Técnicas moleculares em biologia aplicadas ao diagnóstico

8/14/2019 Tcnicas moleculares em biologia aplicadas ao diagnstico

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Tcnicas moleculares em biologia aplicadas aodiagnstico

Esta disciplina tem 60 h (30T e 30P) e oferecida como eletiva pelo Curso

de Cincias Biolgicas do Centro de Cincias Biolgicas da UFPE. Para o

roteiro deste semestre (1o. sem/2006), consulteNotcias para TMB.

A disciplina no 1o. semestre em que foi oferecida (2o. sem. 2005,ministrada em 2006) seguiu o roteiro abaixo. Para este anoprocuraremos seguir o roteiro especificado em Programa.

Roteiro 2o. sem. 2005, ministrada em 2006Parte A: 6 aulas baseadas no programa de Gentica Molecular paraCincias BiolgicasParte BAula 1: PCRAula 2: Desenho de primersAula 3: Outras tcnicas molecularesAula 4: Ferramentas de data-mining on-line para busca de alvos dePCR (aula dividida em 3 partes, acessadas ao final de cada parteanterior)

Programao 2005 (2o. sem) de seminrios

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Aula 1: PCR

Esta aula foi baseada no captulo 2 de nosso livro-texto.

O captulo comenta vrias tcnicas, entre elas o PCR. Fala tambm de formabreve sobre a extrao de DNA e de RNA. Nesta aula complementamos emsala alguns pontos que julgamos importantes e que estavam poucoexplorados no livro ou mesmo no foram comentados.

1. Extrao de DNA

Durante toda a primeira parte do sculo XX as protenas tiveram muito maisateno da cincia do que os cidos nuclicos. Como censequncia, os
http://www.ufpe.br/biolmol/noticias-tmb.htmhttp://www.ufpe.br/biolmol/Tec-mol-biol/programa2006.htmhttp://www.ufpe.br/biolmol/Tec-mol-biol/aula1-PCR.htm#Aula%201%23Aula%201http://www.ufpe.br/biolmol/Tec-mol-biol/aula1-PCR.htm#Aula%202%23Aula%202http://www.ufpe.br/biolmol/Tec-mol-biol/aula1-PCR.htm#Aula%203%23Aula%203http://www.ufpe.br/biolmol/Tec-mol-biol/Aula4.htmhttp://www.ufpe.br/biolmol/Tec-mol-biol/seminarios-tmb.htmhttp://www.ufpe.br/biolmol/bibliografia.htmhttp://www.ufpe.br/biolmol/Tec-mol-biol/programa2006.htmhttp://www.ufpe.br/biolmol/Tec-mol-biol/aula1-PCR.htm#Aula%201%23Aula%201http://www.ufpe.br/biolmol/Tec-mol-biol/aula1-PCR.htm#Aula%202%23Aula%202http://www.ufpe.br/biolmol/Tec-mol-biol/aula1-PCR.htm#Aula%203%23Aula%203http://www.ufpe.br/biolmol/Tec-mol-biol/Aula4.htmhttp://www.ufpe.br/biolmol/Tec-mol-biol/seminarios-tmb.htmhttp://www.ufpe.br/biolmol/bibliografia.htmhttp://www.ufpe.br/biolmol/noticias-tmb.htm


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mtodos de extrao, purificao e anlise de protenas avanaram muitomais do que os equivalentes para DNA. A partir da dcada de 60 estasituao foi lentamente se modificando at que, ao final do sculo, ficoumuito mais fcil extrair, purificar e analisar DNA do que protena. Parecia

um caminho sem volta, mas a protemica aos poucos vai igualando esteplacar outra vez, Esta, entretanto, outra histria, que vamos contar emoutras aulas.

A extrao clssica de DNA envolve os passos descritos no livro: lise,desproteinizao e concentrao do DNA. Devemos manter em mente que oDNA extremamente solvel em gua, muito mais do que a maioria dasprotenas e mesmo de muitos acares. Mas mesmo antes que se possaproceder primeira destas etapas, preciso considerar o material que nos

vai doar as clulas ou, ao menos, o DNA (j fora delas),

1.1 Tipos de material fonte e manipulaes prvias extrao

H uma ampla gama de material do qual poderemos ter interesse em extrairo DNA, como mostrado na tabela abaixo. Uns so duros, outros moles oulquidos, uns abundantes, outros escassos, uns fceis de extrair o DNA eoutros positivamente dificlimos.

Tabela I. Alguns exemplos de fontes de DNA. Podem ser duras ou friveis emesmo lquidas.

material duromaterial mole ou

fluido

osso ascite

tumor slido aspirado de medula

coral tecidos moles em geral

esponjas marinhas sangue

coprlitos gua de reservatriosnaturais ou artificiais

O material duro geralmente fragmentado antes da extrao pormacerao, o que pode ser feito de muitas formas distintas: com um pistiloe uma cuba, com um ralador, com alicate, etc. Em geral o material a sermacerado e os instrumentos so todos congelados ou pelo menos mantidosem gelo durante o trabalho, embora o DNA seja muito resistente stemperaturas usuais, O problema que a macerao gera um calor local

surpreendente, que no se percebe facilmente.


