Texto Integralmm

Validao de metodologia de anlise de pesticidas agrcolas em guas por LC/MS

Projecto de Desenvolvimento em Ambiente Acadmico

Mestrado Integrado em Engenharia Qumica

Rita Maria dos Santos Cardoso Gonalves de Arajo

Orientadora: Professora Doutora Arminda Alves (LEPAE-DEQ-FEUP)

Co-orientadora: Professora Doutora Lcia Santos (LEPAE-DEQ-FEUP)

Fevereiro de 2008

Validao de metodologia de anlise de pesticidas agrcolas em guas por LC-MS

i

Agradecimentos Professora Doutora Arminda Alves pela oportunidade de desenvolver este trabalho, por

todo o apoio e ateno que me deu durante a realizao do trabalho experimental e durante

a elaborao desta tese.

Professora Doutora Lcia Santos pelo apoio e preocupao demonstrados.

Professora Doutora Olga Nunes por ter amavelmente emprestado o HPLC-UV do seu

laboratrio.

Vera com quem trabalhei em LC/MS e me ajudou sempre que necessrio.

A todos as pessoas que me ajudaram em tudo o que precisei durante o meu trabalho e me

deram apoio e motivao, a Ftima, o Sr. Serafim, o Z Lus, a Joana, a Raquel e o Nuno.

Ao LEPAE Laboratrio de Engenharia de Processos, Ambiente e Energia e ao DEQ

Departamento de Engenharia Qumica, pela disponibilizao do espao fsico e dos meios que

permitiram que este trabalho se realizasse.


ii

Resumo As anlises multiresduo de pesticidas em gua tm sido uma preocupao crescente nos

laboratrios de controlo de qualidade, principalmente se os compostos alvo forem substncias

prioritrias includas na Directiva da gua (2000/60/CE).

Neste tipo de anlises podem surgir dois problemas principais: a diversidade dos

compostos alvo (no que diz respeito s suas propriedades fsico-qumicas) e a obrigao de

cumprir os limites legais mximos quando estes esto estabelecidos. Na maioria dos casos

podem ser usados mtodos analticos, em que se aplicam procedimentos de extraco,

seguidos de deteco com cromatografia gasosa ou lquida de alta resoluo, acoplada com

espectrometria de massa, para a deteco de um grande nmero de compostos numa nica

corrida. Os mtodos analticos tm de ser validados e devem ser determinadas as incertezas

globais correspondentes.

Neste trabalho foi implementado, validado e avaliado em termos de incerteza global um

mtodo multiresduo de screening para determinar, em gua, quatro pesticidas usados na

agricultura- cimoxanil, bentazona, diuro e 2,4-D, atravs de extraco em fase slida (SPE)

antes da etapa de cromatografia lquida com deteco por ultravioleta (HPLC-UV), bem como

um mtodo de confirmao por cromatografia lquida acoplada a espectrometria de massa

(LC/MS/MS).

Os parmetros de validao da metodologia analtica foram obtidos para todos os

compostos em estudo com HPLC-UV. A optimizao dos procedimentos em LC/MS/MS foi

efectuada para os compostos alvo usando injeco directa de padres. No entanto, o mtodo

para amostras extradas foi apenas optimizado para o cimoxanil e a bentazona.

Os limites de deteco foram de 70 ppb, 39 ppb, 420 ppb e de 470 ppb para o cimoxanill,

bentazona, 2,4-D e diuro, respectivamente.

Os valores de recuperao mdia foram de 90,1% para o cimoxanil, 52,1% para a

bentazona, 88,0% para o 2,4-D e 91,6% para o diuro.

As incertezas globais associadas ao resultado analtico foram de 10,8% para o cimoxanil,

21,8% para a bentazona, 34,5% para o 2,4-D e 55,8% para o diuro.

A metodologia analtica implementada e validada foi considerada adequada para os

objectivos propostos.

Palavras Chave: Poluentes prioritrios; Cromatografia lquida-espectrometria de massa;

Validao.


iii

Abstract Multiresidue analysis of pesticides in waters is of increasing concern for quality control

laboratories, mainly if the targets are the priority substances included in the Water

Framework Directive (2000/60/EC).

In this kind of analysis two mainly problems can arise: the diversity of the target

compounds (in terms of physico-chemical behaviour) and the obligation to accomplish the

maximum legal limits when they are established. For most cases the use of analytical

methods that apply an extraction procedure followed by detection with high resolution gas or

liquid chromatography coupled with mass spectrometry can be used for detecting a large

number of compounds in a single run. The analytical methodologies must be validated and the

corresponding global uncertainties should be determined.

In this work, a multiresidue method was implemented, validated and evaluated in terms

of global uncertainty which was used for four selected pesticides used in agriculture-

cymoxanil, bentazone, diuron and 2,4-D - in water, by solid phase extraction (SPE) prior to

liquid-chromatography with ultraviolet detection (HPLC-UV), as screening method and liquid-

tandem mass spectrometry (LC/MS/MS) for confirmation.

The validation parameters of the analytical methodology were obtained for all the

compounds in study with HPLC-UV. The optimization of the LC/MS/MS procedures was

established for the target compounds using direct injection of standard solutions, but the

methodology for extracted samples was only obtained for cymoxanil and bentazone.

The limits of detection for the screening analytical methodology were of 70 ppb, 39 ppb,

420 ppb and 470 ppb for cymoxanil, bentazone, 2,4-D and diuron respectively.

Recovery values were of 90,1% for cymoxanil, 52,1% for bentazone, 88,0% for 2,4-D and

91,6% for diuron.

Global uncertainties were 10,8% for cymoxanil, 21,8% for bentazone, 34,5% for 2,4-D and

55,8% for diuron.

The implemented and validated analytical methodology was proved adequate for the

proposed objectives.

Keywords: Priority pollutants; Liquid chromatography-mass spectrometry; Validation.


iv

ndice Geral

Agradecimentos............................................................................................. i

Resumo ...................................................................................................... ii

Abstract .................................................................................................... iii

ndice ....................................................................................................... iv

Notao e Glossrio ...................................................................................... vi

Lista de Figuras ...........................................................................................vii

Lista de Tabelas........................................................................................... ix

1 Introduo... 1

1.1 Enquadramento e Apresentao do Projecto .............................................. 1

1.2 Contributos do Trabalho ....................................................................... 2

1.3 Organizao da Tese............................................................................ 2

2 Estado da Arte ......................................................................................... 4

2.1 Breve caracterizao dos pesticidas em estudo .......................................... 4

2.2 Mtodos de anlise dos pesticidas em estudo.............................................. 7

2.2.1 Princpios gerais de Extraco em Fase slida (SPE) ................................ 9

2.2.2 Princpios gerais de LC/MS.............................................................. 12

3 Materiais e Mtodos ................................................................................ 23

3.1 Reagentes ....................................................................................... 23

3.2 Equipamento ................................................................................... 23

3.3 Preparao de padres ....................................................................... 24

3.4 Extraco por SPE ............................................................................. 26

3.5 Anlise por HPLC-UV.......................................................................... 27

3.6 Anlise por LC/MS ............................................................................. 27


v

4 Resultados e Discusso............................................................................. 29

4.1 Optimizao das condies operatrias................................................... 29

4.1.1 Optimizao da fase mvel para HPLC-UV .......................................... 29

4.1.2 Optimizao das condies de extraco por SPE ................................. 32

4.1.3 Validao do procedimento analtico de "screening" por SPE-HPLC-UV ....... 35

4.1.4 Estimativa de da incerteza analtica do mtodo de "screening" por

SPE-HPLC-UV ........................................................................................ 38

4.1.5. Optimizao das condies de LC/MS................................................. 40

5 Concluses ........................................................................................... 45

6 Avaliao do trabalho realizado.................................................................. 45

6.1 Objectivos Realizados ........................................................................ 45

6.2 Outros Trabalhos Realizados ................................................................ 46

6.3 Limitaes e Trabalho Futuro............................................................... 46

Referncias ............................................................................................... 47

Anexo A Dados referentes s rectas de calibrao por injeco directa de padres de

mistura.. ............................................................................................ 51

Anexo B Dados referentes s rectas de calibrao por injeco de padres extrados. 52

Anexo C Dados referentes aos ensaios de preciso............................................ 53

Anexo D Equaes usadas para determinar os parmetros de linearidade ............... 54

Anexo E Equaes usadas na estimativa da incerteza global ................................ 55

Anexo F Poster apresentado no workshop de LC/MS........................................... 57

Anexo G Fragmentao de cada um dos pesticidas em estudo............................... 58


vi

Notao e Glossrio

Lista de Siglas

APCI Ionizao qumica a presso atmosfrica

API Ionizao a presso atmosfrica

BEN Bentazona

CIM Cimoxanil

DC Potencial de corrente

DCM Diclorometano

DIU Diuro

ESI Electrospray

GC/MS Cromatografia gasosa com espectrometria de massa

HPLC Cromatografia lquida

HPLC-UV Cromatografia lquida com detector ultravioleta-visvel

LC/MS Cromatografia lquida com detector de espectrometria de massa

LEPAE Laboratrio de Engenharia de Processo Ambiente e Energia

LLE Extraco lquido-lquido

MET Metanol

MS/MS Dois nveis de fragmentao recorrendo a espectrometria de massa

MSPD Matrix solid-phase dispersioncomprimento da coluna

ODS Octadecilsiloxano

QIT/TOF Quadrupoloion-trap

QqQ Quadrupolo triplo

Q-TOF Quadrupolo-Time of flight

Q-trap 3D quadrupolo-ion-trap

RF Voltagem de corrente varivel

SBSE Stir-bar sorptive extractionespessura da membrana

SIM Selected ion monitoring

SPE Extraco em fase slida

SPE-LC/MS Extraco em fase slida e cromatografia lquida com espectometria de massa

SPME Microextraco em fase slida

SRM Selected reaction monitoring

TClA cido tricloroactico

TOF/TOF Dois Time of flight acoplados

ue Incerteza associada exactido Uglobal Incerteza global

Umglobal Incerteza global mdia up Incerteza associada preciso upp Incerteza associada preparao dos padres uxo Incerteza associada s rectas de calibrao


vii

Lista de Figuras

Figura 1-Procedimento de SPE (extrado de Fritz, 1999).

