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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO BIOLOGIA DE AGENTES INFECCIOSOS E PARASITÁRIOS
CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE VÍRUS PERTENCENTES AO GRUPO DA FEBRE DOS FLEBÓTOMOS (BUNYAVIRIDAE: PHLEBOVIRUS) ISOLADOS NA AMAZÔNIA BRASILEIRA
JOAQUIM PINTO NUNES NETO
Belém-Pará 2013
JOAQUIM PINTO NUNES NETO
CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE VÍRUS PERTENCENTES AO GRUPO DA FEBRE DOS FLEBÓTOMOS (BUNYAVIRIDAE: PHLEBOVIRUS) ISOLADOS NA AMAZÔNIA BRASILEIRA
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará como requisito parcial para a obtenção do grau de Doutor em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários. Orientador: Prof. Dr. Pedro Fernando da Costa Vasconcelos
Belém-Pará 2013
1
JOAQUIM PINTO NUNES NETO
CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE VÍRUS PERTENCENTES AO GRUPO DA FEBRE DOS FLEBÓTOMOS (BUNYAVIRIDAE: PHLEBOVIRUS) ISOLADOS NA
AMAZÔNIA BRASILEIRA
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários, do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará, como requisito para a obtenção do grau de Doutor em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários.
Orientador: Banca examinadora: Suplente:
Prof. Dr. Pedro Fernando da Costa Vasconcelos Instituto Evandro Chagas / MS Profa. Dra. Conceição de M. Almeida Vieira Universidade Federal Rural da Amazônia Dra. Daniele Barbosa de Almeida Medeiros Instituto Evandro Chagas / MS Prof. Dr.Márcio Roberto Teixeira Nunes Instituto Evandro Chagas / MS Prof. Dr.Ricardo Israk Universidade Federal do Pará Dra. Jannifer Oliveira Chiang Instituto Evandro Chagas / MS Belém 17 de dezembro de 2013.
2
Dedico esta Tese aos meus familiares e
amigos
3
"O MAIOR INIMIGO DO
CONHECIMENTO NÃO É A
IGNORÂNCIA É A ILUSÃO DE
CONHECIMENTO"
(Stephen Hawking)
4
AGRADECIMENTOS
A Deus, por tudo de bom que aconteceu em minha vida.
Aos meus pais, José Antônio Bitencourt Nunes e Júlia Faial Nunes pelo amor e
compreensão que sempre me dedicaram.
Aos meus irmãos, Cristiano Augusto Faial Nunes e Luciano Augusto Fayal Nunes,
pelo incentivo e amizade.
À minhas tias, Maria de Nazaré Bittencourt Nunes e Maria Emília Bittencourt Nunes
(in memoriam), pelo amor que sempre demonstraram por mim.
A meu orientador, Dr. Pedro Fernando da Costa Vasconcelos, pelos ensinamentos,
incentivos e sobre tudo pela paciência demonstrada ao longo desse trabalho.
Ao Dr. Márcio Roberto Teixeira Nunes pelo grande apoio na realização das técnicas
de biologia molecular, e leitura crítica dos originais.
À Dra. Daniele Medeiros, Dr.Sandro Patroca, MSc. Jedson Cardoso e MSc. João
Lídio, pela ajuda inestimável nas análises em bioinformática.
À Dra. Eliana Vieira e Dra.Valéria Carvalho, pela amizade e colaboração nas
técnicas de cultivo celular.
Ao MSc. Clayton, Dra. Daisy Elaine, e a Bióloga Keley Nunes, pela ajuda na
realização do sequenciamento das amostras.
Á Dra. Lívia Martins, Dra. Jannifer Chiang, MSc. Milene Silveira, Dra.Lívia Casseb e
Dra.Taciana Barbosa, pela ajuda nas etapas de sorologia,preparação de amostras e
biotério.
5
Aos meus amigos do laboratório de entomologia, Hamilton Monteiro, Hélio Saraiva,
Francisco Castro, Orlando Vaz e Nazaré Segura, pela amizade e ensinamentos ao
longo dos anos.
Ao Dr. Gustavo Palacios e Dra. Ámélia Travassos da Rosa, pelo trabalho
colaborativo de sequenciamento das amostras.
À Dra. Elisabeth Santos, diretora do Instituto Evandro Chagas, por ter proporcionado
condições para a realização desse trabalho.
Aos funcionários da biblioteca do IEC, pelo envio dos artigos solicitados.
Aos meus amigos da SAARB e CIT, José Wilson, Edivaldo Jr, Davi Toshiu, Samir
Casseb, Helena Baldez, Sílvia Mendoça, Aguinaldo Borges, pela disponibilidade de
ajuda.
Aos membros da banca examinadora Dra. Conceição de M. Almeida Vieira, Dra.
Daniele Barbosa de Almeida Medeiros, Dr. Márcio Roberto Teixeira Nunes,
Dr.Ricardo Israk e Dra. Jannifer Oliveira Chiang, que aceitaram o convite para
participarem da banca de avaliação.
A todos que desenvolvem seus trabalhos na Secção de Arbovirologia e Febres
Hemorrágicas do Instituto Evandro Chagas, pois todos direta ou indiretamente
contribuíram para a realização deste trabalho.
Ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários,
do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará , pelo apoio ao
longo desses anos.
À CAPES, pelo suporte financeiro, que contribuiu para a minha permanência no
doutorado.
6
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS ................................................................................................... 8
LISTA DE TABELAS E QUADROS ......................................................................... 10
RESUMO................................................................................................................... 12
ABSTRACT ............................................................................................................... 13
1.1. CONSIDERAÇÕES GERAIS SOBRE ARBOVÍRUS .................................... 14
1.1.1. Arbovírus no Brasil .................................................................................... 17
1.1.2. Propriedades Físico – Químicas dos Arbovírus ...................................... 17
1.1.3. Características Epidemiológicas dos Arbovírus ..................................... 19
1.2. FAMÍLIA BUNYAVIRIDAE ............................................................................ 21
1.2.1. Propriedades Físico – Químicas dos Vírus da Família Bunyaviridae .... 22
1.2.2. Replicação Viral dos Membros da Família Bunyaviridae ....................... 25
1.3. GÊNERO PHLEBOVIRUS ........................................................................... 27
1.3.1. Propriedades Físico - Químicas dos Membros do Gênero Phlebovirus29
1.3.2. Organização Genômica ............................................................................. 31
1.3.3. Membros do Gênero Phlebovirus Isolados na Amazônia Brasileira ..... 32
1.4. OBJETIVOS ................................................................................................. 35
1.4.1. Objetivo Geral ............................................................................................. 35
1.4.2. Objetivos Específicos ................................................................................ 35
2. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................ 36
2.1. MATERIAL ................................................................................................... 36
2.1.1. Amostras Virais .......................................................................................... 36
2.2. MÉTODO ..................................................................................................... 38
2.2.1. Vírus em Estudo ......................................................................................... 38
2.2.2. Tratamento das Amostras com Nuclease ................................................ 39
2.2.3. Extração do RNA Viral ............................................................................... 39
2.2.4. Quantificação do RNA ............................................................................... 39
2.2.5. Obtenção das Sequências Nucleotídicas no GS FLX Genome
Sequencer 454™ ..................................................................................................... 40
2.2.6. Preparação da Biblioteca Genômica ........................................................ 40
2.2.7. PCR emulsão (emPCR) .............................................................................. 41
2.2.8. emPCR para titulação ................................................................................ 41
2.2.9. Sequenciamento das Amostras por Pirosequenciamento ..................... 42
7
2.2.10. Análise Computacional .............................................................................. 43
2.2.10.1. Montagem dos Genomas obtidos pelo GS FLX Genome Sequencer
454™ (Roche Applied Science) ................................................................................ 43
2.2.10.2. Genômica Descritiva: Análises e Identificações ...................................... 44
2.2.10.3. Identificação de possíveis rearranjos genéticos ...................................... 45
2.2.10.4. Análise Filogenética ................................................................................ 46
3. RESULTADOS ............................................................................................ 47
3.1. OBTENÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DAS SEQUÊNCIAS NUCLEOTÍDICAS .. 47
3.2. ORGANIZAÇÃO GENÔMICA ...................................................................... 49
3.2.1. Segmento SRNA ......................................................................................... 49
3.2.2. Segmento MRNA ........................................................................................ 51
3.2.3. Segmento L ................................................................................................. 53
3.3. PROTEÍNAS VIRAIS .................................................................................... 55
3.3.1. Análise dos Domínios e Subdomínios Protéicos .................................... 55
3.3.2. Sítios de Clivagem para a Poliproteína M ................................................ 57
3.3.3. Identificação de Motivos Conservados .................................................... 58
3.3.3.1. Proteína N .................................................................................................... 58
3.3.3.2. Proteínas NSm, Gn e Gc .............................................................................. 59
3.3.3.3. Polimerase Viral ........................................................................................... 62
3.3.4. Determinação dos Resíduos de Cisteína ................................................. 63
3.3.5. Determinação dos sítios de glicosilação ................................................. 64
3.4. RELAÇÃO GENÉTICA ENTRE O COMPLEXO CANDIRU E OUTROS
MEMBROS DO GÊNERO PHLEBOVIRUS............................................................... 69
3.4.1. Similaridade Genética Nucleotídica e Aminoacídica .............................. 69
3.5. RELAÇÃO FILOGENÉTICA ......................................................................... 74
3.6. MODELO HIPOTÉTICO DE REARRANJO GENÉTICO DOS VÍRUS DO
COMPLEXO CANDIRU. ............................................................................................ 83
4. DISCUSSÃO ......................................................................................................... 85
5. CONCLUSÕES ..................................................................................................... 92
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................................... 94 ANEXOS ................................................................................................................. 107
8
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Exemplo de ciclo de manutenção dos Arbovírus em natureza. ................ 16 Figura 2 - Representação esquemática da partícula viral dos membros da família Bunyaviridae. ............................................................................................................. 23 Figura 3 - Organização genômica e estratégias de codificação das proteínas dos vírus pertencentes a diferentes gêneros da família Bunyaviridae.............................. 25 Figura 4 - Estratégia de replicação dos membros da família Bunyaviridae. ............. 26 Figura 5 - Partículas do Virus Rift Valley fever e Virus Uukuniemi. A barra representa 50 nm. ....................................................................................................................... 30 Figura 6 - Local de coleta das amostras estudadas. ................................................ 37 Figura 7 - Representação esquemática dos genomas dos segmentos SRNA (sentido 3’->5’) obtidos para os 14 isolados virais identificados como membros da família Bunyaviridae, gênero Phlebovirus. ............................................................................ 50 Figura 8 – Representação esquemática dos genomas dos segmentos MRNA (sentido 3’-> 5’) obtidos para os 14 isolados virais identificados como membros da família Bunyaviridae, gênero Phlebovirus. ................................................................ 52 Figura 9 - Representação esquemática dos genomas dos segmentos LRNA (sentido 3’-> 5’), obtidos para as 14 cepas virais identificadas como membros da família Bunyaviridae, gênero Phlebovirus. ............................................................................ 54 Figura 10 - Domínios e subdomínios das proteínas virais evidenciadas ao longo dos segmentos SRNA (a), MRNA (b) e LRNA (c) dos 10 vírus do Complexo Candiru, bem como para os Virus Anhanga, Virus Tapara, Virus Uriurana e Virus Urucuri. ... 56 Figura 11 - Alinhamento múltiplo da proteína de nucleocapsideo (N) do Virus Candiru (representante do Complexo Candiu), Virus Anhanga, Virus Punta Toro, Virus Rift Valley, Virus Tapara, Virus Uriurana e Virus Uukuniemi. ........................... 59 Figura 12 - Alinhamento múltiplo da poliproteína M, região da proteína NSm (azul escuro) do Virus Candiru (representante do Complexo Candiru), Virus Anhanga, Virus Rift Valley, Virus Tapara, Virus Uriurana e Virus Sandfly fever Naples_Poona. .................................................................................................................................. 60 Figura 13 - Alinhamento múltiplo da poliproteína M, região da proteína Gn (azul escuro) do Virus Candiru (representante do Complexo Candiru), Virus Anhanga, Virus Rift Valley, Virus Tapara, Virus Uriurana e Virus Sandfly fever Naples Poona, Virus Uukuniemi e Virus Bhanja. ............................................................................... 61 Figura 14 - Alinhamento múltiplo da poliproteína M, região da proteína Gc (azul escuro) do Virus Candiru (representante do Complexo Candiru), Virus Anhanga, Virus Rift Valley, Virus Tapara, Virus Uriurana e Virus Sandfly fever Naples Poona, Virus Uukuniemi e Virus Bhanja. ............................................................................... 62 Figura 15 - Alinhamento múltiplo da proteína L (polimerase viral) do Virus Candiru (representante do Complexo Candiru), Virus Palma, Virus Anhanga, Virus Rift Valley, Virus Tapara, Virus Uriurana e Virus Uukuniemi. ...................................................... 63 Figura 16 - Árvore filogenética construída pelo método de MV para a proteína N (média de 244 aminoácidos) dos phlebovírus. .......................................................... 74 Figura 17 - Árvore filogenética construída pelo método de MV para a proteína NSs (média de 277 aminoácidos) dos phlebovírus. .......................................................... 75 Figura 18 - Árvore filogenética construída pelo método de MV para a proteína M (média de 1326 aminoácidos) dos phlebovírus. ........................................................ 76 Figura 19 - Árvore filogenética construída pelo método de MV para a proteína L (média de 2091 aminoácidos) dos phlebovírus. ........................................................ 77
9
Figura 20 - Análise de rearranjo genético pelo método de bootscan utilizando o segmento SRNA do Virus Ariquemes e membros selecionados do Complexo Candiru (Bunyaviridae: Phlebovirus). ...................................................................................... 78 Figura 21 - Análise de rearranjo genético pelo método de bootscan utilizando o segmento SRNA do Virus Itaituba e membros selecionados do Complexo Candiru (Bunyaviridae: Phlebovirus). ...................................................................................... 79 Figura 22 - Análise de rearranjo genético pelo método de bootscan utilizando o segmento MRNA do Virus Itaituba e membros selecionados do Complexo Candiru (Bunyaviridae: Phlebovirus). ...................................................................................... 80 Figura 23 - Análise de rearranjo genético pelo método de bootscan utilizando o segmento MRNA do Virus Ariquemes e membros selecionados do Complexo Candiru (Bunyaviridae: Phlebovirus). ........................................................................ 81 Figura 24 - Análise de rearranjo genético para os membros do Complexo Candiru empregando o método de Kishino Hasegawa. .......................................................... 82 Figura 25 - Possível padrão de rearranjo genético para os vírus do Complexo Candiru com base no relacionamento genético dos vírus para os segmentos genômicos SRNA, MRNA e LRNA. ........................................................................... 84
10
LISTA DE TABELAS E QUADROS
Tabela 1 - Organização dos genomas correspondentes ao segmento SRNA dos phlebovirus segundo os tamanhos dos genes N e NSs, posição nucleotídica, percentual de adenina-uracila (AU), região intergênica, e tamanhos das regiões não codificantes (NCR). ................................................................................................... 51 Tabela 2 - Organização dos genomas correspondentes ao segmento MRNA dos Phlebovirus segundo os tamanhos das poliproteínas, genes NSm, Gn e GC em nucleotídeos (nt) e aminoácidos (aa), peso molecular em KDa, posição aminoacídica de cada proteína, tamanho das regiões não codificantes (NCR) em nucleotídeos (nt) percentual de adenina - uracila (AU). ........................................................................ 53 Tabela 3 - Organização dos genomas correspondentes ao segmento LRNA dos membros do gênero Phlebovirus utilizados no estudo, segundo os tamanhos das poliproteínas codificadoras da polimerase viral em nucleotídeos (nt) e aminoácidos, peso molecular em KDa, posição nucleotídica , sentido da cadeia de leitura, tamanho das regiões não codificantes (NCR) em nucleotídeos (nt) percentual de Adenina-Uracila (AU). ............................................................................................... 55 Tabela 4 - Valores de PFAM gerados pelo programa Interproscan segundo o segmento genômico, proteínas e domínios protéicos dos membros do gênero Phlebovirus. ............................................................................................................... 57 Tabela 5 - Sítios de clivagem para as poliproteínas NSM, Gn e Gc codificadas pelo segmento MRNA dos membros do gênero phlebovirus do Complexo Candiru, Virus Anhanga, Virus Tapara, Virus Uriurana e Virus Urucuri, preditos pelo programa Signal P v.4.1 e Interproscan. ................................................................................... 58 Tabela 6 - Sítios de glicosilação encontrados na poliproteína do segmento M-RNA para os diferentes membros do gênero Phlebovirus utilizados no estudo com valor limítrofe de 0,5. .......................................................................................................... 65 Tabela 7 - Sítios de glicosilação encontrados na poliproteína do segmento M-RNA para os diferentes membros do gênero Phlebovirus utilizados no estudo com valor limítrofe de 0,5. .......................................................................................................... 66 Tabela 8 - Sítios de glicosilação encontrados na poliproteína do segmento MRNA para os diferentes membros do gênero Phlebovirus utilizados no estudo com valor limítrofe de 0,5. .......................................................................................................... 67 Tabela 9 - Sítios de glicosilação encontrados na poliproteína do segmento M-RNA para os diferentes membros do gênero Phlebovirus utilizados no estudo com valor limítrofe de 0,5. .......................................................................................................... 68 Tabela 10 - Valores percentuais de similaridade nucleotídica e aminoácidica ,determinados por alinhamento múltiplo para o gene N (segmento SRNA) dos diferentes membros do gênero Phlebovirus isolados na Amazônia brasileira. ......... 70 Tabela 11 - Valores percentuais de similaridade nucleotídica e aminoacídica , determinados por alinhamento múltiplo para o gene NSs (segmento SRNA) dos diferentes membros do gênero Phlebovirus isolados na Amazônia brasileira. ......... 71 Tabela 12- Valores percentuais de similaridade nucleotídica e aminoacídica (determinados por alinhamento múltiplo para a poliproteína M (genes NSm, Gn e Gc) dos diferentes membros do gênero Phlebovirus. ...................................................... 72 Tabela 13 - Valores percentuais de similaridade nucleotídica (triângulo superior com números em azul) e aminoacídica (triângulo inferior com números em preto) determinados por alinhamento múltiplo para sequências parciais do gene da polimerase presente no segmento LRNA dos diferentes membros do gênero Phlebovirus. ............................................................................................................... 73
11
Quadro 1 - Características gerais das famílias com arbovírus segundo algumas características físico-químicas. ................................................................................. 18 Quadro 2 - Arbovírus patogênicos para humanos isolados no Brasil, 1954 -2013. .. 20 Quadro 3 - Os cinco gêneros da família Bunyaviridae. ............................................ 22 Quadro 4 - Tamanho em nucleotídeos (nt), da sequência completa dos três segmentos de alguns membros da família Bunyaviridae. ......................................... 24 Quadro 5 - Phlebovirus isolados na Amazônia brasileira. ........................................ 33 Quadro 6 - Amostras Virais. ..................................................................................... 36 Quadro 7 - Sequências nucleotídicas obtidas para o genoma das 14 cepas virais incluídas no estudo evidenciando o total de nucleotídeos recuperados por segmento genômico (SRNA, MRNA e LRNA). .......................................................................... 48 Quadro 8 - Número de resíduos de Cisteínas determinadas para as diferentes proteínas dos phlebovirus do grupo Candiru, Virus Uriarana, Virus Urucuri e Virus Tapara. ...................................................................................................................... 64 Quadro 9 - Grupos genéticos observados entre os vírus do Complexo Candiru conforme as topologias das árvores geradas para os segmentos SRNA (gene N), MRNA (poliproteína) e LRNA (polimerase viral).........................................................83
12
RESUMO
A Amazônia Brasileira é considerada um dos mais ricos ecossistemas do
mundo em termos de biodiversidade. De fato, a grande variedade de vertebrados e
insetos hematófagos (mosquitos, culicoides, flebotomineos, carrapatos etc...)
existentes na Amazônia têm sido associados à manutenção de um grande número
de arbovírus e virus zoonóticos. A destruição desse ecossistema naturalmente
estável pode resultar na emergencia de novos arbovírus na região Amazônica. Os
membros do gênero Phlebovirus (família Bunyaviridae), dentre as centenas de
arbovírus isolados na Amazônia brasileira, constituem um grupo viral
antigenicamente relacionado, de considerável importância médica, cuja manutenção
em natureza está basicamente relacionada á interação entre vertebrados silvestres e
flebotomíneos. Na Amazônia brasileira, já foram isolados até o momento 22 tipos
diferentes de phlebovírus, dos quais nove vírus ainda não se encontram registrados
no ICTV, quatro são vírus registrados, porém não agrupados em complexos
sorológicos: Virus Anhanga, Virus Itaporanga, Virus Uriurana e Virus Urucuri. Este
estudo objetivou caracterizar geneticamente e avaliar os aspectos evolutivos de 14
membros do gênero Phlebovirus (Bunyaviridae), isolados na Amazônia brasilera. As
sequências nucleotídicas completas de cada um dos segmentos genômicos de RNA
(SRNA, MRNA e LRNA) foram obtidas para 12 dos 14 phlebovírus estudados
(exceto para os Virus Anhanga e Virus Urucuri). A organização genômica e
caracteres genéticos (motivos conservados, sítios de glicosilação, resíduos de
cisteína) foram compatíveis com o observado nos demias membros do gênero
Phlebovirus previamente estudados. A análise de relacionamento genético, bem
como a avaliação evolutiva empregando a reconstrução filogenética e análise de
permutação de segmentos genômicos evidenciou que os phlebovírus incluídos no
estudo, em especial os membros do Complexo Candiru, utilizam o mecanismo de
rearranjo genético como mecanismo de geração de biodiversidade viral. Os
resultados obtidos nesse estudo contribuirão para estudos futuros ao nível de
epidemiologia molecular e evolução, bem como para o desenvolvimento de métodos
moleculares para detecção rápida do genoma de phlebovírus associados a doença
em humanos.
