UNIVERSIDADE FEDERAL DOS VALES DO JEQUITINHONHA E MUCURIESCOLA DE FARMCIACONTROLE BIOLGICO DE QUALIDADEROTEIRO DE AULA PRTICA

3 AULA PRTICA- CONTAGEM DO NMERO DE MICRORGANISMOS MESFILOS E VALIDAO

Mtodo de Contagem em placa

Avalia o nmero de microrganismos mesfilos no produto aps neutralizao da propriedade antimicrobiana presente no produto.Controles realizados: Controle negativoValidaes do teste: Teste de Capacidade nutritiva dos meios de cultura (Teste de Promoo do crescimento); Teste de eliminao/neutralizao da propriedade antimicrobiana

Medicamento/cosmtico:Fabricante:Nmero do Lote:Data de validade:Data da Fabricao:Condies da amostra:

A. Neutralizao: para que o aspecto quantitativo (contagem) seja observado, torna-se necessria a neutralizao da atividade antimicrobiana do conservante presente no produto.

Tabela 1- Neutralizante PolivalenteLecitina3 g ( quaternrio de amnio)

Tween 8030 mL (fenlicos)

Tiossulfato de sdio5 g ( cloro)

L-histidina1 g ( formaldedo)

Peptona pancretica1 g

Cloreto de sdio8,5 g

Tampo fosfato10 mL

gua destilada1000 mL

Usa-se para cada caso o(s) neutralizante(s)/mtodo de neutralizao descrito(s) na Tabela 2.

Tabela 2- Agentes conservantes e neutralizantes

PREPARO DA SOLUO SALINA PEPTONADA E TAMPONADA

Fosfato monopotssico--------------------- 3,56 gFosfato dissdico------------------------------7,32 gCloreto de sdio-------------------------------4,00 gPeptona ( de carne ou de casena)--------1,00 gH2O destilada--------------------------------1000 mL

PREPARO DA SOLUO SALINA + NEUTRALIZANTE

Acrescentar Tween 80 a 3% e lecitina a 0,3% diluio 10-1. Para 20 mL de salina:

Tween 80------------6 gLecitina--------------0,6 gSol. Salina q.s.p----200 mL

B. Teste de Contagem do nmero de microrganismos mesfilos (mtodo de Contagem em placa) - Mtodo de profundidade

Homogeneizar 10 g ou 10 mL do produto em 90 mL de SSPT adicionados do neutralizante adequado (diluio 1:10); Corrigir o pH, utilizando papel indicador; Preparar diluies decimais do produto (1:100; 1:1000; 1:10.000) em SSPT;Adicionar 1,0 mL de cada diluio s placas de Petri previamente esterilizadas (em quadruplicata); Para duas placas de cada diluio preparada anteriormente adicionar 20 mL de gar Casena-soja e para as outras duas placas adicionar 20 mL de gar Sabouraud-dextrose (os meios devem ser fundidos e resfriados a 45 C). Misturar cuidadosamente, deixar solidificar e incubar as placas invertidas de acordo com as especificaes de cada meio (30 a 35 C por 3 dias gar Casena-soja; 20 a 25 C por 5 dias - gar Sabouraud-dextrose). Tomar a mdia aritmtica das placas de cada meio de cultura e calcular o nmero de UFC por grama ou mL do produto.- Controle negativo: Para verificar a esterilidade dos meios de cultura, coloc-los em incubao por, no mnimo, 72 horas, na temperatura adequada. No deve haver crescimento de micro-organismos.

C. Validao: Deve ser realizada antes do Teste de Contagem do nmero de microrganismos mesfilos

Microrganismos utilizados nos testes de validao (segundo F. Brasileira V):a- Staphylococcus aureus ATCC 6538b- Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027c- Bacillus subtilis ATCC 6633d- Candida albicans ATCC 10231e- Aspergillus brasiliensis ATCC 16404

Observaes:- Repiques de a, b e c: 24 horas antes do ensaio em meio inclinado (gar Casena-soja). Incubao a 30 35 C- Repiques de d e e: em gar Sabouraud Dextrose inclinado. Incubao a 30 35 C por 3 dias para d e 20 25 C por 5 dias para e.

