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UNIVERSIDADE DE BRASIacuteLIA
FACULDADE DE CEILAcircNDIA
CURSO DE FARMAacuteCIA
Tawana Correa Rodrigues Amorim Rosa
Anaacutelise de aspectos epidemioloacutegicos e cliacutenicos e caracterizaccedilatildeo de genes de
resistecircncia das Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases em um
hospital do Distrito Federal
CEILAcircNDIA DF
2014
Tawana Correa Rodrigues Amorim Rosa
Anaacutelise de aspectos epidemioloacutegicos e cliacutenicos e caracterizaccedilatildeo de
genes de resistecircncia das Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases em
um hospital do Distrito Federal
Monografia de Conclusatildeo de Curso
apresentada como requisito parcial
para obtenccedilatildeo do grau de Bacharel
em Farmaacutecia na Universidade de
Brasiacutelia Faculdade de Ceilacircndia
Orientadora Profa DraMargocirc Gomes de Oliveira Karnikowski
Co-orientadora Profa Dra Izabel Cristina Rodrigues da Silva
CEILAcircNDIA DF
2014
Tawana Correa Rodrigues Amorim Rosa
Anaacutelise de aspectos epidemioloacutegicos e cliacutenicos e caracterizaccedilatildeo de
genes de resistecircncia das Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases em
um hospital do Distrito Federal
Orientadora Profa Dr Margocirc Gomes de Oliveira Karnikowski
(FCe Universidade de Brasiacutelia)
Co-orientadora Profa Dr Izabel Cristina Rodrigues da Silva
(FCe Universidade de Brasiacutelia)
CEILAcircNDIA DF
2014
Tawana Correa Rodrigues Amorim Rosa
Anaacutelise de aspectos epidemioloacutegicos e cliacutenicos e caracterizaccedilatildeo de
genes de resistecircncia das Enterobacteacuterias produtoras de carbapemases em um
hospital do Distrito Federal
BANCA EXAMINADORA
_______________________________________
Orientadora Profa Dr Margocirc Gomes de Oliveira Karnikovski
(FCe Universidade de Brasiacutelia)
_______________________________________
Profa MSc Micheline Marie Milward de Azevedo Meiners
(FCe Universidade de Brasiacutelia)
_______________________________________
Prof MSc Daniel Oliveira Freire
(LS Faculdade LS)
CEILAcircNDIA DF
2014
AGRADECIMENTOS
Primeiramente aacute Deus autor da vida que me concedeu a graccedila e a benccedilatildeo
de ter conquistado este sonho da graduaccedilatildeo
Agrave minha amada famiacutelia principalmente meus pais Elias Amorim e Liliana
Correa irmatildeo Thales Correa e avoacute Herondina por serem a minha base meu
refuacutegio em todos os momentos e acreditarem em mim
Agrave minha grande amiga de graduaccedilatildeo Susan Suellen por partilhar dos meus
medos alegrias vitoacuterias angustias e em todos os momentos ser meu braccedilo direito
Ao meu amor Robson Bastos que mais que um noivo foi meu amigo e
companheiro me apoiando e me incentivando
Agrave minha querida orientadora DraMargocirc Gomes e querida co-orientadora Dra
Izabel Cristina por acreditarem em mim me dando a oportunidade de trabalhar com
elas Aleacutem do apoio ensino e dedicaccedilatildeo
Agrave todos os professores (as) da Universidade de Brasiacutelia- Faculdade de
Ceilacircndia pelo ensino e pela contribuiccedilatildeo na minha formaccedilatildeo acadecircmica
Agrave MSc Fabiana Cartaxo pela ajuda e apoio aleacutem da prontidatildeo quando
solicitada a sua ajuda
Ao professor mestre Daniel Oliveira e a teacutecnica de laboratoacuterio Thais Mendes
pela ajuda laboratorial contribuindo para a realizaccedilatildeo de um bom trabalho
RESUMO
Introduccedilatildeo A Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) eacute uma enzima
produzida por bacteacuterias gram-negativas (enterobacteacuterias) que confere resistecircncia
aos antimicrobianos carbapenecircmicos meropenen ertapenen imipenen classe
amplamente utilizada no tratamento de infecccedilotildees envolvendo Enterobacteriaceae
Esta resistecircncia eacute uma das principais causas de falha terapecircutica devido agrave
produccedilatildeo de beta-lactamases de espectro estendido (ESBL) por esta bacteacuteria
mecanismo de resistecircncia mais comum aos antibioacuteticos beta-lactacircmicos de amplo
espectro A identificaccedilatildeo destas enterobacteacuterias pode ser feita atraveacutes de teacutecnicas
de identificaccedilatildeo molecular de patoacutegenos dentre elas a Reaccedilatildeo em Cadeia de
Polimerase (PCR) que consiste na anaacutelise do padratildeo de amplificaccedilatildeo de elementos
repetidos encontrados no genoma bacteriano permitindo uma maior rapidez na
obtenccedilatildeo de resultados quando comparada com outros meacutetodos aleacutem de
apresentar alta reprodutibilidade simples execuccedilatildeo e implementaccedilatildeo dependendo
da aplicaccedilatildeo da teacutecnica natildeo enfrenta problemas com a degradaccedilatildeo do DNA
Objetivo Caracterizar genes de resistecircncia das Enterobacteacuterias produtoras de
carbapenemases e aspectos epidemioloacutegicos e cliacutenicos de pacientes internados em
um hospital puacuteblico do Distrito Federal Materiais e meacutetodos Estudo transversal
onde foi realizado o teste de susceptibilidade das Enterobacteacuterias aos antibioacuteticos
Carbapenecircmicos a partir dos materiais bioloacutegicos coletados dos pacientes
internados no Hospital Regional da Asa Norte (HRAN) Anaacutelise molecular dos genes
16S rRNA e blaKPC utilizando PCR aleacutem de anaacutelises estatiacutesticas Resultados e
discussatildeo Detectou-se a regiatildeo ribossomal e o gene de resistecircncia testado
confirmando a resistecircncia microbiana Maior prevalecircncia de pacientes do sexo
masculino (53) desfecho cliacutenico de oacutebito(59) siacutetio de infecccedilatildeo de swab retal
(47) Klebsiella pneumoniae foi microrganismo mais encontrado (82) Natildeo houve
diferenccedila estatiacutestica entre as variaacuteveis e o desfecho cliacutenico (p foi gt 005)
Conclusatildeo Atraveacutes da caracterizaccedilatildeo molecular dos genes de resistecircncia blaKPC
e Universal confirmou-se a presenccedila de Klebsiella pneumoniae resistente aos
carbapenecircmicos Os valores de p natildeo foram significativos (lt005) sendo
assimnenhuma das variaveacuteis estudadas foram o principal motivo do desfecho
cliacutenico (alta ou oacutebito)
Palavras chaves Klebsiella pneumoniae carbapenemase Resistecircncia bacteriana a
antimicrobianos β-lactamases de espectro estendido (ESBL) Reaccedilatildeo em Cadeia de
Polimerase (PCR)
ABSTRACT
Introduction Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) is an enzyme produced
by gram - negative bacteria (Enterobacteriaceae) which confers resistance to
carbapenem antibiotics meropenen ertapenen imipenem class widely used in the
treatment of infections involving Enterobacteriaceae This resistance is a major
cause of treatment failure due to beta-lactamases production of extended spectrum
(ESBL) by this bacterium most commonly resistance to beta-lactam antibiotics of
wide spectrum engine The identification of these Enterobacteriaceae can be made
by techniques of molecular identification of pathogens among them the Polymerase
Chain Reaction (PCR) which consists in the analysis of the amplification pattern of
repeated elements found in the bacterial genome allowing faster in getting results
when compared with other methods in addition to presenting high reliability simple
implementation and deployment depending on the application of the technique has
no trouble with the degradation of DNA Objective To characterize the resistance
genes of Enterobacteriaceae producing carbapenemases and epidemiological and
clinical features of patients admitted to a public hospital in the Federal District
aspects Materials and methods Cross-sectional study where susceptibility testing
of Enterobacteriaceae to antibiotics Carbapenems from biological materials collected
from patients admitted to the Hospital Regional da Asa Norte ( HRAN ) was
performed Molecular analysis of 16S rRNA genes and blaKPC using PCR in
addition to statistical analysis Results and Discussion Was detected region and
the ribosomal tested resistance gene confirming the microbial resistance Higher
prevalence of male patients (53 ) clinical outcome of death (59 ) site of infection
rectal swabs (47 ) Klebsiella pneumoniae was found more microorganism (82)
There was no statistical difference between the variables and the clinical outcome (p
was gt 005) Conclusion Through molecular characterization of genes and the
Universal blaKPC resistance confirmed the presence of Klebsiella pneumoniae
resistant to carbapenems P values were not significant (lt 005) so none of the
variables studied were the main reason the clinical outcome (discharge or death)
Keywords Klebsiella pneumoniae Carbapenemase Bacterial resistance to
antibiotics Extended-Spectrumβ-lactamases (ESBL) Polimerase Chain Reaction
(PCR)
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Accedilatildeo do szlig-lactacircmico sobre a bacteacuteria gram-positiva e gram-negativa
Figura 2 Divulgaccedilatildeo internacional de Klebsiella pneumoniae Carbapenemase
(KPC) produtoras de Enterobacteriaceae
Figura 3 Mecanismos de resistecircncia bacteriana
Figura 4 Etapas da Reaccedilatildeo de PCR
Figura 5 Mecanismo de semeamento de material bioloacutegico oriundos de pacientes
com suspeita de infecccedilatildeo por KPC
Figura 6 Interpretaccedilatildeo resultado do Teste de Hodge Modificado
Figura 7 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC das amostras dos
17 pacientes estudados
Figura 8 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC da mostra A3
estudada
Figura 9 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA das amostras
dos 17 pacientes estudados
Figura 10 Gel de agarose a 2 da digestatildeo do amplicon do gene 16S rRNA das
amostras com a enzima HaeIII evidenciando diversos fragmentos proacuteximos a 200
pb
Figura 11 Infecccedilatildeo por KPC segundo sexo dos 17 pacientes investigados no
HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
Figura 12Isolado de KPC segundo desfecho cliacutenico dos 17 pacientes investigados
no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
Figura 13 Isolados de KPC segundo local da coleta da amostra nos 17 pacientes
investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
Figura 14Isolado de KPC segundo microrganismo encontrado em 17 pacientes
investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Criteacuterios Interpretativos para testes de sensibilidade
Tabela 2 Nuacutemero de acesso ao GenBank dos alelos blaKPC e seus microrganismos
originais
Tabela 3 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do gene blaKPC
Tabela 4 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do gene
universal
Tabela 5 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da digestatildeo do gene universal
Tabela 6 - Distribuiccedilatildeo das variaacuteveis estudadas perfil geneacutetico sexo coleta
tipificaccedilatildeo de microrganismos e anaacutelise da resistecircncia bacteriana segundo o
desfecho cliacutenico Brasiacutelia-DF 2010 a 2012
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AmpC- Adenosina Monofosfato Ciacuteclico
BRMD- Bacteacuterias multirresistentes
CCIH- Comissatildeo de Controle de Infecccedilatildeo Hospitalar
CDC- Centers for Disease Control and Prevention
CIM- Concentraccedilatildeo Inibitoacuteria Miacutenima
CLSI- Clinical and Laboratory Standards Institute
DNA- Aacutecido Desoxirribonucleacuteico
E coli- Escherichia coli
ERIC-PCR - Enterobacterial Repet it ive Intergenic Consensus
ESBL- Beta-Lactamases de Espectro Estendido
Et al- e outros
ETP- Ertapenem
HRAN- Hospital Regional da Asa Norte
K ornithinolytica- Klebsiella ornithinolytica
K oxytoca- Klebsiella oxytoca
K planticola- Klebsiella planticola
K pneumoniae- Klebsiella pneumoniae
K terrigena- Klebsiella terrigena
KPC - Klebsiella pneumoniae produtora de Carbapenemase
KPCNEG- Bacilos Gram-Negativos Natildeo Fermentadores
KPCPOS- Bacilos Gram-Positivo Natildeo Fermentadores
MBL- metalo-beta-lactamases
MEM- Meropenem
NA- Natildeo se aplica
Oligo- Oligonucleotiacutedeos
PB- Pares de Bases
PBPs (Penicilim-Binding-Protein)- Proteiacutenas de ligaccedilatildeo agrave penicilina
PCR- Polymerase Chain Reaction (Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase)
PFGE - Pulsed-Field Gel Electrophoresis (Eletroforese em campo pulsado)
RAPD- Randomly Amplified Polymorphic DNA (DNA polimoacuterfico amplificado
aleatoriamente)
RFLPrsquos - ldquoRestriction Fragment Length Polymorphismsrdquo( polimorfismos de tamanho
de fragmentos de restriccedilatildeo)
THM- Teste de Hodge Modificado
TSA- Teste de Susceptibilidade aos Antibioacuteticos
UTI- Unidade de Terapia Intensiva
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 15
11 Klebsiella pneumoniae produtora de Carbapenemase (KPC) 15
1 2 Resistecircncia bacteriana 20
13 Anaacutelise geneacutetica de microrganismos 27
2 JUSTIFICATIVA 30
3 OBJETIVOS 31
31 Objetivo geral 31
32 Objetivos Especiacuteficos 31
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS 32
4 1 Coleta e transporte das amostras bioloacutegicas 32
4 2 Procedimentos para confirmaccedilatildeo de resistecircncia bacteriana por disco de
Ertapenem (adaptado CDC 2004) 32
4 2 1 Interpretaccedilatildeo dos Resultados 33
4 3 Teste de susceptibilidade aos antibioacuteticos 34
4 4Teste de Hodge Modificado (THM) (adaptado CDC 2004) 35
441 Controle de qualidade (CQ) 35
442 InterpretaccedilatildeoResultados 35
4 5 Extraccedilatildeo de DNA bacteriano 37
4 6 Iniciadores e reaccedilatildeo de PCR 38
4 7 Digestatildeo 41
4 8 Eletroforese em gel de agarose 41
4 9 Descarte de resiacuteduos 42
4 10 Aspectos epidemioloacutegicos e cliacutenicos 42
4 12 Anaacutelises estatiacutesticas 42
4 13 Preceitos eacuteticos 43
5 RESULTADOS 44
51 Anaacutelise molecular 44
5 1 1 Gene blaKPC 44
5 1 2 Gene 16S rRNA 45
5 2 Anaacutelises epidemioloacutegicas 46
5 2 1 Sexo 46
5 2 2 Desfecho cliacutenico 47
5 2 3 Local da coleta 48
5 2 4 Microrganismo 48
6 DISCUSSAtildeO 53
7 CONCLUSAtildeO 57
15
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC)
Klebsiella pneumoniae pertence aacute famiacutelia Enterobacteriaceae
encontrado em locais como aacutegua solo plantas e esgoto Satildeo encontradas cinco
espeacutecies K pneumoniae K oxytoca K planticola K terrigena e K ornithinolytica
O gecircnero Klebsiella eacute definido como contendo bacilos Gram-negativos natildeo moacuteveis
em forma de bastatildeo e geralmente encapsuladas que produzem lisina
descarboxilase mas natildeo produzem ornitina descarboxilase Provavelmente a
colonizaccedilatildeo em seres humanos ocorre por contato com as diferentes fontes
ambientais podendo ser encontrada colonizando a orofaringe e fezes de pessoas
sadias Pessoas imunocomprometidas a bacteacuteria encontra um ambiente favoraacutevel
para seu crescimento levando aos quadros de infecccedilatildeo (MOREIRA et al 2014)
A Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) eacute uma enzima produzida por
enterobacteacuterias gram-negativas sendo um mecanismo de resistecircncia aos antimi-
crobianos carbapenecircmicos meropenen ertapenen eou imipenen classe
amplamente utilizada no tratamento de infecccedilotildees envolvendo Enterobacteriaceae
Ela tambeacutem eacute capaz de inativar os agentes β-lactacircmicos cefalosporinas penicilinas
e o aztreonam (COTRIM et al 2012)
Devido agrave semelhanccedila estrutural e estereoquiacutemica os antibioacuteticos beta-
lactacircmicos possuem um mecanismo de accedilatildeo comum ao grupo Eles atuam inibindo
a siacutentese da parede celular bacteriana atraveacutes do mecanismo de bloqueio da
transpeptidaccedilatildeo responsaacutevel pela uniatildeo dos componentes individuais do
peptidoglicano conforme demonstrado na figura 1 (KIDWAI et al 1999)
A accedilatildeo destes antibioacuteticos eacute atraveacutes de ligaccedilotildees covalentes com as proteiacutenas
as Penicilim-Binding-Protein (proteiacutena de ligaccedilatildeo da penicilina- PBP ou PLP) que se
encontram presentes na membrana citoplasmaacutetica de todas as bacteacuterias Devido agraves
mutaccedilotildees ocorre uma induccedilatildeo na alteraccedilatildeo dessas proteiacutenas podendo determinar
uma diminuiccedilatildeo da afinidade dos beta-lactacircmicos agraves mesmas A accedilatildeo dos
carbapenecircmicos eacute atraveacutes da sua ligaccedilatildeo agraves PBPs presentes na parede bacteriana
especialmente as PBP1 e PBP2 provocando a lise osmoacutetica da bacteacuteria Aleacutem
disso eles tecircm uma facilidade na penetraccedilatildeo da bacteacuteria por meio dos canais
poriacutenicos presentes nas bacteacuterias gram-negativas induzindo um efeito poacutes-
16
antibioacutetico Quando comparados com outros beta-lactacircmicos os carbapenecircmicos
satildeo mais resistentes agrave hidroacutelise pela maioria das beta-lactamases tanto
cromossocircmicas como plasmiacutedicas (LIVERMORE 1995 LIVERMORE et al 2000)
Figura 1 Accedilatildeo do szlig-lactacircmico sobre a bacteacuteria gram-positiva e gram-
negativa Fonte
ltlthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controle
opas_webmodulo3gramn_lacta2htmgt (adaptado)
A bacteacuteria Klebsiella pneumoniae quando apresenta gene ESBL pode
expressar resistecircncia a ateacute 95 dos antimicrobianos existentes no acircmbito
farmacecircutico sendo a produccedilatildeo de beta-lactamases de espectro estendido (ESBL)
17
por esta bacteacuteria uma das principais causas de falha terapecircutica Existem outras
formas de resistecircncia emergentes de grande importacircncia como a produccedilatildeo de
beta-lactamases tipo adenosina monofosfato ciacuteclico (AmpC) que hidrolizam
cefoxitina as carbapenemases como as metalo-beta-lactamases (MBL) e
carbapenemases tipo KPC (MOREIRA et al 2014)
O mecanismo de resistecircncia mais comum aos antibioacuteticos beta-lactacircmicos de
amplo espectro eacute a produccedilatildeo de ESBL por enterobacteacuterias A accedilatildeo hidroliacutetica
apresentadas por estas enzimas pode conferir clinicamente resistecircncia ao
aztreonam cefalosporina e a todas as penicilinas (PATERSON et al 2005) As
ESBL satildeo enzimas mediadas por genes plasmidiais (transmissiacuteveis entre as
espeacutecies) Os principais microrganismos produtores de ESBL satildeo Klebsiella
pneumoniae (mais encontrada) Escherichia coli e Proteus mirabilis podendo ocorrer
em outros membros da famiacutelia Enterobacteriaceae e em alguns microrganismos natildeo
enteacutericos como Acinetobacter ssp (TURNER 2005) A importacircncia cliacutenica meacutedica
destes microrganismos portadores de ESBL eacute que graccedilas aacutes suas resistecircncias a
muitas classes de antimicrobianos o tratamento de infecccedilotildees eacute difiacutecil gerando um
aumento da morbidade e mortalidade dos pacientes (SHAH et al 2004)
A enzima KPC foi detectada pela primeira vez na Carolina do Norte Costa
Leste dos Estados Unidos no ano de 1996 em Klebsiella pneumoniae dando entatildeo
este nome a enzima Em pouco tempo ela disseminou por outras regiotildees e
recentemente tornou-se uma das preocupaccedilotildees quanto agrave sauacutede puacuteblica mundial
Os paiacuteses de onde KPCs tecircm sido relatados desde 2001 satildeo mostrados na figura 2
apresentando como os organismos tecircm agora sido disseminados amplamente pelo
mundo (NEIL GUPTA et al 2011)
18
Figura 2 Divulgaccedilatildeo internacional de Enterobacteriaceae produtora de
Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC)( NEIL GUPTA et al 2011)
Este mapa apresenta paiacuteses onde Enterobacteriaceae produtoras KPC de
foram descritos em relatoacuterios publicados disponiacuteveis a partir de 11 fevereiro de
2011 Os paiacuteses natildeo destacadas nesta figura tambeacutem podem apresentar a presenccedila
de Enterobacteriaceae produtoras de KPC poreacutem pode ter tido uma falta de
vigilacircncia sistemaacutetica para estes organismos ( NEIL GUPTA et al 2011)
No ano de 2005 foram registradas pela primeira vez essas bacteacuterias
produtoras de carbapenemases Apoacutes 6 anos deste primeiro relato elas passaram a
causar surtos mais graves em nosso paiacutes Em janeiro de 2011 foram notificados no
Distrito FederalBrasil 367 casos em um curto espaccedilo de tempo (01 a 08 de janeiro
de 2011) com 26 oacutebitos A maior parte destes casos (263 casos) foi identificada nas
unidades de terapia intensiva ndash UTI (COTRIM et al 2012)
O potencial de disseminaccedilatildeo da KPC eacute alto devido agrave grande capacidade de
transferecircncia do seu material geneacutetico e por conseguinte os genes de resistecircncia
O controle de epidemias eacute difiacutecil devido a esta caracteriacutestica de faacutecil disseminaccedilatildeo
preocupando os profissionais da aacuterea de sauacutede devido agrave dificuldade de tratamento
podendo resultar em um aumento das taxas de mortalidade Apesar da maior
19
frequumlecircncia em Klebsiella pneumoniae a KPC pode ser identificada em outras
bacteacuterias como a Enterobacter cloacae Citrobacter freundii Salmonella spp E coli
e Pseudomonas spp (DIENSTMANN et al 2010)
Os pacientes com comorbidades incluindo pacientes transplantados
neutropecircnicos em ventilaccedilatildeo mecacircnica em Unidade de Terapia Intensiva (UTI)
com longos periacuteodos de internaccedilatildeo que apresentam risco aumentado de infecccedilatildeo ou
colonizaccedilatildeo para bacteacuterias multirresistentes satildeo mais vulneraacuteveis a Klebsiella
pneumoniae produtora de KPC (COTRIM et al 2012)
Os sinais e sintomas apresentados por um indiviacuteduo infectado por KPC satildeo
febre ou hipotermia taquicardia piora do quadro respiratoacuterio e em casos mais
graves hipotensatildeo inchaccedilo e sepse Quanto ao siacutetio de infecccedilatildeo a bacteacuteria que
possui a enzima KPC pode causar pneumonia associada agrave ventilaccedilatildeo mecacircnica
infecccedilatildeo do trato urinaacuterio infecccedilatildeo de corrente sanguiacutenea infecccedilatildeo de partes moles
e outros tipos de infecccedilatildeo (COTRIM et al 2012)
Para desenvolver a infecccedilatildeo a colonizaccedilatildeo eacute um preacute-requisito poreacutem o
pacientes pode estar colonizado ou seja ser portadores de KPC e natildeo desenvolver
a infecccedilatildeo (ALVES et al 2013) A forma de transmissatildeo eacute basicamente por
contato com secreccedilatildeo ou excreccedilatildeo de pacientes infectados ou colonizados logo
fora do ambiente hospitalar a bacteacuteria natildeo representa perigo (COTRIM et al
2012)
As opccedilotildees terapecircuticas para o tratamento da Klebsiella pneumoniae eacute
dividida em Terapia Empiacuterica e Terapia apoacutes a determinaccedilatildeo do perfil de
sensibilidade A terapia empiacuterica para infecccedilotildees por enterobacteacuterias multirresistentes
se baseia na utilizaccedilatildeo de polimixina B ou polimixina E (Colistina) em associaccedilatildeo
com um (1) ou mais dos antimicrobianos da classe dos aminoglicosiacutedeos
(gentamicina ou amicacina) Carbapenecircmicos (meropenem ou doripenem) eou
tigeciclina (ANVISA 2013)
Recomenda-se usar sempre associaccedilotildees de dois ou trecircs antimicrobianos
sendo um deles a polimixina B ou a polimixina E (colistina) Deve-se evitar a
utilizaccedilatildeo de monoterapias pelo risco de raacutepido desenvolvimento de resistecircncia A
escolha do(s) faacutermaco(s) de associaccedilatildeo com polimixina B ou E deve se basear
preferencialmente no perfil de susceptibilidade esperado aos referidos
20
medicamentos das enterobacteacuterias resistentes aos carbapenecircmicos detectadas no
hospital ou na ausecircncia de dados locais na regiatildeo Deve-se considerar igualmente
o local de infecccedilatildeo e a penetraccedilatildeo esperada do antimicrobiano na escolha da droga
a ser utilizada na combinaccedilatildeo (ANVISA 2013)
Apoacutes a liberaccedilatildeo do perfil de sensibilidade deve-se adequar o uso dos
medicamentos Sempre que possiacutevel manter no miacutenimo 2 (dois) faacutermacos com
sensibilidade comprovada in vitro Natildeo havendo sensibilidade a um segundo
medicamento (suscetibilidade apenas agrave polimixina B ou E) recomenda-se manter a
terapia combinada de polimixina B ou E com carbapenecircmicos (meropenem ou
doripenem) ou tigeciclina na tentativa de ocorrecircncia de sinergismo entre elas
(ANVISA 2013)
Sugere-se aleacutem da determinaccedilatildeo das Concentraccedilotildees Inibitoacuterias Miacutenimas
(CIMs) para uma das polimixinas (B ou E) que tambeacutem sejam determinadas as
CIMs de tigeciclina e carbapenecircmicos (meropenem) bem como a consultoria de um
infectologista (ou Comissatildeo de Controle de Infecccedilatildeo Hospitalar- CCIH) para a
determinaccedilatildeo da terapia combinada com base na interpretaccedilatildeo do antibiograma
CIM e quadro cliacutenico do paciente No caso de resistecircncia agraves polimixinas
(concentraccedilotildees inibitoacuterias miacutenimas [CIMs] gt 2 mgL) recomenda-se a associaccedilatildeo de
dois ou trecircs do antimicrobianos sugeridos para a combinaccedilatildeo (ANVISA 2013)
A antissepsia eficiente do ambiente dos instrumentos ciruacutergicos e das matildeos
com o uso do aacutelcool a 70 eacute fundamental para a contenccedilatildeo de surtos Aleacutem disto
os pacientes contaminados devem permanecer isolados ateacute o controle da infecccedilatildeo
para evitar a disseminaccedilatildeo da bacteacuteria (COTRIM et al 2012)
1 2 Resistecircncia bacteriana
Hoje a disseminaccedilatildeo e a proliferaccedilatildeo das bacteacuterias resistentes estatildeo cada
dia mais presente As bacteacuterias multirresistentes (BRMD) poderatildeo levar agrave
humanidade a uma era poacutes-antibioacutetica resultando em uma ausecircncia de qualquer
opccedilatildeo de tratamento para os portadores destas cepas (HENRIQUE et al 2014)
Os fatores envolvidos na disseminaccedilatildeo desses patoacutegenos multirresistentes
satildeo diversos incluindo o uso irracional de antimicrobianos procedimentos invasivos
21
(cirurgias implantaccedilatildeo de proacuteteses meacutedicas e outros) e a transferecircncia de material
geneacutetico com a informaccedilatildeo de resistecircncia a antibioacuteticos entre as bacteacuterias
(DIENSTMANN et al 2010 ENDIMIAMI et al 2009 FONTANA et al 2010)
Com a praacutetica da antibioticoterapia principalmente em ambientes
nosocomiais os mecanismos de resistecircncia tornaram-se comuns Esses
mecanismos incluem alteraccedilatildeo na permeabilidade da membrana celular que
impede a entrada do antibioacutetico na ceacutelula bombeamento do antibioacutetico para fora da
mesma pelo mecanismo de efluxo mutaccedilatildeo geneacutetica que altera de alguma forma o
alvo do antibioacutetico e consequumlentemente natildeo afeta o funcionamento da bacteacuteria
bem como desenvolvimento da capacidade de degradar ou da inativaccedilatildeo do
antibioacutetico (COTRIM et al 2012) Estes mecanismos estatildeo representados na figura
3
Figura 3 Mecanismos de resistecircncia bacteriana Fonte
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controle
opas_webmodulo3pop_mecanismohtmgt
Um dos mais importantes mecanismos de resistecircncia eacute a alteraccedilatildeo do local-
alvo onde atua determinado antimicrobiano de modo a impedir a ocorrecircncia de
qualquer efeito inibitoacuterio ou bactericida As bacteacuterias podem adquirir um gene que
22
codifica um novo produto resistente aos antimicrobianos substituindo o alvo original
por exemplo o Staphylococcus aureus resistente agrave oxacilina e estafilococos
coagulase-negativos adquiriram o gene cromossocircmico Mec A e produzem uma PBP
ou PLP resistente aos β-lactacircmicos denominada 2a ou 2 que eacute suficiente para
manter a integridade da parede celular durante o crescimento quando outras PBPs
essenciais satildeo inativadas por antibimicrobianos β-lactacircmicos Como alternativa um
gene receacutem-adquirido pode atuar para modificar um alvo tomando-o menos
vulneraacutevel a determinado antimicrobiano Assim um gene transportado por
plasmiacutedeo ou por transposon codifica uma enzima que inativa os alvos ou altera a
ligaccedilatildeo dos antimicrobianos como ocorre com eritromicina e clindamicina (ANVISA
2007)
Em funccedilatildeo da bomba de efluxo pode variar a especificidade do antibioacutetico
Ele atua por meio do bombeamento ativo de antimicrobianos do meio intracelular
para o extracelular gerando uma resistecircncia bacteriana a determinados
antimicrobianos como eacute o caso da resistecircncia agraves tetraciclinas codificada por
plasmiacutedeos em Escherichia coli devido agrave presenccedila de proteiacutenas integrantes da
membrana plasmaacutetica bacteriana (PIDDOCK 2006)
O aumento da siacutentese de proteiacutenas eacute o principal responsaacutevel pela resistecircncia
antimicrobiana devido agraves vaacuterias mutaccedilotildees que ocorrem em seus repressores
transcricionais Estas mutaccedilotildees tambeacutem podem influenciar levando a um aumento
da eficiecircncia do transporte dos antibioacuteticos para o exterior da ceacutelula (HARBOTTLE
et al 2006)
A resistecircncia aos antibioacuteticos eacute frequumlentemente associada agrave alteraccedilatildeo
diminuiccedilatildeo da permeabilidade que ocorre na membrana externa das bacteacuterias gram-
negativas O fluxo de moleacuteculas para o interior da ceacutelula ocorre por caracteriacutesticas
peculiares como carga estrutura e dimensatildeo e atraveacutes de proteiacutenas de membrana
as quais formam canais Este percurso eacute utilizado pelos antibioacuteticos para atingir o
interior da ceacutelula bacteriana ou o espaccedilo periplasmaacutetico como eacute o caso dos
antibioacuteticos β-lactacircmicos Portanto a perda de funccedilatildeo destas proteiacutenas pode
efetivamente causar a diminuiccedilatildeo da susceptibilidade a vaacuterios antibioacuteticos
(LIVERMORE 2003)
23
Os mecanismos de resistecircncia que podem impedir a accedilatildeo de antimicrobianos
satildeo vaacuterios O faacutermaco atua de forma a inibir os processos essenciais a multiplicaccedilatildeo
e sobrevivecircncia da ceacutelula bacteriana como a membrana citoplasmaacutetica e
consequumlentemente bloqueando a siacutentese proteacuteica de aacutecidos nucleacuteicos e da parede
celular A resistecircncia bacteriana eacute um mecanismo natural de defesa Sendo assim
as bacteacuterias estatildeo em constante defesa e para cada novo faacutermaco desenvolvido as
bacteacuterias iratildeo desenvolver resistecircncia em algum momento (POSSEBON et al
2003)
O grupo de antibioacuteticos beta-lactacircmicos satildeo amplamente utilizado e se
encontram dentro da classe dos melhores agentes antimicrobianos com relevacircncia
cliacutenica No entanto o seu uso tem sido restringido devido a vaacuterios mecanismos de
resistecircncia O desenvolvimento dos carbapenecircmicos surgiu devido agrave proliferaccedilatildeo de
beta-lactamases mediadas por plasmiacutedeos e cromossomos (POSSEBON et al
2003)
A bacteacuteria KPC tem um gene chamado SHV-1 que tem a caracteriacutestica de
resistecircncia a quase todos os tipos de antimicrobianos inclusive os carbapenecircmicos
especiacuteficos para o tratamento de infecccedilotildees por bacteacuterias multiresistentes e
emergecircncias Mesmo com no seu coacutedigo geneacutetico a informaccedilatildeo necessaacuteria para o
desenvolvimento da resistecircncia a resistecircncia da bacteacuteria soacute eacute desenvolvida caso a
bacteacuteria entre em contato com o antibacteriano desencadeando todo o processo
nos casos de resistecircncia induzida comuns em KPC (MOREIRA et al 2014)
A resistecircncia bacteriana pode ser apresentada de forma intriacutenseca ou
adquirida A resistecircncia intriacutenseca faz parte das caracteriacutesticas fenotiacutepicas naturais
do microrganismo ou seja faz parte de sua heranccedila geneacutetica sendo transmitida
verticalmente a prole sem perda da caracteriacutestica A presenccedila ou ausecircncia do alvo
para a accedilatildeo da droga eacute o principal determinante deste tipo de resistecircncia
(MOREIRA et al 2014) Essa resistecircncia corresponde a uma caracteriacutestica de
espeacutecie bacteriana quando estes microrganismos satildeo naturalmente resistentes a
certo tipo de antibioacutetico Este processo eacute decorrente da ausecircncia de estruturas de
atuaccedilatildeo de antimicrobianos ou a impermeabilidade por parte de estruturas
perifeacutericas das bacteacuterias (HENRIQUE et al 2014)
24
A resistecircncia adquirida aos antibioacuteticos por sua vez ocorre quando haacute uma
da mutaccedilatildeo de genes reguladores ou estruturais aquisiccedilatildeo de genes de resistecircncia
veiculados por elementos geneacuteticos moacuteveis ou da combinaccedilatildeo entre eles Este
aparecimento de resistecircncia em uma espeacutecie bacteriana era anteriormente sensiacutevel
a droga e devido a um destes fatores se torna resistente O fenoacutetipo resultante
desta resistecircncia natildeo estaraacute presente nas ceacutelulas genitoras e sim nos indiviacuteduos de
uma linhagem bacteriana derivada de um organismo susceptiacutevel Os genes muitas
vezes satildeo adquiridos por meio de elementos moacuteveis como plasmiacutedeos e
transposons (MOREIRA et al 2014)
Entatildeo a resistecircncia adquirida ocorre por diversos mecanismos geneacuteticos tais
como produccedilatildeo de enzimas inativadoras interferecircncia com a entrada e acuacutemulo de
droga na bacteacuteria alteraccedilatildeo do receptor para accedilatildeo da droga via metaboacutelica
alternativa Eacute originada por meio de uma alteraccedilatildeo a niacutevel geneacutetico da ceacutelula de
natureza cromossocircmica pelos processos de mutaccedilatildeo transduccedilatildeo e transformaccedilatildeo
ou extra cromossocircmica (plasmidial) (HENRIQUE et al 2014)
Como todo antibioacutetico β-lactacircmicoos carbapenecircmicos tem como mecanismo
de accedilatildeo a inibiccedilatildeo da siacutentese proteacuteica atraveacutes da accedilatildeo de inibiccedilatildeo da parede
microbiana fazendo a ligaccedilatildeo e inativaccedilatildeo das proteiacutenas ligadoras de penicilinas
(NETO et al 2007)
Imipenem e meropenem antibioacuteticos pertencentes ao grupo dos
carbapenecircmicos possuem um amplo espectro de accedilatildeo in vitro incluindo atividade
contra cocos gram-positivos bacilos gram-negativos e bacteacuterias anaeroacutebias (MOHR
2008) Jaacute o ertapenem possui um espectro de accedilatildeo mais limitado que o os dois
antibioacuteticos anteriormente citados tendo uma eficiecircncia limitada contra os bacilos
gram-negativos natildeo fermentadores Um novo antibioacutetico carbapenecircmico ainda natildeo
disponiacutevel no Brasil doripenem possui uma atividade mais potente principalmente
contra Pseudomona aeruginosa devido ao seu mecanismo de accedilatildeo que combina os
espectros de accedilatildeo de imipenem e meropenem (ZHANEL et al 2007)
Devido as suas estabilidades espectro de accedilatildeo poucos relatos de
resistecircncia boa toleracircncia pelos pacientes com efeitos adversos mais comuns as
complicaccedilotildees no siacutetio da infusatildeo e toxicidade gastrintestinal estes antibioacuteticos
carbapenecircmicos tecircm sido considerados terapia de escolha (NICOLAU 2008) Como
25
uma resposta adaptativa das Enterobacteacuterias o iacutendice de resistecircncia aos
carbapenecircmicos tem aumentado nos uacuteltimos anos de forma proporcional ao seu
uso limitando imensamente as opccedilotildees terapecircuticas para as infecccedilotildees causadas por
estes microrganismos (FALAGAS et al 2009)
As enzimas produtoras de betalactamases hidrolisam o anel betalactacircmico
tornando este mecanismo de resistecircncia o mais importante Os dois grupos mais
preocupantes satildeo o grupo das betalactamases de aspecto ampliado e os da
carbapenemases que aleacutem de hidrolizar os carbapenecircmicos hidrolizam todas as
outras classes de betalactacircmicos Em enterobacteacuterias as carbapenemases mais
prevalentes satildeo codificadas por genes dos grupos blaKpc blaIMP blaVIM blaNdm
e blaOxa A ocorrecircncia de carbapenemases eacute mais frequentemente em bacteacuterias
gram-negativas fermentadoras da glicose conhecidas como enterobacteacuterias
predominantes nos gecircneros Klebsiella Serratia Citrobacter Enterobacter
Escherichia Samonella Proteus Morganella Podem ser encontradas tambeacutem em
bacteacuterias gram-negativas natildeo fermentadoras como espeacutecies de Acinetobacter e de
Pseudomonas (ALVES et al 2013)
Carbapenemases satildeo enzimas plasmiacutedio-mediados resistentes a todos
antibioacuteticos betalactacircmicos As bacteacuterias que possuem o gene blaKpC responsaacutevel
pela codificaccedilatildeo da produccedilatildeo de carbapenemases apresentam resistecircncia aos
antibioacuteticos betalactacircmicos impedindo a accedilatildeo destes antibioacuteticos contra infecccedilotildees
(ALVES et al 2013)
A transmissatildeo das carbapenemases a diferentes cepas de enterobacteacuterias se
daacute atraveacutes de plasmiacutedeos que satildeo pequenas moleacuteculas circulares de DNA com a
capacidade de se replicarem independentemente do DNA cromossocircmico
permitindo a troca de material geneacutetico entre gecircneros e espeacutecies diferentes de
enterobacteacuterias O raacutepido desenvolvimento de surtos em ambientes hospitalares eacute
explicado por essa disseminaccedilatildeo plasmidial (COTRIM et al 2012)
De acordo com o criteacuterio de interpretaccedilatildeo do Clinical and Laboratory
Standards Institute (CLSI 2009) a maioria das KPC isoladas natildeo apresenta
resistecircncia completa aos carbapenecircmicos (Imipenem e Meropenem apresentam
uma Concentraccedilatildeo Inibitoacuteria Miacutenima (CIM) de 2-8 μgmL) (COTRIM et al 2012)
26
Os mecanismos de resistecircncia capazes de impedir a accedilatildeo dos
carbapenecircmicos satildeo vaacuterios Poreacutem a degradaccedilatildeo de antibioacuteticos por enzimas
principalmente as carbapenemases constituem o principal mecanismo de
resistecircncia aos antibioacuteticos β-lactacircmicos (DIAS 2009) Devido a ampla atividade
hidroliacutetica agrave maioria dos antibioacuteticos β-lactacircmicos estes grupos de enzimas possuem
alta versatilidade (QUEENAM et al 2007)
Existem trecircs grandes classes moleculares de Ambler a qual as
carbapenemases pertencem denominadas classe A (serino-carbapenemases os
quais incluem membros designados SME IMI NMC GES e a famiacutelia das KPCs)
classe B(as metalo-β-lactamase incluem os tipos IMP e VIM) e classe D
(oxacilinases similares as da classe A e incluem as OXA e PSE) (DIAS 2009)
Dentre estes as mais importantes e prevalentes encontradas em plasmiacutedeos
de Klebsiella pneumoniae satildeo as KPC (DIENSTMANN et al 2010) Por meio de
estudos moleculares a enzima KPC jaacute foi documentada em diferentes bacteacuterias e
diferenciada em KPC-1 a 13 (NETIKUL et al 2011) No ano de 2009 foi realizada
uma pesquisa onde descreveram as seguintes carbapenemases KPC-1 em isolados
de Klebsiella pneumoniae KPC-2 em K pneumoniae K oxytoca Salmonella
enterica e em Enterobacter sp e KPC-3 em K pneumoniae e Enterobacter cloacae
(MONTEIRO et al 2009) As enzimas KPC-4 e KPC-5 foram encontradas em
isolados de Pseudomonas aeruginosa (PEIRANO et al 2009)
Foi observada uma correccedilatildeo da sequumlecircncia KPC-1 indicando que o gene
blaKPC-1 e blaKPC-2 satildeo idecircnticos Trecircs novas variantes blaKPC-3 blaKPC-4 e
blaKPC-5 satildeo resultados de mutaccedilotildees do gene estrutural da enzima KPC-2
(WOLTER et al 2008) apresentando diferentes perfis de hidroacutelise As enzimas
KPC-2 e KPC-3 possuem alta eficiecircncia em hidrolisar cefalotina cefaloridina e
nitrocefin poreacutem possuem uma menor eficiecircncia contra carbapenecircmicos e
cefotaxima (ALBA et al 2005) As enzimas KPC-5 e KPC-4 apresentam menor
hidroacutelise de carbapenecircmicos eacute do que em KPC-2 Em contrapartida possuem
melhor eficiecircncia contra ceftazidima e uma maior inibiccedilatildeo pelo aacutecido clavulacircnico
(WOLTER et al 2008)
27
13 Anaacutelise geneacutetica de microrganismos
Eacute de extrema importacircncia praacutetica natildeo soacute no aspecto cliacutenico mas tambeacutem na
fitopatologia biotecnologia e estudos ambientais a correta identificaccedilatildeo e
classificaccedilatildeo de microrganismos Os meacutetodos usados na diferenciaccedilatildeo de gecircneros
espeacutecies e estirpes de microrganismos podem ser divididos em meacutetodos fenotiacutepicos
(baseados em fenocircmenos bioquiacutemicos fisioloacutegicos e bioloacutegicos) e genotiacutepicos
(detectam polimorfismos ao niacutevel dos aacutecidos nucleacuteicos ou variaccedilatildeo aleacutelica ao niacutevel
de enzimas) (ALVES et al 2003)
Para este tipo de estudo existem alguns meacutetodos como o RFLPrsquos -
ldquoRestriction Fragment Length Polymorphismsrdquo (polimorfismos de tamanho de
fragmentos de restriccedilatildeo) rep-PCR (Meacutetodo de tipagem baseado na amplificaccedilatildeo via
PCR de elementos de DNA repetitivos presentes em genomas bacterianos) anaacutelise
de sequumlecircncias nucleotiacutedeas (discriminaccedilatildeo eou identificaccedilatildeo atraveacutes de sequumlecircncias
de DNA) PFGE - Pulsed-Field Gel Electrophoresis (Eletroforese em campo
pulsado) ( A L V E S et al 2003)
A diferenciaccedilatildeo clara da cepa e principalmente a alta reprodutibilidade devem
ser caracteriacutesticas de qualquer meacutetodo de tipagem geneacutetica Poreacutem nem todos os
meacutetodos moleculares de tipagem satildeo igualmente eficazes Sendo assim de acordo
com a finalidade pretendida (identificaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo custo reprodutibilidade
etc) eacute feita a escolha do meacutetodo a ser aplicado (A L V E S et al 2003)
O processo de identificaccedilatildeo fenotiacutepica de KPC entre os membros da famiacutelia
Enterobacteriaceae ainda eacute difiacutecil e os meacutetodos para a sua identificaccedilatildeo devem ser
revistos e ajustados Mesmo com o avanccedilo tecnoloacutegico natildeo existem ensaios que
combinam alta especificidade e sensibilidade na detecccedilatildeo destas enzimas Satildeo
diversas as metodologias usadas para rastreamento de KPC como por exemplo a
focalizaccedilatildeo isoeleacutetrica a teacutecnica de disco-difusatildeo E-test teste de Hodge
modificado dentre outros Aleacutem disso a pesquisa do gene blaKPC pode ser feita
pela Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) Os sistemas de automaccedilatildeo
existentes no entanto podem natildeo identificar com precisatildeo os isolados KPC
positivos (COTRIM et al 2012)
A identificaccedilatildeo blaKPC pelo PCR eacute um meacutetodo raacutepido preciso sensiacutevel e
altamente especiacutefico no entanto a PCR exige equipamento e conhecimentos
28
especializados em diagnoacutestico molecular dificultando ainda a utilizaccedilatildeo dele na
rotina dos laboratoacuterios de microbiologia (COTRIM et al 2012)
Em estudo de infecccedilotildees hospitalares identificaccedilatildeo molecular de patoacutegenos
bacterianos eacute bastante utilizada Para diferenciar carbapenemases tipo KPC a partir
de outros tipos como SME NMC-A-IMI e GES eacute necessaacuterio um exame molecular
As identificaccedilotildees do microrganismo juntamente com a triagem molecular iratildeo definir
um resultado mais especiacutefico podendo ser usado para identificar o antibioacutetico mais
adequado para o tratamento Poreacutem a principal desvantagem de alguns exames
baseados em PCR por exemplo eacute que devido agrave sua limitada capacidade de
multiplexaccedilatildeo eles distinguem apenas algumas variaccedilotildees (MOREIRA et al 2014)
Estatildeo descritas para a identificaccedilatildeo molecular de patoacutegenos pertencentes agrave
famiacutelia Enterobacteriaceae as teacutecnicas de PFGE RAPD (randomly amplified
polymorphic DNA) e ERIC-PCR (Enterobacterial Repet it ive Intergenic Consensus)
A PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) eacute considerada padratildeo ouro devido sua
alta capacidade de diferenciaccedilatildeo baseada na anaacutelise do perfil de restriccedilatildeo do DNA
genocircmico por meio de eletroforese Como desvantagem para a sua execuccedilatildeo eacute
necessaacuterios vaacuterios dias impedindo a tipagem de algumas cepas bacterianas devido
agrave degradaccedilatildeo do DNA aleacutem do alto custo empregado (MOREIRA et al 2014)
O meacutetodo baseado em ERIC-PCR tem sido bastante utilizado como uma
alternativa para a teacutecnica de PFGE Esta teacutecnica consiste na anaacutelise do padratildeo de
amplificaccedilatildeo de elementos repetidos encontrados no genoma bacteriano Isto
permite uma maior rapidez na obtenccedilatildeo de resultados quando comparada com o
PFGE aleacutem de alta reprodutibilidade simples execuccedilatildeo e implementaccedilatildeo baixo
custo e natildeo sem problemas com a degradaccedilatildeo do DNA (MOREIRA et al 2014)
A PCR eacute considerada uma teacutecnica de biologia molecular revolucionaacuteria que
consiste na siacutentese enzimaacutetica de coacutepias de aacutecidos nucleacuteicos Ela permitiu o raacutepido
desenvolvimento do estudo de sequumlecircncias de aacutecidos nucleacuteico Foi desenvolvida por
Kary Banks Mullis que ganhou o precircmio Nobel de quiacutemica de 1993 devido ao
desenvolvimento dessa teacutecnica em abril de 1983 (CAMARGO et al 2014)
Por meio de etapas de variaccedilatildeo de temperatura a teacutecnica de PCR promove a
duplicaccedilatildeo de cadeias de DNA in vitro A reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo de DNA por PCR
envolve o emprego de sequumlecircncias iniciadoras (primers) quatro nucleotiacutedeos
29
(dNTPrsquos) do DNA e uma DNA polimerase termoestaacutevel podendo assim obter-se a
partir de uma fita molde muitas coacutepias de uma sequumlecircncia especiacutefica de aacutecido
nucleacuteico O princiacutepio da PCR consiste na variaccedilatildeo de temperatura por ciclo
envolvendo trecircs etapas baacutesicas desnaturaccedilatildeo pareamento e amplificaccedilatildeo
(CAMARGO et al 2014)
A desnaturaccedilatildeo da fita molde de DNA eacute uma etapa com duraccedilatildeo entre 30
segundos a 1 minuto a temperatura entre 92 ordmC a 96 ordmC Apoacutes isso o pareamento de
dois iniciadores sinteacuteticos de composiccedilotildees distintas que funcionam como os
iniciadores da reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo liga-se agrave regiatildeo complementar da fita de
DNA alvo que sofreraacute a duplicaccedilatildeo Esta etapa tem duraccedilatildeo de 30 segundos a 1
minuto a temperatura entre 58 ordmC e 65 ordmC Por uacuteltimo a amplificaccedilatildeo por meio da
enzima Taq DNA polimerase das novas fitas de DNA se daacute a partir de cada um dos
iniciadores utilizando os quatro dNTPrsquos como substrato da reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo
Esta etapa possui duraccedilatildeo entre 45 segundos e 1 minuto a 72 ordmC Cada ciclo eacute
repetido em torno de 30 a 35 vezes e promove a amplificaccedilatildeo da regiatildeo alvo
determinada conforme o anelamento dos iniciadores sinteacuteticos de DNA (CAMARGO
et al 2014) Estas etapas estatildeo demonstradas na figura 4
Figura 4 Etapas da Reaccedilatildeo de PCR
30
2 JUSTIFICATIVA
No ano de 2010 no Distrito Federal foram identificados 111 pacientes com
suspeita de infecccedilatildeo por Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) e a
Secretaria de Sauacutede do Distrito Federal confirmaram ainda a morte de 18 pacientes
dentre os hospitais puacuteblicos e particulares Um desafio encontrado por ocasiatildeo do
surto infeccioso no Distrito Federal foi o de confirmar as KPCs por Reaccedilatildeo da
Polimerase em Cadeia sendo que as amostras foram enviadas com esta finalidade
para a Fiocruz no Rio de Janeiro
Pesquisas que possam contribuir na elaboraccedilatildeo de estrateacutegias preventivas e
de intervenccedilatildeo para infecccedilotildees causadas por enterobacteacuterias bem como contribuir
para gerar uma integraccedilatildeo beneacutefica entre a equipe acadecircmica e os serviccedilos de
sauacutede devem ser estimuladas Neste sentido o presente estudo permitiu escrutinar
os genes envolvidos na expressatildeo de carbapenemases presentes em espeacutecies de
enterobacteacuterias isoladas em ambiente hospitalar visto que elucidar genes de
resistecircncia de enterobacteacuterias aos antibioacuteticos carbapenecircmicos eacute o primeiro passo
para garantir um controle epidemioloacutegico efetivo para estes tipos de microorganismo
assim como sua associaccedilatildeo com surtos fatais particularmente em pacientes com
baixa imunidade
31
3 OBJETIVOS
31 Objetivo geral Caracterizar os genes de resistecircncia das
Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases e os aspectos epidemioloacutegicos de
pacientes internados em um hospital puacuteblico do Distrito Federal
32 Objetivos Especiacuteficos
Identificar genotipicamente a enzima KPC (Klebsiella pneumoniae
carbapenemase) de isolados de Klebsiella pneumoniae
Investigar aspectos epidemioloacutegicos dos pacientes portadores de
Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases
Identificar quais variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana influenciaram para o
desfecho oacutebito ou alta
Avaliar a susceptibilidade das Enterobacteacuterias aos antibioacuteticos
carbapenecircmicos dos pacientes em ambiente hospitalar
32
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
Trata-se de um estudo transversal onde foi realizado o teste de
susceptibilidade das enterobacteacuterias aos antibioacuteticos carbapenecircmicos a partir dos
materiais bioloacutegicos coletados dos pacientes internados no Hospital Regional da Asa
Norte (HRAN) e enviados ao Laboratoacuterio de Anaacutelises Cliacutenicas da mesma Instituiccedilatildeo
Os materiais bioloacutegicos investigados foram sangue aspirado traqueal ou brocircnquico
urina e cultura semi quantitativa de ponta de cateter venoso central O HRAN eacute um
hospital puacuteblico do Distrito Federal com 395 leitos sendo as cliacutenicas de internaccedilatildeo
Berccedilaacuterio Cirurgia Geral Cirurgia Plaacutestica Cliacutenica Meacutedica Ginecologia Maternidade
Pediatria Queimados UTI com atendimento a pacientes portadores de doenccedilas de
caraacuteter cliacutenico e ciruacutergico
4 1 Coleta e transporte das amostras bioloacutegicas
As amostras foram coletadas de pacientes internados no Hospital Regional da
Asa Norte (HRAN) com suspeitas de infecccedilatildeo por KPC A identificaccedilatildeo primaacuteria foi
realizada pelo Laboratoacuterio de Microbiologia do hospital de origem dos pacientes e os
demais procedimentos que foram utilizados na identificaccedilatildeo encontram-se descritos
abaixo
4 2 Procedimentos para confirmaccedilatildeo de resistecircncia bacteriana por
disco de ertapenem (adaptado CDC 2004)
Para diagnosticar amostra como portadora de bacteacuteria produtora de
carbapenemase foi realizado o teste com disco de ertapenem como forma de
triagem Inicialmente utilizou-se o swab contaminado com a amostra que foi
distribuiacuteda em uma pequena aacuterea da placa de aacutegar MacConkey para apoacutes o
crescimento ser realizada a pesquisa de colonizaccedilatildeo por enterobacteacuterias resistentes
aos carbapenecircmicos (Pesquisa de CRE) Procedeu-se a semeadura por teacutecnica
semi-quantitativaesgotamento com alccedila bacterioloacutegica na diluiccedilatildeo de 1100 O disco
de Ertapenem foi colocado na superfiacutecie da placa de MacConkey na junccedilatildeo dos dois
primeiros campos de semeadura conforme demonstrado na figura 5 Incubou a placa
33
em estufa aeroacutebia a 35ordmC por 24 e 48 horas e observou-se o halo de difusatildeo do
disco de Ertapenem na placa para proceder agrave leitura
O teste deixou de ser obrigatoacuterio apoacutes a modificaccedilatildeo dos criteacuterios
interpretativos para carbapenecircmicos para enterobacteacuterias publicados no suplemento
do CLSI 2010 M100-S20-U
Figura 5 Mecanismo de semeamento de material bioloacutegico oriundos de
pacientes com suspeita de infecccedilatildeo por KPC Fonte adaptado CDC 2004
4 2 1 Interpretaccedilatildeo dos resultados
Na ausecircncia de crescimento ateacute 24 horas (MacConkey) ou halo de difusatildeo
gt27 mm na placa deve-se reincubar as placas por mais 24 horas Quando for
ausente o crescimento apoacutes 48 horas ou halo de difusatildeo gt27 mm na placa libera-se
como enterobacteacuterias resistentes a carbapenecircmicos (KPCNEG)Havendo
crescimento de colocircnias na placa de MacConkey com halo lt 27 mm (apenas para
colocircnias com crescimento dentro do halo) deve-se reisolar e realizar identificaccedilatildeo e
antibiograma automatizado teste de sensibilidade por disco-difusatildeo e Teste de
Hodge Modificado (THM) Os isolados de enterobacteacuterias cujos testes comprovarem
a resistecircncia aos carbapanecircmicos testados (KPCPOS) foram reportado a Comissatildeo
de Controle de Infecccedilatildeo Hospitalar (CCIH) Jaacute osbacilos Gram-negativos natildeo
fermentadores natildeo foram reportados (KPCNEG) Para interpretaccedilatildeodos resultados
foram utilizados os valores conforme demonstrados na tabela 1
Tabela 1 Criteacuterios Interpretativos para testes de sensibilidade
ENTEROBACTEacuteRIAS
Disco difusatildeo (mm) MIC (microgml)
34
Antibioacutetico Sigla S I R S I R
Ertapenem 10
microg
ETP 22 19-
21
18 05 1 2
Meropenem 10
microg
MEM 23 20-
22
19 1 2 4
Fonte Manual Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)
2013
Os resultados que apresentaram resistecircncia ao antibioacutetico Ertapenem foram
considerados como suspeitos de contaminaccedilatildeo por KPC Fez-se o teste de
susceptibilidade aos antibioacuteticos (TSA) em aparelho automatizado MicroScan Walk
Away 96sl Dade Behring
4 3 Teste de susceptibilidade aos antibioacuteticos (adaptado CDC 2004)
A determinaccedilatildeo da susceptibilidade dos isolados foi feita pelo teste de
susceptibilidade aos antibioacuteticos (TSA) apoacutes cultura em meio de gelose simples
(INSA) para avaliaccedilatildeo da sua pureza e obtenccedilatildeo de colocircnias isoladas Para
preparaccedilatildeo de uma suspensatildeo bacteriana com turvaccedilatildeo aproximada de 05
McFarland (Dade BehringMicroScanregTurbidity Meter) ressuspendeu duas a cinco
colocircnias em 2ml de soro fisioloacutegico esteacuteril diluindo a 1100 em soro fisioloacutegico num
volume total de 10ml em seguida foi feita uma semeadura em duas placas
quadradas (120mm x 120mm) de Muller-Hinton Agar (INSA) por inundaccedilatildeo
Os discos de antibioacutetico carbapenecircmicos imipenem meropenem e
ertapenem (Biorad) foram aplicados com o auxiacutelio de um dispensador automaacutetico A
susceptibilidade das Enterobacteacuterias aos carbapenecircmicos foi definida de acordo
com o protocolo Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI 2011)
Para aquelas Enterobacteacuterias que apresentaram resistecircncia ao ertapenem
foram realizados o Teste de Hodge Modificado para Detecccedilatildeo de Enterobacteacuterias
Produtoras de Carbapenemases conforme descrito pelo Centers for Disease Control
and Prevention (CDC 2004)
35
4 4Teste de Hodge Modificado (THM) (adaptado CDC 2004)
Preparou-se uma suspensatildeo em salina esteacuteril com a cepa Escherichia coli
ATCC 25922 (padratildeo 05 de McFarland) Apoacutes isto diluiu a suspensatildeo 110 em
salina (05 ml da soluccedilatildeo de Ecoli ATCC 25922 + 45 ml salina)Foi entatildeo semeado
na superfiacutecie de uma placa de Agar Muller-Hinton com a suspensatildeo diluiacuteda de Ecoli
ATCC 25922 com auxilio de swab seco assegurando que houvesse uma
distribuiccedilatildeo uniforme cobrindo toda a superfiacutecie do Agar Deixou secar por 3 a 5
minutos em temperatura ambienteColocou-se o disco de ertapenem 10microg no centro
da placa e apoacutes isto fez-se uma estria linear da cepa a ser testada da borda do
disco ateacute a borda da placa utilizando uma alccedila calibrada 10 microl ou um swab Incubou
a placa na estufa em atmosfera aeroacutebia a 35 plusmn 2ordmC por 16 a 24 horas
441 Controle de qualidade (CQ)
Foi utilizado um CQ todos os dias em que se realizou o teste tendo como
controle Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1705- teste de Hodge modificado
positivo Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1706- teste de Hodge modificado
negativo
442 InterpretaccedilatildeoResultados
Apoacutes 16ndash24 horas de incubaccedilatildeo examinar as placas para verificar a presenccedila
de uma distorccedilatildeo no halo de inibiccedilatildeo do disco de ertapenem devido ao crescimento
realccedilado da cepa ATCC na intersecccedilatildeo do organismo teste e a Ecoli ATCC 25922
dentro dos limites do halo O THM positivo apresentaraacute presenccedila de distorccedilatildeo no
halo de inibiccedilatildeo de ertapenem devido ao crescimento da cepa Ecoli ATCC 25922 ao
longo da estria da cepa teste para dentro dos limites do halo de inibiccedilatildeo Jaacute o THM
negativo teraacute ausecircncia de crescimento da cepa Ecoli ATCC 5922 ao longo da estria
da cepa teste para dentro dos limites do halo de inibiccedilatildeo do disco de ertapenem
Este resultado estaacute representado na figura 6
36
Figura 6 Interpretaccedilatildeo resultado do Teste de Hodge Modificado
(adaptado CDC 2004) Teste positivo na estria da cepa teste na parte superior
da placa teste negativo na estria da cepa teste na parte inferior da placa
Tendo positivo como resultado o paciente era um provaacutevel contaminado por
KPC As amostras entatildeo foram encaminhadas para a Fundaccedilatildeo Osvaldo Cruz
(FIOCRUZ) para confirmaccedilatildeo final As amostras finalmente confirmadas como
positivas para KPC foram isoladas e guardadas no banco de cepas cliacutenicas do
hospital Apoacutes a autorizaccedilatildeo do CEP amostras das cepas foram transferidas para
meio de transporte Stuard em caixa teacutermica fechada em baixa temperatura e
levadas para o laboratoacuterio de microbiologia cliacutenica da universidade
No laboratoacuterio da universidade as amostras foram separadas e realizadas
repiques em meios MacConkey e incubadas por 24h As colocircnias caracteriacutesticas
foratildeo isoladas em caldo BHI e mantidas em shaker a 37oC por 2h Apoacutes isto foram
executadas as anaacutelises a seguir
Os isolados de Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases foram
submetidos agrave extraccedilatildeo de DNA e posterior sequumlenciamento para identificaccedilatildeo dos
genes de resistecircncia blaKPC de 1 a 13 e identificaccedilatildeo do gene universal Os
pacientes de onde os materiais bioloacutegicos contendo as Enterobacteacuterias produtoras
de carbapenemases foram os isolados foram investigados quanto aos aspectos
epidemioloacutegicos e cliacutenicos
37
4 5 Extraccedilatildeo de DNA bacteriano
A extraccedilatildeo de DNA bacteriano foi realizada utilizando o kit NucleoSpin
Plasmidreg (MN) Antes de iniciar a extraccedilatildeo foi feito a preparaccedilatildeo das soluccedilotildees
reagentes materiais e amostras (vortexando) colocou-se em banho-maria agrave 50ordmC o
tampatildeo AW Partiu-se de colocircnias isoladas cultivadas que sofreram passagem em
meio LB liacutequido por 12h Adicionou-se 15 mL da amostra no tubo eppendorf
centrifugou por 5 minutos descartou o sobrenadante (com cuidado para natildeo
descartar o Pellet) Repetiu-se este procedimento por mais trecircs vezes completando-
se o volume de 6mL Foram adicionados 250microL do tampatildeo Resuspension Buffer A1
encostando a ponteira no Pellet e misturando (este tampatildeo tem como funccedilatildeo
separar a formaccedilatildeo de grumos celulares) Apoacutes isso homogeneizou e vortexou os
tubos eppendorfs Apoacutes isso foram adicionados 250microL do tampatildeo Lysis Buffer A2
homogenizou e deixou descansar por 5 minutos (esta etapa eacute importante para a lise
da parede e da membrana celulares e liberaccedilatildeo do conteuacutedo da ceacutelula)
Passado o tempo de descanso foi adicionado 300microL do tampatildeo
Neutralization Buffer A3 homogeneizou e centrifugou por 10 minutos (este tampatildeo
iraacute retirar as proteiacutenas que envolvem o DNA e voltaraacute com o pH para proacuteximo de 8
impedindo que a soluccedilatildeo de lise facilite a quebra das ligaccedilotildees covalentes do aacutecido
nucleacuteico) Em seguida enumeraram-se os tubos contendo filtros com siacutelica
transferiu-se o sobrenadante para o filtro e centrifugou por 5 minutos Descartou-se
o que foi filtrado adicionou 500microL do tampatildeo AW (banho-maria) centrifugou por 2
minutos Novamente foi descartado o filtrado Adicionou-se 600microL do tampatildeo A4
centrifugou por 2 minutos e descartou o filtrado (os tampotildees AW e A4 contecircm
isotiocianato de guanidina em concentraccedilotildees crescentes para facilitar a adsorccedilatildeo
do DNA na siacutelica e retirada das outras biomoleacuteculas da amostra) Foi feita outra
centrifugaccedilatildeo com o tubo vazio Apoacutes isto o filtro foi trocado para outro eppendorf
definitivo onde foi adicionado 50microL do tampatildeo Elution Buffer AE (este tampatildeo
favorece a eluiccedilatildeo do DNA) centrifugou por 2 minutos descartou o filtro e
armazenou as amostras em freezer -20ordmC
38
4 6 Iniciadores e reaccedilatildeo de PCR
Os iniciadores universais para o gene blaKPC foram desenhados baseados
em sequumlecircncias conservadas apresentadas pelos sub-grupos de genes que
codificam a enzima carbapenemase de klebsiella pneumoniae (YIGIT et al 2001)
Baseado na sequumlecircncia para o blakpc-1 depositada no GenBank
(AF2975541) o oligonucleotiacutedio (oligo) iniciador direto (5-
ATGTCACTGTATCGCCGTC-3rsquo) foi desenhado para reconhecer a sequumlecircncia
blaKPC na posiccedilatildeo (131149) enquanto que o iniciador reverso (5-
TTACTGCCCGTTGACGCC-3rsquo) foi reconhecido na posiccedilatildeo (9951012) As anaacutelises
baseadas em alinhamento de sequumlecircncias mostraram que o par de iniciadores
blaKPC podem detectar os alelos de 1 a 13 do gene blaKPC conforme a tabela 2
Tabela 2 Nuacutemero de acesso ao GenBank dos alelos blaKPC e seus
microrganismos originais
Nuacutemero de
Acesso GenBank
Microrganismo Alvo
AF2975541 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-1
GU0862251 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-2
HQ2589341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-2-like
AB5577341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC -3
EU4473041 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-4
EU4002222 Pseudomonas
aeruginosa
blaKPC-5
EU5555341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-6
EU7297271 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-7
39
FJ2344121 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-8
FJ624872 Escherichia coli blaKPC-9
GQ1403481 Acinetobacter
baumannii
blaKPC-10
HM0669951 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-11
HQ3428891 Enterobacter cloacae blaKPC-12
HQ3428901 Enterobacter cloacae blaKPC-13
As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo de blaKPC foram realizadas em um
primeiro tempo de desnaturaccedilatildeo em que foi 94ordmC por 5 minutos seguido de 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 58 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 90 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 78ordmC por 8 minutos Aleacutem das amostras foi utilizado um
controle negativo
A PCR do blaKPC foi realizada utilizando os componentes para o volume da
reaccedilatildeo de 25 microL citados na tabela 3 A banda do tamanho do produto de PCR foi de
881 pares de bases (pb) o que corresponde ao plasmiacutedeo
Tabela 3 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do
gene blaKPC
Reagente Volume
DNA molde 4 microL
Tampatildeo Taq 25 microL
MgCl2 075 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP
2 microL
Oligo F 1 microL
Oligo R 1 microL
Taq DNA polimerase 05 microL
Aacutegua MiliQ 1335 microL
40
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
Baseado na sequumlecircncia para o gene 16S rRNA em que o oligonucleotiacutedio
Universal iniciador direto foward (5-CCAGCAGCCGCCGTAATACG-3rsquo) foi
desenhado para reconhecer a sequumlecircncia universal na posiccedilatildeo 1513 enquanto que o
iniciador reverso (5-ATCGGYTACCTTGTTACGACTTC-3rsquo) foi reconhecido na
posiccedilatildeo 1491 foram realizadas PCRrsquos As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo deste
gene foram realizadas nos seguinte tempos separaccedilatildeo 94ordmC por 10 minutos 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 55 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 120 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 72ordmC por 10 minutos
A PCR do gene 16S rRNA foi realizada utilizando os componentes para o
volume da reaccedilatildeo de 25microL citados na tabela 4 A banda do tamanho do produto de
PCR foi de 996 pb correspondente aacute regiatildeo ribossomal capaz de amplificar todas
as espeacutecies
Tabela 4Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do gene
universal
Reagente (quantidade
concentraccedilatildeo do estoque)
Volume
DNA molde 10 ng 4 microL
Tampatildeo Taq 10 x 25 microL
MgCl2 50mM 125 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP 25 mM
125 microL
Oligo F 10microM 05 microL
Oligo R 10microM 05 microL
Taq DNA polimerase 5UmicroL 04 microL
Aacutegua Miliq 146 microL
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
41
O termociclador utilizado para os experimentos foi o LifeTouch da BIOER
4 7 Digestatildeo
Para realizaccedilatildeo da digestatildeo foi utilizada a enzima BshF I (Hae III) EN- 1105
tamanho 7000 units concentraccedilatildeo 10 unitsmicroL fonte Bacillus sphaericus empresa
Jena bioscienceUtilizaram-se os componentes para o volume de 50microL da reaccedilatildeo
citados na tabela 5
Tabela 5 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da digestatildeo do gene
universal
Reagente Volume
Produto de PCR 10 microL
Enzima BshF I 01 microL
Tampatildeo (10x) 5 microL
Aacutegua Miliq 349 microL
Total (em cada ependorff) 50 microL
Valores para 1 digestatildeo
Os ependorffs foram colocados por 30 minutos em banho-maria a 37ordmC Apoacutes
isso fez-se a corrida das amostras em gel de agarose para verificaccedilatildeo do resultado
(LU et al 2000)
4 8 Eletroforese em gel de agarose
Os produtos de DNA PCR e digestatildeo foram analisados em gel de agarose
2 O tempo de corrida do gel eacute de aproximadamente 1hora e 30minutos sendo
que no comeccedilo foi usada agrave voltagem de 50 V e apoacutes comeccedilar a correr o gel
aumentou a voltagem para 100 v Utilizou-se o marcador de 100pb (pares de bases)
Foi adicionado 3microL de corante Bromophenol (que tem a funccedilatildeo de fazer uma ligaccedilatildeo
na amostra de DNA e permitir a visualizaccedilatildeo da corrida no gel de agarose) em 7microL
de amostra tanto de DNA quanto de PCR Para o preparo do gel foi utilizado TBE
42
(Tris- Aacutecido Boacuterico) agarose e brometo de etiacutedio (sua funccedilatildeo eacute de corante para o gel
e permitir a visualizaccedilatildeo do DNA quando colocado agrave luz ultravioleta) Para o oligo
blaKPC a banda da amplificaccedilatildeo foi em 881ppb correspondendo ao plasmiacutedeo Jaacute
o oligo Universal foi em 996 pb
4 9 Descarte de resiacuteduos
Todos os materiais utilizados nos ensaios foram de uso uacutenico e manipulados
em cacircmaras de seguranccedila bioloacutegica classe II Apoacutes o uso foram colocados em
soluccedilatildeo desinfetantes (hipoclorito a 1) e em seguida autoclavados a 127oC por 20
min em sacos apropriados para autoclavaccedilatildeo Apoacutes a finalizaccedilatildeo do ciclo de
esterilizaccedilatildeo os sacos contendo o material descartaacutevel foram colocados em
recipientes de coleta da empresa responsaacutevel pela coleta de materiais bioloacutegicos
produzidos no laboratoacuterio de microbiologia Todos os procedimentos seguiram a
normativa RDC-ANVISA 3062004 sobre o descarte de resiacuteduos de serviccedilo de
sauacutede
4 10 Aspectos epidemioloacutegicos e cliacutenicos
Os aspectos cliacutenicos e epidemioloacutegicos foram investigados por meio de
prontuaacuterios dos pacientes portadores de enterobacteacuterias produtoras de
carbapenemases e envolveram topografia mais provaacutevel do foco infeccioso a
enfermidade motivadora da internaccedilatildeo o desfecho cliacutenico a idade e o tempo de
internaccedilatildeo
4 12 Anaacutelises eepidemioloacutegicas
As anaacutelises foram realizadas com o pacote estatiacutestico SPSS versatildeo 200
Para verificar quais variaacuteveis referentes aos dados epidemioloacutegicos e
microbioloacutegicos influenciaram no desfecho verificou- se a diferenccedila meacutedia das
variaacuteveis idade e tempo de internaccedilatildeo em cada grupo O teste estatiacutestico utilizado foi
o teste t de Student apoacutes se executar o teste de normalidade de Shapiro-Wilk Para
as variaacuteveis sexo perfil microbioloacutegico das enterobacteacuterias produtoras de
43
carbapenemases foi avaliada a associaccedilatildeo com o desfecho por meio do teste Exato
de Fisher O niacutevel de significacircncia adotado foi de 5
4 13 Preceitos eacuteticos
Este projeto estaacute inserido em um projeto maior denominado ldquoEpidemiologia
cliacutenica e caracterizaccedilatildeo molecular do Acinetobacter Baumannii resistente a
antibioticoterapia em pacientes internado em hospitais do Sistema Uacutenico de Sauacutederdquo
que foi submetido ao Comitecirc de Eacutetica em Pesquisa da Secretaria do Estado de
Sauacutede do Distrito Federal (SESDF) e emitido parecer aprovado pelo protocolo nordm
23109 (anexo)
44
5 RESULTADOS
51 Anaacutelise molecular
Para a amplificaccedilatildeo com o oligo blaKPC foram amplificadas amostras
que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 881 pb correspondente ao
plasmiacutedeo A anaacutelise da amplificaccedilatildeo da regiatildeo do gene blaKPC mostrou que
apenas a amostra A10 natildeo amplificou isso demonstra que esta amostra natildeo
possuiacutea o gene de resistecircncia
5 1 1 Gene blaKPC
Figura 7 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 881 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
A amostra A3 natildeo amplificou no primeiro momento entatildeo foi realizado
novamente a PCR e corrida de gel obtendo entatildeo a amplificaccedilatildeo da amostra como
apresentado na figura 8
45
Figura 8 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC da
mostra A3 estudada A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo de 881
pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 1 2 Gene 16S rRNA
Para a amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA utilizou-se o oligo universal Foram
amplificadas amostras que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 996 pb
Figura 9 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
46
Segundo Lu et al (2000) a digestatildeo com a enzima HaeIII deste amplicons de
16S rRNA devolveriam bandas com perfis entre 150 a 200 pb No gel abaixo eacute
possiacutevel evidenciar que este perfil ocorreu com o predomiacutenio de bandas na altura
de 200pb
Figura 10 Gel de agarose a 2 da digestatildeo do amplicon do gene 16S
rRNA das amostras com a enzima HaeIII evidenciando diversos fragmentos
proacuteximos a 200 pb A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo ribossomal
de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 2 Anaacutelises epidemioloacutegicas
5 2 1 Sexo
No total foram detectados 17 isolados de KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 onde a maior a prevalecircncia foi
detecatada em amostras de pacientes do sexo masculino (53) do que no sexo
feminino (47)
47
Figura 11 Isolado de KPC segundo sexo dos 17 pacientes investigados
no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 2 Desfecho cliacutenico
Em 17 isolados de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo
de 2010 aacute 2011 a porcentagem de pacientes que foram a oacutebito (59) foi maior que
a de pacientes que tiverm alta (41)
Figura 12 Isolado de KPC segundo desfecho cliacutenico dos 17 pacientes
investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
48
5 2 3 Local da coleta
Dos 17 episoacutedios detectados de infecccedilatildeo por KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 a infecccedilatildeo em swab retalfoi mais
frequente (47) seguida de ponta de cateacuteter (18) e secreccedilatildeo traqueal (12)
Figura 13 Isolados de KPC segundo local da coleta da amostra nos 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 4 Microorganismo
O microorganismo mais encontrado foi a Klebsiella pneumoniae (82)
seguida da Enterobacter clocae (12) e Serratia marcescens (6) dos 17 isolados
de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 Isto afirma o
fato de a sigla KPC ser utilizada de forma errocircnea aacute Klebsiella pneumoniae visto
que a evidecircncia dela eacute maior em relaccedilatildeo as outras cepas
49
Figura 14 Isolado de KPC segundo microrganismo encontrado em 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 5 Relaccedilotildees variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana e desfecho
cliacutenico
Tabela 6 ndash Distribuiccedilatildeo do perfil geneacutetico sexo coleta tipificaccedilatildeo de
microrganismos e anaacutelise da resistecircncia bacteriana segundo o desfecho
cliacutenico Brasiacutelia-DF 2010 a 2011
Variaacutevel Resultado
Desfecho
Alta Oacutebito
N N P
Gene 16S rRNA Positivo 7 1000 10 1000
NA Gene blaKPC Positivo 6 857 10 1000
Negativo 1 143 0 00 0218 Sexo Feminino 2 286 6 600
Masculino 5 714 4 400 0201 Local da coleta Fundo saco de
Douglas 1 143 0 00
Hemocultura 0 00 1 100 0463 Ponta de cateter 1 143 2 200
Sec TraquealBrocircnquica
0 00 1 100
50
Secreccedilatildeo traqueal 2 286 0 00
Swab retal 3 429 5 500
Urina 0 00 1 100
Microrganismo Enterobacter cloacae (KPC)
1 143 1 100
Klebsiella pneumoniae
6 857 8 800
0416 Serratia
marcescens 0 00 1 100
Teste de Hodge Hodge positivo 7 1000 10 1000
NA Amicacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 1 100 0848 resistente 0 00 1 100
sensiacutevel 2 286 3 300
Amoxicilina Aacutecido Clavulacircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Ampicilina Sulbactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ampicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Aztreonan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefazolina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Cefoperazona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Cefotaxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefoxitina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0509 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 2 286 4 400
Ceftazidima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cetriaxona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 3 429 5 500 0772 Cefalotina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ciprofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772
51
resistente 3 429 5 500
Claritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Clindamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Eritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Gentamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0942 resistente 2 286 3 300
sensiacutevel 1 143 2 200
Imipenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 0 00 2 200 0193 Resistente 1 143 3 300
sensiacutevel 2 286 0 00
Nitrofurantoiacutena sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Norfloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Oxacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Penicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Piperacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Rifampicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tetraciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Ticarcilina Aacutecido Clavulocircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0688 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 3 429 4 400
Tobramicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Trimetoprima Sulfametoxazol
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0112 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 2 286 0 00
Vancomicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tigeciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediario 0 00 1 100 0211 natildeo testado 1 143 4 400
resistente 2 286 0 00
52
Cefepime sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefuroxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Levofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Piperacilina Tazobactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Ertapenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Meropenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0223 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 1 143 0 00
Cefotetan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 sensiacutevel 0 00 1 100
Gemifloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 7 700 0585 natildeo testado 3 429 3 300
Desfecho
Alta Oacutebito
Meacutedia Erro
padratildeo Meacutedia Erro
padratildeo p
Idade 58 9 59 5 0991
Tempo Internaccedilatildeo (dias)
50 13 46 12 0571
n= 17 p(lt 005) NA natildeo se aplica
53
6 DISCUSSAtildeO
Nos uacuteltimos anos houve um aumento na incidecircncia de bacteacuterias
multirresistentes aos antimicrobianos no ambiente hospitalar tornando isto um
problema mundial de sauacutede puacuteblica (HULSCHER et al 2010) Quando se trata
principalmente de bacilos Gram negativos a frequumlecircncia destas bacteacuterias eacute ainda
maior em paiacuteses da Ameacuterica Latina quando comparada a paiacuteses desenvolvidos
(GALES etal 2012)
De acordo com dados do ldquoMeropenem Yearly Susceptibility Test Information
Collectionrdquo (MYSTIC) ocorreu nos Estados Unidos um aumento na susceptibilidade
de K pneumoniae nos uacuteltimos anos graccedilas a praacuteticas de controle de disseminaccedilatildeo
de amostras resistentes(RHOMBERG P R et al 2009) O aumento crescente da
prevalecircncia destes microrganismos foi proporcional ao aumento da dependecircncia do
uso de antibioacuteticos carbapenecircmicos considerados como a opccedilatildeo terapecircutica para o
tratamento de infecccedilotildees por bacilos Gram negativos multi-resistentes (LIVERMORE
2012) Isto afeta diretamente as opccedilotildees de tratamento sobrando poucas alternativas
para a terapecircutica que incluem colistina (polimixina E) e tigeciclina que apresentam
respectivamente problemas em termos de toxicidade e eficaacutecia (LIVERMORE et
al 2011) Um dos efeitos adversos mais importantes das poliminas B e E por
exemplo satildeo a neurotoxicidade e nefrotoxicidade (MENDES C A C et al2009 )
Devido agrave resistecircncia ser usualmente de natureza plasmidial e portanto de
maior disseminaccedilatildeo especialmente quando carreadas por K pneumoniae
microrganismo com uma notoacuteria capacidade para acumular e transferir plasmiacutedeos
com determinantes para resistecircncia o nuacutemero de casos detectados pelo
fenoacutetipogenoacutetipo blaKPC eacute bastante preocupante (MONTEIRO et al 2009)
Comparada com outras bacteacuterias hospitalares a transmissatildeo de clones
multirresistentes de K pneumoniae eacute maior e podem natildeo ser controladas pelos
meacutetodos de controle de infecccedilatildeo hospitalar (PAAUW et al 2007) A forma
plasmidial para transferecircncia da resistecircncia adicionada a este grande potencial para
disseminaccedilatildeo de clones resistentes eacute preocupante visto que apoacutes surtos muitas
vezes pode se tornar endecircmica Jaacute eacute uma realidade a disseminaccedilatildeo desta bacteacuteria
54
entre pacientes hospitais paiacuteses e ateacute mesmo continentes (WOODFORF et al
2010 ROGERS et al 2011)
As chances de surtos satildeo maiores em paiacuteses com poucos recursos devido agrave
maior carecircncia de praacuteticas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees hospitalares e o
uso irracional de antimicrobianos de forma empiacuterica e inadequada (KUMARASAMY
et al 2010) Ateacute o momento os mecanismos de resistecircncia aos cabapenecircmicos
geralmente encontrado eram a produccedilatildeo de ESBL (CTX-M) somada aacute perda de
porina (CARVALHAES et al 2010) Foi notado a partir do ano de 2008 um
aumento no nuacutemero de K pneumoniae produtoras de KPC-2 apresentando outra
forma de resistecircncia (GALES 2012)
Um estudo mostrou que o perfil do paciente colonizado ou infectado por KPC
foi de um paciente entre os 33 e os 82 anos de idade internado haacute mais de 1
semana no hospital A mortalidade geral nos uacuteltimos anos ficou em torno de 7
sendo que dos 77 pacientes estudados 32 (415) pacientes evoluiacuteram para oacutebito
evidenciando a alta morbi-mortalidade associada (ALVES A P et al 2013)
Em estudo com 2316 pacientes avaliados a populaccedilatildeo de sexo masculino foi
de 526 idade meacutedia global de 53 anos (mediana de 55 anos) permanecircncia meacutedia
de 58 dias (mediana de 3 dias) (OLIVEIRA A C et al 2010) Outros trabalhos
apresentaram ausecircncia de significacircncia entre sexoidade e o desenvolvimento de
infecccedilotildees por microrganismos resistentes (PERES-BOTA D et al 2003 COLPAN
A et al 2005 COELLO R et al 1997)
Outro estudo utilizou um total de 30 amostras sendo elas isoladas de urina
escarro secreccedilatildeo pleural ponta de cateter aspirado traqueal e hemocultura A mais
prevalente foi em urina (40) Entre as 30 cepas analisadas a maior porcentagem
foi da cepa Klebsiella pneumoniae (70) Enterobacter sp (133) Klebsiella
ozaenae (10) Escherichia coli (333) e Klebsiella oxytoca (333)
(DIENSTMANN R et al 2010) Nos Estados Unidos a enzima KPC jaacute se tornou
endecircmica Foi realizada uma pesquisa em dois hospitais de Nova York onde
testaram 602 amostras e 45 apresentaram algum mecanismo de resistecircncia
sendo apenas 33 confirmadas por biologia molecular como KPC-2 (BRATU et
al 2005)
55
Estudo sobre os tipos de ESBL feito no Japatildeo apresentou o tipo Toho-1 como
o mais prevalente nessa pesquisa Ateacute o ano de 2000 ano em que foi publicado tal
estudo este era o primeiro relatoacuterio no Japatildeo para identificar derivados de ESBLs
como tipo de SHV e TEM entre E coli e K pneumoniae Em especial o tipo SHV- 12
foi identificado com uma maior frequumlecircncia Estes resultados indicam que tipos
distintos de ESBLs que satildeo diferentes em sua especificidade de substrato e origem
geneacutetica coexistem no Japatildeo Isto mostra a importacircncia de caracterizar genoacutetipos
distintos de ESBLs e de estar em alerta continuamente para as tendecircncias de
ESBLs no Japatildeo aleacutem da necessidade de uma interpretaccedilatildeo uniforme utilizando as
diretrizes do CSLI para relatar cepas produtoras de ESBL Aleacutem da detecccedilatildeo de
ESBLs satildeo necessaacuterias mais informaccedilotildees tais como o perfil de sensibilidade
especiacutefica para diversas β-lactacircmicos e o local da infecccedilatildeo Esses fatores satildeo
essenciais para a escolha adequada de antibioacuteticos (YAGI T et al 2000)
No ano de 2004 uma pesquisa avaliou a produccedilatildeo de uma enzima de
hidroacutelise de carbapenecircmicos atraveacutes da teacutecnica de sequumlenciamento foi revelado
um novo membro da famiacutelia KPC designado KPC- 3 Pesquisadores encontraram
em um mutante de K pneumoniae uma substituiccedilatildeo de um gene associado com
resistecircncia a Imipenem mas essa substituiccedilatildeo foi considerada improvaacutevel na
contribuiccedilatildeo da resistecircncia aos carbapenecircmicos da espeacutecie estudada Aleacutem da
resistecircncia aos carbapenecircmicos estes isolados eram em sua maioria resistentes agraves
cefalosporinas penicilinas e aminoglicosiacutedeos Usando estudos de transformaccedilatildeo
conjugaccedilatildeo e hibridaccedilatildeo localizaram o alelo blaKPC em plasmiacutedeo aleacutem disso
mostraram que esse alelo tambeacutem carregava uma resistecircncia aos aminoglicosiacutedeos
A transferecircncia das enzimas KPCs foi demonstrada in vitro tanto neste como em
outros estudos pode ser que os plasmiacutedeos que fazem esta transferecircncia estavam
comeccedilando a se espalhar no ambiente cliacutenico resultando na multiresistecircncia dessas
estirpes (WOODFORD et al 2004)
O presente estudo apresentou um vieacutes quanto aos resultados dos testes de
susceptibilidade microbiana Observou-se que natildeo foi encontrado resultado deste
teste em algumas amostras o que natildeo cooperou para um estudo mais preciso
futuros estudos quanto agraves amostras e um melhor acompanhamento deste tipo de
patologia Poreacutem mesmo sem algumas amostras com este resultado disponiacutevel foi
56
confirmada a presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos
carbapenecircmicos por meio dos genes de resistecircncia blaKPC e 16S rRNA que as
amostras apresentaram em sua maioria serem portadoras Quanto aos resultados
estatiacutesticos nenhuma das variaacuteveis apresentou significacircncia estatiacutestica (p gt 005)
mostrando assim que estas variaacuteveis isoladas natildeo foram o fator determinante para
o desfecho cliacutenico de alta ou oacutebito
57
7 CONCLUSAtildeO
Os genes blaKPC e 16S rRNA foram caracterizados confirmando a a
presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos carbapenecircmicos
Houve uma maior prevalecircncia da cepa K pneumoniae e isto confirma outros
estudos que apresentam a maior prevalecircncia desta cepa em amostras com KPC
Aleacutem disso isso justifica a forma popular da K pneumoniae ser chamada de KPC
enquanto que na verdade KPC eacute uma enzima podendo estar presente em outras