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Tecidos moles e tumores devem ser congelados em nitrognio lquido ou geloseco e macerados como o material duro. Sangue, ascite, gua e qualqueroutro material que contenha o DNA em suspenso celular devem ser

centrifugados para a coleta das clulas e fragmentos de tecidos.

O precipitado (ou pellet) deve ser ressuspenso num tampoadequado e passado por um homogeneizador Potter, que consistede um tubo onde passa muito justo um mbolo de vidrosinterizado ligado a uma haste. O material lquido obrigado,

pelo movimento do mbolo, a subir e descer pelo tudo, entre a parede dotubo e a do mbolo. Nesta passagem as clulas so rompidas. Dependendo doajuste entre o mbolo e o tubo, at mesmo as organelas sero rompidas. Afigurinha ao lado mostra trs tubos Potter e seus mbolos. Em geral omaterial que vai ser homogeneizado num Potter mantido gelado e o prprio

Potter fica imerso num banho de gelo. Este procedimento especialmenteimportante na extrao do RNA. A figura abaixo mostra um Potter numbanho de gelo.

Figura 1. Homogeneizador Potter num banho de gelo. A suspenso de clulas obrigada asubir e descer pelo mbolo quando este gentilmente movimentado ao longo do tubo.

Simplificaes so possveis na etapa de preparao prvia do material,como passar a suspenso de clulas repetidas vezes por uma agulha fina,empurrando a suspenso com uma seringa. Ainda mais simples, pode-seferver o material e usar o sobrenadante como fonte de DNA.

1.2 Lise qumica

Esta etapa est bem detalhada no texto do livro. Lembramos apenas algunspontos suplementares:


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algumas clulas tm uma parede celular rgida (como os vegetais) ou estode alguma forma protegidas pro material duro (como no caso das esponjas).Em alguns casos podemos empregar uma enzima especfica para estasparedes rgidas (lisozimas, quitinases, proteinases, etc.), em outros casos

temos que empregar o Potter ou mesmo a prensa francesa. Outra formamuito eficiente de lise e a quebra por ultra-som.

Se a lise feita num tubo de ensaio (um micro-tubo tipo eppendorf, porexemplo), o DNA liberado da clula vai para o sobrenadante. A manipulaod soluo com as ponteiras usuais das micropipetas tendem a quebrar oDMA em grandes fragmentos, de 100 mil a 500 mil bases. Estes grandesfragmentos so teis para quase todas as tcnicas de anlise de DMA.Apenas para a anlise de tamanhos de cromossomos temos que ser muito

cuidadosos na extrao, mas isto no ser tema de nossa disciplina.

O aquecimento do material a ser lisado ajuda na lise, mas se for acima de 65oC vai levar desnaturao do DNA cromossmicos (que est em grandesfragmentos, como dito acima). O DNA desnaturado pouco solvel etender a precipitar na etapa de desproteinizao, o que vai forar a perdade material para anlise. O aquecimento, contudo, usado quando queremosextrair DNA plasmidial de uma clula, e nos ver livres do DNAcromossmico.

1.3 Desproteinizao

Classicamente a retirada de protenas feita com o uso do fenol. Estesolvente orgnico tem um coeficiente de partio muito elevado paraprotenas, isto , quando misturado numa soluo aquosa contendo protenas,o feno sequestra as protenas em sua fase e, medida em que vai seseparando da gua, leva as protenas consigo. A gua fica no sobrenadante eas protenas ficam retidas no fenol, no fundo do tubo. Mas normalmente aetapa de extrao com fenol precedida de uma outra, mais simples, emque as protenas menos solveis so retiradas pela adio de sal suspenso. Este o clssico "salting out" da bioqumica, que tambm oprincpio da conservao de carnes por salmouras, etc. Aps a adio do sal(em geral acetato de amnia) a suspenso centrifugada e o pelletdescartado. No sobrenadante h, agora menos protena e j se pode extrairo que ficou com fenol.

A desproteinizao est bem descrita no livro e no vamos dar maior nfasea ela aqui.


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1.4 Concentrao do DNA

Uma vez que nos vimos livres das protenas (e com elas outras molculas,que vo embora no salting out), sobra no sobrenadante o DNA. Paraconcentrar o DNA geralmente precipitamos o dito com lcool. Para issoadicionamos lcool 100% gelado ao mesmo volume de soluo de DNA ecentrifugamos o tubo a 13.000 por 5 minutos. Aps o descarte do lcoolpode-se lavar gentilmente o pellet com lcool a 70% e deixar secar omaterial. Uma vez seco, o DNA pode ser re-dissolvido num volume adequadode gua ou de tampo (em geral Tris-EDTA). H outros detalhes ecomentrios importantes no texto do livro.

