Anais do Conic-Semesp. Volume 1, 2013 - Faculdade Anhanguera de Campinas - Unidade 3. ISSN 2357-8904

TÍTULO: PADRÃO DE EXPRESSÃO DE UROCORTINA NO NÚCLEO EDINGER-WESTPHAL DEPOMBOS FRENTE AO ESTRESSE ALCOOLICOTÍTULO:

CATEGORIA: CONCLUÍDOCATEGORIA:

ÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E SAÚDEÁREA:

SUBÁREA: BIOMEDICINASUBÁREA:

INSTITUIÇÃO: UNIVERSIDADE CIDADE DE SÃO PAULOINSTITUIÇÃO:

AUTOR(ES): FERNANDA SOARES QUINTEIRO GOMES DA SILVAAUTOR(ES):

ORIENTADOR(ES): RENATO FIGUEIREDO DE SANTANAORIENTADOR(ES):

PADRÃO DE EXPRESSÃO DE UROCORTINA NO NÚCLEO EDINGER-WESTPHAL DE POMBOS FRENTE AO ESTRESSE ALCOOLICO

1. Resumo

O processamento neural de estímulos estressores, assim como o

consumo de alimentos e alcool envolve vasta circuitaria neural. Uma das áreas

possivelmente envolvidos nesta circuitaria é o núcleo Edinger-Westphal de

projeção central (Ewcp), cujos neurônios são peptidérgicos. Além do Ewcp, o

núcleo de Edinger-Westphal também possui outra subdivisão, com função

oculomotora parassimpática e neurônios colinérgicos, denominado pré-gaglionar (Ewpg). No EWcp há, aparentemente, uma proeminente espressão

de urocortina 1 (UCN-1), um neuropeptídeo membro da ampla família do(s)

fator(es) liberador(es) de corticotrofina (CRH) envolvida na resposta ao

estresse. Estudos revelam que a indução de drogas, como álcool, pode

influenciar a expressão de fatores de transcrição como a proteina nuclear c-Fos

no EW, sugerindo que este núcleo possa desempenhar um papel importante na resposta ao álcool. No experimento, utilizamos 16 pombos adultos, sendo 4

controles e 12 experimentais. Durante um período de trinta dias, todos os

animais eram pesados e, recebiam gavagens de álcool (experimental) ou água

(controle) de acordo com seu peso. Ao final do procedimento, os animais foram

perfundidos, seus encéfalos retirados, seccionados, processados

imunohistologicamente com anticorpos contra UCN-1 e c-Fos e analisados. A contagem de células imunorreativas no EWcp revelou que nos pombos os

quais a gavagem continha álcool, a expressão de células marcadas contra

UCN-1 e c-Fos era maior que aqueles cujo a gavagem continha água A

diferença encontrada na imunomarcação deixa-se supor uma relação entre o

estresse alcoólico sofrido pelo animal e o incremento da atividade neural em

neurônios UCN-1+ no núcleo de Edinger-Westphal evidenciada pela expressão

de c-Fos. Em conclusão, nossos dados corroboram com os dados da literatura

indicando o sistema urocortinérgico presente no EWcp desempenha um papel

importante na adaptação ao estresse alcoólico.

2. Introdução

O núcleo de Edinger-Westphal (EW) é conhecido como o núcleo

acessório parassimpático do complexo nuclear do oculomotor (Klooster et al,

1993), fonte de motoneurônios pré-ganglionares parassimpáticos para o

gânglio ciliar, através do qual, controla a constrição da pupila e acomodação da lente. Uma nova visão consta que o EW pode ser dividido em duas distintas

populações neuronais, de acordo com a conectitividade: uma colinérgica com

função oculomotora parassimpática, denominado Ewpg (EW pré-ganglionar) e

outra peptidérgica, relacionado com estresse e consumo de álcool e alimentos,

o Ewcp ( EW de projeções centrais). O Ewcp também pode ser denomeado

npEW (EW não pré-ganglionar) (Saper et al, 1976; Burde et al., 1982; Vasconcelos et al, 2003;. Ryabinin et al, 2005;. Laursen e Rekling, 2006; L. Xu

et al, 2009, Kozicz, 2011).