Preparao do inculo: Suspender cada tipo de mo (a, b, c, d, e ) em soluo salina estril peptonada (SSPT) at atingir 30% de transmitncia a 580 nm ou turvao comparada a do tubo n 3 de Mc Farland.

C.1- Teste de Capacidade nutritiva dos meios de cultura (Teste de Promoo do crescimento)Quando deve ser realizado? __________________________________________________________________________________________________________________________________________________________Princpio: inocular cada placa contendo o meio de cultura indicado com menos que 100 UFC do micro-organismo teste. Incubar temperatura adequada e comparar o crescimento obtido que no deve ser inferior a 50% em relao ao inculo padronizado. Adicionar 0,1 mL da suspenso de cada mo s placas de Petri previamente esterilizadas (em duplicata); Adicionar s mesmas 20 mL de gar fundido e resfriado a 45 C (mos a, b e c gar Casena-soja; mos d e e- gar Sabouraud-dextrose); Misturar cuidadosamente, deixar solidificar e incubar as placas invertidas de acordo com as especificaes de cada mo ( a, b e c 30 a 35 C por 3 dias; d e e -20 a 25 C por por 5 dias). Tomar a mdia aritmtica das placas de cada mo e calcular o nmero de UFC de cada mo no seu respectivo meio de cultura.O crescimento obtido que no deve ser inferior a 50% em relao ao inculo padronizado.- Controle negativo: Para verificar a esterilidade dos meios de cultura, coloc-los em incubao por, no mnimo, 72 horas, na temperatura adequada. No deve haver crescimento de micro-organismos.

C.2- Teste de eficcia da neutralizao/remoo da propriedade antimicrobianaPrincpio: Neutraliza-se inicialmente o conservante presente no produto e avalia-se a remoo da propriedade antimicrobiana contaminando-o com linhagens padro de micro-organismos. Adicionar 0,1 mL da suspenso de cada mo s placas de Petri previamente esterilizadas (em duplicata);Adicionar 1,0 mL de cada diluio do produto preparada anteriormente s placas de Petri previamente esterilizadas. Adicionar s mesmas 20 mL de gar fundido e resfriado a 45 C (mos a, b e c gar Casena-soja; mos d e e- gar Sabouraud-dextrose); Misturar cuidadosamente, deixar solidificar e incubar as placas invertidas de acordo com as especificaes de cada mo ( a, b e c 30 a 35 C por 3 dias; d e e -20 a 25 C por por 5 dias). Tomar a mdia aritmtica das placas de cada mo e calcular o nmero de UFC de cada mo no seu respectivo meio de cultura. Controle positivo: adicionar 0,1 mL da suspenso de cada mo s placas de Petri previamente esterilizadas (em duplicata) e acrescentar o meio de cultura de acordo com as especificaes de cada micro-organismo.

Para que o conservante no esteja atuando ou tenha seu efeito antimicrobiano inibido pela ao do neutralizante, o nmero de micro-organismo encontrado no teste com a amostra deve ser 50% do nmero encontrado no controle positivo.

D. Esquema do teste:

E. Resultados:

E.1- Teste de Contagem do nmero de microrganismos mesfilos

Tabela 3- Nmero de UFC encontrado em cada diluio do produtoDILUIESControle negativo

10-110-210-310-4ACSAS

ACSASACSASACSASACSAS

Clculo do nmero de UFC/mL ou UFC/g no produto:Nmero de bactrias:

Nmero de leveduras e fungos:

Especificao:

ValidaesE.2- Teste de Capacidade nutritiva dos meios de cultura (Teste de Promoo do crescimento)

E.3- Teste de eficcia da neutralizao/remoo da propriedade antimicrobiana

Resultado do teste: