TesePCSFT Dr Tudo

7/25/2019 TesePCSFT Dr Tudo

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PAULA CRISTINA DE SOUSA FARIA-TISCHER

ESTRUTURA QUMICA, PROPRIEDADES REOLGICAS EATIVIDADE ANTIVIRAL DAS GALACTANAS SULFATADAS

DAS ALGAS VERMELHAS Meristiella gelidium eGymnogongrus griffithsiae (GIGARTINALES)

Tese apresentada ao Curso de Ps-Graduao em Bioqumica e BiologiaMolecular, Setor de Cincias Biolgicas,Universidade Federal do Paran, comorequisito parcial para a obteno do ttulode Doutor em Cincias.

Orientadora: Profa. Dra. Maria EugniaDuarte Noseda

Co-orientador: Prof. Dr. Miguel DanielNoseda

CURITIBA2006


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PAULA CRISTINA DE SOUSA FARIA-TISCHER

ESTRUTURA QUMICA, PROPRIEDADES REOLGICAS EATIVIDADE ANTIVIRAL DAS GALACTANAS SULFATADAS

DAS ALGAS VERMELHAS Meristiella gelidium e

Gymnogongrus griffithsiae (GIGARTINALES)

Tese apresentada ao Curso de Ps-Graduao em Bioqumica e BiologiaMolecular, Setor de Cincias Biolgicas,Universidade Federal do Paran, comorequisito parcial para a obteno do ttulode Doutor em Cincias.

Orientadora: Profa. Dra. Maria EugniaDuarte Noseda

Co-orientador: Prof. Dr. Miguel DanielNoseda

CURITIBA2006


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Dedico esta tese minha famlia,ao meu marido e aos amigos queconquistei nesta jornada.


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Quando achamos que sabemos as respostasa vida muda as perguntas.

Esse o desafio da vida e da pesquisa.


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AGRADECIMENTOS

Deus, pela oportunidade de estudar, me graduar e ainda estar no seleto

grupo de pessoas que tm uma ps-graduao. Mas acima de tudo pela

sade fsica e mental para saber aproveitar todas as boas oportunidades que

a vida gentilmente me oferece.

Profa. Maria Eugnia D. Noseda que acompanhou a minha caminhada no

mestrado e no doutorado, me apresentou a Qumica de Carboidratos das

Algas Vermelhas, me orientou e me ajudou a crescer muito em todos esses

anos. Muito Obrigada!

Ao Prof. Miguel D. Noseda, que me apresentou as carragenanas e me

despertou para as propriedades e peculiaridades desses polissacardeos.

Obrigada pela orientao!

Profa Maria Rita Sierakowski que tornou possvel a minha iniciao no

estudo das propriedades reolgicas de biopolmeros. Obrigada pela

orientao, disposio e por acreditar em mim e no trabalho.

Ao Prof. Phillip Gorin e Profa Carmem Petkowicz pela disponibilidade e

correo da tese na banca interna.

s Profas Tnia Bresolin, Sandra Barreira, Maria de Lurdes da Silva e

Carmem Petkowicz, pela presena na banca e pela valiosa avaliao da tese.

Aos meus maiores e melhores orientadores na vida, meu pai Arnaldo Faria e

a minha me Ana Paula F. S. e Sousa Faria, pelo amor incondicional, pelo

apoio quando eu me sentia perdida e acima de tudo pela formao do meu

carter. Vocs iluminam meu caminho. Muito Obrigada!!!!!!!


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minha querida irm Raquel de Sousa Faria Pavan, sua fora, alegria,

energia, carinho e amizade so indispensveis. Muito Obrigada!! Voc

muito especial!! E a voc, Flvio, por sempre torcer muito por mim.

Obrigada!

Ao meu marido e companheiro, Cesar Augusto Tischer, melhor presente que

a vida poderia me dar. Obrigada por ser persistente. Voc trouxe para a

minha vida, serenidade, aconchego, otimismo e paz. Te amo!!

Caroline G. Mellinger, exemplo de fora, garra e humanidade. Obrigada

pelo estimulo e carinho sempre que precisei. Tnhamos que fazer ps-

graduao para nos tornarmos amigas.

Rosiane G. M. Zibetti, pelo companheirismo, carinho, troca de experincias

e principalmente pela amizade.

Ao Adriano (Dridri), sua alegria e entusiasmo eu no vou esquecer.

Aos colegas de turma de mestrado, Alan e Srgio, pelos bons momentos de

convvio e conversas.

Juliana (Juju), Diogo (Dioguito), Luciana (Lulu), Marco (Marquito), obrigada

pelo companheirismo, amizade, por fecharem a coluna, e por me esperarem

para ir almoar quando eu s tinha que colocar uma dilise. Sinto saudade!!!


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Marquito, obrigada por colocar Enya no final do dia de trabalho!

Ana Helena, obrigada pelas timas conversas, risos e acima de tudo pela

amizade. Gosto muito de voc!

Elaine que no me cumprimentava, mas que no final do doutorado at me

deu um abrao. Que bom que voc deixou eu te conhecer. Obrigada pela

ajuda e conversas cientficas. Gosto muito de voc e saiba que sou sua

amiga!!

Fernanda (Fefer), Ricardo W., ao Thales, obrigada pelo carinho que vocs

sempre me deram. Fefer, obrigada pela sua amizade demonstrada de vriasformas, entre elas por ter ido ao meu ch de panela.

Ao Renato e Mariana, pela amizade, pelos timos passeios e por me

ajudarem de maneira muito especial antes do seminrio de tese. Vocs so

grandes amigos!

Cris, Fran, Charles, Tati, Neoli, do laboratrio de Biopolmeros, obrigada

por me adotarem e me receberem com tanto carinho. Sempre lembrarei de

vocs.

De maneira muito especial, agradeo a grande amiga Lucy Ono, que me

acompanhou desde qualificao. Sua amizade especial!! Obrigada pela

fora!!

Andria, Rosane e Lauro pelas anlises de GPC, GC e GC-MS. Obrigada!

Andria obrigada pelas conversas e leitura das cartas, lembra?!

D. Marilza, aos funcionrios do departamento, as bibliotecrias pela

colaborao. Obrigada!


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A todas as pessoas que direta ou indiretamente participaram e participam da

minha vida e contriburam para a concluso desta tese e desta etapa na

minha vida. Obrigada!!!!!


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SUMRIO

LISTA DE FIGURAS ...............................................................................

LISTA DE TABELAS ..............................................................................

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS ............................................

RESUMO ....................................................................................................

ABSTRACT ...............................................................................................

1. INTRODUO .................................................................................... 1

1.1. ALGAS VERMELHAS ........................................................................... 1

1.2. GALACTANAS: ESTRUTURA GERAL ................................................ 2

1.2.1. CARRAGENANAS ............................................................................. 4

1.2.2. AGARANAS ....................................................................................... 7

1.2.3. GALACTANAS DL-HBRIDAS ........................................................... 8

1.3. CICLO DE VIDA E REPRODUO DAS ALGAS VERMELHAS ........ 10

1.4. ORDEM GIGARTINALES: VARIABILIDADE ESTRUTURAL DAS

GALACTANAS E SIGNIFICADO QUIMIOTAXONMICO .......................... 11

1.4.1. FAMLIA PHYLLOPHORACEAE ....................................................... 16

1.4.2. FAMLIA SOLIERIACEAE ................................................................. 20

1.5. APLICAO INDUSTRIAL DAS GALACTANAS SULFATADAS ...... 23

1.5.1. FORMAO DE GEL, FONTES E PROCESSAMENTO DAS

CARRAGENANAS ....................................................................................... 27

1.5.2. INFLUNCIA DOS SAIS NO PROCESSO DE GELEIFICAO E

INTERAO COM AMIDO .......................................................................... 34

1.6. REOLOGIA: HISTRICO E ASPECTOS TERICOS ........................ 40

1.7. GALACTANAS SULFATADAS COMO COMPOSTOS

BIOLOGICAMENTE ATIVOS: ATIVIDADE ANTIVIRAL ............................. 482.0. OBJETIVOS ..................................................................................... 56

2.1. OBJETIVO GERAL ............................................................................... 56


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2.2. OBJETIVOS ESPECFICOS ................................................................. 56

3.0. MATERIAL E MTODOS ............................................................. 57

3.1. ESPCIES ESTUDADAS E SEUS POSICIONAMENTOSSISTEMTICOS ........................................................................................... 57

3.2. COLETA E PROCESSAMENTO .......................................................... 57

3.3. EXTRAO DAS GALACTANAS DE Meristiella gelidium E

Gymnogongrus griffithsiae ........................................................................ 58

3.4. FRACIONAMENTO E CARACTERIZAO ESTRUTURAL ............... 59

3.4.1. MTODOS ANALTICOS GERAIS .................................................... 59

3.4.2. PRECIPITAO DOS POLISSACARDEOS COM KCl .................. 603.4.3. PURIFICAO DOS POLISSACARDEOS DE M. gelidium POR

CROMATOGRAFIA DE TROCA-INICA .................................................... 60

3.4.4. HIDRLISE CIDA TOTAL DO TIPO HIDRLISE REDUTIVA ....... 61

3.4.5. HIDRLISE CIDA TOTAL ............................................................... 61

3.4.6. METILAO ...................................................................................... 62

3.4.7. MTODOS CROMATOGRFICOS .................................................. 62

3.4.7.1. CROMATOGRAFIA LQUIDO-GASOSA (GLC) ............................ 62

3.4.7.2.CROMATOGRAFIA LQUIDO-GASOSA ACOPLADA

ESPECTROMETRIA DE MASSA (GC-MS) ................................................ 63

3.4.7.3. CROMATOGRAFIA DE GEL PERMEAO (HPSEC-MALLS)

ANLISE DE HOMOGENEIDADE E MASSA MOLECULAR ..................... 63

3.4.8. DESSULFATAO POR TRATAMENTO SOLVOLTICO ............... 64

3.4.8.1. PREPARO DO SAL DE PIRIDNIO .............................................. 64

3.4.8.2. SOLVLISE .................................................................................... 65

3.4.9. TRATAMENTO ALCALINO ............................................................... 65


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3.4.10. MTODOS ESPECTROSCPICOS ................................................ 66

3.4.10.1. RESSONNCIA MAGNTICA NUCLEAR ................................... 66

3.4.10.2. ESPECTROSCOPIA DE INFRAVERMELHO POR

TRANSFORMADA DE FOURIER (FT-IR) .................................................... 66

3.5. ANLISES REOLGICAS .................................................................... 66

3.5.1. PREPARO DAS GALACTANAS SULFATADAS .............................. 67

3.5.2. PREPARO DOS AMIDOS .................................................................. 67

3.5.3. PREPARO DAS MISTURAS DE POLISSACARDEOS .................... 67

3.5.4. ANLISES EM SISTEMA DINMICO ............................................... 68

3.5.5. DETERMINAO DO COMPORTAMENTO VISCOELSTICO

LINEAR ......................................................................................................... 683.5.6. VARREDURA DE FREQNCIA EM SISTEMA VISCOELSTICO