Palavra-chaves: Amazônia Brasileira, Phlebovírus, caracterização genética
13
ABSTRACT
The Brazilian Amazon is considered one of the richest ecosystems in the
world in terms of biodiversity. Indeed, the wide variety of vertebrates and
hematophagous insects ( mosquitoes , Culicoides , phlebotomineos ,ticks etc… )
have been associated with natural maintainance of a large number of arbovirus and
zoonotic virus . Destruction of this naturally stable ecosystem can result in
emergence of new arboviruses in the Amazon region . Members of the genus
Phlebovirus (family Bunyaviridae), contitute an antigenically related group of viruses,
which has a considerable medical importance. These viruses are basically
mainteined in nature by wild vertebrates and phlebotominae sandflies. In the
Brazilian Amazon , 22 phleboviruses have been isolated, whose nine of them have
not been recognized by the ICTV, and four not grouped into serological complexes
: Anhanga virus, Itaporanga virus, Uriurana virus and Urucuri virus. This study aimed
to genetically characterize and evaluate the evolutionary aspects of 14 members of
the genus Phlebovirus (Family Bunyaviridae ) isolated in Brazilian Amazon region.
Nearly complete nucleotide sequences for each of the genomic RNA segments
(SRNA, MRNA and LRNA) were obtained for 12 of the 14 studied except for
Anhanga virus and Urucuri viruses that were only partially sequenced. Genomic
organization and genetic characteristics (conserved motifs, glycosylation sites end
cysteine residues ) were consistent with those observed for members of Phlebovirus
genus previously characterized . The analysis of genetic relationship, as well as the
evolutionary aspects using the phylogenetic analysis and evaluation of genomic
segment permutation showed that the studied phleboviruses, particularly the
members of the Candiru virus complex, use the genetic reassortment as a
mechanism to generate viral biodiversity. The results of this study contribute to
further studies on genetic evolution and molecular epidemiology of phleboviruses,
and for the development of molecular methods for rapid genome detection of
phleboviruses associated with human disease.
Key word : Brazilian Amazon , Phleboviruses , genetic characterization
14
INTRODUÇÃO
1.1. CONSIDERAÇÕES GERAIS SOBRE ARBOVÍRUS
Os vírus são considerados biossistemas elementares que apresentam
algumas características encontradas em seres vivos, como genoma e capacidade de
adaptarem-se as mudanças do microambiente em que se encontram. Entretanto,
não podem captar ou armazenar energia e não são funcionalmente ativos fora da
célula hospedeira (Van Regenmortel & Mahy, 2004).
O vírus só se torna parte de um sistema vivo, quando seu genoma é
interiorizado na célula hospedeira e a produção de novas partículas torna-se
possível, por meio da utilização do metabolismo celular. Durante esse processo de
replicação podem ocorrer alterações genômicas, proporcionando ao vírus uma
variabilidade genética intrínseca, que permite sua adaptação por meio da seleção
natural, o que garante sua sobrevivência (Van Regenmortel, 2000).
Os vírus são constituídos por apenas um tipo de ácido nucléico: o ácido
desoxirribonucléico (DNA) ou ácido ribonucléico (RNA), o qual está envolvido por
uma estrutura de natureza protéica, o capsídeo, composta de unidades
denominadas capsômeros. Ao conjunto de capsídeo e ácido nucléico denomina-se
nucleocapsídeo, que pode ser circundado ou não por um envelope lípidico. Os vírus
com envelope possuem ainda glicoproteínas sob a forma de projeções (Oliveira,
1994; Pelczar Jr et al., 1997). De acordo com análises ultraestruturais, os capsídeos
virais podem apresentar simetria cúbica (icosaédrica), helicoidal ou ainda estruturas
complexas (Harrison et al., 1996).
O termo Arbovírus refere-se ao principal mecanismo biológico pelo qual os
vírus transmitidos por insetos hematófagos são mantidos em natureza. Os arbovírus
são mantidos em ciclos entre artrópodes hematófagos – vertebrados suscetíveis e
artrópodes hematófagos (Figura 1), ciclos esses que, geralmente não resultam no
envolvimento de seres humanos. Na maioria das vezes, a transmissão envolve uma
complexa interação entre vírus, vetor artrópode e hospedeiro vertebrado. A
competência do vetor, que é a sua habilidade de tornar-se infectado e de transmitir o
vírus a um hospedeiro vertebrado, é determinada por diversos fatores, incluindo o
próprio vírus, fatores genéticos, concentração viral no hospedeiro vertebrado
15
infectado, meio ambiente, temperatura, barreiras intestinais dos vetores e outros não
bem compreendidos (Calisher, 1998).
Artrópodes hematófagos de muitas espécies podem servir como vetores de
manutenção ou de disseminação. Vetores que amplificam o vírus podem ter altas
taxas de infecção e baixas taxas de transmissão, o que muitas vezes é compensada
por uma grande densidade populacional e grande propensão para alimentar-se
sobre uma eclética variedade de espécies de hospedeiros vertebrados (Calisher,
1998).
Os hospedeiros vertebrados dos arbovírus também tem um papel crítico na
manutenção e amplificação viral. Nestes, a replicação deverá ser suficiente para que
possa servir como fonte de infecção para o hospedeiro invertebrado no momento do
repasto sanguíneo, ou seja, o título viral tem que ser elevado o suficiente para
garantir a infecção dos vetores artrópodes. Além disso, o tamanho populacional dos
vertebrados suscetíveis deverá, também, ser grande o suficiente para que promova
um contato com outros artrópodes. Um único hospedeiro vertebrado infectado
poderá servir como fonte de infecção para muitos artrópodes, de tal maneira que
esses artrópodes possam tornar-se uma fonte de amplificação viral em situações
epidêmicas (Figura 1). (Calisher, 1998).
16
Figura 1 - Exemplo de ciclo de manutenção dos Arbovírus em natureza. Fonte: Azevedo et al., 2007.
A distribuição geográfica dos arbovírus é ampla. Com efeito, esses vírus têm
sido isolados em todos os continentes tanto nas regiões tropicais quanto nas
temperadas, com exceção da Antártida. Todavia, observa-se uma nítida
predominância dos arbovírus nas regiões tropicais, que oferecerem condições
ecológicas mais favoráveis. Isso ocorre devido, nos trópicos, existir maior
biodiversidade o que favorece a coexistência de grande diversidade de vetores e
hospedeiros vertebrados em todas as épocas do ano, ao passo que nos países de
clima temperado, o ciclo é diminuido durante o inverno, reiniciando-se na primavera
ou verão (Dégallier et al., 1990).
A distribuição dos 537 arbovírus isolados e registrados no Catálogo
Internacional de Arbovírus, incluindo outros vírus de vertebrados (Karabatsos,1985)
de acordo com os continentes inclui : África com 135, Ásia com 78, Austrália e ilhas
do Pacifico 60, Europa 35, América do Norte 91 e América do Sul 138 (Karabatsos,
2002).
17
1.1.1. Arbovírus no Brasil
No Brasil já foram isolados pelo menos 210 cepas diferentes de arbovírus e
outros vírus de vertebrados. A Seção de Arbovirologia e Febres Hemorrágicas
(SAARB) do Instituto Evandro Chagas (IEC) no período de 1954 a 2010 obteve
cerca de 14.000 isolamentos virais (Castro , 2012). Neste período, 200 tipos
diferentes de arbovírus e outros vírus de vertebrados foram identificados e
caracterizados, representando mais de um terço dos 537 vírus registrados no
Catálogo Internacional de Arbovírus Incluindo outros Vírus de Vertebrados. Entre
eles, 37 são patogênicos para o homem, 170 foram isolados pela primeira vez no
Brasil; e pelo menos 110, foram confirmados como novos vírus para a ciência
(Vasconcelos et al., 1998; Vasconcelos ,comunicação pessoal).
Na Amazônia brasileira, esses vírus estão distribuídos em cinco famílias e em
20 grupos sorológicos com 134 sorotipos diferentes, 34 estão associados com
infecções em humanos e mais um número significativo de vírus ainda não foram
agrupados ou classificados (Travassos da Rosa, et. al., 1997; 2000; Vasconcelos, et.
al., 1998; Azevedo et al., 2007; Martins et al., 2007).
A floresta Amazônica é uma das maiores reservas de arbovírus do mundo.
Tal fato ocorre não só devido às condições climáticas que favorecem a existência da
grande diversidade de fauna e flora, mas também a abundante variedade de
artrópodes hematófagos e animais silvestres, que constituem os elementos
essenciais para a manutenção desses vírus (Travassos da Rosa et al., 1997).
1.1.2. Propriedades Físico – Químicas dos Arbovírus
A classificação dos arbovírus pode ser feita de acordo com suas propriedades
antigênicas ou segundo suas características físico-químicas (Karabatsos, 1985).
As propriedades antigênicas classificam esses agentes em grupos
antigênicos, com base nos resultados de testes sorológicos, como: Fixação do
Complemento (FC); Inibição de Hemaglutinação (IH) e Teste de Neutralização (TN)
(Casals, 1967). Quando dois ou mais vírus apresentam cruzamento sorológico,
passam a constituir um grupo antigênico; os três primeiros grupos constituídos foram
18
designados pelas letras: A, B e C, os demais receberam o nome do primeiro vírus
isolado no respectivo grupo (Casals, 1957).
Com base em suas propriedades físico-químicas, a maioria dos arbovírus
está distribuída em cinco famílias: Bunyaviridae, Flaviviridae, Reoviridae,
Rhabdoviridae e Togaviridae (Van Regenmortel, 2000; King et al., 2012).
Os arbovírus possuem genoma constituído por RNA, exceto o vírus da peste
suína africana, que apresenta DNA (king et al., 2012). O RNA dos arbovírus pode
ser segmentado ou não, e apresentar-se com uma ou duas fitas nucleotídicas. Os
arbovírus com genomas não segmentados estão incluídos nas famílias Flaviviridae
(flavivirus), Rhabdoviridae (vesiculovirus) e Togaviridae (alfavirus) enquanto aqueles
com genomas segmentados incluem-se nas famílias Bunyaviridae (phlebovirus e
orthobunyavirus) e Reoviridae (orbivirus e coltivirus) (Quadro 1) ( Karabatsos, 1985;
Beaty et al., 1988: king et al., 2012).
Fonte: Adaptado de Van Regenmortel, 2000.
Os arbovírus das famílias Bunyaviridae, Flaviviridae, Rhabdoviridae e
Togaviridae apresentam acentuada sensibilidade aos solventes lipídicos (éter e
clorofórmio), e a detergentes (desoxicolato de sódio) enquanto que, os membros da
família Reoviridae, são pouco sensíveis (ou resistentes) aos mesmos. Essa
sensibilidade ou resistência deve-se a presença ou ausência do envelope lípidico,
Quadro 1 - Características gerais das famílias com arbovírus segundo algumas características físico-químicas.
19
respectivamente. Via de regra, os arbovírus são lábeis em pH ácido e estáveis em
pH alcalino. São rapidamente inativados a 56ºC, mas preservam-se bem quando
mantidos à temperatura de -70ºC ou, se liofilizados e mantidos à temperatura de -
20ºC (Pinheiro et al., 1997).
1.1.3. Características Epidemiológicas dos Arbovírus
As arboviroses podem constituir importantes problemas de saúde pública e
econômico-financeiro em todos os continentes, com exceção da Antártida. De fato
mais de 100 espécies de arbovírus são conhecidos por causar doenças em
humanos, 40 deles infectam animais domésticos e, pelo menos, 20 foram
responsáveis por epidemias (Karabastsos, 1985). Entre os arbovírus conhecidos no
Brasil, 34 têm sido incriminados como causadores de doença humana (Quadro 2),
dentre estes, cinco destacam-se por estarem associados a epidemias em humanos :
Virus dengue (VDEN) , Virus da febre amarela ( VFA) , Virus Mayaro (VMAY) , Virus
Oropouche (VORO) e Virus Rocio (VROC) (Vasconcelos et al., 1992; Travassos da
Rosa et al., 1997; 2000).
20
* EEE (Encefalite Equina Leste), EEV (Encefalite Equina Venezuelana), EEO (Encefalite Equina Oeste) e ESL (Encefalite Saint Louis). Fonte: Modificado de Vasconcelos et al., 2001.
A natureza da doença produzida em seres humanos varia conforme o tipo de
arbovírus responsável pela infecção. A maioria provoca uma síndrome febril, por
vezes acompanhada de exantema, que cursa sem causar morte ou incapacitação;
enquanto outros determinam quadros hemorrágicos (VDEN e VFA) ou encefalite
(VROC e VESL), observando-se significativa letalidade (Pinheiro et al., 1997;
Quadro 2 - Arbovírus patogênicos para humanos isolados no Brasil, 1954 -2013.
21
Travassos da Rosa et al., 1997; 1998). É oportuno frisar que o mesmo arbovírus é
capaz de causar diferentes síndromes clínicas e, por outro lado, a mesma
sintomatologia pode ser determinada por diferentes arbovírus (Travassos da Rosa et
al., 2000).
Com exceção do VDEN, todos os demais arbovírus isolados pela Seção de
Arbovirologia e Febres Hemorrágicas (SAARB) do IEC, mostram-se patogênicos
para camundongos albinos suíços recém-nascidos, ocasionando, sobretudo quadro
de encefalite fatal. Depois do sistema nervoso central (snc), o fígado parece ser o
órgão alvo mais comum de agressão desses vírus nos referidos animais (Araújo,
1980; Dias, 1986).
1.2. FAMÍLIA BUNYAVIRIDAE
Os vírus da família Bunyaviridae são encontrados, em todo mundo. A maioria
deles é constituída por arbovírus mantidos em natureza por transmissão biológica
entre hospedeiros vertebrados susceptíveis e artrópodes hematófagos, tais como:
mosquitos, flebotomíneos, maruins e carrapatos. Os hospedeiros são principalmente
primatas, roedores, marsupiais e aves. Mais de 60 membros desta família tem sido
reconhecidos por causarem doença em humanos ou animais; alguns,
inclusive,causam doenças em aves marinhas (Calisher, 1996).
Segundo o nono relatório do Comitê Internacional de Taxonomia Viral (ICTV),
a família Bunyaviridae registra 288 tipos diferentes de vírus, distribuídos em cinco
gêneros de acordo com suas propriedades físico químicas e antigênicas. Existem
atualmente, 148 vírus no gênero Orthobunyavirus; 42 no gênero Hantavirus; 31 no
gênero Nairovirus; 53 no gênero Phlebovirus e 14 no gênero Tospovirus. Dezenove
vírus adicionais têm características da família Bunyaviridae e foram colocados em
grupos sorológicos, mas não foram assinalados em nenhum gênero, além destes
existem 21 vírus não grupados e não classificados, com morfologia similar a dos
membros da família Bunyaviridae, para a maioria dos quais nenhuma caracterização
bioquímica tem sido informada para determinar seu “Status” taxonômico (king et al.,
2012).
Entre os membros desta família, alguns, são reconhecidamente patogênicos
para humanos, vertebrados silvestres ou plantas, por comprometerem
simultaneamente diversos órgãos ou tecidos, entre os quais temos: Orthobunyavirus
22
Não ArbovírusPlantasVirus tomato spotted wiltTospovirus
Não ArbovírusVertebradosVirus HantaanHantavirus
ArbovírusVertebradosVirus Nairobi sheep diseaseNairovirus
ArbovírusVertebradosVirus Sandfly fever SicilianPhlebovirus
ArbovírusVertebradosVirus BunyamweraOrthobunyavirusBunyaviridae
ClassificaçãoHospedeirosEspécie TipoGêneroFamília
(Virus La Crosse, Virus Oropouche, Virus Akabane); Nairovirus (Virus Crimean-
Congo hemorrhagic fever, Virus Nairobi sheep disease); Phlebovirus (Virus Rift
Valley fever, Sandfly Fever virus); Hantavirus (Virus Hantaan, Virus Puumala, Virus
Sin nombre) e Tospovirus (Virus tomato spotted wilt), sendo que os dois últimos
gêneros, não incluem arbovírus como membros. Outros Bunyaviridae ocasionam
doenças febris ou encefalites em humanos (Quadro 3) (Brés, 1988).
Fonte: Modificado de http://www-micro.msb.le.ac.uk/3035/Bunyaviruses.html.
1.2.1. Propriedades Físico – Químicas dos Vírus da Família Bunyaviridae
Os membros da família Bunyaviridae são vírus de RNA, esféricos e
envelopados, medindo de 80 a 120 nm de diâmetro, que possuem projeções
glicoprotéicas na superfície de 5 a 10 nm, e que estão fixadas em uma matriz lipídica
de 5 nm de espessura. O envelope viral é normalmente derivado das membranas do
Complexo de Golgi ou da própria membrana celular citoplasmática da célula
hospedeira (Figura 2) (King et al., 2012).
Quadro 3 - Os cinco gêneros da família Bunyaviridae.
23
Esses vírus possuem composição química aproximada de 2 % de RNA, 58 %
de proteínas, 33 % de lipídeos, e 7 % de carboidratos (Virus Uukuniemi)
(Schmaljohn,1996; Mertz,1997). Apresentam RNA de fita simples que é
trissegmentado, dois segmentos têm polaridade negativa (RNAc) e são
denominados grande (L), com 6.875 nucleotídeos (Virus Bunyamwera) e médio (M),
com 4.458 nucleotídeos (Virus Bunyamwera). O terceiro segmento, denominado
pequeno (S), possui 961 nucleotídeos (Virus Bunyamwera) e pode apresentar-se
ambisenso em alguns membros da família (Lees et al., 1986; Elliott, 1989 a; 1989 b;
King et al., 2012; Mertz, 1997).
Figura 2 - Representação esquemática da partícula viral dos membros da família Bunyaviridae. Legenda: Gc glicoproteína de superfície carboxiterminal; Gn glicoproteína aminoterminal; SRNA, MRNA e LRNA. Fonte: Adaptado de King et al., 2012.
24
Os tamanhos dos três segmentos genômicos variam entre os cinco diferentes
gêneros da família Bunyaviridae (Quadro 4), e as sequências complementares 3’ e 5’
terminais oferecem ligações estáveis, não covalentes, com pareamento de bases, o
que permite aos segmentos apresentar-se em forma circular. O vírus apresenta,
também, uma RNA polimerase (dependente de RNA), de 240 a 260 kDa,
denominada L. As extremidades dos segmentos de RNA servem como sítio de
reconhecimento para a polimerase viral (Schmaljohn, 1996).
Quadro 4 - Tamanho em nucleotídeos (nt), da sequência completa dos três segmentos de alguns membros da família Bunyaviridae.
L
Fonte: Adaptado de King et al., 2012.
As proteínas estruturais dos vírus da família Bunyaviridae são a
ribonucleoproteina N, com 26,5 kDa, que é codificada no segmento S do RNA viral e
as glicoproteínas Gn e Gc do envelope viral, que são proteínas estruturais,
codificadas no segmento M. A proteína L, que possui atividade de RNA polimerase
dependente de RNA é codificada no segmento L. O segmento S é ambisenso em
vários membros da família, sendo a cadeia aberta de leitura da nucleoproteína N,
localizada na primeira metade do segmento, próximo à extremidade 3’ e à proteína
NSs sobreposta à proteina N ,na segunda metade (Pekosz & Gonzáles-
Scarano,1996; Schmaljohn,1996; King et al., 2012).
Além das proteínas estruturais, existem proteínas não estruturais, NSs e
NSm, nos segmentos SRNA e MRNA,respectivamente . A proteína NSs de 7,5 kDa
atua como um fator de virulência, ajudando o vírus a desviar a síntese protéica da
célula hospedeira e inibindo a síntese de interferon (Bridgen et al., 2001), além de
controlar a atividade da polimerase no processo de replicação viral (Weber et al.,
25
2001). A proteína NSm de 11 kDa, provavelmente está envolvida no processo de
montagem da partícula viral (Figura 3) (Nakitare & Elliott,1993).
Figura 3 - Organização genômica e estratégias de codificação das proteínas dos
vírus pertencentes a diferentes gêneros da família Bunyaviridae
Fonte: Modificado de King et al., 2012.
1.2.2. Replicação Viral dos Membros da Família Bunyaviridae
A infecção causada por vírus da família Bunyaviridae inicia-se pela ligação
viral à membrana celular, sendo ligantes a proteína Gc para células de vertebrados e
a proteína Gn para células de artrópodes (Mertz, 1997).
Os vírus invadem a célula, por endocitose, e fundem seu envelope a
membranas endossômicas, o que permite ao nucleocapsideo viral atingir o
citoplasma. Caracteristicamente, o genoma viral permanece como
ribonucleoproteína, sem desnudamento total do capsídeo, que se apresenta com
formato circular, associado às numerosas cópias de proteína N e poucas cópias de
Proteína L (RNA polimerase) (Schmaljohn,1996; King et al ., 2012).