cepas como Enterobacter clocae tambeacutem apresentada no presente estudo O
desfecho cliacutenico de oacutebitos maior que 50 eacute um possiacutevel indicador sobre a
necessidade de se realizar um teste raacutepido para identificaccedilatildeo de KPC visando
iniciar o mais raacutepido possiacutevel o tratamento afim de diminuir a mortalidade por esta
infecccedilatildeo
Nenhuma das variaacuteveis isoladamente estaacute relacionada ao desfecho cliacutenico
oacutebito ou alta pois natildeo apresentaram relevacircncia estatiacutestica O presente estudo
mostrou que haacute presenccedila da bacteacuteria nas amostras de pacientes do hospital
estudado podendo entatildeo afirmar que este tipo de bacteacuteria se encontra tambeacutem
presente em ambiente hospitalar O uso irracional de antimicrobiano eacute demonstrado
de forma indireta quando foi apresentado atraveacutes do Teste de Hodge Modificado
uma resistecircncia de 100 aos antibioacuteticos carbapenecircmicos Isto tambeacutem reflete na
terapecircutica sendo que pacientes portadores de bacteacuterias resistentes aos
antibioacuteticos carabepecircmicos tem uma escassa opccedilatildeo de tratamento e as opccedilotildees
apresentam problemas quanto agrave toxicidade e eficaacutecia
58
REFEREcircNCIAS
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Mecanismos
de resistecircncia bacteriana aos antimicrobianos Disponiacutevel em
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controleopas_
webmodulo3mec_sitiohtmgt Acesso em 25 de abril de 2014
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Nota teacutecnica nordm
012013 medidas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees por enterobacteacuterias
multiresistentes Acesso em 17 de abril de 2013
ALBA J et al Kinetics study of KPC-3 a plasmid-encoded class A
carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase Antimicrob Agents Chemother
Nov49(11)4760-2 2005
ALVES A P et al Nosocomial infections by KPC-producing enterobacteria in
a tertiary hospital in Southern Brazil Revista da AMRIGS Porto Alegre 57 (3) 213-
218 jul-set 2013
ALVES A et al Tipagem Geneacutetica de Microrganismos Lab De Diversidade
Microbiana Centro de Biologia Celular Dep de Biologia U de Aveiro 3810-193
Aveiro- 2003
BELL J M et Al Prevalence and significance of a negative extended-
spectrum beta-lactamase (ESBL) confirmation test result after a positive ESBL
screening test result for isolates of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae
results from the SENTRY Asia-Pacific Surveillance Program J Clin Microbiol
May45(5)1478-82 2007
BRATU S et al Detection of KPC carbapenem-hydrolyzing enzymes in
Enterobacter spp from Brooklyn New York Antimicrob Agents Chemother v 49 n
2 p 776-8 2005
59
BRATU S et al Emergence of KPC-possessing Klebsiella pneumoniae in
Brooklyn New York epidemiology and recommendations for detection Antimicrob
Agents Chemother v 49 n 7 p 3018-20 2005
BRATU S et al Rapid spread of carbapenem-resistant Klebsiella
pneumoniae in New York City Arch Intern Med v 165 p 1430-5 2005
CAMARGO C F et al Aplicaccedilatildeo das teacutecnicas de pcr e suas teacutecnicas
derivadas em diagnoacutestico molecular Disponiacutevel em
ltfileDUnB10C2BA20semestreArtigosPCR-
20CLEYTON20FLORENCIO20DE20CAMARGO20E20PAULO20ROB
ERTO20QUEIROZpdfgtgt Acesso em 08 de abril de 2014
CARVALHES C G et al Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting
carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive
results Journal of Antimicrobial Chemotherapy v 65 n2 p 249-251 2010
CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION- CDC Modified
Hodge Test for Carbapenemase Detection in Enterobacteriaceae 2004
CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE Methods for
dilutionantimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically Approved
standard M7ndashA7 7th ed CLSI Wayne PA 2011
COELLO R et al Risk factors for developing clinical infection with methicillin-
resistant Staphylococcus aureus (MRSA) amongst hospital patients initially only
colonized with MRSA J Hosp Infect 19973739-46
COLPAN A et al Evaluation of risk factors for mortality in intensive care
units A prospective study from a referral hospital in Turkey Am J Infect Control
200533(1)42-7
60
CORNAGLIA G et al Living with ESBLs Introduction Clinical Microbiology
and Infection 14 Suppl 1 1-2 2008
COTRIM E R et al Klebsiella pneumoniae carbapenemase ndash KPC em
Enterobacteriaceae o desafio das bacteacuterias multirresistentes Poacutes em revista do
centro universitaacuterio Newton Paiva 12012 - ediccedilatildeo 5 - issn 2176 7785
DESHPANDE L M et al Occurrence and characterization of
carbapenemase-producing Enterobacteacuteriaceae report from the SENTRY
Antimicrobial Surveillance Program (2000-2004) Microb Drug Resist 12(4)223-30
2006
DIAS D J A Estudos dos principais mecanismos de resistecircncia aos
antibioacuteticos β-lactacircmicos em bacteacuterias patogecircnicas gram negativas 2009 100 f
Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Geneacutetica Molecular e Biomedicina) ndash Faculdade de
Ciecircncias e Tecnologia Universidade de Nova Lisboa Lisboa
DIENSTMANN R et al Avaliaccedilatildeo fenotiacutepica da enzima Klebsiella
pneumoniae carbapenemase (KPC) em Enterobacteriaceae de ambiente hospitalar
J Bras Patol Med Lab v 46 n 1 p 23-27 fevereiro 2010
ENDIMIAMI A et al Emergence of blaKPC-containing Klebsiella
pneumoniae in a long-term acute care hospital a new challenge to our healthcare J
Antimicrob Chemother 64 1102-1110 Nov 2009
FALAGAS M E et al Extended-spectrum beta-lactamase producing
organisms The Journal of Hospital Infection 73 (4) pp 345-54 2009
FONTANA C et al Emergence of KPC-producing Klebsiella pneumoniae in
Italy BMC Rev Notes 3 40 2010
61
GALES A C et al Antimicrobial resistance among Gram-negative bacilli
isolated from Latin America results from Sentry Antimicrobial Surveillance Program
(Latin America 2008-2010) Diagnostic Microbiology and Infectious Disease v 3 n
4 p 354 -360 2012
GUPTA N et al Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Epidemiology
and Prevention HEALTHCARE EPIDEMIOLOGY Clinical Infectious Diseases
201153(1)60ndash67 Published by Oxford University Press on behalf of the Infectious
Diseases Society of America 2011
HARBOTTLE H et al Genetics of antimicrobial resistance Anim Biotechnol
n17 p111-124 2006
HENRIQUE W N et al RESISTEcircNCIA BACTERIANA Uniatildeo das
Faculdades Alfredo NasserInstituto de Ciecircncias da Sauacutede Disponiacutevel em lt
httpwwwfaculdadealfredonasseredubrfilespesquisaposter20HENRIQUE20
Wilker20Natividade20SANTIAGO20Silvania20CAVALCANTI20DSP
20ResistC3AAncia20Bacterianapdfgt Acesso em 17 marccedilo 2014
HULSCHER M E J I et al Antibiotic prescribing in hospital a social and
behavioral scientific approach The Lancet Infectious Diaseases v 10 n 3 p 167-
165 2010
KIDWAI M SAPRA P BHUSHAN KR Synthetic strategies and medicinal
properties of beta-lactams Curr Med Chem 1999 695-215
KUMARASAMY K K et al Emergence of a new antibiotic resistance
mechanism in India Pakistan and the UK a molecular biological and
epidemiological stuy The Lancet Infectious Diseases v10 n 9 p 597- 602 2010
LINCOPAN N et al Enterobacteacuteria producing extended-spectrum β-
lacatamases and IMP-1 Metalo-β-lactamases isolated from Brazilian hospitals J Med
62
Microbiol 7 1-3 2006
LINCOPAN N et al First Isolation of Metalo-β-Lacatamase-Producing
Multiresistant Klebsiella pneumoniae from a patient in Brazil J Clin Microbiol 43(1)
516-519 2005
LIVERMORE D M et al What remains against carbapenem- resistant
Enterobacteriaceae Evaluation of choramphenicol ciprofloxacin colistina
fosfomycin minocycline nitrofurantoin temocilin and tigecycline International
Journal of Antimicrobial Agents v 37 n 5 p 415- 459 2011
LIVERMORE D M Fourten years in resistance International Journal of
Antimicrobial Agents v 39 283- 294 2012
LIVERMORE D M Bacterial resistance to carbapenems Adv Exp Med Biol
1995 39025-47
LIVERMORE D M Bacterial resistance origins epidemiology and impact
Clin Infect Dis 36S11-S23 2003
LIVERMORE D M et al Carbapenemases a problem in waiting Curr
Opin Microbiol 2000 3489-95
LU et al Universal pcr for common bacterial pathogens J CLIN
MICROBIOL VOL 38 2000
LU et al Use of PCR with Universal Primers and Restriction Endonuclease
Digestions for Detection and Identification of Common Bacterial Pathogens in
Cerebrospinal Fluid Journal of Clinical Microbiology June 2000 p 2076ndash2080
MARSCHALL J Met al Presence of the KPC Carbapenemase Gene in
Enterobacteriaceae Causing Bacteremia and Its Correlation with In Vitro
Carbapenem Susceptibility J Clin Microbiol 47 239-241 Jan 2009
63
MARTINS WMBS et al Prevalecircncia do gene blaKPC em isolados cliacutenicos
de Enterobacteriaceae e natildeo fermentadores encontrados em amostras clinicas em
um hospital universitaacuterio do Recife X Jornada de ensino pesquisa e extensatildeo ndash
JEPEX 2010 ndash UFRPE Recife 18 a 22 de outubro
MENDES C A C et al Polimixinas Revisatildeo com ecircnfase na sua
nefrotoxicidade Rev Assoc Med Bras 2009 55(6) 752-9
MOHR J F 3rd Update on the efficacy and tolerability of meropenem in the
treatment of serious bacteacuterial infections Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S41-51
2008
MONTEIRO J et al First report of KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae
strains in Brazil Antimicrob Agents Chemother Jan53(1)333-4 2009
MOREIRA V C et al Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia a antibioacuteticos
Disponiacutevel em
lthttpwwwcpglsucgbr6mostraartigosSAUDEVANESSA20CARVALHO20M
OREIRApdfgt Acesso em 21 marccedilo 2014
NETIKUL T et al Emergence of novel blaKPC-12 and blaKPC-13 variants in
carbapenem non-susceptible Enterobacter cloacae a first report of blaKPC gene in
Thailand European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases May
S372 2011
NETO V A et al Antibioacuteticos na praacutetica Meacutedica 6ordf Ediccedilatildeo Editorial
SarverSP Brasil 2007
NICOLAU D P Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of
meropenem Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S32-40 2008
64
OLIVEIRA A C et al Resistecircncia bacteriana e mortalidade em um centro de
terapia intensiva Rev Latino-Am Enfermagem nov-dez 2010
PAAUW A et al Failure to control an outbreak of qnrA 1-positive multidrug-
resistant Enterobacter clocae despite adequate implementation of recommended
infection control measures Journal of Clinical Microbiology v 45 n 5 p 1420-1425
2007
PATERSON D L et al Extended-Spectrum Beta-Lactamases a Clinical
Update Clinical Microbiology Reviews v 18 p 657-686 2005
PEIRANO G et al Carbapenem-hydrolysing beta-lactamase KPC-2 in
Klebsiella pneumonia isolated in Rio de Janeiro Brazil J Antimicrob Chemother Nov
20 2009
PERES-BOTA D et al Are infections due to resistant pathogens associated
with worse outcome in critically ill patients J Infect 200347(4)307-16
PIDDOCK L J V Clinically relevant chromosomally encoded multidrug
resistance effl ux pumps in bacterial Clin Microbiol Rev n19 p382-402 2006
PITOUT J D D et al Emergence of Enterobacteriaceae producing
extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) in the community J Antimicrob
Chemother May 56 2005
POSSEBON M I et al Resistecircncia bacteriana aos carbapenecircmicos
Bacterial resitence to carbapenems RBM rev bras med60(6)378380-378-382
jun 2003
QUEENAN A M et al Carbapenemases the versatile beta-lactamases
Clin Microbiol Rev Jul20(3)440-58 2007
65
RHOMBERG P R et al Summary trends for the meropenem yearly
susceptibility test information collection program a 10- year experience in the United
States (1999-2008) Diagnostic Microbiology and Infectiois Disease v 65 n4 p
414-426 2009
ROBLEDO I E et al Detection of KPC in Acinetobacter spp in Puerto Rico
J Antimicrob Agents Chemother 54 1354-1357 Mar 2010
ROGERS B A et al Country-to-country transfer os patients and the risk of
multi-resistant bacterial infection Clinical Infectious Disease v53 n1 p49- 56
2011
SHAH A A et al Characteristics epidemiology and clinicalimportance of
emerging strains of Gram-negative bacilli producing extended-spectrum
betalactamases Research in Microbiology v 155 p 409-421 2004
TURNER P J Extended- Spectrum Beta-Lactamases Clinical Infectious
Diseases v 41 p 273-275 2005
WOLTER D J et al Phenotypic and Enzymatic Comparative Analysis
between the Novel KPC variant KPC-5 and Its Evolutionary Variants KPC-2 and
KPC-4 Antimicrob Agents Chemother Nov 17 2008
WOODFORD N et al Carbapenemases of Chryseobacterium
(Flavobacterium) meningosepticum distribution of blaB and characterization of a
novel Metalo-beta-lactamase gene blaB3 in the type strain NCTC 10016
Antimicrob Agents Chemother Jun44(6)1448-52 2000
WOODFORF N Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in
India Pakistan and the UK a molecular biological and epidemiological study The
Lancet Infectious Diseases v 10 n 9 p 597-602 2010
66
WOODFORD et al Outbreak of Klebsiella pneumoniae Producing a New
Carbapenem- Hydrolyzing Class A β-Lactamase KPC-3 in a New York Medical
Center Antimicrobial agents and chemotherapy Dec 2004 p 4793ndash4799 Vol 48
No 12
YAGI T et al A preliminary survey of extended-spectrum β-lactamases
(ESBLs) in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Japan
FEMS Microbiology Letters 184 (2000) 53-56
YIGIT H et al Novel carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase KPC-1 from
a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumonia J Antimicrob Agents
Chemother 45 (4) 1151-1161 (2001)
ZAVASCKI A P et al KPC-2- producing Enterobacter cloacae in two cities
from Southern Brazil Int J Antimicrob Agents Apr 28 2009
ZHANEL G G et al Comparative review of the carbapenecircmicos Drugs
67(7)1027-52 2007
67
ANEXOS
Sequumlecircncia do oligo blaKPC
Query 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
Query 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
Query 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
68
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
Query 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
Query 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
69
Query 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
Query 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
Query 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
70
Sbjct 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
Query 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
Query 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
Query 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
71
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
Query 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
Query 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
72
Query 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
Query 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
Query 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
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73
Sbjct 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
Query 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
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Sbjct 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
Query 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
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Sbjct 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
Query 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
74
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Sbjct 1081
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AGCACTG 1140
Query 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
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Sbjct 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
Query 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
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Sbjct 1201
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CTTCGCC 1260
75
Query 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
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Sbjct 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
Query 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
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Sbjct 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
LOCUS AF297554 1377 bp
DNA linear BCT 26-MAR-2001
DEFINITION Klebsiella pneumoniae carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
gene complete cds
ACCESSION AF297554
VERSION AF2975541 GI10121874
76
KEYWORDS
SOURCE Klebsiella pneumoniae
ORGANISM Klebsiella pneumoniae
Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Enterobacteriaceae Klebsiella
REFERENCE 1 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH QueenanAM
AndersonGJ Domenech-SanchezA
BiddleJW StewardCD
AlbertiS BushK and TenoverFC
TITLE Novel carbapenem-hydrolyzing beta-
lactamase KPC-1 from a
carbapenem-resistant strain of
Klebsiella pneumoniae
JOURNAL Antimicrob Agents Chemother 45 (4)
1151-1161 (2001)
PUBMED 11257029
REFERENCE 2 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH AndersonGJ and
TenoverFC
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (19-AUG-2000) Nosocomial
Pathogens Laboratory Branch
Centers for Disease Control and
Prevention 1600 Clifton Rd MS
G08 Atlanta GA 30333 USA
FEATURES LocationQualifiers
77
source 11377
organism=Klebsiella
pneumoniae
mol_type=genomic DNA
db_xref=taxon573
-35_signal 5560
-10_signal 7883
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product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
RBS 117122
CDS 1311012
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codon_start=1
transl_table=11
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
protein_id=AAG134101
db_xref=GI10121875
translation=MSLYRRLVLLSCLSWPLAGFSATALTNLVAEPFAKLEQD
FGGSI
GVYAMDTGSGATVSYRAEERFPLCSSFKGFLAAAVLARSQQQAGLLDTPIRYG
KNALV
PWSPISEKYLTTGMTVAELSAAAVQYSDNAAANLLLKELGGPAGLTAFMRSIG
DTTFR
78
LDRWELELNSAIPSDARDTSSPRAVTESLQKLTLGSALAAPQRQQFVDWLKGN
TTGNH
RIRAAVPADWAVGDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTRAPNKDDK
HSEAV
IAAAARLALEGLGVNGQ
ORIGIN
1 cggggcagtt acagccgtta cagcctctgg
agagggagcg gcttgccgct cggtgataat
61 cccagctgta gcggcctgat tacatccggc
cgctacacct agctccacct tcaaacaagg
121 aatatcgttg atgtcactgt atcgccgtct
agttctgctg tcttgtctct catggccgct
181 ggctggcttt tctgccaccg cgctgaccaa
cctcgtcgcg gaaccattcg ctaaactcga
241 acaggacttt ggcggctcca tcggtgtgta
cgcgatggat accggctcag gcgcaactgt
301 aagttaccgc gctgaggagc gcttcccact
gtgcagctca ttcaagggct ttcttgctgc
361 cgctgtgctg gctcgcagcc agcagcaggc
cggcttgctg gacacaccca tccgttacgg
421 caaaaatgcg ctggttccgt ggtcacccat
ctcggaaaaa tatctgacaa caggcatgac
481 ggtggcggag ctgtccgcgg ccgccgtgca
atacagtgat aacgccgccg ccaatttgtt
541 gctgaaggag ttgggcggcc cggccgggct
gacggccttc atgcgctcta tcggcgatac
79
601 cacgttccgt ctggaccgct gggagctgga
gctgaactcc gccatcccaa gcgatgcgcg
661 cgatacctca tcgccgcgcg ccgtgacgga
aagcttacaa aaactgacac tgggctctgc
721 actggctgcg ccgcagcggc agcagtttgt
tgattggcta aagggaaaca cgaccggcaa
781 ccaccgcatc cgcgcggcgg tgccggcaga
ctgggcagtc ggagacaaaa ccggaacctg
841 cggagtgtat ggcacggcaa atgactatgc
cgtcgtctgg cccactgggc gcgcacctat
901 tgtgttggcc gtctacaccc gggcgcctaa
caaggatgac aagcacagcg aggccgtcat
961 cgccgctgcg gctagactcg cgctcgaggg
attgggcgtc aacgggcagt aaggctctga
1021 aaatcatcta ttggcccacc accgccgccc
ttgcgggcgg catggattac caaccactgt
1081 cacatttagg ctaggagtct gcgcggcaga
gccgtgtgac cggttttctg tagagcactg
1141 acgatggcgg cggcgctctc tgcaattggc
aaggcgtcgg cgccaaggat accaatcttg
1201 cggcgcgcgg cgtgttatga cgactggggt
gcatttgagc cgccccattt aaccttcgcc
1261 ctcacagata cgccattcgc ctcaaattta
gcgccatgca gacgagcttc cactcggctt
1321 gcaccttgtc caggcccctc atgctgaact
gacgcaatcc catcaccgcc ttgatca
80
Tawana Correa Rodrigues Amorim Rosa
Anaacutelise de aspectos epidemioloacutegicos e cliacutenicos e caracterizaccedilatildeo de
genes de resistecircncia das Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases em
um hospital do Distrito Federal
Monografia de Conclusatildeo de Curso
apresentada como requisito parcial
para obtenccedilatildeo do grau de Bacharel
em Farmaacutecia na Universidade de
Brasiacutelia Faculdade de Ceilacircndia
Orientadora Profa DraMargocirc Gomes de Oliveira Karnikowski
Co-orientadora Profa Dra Izabel Cristina Rodrigues da Silva
CEILAcircNDIA DF
2014
Tawana Correa Rodrigues Amorim Rosa
Anaacutelise de aspectos epidemioloacutegicos e cliacutenicos e caracterizaccedilatildeo de
genes de resistecircncia das Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases em
um hospital do Distrito Federal
Orientadora Profa Dr Margocirc Gomes de Oliveira Karnikowski
(FCe Universidade de Brasiacutelia)
Co-orientadora Profa Dr Izabel Cristina Rodrigues da Silva
(FCe Universidade de Brasiacutelia)
CEILAcircNDIA DF
2014
Tawana Correa Rodrigues Amorim Rosa
Anaacutelise de aspectos epidemioloacutegicos e cliacutenicos e caracterizaccedilatildeo de
genes de resistecircncia das Enterobacteacuterias produtoras de carbapemases em um
hospital do Distrito Federal
BANCA EXAMINADORA
_______________________________________
Orientadora Profa Dr Margocirc Gomes de Oliveira Karnikovski
(FCe Universidade de Brasiacutelia)
_______________________________________
Profa MSc Micheline Marie Milward de Azevedo Meiners
(FCe Universidade de Brasiacutelia)
_______________________________________
Prof MSc Daniel Oliveira Freire
(LS Faculdade LS)
CEILAcircNDIA DF
2014
AGRADECIMENTOS
Primeiramente aacute Deus autor da vida que me concedeu a graccedila e a benccedilatildeo
de ter conquistado este sonho da graduaccedilatildeo
Agrave minha amada famiacutelia principalmente meus pais Elias Amorim e Liliana
Correa irmatildeo Thales Correa e avoacute Herondina por serem a minha base meu
refuacutegio em todos os momentos e acreditarem em mim
Agrave minha grande amiga de graduaccedilatildeo Susan Suellen por partilhar dos meus
medos alegrias vitoacuterias angustias e em todos os momentos ser meu braccedilo direito
Ao meu amor Robson Bastos que mais que um noivo foi meu amigo e
companheiro me apoiando e me incentivando
Agrave minha querida orientadora DraMargocirc Gomes e querida co-orientadora Dra
Izabel Cristina por acreditarem em mim me dando a oportunidade de trabalhar com
elas Aleacutem do apoio ensino e dedicaccedilatildeo
Agrave todos os professores (as) da Universidade de Brasiacutelia- Faculdade de
Ceilacircndia pelo ensino e pela contribuiccedilatildeo na minha formaccedilatildeo acadecircmica
Agrave MSc Fabiana Cartaxo pela ajuda e apoio aleacutem da prontidatildeo quando
solicitada a sua ajuda
Ao professor mestre Daniel Oliveira e a teacutecnica de laboratoacuterio Thais Mendes
pela ajuda laboratorial contribuindo para a realizaccedilatildeo de um bom trabalho
RESUMO
Introduccedilatildeo A Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) eacute uma enzima
produzida por bacteacuterias gram-negativas (enterobacteacuterias) que confere resistecircncia
aos antimicrobianos carbapenecircmicos meropenen ertapenen imipenen classe
amplamente utilizada no tratamento de infecccedilotildees envolvendo Enterobacteriaceae
Esta resistecircncia eacute uma das principais causas de falha terapecircutica devido agrave
produccedilatildeo de beta-lactamases de espectro estendido (ESBL) por esta bacteacuteria
mecanismo de resistecircncia mais comum aos antibioacuteticos beta-lactacircmicos de amplo
espectro A identificaccedilatildeo destas enterobacteacuterias pode ser feita atraveacutes de teacutecnicas
de identificaccedilatildeo molecular de patoacutegenos dentre elas a Reaccedilatildeo em Cadeia de
Polimerase (PCR) que consiste na anaacutelise do padratildeo de amplificaccedilatildeo de elementos
repetidos encontrados no genoma bacteriano permitindo uma maior rapidez na
obtenccedilatildeo de resultados quando comparada com outros meacutetodos aleacutem de
apresentar alta reprodutibilidade simples execuccedilatildeo e implementaccedilatildeo dependendo
da aplicaccedilatildeo da teacutecnica natildeo enfrenta problemas com a degradaccedilatildeo do DNA
Objetivo Caracterizar genes de resistecircncia das Enterobacteacuterias produtoras de
carbapenemases e aspectos epidemioloacutegicos e cliacutenicos de pacientes internados em
um hospital puacuteblico do Distrito Federal Materiais e meacutetodos Estudo transversal
onde foi realizado o teste de susceptibilidade das Enterobacteacuterias aos antibioacuteticos
Carbapenecircmicos a partir dos materiais bioloacutegicos coletados dos pacientes
internados no Hospital Regional da Asa Norte (HRAN) Anaacutelise molecular dos genes
16S rRNA e blaKPC utilizando PCR aleacutem de anaacutelises estatiacutesticas Resultados e
discussatildeo Detectou-se a regiatildeo ribossomal e o gene de resistecircncia testado
confirmando a resistecircncia microbiana Maior prevalecircncia de pacientes do sexo
masculino (53) desfecho cliacutenico de oacutebito(59) siacutetio de infecccedilatildeo de swab retal
(47) Klebsiella pneumoniae foi microrganismo mais encontrado (82) Natildeo houve
diferenccedila estatiacutestica entre as variaacuteveis e o desfecho cliacutenico (p foi gt 005)
Conclusatildeo Atraveacutes da caracterizaccedilatildeo molecular dos genes de resistecircncia blaKPC
e Universal confirmou-se a presenccedila de Klebsiella pneumoniae resistente aos
carbapenecircmicos Os valores de p natildeo foram significativos (lt005) sendo
assimnenhuma das variaveacuteis estudadas foram o principal motivo do desfecho
cliacutenico (alta ou oacutebito)
Palavras chaves Klebsiella pneumoniae carbapenemase Resistecircncia bacteriana a
antimicrobianos β-lactamases de espectro estendido (ESBL) Reaccedilatildeo em Cadeia de
Polimerase (PCR)
ABSTRACT
Introduction Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) is an enzyme produced
by gram - negative bacteria (Enterobacteriaceae) which confers resistance to
carbapenem antibiotics meropenen ertapenen imipenem class widely used in the
treatment of infections involving Enterobacteriaceae This resistance is a major
cause of treatment failure due to beta-lactamases production of extended spectrum
(ESBL) by this bacterium most commonly resistance to beta-lactam antibiotics of
wide spectrum engine The identification of these Enterobacteriaceae can be made
by techniques of molecular identification of pathogens among them the Polymerase
Chain Reaction (PCR) which consists in the analysis of the amplification pattern of
repeated elements found in the bacterial genome allowing faster in getting results
when compared with other methods in addition to presenting high reliability simple
implementation and deployment depending on the application of the technique has
no trouble with the degradation of DNA Objective To characterize the resistance
genes of Enterobacteriaceae producing carbapenemases and epidemiological and
clinical features of patients admitted to a public hospital in the Federal District
aspects Materials and methods Cross-sectional study where susceptibility testing
of Enterobacteriaceae to antibiotics Carbapenems from biological materials collected
from patients admitted to the Hospital Regional da Asa Norte ( HRAN ) was
performed Molecular analysis of 16S rRNA genes and blaKPC using PCR in
addition to statistical analysis Results and Discussion Was detected region and
the ribosomal tested resistance gene confirming the microbial resistance Higher
prevalence of male patients (53 ) clinical outcome of death (59 ) site of infection
rectal swabs (47 ) Klebsiella pneumoniae was found more microorganism (82)
There was no statistical difference between the variables and the clinical outcome (p
was gt 005) Conclusion Through molecular characterization of genes and the
Universal blaKPC resistance confirmed the presence of Klebsiella pneumoniae
resistant to carbapenems P values were not significant (lt 005) so none of the
variables studied were the main reason the clinical outcome (discharge or death)
Keywords Klebsiella pneumoniae Carbapenemase Bacterial resistance to
antibiotics Extended-Spectrumβ-lactamases (ESBL) Polimerase Chain Reaction
(PCR)
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Accedilatildeo do szlig-lactacircmico sobre a bacteacuteria gram-positiva e gram-negativa
Figura 2 Divulgaccedilatildeo internacional de Klebsiella pneumoniae Carbapenemase
(KPC) produtoras de Enterobacteriaceae
Figura 3 Mecanismos de resistecircncia bacteriana
Figura 4 Etapas da Reaccedilatildeo de PCR
Figura 5 Mecanismo de semeamento de material bioloacutegico oriundos de pacientes
com suspeita de infecccedilatildeo por KPC
Figura 6 Interpretaccedilatildeo resultado do Teste de Hodge Modificado
Figura 7 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC das amostras dos
17 pacientes estudados
Figura 8 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC da mostra A3
estudada
Figura 9 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA das amostras
dos 17 pacientes estudados
Figura 10 Gel de agarose a 2 da digestatildeo do amplicon do gene 16S rRNA das
amostras com a enzima HaeIII evidenciando diversos fragmentos proacuteximos a 200
pb
Figura 11 Infecccedilatildeo por KPC segundo sexo dos 17 pacientes investigados no
HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
Figura 12Isolado de KPC segundo desfecho cliacutenico dos 17 pacientes investigados
no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
Figura 13 Isolados de KPC segundo local da coleta da amostra nos 17 pacientes
investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
Figura 14Isolado de KPC segundo microrganismo encontrado em 17 pacientes
investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Criteacuterios Interpretativos para testes de sensibilidade
Tabela 2 Nuacutemero de acesso ao GenBank dos alelos blaKPC e seus microrganismos
originais
Tabela 3 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do gene blaKPC
Tabela 4 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do gene
universal
Tabela 5 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da digestatildeo do gene universal
Tabela 6 - Distribuiccedilatildeo das variaacuteveis estudadas perfil geneacutetico sexo coleta
tipificaccedilatildeo de microrganismos e anaacutelise da resistecircncia bacteriana segundo o
desfecho cliacutenico Brasiacutelia-DF 2010 a 2012
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AmpC- Adenosina Monofosfato Ciacuteclico
BRMD- Bacteacuterias multirresistentes
CCIH- Comissatildeo de Controle de Infecccedilatildeo Hospitalar
CDC- Centers for Disease Control and Prevention
CIM- Concentraccedilatildeo Inibitoacuteria Miacutenima
CLSI- Clinical and Laboratory Standards Institute
DNA- Aacutecido Desoxirribonucleacuteico
E coli- Escherichia coli
ERIC-PCR - Enterobacterial Repet it ive Intergenic Consensus
ESBL- Beta-Lactamases de Espectro Estendido
Et al- e outros
ETP- Ertapenem
HRAN- Hospital Regional da Asa Norte
K ornithinolytica- Klebsiella ornithinolytica
K oxytoca- Klebsiella oxytoca
K planticola- Klebsiella planticola
K pneumoniae- Klebsiella pneumoniae
K terrigena- Klebsiella terrigena
KPC - Klebsiella pneumoniae produtora de Carbapenemase
KPCNEG- Bacilos Gram-Negativos Natildeo Fermentadores
KPCPOS- Bacilos Gram-Positivo Natildeo Fermentadores
MBL- metalo-beta-lactamases
MEM- Meropenem
NA- Natildeo se aplica
Oligo- Oligonucleotiacutedeos
PB- Pares de Bases
PBPs (Penicilim-Binding-Protein)- Proteiacutenas de ligaccedilatildeo agrave penicilina
PCR- Polymerase Chain Reaction (Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase)
PFGE - Pulsed-Field Gel Electrophoresis (Eletroforese em campo pulsado)
RAPD- Randomly Amplified Polymorphic DNA (DNA polimoacuterfico amplificado
aleatoriamente)
RFLPrsquos - ldquoRestriction Fragment Length Polymorphismsrdquo( polimorfismos de tamanho
de fragmentos de restriccedilatildeo)
THM- Teste de Hodge Modificado
TSA- Teste de Susceptibilidade aos Antibioacuteticos
UTI- Unidade de Terapia Intensiva
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 15
11 Klebsiella pneumoniae produtora de Carbapenemase (KPC) 15
1 2 Resistecircncia bacteriana 20
13 Anaacutelise geneacutetica de microrganismos 27
2 JUSTIFICATIVA 30
3 OBJETIVOS 31
31 Objetivo geral 31
32 Objetivos Especiacuteficos 31
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS 32
4 1 Coleta e transporte das amostras bioloacutegicas 32
4 2 Procedimentos para confirmaccedilatildeo de resistecircncia bacteriana por disco de
Ertapenem (adaptado CDC 2004) 32
4 2 1 Interpretaccedilatildeo dos Resultados 33
4 3 Teste de susceptibilidade aos antibioacuteticos 34
4 4Teste de Hodge Modificado (THM) (adaptado CDC 2004) 35
441 Controle de qualidade (CQ) 35
442 InterpretaccedilatildeoResultados 35
4 5 Extraccedilatildeo de DNA bacteriano 37
4 6 Iniciadores e reaccedilatildeo de PCR 38
4 7 Digestatildeo 41
4 8 Eletroforese em gel de agarose 41
4 9 Descarte de resiacuteduos 42
4 10 Aspectos epidemioloacutegicos e cliacutenicos 42
4 12 Anaacutelises estatiacutesticas 42
4 13 Preceitos eacuteticos 43
5 RESULTADOS 44
51 Anaacutelise molecular 44
5 1 1 Gene blaKPC 44
5 1 2 Gene 16S rRNA 45
5 2 Anaacutelises epidemioloacutegicas 46
5 2 1 Sexo 46
5 2 2 Desfecho cliacutenico 47
5 2 3 Local da coleta 48
5 2 4 Microrganismo 48
6 DISCUSSAtildeO 53
7 CONCLUSAtildeO 57
15
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC)
Klebsiella pneumoniae pertence aacute famiacutelia Enterobacteriaceae
encontrado em locais como aacutegua solo plantas e esgoto Satildeo encontradas cinco
espeacutecies K pneumoniae K oxytoca K planticola K terrigena e K ornithinolytica
O gecircnero Klebsiella eacute definido como contendo bacilos Gram-negativos natildeo moacuteveis
em forma de bastatildeo e geralmente encapsuladas que produzem lisina
descarboxilase mas natildeo produzem ornitina descarboxilase Provavelmente a
colonizaccedilatildeo em seres humanos ocorre por contato com as diferentes fontes
ambientais podendo ser encontrada colonizando a orofaringe e fezes de pessoas
sadias Pessoas imunocomprometidas a bacteacuteria encontra um ambiente favoraacutevel
para seu crescimento levando aos quadros de infecccedilatildeo (MOREIRA et al 2014)
A Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) eacute uma enzima produzida por
enterobacteacuterias gram-negativas sendo um mecanismo de resistecircncia aos antimi-
crobianos carbapenecircmicos meropenen ertapenen eou imipenen classe
amplamente utilizada no tratamento de infecccedilotildees envolvendo Enterobacteriaceae
Ela tambeacutem eacute capaz de inativar os agentes β-lactacircmicos cefalosporinas penicilinas
e o aztreonam (COTRIM et al 2012)
Devido agrave semelhanccedila estrutural e estereoquiacutemica os antibioacuteticos beta-
lactacircmicos possuem um mecanismo de accedilatildeo comum ao grupo Eles atuam inibindo
a siacutentese da parede celular bacteriana atraveacutes do mecanismo de bloqueio da
transpeptidaccedilatildeo responsaacutevel pela uniatildeo dos componentes individuais do
peptidoglicano conforme demonstrado na figura 1 (KIDWAI et al 1999)
A accedilatildeo destes antibioacuteticos eacute atraveacutes de ligaccedilotildees covalentes com as proteiacutenas
as Penicilim-Binding-Protein (proteiacutena de ligaccedilatildeo da penicilina- PBP ou PLP) que se
encontram presentes na membrana citoplasmaacutetica de todas as bacteacuterias Devido agraves
mutaccedilotildees ocorre uma induccedilatildeo na alteraccedilatildeo dessas proteiacutenas podendo determinar
uma diminuiccedilatildeo da afinidade dos beta-lactacircmicos agraves mesmas A accedilatildeo dos
carbapenecircmicos eacute atraveacutes da sua ligaccedilatildeo agraves PBPs presentes na parede bacteriana
especialmente as PBP1 e PBP2 provocando a lise osmoacutetica da bacteacuteria Aleacutem
disso eles tecircm uma facilidade na penetraccedilatildeo da bacteacuteria por meio dos canais
poriacutenicos presentes nas bacteacuterias gram-negativas induzindo um efeito poacutes-
16
antibioacutetico Quando comparados com outros beta-lactacircmicos os carbapenecircmicos
satildeo mais resistentes agrave hidroacutelise pela maioria das beta-lactamases tanto
cromossocircmicas como plasmiacutedicas (LIVERMORE 1995 LIVERMORE et al 2000)
Figura 1 Accedilatildeo do szlig-lactacircmico sobre a bacteacuteria gram-positiva e gram-
negativa Fonte
ltlthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controle
opas_webmodulo3gramn_lacta2htmgt (adaptado)
A bacteacuteria Klebsiella pneumoniae quando apresenta gene ESBL pode
expressar resistecircncia a ateacute 95 dos antimicrobianos existentes no acircmbito
farmacecircutico sendo a produccedilatildeo de beta-lactamases de espectro estendido (ESBL)
17
por esta bacteacuteria uma das principais causas de falha terapecircutica Existem outras
formas de resistecircncia emergentes de grande importacircncia como a produccedilatildeo de
beta-lactamases tipo adenosina monofosfato ciacuteclico (AmpC) que hidrolizam
cefoxitina as carbapenemases como as metalo-beta-lactamases (MBL) e
carbapenemases tipo KPC (MOREIRA et al 2014)
O mecanismo de resistecircncia mais comum aos antibioacuteticos beta-lactacircmicos de
amplo espectro eacute a produccedilatildeo de ESBL por enterobacteacuterias A accedilatildeo hidroliacutetica
apresentadas por estas enzimas pode conferir clinicamente resistecircncia ao
aztreonam cefalosporina e a todas as penicilinas (PATERSON et al 2005) As
ESBL satildeo enzimas mediadas por genes plasmidiais (transmissiacuteveis entre as
espeacutecies) Os principais microrganismos produtores de ESBL satildeo Klebsiella
pneumoniae (mais encontrada) Escherichia coli e Proteus mirabilis podendo ocorrer
em outros membros da famiacutelia Enterobacteriaceae e em alguns microrganismos natildeo
enteacutericos como Acinetobacter ssp (TURNER 2005) A importacircncia cliacutenica meacutedica
destes microrganismos portadores de ESBL eacute que graccedilas aacutes suas resistecircncias a
muitas classes de antimicrobianos o tratamento de infecccedilotildees eacute difiacutecil gerando um
aumento da morbidade e mortalidade dos pacientes (SHAH et al 2004)
A enzima KPC foi detectada pela primeira vez na Carolina do Norte Costa
Leste dos Estados Unidos no ano de 1996 em Klebsiella pneumoniae dando entatildeo
este nome a enzima Em pouco tempo ela disseminou por outras regiotildees e
recentemente tornou-se uma das preocupaccedilotildees quanto agrave sauacutede puacuteblica mundial
Os paiacuteses de onde KPCs tecircm sido relatados desde 2001 satildeo mostrados na figura 2
apresentando como os organismos tecircm agora sido disseminados amplamente pelo
mundo (NEIL GUPTA et al 2011)
18
Figura 2 Divulgaccedilatildeo internacional de Enterobacteriaceae produtora de
Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC)( NEIL GUPTA et al 2011)
Este mapa apresenta paiacuteses onde Enterobacteriaceae produtoras KPC de
foram descritos em relatoacuterios publicados disponiacuteveis a partir de 11 fevereiro de
2011 Os paiacuteses natildeo destacadas nesta figura tambeacutem podem apresentar a presenccedila
de Enterobacteriaceae produtoras de KPC poreacutem pode ter tido uma falta de
vigilacircncia sistemaacutetica para estes organismos ( NEIL GUPTA et al 2011)
No ano de 2005 foram registradas pela primeira vez essas bacteacuterias
produtoras de carbapenemases Apoacutes 6 anos deste primeiro relato elas passaram a
causar surtos mais graves em nosso paiacutes Em janeiro de 2011 foram notificados no
Distrito FederalBrasil 367 casos em um curto espaccedilo de tempo (01 a 08 de janeiro
de 2011) com 26 oacutebitos A maior parte destes casos (263 casos) foi identificada nas
unidades de terapia intensiva ndash UTI (COTRIM et al 2012)
O potencial de disseminaccedilatildeo da KPC eacute alto devido agrave grande capacidade de
transferecircncia do seu material geneacutetico e por conseguinte os genes de resistecircncia
O controle de epidemias eacute difiacutecil devido a esta caracteriacutestica de faacutecil disseminaccedilatildeo
preocupando os profissionais da aacuterea de sauacutede devido agrave dificuldade de tratamento
podendo resultar em um aumento das taxas de mortalidade Apesar da maior
19
frequumlecircncia em Klebsiella pneumoniae a KPC pode ser identificada em outras
bacteacuterias como a Enterobacter cloacae Citrobacter freundii Salmonella spp E coli
e Pseudomonas spp (DIENSTMANN et al 2010)
Os pacientes com comorbidades incluindo pacientes transplantados
neutropecircnicos em ventilaccedilatildeo mecacircnica em Unidade de Terapia Intensiva (UTI)
com longos periacuteodos de internaccedilatildeo que apresentam risco aumentado de infecccedilatildeo ou
colonizaccedilatildeo para bacteacuterias multirresistentes satildeo mais vulneraacuteveis a Klebsiella
pneumoniae produtora de KPC (COTRIM et al 2012)
Os sinais e sintomas apresentados por um indiviacuteduo infectado por KPC satildeo
febre ou hipotermia taquicardia piora do quadro respiratoacuterio e em casos mais
graves hipotensatildeo inchaccedilo e sepse Quanto ao siacutetio de infecccedilatildeo a bacteacuteria que
possui a enzima KPC pode causar pneumonia associada agrave ventilaccedilatildeo mecacircnica
infecccedilatildeo do trato urinaacuterio infecccedilatildeo de corrente sanguiacutenea infecccedilatildeo de partes moles
e outros tipos de infecccedilatildeo (COTRIM et al 2012)
Para desenvolver a infecccedilatildeo a colonizaccedilatildeo eacute um preacute-requisito poreacutem o
pacientes pode estar colonizado ou seja ser portadores de KPC e natildeo desenvolver
a infecccedilatildeo (ALVES et al 2013) A forma de transmissatildeo eacute basicamente por
contato com secreccedilatildeo ou excreccedilatildeo de pacientes infectados ou colonizados logo
fora do ambiente hospitalar a bacteacuteria natildeo representa perigo (COTRIM et al
2012)
As opccedilotildees terapecircuticas para o tratamento da Klebsiella pneumoniae eacute
dividida em Terapia Empiacuterica e Terapia apoacutes a determinaccedilatildeo do perfil de
sensibilidade A terapia empiacuterica para infecccedilotildees por enterobacteacuterias multirresistentes
se baseia na utilizaccedilatildeo de polimixina B ou polimixina E (Colistina) em associaccedilatildeo
com um (1) ou mais dos antimicrobianos da classe dos aminoglicosiacutedeos
(gentamicina ou amicacina) Carbapenecircmicos (meropenem ou doripenem) eou
tigeciclina (ANVISA 2013)
Recomenda-se usar sempre associaccedilotildees de dois ou trecircs antimicrobianos
sendo um deles a polimixina B ou a polimixina E (colistina) Deve-se evitar a
utilizaccedilatildeo de monoterapias pelo risco de raacutepido desenvolvimento de resistecircncia A
escolha do(s) faacutermaco(s) de associaccedilatildeo com polimixina B ou E deve se basear
preferencialmente no perfil de susceptibilidade esperado aos referidos
20
medicamentos das enterobacteacuterias resistentes aos carbapenecircmicos detectadas no
hospital ou na ausecircncia de dados locais na regiatildeo Deve-se considerar igualmente
o local de infecccedilatildeo e a penetraccedilatildeo esperada do antimicrobiano na escolha da droga
a ser utilizada na combinaccedilatildeo (ANVISA 2013)
Apoacutes a liberaccedilatildeo do perfil de sensibilidade deve-se adequar o uso dos
medicamentos Sempre que possiacutevel manter no miacutenimo 2 (dois) faacutermacos com
sensibilidade comprovada in vitro Natildeo havendo sensibilidade a um segundo
medicamento (suscetibilidade apenas agrave polimixina B ou E) recomenda-se manter a
terapia combinada de polimixina B ou E com carbapenecircmicos (meropenem ou
doripenem) ou tigeciclina na tentativa de ocorrecircncia de sinergismo entre elas
(ANVISA 2013)
Sugere-se aleacutem da determinaccedilatildeo das Concentraccedilotildees Inibitoacuterias Miacutenimas
(CIMs) para uma das polimixinas (B ou E) que tambeacutem sejam determinadas as
CIMs de tigeciclina e carbapenecircmicos (meropenem) bem como a consultoria de um
infectologista (ou Comissatildeo de Controle de Infecccedilatildeo Hospitalar- CCIH) para a
determinaccedilatildeo da terapia combinada com base na interpretaccedilatildeo do antibiograma
CIM e quadro cliacutenico do paciente No caso de resistecircncia agraves polimixinas
(concentraccedilotildees inibitoacuterias miacutenimas [CIMs] gt 2 mgL) recomenda-se a associaccedilatildeo de
dois ou trecircs do antimicrobianos sugeridos para a combinaccedilatildeo (ANVISA 2013)
A antissepsia eficiente do ambiente dos instrumentos ciruacutergicos e das matildeos
com o uso do aacutelcool a 70 eacute fundamental para a contenccedilatildeo de surtos Aleacutem disto
os pacientes contaminados devem permanecer isolados ateacute o controle da infecccedilatildeo
para evitar a disseminaccedilatildeo da bacteacuteria (COTRIM et al 2012)
1 2 Resistecircncia bacteriana
Hoje a disseminaccedilatildeo e a proliferaccedilatildeo das bacteacuterias resistentes estatildeo cada
dia mais presente As bacteacuterias multirresistentes (BRMD) poderatildeo levar agrave
humanidade a uma era poacutes-antibioacutetica resultando em uma ausecircncia de qualquer
opccedilatildeo de tratamento para os portadores destas cepas (HENRIQUE et al 2014)
Os fatores envolvidos na disseminaccedilatildeo desses patoacutegenos multirresistentes
satildeo diversos incluindo o uso irracional de antimicrobianos procedimentos invasivos
21
(cirurgias implantaccedilatildeo de proacuteteses meacutedicas e outros) e a transferecircncia de material
geneacutetico com a informaccedilatildeo de resistecircncia a antibioacuteticos entre as bacteacuterias
(DIENSTMANN et al 2010 ENDIMIAMI et al 2009 FONTANA et al 2010)
Com a praacutetica da antibioticoterapia principalmente em ambientes
nosocomiais os mecanismos de resistecircncia tornaram-se comuns Esses
mecanismos incluem alteraccedilatildeo na permeabilidade da membrana celular que
impede a entrada do antibioacutetico na ceacutelula bombeamento do antibioacutetico para fora da
mesma pelo mecanismo de efluxo mutaccedilatildeo geneacutetica que altera de alguma forma o
alvo do antibioacutetico e consequumlentemente natildeo afeta o funcionamento da bacteacuteria
bem como desenvolvimento da capacidade de degradar ou da inativaccedilatildeo do
antibioacutetico (COTRIM et al 2012) Estes mecanismos estatildeo representados na figura
3
Figura 3 Mecanismos de resistecircncia bacteriana Fonte
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controle
opas_webmodulo3pop_mecanismohtmgt
Um dos mais importantes mecanismos de resistecircncia eacute a alteraccedilatildeo do local-
alvo onde atua determinado antimicrobiano de modo a impedir a ocorrecircncia de
qualquer efeito inibitoacuterio ou bactericida As bacteacuterias podem adquirir um gene que
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codifica um novo produto resistente aos antimicrobianos substituindo o alvo original
por exemplo o Staphylococcus aureus resistente agrave oxacilina e estafilococos
coagulase-negativos adquiriram o gene cromossocircmico Mec A e produzem uma PBP
ou PLP resistente aos β-lactacircmicos denominada 2a ou 2 que eacute suficiente para
manter a integridade da parede celular durante o crescimento quando outras PBPs
essenciais satildeo inativadas por antibimicrobianos β-lactacircmicos Como alternativa um
gene receacutem-adquirido pode atuar para modificar um alvo tomando-o menos
vulneraacutevel a determinado antimicrobiano Assim um gene transportado por
plasmiacutedeo ou por transposon codifica uma enzima que inativa os alvos ou altera a
ligaccedilatildeo dos antimicrobianos como ocorre com eritromicina e clindamicina (ANVISA
2007)
Em funccedilatildeo da bomba de efluxo pode variar a especificidade do antibioacutetico
Ele atua por meio do bombeamento ativo de antimicrobianos do meio intracelular
para o extracelular gerando uma resistecircncia bacteriana a determinados
antimicrobianos como eacute o caso da resistecircncia agraves tetraciclinas codificada por
plasmiacutedeos em Escherichia coli devido agrave presenccedila de proteiacutenas integrantes da
membrana plasmaacutetica bacteriana (PIDDOCK 2006)
O aumento da siacutentese de proteiacutenas eacute o principal responsaacutevel pela resistecircncia
antimicrobiana devido agraves vaacuterias mutaccedilotildees que ocorrem em seus repressores
transcricionais Estas mutaccedilotildees tambeacutem podem influenciar levando a um aumento
da eficiecircncia do transporte dos antibioacuteticos para o exterior da ceacutelula (HARBOTTLE
et al 2006)
A resistecircncia aos antibioacuteticos eacute frequumlentemente associada agrave alteraccedilatildeo
diminuiccedilatildeo da permeabilidade que ocorre na membrana externa das bacteacuterias gram-
negativas O fluxo de moleacuteculas para o interior da ceacutelula ocorre por caracteriacutesticas
peculiares como carga estrutura e dimensatildeo e atraveacutes de proteiacutenas de membrana
as quais formam canais Este percurso eacute utilizado pelos antibioacuteticos para atingir o
interior da ceacutelula bacteriana ou o espaccedilo periplasmaacutetico como eacute o caso dos
antibioacuteticos β-lactacircmicos Portanto a perda de funccedilatildeo destas proteiacutenas pode
efetivamente causar a diminuiccedilatildeo da susceptibilidade a vaacuterios antibioacuteticos
(LIVERMORE 2003)
23
Os mecanismos de resistecircncia que podem impedir a accedilatildeo de antimicrobianos
satildeo vaacuterios O faacutermaco atua de forma a inibir os processos essenciais a multiplicaccedilatildeo
e sobrevivecircncia da ceacutelula bacteriana como a membrana citoplasmaacutetica e
consequumlentemente bloqueando a siacutentese proteacuteica de aacutecidos nucleacuteicos e da parede
celular A resistecircncia bacteriana eacute um mecanismo natural de defesa Sendo assim
as bacteacuterias estatildeo em constante defesa e para cada novo faacutermaco desenvolvido as
bacteacuterias iratildeo desenvolver resistecircncia em algum momento (POSSEBON et al
2003)
O grupo de antibioacuteticos beta-lactacircmicos satildeo amplamente utilizado e se
encontram dentro da classe dos melhores agentes antimicrobianos com relevacircncia
cliacutenica No entanto o seu uso tem sido restringido devido a vaacuterios mecanismos de
resistecircncia O desenvolvimento dos carbapenecircmicos surgiu devido agrave proliferaccedilatildeo de
beta-lactamases mediadas por plasmiacutedeos e cromossomos (POSSEBON et al
2003)
A bacteacuteria KPC tem um gene chamado SHV-1 que tem a caracteriacutestica de
resistecircncia a quase todos os tipos de antimicrobianos inclusive os carbapenecircmicos
especiacuteficos para o tratamento de infecccedilotildees por bacteacuterias multiresistentes e
emergecircncias Mesmo com no seu coacutedigo geneacutetico a informaccedilatildeo necessaacuteria para o
desenvolvimento da resistecircncia a resistecircncia da bacteacuteria soacute eacute desenvolvida caso a
bacteacuteria entre em contato com o antibacteriano desencadeando todo o processo
nos casos de resistecircncia induzida comuns em KPC (MOREIRA et al 2014)
A resistecircncia bacteriana pode ser apresentada de forma intriacutenseca ou
adquirida A resistecircncia intriacutenseca faz parte das caracteriacutesticas fenotiacutepicas naturais
do microrganismo ou seja faz parte de sua heranccedila geneacutetica sendo transmitida
verticalmente a prole sem perda da caracteriacutestica A presenccedila ou ausecircncia do alvo
para a accedilatildeo da droga eacute o principal determinante deste tipo de resistecircncia
(MOREIRA et al 2014) Essa resistecircncia corresponde a uma caracteriacutestica de
espeacutecie bacteriana quando estes microrganismos satildeo naturalmente resistentes a
certo tipo de antibioacutetico Este processo eacute decorrente da ausecircncia de estruturas de
atuaccedilatildeo de antimicrobianos ou a impermeabilidade por parte de estruturas
perifeacutericas das bacteacuterias (HENRIQUE et al 2014)
24
A resistecircncia adquirida aos antibioacuteticos por sua vez ocorre quando haacute uma
da mutaccedilatildeo de genes reguladores ou estruturais aquisiccedilatildeo de genes de resistecircncia
veiculados por elementos geneacuteticos moacuteveis ou da combinaccedilatildeo entre eles Este
aparecimento de resistecircncia em uma espeacutecie bacteriana era anteriormente sensiacutevel
a droga e devido a um destes fatores se torna resistente O fenoacutetipo resultante
desta resistecircncia natildeo estaraacute presente nas ceacutelulas genitoras e sim nos indiviacuteduos de
uma linhagem bacteriana derivada de um organismo susceptiacutevel Os genes muitas
vezes satildeo adquiridos por meio de elementos moacuteveis como plasmiacutedeos e
transposons (MOREIRA et al 2014)
Entatildeo a resistecircncia adquirida ocorre por diversos mecanismos geneacuteticos tais
como produccedilatildeo de enzimas inativadoras interferecircncia com a entrada e acuacutemulo de
droga na bacteacuteria alteraccedilatildeo do receptor para accedilatildeo da droga via metaboacutelica
alternativa Eacute originada por meio de uma alteraccedilatildeo a niacutevel geneacutetico da ceacutelula de
natureza cromossocircmica pelos processos de mutaccedilatildeo transduccedilatildeo e transformaccedilatildeo
ou extra cromossocircmica (plasmidial) (HENRIQUE et al 2014)
Como todo antibioacutetico β-lactacircmicoos carbapenecircmicos tem como mecanismo
de accedilatildeo a inibiccedilatildeo da siacutentese proteacuteica atraveacutes da accedilatildeo de inibiccedilatildeo da parede
microbiana fazendo a ligaccedilatildeo e inativaccedilatildeo das proteiacutenas ligadoras de penicilinas
(NETO et al 2007)
Imipenem e meropenem antibioacuteticos pertencentes ao grupo dos
carbapenecircmicos possuem um amplo espectro de accedilatildeo in vitro incluindo atividade
contra cocos gram-positivos bacilos gram-negativos e bacteacuterias anaeroacutebias (MOHR
2008) Jaacute o ertapenem possui um espectro de accedilatildeo mais limitado que o os dois
antibioacuteticos anteriormente citados tendo uma eficiecircncia limitada contra os bacilos
gram-negativos natildeo fermentadores Um novo antibioacutetico carbapenecircmico ainda natildeo
disponiacutevel no Brasil doripenem possui uma atividade mais potente principalmente
contra Pseudomona aeruginosa devido ao seu mecanismo de accedilatildeo que combina os
espectros de accedilatildeo de imipenem e meropenem (ZHANEL et al 2007)
Devido as suas estabilidades espectro de accedilatildeo poucos relatos de
resistecircncia boa toleracircncia pelos pacientes com efeitos adversos mais comuns as
complicaccedilotildees no siacutetio da infusatildeo e toxicidade gastrintestinal estes antibioacuteticos
carbapenecircmicos tecircm sido considerados terapia de escolha (NICOLAU 2008) Como
25
uma resposta adaptativa das Enterobacteacuterias o iacutendice de resistecircncia aos
carbapenecircmicos tem aumentado nos uacuteltimos anos de forma proporcional ao seu
uso limitando imensamente as opccedilotildees terapecircuticas para as infecccedilotildees causadas por
estes microrganismos (FALAGAS et al 2009)
As enzimas produtoras de betalactamases hidrolisam o anel betalactacircmico
tornando este mecanismo de resistecircncia o mais importante Os dois grupos mais
preocupantes satildeo o grupo das betalactamases de aspecto ampliado e os da
carbapenemases que aleacutem de hidrolizar os carbapenecircmicos hidrolizam todas as
outras classes de betalactacircmicos Em enterobacteacuterias as carbapenemases mais
prevalentes satildeo codificadas por genes dos grupos blaKpc blaIMP blaVIM blaNdm
e blaOxa A ocorrecircncia de carbapenemases eacute mais frequentemente em bacteacuterias
gram-negativas fermentadoras da glicose conhecidas como enterobacteacuterias
predominantes nos gecircneros Klebsiella Serratia Citrobacter Enterobacter
Escherichia Samonella Proteus Morganella Podem ser encontradas tambeacutem em
bacteacuterias gram-negativas natildeo fermentadoras como espeacutecies de Acinetobacter e de
Pseudomonas (ALVES et al 2013)
Carbapenemases satildeo enzimas plasmiacutedio-mediados resistentes a todos
antibioacuteticos betalactacircmicos As bacteacuterias que possuem o gene blaKpC responsaacutevel
pela codificaccedilatildeo da produccedilatildeo de carbapenemases apresentam resistecircncia aos
antibioacuteticos betalactacircmicos impedindo a accedilatildeo destes antibioacuteticos contra infecccedilotildees
(ALVES et al 2013)
A transmissatildeo das carbapenemases a diferentes cepas de enterobacteacuterias se
daacute atraveacutes de plasmiacutedeos que satildeo pequenas moleacuteculas circulares de DNA com a
capacidade de se replicarem independentemente do DNA cromossocircmico
permitindo a troca de material geneacutetico entre gecircneros e espeacutecies diferentes de
enterobacteacuterias O raacutepido desenvolvimento de surtos em ambientes hospitalares eacute
explicado por essa disseminaccedilatildeo plasmidial (COTRIM et al 2012)
De acordo com o criteacuterio de interpretaccedilatildeo do Clinical and Laboratory
Standards Institute (CLSI 2009) a maioria das KPC isoladas natildeo apresenta
resistecircncia completa aos carbapenecircmicos (Imipenem e Meropenem apresentam
uma Concentraccedilatildeo Inibitoacuteria Miacutenima (CIM) de 2-8 μgmL) (COTRIM et al 2012)
26
Os mecanismos de resistecircncia capazes de impedir a accedilatildeo dos
carbapenecircmicos satildeo vaacuterios Poreacutem a degradaccedilatildeo de antibioacuteticos por enzimas
principalmente as carbapenemases constituem o principal mecanismo de
resistecircncia aos antibioacuteticos β-lactacircmicos (DIAS 2009) Devido a ampla atividade
hidroliacutetica agrave maioria dos antibioacuteticos β-lactacircmicos estes grupos de enzimas possuem
alta versatilidade (QUEENAM et al 2007)
Existem trecircs grandes classes moleculares de Ambler a qual as
carbapenemases pertencem denominadas classe A (serino-carbapenemases os
quais incluem membros designados SME IMI NMC GES e a famiacutelia das KPCs)
classe B(as metalo-β-lactamase incluem os tipos IMP e VIM) e classe D
(oxacilinases similares as da classe A e incluem as OXA e PSE) (DIAS 2009)
Dentre estes as mais importantes e prevalentes encontradas em plasmiacutedeos
de Klebsiella pneumoniae satildeo as KPC (DIENSTMANN et al 2010) Por meio de
estudos moleculares a enzima KPC jaacute foi documentada em diferentes bacteacuterias e
diferenciada em KPC-1 a 13 (NETIKUL et al 2011) No ano de 2009 foi realizada
uma pesquisa onde descreveram as seguintes carbapenemases KPC-1 em isolados
de Klebsiella pneumoniae KPC-2 em K pneumoniae K oxytoca Salmonella
enterica e em Enterobacter sp e KPC-3 em K pneumoniae e Enterobacter cloacae
(MONTEIRO et al 2009) As enzimas KPC-4 e KPC-5 foram encontradas em
isolados de Pseudomonas aeruginosa (PEIRANO et al 2009)
Foi observada uma correccedilatildeo da sequumlecircncia KPC-1 indicando que o gene
blaKPC-1 e blaKPC-2 satildeo idecircnticos Trecircs novas variantes blaKPC-3 blaKPC-4 e
blaKPC-5 satildeo resultados de mutaccedilotildees do gene estrutural da enzima KPC-2
(WOLTER et al 2008) apresentando diferentes perfis de hidroacutelise As enzimas
KPC-2 e KPC-3 possuem alta eficiecircncia em hidrolisar cefalotina cefaloridina e
nitrocefin poreacutem possuem uma menor eficiecircncia contra carbapenecircmicos e
cefotaxima (ALBA et al 2005) As enzimas KPC-5 e KPC-4 apresentam menor
hidroacutelise de carbapenecircmicos eacute do que em KPC-2 Em contrapartida possuem
melhor eficiecircncia contra ceftazidima e uma maior inibiccedilatildeo pelo aacutecido clavulacircnico
(WOLTER et al 2008)
27
13 Anaacutelise geneacutetica de microrganismos
Eacute de extrema importacircncia praacutetica natildeo soacute no aspecto cliacutenico mas tambeacutem na
fitopatologia biotecnologia e estudos ambientais a correta identificaccedilatildeo e
classificaccedilatildeo de microrganismos Os meacutetodos usados na diferenciaccedilatildeo de gecircneros
espeacutecies e estirpes de microrganismos podem ser divididos em meacutetodos fenotiacutepicos
(baseados em fenocircmenos bioquiacutemicos fisioloacutegicos e bioloacutegicos) e genotiacutepicos
(detectam polimorfismos ao niacutevel dos aacutecidos nucleacuteicos ou variaccedilatildeo aleacutelica ao niacutevel
de enzimas) (ALVES et al 2003)
Para este tipo de estudo existem alguns meacutetodos como o RFLPrsquos -
ldquoRestriction Fragment Length Polymorphismsrdquo (polimorfismos de tamanho de
fragmentos de restriccedilatildeo) rep-PCR (Meacutetodo de tipagem baseado na amplificaccedilatildeo via
PCR de elementos de DNA repetitivos presentes em genomas bacterianos) anaacutelise
de sequumlecircncias nucleotiacutedeas (discriminaccedilatildeo eou identificaccedilatildeo atraveacutes de sequumlecircncias
de DNA) PFGE - Pulsed-Field Gel Electrophoresis (Eletroforese em campo
pulsado) ( A L V E S et al 2003)
A diferenciaccedilatildeo clara da cepa e principalmente a alta reprodutibilidade devem
ser caracteriacutesticas de qualquer meacutetodo de tipagem geneacutetica Poreacutem nem todos os
meacutetodos moleculares de tipagem satildeo igualmente eficazes Sendo assim de acordo
com a finalidade pretendida (identificaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo custo reprodutibilidade
etc) eacute feita a escolha do meacutetodo a ser aplicado (A L V E S et al 2003)
O processo de identificaccedilatildeo fenotiacutepica de KPC entre os membros da famiacutelia
Enterobacteriaceae ainda eacute difiacutecil e os meacutetodos para a sua identificaccedilatildeo devem ser
revistos e ajustados Mesmo com o avanccedilo tecnoloacutegico natildeo existem ensaios que
combinam alta especificidade e sensibilidade na detecccedilatildeo destas enzimas Satildeo
diversas as metodologias usadas para rastreamento de KPC como por exemplo a
focalizaccedilatildeo isoeleacutetrica a teacutecnica de disco-difusatildeo E-test teste de Hodge
modificado dentre outros Aleacutem disso a pesquisa do gene blaKPC pode ser feita
pela Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) Os sistemas de automaccedilatildeo
existentes no entanto podem natildeo identificar com precisatildeo os isolados KPC
positivos (COTRIM et al 2012)
A identificaccedilatildeo blaKPC pelo PCR eacute um meacutetodo raacutepido preciso sensiacutevel e
altamente especiacutefico no entanto a PCR exige equipamento e conhecimentos
28
especializados em diagnoacutestico molecular dificultando ainda a utilizaccedilatildeo dele na
rotina dos laboratoacuterios de microbiologia (COTRIM et al 2012)
Em estudo de infecccedilotildees hospitalares identificaccedilatildeo molecular de patoacutegenos
bacterianos eacute bastante utilizada Para diferenciar carbapenemases tipo KPC a partir
de outros tipos como SME NMC-A-IMI e GES eacute necessaacuterio um exame molecular
As identificaccedilotildees do microrganismo juntamente com a triagem molecular iratildeo definir
um resultado mais especiacutefico podendo ser usado para identificar o antibioacutetico mais
adequado para o tratamento Poreacutem a principal desvantagem de alguns exames
baseados em PCR por exemplo eacute que devido agrave sua limitada capacidade de
multiplexaccedilatildeo eles distinguem apenas algumas variaccedilotildees (MOREIRA et al 2014)
Estatildeo descritas para a identificaccedilatildeo molecular de patoacutegenos pertencentes agrave
famiacutelia Enterobacteriaceae as teacutecnicas de PFGE RAPD (randomly amplified
polymorphic DNA) e ERIC-PCR (Enterobacterial Repet it ive Intergenic Consensus)
A PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) eacute considerada padratildeo ouro devido sua
alta capacidade de diferenciaccedilatildeo baseada na anaacutelise do perfil de restriccedilatildeo do DNA
genocircmico por meio de eletroforese Como desvantagem para a sua execuccedilatildeo eacute
necessaacuterios vaacuterios dias impedindo a tipagem de algumas cepas bacterianas devido
agrave degradaccedilatildeo do DNA aleacutem do alto custo empregado (MOREIRA et al 2014)
O meacutetodo baseado em ERIC-PCR tem sido bastante utilizado como uma
alternativa para a teacutecnica de PFGE Esta teacutecnica consiste na anaacutelise do padratildeo de
amplificaccedilatildeo de elementos repetidos encontrados no genoma bacteriano Isto
permite uma maior rapidez na obtenccedilatildeo de resultados quando comparada com o
PFGE aleacutem de alta reprodutibilidade simples execuccedilatildeo e implementaccedilatildeo baixo
custo e natildeo sem problemas com a degradaccedilatildeo do DNA (MOREIRA et al 2014)
A PCR eacute considerada uma teacutecnica de biologia molecular revolucionaacuteria que
consiste na siacutentese enzimaacutetica de coacutepias de aacutecidos nucleacuteicos Ela permitiu o raacutepido
desenvolvimento do estudo de sequumlecircncias de aacutecidos nucleacuteico Foi desenvolvida por
Kary Banks Mullis que ganhou o precircmio Nobel de quiacutemica de 1993 devido ao
desenvolvimento dessa teacutecnica em abril de 1983 (CAMARGO et al 2014)
Por meio de etapas de variaccedilatildeo de temperatura a teacutecnica de PCR promove a
duplicaccedilatildeo de cadeias de DNA in vitro A reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo de DNA por PCR
envolve o emprego de sequumlecircncias iniciadoras (primers) quatro nucleotiacutedeos
29
(dNTPrsquos) do DNA e uma DNA polimerase termoestaacutevel podendo assim obter-se a
partir de uma fita molde muitas coacutepias de uma sequumlecircncia especiacutefica de aacutecido
nucleacuteico O princiacutepio da PCR consiste na variaccedilatildeo de temperatura por ciclo
envolvendo trecircs etapas baacutesicas desnaturaccedilatildeo pareamento e amplificaccedilatildeo
(CAMARGO et al 2014)
A desnaturaccedilatildeo da fita molde de DNA eacute uma etapa com duraccedilatildeo entre 30
segundos a 1 minuto a temperatura entre 92 ordmC a 96 ordmC Apoacutes isso o pareamento de
dois iniciadores sinteacuteticos de composiccedilotildees distintas que funcionam como os
iniciadores da reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo liga-se agrave regiatildeo complementar da fita de
DNA alvo que sofreraacute a duplicaccedilatildeo Esta etapa tem duraccedilatildeo de 30 segundos a 1
minuto a temperatura entre 58 ordmC e 65 ordmC Por uacuteltimo a amplificaccedilatildeo por meio da
enzima Taq DNA polimerase das novas fitas de DNA se daacute a partir de cada um dos
iniciadores utilizando os quatro dNTPrsquos como substrato da reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo
Esta etapa possui duraccedilatildeo entre 45 segundos e 1 minuto a 72 ordmC Cada ciclo eacute
repetido em torno de 30 a 35 vezes e promove a amplificaccedilatildeo da regiatildeo alvo
determinada conforme o anelamento dos iniciadores sinteacuteticos de DNA (CAMARGO
et al 2014) Estas etapas estatildeo demonstradas na figura 4
Figura 4 Etapas da Reaccedilatildeo de PCR
30
2 JUSTIFICATIVA
No ano de 2010 no Distrito Federal foram identificados 111 pacientes com
suspeita de infecccedilatildeo por Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) e a
Secretaria de Sauacutede do Distrito Federal confirmaram ainda a morte de 18 pacientes
dentre os hospitais puacuteblicos e particulares Um desafio encontrado por ocasiatildeo do
surto infeccioso no Distrito Federal foi o de confirmar as KPCs por Reaccedilatildeo da
Polimerase em Cadeia sendo que as amostras foram enviadas com esta finalidade
para a Fiocruz no Rio de Janeiro
Pesquisas que possam contribuir na elaboraccedilatildeo de estrateacutegias preventivas e
de intervenccedilatildeo para infecccedilotildees causadas por enterobacteacuterias bem como contribuir
para gerar uma integraccedilatildeo beneacutefica entre a equipe acadecircmica e os serviccedilos de
sauacutede devem ser estimuladas Neste sentido o presente estudo permitiu escrutinar
os genes envolvidos na expressatildeo de carbapenemases presentes em espeacutecies de
enterobacteacuterias isoladas em ambiente hospitalar visto que elucidar genes de
resistecircncia de enterobacteacuterias aos antibioacuteticos carbapenecircmicos eacute o primeiro passo
para garantir um controle epidemioloacutegico efetivo para estes tipos de microorganismo
assim como sua associaccedilatildeo com surtos fatais particularmente em pacientes com
baixa imunidade
31
3 OBJETIVOS
31 Objetivo geral Caracterizar os genes de resistecircncia das
Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases e os aspectos epidemioloacutegicos de
pacientes internados em um hospital puacuteblico do Distrito Federal
32 Objetivos Especiacuteficos
Identificar genotipicamente a enzima KPC (Klebsiella pneumoniae
carbapenemase) de isolados de Klebsiella pneumoniae
Investigar aspectos epidemioloacutegicos dos pacientes portadores de
Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases
Identificar quais variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana influenciaram para o
desfecho oacutebito ou alta
Avaliar a susceptibilidade das Enterobacteacuterias aos antibioacuteticos
carbapenecircmicos dos pacientes em ambiente hospitalar
32
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
Trata-se de um estudo transversal onde foi realizado o teste de
susceptibilidade das enterobacteacuterias aos antibioacuteticos carbapenecircmicos a partir dos
materiais bioloacutegicos coletados dos pacientes internados no Hospital Regional da Asa
Norte (HRAN) e enviados ao Laboratoacuterio de Anaacutelises Cliacutenicas da mesma Instituiccedilatildeo
Os materiais bioloacutegicos investigados foram sangue aspirado traqueal ou brocircnquico
urina e cultura semi quantitativa de ponta de cateter venoso central O HRAN eacute um
hospital puacuteblico do Distrito Federal com 395 leitos sendo as cliacutenicas de internaccedilatildeo
Berccedilaacuterio Cirurgia Geral Cirurgia Plaacutestica Cliacutenica Meacutedica Ginecologia Maternidade
Pediatria Queimados UTI com atendimento a pacientes portadores de doenccedilas de
caraacuteter cliacutenico e ciruacutergico
4 1 Coleta e transporte das amostras bioloacutegicas
As amostras foram coletadas de pacientes internados no Hospital Regional da
Asa Norte (HRAN) com suspeitas de infecccedilatildeo por KPC A identificaccedilatildeo primaacuteria foi
realizada pelo Laboratoacuterio de Microbiologia do hospital de origem dos pacientes e os
demais procedimentos que foram utilizados na identificaccedilatildeo encontram-se descritos
abaixo
4 2 Procedimentos para confirmaccedilatildeo de resistecircncia bacteriana por
disco de ertapenem (adaptado CDC 2004)
Para diagnosticar amostra como portadora de bacteacuteria produtora de
carbapenemase foi realizado o teste com disco de ertapenem como forma de
triagem Inicialmente utilizou-se o swab contaminado com a amostra que foi
distribuiacuteda em uma pequena aacuterea da placa de aacutegar MacConkey para apoacutes o
crescimento ser realizada a pesquisa de colonizaccedilatildeo por enterobacteacuterias resistentes
aos carbapenecircmicos (Pesquisa de CRE) Procedeu-se a semeadura por teacutecnica
semi-quantitativaesgotamento com alccedila bacterioloacutegica na diluiccedilatildeo de 1100 O disco
de Ertapenem foi colocado na superfiacutecie da placa de MacConkey na junccedilatildeo dos dois
primeiros campos de semeadura conforme demonstrado na figura 5 Incubou a placa
33
em estufa aeroacutebia a 35ordmC por 24 e 48 horas e observou-se o halo de difusatildeo do
disco de Ertapenem na placa para proceder agrave leitura
O teste deixou de ser obrigatoacuterio apoacutes a modificaccedilatildeo dos criteacuterios
interpretativos para carbapenecircmicos para enterobacteacuterias publicados no suplemento
do CLSI 2010 M100-S20-U
Figura 5 Mecanismo de semeamento de material bioloacutegico oriundos de
pacientes com suspeita de infecccedilatildeo por KPC Fonte adaptado CDC 2004
4 2 1 Interpretaccedilatildeo dos resultados
Na ausecircncia de crescimento ateacute 24 horas (MacConkey) ou halo de difusatildeo
gt27 mm na placa deve-se reincubar as placas por mais 24 horas Quando for
ausente o crescimento apoacutes 48 horas ou halo de difusatildeo gt27 mm na placa libera-se
como enterobacteacuterias resistentes a carbapenecircmicos (KPCNEG)Havendo
crescimento de colocircnias na placa de MacConkey com halo lt 27 mm (apenas para
colocircnias com crescimento dentro do halo) deve-se reisolar e realizar identificaccedilatildeo e
antibiograma automatizado teste de sensibilidade por disco-difusatildeo e Teste de
Hodge Modificado (THM) Os isolados de enterobacteacuterias cujos testes comprovarem
a resistecircncia aos carbapanecircmicos testados (KPCPOS) foram reportado a Comissatildeo
de Controle de Infecccedilatildeo Hospitalar (CCIH) Jaacute osbacilos Gram-negativos natildeo
fermentadores natildeo foram reportados (KPCNEG) Para interpretaccedilatildeodos resultados
foram utilizados os valores conforme demonstrados na tabela 1
Tabela 1 Criteacuterios Interpretativos para testes de sensibilidade
ENTEROBACTEacuteRIAS
Disco difusatildeo (mm) MIC (microgml)
34
Antibioacutetico Sigla S I R S I R
Ertapenem 10
microg
ETP 22 19-
21
18 05 1 2
Meropenem 10
microg
MEM 23 20-
22
19 1 2 4
Fonte Manual Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)
2013
Os resultados que apresentaram resistecircncia ao antibioacutetico Ertapenem foram
considerados como suspeitos de contaminaccedilatildeo por KPC Fez-se o teste de
susceptibilidade aos antibioacuteticos (TSA) em aparelho automatizado MicroScan Walk
Away 96sl Dade Behring
4 3 Teste de susceptibilidade aos antibioacuteticos (adaptado CDC 2004)
A determinaccedilatildeo da susceptibilidade dos isolados foi feita pelo teste de
susceptibilidade aos antibioacuteticos (TSA) apoacutes cultura em meio de gelose simples
(INSA) para avaliaccedilatildeo da sua pureza e obtenccedilatildeo de colocircnias isoladas Para
preparaccedilatildeo de uma suspensatildeo bacteriana com turvaccedilatildeo aproximada de 05
McFarland (Dade BehringMicroScanregTurbidity Meter) ressuspendeu duas a cinco
colocircnias em 2ml de soro fisioloacutegico esteacuteril diluindo a 1100 em soro fisioloacutegico num
volume total de 10ml em seguida foi feita uma semeadura em duas placas
quadradas (120mm x 120mm) de Muller-Hinton Agar (INSA) por inundaccedilatildeo
Os discos de antibioacutetico carbapenecircmicos imipenem meropenem e
ertapenem (Biorad) foram aplicados com o auxiacutelio de um dispensador automaacutetico A
susceptibilidade das Enterobacteacuterias aos carbapenecircmicos foi definida de acordo
com o protocolo Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI 2011)
Para aquelas Enterobacteacuterias que apresentaram resistecircncia ao ertapenem
foram realizados o Teste de Hodge Modificado para Detecccedilatildeo de Enterobacteacuterias
Produtoras de Carbapenemases conforme descrito pelo Centers for Disease Control
and Prevention (CDC 2004)
35
4 4Teste de Hodge Modificado (THM) (adaptado CDC 2004)
Preparou-se uma suspensatildeo em salina esteacuteril com a cepa Escherichia coli
ATCC 25922 (padratildeo 05 de McFarland) Apoacutes isto diluiu a suspensatildeo 110 em
salina (05 ml da soluccedilatildeo de Ecoli ATCC 25922 + 45 ml salina)Foi entatildeo semeado
na superfiacutecie de uma placa de Agar Muller-Hinton com a suspensatildeo diluiacuteda de Ecoli
ATCC 25922 com auxilio de swab seco assegurando que houvesse uma
distribuiccedilatildeo uniforme cobrindo toda a superfiacutecie do Agar Deixou secar por 3 a 5
minutos em temperatura ambienteColocou-se o disco de ertapenem 10microg no centro
da placa e apoacutes isto fez-se uma estria linear da cepa a ser testada da borda do
disco ateacute a borda da placa utilizando uma alccedila calibrada 10 microl ou um swab Incubou
a placa na estufa em atmosfera aeroacutebia a 35 plusmn 2ordmC por 16 a 24 horas
441 Controle de qualidade (CQ)
Foi utilizado um CQ todos os dias em que se realizou o teste tendo como
controle Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1705- teste de Hodge modificado
positivo Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1706- teste de Hodge modificado
negativo
442 InterpretaccedilatildeoResultados
Apoacutes 16ndash24 horas de incubaccedilatildeo examinar as placas para verificar a presenccedila
de uma distorccedilatildeo no halo de inibiccedilatildeo do disco de ertapenem devido ao crescimento
realccedilado da cepa ATCC na intersecccedilatildeo do organismo teste e a Ecoli ATCC 25922
dentro dos limites do halo O THM positivo apresentaraacute presenccedila de distorccedilatildeo no
halo de inibiccedilatildeo de ertapenem devido ao crescimento da cepa Ecoli ATCC 25922 ao
longo da estria da cepa teste para dentro dos limites do halo de inibiccedilatildeo Jaacute o THM
negativo teraacute ausecircncia de crescimento da cepa Ecoli ATCC 5922 ao longo da estria
da cepa teste para dentro dos limites do halo de inibiccedilatildeo do disco de ertapenem
Este resultado estaacute representado na figura 6
36
Figura 6 Interpretaccedilatildeo resultado do Teste de Hodge Modificado
(adaptado CDC 2004) Teste positivo na estria da cepa teste na parte superior
da placa teste negativo na estria da cepa teste na parte inferior da placa
Tendo positivo como resultado o paciente era um provaacutevel contaminado por
KPC As amostras entatildeo foram encaminhadas para a Fundaccedilatildeo Osvaldo Cruz
(FIOCRUZ) para confirmaccedilatildeo final As amostras finalmente confirmadas como
positivas para KPC foram isoladas e guardadas no banco de cepas cliacutenicas do
hospital Apoacutes a autorizaccedilatildeo do CEP amostras das cepas foram transferidas para
meio de transporte Stuard em caixa teacutermica fechada em baixa temperatura e
levadas para o laboratoacuterio de microbiologia cliacutenica da universidade
No laboratoacuterio da universidade as amostras foram separadas e realizadas
repiques em meios MacConkey e incubadas por 24h As colocircnias caracteriacutesticas
foratildeo isoladas em caldo BHI e mantidas em shaker a 37oC por 2h Apoacutes isto foram
executadas as anaacutelises a seguir
Os isolados de Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases foram
submetidos agrave extraccedilatildeo de DNA e posterior sequumlenciamento para identificaccedilatildeo dos
genes de resistecircncia blaKPC de 1 a 13 e identificaccedilatildeo do gene universal Os
pacientes de onde os materiais bioloacutegicos contendo as Enterobacteacuterias produtoras
de carbapenemases foram os isolados foram investigados quanto aos aspectos
epidemioloacutegicos e cliacutenicos
37
4 5 Extraccedilatildeo de DNA bacteriano
A extraccedilatildeo de DNA bacteriano foi realizada utilizando o kit NucleoSpin
Plasmidreg (MN) Antes de iniciar a extraccedilatildeo foi feito a preparaccedilatildeo das soluccedilotildees
reagentes materiais e amostras (vortexando) colocou-se em banho-maria agrave 50ordmC o
tampatildeo AW Partiu-se de colocircnias isoladas cultivadas que sofreram passagem em
meio LB liacutequido por 12h Adicionou-se 15 mL da amostra no tubo eppendorf
centrifugou por 5 minutos descartou o sobrenadante (com cuidado para natildeo
descartar o Pellet) Repetiu-se este procedimento por mais trecircs vezes completando-
se o volume de 6mL Foram adicionados 250microL do tampatildeo Resuspension Buffer A1
encostando a ponteira no Pellet e misturando (este tampatildeo tem como funccedilatildeo
separar a formaccedilatildeo de grumos celulares) Apoacutes isso homogeneizou e vortexou os
tubos eppendorfs Apoacutes isso foram adicionados 250microL do tampatildeo Lysis Buffer A2
homogenizou e deixou descansar por 5 minutos (esta etapa eacute importante para a lise
da parede e da membrana celulares e liberaccedilatildeo do conteuacutedo da ceacutelula)
Passado o tempo de descanso foi adicionado 300microL do tampatildeo
Neutralization Buffer A3 homogeneizou e centrifugou por 10 minutos (este tampatildeo
iraacute retirar as proteiacutenas que envolvem o DNA e voltaraacute com o pH para proacuteximo de 8
impedindo que a soluccedilatildeo de lise facilite a quebra das ligaccedilotildees covalentes do aacutecido
nucleacuteico) Em seguida enumeraram-se os tubos contendo filtros com siacutelica
transferiu-se o sobrenadante para o filtro e centrifugou por 5 minutos Descartou-se
o que foi filtrado adicionou 500microL do tampatildeo AW (banho-maria) centrifugou por 2
minutos Novamente foi descartado o filtrado Adicionou-se 600microL do tampatildeo A4
centrifugou por 2 minutos e descartou o filtrado (os tampotildees AW e A4 contecircm
isotiocianato de guanidina em concentraccedilotildees crescentes para facilitar a adsorccedilatildeo
do DNA na siacutelica e retirada das outras biomoleacuteculas da amostra) Foi feita outra
centrifugaccedilatildeo com o tubo vazio Apoacutes isto o filtro foi trocado para outro eppendorf
definitivo onde foi adicionado 50microL do tampatildeo Elution Buffer AE (este tampatildeo
favorece a eluiccedilatildeo do DNA) centrifugou por 2 minutos descartou o filtro e
armazenou as amostras em freezer -20ordmC
38
4 6 Iniciadores e reaccedilatildeo de PCR
Os iniciadores universais para o gene blaKPC foram desenhados baseados
em sequumlecircncias conservadas apresentadas pelos sub-grupos de genes que
codificam a enzima carbapenemase de klebsiella pneumoniae (YIGIT et al 2001)
Baseado na sequumlecircncia para o blakpc-1 depositada no GenBank
(AF2975541) o oligonucleotiacutedio (oligo) iniciador direto (5-
ATGTCACTGTATCGCCGTC-3rsquo) foi desenhado para reconhecer a sequumlecircncia
blaKPC na posiccedilatildeo (131149) enquanto que o iniciador reverso (5-
TTACTGCCCGTTGACGCC-3rsquo) foi reconhecido na posiccedilatildeo (9951012) As anaacutelises
baseadas em alinhamento de sequumlecircncias mostraram que o par de iniciadores
blaKPC podem detectar os alelos de 1 a 13 do gene blaKPC conforme a tabela 2
Tabela 2 Nuacutemero de acesso ao GenBank dos alelos blaKPC e seus
microrganismos originais
Nuacutemero de
Acesso GenBank
Microrganismo Alvo
AF2975541 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-1
GU0862251 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-2
HQ2589341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-2-like
AB5577341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC -3
EU4473041 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-4
EU4002222 Pseudomonas
aeruginosa
blaKPC-5
EU5555341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-6
EU7297271 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-7
39
FJ2344121 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-8
FJ624872 Escherichia coli blaKPC-9
GQ1403481 Acinetobacter
baumannii
blaKPC-10
HM0669951 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-11
HQ3428891 Enterobacter cloacae blaKPC-12
HQ3428901 Enterobacter cloacae blaKPC-13
As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo de blaKPC foram realizadas em um
primeiro tempo de desnaturaccedilatildeo em que foi 94ordmC por 5 minutos seguido de 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 58 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 90 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 78ordmC por 8 minutos Aleacutem das amostras foi utilizado um
controle negativo
A PCR do blaKPC foi realizada utilizando os componentes para o volume da
reaccedilatildeo de 25 microL citados na tabela 3 A banda do tamanho do produto de PCR foi de
881 pares de bases (pb) o que corresponde ao plasmiacutedeo
Tabela 3 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do
gene blaKPC
Reagente Volume
DNA molde 4 microL
Tampatildeo Taq 25 microL
MgCl2 075 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP
2 microL
Oligo F 1 microL
Oligo R 1 microL
Taq DNA polimerase 05 microL
Aacutegua MiliQ 1335 microL
40
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
Baseado na sequumlecircncia para o gene 16S rRNA em que o oligonucleotiacutedio
Universal iniciador direto foward (5-CCAGCAGCCGCCGTAATACG-3rsquo) foi
desenhado para reconhecer a sequumlecircncia universal na posiccedilatildeo 1513 enquanto que o
iniciador reverso (5-ATCGGYTACCTTGTTACGACTTC-3rsquo) foi reconhecido na
posiccedilatildeo 1491 foram realizadas PCRrsquos As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo deste
gene foram realizadas nos seguinte tempos separaccedilatildeo 94ordmC por 10 minutos 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 55 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 120 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 72ordmC por 10 minutos
A PCR do gene 16S rRNA foi realizada utilizando os componentes para o
volume da reaccedilatildeo de 25microL citados na tabela 4 A banda do tamanho do produto de
PCR foi de 996 pb correspondente aacute regiatildeo ribossomal capaz de amplificar todas
as espeacutecies
Tabela 4Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do gene
universal
Reagente (quantidade
concentraccedilatildeo do estoque)
Volume
DNA molde 10 ng 4 microL
Tampatildeo Taq 10 x 25 microL
MgCl2 50mM 125 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP 25 mM
125 microL
Oligo F 10microM 05 microL
Oligo R 10microM 05 microL
Taq DNA polimerase 5UmicroL 04 microL
Aacutegua Miliq 146 microL
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
41
O termociclador utilizado para os experimentos foi o LifeTouch da BIOER
4 7 Digestatildeo
Para realizaccedilatildeo da digestatildeo foi utilizada a enzima BshF I (Hae III) EN- 1105
tamanho 7000 units concentraccedilatildeo 10 unitsmicroL fonte Bacillus sphaericus empresa
Jena bioscienceUtilizaram-se os componentes para o volume de 50microL da reaccedilatildeo
citados na tabela 5
Tabela 5 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da digestatildeo do gene
universal
Reagente Volume
Produto de PCR 10 microL
Enzima BshF I 01 microL
Tampatildeo (10x) 5 microL
Aacutegua Miliq 349 microL
Total (em cada ependorff) 50 microL
Valores para 1 digestatildeo
Os ependorffs foram colocados por 30 minutos em banho-maria a 37ordmC Apoacutes
isso fez-se a corrida das amostras em gel de agarose para verificaccedilatildeo do resultado
(LU et al 2000)