1.5 Alternativas ao fenol

Hoje em dia h um grande nmero de kits comerciais que empregam resinase outros produtos para a purificao rpida de DNA. Em nossas mos oDNAzol um dos mais eficientes: a quantidade de DNA obtida por mg detecido no muito grande, mas a pureza satisfatria para a maioria dasaplicaes. H tambm uma variante do DNAzol para extrao de DNA dosangue, o BloodDNAzol, e outra para extrao de RNA (o RNAzol). Estes

kits so baseados nas propriedades caotrpicas da tioguanidina naconcentrao de 6M ou maior: neste produto os componentes celulares sedesagregam, as enzimas pram de atuar e o material se torna estvel porlongo tempo temperatura ambiente. a forma ideal de transportaramostras para extrao e anlise posterior

2. Observaes sobre o PCR

A tcnica de PCR j foi discutida nas aulas anteriores (veja Aulas deGentica Molecular no site www.biolmol.cjb.net) e vamos aqui apenasenfatizar certos pontos.

2.1 Tubos, placas e evaporao

Os termocicladores de hoje, tambm chamados mquinas de PCR ousimplemente PCRs, trabalham com tubos diminutos de plstico (para volumesde, no mximo, 200 l, mas usualmente levam reaes com 10 a 50 l) ou

com microplacas com 96 poos, cada um para at 200 l. claro que umareao feita com 10 ou 50 microlitros, se aquecida repetidamente como
http://www.biolmol.cjb.net/http://www.biolmol.cjb.net/


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pede uma reao de PCR, vai evaporar completamente. Para evitar isso pode-se colocar uma pequena gota de leo mineral sobre a reao, em cada tubo,ou selar a placa com um filme plstico muito aderente. Ultimamente aindstria vende tubos com uma tampa especial que evita a evaporao e

tambm um selo plstico formado por 96 pequenas tampas que pode sercolocado sobre a placa e mantido apertado contra ela pela tampa dotermociclador, o que tambm evita a evaporao.

2.2 Falta de energia

Um problema crtico no PCR que ele nodeve ser interrompido e retomado algum

tempo depois. Assim, falta de energia sempre uma dor de cabea para oexperimentador. idealmente, a mquina dePCR deve estar conectada a um no-break,como um computador.

2.3 Rampas de aquecimento eresfriamento

Quanto mais rpida seja a mudana detemperatura entre os pontos escolhidospara uma reao de PCR (usualmente 96,

56 e 72 oC). melhor ser o resultado do PCR: menos bandas esprias, maisnitidez da banda esperada, etc. Entretanto, aquecer rapidamente no peto simples, e esfriar rapidamente ainda mais complicado. As rampas deesfriamento e aquecimento mais ngremes so as melhores. O sistemaPeltier, pelo qual a passagem de corrente eltrica num bi-mental aquece ouesfria uma placa, muito simples e confivel, mas no d rampas muitongremes. Os melhores termocicladores no usam este princpio, mas somuito caros. Ento, o comprador deve estar atento ao resultado que queratingir e aos custos que deve tolerar.

A figura ao lado mostra duas rampas de inclinao diferente para umtermociclador hipottico.

Outro ponto importante: os termocicladores no servem s para fazer PCR,

mas podem ser usados para um grande nmero de outras aplicaes nolaboratrio.


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2.4 Hot startQuando se comea um PCR, a enzima Taq polimerase vai atuar ainda durantea rampa de aquecimento, antes que os DNAs estejam devidamentedesnaturados a 96 oC. Isto pode dar umas bandas extras no PCR e borresfeios no gel. Para evitar isso pode-se pipetar a Taq no tubo quando a misturaj alcanou a temperatura de desnaturao. H hoje em dia resinasespeciais que se desmancham quando a temperatura adequada e liberam aTaq. Comear a ao da Taq quando a temperatura alta conhecido como

hot start.2.5 PCR touch down

No livro h um item sobre o uso desta tcnica para determinar a melhortemperatura de pareamento (anelamento ou annealing). Mas hoje em dia muito mais corriqueiro o uso de termocicladores com gradiente detemperatura. Pode-se regular a placa aquecedora para ter sua esquerdauma temperatura e direita outra, vrios graus maior ou menor. O

resultado que todas as temperaturas intermedirias estaro distribudasnos poos ao longo da placa. Esta forma muito mais eficiente paradeterminar a melhor temperatura de pareamento, ou de extenso.

2.6 PCR em tempo real

Muitas vezes as pessoas confundem a nomenclatura RT-PCR, porque defato ela tem dois significados. Um que est no livro, reverse-transcriptase-PCR, um PCR que comea pela ao da transcriptase reversa,

para transformar um RNA num cDNA. Depois a reao continua como umPCR convencional. O outro significado real time PCR, um sistema modernode PCR, quantitativo, em que a reao no visualisada num gel e sim medidapela fluorescncia emitida no sistema. esta tcnica est breveente descritae comentada no final da aula de PCR na pgina de aulas de genticamolecular deste site.

