Título do evento Luciene Bottentuit Balottin, D.Sc. Pesquisadora-Tecnologista em Metrologia e Qualidade Contribuições do Inmetro para a estruturação da

Título do evento

Luciene Bottentuit Balottin, D.Sc.Pesquisadora-Tecnologista em Metrologia e Qualidade

Contribuições do Inmetropara a estruturação da Rede Nacional

de Métodos Alternativos

Rede de Metrologia Química do Inmetro I Remeq-l

Parte 1

Título do eventoRede de Metrologia Química do Inmetro I Remeq-l

MÉTODOS ALTERNATIVOS AO USO DE ANIMAIS

Historicamente estas avaliações toxicológicas utilizavam somente modelos animais

Toxicidade agudaToxicidade crônicaIrritação ocularIrritação dérmicaDermosensibilizaçãoMutagenicidadeCarcinogenicidadeToxicidade reprodutivaToxicocinéticaEtc.




Toxicidade agudaToxicidade crônicaIrritação ocularIrritação dérmicaDermosensibilizaçãoMutagenicidadeCarcinogenicidadeToxicidade reprodutivaToxicocinéticaEtc. John Draize, 1944

Éticas




ENSAIO COM ANIMAIS X

RESPOSTA EM HUMANOS



1957 – “Principles of Human Experimental Technique”

Conceito 3Rs: Replacement Reduction

Refinement

Russell and Burch

Toda abordagem experimental que contribuí para a substituição, redução ou refinamento dos ensaios com

animais para avaliação de toxicológico são chamados métodos alternativos.






PANORAMA REGULATÓRIO

Diretiva 86/609/EEC de 24 de Novembro de 1986 referente à proteção dos animais utilizados para fins experimentais e

outros fins científicos.

1991- European Center for the Validation of Alternative Methods (ECVAM)

Diretiva 2003/15/EEC de 27 de Fevereiro de 2003: Sétima emenda a Diretiva de Cosméticos(Directive 76/768/EEC).

Proíbe a comercialização de cosméticos testados em animais (março 2013)



Regulamento (EC) No 1907/2006 de18 Decembro de 2006 concerning the Registration, Evaluation, Authorisation and

Restriction of Chemicals (REACH)

Deadline 2018





Lei AroucaLei Arouca(11.794, 08/10/2008)(11.794, 08/10/2008)

•Cria o Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal – CONCEA•Estabelece procedimentos para o uso de animais para fins de ensino e pesquisa científica•Organiza o Sistema Nacional de Experimentação Animal

• Competências do CONCEA (Art 5, Lei 11.794/2008)• Ações Regulatórias, consultivas e deliberativas• Políticas e ações transversais• Diagnóstico de métodos alternativos• Aprovação de procedimentos e materiais de referência• Monitorar e avaliar a introdução de métodos alternativos que

substitua o uso de animais em ensino e pesquisa.



• RESOLUÇÃO NORMATIVA Nº 17, DE 3 DE JULHO DE 2014

Esta Resolução Normativa dispõe sobre o reconhecimento no país de métodos alternativos validados que tenham por finalidade a redução, a substituição ou o refinamento do uso de animais em atividades de pesquisa, nos termos do inciso III do art. 5º da Lei nº 11.794, de 8 de outubro de 2008, e sua regulamentação.



• RESOLUÇÃO NORMATIVA Nº 18, DE 24 DE SETEMBRO DE 2014

Art. 1º Esta Resolução Normativa reconhece o uso no país de métodos alternativos validados, que tenham por finalidade a redução e substituição ou o refinamento do uso de animais em atividades de pesquisa, nos termos do inciso III do art. 5º da Lei nº 11.794, de 08 de outubro de 2008, e sua regulamentação.

Art. 2º Para os efeitos desta Resolução Normativa, o CONCEA

reconhece os 17 (dezessete) métodos alternativos agrupados nos 07 (sete) desfechos



Para avaliação do potencial de irritação e corrosão da pele o Concea reconhece o método OECD TG 430 – Corrosão dérmica in vitro: Teste de Resistência Elétrica Transcutânea; método OECD TG 431 – Corrosão dérmica in vitro: Teste da Epiderme Humana Reconstituída; o método OECD TG 435 – Teste de Barreira de Membrana in vitro; o método OECD TG 439 – Teste de Irritação Cutânea in vitro. Para avaliação do potencial de irritação e corrosão ocular o Concea reconhece o método OECD TG 437 – Teste de Permeabilidade e Opacidade de Córnea Bovina; ométodo OECD TG 438 – Teste do Olho Isolado de Galinha; o método OECD TG 460 – Teste de Permeação de Fluoresceína. Para avaliação do potencial de fototoxicidade o Concea reconhece o método OECD TG 432 – Teste de Fototoxicidade in vitro 3T3 NRU. Para avaliação de absorção cutânea o Concea reconhece o método OECD TG 428 – Absorção Cutânea método in vitro.



Para avaliação do potencial de sensibilização cutânea o Concea reconhece o método OECD TG 429 – Sensibilização Cutânea: Ensaio do Linfonodo Local; o método OECD TG 442A e 442B – Versões não radioativas do Ensaio do Linfonodo Local. Para avaliação de toxicidade aguda o Concea reconhece o método OECD TG 420 – Toxicidade Aguda Oral – Procedimento de Doses Fixas; o método OECD TG 423 – Toxicidade Aguda Oral – Classe Tóxica Aguda; o método OECD TG 425 – Toxicidade Aguda Oral – Procedimento “Up and Down”; o método OECD GD 129 – Estimativa da dose inicial para teste de toxicidade aguda oral sistêmica. Para avaliação de genotoxicidade o Concea reconhece o método OECD TG 487 – Teste do Micronúcleo em Célula de Mamífero in vitro.




VALIDAÇÃO DE MÉTODOS E ACEITAÇÃO REGULATÓRIA

Reliability is defined as the extent of reproducibility of results from a test within and among laboratories over time, when performed using the same standardised protocol.

The relevance of a test method describes the relationship between the test and the effect in the target species and whether the test method is meaningful and useful for a defined purpose, with the limitations identified.



VALIDAÇÃO DE MÉTODOS E ACEITAÇÃO REGULATÓRIA

http://www.oecd.org/chemicalsafety/testing/oecdguidelinesforthetestingofchemicals.htm


TEST GUIDELINES – MÉTODOS IN VITRO



Plac

a A

Plac

a B

Duas placas semeadas com o modelo teste são tratadas por 1hora com oito

concentrações da substância teste.

UVA 5 J/cm2

Mantida no escuro

Simulador Solar

Irradiação

Cultivo por 24horas à 370C, 5% CO2

Viabilidade Celular aferida pela captação do vermelho Neutro

Cálculo de IC50 +UVA e IC50 -UVA

PIF< 2 ou MPE < 0.1– não fototóxico

PIF>2 e < 5 ou MPE >0.1 e < 0.15 – provável fototoxicidade

PIF>5 ou MPE > 0.15 - Fototoxicidade

Fototoxicidade in vitro –TG 432- Determina a toxicidade de substâncias após sua exposição à luz solar (fototoxicidade).



A B

Figura 1- Exemplo de fibroblastos Murinos 3T3 antes (A) e depois da exposição ao vermelho Neutro (VN). Exemplo de células viáveis, repletas de VN no citoplasma podem ser vistas em B.

540nm

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Título do evento Luciene Bottentuit Balottin, D.Sc. Pesquisadora-Tecnologista em Metrologia e Qualidade Contribuições do Inmetro para a estruturação da