A urocortina 1 (UCN-1) é um neuropeptídeo membro da ampla família

do(s) fator(es) liberador(es) de corticotrofina (CRH) expressa em muitas

regiões do Sistema Nervoso, mas em grande parte no núcleo não-pré-

ganglionar de Edinger-Westphal (npEW) (Kozicz et al, 1998; Skelton et al, 2000; Bittencourt et al, 1999; Fekete & Zorrilla, 2006; Ryabinin et al, 2005; Xu

et al, 2009).

A substância UCN-1 está potencialmente relacionada com a modulação

do eixo hipotálamo-adreno-hipofisiário e particularmente envolvida em

respostas de estresse. As corticotrofinas são parte integrante da cascata de

eventos fisiológicos de indivíduos submetidos a uma carga de estresse, cujas alterações orgânicas são típicas de um aumento da ativação simpática. Sendo

assim neurônios no npEW-UCN-1 respondem fortemente e selectivamente a

paradigmas de vários estresse, incluindo ao alcóolico. (Weninger et al, 1999,

2000; Gaszner et al, 2004; Korosi et al, 2005; Kozicz, 2007, Xu et al, 2009)

Os IEGs (genes de ativação imediata ou “immediate early genes”) foram

descritos como uma classe de genes que aparentemente expressam-se de

forma diversa, em diferentes áreas do SNC, após estimulação específica. São

considerados como marcadores de atividade celular, que promovem alterações

a longo prazo em certos aspectos da fisiologia neuronal. Um desses genes é a

proteína nuclear c-Fos, produzida mediante a ativação neuronal após diversos

estímulos como exemplo a despolarização de neurônios e o estresse.

(Ryabinin et al, 1995; PRADO & DEL BEL, 1998).

Trabalhos de diversos grupos têm concordado que a(s) função(ções) do

sistema urocortinérgico central parecem convergir para algum papel na resposta fisiológica ao estresse (Fekete e Zorrilla, 2006). Bachtell et al (2002)

tem mostrado elevação de expressão de fatores de transcrição durante a

exposição a drogas, sugerindo que o EW esteja envolvido neste processo.

Este trabalho visou ampliar e aprofundar o conhecimento dos

mecanismos neurais envolvidos em situações de estresse relacionadas a

exposição a drogas, no caso etanol. Para isso, estabelecemos uma relação entre a expressão de neurônios UCN-1+ e a imunomarcação da proteína c-Fos

no núcleo de Edinger-Westphal (EW) durante o estresse alcóolico utilizando

como modelo experimental pombos.

3. Objetivos

Caracterizar morfologicamente e quantificar possíveis diferenças na expressão da proteína c-Fos na região do núcleo de Edinger-Westphal (EW)

em resposta ao estresse alcoólico. 4. Metodologia Para alcançar os objetivos propostos, os animais foram submetidos a

gavagens com etanol ou água e após, utilizamos as técnicas de imunohistoquímica, dosagem alcoólica e para análise quantitativa, foi realizada

contagem celular. 5. Desenvolvimento Foram utilizados 16 animais adultos (pombo – Columba livia), sendo, 4

controles e 12 experimentais.

Os animais foram mantidos no biotério do Laboratório de Neurociências

da UNICID com ciclo de luz claro-escuro de 12/12 horas, temperatura

controlada e com água e alimentação irrestritas. Todos os experimentos foram

conduzidos segundo as rígidas normas do Conselho Brasileiro de

Experimentação Animal, dentro dos princípios éticos que norteiam a atividade

científica.

Os animais foram mantidos em jejum por 4 horas, pesados e, através de

gavagem, administrado o volume determinado de aguardente de acordo com o peso corpóreo, por um período de 60 dias, numa freqüência de cinco vezes por

semana.