4 8 Eletroforese em gel de agarose
Os produtos de DNA PCR e digestatildeo foram analisados em gel de agarose
2 O tempo de corrida do gel eacute de aproximadamente 1hora e 30minutos sendo
que no comeccedilo foi usada agrave voltagem de 50 V e apoacutes comeccedilar a correr o gel
aumentou a voltagem para 100 v Utilizou-se o marcador de 100pb (pares de bases)
Foi adicionado 3microL de corante Bromophenol (que tem a funccedilatildeo de fazer uma ligaccedilatildeo
na amostra de DNA e permitir a visualizaccedilatildeo da corrida no gel de agarose) em 7microL
de amostra tanto de DNA quanto de PCR Para o preparo do gel foi utilizado TBE
42
(Tris- Aacutecido Boacuterico) agarose e brometo de etiacutedio (sua funccedilatildeo eacute de corante para o gel
e permitir a visualizaccedilatildeo do DNA quando colocado agrave luz ultravioleta) Para o oligo
blaKPC a banda da amplificaccedilatildeo foi em 881ppb correspondendo ao plasmiacutedeo Jaacute
o oligo Universal foi em 996 pb
4 9 Descarte de resiacuteduos
Todos os materiais utilizados nos ensaios foram de uso uacutenico e manipulados
em cacircmaras de seguranccedila bioloacutegica classe II Apoacutes o uso foram colocados em
soluccedilatildeo desinfetantes (hipoclorito a 1) e em seguida autoclavados a 127oC por 20
min em sacos apropriados para autoclavaccedilatildeo Apoacutes a finalizaccedilatildeo do ciclo de
esterilizaccedilatildeo os sacos contendo o material descartaacutevel foram colocados em
recipientes de coleta da empresa responsaacutevel pela coleta de materiais bioloacutegicos
produzidos no laboratoacuterio de microbiologia Todos os procedimentos seguiram a
normativa RDC-ANVISA 3062004 sobre o descarte de resiacuteduos de serviccedilo de
sauacutede
4 10 Aspectos epidemioloacutegicos e cliacutenicos
Os aspectos cliacutenicos e epidemioloacutegicos foram investigados por meio de
prontuaacuterios dos pacientes portadores de enterobacteacuterias produtoras de
carbapenemases e envolveram topografia mais provaacutevel do foco infeccioso a
enfermidade motivadora da internaccedilatildeo o desfecho cliacutenico a idade e o tempo de
internaccedilatildeo
4 12 Anaacutelises eepidemioloacutegicas
As anaacutelises foram realizadas com o pacote estatiacutestico SPSS versatildeo 200
Para verificar quais variaacuteveis referentes aos dados epidemioloacutegicos e
microbioloacutegicos influenciaram no desfecho verificou- se a diferenccedila meacutedia das
variaacuteveis idade e tempo de internaccedilatildeo em cada grupo O teste estatiacutestico utilizado foi
o teste t de Student apoacutes se executar o teste de normalidade de Shapiro-Wilk Para
as variaacuteveis sexo perfil microbioloacutegico das enterobacteacuterias produtoras de
43
carbapenemases foi avaliada a associaccedilatildeo com o desfecho por meio do teste Exato
de Fisher O niacutevel de significacircncia adotado foi de 5
4 13 Preceitos eacuteticos
Este projeto estaacute inserido em um projeto maior denominado ldquoEpidemiologia
cliacutenica e caracterizaccedilatildeo molecular do Acinetobacter Baumannii resistente a
antibioticoterapia em pacientes internado em hospitais do Sistema Uacutenico de Sauacutederdquo
que foi submetido ao Comitecirc de Eacutetica em Pesquisa da Secretaria do Estado de
Sauacutede do Distrito Federal (SESDF) e emitido parecer aprovado pelo protocolo nordm
23109 (anexo)
44
5 RESULTADOS
51 Anaacutelise molecular
Para a amplificaccedilatildeo com o oligo blaKPC foram amplificadas amostras
que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 881 pb correspondente ao
plasmiacutedeo A anaacutelise da amplificaccedilatildeo da regiatildeo do gene blaKPC mostrou que
apenas a amostra A10 natildeo amplificou isso demonstra que esta amostra natildeo
possuiacutea o gene de resistecircncia
5 1 1 Gene blaKPC
Figura 7 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 881 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
A amostra A3 natildeo amplificou no primeiro momento entatildeo foi realizado
novamente a PCR e corrida de gel obtendo entatildeo a amplificaccedilatildeo da amostra como
apresentado na figura 8
45
Figura 8 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC da
mostra A3 estudada A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo de 881
pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 1 2 Gene 16S rRNA
Para a amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA utilizou-se o oligo universal Foram
amplificadas amostras que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 996 pb
Figura 9 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
46
Segundo Lu et al (2000) a digestatildeo com a enzima HaeIII deste amplicons de
16S rRNA devolveriam bandas com perfis entre 150 a 200 pb No gel abaixo eacute
possiacutevel evidenciar que este perfil ocorreu com o predomiacutenio de bandas na altura
de 200pb
Figura 10 Gel de agarose a 2 da digestatildeo do amplicon do gene 16S
rRNA das amostras com a enzima HaeIII evidenciando diversos fragmentos
proacuteximos a 200 pb A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo ribossomal
de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 2 Anaacutelises epidemioloacutegicas
5 2 1 Sexo
No total foram detectados 17 isolados de KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 onde a maior a prevalecircncia foi
detecatada em amostras de pacientes do sexo masculino (53) do que no sexo
feminino (47)
47
Figura 11 Isolado de KPC segundo sexo dos 17 pacientes investigados
no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 2 Desfecho cliacutenico
Em 17 isolados de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo
de 2010 aacute 2011 a porcentagem de pacientes que foram a oacutebito (59) foi maior que
a de pacientes que tiverm alta (41)
Figura 12 Isolado de KPC segundo desfecho cliacutenico dos 17 pacientes
investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
48
5 2 3 Local da coleta
Dos 17 episoacutedios detectados de infecccedilatildeo por KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 a infecccedilatildeo em swab retalfoi mais
frequente (47) seguida de ponta de cateacuteter (18) e secreccedilatildeo traqueal (12)
Figura 13 Isolados de KPC segundo local da coleta da amostra nos 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 4 Microorganismo
O microorganismo mais encontrado foi a Klebsiella pneumoniae (82)
seguida da Enterobacter clocae (12) e Serratia marcescens (6) dos 17 isolados
de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 Isto afirma o
fato de a sigla KPC ser utilizada de forma errocircnea aacute Klebsiella pneumoniae visto
que a evidecircncia dela eacute maior em relaccedilatildeo as outras cepas
49
Figura 14 Isolado de KPC segundo microrganismo encontrado em 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 5 Relaccedilotildees variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana e desfecho
cliacutenico
Tabela 6 ndash Distribuiccedilatildeo do perfil geneacutetico sexo coleta tipificaccedilatildeo de
microrganismos e anaacutelise da resistecircncia bacteriana segundo o desfecho
cliacutenico Brasiacutelia-DF 2010 a 2011
Variaacutevel Resultado
Desfecho
Alta Oacutebito
N N P
Gene 16S rRNA Positivo 7 1000 10 1000
NA Gene blaKPC Positivo 6 857 10 1000
Negativo 1 143 0 00 0218 Sexo Feminino 2 286 6 600
Masculino 5 714 4 400 0201 Local da coleta Fundo saco de
Douglas 1 143 0 00
Hemocultura 0 00 1 100 0463 Ponta de cateter 1 143 2 200
Sec TraquealBrocircnquica
0 00 1 100
50
Secreccedilatildeo traqueal 2 286 0 00
Swab retal 3 429 5 500
Urina 0 00 1 100
Microrganismo Enterobacter cloacae (KPC)
1 143 1 100
Klebsiella pneumoniae
6 857 8 800
0416 Serratia
marcescens 0 00 1 100
Teste de Hodge Hodge positivo 7 1000 10 1000
NA Amicacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 1 100 0848 resistente 0 00 1 100
sensiacutevel 2 286 3 300
Amoxicilina Aacutecido Clavulacircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Ampicilina Sulbactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ampicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Aztreonan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefazolina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Cefoperazona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Cefotaxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefoxitina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0509 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 2 286 4 400
Ceftazidima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cetriaxona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 3 429 5 500 0772 Cefalotina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ciprofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772
51
resistente 3 429 5 500
Claritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Clindamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Eritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Gentamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0942 resistente 2 286 3 300
sensiacutevel 1 143 2 200
Imipenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 0 00 2 200 0193 Resistente 1 143 3 300
sensiacutevel 2 286 0 00
Nitrofurantoiacutena sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Norfloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Oxacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Penicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Piperacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Rifampicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tetraciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Ticarcilina Aacutecido Clavulocircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0688 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 3 429 4 400
Tobramicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Trimetoprima Sulfametoxazol
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0112 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 2 286 0 00
Vancomicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tigeciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediario 0 00 1 100 0211 natildeo testado 1 143 4 400
resistente 2 286 0 00
52
Cefepime sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefuroxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Levofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Piperacilina Tazobactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Ertapenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Meropenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0223 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 1 143 0 00
Cefotetan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 sensiacutevel 0 00 1 100
Gemifloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 7 700 0585 natildeo testado 3 429 3 300
Desfecho
Alta Oacutebito
Meacutedia Erro
padratildeo Meacutedia Erro
padratildeo p
Idade 58 9 59 5 0991
Tempo Internaccedilatildeo (dias)
50 13 46 12 0571
n= 17 p(lt 005) NA natildeo se aplica
53
6 DISCUSSAtildeO
Nos uacuteltimos anos houve um aumento na incidecircncia de bacteacuterias
multirresistentes aos antimicrobianos no ambiente hospitalar tornando isto um
problema mundial de sauacutede puacuteblica (HULSCHER et al 2010) Quando se trata
principalmente de bacilos Gram negativos a frequumlecircncia destas bacteacuterias eacute ainda
maior em paiacuteses da Ameacuterica Latina quando comparada a paiacuteses desenvolvidos
(GALES etal 2012)
De acordo com dados do ldquoMeropenem Yearly Susceptibility Test Information
Collectionrdquo (MYSTIC) ocorreu nos Estados Unidos um aumento na susceptibilidade
de K pneumoniae nos uacuteltimos anos graccedilas a praacuteticas de controle de disseminaccedilatildeo
de amostras resistentes(RHOMBERG P R et al 2009) O aumento crescente da
prevalecircncia destes microrganismos foi proporcional ao aumento da dependecircncia do
uso de antibioacuteticos carbapenecircmicos considerados como a opccedilatildeo terapecircutica para o
tratamento de infecccedilotildees por bacilos Gram negativos multi-resistentes (LIVERMORE
2012) Isto afeta diretamente as opccedilotildees de tratamento sobrando poucas alternativas
para a terapecircutica que incluem colistina (polimixina E) e tigeciclina que apresentam
respectivamente problemas em termos de toxicidade e eficaacutecia (LIVERMORE et
al 2011) Um dos efeitos adversos mais importantes das poliminas B e E por
exemplo satildeo a neurotoxicidade e nefrotoxicidade (MENDES C A C et al2009 )
Devido agrave resistecircncia ser usualmente de natureza plasmidial e portanto de
maior disseminaccedilatildeo especialmente quando carreadas por K pneumoniae
microrganismo com uma notoacuteria capacidade para acumular e transferir plasmiacutedeos
com determinantes para resistecircncia o nuacutemero de casos detectados pelo
fenoacutetipogenoacutetipo blaKPC eacute bastante preocupante (MONTEIRO et al 2009)
Comparada com outras bacteacuterias hospitalares a transmissatildeo de clones
multirresistentes de K pneumoniae eacute maior e podem natildeo ser controladas pelos
meacutetodos de controle de infecccedilatildeo hospitalar (PAAUW et al 2007) A forma
plasmidial para transferecircncia da resistecircncia adicionada a este grande potencial para
disseminaccedilatildeo de clones resistentes eacute preocupante visto que apoacutes surtos muitas
vezes pode se tornar endecircmica Jaacute eacute uma realidade a disseminaccedilatildeo desta bacteacuteria
54
entre pacientes hospitais paiacuteses e ateacute mesmo continentes (WOODFORF et al
2010 ROGERS et al 2011)
As chances de surtos satildeo maiores em paiacuteses com poucos recursos devido agrave
maior carecircncia de praacuteticas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees hospitalares e o
uso irracional de antimicrobianos de forma empiacuterica e inadequada (KUMARASAMY
et al 2010) Ateacute o momento os mecanismos de resistecircncia aos cabapenecircmicos
geralmente encontrado eram a produccedilatildeo de ESBL (CTX-M) somada aacute perda de
porina (CARVALHAES et al 2010) Foi notado a partir do ano de 2008 um
aumento no nuacutemero de K pneumoniae produtoras de KPC-2 apresentando outra
forma de resistecircncia (GALES 2012)
Um estudo mostrou que o perfil do paciente colonizado ou infectado por KPC
foi de um paciente entre os 33 e os 82 anos de idade internado haacute mais de 1
semana no hospital A mortalidade geral nos uacuteltimos anos ficou em torno de 7
sendo que dos 77 pacientes estudados 32 (415) pacientes evoluiacuteram para oacutebito
evidenciando a alta morbi-mortalidade associada (ALVES A P et al 2013)
Em estudo com 2316 pacientes avaliados a populaccedilatildeo de sexo masculino foi
de 526 idade meacutedia global de 53 anos (mediana de 55 anos) permanecircncia meacutedia
de 58 dias (mediana de 3 dias) (OLIVEIRA A C et al 2010) Outros trabalhos
apresentaram ausecircncia de significacircncia entre sexoidade e o desenvolvimento de
infecccedilotildees por microrganismos resistentes (PERES-BOTA D et al 2003 COLPAN
A et al 2005 COELLO R et al 1997)
Outro estudo utilizou um total de 30 amostras sendo elas isoladas de urina
escarro secreccedilatildeo pleural ponta de cateter aspirado traqueal e hemocultura A mais
prevalente foi em urina (40) Entre as 30 cepas analisadas a maior porcentagem
foi da cepa Klebsiella pneumoniae (70) Enterobacter sp (133) Klebsiella
ozaenae (10) Escherichia coli (333) e Klebsiella oxytoca (333)
(DIENSTMANN R et al 2010) Nos Estados Unidos a enzima KPC jaacute se tornou
endecircmica Foi realizada uma pesquisa em dois hospitais de Nova York onde
testaram 602 amostras e 45 apresentaram algum mecanismo de resistecircncia
sendo apenas 33 confirmadas por biologia molecular como KPC-2 (BRATU et
al 2005)
55
Estudo sobre os tipos de ESBL feito no Japatildeo apresentou o tipo Toho-1 como
o mais prevalente nessa pesquisa Ateacute o ano de 2000 ano em que foi publicado tal
estudo este era o primeiro relatoacuterio no Japatildeo para identificar derivados de ESBLs
como tipo de SHV e TEM entre E coli e K pneumoniae Em especial o tipo SHV- 12
foi identificado com uma maior frequumlecircncia Estes resultados indicam que tipos
distintos de ESBLs que satildeo diferentes em sua especificidade de substrato e origem
geneacutetica coexistem no Japatildeo Isto mostra a importacircncia de caracterizar genoacutetipos
distintos de ESBLs e de estar em alerta continuamente para as tendecircncias de
ESBLs no Japatildeo aleacutem da necessidade de uma interpretaccedilatildeo uniforme utilizando as
diretrizes do CSLI para relatar cepas produtoras de ESBL Aleacutem da detecccedilatildeo de
ESBLs satildeo necessaacuterias mais informaccedilotildees tais como o perfil de sensibilidade
especiacutefica para diversas β-lactacircmicos e o local da infecccedilatildeo Esses fatores satildeo
essenciais para a escolha adequada de antibioacuteticos (YAGI T et al 2000)
No ano de 2004 uma pesquisa avaliou a produccedilatildeo de uma enzima de
hidroacutelise de carbapenecircmicos atraveacutes da teacutecnica de sequumlenciamento foi revelado
um novo membro da famiacutelia KPC designado KPC- 3 Pesquisadores encontraram
em um mutante de K pneumoniae uma substituiccedilatildeo de um gene associado com
resistecircncia a Imipenem mas essa substituiccedilatildeo foi considerada improvaacutevel na
contribuiccedilatildeo da resistecircncia aos carbapenecircmicos da espeacutecie estudada Aleacutem da
resistecircncia aos carbapenecircmicos estes isolados eram em sua maioria resistentes agraves
cefalosporinas penicilinas e aminoglicosiacutedeos Usando estudos de transformaccedilatildeo
conjugaccedilatildeo e hibridaccedilatildeo localizaram o alelo blaKPC em plasmiacutedeo aleacutem disso
mostraram que esse alelo tambeacutem carregava uma resistecircncia aos aminoglicosiacutedeos
A transferecircncia das enzimas KPCs foi demonstrada in vitro tanto neste como em
outros estudos pode ser que os plasmiacutedeos que fazem esta transferecircncia estavam
comeccedilando a se espalhar no ambiente cliacutenico resultando na multiresistecircncia dessas
estirpes (WOODFORD et al 2004)
O presente estudo apresentou um vieacutes quanto aos resultados dos testes de
susceptibilidade microbiana Observou-se que natildeo foi encontrado resultado deste
teste em algumas amostras o que natildeo cooperou para um estudo mais preciso
futuros estudos quanto agraves amostras e um melhor acompanhamento deste tipo de
patologia Poreacutem mesmo sem algumas amostras com este resultado disponiacutevel foi
56
confirmada a presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos
carbapenecircmicos por meio dos genes de resistecircncia blaKPC e 16S rRNA que as
amostras apresentaram em sua maioria serem portadoras Quanto aos resultados
estatiacutesticos nenhuma das variaacuteveis apresentou significacircncia estatiacutestica (p gt 005)
mostrando assim que estas variaacuteveis isoladas natildeo foram o fator determinante para
o desfecho cliacutenico de alta ou oacutebito
57
7 CONCLUSAtildeO
Os genes blaKPC e 16S rRNA foram caracterizados confirmando a a
presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos carbapenecircmicos
Houve uma maior prevalecircncia da cepa K pneumoniae e isto confirma outros
estudos que apresentam a maior prevalecircncia desta cepa em amostras com KPC
Aleacutem disso isso justifica a forma popular da K pneumoniae ser chamada de KPC
enquanto que na verdade KPC eacute uma enzima podendo estar presente em outras
cepas como Enterobacter clocae tambeacutem apresentada no presente estudo O
desfecho cliacutenico de oacutebitos maior que 50 eacute um possiacutevel indicador sobre a
necessidade de se realizar um teste raacutepido para identificaccedilatildeo de KPC visando
iniciar o mais raacutepido possiacutevel o tratamento afim de diminuir a mortalidade por esta
infecccedilatildeo
Nenhuma das variaacuteveis isoladamente estaacute relacionada ao desfecho cliacutenico
oacutebito ou alta pois natildeo apresentaram relevacircncia estatiacutestica O presente estudo
mostrou que haacute presenccedila da bacteacuteria nas amostras de pacientes do hospital
estudado podendo entatildeo afirmar que este tipo de bacteacuteria se encontra tambeacutem
presente em ambiente hospitalar O uso irracional de antimicrobiano eacute demonstrado
de forma indireta quando foi apresentado atraveacutes do Teste de Hodge Modificado
uma resistecircncia de 100 aos antibioacuteticos carbapenecircmicos Isto tambeacutem reflete na
terapecircutica sendo que pacientes portadores de bacteacuterias resistentes aos
antibioacuteticos carabepecircmicos tem uma escassa opccedilatildeo de tratamento e as opccedilotildees
apresentam problemas quanto agrave toxicidade e eficaacutecia
58
REFEREcircNCIAS
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Mecanismos
de resistecircncia bacteriana aos antimicrobianos Disponiacutevel em
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controleopas_
webmodulo3mec_sitiohtmgt Acesso em 25 de abril de 2014
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Nota teacutecnica nordm
012013 medidas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees por enterobacteacuterias
multiresistentes Acesso em 17 de abril de 2013
ALBA J et al Kinetics study of KPC-3 a plasmid-encoded class A
carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase Antimicrob Agents Chemother
Nov49(11)4760-2 2005
ALVES A P et al Nosocomial infections by KPC-producing enterobacteria in
a tertiary hospital in Southern Brazil Revista da AMRIGS Porto Alegre 57 (3) 213-
218 jul-set 2013
ALVES A et al Tipagem Geneacutetica de Microrganismos Lab De Diversidade
Microbiana Centro de Biologia Celular Dep de Biologia U de Aveiro 3810-193
Aveiro- 2003
BELL J M et Al Prevalence and significance of a negative extended-
spectrum beta-lactamase (ESBL) confirmation test result after a positive ESBL
screening test result for isolates of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae
results from the SENTRY Asia-Pacific Surveillance Program J Clin Microbiol
May45(5)1478-82 2007
BRATU S et al Detection of KPC carbapenem-hydrolyzing enzymes in
Enterobacter spp from Brooklyn New York Antimicrob Agents Chemother v 49 n
2 p 776-8 2005
59
BRATU S et al Emergence of KPC-possessing Klebsiella pneumoniae in
Brooklyn New York epidemiology and recommendations for detection Antimicrob
Agents Chemother v 49 n 7 p 3018-20 2005
BRATU S et al Rapid spread of carbapenem-resistant Klebsiella
pneumoniae in New York City Arch Intern Med v 165 p 1430-5 2005
CAMARGO C F et al Aplicaccedilatildeo das teacutecnicas de pcr e suas teacutecnicas
derivadas em diagnoacutestico molecular Disponiacutevel em
ltfileDUnB10C2BA20semestreArtigosPCR-
20CLEYTON20FLORENCIO20DE20CAMARGO20E20PAULO20ROB
ERTO20QUEIROZpdfgtgt Acesso em 08 de abril de 2014
CARVALHES C G et al Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting
carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive
results Journal of Antimicrobial Chemotherapy v 65 n2 p 249-251 2010
CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION- CDC Modified
Hodge Test for Carbapenemase Detection in Enterobacteriaceae 2004
CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE Methods for
dilutionantimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically Approved
standard M7ndashA7 7th ed CLSI Wayne PA 2011
COELLO R et al Risk factors for developing clinical infection with methicillin-
resistant Staphylococcus aureus (MRSA) amongst hospital patients initially only
colonized with MRSA J Hosp Infect 19973739-46
COLPAN A et al Evaluation of risk factors for mortality in intensive care
units A prospective study from a referral hospital in Turkey Am J Infect Control
200533(1)42-7
60
CORNAGLIA G et al Living with ESBLs Introduction Clinical Microbiology
and Infection 14 Suppl 1 1-2 2008
COTRIM E R et al Klebsiella pneumoniae carbapenemase ndash KPC em
Enterobacteriaceae o desafio das bacteacuterias multirresistentes Poacutes em revista do
centro universitaacuterio Newton Paiva 12012 - ediccedilatildeo 5 - issn 2176 7785
DESHPANDE L M et al Occurrence and characterization of
carbapenemase-producing Enterobacteacuteriaceae report from the SENTRY
Antimicrobial Surveillance Program (2000-2004) Microb Drug Resist 12(4)223-30
2006
DIAS D J A Estudos dos principais mecanismos de resistecircncia aos
antibioacuteticos β-lactacircmicos em bacteacuterias patogecircnicas gram negativas 2009 100 f
Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Geneacutetica Molecular e Biomedicina) ndash Faculdade de
Ciecircncias e Tecnologia Universidade de Nova Lisboa Lisboa
DIENSTMANN R et al Avaliaccedilatildeo fenotiacutepica da enzima Klebsiella
pneumoniae carbapenemase (KPC) em Enterobacteriaceae de ambiente hospitalar
J Bras Patol Med Lab v 46 n 1 p 23-27 fevereiro 2010
ENDIMIAMI A et al Emergence of blaKPC-containing Klebsiella
pneumoniae in a long-term acute care hospital a new challenge to our healthcare J
Antimicrob Chemother 64 1102-1110 Nov 2009
FALAGAS M E et al Extended-spectrum beta-lactamase producing
organisms The Journal of Hospital Infection 73 (4) pp 345-54 2009
FONTANA C et al Emergence of KPC-producing Klebsiella pneumoniae in
Italy BMC Rev Notes 3 40 2010
61
GALES A C et al Antimicrobial resistance among Gram-negative bacilli
isolated from Latin America results from Sentry Antimicrobial Surveillance Program
(Latin America 2008-2010) Diagnostic Microbiology and Infectious Disease v 3 n
4 p 354 -360 2012
GUPTA N et al Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Epidemiology
and Prevention HEALTHCARE EPIDEMIOLOGY Clinical Infectious Diseases
201153(1)60ndash67 Published by Oxford University Press on behalf of the Infectious
Diseases Society of America 2011
HARBOTTLE H et al Genetics of antimicrobial resistance Anim Biotechnol
n17 p111-124 2006
HENRIQUE W N et al RESISTEcircNCIA BACTERIANA Uniatildeo das
Faculdades Alfredo NasserInstituto de Ciecircncias da Sauacutede Disponiacutevel em lt
httpwwwfaculdadealfredonasseredubrfilespesquisaposter20HENRIQUE20
Wilker20Natividade20SANTIAGO20Silvania20CAVALCANTI20DSP
20ResistC3AAncia20Bacterianapdfgt Acesso em 17 marccedilo 2014
HULSCHER M E J I et al Antibiotic prescribing in hospital a social and
behavioral scientific approach The Lancet Infectious Diaseases v 10 n 3 p 167-
165 2010
KIDWAI M SAPRA P BHUSHAN KR Synthetic strategies and medicinal
properties of beta-lactams Curr Med Chem 1999 695-215
KUMARASAMY K K et al Emergence of a new antibiotic resistance
mechanism in India Pakistan and the UK a molecular biological and
epidemiological stuy The Lancet Infectious Diseases v10 n 9 p 597- 602 2010
LINCOPAN N et al Enterobacteacuteria producing extended-spectrum β-
lacatamases and IMP-1 Metalo-β-lactamases isolated from Brazilian hospitals J Med
62
Microbiol 7 1-3 2006
LINCOPAN N et al First Isolation of Metalo-β-Lacatamase-Producing
Multiresistant Klebsiella pneumoniae from a patient in Brazil J Clin Microbiol 43(1)
516-519 2005
LIVERMORE D M et al What remains against carbapenem- resistant
Enterobacteriaceae Evaluation of choramphenicol ciprofloxacin colistina
fosfomycin minocycline nitrofurantoin temocilin and tigecycline International
Journal of Antimicrobial Agents v 37 n 5 p 415- 459 2011
LIVERMORE D M Fourten years in resistance International Journal of
Antimicrobial Agents v 39 283- 294 2012
LIVERMORE D M Bacterial resistance to carbapenems Adv Exp Med Biol
1995 39025-47
LIVERMORE D M Bacterial resistance origins epidemiology and impact
Clin Infect Dis 36S11-S23 2003
LIVERMORE D M et al Carbapenemases a problem in waiting Curr
Opin Microbiol 2000 3489-95
LU et al Universal pcr for common bacterial pathogens J CLIN
MICROBIOL VOL 38 2000
LU et al Use of PCR with Universal Primers and Restriction Endonuclease
Digestions for Detection and Identification of Common Bacterial Pathogens in
Cerebrospinal Fluid Journal of Clinical Microbiology June 2000 p 2076ndash2080
MARSCHALL J Met al Presence of the KPC Carbapenemase Gene in
Enterobacteriaceae Causing Bacteremia and Its Correlation with In Vitro
Carbapenem Susceptibility J Clin Microbiol 47 239-241 Jan 2009
63
MARTINS WMBS et al Prevalecircncia do gene blaKPC em isolados cliacutenicos
de Enterobacteriaceae e natildeo fermentadores encontrados em amostras clinicas em
um hospital universitaacuterio do Recife X Jornada de ensino pesquisa e extensatildeo ndash
JEPEX 2010 ndash UFRPE Recife 18 a 22 de outubro
MENDES C A C et al Polimixinas Revisatildeo com ecircnfase na sua
nefrotoxicidade Rev Assoc Med Bras 2009 55(6) 752-9
MOHR J F 3rd Update on the efficacy and tolerability of meropenem in the
treatment of serious bacteacuterial infections Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S41-51
2008
MONTEIRO J et al First report of KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae
strains in Brazil Antimicrob Agents Chemother Jan53(1)333-4 2009
MOREIRA V C et al Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia a antibioacuteticos
Disponiacutevel em
lthttpwwwcpglsucgbr6mostraartigosSAUDEVANESSA20CARVALHO20M
OREIRApdfgt Acesso em 21 marccedilo 2014
NETIKUL T et al Emergence of novel blaKPC-12 and blaKPC-13 variants in
carbapenem non-susceptible Enterobacter cloacae a first report of blaKPC gene in
Thailand European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases May
S372 2011
NETO V A et al Antibioacuteticos na praacutetica Meacutedica 6ordf Ediccedilatildeo Editorial
SarverSP Brasil 2007
NICOLAU D P Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of
meropenem Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S32-40 2008
64
OLIVEIRA A C et al Resistecircncia bacteriana e mortalidade em um centro de
terapia intensiva Rev Latino-Am Enfermagem nov-dez 2010
PAAUW A et al Failure to control an outbreak of qnrA 1-positive multidrug-
resistant Enterobacter clocae despite adequate implementation of recommended
infection control measures Journal of Clinical Microbiology v 45 n 5 p 1420-1425
2007
PATERSON D L et al Extended-Spectrum Beta-Lactamases a Clinical
Update Clinical Microbiology Reviews v 18 p 657-686 2005
PEIRANO G et al Carbapenem-hydrolysing beta-lactamase KPC-2 in
Klebsiella pneumonia isolated in Rio de Janeiro Brazil J Antimicrob Chemother Nov
20 2009
PERES-BOTA D et al Are infections due to resistant pathogens associated
with worse outcome in critically ill patients J Infect 200347(4)307-16
PIDDOCK L J V Clinically relevant chromosomally encoded multidrug
resistance effl ux pumps in bacterial Clin Microbiol Rev n19 p382-402 2006
PITOUT J D D et al Emergence of Enterobacteriaceae producing
extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) in the community J Antimicrob
Chemother May 56 2005
POSSEBON M I et al Resistecircncia bacteriana aos carbapenecircmicos
Bacterial resitence to carbapenems RBM rev bras med60(6)378380-378-382
jun 2003
QUEENAN A M et al Carbapenemases the versatile beta-lactamases
Clin Microbiol Rev Jul20(3)440-58 2007
65
RHOMBERG P R et al Summary trends for the meropenem yearly
susceptibility test information collection program a 10- year experience in the United
States (1999-2008) Diagnostic Microbiology and Infectiois Disease v 65 n4 p
414-426 2009
ROBLEDO I E et al Detection of KPC in Acinetobacter spp in Puerto Rico
J Antimicrob Agents Chemother 54 1354-1357 Mar 2010
ROGERS B A et al Country-to-country transfer os patients and the risk of
multi-resistant bacterial infection Clinical Infectious Disease v53 n1 p49- 56
2011
SHAH A A et al Characteristics epidemiology and clinicalimportance of
emerging strains of Gram-negative bacilli producing extended-spectrum
betalactamases Research in Microbiology v 155 p 409-421 2004
TURNER P J Extended- Spectrum Beta-Lactamases Clinical Infectious
Diseases v 41 p 273-275 2005
WOLTER D J et al Phenotypic and Enzymatic Comparative Analysis
between the Novel KPC variant KPC-5 and Its Evolutionary Variants KPC-2 and
KPC-4 Antimicrob Agents Chemother Nov 17 2008
WOODFORD N et al Carbapenemases of Chryseobacterium
(Flavobacterium) meningosepticum distribution of blaB and characterization of a
novel Metalo-beta-lactamase gene blaB3 in the type strain NCTC 10016
Antimicrob Agents Chemother Jun44(6)1448-52 2000
WOODFORF N Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in
India Pakistan and the UK a molecular biological and epidemiological study The
Lancet Infectious Diseases v 10 n 9 p 597-602 2010
66
WOODFORD et al Outbreak of Klebsiella pneumoniae Producing a New
Carbapenem- Hydrolyzing Class A β-Lactamase KPC-3 in a New York Medical
Center Antimicrobial agents and chemotherapy Dec 2004 p 4793ndash4799 Vol 48
No 12
YAGI T et al A preliminary survey of extended-spectrum β-lactamases
(ESBLs) in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Japan
FEMS Microbiology Letters 184 (2000) 53-56
YIGIT H et al Novel carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase KPC-1 from
a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumonia J Antimicrob Agents
Chemother 45 (4) 1151-1161 (2001)
ZAVASCKI A P et al KPC-2- producing Enterobacter cloacae in two cities
from Southern Brazil Int J Antimicrob Agents Apr 28 2009
ZHANEL G G et al Comparative review of the carbapenecircmicos Drugs
67(7)1027-52 2007
67
ANEXOS
Sequumlecircncia do oligo blaKPC
Query 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
Query 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
Query 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
68
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
Query 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
Query 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
69
Query 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
Query 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
Query 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
70
Sbjct 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
Query 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
Query 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
Query 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
71
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
Query 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
Query 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
72
Query 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
Query 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
Query 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
73
Sbjct 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
Query 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
Query 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
Query 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
74
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
Query 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
Query 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
75
Query 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
Query 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
||||
Sbjct 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
LOCUS AF297554 1377 bp
DNA linear BCT 26-MAR-2001
DEFINITION Klebsiella pneumoniae carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
gene complete cds
ACCESSION AF297554
VERSION AF2975541 GI10121874
76
KEYWORDS
SOURCE Klebsiella pneumoniae
ORGANISM Klebsiella pneumoniae
Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Enterobacteriaceae Klebsiella
REFERENCE 1 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH QueenanAM
AndersonGJ Domenech-SanchezA
BiddleJW StewardCD
AlbertiS BushK and TenoverFC
TITLE Novel carbapenem-hydrolyzing beta-
lactamase KPC-1 from a
carbapenem-resistant strain of
Klebsiella pneumoniae
JOURNAL Antimicrob Agents Chemother 45 (4)
1151-1161 (2001)
PUBMED 11257029
REFERENCE 2 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH AndersonGJ and
TenoverFC
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (19-AUG-2000) Nosocomial
Pathogens Laboratory Branch
Centers for Disease Control and
Prevention 1600 Clifton Rd MS
G08 Atlanta GA 30333 USA
FEATURES LocationQualifiers
77
source 11377
organism=Klebsiella
pneumoniae
mol_type=genomic DNA
db_xref=taxon573
-35_signal 5560
-10_signal 7883
mRNA 921012
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
RBS 117122
CDS 1311012
note=blaKPC-1
codon_start=1
transl_table=11
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
protein_id=AAG134101
db_xref=GI10121875
translation=MSLYRRLVLLSCLSWPLAGFSATALTNLVAEPFAKLEQD
FGGSI
GVYAMDTGSGATVSYRAEERFPLCSSFKGFLAAAVLARSQQQAGLLDTPIRYG
KNALV
PWSPISEKYLTTGMTVAELSAAAVQYSDNAAANLLLKELGGPAGLTAFMRSIG
DTTFR
78
LDRWELELNSAIPSDARDTSSPRAVTESLQKLTLGSALAAPQRQQFVDWLKGN
TTGNH
RIRAAVPADWAVGDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTRAPNKDDK
HSEAV
IAAAARLALEGLGVNGQ
ORIGIN
1 cggggcagtt acagccgtta cagcctctgg
agagggagcg gcttgccgct cggtgataat
61 cccagctgta gcggcctgat tacatccggc
cgctacacct agctccacct tcaaacaagg
121 aatatcgttg atgtcactgt atcgccgtct
agttctgctg tcttgtctct catggccgct
181 ggctggcttt tctgccaccg cgctgaccaa
cctcgtcgcg gaaccattcg ctaaactcga
241 acaggacttt ggcggctcca tcggtgtgta
cgcgatggat accggctcag gcgcaactgt
301 aagttaccgc gctgaggagc gcttcccact
gtgcagctca ttcaagggct ttcttgctgc
361 cgctgtgctg gctcgcagcc agcagcaggc
cggcttgctg gacacaccca tccgttacgg
421 caaaaatgcg ctggttccgt ggtcacccat
ctcggaaaaa tatctgacaa caggcatgac
481 ggtggcggag ctgtccgcgg ccgccgtgca
atacagtgat aacgccgccg ccaatttgtt
541 gctgaaggag ttgggcggcc cggccgggct
gacggccttc atgcgctcta tcggcgatac
79
601 cacgttccgt ctggaccgct gggagctgga
gctgaactcc gccatcccaa gcgatgcgcg
661 cgatacctca tcgccgcgcg ccgtgacgga
aagcttacaa aaactgacac tgggctctgc
721 actggctgcg ccgcagcggc agcagtttgt
tgattggcta aagggaaaca cgaccggcaa
781 ccaccgcatc cgcgcggcgg tgccggcaga
ctgggcagtc ggagacaaaa ccggaacctg
841 cggagtgtat ggcacggcaa atgactatgc
cgtcgtctgg cccactgggc gcgcacctat
901 tgtgttggcc gtctacaccc gggcgcctaa
caaggatgac aagcacagcg aggccgtcat
961 cgccgctgcg gctagactcg cgctcgaggg
attgggcgtc aacgggcagt aaggctctga
1021 aaatcatcta ttggcccacc accgccgccc
ttgcgggcgg catggattac caaccactgt
1081 cacatttagg ctaggagtct gcgcggcaga
gccgtgtgac cggttttctg tagagcactg
1141 acgatggcgg cggcgctctc tgcaattggc
aaggcgtcgg cgccaaggat accaatcttg
1201 cggcgcgcgg cgtgttatga cgactggggt
gcatttgagc cgccccattt aaccttcgcc
1261 ctcacagata cgccattcgc ctcaaattta
gcgccatgca gacgagcttc cactcggctt
1321 gcaccttgtc caggcccctc atgctgaact
gacgcaatcc catcaccgcc ttgatca
80
Tawana Correa Rodrigues Amorim Rosa
Anaacutelise de aspectos epidemioloacutegicos e cliacutenicos e caracterizaccedilatildeo de
genes de resistecircncia das Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases em
um hospital do Distrito Federal
Orientadora Profa Dr Margocirc Gomes de Oliveira Karnikowski
(FCe Universidade de Brasiacutelia)
Co-orientadora Profa Dr Izabel Cristina Rodrigues da Silva
(FCe Universidade de Brasiacutelia)
CEILAcircNDIA DF
2014
Tawana Correa Rodrigues Amorim Rosa
Anaacutelise de aspectos epidemioloacutegicos e cliacutenicos e caracterizaccedilatildeo de
genes de resistecircncia das Enterobacteacuterias produtoras de carbapemases em um
hospital do Distrito Federal
BANCA EXAMINADORA
_______________________________________
Orientadora Profa Dr Margocirc Gomes de Oliveira Karnikovski
(FCe Universidade de Brasiacutelia)
_______________________________________
Profa MSc Micheline Marie Milward de Azevedo Meiners
(FCe Universidade de Brasiacutelia)
_______________________________________
Prof MSc Daniel Oliveira Freire
(LS Faculdade LS)
CEILAcircNDIA DF
2014
AGRADECIMENTOS
Primeiramente aacute Deus autor da vida que me concedeu a graccedila e a benccedilatildeo
de ter conquistado este sonho da graduaccedilatildeo
Agrave minha amada famiacutelia principalmente meus pais Elias Amorim e Liliana
Correa irmatildeo Thales Correa e avoacute Herondina por serem a minha base meu
refuacutegio em todos os momentos e acreditarem em mim
Agrave minha grande amiga de graduaccedilatildeo Susan Suellen por partilhar dos meus
medos alegrias vitoacuterias angustias e em todos os momentos ser meu braccedilo direito
Ao meu amor Robson Bastos que mais que um noivo foi meu amigo e
companheiro me apoiando e me incentivando
Agrave minha querida orientadora DraMargocirc Gomes e querida co-orientadora Dra
Izabel Cristina por acreditarem em mim me dando a oportunidade de trabalhar com
elas Aleacutem do apoio ensino e dedicaccedilatildeo
Agrave todos os professores (as) da Universidade de Brasiacutelia- Faculdade de
Ceilacircndia pelo ensino e pela contribuiccedilatildeo na minha formaccedilatildeo acadecircmica
Agrave MSc Fabiana Cartaxo pela ajuda e apoio aleacutem da prontidatildeo quando
solicitada a sua ajuda
Ao professor mestre Daniel Oliveira e a teacutecnica de laboratoacuterio Thais Mendes
pela ajuda laboratorial contribuindo para a realizaccedilatildeo de um bom trabalho
RESUMO
Introduccedilatildeo A Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) eacute uma enzima
produzida por bacteacuterias gram-negativas (enterobacteacuterias) que confere resistecircncia
aos antimicrobianos carbapenecircmicos meropenen ertapenen imipenen classe
amplamente utilizada no tratamento de infecccedilotildees envolvendo Enterobacteriaceae
Esta resistecircncia eacute uma das principais causas de falha terapecircutica devido agrave
produccedilatildeo de beta-lactamases de espectro estendido (ESBL) por esta bacteacuteria
mecanismo de resistecircncia mais comum aos antibioacuteticos beta-lactacircmicos de amplo
espectro A identificaccedilatildeo destas enterobacteacuterias pode ser feita atraveacutes de teacutecnicas
de identificaccedilatildeo molecular de patoacutegenos dentre elas a Reaccedilatildeo em Cadeia de
Polimerase (PCR) que consiste na anaacutelise do padratildeo de amplificaccedilatildeo de elementos
repetidos encontrados no genoma bacteriano permitindo uma maior rapidez na
obtenccedilatildeo de resultados quando comparada com outros meacutetodos aleacutem de
apresentar alta reprodutibilidade simples execuccedilatildeo e implementaccedilatildeo dependendo
da aplicaccedilatildeo da teacutecnica natildeo enfrenta problemas com a degradaccedilatildeo do DNA
Objetivo Caracterizar genes de resistecircncia das Enterobacteacuterias produtoras de
carbapenemases e aspectos epidemioloacutegicos e cliacutenicos de pacientes internados em
um hospital puacuteblico do Distrito Federal Materiais e meacutetodos Estudo transversal
onde foi realizado o teste de susceptibilidade das Enterobacteacuterias aos antibioacuteticos
Carbapenecircmicos a partir dos materiais bioloacutegicos coletados dos pacientes
internados no Hospital Regional da Asa Norte (HRAN) Anaacutelise molecular dos genes
16S rRNA e blaKPC utilizando PCR aleacutem de anaacutelises estatiacutesticas Resultados e
discussatildeo Detectou-se a regiatildeo ribossomal e o gene de resistecircncia testado
confirmando a resistecircncia microbiana Maior prevalecircncia de pacientes do sexo
masculino (53) desfecho cliacutenico de oacutebito(59) siacutetio de infecccedilatildeo de swab retal
(47) Klebsiella pneumoniae foi microrganismo mais encontrado (82) Natildeo houve
diferenccedila estatiacutestica entre as variaacuteveis e o desfecho cliacutenico (p foi gt 005)
Conclusatildeo Atraveacutes da caracterizaccedilatildeo molecular dos genes de resistecircncia blaKPC
e Universal confirmou-se a presenccedila de Klebsiella pneumoniae resistente aos
carbapenecircmicos Os valores de p natildeo foram significativos (lt005) sendo
assimnenhuma das variaveacuteis estudadas foram o principal motivo do desfecho
cliacutenico (alta ou oacutebito)
Palavras chaves Klebsiella pneumoniae carbapenemase Resistecircncia bacteriana a
antimicrobianos β-lactamases de espectro estendido (ESBL) Reaccedilatildeo em Cadeia de
Polimerase (PCR)
ABSTRACT
Introduction Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) is an enzyme produced
by gram - negative bacteria (Enterobacteriaceae) which confers resistance to
carbapenem antibiotics meropenen ertapenen imipenem class widely used in the
treatment of infections involving Enterobacteriaceae This resistance is a major
cause of treatment failure due to beta-lactamases production of extended spectrum
(ESBL) by this bacterium most commonly resistance to beta-lactam antibiotics of
wide spectrum engine The identification of these Enterobacteriaceae can be made
by techniques of molecular identification of pathogens among them the Polymerase
Chain Reaction (PCR) which consists in the analysis of the amplification pattern of
repeated elements found in the bacterial genome allowing faster in getting results
when compared with other methods in addition to presenting high reliability simple
implementation and deployment depending on the application of the technique has
no trouble with the degradation of DNA Objective To characterize the resistance
genes of Enterobacteriaceae producing carbapenemases and epidemiological and
clinical features of patients admitted to a public hospital in the Federal District
aspects Materials and methods Cross-sectional study where susceptibility testing
of Enterobacteriaceae to antibiotics Carbapenems from biological materials collected
from patients admitted to the Hospital Regional da Asa Norte ( HRAN ) was
performed Molecular analysis of 16S rRNA genes and blaKPC using PCR in
addition to statistical analysis Results and Discussion Was detected region and
the ribosomal tested resistance gene confirming the microbial resistance Higher
prevalence of male patients (53 ) clinical outcome of death (59 ) site of infection
rectal swabs (47 ) Klebsiella pneumoniae was found more microorganism (82)
There was no statistical difference between the variables and the clinical outcome (p
was gt 005) Conclusion Through molecular characterization of genes and the
Universal blaKPC resistance confirmed the presence of Klebsiella pneumoniae
resistant to carbapenems P values were not significant (lt 005) so none of the
variables studied were the main reason the clinical outcome (discharge or death)
Keywords Klebsiella pneumoniae Carbapenemase Bacterial resistance to
antibiotics Extended-Spectrumβ-lactamases (ESBL) Polimerase Chain Reaction
(PCR)
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Accedilatildeo do szlig-lactacircmico sobre a bacteacuteria gram-positiva e gram-negativa
Figura 2 Divulgaccedilatildeo internacional de Klebsiella pneumoniae Carbapenemase
(KPC) produtoras de Enterobacteriaceae
Figura 3 Mecanismos de resistecircncia bacteriana
Figura 4 Etapas da Reaccedilatildeo de PCR
Figura 5 Mecanismo de semeamento de material bioloacutegico oriundos de pacientes
com suspeita de infecccedilatildeo por KPC
Figura 6 Interpretaccedilatildeo resultado do Teste de Hodge Modificado
Figura 7 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC das amostras dos
17 pacientes estudados
Figura 8 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC da mostra A3
estudada
Figura 9 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA das amostras
dos 17 pacientes estudados
Figura 10 Gel de agarose a 2 da digestatildeo do amplicon do gene 16S rRNA das
amostras com a enzima HaeIII evidenciando diversos fragmentos proacuteximos a 200
pb
Figura 11 Infecccedilatildeo por KPC segundo sexo dos 17 pacientes investigados no
HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
Figura 12Isolado de KPC segundo desfecho cliacutenico dos 17 pacientes investigados
no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
Figura 13 Isolados de KPC segundo local da coleta da amostra nos 17 pacientes
investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
Figura 14Isolado de KPC segundo microrganismo encontrado em 17 pacientes
investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Criteacuterios Interpretativos para testes de sensibilidade
Tabela 2 Nuacutemero de acesso ao GenBank dos alelos blaKPC e seus microrganismos
originais
Tabela 3 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do gene blaKPC
Tabela 4 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do gene
universal
Tabela 5 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da digestatildeo do gene universal
Tabela 6 - Distribuiccedilatildeo das variaacuteveis estudadas perfil geneacutetico sexo coleta
tipificaccedilatildeo de microrganismos e anaacutelise da resistecircncia bacteriana segundo o
desfecho cliacutenico Brasiacutelia-DF 2010 a 2012
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AmpC- Adenosina Monofosfato Ciacuteclico
BRMD- Bacteacuterias multirresistentes
CCIH- Comissatildeo de Controle de Infecccedilatildeo Hospitalar
CDC- Centers for Disease Control and Prevention
CIM- Concentraccedilatildeo Inibitoacuteria Miacutenima
CLSI- Clinical and Laboratory Standards Institute
DNA- Aacutecido Desoxirribonucleacuteico
E coli- Escherichia coli
ERIC-PCR - Enterobacterial Repet it ive Intergenic Consensus
ESBL- Beta-Lactamases de Espectro Estendido
Et al- e outros
ETP- Ertapenem
HRAN- Hospital Regional da Asa Norte
K ornithinolytica- Klebsiella ornithinolytica
K oxytoca- Klebsiella oxytoca
K planticola- Klebsiella planticola
K pneumoniae- Klebsiella pneumoniae
K terrigena- Klebsiella terrigena
KPC - Klebsiella pneumoniae produtora de Carbapenemase
KPCNEG- Bacilos Gram-Negativos Natildeo Fermentadores
KPCPOS- Bacilos Gram-Positivo Natildeo Fermentadores
MBL- metalo-beta-lactamases
MEM- Meropenem
NA- Natildeo se aplica
Oligo- Oligonucleotiacutedeos
PB- Pares de Bases
PBPs (Penicilim-Binding-Protein)- Proteiacutenas de ligaccedilatildeo agrave penicilina
PCR- Polymerase Chain Reaction (Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase)
PFGE - Pulsed-Field Gel Electrophoresis (Eletroforese em campo pulsado)
RAPD- Randomly Amplified Polymorphic DNA (DNA polimoacuterfico amplificado
aleatoriamente)
RFLPrsquos - ldquoRestriction Fragment Length Polymorphismsrdquo( polimorfismos de tamanho
de fragmentos de restriccedilatildeo)
THM- Teste de Hodge Modificado
TSA- Teste de Susceptibilidade aos Antibioacuteticos
UTI- Unidade de Terapia Intensiva
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 15
11 Klebsiella pneumoniae produtora de Carbapenemase (KPC) 15
1 2 Resistecircncia bacteriana 20
13 Anaacutelise geneacutetica de microrganismos 27
2 JUSTIFICATIVA 30
3 OBJETIVOS 31
31 Objetivo geral 31
32 Objetivos Especiacuteficos 31
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS 32
4 1 Coleta e transporte das amostras bioloacutegicas 32
4 2 Procedimentos para confirmaccedilatildeo de resistecircncia bacteriana por disco de
Ertapenem (adaptado CDC 2004) 32
4 2 1 Interpretaccedilatildeo dos Resultados 33
4 3 Teste de susceptibilidade aos antibioacuteticos 34
4 4Teste de Hodge Modificado (THM) (adaptado CDC 2004) 35
441 Controle de qualidade (CQ) 35
442 InterpretaccedilatildeoResultados 35
4 5 Extraccedilatildeo de DNA bacteriano 37
4 6 Iniciadores e reaccedilatildeo de PCR 38
4 7 Digestatildeo 41
4 8 Eletroforese em gel de agarose 41
4 9 Descarte de resiacuteduos 42
4 10 Aspectos epidemioloacutegicos e cliacutenicos 42
4 12 Anaacutelises estatiacutesticas 42
4 13 Preceitos eacuteticos 43
5 RESULTADOS 44
51 Anaacutelise molecular 44
5 1 1 Gene blaKPC 44
5 1 2 Gene 16S rRNA 45
5 2 Anaacutelises epidemioloacutegicas 46
5 2 1 Sexo 46
5 2 2 Desfecho cliacutenico 47
5 2 3 Local da coleta 48
5 2 4 Microrganismo 48
6 DISCUSSAtildeO 53
7 CONCLUSAtildeO 57
15
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC)
Klebsiella pneumoniae pertence aacute famiacutelia Enterobacteriaceae
encontrado em locais como aacutegua solo plantas e esgoto Satildeo encontradas cinco
espeacutecies K pneumoniae K oxytoca K planticola K terrigena e K ornithinolytica
O gecircnero Klebsiella eacute definido como contendo bacilos Gram-negativos natildeo moacuteveis
em forma de bastatildeo e geralmente encapsuladas que produzem lisina
descarboxilase mas natildeo produzem ornitina descarboxilase Provavelmente a
colonizaccedilatildeo em seres humanos ocorre por contato com as diferentes fontes
ambientais podendo ser encontrada colonizando a orofaringe e fezes de pessoas
sadias Pessoas imunocomprometidas a bacteacuteria encontra um ambiente favoraacutevel
para seu crescimento levando aos quadros de infecccedilatildeo (MOREIRA et al 2014)
A Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) eacute uma enzima produzida por
enterobacteacuterias gram-negativas sendo um mecanismo de resistecircncia aos antimi-
crobianos carbapenecircmicos meropenen ertapenen eou imipenen classe
amplamente utilizada no tratamento de infecccedilotildees envolvendo Enterobacteriaceae
Ela tambeacutem eacute capaz de inativar os agentes β-lactacircmicos cefalosporinas penicilinas
e o aztreonam (COTRIM et al 2012)
Devido agrave semelhanccedila estrutural e estereoquiacutemica os antibioacuteticos beta-
lactacircmicos possuem um mecanismo de accedilatildeo comum ao grupo Eles atuam inibindo
a siacutentese da parede celular bacteriana atraveacutes do mecanismo de bloqueio da
transpeptidaccedilatildeo responsaacutevel pela uniatildeo dos componentes individuais do
peptidoglicano conforme demonstrado na figura 1 (KIDWAI et al 1999)
A accedilatildeo destes antibioacuteticos eacute atraveacutes de ligaccedilotildees covalentes com as proteiacutenas
as Penicilim-Binding-Protein (proteiacutena de ligaccedilatildeo da penicilina- PBP ou PLP) que se
encontram presentes na membrana citoplasmaacutetica de todas as bacteacuterias Devido agraves
mutaccedilotildees ocorre uma induccedilatildeo na alteraccedilatildeo dessas proteiacutenas podendo determinar
uma diminuiccedilatildeo da afinidade dos beta-lactacircmicos agraves mesmas A accedilatildeo dos
carbapenecircmicos eacute atraveacutes da sua ligaccedilatildeo agraves PBPs presentes na parede bacteriana
especialmente as PBP1 e PBP2 provocando a lise osmoacutetica da bacteacuteria Aleacutem
disso eles tecircm uma facilidade na penetraccedilatildeo da bacteacuteria por meio dos canais
poriacutenicos presentes nas bacteacuterias gram-negativas induzindo um efeito poacutes-
16
antibioacutetico Quando comparados com outros beta-lactacircmicos os carbapenecircmicos
satildeo mais resistentes agrave hidroacutelise pela maioria das beta-lactamases tanto
cromossocircmicas como plasmiacutedicas (LIVERMORE 1995 LIVERMORE et al 2000)
Figura 1 Accedilatildeo do szlig-lactacircmico sobre a bacteacuteria gram-positiva e gram-
negativa Fonte
ltlthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controle
opas_webmodulo3gramn_lacta2htmgt (adaptado)
A bacteacuteria Klebsiella pneumoniae quando apresenta gene ESBL pode
expressar resistecircncia a ateacute 95 dos antimicrobianos existentes no acircmbito
farmacecircutico sendo a produccedilatildeo de beta-lactamases de espectro estendido (ESBL)
17
por esta bacteacuteria uma das principais causas de falha terapecircutica Existem outras
formas de resistecircncia emergentes de grande importacircncia como a produccedilatildeo de
beta-lactamases tipo adenosina monofosfato ciacuteclico (AmpC) que hidrolizam
cefoxitina as carbapenemases como as metalo-beta-lactamases (MBL) e
carbapenemases tipo KPC (MOREIRA et al 2014)
O mecanismo de resistecircncia mais comum aos antibioacuteticos beta-lactacircmicos de
amplo espectro eacute a produccedilatildeo de ESBL por enterobacteacuterias A accedilatildeo hidroliacutetica
apresentadas por estas enzimas pode conferir clinicamente resistecircncia ao
aztreonam cefalosporina e a todas as penicilinas (PATERSON et al 2005) As
ESBL satildeo enzimas mediadas por genes plasmidiais (transmissiacuteveis entre as
espeacutecies) Os principais microrganismos produtores de ESBL satildeo Klebsiella
pneumoniae (mais encontrada) Escherichia coli e Proteus mirabilis podendo ocorrer
em outros membros da famiacutelia Enterobacteriaceae e em alguns microrganismos natildeo
enteacutericos como Acinetobacter ssp (TURNER 2005) A importacircncia cliacutenica meacutedica
destes microrganismos portadores de ESBL eacute que graccedilas aacutes suas resistecircncias a
muitas classes de antimicrobianos o tratamento de infecccedilotildees eacute difiacutecil gerando um
aumento da morbidade e mortalidade dos pacientes (SHAH et al 2004)
A enzima KPC foi detectada pela primeira vez na Carolina do Norte Costa
Leste dos Estados Unidos no ano de 1996 em Klebsiella pneumoniae dando entatildeo
este nome a enzima Em pouco tempo ela disseminou por outras regiotildees e
recentemente tornou-se uma das preocupaccedilotildees quanto agrave sauacutede puacuteblica mundial
Os paiacuteses de onde KPCs tecircm sido relatados desde 2001 satildeo mostrados na figura 2
apresentando como os organismos tecircm agora sido disseminados amplamente pelo
mundo (NEIL GUPTA et al 2011)
18
Figura 2 Divulgaccedilatildeo internacional de Enterobacteriaceae produtora de
Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC)( NEIL GUPTA et al 2011)
Este mapa apresenta paiacuteses onde Enterobacteriaceae produtoras KPC de
foram descritos em relatoacuterios publicados disponiacuteveis a partir de 11 fevereiro de
2011 Os paiacuteses natildeo destacadas nesta figura tambeacutem podem apresentar a presenccedila
de Enterobacteriaceae produtoras de KPC poreacutem pode ter tido uma falta de
vigilacircncia sistemaacutetica para estes organismos ( NEIL GUPTA et al 2011)
No ano de 2005 foram registradas pela primeira vez essas bacteacuterias
produtoras de carbapenemases Apoacutes 6 anos deste primeiro relato elas passaram a
causar surtos mais graves em nosso paiacutes Em janeiro de 2011 foram notificados no
Distrito FederalBrasil 367 casos em um curto espaccedilo de tempo (01 a 08 de janeiro
de 2011) com 26 oacutebitos A maior parte destes casos (263 casos) foi identificada nas
unidades de terapia intensiva ndash UTI (COTRIM et al 2012)
O potencial de disseminaccedilatildeo da KPC eacute alto devido agrave grande capacidade de
transferecircncia do seu material geneacutetico e por conseguinte os genes de resistecircncia
O controle de epidemias eacute difiacutecil devido a esta caracteriacutestica de faacutecil disseminaccedilatildeo
preocupando os profissionais da aacuterea de sauacutede devido agrave dificuldade de tratamento
podendo resultar em um aumento das taxas de mortalidade Apesar da maior
19
frequumlecircncia em Klebsiella pneumoniae a KPC pode ser identificada em outras
bacteacuterias como a Enterobacter cloacae Citrobacter freundii Salmonella spp E coli
e Pseudomonas spp (DIENSTMANN et al 2010)
Os pacientes com comorbidades incluindo pacientes transplantados
neutropecircnicos em ventilaccedilatildeo mecacircnica em Unidade de Terapia Intensiva (UTI)
com longos periacuteodos de internaccedilatildeo que apresentam risco aumentado de infecccedilatildeo ou
colonizaccedilatildeo para bacteacuterias multirresistentes satildeo mais vulneraacuteveis a Klebsiella
pneumoniae produtora de KPC (COTRIM et al 2012)
Os sinais e sintomas apresentados por um indiviacuteduo infectado por KPC satildeo
febre ou hipotermia taquicardia piora do quadro respiratoacuterio e em casos mais
graves hipotensatildeo inchaccedilo e sepse Quanto ao siacutetio de infecccedilatildeo a bacteacuteria que
possui a enzima KPC pode causar pneumonia associada agrave ventilaccedilatildeo mecacircnica
infecccedilatildeo do trato urinaacuterio infecccedilatildeo de corrente sanguiacutenea infecccedilatildeo de partes moles
e outros tipos de infecccedilatildeo (COTRIM et al 2012)
Para desenvolver a infecccedilatildeo a colonizaccedilatildeo eacute um preacute-requisito poreacutem o
pacientes pode estar colonizado ou seja ser portadores de KPC e natildeo desenvolver
a infecccedilatildeo (ALVES et al 2013) A forma de transmissatildeo eacute basicamente por
contato com secreccedilatildeo ou excreccedilatildeo de pacientes infectados ou colonizados logo
fora do ambiente hospitalar a bacteacuteria natildeo representa perigo (COTRIM et al
2012)
As opccedilotildees terapecircuticas para o tratamento da Klebsiella pneumoniae eacute
dividida em Terapia Empiacuterica e Terapia apoacutes a determinaccedilatildeo do perfil de
sensibilidade A terapia empiacuterica para infecccedilotildees por enterobacteacuterias multirresistentes
se baseia na utilizaccedilatildeo de polimixina B ou polimixina E (Colistina) em associaccedilatildeo
com um (1) ou mais dos antimicrobianos da classe dos aminoglicosiacutedeos
(gentamicina ou amicacina) Carbapenecircmicos (meropenem ou doripenem) eou
tigeciclina (ANVISA 2013)
Recomenda-se usar sempre associaccedilotildees de dois ou trecircs antimicrobianos
sendo um deles a polimixina B ou a polimixina E (colistina) Deve-se evitar a
utilizaccedilatildeo de monoterapias pelo risco de raacutepido desenvolvimento de resistecircncia A
escolha do(s) faacutermaco(s) de associaccedilatildeo com polimixina B ou E deve se basear
preferencialmente no perfil de susceptibilidade esperado aos referidos
20
medicamentos das enterobacteacuterias resistentes aos carbapenecircmicos detectadas no
hospital ou na ausecircncia de dados locais na regiatildeo Deve-se considerar igualmente
o local de infecccedilatildeo e a penetraccedilatildeo esperada do antimicrobiano na escolha da droga
a ser utilizada na combinaccedilatildeo (ANVISA 2013)
Apoacutes a liberaccedilatildeo do perfil de sensibilidade deve-se adequar o uso dos
medicamentos Sempre que possiacutevel manter no miacutenimo 2 (dois) faacutermacos com
sensibilidade comprovada in vitro Natildeo havendo sensibilidade a um segundo
medicamento (suscetibilidade apenas agrave polimixina B ou E) recomenda-se manter a
terapia combinada de polimixina B ou E com carbapenecircmicos (meropenem ou
doripenem) ou tigeciclina na tentativa de ocorrecircncia de sinergismo entre elas
(ANVISA 2013)
Sugere-se aleacutem da determinaccedilatildeo das Concentraccedilotildees Inibitoacuterias Miacutenimas
(CIMs) para uma das polimixinas (B ou E) que tambeacutem sejam determinadas as
CIMs de tigeciclina e carbapenecircmicos (meropenem) bem como a consultoria de um
infectologista (ou Comissatildeo de Controle de Infecccedilatildeo Hospitalar- CCIH) para a
determinaccedilatildeo da terapia combinada com base na interpretaccedilatildeo do antibiograma
CIM e quadro cliacutenico do paciente No caso de resistecircncia agraves polimixinas
(concentraccedilotildees inibitoacuterias miacutenimas [CIMs] gt 2 mgL) recomenda-se a associaccedilatildeo de
dois ou trecircs do antimicrobianos sugeridos para a combinaccedilatildeo (ANVISA 2013)
A antissepsia eficiente do ambiente dos instrumentos ciruacutergicos e das matildeos
com o uso do aacutelcool a 70 eacute fundamental para a contenccedilatildeo de surtos Aleacutem disto
os pacientes contaminados devem permanecer isolados ateacute o controle da infecccedilatildeo
para evitar a disseminaccedilatildeo da bacteacuteria (COTRIM et al 2012)
1 2 Resistecircncia bacteriana
Hoje a disseminaccedilatildeo e a proliferaccedilatildeo das bacteacuterias resistentes estatildeo cada
dia mais presente As bacteacuterias multirresistentes (BRMD) poderatildeo levar agrave
humanidade a uma era poacutes-antibioacutetica resultando em uma ausecircncia de qualquer
opccedilatildeo de tratamento para os portadores destas cepas (HENRIQUE et al 2014)
Os fatores envolvidos na disseminaccedilatildeo desses patoacutegenos multirresistentes
satildeo diversos incluindo o uso irracional de antimicrobianos procedimentos invasivos
21
(cirurgias implantaccedilatildeo de proacuteteses meacutedicas e outros) e a transferecircncia de material
geneacutetico com a informaccedilatildeo de resistecircncia a antibioacuteticos entre as bacteacuterias
(DIENSTMANN et al 2010 ENDIMIAMI et al 2009 FONTANA et al 2010)
Com a praacutetica da antibioticoterapia principalmente em ambientes
nosocomiais os mecanismos de resistecircncia tornaram-se comuns Esses
mecanismos incluem alteraccedilatildeo na permeabilidade da membrana celular que
impede a entrada do antibioacutetico na ceacutelula bombeamento do antibioacutetico para fora da
mesma pelo mecanismo de efluxo mutaccedilatildeo geneacutetica que altera de alguma forma o
alvo do antibioacutetico e consequumlentemente natildeo afeta o funcionamento da bacteacuteria
bem como desenvolvimento da capacidade de degradar ou da inativaccedilatildeo do
antibioacutetico (COTRIM et al 2012) Estes mecanismos estatildeo representados na figura
3
Figura 3 Mecanismos de resistecircncia bacteriana Fonte
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controle
opas_webmodulo3pop_mecanismohtmgt
Um dos mais importantes mecanismos de resistecircncia eacute a alteraccedilatildeo do local-
alvo onde atua determinado antimicrobiano de modo a impedir a ocorrecircncia de
qualquer efeito inibitoacuterio ou bactericida As bacteacuterias podem adquirir um gene que
22
codifica um novo produto resistente aos antimicrobianos substituindo o alvo original
por exemplo o Staphylococcus aureus resistente agrave oxacilina e estafilococos
coagulase-negativos adquiriram o gene cromossocircmico Mec A e produzem uma PBP
ou PLP resistente aos β-lactacircmicos denominada 2a ou 2 que eacute suficiente para
manter a integridade da parede celular durante o crescimento quando outras PBPs
essenciais satildeo inativadas por antibimicrobianos β-lactacircmicos Como alternativa um
gene receacutem-adquirido pode atuar para modificar um alvo tomando-o menos
vulneraacutevel a determinado antimicrobiano Assim um gene transportado por
plasmiacutedeo ou por transposon codifica uma enzima que inativa os alvos ou altera a
ligaccedilatildeo dos antimicrobianos como ocorre com eritromicina e clindamicina (ANVISA
2007)
Em funccedilatildeo da bomba de efluxo pode variar a especificidade do antibioacutetico
Ele atua por meio do bombeamento ativo de antimicrobianos do meio intracelular
para o extracelular gerando uma resistecircncia bacteriana a determinados
antimicrobianos como eacute o caso da resistecircncia agraves tetraciclinas codificada por
plasmiacutedeos em Escherichia coli devido agrave presenccedila de proteiacutenas integrantes da
membrana plasmaacutetica bacteriana (PIDDOCK 2006)
O aumento da siacutentese de proteiacutenas eacute o principal responsaacutevel pela resistecircncia
antimicrobiana devido agraves vaacuterias mutaccedilotildees que ocorrem em seus repressores
transcricionais Estas mutaccedilotildees tambeacutem podem influenciar levando a um aumento
da eficiecircncia do transporte dos antibioacuteticos para o exterior da ceacutelula (HARBOTTLE
et al 2006)
A resistecircncia aos antibioacuteticos eacute frequumlentemente associada agrave alteraccedilatildeo
diminuiccedilatildeo da permeabilidade que ocorre na membrana externa das bacteacuterias gram-
negativas O fluxo de moleacuteculas para o interior da ceacutelula ocorre por caracteriacutesticas
peculiares como carga estrutura e dimensatildeo e atraveacutes de proteiacutenas de membrana
as quais formam canais Este percurso eacute utilizado pelos antibioacuteticos para atingir o
interior da ceacutelula bacteriana ou o espaccedilo periplasmaacutetico como eacute o caso dos
antibioacuteticos β-lactacircmicos Portanto a perda de funccedilatildeo destas proteiacutenas pode
efetivamente causar a diminuiccedilatildeo da susceptibilidade a vaacuterios antibioacuteticos
(LIVERMORE 2003)
23
Os mecanismos de resistecircncia que podem impedir a accedilatildeo de antimicrobianos
satildeo vaacuterios O faacutermaco atua de forma a inibir os processos essenciais a multiplicaccedilatildeo
e sobrevivecircncia da ceacutelula bacteriana como a membrana citoplasmaacutetica e
consequumlentemente bloqueando a siacutentese proteacuteica de aacutecidos nucleacuteicos e da parede
celular A resistecircncia bacteriana eacute um mecanismo natural de defesa Sendo assim
as bacteacuterias estatildeo em constante defesa e para cada novo faacutermaco desenvolvido as
bacteacuterias iratildeo desenvolver resistecircncia em algum momento (POSSEBON et al
2003)
O grupo de antibioacuteticos beta-lactacircmicos satildeo amplamente utilizado e se
encontram dentro da classe dos melhores agentes antimicrobianos com relevacircncia
cliacutenica No entanto o seu uso tem sido restringido devido a vaacuterios mecanismos de
resistecircncia O desenvolvimento dos carbapenecircmicos surgiu devido agrave proliferaccedilatildeo de
beta-lactamases mediadas por plasmiacutedeos e cromossomos (POSSEBON et al
2003)
A bacteacuteria KPC tem um gene chamado SHV-1 que tem a caracteriacutestica de
resistecircncia a quase todos os tipos de antimicrobianos inclusive os carbapenecircmicos
especiacuteficos para o tratamento de infecccedilotildees por bacteacuterias multiresistentes e
emergecircncias Mesmo com no seu coacutedigo geneacutetico a informaccedilatildeo necessaacuteria para o
desenvolvimento da resistecircncia a resistecircncia da bacteacuteria soacute eacute desenvolvida caso a
bacteacuteria entre em contato com o antibacteriano desencadeando todo o processo
nos casos de resistecircncia induzida comuns em KPC (MOREIRA et al 2014)
A resistecircncia bacteriana pode ser apresentada de forma intriacutenseca ou
adquirida A resistecircncia intriacutenseca faz parte das caracteriacutesticas fenotiacutepicas naturais
do microrganismo ou seja faz parte de sua heranccedila geneacutetica sendo transmitida
verticalmente a prole sem perda da caracteriacutestica A presenccedila ou ausecircncia do alvo
para a accedilatildeo da droga eacute o principal determinante deste tipo de resistecircncia
(MOREIRA et al 2014) Essa resistecircncia corresponde a uma caracteriacutestica de
espeacutecie bacteriana quando estes microrganismos satildeo naturalmente resistentes a
certo tipo de antibioacutetico Este processo eacute decorrente da ausecircncia de estruturas de
atuaccedilatildeo de antimicrobianos ou a impermeabilidade por parte de estruturas
perifeacutericas das bacteacuterias (HENRIQUE et al 2014)
24
A resistecircncia adquirida aos antibioacuteticos por sua vez ocorre quando haacute uma
da mutaccedilatildeo de genes reguladores ou estruturais aquisiccedilatildeo de genes de resistecircncia
veiculados por elementos geneacuteticos moacuteveis ou da combinaccedilatildeo entre eles Este
aparecimento de resistecircncia em uma espeacutecie bacteriana era anteriormente sensiacutevel
a droga e devido a um destes fatores se torna resistente O fenoacutetipo resultante
desta resistecircncia natildeo estaraacute presente nas ceacutelulas genitoras e sim nos indiviacuteduos de
uma linhagem bacteriana derivada de um organismo susceptiacutevel Os genes muitas
vezes satildeo adquiridos por meio de elementos moacuteveis como plasmiacutedeos e
transposons (MOREIRA et al 2014)
Entatildeo a resistecircncia adquirida ocorre por diversos mecanismos geneacuteticos tais
como produccedilatildeo de enzimas inativadoras interferecircncia com a entrada e acuacutemulo de
droga na bacteacuteria alteraccedilatildeo do receptor para accedilatildeo da droga via metaboacutelica
alternativa Eacute originada por meio de uma alteraccedilatildeo a niacutevel geneacutetico da ceacutelula de
natureza cromossocircmica pelos processos de mutaccedilatildeo transduccedilatildeo e transformaccedilatildeo
ou extra cromossocircmica (plasmidial) (HENRIQUE et al 2014)
Como todo antibioacutetico β-lactacircmicoos carbapenecircmicos tem como mecanismo
de accedilatildeo a inibiccedilatildeo da siacutentese proteacuteica atraveacutes da accedilatildeo de inibiccedilatildeo da parede
microbiana fazendo a ligaccedilatildeo e inativaccedilatildeo das proteiacutenas ligadoras de penicilinas
(NETO et al 2007)
Imipenem e meropenem antibioacuteticos pertencentes ao grupo dos
carbapenecircmicos possuem um amplo espectro de accedilatildeo in vitro incluindo atividade
contra cocos gram-positivos bacilos gram-negativos e bacteacuterias anaeroacutebias (MOHR
2008) Jaacute o ertapenem possui um espectro de accedilatildeo mais limitado que o os dois
antibioacuteticos anteriormente citados tendo uma eficiecircncia limitada contra os bacilos
gram-negativos natildeo fermentadores Um novo antibioacutetico carbapenecircmico ainda natildeo
disponiacutevel no Brasil doripenem possui uma atividade mais potente principalmente
contra Pseudomona aeruginosa devido ao seu mecanismo de accedilatildeo que combina os
espectros de accedilatildeo de imipenem e meropenem (ZHANEL et al 2007)
Devido as suas estabilidades espectro de accedilatildeo poucos relatos de
resistecircncia boa toleracircncia pelos pacientes com efeitos adversos mais comuns as
complicaccedilotildees no siacutetio da infusatildeo e toxicidade gastrintestinal estes antibioacuteticos
carbapenecircmicos tecircm sido considerados terapia de escolha (NICOLAU 2008) Como
25
uma resposta adaptativa das Enterobacteacuterias o iacutendice de resistecircncia aos
carbapenecircmicos tem aumentado nos uacuteltimos anos de forma proporcional ao seu
uso limitando imensamente as opccedilotildees terapecircuticas para as infecccedilotildees causadas por
estes microrganismos (FALAGAS et al 2009)
As enzimas produtoras de betalactamases hidrolisam o anel betalactacircmico
tornando este mecanismo de resistecircncia o mais importante Os dois grupos mais
preocupantes satildeo o grupo das betalactamases de aspecto ampliado e os da
carbapenemases que aleacutem de hidrolizar os carbapenecircmicos hidrolizam todas as
outras classes de betalactacircmicos Em enterobacteacuterias as carbapenemases mais
prevalentes satildeo codificadas por genes dos grupos blaKpc blaIMP blaVIM blaNdm
e blaOxa A ocorrecircncia de carbapenemases eacute mais frequentemente em bacteacuterias
gram-negativas fermentadoras da glicose conhecidas como enterobacteacuterias
predominantes nos gecircneros Klebsiella Serratia Citrobacter Enterobacter
Escherichia Samonella Proteus Morganella Podem ser encontradas tambeacutem em
bacteacuterias gram-negativas natildeo fermentadoras como espeacutecies de Acinetobacter e de
Pseudomonas (ALVES et al 2013)
Carbapenemases satildeo enzimas plasmiacutedio-mediados resistentes a todos
antibioacuteticos betalactacircmicos As bacteacuterias que possuem o gene blaKpC responsaacutevel
pela codificaccedilatildeo da produccedilatildeo de carbapenemases apresentam resistecircncia aos
antibioacuteticos betalactacircmicos impedindo a accedilatildeo destes antibioacuteticos contra infecccedilotildees
(ALVES et al 2013)
A transmissatildeo das carbapenemases a diferentes cepas de enterobacteacuterias se
daacute atraveacutes de plasmiacutedeos que satildeo pequenas moleacuteculas circulares de DNA com a
capacidade de se replicarem independentemente do DNA cromossocircmico
permitindo a troca de material geneacutetico entre gecircneros e espeacutecies diferentes de
enterobacteacuterias O raacutepido desenvolvimento de surtos em ambientes hospitalares eacute
explicado por essa disseminaccedilatildeo plasmidial (COTRIM et al 2012)
De acordo com o criteacuterio de interpretaccedilatildeo do Clinical and Laboratory
Standards Institute (CLSI 2009) a maioria das KPC isoladas natildeo apresenta
resistecircncia completa aos carbapenecircmicos (Imipenem e Meropenem apresentam
uma Concentraccedilatildeo Inibitoacuteria Miacutenima (CIM) de 2-8 μgmL) (COTRIM et al 2012)
26
Os mecanismos de resistecircncia capazes de impedir a accedilatildeo dos
carbapenecircmicos satildeo vaacuterios Poreacutem a degradaccedilatildeo de antibioacuteticos por enzimas
principalmente as carbapenemases constituem o principal mecanismo de
resistecircncia aos antibioacuteticos β-lactacircmicos (DIAS 2009) Devido a ampla atividade
hidroliacutetica agrave maioria dos antibioacuteticos β-lactacircmicos estes grupos de enzimas possuem
alta versatilidade (QUEENAM et al 2007)
Existem trecircs grandes classes moleculares de Ambler a qual as
carbapenemases pertencem denominadas classe A (serino-carbapenemases os
quais incluem membros designados SME IMI NMC GES e a famiacutelia das KPCs)
classe B(as metalo-β-lactamase incluem os tipos IMP e VIM) e classe D
(oxacilinases similares as da classe A e incluem as OXA e PSE) (DIAS 2009)
Dentre estes as mais importantes e prevalentes encontradas em plasmiacutedeos
de Klebsiella pneumoniae satildeo as KPC (DIENSTMANN et al 2010) Por meio de
estudos moleculares a enzima KPC jaacute foi documentada em diferentes bacteacuterias e
diferenciada em KPC-1 a 13 (NETIKUL et al 2011) No ano de 2009 foi realizada
uma pesquisa onde descreveram as seguintes carbapenemases KPC-1 em isolados
de Klebsiella pneumoniae KPC-2 em K pneumoniae K oxytoca Salmonella
enterica e em Enterobacter sp e KPC-3 em K pneumoniae e Enterobacter cloacae
(MONTEIRO et al 2009) As enzimas KPC-4 e KPC-5 foram encontradas em
isolados de Pseudomonas aeruginosa (PEIRANO et al 2009)
Foi observada uma correccedilatildeo da sequumlecircncia KPC-1 indicando que o gene
blaKPC-1 e blaKPC-2 satildeo idecircnticos Trecircs novas variantes blaKPC-3 blaKPC-4 e
blaKPC-5 satildeo resultados de mutaccedilotildees do gene estrutural da enzima KPC-2
(WOLTER et al 2008) apresentando diferentes perfis de hidroacutelise As enzimas
KPC-2 e KPC-3 possuem alta eficiecircncia em hidrolisar cefalotina cefaloridina e
nitrocefin poreacutem possuem uma menor eficiecircncia contra carbapenecircmicos e
cefotaxima (ALBA et al 2005) As enzimas KPC-5 e KPC-4 apresentam menor
hidroacutelise de carbapenecircmicos eacute do que em KPC-2 Em contrapartida possuem
melhor eficiecircncia contra ceftazidima e uma maior inibiccedilatildeo pelo aacutecido clavulacircnico
(WOLTER et al 2008)
27
13 Anaacutelise geneacutetica de microrganismos
Eacute de extrema importacircncia praacutetica natildeo soacute no aspecto cliacutenico mas tambeacutem na
fitopatologia biotecnologia e estudos ambientais a correta identificaccedilatildeo e
classificaccedilatildeo de microrganismos Os meacutetodos usados na diferenciaccedilatildeo de gecircneros
espeacutecies e estirpes de microrganismos podem ser divididos em meacutetodos fenotiacutepicos
(baseados em fenocircmenos bioquiacutemicos fisioloacutegicos e bioloacutegicos) e genotiacutepicos
(detectam polimorfismos ao niacutevel dos aacutecidos nucleacuteicos ou variaccedilatildeo aleacutelica ao niacutevel
de enzimas) (ALVES et al 2003)
Para este tipo de estudo existem alguns meacutetodos como o RFLPrsquos -
ldquoRestriction Fragment Length Polymorphismsrdquo (polimorfismos de tamanho de
fragmentos de restriccedilatildeo) rep-PCR (Meacutetodo de tipagem baseado na amplificaccedilatildeo via
PCR de elementos de DNA repetitivos presentes em genomas bacterianos) anaacutelise
de sequumlecircncias nucleotiacutedeas (discriminaccedilatildeo eou identificaccedilatildeo atraveacutes de sequumlecircncias
de DNA) PFGE - Pulsed-Field Gel Electrophoresis (Eletroforese em campo
pulsado) ( A L V E S et al 2003)
A diferenciaccedilatildeo clara da cepa e principalmente a alta reprodutibilidade devem
ser caracteriacutesticas de qualquer meacutetodo de tipagem geneacutetica Poreacutem nem todos os
meacutetodos moleculares de tipagem satildeo igualmente eficazes Sendo assim de acordo
com a finalidade pretendida (identificaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo custo reprodutibilidade
etc) eacute feita a escolha do meacutetodo a ser aplicado (A L V E S et al 2003)
O processo de identificaccedilatildeo fenotiacutepica de KPC entre os membros da famiacutelia
Enterobacteriaceae ainda eacute difiacutecil e os meacutetodos para a sua identificaccedilatildeo devem ser
revistos e ajustados Mesmo com o avanccedilo tecnoloacutegico natildeo existem ensaios que
combinam alta especificidade e sensibilidade na detecccedilatildeo destas enzimas Satildeo
diversas as metodologias usadas para rastreamento de KPC como por exemplo a
focalizaccedilatildeo isoeleacutetrica a teacutecnica de disco-difusatildeo E-test teste de Hodge
modificado dentre outros Aleacutem disso a pesquisa do gene blaKPC pode ser feita
pela Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) Os sistemas de automaccedilatildeo
existentes no entanto podem natildeo identificar com precisatildeo os isolados KPC
positivos (COTRIM et al 2012)
A identificaccedilatildeo blaKPC pelo PCR eacute um meacutetodo raacutepido preciso sensiacutevel e
altamente especiacutefico no entanto a PCR exige equipamento e conhecimentos
28
especializados em diagnoacutestico molecular dificultando ainda a utilizaccedilatildeo dele na
rotina dos laboratoacuterios de microbiologia (COTRIM et al 2012)
Em estudo de infecccedilotildees hospitalares identificaccedilatildeo molecular de patoacutegenos
bacterianos eacute bastante utilizada Para diferenciar carbapenemases tipo KPC a partir
de outros tipos como SME NMC-A-IMI e GES eacute necessaacuterio um exame molecular
As identificaccedilotildees do microrganismo juntamente com a triagem molecular iratildeo definir
um resultado mais especiacutefico podendo ser usado para identificar o antibioacutetico mais
adequado para o tratamento Poreacutem a principal desvantagem de alguns exames
baseados em PCR por exemplo eacute que devido agrave sua limitada capacidade de
multiplexaccedilatildeo eles distinguem apenas algumas variaccedilotildees (MOREIRA et al 2014)
Estatildeo descritas para a identificaccedilatildeo molecular de patoacutegenos pertencentes agrave
famiacutelia Enterobacteriaceae as teacutecnicas de PFGE RAPD (randomly amplified
polymorphic DNA) e ERIC-PCR (Enterobacterial Repet it ive Intergenic Consensus)
A PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) eacute considerada padratildeo ouro devido sua
alta capacidade de diferenciaccedilatildeo baseada na anaacutelise do perfil de restriccedilatildeo do DNA
genocircmico por meio de eletroforese Como desvantagem para a sua execuccedilatildeo eacute
necessaacuterios vaacuterios dias impedindo a tipagem de algumas cepas bacterianas devido
agrave degradaccedilatildeo do DNA aleacutem do alto custo empregado (MOREIRA et al 2014)
O meacutetodo baseado em ERIC-PCR tem sido bastante utilizado como uma
alternativa para a teacutecnica de PFGE Esta teacutecnica consiste na anaacutelise do padratildeo de
amplificaccedilatildeo de elementos repetidos encontrados no genoma bacteriano Isto
permite uma maior rapidez na obtenccedilatildeo de resultados quando comparada com o
PFGE aleacutem de alta reprodutibilidade simples execuccedilatildeo e implementaccedilatildeo baixo
custo e natildeo sem problemas com a degradaccedilatildeo do DNA (MOREIRA et al 2014)
A PCR eacute considerada uma teacutecnica de biologia molecular revolucionaacuteria que
consiste na siacutentese enzimaacutetica de coacutepias de aacutecidos nucleacuteicos Ela permitiu o raacutepido
desenvolvimento do estudo de sequumlecircncias de aacutecidos nucleacuteico Foi desenvolvida por
Kary Banks Mullis que ganhou o precircmio Nobel de quiacutemica de 1993 devido ao
desenvolvimento dessa teacutecnica em abril de 1983 (CAMARGO et al 2014)
Por meio de etapas de variaccedilatildeo de temperatura a teacutecnica de PCR promove a
duplicaccedilatildeo de cadeias de DNA in vitro A reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo de DNA por PCR
envolve o emprego de sequumlecircncias iniciadoras (primers) quatro nucleotiacutedeos
29
(dNTPrsquos) do DNA e uma DNA polimerase termoestaacutevel podendo assim obter-se a
partir de uma fita molde muitas coacutepias de uma sequumlecircncia especiacutefica de aacutecido
nucleacuteico O princiacutepio da PCR consiste na variaccedilatildeo de temperatura por ciclo
envolvendo trecircs etapas baacutesicas desnaturaccedilatildeo pareamento e amplificaccedilatildeo
(CAMARGO et al 2014)
A desnaturaccedilatildeo da fita molde de DNA eacute uma etapa com duraccedilatildeo entre 30
segundos a 1 minuto a temperatura entre 92 ordmC a 96 ordmC Apoacutes isso o pareamento de
dois iniciadores sinteacuteticos de composiccedilotildees distintas que funcionam como os
iniciadores da reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo liga-se agrave regiatildeo complementar da fita de
DNA alvo que sofreraacute a duplicaccedilatildeo Esta etapa tem duraccedilatildeo de 30 segundos a 1
minuto a temperatura entre 58 ordmC e 65 ordmC Por uacuteltimo a amplificaccedilatildeo por meio da
enzima Taq DNA polimerase das novas fitas de DNA se daacute a partir de cada um dos
iniciadores utilizando os quatro dNTPrsquos como substrato da reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo
Esta etapa possui duraccedilatildeo entre 45 segundos e 1 minuto a 72 ordmC Cada ciclo eacute
repetido em torno de 30 a 35 vezes e promove a amplificaccedilatildeo da regiatildeo alvo
determinada conforme o anelamento dos iniciadores sinteacuteticos de DNA (CAMARGO
et al 2014) Estas etapas estatildeo demonstradas na figura 4
Figura 4 Etapas da Reaccedilatildeo de PCR
30
2 JUSTIFICATIVA
No ano de 2010 no Distrito Federal foram identificados 111 pacientes com
suspeita de infecccedilatildeo por Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) e a
Secretaria de Sauacutede do Distrito Federal confirmaram ainda a morte de 18 pacientes
dentre os hospitais puacuteblicos e particulares Um desafio encontrado por ocasiatildeo do
surto infeccioso no Distrito Federal foi o de confirmar as KPCs por Reaccedilatildeo da
Polimerase em Cadeia sendo que as amostras foram enviadas com esta finalidade
para a Fiocruz no Rio de Janeiro
Pesquisas que possam contribuir na elaboraccedilatildeo de estrateacutegias preventivas e
de intervenccedilatildeo para infecccedilotildees causadas por enterobacteacuterias bem como contribuir
para gerar uma integraccedilatildeo beneacutefica entre a equipe acadecircmica e os serviccedilos de
sauacutede devem ser estimuladas Neste sentido o presente estudo permitiu escrutinar
os genes envolvidos na expressatildeo de carbapenemases presentes em espeacutecies de
enterobacteacuterias isoladas em ambiente hospitalar visto que elucidar genes de
resistecircncia de enterobacteacuterias aos antibioacuteticos carbapenecircmicos eacute o primeiro passo
