técnicas para estudo taxonômico de copépodes harpacticóides da

Terue Cristina KiharaCarlos Eduardo Falavigna da Rocha

TÉCNICAS PARA ESTUDO

TAXONÔMICO DE

COPÉPODES HARPACTICÓIDES

DA MEIOFAUNA MARINHA

1

TÉCNICAS PARA ESTUDO TAXONÔMICO DE

COPÉPODES HARPACTICÓIDES DA

MEIOFAUNA MARINHA

Terue Cristina Kihara

Carlos Eduardo Falavigna da Rocha

� asteriscoeditora

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Copyright © 2009 Editora Asterisco

Projeto gráfico: Terue Cristina Kihara & Alexandre Dias RamosRevisão técnica: Terue Cristina Kihara & Carlos Eduardo Falavigna da Rocha

Editoração: William C. Amaral

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)(Sindicato Nacional dos Editores de Livros, Brasil)

K59tTécnicas para estudo taxonômico de copépodes harpacticóides damaiofauna marinha / Terue Cristina Kihara, Carlos Eduardo Falavignada Rocha;Porto Alegre, RS: Asterisco, 2009.il.Apêndice: Ordem HarpacticoidaInclui bibliografia

ISBN 978-85-88840-86-7

1. Copepoda - Identificação. 2. Harpacticoida - Identificação. 3. Crustáceo- Identificação. 4. Zoologia - Classificação. I. Rocha, Carlos EduardoFalavigna da. II. Título.

08-4780. CDD - 595.34CDU - 595.34

1a edição

direitos reservados à

EDITORA ASTERISCOr. Garibaldi. 1329. Bom Fim.90035.052. Porto Alegre. RS.

f. 51 3024.7554

— 2009 —

3

SUMÁRIO

PREFÁCIO

1. INTRODUÇÃO

2. FIXAÇÃO DA AMOSTRA

3. EXTRAÇÃO DA FAUNA

4. COLORAÇÃO

5. TRIAGEM DAS AMOSTRAS

5.1. SEPARAÇÃO DOS COPÉPODES

5.2. SEPARAÇÃO DE MORFOTIPOS

6. PREPARAÇÃO DE LÂMINAS

6.1. PRÉ-TRATAMENTO DO MATERIAL

6.2. DISSECÇÃO

6.3. MONTAGEM DE LÂMINAS

7. IDENTIFICAÇÃO

7.1. TÁXON NOVO

8. CONSIDERAÇÕES FINAIS

9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

10. APÊNDICE - ORDEM HARPACTICOIDA

5

7

8

11

19

21

21

31

42

42

44

50

64

68

87

88

93

4

5

PREFÁCIO

Janet W. Reid

Research Associate

Virginia Museum of Natural History, Martinsville, E.U.A.

A capacidade de efetuar a manipulação dos chamados

microcrustáceos, como os copépodes, branquiópodos e

ostrácodes, faz parte do “kit” de habilidades de cada investigador.

Para quem quer trabalhar com esses animais tão comuns em

ecossistemas aquáticos e ainda semi-terrestres, o desafio primeiro

e fundamental é dominar a forma de manipulá-los para fazer

contagens ou efetuar determinações taxonômicas.

Contudo, a referida metodologia é normalmente

transmitida de orientador para aluno nos confins do próprio

laboratório, informalmente e via oral. São escassos – infelizmente

– os trabalhos publicados sobre o uso de corantes, meios, vidraria

especializada e outros aspectos do estudo desses animais. Assim

sendo, as técnicas tendem a se diferenciar entre laboratórios

acarretando falta de padronização e dificuldade em comparar

os dados.

Baseando-se na experiência de vários anos no estudo de

copépodes harpacticóides, e com as vantagens de ter trabalhado

com diversos pesquisadores na área e ainda estar jovem suficiente

para se lembrar como e em quais fases ela enfrentou as

dificuldades para adquirir a habilidade necessária ao estudo

6

desses organismos, a autora deste livro “quebra o galho” de

muitos jovens pesquisadores. Ela apresenta detalhadamente e

com uma fartura de fotos e desenhos, uma espécie de livro de

receitas, passo a passo as principais técnicas.

A obra, resultante de experiência pessoal e pesquisas

detalhadas, composta e editada com o maior cuidado e carinho,

vai servir bem a comunidade brasileira de oceanólogos e

limnólogos. Vai tornar a metodologia acessível a todos os

interessados, e ainda, mais científica e menos artesanal. Todos

nós devemos agradecer a autora pela vontade e pelo trabalho

prestado ao dividir seus conhecimentos com a comunidade.

Esperamos contar com mais obras dessa pesquisadora, ainda

jovem, para o benefício e a instrução de seus leitores.

7

1. INTRODUÇÃO

Este livro pretende fornecer ao leitor uma idéia geral sobre as

técnicas empregadas no estudo taxonômico dos copépodes

harpacticóides da meiofauna marinha, padronizando a metodologia

a ser utilizada por iniciantes e servindo de guia de referência rápida

e consulta para pesquisadores que já trabalham nessa área.

Privilegiou-se o desenvolvimento particular de cada

procedimento, fornecendo técnicas e instruções específicas em

quadros explicativos. A preparação de reagentes, e a produção

de aparatos e instrumentos são detalhadas, utilizando-se

ilustrações, a fim de facilitar o reconhecimento visual dos

procedimentos descritos.

Abordando de forma prática e sem se aprofundar em

extensas explicações sobre fundamentações teóricas, são

incluídas algumas abordagens relevantes para o estudo

taxonômico do grupo, deixando de lado detalhes da morfologia

que podem facilmente ser encontrados em literatura de

referência.

Os procedimentos relatados representam o básico para

que se possa começar o trabalho em laboratório. Detalhamentos

sobre outras técnicas de processamento de amostras de

meiofauna foram descritos por HULINGS & GRAY (1971),

PFANNKUCHE & THIEL (1988), WESTHEIDE & PURSCHKE (1988)

e GIERE (1993). Os métodos utilizados especificamente para o

estudo de copépodes da meiofauna podem ser encontrados em

HAMOND (1969), WELLS (1988), HUYS & BOXSHALL (1991),

HUYS et al. (1996) e REID (2000).

8

2. FIXAÇÃO DA AMOSTRA

A fixação da meiofauna é feita através da adição de um

fixador às amostras de sedimento recém-coletadas. Esse

procedimento tem por finalidade prevenir a autólise e degradação

de tecidos, mantendo a integridade do material a ser estudado.

Os principais fixativos utilizados são formalina a 4% e álcool

etanol a 95%.

Amostras de copépodes são normalmente fixadas e

preservadas em solução de formalina a 4%. A baixa concentração

da solução diminui a tendência do formaldeídeo tornar os

copépodes quebradiços (HUYS et al., 1996).

Para preservação a longo prazo, é necessário um

cuidadoso tamponamento da solução de formalina através da

adição de bórax, carbonato de sódio ou acetato de sódio, até a

obtenção de pH mínimo de 8,0–8,2 (REID, 2000).

Uma discussão mais detalhada sobre a utilização de

formaldeído para fixação e preservação de organismos marinhos

pode se encontrada em STEEDMAN (1976).

PROCEDIMENTO:

1. adicionar às amostras 1/10 de solução de formalina 40%

tamponada (Quadro 1). Levar em conta o volume total do

recipiente e não somente o volume da amostra de sedimento ou

do líquido sobrenadante (Figs. 1A–C);

9

2. completar com água do mar (se possível filtrada, para evitar

contaminação da amostra) até obter uma concentração final de

solução de formalina a 4% tamponada (Figs. 2A–B);

3. homogeneizar a mistura de fixador, água e sedimento com

um bastão de vidro (caso o recipiente possa ser hermeticamente

fechado com tampa de rosca ou pressão, invertê-lo várias vezes

para providenciar a mistura);

4. as amostras devem permanecer no fixador por, no mínimo, 7

dias.

Figs. 1A–C - Adição de solução de formalina 40% tamponada à amostra.

Figs. 2A–B - Diluição da solução de formalina tamponada até obtera concentração final de 4%.

1A 1B 1C

2A 2B

10

OBS: O contato e a inalação da formalina podem causar irritação

na pele, nos olhos e vias respiratórias. Os efeitos da exposição

prolongada vão desde alergias até casos de câncer (BLACK &

DODSON, 2003). O manuseio da formalina deve ser feito com

cuidado e a exposição ao reagente deve ser restrita ao mínimo

necessário. Recomenda-se que esse fixativo seja manuseado com

luvas, óculos de segurança e protetor facial, sempre em locais

bem ventilados ou com exaustão.

QUADRO 1. SOLUÇÃO DE FORMALINA A 40%TAMPONADA (PFANNKUCHE & THIEL,1988)

• 1000 ml de formalina a 40%;

• 200g de bórax (Tetraborato de sódio - Na2B

4O

7);

• inverter o frasco fechado várias vezes no período de 1

hora.