Figura 2-Esquema da estrutura do sistema de espectrometria de massa (extrado de Waters

Corporation, 2008).

Figura 3-Esquema geral de uma interface a presso atmosfrica e fonte de ies (extrado

de Niessen, 1999).

Figura 4-Representao da deformao e exploso de Coulomb resultando na produo de

pequenas e micro-gotas carregadas (extrado de Niessen, 1999).

Figura 5-Quadrupolo linear (extrado de Waters Corporation, 2008).

Figura 6-Ilustrao de um quadrupolo triplo (extrado de Kuster et al, 2006).

Figura 7 Quadrupolo ion trap com fonte de ies externa (extrado de Niessen, 2006).

Figura 8- Electromultiplicador (extrado de Waters Corporation, 2008).

Figura 9- Fotomultiplicador de dodos (extrado de Waters Corporation, 2008).

Figura 10- Placas de microcanal (extrado de Waters Corporation, 2008).

Figura 11-Procedimento de SPE utilizado.

Figura 12-Cromatogramas dos 4 pesticidas em estudo obtidos por injeco de padres

individuais com concentraes de 100 ppm para a bentazona e diuro, 500 ppm

para o cimoxanil e 200 ppm para o 2,4-D recorrendo a um fluxo de 1,0 mL/min e

=245 nm.

Figura 13-Cromatograma dos 4 pesticidas em estudo obtido por injeco de um padro de

mistura com bentazona (20 ppm), cimoxanil (125 ppm), diuro (60 ppm) e 2,4-D

(40 ppm) usando um fluxo de fase mvel de 1,0 mL/min e um comprimento de

onda de 230 nm.

Figura 14-Esquema do procedimento de SPE anteriormente referido.

Figura 15-Cromatograma de um extracto recorrendo metodologia apresentada na figura

14.

Figura 16-Cromatograma de um padro de cimoxanil 500 ppb, bentazona 2500 ppb, 2,4-D

1400 ppb e diuro 800 ppb extrado nas condies do mtodo C utilizando a

coluna Nucleosil da Macherey-Nagel.

Figura 17-Rectas de calibrao obtidas para cada um dos pesticidas por injeco directa de

padres de mistura.

Figura 18-Rectas de calibrao obtidas para cada um dos pesticidas por injeco de padres

extrados.


viii

Figura 19-Fotografia do LC/MS utilizado.

Figura 20-Representao em corte do espectrmetro de massa (extrado de Varian, 2007).

Figura 21-Cromatograma obtido por injeco directa de um padro de bentazona de 1 ppm

e o espectro de massa correspondente, em LC/MS.

Figura 22-Cromatograma obtido por injeco directa de um padro de cimoxanil de 5 ppm

e o espectro de massa correspondente, em LC/MS.

Figura 23-Cromatograma obtido por injeco de um padro extrado de cimoxanil de 2,5

ppm e o espectro de massa correspondente, em LC/MS/MS.

Figura 24-Cromatograma obtido por injeco de um padro extrado de bentazona de 0,5

ppm e o espectro de massa correspondente, em LC/MS/MS.


ix

Lista de Tabelas

Tabela 1-Propriedades fsicas dos pesticidas em estudo.

Tabela 2-Aductos mais comuns encontrados nos modos de ionizao positiva e negativa

(extrado de Niessen, 2006).

Tabela 3-Valores de concentrao dos padres de cimoxanil (CIM), de bentazona (BEN),

diuro (DIU) e 2,4-D em ppb necessrios para preparar os padres de mistura.


diuro (DIU) e 2,4-D em ppb, assim como o volume de padro MIX_0 que foi

utilizado.

Tabela 5-Valores de concentrao de cada um dos pesticidas em cada padro de mistura

(Cf), assim como o volume de padro-me utilizado para preparar o padro

(Vret).

Tabela 6-Descrio das condies operatrias por LC/MS em que a gua o solvente A e o

acetonitrilo, o solvente B.

Tabela 7-Descrio das condies de aquisio de dados em LC/MS.

Tabela 8-Condies de extraco por SPE (A, B, C e D).

Tabela 9-Valores de concentrao, nmero de ensaios, recuperao mdia (% Rmdia) e o

coeficiente de variao em percentagem para ensaios a um nvel de concentrao

(preciso/exactido) e a nveis de concentrao diferentes.

Tabela 10-Valores obtidos para as incertezas associadas a cada uma das fontes e os valores

dos coeficientes globais e o coeficiente global mdio para o cimoxanil.


dos coeficientes globais e o coeficiente global mdio para o bentazona.


dos coeficientes globais e o coeficiente global mdio para o 2,4-D.


dos coeficientes globais e o coeficiente global mdio para o diuro.

Tabela 14-Valores de concentrao e reas obtidas para cada um dos pesticidas por

injeco directa de padres de mistura e que foram usados para a recta de

calibrao.

Tabela 15-Dados de linearidade das rectas de injeco directa para cada um dos pesticidas

em estudo, cimoxanil (CIM), bentazona (BEN), 2,4-D e diuro (DIU), em que Sa/a%

o desvio-padro relativo do declive.


x

Tabela 16-Valores de concentrao e reas obtidas para cada um dos pesticidas por

injeco de padres de mistura extrados e que foram usados para a recta de

calibrao.

Tabela 17-Dados de linearidade das rectas injeco de padres extrados para cada um dos

pesticidas em estudo, cimoxanil (CIM), bentazona (BEN), 2,4-D e diuro (DIU), em

que Sa/a o desvio-padro relativo do declive.

Tabela 18-Valores de concentrao, rea dos picos, rea mdia e coeficiente de variao

para cada um dos compostos.


1

1. Introduo

1.1. Enquadramento e apresentao do projecto

O uso intensivo de pesticidas na agricultura e a poluio adicional, causada pela emisso

industrial, durante a sua produo, tem resultado na ocorrncia de resduos destes qumicos

e dos seus produtos de transformao em alimentos, guas e solos.

Atendendo ao seu modo de aco, conhecido ou suposto, estes xenobiticos podem ser

classificados nos seguintes grupos principais: herbicidas, insecticidas, reguladores do

crescimento, fungicidas e bactericidas. Esta classificao revela-se importante, na medida

em que as propriedades apresentadas pelos pesticidas de cada um dos grupos influenciam o

impacto ambiental ocasionado pelos mesmos.

Apesar da grande diversidade de pesticidas aplicados para diferentes fins, apenas alguns

so regulamentados pela Unio Europeia (Kuster et al, 2006). A recente Proposta de

Directiva Europeia, de 17 de Julho de 2006 (2006/0129/CE), vem regulamentar os nveis

mximos permitidos ou aconselhados para um conjunto de 33 substncias prioritrias em

guas. Estes nveis so, em alguns casos, extremamente baixos, e na maioria destes, ainda

no tm associados mtodos analticos de referncia. Por outro lado, compete aos estados-

membros da Unio Europeia, definirem os planos de monitorizao das guas, de acordo

com o tipo de contaminaes esperadas (por exemplo, tipo de indstrias, tipo de pesticidas

aplicados na agricultura, entre outros), de forma a cumprirem as exigncias de qualidade

das guas residuais, superficiais e interiores definidas na referida Directiva.

Em Portugal, esto definidos pelas Comisses de Coordenao e Desenvolvimento

Regional, quais os planos de monitorizao aplicveis e quais os contaminantes a analisar,

bem como qual a frequncia e locais de amostragem. No caso particular dos pesticidas

agrcolas, existem mtodos desenvolvidos para vrias classes de pesticidas mas poucos

mtodos contemplam a anlise multiresduo, envolvendo pesticidas de diferentes classes.

Neste trabalho, procurou-se implementar um mtodo multiresduo aplicado a quatro

pesticidas (bentazona, cimoxanil, diuro e cido 2,4-diclorofenoxiactico) includos no plano

de monitorizao das guas da regio Norte, tendo ainda como objectivos:

Validar um mtodo simples, mas fivel, de screening para anlise de um elevado

nmero de amostras, usando um mtodo de extraco em fase slida (SPE) e

subsequente determinao cromatogrfica por HPLC-UV;


2

Desenvolver um mtodo de confirmao, para as amostras em que os pesticidas

fossem detectados na etapa de screening, usando o mesmo mtodo de extraco

em fase slida (SPE) e subsequente determinao por LC/MS.

1.2. Contributos do trabalho

Espera-se que o trabalho desenvolvido represente uma contribuio significativa no

domnio dos mtodos de anlise de poluentes prioritrios em guas, permitindo uma

resposta eficaz e adequada s necessidades de monitorizao dos recursos naturais

(hdricos), de forma a prevenir e combater a permanente degradao destes.

A tendncia actual de utilizao de mtodos instrumentais de anlise cada vez mais

complexos, como so as tcnicas hifenadas de cromatografia gasosa ou lquida com

espectrometria de massa, tem a vantagem de possibilitar a inequvoca determinao dos

poluentes, por vezes presentes em quantidades nfimas. No entanto, apresenta inmeras

desvantagens como o custo do equipamento e a necessidade de existirem tcnicos

especializados, diminuindo as possibilidades de monitorizao de um amplo nmero de

pontos de amostragem.

Outro contributo esperado para este trabalho a implementao de um mtodo

simples e expedito que permita efectuar uma triagem inicial de um vasto nmero de

amostras, sendo que destas, s aquelas onde tiverem sido detectados poluentes, so sujeitas

a confirmao pelas tcnicas mais complexas referidas atrs.

Finalmente, espera-se poder contribuir para a definio das incertezas analticas

associadas a estes compostos, cuja informao inexistente na literatura internacional.

1.3. Organizao da tese

Na Introduo desta tese apresentado o enquadramento do trabalho e os motivos pelos

quais se torna importante desenvolver mtodos multiresduos para a deteco de poluentes

prioritrios, como pesticidas que se encontram presentes no ambiente.


