Tese de doutorado de Andréa Farias de Almeida€¦ · andréa farias de almeida estratÉgias de produÇÃo in vitro de bioinseticida viral: influÊncias do isolado, da cinÉtica

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE TECNOLOGIA

DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA

TESE DE DOUTORADO

Estratégias de Produção in vitro de Bioinseticida Viral: Influências do Isolado, da Cinética e do Modo de

Operação

Andréa Farias de Almeida

Natal/RN

Março/2010

Andréa Farias de Almeida

ESTRATÉGIAS DE PRODUÇÃO IN VITRO DE BIOINSETICIDA VIRAL: INFLUÊNCIAS DO ISOLADO, DA CINÉTICA E DO

MODO DE OPERAÇÃO

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química – PPGEQ, da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutora em Engenharia Química, sob a orientação da Profª. Drª. Márcia Regina da Silva Pedrini e a co-orientação da Profª. Drª. Gorete Ribeiro de Macedo.

Natal/RN

Março/2010

Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / CT / PPGEQ /

Biblioteca Setorial “Professor Horácio Nicolas Solimo”.

Almeida, Andréa Farias de. Estratégias de produção in vitro de bioinseticida viral: Influências do isolado, da cinética e do modo de operação / Andréa Farias de Almeida. – Natal, 2010. 133 f. : il.

Orientadora: Márcia Regina da Silva Pedrini. Co-orientadora: Gorete Ribeiro de Macedo. Tese (Doutorado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Tecnologia. Departamento de Engenharia Química. Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química. 1. Baculovírus AgMNPV – Produção in vitro – Tese. 2. Baculovírus recombinante – Tese. 3. Bioinseticida viral - Produção – Tese. 4. Pragas da soja - Controle biológico – Tese. I. Pedrini, Márcia Regina da Silva. II. Macedo, Gorete Ribeiro de. III. Título.

RN/UF/BSEQ CDU 661.164.2:578.841(043.2)

AGRADECIMENTOS

Agradeço antes de tudo à minha mãe, presente em todos os momentos da minha vida,

sempre.

Às minhas orientadoras, Márcia Pedrini e Gorete, pela orientação e dedicação

prestadas para o desenvolvimento deste trabalho.

Aos amigos do Laboratório de Engenharia Bioquímica que de alguma forma ajudou-

me na realização do meu trabalho, em especial, agradeço a Graciana Clécia e Cinthia Meirelly

pela ajuda nos experimentos.

À pesquisadora Marlinda Lobo de Souza, do Laboratório de Genética Molecular de

Micro-organismos e Invertebrados (LGM) - Núcleo de Controle Biológico da

Embrapa/Cernagen, por ter cedido os clones selvagens do baculovírus AgMNPV: AgMNPV-

MP2, AgMNPV-MP5 e AgMNPV-2D.

Ao pesquisador Bergmann Ribeiro, da Universidade de Brasília (UNB), por ter cedido

o baculovírus recombinante vAgEGT∆-lacZ para realização deste trabalho.

Aos professores Everaldo Silvino e Paulo Marinho que estiveram presentes à minha

banca de qualificação contribuindo muito com seus conhecimentos.

Finalmente, agradeço ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química da

UFRN e a Capes pela bolsa concedida durante o doutorado.

ALMEIDA, Andréa Farias – Estratégias de Produção in vitro de Bioinseticida Viral: Influências do Isolado, da Cinética e do Modo de Operação. Tese de Doutorado, UFRN, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química. Área de concentração: Engenharia de Processos, Natal/RN, Brasil. Orientação: Profª. Drª. Márcia Regina da Silva Pedrini Co-orientação: Profª. Drª. Gorete Ribeiro de Macedo ___________________________________________________________________________

RESUMO: A preocupação da sociedade com o meio ambiente tem levado a buscar alternativas de substituição dos inseticidas químicos por outros produtos menos agressivos ao homem e ao ambiente. Assim, a utilização de controle biológico contra pragas é altamente desejável, pois reduz os riscos ambientais e públicos da utilização de produtos químicos convencionais. Em particular, os vírus do tipo baculovírus são uma grande alternativa devido à especificidade oferecida aos seus hospedeiros e a sua forma de propagação. No Brasil, o baculovírus Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) é o principal agente de controle biológico da praga da soja Anticarsia gemmatalis. A crescente demanda deste bioinseticida tem estimulado o interesse no desenvolvimento de processos com base na produção in vitro de baculovírus. Deste modo, poderá aumentar a oferta de vírus, suprindo a necessidade do mercado deste bioinseticida para o controle de A. gemmatalis. Neste trabalho, estratégias de produção in vitro do baculovírus selvagem AgMNPV e do seu recombinante vAgEGT∆-LacZ, como influência do isolado, da cinética e do modo de operação, foram analisadas como alternativa para futura ampliação de escala na produção deste bioinseticida viral. A produção em batelada de três isolados selvagens do baculovírus AgMNPV (AgMNPV-2D, AgMNPV-MP2 e AgMNPV-MP5) utilizando o cultivo em shaker, foi realizada com a finalidade de selecionar o melhor produtor de corpos de oclusão a partir das infecções em células de inseto Spodoptera frugiperda, linhagem IPLB-SF21 para avaliação comparativa com recombinante vAgEGT∆-LacZ. A seleção identificou o isolado AgMNPV-MP5 como melhor produtor de corpos de oclusão de (5,30±0,85) x108 OB/mL em 8 dias de infecção. A produção in vitro do vAgEGT∆-LacZ foi foco principal deste trabalho, pois não há, na literatura, a produção deste recombinante em sistemas de cultivo em suspensão. Foi realizado estudo da multiplicidade de infecção para identificar a quantidade de inóculo viral para o cultivo. A partir daí, foram realizadas cinco bateladas sucessivas obtendo-se (8,9±1,42)x1014 corpos de oclusão para um volume final de 10m³ de suspensão de células infectadas. O aumento da produção de corpos de oclusão obtidos a partir do vAgEGT∆-LacZ foi analisado utilizando a estratégia de cultivo em batelada alimentada utilizando baixa multiplicidade de infecção. Esta estratégia permitiu aumento de três vezes na produção de corpos de oclusão quando comparada à produção em cultivos em batelada (5,3x107 e 1,8x107 OB/mL, respectivamente). E ainda, o baculovírus recombinante vAgEGT∆-LacZ mostrou-se competitivo em relação ao baculovírus selvagem AgMNPV-MP5.

Palavras-chaves: baculovírus, baculovírus recombinante, produção in vitro, batelada-alimentada, AgMNPV

ABSTRACT

Societal concerns about environmental sustainability has lead to the development of ecologically-friendly alternatives to chemical insecticides for crop protection. One such alternative is biological pest control. In particular, baculoviruses are well suited as insect biopesticides due to their narrow host specificity and relative ease of propagation. In Brazil, the baculovirus Anticarsia gemmatalis nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) is the main biological control agent employed for the soybean pest, Anticarsia gemmatalis. This baculovirus biopesticide is currently produced using caterpillars, but increasing market demand for the product has encouraged the development of an in vitro manufacturing process, which can be scaled up to much higher virus productivities. In this study, three wild-type AgMNPV isolates (AgMNPV-2D, AgMNPV-MP2 and AgMNPV-MP5) and a recombinant form (vAgEGT∆-LacZ) were characterised in terms of occlusion body (OB) production and infection kinetics, to enable future optimisation of the in vitro production process. These viruses were propagated using a Spodoptera frugiperda (IPLB-SF21) insect cell line grown in shaker-flask batch cultures. Among the virus isolates tested, AgMNPV-MP5 was found to be the best producer, yielding (5.3±0.85)x108 OB/mL after 8 days post infection. The characterisation of vAgEGT∆-LacZ propagation in suspension cell cultures has not been previously reported in the literature; hence it became the main focus for this thesis. In particular, it was carried out a study on the effect of the multiplicity of infection (MOI) on OB production. Five successive batches were performed getting a final production (8.9±1.42)x1014 occlusion bodies, considering that production is related for a bioreactor with final volume of 10m3. A low MOI associated with a fed-batch process for vAgEGT∆-LacZ production was found to support a 3-fold higher OB yield when compared to the default batch process (1.8x107 and 5.3x107 OB/mL, respectively). This yield is competitive with regards to the production process.

Key words: baculovirus, recombinant baculovirus, in vitro production, fed-batch, AgMNPV.

SUMÁRIO

Lista de Figuras ...................................................................................................... i

Lista de Tabelas....................................................................................................iii

Lista de Variáveis................................................................................................. iv

Nomenclatura ......................................................................................................vii

1 Introdução Geral................................................................................................. 2

2 Revisão Bibliográfica......................................................................................... 8

2.1 Baculovírus .................................................................................................. 8 2.1.1 Baculovírus AgMNPV ............................................................................................10

2.2 Produção in vitro de baculovírus ............................................................... 12

2.2.1 Passagem seriada .....................................................................................................15

2.2.2 Multiplicidade de infecção (MOI)...........................................................................18

2.2.3 Titulação viral (TCLD50) .........................................................................................19

2.3 Estratégias de produção in vitro de baculovírus........................................ 21

2.3.1 Processo em batelada ou descontínuo .....................................................................22

2.3.2 Processo em batelada-alimentada ou descontínuo-alimentado ...............................29

2.3.3 Processo de produção em baixa MOI (Low MOI)...................................................32

3 Seleção dos isolados selvagens de baculovírus AgMNPV.............................. 35

3.1 Introdução .................................................................................................. 35 3.2 Metodologia experimental ......................................................................... 38

3.2.1 Células .....................................................................................................................38

3.2.2 Vírus ........................................................................................................................39

3.2.3 Cálculo do TCLD50 dos isolados selvagens ............................................................40

3.2.4 Produção in vitro dos isolados de baculovírus selvagem ........................................41

3.2.5 Cálculo dos parâmetros cinéticos para produção in vitro........................................41

3.3 Resultados e discussão............................................................................... 42

3.4 Conclusão................................................................................................... 52 4 Produção in vitro do baculovírus recombinante vAgEGT∆-LacZ................... 54


4.2.1 Células .....................................................................................................................58

4.2.2 Vírus ........................................................................................................................59

4.2.3 Produção do baculovírus vAgEGT∆-LacZ..............................................................59

4.2.4 Cálculo TCLD50 e MOI do vAgEGT∆-LacZ...........................................................59

4.2.5 Passagem seriada do baculovírus vAgEGT∆-LacZ.................................................60

4.2.6 Obtenção dos parâmetros cinéticos na produção do baculovírus vAgEGT∆-LacZ 60

4.2.7 Comparação da produção de corpos de oclusão dos baculovírus AgMNPV-MP5 e

vAgEGT∆-LacZ................................................................................................................60


4.3.1 Estudo da multiplicidade de infecção (MOI) ..........................................................61

4.3.2 Passagem seriada (escalonamento da produção in vitro) ........................................67

4.3.3 Comparação da produção in vitro do baculovírus selvagem AgMNPV-MP5 e o

baculovírus recombinante vAgEGT∆-LacZ.....................................................................73

4.4 Conclusão................................................................................................... 77 5 Produção em batelada-alimentada do baculovírus recombinante vAgEGT∆-

LacZ..................................................................................................................... 80


5.2.1 Células .....................................................................................................................83

5.2.2 Vírus ........................................................................................................................84

5.2.3 Solução de alimentação ...........................................................................................84

5.2.4 Produção em batelada-alimentada...........................................................................85


5.3.1 Batelada-alimentada com a solução de alimentação: nutrientes .............................86

5.3.2 Batelada-alimentada com a solução de alimentação: nutrientes combinada com o

meio de cultura SF900II ...................................................................................................90

5.3.3 Batelada-alimentada com a solução de alimentação: meio de cultura SF900II ......93

5.4 Conclusão................................................................................................... 96 6 Conclusão Geral ............................................................................................... 98

Referências ........................................................................................................ 101

Anexos............................................................................................................... 113

i

Lista de Figuras

Figura 2.1. Estrutura da forma oclusa dos baculovírus ..............................................................9

Figura 2.2 Ciclo da multiplicação in vitro de baculovírus (adaptado de ROHRMANN, 1999)

..................................................................................................................................................12

Figura 2.3. Estrutura do virion..................................................................................................14

Figura 2.4 Núcleo de células infectadas apresentando dois tipos de fenótipos: (A) Baculovírus

muitos poliedros (MP); (B) Baculovírus com poucos poliedros (FP) (Fonte: PEDRINI, 2003).

..................................................................................................................................................16

Figura 2.5 Gel de eletroforose que mostra a mudança genotípica do baculovírus Helicoverpa

armigera SNPV durante passagem seriada em cultura de células. (Fonte: PEDRINI et al.,

2005a) .......................................................................................................................................18

Figura 2.6 Clivagem do anel tetrazólio do MTT......................................................................20

Figura 2.7 Curva característica de processo em batelada: Xv – concentração de células viáveis;

[S] – concentração de substrato................................................................................................23

Figura 2.8 Curva característica da produção de OB em células de inseto: [OB] – concentração

de OB; τi – tempo inicial de pós-infecção e τf – tempo final de pós-infecção .........................28

Figura 2.9 Curva representativa de um processo em batelada-alimentada: Xv – concentração

de células viáveis; [S] – concentração de substrato..................................................................30

Figura 3.1 Infecções com os isolados selvagens de baculovírus AgMNPV ............................43

Figura 3.2 Produção volumétrica de OB dos isolados selvagens de AgMNPV.......................47

Figura 3.3 Produção específica de OB dos isolados selvagens de AgMNPV..........................49

Figura 3.4 Células Sf21 infectadas com AgMNPV-MP5 em 4 d.p.i .......................................50

Figura 4.1 Processo de produção em batelada (Fonte: RHODES, 1996).................................57

Figura 4.2 Cinética de crescimento das células Sf21 infectadas com diferentes MOIs de BV

do baculovírus recombinante vAgEGT∆-LacZ........................................................................62

Figura 4.3 Produção de OB do baculovírus vAgEGT∆-LacZ..................................................65

Figura 4.4 Perfis da produção volumétrica de OB do baculovírus vAgEGT∆-LacZ com

diferentes MOIs ........................................................................................................................66

Figura 4.5 Passagem seriada do baculovírus vAgEGT∆-LacZ.................................................68

Figura 4.6 Produção volumétrica de OB na passagem seriada do vAgEGT∆-LacZ................69

ii

Figura 4.7 Esquema representativo da produção em escala do baculovírus recombinante

vAgEGT∆-LacZ........................................................................................................................70

Figura 4.8 Produção específica de OB na passagem seriada do vAgEGT∆-LacZ...................73

Figura 4.9 Cinética de crescimento das células não infectadas e infectadas com os baculovírus

selvagem e recombinante..........................................................................................................74

Figura 4.10 Produção volumétrica de OB da infecção com os baculovírus selvagem e

recombinante. ...........................................................................................................................75

Figura 5.1 Cinética da infecção com vAgEGT∆-LacZ em batelada-alimentada (nutrientes) ..87

Figura 5.2. Perfil da produção de OB da infecção com vAgEGT∆-LacZ sem alimentação ....88

Figura 5.3 Perfil da produção de OB da infecção com vAgEGT∆-LacZ com alimentação

(nutrientes)................................................................................................................................89

Figura 5.4 Cinética da infecção com vAgEGT∆-LacZ em batelada-alimentada (nutrientes +

meio de cultura) ........................................................................................................................91

Figura 5.5 Perfil da produção de OB com alimentação (nutrientes + meio de cultura) ...........92

Figura 5.6 Cinética da infecção com vAgEGT∆-LacZ em batelada-alimentada (meio de cultura)......................................................................................................................................94

Figura 5.7 Perfil de produção de OB com alimentação (meio de cultura) ...............................95

iii

Lista de Tabelas

Tabela 2.1 Gênero da família Baculoviridae............................................................................10

Tabela 3.1 Parâmetros cinéticos das infecções com os isolados selvagens..............................44

Tabela 3.2 Velocidade média de infecção................................................................................46

Tabela 4.1 Parâmetros cinéticos das infecções com diferentes MOIs......................................64

Tabela 4.2 Velocidades médias de produção de OB ................................................................66

Tabela 4.3 Quantidade de OB produzido em cada passagem do cultivo .................................71

Tabela 4.4 Resultado da ANOVA para produção de OB.........................................................75

Tabela 4.5 Ajustes aos pontos experimentais da curva de produção de OB ............................76

iv

Lista de Variáveis

a Absorbância maxima (0% de resposta)

b Fator de inclinação

CC Concentração celular (células/mL)

CMCT Concentração máxima de células totais (células/mL)

CMOB Concentração maxima de OBs (OB/mL)

COB Concentração de OB (OB/mL)

D Fator de diluição

D0 Diluição na qual a resposta foi 50%

dt

dP

Velocidade de variação de produto (mg/d)

dt

dS

Velocidade de variação de substrato (mg/d)

dt

dX

Velocidade de variação de crescimento (células/d)

dt

dXNVNI Velocidade de variação de crescimento das células não infectadas e

não viáveis (células não infectadas não viáveis/d)

dt

dXVI Velocidade de variação de crescimento das células viáveis infectadas

(células viáveis infectadas/d)

dt

dXVNI Velocidade de variação de crescimento das células não infectadas

(células não infectadas/d)

F Vazão volumétrica de alimentação (mL.d)

Kd Velocidade específica de morte celular (d-1)

v

Kdv Taxa de decomposição do vírus

MC Média da contagem de células

MOB Média da contagem de OBs

N Número de etapas ou passagens

P Concentração de produto (mg/mL)

PEOB Produção específica de OBs (OB/Célula)

qs Velocidade específica de consumo de substrato (mg/mL.d)

qp Velocidade específica de formação de produto (mg/mL.d)

R2 Coeficiente de correlação

Ri Velocidade de infecção (célula/mL.d)

Rp Velocidade de formação de produto (OB/mL.d)

S Concentração final de substrato (mg/mL)

S0 Concentração inicial de substrato (mg/mL)

td Tempo de duplicação (d)

V Volume (mL)

Vf Volume final (mL ou m³)

Vi Volume inicial (mL ou m³)

X Concentração de células (células/mL)

XNVNI Concentração de células não viáveis não infectadas (células/mL)

XVI Concentração de células viáveis infectadas (células/mL)

XVNI Concentração de células viáveis não infectadas (células/mL)

vi

Y Absorbância

Y0 Absorbância mínima (100% de resposta)

YS Rendimento do crescimento de células por unidade de substrato

αpOB Taxa específica de produção de OB (OB/mL.d)

αpv Taxa de produção de vírus por célula infectada

∆ Fator de diluição

µ Velocidade específica de crescimento (d-1)

µap Velocidade específica de crescimento aparente (d-1)

µx Velocidade específica de crescimento celular (d-1)

µ(τ) Velocidade específica de crescimento no tempo de pós-infecção (d-1)

τ Tempo de pós-infecção (d)

τd Tempo final de infecção (d)

τei Tempo inicial da replicação (d)

τf Tempo final de intensa produção de OB (d)

τi Tempo inicial de intensa produção de OB (d)

τvrs Tempo em que o primeiro virion foi liberado (d)

τvre Tempo de quantidade máxima de virus extracelular (d)

vii

Nomenclatura

AcMNPV Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus

AgMNPV Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus

AgMNPV-2D Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus clone 2D

AgMNPV-MP2 Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus clone MP2

AgMNPV-MP5 Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus clone MP5

ANOVA Análise de variância

BEVS Sistemas de vetores de expressão em baculovírus

BM-5 Linhagem de célula Bombyx mori

BTI-Tn-5B1-4 Linhagem de célula da Trichoplusia ni

BV Budded virus – vírus extracelular

CHO Células do ovário do hamster chinês

CPE Ensaio do efeito citopático

DIP Partículas interferentes defectivas

egt Gene ecdisteroide udp-glicosil transferase

FP Mutantes few polyhedra – Mutantes poucos poliedros

GmMNPV Galleria mellonella multiple nucleopolyhedrovirus

GV Granulovírus

HaSNPV Helicoverpa armigera single nucleopolyhedrovirus

HzSNPV Helicoverpa zea single nucleopolyhedrovirus

IPLB-LD-652Y Linhagem de célula Lymantria díspar

IPLB-Sf21 Linhagem de célula Sf21 de Spodoptera frugiperda

MIP Manejo Integrado de Pragas

MNPV multiple nucleopolyhedrovirus

MOI Multiplicity of infection - Multiplicidade de infecção

MP Mutantes many polyhedra – mutantes muitos poliedros

MTT 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-brometo de difenil tetrazólio

NPV Nucleopoliedrovírus

OB Occlusion body – corpos de oclusão

ODV Occlusion derived virus - Vírus derivado do OB

ORF Open reading frame

viii

pb Pares de base

Sf9 Linhagem de célula de Spodoptera frugiperda

SFM Serum free medium - meio sem soro

SfMNPV Spodoptera frugiperda multiple nucleopolyhedrovirus

SNPV Single nucleopolyhedrovirus

TCLD50 Dose letal para infectar 50% da cultura de tecidos

TOH Time of harvest – tempo de coleta após infecção

TOI Time of infection – tempo de infecção

tPA Ativador plasminogênico tecidual

UFP Unidades formadoras de placas

UFL-AG-286 Linhagem de célula de Anticarsia gemmatalis

vAgEGT∆-LacZ Baculovírus recombinante de Anticarsia gemmatalis multiple

nucleopolyhedrovirus

Capítulo 1

Introdução Geral

2 __________________________________________________________________________________________Capítulo 1 Introdução Geral

________________________________________________________________________ Andréa Farias de Almeida – Tese de Doutorado – UFRN – PPGEQ

1 Introdução Geral

Os inseticidas químicos têm papel importante no desenvolvimento da produção

agrícola, principalmente quando se trata do Manejo Integrado de Pragas (MIP). O MIP

compõe-se de um conjunto de técnicas que busca o equilíbrio com a natureza, ao aperfeiçoar a

atuação de inimigos naturais, com a utilização mínima de inseticidas químicos. No entanto,

esses produtos, mesmo em quantidades mínimas, são tóxicos e apresentam ampla capacidade

de atuação em relação a outros animais ecologicamente importantes e potencialmente úteis à

agricultura. Além disso, sua utilização frequente favorece o aumento da resistência das

pragas.

Para países exportadores de produtos agrícolas, como o Brasil, existe ainda uma razão

comercial suplementar para redução do uso de inseticidas químicos. Segundo Hamilton;

Sunding; Zilberman (2003), as pesquisas mostram a utilização de inseticidas químicos como o

problema mais sério em relação à qualidade dos alimentos consumidos. Os consumidores têm

mostrado uma forte preferência por produtos que são cultivados em ambientes com menor

exposição à inseticida químico (LISANSKI, 1994). Exemplo disto é o aumento do mercado

de produtos orgânicos que estão livres de inseticidas químicos, ou, até mesmo, ausentes de

defensivos agrícolas (LEVIDOW; BIJMAN, 2002).

Diante disso, a preocupação da sociedade com o meio ambiente tem levado a buscar

alternativas de substituição dos inseticidas químicos, em lavouras, por outros produtos menos

agressivos ao homem e ao ambiente. Assim, a utilização de controle biológico contra pragas é

altamente desejável, pois reduz os riscos ambientais e públicos da utilização de produtos

químicos convencionais. O controle de pragas por métodos naturais é um avanço na

agricultura mundial. Segundo Federici (1999), agentes de biocontrole como fungos, bactérias

e vírus são aplicados em mais de 1 milhão de hectares para controlar pragas em agricultura.

Organismos que normalmente têm preferências específicas para determinadas pragas e podem

não causar danos a outros animais benéficos e a pessoas, em particular, os vírus do tipo

baculovírus são importantes agentes de controle biológico devido à especificidade oferecida

aos seus organismos-alvo (hospedeiros) e a sua forma de propagação.



A propagação de baculovírus é realizada através dos próprios hospedeiros (cultivo in

vivo) ou utilizando as células embrionárias ou epiteliais isoladas destes hospedeiros (cultivo in

vitro).

No cultivo in vitro de baculovírus, destaca-se a importante contribuição das células

animais, principalmente as células de inseto, na expressão de proteínas recombinantes através

de sistemas de vetores de expressão em baculovírus, do inglês baculovirus expression vectors

systems (BEVS) e na produção de bioinseticida viral. As células de inseto, devido às

vantagens que as oferecem em relação às células de mamíferos, são facilmente cultivadas in

vitro e sua manutenção é relativamente simples (KING; POSSEE, 1992). Deste modo, o

conhecimento das metodologias de cultivo das células de inseto permitiu estudar o ciclo de

replicação/propagação de vários baculovírus (KING; POSSEE, 1992) e com isso, a produção

de baculovírus despertou interesse na agricultura como alternativa ao controle de pragas.