Quando houver a necessidade da aplicação de técnicas

de microscopia eletrônica ou de biologia molecular não se

recomenda a utilização de formaldeído, devendo ser empregado

um fixador específico para a finalidade desejada (HUYS &

BOXSHALL, 1991).

11

Um outro método para fixação de material é a utilização

de álcool etanol a 95%. Uma alternativa tão eficaz quanto a

formalina, sem os efeitos prejudiciais à saúde.

PROCEDIMENTO:

1. adicionar a cada 6,25 ml de amostra, 100 ml de solução de

álcool etanol 100%;

2. homogeneizar a mistura de fixador e sedimento com um bastão

de vidro (caso o recipiente possa ser hermeticamente fechado

com tampa de rosca ou pressão, invertê-lo várias vezes para

providenciar a mistura);

3. as amostras devem permanecer no fixador por, no mínimo, 7

dias.

OBS: O álcool etanol é uma substância inflamável e sua compra

muitas vezes é controlada.

3. EXTRAÇÃO DA FAUNA

Como o volume total da fauna a ser estudado é muito

pequeno quando comparado com o volume do material

coletado, as amostras devem passar por processo de remoção

do sedimento e concentração da meiofauna.

A extração de copépodes harpacticóides do sedimento é

relativamente fácil e pode ser obtida por decantação seguida de

12

peneiramento. Esse método simples fornece excelentes amostras

de copépodes de sedimento arenoso, mas as amostras com

sedimentos mais finos podem ficar contaminadas com detrito

(HUYS et al., 1996).

Embora seja possível extrair 80 a 90% da fauna das

amostras, recomenda-se um acompanhamento periódico da

eficiência da extração através do re-exame das amostras

previamente tratadas (HULINGS & GRAY,1971).

Técnicas de extração de meiofauna para tipos específicos

de sedimento são descritas por PFANNKUCHE & THIEL (1988) e

GIERE (1993).

PROCEDIMENTO:

1. colocar amostra previamente fixada em recipiente de tamanho

adequado (béquer de 1l ou balde) (Figs. 3A–B). Grandes

quantidades de sedimento ou sedimento fino devem ser divididas

em porções menores;

2. adicionar água até cobrir o sedimento (Fig. 4);

3. agitar gentilmente o sedimento para homogeneizar a mistura

(Fig. 5);

4. deixar a mistura em repouso por alguns segundos, para que

as partículas mais pesadas de sedimento se assentem sobre o

fundo do recipiente (Fig. 6);

13

5. passar o líquido sobrenadante por conjunto de peneiras

(Quadro 2) de malhas de 500, 250, 125 e 42 μm, empilhadas

em ordem decrescente (Figs. 7A–C). Cuidado para não entupir

as peneiras e transbordar o líquido (Fig. 7D). Para se evitar o

transbordamento, o volume a ser vertido nunca deve ultrapassar

a capacidade de uma peneira;

Fig. 4 - Adição de água à parte da amostra contida no béquer até dobrar ovolume.

Fig. 5 - Homogeneização da mistura amostra/água.

Fig. 6 - Amostra em repouso para que o sedimento mais grosseiro se assentesobre o fundo do recipiente.

Figs. 3A–B - Transferência de parte de uma amostra para recipientemaior, no caso um béquer com capacidade de 1l.

3A 3B

4 5 6

14

6. lavar delicadamente o material retido na peneira em água

corrente, sem forçar sua passagem através da tela e assim causar

danos aos animais;

7. repetir os passos 2 a 6 por 5 vezes;

Figs. 7A–C - Passagem do líquido sobrenadante da amostra por peneiras dediferentes malhagens.

Fig. 7D - Peneira de malha mais fina com obstrução de tela denotada pelovolume de líquido nela contida.

7A 7B 7C

7D

15

8. utilizar pisseta com solução de formalina a 4% tamponada

(Quadro 3) ou álcool etanol a 70% (Quadro 4) para recolher o

material das peneiras em frascos contendo pequeno volume da

mesma solução (Figs. 8A–D);

9. colocar etiqueta interna e externa (Quadro 5) nos frascos

(Figs. 9A–B).

Figs. 8A–D - Transferência do material retido em peneiras de diferentesmalhagens para frascos contendo solução preservativa.

Fig. 9A - Frasco com etiqueta externa.

Fig. 9B - Frasco com etiqueta interna.

8A 8B

8C 8D

9A 9B

16

QUADRO 2. PENEIRAS (PFANNKUCHE &THIEL,1988) (Figs. 10A–C)

Normalmente utilizam-se peneiras com malhas de:

• 1000 μm - representa o limite superior da meiofauna;

• 500 μm - algumas vezes utilizada como limite superior

da meiofauna, malha em que geralmente fica retida a

meiofauna temporária;

• 250 μm;

• 125 μm;

• 63 μm - utilizada por alguns autores como o limite inferior

para a retenção da meiofauna;

• 42 μm - geralmente aceita como o limite inferior para a

retenção de meiofauna.

Fig. 10A - Conjunto de 4 peneiras (500, 250, 125 e 63 μm) utilizadosno presente trabalho para a extração da meiofauna.

Fig. 10B - Conjunto completo de peneiras (1000, 500, 250, 125 e 63μm) para extração de meiofauna.

Fig. 10C - Detalhe das malhas de duas peneiras.

10A 10B 10C

17

QUADRO 3. SOLUÇÃO DE FORMALINA A 4%TAMPONADA

• 100 ml de solução de formalina a 40% tamponada;

• 900 ml de água.

Essa solução, além de ser um ótimo fixador, é muito

utilizada como líquido preservativo, pois mantém o material

com o mínimo de distorção por um longo período de tempo.

QUADRO 4. SOLUÇÃO DE ÁLCOOL ETANOL A70%

• 700 ml de álcool etanol a 100%;

• 300 ml de água.

Ao optar pelo álcool como líquido preservativo,

tomar cuidado com a vedação do frasco para evitar

evaporação, e checar uma vez por ano o nível do líquido.

STEEDMAN (1976) chama a atenção para a possibilidade

do material se tornar quebradiço com o passar do tempo.

Para minimizar esses contratempos, MORTON (1950)

recomenda a adição de uma colher de chá de glicerina

líquida a cada 250 ml de álcool etanol a 70%.

18

QUADRO 5. ETIQUETA INTERNA E EXTERNA

Durante o procedimento de coleta, cada frasco

utilizado para guardar a amostra deve ser etiquetado.

Entretanto, a redução do volume das amostras pela extração

da meiofauna e sua transferência para novos recipientes

faz com que sejam necessárias outras etiquetas (Fig. 11A).

As novas etiquetas devem conter as informações

presentes nas etiquetas originais como local e data da

coleta, nome do coletor. Outras informações podem ser

adicionadas: nome do projeto, No/nome da estação de

coleta, No da amostra/subamostra, etc. (Fig. 11B).

A etiqueta interna (Fig. 11C) deve ser feita em papel

vegetal e escrita com tinta nanquim ou a lápis; a externa

(Fig. 11D), em papel sulfite ou adesivo e recoberta por

filme impermeável. O nanquim deve ser testado para

verificar se se dilui na água.

Fig.11A - Frasco contendo etiqueta interna e externa.

Fig. 11B - Exemplo de etiqueta que pode ser utilizada para identificarfrascos com amostras.

Projeto:_________________________

Local:__________ Estação:_________

Amostra:__________ Data:__/__/___

Coletor:_________________________

11A 11B

19

4. COLORAÇÃO

Consiste na adição de corantes durante ou após a fixação

das amostras. Auxilia na separação visual dos copépodes

harpacticóides, de partículas do sedimento.

É interessante a utilização de um corante seletivo para um

reconhecimento e discriminação mais fácil entre detritos e

animais. Um dos mais utilizados é o Rosa de Bengala, um corante

vital, solúvel em água e removível com álcool ou ácido láctico

(Figs. 12A–B).

Outros métodos de coloração de copépodes podem ser

encontrados em STEEDMAN (1976) e HUYS & BOXSHALL (1991).

Fig. 12A - Amostra de meiofauna sem adição de corante, vista ao estéreo microscópio.

Fig. 12B - Amostra de meiofauna, com a adição de corante Rosa de Bengala.

Fig. 11C - Detalhe da etiqueta interna. Fig. 11D - Detalhe da etiqueta externa.

11C 11D

12A 12B

QUADRO 5 (CONT.)

20

PROCEDIMENTO:

1. adicionar alguns grãos de Rosa de Bengala à amostra (ponta

de um estilete umedecido) (Figs. 13A–C) ou solução de Rosa de

Bengala a 1% (Quadro 6);

2. agitar gentilmente o recipiente para homogeneizar a mistura

(Fig. 14);

OBS: Como regra geral, o tempo para corar copépodes

harpacticóides é de 2 horas. Sedimentos argilosos ou com grande

quantidade de matéria orgânica podem necessitar de mais tempo.

