as duas fitas unidas é a soltura das mesmas, o que dá origem uma
região do DNA, mais exatamente em uma de suas extremidades, que se
passa a se apresentar como duas fitas simples separadas. Essa separação
das fitas em uma das extremidades forma uma estrutura conhecida como
forquilha de replicação (ALBERTS, JOHNSON, LEWIS et al., 2007).
Tabela 1. Relação dos elementos necessários para a replicação do DNA e suas respectivas
funções durante esse processo.
Elemento Função
Enzima Topoisomerase Linearizar a estrutura de hélice e manter sua
estabilidade
Enzima Helicase Romper as pontes de hidrogênio, “abrindo” a
dupla-fita em duas fitas simples
Enzima DNA Polimerase Sintetizar a nova fita de DNA com base na
fita molde
Iniciadores, ou Primers Elemento indispensável para que a DNA
Polimerase inicie a síntese de DNA
Nucleotídeos (A, C, T e G) Elementos indispensáveis que irão compor a
nova fita de DNA
Enzima DNA Ligase
Realiza a fusão dos fragmentos de DNA
formados durante a síntese da nova fita
(fragmentos de Okazaki)
35
A forquilha de replicação expõe os nucleotídeos da fita molde para
que, a partir da complementaridade das nucleobases, a nova fita de DNA
seja sintetizada. Tal processo de síntese, que também pode ser entendido
como polimerização ou alongamento de uma cadeia de nucleotídeos, é
realizado pela enzima DNA polimerase (NELSON e COX, 2005). Essa
enzima, para estar apta a dar início à polimerização, necessita da presença
de uma curta sequência de nucleotídeos que seja complementar a algum
ponto da região de início da replicação. A essa curta sequência de
nucleotídeos, ou a esse oligonucleotídeo, dá-se o nome de iniciador ou
primer (LODISH, BERK, KAISER et al., 2007). Uma vez que a forquilha esteja
preparada e que os iniciadores estejam ligados às suas sequências
complementares nas fitas molde, a enzima DNA polimerase é então capaz de
realizar sua função de síntese da nova fita de DNA. Isso é feito pela adição
consecutiva de nucleotídeos à nova fita, por meio de ligações fosfodiéster. A
sequência dos nucleotídeos será exatamente complementar à sequência da
fita molde, o que, em última análise, resulta em uma nova fita dupla que é, na
verdade, composta por uma fita recém-sintetizada e uma fita que já estava
presente na célula (fita molde). Considerando que esse processo ocorre
simultaneamente nas duas fitas molde, o resultado final da replicação é a
formação de duas fitas duplas novas, ambas compostas por uma fita recém-
sintetizada complementar à fita “antiga”, ou fita molde (LODISH, BERK,
KAISER et al., 2007).
Um importante detalhe desse processo é que a DNA polimerase só é
capaz de realizar a extensão no sentido 5’à3’. Já que as fitas
complementares são antiparalelas (ou seja, o sentido 5’à3’ de uma fita é
invertido em relação à sua fita complementar – veja figura 6), a DNA
polimerase fará a síntese da nova fita em um sentido em uma das fitas, e no
sentido oposto na fita complementar. Em outras palavras, em uma das fitas a
nova cadeia será sintetizada em direção à forquilha de replicação (cuja
nomenclatura é fita líder, do inglês leading strand), ao passo que na fita
complementar, a nova cadeia será sintetiza a partir da forquilha (cujo nome é
fita tardia, do inglês lagging strand) (WEAVER, 2011). Como resultado, a
síntese da fita líder pode ser feita de forma contínua, enquanto que síntese
da fita tardia é constantemente interrompida à medida que a forquilha avança
36
sobre a região do DNA que ainda não foi copiado. Isso faz com que a fita que
foi recém-sintetizada a partir da forquilha se apresente sob a forma de
inúmeros fragmentos, os quais são conhecidos por fragmento de Okazaki
(NELSON e COX, 2005). Ao final da replicação, a ação de uma última
enzima, a DNA ligase, une os fragmentos de Okazaki uns aos outros,
tornando a fita contínua e completando a cópia do DNA (NELSON e COX,
2005). A figura 10 apresenta um esquema que resume a replicação do DNA.
Figura 10. Ilustração esquemática que representa o processo de replicação ou cópia do
DNA, com os seus principais elementos.
2.3.3. Organização dos genes Gene refere-se a uma região cromossômica que contém uma
sequência de pares de bases com a informação necessária para a síntese de
um produto biologicamente ativo (BROWN, 2010). Embora esse produto seja,
na maioria das vezes, uma proteína, alguns genes codificam moléculas de
RNA que exercem suas funções sem que sejam convertidas em proteínas
(PEARSON, 2006). Os genes também contêm sequências que não codificam
para proteínas ou RNAs, mas que, por outro lado, permitem a regulação de
sua expressão (PENNISI, 2007). Em alguns casos, um único gene pode dar
origem a mais de uma isoforma de uma proteína, o que ocorre pelo processo
denominado splicing alternativo (ver tópico “Transcrição do DNA e tradução
do RNA” adiante).
37
Em humanos, conforme descreve o dogma central da biologia
molecular, o gene, que é uma região do DNA, deve ser convertido em RNA
para então poder ser convertido em proteína. A esse processo de conversão
do DNA em RNA, dá-se o nome de transcrição, ao passo que a conversão do
RNA em proteína é chamada de tradução. A transcrição de um gene em seu
RNA correspondente é referida como “expressão gênica” e a tradução do
RNA em sua proteína correspondente é denominada “expressão proteica”.
Todas as células de um organismo possuem a mesma informação
genética, ou o genoma completo daquele indivíduo. Entretanto, para que
possam cumprir diferentes funções especializadas, cada célula deve produzir
apenas as proteínas necessárias para que sua função específica seja
realizada. Exemplificando, uma célula muscular e um neurônio possuem os
mesmos genes e, portanto, potencial para produzir as mesmas proteínas.
Contudo, o que permite que tais células possuam um grau tão elevado de
especialização e sejam tão diferentes do ponto de vista fenotípico é a
capacidade que ambas possuem de produzir apenas as proteínas que lhes
conferem seu fenótipo. De forma simplificada, uma célula muscular só
consegue contrair-se porque expressa proteínas contráteis, enquanto que um
neurônio só consegue transmitir informações porque expressa
neurotransmissores e receptores. Isso ocorre a despeito do fato de ambas as
células possuírem as informações necessárias para sintetizar tanto as
proteínas contráteis quanto os neurotransmissores. Tal grau de
especialização celular só é possível pela capacidade que as células têm de
“ativar” e “desativar” a expressão de seus genes. Assim, torna-se claro que a
regulação da expressão gênica é fundamental para a homeostase de uma
célula e de um organismo como um todo.
A regulação fina da expressão gênica é possível graças à estrutura de
um gene, o qual contém regiões que ativam sua expressão, além de outras
regiões que aumentam ou diminuem a sua taxa de expressão (BROWN,
2010) (figura 11). Existem diversos mecanismos de controle da expressão
gênica, que incluem regulação pela heterocromatina (isto é, quando o
cromossomo está compactado, não há acesso das enzimas e fatores de
transcrição ao gene e, assim, o gene não se expressa) e regulação
epigenética (isto é, o padrão de metilação, especialmente em regiões CpG –
38
sequência citosina-guanina ligadas por fosfato – geralmente leva à repressão
da expressão gênica (JAENISCH e BIRD, 2003)), entre outras. O mais
importante mecanismo de regulação da expressão gênica é, no entanto, o
controle do início da transcrição.
O início da transcrição de um gene é, de forma simplificada, controlado
pela interação de elementos denominados fatores de transcrição com
sequências do DNA com funções regulatórias, conhecidas como promotores
(WESOLOWSKI e RAMASWAMY, 2011). Os fatores de transcrição podem
ser diversos, como proteínas, hormônios ou outros elementos. Em geral, as
sequências regulatórias de um gene localizam-se algumas dezenas ou
centenas de pares de bases antes das sequências codificadoras (tomando
como referência o sentido 5’à3’, que corresponde ao sentido em que ocorre
a transcrição gênica) (figura 11). A ligação de fatores de transcrição às
sequências promotoras de um gene tem o potencial de ativar a enzima RNA
polimerase que, em última análise, é responsável por transcrever a região
codificadora de um gene em seu RNA correspondente (ALBERTS,
JOHNSON, LEWIS et al., 2007). Assim, a própria estrutura de um gene,
combinada com fatores que muitas vezes resultam da interação do
organismo com o ambiente (como, por exemplo, exposição a agentes
patológicos, fármacos, nutrientes e o próprio exercício físico) (RAUE,
TRAPPE, ESTREM, QIAN, HELVERING, SMITH e TRAPPE, 2012),
possibilita a regulação de sua expressão.
A expressão de um gene não é regulada apenas pelo início da sua
transcrição. Tal regulação, na verdade, determinará se certo gene será ou
não transcrito, isto é, se ele será expresso ou se será mantido silenciado
(NELSON e COX, 2005). Adicionalmente, um gene ativo também pode ter
sua taxa de expressão regulada, seja por meio de sua potencialização ou de
sua repressão. Isso se dá graças à presença de sequências de DNA
(conhecidas como enhancers e repressores) que normalmente se encontram
algumas centenas ou milhares de pares de bases antes do sítio de início da
transcrição de um gene (figura 11). Assim como ocorre no controle do início
da transcrição, a taxa de expressão de um gene é aumentada ou diminuída
através de ligação dos mais diversos tipos de moléculas com as sequências
enhancers ou repressoras (LODISH, BERK, KAISER et al., 2007).
39
Uma das mais importantes regiões promotoras de um gene é
conhecida como TATA-box (figura 11). Tal nome deve-se ao fato de
virtualmente todos os genes apresentarem uma região rica em sequências
TATA. Essa região normalmente se localiza poucos pares de base, algumas
dezenas, antes do sítio de início da transcrição (LODISH, BERK, KAISER et
al., 2007). Sua função primária é permitir que a enzima RNA polimerase se
ligue à molécula de DNA logo antes do sítio de início da transcrição,
sinalizando onde a transcrição deve ser iniciada (LODISH, BERK, KAISER et
al., 2007). Obviamente, a sequência TATA por si só não é capaz de promover
a ligação da RNA polimerase ao DNA, pois isso redundaria na transcrição
irrestrita de virtualmente todos os genes em uma mesma célula. Ao contrário,
a sequência TATA por ser um importante promotor de transcrição gênica,
deve apresentar-se ligada a fatores de transcrição para que a enzima RNA
polimerase possa reconhecê-la e, assim, dar início à transcrição de um gene
específico (WEAVER, 2011).
Conforme mencionado anteriormente, apenas 5% do genoma humano
correspondem a sequências de DNA que contêm código para formação de
proteínas. Obviamente, 95% do DNA não é composto por sequências sem
função. Ao contrário, as sequências não codificadoras desempenham
importantes funções, dentre as quais se destacam a regulação e a
manutenção da estrutura do DNA (STRACHAN e READ, 2010).
Além das sequências regulatórias que geralmente se apresentam
antes das regiões codificadoras, os genes quase sempre possuem regiões
codificadoras que se intercalam com regiões não codificadoras. Às regiões
codificadoras dá-se o nome de éxons e, às não codificadoras, íntrons. A
figura 11 ilustra a estrutura simplificada de um gene, com suas regiões
regulatórias, éxons e íntrons.
40
Figura 11. Ilustração esquemática da estrutura de um gene. A figura mostra um gene, que
ocupa uma região pequena em relação ao total de pares de bases de um cromossomo, com
suas regiões regulatórias, codificadoras (éxons) e não codificadoras (íntrons). O número de
íntrons e éxons, bem como seus tamanhos, varia de acordo com cada gene.
2.3.4. Transcrição do DNA e tradução do RNA Quando um gene se expressa, ou é transcrito, ele é convertido em seu
RNA correspondente. Em outras palavras, uma região específica do DNA
(isto é, a parte de um gene que deve ser transcrita) é usada como molde para
que seja sintetizada uma molécula de RNA, a qual é complementar à fita
molde de DNA (figura 12) (ALBERTS, JOHNSON, LEWIS et al., 2007).
Embora esse processo guarde alguma semelhança à replicação do DNA,
inúmeras são as diferenças. Dentre as mais importantes, destacam-se: i) na
replicação, uma molécula inteira de DNA é copiada em sua totalidade,
resultando em duas moléculas de DNA idênticas. Já na transcrição, apenas
parte de um gene é transcrito; ii) na replicação, DNA dupla fita é sintetizado a
partir de DNA dupla fita. Na replicação, uma fita simples de RNA é sintetizada
a partir de DNA dupla fita; iii) na replicação, a nova fita de DNA é feita com
base em uma fita molde, adicionando-se os nucleotídeos A, C, T e G através
de ligações fosfodiéster. Na transcrição, a nova fita de RNA é sintetizada pela
adição de A, C, U (uracila) e G, também por meio de ligações fosfodiéster; iv)
na replicação, uma única enzima DNA polimerase liga-se ao DNA para fazer
uma cópia única de cada molécula. Na transcrição, diversas enzimas RNA
polimerase podem ligar-se ao DNA para fazer inúmeras cópias do RNA
daquele gene. Isso determina a taxa de transcrição do gene e pode ser
regulado pelos enhancers e pelos repressores.
41
Figura 12. Representação de uma molécula de RNA recém-sintetizada (destacada em
vermelho) com base na informação contida em uma sequência de DNA (gene). Note que a
sequência da fita de RNA é complementar à fita molde de DNA, o que a torna idêntica à fita
complementar de DNA (exceto pela troca de timina por uracila, em vermelho).
A troca de timina por uracila deve-se a diferenças estruturais entre
moléculas de DNA e RNA (ALBERTS, JOHNSON, LEWIS et al., 2007). Cabe
salientar que enquanto o DNA é formado por bases nitrogenadas ligadas a
uma desoxirribose, o RNA é formado pelas mesmas bases nitrogenadas
(exceção da timina que é substituída por uracila) ligadas a uma ribose (figura
13).
Figura 13. Ilustração esquemática da estrutura do RNA. O desenho mostra como as
nucleobases se ligam para formarem as fitas de RNA, por meio de ligações fosfodiéster, a
exemplo do que ocorre nas moléculas de DNA. As principais diferenças estruturais em
relação ao DNA estão destacadas em vermelho (presença da base uracila em substituição à
timina e um grupo hidroxil a mais na pentose, que a configura como uma ribose).
42
Para que a transcrição seja iniciada, é preciso que a enzima
responsável pela transcrição RNA polimerase (no caso dos eucariotos,
incluindo os seres humanos, a RNA polimerase II realiza a transcrição
gênica) ligue-se a regiões promotoras do gene a ser expresso. Essa ligação
só ocorrerá se fatores de transcrição estiverem anexados à região promotora
(RAUE, TRAPPE, ESTREM et al., 2012). Uma vez que a região promotora do
gene apresenta ligações com fatores de transcrição e com a RNA polimerase
II, forma-se o chamado complexo de transcrição e a transcrição tem início.
Para que a transcrição de um gene de fato ocorra é necessário,
entretanto, que a enzima RNA polimerase II tenha acesso às regiões
promotoras e ao sítio de início da transcrição (NELSON e COX, 2005). Isso
ocorre graças à ação da enzima helicase que, a exemplo do que ocorre
durante a replicação do DNA, rompe as pontes de hidrogênio das
nucleobases entre as fitas, expondo o DNA à ação da RNA polimerase. Para
evitar que a dupla fita de DNA forme superexpirais nas regiões anteriores e
posteriores ao sítio de transcrição, a enzima topoisomerase, semelhante ao
que ocorre na replicação, mantém a estrutura do DNA durante a transcrição
(NELSON e COX, 2005). A tabela 2 mostra os principais elementos
necessários para que um gene seja transcrito.
Tabela 2. Enzimas e elementos necessários para a transcrição gênica.
Elemento Função
Enzima Topoisomerase Linearizar a estrutura de hélice e manter sua estabilidade
Enzima Helicase Romper as pontes de hidrogênio, “abrindo” a dupla-fita em duas fitas simples
Fatores de transcrição Ligarem-se às regiões promotoras do DNA para ativar a RNA polimerase e dar início à transcrição daquele gene
Enzima RNA Polimerase Sintetizar a fita de RNA com base na fita molde de DNA
Nucleotídeos (A, C, U e G) Elementos indispensáveis que irão compor a nova fita de RNA
43
Uma vez ligada ao DNA poucos pares de bases antes do sítio de início
da transcrição, a enzima RNA polimerase inicia sua leitura do gene na
direção 5’à3’, dando início à transcrição assim que encontrar o sítio de início
de transcrição (figura 11). Durante a transcrição, a RNA polimerase utiliza
apenas uma das fitas de DNA como molde, fazendo o alongamento da
cadeia de RNA a partir da sequência encontrada no molde de DNA (figura
14) (NELSON e COX, 2005). Em consequência, a fita de RNA recém-
sintetizada terá sequência idêntica à fita de DNA complementar àquela que
foi usada como molde, exceto pelas trocas de timina por uracila (figuras 11 e
14). É importante reforçar que, diferente do DNA, o RNA apresenta-se sob a
forma de fita simples, molécula cujo nome é transcrito primário (figura 14).
Ao contrário da replicação, a transcrição não percorre toda a molécula
de DNA do início ao fim, mas tem início e término em um pequeno segmento
da fita (NELSON e COX, 2005). Assim, a transcrição não resulta em uma
forquilha, mas em uma estrutura semelhante a uma bolha, a qual é
denominada bolha de transcrição. Tal bolha nada mais é do que a região na
qual as fitas de DNA estão separadas (pela ação da helicase) e a RNA
polimerase faz a síntese da molécula de RNA com base na fita molde de
DNA (ALBERTS, JOHNSON, LEWIS et al., 2007) (figura 14).
