Prof.Doutor José Cabeda Técnicas de Biologia Molecular em microbiologia Clínica

Prof.Doutor José Cabeda

Técnicas de Biologia Molecular em microbiologia Clínica

Quantificação e caracterização de ácidos nucleicos

EspectrofotometriaEspectrofotometria ElectroforeseElectroforese Revelação dos ácidos nucleicosRevelação dos ácidos nucleicos FotografiaFotografia Sistemas computadorizados de aquisição de imagemSistemas computadorizados de aquisição de imagem Quantificação de bandas em geisQuantificação de bandas em geis Reacções de restriçãoReacções de restrição

Sistemas R/MSistemas R/MMontar uma reacção de restriçãoMontar uma reacção de restrição

Espectrofotometria

Lei de Bert-LambertLei de Bert-LambertC=C=AA

maxmax

L=1 cmL=1 cm AA(suporte)(suporte)

A(solvente)A(solvente)

Espectrofotometria

Lei de Bert-LambertLei de Bert-Lambert C=C=AA

maxmax


A(solvente)A(solvente)

Espectofotometria

Espectrofotometria

Lei de Bert-LambertLei de Bert-Lambert C=C=AA

maxmax


A(solvente)A(solvente) AA(contaminantes)(contaminantes)

maxmax=260 nm=260 nm max(proteínas) max(proteínas) =280 nm=280 nm ref ref =320 nm=320 nm Concentração = f(ODConcentração = f(OD260260). Se L=1cm:). Se L=1cm:

dsDNA 1OD=50µg/mldsDNA 1OD=50µg/ml ssDNA 1OD=40µg/mlssDNA 1OD=40µg/ml ssRNA 1OD=40µg/mlssRNA 1OD=40µg/ml Oligos 1OD=20µg/ml (varia muito com a sequência)Oligos 1OD=20µg/ml (varia muito com a sequência)

(se puro deve situar-se entre 1.75 e 2)(se puro deve situar-se entre 1.75 e 2)

Quantificação de DNA

)280(

)260(

fPureza




Fazer um gel de agarose

Electroforese

ELECTROFORESE

V=IR V=IR P=IP=I22RR A resistência é inversamente proporcional á secção e á A resistência é inversamente proporcional á secção e á

força iónica da soluçãoforça iónica da solução

TIPOS DE GEIS Agarose (TAE e TBE)Agarose (TAE e TBE)

SeakamSeakam NusieveNusieve Nusieve 3:1Nusieve 3:1 outras (LMP, HGT, etc)outras (LMP, HGT, etc) formamida como desnaturanteformamida como desnaturante

Acrilamida Acrilamida Acrilamida/bisacrilamida Acrilamida/bisacrilamida

/TEMED /peróxido de amónio/TEMED /peróxido de amónio SDS como desnaturanteSDS como desnaturante

HorizontaisHorizontais VerticaisVerticais

Limitações da Electroforese

Eficaz de 100bp até no máximo 50kbEficaz de 100bp até no máximo 50kb Deixa de fora muitos fragmentosDeixa de fora muitos fragmentos Deixa de fora os cromossomasDeixa de fora os cromossomas

Não permite separar simultâneamente os Não permite separar simultâneamente os fragmentos pequenos e grandesfragmentos pequenos e grandes Ineficaz para caracterizar genotipos Ineficaz para caracterizar genotipos

complexos de organismos complexos de organismos

Electroforese Convencional

Matriz semisólidaMatriz semisólida Campo eléctrico Campo eléctrico

uniforme uniforme EstáticoEstático

Moleculas migram Moleculas migram Segundo uma única dimensãoSegundo uma única dimensão Uniformemente ao longo da electroforeseUniformemente ao longo da electroforese

Solução: PFGE

Campo eléctrico variávelCampo eléctrico variável Direcção variavelDirecção variavel Duração variávelDuração variável Intensidade variávelIntensidade variável

As moléculas respondem ao campo elétrico:As moléculas respondem ao campo elétrico: Reorientando-se (a maior parte do tempo)Reorientando-se (a maior parte do tempo)

Reorientação dependente do ângulo dos Reorientação dependente do ângulo dos campos elétricos anternantescampos elétricos anternantes

Migrando no gel (no tempo que sobra)Migrando no gel (no tempo que sobra)

Electroforese em Campo Pulsado (PFGE)

Field-inversion G.E.Field-inversion G.E. Transverse-Alternating Field G.E.Transverse-Alternating Field G.E. Rotating Gel ElectrophoresisRotating Gel Electrophoresis Contour-Clamped Homogeneous Contour-Clamped Homogeneous

Electric FieldElectric Field Orthogonal-FieldAlternation G.E.Orthogonal-FieldAlternation G.E. Programable Autonomously-Programable Autonomously-

controled Electrodescontroled Electrodes Pulsed Homogeneous Orthogonal Pulsed Homogeneous Orthogonal

Field Gel ElectrophoresisField Gel Electrophoresis

Field inversion gel electrophoresis (FIGE)