Os baculovírus são patógenos de artrópodes, principalmente insetos da ordem

Lepidóptera, caracterizam-se por possuir corpo de oclusão, do inglês occlusion body (OB), e

um cristal proteico (poliedrina ou granulina) que envolve os virions (partículas virais)

protegendo-os no ambiente. Eles têm sido utilizados com sucesso como agentes de controle

de pragas agrícolas (GRANADOS; FEDERICI, 1986; MOSCARDI, 1999). Estes

bioinseticidas são utilizados na agricultura em vários países. Por exemplo, na América do

Norte dois produtos são utilizados no controle de pragas de florestas, o TM Biocontrol

(Orgyia pseudotsugata nucleopolyhedrovirus) e o Gypchek (Lymantria dispar

nucleopolyhedrovirus) (WOOD; GRANADOS, 1991). Nos Estados Unidos, Canadá e na

Europa o baculovírus também é utilizado como agente contra pragas florestais do algodão,

tomate, milho, repolho e outros vegetais. No Brasil, um bioinseticida denominado baculovírus

anticarsia, cujo princípio ativo é o Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus

(AgMNPV), já foi empregado para o controle da praga da soja, em uma área de tratamento

biológico de 1,6 milhão de hectares, ou seja, mais de 10% da área cultivada de soja no país

(MOSCARDI, 1999). Atualmente, essa área foi reduzida para 300 mil hectares devido à

manifestação de outras pragas na lavoura de soja (MOSCARDI, comunicação pessoal).

A produção do baculovírus anticarsia é atualmente realizada in vivo, onde sua

multiplicação é na própria lavoura de soja com populações de lagartas A. gemmatalis



infectadas. As lagartas infectadas coletadas no campo são conduzidas ao laboratório para

purificação e formulação viral. Esse processo é ineficiente devido à necessidade da presença

de lagartas na lavoura e tendo aplicação em poucos meses do ano, somente durante o cultivo

de soja. A crescente demanda deste bioinseticida tem estimulado o interesse no

desenvolvimento de alternativas de processos com base na produção in vitro (MOSCARDI;

SOUZA, 2002; RODAS et al., 2005; CASTRO; RIBEIRO; SOUZA, 2006; REZENDE;

CASTRO; SOUZA, 2008). Assim, a produção de baculovírus em larga escala, utilizando

cultivo de células poderá aumentar a oferta de vírus na aplicação em lavouras, suprindo a

necessidade deste bioinseticida no cultivo da soja, uma vez que as empresas produtoras ainda

não atendem a demanda pelo produto (MOSCARDI; SOUZA, 2002).

Apesar das vantagens ambientais conferidas ao tratamento com baculovírus, um fator

importante que limita o interesse da indústria e a aceitação dos agricultores da sua utilização

no controle insetos-praga, é a baixa velocidade de ação desses vírus sobre os hospedeiros

naturais. A larva infectada pode levar de 5 a 8 dias para morrer e permitindo que o inseto,

mesmo infectado, ainda cause danos à lavoura (MOSCARDI, 1999).

Com os recursos da engenharia genética têm sido criados micro-organismos

entomopatogênicos (patogênicos a insetos) geneticamente modificados, que apresentam

características adicionais àquelas dos patógenos não modificados. Com baculovírus não é

diferente, alguns baculovírus têm sido modificados geneticamente para ampliar a ação viral

sobre seus hospedeiros (O’REILLY; MILLER, 1991; PINEDO et al., 2003). Outra

característica importante, sendo um parasita obrigatório, o baculovírus só se multiplica no

interior do seu hospedeiro, logo, é considerado bastante seguro para ser modificado

geneticamente, não apresentando riscos de invasão e multiplicação fora do ambiente de

liberação (MOSCARDI; SOUZA, 2002).

A produção de baculovírus em cultivo de células (in vitro) visando à ampliação de

escala é desejável, pois permitiria sua multiplicação em menor espaço laboratorial e utilizando

número reduzido de mão de obra, ao contrário da produção in vivo em laboratório (BLACK et

al, 1997, WEISS et al., 1994, MOSCARDI, 1999, MOSCARDI; SOUZA, 2002). E ainda,

resultaria em melhor planejamento e qualidade do material obtido quando comparado à

produção em campo, pois o material resultante da coleta em campo é de qualidade inferior



devido às impurezas presentes nas amostras. Contudo, a produção de baculovírus em cultivo

de células apresenta instabilidade em relação à atividade viral (formação de mutantes).

A instabilidade da virulência é evidenciada pelo efeito passagem (diminuição da

produção dos corpos de oclusão durante o cultivo seriado de baculovírus), que pode ser

minimizada pela redução de passagens, nos cultivos em batelada, utilizando biorreatores de

volumes maiores para produzir a mesma quantidade de corpos de oclusão (CHICO;

RODRÍGUEZ; FIGUEREDO, 2007).

Deste modo, adaptar sistemas de produção que são utilizados há muito tempo com

sucesso em processos com células microbianas (bactérias, fungos ou leveduras), tais como

processo descontínuo alimentado, para a produção in vitro de bioinseticidas virais é

importante para o aumento da produção deste bioproduto. Vale salientar que o estudo cinético

do processo descontínuo também é necessário, pois é de extremo interesse para o

conhecimento dos parâmetros cinéticos do crescimento das células de inseto e do processo de

infecção utilizados nesta produção.

Neste contexto, objetiva-se aplicar estratégias de cultivo para produção in vitro do

baculovírus Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) – seleção de

isolados, estudo da multiplicidade de infecção, modo de operação de cultivo - visando a

obtenção de bioinseticida viral para o controle da praga da soja A. gemmatalis. Será avaliada a

produção de corpos de oclusão utilizando como inóculo o vírus extracelular dos isolados

selvagens AgMNPV-2D, AgMNPV-MP2 e AgMNPV-MP5 para selecionar o isolado que

demonstrar melhor desempenho em relação a sua produtividade, e comparar esta

produtividade com o baculovírus recombinante vAgEGT∆-LacZ. O baculovirus recombinante

vAgEGT∆-LacZ não possui dados referentes ao seu cultivo em suspensão, portanto, será

analisada a produção deste recombinante utilizando a linhagem Sf21, bem como, a avaliação

cinética da produção deste bioinseticida viral.

A análise cinética da produção do baculovírus recombinante vAgEGT∆-lacZ e dos

clones do baculovírus selvagem AgMNPV foi realizada em todos os resultados com base na

produção de corpos de oclusão (OB). Logo, as variáveis analisadas para o conhecimento da

cinética de produção do bioinseticida foram as velocidades de crescimento das células Sf21 e

as de produção de OB, relevantes neste tipo de cultivo.



Esta tese foi dividida em seis capítulos, onde este primeiro mostrou uma breve

introdução geral sobre o tema abordado. O capítulo dois aborda a revisão bibliográfica a cerca

da produção de bioinseticidas virais a partir de células de inseto considerando as estratégias

de produção que são utilizadas normalmente em sistemas microbianos. O capítulo três

descreve o primeiro passo deste trabalho, o qual foi selecionar os isolados virais disponíveis

para a produção do bioinseticida. Os isolados genéticos do baculovírus AgMNPV

representados por três diferentes clones (AgMNPV-2D, AgMNPV-MP2 e AgMNPV-MP5)

foram cultivados em shaker e observados aqueles com maior capacidade de produção dos

corpos de oclusão. O capítulo quatro refere-se à produção in vitro do baculovírus

recombinante vAgEGT∆-LacZ observando seu desempenho em relação ao baculovírus

selvagem AgMNPV e o capítulo cinco aborda o aumento da produção in vitro do baculovírus

recombinante vAgEGT∆-LacZ através da estratégia de produção em batelada-alimentada

associada a baixa multiplicidade de infecção. O Capítulo 6 apresenta as conclusões finais e,

por fim, as referências que foram utilizadas para embasar a revisão bibliográfica e os

resultados obtidos durante este estudo.

Capítulo 2

Revisão Bibliográfica

8 __________________________________________________________________________________________Capítulo 2 Revisão Bibliográfica


2 Revisão Bibliográfica

2.1 Baculovírus

Os baculovírus são vírus isolados de invertebrados, principalmente de lepidópteros,

que possuem alta especificidade e não oferecem riscos ao homem e ao ambiente, pois não se

replicam em vertebrados e em plantas, características que os tornam excelentes agentes de

biocontrole de pragas agrícolas.

Os baculovírus são vírus da família Baculoviridae, que contêm DNA circular de fita

dupla como material genético, variando de tamanho entre 80 e 180 kbases (CASTRO;

RIBEIRO; SOUZA, 2006), são caracterizados pelos nucleocapsídeos em forma de bastão,

envelopados, apresentando um diâmetro entre 40-50nm e comprimento entre 200-400nm

(O’REILLY; MILLER; LUCKOW, 1994). Os nucleocapsídeos encontram-se no interior de

uma matriz proteica, formando os chamados corpos de oclusão (OB – occlusion bodies). Os

corpos de oclusão possuem cerca de 0,15 a 15 µm de diâmetro (BILIMORIA, 1991) que

permitem a sobrevivência das partículas infectivas fora de seu hospedeiro natural (KING;

POSSEE, 1992).

Existem dois gêneros distintos na família dos baculovírus, os Nucleopoliedrovirus

(NPVs) e os Granulovirus (GVs). Estes gêneros são diferenciados pelo tamanho das partículas

virais e pela natureza da proteína do corpo de oclusão (OB) (KING; POSSEE, 1992). Os

NPVs são classificados em dois subgrupos, grupo I e grupo II, baseados em dados

filogenéticos das sequências dos aminoácidos da poliedrina e da DNA polimerase

(ZANOTTO; KESSING; MARUNIAK, 1993; BULACH et al., 1997), apresentam forma

poliédrica que é constituída pela poliedrina, proteína com cerca de 30kDa de massa molecular

(SUMMERS et al., 1980), correspondendo cerca de 95% do seu conteúdo proteico

(MARUNIAK, 1986). Os NPVs, ainda, podem ser do tipo múltiplo (MNPV) ou simples

(SNPV), de acordo com o número de capsídeos existentes no virion. Os GVs são



caracterizados pela forma ovicilíndrica do corpo de oclusão, denominada grânulo, com

dimensão entre 0,3 e 0,5µm (CROOK, 1991), que geralmente possui uma única partícula viral

contendo somente um nucleocapsídeo, ocluso pela matriz proteica constituída pela proteína

granulina, conforme observa-se na Figura 2.1.

Figura 2.1. Estrutura da forma oclusa dos baculovírus

A nomenclatura dos baculovírus é baseada no nome do hospedeiro do qual foi isolado.

Por exemplo, o baculovírus isolado da lagarta do cartucho do milho, Spodoptera frugiperda,

recebe o nome de Spodoptera frugiperda multiple nucleopolyhedrovirus (SfMNPV), isolado

por Smith em 1978; o baculovírus isolado da lagarta da alfafa, Autographa californica, é

chamado de Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV), isolado por

Vail em 1971; outro exemplo clássico é o baculovírus isolado da lagarta da soja, Anticarsia

gemmatalis, denominado Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV),

isolado por Allen e Knell em 1977.

Recentemente, foi proposta a revisão substancial da taxonomia e classificação da

família Baculoviridae a partir de análises da sequência genômica de alguns baculovírus.

Comparações de 29 genomas de baculovírus indicaram que a filogenia dos baculovírus seguia

a classificação dos hospedeiros mais próximos do que as características morfológicas que

foram anteriormente utilizadas para classificação dos vírus dessa família. De acordo com a



nova proposta de classificação incluem-se mais quatro gêneros (JEHLE et al., 2006),

conforme mostra a Tabela 2.1.

Tabela 2.1 Gênero da família Baculoviridae

Gênero Membros

Alfabaculovírus NPVs de Lepidópteros

Betabaculovírus GVs de Lepidópteros

Gamabaculovírus NPVs de Hymenópteros

Deltabaculovírus NPVs de Dípteros

Diversos baculovírus já foram estudados, mas o baculovírus mais explorado em se

tratando da sua biologia molecular é o Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus

(AcMNPV), seu modelo de replicação é caracterizado e aceito como protótipo para os demais

baculovírus, o que permitiu desenvolver baculovírus recombinantes para o controle de pragas

e para serem utilizados como vetor de expressão de genes heterólogos. Além disso, o

AcMNPV foi o primeiro baculovírus a ser totalmente sequenciado. Tendo em vista que a

eficácia e segurança na utilização de baculovírus como vetores de expressão ou como

bioinseticidas dependem do profundo conhecimento da biologia desses vírus e suas interações

com seus hospedeiros naturais. Com o desenvolvimento de baculovírus geneticamente

modificados para serem utilizados como bioinseticidas, questões de biossegurança e análise

de riscos devem ser consideradas.

2.1.1 Baculovírus AgMNPV

O baculovírus Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) é um

vírus de DNA circular de fita dupla e genoma com 132.239 pb, patogênico em lepidópteros e

pertecente ao gênero alfabaculovírus (JOHNSON; MARUNIAK, 1989; OLIVEIRA et al.,

2006; JEHLE et al., 2006). O AgMNPV foi isolado de larvas de A. gemmatalis coletadas em

Campinas/SP (ALLEN; KNELL, 1977), a partir daí, vários isolados foram identificados e



caracterizados, dentre eles destaca-se o isolado de AgMNPV (LD-79) obtido, em 1979, a

partir larvas A. gemmatalis infectadas no campo de cultivo de soja perto de Londrina/PR. Este

isolado é rotineiramente produzido in vivo para uso como um bioinseticida no Brasil

(MOSCARDI, 1989) e aplicado nas culturas de soja para o controle biológico do seu

hospedeiro natural A. gemmatalis.

A utilização do baculovírus AgMNPV no Brasil representa o maior programa mundial

de aplicação de bioinseticida viral como controle biológico de pragas. Ele vinha sendo

aplicado anualmente para o controle da lagarta Anticarsia gemmatalis (principal

desfolheadora da lavoura de soja) em mais de um milhão de hectares de soja (MOSCARDI,

1999) o que proporcionava anualmente ao país, uma economia de 13 milhões/reais ao ano,

uma vez que eliminava a aplicação de cerca de 1,5 milhão de litros de inseticidas nas lavouras

brasileiras (MOSCARDI; SOUZA, 2002). Recentemente, o seu uso vem diminuindo, devido

ao aparecimento de outras pragas na cultura da soja e da estratégia agressiva de vendas das

empresas de inseticidas químicos (MOSCARDI, comunicação pessoal). Entretato, este ainda é

o maior exemplo mundial de utilização de um inseticida viral, além disso, representa um

modelo importante de substituição de agrotóxicos, que são altamente prejudiciais ao homem e

ao meio ambiente, por um controle ambientalmente correto.

Geralmente, uma aplicação bem sucedida de baculovírus é suficiente para manter o

controle durante todo o ciclo da cultura, porque há uma reposição e redistribuição do vírus,

devido aos focos deixados pelas lagartas mortas e pela grande quantidade de inóculo lançados

na lavoura (SECCHI, 2002). Embora o AgMNPV seja utilizado frequentemente no controle

da praga, o vírus demora em média 7 a 9 dias para matar a praga nas condições de campo.

Consequentemente, a engenharia genética, com o desenvolvimento de baculovírus

recombinante, deverá melhorar as propriedades inseticidas do vírus, inclusive a redução do

tempo para matar o hospedeiro devido ao aumento da virulência e, assim, poderá no futuro

aumentar sua utilização com menos dependência dos agrotóxicos.



2.2 Produção in vitro de baculovírus

Para multiplicação de baculovírus em cultura de células, o ciclo de infecção ocorre em

três fases básicas: inicial (early), tardia (late), e muito tardia (very late). Essas três fases

correspondem biologicamente a: (i) reprogramação da célula para replicação viral, (ii)

produção de BV, e (iii) produção de OB (O’REILLY, MILLER; LUCKOW, 1994).

A Figura 2.2 mostra o ciclo de infecção in vitro dos baculovírus. A primeira indicação

de infecção por vírus é o inchaço do núcleo celular e a formação de um material granular no

centro do núcleo que podem ser observados na fase inicial do processo (LUA; REID, 2000).

As alterações morfológicas (núcleo celular hipertrofiado) que podem ser visualizadas ao

microscópico ótico recebem o nome de efeito citopático. A próxima fase de infecção (tardia) é

caracterizada pela formação de uma estrutura densa, chamada estroma virogênico, onde

ocorre uma intensa produção de vírus extracelular (BV) e replicação do DNA viral. Na

terceira fase (muito tardia), há a síntese de novo da membrana que envolve os

nucleocapsídeos para formação do envelope viral e a posterior oclusão dos virions na matriz

proteica formando os corpos de oclusão (OB).

Figura 2.2 Ciclo da multiplicação in vitro de baculovírus (adaptado de ROHRMANN, 1999)



A replicação de baculovírus em células de inseto é caracterizada pela produção de dois

fenótipos diferentes que são produzidos em tempos distintos no ciclo de infecção. O vírus

extracelular ou budded virus (BV) é produzido no início do ciclo de infecção (fase tardia –

late) e responsável pela infecção de células a células no hospedeiro (infecção sistêmica). O

segundo fenótipo é caracterizado pelo empacotamento do virion (partícula viral) em uma

matriz proteica (fase muito tardia – very late), este fenótipo é denominado de corpo de

oclusão ou occlusion body (OB) (BLISSARD, 1996). O OB é menos infectivo para cultura de

células de inseto devido ao empacotamento proteico, mas, é responsável pela infecção de

inseto para inseto (infecção horizontal) através da ingestão do OB presente na dieta alimentar

do hospedeiro.

A partícula viral chamada de vírus derivado do corpo de oclusão ou occlusion derived

virion (ODV) são os virions contidos no interior do OB. O ODV pode conter um ou vários

nucleocapsídeos. Os GVs, por exemplo, contêm, geralmente, um único nucleocapsídeo por

envelope e, um único ODV por OB. Em contraste, cada OB de um NPV contém vários ODVs

(BLISSARD, 1996). Portanto, quando se libera ODV de um OB de NPV tem-se mais

possibilidade de infectar as células devido ao número maior de nucleocapsídeos em seu

interior.

Os virions envelopados normalmente entram na célula por fusão direta pela membrana

da superfície celular ou por endocitose (processo natural de absorção de material pela célula).

O ODV entra nas células por fusão do envelope do virion com a membrana plasmática da

célula (BLISSARD, 1996). A produção in vitro de baculovírus em cultivo de células é

realizada normalmente com o vírus extracelular (BV) da hemolinfa de insetos infectados ou

do sobrenadante (contendo BVs) das células previamente infectadas (KING; POSSEE, 1992).

Porém, é possível utilizar o ODV como fonte viral para inocular a cultura de células. Este

ODV é liberado dos corpos de oclusão (OB) a partir de soluções alcalinas (LYNN, 1994).

Estas formas virais podem ser observadas mais claramente na Figura 2.3.



Figura 2.3. Estrutura do virion

(Fonte: http://www.expasy.ch/viralzone/all_by_protein/13.html)

A produção de baculovírus em cultivo de células é relativamente fácil quando

comparada com o processo de produção in vivo e oferece algumas vantagens: podem ser

selecionadas linhagens específicas, preservadas e armazenadas em meios criogênicos para sua

utilização no futuro e podem ser testadas para assegurar que estejam livres de contaminantes

que certamente afetariam a qualidade do produto final (KING; POSSEE, 1992). No entanto, o

processo de produção in vitro de baculovírus apresenta algumas limitações. Uma das

limitações é a diminuição da eficiência de infecção (virulência) do vírus pela rápida

acumulação de mutantes FP (few polyhedra) ou de partículas interferentes defectivas (DIPs)

resultantes de passagens sucessivas do vírus em cultivo de células.

Diversos estudos têm abordado a produção in vitro de baculovírus para produção de

proteínas recombinantes e de bioinseticida viral, dentre eles destacam-se: Chan; Greenfield;

Reid (1998) utilizando células Sf9 infectadas com baculovírus recombinante de Autographa

californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV), como sistema de expressão, para

produção de β-galactosidase; estudando cultivos do baculovírus SfMNPV, Pedrini; Wolff;

Reid, (2004) analisaram a estabilidade do SfMNPV durante a passagem seriada também



utilizando células Sf9 caracterizando o efeito passagem; Almeida, (2005) utilizando duas

linhagens de S. frugiperda, Sf21 e Sf9, verificou a capacidade de produção de corpos de

oclusão do baculovírus Spodoptera frugiperda multiple nucleopolyhedrovirus (SfMNPV) em

cultivos em shaker; Castro et al. (2006) verificaram a infectividade do baculovírus Anticarsia

gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) em diferentes linhagens de células:

Trichoplusia ni BTI-Tn-5B1-4, Anticarsia gemmatalis UFL-AG-286, S. frugiperda IPLB-SF-

21AE e Sf9, L. dispar IPLB-LD- 652Y e por fim, a B. mori BM-5 com a finalidade de

quantificar a produção viral, observar a morfologia e a síntese de proteínas; Pedrini et al.

(2006) utilizando células de Helicoverpa zea para produção e estabilidade através da

passagem seriada dos baculovírus Helicoverpa armigera single nucleopolyhedrovirus

(HaSNPV) e Helicoverpa zea single nucleopolyhedrovirus (HzSNPV); Gioria; Jäger; Claus.

(2006) utilizando as células Anticarsia gemmatalis UFL-AG-286 verificaram a produção dos

corpos de oclusão do baculovírus Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus

(AgMNPV) produzidos em suspensão; Rezende; Castro; Souza. (2008) também utilizando o

baculovírus AgMNPV verificou a produção de corpos de oclusão e estabilidade deste virus

cultivado sucessivas vezes em células Trichoplusia ni BTI-Tn-5B1-4.

Estes estudos evidenciam o grande interesse no cultivo de baculovírus para a produção

de proteínas ou bioinseticidas virais.

2.2.1 Passagem seriada

A passagem seriada consiste em uma série consecutiva de infecções virais em células

hospedeiras. Nestas infecções virais, utiliza-se o inóculo (normalmente, vírus extracelular)

obtido da infecção anterior e, assim, sucessivamente. Com isto, pode ser analisada a

estabilidade do vírus durante seu cultivo em células e a produção dos corpos de oclusão

durante o processo de aumento de escala.

A passagem seriada de baculovírus em cultura de células de inseto pode observar uma

variedade de mutações (CHAKRABORTY; REID, 1999). As mutações mais freqüentes são:

mutantes FP (Few Polyhedra) e partículas interferentes defectivas (DIPs). A geração destes



mutantes durante as passagens do cultivo de células pode comprometer o sistema in vitro para

produção de baculovírus em larga escala.

Os mutantes FPs são caracterizados por um decréscimo na formação de OB e um

aumento significativo na formação de BV. Os OBs produzidos praticamente não contêm

partículas virais infecciosas, portanto, possuindo baixa ou nenhuma infectividade aos seus

hospedeiros.

A Figura 2.4 mostra o núcleo de células infectadas que apresentam os dois tipos de

variantes produzidos in vitro: os baculovírus muitos poliedros (MP) e os baculovirus com

poucos poliedros (FP) que podem ser observados durante a passagem seriada de baculovírus

em cultivo de células hospedeiras.

Figura 2.4 Núcleo de células infectadas apresentando dois tipos de fenótipos: (A) Baculovírus muitos poliedros (MP); (B) Baculovírus com poucos poliedros (FP) (Fonte: PEDRINI, 2003).

Diversos mutantes FP de Autographa californica MNPV (AcMNPV) e Galleria

mellonella MNPV (GmMNPV) têm sido caracterizados. A geração de mutantes FP destes

vírus estão correlacionados com a ausência da proteína 25kDa e com a presença de grandes

inserções e deleções (0,4 a 2,8 kpb) dentro de uma região específica dos genomas virais do



AcMNPV e GmMNPV. Esta região contém o gene 25K FP, que é essencial para formação da

matriz proteica e do corpo de oclusão (OB) (revisado por BISCHOFF; SLAVICEK, 1997).