O processo de finalização da transcrição de um gene em células
eucarióticas não é muito bem compreendido e parece ser diferente para cada
isoforma de RNA polimerase e dependente da ligação de proteínas à RNA
polimerase no sítio de término da transcrição. A figura 14 apresenta uma
representação de como ocorre esse processo de transcrição de um gene.
44
Figura 14. Ilustração esquemática do processo de transcrição de um gene, com a síntese de
uma molécula de RNA mensageiro a partir de um molde de DNA. A enzima RNA polimerase
é responsável pela leitura da fita molde e alongamento da fita de RNA. O sentido da leitura é
5’à3’. A quebra das pontes de hidrogênio é feita pela enzima helicase, o que forma a bolha
de replicação. A topoisomerase, por sua vez, mantém a estrutura do DNA, evitando a
formação de superexpirais antes e depois da bolha de transcrição.
O resultado final da transcrição de um gene é uma molécula de RNA
mensageiro (mRNA), conforme ilustrado nas figuras 12 e 14. Esse transcrito
primário carrega a informação (ou a mensagem) para a síntese de uma
determinada proteína e, para tanto, precisa deixar o núcleo e chegar até o
ribossomo (ALBERTS, JOHNSON, LEWIS et al., 2007). Entretanto, é
importante salientar que um gene é transcrito desde o sítio de início da
transcrição até o sítio de término da transcrição. Isso inclui regiões que não
contêm informações para a síntese proteica (figura 15), quais sejam: i) região
entre o sítio de início de transcrição e o códon inicial (ver definição de códon
adiante); ii) região entre o códon de parada e o sítio de término da
transcrição; iii) íntrons (ALBERTS, JOHNSON, LEWIS et al., 2007).
Consequentemente, um transcrito primário necessita ser processado
antes de deixar o núcleo e dirigir-se ao ribossomo. Tal processamento
envolve três etapas básicas (WEAVER, 2011). Uma delas é a adição de um
cap (cuja possível tradução para o português seria “boné” ou “touca”) à sua
extremidade 5’, também chamado de “5’ cap”. O cap recebe esse nome pelo
seu papel de “cobrir” a extremidade do RNA sujeita à ação de enzimas que
podem degradá-lo, protegendo assim o transcrito primário e preservando
sua estrutura e integridade. Do ponto de vista de sua estrutura química, o
45
5’cap é uma base nitrogenada (guanina) com um grupamento metil na
posição 7 e, por isso, recebe o nome de 7-metilguanilato (WEAVER, 2011).
Além de proteger o mRNA, o 5’cap também possui outras funções, como
sinalizar o transporte do mRNA para fora do núcleo e iniciar sua tradução
nos ribossomos (WEAVER, 2011).
Uma segunda etapa é a adição de uma cauda poli-A (isto é, um
poliadenilato, ou uma cadeia de adeninas ligadas em série, com
aproximadamente 100-250 bases de comprimento) a extremidade 3’ do
transcrito primário. A cauda poli-A também tem a função de aumentar a
estabilidade do mRNA e impedir sua degradação (WEAVER, 2011).
Por fim, o transcrito primário também deve ter seus íntrons retirados
antes que possa levar a mensagem ao núcleo. Após a retirada dos íntrons,
os éxons que contém a informação para síntese da proteína devem ser
reconectados uns aos outros. Esse processo de retirada de íntrons e fixação
de éxons é chamado de splicing (WEAVER, 2011). A figura 15 ilustra o
processamento do transcrito primário.
Figura 15. Ilustração da transcrição de um gene e processamento do transcrito primário.
Diversas regiões do gene não são transcritas, mas apenas as sequências que estão
compreendidas entre os sítios de início e fim da transcrição. Como os íntrons encontram-se
46
nessa região, eles são transcritos, mas precisam ser removidos por meio do splicing. A figura
também ilustra o transcrito primário com sua cauda poli-A na extremidade 3’ e o 5’ cap na
extremidade 5’, bem como regiões do transcrito maduro que não são traduzidas, as UTRs
(do inglês Untranslated Region).
Interessantemente, alguns genes podem dar origem a mais uma
isoforma proteica, devido à capacidade de ocorrência de splicing alternativos.
Nos splicing alternativos, o mRNA é formado a partir de diferentes
composições de éxons, cada qual resultando em um transcrito primário com
uma sequência única de bases (figura 16) (LODISH, BERK, KAISER et al.,
2007). Assim, diferentes proteínas, ainda que com certa similaridade, podem
ser formadas a partir de um mesmo gene.
Figura 16. Ilustração esquemática de como o splicing alternativo do mesmo transcrito
primário pode levar à formação de diferentes isoformas de uma proteína.
Após o processamento do transcrito primário, o mRNA atinge o estado
de transcrito maduro, sendo então capaz de deixar o núcleo e dirigir-se ao
ribossomo. No ribossomo o mRNA maduro transmitirá a informação contida
no DNA para a síntese de uma cadeia de aminoácidos que posteriormente
será convertida em uma proteína ativa, no processo chamado de tradução.
No ribossomo, a tradução do mRNA dá-se através da leitura do código
genético, realizada pelas moléculas de RNA transportadores (tRNA).
Segundo o código genético, cada três bases da cadeia de RNA
correspondem a um aminoácido específico da cadeia polipeptídica que está
sendo sintetizada (figura 17) (LODISH, BERK, KAISER et al., 2007). Cada
trinca de bases que contém a informação para um dado aminoácido recebe o
47
nome de códon. Além dos códons que levam à incorporação de aminoácidos,
existem também códons que sinalizam o início da cadeia de aminoácidos
(isto é, em que posição do mRNA a tradução deve começar a ser feita), bem
como o fim da cadeia (isto é, em que posição do mRNA a tradução deve ser
interrompida) (figura 17).
Figura 17. O código genético. Cada três bases na fita de mRNA correspondem a um códon,
com a informação para a incorporação de um aminoácido específico à cadeia polipeptídica
que está sendo sintetizada. A trinca AUG, destacada em verde, corresponde ao aminoácido
metionina e é o códon de início da tradução. Já as trincas em vermelho correspondem a
códons de término da tradução (stop códons).
Para cada trinca de bases (ou códon) existe um tRNA com uma trinca
de bases complementares, isto é, com um anticódon (figura 18). Isso significa
que cada molécula de tRNA tem a capacidade de reconhecer um códon
específico do mRNA, o que ocorre graças à complementaridade
códonàanticódon. Cada tRNA carrega consigo um aminoácido
correspondente ao códon que seu anticódon é capaz de reconhecer. Assim
que um tRNA reconhece um códon no mRNA, ele adiciona seu aminoácido
48
correspondente à cadeia peptídica que está sendo formada (figura 18)
(LODISH, BERK, KAISER et al., 2007).
Figura 18. Ilustração esquemática da tradução de um mRNA em sua proteína
correspondente, processo que ocorre nos ribossomos. Os RNAs transportadores (tRNAs)
contém uma trica de bases, ou anticódon, capaz de reconhecer um códon do mRNA. Cada
tRNA carrega consigo o aminoácido correspondente ao códon que ele é capaz de
reconhecer. Assim que o anticódon do tRNA reconhece o códon do mRNA, o aminoácido
que ele transporta é adicionada à cadeia polipeptídica que está sendo sintetizada.
Após a síntese completa da cadeia polipeptídica, a proteína ainda não
se encontra em sua forma ativa, pois ela necessita ser submetida a
modificações pós-traducionais. Tais modificações envolvem basicamente o
enovelamento da cadeia peptídica (isto é, a formação de sua estrutura
tridimensional) e a adição de diferentes grupos químicos (como, por exemplo:
grupo heme, fosfatos, sulfetos, entre outros). Ao final desse processo, a
proteína recém-sintetizada já terá atingido seu estado ativo e poderá exercer
suas funções dentro ou fora da célula (LODISH, BERK, KAISER et al., 2007).
2.4. Reação em cadeia da polimerase (PCR)
Em 1983, um grupo de pesquisadores da Califórnia publicou um
trabalho descrevendo uma técnica que iria revolucionar o campo da genética,
49
biologia molecular e ciências da saúde (BARTLETT e STIRLING, 2003).
Trata-se de uma reação que ficou conhecida como PCR (do inglês
Polymerase Chain Reaction). A reação acabou tendo tantas aplicações e
possibilitando tantos avanços científicos que foi contemplada com o prêmio
Nobel em 1993, apenas dez anos depois de sua primeira divulgação
(BARTLETT e STIRLING, 2003).
A técnica do PCR é baseada nas propriedades do DNA dupla fita e da
DNA polimerase de uma bactéria denominada Thermus Aquaticus. Essa
bactéria foi descoberta em gêiseres em 1969, quando foi demonstrado que
era capaz de se reproduzir em temperaturas extremas, de aproximadamente
70º C (BROCK e FREEZE, 1969). Em temperaturas tão altas, nenhuma
enzima de qualquer célula eucariótica é capaz de manter sua estrutura
tridimensional, tampouco de manter sua atividade biológica (VAN PELT-
VERKUIL, VAN BELKUN e HAYS, 2010). Ao mesmo tempo, em
temperaturas assim elevadas, o DNA dupla fita apresenta-se desnaturado,
isto é, com suas pontes de hidrogênio rompidas. Logo, o DNA desnaturado
não tem a estrutura de dupla fita, mas de duas fitas simples. Com base nisso,
foi possível criar uma reação na qual a enzima DNA polimerase extraída da
Thermus Aquaticus faz a extensão de uma nova cadeia de DNA (ou seja, faz
a cópia de uma fita molde de DNA) enquanto o DNA encontra-se
desnaturado (VAN PELT-VERKUIL, VAN BELKUN e HAYS, 2010).
Baseada nesse princípio básico, a reação de PCR utiliza de ciclos de
temperaturas diferentes para produzir inúmeras cópias de um fragmento de
DNA. A quantidade de cópias do(s) fragmento(s) amplificado(s) em uma
reação de PCR é tão grande, que é possível identificá-lo(s) com técnicas
simples de separação, sem que seja necessário nenhum procedimento de
purificação (VAN PELT-VERKUIL, VAN BELKUN e HAYS, 2010). Para que
possa ocorrer, a PCR requer os seguintes reagentes:
1. Enzima Taq Polimerase (DNA polimerase purificada de bactéria
Thermus Aquaticus);
2. Primers que flanqueiem a região do DNA a ser amplificada;
3. DNA que contenha a região a ser amplificada;
50
4. Nucleotídeos (A, C, T e G, também denominados dNTPs)
necessários para que a extensão dos fragmentos de DNA seja
realizada pela Taq Polimerase;
5. MgCl2, que doam íons Mg++ durante a reação, indispensáveis ao
funcionamento da enzima Taq Polimerase;
6. Tampão cuja formulação (isto é, concentração de sais, presença de
detergentes, antioxidantes, valor de pH e etc.) permita a atividade
ótima da enzima Taq Polimerase.
Uma vez que todos os reagentes estão presentes no tubo de ensaio,
os mesmos são submetidos a uma grande quantidade de ciclos de
temperaturas diferentes. Normalmente, uma reação convencional de PCR
utiliza cerca de 35 a 40 ciclos de 3 temperaturas, a saber: i) 95º C, durante a
qual ocorre a desnaturação das fitas de DNA; ii) 60º C, durante a qual ocorre
a anelamento dos primers às regiões do DNA que se são complementares a
eles; iii) 70º C, durante a qual a enzima Taq Polimerase apresenta sua
atividade máxima e, portanto, realiza a extensão das novas cadeias de DNA
a partir dos primers (BROWN, 2010). Normalmente, cada uma das
temperaturas é mantida por 30 a 60 segundos, mas tais condições podem
sofrer alguns pequenos ajustes, a depender do tipo de Taq Polimerase que
se está usando, do par de primers que se está usando e do tamanho do
fragmento a ser amplificado (BROWN, 2010). A figura 19 apresenta um
esquema de como funciona a reação de PCR. Nota-se que, a cada ciclo de
temperatura, a quantidade de cópias do(s) fragmento(s) de DNA é
multiplicada por 2, o que resulta em uma quantidade exponencialmente
crescente do(s) fragmento(s) amplificado(s). O padrão de amplificação do(s)
fragmento(s) deixa de ser exponencial e atinge um platô quando a reação
começa a aproximar-se de seu ponto de saturação. Isso ocorre porque a
quantidade de reagentes disponíveis do tubo de ensaio (especialmente os
dNTPs) começa a diminuir, uma vez que eles deixam de estar livres e
passam a estar incorporados nas novas cadeias de DNA sintetizadas durante
a reação (VAN PELT-VERKUIL, VAN BELKUN e HAYS, 2010). Logo, a curva
matemática que melhor representa o padrão de amplificação do(s)
fragmento(s) de DNA em uma reação de PCR está ilustrada na figura 20.
51
Figura 19. Ilustração esquemática do mecanismo de funcionamento da reação de PCR. Na
figura, estão representados apenas os dois primeiros ciclos, durante os quais uma única
molécula de DNA é convertida em 4 cópias do fragmento flanqueado pelos primers
52
(destacados em vermelho). Em última análise, é a sequência dos primers que irá determinar
qual o segmento do DNA será amplificado durante a reação.
Figura 20. Ilustração representativa da curva que descreve o padrão de amplificação do(s)
fragmento(s) de DNA durante a reação de PCR. O número de cópias do(s) fragmento(s)
amplificado(s) varia em função do número inicial de fitas duplas de DNA que contêm o(s)
fragmento(s) a ser(em) amplificado(s). O número de ciclos necessários até que o ponto de
saturação da reação seja atingido também varia, de acordo com detalhes específicos da
reação como, por exemplo, a quantidade de reagentes disponíveis no tubo de ensaio e o
número inicial de fitas de DNA contendo o(s) fragmento(s) alvo.
Ao final da reação, é possível visualizar o fragmento amplificado ou
separar os fragmentos, caso a reação tenha sido desenhada para amplificar
mais de um segmento de DNA (BROWN, 2010). A separação é na maioria
das vezes feita por eletroforese em gel de agarose, utilizando-se algum
corante capaz de identificar DNA dupla fita (como, por exemplo, brometo de
etídio) (BROWN, 2010).
2.5. As bases genéticas da variação humana O genoma humano é composto por ~3 bilhões de pares de bases, as
quais se encontram espalhadas por 23 pares de cromossomos e dão origem
a cerca de 25 mil genes. Todo e qualquer indivíduo da espécie humana
possui virtualmente os mesmos genes que qualquer outro indivíduo da
mesma espécie. De fato, sabe-se que as sequências de DNA são ~99,9%
53
idênticas entre quaisquer representantes de nossa espécie (DOLGIN, 2008b)
e que, portanto, toda a vasta diversidade que existe entre os Homens é
explicada por diferenças em apenas 0,01% do genoma. Ainda que pareça
pouco, isso equivale a cerca de 3 milhões de pares de bases.
Evidentemente, a ciência tem dedicado grandes esforços para
compreender esses 0,1% do genoma, nos quais estão as bases da variação
humana. É nessa pequena parcela polimórfica que estão respostas para
questões como susceptibilidade a doenças, respostas a tratamentos,
diversidade fenotípica (DOLGIN, 2008b) e o talento. Tal diferença
relativamente pequena no genoma pode ocorre de diversas formas, sendo a
mais comum delas a troca de pares de bases (DOLGIN, 2008b). Esse tipo de
troca pode ocorrer em apenas um par de bases, fenômeno chamado de SNP
(do inglês, single nucleotide polymorphism), ou em segmentos um pouco
maiores (SCHRIDER e HAHN, 2010).
Quando há uma troca em um único par de bases em um gene, as
consequências podem ser as mais diversas. Muitas das trocas de um único
par de bases não levam a alterações na cadeia proteica que será originada a
partir do gene polimórfico. Isso porque, conforme ilustra a figura 17, o código
genético humano é degenerado (isto é, um mesmo aminoácido é codificado
por mais de uma única combinação de trincas de bases). Exemplificando, a
troca de um C por um U no códon GUC levaria ao códon GUU. Ambos os
códons levam à incorporação do aminoácido valina à cadeia peptídica.
Assim, a troca de bases CàU levou à mudança de códon GUCàGUU, mas
não resultou em mudança no aminoácido codificado, em ambos os casos,
valina (figura 21). Esse tipo de variação tem pouco ou nenhum impacto
fenotípico e é chamado de “substituição sinônima” (STRACHAN e READ,
2010).
54
Figura 21. Ilustração representativa de uma substituição sinônima, na qual um único par de
bases é trocado por outro, mas não há alteração na sequência da proteína correspondente.
Todas as demais formas de troca em um único par de bases que
resultam na modificação da sequência de aminoácidos de uma proteína são
chamadas de “substituições não sinônimas”. Quando a troca de um par de
bases leva à troca de um aminoácido, diz-se que a substituição é missense
(STRACHAN e READ, 2010). Exemplificando, ao se considerar o códon UCU
(codifica o aminoácido tirosina), uma troca de C por A (CàA) levaria à
formação do códon UAU, o qual codifica uma tirosina. Como resultado,
haveria a troca do aminoácido serina por tirosina na cadeia peptídica (figura
22).
55
Figura 22. Ilustração representativa de uma substituição do tipo missense, na qual uma troca
de um único par de bases resulta na troca de um aminoácido na cadeia peptídica
correspondente.
Uma outra possível consequência da troca de um par de bases é a
modificação de um códon de um aminoácido qualquer para um stop códon.