3

No Estado da Arte apresentada uma breve caracterizao dos pesticidas em estudo,

sendo referidas algumas propriedades fsico-qumicas dos compostos, as suas aplicaes, os

efeitos sobre a sade e os limites legais estipulados. So tambm descritos os princpios

gerais dos mtodos de anlise de pesticidas, nomeadamente a extraco em fase slida

(SPE) e a constituio e funcionamento da cromatografia lquida acoplada com

espectrometria de massa.

Na seco correspondente a Materiais e Mtodos so apresentados os reagentes e o

equipamento utilizado durante a realizao deste trabalho, o modo como foram preparados

os padres e as condies operatrias finais obtidas para a extraco em fase slida, anlise

em HPLC-UV e LC/MS.

De seguida, surge a parte correspondente aos Resultados e Discusso, na qual so

descritas e discutidas as fases de optimizao da fase mvel para HPLC-UV e das condies

de extraco em SPE e LC/MS. apresentado o procedimento de validao do mtodo de

screening por SPE-HPLC-UV, assim como a estimativa das incertezas globais associadas.

Aps o captulo das Concluses surge a seco de avaliao do trabalho realizado, na

qual so enunciados os objectivos, outros trabalhos realizados, as limitaes e trabalho

futuro.


4

2. Estado da arte

Neste captulo, depois de uma breve introduo sobre a utilizao, os efeitos na

sade humana e a legislao, sero apresentadas as caractersticas fsico-qumicas das

substncias em estudo, que permitem compreender os resultados experimentais.

De seguida, e de uma forma brevssima apresentar-se-o as noes-base da tcnica

instrumental usada como mtodo de extraco (SPE) e de determinao cromatogrfica

(LC/MS).

2.1. Breve caracterizao dos pesticidas em estudo

Durante a realizao deste estudo procurou-se identificar e quantificar alguns

pesticidas pertencentes a vrios grupos. Foram usados diuro, 2,4-D, bentazona, os quais

apesar de serem herbicidas correspondem respectivamente subclasse das fenilureias,

cidos fenoxiacticos e benzotiodizinas, apresentando propriedades diferentes. Recorreu-se

tambm ao estudo de cimoxanil que um fungicida aliftico hidrogenado.

Algumas caractersticas e propriedades fsicas dos pesticidas usados so apresentadas

na Tabela 1.


5

Tabela 1- Propriedades fsicas dos pesticidas em estudo.

Nome Nome qumico Frmula qumica

Frmula de estrutura

Actividade Solubilidade pKa

Bentazona

3-isopropil-1H-2,1,3-benzotiodiazina-4(3H)-ona-2,2

dixido

C10H12N2O3S

Herbicidas Benzotiodizina

Solvel em gua: 500 mg/L (20C) (Wells et al,

2000)

2,6-2,8 (Thorstensen et

al, 2000)

2,4-D cido 2,4-

diclorofenoxiactico C8H6Cl2O3

Herbicidas cidos

fenoxiacticos

Solvel em gua: 900 mg/L (25C) (Wells et al,

2000)

2,8 (Wells et al,

2000)

Diuro 3-(3,4-diclorofenil)-1,1-dimetilureia C9H10Cl2N2O

Herbicidas de fenilureia

36,4 mg/L

(25C) (Tran et al, 2006)

-

Cimoxanil 1-(2-ciano-2-

metoxiiminoacetil) -3-etilureia

C7H10N4O3

Fungicidas alifticos azotados

Solvel em gua: 890 mg/L (20C) (Pesticide

Manual, 1997)

9,70 (Pesticide

Manual, 1997)

NSO2

NH

OCH(CH3)2

NH

NHN

NO

O O

Cl Cl

OOH

O

Cl

ClNH

N

O


6

Como se pode verificar pela anlise da Tabela 1, o cimoxanil e o 2,4D so os compostos

mais solveis em gua e o composto que apresenta maior tendncia para ficar protonado o

cimoxanil, atendendo ao valor de pKa apresentado. Atendendo s frmulas de estrutura, o

cimoxanil o composto mais polar, seguido pela bentazona. O diuro e o 2,4-D devero

apresentar polaridades semelhantes.

Estes pesticidas so aplicados em diferentes reas. O diuro utilizado no controlo de

vrios tipos de culturas como frutos e plantas, tendo vindo tambm a ser usado em reas

no agrcolas, como ruas e linhas de caminhos-de-ferro. Por sua vez, o 2,4-D tem sido

aplicado num grande nmero de culturas, actuando como regulador do crescimento de

plantas. O cimoxanil e a bentazona so tambm utilizados na agricultura, sendo o primeiro

usado em culturas como batatas, tomates e uvas e o segundo para o controlo de ervas

daninhas em culturas de milho, arroz, soja e amendoim (Giacomazzi et Cochet, 2004, EPA;

IPCS; EXTOXNET, 1997).

Tm vindo a ser efectuados estudos que demonstram a influncia destes pesticidas no

ambiente e as consequncias na sade humana ocasionadas pela sobre exposio a estes

compostos.

Estudos em humanos revelaram que concentraes elevadas de 2,4-D afectam o sistema

nervoso central e podem causar irritaes no tracto gastrointestinal e na pele. Outros

estudos sugerem que a exposio a 2,4-D, conjuntamente com outros pesticidas, pode

aumentar a incidncia de um tumor.

Por sua vez, o diuro ligeiramente txico para mamferos. Foi verificada a depresso

do sistema nervoso central aquando da sobre exposio a elevadas concentraes deste

composto, no tendo sido observados sintomas aps a sua exposio oral (Giacomazzi et

Cochet, 2004).

A bentazona e o cimoxanil apresentam um reduzido efeito toxicolgico. No foram

verificados efeitos de sade adversos como resultado da exposio ao herbicida

(bentazona), assim como no so esperados efeitos endcrinos prejudiciais como resultado

da exposio ao fungicida (cimoxanil). (IPCS; EXTOXNET, 1997).


7

A disperso de diuro na agricultura e a sua penetrao atravs do solo tem levado

poluio de matrizes aquticas subterrneas e superficiais. Este constitui assim um poluente

biologicamente activo que se encontra presente nos solos, na gua e nos sedimentos tendo

sido por isso considerado um dos 33 poluentes orgnicos prioritrios estabelecidos pela

Directiva Europeia de 17 de Julho de 2006 (2006/0129/CE), sendo o valor de concentrao

mximo admissvel para guas superficiais e subterrneas de 18 g/L e o valor mdio anual

nas mesmas matrizes de 0,2 g/L (Directiva Europeia, 2006).

Para os restantes pesticidas em estudo no est estabelecido um valor especfico para a

sua concentrao, sendo os seus valores de concentrao mxima admissvel estabelecidos

pela Directiva 98/83/CE, na qual se fixou limites para pesticidas na gua para o consumo

humano de 100 ng/L para cada pesticida e 500 ng/L para a soma de todos os pesticidas

(Kuster et al, 2006).

2.2. Mtodos de anlise dos compostos em estudo

Existem vrios mtodos analticos para a determinao dos 4 compostos em estudo em

guas. Normalmente utilizam uma etapa preliminar de extraco, cujo objectivo a

remoo de interferentes e a pr-concentrao e uma etapa de anlise cromatogrfica.

Existem vrios estudos no que diz respeito a etapas de extraco e pr-concentrao de

pesticidas recorrendo a SPME Solid phase microextraction (Beltran et al, 2000), a SPE

(Sabik et al, 2000), assim como outros que para alm das tcnicas de extraco referidas

apresentam outras como In-tube solid-phase extraction, Matrix Solid-Phase Dispersion

(MSPD) e Stir-bar sorptive extraction (SBSE) (Pico et al, 2007).

O facto de a maioria dos pesticidas serem polares e termolbeis faz com que

actualmente a maioria das anlises cromatogrficas destes compostos sejam efectuadas

recorrendo a LC/MS, em detrimento de GC/MS. No entanto, surgem alguns estudos nos quais

se utiliza GC/MS como mtodo cromatogrfico. Para o caso do 2,4-D e da bentazona,

recomendado o processo de derivatizao para melhorar a sensibilidade da sua anlise por

cromtografia em fase gasosa (Thorstensen et al, 2000 e VinK et Poll, 1996). Surgem tambm

artigos que apresentam mtodos, que apenas incluem um dos pesticidas em estudo, 2,4-D

(com derivatizao- Catalina et al, 2000) e diuro (Azevedo et al, 2000, Pea et al, 2002).

Foi publicado em 2006 um estudo que envolve as etapas de extraco e pr-

concentrao para pesticidas oriundos de diferentes matrizes, assim como as tcnicas e


8

mtodos de deteco cromatogrfica em LC/MS, as quais foram utilizadas por alguns autores

nos ltimos anos (Kuster et al, 2006). Deste artigo foram seleccionados aqueles que

recorrem ao uso de amostras de gua e estudam um ou mais dos pesticidas em estudo. Um

deles corresponde a um estudo de 14 pesticidas, incluindo diuro (Hogenboom et al, 1998),

outro apresenta tambm um mtodo para 35 pesticidas, incluindo diuro (Hernndez et al,

2001) e surge um estudo com 18 pesticidas, no qual o 2,4-D e o diuro esto presentes

(Stoob et al, 2005).

Para alm dos mtodos que recorrem a deteco em LC/MS existem vrios artigos que

apresentam tcnicas de extraco em fase slida e recorrem a HPLC-UV como etapa

cromatogrfica. A bentazona e o 2,4-D so includos num estudo de fenoxicidos e

bentazona em gua recorrendo a esta combinao (Thorstensen et al, 2000 e Zanella et al,

2003), o mesmo acontece no artigo Tran et al, 2006, o qual contm um mtodo que, entre

outros pesticidas, permite analisar 2,4-D e diuro

Rodrigues et al (2006) apresentam tcnicas de extraco em fase slida e deteco por

LC/MS, onde, para alm de outros pesticidas, incluem diuro e cimoxanil. Foram tambm

publicados estudos que apresentam mtodos multiresduo para a determinao de pesticidas

em gua recorrendo a SPE-LC/MS, os quais incluem bentazona, diuro e 2,4-D (Kampioti et

al, 2005, Borba da Cunha et al, 2004 e Kuster et al, 2008).

Existe um artigo que apresenta um mtodo para a determinao de 660 pesticidas

recorrendo a LC/MS e GC/MS, no entanto, apenas inclui a determinao de diuro

recorrendo a LC/MS/MS.