As dosagens de álcool no sangue foram feitas através de um método de

análise enzimática via fotometria, utilizando um leitor de para teste Elisa

(Versamax) e comparada (concentração alcoólica) com a tabela de estágios de

influência alcoólica, sugerida pelo Departamento de Adolescência da Sociedade Brasileira de Pediatria (2007).

Para os estudos imunohistoquímicos, os animais foram anestesiados e

perfundidos por via intracardíaca com salina tamponada (pH 7,4) seguido de

solução de paraformaldeído a 4% em 0.1M de tampão fosfato (PFA 4%). Os

cérebros foram removidos, pós-fixados (PFA 4%) e crioprotegidos em solução

com sacarose a 30% para serem seccionados em micrótomo de congelamento. Em cada etapa do processo de imunohistoquimica, os tecidos foram

lavados em solução tampão 0,1M em temperatura ambiente por

aproximadamente 30 minutos.

Os cortes de um compartimento foram incubados, por 24 horas a 4C,

com o anticorpo primário contra c-Fos 1: 20 000 (Sigma-Aldrich, S. Louis, MO,

USA) Os cortes foram então incubados por uma hora com o anticorpo

secundário contra as imunoglobulinas do animal em que foi feito o anticorpo

primário (Jackson Immuno Research, USA) marcado com biotina. A seguir, os

tecidos foram colocados por uma hora numa nova solução onde se incluia o

complexo avidina-biotina-peroxidase (ABC ELITE kit, Vector Labs.)e revelados

pelo método da peroxidase, na presença de solução de sulfato de níquel cromo

Os cortes sofreram nova reincubação, passando pelos mesmos

processos, apenas substituindo o anticorpo primário por outro anticorpo

primário, agora contra UCN-1 1:1000 (gentilmente doados pelo SalK Instiute,

La Jolla, CA - USA) e revelado sem a presença de níquel-cromo. Alguns cortes também foram corados pelo método de Giemsa para

servir de referência para a citoarquitetura.

Os cortes foram montados em lâminas tratadas com gelatina e

banhados em tetróxido de ósmio 0,1% por 15-30 segundos, tratados com a

série de álcool em concentrações crescentes, clarificantes (Citrisolv, Fisher) e

cobertas com lamínulas tendo com meio de montagem Permount (Fischer). Uma vez prontos, os tecidos foram observados em microscopia de

campo claro para quantificação dos dados obtidos.

6. Resultados Os experimentos imunohistoquímicos permitiram identificar a presença

da expressão de proteína c-Fos em neurônios urocortinérgicos de animais que receberam etanol (figura 1 A) e animais controle (figura 1 B).

A marcação c-Fos+ na região do EWcp ocupou não apenas a região

nuclear da células, como foi uma marcação que estava distribuída em todo o

citoplasma. A expressão de c-Fos foi visualmente maior em pombos que

receberam gavagens com etanol (figura 1).

Figura 1: Fotomicrografias de corte coronal do encéfalo de pombo processadas

imunohistoquimicamente com anticorpos contra a proteína c-Fos e contra a

proteína UCN-1 adquirida da empresa Salk. Podemos notar na figura A,

encontra-se uma maior expressão de células reativas comparadas a figura B.

Na contagem de células imunorreativas no núcleo EW, foi observado

que os pombos na qual a gavagem continha álcool, a expressão de células

marcadas contra UCN-1 e c-Fos era maior que aqueles cujo a gavagem

continha álcool (fig.3).

Figura 2: Gráfico da contagem de imunomarcação de UCN-1 + c-Fos,

comparando a quantidade de células imunorreativas em animais que

receberam gavagem com agua (controle) e animais cujo a gavagem continha

etanol (álcool).