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Aula 2: Desenho de primers

Alm da apresentao do Prof. Kido, h tambm aqui d o site do programa

que foi empregado na aula parta desenho de primers (software on-lineprimer3).

http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi

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Aula 3: Outras tcnicas moleculares e aplicaes no mencionadasna aula 1

O PCR foi inventado no meio da dcada e 80 e s veio encontraruma ampla aplicao, inclusive comercial, na dcada de 90. Antesdisso, outras tcnicas moleculares dominavam o mercado. Comoeram todas menos sensveis que o PCR, suas aplicaes eram, de

certa forma, mais limitadas. Duas delas se destacavam e secomplementavam: o uso de sondas de DNA e o uso de enzimas derestrio. A unio das duas tcnicas ficou conhecida como RFLP(restriction fragment lenght polymorphism, polimorfismo doscomprimentos de fragmentos de restrio). As sondas e o RFLPcontinuam tendo grande aplicao, inclusive no diagnsticolaboratorial, apesar do PCR. A seguir comentaremos brevemente odesenvolvimento de sondas e suas aplicaes e o RFLP.

1. Sondas de DNA e hibridizao com DNA ou RNA

Uma sonda de DNA um DNA fita simples, de tamanho pequeno(em geral ente 50 e 300 bases), que est marcado com umasusbtncia radiativa ou conjugado a um produto qualquer quepermita sua visualizao nuam etapa final do ensaio de hibridizao.Assim, o objetivo de uma sonda encontrar (hibridizar com) umtrecho de um DNA para o qual ela seja pelo menos parcialmentecomplementar, e permitir a posterior localizao de sua presena
http://www.ufpe.br/biolmol/Tec-mol-biol/Desenho_de_primer_Kido.ppthttp://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgihttp://www.ufpe.br/biolmol/Tec-mol-biol/Desenho_de_primer_Kido.ppthttp://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi


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num ensaio qualquer: num Southern blot (como uma banda), num dotassay (como um ponto), num ELISA (como susbtrato colorido), etc.Veremos inicialmente, de forma muito breve, como possvelproduzir uma sonda com uma sequncia conhecida, e de tamanhodeterminado.

H vrias formas de se produzir uma sonda e as que vamosdescrever so apenas duas delas, talvez as mais frequentementeempregadas. Para uma reviso mais completa deste assunto, favorconsultar o site http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=hmg.section.458 , que mostra o captulo de um dos nossos livrosda bibliografia (neste caso, em ingls), o Gentica Molecular

Humana, de Strachan e Reed.

1.1 Preparao de sondas de DNA

As sondas de DNA vo servir, em geral, para vrios tipos de testes dehibridizao. Estes testes tm, em comum, o objetivo de identificarvisualmente uma sequencia de cido nucleico (em geral DNA, mas tambmam alguns casos RNA) que est em mistura com muitas outras. As sondas deDNA podem ser feitas como fitas duplas ou fitas simples, mas para

funcionarem nos ensaios de hibridizao, elas devem ser desnaturadas,numa primeira etapa, se forem feitas como fitas duplas.

As sondas convencionais so feitas de DNA clonado num plasmdeo. A partirdeste plasmdeo possvel produzir fitas simples de DNA copiadas dotrecho clonado, como primeiro passo para a produo de sondas fitassimples. Pode-se tambm amplificar o DNA clonado por PCR (empregandoprimers que hibridizam com as regies flanqueadores do inserto noplasmdeo). Estas duas formas bsicas de iniciar a produo de sondas fita

simples ou fita dupla esto mostradas na figura 1 abaixo: Um pedao deDNA fita dupla (em segmento de um gene, uma regio com repeties, umaregio telomrica, etc.) pode ser clonado num plasmdeo e a partir destaconstruo pode-se produzir uma fita simples (por extenso de um primer, esquerda, como na parte A da figura 1) ou por PCR, direita. Pode-se, nesteprocesso, incorporar, por exemplo, um precursor radioativo de uma dasbases nitrogenadas, e a fita simples ou dupla j ser produzida marcada eser, portanto, uma sonda. Por outro lado, pode-se marcar o DNA fitasimples ou fita dupla recm produzido pela conjugao com uma enzima oubiotina (parte B da figura 1 ) ou se pode ainda empregar um primer
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=hmg.section.458http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=hmg.section.458http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=hmg.section.458http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=hmg.section.458


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previamente "marcado" com material radioativo ou fluorescente (parte C dafigura 1 ). H vrias outras possibilidades de se marcar uma sonda, masremetemos o leitor ao link j comentado anteriormente ou a manuaisespecficos de laboratrio. Quanto ao tamanho da sonda, ela pode ter umas

poucas centenas de bases, mas pode, em alguns casos, ser muito longa, commais de 10.000 bases. Tudo depender do que queremos identificar na nossaposterior hibridao.

Figura 1: A - Um segmento de DNA (em vermelho) pode ser clonado num plasmdeo (emamarelo) e a partir de posies especficas no plasmdeo pode-se estender uma fita simples(com o auxlio de uma DNA polimerase) ou produzir uma fita dupla (por PCR). Se

precursores de bases (dNTPs) marados forem empregados neste processo, a fita simplesou dupla j sai marcada, sendo, poranto, uma sonda. B - uma fita previamente produzidapode ser "marcada" pela conjugao de algumas bases com uma enzima ou outra molculaapropriada (biotina, por exemplo). Estas molculas auxiliaro na visualizao posterior dasonda, no ensaio de hibridizao. C - A marcao da sonda pode ser feita pelo uso de umprimer previamente marcado.