Primeiramente, utilizando a polimerase viral, ocorre uma transcrição primária
de RNA (-) do vírus para RNA (+) mensageiro (RNAm) e uma replicação a RNA (+)
complementar. Em seguida, em ribossomos livres, inicia-se uma rápida tradução dos
26
RNAm dos segmentos L e S. As proteínas N e NSs de membros do gênero
Phlebovirus estão presentes no citoplasma da célula infectada duas horas após a
infecção. A Tradução também ocorre com o RNAm do segmento M, o qual se liga a
ribossomos de membrana do retículo endoplasmático rugoso e ali ocorre a síntese
de uma poliproteina. Em determinado momento, a polimerase viral muda sua função
de transcrição primária de RNAm do genoma viral para a replicação do genoma da
progênie (Schmaljohn,1996 ).
Inicia-se a transcrição do RNA (+) complementar, a partir do terminal 3’,
produzindo-se um RNA (-) encapsulado na progênie viral. A poliproteína codificada
pelo segmento M é clivada, formando as proteínas Gn e Gc, as quais são, em
seguida, glicosiladas no complexo de Golgi (Schmaljohn,1996; King et al., 2012).
A montagem viral ocorre após o acúmulo das glicoproteínas no complexo de
Golgi, em seguida a partícula viral brota através de vesículas do complexo de Golgi.
Finalmente, a progênie viral é liberada por exocitose com fusão das membranas das
vesículas citoplasmáticas à membrana celular (Figura 4) (Schmaljohn, 1996; King et
al., 2012).
Figura 4 - Estratégia de replicação dos membros da família Bunyaviridae. Fonte: Fonte: Adaptado de Schmaljohn & Nichol, 2007.
27
1.3. GÊNERO PHLEBOVIRUS
Os vírus do gênero Phlebovirus, são de considerável importância em saúde
pública, porque podem causar uma variedade de síndromes clínicas, que variam de
uma doença febril autolimitada, com ou sem exantema, até retinites, encefalites,
meningoencefalites e febre hemorrágica fatal (Bartelloni & Tesh 1976; Laughlin et
al., 1979; Meegan et al., 1979; Peters & Slone, 1982, Tesh, 1988; Nicoletti et al.
1991; Braito et al. 1998; Charrel et al.,2009; Moureau et al., 2010).
Os vírus do grupo da febre dos flebótomos são transmitidos por
flebotomíneos, culicídeos e ceratopogonídeos, já os vírus do grupo Uukuniemi são
transmitidos por carrapatos (Elliott et al., 2000; King et al., 2012).
Historicamente, os Phebovirus causaram doenças de importância militar,
tendo ocorrido em tropas austríacas estacionadas no mar Adriático, e foi um
problema persistente entre as tropas coloniais britânicas na Índia e no Paquistão no
início do século 20 (Anderson et al., 1941).
Durante a segunda guerra mundial, grande número de soldados americanos,
britânicos e germânicos ficaram doentes no norte da África e na região do
Mediterrâneo, doenças essas causadas por Phlebovirus (Walker, 1941).
Epidemias causadas por Phlebovirus são comuns na Europa Central e em
regiões da antiga União Soviética, nos meses de verão, ocorrendo também entre
turistas que visitam o mar Negro, tendo ocorrido uma epidemia na Sérvia em 1948,
onde mais de um milhão de pessoas ficaram doentes (Pavlovsky, 1947; Guelmino &
Jevtic, 1955; Tesh & Papaevangelou, 1977).
Ainda no Velho Mundo, a ocorrência de epidemias e casos isolados de
doença são observadas em áreas endêmicas da Europa, da África e da Ásia, onde
nativos, turistas e militares, tornam-se alvos dessas arboviroses (Laughlin et al.,
1979; Ehrnst et al., 1985; Moureau et al., 2010 ).
O Virus Toscana é endêmico na Itália, onde causa quadros de meningites em
adultos e crianças, tendo casos confirmados na Espanha e Portugal, e ocorrência
em outros países banhados pelo mediterrâneo (Santos et al.,2007).
No Novo Mundo, durante as décadas de 1960 e 1970, arbovírus desse
gênero foram identificados, inicialmente nas Américas do Sul e Central e
posteriormente na América do Norte (Mclean, 1972; Srihongse & Johnson, 1974;
Calisher et al., 1977;Travassos da Rosa et al., 1983).
28
O gênero Phlebovirus (Bunyaviridae) contém aproximadamente 53 tipos virais
conhecidos e registrados pelo ICTV, que são divididos em dois grupos antigênicos :
O grupo da febre dos flebótomos (Sandfly Fever), 40 membros , e o grupo
Uukuniemi com 13 membros ; e mais dezesseis vírus do gênero não agrupados. O
grupo Uukuniemi apresenta-se com somente um sorocomplexo com o mesmo nome,
já o grupo da febre dos flebótomos é dividido em oito sorocomplexos (Bujaru,
Candiru, Chilibre, Frijoles, Punta Toro, Rift Valley fever, Salehebad e Sandfly fever
Naples), listados no nono relatório do Comitê Internacional de Taxonomia Viral,nos
últimos anos novos sorocomplexos foram criados ,mas ainda não constam no
relatório do ICTV, como: Aguacate,Joa, Salobo,Bhanja,Murre, Heartland, Precarious
Point , Grand Arbaud e SFTSV (Xu et al., 2007 a;2007 b ; King et al., 2012; Palacios
et al.,2011a, 2011b;Matsuno et al.,2013).
Entre os vírus do grupo da febre dos flebótomos registrados, oito destacam-se
por sua importância médica: Virus Sandfly fever Sicilian, Virus Sandfly fever Naples,
Virus Toscana, Virus Rift Valley fever, Virus Chagres, Virus Punta Toro, Virus
Candiru e Virus Alenquer, todos isolados de pessoas com quadro clínico de doença
febril aguda (Karabatsos,1985).
Podemos incluir a esses outros dois vírus também isolados de humanos, mas
ainda não registrados no Catálogo Internacional de Arbovírus, incluindo outros Vírus
de Vertebrados, a saber: Virus Morumbi e Virus Serra Norte, isolados de pacientes
apresentando quadro febril agudo autolimitado (Rodrigues et al.,1998). Existem
evidências sorológicas que outros vírus do grupo causam infecção em humanos, são
eles: Virus Arumowot, Virus Bujaru, Virus Itaporanga, Virus Gabek forest, Virus
Gordil, Virus Karinabad e Virus Saint Floris (Tesh et al., 1982).
O Virus Rift Valley fever é o único que produz doença em humanos e animais
domésticos, sendo que em humanos, esse vírus causa desde um quadro febril
autolimitado até encefalites, e hepatites fatais acompanhadas de hemorragias (Tesh,
1988). Crianças tem sido afetadas com mais severidade. Quadros não usuais como
retinites são descritos com certa frequência e costumam ser graves. Entre animais
jovens, bezerros e cordeiros, a maioria morre por hepatite aguda, vale ressaltar que
abortos são frequentes entre animais infectados por esse vírus (Vialat et al., 2000).
O grupo Uukuniemi, foi considerado no passado um gênero isolado, mas
atualmente está incluído no gênero Phlebovirus, por apresentar significativas
relações antigênicas e sequências nucleotidícas homólogas com os vírus desse
29
gênero, quando comparado com outros gêneros (Murphy et al., 1995; King et
al.,2012).
Diversos vírus do grupo da febre dos flebótomos, mas nenhum do grupo
Uukuniemi foi associados a doenças em humanos, embora anticorpos para vírus
deste grupo tenham sido detectados em populações humanas no Velho Mundo
(Tesh, 1988; Beaty & Calisher, 1991). Os vírus do grupo Uukuniemi tem sido
utilizados há muitos anos como modelo para estudar a estrutura e replicação da
família Bunyaviridae (Simons et al., 1990; Overby et al., 2006).
1.3.1. Propriedades Físico - Químicas dos Membros do Gênero Phlebovirus
As primeiras observações sobre a morfologia dos membros do gênero
Phlebovirus foram feitas por microscopia eletrônica, mediante a técnica de
contrastação negativa do Virus Uukuniemi. Esse vírus apresenta partículas
esféricas, com diâmetro variando entre 80 e 120 nm; superfície com arranjo
hexagonal regular de subunidades, que parecem capsômeros ocos, com projeção
medindo em torno de 9 nm (Figura 5) (Saikku & Von Bonsdorff, 1968; Saikku et
al.,1970; King et al.,2012).
30
Figura 5 - Partículas do Virus Rift Valley fever e Virus Uukuniemi. A barra representa 50 nm. Fonte: King et al., 2012.
A classificação atual dos membros do gênero Phlebovirus é insatisfatória, por
causa da pouca informação genética sobre os mesmos, e por existirem ainda 16
vírus não agrupados (Liu et al., 2003 ; King et al.,2012) . Os vírus desse gênero
foram classificados por seus relacionamentos sorológicos, sendo as relações
antigênicas entre eles determinadas pelo teste de IH (usado para determinar
gênero), enquanto o teste de FC se presta para determinar o sorogrupo e a
classificação dentro de um complexo. O Teste de neutralização e o teste de
neutralização com redução de placa (TNRP) são usados para a diferenciação do
sorotipo e do subtipo, sendo o TNRP o método sorológico mais sensível para a
classificação, e por todos esses testes, os Phlebovirus apresentam variados graus
de reação cruzada, sendo normalmente reações fracas (Tesh et al., 1976, 1982;
Travassos da Rosa et al., 1983; Liu et al., 2003; Xu et al.,2007 a).
31
1.3.2. Organização Genômica
O genoma dos membros do gênero Phlebovirus, como ocorre em outros
gêneros da família Bunyaviridae, compreende três segmentos de RNA de fita
simples, helicoidais e suplementares, denominados, L (Grande), M (Médio) e S
(Pequeno), e cada um dos segmentos contribui de forma diferente para a
patogênese viral (King et al.,2012) . Os segmentos L e M são de polaridade
negativa. O segmento L codifica a proteína L, uma proteína com função de RNA
polimerase dependente de RNA, enquanto o segmento MRNA codifica as
glicoproteínas de superfície Gn e Gc e a proteína não estrutural NSm ; por outro
lado, nos Phlebovirus o segmento SRNA utiliza uma estratégia ambisenso e produz
duas proteínas, a nucleoproteína estrutural N no sentido anti-senso e a não
estrutural NSs na direção senso, já tendo sido demonstrado que essas duas
proteínas são as principais determinantes para a patogênese neste gênero.
Internamente cada segmento parece conter uma única sequência primária sem
sobreposição entre os mesmos (Petterson et al., 1977, Roberson et al., 1979; King et
al., 2012, Nichol et al., 2005., Nunes et al., 2005, Perrone et al., 2007). Pouco se
sabe sobre as propriedades do segmento LRNA em Phlebovirus; a proteína L,
presumivelmente possui função de transcriptase viral, porém são necessários mais
estudos para elucidar a estratégia de expressão desse segmento, assim como as
propriedades funcionais de seu produto gênico com maior exatidão (Bishop, 1990).
O segmento MRNA já foi bastante estudado, para os seguintes vírus; Virus
Rift Valley fever, Virus Toscana, Virus Punta Toro e Virus Uukuniemi (Collet et
al.,1985 ; Ihara et al.,1985; Ronnholm & Pettersson, 1987; Suzich et al.,1990; Di
Bonito et al.,1997; Liu et al., 2003).
As glicoproteínas Gn e Gc são importantes para a infecção, patogênese e
imunidade virais, e são alvos dos anticorpos produzidos (Keegan & Collet,1986; Pifat
et al.,1988). A atividade biológica é depende da estrutura terciária dessas
glicoproteinas e mesmo uma única substituição de amino ácido pode comprometer
essa atividade (Schmaljohn et al., 1990).
Como estão expostas na superfície dos vírus, as glicoproteínas devem sofrer
pressão seletiva de hospedeiro, e é provável que elas variem de cepa para cepa,
particularmente os epítopos que entram em contato com os anticorpos.
Consequentemente, a análise do segmento MRNA pode fornecer uma aproximação
32
mais sensível à classificação dos phlebovírus (Liu et al., 2003, Nunes-Neto, 2007).
Assim como seu estudo é importante para uma futura e eventual produção de vacina
recombinante (Bishop, 1990), enquanto que o estudo do segmento SRNA é
importante tanto para o entendimento dos mecanismos de patogênese, como para
auxiliar nos estudos de rearranjo viral dentro do gênero Phlebovirus (Bishop,1990;
Nunes et al., 2005;Perrone et al.,2007; Xu et al., 2007b, Nunes-Neto, 2007).
1.3.3. Membros do Gênero Phlebovirus Isolados na Amazônia Brasileira
Na Amazônia brasileira, já foram isolados até o momento 22 membros do
gênero Phlebovirus (quadro 5), dos quais nove vírus ainda não se encontram
registrados no ICTV e cinco vírus registrados, mas ainda não agrupados em
complexos sorológicos:Virus Anhanga, Virus Itaporanga, Virus Uriurana e Virus
Urucuri ( Rodrigues et al.,1998; King et al.,2012).
33
Fonte: Modificado de Rodrigues et al., 1998.
Quadro 5 - Membros do gênero Phlebovirus isolados na Amazônia brasileira.
34
Desse total de 22 Phlebovirus, quatro foram obtidos de amostras de
sangue e soro de seres humanos com doença febril aguda autolimitada e os
demais foram isolados de marsupiais, roedores, flebotomíneos (Lutzomyia) e
mosquitos (Culex e Coquillettidia);o isolamento desses vírus está ligado à
implantação de grandes projetos na região, como construção de estradas,
hidrelétricas e projetos minerais ao longo das décadas de 1960 à 1990 (Aitken
et al., 1975, Rodrigues et al.,1998;Travassos da Rosa et al., 1998).
Um fato importante é que todos os vírus isolados de seres humanos até
o momento, quais sejam Virus Candiru, Virus Alenquer, Virus Serra Norte e
Virus Morumbi pertencem ao mesmo complexo antigênico, o Complexo
Candiru (Vasconcelos et al.,1992; Nunes-Neto, 2007). Pouco se sabe sobre os
relacionamentos genéticos dos Phlebovirus isolados na Amazônia brasileira, já
que tem sido realizados, principalmente, estudos de sequenciamento
nucleotídeo parcial de alguns vírus e estudos de relação antigênica através de
testes sorológicos (Tesh et al.,1982; Travassos da Rosa et al.,1983;
Bishop,1990; Rodrigues et al.,1998; Xu et al., 2007a; 2007 b; Nunes-Neto,
2007).
35
1.4. OBJETIVOS
1.4.1. Objetivo Geral
Caracterizar molecularmente de vírus pertencentes ao gênero
Phlebovirus, grupo da febre dos flebótomos isolados na Amazônia brasileira.
1.4.2. Objetivos Específicos
Obter sequências nucleotídicas completas para os segmentos SRNA,
MRNA e LRNA dos membros do gênero Phlebovirus incluídos no
estudo;
Caracterizar geneticamente os segmentos SRNA, MRNA e LRNA;
Identificar os domínios e os motivos conservados das proteínas dos
membros do gênero phlebovirus incluidos no estudo;
Identificar os sítios de clivagem, resíduos de cisteína e sítio de
glicosilação nas sequências de aminoácidos dos vírus em estudo;
Realizar análise filogenética comparativa e evolutiva;
Avaliar a possibilidade de rearranjo genético em natureza.
36
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1. MATERIAL
2.1.1. Amostras Virais
Nesse estudo foram utilizados 14 vírus do gênero Phlebovirus (família:
Bunyaviridae), isoladas na Amazônia brasileira. As informações referentes o
seu registro, abreviatura, hospedeiro, ano de isolamento e localização
geografica da coleta da amostra original, encontram-se assinaladas no quadro
6 e figura 6. As amostras virais foram obtidas da coleção de vírus da Seção de
Arbovirologia e Febres Hemorrágicas do IEC / SVS / MS, Ananindeua - Pará.
Quadro 6 - Amostras Virais.
Vírus Abreviatura Registro Hospedeiro Ano de isolamento
Virus Alenquer VALE BEH301101 Homo sapiens 31-05-1976
Virus Anhanga VANH BEAN46852 Choleopus brasiliensis 01-10-1962
Virus Ariquemes VARQ BEAR485678 Luztzomyia sp. 30-12-1988
Virus Candiru VCDU BEH22511 Homo sapiens 27-09-1960
Virus Itaituba VITA BEAN213452 Didelphis marsupialis 08-12-1971
Virus Jacunda VJAN BEAN428329 Myoprocta agouci 31-10-1984
Virus Morumbi VMRB BEH475236 Homo sapiens 12-04-1988
Virus Mucura VMRA BEAR455230 Anophleles triannulatus 30-05-1985
Virus Oriximina VORX BEAR385309 Luztzomyia spp. 07-03-1980
Virus Serra Norte VSRN BEH505240 Homo sapiens 01-03-1991
Virus Tapara VTAP BEAR413570 Phlebotominae sp. 04-02-1983
Virus Turuna VTUA BEAR352492 Luztzomyia sp. 26-07-1978
Vrus Uriurana VURI BEAR479776 Phlebotominae sp. 16-12-1985
Virus Urucuri VURU BEAN100049 Proechimys guyannensis 19-04-1966
37
Figura 6 - Local de coleta das amostras estudadas.
38
2.2. MÉTODO
2.2.1. Vírus em Estudo
Os 19 vírus do grupo da febre dos flebótomos utilizados neste estudo
foram obtidos a partir do estoque viral da SAARB-IEC, utilizando cérebros de
camundongos suíços recém-nascidos (Mus musculus) infectados com esses
vírus. Foi preparada suspensão de cérebro de camundongo diluída em 1 mL de
água livre de RNAse e DNAse para cada um dos vírus, sendo essa suspensão
utilizada para todas as demais etapas que envolvam o sequenciamento desses
agentes virais.
2.2.1.1 Preparo de estoque viral
A partir dos cérebros de camundongos recém-nascidos infectados
obtidos foi preparada suspensão, macerando-se os cérebros de camundongos
com auxílio de gral e pistilo, e diluindo-se em 1,5 mL de água livre de RNAse e
DNAse. A suspensão preparada foi centrifugada em centrífuga refrigerada
(Thermo Scientific) por 5 minutos à 5.000 rpm e, em seguida, foi filtrada com
auxilio de filtro de 0,22 µm acoplado em seringa. Posteriomente, cada
suspensão foi inoculada em sua respectiva garrafa de 150 cm2 contendo
células VERO oriundas de macaco verde africano (Cercopithecus aethiops)
(ATCC: CCL-81) (RHIM et al., 1962). Para a inoculação, o meio de crescimento
(meio 199 com 5% de soro bovino fetal) das garrafas foi substituído pelo meio
de manutenção (meio 199 com 2% de soro bovino fetal) e, em seguida o
volume de 1 mL da suspensão filtrada foi diluído em 4 mL de meio de cultura
de manutenção. Esses 5 mL foram inoculados utilizando o método de
adsorção, pelo qual as garrafas, após inoculação, foram incubadas em estufa a
37 ºC com 5% de CO2 durante 1 hora, realizando homogeneização manual das
garrafas para espalhamento da suspensão por toda a área.
Imediatamente após o intervalo de incubação de 1 hora, as garrafas
foram retiradas da estufa e foram então, acrescentados 45 mL de meio de
manutenção em cada uma delas. Seguidamente, as garrafas contendo as
células infectadas foram incubadas novamente em estufa, conforme
especificações descritas anteriormente, e visualizadas diariamente em
39
microscópio invertido (Zeiss) para detecção de efeito citopático (ECP), sendo
estas garrafas coletadas (congeladas a -70ºC) quando obsevou-se
aproximadamente 90 % de ECP.
2.2.2. Tratamento das Amostras com Nuclease
Objetivando reduzir a quantidade de DNA e RNA contaminante (ácidos
nucléicos provenientes da célula hospedeira), cada amostra (165,7 µL) foi
tratada com 20 U de DNAse Turbo (Ambion, Austin, TX), 36 U de benzonase
(Novagen, Damstadt, Germany) e 28 U de RNAse One (Promega, Madson,
WI). As amostras foram ajustadas para o volume final de 200 µL usando o
tampão DNAse 10X (Ambion, Austin, TX) e incubadas a 37 ºC por duas horas.
Após o período de incubação, as amostras foram imediatamente utilizadas para
a extração do RNA viral.
2.2.3. Extração do RNA Viral
Para a obtenção do RNA genômico serão utilizados 200 µL da amostra
viral previamente tratada, sendo, o RNA genômico, extraído pelo equipamento
MagNA Pure LC 2.0 (Roche, Alemanha) utilizando o kit MagNA Pure LC Total
Nucleic Acid Isolation, seguindo as instruções do fabricante, ao final o RNA foi
eluído em 50 µL de tampão disponível no referido kit.
2.2.4. Quantificação do RNA
A quantificação do RNA foi realizada no espectrofotômetro NanoDrop
2000 (Thermo Fisher Scientific, EUA), de acordo com as instruções do
fabricante. Este procedimento foi realizado para averiguar a concentração do
RNA viral após a extração, no qual esta concentração é medida em
nanogramas por microlitro (ng/ µL). Para tal, foi utilizado 1 µL da solução
contendo o RNA viral. Além disso, a qualidade do RNA obtido na extração
também foi avaliada no NanoDrop 2000, a qual foi determinada através da
razão 260/280 nm, cujo resultado, ficou entre 1,8 a 2,0 nm.
40
2.2.5. Obtenção das Sequências Nucleotídicas no GS FLX Genome
Sequencer 454™
Para a obtenção das sequências nucleotídicas completas foi utilizada a
plataforma de sequenciamento: GS FLX Genome Sequencer 454™ (Roche
Applied Science). A obtenção das sequências nucleotídicas utilizando a
plataforma de sequenciamento GS FLX Genome Sequencer 454™ (Roche
Applied Science) incluiu três etapas: I) Preparação de biblioteca genômica; II)
Amplificação clonal da biblioteca genômica utilizando micro - esferas de
captura; III) sequenciamento.