A determinação da concentração de etanol em amostras de sangue de

pombos (tabela 1) foi comparada a tabela de estágios de influência alcoólica

(fig.3), sugerida pelo Departamento de Adolescência da Sociedade Brasileira

de Pediatria (2007), demostrando que os animais que receberam gavagem

com álcool estavam em estagio de euforia e agitação.

EW

ESTÁGIOS DA INTOXICAÇÃO ALCOOLICA AGUDA

Figura 3 Estágios de influência alcoólica segundo o Departamento de

Adolescência da Sociedade Brasileira de Pediatria (2007).

Dosagem de álcool no sangue

Amostra Concentração Estágio

Experimental

(com álcool)

0,9 g/l Euforia/excitação

Controle (sem

álcool)

0 g/l Não alcoolizado

Tabela 1: Concentração de álcool no sangue de pombos que receberam

gavagem com água (controle) e animais que receberam gavagem com etanol (experimental).

. 5. Considerações finais Nossos resultados demonstraram a presença de células UCN+ na região

perioculomotora, especificamente no núcleo de Edinger-Westphal, confirmando

resultados de estudos anteriores (Chang et al, 1995;. Bachtell et ai, 1999;

Ryabinin et al, 2001; Weitemier et al, 2001).

Além disso, o mapeamento da co-localização de c-Fos e UCN-1 em

pombos submetidos a administração de álcool, aponta um possível

envolvimento de células urocortinegicas presentes EW neste mecanismo

estressor. Os dados revelaram uma maior expressão de células imunoreativas

em animais que receberam gavagem de álcool, assim como sugerido por

Bachtell et al. (2003) provavelmente por fazer parte de eventos fisiológicos de

uma via alternativa de resposta ao estresse.

As células de UCN-1 no EWcp estão envolvidos em processos de adaptação ao estresse, podendo ser a chave para a identificação e

caracterização de regiões do cérebro que regulam o consumo de álcool e para

a compreensão dos mecanismos de alcoolismo. Mais esforços são necessários

para elucidar o papel da UCN no EW para o consumo de álcool.

A utilização de c-fos é vastamente utilizada na literatura para identificar

mudanças de atividade em situações agudas. Korosi et al. (2005) mostraram que a expressão de mRNA para Fos acontece em situações agudas quanto em

situações crônicas, porém em situações crônicas pode haver um declínio da

robustez da expressão.

Em um elegante artigo de revisão, Ryabinin and Wetemier (2006)

mostraram evidências do envolvimento do sistema urocortinérgico no consumo

alcoólico que levam a três hipóteses: 1) neurônios urocortinérgicos são extremamente sensíveis ao álcool; 2) o circuito urocortinérgico pode contribuir

para predisposição genética ao consumo de álcool em ratos e camundongos e

3) manipulação do sistema urocortinérgico altera consumo e sensitividade ao

álcool.

Em conclusão, nossos dados identificaram um aumento na expressão de

c-fos em neurônios urocortinérgicos do núcleo EWcp em pombos submetidos a ingestão alcoólica, revelando um possível envolvimento deste sistema em

situações de estresse alcoólico. 8. Fontes consultadas

Bachtell RK, Wang YM, Freeman P, Risinger FO, Ryabinin AE. Alcohol

drinking produces brain region-selective changes in expression of inducible

transcription factors. Brain Res 847:157–165; 1999

Bachtell, R.K.; Tsivkovskaia, N.O.; Ryabinin, A. E. Strain differences in

urocortin expression in the Edinger-Westphal nucleus and its relation to alcohol-

induced hypothermia. Neuroscience 113(2):421-434, 2002.

Burde, R.M.; Parelman, J.J.; Luskin, M. Lack of unity of the Edinger-

Westphal nucleus projections to the ciliary ganglion and spinal cord: a double

labeling approach. Brain Res 249:379–382, 1982.

Fekete, E.V. & Zorrilla, E.P. Physiology, pharmacology, and therapeutic relevance of urocortins in mammals: ancient CRF paralogs. Front

Neuroendocrinol. 28:1-27, 2006.