Fig. 14 - Homogeneização damistura.

Figs. 13A–C - Adição de grãos do corante Rosade Bengala à amostra com a utilização de umestilete.13A

13B 13C

14

21

Entretanto, GIERE (1993) e REID (2000) ressaltam que não

convém deixar a amostra com corante por um longo período de

tempo, porque os animais ficarão excessivamente corados. Nesse

estágio, o corante é difícil de ser removido e prejudica o

reconhecimento de determinados padrões de cor e a análise de

certos detalhes estruturais ao microscópio.

QUADRO 6. SOLUÇÃO DE ROSA DE BENGALA A 1%

• 1g de Rosa de Bengala;

• 1000 ml de solução de formalina a 10% tamponada ou

400 ml de solução de formalina a 4% tamponada.

5. TRIAGEM DAS AMOSTRAS

5.1. SEPARAÇÃO DOS COPÉPODES

O estudo taxonômico desse grupo requer amostras livres

de detritos e de outros táxons da meiofauna.

Essas condições não são atendidas pelos métodos de

extração, que por melhor que sejam, são falhos em remover

todos os detritos e incapazes de separar os diferentes táxons da

meiofauna (Fig. 15A).

22

Esse problema só é resolvido colocando a amostra sob

estéreo-microscópio e removendo os copépodes harpacticóides

para outros recipientes (Fig. 15B).

PROCEDIMENTO:

1. agitar a amostra para que os animais depositados no

sedimento passem para o líquido sobrenadante (Fig. 16);

2. deixar a amostra em repouso por alguns segundos para que

as partículas de sedimento mais grosseiro se assentem (Fig. 17);

Fig. 16 - Agitação da amostra. Fig. 17 - Amostra em repouso.

Fig. 15A - Amostra de meiofauna, vistaao estéreo-microscópio, com váriostáxons e detritos.

Fig. 15B - Copépodes harpacticóides já triados.

15A

15B

16 17

23

3. verter parte do líquido sobrenadante em uma placa

quadriculada (Quadro 7) (Figs. 18A–C);

4. sob estéreo-microscópio, transfira os copépodes para lâmina

escavada ou frasco (Fig. 19) com o auxílio de estilete ou pipeta

(Quadro 8);

5. repetir os passos de 1 a 6 até não haver mais copépodes na

amostra. Quando necessário, acrescentar mais líquido fixador

ou água à amostra;

Figs. 18A–C - Transferência do líquido sobrenadante para placasquadriculadas.

18A 18B

18C

24

6. colocar o material triado em recipientes adequados para

estocagem (Quadro 9) com solução de formalina a 4%

tamponada ou álcool etanol a 70% (Fig. 20);

7. etiquetar os recipientes com dados de coleta existentes na

etiqueta da amostra triada;

8. anotar as informações relacionadas às amostras em caderno

de controle ou em fichas de controle (Quadro 10).

Fig. 19 - Lâmina escavada commaterial triado no centro daescavação.

Fig. 20 - Frasco plástico com tampade rosca (capacidade para 2 ml) paraestocagem de material triado.

19

20

25

QUADRO 7. PLACAS QUADRICULADAS

A triagem de amostras é facilitada quando se utilizam

placas com subdivisões que permitem o controle do que

já foi esquadrinhado (Figs. 21A–C).

O mais comum é comprar placas de Petri

subdivididas. Entretanto, uma solução simples e

econômica é quadricular a superfície externa do fundo

de uma placa de Petri com caneta que escreva em plástico

ou vidro (Figs. 22A–D).

Fig. 21A - Diferentes tipos deplacas quadriculadas.

Fig. 21B - Detalhe de placa quadriculada que possui coordenadasgravadas na superfície de triagem.

Fig. 21C - Placa quadriculada com divisões escavadas.

21A

21B

21C

26

QUADRO 7 (CONT.)

É possível encontrar em casas especializadas, placas

próprias para triagem de plâncton ou meiofauna, como a

placa de Bogorov (Figs. 23A–B).

Fig. 23A - Placa de Bogorov, vista superior.

Fig. 23B - Placa de Bogorov, vista lateral.

Figs. 22A–D - Confecção de placa quadriculada, utilizando placa dePetri de vidro e caneta de retroprojetor.

22A 22B

22C 22D

23A 23B

27

QUADRO 8. ESTILETE E PIPETA

A triagem de copépodes pode ser realizada com

estiletes de ponta fina, em alguns casos com estiletes que

terminem em gancho ou em minúsculas argolas (Irwin

loops) (Figs. 24A–E).

Fig. 24A - Diferentes tipos de estiletes utilizados na triagem decopépodes harpacticóides.

Fig. 24B - Detalhe das extremidades dos estiletes.

Fig. 24C - Detalhe da extremidade do estilete de ponta em gancho.

Fig. 24D - Detalhe da extremidade do estilete com argola.

Fig. 24E - Detalhe da extremidade do estilete de ponta fina.

24A 24B

24C

24D 24E

28

QUADRO 8 (CONT.)

Recomenda-se cuidado para não espetar ou

danificar o material triado com os estiletes, pois a

manipulação inadequada pode inviabilizar a identificação

dos animais (Fig. 25).

É possível confeccionar bons estiletes de ponta fina

para triagem utilizando agulhas descartáveis acopladas a

bastões de madeira (Fig. 26).

Fig. 25 - Forma correta de transportar copépodes harpacticóides comestilete de ponta fina ou chanfrada.

25

29

QUADRO 8 (CONT.)

Um outro instrumento usado na manipulação de

copépodes é a pipeta Pasteur de ponta bem fina (Fig. 27),

que deve ser utilizada com atenção, pois os animais podem

aderir à superfície interna da pipeta.

Fig. 27 - Diferentes tipos de pipetas utilizadas para triagemde copépodes harpacticóides: as três superiores são deplástico, as duas inferiores de vidro com bulbo de látex.

Fig. 26 - Material utilizado na confecção de estiletes deponta fina para triagem de copépodes harpacticóides.

26

27

30

QUADRO 9. RECIPIENTES ADEQUADOS PARAESTOCAGEM

Podem ser utilizados recipientes plásticos ou de vidro

com tampas plásticas (Fig. 28A), tomando cuidado de

verificar periodicamente a integridade da tampa e o nível

do líquido preservativo.

Um frasco que vem apresentando ótimos resultados

quando há necessidade de longo tempo de estocagem é

o tubo de polipropileno com tampa de rosquear e com

anel interno vedante (Screw cap tube) (Figs. 28B–C).

Fig. 28A - Diferentes tipos de recipientes utilizados para estocagem decopépodes harpacticóides. Fig. 28B - Tubos de polipropileno comtampa de rosquear (Screw cap tube). Fig. 28C - Detalhe da tampa derosquear do screw cap tube, com anel interno vedante.

28A

28B 28C

31

QUADRO 10. CADERNO DE CONTROLE E FICHASDE CONTROLE (TABELA1)

Freqüentemente, coletas com grandes quantidades

de amostras passam por longos períodos de estocagem

antes de serem triadas e identificadas. Por isso é necessário

que cada material processado tenha anotações com

detalhes sobre a coleta e dados ecológicos, arquivados

de forma permanente.

5.2. SEPARAÇÃO DE MORFOTIPOS

Segundo HUYS et al. (1996), o método mais eficiente para

triar grandes quantidades de amostras é separar os copépodes

em “supostas” espécies, reunindo os indivíduos adultos em grupos

de animais com o mesmo morfotipo.

Tabela 1. Exemplo de ficha para controle de triagem das estações,amostras e subamostras, e informações sobre o No de copépodesharpacticóides encontrados.

Local de coleta:___________________ Data:___/___/______

Estações Amostras Sub-amostras No Indivíduos

Total:

Observações:

32

PROCEDIMENTO:

1. transferir os animais dos recipientes de estocagem para uma

placa de Petri pequena, câmara de contagem ou lâmina escavada,

com o auxílio de uma pipeta de ponta fina. Cuidado para que

não fiquem animais nas paredes do recipiente ou da pipeta;

2. observar as características da morfologia externa dos copépodes

harpacticóides (Quadro 11) com auxílio de um estéreo-microscópio.

3. separar os animais da amostra em grupos de mesmo morfotipo

(Figs. 29A–B);

Fig. 29A - Amostra contendocopépodes harpacticóides.

Fig. 29B - Amostra de copépodesharpacticóides agrupados pormorfotipos

29A

29B

33

4. transferir cada um dos grupos para diferentes lâminas

escavadas (Fig. 30);

5. dar um código de identificação para cada morfotipo. Podem

ser utilizados números, letras, junção de número/letra (Fig. 31);

6. anotar as informações relacionadas ao material (Tabelas 2 e 3);

Tabela 2. Ficha de controle do No de indivíduos de cada morfotipo encontradonas estações triadas.

Fig. 30 - Conjunto de lâminas escavadas, cada uma contendo um morfotipode copépode harpacticóide.