LINEAR ......................................................................................................... 69

3.5.7. VARREDURA DE TEMPERATURA ................................................... 69

3.5.8. TESTE DE INCHAMENTO DO GEL SWEELLING ......................... 69

3.6. DETERMINAO DA ATIVIDADE ANTIHERPTICA E

ANTIDENGUE DAS GALACTANAS DE M. gelidium e G. griffithsiae ...... 70

3.6.1. CLULAS UTILIZADAS ..................................................................... 70

3.6.2. VRUS UTILIZADOS ........................................................................... 71

3.6.3. POLISSACARDEOS DE M. gelidium E G. griffithsiae

UTILIZADOS NA AVALIAO ANTIVIRAL ................................................ 71

3.6.4. ENSAIO CITOTXICO ....................................................................... 72

3.6.5. FORMAO DE PLACAS EM CLULAS Vero ................................ 72

3.6.6. DETERMINAO DA ATIVIDADE ANTIVIRAL in vitro ................... 73

3.6.7. DETERMINAO DA ATIVIDADE VIRUCIDA in vitro ..................... 74

3.6.8. DETERMINAO DO TEMPO DE ADIO DAS FRAES

POLISSACARDICAS ................................................................................... 75

3.6.9. ENSAIO DE ADSORO VIRAL ....................................................... 75


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3.6.10. ENSAIO DE INTERNALIZAO VIRAL .......................................... 75

4.1. RESULTADOS E DISCUSSO ................................................... 77

4.1.1. ANLISES ESTRUTURAIS DOS POLISSACARDEOS DA ALGA

Meristiella gelidium (J. Agardh) ................................................................. 77

4.1.2. ANLISES REOLGICAS DAS GALACTANAS DE Meristiella

gelidium ....................................................................................................... 112

4.1.3. ANLISES REOLGICAS DOS AMIDOS E DAS MISTURAS COM

-CAR ............................................................................................................ 117

4.1.4. ATIVIDADE ANTIVIRAL DAS GALACTANAS SULFATADAS ........ 146

4.1.5. ATIVIDADE ANTIHERPTICA E ANTIDENGUE DAS

GALACTANAS DE G. griffithsiae .............................................................. 146

4.1.6. ATIVIDADE ANTIHERPTICA E ANTIDENGUE DAS

GALACTANAS DE M. gelidium E COMPARAO COM AS

GALACTANAS DE G. griffithsiae. .,............................................................ 160

5.0. CONCLUSES ................................................................................ 163

6.0. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ... 166

ANEXOS


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LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1. ESTRUTURA BSICA REPETITIVA DE CARRAGENANAS,

(UNIDADES D- ALTERNANTES)...................................................................... 4

FIGURA 2. ESTRUTURA BSICA REPETITIVA DE AGARANAS

(UNIDADES D- E L- ALTERNANTES) ......................................................... 7

FIGURA 3. ESTRUTURAS IDEAIS REPETITIVAS DA (A) (NU-

CARRAGENANA), CONFORMAO 4C1 E DA (B) (IOTA-

CARRAGENANA), CONFORMAO 1C4................................................... 28

FIGURA 4. FORMAO DE GEL EM CARRAGENANAS .......................... 35FIGURA 5: ESCOAMENTO DE FLUDO EM REGIME LAMINAR .............. 42

FIGURA 6. FOTO DA ALGA Meristiella gelidium (J. Agardh) .................. 77

FIGURA 7. FLUXOGRAMA DE EXTRAO DOS POLISSACARDEOS

DA ALGA VERMELHA Meristiella gelidium .............................................. 78

FIGURA 8. ESPECTRO DE RMN DE 13C DA FRAO M5 DE M.

gelidium ........................................................................................................ 81

FIGURA 9. ESPECTROS DE RMN DE 13C DAS FRAES BRUTAS M1

(A), M2 (B) E M3 (C) DE M. gelidium .......................................................... 83

FIGURA 10. ESPECTROS DE INFRAVERMELHO DAS FRAES

BRUTAS (M1-M5) EXTRADAS DE ALGA VERMELHA M. gelidium ........ 84

FIGURA 11. ANLISES DE HOMOGENEIDADE DAS FRAES M1 (A)

e M3 (B) POR CROMATOGRAFIA DE GEL PERMEAO (HPSEC-

MALLS) ......................................................................................................... 85

FIGURA 12. FLUXOGRAMA (A) FRACIONAMENTO COM KCl; (B)

PURIFICAO POR CROMOTOGRAFIA DE TROCA INICA DASFRAES DE M. gelidium .......................................................................... 86

FIGURA 13. ANLISE DE HOMOGENEIDADE DA SUBFRAO M3a

HPSEC-MALLS ............................................................................................ 90


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FIGURA 14. ANLISE DE HOMOGENEIDADE DA SUBFRAO M3S

POR CROMATOGRAFIA DE GEL PERMEAO (HPSEC) ....................... 96

FIGURA 15. ESPECTRO DE RMN DE 13C DA FRAO M3S SOLVEL

EM KCl 2M DE M. gelidium ........................................................................ 97

FIGURA 16. ESPECTRO DE RMN DE 13C (A) FRAO NATIVA M3S-3 E

(B) FRAO DESSULFATADA M3S-3D .................................................... 103

FIGURA 17. ESPECTROS DE RMN DE 13C (A) FRAO NATIVA M3S-4

E (B) FRAO DESSULFATADA M3S-4D E ANLISE DE DEPT ............ 107

FIGURA 18. PRINCIPAIS UNIDADES MONOSSACARDICAS

PRESENTES NAS AGARANAS M3S-3 E M3S-4 ........................................ 111

FIGURA 19. ESTRUTURA REPETITIVA DA IOTA-CARRAGENANA ........ 112FIGURA 20. REPRESENTAO GRFICA DA REGIO

DECOMPORTAMENTO VISCOELSTICO LINEAR PARA A FRAO

M1 (10 g/L) EM PRESENA DE 120Mm de KCl. (A) FREQUNCIA DE

0,01 Hz E (B) FREQUNCIA DE 10 Hz, TEMPERATURA DE 25 C ......... 113

FIGURA 21. MDULO ELSTICO (G), MDULO VISCOSO (G) EM

FUNO DA FREQUNCIA (A) FRAO M1 (10g/L) EM PRESENA

DE KCl 120 mM; (B) FRAO M3a (10g/L) EM PRESENA DE KCl 120mM. SENSOR C60/2C, DEFORMAO DE 1%, A 25C .......................... 114


FUNO DA TEMPERATURA ( AQUECIMENTO DE 5 - 85 C E

RESFRIAMENTO DE 85 - 5 C). (A) FRAO M1 (10 g/L) EM

PRESENA DE KCl 120 mM; (B) FRAO M3a (10 g/L) EM

PRESENA DE KCl 120mM. SENSOR C-60/2, EM FREQUNCIA DE 1

Hz E DEFORMAO DE 1% ....................................................................... 116

FIGURA 23. REPRESENTAO GRFICA DA REGIO

DECOMPORTAMENTO VISCOELSTICO LINEAR PARA O AMIDO DE

MILHO COMUM (CS) (25 g/L). (A) FREQUNCIA DE 0,01 Hz E (B)

FREQUNCIA DE 10 Hz, TEMPERATURA DE 25 C ................................. 119


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FIGURA 24. REPRESENTAO GRFICA DA REGIO DE

COMPORTAMENTO VISCOELSTICO LINEAR PARA O AMIDO DE

MILHO COM ALTOS TEORES DE AMILOSE (MS) (25 g/L). (A)

FREQUNCIA DE 0,01 Hz E (B) FREQUNCIA DE 10 Hz,

TEMPERATURA DE 25 C ........................................................................... 119

FIGURA 25. REPRESENTAO GRFICA DA REGIO DE

COMPORTAMENTO VISCOELSTICO LINEAR PARA O AMIDO DE

MILHO COM ALTOS TEORES DE AMILOPECTINA (WS) (25 g/L). (A)

FREQUNCIA DE 0,01 Hz E (B) FREQUNCIA DE 10 Hz,

TEMPERATURA DE 25 C .......................................................................... 120

FIGURA 26. REPRESENTAO GRFICA DA REGIO DECOMPORTAMENTO VISCOELSTICO LINEAR PARA O AMIDO DE

CAR (YS) (25 g/L). (A) FREQUNCIA DE 0,01 Hz E (B) FREQUNCIA

DE 10 Hz, TEMPERATURA DE 25 C ......................................................... 120

FIGURA 27.REPRESENTAO GRFICA DA REGIO DE

COMPORTAMENTO VISCOELSTICO LINEAR PARA A MISTURA

AMIDO DE CAR (20 g/L) -CAR (5 g/L). (A) FREQUNCIA DE 0,01

Hz E (B) FREQUNCIA DE 10 Hz, TEMPERATURA DE25 C ............................................................................................................. 121


FUNO DA FREQUNCIA PARA (A) CS (25 g/L) E (B) MISTURA -

CAR (5 g/L)-CS (20 g/L), SENSOR , pp35/Ti, DEFORMAO DE 1%, A

25 C ............................................................................................................. 122


FUNO DA FREQUNCIA PARA (A) MS (25 g/L) E (B) MISTURA -CAR (5 g/L)-MS (20 g/L), SENSOR pp35/Ti, DEFORMAO DE 1%, A

25 C ............................................................................................................. 122


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FUNO DA FREQUNCIA PARA (A) WS (25g/L) E (B) MISTURA -

CAR (5 g/L)-WS (20 g/L), SENSOR pp35/Ti, DEFORMAO DE 1%, A

25 C ............................................................................................................. 123


FUNO DA FREQUNCIA PARA (A) YS (25 g/L) E (B) MISTURA -

CAR (5 g/L)-YS (20 g/L), SENSOR C60/2oTi, DEFORMAO DE 1%, A

25 C ............................................................................................................. 124

FIGURA 32. GRFICO DE Tan EM FUNO DA FREQUENCIA PARA

(A) YS (25 g/L) e (B) MISTURA -CAR (5 g/L) YS (20 g/L) ...................... 125


FUNO DA TEMPERATURA PARA (A) MS (25 g/L) E (B) MISTURA -

CAR (5 g/L) MS (20 g/L). SENSOR pp35/Ti, FREQUNCIA DE 1 Hz E

DEFORMAO DE 1%. ( AQUECIMENTO DE 5-85 C E

RESFRIAMENTO DE 85-5 C) ..................................................................... 126


FUNO DA TEMPERATURA PARA (A) CS (25 g/L) E (B) -CAR (5 g/L)

CS (20 g/L). SENSOR pp35/Ti, FREQUNCIA DE 1 Hz E

DEFORMAO DE 1%. ( AQUECIMENTO DE 5-85 C E

RESFRIAMENTO DE 85-5 C) ..................................................................... 127


FUNO DA TEMPERATURA PARA (A) WS (25 g/L) E (B) MISTURA -

CAR (5g/L) WS (20 g/L). SENSOR pp35/Ti, FREQUNCIA DE 1 Hz E

DEFORMAO DE 1%. ( AQUECIMENTO DE 5-85C E

RESFRIAMENTO DE 85-5C) ...................................................................... 128


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FUNO DA TEMPERATURA PARA (A) YS (25 g/L) E (B) MISTURA -

CAR (5 g/L) YS (20 g/L). SENSOR C60/2oTi, EM FREQUNCIA DE 1

Hz E DEFORMAO DE 1%. ( AQUECIMENTO DE 5-85 C E

RESFRIAMENTO DE 85-5C) ...................................................................... 130


FUNO DA FREQUNCIA PARA (A) MISTURA -CAR (5 g.L1) YS

(20 g.L1), -CAR NO AUTOCLAVADA E (B) MISTURA -CAR (5 g.L1)

YS (20 g.L1), -CAR AUTOCLAVADA SEPARADO. SENSOR pp35/Ti,

DEFORMAO DE 1%, A 25 C ................................................................. 133


FUNO DA TEMPERATURA PARA (A) MISTURA -CAR (5 g/L) YS

(20 g/L), -CAR NO AUTOCLAVADA E (B) MISTURA -CAR (5 g/L)