Gazner, B.; Csernus, V.; Kozicz, T. Urocortinergic neurons respond in a

differentiated manner to various acute stressors in the Edinger-Westphal

nucleus in the rat. J. Comp. Neurol. 480(2):170-179, 2004.

Klooster, J.; Beckers, H.J.M.; Vrensen, G.F.J.M. & VanderWant, J.J.L. The peripheral and central projections of the Edinger–Westphal nucleus in the

rat. A light and electron microscopic tracing study. Brain Res. 632,260–273,

1993.

Korosi, A.; Schotanus, S.; Olivier, B.; Roubos, E.W. & Kozicz, T. Chronic

ether stress-induced response or urocortin 1 neurons in the Edinger Westphal

nucleus in the mouse. Brain Res. 1046:172-179, 2005. Kozicz, T. On the role of urocotin 1 in the non-preganglionic Edinger-

Westphal nucleus in stress adaptation. General and comparative endocrinology

153(1-3):235-240, 2007.

Kozicz, T.; Bittencourt, J.C.; May, P.J.; Reiner, A.; Gamlin, P.D.;

Palkovits, M.; Reiner, A.; Horn, A.K.E.; Toledo, C.A.B.; Ryabinin, A.E. The

Edinger-Westphal nucleus: a historical, structural, and functional perspective on a dichotomous terminology. J Comp Neurol 519:1413–1434, 2011.

Kozicz, T.; Yanaihara, H.; Arimura, A. Distribution of urocortin-like

immunoreactivity in the central nervous system of the rat. Journal of

Comparative Neurology 391(1):1-10, 1998.

Laursen, M. & Rekling, J.S. The Edinger-Westphal nucleus of the

juvenile rat contains transient- and repetitive-firing neurons. Neuroscience

141:191-200, 2006.

Prado, P.T.C. & Del Bel, E.A. C-fos, um gene de ativação imediata como

marcador neural de nocicepção. Medicina, Ribeirão Preto, 31: 424-433, 1998.

Ryabinin AE, Weitemier AZ. The urocortin 1 neurocircuit: ethanol-

sensitivity and potential involvement in alcohol consumption. Brain Res Rev.,

Sep;52(2):368-80, 2006.

Ryabinin, A.E.; Melia K.L.; Cole M.; Bloom F.E.; Wilson M.C. Alcohol Selectively Attenuates Stress-Induced c-fos Expression in Rat Hippocampus

The Journal of Neuroscience, 15(1): 721-730, 1995.

Ryabinin, A.E.; Tsivkovskaia, N.O. & Ryabinin, S.A. Urocortin 1-

containing neurons in the human Edinger-Westphal nucleus. Neuroscience

134(4):1317-1323, 2005.

Saper, C.B.; Loewy, A.D.; Swanson, L.W.; Cowan, W.M. Direct hypothalamo-autonomic connections. Brain Res 117:305-312, 1976.

Skelton, K.H.; Owens, M.J.; Nemeroff, C.B. The neurobiology of

urocortin. Regulatory Peptides 93(1-3)85-92, 2000.

Vasconcelos, L.A.; Donaldson, C.; Sita, L.V.; Casatti, C.A.; Lotfi, C.F.;

Wang, L.; Cadinouche, M.Z.; Frigo, L.; Elias, C.F.; Lovejoy, D.A.; Bittencourt,

J.C. Urocortin in the central nervous system of a primate (Cebus apella): sequencing, immunohistochemical, and hybridization histochemical

characterization. The Journal of Comparative Neurology 463(2):157-175, 2003.

Weninger, S.C.; Dunn, A.J.; Muglia, L.J.; Dikkes, P.; Miczek, K.A.;

Swiergiel, A.H.; Berridge, C.W.; Majzoub, J.A. Stress-induced behaviors require

the corticotropin-releasing hormone (CRH) receptor, but not CRH. Proc Natl

Acad Sci U S A. 96(14):8283-8288, 1999.