Nesses casos, a substituição chama-se nonsense (STRACHAN e READ,
2010). Como exemplo, a troca CàG no códon UAC levaria ao códon UAG, o
que implicaria o fim da síntese proteica em vez da incorporação do
aminoácido tirosina (figura 23). Certamente, substituições nonsense tendem
a ter um impacto fenotípico muito maior do que as substituições missense e
as sinônimas (STRACHAN e READ, 2010).
Figura 23. Ilustração representativa de uma substituição do tipo nonsense, na qual a troca de
um único par de bases leva à interrupção precoce da síntese da proteína correspondente
devido à inclusão de um códon de parada.
56
É possível, ainda, que segmentos pequenos ou um único par de bases
esteja presente em alguns indivíduos e ausente em outros, tipo de variação
que recebe o nome de “indel” (referência a “inserção/deleção”). Enquanto a
deleção de três pares de bases pode resultar na perda de apenas um
aminoácido em uma cadeia peptídica, a deleção ou inserção de um único par
de bases pode ser muito mais comprometedora para a estrutura e função de
uma proteína (STRACHAN e READ, 2010). Isso porque pode ocorrer uma
mudança no quadro de leitura (fenômeno também conhecido frameshift) em
todos os códons posteriores ao sítio de deleção ou inserção (figura 24)
(STRACHAN e READ, 2010).
Figura 24. Ilustração representativa de uma mudança de quadro de leitura (frameshift)
causada pela deleção de um único par de bases. Esse tipo de alteração poderia também ser
causado pela inserção de um ou mais pares de bases, bem como pela deleção de alguns
pares de bases. A vasta maioria dos aminoácidos localizados depois do ponto polimórfico
será diferente da sequência “original” de aminoácidos, levando à formação de uma proteína
provavelmente pouco ou nada funcional.
Uma outra importante forma de variação genotípica são as variações
de número de cópias, ou CNV (do inglês, copy number variation) (KING,
RATHOUZ e NICOLAE, 2010). Por definição CNV é um segmento de DNA
maior do que 1000 pares de bases cuja similaridade das sequências entre
indivíduos é maior do que 90%, mas que difere no número de cópias entre
diferentes indivíduos. De fato, uma região com CNV pode se apresentar
como deleção, inserção, duplicação ou até mesmo como mais de três cópias
57
(BAILEY, KIDD e EICHLER, 2008; SCHRIDER e HAHN, 2010). Embora
menos comum do que os SNPs, os CNVs são responsáveis por uma maior
variação no genoma, considerando o número absoluto de pares de base
(JAKOBSSON, SCHOLZ, SCHEET et al., 2008). Isso significa que os
polimorfismos do tipo CNV são, no mínimo, tão importantes quanto os SNPs
para a variação no genoma humano. Notavelmente, muitos autores têm
considerado genes que apresentam CNV como potenciais candidatos para
associação com doenças (BAILEY, KIDD e EICHLER, 2008) e também para
a variação fenotípica comum (SCHRIDER e HAHN, 2010). De fato, sabe-se
que mais de 400 genes do genoma humano possuem esse tipo de variação
(BAILEY, KIDD e EICHLER, 2008), e que os CNVs contribuem tanto para
variação gênica (BAILEY, KIDD e EICHLER, 2008) quanto para a variação no
padrão de expressão de alguns genes (SCHRIDER e HAHN, 2010).
É importante salientar que todo e qualquer tipo de variação na
sequência de nucleotídeos de DNA terá impacto sobre a estrutura de uma
proteína apenas se ocorrer em uma região codificadora de um gene que
codifica uma proteína. Em contraste, muitos sítios polimórficos encontram-se
em regiões não codificadoras, sejam elas íntrons ou regiões regulatórias.
Ainda que variações em regiões não codificadoras não resultem, como regra,
em alteração da estrutura proteica, muitas delas são capazes de alterar
significativamente o grau de expressão da proteína, o que certamente pode
resultar em um marcante impacto biológico. Um exemplo clássico disso no
campo das ciências do esporte é o polimorfismo indel do gene ACE
(GAYAGAY, YU, HAMBLY et al., 1998), que será discutido em detalhes mais
adiante.
2.5.1. Mutação vs. Polimorfismo
Todos os tipos de variações acima descritos podem ser considerados
polimorfismos ou mutações. Basicamente, uma variação é considerada
mutação quando leva a algum impacto negativo sobre o indivíduo e, por esse
motivo, sua frequência na população é rara (geralmente menor do que 1%).
Por outro lado, variações que não resultam em perda de função para o
indivíduo e, portanto, apresentam frequências populacionais normalmente
58
superiores a 1%, são consideradas polimorfismos. Como regra geral, uma
mutação é causa de uma doença ou anormalidade de origem genética ao
passo que o polimorfismo é causa apenas de variações normais entre
indivíduos saudáveis (BRECKPOT, THIENPONT, ARENS, TRANCHEVENT,
VERMEESCH, MOREAU, GEWILLIG e DEVRIENDT, 2011).
2.6. Herdabilidade de variáveis associadas ao desempenho esportivo
Embora a identificação de genes que se associam ao desempenho
esportivo tenha sido iniciada há pouco mais de dez anos, diversos estudos
anteriores já haviam produzido evidências de que algumas variáveis
determinantes do desempenho físico e esportivo apresentam um forte
componente herdado.
Lortie et al. (LORTIE, SIMONEAU, HAMEL, BOULAY, LANDRY e
BOUCHARD, 1984) em 1984 foi um dos primeiros a demonstrar que a
variação interindividual da resposta do VO2max ao treino aeróbio é enorme.
Em seu estudo, 24 indivíduos jovens e sedentários (13 mulheres e 11
homens) foram submetidos a 20 semanas de treinamento físico aeróbio e
avaliados antes e após o período de treino. O ganho médio de VO2max após o
treinamento foi de ~35%. Todavia, alguns sujeitos responderam com ganho
ínfimo de potência aeróbia (isto é, 5% de aumento no VO2max) ao passo que,
no outro extremo, outros indivíduos experimentaram ganhos de cerca de
90%, o que corresponde a, aproximadamente, 1 L de O2. Tal variação
ocorreu a despeito do estímulo de treino ter sido idêntico para todos os
indivíduos, o que levou os autores a especular que diferentes genótipos
poderiam explicar tamanha variação no ganho de VO2max. Além disso, a
magnitude do ganho de VO2max também variou bastante entre esses dois
extremos, conforme ilustra a figura 25. Estudos posteriores realizados em
diferentes centros com um grupo bastante numeroso de sujeitos confirmaram
o mesmo padrão de variação na resposta ao treino (BOUCHARD, AN, RICE,
SKINNER, WILMORE, GANONG, PERUSSE, LEON e RAO, 1999).
59
Figura 25. Ilustração representativa da variação interindividual no ganho de VO2max em
resposta ao treinamento físico aeróbio. Cada barra cinza representa o ganho de VO2max de
cada indivíduo (desenhado a partir de Bouchard et al. (BOUCHARD, AN, RICE et al., 1999)).
Assim como o VO2max, a composição dos tipos de fibras musculares é
também uma variável que indubitavelmente interfere no desempenho
esportivo e que apresenta elevado grau de variação interindividual. Um
estudo realizado com mais de 400 indivíduos norte-americanos de ambos os
sexos (SIMONEAU e BOUCHARD, 1989) mostrou que cerca de 25% da
amostra apresentou menos de 35% ou mais de 65% de fibras do tipo I. Isso
significa que significativa parcela da população possui um percentual muito
baixo ou muito alto de fibras do tipo I e que, assim, a variação individual é
muito grande e, como tal, não pode ser negligenciada. É necessário saber,
contudo, qual o grau de influência da genética nessa variação.
De fato, um estudo de 1977 realizado com 31 pares de ambos os
sexos de gêmeos dizigóticos e homozigóticos (KOMI, VIITASALO, HAVU,
THORSTENSSON, SJODIN e KARLSSON, 1977) demonstrou que a
distribuição dos tipos de fibras musculares é fortemente influenciada por
fatores genéticos. Mais detalhadamente, esses autores retiraram uma
amostra do músculo vasto medial por meio de biópsia e compararam a
variação da distribuição dos tipos de fibra e da atividade de diversas enzimas
musculares entre os gêmeos. Os autores verificaram que, diferente do
observado nos gêmeos não idênticos, a distribuição dos tipos de fibras era
essencialmente idêntica entre os irmãos homozigóticos. Assim, foi calculado
que o fator de herdabilidade desse fenótipo é de ~95%. Por outro lado, não
60
foi verificada influência de fatores genéticos sobre a atividade das enzimas
ATPase, creatina fosfoquinase, mioquinase, fosforilase e lactato
desidrogenase.
Em contraste, um estudo posterior realizado pelo mesmo grupo de
pesquisadores revelou que, quando os dados são ajustados pela idade e
gênero, o percentual de herdabilidade da distribuição dos tipos de fibra varia
em torno de 50% (BOUCHARD, SIMONEAU, LORTIE, BOULAY,
MARCOTTE e THIBAULT, 1986). Outras fontes de variação desse fenótipo
estão relacionadas a fatores ambientais (cerca de 40%) e de questões
técnicas, como coleta, processamento e análise da amostra de tecido
muscular (cerca de 10%) (SIMONEAU e BOUCHARD, 1989).
O mesmo estudo mostrou, ainda, que a relação oxidativa/glicolítica
(avaliada pela razão de atividade das enzimas chaves da via glicolítica e do
ciclo de Krebs, LDH/OGDH) do músculo também é significantemente
influenciada por fatores hereditários. Confirmando os resultados do estudo
anterior (KOMI, VIITASALO, HAVU et al., 1977), o trabalho de Bouchard et al.
(BOUCHARD, SIMONEAU, LORTIE et al., 1986) também produziu
evidências de que a atividade da maioria das enzimas envolvidas no
metabolismo energético muscular é majoritariamente dependente de fatores
ambientais.
A despeito da considerável influência genética sobre a composição
das fibras musculares em estado não treinado, a resposta dos tipos de fibra
ao treinamento aeróbio parece não estar relacionada a fatores genéticos
(RICO-SANZ, RANKINEN, JOANISSE, LEON, SKINNER, WILMORE, RAO e
BOUCHARD, 2003). Esse dado foi confirmado por estudos com gêmeos
tanto após um período de treinamento anaeróbio de alta intensidade
(SIMONEAU, LORTIE, BOULAY, MARCOTTE, THIBAULT e BOUCHARD,
1986) quanto após o treinamento de endurance (HAMEL, SIMONEAU,
LORTIE, BOULAY e BOUCHARD, 1986). Interessantemente, a resposta ao
treinamento da atividade de algumas enzimas musculares envolvidas no
metabolismo energético (por exemplo: CK, PFK, e citrato sintase) parecer ser
influenciada por fatores genéticos (SIMONEAU, LORTIE, BOULAY et al.,
1986; RICO-SANZ, RANKINEN, JOANISSE et al., 2003), ao contrário do que
parece ocorrer para este fenótipo no estado não treinado.
61
As influências genéticas que, ao menos em parte, comandam
fenótipos como a potência aeróbia, a atividade de enzimas oxidativas e
glicolítica, e a distribuição dos tipos de fibras musculares permaneceram
indeterminadas por muito tempo (SIMONEAU e BOUCHARD, 1995). Ainda
que a ciência esteja muito longe do completo entendimento dessas questões,
estudos mais recentes começaram a identificar polimorfismos que até certo
ponto explicam a variação interindividual de fenótipos relacionados ao
desempenho esportivo. Esses polimorfismos serão discutidos nos tópicos
que seguem.
2.7. Polimorfismos associados à aptidão física e ao desempenho esportivo
Embora existam atualmente centenas de polimorfismos associados ao
desempenho esportivo, as evidências para a maioria deles ainda são
bastante limitadas (RANKINEN, ROTH, BRAY et al., 2010). Assim, este
tópico abordará apenas os dois polimorfismos que cuja quantidade de
estudos e evidências disponíveis permitem determinar a associação com o
desempenho de forma mais conclusiva. A saber, são os polimorfismos I/D do
gene ACE1 e R577X do gene ACTN3.
2.7.1. Enzima conversora de angiotensina Um polimorfismo no gene que codifica a enzima conversora de
angiotensina (ECA), a qual desempenha papel crucial no sistema renina-
angiotensina-aldosterona, foi o primeiro a ser descrito como capaz de
influenciar o desempenho esportivo, em um estudo de bastante repercussão
publicado na revista Nature em 21 de maio de 1998 por Montgomery e seus
colaboradores (MONTGOMERY, MARSHALL, HEMINGWAY et al., 1998).
Já é bem conhecida a função chave que o sistema renina-
angiotensina-aldosterona exerce sobre a homeostase circulatória (GUYTON
e HALL, 2001). Brevemente, o peptídeo angiotensinogênio é produzido e
liberado na circulação sanguínea pelos hepatócitos. O angiotensinogênio é
uma longa cadeia peptídica de ação biológica direta negligenciável, embora
62
sua concentração plasmática seja regulada por alguns hormônios, como o
estrógeno e o hormônio tireoidiano T3. A principal função do
angiotensinogênio, contudo, é servir de substrato da renina, uma enzima
produzida por células renais especializadas e liberada na corrente sanguínea
em resposta à queda da pressão arterial, diminuição da concentração
plasmática de sódio e ao aumento da atividade nervosa simpática. A renina
age sobre o angiotensinogênio, clivando-o e dando origem a um
oligopeptídeo composto por 10 aminoácidos denominado angiotensina I. Tal
qual o angiotensinogênio, a angiotensina I parece não possuir efeito biológico
relevante, senão servir como substrato de uma outra enzima presente no
sangue, a enzima conversora de angiotensina. A ECA, por sua vez, retira
dois aminoácidos da angiotensina I, clivando-a e dando origem a um
oligopeptídeo extremamente ativo composto por 8 aminoácidos, cuja
denominação é angiotensina II. A angiotensina II possui potentes efeitos
sistêmicos, os quais são mediados pelo receptor de angiotensina I (AT1-R) e
culminam em aumento da pressão arterial. Trata-se, assim, de um sistema
capaz de evitar ou contornar crises hipotensivas. Dentre esses efeitos
sistêmicos, destacam-se a ação direta nos vasos periféricos, causando
vasoconstrição, e a ação mediada pela aldosterona, causando diminuição da
eliminação de água e sódio pelos rins. Além dos efeitos sistêmicos clássicos,
outro importante efeito da ECA é a clivagem da bradicinina, um oligopeptídeo
composto por 9 aminoácidos que possui potente ação vasodilatadora
(DENDORFER, WOLFRUM, WAGEMANN, QADRI e DOMINIAK, 2001). Ao
ser clivada pela ECA, a bradicinina deixa de exercer sua ação de
relaxamento dos vasos.
Em adição aos efeitos sistêmicos mencionados acima, o sistema
renina-angiotensina também possui alguns efeitos locais, tanto parácrinos
quanto autócrinos, que podem ser observados em diferentes tecidos e que
são de grande importância biológica. Em geral, esses efeitos estão
relacionados ao crescimento tecidual e à resposta de reparo tecidual após
uma injúria (PUTHUCHEARY, SKIPWORTH, RAWAL, LOOSEMORE, VAN
SOMEREN e MONTGOMERY, 2011). Dos efeitos locais desse sistema que
apresentam implicações para o cenário esportivo, pode-se destacar:
alteração do uso de lipídios como substrato energético nas células
63
musculares (RENNIE, WINDER e HOLLOSZY, 1976), alteração da
densidade mitocondrial dos miócitos e alteração do conteúdo de mioglobulina
das células musculares esqueléticas (BLOOM, JOHNSON, PARK, RENNIE e
SULAIMAN, 1976; HUDLICKA, WRIGHT, HOPPELER e UHLMANN, 1988).
Embora existam diversos polimorfismos nos genes que codificam as
proteínas envolvidas no sistema renina-angiotensina-aldosterona
(PUTHUCHEARY, SKIPWORTH, RAWAL et al., 2011), a variante mais
estudada até o momento é, sem dúvidas, a rs4340 do gene ACE1 (nome
oficial do gene, do inglês Angiotensin-Converting Enzyme). Trata-se de um
polimorfismo do tipo indel (ou I/D), no qual um fragmento de 288 pares de
bases pode estar presente (genótipo I – inserção) ou ausente (genótipo D –
deleção) no íntron 16 do gene que, por sua vez, encontra-se no cromossomo
17 (www.ncbi.nlm.nih.gov/projects//SNP/snp_ref.cgi?rs=4340).
Estudos mostram que os níveis plasmáticos de ECA são altamente
variáveis entre diferentes indivíduos (ALHENC-GELAS, RICHARD,
COURBON, WARNET e CORVOL, 1991) e que o polimorfismo I/D do gene
ACE1 contribui com cerca de 50% da variação observada nesse fenótipo
(RIGAT, HUBERT, ALHENC-GELAS, CAMBIEN, CORVOL e SOUBRIER,
1990). Mais especificamente, o alelo sem o fragmento de 288 pares de bases
(ou seja, o alelo D), está associado com elevada atividade da ECA no plasma
e nos tecidos (RIGAT, HUBERT, ALHENC-GELAS et al., 1990; DANSER,
SCHALEKAMP, BAX, VAN DEN BRINK, SAXENA, RIEGGER e
SCHUNKERT, 1995). Portanto, o alelo D está relacionado à exacerbação do
sistema renina-angiotensina-aldosterona, tanto em nível sistêmico quanto em
nível tecidual (PUTHUCHEARY, SKIPWORTH, RAWAL et al., 2011), fato que
não ocorre para o alelo I.
De fato, o trabalho pioneiro de Montgomery e colaboradores
(MONTGOMERY, MARSHALL, HEMINGWAY et al., 1998) foi o primeiro a
demonstrar como esse polimorfismo poderia influenciar o desempenho
esportivo. Partindo de evidências de que existe um sistema muscular renina-
angiotensina de ação local (RENELAND e LITHELL, 1994), os autores
formularam a hipótese de que o alelo D pudesse favorecer o crescimento do
tecido muscular e, assim, influenciar o desempenho (MONTGOMERY,
MARSHALL, HEMINGWAY et al., 1998). Contudo, os autores relatam que
64
seus estudos preliminares apontavam que o alelo I estava associado ao
desempenho de endurance. Para testar essa hipótese, dois experimentos
diferentes foram conduzidos.
No primeiro experimento, 25 montanhistas com histórico de escaladas
superiores a 7000 metros de altura fizeram parte do estudo. Eles foram
genotipados para os alelos D/I do gene ACE1 e a frequência dos alelos e dos
genótipos foi comparada com a de 1906 sujeitos não atletas (grupo controle).
Foi observado que a frequência do alelo I e do genótipo II foi
significativamente maior no grupo de atletas em relação ao controle. Ainda,
dentre os 15 montanhistas que conseguiram escalar altitudes superiores a
8000 metros sem suplementação de oxigênio, nenhum era homozigoto para
o alelo D. Por fim, dentre os escaladores com maior número de escaladas
superiores a 8000 metros, todos eram homozigotos para o alelo I
(MONTGOMERY, MARSHALL, HEMINGWAY et al., 1998).
No segundo experimento, 78 adultos jovens tiveram seu genótipo
determinado e foram submetidos a 10 semanas de treinamento físico geral.
Antes e após o período de treinamento, os sujeitos realizaram um teste de
repetições máximas de flexão de cotovelo com uma carga de 15 kg. Os
autores verificaram que os 66 sujeitos que tinham o alelo I (isto é, DI ou II)
experimentaram melhoras no desempenho após o período de treino,
enquanto que os sujeitos DD não apresentaram melhora alguma.
Comparando somente os homozigotos, a melhora no desempenho nos
indivíduos II foi onze vezes maior do que a melhora nos indivíduos DD. Uma
vez que o treino não foi específico para a tarefa avaliada e que não teve
duração suficiente para promover hipertrofia muscular, essa diferença na
resposta ao treinamento não pode ser explicada por diferenças na adaptação
neuromuscular, tampouco por diferenças no crescimento muscular entre os
genótipos. Os autores sugerem que o alelo I, pela menor atividade do
sistema renina-angiotensina, é capaz de favorecer o desempenho de
endurance por um ou mais dos seguintes mecanismos: maior vasodilatação,
maior oxidação de gorduras, maior densidade mitocondrial muscular, maior
conteúdo de mioglobulina ou por diferenças na composição das fibras
musculares (MONTGOMERY, MARSHALL, HEMINGWAY et al., 1998).
65
Menos de dois meses depois da publicação do trabalho de
Montgomery e colegas, Gaygay et al. (GAYAGAY, YU, HAMBLY et al., 1998)
também apresentaram dados confirmando a associação do alelo I no
desempenho de endurance. Nesse estudo, 64 remadores australianos (43
homens e 21 mulheres) que participaram da seletiva nacional para os jogos
olímpicos de Atlanta foram genotipados para a o polimorfismo I/D do gene
ACE1. A frequência dos alelos e dos genótipos foi comparada com 114
controles saudáveis. Segundo os autores, o remo foi escolhido por ser um
esporte de endurance. Foi verificado que o alelo I é super-representado entre
os remadores e que o genótipo I/I também é consideravelmente mais
frequente nos atletas do que nos controles (GAYAGAY, YU, HAMBLY et al.,
1998).
Em seguida, inúmeros outros estudos reproduziram dados de maior
frequência do alelo I em atletas de endurance, corroborando a hipótese de
associação com o desempenho de resistência. Tais estudos foram feitos em
coortes mistas de atletas de endurance de diferentes modalidades
(ALVAREZ, TERRADOS, ORTOLANO, IGLESIAS-CUBERO, REGUERO,
BATALLA, CORTINA, FERNANDEZ-GARCIA, RODRIGUEZ, BRAGA,
ALVAREZ e COTO, 2000; TURGUT, TURGUT, GENC, ATALAY e ATALAY,
2004; MORAN, VASSILOPOULOS, TSIOKANOS, JAMURTAS, BAILEY,
MONTGOMERY, WILSON e PITSILADIS, 2006), e também em grupos de
atletas de modalidades específicas, como natação (TSIANOS, SANDERS,
DHAMRAIT, HUMPHRIES, GRANT e MONTGOMERY, 2004), corrida (MIN,
TAKAHASHI, ISHIGAMI, HIRANUMA, MIZUNO, ISHII, KIM e NAKAZATO,
2009) e triátlon (COLLINS, XENOPHONTOS, CARIOLOU, MOKONE,
HUDSON, ANASTASIADES e NOAKES, 2004).
Além da maior frequência do alelo I em atletas de endurance, outros
estudos também mostraram que atletas carregando o alelo I desempenham
melhor tarefas de endurance, sejam elas testes de desempenho ou o
sucesso em situações reais (ZHAO, MOOCHHALA, THAM, LU, CHIA,
BYRNE, HU e LEE, 2003; CAM, COLAKOGLU, SEKURI, COLAKOGLU,
SAHAN e BERDELI, 2005; TSIANOS, ELEFTHERIOU, HAWE, WOOLRICH,
WATT, WATT, PEACOCK, MONTGOMERY e GRANT, 2005;
HRUSKOVICOVA, DZURENKOVA, SELINGEROVA, BOHUS,
66
TIMKANICOVA e KOVACS, 2006; MORAN, VASSILOPOULOS,
TSIOKANOS et al., 2006).
Se, por um lado, o alelo I tem sido consistentemente associado ao
desempenho de endurance, o alelo D, por sua vez, tem sido associado ao
desempenho em tarefas de curta duração, com forte componente de força,
potência e velocidade. Cerit et al. (CERIT, COLAKOGLU, ERDOGAN,
BERDELI e CAM, 2006), por exemplo, investigando os efeitos de 6 meses de
treinamento físico sobre o desempenho em corrida de 2400 m em jovens
saudáveis não atletas, verificaram que os indivíduos com o genótipo DD
melhoraram mais o desempenho do que aqueles com genótipo DI ou II. Além
disso, esses autores também observaram um “efeito de dose” do alelo D
sobre as melhoras no desempenho, de tal forma que o grupo DD foi melhor
do que o DI que, por sua vez, foi melhor do que o II (CERIT, COLAKOGLU,
ERDOGAN et al., 2006).
No mesmo sentido, os trabalhos de Costa et al. (COSTA, SILVA,
GARRIDO, LOURO, DE OLIVEIRA e BREITENFELD, 2009) e Woods et al.
(WOODS, HICKMAN, JAMSHIDI, BRULL, VASSILIOU, JONES,
HUMPHRIES e MONTGOMERY, 2001) também mostraram que o alelo D é
super-representado em nadadores de elite que competem em provas de
curta e média distância. Outra importante evidência da associação do alelo D
com tarefas com predominância de força vem do estudo de Juffer et al.
(JUFFER, FURRER, GONZALEZ-FREIRE, SANTIAGO, VERDE,
SERRATOSA, MORATE, RUBIO, MARTIN, RUIZ, ARENAS, GOMEZ-
GALLEGO e LUCIA, 2009), o qual mostrou que a frequência do alelo D é
maior em jogadores profissionais de futebol quando comparados com
corredores de longa distância. Similarmente, Colakoglu et al. (COLAKOGLU,
CAM, KAYITKEN, CETINOZ, COLAKOGLU, TURKMEN e SAYIN, 2005)
demonstraram que indivíduos homozigotos para o alelo D apresentam
maiores ganhos de força em resposta ao treinamento de força.
Apesar da quantidade grande de investigações confirmando a
associação do alelo I com o desempenho de endurance e a associação do
alelo D com o desempenho de força e potência, a literatura científica não é
unânime nesse aspecto, já que alguns estudos falharam em demonstrar tais
associações (TAYLOR, MAMOTTE, FALLON e VAN BOCKXMEER, 1999;
67
RANKINEN, WOLFARTH, SIMONEAU, MAIER-LENZ, RAURAMAA,
RIVERA, BOULAY, CHAGNON, PERUSSE, KEUL e BOUCHARD, 2000; OH,
2007). Além dos estudos que não mostraram nenhuma associação do
polimorfismo I/D do gene ACE1 com o desempenho esportivo, outros
demonstraram ainda associações incomuns entre o alelo D e o desempenho
de endurance (LUCIA, GOMEZ-GALLEGO, CHICHARRO, HOYOS, CELAYA,
CORDOVA, VILLA, ALONSO, BARRIOPEDRO, PEREZ e EARNEST, 2005).
Obviamente, esses estudos que produziram resultados controversos não
invalidam a forte associação dessa variante gênica com o desempenho.
Alguns autores ponderam que a principal causa de tais resultados
discrepantes é a heterogeneidade das amostras, em sua maioria compostas
por atletas de diferentes modalidades esportivas e/ou de diferentes origens
étnicas, além da inclusão de atletas que não são, de fato, competidores de
elite (RANKINEN, ROTH, BRAY et al., 2010; PUTHUCHEARY, SKIPWORTH,
RAWAL et al., 2011).
2.7.2. ACTN-3 Sarcômeros são as unidades contráteis dos músculos estriados. As
principais proteínas contráteis do músculo esquelético são actina e miosina,
cujos polímeros formam os filamentos finos e grossos do aparato contrátil,
respectivamente (GUYTON e HALL, 2001). Ambos os filamentos finos e
grossos ancoram-se nas linhas Z do sarcômero (figura 25). As proteínas alfa-
actininas são as principais componentes da linha Z, e suas principais funções
são manter o metabolismo e a estrutura do citoesqueleto, coordenando o
processo de contração muscular (BLANCHARD, OHANIAN e CRITCHLEY,
1989; MACARTHUR e NORTH, 2004; MACARTHUR, SETO, CHAN et al.,
2008). Isso ocorre porque essas proteínas mantêm os filamentos de actina
em arranjos paralelos, favorecendo a interação proteica (figura 26). Além
disso, as alfa-actininas são responsáveis por manter a integridade da linha Z,
devido à sua interação com componentes do citoesqueleto (YANG, GARTON
e NORTH, 2009).
68
Figura 26. Ilustração representativa da ultraestrutura do sarcômero de uma célula muscular
estriada esquelética (acima). No quadro inferior está representada a linha Z com mais
detalhes, sendo possível observar o papel das alfa-actininas no ancoramento dos filamentos
finos de actina.
Em humanos, estão presentes no músculo esquelético duas isoformas
de alfa actinina: alfa-actinina-2 e alfa-actinina-3, codificadas por dois genes
diferentes, quais sejam: ACTN2 e ACTN3, respectivamente. Enquanto o
ACTN2 é expresso em todas as fibras musculares, o ACTN3 é expresso
somente nas fibras do tipo IIb (com menor função oxidativa e maior função
glicolítica) (MILLS, YANG, WEINBERGER, VANDER WOUDE, BEGGS,
EASTEAL e NORTH, 2001; YANG, GARTON e NORTH, 2009).
O gene ACTN3 encontra-se no cromossomo 11, possui 16407 pares
de bases e mais de 130 variações comuns, porém a maior parte delas ocorre
em regiões intrônicas e não resulta em alterações fenotípicas aparentes
(www.genome.uscs.edu). Contudo, existe uma variante polimórfica do gene
ACTN3 que ocorre na posição 1747 do gene, em uma região codificadora, e
69
consiste na troca de citosina por uma timina no (CàT). Essa troca resulta na
substituição de um códon do aminoácido arginina (R) por um stop códon
prematuro (X), na posição 577 da cadeia polipeptídica
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_ref.cgi?rs=1815739). Logo,
trata-se de um polimorfismo do tipo nonsense e sua denominação é “R577X”
(número de referência rs1815739). Tal variante, embora bastante comum na
população caucasiana geral (NORTH, YANG, WATTANASIRICHAIGOON et
al., 1999), resulta em uma proteína truncada não funcional. O alelo nulo é
denominado X, ao passo que o alelo não polimórfico que produz a proteína
íntegra é denominado R. Vale salientar que indivíduos homozigotos para o
alelo X (XX) possuem deficiência total na proteína alfa-actinina-3, ao passo
que é assumido que indivíduos com o genótipo RX (ou seja, que carregam
um alelo funcional e o outro nulo) produzem cerca de metade da quantidade
de alfa-actinina-3 daqueles que carregam os dois alelos funcionais (RR). É
provável que a alfa-actinina-2 compense a ausência de alfa-actinina-3 nas
fibras do tipo II em indivíduos que carregam o alelo X, haja vista a que a
ausência de alfa-actinina-3 não acarreta nenhuma anormalidade fenotípica
(BERMAN e NORTH, 2010).
Embora essa compensação possa conduzir à ideia de que as alfa-
actininas 2 e 3 possuam funções redundantes, alguns autores consideram tal
hipótese pouco provável. Isso porque a sequência do gene ACTN3
provavelmente surgiu da sequência do ACTN2 há cerca de 300 milhões de
anos, e ambas as sequências têm se mantido altamente conversadas ao
longo desse período em diversas espécies (MILLS, YANG, WEINBERGER et
al., 2001). Outra importante evidência que dá suporte à tese de funções
distintas entre ACTN2 e ACTN3 é o padrão de expressão desses genes
durante o desenvolvimento embrionário. Segundo Mills et al. (2001), esses
genes expressam-se tanto em momentos quanto em locais diferentes.
Dessa forma, acredita-se que pressões seletivas ambientais dirigiram
mais ou menos a presença ou ausência do gene polimórfico na população.
Interessantemente, dados sobre a frequência do polimorfismo em diferentes
populações indicam que o gene pode, de fato, ter sofrido pressões
ambientais. Estudos mostram que a frequência do genótipo XX na população
comum varia de 1%, como ocorre em populações africanas Buntu (YANG,
70
MACARTHUR, WOLDE, ONYWERA, BOIT, LAU, WILSON, SCOTT,
PITSILADIS e NORTH, 2007), até aproximadamente 25%, como ocorre no
leste asiático (NORTH, 2008). Na Europa, a frequência desse polimorfismo
atinge cerca de 18% da população (NORTH, YANG,
WATTANASIRICHAIGOON et al., 1999). Provavelmente, a ausência da
proteína alfa-actinina-3 confere um padrão de aptidão física que pôde ter sido
desfavorável para a sobrevivência em certas regiões da África, mas
adequado para a sobrevivência na Ásia (MILLS, YANG, WEINBERGER et al.,
2001; MACARTHUR e NORTH, 2004).
Com base nessa perspectiva evolutiva de conservação diferencial do
polimorfismo R577X em populações distintas, alguns autores conjecturaram
que essa variante poderia estar associada com a função musculoesquelética
(YANG, MACARTHUR, GULBIN et al., 2003). De fato, diversos estudos de
associação mostraram que a produção de alfa-actinina-3 influencia o
desempenho do músculo esquelético, favorecendo a tese de que o
polimorfismo pode ter sido selecionado em função de pressões ambientais
que exigiam um perfil metabólico mais direcionado à produção de força ou ao
metabolismo oxidativo (YANG, MACARTHUR, GULBIN et al., 2003;
CLARKSON, DEVANEY, GORDISH-DRESSMAN, THOMPSON, HUBAL,
URSO, PRICE, ANGELOPOULOS, GORDON, MOYNA, PESCATELLO,
VISICH, ZOELLER, SEIP e HOFFMAN, 2005; DELMONICO, KOSTEK,
DOLDO, HAND, WALSH, CONWAY, CARIGNAN, ROTH e HURLEY, 2007;
MACARTHUR, SETO, RAFTERY et al., 2007; DRUZHEVSKAYA,
AHMETOV, ASTRATENKOVA e ROGOZKIN, 2008; MACARTHUR, SETO,
CHAN et al., 2008; AHMETOV, DRUZHEVSKAYA, LYUBAEVA, POPOV,
VINOGRADOVA e WILLIAMS, 2011; CHIU, WU, TANG, YU, HSIEH e
HSIEH, 2011; GINEVICIENE, PRANCULIS, JAKAITIENE, MILASIUS e
KUCINSKAS, 2011; PASQUA, ARTIOLI, PIRES et al., 2011).
Um grupo de pesquisadores australianos liderado pela Profa. Kathryn
North foi o primeiro a publicar evidências contundentes de que o polimorfismo
R577X está associado com o desempenho esportivo (YANG, MACARTHUR,
GULBIN et al., 2003). Mais especificamente, 301 atletas australianos de elite,
todos caucasianos, de diferentes modalidades esportivas, foram genotipados
71
quanto ao polimorfismo R577X do gene ACTN3 e comparados com 436
controles, também caucasianos. Todos os atletas avaliados competiram
internacionalmente, dos quais 50 já haviam participado dos jogos olímpicos.
Eles foram divididos em dois grupos distintos: os atletas dedicados a
modalidades de força e potência e os de endurance. Os resultados
mostraram que a frequência do alelo X não diferiu entre os atletas e os
controles. Entretanto, quando os atletas foram separados em modalidades de
força/potência e endurance, foi observado que o alelo R foi super-
representado nos atletas de força/potência (50% de indivíduos RR vs. 30%
no grupo controle). Da mesma forma, alelo X foi subrepresentado nos atletas
de força/potência (6% de indivíduos XX vs. 18% no grupo controle). Já os
atletas de endurance apresentaram frequência maior do alelo X em relação
ao grupo controle (24% vs. 18%). A frequência dos alelos R e X em direções
opostas nos atletas de força/potência e endurance resultam em um processo
de “cancelamento” das diferenças, o que explica porque não foram
observadas diferenças quando o grupo de atletas como um todo foi
comparado ao grupo controle.