YS (20 g/L), -CAR AUTOCLAVADA SEPARADO. SENSOR pp35/Ti,

DEFORMAO DE 1%, A 25C .................................................................. 134

FIGURA 39. SISTEMAS PR-AQUECIDOS A 85C. MDULO

ELSTICO (G), MDULO VISCOSO (G) EM FUNO DA

FREQUNCIA PARA (A) YS (25 g/L) E (B) MISTURA -CAR (5 g/L) YS

(20 g/L) COM PR-AQUECIMENTO. SENSOR pp35/Ti, DEFORMAO

DE 1%, A 25 C ............................................................................................ 135

FIGURA 40. SISTEMAS PR-AQUECIDOS A 85C. MDULO

ELSTICO (G), MDULO VISCOSO (G) EM FUNO DA

TEMPERATURA PARA (A) YS (25 g/L) E (B) MISTURA -CAR (5 g/L)

YS (20 g/L) COM PR-AQUECIMENTO. SENSOR pp35/Ti, EM

FREQUNCIA DE 1 Hz E DEFORMAO DE 1%. (AQUECIMENTO

DE 5-85 C E RESFRIAMENTO DE 85-5 C) .............................................. 137


18/226

FIGURA 41. VISCOSIDADE DINMICA DAS AMOSTRAS DE (A)

MISTURA -CAR-YS, SEM PR-AQUECIMENTO (B) MISTURA -CAR-

YS, PR-AQUECIDA (C) YS, SEM PR-AQUECIMENTO E (D) YS, PR-

AQUECIDO. SENSOR pp 35.Ti, EM FREQUNCIA DE 1 Hz E

DEFORMAO DE 1% ................................................................................ 138

FIGURA 42. COX-MERZ DO (A) YS (25 g/L) E (B) -CAR (5 g/L) YS (20

g/L) () VISCOSIDADE COMPLEXA, () VISCOSIDADE APARENTE .... 139


FUNO DA FREQUNCIA PARA MISTURA -CAR (5 g.L1) YS (20

g.L1) SEM PR-AQUECIMENTO (A) SEM SAL (KCl 120 mM) (B) COM

SAL (KCl 120 mM) SENSOR pp35/Ti, DEFORMAO DE 1%, A 25 C ... 141

FIGURA 44. GRFICO DE Tan EM FUNO DA FREQUNCIA PARA

(A) MISTURA -CAR (5 g/L) YS (20 g/L), (A) SEM SAL, (B) COM SAL

(KCl 120mM) ................................................................................................ 141


FUNO DA TEMPERATURA PARA -CAR (5 g.L1) YS (20 g.L1) SEM

PR-AQUECIMENTO (A) SEM SAL (KCl 120 mM) (B) COM SAL (KCl

120 mM) SENSOR pp35/Ti, DEFORMAO DE 1%, A 25 C ................... 142FIGURA 46. MDULO ELSTICO (G), MDULO VISCOSO (G) EM

FUNO DA FREQUNCIA PARA -CAR (5 g.L1) YS (20 g.L1) COM

PR-AQUECIMENTO (A) SEM SAL (KCl 120 mM) (B) COM SAL (KCl

120 mM) SENSOR pp35/Ti, DEFORMAO DE 1%, A 25 C ................... 143


FUNO DA TEMPERATURA PARA A MISTURA -CAR (5 g.L1) YS

(20 g.L1

) COM PR-AQUECIMENTO (A) SEM SAL, (B) COM SAL (KCl120 mM) SENSOR pp35/Ti, DEFORMAO DE 1%, A 25 C ................... 144


19/226

FIGURA 48. FLUXOGRAMA (A) EXTRAO; (B) FRACIONAMENTO

COM KCl E (C) PURIFICAO POR CROMATOGRAFIA DE TROCA

INICA DAS GALACTANAS DE G. griffithisiae ....................................... 147

FIGURA 49. (A) ESTRUTURA DA MNIMA SEQNCIA DE LIGAO

DO HEPARAN SULFATO. (B) MNIMA ESTRUTURA DE LIGAO DA

AGARANA DE A. spicifera ......................................................................... 153


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LISTA DE TABELAS

TABELA 1. CLASSIFICAO DAS CARRAGENANAS DE ACORDO

COM ESTRUTURAS IDEAIS DE UNIDADES A E B ................................... 6

TABELA 2. PROPRIEDADES IMPORTANTES E APLICAES DAS

AGARANAS .................................................................................................. 24

TABELA 3. APLICAO, FUNO E CONCENTRAO DAS

CARRAGENANAS EM DIFERENTES PREPARAES ............................ 26

TABELA 4. ALGAS, LOCALIZAO E COMPOSIO EM

CARRAGENANAS ....................................................................................... 31

TABELA 5. PROCESSAMENTO DE CARRAGENANAS. CAPACIDADE

EM TONELADAS, DADOS DE 2001 ............................................................ 33TABELA 6. SOLUBILIDADE E CAPACIDADE DE GELEIFICAO DE

DIFERENTES CARRAGENANAS ................................................................ 36

TABELA 7. ATIVIDADE ANTIVIRAL DE POLISSACARDEOS

SULFATADOS OBTIDOS DE ALGAS VERMELHAS ................................. 53

TABELA 8. RENDIMENTO E ANLISE QUMICA DAS FRAES

BRUTAS EXTRADAS DA ALGA VERMELHA Meristiella gelidium ......... 79

TABELA 9. COMPOSIO MONOSSACARDICA DAS FRAESBRUTAS OBTIDAS DA ALGA VERMELHA Meristiella gelidium ............. 80

TABELA 10. FAIXA DE FRACIONAMENTO, RENDIMENTO E

ANLISES QUMICAS DAS SUBFRAES DE M1, M2 E M3 OBTIDAS

APS FRACIONAMENTO COM KCl .......................................................... 87

TABELA 11. COMPOSIO MONOSSACARDICA DAS SUBFRAES

OBTIDAS APS FRACIONAMENTO COM KCl E TRATAMENTO

ALCALINO .................................................................................................... 91

TABELA 12. ASSINALAMENTOS DAS PRINCIPAIS DADES

PRESENTES NAS FRAES M1a, M2b e M3a OBTIDAS ATRAVS

FRACIONAMENTO COM KCl DE M. gelidium .......................................... 92


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TABELA 13. ANLISES DE METILAO DAS FRAES M1a E M3a

DE M. gelidium ............................................................................................ 95

TABELA 14. RENDIMENTO E COMPOSIO QUMICA DAS FRAES

OBTIDAS DA COLUNA DE TROCA INICA DEAE-SEPHACEL A

PARTIR DA FRAO M3S .......................................................................... 98

TABELA 15. COMPOSIO MONOSSACARDICA DAS FRAES

OBTIDAS POR CROMATOGRAFIA DE TROCA-INICA DEAE-

SEPHACEL E DAS FRAES DESSULFATADAS M3S-3D E M3S-4D .... 99

TABELA 16. ANLISE DE METILAO DAS FRAES M3S-3 E

M3S-D ........................................................................................................... 101

TABELA 17. ANLISE DE METILAO DA FRAO M3S-4 .................. 106TABELA 18. ASSINALAMENTOS QUMICOS DE RMN DE 13C

OBSERVADOS NA FRAO M3S-4D de M. gelidium .............................. 109

TABELA 19. COMPOSIO QUMICA (g%) DAS AMOSTRAS DE

AMIDO .......................................................................................................... 118

TABELA 20. ATIVIDADE ANTI-HSV-1 E ENSAIO CITOTXICO DE

GALACTANAS ISOLADAS DE G. griffithsiae ........................................... 150

TABELA 21. ATIVIDADE ANTI-HSV-1 E HSV-2 DE GALACTANAS

ISOLADAS DE G. griffithsiae ..................................................................... 154

TABELA 22. INFLUNCIA DOS DIFERENTES PERIODOS DE

TRATAMENTO NA ATIVIDADE DAS GALACTANAS DE G. griffithsiae

CONTRA HSV-1 ........................................................................................... 155

TABELA 23. ESPECTRO DE ATIVIDADE ANTI-DENGUE DA

GALACTANA G3d EM CLULAS VERO .................................................... 157

TABELA 24. ATIVIDADE ANTI-DENGUE DA GALACTANA G3d EM

CLULAS VERO, HEPG2, PH E C6/36 HT ................................................. 158

TABELA 25. ATIVIDADE ANTIVIRAL CONTRA VRUS HERPES

SIMPLEX E VRUS DA DENGUE DAS FRAES DE M. gelidium .......... 161


22/226

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

13C carbono 13

GLC cromatografia lquida-gasosaGC-MS cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa

D2O gua deuterada

DEAE dietilaminoetil

DMSO dimetil sulfxido

FT-IRespectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier

HPSEC- MALLS cromatografia de excluso estrica de alta presso (HPSEC)

acoplada a detector de ndice de refrao diferencial e espalhamento de luz em

multingulos (MALLS)

Hzhertz

ppm partes por milho

RMN ressonncia magntica nuclear

TFA cido trifluoractico

Galp unidade de galactose na forma piranosdica

NaNO2 nitrito de sdio

NaNO3 nitrato de sdio

NaN3 azida de sdio

G modulo elstico

G modulo viscoso

Tan relao G/G

mPa mili pascal

HS heparan sulfato

PFU unidades formadoras de placasCC50 concentrao citotxica, ou concentrao necessria para reduzir em 50%

a viabilidade das clulas Vero aps 48 horas de incubao com cada frao.

IC50 concentrao inibitria, ou concentrao que inibe em 50% o nmero de

placas em clulas Vero

SI - ndice de seletividade ou CC50/IC50


23/226

VC50 concentrao virucida, ou concentrao necessria para inativar os vrus

em 50%.

p.i ps infeco

MM meio de manuteno

MEM meio essencial de Eagle

HPLC cromatografia lquido-gasosa

DEAE dietilaminoetil

HPSEC-MALLS cromatografia de excluso estrica de alta presso (hpsec)

acoplada a detector de ndice de refrao diferencial e espalhamento de luz em

multingulos (malls)

M extrato polissacardico obtido por extrao aquosa da alga Meristiela gellidum

M1 frao obtida a partir da primeira extrao aquosa a 25C

M2 frao obtida a partir da segunda extrao aquosa a 25C

M3 frao obtida a partir da primeira extrao aquosa a 100C

M4 frao obtida a partir da segunda extrao aquosa a 100C

M5 frao obtida a partir da terceira extrao aquosa a 100C

M1a frao precipitada entre 1,4 1,5 M de KCl obtida a partir de M1M1a-T frao M1a aps tratamento alcalino

M2a frao precipitada entre 0,1 0,2 M de KCl obtida a partir de M2

M2b frao precipitada entre 1,0 1,2 M de KCl obtida a partir de M2

M3a frao precipitada entre 0,75 1,0 M de KCl obtida a partir de M3

M3a-T frao M3a aps tratamento alcalino

M1S frao solvel em KCl 2,0 M obtida da frao M1



M3S-1 frao eluda com gua mediante cromatografia em DEAE-Sephacel da

frao M3S

M3S-2 frao eluda com NaCl 0,4 M mediante cromatografia em DEAE-

Sephacel frao M3S


24/226


Sephacel frao M3S


Sephacel frao M3S


Sephacel frao M3S


Sephacel frao M3S

G extrato polissacardico obtido por extrao aquosa da alga Gymnogongrus

griffithsiae

G1 frao obtida a partir da primeira extrao aquosa a 25CG2 frao obtida a partir da segunda extrao aquosa a 25C