Uma alternativa para a produo de sondas de pequeno tamanho a sntesede oligonucleotdeos, isto , pequenas sequncias de DNA fita simples,neste caso, marcadas com radiatividade ou outro tipo qualquer de marcao.

Os oligonucleotdeos tm em geral menos de 50 bases e a hibridizao deve


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ser feita em condies especiais para que estas sondas possam ficaraderidas ao DNA alvo ao fim do ensaio de hibridizao.

Os marcadores de sondas podem ser, como dito anteriormente, de origem

radioativa ou no. Tradicionalmente, a marcao radioativa feita pelaincorporao de nucleotdeos contendo radioistopos (32P, 33P, 35S ou 3H),que pode ser detectada de vrias formas, sendo a mais usual a auto-radiografia (exposio do material - gel, membrana de blot, etc - a um filmede raio X).

As marcaes no radioativas, pela conjugao de uma molcula especfica avrias bases da cadeia de DNA, so em geral de trs tipos:

incorporao de um fluorforo (ou fluorocromo), isto , uma molculaque emitir florescncia quando devidamente excitada (Figura 2,abaixo)

incorporao de uma enzima, que dever quebrar um substratocromognico adicionado posteriormente, que ir gerar uma cor sobreo ponto em que ocorreu a reao ou dentro do recipiente onde asonda est presente.

incorporao de uma molcula reprter, que ser ligada numa segundaetapa a uma segunda molcula com a misso de identificar a primeira,

por reao cromognica ou por outro sistema qualquer. Atualmente amolcula reprter biotina tem sido bastante utilizada: ela fortemente reconhecida pela avidina (ou estreptoavidina), sendo asegunda molcula conjugada com uma molcula adequada para agerao do sinal (cor, fluorescncia, etc) no ensaio. Outra molculabastante empregada a digoxigenina (um esteride de planta), queatua como reprter. Um anticorpo especfico anti-digoxigenina,conjugado com uma enzima (a peroxidase, por exemplo) empregadopara revelar a posio da digoxigenina no ensaio.


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Figura 2: A - A conjugao de um fluorocromo (fluorescena, que brilha verde nomicroscpio) ou rodamina (que tem uma cor avermelhada) feita atravs de um brao

espaador ao nucleotdeo de uma cadeia ou diretamente oa precursor de basestrifosfatado (como na figura). B - A amostra cujo DNA foi reconhecido com a sondamarcada com fluorescena observada ao microscpio de fluorescncia por epi-iluminao.O comprimento de luz adequado para a excitao do fluorocromo selecionado pelo filtrode excitao, a luz reflete no espelho dicrico e desce pela objetiva at a amostra. Oflouorocromo excitado emite a radiao verde caracterstica que direcionada pelaobjetiva de volta ao espelho, mas desta vez a luz o atravessa e vai, atravs da ocular, aoolho do observador. Fonte da imagem: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=hmg.figgrp.476
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=hmg.figgrp.476http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=hmg.figgrp.476http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=hmg.figgrp.476http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=hmg.figgrp.476


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1.2 Princpios de hibridizao de cidos nuclicos

A hibridizao de cidos nuclicos pressupe a mistura de fitas simples deDNA de fontes distintas. A sonda usualmente composta de um conjunto de

molculas idnticas de DNA, marcadas como discutido acima. O DNA alvopode ser composto de fragmentos de genoma, DNA previamente submetidoa digesto por enzimas de restrio, RNA mensageiro e ainda muitas outrasfontes de cidos nuclicos. A fonte de DNA alvo tem, em geral, umanatureza heterognea, isto , muitas diferentes sequncias de basesestaro presentes nos fragmentos de DNA oferecidos anlise.

Se o DNA alvo ou a sonda (ou ambos) so DNA fita dupla, preciso separaras duas fitas antes de iniciar a hibridizao, o que geralmente obtido por

aquecimento ou por tratamento com tampo muito alcalino. Quando serestauram as condies adequadas para o pareamento de bases, as fitasvoltam a parear. A sonda pode ento parear com sua regio decomplementariedade no DNA alvo. claro que, se a sonda era originalmentefita dupla, ela tender a formar de novo a fita dupla, assim como o DNA alvovoltar a formar uma dupla fita, se originalmente ele estava nesta forma noensaio. Mas o que interessa para o ensaio a hibridizao da sonda com oDNA alvo. Em geral o DNA alvo est aderido a um suporte, enquanto a sondaest na fase lquida, o que permite, por simples lavagem, retirar toda a

sonda que no pareou com o DNA alvo ao final do ensaio, e revelar oresultado.