Os mutantes de Lymantria dispar MNPV (LdMNPV) com fenótipos alterados na formação do

poliedro (PF) são gerados com alta freqüência durante a passagem seriada em cultivo de

células. A maioria destes mutantes exibe todas as características dos mutantes FP. As

mutações encontradas nos isolados de LdMNPV foram mapeados para o gene 25 K FP e após

analisados não continham grandes inserções ou deleções como são normalmente encontrados

nos mutantes FP dos baculovírus AcMNPV e GmMNPV (BISCHOFF; SLAVICEK, 1997).

A rápida geração de fenótipo (FP) também foi observada na produção in vitro de

baculovírus Spodoptera frugiperda multiple nucleopolyhedrovirus (SfMNPV), detectada após

somente duas passagens do isolado SfMNPV em cultura de células Sf9 (PEDRINI; WOLFF;

REID, 2004). Em cultivos realizados por Almeida (2005) utilizando também um isolado de

SfMNPV cultivado em células Sf9, observou-se uma maior estabilidade deste isolado, visto

que a diminuição da sua produtividade (indicativo de formação de mutantes) foi identificada

após a quarta passagem em células.

Outro tipo frequente de alteração genética é a produção de DIPs, estas partículas

contêm apenas parte do genoma viral, replicam mais rapidamente que o vírus padrão. A

maioria das partículas defectivas está presente em altas passagens seriadas do vírus e é

produzida mais rapidamente quando se utiliza uma multiplicidade de infecção (MOI) muita

alta (SOUZA et al., 2003).

A Figura 2.5 mostra um gel de eletroforese que apresenta a mudança genotípica do

baculovírus Helicoverpa armigera single nucleopolyhedrovirus (HaSNPV), neste caso,

percebe-se que os vírus provenientes de corpos de oclusão (ODV) e de baixa passagem

possuem DNA com aproximadamente 133-134 kb (de acordo com a literatura para o

baculovírus HaSNPV). As passagens mais altas apresentam o aumento de partículas com um

menor tamanho (92,3 kb) e diminuição de partículas com tamanho original, indicando a

produção de partículas defectivas (DIPs) (PEDRINI et al, 2005a).



Figura 2.5 Gel de eletroforose que mostra a mudança genotípica do baculovírus Helicoverpa armigera SNPV durante passagem seriada em cultura de células. (Fonte: PEDRINI et al.,

2005a)

2.2.2 Multiplicidade de infecção (MOI)

A infectividade de um vírus depende de vários fatores, entre eles, da proporção de

partículas virais completas, ou infecciosas; da suscetibilidade da célula hospedeira (ex.

quantidade de receptor) e da chance desta partícula encontrar o receptor e penetrar na célula.

Quando células suscetíveis são misturadas com uma suspensão de vírus, estas podem receber

um, dois, três, dez partículas virais ou nenhuma. Isto depende da proporção entre a quantidade

de vírus infecciosa presente no inóculo (título viral) e a quantidade de células utilizada no

momento da infecção (TOI). Esta relação é denominada de multiplicidade de infecção ou

MOI .



2.2.3 Titulação viral (TCLD50)

O título do estoque viral é a concentração de partículas virais infecciosas. O título não

é equivalente à concentração total de partículas virais porque nem todas as partículas virais

são infecciosas.

Existe uma ampla variabilidade de ensaios que podem ser utilizados para detectar e

quantificar o título viral. Cada método tem suas vantagens e desvantagens, os dois principais

métodos utilizados para quantificar as partículas virais infecciosas são: o ensaio de placas

(plaque assay) e o ensaio do efeito citopático (CPE). Ambos os tipos de ensaios têm sido

utilizados frequentemente para quantificar o título viral (DARLING et al., 1998).

No ensaio em placas (plaque assay), o vírus entra nas células após um período de 1

hora de adsorção, o inóculo viral é removido e uma camada de agarose é adicionada na placa.

A camada restringe os focos de infecção às células adjacentes, por que cada placa possui uma

única partícula infecciosa, a concentração de vírus infeccioso pode ser determinada pela

contagem das placas formadas pelas diferentes diluições virais. O título é expresso em

unidades formadoras de placas por mililitro (UFP/mL) e a MOI em UFP (unidades

formadoras de placas) adicionada por célula (DEE; SHULLER, 1997).

Outro método comumente utilizado para titulação viral é o ensaio da diluição do ponto

final (endpoint dilution assay). Este método produz alta variabilidade na qual é inerente às

propriedades biológicas, mas é também um método de avaliação qualitativa utilizado para

identificar as células infectadas, especialmente quando possuem proteínas, tais como a β-

galactosidase (MENA; RAMÍREZ; PALOMARES, 2003).

No ensaio de diluição de ponto-final, as diferentes diluições virais são inoculadas em

múltiplas culturas em monocamadas. O título obtido a partir deste método é conhecido como

a dose letal para infectar 50% da cultura de tecidos (TCLD50) que pode ser convertida em

UFP pela seguinte relação estatística UFP/mL = 0,69 x TCLD50/mL (DEE; SHULLER,

1997).

O método da viabilidade celular consiste na clivagem do anel tetrazólio do reagente

MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-brometo de difenil tetrazólio) através da enzima redutase

mitocondrial em células viáveis. O produto resultante desta quebra é o sal de formazan que



possui uma coloração magenta, permitindo quantificar as células viáveis com auxílio do

espectrofotômetro (leitora de microplacas) a 570nm.

Como o baculovírus é um vírus lítico, ou seja, ocasiona a lise celular, portanto, espera-

se com a infecção uma diminuição do crescimento celular. Tal redução poderá ser estimada

pela medida a concentração de células viáveis utilizando o MTT e, consequentemente, poderá

ser correlacionada com o título viral (MENA; RAMÍREZ; PALOMARES, 2003). A Figura

2.6 mostra a clivagem do anel tetrazólio do MTT provocada pela enzima mitocondrial

redutase para formação dos cristais de formazan.

Figura 2.6 Clivagem do anel tetrazólio do MTT

(Fonte: en.wikipedia.org/wiki/File:Mtt_scheme.gif)

Para determinar o TCLD50, uma curva sigmoidal é ajustada aos dados obtidos através

da absorbância lida, obedecendo à seguinte Equação (1):

b

D

D

aYY

+

+=

0

0

1

(1)

Onde:

Y – absorbância

Y0 – mínima absorbância (mínima concentração de células viáveis, 100% de resposta)



a – absorbância máxima (0% de resposta)

D – diluição

D0 – diluição na qual a resposta foi 50% (1/TCLD50)

b – fator de inclinação

Então, para obter-se o valor de TCLD50/mL, pode ser utilizada a seguinte Equação:

VDmLTCLD

.

1/

050 = (2)

Onde:

V – volume da diluição viral adicionado em cada poço.

D0 - diluição na qual a resposta foi 50% (1/TCLD50)

2.3 Estratégias de produção in vitro de baculovírus

Para se decidir sobre o modo de operação mais adequado para produção em biorreator,

vários fatores devem ser levados em consideração. Em escala industrial, os principais fatores

são: (i) características da linhagem de célula utilizada, tais como estabilidade de expressão do

produto, grau de resistência aos metabólitos inibitórios e ainda, resistência à tensão de

cisalhamento; (ii) a demanda de mercado do produto; (iii) experiência técnica da equipe

responsável para ambos os processos de desenvolvimento e regulatórios (VÉLIZ;

RODRIGUEZ; CORDERO, 2008).

As diferentes estratégias de operação utilizadas normalmente nos cultivos com micro-

organismos são aplicáveis também aos cultivos com células animais, tais como: cultivo

descontínuo (batelada ou batch), cultivo descontínuo alimentado (batelada-alimentada ou fed-

batch), cultivo contínuo e cultivo contínuo com retenção de células, também conhecido como

perfusão. Neste item, a abordagem será somente sobre os cultivos em batelada e batelada

alimentada que foram utilizados como estratégias na produção in vitro do baculovírus

AgMNPV.



2.3.1 Processo em batelada ou descontínuo

O processo em batelada ou descontínuo de produção consiste em inocular uma única

vez a suspensão celular sem qualquer suplementação adicional de nutrientes/substrato

(sistema fechado), o volume é mantido constante durante o cultivo. A concentração celular

aumenta desde a concentração de inóculo variando normalmente de 1,0 a 5,0x105 células

viáveis/mL até atingir valores máximos entre 4,0 a 6,0x106 células viáveis/mL, com

velocidades específicas de crescimento oscilando entre 0,48 e 0,96d-1, com tempo necessário

para atingir a máxima concentração celular de aproximadamente 5 dias (CHICO;

RODRÍGUEZ; FIGUEREDO, 2007). Neste tipo de processo, existe uma limitação quanto ao

esgotamento de nutrientes e/ou acúmulo de metabólitos tóxicos ou inibidores

(ALTAMIRANO et al., 2004).

A estratégia de operação em batelada é a mais simples de ser executada, portanto, a

mais empregada nos cultivos. É utilizada em frascos de cultivo em monocamadas

(estacionário), nos frascos agitados (Erlemeyers ou spinners) e, ainda, em biorreatores

variando escala de pequena a intermediária para propagação de inóculo e também em várias

indústrias para produção em escala. No caso da propagação de inóculo, a cutura é cessada

quando as células atingem a fase exponencial de crescimento, que promove alta concentração

de biomassa multiplicando-se com máxima velocidade. Dessa maneira, garantindo que estas

células, quando inoculadas em reator com alto volume, possuem uma mínima fase de

adaptação, e assim reduzindo o período de improdutividade (VÉLIZ; RODRIGUEZ;

CARDERO, 2008).

O cultivo em batelada apresenta algumas vantagens como: facilidade para realizar e

controlar o processo; reduz o risco de contaminação (sistema fechado); construção e

instrumentação simples e barata; processo adequado para curtos períodos de tempo. Porém,

também apresenta algumas desvantagens como: baixos rendimentos e/ou produtividades;

quando o substrato é adicionado de uma só vez no início do cultivo exerce efeitos de inibição,

repressão, ou desvia o metabolismo celular a produtos que não se tem interesse no processo.

(CARVALHO; SATO, 2001).



A baixa produtividade desses cultivos é limitada pela concentração de células obtidas,

considerando que o produto necessariamente precisa das células para se desenvolver,

consequentemente, ocorre uma baixa concentração do produto ao final do processo.

Entretanto, uma estratégia variante conhecida como “bateladas repetidas” é uma alternativa

interessante. Esta estratégia consiste em realizar o cultivo em batelada por um tempo

necessário até atingir uma concentração desejada do produto. Neste momento, parte do

conteúdo do biorreator é coletada. A suspensão de células remanescente dentro do biorreator é

utilizada como inóculo para uma nova batelada. Este procedimento pode ser repetido várias

vezes, até que seja observada uma redução na concentração celular ou na formação do

produto desejado.

A Figura 2.7 mostra o comportamento da concentração de biomassa e de substrato

durante um processo em batelada. Este comportamento em termos de células, nutrientes, e

concentração de produtos pode ser descritos matematicamente pelos balanços de massa e

expressões cinéticas, tais como a Equação de Monod, que descreve os efeitos dos nutrientes e

concentração de metabólitos através das velocidades específicas de reação (AUGUSTO;

BARRAL; PICCOLI, 2007).

Figura 2.7 Curva característica de processo em batelada: Xv – concentração de células viáveis; [S] – concentração de substrato



Equações de balanço:

Xdt

dX ⋅= µ (3)

Xqdt

dSS ⋅−= (4)

Xqdt

dPP.= (5)

Onde:

µ – velocidade específica de crescimento (d-1)

X – concentração de células (células/mL)

qS – velocidade de específica de consumo de substrato (mg/mL.d)

qp – velocidade de específica de formação de produto (mg/mL.d)

dt

dX – velocidade de variação de crescimento (células/d)

dt

dS – velocidade de variação de substrato (mg/d)

dt

dP – velocidade de variação de produto (mg/d)

O termo µ da Equação (3) é historicamente proveniente do cultivo microbiano no qual

a morte natural das células é insignificante durante o crescimento. No caso do cultivo de

células animais, há sempre uma quantidade mensurável de morte celular (quantificado por

método de exclusão), e esta é incluída no cálculo da velocidade específica de crescimento.

Power (1993) desenvolveu um modelo cinético que representa a dinâmica da população de

células (viáveis e mortas) e a cinética de produção de baculovírus que descreve o modelo

dinâmico não estruturado com ênfase no processo de infecção. Portanto, para o cultivo de



células animais, o valor de µ obtido a partir do crescimento de células viáveis é chamado de

velocidade de crescimento “aparente” (µap), que é a diferença entre a velocidade específica de

crescimento (µ) e a taxa de mortalidade ou velocidade específica de morte celular (Kd)

representados na Equação (6):

µap = µ - Kd (6)

Substituindo a Equação (6) na Equação (3) obtém-se a equação para o crescimento de células

viáveis não infectadas (XVNI) antes da inoculação com o baculovírus, conforme Equação (7):

VNIdVNI XK

dt

dX⋅−= )(µ (7)

Similarmente, a concentração das células não viáveis não infectadas (XNVNI) depende da

concentração de células viáveis não infectadas e é dado pela Equação (8):

VNIdNVNI XK

dt

dX⋅= (8)

Onde Kd é a constante de mortalidade de 1ª Ordem, portanto, a velocidade específica de morte

celular. Valores de µ e Kd são obtidos a partir da quantificação do número de células e

viabilidade retirados durante os experimentos de crescimento celular. A metodologia mais

utilizada para determinação da concentração de células mortas é o método por exclusão por

corante, e não se aplica quando a lise celular é significativa (no caso, quando a infecção é

estabelecida). A velocidade especifica de morte celular pode ser calculada conforme indica a

Equação (9).

)0(.

)0(

).1(

).(

VNIt

apNVNINVNId

Xe

XXK

ap −

−= µ

µ (9)



Para o cálculo de Kd pela Equação (9), o número de células viáveis não infectadas do começo

(XVNI(0)) foi normalizado em relação ao número de células não viáveis não infectadas

(XNVNI(0)).

Na ausência da infecção viral, o substrato (S) é consumido a uma velocidade constante

(qs) através do crescimento exponencial das células animais em suspensão, Equação (10).

VNIS Xqdt

dS ⋅−= (10)

O termo qs representa a velocidade de consumo de substrato em cada célula viável não

infectada. Esta velocidade especifica de consumo é considerada proporcional à velocidade de

crescimento, conforme a Equação (11):

ss Y

qµ= (11)

Onde Ys é o rendimento do crescimento de células por unidade de substrato. Os valores de µ e

Ys podem ser estimados a partir dos experimentos de crescimento celular.

No processo de infecção, após a inoculação viral, considerando alta multiplicidade de

infecção e que todas as células tornam-se infectadas imediatamente. O modelo cinético é

baseado no “sincronismo” da infecção celular, assim, o número de células viáveis infectadas é

igual ao número de células viáveis não infectadas no tempo de infecção (TOI). No modelo, é

considerado que o crescimento celular é inibido após a exposição ao vírus.

Para estimar a velocidade específica de crescimento )(τµ das células infectadas utiliza-

se a Equação (12):

VIdVI XK

dt

dX⋅−= ))()(( ττµ (12)



Onde Kd é a taxa de mortalidade das células infectadas, refletindo o impacto letal do vírus. A

velocidade específica de crescimento (µ) das células infectadas é uma função do tempo de

pós-infecção (τ), e é considerado igual às células não infectadas enquanto o virus está em

estágio inicial da replicação (τei) (POWER; NIELSEN, 1996).

Como outros parâmetros de infecção, Kd é uma função do tempo que as células têm

sido infectadas (τ). Este valor é igual à medida da taxa de mortalidade das células não

infectadas enquanto a infecção não é iniciada. Após este momento, a taxa de mortalidade é

zero até o tempo final da infecção (τd), ponto em que ocorre a lise celular. A lise da

população de células infectadas é descrita por uma taxa de mortalidade infinita, conforme

Equação (13):

dK

=)(τdK 0 0 (13)

∞

Cada célula infectada passa por um ciclo específico de eventos durante seu período de

infecção. As células infectadas produzem vírus extracelular (na fase inicial do processo de

infecção) a uma taxa dependente do número de células viáveis infectadas, dada pela Equação

(14):

VKXdt

dVdvVIpv .).( −= τα (14)

Onde: Kdv taxa de decomposição do virus e αpv é a taxa de produção de vírus por célula

infectada. Assumindo sincronismo de infecção, esta taxa de produção é em função do tempo

em que as células foram infectadas (τ). Ela é constante e positiva enquanto as células estão em

fase de produção viral, que dura do tempo em que o primeiro virion foi liberado (τvrs) até o

tempo de quantidade máxima de vírus extracelular (τvre).

para eiττ ≤

para dei τττ ≤<

para dττ >



Para quantificação dos corpos de oclusão (OB) produzidos na fase mais tardia do

processo de infecção utiliza-se a Equação (15):

)().()(

OBKXdt

OBddpOBVIpOB −= τα (15)

A taxa específica de produção de OB (αpOB) é constante no tempo de inicio da intensa

produção de OB (τi) até o tempo do final da produção intensa de OB (τf).

A Figura 2.8 apresenta o perfil da produção de OB em células de inseto, a curva prediz

um aumento linear e constante na atividade de produção de OB com o tempo, portanto, o

cálculo da constante pOBα pode ser obtido através de um ajuste linear aos pontos

experimentais da produção de OB durante a intensa atividade viral. Esta constante é a

velocidade média de produção de OB no processo de infecção.

Figura 2.8 Curva característica da produção de OB em células de inseto: [OB] – concentração de OB; τi – tempo inicial de pós-infecção e τf – tempo final de pós-infecção



2.3.2 Processo em batelada-alimentada ou descontínuo-alimentado

O processo descontínuo alimentado, também conhecido como processo por batelada

alimentada ou, simplesmente, fermentação descontínua alimentada é definido como uma

técnica onde um ou mais nutrientes são adicionados durante o cultivo e os produtos

permanecem até o final do cultivo (CHICO; RODRÍGUEZ; FIGUEREDO, 2007). A vazão de

alimentação pode ser constante ou variar com o tempo, e adição de substrato pode ser

continua ou intermitente. A mudança de volume pode ou não ocorrer, dependendo da

concentração de substrato e da taxa de evaporação do sistema (CARVALHO; SATO, 2001).

A alimentação de nutrientes ao longo do processo permite aumentar a quantidade total

de nutrientes utilizados pelas células, o que proporciona maiores concentrações finais de

células e produto. Esta alimentação de nutrientes pode ser administrada utilizando diferentes

maneiras: adição por pulsos, adições segundo perfis escalonados e adições à vazão constante

(CHICO; RODRÍGUEZ; FIGUEREDO, 2007).

A utilização do processo descontínuo alimentado pode ser útil quando se procura

contornar alguns fatores como: a minimização dos efeitos do controle do metabolismo celular

- para que não haja superprodução de um determinado produto ou síntese de uma enzima

desnecessária; prevenção da inibição por substrato – o controle da vazão de alimentação

permite que se evite o trabalho em condições inibitórias, melhorando a produtividade e/ou

rendimento dos bioprocessos; a minimização da formação de produtos de metabolismo

tóxicos que é particularmente crítica em processos em que se deseja a obtenção de altas

concentrações celulares, como é o caso do cultivo de células animais, neste tipo de cultivo os

metabólitos tóxicos mais comuns são lactato e amônia (revisado por CHICO; RODRÍGUEZ;

FIGUEREDO, 2007).

Estratégias de alimentação para manter baixos os níveis de nutrientes, assim como a

substituição parcial ou total de substratos como a glicose e a glutamina por outros mais

lentamente metabolizáveis, permitem diminuir a produção de lactato e amônio. Altamirano et

al. (2004) propuseram que para o cultivo em batelada-alimentada com células derivadas do

ovário do hamster chinês (CHO) produtoras de tPA (ativador plasminogênio tecidual), a

substituição de glicose por galactose, um açúcar mais lentamente assimilável, o que permite a



diminuição da produção de lactato, associada ao aumento na viabilidade celular e na produção

de tPA. O controle da velocidade de fornecimento de substrato ao sistema permite que se

mantenha a velocidade de crescimento celular em intervalos desejados que minimize a

formação destes produtos tóxicos para as células, possibilitando altas concentrações celulares

e, consequentemente, aumento na quantidade de produto formado. (CARVALHO; SATO,

2001).

A definição clássica de alimentada é limitar o fornecimento de um substrato,

geralmente glicose, como uma ferramenta para controlar a velocidade específica de

crescimento. Esta estratégia, no entanto, não é possível para células animais, pois

concentração muito baixa de substrato poderia induzir a apoptose (morte programada) das

células (AUGUSTO; BARRAL; PICCOLI, 2007). A batelada-alimentada para cultura células

animais é uma questão mais de limitar a formação de subprodutos metabólicos e fornecimento

de nutrientes (SPENS, 2006).

A Figura 2.9 mostra o perfil da concentração de biomassa e substrato em um processo

em batelada-alimentada, característica fundamental é a concentração de substrato permanecer

constante durante o processo.

Figura 2.9 Curva representativa de um processo em batelada-alimentada: Xv – concentração de células viáveis; [S] – concentração de substrato



As Equações (16), (17) e (18) representam o processo descontínuo-alimentado e

permitem estimar as variáveis cinéticas, bem como sua otimização:

XV

FX

dt

dX.−⋅= µ (16)

( ) XqSSV

F

dt

dSS ⋅−−= 0 (17)

PV

FXq

dt

dPP ⋅−= . (18)

Onde:

µ – velocidade específica de crescimento (d-1)

X – concentração de células (células/mL)

F – vazão volumétrica de alimentação (mL/d)

V – volume de cultivo (mL)

P – concentração de produto (mg/mL)

S0 – concentração inicial de substrato (mg/mL)

S – concentração final de substrato (mg/mL)

qS – velocidade de consumo de substrato (mg/mL.d)

qp – velocidade de formação de produto (mg/mL.d)

dt

dX – velocidade de variação de crescimento (células/d)

dt

dS – velocidade de variação de substrato (mg/d)

dt

dP – velocidade de variação de produto (mg/d)



Observa-se que essas equações distinguem-se daquelas apresentadas para o cultivo em

batelada pelos termos relativos à adição, a uma vazão (F), de meio de cultura ou solução de

nutrientes, com concentração de substrato (S0).

Uma desvantagem do cultivo em batelada-alimentada é o longo tempo de residência

do produto no ambiente de cultivo. Durante o tempo de cultivo, o produto sofre influências

devido à presença de proteases e glicosidases, estas enzimas podem degradá-lo e, em alguns

casos, destrói uma fração importante do material ativo sintetizado (revisado por VÉLIZ;

RODRIGUEZ; CARDERO, 2008).

2.3.3 Processo de produção em baixa MOI (Low MOI)

Existem algumas maneiras para infectar as células de inseto em suspensão no que se

refere à multiplicidade de infecção. A MOI pode ser classificada em alta e baixa. Em

processos de batelada geralmente emprega-se uma alta MOI na fase exponencial de

crescimento, essencialmente as células serão infectadas imediatamente, o que resulta no

sincronismo da infecção das células de inseto (WONG et al., 1996). O sincronismo de

infecção favorece o rendimento na produção de baculovírus, mas a utilização de alta MOI

pode resultar na formação de partículas interferentes defectivas (DIPs) durante a passagem

seriada do vírus provocando assim o chamado efeito passagem (WICKHAM et al., 1991).

No caso de baixa MOI, entretanto, somente uma fração das células são inicialmente

infectadas (infecção primária). As células remanescentes não são afetadas pelo processo de

infecção e continuam crescendo (ZHANG; ENDEN; MERCHUK, 2005). Posteriormente,

estas células poderão ser infectadas pelos vírus gerados na infecção primária, permitindo que

mais células sejam infectadas no cultivo antes da lise celular (LIEBMAN et al., 1999),

caracterizando o não sincronismo no processo de infecção originando populações múltiplas de

células que coexistem simultaneamente, isto aumenta a complexidade do processo

(MARANGA et al., 2004).



Utilizando baixa MOI com um tempo de infecção mínimo, ou seja, uma concentração

muito baixa de células viáveis, poderá minimizar a formação de mutantes ou de DIPs (KOOL

et al.,1991; ZHENG; GREENFIELD; REID, 1999). A amplificação viral em baixa MOI é a

melhor estratégia para preservar a integridade genética do vírus prevenindo a formação destes

interferentes.