G3 frao obtida a partir da primeira extrao aquosa a 100C

G3a frao precipitada entre 0,0 -0,1 M de KCl obtida a partir de G3

G3b frao precipitada entre 0,2 0,3 M de KCl obtida a partir de G3

G3c frao precipitada entre 0,75 1,0 M de KCl obtida a partir de G3

G3d frao precipitada entre 1,0 1,2 M de KCl obtida a partir de G3

G3S frao solvel em KCl 2,0 M obtida a partir de G3G3S-1 frao eluda com gua mediante cromatografia em DEAE-Sephacel da

frao G3S

G3S-2 frao eluda com NaCl 0,25 M mediante cromatografia em DEAE-

Sephacel da frao G3S



G3S-4 frao eluda com NaCl 0,75M mediante cromatografia em DEAE-







25/226



YS amido de Car

MS amido de milho com altos teores de amilose

CS amido de milho comum

WS amido de milho com altos teores de amilopectina

-CAR iota-carragenana (extrato bruto M1)


26/226

RESUMO

Da alga vermelha Meristiella gelidium (Solieriaceae, Gigartinales) foramobtidas as carragenanas homogneas M1a (Mw = 425.600 g/mol), M2b (Mw =

950.800 g/mol) e M3a (Mw = 956.700 g/mol) por extrao aquosa a 25oC e a100oC e fracionamento com KCl. Essas carragenanas sulfatadas (24,0; 25,0;29,0%, respectivamente) so constitudas majoritariamente por unidadesdissacardicas repetitivas de iota-carragenana (-D-galactose 4-O-sulfato e 3,6-anidro--D-galactose 2-sulfato), correspondendo a 84,0% do polmero. Dades dekappa- (-D-galactose 4-O-sulfato e 3,6-anidro--D-galactose) e nu-carragenana(-D-galactose 4-O-sulfato e -D-galactose 2,6-sulfato), esto presentes em baixapercentagem 4,0 % e 6,0-8,0%, respectivamente. Alm das carragenanasmajoritrias essa espcie biossintetiza agaranas com caractersticas estruturaissemelhantes, em relao ao padro de sulfatao. A agarana M3S-3 (Mw =187.000 g/mol) possui 40,0% das unidades A 2-O-sulfatadas e as unidades B so

~75,0% substitudas por grupos sulfato no C-3, as quais esto em partesubstitudas em C-2 por unidades simples de xilose (~30,0%) ou grupos sulfato(~18,0%). Na agarana M3S-4 (Mw = 61.430 g/mol) as unidades A, ~60,0% sorepresentadas por -D-galactose 2-sulfato e ~75,0% das unidades B por -L-galactose 3-sulfato. Nessa galactana as unidades simples de xilose glicosilam o C-6 de parte das unidades A. A iota-carragenana presente no extrato bruto M1(1,0%, 120 mM de KCl), forma gel sem histerese com temperatura de transiofita-hlice acima de 45 C, caracterstico dos gis de iota-carragenana. Asmisturas formadas pela iota-carragenana (0,5% p/p) e amidos (20,0% p/p) quando,autoclavadas juntas sem pr-aquecimento e sem sal, originam soluesviscoelsticas com os amidos de milho comum, amido de milho rico em amilose eamido de milho rico em amilopectina. De maneira distinta a iota-carragenana como amido de car forma um gel forte. Efeito sinrgico demonstrado pela maiordiferena entre os mdulos elstico (G) e viscoso (G) ocorre em funo datemperatura, entre 45 85C, nas pastas iota-carragenana e amido de milhocomum, amido de milho rico em amilose e amido de milho rico em amilopectina.Na pasta formada com o amido de milho rico em amilose, a iota-carragenanaevitou a histerese trmica. A presena do ficocolide no alterou o comportamentodo amido de milho comum e na pasta formada com o amido de car a histereseno foi evitada. O processo de autoclavao dos polmeros juntos importante noque diz respeito solubilizao do amido, alterando a formao de gel. A pastapr-aquecida (85C) e sem sal, formada pela iota-carragenana e amido de carorigina um gel mais forte, porm com intensa histerese trmica. A presena de sal(KCl 120 mM) no sistema, estabiliza as hlices da carragenana formando umarede mais estvel e um gel sem histerese trmica. O sal evita a histerese,enquanto que o pr-aquecimento permite a formao de um gel mais forte, pormcom intensa histerese trmica. Os extratos brutos M1 e M3 e a carragenana M3ade M. gelidium, assim como as fraes obtidas de Gymnogongrus griffithsiae(Phyllophoraceae, Gigartinales) (G3, G3d, G3S, G3S-1, G3S-3, G3S-4, G3S-5 eG3S-6) possuem atividade antiviral contra o vrus da herpes simplex e/ou o vrus


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da dengue. Esses polissacardeos apresentam atividade antiherptica frente adiferentes cepas de HSV-1 e HSV-2, so desprovidas de citotoxicidade contraclulas Vero e atuam inibindo a etapa de adsoro do vrus clula hospedeira. Oextrato bruto G3 e a carragenana G3d de G. griffithsiae apresentam potenteatividade antiherptica (IC50 ~1 g/ml). A carragenana M3a de M. gelidium

apresentou maior atividade contra HSV-2 e DENV-2 (frente clulas Vero) do quea carragenana G3d de G. griffithsiae. As galactanas M1, M3 e M3a apresentampotente atividade contra HSV-2 (IC50 0,04 0,06 g/mL) e so desprovidas deatividade citotxica (CC50> 1000 g/mL). A carragenana M3a o composto queapresenta maior IS relatado na literatura (IS 25000). Assim as galactanas de M.gelidum so promissores compostos antiherpticos e apresentam propriedadesreolgicas com potencial utilizao industrial.


28/226

ABSTRACT

The carrageenans M1a (Mw = 425,600), M2b (Mw = 950,800) e M3a (Mw =956,700) were obtained from the red seaweed Meristiella gelidium (Solieriaceae,

Gigartinales) by successive aqueous extraction at 25oC and 100oC followed by KClprecipitation. These sulfated carrageenans (24.0; 25.0; 29.0%, respectively) aremainly constituted (84,0%) by repeating units of iota-carrageenan (-D-galactose 4-O-sulfate and 3,6-anidro--D-galactose 2-sulfate). Kappa- (-D-galactose 4-O-sulfate and 3,6-anidro--D-galactose) and nu-carrageenan (-D-galactose 4-O-sulfate and -D-galactose 2,6-sulfate) are present in low amounts of 4.0 % and 6.0-8.0%, respectively. In addition to carrageenans, this species biosynthesizesagarans, with similar structural characteristics of sulfatation distribution. The unitsA (3-O-substituted -D-galactose) in the agaran M3S-3 (Mw = 187.000) are 40.0%2-O-sulfated and the units B (4-O-substituted -L-galactose) are ~75.0% 3-O-sulfated. The B units are ~30.0% substituted at C-2 by xylose or sulfate (~18.0%).In the agaran M3S-4 (Mw = 61.430) the A units are ~60.0% -D-galactose 2-sulfateand ~75.0% of its B units are -L-galactose 3-sulfato. A part of the A units are,substituted by xylose at C-6. The gel formed by iota-carrageenan present in thecrude extract M1 (1.0%, 120 mM of KCl), did not showed hysteresis and itsconformational coil-helix transition is upper 45 C, characteristic of an iota-carrageenanss gel. Iota-carrageenan (0.5% w/w) and starch (2.0% w/w) mixtures,when autoclaved together without pre-heating and salt, gave rase to viscoelasticsolutions in systems with common corn starch, corn starch rich in amylose, andwaxy corn starch components. In contrast the iota-carrageenan with yam starchformed a strong gel. In the range of temperature 45 85C, a strong interaction

between biopolymers was observed, reflected by a difference between the modulielastic (G) and viscous (G) in the mixtures with common corn starch, corn starchrich in amylose and waxy corn starch. In the paste formed by corn starch rich inamylose, did not occur thermal hysteresis. The rheological characteristics of thepaste formed with common corn starch were not modified by the presence of iota-carrageenan. A strong interaction between iota-carrageenan yam starch wasobserved when they were autoclaved together, as a gel was formed. When thissystem was pre-heated (85C) without salt a stronger gel was formed buthysteresis was present. In contrast, when salt (KCl 120 mM) was present, thecarrageenan helices were more stable and the water was retained. The salt in thesystem did not allow hysteresis and the pre-heating gave rase to a stronger gel,

but with intense thermal hysteresis. The crude extracts M1, M3 and thecarrageenan M3a from M. gelidium as with the fractions obtained fromGymnogongrus griffithsiae (Phyllophoraceae, Gigartinales) (G3, G3d, G3S, G3S-1,G3S-3, G3S-4, G3S-5 e G3S-6) had antiviral activity against herpes simplex anddengue viruses. These polysaccharides are effective against HSV-1 and HSV-2,were not cytotoxicy to Vero cells, and influence virion binding to the host cell. Thecrude extract G3 and the carrageenan G3d from G. griffithsiae had potent antiviralactivity (IC50~1 g/mL). The effectiveness of carrageenan M3a from M. gelidium


29/226

was greater against HSV-2 and DENV-2 (in Vero cells) than the correspondingcarrageenan G3d from G. griffithsiae. The galactans M1, M3 and M3a are the mostpotent polysaccharides against HSV-2 (IC50 0,04 0,06 g/mL), without anycytotoxicity (CC50> 1000 g/mL). The selectivity index of carrageenan M3a (IS =25.000) is the highest found in the literature. In this way, the galactans from M.

gelidium showed potential as antiherpectic compounds and had rheologicalproperties possible industrial utilization.


30/226

1. INTRODUO

1.1. ALGAS VERMELHAS

Entre as macroalgas, as algas vermelhas (Rhodophyta), representam o

grupo com maior diversidade de espcies (USOV, 1992) incluindo

aproximadamente 6.000 espcies, sendo 100 de gua doce (RAVEN et al., 2001).

Elas so comuns ao longo da costa brasileira, sendo mais abundantes e

diversificadas na costa nordeste do pas. Outras reas de alta biodiversidade so

encontradas nos costes rochosos desde o norte do estado do Esprito Santo at

a Ilha de Santa Catarina (SAITO; OLIVEIRA, 1990).

As algas pertencentes diviso Rhodophyta so, do ponto de vistaeconmico as mais exploradas, pois, biossintetizam uma grande variedade de

galactanas sulfatadas como principais componentes da matriz intercelular (USOV,

1998). Esses polissacardeos so utilizados em setores economicamente

importantes, como nas indstrias alimentcias e farmacuticas apresentando alto

potencial biotecnolgico, despertando interesse mundial, devido ao seu alto valor

econmico (DE RUITER; RUDOLPH, 1997).

Alm da importncia industrial as galactanas tm despertado interesses narea biomdica, pois so promissoras como compostos biologicamente ativos

desempenhando atividade antiviral (DUARTE et al., 2001, 2004; TALARICO et al.,

2004, 2005; DAMONTE et al., 1996; CCERES et al., 2000,) anticoagulante

(CARLUCCI et al.,1997; FARIAS et al., 2000), antitrombtica (SEN et al., 2002),

antiangiognica (SATORU et al., 2003) e antitumoral (FERNANDEZ et al.,1989;

ZHOU et al., 2004).