Esses dados indicam que a presença da alfa-actinina-3 pode ter um
papel no desenvolvimento de força e produção de energia em atividades de
alta intensidade e curta duração, ao passo que sua ausência pode favorecer
o metabolismo aeróbio e a resistência à fadiga. De fato, os autores
especulam que a alfa-actinina-3 pode ser responsável por transmitir a força
gerada na linha Z durante a contração muscular rápida (YANG,
MACARTHUR, GULBIN et al., 2003). Vale salientar que alguns estudos
mostram que as alfa-actininas sarcoméricas ligam-se à frutose-1,6-
bisfosfatase (GIZAK, RAKUS e DZUGAJ, 2003), glicogênio fosforilase
(CHOWRASHI, MITTAL, SANGER e SANGER, 2002) e calsarcinas (FREY e
OLSON, 2002). Isso sugere que a presença da alfa-actinina-3 pode estimular
a atividade de enzimas importantes da via glicolítica, bem como a atividade
da calsarcina. Considerando que as calsarcinas modulam a calcineurina, um
fator de sinalização para determinação da distribuição dos tipos de fibras
musculares (SERRANO, MURGIA, PALLAFACCHINA, CALABRIA,
CONIGLIO, LOMO e SCHIAFFINO, 2001), é possível que a alfa-actinina-3
também possa influenciar a proporção de fibras de contração lenta e rápida,
72
mais especificamente contribuindo para maior quantidade de fibras do tipo II
(YANG, MACARTHUR, GULBIN et al., 2003).
É interessante notar que, no estudo de Yang et al. (2003), as
diferenças na frequência dos alelos R entre atletas de força/potência foram
mais acentuadas no sexo feminino do que no masculino. Segundo os
autores, o efeito dos hormônios esteroides anabólicos produzidos em
grandes quantidades pelos homens pode se sobrepor aos efeitos do alelo R,
minimizando sua importância para o desenvolvimento de força muscular. Nas
mulheres, em consequência da produção relativamente baixa desses
hormônios, o alelo R provavelmente tem um papel mais visível no
desenvolvimento da força muscular. Isso pode explicar porque nenhum atleta
olímpico de força/potência do sexo feminino apresentou o genótipo XX
(frequência de 71% do alelo R), fato que não foi observado no sexo
masculino.
Diversos estudos posteriores confirmaram os dados de Yang et al.
(2003), fortalecendo as evidências de que o polimorfismo R577X do gene
ACTN3 influencia o sucesso competitivo de atletas de força/potência (para os
que carregam o alelo R) e o de endurance (para os que carregam o alelo X)
(AHMETOV, DRUZHEVSKAYA, LYUBAEVA et al., 2011; PASQUA, ARTIOLI,
PIRES et al., 2011). Os dados de frequência do polimorfismo foram
reproduzidos em diferentes populações, como do sudeste asiático (CHIU,
WU, TANG et al., 2011), Rússia (DRUZHEVSKAYA, AHMETOV,
ASTRATENKOVA et al., 2008), Israel (EYNON, ALVES, YAMIN, SAGIV,
DUARTE, OLIVEIRA, AYALON, GOLDHAMMER e MECKEL, 2009), Grécia
(PAPADIMITRIOU, PAPADOPOULOS, KOUVATSI e TRIANTAPHYLLIDIS,
2008) e China (SHANG, HUANG, CHANG, ZHANG e HUANG, 2010), entre
outras. Alguns desses estudos também confirmaram que a influência desse
polimorfismo sobre o desempenho é maior em atletas do sexo feminino em
relação aos do sexo masculino (SHANG, HUANG, CHANG et al., 2010;
CHIU, WU, TANG et al., 2011).
Embora a maioria dos estudos tenha indicado a associação do
polimorfismo R577X do gene ACTN3 com o desempenho esportivo, alguns
poucos trabalhos falharam em reproduzir esses dados (YANG,
MACARTHUR, WOLDE et al., 2007; DORING, ONUR, GEISEN, BOULAY,
73
PERUSSE, RANKINEN, RAURAMAA, WOLFAHRT e BOUCHARD, 2010).
Provavelmente, o polimorfismo não influencia o desempenho esportivo em
todas as populações, como é o caso do leste e do oeste asiático (YANG,
MACARTHUR, WOLDE et al., 2007), da Jamaica e de negros norte-
americanos (SCOTT, IRVING, IRWIN, MORRISON, CHARLTON, AUSTIN,
TLADI, DEASON, HEADLEY, KOLKHORST, YANG, NORTH e PITSILADIS,
2010). Apesar disso, estudos com atletas caucasianos não observaram
diferenças na frequência dos genótipos e dos alelos entre atletas e controles
(SAUNDERS, SEPTEMBER, XENOPHONTOS, CARIOLOU,
ANASTASSIADES, NOAKES e COLLINS, 2007; DORING, ONUR, GEISEN
et al., 2010). Uma possível explicação para a falta de associação observada
nos estudos de Doring et al. (2010) e Saunders et al. (2007) é a composição
de suas amostras, que contaram apenas com atletas do sexo masculino.
Ainda que os estudos de associação tenham mostrado de forma
bastante consistente a influência do alelo R para o desempenho de
força/potência, muitos estudos que utilizaram outras abordagens
experimentais não foram capazes de demonstrar o papel da presença da
alfa-actinina-3 na produção de força e potência. Mais especificamente, o
desempenho de potência de membros superiores em jogadores de vôlei
parece não ser influenciado pelo genótipo R577X (RUIZ, FERNANDEZ DEL
VALLE, VERDE, DIEZ-VEGA, SANTIAGO, YVERT, RODRIGUEZ-ROMO,
GOMEZ-GALLEGO, MOLINA e LUCIA, 2011). O mesmo parece ocorrer com
os índices de desempenho em ciclistas de endurance profissionais (LUCIA,
GOMEZ-GALLEGO, SANTIAGO, BANDRES, EARNEST, RABADAN,
ALONSO, HOYOS, CORDOVA, VILLA e FOSTER, 2006). Assim como
ocorre em atletas, os índices de desempenho muscular, avaliados por meio
do teste de Wingate (NORMAN, ESBJORNSSON, RUNDQVIST et al., 2009;
HANSON, LUDLOW, SHEAFF, PARK e ROTH, 2010) e de avaliação
isocinética (HANSON, LUDLOW, SHEAFF et al., 2010), não são diferentes
entre os genótipos RR, RX e XX em indivíduos fisicamente ativos.
Em 2007, o mesmo grupo australiano que publicou o primeiro estudo
com ACTN3 e desempenho esportivo apresentou dados de um modelo
animal desenvolvido para mimetizar o genótipo XX de humanos
(MACARTHUR, SETO, RAFTERY et al., 2007). Trata-se de um camundongo
74
nocaute para o gene ACTN3. Em consonância com os dados de frequência
dos genótipos que indicam o favorecimento do alelo X para o metabolismo
aeróbio e do alelo R para a produção de força, estudos experimentais com os
animais ACTN3-/- mostraram que a ausência da alfa-actinina-3 leva ao
aumento de importantes enzimas do metabolismo aeróbio, como NADH-
redutase, citrato sintase, citocromo-C oxidase e succinato desidrogenase,
além de redução de enzimas da via glicolítica, como a lactato desidrogenase
(MACARTHUR, SETO, RAFTERY et al., 2007). No mesmo sentido,
marcadores mitocondriais também se mostraram aumentados nos
camundongos nocaute (MACARTHUR, SETO, RAFTERY et al., 2007). Em
relação o desempenho, os camundongos XX conseguiram correr uma
distância, em média, 33% maior do que seus pares selvagens em um teste
máximo até a exaustão (MACARTHUR, SETO, RAFTERY et al., 2007).
É interessante notar que a falta da alfa-actinina-3 foi compensada por
um aumento da expressão de alfa-actinina-2 nos animais nocaute
(MACARTHUR, SETO, RAFTERY et al., 2007). Apesar da ausência da
proteína, nenhuma alteração fenotípica ou histológica foi observada na
musculatura esquelética desses animais (MACARTHUR, SETO, RAFTERY et
al., 2007). Ainda assim, os camundongos nocaute apresentam redução da
massa magra total, causada provavelmente pela redução no diâmetro das
fibras do tipo IIb (MACARTHUR, SETO, CHAN et al., 2008), o que pode ser
demonstrado pela diminuição da massa de todos os grupos musculares
compostos por fibras brancas (MACARTHUR, SETO, CHAN et al., 2008).
Diminuição da força de preensão e alteração das propriedades contráteis do
músculo isolado (i.e., aumento do tempo de relaxamento e melhor
recuperação da fadiga) também são características dos camundongos
ACTN3-/- que corroboram a hipótese de mudança na distribuição dos tipos
de fibra e do metabolismo muscular em consequência da ausência da
proteína alfa-actinina-3 (MACARTHUR, SETO, CHAN et al., 2008; YANG,
GARTON e NORTH, 2009).
Em humanos, os dados sobre a influência dos genótipos sobre os
tipos de fibras musculares ainda são controversos. Vincent et al. (2007),
avaliando amostras do músculo vasto lateral de 90 homens saudáveis,
mostraram que o percentual de fibras do tipo IIx é maior em indivíduos RR
75
em relação aos XX. Por outro lado, Norman et al. (2009) não demonstraram
qualquer dependência entre os genótipos RR, RX ou XX e o padrão de
distribuição de fibras em 120 homens e mulheres treinados (NORMAN,
ESBJORNSSON, RUNDQVIST et al., 2009). Sem dúvidas, mais estudos com
humanos se fazem necessários para determinar de forma mais clara a
influência do polimorfismo R577X sobre o padrão de distribuição de fibras
musculares e seu impacto sobre o metabolismo energético muscular.
2.8. O gene PDLIM3 como candidato a associação com o desempenho esportivo
O gene PDLIM3 (ou ALP; accession number NM_014476) encontra-se
no cromossomo 4, banda q35.1, mais especificamente entre os pares de
bases 186422852 e 186456712. O mesmo é composto for 33861 pares de
bases, formando 8 éxons. A proteína codificada pelo gene PDLIM3 também
é chamada de PDLIM3, ou ALP (do inglês, Alpha-actinin-associated LIM
Protein).
Em humanos, o gene é altamente expresso nos tecidos musculares,
em especial os estriados, embora níveis discretos de expressão tenham sido
detectado em outros tecidos (OHSAWA, KOEBIS, SUO, NISHINO e
ISHIURA, 2011). Isso sugere que a principal função da PDLIM3 esteja
relacionada à estrutura ou funcionamento do sarcômero.
A proteína PDLIM3 foi identificada e descrita pela primeira vez em
1997, a partir de amostras de músculo esquelético e cardíaco de ratos (XIA,
WINOKUR, KUO, ALTHERR e BREDT, 1997). Inicialmente, duas isoformas
diferentes foram identificadas, resultantes de splicings alternativos. Uma
delas foi primordialmente encontrada no músculo cardíaco enquanto a outra
isoforma foi primordialmente encontrada no músculo esquelético (XIA,
WINOKUR, KUO et al., 1997). Ambas isoformas são constituídas por 3
regiões diferentes: domínio PDZ (N-terminal), domínio central e LIM (C-
terminal) (figura 27). Na isoforma cardíaca, o domínio central é composto por
182 aminoácidos ao passo que a isoforma do músculo esquelético contém
230 aminoácidos (figura 26) (XIA, WINOKUR, KUO et al., 1997). A proteína
PDLIM3 se colocaliza com as alpha-actininas na linha Z sarcomérica
76
(AROLA, SANCHEZ, MURPHY, HASLE, LI, ELLIOTT, MCKENNA, TOWBIN
e BOWLES, 2007), provavelmente em função da capacidade que o domínio
PDZ tem de interagir com a região C-terminal das alpha-actininas (XIA,
WINOKUR, KUO et al., 1997) (figura 27).
Figura 27. Ilustração esquemática das duas isoformas da proteína PDLIM3 (ALP)
inicialmente identificadas em músculo esquelético e cardíaco de ratos (XIA, WINOKUR, KUO
et al., 1997) (painel à esquerda). A estrutura das alfa-actininas-sarcoméricas e seus
domínios estão representados no painel à direita (XIA, WINOKUR, KUO et al., 1997; YANG,
GARTON e NORTH, 2009).
O tema estrutural PDZ (sigla que representa as iniciais das três
primeiras proteínas que foram descritas com o mesmo domínio: PSD95, Dlg1
e Zo-1) é comumente encontrado em diversas proteínas, a maioria das quais
interage com outras proteínas do citoesqueleto (PONTING e PHILLIPS,
1995). Os temas PDZ geralmente contêm entre 80 e 120 aminoácidos e
apresentam múltiplas funções, dentre as quais se destaca a transmissão de
sinais que chegam à membrana celular para proteínas-alvo intracelular (XIA,
WINOKUR, KUO et al., 1997).
Já os domínios LIM são compostos por dois domínios do tipo Zinc-
finger contíguos e recebem esse nome por estarem presentes nas proteínas
Lin11, Isl1 e Mec3, as três primeiras descritas que dividiam o mesmo domínio
(BACH, 2000). No músculo esquelético, proteínas contendo o domínio LIM
são capazes de se interagir com fatores de transcrição (WADMAN, LI, BASH,
FORSTER, OSADA, RABBITTS e BAER, 1994), proteína quinase C
(KURODA, TOKUNAGA, KIYOHARA, HIGUCHI, KONISHI, MIZUNO, GILL e
KIKKAWA, 1996) e receptor de tirosina quinase (WU, DURICK, SONGYANG,
CANTLEY, TAYLOR e GILL, 1996). Sabe-se que o músculo esquelético
possui uma proteína composta apenas por um domínio LIM (MLP, do inglês
Muscle LIM Protein), a qual se encontra na linha Z dos sarcômeros e tem
77
importante função na regulação da diferenciação miogênica no período
embrionário (ARBER, HALDER e CARONI, 1994). Considerando que o
domínio LIM da PDLIM3 interage com o domínio LIM de outras proteínas, é
possível que a proteína PDLIM3 interaja com a MLP e, de alguma forma,
interfira no processo de diferenciação muscular (XIA, WINOKUR, KUO et al.,
1997).
Embora a literatura científica não disponha de muitas informações
sobre as funções da proteína PDLIM3, tem sido sugerido que essa proteína
desempenhe papéis na estabilização estrutural do miócito, na geração e
transmissão de tensão mecânica durante a contração e na
mecanotransdução de sinais durante os processos de crescimento e
remodelamento (CLARK, MCELHINNY, BECKERLE e GREGORIO, 2002).
Um estudo recente confirmou, em humanos, que PDLIM3 é altamente
expressa no músculo esquelético, e demonstrou que existem três isoformas
da proteína, todas resultantes de splicings diferentes (OHSAWA, KOEBIS,
SUO et al., 2011). Em condições normais, apenas duas dessas isoformas
são encontradas no músculo esquelético (PDLIM3a e PDLIM3c). Uma delas,
a PDLIM3a, tem 364 aminoácidos e resulta de um splicing que mantém os
éxons 2-3-5-6-7. A outra, PDLIM3c, tem 276 aminoácidos, resulta de um
splicing alternativo que mantém os éxons 2-3-5-7 (isto é, exclui o éxon 6) e é
menos expressa do que a PDLIM3a (OHSAWA, KOEBIS, SUO et al., 2011).
Interessantemente, uma isoforma que só é expressa no músculo durante o
desenvolvimento embrionário foi encontrada em grandes quantidades em
amostras de músculo esquelético de um paciente adulto com distrofia
muscular miotônica (OHSAWA, KOEBIS, SUO et al., 2011). Trata-se de uma
isoforma de 316 aminoácidos proveniente de um splicing que, em músculo
esquelético maduro é aberrante, e que mantém os éxons 2-3-4-7 (isto é,
exclui os éxons 5 e 6, mas inclui o éxon 4) (OHSAWA, KOEBIS, SUO et al.,
2011) (figura 28).
78
Figura 28. Representação das três isoformas da proteína PDLIM3 (ALP) encontradas em
humanos, resultantes de splicings alternativos do mesmo transcrito primário. As isoformas
PDLIM3a e PDLIM3c são encontradas no músculo esquelético adulto, sendo a isoforma “a” a
mais predominantemente expressa. A isoforma PDLIM3b é expressa apenas durante o
desenvolvimento embrionário, mas foi encontrada no músculo esquelético de um paciente
adulto com distrofia muscular (OHSAWA, KOEBIS, SUO et al., 2011).
Essa isoforma anormal da proteína PDLIM3 é muito raramente
encontrada em pacientes com distrofia miotônica, o que indica que tal
condição clínica, na maioria dos casos, não tem relação com PDLIM3.
Entretanto, a alta expressão da isoforma embrionária (PDLIM3b) encontrada
em um paciente com distrofia amiotônica sugere que anormalidades na
PDLIM3 também podem levar à anormalidades fenotípicas no músculo
esquelético (OHSAWA, KOEBIS, SUO et al., 2011). Sabe-se que PDLIM3 é
da mesma família da proteína ZASP (também conhecida como Cypher ou
LDB3) (MCKEOWN, HAN e BECKERLE, 2006), cuja variante truncada já foi
relacionada com miopatia congênita em humanos (SELCEN e ENGEL, 2005).
Conforme mencionado anteriormente, a PDLIM3 liga-se às alfa-
actininas, o que ocorre via domínio PDZ. Para que tal interação ocorra, o
tema semelhante ao ZASP, codificado pelo éxon 6, é essencial. Logo, as
isoformas que não incluem o éxon 6 (isto é, isoformas “b” e “c”) podem não
se ligar de forma apropriada às alfa-actininas, o que poderia de alguma forma
explicar os sintomas de distrofia muscular observados no paciente que não
79
expressava a isoforma “a” no músculo esquelético (OHSAWA, KOEBIS, SUO
et al., 2011).