No do conhecimento do autor que tenham sido publicados estudos que apresentem

um mtodo simultneo de extraco em fase slida para os pesticidas em estudo, conjugado

com a identificao e quantificao em HPLC-UV e LC/MS.

Dada a necessidade de extraco dos analitos, de forma a obter limites de deteco

baixos, compatveis com a legislao, bem como remover eventuais interferentes, a

extraco em fase slida parece ser um mtodo que permite compatibilizar as condies

experimentais para os 4 analitos simultneamente, razo pela qual foi seleccionada neste

estudo. A seco seguinte apresenta as noes bsicas relacionada com a extraco em fase

slida.

Por outro lado, dada a necessidade bvia de proceder confirmao dos analitos por

LC/MS, na seco subsequente apresentam-se umas breves noes sobre esta tcnica.


9

2.2.1. Princpios gerais de Extraco em Fase Slida (SPE)

Quando se efectua a identificao / quantificao de um determinado analito,

necessrio proceder a etapas de extraco e de pr-concentrao. As etapas de preparao

da amostra, nas quais a extraco se inclui, ocupam a maior parte do tempo necessrio para

realizar a anlise. Surge portanto a necessidade de conseguir encontrar tcnicas simples que

permitam reduzir o uso de solventes orgnicos, que sejam mais rpidas e baratas e que,

acima de tudo, originem resultados reprodutveis.

Inicialmente a extraco lquido-lquido era a tcnica de extraco mais utilizada para

fazer o clean up e a concentrao dos analitos em estudo. No entanto, as recuperaes

obtidas utilizando esta tcnica raramente so completas. A extraco em fase lquida

constitui normalmente um procedimento demorado. Por outro lado, esta tcnica recorre a

grandes volumes de solventes orgnicos e origina tambm grandes volumes de resduos, o

que causa problemas a nvel ambiental. Entre outras tcnicas, que so actualmente mais

utilizadas, destacam-se o SPE e o SPME, alm de outras tcnicas como MSPD e SBSE (Pico et

al, 2007).

A extraco em fase slida (SPE) mais rpida e, geralmente, mais eficiente do que a

extraco em fase lquida. As partculas usadas em SPE no so poluentes e a quantidade de

solventes utilizados muito menor do que a necessria para proceder a LLE (Fritz, 1999). Na

extraco em fase slida, os solutos so extrados da fase lquida para uma fase slida,

normalmente constituda por partculas porosas de pequenas dimenses, nas quais a slica se

encontra ligada a uma fase orgnica ou um polmero orgnico. As substncias que foram

extradas podem ser removidas do adsorvente recorrendo a um solvente apropriado.

Alguns dos conceitos de extraco lquido-lquido podem ser aplicados extraco em

fase slida. Para efectuar uma extraco lquido-lquido, adiciona-se o solvente extractivo

soluo de amostra aquosa num reservatrio bem tapado e agita-se a ampola de decantao

vigorosamente, de modo a criar uma emulso temporria. A emulso consiste em pequenas

gotas esfricas do lquido extractivo em suspenso na fase aquosa. A rea de contacto

interfacial entre as duas fases tem de ser bastante grande para permitir uma rpida

transferncia de massa dos solutos pretendidos de uma fase para a outra. Quando se acaba

de agitar deveria deixar de haver emulso e os lquidos deveriam formar duas fases lquidas

contnuas mas no miscveis. Na prtica, uma das dificuldades da extraco lquido-lquido

corresponde ao facto de as emulses se separarem muito lentamente e de um modo

incompleto.


10

Em SPE, em vez de uma emulso lquida temporria, o material extractivo uma

suspenso de partculas slidas esfricas num meio aquoso. necessria uma rea

interfacial entre as partculas e a amostra em soluo para que haja uma transferncia de

massa rpida dos solutos extrados de uma fase para a outra (Fritz, 1999). O processo de

extraco de SPE pode ser dividido em 4 fases (Figura 1):

(i) Condicionamento - Antes de se poder iniciar a adsoro dos analitos pela fase

estacionria, o leito do adsorvente deve ser preparado e tornado compatvel com a

soluo lquida. Para realizar a extraco de substncias hidrofbicas de um meio

aquoso necessrio haver contacto directo entre a fase apolar (adsorvente, como

C18) e a soluo polar. Se no for utilizado qualquer pr-tratamento, o lquido

polar passa por pequenos canais gerados no adsorvente sem efectuar o contacto

necessrio para ocorrer a extraco. O tratamento prvio implica o uso de um

solvente intermedirio que permitir uma melhor superfcie de contacto entre as

fases.

(ii) Adsoro - a amostra lquida a extrair passada atravs da coluna de SPE

recorrendo aplicao de presso ou utilizao de uma bomba. O fluxo utilizado

deve ser constante e ter em conta as dimenses da coluna e das partculas que

constituem o adsorvente slido.

(iii) Lavagem - efectuada a lavagem de modo a remover interferentes que se

encontrem coadsorvidos na matriz slida das colunas de SPE. A gua permite

realizar a lavagem de ies inorgnicos do adsorvente slido, no entanto, no

suficiente para remover outros interferentes que se encontrem fracamente

adsorvidos. Nestes casos, gua com 5 20% de solvente orgnico seria um lquido

adequado. Esta etapa pode ser eliminada atendendo tcnica de SPE usada, ou

substituda por uma fase de secagem com vcuo ou com um baixo fluxo de um gs.

(iv) Eluio - na fase de eluio, os analitos adsorvidos so removidos da fase slida e

retornam fase lquida, que adequada para uma determinao analtica. O mais

comum recorrer a um lquido orgnico como eluente, embora seja possvel

realizar a dessoro do analito termicamente ou usando uma corrente gasosa. O

solvente de eluio deve ser adicionado lenta e cuidadosamente ao adsorvente, de

modo a evitar a ocorrncia de canais. O mais importante seleccionar um lquido

que elua completamente os analitos da fase slida usando o menor volume de

eluente possvel. O solvente de eluio deve ser compatvel com os mtodos

analticos que se vo utilizar.


11

Figura 1-Procedimento de SPE (extrado de Fritz, 1999).

Tem sido usado um grande nmero de partculas slidas como adsorventes de SPE para

remover compostos orgnicos de amostras lquidas. As partculas de compostos ligados a

slica, como ODS slica (octadecilsiloxano slica) so um dos tipos mais usados. O carvo

activado e, mais recentemente, materiais de carvo grafitizado constituem outra classe de

partculas slidas usadas em SPE. Existem diferentes tipos de SPE, tendo em conta as

interaces estabelecidas entre a matriz lquida e o adsorvente. Os compostos podem ser

retidos no adsorvente atravs de um dos seguintes processos: SPE em fase reversa, SPE em

fase normal e SPE em permuta inica.

As colunas de SPE utilizadas durante o processo de extraco foram Supelclean ENVI TM

Carb (Supelco), as quais so constitudas por carbono graftico no poroso, que tem uma

elevada atraco por compostos polares e no polares, de matrizes polares e no polares. A

estrutura em forma de anel hexagonal e a selectividade das colunas ENVI TM Carb torna-as

uma excelente alternativa quando os adsorventes ligados a slica no permitem realizar a

extraco numa determinada anlise.


12

2.2.2. Princpios gerais de LC/MS

O LC/MS uma tcnica hifenada que combina a capacidade de separao do HPLC com

o poder de deteco do espectrmetro de massa. Mesmo com um instrumento de deteco

muito sofisticado, o HPLC til para remover as interferncias da amostra que iam

influenciar a ionizao. O desafio neste equipamento eliminar o solvente mantendo o nvel

de vcuo adequado no espectrmetro de massa e em simultneo gerar ies em fase gasosa.

necessria uma interface que elimina o solvente e gera ies em fase gasosa, sendo

estes depois transferidos para o sistema do espectrmetro de massa. A maioria dos

instrumentos recorre a uma tcnica de ionizao a presso atmosfrica (API), em que a

eliminao do solvente e as etapas de ionizao ocorrem na fonte a presso atmosfrica.

O espectrmetro de massa o instrumento destinado a separar os ies em fase gasosa

atendendo sua razo massa carga (m/z). Por sua vez, o analisador a pea principal deste

aparelho que utiliza os campos elctrico, ou magntico ou uma combinao de ambos para

deslocar os ies da regio em que so produzidos para o detector, onde produzem um sinal

que ampliado. O analisador funciona sob vcuo, de modo a que os ies possam deslocar-se

para o detector com rendimento suficiente (Water Corporation, 2008).

MS/MS a combinao de duas ou mais experincias de MS. O objectivo pode ser obter

informao acerca da estrutura fragmentando os ies isolados durante a primeira

experincia e/ou conseguir uma maior selectividade e sensibilidade em anlises

quantitativas.

MS/MS pode ser efectuado recorrendo a sistemas de analisadores acoplados (do mesmo

tipo ou de tipos diferentes) ou utilizando um ion trap e efectuando as vrias experincias

dentro da trap.

Figura 2-Esquema da estrutura do sistema de espectrometria de massa (extrado de

Waters Corporation, 2008).


13

No passado a monitorizao de pesticidas era restringida investigao de compostos

apolares que surgiam de forma persistente no ambiente, os quais eram analisados

recorrendo a tcnicas de anlise em cromatografia gasosa (Kuster et al, 2008).

Com o desenvolvimento de interfaces de ionizao a presso atmosfrica foram surgindo

mais aplicaes em LC/MS, de modo a permitir alargar a monitorizao a uma gama mais

alargada de compostos com propriedades mais polares. Actualmente o LC/MS a tcnica

mais utilizada para a deteco e determinao de pesticidas, sendo no entanto muitas vezes

necessrio recorrer a LC/MS/MS para efectuar anlises ambientais e evitar o aparecimento

de falsos resultados positivos (Kuster et al, 2006).

A espectrometria de massa baseia-se na produo de ies que so separados e filtrados

atendendo sua relao massa carga (m/z) e detectados. O espectro de massa resultante

corresponde a um grfico que apresenta a abundncia relativa de cada um dos ies

formados em funo da sua relao massa/carga. Permite obter excelente sensibilidade,

que importante para a realizao de anlises de compostos que se encontrem em

quantidades vestigiais (Niessen, 2006).

