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Técnica de Observação de Células e Tecidos

Desenvolvimento da Microscopia

-Microscópio Óptico (luz)

-Microscópio Eletrônico (elétrons)

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Microscópio óptico – utiliza feixes de luz

Desenvolvimento da Microscopia

Sistemas de lentes (condensador, objetiva e ocular)

Resolução: menor distância para que duas partículas apareçam como objetos separados. O limite de resolução do MO éde 0,2 µm e depende essencialmente da objetiva.

Microscópio óptico

Desenvolvimento da Microscopia

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Microscópio óptico de campo claro

Desenvolvimento da Microscopia

Microscópio óptico de fluorescência

Desenvolvimento da Microscopia

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Microscópio óptico de fluorescência

Desenvolvimento da Microscopia

Tipos de microscópios ópticos

Desenvolvimento da Microscopia

Iluminação direta (sem coloração)

Contraste de fase (refração da luz)

Contraste diferencial de interferência (refração da luz)

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Microscópio óptico confocal

Desenvolvimento da Microscopia

Microscópio eletrônico-utiliza feixes de elétrons

Desenvolvimento da Microscopia

→Alta resolução, abaixo de 0,3 nm.→Material biológico é impregnado com metais pesados como ósmio, chumbo e urânio

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Microscópio eletrônico de transmissão:

Desenvolvimento da Microscopia

Estrutura e funcionamento

→ Alta resolução→ Necessita de cortes muito finos (0,02 a 0,1 µm)→ Material biológico é impregnado com metais pesados como ósmio, chumbo e urânio→ Elétron-denso (escuro) e elétron-lúcido (claro)

Microscópio eletrônico de transmissão

Centro de Microscopia Eletrônica-IB/UNESP

Desenvolvimento da Microscopia

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Microscópio eletrônico de transmissão

Desenvolvimento da Microscopia

Microscópio eletrônico de varredura

Desenvolvimento da Microscopia

→ Alta resolução→ Fragmentos maiores ou tecidos inteiros→ Material biológico é recoberto com metais como ouro ou platina→ Estrutura tridimensional (3D)

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Microscópio eletrônico de varredura

Desenvolvimento da Microscopia

MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA

Microscópio eletrônico de varredura

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Centro de Microscopia Eletrônica

UNESP - Botucatu

MEVMET

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Preparação de material para análise ao microscópio

As células e tecidos precisam estar perfeitamente preservados, apresentando a mesma estrutura e composição química que possuíam quando vivas.

Preparação de material para análise ao microscópio

FixaFixaFixaFixaççççãoãoãoão – Preserva a morfologia e composição do tecido. Fixador mais utilizado → Formaldeído. Para microscopia eletrônica (ME) os tecidos necessitam de tratamentos especiais em soluções de aldeído glutárico e tetróxido de ósmio.

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Preparação de material para análise ao microscópio

LavagemLavagemLavagemLavagem

Preparação de material para análise ao microscópio

DesidrataDesidrataDesidrataDesidrataççççãoãoãoão – Retirada da água presente nos tecidos através de sucessivos banhos em uma série de etanol (70%→80%→90%→100%).

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Preparação de material para análise ao microscópio

DiafanizaDiafanizaDiafanizaDiafanizaççççãoãoãoão ou ou ou ou clareamentoclareamentoclareamentoclareamento – Substituição do etanol por líquido miscível (geralmente xilol) com o meio de impregnação e retirada de lipídios.

Preparação de material para análise ao microscópio

Meio de impregnaMeio de impregnaMeio de impregnaMeio de impregnaççççãoãoãoão – Substituição do líquido (xilol) por parafina ou resina sintética. A resina sintética possibilita cortes mais finos (1 a 2 µm). O ME necessita de cortes muito finos (0,02 a 0,1 µm) e por isso utiliza se resinas mais duras. Neste caso os cortes são feitos com navalhas de vidro ou diamante.

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Preparação de material para análise ao microscópio

Meio de inclusãoMeio de inclusãoMeio de inclusãoMeio de inclusão – Suporte para o tecido impregnado.

Preparação de material para análise ao microscópio

Tecido preparado para análise ao Microscópio Eletrônico

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Preparação de material para análise ao microscópio

MicrMicrMicrMicróóóótomotomotomotomoInstrumento para cortar finas fatias do tecido (menores que 1µm de espessura).

Preparação de material para análise ao microscópio

MicrMicrMicrMicróóóótomo automatizado tomo automatizado tomo automatizado tomo automatizado – Permite a obtenção rápida de cortes sem passar pelas etapas descritas antes.

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Preparação de material para análise ao microscópio

MicrMicrMicrMicróóóótomotomotomotomoRealizando cortes do material

Preparação de material para análise ao microscópio

MicrMicrMicrMicróóóótomotomotomotomoInstrumento para cortar finas fatias do tecido (menores que 1µm de espessura).

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Preparação de material para análise ao microscópio

Estufa 60 Estufa 60 Estufa 60 Estufa 60 ooooCCCCDerreter e eliminar a parafina

Preparação de material para análise ao microscópio

XilolXilolXilolXilolRetirada da parafina

SSSSéééérie alcorie alcorie alcorie alcoóóóólica lica lica lica ---- Rehidratação.

Hidratação completa

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Preparação de material para análise ao microscópio

Coloração

Preparação de material para análise ao microscópio

Hematoxilina/Eosina (HHHHEEEE))))Coloração freqüentemente utilizada

ColoraColoraColoraColoraççççãoãoãoão – A maioria dos corantes utilizados se comportam como ácido ou base.

→Estrutura celular basófila, liga-se a corantes básicos.

→Estrutura celular acidófila, liga-se a corantes ácidos.

Corantes básicos: azul-de-tuluidina, azul-de-metileno, hematoxilina...

Corantes ácidos: eosina, orange G, fucsina ácida...

Além destes corantes freqüentemente utilizados, utiliza se também outros

tipos de coloração, como a impregnação com sais de prata e ouro.

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Preparação de material para análise ao microscópio

Além destas colorações frequentemente utilizadas, outros métodos baseados

em reações químicas (citoquímica), imunológicas (imunocitoquímica), entre

outras, também podem ser empregados.

Preparação de material para análise ao microscópio

Montagem das lâminas

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Preparação de material para análise ao microscópio

Análise do Material

Preparação de material para análise ao microscópio

Resultados