Algumas outras importantes funções têm sido atribuídas à proteína
PDLIM3. Segundo Pomies et al. (POMIES, PASHMFOROUSH, VEGEZZI et
al., 2007), essa proteína pode regular a diferenciação muscular durante o
período embrionário, uma vez que a falta de PDLIM3 afeta a expressão de
MyoD e miogenina, responsáveis pelos estágios iniciais da formação e pela
manutenção dos mioblastos. Uma importante evidência que apoia essa teoria
é o fato da expressão do gene PDLIM3 ser drasticamente regulado para mais
durante a diferenciação muscular (POMIES, PASHMFOROUSH, VEGEZZI et
al., 2007). É provável que o éxon 6 tenha função específica no músculo
esquelético maduro, o que possivelmente ocorre via interação com as alfa-
actininas (OHSAWA, KOEBIS, SUO et al., 2011). Já o éxon 4 pode exercer
algum papel importante no desenvolvimento do músculo (OHSAWA,
KOEBIS, SUO et al., 2011), muito embora sua exata função ainda permaneça
desconhecida.
Estudos in vitro mostraram que PDLIM3 aumenta a capacidade das
alfa-actininas de se ligar aos filamentos de actina, o que indica que PDLIM3
tem algum papel na organização do sarcômero e ancoramento dos filamentos
finos de actina (PASHMFOROUSH, POMIES, PETERSON et al., 2001). De
fato, a superexpressão de PDLIM3 demonstrou-se capaz de induzir arranjos
de actinina altamente robustos e organizados (PASHMFOROUSH, POMIES,
PETERSON et al., 2001).
Estudos com camundongos nocaute para o gene PDLIM3
demonstraram prejuízo na função cardíaca, alterações na câmara ventricular
direita e cardiomiopatia no ventrículo direito (PASHMFOROUSH, POMIES,
PETERSON et al., 2001). Curiosamente, outro estudo que utilizou um modelo
de camundongo nocaute para o gene PDLIM3 não observou qualquer
alteração evidente no tecido muscular esquelético (JO, RUTTEN, BUNN et
al., 2001), o que refuta todas as funções atribuídas ao gene PDLIM3 para o
desenvolvimento do músculo esquelético durante o período embrionário e
para a manutenção de sua estrutura e regulação de seu funcionamento após
no período maduro. Entretanto, é importante ressaltar que o estudo de Jo et
al. (JO, RUTTEN, BUNN et al., 2001) gerou camundongos nocautes apenas
80
para o éxon 1 do gene PDLIM3. Embora os autores tenham assumido que a
falta do éxon 1 iria levar à produção de uma proteína não funcional, é muito
provável que os camundongos nocautes de seu estudo não fossem, de fato,
nulos para a forma funcional da proteína PDLIM3, haja vista que,
posteriormente, foi demonstrado que o éxon 1 não participa de nenhuma das
isoformas da proteína (figura 27) (OHSAWA, KOEBIS, SUO et al., 2011).
Assim, as escassas evidências apontam, até o momento, para um papel
importante da proteína PDLIM3 no desenvolvimento e manutenção dos
músculos estriados esquelético e cardíaco.
A respeito do gene PDLIM3, estudos mostram que ele consta dentre
os cerca de 250 genes do genoma humano que apresentam polimorfismos
de variação do número de cópias (BAILEY, KIDD e EICHLER, 2008;
CONRAD, PINTO, REDON, FEUK, GOKCUMEN, ZHANG, AERTS,
ANDREWS, BARNES, CAMPBELL, FITZGERALD, HU, IHM,
KRISTIANSSON, MACARTHUR, MACDONALD, ONYIAH, PANG, ROBSON,
STIRRUPS, VALSESIA, WALTER, WEI, TYLER-SMITH, CARTER, LEE,
SCHERER e HURLES, 2010). Uma análise in silico realizada por nosso
grupo de pesquisa em bancos de dados sobre genes constatou que existe
um polimorfismo do tipo CNV no gene PDLIM3 que consiste na inserção ou
deleção de cerca de 2600 pares de base em uma região não codificadora,
mais especificamente no íntrons 3. Embora nosso grupo não tenha
encontrado nenhum dado na literatura a respeito dos efeitos desse CNV
sobre a estrutura, função ou regulação da expressão da proteína, dados não
publicados do Wellcome Trust Sanger Institute (Daniel G McArthur,
comunicação pessoal) verificou, em um estudo piloto, que a frequência do
polimorfismo foi de 100% em uma população da Etiópia (20 polimorfismos em
20 sujeitos avaliados) e de apenas 10% em uma população caucasiana
europeia (2 polimorfismos em 20 sujeitos).
Considerando sua importante função no desenvolvimento do tecido
muscular estriado, na regulação da estrutura sarcomérica, sua importante
relação com as alfa-actininas e sua provável frequência diferencial entre
etnias, o polimorfismo de variação no número de cópias do gene ALP torna-
se uma importante variante candidata a apresentar relação com a função da
81
musculatura esquelética e/ou cardíaca e, por consequência, com o
desempenho esportivo.
Assim sendo, o presente projeto de pesquisa teve como objetivos
avaliar a associação entre o CNV do gene ALP e o sucesso competitivo e
avaliar o impacto do polimorfismo na expressão gênica e protéica de ALP
(PDLIM3) e de alfa-actinina 3 no músculo esquelético de Humanos
saudáveis.
82
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo geral Com base no que foi discutido até então, o presente estudo tem por
objetivo avaliar a associação do polimorfismo de variação do número de
cópias do gene PDLIM3 com o estado atlético.
3.2. Objetivos específicos São objetivos específicos deste estudo:
1. Construir um amplo banco de DNA de atletas de diferentes
modalidades esportivas e de controles não atletas para que estudos
futuros sobre genética e esporte possam ser realizados no Brasil;
2. Determinar a frequência do polimorfismo CNV do gene PDLIM3 na
população geral brasileira e contrastá-la com uma coorte de atletas
brasileiros;
3. Determinar a frequência do polimorfismo CNV do gene PDLIM3 na
população geral australiana e contrastá-la com uma coorte de atletas
australianos;
4. Avaliar a associação do polimorfismo CNV do gene PDLIM3 com o
estado atlético considerando as especificidades do esporte, como
solicitação predominante (força/potência ou resistência), nível
competitivo e modalidade específica;
5. Avaliar o impacto do polimorfismo CNV do gene PDLIM3 sobre a
expressão da proteína ALP no músculo esquelético.
83
4. MÉTODOS
4.1. Construção do banco de DNA de atletas e controles não atletas
4.1.1. Participantes
Por meio de contato direto com atletas, colegas, técnicos e dirigentes
esportivos, convidamos o maior número possível de atletas a participar da
coleta de material biológico. Para ser considerado atleta, o indivíduo deveria
ter dedicação de, no mínimo, 6 horas por semana aos treinos de sua
modalidade esportiva, ser federado e participar regularmente de competições
oficiais de sua modalidade esportiva. No momento da coleta, cada atleta
preencheu um questionário informando sobre a modalidade em que era
especialista, horas de treinamento por semana, histórico competitivo,
competição mais proeminente em que já havia participado, além de etnia
própria e etnia dos pais.
Para coleta de material biológico dos indivíduos não atletas, nossa
equipe dirigiu-se a diversas unidades da Universidade de São Paulo (FFLCH,
FEA, POLI, EEFE e CEPE) e convidou o maior número possível de
estudantes que transitavam próximos dos pesquisadores para participar do
estudo. Para serem considerados controles não atletas, os indivíduos não
poderiam se encaixar nos critérios adotados neste estudo para definição de
atleta. No momento da coleta, cada indivíduo respondia a um questionário
informando a etnia própria, etnia dos pais e a presença de desordens
genéticas conhecidas. O único critério de exclusão adotado foi a presença de
doença de origem genética (cromossômica ou monogênica) confirmada por
diagnóstico clínico e molecular.
Todos os procedimentos deste estudo foram aprovados pelos Comitês
de Ética da EEFE-USP e do Children’s Hospital at Westmead, Sydney,
Austrália. Antes de participarem das coletas de material biológico, os sujeitos
eram esclarecidos sobre os objetivos do estudo, os procedimentos que
seriam utilizados e sobre o armazenamento de seu material genético. Em
seguida, os participantes assinaram o termo de consentimento livre e
esclarecido.
84
Aos sujeitos foi dado o direito de optar por permitir ou não o
armazenamento de seu DNA para estudos futuros e por conhecer ou não os
resultados do estudo. As amostras de todos os indivíduos que não permitiram
armazenamento foram descartadas tão logo as análises deste estudo foram
concluídas.
4.1.2. Coleta de material biológico para extração do DNA genômico O DNA genômico dos participantes foi extraído a partir de amostras de
sangue venoso ou de lavagens bucais. Nas coletas de sangue venoso, cerca
de 5 ml de sangue era retirado por meio de punção da veia antecubital em
tubos a vácuo (Vacutainer, BD®) contendo anticoagulante EDTA. O sangue
coletado era armazenado a -80º C até o momento da extração do DNA.
Nas coletas de lavagem bucal, os indivíduos eram instruídos a realizar
uma breve limpeza da boca utilizando soro fisiológico para que a presença de
restos de alimentos ou outros contaminantes fosse minimizada. Em seguida,
os pesquisadores pediam que os sujeitos raspassem a linga e bochechas
com os dentes, a fim de aumentar a quantidade de células da mucosa bucal
coletada durante o bochecho. Cerca de 10 ml de soro fisiológico era então
fornecido aos sujeitos em tubos livres de DNA e DNAse, para que eles
fizessem um forte e prolongado bochecho. Ao final do bochecho, o material
era coletado em um tubo cônico de 50 ml livre de DNA a DNAse. O
procedimento era repetido três vezes por coleta. Os tubos contendo o
produto da lavagem bucal eram armazenados a -20º C até o momento da
extração do DNA.
4.1.3. Extração de DNA genômico das amostras de sangue Cerca de 700 µl do sangue coletado era transferido para um microtubo
de 1,7 ml contendo cerca de 900 µl de tampão de lise de células vermelhas
(0,01 M Tris-HCl pH 7,6; 320 mM sacarose; 5 mM MgCl2; 1% Triton X-100).
Após leve agitação, o tubo era submetido à centrifugação a 2000 g por 4
minutos e o sobrenadante era descartado. Ao pellet remanescente, 1000 µl
85
do mesmo tampão era adicionado e o procedimento era repetido duas ou três
vezes, até que as células vermelhas tivessem sido quase 100% eliminadas.
Em seguida, o pellet contendo o concentrado de células brancas era
submetido à lise por meio da adição de um tampão de lise de células brancas
(0.01 M Tris-HCl pH 7,6; 11,4 mM citrato de sódio; 1 mM EDTA; 1% dodecil
sulfato de sódio) e 100 µl de NaCl 5 M. Após a lise, as amostras eram
separadas por gradiente de densidade utilizando-se 300 µl de clorofórmio e
centrifugação a 5000 g por 5 minutos. Ao final da centrifugação, o
sobrenadante contendo ácidos nucleicos era transferido a um novo
microtubo. Os ácidos nucleicos eram precipitados pela adição de 500 µl de
etanol 100% ou isopropanol 100% e separados por centrifugação a 3000 g
por 5 minutos. Após a retirada do sobrenadante, o pellet contendo ácidos
nucleicos purificados era deixado em temperatura ambiente por 15 minutos
para evaporação de etanol e isopropanol residuais. Finalizada a secagem, o
pellet era ressuspendido em 100-300 µl de tampão TE (Tris-EDTA) livre de
DNA e DNAse. O DNA purificado era então submetido à determinação da
concentração e pureza por meio de leituras espectrofotométricas (NanoDrop
ND 2000®) e armazenado a -20º C para posterior análise.
4.1.4. Extração de DNA genômico das amostras de lavagem bucal Os tubos cônicos contendo o produto da lavagem bucal eram,
inicialmente, submetidos à centrifugação a 7000 g por 10 minutos para
separar as células da mucosa do soro fisiológico e da saliva. A maior
quantidade possível de células era então transferida para um microtubo de
1,7 ml juntamente com 700 µl de tampão de lise celular (100 mM Tris-HCl pH
8,0; 0,5 mM EDTA; 0,2 M NaCl; 0,2% SDS; 50 mg Proteinase K) para
incubação por mínimo de 8 horas a 55º C. Após a incubação, as amostras
eram separadas por gradiente de densidade utilizando-se 300 µl de
clorofórmio e centrifugação a 5000 g por 5 minutos. Ao final da centrifugação,
o sobrenadante contendo ácidos nucleicos era transferido a um novo
microtubo. Os ácidos nucleicos eram precipitados pela adição de 500 µl de
etanol 100% ou isopropanol 100% e separados por centrifugação a 3000 g
por 5 minutos. Após a retirada do sobrenadante, o pellet contendo ácidos
86
nucleicos purificados era deixado em temperatura ambiente por 15 minutos
para evaporação de etanol e isopropanol residuais. Finalizada a secagem, o
pellet era ressuspendido em 100-300 µl de tampão TE (Tris-EDTA) livre de
DNA e DNAse. O DNA purificado era então submetido à determinação da
concentração e pureza por meio de leituras espectrofotométricas (NanoDrop
ND 2000®) e armazenado a -20º C para posterior análise.
4.2. Estudo de associação do polimorfismo CNV do gene PDLIM3 com o desempenho esportivo
4.2.1. Participantes Fizeram parte deste estudo 1074 indivíduos dos gêneros masculino e
feminino, os quais foram classificados como atletas (n=635) ou controles não
atletas (n=439). Nenhum indivíduo da amostra possuía qualquer relação
conhecida de parentesco com qualquer outro indivíduo. Do total de 1074
sujeitos avaliados, 617 pertenceram à coorte de indivíduos brasileiros
(atletas: n=328; controles: n=289) enquanto 457 pertenceram à coorte de
indivíduos australianos (atletas: n=307; controles: n=150). Somente
indivíduos caucasianos fizeram parte da coorte australiana ao passo que
representantes das principais etnias (isto é, brancos, negros, pardos,
asiáticos e índios) foram incluídos na coorte brasileira. A etnia dos
participantes foi determinada de forma autorrelatada, conforme procedimento
adotado pelo IBGE (IBGE, 2008). Atletas de diversas modalidades esportivas
de ambos os gêneros e de todos os níveis competitivos foram avaliados nas
coortes brasileira e australiana. Os critérios para classificação do nível
competitivo dos atletas estão descritos na Tabela 3. As características gerais
dos participantes deste estudo estão apresentadas nas Tabelas 4 e 5.
87
Tabela 3. Critérios adotados neste estudo para classificação dos atletas segundo seu nível
competitivo (adaptado de Ostrander et al. 2009(OSTRANDER, HUSON e OSTRANDER,
2009).
Classificação Critério
Alta-elite Participante de jogos olímpicos, campeonatos mundiais ou
competição equivalente em sua modalidade
Elite Participante de campeonatos continentais
Sub-elite Participante de campeonatos nacionais
Não elite Participante de campeonatos estaduais ou regionais
Tabela 4. Características gerais das coortes avaliadas neste estudo. *diferente de controles
(p<0,05; teste do qui-quadrado); NA=não se aplica; SI=sem informação. Dados apresentados
em %(número de indivíduos).
Coorte brasileira (n= 617) Coorte australiana (n= 457)
atletas (n=328) controles (n=289) atletas (n=307) controles (n=150)
Homens 72% (237)* 57% (166) 65% (200) 66% (99)
Mulheres 28% (91)* 43% (123) 35% (107) 34% (51)
Etnia
branco 57,1% (186)* 73,3% (211) 100% (307) 100% (150)
negro 13,1% (43)* 6,6% (19) 0% 0%
pardo 25,2% (82)* 12,8% (37) 0% 0%
asiático 4% (13) 7,3% (21) 0% 0%
índio 0,6% (2) 0% 0% 0%
Classificação
alta-elite 24% (79) NA SI NA
elite 14% (45) NA SI NA
sub-elite 39% (130) NA SI NA
não elite 23% (77) NA SI NA
Predomínio
força/potência 76% (246) NA 36,5% (112) NA
resistência 24% (79) NA 63,5% (195) NA
88
Tabela 5. Modalidades esportivas dos participantes deste estudo.
Coorte brasileira Coorte australiana
Lutas judô 11,8% (39) 2,9% (9) jiu-jitsu 9% (30) 0% MMA 3% (10) 0% luta-olímpica 0,3% (1) 0% tae-kwon-do 0,3% (1) 0% muai-tai 0,9% (3) 0% Esportes coletivos basquete 9,9% (33) 0% vôlei 8,2% (27) 0% futebol 0,3% (1) 0% polo aquático 0,3% (1) 0% Atletismo 100m e 200m 4,0% (13) 8,5% (26) 110m c/ barreira 2,4% (8) 5,9% (18) lançamento martelo 0,3% (1) 0% salto em distância 0,3% (1) 1,6% (5) salto com vara 0,9% (3) 0% 800m/maratona/triátlon 1,5% (5) 4,6% (14) Ciclismo velocidade (pista) 5,5% (18) 2,3% (7) resistência (estrada) 16,3% (54) 24,8% (76) Natação <400m 11,2% (37) 14,3% (44) >400m 1,2% (4) 4,9% (15) Canoagem velocidade 4,0% (13) 0% maratona/remo 5,1% (17) 27% (83) Esqui velocidade 0% 1,0% (3) endurance 0% 2,3% (7) Ginástica olímpica 3,3% (11) 0% Dados expressos em % (número de indivíduos).