Segundo KLOAREG; QUATRANO (1988) os polissacardeos da matriz das

algas marinhas, esto correlacionados com a regulao osmtica ou inica,

adaptando-as ao ambiente marinho. Ainda com funo de osmorregulao, as

algas biossintetizam carboidratos de baixo peso molecular e/ou poliis

(KARSTEN; BARROW; KING, 1993).


31/226

2

Como polissacardeo de reserva elas sintetizam um polmero constitudo

por -D-glucose, denominado amido das flordeas, com ligaes glicosdicas do

tipo -(14) e pontos de ramificao no carbono-6 similar a amilopectina

(PAINTER, 1983), porm possui uma proporo maior de ramificaes

assemelhando-se ao glicognio animal.

A determinao estrutural das galactanas sulfatadas contribui para a

prospeco de novas aplicaes industriais e biolgicas alm de ser til como

ferramenta para posicionamento taxonmico das algas vermelhas.

1.2. GALACTANAS: ESTRUTURA GERAL

As galactanas sulfatadas de algas marinhas so polmeros lineares,constitudos por unidades de -galactopiranose substitudas glicosidicamente na

posio 3 (unidade A) e -galactopiranose substitudas glicosidicamente atravs

da posio 4 (unidade B) (PERCIVAL; McDOWELL, 1967). A unidade A sempre

pertence srie estereoqumica D e a estereoqumica da unidade B a base para

a classificao geral das galactanas, sendo classificadas como agaranas (srie L)

ou carragenanas (srie D) (PAINTER, 1983). Deste modo formam um arranjo

alternado entre as unidades A e B (AB)n.

[ (3)--D-galactopiranose - (14)--galactopiranose-(1) ]

unidade A unidade B

Uma caracterstica estrutural particular dos polissacardeos sintetizadospelas algas vermelhas a presena da unidade B total ou parcialmente ciclizada

na forma de 3,6-anidrogalactose. As galactanas sulfatadas que apresentam este

anidro-acar na sua estrutura, podem apresentar propriedades geleificantes ou

viscosantes (RENN, 1997) e so denominadas de ficocolides ou hidrocolides,

n


32/226

3

pela elevada capacidade que apresentam de formar gis em meios aquosos

(GLICKSMAN, 1987).

Estudos estruturais detalhados tm demonstrado que uma importante

caracterstica de vrios polissacardeos de algas vermelhas a presena de

grupos estruturais dissacardicas de carragenanas e agaranas na mesma

molcula. Esse tipo estrutural foi denominado de carrgar por CHOPIN; KERIN;

MAZEROLLE (1999) e posteriormente STORZ; CEREZO (2000) adotaram o termo

galactana DL-hbrida. Foi definido ento um terceiro grupo de polissacardeos,

onde as unidades de -galactose ou 3,6-anidro--galactose podem apresentar

tanto a configurao D (D ou DA) como L (L ou LA).

Essa estrutura alternante de unidades (13) -galactopiranose e (14)

-galactopiranose das galactanas, pode apresentar variaes estruturais como a

presena de grupos metil, ster sulfato, acetal de cido pirvico, cadeias laterais

de -D-xilopiranose, entre outros.

A unidade B, -galactopiranose, pode apresentar cadeias laterais de -D-

xilopiranose no C-3 e/ou no C-6, grupos metil, assim como grupos sulfato podem

estar presentes nos C-2, C-3 e/ou C-6 ou ainda esta unidade pode apresentar-se

total ou parcialmente ciclizada como 3,6-anidro--galactopiranose, com ou sem

grupo metil ou sulfato no C-2 (PAINTER, 1983).Por sua vez a unidade A, -galactopiranose pode apresentar acetal de

cido pirvico nas posies C-4 e C-6 e grupos metil, sulfato assim como cadeias

laterais de xilose em C-2, C-4 e C-6.

Esta variabilidade estrutural das galactanas biossintetizadas pelas algas

vermelhas normalmente explicada em decorrncia de modificaes incompletas

ou irregulares que ocorrem a partir do esqueleto das unidades de galactose pr-

formado. A biossntese das galactanas de algas vermelhas envolveria osseguintes passos: i)formao da cadeia regular de unidades de galactose a partir

de aucares-UDP (GOULARD et al., 1999); ii) sulfatao de vrios grupos

hidroxilas e/ou substituio com outros grupos constituintes (xilose, cido pirvico,

metil) e por fim iii)eliminao enzimtica dos grupos sulfato do C-6 de algumas


33/226

4

unidades de 4)- -galactose 6-sulfato-(1, originando as unidades 4)- 3,6-

anidro--galactose (1e seu derivado sulfatado em C-2 (REES, 1961a e b).

Desse modo, as galactanas sulfatadas apresentam ampla diversidade

estrutural dependendo da espcie, e em decorrncia, diferentes propriedades

fsico-qumicas e biolgicas.

1.2.1. CARRAGENANAS

As carragenanas so conhecidas desde o sculo XVIII quando eram

utilizadas pela populao de Carrageen (cidade costeira da Irlanda), como

agentes espessantes e geleificante em alimentos caseiros. Estes polissacardeos

normalmente apresentam mais grupos sulfato que as agaranas, e a capacidade deformar gel depende, da interao de determinados ctions, especialmente K+/Ca2+

e a presena das unidades 3,6-anidro--D-galactopiranose na dade repetitiva.

Basicamente, as carragenanas apresentam uma estrutura linear repetitiva

unidade A (-D-galactopiranose) e unidade B (-D-galactopiranose) (Figura 1).

FIGURA 1. ESTRUTURA BSICA REPETITIVA DE CARRAGENANAS, (UNIDADES D-

ALTERNANTES).

R = H, SO-3ou CH3

O

OR

OR

OO

OR

O

OR

OR

OR

n


34/226

5

As carragenanas so agrupadas em quatro famlias de acordo com a

posio dos grupos sulfato na unidade -D-galactose, sendo nominadas com

letras do alfabeto grego.

I - Famlia Kappa (): grupos sulfato em C-4.

II - Famlia Lambda (): grupos sulfato em C-2.

III - Famlia mega (): grupos sulfato em C-6.

IV - Famlia Beta (): no possui grupos sulfato na unidade A.

Na Tabela 1 est demonstrada a classificao das carragenanas baseada

nas dades ideais repetitivas. importante ressaltar que as algas sintetizam

polissacardeos com uma ou mais dades repetitivas na mesma molcula em

diferentes propores, as quais recebem a denominao de carragenanas

hbridas (carragenana kappa / iota).

Na famlia Kappa esto presentes as carragenanas com maior valor

econmico, as geleificantes kappa e iota e a no geleificante lambda. A diferena

na capacidade de geleificao das carragenanas foi explorada como um processo

de separao das mesmas. O primeiro exemplo de separao de carragenanas

estruturalmente diferentes foi realizado a partir da alga vermelha Chondrus crispus

com base na capacidade diferencial de geleificao em soluo de cloreto depotssio, a partir de exemplares que pertenciam a diferentes estados reprodutivos

(McCANDLESS et al., 1973).

Observou-se que as plantas esporofticas das algas do gnero Chondrus

produzem lambda-carragenana, enquanto plantas gametofticas (ver item 1.3)

produzem carragenanas hbridas kappa/iota (McCANDLESS et al., 1982), o que

demonstra que as variaes quanto ao tipo de estrutura no ocorrem somente

entre diferentes espcies, mas que de acordo com os estgios de vida, uma

mesma espcie pode produzir diferentes tipos de carragenanas.

Variaes estruturais foram observadas, como as carragenanas com alto

teor de piruvatao (43-49%) sintetizadas pelas algas do gnero Callophycus

(CHIOVITTI et al.,1997) e carragenanas altamente metiladas (6-O-metil--D-


35/226

6

galactose) biossintetizadas por espcies do gnero Rhabdonia (17-31%)

(CHIOVITTI et al., 1996) e do gnero Claviclonium (45%) (CHIOVITTI et al., 2004).

TABELA 1. CLASSIFICAO DAS CARRAGENANAS DE ACORDO COM

ESTRUTURAS IDEAIS DE UNIDADES A E B.

Famlia (3)--D-Galp (14) --D-Galp -(1)

(Unidade A) ( Unidade B)

Nomenclatura de

KNUTSEN et al. (1994)

KAPPA

(kappa) 4-sulfato3,6-anidrogalactose G4S DA

(iota) 4-sulfato3,6-anidrogalactose 2-sulfato G4S DA2S

(mu) 4-sulfato6-sulfato G4S D6S

(nu) 4-sulfato2,6-dissulfato G4S D2,6S

LAMBDA

(lambda) 2-sulfato2,6-dissulfato G2S D2,6S

(xi) 2-sulfato 2-sulfato G2S D2S

(pi) 2-sulfato; 4,6-O-(1-carboxietilideno)2-sulfato GP,2S D2S

(theta) 2-sulfato3,6-anidrogalactose 2-sulfato* G2S DA2S

OMEGA

(omega) 6-sulfato3,6-anidrogalactose G6S DA

(psi) 6-sulfato6-sulfato G6S D6S

BETA

(beta) no-sulfatada 3,6-anidrogalactose G DA

(alpha) no sulfatada3,6-anidrogalactose 2-sulfato G DA2S(gamma) no sulfatada6-sulfato G D6S

(delta) no sulfatada2,6-dissulfato G D2,6S

*A -carragenana no biossintetizada naturalmente pelas algas, para sua obteno necessrio o

tratamento alcalino da -carragenana.Tabela modificada de: KNUTSEN et al. (1994).


36/226

7

1.2.2. AGARANAS

As galactanas deste grupo apresentam a estrutura repetitiva formada por

unidades de (13)--D-Galp e (14)--L-Galp, portanto diferindo das

carragenanas na estereoqumica da unidade B. Esta unidade pode ainda estar

total ou parcialmente ciclizada na forma de 3,6-anidro--L-galactopiranose

(PAINTER, 1983) (Figura 2).

FIGURA 2. ESTRUTURA BSICA REPETITIVA DE AGARANAS (UNIDADES D- E L-

ALTERNANTES).

No existe uma classificao to detalhada para as agaranas como a das

carragenanas. ARAKI em 1966 realizou os primeiros estudos estruturais de

agaranas analisando os polissacardeos de Gelidium amansii (Gelidiales) e

observou duas fraes distintas com base na solubilidade em clorofrmio. A frao

solvel foi denominada de agarose e apresenta a estrutura ideal repetitiva ([3)

-D-galactose(14) -L-3,6-anidrogalactose (1]) e agaropectina, a frao

insolvel, apresentou uma estrutura mais complexa contendo substituintes como

grupos sulfato e cido pirvico.

A partir da agarose neutra, as unidades -L-3,6-anidrogalactose podem

estar como unidades precursoras -L-galactose 6-sulfato, estrutura que foi

denominada de porfinara([3) -D-galactose (14) -L-galactose 6-sulfato (1])

O

OH

OH

OO

OR'O

OR'

OH

R'O

n


37/226

8

por ter sido isolada pela primeira vez de algas do gnero Porphyra(REES, 1961b)

e posteriormente em algas do gnero Bangia(ASPINALL, 1970).

Na frao que foi denominada agaropectina esto presentes agaranas com

grupos sulfato em vrias posies com percentagens que variam de 3% a 10%,

grupos metil nas unidades -D-galactose 4-metil, -L-galactose 4-metil e -L-

galactose 2-metil e pequenas quantidades de cido pirvico na unidade -D-

galactose (DUCKWORTH e YAPHE, 1970).

