Técnicas de Imunologia Prof.Doutor José Cabeda Estudo do complemento

Prof.Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia

Estudo do complemento

Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia

O sistema do complemento


Testes funcionais do complemento (I)

CH50CH50 Baseada na lise pelo complemento de eritrócitos de carneiro Baseada na lise pelo complemento de eritrócitos de carneiro

sensibilizados com anticorpo de coelho anti-eritrócitos de carneirosensibilizados com anticorpo de coelho anti-eritrócitos de carneiro Diluições seriadas de soro teste são misturados com igual volume Diluições seriadas de soro teste são misturados com igual volume

dos eritrócitos sensibilizados e incubados a 37ºCdos eritrócitos sensibilizados e incubados a 37ºC A reacção é parada com PBS frioA reacção é parada com PBS frio A lise é estimada pela [hemoglobina] por espectrofotometriaA lise é estimada pela [hemoglobina] por espectrofotometria Comparação com 0% de lise (sem soro) e 100% lise (por acção de Comparação com 0% de lise (sem soro) e 100% lise (por acção de

água pura).água pura). Actividade do complemento dada pela diluição necessária para Actividade do complemento dada pela diluição necessária para

obter 50% de lise. Resultado expresso pelo inverso desta diluição obter 50% de lise. Resultado expresso pelo inverso desta diluição em unidades de CH50/mL soro.em unidades de CH50/mL soro.

Resultado baixo pode significar deficiência ou consumoResultado baixo pode significar deficiência ou consumo Heterozigotos têm habitualmente valores normais-baixos de CH50Heterozigotos têm habitualmente valores normais-baixos de CH50


Testes funcionais do complemento (II)

AH50AH50 Semelhante ao CH50, por se basear na Semelhante ao CH50, por se basear na

quantificação da lise de eritrócitosquantificação da lise de eritrócitos Baseia-se no facto de a via alterna ser activada Baseia-se no facto de a via alterna ser activada

por e provocar a lise de eritrócitos de coelhopor e provocar a lise de eritrócitos de coelho Activação da via clássica inibida por quelatação Activação da via clássica inibida por quelatação

do Cado Ca2+2+ com EGTA com EGTA A maior parte das deficiências de C3 por A maior parte das deficiências de C3 por

consumo são devidas à activação da via alterna, consumo são devidas à activação da via alterna, devido ao ciclo de amplificação do C3devido ao ciclo de amplificação do C3


Testes funcionais do complemento (III)

OutrosOutros ELISAELISA

Detecção do componente terminal da Detecção do componente terminal da cascata de activação clássicacascata de activação clássica

• C5b-6-7-8-9C5b-6-7-8-9 Medida de lise de liposomas contendo Medida de lise de liposomas contendo

enzimasenzimasUtiliza processos automáticos de Utiliza processos automáticos de

quimica clínicaquimica clínica


Testes funcionais do complemento (IV)

Testes funcionais para componentes do Testes funcionais para componentes do complementocomplemento Fazer CH50 ou AH50 comFazer CH50 ou AH50 com

Complementação por soros deficientes Complementação por soros deficientes num componentenum componente

Complementação com componentes Complementação com componentes purospuros


Testes quantitativos do complemento

Quantificação de proteínas do complementoQuantificação de proteínas do complemento Identificação das deficiênciasIdentificação das deficiências

Quantificação de produtos de hidrólise do Quantificação de produtos de hidrólise do complementocomplemento Diferenciação entre deficiência e consumoDiferenciação entre deficiência e consumo

C4a/C4 ou C4d/C4=> via clássicaC4a/C4 ou C4d/C4=> via clássicaBb => via alternaBb => via alternaC3a e C5a => via final (mas têm curtas semi-C3a e C5a => via final (mas têm curtas semi-

vidas, pelo que a Protein S é uma melhor vidas, pelo que a Protein S é uma melhor alternativa)alternativa)

NefelometriaNefelometria



Colheitas Má colheita => deficiência de complementoMá colheita => deficiência de complemento Evitar >2 ciclos de congelação/descongelaçãoEvitar >2 ciclos de congelação/descongelação Soro com crioglobulinas tem que ser testado Soro com crioglobulinas tem que ser testado

de imediatode imediato Utilizar tubo sem anticoagulante, deixar Utilizar tubo sem anticoagulante, deixar

coagular (30 min a 37ºC ou 60 a RT), coagular (30 min a 37ºC ou 60 a RT), centrifugar e guardar a –70ºCcentrifugar e guardar a –70ºC

Tempo excessivo de espera origina Tempo excessivo de espera origina deficiência (as proteases celulares degradam deficiência (as proteases celulares degradam as proteínas do complemento)as proteínas do complemento)

Crioglobulinas, complexos imunes, bactérias Crioglobulinas, complexos imunes, bactérias e particulas activam o complemento e particulas activam o complemento in vitroin vitro provocando falsa deficiênciaprovocando falsa deficiência

Hemólise interfere na leituraHemólise interfere na leitura

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Análise Genética do C4


O Gene do C4 localiza-se no MHC-III


O gene do C4

dois genes: dois genes: C4A (ácido) C4A (ácido) C4B (básico)C4B (básico)

6p21.36p21.3 41 exões 41 exões intrão 9 tem 7 Kbintrão 9 tem 7 Kb

Se intrão 7 presente Se intrão 7 presente o gene tem 21 Kb o gene tem 21 Kb

Se intrão 7 ausente Se intrão 7 ausente o gene tem 16 Kb.o gene tem 16 Kb.


Os Módulos RCCX

Módulo RCCXMódulo RCCX RP1RP1 C4C4 CYP21CYP21 Tenascin XTenascin X

Normalmente 2 módulos em tandemNormalmente 2 módulos em tandem RP1-C4A-CYP21A-TNXA --- RP2-C4B-CYP21B-TNXBRP1-C4A-CYP21A-TNXA --- RP2-C4B-CYP21B-TNXB


Os alelos C4A e C4B C4BC4B

o aminoácido o aminoácido nucleofílico (His) ataca o nucleofílico (His) ataca o grupo tiol de um resíduo grupo tiol de um resíduo de cisteína, formando um de cisteína, formando um intermediário acídicointermediário acídico

C4A C4A a asparagina, não sendo a asparagina, não sendo

nucleofílica não origina a nucleofílica não origina a formação do formação do intermediário pelo que a intermediário pelo que a reacção de ligação ás reacção de ligação ás outras moléculas é mais outras moléculas é mais lentalenta

AC CCC TGT CCA GTG TTA GAC AGG

AC CTC TCT CCA GTG ATA CAT AGG

C4A

C4B

L D

H

C

I S

P

L 1101 1102 1105 1106


TaqI - RFLP (quantificação dos elementos RCCX)


Taq I e pshA I RFLP


Imunofixação de C4A e C4B



Determinação de fenótipo C4


PFGE para genotipagem C4

M S => 75Kb; L => 85KbM S => 75Kb; L => 85Kb B LS => 105Kb; LL => 115 KbB LS => 105Kb; LL => 115 Kb TT

LSS => 135 KbLSS => 135 Kb LLS => 140 KbLLS => 140 Kb LLL => 150 KbLLL => 150 Kb


Número de módulos RCCX

RP1-C4A-CYP21A-TNXA --- RP2-C4B-CYP21B-TNXBRP1-C4A-CYP21A-TNXA --- RP2-C4B-CYP21B-TNXB

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