A temperatura de desnaturao dos cidos nuclicos depende dacomposio de bases do DNA: quanto maior o contedo CG maior atemperatura necessria para a desnaturao. A temperatura em que 50%das molculas de DNA se desnaturam (chamada Tm), para o genoma humano(que tem perto de 40% de C+C) de 87 oC. Ento, quando a desnaturao feita pelo aumento de temperatura, classicamente empregamos 94 oC. Mas

a temperatura de desnaturao tambm determina a melhor temperaturade pareamento (ou anelamento, como designado o processo no nosso livro-texto de Rossetti e cols.). Geralmente ela 25 oC menor que a dedesnaturao. Ento, temperaturas de hibridizao entre 56 e 64 oC socomuns. Se descermos demais a temperatura de hibridizao (pareamentoou anelamento) h sempre o risco, como no PCR, de provocarmospareamentos sem sentido, ruins, que vo atrapalhar nossa anlise dosresultados, posteriormente.

Depois que o pareamento feito, preciso lavar o excesso de sonda, queno pareou com o DNA alvo. Isso pode ser feito com o tampo de lavagem a


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uma temperatura mais alta do que a ambiente. Esta temperatura mais alta(em geral 37 a 45 oC) cria uma condio de estringncia (de rigor) maisforte, e lava embora o que no estiver muito bem preso no suporte ondeest preso o DNA alvo.

Um dos fatores que vai determinar se a sonda fica bem aderida ao DNA alvo o seu tamanho. Outro fator a porcentagem de identidade(complementariedade) entre a sonda e o DNA alvo. Com a prtica (e aleitura de manuais especficos) o experimentador vai se familiarizando comestas variveis do ensaio de hibridizao. Vrios outros fatores influenciamna reao de hibridizao e no cabe aqui uma discusso mais completa.

1.3 Ensaios de hibridizao de cidos nuclicos

A imobilizao do DNA alvo num suporte qualquer, em geral umamembrana de nylon ou uma lmina de vidro, foi a forma encontradapara, ao mesmo tempo, aumentar muito a concentrao de DNA alvono ensaio e facilitar as etapas de lavagem da sonda no aderida aoDNA alvo. Praticamente todos os ensaios de hibridizao so, assimheterogneos, isto , uma parte dos reagentes fica na fase slida

(a membrana) e outra na fase lquida (o tampo). Nos ltimos anosa inverso dos elementos do suporte passou a ser adotada emensaios de alto desempenho (high throughput). A tabela abaixomostra os vrios ensaios mais comumente empregados emlaboratrios de pesquisa e de servios no mundo todo.

Tabela I - Ensaios padro e ensaios reversos mais adotados em laboratriosde pesquisa e servios no mundo. Baseado emhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=hmg.table.499

Ensaios padro Sonda marcada em soluo DNA alvo no marcado liga

Dot-blotQualquer DNA ou RNA marcados, masusualmente um oligonucleotdeo

Populaes complexas de DNtamanho, mas pipetadas diretapequenos pontos (dots)

Southern blot Qualquer Geralmente DNA genmico c

individuais de DNA), digerido ctamanho (em eletroforese), e t
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Northern blot QualquerPopulao complexa de RNA

fracionada por tamanho (em elmembrana

Hibridizao in situde cromossomo Geralmente um clone genmico marcadoDNA nos cromossomos (em gnuma lmina de microscpio

Hibridizao in situde tecidoGeralmente uma ribo-sonda anti-sense (isto, complementar fita de RNA do tecido) ouainda um oligonucleotdeo

RNA dentro de clulas de tecimicroscpio

Blot de colnia QualquerColnias de bactrias ou clultransferidas para uma membra

Blot de plaque viral (ou fgica) QualquerPlaques de lise fgica em tapegar nutriente, transferidas par

Ensaio de hibridizao de grid decolnias

QualquerClones de bactrias transferidordenada, em membrana. Podmenor.

Ensaios reversos DNA alvo marcado em soluo Sondas no marcadas ligad

Dot-blot reverso DNA complexo Oligonucleotideos pipetados e

DNA microarray DNA complexoClones de DNA aplicados emauxlio de um rob

Microarray de oligonucleotdeos DNA complexoOligonucleotideos sintetizadosmicro-pontos ordenados.

Muitas das tcnicas acima podem encontrar aplicao imediata em

diagnstico.No Dot blotpodemos pipetar numa membrana os DNAs extrados de tecidosde pacientes com uma suposta infeco por um fungo, por exemplo, e emseguida hibridizarmos o material com uma sonda representando uma regiognica exclusiva (caracterstica) deste fungo. Muitos pacientes podem serinvestigados, assim, ao mesmo tempo. A limitao a quantidade de DNA dofungo presente no ensaio, que no deve ser to pequena que, frente aoenorme excesso de DNA do prprio paciente, no possa ser localizada pela

sonda.A hibridizao de cromossomos, tambm chamada FISH, pode ser aplicada identificao de alteraes de sequncias nos cromossomos que no levama mudanas conformacionais detectveis pelas tcnicas de bandeamentoconvencionais. , assim, uma aliada do diangstico gentico humano ou deanimais, alm de ter inmeras aplicaes em pesquisa.

