Técnicas analíticas para la monitorización de fármacos biológicos

Dra. MD Bellés Medall

21 Octubre 2017

Fundamento del E.L.I.S.A

Equipos comerciales: diferencias

Inmunogenicidad

Otras técnicas

Interpretación resultados

Coste-efectividad monitorización farmacocinética anti-TNFs

La técnica ELISA de captura, empleada para lamonitorización de fármacos biológicos presentaentre sus ventajas, las siguientes; excepto:

A. Sencillez y automatización

B. Amplificación de la señal

C. Rapidez

D. Cuantificación fármaco biológicamente activo

¿Qué técnica analítica es considerada “goldstandard” para la determinación de fármacosbiológicos?

A. ELISA de captura

B. Radioinmunoensayo

C. Cromatografía

D. Ninguna de las anteriores

Paciente en tratamiento con IFX a dosis de 5 mg/Kg c/8semanas. Cmin=0.7 mcg/mL.¿Recomendarías la cuantificación del anticuerpo anti-IFX,mediante la técnica ELISA puente?(IT=3-7 mcg/mL, límite detección=0.3 mcg/mL)

A. Si, es muy probable que el paciente haya desarrollado inmunogenicidad

B. No, realizaría seguimiento farmacocinético estrecho.

C. Si, se recomienda cuantificar anticuerpo anti-fármaco en todas las muestras.

D. No, el paciente no presenta inmunogenicidad.

Resultado negativo para una determinación deanticuerpos anti-fármaco mediante técnica ELISApuente. ¿Cómo interpretaríamos este resultado?

A. Ausencia de inmunogenicidad

B. Resultado “no concluyente”

C. Presencia de inmunocomplejos fármaco/anticuerpo anti-fármaco

D. La técnica no cuantifica inmunogenicidad

¿Podemos comparar los resultados obtenidos porlos distintos equipos ELISA comercializados parala cuantificación de fármacos anti-TNF?

A. Si, son equipos idénticos.

B. No, son necesarios mas estudios de concordancia.

C. No, son equipos completamente distintos.

D. Si, se han contrastado con estudios de concordancia.

Disponemos de un equipo ELISA para cuantificarInfliximab. ¿Podríamos utilizar el mismo equipopara medir el fármaco biosimilar?

A. Si

B. No

C. Habrá que adquirir un equipo específico para el biosimilar

D. Se deberá confirmar con el fabricante la compatibilidad

E.L.I.S.A.(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay)

Componentes ELISA

• Fase sólida

• Muestra

• Conjugado: Enzima

• Sustrato

• Solución parada

Equipos Fabricante Distribuidor

DAS

(Double Antibody Sandwich)

Conjugado Ac-HRP Ac biotiniladoEstreptavidina-HRP

Sustrato TMB TMB

Solución parada ClH H2SO4

CP + +

CN + -

Calibración 6 ptos(0,024-12 mcg/mL)

5 ptos(0,1-16 mcg/mL)

Nº muestras/placa 40 42

Diluciones 1:10; 1:200 1:101

Infliximab-AAI X X X X X

Adalimumab-AAA X X X X X

Etanercept-AAE X X X X

Rituximab-AAR X X X X

Golimumab-AAG X X X X X

Certolizumab-AAC X X

Tocilizumab-AAT X X

Ustekinumab-AAU X X

Bevacizumab-AAB X X X

Trastuzumab-AAT X X X

Vedolizumab-AAV X X

Cetuximab-AAC X

Denosumab-AAD X

Nivolumab-AAN X X

Pembrolizumab-AAP X

Ipilimumab-AAI

Omalizumab-AAO X X

Aflibecept X

Unión No-covalente

Tª, pH, humedad, luz

Aspectos prácticos:

o Almacenamiento micropocillos

o Alicuotar muestras

o Homogeneizar

o Atemperar reactivos

Automatizado

Sencillo y rápido (2,5-3h)

Nº muestras/sesión = 40-42

Cuantificación del fármaco libre

Poco espacio (80x150cm, 1,9m3)

Amplificación de la señal

especificidad

Pérdida de reactividad (humedad, Tª,

luz)

Curva calibración/sesión

Ausencia patrón estándar

Inmunogenicidad: ELISA puente

ELISA puente• Ac (-): datos “no–concluyentes”

• Baja especificidad:

oNo detecta IgG4

o Falsos positivos: FR, complemento activado

Disociación ácida20 μl suero + 100 ml ácido acético 300 mM (pH=3)

15 min , Tª amb

+ 31 μl Tris base sol (neutralizar)

5 min, agitar

+ 49 μl sol buffer (dil 1:10)

Disociación ácida• Estrategia para detectar precozmente inmunogenicidad

• Técnica cualitativa

• No se detecta IgG4

• % recuperación AAF :

o Desnaturalización de los AAF tras acidificación

o AAF baja afinidad pérdida por lavados

o Parcial formación de inmunocomplejos tras

neutralización.