2.2.6. Preparação da Biblioteca Genômica
Partindo-se de um genoma de RNA, o primeiro passo foi realizar a
preparação de uma biblioteca a partir de DNA complementar fita dupla
(dscDNA) ao RNA viral previamente fragmentado. A fragmentação do RNA foi
realizada pelo método de fragmentação química pela exposição ao cloreto de
zinco (ZnCl2) a 5% e Tris-HCl (1M - PH 7,0), durante cinco minutos à
temperatura ambiente (±25°C). A fragmentação do RNA foi avaliada utilizando
o RNA 6000 Pico chip (Agilent Technologies, Alemanha) sendo gerados
fragmentos com tamanho entre 200 a 700 pares de bases (pb) , sendo utilizado
para a leitura o equipamento Bioanalyzer 2100 (Agilent Tecnologies,
Alemanha) , conforme instruções do fabricante.
Após uma fragmentação bem sucedida, foi realizada a construção da
dupla fita de cDNA, onde a síntese da primeira e da segunda fita de cDNA
ocorre em momentos distintos, utilizando-se para tal o kit cDNA Synthesis
System (Roche,Alemanha). Em seguida, foi realizada a purificação da dupla fita
do cDNA com o intuito de eliminar produtos inespecíficos que possam interferir
nas próximas etapas. Posteriormente, realizou- se o reparo das extremidades
dos fragmentos gerados com a síntese do cDNA.
Após a realização do reparo das extremidades, dois diferentes
adaptadores universais foram ligados a extremidades das fitas de cDNA
(adaptador A e adaptador B), sendo que o adaptador A promove a ligação da
polimerase para a amplificação clonal de um único fragmento ao redor da
41
microesfera (bead), e o adaptador B confere a propriedade de ligação desse
fragmento à microesfera, as bibliotecas foram construídas empregando o kit de
preparação de bibliotecas genômicas (fragment cDNA library kit, Roche).
2.2.7. PCR emulsão (emPCR)
Por meio do processo de amplificação clonal baseada em emulsão
(emPCR), a biblioteca contendo os fragmentos genômicos (cDNAs contendo os
adaptadores) foram postas em contato com esferas magnéticas de captura
requeridas durante a etapa de sequenciamento mediante o processo de
criação de microreatores (emulsão). Este processo foi realizado pelo kit
emPCR (Roche) levando aproximadamente oito horas de processamento.
2.2.8. emPCR para titulação
Antes de realizar o emPCR para sequenciamento propriamente dito,
torna-se necessário conhecer o número de cópias de cDNA por microesfera de
captura ideal para obtenção do rendimento máximo do sequenciador
(100.000.000 de leituras para uma região; 40.000.000 de leituras para duas
regiões; 15.000.000 de leituras para oito regiões). Este processo denomina-se
emPCR de titulação.
A titulação foi realizada para cada amostra previamente amplificada pelo
PCR em emulsão empregando o kit Small Volume (Roche Applied Science)
seguindo a recomendação do protocolo do fabricante que submete cada
amostra a quatro diluições distintas que representam: 2, 4, 8 e 16 cópias de
cDNA por microesfera de captura.
Inicialmente tubos de 2 mL contendo, emulsão oleosa foram submetidos
à vigorosa agitação no equipamento Tissuelyser II (Qiagen) ajustado para 50
Hz durante cinco minutos. Após a homogeneização da emulsão oleosa, as
amostras foram adicionadas aos respectivos tubos juntamente com as
enzimas, iniciadores complementares aos adaptadores e tampão de emPCR,
sendo novamente submetidos à vigorosa agitação 50 Hz durante cinco
minutos, objetivando a formação de microreatores.
42
Em geral, cada microrreator (gotícula emulsão oleosa), contém somente
um fragmento de cDNA ligado a uma única micro-esfera pelo adaptador B
(microreator clonal). O fragmento de cDNA contido em cada microreator foi
amplificado isoladamente produzindo milhões de cópias clonais.
Ao final da reação de PCR em emulsão, o processo de enriquecimento
foi realizado. Esta etapa consiste na recuperação de microesferas que
contenham fragmentos de DNA e eliminação das que não contenham DNA
amplificado. A seleção das microesferas com amplificação clonal foi realizado
pelo processo de ligação de sondas complementares ao DNA amplificado
capazes de se hibridizarem a microesferas de captura.
A quantificação e determinação da melhor relação cópias de DNA/micro-
esferas de captura foram verificadas para o sequenciamento no GS FLX
Genome Sequencer 454™ (Roche Applied Science), pelo emprego do
equipamento CASY DT (Roche Innovatis). Após a obtenção das informações
referentes à quantidade de cópias de DNA / microesferas de capturas, realizou-
se o emPCR para sequenciamento de forma semelhante ao descrito acima,
apenas substituindo-se o kit small Volume , pelo kit Large Volume (Roche
Applied Science).
2.2.9. Sequenciamento das Amostras por Pirosequenciamento
O primeiro quesito a ser observado para que se tenha um bom
sequenciamento é a realização da limpeza do sistema (pre-wash) GS FLX
Genome Sequencer 454™. Posteriormente, seleciona-se a placa com a
apropriada quantidade de regiões, na qual foram depositadas as amostras. De
modo que existem placas para 2, 4 e 8 regiões, as quais permitem,
individualmente, o depósito de, respectivamente, 2, 4 e 8 amostras.
A escolha da placa para o sequenciamento depende: (1º) diretamente do
tamanho do organismo que se pretende sequenciar; (2º) da cobertura do
sequenciamento, a qual se refere à confirmação da veracidade da posição das
bases nucleotídicas. Assim, dependendo da placa escolhida, será depositada
uma quantidade diferente de microesferas de bibliotecas de cDNA por região, o
que resulta em uma quantidade de fragmentos de leitura diferentes para
análise. Desta forma, a placa com duas regiões proporciona o depósito de mais
43
microesferas, e a placa com oito regiões resulta no depósito de menos
microesferas. Consequentemente, a placa com duas regiões fornecerá mais
fragmentos de leitura de oito regiões gerará menos fragmentos de leitura.
O processo de confecção da placa envolve o depósito de quatro
camadas de microesferas, com o auxílio de um suporte para deposição. A
primeira camada corresponde ao depósito de microesferas enzimáticas (pré-
camada), a segunda camada a microesferas que contém a biblioteca de cDNA,
a terceira camada a microesferas enzimáticas (pós-camada), e a quarta
camada a microesferas com PPiase. Após o depósito da última camada, a
placa foi levada ao GS FLX 454 e o equipamento promoveu, dentro de
aproximadamente 8 horas, o sequenciamento completo do genoma viral.
A leitura da sequência nesse sistema é realizada a partir de uma
combinação de reações enzimáticas que se inicia com a liberação de um
pirofosfato, oriundo da adição de um ou mais desoxinucleotídeos
complementares ao DNA alvo. Em seguida, esse pirofosfato é convertido em
ATP, pela ATP sulfurilase, sendo este utilizado pela luciferase para oxidar a
luciferina, produzindo um sinal de luz capturado por uma câmera CCD (charge-
coupled device) acoplada ao sistema.
2.2.10. Análise Computacional
2.2.10.1. Montagem dos Genomas obtidos pelo GS FLX Genome Sequencer
454™ (Roche Applied Science)
Para montagem das sequências obtidas pelo sistema de
pirosequenciamento foi utilizado o pipeline desenvolvido laboratório de
Bioinformática do Centro de Inovações Tecnológicas do Instituto Evandro
Chagas, o qual corresponde à etapa de pré-processo utilizando-se o modulo
GS De Novo Assembler (www.454.com/products-solutions/analysis-tools/gs-de-
novo assembler) foi usado para a montagem propriamente dita, disponível no
pacote de programas Newbler versão 2.0 (Roche Applied Science) como
algoritmo de montagem. Inicialmente, as sequências foram submetidas a um
prévio processo de montagem onde as reads (pequenas sequências de DNA
geradas pelo sequenciador) foram confrontadas contra um banco de dados do
44
Genbank que contém sequências de hospedeiros (mosquitos, humanos e
vertebrados silvestres). Esta estratégia tem como objetivo a retirada de
sequências inespecíficas (sequências do hospedeiro). Este pré-processo
favorecerá a montagem mais rápida e efetiva computacionalmente (Gordon,
2004).
A validação do genoma foi feita mediante comparação entre os contigs
(conjunto de reads) montados, sendo escolhida como a montagem mais correta
aquela que obteve o maior valor de confiabilidade do programa Newbler e com
a maior incorporação de leituras (reads) no contig. O genoma final obtido foi
visualizado pelo programa Geneious versão 7 (Biomatters, Nova Zelândia), o
mesmo foi utilizado nas etapas de fechamento de gaps e curadoria, e
posteriormente o contigs foram confrontados com sequências disponíveis no
banco de dados do National Center for Biotechnology Information (NCBI)
(www.ncbi.nlm.nih.gov/) para identificação empregando o programa BLASTP e
BLASTN (www.blast.ncbi.nlm. nih.gov/Blast).
2.2.10.2. Genômica Descritiva: Análises e Identificações
Para geração de dados descritivos, inicialmente as sequências
nucleotídicas completas obtidas dos segmentos SRNA, MRNA e LRNA foram
identificadas pelo programa BLAST (Basic Local Aligning Search Toll)
disponível no portal do NCBI (www.nchi.nhi.org) (Altschul et al., 1996). Neste
mesmo programa foi possível selecionar as sequências disponíveis no
GenBank de outros Phlebovirus. Posteriormente, as sequências nucleotídicas
foram comparadas entre si e com outras sequências de membros do gênero
Phlebovirus disponíveis no GenBank utilizando o programa Geneious e Clustal
X (Thompson, 1998). Em seguida, o pacote de programas DNAstar lasergene®
(DNAstar, Mega Align, Seqman, Genequest, Protean) foi utilizado para avaliar
as sequências quanto ao tamanho, predição de ORF´s, regiões não
codificantes (RNC), presença de substituições nucleotídicas (nt) e de
aminoácidos (aa).
Para efeito de comparações de divergência e homologia nucleotídica e
aminoacídica foram usadas as regiões codificantes e o produto protéico desses
sítios, respectivamente.
45
As análises de divergência nucleotídica e aminoacídica foram realizadas
usando os programas Geneious para alinhamento e Mega 5.1 (Kumar et al.,
2004; Tamura et al., 2011) para construção das matrizes.
A determinação de sítios de clivagem foi obtida por comparação com
outros phlebovirus no banco de dados de família de proteínas PFAM
(http://pfam.sanger.ac.uk/), InterProScan (www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/) e
Signal P versão 4.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) (Petersen et al.,
2011). Para determinar a previsão de sítios de glicosilação foi utilizado o
programa NetNGlyc 1.0 (http://www.cbs.dtu.dk/ services/NetNGlyc/).
Os motivos conservados das proteínas dos phlebovirus estudados foram
verifiados no alinhamento das sequências aminoacídicas entre os vírus
estudados e outros phlebovirus, de acordo com os achados da literatura,
atraves do programa Geneious versão 7 (Biomatters, Nova Zelândia).
2.2.10.3. Identificação de possíveis rearranjos genéticos
As regiões codificantes dos membros do gênero Phlebovirus foram
identificadas utilizando o programa ORF finder
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/) e posteriormente para analise de
genetica nucleotidica e aminoacidica foi utilizado o programa Mega 5 (Tamura
et al.,2011).
Posteriormente, o programa Simplot versão 3.5.1 (Lole et al., 1999) foi
empregado para determinar a similaridade, utilizando as sequências
nucleotídicas, dos vírus em estudo ao longo da cadei aberta de leitura (CAL)
para uma análise intragrupo, bem como, para uma análise intergrupo,
comparando-se sequências do grupo Guamá com as de outros
orthobunyavirus. Em todas as análises execultadas foi utilizado um vírus ou um
grupo de vírus como referência (query) O ponto de corte foi de 50% (enviar
rearanjo).
Foi realizado alinhamento, bem como geração de árvores filogenéticas
pelo método de Neighbour Joining (NJ), das sequências completas dos
segmentos SRNA, MRNA e LRNA dos phlebovirus do Complexo Candiru,
análise de bootstrap (1000 réplicas) foi realizada para gerar maior
confiabilidade nos valores dos grupamentos obtidos. A Análise de rearranjo
46
genético para os membros do Complexo Candiru foi empregando o método de
Kishino Hasegawa.
2.2.10.4. Análise Filogenética
As análises filogenéticas foram realizadas basicamente pelo programa,
PHYML (Guindon et al., 2010), utilizando os métodos de máxima
verossimilhança (Saitou & Nei, 1987). As árvores filogenéticas foram
construídas usando os métodos de Máxima Verossimilhança (MV) utilizando o
programa PHYML devido à melhor performance deste programa para a análise
de máxima verossimilhança (rápido processamento). O programa jMoldest v.
3.6 (Posada, 2008) foi utilizados para determinar o melhor modelo de
substituição nucleotídica a ser usado baseado no critério de informação Akaike
(AIC).
Para a análise pelo método NJ, a matriz de distância foi calculada a
partir das sequências alinhadas usando o modelo de substituição nucleotídica
indicado pelo Modeltest (kimura 2 parâmetros, Tamura-3, parâmetro de
distribuição gama). A análise de bootstrap (1000 réplicas) foi realizada para
gerar maior confiabilidade nos valores dos grupamentos obtidos (Felsenstein,
1985) para os métodos de MV.
47
3. RESULTADOS
3.1. OBTENÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DAS SEQUÊNCIAS NUCLEOTÍDICAS
O total de 14 isolados virais tiveram os seus genomas completamente
(ORF- open reading frame ou cadeia aberta para leitura) ou parcialmente
sequenciados. O total de 171.137 nucleotídeos foram obtidos sendo 100% das
sequências identificadas como genomas de vírus pertencentes ao gênero
Phlebovirus (segmentos SRNA, MRNA e LRNA). Identificação das sequências
pelo site do NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), valor de probabilidade (e),
máxima identidade, cobertura do genoma com vírus de maior similaridade e
seu respectivo número de acesso ao GenBank. (Quadro 7)
48
Quadro 7 - Sequências nucleotídicas obtidas para o genoma das 14 cepas virais incluídas no estudo evidenciando o total de nucleotídeos recuperados por segmento genômico (SRNA, MRNA e LRNA).
VALE
VANH
VARQ
VCDU
VITA
VMRB
VMRA
VORX
VSRN
VURI
VTUA
VURU
VTAP
VJAN
49
3.2. ORGANIZAÇÃO GENÔMICA
A organização genômica dos membros do gênero Phlebovirus em
estudo é similar à observada para os demais vírus do gênero, revelando a
presença de três segmentos de RNA e seus produtos gênicos principais: o
segmento SRNA que codifica as proteínas N e NSs; segmento MRNA que
codifica a poliproteína que é pos-traducionamente clivada em NSm-Gn-Gc para
os membros do grupo da febre dos flebótomus e clivadas em Gn-Gc para os
representantes do grupo Uukuniemi ( não incluidos neste estudo); e o
segmento LRNA que codifica a polimerase dependente de RNA (proteína L).
As ORF's dos três segmentos são flanqueadas pelas RNC 3’ e 5’.
Das 14 amostras virais identificadas como membros do gênero
Phlebovirus, 12 foram sequenciadas completamente (ORF e parte das regiões
não codificantes 3’ e 5’) e duas,Virus Urucuri e Virus Anhanga, tiveram 62,7%
e 97,3% dos seus genomas recuperados, respectivamente. Das amostras com
ORF's e parte das regiões não traduzidas sequenciadas, observou-se variação
no tamanho genômico de 1519 nt a 1894 nt (segmento SRNA), de 3963 nt a
4579 nt (segmento MRNA) e 6137 nt a 6844 nt (segmento LRNA).
A análise dos genomas utilizando o programa Geneious identificou a
presença de ORF's em cada um dos três segmentos genômicos, como
mostrado a seguir.
3.2.1. Segmento SRNA
Para o segmento SRNA, o programa computacional revelou a presença
de duas ORF's de sentidos opostos localizadas na mesma cadeia (frame) de
leitura ou em cadeias diferentes. O tamanho das ORFs do gene N variou de
735 nt a 753 nt , enquanto que a ORF para o gene NSs variou entre 750 nt a
885 nt (Figura 7).
50
Legenda: Observar a presença de regiões não codificantes completas (linhas pretas contínuas nas extremidades 3’ e 5’) e incompletas (linhas pretas tracejadas nas extremidades) flanqueando as regiões codificantes para as proteínas NSs (amarelo) e N (azul claro). Notar a presença entre genes de regiões não codificantes (linhas pretas contínuas entre os genes NSs e N). A linha tracejada em azul representa a região do genoma (gene N) não sequenciada. ORF1; ORF2; - Frame 1(cadeia): cadeia negativa 1; - Frame 2: cadeia negativa 2; + Frame 1: cadeia positiva 1; + Frame 2: cadeia positiva 2; + Frame 3: cadeia positiva 3. Os tamanhos das ORFs encontram-se em nucleotídeos (nt). Os valores abaixo da barra correspondem às posições nucleotídicas estimadas com base no tamanho médio das sequências obtidas.
A descrição dos genomas sequenciados no que tange o tamanho,
percentual de A+U (Adenina + Uracila), posição nucleotídica, tamanho das
proteínas codificadas (em aminoácidos; aa) e peso molecular em KDa
encontra-se apresentada na Tabela 1.
Figura 7 - Representação esquemática dos genomas dos segmentos SRNA (sentido 3’->5’) obtidos para os 14 isolados virais identificados como membros da família Bunyaviridae, gênero Phlebovirus.
51
****** Dados não obtidos. (+) sentido positivo; (-) sentido negativo;
3.2.2. Segmento MRNA
Em relação ao segmento MRNA, uma única e longa cadeia aberta de
leitura (ORF) foi observada, sendo todas com sentido negativo (-). As ORF's
apresentaram tamanhos que variaram de 3.909 nt (Virus Uriurana e Virus
Tabela 1 - Organização dos genomas correspondentes ao segmento SRNA dos phlebovirus segundo os tamanhos dos genes N e NSs, posição nucleotídica, percentual de adenina-uracila (AU), região intergênica, e tamanhos das regiões não codificantes (NCR).
52
Urucuri) a 4.080 nt (Virus Anhanga), sendo em geral flanqueadas por regiões
não traduzidas (3’ e 5’ NCR ) ao nível dos términos dos segmentos genômicos.
Para o Virus Jacunda, somente a ORF foi obtida, enquanto que para o Virus
Tapara e Virus Mucura, parte da ORF permaneceu incompleta ao nível da
região terminal 5’ (Figura 8).
Legenda : Observar a presença de regiões não codificantes completas (linhas pretas contínuas nas extremidades 3’ e 5’) e incompletas (linhas pretas tracejadas nas extremidades) flanqueando as regiões codificantes para a poliproteína (alaranjado). Blocos azuis com linha tracejada em preto representam a região do genoma não sequenciado. ORF1: open reading frame 1; Frame 1(cadeia): cadeia negativa 1; Frame 2: cadeia negativa 2; Frame 3: cadeia negativa 3. Os tamanhos das ORF's,encontram-se em nucleotídeos (nt). Os valores abaixo da barra correspondem às posições nucleotídicas estimadas com base no tamanho médio das sequências obtidas.
As características dos genomas sequenciados para o segmento M,
segundo o tamanho, percentual de A+U (Adenina + Uracila), posição
aminoacídica, tamanho das proteínas codificadas (em aminoácidos; aa) e peso
molecular em KDa encontram-se descritas na Tabela 2.
Figura 8 – Representação esquemática dos genomas dos segmentos MRNA (sentido 3’-> 5’) obtidos para os 14 isolados virais identificados como membros da família Bunyaviridae, gênero Phlebovirus.
53
* referente à poliproteína --------: dados não obtidos.
3.2.3. Segmento L
Para o segmento LRNA, dos 14 isolados utilizadas no estudo, 12 tiveram
suas ORFs totalmente sequenciadas. O Virus Anhanga em relação aos
genomas dos demais vírus sequenciados apresentou duas regiões de gaps,
uma de 81 nucleotídeos entre a região entrre a posição nucleotídica 4992 e
5072 e outra de 68 nucleotídeos na posição 3' terminal . Para o Virus Jacunda,
conseguiu-se apenas a sequência completa para a região codificante,
enquanto que para o Virus Mucura, obteve-se a sequência completa para a
ORF e para a região 3’ NCR. No caso do Virus Urucuri, apenas parte do
Tabela 2 - Organização dos genomas correspondentes ao segmento MRNA dos Phlebovirus segundo os tamanhos das poliproteínas, genes NSm, Gn e GC em nucleotídeos (nt) e aminoácidos (aa), peso molecular em KDa, posição aminoacídica de cada proteína, tamanho das regiões não codificantes (NCR) em nucleotídeos (nt) percentual de adenina - uracila (AU).
54
segmento LRNA foi recuperado entre as posições nucleotídicas 284 e 1.335
(1.052 nt) e 2.779 e 3.627 (849 nt) , (Figura 9).
Figura 9 - Representação esquemática dos genomas dos segmentos LRNA
(sentido 3’-> 5’), obtidos para as 14 cepas virais identificadas como membros
da família Bunyaviridae, gênero Phlebovirus.
Legenda: Observar a presença de regiões não codificantes incompletas (linhas
pretas tracejadas nas extremidades) flanqueando as regiões codificantes para
a poliproteína (alaranjado). Blocos com linha tracejada em azul claro
representam a região do genoma não sequenciado. ORF1; Frame 1(cadeia):
cadeia negativa 1; Frame 2: cadeia negativa 2; Frame 3: cadeia negativa 3. Os
tamanhos das ORF's encontram-se em nucleotídeos (nt). Os valores abaixo da
barra correspondem as posições nucleotídicas estimadas com base no
tamanho médio das sequências obtidas.