Ângulo de 180ºÂngulo de 180º Pulsos Forward/reversePulsos Forward/reverse

Tempo F/R=3:1Tempo F/R=3:1 Se pulsos aumentam com a Se pulsos aumentam com a

corrida, melhora a resolução corrida, melhora a resolução (swich time ramping)(swich time ramping)

Resolução aceitável até 800 kbResolução aceitável até 800 kb

Traverse-alternating field gel electrophoresis (TAFE)

Gel verticalGel vertical Campos eléctricos fora do plano do Campos eléctricos fora do plano do

gelgel DNA zigzagueia no gelDNA zigzagueia no gel Ângulo dos campos difere ao longo Ângulo dos campos difere ao longo

do geldo gel Aumenta a resolução pois Aumenta a resolução pois

DNA maiores menor ângulo DNA maiores menor ângulo de reorientaçãode reorientação

DNA menores maior ângulo DNA menores maior ângulo de reorientação de reorientação

Separações até 1,600 kbSeparações até 1,600 kb

Rotating Gel Electrophoresis (RGE)

Gel roda com campo desligadoGel roda com campo desligado Campo eléctrico uniformeCampo eléctrico uniforme Fácil de fazer protocolos comFácil de fazer protocolos com

Ramping voltageRamping voltage Ramping time pulseRamping time pulse Ângulo variávelÂngulo variável

Tempo para a mudança do ângulo Tempo para a mudança do ângulo é o mais longoé o mais longo

Separações de 50 kb a 6000 kbSeparações de 50 kb a 6000 kb

Contour Clamped Homogeneous Electric Fields (CHEF) Solução mais sofisticadaSolução mais sofisticada Campo elétrico uniformeCampo elétrico uniforme

resistores aplicados a resistores aplicados a todos os 24 eléctrodostodos os 24 eléctrodos

Todas as “lanes” são Todas as “lanes” são perfeitamente paralelasperfeitamente paralelas

Ângulo de reorientação de Ângulo de reorientação de 120º120º

Separações até 7,000 kbSeparações até 7,000 kb

Aspectos Criticos em PFGE

Pulse Time e rapidez de mudançaPulse Time e rapidez de mudança Suficientemente longo para Suficientemente longo para

haver corridahaver corrida Suficientemente curto para Suficientemente curto para

haver principalmente haver principalmente reorganizaçãoreorganização

Forma do campo eléctricoForma do campo eléctrico Número e configuração dos Número e configuração dos

eléctrodoseléctrodos Ângulo dos campos Ângulo dos campos

Sempre >100ºSempre >100º Óptimo entre 120º e 150ºÓptimo entre 120º e 150º Nunca Nunca ≤≤90º90º Ângulos variáveis tornam Ângulos variáveis tornam

as bandas mais finasas bandas mais finas

VoltagemVoltagem 6-10V/cm (DNA< 1 Mb)6-10V/cm (DNA< 1 Mb) <2 V cm (3-6 Mb)<2 V cm (3-6 Mb) 1.5 V/cm (>12 Mb)1.5 V/cm (>12 Mb) Menor V => aumento tempoMenor V => aumento tempo

TemperaturaTemperatura Arrefecimento e recirculação Arrefecimento e recirculação

do tampão é mandatóriodo tampão é mandatório Ar condicionado eficiente e Ar condicionado eficiente e

24h/dia – 7dias/semana24h/dia – 7dias/semana 14ºC – 22ºC14ºC – 22ºC

Escolha da enzima de restriçãoEscolha da enzima de restrição Deve originar:Deve originar:

Grandes fragmentosGrandes fragmentos Poucos fragmentosPoucos fragmentos

Utilização do PFGE

Genotipagem bacterianaGenotipagem bacteriana Discriminação de surtos de infecção nosocomialDiscriminação de surtos de infecção nosocomial Estudos epidemiológicos da mobilidade de estirpes Estudos epidemiológicos da mobilidade de estirpes

bacterianas patogénicasbacterianas patogénicas Mapas genéticos de mais de 180 bactériasMapas genéticos de mais de 180 bactérias Mapa do genoma humanoMapa do genoma humano Isolamento e caraterização de cromossomasIsolamento e caraterização de cromossomas

Construção de bibliotecasConstrução de bibliotecas Construção de YACConstrução de YAC

Produção de Ratinhos transgénicosProdução de Ratinhos transgénicos

Exemplo de PFGE

Electroforese Capilar

Electroforese em capilares de pequeno Electroforese em capilares de pequeno diâmetro (cerca de 50 µm de diâmetro diâmetro (cerca de 50 µm de diâmetro interno)interno)

Utiliza campos eléctricos muito elevados Utiliza campos eléctricos muito elevados (20-30 kV), já que os capilares dissipam o (20-30 kV), já que os capilares dissipam o calor com muita eficiênciacalor com muita eficiência

Separações muito boas, num período de Separações muito boas, num período de tempo inferior. tempo inferior.