A multiplicidade de infecção (MOI) é, provavelmente, o conceito mais amplo

utilizado nas pesquisas de produção de vírus (MARANGA et al., 2004). A utilização da baixa

multiplicidade de infecção (Low MOI) para produção de baculovírus em sistema de células de

inseto é uma alternativa atrativa para o processo de ampliação de escala, pois, há uma

diminuição no tempo de produção, no custo do equipamento e na possibilidade de

contaminação (ZHANG; ENDEN; MERCHUK, 2005). Existe ainda um incentivo comercial

para utilizar baixas MOIs, devido ao menor custo de obtenção de inóculo viral, ou seja, menos

quantidade de vírus é utilizada para infectar as células (WONG et al., 1996).

Nos cultivos em batelada tradicionalmente emprega-se uma MOI que varia de

intermediária a alta necessitando de dois processos paralelos de ampliação de escala – um

para as células e outro para os vírus. A utilização de MOI tão baixa quanto 0,0001

UFP/Célula permite o processo de infecção, ainda que se utilize este baixo nível de vírus.

Utilizando baixa MOI no sistema células Sf9/AcMNPV para produção de β-galactosidase, a

quantidade de proteína recombinante obtida foi comparável ao obtido no sistema utilizando

alta MOI, portanto sem perdas no rendimento de produção (WONG et al., 1996).

Apesar de alguns estudos já tenham sido desenvolvidos com baixa multiplicidade de

infecção para a expressão de proteínas recombinantes utilizando o sistema células de inseto-

baculovírus, pouca informação é encontrada na literatura sobre esta metodologia para a

produção de bioinseticidas.

Capítulo 3

Seleção dos isolados selvagens de baculovírus AgMNPV

35 __________________________________________________________________________________________Capítulo 3 Seleção dos isolados selvagens de baculovírus AgMNPV


3 Seleção dos isolados selvagens de baculovírus AgMNPV

Neste capítulo, será mostrado a cinética de crescimento celular e de produção dos

corpos de oclusão obtidos das infecções com três isolados genéticos do baculovírus AgMNPV

purificados em cultura de células, AgMNPV-2D (padrão), AgMNPV-MP2 e AgMNPV-MP5.

A seleção de isolados genéticos estáveis que possuem o melhor desempenho na capacidade de

produção in vitro de bioinseticidas virais foi necessária para a comparação entre o AgMNPV

selvagem e seu recombinante vAgEGT∆-LacZ que integra o estudo da produção in vitro de

corpos de oclusão utilizados como bioinseticidas.

3.1 Introdução

Os baculovírus encontram-se naturalmente como populações heterogêneas de

genótipos virais (MARUNIAK; BROWN; KUNDSON, 1984; SHAPIRO et al., 1991). O

estudo das variações ocorridas espontaneamente em baculovírus pode ser fundamental para o

entendimento de mecanismos envolvidos na patogenicidade e especificidade destes isolados.

Existe grande interesse em conhecer os mecanismos genéticos responsáveis por essa variação

e a avaliação dessa diversidade tem mostrado a existência de grande variabilidade genética,

seja de diferentes tipos de baculovírus ou dentro de um mesmo isolado.

Pesquisas têm mostrado a importância na diferença de suscetibilidades de diversos

isolados virais em linhagens celulares. Os baculovírus exibem um alto grau de instabilidade

genética quando propagados in vitro e os variantes identificados na passagem seriada deste

vírus pode não representar os constituintes do isolado original. A análise desta variabilidade é

uma fonte de informação que pode ser utilizada para modificá-los ou melhorá-los

geneticamente. A análise do perfil de restrição do genoma viral, digerido com várias enzimas,

tem sido utilizada para identificar esta variabilidade entre os baculovírus e para diagnosticar

variantes genômicos do mesmo vírus, que podem ter sido isolados originalmente de



hospedeiros diferentes e classificados como vírus distintos (BROWN; MARUNIAK;

KNUDSON, 1984; GOTO; MINOBE; LIZUKA, 1992).

Estudos foram realizados com o AgMNPV na identificação e distinção de diferentes

genótipos virais, e na construção do mapa físico de seu genoma. Isolados foram purificados

por plaque assay, no qual os DNA virais foram submetidos à análise de restrição.

Inicialmente, foram detectados seis variantes genotípicos (MARUNIAK, 1989), a partir de

um isolado viral coletado em 1979 no Brasil (AgMNPV-79). Em seguida, a partir desses

variantes e utilizando a mesma técnica, foram selecionados 45 clones virais. Desses, o DNA

do protótipo denominado AgMNPV-2D, representando 40% dos isolados obtidos, foi

mapeado e um total de 51 sítios de restrição foram determinados (JOHNSON; MARUNIAK,

1989). A região do gene da poliedrina do vírus AgMNPV-2D foi sequenciada, sendo

identificada uma ORF (open reading frame), ou seja, as sequências de DNA compreendidas

entre o códon de início da tradução e um códon de terminação, com a capacidade de codificar

um polipeptídio de 245 aminoácidos (cerca de 735pb), com massa molecular de 28,55 kDa

(ZANOTTO et al., 1992). O sequenciamento dessa região e do genoma completo do isolado

AgMNPV-2D (OLIVEIRA et al., 2006), juntamente com estudos filogenéticos mostraram

que o AgMNPV apresenta organização genômica e identidade de sequência com os vírus

Choristoneura fumiferana defective MNPV (CfDefNPV), Autographa californica multiple

nucleopolyhedrovirus (AcMNPV), Orgyia pseudotsugata multiple nucleopolyhedrovirus

(OpMNPV) e Bombyx mori multiple nucleopolyhedrovirus (BmMNPV) entre outros

baculovírus (ZANOTTO; KESSING; MARUNIAK, 1993; OLIVEIRA et al., 2006).

Clones denominados many polyhedra (MP) têm sido considerados uma alternativa

interessante para o desenvolvimento da produção in vitro de baculovírus. Estes variantes têm

sido obtidos após passagem seriada em cultura de células e estão presentes na mistura de

populações do vírus selvagem e de mutantes few polyhedra (FP), decorrentes do efeito

passagem. Portanto, os variantes many polyhedra são morfologicamente semelhantes ao vírus

selvagem (wild type), com capacidade de formar vários poliedros no núcleo das células, e

podendo produzir uma alta quantidade de vírus extracelulares (BV) de forma a competir com

os mutantes few polyhedra. A seleção de vírus estáveis com fenótipo MP, isolados durante a

passagem seriada em cultivos celulares, foi descrita para os baculovírus LdMNPV



(SLAVICEK et al. 1996; SLAVICEK; HAYES-PLAZOLLES; KELLY, 2001), HaSNPV

(PEDRINI et al., 2005) e AgMNPV (REZENDE et al., 2008).

Estudos realizados por Rezende et al. (2008) mostraram a obtenção dos clones virais

AgMNPV-MP2 e AgMNPV-MP5. O baculovírus AgMNPV-2D foi propagado

sucessivamente até a 7ª passagem em células Tn5B1-4 cultivadas em monocamadas. Durante

a passagem seriada, os clones virais foram selecionados pela técnica de plaque assay

(KUNDSON, 1976) adaptada por O’Reilly; Miller; Luckow (1994) com características

morfológicas Few Polyhedra (FP) e Many Polyhedra (MP) e amplificados em células Sf21.

Após amplificação, os clones com características (MP) e possivelmente geneticamente

estáveis foram selecionados. Seis clones de variantes Many Polyhedra (MP1, MP2, MP3,

MP4, MP5 e MP6) foram obtidos pelo método de plaque assay e dentre eles, os clones

AgMNPV-MP2 e AgMNPV-MP5 se mostraram mais estáveis e continham células com

muitos poliedros (indicando fenótipo MP). Estes variantes many polyhedra MP2 e MP5 foram

originalmente selecionados após sete passagens consecutivas em cultura de células, por

apresentarem formação de vários poliedros no núcleo celular e alto título viral.

Além da importância da qualidade do vírus utilizado para o sistema de produção in

vitro de bioinseticida viral, conhecer o comportamento das células utilizadas para a produção

é altamente desejável sob o ponto de vista tecnológico, pois permite atuar sobre os cultivos

estabelecendo uma base mais criteriosa para incrementar a produtividade e os rendimentos

dos processos em suspensão (AUGUSTO; BARRAL; PICCOLI, 2007). Os cultivos em

suspensão favorecem o estudo das variáveis cinéticas proporcionando a avaliação do

comportamento cinético das células e sua capacidade de produção. Durante todo o cultivo em

suspensão, pode-se analisar a concentração celular, variável mais importante, pois dela

depende a estimativa das velocidades específicas de crescimento e produção. Além disso,

pode-se determinar a velocidade média de crescimento referente ao tempo total de cultivo

(produtividade) que avalia o desempenho destas células no processo de cultivo (HISS, 2001).

Esta seleção teve como finalidade usar um baculovírus selvagem de melhor

capacidade de produção de OB para comparar com os resultados obtidos pelo baculovírus

recombinante vAgEGT∆-LacZ durante o cultivo utilizando as células Sf21 na etapa seguinte

deste trabalho.



3.2 Metodologia experimental

3.2.1 Células

A linhagem de célula de inseto, IPLB-SF21 (VAUGHN et al., 1977) (American Type

Culture Collection, MD) cedida pela Embrapa/Cenargen, adaptada ao meio de cultura em

suspensão SF900II SFM (meio sem soro, do inglês serum free medium)(Gibco) foi utilizada

para a replicação dos isolados selvagens de AgMNPV. A morfologia, concentração e a

viabilidade celular foram monitoradas através de microscopia ótica (Olympus CX40) e a sua

manutenção (3 em 3 dias de cultivo) foi realizada em shaker orbital (Tecnal, TE422) com

agitação de 120 rpm e temperatura controlada a 28oC.

A contagem de células (em triplicata) foi realizada em cada amostra, conforme a

Equação (19), com erro de cerca de 15%, com nível de confiança de 95%, e média de 200

células contadas em ambos os lados do hemocitômetro (NIELSEN; SMYTH; GREENFIELD,

1991).

41018 −

×=

x

DM

mL

célulasC C

C (19)

Onde:

CC – Concentração Celular

MC – Média da contagem de células

D – Fator de diluição

18x10-4 – Volume total do hemocitômetro



A concentração de células viáveis e a viabilidade foram determinadas pela contagem

de células, através da técnica de exclusão, pela coloração com azul de tripan (Sigma-Aldrich)

a uma concentração final de 0,1% (v/v). As células que permitem a entrada do corante e

tornam-se azuladas, não apresentam mais a membrana intacta, e devem ser consideradas não-

viáveis, enquanto que as células transparentes são consideradas viáveis.

3.2.2 Vírus

Foram utilizados três isolados genéticos do baculovírus Anticarsia gemmatalis

multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV). O isolado viral AgMNPV-2D (JOHNSON;

MARUNIAK, 1989), utilizado como modelo na produção in vitro do baculovírus anticarsia, o

qual foi obtido pelo Dr. James Maruniak (Universidade da Florida/EUA). Os isolados

AgMNPV-MP2 e AgMNPV-MP5 foram obtidos após sete passagens consecutivas do clone

AgMNPV-2D em células BTI-Tn-5B1-4, originárias de Trichoplusia ni (GRANADOS et al,

1994). Estes clones, cedidos pela Dra. Marlinda L. Souza (Embrapa Recursos Genéticos e

Biotecnologia), foram selecionados por plaque assay devido à presença de vários corpos de

oclusão no núcleo celular e de um alto título viral de vírus extracelular.

Para a liberação e contagem dos corpos de oclusão (OBs) produzidos pelas células

infectadas, um volume igual de 1% (p/v) de dodecil sulfato de sódio (SDS) foi adicionado a

0,5mL da suspensão de células infectadas. A mistura foi incubada a 28oC por duas horas para

promover a dissolução das membranas celulares e liberação dos OBs. A solução contendo

OBs foi diluída com água para se obter um número de OB entre 100 e 150 no quadrante

central do hemacitômetro. Estes OBs foram contados utilizando um microscópio ótico

(Olympus CX40) com aumento de 400 vezes. Cada amostra foi contada em triplicata. A

produção volumétrica de OBs foi calculada conforme a Equação (20) e a produção específica

de OBs (OB/célula) foi calculada pela Equação (21).



4101

5−

××=

x

MD

mL

OBC OB

OB (20)

Onde:

COB – Concentração de OB

D – Fator de diluição

MOB – Média da contagem de OBs

1x10-4 – Volume de um quadrante do hemocitômetro

CT

OBOB CM

CM

Célula

OBPE =

(21)

Onde:

PEOB – Produção específica de OBs

CMOB – Concentração máxima de OBs

CMCT – Concentração máxima de células totais

3.2.3 Cálculo do TCLD50 dos isolados selvagens

Para o cálculo do título viral foi utilizado o método da viabilidade celular através da

clivagem do anel tetrazólio do reagente MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-brometo de

difenil tetrazólio) (Sigma-aldrich) através da enzima redutase mitocondrial em células viáveis.

A medida da concentração de células viáveis utilizando o MTT é correlacionada com o título

viral, ou seja, quanto maior a concentração celular menor será o título viral, conforme já

descrito no item 2.2.3 (MENA; RAMÍREZ; PALOMARES, 2003). A multiplicidade de

infecção (MOI) foi estimada através da relação título viral e a quantidade de células

infectadas.



3.2.4 Produção in vitro dos isolados de baculovírus selvagem

O cultivo de baculovírus foi realizado através de infecções em células Spodoptera

frugiperda, linhagem IPLB-Sf21. As células Sf21 sadias, apresentando viabilidade de 95%

ou superior, foram infectadas com os vírus extracelulares (BVs) dos isolados de baculovírus

AgMNPV. Estas infecções foram realizadas com tempo de infecção (TOI) equivalente a

5,0x105 células viáveis/mL, utilizando um inóculo viral com multiplicidade de infecção

(MOI) de aproximadamente 2,0 para todos os isolados (Anexo A). Amostras foram retiradas

diariamente para contagem (em triplicata) das células não infectadas e infectadas, bem como,

a contagem dos corpos de oclusão (OBs) formados durante o processo de infecção.

Infecções preliminares (Passagem 0) foram realizadas para padronização do inóculo.

Nesta padronização foi utilizado o inóculo original, BVs dos isolados AgMNPV-2D,

AgMNPV-MP2 e AgMNPV-MP5 obtidos de infecções com células Tn5B1-4 para infectar as

células Sf21. Para as demais infecções foi utilizado o inóculo gerado das infecções

preliminares em células Sf21.

A padronização do inóculo consistiu em utilizar os BVs obtidos de infecções com a

mesma linhagem estudada, ou seja, linhagem Sf21 nas mesmas condições de produção de OB

(meio de cultura SF900II SFM, temperatura de 28°C, 120 rpm e cultivo em suspensão).

Portanto, os inóculos produzidos a partir dessas infecções (denominada de Passagem 0) foram

utilizados para produção in vitro de OB.

3.2.5 Cálculo dos parâmetros cinéticos para produção in vitro

Durante o processo de infecção foram obtidos os parâmetros cinéticos das curvas de

crescimento das células (não infectadas e infectadas) e produção dos corpos de oclusão. Os

parâmetros como velocidades específicas de crescimento celular (µap) e velocidade de

formação de produtos (Rp) foram estimados por ajustes lineares aos pontos experimentais e as



velocidades específicas de morte celular (Kd) foram calculadas pelas Equações (6) e (9)

citadas no item 2.3.1 do Capítulo 2 (Revisão bibliográfica).

O tempo de duplicação celular foi obtido através da Equação (22):

dx t

Lnmáx

2=µ (22)

O cálculo das velocidades de infecção (Ri) foi realizado por ajuste linear aos pontos

experimentais, após a fase exponencial de crescimento, período que foi estabelecida a

infecção.

3.3 Resultados e discussão

O baculovírus AgMNPV representado pelos seus diferentes isolados genéticos

AgMNPV-2D, AgMNPV-MP2 e AgMNPV-MP5 foi analisado quanto à sua capacidade de

produção de OB utilizando cultivo em suspensão das células de Spodoptera frugiperda,

linhagem Sf21. A seleção de isolados genéticos é importante quando se trata de cultivo in

vitro de baculovírus, principalmente na estabilidade em relação à produção de corpos de

oclusão.

A Figura 3.1 mostra as infecções das células Sf21 com os isolados AgMNPV-2D,

AgMNPV-MP2 e AgMNPV-MP5. Percebe-se que as infecções com os isolados AgMNPV-

2D e AgMNPV-MP2 apresentam praticamente o mesmo crescimento celular, as células

infectadas apresentaram uma pequena diferenciação das células não infectadas ((1,56±0,078)

x106 células viáveis/mL) no segundo dia de infecção, atingindo concentrações máximas de

(1,31±0,066)x106 células viáveis/mL e (1,39±0,070)x106 células viáveis/mL,

respectivamente. Para a infecção com AgMNPV-2D, as células infectadas pararam de crescer,

no 3º dia, fato que caracteriza o estabelecimento do processo infectivo. Neste momento, os



vírus utilizam a maquinaria das células para replicação viral, ou seja, ao invés das células

utilizarem os genes para o crescimento celular os utilizam para produção do DNA viral.

Observando a cinética de crescimento das células infectadas com isolado AgMNPV-MP2, no

3º dia, as células infectadas continuaram a crescer mais lentamente até a concentração de

(1,79±0,29)x106 células viáveis/mL, após esse momento, houve uma diminuição na

concentração de células infectadas viáveis, caracterizando o estabelecimento da infecção.

Enquanto que as células não infectadas (células controle) já possuíam uma concentração de

(4,21±0,67) x106 células viáveis/mL.

0 1 2 3 4 50

1

2

3

4

5

6

Cél

ulas

viá

veis

x 1

06 /mL

Tempo (dia)

Células não infectadas Células infectadas com AgMNPV-2D Células infectadas com AgMNPV-MP2 Células infectadas com AgMNPV-MP5

Figura 3.1 Infecções com os isolados selvagens de baculovírus AgMNPV



Analisando a infecção com o isolado AgMNPV-MP5 pode-se observar, ainda na

Figura 3.1, que as células infectadas atingiram uma concentração máxima de células

infectadas de (1,56 ±0,25)x106 células viáveis/mL em 3 dias de infecção.

A partir do perfil de crescimento das células não infectadas e infectadas com os

isolados selvagens, estimaram-se os parâmetros cinéticos referentes ao crescimento das

células e à produção dos corpos de oclusão. Os parâmetros cinéticos estimados foram as

velocidades especificas de crescimento (µap e µx) das células não infectadas e infectadas, além

das taxas de mortalidade (Kd) e do tempo de duplicação (td). Tais parâmetros estão

apresentados na Tabela 3.1. As velocidades específicas aparentes (µap) foram calculadas a

partir da linearização das concentrações de células viáveis durante a fase exponencial de

crescimento, as taxas de mortalidade celular (Kd) foram obtidas através da Equação (9),

utilizando as concentrações de células não viáveis também durante a fase exponencial de

crescimento.

Tabela 3.1 Parâmetros cinéticos das infecções com os isolados selvagens

Células µap(d-1) Kd (d

-1) µx (d-1) td (d)

Não infectadas 0,915±0,08 0,009 0,924 0,75

Infectadas (AgMNPV-2D) 0,726±0,05 0,028 0,754 0,92

Infectadas (AgMNPV-MP2) 0,619±0,06 0,053 0,674 1,03

Infectadas (AgMNPV-MP5) 0,612±0,12 0,064 0,676 1,03

Considerando as velocidades específicas de crescimento, observa-se que as células não

infectadas apresentaram µx = 0,924d-1 e µap = 0,915d-1 (Anexo B – Figura B.2),

correspondendo ao tempo de duplicação (td) de 0,75d, valores que comparados com alguns

trabalhos da literatura são bastante representativos. Estes valores demonstram que as células

Sf21 estão adaptadas às condições de cultivo e principalmente ao meio de cultura SF900II

SFM (Gibco), isso pode ser justificado também pelo valor de Kd das células Sf21 que foi de

0,009d-1, mostrando que a velocidade de morte dessas células é insignificante. No trabalho de

Power (1993) utilizando as células de S. frugiperda, linhagem Sf9, e utilizando o mesmo meio



de cultura deste estudo (SF900II SFM, Gibco) atingiu-se um µap = 0,682d-1 e td = 1d, valores

próximos aos obtidos neste trabalho. Também utilizando células Sf9, Almeida et al. (2010)

obteve um µx = 0,775d-1, cultivadas em meio HyClone suplementado com 5% (v/v) de soro

fetal bovino. Ainda utilizando células Sf9, Power et al. (1994) obtiveram um µx = 0,672d-1 e

Kd = 1,9x10-3d-1. Como as linhagens Sf21 e Sf9 são originárias do mesmo hospedeiro, S.

frugiperda, apresentam características semelhantes quanto à cinética de crescimento quando

cultivadas em mesmo meio de cultura.

Para as velocidades específicas de morte celular (Kd) obtidas das infecções com os

diferentes isolados foram consideradas, para o cálculo, as células infectadas que ainda

apresentaram crescimento celular, e assim, foram calculadas da mesma maneira que as células

não infectadas (POWER, 1993). Os valores de Kd, nesse caso, refletem o quanto as células

foram afetadas pela ação viral, ou seja, quanto maior for o Kd maior será a influência e

atividade viral sobre as células infectadas durante o crescimento celular. As células infectadas

com AgMNPV-2D obtiveram um µap = 0,726 ± 0,05d-1 e K d igual a 0,028d-1,

consequentemente um µx = 0,754d-1. As células infectadas com AgMNPV-MP2 e AgMNPV-

MP5 apresentaram parâmetros cinéticos de crescimento semelhantes, µap = 0,619 ± 0,06d-1

(Anexo B – Figura B.3), Kd igual a 0,053d-1, µx = 0,674d-1 e µap = 0,612 ± 0,12d-1 (Anexo B

– Figura B.4) e Kd igual a 0,064d-1, µx = 0,676d-1, respectivamente. Esses valores

demonstraram que as células infectadas com os clones MP2 e MP5 possuem comportamento

similar após serem inoculadas, mesmo utilizando quantidades de inóculo diferentes

(AgMNPV-MP2 – 10% v/v de BV e AgMNPV-MP5 – 1% v/v de BV), no entanto, a partir do

momento que a infecção foi estabelecida ocorreu uma diferenciação quanto à velocidade de

infecção e formação dos corpos de oclusão.

A Tabela 3.2 apresenta os resultados das velocidades médias de infecção (Ri) para

cada isolado selvagem de AgMNPV.



Tabela 3.2 Velocidade média de infecção

Isolado Ri (células/mL.d) R2(ajuste linear)

AgMNPV-2D (1,31 ±0,11) x 105 0,9961

AgMNPV-MP2 (7,00 ±0,12) x 104 0,9867

AgMNPV-MP5 (5,77 ±0,36) x 105 0,9981

Para a infecção AgMNPV-2D foi obtida uma velocidade média de infecção (Ri) igual

a (1,31±0,11) x105células/mL.d (Anexo C – Figura C.1). Para a infecção com AgMNPV-

MP2 foi obtida uma velocidade média de infecção (Ri) = (7,00±0,12) x104 células/mL.d

(Anexo D – Figura D.1). Para a infecção com AgMNPV-MP5 foi obtido uma velocidade

média de infecção (Ri) igual a (5,76 ± 0,36) x105 células/mL.d (Anexo E – Figura E.1).

Analisando as velocidades médias de infecção obtidas para cada isolado, observou-se

que o isolado AgMNPV-MP5 alcançou a maior velocidade média de infecção quando

comparado aos outros isolados AgMNPV-2D e AgMNPV-MP2. A velocidade média de

infecção representa a velocidade na qual as células são infectadas durante o processo de

infecção, portanto, tendo maior velocidade média de infecção maior será a capacidade de

infectar as células viáveis durante o mesmo período do processo de infecção, portanto, as

células Sf21 demonstraram possuir maior suscetibilidade ao isolado AgMNPV-MP5.

A Figura 3.2 mostra a produção de OB produzidos na infecção em células Sf21

utilizando diferentes isolados selvagens do baculovírus AgMNPV.



2 3 4 5 6 7 80

10

20

30

40

50

60

70

OB

x 1

07 /mL

Tempo (dia)

Produção de OB - AgMNPV-2D Produção de OB - AgMNPV-MP2 Produção de OB - AgMNPV-MP5

Figura 3.2 Produção volumétrica de OB dos isolados selvagens de AgMNPV

A produção média de OB foi de (1,3 ±0,21)x108OB/mL ao final de 8 dias de infecção

para o isolado AgMNPV-2D e (1,9±0,30)x108OB/mL para o isolado AgMNPV-MP2,

mostrando um comportamento semelhante da curva de produção volumétrica de OB. Já o

isolado AgMNPV-MP5 obteve uma produção média de OB de (5,3±0,85)x108OB/mL durante

8 dias de infecção. Assim, o isolado AgMNPV-MP5 teve uma produção volumétrica 4 vezes

maior do que a produção do AgMNPV-2D e cerca de 3 vezes maior do que o isolado

AgMNPV-MP2.