Fig. 31 - Exemplo de código de identificação (Sp 01) para morfotipos de copépodesharpacticóides (St 07i – refere-se a estação de coleta e o período do ano).

30 31

Local:__________________________ Data:______________

Código Estações

Morfotipo 1 2 3 4 5

12345678910

34

Tabela 3. Ficha com todas as características taxonômicas a serem observadasem copépodes harpacticóides.

espaços para anotar as coordenadas das peças em cada lâmina;

espaços para anotar a identificação;

espaço para desenho esquemático do morfotipo.

Pernas Perna 1 Perna 2 Perna 3 Perna 4 Perna 5 Perna 6

coxa: base: exópodo:endópodo:

Corpo Forma:____________Ornamentação:____________

Rostro _____________

AntênulaNo Art.:_____________

Fórmula:_____________

Antenaexópodo:_____________

endópodo:_____________

Mandíbula_________________________________________________________________________________

Maxílula______________________________________________________

Maxila______________________________________________________

Maxilípede____________________________

Labro_______________________________________________________

Família:Gênero:Espécie:

Local:_______________ Estação:_______________ Data de coleta:_______________ No Espécie

Somito GenitalGonóporo:_____________

Poros copulatórios:_____________Receptáculo seminal:______________

Saco ovígero:_____________

Desenho

Somito anal o opérculo o pseudopérculo ânus: o terminal o dorsal

Ramo caudal Cerdas:________________

35

7. fazer um desenho esquemático (Fig. 32) ou tirar fotos,

ressaltando as principais características observadas nos diferentes

morfotipos (Tabela 3);

Fig. 32 - Desenho esquemático de morfotipo de copépode harpacticóide.

32

36

8. transferir cada morfotipo para recipiente etiquetado e

contendo solução de formalina a 4% tamponada ou álcoool

etanol a 70%;

9. a cada nova amostra, os morfotipos separados devem ser

comparados com as ilustrações e anotações prévias. Caso sejam

encontrados morfotipos já observados em amostras triadas

anteriormente, usar o mesmo código de identificação.

QUADRO 11. CARACTERÍSTICAS DA MORFOLOGIAEXTERNA DOS COPÉPODES HARPACTICÓIDES

A terminologia utilizada para descrever a morfologia

externa e uma boa discussão sobre a estrutura geral do

corpo de copépodes harpacticóides pode ser encontrada

em HUYS & BOXSHALL (1991), HUYS et al. (1996),

BOXSHALL & HALSEY, 2004. Um pequeno resumo sobre

esse tópico pode ser encontrado no apêndice.

Segue abaixo uma lista de características de fácil

observação:

• Corpo - Forma e tamanho (Figs. 33A–G).

33A

37

QUADRO 11 (CONT.)

Fig. 33 - Diferentes formas do corpo que podem ser encontradas emcopépodes harpacticóides. Nomenclatura adaptada de Hicks & Coull(1983). A - Cilíndrico. B - Sub-cilíndrico. C - Deprimido. D - Piriforme.E - Fusiforme. F - Fusiforme deprimido. G - Fusiforme comprimido.Barra de escala = 200 μm.

33B 33C 33D

33E 33F 33G

38

QUADRO 11 (CONT.)

• Rostro - Forma e tamanho (Figs. 34A–E).

Figs. 34 - Diferentes tipos de rostroque podem ser encontrados emcopépodes harpacticóides. A -Com ápice bífido. B - Hialino, nãodefinido na base e obtuso naregião anterior. C - Triangular enão definido na base. D -Proeminente, com parte apical emângulo agudo. E - Largo ealongado, atingindo a margemdistal do 2º artículo da antênula.Barra de escala A–D = 100 μm, E= 50 μm.

34A

34B

34C

34D

34E

39

QUADRO 11 (CONT.)

• Antênulas - Forma e tamanho (Figs. 35A–C).

• Ramo caudal - Forma e tamanho (Figs. 36A–E)

Figs. 35 - Diferentes tipos de antênula que podem ser encontrados emcopépodes harpacticóides. A - Delgada, na qual a maioria dos artículosé mais longa que larga. B - Robusta, na qual a maioria dos artículos émais larga que longa. C - Delgada, com processo em forma de espinhono 2º artículo. Barra de escala A = 50 μm, B = 100 μm e C = 200 μm.

35A

35B

36A

36B

35C

40

• Pernas - Detalhes característicos como: redução no No

de artículos, artículos das pernas alongados, perna preênsil

ou com garras (Figs. 37A–B).

Fig. 36 - Diferentes tipos de ramos caudais que podem ser encontradasem copépodes harpacticóides. A - Mais longo que largo, com bordaexterna irregular e borda interna côncava. B - Mais largo que longo.C - Mais longo que largo e com borda interna convexa. D - Comlargura e comprimento semelhantes. E - Mais longo que largo,triangular, com região proximal mais larga e região distal mais afilada.Barra de escala A = 200 μm, B–E = 100 μm.

Fig. 37 - Diferentes tipos de pernas que podem ser encontrados emcopépodes harpacticóides. A - Perna 1 alongada e terminando emgarra. B - Perna 5 alongada e com cerdas plumosas bastanteproeminentes. Barra de escala A–B = 200 μm.

36C 36D 36E

37A 37B

QUADRO 11 (CONT.)

41

QUADRO 11 (CONT.)

• Dimorfismo sexual - Machos geralmente menores que as

fêmeas, com antênulas geniculadas e completa separação

dos segmentos 2 e 3 do urossomo (Figs. 38A–C).

Fig. 38 - Dimorfismo sexual em copépodes harpacticóides. A - Tamanhodo corpo: machos geralmente menores que as fêmeas. B - Antênulas:machos com antênulas geniculadas para segurar a fêmea durante acópula . C - Urossomo: 2o e 3o segmentos do urossomo dos machostotalmente separados; nas fêmeas esses segmentos geralmenteencontran-se fundidos, formando o segmento genital duplo (SG). Barrade escala A e C = 200 μm, B = 100 μm.

38A 38C

38B

42

6. PREPARAÇÃO DE LÂMINAS

6.1. PRÉ-TRATAMENTO DO MATERIAL

6.1.1. SELEÇÃO

Para identificação ao nível de espécie devem ser

selecionados animais adultos de cada morfotipo que estejam

em bom estado para observação e dissecção.

6.1.2. LIMPEZA

Caso o material esteja muito sujo, HUYS & BOXSHALL

(1991) sugerem pipetar o animal várias vezes até que os detritos

se soltem ou colocá-lo no interior de um recipiente pequeno

com 2/3 de líquido e agitar vigorosamente.

Uma outra técnica consiste em firmar o animal, de porte

relativamente grande, com a ponta de um estilete e passar um

pincel ou outro estilete com cuidado sobre o corpo, afim de

retirar os detritos.

6.1.3. CLAREAMENTO

Como a taxonomia de copépodes se baseia

principalmente em sua morfologia externa, é necessário

reconhecer as estruturas do tegumento para que seja possível

43

a identificação. REID (2000) fornece um procedimento

detalhado para a remoção de tecidos e clareamento do

exoesqueleto.

Normalmente, colocar o animal em ácido láctico a 85%

é suficiente para remover material aderido ao exoesqueleto

(Figs. 39A–B), clarear e tornar a cutícula mais flexível (Figs.

39 C–D).

Fig. 39A - Detritos aderidos à fileira de espinhos do prossomo de umcopépode harpacticóide. B - Remoção dos detritos após tratamento comácido láctico. C - Copépode harpacticóide sem passar por processo declareamento. D - O mesmo copépode da figura C após tratamento comácido láctico.

39A 39B

39C 39D

44

O tempo de imersão no agente clarificante irá variar de

acordo com o animal a ser observado. Entretanto, não se

recomenda a permanência em ácido láctico por longos períodos,

pois o exoesqueleto tornar-se-á muito fino e o material perde

sua integridade.

6.2. DISSECÇÃO

O processo de dissecção é reconhecido por grande parte

das pessoas que trabalham com a taxonomia de copépodes

harpacticóides como a etapa mais difícil do estudo desse grupo

(REID, 2000).

Apesar de ser um procedimento delicado e trabalhoso, na

maioria dos casos é necessária a montagem de lâminas com as

peças dissecadas e sua detalhada observação para identificação

conclusiva do material. Recomenda-se que pessoas pouco

familiarizadas com essa técnica sejam assistidas por outras mais

experientes (HUYS et al.,1996).

Outras técnicas de dissecção podem ser encontradas em

HUMES & GOODING (1964), HAMOND (1969) e COULL

(1973).

PROCEDIMENTO adaptado de HUYS & BOXSHALL (1991):

1. colocar uma gota de glicerina em lâmina de vidro;

2. dispor o material a ser dissecado na borda da gota, sob o

maior aumento do estéreo-microscópio;

45

3. apoiar lateralmente o animal com estilete para dissecção

(Quadro 12) e utilizar outro estilete para efetuar o corte (Figs.