A variabilidade estrutural nas agaranas est relacionada, como nas

carragenanas, com presena dos grupos sulfato, metil e cido pirvico. As

unidades -D-galactose podem estar piruvatadas, metiladas (6-O-metil-L-

galactose) e apresentar cadeias laterais de 4-O-metil--L-galactose, -L-galactose

e ou -D-xilose (STORTZ e CEREZO 2000).As agaranas so principalmente biossintetizadas pelas algas vermelhas

pertencentes s ordens Gelidiales e Gracilariales, sendo que agaranas com

diversas modificaes estruturais podem ainda ser sintetizadas por algas das

ordens Bangiales, Ceramiales, Corallinales e Nemaliales (MILLER 1997; CHOPIN

et al., 1999; STORZ e CEREZO, 2000).

As agaranas so amplamente utilizadas nas indstrias farmacuticas,

alimentcias, assim como meio de cultura para anlise microbiolgica. A agarosepossui alto valor econmico devido sua elevada capacidade de geleificao,

porm a presena de substituintes e de unidades precursoras diminui este poder

geleificante (FALSHAW et al., 1998).

1.2.3. GALACTANAS DL-HBRIDAS

Este terceiro grupo de galactanas no apresenta uma estrutura regular,

mas sim caractersticas de carragenanas e de agaranas na mesma molcula. Com

o uso de tcnicas de fracionamento e caracterizao mais apuradas este grupo de

galactanas est sendo encontrado em algas pertencentes a diferentes ordens,

entre elas em maior proporo nas ordens Rhodymeniales, Plocamiales e

Halymeniales (STORTZ e CEREZO, 2000). CHOPIN et al. em 1999 denominaram


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este tipo estrutural de carrgar e posteriormente STORTZ e CEREZO (2000)

adotaram o termo galactana DL-hbrida, para diferenci-las do termo hbrido

utilizado para as carragenanas.

[3)--D-galactopiranose-(14)--D/L-galactopiranose-(1]n

unidade A unidade B

Ainda no est claro se estas estruturas se encontram na forma de blocos

na mesma molcula ou se esto em um mesmo sistema, porm em molculas

separadas. At o momento a definio das galactanas DL-hbridas realizada de

acordo com a proporo da configurao presente na unidade B, se maior

configurao L-, denomina-se: DL-hbrida com predomnio da estrutura de

agarana, e se predomina configurao D-: DL-hbrida com predomnio da estrutura

de carragenana.

Uma ferramenta estrutural muito importante na caracterizao dessas

galactanas a determinao das unidades enantiomricas, que em conjunto com

tcnicas de fracionamento mais minuciosas tm permitido o isolamento e acaracterizao desses polissacardeos em extratos de algas que anteriormente

eram consideradas somente produtoras de carragenanas (carragenfitas)

(CIANCIA et al., 1993; STORTZ et al., 1997), por exemplo, ordem Gigartinales, ou

produtoras de agaranas (agarfitas) (TAKANO et al., 1999; TAKANO et al., 2003)

como foi observado em espcies pertencentes ordem Ceramiales.

Avanos nas pesquisas voltadas determinao estrutural de

polissacardeos provavelmente levar caracterizao de novas galactanas DL-

hbridas. Estas descobertas podem ter um impacto quimiotaxmico, visto que a

reanlise de polissacardeos de algas, anteriormente consideradas produtoras

somente de carragenanas ou agaranas, so na realidade produtoras de mais de

um tipo de galactana (STORTZ e CEREZO, 2000).


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1.3. CICLO DE VIDA E REPRODUO DAS ALGAS VERMELHAS

O tipo de ciclo de vida, em conjunto com outros caracteres, tambm uma

ferramenta importante utilizada na classificao das algas vermelhas. A

reproduo das Rhodophyta ocorre pela fuso de um pequeno gameta masculino,

denominado espermcio, com o gameta feminino denominado carpognio. O

carpognio se desenvolve no interior do oognio (gametngio feminino) e os

espermcios so clulas esfricas, sem parede celular que se desenvolvem

dentro dos espermatngios (gametngio masculino) (MASUDAet al., 1996).

Na maioria das algas vermelhas, o carpognio se forma no pice de um

conjunto de clulas especializadas denominadas de ramo carpogonial. O nmero

de clulas de cada ramo, a presena ou no de clulas acessrias e o nmero decarpognios por cada ramo carpogonial so caractersticas de cada grupo

taxonmico. Geralmente, cada espermatngio produz somente um espermcio

que liberado e levado pela gua passivamente at o carpognio, e como

resultado da fertilizao do carpognio, se desenvolve uma fase diplide, in situ,

sobre o gametfito feminino, denominada carposporfito (HOMMERSAND e

FREDERICQ, 1990).

O carposporfito quando maduro produz carpsporos, que so esporos de

origem mittica, os quais so liberados e, se em condies adequadas, germinam

e originam a outra fase diplide de vida livre, denominada tetrasporfito. Nessa

fase sero formados os tetrasporngios (que do origem a esporos por meiose)

nos quais se originam os tetrsporos. Ao ser liberado, o tetrsporo de natureza

haplide, quando encontra um habitat adequado, por divises mitticas originar

os gametfitos (masculino ou feminino), completando o ciclo de vida trifsico

caracterstico e nico das algas vermelhas (HOMMERSAND e FREDERICQ,

1990).

Baseando-se no ciclo de vida constitudo pelas fases gametfiticas

(haplide-n), carposporoftica (diplide-2n) e tetrasporoftica (diplide-2n), o tipo

Polysiphonia denominado quando tanto o gametfito quanto o tetrasporfito so

morfologicamente idnticos, tendo o ciclo de vida uma alternncia isomrfica. Em


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contraste quando h alternncia heteromrfica das geraes, o ciclo de vida

denominado,Bonnemaisonia(MASUDA et al., 1996).

As fases gametofticas, masculina e feminina se desenvolvem em plantas

independentes e macroscpicas na grande maioria das famlias pertencentes

ordem Gigartinales. No entanto o ciclo de vida trifsico das algas vermelhas pode

apresentar modificaes ou redues em algumas de suas fases.

Na famlia Phyllophoraceae, a literatura relata uma notvel diversidade no

tipo de ciclo de vida, como por exemplo, quando as algas no possuem

carposporfitos, mas sim tetrasporfitos, que so parasitados e se desenvolvem

sobre os gametfitos femininos. Este ciclo bifsico e se denomina

tetrasporoblstico, ou tipo Gymnogongrus griffitsiae, ou seja, em uma mesma

planta se desenvolve a fase gametoftica (masculina e feminina) e a fasetetrasporoftica. Algas pertencentes a esta famlia podem apresentam, alm do

tipo tetrasporoblstico, os outros dois tipos j citados Polysiphonia e

Bonnemaisonia e ainda o ciclo de vida direto no qual s esto presentes os

gametfitos femininos (KAPRAUM et al., 1993).

Em muitas famlias pertencentes ordem Gigartinales h produo de

diferentes polissacardeos de acordo com a fase do ciclo de vida que a alga se

encontra. Nas famlias Gigartinaceae e Phyllophoraceae, as algas na fase

gametoftica (n) produzem carragenanas da famlia kappa, enquanto que os

esporofitos (2n) biossintetizam carragenanas da famlialambda (McCANDLESS et

al., 1982).

1.4. ORDEM GIGARTINALES: VARIABILIDADE ESTRUTURAL DAS

GALACTANAS E SIGNIFICADO QUIMIOTAXONMICO

A estrutura qumica dos polissacardeos solveis em gua biossintetizados

pelas algas vermelhas at pouco tempo atrs era utilizada como base para

classificao das algas dentro da ordem Gigartinales. Um exemplo a afirmao

que as carragenfitas eram exclusivas desta ordem, assim como as agarfitas


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estavam compreendidas nas ordens Bangiales, Ceramiales, Gelidiales e

Gracilariales.

A ordem Gigartinales a mais numerosa dentro da diviso Rhodophyta e

com a criao das ordens Gracilariales (FREDERICQ e HOMMERSAND, 1989),

Plocamiales (SAUNDERS e KRAFT, 1996), Ahnfeltiales (MAGGS e PUESCHEL,

1989) e Halymeniales (SAUNDERS e KRAFT, 1996), aproximadamente 10

gneros e 172 espcies foram removidas da ordem Gigartinales, que atualmente

composta por 41 famlias, 100 gneros e 700 espcies (CHOPIN et al., 1999).

A necessidade destas alteraes taxonmicas e criaes de novas ordens

uma resposta no somente dos avanos nas anlises estruturais dos

polissacardeos biossintetizados pelas Rhodophyta, mas tambm das anlises

seqenciais do gene rbcL (subunidade maior da rubisco) (FRESHWATER et al.,1994) que demonstram que este um grupo heterogneo e polifiltico.

Em 1996, FREDERICQ et al. apresentaram a hiptese de relao

filogentica entre 57 espcies pertencentes a 37 famlias de algas vermelhas

produtoras de carragenanas, agaranas ou que apresentam ambas as estruturas,

dentro da ordem Gigartinales, baseado nas seqncias de rbcL.

De acordo com os trabalhos de CRAIGIE em 1990 e MILLER em 1997,

espera-se que as galactanas produzidas pelas algas da ordem Gigartinales sejam

carragenfitas, porm tem-se observado e destacado nesta ordem a presena de

algas produtoras de agaranas e galactanas DL-hbridas (USOV e KLOCHKOVA,

1992; CHOPIN et al., 1999; TAKANO et al.,1995; ESTEVEZ et al., 2001;

ESTEVEZ et al., 2004).

De acordo com STORTZ; CEREZO (2000) as famlias dentro da ordem

Gigartinales poderiam ser divididas em trs grupos: (i) famlias que apresentam

alternncia biossinttica de carragenanas (Gigartinaceae, Petrocilidaceae e

Phyllophoraceae), (ii) famlias que no apresentam uma caracterstica estrutural

dos seus biopolmeros de acordo com a fase do ciclo de vida da alga

(Sarcodiaceae, Solieriaceae, entre outras) e (iii) famlias pertencentes antiga

ordem Cryptonemiales (Tichocarpaceae, Endocladiaceae, Kallymenaceae e


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Dumontiaceae). As algas pertencentes s famlias Phyllophoraceae e Solieriaceae

sero discutidas em um item parte.

A presena de carragenanas com dades desviantes como, por exemplo,

ricas em grupos metil e com estruturas mais complexas um exemplo da

influncia dos polissacardeos biossintetizados pelas algas na classificao

taxonmica das mesmas. Essas variaes estruturais fizeram com que alguns

gneros pertencentes famlia Solieriaceae e Cystocloniaceae fossem agrupados

na famlia Areschougiaceae.

CHIOVITTI et al., em 1996 observaram que algas da famlia Solieriacea

(Rhabdonia coccinea e Rhabdonia verticillata) eram uma rica fonte de

polissacardeos de parede celular do tipo iota-carragenana altamente metilada, e

devido ao alto grau de grupos O-metil (31% e 17% respectivamente) estespolissacardeos foram considerados distintos dos demais da famlia Solieriaceae.

Dois anos depois CHIOVITTI et al. (1998b) analisando os polissacardeos

de trs espcies do gnero Erythroclonium (Solieriaceae) por anlise de

infravermelho, RMN de 13C e anlise de metilao constatou grande semelhana

estrutural dos seus polissacardeos constitudos por iota- e alfa-carragenana 6-O-

metiladas, podendo estar ainda substitudas por cido pirvico e as unidades B (-

D-galactopiranosil) presentes principalmente no substitudas ou em menorespropores 3-O-metiladas e com terminal glicosil.