Com base nas curvas de produção de OB foi realizada estimativa das velocidades

médias de formação de OB para todos os isolados genéticos utilizados neste processo de

infecção. A maior atividade de produção de OB é demonstrada na curva de formação de OB

em períodos distintos para cada isolado, e esta é constante e obedece a linearidade, portanto, o

ajuste linear do trecho que corresponde à maior atividade de formação de OB é representativo

e seu coeficiente angular é a velocidade média de formação do OB.



O isolado AgMNPV-2D apresentou intensa produção de OB no período de 3 a 6 dias

do processo de infecção, estimando a velocidade média de formação de OB (Rp)

correspondente a esse período obtém-se um Rp igual a (3,879±0,06)x107 OB/mL.d (Anexo C

– Figura C.2). A infecção utilizando o isolado AgMNPV-MP2 teve o período de intensa

atividade de produção de OB correspondente ao período de 2 a 4 dias de infecção, obtendo

uma Rp igual a (1,074±0,0001)x108 OB/mL.d (Anexo D – Figura D.2) e, por fim, o isolado

AgMNPV-MP5 teve plena produção de OB, também no período de 2 a 4 dias de infecção,

com uma Rp de (1,893±0,14)x108 OB/mL.d. (Anexo E – Figura E.2).

O isolado AgMNPV-MP5 apresentou uma velocidade média de formação de OB

quase 2 vezes maior do que o isolado AgMNPV-MP2 e cerca de 5 vezes maior do que a

velocidade de formação de OB do isolado AgMNPV-2D, demonstrando ser um melhor

produtor de corpos de oclusão neste sistema de produção in vitro de baculovírus selvagem de

AgMNPV utilizando a linhagem de células Sf21.

O que ficou bastante evidente foi à produção específica de OB para cada isolado,

mostrada na Figura 3.3. O isolado AgMNPV-MP2 obteve uma relação OB/Célula semelhante

ao isolado AgMNPV-2D. Sendo o AgMNPV-MP2 com a produção de 72,37±11,58

OB/Célula e o AgMNPV-2D com a produção de 75,71±12,11 OB/Célula. No entanto, o

isolado AgMNPV-MP5, mesmo tendo um processo de purificação idêntico ao AgMNPV-

MP2, obteve a melhor relação OB/Célula atingindo 297,73±47,64 OB/Célula ao final de 8

dias de infecção.



2 3 4 5 6 7 80

50

100

150

200

250

300

350

400O

B/C

élul

a

Tempo (dia)

AgMNPV - 2D AgMNPV - MP2 AgMNPV - MP5

Figura 3.3 Produção específica de OB dos isolados selvagens de AgMNPV

Com base nos resultados, pode-se considerar o isolado AgMNPV-MP5 com melhor

desempenho na produção dos corpos de oclusão do baculovírus selvagem de AgMNPV e isso

pode ser comprovado com os valores dos parâmetros cinéticos obtidos durante o processo de

infecção nas mesmas condições de cultivo dos outros isolados, pois o mesmo apresentou os

melhores valores de velocidades específicas de crescimento de células infectadas, velocidades

de infecção e por fim, velocidades de formação de OB. Outro fator que torna o isolado

AgMNPV-MP5 como melhor na produção de OB foi a menor quantidade de inóculo utilizado

para infectar a mesma concentração de células (utilização da mesma multiplicidade de

infecção – MOI). Para a infecção com os isolados AgMNPV-MP2 e AgMNPV-2D foi

necessário utilizar 10% v/v de inóculo e para o isolado AgMNPV-MP5 de apenas 1% v/v para

infectar as células Sf21, visando uma futura ampliação de escala, a quantidade de inóculo



inicial é um parâmetro economicamente importante quando se deseja produzir grandes

quantidades de baculovírus (WONG et al, 1996).

A Figura 3.4 apresenta uma micrografia ótica (aumento 400x em microscópio ótico)

das células Sf21 infectadas com o isolado selvagem AgMNPV-MP5 com 4 dias de infecção

(d.p.i). Observa-se que as células apresentam OB no interior do seu núcleo hipertrofiado

devido ao processo de infecção.

Figura 3.4 Células Sf21 infectadas com AgMNPV-MP5 em 4 d.p.i

Estudos realizados por Slavicek et al. (1996) mostraram que isolados de um mesmo

baculovírus Lymantria dispar multiple nucleopolyhedrovirus (LdMNPV), também

purificados, produziram diferentes concentrações de OBs quando utilizados em infecções em

células da linhagem L. dispar 652Y. Pedrini et al. (2005) utilizaram isolados genéticos do

Helicoverpa armigera single nucleopolyhedrovirus (HaSNPV) multiplicados na passagem

seriada em células de Helicoverpa zea, foram selecionados mutantes few polyhedra (FP)

(ppC19) que produziram cinco vezes mais corpos de oclusão que típicos mutantes FP

(FP8AS), onde normalmente produziam menos corpos de oclusão do que o baculovírus

HaSNPV selvagem, portanto. Neste trabalho, os isolados genéticos AgMNPV-MP2 e

AgMNPV-MP5 apesar de serem originários do mesmo processo de purificação apresentaram

diferenças quanto à produção de OB.



Estudos com o baculovírus AgMNPV têm sido realizados com a finalidade de mostrar

sua produção in vitro (CLAUS et al., 1993; CASTRO et al., 1997; RODAS et al., 2005;

CASTRO; RIBEIRO; SOUZA, 2006). A infectividade do Anticarsia gemmatalis multiple

nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) em sete diferentes linhagens celulares foi investigada

(CASTRO; RIBEIRO; SOUZA, 2006). A linhagen BTI-Tn-5B1-4, de Trichoplusia ni, e a

linhagem UFL-AG-286, de Anticarsia gemmatalis, foram altamente produtivas em termos de

produção de poliedros e de vírus extracelulares (BV). Por outro lado, uma linhagem de

Lymantria dispar (Ld652Y) não apresentou susceptilidade ao vírus enquanto uma linhagem

de Bombyx mori (BM 5) resultou em apoptose (auto-destruição celular ou morte natural da

célula). A produção in vitro do AgMNPV utilizando as células de Spodoptera frugiperda,

linhagem Sf9, foi analisada por Rodas et al. (2005), esta linhagem produziu na ordem da 106

OB/mL de vírus e apenas 27,8 OB/Célula. Já neste trabalho, utilizando as células Sf21 em

cultivo em suspensão, obteve-se para o isolado AgMNPV-2D em média 75,71±12,11

OB/Célula; para o isolado AgMNPV-MP2 em média 72,37±11,58 OB/Célula e para o isolado

AgMNPV-MP5 em média 297,73±47,64 OB/Célula que demonstrou a melhor capacidade de

produção de corpos de oclusão deste isolado genético.

A produção in vitro da isolado AgMNPV-MP5 foi bastante significativa por

apresentar uma alta produção especifica de OB, somente observados em poucos sistemas in

vitro de produção de baculovírus como exemplo o Helicoverpa armigera SNPV cultivados

em células H. zea que produziu 222 OB/Célula (LUA et al., 2002) e o Spodoptera frugiperda

MNPV cultivados em células S. frugiperda produzindo em média 400 OB/Célula

(ALMEIDA, 2005).

Sabendo que a estabilidade e produtividade virais são amplamente dependentes do

vírus isolado, e isolados mais estáveis têm sido purificados por plaqueamento e obtendo maior

produção de OB em altas passagens seriadas (SLAVICEK et al., 1996; SLAVICEK; HAYES-

PLAZOLLES; KELLY, 2001). Deste modo, o isolado AgMNPV-MP5 purificado por

plaqueamento em alta passagem (7ª) produziu mais corpos de oclusão do que os isolados

AgMNPV-MP2 e AgMNPV-2D.



3.4 Conclusão

Analisando o comportamento cinético dos isolados genéticos, foram verificadas

algumas diferenças significativas nos parâmetros cinéticos estimados para o processo de

infecção. O isolado AgMNPV-MP5 obteve os maiores valores cinéticos para os parâmetros de

velocidade específica de crescimento das células infectadas (Kd = 0,064 d-1 e µx = 0,676 d-1),

velocidade de infecção (Ri = 5,77 x 105 ± 0,36 células/mL.d) e da velocidade de formação de

OB (Rp = 1,893x108 OB/mL.d) quando comparados aos isolados AgMNPV-2D e AgMNPV-

MP2.

Diante destes parâmetros cinéticos conclui-se que isolado genético AgMNPV-MP5

teve maior capacidade de infectar as células Sf21 e produzir os corpos de oclusão durante o

processo in vitro de infecção obtendo uma produtividade média de 297±47,64 OB/Célula e

(5,3±0,85)x108 OB/mL, resultados bastante expressivos no que se refere à produção in vitro

de baculovírus.

Os resultados comprovaram que mesmo os isolados serem do mesmo baculovírus

pode apresentar diferentes capacidades de produção de corpos de oclusão quando submetidos

ao processo idêntico de infecção.

Capítulo 4

Produção in vitro do baculovírus recombinante vAgEGT∆-LacZ

54 __________________________________________________________________________________________Capítulo 4 Produção in vitro do baculovírus recombinante vAgEGT�-LacZ


4 Produção in vitro do baculovírus recombinante vAgEGT�-LacZ

4.1 Introdução

O genona do baculovírus AgMNPV foi sequenciado recentemente (OLIVEIRA et al.,

2006) o que torna possível analisar com mais detalhes a origem desse vírus. Antes do

sequenciamento genético, o mapa físico do baculovírus AgMNPV já havia sido determinado

(JOHNSON; MARUNIAK, 1989), permitindo a caracterização de alguns genes, como o gene

ecdisteroide udp-glicosil transferase (egt), responsável pela inibição do hormônio ecdisona. O

ecdisona é o ativador do crescimento do inseto fazendo a mudança de estágio larval e de larva

para pupa (RODRIGUES et al., 2001; PINEDO et al., 2003).

Alguns baculovírus têm sido modificados para a inativação dos seus genes egts, que os

tornam mais eficazes na velocidade de morte de larvas infectadas quando comparados aos

vírus selvagens (O’REILLY; MILLER, 1991; PINEDO et al., 2003). Assim, são construídos

baculovírus recombinantes capazes de aumentar à patogenicidade viral e consequentemente,

diminuir o tempo de vida dos insetos infectados.

Para a construção do baculovírus recombinante vAgEGT∆-LacZ, o gene ecdisteroide

glicosil transferase (egt) foi inativado pela inserção (no lócus do gene) da enzima β-

galactosidase (LacZ) de Escherichia coli, sobre o controle do promotor constitutivo heat

shock protein 70 de Drosophila melanogaster (hsp70) (PINEDO et al., 2003).

Os vírus recombinantes, que apresentam inativação dos seus genes egts, são

reconhecidamente mais agressivos que os selvagens. Surgem algumas preocupações quanto

ao seu impacto sobre os organismos não-alvo, quanto à possibilidade de transferência dos

genes inseridos para baculovírus de outras espécies de insetos, bem como sua segurança em

relação aos outros organismos benéficos não-alvo. Por outro lado, porém, haveria uma menor

dispersão dos OBs por autodisseminação de parasitas e predadores, uma vez que a inativação

do gene egt inativado, acelera a morte. Há, portanto, menos tempo deste se replicar e,

consequentemente, há uma menor produção de OB.



Para a produção in vitro de baculovírus é necessário ter um amplo conhecimento do

crescimento e da biologia das células que são utilizadas para sua produção. Portanto, a

cinética de crescimento celular é importante quando se deseja o levantamento de variáveis

cinéticas com a finalidade de um aumento de escala de produção. Fatores como a

concentração e a viabilidade das células, o estágio de crescimento celular (Fases de adaptação,

exponencial, estacionária e declínio), a multiplicidade de infecção (MOI) e o instante de

infecção (TOI), tempo de pós-infecção para a coleta das células (TOH), nutrição das células, a

razão de aeração do cultivo, temperatura, pH e pressão osmótica do meio de cultivo são

importantes para a ampliação de escala (AGATHOS, 1996).

A estratégia da produção de baculovírus em cultura de células de inseto, utilizando o

sistema em batelada, é determinada principalmente pela seleção da multiplicidade de infecção

(MOI) e a concentração inicial de células. A multiplicidade de infecção (MOI) é definida

como a quantidade de vírus suficiente para infectar um determinado número de células. No

processo de replicação viral utiliza-se normalmente uma MOI entre 5 e 50 para infectar as

células como forma de garantir que cada célula é infectada e os eventos de replicação do vírus

estejam em sincronia (KING; POSSEE, 1992). Outro ponto importante é a cinética de

crescimento celular e formação dos corpos de oclusão que fornecerá parâmetros cinéticos

relevantes para uma futura ampliação de escala.

Para atender a demanda de mercado do produto de interesse, duas aproximações são

aplicáveis; a intensificação do processo para o aumento da produtividade ou aumento da

produção em escala (VÉLIZ; RODRÍGUEZ; CARDERO, 2008). Para os cultivos de células

de inseto para produção de bioinseticidas ou proteínas recombinantes podem-se utilizar os

modos de operação tais como: batelada, batelada-alimentação ou sistemas em perfusão com a

finalidade de aumentar a produtividade do produto de interesse. Entretanto, visando

ampliação de escala podem-se utilizar estratégias de produção como bateladas sucessivas ou

passagem seriada quando se trata de produção de baculovírus para uso como bioinseticidas.

Outra situação que pode ser analisada para o escalonamento da produção é o aumento o

número de biorreatores de uma determinada dimensão ou utilização de biorreatores com

volumes elevados. A partir do ponto de vista econômico, normalmente a segunda opção é

mais conveniente para a produção de bioinseticida, desde que o custo com equipamentos não



ultrapasse 60% do aumento de escala (revisado por VÉLIZ; RODRÍGUEZ; CARDERO,

2008).

Quando se deseja o escalonamento da produção de baculovírus seja para a produção

de proteínas recombinantes ou para a produção de bioinseticidas utilizando os sistemas de

cultivo em batelada, também leva-se em consideração a quantidade inicial de inóculo viral,

pois, depende-se desta quantidade para que se obtenha um nível de produção de baculovírus

suficiente para uma escala industrial. (MARTEIJN et al., 2000)

Em cultivos em suspensão (shaker) uma concentração de inóculo de 5x104 células/mL

pode ser utilizada sem graves influências na velocidade média de crescimento (MARTEIJN et

al., 2000). Uma concentração mais baixa de inóculo resulta em menos etapas no processo de

aumento de escala e pode ser uma ferramenta de by pass no efeito passagem viral (formação

de mutantes após várias infecções). Quando se parte de banco de células, com frascos de 1mL

e deseja-se atingir um volume final de 180m3, utilizando um fator de diluição (∆) de 10, o

número de biorreatores pode ser calculado pela Equação (23):

( )∆

=ln

ln0V

V

N

f

(23)

Onde N é o número de etapas (biorreatores) e Vf e V0 são os volumes final e inicial,

respectivamente. Assim, obtém-se N = 8,3 ou na prática 9 biorreatores para esta situação

proposta. Com um fator de diluição de 50, N é reduzido para somente 5 biorreatores.

Consequentemente, se o fator de diluição pode ser aumentado, menos etapas são necessárias

durante o escalonamento (MARTEIJN et al., 2000).

A Figura 4.1 representa o processo em batelada para ampliação de escala. Este

processo pode ser relacionado com as passagens sucessivas do cultivo de células de inseto e

produção de baculovírus.



Figura 4.1 Processo de produção em batelada (Fonte: RHODES, 1996)

Quando se amplia escala para volumes industriais existem dois aspectos que

necessitam de atenção. Primeiro é o decréscimo na produtividade conhecido como efeito

passagem, no caso da produção de baculovírus. Segundo, é necessária alta concentração de

inóculo de células para atingir o volume desejado, para isto, deverá utilizar grande número de

biorreatores (revisado por MARTEIJN et al., 2000). Assim, o inóculo produzido no reator

anterior sempre será o novo inóculo para o reator subsequente. Cada aumento no volume de

produção representa uma passagem de células e/ou baculovírus.

A produção comercial de baculovírus para bioinseticidas e vacinas veterinárias

provalvemente precisaria de grande número de reatores em batelada de 10 a 100m³ (WONG

et al., 1995). Para tanto, a passagem seriada realizada com o baculovírus recombinante

vAgEGT∆-LacZ terá como finalidade a produção de corpos de oclusão visando o



levantamento de parâmetros para uma futura ampliação de escala utilizando os cultivos em

bateladas sucessivas, fazendo, assim uma analogia ao sistema idealizado por Rhodes et al.

(1996) e calculando ao final do processo uma estimativa preliminar de produção utilizando

como base reatores industriais com 100m³ de volume. O ponto principal para um

escalonamento é reproduzir em escala de produção as condições otimizadas em laboratório

e/ou em escala piloto de produção (VÉLIZ; RODRÍGUEZ; CARDERO, 2008).

Como primeira análise da produção dos corpos de oclusão (OB) do recombinante

vAgEGT∆-LacZ foram realizadas infecções com diferentes concentrações de inóculo viral

com a finalidade de selecionar a MOI mais apropriada para essa produção. Visto que o

baculovírus recombinante vAgEGT∆-LacZ demonstrou possuir um grande potencial quando

comparado ao baculovírus selvagem AgMNPV no controle da lagarta da soja, Anticarsia

gemmatalis. (PINEDO et al., 2003; SOARES; RIBEIRO, 2005). No entanto, não há produção

deste recombinante utilizando as células de inseto em suspensão, tão pouco o conhecimento

da sua cinética de produção. Após a análise da multiplicidade de infecção e da cinética, foi

realizada a passagem seriada do vAgEGT∆-LacZ em células Sf21 para analisar a estabilidade

do recombinante e além da ampliação de escala de produção deste vírus, bem como, a

comparação deste recombinante em relação ao baculovírus selvagem AgMNPV-MP5.


4.2.1 Células

A linhagem de célula de inseto, Sf21 (American Type Culture Collection, MD) cedida

pela Embrapa/Cenargen, adaptada ao meio de cultura em suspensão (SF900II SFM, Gibco)

foi utilizada para a replicação dos baculovírus recombinante vAgEGT∆-LacZ. A morfologia,

concentração e a viabilidade celular foram monitoradas através de microscopia ótica e a sua

manutenção foi realizada em shaker orbital (Tecnal, TE421) com agitação de 120 rpm e



temperatura controlada a 28oC. A concentração celular foi calculada conforme descrito no

item 3.2.1 desta tese.

4.2.2 Vírus

Nesta etapa da tese foi utilizado o BV do vírus recombinante do AgMNPV

denominado de vAgEGT∆-lacZ fornecido gentilmente pelo Dr. Bergmann Morais Ribeiro da

Universidade de Brasília. E o BV do baculovírus selvagem AgMNPV-MP5 cedido pela

pesquisadora da Embrapa/Cenargen Dra. Marlinda Lobo Souza.

4.2.3 Produção do baculovírus vAgEGT�-LacZ

Para o estudo da multiplicidade de infecção (MOI) do baculovírus recombinante, as

células Sf21, cultivadas em meio SF900II SFM (Gibco), foram infectadas com o vírus

extracelular (BV) do vAgEGT∆-LacZ. Este BV foi coletado da infecção em células TN5B1-4

com 5 dias de infecção (dados fornecidos pelo Dr. Bergmann da Universidade de Brasília), e

utilizado como inóculo para as infecções. As condições de cultivo utilizadas para as infecções

foram 28°C, 120 rpm e suspensão de células de 50mL em frascos Erlenmeyers de 125mL e

com tempo de infecção (TOI) correspondente a 5,0x105células viáveis/mL. Ao final de 8 dias

pós-infecção (d.p.i), a produção de OBs foi determinada por contagem, conforme descrito no

item 3.2.2. Todos os experimentos foram realizados em duplicata.

4.2.4 Cálculo TCLD50 e MOI do vAgEGT�-LacZ O cálculo do TCLD50 foi estimado através do método já descrito no item 3.2.3

desta tese.



4.2.5 Passagem seriada do baculovírus vAgEGT�-LacZ

Para todas as passagens, 100mL de suspensões celulares com TOI equivalente a

5,0x105 células viáveis/mL foram infectadas com BVs do vAgEGT∆-LacZ com a

concentração de inóculo viral de 1% (v/v). As infecções foram mantidas em shaker sob

agitação de 120rpm e temperatura controlada de 28ºC. Diariamente foi quantificada a

concentração de células e concentração de OB. Em cada passagem, foi retirado o

sobrenadante contendo BVs, normalmente, quando diminuía a concentração de células viáveis

infectadas, caracterizando o estabelecimento da infecção. Esse sobrenadante servia de inóculo

para a passagem subsequente.

4.2.6 Obtenção dos parâmetros cinéticos na produção do baculovírus vAgEGT�-LacZ

As velocidades específicas de crescimento celular, células não infectadas e células

infectadas, foram obtidas após os ajustes polinomiais aos pontos experimentais, bem como,

utilizando os modelos cinéticos considerados por Power (1993) e as estimativas das

velocidades de transformação ou velocidades médias (Ri e Rp) foram obtidas através dos

coeficientes angulares das retas ajustadas aos pontos referentes à velocidade de infecção

durante o processo.

4.2.7 Comparação da produção de corpos de oclusão dos baculovírus AgMNPV-MP5 e vAgEGT�-LacZ

Para a comparação dos baculovírus selvagem AgMNPV-MP5 e recombinante

vAgEGT∆-LacZ, as células Sf21, cultivadas em meio SF900II SFM (Gibco), foram infectadas

com o vírus extracelular (BV) destes baculovírus. Os BVs foram coletados, normalmente após



3 dias de infecção, e utilizado como inóculo para as infecções. As condições de cultivo

utilizadas para as infecções foram 28°C e 120 rpm. 100mL das suspensões de células em

frascos Erlenmeyers de 250mL foram infectadas com tempo de infecção (TOI)

correspondente a 5,0x105células viáveis/mL e a mesma multiplicidade de infecção

equivalendo a percentagem de 2,5% (v/v) de inóculo viral para o baculovírus AgMNPV-MP5

na passagem 2 (P2) e 1% (v/v) de inóculo viral para o baculovírus recombinante vAgEGT∆-

LacZ na passagem 1 (P1). Ao final de 10 dias pós-infecção (d.p.i), a produção de OBs foi

determinada por contagem, conforme descrito no item 3.2.2. Todos os experimentos foram

realizados em duplicata.


Os resultados mostrados, neste capítulo, referem-se à produção in vitro do baculovírus

recombinante vAgEGT∆-LacZ através da quantificação dos corpos de oclusão (OB)

produzidos durante o processo de infecção. As estimativas dos parâmetros cinéticos foram

obtidas a partir dos perfis de concentração de células viáveis infectadas e da concentração dos

corpos de oclusão produzidos neste sistema. Todos os experimentos foram realizados em

duplicata, apresentando um erro médio de 5% para a contagem de células, 16% para

quantificação de corpos de oclusão e as estimativas dos parâmetros cinéticos apresentaram os

erros conforme os ajustes realizados.

4.3.1 Estudo da multiplicidade de infecção (MOI)

O estudo da multiplicidade de infecção (MOI) teve como finalidade definir a

quantidade de inóculo necessária para a produção in vitro do baculovírus recombinante

vAgEGT∆-LacZ. Sendo a MOI um parâmetro importante no que se refere à estratégia de

produção in vitro de baculovírus, é importante analisar a quantidade de vírus inoculado no



sistema de produção. Para tanto, foram realizadas infecções com diferentes quantidades de

vírus extracelular obtidos do recombinante e observadas às produções de corpos de oclusão

em cada infecção.

A Figura 4.2 mostra as infecções com o BV do baculovírus vAgEGT∆-LacZ em

diferentes multiplicidades de infecção (MOI).

0 1 2 3 4 5

0

1

2

3

4

5

6

7

Cél

ulas

Viá

veis

x 1

06 /mL

Tempo (dia)

Células não Infectadas Células Infectadas - MOI (1,25) Células Infectadas - MOI (12,5)

Células Infectadas - MOI (2,5) Células Infectadas - MOI (25,0) Células Infectadas - MOI (5,0) Células Infectadas - MOI (50,0)

Figura 4.2 Cinética de crescimento das células Sf21 infectadas com diferentes MOIs de BV do baculovírus recombinante vAgEGT∆-LacZ.