para garantir um controle epidemioloacutegico efetivo para estes tipos de microorganismo
assim como sua associaccedilatildeo com surtos fatais particularmente em pacientes com
baixa imunidade
31
3 OBJETIVOS
31 Objetivo geral Caracterizar os genes de resistecircncia das
Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases e os aspectos epidemioloacutegicos de
pacientes internados em um hospital puacuteblico do Distrito Federal
32 Objetivos Especiacuteficos
Identificar genotipicamente a enzima KPC (Klebsiella pneumoniae
carbapenemase) de isolados de Klebsiella pneumoniae
Investigar aspectos epidemioloacutegicos dos pacientes portadores de
Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases
Identificar quais variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana influenciaram para o
desfecho oacutebito ou alta
Avaliar a susceptibilidade das Enterobacteacuterias aos antibioacuteticos
carbapenecircmicos dos pacientes em ambiente hospitalar
32
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
Trata-se de um estudo transversal onde foi realizado o teste de
susceptibilidade das enterobacteacuterias aos antibioacuteticos carbapenecircmicos a partir dos
materiais bioloacutegicos coletados dos pacientes internados no Hospital Regional da Asa
Norte (HRAN) e enviados ao Laboratoacuterio de Anaacutelises Cliacutenicas da mesma Instituiccedilatildeo
Os materiais bioloacutegicos investigados foram sangue aspirado traqueal ou brocircnquico
urina e cultura semi quantitativa de ponta de cateter venoso central O HRAN eacute um
hospital puacuteblico do Distrito Federal com 395 leitos sendo as cliacutenicas de internaccedilatildeo
Berccedilaacuterio Cirurgia Geral Cirurgia Plaacutestica Cliacutenica Meacutedica Ginecologia Maternidade
Pediatria Queimados UTI com atendimento a pacientes portadores de doenccedilas de
caraacuteter cliacutenico e ciruacutergico
4 1 Coleta e transporte das amostras bioloacutegicas
As amostras foram coletadas de pacientes internados no Hospital Regional da
Asa Norte (HRAN) com suspeitas de infecccedilatildeo por KPC A identificaccedilatildeo primaacuteria foi
realizada pelo Laboratoacuterio de Microbiologia do hospital de origem dos pacientes e os
demais procedimentos que foram utilizados na identificaccedilatildeo encontram-se descritos
abaixo
4 2 Procedimentos para confirmaccedilatildeo de resistecircncia bacteriana por
disco de ertapenem (adaptado CDC 2004)
Para diagnosticar amostra como portadora de bacteacuteria produtora de
carbapenemase foi realizado o teste com disco de ertapenem como forma de
triagem Inicialmente utilizou-se o swab contaminado com a amostra que foi
distribuiacuteda em uma pequena aacuterea da placa de aacutegar MacConkey para apoacutes o
crescimento ser realizada a pesquisa de colonizaccedilatildeo por enterobacteacuterias resistentes
aos carbapenecircmicos (Pesquisa de CRE) Procedeu-se a semeadura por teacutecnica
semi-quantitativaesgotamento com alccedila bacterioloacutegica na diluiccedilatildeo de 1100 O disco
de Ertapenem foi colocado na superfiacutecie da placa de MacConkey na junccedilatildeo dos dois
primeiros campos de semeadura conforme demonstrado na figura 5 Incubou a placa
33
em estufa aeroacutebia a 35ordmC por 24 e 48 horas e observou-se o halo de difusatildeo do
disco de Ertapenem na placa para proceder agrave leitura
O teste deixou de ser obrigatoacuterio apoacutes a modificaccedilatildeo dos criteacuterios
interpretativos para carbapenecircmicos para enterobacteacuterias publicados no suplemento
do CLSI 2010 M100-S20-U
Figura 5 Mecanismo de semeamento de material bioloacutegico oriundos de
pacientes com suspeita de infecccedilatildeo por KPC Fonte adaptado CDC 2004
4 2 1 Interpretaccedilatildeo dos resultados
Na ausecircncia de crescimento ateacute 24 horas (MacConkey) ou halo de difusatildeo
gt27 mm na placa deve-se reincubar as placas por mais 24 horas Quando for
ausente o crescimento apoacutes 48 horas ou halo de difusatildeo gt27 mm na placa libera-se
como enterobacteacuterias resistentes a carbapenecircmicos (KPCNEG)Havendo
crescimento de colocircnias na placa de MacConkey com halo lt 27 mm (apenas para
colocircnias com crescimento dentro do halo) deve-se reisolar e realizar identificaccedilatildeo e
antibiograma automatizado teste de sensibilidade por disco-difusatildeo e Teste de
Hodge Modificado (THM) Os isolados de enterobacteacuterias cujos testes comprovarem
a resistecircncia aos carbapanecircmicos testados (KPCPOS) foram reportado a Comissatildeo
de Controle de Infecccedilatildeo Hospitalar (CCIH) Jaacute osbacilos Gram-negativos natildeo
fermentadores natildeo foram reportados (KPCNEG) Para interpretaccedilatildeodos resultados
foram utilizados os valores conforme demonstrados na tabela 1
Tabela 1 Criteacuterios Interpretativos para testes de sensibilidade
ENTEROBACTEacuteRIAS
Disco difusatildeo (mm) MIC (microgml)
34
Antibioacutetico Sigla S I R S I R
Ertapenem 10
microg
ETP 22 19-
21
18 05 1 2
Meropenem 10
microg
MEM 23 20-
22
19 1 2 4
Fonte Manual Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)
2013
Os resultados que apresentaram resistecircncia ao antibioacutetico Ertapenem foram
considerados como suspeitos de contaminaccedilatildeo por KPC Fez-se o teste de
susceptibilidade aos antibioacuteticos (TSA) em aparelho automatizado MicroScan Walk
Away 96sl Dade Behring
4 3 Teste de susceptibilidade aos antibioacuteticos (adaptado CDC 2004)
A determinaccedilatildeo da susceptibilidade dos isolados foi feita pelo teste de
susceptibilidade aos antibioacuteticos (TSA) apoacutes cultura em meio de gelose simples
(INSA) para avaliaccedilatildeo da sua pureza e obtenccedilatildeo de colocircnias isoladas Para
preparaccedilatildeo de uma suspensatildeo bacteriana com turvaccedilatildeo aproximada de 05
McFarland (Dade BehringMicroScanregTurbidity Meter) ressuspendeu duas a cinco
colocircnias em 2ml de soro fisioloacutegico esteacuteril diluindo a 1100 em soro fisioloacutegico num
volume total de 10ml em seguida foi feita uma semeadura em duas placas
quadradas (120mm x 120mm) de Muller-Hinton Agar (INSA) por inundaccedilatildeo
Os discos de antibioacutetico carbapenecircmicos imipenem meropenem e
ertapenem (Biorad) foram aplicados com o auxiacutelio de um dispensador automaacutetico A
susceptibilidade das Enterobacteacuterias aos carbapenecircmicos foi definida de acordo
com o protocolo Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI 2011)
Para aquelas Enterobacteacuterias que apresentaram resistecircncia ao ertapenem
foram realizados o Teste de Hodge Modificado para Detecccedilatildeo de Enterobacteacuterias
Produtoras de Carbapenemases conforme descrito pelo Centers for Disease Control
and Prevention (CDC 2004)
35
4 4Teste de Hodge Modificado (THM) (adaptado CDC 2004)
Preparou-se uma suspensatildeo em salina esteacuteril com a cepa Escherichia coli
ATCC 25922 (padratildeo 05 de McFarland) Apoacutes isto diluiu a suspensatildeo 110 em
salina (05 ml da soluccedilatildeo de Ecoli ATCC 25922 + 45 ml salina)Foi entatildeo semeado
na superfiacutecie de uma placa de Agar Muller-Hinton com a suspensatildeo diluiacuteda de Ecoli
ATCC 25922 com auxilio de swab seco assegurando que houvesse uma
distribuiccedilatildeo uniforme cobrindo toda a superfiacutecie do Agar Deixou secar por 3 a 5
minutos em temperatura ambienteColocou-se o disco de ertapenem 10microg no centro
da placa e apoacutes isto fez-se uma estria linear da cepa a ser testada da borda do
disco ateacute a borda da placa utilizando uma alccedila calibrada 10 microl ou um swab Incubou
a placa na estufa em atmosfera aeroacutebia a 35 plusmn 2ordmC por 16 a 24 horas
441 Controle de qualidade (CQ)
Foi utilizado um CQ todos os dias em que se realizou o teste tendo como
controle Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1705- teste de Hodge modificado
positivo Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1706- teste de Hodge modificado
negativo
442 InterpretaccedilatildeoResultados
Apoacutes 16ndash24 horas de incubaccedilatildeo examinar as placas para verificar a presenccedila
de uma distorccedilatildeo no halo de inibiccedilatildeo do disco de ertapenem devido ao crescimento
realccedilado da cepa ATCC na intersecccedilatildeo do organismo teste e a Ecoli ATCC 25922
dentro dos limites do halo O THM positivo apresentaraacute presenccedila de distorccedilatildeo no
halo de inibiccedilatildeo de ertapenem devido ao crescimento da cepa Ecoli ATCC 25922 ao
longo da estria da cepa teste para dentro dos limites do halo de inibiccedilatildeo Jaacute o THM
negativo teraacute ausecircncia de crescimento da cepa Ecoli ATCC 5922 ao longo da estria
da cepa teste para dentro dos limites do halo de inibiccedilatildeo do disco de ertapenem
Este resultado estaacute representado na figura 6
36
Figura 6 Interpretaccedilatildeo resultado do Teste de Hodge Modificado
(adaptado CDC 2004) Teste positivo na estria da cepa teste na parte superior
da placa teste negativo na estria da cepa teste na parte inferior da placa
Tendo positivo como resultado o paciente era um provaacutevel contaminado por
KPC As amostras entatildeo foram encaminhadas para a Fundaccedilatildeo Osvaldo Cruz
(FIOCRUZ) para confirmaccedilatildeo final As amostras finalmente confirmadas como
positivas para KPC foram isoladas e guardadas no banco de cepas cliacutenicas do
hospital Apoacutes a autorizaccedilatildeo do CEP amostras das cepas foram transferidas para
meio de transporte Stuard em caixa teacutermica fechada em baixa temperatura e
levadas para o laboratoacuterio de microbiologia cliacutenica da universidade
No laboratoacuterio da universidade as amostras foram separadas e realizadas
repiques em meios MacConkey e incubadas por 24h As colocircnias caracteriacutesticas
foratildeo isoladas em caldo BHI e mantidas em shaker a 37oC por 2h Apoacutes isto foram
executadas as anaacutelises a seguir
Os isolados de Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases foram
submetidos agrave extraccedilatildeo de DNA e posterior sequumlenciamento para identificaccedilatildeo dos
genes de resistecircncia blaKPC de 1 a 13 e identificaccedilatildeo do gene universal Os
pacientes de onde os materiais bioloacutegicos contendo as Enterobacteacuterias produtoras
de carbapenemases foram os isolados foram investigados quanto aos aspectos
epidemioloacutegicos e cliacutenicos
37
4 5 Extraccedilatildeo de DNA bacteriano
A extraccedilatildeo de DNA bacteriano foi realizada utilizando o kit NucleoSpin
Plasmidreg (MN) Antes de iniciar a extraccedilatildeo foi feito a preparaccedilatildeo das soluccedilotildees
reagentes materiais e amostras (vortexando) colocou-se em banho-maria agrave 50ordmC o
tampatildeo AW Partiu-se de colocircnias isoladas cultivadas que sofreram passagem em
meio LB liacutequido por 12h Adicionou-se 15 mL da amostra no tubo eppendorf
centrifugou por 5 minutos descartou o sobrenadante (com cuidado para natildeo
descartar o Pellet) Repetiu-se este procedimento por mais trecircs vezes completando-
se o volume de 6mL Foram adicionados 250microL do tampatildeo Resuspension Buffer A1
encostando a ponteira no Pellet e misturando (este tampatildeo tem como funccedilatildeo
separar a formaccedilatildeo de grumos celulares) Apoacutes isso homogeneizou e vortexou os
tubos eppendorfs Apoacutes isso foram adicionados 250microL do tampatildeo Lysis Buffer A2
homogenizou e deixou descansar por 5 minutos (esta etapa eacute importante para a lise
da parede e da membrana celulares e liberaccedilatildeo do conteuacutedo da ceacutelula)
Passado o tempo de descanso foi adicionado 300microL do tampatildeo
Neutralization Buffer A3 homogeneizou e centrifugou por 10 minutos (este tampatildeo
iraacute retirar as proteiacutenas que envolvem o DNA e voltaraacute com o pH para proacuteximo de 8
impedindo que a soluccedilatildeo de lise facilite a quebra das ligaccedilotildees covalentes do aacutecido
nucleacuteico) Em seguida enumeraram-se os tubos contendo filtros com siacutelica
transferiu-se o sobrenadante para o filtro e centrifugou por 5 minutos Descartou-se
o que foi filtrado adicionou 500microL do tampatildeo AW (banho-maria) centrifugou por 2
minutos Novamente foi descartado o filtrado Adicionou-se 600microL do tampatildeo A4
centrifugou por 2 minutos e descartou o filtrado (os tampotildees AW e A4 contecircm
isotiocianato de guanidina em concentraccedilotildees crescentes para facilitar a adsorccedilatildeo
do DNA na siacutelica e retirada das outras biomoleacuteculas da amostra) Foi feita outra
centrifugaccedilatildeo com o tubo vazio Apoacutes isto o filtro foi trocado para outro eppendorf
definitivo onde foi adicionado 50microL do tampatildeo Elution Buffer AE (este tampatildeo
favorece a eluiccedilatildeo do DNA) centrifugou por 2 minutos descartou o filtro e
armazenou as amostras em freezer -20ordmC
38
4 6 Iniciadores e reaccedilatildeo de PCR
Os iniciadores universais para o gene blaKPC foram desenhados baseados
em sequumlecircncias conservadas apresentadas pelos sub-grupos de genes que
codificam a enzima carbapenemase de klebsiella pneumoniae (YIGIT et al 2001)
Baseado na sequumlecircncia para o blakpc-1 depositada no GenBank
(AF2975541) o oligonucleotiacutedio (oligo) iniciador direto (5-
ATGTCACTGTATCGCCGTC-3rsquo) foi desenhado para reconhecer a sequumlecircncia
blaKPC na posiccedilatildeo (131149) enquanto que o iniciador reverso (5-
TTACTGCCCGTTGACGCC-3rsquo) foi reconhecido na posiccedilatildeo (9951012) As anaacutelises
baseadas em alinhamento de sequumlecircncias mostraram que o par de iniciadores
blaKPC podem detectar os alelos de 1 a 13 do gene blaKPC conforme a tabela 2
Tabela 2 Nuacutemero de acesso ao GenBank dos alelos blaKPC e seus
microrganismos originais
Nuacutemero de
Acesso GenBank
Microrganismo Alvo
AF2975541 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-1
GU0862251 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-2
HQ2589341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-2-like
AB5577341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC -3
EU4473041 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-4
EU4002222 Pseudomonas
aeruginosa
blaKPC-5
EU5555341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-6
EU7297271 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-7
39
FJ2344121 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-8
FJ624872 Escherichia coli blaKPC-9
GQ1403481 Acinetobacter
baumannii
blaKPC-10
HM0669951 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-11
HQ3428891 Enterobacter cloacae blaKPC-12
HQ3428901 Enterobacter cloacae blaKPC-13
As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo de blaKPC foram realizadas em um
primeiro tempo de desnaturaccedilatildeo em que foi 94ordmC por 5 minutos seguido de 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 58 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 90 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 78ordmC por 8 minutos Aleacutem das amostras foi utilizado um
controle negativo
A PCR do blaKPC foi realizada utilizando os componentes para o volume da
reaccedilatildeo de 25 microL citados na tabela 3 A banda do tamanho do produto de PCR foi de
881 pares de bases (pb) o que corresponde ao plasmiacutedeo
Tabela 3 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do
gene blaKPC
Reagente Volume
DNA molde 4 microL
Tampatildeo Taq 25 microL
MgCl2 075 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP
2 microL
Oligo F 1 microL
Oligo R 1 microL
Taq DNA polimerase 05 microL
Aacutegua MiliQ 1335 microL
40
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
Baseado na sequumlecircncia para o gene 16S rRNA em que o oligonucleotiacutedio
Universal iniciador direto foward (5-CCAGCAGCCGCCGTAATACG-3rsquo) foi
desenhado para reconhecer a sequumlecircncia universal na posiccedilatildeo 1513 enquanto que o
iniciador reverso (5-ATCGGYTACCTTGTTACGACTTC-3rsquo) foi reconhecido na
posiccedilatildeo 1491 foram realizadas PCRrsquos As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo deste
gene foram realizadas nos seguinte tempos separaccedilatildeo 94ordmC por 10 minutos 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 55 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 120 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 72ordmC por 10 minutos
A PCR do gene 16S rRNA foi realizada utilizando os componentes para o
volume da reaccedilatildeo de 25microL citados na tabela 4 A banda do tamanho do produto de
PCR foi de 996 pb correspondente aacute regiatildeo ribossomal capaz de amplificar todas
as espeacutecies
Tabela 4Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do gene
universal
Reagente (quantidade
concentraccedilatildeo do estoque)
Volume
DNA molde 10 ng 4 microL
Tampatildeo Taq 10 x 25 microL
MgCl2 50mM 125 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP 25 mM
125 microL
Oligo F 10microM 05 microL
Oligo R 10microM 05 microL
Taq DNA polimerase 5UmicroL 04 microL
Aacutegua Miliq 146 microL
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
41
O termociclador utilizado para os experimentos foi o LifeTouch da BIOER
4 7 Digestatildeo
Para realizaccedilatildeo da digestatildeo foi utilizada a enzima BshF I (Hae III) EN- 1105
tamanho 7000 units concentraccedilatildeo 10 unitsmicroL fonte Bacillus sphaericus empresa
Jena bioscienceUtilizaram-se os componentes para o volume de 50microL da reaccedilatildeo
citados na tabela 5
Tabela 5 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da digestatildeo do gene
universal
Reagente Volume
Produto de PCR 10 microL
Enzima BshF I 01 microL
Tampatildeo (10x) 5 microL
Aacutegua Miliq 349 microL
Total (em cada ependorff) 50 microL
Valores para 1 digestatildeo
Os ependorffs foram colocados por 30 minutos em banho-maria a 37ordmC Apoacutes
isso fez-se a corrida das amostras em gel de agarose para verificaccedilatildeo do resultado
(LU et al 2000)
4 8 Eletroforese em gel de agarose
Os produtos de DNA PCR e digestatildeo foram analisados em gel de agarose
2 O tempo de corrida do gel eacute de aproximadamente 1hora e 30minutos sendo
que no comeccedilo foi usada agrave voltagem de 50 V e apoacutes comeccedilar a correr o gel
aumentou a voltagem para 100 v Utilizou-se o marcador de 100pb (pares de bases)
Foi adicionado 3microL de corante Bromophenol (que tem a funccedilatildeo de fazer uma ligaccedilatildeo
na amostra de DNA e permitir a visualizaccedilatildeo da corrida no gel de agarose) em 7microL
de amostra tanto de DNA quanto de PCR Para o preparo do gel foi utilizado TBE
42
(Tris- Aacutecido Boacuterico) agarose e brometo de etiacutedio (sua funccedilatildeo eacute de corante para o gel
e permitir a visualizaccedilatildeo do DNA quando colocado agrave luz ultravioleta) Para o oligo
blaKPC a banda da amplificaccedilatildeo foi em 881ppb correspondendo ao plasmiacutedeo Jaacute
o oligo Universal foi em 996 pb
4 9 Descarte de resiacuteduos
Todos os materiais utilizados nos ensaios foram de uso uacutenico e manipulados
em cacircmaras de seguranccedila bioloacutegica classe II Apoacutes o uso foram colocados em
soluccedilatildeo desinfetantes (hipoclorito a 1) e em seguida autoclavados a 127oC por 20
min em sacos apropriados para autoclavaccedilatildeo Apoacutes a finalizaccedilatildeo do ciclo de
esterilizaccedilatildeo os sacos contendo o material descartaacutevel foram colocados em
recipientes de coleta da empresa responsaacutevel pela coleta de materiais bioloacutegicos
produzidos no laboratoacuterio de microbiologia Todos os procedimentos seguiram a
normativa RDC-ANVISA 3062004 sobre o descarte de resiacuteduos de serviccedilo de
sauacutede
4 10 Aspectos epidemioloacutegicos e cliacutenicos
Os aspectos cliacutenicos e epidemioloacutegicos foram investigados por meio de
prontuaacuterios dos pacientes portadores de enterobacteacuterias produtoras de
carbapenemases e envolveram topografia mais provaacutevel do foco infeccioso a
enfermidade motivadora da internaccedilatildeo o desfecho cliacutenico a idade e o tempo de
internaccedilatildeo
4 12 Anaacutelises eepidemioloacutegicas
As anaacutelises foram realizadas com o pacote estatiacutestico SPSS versatildeo 200
Para verificar quais variaacuteveis referentes aos dados epidemioloacutegicos e
microbioloacutegicos influenciaram no desfecho verificou- se a diferenccedila meacutedia das
variaacuteveis idade e tempo de internaccedilatildeo em cada grupo O teste estatiacutestico utilizado foi
o teste t de Student apoacutes se executar o teste de normalidade de Shapiro-Wilk Para
as variaacuteveis sexo perfil microbioloacutegico das enterobacteacuterias produtoras de
43
carbapenemases foi avaliada a associaccedilatildeo com o desfecho por meio do teste Exato
de Fisher O niacutevel de significacircncia adotado foi de 5
4 13 Preceitos eacuteticos
Este projeto estaacute inserido em um projeto maior denominado ldquoEpidemiologia
cliacutenica e caracterizaccedilatildeo molecular do Acinetobacter Baumannii resistente a
antibioticoterapia em pacientes internado em hospitais do Sistema Uacutenico de Sauacutederdquo
que foi submetido ao Comitecirc de Eacutetica em Pesquisa da Secretaria do Estado de
Sauacutede do Distrito Federal (SESDF) e emitido parecer aprovado pelo protocolo nordm
23109 (anexo)
44
5 RESULTADOS
51 Anaacutelise molecular
Para a amplificaccedilatildeo com o oligo blaKPC foram amplificadas amostras
que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 881 pb correspondente ao
plasmiacutedeo A anaacutelise da amplificaccedilatildeo da regiatildeo do gene blaKPC mostrou que
apenas a amostra A10 natildeo amplificou isso demonstra que esta amostra natildeo
possuiacutea o gene de resistecircncia
5 1 1 Gene blaKPC
Figura 7 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 881 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
A amostra A3 natildeo amplificou no primeiro momento entatildeo foi realizado
novamente a PCR e corrida de gel obtendo entatildeo a amplificaccedilatildeo da amostra como
apresentado na figura 8
45
Figura 8 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC da
mostra A3 estudada A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo de 881
pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 1 2 Gene 16S rRNA
Para a amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA utilizou-se o oligo universal Foram
amplificadas amostras que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 996 pb
Figura 9 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
46
Segundo Lu et al (2000) a digestatildeo com a enzima HaeIII deste amplicons de
16S rRNA devolveriam bandas com perfis entre 150 a 200 pb No gel abaixo eacute
possiacutevel evidenciar que este perfil ocorreu com o predomiacutenio de bandas na altura
de 200pb
Figura 10 Gel de agarose a 2 da digestatildeo do amplicon do gene 16S
rRNA das amostras com a enzima HaeIII evidenciando diversos fragmentos
proacuteximos a 200 pb A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo ribossomal
de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 2 Anaacutelises epidemioloacutegicas
5 2 1 Sexo
No total foram detectados 17 isolados de KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 onde a maior a prevalecircncia foi
detecatada em amostras de pacientes do sexo masculino (53) do que no sexo
feminino (47)
47
Figura 11 Isolado de KPC segundo sexo dos 17 pacientes investigados
no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 2 Desfecho cliacutenico
Em 17 isolados de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo
de 2010 aacute 2011 a porcentagem de pacientes que foram a oacutebito (59) foi maior que
a de pacientes que tiverm alta (41)
Figura 12 Isolado de KPC segundo desfecho cliacutenico dos 17 pacientes
investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
48
5 2 3 Local da coleta
Dos 17 episoacutedios detectados de infecccedilatildeo por KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 a infecccedilatildeo em swab retalfoi mais
frequente (47) seguida de ponta de cateacuteter (18) e secreccedilatildeo traqueal (12)
Figura 13 Isolados de KPC segundo local da coleta da amostra nos 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 4 Microorganismo
O microorganismo mais encontrado foi a Klebsiella pneumoniae (82)
seguida da Enterobacter clocae (12) e Serratia marcescens (6) dos 17 isolados
de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 Isto afirma o
fato de a sigla KPC ser utilizada de forma errocircnea aacute Klebsiella pneumoniae visto
que a evidecircncia dela eacute maior em relaccedilatildeo as outras cepas
49
Figura 14 Isolado de KPC segundo microrganismo encontrado em 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 5 Relaccedilotildees variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana e desfecho
cliacutenico
Tabela 6 ndash Distribuiccedilatildeo do perfil geneacutetico sexo coleta tipificaccedilatildeo de
microrganismos e anaacutelise da resistecircncia bacteriana segundo o desfecho
cliacutenico Brasiacutelia-DF 2010 a 2011
Variaacutevel Resultado
Desfecho
Alta Oacutebito
N N P
Gene 16S rRNA Positivo 7 1000 10 1000
NA Gene blaKPC Positivo 6 857 10 1000
Negativo 1 143 0 00 0218 Sexo Feminino 2 286 6 600
Masculino 5 714 4 400 0201 Local da coleta Fundo saco de
Douglas 1 143 0 00
Hemocultura 0 00 1 100 0463 Ponta de cateter 1 143 2 200
Sec TraquealBrocircnquica
0 00 1 100
50
Secreccedilatildeo traqueal 2 286 0 00
Swab retal 3 429 5 500
Urina 0 00 1 100
Microrganismo Enterobacter cloacae (KPC)
1 143 1 100
Klebsiella pneumoniae
6 857 8 800
0416 Serratia
marcescens 0 00 1 100
Teste de Hodge Hodge positivo 7 1000 10 1000
NA Amicacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 1 100 0848 resistente 0 00 1 100
sensiacutevel 2 286 3 300
Amoxicilina Aacutecido Clavulacircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Ampicilina Sulbactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ampicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Aztreonan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefazolina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Cefoperazona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Cefotaxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefoxitina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0509 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 2 286 4 400
Ceftazidima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cetriaxona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 3 429 5 500 0772 Cefalotina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ciprofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772
51
resistente 3 429 5 500
Claritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Clindamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Eritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Gentamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0942 resistente 2 286 3 300
sensiacutevel 1 143 2 200
Imipenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 0 00 2 200 0193 Resistente 1 143 3 300
sensiacutevel 2 286 0 00
Nitrofurantoiacutena sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Norfloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Oxacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Penicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Piperacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Rifampicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tetraciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Ticarcilina Aacutecido Clavulocircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0688 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 3 429 4 400
Tobramicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Trimetoprima Sulfametoxazol
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0112 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 2 286 0 00
Vancomicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tigeciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediario 0 00 1 100 0211 natildeo testado 1 143 4 400
resistente 2 286 0 00
52
Cefepime sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefuroxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Levofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Piperacilina Tazobactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Ertapenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Meropenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0223 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 1 143 0 00
Cefotetan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 sensiacutevel 0 00 1 100
Gemifloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 7 700 0585 natildeo testado 3 429 3 300
Desfecho
Alta Oacutebito
Meacutedia Erro
padratildeo Meacutedia Erro
padratildeo p
Idade 58 9 59 5 0991
Tempo Internaccedilatildeo (dias)
50 13 46 12 0571
n= 17 p(lt 005) NA natildeo se aplica
53
6 DISCUSSAtildeO
Nos uacuteltimos anos houve um aumento na incidecircncia de bacteacuterias
multirresistentes aos antimicrobianos no ambiente hospitalar tornando isto um
problema mundial de sauacutede puacuteblica (HULSCHER et al 2010) Quando se trata
principalmente de bacilos Gram negativos a frequumlecircncia destas bacteacuterias eacute ainda
maior em paiacuteses da Ameacuterica Latina quando comparada a paiacuteses desenvolvidos
(GALES etal 2012)
De acordo com dados do ldquoMeropenem Yearly Susceptibility Test Information
Collectionrdquo (MYSTIC) ocorreu nos Estados Unidos um aumento na susceptibilidade
de K pneumoniae nos uacuteltimos anos graccedilas a praacuteticas de controle de disseminaccedilatildeo
de amostras resistentes(RHOMBERG P R et al 2009) O aumento crescente da
prevalecircncia destes microrganismos foi proporcional ao aumento da dependecircncia do
uso de antibioacuteticos carbapenecircmicos considerados como a opccedilatildeo terapecircutica para o
tratamento de infecccedilotildees por bacilos Gram negativos multi-resistentes (LIVERMORE
2012) Isto afeta diretamente as opccedilotildees de tratamento sobrando poucas alternativas
para a terapecircutica que incluem colistina (polimixina E) e tigeciclina que apresentam
respectivamente problemas em termos de toxicidade e eficaacutecia (LIVERMORE et
al 2011) Um dos efeitos adversos mais importantes das poliminas B e E por
exemplo satildeo a neurotoxicidade e nefrotoxicidade (MENDES C A C et al2009 )
Devido agrave resistecircncia ser usualmente de natureza plasmidial e portanto de
maior disseminaccedilatildeo especialmente quando carreadas por K pneumoniae
microrganismo com uma notoacuteria capacidade para acumular e transferir plasmiacutedeos
com determinantes para resistecircncia o nuacutemero de casos detectados pelo
fenoacutetipogenoacutetipo blaKPC eacute bastante preocupante (MONTEIRO et al 2009)
Comparada com outras bacteacuterias hospitalares a transmissatildeo de clones
multirresistentes de K pneumoniae eacute maior e podem natildeo ser controladas pelos
meacutetodos de controle de infecccedilatildeo hospitalar (PAAUW et al 2007) A forma
plasmidial para transferecircncia da resistecircncia adicionada a este grande potencial para
disseminaccedilatildeo de clones resistentes eacute preocupante visto que apoacutes surtos muitas
vezes pode se tornar endecircmica Jaacute eacute uma realidade a disseminaccedilatildeo desta bacteacuteria
54
entre pacientes hospitais paiacuteses e ateacute mesmo continentes (WOODFORF et al
2010 ROGERS et al 2011)
As chances de surtos satildeo maiores em paiacuteses com poucos recursos devido agrave
maior carecircncia de praacuteticas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees hospitalares e o
uso irracional de antimicrobianos de forma empiacuterica e inadequada (KUMARASAMY
et al 2010) Ateacute o momento os mecanismos de resistecircncia aos cabapenecircmicos
geralmente encontrado eram a produccedilatildeo de ESBL (CTX-M) somada aacute perda de
porina (CARVALHAES et al 2010) Foi notado a partir do ano de 2008 um
aumento no nuacutemero de K pneumoniae produtoras de KPC-2 apresentando outra
forma de resistecircncia (GALES 2012)
Um estudo mostrou que o perfil do paciente colonizado ou infectado por KPC
foi de um paciente entre os 33 e os 82 anos de idade internado haacute mais de 1
semana no hospital A mortalidade geral nos uacuteltimos anos ficou em torno de 7
sendo que dos 77 pacientes estudados 32 (415) pacientes evoluiacuteram para oacutebito
evidenciando a alta morbi-mortalidade associada (ALVES A P et al 2013)
Em estudo com 2316 pacientes avaliados a populaccedilatildeo de sexo masculino foi
de 526 idade meacutedia global de 53 anos (mediana de 55 anos) permanecircncia meacutedia
de 58 dias (mediana de 3 dias) (OLIVEIRA A C et al 2010) Outros trabalhos
apresentaram ausecircncia de significacircncia entre sexoidade e o desenvolvimento de
infecccedilotildees por microrganismos resistentes (PERES-BOTA D et al 2003 COLPAN
A et al 2005 COELLO R et al 1997)
Outro estudo utilizou um total de 30 amostras sendo elas isoladas de urina
escarro secreccedilatildeo pleural ponta de cateter aspirado traqueal e hemocultura A mais
prevalente foi em urina (40) Entre as 30 cepas analisadas a maior porcentagem
foi da cepa Klebsiella pneumoniae (70) Enterobacter sp (133) Klebsiella
ozaenae (10) Escherichia coli (333) e Klebsiella oxytoca (333)
(DIENSTMANN R et al 2010) Nos Estados Unidos a enzima KPC jaacute se tornou
endecircmica Foi realizada uma pesquisa em dois hospitais de Nova York onde
testaram 602 amostras e 45 apresentaram algum mecanismo de resistecircncia
sendo apenas 33 confirmadas por biologia molecular como KPC-2 (BRATU et
al 2005)
55
Estudo sobre os tipos de ESBL feito no Japatildeo apresentou o tipo Toho-1 como
o mais prevalente nessa pesquisa Ateacute o ano de 2000 ano em que foi publicado tal
estudo este era o primeiro relatoacuterio no Japatildeo para identificar derivados de ESBLs
como tipo de SHV e TEM entre E coli e K pneumoniae Em especial o tipo SHV- 12
foi identificado com uma maior frequumlecircncia Estes resultados indicam que tipos
distintos de ESBLs que satildeo diferentes em sua especificidade de substrato e origem
geneacutetica coexistem no Japatildeo Isto mostra a importacircncia de caracterizar genoacutetipos
distintos de ESBLs e de estar em alerta continuamente para as tendecircncias de
ESBLs no Japatildeo aleacutem da necessidade de uma interpretaccedilatildeo uniforme utilizando as
diretrizes do CSLI para relatar cepas produtoras de ESBL Aleacutem da detecccedilatildeo de
ESBLs satildeo necessaacuterias mais informaccedilotildees tais como o perfil de sensibilidade
especiacutefica para diversas β-lactacircmicos e o local da infecccedilatildeo Esses fatores satildeo
essenciais para a escolha adequada de antibioacuteticos (YAGI T et al 2000)
No ano de 2004 uma pesquisa avaliou a produccedilatildeo de uma enzima de
hidroacutelise de carbapenecircmicos atraveacutes da teacutecnica de sequumlenciamento foi revelado
um novo membro da famiacutelia KPC designado KPC- 3 Pesquisadores encontraram
em um mutante de K pneumoniae uma substituiccedilatildeo de um gene associado com
resistecircncia a Imipenem mas essa substituiccedilatildeo foi considerada improvaacutevel na
contribuiccedilatildeo da resistecircncia aos carbapenecircmicos da espeacutecie estudada Aleacutem da
resistecircncia aos carbapenecircmicos estes isolados eram em sua maioria resistentes agraves
cefalosporinas penicilinas e aminoglicosiacutedeos Usando estudos de transformaccedilatildeo
conjugaccedilatildeo e hibridaccedilatildeo localizaram o alelo blaKPC em plasmiacutedeo aleacutem disso
mostraram que esse alelo tambeacutem carregava uma resistecircncia aos aminoglicosiacutedeos
A transferecircncia das enzimas KPCs foi demonstrada in vitro tanto neste como em
outros estudos pode ser que os plasmiacutedeos que fazem esta transferecircncia estavam
comeccedilando a se espalhar no ambiente cliacutenico resultando na multiresistecircncia dessas
estirpes (WOODFORD et al 2004)
O presente estudo apresentou um vieacutes quanto aos resultados dos testes de
susceptibilidade microbiana Observou-se que natildeo foi encontrado resultado deste
teste em algumas amostras o que natildeo cooperou para um estudo mais preciso
futuros estudos quanto agraves amostras e um melhor acompanhamento deste tipo de
patologia Poreacutem mesmo sem algumas amostras com este resultado disponiacutevel foi
56
confirmada a presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos
carbapenecircmicos por meio dos genes de resistecircncia blaKPC e 16S rRNA que as
amostras apresentaram em sua maioria serem portadoras Quanto aos resultados
estatiacutesticos nenhuma das variaacuteveis apresentou significacircncia estatiacutestica (p gt 005)
mostrando assim que estas variaacuteveis isoladas natildeo foram o fator determinante para
o desfecho cliacutenico de alta ou oacutebito
57
7 CONCLUSAtildeO
Os genes blaKPC e 16S rRNA foram caracterizados confirmando a a
presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos carbapenecircmicos
Houve uma maior prevalecircncia da cepa K pneumoniae e isto confirma outros
estudos que apresentam a maior prevalecircncia desta cepa em amostras com KPC
Aleacutem disso isso justifica a forma popular da K pneumoniae ser chamada de KPC
enquanto que na verdade KPC eacute uma enzima podendo estar presente em outras
cepas como Enterobacter clocae tambeacutem apresentada no presente estudo O
desfecho cliacutenico de oacutebitos maior que 50 eacute um possiacutevel indicador sobre a
necessidade de se realizar um teste raacutepido para identificaccedilatildeo de KPC visando
iniciar o mais raacutepido possiacutevel o tratamento afim de diminuir a mortalidade por esta
infecccedilatildeo
Nenhuma das variaacuteveis isoladamente estaacute relacionada ao desfecho cliacutenico
oacutebito ou alta pois natildeo apresentaram relevacircncia estatiacutestica O presente estudo
mostrou que haacute presenccedila da bacteacuteria nas amostras de pacientes do hospital
estudado podendo entatildeo afirmar que este tipo de bacteacuteria se encontra tambeacutem
presente em ambiente hospitalar O uso irracional de antimicrobiano eacute demonstrado
de forma indireta quando foi apresentado atraveacutes do Teste de Hodge Modificado
uma resistecircncia de 100 aos antibioacuteticos carbapenecircmicos Isto tambeacutem reflete na
terapecircutica sendo que pacientes portadores de bacteacuterias resistentes aos
antibioacuteticos carabepecircmicos tem uma escassa opccedilatildeo de tratamento e as opccedilotildees
apresentam problemas quanto agrave toxicidade e eficaacutecia
58
REFEREcircNCIAS
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Mecanismos
de resistecircncia bacteriana aos antimicrobianos Disponiacutevel em
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controleopas_
webmodulo3mec_sitiohtmgt Acesso em 25 de abril de 2014
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Nota teacutecnica nordm
012013 medidas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees por enterobacteacuterias
multiresistentes Acesso em 17 de abril de 2013
ALBA J et al Kinetics study of KPC-3 a plasmid-encoded class A
carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase Antimicrob Agents Chemother
Nov49(11)4760-2 2005
ALVES A P et al Nosocomial infections by KPC-producing enterobacteria in
a tertiary hospital in Southern Brazil Revista da AMRIGS Porto Alegre 57 (3) 213-
218 jul-set 2013
ALVES A et al Tipagem Geneacutetica de Microrganismos Lab De Diversidade
Microbiana Centro de Biologia Celular Dep de Biologia U de Aveiro 3810-193
Aveiro- 2003
BELL J M et Al Prevalence and significance of a negative extended-
spectrum beta-lactamase (ESBL) confirmation test result after a positive ESBL
screening test result for isolates of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae
results from the SENTRY Asia-Pacific Surveillance Program J Clin Microbiol
May45(5)1478-82 2007
BRATU S et al Detection of KPC carbapenem-hydrolyzing enzymes in
Enterobacter spp from Brooklyn New York Antimicrob Agents Chemother v 49 n
2 p 776-8 2005
59
BRATU S et al Emergence of KPC-possessing Klebsiella pneumoniae in
Brooklyn New York epidemiology and recommendations for detection Antimicrob
Agents Chemother v 49 n 7 p 3018-20 2005
BRATU S et al Rapid spread of carbapenem-resistant Klebsiella
pneumoniae in New York City Arch Intern Med v 165 p 1430-5 2005
CAMARGO C F et al Aplicaccedilatildeo das teacutecnicas de pcr e suas teacutecnicas
derivadas em diagnoacutestico molecular Disponiacutevel em
ltfileDUnB10C2BA20semestreArtigosPCR-
20CLEYTON20FLORENCIO20DE20CAMARGO20E20PAULO20ROB
ERTO20QUEIROZpdfgtgt Acesso em 08 de abril de 2014
CARVALHES C G et al Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting
carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive
results Journal of Antimicrobial Chemotherapy v 65 n2 p 249-251 2010
CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION- CDC Modified
Hodge Test for Carbapenemase Detection in Enterobacteriaceae 2004
CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE Methods for
dilutionantimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically Approved
standard M7ndashA7 7th ed CLSI Wayne PA 2011
COELLO R et al Risk factors for developing clinical infection with methicillin-
resistant Staphylococcus aureus (MRSA) amongst hospital patients initially only
colonized with MRSA J Hosp Infect 19973739-46
COLPAN A et al Evaluation of risk factors for mortality in intensive care
units A prospective study from a referral hospital in Turkey Am J Infect Control
200533(1)42-7
60
CORNAGLIA G et al Living with ESBLs Introduction Clinical Microbiology
and Infection 14 Suppl 1 1-2 2008
COTRIM E R et al Klebsiella pneumoniae carbapenemase ndash KPC em
Enterobacteriaceae o desafio das bacteacuterias multirresistentes Poacutes em revista do
centro universitaacuterio Newton Paiva 12012 - ediccedilatildeo 5 - issn 2176 7785
DESHPANDE L M et al Occurrence and characterization of
carbapenemase-producing Enterobacteacuteriaceae report from the SENTRY
Antimicrobial Surveillance Program (2000-2004) Microb Drug Resist 12(4)223-30
2006
DIAS D J A Estudos dos principais mecanismos de resistecircncia aos
antibioacuteticos β-lactacircmicos em bacteacuterias patogecircnicas gram negativas 2009 100 f
Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Geneacutetica Molecular e Biomedicina) ndash Faculdade de
Ciecircncias e Tecnologia Universidade de Nova Lisboa Lisboa
DIENSTMANN R et al Avaliaccedilatildeo fenotiacutepica da enzima Klebsiella
pneumoniae carbapenemase (KPC) em Enterobacteriaceae de ambiente hospitalar
J Bras Patol Med Lab v 46 n 1 p 23-27 fevereiro 2010
ENDIMIAMI A et al Emergence of blaKPC-containing Klebsiella
pneumoniae in a long-term acute care hospital a new challenge to our healthcare J
Antimicrob Chemother 64 1102-1110 Nov 2009
FALAGAS M E et al Extended-spectrum beta-lactamase producing
organisms The Journal of Hospital Infection 73 (4) pp 345-54 2009
FONTANA C et al Emergence of KPC-producing Klebsiella pneumoniae in
Italy BMC Rev Notes 3 40 2010
61
GALES A C et al Antimicrobial resistance among Gram-negative bacilli
isolated from Latin America results from Sentry Antimicrobial Surveillance Program
(Latin America 2008-2010) Diagnostic Microbiology and Infectious Disease v 3 n
4 p 354 -360 2012
GUPTA N et al Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Epidemiology
and Prevention HEALTHCARE EPIDEMIOLOGY Clinical Infectious Diseases
201153(1)60ndash67 Published by Oxford University Press on behalf of the Infectious
Diseases Society of America 2011
HARBOTTLE H et al Genetics of antimicrobial resistance Anim Biotechnol
n17 p111-124 2006
HENRIQUE W N et al RESISTEcircNCIA BACTERIANA Uniatildeo das
Faculdades Alfredo NasserInstituto de Ciecircncias da Sauacutede Disponiacutevel em lt
httpwwwfaculdadealfredonasseredubrfilespesquisaposter20HENRIQUE20
Wilker20Natividade20SANTIAGO20Silvania20CAVALCANTI20DSP
20ResistC3AAncia20Bacterianapdfgt Acesso em 17 marccedilo 2014
HULSCHER M E J I et al Antibiotic prescribing in hospital a social and
behavioral scientific approach The Lancet Infectious Diaseases v 10 n 3 p 167-
165 2010
KIDWAI M SAPRA P BHUSHAN KR Synthetic strategies and medicinal
properties of beta-lactams Curr Med Chem 1999 695-215
KUMARASAMY K K et al Emergence of a new antibiotic resistance
mechanism in India Pakistan and the UK a molecular biological and
epidemiological stuy The Lancet Infectious Diseases v10 n 9 p 597- 602 2010
LINCOPAN N et al Enterobacteacuteria producing extended-spectrum β-
lacatamases and IMP-1 Metalo-β-lactamases isolated from Brazilian hospitals J Med
62
Microbiol 7 1-3 2006
LINCOPAN N et al First Isolation of Metalo-β-Lacatamase-Producing
Multiresistant Klebsiella pneumoniae from a patient in Brazil J Clin Microbiol 43(1)
516-519 2005
LIVERMORE D M et al What remains against carbapenem- resistant
Enterobacteriaceae Evaluation of choramphenicol ciprofloxacin colistina
fosfomycin minocycline nitrofurantoin temocilin and tigecycline International
Journal of Antimicrobial Agents v 37 n 5 p 415- 459 2011
LIVERMORE D M Fourten years in resistance International Journal of
Antimicrobial Agents v 39 283- 294 2012
LIVERMORE D M Bacterial resistance to carbapenems Adv Exp Med Biol
1995 39025-47
LIVERMORE D M Bacterial resistance origins epidemiology and impact
Clin Infect Dis 36S11-S23 2003
LIVERMORE D M et al Carbapenemases a problem in waiting Curr
Opin Microbiol 2000 3489-95
LU et al Universal pcr for common bacterial pathogens J CLIN
MICROBIOL VOL 38 2000
LU et al Use of PCR with Universal Primers and Restriction Endonuclease
Digestions for Detection and Identification of Common Bacterial Pathogens in
Cerebrospinal Fluid Journal of Clinical Microbiology June 2000 p 2076ndash2080
MARSCHALL J Met al Presence of the KPC Carbapenemase Gene in
Enterobacteriaceae Causing Bacteremia and Its Correlation with In Vitro
Carbapenem Susceptibility J Clin Microbiol 47 239-241 Jan 2009
63
MARTINS WMBS et al Prevalecircncia do gene blaKPC em isolados cliacutenicos
de Enterobacteriaceae e natildeo fermentadores encontrados em amostras clinicas em
um hospital universitaacuterio do Recife X Jornada de ensino pesquisa e extensatildeo ndash
JEPEX 2010 ndash UFRPE Recife 18 a 22 de outubro
MENDES C A C et al Polimixinas Revisatildeo com ecircnfase na sua
nefrotoxicidade Rev Assoc Med Bras 2009 55(6) 752-9
MOHR J F 3rd Update on the efficacy and tolerability of meropenem in the
treatment of serious bacteacuterial infections Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S41-51
2008
MONTEIRO J et al First report of KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae
strains in Brazil Antimicrob Agents Chemother Jan53(1)333-4 2009
MOREIRA V C et al Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia a antibioacuteticos
Disponiacutevel em
lthttpwwwcpglsucgbr6mostraartigosSAUDEVANESSA20CARVALHO20M
OREIRApdfgt Acesso em 21 marccedilo 2014
NETIKUL T et al Emergence of novel blaKPC-12 and blaKPC-13 variants in
carbapenem non-susceptible Enterobacter cloacae a first report of blaKPC gene in
Thailand European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases May
S372 2011
NETO V A et al Antibioacuteticos na praacutetica Meacutedica 6ordf Ediccedilatildeo Editorial
SarverSP Brasil 2007
NICOLAU D P Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of
meropenem Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S32-40 2008
64
OLIVEIRA A C et al Resistecircncia bacteriana e mortalidade em um centro de
terapia intensiva Rev Latino-Am Enfermagem nov-dez 2010
PAAUW A et al Failure to control an outbreak of qnrA 1-positive multidrug-
resistant Enterobacter clocae despite adequate implementation of recommended
infection control measures Journal of Clinical Microbiology v 45 n 5 p 1420-1425
2007
PATERSON D L et al Extended-Spectrum Beta-Lactamases a Clinical
Update Clinical Microbiology Reviews v 18 p 657-686 2005
PEIRANO G et al Carbapenem-hydrolysing beta-lactamase KPC-2 in
Klebsiella pneumonia isolated in Rio de Janeiro Brazil J Antimicrob Chemother Nov
20 2009
PERES-BOTA D et al Are infections due to resistant pathogens associated
with worse outcome in critically ill patients J Infect 200347(4)307-16
PIDDOCK L J V Clinically relevant chromosomally encoded multidrug
resistance effl ux pumps in bacterial Clin Microbiol Rev n19 p382-402 2006
PITOUT J D D et al Emergence of Enterobacteriaceae producing
extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) in the community J Antimicrob
Chemother May 56 2005
POSSEBON M I et al Resistecircncia bacteriana aos carbapenecircmicos
Bacterial resitence to carbapenems RBM rev bras med60(6)378380-378-382
jun 2003
QUEENAN A M et al Carbapenemases the versatile beta-lactamases
Clin Microbiol Rev Jul20(3)440-58 2007
65
RHOMBERG P R et al Summary trends for the meropenem yearly
susceptibility test information collection program a 10- year experience in the United
States (1999-2008) Diagnostic Microbiology and Infectiois Disease v 65 n4 p
414-426 2009
ROBLEDO I E et al Detection of KPC in Acinetobacter spp in Puerto Rico
J Antimicrob Agents Chemother 54 1354-1357 Mar 2010
ROGERS B A et al Country-to-country transfer os patients and the risk of
multi-resistant bacterial infection Clinical Infectious Disease v53 n1 p49- 56
2011
SHAH A A et al Characteristics epidemiology and clinicalimportance of
emerging strains of Gram-negative bacilli producing extended-spectrum
betalactamases Research in Microbiology v 155 p 409-421 2004
TURNER P J Extended- Spectrum Beta-Lactamases Clinical Infectious
Diseases v 41 p 273-275 2005
WOLTER D J et al Phenotypic and Enzymatic Comparative Analysis
between the Novel KPC variant KPC-5 and Its Evolutionary Variants KPC-2 and
KPC-4 Antimicrob Agents Chemother Nov 17 2008
WOODFORD N et al Carbapenemases of Chryseobacterium
(Flavobacterium) meningosepticum distribution of blaB and characterization of a
novel Metalo-beta-lactamase gene blaB3 in the type strain NCTC 10016
Antimicrob Agents Chemother Jun44(6)1448-52 2000
WOODFORF N Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in
India Pakistan and the UK a molecular biological and epidemiological study The
Lancet Infectious Diseases v 10 n 9 p 597-602 2010
66
WOODFORD et al Outbreak of Klebsiella pneumoniae Producing a New
Carbapenem- Hydrolyzing Class A β-Lactamase KPC-3 in a New York Medical
Center Antimicrobial agents and chemotherapy Dec 2004 p 4793ndash4799 Vol 48
No 12
YAGI T et al A preliminary survey of extended-spectrum β-lactamases
(ESBLs) in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Japan
FEMS Microbiology Letters 184 (2000) 53-56
YIGIT H et al Novel carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase KPC-1 from
a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumonia J Antimicrob Agents
Chemother 45 (4) 1151-1161 (2001)
ZAVASCKI A P et al KPC-2- producing Enterobacter cloacae in two cities
from Southern Brazil Int J Antimicrob Agents Apr 28 2009
ZHANEL G G et al Comparative review of the carbapenecircmicos Drugs
67(7)1027-52 2007
67
ANEXOS
Sequumlecircncia do oligo blaKPC
Query 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
Query 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
Query 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
68
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
Query 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
Query 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
69
Query 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
Query 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
Query 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
70
Sbjct 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
Query 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
Query 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
Query 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
71
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
Query 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
Query 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
72
Query 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
Query 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
Query 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
73
Sbjct 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
Query 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
Query 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
Query 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
74
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
Query 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
Query 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
75
Query 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
Query 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
||||
Sbjct 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
LOCUS AF297554 1377 bp
DNA linear BCT 26-MAR-2001
DEFINITION Klebsiella pneumoniae carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
gene complete cds
ACCESSION AF297554
VERSION AF2975541 GI10121874
76
KEYWORDS
SOURCE Klebsiella pneumoniae
ORGANISM Klebsiella pneumoniae
Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Enterobacteriaceae Klebsiella
REFERENCE 1 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH QueenanAM
AndersonGJ Domenech-SanchezA
BiddleJW StewardCD
AlbertiS BushK and TenoverFC
TITLE Novel carbapenem-hydrolyzing beta-
lactamase KPC-1 from a
carbapenem-resistant strain of
Klebsiella pneumoniae
JOURNAL Antimicrob Agents Chemother 45 (4)
1151-1161 (2001)
PUBMED 11257029
REFERENCE 2 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH AndersonGJ and
TenoverFC
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (19-AUG-2000) Nosocomial
Pathogens Laboratory Branch
Centers for Disease Control and
Prevention 1600 Clifton Rd MS
G08 Atlanta GA 30333 USA
FEATURES LocationQualifiers
77
source 11377
organism=Klebsiella
pneumoniae
mol_type=genomic DNA
db_xref=taxon573
-35_signal 5560
-10_signal 7883
mRNA 921012
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
RBS 117122
CDS 1311012
note=blaKPC-1
codon_start=1
transl_table=11
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
protein_id=AAG134101
db_xref=GI10121875
translation=MSLYRRLVLLSCLSWPLAGFSATALTNLVAEPFAKLEQD
FGGSI
GVYAMDTGSGATVSYRAEERFPLCSSFKGFLAAAVLARSQQQAGLLDTPIRYG
KNALV
PWSPISEKYLTTGMTVAELSAAAVQYSDNAAANLLLKELGGPAGLTAFMRSIG
DTTFR
78
LDRWELELNSAIPSDARDTSSPRAVTESLQKLTLGSALAAPQRQQFVDWLKGN
TTGNH
RIRAAVPADWAVGDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTRAPNKDDK
HSEAV
IAAAARLALEGLGVNGQ
ORIGIN
1 cggggcagtt acagccgtta cagcctctgg
agagggagcg gcttgccgct cggtgataat
61 cccagctgta gcggcctgat tacatccggc
cgctacacct agctccacct tcaaacaagg
121 aatatcgttg atgtcactgt atcgccgtct
agttctgctg tcttgtctct catggccgct
181 ggctggcttt tctgccaccg cgctgaccaa
cctcgtcgcg gaaccattcg ctaaactcga
241 acaggacttt ggcggctcca tcggtgtgta
cgcgatggat accggctcag gcgcaactgt
301 aagttaccgc gctgaggagc gcttcccact
gtgcagctca ttcaagggct ttcttgctgc
361 cgctgtgctg gctcgcagcc agcagcaggc
cggcttgctg gacacaccca tccgttacgg
421 caaaaatgcg ctggttccgt ggtcacccat
ctcggaaaaa tatctgacaa caggcatgac
481 ggtggcggag ctgtccgcgg ccgccgtgca
atacagtgat aacgccgccg ccaatttgtt
541 gctgaaggag ttgggcggcc cggccgggct
gacggccttc atgcgctcta tcggcgatac
79
601 cacgttccgt ctggaccgct gggagctgga
gctgaactcc gccatcccaa gcgatgcgcg
661 cgatacctca tcgccgcgcg ccgtgacgga
aagcttacaa aaactgacac tgggctctgc
721 actggctgcg ccgcagcggc agcagtttgt
tgattggcta aagggaaaca cgaccggcaa
781 ccaccgcatc cgcgcggcgg tgccggcaga
ctgggcagtc ggagacaaaa ccggaacctg
841 cggagtgtat ggcacggcaa atgactatgc
cgtcgtctgg cccactgggc gcgcacctat
901 tgtgttggcc gtctacaccc gggcgcctaa
caaggatgac aagcacagcg aggccgtcat
961 cgccgctgcg gctagactcg cgctcgaggg
attgggcgtc aacgggcagt aaggctctga
1021 aaatcatcta ttggcccacc accgccgccc
ttgcgggcgg catggattac caaccactgt
1081 cacatttagg ctaggagtct gcgcggcaga
gccgtgtgac cggttttctg tagagcactg
1141 acgatggcgg cggcgctctc tgcaattggc
aaggcgtcgg cgccaaggat accaatcttg
1201 cggcgcgcgg cgtgttatga cgactggggt
gcatttgagc cgccccattt aaccttcgcc
1261 ctcacagata cgccattcgc ctcaaattta
gcgccatgca gacgagcttc cactcggctt
1321 gcaccttgtc caggcccctc atgctgaact
gacgcaatcc catcaccgcc ttgatca
80
Tawana Correa Rodrigues Amorim Rosa
Anaacutelise de aspectos epidemioloacutegicos e cliacutenicos e caracterizaccedilatildeo de
genes de resistecircncia das Enterobacteacuterias produtoras de carbapemases em um
hospital do Distrito Federal
BANCA EXAMINADORA
_______________________________________
Orientadora Profa Dr Margocirc Gomes de Oliveira Karnikovski
(FCe Universidade de Brasiacutelia)
_______________________________________
Profa MSc Micheline Marie Milward de Azevedo Meiners
(FCe Universidade de Brasiacutelia)
_______________________________________
Prof MSc Daniel Oliveira Freire
(LS Faculdade LS)
CEILAcircNDIA DF
2014
AGRADECIMENTOS
Primeiramente aacute Deus autor da vida que me concedeu a graccedila e a benccedilatildeo
de ter conquistado este sonho da graduaccedilatildeo
Agrave minha amada famiacutelia principalmente meus pais Elias Amorim e Liliana
Correa irmatildeo Thales Correa e avoacute Herondina por serem a minha base meu
refuacutegio em todos os momentos e acreditarem em mim
Agrave minha grande amiga de graduaccedilatildeo Susan Suellen por partilhar dos meus
medos alegrias vitoacuterias angustias e em todos os momentos ser meu braccedilo direito
Ao meu amor Robson Bastos que mais que um noivo foi meu amigo e
companheiro me apoiando e me incentivando
Agrave minha querida orientadora DraMargocirc Gomes e querida co-orientadora Dra
Izabel Cristina por acreditarem em mim me dando a oportunidade de trabalhar com
elas Aleacutem do apoio ensino e dedicaccedilatildeo
Agrave todos os professores (as) da Universidade de Brasiacutelia- Faculdade de
Ceilacircndia pelo ensino e pela contribuiccedilatildeo na minha formaccedilatildeo acadecircmica
Agrave MSc Fabiana Cartaxo pela ajuda e apoio aleacutem da prontidatildeo quando
solicitada a sua ajuda
Ao professor mestre Daniel Oliveira e a teacutecnica de laboratoacuterio Thais Mendes
pela ajuda laboratorial contribuindo para a realizaccedilatildeo de um bom trabalho
RESUMO
Introduccedilatildeo A Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) eacute uma enzima
produzida por bacteacuterias gram-negativas (enterobacteacuterias) que confere resistecircncia
aos antimicrobianos carbapenecircmicos meropenen ertapenen imipenen classe
amplamente utilizada no tratamento de infecccedilotildees envolvendo Enterobacteriaceae
Esta resistecircncia eacute uma das principais causas de falha terapecircutica devido agrave
produccedilatildeo de beta-lactamases de espectro estendido (ESBL) por esta bacteacuteria
mecanismo de resistecircncia mais comum aos antibioacuteticos beta-lactacircmicos de amplo
espectro A identificaccedilatildeo destas enterobacteacuterias pode ser feita atraveacutes de teacutecnicas
de identificaccedilatildeo molecular de patoacutegenos dentre elas a Reaccedilatildeo em Cadeia de
Polimerase (PCR) que consiste na anaacutelise do padratildeo de amplificaccedilatildeo de elementos
repetidos encontrados no genoma bacteriano permitindo uma maior rapidez na
obtenccedilatildeo de resultados quando comparada com outros meacutetodos aleacutem de
apresentar alta reprodutibilidade simples execuccedilatildeo e implementaccedilatildeo dependendo
da aplicaccedilatildeo da teacutecnica natildeo enfrenta problemas com a degradaccedilatildeo do DNA
Objetivo Caracterizar genes de resistecircncia das Enterobacteacuterias produtoras de
carbapenemases e aspectos epidemioloacutegicos e cliacutenicos de pacientes internados em
um hospital puacuteblico do Distrito Federal Materiais e meacutetodos Estudo transversal
onde foi realizado o teste de susceptibilidade das Enterobacteacuterias aos antibioacuteticos
Carbapenecircmicos a partir dos materiais bioloacutegicos coletados dos pacientes
internados no Hospital Regional da Asa Norte (HRAN) Anaacutelise molecular dos genes
16S rRNA e blaKPC utilizando PCR aleacutem de anaacutelises estatiacutesticas Resultados e
discussatildeo Detectou-se a regiatildeo ribossomal e o gene de resistecircncia testado
confirmando a resistecircncia microbiana Maior prevalecircncia de pacientes do sexo
masculino (53) desfecho cliacutenico de oacutebito(59) siacutetio de infecccedilatildeo de swab retal
(47) Klebsiella pneumoniae foi microrganismo mais encontrado (82) Natildeo houve
diferenccedila estatiacutestica entre as variaacuteveis e o desfecho cliacutenico (p foi gt 005)
Conclusatildeo Atraveacutes da caracterizaccedilatildeo molecular dos genes de resistecircncia blaKPC
e Universal confirmou-se a presenccedila de Klebsiella pneumoniae resistente aos
carbapenecircmicos Os valores de p natildeo foram significativos (lt005) sendo
assimnenhuma das variaveacuteis estudadas foram o principal motivo do desfecho
cliacutenico (alta ou oacutebito)
Palavras chaves Klebsiella pneumoniae carbapenemase Resistecircncia bacteriana a
antimicrobianos β-lactamases de espectro estendido (ESBL) Reaccedilatildeo em Cadeia de
Polimerase (PCR)
ABSTRACT
Introduction Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) is an enzyme produced
by gram - negative bacteria (Enterobacteriaceae) which confers resistance to
carbapenem antibiotics meropenen ertapenen imipenem class widely used in the
treatment of infections involving Enterobacteriaceae This resistance is a major
cause of treatment failure due to beta-lactamases production of extended spectrum
(ESBL) by this bacterium most commonly resistance to beta-lactam antibiotics of
wide spectrum engine The identification of these Enterobacteriaceae can be made
by techniques of molecular identification of pathogens among them the Polymerase
Chain Reaction (PCR) which consists in the analysis of the amplification pattern of
repeated elements found in the bacterial genome allowing faster in getting results
when compared with other methods in addition to presenting high reliability simple
implementation and deployment depending on the application of the technique has
no trouble with the degradation of DNA Objective To characterize the resistance
genes of Enterobacteriaceae producing carbapenemases and epidemiological and
clinical features of patients admitted to a public hospital in the Federal District
aspects Materials and methods Cross-sectional study where susceptibility testing
of Enterobacteriaceae to antibiotics Carbapenems from biological materials collected
from patients admitted to the Hospital Regional da Asa Norte ( HRAN ) was
performed Molecular analysis of 16S rRNA genes and blaKPC using PCR in
addition to statistical analysis Results and Discussion Was detected region and
the ribosomal tested resistance gene confirming the microbial resistance Higher
prevalence of male patients (53 ) clinical outcome of death (59 ) site of infection
rectal swabs (47 ) Klebsiella pneumoniae was found more microorganism (82)
There was no statistical difference between the variables and the clinical outcome (p
was gt 005) Conclusion Through molecular characterization of genes and the
Universal blaKPC resistance confirmed the presence of Klebsiella pneumoniae
resistant to carbapenems P values were not significant (lt 005) so none of the
variables studied were the main reason the clinical outcome (discharge or death)
Keywords Klebsiella pneumoniae Carbapenemase Bacterial resistance to
antibiotics Extended-Spectrumβ-lactamases (ESBL) Polimerase Chain Reaction
(PCR)
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Accedilatildeo do szlig-lactacircmico sobre a bacteacuteria gram-positiva e gram-negativa
Figura 2 Divulgaccedilatildeo internacional de Klebsiella pneumoniae Carbapenemase
(KPC) produtoras de Enterobacteriaceae
Figura 3 Mecanismos de resistecircncia bacteriana
Figura 4 Etapas da Reaccedilatildeo de PCR
Figura 5 Mecanismo de semeamento de material bioloacutegico oriundos de pacientes
com suspeita de infecccedilatildeo por KPC
Figura 6 Interpretaccedilatildeo resultado do Teste de Hodge Modificado
Figura 7 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC das amostras dos
17 pacientes estudados
Figura 8 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC da mostra A3
estudada
Figura 9 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA das amostras
dos 17 pacientes estudados
Figura 10 Gel de agarose a 2 da digestatildeo do amplicon do gene 16S rRNA das
amostras com a enzima HaeIII evidenciando diversos fragmentos proacuteximos a 200
pb
Figura 11 Infecccedilatildeo por KPC segundo sexo dos 17 pacientes investigados no
HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
Figura 12Isolado de KPC segundo desfecho cliacutenico dos 17 pacientes investigados
no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
Figura 13 Isolados de KPC segundo local da coleta da amostra nos 17 pacientes
investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
Figura 14Isolado de KPC segundo microrganismo encontrado em 17 pacientes
investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Criteacuterios Interpretativos para testes de sensibilidade
Tabela 2 Nuacutemero de acesso ao GenBank dos alelos blaKPC e seus microrganismos
originais
Tabela 3 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do gene blaKPC
Tabela 4 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do gene
universal
Tabela 5 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da digestatildeo do gene universal
Tabela 6 - Distribuiccedilatildeo das variaacuteveis estudadas perfil geneacutetico sexo coleta
tipificaccedilatildeo de microrganismos e anaacutelise da resistecircncia bacteriana segundo o
desfecho cliacutenico Brasiacutelia-DF 2010 a 2012
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AmpC- Adenosina Monofosfato Ciacuteclico
BRMD- Bacteacuterias multirresistentes
CCIH- Comissatildeo de Controle de Infecccedilatildeo Hospitalar
CDC- Centers for Disease Control and Prevention
CIM- Concentraccedilatildeo Inibitoacuteria Miacutenima
CLSI- Clinical and Laboratory Standards Institute
DNA- Aacutecido Desoxirribonucleacuteico
E coli- Escherichia coli
ERIC-PCR - Enterobacterial Repet it ive Intergenic Consensus
ESBL- Beta-Lactamases de Espectro Estendido
Et al- e outros
ETP- Ertapenem
HRAN- Hospital Regional da Asa Norte
K ornithinolytica- Klebsiella ornithinolytica
K oxytoca- Klebsiella oxytoca
K planticola- Klebsiella planticola
K pneumoniae- Klebsiella pneumoniae
K terrigena- Klebsiella terrigena
KPC - Klebsiella pneumoniae produtora de Carbapenemase
KPCNEG- Bacilos Gram-Negativos Natildeo Fermentadores
KPCPOS- Bacilos Gram-Positivo Natildeo Fermentadores
MBL- metalo-beta-lactamases
MEM- Meropenem
NA- Natildeo se aplica
Oligo- Oligonucleotiacutedeos
PB- Pares de Bases
PBPs (Penicilim-Binding-Protein)- Proteiacutenas de ligaccedilatildeo agrave penicilina
PCR- Polymerase Chain Reaction (Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase)
PFGE - Pulsed-Field Gel Electrophoresis (Eletroforese em campo pulsado)
RAPD- Randomly Amplified Polymorphic DNA (DNA polimoacuterfico amplificado
aleatoriamente)
RFLPrsquos - ldquoRestriction Fragment Length Polymorphismsrdquo( polimorfismos de tamanho
de fragmentos de restriccedilatildeo)
THM- Teste de Hodge Modificado
TSA- Teste de Susceptibilidade aos Antibioacuteticos
UTI- Unidade de Terapia Intensiva
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 15
11 Klebsiella pneumoniae produtora de Carbapenemase (KPC) 15
1 2 Resistecircncia bacteriana 20
13 Anaacutelise geneacutetica de microrganismos 27
2 JUSTIFICATIVA 30
3 OBJETIVOS 31
31 Objetivo geral 31
32 Objetivos Especiacuteficos 31
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS 32
4 1 Coleta e transporte das amostras bioloacutegicas 32
4 2 Procedimentos para confirmaccedilatildeo de resistecircncia bacteriana por disco de
Ertapenem (adaptado CDC 2004) 32
4 2 1 Interpretaccedilatildeo dos Resultados 33
4 3 Teste de susceptibilidade aos antibioacuteticos 34
4 4Teste de Hodge Modificado (THM) (adaptado CDC 2004) 35
441 Controle de qualidade (CQ) 35
442 InterpretaccedilatildeoResultados 35
4 5 Extraccedilatildeo de DNA bacteriano 37
4 6 Iniciadores e reaccedilatildeo de PCR 38
4 7 Digestatildeo 41
4 8 Eletroforese em gel de agarose 41
4 9 Descarte de resiacuteduos 42
4 10 Aspectos epidemioloacutegicos e cliacutenicos 42
4 12 Anaacutelises estatiacutesticas 42
4 13 Preceitos eacuteticos 43
5 RESULTADOS 44
51 Anaacutelise molecular 44
5 1 1 Gene blaKPC 44
5 1 2 Gene 16S rRNA 45
5 2 Anaacutelises epidemioloacutegicas 46
5 2 1 Sexo 46
5 2 2 Desfecho cliacutenico 47
5 2 3 Local da coleta 48
5 2 4 Microrganismo 48
6 DISCUSSAtildeO 53
7 CONCLUSAtildeO 57
15
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC)
Klebsiella pneumoniae pertence aacute famiacutelia Enterobacteriaceae
encontrado em locais como aacutegua solo plantas e esgoto Satildeo encontradas cinco
espeacutecies K pneumoniae K oxytoca K planticola K terrigena e K ornithinolytica
O gecircnero Klebsiella eacute definido como contendo bacilos Gram-negativos natildeo moacuteveis
em forma de bastatildeo e geralmente encapsuladas que produzem lisina
descarboxilase mas natildeo produzem ornitina descarboxilase Provavelmente a
colonizaccedilatildeo em seres humanos ocorre por contato com as diferentes fontes
ambientais podendo ser encontrada colonizando a orofaringe e fezes de pessoas
sadias Pessoas imunocomprometidas a bacteacuteria encontra um ambiente favoraacutevel
para seu crescimento levando aos quadros de infecccedilatildeo (MOREIRA et al 2014)
A Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) eacute uma enzima produzida por
enterobacteacuterias gram-negativas sendo um mecanismo de resistecircncia aos antimi-
crobianos carbapenecircmicos meropenen ertapenen eou imipenen classe
amplamente utilizada no tratamento de infecccedilotildees envolvendo Enterobacteriaceae
Ela tambeacutem eacute capaz de inativar os agentes β-lactacircmicos cefalosporinas penicilinas
e o aztreonam (COTRIM et al 2012)
Devido agrave semelhanccedila estrutural e estereoquiacutemica os antibioacuteticos beta-
lactacircmicos possuem um mecanismo de accedilatildeo comum ao grupo Eles atuam inibindo
a siacutentese da parede celular bacteriana atraveacutes do mecanismo de bloqueio da
transpeptidaccedilatildeo responsaacutevel pela uniatildeo dos componentes individuais do
peptidoglicano conforme demonstrado na figura 1 (KIDWAI et al 1999)
A accedilatildeo destes antibioacuteticos eacute atraveacutes de ligaccedilotildees covalentes com as proteiacutenas
as Penicilim-Binding-Protein (proteiacutena de ligaccedilatildeo da penicilina- PBP ou PLP) que se
encontram presentes na membrana citoplasmaacutetica de todas as bacteacuterias Devido agraves
mutaccedilotildees ocorre uma induccedilatildeo na alteraccedilatildeo dessas proteiacutenas podendo determinar
uma diminuiccedilatildeo da afinidade dos beta-lactacircmicos agraves mesmas A accedilatildeo dos
carbapenecircmicos eacute atraveacutes da sua ligaccedilatildeo agraves PBPs presentes na parede bacteriana
especialmente as PBP1 e PBP2 provocando a lise osmoacutetica da bacteacuteria Aleacutem
disso eles tecircm uma facilidade na penetraccedilatildeo da bacteacuteria por meio dos canais
poriacutenicos presentes nas bacteacuterias gram-negativas induzindo um efeito poacutes-
16
antibioacutetico Quando comparados com outros beta-lactacircmicos os carbapenecircmicos
satildeo mais resistentes agrave hidroacutelise pela maioria das beta-lactamases tanto
cromossocircmicas como plasmiacutedicas (LIVERMORE 1995 LIVERMORE et al 2000)
Figura 1 Accedilatildeo do szlig-lactacircmico sobre a bacteacuteria gram-positiva e gram-
negativa Fonte
ltlthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controle
opas_webmodulo3gramn_lacta2htmgt (adaptado)
A bacteacuteria Klebsiella pneumoniae quando apresenta gene ESBL pode
expressar resistecircncia a ateacute 95 dos antimicrobianos existentes no acircmbito
farmacecircutico sendo a produccedilatildeo de beta-lactamases de espectro estendido (ESBL)
17
por esta bacteacuteria uma das principais causas de falha terapecircutica Existem outras
formas de resistecircncia emergentes de grande importacircncia como a produccedilatildeo de
beta-lactamases tipo adenosina monofosfato ciacuteclico (AmpC) que hidrolizam
cefoxitina as carbapenemases como as metalo-beta-lactamases (MBL) e
carbapenemases tipo KPC (MOREIRA et al 2014)
O mecanismo de resistecircncia mais comum aos antibioacuteticos beta-lactacircmicos de
amplo espectro eacute a produccedilatildeo de ESBL por enterobacteacuterias A accedilatildeo hidroliacutetica
apresentadas por estas enzimas pode conferir clinicamente resistecircncia ao
aztreonam cefalosporina e a todas as penicilinas (PATERSON et al 2005) As
ESBL satildeo enzimas mediadas por genes plasmidiais (transmissiacuteveis entre as
espeacutecies) Os principais microrganismos produtores de ESBL satildeo Klebsiella
pneumoniae (mais encontrada) Escherichia coli e Proteus mirabilis podendo ocorrer
em outros membros da famiacutelia Enterobacteriaceae e em alguns microrganismos natildeo
enteacutericos como Acinetobacter ssp (TURNER 2005) A importacircncia cliacutenica meacutedica
destes microrganismos portadores de ESBL eacute que graccedilas aacutes suas resistecircncias a
muitas classes de antimicrobianos o tratamento de infecccedilotildees eacute difiacutecil gerando um
aumento da morbidade e mortalidade dos pacientes (SHAH et al 2004)
A enzima KPC foi detectada pela primeira vez na Carolina do Norte Costa
Leste dos Estados Unidos no ano de 1996 em Klebsiella pneumoniae dando entatildeo
este nome a enzima Em pouco tempo ela disseminou por outras regiotildees e
recentemente tornou-se uma das preocupaccedilotildees quanto agrave sauacutede puacuteblica mundial
Os paiacuteses de onde KPCs tecircm sido relatados desde 2001 satildeo mostrados na figura 2
apresentando como os organismos tecircm agora sido disseminados amplamente pelo
mundo (NEIL GUPTA et al 2011)
18
Figura 2 Divulgaccedilatildeo internacional de Enterobacteriaceae produtora de
Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC)( NEIL GUPTA et al 2011)
Este mapa apresenta paiacuteses onde Enterobacteriaceae produtoras KPC de
foram descritos em relatoacuterios publicados disponiacuteveis a partir de 11 fevereiro de
2011 Os paiacuteses natildeo destacadas nesta figura tambeacutem podem apresentar a presenccedila
de Enterobacteriaceae produtoras de KPC poreacutem pode ter tido uma falta de
vigilacircncia sistemaacutetica para estes organismos ( NEIL GUPTA et al 2011)
No ano de 2005 foram registradas pela primeira vez essas bacteacuterias
produtoras de carbapenemases Apoacutes 6 anos deste primeiro relato elas passaram a
causar surtos mais graves em nosso paiacutes Em janeiro de 2011 foram notificados no
Distrito FederalBrasil 367 casos em um curto espaccedilo de tempo (01 a 08 de janeiro
de 2011) com 26 oacutebitos A maior parte destes casos (263 casos) foi identificada nas
unidades de terapia intensiva ndash UTI (COTRIM et al 2012)
O potencial de disseminaccedilatildeo da KPC eacute alto devido agrave grande capacidade de
transferecircncia do seu material geneacutetico e por conseguinte os genes de resistecircncia
O controle de epidemias eacute difiacutecil devido a esta caracteriacutestica de faacutecil disseminaccedilatildeo
preocupando os profissionais da aacuterea de sauacutede devido agrave dificuldade de tratamento
podendo resultar em um aumento das taxas de mortalidade Apesar da maior
19
frequumlecircncia em Klebsiella pneumoniae a KPC pode ser identificada em outras
bacteacuterias como a Enterobacter cloacae Citrobacter freundii Salmonella spp E coli
e Pseudomonas spp (DIENSTMANN et al 2010)
Os pacientes com comorbidades incluindo pacientes transplantados
neutropecircnicos em ventilaccedilatildeo mecacircnica em Unidade de Terapia Intensiva (UTI)
com longos periacuteodos de internaccedilatildeo que apresentam risco aumentado de infecccedilatildeo ou
colonizaccedilatildeo para bacteacuterias multirresistentes satildeo mais vulneraacuteveis a Klebsiella
pneumoniae produtora de KPC (COTRIM et al 2012)
Os sinais e sintomas apresentados por um indiviacuteduo infectado por KPC satildeo
febre ou hipotermia taquicardia piora do quadro respiratoacuterio e em casos mais
graves hipotensatildeo inchaccedilo e sepse Quanto ao siacutetio de infecccedilatildeo a bacteacuteria que
possui a enzima KPC pode causar pneumonia associada agrave ventilaccedilatildeo mecacircnica
infecccedilatildeo do trato urinaacuterio infecccedilatildeo de corrente sanguiacutenea infecccedilatildeo de partes moles
e outros tipos de infecccedilatildeo (COTRIM et al 2012)
Para desenvolver a infecccedilatildeo a colonizaccedilatildeo eacute um preacute-requisito poreacutem o
pacientes pode estar colonizado ou seja ser portadores de KPC e natildeo desenvolver
a infecccedilatildeo (ALVES et al 2013) A forma de transmissatildeo eacute basicamente por
contato com secreccedilatildeo ou excreccedilatildeo de pacientes infectados ou colonizados logo
fora do ambiente hospitalar a bacteacuteria natildeo representa perigo (COTRIM et al
2012)
As opccedilotildees terapecircuticas para o tratamento da Klebsiella pneumoniae eacute
dividida em Terapia Empiacuterica e Terapia apoacutes a determinaccedilatildeo do perfil de
sensibilidade A terapia empiacuterica para infecccedilotildees por enterobacteacuterias multirresistentes
se baseia na utilizaccedilatildeo de polimixina B ou polimixina E (Colistina) em associaccedilatildeo
com um (1) ou mais dos antimicrobianos da classe dos aminoglicosiacutedeos
(gentamicina ou amicacina) Carbapenecircmicos (meropenem ou doripenem) eou
tigeciclina (ANVISA 2013)
Recomenda-se usar sempre associaccedilotildees de dois ou trecircs antimicrobianos
sendo um deles a polimixina B ou a polimixina E (colistina) Deve-se evitar a
utilizaccedilatildeo de monoterapias pelo risco de raacutepido desenvolvimento de resistecircncia A
escolha do(s) faacutermaco(s) de associaccedilatildeo com polimixina B ou E deve se basear
preferencialmente no perfil de susceptibilidade esperado aos referidos
20
medicamentos das enterobacteacuterias resistentes aos carbapenecircmicos detectadas no
hospital ou na ausecircncia de dados locais na regiatildeo Deve-se considerar igualmente
o local de infecccedilatildeo e a penetraccedilatildeo esperada do antimicrobiano na escolha da droga
a ser utilizada na combinaccedilatildeo (ANVISA 2013)
Apoacutes a liberaccedilatildeo do perfil de sensibilidade deve-se adequar o uso dos
medicamentos Sempre que possiacutevel manter no miacutenimo 2 (dois) faacutermacos com
sensibilidade comprovada in vitro Natildeo havendo sensibilidade a um segundo
medicamento (suscetibilidade apenas agrave polimixina B ou E) recomenda-se manter a
terapia combinada de polimixina B ou E com carbapenecircmicos (meropenem ou
doripenem) ou tigeciclina na tentativa de ocorrecircncia de sinergismo entre elas
(ANVISA 2013)
Sugere-se aleacutem da determinaccedilatildeo das Concentraccedilotildees Inibitoacuterias Miacutenimas
(CIMs) para uma das polimixinas (B ou E) que tambeacutem sejam determinadas as
CIMs de tigeciclina e carbapenecircmicos (meropenem) bem como a consultoria de um
infectologista (ou Comissatildeo de Controle de Infecccedilatildeo Hospitalar- CCIH) para a
determinaccedilatildeo da terapia combinada com base na interpretaccedilatildeo do antibiograma
CIM e quadro cliacutenico do paciente No caso de resistecircncia agraves polimixinas
(concentraccedilotildees inibitoacuterias miacutenimas [CIMs] gt 2 mgL) recomenda-se a associaccedilatildeo de
dois ou trecircs do antimicrobianos sugeridos para a combinaccedilatildeo (ANVISA 2013)
A antissepsia eficiente do ambiente dos instrumentos ciruacutergicos e das matildeos
com o uso do aacutelcool a 70 eacute fundamental para a contenccedilatildeo de surtos Aleacutem disto
os pacientes contaminados devem permanecer isolados ateacute o controle da infecccedilatildeo
para evitar a disseminaccedilatildeo da bacteacuteria (COTRIM et al 2012)
1 2 Resistecircncia bacteriana
Hoje a disseminaccedilatildeo e a proliferaccedilatildeo das bacteacuterias resistentes estatildeo cada
dia mais presente As bacteacuterias multirresistentes (BRMD) poderatildeo levar agrave
humanidade a uma era poacutes-antibioacutetica resultando em uma ausecircncia de qualquer
opccedilatildeo de tratamento para os portadores destas cepas (HENRIQUE et al 2014)
Os fatores envolvidos na disseminaccedilatildeo desses patoacutegenos multirresistentes
satildeo diversos incluindo o uso irracional de antimicrobianos procedimentos invasivos
21
(cirurgias implantaccedilatildeo de proacuteteses meacutedicas e outros) e a transferecircncia de material
geneacutetico com a informaccedilatildeo de resistecircncia a antibioacuteticos entre as bacteacuterias
(DIENSTMANN et al 2010 ENDIMIAMI et al 2009 FONTANA et al 2010)
Com a praacutetica da antibioticoterapia principalmente em ambientes
nosocomiais os mecanismos de resistecircncia tornaram-se comuns Esses
mecanismos incluem alteraccedilatildeo na permeabilidade da membrana celular que
impede a entrada do antibioacutetico na ceacutelula bombeamento do antibioacutetico para fora da
mesma pelo mecanismo de efluxo mutaccedilatildeo geneacutetica que altera de alguma forma o
alvo do antibioacutetico e consequumlentemente natildeo afeta o funcionamento da bacteacuteria
bem como desenvolvimento da capacidade de degradar ou da inativaccedilatildeo do
antibioacutetico (COTRIM et al 2012) Estes mecanismos estatildeo representados na figura
3
Figura 3 Mecanismos de resistecircncia bacteriana Fonte
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controle
opas_webmodulo3pop_mecanismohtmgt
Um dos mais importantes mecanismos de resistecircncia eacute a alteraccedilatildeo do local-
alvo onde atua determinado antimicrobiano de modo a impedir a ocorrecircncia de
qualquer efeito inibitoacuterio ou bactericida As bacteacuterias podem adquirir um gene que
22
codifica um novo produto resistente aos antimicrobianos substituindo o alvo original
por exemplo o Staphylococcus aureus resistente agrave oxacilina e estafilococos
coagulase-negativos adquiriram o gene cromossocircmico Mec A e produzem uma PBP
ou PLP resistente aos β-lactacircmicos denominada 2a ou 2 que eacute suficiente para
manter a integridade da parede celular durante o crescimento quando outras PBPs
essenciais satildeo inativadas por antibimicrobianos β-lactacircmicos Como alternativa um
gene receacutem-adquirido pode atuar para modificar um alvo tomando-o menos
vulneraacutevel a determinado antimicrobiano Assim um gene transportado por
plasmiacutedeo ou por transposon codifica uma enzima que inativa os alvos ou altera a
ligaccedilatildeo dos antimicrobianos como ocorre com eritromicina e clindamicina (ANVISA
2007)
Em funccedilatildeo da bomba de efluxo pode variar a especificidade do antibioacutetico
Ele atua por meio do bombeamento ativo de antimicrobianos do meio intracelular
para o extracelular gerando uma resistecircncia bacteriana a determinados
antimicrobianos como eacute o caso da resistecircncia agraves tetraciclinas codificada por
plasmiacutedeos em Escherichia coli devido agrave presenccedila de proteiacutenas integrantes da
membrana plasmaacutetica bacteriana (PIDDOCK 2006)
O aumento da siacutentese de proteiacutenas eacute o principal responsaacutevel pela resistecircncia
antimicrobiana devido agraves vaacuterias mutaccedilotildees que ocorrem em seus repressores
transcricionais Estas mutaccedilotildees tambeacutem podem influenciar levando a um aumento
da eficiecircncia do transporte dos antibioacuteticos para o exterior da ceacutelula (HARBOTTLE
et al 2006)
A resistecircncia aos antibioacuteticos eacute frequumlentemente associada agrave alteraccedilatildeo
diminuiccedilatildeo da permeabilidade que ocorre na membrana externa das bacteacuterias gram-
negativas O fluxo de moleacuteculas para o interior da ceacutelula ocorre por caracteriacutesticas
peculiares como carga estrutura e dimensatildeo e atraveacutes de proteiacutenas de membrana
as quais formam canais Este percurso eacute utilizado pelos antibioacuteticos para atingir o
interior da ceacutelula bacteriana ou o espaccedilo periplasmaacutetico como eacute o caso dos
antibioacuteticos β-lactacircmicos Portanto a perda de funccedilatildeo destas proteiacutenas pode
efetivamente causar a diminuiccedilatildeo da susceptibilidade a vaacuterios antibioacuteticos
(LIVERMORE 2003)
23
Os mecanismos de resistecircncia que podem impedir a accedilatildeo de antimicrobianos
satildeo vaacuterios O faacutermaco atua de forma a inibir os processos essenciais a multiplicaccedilatildeo
e sobrevivecircncia da ceacutelula bacteriana como a membrana citoplasmaacutetica e
consequumlentemente bloqueando a siacutentese proteacuteica de aacutecidos nucleacuteicos e da parede
celular A resistecircncia bacteriana eacute um mecanismo natural de defesa Sendo assim
as bacteacuterias estatildeo em constante defesa e para cada novo faacutermaco desenvolvido as
bacteacuterias iratildeo desenvolver resistecircncia em algum momento (POSSEBON et al
2003)
O grupo de antibioacuteticos beta-lactacircmicos satildeo amplamente utilizado e se
encontram dentro da classe dos melhores agentes antimicrobianos com relevacircncia
cliacutenica No entanto o seu uso tem sido restringido devido a vaacuterios mecanismos de
resistecircncia O desenvolvimento dos carbapenecircmicos surgiu devido agrave proliferaccedilatildeo de
beta-lactamases mediadas por plasmiacutedeos e cromossomos (POSSEBON et al
2003)
A bacteacuteria KPC tem um gene chamado SHV-1 que tem a caracteriacutestica de