A espectroscopia de massa pode ser efectuada principalmente em dois modos de

aquisio diferentes: um em que se realizam anlises em full scan e se faz a aquisio de

massas numa gama contnua (normalmente utilizado em anlises qualitativas) e outro, no

qual realizada a monitorizao selectiva de ies (selected-ion monitoring SIM), o qual

permite fazer a pr-seleco dos ies mais abundantes, de modo a que estes sejam

adquiridos (usado normalmente para proceder a anlises de quantificao).

A sensibilidade da resposta obtida recorrendo a espectrometria de massa depende do

tipo de interface que utilizado. As interfaces de ionizao mais utilizadas correspondem a

fontes de ionizao a presso atmosfrica por electrospray (ESI) e por ionizao qumica

(APCI), por sua vez os tipos de analisadores de massa utilizados dependem dos compostos

em estudo. As interfaces APCI e ESI constituem a melhor escolha para a anlise de pesticidas

e a sua seleco deve ser efectuada atendendo aos pesticidas que esto a ser estudados.

Recorrendo a ionizao por ESI e APCI (ionizao suave) as molculas so protonadas no

modo de ionizao positivo e desprotonadas no modo de ionizao negativo, podendo

ocorrer a formao de ies aductos que vo surgir no espectro de massa. A presena dos

picos correspondentes aos ies aductos pode ser til para determinar a massa molar

correcta das molculas em estudo. Por sua vez, o uso simultneo dos modos de ionizao

positivo e negativo pode tambm facilitar a identificao de compostos em estudo. Da


14

ionizao em modo positivo, resulta o aparecimento de uma razo massa/ carga,

correspondente ao io protonado [M+ H] + e da ionizao em modo negativo, resulta o

aparecimento de uma razo massa carga do io desprotonado [M- H] para alm de outros

ies aductos (Tabela 2) que podem ou no surgir, dependendo das caractersticas da

amostra e do tipo de ionizao (Niessen, 2006).

Recorrendo maioria dos instrumentos de LC/MS possvel alternar entre modos de

ionizao positivos e negativos, de modo a analisar na mesma corrida molculas que so

ionizadas em modo positivo e outras que ionizam em modo negativo.

Tabela 2- Aductos mais comuns encontrados nos modos de ionizao positiva e negativa

(extrado de Niessen, 2006).

Interfaces de ionizao a presso atmosfrica (API)

As interfaces/fontes de API so constitudas por 5 partes: (1) o dispositivo onde o lquido

introduzido ou spray probe, (2) a regio da fonte de ies a presso atmosfrica, na qual

os ies so gerados recorrendo a ionizao por electrospray (ESI), a ionizao qumica

(APCI), entre outras, (3) uma abertura de passagem dos ies da amostra, (4) uma interface

entre a zona de presso atmosfrica e a zona em que utilizado o vcuo e um sistema

ptico de ies (5), no qual estes so transportados para o analisador de massa.


15

Figura 3-Esquema geral de uma interface a presso atmosfrica e fonte de ies (extrado de

Niessen, 1999).

O princpio de funcionamento das interfaces de API e da fonte de ies do LC/MS pode

ser sintetizado da seguinte forma. O efluente da coluna de LC nebulizado na regio da

fonte de ies que se encontra presso atmosfrica. A nebulizao efectuada de forma

pneumtica, como em nebulizadores aquecidos de APCI ou recorrendo aco de um campo

elctrico forte como em ESI, podendo tambm resultar da combinao de ambas as

metodologias (Niessen, 1999).

A partir do aerosol estabelecido, vai sendo constituda uma fase gasosa na qual ocorre a

formao de ies. Estes ies, juntamente com o vapor do solvente e o gs de secagem, so

deslocados pela zona de amostragem de ies para o primeiro dispositivo que se encontra sob

a aco de uma bomba a qual nesta etapa uma bomba rotativa (rotary pump). A mistura

de gs, vapor do solvente e os ies expandida de forma supersnica numa regio de baixas

presses (10-100 Pa). O ncleo de expanso, que contm os ies e outros materiais de maior

peso molecular, so amostrados pelo skimmer na segunda zona em que actua uma bomba,

desta vez uma bomba turbomolecular (presso entre 0,1 1 Pa). Nesta zona h um

equipamento de transferncia de ies que os desloca para a regio do analisador de massa

do modo mais adequado (


16

Mecanismos de ionizao

Os mecanismos de nebulizao em ionizao a presso atmosfrica so diferentes

quando se aplica ESI e APCI. A ionizao na interface ESI considerada uma tcnica de

ionizao em fase lquida, na qual os ies formados em soluo so dessorvidos ou

evaporados para a fase gasosa e podem consequentemente ser analisados por

espectrometria de massa. Por sua vez, a ionizao em APCI considerada como sendo

baseada em reaces na fase gasosa, estabelecidas entre as molculas do analito e um gs

reagente que deriva do solvente, o qual gerado atravs de uma srie de reaces entre io

e a molcula, as quais so iniciadas por electres resultantes da descarga de uma agulha

corona. (Este processo de ionizao no ser aqui detalhado, pois no foi usado no

equipamento de LC-MS disponvel, podendo ser consultadas as referncias Niessen, 1999 e

Niessen, 2006).

O modelo de mecanismo de ESI normalmente conhecido por charge-residue model

ou ion-evaporation. Ambos os processos so iniciados com a nebulizao de uma corrente

lquida em pequenas gotas com carga positiva e negativa. No entanto, em electrospray

apenas podem ser geradas gotas constitudas por ies com um tipo de polaridade, uma vez

que as gotas de sinal contrrio perdem a sua carga na superfcie da agulha aquando da sua

formao, como resultado da natureza electroqumica dos processos de electrospray. A

carga gerada depende do tipo de electrospray realizado (Niessen, 1999).

As gotas carregadas passam por uma srie de processos de preservao da carga,

evaporao do solvente. Vai ocorrendo uma diminuio do tamanho das gotas, o qual

acompanhado por um aumento do campo elctrico superfcie das gotas. A determinada

altura, as repulses de Coulomb entre as cargas superficiais excedem as foras coesivas

devido tenso superficial e as gotas rebentam (Niessen, 1999).

Figura 4- Representao da deformao e

exploso de Coulomb resultando na

produo de pequenas e micro-gotas

carregadas (extrado de Niessen, 1999)


17

nesta etapa final que os modelos ion-evaporation e o charge-residue model

diferem. No caso do modelo charge-residue assumido que as pequenas gotas contm

apenas molculas de um analito, o qual transferido para a fase vapor por evaporao da

gota. Por outro lado, o modelo de ion-evaporation defende que podem ser gerados ies

em fase gasosa. Estes resultam de gotas fortemente carregadas, nas quais a intensidade do

campo suficiente para permitir a emisso de ies em soluo para a fase de vapor.

Estes dois mecanismos podem ser considerados complementares, uma vez que as gotas

que no so suficientemente carregadas para integrarem a fase de vapor levam formao

de uma fase de vapor-io, no caso de processos suaves de nebulizao (Niessen, 1999).

Analisadores de massa

A configurao que mais frequentemente usada nas anlises de resduos de pesticidas

em gua resulta da conjugao de um sistema de cromatografia lquida com analisadores de

triplo quadrupolo (QqQ), os quais operam no modo monitorizao em Selected reaction

monitoring (SRM) e recorrendo a interfaces de API (Kuster et al, 2006).

Surgem tambm sistemas que apresentam uma conjugao entre interfaces API e

detectores de massa ion-trap, que o usado neste trabalho.

Se, por um lado, as anlises quantitativas so preferencialmente realizadas em

selection reaction monitoring (SRM) usando um quadrupolo triplo (QqQ), a utilizao de

API com ion-trap pode ser muito eficiente em anlise qualitativa, sendo possvel recorrer

a mltiplas etapas de MS-MS, de modo a permitir identificar a presena de um determinado

composto atendendo sua estrutura.

Os quadrupolos lineares j no so considerados adequados para a deteco de vestgios

de poluentes em amostras ambientais.

Para alm dos sistemas de deteco de massa referidos tm vindo a ganhar alguma

popularidade os mtodos de instrumentao do Q-Trap (3-D quadrupolo-ion-trap) e os

quadrupole- time-of-flight (Q-TOF).


18

Quadrupolo linear

O quadrupolo o analisador mais amplamente utilizado devido sua utilizao fcil,

gama de massas analisada, a ter uma boa linearidade para anlise qualitativa, apresentar

uma boa resoluo e uma boa qualidade dos espectros de massa (extrado de Waters

Corporation, 2008).

Os quadrupolos lineares consistem em quatro tubos hiperblicos ou cilndricos que so

posicionados paralelamente numa conformao radial (Niessen, 2006). Um conjunto de

tubos tem um potencial elctrico positivo e o outro negativo. -lhes aplicado um potencial

de corrente contnua (DC) e uma voltagem de corrente varivel (RF). O par de tubos positivo

actua como filtro para massas elevadas e o outro par como filtro para massas baixas. A

resoluo depende do valor de DC em relao ao RF. Uma determinada combinao das

voltagens DC e RF permite que os ies com uma determinada razo massa carga (m/z) sigam

uma trajectria estvel e passem o quadrupolo sendo transmitidos ao detector. Os outros

ies so destabilizados e chocam com os tubos.

Aumentar a resoluo corresponde a fazer com que uma menor quantidade de ies

alcance o detector e consequentemente influencie a sensibilidade.

O quadrupolo pode ser usado em dois modos: SIM (single ion monitoring) ou Scan. No

modo de SIM os parmetros (DC e RF) so fixados de modo a observar unicamente uma

massa especfica ou uma seleco especfica de massas. Este modo permite obter uma

sensibilidade muito elevada.

No modo de Scan a amplitude entre as voltagens DC e RF em rampa, de modo a obter

um espectro de massa na gama de massas que inclui as massas pretendidas. A sensibilidade

funo da gama de massas, da velocidade do scan e da resoluo.

Figura 5-Quadrupolo linear (extrado de Waters Corporation, 2008).