Fazendo parte da famlia Cystocloniaceae (Gigartinales, Rhodophyta),

CHIOVITTI et al., (1998c) analisaram os polissacardeos biossintetizados pelas

algas dos gneros Austroclonium, Gloiophyllis, Erythronaema e Stictosporum.

Todas as espcies analisadas produziam tipicamente iota-carragenana com

exceo da alga do gnero Austroclonium que biossintetizava uma galactana

sulfatada contendo predominantemente estrutura repetitiva de iota- e alfa-

carragenanas 6-O-metiladas. A produo destas carragenanas se assemelha aos

polissacardeos sintetizados pelas algas Rhabdonia e Erythroclonium

(Solieriaceae), mas que tambm produzem carragenanas significativamente

diferentes de outros gneros dentro desta famlia.


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Em 2001 CHIOVITTI et al avaliaram as estruturas qumicas e as

implicaes filogenticas das carragenanas parcialmente metiladas,

biossintetizadas pelas algas do gnero Areschougia. As anlises estruturais

demonstraram que h predominncia de variaes sobre a estrutura repetitiva da

iota-carragenana, como a presena de 6-O-metil (G4S,6M-DA2S e G6M-DA2S),

cido pirvico (GP -DA2S) e ainda menores propores de grupos metil, sulfato

e/ou glicosil substituindo o C-3 das unidades -D-galactopiranose. Foi

demonstrado que essas galactanas sulfatadas so ricas em mono-O-metil

galactose, o que as assemelha com as algas dos gneros Rhabdonia,

Erythroclonium e Austroclonium, constituindo desse modo a famlia

Areschougiaceae.

Na famlia Sarcodiaceae, inicialmente foi demonstrado que algas do gneroSarcodia biossintetizam em ambos os estgios gametofticos e tetrasporofitico,

polissacardeos equivalentes lambda-carragenana (LIAO et al., 1993). Porm,

Em 2003, MILLER, realizou a anlise estrutural por RMN de 13C dos

polissacardeos de Sarcodia montagneana e Sarcodia flabellatae demonstrou que

as unidades -D-galactopiranosil esto principalmente substitudas por grupos

sulfato no C-2 e acetal de cido pirvico. As unidades 4-O-ligadas (-

galactopiranosil) esto quase exclusivamente na configurao L, sulfatadasprincipalmente no C-3 e C-2 e ainda esto presentes quantidades significativas

destas unidades sulfatadas nos carbonos 2, 3 e 6. Estes polissacardeos de

Sarcodiaapresentam muita similaridade com os polissacardeos biossintetizados

por algas do gnero Trematocarpus(MILLER, 2002).

As famlias pertencentes antiga ordem Cryptonemiales (Tichocarpaceae,

Endocladiaceae, Kallymenaceae e Dumontiaceae) esto agora includas na ordem

Gigartinales (SAUNDERS e KRAFT, 1996).

Os polissacardeos sintetizados pelas algas pertencentes a estas famlias

apresentam grande variedade estrutural, como observado nas algas do gnero

Kallymenia (K. reniformise K. westii) (Kallymenaceae) (DESLANDES et al., 1990;

CHOPIN et al., 1994) que sintetizam galactanas denominadas genericamente de

aeodanas. Estes polmeros apresentam uma estrutura majoritria de carragenana,


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porm grupos sulfato apenas nas unidades A, principalmente em C-2 e C-4,

grupos metoxil geralmente localizados em C-6 das unidades A e em C-2 das

unidades B e pequena percentagem de -L-galactose (USOV et al., 1980).

Uma galactana com estrutura muito mais complexa foi isolada da alga K.

berggrenii (MILLER e FURNEAUX, 1996). Esta alga biossintetiza uma galactana

DL-hbrida, cuja estrutura no foi completamente elucidada, mas que apresenta

relativamente altas percentagens de 3,6-anidrogalactose e seu derivado 2-O-metil

galactose, possuindo ainda galactose, 2-O-metilgalactose, 6-O-metilgalactose,

xilose e acetal de cido pirvico. Este polissacardeo possui ainda grupos sulfato

substituindo os carbonos 2 e 6 em ambas as unidades, demonstrado pelas

anlises de metilao realizadas antes e aps o processo de dessulfatao.

Na famlia Endocladiaceae, WHYTE et al. (1984), observaram que a algaEndocladia muricata, biossintetiza um polissacardeo constitudo principalmente

por carrabiose [-D-galactose-(14)-3,6-anidro--D-galactose], mas tambm com

6% de agarobiose [-D-galactose-(14)-3,6-anidro--L-galactose]. Nesta mesma

famlia, algas do gnero Gloiopeltis, foram classificadas como agarfitas, devido

caracterizao dos seus polissacardeos como agaranas sulfatadas, como por

exemplo, em G. cervicornis(PENMAN e REES, 1973).

Prem, TAKANO et al. em 1995 isolaram de G. complanata umpolissacardeo com estrutura hbrida de carragenana e agarana e em 1998 o

mesmo grupo (TAKANO et al., 1998) caracterizou da alga Gloiopeltis complanata

um polissacardeo que por hidrlise parcial, originou oligossacardeos com

estrutura de carragenana, e outros com estrutura de agarana. Resultados

diferentes foram observados dentro do mesmo gnero com as espcies G.

coliformise G. tenax, caracterizadas como produtoras de carragenanas (CHOPIN

et al., 1999).

CHOPIN et al. (1999), classificaram as espcies:Constantinea rosa-marina,

C. subulifera, Cryptosiphonia woodii, Neodilsea borealis, N. natashae e N.

yendoana pertencentes famlia Dumontiaceae como produtoras de galactanas

do tipo DL-hbrida uma vez que apresentavam no seu espectro de infravermelho,

bandas de absoro caractersticas de agarana e de carragenana.


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As algas pertencentes s famlias Gigartinaceae, Phyllphoraceae e

Petrocilidaceae, dentro da ordem Gigartinales, apresentam alternncia das

carragenanas produzidas durante o ciclo de vida. Os gametfitos produzem

carragenanas da famlia kappa e a fase tetrasprica (esporfitos) biossintetizam

carragenanas da famlia lambda (McCANDLESS et al., 1982, 1983). Estas famlias

constituem um grupo dentro da ordem Gigartinales e a alternncia biossinttica de

carragenanas kappa/lambda exclusiva destas famlias na ordem Gigartinales

(CRAIGIE 1990; CHOPIN et al., 1999).

Porm, gametfitos das algas Gigartina skottsbergii (Gigartinaceae),

Mastocarpus stellatus (Petrocilidaceae), Chondracanthus canaliculatus

(Gigartinaceae), Chondrus crispus (Gigartinaceae), e Mazzaella leptorhynchos

(Gigartinaceae) que eram consideradas carragenfitas biossintetizam pequenasquantidades de agaranas (CIANCIA et al., 1993, 1997).

Assim como foi observado na alga Gigartina skottsbergii (Gigartinaceae), a

alga Iridaea undulosa (= Sarcothalia crispata), tambm pertencente famlia

Gigartinaceae, biossintetiza quantidades significativas de polissacardeos com

unidades na configurao L (-L-galactose e 3,6-anidro--L-galactose) presente

tanto em plantas cistocrpicas (gametofticas) quanto em tetraspricas (STORTZ e

CEREZO, 1993; STORTZ et al., 1997).Esses resultados demonstram que as algas da ordem Gigartinales podem

biossintetizar agaranas, carragenanas e galactanas DL-hbridas, quando so

analisados os polissacardeos produzidos em menor proporo, e sendo esta

ordem a mais numerosa, pesquisadores tm avaliado a relevncia

quimiotaxonmica dessas diferenas estruturais.

1.4.1. FAMLIA PHYLLOPHORACEAE

At pouco tempo atrs na famlia Phyllophoraceae estavam agrupados 8

gneros: Gymnogongrus Martius, Phyllophora Greville, Stenogramme Harvey,

Ozophora J. Agardh, Petroglossum Hollenberg, Schottera Guiry et Hollenberg,


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Ceratocolax Rosenvinge e Besa Setchell (FREDERICQ e LOPEZ-BATISTA,

2003).

Como j citado, as algas pertencentes a esta famlia apresentam grande

diversidade em relao ao ciclo de vida, podendo apresentar:

- Alternncia trifsica isomrfica: com gametfitos e tetrasporfitos

morfologicamente similares e bem desenvolvidos (Ex. Phyllophora).

- Alternncia trifsica heteromrfica: nos quais os gametfitos so eretos

com dimenses macroscpicas e os tetrasporfitos so de vida livre, com

morfologia crustosa e microscpica (Ex. Ahnfeltiopsis).

- Alternncia bifsica: com a presena de gametfitos e tetrasporfitos,

porm ausncia de carposporfitos. Sobre o gametfito feminino se desenvolve

uma fase denominada tetrasporoblstica (Ex. Gymnogongrus griffithsiae)(NEWROTH, 1971; KAPRAUN et al., 1993; MASUDA et al., 1996).

- Ciclo de vida direto: no qual s se encontram presentes gametfitos

femininos macroscpicos que produzem carposporos. Estes carposporos voltam a

dar lugar fase gametoftica (Ex. Gymnogongrus devoniensis).

Essas variaes fizeram com que algumas espcies de Gymnogongrus

(espcie tipo G. griffithsiae) que no apresentavam tetrasporoblastos, mas sim

cistocarpos internos e um ciclo de vida heteromrfico fossem transferidas para um

novo gnero Ahnfeltiopsis (SILVA e De CREW, 1992; MASUDA e KOGAME,

1998). A espcie heteromrfica Phyllophora trailli foi transferida para o gnero

Erythrodermis (GUIRY e GARBARY, 1990) e no gnero Phyllophora

permaneceram somente as algas que apresentavam alternncia isomrfica das

geraes.

Por este motivo nessa famlia o ciclo de vida muito importante, como em

nenhuma outra famlia dentro das algas vermelhas, pois utilizado como um dos

caracteres mais significativos para se definir os gneros dentro da famlia

Phyllophoraceae (Gigartinales).

Com base em evidncias morfolgicas e por anlises filogenticas de

seqenciais de rbcL (FRESHWATER et al., 1994; FREDERICQ et al., 1996) a

famlia Phyllophoraceae apresenta maior proximidade com a famlia


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Gigartinaceae. E em relao produo de galactanas sulfatadas McCANDLESS

et al. (1982, 1983) estudaram o padro de carragenanas biossintetizado pelas

algas da famlia Phyllopharaceae e Gigartinaceae, respectivamente.

Na famlia Phyllophoraceae (McCANDLESS et al., 1982) observaram que

plantas gemetofticas produzem iota- ou iota/kappa- carragenanas hbridas,

enquanto que na famlia Gigartinaceae (McCANDLESS et al., 1983) h produo

de kappa- ou kappa/iota-carragenanas hbridas. Em ambas as famlias, os

tetrasporfitos produzem lambda-carragenana.

Nessa famlia j foram realizados vrios estudos das galactanas sulfatadas

produzidas por gneros muito semelhantes como Gymnogongrus (6 espcies) e

Ahnfeltiopsis (7 espcies).

Estruturas referentes iota-carragenana foram encontradas em gametfitosde Ahnfeltiopsis leptophylla (McCANDLESS et al., 1982) determinadas por anlise

espectroscpica de infravermelho. Carragenanas hbridas kappa/iota foram

determinadas em Ahnfeltiopsis concinna, A. devoniensis, A. flabeliformis, A.

furcellata (McCANDLESS et al., 1982), A. gigartinoides (BELLION et al., 1983), A.

linearis, Gymnogongrus crustiforme, G. crenulatus, G. vermicularis e G. griffithsiae

(McCANDLESS et al., 1982). FURNEAUX e MILLER, (1985) tambm

determinaram carragenanas kappa/iota por RMN de 13C em diferentes espcies de

Gymnogongrus, Ahnfeltiae Stenogramme.