89
4.2.2. Determinação do genótipo relativo ao polimorfismo CNV do gene PDLIM3
O DNA extraído e purificado de cada participante foi submetido à
reação em cadeia da polimerase utilizando-se três primers diferentes (Tabela
6) que permitiram amplificar a região com o polimorfismo (inserção de ~2600
pares de bases) ou sem o polimorfismo (deleção).
Tabela 6. Sequências dos três primers utilizados neste estudo para amplificação das regiões
contendo ou não a inserção.
Designação do primer Sequência
PDLIM3-Forward TGACGCAAAGTCATGGAATG
PDLIM3-Reverse TTCGAGGTCTTCACCCAGAT
PDLIM3-Insertion TACCTGGACCAACCAGAAGG
O primer Forward foi desenhado para se anelar a uma sequência não
variável na região upstream em relação ao ponto de quebra da inserção, de
tal forma que o mesmo anela-se ao DNA de todos os indivíduos,
independente de apresentarem ou não a inserção (figura 28). O primer
Reverse foi desenhado para anelar-se a uma sequência não variável na
região downstream em relação ao ponto de quebra da inserção, de tal forma
que ele se anela ao DNA de todos os indivíduos, independente de
apresentarem ou não a inserção (figura 28). Já o primer Insertion foi
desenhado para anelar-se a uma região exclusiva da inserção, localizada
cerca de 500 pares de base downstream ao ponto de quebra. Dessa forma, a
reação de PCR em indivíduos homozigotos que apresentem a inserção (isto
é, genótipo I/I) vai resultar em fragmentos de apenas um tamanho, com 632
pares de bases (resultado da amplificação direcionada pelos primers
Forward+Insertion). Em indivíduos homozigotos sem a inserção (isto é,
genótipo D/D), a reação terá como produto fragmentos com um único
tamanho, com 152 pares de bases (resultado da amplificação direcionada
pelos primers Forward+Reverse). Já os indivíduos heterozigotos (isto é,
90
genótipo D/I), ambos os fragmentos poderão ser visualizados ao final da
reação de PCR (figura 29).
Figura 29. Ilustração da reação de PCR desenhada especificamente para amplificar o
fragmento de inserção do gene PDLIM3 e, assim, determinar o genótipo para o polimorfismo
CNV do gene PDLIM3.
As reações de PCR foram preparadas em microtubos de 0,1 ml
contendo: 1 µl de DNA a 10 ng/µl, 1,0 ul de cada primer a 10 nM, 1,6 µl de
MgCl2 a 25 mM, 1,6 µl de dNTPs a 10 mM, 4 µl de 5x Green Buffer
(Promega®), 0,2 µl da enzima GoTaq Polimerase (Promega®) a 5 U/µl e 8,6 µl
de água ultrapura livre de DNA a DNAse (Invitrogen®), totalizando volume
final de reação de 20 µl. Após o preparo das amostras e reagentes, os tubos
eram alocados em um termociclador (Rotor Gene Q, Quiagen®) e submetidos
à seguinte condição de ciclagem de temperatura:
a) 94º C por 2 minutos (desnaturação inicial);
b) 94º C por 30 segundos (desnaturação);
c) 61º C por 30 segundos (anelamento dos primers);
d) 72º C por 60 segundos (extensão das cadeias pela Polimerase);
e) 72º C por 7 minutos (período final de extensão das cadeias),
sendo que os ciclos “b”, “c” e “d” foram repetidos por 40 vezes.
Após a amplificação, os fragmentos foram separados em função de
seu tamanho por eletroforese em gel de agarose 2%, corados com brometo
de etídio e visualizados por meio de luz ultravioleta, com o auxílio de um
transiluminador acoplado a um fotodocumentador (Image-Quant, GE®). A
determinação dos genótipos era feita visualmente, observando-se a presença
dos fragmentos de 152 e 632 pares de bases, conforme indica a figura 28.
Para garantir a correção na determinação dos genótipos e para assegurar de
91
que as reações não estavam apresentando fragmentos oriundos de
contaminação, a cada corrida eram acrescentados controles positivos (isto é,
amostras cujos genótipos já eram conhecidos) e controles negativos (isto é,
mistura de reagentes sem a presença de DNA).
4.2.3. Validação da reação de PCR Para garantir que a reação de PCR estava, de fato, amplificando os
fragmentos desejados do gene PDLIM3, amostras de 3 indivíduos
genotipados como D/D e de outros 3 genotipados como I/I foram submetidas
à amplificação por PCR conforme descrito acima, ajustando-se o volume final
para 40 µl. Após a amplificação, todo o volume da reação foi aplicado ao gel
de agarose para confirmação da reação e dos genótipos. Ao final da
eletroforese e após a confirmação dos genótipos, as bandas contendo os
fragmentos amplificados foram cortadas do gel manualmente, com o auxílio
de um bisturi e, em seguida, inseridas em um microtubo para purificação. Os
fragmentos foram purificados e separados da agarose utilizando-se um kit
comercialmente disponível (Jetquick Gel Extraction Spin Kit 50, Genomed®).
Após a extração dos fragmentos do gel, os mesmos foram preparados para
reação de sequenciamento adicionando-se 1 µl de cada primer aos tubos, os
quais foram devidamente etiquetados e enviados para um laboratório
especializado em sequenciamento (Children’s Hospital at Westmead,
Sydney, Austrália). O resultado do sequenciamento foi entregue em formato
eletrônico e imediatamente lançado ao banco de dados do genoma humano.
As 3 amostras de cada genótipo foram idênticas em suas sequências e a
análise in silico confirmou que as sequências correspondiam ao gene ALP,
sendo as dos sujeitos I/I pertencentes à inserção que é objeto deste estudo.
4.2.4. Determinação do impacto do polimorfismo CNV do gene PDLIM3 sobre a expressão proteica da proteína ALP
Para avaliar o efeito do polimorfismo CNV do gene PDLIM3 sobre os
níveis de expressão de sua proteína correspondente, amostras de biópsia
muscular de 26 pacientes sem identificação, pertencentes ao banco de
92
tecidos do Children’s Hospital at Westmead, foram submetidas à extração de
DNA e genotipadas, conforme os procedimentos já descritos acima. Desses,
4 foram identificadas como carreadores do alelo I (3 pacientes D/I e 1
paciente I/I), cujas amostras quais foram, juntamente com as de outros 5
pacientes D/D pareados por gênero e idade, submetidas à análise qualitativa
de expressão da proteína ALP por meio da técnica de Western Blot.
As amostras de tecido muscular foram obtidas por meio de biópsia e
armazenadas na fase gasosa de um tanque de nitrogênio líquido. Elas foram
cortadas em criostato de chão (CM1900, Leica®) de modo a serem obtidas
10 fatias de 10 µm cada. Os cortes foram transferidos a um microtubo de 1,5
ml, ao qual foi adicionado 200 µl de tampão de lise (100 mM KCl; 10 mM
HEPES; 3 mM MgCl2; 5 mM EDTA; glicerol 50%; 1 mM DTT; SDS 3%;
coquetel inibidor de proteases e azul coomassie). Em seguida, as amostras
foram rompidas por meio de 10 pulsos ultrassônicos em desruptor de células
(TissueRuptor, Qiagen®) e homogeneizadas. Para garantir que a quantidade
de proteína aplicada ao gel de eletroforese fosse similar para todas as
amostras, uma eletroforese de verificação de carregamento em gel de
poliacrilamida com gradiente de 4 a 12% (NuPage Bis-Tris, Invitrogen®) foi
realizada. Ao final da eletroforese, o gel foi corado com solução corante
(0.1% azul coomassie, 10% ácido acético e 40% metanol) e a intensidade
das bandas correspondentes à actina e miosina foi utilizada como indicativo
de que o conteúdo total de proteína estava sendo adicionado ao gel de modo
equivalente entre todas as amostras (figura 30).
Figura 30. Gel de carregamento de proteínas dos pacientes que carregavam a inserção (DI e
II) e seus controles (DD). A banda superior corresponde à miosina e a banda inferior
corresponde à actina. A intensidade das bandas mostra que o carregamento foi
adequadamente semelhante entre as amostras.
93
Após o ajuste da quantidade de cada amostra que deveria ser aplicada
ao gel, uma nova eletroforese foi realizada em gel de poliacrilamida com
gradiente de 8 a 16%. Após a separação das proteínas por peso molecular,
as mesmas foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose
utilizando-se um sistema úmido de transferência (XCell II, Invitrogen®). O
tempo de transferência foi de 90 minutos. Em seguida, a membrana foi
incubada com solução de bloqueio ao longo de uma noite (leite desnatado
liofilizado 5% em PBST). Na manhã do dia seguinte, a membrana foi
incubada por 2 horas com anticorpo primário para a proteína PDLIM3
humana (Sigma-Aldrich®, número de catálogo HPA004749) diluído a 1:2000.
Terminado o tempo de incubação, a membrana foi lavada 5 vezes por 5
minutos com PBST e então incubada com o anticorpo secundário anticoelho
(Sigma-Aldrich®, número de catálogo R2004) diluído a 1:2000 por 1 hora.
Após a incubação, a membrana foi novamente lavada 5 vezes por 5 minutos
com PBST e, em seguida, um kit de reagentes quimioluminescentes
(Amersham ECL Plex®) foi derramado sobre a membrana para que, em
seguida, ela fosse exposta, em uma sala escura, a um filme fotossensível.
Por fim, o filme foi revelado em um equipamento automatizado (Kodak X-
Omat 1000A®).
4.2.5. Análises estatísticas Todos os dados foram submetidos à análise de frequência e estão
apresentados como % da população (número de indivíduos). Para
comparação das frequências dos genótipos e dos alelos em diferentes
populações, foram construídas tabelas de contingência e o teste do qui-
quadrado de Pearson foi aplicado. Sempre que o número de observações em
um grupo fosse menor do que 5, foi utilizado o teste exato de Fischer. O nível
de significância adotado previamente foi de 5%.
94
5. RESULTADOS
Na coorte brasileira, a frequência do genótipo I/I nos atletas foi
aproximadamente duas vezes maior do que nos controles (Tabela 7). Na
coorte australiana, resultado similar foi observado, mas o percentual de
indivíduos I/I foi muito menor em comparação com a coorte brasileira, e
nenhuma diferença estatística foi observada entre os genótipos (Tabela 7). A
análise da frequência dos alelos confirmou os dados observados nas
frequências genotípicas, sendo o alelo I significantemente mais representado
nos atletas brasileiros, mas não nos australianos (Tabela 7). Confirmando os
dados inicialmente obtidos pelo Wellcome Trust Sanger Institute (Daniel G
McArthur, comunicação pessoal), a frequência do alelo I parece ter forte
associação com a etnia, já que a inserção foi notadamente mais frequente na
população brasileira em relação à australiana (Tabela 7).
Tabela 7. Frequências dos genótipos e dos alelos nas coortes de atletas e não atletas
brasileiros e australianos.
%DD (n) %DI (n) %II (n) %alelo D (n) %alelo I (n) x2 (p)
Coorte brasileira
atletas 48,3 (158)# 35,2 (115)# 15,9 (52)# 66,3 (431) 33,7 (219) 8,34 (0,004)
controles 56 (158) 35,8 (101) 8,2 (23) 73,9 (417)* 26,1 (147)* -
Coorte australiana
atletas 80,1 (246)ns 18,6 (57)ns 1,3 (4)ns 89,4 (549) 10,6 (65) 1,11 (0,21)
controles 83,8 (134) 15,6 (25) 0,6 (1) 91,6 (293) 8,4 (27) -
*significantemente diferente dos controles australianos (x2=39,02; p<0,0001); #significantemente diferente dos controles brasileiros (x2=9,12; p=0.01); nsnão
significantemente diferente de controles australianos. Os valores de x2 e p reportados na
tabela referem-se à comparação das frequências alélicas entre atletas vs. controles.
Conforme mostra a Tabela 8, a frequência dos genótipos é, de fato,
bastante diferente entre os principais grupos étnicos brasileiros (isto é, o
genótipo I/I é especialmente mais frequente na população negra),
independente dos indivíduos serem atletas ou não. Apesar disso, a
comparação da frequência dos genótipos entre atletas e controles do mesmo
95
grupo étnico confirma que os genótipos D/I e I/I são super-representados nos
atletas (Tabela 8).
Tabela 8. Distribuição dos genótipos e dos alelos entre atletas e controles da coorte
brasileira de acordo com os três principais grupos étnicos.
%DD (n) %DI (n) %II (n) %alelo D (n) %alelo I (n) x2 (p)
Atletas
brancos$ 36,6% (106) 31,9% (59) 10,8% (20) 73,2% (271) 26,8% (99) 0,69 (0,40)
negros$ 14,3% (6)* 47,6% (20)* 38,1% (16)* 38,1% (32) 61,9% (52) 0,53 (0,47)
pardos 43,9% (36) 37,8% (31) 18,3% (15) 62,8% (103) 37,2% (61) 0,82 (0,36)
Controles
brancos 56,1% (115)& 40% (82)& 3,9% (8)& 76,1% (312) 23,9% (98) -
negros 38,9% (7)# 16,7% (3)# 44,4% (8)# 47,32% (17) 52,8% (19) -
pardos 54,3% (19) 31,4% (11) 14,3% (5) 70% (49) 30% (21) -
*diferente de brancos e pardos (x2>30; p<0,0001); #diferente de brancos (x2>30; p<0,0001) e
diferente de pardos (x2=5,96; p=0,05); &diferente de pardos (x2=6,53, p=0,04); $frequências
dos genótipos diferente do grupo controle para o mesmo grupo étnico (brancos: x2=8,26,
p=0,016; negros: x2=6,8, p=0,033). Os valores de x2 e p apresentados na tabela referem-se
às comparações da frequência dos alelos entre atletas vs. controles dentro de cada uma das
etnias.
Embora os genótipos D/I e I/I estejam associados com a condição
atlética, essa variante parece não ter qualquer tipo de influência sobre o
sucesso e sobre o nível competitivo alcançado (Tabela 9). De forma similar, a
frequência dos genótipos não mostrou associação com o predomínio de
solicitação da modalidade, embora uma discreta associação do alelo I com
modalidades de força/potência tenha sido observada nas coortes australiana
e brasileira (Tabela 10).
96
Tabela 9. Distribuição dos genótipos e dos alelos entre atletas da coorte brasileira de acordo
com os níveis competitivos.
%DD (n) %DI (n) %II (n) %alelo D (n) %alelo I (n)
alta-elite 51,9 (40) 35,1 (27) 13 (10) 69,5 (107) 30,5 (47)
elite 42,2 (19) 35,6 (16) 22,2 (10) 60 (54) 40 (36)
sub-elite 48,1 (62) 34,1 (44) 17,8 (23) 65,1 (168) 34,9 (90)
não elite 50,7 (38) 37,3 (28) 12 (9) 69,3 (104) 30,7 (46)
nenhuma diferença estatisticamente significante foi observada entre os níveis competitivos,
tanto para frequência do polimorfismo como para frequência do alelo.
Tabela 10. Distribuição dos genótipos e dos alelos entre atletas das coortes brasileiras e
australianas de acordo com o predomínio das modalidades (isto é, força/potência ou
resistência).
%DD (n) %DI (n) %II (n) %alelo I (n) %alelo D (n) x2 (p)
Coorte brasileira
potência 49,2 (121)ns 34,6 (85)ns 16,3 (40)ns 66,5 (327)ns 33,5 (165)ns 6,7 (0,01)
resistência 46,8 (37) 38 (30) 15,2 (12) 65,8 (104) 34,2 (54) 3,65 (0,06)
Coorte australiana
potência 75,9 (85)ns 22,3 (25)ns 1,8 (2)ns 87,1 (195)ns 12,9 (29)ns 2,85 (0,06)
resistência 82,6 (161) 16,4 (32) 1,0 (2) 90,8 (354) 9,2 (36) 0,14 (0,99) nssem diferença estatisticamente significante em relação aos atletas de resistência. Os
valores de x2 e p apresentados na tabela referem-se às comparações da frequência dos
alelos entre atletas vs. controles dentro de cada uma das coortes.
Ao avaliar a frequência dos genótipos e alelos entre os atletas de
diferentes modalidades, observamos que a inserção é mais representada nas
modalidades de ciclismo, esportes coletivos e, em especial, no atletismo
(Tabela 11). Surpreendentemente, essa associação foi bastante similar em
ambas as coortes de atletas, muito embora o percentual de indivíduos
carregadores do alelo I tenha sido consideravelmente menor na coorte
australiana (Tabela 11). Curiosamente, a frequência do alelo I foi
significantemente menor em atletas de remo em relação aos controles, o que
vai de encontro aos resultados encontrados até aqui neste estudo.
97
Tabela 11. Distribuição dos genótipos e dos alelos entre atletas das coortes brasileira e
australiana de acordo com modalidades esportivas específicas.
%DD %DI %II x2 (p) %alelo D %alelo I x2 (p)
Coorte brasileira
lutas 52,4 32,9 14,6 3,07 (0,21) 68,9 31,1 1,38 (0,24)
ciclismo 44,4 43,1 12,5 3,44 (0,18) 66 34 3,25 (0,07)
natação 65,9 26,8 7,3 1,47 (0,48) 79,3 20,7 0,81 (0,36)
canoagem 50 34,6 15,4 1,58 (0,45) 67,3 32,7 0,76 (0,36)
coletivos 41,7 36,7 21,7 10,5 (0,005) 60 40 8,76 (0,003)
atletismo 33,3 33,3 33,3 18,89 (<0,0001) 50 50 14,14 (0,0002)
Coorte australiana
ciclismo 72,6 26,2 1,2 4,26 (0,12) 85,7 14,3 4,01 (0,027)
natação 86,4 13,6 0 0,53 (0,77) 93,2 6,8 0,34 (0,58)
remo 92,8 7,2 0 4,05 (0,13) 96,4 3,6 4,48 (0,02)
atletismo 70,8 24,6 4,6 7,16 (0,028) 83,1 16, 9 6,05 (0,008)
os valores de x2 e p apresentados na tabela corresponde à comparação vs. controles.