AAI totales X X

AAA totales X

Otras técnicas

•RIA

•HMSA

•Gen reportero

Especificidad

Sensibilidad

Complejidad

Caro

tiempo incubación

Especificidad

Sensibilidad

Investigación

Fraccionamiento immunocomplejos

Actividad biológica

Universal

Rápido

Cultivo celular

Precio (??)

ELISA captura ++ + - -

ELISA puente - - - +

RIA - - - ++

RGA - - + +

HMSA - +/- + ++

AAF

(76%)

(74%)

(82%)

(88%)

(9%)

(11%)

(27%)

(33%)

85%

94%

82%

88%

79%

84%

• Técnicas: elevada variabilidad con diferencias

sistémicas.

• Resultados no comparables.

• Ensayos > sensibilidad para AAF: HMSA y RIA.

• concordancia en clasificación de los pacientes

según fallo secundario.

• Tras seguimiento a largo plazo: resultados

comparables.

QUIMIOLUMINISCENCIA

Interpretación resultados

• No comparar resultados entre técnicas, ni equipos.

• ELISA puente:

o Datos “no concluyentes”

o Técnica cualitativa

o Unidades medida no estandarizadas (ng/mL;

AU/mL)

• Titulaciones bajas de Ac :

o Falso positivo

o Ac “transitorios”

o Fracaso secundario por inmunogenicidad

BIOSIMILARES: IFX, ETA, RTX…

34 €/determinación 1 sesión trabajo/placa

(42 niveles/sesión)

40 €/determinación 2 sesiones trabajo/placa

(18 niveles/sesión)

60 €/determinación 4 sesiones trabajo/placa

(6 niveles/sesión)

Paracetamol

MTX

48 €/determinación 3 sesiones trabajo/placa

(10 niveles/sesión)

CysA

Teofilina €

La técnica ELISA de captura, empleada para lamonitorización de fármacos biológicos presentaentre sus ventajas, las siguientes; excepto:

A. Sencillez y automatización

B. Amplificación de la señal

C. Rapidez

D. Cuantificación fármaco biológicamente activo

¿Qué técnica analítica es considerada “goldstandard” para la determinación de fármacosbiológicos?

A. ELISA de captura

B. Radioinmunoensayo

C. Cromatografía

D. Ninguna de las anteriores

Paciente en tratamiento con IFX a dosis de 5mg/Kg c/8 semanas. Cmin=0.7 mcg/mL.¿Recomendarías la cuantificación del AAI, conELISA puente?(IT=3-7 mcg/mL, límite detección=0.3 mcg/mL)

A. Si, es muy probable que hay desarrollado inmunogenicidad

B. No, realizaría seguimiento farmacocinético estrecho.

C. Si, se recomienda cuantificar AAF en todas las muestras.

D. No, el paciente no presenta AAF.

Resultado negativo para una determinación deanticuerpos anti-fármaco mediante técnica ELISApuente. ¿Cómo interpretaríamos este resultado?

A. Ausencia de inmunogenicidad

B. Resultado “no concluyente”

C. Presencia de inmunocomplejos fármaco/anticuerpo anti-fármaco

D. La técnica no cuantifica inmunogenicidad

¿Podemos comparar los resultados obtenidos porlos distintos equipos ELISA comercializados parala cuantificación de fármacos anti-TNF?

A. Si, son equipos idénticos.

B. No, son necesarios mas estudios de concordancia.

C. No, son equipos completamente distintos.

D. Si, se han contrastado con estudios de concordancia

Disponemos de un equipo ELISA para cuantificarInfliximab. ¿Podríamos utilizar el mismo equipopara medir el fármaco biosimilar?

A. Si

B. No

C. Habrá que adquirir un equipo específico para el biosimilar

D. Se deberá confirmar con el fabricante la compatibilidad

belles_dol@gva.es