resistecircncia a quase todos os tipos de antimicrobianos inclusive os carbapenecircmicos
especiacuteficos para o tratamento de infecccedilotildees por bacteacuterias multiresistentes e
emergecircncias Mesmo com no seu coacutedigo geneacutetico a informaccedilatildeo necessaacuteria para o
desenvolvimento da resistecircncia a resistecircncia da bacteacuteria soacute eacute desenvolvida caso a
bacteacuteria entre em contato com o antibacteriano desencadeando todo o processo
nos casos de resistecircncia induzida comuns em KPC (MOREIRA et al 2014)
A resistecircncia bacteriana pode ser apresentada de forma intriacutenseca ou
adquirida A resistecircncia intriacutenseca faz parte das caracteriacutesticas fenotiacutepicas naturais
do microrganismo ou seja faz parte de sua heranccedila geneacutetica sendo transmitida
verticalmente a prole sem perda da caracteriacutestica A presenccedila ou ausecircncia do alvo
para a accedilatildeo da droga eacute o principal determinante deste tipo de resistecircncia
(MOREIRA et al 2014) Essa resistecircncia corresponde a uma caracteriacutestica de
espeacutecie bacteriana quando estes microrganismos satildeo naturalmente resistentes a
certo tipo de antibioacutetico Este processo eacute decorrente da ausecircncia de estruturas de
atuaccedilatildeo de antimicrobianos ou a impermeabilidade por parte de estruturas
perifeacutericas das bacteacuterias (HENRIQUE et al 2014)
24
A resistecircncia adquirida aos antibioacuteticos por sua vez ocorre quando haacute uma
da mutaccedilatildeo de genes reguladores ou estruturais aquisiccedilatildeo de genes de resistecircncia
veiculados por elementos geneacuteticos moacuteveis ou da combinaccedilatildeo entre eles Este
aparecimento de resistecircncia em uma espeacutecie bacteriana era anteriormente sensiacutevel
a droga e devido a um destes fatores se torna resistente O fenoacutetipo resultante
desta resistecircncia natildeo estaraacute presente nas ceacutelulas genitoras e sim nos indiviacuteduos de
uma linhagem bacteriana derivada de um organismo susceptiacutevel Os genes muitas
vezes satildeo adquiridos por meio de elementos moacuteveis como plasmiacutedeos e
transposons (MOREIRA et al 2014)
Entatildeo a resistecircncia adquirida ocorre por diversos mecanismos geneacuteticos tais
como produccedilatildeo de enzimas inativadoras interferecircncia com a entrada e acuacutemulo de
droga na bacteacuteria alteraccedilatildeo do receptor para accedilatildeo da droga via metaboacutelica
alternativa Eacute originada por meio de uma alteraccedilatildeo a niacutevel geneacutetico da ceacutelula de
natureza cromossocircmica pelos processos de mutaccedilatildeo transduccedilatildeo e transformaccedilatildeo
ou extra cromossocircmica (plasmidial) (HENRIQUE et al 2014)
Como todo antibioacutetico β-lactacircmicoos carbapenecircmicos tem como mecanismo
de accedilatildeo a inibiccedilatildeo da siacutentese proteacuteica atraveacutes da accedilatildeo de inibiccedilatildeo da parede
microbiana fazendo a ligaccedilatildeo e inativaccedilatildeo das proteiacutenas ligadoras de penicilinas
(NETO et al 2007)
Imipenem e meropenem antibioacuteticos pertencentes ao grupo dos
carbapenecircmicos possuem um amplo espectro de accedilatildeo in vitro incluindo atividade
contra cocos gram-positivos bacilos gram-negativos e bacteacuterias anaeroacutebias (MOHR
2008) Jaacute o ertapenem possui um espectro de accedilatildeo mais limitado que o os dois
antibioacuteticos anteriormente citados tendo uma eficiecircncia limitada contra os bacilos
gram-negativos natildeo fermentadores Um novo antibioacutetico carbapenecircmico ainda natildeo
disponiacutevel no Brasil doripenem possui uma atividade mais potente principalmente
contra Pseudomona aeruginosa devido ao seu mecanismo de accedilatildeo que combina os
espectros de accedilatildeo de imipenem e meropenem (ZHANEL et al 2007)
Devido as suas estabilidades espectro de accedilatildeo poucos relatos de
resistecircncia boa toleracircncia pelos pacientes com efeitos adversos mais comuns as
complicaccedilotildees no siacutetio da infusatildeo e toxicidade gastrintestinal estes antibioacuteticos
carbapenecircmicos tecircm sido considerados terapia de escolha (NICOLAU 2008) Como
25
uma resposta adaptativa das Enterobacteacuterias o iacutendice de resistecircncia aos
carbapenecircmicos tem aumentado nos uacuteltimos anos de forma proporcional ao seu
uso limitando imensamente as opccedilotildees terapecircuticas para as infecccedilotildees causadas por
estes microrganismos (FALAGAS et al 2009)
As enzimas produtoras de betalactamases hidrolisam o anel betalactacircmico
tornando este mecanismo de resistecircncia o mais importante Os dois grupos mais
preocupantes satildeo o grupo das betalactamases de aspecto ampliado e os da
carbapenemases que aleacutem de hidrolizar os carbapenecircmicos hidrolizam todas as
outras classes de betalactacircmicos Em enterobacteacuterias as carbapenemases mais
prevalentes satildeo codificadas por genes dos grupos blaKpc blaIMP blaVIM blaNdm
e blaOxa A ocorrecircncia de carbapenemases eacute mais frequentemente em bacteacuterias
gram-negativas fermentadoras da glicose conhecidas como enterobacteacuterias
predominantes nos gecircneros Klebsiella Serratia Citrobacter Enterobacter
Escherichia Samonella Proteus Morganella Podem ser encontradas tambeacutem em
bacteacuterias gram-negativas natildeo fermentadoras como espeacutecies de Acinetobacter e de
Pseudomonas (ALVES et al 2013)
Carbapenemases satildeo enzimas plasmiacutedio-mediados resistentes a todos
antibioacuteticos betalactacircmicos As bacteacuterias que possuem o gene blaKpC responsaacutevel
pela codificaccedilatildeo da produccedilatildeo de carbapenemases apresentam resistecircncia aos
antibioacuteticos betalactacircmicos impedindo a accedilatildeo destes antibioacuteticos contra infecccedilotildees
(ALVES et al 2013)
A transmissatildeo das carbapenemases a diferentes cepas de enterobacteacuterias se
daacute atraveacutes de plasmiacutedeos que satildeo pequenas moleacuteculas circulares de DNA com a
capacidade de se replicarem independentemente do DNA cromossocircmico
permitindo a troca de material geneacutetico entre gecircneros e espeacutecies diferentes de
enterobacteacuterias O raacutepido desenvolvimento de surtos em ambientes hospitalares eacute
explicado por essa disseminaccedilatildeo plasmidial (COTRIM et al 2012)
De acordo com o criteacuterio de interpretaccedilatildeo do Clinical and Laboratory
Standards Institute (CLSI 2009) a maioria das KPC isoladas natildeo apresenta
resistecircncia completa aos carbapenecircmicos (Imipenem e Meropenem apresentam
uma Concentraccedilatildeo Inibitoacuteria Miacutenima (CIM) de 2-8 μgmL) (COTRIM et al 2012)
26
Os mecanismos de resistecircncia capazes de impedir a accedilatildeo dos
carbapenecircmicos satildeo vaacuterios Poreacutem a degradaccedilatildeo de antibioacuteticos por enzimas
principalmente as carbapenemases constituem o principal mecanismo de
resistecircncia aos antibioacuteticos β-lactacircmicos (DIAS 2009) Devido a ampla atividade
hidroliacutetica agrave maioria dos antibioacuteticos β-lactacircmicos estes grupos de enzimas possuem
alta versatilidade (QUEENAM et al 2007)
Existem trecircs grandes classes moleculares de Ambler a qual as
carbapenemases pertencem denominadas classe A (serino-carbapenemases os
quais incluem membros designados SME IMI NMC GES e a famiacutelia das KPCs)
classe B(as metalo-β-lactamase incluem os tipos IMP e VIM) e classe D
(oxacilinases similares as da classe A e incluem as OXA e PSE) (DIAS 2009)
Dentre estes as mais importantes e prevalentes encontradas em plasmiacutedeos
de Klebsiella pneumoniae satildeo as KPC (DIENSTMANN et al 2010) Por meio de
estudos moleculares a enzima KPC jaacute foi documentada em diferentes bacteacuterias e
diferenciada em KPC-1 a 13 (NETIKUL et al 2011) No ano de 2009 foi realizada
uma pesquisa onde descreveram as seguintes carbapenemases KPC-1 em isolados
de Klebsiella pneumoniae KPC-2 em K pneumoniae K oxytoca Salmonella
enterica e em Enterobacter sp e KPC-3 em K pneumoniae e Enterobacter cloacae
(MONTEIRO et al 2009) As enzimas KPC-4 e KPC-5 foram encontradas em
isolados de Pseudomonas aeruginosa (PEIRANO et al 2009)
Foi observada uma correccedilatildeo da sequumlecircncia KPC-1 indicando que o gene
blaKPC-1 e blaKPC-2 satildeo idecircnticos Trecircs novas variantes blaKPC-3 blaKPC-4 e
blaKPC-5 satildeo resultados de mutaccedilotildees do gene estrutural da enzima KPC-2
(WOLTER et al 2008) apresentando diferentes perfis de hidroacutelise As enzimas
KPC-2 e KPC-3 possuem alta eficiecircncia em hidrolisar cefalotina cefaloridina e
nitrocefin poreacutem possuem uma menor eficiecircncia contra carbapenecircmicos e
cefotaxima (ALBA et al 2005) As enzimas KPC-5 e KPC-4 apresentam menor
hidroacutelise de carbapenecircmicos eacute do que em KPC-2 Em contrapartida possuem
melhor eficiecircncia contra ceftazidima e uma maior inibiccedilatildeo pelo aacutecido clavulacircnico
(WOLTER et al 2008)
27
13 Anaacutelise geneacutetica de microrganismos
Eacute de extrema importacircncia praacutetica natildeo soacute no aspecto cliacutenico mas tambeacutem na
fitopatologia biotecnologia e estudos ambientais a correta identificaccedilatildeo e
classificaccedilatildeo de microrganismos Os meacutetodos usados na diferenciaccedilatildeo de gecircneros
espeacutecies e estirpes de microrganismos podem ser divididos em meacutetodos fenotiacutepicos
(baseados em fenocircmenos bioquiacutemicos fisioloacutegicos e bioloacutegicos) e genotiacutepicos
(detectam polimorfismos ao niacutevel dos aacutecidos nucleacuteicos ou variaccedilatildeo aleacutelica ao niacutevel
de enzimas) (ALVES et al 2003)
Para este tipo de estudo existem alguns meacutetodos como o RFLPrsquos -
ldquoRestriction Fragment Length Polymorphismsrdquo (polimorfismos de tamanho de
fragmentos de restriccedilatildeo) rep-PCR (Meacutetodo de tipagem baseado na amplificaccedilatildeo via
PCR de elementos de DNA repetitivos presentes em genomas bacterianos) anaacutelise
de sequumlecircncias nucleotiacutedeas (discriminaccedilatildeo eou identificaccedilatildeo atraveacutes de sequumlecircncias
de DNA) PFGE - Pulsed-Field Gel Electrophoresis (Eletroforese em campo
pulsado) ( A L V E S et al 2003)
A diferenciaccedilatildeo clara da cepa e principalmente a alta reprodutibilidade devem
ser caracteriacutesticas de qualquer meacutetodo de tipagem geneacutetica Poreacutem nem todos os
meacutetodos moleculares de tipagem satildeo igualmente eficazes Sendo assim de acordo
com a finalidade pretendida (identificaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo custo reprodutibilidade
etc) eacute feita a escolha do meacutetodo a ser aplicado (A L V E S et al 2003)
O processo de identificaccedilatildeo fenotiacutepica de KPC entre os membros da famiacutelia
Enterobacteriaceae ainda eacute difiacutecil e os meacutetodos para a sua identificaccedilatildeo devem ser
revistos e ajustados Mesmo com o avanccedilo tecnoloacutegico natildeo existem ensaios que
combinam alta especificidade e sensibilidade na detecccedilatildeo destas enzimas Satildeo
diversas as metodologias usadas para rastreamento de KPC como por exemplo a
focalizaccedilatildeo isoeleacutetrica a teacutecnica de disco-difusatildeo E-test teste de Hodge
modificado dentre outros Aleacutem disso a pesquisa do gene blaKPC pode ser feita
pela Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) Os sistemas de automaccedilatildeo
existentes no entanto podem natildeo identificar com precisatildeo os isolados KPC
positivos (COTRIM et al 2012)
A identificaccedilatildeo blaKPC pelo PCR eacute um meacutetodo raacutepido preciso sensiacutevel e
altamente especiacutefico no entanto a PCR exige equipamento e conhecimentos
28
especializados em diagnoacutestico molecular dificultando ainda a utilizaccedilatildeo dele na
rotina dos laboratoacuterios de microbiologia (COTRIM et al 2012)
Em estudo de infecccedilotildees hospitalares identificaccedilatildeo molecular de patoacutegenos
bacterianos eacute bastante utilizada Para diferenciar carbapenemases tipo KPC a partir
de outros tipos como SME NMC-A-IMI e GES eacute necessaacuterio um exame molecular
As identificaccedilotildees do microrganismo juntamente com a triagem molecular iratildeo definir
um resultado mais especiacutefico podendo ser usado para identificar o antibioacutetico mais
adequado para o tratamento Poreacutem a principal desvantagem de alguns exames
baseados em PCR por exemplo eacute que devido agrave sua limitada capacidade de
multiplexaccedilatildeo eles distinguem apenas algumas variaccedilotildees (MOREIRA et al 2014)
Estatildeo descritas para a identificaccedilatildeo molecular de patoacutegenos pertencentes agrave
famiacutelia Enterobacteriaceae as teacutecnicas de PFGE RAPD (randomly amplified
polymorphic DNA) e ERIC-PCR (Enterobacterial Repet it ive Intergenic Consensus)
A PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) eacute considerada padratildeo ouro devido sua
alta capacidade de diferenciaccedilatildeo baseada na anaacutelise do perfil de restriccedilatildeo do DNA
genocircmico por meio de eletroforese Como desvantagem para a sua execuccedilatildeo eacute
necessaacuterios vaacuterios dias impedindo a tipagem de algumas cepas bacterianas devido
agrave degradaccedilatildeo do DNA aleacutem do alto custo empregado (MOREIRA et al 2014)
O meacutetodo baseado em ERIC-PCR tem sido bastante utilizado como uma
alternativa para a teacutecnica de PFGE Esta teacutecnica consiste na anaacutelise do padratildeo de
amplificaccedilatildeo de elementos repetidos encontrados no genoma bacteriano Isto
permite uma maior rapidez na obtenccedilatildeo de resultados quando comparada com o
PFGE aleacutem de alta reprodutibilidade simples execuccedilatildeo e implementaccedilatildeo baixo
custo e natildeo sem problemas com a degradaccedilatildeo do DNA (MOREIRA et al 2014)
A PCR eacute considerada uma teacutecnica de biologia molecular revolucionaacuteria que
consiste na siacutentese enzimaacutetica de coacutepias de aacutecidos nucleacuteicos Ela permitiu o raacutepido
desenvolvimento do estudo de sequumlecircncias de aacutecidos nucleacuteico Foi desenvolvida por
Kary Banks Mullis que ganhou o precircmio Nobel de quiacutemica de 1993 devido ao
desenvolvimento dessa teacutecnica em abril de 1983 (CAMARGO et al 2014)
Por meio de etapas de variaccedilatildeo de temperatura a teacutecnica de PCR promove a
duplicaccedilatildeo de cadeias de DNA in vitro A reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo de DNA por PCR
envolve o emprego de sequumlecircncias iniciadoras (primers) quatro nucleotiacutedeos
29
(dNTPrsquos) do DNA e uma DNA polimerase termoestaacutevel podendo assim obter-se a
partir de uma fita molde muitas coacutepias de uma sequumlecircncia especiacutefica de aacutecido
nucleacuteico O princiacutepio da PCR consiste na variaccedilatildeo de temperatura por ciclo
envolvendo trecircs etapas baacutesicas desnaturaccedilatildeo pareamento e amplificaccedilatildeo
(CAMARGO et al 2014)
A desnaturaccedilatildeo da fita molde de DNA eacute uma etapa com duraccedilatildeo entre 30
segundos a 1 minuto a temperatura entre 92 ordmC a 96 ordmC Apoacutes isso o pareamento de
dois iniciadores sinteacuteticos de composiccedilotildees distintas que funcionam como os
iniciadores da reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo liga-se agrave regiatildeo complementar da fita de
DNA alvo que sofreraacute a duplicaccedilatildeo Esta etapa tem duraccedilatildeo de 30 segundos a 1
minuto a temperatura entre 58 ordmC e 65 ordmC Por uacuteltimo a amplificaccedilatildeo por meio da
enzima Taq DNA polimerase das novas fitas de DNA se daacute a partir de cada um dos
iniciadores utilizando os quatro dNTPrsquos como substrato da reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo
Esta etapa possui duraccedilatildeo entre 45 segundos e 1 minuto a 72 ordmC Cada ciclo eacute
repetido em torno de 30 a 35 vezes e promove a amplificaccedilatildeo da regiatildeo alvo
determinada conforme o anelamento dos iniciadores sinteacuteticos de DNA (CAMARGO
et al 2014) Estas etapas estatildeo demonstradas na figura 4
Figura 4 Etapas da Reaccedilatildeo de PCR
30
2 JUSTIFICATIVA
No ano de 2010 no Distrito Federal foram identificados 111 pacientes com
suspeita de infecccedilatildeo por Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) e a
Secretaria de Sauacutede do Distrito Federal confirmaram ainda a morte de 18 pacientes
dentre os hospitais puacuteblicos e particulares Um desafio encontrado por ocasiatildeo do
surto infeccioso no Distrito Federal foi o de confirmar as KPCs por Reaccedilatildeo da
Polimerase em Cadeia sendo que as amostras foram enviadas com esta finalidade
para a Fiocruz no Rio de Janeiro
Pesquisas que possam contribuir na elaboraccedilatildeo de estrateacutegias preventivas e
de intervenccedilatildeo para infecccedilotildees causadas por enterobacteacuterias bem como contribuir
para gerar uma integraccedilatildeo beneacutefica entre a equipe acadecircmica e os serviccedilos de
sauacutede devem ser estimuladas Neste sentido o presente estudo permitiu escrutinar
os genes envolvidos na expressatildeo de carbapenemases presentes em espeacutecies de
enterobacteacuterias isoladas em ambiente hospitalar visto que elucidar genes de
resistecircncia de enterobacteacuterias aos antibioacuteticos carbapenecircmicos eacute o primeiro passo
para garantir um controle epidemioloacutegico efetivo para estes tipos de microorganismo
assim como sua associaccedilatildeo com surtos fatais particularmente em pacientes com
baixa imunidade
31
3 OBJETIVOS
31 Objetivo geral Caracterizar os genes de resistecircncia das
Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases e os aspectos epidemioloacutegicos de
pacientes internados em um hospital puacuteblico do Distrito Federal
32 Objetivos Especiacuteficos
Identificar genotipicamente a enzima KPC (Klebsiella pneumoniae
carbapenemase) de isolados de Klebsiella pneumoniae
Investigar aspectos epidemioloacutegicos dos pacientes portadores de
Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases
Identificar quais variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana influenciaram para o
desfecho oacutebito ou alta
Avaliar a susceptibilidade das Enterobacteacuterias aos antibioacuteticos
carbapenecircmicos dos pacientes em ambiente hospitalar
32
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
Trata-se de um estudo transversal onde foi realizado o teste de
susceptibilidade das enterobacteacuterias aos antibioacuteticos carbapenecircmicos a partir dos
materiais bioloacutegicos coletados dos pacientes internados no Hospital Regional da Asa
Norte (HRAN) e enviados ao Laboratoacuterio de Anaacutelises Cliacutenicas da mesma Instituiccedilatildeo
Os materiais bioloacutegicos investigados foram sangue aspirado traqueal ou brocircnquico
urina e cultura semi quantitativa de ponta de cateter venoso central O HRAN eacute um
hospital puacuteblico do Distrito Federal com 395 leitos sendo as cliacutenicas de internaccedilatildeo
Berccedilaacuterio Cirurgia Geral Cirurgia Plaacutestica Cliacutenica Meacutedica Ginecologia Maternidade
Pediatria Queimados UTI com atendimento a pacientes portadores de doenccedilas de
caraacuteter cliacutenico e ciruacutergico
4 1 Coleta e transporte das amostras bioloacutegicas
As amostras foram coletadas de pacientes internados no Hospital Regional da
Asa Norte (HRAN) com suspeitas de infecccedilatildeo por KPC A identificaccedilatildeo primaacuteria foi
realizada pelo Laboratoacuterio de Microbiologia do hospital de origem dos pacientes e os
demais procedimentos que foram utilizados na identificaccedilatildeo encontram-se descritos
abaixo
4 2 Procedimentos para confirmaccedilatildeo de resistecircncia bacteriana por
disco de ertapenem (adaptado CDC 2004)
Para diagnosticar amostra como portadora de bacteacuteria produtora de
carbapenemase foi realizado o teste com disco de ertapenem como forma de
triagem Inicialmente utilizou-se o swab contaminado com a amostra que foi
distribuiacuteda em uma pequena aacuterea da placa de aacutegar MacConkey para apoacutes o
crescimento ser realizada a pesquisa de colonizaccedilatildeo por enterobacteacuterias resistentes
aos carbapenecircmicos (Pesquisa de CRE) Procedeu-se a semeadura por teacutecnica
semi-quantitativaesgotamento com alccedila bacterioloacutegica na diluiccedilatildeo de 1100 O disco
de Ertapenem foi colocado na superfiacutecie da placa de MacConkey na junccedilatildeo dos dois
primeiros campos de semeadura conforme demonstrado na figura 5 Incubou a placa
33
em estufa aeroacutebia a 35ordmC por 24 e 48 horas e observou-se o halo de difusatildeo do
disco de Ertapenem na placa para proceder agrave leitura
O teste deixou de ser obrigatoacuterio apoacutes a modificaccedilatildeo dos criteacuterios
interpretativos para carbapenecircmicos para enterobacteacuterias publicados no suplemento
do CLSI 2010 M100-S20-U
Figura 5 Mecanismo de semeamento de material bioloacutegico oriundos de
pacientes com suspeita de infecccedilatildeo por KPC Fonte adaptado CDC 2004
4 2 1 Interpretaccedilatildeo dos resultados
Na ausecircncia de crescimento ateacute 24 horas (MacConkey) ou halo de difusatildeo
gt27 mm na placa deve-se reincubar as placas por mais 24 horas Quando for
ausente o crescimento apoacutes 48 horas ou halo de difusatildeo gt27 mm na placa libera-se
como enterobacteacuterias resistentes a carbapenecircmicos (KPCNEG)Havendo
crescimento de colocircnias na placa de MacConkey com halo lt 27 mm (apenas para
colocircnias com crescimento dentro do halo) deve-se reisolar e realizar identificaccedilatildeo e
antibiograma automatizado teste de sensibilidade por disco-difusatildeo e Teste de
Hodge Modificado (THM) Os isolados de enterobacteacuterias cujos testes comprovarem
a resistecircncia aos carbapanecircmicos testados (KPCPOS) foram reportado a Comissatildeo
de Controle de Infecccedilatildeo Hospitalar (CCIH) Jaacute osbacilos Gram-negativos natildeo
fermentadores natildeo foram reportados (KPCNEG) Para interpretaccedilatildeodos resultados
foram utilizados os valores conforme demonstrados na tabela 1
Tabela 1 Criteacuterios Interpretativos para testes de sensibilidade
ENTEROBACTEacuteRIAS
Disco difusatildeo (mm) MIC (microgml)
34
Antibioacutetico Sigla S I R S I R
Ertapenem 10
microg
ETP 22 19-
21
18 05 1 2
Meropenem 10
microg
MEM 23 20-
22
19 1 2 4
Fonte Manual Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)
2013
Os resultados que apresentaram resistecircncia ao antibioacutetico Ertapenem foram
considerados como suspeitos de contaminaccedilatildeo por KPC Fez-se o teste de
susceptibilidade aos antibioacuteticos (TSA) em aparelho automatizado MicroScan Walk
Away 96sl Dade Behring
4 3 Teste de susceptibilidade aos antibioacuteticos (adaptado CDC 2004)
A determinaccedilatildeo da susceptibilidade dos isolados foi feita pelo teste de
susceptibilidade aos antibioacuteticos (TSA) apoacutes cultura em meio de gelose simples
(INSA) para avaliaccedilatildeo da sua pureza e obtenccedilatildeo de colocircnias isoladas Para
preparaccedilatildeo de uma suspensatildeo bacteriana com turvaccedilatildeo aproximada de 05
McFarland (Dade BehringMicroScanregTurbidity Meter) ressuspendeu duas a cinco
colocircnias em 2ml de soro fisioloacutegico esteacuteril diluindo a 1100 em soro fisioloacutegico num
volume total de 10ml em seguida foi feita uma semeadura em duas placas
quadradas (120mm x 120mm) de Muller-Hinton Agar (INSA) por inundaccedilatildeo
Os discos de antibioacutetico carbapenecircmicos imipenem meropenem e
ertapenem (Biorad) foram aplicados com o auxiacutelio de um dispensador automaacutetico A
susceptibilidade das Enterobacteacuterias aos carbapenecircmicos foi definida de acordo
com o protocolo Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI 2011)
Para aquelas Enterobacteacuterias que apresentaram resistecircncia ao ertapenem
foram realizados o Teste de Hodge Modificado para Detecccedilatildeo de Enterobacteacuterias
Produtoras de Carbapenemases conforme descrito pelo Centers for Disease Control
and Prevention (CDC 2004)
35
4 4Teste de Hodge Modificado (THM) (adaptado CDC 2004)
Preparou-se uma suspensatildeo em salina esteacuteril com a cepa Escherichia coli
ATCC 25922 (padratildeo 05 de McFarland) Apoacutes isto diluiu a suspensatildeo 110 em
salina (05 ml da soluccedilatildeo de Ecoli ATCC 25922 + 45 ml salina)Foi entatildeo semeado
na superfiacutecie de uma placa de Agar Muller-Hinton com a suspensatildeo diluiacuteda de Ecoli
ATCC 25922 com auxilio de swab seco assegurando que houvesse uma
distribuiccedilatildeo uniforme cobrindo toda a superfiacutecie do Agar Deixou secar por 3 a 5
minutos em temperatura ambienteColocou-se o disco de ertapenem 10microg no centro
da placa e apoacutes isto fez-se uma estria linear da cepa a ser testada da borda do
disco ateacute a borda da placa utilizando uma alccedila calibrada 10 microl ou um swab Incubou
a placa na estufa em atmosfera aeroacutebia a 35 plusmn 2ordmC por 16 a 24 horas
441 Controle de qualidade (CQ)
Foi utilizado um CQ todos os dias em que se realizou o teste tendo como
controle Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1705- teste de Hodge modificado
positivo Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1706- teste de Hodge modificado
negativo
442 InterpretaccedilatildeoResultados
Apoacutes 16ndash24 horas de incubaccedilatildeo examinar as placas para verificar a presenccedila
de uma distorccedilatildeo no halo de inibiccedilatildeo do disco de ertapenem devido ao crescimento
realccedilado da cepa ATCC na intersecccedilatildeo do organismo teste e a Ecoli ATCC 25922
dentro dos limites do halo O THM positivo apresentaraacute presenccedila de distorccedilatildeo no
halo de inibiccedilatildeo de ertapenem devido ao crescimento da cepa Ecoli ATCC 25922 ao
longo da estria da cepa teste para dentro dos limites do halo de inibiccedilatildeo Jaacute o THM
negativo teraacute ausecircncia de crescimento da cepa Ecoli ATCC 5922 ao longo da estria
da cepa teste para dentro dos limites do halo de inibiccedilatildeo do disco de ertapenem
Este resultado estaacute representado na figura 6
36
Figura 6 Interpretaccedilatildeo resultado do Teste de Hodge Modificado
(adaptado CDC 2004) Teste positivo na estria da cepa teste na parte superior
da placa teste negativo na estria da cepa teste na parte inferior da placa
Tendo positivo como resultado o paciente era um provaacutevel contaminado por
KPC As amostras entatildeo foram encaminhadas para a Fundaccedilatildeo Osvaldo Cruz
(FIOCRUZ) para confirmaccedilatildeo final As amostras finalmente confirmadas como
positivas para KPC foram isoladas e guardadas no banco de cepas cliacutenicas do
hospital Apoacutes a autorizaccedilatildeo do CEP amostras das cepas foram transferidas para
meio de transporte Stuard em caixa teacutermica fechada em baixa temperatura e
levadas para o laboratoacuterio de microbiologia cliacutenica da universidade
No laboratoacuterio da universidade as amostras foram separadas e realizadas
repiques em meios MacConkey e incubadas por 24h As colocircnias caracteriacutesticas
foratildeo isoladas em caldo BHI e mantidas em shaker a 37oC por 2h Apoacutes isto foram
executadas as anaacutelises a seguir
Os isolados de Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases foram
submetidos agrave extraccedilatildeo de DNA e posterior sequumlenciamento para identificaccedilatildeo dos
genes de resistecircncia blaKPC de 1 a 13 e identificaccedilatildeo do gene universal Os
pacientes de onde os materiais bioloacutegicos contendo as Enterobacteacuterias produtoras
de carbapenemases foram os isolados foram investigados quanto aos aspectos
epidemioloacutegicos e cliacutenicos
37
4 5 Extraccedilatildeo de DNA bacteriano
A extraccedilatildeo de DNA bacteriano foi realizada utilizando o kit NucleoSpin
Plasmidreg (MN) Antes de iniciar a extraccedilatildeo foi feito a preparaccedilatildeo das soluccedilotildees
reagentes materiais e amostras (vortexando) colocou-se em banho-maria agrave 50ordmC o
tampatildeo AW Partiu-se de colocircnias isoladas cultivadas que sofreram passagem em
meio LB liacutequido por 12h Adicionou-se 15 mL da amostra no tubo eppendorf
centrifugou por 5 minutos descartou o sobrenadante (com cuidado para natildeo
descartar o Pellet) Repetiu-se este procedimento por mais trecircs vezes completando-
se o volume de 6mL Foram adicionados 250microL do tampatildeo Resuspension Buffer A1
encostando a ponteira no Pellet e misturando (este tampatildeo tem como funccedilatildeo
separar a formaccedilatildeo de grumos celulares) Apoacutes isso homogeneizou e vortexou os
tubos eppendorfs Apoacutes isso foram adicionados 250microL do tampatildeo Lysis Buffer A2
homogenizou e deixou descansar por 5 minutos (esta etapa eacute importante para a lise
da parede e da membrana celulares e liberaccedilatildeo do conteuacutedo da ceacutelula)
Passado o tempo de descanso foi adicionado 300microL do tampatildeo
Neutralization Buffer A3 homogeneizou e centrifugou por 10 minutos (este tampatildeo
iraacute retirar as proteiacutenas que envolvem o DNA e voltaraacute com o pH para proacuteximo de 8
impedindo que a soluccedilatildeo de lise facilite a quebra das ligaccedilotildees covalentes do aacutecido
nucleacuteico) Em seguida enumeraram-se os tubos contendo filtros com siacutelica
transferiu-se o sobrenadante para o filtro e centrifugou por 5 minutos Descartou-se
o que foi filtrado adicionou 500microL do tampatildeo AW (banho-maria) centrifugou por 2
minutos Novamente foi descartado o filtrado Adicionou-se 600microL do tampatildeo A4
centrifugou por 2 minutos e descartou o filtrado (os tampotildees AW e A4 contecircm
isotiocianato de guanidina em concentraccedilotildees crescentes para facilitar a adsorccedilatildeo
do DNA na siacutelica e retirada das outras biomoleacuteculas da amostra) Foi feita outra
centrifugaccedilatildeo com o tubo vazio Apoacutes isto o filtro foi trocado para outro eppendorf
definitivo onde foi adicionado 50microL do tampatildeo Elution Buffer AE (este tampatildeo
favorece a eluiccedilatildeo do DNA) centrifugou por 2 minutos descartou o filtro e
armazenou as amostras em freezer -20ordmC
38
4 6 Iniciadores e reaccedilatildeo de PCR
Os iniciadores universais para o gene blaKPC foram desenhados baseados
em sequumlecircncias conservadas apresentadas pelos sub-grupos de genes que
codificam a enzima carbapenemase de klebsiella pneumoniae (YIGIT et al 2001)
Baseado na sequumlecircncia para o blakpc-1 depositada no GenBank
(AF2975541) o oligonucleotiacutedio (oligo) iniciador direto (5-
ATGTCACTGTATCGCCGTC-3rsquo) foi desenhado para reconhecer a sequumlecircncia
blaKPC na posiccedilatildeo (131149) enquanto que o iniciador reverso (5-
TTACTGCCCGTTGACGCC-3rsquo) foi reconhecido na posiccedilatildeo (9951012) As anaacutelises
baseadas em alinhamento de sequumlecircncias mostraram que o par de iniciadores
blaKPC podem detectar os alelos de 1 a 13 do gene blaKPC conforme a tabela 2
Tabela 2 Nuacutemero de acesso ao GenBank dos alelos blaKPC e seus
microrganismos originais
Nuacutemero de
Acesso GenBank
Microrganismo Alvo
AF2975541 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-1
GU0862251 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-2
HQ2589341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-2-like
AB5577341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC -3
EU4473041 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-4
EU4002222 Pseudomonas
aeruginosa
blaKPC-5
EU5555341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-6
EU7297271 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-7
39
FJ2344121 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-8
FJ624872 Escherichia coli blaKPC-9
GQ1403481 Acinetobacter
baumannii
blaKPC-10
HM0669951 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-11
HQ3428891 Enterobacter cloacae blaKPC-12
HQ3428901 Enterobacter cloacae blaKPC-13
As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo de blaKPC foram realizadas em um
primeiro tempo de desnaturaccedilatildeo em que foi 94ordmC por 5 minutos seguido de 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 58 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 90 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 78ordmC por 8 minutos Aleacutem das amostras foi utilizado um
controle negativo
A PCR do blaKPC foi realizada utilizando os componentes para o volume da
reaccedilatildeo de 25 microL citados na tabela 3 A banda do tamanho do produto de PCR foi de
881 pares de bases (pb) o que corresponde ao plasmiacutedeo
Tabela 3 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do
gene blaKPC
Reagente Volume
DNA molde 4 microL
Tampatildeo Taq 25 microL
MgCl2 075 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP
2 microL
Oligo F 1 microL
Oligo R 1 microL
Taq DNA polimerase 05 microL
Aacutegua MiliQ 1335 microL
40
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
Baseado na sequumlecircncia para o gene 16S rRNA em que o oligonucleotiacutedio
Universal iniciador direto foward (5-CCAGCAGCCGCCGTAATACG-3rsquo) foi
desenhado para reconhecer a sequumlecircncia universal na posiccedilatildeo 1513 enquanto que o
iniciador reverso (5-ATCGGYTACCTTGTTACGACTTC-3rsquo) foi reconhecido na
posiccedilatildeo 1491 foram realizadas PCRrsquos As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo deste
gene foram realizadas nos seguinte tempos separaccedilatildeo 94ordmC por 10 minutos 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 55 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 120 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 72ordmC por 10 minutos
A PCR do gene 16S rRNA foi realizada utilizando os componentes para o
volume da reaccedilatildeo de 25microL citados na tabela 4 A banda do tamanho do produto de
PCR foi de 996 pb correspondente aacute regiatildeo ribossomal capaz de amplificar todas
as espeacutecies
Tabela 4Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do gene
universal
Reagente (quantidade
concentraccedilatildeo do estoque)
Volume
DNA molde 10 ng 4 microL
Tampatildeo Taq 10 x 25 microL
MgCl2 50mM 125 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP 25 mM
125 microL
Oligo F 10microM 05 microL
Oligo R 10microM 05 microL
Taq DNA polimerase 5UmicroL 04 microL
Aacutegua Miliq 146 microL
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
41
O termociclador utilizado para os experimentos foi o LifeTouch da BIOER
4 7 Digestatildeo
Para realizaccedilatildeo da digestatildeo foi utilizada a enzima BshF I (Hae III) EN- 1105
tamanho 7000 units concentraccedilatildeo 10 unitsmicroL fonte Bacillus sphaericus empresa
Jena bioscienceUtilizaram-se os componentes para o volume de 50microL da reaccedilatildeo
citados na tabela 5
Tabela 5 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da digestatildeo do gene
universal
Reagente Volume
Produto de PCR 10 microL
Enzima BshF I 01 microL
Tampatildeo (10x) 5 microL
Aacutegua Miliq 349 microL
Total (em cada ependorff) 50 microL
Valores para 1 digestatildeo
Os ependorffs foram colocados por 30 minutos em banho-maria a 37ordmC Apoacutes
isso fez-se a corrida das amostras em gel de agarose para verificaccedilatildeo do resultado
(LU et al 2000)
4 8 Eletroforese em gel de agarose
Os produtos de DNA PCR e digestatildeo foram analisados em gel de agarose
2 O tempo de corrida do gel eacute de aproximadamente 1hora e 30minutos sendo
que no comeccedilo foi usada agrave voltagem de 50 V e apoacutes comeccedilar a correr o gel
aumentou a voltagem para 100 v Utilizou-se o marcador de 100pb (pares de bases)
Foi adicionado 3microL de corante Bromophenol (que tem a funccedilatildeo de fazer uma ligaccedilatildeo
na amostra de DNA e permitir a visualizaccedilatildeo da corrida no gel de agarose) em 7microL
de amostra tanto de DNA quanto de PCR Para o preparo do gel foi utilizado TBE
42
(Tris- Aacutecido Boacuterico) agarose e brometo de etiacutedio (sua funccedilatildeo eacute de corante para o gel
e permitir a visualizaccedilatildeo do DNA quando colocado agrave luz ultravioleta) Para o oligo
blaKPC a banda da amplificaccedilatildeo foi em 881ppb correspondendo ao plasmiacutedeo Jaacute
o oligo Universal foi em 996 pb
4 9 Descarte de resiacuteduos
Todos os materiais utilizados nos ensaios foram de uso uacutenico e manipulados
em cacircmaras de seguranccedila bioloacutegica classe II Apoacutes o uso foram colocados em
soluccedilatildeo desinfetantes (hipoclorito a 1) e em seguida autoclavados a 127oC por 20
min em sacos apropriados para autoclavaccedilatildeo Apoacutes a finalizaccedilatildeo do ciclo de
esterilizaccedilatildeo os sacos contendo o material descartaacutevel foram colocados em
recipientes de coleta da empresa responsaacutevel pela coleta de materiais bioloacutegicos
produzidos no laboratoacuterio de microbiologia Todos os procedimentos seguiram a
normativa RDC-ANVISA 3062004 sobre o descarte de resiacuteduos de serviccedilo de
sauacutede
4 10 Aspectos epidemioloacutegicos e cliacutenicos
Os aspectos cliacutenicos e epidemioloacutegicos foram investigados por meio de
prontuaacuterios dos pacientes portadores de enterobacteacuterias produtoras de
carbapenemases e envolveram topografia mais provaacutevel do foco infeccioso a
enfermidade motivadora da internaccedilatildeo o desfecho cliacutenico a idade e o tempo de
internaccedilatildeo
4 12 Anaacutelises eepidemioloacutegicas
As anaacutelises foram realizadas com o pacote estatiacutestico SPSS versatildeo 200
Para verificar quais variaacuteveis referentes aos dados epidemioloacutegicos e
microbioloacutegicos influenciaram no desfecho verificou- se a diferenccedila meacutedia das
variaacuteveis idade e tempo de internaccedilatildeo em cada grupo O teste estatiacutestico utilizado foi
o teste t de Student apoacutes se executar o teste de normalidade de Shapiro-Wilk Para
as variaacuteveis sexo perfil microbioloacutegico das enterobacteacuterias produtoras de
43
carbapenemases foi avaliada a associaccedilatildeo com o desfecho por meio do teste Exato
de Fisher O niacutevel de significacircncia adotado foi de 5
4 13 Preceitos eacuteticos
Este projeto estaacute inserido em um projeto maior denominado ldquoEpidemiologia
cliacutenica e caracterizaccedilatildeo molecular do Acinetobacter Baumannii resistente a
antibioticoterapia em pacientes internado em hospitais do Sistema Uacutenico de Sauacutederdquo
que foi submetido ao Comitecirc de Eacutetica em Pesquisa da Secretaria do Estado de
Sauacutede do Distrito Federal (SESDF) e emitido parecer aprovado pelo protocolo nordm
23109 (anexo)
44
5 RESULTADOS
51 Anaacutelise molecular
Para a amplificaccedilatildeo com o oligo blaKPC foram amplificadas amostras
que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 881 pb correspondente ao
plasmiacutedeo A anaacutelise da amplificaccedilatildeo da regiatildeo do gene blaKPC mostrou que
apenas a amostra A10 natildeo amplificou isso demonstra que esta amostra natildeo
possuiacutea o gene de resistecircncia
5 1 1 Gene blaKPC
Figura 7 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 881 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
A amostra A3 natildeo amplificou no primeiro momento entatildeo foi realizado
novamente a PCR e corrida de gel obtendo entatildeo a amplificaccedilatildeo da amostra como
apresentado na figura 8
45
Figura 8 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC da
mostra A3 estudada A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo de 881
pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 1 2 Gene 16S rRNA
Para a amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA utilizou-se o oligo universal Foram
amplificadas amostras que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 996 pb
Figura 9 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
46
Segundo Lu et al (2000) a digestatildeo com a enzima HaeIII deste amplicons de
16S rRNA devolveriam bandas com perfis entre 150 a 200 pb No gel abaixo eacute
possiacutevel evidenciar que este perfil ocorreu com o predomiacutenio de bandas na altura
de 200pb
Figura 10 Gel de agarose a 2 da digestatildeo do amplicon do gene 16S
rRNA das amostras com a enzima HaeIII evidenciando diversos fragmentos
proacuteximos a 200 pb A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo ribossomal
de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 2 Anaacutelises epidemioloacutegicas
5 2 1 Sexo
No total foram detectados 17 isolados de KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 onde a maior a prevalecircncia foi
detecatada em amostras de pacientes do sexo masculino (53) do que no sexo
feminino (47)
47
Figura 11 Isolado de KPC segundo sexo dos 17 pacientes investigados
no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 2 Desfecho cliacutenico
Em 17 isolados de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo
de 2010 aacute 2011 a porcentagem de pacientes que foram a oacutebito (59) foi maior que
a de pacientes que tiverm alta (41)
Figura 12 Isolado de KPC segundo desfecho cliacutenico dos 17 pacientes
investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
48
5 2 3 Local da coleta
Dos 17 episoacutedios detectados de infecccedilatildeo por KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 a infecccedilatildeo em swab retalfoi mais
frequente (47) seguida de ponta de cateacuteter (18) e secreccedilatildeo traqueal (12)
Figura 13 Isolados de KPC segundo local da coleta da amostra nos 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 4 Microorganismo
O microorganismo mais encontrado foi a Klebsiella pneumoniae (82)
seguida da Enterobacter clocae (12) e Serratia marcescens (6) dos 17 isolados
de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 Isto afirma o
fato de a sigla KPC ser utilizada de forma errocircnea aacute Klebsiella pneumoniae visto
que a evidecircncia dela eacute maior em relaccedilatildeo as outras cepas
49
Figura 14 Isolado de KPC segundo microrganismo encontrado em 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 5 Relaccedilotildees variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana e desfecho
cliacutenico
Tabela 6 ndash Distribuiccedilatildeo do perfil geneacutetico sexo coleta tipificaccedilatildeo de
microrganismos e anaacutelise da resistecircncia bacteriana segundo o desfecho
cliacutenico Brasiacutelia-DF 2010 a 2011
Variaacutevel Resultado
Desfecho
Alta Oacutebito
N N P
Gene 16S rRNA Positivo 7 1000 10 1000
NA Gene blaKPC Positivo 6 857 10 1000
Negativo 1 143 0 00 0218 Sexo Feminino 2 286 6 600
Masculino 5 714 4 400 0201 Local da coleta Fundo saco de
Douglas 1 143 0 00
Hemocultura 0 00 1 100 0463 Ponta de cateter 1 143 2 200
Sec TraquealBrocircnquica
0 00 1 100
50
Secreccedilatildeo traqueal 2 286 0 00
Swab retal 3 429 5 500
Urina 0 00 1 100
Microrganismo Enterobacter cloacae (KPC)
1 143 1 100
Klebsiella pneumoniae
6 857 8 800
0416 Serratia
marcescens 0 00 1 100
Teste de Hodge Hodge positivo 7 1000 10 1000
NA Amicacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 1 100 0848 resistente 0 00 1 100
sensiacutevel 2 286 3 300
Amoxicilina Aacutecido Clavulacircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Ampicilina Sulbactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ampicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Aztreonan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefazolina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Cefoperazona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Cefotaxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefoxitina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0509 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 2 286 4 400
Ceftazidima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cetriaxona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 3 429 5 500 0772 Cefalotina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ciprofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772
51
resistente 3 429 5 500
Claritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Clindamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Eritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Gentamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0942 resistente 2 286 3 300
sensiacutevel 1 143 2 200
Imipenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 0 00 2 200 0193 Resistente 1 143 3 300
sensiacutevel 2 286 0 00
Nitrofurantoiacutena sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Norfloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Oxacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Penicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Piperacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Rifampicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tetraciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Ticarcilina Aacutecido Clavulocircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0688 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 3 429 4 400
Tobramicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Trimetoprima Sulfametoxazol
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0112 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 2 286 0 00
Vancomicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tigeciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediario 0 00 1 100 0211 natildeo testado 1 143 4 400
resistente 2 286 0 00
52
Cefepime sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefuroxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Levofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Piperacilina Tazobactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Ertapenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Meropenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0223 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 1 143 0 00
Cefotetan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 sensiacutevel 0 00 1 100
Gemifloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 7 700 0585 natildeo testado 3 429 3 300
Desfecho
Alta Oacutebito
Meacutedia Erro
padratildeo Meacutedia Erro
padratildeo p
Idade 58 9 59 5 0991
Tempo Internaccedilatildeo (dias)
50 13 46 12 0571
n= 17 p(lt 005) NA natildeo se aplica
53
6 DISCUSSAtildeO
Nos uacuteltimos anos houve um aumento na incidecircncia de bacteacuterias
multirresistentes aos antimicrobianos no ambiente hospitalar tornando isto um
problema mundial de sauacutede puacuteblica (HULSCHER et al 2010) Quando se trata
principalmente de bacilos Gram negativos a frequumlecircncia destas bacteacuterias eacute ainda
maior em paiacuteses da Ameacuterica Latina quando comparada a paiacuteses desenvolvidos
(GALES etal 2012)
De acordo com dados do ldquoMeropenem Yearly Susceptibility Test Information
Collectionrdquo (MYSTIC) ocorreu nos Estados Unidos um aumento na susceptibilidade
de K pneumoniae nos uacuteltimos anos graccedilas a praacuteticas de controle de disseminaccedilatildeo
de amostras resistentes(RHOMBERG P R et al 2009) O aumento crescente da
prevalecircncia destes microrganismos foi proporcional ao aumento da dependecircncia do
uso de antibioacuteticos carbapenecircmicos considerados como a opccedilatildeo terapecircutica para o
tratamento de infecccedilotildees por bacilos Gram negativos multi-resistentes (LIVERMORE
2012) Isto afeta diretamente as opccedilotildees de tratamento sobrando poucas alternativas
para a terapecircutica que incluem colistina (polimixina E) e tigeciclina que apresentam
respectivamente problemas em termos de toxicidade e eficaacutecia (LIVERMORE et
al 2011) Um dos efeitos adversos mais importantes das poliminas B e E por
exemplo satildeo a neurotoxicidade e nefrotoxicidade (MENDES C A C et al2009 )
Devido agrave resistecircncia ser usualmente de natureza plasmidial e portanto de
maior disseminaccedilatildeo especialmente quando carreadas por K pneumoniae
microrganismo com uma notoacuteria capacidade para acumular e transferir plasmiacutedeos
com determinantes para resistecircncia o nuacutemero de casos detectados pelo
fenoacutetipogenoacutetipo blaKPC eacute bastante preocupante (MONTEIRO et al 2009)
Comparada com outras bacteacuterias hospitalares a transmissatildeo de clones
multirresistentes de K pneumoniae eacute maior e podem natildeo ser controladas pelos
meacutetodos de controle de infecccedilatildeo hospitalar (PAAUW et al 2007) A forma
plasmidial para transferecircncia da resistecircncia adicionada a este grande potencial para
disseminaccedilatildeo de clones resistentes eacute preocupante visto que apoacutes surtos muitas
vezes pode se tornar endecircmica Jaacute eacute uma realidade a disseminaccedilatildeo desta bacteacuteria
54
entre pacientes hospitais paiacuteses e ateacute mesmo continentes (WOODFORF et al
2010 ROGERS et al 2011)
As chances de surtos satildeo maiores em paiacuteses com poucos recursos devido agrave
maior carecircncia de praacuteticas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees hospitalares e o
uso irracional de antimicrobianos de forma empiacuterica e inadequada (KUMARASAMY
et al 2010) Ateacute o momento os mecanismos de resistecircncia aos cabapenecircmicos
geralmente encontrado eram a produccedilatildeo de ESBL (CTX-M) somada aacute perda de
porina (CARVALHAES et al 2010) Foi notado a partir do ano de 2008 um
aumento no nuacutemero de K pneumoniae produtoras de KPC-2 apresentando outra
forma de resistecircncia (GALES 2012)
Um estudo mostrou que o perfil do paciente colonizado ou infectado por KPC
foi de um paciente entre os 33 e os 82 anos de idade internado haacute mais de 1
semana no hospital A mortalidade geral nos uacuteltimos anos ficou em torno de 7
sendo que dos 77 pacientes estudados 32 (415) pacientes evoluiacuteram para oacutebito
evidenciando a alta morbi-mortalidade associada (ALVES A P et al 2013)
Em estudo com 2316 pacientes avaliados a populaccedilatildeo de sexo masculino foi
de 526 idade meacutedia global de 53 anos (mediana de 55 anos) permanecircncia meacutedia
de 58 dias (mediana de 3 dias) (OLIVEIRA A C et al 2010) Outros trabalhos
apresentaram ausecircncia de significacircncia entre sexoidade e o desenvolvimento de
infecccedilotildees por microrganismos resistentes (PERES-BOTA D et al 2003 COLPAN
A et al 2005 COELLO R et al 1997)
Outro estudo utilizou um total de 30 amostras sendo elas isoladas de urina
escarro secreccedilatildeo pleural ponta de cateter aspirado traqueal e hemocultura A mais
prevalente foi em urina (40) Entre as 30 cepas analisadas a maior porcentagem
foi da cepa Klebsiella pneumoniae (70) Enterobacter sp (133) Klebsiella
ozaenae (10) Escherichia coli (333) e Klebsiella oxytoca (333)
(DIENSTMANN R et al 2010) Nos Estados Unidos a enzima KPC jaacute se tornou
endecircmica Foi realizada uma pesquisa em dois hospitais de Nova York onde
testaram 602 amostras e 45 apresentaram algum mecanismo de resistecircncia
sendo apenas 33 confirmadas por biologia molecular como KPC-2 (BRATU et
al 2005)
55
Estudo sobre os tipos de ESBL feito no Japatildeo apresentou o tipo Toho-1 como
o mais prevalente nessa pesquisa Ateacute o ano de 2000 ano em que foi publicado tal
estudo este era o primeiro relatoacuterio no Japatildeo para identificar derivados de ESBLs
como tipo de SHV e TEM entre E coli e K pneumoniae Em especial o tipo SHV- 12
foi identificado com uma maior frequumlecircncia Estes resultados indicam que tipos
distintos de ESBLs que satildeo diferentes em sua especificidade de substrato e origem
geneacutetica coexistem no Japatildeo Isto mostra a importacircncia de caracterizar genoacutetipos
distintos de ESBLs e de estar em alerta continuamente para as tendecircncias de
ESBLs no Japatildeo aleacutem da necessidade de uma interpretaccedilatildeo uniforme utilizando as
diretrizes do CSLI para relatar cepas produtoras de ESBL Aleacutem da detecccedilatildeo de
ESBLs satildeo necessaacuterias mais informaccedilotildees tais como o perfil de sensibilidade
especiacutefica para diversas β-lactacircmicos e o local da infecccedilatildeo Esses fatores satildeo
essenciais para a escolha adequada de antibioacuteticos (YAGI T et al 2000)
No ano de 2004 uma pesquisa avaliou a produccedilatildeo de uma enzima de
hidroacutelise de carbapenecircmicos atraveacutes da teacutecnica de sequumlenciamento foi revelado
um novo membro da famiacutelia KPC designado KPC- 3 Pesquisadores encontraram
em um mutante de K pneumoniae uma substituiccedilatildeo de um gene associado com
resistecircncia a Imipenem mas essa substituiccedilatildeo foi considerada improvaacutevel na
contribuiccedilatildeo da resistecircncia aos carbapenecircmicos da espeacutecie estudada Aleacutem da
resistecircncia aos carbapenecircmicos estes isolados eram em sua maioria resistentes agraves
cefalosporinas penicilinas e aminoglicosiacutedeos Usando estudos de transformaccedilatildeo
conjugaccedilatildeo e hibridaccedilatildeo localizaram o alelo blaKPC em plasmiacutedeo aleacutem disso
mostraram que esse alelo tambeacutem carregava uma resistecircncia aos aminoglicosiacutedeos
A transferecircncia das enzimas KPCs foi demonstrada in vitro tanto neste como em
outros estudos pode ser que os plasmiacutedeos que fazem esta transferecircncia estavam
comeccedilando a se espalhar no ambiente cliacutenico resultando na multiresistecircncia dessas
estirpes (WOODFORD et al 2004)
O presente estudo apresentou um vieacutes quanto aos resultados dos testes de
susceptibilidade microbiana Observou-se que natildeo foi encontrado resultado deste
teste em algumas amostras o que natildeo cooperou para um estudo mais preciso
futuros estudos quanto agraves amostras e um melhor acompanhamento deste tipo de
patologia Poreacutem mesmo sem algumas amostras com este resultado disponiacutevel foi
56
confirmada a presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos
carbapenecircmicos por meio dos genes de resistecircncia blaKPC e 16S rRNA que as
amostras apresentaram em sua maioria serem portadoras Quanto aos resultados
estatiacutesticos nenhuma das variaacuteveis apresentou significacircncia estatiacutestica (p gt 005)
mostrando assim que estas variaacuteveis isoladas natildeo foram o fator determinante para
o desfecho cliacutenico de alta ou oacutebito
57
7 CONCLUSAtildeO
Os genes blaKPC e 16S rRNA foram caracterizados confirmando a a
presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos carbapenecircmicos
Houve uma maior prevalecircncia da cepa K pneumoniae e isto confirma outros
estudos que apresentam a maior prevalecircncia desta cepa em amostras com KPC
Aleacutem disso isso justifica a forma popular da K pneumoniae ser chamada de KPC
enquanto que na verdade KPC eacute uma enzima podendo estar presente em outras
cepas como Enterobacter clocae tambeacutem apresentada no presente estudo O
desfecho cliacutenico de oacutebitos maior que 50 eacute um possiacutevel indicador sobre a
necessidade de se realizar um teste raacutepido para identificaccedilatildeo de KPC visando
iniciar o mais raacutepido possiacutevel o tratamento afim de diminuir a mortalidade por esta
infecccedilatildeo
Nenhuma das variaacuteveis isoladamente estaacute relacionada ao desfecho cliacutenico
oacutebito ou alta pois natildeo apresentaram relevacircncia estatiacutestica O presente estudo
mostrou que haacute presenccedila da bacteacuteria nas amostras de pacientes do hospital
estudado podendo entatildeo afirmar que este tipo de bacteacuteria se encontra tambeacutem
presente em ambiente hospitalar O uso irracional de antimicrobiano eacute demonstrado
de forma indireta quando foi apresentado atraveacutes do Teste de Hodge Modificado
uma resistecircncia de 100 aos antibioacuteticos carbapenecircmicos Isto tambeacutem reflete na
terapecircutica sendo que pacientes portadores de bacteacuterias resistentes aos
antibioacuteticos carabepecircmicos tem uma escassa opccedilatildeo de tratamento e as opccedilotildees
apresentam problemas quanto agrave toxicidade e eficaacutecia
58
REFEREcircNCIAS
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Mecanismos
de resistecircncia bacteriana aos antimicrobianos Disponiacutevel em
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controleopas_
webmodulo3mec_sitiohtmgt Acesso em 25 de abril de 2014
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Nota teacutecnica nordm
012013 medidas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees por enterobacteacuterias
multiresistentes Acesso em 17 de abril de 2013
ALBA J et al Kinetics study of KPC-3 a plasmid-encoded class A
carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase Antimicrob Agents Chemother
Nov49(11)4760-2 2005
ALVES A P et al Nosocomial infections by KPC-producing enterobacteria in
a tertiary hospital in Southern Brazil Revista da AMRIGS Porto Alegre 57 (3) 213-
218 jul-set 2013
ALVES A et al Tipagem Geneacutetica de Microrganismos Lab De Diversidade
Microbiana Centro de Biologia Celular Dep de Biologia U de Aveiro 3810-193
Aveiro- 2003
BELL J M et Al Prevalence and significance of a negative extended-
spectrum beta-lactamase (ESBL) confirmation test result after a positive ESBL
screening test result for isolates of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae
results from the SENTRY Asia-Pacific Surveillance Program J Clin Microbiol
May45(5)1478-82 2007
BRATU S et al Detection of KPC carbapenem-hydrolyzing enzymes in
Enterobacter spp from Brooklyn New York Antimicrob Agents Chemother v 49 n
2 p 776-8 2005
59
BRATU S et al Emergence of KPC-possessing Klebsiella pneumoniae in
Brooklyn New York epidemiology and recommendations for detection Antimicrob
Agents Chemother v 49 n 7 p 3018-20 2005
BRATU S et al Rapid spread of carbapenem-resistant Klebsiella
pneumoniae in New York City Arch Intern Med v 165 p 1430-5 2005
CAMARGO C F et al Aplicaccedilatildeo das teacutecnicas de pcr e suas teacutecnicas
derivadas em diagnoacutestico molecular Disponiacutevel em
ltfileDUnB10C2BA20semestreArtigosPCR-
20CLEYTON20FLORENCIO20DE20CAMARGO20E20PAULO20ROB
ERTO20QUEIROZpdfgtgt Acesso em 08 de abril de 2014
CARVALHES C G et al Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting
carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive
results Journal of Antimicrobial Chemotherapy v 65 n2 p 249-251 2010
CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION- CDC Modified
Hodge Test for Carbapenemase Detection in Enterobacteriaceae 2004
CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE Methods for
dilutionantimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically Approved
standard M7ndashA7 7th ed CLSI Wayne PA 2011
COELLO R et al Risk factors for developing clinical infection with methicillin-
resistant Staphylococcus aureus (MRSA) amongst hospital patients initially only
colonized with MRSA J Hosp Infect 19973739-46
COLPAN A et al Evaluation of risk factors for mortality in intensive care
units A prospective study from a referral hospital in Turkey Am J Infect Control
200533(1)42-7
60
CORNAGLIA G et al Living with ESBLs Introduction Clinical Microbiology
and Infection 14 Suppl 1 1-2 2008
COTRIM E R et al Klebsiella pneumoniae carbapenemase ndash KPC em
Enterobacteriaceae o desafio das bacteacuterias multirresistentes Poacutes em revista do
centro universitaacuterio Newton Paiva 12012 - ediccedilatildeo 5 - issn 2176 7785
DESHPANDE L M et al Occurrence and characterization of
carbapenemase-producing Enterobacteacuteriaceae report from the SENTRY
Antimicrobial Surveillance Program (2000-2004) Microb Drug Resist 12(4)223-30
2006
DIAS D J A Estudos dos principais mecanismos de resistecircncia aos
antibioacuteticos β-lactacircmicos em bacteacuterias patogecircnicas gram negativas 2009 100 f
Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Geneacutetica Molecular e Biomedicina) ndash Faculdade de
Ciecircncias e Tecnologia Universidade de Nova Lisboa Lisboa
DIENSTMANN R et al Avaliaccedilatildeo fenotiacutepica da enzima Klebsiella
pneumoniae carbapenemase (KPC) em Enterobacteriaceae de ambiente hospitalar
J Bras Patol Med Lab v 46 n 1 p 23-27 fevereiro 2010
ENDIMIAMI A et al Emergence of blaKPC-containing Klebsiella
pneumoniae in a long-term acute care hospital a new challenge to our healthcare J
Antimicrob Chemother 64 1102-1110 Nov 2009
FALAGAS M E et al Extended-spectrum beta-lactamase producing
organisms The Journal of Hospital Infection 73 (4) pp 345-54 2009
FONTANA C et al Emergence of KPC-producing Klebsiella pneumoniae in
Italy BMC Rev Notes 3 40 2010
61
GALES A C et al Antimicrobial resistance among Gram-negative bacilli
isolated from Latin America results from Sentry Antimicrobial Surveillance Program
(Latin America 2008-2010) Diagnostic Microbiology and Infectious Disease v 3 n
4 p 354 -360 2012
GUPTA N et al Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Epidemiology
and Prevention HEALTHCARE EPIDEMIOLOGY Clinical Infectious Diseases
201153(1)60ndash67 Published by Oxford University Press on behalf of the Infectious
Diseases Society of America 2011
HARBOTTLE H et al Genetics of antimicrobial resistance Anim Biotechnol
n17 p111-124 2006
HENRIQUE W N et al RESISTEcircNCIA BACTERIANA Uniatildeo das
Faculdades Alfredo NasserInstituto de Ciecircncias da Sauacutede Disponiacutevel em lt
httpwwwfaculdadealfredonasseredubrfilespesquisaposter20HENRIQUE20
Wilker20Natividade20SANTIAGO20Silvania20CAVALCANTI20DSP
20ResistC3AAncia20Bacterianapdfgt Acesso em 17 marccedilo 2014
HULSCHER M E J I et al Antibiotic prescribing in hospital a social and
behavioral scientific approach The Lancet Infectious Diaseases v 10 n 3 p 167-
165 2010
KIDWAI M SAPRA P BHUSHAN KR Synthetic strategies and medicinal
properties of beta-lactams Curr Med Chem 1999 695-215
KUMARASAMY K K et al Emergence of a new antibiotic resistance
mechanism in India Pakistan and the UK a molecular biological and
epidemiological stuy The Lancet Infectious Diseases v10 n 9 p 597- 602 2010
LINCOPAN N et al Enterobacteacuteria producing extended-spectrum β-
lacatamases and IMP-1 Metalo-β-lactamases isolated from Brazilian hospitals J Med
62
Microbiol 7 1-3 2006
LINCOPAN N et al First Isolation of Metalo-β-Lacatamase-Producing
Multiresistant Klebsiella pneumoniae from a patient in Brazil J Clin Microbiol 43(1)
516-519 2005
LIVERMORE D M et al What remains against carbapenem- resistant
Enterobacteriaceae Evaluation of choramphenicol ciprofloxacin colistina
fosfomycin minocycline nitrofurantoin temocilin and tigecycline International
Journal of Antimicrobial Agents v 37 n 5 p 415- 459 2011
LIVERMORE D M Fourten years in resistance International Journal of
Antimicrobial Agents v 39 283- 294 2012
LIVERMORE D M Bacterial resistance to carbapenems Adv Exp Med Biol
1995 39025-47
LIVERMORE D M Bacterial resistance origins epidemiology and impact
Clin Infect Dis 36S11-S23 2003
LIVERMORE D M et al Carbapenemases a problem in waiting Curr
Opin Microbiol 2000 3489-95
LU et al Universal pcr for common bacterial pathogens J CLIN
MICROBIOL VOL 38 2000
LU et al Use of PCR with Universal Primers and Restriction Endonuclease
Digestions for Detection and Identification of Common Bacterial Pathogens in
Cerebrospinal Fluid Journal of Clinical Microbiology June 2000 p 2076ndash2080
MARSCHALL J Met al Presence of the KPC Carbapenemase Gene in
Enterobacteriaceae Causing Bacteremia and Its Correlation with In Vitro
Carbapenem Susceptibility J Clin Microbiol 47 239-241 Jan 2009
63
MARTINS WMBS et al Prevalecircncia do gene blaKPC em isolados cliacutenicos
de Enterobacteriaceae e natildeo fermentadores encontrados em amostras clinicas em
um hospital universitaacuterio do Recife X Jornada de ensino pesquisa e extensatildeo ndash
JEPEX 2010 ndash UFRPE Recife 18 a 22 de outubro
MENDES C A C et al Polimixinas Revisatildeo com ecircnfase na sua
nefrotoxicidade Rev Assoc Med Bras 2009 55(6) 752-9
MOHR J F 3rd Update on the efficacy and tolerability of meropenem in the
treatment of serious bacteacuterial infections Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S41-51
2008
MONTEIRO J et al First report of KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae
strains in Brazil Antimicrob Agents Chemother Jan53(1)333-4 2009
MOREIRA V C et al Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia a antibioacuteticos
Disponiacutevel em
lthttpwwwcpglsucgbr6mostraartigosSAUDEVANESSA20CARVALHO20M
OREIRApdfgt Acesso em 21 marccedilo 2014
NETIKUL T et al Emergence of novel blaKPC-12 and blaKPC-13 variants in
carbapenem non-susceptible Enterobacter cloacae a first report of blaKPC gene in
Thailand European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases May
S372 2011
NETO V A et al Antibioacuteticos na praacutetica Meacutedica 6ordf Ediccedilatildeo Editorial
SarverSP Brasil 2007
NICOLAU D P Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of
meropenem Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S32-40 2008
64
OLIVEIRA A C et al Resistecircncia bacteriana e mortalidade em um centro de
terapia intensiva Rev Latino-Am Enfermagem nov-dez 2010
PAAUW A et al Failure to control an outbreak of qnrA 1-positive multidrug-
resistant Enterobacter clocae despite adequate implementation of recommended
infection control measures Journal of Clinical Microbiology v 45 n 5 p 1420-1425
2007
PATERSON D L et al Extended-Spectrum Beta-Lactamases a Clinical
Update Clinical Microbiology Reviews v 18 p 657-686 2005
PEIRANO G et al Carbapenem-hydrolysing beta-lactamase KPC-2 in
Klebsiella pneumonia isolated in Rio de Janeiro Brazil J Antimicrob Chemother Nov
20 2009
PERES-BOTA D et al Are infections due to resistant pathogens associated
with worse outcome in critically ill patients J Infect 200347(4)307-16
PIDDOCK L J V Clinically relevant chromosomally encoded multidrug
resistance effl ux pumps in bacterial Clin Microbiol Rev n19 p382-402 2006
PITOUT J D D et al Emergence of Enterobacteriaceae producing
extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) in the community J Antimicrob
Chemother May 56 2005
POSSEBON M I et al Resistecircncia bacteriana aos carbapenecircmicos
Bacterial resitence to carbapenems RBM rev bras med60(6)378380-378-382
jun 2003
QUEENAN A M et al Carbapenemases the versatile beta-lactamases
Clin Microbiol Rev Jul20(3)440-58 2007
65
RHOMBERG P R et al Summary trends for the meropenem yearly
susceptibility test information collection program a 10- year experience in the United
States (1999-2008) Diagnostic Microbiology and Infectiois Disease v 65 n4 p
414-426 2009
ROBLEDO I E et al Detection of KPC in Acinetobacter spp in Puerto Rico
J Antimicrob Agents Chemother 54 1354-1357 Mar 2010
ROGERS B A et al Country-to-country transfer os patients and the risk of
multi-resistant bacterial infection Clinical Infectious Disease v53 n1 p49- 56
2011
SHAH A A et al Characteristics epidemiology and clinicalimportance of
emerging strains of Gram-negative bacilli producing extended-spectrum
betalactamases Research in Microbiology v 155 p 409-421 2004
TURNER P J Extended- Spectrum Beta-Lactamases Clinical Infectious
Diseases v 41 p 273-275 2005
WOLTER D J et al Phenotypic and Enzymatic Comparative Analysis
between the Novel KPC variant KPC-5 and Its Evolutionary Variants KPC-2 and
KPC-4 Antimicrob Agents Chemother Nov 17 2008
WOODFORD N et al Carbapenemases of Chryseobacterium
(Flavobacterium) meningosepticum distribution of blaB and characterization of a
novel Metalo-beta-lactamase gene blaB3 in the type strain NCTC 10016
Antimicrob Agents Chemother Jun44(6)1448-52 2000
WOODFORF N Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in
India Pakistan and the UK a molecular biological and epidemiological study The
Lancet Infectious Diseases v 10 n 9 p 597-602 2010
66
WOODFORD et al Outbreak of Klebsiella pneumoniae Producing a New
Carbapenem- Hydrolyzing Class A β-Lactamase KPC-3 in a New York Medical
Center Antimicrobial agents and chemotherapy Dec 2004 p 4793ndash4799 Vol 48
No 12
YAGI T et al A preliminary survey of extended-spectrum β-lactamases
(ESBLs) in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Japan
FEMS Microbiology Letters 184 (2000) 53-56
YIGIT H et al Novel carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase KPC-1 from
a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumonia J Antimicrob Agents
Chemother 45 (4) 1151-1161 (2001)
ZAVASCKI A P et al KPC-2- producing Enterobacter cloacae in two cities
from Southern Brazil Int J Antimicrob Agents Apr 28 2009
ZHANEL G G et al Comparative review of the carbapenecircmicos Drugs
67(7)1027-52 2007
67
ANEXOS
Sequumlecircncia do oligo blaKPC
Query 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
Query 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
Query 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
68
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
Query 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
Query 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
69
Query 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
Query 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
Query 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
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|||||||
70
Sbjct 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
Query 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
Query 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
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|||||||
Sbjct 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
Query 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
71
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
Query 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
Query 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
72
Query 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
Query 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
Query 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
73
Sbjct 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
Query 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
Query 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
Query 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
74
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
Query 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
Query 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
75
Query 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
Query 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
||||
Sbjct 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
LOCUS AF297554 1377 bp
DNA linear BCT 26-MAR-2001
DEFINITION Klebsiella pneumoniae carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
gene complete cds
ACCESSION AF297554
VERSION AF2975541 GI10121874
76
KEYWORDS
SOURCE Klebsiella pneumoniae
ORGANISM Klebsiella pneumoniae
Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Enterobacteriaceae Klebsiella
REFERENCE 1 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH QueenanAM
AndersonGJ Domenech-SanchezA
BiddleJW StewardCD
AlbertiS BushK and TenoverFC
TITLE Novel carbapenem-hydrolyzing beta-
lactamase KPC-1 from a
carbapenem-resistant strain of
Klebsiella pneumoniae
JOURNAL Antimicrob Agents Chemother 45 (4)
1151-1161 (2001)
PUBMED 11257029
REFERENCE 2 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH AndersonGJ and
TenoverFC
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (19-AUG-2000) Nosocomial
Pathogens Laboratory Branch
Centers for Disease Control and
Prevention 1600 Clifton Rd MS
G08 Atlanta GA 30333 USA
FEATURES LocationQualifiers
77
source 11377
organism=Klebsiella
pneumoniae
mol_type=genomic DNA
db_xref=taxon573
-35_signal 5560
-10_signal 7883
mRNA 921012
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
RBS 117122
CDS 1311012
note=blaKPC-1
codon_start=1
transl_table=11
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
protein_id=AAG134101
db_xref=GI10121875
translation=MSLYRRLVLLSCLSWPLAGFSATALTNLVAEPFAKLEQD
FGGSI
GVYAMDTGSGATVSYRAEERFPLCSSFKGFLAAAVLARSQQQAGLLDTPIRYG
KNALV
PWSPISEKYLTTGMTVAELSAAAVQYSDNAAANLLLKELGGPAGLTAFMRSIG
DTTFR
78
LDRWELELNSAIPSDARDTSSPRAVTESLQKLTLGSALAAPQRQQFVDWLKGN
TTGNH
RIRAAVPADWAVGDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTRAPNKDDK
HSEAV
IAAAARLALEGLGVNGQ
ORIGIN
1 cggggcagtt acagccgtta cagcctctgg
agagggagcg gcttgccgct cggtgataat
61 cccagctgta gcggcctgat tacatccggc
cgctacacct agctccacct tcaaacaagg
121 aatatcgttg atgtcactgt atcgccgtct
agttctgctg tcttgtctct catggccgct
181 ggctggcttt tctgccaccg cgctgaccaa
cctcgtcgcg gaaccattcg ctaaactcga
241 acaggacttt ggcggctcca tcggtgtgta
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79
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80
AGRADECIMENTOS
Primeiramente aacute Deus autor da vida que me concedeu a graccedila e a benccedilatildeo
de ter conquistado este sonho da graduaccedilatildeo
Agrave minha amada famiacutelia principalmente meus pais Elias Amorim e Liliana
Correa irmatildeo Thales Correa e avoacute Herondina por serem a minha base meu
refuacutegio em todos os momentos e acreditarem em mim
Agrave minha grande amiga de graduaccedilatildeo Susan Suellen por partilhar dos meus
medos alegrias vitoacuterias angustias e em todos os momentos ser meu braccedilo direito
Ao meu amor Robson Bastos que mais que um noivo foi meu amigo e
companheiro me apoiando e me incentivando
Agrave minha querida orientadora DraMargocirc Gomes e querida co-orientadora Dra
Izabel Cristina por acreditarem em mim me dando a oportunidade de trabalhar com
elas Aleacutem do apoio ensino e dedicaccedilatildeo
Agrave todos os professores (as) da Universidade de Brasiacutelia- Faculdade de
Ceilacircndia pelo ensino e pela contribuiccedilatildeo na minha formaccedilatildeo acadecircmica
Agrave MSc Fabiana Cartaxo pela ajuda e apoio aleacutem da prontidatildeo quando
solicitada a sua ajuda
Ao professor mestre Daniel Oliveira e a teacutecnica de laboratoacuterio Thais Mendes
pela ajuda laboratorial contribuindo para a realizaccedilatildeo de um bom trabalho
RESUMO
Introduccedilatildeo A Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) eacute uma enzima
produzida por bacteacuterias gram-negativas (enterobacteacuterias) que confere resistecircncia
aos antimicrobianos carbapenecircmicos meropenen ertapenen imipenen classe
amplamente utilizada no tratamento de infecccedilotildees envolvendo Enterobacteriaceae
Esta resistecircncia eacute uma das principais causas de falha terapecircutica devido agrave
produccedilatildeo de beta-lactamases de espectro estendido (ESBL) por esta bacteacuteria
mecanismo de resistecircncia mais comum aos antibioacuteticos beta-lactacircmicos de amplo
espectro A identificaccedilatildeo destas enterobacteacuterias pode ser feita atraveacutes de teacutecnicas
de identificaccedilatildeo molecular de patoacutegenos dentre elas a Reaccedilatildeo em Cadeia de
Polimerase (PCR) que consiste na anaacutelise do padratildeo de amplificaccedilatildeo de elementos
repetidos encontrados no genoma bacteriano permitindo uma maior rapidez na
obtenccedilatildeo de resultados quando comparada com outros meacutetodos aleacutem de
apresentar alta reprodutibilidade simples execuccedilatildeo e implementaccedilatildeo dependendo
da aplicaccedilatildeo da teacutecnica natildeo enfrenta problemas com a degradaccedilatildeo do DNA
Objetivo Caracterizar genes de resistecircncia das Enterobacteacuterias produtoras de
carbapenemases e aspectos epidemioloacutegicos e cliacutenicos de pacientes internados em
um hospital puacuteblico do Distrito Federal Materiais e meacutetodos Estudo transversal
onde foi realizado o teste de susceptibilidade das Enterobacteacuterias aos antibioacuteticos
Carbapenecircmicos a partir dos materiais bioloacutegicos coletados dos pacientes
internados no Hospital Regional da Asa Norte (HRAN) Anaacutelise molecular dos genes
16S rRNA e blaKPC utilizando PCR aleacutem de anaacutelises estatiacutesticas Resultados e
discussatildeo Detectou-se a regiatildeo ribossomal e o gene de resistecircncia testado
confirmando a resistecircncia microbiana Maior prevalecircncia de pacientes do sexo
masculino (53) desfecho cliacutenico de oacutebito(59) siacutetio de infecccedilatildeo de swab retal
(47) Klebsiella pneumoniae foi microrganismo mais encontrado (82) Natildeo houve
diferenccedila estatiacutestica entre as variaacuteveis e o desfecho cliacutenico (p foi gt 005)
Conclusatildeo Atraveacutes da caracterizaccedilatildeo molecular dos genes de resistecircncia blaKPC
e Universal confirmou-se a presenccedila de Klebsiella pneumoniae resistente aos
carbapenecircmicos Os valores de p natildeo foram significativos (lt005) sendo
assimnenhuma das variaveacuteis estudadas foram o principal motivo do desfecho
cliacutenico (alta ou oacutebito)
Palavras chaves Klebsiella pneumoniae carbapenemase Resistecircncia bacteriana a
antimicrobianos β-lactamases de espectro estendido (ESBL) Reaccedilatildeo em Cadeia de
Polimerase (PCR)
ABSTRACT
Introduction Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) is an enzyme produced
by gram - negative bacteria (Enterobacteriaceae) which confers resistance to
carbapenem antibiotics meropenen ertapenen imipenem class widely used in the
treatment of infections involving Enterobacteriaceae This resistance is a major
cause of treatment failure due to beta-lactamases production of extended spectrum
(ESBL) by this bacterium most commonly resistance to beta-lactam antibiotics of
wide spectrum engine The identification of these Enterobacteriaceae can be made
by techniques of molecular identification of pathogens among them the Polymerase
Chain Reaction (PCR) which consists in the analysis of the amplification pattern of
repeated elements found in the bacterial genome allowing faster in getting results
when compared with other methods in addition to presenting high reliability simple
implementation and deployment depending on the application of the technique has
no trouble with the degradation of DNA Objective To characterize the resistance
genes of Enterobacteriaceae producing carbapenemases and epidemiological and
clinical features of patients admitted to a public hospital in the Federal District
aspects Materials and methods Cross-sectional study where susceptibility testing
of Enterobacteriaceae to antibiotics Carbapenems from biological materials collected
from patients admitted to the Hospital Regional da Asa Norte ( HRAN ) was
performed Molecular analysis of 16S rRNA genes and blaKPC using PCR in
addition to statistical analysis Results and Discussion Was detected region and
the ribosomal tested resistance gene confirming the microbial resistance Higher
prevalence of male patients (53 ) clinical outcome of death (59 ) site of infection
rectal swabs (47 ) Klebsiella pneumoniae was found more microorganism (82)
There was no statistical difference between the variables and the clinical outcome (p
was gt 005) Conclusion Through molecular characterization of genes and the
Universal blaKPC resistance confirmed the presence of Klebsiella pneumoniae
resistant to carbapenems P values were not significant (lt 005) so none of the
variables studied were the main reason the clinical outcome (discharge or death)
Keywords Klebsiella pneumoniae Carbapenemase Bacterial resistance to
antibiotics Extended-Spectrumβ-lactamases (ESBL) Polimerase Chain Reaction
(PCR)
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Accedilatildeo do szlig-lactacircmico sobre a bacteacuteria gram-positiva e gram-negativa
Figura 2 Divulgaccedilatildeo internacional de Klebsiella pneumoniae Carbapenemase
(KPC) produtoras de Enterobacteriaceae
Figura 3 Mecanismos de resistecircncia bacteriana
Figura 4 Etapas da Reaccedilatildeo de PCR
Figura 5 Mecanismo de semeamento de material bioloacutegico oriundos de pacientes
com suspeita de infecccedilatildeo por KPC
Figura 6 Interpretaccedilatildeo resultado do Teste de Hodge Modificado
Figura 7 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC das amostras dos
17 pacientes estudados
Figura 8 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC da mostra A3
estudada
Figura 9 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA das amostras
dos 17 pacientes estudados
Figura 10 Gel de agarose a 2 da digestatildeo do amplicon do gene 16S rRNA das
amostras com a enzima HaeIII evidenciando diversos fragmentos proacuteximos a 200
pb
Figura 11 Infecccedilatildeo por KPC segundo sexo dos 17 pacientes investigados no
HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
Figura 12Isolado de KPC segundo desfecho cliacutenico dos 17 pacientes investigados
no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
Figura 13 Isolados de KPC segundo local da coleta da amostra nos 17 pacientes
investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
Figura 14Isolado de KPC segundo microrganismo encontrado em 17 pacientes
investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Criteacuterios Interpretativos para testes de sensibilidade
Tabela 2 Nuacutemero de acesso ao GenBank dos alelos blaKPC e seus microrganismos
originais
Tabela 3 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do gene blaKPC
Tabela 4 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do gene
universal
Tabela 5 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da digestatildeo do gene universal
Tabela 6 - Distribuiccedilatildeo das variaacuteveis estudadas perfil geneacutetico sexo coleta
tipificaccedilatildeo de microrganismos e anaacutelise da resistecircncia bacteriana segundo o
desfecho cliacutenico Brasiacutelia-DF 2010 a 2012
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AmpC- Adenosina Monofosfato Ciacuteclico
BRMD- Bacteacuterias multirresistentes
CCIH- Comissatildeo de Controle de Infecccedilatildeo Hospitalar
CDC- Centers for Disease Control and Prevention
CIM- Concentraccedilatildeo Inibitoacuteria Miacutenima
CLSI- Clinical and Laboratory Standards Institute
DNA- Aacutecido Desoxirribonucleacuteico
E coli- Escherichia coli
ERIC-PCR - Enterobacterial Repet it ive Intergenic Consensus
ESBL- Beta-Lactamases de Espectro Estendido
Et al- e outros
ETP- Ertapenem
HRAN- Hospital Regional da Asa Norte
K ornithinolytica- Klebsiella ornithinolytica
K oxytoca- Klebsiella oxytoca
K planticola- Klebsiella planticola
K pneumoniae- Klebsiella pneumoniae
K terrigena- Klebsiella terrigena
KPC - Klebsiella pneumoniae produtora de Carbapenemase
KPCNEG- Bacilos Gram-Negativos Natildeo Fermentadores
KPCPOS- Bacilos Gram-Positivo Natildeo Fermentadores
MBL- metalo-beta-lactamases
MEM- Meropenem
NA- Natildeo se aplica
Oligo- Oligonucleotiacutedeos
PB- Pares de Bases
PBPs (Penicilim-Binding-Protein)- Proteiacutenas de ligaccedilatildeo agrave penicilina
PCR- Polymerase Chain Reaction (Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase)
PFGE - Pulsed-Field Gel Electrophoresis (Eletroforese em campo pulsado)
RAPD- Randomly Amplified Polymorphic DNA (DNA polimoacuterfico amplificado
aleatoriamente)
RFLPrsquos - ldquoRestriction Fragment Length Polymorphismsrdquo( polimorfismos de tamanho
de fragmentos de restriccedilatildeo)
THM- Teste de Hodge Modificado
TSA- Teste de Susceptibilidade aos Antibioacuteticos
UTI- Unidade de Terapia Intensiva
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 15
11 Klebsiella pneumoniae produtora de Carbapenemase (KPC) 15
1 2 Resistecircncia bacteriana 20
13 Anaacutelise geneacutetica de microrganismos 27
2 JUSTIFICATIVA 30
3 OBJETIVOS 31
31 Objetivo geral 31
32 Objetivos Especiacuteficos 31
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS 32
4 1 Coleta e transporte das amostras bioloacutegicas 32
4 2 Procedimentos para confirmaccedilatildeo de resistecircncia bacteriana por disco de
Ertapenem (adaptado CDC 2004) 32
4 2 1 Interpretaccedilatildeo dos Resultados 33
4 3 Teste de susceptibilidade aos antibioacuteticos 34
4 4Teste de Hodge Modificado (THM) (adaptado CDC 2004) 35
441 Controle de qualidade (CQ) 35
442 InterpretaccedilatildeoResultados 35
4 5 Extraccedilatildeo de DNA bacteriano 37
4 6 Iniciadores e reaccedilatildeo de PCR 38
4 7 Digestatildeo 41
4 8 Eletroforese em gel de agarose 41
4 9 Descarte de resiacuteduos 42
4 10 Aspectos epidemioloacutegicos e cliacutenicos 42
4 12 Anaacutelises estatiacutesticas 42
4 13 Preceitos eacuteticos 43
5 RESULTADOS 44
51 Anaacutelise molecular 44
5 1 1 Gene blaKPC 44
5 1 2 Gene 16S rRNA 45
5 2 Anaacutelises epidemioloacutegicas 46
5 2 1 Sexo 46
5 2 2 Desfecho cliacutenico 47
5 2 3 Local da coleta 48
5 2 4 Microrganismo 48
6 DISCUSSAtildeO 53
7 CONCLUSAtildeO 57
15
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC)
Klebsiella pneumoniae pertence aacute famiacutelia Enterobacteriaceae
encontrado em locais como aacutegua solo plantas e esgoto Satildeo encontradas cinco
espeacutecies K pneumoniae K oxytoca K planticola K terrigena e K ornithinolytica
O gecircnero Klebsiella eacute definido como contendo bacilos Gram-negativos natildeo moacuteveis
em forma de bastatildeo e geralmente encapsuladas que produzem lisina
descarboxilase mas natildeo produzem ornitina descarboxilase Provavelmente a
colonizaccedilatildeo em seres humanos ocorre por contato com as diferentes fontes
ambientais podendo ser encontrada colonizando a orofaringe e fezes de pessoas
sadias Pessoas imunocomprometidas a bacteacuteria encontra um ambiente favoraacutevel
para seu crescimento levando aos quadros de infecccedilatildeo (MOREIRA et al 2014)
A Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) eacute uma enzima produzida por
enterobacteacuterias gram-negativas sendo um mecanismo de resistecircncia aos antimi-
crobianos carbapenecircmicos meropenen ertapenen eou imipenen classe
amplamente utilizada no tratamento de infecccedilotildees envolvendo Enterobacteriaceae