A descrição dos genomas sequenciados para o segmento L, segundo o
tamanho, percentual de A+U (Adenina + Uracila), posição aminoacídica,
tamanho das proteínas codificadas (em aminoácidos; aa) e peso molecular em
KDa encontra-se descrita na Tabela 3.
55
Tabela 3 - Organização dos genomas correspondentes ao segmento LRNA dos membros do gênero Phlebovirus utilizados no estudo, segundo os tamanhos das poliproteínas codificadoras da polimerase viral em nucleotídeos (nt) e aminoácidos, peso molecular em KDa, posição nucleotídica , sentido da cadeia de leitura, tamanho das regiões não codificantes (NCR) em nucleotídeos (nt) percentual de Adenina-Uracila (AU).
(+) Sentido positivo * Sequencia incompleta ****** Dados não gerados.
3.3. PROTEÍNAS VIRAIS
3.3.1. Análise dos Domínios e Subdomínios Protéicos
A avaliação dos domínios e subdomínios protéicos empregando a
combinação de análises pelos programas Blast tx e Interproscan evidenciou as
VÍRUS
Gene L Tamanho da RNC (nt)
CAL N (nt)
Posição (nt)/ Sentido
A/U (%)
Tamanho aa
Peso molecular
5’ 3’
VALE
6267
23 - 6289 (+)
60,5
2088
238 kDa
22
129
VANH*
6092
******
******
******
******
8
******
VARQ
6270
15 - 6284 (+)
61
2089
237 kDa
14
125
VCDU
6291
1- 6291 (+)
60,8
2096
238 kDa
******
36
VITA
6267
61-6327(+)
60.4
2088
237 kDa
60
121
VJAN
6267
1 - 6267 (+)
60,4
2088
237 kDa
******
******
VMRB
6267
23 - 6289 (+)
60,8
2088
237 kDa
22
121
VMRA
6336
1 - 6336 (+)
60,9
2111
240 kDa
******
124
VORX
6267
20 - 6286 (+)
61
2088
238 kDa
19
122
VSRN
6267
20 - 6286 (+)
61
2088
237 kDa
19
126
VTAP
6270
111 - 6380 (+)
57,4
2089
238 kDa
110
103
VTUA
6267
20 - 6286 (+)
59,7
2088
237 kDa
19
119
VURI
6300
1 - 6300 (+)
59,8
2099
239 kDa
******
103
VURU*
2274
******
*******
******
******
******
******
Média
6278
24 - 6293
60,2
2091
237 kDa
32
111
56
assinaturas protéicas para diferentes grupos de proteínas dos phlebovirus
identificadas como nucleoproteína e proteína não estrutural NSs (segmento
SRNA), proteína não estrutural NSm e glicoproteínas de superfície Gn e Gc
(segmento MRNA), bem como para a polimerase viral L (segmento LRNA).
Para a polimerase viral, subdomínios foram identificados: domínio
catalítico, domínio RdRp (RNA-dependente de RNA polimerase) dos
bunyavirus e o subdomínio DUF 3770. A figura 10 ilustra os domínios e
subdomínios referentes as proteínas virais evidenciadas em cada segmento
genômico dos Virus Candiru (representante do Complexo Candiru), Virus
Anhanga, Virus Tapara, Virus Uriurana e Virus Urucuri. Os valores de PFAM
para cada proteína podem ser observados na tabela 4.
Legenda: Em (a), blocos em rosa e em lilás correspondem as proteínas N e NSs, respectivamente. Em (b) e (c), observar os blocos em azul escuro e alaranjado representando proteínas virais com função conhecida e
Figura 10 - Domínios e subdomínios das proteínas virais evidenciadas ao longo dos segmentos SRNA (a), MRNA (b) e LRNA (c) dos 10 vírus do Complexo Candiru, bem como para os Virus Anhanga, Virus Tapara, Virus Uriurana e Virus Urucuri.
57
desconhecidas. Quadrados coloridos representam diferentes bancos de dados de proteinas aos quais as sequências de aminoácidos das regiões codificantes de cada segmento genômico foram submetidos. Quadrados multicores representam as diferentes bases de dados para proteínas. Tabela 4 - Valores de PFAM gerados pelo programa Interproscan segundo o segmento genômico, proteínas e domínios protéicos dos membros do gênero Phlebovirus.
SRNA MRNA LRNA
VÍRUS N NSs NSm Gn Gc L
Cat RdRp DUF 3770
Virus Alenquer 1.6E-71 2.3E-69 1.9E-24 0.0 0.0 0.0 0.0 1.2 E - 61
Virus Anhanga 7.2E-75 5.3E-26 1.0E-10 6.1E-185 3.4E-231 **** **** ****
Virus Ariquemes 1.2E-72 1.0E-64 5.6E-26 1.3E-193 5.7E-235 0.0 0.0 5.0E - 56
Virus Candiru 3.3E-72 7.5E-65 1.9-E-32 0.0 0.0 0.0 0.0 3.0E - 55
Virus Itaituba 5.5E-72 2.3E-65 5.0E-24 0.0 0.0 0.0 0.0 9.0E - 57
Virus Jacunda 7.9E-73 5.9E-65 8.1E-23 0.0 0.0 6.4E 29.9 3.1E - 55
Virus Morumbi 7.9E-73 5.9E-65 4.2E-24 0.0 0.0 0.0 0.0 2.9E - 55
Virus Mucura 1.0E-72 7.9E-65 2.4E-22 0.0 0.0 1.1E-187 29.9 9.1E- 54
Virus Oriximina 9.6E-74 2.0E-65 8.1E-22 0.0 0.0 0.0 0.0 5.4 E- 56
Virus Serra Norte 7.9E-73 2.9E-66 3.0E-27 0.0 0.0 0.0 0.0 3.6 E - 55
Virus Tapara 1.6E-68 2.9E-60 1.47E-04 * 7.10E-174* 0.0* 1.0E-187 30.0 2.3E- 66
Virus Turuna 4.6E-73 2.5E-66 7.0E-23 0.0 0.0 0.0 0.0 2.5E- 51
Virus Urucuri **** 4.3E-52 2.9E-14 3.4E--188 1.8E-221 **** **** ****
Virus Uriurana 1.2E-75 8.0E-52 2.9E-14 3.4E-188 1.8E-221 3.9E-189 30.9 8.1E- 66
* Foi utilizado o programa BLASTP para realização dos cálculos
3.3.2. Sítios de Clivagem para a Poliproteína M
A análise combinatória dos programas Interproscan e Signal P
evidenciou a presença de diferentes sítios potenciais de clivagem ao longo da
poliproteína M levando a subdivisão da mesma em três porções básicas: NSm,
Gn e Gc. A tabela 5 sumariza as junções e sequências de clivagem que origina
cada proteína viral.
58
Tabela 5 - Sítios de clivagem para as poliproteínas NSM, Gn e Gc codificadas pelo segmento MRNA dos membros do gênero phlebovirus do Complexo Candiru, Virus Anhanga, Virus Tapara, Virus Uriurana e Virus Urucuri, preditos pelo programa Signal P v.4.1 e Interproscan.
Vírus Regiões de junção gênica
Met--/NSM Escore NSM/GN Escore Gn/Gc Escore Gc/--TAG(A) Escore
VTAP VDA / TF 0,615 LAI/DL 0,632 ASS/CS 0,534 KAI/GL 0,194
VALE ALA / AY 0,693 ADA/ST 0,267 GLS/CS 0,741 AAV/MK 0,165
VMRB MAS / AY 0,65 DKM/AV 0,239 CLG/CS 0,883 TAI/LK 0,244
VTUA ALA / AY 0,674 VHP/VF 0,237 VLC/CS 0,874 TAI/LK 0,200
VCDU ALG / AY 0,61 SLA/AT 0,637 ALA/CS 0,84 MAV/LK 0,238
VITA AYA / AY 0,698 SNQ/VN 0,345 ALS/CS 0,829 SGI/LK 0,245
VARQ TMS/ AY 0,589 DKM/AV 0,329 CLG/CS 0,815 LAI/LK 0,285
VSRN AYA / AY 0,631 SNQ/VN 0,315 ALS/CS 0,845 TGV/LK 0,232
VJAN ANA / AY 0,607 TAQ/IN 0,32 VLG/CS 0,857 TAI/LK 0,217
VORX ANA / AY 0,618 TAH/IN 0,28 ALG/CS 0,875 MAV/LK 0,224
VMRA AHA / AY 0,631 TAH/KN 0,32 TLS/CS 0,84 AAI/LK 0,203
VURI AYC / SY 0,604 SMA/EL 0,512 ASG/CS 0,8 KTI/LL 0,247
VANH SES / LI 0,671 ASA/ME 0,618 TDA/CS 0,545 KAI/LM 0,267
VURU - - ALA/AR 0,651 AES /CS 0,729 KTI/VV 0,264
Média dos
escores 0,638 0,389 0,805 0,228
Cutoff 0,450 0,200 0,200 0,100
Met: metionina=códon de inicialização da poliproteína; TAG(A): códons alternativos de parada da poliproteína do seguimento MRNA. ( / ): região de clivagem.
3.3.3. Identificação de Motivos Conservados
3.3.3.1. Proteína N
A análise do alinhamento múltiplo das sequências aminoacídicas da
nucleoproteína dos Virus Candiru (representante do Complexo Candiru), Virus
Anhanga, Virus Tapara, Virus Uriurana e Virus Urucuri revelou a presença de
aminoácidos conservados (D63, I67, S85 e G88), bem como de um bloco
constituído por seis aminoácidos 71-LTRGNK-76. Observou-se a presença de
aminoácidos associados com a atividade de ligação da proteina N ao RNA viral
(R73, K76 e K/R 83) (Figura 11).
59
Figura 11 - Alinhamento múltiplo da proteína de nucleocapsideo (N) do Virus Candiru (representante do Complexo Candiu), Virus Anhanga, Virus Punta Toro, Virus Rift Valley, Virus Tapara, Virus Uriurana e Virus Uukuniemi. Legenda: Blocos em cinza representam as regiões hiperconservadas. Asteriscos localizados abaixo das sequências representam os aminoácidos cruciais para a ligação da nucleoproteína ao RNA viral que se encontram conservados entre os diferentes membros do gênero Phlebovirus. * resíduos aminoacídicos associados à interação da proteína N ao RNA viral.
3.3.3.2. Proteínas NSm, Gn e Gc
Em relação às proteínas NSm, Gn e Gc, regiões conservadas
reconhecidas como domínios transmembrana, foram observadas nas posições
C terminais de cada uma das proteínas dos phlebovírus estudados (Figuras 12,
13, 14).
60
Figura 12 - Alinhamento múltiplo da poliproteína M, região da proteína NSm (azul escuro) do Virus Candiru (representante do Complexo Candiru), Virus Anhanga, Virus Rift Valley, Virus Tapara, Virus Uriurana e Virus Sandfly fever Naples_Poona. Legenda: Região em azul claro representa o domínio transmembrana conservado entre os diferentes membros do gênero Phlebovirus. Setas em vermelho representam os domínios específicos para cada vírus. Números acima da barra representam a posição aminoacídica aproximada dos domínios, as setas em vermelho indicam o domínio transmembrana.
61
Figura 13 - Alinhamento múltiplo da poliproteína M, região da proteína Gn (azul escuro) do Virus Candiru (representante do Complexo Candiru), Virus Anhanga, Virus Rift Valley, Virus Tapara, Virus Uriurana e Virus Sandfly fever Naples Poona, Virus Uukuniemi e Virus Bhanja. Legenda: Região em azul claro representa o domínio transmembrana conservado entre os diferentes membros do gênero Phlebovirus. Setas em vermelho representam os domínios específicos para cada vírus. Números acima da barra representam a posição aminoacídica aproximada dos domínios.
62
Figura 14 - Alinhamento múltiplo da poliproteína M, região da proteína Gc (azul escuro) do Virus Candiru (representante do Complexo Candiru), Virus Anhanga, Virus Rift Valley, Virus Tapara, Virus Uriurana e Virus Sandfly fever Naples Poona, Virus Uukuniemi e Virus Bhanja. Legenda: A região em azul claro representa o domínio transmembrana conservado entre os diferentes membros do gênero Phlebovirus. Setas em vermelho representam os domínios específicos para cada vírus. Números acima da barra representam a posição aminoacídica aproximada dos domínios. O aminoácido lisina (K) conservado em todos os phlebovirus ao nível da terceira posição a partir do terminal C da glicoproteína foi evidenciado no interior do boco vertical.
3.3.3.3. Polimerase Viral
A análise pelo programa Geneious 7.0, evidenciou a presença de
diferentes motivos conservados ao longo da sequência nucleotídica da
polimerase viral dos membros representantes do Complexo Candiru, Virus
Anhanga, Virus Tapara, Virus Uriurana e Virus Urucuri denominados de Motivo
1 (89-LVHDF-93), Motivo 2 (123-LTPDM-127), Motivo 3 (716-IQRYI-727),
Motivo pré A (975-KAQHGGLREIYVLRLEERMIQFGIEL-1000), Motivo A
(1039TMITLCSSNDART WNQGHY-1057), Motivo B (1137-
ILTETGMMnQGILHLTSSLYHA - 1157) , Motivo C (1183-VLIDVIEGSDDSAIII-
1189), Motivo D (1228-YAGIYMSPKSTIG-1240) , Motivo E (1242-
LDVCEYNSEF-1251) (Figura 15).
63
M1 M2 M3
pMA MA MB
MC MD ME
Figura 15 - Alinhamento múltiplo da proteína L (polimerase viral) do Virus Candiru (representante do Complexo Candiru), Virus Palma, Virus Anhanga, Virus Rift Valley, Virus Tapara, Virus Uriurana e Virus Uukuniemi. Legenda:Blocos em cinza representam as regiões hiperconservadas reconhecidas como motivos(M). M1: motivo 1; M2: motivo 2; M3: motivo 3; pMA: pré motivo A; MA: motivo A; MB: motivo B; MC: motivo C; MD: motivo D; ME: motivo E.
3.3.4. Determinação dos Resíduos de Cisteína
De acordo com o tipo de vírus e proteína avaliada, o número de resíduos
de cisteína foi distinto variando de 7 (proteínas N e NSs; segmento SRNA) a 62
(proteínas NSm, Gn e Gc). O número de resíduos de cisteína para cada
membro do gênero Phlebovirus estudado, segundo suas proteínas específicas
encontra-se no quatro 8.
64
Quadro 8 - Número de resíduos de Cisteínas determinadas para as diferentes proteínas dos phlebovirus do grupo Candiru, Virus Uriarana, Virus Urucuri e Virus Tapara.
VÍRUS N NSs Poliproteína NSm Gn Gc Polimerase
VANH 1 7 58 4 28 26 ******
VTAP 1 7 59 4 32 23 30
VURI 1 6 62 5 30 27 41
VURU ****** 5 56 4 28 24 ******
VCDU 3 4 58 4 29 25 42
VARQ 3 4 57 4 29 24 45
VJAN 3 4 57 3 30 24 42
VMRB 3 4 57 4 29 24 42
VMRA 3 4 57 5 28 24 42
VSRN 3 4 56 4 28 24 42
VITA 3 4 57 4 29 24 42
VORX 3 4 57 4 29 24 42
VALE 2 4 57 4 29 24 45
VTUA 2 6 57 4 29 24 44
**** não determinado. 3.3.5. Determinação dos sítios de glicosilação
Foram identificados 41 sítios de glicosilação diferentes, pelo programa
NetNglyc (www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/) para os phlebovirus incluídos no
estudo variando de 11 para o VJCN; 10 para VALE,VITA e VORX; 9 VCDU,
VSRN e VTUA; 8 VARQ,VMRB,VMRA;6 VURU;4 VANH e VURI ; 3 VTAP.As
tabelas 6, 7 ,8 e 9 sumarizam os sítios encontrados e seus respectivos valores.
65
Tabela 6 - Sítios de glicosilação encontrados na poliproteína do segmento M-RNA para os diferentes membros do gênero Phlebovirus utilizados no estudo com valor limítrofe de 0,5.
Legenda: Nxx ( posição na sequência de determinado vírus); P{ xx }: posição comum em relação ao alinhamento; (xx) : Indica o valor do
potencial do sítio de glicosilação determinado pelo programa NetNglyc.
Sítio Vírus
P1 {34}
P2 {58}
P3 {60}
P4 {81}
P5 {108}
P6 {169}
P7 {228}
P8 {237}
P9 {254}
P10 {270}
P11 (276)
P12 {277}
P13 {279}
VALE - - - N78 (0,59) - N151 (0,55) N 202(0,76) N 211 (0,51) - - - - -
VANH - - - - - - - - - - - - -
VARQ - N55 (0,56) - N73 (0,75) - - N197 (0,76) N 206 (0,68) N220 (0,56) - - - -
VCDU - - - N74 (0,76) N100 (0,6) N147 (0,59) N198 (0,70) - - - - - -
VITA - - - N73 (0,75) - N146 (0,57) N197 (0,73) N 206 (0,54) - - - N243(0,56) -
VJAN - - - N73 (0,73) - N146 (0,63) N197 (0,77) N 207 (0,64) - - - - N245(0,6)
VMRB - N55 (0,55) - N73 (0,76) - - N197 (0,71) N 206 (0,58) N220 (0,57) - - - -
VMRA - - - N73 (0,73) - N146 (0,67) N197 (0,77) N 206 (0,60) - - - - -
VORX - - - N73 (0,73) - N146 (0,57) N197 (0,76) N 206 (0,67) - - - - -
VSRN - - - N73 (0,76) - - N197(0,54) N 206 (0,54) - - N240 (0,52) - -
VTAP - - - - - - - - - - - - -
VTUA - - - N73 (0,68) - N 146 (0,65) N197 (0,72) N 206 (0,64) - - - - -
VURI - - - N74 (0,70) - - - - - N221(0,73) - - -
VURU N34 (0,59) - N 57 (0,65) - - - - - - - - - -
66
Tabela 7 - Sítios de glicosilação encontrados na poliproteína do segmento M-RNA para os diferentes membros do gênero
Phlebovirus utilizados no estudo com valor limítrofe de 0,5.
Sítio Vírus
P14 {285}
P15 {290}
P16 {296}
P17 {299}
P18 {407}
P19 {475}
P20 {497}
P21 {546}
P22 {556}
P23 {574}
P24 {593}
P25 {595}
P26 {606}
VALE N256 (0,61) N261 (0,71) - - - - - - - - N547 (0,65) - -
VANH - - N279 (0,51) - - - - - - - - - -
VARQ - - - - - - - - N498 (0,54) - - N533 (0,66) -
VCDU - - - - - N419 (0,67) N437 (0,53) - - - N532 (0,58) - -
VITA - - - - N352 (0,52) - - - N499 (0,63) N512 (0,68) - - -
VJAN - - - - - - - N499 (0,65) - - - - N555 (068)
VMRB - - - - - - - - N498 (0,53) - - N 533 (0,68) -
VMRA - - - - N350 (0,51) - - - N499 (0,66) - - - -
VORX - - - - N351 (0,57) - - - N499 (0,62) - - -
VSRN - - - - N 350 (0,52) - - - N497 (0,63) N510 (0,66) - - -
VTAP - - - - - - - - - - N553 (053) - -
VTUA - - - - - - - - N497 (0,63) - N530(0,65) - -
VURI - - - - - - - - - - - - -
VURU - - - N263(0,65) - - - - - - - - -
Legenda: Nxx ( posição na sequência de determinado vírus); P{ xx }: posição comum em relação ao alinhamento; (xx) : Indica o valor do
potencial do sítio de glicosilação determinado pelo programa NetNglyc.
67
Tabela 8 - Sítios de glicosilação encontrados na poliproteína do segmento MRNA para os diferentes membros do gênero
Phlebovirus utilizados no estudo com valor limítrofe de 0,5.
Sítio Vírus
P27 {616}
P28 {660}
P29 {835}
P30 {871}
P31 {880}
P32 {998}
P33 {1000}
P34 {1026}
P35 {1035}
P36 {1125}
P37 {1232}
P38 {1241}
P39 {1331}
VALE - - - - - - - - N972 (0,55) - - - -
VANH - - - - - N954 (0,58) - - N991 (0,59) - - - - VARQ - - - - - - - - N952 (0,55) - - - -
VCDU - - - - - - - - N954 (0,55) - - - -
VITA - - - - - - - - N953 (0,54) - - N1159 (0,50)
VJAN - - - N800 (0,61) - - - N954 (0,55) - - N1160 (0.51) - N1259 (0,54)
VMRB - - - - - - - - N952 (0,55) - - - -
VMRA N553 (0,63) - - - - - - - N951 (0,62) - - - -
VORX N555 (0,66) - N773 (054) - - - - - N954 (0,54) - - - -
VSRN - - - - - - - - N951 (0,54) - - - -
VTAP - N616 (0,74) - - - - - - - - - N1181 (0,55) -
VTUA - - - - N797(0,61) - - - N951 (0,55) - - N1157 (0,52) -
VURI - - - - - - N898 (0,72) - N933 (0,54) - - - -
VURU - - - - - - - - N985 (0,61) N1075 (0,56) - N1191 (0,51) -
Legenda: Nxx (posição na sequência de determinado vírus); P{ xx }: posição comum em relação ao alinhamento; (xx) : Indica o valor do
potencial do sítio de glicosilação determinado pelo programa NetNglyc.