40A–C);

4. separar o prossomo do urossomo (Fig. 41);

5. separar a perna 5 do urossomo (Fig. 41);

6. tomar o prossomo e separar cada uma das pernas (Fig. 41);

7. dissecar os apêndices cefálicos (Fig. 41);

8. se as peças dissecadas forem grandes o suficiente, transferir

cada uma delas para uma nova lâmina. Em animais muito

pequenos, as peças bucais podem permanecer juntas;

Figs. 40A–C - Posicionamento dosestiletes no processo de dissecção deum copépode harpacticóide.40A

40B 40C

46

9. realizar a montagem de lâminas temporárias (Item 6.3.1) ou

semi-permanentes (Item 6.3.2), dependendo do objetivo do

estudo;

10. identificar adequadamente a lâmina com etiqueta ou caneta

de retro-projetor.

Fig. 41 – Etapas da dissecção de um copépode harpcticóide.

47

QUADRO 12. ESTILETE PARA DISSECÇÃO

Para a dissecção, utilizam-se dois estiletes

confeccionados com alfinetes entomológicos (000) presos

na extremidade de ponteiras descartáveis de micropipeta.

As ponteiras são acopladas a bastões de madeira de

aproximadamente 10 cm (Figs. 42A–B).

Fig. 42A - Material utilizado na confecção de estiletes para dissecçãode copépodes harpacticóides.

Fig. 42B - Detalhe da ponteira de micropipeta e alfinetes entomológicos.

42A

42B

48

QUADRO 12 (CONT.)

Pode-se utilizar o alfinete entomológico preso

diretamente ao suporte de alfinetes. O importante é que a

ponta esteja afiada e o alfinete firme o suficiente para

promover os cortes necessários (Fig. 42C).

HUYS & BOXSHALL (1991) confeccionam as pontas

dos estiletes de dissecção com fio de tungstênio (Ø = 0,3

mm) afiado por eletrólise. Um pedaço de fio de 20 mm é

imerso em solução saturada de hidróxido de sódio ou

potássio com eletrodo conectado a fonte de 6 V

(iluminação de estéreo microscópio) (Figs. 43A–C).

Fig. 42C - Estilete de metal utilizado na dissecção de copépodesharpacticóides.

42C

49

Figs. 43 - Aparato utilizado para afilar as pontas de tungstênio dosestiletes de dissecção. A - Vista geral. B - Vista lateral, mostrando aposição dos eletrodos e do estilete. C - Detalhe do suporte para estiletee da disposição dos eletrodos.

43A

43C

43B

QUADRO 12 (CONT.)

50

6.3. MONTAGEM DE LÂMINAS

6.3.1. MONTAGEM TEMPORÁRIA

Procedimento recomendado nos casos em que não há

necessidade da preservação do material em lâmina por longo

período de tempo.

Esse tipo de montagem pode ser utilizado como forma de

verificar se um grupo de espécimes pertence a uma mesma espécie.

Vários animais podem ser montados na mesma lâmina para

observação sob microscópio óptico. Após a análise é possível

retornar os indivíduos para seus recipientes de estocagem.

Às vezes a montagem temporária do animal inteiro é

suficiente para identificação de família ou gênero e até espécie,

se a fauna da região estudada for bem conhecida (HUYS et

al.,1996).

HUYS & BOXSHALL (1991) recomendam cuidado ao

montar lâminas, sejam elas temporárias ou semi-permanentes,

para que o material não receba pressão em demasia. Isso

acarretaria a perda da forma e configuração natural do corpo e

segmentos, o que poderia levar a interpretações errôneas sobre

a morfologia do animal observado.

PROCEDIMENTO:

1. colocar uma pequena gota de glicerina no centro da lâmina

histológica (Quadro 13) (Fig. 44);

51

2. com a ponta de um estilete, depositar o material no centro da

gota (Figs. 45A–B);

Fig. 44 - Depósito de gota de glicerina no centro de lâmina histológica.

Fig. 45A - Transferência de material para o centro da gota, com auxílio de estilete.

Fig. 45B - A seta indica material na gota de glicerina.

44

45A

45B

52

3. colocar um fragmento de lamínula para apoiar a borda da

lamínula (Quadro 14) de cobertura ou um anel plástico (Quadro

15), evitando que o material seja esmagado e possibilitando a

sua manipulação (Figs. 46A–B). A altura do calço deve variar de

acordo com a espessura do animal a ser examinado;

4. encostar uma das bordas da lamínula da preparação na região

seca da lâmina e descer cuidadosamente a borda oposta sobre

o material (Figs. 47A–C). É importante que não se formem bolhas

de ar na montagem;

Figs. 46A - Colocação de fragmento de lamínula para servir de suporte paraa lamínula da preparação. 46B - Detalhe.

46A

46B

53

5. sob um estéreo-microscópio, o observador poderá movimentar

a lamínula da preparação com seus dedos ou através de toques

leves com um estilete de forma orientar o material e obter a

melhor visualização possível do animal interio ou de algum

detalhe de sua morfologia;

6. etiquetar a lâmina com dados que permitam a identificação

do material (referência do morfotipo, sexo, procedência etc.)

(Fig. 48).

Figs. 47A–B - Colocação da lamínula da preparação. Fig. 47C - Montagemconcluída.

47C

47A 47B

54

QUADRO 13. LÂMINA DE VIDRO

Recomenda-se a utilização de lâminas histológicas

com tamanho padrão de 75 X 25 mm e espessura variando

0,8–1,1 mm (Fig. 49).

Fig. 48 – Exemplo de identificação da preparação.

Fig. 49 - Lâminas de vidro utilizadas em montagens temporárias ousemi-permanentes.

48

49

55

QUADRO 14. LAMÍNULA

Normalmente utilizam-se lamínulas quadradas ou

redondas No 1, 1/2 ou 0. O tamanho da lamínula pode

variar de acordo com o material a ser montado. Para

animais inteiros, 20 X 20 ou 18 X 18 mm; para peças

dissecadas, 15 X 15 mm (Fig. 50).

QUADRO 15. ANEL PLÁSTICO

Esse tipo de calço pode ser

encontrado em papelarias como

reforço de folhas de fichário (Fig. 51).

Deve-se colar o anel plástico no meio

da lâmina (Fig. 52), e repetir o

procedimento de montagem de

lâmina temporária. A altura do calço

pode ser ajustada de acordo com a

espessura do animal a ser examinado,

colocando-se um anel sobre o já

colado sobre a lâmina (Fig. 53).

Fig. 51 - Anel plástico autoadesivo. Fig. 52 - Colocação de anel plásticopara servir de suporte para a lamínula da preparação. Fig. 53 -Sobreposição de anéis para ajuste da altura do calço.

Fig. 50 - Diferentes tipos de lamínulas quepodem ser util izadas em montagenstemporárias ou semi-permanentes. 50

51

52

53

56

6.3.2. MONTAGEM SEMI-PERMANENTE

A identificação do material ao nível de espécie pode ser

realizada através de uma montagem temporária das peças

dissecadas e sua observação detalhada. Entretanto, no caso de

espécies raras, novas ou já conhecidas mas descritas de forma

incompleta, é necessária a montagem de lâminas semi-

permanentes.

Esse processo possibilita o estudo do material por um

período de tempo prolongado, permitindo uma observação mais

detalhada e o desenho das partes taxonomicamente importantes

do animal.

A montagem semi-permanente propicia uma melhor

preservação dos espécimes montados nas lâminas para depósito

em instituições ou coleção de referência do próprio pesquisador.

PROCEDIMENTO:

As etapas de 1 a 4 são as mesmas sugeridas para a

preparação de montagens temporárias. No caso de se optar

por utilizar gelatina glicerinada como meio, ver procedimento

recomendado no Quadro 16.

1. colocar uma pequena gota de meio de montagem (Quadro

16) no centro de lâmina histológica e depositar o material com

auxílio de um estilete;

2. colocar calço e cobrir com lamínula;

57

3. com o auxílio do estéreo-microscópio, orientar o material de

forma a obter a melhor visualização;

OBS: O urossomo deve ser posicionado com a face ventral

voltada para o observador e as pernas com a face anterior;

4. etiquetar a preparação;

5. observar o material sob microscópio óptico e com auxílio de

charriot graduado (Figs. 54A–B), localizar as partes dissecadas,

anotando as coordenadas (Tabela 3);

Fig. 54A - Charriot graduado.

Fig. 54B - Detalhe das marcações das coordenadas do charriot graduado.

54A

54B

58

6. quando não houver mais a necessidade da movimentação

do material para observação ou desenho, retirar lenta e

cuidadosamente o calço de fragmento de lamínula (Figs. 55A–B).

Se o material for muito espesso e correr risco de esmagamento,

manter o calço empurrando-o para debaixo da lamínula (Figs.