Percebe-se que em maiores quantidades de inóculo, ou seja, em MOI altas (50, 25 e

12,5) as células infectadas não atingiram concentrações elevadas. As células são infectadas

muito rapidamente devido à ação viral, não tendo células suficientes para maior replicação do

vírus. Já com MOIs baixas (1,25; 2,5 e 5,0) somente uma fração de células são inicialmente

infectadas (infecção primária). As células remanescentes continuam crescendo como as



células não infectadas. Estas células serão infectadas em algum momento mais tarde (infecção

secundária) quando as células infectadas na infecção primária começarem a liberar os BVs

produzidos. O mesmo foi observado quando células Sf9 foram infectadas com baculovírus

selvagem AgMNPV (RODAS et al., 2005).

Em processos em batelada, como é o caso desta produção, geralmente emprega-se uma

MOI de intermediária a alta no início da fase exponencial de crescimento células, que resulta

no sincronismo da infecção. Segundo Zhang; Enden; Merchuk, (2005), este sincronismo da

infecção pode proporcionar melhores rendimentos de produção de OB.

Neste estudo, pode-se observar que já no primeiro dia de infecção constatou-se uma

diferenciação significativa no crescimento celular, comparando as células não infectadas e

células infectadas. Para as células infectadas com baixas concentrações de vírus, a

diferenciação entre as células não infectadas e infectadas pode ser visualizada no segundo dia

de infecção.

Com base na cinética de crescimento das células não infectadas e das infectadas com

as diferentes MOIs, foram obtidos os parâmetros cinéticos de todas as infecções (Anexos F a

K). As velocidades específicas (µap e µx), as velocidades específicas de morte celular (Kd), e

as velocidades médias de infecção (Ri) foram estimadas e mostradas na Tabela 4.1. As

velocidades específicas aparentes (µap) foram calculadas a partir da linearização das

concentrações de células viáveis durante a fase exponencial de crescimento, as velocidades

específicas de morte celular (Kd) foram obtidas através da Equação (9), utilizando as

concentrações de células não viáveis também durante a fase exponencial de crescimento.



Tabela 4.1 Parâmetros cinéticos das infecções com diferentes MOIs

MOI µ ap (d-1) Kd (d

-1) µx (d-1) td (d) Ri (células/mL.d)

1,25 1,0030 ± 0,03 0,0193 1,0223 0,678 (5,15 ± 10-4)x 105

2,5 0,8047 ± 0,09 0,0378 0,8425 0,823 (4,50 ± 0,87)x 105

5,0 0,5901 ± 10-4 0,0744 0,6645 1,043 (6,13 ± 0,14)x 105

12,5 0,4010 ± 10-4 0,0871 0,4881 1,420 (3,25 ± 0,79)x 105

25,0 0,2703 ± 10-4 0,1504 0,4207 1,648 (4,77 ± 10-4)x 105

50,0 0,2141 ± 10-4 0,1396 0,3537 1,959 (1,80 ± 0,16)x 105

Diante dos resultados dos parâmetros cinéticos obtidos para as infecções com

diferentes MOIs, observou-se que, dentro da faixa estudada, quanto menores as concentrações

de vírus no processo de infecção, MOIs 1,25; 2,5 e 5,0, maiores foram as velocidades

específicas de crescimento µap (1,0030±0,03d-1; 0,8047±0,09d-1e 0,5901±0,0001d-1,

respectivamente). Consequentemente, as células se desenvolveram mesmo com a ação viral.

A velocidade de infecção (Ri) foi considerável nos experimentos com baixa MOI,

observando-se as maiores velocidades médias de infecção de (5,15±0,0001)x105

células/mL.d., (4,5±0,87)x105 células/mL.d. e (6,13±0,14)x105células/mL.d, respectivamente,

quando comparadas as velocidades médias obtidas nos experimentos com alta MOI (12,5;

25,0; 50,0).

A Figura 4.3 mostra as produções de OB em todas as concentrações de inóculo

utilizadas nas infecções com diferentes MOIs. Observa-se claramente que em baixas

concentrações de vírus (MOIs 1,25; 2,5 e 5,0) obtêm-se melhor produção de OB. Baixas

MOIs produzem altos rendimentos de proteína recombinante (NGUYEN et al., 1993), que

também pode ser associado a produção de OB, pois para obtenção de proteína

necessariamente deverá se produzir vírus. Isto é devido ao processo de infecção das células

acontecer em momentos distintos, em decorrência da menor quantidade de inóculo na

produção. No primeiro momento, só uma fração de células são infectadas rapidamente, a

partir desta infecção serão obtidos novas partículas virais que, consequentemente, irão infectar

a outra fração de células que ainda permaneceu se multiplicando.



2 3 4 5 6 7 80,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5O

B x

107 /m

L

Tempo (dia) Produção de OB - MOI (1,25) Produção de OB - MOI (12,5) Produção de OB - MOI (2,5) Produção de OB - MOI (25,0) Produção de OB - MOI (5,0) Produção de OB - MOI (50,0)

Figura 4.3 Produção de OB do baculovírus vAgEGT∆-LacZ

Todas as infecções duraram 8 dias, exceto a infecção onde foi utilizada MOI igual a

50, que durou apenas 6 dias, devido a alta concentração de inóculo viral que não permitiu que

as células permanecessem viáveis por mais tempo. Em destaque, a concentração de inóculo

com MOI igual a 5,0 que obteve a produção mais alta de OB: (2,8±0,45)x107OB/mL.

A Figura 4.4 mostra os perfis da produção de OB do baculovírus recombinante

vAgEGT∆-LacZ nas diferentes MOIs. A partir desses perfis, foram estimadas as velocidades

médias de formação de OB (Rp), uma vez que, observou-se em cada perfil cinético de

produção de OB uma intensa formação de OB em períodos que normalmente variaram de 2 a

4 dias do processo de produção. Cada período de aumento intenso de corpos de oclusão

corresponde ao aumento linear e constante da produção de OB com o tempo, portanto, através

de ajustes lineares podem-se estimar a velocidade média de formação de OB para cada perfil.



2 3 4 5 6 7 80

1

2

3

4

MOI 1,25 MOI 2,5 MOI 5,0 MOI 12,5 MOI 25,0 MOI 50,0

Tempo (dia)

OB

x 1

07 /mL

0

1

2

3

4

5

6

7

8

OB

x 1

06 /mL

Figura 4.4 Perfis da produção volumétrica de OB do baculovírus vAgEGT∆-LacZ com diferentes MOIs

A Tabela 4.2 mostra as velocidades médias de formação de OB (Anexos F a K) para

cada infecção realizada com diferentes MOIs.

Tabela 4.2 Velocidades médias de produção de OB

MOI OB/mL R p (OB/mL.d) R2(ajuste linear) 1,25 (1,7± 0,27)x107 (1,89± 0,38)x108 0,9805

2,5 (2,1± 0,34)x107 (6,47± 1,08)x106 0,9864

5,0 (2,8± 0,45)x107 (5,55± 0,82)x106 0,9893

12,5 (1,7± 0,27)x107 (6,50± 0,87)x106 0,9912

25,0 (1,3± 0,21)x107 (4,36±0,0001)x106 0,9811

50,0 (6,0± 0,96)x106 (1,17± 0,11)x106 0,9920



Utilizando MOI 1,25 obteve-se velocidade média de formação de OB (Rp) igual a

(1,89±0,38)x108 OB/mL.d que promoveu a produção de (1,7±0,27)x107OB/mL. Para as

demais MOIs as velocidades médias de formação de OB foram na mesma ordem de grandeza,

variando de (1,17 ±0,11)x106 a (6,50±0,87)x106OB/mL.d. Observou-se também que a menor

Rp aconteceu para a infecção com MOI 50,0. A alta MOI não proporcionou o crescimento

celular, logo, não restaram células viáveis durante um período suficiente para que ocorresse

maior produção de OB.

As infecções com baixa MOI apresentaram velocidades médias de formação de OB

mais elevadas quando comparadas às velocidades médias obtidas em alta MOI observadas

nesse sistema. Os cultivos com baixa MOI proporcionam uma maior concentração de células

(infectadas e não infectadas) presentes na infecção. Nesta situação, o vírus tem mais

possibilidade de infectar, no segundo momento, as células que ainda não foram infectadas

inicialmente (ZHANG et al., 2005). Maior concentração de células infectadas significa maior

velocidade de formação de OB, consequentemente, as concentrações mais baixas de inóculo

viral (MOI 1,25; 2,5; 5,0) proporcionarão velocidades médias de formação de OB maiores do

que as velocidades médias de formação de OB observadas em altas concentrações de inóculo

viral (MOI 12,5; 25,0; 50,0).

Diante da análise das infecções com diferentes MOIs, a multiplicidade de infecção que

apresentou a maior produção de OB foi a MOI 5,0 ((2,8±0,45)x107OB/mL), que equivale à

quantidade de 1% (v/v) de inóculo viral. A partir da escolha da MOI foi realizada uma

passagem seriada do baculovírus recombinante vAgEGT∆-LacZ.

4.3.2 Passagem seriada (escalonamento da produção in vitro)

Com base no estudo realizado por Marteijn et al. (2000) realizou-se uma passagem

seriada em baixa MOI (MOI 5,0), em passagem 0 (P0), como estratégia de ampliação de

escala para produção do baculovírus recombinante vAgEGT∆-LacZ visando sua utilização

como bioinseticida viral. A quantidade de inóculo viral utilizada foi de apenas 1% (v/v) para



infectar a passagem subsequente, o que demonstra alta infectividade do recombinante

vAgEGT∆-LacZ em células Sf21. Todos os experimentos foram realizados em duplicata.

A Figura 4.5 mostra a passagem seriada do baculovírus recombinante vAgEGT∆-LacZ

até a quinta passagem em células Sf21. Observou-se que nas passagens (P0), (P1), (P2) e (P4)

a MOI foi baixa, utilizando somente 1% (v/v) de inóculo viral, justificando o maior

crescimento das células mesmo infectadas, ao contrário, na passagem (P3) observou-se uma

alta MOI (mesmo utilizando apenas 1% (v/v) de inóculo viral) o que não permitiu o

crescimento das células infectadas.

0 5 10 15 20 25 30 350

1

2

3

4

5

6

7

8

P5

P4

P3

P2

P1

P0

Cél

ulas

Viá

veis

x 1

06 /mL

Tempo (dia)

Células não infectadas Células infectadas

Figura 4.5 Passagem seriada do baculovírus vAgEGT∆-LacZ



A Figura 4.6 mostra a produção volumétrica do baculovírus recombinante vAgEGT∆-

LacZ ao longo do cultivo em passagem seriada. As infecções das passagens (P2), (P4) e (P5)

produziram quantidades semelhantes de corpos de oclusão por volume de suspensão de

células, (1,5±0,24)x108OB/mL; (0,98±0,16)x108OB/mL e (0,887±0,14)x108 OB/mL,

respectivamente. Já na passagem (P3), obteve-se produção volumétrica inferior que as

demais, causado, provalvemente, pela alta MOI utilizada nessa passagem. Com isso, as

células na passagem (P3) não conseguiram se multiplicar devido, provavelmente, à alta

concentração de virus e, consequentemente, produziram menos vírus por volume de

suspensão de células infectadas.

0 1 2 3 4 50

4

8

12

16

20

2,8

9,80 8,87

2,49

15,0

5,51

OB

x 1

07 /mL

Número de Passagens

Figura 4.6 Produção volumétrica de OB na passagem seriada do vAgEGT∆-LacZ

Utilizando o sistema de passagem seriada com a finalidade de ampliação de escala de

produção do baculovírus recombinante vAgEGT∆-LacZ, deve-se considerar algumas



situações: para a manutenção do banco de células utilizado para produção de baculovírus

recombinante vAgEGT∆-LacZ é necessário que se dilua a suspensão celular a cada 3 dias de

cultivo com a finalidade de manter as células sempre na fase exponencial de crescimento.

Normalmente, esta diluição é de 10 vezes a suspensão celular, portanto, o fator de diluição

para as células é 10. Considerando o estoque de vírus, o inóculo utilizado em cada batelada do

cultivo do recombinante vAgEGT∆-LacZ foi apenas 1% (v/v), com um volume de 1mL de

vírus foi suficiente para infectar (com sincronismo) uma suspensão celular de 100mL,

portanto, para o vírus tem-se um fator de diluição igual a 100.

A Figura 4.7 mostra o esquema das bateladas repetidas tanto para as células como para

o vírus durante a produção do baculovírus recombinante vAgEGT∆-LacZ, representando a

passagem seriada como as bateladas repetidas com base em Rhodes (1996). Observa-se que o

volume da produção final foi de 10 m³, baseado somente no volume da suspensão celular,

volume utilizado em cada passagem do cultivo. Fazendo uma associação com Marteijn et al.

(2000) calculando a produção volumétrica de OB, Figura 4.6, em cada passagem do

baculovírus, obtém-se a quantidade de OB produzidos neste sistema.

Figura 4.7 Esquema representativo da produção em escala do baculovírus recombinante vAgEGT∆-LacZ



A Tabela 4.3 mostra a quantidade de corpos de oclusão produzida no processo de

produção em bateladas sucessivas com a finalidade de ampliação da escala de produção do

bioinseticida vAgEGT∆-LacZ.

Tabela 4.3 Quantidade de OB produzido em cada passagem do cultivo

Passagem OB/mL Volume de infecção(mL) Quantidade de OB

0 (2,8±0,45)x107 102 (2,8±0,45)x109

1 (5,5±0,88)x107 103 (5,5±0,88)x1010

2 (1,5±0,24)x108 104 (1,5±0,24)x1012

3 (2,5±0,40)x107 105 (2,5±0,40)x1012

4 (9,8±1,57)x107 106 (9,8±1,57)x1013

5 (8,9±1,42)x107 107 (8,9±1,42)x1014

Considerando as bateladas sucessivas ou repetidas para manutenção do banco de

células, fator de diluição 10, serão necessárias cinco passagens sucessivas para obter a

quantidade de células suficiente para a produção viral. Isto pode ser calculado conforme a

Equação (23) utilizando este sistema de produção. Observando os resultados de produção de

OB mostrados na Tabela 4.3, percebe-se que para um volume final de 107 mL ou 10 m³ de

produção foi obtida uma quantidade de (8,9±1,42)x1014 corpos de oclusão. Considerando a

produção de baculovírus, com fator de diluição 100 e apenas 1% (v/v) de inóculo viral, serão

necessárias também cinco passagens sucessivas deste baculovírus para a obtenção desta

produção final.

A partir da concentração de OB obtida em cada passagem pode-se calcular a

quantidade de OB necessária para futura ampliação de escala. Supondo-se uma produção em

escala industrial, com volume final de produção de 100m3 e demanda de produto de

(8,9±1,42)x1015corpos de oclusão, e ainda, o sistema de bateladas sucessivas para a produção

deste recombinante. Para obtenção de banco de células seriam necessárias 6 passagens para

atender a capacidade de produzir (8,9±1,42)x1015 corpos de oclusão. Considerando a

quantidade de inóculo seriam necessárias apenas 3 passagens do vírus para atender a demanda

de produção do baculovírus vAgEGT∆-LacZ proposta.



Vale salientar que esta proposta foi realizada sem analisar parâmetros importantes para

o escolamento de produção, tais como: dimensão de impelidores, diâmetro de reator, demanda

de oxigênio, parâmetros cinéticos de crescimento celular, de consumo de substrato, de

formação de produtos e formação de subprodutos tóxicos. O esquema proposto aqui é

somente uma visão preliminar da ampliação de escala de produção, baseado em resultados de

sistemas sem otimização de produção.

Considera-se que as preparações de baculovírus anticarsia são aplicadas com a relação

de 1,5x1011 OB/hectare de área tratada, ou seja, cerca de 20g ou equivalente a 50 larvas de

Anticarsia gemmatalis (ROHRMANN, 2008). Para atender a demanda do mercado nacional

de 1,5 milhão de hectare/ano, precisaríamos de 2,25x1017 OBs para suprir essa necessidade.

Como a produção final deste sistema é (8,9±1,42)x1014 OBs, então serão necessários 253

sistemas de produção com 5 passagens sucessivas do recombinante vAgEGT∆-LacZ para

atender a demanda de mercado.

A Figura 4.8 apresenta a produção específica de OB obtida durante a passagem seriada

do baculovírus recombinante vAgEGT∆-LacZ. A produção de OB analisada da passagem 0

(P0) até a passagem 5 (P5) em cultivo em células foi estável, apresentando produção que

variou de 18,87 ± 3,02 a 46,02 ± 7,36 OB/Célula. Na passagem 4 (P4) houve redução de 34%

na produção em relação a média das passagens P3 e P5 que foi 43,73 ± 6,99 OB/Célula. Esse

decréscimo não caracterizou o efeito passagem, mas foi ocasionado pela MOI utilizada nessa

infecção, pode ser observada na Figura 4.5.

Análises futuras do perfil de restrição, bem como das características fenotípicas e do

título viral de cada passagem poderá fornecer mais dados para discussão mais ampla neste

sentido. No entanto, nota-se que o efeito de passagem, nesse caso, não foi comprometedor

como em outros trabalhos observados na literatura como a Lymantria díspar

nucleopolyhedrovirus (LdMNPV) que apresentou redução de 57 – 35 OB/Célula em 5

passagens sucessivas (SLAVICEK et al., 1996), o Spodoptera frugiperda

nucleopolyhedrovirus (SfMNPV) (PEDRINI et al. 2004) que apresentou o efeito de passagem

já na segunda passagem e o Helicoverpa armigera nucleopolyhedrovirus (HaSNPV) em

células H. zea que reduziu a produção de 222 a 2 OB/Célula em 6 passagens sucessivas do

vírus (LUA et al., 2002).



0 1 2 3 4 50

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

18,87

46,02

28,48

41,4337,73

27,23

OB

/Cél

ula

Número de Passagens

Figura 4.8 Produção específica de OB na passagem seriada do vAgEGT∆-LacZ

4.3.3 Comparação da produção in vitro do baculovírus selvagem AgMNPV-MP5 e o baculovírus recombinante vAgEGT�-LacZ

A comparação do baculovírus selvagem AgMNPV-MP5 com o baculovírus

recombinante vAgEGT∆-LacZ teve a finalidade verificar a potencialidade do baculovírus

recombinante produzido in vitro em relação ao baculovírus selvagem utilizando o mesmo

sistema de produção e a mesma multiplicidade de infecção. Além de verificar a produção, foi

realizado ajuste polinomial aos pontos experimentais.

A Figura 4.9 mostra o ajuste polinomial aos pontos experimentais da cinética de

crescimento celular (células não infectadas e células infectadas). O comportamento da



cinética de crescimento das células infectadas com os baculovírus, selvagem e recombinante,

foram semelhantes, haja vista, que foi utilizada a mesma multiplicidade de infecção.

0 1 2 3 4 50

1

2

3

4

5

6

7

Cél

ulas

viá

veis

x 1

06 /mL

Tempo (dia)

Células não infectadas Células infectadas com AgMNPV-MP5 (Selvagem) Células infectadas com vAgEGT∆-LacZ (Recombinante) Ajuste polinomial de 4ª ordem Ajuste polinomial de 2ª ordem Ajuste polinomial de 3ª ordem

Figura 4.9 Cinética de crescimento das células não infectadas e infectadas com os baculovírus selvagem e recombinante

A produção de corpos de oclusão foi testada em relação à infecção das células Sf21

com dois baculovírus AgMNPV: selvagem e recombinante. A Figura 4.10 mostra as curvas

de produção de OB para os baculovírus AgMNPV-MP5 e vAgEGT∆-LacZ. A produção

volumétrica média do baculovírus selvagem AgMNPV-MP5 foi (5,16±0,83)x107 OB/mL e

do baculovírus recombinante vAgEGT∆-LacZ foi de (5,00±0,80)x107OB/mL.



2 3 4 5 6 7 8 9 10

0

1

2

3

4

5

6O

B x

107 /m

L

Tempo (dia)

Produção de OB - AgMNPV-MP5 (Selvagem) Produção de OB - vAgEGT∆-LacZ(Recombinante)

- - - - Ajuste sigmoidal - AgMNPV-MP5 (Selvagem)- - - - Ajuste sigmoidal - vAgEGT∆-LacZ(Recombinante)

Figura 4.10 Produção volumétrica de OB da infecção com os baculovírus selvagem e recombinante.

Os valores obtidos a partir das infecções com os isolados, selvagem e recombinante,

foram submetidos à análise de variância (ANOVA) para verificar se existe diferença

significativa entre as produções dos dois baculovírus, conforme a Tabela 4.4.

Tabela 4.4 Resultado da ANOVA para produção de OB

Baculovírus Média Variância N

AgMNPV-MP5 5,26x107 4,9733x1012 4

vAgEGT∆-LacZ 4,77x107 1,5859x1014 4

F = 0,59318

p = 0,47042

As médias não são significativamente diferentes, com 95% de

intervalo de confiança.



Os resultados mostram que não houve diferença significativa da produção dos

baculovírus selvagem e recombinante. Isto é um dado importante, uma vez que a capacidade

de produção dos baculovírus recombinantes em relação aos seus selvagens é uma

característica revelante. Neste cultivo, o fato do recombinante apresentar capacidade similar

de produzir OB durante o processo de infecção é um resultado interessante quanto ao

processo de produção de bioinseticida viral, pois, utilizando-se menos inóculo, alcança-se

potencial semelhante de infectividade do vírus selvagem. A quantidade de inóculo do

recombinante vAgEGT∆-LacZ foi 1% (v/v) enquanto para o selvagem AgMNPV-MP5 foi

2,5% (v/v) para que os dois baculovírus apresentassem a mesma MOI.

Os ajustes foram realizados com o auxílio do software Origin 6.0, utilizando-se a

Equação sigmoidal de Boltzman que melhor se ajustou aos pontos experimentais. Os

resultados dos ajustes estão apresentados na Tabela 4.5.

Tabela 4.5 Ajustes aos pontos experimentais da curva de produção de OB

Baculovirus Selvagem

(AgMNPV-MP5)

Baculovírus Recombinante

(vAgEGT�-LacZ)

Produção volumétrica (OBx107/mL) Produção volumétrica (OBx107/mL)

R2 = 0,9886 R2 = 0,9792

A1 = -0,51336 ±0,572 A1 = 0,56562 ± 0,231

A2 = 5,1824 ± 0,124 A2 = 5,2499 ± 0,340

X0 = 3,4213 ± 0,189 X0 = 6,7895 ±0,230

dX = 0,60231± 0,137 dX = 0,70037 ± 0,208

Parâmetros ajustados da Equação de Boltzmann,

Os valores para produção de OB obtidos após o ajuste aos pontos experimentais da

infecção com o baculovírus selvagem e recombinante foram semelhantes (COB = (5,18±0,124)

x107OB/mL e COB =(5,25±0,34)x107 OB/mL, respectivamente), conforme a Tabela 4.5,

comprovados com o teste da análise de variância (ANOVA) (Tabela 4.4), com 95% de

confiança, que não identificou diferenças significativas na produção.



Os resultados apresentados demonstram que o baculovírus recombinante é

quantitativamente similar em relação à produção in vitro quando comparado com o

baculovírus selvagem.

4.4 Conclusão

Com base na cinética de crescimento das células infectadas com as diferentes MOIs

verificou-se que os valores obtidos das velocidades específicas de crescimento celular em

baixa MOI (1,25; 2,5 e 5,0) foram maiores do que os obtidos em mais alta MOI (12,5; 25,0 e

50,0). Pode-se concluir que ao infectar as células com concentrações mais baixas de inóculo

viral, mais células permanecem crescendo mesmo submetidas à ação viral. Isto foi

evidenciado pelos valores obtidos das velocidades específicas de crescimento (µx = 1,0223d-1

para MOI 1,25; µx = 0,8425d-1 para MOI 2,5 e µx = 0,6645d-1 para MOI 5,0) que foram mais

elevados que os valores das velocidades específicas de crescimento para altas MOIs (µx =

0,4881d-1 para MOI 12,5; µx = 0,4207d-1 para MOI 25,0 e µx = 0,3537d-1 para MOI 50,0).

Ainda considerando a cinética, as velocidades médias de infecção e velocidades médias de

formação de OB seguiram o mesmo comportamento das velocidades específicas.

