Técnicas de Imunologia Prof.Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia Citometria de Fluxo Slides adaptados de uma colecção amavelmente cedida por Alexandre

Prof.Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia

Técnicas de Imunologia

Citometria de FluxoCitometria de Fluxo

Slides adaptados de uma colecção amavelmente cedida por Alexandre Salvador (BioAtlântico)

Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia

O que é um Citometro de Fluxo?O que é um Citometro de Fluxo?


O que é um Citómetro de Fluxo?O que é um Citómetro de Fluxo?

É um aparelho que permite analisar vários É um aparelho que permite analisar vários

parâmetros (celulares?)parâmetros (celulares?)

Capta e digitaliza a dispersão de fotões, provocada Capta e digitaliza a dispersão de fotões, provocada

pela passagem de partículas em suspensão pela passagem de partículas em suspensão

alinhadas uma a uma, num fluxo laminar, frente a alinhadas uma a uma, num fluxo laminar, frente a

um feixe de luz.um feixe de luz.


Componentes Básicos de um Citómetro de Fluxo

• Suspensão de partículasSuspensão de partículas• Fluxo laminarFluxo laminarFluídosFluídosFluídosFluídos

ÓpticaÓpticaÓpticaÓptica

ElectrónicaElectrónicaElectrónicaElectrónica• Conversão do sinal em valores analógico-digitaisConversão do sinal em valores analógico-digitais• Aquisição, Processamento, Análise e Aquisição, Processamento, Análise e

Armazenamento por computadorArmazenamento por computador

• Fonte de iluminação Fonte de iluminação • Captação da dispersão da luz e da fluorescênciaCaptação da dispersão da luz e da fluorescência• Filtração da dispersão e da fluorescênciaFiltração da dispersão e da fluorescência



Exemplos do que podemos Exemplos do que podemos analisar por Citometria de Fluxo:analisar por Citometria de Fluxo:

MetabolismosMetabolismos

ReceptoresReceptores ADNADN CitoquinasCitoquinas

EnzimasEnzimas

Antigénios celularesAntigénios celularesTamanhoTamanho

ComplexidadeComplexidade


Propriedades de FSC e SSCPropriedades de FSC e SSC

LaserLaser


Óptica - Canal de Dispersão Óptica - Canal de Dispersão Frontal ( tamanho- FS )Frontal ( tamanho- FS )

Sensor de FSSensor de FS

LaserLaser


Óptica - Canal de Dispersão Óptica - Canal de Dispersão Lateral ( complexidade- SS )Lateral ( complexidade- SS )

LaserLaser


Sensor SS 90Sensor SS 9000


Óptica - Dispersão da Óptica - Dispersão da FluorescênciaFluorescência

LaserLaser


Detectores de FluorescênciaDetectores de Fluorescência(PMT1, PMT4 etc.)(PMT1, PMT4 etc.)


Óptica - Propriedade dos FiltrosÓptica - Propriedade dos Filtros

Filtro ou Espelho Dicróico Colocado a Filtro ou Espelho Dicróico Colocado a 4545oo

Luz Luz ReflectidaReflectida

Luz TransmitidaLuz TransmitidaFonte de LuzFonte de Luz


BDBD


Low Sample Pressure12µl/min

LaminarFlow

Sheath SheathSample


O que pode então dizer um O que pode então dizer um Citometro de fluxo de uma célula?Citometro de fluxo de uma célula?

Tamanho (FSC)Tamanho (FSC)

Complexidade (SSC)Complexidade (SSC)

Fluorescência relativa.Fluorescência relativa.

(FL1, FL2, FL3, FL4,...)(FL1, FL2, FL3, FL4,...)



O que é a Fluorescência?