Apesar dos dados de frequência alélica e genotípica confirmarem de
certa forma nossa hipótese inicial, a análise da expressão da proteína
PDLIM3 mostrou que, ainda que ela sofra forte regulação, o genótipo, a idade
e o gênero não são fatores determinantes nessa regulação (figura 31).
Figura 31. Determinação da expressão da proteína PDLIM3 em 4 pacientes carregadores do
alelo I e em 5 pacientes não carregadores do alelo I pareados por gênero e idade.
98
6. DISCUSSÃO
O presente estudo teve como objetivo avaliar a associação do
polimorfismo de variação do número de cópias do gene PDLIM3 com o
desempenho no esporte. Tal variante no gene PDLIM3 foi tratada como um
provável candidato para associação com o desempenho esportivo por
algumas razões, as quais serão discutidas abaixo.
O gene PDLIM3 se expressa a elevadas taxas nos tecidos musculares
estriados, tanto o esquelético quanto o cardíaco. Esses tecidos são, muito
provavelmente, os mais diretamente relacionados com o desempenho físico e
esportivo (THOMPSON, MOYNA, SEIP, PRICE, CLARKSON,
ANGELOPOULOS, GORDON, PESCATELLO, VISICH, ZOELLER,
DEVANEY, GORDISH, BILBIE e HOFFMAN, 2004). Alguns autores
consideram o músculo esquelético como o tecido mais propenso a exibir
variantes gênicas que apresentem relação com o desempenho (THOMPSON,
MOYNA, SEIP et al., 2004). Isso porque o tamanho dos músculos, a massa
muscular e a força muscular são altamente variáveis entre indivíduos
(THOMIS, BEUNEN, MAES, BLIMKIE, VAN LEEMPUTTE, CLAESSENS,
MARCHAL, WILLEMS e VLIETINCK, 1998; THOMIS, BEUNEN, VAN
LEEMPUTTE, MAES, BLIMKIE, CLAESSENS, MARCHAL, WILLEMS e
VLIETINCK, 1998). Além disso, o tecido muscular é extremamente plástico,
podendo responder de forma rápida e diversificada aos mais diversos
estímulos como, por exemplo, o exercício físico (THOMPSON, MOYNA, SEIP
et al., 2004). Muitos dos genes que se expressam no músculo esquelético
apresentam um ou mais sítios de variação, muitas das quais são do tipo não
sinônimas e que, portanto, resultam em alteração na sequência de
aminoácidos (THOMPSON, MOYNA, SEIP et al., 2004). De fato, o gene
PDLIM3 apresenta um sítio de variação que figura dentre os maiores em
termos de número absoluto de pares de bases (JAKOBSSON, SCHOLZ,
SCHEET et al., 2008) e seu padrão de distribuição diferencial entre
populações diferentes sugere que pode ter tido alguma importância evolutiva,
provavelmente afetando o desenvolvimento e/ou função dos músculos
esquelético e cardíaco.
99
Embora as funções exatas que o gene PDLIM3 exerce nesses tecidos
não estejam elucidadas, algumas evidências apontam que a presença da
proteína é indispensável durante o período de desenvolvimento embrionário,
provavelmente atuando na sinalização para a diferenciação muscular (XIA,
WINOKUR, KUO et al., 1997; POMIES, PASHMFOROUSH, VEGEZZI et al.,
2007). Outras evidências sugerem que PDLIM3 atua na estabilização
estrutural do sarcômero, na transmissão de tensão mecânica e na sinalização
da mecanotransdução de sinais oriundos do citoesqueleto (CLARK,
MCELHINNY, BECKERLE et al., 2002). A proteína PDLIM3 tem a capacidade
de ligar-se às alfa-actininas sarcoméricas, provavelmente regulando sua
atividade de ancoramento dos filamentos de actina (AROLA, SANCHEZ,
MURPHY et al., 2007). Considerando que a presença ou ausência da alfa-
actnina-3 tem um profundo impacto sobre o metabolismo muscular, resposta
ao treino e alta associação com desempenho esportivo (YANG,
MACARTHUR, GULBIN et al., 2003; MACARTHUR e NORTH, 2004;
MACARTHUR, SETO, RAFTERY et al., 2007; MACARTHUR, SETO, CHAN
et al., 2008; YANG, GARTON e NORTH, 2009), é plausível especular que
alterações na proteína PDLIM3 possam de forma direta ou indireta, por meio
de sua relação com as alfa-actininas, influenciar o metabolismo muscular.
Os resultados deste estudo, em confluência com nossa hipótese
inicial, mostram que o polimorfismo CNV do gene PDLIM3 está associado
com o desempenho esportivo. Mais corretamente, essa variante está
associada com o fato de um indivíduo ser ou não um atleta. Tal associação,
no entanto, foi observada apenas na coorte brasileira, mas não na
australiana. É possível que essa associação tenha sido observada apenas na
coorte brasileira em função de diferenças étnicas entre as coortes estudadas.
Nesse sentido, é possível observar que a frequência do alelo I na coorte
brasileira de controles foi mais do que 3 vezes maior do que o encontrado na
coorte australiana (26% vs. 8,4%), resultado similar para os genótipos D/I e I/I
(35,8% e 8,2% vs. 15,6% e 0,6%, respectivamente). Em vista da raridade do
alelo I na coorte australiana, seria muito improvável que algum tipo de
associação com um fenótipo tão complexo fosse de fato encontrada. Esses
dados indicam que o polimorfismo CNV do gene ALP, a exemplo de outras
variações encontradas em outros genes (RANKINEN, ROTH, BRAY et al.,
100
2010), é relevante para o desempenho apenas em determinados grupos
étnicos, mas não em outros.
Ainda em relação às diferenças étnicas, foi possível observar que, a
despeito de todas as limitações inerentes à relação entre cor da pele e
background genético (PIMENTA, ZUCCHERATO, DEBES, MASELLI,
SOARES, MOURA-NETO, ROCHA, BYDLOWSKI e PENA, 2006;
OSTRANDER, HUSON e OSTRANDER, 2009), o alelo I e os genótipos D/I e
I/I foram muito mais frequentes na população negra em relação aos brancos
e pardos, e mais frequentes nos pardos em relação aos brancos. A principal
implicação desses resultados é que, em função da maior proporção de
negros e pardos na coorte de atletas em comparação com os controles, é
possível que a diferenças encontradas nas distribuições alélicas e
genotípicas sejam reflexo da maior quantidade de representantes desses
grupos étnicos, ao invés de refletirem uma associação propriamente dita do
polimorfismo com o desempenho. Contudo, ao se contrastar a frequências
genotípicas entre atletas e controles dentre de cada grupo étnico, o alelo I
continua sendo super-representado entre os atletas. Ainda que o grau de
associação seja um pouco menor do que o observado quando as
comparações não levam em conta a etnia, esses dados corroboram a tese de
que o polimorfismo CNV do gene PDLIM3 é associado ao estado atlético. De
qualquer forma, todas as análises desse polimorfismo devem levar em
consideração a proporção dos grupos étnicos para que isso não se torne um
viés. Com base nisso, todas as análises de associação entre subgrupos
apresentadas neste estudo foram previamente testadas quanto ao
desbalanceamento de etnias entre os grupos.
Surpreendentemente, o polimorfismo CNV do gene PDLIM3 não se
mostrou distribuído de forma diferencial entre atletas de diferentes níveis
competitivos. Embora esse dado enfraqueça um pouco a tese de associação
com o desempenho esportivo, é possível que tal variação não influencie o
tecido muscular de modo tão impactante a ponto de determinar o grau de
sucesso competitivo. Essa é uma provável consequência do tipo de
abordagem utilizada neste estudo, a abordagem de gene único. De acordo
com Flueck et al. (FLUECK, VAUGHAN e WESTERBLAD, 2010), o gene
estudado, por qualquer que seja, pode não ser o “gargalo” da regulação das
101
variáveis que contribuem para o desempenho, como força e massa
musculares, capacidade aeróbia, entre outras. É muito provável que haja, na
verdade, sobreposição de genes sobre essas variáveis de forma que uma
variação em um único gene pode ser compensada por outros genes, o que
pode ser entendido como um indicativo da robustez do sistema em “proteger-
se” de eventuais falhas comuns (FLUECK, VAUGHAN e WESTERBLAD,
2010). No mesmo sentido, é possível que uma variação tenha certo impacto
no local onde o gene se expressa, mas em nível sistêmico ela pode ser
apenas marginalmente relevante e, portanto, difícil de ser identificada
(FLUECK, VAUGHAN e WESTERBLAD, 2010), especialmente quando o
fenótipo que está sendo associado com a variação é tão complexo e
multifatorial.
A comparação da frequência dos genótipos entre atletas de
força/potência e resistência não revelou nenhuma diferença estatisticamente
significante, tanto na coorte de atletas brasileiros como na de australianos.
Por outro lado, a análise da frequência alélica mostrou que o alelo I tende a
ser mais frequente em atletas de força/potência em relação aos de
resistência, na coorte australiana. Resultado semelhante foi observado na
coorte brasileira. Embora ambos o grupo de atletas de resistência tenha
apresentado uma tendência de associação com o alelo I, o grau dessa
associação foi maior entre os representantes de força/potência. Apesar da
falta de informação disponível a respeito do impacto desse polimorfismo
sobre a função muscular, é possível especular que tal associação esteja
relacionada com a função da proteína PDLIM3 em contribuir para sarcômeros
mais robustos, provavelmente capazes de gerar e transmitir melhor a tensão
produzida pela contração muscular (CLARK, MCELHINNY, BECKERLE et al.,
2002). Uma outra possível explicação estaria baseada na função da proteína
PDLIM3 sobre o processo de mecanotransdução de sinais (CLARK,
MCELHINNY, BECKERLE et al., 2002), o que poderia afetar diretamente o
processo de adaptação muscular pós-treino e, em consequência, modular as
respostas hipertróficas ao treinamento físico. Contudo, é importante salientar
que essas explicações ainda são sobremaneira especulativas, de tal forma
que não há evidências diretas que as sustentem. Sem dúvidas, estudos
prospectivos devem determinar se indivíduos que carregam o alelo I
102
respondem melhor ao treino de força do que aqueles que não o carregam.
Ainda, estudos mais específicos devem determinar a influência da inserção
sobre a arquitetura, metabolismo e função musculares.
Curiosamente, a frequência do alelo I foi significantemente maior em
atletas de atletismo, fato observado tanto na coorte australiana quanto na
coorte brasileira. De modo muito similar, a frequência do alelo tendeu a ser
maior em ciclistas na coorte brasileira e foi, de fato, maior na coorte
australiana. O mesmo foi observado em atletas de esportes coletivos da
coorte brasileira (a maior parte deles competindo basquete e vôlei – a coorte
australiana não tem representantes dessas modalidades). Embora seja
extremamente difícil estabelecer uma conexão entre o alelo e as demandas
específicas dessas modalidades, é ainda mais difícil assumir que a maior
frequência do alelo I nas mesmas modalidades em ambas as coortes, a
despeito das enormes diferenças étnicas, tenha sido mera coincidência.
Certamente, explicações que conectem esses resultados com informações
fisiológicas só serão possíveis quando houver entendimento das alterações
provocadas pelo polimorfismo CNV do gene PDLIM3 sobre o fenótipo
muscular. Baseado apenas nos dados obtidos e nas escassas informações
da literatura, é possível apenas especular que, de alguma forma, essa
variação genética é mais importante para o atletismo e para o ciclismo do que
para outras modalidades. De fato, para as demais modalidades, nenhuma
associação foi observada com o alelo I em nenhuma das cortes.
Surpreendentemente, foi observada uma maior frequência do alelo D nos
remadores australianos, outro resultado para o qual não é possível prover
uma explicação que ligue a função do gene e da proteína com as
especificidades da modalidade.
Por fim, o ensaio de determinação de expressão da proteína PDLIM3
não revelou nenhuma diferença em função dos genótipos. Pode-se observar
que, de fato, sua expressão é bastante regulada, já que os níveis da proteína
são marcadamente diferentes entre os indivíduos. Entretanto, o fato dos
indivíduos carregarem ou não o alelo I parece ter pouca ou nenhuma
influência sobre a quantidade de PDLIM3 no tecido muscular. As outras
variáveis conhecidas e que também poderiam exercer algum tipo de
influência sobre o padrão de expressão proteica (isto é gênero e idade)
103
também não parecem ter qualquer tipo de relação com a quantidade de
PDLIM3 encontrada nos músculos dos pacientes avaliados. Esses resultados
tornam o estabelecimento de uma relação fisiológica entre o genótipo e o
fenótipo ainda mais difícil. Se, por um lado, os dados são consistentes o
suficiente para demonstrar a associação entre o polimorfismo e o estado
atlético, por outro, tal associação não está baseada na alteração do padrão
de expressão da proteína PDLIM3 causada pelo polimorfismo. Considerando
que a inserção ocorre no íntron 3, ou seja, uma região não codificadora, não
é razoável assumir que o polimorfismo afete a função da proteína por alterar
sua estrutura. Uma vez que o polimorfismo estudado não altera a expressão
tampouco a estrutura da proteína, outros mecanismos devem explicar a
associação com o desempenho esportivo observada neste estudo. Tais
mecanismos podem envolver a alteração da expressão das proteínas com as
quais ele interage, como alfa-actinina-2 e alfa-actinina-3, ou alterações que
ocorrem durante a diferenciação e desenvolvimento musculares que não
seriam detectáveis em tecido muscular adulto, mas que poderiam ter algum
impacto sobre a ultraestrutura do sarcômero. Mais uma vez, somente estudos
mais específicos poderiam confirmar ou refutar tais essas hipóteses. Embora
o presente estudo tenha demostrado de forma razoavelmente contundente
que o polimorfismo CNV do gene ALP está associado com a condição
atlética, ainda há muito a se investigar a respeito das razões biológicas que
levam a tal associação.
Este estudo tem algumas limitações, as quais precisam ser
destacadas. Primeiramente, este estudo é primordialmente correlacional, o
que limita qualquer tentativa de estabelecimento de relação causa-efeito.
Portanto, todas as evidências aqui apresentadas de associação do
polimorfismo CNV do gene PDLIM3 com a condição atlética precisam ser
estendidas ou refutadas por meio de estudos cujos desenhos experimentais
prospectivos permitam que relações de causa e efeito. Ainda assim, é preciso
reconhecer o mérito deste trabalho, o qual conta com uma amostra
geneticamente heterogênea e que, a despeito disso, foi capaz de observar
associação entre a variante gênica estudada e a condição atlética.
Uma segunda limitação inerente a qualquer estudo de associação
entre uma variável genética e um fenótipo tão complexo quanto o
104
desempenho esportivo é o aspecto multifatorial do desempenho esportivo.
Deve-se ponderar que a genética é apenas um de inúmeros fatores que
determinam se um indivíduo é ou não bem sucedido no esporte
(BOUCHARD, MALINA e PÉRUSSE, 1997; VAEYENS, LENOIR, WILLIAMS
et al., 2008; HENRIKSEN, STAMBULOVA e ROESSLER, 2010) e, dentre os
inúmeros fatores genéticos, este estudo focou-se em apenas um.
Uma última limitação que deve ser discutida refere-se ao ensaio de
quantificação da expressão da proteína PDLIM3 realizada neste estudo.
Deve ser enfatizado que apenas amostras de tecido muscular já disponíveis
no banco de tecidos do Children’s Hospital at Westmead estavam disponíveis
para análise. Entretanto, todos os tecidos desse banco pertenciam a
pacientes com diferentes doenças neuromusculares de origem genética.
Embora nossa equipe tenha tomado o cuidado de parear os genótipos por
idade e gênero, é importante ressaltar que apena 1 sujeito I/I foi identificado
nesse grupo. Logo, os efeitos da presença total da inserção não puderam ser
avaliados nesse ensaio. Ainda, a amostra de nenhum sujeito que
apresentasse algum tipo de desordem muscular foi incluída nesse ensaio.
Todas as amostras pertenciam ao banco de pacientes com doenças
musculares de causa genética, para os quais havia apenas identificação
mínima, conforme as normas do comitê de ética local. Mesmo que a
desordem genética que os sujeitos apresentavam tivesse impacto direto
mínimo, se algum, sobre a expressão da proteína PDLIM3, não se pode
negligenciar o impacto da diminuição da atividade física sobre o padrão geral
de expressão das proteínas musculares. Logo, os resultados aqui
apresentados podem não necessariamente corresponder aos efeitos do
genótipo sobre o padrão de expressão da proteína PDLIM3 em sujeitos
saudáveis, tampouco em atletas. Assim, é indispensável que estudos futuros
confirmem/refutem esses resultados em um grupo de sujeitos saudáveis.
Em conclusão, o presente estudo mostrou que o polimorfismo CNV do
gene PDLIM3 é associado à condição atlética, em especial na população
brasileira. Tal associação não tem relação com o nível competitivo, embora
pareça ter associação mais forte com os esportes de força/potência. Em
particular, esse polimorfismo parece favorecer as modalidades de ciclismo,
atletismo e basquete/vôlei. A presença do alelo I parece não influenciar o
105
padrão de expressão da proteína PDLIM3 e, portanto, estudos futuros devem
avaliar os mecanismos responsáveis pela associação observada neste
estudo.
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