55C–D);

7. encostar um pedaço de papel de filtro nas bordas da lamínula

quando houver necessidade de remoção de excesso do meio de

montagem (Figs. 56A–B);

8. guardar as lâminas em laminário (Quadro 17), na posição

horizontal até que o meio se estabilize;

Figs. 55A–B - Retirada do calço da lamínula.

Figs. 55C–D - Manutenção do calço, empurrando-o sob a lamínula decobertura.

55A 55B

55C 55D

59

9. selar com esmalte de unha incolor (Figs. 57A–B).

Figs. 56A–B - Retirada do excesso de meio de montagem utilizando-se tirasde papel de filtro.

Figs. 57A–B - Selagem de lâmina semi-permanente com esmalte de unhaincolor.

56A

56B

57A 57B

60

QUADRO 16. MEIOS DE MONTAGEM

Vários meios podem ser utilizados para a montagem

de lâminas semi-permanentes. Os mais comuns são:

Glicerina

Fornece bom contraste para observação ao

microscópio óptico. Por ser líquido e se manter estável por

longo período de tempo, possibilita a manipulação e re-

orientação do material montado.

Em locais quentes e úmidos, recomenda-se a adição

de formalina 1% para impedir o aparecimento de fungos

e bactérias.

Cuidado – pode atrair formigas e outros insetos.

CMC®

Pode ser comprado pronto ou preparado em

laboratório (REID, 2000). Está disponível em diferentes

graus de viscosidade (CMC-9 pouco viscoso, CMC-10

muito viscoso) e com ou sem a adição de corante.

O meio começa a ficar muito viscoso 5–10 minutos

após ser depositado na lâmina, portanto é recomendável

uma rápida dissecção do material no próprio CMC ou a

montagem de peças já dissecadas.

61

QUADRO 16 (CONT.)

Caso o meio se retraia alguns dias após a montagem

da lâmina, preencher o espaço com mais CMC, esperar

secar e selar.

Lactofenol

Recomendado por HUYS & BOXSHALL (1991) para

a montagem de espécimes-tipo para coleção, por se

manter estável indefinidamente e não produzir clareamento

excessivo do material.

Receita – REID (2000)

Ingredientes:

• 30 ml de cristais de fenol derretidos

• 10 ml de ácido láctico

• 20 ml de glicerina

• 10 ml de água destilada

Preparo:

1. colocar todos os ingredientes em um recipiente

de vidro;

2. misturar com um bastão de vidro;

3. armazenar em frasco hermeticamente fechado.

62

QUADRO 16 (CONT.)

Gelatina glicerinada

Meio bastante utilizado, promove um clareamento

suave do material e com a adição do fenol, não há

desenvolvimento de fungos e bactérias.

Receita - MORHOLT et al. (1966)

Ingredientes:

• 10g de gelatina em folha de boa qualidade

• 60ml de água destilada

• 70ml de glicerina pura a 30o C

• 1g de fenol concentrado

Preparo:

1. cortar a gelatina em pequenos pedaços e deixar

de molho em água destilada por 2 horas;

2. derreter a gelatina em banho-maria (40 oC);

3. adicionar a glicerina e o fenol e misturar com

um bastão de vidro;

4. transferir a gelatina para dois frascos enquanto

a mistura ainda estiver liqüefeita. Utilizar um frasco

grande para solução estoque e um pequeno para

solução de uso imediato. Isso evita o constante re-

aquecimento de toda a mistura.

63

QUADRO 16 (CONT.)

Procedimento:

• colocar a solução para uso imediato de gelatina

glicerinada em banho-maria para liqüefação do

meio;

• como esse meio passa do estado líquido para

sólido em curto período de tempo, não é

recomendável proceder a dissecção em gelatina.

É preferível dissecar o material em glicerina e

transportar as peças para o meio final;

• para re-orientar o material, aquecer a lâmina em

placa quente à 40 oC e deslizar a lamínula com

cuidado até atingir a posição adequada;

• caso haja excesso de meio de montagem, esperar

que ele se solidifique e cortar com lâmina de bisturi

ou gilete;

• estocar em local fresco e não aproximar as lâminas

de lâmpadas e outras fontes de calor que possam

liqüefazer o meio.

64

QUADRO 17. LAMINÁRIO

Caixa para guardar lâminas

montadas com material de estudo

(Fig. 58). Podem guardar as

lâminas recém montadas na

posição horizontal por curto

período de tempo ou lâminas semi-

permanentes já estudadas.

7. IDENTIFICAÇÃO

A ordem Harpacticoida possui cerca de 3000 espécies

marinhas distribuídas em 460 gêneros e 50 famílias (HUYS et

al.,1996; BODIN, 1997). Entretanto, acredita-se que muitas

espécies ainda estão por serem descobertas.

Para que seja possível a correta identificação de espécies,

é necessário reconhecer a morfologia geral dos copépodes

harpacticóides e dominar a terminologia utilizada nas chaves de

identificação. Uma proposta de padronização da nomenclatura

morfológica atual do grupo pode ser encontrada em HUYS &

BOXSHALL (1991).

Segundo WELLS (1988), os caracteres normalmente

utilizados para identificação de copépodes harpacticóides são

Fig. 58 - Diferentes tipos de laminários. 58

65

todos externos, e na maioria das vezes, de fácil visualização ao

se observar, ao microscópio óptico, a superfície do corpo, as

antênulas, as antenas, os maxilípedes, as pernas1–5 e os ramos

caudais do animal.

WELLS (1976), COULL (1977), HUYS & BOXSHALL (1991),

HUYS et al. (1996) e DUSSART & DEFAYE (2001) ilustraram os

caracteres taxonomicamente importantes para o estudo do grupo.

Chaves de identificação pictóricas, como as de HUYS et al.

(1996), possibilitam o rápido reconhecimento desses caracteres,

facilitando em muito o trabalho de identificação.

Outras obras fundamentais para o estudo taxonômico dos

copépodes harpacticóides são as de SARS (1911, 1921), LANG

(1948, 1965), WELLS (1978, 1979, 1981, 1983, 1985) e

BOXSHALL & HALSEY (2004).

PROCEDIMENTO:

1. proceder a montagem temporária de um indivíduo inteiro,

preferencialmente uma fêmea (Item 6.3.1);

2. observar o material sob microscópio óptico (Quadro 18), de

preferência utilizando recursos de contraste de fase e/ou

interferência diferencial;

3. anotar as observações (Tabela 3) e/ou utilizar chave de

identificação;

4. caso a identificação não tenha sido conclusiva, dissecar o

animal (Item 6.2);

5. montar as peças em lâminas temporárias (Item 6.3.1);

66

6. observar o material sob microscópio óptico;

7. anotar as características de cada peça dissecada (Tabela 3)

e/ou utilizar chaves de identificação;

8. anotar a identificação do animal (Tabela 3);

9. retornar o espécime para o frasco ou fazer preparação semi-

permanente.

QUADRO 18. MICROSCÓPIO ÓPTICO(WESTHEIDE & PURSCHKE,1988)

Para análises-padrão, recomenda-se a utilização de

um microscópio que possua objetiva com aumento de

100X e imersão.

Como a maioria dos animais a ser estudada passa

pelo processo de clareamento, devem ser utilizadas

técnicas especiais de iluminação para evidenciar diferentes

estruturas.

Os recursos mais comuns são:

• contraste de fase - a imagem fica mais clara ou escura

destacando-se do fundo. Ideal para a observação de

pequenos detalhes como fileiras de espínulos, cerdas e

plumosidades (Figs. 59A–B);

• contraste de interferência diferencial - a polarização da

luz produz imagens tridimensionais, o que possibilita a

67

observação de detalhes em relevo na superfície do material.

Como a imagem fica livre de halos luminosos e parece

receber iluminação oblíqua, é o recurso mais adequado

para obtenção de fotomicrografias (Figs. 60A–B).

Bons resultados têm sido obtidos com microscópio de

varredura laser confocal (BUNDY & PAFFENHÖFER, 1993;

GALASSI et al., 1998; CAROTENUTO, 1999; BUTTINO et

al., 2003; KLAUS & SCHAWAROCH, 2006 e MICHELS, 2007).

Fig. 60A - Imagem fornecida por microscópio óptico com iluminaçãoconvencional. Fig. 60B - Imagem obtida utilizando-se recurso decontraste de interferência diferencial.

Fig. 59A - Imagem obtida ao microscópio óptico com iluminaçãoconvencional. Fig. 59B - Imagem obtida utilizando-se recurso decontraste de fase.