Ela tambeacutem eacute capaz de inativar os agentes β-lactacircmicos cefalosporinas penicilinas
e o aztreonam (COTRIM et al 2012)
Devido agrave semelhanccedila estrutural e estereoquiacutemica os antibioacuteticos beta-
lactacircmicos possuem um mecanismo de accedilatildeo comum ao grupo Eles atuam inibindo
a siacutentese da parede celular bacteriana atraveacutes do mecanismo de bloqueio da
transpeptidaccedilatildeo responsaacutevel pela uniatildeo dos componentes individuais do
peptidoglicano conforme demonstrado na figura 1 (KIDWAI et al 1999)
A accedilatildeo destes antibioacuteticos eacute atraveacutes de ligaccedilotildees covalentes com as proteiacutenas
as Penicilim-Binding-Protein (proteiacutena de ligaccedilatildeo da penicilina- PBP ou PLP) que se
encontram presentes na membrana citoplasmaacutetica de todas as bacteacuterias Devido agraves
mutaccedilotildees ocorre uma induccedilatildeo na alteraccedilatildeo dessas proteiacutenas podendo determinar
uma diminuiccedilatildeo da afinidade dos beta-lactacircmicos agraves mesmas A accedilatildeo dos
carbapenecircmicos eacute atraveacutes da sua ligaccedilatildeo agraves PBPs presentes na parede bacteriana
especialmente as PBP1 e PBP2 provocando a lise osmoacutetica da bacteacuteria Aleacutem
disso eles tecircm uma facilidade na penetraccedilatildeo da bacteacuteria por meio dos canais
poriacutenicos presentes nas bacteacuterias gram-negativas induzindo um efeito poacutes-
16
antibioacutetico Quando comparados com outros beta-lactacircmicos os carbapenecircmicos
satildeo mais resistentes agrave hidroacutelise pela maioria das beta-lactamases tanto
cromossocircmicas como plasmiacutedicas (LIVERMORE 1995 LIVERMORE et al 2000)
Figura 1 Accedilatildeo do szlig-lactacircmico sobre a bacteacuteria gram-positiva e gram-
negativa Fonte
ltlthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controle
opas_webmodulo3gramn_lacta2htmgt (adaptado)
A bacteacuteria Klebsiella pneumoniae quando apresenta gene ESBL pode
expressar resistecircncia a ateacute 95 dos antimicrobianos existentes no acircmbito
farmacecircutico sendo a produccedilatildeo de beta-lactamases de espectro estendido (ESBL)
17
por esta bacteacuteria uma das principais causas de falha terapecircutica Existem outras
formas de resistecircncia emergentes de grande importacircncia como a produccedilatildeo de
beta-lactamases tipo adenosina monofosfato ciacuteclico (AmpC) que hidrolizam
cefoxitina as carbapenemases como as metalo-beta-lactamases (MBL) e
carbapenemases tipo KPC (MOREIRA et al 2014)
O mecanismo de resistecircncia mais comum aos antibioacuteticos beta-lactacircmicos de
amplo espectro eacute a produccedilatildeo de ESBL por enterobacteacuterias A accedilatildeo hidroliacutetica
apresentadas por estas enzimas pode conferir clinicamente resistecircncia ao
aztreonam cefalosporina e a todas as penicilinas (PATERSON et al 2005) As
ESBL satildeo enzimas mediadas por genes plasmidiais (transmissiacuteveis entre as
espeacutecies) Os principais microrganismos produtores de ESBL satildeo Klebsiella
pneumoniae (mais encontrada) Escherichia coli e Proteus mirabilis podendo ocorrer
em outros membros da famiacutelia Enterobacteriaceae e em alguns microrganismos natildeo
enteacutericos como Acinetobacter ssp (TURNER 2005) A importacircncia cliacutenica meacutedica
destes microrganismos portadores de ESBL eacute que graccedilas aacutes suas resistecircncias a
muitas classes de antimicrobianos o tratamento de infecccedilotildees eacute difiacutecil gerando um
aumento da morbidade e mortalidade dos pacientes (SHAH et al 2004)
A enzima KPC foi detectada pela primeira vez na Carolina do Norte Costa
Leste dos Estados Unidos no ano de 1996 em Klebsiella pneumoniae dando entatildeo
este nome a enzima Em pouco tempo ela disseminou por outras regiotildees e
recentemente tornou-se uma das preocupaccedilotildees quanto agrave sauacutede puacuteblica mundial
Os paiacuteses de onde KPCs tecircm sido relatados desde 2001 satildeo mostrados na figura 2
apresentando como os organismos tecircm agora sido disseminados amplamente pelo
mundo (NEIL GUPTA et al 2011)
18
Figura 2 Divulgaccedilatildeo internacional de Enterobacteriaceae produtora de
Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC)( NEIL GUPTA et al 2011)
Este mapa apresenta paiacuteses onde Enterobacteriaceae produtoras KPC de
foram descritos em relatoacuterios publicados disponiacuteveis a partir de 11 fevereiro de
2011 Os paiacuteses natildeo destacadas nesta figura tambeacutem podem apresentar a presenccedila
de Enterobacteriaceae produtoras de KPC poreacutem pode ter tido uma falta de
vigilacircncia sistemaacutetica para estes organismos ( NEIL GUPTA et al 2011)
No ano de 2005 foram registradas pela primeira vez essas bacteacuterias
produtoras de carbapenemases Apoacutes 6 anos deste primeiro relato elas passaram a
causar surtos mais graves em nosso paiacutes Em janeiro de 2011 foram notificados no
Distrito FederalBrasil 367 casos em um curto espaccedilo de tempo (01 a 08 de janeiro
de 2011) com 26 oacutebitos A maior parte destes casos (263 casos) foi identificada nas
unidades de terapia intensiva ndash UTI (COTRIM et al 2012)
O potencial de disseminaccedilatildeo da KPC eacute alto devido agrave grande capacidade de
transferecircncia do seu material geneacutetico e por conseguinte os genes de resistecircncia
O controle de epidemias eacute difiacutecil devido a esta caracteriacutestica de faacutecil disseminaccedilatildeo
preocupando os profissionais da aacuterea de sauacutede devido agrave dificuldade de tratamento
podendo resultar em um aumento das taxas de mortalidade Apesar da maior
19
frequumlecircncia em Klebsiella pneumoniae a KPC pode ser identificada em outras
bacteacuterias como a Enterobacter cloacae Citrobacter freundii Salmonella spp E coli
e Pseudomonas spp (DIENSTMANN et al 2010)
Os pacientes com comorbidades incluindo pacientes transplantados
neutropecircnicos em ventilaccedilatildeo mecacircnica em Unidade de Terapia Intensiva (UTI)
com longos periacuteodos de internaccedilatildeo que apresentam risco aumentado de infecccedilatildeo ou
colonizaccedilatildeo para bacteacuterias multirresistentes satildeo mais vulneraacuteveis a Klebsiella
pneumoniae produtora de KPC (COTRIM et al 2012)
Os sinais e sintomas apresentados por um indiviacuteduo infectado por KPC satildeo
febre ou hipotermia taquicardia piora do quadro respiratoacuterio e em casos mais
graves hipotensatildeo inchaccedilo e sepse Quanto ao siacutetio de infecccedilatildeo a bacteacuteria que
possui a enzima KPC pode causar pneumonia associada agrave ventilaccedilatildeo mecacircnica
infecccedilatildeo do trato urinaacuterio infecccedilatildeo de corrente sanguiacutenea infecccedilatildeo de partes moles
e outros tipos de infecccedilatildeo (COTRIM et al 2012)
Para desenvolver a infecccedilatildeo a colonizaccedilatildeo eacute um preacute-requisito poreacutem o
pacientes pode estar colonizado ou seja ser portadores de KPC e natildeo desenvolver
a infecccedilatildeo (ALVES et al 2013) A forma de transmissatildeo eacute basicamente por
contato com secreccedilatildeo ou excreccedilatildeo de pacientes infectados ou colonizados logo
fora do ambiente hospitalar a bacteacuteria natildeo representa perigo (COTRIM et al
2012)
As opccedilotildees terapecircuticas para o tratamento da Klebsiella pneumoniae eacute
dividida em Terapia Empiacuterica e Terapia apoacutes a determinaccedilatildeo do perfil de
sensibilidade A terapia empiacuterica para infecccedilotildees por enterobacteacuterias multirresistentes
se baseia na utilizaccedilatildeo de polimixina B ou polimixina E (Colistina) em associaccedilatildeo
com um (1) ou mais dos antimicrobianos da classe dos aminoglicosiacutedeos
(gentamicina ou amicacina) Carbapenecircmicos (meropenem ou doripenem) eou
tigeciclina (ANVISA 2013)
Recomenda-se usar sempre associaccedilotildees de dois ou trecircs antimicrobianos
sendo um deles a polimixina B ou a polimixina E (colistina) Deve-se evitar a
utilizaccedilatildeo de monoterapias pelo risco de raacutepido desenvolvimento de resistecircncia A
escolha do(s) faacutermaco(s) de associaccedilatildeo com polimixina B ou E deve se basear
preferencialmente no perfil de susceptibilidade esperado aos referidos
20
medicamentos das enterobacteacuterias resistentes aos carbapenecircmicos detectadas no
hospital ou na ausecircncia de dados locais na regiatildeo Deve-se considerar igualmente
o local de infecccedilatildeo e a penetraccedilatildeo esperada do antimicrobiano na escolha da droga
a ser utilizada na combinaccedilatildeo (ANVISA 2013)
Apoacutes a liberaccedilatildeo do perfil de sensibilidade deve-se adequar o uso dos
medicamentos Sempre que possiacutevel manter no miacutenimo 2 (dois) faacutermacos com
sensibilidade comprovada in vitro Natildeo havendo sensibilidade a um segundo
medicamento (suscetibilidade apenas agrave polimixina B ou E) recomenda-se manter a
terapia combinada de polimixina B ou E com carbapenecircmicos (meropenem ou
doripenem) ou tigeciclina na tentativa de ocorrecircncia de sinergismo entre elas
(ANVISA 2013)
Sugere-se aleacutem da determinaccedilatildeo das Concentraccedilotildees Inibitoacuterias Miacutenimas
(CIMs) para uma das polimixinas (B ou E) que tambeacutem sejam determinadas as
CIMs de tigeciclina e carbapenecircmicos (meropenem) bem como a consultoria de um
infectologista (ou Comissatildeo de Controle de Infecccedilatildeo Hospitalar- CCIH) para a
determinaccedilatildeo da terapia combinada com base na interpretaccedilatildeo do antibiograma
CIM e quadro cliacutenico do paciente No caso de resistecircncia agraves polimixinas
(concentraccedilotildees inibitoacuterias miacutenimas [CIMs] gt 2 mgL) recomenda-se a associaccedilatildeo de
dois ou trecircs do antimicrobianos sugeridos para a combinaccedilatildeo (ANVISA 2013)
A antissepsia eficiente do ambiente dos instrumentos ciruacutergicos e das matildeos
com o uso do aacutelcool a 70 eacute fundamental para a contenccedilatildeo de surtos Aleacutem disto
os pacientes contaminados devem permanecer isolados ateacute o controle da infecccedilatildeo
para evitar a disseminaccedilatildeo da bacteacuteria (COTRIM et al 2012)
1 2 Resistecircncia bacteriana
Hoje a disseminaccedilatildeo e a proliferaccedilatildeo das bacteacuterias resistentes estatildeo cada
dia mais presente As bacteacuterias multirresistentes (BRMD) poderatildeo levar agrave
humanidade a uma era poacutes-antibioacutetica resultando em uma ausecircncia de qualquer
opccedilatildeo de tratamento para os portadores destas cepas (HENRIQUE et al 2014)
Os fatores envolvidos na disseminaccedilatildeo desses patoacutegenos multirresistentes
satildeo diversos incluindo o uso irracional de antimicrobianos procedimentos invasivos
21
(cirurgias implantaccedilatildeo de proacuteteses meacutedicas e outros) e a transferecircncia de material
geneacutetico com a informaccedilatildeo de resistecircncia a antibioacuteticos entre as bacteacuterias
(DIENSTMANN et al 2010 ENDIMIAMI et al 2009 FONTANA et al 2010)
Com a praacutetica da antibioticoterapia principalmente em ambientes
nosocomiais os mecanismos de resistecircncia tornaram-se comuns Esses
mecanismos incluem alteraccedilatildeo na permeabilidade da membrana celular que
impede a entrada do antibioacutetico na ceacutelula bombeamento do antibioacutetico para fora da
mesma pelo mecanismo de efluxo mutaccedilatildeo geneacutetica que altera de alguma forma o
alvo do antibioacutetico e consequumlentemente natildeo afeta o funcionamento da bacteacuteria
bem como desenvolvimento da capacidade de degradar ou da inativaccedilatildeo do
antibioacutetico (COTRIM et al 2012) Estes mecanismos estatildeo representados na figura
3
Figura 3 Mecanismos de resistecircncia bacteriana Fonte
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controle
opas_webmodulo3pop_mecanismohtmgt
Um dos mais importantes mecanismos de resistecircncia eacute a alteraccedilatildeo do local-
alvo onde atua determinado antimicrobiano de modo a impedir a ocorrecircncia de
qualquer efeito inibitoacuterio ou bactericida As bacteacuterias podem adquirir um gene que
22
codifica um novo produto resistente aos antimicrobianos substituindo o alvo original
por exemplo o Staphylococcus aureus resistente agrave oxacilina e estafilococos
coagulase-negativos adquiriram o gene cromossocircmico Mec A e produzem uma PBP
ou PLP resistente aos β-lactacircmicos denominada 2a ou 2 que eacute suficiente para
manter a integridade da parede celular durante o crescimento quando outras PBPs
essenciais satildeo inativadas por antibimicrobianos β-lactacircmicos Como alternativa um
gene receacutem-adquirido pode atuar para modificar um alvo tomando-o menos
vulneraacutevel a determinado antimicrobiano Assim um gene transportado por
plasmiacutedeo ou por transposon codifica uma enzima que inativa os alvos ou altera a
ligaccedilatildeo dos antimicrobianos como ocorre com eritromicina e clindamicina (ANVISA
2007)
Em funccedilatildeo da bomba de efluxo pode variar a especificidade do antibioacutetico
Ele atua por meio do bombeamento ativo de antimicrobianos do meio intracelular
para o extracelular gerando uma resistecircncia bacteriana a determinados
antimicrobianos como eacute o caso da resistecircncia agraves tetraciclinas codificada por
plasmiacutedeos em Escherichia coli devido agrave presenccedila de proteiacutenas integrantes da
membrana plasmaacutetica bacteriana (PIDDOCK 2006)
O aumento da siacutentese de proteiacutenas eacute o principal responsaacutevel pela resistecircncia
antimicrobiana devido agraves vaacuterias mutaccedilotildees que ocorrem em seus repressores
transcricionais Estas mutaccedilotildees tambeacutem podem influenciar levando a um aumento
da eficiecircncia do transporte dos antibioacuteticos para o exterior da ceacutelula (HARBOTTLE
et al 2006)
A resistecircncia aos antibioacuteticos eacute frequumlentemente associada agrave alteraccedilatildeo
diminuiccedilatildeo da permeabilidade que ocorre na membrana externa das bacteacuterias gram-
negativas O fluxo de moleacuteculas para o interior da ceacutelula ocorre por caracteriacutesticas
peculiares como carga estrutura e dimensatildeo e atraveacutes de proteiacutenas de membrana
as quais formam canais Este percurso eacute utilizado pelos antibioacuteticos para atingir o
interior da ceacutelula bacteriana ou o espaccedilo periplasmaacutetico como eacute o caso dos
antibioacuteticos β-lactacircmicos Portanto a perda de funccedilatildeo destas proteiacutenas pode
efetivamente causar a diminuiccedilatildeo da susceptibilidade a vaacuterios antibioacuteticos
(LIVERMORE 2003)
23
Os mecanismos de resistecircncia que podem impedir a accedilatildeo de antimicrobianos
satildeo vaacuterios O faacutermaco atua de forma a inibir os processos essenciais a multiplicaccedilatildeo
e sobrevivecircncia da ceacutelula bacteriana como a membrana citoplasmaacutetica e
consequumlentemente bloqueando a siacutentese proteacuteica de aacutecidos nucleacuteicos e da parede
celular A resistecircncia bacteriana eacute um mecanismo natural de defesa Sendo assim
as bacteacuterias estatildeo em constante defesa e para cada novo faacutermaco desenvolvido as
bacteacuterias iratildeo desenvolver resistecircncia em algum momento (POSSEBON et al
2003)
O grupo de antibioacuteticos beta-lactacircmicos satildeo amplamente utilizado e se
encontram dentro da classe dos melhores agentes antimicrobianos com relevacircncia
cliacutenica No entanto o seu uso tem sido restringido devido a vaacuterios mecanismos de
resistecircncia O desenvolvimento dos carbapenecircmicos surgiu devido agrave proliferaccedilatildeo de
beta-lactamases mediadas por plasmiacutedeos e cromossomos (POSSEBON et al
2003)
A bacteacuteria KPC tem um gene chamado SHV-1 que tem a caracteriacutestica de
resistecircncia a quase todos os tipos de antimicrobianos inclusive os carbapenecircmicos
especiacuteficos para o tratamento de infecccedilotildees por bacteacuterias multiresistentes e
emergecircncias Mesmo com no seu coacutedigo geneacutetico a informaccedilatildeo necessaacuteria para o
desenvolvimento da resistecircncia a resistecircncia da bacteacuteria soacute eacute desenvolvida caso a
bacteacuteria entre em contato com o antibacteriano desencadeando todo o processo
nos casos de resistecircncia induzida comuns em KPC (MOREIRA et al 2014)
A resistecircncia bacteriana pode ser apresentada de forma intriacutenseca ou
adquirida A resistecircncia intriacutenseca faz parte das caracteriacutesticas fenotiacutepicas naturais
do microrganismo ou seja faz parte de sua heranccedila geneacutetica sendo transmitida
verticalmente a prole sem perda da caracteriacutestica A presenccedila ou ausecircncia do alvo
para a accedilatildeo da droga eacute o principal determinante deste tipo de resistecircncia
(MOREIRA et al 2014) Essa resistecircncia corresponde a uma caracteriacutestica de
espeacutecie bacteriana quando estes microrganismos satildeo naturalmente resistentes a
certo tipo de antibioacutetico Este processo eacute decorrente da ausecircncia de estruturas de
atuaccedilatildeo de antimicrobianos ou a impermeabilidade por parte de estruturas
perifeacutericas das bacteacuterias (HENRIQUE et al 2014)
24
A resistecircncia adquirida aos antibioacuteticos por sua vez ocorre quando haacute uma
da mutaccedilatildeo de genes reguladores ou estruturais aquisiccedilatildeo de genes de resistecircncia
veiculados por elementos geneacuteticos moacuteveis ou da combinaccedilatildeo entre eles Este
aparecimento de resistecircncia em uma espeacutecie bacteriana era anteriormente sensiacutevel
a droga e devido a um destes fatores se torna resistente O fenoacutetipo resultante
desta resistecircncia natildeo estaraacute presente nas ceacutelulas genitoras e sim nos indiviacuteduos de
uma linhagem bacteriana derivada de um organismo susceptiacutevel Os genes muitas
vezes satildeo adquiridos por meio de elementos moacuteveis como plasmiacutedeos e
transposons (MOREIRA et al 2014)
Entatildeo a resistecircncia adquirida ocorre por diversos mecanismos geneacuteticos tais
como produccedilatildeo de enzimas inativadoras interferecircncia com a entrada e acuacutemulo de
droga na bacteacuteria alteraccedilatildeo do receptor para accedilatildeo da droga via metaboacutelica
alternativa Eacute originada por meio de uma alteraccedilatildeo a niacutevel geneacutetico da ceacutelula de
natureza cromossocircmica pelos processos de mutaccedilatildeo transduccedilatildeo e transformaccedilatildeo
ou extra cromossocircmica (plasmidial) (HENRIQUE et al 2014)
Como todo antibioacutetico β-lactacircmicoos carbapenecircmicos tem como mecanismo
de accedilatildeo a inibiccedilatildeo da siacutentese proteacuteica atraveacutes da accedilatildeo de inibiccedilatildeo da parede
microbiana fazendo a ligaccedilatildeo e inativaccedilatildeo das proteiacutenas ligadoras de penicilinas
(NETO et al 2007)
Imipenem e meropenem antibioacuteticos pertencentes ao grupo dos
carbapenecircmicos possuem um amplo espectro de accedilatildeo in vitro incluindo atividade
contra cocos gram-positivos bacilos gram-negativos e bacteacuterias anaeroacutebias (MOHR
2008) Jaacute o ertapenem possui um espectro de accedilatildeo mais limitado que o os dois
antibioacuteticos anteriormente citados tendo uma eficiecircncia limitada contra os bacilos
gram-negativos natildeo fermentadores Um novo antibioacutetico carbapenecircmico ainda natildeo
disponiacutevel no Brasil doripenem possui uma atividade mais potente principalmente
contra Pseudomona aeruginosa devido ao seu mecanismo de accedilatildeo que combina os
espectros de accedilatildeo de imipenem e meropenem (ZHANEL et al 2007)
Devido as suas estabilidades espectro de accedilatildeo poucos relatos de
resistecircncia boa toleracircncia pelos pacientes com efeitos adversos mais comuns as
complicaccedilotildees no siacutetio da infusatildeo e toxicidade gastrintestinal estes antibioacuteticos
carbapenecircmicos tecircm sido considerados terapia de escolha (NICOLAU 2008) Como
25
uma resposta adaptativa das Enterobacteacuterias o iacutendice de resistecircncia aos
carbapenecircmicos tem aumentado nos uacuteltimos anos de forma proporcional ao seu
uso limitando imensamente as opccedilotildees terapecircuticas para as infecccedilotildees causadas por
estes microrganismos (FALAGAS et al 2009)
As enzimas produtoras de betalactamases hidrolisam o anel betalactacircmico
tornando este mecanismo de resistecircncia o mais importante Os dois grupos mais
preocupantes satildeo o grupo das betalactamases de aspecto ampliado e os da
carbapenemases que aleacutem de hidrolizar os carbapenecircmicos hidrolizam todas as
outras classes de betalactacircmicos Em enterobacteacuterias as carbapenemases mais
prevalentes satildeo codificadas por genes dos grupos blaKpc blaIMP blaVIM blaNdm
e blaOxa A ocorrecircncia de carbapenemases eacute mais frequentemente em bacteacuterias
gram-negativas fermentadoras da glicose conhecidas como enterobacteacuterias
predominantes nos gecircneros Klebsiella Serratia Citrobacter Enterobacter
Escherichia Samonella Proteus Morganella Podem ser encontradas tambeacutem em
bacteacuterias gram-negativas natildeo fermentadoras como espeacutecies de Acinetobacter e de
Pseudomonas (ALVES et al 2013)
Carbapenemases satildeo enzimas plasmiacutedio-mediados resistentes a todos
antibioacuteticos betalactacircmicos As bacteacuterias que possuem o gene blaKpC responsaacutevel
pela codificaccedilatildeo da produccedilatildeo de carbapenemases apresentam resistecircncia aos
antibioacuteticos betalactacircmicos impedindo a accedilatildeo destes antibioacuteticos contra infecccedilotildees
(ALVES et al 2013)
A transmissatildeo das carbapenemases a diferentes cepas de enterobacteacuterias se
daacute atraveacutes de plasmiacutedeos que satildeo pequenas moleacuteculas circulares de DNA com a
capacidade de se replicarem independentemente do DNA cromossocircmico
permitindo a troca de material geneacutetico entre gecircneros e espeacutecies diferentes de
enterobacteacuterias O raacutepido desenvolvimento de surtos em ambientes hospitalares eacute
explicado por essa disseminaccedilatildeo plasmidial (COTRIM et al 2012)
De acordo com o criteacuterio de interpretaccedilatildeo do Clinical and Laboratory
Standards Institute (CLSI 2009) a maioria das KPC isoladas natildeo apresenta
resistecircncia completa aos carbapenecircmicos (Imipenem e Meropenem apresentam
uma Concentraccedilatildeo Inibitoacuteria Miacutenima (CIM) de 2-8 μgmL) (COTRIM et al 2012)
26
Os mecanismos de resistecircncia capazes de impedir a accedilatildeo dos
carbapenecircmicos satildeo vaacuterios Poreacutem a degradaccedilatildeo de antibioacuteticos por enzimas
principalmente as carbapenemases constituem o principal mecanismo de
resistecircncia aos antibioacuteticos β-lactacircmicos (DIAS 2009) Devido a ampla atividade
hidroliacutetica agrave maioria dos antibioacuteticos β-lactacircmicos estes grupos de enzimas possuem
alta versatilidade (QUEENAM et al 2007)
Existem trecircs grandes classes moleculares de Ambler a qual as
carbapenemases pertencem denominadas classe A (serino-carbapenemases os
quais incluem membros designados SME IMI NMC GES e a famiacutelia das KPCs)
classe B(as metalo-β-lactamase incluem os tipos IMP e VIM) e classe D
(oxacilinases similares as da classe A e incluem as OXA e PSE) (DIAS 2009)
Dentre estes as mais importantes e prevalentes encontradas em plasmiacutedeos
de Klebsiella pneumoniae satildeo as KPC (DIENSTMANN et al 2010) Por meio de
estudos moleculares a enzima KPC jaacute foi documentada em diferentes bacteacuterias e
diferenciada em KPC-1 a 13 (NETIKUL et al 2011) No ano de 2009 foi realizada
uma pesquisa onde descreveram as seguintes carbapenemases KPC-1 em isolados
de Klebsiella pneumoniae KPC-2 em K pneumoniae K oxytoca Salmonella
enterica e em Enterobacter sp e KPC-3 em K pneumoniae e Enterobacter cloacae
(MONTEIRO et al 2009) As enzimas KPC-4 e KPC-5 foram encontradas em
isolados de Pseudomonas aeruginosa (PEIRANO et al 2009)
Foi observada uma correccedilatildeo da sequumlecircncia KPC-1 indicando que o gene
blaKPC-1 e blaKPC-2 satildeo idecircnticos Trecircs novas variantes blaKPC-3 blaKPC-4 e
blaKPC-5 satildeo resultados de mutaccedilotildees do gene estrutural da enzima KPC-2
(WOLTER et al 2008) apresentando diferentes perfis de hidroacutelise As enzimas
KPC-2 e KPC-3 possuem alta eficiecircncia em hidrolisar cefalotina cefaloridina e
nitrocefin poreacutem possuem uma menor eficiecircncia contra carbapenecircmicos e
cefotaxima (ALBA et al 2005) As enzimas KPC-5 e KPC-4 apresentam menor
hidroacutelise de carbapenecircmicos eacute do que em KPC-2 Em contrapartida possuem
melhor eficiecircncia contra ceftazidima e uma maior inibiccedilatildeo pelo aacutecido clavulacircnico
(WOLTER et al 2008)
27
13 Anaacutelise geneacutetica de microrganismos
Eacute de extrema importacircncia praacutetica natildeo soacute no aspecto cliacutenico mas tambeacutem na
fitopatologia biotecnologia e estudos ambientais a correta identificaccedilatildeo e
classificaccedilatildeo de microrganismos Os meacutetodos usados na diferenciaccedilatildeo de gecircneros
espeacutecies e estirpes de microrganismos podem ser divididos em meacutetodos fenotiacutepicos
(baseados em fenocircmenos bioquiacutemicos fisioloacutegicos e bioloacutegicos) e genotiacutepicos
(detectam polimorfismos ao niacutevel dos aacutecidos nucleacuteicos ou variaccedilatildeo aleacutelica ao niacutevel
de enzimas) (ALVES et al 2003)
Para este tipo de estudo existem alguns meacutetodos como o RFLPrsquos -
ldquoRestriction Fragment Length Polymorphismsrdquo (polimorfismos de tamanho de
fragmentos de restriccedilatildeo) rep-PCR (Meacutetodo de tipagem baseado na amplificaccedilatildeo via
PCR de elementos de DNA repetitivos presentes em genomas bacterianos) anaacutelise
de sequumlecircncias nucleotiacutedeas (discriminaccedilatildeo eou identificaccedilatildeo atraveacutes de sequumlecircncias
de DNA) PFGE - Pulsed-Field Gel Electrophoresis (Eletroforese em campo
pulsado) ( A L V E S et al 2003)
A diferenciaccedilatildeo clara da cepa e principalmente a alta reprodutibilidade devem
ser caracteriacutesticas de qualquer meacutetodo de tipagem geneacutetica Poreacutem nem todos os
meacutetodos moleculares de tipagem satildeo igualmente eficazes Sendo assim de acordo
com a finalidade pretendida (identificaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo custo reprodutibilidade
etc) eacute feita a escolha do meacutetodo a ser aplicado (A L V E S et al 2003)
O processo de identificaccedilatildeo fenotiacutepica de KPC entre os membros da famiacutelia
Enterobacteriaceae ainda eacute difiacutecil e os meacutetodos para a sua identificaccedilatildeo devem ser
revistos e ajustados Mesmo com o avanccedilo tecnoloacutegico natildeo existem ensaios que
combinam alta especificidade e sensibilidade na detecccedilatildeo destas enzimas Satildeo
diversas as metodologias usadas para rastreamento de KPC como por exemplo a
focalizaccedilatildeo isoeleacutetrica a teacutecnica de disco-difusatildeo E-test teste de Hodge
modificado dentre outros Aleacutem disso a pesquisa do gene blaKPC pode ser feita
pela Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) Os sistemas de automaccedilatildeo
existentes no entanto podem natildeo identificar com precisatildeo os isolados KPC
positivos (COTRIM et al 2012)
A identificaccedilatildeo blaKPC pelo PCR eacute um meacutetodo raacutepido preciso sensiacutevel e
altamente especiacutefico no entanto a PCR exige equipamento e conhecimentos
28
especializados em diagnoacutestico molecular dificultando ainda a utilizaccedilatildeo dele na
rotina dos laboratoacuterios de microbiologia (COTRIM et al 2012)
Em estudo de infecccedilotildees hospitalares identificaccedilatildeo molecular de patoacutegenos
bacterianos eacute bastante utilizada Para diferenciar carbapenemases tipo KPC a partir
de outros tipos como SME NMC-A-IMI e GES eacute necessaacuterio um exame molecular
As identificaccedilotildees do microrganismo juntamente com a triagem molecular iratildeo definir
um resultado mais especiacutefico podendo ser usado para identificar o antibioacutetico mais
adequado para o tratamento Poreacutem a principal desvantagem de alguns exames
baseados em PCR por exemplo eacute que devido agrave sua limitada capacidade de
multiplexaccedilatildeo eles distinguem apenas algumas variaccedilotildees (MOREIRA et al 2014)
Estatildeo descritas para a identificaccedilatildeo molecular de patoacutegenos pertencentes agrave
famiacutelia Enterobacteriaceae as teacutecnicas de PFGE RAPD (randomly amplified
polymorphic DNA) e ERIC-PCR (Enterobacterial Repet it ive Intergenic Consensus)
A PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) eacute considerada padratildeo ouro devido sua
alta capacidade de diferenciaccedilatildeo baseada na anaacutelise do perfil de restriccedilatildeo do DNA
genocircmico por meio de eletroforese Como desvantagem para a sua execuccedilatildeo eacute
necessaacuterios vaacuterios dias impedindo a tipagem de algumas cepas bacterianas devido
agrave degradaccedilatildeo do DNA aleacutem do alto custo empregado (MOREIRA et al 2014)
O meacutetodo baseado em ERIC-PCR tem sido bastante utilizado como uma
alternativa para a teacutecnica de PFGE Esta teacutecnica consiste na anaacutelise do padratildeo de
amplificaccedilatildeo de elementos repetidos encontrados no genoma bacteriano Isto
permite uma maior rapidez na obtenccedilatildeo de resultados quando comparada com o
PFGE aleacutem de alta reprodutibilidade simples execuccedilatildeo e implementaccedilatildeo baixo
custo e natildeo sem problemas com a degradaccedilatildeo do DNA (MOREIRA et al 2014)
A PCR eacute considerada uma teacutecnica de biologia molecular revolucionaacuteria que
consiste na siacutentese enzimaacutetica de coacutepias de aacutecidos nucleacuteicos Ela permitiu o raacutepido
desenvolvimento do estudo de sequumlecircncias de aacutecidos nucleacuteico Foi desenvolvida por
Kary Banks Mullis que ganhou o precircmio Nobel de quiacutemica de 1993 devido ao
desenvolvimento dessa teacutecnica em abril de 1983 (CAMARGO et al 2014)
Por meio de etapas de variaccedilatildeo de temperatura a teacutecnica de PCR promove a
duplicaccedilatildeo de cadeias de DNA in vitro A reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo de DNA por PCR
envolve o emprego de sequumlecircncias iniciadoras (primers) quatro nucleotiacutedeos
29
(dNTPrsquos) do DNA e uma DNA polimerase termoestaacutevel podendo assim obter-se a
partir de uma fita molde muitas coacutepias de uma sequumlecircncia especiacutefica de aacutecido
nucleacuteico O princiacutepio da PCR consiste na variaccedilatildeo de temperatura por ciclo
envolvendo trecircs etapas baacutesicas desnaturaccedilatildeo pareamento e amplificaccedilatildeo
(CAMARGO et al 2014)
A desnaturaccedilatildeo da fita molde de DNA eacute uma etapa com duraccedilatildeo entre 30
segundos a 1 minuto a temperatura entre 92 ordmC a 96 ordmC Apoacutes isso o pareamento de
dois iniciadores sinteacuteticos de composiccedilotildees distintas que funcionam como os
iniciadores da reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo liga-se agrave regiatildeo complementar da fita de
DNA alvo que sofreraacute a duplicaccedilatildeo Esta etapa tem duraccedilatildeo de 30 segundos a 1
minuto a temperatura entre 58 ordmC e 65 ordmC Por uacuteltimo a amplificaccedilatildeo por meio da
enzima Taq DNA polimerase das novas fitas de DNA se daacute a partir de cada um dos
iniciadores utilizando os quatro dNTPrsquos como substrato da reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo
Esta etapa possui duraccedilatildeo entre 45 segundos e 1 minuto a 72 ordmC Cada ciclo eacute
repetido em torno de 30 a 35 vezes e promove a amplificaccedilatildeo da regiatildeo alvo
determinada conforme o anelamento dos iniciadores sinteacuteticos de DNA (CAMARGO
et al 2014) Estas etapas estatildeo demonstradas na figura 4
Figura 4 Etapas da Reaccedilatildeo de PCR
30
2 JUSTIFICATIVA
No ano de 2010 no Distrito Federal foram identificados 111 pacientes com
suspeita de infecccedilatildeo por Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) e a
Secretaria de Sauacutede do Distrito Federal confirmaram ainda a morte de 18 pacientes
dentre os hospitais puacuteblicos e particulares Um desafio encontrado por ocasiatildeo do
surto infeccioso no Distrito Federal foi o de confirmar as KPCs por Reaccedilatildeo da
Polimerase em Cadeia sendo que as amostras foram enviadas com esta finalidade
para a Fiocruz no Rio de Janeiro
Pesquisas que possam contribuir na elaboraccedilatildeo de estrateacutegias preventivas e
de intervenccedilatildeo para infecccedilotildees causadas por enterobacteacuterias bem como contribuir
para gerar uma integraccedilatildeo beneacutefica entre a equipe acadecircmica e os serviccedilos de
sauacutede devem ser estimuladas Neste sentido o presente estudo permitiu escrutinar
os genes envolvidos na expressatildeo de carbapenemases presentes em espeacutecies de
enterobacteacuterias isoladas em ambiente hospitalar visto que elucidar genes de
resistecircncia de enterobacteacuterias aos antibioacuteticos carbapenecircmicos eacute o primeiro passo
para garantir um controle epidemioloacutegico efetivo para estes tipos de microorganismo
assim como sua associaccedilatildeo com surtos fatais particularmente em pacientes com
baixa imunidade
31
3 OBJETIVOS
31 Objetivo geral Caracterizar os genes de resistecircncia das
Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases e os aspectos epidemioloacutegicos de
pacientes internados em um hospital puacuteblico do Distrito Federal
32 Objetivos Especiacuteficos
Identificar genotipicamente a enzima KPC (Klebsiella pneumoniae
carbapenemase) de isolados de Klebsiella pneumoniae
Investigar aspectos epidemioloacutegicos dos pacientes portadores de
Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases
Identificar quais variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana influenciaram para o
desfecho oacutebito ou alta
Avaliar a susceptibilidade das Enterobacteacuterias aos antibioacuteticos
carbapenecircmicos dos pacientes em ambiente hospitalar
32
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
Trata-se de um estudo transversal onde foi realizado o teste de
susceptibilidade das enterobacteacuterias aos antibioacuteticos carbapenecircmicos a partir dos
materiais bioloacutegicos coletados dos pacientes internados no Hospital Regional da Asa
Norte (HRAN) e enviados ao Laboratoacuterio de Anaacutelises Cliacutenicas da mesma Instituiccedilatildeo
Os materiais bioloacutegicos investigados foram sangue aspirado traqueal ou brocircnquico
urina e cultura semi quantitativa de ponta de cateter venoso central O HRAN eacute um
hospital puacuteblico do Distrito Federal com 395 leitos sendo as cliacutenicas de internaccedilatildeo
Berccedilaacuterio Cirurgia Geral Cirurgia Plaacutestica Cliacutenica Meacutedica Ginecologia Maternidade
Pediatria Queimados UTI com atendimento a pacientes portadores de doenccedilas de
caraacuteter cliacutenico e ciruacutergico
4 1 Coleta e transporte das amostras bioloacutegicas
As amostras foram coletadas de pacientes internados no Hospital Regional da
Asa Norte (HRAN) com suspeitas de infecccedilatildeo por KPC A identificaccedilatildeo primaacuteria foi
realizada pelo Laboratoacuterio de Microbiologia do hospital de origem dos pacientes e os
demais procedimentos que foram utilizados na identificaccedilatildeo encontram-se descritos
abaixo
4 2 Procedimentos para confirmaccedilatildeo de resistecircncia bacteriana por
disco de ertapenem (adaptado CDC 2004)
Para diagnosticar amostra como portadora de bacteacuteria produtora de
carbapenemase foi realizado o teste com disco de ertapenem como forma de
triagem Inicialmente utilizou-se o swab contaminado com a amostra que foi
distribuiacuteda em uma pequena aacuterea da placa de aacutegar MacConkey para apoacutes o
crescimento ser realizada a pesquisa de colonizaccedilatildeo por enterobacteacuterias resistentes
aos carbapenecircmicos (Pesquisa de CRE) Procedeu-se a semeadura por teacutecnica
semi-quantitativaesgotamento com alccedila bacterioloacutegica na diluiccedilatildeo de 1100 O disco
de Ertapenem foi colocado na superfiacutecie da placa de MacConkey na junccedilatildeo dos dois
primeiros campos de semeadura conforme demonstrado na figura 5 Incubou a placa
33
em estufa aeroacutebia a 35ordmC por 24 e 48 horas e observou-se o halo de difusatildeo do
disco de Ertapenem na placa para proceder agrave leitura
O teste deixou de ser obrigatoacuterio apoacutes a modificaccedilatildeo dos criteacuterios
interpretativos para carbapenecircmicos para enterobacteacuterias publicados no suplemento
do CLSI 2010 M100-S20-U
Figura 5 Mecanismo de semeamento de material bioloacutegico oriundos de
pacientes com suspeita de infecccedilatildeo por KPC Fonte adaptado CDC 2004
4 2 1 Interpretaccedilatildeo dos resultados
Na ausecircncia de crescimento ateacute 24 horas (MacConkey) ou halo de difusatildeo
gt27 mm na placa deve-se reincubar as placas por mais 24 horas Quando for
ausente o crescimento apoacutes 48 horas ou halo de difusatildeo gt27 mm na placa libera-se
como enterobacteacuterias resistentes a carbapenecircmicos (KPCNEG)Havendo
crescimento de colocircnias na placa de MacConkey com halo lt 27 mm (apenas para
colocircnias com crescimento dentro do halo) deve-se reisolar e realizar identificaccedilatildeo e
antibiograma automatizado teste de sensibilidade por disco-difusatildeo e Teste de
Hodge Modificado (THM) Os isolados de enterobacteacuterias cujos testes comprovarem
a resistecircncia aos carbapanecircmicos testados (KPCPOS) foram reportado a Comissatildeo
de Controle de Infecccedilatildeo Hospitalar (CCIH) Jaacute osbacilos Gram-negativos natildeo
fermentadores natildeo foram reportados (KPCNEG) Para interpretaccedilatildeodos resultados
foram utilizados os valores conforme demonstrados na tabela 1
Tabela 1 Criteacuterios Interpretativos para testes de sensibilidade
ENTEROBACTEacuteRIAS
Disco difusatildeo (mm) MIC (microgml)
34
Antibioacutetico Sigla S I R S I R
Ertapenem 10
microg
ETP 22 19-
21
18 05 1 2
Meropenem 10
microg
MEM 23 20-
22
19 1 2 4
Fonte Manual Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)
2013
Os resultados que apresentaram resistecircncia ao antibioacutetico Ertapenem foram
considerados como suspeitos de contaminaccedilatildeo por KPC Fez-se o teste de
susceptibilidade aos antibioacuteticos (TSA) em aparelho automatizado MicroScan Walk
Away 96sl Dade Behring
4 3 Teste de susceptibilidade aos antibioacuteticos (adaptado CDC 2004)
A determinaccedilatildeo da susceptibilidade dos isolados foi feita pelo teste de
susceptibilidade aos antibioacuteticos (TSA) apoacutes cultura em meio de gelose simples
(INSA) para avaliaccedilatildeo da sua pureza e obtenccedilatildeo de colocircnias isoladas Para
preparaccedilatildeo de uma suspensatildeo bacteriana com turvaccedilatildeo aproximada de 05
McFarland (Dade BehringMicroScanregTurbidity Meter) ressuspendeu duas a cinco
colocircnias em 2ml de soro fisioloacutegico esteacuteril diluindo a 1100 em soro fisioloacutegico num
volume total de 10ml em seguida foi feita uma semeadura em duas placas
quadradas (120mm x 120mm) de Muller-Hinton Agar (INSA) por inundaccedilatildeo
Os discos de antibioacutetico carbapenecircmicos imipenem meropenem e
ertapenem (Biorad) foram aplicados com o auxiacutelio de um dispensador automaacutetico A
susceptibilidade das Enterobacteacuterias aos carbapenecircmicos foi definida de acordo
com o protocolo Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI 2011)
Para aquelas Enterobacteacuterias que apresentaram resistecircncia ao ertapenem
foram realizados o Teste de Hodge Modificado para Detecccedilatildeo de Enterobacteacuterias
Produtoras de Carbapenemases conforme descrito pelo Centers for Disease Control
and Prevention (CDC 2004)
35
4 4Teste de Hodge Modificado (THM) (adaptado CDC 2004)
Preparou-se uma suspensatildeo em salina esteacuteril com a cepa Escherichia coli
ATCC 25922 (padratildeo 05 de McFarland) Apoacutes isto diluiu a suspensatildeo 110 em
salina (05 ml da soluccedilatildeo de Ecoli ATCC 25922 + 45 ml salina)Foi entatildeo semeado
na superfiacutecie de uma placa de Agar Muller-Hinton com a suspensatildeo diluiacuteda de Ecoli
ATCC 25922 com auxilio de swab seco assegurando que houvesse uma
distribuiccedilatildeo uniforme cobrindo toda a superfiacutecie do Agar Deixou secar por 3 a 5
minutos em temperatura ambienteColocou-se o disco de ertapenem 10microg no centro
da placa e apoacutes isto fez-se uma estria linear da cepa a ser testada da borda do
disco ateacute a borda da placa utilizando uma alccedila calibrada 10 microl ou um swab Incubou
a placa na estufa em atmosfera aeroacutebia a 35 plusmn 2ordmC por 16 a 24 horas
441 Controle de qualidade (CQ)
Foi utilizado um CQ todos os dias em que se realizou o teste tendo como
controle Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1705- teste de Hodge modificado
positivo Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1706- teste de Hodge modificado
negativo
442 InterpretaccedilatildeoResultados
Apoacutes 16ndash24 horas de incubaccedilatildeo examinar as placas para verificar a presenccedila
de uma distorccedilatildeo no halo de inibiccedilatildeo do disco de ertapenem devido ao crescimento
realccedilado da cepa ATCC na intersecccedilatildeo do organismo teste e a Ecoli ATCC 25922
dentro dos limites do halo O THM positivo apresentaraacute presenccedila de distorccedilatildeo no
halo de inibiccedilatildeo de ertapenem devido ao crescimento da cepa Ecoli ATCC 25922 ao
longo da estria da cepa teste para dentro dos limites do halo de inibiccedilatildeo Jaacute o THM
negativo teraacute ausecircncia de crescimento da cepa Ecoli ATCC 5922 ao longo da estria
da cepa teste para dentro dos limites do halo de inibiccedilatildeo do disco de ertapenem
Este resultado estaacute representado na figura 6
36
Figura 6 Interpretaccedilatildeo resultado do Teste de Hodge Modificado
(adaptado CDC 2004) Teste positivo na estria da cepa teste na parte superior
da placa teste negativo na estria da cepa teste na parte inferior da placa
Tendo positivo como resultado o paciente era um provaacutevel contaminado por
KPC As amostras entatildeo foram encaminhadas para a Fundaccedilatildeo Osvaldo Cruz
(FIOCRUZ) para confirmaccedilatildeo final As amostras finalmente confirmadas como
positivas para KPC foram isoladas e guardadas no banco de cepas cliacutenicas do
hospital Apoacutes a autorizaccedilatildeo do CEP amostras das cepas foram transferidas para
meio de transporte Stuard em caixa teacutermica fechada em baixa temperatura e
levadas para o laboratoacuterio de microbiologia cliacutenica da universidade
No laboratoacuterio da universidade as amostras foram separadas e realizadas
repiques em meios MacConkey e incubadas por 24h As colocircnias caracteriacutesticas
foratildeo isoladas em caldo BHI e mantidas em shaker a 37oC por 2h Apoacutes isto foram
executadas as anaacutelises a seguir
Os isolados de Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases foram
submetidos agrave extraccedilatildeo de DNA e posterior sequumlenciamento para identificaccedilatildeo dos
genes de resistecircncia blaKPC de 1 a 13 e identificaccedilatildeo do gene universal Os
pacientes de onde os materiais bioloacutegicos contendo as Enterobacteacuterias produtoras
de carbapenemases foram os isolados foram investigados quanto aos aspectos
epidemioloacutegicos e cliacutenicos
37
4 5 Extraccedilatildeo de DNA bacteriano
A extraccedilatildeo de DNA bacteriano foi realizada utilizando o kit NucleoSpin
Plasmidreg (MN) Antes de iniciar a extraccedilatildeo foi feito a preparaccedilatildeo das soluccedilotildees
reagentes materiais e amostras (vortexando) colocou-se em banho-maria agrave 50ordmC o
tampatildeo AW Partiu-se de colocircnias isoladas cultivadas que sofreram passagem em
meio LB liacutequido por 12h Adicionou-se 15 mL da amostra no tubo eppendorf
centrifugou por 5 minutos descartou o sobrenadante (com cuidado para natildeo
descartar o Pellet) Repetiu-se este procedimento por mais trecircs vezes completando-
se o volume de 6mL Foram adicionados 250microL do tampatildeo Resuspension Buffer A1
encostando a ponteira no Pellet e misturando (este tampatildeo tem como funccedilatildeo
separar a formaccedilatildeo de grumos celulares) Apoacutes isso homogeneizou e vortexou os
tubos eppendorfs Apoacutes isso foram adicionados 250microL do tampatildeo Lysis Buffer A2
homogenizou e deixou descansar por 5 minutos (esta etapa eacute importante para a lise
da parede e da membrana celulares e liberaccedilatildeo do conteuacutedo da ceacutelula)
Passado o tempo de descanso foi adicionado 300microL do tampatildeo
Neutralization Buffer A3 homogeneizou e centrifugou por 10 minutos (este tampatildeo
iraacute retirar as proteiacutenas que envolvem o DNA e voltaraacute com o pH para proacuteximo de 8
impedindo que a soluccedilatildeo de lise facilite a quebra das ligaccedilotildees covalentes do aacutecido
nucleacuteico) Em seguida enumeraram-se os tubos contendo filtros com siacutelica
transferiu-se o sobrenadante para o filtro e centrifugou por 5 minutos Descartou-se
o que foi filtrado adicionou 500microL do tampatildeo AW (banho-maria) centrifugou por 2
minutos Novamente foi descartado o filtrado Adicionou-se 600microL do tampatildeo A4
centrifugou por 2 minutos e descartou o filtrado (os tampotildees AW e A4 contecircm
isotiocianato de guanidina em concentraccedilotildees crescentes para facilitar a adsorccedilatildeo
do DNA na siacutelica e retirada das outras biomoleacuteculas da amostra) Foi feita outra
centrifugaccedilatildeo com o tubo vazio Apoacutes isto o filtro foi trocado para outro eppendorf
definitivo onde foi adicionado 50microL do tampatildeo Elution Buffer AE (este tampatildeo
favorece a eluiccedilatildeo do DNA) centrifugou por 2 minutos descartou o filtro e
armazenou as amostras em freezer -20ordmC
38
4 6 Iniciadores e reaccedilatildeo de PCR
Os iniciadores universais para o gene blaKPC foram desenhados baseados
em sequumlecircncias conservadas apresentadas pelos sub-grupos de genes que
codificam a enzima carbapenemase de klebsiella pneumoniae (YIGIT et al 2001)
Baseado na sequumlecircncia para o blakpc-1 depositada no GenBank
(AF2975541) o oligonucleotiacutedio (oligo) iniciador direto (5-
ATGTCACTGTATCGCCGTC-3rsquo) foi desenhado para reconhecer a sequumlecircncia
blaKPC na posiccedilatildeo (131149) enquanto que o iniciador reverso (5-
TTACTGCCCGTTGACGCC-3rsquo) foi reconhecido na posiccedilatildeo (9951012) As anaacutelises
baseadas em alinhamento de sequumlecircncias mostraram que o par de iniciadores
blaKPC podem detectar os alelos de 1 a 13 do gene blaKPC conforme a tabela 2
Tabela 2 Nuacutemero de acesso ao GenBank dos alelos blaKPC e seus
microrganismos originais
Nuacutemero de
Acesso GenBank
Microrganismo Alvo
AF2975541 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-1
GU0862251 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-2
HQ2589341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-2-like
AB5577341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC -3
EU4473041 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-4
EU4002222 Pseudomonas
aeruginosa
blaKPC-5
EU5555341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-6
EU7297271 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-7
39
FJ2344121 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-8
FJ624872 Escherichia coli blaKPC-9
GQ1403481 Acinetobacter
baumannii
blaKPC-10
HM0669951 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-11
HQ3428891 Enterobacter cloacae blaKPC-12
HQ3428901 Enterobacter cloacae blaKPC-13
As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo de blaKPC foram realizadas em um
primeiro tempo de desnaturaccedilatildeo em que foi 94ordmC por 5 minutos seguido de 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 58 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 90 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 78ordmC por 8 minutos Aleacutem das amostras foi utilizado um
controle negativo
A PCR do blaKPC foi realizada utilizando os componentes para o volume da
reaccedilatildeo de 25 microL citados na tabela 3 A banda do tamanho do produto de PCR foi de
881 pares de bases (pb) o que corresponde ao plasmiacutedeo
Tabela 3 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do
gene blaKPC
Reagente Volume
DNA molde 4 microL
Tampatildeo Taq 25 microL
MgCl2 075 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP
2 microL
Oligo F 1 microL
Oligo R 1 microL
Taq DNA polimerase 05 microL
Aacutegua MiliQ 1335 microL
40
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
Baseado na sequumlecircncia para o gene 16S rRNA em que o oligonucleotiacutedio
Universal iniciador direto foward (5-CCAGCAGCCGCCGTAATACG-3rsquo) foi
desenhado para reconhecer a sequumlecircncia universal na posiccedilatildeo 1513 enquanto que o
iniciador reverso (5-ATCGGYTACCTTGTTACGACTTC-3rsquo) foi reconhecido na
posiccedilatildeo 1491 foram realizadas PCRrsquos As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo deste
gene foram realizadas nos seguinte tempos separaccedilatildeo 94ordmC por 10 minutos 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 55 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 120 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 72ordmC por 10 minutos
A PCR do gene 16S rRNA foi realizada utilizando os componentes para o
volume da reaccedilatildeo de 25microL citados na tabela 4 A banda do tamanho do produto de
PCR foi de 996 pb correspondente aacute regiatildeo ribossomal capaz de amplificar todas
as espeacutecies
Tabela 4Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do gene
universal
Reagente (quantidade
concentraccedilatildeo do estoque)
Volume
DNA molde 10 ng 4 microL
Tampatildeo Taq 10 x 25 microL
MgCl2 50mM 125 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP 25 mM
125 microL
Oligo F 10microM 05 microL
Oligo R 10microM 05 microL
Taq DNA polimerase 5UmicroL 04 microL
Aacutegua Miliq 146 microL
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
41
O termociclador utilizado para os experimentos foi o LifeTouch da BIOER
4 7 Digestatildeo
Para realizaccedilatildeo da digestatildeo foi utilizada a enzima BshF I (Hae III) EN- 1105
tamanho 7000 units concentraccedilatildeo 10 unitsmicroL fonte Bacillus sphaericus empresa
Jena bioscienceUtilizaram-se os componentes para o volume de 50microL da reaccedilatildeo
citados na tabela 5
Tabela 5 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da digestatildeo do gene
universal
Reagente Volume
Produto de PCR 10 microL
Enzima BshF I 01 microL
Tampatildeo (10x) 5 microL
Aacutegua Miliq 349 microL
Total (em cada ependorff) 50 microL
Valores para 1 digestatildeo
Os ependorffs foram colocados por 30 minutos em banho-maria a 37ordmC Apoacutes
isso fez-se a corrida das amostras em gel de agarose para verificaccedilatildeo do resultado
(LU et al 2000)
4 8 Eletroforese em gel de agarose
Os produtos de DNA PCR e digestatildeo foram analisados em gel de agarose
2 O tempo de corrida do gel eacute de aproximadamente 1hora e 30minutos sendo
que no comeccedilo foi usada agrave voltagem de 50 V e apoacutes comeccedilar a correr o gel
aumentou a voltagem para 100 v Utilizou-se o marcador de 100pb (pares de bases)
Foi adicionado 3microL de corante Bromophenol (que tem a funccedilatildeo de fazer uma ligaccedilatildeo
na amostra de DNA e permitir a visualizaccedilatildeo da corrida no gel de agarose) em 7microL
de amostra tanto de DNA quanto de PCR Para o preparo do gel foi utilizado TBE
42
(Tris- Aacutecido Boacuterico) agarose e brometo de etiacutedio (sua funccedilatildeo eacute de corante para o gel
e permitir a visualizaccedilatildeo do DNA quando colocado agrave luz ultravioleta) Para o oligo
blaKPC a banda da amplificaccedilatildeo foi em 881ppb correspondendo ao plasmiacutedeo Jaacute
o oligo Universal foi em 996 pb
4 9 Descarte de resiacuteduos
Todos os materiais utilizados nos ensaios foram de uso uacutenico e manipulados
em cacircmaras de seguranccedila bioloacutegica classe II Apoacutes o uso foram colocados em
soluccedilatildeo desinfetantes (hipoclorito a 1) e em seguida autoclavados a 127oC por 20
min em sacos apropriados para autoclavaccedilatildeo Apoacutes a finalizaccedilatildeo do ciclo de
esterilizaccedilatildeo os sacos contendo o material descartaacutevel foram colocados em
recipientes de coleta da empresa responsaacutevel pela coleta de materiais bioloacutegicos
produzidos no laboratoacuterio de microbiologia Todos os procedimentos seguiram a
normativa RDC-ANVISA 3062004 sobre o descarte de resiacuteduos de serviccedilo de
sauacutede
4 10 Aspectos epidemioloacutegicos e cliacutenicos
Os aspectos cliacutenicos e epidemioloacutegicos foram investigados por meio de
prontuaacuterios dos pacientes portadores de enterobacteacuterias produtoras de
carbapenemases e envolveram topografia mais provaacutevel do foco infeccioso a
enfermidade motivadora da internaccedilatildeo o desfecho cliacutenico a idade e o tempo de
internaccedilatildeo
4 12 Anaacutelises eepidemioloacutegicas
As anaacutelises foram realizadas com o pacote estatiacutestico SPSS versatildeo 200
Para verificar quais variaacuteveis referentes aos dados epidemioloacutegicos e
microbioloacutegicos influenciaram no desfecho verificou- se a diferenccedila meacutedia das
variaacuteveis idade e tempo de internaccedilatildeo em cada grupo O teste estatiacutestico utilizado foi
o teste t de Student apoacutes se executar o teste de normalidade de Shapiro-Wilk Para
as variaacuteveis sexo perfil microbioloacutegico das enterobacteacuterias produtoras de
43
carbapenemases foi avaliada a associaccedilatildeo com o desfecho por meio do teste Exato
de Fisher O niacutevel de significacircncia adotado foi de 5
4 13 Preceitos eacuteticos
Este projeto estaacute inserido em um projeto maior denominado ldquoEpidemiologia
cliacutenica e caracterizaccedilatildeo molecular do Acinetobacter Baumannii resistente a
antibioticoterapia em pacientes internado em hospitais do Sistema Uacutenico de Sauacutederdquo
que foi submetido ao Comitecirc de Eacutetica em Pesquisa da Secretaria do Estado de
Sauacutede do Distrito Federal (SESDF) e emitido parecer aprovado pelo protocolo nordm
23109 (anexo)
44
5 RESULTADOS
51 Anaacutelise molecular
Para a amplificaccedilatildeo com o oligo blaKPC foram amplificadas amostras
que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 881 pb correspondente ao
plasmiacutedeo A anaacutelise da amplificaccedilatildeo da regiatildeo do gene blaKPC mostrou que
apenas a amostra A10 natildeo amplificou isso demonstra que esta amostra natildeo
possuiacutea o gene de resistecircncia
5 1 1 Gene blaKPC
Figura 7 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 881 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
A amostra A3 natildeo amplificou no primeiro momento entatildeo foi realizado
novamente a PCR e corrida de gel obtendo entatildeo a amplificaccedilatildeo da amostra como
apresentado na figura 8
45
Figura 8 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC da
mostra A3 estudada A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo de 881
pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 1 2 Gene 16S rRNA
Para a amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA utilizou-se o oligo universal Foram
amplificadas amostras que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 996 pb
Figura 9 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
46
Segundo Lu et al (2000) a digestatildeo com a enzima HaeIII deste amplicons de
16S rRNA devolveriam bandas com perfis entre 150 a 200 pb No gel abaixo eacute
possiacutevel evidenciar que este perfil ocorreu com o predomiacutenio de bandas na altura
de 200pb
Figura 10 Gel de agarose a 2 da digestatildeo do amplicon do gene 16S
rRNA das amostras com a enzima HaeIII evidenciando diversos fragmentos
proacuteximos a 200 pb A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo ribossomal
de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 2 Anaacutelises epidemioloacutegicas
5 2 1 Sexo
No total foram detectados 17 isolados de KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 onde a maior a prevalecircncia foi
detecatada em amostras de pacientes do sexo masculino (53) do que no sexo
feminino (47)
47
Figura 11 Isolado de KPC segundo sexo dos 17 pacientes investigados
no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 2 Desfecho cliacutenico
Em 17 isolados de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo
de 2010 aacute 2011 a porcentagem de pacientes que foram a oacutebito (59) foi maior que
a de pacientes que tiverm alta (41)
Figura 12 Isolado de KPC segundo desfecho cliacutenico dos 17 pacientes
investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
48
5 2 3 Local da coleta
Dos 17 episoacutedios detectados de infecccedilatildeo por KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 a infecccedilatildeo em swab retalfoi mais
frequente (47) seguida de ponta de cateacuteter (18) e secreccedilatildeo traqueal (12)
Figura 13 Isolados de KPC segundo local da coleta da amostra nos 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 4 Microorganismo
O microorganismo mais encontrado foi a Klebsiella pneumoniae (82)
seguida da Enterobacter clocae (12) e Serratia marcescens (6) dos 17 isolados
de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 Isto afirma o
fato de a sigla KPC ser utilizada de forma errocircnea aacute Klebsiella pneumoniae visto
que a evidecircncia dela eacute maior em relaccedilatildeo as outras cepas
49
Figura 14 Isolado de KPC segundo microrganismo encontrado em 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 5 Relaccedilotildees variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana e desfecho
cliacutenico
Tabela 6 ndash Distribuiccedilatildeo do perfil geneacutetico sexo coleta tipificaccedilatildeo de
microrganismos e anaacutelise da resistecircncia bacteriana segundo o desfecho
cliacutenico Brasiacutelia-DF 2010 a 2011
Variaacutevel Resultado
Desfecho
Alta Oacutebito
N N P
Gene 16S rRNA Positivo 7 1000 10 1000
NA Gene blaKPC Positivo 6 857 10 1000
Negativo 1 143 0 00 0218 Sexo Feminino 2 286 6 600
Masculino 5 714 4 400 0201 Local da coleta Fundo saco de
Douglas 1 143 0 00
Hemocultura 0 00 1 100 0463 Ponta de cateter 1 143 2 200
Sec TraquealBrocircnquica
0 00 1 100
50
Secreccedilatildeo traqueal 2 286 0 00
Swab retal 3 429 5 500
Urina 0 00 1 100
Microrganismo Enterobacter cloacae (KPC)
1 143 1 100
Klebsiella pneumoniae
6 857 8 800
0416 Serratia
marcescens 0 00 1 100
Teste de Hodge Hodge positivo 7 1000 10 1000
NA Amicacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 1 100 0848 resistente 0 00 1 100
sensiacutevel 2 286 3 300
Amoxicilina Aacutecido Clavulacircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Ampicilina Sulbactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ampicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Aztreonan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefazolina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Cefoperazona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Cefotaxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefoxitina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0509 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 2 286 4 400
Ceftazidima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cetriaxona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 3 429 5 500 0772 Cefalotina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ciprofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772
51
resistente 3 429 5 500
Claritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Clindamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Eritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Gentamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0942 resistente 2 286 3 300
sensiacutevel 1 143 2 200
Imipenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 0 00 2 200 0193 Resistente 1 143 3 300
sensiacutevel 2 286 0 00
Nitrofurantoiacutena sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Norfloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Oxacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Penicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Piperacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Rifampicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tetraciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Ticarcilina Aacutecido Clavulocircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0688 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 3 429 4 400
Tobramicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Trimetoprima Sulfametoxazol
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0112 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 2 286 0 00
Vancomicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tigeciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediario 0 00 1 100 0211 natildeo testado 1 143 4 400
resistente 2 286 0 00
52
Cefepime sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefuroxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Levofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Piperacilina Tazobactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Ertapenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Meropenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0223 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 1 143 0 00
Cefotetan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 sensiacutevel 0 00 1 100
Gemifloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 7 700 0585 natildeo testado 3 429 3 300
Desfecho
Alta Oacutebito
Meacutedia Erro
padratildeo Meacutedia Erro
padratildeo p
Idade 58 9 59 5 0991
Tempo Internaccedilatildeo (dias)
50 13 46 12 0571
n= 17 p(lt 005) NA natildeo se aplica
53
6 DISCUSSAtildeO
Nos uacuteltimos anos houve um aumento na incidecircncia de bacteacuterias
multirresistentes aos antimicrobianos no ambiente hospitalar tornando isto um
problema mundial de sauacutede puacuteblica (HULSCHER et al 2010) Quando se trata
principalmente de bacilos Gram negativos a frequumlecircncia destas bacteacuterias eacute ainda
maior em paiacuteses da Ameacuterica Latina quando comparada a paiacuteses desenvolvidos
(GALES etal 2012)
De acordo com dados do ldquoMeropenem Yearly Susceptibility Test Information
Collectionrdquo (MYSTIC) ocorreu nos Estados Unidos um aumento na susceptibilidade
de K pneumoniae nos uacuteltimos anos graccedilas a praacuteticas de controle de disseminaccedilatildeo
de amostras resistentes(RHOMBERG P R et al 2009) O aumento crescente da
prevalecircncia destes microrganismos foi proporcional ao aumento da dependecircncia do
uso de antibioacuteticos carbapenecircmicos considerados como a opccedilatildeo terapecircutica para o
tratamento de infecccedilotildees por bacilos Gram negativos multi-resistentes (LIVERMORE
2012) Isto afeta diretamente as opccedilotildees de tratamento sobrando poucas alternativas
para a terapecircutica que incluem colistina (polimixina E) e tigeciclina que apresentam
respectivamente problemas em termos de toxicidade e eficaacutecia (LIVERMORE et
al 2011) Um dos efeitos adversos mais importantes das poliminas B e E por
exemplo satildeo a neurotoxicidade e nefrotoxicidade (MENDES C A C et al2009 )
Devido agrave resistecircncia ser usualmente de natureza plasmidial e portanto de
maior disseminaccedilatildeo especialmente quando carreadas por K pneumoniae
microrganismo com uma notoacuteria capacidade para acumular e transferir plasmiacutedeos
com determinantes para resistecircncia o nuacutemero de casos detectados pelo
fenoacutetipogenoacutetipo blaKPC eacute bastante preocupante (MONTEIRO et al 2009)
Comparada com outras bacteacuterias hospitalares a transmissatildeo de clones
multirresistentes de K pneumoniae eacute maior e podem natildeo ser controladas pelos
meacutetodos de controle de infecccedilatildeo hospitalar (PAAUW et al 2007) A forma
plasmidial para transferecircncia da resistecircncia adicionada a este grande potencial para
disseminaccedilatildeo de clones resistentes eacute preocupante visto que apoacutes surtos muitas
vezes pode se tornar endecircmica Jaacute eacute uma realidade a disseminaccedilatildeo desta bacteacuteria
54
entre pacientes hospitais paiacuteses e ateacute mesmo continentes (WOODFORF et al
2010 ROGERS et al 2011)
As chances de surtos satildeo maiores em paiacuteses com poucos recursos devido agrave
maior carecircncia de praacuteticas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees hospitalares e o
uso irracional de antimicrobianos de forma empiacuterica e inadequada (KUMARASAMY
et al 2010) Ateacute o momento os mecanismos de resistecircncia aos cabapenecircmicos
geralmente encontrado eram a produccedilatildeo de ESBL (CTX-M) somada aacute perda de
porina (CARVALHAES et al 2010) Foi notado a partir do ano de 2008 um
aumento no nuacutemero de K pneumoniae produtoras de KPC-2 apresentando outra
forma de resistecircncia (GALES 2012)
Um estudo mostrou que o perfil do paciente colonizado ou infectado por KPC
foi de um paciente entre os 33 e os 82 anos de idade internado haacute mais de 1
semana no hospital A mortalidade geral nos uacuteltimos anos ficou em torno de 7
sendo que dos 77 pacientes estudados 32 (415) pacientes evoluiacuteram para oacutebito
evidenciando a alta morbi-mortalidade associada (ALVES A P et al 2013)
Em estudo com 2316 pacientes avaliados a populaccedilatildeo de sexo masculino foi
de 526 idade meacutedia global de 53 anos (mediana de 55 anos) permanecircncia meacutedia
de 58 dias (mediana de 3 dias) (OLIVEIRA A C et al 2010) Outros trabalhos
apresentaram ausecircncia de significacircncia entre sexoidade e o desenvolvimento de
infecccedilotildees por microrganismos resistentes (PERES-BOTA D et al 2003 COLPAN
A et al 2005 COELLO R et al 1997)
Outro estudo utilizou um total de 30 amostras sendo elas isoladas de urina
escarro secreccedilatildeo pleural ponta de cateter aspirado traqueal e hemocultura A mais
prevalente foi em urina (40) Entre as 30 cepas analisadas a maior porcentagem
foi da cepa Klebsiella pneumoniae (70) Enterobacter sp (133) Klebsiella
ozaenae (10) Escherichia coli (333) e Klebsiella oxytoca (333)
(DIENSTMANN R et al 2010) Nos Estados Unidos a enzima KPC jaacute se tornou
endecircmica Foi realizada uma pesquisa em dois hospitais de Nova York onde
testaram 602 amostras e 45 apresentaram algum mecanismo de resistecircncia
sendo apenas 33 confirmadas por biologia molecular como KPC-2 (BRATU et
al 2005)
55
Estudo sobre os tipos de ESBL feito no Japatildeo apresentou o tipo Toho-1 como
o mais prevalente nessa pesquisa Ateacute o ano de 2000 ano em que foi publicado tal
estudo este era o primeiro relatoacuterio no Japatildeo para identificar derivados de ESBLs
como tipo de SHV e TEM entre E coli e K pneumoniae Em especial o tipo SHV- 12
foi identificado com uma maior frequumlecircncia Estes resultados indicam que tipos
distintos de ESBLs que satildeo diferentes em sua especificidade de substrato e origem
geneacutetica coexistem no Japatildeo Isto mostra a importacircncia de caracterizar genoacutetipos
distintos de ESBLs e de estar em alerta continuamente para as tendecircncias de
ESBLs no Japatildeo aleacutem da necessidade de uma interpretaccedilatildeo uniforme utilizando as
diretrizes do CSLI para relatar cepas produtoras de ESBL Aleacutem da detecccedilatildeo de
ESBLs satildeo necessaacuterias mais informaccedilotildees tais como o perfil de sensibilidade
especiacutefica para diversas β-lactacircmicos e o local da infecccedilatildeo Esses fatores satildeo
essenciais para a escolha adequada de antibioacuteticos (YAGI T et al 2000)
No ano de 2004 uma pesquisa avaliou a produccedilatildeo de uma enzima de
hidroacutelise de carbapenecircmicos atraveacutes da teacutecnica de sequumlenciamento foi revelado
um novo membro da famiacutelia KPC designado KPC- 3 Pesquisadores encontraram
em um mutante de K pneumoniae uma substituiccedilatildeo de um gene associado com
resistecircncia a Imipenem mas essa substituiccedilatildeo foi considerada improvaacutevel na
contribuiccedilatildeo da resistecircncia aos carbapenecircmicos da espeacutecie estudada Aleacutem da
resistecircncia aos carbapenecircmicos estes isolados eram em sua maioria resistentes agraves
cefalosporinas penicilinas e aminoglicosiacutedeos Usando estudos de transformaccedilatildeo
conjugaccedilatildeo e hibridaccedilatildeo localizaram o alelo blaKPC em plasmiacutedeo aleacutem disso
mostraram que esse alelo tambeacutem carregava uma resistecircncia aos aminoglicosiacutedeos
A transferecircncia das enzimas KPCs foi demonstrada in vitro tanto neste como em
outros estudos pode ser que os plasmiacutedeos que fazem esta transferecircncia estavam
comeccedilando a se espalhar no ambiente cliacutenico resultando na multiresistecircncia dessas
estirpes (WOODFORD et al 2004)
O presente estudo apresentou um vieacutes quanto aos resultados dos testes de
susceptibilidade microbiana Observou-se que natildeo foi encontrado resultado deste
teste em algumas amostras o que natildeo cooperou para um estudo mais preciso
futuros estudos quanto agraves amostras e um melhor acompanhamento deste tipo de
patologia Poreacutem mesmo sem algumas amostras com este resultado disponiacutevel foi
56
confirmada a presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos
carbapenecircmicos por meio dos genes de resistecircncia blaKPC e 16S rRNA que as
amostras apresentaram em sua maioria serem portadoras Quanto aos resultados
estatiacutesticos nenhuma das variaacuteveis apresentou significacircncia estatiacutestica (p gt 005)
mostrando assim que estas variaacuteveis isoladas natildeo foram o fator determinante para
o desfecho cliacutenico de alta ou oacutebito
57
7 CONCLUSAtildeO
Os genes blaKPC e 16S rRNA foram caracterizados confirmando a a
presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos carbapenecircmicos
Houve uma maior prevalecircncia da cepa K pneumoniae e isto confirma outros
estudos que apresentam a maior prevalecircncia desta cepa em amostras com KPC
Aleacutem disso isso justifica a forma popular da K pneumoniae ser chamada de KPC
enquanto que na verdade KPC eacute uma enzima podendo estar presente em outras
cepas como Enterobacter clocae tambeacutem apresentada no presente estudo O
desfecho cliacutenico de oacutebitos maior que 50 eacute um possiacutevel indicador sobre a
necessidade de se realizar um teste raacutepido para identificaccedilatildeo de KPC visando
iniciar o mais raacutepido possiacutevel o tratamento afim de diminuir a mortalidade por esta
infecccedilatildeo
Nenhuma das variaacuteveis isoladamente estaacute relacionada ao desfecho cliacutenico
oacutebito ou alta pois natildeo apresentaram relevacircncia estatiacutestica O presente estudo
mostrou que haacute presenccedila da bacteacuteria nas amostras de pacientes do hospital
estudado podendo entatildeo afirmar que este tipo de bacteacuteria se encontra tambeacutem
presente em ambiente hospitalar O uso irracional de antimicrobiano eacute demonstrado
de forma indireta quando foi apresentado atraveacutes do Teste de Hodge Modificado
uma resistecircncia de 100 aos antibioacuteticos carbapenecircmicos Isto tambeacutem reflete na
terapecircutica sendo que pacientes portadores de bacteacuterias resistentes aos
antibioacuteticos carabepecircmicos tem uma escassa opccedilatildeo de tratamento e as opccedilotildees
apresentam problemas quanto agrave toxicidade e eficaacutecia
58
REFEREcircNCIAS
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Mecanismos
de resistecircncia bacteriana aos antimicrobianos Disponiacutevel em
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controleopas_
webmodulo3mec_sitiohtmgt Acesso em 25 de abril de 2014
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Nota teacutecnica nordm
012013 medidas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees por enterobacteacuterias
multiresistentes Acesso em 17 de abril de 2013
ALBA J et al Kinetics study of KPC-3 a plasmid-encoded class A
carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase Antimicrob Agents Chemother
Nov49(11)4760-2 2005
ALVES A P et al Nosocomial infections by KPC-producing enterobacteria in
a tertiary hospital in Southern Brazil Revista da AMRIGS Porto Alegre 57 (3) 213-
218 jul-set 2013
ALVES A et al Tipagem Geneacutetica de Microrganismos Lab De Diversidade
Microbiana Centro de Biologia Celular Dep de Biologia U de Aveiro 3810-193
Aveiro- 2003
BELL J M et Al Prevalence and significance of a negative extended-
spectrum beta-lactamase (ESBL) confirmation test result after a positive ESBL
screening test result for isolates of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae
results from the SENTRY Asia-Pacific Surveillance Program J Clin Microbiol
May45(5)1478-82 2007
BRATU S et al Detection of KPC carbapenem-hydrolyzing enzymes in
Enterobacter spp from Brooklyn New York Antimicrob Agents Chemother v 49 n
2 p 776-8 2005
59
BRATU S et al Emergence of KPC-possessing Klebsiella pneumoniae in
Brooklyn New York epidemiology and recommendations for detection Antimicrob
Agents Chemother v 49 n 7 p 3018-20 2005
BRATU S et al Rapid spread of carbapenem-resistant Klebsiella
pneumoniae in New York City Arch Intern Med v 165 p 1430-5 2005
CAMARGO C F et al Aplicaccedilatildeo das teacutecnicas de pcr e suas teacutecnicas
derivadas em diagnoacutestico molecular Disponiacutevel em
ltfileDUnB10C2BA20semestreArtigosPCR-
20CLEYTON20FLORENCIO20DE20CAMARGO20E20PAULO20ROB
ERTO20QUEIROZpdfgtgt Acesso em 08 de abril de 2014
CARVALHES C G et al Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting
carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive
results Journal of Antimicrobial Chemotherapy v 65 n2 p 249-251 2010
CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION- CDC Modified
Hodge Test for Carbapenemase Detection in Enterobacteriaceae 2004
CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE Methods for
dilutionantimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically Approved
standard M7ndashA7 7th ed CLSI Wayne PA 2011
COELLO R et al Risk factors for developing clinical infection with methicillin-
resistant Staphylococcus aureus (MRSA) amongst hospital patients initially only
colonized with MRSA J Hosp Infect 19973739-46
COLPAN A et al Evaluation of risk factors for mortality in intensive care
units A prospective study from a referral hospital in Turkey Am J Infect Control
200533(1)42-7
60
CORNAGLIA G et al Living with ESBLs Introduction Clinical Microbiology
and Infection 14 Suppl 1 1-2 2008
COTRIM E R et al Klebsiella pneumoniae carbapenemase ndash KPC em
Enterobacteriaceae o desafio das bacteacuterias multirresistentes Poacutes em revista do
centro universitaacuterio Newton Paiva 12012 - ediccedilatildeo 5 - issn 2176 7785
DESHPANDE L M et al Occurrence and characterization of
carbapenemase-producing Enterobacteacuteriaceae report from the SENTRY
Antimicrobial Surveillance Program (2000-2004) Microb Drug Resist 12(4)223-30
2006
DIAS D J A Estudos dos principais mecanismos de resistecircncia aos
antibioacuteticos β-lactacircmicos em bacteacuterias patogecircnicas gram negativas 2009 100 f
Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Geneacutetica Molecular e Biomedicina) ndash Faculdade de
Ciecircncias e Tecnologia Universidade de Nova Lisboa Lisboa
DIENSTMANN R et al Avaliaccedilatildeo fenotiacutepica da enzima Klebsiella
pneumoniae carbapenemase (KPC) em Enterobacteriaceae de ambiente hospitalar
J Bras Patol Med Lab v 46 n 1 p 23-27 fevereiro 2010
ENDIMIAMI A et al Emergence of blaKPC-containing Klebsiella
pneumoniae in a long-term acute care hospital a new challenge to our healthcare J
Antimicrob Chemother 64 1102-1110 Nov 2009
FALAGAS M E et al Extended-spectrum beta-lactamase producing
organisms The Journal of Hospital Infection 73 (4) pp 345-54 2009
FONTANA C et al Emergence of KPC-producing Klebsiella pneumoniae in
Italy BMC Rev Notes 3 40 2010
61
GALES A C et al Antimicrobial resistance among Gram-negative bacilli
isolated from Latin America results from Sentry Antimicrobial Surveillance Program
(Latin America 2008-2010) Diagnostic Microbiology and Infectious Disease v 3 n
4 p 354 -360 2012
GUPTA N et al Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Epidemiology
and Prevention HEALTHCARE EPIDEMIOLOGY Clinical Infectious Diseases
201153(1)60ndash67 Published by Oxford University Press on behalf of the Infectious
Diseases Society of America 2011
HARBOTTLE H et al Genetics of antimicrobial resistance Anim Biotechnol
n17 p111-124 2006
HENRIQUE W N et al RESISTEcircNCIA BACTERIANA Uniatildeo das
Faculdades Alfredo NasserInstituto de Ciecircncias da Sauacutede Disponiacutevel em lt
httpwwwfaculdadealfredonasseredubrfilespesquisaposter20HENRIQUE20
Wilker20Natividade20SANTIAGO20Silvania20CAVALCANTI20DSP
20ResistC3AAncia20Bacterianapdfgt Acesso em 17 marccedilo 2014
HULSCHER M E J I et al Antibiotic prescribing in hospital a social and
behavioral scientific approach The Lancet Infectious Diaseases v 10 n 3 p 167-
165 2010
KIDWAI M SAPRA P BHUSHAN KR Synthetic strategies and medicinal
properties of beta-lactams Curr Med Chem 1999 695-215
KUMARASAMY K K et al Emergence of a new antibiotic resistance
mechanism in India Pakistan and the UK a molecular biological and
epidemiological stuy The Lancet Infectious Diseases v10 n 9 p 597- 602 2010
LINCOPAN N et al Enterobacteacuteria producing extended-spectrum β-
lacatamases and IMP-1 Metalo-β-lactamases isolated from Brazilian hospitals J Med
62
Microbiol 7 1-3 2006
LINCOPAN N et al First Isolation of Metalo-β-Lacatamase-Producing
Multiresistant Klebsiella pneumoniae from a patient in Brazil J Clin Microbiol 43(1)
516-519 2005
LIVERMORE D M et al What remains against carbapenem- resistant
Enterobacteriaceae Evaluation of choramphenicol ciprofloxacin colistina
fosfomycin minocycline nitrofurantoin temocilin and tigecycline International
Journal of Antimicrobial Agents v 37 n 5 p 415- 459 2011
LIVERMORE D M Fourten years in resistance International Journal of
Antimicrobial Agents v 39 283- 294 2012
LIVERMORE D M Bacterial resistance to carbapenems Adv Exp Med Biol
1995 39025-47
LIVERMORE D M Bacterial resistance origins epidemiology and impact
Clin Infect Dis 36S11-S23 2003
LIVERMORE D M et al Carbapenemases a problem in waiting Curr
Opin Microbiol 2000 3489-95
LU et al Universal pcr for common bacterial pathogens J CLIN
MICROBIOL VOL 38 2000
LU et al Use of PCR with Universal Primers and Restriction Endonuclease
Digestions for Detection and Identification of Common Bacterial Pathogens in
Cerebrospinal Fluid Journal of Clinical Microbiology June 2000 p 2076ndash2080
MARSCHALL J Met al Presence of the KPC Carbapenemase Gene in
Enterobacteriaceae Causing Bacteremia and Its Correlation with In Vitro
Carbapenem Susceptibility J Clin Microbiol 47 239-241 Jan 2009
63
MARTINS WMBS et al Prevalecircncia do gene blaKPC em isolados cliacutenicos
de Enterobacteriaceae e natildeo fermentadores encontrados em amostras clinicas em
um hospital universitaacuterio do Recife X Jornada de ensino pesquisa e extensatildeo ndash
JEPEX 2010 ndash UFRPE Recife 18 a 22 de outubro
MENDES C A C et al Polimixinas Revisatildeo com ecircnfase na sua
nefrotoxicidade Rev Assoc Med Bras 2009 55(6) 752-9
MOHR J F 3rd Update on the efficacy and tolerability of meropenem in the
treatment of serious bacteacuterial infections Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S41-51
2008
MONTEIRO J et al First report of KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae
strains in Brazil Antimicrob Agents Chemother Jan53(1)333-4 2009
MOREIRA V C et al Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia a antibioacuteticos
Disponiacutevel em
lthttpwwwcpglsucgbr6mostraartigosSAUDEVANESSA20CARVALHO20M
OREIRApdfgt Acesso em 21 marccedilo 2014
NETIKUL T et al Emergence of novel blaKPC-12 and blaKPC-13 variants in
carbapenem non-susceptible Enterobacter cloacae a first report of blaKPC gene in
Thailand European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases May
S372 2011
NETO V A et al Antibioacuteticos na praacutetica Meacutedica 6ordf Ediccedilatildeo Editorial
SarverSP Brasil 2007
NICOLAU D P Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of
meropenem Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S32-40 2008
64
OLIVEIRA A C et al Resistecircncia bacteriana e mortalidade em um centro de
terapia intensiva Rev Latino-Am Enfermagem nov-dez 2010
PAAUW A et al Failure to control an outbreak of qnrA 1-positive multidrug-
resistant Enterobacter clocae despite adequate implementation of recommended
infection control measures Journal of Clinical Microbiology v 45 n 5 p 1420-1425
2007
PATERSON D L et al Extended-Spectrum Beta-Lactamases a Clinical
Update Clinical Microbiology Reviews v 18 p 657-686 2005
PEIRANO G et al Carbapenem-hydrolysing beta-lactamase KPC-2 in
Klebsiella pneumonia isolated in Rio de Janeiro Brazil J Antimicrob Chemother Nov
20 2009
PERES-BOTA D et al Are infections due to resistant pathogens associated
with worse outcome in critically ill patients J Infect 200347(4)307-16
PIDDOCK L J V Clinically relevant chromosomally encoded multidrug
resistance effl ux pumps in bacterial Clin Microbiol Rev n19 p382-402 2006
PITOUT J D D et al Emergence of Enterobacteriaceae producing
extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) in the community J Antimicrob
Chemother May 56 2005
POSSEBON M I et al Resistecircncia bacteriana aos carbapenecircmicos
Bacterial resitence to carbapenems RBM rev bras med60(6)378380-378-382
jun 2003
QUEENAN A M et al Carbapenemases the versatile beta-lactamases
Clin Microbiol Rev Jul20(3)440-58 2007
65
RHOMBERG P R et al Summary trends for the meropenem yearly
susceptibility test information collection program a 10- year experience in the United
States (1999-2008) Diagnostic Microbiology and Infectiois Disease v 65 n4 p
414-426 2009
ROBLEDO I E et al Detection of KPC in Acinetobacter spp in Puerto Rico
J Antimicrob Agents Chemother 54 1354-1357 Mar 2010
ROGERS B A et al Country-to-country transfer os patients and the risk of
multi-resistant bacterial infection Clinical Infectious Disease v53 n1 p49- 56
2011
SHAH A A et al Characteristics epidemiology and clinicalimportance of
emerging strains of Gram-negative bacilli producing extended-spectrum
betalactamases Research in Microbiology v 155 p 409-421 2004
TURNER P J Extended- Spectrum Beta-Lactamases Clinical Infectious
Diseases v 41 p 273-275 2005
WOLTER D J et al Phenotypic and Enzymatic Comparative Analysis
between the Novel KPC variant KPC-5 and Its Evolutionary Variants KPC-2 and
KPC-4 Antimicrob Agents Chemother Nov 17 2008
WOODFORD N et al Carbapenemases of Chryseobacterium
(Flavobacterium) meningosepticum distribution of blaB and characterization of a
novel Metalo-beta-lactamase gene blaB3 in the type strain NCTC 10016
Antimicrob Agents Chemother Jun44(6)1448-52 2000
WOODFORF N Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in
India Pakistan and the UK a molecular biological and epidemiological study The
Lancet Infectious Diseases v 10 n 9 p 597-602 2010
66
WOODFORD et al Outbreak of Klebsiella pneumoniae Producing a New
Carbapenem- Hydrolyzing Class A β-Lactamase KPC-3 in a New York Medical
Center Antimicrobial agents and chemotherapy Dec 2004 p 4793ndash4799 Vol 48
No 12
YAGI T et al A preliminary survey of extended-spectrum β-lactamases
(ESBLs) in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Japan
FEMS Microbiology Letters 184 (2000) 53-56
YIGIT H et al Novel carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase KPC-1 from
a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumonia J Antimicrob Agents
Chemother 45 (4) 1151-1161 (2001)
ZAVASCKI A P et al KPC-2- producing Enterobacter cloacae in two cities
from Southern Brazil Int J Antimicrob Agents Apr 28 2009
ZHANEL G G et al Comparative review of the carbapenecircmicos Drugs
67(7)1027-52 2007
67
ANEXOS
Sequumlecircncia do oligo blaKPC
Query 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
Query 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
Query 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
68
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
Query 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
Query 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
69
Query 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
Query 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
Query 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
70
Sbjct 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
Query 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
Query 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
Query 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
71
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
Query 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
Query 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
72
Query 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Sbjct 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
Query 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
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Sbjct 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
Query 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
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73