68
Tabela 9 - Sítios de glicosilação encontrados na poliproteína do segmento M-RNA para os diferentes membros do gênero Phlebovirus utilizados no estudo com valor limítrofe de 0,5.
Legenda: Nxx (posição na sequência de determinado vírus); P{ xx }: posição comum em relação ao alinhamento; (xx) : Indica o valor do potencial do sítio de glicosilação determinado pelo programa NetNglyc.
Sítio Vírus
P40 {1340} P41 {1347}
VALE N1277 (0,55) N1284 (0,56)
VANH N1296 (0,54) -
VARQ - -
VCDU N1259 (0,51) -
VITA - -
VJAN - -
VMRB - -
VMRA - -
VORX N1259 (0,51) -
VSRN 1256 (0,50) -
VTAP - -
VTUA - -
VURI - -
VURU - -
69
3.4. RELAÇÃO GENÉTICA ENTRE O COMPLEXO CANDIRU E OUTROS
MEMBROS DO GÊNERO PHLEBOVIRUS
3.4.1. Similaridade Genética Nucleotídica e Aminoacídica
A análise de similaridade genética nucleotídica e aminoacídica para o gene N
com relação aos integrantes do grupo da febre dos phlebotomos isolados na
Amazônia brasileira evidenciou maior similaridade entre os vírus do Complexo
Candiru, onde, o VMRB apresentou 100% de similaridade aminoacídica com os vírus
VJAN e VSRN, sendo a similaridade nucleotídica de 99,4% e 88,3%
respectivamente; os mesmos vírus apresentam 99,6% de similaridade aminoacídica
com o vírus VCDU, sendo a similaridade nucleotídica de 92,8%, 93% e 89,1%
respectivamente.O vírus VANH possui maior similaridade com o vírus VALE (54,9%
aa e 61 % nt ), e menor com VARQ (52% aa) e VTUA (57,4%nt); o VTAP , possui
maior similaridade com o vírus VORX (54,3% aa e 60,1% nt) e menor com VTUA
(48,4% aa e 56,1% nt) ; o vírus VURI_ IEC (passagem original), possui maior
similaridade com os vírus VURI (98,8% aa e 99,2% nt) e VORX (58,8% aa e 64,8%
nt) e menor com VTUA (57,8% aa) e VARQ (60,1% nt) (Tabela 10).
70
Tabela 10 - Valores percentuais de similaridade nucleotídica e aminoácidica ,determinados por alinhamento múltiplo para o gene N (segmento SRNA) dos diferentes membros do gênero Phlebovirus isolados na Amazônia brasileira.
VÍRUS VANH VTAP VURI_IEC VURI VCHG VCDU VARQ VMLO VJAN VMRB VMRA VSRN VITA VORX VESC VALE VNIQ VTUA VPT VSFN VTOS VAGU VIXC VSFS VCFU VSBO VRVF
VANH *** 60,8 57,7 58,2 55,5 58,5 59,2 59 60,4 60,3 60,1 59,5 59,5 59,7 58,7 61 58,9 57,4 61,9 54,7 56,2 58,1 58,9 56 56,2 60,4 60,5
VTAP 52,4 *** 56,3 56,8 59,3 59,4 57,7 57,7 59,1 59,1 59,5 59,4 59,6 60,1 56,4 57,7 54,8 56,1 59,1 56,8 58,4 57,9 58,5 54,1 54,6 59 57,5
VURI_IEC 51,8 48,6 *** 99,2 70,4 61,1 60,1 62 62,1 62,4 62 62,3 62,3 64,8 62 64 60,8 62,8 64,1 55,4 55,4 62,4 60,8 58,9 59,2 58,6 58
VURI 52 49 98,8 *** 69,9 61,2 60,2 62,1 62,2 62,5 62,1 62,4 62,4 65,2 62,4 63,9 60,7 63,3 64,3 55,6 55,6 62,4 60,9 59 59,2 59 57,7
VCHG 48,6 50,2 72,9 72,7 *** 62,1 62,5 62,4 62,4 62,1 62,8 62,1 63 61,1 58,7 61,4 60,3 61 62,8 55,5 55 60,4 59,7 56,5 57,4 59,9 61,3
VCDU 52,5 51,4 56,7 57 56,7 *** 83,9 84,9 93 92,8 92,1 89,1 88,1 81,3 74,3 73,2 71,6 74,7 66,8 56,2 58 61,6 61,3 58,7 57,9 62,9 62,4
VARQ 52 52,7 56,3 56,6 56,7 96,3 *** 90,2 85,2 85,4 84,5 84,4 85 82,5 76,1 72,5 76 73,1 68,1 54,7 56,1 60,6 60 57,6 57,9 60,1 60,1
VMLO 52,5 52,7 55,9 56,1 56,3 96,3 99,2 *** 85,4 85,3 84,5 84,7 84,4 81,6 74,2 72,7 74,1 73,6 67,2 54 56,9 61,3 59 56,4 57,7 61,3 60,6
VJAN 52,9 51,8 57,1 57,4 57,1 99,6 96,7 96,7 *** 99,4 97,5 88,2 87,4 81,6 74 73,2 73 76 67,7 56,7 57,7 61,8 60,8 58,2 58,7 62,6 61,8
VMRB 52,9 51,8 57,1 57,4 57,1 99,6 96,7 96,7 100 *** 97,6 88,3 87,8 82 73,8 73,5 73,2 76 67,7 56,7 57,6 61,6 61 58,5 58,5 62,6 61,8
VMRA 52,5 51,4 57,1 57,4 57,1 99,2 96,3 96,3 99,6 99,6 *** 87,8 87,3 81,1 73,1 73,3 72,8 75,5 67,2 56,4 57,5 61,4 61,1 58,1 58,4 62 61,8
VSRN 52,9 51,8 57,1 57,4 57,1 99,6 96,7 96,7 100 100 99,6 *** 88,2 82 73,8 74,7 74,6 74,2 65,7 55,6 57,2 61,6 60,3 58,1 58,4 62,5 61,8
VITA 53,3 53,1 56,7 57 57,1 98 98 98 98,4 98,4 98 99,6 *** 81,5 74,8 73,5 74,3 73,2 65 55,3 57,4 61,9 61,1 59,1 58,1 62,6 61,1
VORX 54,1 54,3 58,8 59,4 57,1 90,2 91,4 91 90,6 90,6 90,2 98 98,4 *** 74,5 73,3 73 74,3 67,4 55,6 57,6 61,5 61 59,9 59,1 64,2 63,3
VESC 52,9 49,8 56,7 57,4 54,7 80,8 82,9 82 81,2 81,2 81,2 90,2 90,6 91 *** 75,3 76,1 78,1 65,8 53,7 55,6 59 58,1 58,5 58,4 59,7 61,9
VALE 54,9 50,6 58,4 58,2 55,5 77,1 77,6 77,6 77,6 77,6 77,6 81,2 81,2 82,4 80 *** 79 74,7 66,2 56 55,3 59,9 59,6 57,4 56,1 60,4 63,5
VNIQ 54,5 49,4 56,7 56,6 56,3 79,6 81,2 80,8 80 80 80 77,6 77,6 78 77,6 88,6 *** 75,8 67,6 55,2 55,1 59,9 59,9 58,5 56,7 58,4 61,1
VTUA 54,3 48,4 55,7 56,3 58,1 80,4 80 79,6 80,8 80,8 80,8 80 80 81,2 80,4 82,4 85,7 *** 66 54,5 55,5 61,9 61,5 57,9 58,6 63,1 62,1
VPT 55,6 52,5 57,8 58,2 57,8 60,2 61,1 61,1 60,7 60,7 60,7 80,8 80,8 80,8 79,6 62,7 63,5 62,7 *** 59,1 58 61,2 60,2 58,3 56,6 60,9 63,1
VSFN 45,1 45,8 44,1 44,5 43,3 47,8 46,9 46,9 47,8 47,8 47,8 60,7 60,7 61,1 63,5 45,3 45,7 46,3 51,6 *** 79,4 55,1 54,5 53,2 52,2 55,6 54,1
VTOS 45,9 47,4 44,1 44,5 42,5 49,4 49 49 49,4 49,4 49,4 47,8 47,8 47,3 46,1 46,9 48,2 48,4 52 90,2 *** 55,8 53,1 52,7 53,7 58,4 54,7
VAGU 55,5 51,6 56,1 56,3 56,1 55,5 55,1 55,1 55,9 55,9 56,3 49,4 49,4 49,4 47,8 56,3 56,7 56,5 54,9 45,9 46,7 *** 84,7 57,2 56,7 60,9 63,1
VIXC 55,5 50,4 54,9 55,5 55,3 55,5 55,1 55,1 55,9 55,9 56,3 56,3 55,9 55,9 56,3 55,1 55,9 56,9 54,1 45,1 45,5 97,6 *** 57,2 57,2 60,8 64,3
VSFS 50,6 45,1 54,1 53,9 52 51 50,6 50,2 51,4 51,4 51 56,3 55,9 55,9 55,9 50,6 51 50,8 50 43,7 42,9 50 50 *** 77,1 61,5 61,6
VCFU 52,2 45,5 56,5 56,3 53,7 52,7 51,8 51,8 53,1 53,1 52,7 50,6 51 51 51 51,4 51,4 51,6 51,6 42,1 42,5 53,3 52,4 85 *** 58,6 61,5
VSBO 54,3 50,8 51,6 51,8 53,3 52,7 51,4 51,8 53,1 53,1 53,5 52,7 53,1 53,1 52,2 53,9 52,2 53,7 57 49,2 52 57,3 56,9 52 50,8 *** 63,4
VRVF 57,1 49,6 54,1 53,9 54,9 58 58 58 58,4 58,4 58,4 53,5 53,1 52,2 53,1 58,8 60 59,3 53,7 50,4 50 60,6 61 53,3 53,3 58,1 *** Legenda: Virus Chagres (VCHG), Virus Maldonado (VMLO), Virus Escharate (VESC), Virus Nique (VNIQ),Virus Punta Toro (VPT), Virus Sandfly Fever Naples (VSFN),Virus Toscana (VTOS),Virus Aguacate (VAGU), Virus Ixcanal (VIXC), Virus Sandflay fever Sicilian (VFFS), Virus Corfou (VCFU), Virus Salobo (VSBO), Virus Rift Valley Fever (VRVF).Em amarelo vírus do Complexo Candiru; Verde: vírus estudados que não fazem parte do Complexo Candiru; Similaridade nucleotídica (triângulo superior com números em azul) e aminoacídica (triângulo inferior com números em preto).
71
Comparando-se a similaridade aminoacídica / nucleotídica do Gene NSs dos Phlebovirus isolados na Amazônia brasileira,
observa-se que a maior similaridade é encontrada entre os vírus do Complexo Candiru, VMRMB com os vírus VJAN e VMRA
(99,6% aa para ambos, 98,4% nt e 97,5% nt respectivamente) e a maior divergência entre o vírus VANH e os vírus
VCDU,VARQ,VJAN, VMLO (20,1% aa) e entre VANH e os vírus VMLO e VARQ (36,1% nt e 36,4% nt respectivamente) (tabela
11).
Tabela 11 - Valores percentuais de similaridade nucleotídica e aminoacídica , determinados por alinhamento múltiplo para o gene NSs (segmento SRNA) dos diferentes membros do gênero Phlebovirus isolados na Amazônia brasileira. Vírus VANH VTAP VURU VURI VCHG VCDU VARQ VJAN VMLO VMRB VMRA VORX VITA VSRN VALE VNIQ VTUA VESC VRVF VAGU VIXC VTOS VSFN VSFS VCFU VSBO VPT
VANH *** 39.5 37.0 36.6 39.7 36.6 36.4 37.0 36.1 37.8 36.9 38.8 37.6 36.5 37.0 35.7 36.9 38.3 35.7 35.6 36.1 32.1 31.3 35.0 35.2 38.5 35.1
VTAP 20.6 *** 39.0 37.4 39.1 39.1 40.8 40.8 38.9 40.5 40.5 38.9 39.1 39.7 40.4 39.1 39.0 39.0 39.5 53.0 56.1 34.7 31.9 41.8 42.2 47.5 41.6
VURU 22.7 26.9 *** 53.0 52.2 39.9 41.6 40.3 42.1 40.3 40.3 40.2 40.5 41.0 43.3 40.8 41.6 40.5 36.9 38.3 40.0 30.8 34.8 39.6 38.8 38.6 42.3
VURI 20.2 25.0 39.5 *** 63.8 42.2 44.5 43.8 43.9 44.4 43.7 44.1 43.3 44.2 43.5 44.4 44.0 42.8 37.0 39.4 40.7 30.0 30.9 41.3 42.0 37.5 44.5
VCHG 22.6 28.4 39.5 61.7 *** 41.3 43.5 42.1 43.1 42.1 42.3 42.1 42.0 43.5 42.1 43.3 42.2 42.7 38.2 38.9 39.5 32.7 33.1 38.8 40.3 40.0 44.9
VCDU 20.1 28.5 26.8 31.3 30.1 *** 82.1 90.3 83.0 90.0 90.7 82.0 81.2 83.9 66.7 61.9 67.8 *** 35.5 41.4 41.1 31.3 33.7 39.2 36.9 38.2 51.2
VARQ 20.1 28.5 26.8 30.9 29.7 96.1 *** 82.4 87.2 82.6 82.7 82.1 83.0 83.2 67.7 62.6 66.4 96.2 36.3 41.1 41.2 30.4 33.9 37.5 37.5 37.1 51.1
VJAN 20.1 28.5 26.4 30.9 30.1 97.9 96.4 *** 83.6 98.4 97.1 81.8 82.7 84.6 67.1 63.5 66.9 97.10 36.9 39.8 40.7 31.4 34.4 38.7 37.4 36.7 50.8
VMLO 20.1 28.5 26.4 31.3 30.1 96.1 97.5 95.7 *** 83.9 84.1 80.9 81.9 83.0 66.0 63.3 66.0 96.2 36.3 39.8 39.8 31.5 34.3 38.0 39.5 36.7 50.4
VMRB 20.5 28.9 26.8 31.3 30.5 98.2 96.8 99.6 96.1 *** 97.5 81.9 82.7 84.9 67.2 63.0 67.3 98.2 36.0 39.3 40.4 31.9 34.4 39.2 37.9 37.1 50.6
VMRA 20.5 28.9 26.8 31.3 30.5 98.6 97.2 99.3 96.4 99.6 *** 82.1 82.4 85.1 66.4 62.7 66.9 98.6 35.7 40.3 40.1 32.1 34.5 39.5 37.3 37.1 51.1
VORX 21.7 28.5 26.0 31.3 30.5 95.0 94.7 95.4 94.0 95.7 96.1 *** 81.7 80.9 67.5 64.2 66.6 95.0 36.4 39.9 40.0 33.2 33.5 38.7 37.0 37.1 52.7
VITA 20.5 28.5 26.8 30.9 29.7 95.4 96.8 96.4 95.7 96.8 96.4 95.0 *** 83.3 66.6 63.7 68.3 95.4 36.9 40.1 40.0 31.1 34.5 38.5 38.2 37.9 52.0
VSRN 20.5 28.5 26.8 31.3 30.5 96.8 96.1 98.2 95.4 98.6 98.2 95.0 97.5 *** 66.9 63.4 66.7 96.6 37.0 40.6 40.7 31.5 34.7 37.4 36.5 37.7 52.0
VALE 20.5 29.7 27.7 28.4 29.8 69.8 70.5 69.8 69.8 70.2 70.2 71.6 70.2 70.2 *** 65.2 64.2 69.9 36.1 39.3 40.5 31.4 33.6 40.9 37.9 36.2 52.2
VNIQ 22.5 29.5 25.7 28.7 30.8 64.1 64.8 64.1 64.8 64.4 64.4 66.3 64.8 64.4 69.0 *** 61.2 64.1 37.6 40.3 38.1 30.6 33.6 39.1 36.5 35.4 54.5
VTUA 21.3 30.3 26.3 30.8 30.3 72.2 71.9 71.9 70.8 72.2 72.6 70.8 71.2 71.9 66.2 64.8 *** 72.3 38.2 40.3 39.7 32.2 34.7 38.5 37.5 39.0 51.1
VESC 20.9 27.0 24.5 28.3 28.6 75.8 75.8 76.2 75.8 76.5 76.2 76.9 76.5 76.2 69.8 65.6 70.7 *** 36.7 39.1 39.8 32.8 34.7 37.4 36.4 36.8 52.0
VRVF 20.2 24.3 25.2 24.8 25.1 27.8 27.4 28.2 27.0 27.8 27.8 27.8 27.8 27.8 28.7 25.9 27.4 26.3 *** 41.7 41.1 30.0 32.5 39.7 37.7 41.3 35.7
VAGU 21.7 48.5 28.7 25.3 26.3 29.7 30.9 29.7 29.7 30.1 30.1 29.4 30.1 29.7 29.9 30.5 29.3 28.6 28.3 *** 81.5 31.0 30.8 40.7 40.1 47.3 39.5
VIXC 21.3 49.6 27.5 25.3 25.6 30.5 30.9 30.5 29.7 30.9 30.9 30.1 30.1 30.5 31.1 30.1 30.0 29.0 28.3 93.1 *** 31.1 31.5 41.1 41.4 47.4 40.1
VTOS 12.1 18.1 19.0 12.9 17.4 13.3 12.9 13.7 12.9 13.7 13.7 14.0 13.7 14.0 14.7 15.0 13.0 13.7 14.9 16.9 15.8 *** 56.9 33.3 32.2 34.3 31.3
VSFN 14.7 18.5 21.6 15.5 16.4 17.9 17.4 17.9 17.4 17.9 17.9 17.9 17.9 18.3 18.7 17.4 17.9 17.4 19.9 17.7 16.9 53.7 *** 33.3 32.8 32.9 28.9
VSFS 19.4 28.9 25.2 26.8 23.5 25.4 25.0 25.4 26.2 25.8 25.8 25.8 25.8 25.8 30.1 26.6 25.8 26.6 25.5 27.2 26.8 13.6 16.6 *** 61.6 42.8 39.0
VCFU 20.6 27.5 28.1 24.9 24.4 23.5 23.5 23.5 24.7 23.9 23.9 23.1 23.9 23.9 25.1 23.1 24.7 23.5 23.6 27.3 26.9 13.3 16.6 62.8 *** 40.6 38.1
VSBO 19.8 35.0 28.5 24.7 25.4 26.6 27.0 26.6 26.6 26.6 26.6 26.6 26.6 26.6 27.9 26.2 28.0 25.9 29.5 38.0 35.1 17.6 16.9 26.6 26.0 *** 39.5
VPT 19.4 27.9 29.6 30.8 31.5 42.6 42.6 43.0 43.4 43.0 43.0 43.8 43.4 43.8 43.0 45.4 42.2 43.8 23.6 27.4 27.4 12.1 13.2 23.1 22.0 25.9 *** Legenda: Em amarelo, vírus do Complexo Candiru; Verde, vírus estudados que não fazem parte do Complexo Candiru; Similaridade nucleotídica (triângulo superior com números em azul) e aminoacídica (triângulo inferior com números em preto).
72
Com relação ao M-RNA (poliproteína), na análise intragrupo, observou-se maior similaridade entre os vírus VARQ e VESC
(100% nt / 100% aa), e entre os vírus VITA e VSRN (78,8%nt e 88,5% aa ), o VTAP foi o que apresentou menor similaridade com
os demais phlebovírus estudados, sendo a média de similaridade nucleotídica com os demais vírus desse estudo foi de 50,6 %,
e a aminoacídica de 38,7 % (Tabela 12).