19

Quadrupolo triplo

O quadrupolo triplo o detector de massa mais verstil e aquele que mais usado para

efectuar a configurao em MS-MS.

Este analisador consiste em dois quadrupolos separados por uma clula de coliso. Tal

configurao frequentemente referida como um instrumento tandem in space (extrado

de Waters Corporation, 2008).

Os ies percursores e ies produto so criados e analisados em diferentes espaos

fsicos. O primeiro quadrupolo usado para seleccionar um primeiro io (percursor) que

fragmentado na clula de coliso, na qual os ies so acelerados e colidem entre si na

presena de um gs de coliso. Este processo constitudo por duas etapas: uma em que

durante a coliso a energia resultante da deslocao do io convertida na sua energia

interna e outra na qual ocorre a decomposio unimolecular dos ies excitados originando

vrios ies filhos.

A energia de coliso com o gs pode variar para permitir diferentes graus de

fragmentao. Os fragmentos resultantes so analisados pelo segundo quadrupolo usando o

modo SIM ou Scan. O estudo dos fragmentos de massa espectral pode fornecer informao

quanto estrutura dos analitos.

Um outro uso dos quadrupolos triplos (QqQ) a quantificao. O primeiro analisador

usado em modo SIM, selecciona o io pai. O segundo analisador usado em modo SIM para

monitorizar um fragmento especfico.

Figura 6-Ilustrao de um quadrupolo triplo (extrado de Kuster et al, 2006).

Quadrupolo ion-trap"

Este analisador tambm conhecido como quadrupolo ion-trap. Foi inicialmente

usado em GC/MS e depois em LC/MS.


20

O princpio da trap armazenar ies num dispositivo constitudo por um elctrodo em

anel e dois elctrodos end-cap. Um dos elctrodos end-cap contm furos atravs dos

quais os electres ou ies so introduzidos na trap, enquanto que outros furos so

utilizados para ejectar ies da trap na direco do electron multiplier. Os ies so

introduzidos na trap em pulso e vo sendo armazenados. Os ies so estabilizados na

trap atravs da aplicao de uma voltagem RF no elctrodo em anel.

Para uma eficincia mxima os ies so focalizados junto do centro dos campos da

trap e apresentam propriedades mais prximas das ideais, uma vez que so menos

distorcidos, permitindo uma resoluo mxima e uma maior sensibilidade. Estas condies

so conseguidas atravs da introduo de um gs que colide com os ies e arrefece os

injectados alterando as suas oscilaes at que estes de tornem estveis (Waters

Corporation, 2008).

Atravs de variaes em rampa da voltagem de RF ou atravs da aplicao de voltagens

suplementares nos elctrodos end cap, ou recorrendo a uma combinao de ambos estes

factores possvel:

destabilizar os ies e eject-los progressivamente da trap;

manter na trap apenas os ies com uma determinada razo massa/carga e,

de seguida eject-los para os observar especificamente;

manter apenas um io na trap e fragment-lo recorrendo a vibraes

induzidas e observar os fragmentos formados (MS/MS);

repetir a ltima operao vrias vezes e observar os vrios ies que vo sendo

formados como resultado da fragmentao (MS/MSn).

A resoluo que alcanvel recorrendo a um ion-trap depende da gama de scan e da

velocidade a que efectuado. Quando se realiza o scanning acima de algumas centenas de

Daltons numa fraco de segundo, a resoluo similar que seria obtida num quadrupolo.

no entanto possvel aumentar a resoluo efectuando o scanning com menor

velocidade e reduzindo a gama de massas.

A aquisio do espectro de massa atravs do sistema ion-trap com fonte de ies

externa requer um nmero de factores e de passos consecutivos. O nmero de ies que

armazenado na trap sem que seja afectada a resoluo da massa e a preciso limitado

devido aos efeitos massa carga. necessria uma voltagem apropriada do RF aplicado nos

elctrodos em anel para permitir captar e armazenar ies com uma razo massa/carga numa

gama entre os valores de razo massa/carga limitados como superior e inferior, ou


21

seleccionar um determinado io no modo SIM, sendo os restantes removidos da trap. Por

fim, ocorre a etapa de aquisio das massas seleccionadas. (Niessen, 2006)

Figura 7 Quadrupolo ion trap com fonte de ies externa (extrado de Niessen, 2006).

Time of Flight

Este analisador normalmente designado por TOF. usado em sistemas de MS

recorrendo a cromatografia lquida, gasosa e a ionizao MALDI.

Em MS/MS o TOF associado a um quadrupolo ou a outro TOF (TOF-TOF) ou a um ion-

trap (QIT/TOF).

Neste espectrmetro de massa os ies formados numa fonte de ies so extrados e

acelerados a grande velocidade devido a um campo elctrico gerado no analisador, o qual

consiste num tubo drift que longo e direito. Os ies passam ao longo do tubo at

atingirem o detector.

Aps a fase inicial de acelerao a velocidade que alcanada pelos ies

inversamente proporcional raiz quadrada da sua razo massa/carga. Uma vez que a

distncia entre o local onde o io gerado e o detector fixo, o tempo que o io demora a

chegar ao analisador numa trajectria linear inversamente proporcional sua velocidade e

directamente proporcional raiz quadrada da razo massa/carga. Cada razo massa/carga

tem determinadas caractersticas num time-of-flight atendendo fonte e ao detector

usados (Waters Corporation, 2008).


22

Os detectores correspondem ao dispositivo no qual so detectados os ies separados no

analisador. usado um de trs tipos de detectores diferentes: electromultiplicadores,

fotomultiplicadores de dodos e placas de microcanal.

Figura 8- Electromultiplicador

(extrado de Waters Corporation, 2008).

Figura 9- Fotomultiplicadores de dodos


Figura 10- Placas de microcanal


O LC/MS utilizado neste estudo um Varian 500-MS LC Ion Trap Mass Spectrometer,

o qual corresponde a um equipamento com uma fonte de ionizao a presso

atmosfrica por electrospray, um ion-trap como analisador de massa e um detector de

massa do tipo electromultiplicador.


23

3. Materiais e Mtodos

A parte experimental deste estudo englobou: i) a etapa de extraco em fase slida; ii)

mtodo de screening em HPLC-UV e o iii) mtodo de confirmao em LC/MS.

3.1. Reagentes

Os solventes foram: acetona (HPLC grade, CARLO ERBA), metanol (HPLC grade, CARLO

ERBA) e acetonitrilo (Lichrosolv hypergrade for liquid chromatography (LC/MS), Merck). O

cido clordrico era 37% p.a., PRONALAB e o cido tricloroactico era p.a. ACS Merck.

A gua era destilada e desionisada, excepto a usada em LC/MS, que era Lichrosolv para

cromatografia da Merck.

Os padres de pesticidas eram cimoxanil (PESTANAL , analytical standard, 99,1%,

Riedel- de-Han), bentazona (PESTANAL , analytical standard, 99,1%, Riedel- de-Han),

2,4-D (PESTANAL , analytical standard, 99,9%, Riedel- de-Han), diuro (p.a., 99,5%, Chem

Service).

3.2. Equipamento

Para extraco em fase slida usaram-se colunas Supelclean TM ENVI TM- Carb SPE Tubes

de 3 mL (0.25g). Os extractos foram evaporados secura em dois rota-vapores, Buchi R-200

+ Heating Bath B-490 e Buchi R-210 + Heating Bath B-491.

Para anlise cromatogrfica (HPLC-UV) usou-se um HPLC Knauer com detector Knauer

Variable Wavelenght e sistema de aquisio de dados Merck-Hitachi D-2500. Numa fase

espordica, que correspondeu avaria deste equipamento, recorreu-se a um HPLC Merck

com detector Merck e sistema de deteco CSW32-Chromatography Station, DataApex 2001.

Tambm em termos de coluna cromatogrfica houve necessidade de mudar de coluna a

meio do trabalho, pelo que as colunas usadas foram Supersher 100 RP-18e (250x4 mmm, 5

m) e Nucleosil 100-5 C18 Macherey-Nagel (250x4 mmm, 5 m). O LC/MS um Varian 500-MS LC Ion Trap Mass Spectrometer equipado com uma fonte de

ionizao por electrospray e uma coluna Polaris C18A 5 m, 50 x 2 mm ID. O sistema de

aquisio usado foi o Varian MS Workstation verso 6.5.


24

3.3. Preparao de padres

Numa fase inicial do trabalho experimental foram preparados padres individuais de

cada um dos pesticidas e de seguida uma mistura destes, retirando um determinado volume

dos padres-me. Estes foram preparados em etanol em bales de 100 mL, tendo sido as

concentraes destes de 500 ppm para a bentazona e o cimoxanil e de 200 ppm para o

diuro e para o 2,4-D.

Foram preparados padres de mistura, os quais foram injectados no segundo HPLC

referido, aps terem sido detectados os tempos de reteno de cada um dos compostos em

estudo. Estes trs padres de mistura em fase mvel, padro misto 0 (MIX_0), padro misto

1 (MIX_1) e padro misto 2 (MIX_2), contm as concentraes de cada um dos pesticidas que

so apresentadas na Tabela 3.


diuro (DIU) e 2,4-D em ppm necessrios para preparar os padres de mistura.

O padro MIX_0 foi preparado num balo volumtrico de 10 mL recorrendo a

microseringas. Por sua vez, os outros dois padres foram preparados em vials de 1mL,

utilizando um determinado volume do padro MIX_0. Para preparar o padro MIX_1

adicionou-se ao vial de 1,5 mL, 500 L de fase mvel e 500 L de MIX_0 com uma

microseringa. Para preparar o padro MIX_2, adicionaram-se 50 L de MIX_0 e 500 L de fase

mvel.

Com a finalidade de efectuar a recta de calibrao foram preparados 6 padres de

mistura com bentazona, cimoxanil, diuro e 2,4-D. Efectuou-se um padro MIX_0 em gua

(bentazona (50 ppm), cimoxanil (50 ppm), diuro (40 ppm), 2,4-D (40 ppm)) num balo

volumtrico de 25 mL e os restantes padres foram preparados em bales volumtricos de

10 mL retirando um determinado volume do padro MIX_0.