Electroforese Capilar (II) Elevada voltagemElevada voltagem

Grande velocidadeGrande velocidade Produção de calorProdução de calor

Janela de detecçãoJanela de detecção Capilar finoCapilar fino

Eficiente gestão do calorEficiente gestão do calor Matriz de separaçãoMatriz de separação Tampão condutorTampão condutor

Electroforese Capilar (III)

Moléculas neutras viajam á velocidade do FEOMoléculas neutras viajam á velocidade do FEO Moléculas positivas são mais rápidas que o FEOMoléculas positivas são mais rápidas que o FEO Moléculas negativas são mais lentas que o FEOMoléculas negativas são mais lentas que o FEO todas as moléculas migram para o pólo negativo todas as moléculas migram para o pólo negativo

velocidade depende da carga e do peso molecularvelocidade depende da carga e do peso molecular

Fluxo Electroendosmótico (FEO)Fluxo Electroendosmótico (FEO) Superfície do capilar C/ grupos negativos Superfície do capilar C/ grupos negativos Junto à superficie grupos positivos:Junto à superficie grupos positivos:

migram para o polo negativomigram para o polo negativo arrastam consigo o tampão/solventearrastam consigo o tampão/solvente

Electroforese Capilar (IV)

Detecção por fluorescênciaDetecção por fluorescência Moléculas marcadasMoléculas marcadas Fluorocromos c/ afinidadeFluorocromos c/ afinidade Sinal quantitativoSinal quantitativo Grande sensibilidadeGrande sensibilidade

Sinal em função do tempoSinal em função do tempo Imagem de gel simuladaImagem de gel simulada Grande resoluçãoGrande resolução

Electroforese Capilar (V)

DNA Demo

Videos:1-Load Matrix2-Load Samples/markers3-Run




REVELAÇÃO DOS ÁCIDOS NUCLEICOS

Brometo de etidio e análogosBrometo de etidio e análogos RadioactividadeRadioactividade

3232P e P e 3333PP 3535SS 125125II 1414CC 33HH Tempos de exposiçãoTempos de exposição Cassetes com e sem ecran repetidorCassetes com e sem ecran repetidor Necessidade de secagem dos geisNecessidade de secagem dos geis

Nitrato de prataNitrato de prata

Marcação de sondas

Radio-isótoposRadio-isótopos 3232PP 3333PP 3535SS 33HH 1414CC 125125II

DigoxigeninaDigoxigenina BiotinaBiotina

detecção directa da cadeia dupladetecção directa da cadeia dupla

Marcação de sondas

Enzimas para a marcação de sondas PolimerasesPolimerases

Actividade exonucleoliticaActividade exonucleolitica Temp. optimaTemp. optima estabilidade térmicaestabilidade térmica

TdTTdT

Tipos de sondas

OligonucleótidosOligonucleótidos inserts de plasmideosinserts de plasmideos prod. de PCRprod. de PCR




Fotografia

FOTOGRAFIA

Abertura do diafragmaAbertura do diafragma Tempo de exposiçãoTempo de exposição Focagem e profundidade de focoFocagem e profundidade de foco Filtros necessáriosFiltros necessários Tipos de fotos PolaroidTipos de fotos Polaroid Sistemas alternativosSistemas alternativos




Aquisição computorizada de imagens de geis




Integração de histogramas




Reacção de restrição

SISTEMAS R-M

Protecção contra DNA estranhoProtecção contra DNA estranho TIPO I: pouco frequentes (1%)TIPO I: pouco frequentes (1%) TIPO II: (93% das enzimas)TIPO II: (93% das enzimas)

reconhecem sequencias simétricas cortando reconhecem sequencias simétricas cortando entre as sequenciasentre as sequencias

As endonucleases requerem MgAs endonucleases requerem Mg2+ 2+ e as e as metiltransferases requerem s-adenosylmetioninametiltransferases requerem s-adenosylmetionina

endonucleases compostas por um homodimeroendonucleases compostas por um homodimero metiltransferases compostas por monomerometiltransferases compostas por monomero

SISTEMAS R-M

TIPO IIs:TIPO IIs: como as Iis, mas com sequencias de como as Iis, mas com sequencias de

reconhecimento assimétricas e interrompidasreconhecimento assimétricas e interrompidas local de corte a até 20 nucleótidos da sequência local de corte a até 20 nucleótidos da sequência

reconhecidareconhecida Metilação efectuada po 2 metilases (uma para Metilação efectuada po 2 metilases (uma para

cada cadeia, podendo ser metiladas bases cada cadeia, podendo ser metiladas bases diferentes em cada cadeia)diferentes em cada cadeia)

TIPO III: pouco frequentes (<1%)TIPO III: pouco frequentes (<1%) TIPO IV: as restantesTIPO IV: as restantes

MONTAR UMA REACÇÃO DE RESTRIÇÃO

Instabilidade térmicaInstabilidade térmica Concentração de glicerolConcentração de glicerol Tampão de reacçãoTampão de reacção Actividade enzimática:Actividade enzimática:

1UI digere 1µg de DNA em 50µl em uma hora1UI digere 1µg de DNA em 50µl em uma hora conformação e pureza do DNAconformação e pureza do DNA utilizar 2-3 x mais enzimautilizar 2-3 x mais enzima volume total > 50µlvolume total > 50µl Homogeneizar por pipetagemHomogeneizar por pipetagem Verificar a temperatur de reacçãoVerificar a temperatur de reacção

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