Tabela 12- Valores percentuais de similaridade nucleotídica e aminoacídica (determinados por alinhamento múltiplo para a poliproteína M (genes NSm, Gn e Gc) dos diferentes membros do gênero Phlebovirus. Vírus VANH VTAP VURU VURI_IEC VURI VCHG VCDU VARQ VALE VESC VITA VIXC VJAN VMLO VMRB VMRA VNIQ VSRN VORX VTUA VRVFV_67 VSBO VSFN_Poona VAGU
VANH *** 49.9 50.1 52.6 52.6 52.5 51.6 50.4 50.7 50.4 52.3 49.2 52.0 50.7 51.6 52.6 50.8 52.0 51.2 51.0 46.9 46.5 48.0 49.3
VTAP 38.0 *** 49.4 51.3 51.3 50.5 51.7 49.9 50.1 49.9 50.2 53.9 51.0 49.8 50.2 50.6 50.3 50.6 50.8 51.5 48.7 48.3 48.4 51.7
VURU 40.2 38.1 *** 53.8 53.8 52.7 52.2 51.8 51.6 51.8 52.1 50.6 52.7 51.7 52.4 51.8 51.1 51.6 52.1 51.6 47.3 47.9 45.7 50.6
VURI_IEC 41.3 39.9 46.2 *** 100.0 65.0 54.1 54.0 53.0 54.0 54.9 50.5 54.3 54.4 53.8 54.2 53.4 54.7 53.3 54.1 50.8 47.7 48.4 51.1
VURI 41.3 39.9 46.3 99.8 *** 65.0 54.1 54.0 53.0 54.0 54.9 50.4 54.3 54.4 53.8 54.2 53.4 54.7 53.3 54.1 50.8 47.7 48.4 51.1
VCHG 42.6 38.0 44.1 59.8 59.8 *** 52.9 52.6 52.3 52.6 52.9 49.4 52.6 52.3 53.3 53.5 50.8 52.3 51.7 53.6 51.2 47.2 46.7 50.3
VCDU 42.3 38.9 40.6 42.5 42.5 39.8 *** 66.0 64.5 66.0 63.5 51.0 65.0 63.3 66.3 64.5 64.6 63.2 64.9 66.3 47.8 47.6 47.9 50.3
VARQ 39.8 38.7 41.5 42.5 42.5 40.7 62.7 *** 65.0 100.0 64.4 50.6 64.5 63.0 79.0 65.2 64.7 63.5 65.0 67.7 48.6 47.7 46.8 50.8
VALE 41.4 38.8 42.1 42.0 42.1 39.5 62.9 61.5 *** 65.0 62.8 48.9 63.8 62.5 64.8 64.0 65.8 63.0 63.5 65.8 47.0 46.7 47.4 49.4
VESC 39.8 38.7 41.5 42.5 42.5 40.7 62.7 100.0 61.5 *** 64.4 50.6 64.5 63.0 79.0 65.2 64.7 63.5 65.0 67.7 48.6 47.7 46.8 50.8
VITA 40.8 37.0 40.6 43.8 43.8 40.2 59.1 61.3 58.1 61.3 *** 50.0 68.0 78.2 64.1 68.2 61.8 78.8 68.1 63.7 47.5 46.7 48.5 49.5
VIXC 37.1 44.3 38.1 37.2 37.2 36.9 36.9 37.7 38.3 37.7 36.4 *** 50.3 49.4 50.6 50.1 49.0 50.1 50.2 50.4 47.8 46.6 47.0 67.8
VJAN 41.0 38.4 41.0 42.6 42.6 40.4 60.8 61.9 60.1 61.9 66.4 36.0 *** 66.9 64.4 72.4 63.0 67.7 76.8 65.5 48.4 47.8 49.0 49.6
VMLO 41.0 36.3 41.4 43.4 43.4 39.9 60.0 60.9 58.1 60.9 88.6 37.2 65.6 *** 63.5 67.7 61.7 76.9 66.4 63.5 47.2 45.9 47.8 48.8
VMRB 41.2 39.5 42.7 43.0 43.0 41.4 63.7 87.6 61.4 87.6 60.5 37.8 61.5 60.5 *** 65.1 63.9 63.7 65.1 66.8 48.1 47.1 46.6 50.7
VMRA 41.3 37.8 40.9 42.4 42.4 39.2 61.1 60.9 61.3 60.9 65.3 35.8 73.3 64.4 60.8 *** 63.2 68.0 70.8 66.6 47.6 47.2 49.3 50.8
VNIQ 40.1 37.8 41.3 42.9 42.9 38.2 62.2 62.3 65.4 62.3 57.8 37.3 59.8 58.1 61.8 59.5 *** 62.3 63.0 65.0 46.6 47.2 47.4 49.1
VSRN 41.4 37.2 40.4 43.7 43.7 39.5 59.5 60.4 58.8 60.4 88.5 36.9 66.6 85.9 60.1 65.3 57.9 *** 68.0 63.6 48.0 46.7 48.3 49.5
VORX 40.4 38.2 40.3 42.5 42.5 39.2 61.4 61.7 60.0 61.7 65.9 35.7 83.8 65.9 61.3 72.7 60.3 67.5 *** 65.3 48.3 47.8 48.7 50.3
VTUA 41.3 39.7 40.6 42.9 42.9 40.8 63.1 65.2 63.8 65.2 61.2 37.7 62.7 60.8 66.7 63.7 63.1 60.9 62.2 *** 47.8 48.6 48.2 49.9
VRVF_67 41.1 41.2 40.9 43.0 43.0 42.4 40.1 40.8 41.0 40.8 39.3 38.6 40.0 38.8 40.8 38.4 39.1 40.4 40.2 40.6 *** 45.6 44.3 46.7
VSBO 35.5 34.7 34.4 35.2 35.2 37.2 37.2 36.5 35.9 36.5 34.3 34.7 35.5 34.3 37.4 34.2 35.0 34.9 35.5 36.5 38.9 *** 46.6 46.6
VSFN_Poona 34.8 32.7 33.0 34.5 34.5 31.5 33.8 32.8 34.5 32.8 33.5 32.2 34.0 34.2 33.1 34.3 33.6 33.4 34.4 34.0 35.9 33.6 *** 46.1
VAGU 38.3 43.2 37.7 37.5 37.4 36.7 37.2 37.7 37.9 37.7 35.3 66.9 37.0 35.7 38.5 37.1 38.1 36.2 36.6 37.7 39.6 34.3 31.1 ***
Legenda: Em amarelo vírus do Complexo Candiru; Verde, vírus estudados que não fazem parte do Complexo Candiru;
Similaridade nucleotídica (triângulo superior com números em azul) e aminoacídica (triângulo inferior com números em preto)
73
Quanto a determinação da similaridade para o gene L (L-RNA) observou-se que, dentre os vírus estudados, a maior
similaridade encontrada ocorreu entre o VMRB e o VJAN (96,7 % nt e 99,3 % aa), e entre o vírus VCDU e os vírus, VMRB, VJCN
e VMRA (90,5% , 90,8% e 89,8% nt , respectivamente e 96,8% aa para todos), sendo novamente o VTAP o mais divergente entre
eles,com média para os demais vírus estudados de 50,1 % nt e 41,6 % aa (Tabela 13).
Tabela 13 - Valores percentuais de similaridade nucleotídica (triângulo superior com números em azul) e aminoacídica (triângulo inferior com números em preto) determinados por alinhamento múltiplo para sequências parciais do gene da polimerase presente no segmento LRNA dos diferentes membros do gênero Phlebovirus. VÍRUS VANH VTAP VURU VURI_IEC VURI VCHG VCDU VMRB VARQ VMLO VJAN VMRA VSRN VITA VORX VNIQ VALE VESC VTUA VSBO VSFN_Poona VRVF VAGU VIXC
VANH *** 50.9 54.1 54.8 52.9 52.8 52.4 52.6 51.6 52.7 52.1 51.0 51.8 51.4 49.5 52.5 51.4 51.4 52.3 49.7 47.4 51.2 52.8 51.7
VTAP 42.3 *** 54.4 54.5 52.4 51.2 49.5 49.4 49.7 49.1 49.3 49.5 50.2 47.9 48.9 48.0 46.5 49.4 48.4 53.2 50.4 51.6 51.4 52.9
VURU 46.2 45.7 *** 57.7 54.9 54.0 51.1 50.6 50.9 50.7 50.5 51.5 51.1 50.3 50.6 48.6 50.6 51.6 50.2 50.1 48.3 51.5 50.9 50.9
VURI_IEC 47.8 45.9 53.0 *** 95.2 65.2 51.4 51.7 50.6 50.9 51.6 50.6 52.2 52.8 50.1 50.0 50.0 50.9 50.8 51.9 48.7 52.7 50.3 50.9
VURI 47.8 45.9 53.0 100.0 *** 69.0 52.9 53.0 52.0 52.2 52.9 52.1 53.6 54.6 52.0 52.3 51.8 52.7 52.7 54.3 50.1 55.0 52.0 53.0
VCHG 48.3 45.9 51.8 76.3 76.3 *** 54.7 53.9 53.9 53.2 54.0 54.1 54.6 53.3 51.7 53.2 53.2 53.7 52.7 54.4 51.3 53.1 53.2 54.0
VCDU 46.6 41.7 45.2 43.6 43.6 45.2 *** 90.5 79.3 77.9 90.8 89.8 81.5 77.9 75.8 65.4 66.0 67.9 69.9 52.2 50.2 52.6 52.6 53.1
VMRB 46.6 41.1 44.5 43.3 43.3 45.0 96.8 *** 78.6 78.6 96.7 89.5 81.5 78.9 76.6 65.4 65.1 68.2 69.4 52.0 50.5 53.5 53.2 52.9
VARQ 47.0 40.4 43.6 43.8 43.8 44.7 89.2 89.9 *** 84.6 78.5 79.2 79.2 78.3 77.1 64.9 64.8 69.3 70.7 51.8 49.1 51.9 52.2 52.9
VMLO 47.2 40.6 43.3 43.3 43.3 45.0 88.8 89.9 95.9 *** 78.7 77.8 78.4 78.3 77.1 63.7 65.6 68.3 69.1 52.0 49.1 53.6 51.8 52.9
VJAN 46.1 41.1 44.5 43.3 43.3 44.7 96.8 99.3 89.5 89.5 *** 89.7 81.7 78.2 76.5 65.6 65.5 68.3 69.9 52.9 50.7 53.1 53.2 53.3
VMRA 45.9 41.1 44.7 43.1 43.1 45.2 96.8 96.8 89.5 88.8 97.3 *** 81.7 78.6 77.3 66.1 66.1 67.6 70.0 52.3 50.9 52.9 53.2 53.7
VSRN 45.6 41.3 44.7 43.1 43.1 44.3 94.5 94.5 88.8 88.8 94.7 94.1 *** 78.8 75.3 64.3 65.1 68.7 68.1 52.2 50.0 52.6 51.8 53.1
VITA 46.1 41.3 43.6 43.3 43.3 44.3 89.2 90.2 90.2 89.9 89.9 89.2 88.8 *** 76.5 65.6 66.1 68.1 69.5 52.6 49.7 52.7 52.0 51.2
VORX 45.6 40.4 42.9 43.6 43.6 44.7 86.3 87.4 88.1 88.3 87.0 86.5 86.3 87.6 *** 65.0 64.4 68.2 67.3 51.1 49.8 51.8 51.7 53.2
VNIQ 45.4 38.3 41.7 41.1 41.1 43.3 65.0 65.0 64.5 63.4 65.0 65.2 63.4 63.6 64.8 *** 66.5 64.9 67.5 51.9 48.1 52.6 52.6 51.9
VALE 45.4 39.2 44.0 44.3 44.3 45.4 68.4 68.2 68.2 67.5 68.2 68.0 66.6 69.6 67.0 68.0 *** 66.0 67.9 53.2 48.4 52.4 51.7 51.3
VESC 43.9 39.1 44.4 42.6 42.6 43.0 71.9 71.9 73.0 73.2 71.9 72.1 72.3 72.8 74.6 65.7 68.4 *** 71.5 53.5 49.0 52.9 51.0 53.1
VTUA 47.0 38.5 44.5 43.6 43.6 43.6 71.2 71.4 72.3 71.9 71.4 71.4 71.4 71.6 70.9 67.5 69.3 77.3 *** 51.5 49.4 51.7 52.8 52.1
VSBO 46.3 46.6 42.5 47.8 47.8 48.3 43.9 43.6 43.9 43.9 43.4 43.9 43.2 44.6 43.2 44.1 44.8 44.2 43.2 *** 49.4 55.3 54.3 55.2
VSFN_Poona 41.8 45.1 40.6 40.1 40.1 43.1 40.1 41.0 40.3 39.9 40.3 40.3 39.9 41.0 40.1 39.4 40.6 38.9 39.6 40.5 *** 49.8 53.0 52.8
VRVF 44.3 42.7 42.3 44.9 44.9 43.2 42.3 42.5 43.2 43.2 42.5 41.8 42.5 41.8 40.5 43.0 43.7 42.4 41.1 48.6 40.3 *** 53.4 54.0
VAGU 45.3 49.1 45.6 44.3 44.3 45.9 43.8 43.3 42.9 42.6 43.3 43.3 42.6 42.4 42.2 42.9 44.0 43.2 42.6 46.0 44.7 45.5 *** 79.4
VIXC 45.1 48.2 44.7 45.0 45.0 45.4 43.8 43.3 43.5 43.5 43.3 43.3 43.1 43.5 42.9 42.9 42.9 44.8 42.9 47.3 43.1 44.4 87.8 *** Legenda: Em amarelo vírus do Complexo Candiru; Verde, vírus estudados que não fazem parte do Complexo Candiru; Similaridade nucleotídica (triângulo superior com números em azul) e aminoacídica (triângulo inferior com números em preto).
3.5. RELAÇÃO FILOGENÉTICA
As árvores filogenéticas construídas através do método de de Máxima
Verissimilhança , para as regiões codificantes dos segmentos S, M e L (aminoácido)
que codificam as proteínas N, NSs e as poliproteínas M e L evidenciaram a
formação de diferentes grupos filogenéticos (Figuras 16 e 17, 18 e 19).
Em relação ao segmento SRNA (Figuras 16 e 17), a análise filogenética das
proteínas N dos phlebovírus evidenciou a formação de dois grupos (clados)
polifiléticos principais identificados como grupo dos phlebovírus transmitidos por
mosquitos e transmitidos por carrapatos que incluíram 17 subgrupamentos
(subclados) filogenéticos suportados por valores de bootstrap acima de 800.
Chagres
Figura 16 - Árvore filogenética construída pelo método de MV para a proteína N
(média de 244 aminoácidos) dos phlebovírus.
Legenda: Observar a presença de dois grandes grupos denominados de Grupo dos
Mosquitos e Grupo dos Carrapatos bem como a definição de diferentes subgrupos.
75
Valores de bootstrap encontram-se acima de cada nó principal dos ramos da árvore
filogenética. As chaves em vermelho indicam a presença de amostras virais
sequenciadas no presente estudo. O valor indicado abaixo da barra (0,4)
corresponde à divergência aminoacídica entre as sequências das proteínas. O Virus
Gouleako foi utilizado como grupo-externo.
Em relação a proteína NSs (Figura 17), obteve-se também a mesma
organização filogenética evidenciando-se dois grandes grupos polifiléticos (Grupo
dos Mosquitos e Grupo dos Carrapatos), sendo também observada a presença de
diferentes subgrupos (Salobo, Aguacate, Chagres, Punta Toro, Naples, I, II, III,
Candiru, Sandfly fever Sicilian, Rift Valley, Heartland, SFTVS, Bhanja, Grand
Arbaud, Uukuniemi, Precarious point e Murre) com valores de bootstrap acima de
900. Os Virus Tapara ,Virus Anhanga e Virus Urucuri foram incluídos nos subgrupos
I, II e III, respectivamente.
Figura 17 - Árvore filogenética construída pelo método de MV para a proteína NSs (média de 277 aminoácidos) dos phlebovírus. Legenda: Observar a presença de dois grandes grupos denominados de Grupo (clado) dos Mosquitos e Grupo (clado) dos Carrapatos bem como a definição de diferentes subgrupos. Valores de bootstrap encontram-se acima de cada nó principal
76
Chagres
dos ramos da árvore filogenética. As chaves em vermelho indicam a presença de amostras virais sequenciadas no presente estudo. O valor indicado abaixo da barra (0,5) corresponde à divergência aminoacídica entre as sequências das proteínas.
Para as poliproteínas codificadas pelas ORF's dos segmentos M (proteína M)
e LRNA (polimerase viral), a mesma conformação filogenética em termos de grupos
e subgrupos foi observada. Valores de bootstrap acima de 900 também foram
observados para a maioria dos principais agrupamentos filogenéticos. Independente
da proteína analisada (M ou L) os grupos I, II e III incluíram os Virus Tapara, Virus
Anhanga e Virus Urucuri (Figuras 18 e 19).
Figura 18 - Árvore filogenética construída pelo método de MV para a proteína M (média de 1326 aminoácidos) dos phlebovírus. Legenda: Observar a presença de dois grandes grupos denominados de Grupo (clado) dos Mosquitos e Grupo (clado) dos Carrapatos bem como a definição de diferentes subgrupos. Valores de bootstrap encontram-se acima de cada nó principal dos ramos da árvore filogenética. As chaves em vermelho indicam a presença de amostras virais sequenciadas no presente estudo. O valor indicado abaixo da barra (0,8) corresponde à divergência aminoacídica entre as sequências das proteínas. O Virus Gouleako foi utilizado como grupo externo.
77
Figura 19 - Árvore filogenética construída pelo método de MV para a proteína L (média de 2091 aminoácidos) dos phlebovírus. Legnda: Observar a presença de dois grandes grupos denominados de Grupo (clado) dos Mosquitos e Grupo (clado) dos Carrapatos bem como a definição de diferentes subgrupos. Valores de bootstrap encontram-se acima de cada nó principal dos ramos da árvore filogenética. As chaves em vermelho indicam a presença de amostras virais sequenciadas no presente estudo. O valor indicado abaixo da barra (0,5) corresponde à divergência aminoacídica entre as sequências das proteínas. O Virus Gouleako foi utilizado como grupo externo.
3.6. REARRANJO GENÉTICO
Os resultados obtidos pela análise de Bootscan realizada pelo programa
Simplot, revelou existência de rearranjo genético entre os membros do Complexo
Candiru.
Em relação ao segmento SRNA, o Virus Ariquemes mostrou maior percentual
de permutação (média de 80%; Intervalo: 5%-95%) com maior parte de seu genoma
relacionado com o Virus Maldonado em especial para os terços terminais do genoma
que codificam o gene N e terminal-posterior da região que codifica para a proteína
NSs (Figura 20).
78
Figura 20 - Análise de rearranjo genético pelo método de bootscan utilizando o segmento SRNA do Virus Ariquemes e membros selecionados do Complexo Candiru (Bunyaviridae: Phlebovirus). Legenda: Observar regiões de interseção ao longo das regiões que codificam os genes N e NSs entre o Virus Ariquemes e os Virus Echarate, Virus Maldonado e Virus Itaituba. Valores plotados no eixo das ordenadas correspondem aos percentuais de permutação entre os segmentos genômicos, enquanto que os valores no eixo das abcissas representam a posição nucleotídica ao longo do genoma. As setas em azul e vermelho correspondem aos genes N e NSs.
Por outro lado, utilizando o segmento SRNA do Virus Itaituba como alvo,
observou-se maior similaridade com o Virus Serra Norte com alto percentual de
permutação (100%) ao longo de toda a região genômica responsável pela
codificação da proteína N e valores percentuais reduzidos (média de 10%; Intervalo
= 0% e 35%) ao longo da região correspondente a proteína NSs (Figura 21).
79
Figura 21 - Análise de rearranjo genético pelo método de bootscan utilizando o segmento SRNA do Virus Itaituba e membros selecionados do Complexo Candiru (Bunyaviridae: Phlebovirus). Legenda: Observar regiões de interseção ao longo das regiões que codificam os genes N e NSs entre o Virus Itaituba e os Virus Jacunda, Virus Morumbi e Virus Serra Norte. Valores plotados no eixo das ordenadas correspondem aos percentuais de permutação entre os segmentos genômicos, enquanto que os valores no eixo das abcissas representam a posição nucleotídica ao longo do genoma. As setas em azul e vermelho correspondem aos genes N e NSs.
Em relação ao segmento MRNA, a análise pelo método de bootscan
evidenciou maior similaridade cruzada entre os vírus do Complexo Candiru com
valores de permutação que variaram entre 5% - 75% e 5% - 85%, quando utilizados
os Virus Itaituba e Virus Ariquemes, respectivamente (Figura 22 e Figura 23).
80
Figura 22 - Análise de rearranjo genético pelo método de bootscan utilizando o segmento MRNA do Virus Itaituba e membros selecionados do Complexo Candiru (Bunyaviridae: Phlebovirus). Legenda: Observar áreas de interseção ao longo das regiões que codificam os genes NSm, Gn e Gc entre o Virus Itaituba os Virus Jacunda, Virus Morumbi e Virus Serra Norte. Valores plotados no eixo das ordenadas correspondem aos percentuais de permutação entre os segmentos genômicos, enquanto que os valores no eixo das abcissas representam a posição nucleotídica ao longo do genoma. Setas em azul, vermelho e amarelo correspondem aos genes NSm, Gn e Gc.
81
Figura 23 - Análise de rearranjo genético pelo método de bootscan utilizando o segmento MRNA do Virus Ariquemes e membros selecionados do Complexo Candiru (Bunyaviridae: Phlebovirus). Legenda: Observar regiões de interseção ao longo das regiões que codificam os genes NSm, Gn e Gc entre o Virus Itaituba os Virus Jacunda, Virus Morumbi e Virus Serra Norte. Valores plotados no eixo das ordenadas correspondem aos percentuais de permutação entre os segmentos genômicos, enquanto que os valores no eixo das abcissas representam a posição nucleotídica ao longo do genoma. As setas em azul, vermelho e amarelo correspondem aos genes NSm, Gn e Gc.
Os resultados obtidos pela análise das sequências nucleotídicas completas
para os genes N (segmento SRNA), poliproteína M (NSm, Gn e Gc) e polimerase
viral (segmento LRNA) para os dez vírus do Complexo Candiru, evidenciou
diferenças topológicas entre as árvores filogenéticas construídas para os segmentos
S (gene N) e M (poliproteína) . A troca de pares genéticos foi claramente observada
entre os VJCN e VORI, VARQ e VESC, VITA e VMLO. A análise pelo método de MV
mostrou que, independente do modelo evolutivo selecionado, as topologias geradas
pelos métodos de NJ e MP para um determinado segmento genômico foram
significativamente mais prováveis do que a topologia competitiva utilizando o outro
segmento (P<0.001). Tais resultados indicaram que as topologias obtidas para os
segmentos SRNA (gene N) e M (poliproteína) foram diferentes, sugerindo ainda que
cada segmento de RNA apresenta uma história evolutiva distinta (Figura 24).
82
S (N)
Figura 24 - Análise de rearranjo genético para os membros do Complexo Candiru empregando o método de Kishino Hasegawa. Legenda: Árvores filogenéticas construídas pelo método de NJ para o gene de Nucleocapsídeo (N; 735 nt), gene codificador da poliproteína M (M: 3973 nt) e gene codificador da polimerase viral (L: 6278 nt). Valores de boostrap encontram-se acima de cada nó dos braços das árvores. Valores abaixo das escalas representam a divergência genética entre os segmentos genômicos dos phlebovirus.