Padro MIX_0 MIX_1 MIX_2

Cimoxanil 50 ppm 25 ppm 12,5 ppm

Bentazona 50 ppm 25 ppm 12,5 ppm

Diuro 40 ppm 20 ppm 10 ppm

2,4-D 40 ppm 20 ppm 10 ppm


25

Os volumes de padro MIX_0 e as concentraes dos padres obtidos so apresentados

na Tabela 4:


diuro (DIU) e 2,4-D em ppb, assim como o volume de padro MIX_0 que foi utilizado.

O padro de mistura usado para testar os quatro mtodos de extraco em fase slida

foi preparado em gua num balo volumtrico de 2 L. Este apresenta uma concentrao de

500 ppb de cimoxanil e bentazona e 400 ppb de diuro e 2,4-D. Foi novamente usado para

efectuar a repetio dos ensaios dos vrios mtodos quando se fez a alterao do volume de

metanol na etapa de eluio.

Antes de ser realizada a recta de calibrao com padres extrados foi necessrio

preparar um novo padro de 2,4-D. Este novo padro foi preparado em etanol num balo

volumtrico de 100 mL e apresentava uma concentrao de 500 ppm.

Recorrendo aos padres-me foram preparados padres de mistura em gua, os quais

foram extrados de modo a efectuar a recta de padres extrados.

Na tabela 5 so apresentadas as concentraes de cada um dos pesticidas no respectivo

padro de mistura, assim como os volumes retirados dos padres-me e o volume dos bales

volumtricos utilizados para a preparao dos mesmos. Os padres de 1 a 7 foram

preparados em bales volumtricos de 250 mL e os restantes foram preparados em bales

volumtricos de 100 mL.

Padro Concentrao/ppb

CIM e de BEN

Concentrao/ppb

DIU e de 2,4-D V (MIX_0) / L

P0 250 200 50

P1 500 400 100

P2 750 600 150

P3 1000 800 200

P4 2500 2000 500

P5 4000 3200 800

P6 5000 4000 1000


26

Tabela 5-Valores de concentrao de cada um dos pesticidas em cada padro de mistura

(Cf), assim como o volume de padro-me utilizado para preparar o padro (Vret).

Padro Cimoxanil Bentazona 2,4-D Diuro Cf(ppm) Vret(L) Cf(ppm) Vret(L) Cf(ppm) Vret(L) Cf(ppm) Vret(L)

P1 0,05 25 0,05 25 0,2 100 0,06 75 P2 0,1 50 0,1 50 0,3 150 0,1 125 P3 0,15 75 0,5 250 0,4 200 0,2 250 P4 0,2 100 0,6 300 0,6 300 0,3 375 P5 0,3 150 1,0 500 0,8 400 0,4 500 P6 0,4 200 1,25 625 1,2 600 0,6 750 P7 0,5 250 2,5 1250 1,4 700 0,8 1000 P8 0,3 60 1,0 200 2,5 500 0,4 200 P9 0,4 80 1,25 250 5,0 1000 0,6 300 P10 0,5 100 2,5 500 10 2000 0,8 400 P11 0,3 60 1 200 1 200 1 500 P12 0,4 80 1,3 260 1,3 260 1,3 650 P13 0,5 100 2,5 500 2,5 500 2,5 1250

3.4. Extraco por SPE

As condies de extraco foram optimizadas, tendo-se obtido as condies que so

apresentadas na figura seguinte.

Figura 11-Procedimento de SPE utilizado.

Condicionamento: 6 mL acetona 6mL de gua acidificada com HCl (0,2%)

Amostra: 100 mL de Padro de mistura ou amostra de gua t 1 hora

Eluio:1 mL metanol 6 mL de acetona

Secagem no rota-vapor a 35C e com uma rotao de 5 t 30 minutos

Retoma em 1 mL de fase mvel (gua/metanol 50:50 com 0,6 mM de TClA)

Secar sob vcuo durante 60 minutos


27

3.5. Anlise por HPLC-UV

A fase mvel era gua/metanol 50:50 com 0,6 mM de TClA, o fluxo de 1 mL/min e

trabalhou-se em condies isocrticas. A anlise foi realizada temperatura ambiente, com

um volume de injeco de 20 L e um comprimento de onda de deteco de 230 nm. O

sistema de aquisio de dados funcionou com velocidade do papel 2,5 mm/min e atenuao

4x.

As fases mveis utilizadas ao longo dos procedimentos experimentais eram filtradas sob

vcuo e de seguida desgaseificadas durante 12 minutos com ultrasons.

3.6. Anlise por LC/MS

Utilizou-se uma fase mvel gua/acetonitrilo, um fluxo de 0,2 mL/min e operou-se em

modo gradiente, sendo as condies apresentadas na tabela 6. Por sua vez, as condies

operatrias optimizadas para cada um dos compostos encontram-se na tabela 7. O volume

de injeco foi de 10 L.

Tabela 6-Descrio das condies operatrias por LC/MS em que a gua o solvente A e o

acetonitrilo, o solvente B.

Tempo/(min) %A %B

0,00 0 100

1,23 0 100

1,50 40 60

2,25 40 60

2,50 0 100

3,00 0 100


28

Tabela 7-Descrio das condies de aquisio de dados em LC/MS

Parmetros MS CIM BEN 2,4-D DIU

Modo de Ionizao positivo negativo negativo positivo

Gs de Nebulizao (psi) 25 55 52 30

Gs de Secagem

Presso (psi) 10 30 19 25

Temperatura ( C) 350 330 250 350

Voltagem da agulha (V) 5500 4000 3500 5000

Voltagem do Escudo (V) 600 600 600 600

Voltagem do Capilar (V) 50 55 30 40

RF loading (%) 63 51 100 72

Parmetros MS/MS

Io Percursor (m/z) 199, 221 239 219 233,235

Io Produto (m/z) 171,182,

128

197,175,1

32 161 72,16

Amplitude de Excitao 1,10 V 0,68 V 0,72 V 0,64 V


29

4. Resultados e Discusso

Para obter as condies finais descritas em Materiais e Mtodos, foi necessrio recorrer

a sucessivos ensaios de optimizao, que envolveram a definio da fase mvel mais

adequada para HPLC, a definio das melhores condies de extraco e a definio das

condies de funcionamento de LC/MS.

Posteriormente procedeu-se validao da metodologia analtica que envolve duas

etapas, a de screening por HPLC-UV e a de confirmao por LC/MS.

4.1. Optimizao das condies operatrias

4.1.1. Optimizao da fase mvel para HPLC-UV

Ao longo da realizao deste trabalho pretendia-se determinar um mtodo multi-resduo

que permitisse detectar a presena de vrios pesticidas polares com diferentes

caractersticas fsico-qumicas. Com essa finalidade optimizaram-se condies de

cromatografia lquida como a composio da fase mvel e o comprimento de onda.

Com o intuito de determinar as melhores condies a utilizar realizaram-se injeces

individuais de cada um dos padres dos pesticidas em estudo mantendo a fase mvel e o

comprimento de onda. Foi assim possvel determinar o tempo de reteno correspondente a

cada composto.

Tendo como base as condies experimentais descritas por Taguchi et al (1998)

preparou-se uma fase mvel composta por 7% de metanol, 93% de gua e com 25 mM de

cido tricloroactico (TClA). Esta fase mvel apresenta um pH prximo de 1,5 tendo sido

injectados padres dos compostos em estudo, na concentrao de 5 mg/L com um fluxo de

1,0 mL/min e um comprimento de onda de 275 nm. No foi possvel detectar nenhum pico

em nenhum dos cromatogramas, fazendo supor que ou a concentrao era baixa (abaixo do

limite de deteco) ou o comprimento de onda de anlise no era o mais adequado. Alis

este um dos problemas de anlise multiresduo, pois cada um dos compostos absorve

radiao num comprimento de onda ptimo diferente e h que encontrar uma situao de

compromisso.

Foi preparada uma nova fase mvel composta por 90% de gua, 10% de Metanol e 6 mM

de TClA, mas mesmo assim no foi possvel detectar 2,4-D.

Testou-se o efeito da alterao do comprimento de onda na resposta do padro de 2,4-

D, tendo sido o padro de 50 mg/L injectado com um comprimento de onda de 275 e 250

nm, mantendo o fluxo de 1,0 mL/min, no entanto no se conseguiu detectar o composto.


30

Foi preparada uma nova fase mvel com 3mM de TClA e o pH obtido foi de cerca de

2,50. Alterou-se o comprimento de onda para 245 nm. Realizou-se a injeco do padres de

cimoxanil e de diuro de 100 mg/L, tendo sido detectados nos cromatogramas picos que

podem corresponder a estes compostos. No foi possvel obter um pico correspondente ao

2,4-D aps a injeco de padres deste pesticida em diferentes concentraes.

Testaram-se outras fases mveis com a mesma concentrao de TClA, com as

propores de 70:30 e 80:20 de gua:metanol. Com estas fases mveis no foi possvel

detectar numa corrida todos os picos correspondentes aos compostos em estudo.

A dificuldade de deteco parecia residir mais na diferente polaridade dos compostos

em estudo, bem como no comprimento de onda utilizado.

Decidiu-se recorrer a uma fase mvel constituda por metanol e gua (50:50) e 3 mM de

TClA, com um pH prximo de 2, fluxo de 1,0 mL/min e comprimento de onda de 245 nm.

Injectaram-se padres individuais de bentazona (100 ppm), 2,4-D (200 ppm em etanol),

diuro (100 ppm) e cimoxanil (500 ppm), tendo-se recorrido a um HPLC diferente do

utilizado na validao por avaria do mesmo. Foi possvel detectar os picos correspondentes a

cada um dos pesticidas em estudo (Figura 12).

Figura 12-Cromatogramas dos 4 pesticidas em estudo obtidos por injeco de padres

individuais com concentraes de 100 ppm para a bentazona e diuro, 500 ppm para o

cimoxanil e 200 ppm para o 2,4-D recorrendo a um fluxo de 1,0 mL/min e =245 nm.