A hibridizao in situ de tecidos se assemelha ao FISH, mas o alvo emgeral o RNA das clulas, e no um cromossomo individualizado na metfase.Ela pode ser aplicada ao estudo da expresso de certos genes que podem


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estar ligados, por exemplo, ao cncer. Mas tambm pode ser aplicada deteco de RNA viral ou de um agente infeccioso qualquer no tecido de umpaciente.

O Southern blot (que ganhou este nome por ter sido inventado por umpesquisador de nome Southern) tambm encontrou muitas aplicaes nodiagnstico. Estranhamente, no uma tcnica trivial, mas foi de tal formaaprimorada e padronizada pelas vrias empress fornecedoras de insumosque alcanou considervel uso na rea diagnstico, com especial aplicao nadeteco de doenas genticas e no diagnstico de paternidade. Vamosfocalizar um pouco mais a ateno sobre este ensaio e deixaremos osdemais para outra disciplina, que ser oferecida em breve no CCB (UFPE)pelo Gentrop (Departamento de Gentica). Para uma leitura on-line (em

ingls) deste assunto, recomendamos o livro texto de Gentica MolecularHumana - Strachan e Reed, pelo linkhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=hmg.

A figura abaixo sumariza os principais passos do Southern blot aplicado aum DNA pr-digerido com enzimas de restrio. Esta associao tcnica conhecid como RFLP e envolve a purificao do DNA alvo (de um paciente,por exemplo), sua digesto com enzimas de restrio, a separao dosfragmentos gerados e a transferncia destes fragmentos para uma

membrana de nylon ou material anlogo. Esta membrana ser ento incubadacom a sonda de DNA marcada, que dever ser dirigida contra o segmento deDNA que se tem interesse em estudar. Vo aparecer bandascorrespondentes a fagmentos de restrio do DNA original que tmsequncias total ou parcialmente complementares sonda.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=hmghttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=hmg


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Figura 3: Esquema representativo da tcnica conhecida como RAPD, que de fato aaplicao do Souther blot a um conjunto de amostras de DNA pr-digeridas com enzima derestrio. A figura auto-explicativa. Ressaltamos apenas o resultado da eletroforese, qued um nmero muito grande de bandas com diferentes pesos moleculares e que no podemser resolvidas no gel, que mostra apenas um rastro (smear) no lugar das bandas. As bandass surgiro pela identificao destas pela sonda.

Se a sonda tiver um nmero razovel de bases (suponhamos, 1000 b), ela

poder ser capaz de identificar alteraes ocorridas no padro defragmentao do DNA pelas enzimas de restrio, toda vez que um stio derestrio dentro da regio de reconhecimento da sonda o prximo a ela forcriado ou desaparecer, devido a uma mutao. Isto vai provocar oaparecimento ou desaparecimento de uma banda no resultado final mostradona figura abaixo, indicando que houve alterao na sequncia de DNA.


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Figura 4: - A digesto de um DNA genmico com enzimas de restrio gera um nmeromuito elevado de bandas. Mas com o uso de uma sonda dirigida a uma nica regio dogenoma (um gene ou regio intergnica de interesse) possvel estudar apenas um pequenotrecho. A figura mostra esquerda e direita dois segmentos de DNA idnticos exceto

pela presena de uma mutao que elimina um stio de restrio para a enzima BamH1(GGATCC) do segmento em estudo; Os stios de restrio que ainda permanecem no DNAmutado geram um segmento de 9 kpb, que ser identificado pela sonda no Southern blot,enquanto no DNA selvagem (no mutante) o mesmo fregmanto ser cortado em dois pelaenzima de restrio, gerando dois fragmentos de 4 e 5 kpb. Apenas um deles (o de 4 kpb)ser reconhecido, j que o outro no contm regio de homologia com a sonda.

Quando o RFPL aplicado ao estudo de diferenas entre fragmentos derestrio contendo regies repetidas, que no fazem parte de genes, elepode se tornar uma ferramenta para identificar indivduos e apontarrelaes de cruzamento entre casais. Isto se deve ao fato de que estarregies ricas em repeties, no sendo genes, divergem muito entreindivduos. Estas repeties, chamadas VNTR, poderiam, em princpio, terum nmero muito variado de repeties, mas na prtica o termo guardadopara arranjos de tamanho moderado, contendo repeties de 5 a 64 pb.estas repeties so conhecidas como DNA mini-satlite hipervarivel, aocontrrio das repeties de um a 4 nucleotdeos, que so chamadas micro-satlites.


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Cada um de ns carrega, em princpio, dois alelos para quaisquer destasrepeties, uma trazida do genoma de nossas mes e outra de nossos pais.Quando transmitimos prognie estas "marcas", uma delas apenas passar F1, que receber a outra do outro parceiro (ou parceira) do cruzamento.

Ento, estudando estas regies, que so polimrficas em tamanho,poderemos inferir hereditariedade e individualidade. A figura abaixo,adaptada de um excelente portal sobre biologia molecular(http://www.bioteach.ubc.ca/MolecularBiology/), mostra como poderiamaparecer estes fragmentos de restrio reconhecidos por uma sonda, numaanlise de relao de parentesco.