59B59A

60B60A

68

7.1. TÁXON NOVO

PROCEDIMENTO:

1. proceder a montagem temporária (Item 6.3.1) de indivíduos

adultos de cada sexo;

2. observar o material ao microscópio óptico com câmara clara

(Quadro 19) acoplada;

3. tomar medidas (Quadro 20) do comprimento total, do

prossomo e do urossomo;

4. desenhar o animal inteiro (Item 7.1.1);

5. caso o microscópio tenha recurso fotográfico, tirar

fotomicrografias (Quadro 21);

6. dissecar os animais (Item 6.2);

7. montar as peças em preparações semi-permanentes (Item

6.3.2);

8. desenhar as peças (Item 7.1.1) e, se necessário, tirar

fotomicrografias;

9. descrever e designar o novo táxon (Quadro 22);

10. depositar o material (Quadro 23) em museus

(preferencialmente) ou instituições de pesquisa.

69

QUADRO 19. CÂMARA CLARA

Dispositivo de desenho que permite a representação

do material observado ao microscópio (Figs. 61A–B).

Composto por prisma e espelho acoplados em um braço

extensível (Fig. 61C), a câmara clara projeta o objeto

observado sobre o papel, fornecendo uma visão do

conjunto e possibilitando o desenho (Fig. 61D).

Figs. 61A–B - Microscópio óptico com câmara clara acoplada (seta).Fig. 61C - Detalhe do braço extensível da câmara clara. Fig. 61D -Imagem do espécime projetada sobre o papel.

61B61A

61D61C

70

QUADRO 20. TOMADA DE MEDIDAS

A técnica mais simples é comparar o material

diretamente com a escala.

• Desenhar o animal inteiro ou peças dissecadas (Figs.

62A–C).

• Sem modificar os ajustes do microscópio, colocar lâmina

com gradícula (pequena régua) e focar (Fig. 63A–C).

Figs. 62A–C - Desenho de material com auxílio de câmara clara.

Fig. 63A - Lâmina micrométrica.Fig. 63B - Detalhe da regiãocentral da lâmina, com grademicrométrica. Fig. 63C - Réguamicrométrica vista ao microscópioóptico, aumento de 10X.

62B62A 62C

63B63A

63C

71

QUADRO 20 (CONT.)

• Traçar a escala ao lado do desenho (Figs. 64A–D).

Alguns microscópios possuem oculares com retículo

micrométrico, o que facilita a tomada das medidas do

material.

Figs. 64A–D - Colocação de escala em desenho realizado com auxíliode câmara clara.

64A 64B

64C

64D

72

QUADRO 20 (CONT.)

Para medir o comprimento total do animal ou de

diferentes tagmas (cefalotórax, prossomo e urossomo) utilizando

a câmara clara, proceder como indicado nas Figs. 65:

Fig. 65A - Traçar linha querepresente o comprimento total doanimal.

Fig. 65B - Delimitar o comprimentodo prossomo e do urossomo.

Fig. 65C - Substituir a lâminacontendo o espécime, pela lâminacom régua micrométrica, semmodificar os ajustes domicroscópio, colocar a gradícula.

Fig. 65D - Traçar a barra de escala.

Fig. 65E - Anotar o valor da barrade escala.

Figs. 65A–E - Medição do comprimento total do corpo, do prossomoe do urossomo de copépodes harpacticóides.

65A 65B

65C

65D 65E

73

QUADRO 21. FOTOMICROGRAFIAS

As fotomicrografias são obtidas quando o estéreo-

microscópio ou o microscópio óptico possuem recursos

fotográficos acoplados que possibilitam o registro acurado

da imagem para futuras referências.

Apesar de ser uma forma interessante de mostrar

detalhes taxonômicos, a impossibilidade de retratar o

aspecto tridimensional do animal ou de um apêndice em

particular faz com que fotografias não sejam capazes de

substituir os desenhos na descrição de espécies.

Atualmente utilizam-se câmeras digitais como

recurso de captura de imagens. Esse processo de

digitalização da imagem tem demonstrado vantagens em

termos de obtenção de melhor resolução e fidelidade de

cores quando se trabalha com pouca intensidade luminosa

(maiores aumentos do microscópio).

Outra vantagem das imagens digitalizadas é a maior

flexibilidade na manipulação e armazenamento de dados

com economia de tempo, esforços e custos para a

realização de ilustrações adequadas.

Recursos como o microscópio confocal também

possibilitam uma imagem mais acurada, já que apresenta

um melhor contraste que o microscópio convencional, sendo

possível a reconstrução tri-dimensional do volume do material

pela sobreposição de finas camadas seriadas, tomadas ao

longo de seu eixo vertical (SEMWOGERERE & WEEKS, 2005).

74

QUADRO 22. DESCRIÇÃO E DESIGNAÇÃO DENOVO TÁXON

A descrição de um novo táxon deve auxiliar outros

pesquisadores que tenham interesse no grupo, fornecendo

o máximo de informações possíveis sobre os caracteres

observados. Os tipos devem ser descritos e designados de

acordo com as regras do Código Internacional de

Nomenclatura Zoológica (ICZN,1999).

Maiores informações sobre descrições taxonômicas

podem ser encontradas em MAYR (1969), HULINGS &

GRAY (1971), PAPAVERO (1994) e DUSSART & DEFAYE

(2001). Consultar a literatura disponível sobre o grupo

estudado também é de grande auxílio na elaboração da

descrição de um novo táxon.

QUADRO 23. DEPÓSITO DE MATERIAL

Lotes de espécimes identificados, sejam eles

constituídos de tipos de um novo táxon descrito ou de

material – testemunho, devem ser depositados em um museu

ou instituição que disponha de coleção com curadoria.

O material pode estar montado em lâmina semi-

permanente ou em via úmida, de preferência álcool a 70%.

Espécimes inteiros em via úmida, quando mantidos

75

QUADRO 23 (CONT.)

adequadamente, se preservam por tempo indefinido. O

material montado em lâminas semi-permanentes, por

melhor que seja a manutenção, tendem a se deteriorar

com o passar dos anos.

Espécimes inteiros preservados em álcool etanol a 70%

com 1% de glicerina devem ser colocados em pequenos tubos

de vidro fechados com algodão e imersos invertidamente

em álcool dentro de um tubo maior, também fechado com

um tufo de algodão. A etiqueta do conjunto de tubos deve

ser colocada dentro do frasco maior com tampa e batoque,

de modo a evitar contato com o material e possível dano dos

espécimes a serem depositados (Figs. 66A–B).

Os frascos contendo os animais devem ser checados

periodicamente para que não ocorram a evaporação total do

álcool e conseqüente deterioração do material (REID, 2000).

Número de catálogos ou de identificação devem

ser incluídos nas descrições, tornando o material disponível

para qualquer outro pesquisador interessado.

Figs. 66A–B - Frasco contendo animais inteiros a serem depositadosem instituto de pesquisa.

66A 66B

76

7.1.1. DESENHO DO MATERIAL

Artigos de taxonomia requerem ilustrações de vistas totais

dos animais e detalhes de sua morfologia que auxiliem o

entendimento do texto descritivo.

PROCEDIMENTO:

1. utilizar microscópio óptico com câmara clara acoplada;

2. desenhar o animal inteiro utilizando-se objetiva adequada

para mostrar detalhes de interesse taxonômico. Peças dissecadas

devem ser examinadas com objetivas de maior aumento e/ou

imersão;

3. utilizar lápis com grafite macio e folha sulfite A3 ou A4,

dependendo do tamanho do desenho;

4. anotar na folha a legenda de cada desenho: No de

identificação ou nome da espécie; sexo; peça desenhada

(ex: maxila, hábito, P5,...); orientação da peça (ex: ventral,

anterior, ...); aumento da objetiva; data do desenho; escala do

desenho e qualquer outra informação pertinente (Fig. 67);

5. utilizar ficha para controle dos desenhos (Tabela 4);

6. montar pranchas (Quadro 24) das ilustrações;

7. cobrir as pranchas com papel vegetal e copiar os desenhos a

nanquim (Quadro 25);

77

8. colocar legenda e barra de escala na prancha final

manualmente (transfer gráfico) ou “escanear” a prancha em

vegetal e adicionar legenda e escala utilizando programa de

computador para tratamento de imagem (Quadro 26).

9. fotocopiar a prancha a nanquim reduzindo para formato

especificado nas Instruções aos Autores fornecidas pelo periódico

escolhido para a publicação do artigo.

Fig. 67 - Desenho de uma perna de copépode harpacticóide, feito aomicroscópio óptico com auxílio de câmara clara mostrando as legendasexplicativas.

67

78

Tabela 4. Ficha de controle de desenho em que são listadas as estruturas aserem utilizadas para ilustrar as publicações taxonômicas de copépodesharpacticóides.

Hábito

Urossomo

Ramo caudal

Perna

Labrum

Lábio

Paragnatas

Mandíbula

Maxila

Maxílula

Maxilípede

Antênula

Antena

Dorsal

Ventral

Dorsal Opérculo anal

Ventral P5

Complexo genital

Dorsal

Lateral

Ventral

1

2

3

4

5

6

Dorsal

Lateral

Ventral Formato c/ rostro

Explodido

CONTROLE DOS DESENHOS

Código:________ Família:________

Gênero:________ Espécie:________

Fêmea Macho

79

QUADRO 24. PRANCHAS

Reduzir ou ampliar os desenhos a lápis feitos com a

câmara clara, através de xerox ou scanner. Considerar o

tamanho final ao qual a prancha deverá ser reduzida para

que as figuras não percam a clareza (Fig. 68).