A infecção com MOI (5,0) apresentou a maior velocidade de infecção (Ri =

(6,13±0,14)x105 células/mL.d) e velocidade de formação de OB (Rp = (5,55±0,82)x106

OB/mL.d). Nesta situação de baixa MOI e altos valores de velocidades médias de infecção e

formação de OB, o vírus tem mais possibilidade de infectar, em infecção secundária, aquelas

células que ainda não foram infectadas inicialmente. Sendo assim, o valor da MOI igual a 5,0

foi selecionado para o sistema de produção in vitro, utilizando a estratégia de baixa MOI para

aumentar a produção de vírus ao longo do processo de infecção.

A infecção que apresentou maior produção de OB aconteceu com MOI igual a 5,0

obtendo-se produção volumétrica de (2,8±0,45) x107 OB/mL em 8 dias de cultivo. Esta MOI

equivale a 1% (v/v) do inóculo viral e foi escolhida para realizar os experimentos de bateladas

sucessivas.



A estratégia de escolha da melhor MOI para produção in vitro do baculovírus

recombinante vAgEGT∆-LacZ foi utilizar baixa multiplicidade de infecção (MOI 5,0) para

obter a maior concentração de corpos de oclusão gerados no cultivo em suspensão. Após a

definição da quantidade de inóculo (1% v/v), foram realizadas bateladas sucessivas para

aumentar a produção de OB. Em pelo menos cinco passagens do cultivo, obteve-se

quantidade de vírus suficiente para realizar pequena ampliação de escala, a partir de um

volume inicial de 1mL de inóculo obter quantidade de (8,9±1,42)x1014 corpos de oclusão para

o volume final de reator de 10 m³.

O baculovírus recombinante vAgEGT∆-LacZ apresentou boa estabilidade,

considerando as análises quantitativas da produção, quando comparado com o baculovírus

selvagem AgMNPV-MP5 sem diferenças significativas de produção de OB ao serem

submetidos a mesma condição de cultivo.

Capítulo 5

Produção em batelada-alimentada do baculovírus recombinante vAgEGT∆-

LacZ

80 __________________________________________________________________________________________Capítulo 5 Produção em batelada-alimentada do baculovírus recombinante vAgEGT�-LacZ


5 Produção em batelada-alimentada do baculovírus recombinante

vAgEGT�-LacZ

5.1 Introdução

A crescente demanda de bioinseticidas no mercado nacional, principalmente do

baculovírus anticarsia, é incentivadora para busca de alternativas que promovam o aumento

na produção. As estratégias de produção tais como batelada, bateladas alimentadas, sistemas

em perfusão tornam-se ferramentas indispensáveis para os cultivos in vitro de baculovírus

seja para produção de bioinseticidas ou para proteínas recombinantes. Existe um forte

interesse no desenvolvimento de processos de ampliação de escala para produção de

bioinseticidas baseado no cultivo de células de inseto e subsequente infecção com

baculovírus.

A produção in vitro de baculovírus em cultivo de células tem sido abordada em vários

trabalhos, tais como: Lua e Reid (2000) com o sistema Helicoverpa armigera NPV em células

Helicoverpa zea, os quais obtiveram uma produção máxima de 1,1x108

OB/mL; Claus et al.

(1993) com o sistema Anticarsia gemmatalis NPV em células Spodoptera frugiperda (Sf21),

atingiram uma produção de 3x107

OB/mL; Kariuki et al. (2000) utilizando o sistema Plutella

xylostella MNPV em células Plutella xylostella, obtiveram a produção de 2,8x106

OB/mL;

Bonning et al. (1995), no sistema Autographa californica MNPV em células Sf21, obtiveram

uma produção de 6,0x106 OB/mL; Batista et al. (2005), utilizando o sistema Anticarsia

gemmatalis MNPV em células Sf9, que atingiu uma produção de 1,6x107OB/mL e Almeida

(2005) com o sistema de cultivo em suspensão do Spodoptera frugiperda MNPV em células

Sf9 e Sf21, obteve uma produção máxima de 5x108 OB/mL e 2,5x108 OB/mL,

respectivamente. Estes trabalhos mostram sistemas de cultivo em suspensão ou em

monocamadas que são essenciais e preliminares para uma futura otimização da produção, pois

a partir dos resultados de produção obtidos desses sistemas podem-se obter parâmetros

suficientes para otimização e ampliação da produção do produto de interesse.



Estudos têm sido realizados com a finalidade de aumentar e/ou otimizar a produção in

vitro de baculovírus seja para produção de proteínas ou para a produção de bioinseticidas. A

escolha do processo de produção, bem como, o modo de operação dos sistemas de produção é

de muita importância para obtenção de altos rendimentos com custo efetivo e visando possível

ampliação de escala. Portanto, o modo de operação em batelada alimentada normalmente é

utilizado como alternativa para o aumento de produção quando se utiliza o sistema em

batelada.

O desenvolvimento de um processo de produção, seja de proteínas recombinantes ou

de baculovírus, utilizando células animais exige conhecimento detalhado das suas

necessidades nutricionais e de seu comportamento metabólico que podem selecionar uma

estratégia de cultivo específico, como batelada, batelada-alimentada ou de perfusão (GIORIA;

JÄGER; CLAUS, 2006). Como exemplo, a ausência de produção de subprodutos tóxicos em

cultivos bem oxigenados de lepidópteros como linhagens celulares IPLB-SF-21 e Sf9 torna

possível utilizar estratégias de alimentação nutritiva, a fim para manter as culturas com

elevadas concentrações celulares (NGUYEN et al., 1993; BÉDARD; PERRET; KAMEN,

1997; ELIAS et al., 2000). Inúmeros são os trabalhos que utilizam o cultivo em batelada-

alimentada como estratégia de aumentar a produção (WANG et al. 1999; CHIOU; HSIEH;

HO, 2000; SITTON; SRIENC, 2008; MERGHROUS et al., 2009). Esse tipo de estratégia é

amplamente utilizado para o sistema de expressão em baculovírus, mas para a produção de

baculovírus para serem utilizados como bioinseticidas não é comum.

O nível de nutrientes que pode ser adicionado no meio de cultura é restrito à tolerância

da célula a alta osmolaridade e ao limite de solubilidade individual dos nutrientes. Os

suplementos na batelada-alimentada podem englobar um amplo espectro na nutrição das

células de inseto tais como aminoácidos, açúcares (glicose, frutose, manose), lipídeos,

vitaminas e fatores de crescimento (CHAN, 1998).

Como estratégia de aumentar a produção de β-galactosidase expressa por baculovírus,

Berdád; Perret; Kamen, (1995), utilizando o sistema em batelada-alimentada, fizeram alguns

ajustes na fonte de alimentação que normalmente era utilizada para a produção de proteínas

recombinantes, ou seja, adicionaram à alimentação maior proporção de yeastolate e também

de aminoácidos que promoveram um rendimento 4 vezes melhor na produção de β-



galactosidase quando comparado ao sistema em batelada conduzido com o mesmo tempo de

infecção (TOI).

Rotinas de otimização estatística têm sido empregadas para desenvolver uma

estratégia de alimentação que aumente a produção de proteínas tais como a β-galactosidase.

Esta estratégia envolve a adição simples de nutrientes concentrados (aminoácidos, lipídeos,

glicose) aos cultivos de células Sf9 desenvolvidas em meio SF900II SFM (Gibco). Tal

suplementação favoreceu o aumento da produção de células Sf9 em cultivos em batelada,

atingindo concentração máxima de 3x107 células/mL (CHAN et al., 1998).

Ainda utilizando o cultivo em batelada-alimentada para otimizar a produção de

proteínas recombinantes, Chan et al. (1998a) adicionaram uma solução de multicomponentes

(extrato de levedura, lipídeos, aminoácidos, vitaminas e glicose) como nutrientes de

alimentação para o sistema de produção células/baculovírus (Spodoptera frugiperda

(Sf9)/Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV)) com a finalidade de

expressar também a proteína β-galactosidase (β-Gal). Esta otimização foi realizada em dois

estágios, primeiro foi o procedimento de varredura para determinar as variáveis importantes

no sistema, e finalizando com a análise de superfície de resposta do modelo ajustado

caracterizando a produção volumétrica de β-Gal. A partir deste estudo, obtiveram uma

produção de β-Gal em batelada-alimentada com 2,4 vezes maior do que a produção em

batelada simples. Este resultado foi confirmado em análise estatística com os melhores

resultados do cultivo em batelada e batelada-alimentada, obtendo-se uma média de produção

de 0,5g/L e 1,2g/L de β-Gal, respectivamente.

A utilização de sistemas contínuos de batelada-alimentada estabelece um

desenvolvimento de modelos matemáticos confiáveis para fornecer ótimas estratégias de

alimentação (NIELSEN et al., 1991). Em cultivos descontínuos de batelada-alimentada, a

fonte de nutrientes é geralmente adicionada na cultura em batelada quando o crescimento

celular está bem avançado, ou seja, quando as quantidades dos nutrientes estão esgotadas.

Esta estratégia garante que o processo de alimentação não aumente indevidamente

osmolaridade do meio de cultivo proporcionando maiores concentrações de células (CHAN,

1998).



Visando aumentar a produção da glicoproteína NS1 do vírus da dengue expressa por

BEVS, Chan et al. (2002), utilizaram a estratégia da batelada alimentada em cultivos de

suspensão com células Sf9 infectadas com baculovírus recombinante do AcMNPV. A

batelada alimentada envolveu adição por pulso de alguns nutrientes (aminoácidos, lipídeos,

glicose e extrato de levedura ultrafiltrado), no estudo, esta adição proporcionou alta produção

de produto intracelular β-galactosidase, a mesma estratégia poderia se aplicada em sistemas

que normalmente apresentam baixo rendimento como é o caso da glicoproteína NS1. Os

resultados mostraram que as infecções em batelada-alimentada exibiram produção três vezes

maior no rendimento da proteína NS1 ao ser comparado com o sistema em batelada.

Diante disto, como estratégia para melhorar a produção dos corpos de oclusão do

baculovírus recombinante vAgEGT∆-LacZ propõe-se associar o cultivo em batelada-

alimentada com a baixa multiplicidade de infecção (Low MOI). A baixa multiplicidade de

infecção proporciona um custo menor com a quantidade de inóculo, consequentemente,

menos bateladas ou passagens são necessárias para se obter a quantidade mínima de vírus

suficiente para infectar uma determinada suspensão celular, promovendo, assim uma

economia no custo final de produção (ZHANG; MERCHUK, 2004).


5.2.1 Células

A linhagem de célula de inseto, Sf21 (American Type Culture Collection, MD) cedidas

pela Embrapa/Cenargen, adaptada ao meio de cultura em suspensão (SF900II SFM, Gibco)

foi utilizada para a replicação dos baculovírus recombinante vAgEGT∆-LacZ. A morfologia,

concentração e a viabilidade celular foram monitoradas através de microscopia ótica e a sua

manutenção foi realizada em shaker orbital (Tecnal, TE421) com agitação de 120 rpm e



temperatura controlada a 28oC. A concentração celular foi calculada conforme descrito no

item 3.2.1 desta tese.

5.2.2 Vírus

Nesta etapa do trabalho foi utilizado o vírus extracelular produzido in vitro do

baculovírus recombinante vAgEGT∆-lacZ fornecido gentilmente pelo Dr. Bergmann Morais

Ribeiro da Universidade de Brasília.

5.2.3 Solução de alimentação

Para os cultivos em batelada-alimentada foram utilizados três condições de solução de

alimentação: somente com nutrientes, com nutrientes e meio de cultura e somente com meio

de cultura.

As concentrações dos nutrientes utilizados nos experimentos de batelada-alimentada

foram retiradas do trabalho de Chan; Greenfield; Reid (1998). Os nutrientes utilizados para

50mL de suspensão celular foram 2,3mL de Yestolate (50X yeastolate ultrafiltrado, Sigma),

0,55mL de concentrado de lipídeos (100X concentrado de lipídeos, Sigma), 0,35mL de

glicose (2,8mM, Vetec), 3,75mL de concentrado de aminoácidos (100X, MEM aminoácidos,

Invitrogen) e 1,1mL de glutamina (155,8mM, Gibco). E o meio de cultura utilizado foi o

SF900II SFM (Gibco).



5.2.4 Produção em batelada-alimentada

A produção em batelada-alimentada de baculovírus foi realizada através de infecções

em células Spodoptera frugiperda, linhagem IPLB-Sf21, com adição (por pulso único) da

solução de alimentação. As células Sf21 sadias, apresentando viabilidade de 95% ou

superior, foram infectadas com o vírus extracelular (BV) dos baculovírus recombinante

vAgEGT∆-LacZ. As infecções foram realizadas em shaker (120 rpm e 28C), utilizando

frascos erlenmeyers de 250mL, com volume de suspensão de 100mL (razão de aeração igual a

0,4) e com tempo de infecção (TOI) equivalente a 5,0x105 células viáveis/mL, utilizando um

inóculo viral com multiplicidade de infecção (MOI) correspondente a 1,25, ou seja, uma

quantidade de 0,25% (v/v) de vírus inoculados na suspensão.

Duas suspensões celulares, 100mL cada, foram infectadas com o baculovírus

recombinante vAgEGT∆-LacZ. A concentração celular foi quantificada diariamente, após

atingirem a concentração de alimentação (TOF = 2,5x106 células viáveis/mL). Uma

suspensão celular foi dividida em duas suspensões de igual volume (2x50mL) para serem

alimentadas com a solução de alimentação composta somente por nutrientes e a outra

suspensão celular foi dividida em 4 suspensões de 25mL (4x25mL) onde 2 suspensões foram

alimentadas com igual volume de solução de alimentação suplementada com meio SF900II

SFM (Gibco) e 2 suspensões celulares foram alimentadas com igual volume (50% v/v)

somente com meio SF900II SFM (Gibco). Após alimentação, as infecções foram

acompanhadas diariamente para quantificação de células viáveis e produção de OB durante o

processo de infecção. Todos os experimentos foram realizados em duplicata.


A seguir serão mostrados os resultados referentes ao cultivo em batelada-alimentada

das infecções com o baculovírus recombinante vAgEGT∆-LacZ utilizando as três condições

de alimentação com a finalidade de aumentar a produção dos corpos de oclusão produzidos



durante o processo de infecção. Todos os experimentos foram realizados em duplicata,

apresentando erro médio de 5% para a contagem das células e 16% para a quantificação dos

corpos de oclusão.

5.3.1 Batelada-alimentada com a solução de alimentação: nutrientes

Os resultados apresentados referem-se à batelada-alimentada utilizando como

alimentação uma solução rica em nutrientes como aminoácidos, lipídeos, yeastolate, glicose,

glutamina. Estes resultados foram comparados aos resultados da batelada simples utilizando a

mesma multiplicidade de infecção (MOI 1,25) e tempo de infecção (5,0x105 células

viáveis/mL).

A Figura 5.1 mostra o três perfis de crescimento. Um deles é o crescimento das células

não infectadas, que serviu como controle para as células infectadas, o outro é o crescimento

das células infectadas com o baculovírus recombinante vAgEGT∆-LacZ em baixa MOI

(1,25), controle da infecção (infecção sem alimentação) e por fim, o último perfil foi das

células infectadas na mesma condição da infecção controle suplementada com a adição de

nutrientes. Pode-se observar que as células infectadas cresceram até uma concentração de

(2,10±0,11)x106células viáveis/mL, momento no qual foi realizada a alimentação com os

nutrientes (TOF – tempo de alimentação = (2,10±0,11)x106células viáveis/mL).

A partir do pulso de alimentação houve um pequeno declínio na concentração de

células viáveis ((1,53± 0,08)x106células viáveis/mL) ocasionado pela diluição com a adição

de 8 mL da solução de alimentação. Após este momento, as células permanecem com

concentrações constantes de células viáveis ((1,40±0,07)x106; (1,38±0,07)x106 e

(1,12±0,06)x106), ou seja, não houve declínio brusco mediante a infecção, proporcionando

um número considerável de células viáveis por um período maior durante a infecção, que

favoreceu uma maior replicação viral. Uma quantidade maior de células com uma infecção

sincronizada significa maior produção dos corpos de oclusão durante o processo de infecção.



0 1 2 3 4 5

0

1

2

3

4

5

6

7

TOI

TOF

Cél

ulas

Viá

veis

x 1

06 /mL

Tempo (dia)

Células não infectadas Células infectadas sem alimentação Células infectadas com alimentação

Figura 5.1 Cinética da infecção com vAgEGT∆-LacZ em batelada-alimentada (nutrientes)

A Figura 5.2 mostra a produção de OB produzidos na infecção com vAgEGT∆-LacZ

sem alimentação, observou-se que a produção média de OB foi de (1,83±0,29)x107 OB/mL e

de apenas 3,33±0,53 OB/Célula ao final de 8 dpi. A concentração viral não foi suficiente para

infectar todas as células ao mesmo tempo, não observando assim o sincronismo no processo

de infecção. Em baixa MOI, a quantidade de vírus adicionada no cultivo é muito menor do

que a concentração inicial de células viáveis (ZHANG; MERCHUK, 2004).

Após a alimentação, a produção de OB aumentou consideravelmente, partiu da

concentração de (1,83±0,29)x107 OB/mL para concentração de (5,30±0,85)x107 OB/mL, que

corresponde ao aumento de 3 vezes em relação à infecção controle (infecção sem

alimentação) e produção específica de 3,33±0,53 OB/Célula para 30,87±4,94 OB/Célula, ou

seja, um aumento de cerca de 10 vezes.



2 3 4 5 6 7 80,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

Produção específica de OB Produção volumétrica de OB

Tempo (dia)

OB

x 1

07 /mL

0

1

2

3

4

5

OB

/Cél

ula

Figura 5.2. Perfil da produção de OB da infecção com vAgEGT∆-LacZ sem alimentação

Esta produção maior de OB na infecção com batelada-alimentada identificada no

cultivo é justificada pela correlação denominada rendimento celular (WONG et al, 1996),

onde utilizando o sistema BEVS para produção de proteinas, basicamente a produção

volumétrica de proteína aumentaria proporcionalmente com a concentração máxima celular,

promovido pela adição de nutrientes (CHAN et al., 2002). Pode-se associar a produção de

proteínas com a produção de baculovírus, uma vez que para obtenção de proteínas a partir do

sistema de expressão com baculovírus, necessariamente, haverá produção viral

necessariamente para produzir proteínas. Portanto, o aumento da produção de corpos de

oclusão foi promovido pela adição de nutrientes ao cultivo, e limitado pela densidade máxima

de células.



Neste experimento, provavelmente, ocorreu aumento do título viral que pode ter sido

provocado pela diluição através da adição de nutrientes. Este aumento proporcionou o

sincronismo da infecção e o aumento da produção de OB.

A Figura 5.3 mostra a produção de OB produzidos na infecção com vAgEGT∆-LacZ

com alimentação de nutrientes, observou-se que a produção média de OB foi de

(5,30±0,85)x107 OB/mL e de 30,87±4,94 OB/Célula ao final de 8 d.p.i. Esta produção foi

melhorada devido aos nutrientes adicionados no cultivo, pois permitiu que as células

permanecessem em estado viável por mais tempo (GIORIA; JÄGER; CLAUS, 2006) e,

consequentemente, com a maior possibilidade de serem infectadas, garantindo a produção de

OB devido ao sincronismo da infecção.

2 3 4 5 6 7 80

1

2

3

4

5

6

7


Tempo (dia)

OB

x 1

07 /mL

6

12

18

24

30

36

42

OB

/Cél

ula

Figura 5.3 Perfil da produção de OB da infecção com vAgEGT∆-LacZ com alimentação (nutrientes)



5.3.2 Batelada-alimentada com a solução de alimentação: nutrientes combinada com o meio de cultura SF900II

Os resultados apresentados a seguir referem-se aos cultivos em batelada alimentada

utilizando como alimentação solução de nutrientes associada ao meio de cultura SF900II SFM

(Gibco). Estes resultados foram comparados aos resultados obtidos nos cultivos em batelada

alimentada utilizando a alimentação somente a solução de nutrientes e, também, nos cultivos

em batelada em baixa MOI.

A Figura 5.4 mostra o três perfis de crescimento do processo de infecção em batelada-

alimentada. Pode-se observar que as células infectadas cresceram até uma concentração de

(2,60±0,13)x106 células viáveis/mL, momento no qual foi realizada a alimentação com os

nutrientes suplementada com meio de cultura SF900II SFM (Gibco) (TOF – tempo de

alimentação = (2,60±0,13)x106 células viáveis/mL). Esta adição da solução de alimentação

proporcionou uma diluição de 50% do volume final da suspensão.

A partir do pulso de alimentação houve declínio que correspondeu à metade da

concentração de células viáveis ((1,1±0,06)x106células viáveis/mL) ocasionado pela diluição

com a adição de 25 mL da solução de alimentação. Após a alimentação, as células

continuaram a crescer atingindo as seguintes concentrações de células viáveis

((1,46±0,07)x106e (1,94±0,10)x106 células viáveis/mL) devido à adição de meio de cultura

fresco e suplementação com a solução de nutrientes que proporcionaram condições favoráveis

para o crescimento. Logo em seguida houve um declínio na concentração destas células

((0,96±0,05)x106células viáveis/mL) devido à ação viral provocada pela infecção estabelecida

naquele momento, observando assim o mesmo comportamento do cultivo em batelada

simples.



0 1 2 3 4 5

0

1

2

3

4

5

6

7

TOI

TOF

Cél

ulas

Viá

veis

x 1

06 /mL

Tempo (dia)


Figura 5.4 Cinética da infecção com vAgEGT∆-LacZ em batelada-alimentada (nutrientes + meio de cultura)

A Figura 5.5 mostra a produção de OB durante o processo de infecção em batelada-

alimentada utilizando como solução de alimentação com nutrientes suplementados com meio

SF900II SFM (Gibco). Observa-se que a produção volumétrica média foi menor

((3,20±0,51)x107OB/mL) quando comparada com produção obtida na alimentação somente

com os nutrientes ((5,30±0,85)x107OB/mL). E uma produção específica média de 18,54±2,96

OB/Célula que representa um aumento de cerca de 6 vezes a produção do cultivo em batelada

com baixa MOI.

O aumento observado nessa estratégia foi promovido pelo baixo crescimento celular

observado no sistema devido à adição da solução de alimentação no TOF e,

consequentemente, aumentou a produtividade específica de corpos de oclusão, ou seja, foi

praticamente a mesma produção volumétrica obtida no sistema em batelada simples em



relação à concentração menor de células, portanto, aumento na produção específica de corpos

de oclusão. Além disso, a produção foi cerca de 2 vezes menor do que a produção específica

do cultivo em batelada alimentada utilizando como alimentação somente a solução de

nutrientes. Portanto, houve uma melhora na produção em relação ao cultivo em batelada, mas

quando comparada ao cultivo em batelada alimentada houve uma redução de 60% em relação

à produção média dos corpos de oclusão.

2 3 4 5 6 7 80,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0


Tempo (dia)

OB

x 1

07 /mL

0

3

6

9

12

15

18

21

24

27

OB

/Cél

ula

Figura 5.5 Perfil da produção de OB com alimentação (nutrientes + meio de cultura)

A produção de OB utilizando a solução de nutrientes associada ao meio de cultura não

foi favorecida devido à baixa concentração viral naquele momento, o que proporcionou um

crescimento celular sem o estabelecimento da infecção em sincronismo. Provavelmente, isto

ocorreu devido à quantidade de nutrientes que foi adicionada a suspensão, uma vez que o

próprio meio de cultura também possui aminoácidos, glicose e glutamina em sua formulação,



promovendo uma revitalização nas células que mesmo infectadas, embora em baixa MOI,

apresentaram crescimento durante o processo de infecção, portanto, ainda não observando o

sincronismo na infecção.

5.3.3 Batelada-alimentada com a solução de alimentação: meio de cultura SF900II

Os resultados apresentados a seguir referem-se aos cultivos em batelada alimentada

utilizando como alimentação somente o meio de cultura SF900II SFM (Gibco). E comparados

com os cultivos em batelada alimentada já apresentados e com os cultivos em batelada em

baixa MOI.

A Figura 5.6 mostra o três perfis de crescimento do processo de infecção em batelada-

alimentada utilizando como alimentação somente meio de cultura SF900II SFM (Gibco).