Nas espcies estudadas do gnero Phyllophora (3 espcies) foi

demonstrado a presena de iota- e lambda-carragenanas (McCANDLESS et al.,

1982; USOV e SHASHKOV, 1985). Algas dos gneros Schottera (1 espcie), e

Sternogramme (1 espcie) (McCANDLESS et al., 1982; WHYTE et al., 1984)

parecem sintetizar polissacardeos muito homogneos quanto a sua estrutura,

produzindo tpicas carragenanas kappa/iota na fase citoscrpica e lambda-

carragenana na fase tetrasprica.

Algas da famlia Phyllophoraceaedescritas na literatura (McCANDLESS et

al., 1982) (FURNEAUX e MILLER, 1985), (SAITO e OLIVEIRA, 1990), tm sido

relatadas como produtoras apenas de carragenanas, em concordncia com a

clssica denominao destas como carragenfitas. Porm trabalhos mais recentes


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realizados por MILLER et al. (1998) e ESTEVEZ et al. (2001), demonstraram que

algas pertencentes a esta famlia tambm sintetizam polissacardeos com

diferentes caractersticas estruturais e varivel percentagem de monossacardeos

pertencentes srie L-, seja agaranas ou galactanas D/L-hbridas.

MILLER (1998) detectou por RMN de 13C a presena do acetal de cido

pirvico na galactana isolada de Stenogramme interrupta, sendo este considerado

como critrio quimiotaxonmico para classificao de algas da famlia

Phyllophoraceae.

Em 2001, MILLER analisou tambm por RMN de 13C, os polissacardeos da

fase tetrasprica dessa alga e observou em maior percentagem a unidade B (-D-

galactose) 6-O-sulfatada ligada unidade A (-D-galactose), tambm 6-O

sulfatada (G6S-D6S) que corresponde dade da psi-carragenana, precursora damega-carragenana (G6S-DA). Alternadamente em menores propores, a

unidade B (D6S) tambm estava ligada a -D-galactose 2,6-dissulfato (G2,6S-

D6S). Esses resultados foram semelhantes aos encontrados com algas do gnero

Phyllophora e demonstram que os polissacardeos produzidos pela fase

tetrasprica diferem dos da fase gametoftica (kappa/iota), como relatado para

outros membros das famlias Phyllophoraceae (FURNEAUX e MILLER, 1985),

mas estes polmeros no correspondem lambda-carragenana como esperado.FURNEAUX e MILLER, em 1985 analisaram por RMN de 13C os

polissacardeos da alga Gymnogongrus torulosus da Nova Zelndia (= Ahnfeltia

torulosa) e observaram que alm da presena de kappa-carragenana (32%) e

estruturas de iota-carragenana (46%) esta alga biossintetiza tambm estruturas

precursoras mu/nu-carragenanas (22%). Resultados semelhantes foram

encontrados por ESTEVEZ et al., 2001 e por MILLER em 2003, apesar da maior

percentagem de unidades precursoras mu/nu-carragenanas (31%), 32% de

kappa- e 37% de iota-carragenana.

Esses resultados foram obtidos quando somente foi analisado o extrato

majoritrio, porm ESTEVEZ et al., 2001 observaram a presena minoritria de

agaranas e galactanas DL-hbridas biossintetizadas pela alga G. torulosus. Os

polissacardeos encontrados so formados principalmente por um esqueleto


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bsico de unidades alternantes de -D-galactose 3-O-ligadas e -L-galactose 4-O-

ligadas com: (i)substituio parcial no C-4 da unidade A (-D-galactose), e em C-2

e C-3, ou somente em C-3 ou C-6 da unidade B (-galactose) e (ii)presena de

unidades 3,6-anidro--L-galactose, parcialmente sulfatada no C-2. A galactana

D/L-hbrida apresentou aproximadamente 70% de estrutura similar a de

carragenanas (dados de metilao, anlise enantiomrica e RMN de 13C) e

apresentou as unidades B, principalmente sulfatadas em C-3 (27,4%) (-L-

galactose-3-sulfato) com baixas percentagens de grupo O-metil (4,2%)

esterificando este carbono das unidades de -D-galactose.

Este o nico relato na literatura de uma alga produtora de galactana DL-

hbrida dentro da famlia Phyllophoraceae.

1.4.2. FAMLIA SOLIERIACEAE

As algas pertencentes famlia Solieriaceae so, do ponto de vista

econmico, as mais importantes, pois nesta famlia esto presentes os gneros

Kappaphycuse Eucheuma, principais fontes para extrao comercial de kappa- e

iota-carragenana, respectivamente. A famlia Solieriaceae (incluindo a

Areschougiaceae) contm aproximadamente 20 gneros, que so amplamentedistribudos em guas de regies de clima tropical e temperado (STORTZ e

CEREZO, 2000).

Evidncias morfolgicas e resultados da similaridade das seqncias

cloroplsticas de rbcL auxiliaram no estudo filogentico e biogeogrfico das algas

pertencentes a esta famlia. FREDERICQ et al., em 1999 sugerem que as algas

poderiam ser divididas em sete grupos (1) Sarconema, (2) Eucheuma, (3) Solieria

grupo do Atlntico, (4) Solieria grupo do Pacfico, (5) Meristiella/Meristotheca,

(6) Agardhiella e (7) Sarcodiotheca que incluiria Eucheuma uncinatum do Golfo da

Califrnia. Quatro grupos de espcies so reconhecidos no grupo Eucheuma que

correspondem Eucheuma, Gelatiformia (= Betaphycus), Anaxiferae e

Cottoniformia (= Kappaphycus) proposto por Maxwell Doty.


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Com base no tipo das galactanas sulfatadas as principais mudanas

taxonmicas ocorreram no gnero Eucheuma (DOTY, 1988). As espcies de

Eucheuma que produziam carragenanas do tipo beta (E, gelatinae, E.

especiosum), passaram para o novo gnero Betaphycus (DOTY, 1995), as

espcies produtoras de carragenanas kappa/iota foram transferidas para o novo

gnero Kappaphycus e as espcies restantes que biossintetizavam carragenanas

do tipo iota permaneceriam no antigo gnero Eucheuma.

Esta separao deve ser considerada como uma convenincia taxonmica,

muito mais til comercialmente do que com real significado taxonmico-

filogentico, pois a cada dia est mais aceita a idia de que no existem famlias

puras de carragenanas, mas sim uma disperso de estruturas ao redor de uma

ou vrias estruturas predominantes (CHOPIN et al., 1999).O primeiro relato da existncia de galactanas DL-hbridas fora da extinta

ordem Cryptonemiales foi na famlia Solieriaceae, onde por hidrlise parcial da

galactana de Anatheca dentata (NUNN et al., 1971; 1973; 1981), foram obtidos

fragmentos correspondentes estrutura de carragenana e agarana, porm

nenhum com ambas as estruturas.

ESTEVEZ et al. em 2000 analisaram o extrato obtido a 25 C da alga

Kappaphycus alvarezii e detectaram a presena no somente de kappa-carragenana, mas tambm estruturas incomuns de baixa massa molecular com

caractersticas de galactanas DL-hbridas. Os parmetros que as diferencia da

estrutura ideal repetitiva da kappa-carragenana so: (i)baixa percentagem de 3,6-

anidrogalactose e de unidades precursoras, (ii)pequena quantidade de unidades

incomuns como, -D-galactose 3-O-ligada no sulfatada e na forma 2,4- e 4,6-

dissulfatada, (iii) quantidade significativa de iota-carragenana e (iv)de 6-O-metil

-D-galactose 4-sulfato. A presena de -L-galactose 4-O-ligada e possivelmente,

4-O-ligada 3-substituda e 3-O-ligada 2- e 6-substituda por resduos de galactose

indica a presena de agaranas. A predominncia de D-galactose sugere a co-

ocorrncia de estruturas de carragenanas e agaranas.

As galactanas extradas a 90 oC de Kappaphycus alvarezii, aps prvia

extrao a 25 C, so compostas principalmente por kappa-carragenana


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(aproximadamente 74%). No entanto, significativas quantidades destas galactanas

(pelo menos 14%) representam agaranas sulfatadas e, possivelmente, galactanas

DL-hbrida (ESTEVEZ et al., 2004).

No gnero CallophycusCHIOVITTI et al., (1997) observaram em 6 espcies

a presena de alfa-carragenana com altas percentagens de cido pirvico (8,0% -

10,5%). A presena destes substituintes parece ser constante em todas as

espcies estudadas desse gnero, assim como na alga Sarconema filiforme

(CHIOVITTI et al., 1998a). Os contedos de acetal de cido pirvico encontrados

em Callophycus superam os encontrados em agarfitas e possvel que a

presena deste substituinte nas unidades B possa ter algum valor

quimiotaxonmico neste gnero.

Da alga Solieria robusta tambm foram isoladas carragenanas piruvatadas(CHIOVITTI et al., 1999) determinadas por anlise de composio

monossacardica, anlises de metilao, espectroscopia de infravermelho e RMN

de 13C.

Como j citado anteriormente o alto grau de metilao presente nas

galactanas isoladas das algas dos gneros Erythroclonium (CHIOVITTI et al.,

1998b) e Rhabdonia (CHIOVITTI et al., 1996), que pertenciam famlia

Solieriaceae, foi o fator estrutural responsvel pela transferncia destas algas para

a famlia Areschougiaceae.

A famlia Solieriaceae, juntamente com as famlias Gigartinaceae,

Phyllophoraceae e Hypneaceae so as principais fontes de extrao de

carragenanas e alm dos principais gneros Kappaphycus e Eucheuma, algas dos

gneros Gymnogongrus, Ahnfeltia e Iridaea esto recentemente sendo utilizadas

como matria prima para obteno desses polissacardeos (WEST e MILLER,

2001).


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1.5. APLICAO INDUSTRIAL DAS GALACTANAS SULFATADAS

Novas fontes e aplicaes dos polissacardeos produzidos por algas

marinhas tm despertado o interesse de vrios setores industriais nos ltimos

anos. Atualmente os campos de maior aplicao dos polmeros das algas

marinhas esto nas indstrias alimentcias, nutracuticas, farmacuticas e

odontolgicas. Esses polmeros tambm so utilizados como matria prima para o

desenvolvimento de novos excipientes, por exemplo, para utilizao em sistema

de liberao controlada em biotecnologia enzimtica e biosensores (RENN, 1997).

A ampla utilizao dos polissacardeos de algas est baseada, entre outras

propriedades, na capacidade nica desses de formar gis fortes em solues

aquosas. Estes gis so resultados da peculiar estrutura qumica regular que

possibilita conformaes moleculares ordenadas e agregaes (LAHAYE, 2001).

As agaranas, agaroses e dextranas (Sephadex) modificadas quimicamente,

so utilizadas para a realizao de anlises cromatogrficas por excluso e troca-

inica (DEAE-Sephadex; CM-celulose). A agarose est entre os meios mais

utilizados na confeco de gis para eletroforese, assim como tambm o gar

amplamente utilizado na formulao de meios de cultivo de microorganismos

(ARMISEN, 1991; LAHAYE, 1991).As agaranas podem ser utilizadas na fabricao de cpsulas de vitaminas e

outras drogas, em materiais odontolgicos e como

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