Fig. 68 - Prancha de tamanho A3, montada com recortes de desenhosampliados.

68

80

QUADRO 24 (CONT.)

Recortar as figuras e montar os recortes em papel

sulfite A3. As figuras devem ficar dispostas de forma

harmônica, da direita para esquerda, da margem superior

para a inferior, e ordenadas segundo a ordem em que

são mencionadas no texto descritivo.

Ao se preparar pranchas deve-se deixar margens

superior, esquerda e direita de cerca de 2 cm. A margem

inferior deve ser mais ampla para permitir a inserção da

legenda da figura.

QUADRO 25. DESENHOS A NANQUIM

Material (Fig. 69)

• Papel vegetal de boa qualidade (83g ou mais)

• Canetas especiais para desenho a nanquim (nacionais

ou importadas) com espessura do traço de 0,1; 0,2 e

0,3 mm

• Tinta nanquim de boa qualidade

• Régua

• Borracha para apagar nanquim

• Estilete ou lâmina de barbear, para raspar eventuais erros

no desenho

81

QUADRO 25 (CONT.)

Procedimento:

• não sobrepor grande número de estruturas, isso dificulta

a compreensão da peça desenhada;

• começar a cobrir os desenhos com tinta nanquim pelas

estruturas superiores;

• utilizar caneta de traço de 0,1mm para representar

estruturas delicadas como cerdas e espinhos, 0,2mm para

linhas internas e 0,3mm para estruturas mais robustas e

linhas externas (Fig. 70);

• usar a linha pontilhada ou tracejada para representar

estruturas que estão em plano inferior àquele desenhado

(Fig. 70);

Fig. 69 - Material utilizado na elaboração de desenhos a nanquim.

69

82

QUADRO 25 (CONT.)

Fig. 70 - Desenho a nanquim.

a – Estruturas representadas com traço de espessura 0,1 mm.

b – Linha interna representada com traço de espessura 0,2 mm.

c – Linha externa representada com traço de espessura 0,3 mm.

d – Linha pontilhada representando estruturas que estão em planoinferior àquele desenhado.

O – Evidencia áreas de sobreposição. Note que as linhas sãointerrompidas antes de se tocarem, dando uma melhor percepção detridimensionalidade da peça.

70

a

b

dc

83

QUADRO 25 (CONT.)

• em áreas de sobreposição de traços, aqueles que

representam estruturas em planos inferiores devem ser

interrompidos antes de tocar os traços representando

estruturas em plano superior. Isto dará uma visão adequada

da tridimensionalidade da peça (Fig. 70).

QUADRO 26. SOFTWARE PARA TRATAMENTO

DE IMAGEM

Embora muitos autores ainda usem o método

tradicional de produzir desenhos a nanquim a partir dos

originais a lápis, programas de computação têm sido cada

vez mais utilizados na captura, processamento e

armazenamento de imagens e nas diferentes etapas de

produção de ilustrações científicas (BOUCK & THISTLE,

1998).

Alguns desses programas são o Corel Photo-Paint®,

o Corel Draw®, o Adobe Illustrator® e o Adobe Photoshop®.

84

DICAS DE DESENHO

É importante que os desenhos sejam precisos, agradáveis

e de fácil compreensão para o observador. Para isso deve-se:

• utilizar lápis ou lapiseira com grafite B, 2B ou 3B e borracha

macia especial para desenho (Fig. 71);

• desenhar somente a região central do campo de visão;

• para facilitar o desenho, pode-se prender a folha à bancada

de trabalho à medida que se for mudando a área desenhada,

deslocar a folha para que a imagem a ser desenhada, volte a

região central do campo de visão;

• começar com um esboço e depois compor o desenho traçando

linhas claras e bem definidas (Figs. 72A–B);

Fig. 72 - Etapas da elaboração do desenho a lápis. A - Esboço com linhasfracas. B - Desenho final com linhas bem definidas.

Fig. 71- Material utilizado para a realização de desenhos a lápis.

71

72A 72B

85

• fazer desenhos grandes, em que os detalhes estruturais sejam

visualizados com clareza (Fig. 73A). Caso isso não seja possível,

optar por fazer desenhos dos detalhes em separado ou

desmembrar o próprio desenho em várias partes (Fig. 73B);

Fig. 73A - Desenho em grande escala, realizado em três folhas de sulfite A3emendadas.

73A

86

Fig. 73B - Desenho desmembrado, que permite a observação detalhada decada uma das partes que compõem a peça desenhada.

73B

87

• desenhar somente o que está enxergando claramente e utilizar

os diferentes planos focais de seu microscópio para dar uma

visão tridimensional ao desenho;

• sempre colocar escalas para que se saiba o tamanho exato da

peça representada.

8. CONSIDERAÇÕES FINAIS

Os materiais, técnicas e procedimentos em laboratório aqui

apresentados enfatizam a obtenção de copépodes harpacticóides

fixados para estudo de sua morfologia externa e identificação

em diferentes níveis. Mas são também bastante úteis no estudo

de outros copépodes de vida livre (como os calanóides e

ciclopóides), primordialmente, ou mesmo grupos de copépodes

associados.

Igualmente, a parte inicial pode ser empregada para

estudos gerais da meiofauna, seja ela de ambientes marinhos,

água doce ou de transição, como manguezais e diferentes

hábitats semi-terrestres.

É preciso ter-se em mente que ajustes na metodologia de

trabalho são quase sempre necessários e dependem muito do

empenho e da criatividade do usuário para determinar tempos

e quantidades.

88

9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Meiofauna. Smithsonian Institution Press, Washington. 146–160.

93

10. APÊNDICE - ORDEM HARPACTICOIDA (modificado de

Kihara, 2003)

A ordem Harpacticoida é composta por 50 famílias, com

aproximadamente 460 gêneros e mais de 3000 espécies. Dentre

os copépodes de vida livre, os harpacticóides diferem das demais

ordens por apresentarem organização do corpo podoplea

(posição da articulação prossomo-urossomo entre o 4o e 5o

segmentos pedígeros - pd4 e pd5) (Fig. A–B), antênula com

poucos artículos (Fig. C) (número máximo de artículos nas fêmeas

9, nos machos 14), antena birreme (Fig. D) e perna 5 (Fig. E) de

ambos os sexos com endópodo freqüentemente fundido ao

protópodo, formando um basendópodo (Bsenp).

No grupo, predomina a forma do corpo linear, com o

prossomo (Pr) ligeiramente mais largo que o urossomo (Ur) e

corpo afunilando-se posteriormente (Fig. A). A maioria de seus

representantes é livre-natante e possui tamanho reduzido,

variando de 0,2 a 2,5 mm.

A partir de sua origem epibentônica, os harpacticóides

permaneceram associados ao fundo do mar e invadiram os

habitats adjacentes. Aqueles de fital têm corpo achatado e

estruturas preênseis para fixação em macroalgas e angiospermas

aquáticas. Dentre os poucos representantes planctônicos, estão

as espécies de maior porte, com cerdas alongadas e estruturas

corpóreas que estabilizam a flutuação. Algumas espécies

adentraram a água doce ou são associadas a outros organismos.

Atualmente, os harpacticóides representam o grupo dominante

entre os copépodes da meiofauna marinha.

94

Intolerantes a condições anaeróbicas, os harpacticóides

encontram-se presentes nas camadas mais oxigenadas do

sedimento. São comuns variações na distribuição das diferentes

espécies ao longo dos eixos horizontal e vertical do substrato, e

flutuações sazonais condicionadas por parâmetros ambientais

e/ou biológicos. Alimentam-se de matéria orgânica, detritos e

pequenos organismos.

Informações sobre a ordem: Hicks & Coull (1983), Huys &

Boxshall (1991), Huys et al. (1996), Boxshall & Halsey, 2004.

95

96

Esta obra foi composta pela EditoraAsterisco e impressa pela gráfica

Edelbra em abril de 2009

ISBN 978-85-88840-86-7

� asteriscoeditora

Este livro pretende fornecer ao leitor uma idéia geral sobre

as técnicas empregadas no estudo taxonômico dos copépodes

harpacticóides da meiofauna marinha, padronizando a

metodologia a ser utilizada por iniciantes e servindo de guia de

referência rápida e consulta para pesquisadores que já

trabalhem nessa área.

Privilegiou-se o desenvolvimento particular de cada

procedimento, fornecendo técnicas e instruções específicas em

quadros explicativos e ilustrações que facilitem o reconhecimento

visual dos procedimentos descritos.

Abordando de forma prática, este manual representa o

básico para que se possa começar o trabalho em laboratório.

Documents

técnicas para estudo taxonômico de copépodes harpacticóides da