Sbjct 901
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CCGTCAT 960
Query 961
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GCTCTGA 1020
Query 1021
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CCACTGT 1080
Query 1081
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74
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Query 1141
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AATCTTG 1200
Query 1201
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75
Query 1261
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TCGGCTT 1320
Query 1321
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LOCUS AF297554 1377 bp
DNA linear BCT 26-MAR-2001
DEFINITION Klebsiella pneumoniae carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
gene complete cds
ACCESSION AF297554
VERSION AF2975541 GI10121874
76
KEYWORDS
SOURCE Klebsiella pneumoniae
ORGANISM Klebsiella pneumoniae
Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Enterobacteriaceae Klebsiella
REFERENCE 1 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH QueenanAM
AndersonGJ Domenech-SanchezA
BiddleJW StewardCD
AlbertiS BushK and TenoverFC
TITLE Novel carbapenem-hydrolyzing beta-
lactamase KPC-1 from a
carbapenem-resistant strain of
Klebsiella pneumoniae
JOURNAL Antimicrob Agents Chemother 45 (4)
1151-1161 (2001)
PUBMED 11257029
REFERENCE 2 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH AndersonGJ and
TenoverFC
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (19-AUG-2000) Nosocomial
Pathogens Laboratory Branch
Centers for Disease Control and
Prevention 1600 Clifton Rd MS
G08 Atlanta GA 30333 USA
FEATURES LocationQualifiers
77
source 11377
organism=Klebsiella
pneumoniae
mol_type=genomic DNA
db_xref=taxon573
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-10_signal 7883
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hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
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product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
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translation=MSLYRRLVLLSCLSWPLAGFSATALTNLVAEPFAKLEQD
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KNALV
PWSPISEKYLTTGMTVAELSAAAVQYSDNAAANLLLKELGGPAGLTAFMRSIG
DTTFR
78
LDRWELELNSAIPSDARDTSSPRAVTESLQKLTLGSALAAPQRQQFVDWLKGN
TTGNH
RIRAAVPADWAVGDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTRAPNKDDK
HSEAV
IAAAARLALEGLGVNGQ
ORIGIN
1 cggggcagtt acagccgtta cagcctctgg
agagggagcg gcttgccgct cggtgataat
61 cccagctgta gcggcctgat tacatccggc
cgctacacct agctccacct tcaaacaagg
121 aatatcgttg atgtcactgt atcgccgtct
agttctgctg tcttgtctct catggccgct
181 ggctggcttt tctgccaccg cgctgaccaa
cctcgtcgcg gaaccattcg ctaaactcga
241 acaggacttt ggcggctcca tcggtgtgta
cgcgatggat accggctcag gcgcaactgt
301 aagttaccgc gctgaggagc gcttcccact
gtgcagctca ttcaagggct ttcttgctgc
361 cgctgtgctg gctcgcagcc agcagcaggc
cggcttgctg gacacaccca tccgttacgg
421 caaaaatgcg ctggttccgt ggtcacccat
ctcggaaaaa tatctgacaa caggcatgac
481 ggtggcggag ctgtccgcgg ccgccgtgca
atacagtgat aacgccgccg ccaatttgtt
541 gctgaaggag ttgggcggcc cggccgggct
gacggccttc atgcgctcta tcggcgatac
79
601 cacgttccgt ctggaccgct gggagctgga
gctgaactcc gccatcccaa gcgatgcgcg
661 cgatacctca tcgccgcgcg ccgtgacgga
aagcttacaa aaactgacac tgggctctgc
721 actggctgcg ccgcagcggc agcagtttgt
tgattggcta aagggaaaca cgaccggcaa
781 ccaccgcatc cgcgcggcgg tgccggcaga
ctgggcagtc ggagacaaaa ccggaacctg
841 cggagtgtat ggcacggcaa atgactatgc
cgtcgtctgg cccactgggc gcgcacctat
901 tgtgttggcc gtctacaccc gggcgcctaa
caaggatgac aagcacagcg aggccgtcat
961 cgccgctgcg gctagactcg cgctcgaggg
attgggcgtc aacgggcagt aaggctctga
1021 aaatcatcta ttggcccacc accgccgccc
ttgcgggcgg catggattac caaccactgt
1081 cacatttagg ctaggagtct gcgcggcaga
gccgtgtgac cggttttctg tagagcactg
1141 acgatggcgg cggcgctctc tgcaattggc
aaggcgtcgg cgccaaggat accaatcttg
1201 cggcgcgcgg cgtgttatga cgactggggt
gcatttgagc cgccccattt aaccttcgcc
1261 ctcacagata cgccattcgc ctcaaattta
gcgccatgca gacgagcttc cactcggctt
1321 gcaccttgtc caggcccctc atgctgaact
gacgcaatcc catcaccgcc ttgatca
80
RESUMO
Introduccedilatildeo A Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) eacute uma enzima
produzida por bacteacuterias gram-negativas (enterobacteacuterias) que confere resistecircncia
aos antimicrobianos carbapenecircmicos meropenen ertapenen imipenen classe
amplamente utilizada no tratamento de infecccedilotildees envolvendo Enterobacteriaceae
Esta resistecircncia eacute uma das principais causas de falha terapecircutica devido agrave
produccedilatildeo de beta-lactamases de espectro estendido (ESBL) por esta bacteacuteria
mecanismo de resistecircncia mais comum aos antibioacuteticos beta-lactacircmicos de amplo
espectro A identificaccedilatildeo destas enterobacteacuterias pode ser feita atraveacutes de teacutecnicas
de identificaccedilatildeo molecular de patoacutegenos dentre elas a Reaccedilatildeo em Cadeia de
Polimerase (PCR) que consiste na anaacutelise do padratildeo de amplificaccedilatildeo de elementos
repetidos encontrados no genoma bacteriano permitindo uma maior rapidez na
obtenccedilatildeo de resultados quando comparada com outros meacutetodos aleacutem de
apresentar alta reprodutibilidade simples execuccedilatildeo e implementaccedilatildeo dependendo
da aplicaccedilatildeo da teacutecnica natildeo enfrenta problemas com a degradaccedilatildeo do DNA
Objetivo Caracterizar genes de resistecircncia das Enterobacteacuterias produtoras de
carbapenemases e aspectos epidemioloacutegicos e cliacutenicos de pacientes internados em
um hospital puacuteblico do Distrito Federal Materiais e meacutetodos Estudo transversal
onde foi realizado o teste de susceptibilidade das Enterobacteacuterias aos antibioacuteticos
Carbapenecircmicos a partir dos materiais bioloacutegicos coletados dos pacientes
internados no Hospital Regional da Asa Norte (HRAN) Anaacutelise molecular dos genes
16S rRNA e blaKPC utilizando PCR aleacutem de anaacutelises estatiacutesticas Resultados e
discussatildeo Detectou-se a regiatildeo ribossomal e o gene de resistecircncia testado
confirmando a resistecircncia microbiana Maior prevalecircncia de pacientes do sexo
masculino (53) desfecho cliacutenico de oacutebito(59) siacutetio de infecccedilatildeo de swab retal
(47) Klebsiella pneumoniae foi microrganismo mais encontrado (82) Natildeo houve
diferenccedila estatiacutestica entre as variaacuteveis e o desfecho cliacutenico (p foi gt 005)
Conclusatildeo Atraveacutes da caracterizaccedilatildeo molecular dos genes de resistecircncia blaKPC
e Universal confirmou-se a presenccedila de Klebsiella pneumoniae resistente aos
carbapenecircmicos Os valores de p natildeo foram significativos (lt005) sendo
assimnenhuma das variaveacuteis estudadas foram o principal motivo do desfecho
cliacutenico (alta ou oacutebito)
Palavras chaves Klebsiella pneumoniae carbapenemase Resistecircncia bacteriana a
antimicrobianos β-lactamases de espectro estendido (ESBL) Reaccedilatildeo em Cadeia de
Polimerase (PCR)
ABSTRACT
Introduction Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) is an enzyme produced
by gram - negative bacteria (Enterobacteriaceae) which confers resistance to
carbapenem antibiotics meropenen ertapenen imipenem class widely used in the
treatment of infections involving Enterobacteriaceae This resistance is a major
cause of treatment failure due to beta-lactamases production of extended spectrum
(ESBL) by this bacterium most commonly resistance to beta-lactam antibiotics of
wide spectrum engine The identification of these Enterobacteriaceae can be made
by techniques of molecular identification of pathogens among them the Polymerase
Chain Reaction (PCR) which consists in the analysis of the amplification pattern of
repeated elements found in the bacterial genome allowing faster in getting results
when compared with other methods in addition to presenting high reliability simple
implementation and deployment depending on the application of the technique has
no trouble with the degradation of DNA Objective To characterize the resistance
genes of Enterobacteriaceae producing carbapenemases and epidemiological and
clinical features of patients admitted to a public hospital in the Federal District
aspects Materials and methods Cross-sectional study where susceptibility testing
of Enterobacteriaceae to antibiotics Carbapenems from biological materials collected
from patients admitted to the Hospital Regional da Asa Norte ( HRAN ) was
performed Molecular analysis of 16S rRNA genes and blaKPC using PCR in
addition to statistical analysis Results and Discussion Was detected region and
the ribosomal tested resistance gene confirming the microbial resistance Higher
prevalence of male patients (53 ) clinical outcome of death (59 ) site of infection
rectal swabs (47 ) Klebsiella pneumoniae was found more microorganism (82)
There was no statistical difference between the variables and the clinical outcome (p
was gt 005) Conclusion Through molecular characterization of genes and the
Universal blaKPC resistance confirmed the presence of Klebsiella pneumoniae
resistant to carbapenems P values were not significant (lt 005) so none of the
variables studied were the main reason the clinical outcome (discharge or death)
Keywords Klebsiella pneumoniae Carbapenemase Bacterial resistance to
antibiotics Extended-Spectrumβ-lactamases (ESBL) Polimerase Chain Reaction
(PCR)
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Accedilatildeo do szlig-lactacircmico sobre a bacteacuteria gram-positiva e gram-negativa
Figura 2 Divulgaccedilatildeo internacional de Klebsiella pneumoniae Carbapenemase
(KPC) produtoras de Enterobacteriaceae
Figura 3 Mecanismos de resistecircncia bacteriana
Figura 4 Etapas da Reaccedilatildeo de PCR
Figura 5 Mecanismo de semeamento de material bioloacutegico oriundos de pacientes
com suspeita de infecccedilatildeo por KPC
Figura 6 Interpretaccedilatildeo resultado do Teste de Hodge Modificado
Figura 7 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC das amostras dos
17 pacientes estudados
Figura 8 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC da mostra A3
estudada
Figura 9 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA das amostras
dos 17 pacientes estudados
Figura 10 Gel de agarose a 2 da digestatildeo do amplicon do gene 16S rRNA das
amostras com a enzima HaeIII evidenciando diversos fragmentos proacuteximos a 200
pb
Figura 11 Infecccedilatildeo por KPC segundo sexo dos 17 pacientes investigados no
HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
Figura 12Isolado de KPC segundo desfecho cliacutenico dos 17 pacientes investigados
no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
Figura 13 Isolados de KPC segundo local da coleta da amostra nos 17 pacientes
investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
Figura 14Isolado de KPC segundo microrganismo encontrado em 17 pacientes
investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Criteacuterios Interpretativos para testes de sensibilidade
Tabela 2 Nuacutemero de acesso ao GenBank dos alelos blaKPC e seus microrganismos
originais
Tabela 3 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do gene blaKPC
Tabela 4 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do gene
universal
Tabela 5 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da digestatildeo do gene universal
Tabela 6 - Distribuiccedilatildeo das variaacuteveis estudadas perfil geneacutetico sexo coleta
tipificaccedilatildeo de microrganismos e anaacutelise da resistecircncia bacteriana segundo o
desfecho cliacutenico Brasiacutelia-DF 2010 a 2012
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AmpC- Adenosina Monofosfato Ciacuteclico
BRMD- Bacteacuterias multirresistentes
CCIH- Comissatildeo de Controle de Infecccedilatildeo Hospitalar
CDC- Centers for Disease Control and Prevention
CIM- Concentraccedilatildeo Inibitoacuteria Miacutenima
CLSI- Clinical and Laboratory Standards Institute
DNA- Aacutecido Desoxirribonucleacuteico
E coli- Escherichia coli
ERIC-PCR - Enterobacterial Repet it ive Intergenic Consensus
ESBL- Beta-Lactamases de Espectro Estendido
Et al- e outros
ETP- Ertapenem
HRAN- Hospital Regional da Asa Norte
K ornithinolytica- Klebsiella ornithinolytica
K oxytoca- Klebsiella oxytoca
K planticola- Klebsiella planticola
K pneumoniae- Klebsiella pneumoniae
K terrigena- Klebsiella terrigena
KPC - Klebsiella pneumoniae produtora de Carbapenemase
KPCNEG- Bacilos Gram-Negativos Natildeo Fermentadores
KPCPOS- Bacilos Gram-Positivo Natildeo Fermentadores
MBL- metalo-beta-lactamases
MEM- Meropenem
NA- Natildeo se aplica
Oligo- Oligonucleotiacutedeos
PB- Pares de Bases
PBPs (Penicilim-Binding-Protein)- Proteiacutenas de ligaccedilatildeo agrave penicilina
PCR- Polymerase Chain Reaction (Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase)
PFGE - Pulsed-Field Gel Electrophoresis (Eletroforese em campo pulsado)
RAPD- Randomly Amplified Polymorphic DNA (DNA polimoacuterfico amplificado
aleatoriamente)
RFLPrsquos - ldquoRestriction Fragment Length Polymorphismsrdquo( polimorfismos de tamanho
de fragmentos de restriccedilatildeo)
THM- Teste de Hodge Modificado
TSA- Teste de Susceptibilidade aos Antibioacuteticos
UTI- Unidade de Terapia Intensiva
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 15
11 Klebsiella pneumoniae produtora de Carbapenemase (KPC) 15
1 2 Resistecircncia bacteriana 20
13 Anaacutelise geneacutetica de microrganismos 27
2 JUSTIFICATIVA 30
3 OBJETIVOS 31
31 Objetivo geral 31
32 Objetivos Especiacuteficos 31
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS 32
4 1 Coleta e transporte das amostras bioloacutegicas 32
4 2 Procedimentos para confirmaccedilatildeo de resistecircncia bacteriana por disco de
Ertapenem (adaptado CDC 2004) 32
4 2 1 Interpretaccedilatildeo dos Resultados 33
4 3 Teste de susceptibilidade aos antibioacuteticos 34
4 4Teste de Hodge Modificado (THM) (adaptado CDC 2004) 35
441 Controle de qualidade (CQ) 35
442 InterpretaccedilatildeoResultados 35
4 5 Extraccedilatildeo de DNA bacteriano 37
4 6 Iniciadores e reaccedilatildeo de PCR 38
4 7 Digestatildeo 41
4 8 Eletroforese em gel de agarose 41
4 9 Descarte de resiacuteduos 42
4 10 Aspectos epidemioloacutegicos e cliacutenicos 42
4 12 Anaacutelises estatiacutesticas 42
4 13 Preceitos eacuteticos 43
5 RESULTADOS 44
51 Anaacutelise molecular 44
5 1 1 Gene blaKPC 44
5 1 2 Gene 16S rRNA 45
5 2 Anaacutelises epidemioloacutegicas 46
5 2 1 Sexo 46
5 2 2 Desfecho cliacutenico 47
5 2 3 Local da coleta 48
5 2 4 Microrganismo 48
6 DISCUSSAtildeO 53
7 CONCLUSAtildeO 57
15
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC)
Klebsiella pneumoniae pertence aacute famiacutelia Enterobacteriaceae
encontrado em locais como aacutegua solo plantas e esgoto Satildeo encontradas cinco
espeacutecies K pneumoniae K oxytoca K planticola K terrigena e K ornithinolytica
O gecircnero Klebsiella eacute definido como contendo bacilos Gram-negativos natildeo moacuteveis
em forma de bastatildeo e geralmente encapsuladas que produzem lisina
descarboxilase mas natildeo produzem ornitina descarboxilase Provavelmente a
colonizaccedilatildeo em seres humanos ocorre por contato com as diferentes fontes
ambientais podendo ser encontrada colonizando a orofaringe e fezes de pessoas
sadias Pessoas imunocomprometidas a bacteacuteria encontra um ambiente favoraacutevel
para seu crescimento levando aos quadros de infecccedilatildeo (MOREIRA et al 2014)
A Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) eacute uma enzima produzida por
enterobacteacuterias gram-negativas sendo um mecanismo de resistecircncia aos antimi-
crobianos carbapenecircmicos meropenen ertapenen eou imipenen classe
amplamente utilizada no tratamento de infecccedilotildees envolvendo Enterobacteriaceae
Ela tambeacutem eacute capaz de inativar os agentes β-lactacircmicos cefalosporinas penicilinas
e o aztreonam (COTRIM et al 2012)
Devido agrave semelhanccedila estrutural e estereoquiacutemica os antibioacuteticos beta-
lactacircmicos possuem um mecanismo de accedilatildeo comum ao grupo Eles atuam inibindo
a siacutentese da parede celular bacteriana atraveacutes do mecanismo de bloqueio da
transpeptidaccedilatildeo responsaacutevel pela uniatildeo dos componentes individuais do
peptidoglicano conforme demonstrado na figura 1 (KIDWAI et al 1999)
A accedilatildeo destes antibioacuteticos eacute atraveacutes de ligaccedilotildees covalentes com as proteiacutenas
as Penicilim-Binding-Protein (proteiacutena de ligaccedilatildeo da penicilina- PBP ou PLP) que se
encontram presentes na membrana citoplasmaacutetica de todas as bacteacuterias Devido agraves
mutaccedilotildees ocorre uma induccedilatildeo na alteraccedilatildeo dessas proteiacutenas podendo determinar
uma diminuiccedilatildeo da afinidade dos beta-lactacircmicos agraves mesmas A accedilatildeo dos
carbapenecircmicos eacute atraveacutes da sua ligaccedilatildeo agraves PBPs presentes na parede bacteriana
especialmente as PBP1 e PBP2 provocando a lise osmoacutetica da bacteacuteria Aleacutem
disso eles tecircm uma facilidade na penetraccedilatildeo da bacteacuteria por meio dos canais
poriacutenicos presentes nas bacteacuterias gram-negativas induzindo um efeito poacutes-
16
antibioacutetico Quando comparados com outros beta-lactacircmicos os carbapenecircmicos
satildeo mais resistentes agrave hidroacutelise pela maioria das beta-lactamases tanto
cromossocircmicas como plasmiacutedicas (LIVERMORE 1995 LIVERMORE et al 2000)
Figura 1 Accedilatildeo do szlig-lactacircmico sobre a bacteacuteria gram-positiva e gram-
negativa Fonte
ltlthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controle
opas_webmodulo3gramn_lacta2htmgt (adaptado)
A bacteacuteria Klebsiella pneumoniae quando apresenta gene ESBL pode
expressar resistecircncia a ateacute 95 dos antimicrobianos existentes no acircmbito
farmacecircutico sendo a produccedilatildeo de beta-lactamases de espectro estendido (ESBL)
17
por esta bacteacuteria uma das principais causas de falha terapecircutica Existem outras
formas de resistecircncia emergentes de grande importacircncia como a produccedilatildeo de
beta-lactamases tipo adenosina monofosfato ciacuteclico (AmpC) que hidrolizam
cefoxitina as carbapenemases como as metalo-beta-lactamases (MBL) e
carbapenemases tipo KPC (MOREIRA et al 2014)
O mecanismo de resistecircncia mais comum aos antibioacuteticos beta-lactacircmicos de
amplo espectro eacute a produccedilatildeo de ESBL por enterobacteacuterias A accedilatildeo hidroliacutetica
apresentadas por estas enzimas pode conferir clinicamente resistecircncia ao
aztreonam cefalosporina e a todas as penicilinas (PATERSON et al 2005) As
ESBL satildeo enzimas mediadas por genes plasmidiais (transmissiacuteveis entre as
espeacutecies) Os principais microrganismos produtores de ESBL satildeo Klebsiella
pneumoniae (mais encontrada) Escherichia coli e Proteus mirabilis podendo ocorrer
em outros membros da famiacutelia Enterobacteriaceae e em alguns microrganismos natildeo
enteacutericos como Acinetobacter ssp (TURNER 2005) A importacircncia cliacutenica meacutedica
destes microrganismos portadores de ESBL eacute que graccedilas aacutes suas resistecircncias a
muitas classes de antimicrobianos o tratamento de infecccedilotildees eacute difiacutecil gerando um
aumento da morbidade e mortalidade dos pacientes (SHAH et al 2004)
A enzima KPC foi detectada pela primeira vez na Carolina do Norte Costa
Leste dos Estados Unidos no ano de 1996 em Klebsiella pneumoniae dando entatildeo
este nome a enzima Em pouco tempo ela disseminou por outras regiotildees e
recentemente tornou-se uma das preocupaccedilotildees quanto agrave sauacutede puacuteblica mundial
Os paiacuteses de onde KPCs tecircm sido relatados desde 2001 satildeo mostrados na figura 2
apresentando como os organismos tecircm agora sido disseminados amplamente pelo
mundo (NEIL GUPTA et al 2011)
18
Figura 2 Divulgaccedilatildeo internacional de Enterobacteriaceae produtora de
Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC)( NEIL GUPTA et al 2011)
Este mapa apresenta paiacuteses onde Enterobacteriaceae produtoras KPC de
foram descritos em relatoacuterios publicados disponiacuteveis a partir de 11 fevereiro de
2011 Os paiacuteses natildeo destacadas nesta figura tambeacutem podem apresentar a presenccedila
de Enterobacteriaceae produtoras de KPC poreacutem pode ter tido uma falta de
vigilacircncia sistemaacutetica para estes organismos ( NEIL GUPTA et al 2011)
No ano de 2005 foram registradas pela primeira vez essas bacteacuterias
produtoras de carbapenemases Apoacutes 6 anos deste primeiro relato elas passaram a
causar surtos mais graves em nosso paiacutes Em janeiro de 2011 foram notificados no
Distrito FederalBrasil 367 casos em um curto espaccedilo de tempo (01 a 08 de janeiro
de 2011) com 26 oacutebitos A maior parte destes casos (263 casos) foi identificada nas
unidades de terapia intensiva ndash UTI (COTRIM et al 2012)
O potencial de disseminaccedilatildeo da KPC eacute alto devido agrave grande capacidade de
transferecircncia do seu material geneacutetico e por conseguinte os genes de resistecircncia
O controle de epidemias eacute difiacutecil devido a esta caracteriacutestica de faacutecil disseminaccedilatildeo
preocupando os profissionais da aacuterea de sauacutede devido agrave dificuldade de tratamento
podendo resultar em um aumento das taxas de mortalidade Apesar da maior
19
frequumlecircncia em Klebsiella pneumoniae a KPC pode ser identificada em outras
bacteacuterias como a Enterobacter cloacae Citrobacter freundii Salmonella spp E coli
e Pseudomonas spp (DIENSTMANN et al 2010)
Os pacientes com comorbidades incluindo pacientes transplantados
neutropecircnicos em ventilaccedilatildeo mecacircnica em Unidade de Terapia Intensiva (UTI)
com longos periacuteodos de internaccedilatildeo que apresentam risco aumentado de infecccedilatildeo ou
colonizaccedilatildeo para bacteacuterias multirresistentes satildeo mais vulneraacuteveis a Klebsiella
pneumoniae produtora de KPC (COTRIM et al 2012)
Os sinais e sintomas apresentados por um indiviacuteduo infectado por KPC satildeo
febre ou hipotermia taquicardia piora do quadro respiratoacuterio e em casos mais
graves hipotensatildeo inchaccedilo e sepse Quanto ao siacutetio de infecccedilatildeo a bacteacuteria que
possui a enzima KPC pode causar pneumonia associada agrave ventilaccedilatildeo mecacircnica
infecccedilatildeo do trato urinaacuterio infecccedilatildeo de corrente sanguiacutenea infecccedilatildeo de partes moles
e outros tipos de infecccedilatildeo (COTRIM et al 2012)
Para desenvolver a infecccedilatildeo a colonizaccedilatildeo eacute um preacute-requisito poreacutem o
pacientes pode estar colonizado ou seja ser portadores de KPC e natildeo desenvolver
a infecccedilatildeo (ALVES et al 2013) A forma de transmissatildeo eacute basicamente por
contato com secreccedilatildeo ou excreccedilatildeo de pacientes infectados ou colonizados logo
fora do ambiente hospitalar a bacteacuteria natildeo representa perigo (COTRIM et al
2012)
As opccedilotildees terapecircuticas para o tratamento da Klebsiella pneumoniae eacute
dividida em Terapia Empiacuterica e Terapia apoacutes a determinaccedilatildeo do perfil de
sensibilidade A terapia empiacuterica para infecccedilotildees por enterobacteacuterias multirresistentes
se baseia na utilizaccedilatildeo de polimixina B ou polimixina E (Colistina) em associaccedilatildeo
com um (1) ou mais dos antimicrobianos da classe dos aminoglicosiacutedeos
(gentamicina ou amicacina) Carbapenecircmicos (meropenem ou doripenem) eou
tigeciclina (ANVISA 2013)
Recomenda-se usar sempre associaccedilotildees de dois ou trecircs antimicrobianos
sendo um deles a polimixina B ou a polimixina E (colistina) Deve-se evitar a
utilizaccedilatildeo de monoterapias pelo risco de raacutepido desenvolvimento de resistecircncia A
escolha do(s) faacutermaco(s) de associaccedilatildeo com polimixina B ou E deve se basear
preferencialmente no perfil de susceptibilidade esperado aos referidos
20
medicamentos das enterobacteacuterias resistentes aos carbapenecircmicos detectadas no
hospital ou na ausecircncia de dados locais na regiatildeo Deve-se considerar igualmente
o local de infecccedilatildeo e a penetraccedilatildeo esperada do antimicrobiano na escolha da droga
a ser utilizada na combinaccedilatildeo (ANVISA 2013)
Apoacutes a liberaccedilatildeo do perfil de sensibilidade deve-se adequar o uso dos
medicamentos Sempre que possiacutevel manter no miacutenimo 2 (dois) faacutermacos com
sensibilidade comprovada in vitro Natildeo havendo sensibilidade a um segundo
medicamento (suscetibilidade apenas agrave polimixina B ou E) recomenda-se manter a
terapia combinada de polimixina B ou E com carbapenecircmicos (meropenem ou
doripenem) ou tigeciclina na tentativa de ocorrecircncia de sinergismo entre elas
(ANVISA 2013)
Sugere-se aleacutem da determinaccedilatildeo das Concentraccedilotildees Inibitoacuterias Miacutenimas
(CIMs) para uma das polimixinas (B ou E) que tambeacutem sejam determinadas as
CIMs de tigeciclina e carbapenecircmicos (meropenem) bem como a consultoria de um
infectologista (ou Comissatildeo de Controle de Infecccedilatildeo Hospitalar- CCIH) para a
determinaccedilatildeo da terapia combinada com base na interpretaccedilatildeo do antibiograma
CIM e quadro cliacutenico do paciente No caso de resistecircncia agraves polimixinas
(concentraccedilotildees inibitoacuterias miacutenimas [CIMs] gt 2 mgL) recomenda-se a associaccedilatildeo de
dois ou trecircs do antimicrobianos sugeridos para a combinaccedilatildeo (ANVISA 2013)
A antissepsia eficiente do ambiente dos instrumentos ciruacutergicos e das matildeos
com o uso do aacutelcool a 70 eacute fundamental para a contenccedilatildeo de surtos Aleacutem disto
os pacientes contaminados devem permanecer isolados ateacute o controle da infecccedilatildeo
para evitar a disseminaccedilatildeo da bacteacuteria (COTRIM et al 2012)
1 2 Resistecircncia bacteriana
Hoje a disseminaccedilatildeo e a proliferaccedilatildeo das bacteacuterias resistentes estatildeo cada
dia mais presente As bacteacuterias multirresistentes (BRMD) poderatildeo levar agrave
humanidade a uma era poacutes-antibioacutetica resultando em uma ausecircncia de qualquer
opccedilatildeo de tratamento para os portadores destas cepas (HENRIQUE et al 2014)
Os fatores envolvidos na disseminaccedilatildeo desses patoacutegenos multirresistentes
satildeo diversos incluindo o uso irracional de antimicrobianos procedimentos invasivos
21
(cirurgias implantaccedilatildeo de proacuteteses meacutedicas e outros) e a transferecircncia de material
geneacutetico com a informaccedilatildeo de resistecircncia a antibioacuteticos entre as bacteacuterias
(DIENSTMANN et al 2010 ENDIMIAMI et al 2009 FONTANA et al 2010)
Com a praacutetica da antibioticoterapia principalmente em ambientes
nosocomiais os mecanismos de resistecircncia tornaram-se comuns Esses
mecanismos incluem alteraccedilatildeo na permeabilidade da membrana celular que
impede a entrada do antibioacutetico na ceacutelula bombeamento do antibioacutetico para fora da
mesma pelo mecanismo de efluxo mutaccedilatildeo geneacutetica que altera de alguma forma o
alvo do antibioacutetico e consequumlentemente natildeo afeta o funcionamento da bacteacuteria
bem como desenvolvimento da capacidade de degradar ou da inativaccedilatildeo do
antibioacutetico (COTRIM et al 2012) Estes mecanismos estatildeo representados na figura
3
Figura 3 Mecanismos de resistecircncia bacteriana Fonte
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controle
opas_webmodulo3pop_mecanismohtmgt
Um dos mais importantes mecanismos de resistecircncia eacute a alteraccedilatildeo do local-
alvo onde atua determinado antimicrobiano de modo a impedir a ocorrecircncia de
qualquer efeito inibitoacuterio ou bactericida As bacteacuterias podem adquirir um gene que
22
codifica um novo produto resistente aos antimicrobianos substituindo o alvo original
por exemplo o Staphylococcus aureus resistente agrave oxacilina e estafilococos
coagulase-negativos adquiriram o gene cromossocircmico Mec A e produzem uma PBP
ou PLP resistente aos β-lactacircmicos denominada 2a ou 2 que eacute suficiente para
manter a integridade da parede celular durante o crescimento quando outras PBPs
essenciais satildeo inativadas por antibimicrobianos β-lactacircmicos Como alternativa um
gene receacutem-adquirido pode atuar para modificar um alvo tomando-o menos
vulneraacutevel a determinado antimicrobiano Assim um gene transportado por
plasmiacutedeo ou por transposon codifica uma enzima que inativa os alvos ou altera a
ligaccedilatildeo dos antimicrobianos como ocorre com eritromicina e clindamicina (ANVISA
2007)
Em funccedilatildeo da bomba de efluxo pode variar a especificidade do antibioacutetico
Ele atua por meio do bombeamento ativo de antimicrobianos do meio intracelular
para o extracelular gerando uma resistecircncia bacteriana a determinados
antimicrobianos como eacute o caso da resistecircncia agraves tetraciclinas codificada por
plasmiacutedeos em Escherichia coli devido agrave presenccedila de proteiacutenas integrantes da
membrana plasmaacutetica bacteriana (PIDDOCK 2006)
O aumento da siacutentese de proteiacutenas eacute o principal responsaacutevel pela resistecircncia
antimicrobiana devido agraves vaacuterias mutaccedilotildees que ocorrem em seus repressores
transcricionais Estas mutaccedilotildees tambeacutem podem influenciar levando a um aumento
da eficiecircncia do transporte dos antibioacuteticos para o exterior da ceacutelula (HARBOTTLE
et al 2006)
A resistecircncia aos antibioacuteticos eacute frequumlentemente associada agrave alteraccedilatildeo
diminuiccedilatildeo da permeabilidade que ocorre na membrana externa das bacteacuterias gram-
negativas O fluxo de moleacuteculas para o interior da ceacutelula ocorre por caracteriacutesticas
peculiares como carga estrutura e dimensatildeo e atraveacutes de proteiacutenas de membrana
as quais formam canais Este percurso eacute utilizado pelos antibioacuteticos para atingir o
interior da ceacutelula bacteriana ou o espaccedilo periplasmaacutetico como eacute o caso dos
antibioacuteticos β-lactacircmicos Portanto a perda de funccedilatildeo destas proteiacutenas pode
efetivamente causar a diminuiccedilatildeo da susceptibilidade a vaacuterios antibioacuteticos
(LIVERMORE 2003)
23
Os mecanismos de resistecircncia que podem impedir a accedilatildeo de antimicrobianos
satildeo vaacuterios O faacutermaco atua de forma a inibir os processos essenciais a multiplicaccedilatildeo
e sobrevivecircncia da ceacutelula bacteriana como a membrana citoplasmaacutetica e
consequumlentemente bloqueando a siacutentese proteacuteica de aacutecidos nucleacuteicos e da parede
celular A resistecircncia bacteriana eacute um mecanismo natural de defesa Sendo assim
as bacteacuterias estatildeo em constante defesa e para cada novo faacutermaco desenvolvido as
bacteacuterias iratildeo desenvolver resistecircncia em algum momento (POSSEBON et al
2003)
O grupo de antibioacuteticos beta-lactacircmicos satildeo amplamente utilizado e se
encontram dentro da classe dos melhores agentes antimicrobianos com relevacircncia
cliacutenica No entanto o seu uso tem sido restringido devido a vaacuterios mecanismos de
resistecircncia O desenvolvimento dos carbapenecircmicos surgiu devido agrave proliferaccedilatildeo de
beta-lactamases mediadas por plasmiacutedeos e cromossomos (POSSEBON et al
2003)
A bacteacuteria KPC tem um gene chamado SHV-1 que tem a caracteriacutestica de
resistecircncia a quase todos os tipos de antimicrobianos inclusive os carbapenecircmicos
especiacuteficos para o tratamento de infecccedilotildees por bacteacuterias multiresistentes e
emergecircncias Mesmo com no seu coacutedigo geneacutetico a informaccedilatildeo necessaacuteria para o
desenvolvimento da resistecircncia a resistecircncia da bacteacuteria soacute eacute desenvolvida caso a
bacteacuteria entre em contato com o antibacteriano desencadeando todo o processo
nos casos de resistecircncia induzida comuns em KPC (MOREIRA et al 2014)
A resistecircncia bacteriana pode ser apresentada de forma intriacutenseca ou
adquirida A resistecircncia intriacutenseca faz parte das caracteriacutesticas fenotiacutepicas naturais
do microrganismo ou seja faz parte de sua heranccedila geneacutetica sendo transmitida
verticalmente a prole sem perda da caracteriacutestica A presenccedila ou ausecircncia do alvo
para a accedilatildeo da droga eacute o principal determinante deste tipo de resistecircncia
(MOREIRA et al 2014) Essa resistecircncia corresponde a uma caracteriacutestica de
espeacutecie bacteriana quando estes microrganismos satildeo naturalmente resistentes a
certo tipo de antibioacutetico Este processo eacute decorrente da ausecircncia de estruturas de
atuaccedilatildeo de antimicrobianos ou a impermeabilidade por parte de estruturas
perifeacutericas das bacteacuterias (HENRIQUE et al 2014)
24
A resistecircncia adquirida aos antibioacuteticos por sua vez ocorre quando haacute uma
da mutaccedilatildeo de genes reguladores ou estruturais aquisiccedilatildeo de genes de resistecircncia
veiculados por elementos geneacuteticos moacuteveis ou da combinaccedilatildeo entre eles Este
aparecimento de resistecircncia em uma espeacutecie bacteriana era anteriormente sensiacutevel
a droga e devido a um destes fatores se torna resistente O fenoacutetipo resultante
desta resistecircncia natildeo estaraacute presente nas ceacutelulas genitoras e sim nos indiviacuteduos de
uma linhagem bacteriana derivada de um organismo susceptiacutevel Os genes muitas
vezes satildeo adquiridos por meio de elementos moacuteveis como plasmiacutedeos e
transposons (MOREIRA et al 2014)
Entatildeo a resistecircncia adquirida ocorre por diversos mecanismos geneacuteticos tais
como produccedilatildeo de enzimas inativadoras interferecircncia com a entrada e acuacutemulo de
droga na bacteacuteria alteraccedilatildeo do receptor para accedilatildeo da droga via metaboacutelica
alternativa Eacute originada por meio de uma alteraccedilatildeo a niacutevel geneacutetico da ceacutelula de
natureza cromossocircmica pelos processos de mutaccedilatildeo transduccedilatildeo e transformaccedilatildeo
ou extra cromossocircmica (plasmidial) (HENRIQUE et al 2014)
Como todo antibioacutetico β-lactacircmicoos carbapenecircmicos tem como mecanismo
de accedilatildeo a inibiccedilatildeo da siacutentese proteacuteica atraveacutes da accedilatildeo de inibiccedilatildeo da parede
microbiana fazendo a ligaccedilatildeo e inativaccedilatildeo das proteiacutenas ligadoras de penicilinas
(NETO et al 2007)
Imipenem e meropenem antibioacuteticos pertencentes ao grupo dos
carbapenecircmicos possuem um amplo espectro de accedilatildeo in vitro incluindo atividade
contra cocos gram-positivos bacilos gram-negativos e bacteacuterias anaeroacutebias (MOHR
2008) Jaacute o ertapenem possui um espectro de accedilatildeo mais limitado que o os dois
antibioacuteticos anteriormente citados tendo uma eficiecircncia limitada contra os bacilos
gram-negativos natildeo fermentadores Um novo antibioacutetico carbapenecircmico ainda natildeo
disponiacutevel no Brasil doripenem possui uma atividade mais potente principalmente
contra Pseudomona aeruginosa devido ao seu mecanismo de accedilatildeo que combina os
espectros de accedilatildeo de imipenem e meropenem (ZHANEL et al 2007)
Devido as suas estabilidades espectro de accedilatildeo poucos relatos de
resistecircncia boa toleracircncia pelos pacientes com efeitos adversos mais comuns as
complicaccedilotildees no siacutetio da infusatildeo e toxicidade gastrintestinal estes antibioacuteticos
carbapenecircmicos tecircm sido considerados terapia de escolha (NICOLAU 2008) Como
25
uma resposta adaptativa das Enterobacteacuterias o iacutendice de resistecircncia aos
carbapenecircmicos tem aumentado nos uacuteltimos anos de forma proporcional ao seu
uso limitando imensamente as opccedilotildees terapecircuticas para as infecccedilotildees causadas por
estes microrganismos (FALAGAS et al 2009)
As enzimas produtoras de betalactamases hidrolisam o anel betalactacircmico
tornando este mecanismo de resistecircncia o mais importante Os dois grupos mais
preocupantes satildeo o grupo das betalactamases de aspecto ampliado e os da
carbapenemases que aleacutem de hidrolizar os carbapenecircmicos hidrolizam todas as
outras classes de betalactacircmicos Em enterobacteacuterias as carbapenemases mais
prevalentes satildeo codificadas por genes dos grupos blaKpc blaIMP blaVIM blaNdm
e blaOxa A ocorrecircncia de carbapenemases eacute mais frequentemente em bacteacuterias
gram-negativas fermentadoras da glicose conhecidas como enterobacteacuterias
predominantes nos gecircneros Klebsiella Serratia Citrobacter Enterobacter
Escherichia Samonella Proteus Morganella Podem ser encontradas tambeacutem em
bacteacuterias gram-negativas natildeo fermentadoras como espeacutecies de Acinetobacter e de
Pseudomonas (ALVES et al 2013)
Carbapenemases satildeo enzimas plasmiacutedio-mediados resistentes a todos
antibioacuteticos betalactacircmicos As bacteacuterias que possuem o gene blaKpC responsaacutevel
pela codificaccedilatildeo da produccedilatildeo de carbapenemases apresentam resistecircncia aos
antibioacuteticos betalactacircmicos impedindo a accedilatildeo destes antibioacuteticos contra infecccedilotildees
(ALVES et al 2013)
A transmissatildeo das carbapenemases a diferentes cepas de enterobacteacuterias se
daacute atraveacutes de plasmiacutedeos que satildeo pequenas moleacuteculas circulares de DNA com a
capacidade de se replicarem independentemente do DNA cromossocircmico
permitindo a troca de material geneacutetico entre gecircneros e espeacutecies diferentes de
enterobacteacuterias O raacutepido desenvolvimento de surtos em ambientes hospitalares eacute
explicado por essa disseminaccedilatildeo plasmidial (COTRIM et al 2012)
De acordo com o criteacuterio de interpretaccedilatildeo do Clinical and Laboratory
Standards Institute (CLSI 2009) a maioria das KPC isoladas natildeo apresenta
resistecircncia completa aos carbapenecircmicos (Imipenem e Meropenem apresentam
uma Concentraccedilatildeo Inibitoacuteria Miacutenima (CIM) de 2-8 μgmL) (COTRIM et al 2012)
26
Os mecanismos de resistecircncia capazes de impedir a accedilatildeo dos
carbapenecircmicos satildeo vaacuterios Poreacutem a degradaccedilatildeo de antibioacuteticos por enzimas
principalmente as carbapenemases constituem o principal mecanismo de
resistecircncia aos antibioacuteticos β-lactacircmicos (DIAS 2009) Devido a ampla atividade
hidroliacutetica agrave maioria dos antibioacuteticos β-lactacircmicos estes grupos de enzimas possuem
alta versatilidade (QUEENAM et al 2007)
Existem trecircs grandes classes moleculares de Ambler a qual as
carbapenemases pertencem denominadas classe A (serino-carbapenemases os
quais incluem membros designados SME IMI NMC GES e a famiacutelia das KPCs)
classe B(as metalo-β-lactamase incluem os tipos IMP e VIM) e classe D
(oxacilinases similares as da classe A e incluem as OXA e PSE) (DIAS 2009)
Dentre estes as mais importantes e prevalentes encontradas em plasmiacutedeos
de Klebsiella pneumoniae satildeo as KPC (DIENSTMANN et al 2010) Por meio de
estudos moleculares a enzima KPC jaacute foi documentada em diferentes bacteacuterias e
diferenciada em KPC-1 a 13 (NETIKUL et al 2011) No ano de 2009 foi realizada
uma pesquisa onde descreveram as seguintes carbapenemases KPC-1 em isolados
de Klebsiella pneumoniae KPC-2 em K pneumoniae K oxytoca Salmonella
enterica e em Enterobacter sp e KPC-3 em K pneumoniae e Enterobacter cloacae
(MONTEIRO et al 2009) As enzimas KPC-4 e KPC-5 foram encontradas em
isolados de Pseudomonas aeruginosa (PEIRANO et al 2009)
Foi observada uma correccedilatildeo da sequumlecircncia KPC-1 indicando que o gene
blaKPC-1 e blaKPC-2 satildeo idecircnticos Trecircs novas variantes blaKPC-3 blaKPC-4 e
blaKPC-5 satildeo resultados de mutaccedilotildees do gene estrutural da enzima KPC-2
(WOLTER et al 2008) apresentando diferentes perfis de hidroacutelise As enzimas
KPC-2 e KPC-3 possuem alta eficiecircncia em hidrolisar cefalotina cefaloridina e
nitrocefin poreacutem possuem uma menor eficiecircncia contra carbapenecircmicos e
cefotaxima (ALBA et al 2005) As enzimas KPC-5 e KPC-4 apresentam menor
hidroacutelise de carbapenecircmicos eacute do que em KPC-2 Em contrapartida possuem
melhor eficiecircncia contra ceftazidima e uma maior inibiccedilatildeo pelo aacutecido clavulacircnico
(WOLTER et al 2008)
27
13 Anaacutelise geneacutetica de microrganismos
Eacute de extrema importacircncia praacutetica natildeo soacute no aspecto cliacutenico mas tambeacutem na
fitopatologia biotecnologia e estudos ambientais a correta identificaccedilatildeo e
classificaccedilatildeo de microrganismos Os meacutetodos usados na diferenciaccedilatildeo de gecircneros
espeacutecies e estirpes de microrganismos podem ser divididos em meacutetodos fenotiacutepicos
(baseados em fenocircmenos bioquiacutemicos fisioloacutegicos e bioloacutegicos) e genotiacutepicos
(detectam polimorfismos ao niacutevel dos aacutecidos nucleacuteicos ou variaccedilatildeo aleacutelica ao niacutevel
de enzimas) (ALVES et al 2003)
Para este tipo de estudo existem alguns meacutetodos como o RFLPrsquos -
ldquoRestriction Fragment Length Polymorphismsrdquo (polimorfismos de tamanho de
fragmentos de restriccedilatildeo) rep-PCR (Meacutetodo de tipagem baseado na amplificaccedilatildeo via
PCR de elementos de DNA repetitivos presentes em genomas bacterianos) anaacutelise
de sequumlecircncias nucleotiacutedeas (discriminaccedilatildeo eou identificaccedilatildeo atraveacutes de sequumlecircncias
de DNA) PFGE - Pulsed-Field Gel Electrophoresis (Eletroforese em campo
pulsado) ( A L V E S et al 2003)
A diferenciaccedilatildeo clara da cepa e principalmente a alta reprodutibilidade devem
ser caracteriacutesticas de qualquer meacutetodo de tipagem geneacutetica Poreacutem nem todos os
meacutetodos moleculares de tipagem satildeo igualmente eficazes Sendo assim de acordo
com a finalidade pretendida (identificaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo custo reprodutibilidade
etc) eacute feita a escolha do meacutetodo a ser aplicado (A L V E S et al 2003)
O processo de identificaccedilatildeo fenotiacutepica de KPC entre os membros da famiacutelia
Enterobacteriaceae ainda eacute difiacutecil e os meacutetodos para a sua identificaccedilatildeo devem ser
revistos e ajustados Mesmo com o avanccedilo tecnoloacutegico natildeo existem ensaios que
combinam alta especificidade e sensibilidade na detecccedilatildeo destas enzimas Satildeo
diversas as metodologias usadas para rastreamento de KPC como por exemplo a
focalizaccedilatildeo isoeleacutetrica a teacutecnica de disco-difusatildeo E-test teste de Hodge
modificado dentre outros Aleacutem disso a pesquisa do gene blaKPC pode ser feita
pela Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) Os sistemas de automaccedilatildeo
existentes no entanto podem natildeo identificar com precisatildeo os isolados KPC
positivos (COTRIM et al 2012)
A identificaccedilatildeo blaKPC pelo PCR eacute um meacutetodo raacutepido preciso sensiacutevel e
altamente especiacutefico no entanto a PCR exige equipamento e conhecimentos
28
especializados em diagnoacutestico molecular dificultando ainda a utilizaccedilatildeo dele na
rotina dos laboratoacuterios de microbiologia (COTRIM et al 2012)
Em estudo de infecccedilotildees hospitalares identificaccedilatildeo molecular de patoacutegenos
bacterianos eacute bastante utilizada Para diferenciar carbapenemases tipo KPC a partir
de outros tipos como SME NMC-A-IMI e GES eacute necessaacuterio um exame molecular
As identificaccedilotildees do microrganismo juntamente com a triagem molecular iratildeo definir
um resultado mais especiacutefico podendo ser usado para identificar o antibioacutetico mais
adequado para o tratamento Poreacutem a principal desvantagem de alguns exames
baseados em PCR por exemplo eacute que devido agrave sua limitada capacidade de
multiplexaccedilatildeo eles distinguem apenas algumas variaccedilotildees (MOREIRA et al 2014)
Estatildeo descritas para a identificaccedilatildeo molecular de patoacutegenos pertencentes agrave
famiacutelia Enterobacteriaceae as teacutecnicas de PFGE RAPD (randomly amplified
polymorphic DNA) e ERIC-PCR (Enterobacterial Repet it ive Intergenic Consensus)
A PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) eacute considerada padratildeo ouro devido sua
alta capacidade de diferenciaccedilatildeo baseada na anaacutelise do perfil de restriccedilatildeo do DNA
genocircmico por meio de eletroforese Como desvantagem para a sua execuccedilatildeo eacute
necessaacuterios vaacuterios dias impedindo a tipagem de algumas cepas bacterianas devido
agrave degradaccedilatildeo do DNA aleacutem do alto custo empregado (MOREIRA et al 2014)
O meacutetodo baseado em ERIC-PCR tem sido bastante utilizado como uma
alternativa para a teacutecnica de PFGE Esta teacutecnica consiste na anaacutelise do padratildeo de
amplificaccedilatildeo de elementos repetidos encontrados no genoma bacteriano Isto
permite uma maior rapidez na obtenccedilatildeo de resultados quando comparada com o
PFGE aleacutem de alta reprodutibilidade simples execuccedilatildeo e implementaccedilatildeo baixo
custo e natildeo sem problemas com a degradaccedilatildeo do DNA (MOREIRA et al 2014)
A PCR eacute considerada uma teacutecnica de biologia molecular revolucionaacuteria que
consiste na siacutentese enzimaacutetica de coacutepias de aacutecidos nucleacuteicos Ela permitiu o raacutepido
desenvolvimento do estudo de sequumlecircncias de aacutecidos nucleacuteico Foi desenvolvida por
Kary Banks Mullis que ganhou o precircmio Nobel de quiacutemica de 1993 devido ao
desenvolvimento dessa teacutecnica em abril de 1983 (CAMARGO et al 2014)
Por meio de etapas de variaccedilatildeo de temperatura a teacutecnica de PCR promove a
duplicaccedilatildeo de cadeias de DNA in vitro A reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo de DNA por PCR
envolve o emprego de sequumlecircncias iniciadoras (primers) quatro nucleotiacutedeos
29
(dNTPrsquos) do DNA e uma DNA polimerase termoestaacutevel podendo assim obter-se a
partir de uma fita molde muitas coacutepias de uma sequumlecircncia especiacutefica de aacutecido
nucleacuteico O princiacutepio da PCR consiste na variaccedilatildeo de temperatura por ciclo
envolvendo trecircs etapas baacutesicas desnaturaccedilatildeo pareamento e amplificaccedilatildeo
(CAMARGO et al 2014)
A desnaturaccedilatildeo da fita molde de DNA eacute uma etapa com duraccedilatildeo entre 30
segundos a 1 minuto a temperatura entre 92 ordmC a 96 ordmC Apoacutes isso o pareamento de
dois iniciadores sinteacuteticos de composiccedilotildees distintas que funcionam como os
iniciadores da reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo liga-se agrave regiatildeo complementar da fita de
DNA alvo que sofreraacute a duplicaccedilatildeo Esta etapa tem duraccedilatildeo de 30 segundos a 1
minuto a temperatura entre 58 ordmC e 65 ordmC Por uacuteltimo a amplificaccedilatildeo por meio da
enzima Taq DNA polimerase das novas fitas de DNA se daacute a partir de cada um dos
iniciadores utilizando os quatro dNTPrsquos como substrato da reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo
Esta etapa possui duraccedilatildeo entre 45 segundos e 1 minuto a 72 ordmC Cada ciclo eacute
repetido em torno de 30 a 35 vezes e promove a amplificaccedilatildeo da regiatildeo alvo
determinada conforme o anelamento dos iniciadores sinteacuteticos de DNA (CAMARGO
et al 2014) Estas etapas estatildeo demonstradas na figura 4
Figura 4 Etapas da Reaccedilatildeo de PCR
30
2 JUSTIFICATIVA
No ano de 2010 no Distrito Federal foram identificados 111 pacientes com
suspeita de infecccedilatildeo por Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) e a
Secretaria de Sauacutede do Distrito Federal confirmaram ainda a morte de 18 pacientes
dentre os hospitais puacuteblicos e particulares Um desafio encontrado por ocasiatildeo do
surto infeccioso no Distrito Federal foi o de confirmar as KPCs por Reaccedilatildeo da
Polimerase em Cadeia sendo que as amostras foram enviadas com esta finalidade
para a Fiocruz no Rio de Janeiro
Pesquisas que possam contribuir na elaboraccedilatildeo de estrateacutegias preventivas e
de intervenccedilatildeo para infecccedilotildees causadas por enterobacteacuterias bem como contribuir
para gerar uma integraccedilatildeo beneacutefica entre a equipe acadecircmica e os serviccedilos de
sauacutede devem ser estimuladas Neste sentido o presente estudo permitiu escrutinar
os genes envolvidos na expressatildeo de carbapenemases presentes em espeacutecies de
enterobacteacuterias isoladas em ambiente hospitalar visto que elucidar genes de
resistecircncia de enterobacteacuterias aos antibioacuteticos carbapenecircmicos eacute o primeiro passo
para garantir um controle epidemioloacutegico efetivo para estes tipos de microorganismo
assim como sua associaccedilatildeo com surtos fatais particularmente em pacientes com
baixa imunidade
31
3 OBJETIVOS
31 Objetivo geral Caracterizar os genes de resistecircncia das
Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases e os aspectos epidemioloacutegicos de
pacientes internados em um hospital puacuteblico do Distrito Federal
32 Objetivos Especiacuteficos
Identificar genotipicamente a enzima KPC (Klebsiella pneumoniae
carbapenemase) de isolados de Klebsiella pneumoniae
Investigar aspectos epidemioloacutegicos dos pacientes portadores de
Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases
Identificar quais variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana influenciaram para o
desfecho oacutebito ou alta
Avaliar a susceptibilidade das Enterobacteacuterias aos antibioacuteticos
carbapenecircmicos dos pacientes em ambiente hospitalar
32
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
Trata-se de um estudo transversal onde foi realizado o teste de
susceptibilidade das enterobacteacuterias aos antibioacuteticos carbapenecircmicos a partir dos
materiais bioloacutegicos coletados dos pacientes internados no Hospital Regional da Asa
Norte (HRAN) e enviados ao Laboratoacuterio de Anaacutelises Cliacutenicas da mesma Instituiccedilatildeo
Os materiais bioloacutegicos investigados foram sangue aspirado traqueal ou brocircnquico
urina e cultura semi quantitativa de ponta de cateter venoso central O HRAN eacute um
hospital puacuteblico do Distrito Federal com 395 leitos sendo as cliacutenicas de internaccedilatildeo
Berccedilaacuterio Cirurgia Geral Cirurgia Plaacutestica Cliacutenica Meacutedica Ginecologia Maternidade
Pediatria Queimados UTI com atendimento a pacientes portadores de doenccedilas de
caraacuteter cliacutenico e ciruacutergico
4 1 Coleta e transporte das amostras bioloacutegicas
As amostras foram coletadas de pacientes internados no Hospital Regional da
Asa Norte (HRAN) com suspeitas de infecccedilatildeo por KPC A identificaccedilatildeo primaacuteria foi
realizada pelo Laboratoacuterio de Microbiologia do hospital de origem dos pacientes e os
demais procedimentos que foram utilizados na identificaccedilatildeo encontram-se descritos
abaixo
4 2 Procedimentos para confirmaccedilatildeo de resistecircncia bacteriana por
disco de ertapenem (adaptado CDC 2004)
Para diagnosticar amostra como portadora de bacteacuteria produtora de
carbapenemase foi realizado o teste com disco de ertapenem como forma de
triagem Inicialmente utilizou-se o swab contaminado com a amostra que foi
distribuiacuteda em uma pequena aacuterea da placa de aacutegar MacConkey para apoacutes o
crescimento ser realizada a pesquisa de colonizaccedilatildeo por enterobacteacuterias resistentes
aos carbapenecircmicos (Pesquisa de CRE) Procedeu-se a semeadura por teacutecnica
semi-quantitativaesgotamento com alccedila bacterioloacutegica na diluiccedilatildeo de 1100 O disco
de Ertapenem foi colocado na superfiacutecie da placa de MacConkey na junccedilatildeo dos dois
primeiros campos de semeadura conforme demonstrado na figura 5 Incubou a placa
33
em estufa aeroacutebia a 35ordmC por 24 e 48 horas e observou-se o halo de difusatildeo do
disco de Ertapenem na placa para proceder agrave leitura
O teste deixou de ser obrigatoacuterio apoacutes a modificaccedilatildeo dos criteacuterios
interpretativos para carbapenecircmicos para enterobacteacuterias publicados no suplemento
do CLSI 2010 M100-S20-U
Figura 5 Mecanismo de semeamento de material bioloacutegico oriundos de
pacientes com suspeita de infecccedilatildeo por KPC Fonte adaptado CDC 2004
4 2 1 Interpretaccedilatildeo dos resultados
Na ausecircncia de crescimento ateacute 24 horas (MacConkey) ou halo de difusatildeo
gt27 mm na placa deve-se reincubar as placas por mais 24 horas Quando for
ausente o crescimento apoacutes 48 horas ou halo de difusatildeo gt27 mm na placa libera-se
como enterobacteacuterias resistentes a carbapenecircmicos (KPCNEG)Havendo
crescimento de colocircnias na placa de MacConkey com halo lt 27 mm (apenas para
colocircnias com crescimento dentro do halo) deve-se reisolar e realizar identificaccedilatildeo e
antibiograma automatizado teste de sensibilidade por disco-difusatildeo e Teste de
Hodge Modificado (THM) Os isolados de enterobacteacuterias cujos testes comprovarem
a resistecircncia aos carbapanecircmicos testados (KPCPOS) foram reportado a Comissatildeo
de Controle de Infecccedilatildeo Hospitalar (CCIH) Jaacute osbacilos Gram-negativos natildeo
fermentadores natildeo foram reportados (KPCNEG) Para interpretaccedilatildeodos resultados
foram utilizados os valores conforme demonstrados na tabela 1
Tabela 1 Criteacuterios Interpretativos para testes de sensibilidade
ENTEROBACTEacuteRIAS
Disco difusatildeo (mm) MIC (microgml)
34
Antibioacutetico Sigla S I R S I R
Ertapenem 10
microg
ETP 22 19-
21
18 05 1 2
Meropenem 10
microg
MEM 23 20-
22
19 1 2 4
Fonte Manual Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)
2013
Os resultados que apresentaram resistecircncia ao antibioacutetico Ertapenem foram
considerados como suspeitos de contaminaccedilatildeo por KPC Fez-se o teste de
susceptibilidade aos antibioacuteticos (TSA) em aparelho automatizado MicroScan Walk
Away 96sl Dade Behring
4 3 Teste de susceptibilidade aos antibioacuteticos (adaptado CDC 2004)
A determinaccedilatildeo da susceptibilidade dos isolados foi feita pelo teste de
susceptibilidade aos antibioacuteticos (TSA) apoacutes cultura em meio de gelose simples
(INSA) para avaliaccedilatildeo da sua pureza e obtenccedilatildeo de colocircnias isoladas Para
preparaccedilatildeo de uma suspensatildeo bacteriana com turvaccedilatildeo aproximada de 05
McFarland (Dade BehringMicroScanregTurbidity Meter) ressuspendeu duas a cinco
colocircnias em 2ml de soro fisioloacutegico esteacuteril diluindo a 1100 em soro fisioloacutegico num
volume total de 10ml em seguida foi feita uma semeadura em duas placas
quadradas (120mm x 120mm) de Muller-Hinton Agar (INSA) por inundaccedilatildeo
Os discos de antibioacutetico carbapenecircmicos imipenem meropenem e
ertapenem (Biorad) foram aplicados com o auxiacutelio de um dispensador automaacutetico A
susceptibilidade das Enterobacteacuterias aos carbapenecircmicos foi definida de acordo
com o protocolo Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI 2011)
Para aquelas Enterobacteacuterias que apresentaram resistecircncia ao ertapenem
foram realizados o Teste de Hodge Modificado para Detecccedilatildeo de Enterobacteacuterias
Produtoras de Carbapenemases conforme descrito pelo Centers for Disease Control
and Prevention (CDC 2004)
35
4 4Teste de Hodge Modificado (THM) (adaptado CDC 2004)
Preparou-se uma suspensatildeo em salina esteacuteril com a cepa Escherichia coli
ATCC 25922 (padratildeo 05 de McFarland) Apoacutes isto diluiu a suspensatildeo 110 em
salina (05 ml da soluccedilatildeo de Ecoli ATCC 25922 + 45 ml salina)Foi entatildeo semeado
na superfiacutecie de uma placa de Agar Muller-Hinton com a suspensatildeo diluiacuteda de Ecoli
ATCC 25922 com auxilio de swab seco assegurando que houvesse uma
distribuiccedilatildeo uniforme cobrindo toda a superfiacutecie do Agar Deixou secar por 3 a 5
minutos em temperatura ambienteColocou-se o disco de ertapenem 10microg no centro
da placa e apoacutes isto fez-se uma estria linear da cepa a ser testada da borda do
disco ateacute a borda da placa utilizando uma alccedila calibrada 10 microl ou um swab Incubou
a placa na estufa em atmosfera aeroacutebia a 35 plusmn 2ordmC por 16 a 24 horas
441 Controle de qualidade (CQ)
Foi utilizado um CQ todos os dias em que se realizou o teste tendo como
controle Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1705- teste de Hodge modificado
positivo Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1706- teste de Hodge modificado
negativo
442 InterpretaccedilatildeoResultados
Apoacutes 16ndash24 horas de incubaccedilatildeo examinar as placas para verificar a presenccedila
de uma distorccedilatildeo no halo de inibiccedilatildeo do disco de ertapenem devido ao crescimento
realccedilado da cepa ATCC na intersecccedilatildeo do organismo teste e a Ecoli ATCC 25922
dentro dos limites do halo O THM positivo apresentaraacute presenccedila de distorccedilatildeo no
halo de inibiccedilatildeo de ertapenem devido ao crescimento da cepa Ecoli ATCC 25922 ao
longo da estria da cepa teste para dentro dos limites do halo de inibiccedilatildeo Jaacute o THM
negativo teraacute ausecircncia de crescimento da cepa Ecoli ATCC 5922 ao longo da estria
da cepa teste para dentro dos limites do halo de inibiccedilatildeo do disco de ertapenem
Este resultado estaacute representado na figura 6
36
Figura 6 Interpretaccedilatildeo resultado do Teste de Hodge Modificado
(adaptado CDC 2004) Teste positivo na estria da cepa teste na parte superior
da placa teste negativo na estria da cepa teste na parte inferior da placa
Tendo positivo como resultado o paciente era um provaacutevel contaminado por
KPC As amostras entatildeo foram encaminhadas para a Fundaccedilatildeo Osvaldo Cruz
(FIOCRUZ) para confirmaccedilatildeo final As amostras finalmente confirmadas como
positivas para KPC foram isoladas e guardadas no banco de cepas cliacutenicas do
hospital Apoacutes a autorizaccedilatildeo do CEP amostras das cepas foram transferidas para
meio de transporte Stuard em caixa teacutermica fechada em baixa temperatura e
levadas para o laboratoacuterio de microbiologia cliacutenica da universidade
No laboratoacuterio da universidade as amostras foram separadas e realizadas
repiques em meios MacConkey e incubadas por 24h As colocircnias caracteriacutesticas
foratildeo isoladas em caldo BHI e mantidas em shaker a 37oC por 2h Apoacutes isto foram
executadas as anaacutelises a seguir
Os isolados de Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases foram
submetidos agrave extraccedilatildeo de DNA e posterior sequumlenciamento para identificaccedilatildeo dos
genes de resistecircncia blaKPC de 1 a 13 e identificaccedilatildeo do gene universal Os
pacientes de onde os materiais bioloacutegicos contendo as Enterobacteacuterias produtoras
de carbapenemases foram os isolados foram investigados quanto aos aspectos
epidemioloacutegicos e cliacutenicos
37
4 5 Extraccedilatildeo de DNA bacteriano
A extraccedilatildeo de DNA bacteriano foi realizada utilizando o kit NucleoSpin
Plasmidreg (MN) Antes de iniciar a extraccedilatildeo foi feito a preparaccedilatildeo das soluccedilotildees
reagentes materiais e amostras (vortexando) colocou-se em banho-maria agrave 50ordmC o
tampatildeo AW Partiu-se de colocircnias isoladas cultivadas que sofreram passagem em
meio LB liacutequido por 12h Adicionou-se 15 mL da amostra no tubo eppendorf
centrifugou por 5 minutos descartou o sobrenadante (com cuidado para natildeo
descartar o Pellet) Repetiu-se este procedimento por mais trecircs vezes completando-
se o volume de 6mL Foram adicionados 250microL do tampatildeo Resuspension Buffer A1
encostando a ponteira no Pellet e misturando (este tampatildeo tem como funccedilatildeo
separar a formaccedilatildeo de grumos celulares) Apoacutes isso homogeneizou e vortexou os
tubos eppendorfs Apoacutes isso foram adicionados 250microL do tampatildeo Lysis Buffer A2
homogenizou e deixou descansar por 5 minutos (esta etapa eacute importante para a lise
da parede e da membrana celulares e liberaccedilatildeo do conteuacutedo da ceacutelula)
Passado o tempo de descanso foi adicionado 300microL do tampatildeo
Neutralization Buffer A3 homogeneizou e centrifugou por 10 minutos (este tampatildeo
iraacute retirar as proteiacutenas que envolvem o DNA e voltaraacute com o pH para proacuteximo de 8
impedindo que a soluccedilatildeo de lise facilite a quebra das ligaccedilotildees covalentes do aacutecido
nucleacuteico) Em seguida enumeraram-se os tubos contendo filtros com siacutelica
transferiu-se o sobrenadante para o filtro e centrifugou por 5 minutos Descartou-se
o que foi filtrado adicionou 500microL do tampatildeo AW (banho-maria) centrifugou por 2
minutos Novamente foi descartado o filtrado Adicionou-se 600microL do tampatildeo A4
centrifugou por 2 minutos e descartou o filtrado (os tampotildees AW e A4 contecircm
isotiocianato de guanidina em concentraccedilotildees crescentes para facilitar a adsorccedilatildeo
do DNA na siacutelica e retirada das outras biomoleacuteculas da amostra) Foi feita outra
centrifugaccedilatildeo com o tubo vazio Apoacutes isto o filtro foi trocado para outro eppendorf
definitivo onde foi adicionado 50microL do tampatildeo Elution Buffer AE (este tampatildeo
favorece a eluiccedilatildeo do DNA) centrifugou por 2 minutos descartou o filtro e
armazenou as amostras em freezer -20ordmC
38
4 6 Iniciadores e reaccedilatildeo de PCR
Os iniciadores universais para o gene blaKPC foram desenhados baseados
em sequumlecircncias conservadas apresentadas pelos sub-grupos de genes que
codificam a enzima carbapenemase de klebsiella pneumoniae (YIGIT et al 2001)
Baseado na sequumlecircncia para o blakpc-1 depositada no GenBank
(AF2975541) o oligonucleotiacutedio (oligo) iniciador direto (5-
ATGTCACTGTATCGCCGTC-3rsquo) foi desenhado para reconhecer a sequumlecircncia
blaKPC na posiccedilatildeo (131149) enquanto que o iniciador reverso (5-
TTACTGCCCGTTGACGCC-3rsquo) foi reconhecido na posiccedilatildeo (9951012) As anaacutelises
baseadas em alinhamento de sequumlecircncias mostraram que o par de iniciadores
blaKPC podem detectar os alelos de 1 a 13 do gene blaKPC conforme a tabela 2
Tabela 2 Nuacutemero de acesso ao GenBank dos alelos blaKPC e seus
microrganismos originais
Nuacutemero de
Acesso GenBank
Microrganismo Alvo
AF2975541 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-1
GU0862251 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-2
HQ2589341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-2-like
AB5577341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC -3
EU4473041 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-4
EU4002222 Pseudomonas
aeruginosa
blaKPC-5
EU5555341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-6
EU7297271 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-7
39
FJ2344121 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-8
FJ624872 Escherichia coli blaKPC-9
GQ1403481 Acinetobacter
baumannii
blaKPC-10
HM0669951 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-11
HQ3428891 Enterobacter cloacae blaKPC-12
HQ3428901 Enterobacter cloacae blaKPC-13
As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo de blaKPC foram realizadas em um
primeiro tempo de desnaturaccedilatildeo em que foi 94ordmC por 5 minutos seguido de 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 58 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 90 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 78ordmC por 8 minutos Aleacutem das amostras foi utilizado um
controle negativo
A PCR do blaKPC foi realizada utilizando os componentes para o volume da
reaccedilatildeo de 25 microL citados na tabela 3 A banda do tamanho do produto de PCR foi de
881 pares de bases (pb) o que corresponde ao plasmiacutedeo
Tabela 3 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do
gene blaKPC
Reagente Volume
DNA molde 4 microL
Tampatildeo Taq 25 microL
MgCl2 075 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP
2 microL
Oligo F 1 microL
Oligo R 1 microL
Taq DNA polimerase 05 microL
Aacutegua MiliQ 1335 microL
40
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
Baseado na sequumlecircncia para o gene 16S rRNA em que o oligonucleotiacutedio
Universal iniciador direto foward (5-CCAGCAGCCGCCGTAATACG-3rsquo) foi
desenhado para reconhecer a sequumlecircncia universal na posiccedilatildeo 1513 enquanto que o
iniciador reverso (5-ATCGGYTACCTTGTTACGACTTC-3rsquo) foi reconhecido na
posiccedilatildeo 1491 foram realizadas PCRrsquos As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo deste
gene foram realizadas nos seguinte tempos separaccedilatildeo 94ordmC por 10 minutos 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 55 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 120 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 72ordmC por 10 minutos
A PCR do gene 16S rRNA foi realizada utilizando os componentes para o
volume da reaccedilatildeo de 25microL citados na tabela 4 A banda do tamanho do produto de
PCR foi de 996 pb correspondente aacute regiatildeo ribossomal capaz de amplificar todas
as espeacutecies
Tabela 4Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do gene
universal
Reagente (quantidade
concentraccedilatildeo do estoque)
Volume
DNA molde 10 ng 4 microL
Tampatildeo Taq 10 x 25 microL
MgCl2 50mM 125 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP 25 mM
125 microL
Oligo F 10microM 05 microL
Oligo R 10microM 05 microL
Taq DNA polimerase 5UmicroL 04 microL
Aacutegua Miliq 146 microL
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
41
O termociclador utilizado para os experimentos foi o LifeTouch da BIOER
4 7 Digestatildeo
Para realizaccedilatildeo da digestatildeo foi utilizada a enzima BshF I (Hae III) EN- 1105
tamanho 7000 units concentraccedilatildeo 10 unitsmicroL fonte Bacillus sphaericus empresa
Jena bioscienceUtilizaram-se os componentes para o volume de 50microL da reaccedilatildeo
citados na tabela 5
Tabela 5 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da digestatildeo do gene
universal
Reagente Volume
Produto de PCR 10 microL
Enzima BshF I 01 microL
Tampatildeo (10x) 5 microL
Aacutegua Miliq 349 microL
Total (em cada ependorff) 50 microL
Valores para 1 digestatildeo
Os ependorffs foram colocados por 30 minutos em banho-maria a 37ordmC Apoacutes
isso fez-se a corrida das amostras em gel de agarose para verificaccedilatildeo do resultado
(LU et al 2000)
4 8 Eletroforese em gel de agarose
Os produtos de DNA PCR e digestatildeo foram analisados em gel de agarose
2 O tempo de corrida do gel eacute de aproximadamente 1hora e 30minutos sendo
que no comeccedilo foi usada agrave voltagem de 50 V e apoacutes comeccedilar a correr o gel
aumentou a voltagem para 100 v Utilizou-se o marcador de 100pb (pares de bases)
Foi adicionado 3microL de corante Bromophenol (que tem a funccedilatildeo de fazer uma ligaccedilatildeo
na amostra de DNA e permitir a visualizaccedilatildeo da corrida no gel de agarose) em 7microL
de amostra tanto de DNA quanto de PCR Para o preparo do gel foi utilizado TBE
42
(Tris- Aacutecido Boacuterico) agarose e brometo de etiacutedio (sua funccedilatildeo eacute de corante para o gel
e permitir a visualizaccedilatildeo do DNA quando colocado agrave luz ultravioleta) Para o oligo
blaKPC a banda da amplificaccedilatildeo foi em 881ppb correspondendo ao plasmiacutedeo Jaacute
o oligo Universal foi em 996 pb
4 9 Descarte de resiacuteduos
Todos os materiais utilizados nos ensaios foram de uso uacutenico e manipulados
em cacircmaras de seguranccedila bioloacutegica classe II Apoacutes o uso foram colocados em
soluccedilatildeo desinfetantes (hipoclorito a 1) e em seguida autoclavados a 127oC por 20
min em sacos apropriados para autoclavaccedilatildeo Apoacutes a finalizaccedilatildeo do ciclo de
esterilizaccedilatildeo os sacos contendo o material descartaacutevel foram colocados em
recipientes de coleta da empresa responsaacutevel pela coleta de materiais bioloacutegicos
produzidos no laboratoacuterio de microbiologia Todos os procedimentos seguiram a
normativa RDC-ANVISA 3062004 sobre o descarte de resiacuteduos de serviccedilo de
sauacutede
4 10 Aspectos epidemioloacutegicos e cliacutenicos
Os aspectos cliacutenicos e epidemioloacutegicos foram investigados por meio de
prontuaacuterios dos pacientes portadores de enterobacteacuterias produtoras de
carbapenemases e envolveram topografia mais provaacutevel do foco infeccioso a
enfermidade motivadora da internaccedilatildeo o desfecho cliacutenico a idade e o tempo de
internaccedilatildeo
4 12 Anaacutelises eepidemioloacutegicas
As anaacutelises foram realizadas com o pacote estatiacutestico SPSS versatildeo 200
Para verificar quais variaacuteveis referentes aos dados epidemioloacutegicos e
microbioloacutegicos influenciaram no desfecho verificou- se a diferenccedila meacutedia das
variaacuteveis idade e tempo de internaccedilatildeo em cada grupo O teste estatiacutestico utilizado foi
o teste t de Student apoacutes se executar o teste de normalidade de Shapiro-Wilk Para
as variaacuteveis sexo perfil microbioloacutegico das enterobacteacuterias produtoras de
43
carbapenemases foi avaliada a associaccedilatildeo com o desfecho por meio do teste Exato
de Fisher O niacutevel de significacircncia adotado foi de 5
4 13 Preceitos eacuteticos
Este projeto estaacute inserido em um projeto maior denominado ldquoEpidemiologia
cliacutenica e caracterizaccedilatildeo molecular do Acinetobacter Baumannii resistente a
antibioticoterapia em pacientes internado em hospitais do Sistema Uacutenico de Sauacutederdquo
que foi submetido ao Comitecirc de Eacutetica em Pesquisa da Secretaria do Estado de
Sauacutede do Distrito Federal (SESDF) e emitido parecer aprovado pelo protocolo nordm
23109 (anexo)
44
5 RESULTADOS
51 Anaacutelise molecular
Para a amplificaccedilatildeo com o oligo blaKPC foram amplificadas amostras
que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 881 pb correspondente ao
plasmiacutedeo A anaacutelise da amplificaccedilatildeo da regiatildeo do gene blaKPC mostrou que
apenas a amostra A10 natildeo amplificou isso demonstra que esta amostra natildeo
possuiacutea o gene de resistecircncia
5 1 1 Gene blaKPC
Figura 7 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 881 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
A amostra A3 natildeo amplificou no primeiro momento entatildeo foi realizado
novamente a PCR e corrida de gel obtendo entatildeo a amplificaccedilatildeo da amostra como
apresentado na figura 8
45
Figura 8 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC da
mostra A3 estudada A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo de 881
pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 1 2 Gene 16S rRNA
Para a amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA utilizou-se o oligo universal Foram
amplificadas amostras que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 996 pb
Figura 9 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
46
Segundo Lu et al (2000) a digestatildeo com a enzima HaeIII deste amplicons de
16S rRNA devolveriam bandas com perfis entre 150 a 200 pb No gel abaixo eacute
possiacutevel evidenciar que este perfil ocorreu com o predomiacutenio de bandas na altura
de 200pb
Figura 10 Gel de agarose a 2 da digestatildeo do amplicon do gene 16S
rRNA das amostras com a enzima HaeIII evidenciando diversos fragmentos
proacuteximos a 200 pb A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo ribossomal
de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 2 Anaacutelises epidemioloacutegicas
5 2 1 Sexo
No total foram detectados 17 isolados de KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 onde a maior a prevalecircncia foi
detecatada em amostras de pacientes do sexo masculino (53) do que no sexo
feminino (47)
47
Figura 11 Isolado de KPC segundo sexo dos 17 pacientes investigados
no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 2 Desfecho cliacutenico
Em 17 isolados de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo
de 2010 aacute 2011 a porcentagem de pacientes que foram a oacutebito (59) foi maior que
a de pacientes que tiverm alta (41)
Figura 12 Isolado de KPC segundo desfecho cliacutenico dos 17 pacientes
investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
48
5 2 3 Local da coleta
Dos 17 episoacutedios detectados de infecccedilatildeo por KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 a infecccedilatildeo em swab retalfoi mais
frequente (47) seguida de ponta de cateacuteter (18) e secreccedilatildeo traqueal (12)
Figura 13 Isolados de KPC segundo local da coleta da amostra nos 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 4 Microorganismo
O microorganismo mais encontrado foi a Klebsiella pneumoniae (82)
seguida da Enterobacter clocae (12) e Serratia marcescens (6) dos 17 isolados
de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 Isto afirma o
fato de a sigla KPC ser utilizada de forma errocircnea aacute Klebsiella pneumoniae visto
que a evidecircncia dela eacute maior em relaccedilatildeo as outras cepas
49
Figura 14 Isolado de KPC segundo microrganismo encontrado em 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 5 Relaccedilotildees variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana e desfecho
cliacutenico
Tabela 6 ndash Distribuiccedilatildeo do perfil geneacutetico sexo coleta tipificaccedilatildeo de
microrganismos e anaacutelise da resistecircncia bacteriana segundo o desfecho
cliacutenico Brasiacutelia-DF 2010 a 2011
Variaacutevel Resultado
Desfecho
Alta Oacutebito
N N P
Gene 16S rRNA Positivo 7 1000 10 1000
NA Gene blaKPC Positivo 6 857 10 1000
Negativo 1 143 0 00 0218 Sexo Feminino 2 286 6 600
Masculino 5 714 4 400 0201 Local da coleta Fundo saco de
Douglas 1 143 0 00
Hemocultura 0 00 1 100 0463 Ponta de cateter 1 143 2 200
Sec TraquealBrocircnquica
0 00 1 100
50
Secreccedilatildeo traqueal 2 286 0 00
Swab retal 3 429 5 500
Urina 0 00 1 100
Microrganismo Enterobacter cloacae (KPC)
1 143 1 100
Klebsiella pneumoniae
6 857 8 800
0416 Serratia
marcescens 0 00 1 100
Teste de Hodge Hodge positivo 7 1000 10 1000
NA Amicacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 1 100 0848 resistente 0 00 1 100
sensiacutevel 2 286 3 300
Amoxicilina Aacutecido Clavulacircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Ampicilina Sulbactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ampicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Aztreonan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefazolina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Cefoperazona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Cefotaxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefoxitina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0509 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 2 286 4 400
Ceftazidima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cetriaxona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 3 429 5 500 0772 Cefalotina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ciprofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772
51
resistente 3 429 5 500
Claritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Clindamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Eritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Gentamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0942 resistente 2 286 3 300
sensiacutevel 1 143 2 200
Imipenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 0 00 2 200 0193 Resistente 1 143 3 300
sensiacutevel 2 286 0 00
Nitrofurantoiacutena sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Norfloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Oxacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Penicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Piperacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Rifampicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tetraciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Ticarcilina Aacutecido Clavulocircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0688 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 3 429 4 400
Tobramicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Trimetoprima Sulfametoxazol
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0112 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 2 286 0 00
Vancomicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tigeciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediario 0 00 1 100 0211 natildeo testado 1 143 4 400
resistente 2 286 0 00
52
Cefepime sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefuroxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Levofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Piperacilina Tazobactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Ertapenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Meropenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0223 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 1 143 0 00
Cefotetan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 sensiacutevel 0 00 1 100
Gemifloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 7 700 0585 natildeo testado 3 429 3 300
Desfecho
Alta Oacutebito
Meacutedia Erro
padratildeo Meacutedia Erro
padratildeo p
Idade 58 9 59 5 0991
Tempo Internaccedilatildeo (dias)
50 13 46 12 0571
n= 17 p(lt 005) NA natildeo se aplica
53
6 DISCUSSAtildeO
Nos uacuteltimos anos houve um aumento na incidecircncia de bacteacuterias
multirresistentes aos antimicrobianos no ambiente hospitalar tornando isto um
problema mundial de sauacutede puacuteblica (HULSCHER et al 2010) Quando se trata
principalmente de bacilos Gram negativos a frequumlecircncia destas bacteacuterias eacute ainda
maior em paiacuteses da Ameacuterica Latina quando comparada a paiacuteses desenvolvidos
(GALES etal 2012)
De acordo com dados do ldquoMeropenem Yearly Susceptibility Test Information
Collectionrdquo (MYSTIC) ocorreu nos Estados Unidos um aumento na susceptibilidade
de K pneumoniae nos uacuteltimos anos graccedilas a praacuteticas de controle de disseminaccedilatildeo
de amostras resistentes(RHOMBERG P R et al 2009) O aumento crescente da
prevalecircncia destes microrganismos foi proporcional ao aumento da dependecircncia do
uso de antibioacuteticos carbapenecircmicos considerados como a opccedilatildeo terapecircutica para o
tratamento de infecccedilotildees por bacilos Gram negativos multi-resistentes (LIVERMORE
2012) Isto afeta diretamente as opccedilotildees de tratamento sobrando poucas alternativas
para a terapecircutica que incluem colistina (polimixina E) e tigeciclina que apresentam
respectivamente problemas em termos de toxicidade e eficaacutecia (LIVERMORE et
al 2011) Um dos efeitos adversos mais importantes das poliminas B e E por
exemplo satildeo a neurotoxicidade e nefrotoxicidade (MENDES C A C et al2009 )
Devido agrave resistecircncia ser usualmente de natureza plasmidial e portanto de
maior disseminaccedilatildeo especialmente quando carreadas por K pneumoniae
microrganismo com uma notoacuteria capacidade para acumular e transferir plasmiacutedeos
com determinantes para resistecircncia o nuacutemero de casos detectados pelo
fenoacutetipogenoacutetipo blaKPC eacute bastante preocupante (MONTEIRO et al 2009)
Comparada com outras bacteacuterias hospitalares a transmissatildeo de clones
multirresistentes de K pneumoniae eacute maior e podem natildeo ser controladas pelos
meacutetodos de controle de infecccedilatildeo hospitalar (PAAUW et al 2007) A forma
plasmidial para transferecircncia da resistecircncia adicionada a este grande potencial para
disseminaccedilatildeo de clones resistentes eacute preocupante visto que apoacutes surtos muitas
vezes pode se tornar endecircmica Jaacute eacute uma realidade a disseminaccedilatildeo desta bacteacuteria
54
entre pacientes hospitais paiacuteses e ateacute mesmo continentes (WOODFORF et al
2010 ROGERS et al 2011)
As chances de surtos satildeo maiores em paiacuteses com poucos recursos devido agrave
maior carecircncia de praacuteticas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees hospitalares e o
uso irracional de antimicrobianos de forma empiacuterica e inadequada (KUMARASAMY
et al 2010) Ateacute o momento os mecanismos de resistecircncia aos cabapenecircmicos
geralmente encontrado eram a produccedilatildeo de ESBL (CTX-M) somada aacute perda de
porina (CARVALHAES et al 2010) Foi notado a partir do ano de 2008 um
aumento no nuacutemero de K pneumoniae produtoras de KPC-2 apresentando outra
forma de resistecircncia (GALES 2012)
Um estudo mostrou que o perfil do paciente colonizado ou infectado por KPC
foi de um paciente entre os 33 e os 82 anos de idade internado haacute mais de 1
semana no hospital A mortalidade geral nos uacuteltimos anos ficou em torno de 7
sendo que dos 77 pacientes estudados 32 (415) pacientes evoluiacuteram para oacutebito
evidenciando a alta morbi-mortalidade associada (ALVES A P et al 2013)
Em estudo com 2316 pacientes avaliados a populaccedilatildeo de sexo masculino foi
de 526 idade meacutedia global de 53 anos (mediana de 55 anos) permanecircncia meacutedia
de 58 dias (mediana de 3 dias) (OLIVEIRA A C et al 2010) Outros trabalhos
apresentaram ausecircncia de significacircncia entre sexoidade e o desenvolvimento de
infecccedilotildees por microrganismos resistentes (PERES-BOTA D et al 2003 COLPAN
A et al 2005 COELLO R et al 1997)
Outro estudo utilizou um total de 30 amostras sendo elas isoladas de urina
escarro secreccedilatildeo pleural ponta de cateter aspirado traqueal e hemocultura A mais
prevalente foi em urina (40) Entre as 30 cepas analisadas a maior porcentagem
foi da cepa Klebsiella pneumoniae (70) Enterobacter sp (133) Klebsiella
ozaenae (10) Escherichia coli (333) e Klebsiella oxytoca (333)
(DIENSTMANN R et al 2010) Nos Estados Unidos a enzima KPC jaacute se tornou
endecircmica Foi realizada uma pesquisa em dois hospitais de Nova York onde
testaram 602 amostras e 45 apresentaram algum mecanismo de resistecircncia
sendo apenas 33 confirmadas por biologia molecular como KPC-2 (BRATU et
al 2005)
55
Estudo sobre os tipos de ESBL feito no Japatildeo apresentou o tipo Toho-1 como
o mais prevalente nessa pesquisa Ateacute o ano de 2000 ano em que foi publicado tal
estudo este era o primeiro relatoacuterio no Japatildeo para identificar derivados de ESBLs
como tipo de SHV e TEM entre E coli e K pneumoniae Em especial o tipo SHV- 12
foi identificado com uma maior frequumlecircncia Estes resultados indicam que tipos
distintos de ESBLs que satildeo diferentes em sua especificidade de substrato e origem
geneacutetica coexistem no Japatildeo Isto mostra a importacircncia de caracterizar genoacutetipos
distintos de ESBLs e de estar em alerta continuamente para as tendecircncias de
ESBLs no Japatildeo aleacutem da necessidade de uma interpretaccedilatildeo uniforme utilizando as
diretrizes do CSLI para relatar cepas produtoras de ESBL Aleacutem da detecccedilatildeo de
ESBLs satildeo necessaacuterias mais informaccedilotildees tais como o perfil de sensibilidade
especiacutefica para diversas β-lactacircmicos e o local da infecccedilatildeo Esses fatores satildeo
essenciais para a escolha adequada de antibioacuteticos (YAGI T et al 2000)
No ano de 2004 uma pesquisa avaliou a produccedilatildeo de uma enzima de
hidroacutelise de carbapenecircmicos atraveacutes da teacutecnica de sequumlenciamento foi revelado
um novo membro da famiacutelia KPC designado KPC- 3 Pesquisadores encontraram
em um mutante de K pneumoniae uma substituiccedilatildeo de um gene associado com
resistecircncia a Imipenem mas essa substituiccedilatildeo foi considerada improvaacutevel na
contribuiccedilatildeo da resistecircncia aos carbapenecircmicos da espeacutecie estudada Aleacutem da
resistecircncia aos carbapenecircmicos estes isolados eram em sua maioria resistentes agraves
cefalosporinas penicilinas e aminoglicosiacutedeos Usando estudos de transformaccedilatildeo
conjugaccedilatildeo e hibridaccedilatildeo localizaram o alelo blaKPC em plasmiacutedeo aleacutem disso
mostraram que esse alelo tambeacutem carregava uma resistecircncia aos aminoglicosiacutedeos
A transferecircncia das enzimas KPCs foi demonstrada in vitro tanto neste como em
outros estudos pode ser que os plasmiacutedeos que fazem esta transferecircncia estavam
comeccedilando a se espalhar no ambiente cliacutenico resultando na multiresistecircncia dessas
estirpes (WOODFORD et al 2004)
O presente estudo apresentou um vieacutes quanto aos resultados dos testes de
susceptibilidade microbiana Observou-se que natildeo foi encontrado resultado deste
teste em algumas amostras o que natildeo cooperou para um estudo mais preciso
futuros estudos quanto agraves amostras e um melhor acompanhamento deste tipo de
patologia Poreacutem mesmo sem algumas amostras com este resultado disponiacutevel foi
56
confirmada a presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos
carbapenecircmicos por meio dos genes de resistecircncia blaKPC e 16S rRNA que as
amostras apresentaram em sua maioria serem portadoras Quanto aos resultados