O relacionamento genético provável entre os membros do Complexo Candiru
de acordo com a similaridade nucleotídica entre os três segmentos de RNA viral (S,
M e L) (Quadro 9)
83
Quadro 9 - Grupos genéticos observados entre os vírus do Complexo Candiru conforme as topologias das árvores geradas para os segmentos SRNA (gene N), MRNA (poliproteína) e LRNA (polimerase viral).
Segmento SRNA MRNA LRNA p
VJAN-VMRB VJAN - VORX VJAN-VMRB 0.00025
Grupos VARQ - VMLO VARQ - VESC VARQ-VMLO 0.000135
VESC - VTUA VITA - VMLO VESC-VTUA 0.000214
p: valor de probabilidade obtida para as topologias das árvores; VJAN (Virus
Jacunda); VMRB (Virus Morumbi); VARQ (Virus Ariquemes); VITA: (Virus Itaituba);
VESC (Virus Escharate); VORX (Virus Oriximina); VMLO (Virus Maldonado); VTUA
(Virus Turuna).
3.6. MODELO HIPOTÉTICO DE REARRANJO GENÉTICO DOS VÍRUS DO
COMPLEXO CANDIRU.
Com base nos resultados obtidos pelo Bootscan e Kishino Hasegawa,
estabeleceu-se um modelo hipotético que sugere a geração de progenies virais após
o rearranjo de segmentos genômicos a partir de vírus parentais. Os vírus resultantes
correspondem às progênies com material genético oriundo de ambos os vírus
parentais. No caso dos vírus do Complexo Candiru, observou-se evidências de
padrão de rearranjo genético do tipo rS1M2L1 em relação aos prováveis vírus
parentais que cederam seus segmentos de RNA (Figura 25).
84
Figura 25 - Possível padrão de rearranjo genético para os vírus do Complexo Candiru com base no relacionamento genético dos vírus para os segmentos genômicos SRNA, MRNA e LRNA. Legenda: Padrão de rearranjo S1M2L1. P1: parental 1 (em azul); P2: parental 2 (em vermelho); r: vírus rearranjado (em verde). Fonte: Adaptado de Nunes et al., 2005.
85
4. DISCUSSÃO
Os vírus pertencentes ao gênero Phlebovirus, apresentam-se geneticamente
distintos e dispersos em diferentes grupos antigenicamente e geneticamente
relacionados, conforme os resultados sorológicos e de biologia molecular, obtidos
respectivamente (TESH et al., 1989;BEATY; CALISHER, 1991; LIU et al., 2003;
PALACIOS et al., 2011a, 2011b; PAPA; VELO; BINO, 2011).
Os vírus do Complexo Candiru ,bem como os Virus Anhanga, Virus Tapara,
Virus Urucuri e Virus Uriurana, incluídos no presente estudo, mostraram consistência
com a organização genômica e características genéticas comuns aos membros do
gênero Phlebovirus descritos até o momento (KING et al., 2012), apresentando um
genoma tri-segmentado, incluindo o segmento maior (Large, LRNA) que codifica a
RNA polimerase, o segmento médio (Medium, MRNA) que codifica a proteína não
estrutural NSm e ambas as glicoproteínas de superfície Gn e Gc, bem como o
segmento menor (Small; SRNA) que codifica as proteínas N e NSs em orientações
genômicas contrárias (Figura 3). A diferença em tamanho evidenciada para cada um
dos segmentos genômicos dos membros do gênero Phlebovirus do estudo (Quadro
7) reflete a existência de uma grande variabilidade genética entre vírus distintos
dentro de um mesmo gênero.
As funções biológicas de um agente viral encontram-se associadas a
diferentes fatores, dentre os quais determinadas características genéticas mostram-
se determinantes para que funções como adesão celular, replicação e infectividade
viral possam ocorrer com sucesso. Tais características envolvem as estruturas não
codificadoras e codificadoras do RNA viral, produtos gênicos (proteínas virais),
presença de sítios de glicosilação na proteína viral (CLEREX-VAN HAASTER et al.,
1982; EIFAN et al., 2013; GOUY; GUINDON; GASCUEL, 2010; MURRELL;
YAREMA; LEVCHENKO, 2004; PETTERSSON, 1975) e motivos conservados que
permitem a identificação de regiões gênicas homologas para Orthobunyavirus e
Phlebovirus (HOFFMANN et al., 2012; MORES et al., 2009; SAVJI et al., 2011;
YANDOKO et al., 2007).
Neste contexto, a análise das características genômicas dos membros do
gênero Phlebovirus em estudo, evidenciou, que os mesmos apresentam todas as
proteínas virais, bem como os motivos conservados ao longo das proteínas N , Gn,
Gc e polimerase viral, confirmando que os 10 vírus do Complexo Candiru, mais o
86
Virus Anhanga, Virus Tapara, Virus Uriurana e Virus Urucuri como agentes virais
pertencem ao gênero Phlebovirus.
Para cada segmento genômico em particular, observou-se a presença de
características genéticas marcantes tais como a presença dos resíduos
aminoacídicos R (Arg) – K (Lys) – R (Arg) associados à interação da proteína N ao
RNA viral (Figura 10), domínios transmembranas ao nível das regiões terminais das
proteínas NSm, Gn e Gc (Figuras 11, 12 e 13), além da evidência de todos os
motivos da polimerase conservados entre os membros do gênero Phlebovirus
estudados (M1, M2, M3, pMA, MA ,MB, MC, MD, ME ,Figura 14) sugerindo que as
proteínas dos vírus incluídos no estudo apresentam-se funcionalmente conservadas.
Ainda sob o aspecto estrutural da molécula de RNA dos membros do
Complexo Candiru, Virus Anhanga, Virus Tapara, Virus Urucuri e Virus Uriurana,
sabe-se que resíduos de cisteina (Cys) são essenciais para a conservação e
manutenção da estrutura primária e secundária das proteínas virais, fatores
diretamente associados à função protéica (LIPTON et al., 2002). Neste contexto, os
dados obtidos para o número de resíduos de cisteina por proteína viral para cada
vírus estudado, revelou que a variação numérica de resíduos Cys parece estar em
geral associada a um determinado grupo viral ou vírus em especial (ex: número de
resíduos Cys contidos na proteína N dos vírus do Complexo Candiru entre 2 e 3;
Quadro 8 ). Tal observação sugere que a conservação estrutural e funcional da
proteína em cada grupo viral ou vírus em específico pode estar relacionada ao
número de resíduos de Cys existentes ao longo da proteína.
Em diferentes agentes virais, tais como os vírus influenza, Hendra, SARS-
CoV, Hepatites virais, Virus West Nile, Virus Bunyamwera e membros do gênero
Phlebovirus, o estudo do processo de N-glicosilação de glicoproteínas tem
despertado um grande interesse à comunidade científica devido às implicações
relacionadas às funções biológicas cruciais dos vírus, tais como adsorção em células
hospedeiras (host cell entry), ligação viral aos receptores celulares (hospedeiro),
fusão viral ao nível da membrana celular do hospedeiro, processamento proteolítico,
transporte de proteínas, empacotamento, montagem da partícula viral, replicação e
virulência (BAO et al., 2011; DENG et al., 1994; ITO et al., 2010; MURRELL;
YAREMA; LEVCHENKO, 2004; PANDA et al., 2004; PERSSON; PETTERSSON,
1991; RUSU et al., 2012).
87
Para os vírus incluídos no presente estudo, a variabilidade no número de
sítios potenciais de glicosilação, inclusive entre membros do Complexo Candiru
(Tabelas,6, 7, 8 e 9), sugere que, independente de serem antigenicamente ou
geneticamente relacionados, esses vírus apresentam propriedades biológicas
distintas quanto as suas capacidades fusogênicas e replicativas, tendo sido os sítios
P4, P7,8 e P35 os mais comuns entre os membros do Complexo
Candiru,demostrando serem sítios de grande importância biológica para esse grupo,
os Virus Anhanga, Virus Tapara, Virus Uriurana e Virus Urucuri , apresentaram sítios
diversos e alguns não coincidentes com os demais phlebovírus.
Sabe-se que os vírus do gênero Phlebovirus compõem um grupo viral diverso
que infecta artropodes (flebotomineos, mosquitos e carrapatos) e vertebrados
(ruminantes,roedores, marsupiais e humanos) (KING et al., 2012; TRAVASSOS DA
ROSA et al., 1983). A Amazônia brasileira, no que tange a sua complexa
biodiversidade viral e de hospedeiros, bem como por incluir diferentes nichos
ecológicos, favorece a manutenção de agentes virais em natureza, e a emergência
de novos agentes virais diretamente associados a troca de segmentos genômicos ou
ao fenômeno de rearranjo genético ( NUNES-NETO ,2007 , PALACIOS et al.,2011).
Nas ultimas décadas, dentro da família Bunyaviridae, alguns exemplos de
vírus rearranjados foram descritos, tais como o Virus Ngari (GERRARD et al., 2004),
os vírus do Grupo C (NUNES et al., 2005), Virus Iquitos (AGUILAR et al., 2011), e
mais recentemente o Virus schmallenberg, reconhecido como um possível ancestral
do Virus Shamoda, ou vírus parental que cedeu os segmentos S e L para este último
(BEER; CONRATHS; POEL, 2012; GARIGLIANY et al., 2012; YANASE et al., 2005).
De fato, o rearranjo genético em natureza parece ser um fato mais comum do
que se parece, e acredita-se que este é o mecanismo mais utilizado para geração de
biodiversidade entre os membros da família Bunyaviridae (GERRARD et al., 2004;
HOFFMANN et al., 2012; NUNES et al., 2005).
As análises de alinhamento múltiplo, simplot e filogenia foram conduzidas
objetivando estabelecer o relacionamento genético entre os vírus do Complexo
Candiru e demais membros do gênero Phlebovirus incluídos no estudo, bem como
avaliar a possibilidade de rearranjo genético em natureza.
As reconstruções filogenéticas, associadas a dados de alinhamento múltiplo e
plotagem gráfica (Simplot) vêm demonstrando serem ótimas ferramentas em
conjunto com testes estatísticos (Kishino Hasegawa) para a determinação da
88
existência ou não de rearranjos naturais entre agentes virais (GARIGLIANY et al.,
2012; GERRARD et al., 2004; NUNES et al., 2005). No caso dos phlebovírus do
Complexo Candiru, e os Virus Anhanga, Virus Tapara, Virus Urucuri e Virus
Uriurana, tais ferramentas mostraram que a reconstrução filogenética para os
segmentos S, M e LRNA, foram consistentes com dados prévios indicando que vírus
pertencentes a um mesmo complexo permanecem agrupados em uma única clade
genética (CLARKE; CASALS, 1958; COLLAO et al., 2009)
O rearranjo genômico em natureza ocorrido entre membros da família
Bunyaviridae, mais especificamente entre membros dos gêneros Orthobunyavirus e
Phlebovirus tem sido frequentemente comprovado (AGUILAR et al., 2011; BRIESE;
KAPOOR; LIPKIN, 2007; BRIESE et al., 2006; COLLAO et al., 2010; GERRARD et
al., 2004; NUNES et al., 2005) . No entanto, a extensão desse evento evolutivo em
termos de ocorrência entre os membros do gênero Phlebovirus não é conhecida.
Muitas análises têm sido realizadas com base em poucas sequências completas ou
muitos dados genômicos parciais ( LIU et al., 2003; NUNES-NETO,2007;COLLAO et
al., 2009, 2010; MATSUNO et al., 2013). Com os dados genômicos para sequências
completas para os vírus do Complexo Candiru, e os Virus Anhanga, VirusTapara,
Virus Uriurana e Virus Urucuri, pode-se observar que esse evento não se restringe
ao gênero Orthobunyavirus, sendo encontradas evidências de permutação
(rearranjo) de pelo menos um dos segmentos genômicos em seis dos 10 phlebovírus
do Complexo Candiru incluidos no estudo (Quadro 9, Figura 20, 21, 22, 23 e 24).
Com o uso sistemático da biologia molecular, e mais recentimente a utilização
do sequenciamento de última geração (NGS) para a obtenção de genomas
completos, foi possível ser evidenciado mais eventos de rearranjo em natureza
envolvendo outros membros do gênero Phlebovirus isolados no Brasil ou em outras
regiões do mundo.
Curiosamente, todos os vírus rearranjados descritos até o presente envolvem
a troca do segmento M (BLITVICH et al., 2012; BOWEN et al., 2001; BRIESE;
KAPOOR; LIPKIN, 2007; BRIESE et al., 2006; CHOWDHARY et al., 2012; COLLAO
et al., 2010; NUNES et al., 2005). O mesmo fato foi observado para os membros do
Complexo Candiru que evidenciaram eventos de troca de segmento genômico
envolvendo o segmento M (Figura 25). Apesar do segmento MRNA ser o segmento
genômico mais envolvido em processos de rearranjo genético tanto nos
89
orthobunyavírus quanto nos phlebovírus, a razão pela qual tal segmento é preferido
permanece não esclarecido.
O segmento M dos membros do gênero Phlebovirus codifica duas
glicoproteínas denominadas de Gn e Gc, e uma proteína não-estrutural , NSm (KING
et al., 2012; PETTERSSON, 1975). Tal como acontece com outros membros da
família Bunyaviridae, as glicoproteínas do envelope dos membros do gênero
Phlebovirus são importantes para a infecção viral, patogênese e imunidade. Essas
proteínas servem como alvos de anticorpos neutralizantes e de inibição da
hemaglutinina e são expostas a uma pressão seletiva (BATTLES; DALRYMPLE,
1988; BEATY; CALISHER, 1991). Epítopos neutralizantes tipicamente dependem da
estrutura terciária de proteínas, e até mesmo uma única substituição de aminoácidos
pode influenciar a atividade biológica (HÖRLING; LUNDKVIST, 1997;
SCHMALJOHN et al., 1990).
O ICTV atualmente distingue as espécies do gênero Phlebovirus com base
numa diferença de 4 vezes nos títulos de neutralização. Embora ensaios de
neutralização sejam métodos bem estabelecidos para diferenciar os membros do
gênero Phlebovirus no que tange uma análise taxonômica, a alta taxa de rearranjo
genético do segmento M demonstrada neste estudo para os vírus do Complexo
Candiru, sugere o risco potencial de se utilizar unicamente o teste de neutralização
ou ensaios de inibição da hemaglutinação (IH) para identificação. Apesar de não ser
um membro do gênero Phlebovirus, o Virus Ngari (NRIV) é um caso em questão.
Este vírus foi associado com doença febril grave e febre hemorrágica em humanos
na África Oriental (BRIESE et al., 2006; GERRARD et al., 2004).
A caracterização genética do NRIV evidenciou que esse vírus é um rearranjo
genético que recebeu os segmentos S e L RNA do Virus Bunyamwera (BUNV) e um
segmento de MRNA do Virus Batai (BATV) (BRIESE et al., 2006). Em testes de
PRNT ou com sequenciamento parcial de apenas um dos segmentos genômicos, no
caso o segmento MRNA, o NRIV foi identificado como BATV, no entanto testes de
FC, que detectam a proteína N (proteína da nucleocapsídeo) codificada pelo
segmento de SRNA, o NRIV mostrou-se geneticamente similar ao BUNV.
Testes de Fixação de Complemento (FC) são ensaios extremamente úteis na
identificação de membros de um dado complexo antigênico. No entanto, é menos
provável que os títulos recíprocos de FC sejam suficientes para determinar o exato
relacionamento antigênico entre os membros de um grupo sorológico. Embora não
90
tenhamos encontrado nenhuma correlação entre distância genética e títulos FC ao
nível de espécie viral (dados não mostrados), verificou-se uma boa correlação entre
os resultados sorológicos com a formação das clades filogenéticas evidenciadas
pelo agrupamento dos vírus antigenicamente caracterizados como membros do
Complexo Candiru (Virus Alenquer, Virus Turuna, Virus Serra Norte, Virus Jacunda,
Virus Morumbi, Virus Candiru, Virus Mucura, Virus Oriximina, Virus Ariquemes e
Virus Itaituba), o que corrobora com dados encontrados por Travassos da Rosa e
colaboradores (1983), Guerreiro e colaboradores (1998), Nunes-Neto (2007) e
Palacios e colaboradores (2011a), os Virus Anhanga, Virus Tapara e Virus Urucuri,
agruparan-se em clados distintos formando os grupos I, ll e ll, pouca informação se
têm quanto a sorologia destes vírus com os demais membros do gênero Phlebovirus
,no entanto os achados corroboram os estudos realizados por Travassos da Rosa e
colaboradores (1983) e Tesh e colaboradores (1982) onde se observou um
relacionamento sorologico muito fraco ou até inexistente entre esses vírus e os
demais membros do gênero Phlebovirus , o VURI agrupou com o Virus Chagres com
valor de Bootstrap de 1000, indicando que os mesmo fazem parte de um mesmo
complexo, o Complexo Chagres . A neutralização, por outro lado, não parece
correlacionar-se com a distância evolutiva. Dada a baixa correlação entre os títulos
de fixação de complemento e distância genética, pode ser prudente adotar um
sistema de classificação para os membros do gênero Phlebovirus que também leve
em consideração os dados genéticos.
O atual sistema de taxonomia, que se baseia exclusivamente na classificação
antigênica, pode ser enganoso, dado o fenômeno de rearranjo genético. Neste
contexto, é válido ressaltar que 4 dos 10 membros do Complexo Candiru foram
isolados a partir de pacientes febris (KARABATSOS, 1985; TRAVASSOS DA ROSA
et al., 1998). As manifestações clínicas da doença nesses indivíduos foram
semelhantes caracterizadas como uma doença febril auto- limitada e indistinguíveis
de outras doenças causadas por outros arbovírus menos (TESH, 2006). Com base
na frequência de isolados virais (a maioria isolada uma única vez), pode-se sugerir
que os vírus do Complexo Candiru não constituem uma causa comum de doença
humana em regiões tropicais das Américas. No entanto, a escassez desses isolados
pode ser um reflexo da distribuição geográfica desses agentes virais (regiões de
florestas tropicais), bem como do método de identificação (todos foram isolados e
identificados em Centros de Pesquisa e Diagnóstico para Arbovírus). Devido à
91
limitação laboratorial da maioria das unidades médicas localizadas em áreas
tropicais, além da natureza inespecífica da doença causada pelos membros do
gênero Phlebovirus, os casos humanos esporádicos podem ser não diagnosticados
corretamente ou simplesmente não reconhecidos.
Levando em consideração os dados genéticos evidenciados neste trabalho,
no que tange o sequenciamento completo de diferentes membros do Complexo
Candiru e dos Virus Anhanga, VirusTapara, Virus Uriurana e Virus Urucuri , bem
como a evidência de evento de rearranjo genético entre membros de um mesmo
complexo antigênico (neste caso o Complexo Candiru), ressalte-se a importância da
obtenção de dados genéticos para este importante gênero viral objetivando o melhor
conhecimento da estrutura genômica, características genéticas e regiões do genoma
que possam ser usadas para o desenvolvimento de métodos rápidos, sensíveis e
específicos para o diagnóstico das doenças associadas aos membros do gênero
Phlebovirus de interesse médico e veterinário.
92
5. CONCLUSÕES
- As 14 amostras virais utilizadas no estudo mostraram organização genômica e
caracteristicas genéticas semelhantes com outros membros do gênero Phlebovirus;
- Os phlebovírus incluídos no estudo mostraram domínios conservados ao nível dos
tês segmentos de RNA genômico (SRNA, MRNA e LRNA) todos relacionados aos
phlebovírus previamente sequenciados;
- No segmento LRNA, além dos domínios característicos presentes na polimerase
dos phlebovírus (domínio catalítico, domínio RdRp (RNA-dependente de RNA
polimerase), detectou-se a presença de um subdomínio (DUF 3770) de função
desconhecida;
- Foi observado maior conservação dos motivos aminoacídicos em membros de um
mesmo complexo antigênico em comparação com phlebovírus de outros complexos
ou não agrupados;
- Foi evidênciado, no segmento MRNA a presença de diferentes sítios de clivagem
ao longo da Poliproteína M, resultando na subdivisão da mesma em três proteínas,
Gn e Gc (proteínas estruturais) e NSm (proteína não estrutural);
- Foi revelado uma variação numérica de resíduos de cisteina para cada vírus
estudado,sugerindo que a conservação estrutural e funcional da proteína em cada
Complexo viral ou vírus específico pode estar relacionada ao número de resíduos de
Cisteina existentes ao longo da proteína ;
- A variabilidade no número de sítios potenciais de glicosilação, sugere que,
independente de serem antigenicamente ou geneticamente relacionados, esses
phlebovírus apresentam propriedades biológicas distintas quanto as capacidades
fusogênicas e replicativas;
- A análise filogenética comparativa e evolutiva para os três segmentos genômicos
dos phlebovírus estudados, sugere que os mesmos, fazem parte de cinco
93
Complexos: Complexo Candiru (Virus Alenquer, Virus Ariquemes, Virus Turuna,
Virus Serra Norte, Virus Jacunda, Virus Morumbi, Virus Candiru, Virus Mucura, Virus
Oriximina e Virus Itaituba), Complexo Chagres (Virus Uriurana), Complexo I (Virus
Tapara), Complexo II (Virus Anhanga) e Complexo III (Virus Urucuri);
- Foi observado em seis dos quatorze phlebovírus estudados (Virus Ariquemes,
Virus Itaituba, Virus Jacunda, Virus Morumbi, Virus Oriximina e Virus Turuna),
evidências de padrão de rearranjo genético do tipo rS1M2L1.
94
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107
ANEXOS
Anexo - 1
Autorização para utilização de dados e espécimes biológi
108
Anexo - 2
Autorização para utilização de espécimes biológicos