Figura 5: - O RFLP para paternidade gera um nmero de bandas grande (simplificado nafigura), fruto da digesto do DNA genmico do indivduo com enzimas de restrio e doreconhecimento de mltiplos fragmentos pela sonda dirigida contra a regio repetida deinteresse. Neste esquema as cores das bandas maternas e paternas correspondem s coresde seus ovcito e espermatozide. D1, filha do casal, tem 2 bandas maternas, sendo asrestantes necessariamente paternas. D2, filha de um primeiro casamento da me, tem 3bandas maternas mas as bandas paternas (em vermelho) no coincidem todas elas com asesperadas no atual marido (uma pequena diferena de migrao suficiente paradiferenciar duas bandas). S1, filho do casal, tem duas bandas maternas e as 3 esperadasbandas paternas. S2, filho adotivo, tem bandas que no correspondem nem me nem aopai (embora possa haver algumas coincidncias). Na prtica, o RFLP no tem cores distintaspara as bandas materna e paterna, o que faz com que a distino seja baseadaexclusivamente na posio da banda no gel (migrao).Fonte: http://www.bioteach.ubc.ca/MolecularBiology/DNAfingerprint/

Como as bandas que aparecem na digesto do DNA de um indivduo sonumerosas, relativamente comum que dois indivduos quaisquer, quandocomparados, mostrem ao menos uma banda diferente entre si. Mas avariedade de padres de banda no infinita e numa composio de bandas,

no caso de paternidade, como a descrita acima (Fig. 5), pode havercoincidncia entre as bandas do suposto pai e do filho, sem que este seja,
http://www.bioteach.ubc.ca/MolecularBiology/http://www.bioteach.ubc.ca/MolecularBiology/DNAfingerprint/http://www.bioteach.ubc.ca/MolecularBiology/http://www.bioteach.ubc.ca/MolecularBiology/DNAfingerprint/


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de fato, gerado por aquele. preciso lanar mo de testes estatsticos, queavaliam a probabilidade de que cada banda observada esteja presente umavez num ensaio qualquer. As frequncias destas bandas correspondem sfrequncias allicas que aprendemos, quando estudamos genes. H tabelas

sobre a frequncia de cada banda e uma estatstica rebuscada para analisaros resultados, e recomendamos aos interessados que procurem o livro-textode Strachan e Reed e consultem o site mencionado na legenda da figura.

Na prtica, o RFLP no tem cores distintas para as bandas materna epaterna, o que faz com que a distino seja baseada exclusivamente naposio da banda no gel (migrao). Um RFLP precisa, assim como outrastcnicas onde muitas bandas so geradas numa eletroforese, de umaregularidade grande da corrida eletrofortica, e d para ver que isso nem

sempre alcanado (Figura ao lado)Figura 6: - RFLP real. Veja a distoro dasfaixas (lanes) de eletroforese, tornandodifcil identificar com preciso a posiorelativa de uma banda e outra entre colunasno adjacentes.

O mesmo princpio descrito acima pode ser aplicado para os testes deindividualidade empregados nos casos de criminalstica e gentica forense

(em geral a identificao de paternidade tambm um tema da genticaforense).

Uma variante mais moderna deste ensaio, e que no usa a etapa de Southernblot e sim a amplificao inicial de um trecho do genoma (com as repetiesa serem estudadas), tem sido oferecida como kit e empregada emlaboratrios. Neste caso, um trecho do genoma amplificado por PCR. Oproduto do PCR aplicado ao gel. O resultado est ilustrado na figuraabaixo, para a identificao de um suspeito de um crime.


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Figura 7: Resultado de umainvestigao de um crime (estupro).O DNA da vtima, dos suspeitos, donamorado e do material colhido navagina (evidncia ou corpo de delito)

foi obtido. Um DNA controle tambm empregado no ensaio. As bandasobtidas do suspeito 1 coincidem comas obtidas do esperma do corpo dedelito. As bandas obtidas do DNAdas clulas da mulher, obtidas emmistura com o esperma, coincidemcom as bandas da vtima (de fato, oDNA da vtima).

Pela inspeo simples da imagem acima fica evidente que o padro de bandascom esta variante da tcnica (que est mais detalhadamente descrita napgina da aula 7 para Gentica Molecular - C. Biolgicas) bem mais simples

do que o do RAPD. Geralmente s so discernidas duas bandas,correspondentes aos dois alelos com repeties nos cromossomos homlogosdo indivduo.

2. Outras tcnicas moleculares

Ainda vamos pensar o que vir aqui, o que foi comentado em aula foi o PCR

em tempo real, mas este j est revisto nas aulas de Gentica Molecular deC. Biolgicas.
http://www.ufpe.br/biolmol/aula7_PCR-RAPD-aplicar.htmhttp://www.ufpe.br/biolmol/aula7_PCR-RAPD-aplicar.htm

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Técnicas moleculares em biologia aplicadas ao diagnóstico