BEN CIM

2,4-D

DIU


31

De seguida procurou-se optimizar o comprimento de onda de absoro, usando uma

soluo contendo bentazona (20 ppm), cimoxanil (125 ppm), diuro (60 ppm) e 2,4-D (40

ppm). Esta soluo foi injectada em duplicado para os comprimentos de onda de 245 nm,

230 e 260 nm. E possvel identificar os picos associados a cada um dos pesticidas recorrendo

a cada um dos comprimentos de onda utilizados, no entanto, apenas com o comprimento de

onda de 230 nm possvel distinguir completamente os picos do diuro e do 2,4-D, uma vez

que os tempos de reteno associados a estes compostos so muito prximos (Figura 13).

Figura 13-Cromatograma dos 4 pesticidas em estudo obtido por injeco de um padro de

mistura com bentazona (20 ppm), cimoxanil (125 ppm), diuro (60 ppm) e 2,4-D (40 ppm)

usando um fluxo de fase mvel de 1,0 mL/min e um comprimento de onda de 230 nm.

Atendendo aos resultados que foram sendo obtidos a fase mvel final corresponde a uma

mistura de gua e metanol 50:50 e 0,6 mM TClA, com um comprimento de onda de deteco

de 230 nm.

O agente acidificante usado (TClA) permitiu recorrer a uma fase mvel com um pH mais

baixo e identificar picos definidos correspondentes a cada um dos compostos em estudo, no

entanto este composto bastante agressivo, havendo um compromisso entre a resoluo dos

picos dos compostos em estudo e o tempo de vida do equipamento, em particular vedantes

e material mais sensvel.

CIM BEN DIU 2,4-D


32

4.1.2. Optimizao das condies de extraco por SPE

Na etapa de extraco fase slida recorreu-se ao uso de colunas Envi Carb de 3 mL

(0,25g) e testaram-se vrias condies de extraco. O mtodo seleccionado teve como base

um documento tcnico intitulado: Extract Nonvolatile Pesticides from drinking water, using

a graphitized carbon adsorbent (Supelco, 1997).

Foram efectuados 3 ensaios de extraco nas condies descritas na Figura 14, no foi

possvel extrair todos os pesticidas.

Figura 14-Esquema que apresenta o procedimento de SPE anteriormente referido.

Ccondicionamento: 5 mL DCM: MET (80:20) 1 mL metanol 10 mL cido actico 2% (em gua)

Amostra: 100 mL de Padro de mistura com cimoxanil (500 ppb), bentazona (100 ppb) e diuro (100 ppb)

t 1 hora

Secagem sob vcuo durante 45 min

Eluio: 1 mL MET 2x 3,5 mL DCM: MET (80:20)

Secagem no rota-vapor a 35C e com uma rotao de 5

Retoma em 1 mL de fase mvel (gua/metanol 50:50 com 3mM de TClA)


33

Figura 15-Cromatograma de um extracto recorrendo metodologia apresentada na

figura 14.

Procedeu-se de seguida alterao das condies de condicionamento e de eluio,

tentando encontrar uma soluo de compromisso que atende s compatibilidades diferentes

dos pesticidas em estudo com os solventes de extraco (Tabela 8).

Tabela 8-Condies de extraco por SPE (A, B, C e D)

A B C D

Condicionamento Condicionamento Condicionamento Condicionamento

2 vol. DCM:MET (80:20)

2 vol. gua com cido

actico

2 vol. Acetona

2 vol. de gua com

cido actico

2 vol. Acetona

2 vol. de gua com

cido clordrico

2 vol. : 40 DCM

40 Acet.

20 Met

2 vol. de gua com

cido clordrico

Amostra Amostra Amostra Amostra

100 mL de padro 100 mL de padro 100 mL de padro 100 mL de padro

Eluio Eluio Eluio Eluio

1 vol. de metanol

2 vol. DCM:MET (80:20)

1 vol. de metanol

2 vol. de acetona

1 vol. de metanol

2 vol. de acetona

1 vol. de metanol

2 vol. : 40 DCM

40 Acet.

20 Met

DIU

CIM


34

A etapa correspondente passagem de amostra na coluna dura cerca de 45 minutos e

aps ter sido efectuada a eluio a amostra era evaporada num rota-vapor a 35C sob vcuo.

As amostras demoravam muito tempo a secar principalmente nas condies A e D, porque

continham maior volume de metanol.

Repetiram-se os ensaios com os 4 mtodos descritos na tabela 8, diminuindo o volume

de metanol na etapa de eluio para 1 mL, o que provocou uma diminuio do tempo da

etapa de secagem das amostras. O mtodo de SPE escolhido foi o C. Nestas condies

apresenta-se um cromatograma correspondente extraco de uma mistura padro.

Durante a realizao deste trabalho houve necessidade de substituir a coluna

cromatogrfica. Assim, apesar de ambas apresentarem caractersticas semelhantes o facto

de apenas a primeira ser encaped fez com que ocorresse a alterao da ordem de eluio do

diuro e do 2,4-D devido a apresentarem polaridades semelhantes. Como se pode verificar

pela figura 15 na qual apresentada a mistura dos pesticidas, o diuro tem menor tempo de

reteno do que o 2,4-D (1 coluna) e na figura 16 apresentada abaixo a ordem inverteu-se

(2 coluna).

Figura 16-Cromatograma de um padro de cimoxanil 500 ppb, bentazona 2500 ppb, 2,4-D

1400 ppb e diuro 800 ppb extrado nas condies do mtodo C utilizando a coluna Nucleosil

da Macherey-Nagel.

CIM

BEN

2,4-D

DIU


35

4.1.3. Validao do procedimento analtico de screening por SPE-HPLC-UV

Os parmetros de validao do mtodo analtico que engloba o procedimento de

extraco por SPE e de anlise cromatogrfica por HPLC-UV compreenderam o estudo da

linearidade, com padres por injeco directa e por injeco de padres extrados, a

preciso referente a extraces independentes de padres analticos, a exactido obtida por

comparao da concentrao obtida com a concentrao esperada para padres analticos

no mesmo nvel e em diferentes nveis. Finalmente estimou-se a incerteza global com base

nos parmetros de validao.

Relativamente ao estudo da linearidade com injeco directa de padro, este serve

unicamente para avaliar se a resposta do detector linear numa determinada gama, pois as

rectas de calibrao assim obtidas no so usadas na quantificao nem na estimativa da

incerteza.

As rectas obtidas por injeco directa de padres de mistura nas concentraes

definidas na tabela 4 de Material e Mtodos encontram-se na Figura 17. Os dados

correspondentes encontram-se em Anexo A.

Conclui-se que os coeficientes de correlao se encontram acima de 0,995 e que o erro

relativo do declive 1% para o cimoxanil e a bentazona e 13% e 14% para o 2,4-D e o diuro,

respectivamente. Os limites de deteco nestas condies so 60 ppb, 40 ppb, 1060 ppb e

1090 ppb, para o cimoxanil, bentazona, 2,4-D e diuro, respectivamente.

Figura 17-Rectas de calibrao obtidas para cada um dos pesticidas por injeco

directa de padres de mistura.

Cimoxanily = 90630x - 3620,5

R2 = 0,9997

0

100000

200000

300000

400000

500000

0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00

Concentrao/ppm

rea

Bentazona y = 100424x - 5458,8

R2 = 0,9999

0100000200000300000400000500000600000

0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00

Concentrao/ppm

rea

Diuro y = 121103x - 13954

R2 = 0,9995

0

100000

200000

300000

400000

500000

0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00

Concentrao/ppm

rea

2,4-D y = 53563x - 7243

R2 = 0,9957

050000

100000150000

200000250000

0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50 4,00 4,50

Concentrao/ppm

re

a


36

O processo de quantificao no utiliza a recta de calibrao com injeco directa de

padres porque se verifica que a percentagem de extraco relativamente baixa para

alguns dos compostos. Nestes casos, se existir linearidade em termos da resposta do

detector em funo de padres extrados, recomendvel usar preferencialmente as rectas

de calibrao correspondentes. Na Figura 18, apresentam-se as rectas de calibrao obtidas

com padres extrados, cujos dados correspondentes se encontram no Anexo B.

Figura 18-Rectas de calibrao obtidas para cada um dos pesticidas por injeco de

padres extrados.

Comparando a resposta em termos de rea do pico cromatogrfico com a resposta

obtida por injeco directa, possvel calcular a eficincia de extraco, considerando o

factor de concentrao, uma vez que as amostras so concentradas 100x. As eficincias de

extraco foram 80,6%, 19,6%, 49,5% e 2,87% para cimoxanil, bentazona, 2,4-D e diuro,

respectivamente. Como se comprova so eficincias, excepo do cimoxanill,

suficientemente baixas, para justificar a utilizao de rectas de calibrao com padres

extrados.

Os limites de deteco recorrendo a padres extrados so de 70 ppb, 39 ppb, 420 ppb e

470 ppb, para o cimoxanil, bentazona, 2,4-D e diuro, respectivamente.

Diuroy = 1E+06x - 338201

R2 = 0,9382

-20000000

20000004000000

0 1 2 3

Concentrao/(ppm)

rea

2,4-Dy = 3E+06x + 63638

R2 = 0,9868

010000000

20000000

0,00 2,00 4,00 6,00

Concentrao/(ppm)

rea

Cimoxanily = 6E+06x + 187313

R2 = 0,9791

01000000200000030000004000000

0 0,2 0,4 0,6

Concentrao/(ppm)

rea

Bentazona

y = 5E+06x - 3E+06

R2 = 0,9886

-5000000

0

5000000

10000000

0 1 2 3

Concentrao/(ppm)

rea


37

Relativamente ao estudo da preciso este foi realizado com concentraes de padres

em nveis mais altos da recta de calibrao, nomeadamente 0,4 mg/L para o cimoxanil e 1,2

mg/L para os restantes, tendo sido efectuadas 8 extraces do mesmo padro. Quantificou-

se o coeficiente de variao respectivo.

Para os ensaios de exactido, quantificou-se a percentagem de recuperao resultante,

quer dos ensaios de preciso (o mesmo padro) quer de ensaios a 3 nveis diferentes.

Os resultados obtidos encontram-se na Tabela 9 e os dados experimentais

correspondentes aos ensaios de preciso esto no Anexo C.

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