LaserLaser


Intensidade de Fluorescência

Emitted Fluorescence Intensity Binding Sites

FITC FITC

FITC

FITC

FITC

FITC

FITC

FITC

FITC

FITC

Intensidade de Fluorescência

Num

ero

de e

vent

os


Currently Available Fluorochromes (Visible Light Emission)

Fluorochrome Laser (nm) Emission (nm)

FITC 488 525 Cy3 488 565 R-PE (PE) 488 575 PE-Texas Red (PE-TR) 488 615 Pe-Cy5 (TC1) 488 667 PerCP (BD2) 488 675 PerCP/Cy5.5 (BD) 488 695 PE-Cy7 488 767

Texas Red 595 615

APC 633, 635 660 Cy5 633, 635 667 APC-Cy7 633, 635 767


Espectros de Emissão

PerCP

Wavelength (nm)

400 450 500 550 600 650 700

1000

800

600

400

200

0

RPE APCFITC PI


Pulso electrónico

LaserLaser

LaserLaser

LaserLaser

TimeTime

Volt

age

Volt

age

TimeTime

Volt

age

Volt

age

TimeTime

Volt

age

Volt

age


Tipos de diagramas

1 parâmetro1 parâmetro HistogramaHistograma

2 parâmetros2 parâmetros Dot PlotDot Plot Contour plotContour plot Density plotDensity plot


Dot plot Histograma

As Regiões ou Portas electrónicas


TRANSFERENCIA DE ENERGIA POR RESSONÂNCIA

Ener

gía

Ener

gía

Fluo

resc

encia

Fluo

resc

encia

Molécula ReceptoraTexas Red/Cy5/Cy7Molécula ReceptoraTexas Red/Cy5/Cy7

Molécula DonadoraPE

Molécula DonadoraPE

GSGS

ESES

Transferencia no radiativa de energíaTransferencia no radiativa de energía


1 LASER (488nm) 3 COLORES






Cytomics™ FC500


Cytomics™ FC500OPTICA:

2 lasers colineares:2 lasers colineares: 488 nm488 nm 633 nm633 nm

Detectores:Detectores: FS con dos ángulos de FS con dos ángulos de

captura captura (1-8°, 1-19°)(1-8°, 1-19°) Side ScatterSide Scatter 5 PMT sensibles al rojo 5 PMT sensibles al rojo

(de 185 a 900 nm)(de 185 a 900 nm)


Cytomics™ FC500OPTICA:

488DLP

500LP

600DLP

550D

LP

525BP

620DSP620S

P

710DLP

755LP

675BP

FL1

FL

2

FL

5FL4

FL3

Detailed Filter Specs

Side Scatter


COMPENSATION


500 600 700 800

Wavelength nm

Intensity

FITCFITCFITCFITC PEPE ECDECD PC5PC5


500 600 700 800

Intensity


FL1525


500 600 700 800

Intensity


FL1525

FL2575


500 600 700 800

Intensity


FL1525

FL2575

FL3620


500 600 700 800

Intensity


FL1525

FL2575

FL3620

FL4675


12

<0.1

1

Nominal Measured

SignalFL1

FL2

FL3

FL4

FITCFITCFITCFITC

500 600 700

100



FITC+FITC+FITC+FITC+

PE+PE+

ECD+ECD+

PC5+PC5+

FL1

FL2

FL3

FL4


FL1

FL2

FL3

FL4


????????????????

????????

????????

????????


FL1

FL2

FL3

FL4


85.5%

10.5%

3.1%

0.9%

0.7%

67.8%

25.0%

6.5%

0.3%

8.4%

66.7%

24.6%

0.2%

4.2%

2.3%

93.3%


FL1

FL2

FL3

FL4


100% 1.1% 0.4% 0.2%

12.3% 100% 12.7% 4.5%

3.6% 36.8% 100% 2.4%

1.0% 9.5% 36.9% 100%


Uncompensated vs Compensated

FL1

FL

2


FL1

FL

2COMPENSATION IS INTENSITY

DEPENDENT

uncompensated partially compensated

fully compensated


COMPENSATE INSTRUMENT USING STAINED CELLS

1. Adjust PMT voltages using unstained cells

2. Adjust compensation for each fluorochrome

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