Pode-se observar que as células infectadas cresceram até uma concentração de

(2,60±0,13)x106células viáveis/mL, momento no qual foi realizada a alimentação com meio

SF900II SFM (Gibco) fresco (TOF – tempo de alimentação = (2,60±0,13)x106 células

viáveis/mL). Esta adição da solução de alimentação proporcionou, assim como na infecção

anterior, uma diluição de 50% do volume final da suspensão. Após a alimentação com o meio

SF900II SFM (Gibco), as células ainda cresceram até a concentração de (1,67±0,27)x106

células viáveis/mL e subsequente declínio caracterizando a infecção.

Esta estratégia de alimentação é utilizada normalmente quando se deseja realizar um

processo de low moi, ou seja, diluição da suspensão celular com o próprio meio de cultura

para atingir a mesma produtividade específica observada em altas concentrações de células

(MENA et al., 2010).



0 1 2 3 4 5

0

1

2

3

4

5

6

7

TOI

TOF

Cél

ulas

Viá

veis

x 1

06 /mL

Tempo (dia)


Figura 5.6 Cinética da infecção com vAgEGT∆-LacZ em batelada-alimentada (meio de

cultura)

A Figura 5.7 apresenta a produção de OB para o cultivo em batelada alimentada

utilizando somente o meio SF900II SFM (Gibco) como solução de alimentação. A produção

de corpos de oclusão foi muito baixa em relação aos demais processos de infecção, obtendo-

se apenas em média (5,0±0,80)x106OB/mL em 8 dpi e uma relação muito pequena de

OB/Célula em média 3,33 ±0,53. Portanto, apresentando uma produção volumétrica média de

OB cerca de 6 vezes menor do que o cultivo em batelada alimentada utilizando a solução de

nutrientes associada ao meio de cultura e cerca de 10 vezes menor do que a produção

utilizando somente a solução de nutrientes como fonte de alimentação.



2 3 4 5 6 7 84,0

4,5

5,0

5,5

6,0

6,5

7,0

7,5

8,0

Tempo (dia)

OB

x 1

06 /mL

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

5,0

5,5

6,0

Produção volumétrica de OB Produção específica de OB

OB

/Cél

ula

Figura 5.7 Perfil de produção de OB com alimentação (meio de cultura)

Comparando a produção específica de OB, observa-se que a produção utilizando o

somente o meio de cultura SF900II SFM (Gibco) como solução de alimentação não

apresentou diferença quando comparada com o sistema de produção em batelada,

provavelmente essa produção poderia ter apresentado melhores resultados se fosse realizada

outra adição de meio de cultura proporcionando mais uma diluição (50% v/v) e

consequentemente, o estabelecimento da infecção ocasionando maior produção específica

provocada pela baixa multiplicidade de infecção (low moi) sequenciada, fato observado no

estudo de Mena et al. (2010).

A produção observada nesta condição de alimentação (somente com meio de cultura)

foi cerca de 5 vezes menor do que a produção em batelada alimentada utilizando a solução de



nutrientes associada ao meio de cultura como fonte de alimentação e cerca de 10 vezes menor

do que a produção em batelada alimentada utilizando a solução de nutrientes como única

fonte de alimentação. Tal diferença significativa foi ocasionada pela composição das soluções

de alimentação adicionadas na batelada-alimentada.

5.4 Conclusão

A produção in vitro do baculovírus recombinante vAgEGT∆-LacZ utilizando o sistema

de cultivo em batelada-alimentada associado com a baixa MOI e utilizando como solução de

alimentação somente os nutrientes (aminoácidos, lipídeos, yeastolate, glicose, glutamina)

obteve uma produção de corpos de oclusão ((5,30±0,85)x107OB/mL) 3 vezes maior do que a

infecção utilizando somente baixa MOI ((1,83±0,29)x107OB/mL). A fonte de nutrientes

permitiu que as células viáveis permanecessem mais tempo sadias e consequentemente, com

maior capacidade de produção de produção de OB, devido ao estabelecimento da infecção em

sincronismo.

O processo de infecção em batelada-alimentada utilizando como solução de

alimentação com nutrientes suplementados com meio SF900II SFM (Gibco) apresentou uma

produção ((3,20±0,51)x107OB/mL) cerca de 2 vezes maior quando comparada ao processo de

infecção em batelada ((1,83±0,29)x107OB/mL), portanto, a estratégia de adicionar o meio de

cultura aos nutrientes não favoreceu o aumento da produção de OB.

Com a adição somente do meio a produção foi bem menor ((5,0±0,80)x106OB/mL)

não apresentando uma produção volumétrica significativa e uma produção específica mínima

de cerca de 3,0±0,48 OB/Célula em 8 dias de infecção.

97

Capítulo 6

Conclusão Geral

98 __________________________________________________________________________________________Capítulo 6 Conclusão Geral

______________________________________________________________________ Andréa Farias de Almeida –Tese de Doutorado – UFRN – PPGEQ

6 Conclusão Geral

A produção in vitro de baculovirus recombinante vAgEGT∆-LacZ é desejável pois

este baculovírus por apresentar o gene egt de forma silenciada proporciona diminuição no

tempo de vida do inseto e por ser mais agressivo do que o selvagem AgMNPV desperta

interesse na sua produção em larga escala para produção de bioinseticida viral. Os resultados

de produção apresentaram grande potencial quanto à replicação em células Sf21. Durante o

estudo da multiplicidade de infecção constatou-se que o baculovírus recombinante vAgEGT∆-

LacZ necessitaria de quantidades inferiores de inóculo viral nas infecções quanto comparado

com o baculovírus selvagem, comprovando a sua maior agressividade nas células hospedeiras.

As passagens sucessivas do baculovírus recombinante vAgEGT∆-LacZ

demonstraram estabilidade viral ao longo do processo de infecção uma vez que houve

aumento da produção de OB, produção média de 18,87 ± 3,02 para 46,02 ± 7,36 OB/Célula

ao longo do cultivo, proporcionando um aumento de 59% na sua produção, fato que

normalmente não é observado em sistemas de cultivo em células de inseto, pois o que

geralmente acontece é uma rápida diminuição de OB ao longo do cultivo.

Em vista disto, a ampliação de escala proposta neste trabalho, associando o sistema

de bateladas sucessivas ao processo de produção em passagem seriada, considerando que cada

batelada fosse um reator, e esse reator fosse o inóculo do reator subsequente, apresentou

resultados animadores quanto ao processo em larga escala, onde em somente 5 passagens

virais obteve-se uma produção de 8,9x1014 corpos de oclusão. A demanda nacional é de

1,5x1011OB/hectare de área tratada com o baculovírus AgMNPV e considerando que são

tratados cerca de 1,6 milhão de hectares/ano, então são necessários 253 sistemas de cultivos

do tipo bateladas repetidas com 5 passagens cada para atender a demanda de mercado. Outra

característica interessante desse recombinante é a sua capacidade de produção de OB quando

comparada com o baculovírus selvagem AgMNPV-MP5, que em mesmas condições de

cultivo apresentou uma produção de OB semelhante ao baculovírus selvagem, identificando

assim o potencial de produção de OB do baculovírus recombinante vAgEGT∆-LacZ em

células Sf21 utilizando o sistema de cultivo em suspensão.

99 __________________________________________________________________________________________Capítulo 6 Conclusão Geral


E ainda, comparando as estratégias de produção (batelada e batelada-alimentada)

visando o aumento de produção de OB do baculovírus recombinante vAgEGT∆-LacZ conclui-

se que o processo em batelada alimentada utilizando somente a solução de nutrientes

(aminoácidos, lipídeos, yeastolate, glicose, glutamina) apresentou o melhor resultado de

produção de corpos de oclusão, proporcionando um aumento da produção de três vezes

(5,3x107OB/mL) em relação ao processo em batelada (1,83x107OB/mL). Tornando a

estratégia de batelada alimentada, já muito difundida na produção de proteínas utilizando o

sistema de vetor de expressão em baculovírus, uma alternativa de melhoria também na

produção de bioinseticida viral.

100

Referências

101 __________________________________________________________________________________________Referências


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Anexos

114 __________________________________________________________________________________________Anexos


ANEXO A Cálculo do TCLD50 pelo método da viabilidade celular (MTT) Tabela A.1 - Resultado da leitura da placa de cultura com células Sf21 com o baculovírus AgMNPV-MP5-P0 Vírus: AgMNPV-MP5 - Passagem 0 com data da leitura: 15/06/09

Cálculo do Título Viral utilizando o reagente MTT em placas de 96 poçosMeio Sf900II adicionado 1% (v/v) de SFB

Legenda:

Linha A - Células Controle Linha E - Diluição Viral do AgMNPV-MP5 - 10 -3

Linha B - Diluição Viral do AgMNPV-MP5 - 10 -6 Linha F - Diluição Viral do AgMNPV-MP5 - 10 -2

Linha C - Diluição Viral do AgMNPV-MP5 - 10 -5 Linha G - Diluição Viral do AgMNPV-MP5 - 10 -1

Linha D - Diluição Viral do AgMNPV-MP5 - 10 -4 Linha H Diluição Viral do AgMNPV-MP5 - 10 0

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12A 0,326 0,338 0,407 0,403 0,485 0,372 0,425 0,409 0,314 0,335 0,338 0,274 0,369B 0,338 0,561 0,535 0,653 0,551 0,611 0,621 0,23 0,232 0,551 0,469 0,375 0,477C 0,34 0,488 0,474 0,467 0,533 0,445 0,507 0,472 0,446 0,465 0,461 0,327 0,452D 0,368 0,457 0,557 0,467 0,506 0,467 0,57 0,626 0,25 0,492 0,625 0,364 0,479E 0,273 0,405 0,366 0,423 0,455 0,445 0,411 0,422 0,406 0,420 0,393 0,318 0,395F 0,261 0,369 0,403 0,388 0,45 0,443 0,433 0,402 0,41 0,439 0,411 0,314 0,394G 0,214 0,273 0,264 0,275 0,272 0,315 0,257 0,261 0,253 0,29 0,243 0,248 0,264H 0,207 0,222 0,215 0,215 0,229 0,206 0,213 0,223 0,233 0,261 0,225 0,208 0,221

ABSORBÂNCIASMÉDIAS

1E-6 1E-5 1E-4 1E-3 0,01 0,1 10,20

0,25

0,30

0,35

0,40

0,45

0,50

AB

S (

570

nm)

Diluições Virais

Figura A.1. Gráfico da curva de ajuste sigmoidal

115 __________________________________________________________________________________________Anexos


Tabela A.2 – Cálculos do TCLD50 e MOI

Obs: Para a infecção P1 (publicação dos isolados) o TOI foi de 4,9x105 células viáveis/mL em uma suspensão de 50mL.Quantidade de inóculo utilizado foi de 10% (v/v) equivalendo a 5mL de vírus de AgMNPV-MP5 da passagem 0.

Cálculo do título viral para esta infecção será: Cálculo da MOI para esta infecção será:

TCLD 50 = ((X0*volume de diluição) -̂1)*quantidade de inóculo MOI = (TCLD 50 / TOI)*volume de infecção

TCLD 50 = 1,46E+04 MOI = 1,49

Cálculo da TCLD50 e da MOI para a infecção P1 do AgMNPV-MP5

116 __________________________________________________________________________________________Anexos


ANEXO B

0 1 2 3 4 5 6

0,0

2,0x106

4,0x106

6,0x106

8,0x106

1,0x107

Cél

ulas

/mL

Tempo (dia)

Células Viáveis Células Não Viáveis

Figura B.1 – Curva de crescimento das células Sf21 não infectadas

0 1 2 3

13,0

13,5

14,0

14,5

15,0

15,5

16,0

Y = 0,915X + 13,176R2 = 0,9924

LN (

Xv)

Tempo (dia)

Figura B.2 – Cálculo do µap das células Sf21 não infectadas

117 __________________________________________________________________________________________Anexos


0 1 2

12,6

12,8

13,0

13,2

13,4

13,6

13,8

14,0

14,2

Y = 0,726X + 12,664R2 = 0,9977

LN (

Xv)

Tempo (dia)

Figura B.3 – Cálculo do µap das células Sf21 infectadas com AgMNPV-2D

0 1 212,8

13,0

13,2

13,4

13,6

13,8

14,0

14,2

Y = 0,619X + 12,941R2 = 0,9958

LN (

Xv)

Tempo (dia)

Figura B.4 – Cálculo do µap das células Sf21 infectadas com AgMNPV-MP2

118 __________________________________________________________________________________________Anexos


0 1 2

13,0

13,2

13,4

13,6

13,8

14,0

14,2

14,4

Y = 0,612X + 13,103R2 = 0,9822

LN (

Xv)

Tempo (dia)

Figura B.5 – Cálculo do µap das células Sf21 infectadas com AgMNPV-MP5

119 __________________________________________________________________________________________Anexos


ANEXO C

3 4 5

1,1x106

1,2x106

1,3x106

1,3x106

1,4x106

1,4x106

1,5x106

Y = -1,3x105X - 1,807x106

R2 = 0,9961

Cél

ulas

Infe

ctad

as V

iáve

is/m

L

Tempo (dia)

Figura C.1. Ajuste linear para o cálculo da Ri da Infecção com AgMNPV-2D

3 4 5 6

0,00E+000

2,00E+007

4,00E+007

6,00E+007

8,00E+007

1,00E+008

1,20E+008

Y = 3,879x107X -1,147x108

R2 = 0,9997

OB

/mL

Tempo (dia)

Figura C.2. Ajuste linear para o cálculo da Rp da Infecção com AgMNPV-2D

120 __________________________________________________________________________________________Anexos


ANEXO D

3 4 5

1,64x106

1,65x106

1,66x106

1,67x106

1,68x106

1,69x106

1,71x106

1,72x106

1,73x106

1,74x106

1,75x106

1,76x106

1,77x106

1,78x106

1,79x106

1,80x106

Y = -7x104X + 2,01x106

R2 = 0,987

Cél

ulas

infe

ctad

as v

iáve

is/m

L

Tempo (dia)

Figura D.1. Ajuste linear para o cálculo da Ri da Infecção com AgMNPV-MP2

2,0 2,5 3,0 3,5 4,0

0,00E+000

5,00E+007

1,00E+008

1,50E+008

2,00E+008

2,50E+008

Y = 1,074x108X - 2,127x108

R2 = 1,0

OB

/mL

Tempo (dia)

Figura D.2. Ajuste linear para o cálculo da Rp da Infecção com AgMNPV-MP2

121 __________________________________________________________________________________________Anexos


ANEXO E

3 4 52,0x105

4,0x105

6,0x105

8,0x105

1,0x106

1,2x106

1,4x106

1,6x106

Y = -5,77x105X + 3,19x106

R2 = 0,9981Cél

ulas

Infe

ctad

as V

iáve

is/m

L

Tempo (dia)

Figura E.1 – Ajuste linear para o cálculo da Ri da Infecção com AgMNPV-MP5

2 3 40,00E+000

5,00E+007

1,00E+008

1,50E+008

2,00E+008

2,50E+008

3,00E+008

3,50E+008

4,00E+008

Y = 1,8934x108X -3,982x108

R2=0,9805

OB

/mL

Tempo (dia)

Figura E.2 – Ajuste linear para o cálculo da Rp da Infecção com AgMNPV-MP5

122 __________________________________________________________________________________________Anexos


ANEXO F

0 1 2 3 4 5

0,0

5,0x105

1,0x106

1,5x106

2,0x106

2,5x106

3,0x106

3,5x106

4,0x106

Cél

ulas

/mL

Tempo (dia)

Células Não Viáveis Infectadas Células Viáveis Infectadas

Figura F.1. Curva de crescimento das células Sf21 infectadas com vAgEGT∆-LacZ

(MOI 1,25)

0 1 212,5

13,0

13,5

14,0

14,5

15,0

Y = 1,003X + 12,781R2 = 0,9996

LN (

Xv)

Tempo (dia)

Figura F.2. Ajuste linear para o cálculo de µapp das células Sf21 infectadas com vAgEGT∆-

LacZ (MOI 1,25)

123 __________________________________________________________________________________________Anexos


4 5

3x105

4x105

5x105

6x105

7x105

8x105

9x105

Y = -5,15x105X + 2,901x106

R2 = 1,0Cél

ulas

Infe

ctad

as V

iáve

is/m

L

Tempo (dia)

Figura F.3. Ajuste linear para o cálculo de Ri das células Sf21 infectadas com vAgEGT∆-

LacZ (MOI 1,25)

2 3 4-5,00E+007

0,00E+000

5,00E+007

1,00E+008

1,50E+008

2,00E+008

2,50E+008

3,00E+008

3,50E+008

4,00E+008

Y = 1,8933x108X - 3,9819x108

R2 = 0,9805

OB

/mL

Tempo (dia)

Figura F.4. Ajuste linear para o cálculo de Rp da infecção com vAgEGT∆-LacZ (MOI 1,25)

124 __________________________________________________________________________________________Anexos


ANEXO G

0 1 2 3 4 5

0,0

5,0x105

1,0x106

1,5x106

2,0x106

2,5x106

3,0x106

3,5x106

Cél

ulas

/mL

Tempo (dia)


Figura G.1. Curva de crescimento das células Sf21 infectadas com vAgEGT∆-LacZ

(MOI 2,5)

0 1 213,0

13,2

13,4

13,6

13,8

14,0

14,2

14,4

14,6

14,8

Y = 0,8045X + 13,111R2 = 0,9942

LN (

Xv)

Tempo (dia)

Figura G.2. Ajuste linear para o cálculo de µapp das células Sf21 infectadas com vAgEGT∆-

LacZ (MOI 2,5)

125 __________________________________________________________________________________________Anexos


3 4 51,8x106

2,0x106

2,2x106

2,4x106

2,6x106

2,8x106

Y = -4,5x105X + 4,1x106

R2 = 0,9820

Cél

ulas

Infe

ctad

as V

iáve

is/m

L

Tempo (dia)

Figura G.3. Ajuste linear para o cálculo de Ri das células Sf21 infectadas com vAgEGT∆-

LacZ (MOI 2,5)

2 3 4

2,0x106

4,0x106

6,0x106

8,0x106

1,0x107

1,2x107

1,4x107

1,6x107

Y = 6,465x106X - 9,338R2 = 0,9864

OB

/mL

Tempo (dia)

Figura G.4. Ajuste linear para o cálculo de Rp da infecção com vAgEGT∆-LacZ

(MOI 2,5)

126 __________________________________________________________________________________________Anexos


ANEXO H

0 1 2 3 4 5

0,0

5,0x105

1,0x106

1,5x106

Cél

ulas

/mL

Tempo (dia)


Figura H.1. Curva de crescimento das células Sf21 infectadas com vAgEGT∆-LacZ

(MOI 5,0)

0 1 212,6

12,8

13,0

13,2

13,4

13,6

13,8

14,0

14,2

14,4

Y = 0,59X + 12,981R2 = 0,9764

LN (

Xv)

Tempo (dia)

Figura H.2. Ajuste linear para o cálculo de µapp das células Sf21 infectadas com vAgEGT∆-

LacZ (MOI 5,0)

127 __________________________________________________________________________________________Anexos


3 4 5

2,0x105

4,0x105

6,0x105

8,0x105

1,0x106

1,2x106

1,4x106

1,6x106

Y = -6,1x105X + 3,2797x106

R2 = 0,9750

Cél

ulas

Infe

ctad

as V

iáve

is/m

L

Tempo (dia)

Figura H.3. Ajuste linear para o cálculo de Ri das células Sf21 infectadas com vAgEGT∆-

LacZ (MOI 5,0)

2 3 4

2,0x106

4,0x106

6,0x106

8,0x106

1,0x107

1,2x107

1,4x107

1,6x107

Y = 5,55x106X - 8,1733x106

R2 = 0,9893

OB

/mL

Tempo (dia)

Figura H.4. Ajuste linear para o cálculo de Rp das células Sf21 infectadas com vAgEGT∆-

LacZ (MOI 5,0)

128 __________________________________________________________________________________________Anexos


ANEXO I

0 1 2 3 4 5

0

1x105

2x105

3x105

4x105

5x105

6x105

7x105

8x105

Cél

ulas

/mL

Tempo (dia)


Figura I.1. Curva de crescimento das células Sf21 infectadas com vAgEGT∆-LacZ

(MOI 12,5)

0 1

12,9

13,0

13,1

13,2

13,3

Y = 0,401X + 12,888R2 = 1,0

LN (

Xv)

Tempo (dia)

Figura I.2. Ajuste linear para o cálculo de µapp das células Sf21 infectadas com vAgEGT∆-

LacZ (MOI 12,5)

129 __________________________________________________________________________________________Anexos


3 4 5

0

1x105

2x105

3x105

4x105

5x105

6x105

7x105

Y = -3,2x105X + 1,596x106

R2 = 0,9716

Cél

ulas

Viá

veis

/mL

Tempo (dia)

Figura I.3. Ajuste linear para o cálculo de Ri das células Sf21 infectadas com vAgEGT∆-LacZ

(MOI 12,5)

2 3 4

2,0x106

4,0x106

6,0x106

8,0x106

1,0x107

1,2x107

1,4x107

1,6x107

1,8x107

Y = 6,5x106X - 9,5x106

R2 = 0,9912

OB

/mL

Tempo (dia)

Figura I.4. Ajuste linear para o cálculo de Rp das células Sf21 infectadas com vAgEGT∆-LacZ

(MOI 12,5)

130 __________________________________________________________________________________________Anexos


ANEXO J

0 1 2 3 4

0

1x105

2x105

3x105

4x105

5x105

6x105

7x105

Cél

ulas

/mL

Tempo (dia)

Células Não Viáveis Infectadas Células viáveis Infectadas

Figura J.1. Curva de crescimento das células Sf21 infectadas com vAgEGT∆-LacZ

(MOI 25,0)

0 1

12,95

13,00

13,05

13,10

13,15

13,20

13,25

Y = 0,27X + 12,971R2 = 1,0

LN (

Xv)

Tempo (dia)

Figura J.2. Ajuste linear para o cálculo de µapp das células Sf21 infectadas com vAgEGT∆-

LacZ (MOI 25,0)

131 __________________________________________________________________________________________Anexos


3 4

1x105

2x105

3x105

4x105

5x105

6x105

Y = -4,773x105X + 1,999x106

R2 = 1,0Cél

ulas

Viá

veis

Infe

ctad

as/m

L

Tempo (dia)

Figura J.3. Ajuste linear para o cálculo de Ri das células Sf21 infectadas com vAgEGT∆-LacZ

(MOI 25,0)

2 3 44,0x106

6,0x106

8,0x106

1,0x107

1,2x107

1,4x107

Y = 4,36x106X -3,737x106

R2 = 0,9811

OB

/mL

Tempo (dia)

Figura J.4. Ajuste linear para o cálculo de Rp das células Sf21 infectadas com vAgEGT∆-

LacZ (MOI 25,0)

132 __________________________________________________________________________________________Anexos


ANEXO K

0 1 2 3 4

0

1x105

2x105

3x105

4x105

5x105

6x105

Cél

ulas

/mL

Tempo (dia)


Figura K.1. Curva de crescimento das células Sf21 infectadas com vAgEGT∆-LacZ

(MOI 50,0)

0 1

12,90

12,95

13,00

13,05

13,10

13,15

Y = 0,214X + 12,904R2 = 1,0

LN (

Xv)

Tempo (dia)

Figura K.2. Ajuste linear para o cálculo de µapp das células Sf21 infectadas com vAgEGT∆-

LacZ (MOI 50,0)

133 __________________________________________________________________________________________Anexos


2 3 45,0x104

1,0x105

1,5x105

2,0x105

2,5x105

3,0x105

3,5x105

4,0x105

4,5x105

Y = -1,8x105X + 7,949x105

R2 = 0,9960

Cél

ulas

Viá

veis

Infe

ctad

as/m

L

Tempo (dia)

Figura K.3. Ajuste linear para o cálculo de Ri das células Sf21 infectadas com vAgEGT∆-

LacZ (MOI 50,0)

3 4 5 63,5x106

4,0x106

4,5x106

5,0x106

5,5x106

6,0x106

6,5x106

7,0x106

7,5x106

Y = 1,168x106X + 5,34x105

R2 = 0,9920

OB

/mL

Tempo (dia)

Figura K.4. Ajuste linear para o cálculo de Rp das células Sf21 infectadas com vAgEGT∆-

LacZ (MOI 50,0)

Documents

Tese de doutorado de Andréa Farias de Almeida€¦ · andréa farias de almeida estratÉgias de produÇÃo in vitro de bioinseticida viral: influÊncias do isolado, da cinÉtica