estatiacutesticos nenhuma das variaacuteveis apresentou significacircncia estatiacutestica (p gt 005)
mostrando assim que estas variaacuteveis isoladas natildeo foram o fator determinante para
o desfecho cliacutenico de alta ou oacutebito
57
7 CONCLUSAtildeO
Os genes blaKPC e 16S rRNA foram caracterizados confirmando a a
presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos carbapenecircmicos
Houve uma maior prevalecircncia da cepa K pneumoniae e isto confirma outros
estudos que apresentam a maior prevalecircncia desta cepa em amostras com KPC
Aleacutem disso isso justifica a forma popular da K pneumoniae ser chamada de KPC
enquanto que na verdade KPC eacute uma enzima podendo estar presente em outras
cepas como Enterobacter clocae tambeacutem apresentada no presente estudo O
desfecho cliacutenico de oacutebitos maior que 50 eacute um possiacutevel indicador sobre a
necessidade de se realizar um teste raacutepido para identificaccedilatildeo de KPC visando
iniciar o mais raacutepido possiacutevel o tratamento afim de diminuir a mortalidade por esta
infecccedilatildeo
Nenhuma das variaacuteveis isoladamente estaacute relacionada ao desfecho cliacutenico
oacutebito ou alta pois natildeo apresentaram relevacircncia estatiacutestica O presente estudo
mostrou que haacute presenccedila da bacteacuteria nas amostras de pacientes do hospital
estudado podendo entatildeo afirmar que este tipo de bacteacuteria se encontra tambeacutem
presente em ambiente hospitalar O uso irracional de antimicrobiano eacute demonstrado
de forma indireta quando foi apresentado atraveacutes do Teste de Hodge Modificado
uma resistecircncia de 100 aos antibioacuteticos carbapenecircmicos Isto tambeacutem reflete na
terapecircutica sendo que pacientes portadores de bacteacuterias resistentes aos
antibioacuteticos carabepecircmicos tem uma escassa opccedilatildeo de tratamento e as opccedilotildees
apresentam problemas quanto agrave toxicidade e eficaacutecia
58
REFEREcircNCIAS
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Mecanismos
de resistecircncia bacteriana aos antimicrobianos Disponiacutevel em
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controleopas_
webmodulo3mec_sitiohtmgt Acesso em 25 de abril de 2014
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Nota teacutecnica nordm
012013 medidas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees por enterobacteacuterias
multiresistentes Acesso em 17 de abril de 2013
ALBA J et al Kinetics study of KPC-3 a plasmid-encoded class A
carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase Antimicrob Agents Chemother
Nov49(11)4760-2 2005
ALVES A P et al Nosocomial infections by KPC-producing enterobacteria in
a tertiary hospital in Southern Brazil Revista da AMRIGS Porto Alegre 57 (3) 213-
218 jul-set 2013
ALVES A et al Tipagem Geneacutetica de Microrganismos Lab De Diversidade
Microbiana Centro de Biologia Celular Dep de Biologia U de Aveiro 3810-193
Aveiro- 2003
BELL J M et Al Prevalence and significance of a negative extended-
spectrum beta-lactamase (ESBL) confirmation test result after a positive ESBL
screening test result for isolates of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae
results from the SENTRY Asia-Pacific Surveillance Program J Clin Microbiol
May45(5)1478-82 2007
BRATU S et al Detection of KPC carbapenem-hydrolyzing enzymes in
Enterobacter spp from Brooklyn New York Antimicrob Agents Chemother v 49 n
2 p 776-8 2005
59
BRATU S et al Emergence of KPC-possessing Klebsiella pneumoniae in
Brooklyn New York epidemiology and recommendations for detection Antimicrob
Agents Chemother v 49 n 7 p 3018-20 2005
BRATU S et al Rapid spread of carbapenem-resistant Klebsiella
pneumoniae in New York City Arch Intern Med v 165 p 1430-5 2005
CAMARGO C F et al Aplicaccedilatildeo das teacutecnicas de pcr e suas teacutecnicas
derivadas em diagnoacutestico molecular Disponiacutevel em
ltfileDUnB10C2BA20semestreArtigosPCR-
20CLEYTON20FLORENCIO20DE20CAMARGO20E20PAULO20ROB
ERTO20QUEIROZpdfgtgt Acesso em 08 de abril de 2014
CARVALHES C G et al Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting
carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive
results Journal of Antimicrobial Chemotherapy v 65 n2 p 249-251 2010
CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION- CDC Modified
Hodge Test for Carbapenemase Detection in Enterobacteriaceae 2004
CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE Methods for
dilutionantimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically Approved
standard M7ndashA7 7th ed CLSI Wayne PA 2011
COELLO R et al Risk factors for developing clinical infection with methicillin-
resistant Staphylococcus aureus (MRSA) amongst hospital patients initially only
colonized with MRSA J Hosp Infect 19973739-46
COLPAN A et al Evaluation of risk factors for mortality in intensive care
units A prospective study from a referral hospital in Turkey Am J Infect Control
200533(1)42-7
60
CORNAGLIA G et al Living with ESBLs Introduction Clinical Microbiology
and Infection 14 Suppl 1 1-2 2008
COTRIM E R et al Klebsiella pneumoniae carbapenemase ndash KPC em
Enterobacteriaceae o desafio das bacteacuterias multirresistentes Poacutes em revista do
centro universitaacuterio Newton Paiva 12012 - ediccedilatildeo 5 - issn 2176 7785
DESHPANDE L M et al Occurrence and characterization of
carbapenemase-producing Enterobacteacuteriaceae report from the SENTRY
Antimicrobial Surveillance Program (2000-2004) Microb Drug Resist 12(4)223-30
2006
DIAS D J A Estudos dos principais mecanismos de resistecircncia aos
antibioacuteticos β-lactacircmicos em bacteacuterias patogecircnicas gram negativas 2009 100 f
Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Geneacutetica Molecular e Biomedicina) ndash Faculdade de
Ciecircncias e Tecnologia Universidade de Nova Lisboa Lisboa
DIENSTMANN R et al Avaliaccedilatildeo fenotiacutepica da enzima Klebsiella
pneumoniae carbapenemase (KPC) em Enterobacteriaceae de ambiente hospitalar
J Bras Patol Med Lab v 46 n 1 p 23-27 fevereiro 2010
ENDIMIAMI A et al Emergence of blaKPC-containing Klebsiella
pneumoniae in a long-term acute care hospital a new challenge to our healthcare J
Antimicrob Chemother 64 1102-1110 Nov 2009
FALAGAS M E et al Extended-spectrum beta-lactamase producing
organisms The Journal of Hospital Infection 73 (4) pp 345-54 2009
FONTANA C et al Emergence of KPC-producing Klebsiella pneumoniae in
Italy BMC Rev Notes 3 40 2010
61
GALES A C et al Antimicrobial resistance among Gram-negative bacilli
isolated from Latin America results from Sentry Antimicrobial Surveillance Program
(Latin America 2008-2010) Diagnostic Microbiology and Infectious Disease v 3 n
4 p 354 -360 2012
GUPTA N et al Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Epidemiology
and Prevention HEALTHCARE EPIDEMIOLOGY Clinical Infectious Diseases
201153(1)60ndash67 Published by Oxford University Press on behalf of the Infectious
Diseases Society of America 2011
HARBOTTLE H et al Genetics of antimicrobial resistance Anim Biotechnol
n17 p111-124 2006
HENRIQUE W N et al RESISTEcircNCIA BACTERIANA Uniatildeo das
Faculdades Alfredo NasserInstituto de Ciecircncias da Sauacutede Disponiacutevel em lt
httpwwwfaculdadealfredonasseredubrfilespesquisaposter20HENRIQUE20
Wilker20Natividade20SANTIAGO20Silvania20CAVALCANTI20DSP
20ResistC3AAncia20Bacterianapdfgt Acesso em 17 marccedilo 2014
HULSCHER M E J I et al Antibiotic prescribing in hospital a social and
behavioral scientific approach The Lancet Infectious Diaseases v 10 n 3 p 167-
165 2010
KIDWAI M SAPRA P BHUSHAN KR Synthetic strategies and medicinal
properties of beta-lactams Curr Med Chem 1999 695-215
KUMARASAMY K K et al Emergence of a new antibiotic resistance
mechanism in India Pakistan and the UK a molecular biological and
epidemiological stuy The Lancet Infectious Diseases v10 n 9 p 597- 602 2010
LINCOPAN N et al Enterobacteacuteria producing extended-spectrum β-
lacatamases and IMP-1 Metalo-β-lactamases isolated from Brazilian hospitals J Med
62
Microbiol 7 1-3 2006
LINCOPAN N et al First Isolation of Metalo-β-Lacatamase-Producing
Multiresistant Klebsiella pneumoniae from a patient in Brazil J Clin Microbiol 43(1)
516-519 2005
LIVERMORE D M et al What remains against carbapenem- resistant
Enterobacteriaceae Evaluation of choramphenicol ciprofloxacin colistina
fosfomycin minocycline nitrofurantoin temocilin and tigecycline International
Journal of Antimicrobial Agents v 37 n 5 p 415- 459 2011
LIVERMORE D M Fourten years in resistance International Journal of
Antimicrobial Agents v 39 283- 294 2012
LIVERMORE D M Bacterial resistance to carbapenems Adv Exp Med Biol
1995 39025-47
LIVERMORE D M Bacterial resistance origins epidemiology and impact
Clin Infect Dis 36S11-S23 2003
LIVERMORE D M et al Carbapenemases a problem in waiting Curr
Opin Microbiol 2000 3489-95
LU et al Universal pcr for common bacterial pathogens J CLIN
MICROBIOL VOL 38 2000
LU et al Use of PCR with Universal Primers and Restriction Endonuclease
Digestions for Detection and Identification of Common Bacterial Pathogens in
Cerebrospinal Fluid Journal of Clinical Microbiology June 2000 p 2076ndash2080
MARSCHALL J Met al Presence of the KPC Carbapenemase Gene in
Enterobacteriaceae Causing Bacteremia and Its Correlation with In Vitro
Carbapenem Susceptibility J Clin Microbiol 47 239-241 Jan 2009
63
MARTINS WMBS et al Prevalecircncia do gene blaKPC em isolados cliacutenicos
de Enterobacteriaceae e natildeo fermentadores encontrados em amostras clinicas em
um hospital universitaacuterio do Recife X Jornada de ensino pesquisa e extensatildeo ndash
JEPEX 2010 ndash UFRPE Recife 18 a 22 de outubro
MENDES C A C et al Polimixinas Revisatildeo com ecircnfase na sua
nefrotoxicidade Rev Assoc Med Bras 2009 55(6) 752-9
MOHR J F 3rd Update on the efficacy and tolerability of meropenem in the
treatment of serious bacteacuterial infections Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S41-51
2008
MONTEIRO J et al First report of KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae
strains in Brazil Antimicrob Agents Chemother Jan53(1)333-4 2009
MOREIRA V C et al Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia a antibioacuteticos
Disponiacutevel em
lthttpwwwcpglsucgbr6mostraartigosSAUDEVANESSA20CARVALHO20M
OREIRApdfgt Acesso em 21 marccedilo 2014
NETIKUL T et al Emergence of novel blaKPC-12 and blaKPC-13 variants in
carbapenem non-susceptible Enterobacter cloacae a first report of blaKPC gene in
Thailand European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases May
S372 2011
NETO V A et al Antibioacuteticos na praacutetica Meacutedica 6ordf Ediccedilatildeo Editorial
SarverSP Brasil 2007
NICOLAU D P Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of
meropenem Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S32-40 2008
64
OLIVEIRA A C et al Resistecircncia bacteriana e mortalidade em um centro de
terapia intensiva Rev Latino-Am Enfermagem nov-dez 2010
PAAUW A et al Failure to control an outbreak of qnrA 1-positive multidrug-
resistant Enterobacter clocae despite adequate implementation of recommended
infection control measures Journal of Clinical Microbiology v 45 n 5 p 1420-1425
2007
PATERSON D L et al Extended-Spectrum Beta-Lactamases a Clinical
Update Clinical Microbiology Reviews v 18 p 657-686 2005
PEIRANO G et al Carbapenem-hydrolysing beta-lactamase KPC-2 in
Klebsiella pneumonia isolated in Rio de Janeiro Brazil J Antimicrob Chemother Nov
20 2009
PERES-BOTA D et al Are infections due to resistant pathogens associated
with worse outcome in critically ill patients J Infect 200347(4)307-16
PIDDOCK L J V Clinically relevant chromosomally encoded multidrug
resistance effl ux pumps in bacterial Clin Microbiol Rev n19 p382-402 2006
PITOUT J D D et al Emergence of Enterobacteriaceae producing
extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) in the community J Antimicrob
Chemother May 56 2005
POSSEBON M I et al Resistecircncia bacteriana aos carbapenecircmicos
Bacterial resitence to carbapenems RBM rev bras med60(6)378380-378-382
jun 2003
QUEENAN A M et al Carbapenemases the versatile beta-lactamases
Clin Microbiol Rev Jul20(3)440-58 2007
65
RHOMBERG P R et al Summary trends for the meropenem yearly
susceptibility test information collection program a 10- year experience in the United
States (1999-2008) Diagnostic Microbiology and Infectiois Disease v 65 n4 p
414-426 2009
ROBLEDO I E et al Detection of KPC in Acinetobacter spp in Puerto Rico
J Antimicrob Agents Chemother 54 1354-1357 Mar 2010
ROGERS B A et al Country-to-country transfer os patients and the risk of
multi-resistant bacterial infection Clinical Infectious Disease v53 n1 p49- 56
2011
SHAH A A et al Characteristics epidemiology and clinicalimportance of
emerging strains of Gram-negative bacilli producing extended-spectrum
betalactamases Research in Microbiology v 155 p 409-421 2004
TURNER P J Extended- Spectrum Beta-Lactamases Clinical Infectious
Diseases v 41 p 273-275 2005
WOLTER D J et al Phenotypic and Enzymatic Comparative Analysis
between the Novel KPC variant KPC-5 and Its Evolutionary Variants KPC-2 and
KPC-4 Antimicrob Agents Chemother Nov 17 2008
WOODFORD N et al Carbapenemases of Chryseobacterium
(Flavobacterium) meningosepticum distribution of blaB and characterization of a
novel Metalo-beta-lactamase gene blaB3 in the type strain NCTC 10016
Antimicrob Agents Chemother Jun44(6)1448-52 2000
WOODFORF N Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in
India Pakistan and the UK a molecular biological and epidemiological study The
Lancet Infectious Diseases v 10 n 9 p 597-602 2010
66
WOODFORD et al Outbreak of Klebsiella pneumoniae Producing a New
Carbapenem- Hydrolyzing Class A β-Lactamase KPC-3 in a New York Medical
Center Antimicrobial agents and chemotherapy Dec 2004 p 4793ndash4799 Vol 48
No 12
YAGI T et al A preliminary survey of extended-spectrum β-lactamases
(ESBLs) in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Japan
FEMS Microbiology Letters 184 (2000) 53-56
YIGIT H et al Novel carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase KPC-1 from
a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumonia J Antimicrob Agents
Chemother 45 (4) 1151-1161 (2001)
ZAVASCKI A P et al KPC-2- producing Enterobacter cloacae in two cities
from Southern Brazil Int J Antimicrob Agents Apr 28 2009
ZHANEL G G et al Comparative review of the carbapenecircmicos Drugs
67(7)1027-52 2007
67
ANEXOS
Sequumlecircncia do oligo blaKPC
Query 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
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Sbjct 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
Query 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
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Sbjct 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
Query 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
68
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Sbjct 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
Query 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
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Sbjct 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
Query 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
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Sbjct 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
69
Query 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
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Sbjct 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
Query 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
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Sbjct 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
Query 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
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70
Sbjct 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
Query 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
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Sbjct 481
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ATTTGTT 540
Query 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
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Sbjct 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
Query 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
71
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Sbjct 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
Query 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
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Sbjct 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
Query 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
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Sbjct 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
72
Query 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
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Sbjct 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
Query 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
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Sbjct 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
Query 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
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73
Sbjct 901
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CCGTCAT 960
Query 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
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Sbjct 961
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GCTCTGA 1020
Query 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
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Sbjct 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
Query 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
74
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Sbjct 1081
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AGCACTG 1140
Query 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
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Sbjct 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
Query 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
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Sbjct 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
75
Query 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
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Sbjct 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
Query 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
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Sbjct 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
LOCUS AF297554 1377 bp
DNA linear BCT 26-MAR-2001
DEFINITION Klebsiella pneumoniae carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
gene complete cds
ACCESSION AF297554
VERSION AF2975541 GI10121874
76
KEYWORDS
SOURCE Klebsiella pneumoniae
ORGANISM Klebsiella pneumoniae
Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Enterobacteriaceae Klebsiella
REFERENCE 1 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH QueenanAM
AndersonGJ Domenech-SanchezA
BiddleJW StewardCD
AlbertiS BushK and TenoverFC
TITLE Novel carbapenem-hydrolyzing beta-
lactamase KPC-1 from a
carbapenem-resistant strain of
Klebsiella pneumoniae
JOURNAL Antimicrob Agents Chemother 45 (4)
1151-1161 (2001)
PUBMED 11257029
REFERENCE 2 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH AndersonGJ and
TenoverFC
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (19-AUG-2000) Nosocomial
Pathogens Laboratory Branch
Centers for Disease Control and
Prevention 1600 Clifton Rd MS
G08 Atlanta GA 30333 USA
FEATURES LocationQualifiers
77
source 11377
organism=Klebsiella
pneumoniae
mol_type=genomic DNA
db_xref=taxon573
-35_signal 5560
-10_signal 7883
mRNA 921012
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
RBS 117122
CDS 1311012
note=blaKPC-1
codon_start=1
transl_table=11
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
protein_id=AAG134101
db_xref=GI10121875
translation=MSLYRRLVLLSCLSWPLAGFSATALTNLVAEPFAKLEQD
FGGSI
GVYAMDTGSGATVSYRAEERFPLCSSFKGFLAAAVLARSQQQAGLLDTPIRYG
KNALV
PWSPISEKYLTTGMTVAELSAAAVQYSDNAAANLLLKELGGPAGLTAFMRSIG
DTTFR
78
LDRWELELNSAIPSDARDTSSPRAVTESLQKLTLGSALAAPQRQQFVDWLKGN
TTGNH
RIRAAVPADWAVGDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTRAPNKDDK
HSEAV
IAAAARLALEGLGVNGQ
ORIGIN
1 cggggcagtt acagccgtta cagcctctgg
agagggagcg gcttgccgct cggtgataat
61 cccagctgta gcggcctgat tacatccggc
cgctacacct agctccacct tcaaacaagg
121 aatatcgttg atgtcactgt atcgccgtct
agttctgctg tcttgtctct catggccgct
181 ggctggcttt tctgccaccg cgctgaccaa
cctcgtcgcg gaaccattcg ctaaactcga
241 acaggacttt ggcggctcca tcggtgtgta
cgcgatggat accggctcag gcgcaactgt
301 aagttaccgc gctgaggagc gcttcccact
gtgcagctca ttcaagggct ttcttgctgc
361 cgctgtgctg gctcgcagcc agcagcaggc
cggcttgctg gacacaccca tccgttacgg
421 caaaaatgcg ctggttccgt ggtcacccat
ctcggaaaaa tatctgacaa caggcatgac
481 ggtggcggag ctgtccgcgg ccgccgtgca
atacagtgat aacgccgccg ccaatttgtt
541 gctgaaggag ttgggcggcc cggccgggct
gacggccttc atgcgctcta tcggcgatac
79
601 cacgttccgt ctggaccgct gggagctgga
gctgaactcc gccatcccaa gcgatgcgcg
661 cgatacctca tcgccgcgcg ccgtgacgga
aagcttacaa aaactgacac tgggctctgc
721 actggctgcg ccgcagcggc agcagtttgt
tgattggcta aagggaaaca cgaccggcaa
781 ccaccgcatc cgcgcggcgg tgccggcaga
ctgggcagtc ggagacaaaa ccggaacctg
841 cggagtgtat ggcacggcaa atgactatgc
cgtcgtctgg cccactgggc gcgcacctat
901 tgtgttggcc gtctacaccc gggcgcctaa
caaggatgac aagcacagcg aggccgtcat
961 cgccgctgcg gctagactcg cgctcgaggg
attgggcgtc aacgggcagt aaggctctga
1021 aaatcatcta ttggcccacc accgccgccc
ttgcgggcgg catggattac caaccactgt
1081 cacatttagg ctaggagtct gcgcggcaga
gccgtgtgac cggttttctg tagagcactg
1141 acgatggcgg cggcgctctc tgcaattggc
aaggcgtcgg cgccaaggat accaatcttg
1201 cggcgcgcgg cgtgttatga cgactggggt
gcatttgagc cgccccattt aaccttcgcc
1261 ctcacagata cgccattcgc ctcaaattta
gcgccatgca gacgagcttc cactcggctt
1321 gcaccttgtc caggcccctc atgctgaact
gacgcaatcc catcaccgcc ttgatca
80
Palavras chaves Klebsiella pneumoniae carbapenemase Resistecircncia bacteriana a
antimicrobianos β-lactamases de espectro estendido (ESBL) Reaccedilatildeo em Cadeia de
Polimerase (PCR)
ABSTRACT
Introduction Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) is an enzyme produced
by gram - negative bacteria (Enterobacteriaceae) which confers resistance to
carbapenem antibiotics meropenen ertapenen imipenem class widely used in the
treatment of infections involving Enterobacteriaceae This resistance is a major
cause of treatment failure due to beta-lactamases production of extended spectrum
(ESBL) by this bacterium most commonly resistance to beta-lactam antibiotics of
wide spectrum engine The identification of these Enterobacteriaceae can be made
by techniques of molecular identification of pathogens among them the Polymerase
Chain Reaction (PCR) which consists in the analysis of the amplification pattern of
repeated elements found in the bacterial genome allowing faster in getting results
when compared with other methods in addition to presenting high reliability simple
implementation and deployment depending on the application of the technique has
no trouble with the degradation of DNA Objective To characterize the resistance
genes of Enterobacteriaceae producing carbapenemases and epidemiological and
clinical features of patients admitted to a public hospital in the Federal District
aspects Materials and methods Cross-sectional study where susceptibility testing
of Enterobacteriaceae to antibiotics Carbapenems from biological materials collected
from patients admitted to the Hospital Regional da Asa Norte ( HRAN ) was
performed Molecular analysis of 16S rRNA genes and blaKPC using PCR in
addition to statistical analysis Results and Discussion Was detected region and
the ribosomal tested resistance gene confirming the microbial resistance Higher
prevalence of male patients (53 ) clinical outcome of death (59 ) site of infection
rectal swabs (47 ) Klebsiella pneumoniae was found more microorganism (82)
There was no statistical difference between the variables and the clinical outcome (p
was gt 005) Conclusion Through molecular characterization of genes and the
Universal blaKPC resistance confirmed the presence of Klebsiella pneumoniae
resistant to carbapenems P values were not significant (lt 005) so none of the
variables studied were the main reason the clinical outcome (discharge or death)
Keywords Klebsiella pneumoniae Carbapenemase Bacterial resistance to
antibiotics Extended-Spectrumβ-lactamases (ESBL) Polimerase Chain Reaction
(PCR)
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Accedilatildeo do szlig-lactacircmico sobre a bacteacuteria gram-positiva e gram-negativa
Figura 2 Divulgaccedilatildeo internacional de Klebsiella pneumoniae Carbapenemase
(KPC) produtoras de Enterobacteriaceae
Figura 3 Mecanismos de resistecircncia bacteriana
Figura 4 Etapas da Reaccedilatildeo de PCR
Figura 5 Mecanismo de semeamento de material bioloacutegico oriundos de pacientes
com suspeita de infecccedilatildeo por KPC
Figura 6 Interpretaccedilatildeo resultado do Teste de Hodge Modificado
Figura 7 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC das amostras dos
17 pacientes estudados
Figura 8 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC da mostra A3
estudada
Figura 9 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA das amostras
dos 17 pacientes estudados
Figura 10 Gel de agarose a 2 da digestatildeo do amplicon do gene 16S rRNA das
amostras com a enzima HaeIII evidenciando diversos fragmentos proacuteximos a 200
pb
Figura 11 Infecccedilatildeo por KPC segundo sexo dos 17 pacientes investigados no
HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
Figura 12Isolado de KPC segundo desfecho cliacutenico dos 17 pacientes investigados
no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
Figura 13 Isolados de KPC segundo local da coleta da amostra nos 17 pacientes
investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
Figura 14Isolado de KPC segundo microrganismo encontrado em 17 pacientes
investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Criteacuterios Interpretativos para testes de sensibilidade
Tabela 2 Nuacutemero de acesso ao GenBank dos alelos blaKPC e seus microrganismos
originais
Tabela 3 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do gene blaKPC
Tabela 4 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do gene
universal
Tabela 5 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da digestatildeo do gene universal
Tabela 6 - Distribuiccedilatildeo das variaacuteveis estudadas perfil geneacutetico sexo coleta
tipificaccedilatildeo de microrganismos e anaacutelise da resistecircncia bacteriana segundo o
desfecho cliacutenico Brasiacutelia-DF 2010 a 2012
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AmpC- Adenosina Monofosfato Ciacuteclico
BRMD- Bacteacuterias multirresistentes
CCIH- Comissatildeo de Controle de Infecccedilatildeo Hospitalar
CDC- Centers for Disease Control and Prevention
CIM- Concentraccedilatildeo Inibitoacuteria Miacutenima
CLSI- Clinical and Laboratory Standards Institute
DNA- Aacutecido Desoxirribonucleacuteico
E coli- Escherichia coli
ERIC-PCR - Enterobacterial Repet it ive Intergenic Consensus
ESBL- Beta-Lactamases de Espectro Estendido
Et al- e outros
ETP- Ertapenem
HRAN- Hospital Regional da Asa Norte
K ornithinolytica- Klebsiella ornithinolytica
K oxytoca- Klebsiella oxytoca
K planticola- Klebsiella planticola
K pneumoniae- Klebsiella pneumoniae
K terrigena- Klebsiella terrigena
KPC - Klebsiella pneumoniae produtora de Carbapenemase
KPCNEG- Bacilos Gram-Negativos Natildeo Fermentadores
KPCPOS- Bacilos Gram-Positivo Natildeo Fermentadores
MBL- metalo-beta-lactamases
MEM- Meropenem
NA- Natildeo se aplica
Oligo- Oligonucleotiacutedeos
PB- Pares de Bases
PBPs (Penicilim-Binding-Protein)- Proteiacutenas de ligaccedilatildeo agrave penicilina
PCR- Polymerase Chain Reaction (Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase)
PFGE - Pulsed-Field Gel Electrophoresis (Eletroforese em campo pulsado)
RAPD- Randomly Amplified Polymorphic DNA (DNA polimoacuterfico amplificado
aleatoriamente)
RFLPrsquos - ldquoRestriction Fragment Length Polymorphismsrdquo( polimorfismos de tamanho
de fragmentos de restriccedilatildeo)
THM- Teste de Hodge Modificado
TSA- Teste de Susceptibilidade aos Antibioacuteticos
UTI- Unidade de Terapia Intensiva
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 15
11 Klebsiella pneumoniae produtora de Carbapenemase (KPC) 15
1 2 Resistecircncia bacteriana 20
13 Anaacutelise geneacutetica de microrganismos 27
2 JUSTIFICATIVA 30
3 OBJETIVOS 31
31 Objetivo geral 31
32 Objetivos Especiacuteficos 31
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS 32
4 1 Coleta e transporte das amostras bioloacutegicas 32
4 2 Procedimentos para confirmaccedilatildeo de resistecircncia bacteriana por disco de
Ertapenem (adaptado CDC 2004) 32
4 2 1 Interpretaccedilatildeo dos Resultados 33
4 3 Teste de susceptibilidade aos antibioacuteticos 34
4 4Teste de Hodge Modificado (THM) (adaptado CDC 2004) 35
441 Controle de qualidade (CQ) 35
442 InterpretaccedilatildeoResultados 35
4 5 Extraccedilatildeo de DNA bacteriano 37
4 6 Iniciadores e reaccedilatildeo de PCR 38
4 7 Digestatildeo 41
4 8 Eletroforese em gel de agarose 41
4 9 Descarte de resiacuteduos 42
4 10 Aspectos epidemioloacutegicos e cliacutenicos 42
4 12 Anaacutelises estatiacutesticas 42
4 13 Preceitos eacuteticos 43
5 RESULTADOS 44
51 Anaacutelise molecular 44
5 1 1 Gene blaKPC 44
5 1 2 Gene 16S rRNA 45
5 2 Anaacutelises epidemioloacutegicas 46
5 2 1 Sexo 46
5 2 2 Desfecho cliacutenico 47
5 2 3 Local da coleta 48
5 2 4 Microrganismo 48
6 DISCUSSAtildeO 53
7 CONCLUSAtildeO 57
15
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC)
Klebsiella pneumoniae pertence aacute famiacutelia Enterobacteriaceae
encontrado em locais como aacutegua solo plantas e esgoto Satildeo encontradas cinco
espeacutecies K pneumoniae K oxytoca K planticola K terrigena e K ornithinolytica
O gecircnero Klebsiella eacute definido como contendo bacilos Gram-negativos natildeo moacuteveis
em forma de bastatildeo e geralmente encapsuladas que produzem lisina
descarboxilase mas natildeo produzem ornitina descarboxilase Provavelmente a
colonizaccedilatildeo em seres humanos ocorre por contato com as diferentes fontes
ambientais podendo ser encontrada colonizando a orofaringe e fezes de pessoas
sadias Pessoas imunocomprometidas a bacteacuteria encontra um ambiente favoraacutevel
para seu crescimento levando aos quadros de infecccedilatildeo (MOREIRA et al 2014)
A Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) eacute uma enzima produzida por
enterobacteacuterias gram-negativas sendo um mecanismo de resistecircncia aos antimi-
crobianos carbapenecircmicos meropenen ertapenen eou imipenen classe
amplamente utilizada no tratamento de infecccedilotildees envolvendo Enterobacteriaceae
Ela tambeacutem eacute capaz de inativar os agentes β-lactacircmicos cefalosporinas penicilinas
e o aztreonam (COTRIM et al 2012)
Devido agrave semelhanccedila estrutural e estereoquiacutemica os antibioacuteticos beta-
lactacircmicos possuem um mecanismo de accedilatildeo comum ao grupo Eles atuam inibindo
a siacutentese da parede celular bacteriana atraveacutes do mecanismo de bloqueio da
transpeptidaccedilatildeo responsaacutevel pela uniatildeo dos componentes individuais do
peptidoglicano conforme demonstrado na figura 1 (KIDWAI et al 1999)
A accedilatildeo destes antibioacuteticos eacute atraveacutes de ligaccedilotildees covalentes com as proteiacutenas
as Penicilim-Binding-Protein (proteiacutena de ligaccedilatildeo da penicilina- PBP ou PLP) que se
encontram presentes na membrana citoplasmaacutetica de todas as bacteacuterias Devido agraves
mutaccedilotildees ocorre uma induccedilatildeo na alteraccedilatildeo dessas proteiacutenas podendo determinar
uma diminuiccedilatildeo da afinidade dos beta-lactacircmicos agraves mesmas A accedilatildeo dos
carbapenecircmicos eacute atraveacutes da sua ligaccedilatildeo agraves PBPs presentes na parede bacteriana
especialmente as PBP1 e PBP2 provocando a lise osmoacutetica da bacteacuteria Aleacutem
disso eles tecircm uma facilidade na penetraccedilatildeo da bacteacuteria por meio dos canais
poriacutenicos presentes nas bacteacuterias gram-negativas induzindo um efeito poacutes-
16
antibioacutetico Quando comparados com outros beta-lactacircmicos os carbapenecircmicos
satildeo mais resistentes agrave hidroacutelise pela maioria das beta-lactamases tanto
cromossocircmicas como plasmiacutedicas (LIVERMORE 1995 LIVERMORE et al 2000)
Figura 1 Accedilatildeo do szlig-lactacircmico sobre a bacteacuteria gram-positiva e gram-
negativa Fonte
ltlthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controle
opas_webmodulo3gramn_lacta2htmgt (adaptado)
A bacteacuteria Klebsiella pneumoniae quando apresenta gene ESBL pode
expressar resistecircncia a ateacute 95 dos antimicrobianos existentes no acircmbito
farmacecircutico sendo a produccedilatildeo de beta-lactamases de espectro estendido (ESBL)
17
por esta bacteacuteria uma das principais causas de falha terapecircutica Existem outras
formas de resistecircncia emergentes de grande importacircncia como a produccedilatildeo de
beta-lactamases tipo adenosina monofosfato ciacuteclico (AmpC) que hidrolizam
cefoxitina as carbapenemases como as metalo-beta-lactamases (MBL) e
carbapenemases tipo KPC (MOREIRA et al 2014)
O mecanismo de resistecircncia mais comum aos antibioacuteticos beta-lactacircmicos de
amplo espectro eacute a produccedilatildeo de ESBL por enterobacteacuterias A accedilatildeo hidroliacutetica
apresentadas por estas enzimas pode conferir clinicamente resistecircncia ao
aztreonam cefalosporina e a todas as penicilinas (PATERSON et al 2005) As
ESBL satildeo enzimas mediadas por genes plasmidiais (transmissiacuteveis entre as
espeacutecies) Os principais microrganismos produtores de ESBL satildeo Klebsiella
pneumoniae (mais encontrada) Escherichia coli e Proteus mirabilis podendo ocorrer
em outros membros da famiacutelia Enterobacteriaceae e em alguns microrganismos natildeo
enteacutericos como Acinetobacter ssp (TURNER 2005) A importacircncia cliacutenica meacutedica
destes microrganismos portadores de ESBL eacute que graccedilas aacutes suas resistecircncias a
muitas classes de antimicrobianos o tratamento de infecccedilotildees eacute difiacutecil gerando um
aumento da morbidade e mortalidade dos pacientes (SHAH et al 2004)
A enzima KPC foi detectada pela primeira vez na Carolina do Norte Costa
Leste dos Estados Unidos no ano de 1996 em Klebsiella pneumoniae dando entatildeo
este nome a enzima Em pouco tempo ela disseminou por outras regiotildees e
recentemente tornou-se uma das preocupaccedilotildees quanto agrave sauacutede puacuteblica mundial
Os paiacuteses de onde KPCs tecircm sido relatados desde 2001 satildeo mostrados na figura 2
apresentando como os organismos tecircm agora sido disseminados amplamente pelo
mundo (NEIL GUPTA et al 2011)
18
Figura 2 Divulgaccedilatildeo internacional de Enterobacteriaceae produtora de
Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC)( NEIL GUPTA et al 2011)
Este mapa apresenta paiacuteses onde Enterobacteriaceae produtoras KPC de
foram descritos em relatoacuterios publicados disponiacuteveis a partir de 11 fevereiro de
2011 Os paiacuteses natildeo destacadas nesta figura tambeacutem podem apresentar a presenccedila
de Enterobacteriaceae produtoras de KPC poreacutem pode ter tido uma falta de
vigilacircncia sistemaacutetica para estes organismos ( NEIL GUPTA et al 2011)
No ano de 2005 foram registradas pela primeira vez essas bacteacuterias
produtoras de carbapenemases Apoacutes 6 anos deste primeiro relato elas passaram a
causar surtos mais graves em nosso paiacutes Em janeiro de 2011 foram notificados no
Distrito FederalBrasil 367 casos em um curto espaccedilo de tempo (01 a 08 de janeiro
de 2011) com 26 oacutebitos A maior parte destes casos (263 casos) foi identificada nas
unidades de terapia intensiva ndash UTI (COTRIM et al 2012)
O potencial de disseminaccedilatildeo da KPC eacute alto devido agrave grande capacidade de
transferecircncia do seu material geneacutetico e por conseguinte os genes de resistecircncia
O controle de epidemias eacute difiacutecil devido a esta caracteriacutestica de faacutecil disseminaccedilatildeo
preocupando os profissionais da aacuterea de sauacutede devido agrave dificuldade de tratamento
podendo resultar em um aumento das taxas de mortalidade Apesar da maior
19
frequumlecircncia em Klebsiella pneumoniae a KPC pode ser identificada em outras
bacteacuterias como a Enterobacter cloacae Citrobacter freundii Salmonella spp E coli
e Pseudomonas spp (DIENSTMANN et al 2010)
Os pacientes com comorbidades incluindo pacientes transplantados
neutropecircnicos em ventilaccedilatildeo mecacircnica em Unidade de Terapia Intensiva (UTI)
com longos periacuteodos de internaccedilatildeo que apresentam risco aumentado de infecccedilatildeo ou
colonizaccedilatildeo para bacteacuterias multirresistentes satildeo mais vulneraacuteveis a Klebsiella
pneumoniae produtora de KPC (COTRIM et al 2012)
Os sinais e sintomas apresentados por um indiviacuteduo infectado por KPC satildeo
febre ou hipotermia taquicardia piora do quadro respiratoacuterio e em casos mais
graves hipotensatildeo inchaccedilo e sepse Quanto ao siacutetio de infecccedilatildeo a bacteacuteria que
possui a enzima KPC pode causar pneumonia associada agrave ventilaccedilatildeo mecacircnica
infecccedilatildeo do trato urinaacuterio infecccedilatildeo de corrente sanguiacutenea infecccedilatildeo de partes moles
e outros tipos de infecccedilatildeo (COTRIM et al 2012)
Para desenvolver a infecccedilatildeo a colonizaccedilatildeo eacute um preacute-requisito poreacutem o
pacientes pode estar colonizado ou seja ser portadores de KPC e natildeo desenvolver
a infecccedilatildeo (ALVES et al 2013) A forma de transmissatildeo eacute basicamente por
contato com secreccedilatildeo ou excreccedilatildeo de pacientes infectados ou colonizados logo
fora do ambiente hospitalar a bacteacuteria natildeo representa perigo (COTRIM et al
2012)
As opccedilotildees terapecircuticas para o tratamento da Klebsiella pneumoniae eacute
dividida em Terapia Empiacuterica e Terapia apoacutes a determinaccedilatildeo do perfil de
sensibilidade A terapia empiacuterica para infecccedilotildees por enterobacteacuterias multirresistentes
se baseia na utilizaccedilatildeo de polimixina B ou polimixina E (Colistina) em associaccedilatildeo
com um (1) ou mais dos antimicrobianos da classe dos aminoglicosiacutedeos
(gentamicina ou amicacina) Carbapenecircmicos (meropenem ou doripenem) eou
tigeciclina (ANVISA 2013)
Recomenda-se usar sempre associaccedilotildees de dois ou trecircs antimicrobianos
sendo um deles a polimixina B ou a polimixina E (colistina) Deve-se evitar a
utilizaccedilatildeo de monoterapias pelo risco de raacutepido desenvolvimento de resistecircncia A
escolha do(s) faacutermaco(s) de associaccedilatildeo com polimixina B ou E deve se basear
preferencialmente no perfil de susceptibilidade esperado aos referidos
20
medicamentos das enterobacteacuterias resistentes aos carbapenecircmicos detectadas no
hospital ou na ausecircncia de dados locais na regiatildeo Deve-se considerar igualmente
o local de infecccedilatildeo e a penetraccedilatildeo esperada do antimicrobiano na escolha da droga
a ser utilizada na combinaccedilatildeo (ANVISA 2013)
Apoacutes a liberaccedilatildeo do perfil de sensibilidade deve-se adequar o uso dos
medicamentos Sempre que possiacutevel manter no miacutenimo 2 (dois) faacutermacos com
sensibilidade comprovada in vitro Natildeo havendo sensibilidade a um segundo
medicamento (suscetibilidade apenas agrave polimixina B ou E) recomenda-se manter a
terapia combinada de polimixina B ou E com carbapenecircmicos (meropenem ou
doripenem) ou tigeciclina na tentativa de ocorrecircncia de sinergismo entre elas
(ANVISA 2013)
Sugere-se aleacutem da determinaccedilatildeo das Concentraccedilotildees Inibitoacuterias Miacutenimas
(CIMs) para uma das polimixinas (B ou E) que tambeacutem sejam determinadas as
CIMs de tigeciclina e carbapenecircmicos (meropenem) bem como a consultoria de um
infectologista (ou Comissatildeo de Controle de Infecccedilatildeo Hospitalar- CCIH) para a
determinaccedilatildeo da terapia combinada com base na interpretaccedilatildeo do antibiograma
CIM e quadro cliacutenico do paciente No caso de resistecircncia agraves polimixinas
(concentraccedilotildees inibitoacuterias miacutenimas [CIMs] gt 2 mgL) recomenda-se a associaccedilatildeo de
dois ou trecircs do antimicrobianos sugeridos para a combinaccedilatildeo (ANVISA 2013)
A antissepsia eficiente do ambiente dos instrumentos ciruacutergicos e das matildeos
com o uso do aacutelcool a 70 eacute fundamental para a contenccedilatildeo de surtos Aleacutem disto
os pacientes contaminados devem permanecer isolados ateacute o controle da infecccedilatildeo
para evitar a disseminaccedilatildeo da bacteacuteria (COTRIM et al 2012)
1 2 Resistecircncia bacteriana
Hoje a disseminaccedilatildeo e a proliferaccedilatildeo das bacteacuterias resistentes estatildeo cada
dia mais presente As bacteacuterias multirresistentes (BRMD) poderatildeo levar agrave
humanidade a uma era poacutes-antibioacutetica resultando em uma ausecircncia de qualquer
opccedilatildeo de tratamento para os portadores destas cepas (HENRIQUE et al 2014)
Os fatores envolvidos na disseminaccedilatildeo desses patoacutegenos multirresistentes
satildeo diversos incluindo o uso irracional de antimicrobianos procedimentos invasivos
21
(cirurgias implantaccedilatildeo de proacuteteses meacutedicas e outros) e a transferecircncia de material
geneacutetico com a informaccedilatildeo de resistecircncia a antibioacuteticos entre as bacteacuterias
(DIENSTMANN et al 2010 ENDIMIAMI et al 2009 FONTANA et al 2010)
Com a praacutetica da antibioticoterapia principalmente em ambientes
nosocomiais os mecanismos de resistecircncia tornaram-se comuns Esses
mecanismos incluem alteraccedilatildeo na permeabilidade da membrana celular que
impede a entrada do antibioacutetico na ceacutelula bombeamento do antibioacutetico para fora da
mesma pelo mecanismo de efluxo mutaccedilatildeo geneacutetica que altera de alguma forma o
alvo do antibioacutetico e consequumlentemente natildeo afeta o funcionamento da bacteacuteria
bem como desenvolvimento da capacidade de degradar ou da inativaccedilatildeo do
antibioacutetico (COTRIM et al 2012) Estes mecanismos estatildeo representados na figura
3
Figura 3 Mecanismos de resistecircncia bacteriana Fonte
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controle
opas_webmodulo3pop_mecanismohtmgt
Um dos mais importantes mecanismos de resistecircncia eacute a alteraccedilatildeo do local-
alvo onde atua determinado antimicrobiano de modo a impedir a ocorrecircncia de
qualquer efeito inibitoacuterio ou bactericida As bacteacuterias podem adquirir um gene que
22
codifica um novo produto resistente aos antimicrobianos substituindo o alvo original
por exemplo o Staphylococcus aureus resistente agrave oxacilina e estafilococos
coagulase-negativos adquiriram o gene cromossocircmico Mec A e produzem uma PBP
ou PLP resistente aos β-lactacircmicos denominada 2a ou 2 que eacute suficiente para
manter a integridade da parede celular durante o crescimento quando outras PBPs
essenciais satildeo inativadas por antibimicrobianos β-lactacircmicos Como alternativa um
gene receacutem-adquirido pode atuar para modificar um alvo tomando-o menos
vulneraacutevel a determinado antimicrobiano Assim um gene transportado por
plasmiacutedeo ou por transposon codifica uma enzima que inativa os alvos ou altera a
ligaccedilatildeo dos antimicrobianos como ocorre com eritromicina e clindamicina (ANVISA
2007)
Em funccedilatildeo da bomba de efluxo pode variar a especificidade do antibioacutetico
Ele atua por meio do bombeamento ativo de antimicrobianos do meio intracelular
para o extracelular gerando uma resistecircncia bacteriana a determinados
antimicrobianos como eacute o caso da resistecircncia agraves tetraciclinas codificada por
plasmiacutedeos em Escherichia coli devido agrave presenccedila de proteiacutenas integrantes da
membrana plasmaacutetica bacteriana (PIDDOCK 2006)
O aumento da siacutentese de proteiacutenas eacute o principal responsaacutevel pela resistecircncia
antimicrobiana devido agraves vaacuterias mutaccedilotildees que ocorrem em seus repressores
transcricionais Estas mutaccedilotildees tambeacutem podem influenciar levando a um aumento
da eficiecircncia do transporte dos antibioacuteticos para o exterior da ceacutelula (HARBOTTLE
et al 2006)
A resistecircncia aos antibioacuteticos eacute frequumlentemente associada agrave alteraccedilatildeo
diminuiccedilatildeo da permeabilidade que ocorre na membrana externa das bacteacuterias gram-
negativas O fluxo de moleacuteculas para o interior da ceacutelula ocorre por caracteriacutesticas
peculiares como carga estrutura e dimensatildeo e atraveacutes de proteiacutenas de membrana
as quais formam canais Este percurso eacute utilizado pelos antibioacuteticos para atingir o
interior da ceacutelula bacteriana ou o espaccedilo periplasmaacutetico como eacute o caso dos
antibioacuteticos β-lactacircmicos Portanto a perda de funccedilatildeo destas proteiacutenas pode
efetivamente causar a diminuiccedilatildeo da susceptibilidade a vaacuterios antibioacuteticos
(LIVERMORE 2003)
23
Os mecanismos de resistecircncia que podem impedir a accedilatildeo de antimicrobianos
satildeo vaacuterios O faacutermaco atua de forma a inibir os processos essenciais a multiplicaccedilatildeo
e sobrevivecircncia da ceacutelula bacteriana como a membrana citoplasmaacutetica e
consequumlentemente bloqueando a siacutentese proteacuteica de aacutecidos nucleacuteicos e da parede
celular A resistecircncia bacteriana eacute um mecanismo natural de defesa Sendo assim
as bacteacuterias estatildeo em constante defesa e para cada novo faacutermaco desenvolvido as
bacteacuterias iratildeo desenvolver resistecircncia em algum momento (POSSEBON et al
2003)
O grupo de antibioacuteticos beta-lactacircmicos satildeo amplamente utilizado e se
encontram dentro da classe dos melhores agentes antimicrobianos com relevacircncia
cliacutenica No entanto o seu uso tem sido restringido devido a vaacuterios mecanismos de
resistecircncia O desenvolvimento dos carbapenecircmicos surgiu devido agrave proliferaccedilatildeo de
beta-lactamases mediadas por plasmiacutedeos e cromossomos (POSSEBON et al
2003)
A bacteacuteria KPC tem um gene chamado SHV-1 que tem a caracteriacutestica de
resistecircncia a quase todos os tipos de antimicrobianos inclusive os carbapenecircmicos
especiacuteficos para o tratamento de infecccedilotildees por bacteacuterias multiresistentes e
emergecircncias Mesmo com no seu coacutedigo geneacutetico a informaccedilatildeo necessaacuteria para o
desenvolvimento da resistecircncia a resistecircncia da bacteacuteria soacute eacute desenvolvida caso a
bacteacuteria entre em contato com o antibacteriano desencadeando todo o processo
nos casos de resistecircncia induzida comuns em KPC (MOREIRA et al 2014)
A resistecircncia bacteriana pode ser apresentada de forma intriacutenseca ou
adquirida A resistecircncia intriacutenseca faz parte das caracteriacutesticas fenotiacutepicas naturais
do microrganismo ou seja faz parte de sua heranccedila geneacutetica sendo transmitida
verticalmente a prole sem perda da caracteriacutestica A presenccedila ou ausecircncia do alvo
para a accedilatildeo da droga eacute o principal determinante deste tipo de resistecircncia
(MOREIRA et al 2014) Essa resistecircncia corresponde a uma caracteriacutestica de
espeacutecie bacteriana quando estes microrganismos satildeo naturalmente resistentes a
certo tipo de antibioacutetico Este processo eacute decorrente da ausecircncia de estruturas de
atuaccedilatildeo de antimicrobianos ou a impermeabilidade por parte de estruturas
perifeacutericas das bacteacuterias (HENRIQUE et al 2014)
24
A resistecircncia adquirida aos antibioacuteticos por sua vez ocorre quando haacute uma
da mutaccedilatildeo de genes reguladores ou estruturais aquisiccedilatildeo de genes de resistecircncia
veiculados por elementos geneacuteticos moacuteveis ou da combinaccedilatildeo entre eles Este
aparecimento de resistecircncia em uma espeacutecie bacteriana era anteriormente sensiacutevel
a droga e devido a um destes fatores se torna resistente O fenoacutetipo resultante
desta resistecircncia natildeo estaraacute presente nas ceacutelulas genitoras e sim nos indiviacuteduos de
uma linhagem bacteriana derivada de um organismo susceptiacutevel Os genes muitas
vezes satildeo adquiridos por meio de elementos moacuteveis como plasmiacutedeos e
transposons (MOREIRA et al 2014)
Entatildeo a resistecircncia adquirida ocorre por diversos mecanismos geneacuteticos tais
como produccedilatildeo de enzimas inativadoras interferecircncia com a entrada e acuacutemulo de
droga na bacteacuteria alteraccedilatildeo do receptor para accedilatildeo da droga via metaboacutelica
alternativa Eacute originada por meio de uma alteraccedilatildeo a niacutevel geneacutetico da ceacutelula de
natureza cromossocircmica pelos processos de mutaccedilatildeo transduccedilatildeo e transformaccedilatildeo
ou extra cromossocircmica (plasmidial) (HENRIQUE et al 2014)
Como todo antibioacutetico β-lactacircmicoos carbapenecircmicos tem como mecanismo
de accedilatildeo a inibiccedilatildeo da siacutentese proteacuteica atraveacutes da accedilatildeo de inibiccedilatildeo da parede
microbiana fazendo a ligaccedilatildeo e inativaccedilatildeo das proteiacutenas ligadoras de penicilinas
(NETO et al 2007)
Imipenem e meropenem antibioacuteticos pertencentes ao grupo dos
carbapenecircmicos possuem um amplo espectro de accedilatildeo in vitro incluindo atividade
contra cocos gram-positivos bacilos gram-negativos e bacteacuterias anaeroacutebias (MOHR
2008) Jaacute o ertapenem possui um espectro de accedilatildeo mais limitado que o os dois
antibioacuteticos anteriormente citados tendo uma eficiecircncia limitada contra os bacilos
gram-negativos natildeo fermentadores Um novo antibioacutetico carbapenecircmico ainda natildeo
disponiacutevel no Brasil doripenem possui uma atividade mais potente principalmente
contra Pseudomona aeruginosa devido ao seu mecanismo de accedilatildeo que combina os
espectros de accedilatildeo de imipenem e meropenem (ZHANEL et al 2007)
Devido as suas estabilidades espectro de accedilatildeo poucos relatos de
resistecircncia boa toleracircncia pelos pacientes com efeitos adversos mais comuns as
complicaccedilotildees no siacutetio da infusatildeo e toxicidade gastrintestinal estes antibioacuteticos
carbapenecircmicos tecircm sido considerados terapia de escolha (NICOLAU 2008) Como
25
uma resposta adaptativa das Enterobacteacuterias o iacutendice de resistecircncia aos
carbapenecircmicos tem aumentado nos uacuteltimos anos de forma proporcional ao seu
uso limitando imensamente as opccedilotildees terapecircuticas para as infecccedilotildees causadas por
estes microrganismos (FALAGAS et al 2009)
As enzimas produtoras de betalactamases hidrolisam o anel betalactacircmico
tornando este mecanismo de resistecircncia o mais importante Os dois grupos mais
preocupantes satildeo o grupo das betalactamases de aspecto ampliado e os da
carbapenemases que aleacutem de hidrolizar os carbapenecircmicos hidrolizam todas as
outras classes de betalactacircmicos Em enterobacteacuterias as carbapenemases mais
prevalentes satildeo codificadas por genes dos grupos blaKpc blaIMP blaVIM blaNdm
e blaOxa A ocorrecircncia de carbapenemases eacute mais frequentemente em bacteacuterias
gram-negativas fermentadoras da glicose conhecidas como enterobacteacuterias
predominantes nos gecircneros Klebsiella Serratia Citrobacter Enterobacter
Escherichia Samonella Proteus Morganella Podem ser encontradas tambeacutem em
bacteacuterias gram-negativas natildeo fermentadoras como espeacutecies de Acinetobacter e de
Pseudomonas (ALVES et al 2013)
Carbapenemases satildeo enzimas plasmiacutedio-mediados resistentes a todos
antibioacuteticos betalactacircmicos As bacteacuterias que possuem o gene blaKpC responsaacutevel
pela codificaccedilatildeo da produccedilatildeo de carbapenemases apresentam resistecircncia aos
antibioacuteticos betalactacircmicos impedindo a accedilatildeo destes antibioacuteticos contra infecccedilotildees
(ALVES et al 2013)
A transmissatildeo das carbapenemases a diferentes cepas de enterobacteacuterias se
daacute atraveacutes de plasmiacutedeos que satildeo pequenas moleacuteculas circulares de DNA com a
capacidade de se replicarem independentemente do DNA cromossocircmico
permitindo a troca de material geneacutetico entre gecircneros e espeacutecies diferentes de
enterobacteacuterias O raacutepido desenvolvimento de surtos em ambientes hospitalares eacute
explicado por essa disseminaccedilatildeo plasmidial (COTRIM et al 2012)
De acordo com o criteacuterio de interpretaccedilatildeo do Clinical and Laboratory
Standards Institute (CLSI 2009) a maioria das KPC isoladas natildeo apresenta
resistecircncia completa aos carbapenecircmicos (Imipenem e Meropenem apresentam
uma Concentraccedilatildeo Inibitoacuteria Miacutenima (CIM) de 2-8 μgmL) (COTRIM et al 2012)
26
Os mecanismos de resistecircncia capazes de impedir a accedilatildeo dos
carbapenecircmicos satildeo vaacuterios Poreacutem a degradaccedilatildeo de antibioacuteticos por enzimas
principalmente as carbapenemases constituem o principal mecanismo de
resistecircncia aos antibioacuteticos β-lactacircmicos (DIAS 2009) Devido a ampla atividade
hidroliacutetica agrave maioria dos antibioacuteticos β-lactacircmicos estes grupos de enzimas possuem
alta versatilidade (QUEENAM et al 2007)
Existem trecircs grandes classes moleculares de Ambler a qual as
carbapenemases pertencem denominadas classe A (serino-carbapenemases os
quais incluem membros designados SME IMI NMC GES e a famiacutelia das KPCs)
classe B(as metalo-β-lactamase incluem os tipos IMP e VIM) e classe D
(oxacilinases similares as da classe A e incluem as OXA e PSE) (DIAS 2009)
Dentre estes as mais importantes e prevalentes encontradas em plasmiacutedeos
de Klebsiella pneumoniae satildeo as KPC (DIENSTMANN et al 2010) Por meio de
estudos moleculares a enzima KPC jaacute foi documentada em diferentes bacteacuterias e
diferenciada em KPC-1 a 13 (NETIKUL et al 2011) No ano de 2009 foi realizada
uma pesquisa onde descreveram as seguintes carbapenemases KPC-1 em isolados
de Klebsiella pneumoniae KPC-2 em K pneumoniae K oxytoca Salmonella
enterica e em Enterobacter sp e KPC-3 em K pneumoniae e Enterobacter cloacae
(MONTEIRO et al 2009) As enzimas KPC-4 e KPC-5 foram encontradas em
isolados de Pseudomonas aeruginosa (PEIRANO et al 2009)
Foi observada uma correccedilatildeo da sequumlecircncia KPC-1 indicando que o gene
blaKPC-1 e blaKPC-2 satildeo idecircnticos Trecircs novas variantes blaKPC-3 blaKPC-4 e
blaKPC-5 satildeo resultados de mutaccedilotildees do gene estrutural da enzima KPC-2
(WOLTER et al 2008) apresentando diferentes perfis de hidroacutelise As enzimas
KPC-2 e KPC-3 possuem alta eficiecircncia em hidrolisar cefalotina cefaloridina e
nitrocefin poreacutem possuem uma menor eficiecircncia contra carbapenecircmicos e
cefotaxima (ALBA et al 2005) As enzimas KPC-5 e KPC-4 apresentam menor
hidroacutelise de carbapenecircmicos eacute do que em KPC-2 Em contrapartida possuem
melhor eficiecircncia contra ceftazidima e uma maior inibiccedilatildeo pelo aacutecido clavulacircnico
(WOLTER et al 2008)
27
13 Anaacutelise geneacutetica de microrganismos
Eacute de extrema importacircncia praacutetica natildeo soacute no aspecto cliacutenico mas tambeacutem na
fitopatologia biotecnologia e estudos ambientais a correta identificaccedilatildeo e
classificaccedilatildeo de microrganismos Os meacutetodos usados na diferenciaccedilatildeo de gecircneros
espeacutecies e estirpes de microrganismos podem ser divididos em meacutetodos fenotiacutepicos
(baseados em fenocircmenos bioquiacutemicos fisioloacutegicos e bioloacutegicos) e genotiacutepicos
(detectam polimorfismos ao niacutevel dos aacutecidos nucleacuteicos ou variaccedilatildeo aleacutelica ao niacutevel
de enzimas) (ALVES et al 2003)
Para este tipo de estudo existem alguns meacutetodos como o RFLPrsquos -
ldquoRestriction Fragment Length Polymorphismsrdquo (polimorfismos de tamanho de
fragmentos de restriccedilatildeo) rep-PCR (Meacutetodo de tipagem baseado na amplificaccedilatildeo via
PCR de elementos de DNA repetitivos presentes em genomas bacterianos) anaacutelise
de sequumlecircncias nucleotiacutedeas (discriminaccedilatildeo eou identificaccedilatildeo atraveacutes de sequumlecircncias
de DNA) PFGE - Pulsed-Field Gel Electrophoresis (Eletroforese em campo
pulsado) ( A L V E S et al 2003)
A diferenciaccedilatildeo clara da cepa e principalmente a alta reprodutibilidade devem
ser caracteriacutesticas de qualquer meacutetodo de tipagem geneacutetica Poreacutem nem todos os
meacutetodos moleculares de tipagem satildeo igualmente eficazes Sendo assim de acordo
com a finalidade pretendida (identificaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo custo reprodutibilidade
etc) eacute feita a escolha do meacutetodo a ser aplicado (A L V E S et al 2003)
O processo de identificaccedilatildeo fenotiacutepica de KPC entre os membros da famiacutelia
Enterobacteriaceae ainda eacute difiacutecil e os meacutetodos para a sua identificaccedilatildeo devem ser
revistos e ajustados Mesmo com o avanccedilo tecnoloacutegico natildeo existem ensaios que
combinam alta especificidade e sensibilidade na detecccedilatildeo destas enzimas Satildeo
diversas as metodologias usadas para rastreamento de KPC como por exemplo a
focalizaccedilatildeo isoeleacutetrica a teacutecnica de disco-difusatildeo E-test teste de Hodge
modificado dentre outros Aleacutem disso a pesquisa do gene blaKPC pode ser feita
pela Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) Os sistemas de automaccedilatildeo
existentes no entanto podem natildeo identificar com precisatildeo os isolados KPC
positivos (COTRIM et al 2012)
A identificaccedilatildeo blaKPC pelo PCR eacute um meacutetodo raacutepido preciso sensiacutevel e
altamente especiacutefico no entanto a PCR exige equipamento e conhecimentos
28
especializados em diagnoacutestico molecular dificultando ainda a utilizaccedilatildeo dele na
rotina dos laboratoacuterios de microbiologia (COTRIM et al 2012)
Em estudo de infecccedilotildees hospitalares identificaccedilatildeo molecular de patoacutegenos
bacterianos eacute bastante utilizada Para diferenciar carbapenemases tipo KPC a partir
de outros tipos como SME NMC-A-IMI e GES eacute necessaacuterio um exame molecular
As identificaccedilotildees do microrganismo juntamente com a triagem molecular iratildeo definir
um resultado mais especiacutefico podendo ser usado para identificar o antibioacutetico mais
adequado para o tratamento Poreacutem a principal desvantagem de alguns exames
baseados em PCR por exemplo eacute que devido agrave sua limitada capacidade de
multiplexaccedilatildeo eles distinguem apenas algumas variaccedilotildees (MOREIRA et al 2014)
Estatildeo descritas para a identificaccedilatildeo molecular de patoacutegenos pertencentes agrave
famiacutelia Enterobacteriaceae as teacutecnicas de PFGE RAPD (randomly amplified
polymorphic DNA) e ERIC-PCR (Enterobacterial Repet it ive Intergenic Consensus)
A PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) eacute considerada padratildeo ouro devido sua
alta capacidade de diferenciaccedilatildeo baseada na anaacutelise do perfil de restriccedilatildeo do DNA
genocircmico por meio de eletroforese Como desvantagem para a sua execuccedilatildeo eacute
necessaacuterios vaacuterios dias impedindo a tipagem de algumas cepas bacterianas devido
agrave degradaccedilatildeo do DNA aleacutem do alto custo empregado (MOREIRA et al 2014)
O meacutetodo baseado em ERIC-PCR tem sido bastante utilizado como uma
alternativa para a teacutecnica de PFGE Esta teacutecnica consiste na anaacutelise do padratildeo de
amplificaccedilatildeo de elementos repetidos encontrados no genoma bacteriano Isto
permite uma maior rapidez na obtenccedilatildeo de resultados quando comparada com o
PFGE aleacutem de alta reprodutibilidade simples execuccedilatildeo e implementaccedilatildeo baixo
custo e natildeo sem problemas com a degradaccedilatildeo do DNA (MOREIRA et al 2014)
A PCR eacute considerada uma teacutecnica de biologia molecular revolucionaacuteria que
consiste na siacutentese enzimaacutetica de coacutepias de aacutecidos nucleacuteicos Ela permitiu o raacutepido
desenvolvimento do estudo de sequumlecircncias de aacutecidos nucleacuteico Foi desenvolvida por
Kary Banks Mullis que ganhou o precircmio Nobel de quiacutemica de 1993 devido ao
desenvolvimento dessa teacutecnica em abril de 1983 (CAMARGO et al 2014)
Por meio de etapas de variaccedilatildeo de temperatura a teacutecnica de PCR promove a
duplicaccedilatildeo de cadeias de DNA in vitro A reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo de DNA por PCR
envolve o emprego de sequumlecircncias iniciadoras (primers) quatro nucleotiacutedeos
29
(dNTPrsquos) do DNA e uma DNA polimerase termoestaacutevel podendo assim obter-se a
partir de uma fita molde muitas coacutepias de uma sequumlecircncia especiacutefica de aacutecido
nucleacuteico O princiacutepio da PCR consiste na variaccedilatildeo de temperatura por ciclo
envolvendo trecircs etapas baacutesicas desnaturaccedilatildeo pareamento e amplificaccedilatildeo
(CAMARGO et al 2014)
A desnaturaccedilatildeo da fita molde de DNA eacute uma etapa com duraccedilatildeo entre 30
segundos a 1 minuto a temperatura entre 92 ordmC a 96 ordmC Apoacutes isso o pareamento de
dois iniciadores sinteacuteticos de composiccedilotildees distintas que funcionam como os
iniciadores da reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo liga-se agrave regiatildeo complementar da fita de
DNA alvo que sofreraacute a duplicaccedilatildeo Esta etapa tem duraccedilatildeo de 30 segundos a 1
minuto a temperatura entre 58 ordmC e 65 ordmC Por uacuteltimo a amplificaccedilatildeo por meio da
enzima Taq DNA polimerase das novas fitas de DNA se daacute a partir de cada um dos
iniciadores utilizando os quatro dNTPrsquos como substrato da reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo
Esta etapa possui duraccedilatildeo entre 45 segundos e 1 minuto a 72 ordmC Cada ciclo eacute
repetido em torno de 30 a 35 vezes e promove a amplificaccedilatildeo da regiatildeo alvo
determinada conforme o anelamento dos iniciadores sinteacuteticos de DNA (CAMARGO
et al 2014) Estas etapas estatildeo demonstradas na figura 4
Figura 4 Etapas da Reaccedilatildeo de PCR
30
2 JUSTIFICATIVA
No ano de 2010 no Distrito Federal foram identificados 111 pacientes com
suspeita de infecccedilatildeo por Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) e a
Secretaria de Sauacutede do Distrito Federal confirmaram ainda a morte de 18 pacientes
dentre os hospitais puacuteblicos e particulares Um desafio encontrado por ocasiatildeo do
surto infeccioso no Distrito Federal foi o de confirmar as KPCs por Reaccedilatildeo da
Polimerase em Cadeia sendo que as amostras foram enviadas com esta finalidade
para a Fiocruz no Rio de Janeiro
Pesquisas que possam contribuir na elaboraccedilatildeo de estrateacutegias preventivas e
de intervenccedilatildeo para infecccedilotildees causadas por enterobacteacuterias bem como contribuir
para gerar uma integraccedilatildeo beneacutefica entre a equipe acadecircmica e os serviccedilos de
sauacutede devem ser estimuladas Neste sentido o presente estudo permitiu escrutinar
os genes envolvidos na expressatildeo de carbapenemases presentes em espeacutecies de
enterobacteacuterias isoladas em ambiente hospitalar visto que elucidar genes de
resistecircncia de enterobacteacuterias aos antibioacuteticos carbapenecircmicos eacute o primeiro passo
para garantir um controle epidemioloacutegico efetivo para estes tipos de microorganismo
assim como sua associaccedilatildeo com surtos fatais particularmente em pacientes com
baixa imunidade
31
3 OBJETIVOS
31 Objetivo geral Caracterizar os genes de resistecircncia das
Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases e os aspectos epidemioloacutegicos de
pacientes internados em um hospital puacuteblico do Distrito Federal
32 Objetivos Especiacuteficos
Identificar genotipicamente a enzima KPC (Klebsiella pneumoniae
carbapenemase) de isolados de Klebsiella pneumoniae
Investigar aspectos epidemioloacutegicos dos pacientes portadores de
Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases
Identificar quais variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana influenciaram para o
desfecho oacutebito ou alta
Avaliar a susceptibilidade das Enterobacteacuterias aos antibioacuteticos
carbapenecircmicos dos pacientes em ambiente hospitalar
32
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
Trata-se de um estudo transversal onde foi realizado o teste de
susceptibilidade das enterobacteacuterias aos antibioacuteticos carbapenecircmicos a partir dos
materiais bioloacutegicos coletados dos pacientes internados no Hospital Regional da Asa
Norte (HRAN) e enviados ao Laboratoacuterio de Anaacutelises Cliacutenicas da mesma Instituiccedilatildeo
Os materiais bioloacutegicos investigados foram sangue aspirado traqueal ou brocircnquico
urina e cultura semi quantitativa de ponta de cateter venoso central O HRAN eacute um
hospital puacuteblico do Distrito Federal com 395 leitos sendo as cliacutenicas de internaccedilatildeo
Berccedilaacuterio Cirurgia Geral Cirurgia Plaacutestica Cliacutenica Meacutedica Ginecologia Maternidade
Pediatria Queimados UTI com atendimento a pacientes portadores de doenccedilas de
caraacuteter cliacutenico e ciruacutergico
4 1 Coleta e transporte das amostras bioloacutegicas
As amostras foram coletadas de pacientes internados no Hospital Regional da
Asa Norte (HRAN) com suspeitas de infecccedilatildeo por KPC A identificaccedilatildeo primaacuteria foi
realizada pelo Laboratoacuterio de Microbiologia do hospital de origem dos pacientes e os
demais procedimentos que foram utilizados na identificaccedilatildeo encontram-se descritos
abaixo
4 2 Procedimentos para confirmaccedilatildeo de resistecircncia bacteriana por
disco de ertapenem (adaptado CDC 2004)
Para diagnosticar amostra como portadora de bacteacuteria produtora de
carbapenemase foi realizado o teste com disco de ertapenem como forma de
triagem Inicialmente utilizou-se o swab contaminado com a amostra que foi
distribuiacuteda em uma pequena aacuterea da placa de aacutegar MacConkey para apoacutes o
crescimento ser realizada a pesquisa de colonizaccedilatildeo por enterobacteacuterias resistentes
aos carbapenecircmicos (Pesquisa de CRE) Procedeu-se a semeadura por teacutecnica
semi-quantitativaesgotamento com alccedila bacterioloacutegica na diluiccedilatildeo de 1100 O disco
de Ertapenem foi colocado na superfiacutecie da placa de MacConkey na junccedilatildeo dos dois
primeiros campos de semeadura conforme demonstrado na figura 5 Incubou a placa
33
em estufa aeroacutebia a 35ordmC por 24 e 48 horas e observou-se o halo de difusatildeo do
disco de Ertapenem na placa para proceder agrave leitura
O teste deixou de ser obrigatoacuterio apoacutes a modificaccedilatildeo dos criteacuterios
interpretativos para carbapenecircmicos para enterobacteacuterias publicados no suplemento
do CLSI 2010 M100-S20-U
Figura 5 Mecanismo de semeamento de material bioloacutegico oriundos de
pacientes com suspeita de infecccedilatildeo por KPC Fonte adaptado CDC 2004
4 2 1 Interpretaccedilatildeo dos resultados
Na ausecircncia de crescimento ateacute 24 horas (MacConkey) ou halo de difusatildeo
gt27 mm na placa deve-se reincubar as placas por mais 24 horas Quando for
ausente o crescimento apoacutes 48 horas ou halo de difusatildeo gt27 mm na placa libera-se
como enterobacteacuterias resistentes a carbapenecircmicos (KPCNEG)Havendo
crescimento de colocircnias na placa de MacConkey com halo lt 27 mm (apenas para
colocircnias com crescimento dentro do halo) deve-se reisolar e realizar identificaccedilatildeo e
antibiograma automatizado teste de sensibilidade por disco-difusatildeo e Teste de
Hodge Modificado (THM) Os isolados de enterobacteacuterias cujos testes comprovarem
a resistecircncia aos carbapanecircmicos testados (KPCPOS) foram reportado a Comissatildeo
de Controle de Infecccedilatildeo Hospitalar (CCIH) Jaacute osbacilos Gram-negativos natildeo
fermentadores natildeo foram reportados (KPCNEG) Para interpretaccedilatildeodos resultados
foram utilizados os valores conforme demonstrados na tabela 1
Tabela 1 Criteacuterios Interpretativos para testes de sensibilidade
ENTEROBACTEacuteRIAS
Disco difusatildeo (mm) MIC (microgml)
34
Antibioacutetico Sigla S I R S I R
Ertapenem 10
microg
ETP 22 19-
21
18 05 1 2
Meropenem 10
microg
MEM 23 20-
22
19 1 2 4
Fonte Manual Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)
2013
Os resultados que apresentaram resistecircncia ao antibioacutetico Ertapenem foram
considerados como suspeitos de contaminaccedilatildeo por KPC Fez-se o teste de
susceptibilidade aos antibioacuteticos (TSA) em aparelho automatizado MicroScan Walk
Away 96sl Dade Behring
4 3 Teste de susceptibilidade aos antibioacuteticos (adaptado CDC 2004)
A determinaccedilatildeo da susceptibilidade dos isolados foi feita pelo teste de
susceptibilidade aos antibioacuteticos (TSA) apoacutes cultura em meio de gelose simples
(INSA) para avaliaccedilatildeo da sua pureza e obtenccedilatildeo de colocircnias isoladas Para
preparaccedilatildeo de uma suspensatildeo bacteriana com turvaccedilatildeo aproximada de 05
McFarland (Dade BehringMicroScanregTurbidity Meter) ressuspendeu duas a cinco
colocircnias em 2ml de soro fisioloacutegico esteacuteril diluindo a 1100 em soro fisioloacutegico num
volume total de 10ml em seguida foi feita uma semeadura em duas placas
quadradas (120mm x 120mm) de Muller-Hinton Agar (INSA) por inundaccedilatildeo
Os discos de antibioacutetico carbapenecircmicos imipenem meropenem e
ertapenem (Biorad) foram aplicados com o auxiacutelio de um dispensador automaacutetico A
susceptibilidade das Enterobacteacuterias aos carbapenecircmicos foi definida de acordo
com o protocolo Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI 2011)
Para aquelas Enterobacteacuterias que apresentaram resistecircncia ao ertapenem
foram realizados o Teste de Hodge Modificado para Detecccedilatildeo de Enterobacteacuterias
Produtoras de Carbapenemases conforme descrito pelo Centers for Disease Control
and Prevention (CDC 2004)
35
4 4Teste de Hodge Modificado (THM) (adaptado CDC 2004)
Preparou-se uma suspensatildeo em salina esteacuteril com a cepa Escherichia coli
ATCC 25922 (padratildeo 05 de McFarland) Apoacutes isto diluiu a suspensatildeo 110 em
salina (05 ml da soluccedilatildeo de Ecoli ATCC 25922 + 45 ml salina)Foi entatildeo semeado
na superfiacutecie de uma placa de Agar Muller-Hinton com a suspensatildeo diluiacuteda de Ecoli
ATCC 25922 com auxilio de swab seco assegurando que houvesse uma
distribuiccedilatildeo uniforme cobrindo toda a superfiacutecie do Agar Deixou secar por 3 a 5
minutos em temperatura ambienteColocou-se o disco de ertapenem 10microg no centro
da placa e apoacutes isto fez-se uma estria linear da cepa a ser testada da borda do
disco ateacute a borda da placa utilizando uma alccedila calibrada 10 microl ou um swab Incubou
a placa na estufa em atmosfera aeroacutebia a 35 plusmn 2ordmC por 16 a 24 horas
441 Controle de qualidade (CQ)
Foi utilizado um CQ todos os dias em que se realizou o teste tendo como
controle Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1705- teste de Hodge modificado
positivo Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1706- teste de Hodge modificado
negativo
442 InterpretaccedilatildeoResultados
Apoacutes 16ndash24 horas de incubaccedilatildeo examinar as placas para verificar a presenccedila
de uma distorccedilatildeo no halo de inibiccedilatildeo do disco de ertapenem devido ao crescimento
realccedilado da cepa ATCC na intersecccedilatildeo do organismo teste e a Ecoli ATCC 25922
dentro dos limites do halo O THM positivo apresentaraacute presenccedila de distorccedilatildeo no
halo de inibiccedilatildeo de ertapenem devido ao crescimento da cepa Ecoli ATCC 25922 ao
longo da estria da cepa teste para dentro dos limites do halo de inibiccedilatildeo Jaacute o THM
negativo teraacute ausecircncia de crescimento da cepa Ecoli ATCC 5922 ao longo da estria
da cepa teste para dentro dos limites do halo de inibiccedilatildeo do disco de ertapenem
Este resultado estaacute representado na figura 6
36
Figura 6 Interpretaccedilatildeo resultado do Teste de Hodge Modificado
(adaptado CDC 2004) Teste positivo na estria da cepa teste na parte superior
da placa teste negativo na estria da cepa teste na parte inferior da placa
Tendo positivo como resultado o paciente era um provaacutevel contaminado por
KPC As amostras entatildeo foram encaminhadas para a Fundaccedilatildeo Osvaldo Cruz
(FIOCRUZ) para confirmaccedilatildeo final As amostras finalmente confirmadas como
positivas para KPC foram isoladas e guardadas no banco de cepas cliacutenicas do
hospital Apoacutes a autorizaccedilatildeo do CEP amostras das cepas foram transferidas para
meio de transporte Stuard em caixa teacutermica fechada em baixa temperatura e
levadas para o laboratoacuterio de microbiologia cliacutenica da universidade
No laboratoacuterio da universidade as amostras foram separadas e realizadas
repiques em meios MacConkey e incubadas por 24h As colocircnias caracteriacutesticas
foratildeo isoladas em caldo BHI e mantidas em shaker a 37oC por 2h Apoacutes isto foram
executadas as anaacutelises a seguir
Os isolados de Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases foram
submetidos agrave extraccedilatildeo de DNA e posterior sequumlenciamento para identificaccedilatildeo dos
genes de resistecircncia blaKPC de 1 a 13 e identificaccedilatildeo do gene universal Os
pacientes de onde os materiais bioloacutegicos contendo as Enterobacteacuterias produtoras
de carbapenemases foram os isolados foram investigados quanto aos aspectos
epidemioloacutegicos e cliacutenicos
37
4 5 Extraccedilatildeo de DNA bacteriano
A extraccedilatildeo de DNA bacteriano foi realizada utilizando o kit NucleoSpin
Plasmidreg (MN) Antes de iniciar a extraccedilatildeo foi feito a preparaccedilatildeo das soluccedilotildees
reagentes materiais e amostras (vortexando) colocou-se em banho-maria agrave 50ordmC o
tampatildeo AW Partiu-se de colocircnias isoladas cultivadas que sofreram passagem em
meio LB liacutequido por 12h Adicionou-se 15 mL da amostra no tubo eppendorf
centrifugou por 5 minutos descartou o sobrenadante (com cuidado para natildeo
descartar o Pellet) Repetiu-se este procedimento por mais trecircs vezes completando-
se o volume de 6mL Foram adicionados 250microL do tampatildeo Resuspension Buffer A1
encostando a ponteira no Pellet e misturando (este tampatildeo tem como funccedilatildeo
separar a formaccedilatildeo de grumos celulares) Apoacutes isso homogeneizou e vortexou os
tubos eppendorfs Apoacutes isso foram adicionados 250microL do tampatildeo Lysis Buffer A2
homogenizou e deixou descansar por 5 minutos (esta etapa eacute importante para a lise
da parede e da membrana celulares e liberaccedilatildeo do conteuacutedo da ceacutelula)
Passado o tempo de descanso foi adicionado 300microL do tampatildeo
Neutralization Buffer A3 homogeneizou e centrifugou por 10 minutos (este tampatildeo
iraacute retirar as proteiacutenas que envolvem o DNA e voltaraacute com o pH para proacuteximo de 8
impedindo que a soluccedilatildeo de lise facilite a quebra das ligaccedilotildees covalentes do aacutecido
nucleacuteico) Em seguida enumeraram-se os tubos contendo filtros com siacutelica
transferiu-se o sobrenadante para o filtro e centrifugou por 5 minutos Descartou-se
o que foi filtrado adicionou 500microL do tampatildeo AW (banho-maria) centrifugou por 2
minutos Novamente foi descartado o filtrado Adicionou-se 600microL do tampatildeo A4
centrifugou por 2 minutos e descartou o filtrado (os tampotildees AW e A4 contecircm
isotiocianato de guanidina em concentraccedilotildees crescentes para facilitar a adsorccedilatildeo
do DNA na siacutelica e retirada das outras biomoleacuteculas da amostra) Foi feita outra
centrifugaccedilatildeo com o tubo vazio Apoacutes isto o filtro foi trocado para outro eppendorf
definitivo onde foi adicionado 50microL do tampatildeo Elution Buffer AE (este tampatildeo
favorece a eluiccedilatildeo do DNA) centrifugou por 2 minutos descartou o filtro e
armazenou as amostras em freezer -20ordmC
38
4 6 Iniciadores e reaccedilatildeo de PCR
Os iniciadores universais para o gene blaKPC foram desenhados baseados
em sequumlecircncias conservadas apresentadas pelos sub-grupos de genes que
codificam a enzima carbapenemase de klebsiella pneumoniae (YIGIT et al 2001)
Baseado na sequumlecircncia para o blakpc-1 depositada no GenBank
(AF2975541) o oligonucleotiacutedio (oligo) iniciador direto (5-
ATGTCACTGTATCGCCGTC-3rsquo) foi desenhado para reconhecer a sequumlecircncia
blaKPC na posiccedilatildeo (131149) enquanto que o iniciador reverso (5-
TTACTGCCCGTTGACGCC-3rsquo) foi reconhecido na posiccedilatildeo (9951012) As anaacutelises
baseadas em alinhamento de sequumlecircncias mostraram que o par de iniciadores
blaKPC podem detectar os alelos de 1 a 13 do gene blaKPC conforme a tabela 2
Tabela 2 Nuacutemero de acesso ao GenBank dos alelos blaKPC e seus
microrganismos originais
Nuacutemero de
Acesso GenBank
Microrganismo Alvo
AF2975541 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-1
GU0862251 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-2
HQ2589341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-2-like
AB5577341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC -3
EU4473041 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-4
EU4002222 Pseudomonas
aeruginosa
blaKPC-5
EU5555341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-6
EU7297271 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-7
39
FJ2344121 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-8
FJ624872 Escherichia coli blaKPC-9
GQ1403481 Acinetobacter
baumannii
blaKPC-10
HM0669951 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-11
HQ3428891 Enterobacter cloacae blaKPC-12
HQ3428901 Enterobacter cloacae blaKPC-13
As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo de blaKPC foram realizadas em um
primeiro tempo de desnaturaccedilatildeo em que foi 94ordmC por 5 minutos seguido de 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 58 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 90 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 78ordmC por 8 minutos Aleacutem das amostras foi utilizado um
controle negativo
A PCR do blaKPC foi realizada utilizando os componentes para o volume da
reaccedilatildeo de 25 microL citados na tabela 3 A banda do tamanho do produto de PCR foi de
881 pares de bases (pb) o que corresponde ao plasmiacutedeo
Tabela 3 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do
gene blaKPC
Reagente Volume
DNA molde 4 microL
Tampatildeo Taq 25 microL
MgCl2 075 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP
2 microL
Oligo F 1 microL
Oligo R 1 microL
Taq DNA polimerase 05 microL
Aacutegua MiliQ 1335 microL
40
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
Baseado na sequumlecircncia para o gene 16S rRNA em que o oligonucleotiacutedio
Universal iniciador direto foward (5-CCAGCAGCCGCCGTAATACG-3rsquo) foi
desenhado para reconhecer a sequumlecircncia universal na posiccedilatildeo 1513 enquanto que o
iniciador reverso (5-ATCGGYTACCTTGTTACGACTTC-3rsquo) foi reconhecido na
posiccedilatildeo 1491 foram realizadas PCRrsquos As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo deste
gene foram realizadas nos seguinte tempos separaccedilatildeo 94ordmC por 10 minutos 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 55 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 120 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 72ordmC por 10 minutos
A PCR do gene 16S rRNA foi realizada utilizando os componentes para o
volume da reaccedilatildeo de 25microL citados na tabela 4 A banda do tamanho do produto de
PCR foi de 996 pb correspondente aacute regiatildeo ribossomal capaz de amplificar todas
as espeacutecies
Tabela 4Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do gene
universal
Reagente (quantidade
concentraccedilatildeo do estoque)
Volume
DNA molde 10 ng 4 microL
Tampatildeo Taq 10 x 25 microL
MgCl2 50mM 125 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP 25 mM
125 microL
Oligo F 10microM 05 microL
Oligo R 10microM 05 microL
Taq DNA polimerase 5UmicroL 04 microL
Aacutegua Miliq 146 microL
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
41
O termociclador utilizado para os experimentos foi o LifeTouch da BIOER
4 7 Digestatildeo
Para realizaccedilatildeo da digestatildeo foi utilizada a enzima BshF I (Hae III) EN- 1105
tamanho 7000 units concentraccedilatildeo 10 unitsmicroL fonte Bacillus sphaericus empresa
Jena bioscienceUtilizaram-se os componentes para o volume de 50microL da reaccedilatildeo
citados na tabela 5
Tabela 5 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da digestatildeo do gene
universal
Reagente Volume
Produto de PCR 10 microL
Enzima BshF I 01 microL
Tampatildeo (10x) 5 microL
Aacutegua Miliq 349 microL
Total (em cada ependorff) 50 microL
Valores para 1 digestatildeo
Os ependorffs foram colocados por 30 minutos em banho-maria a 37ordmC Apoacutes
isso fez-se a corrida das amostras em gel de agarose para verificaccedilatildeo do resultado
(LU et al 2000)
4 8 Eletroforese em gel de agarose
Os produtos de DNA PCR e digestatildeo foram analisados em gel de agarose
2 O tempo de corrida do gel eacute de aproximadamente 1hora e 30minutos sendo
que no comeccedilo foi usada agrave voltagem de 50 V e apoacutes comeccedilar a correr o gel
aumentou a voltagem para 100 v Utilizou-se o marcador de 100pb (pares de bases)
Foi adicionado 3microL de corante Bromophenol (que tem a funccedilatildeo de fazer uma ligaccedilatildeo
na amostra de DNA e permitir a visualizaccedilatildeo da corrida no gel de agarose) em 7microL
de amostra tanto de DNA quanto de PCR Para o preparo do gel foi utilizado TBE
42
(Tris- Aacutecido Boacuterico) agarose e brometo de etiacutedio (sua funccedilatildeo eacute de corante para o gel
e permitir a visualizaccedilatildeo do DNA quando colocado agrave luz ultravioleta) Para o oligo
blaKPC a banda da amplificaccedilatildeo foi em 881ppb correspondendo ao plasmiacutedeo Jaacute
o oligo Universal foi em 996 pb
4 9 Descarte de resiacuteduos
Todos os materiais utilizados nos ensaios foram de uso uacutenico e manipulados
em cacircmaras de seguranccedila bioloacutegica classe II Apoacutes o uso foram colocados em
soluccedilatildeo desinfetantes (hipoclorito a 1) e em seguida autoclavados a 127oC por 20
min em sacos apropriados para autoclavaccedilatildeo Apoacutes a finalizaccedilatildeo do ciclo de
esterilizaccedilatildeo os sacos contendo o material descartaacutevel foram colocados em
recipientes de coleta da empresa responsaacutevel pela coleta de materiais bioloacutegicos
produzidos no laboratoacuterio de microbiologia Todos os procedimentos seguiram a
normativa RDC-ANVISA 3062004 sobre o descarte de resiacuteduos de serviccedilo de
sauacutede
4 10 Aspectos epidemioloacutegicos e cliacutenicos
Os aspectos cliacutenicos e epidemioloacutegicos foram investigados por meio de
prontuaacuterios dos pacientes portadores de enterobacteacuterias produtoras de
carbapenemases e envolveram topografia mais provaacutevel do foco infeccioso a
enfermidade motivadora da internaccedilatildeo o desfecho cliacutenico a idade e o tempo de
internaccedilatildeo
4 12 Anaacutelises eepidemioloacutegicas
As anaacutelises foram realizadas com o pacote estatiacutestico SPSS versatildeo 200
Para verificar quais variaacuteveis referentes aos dados epidemioloacutegicos e
microbioloacutegicos influenciaram no desfecho verificou- se a diferenccedila meacutedia das
variaacuteveis idade e tempo de internaccedilatildeo em cada grupo O teste estatiacutestico utilizado foi
o teste t de Student apoacutes se executar o teste de normalidade de Shapiro-Wilk Para
as variaacuteveis sexo perfil microbioloacutegico das enterobacteacuterias produtoras de
43
carbapenemases foi avaliada a associaccedilatildeo com o desfecho por meio do teste Exato
de Fisher O niacutevel de significacircncia adotado foi de 5
4 13 Preceitos eacuteticos
Este projeto estaacute inserido em um projeto maior denominado ldquoEpidemiologia
cliacutenica e caracterizaccedilatildeo molecular do Acinetobacter Baumannii resistente a
antibioticoterapia em pacientes internado em hospitais do Sistema Uacutenico de Sauacutederdquo
que foi submetido ao Comitecirc de Eacutetica em Pesquisa da Secretaria do Estado de
Sauacutede do Distrito Federal (SESDF) e emitido parecer aprovado pelo protocolo nordm
23109 (anexo)
44
5 RESULTADOS
51 Anaacutelise molecular
Para a amplificaccedilatildeo com o oligo blaKPC foram amplificadas amostras
que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 881 pb correspondente ao
plasmiacutedeo A anaacutelise da amplificaccedilatildeo da regiatildeo do gene blaKPC mostrou que
apenas a amostra A10 natildeo amplificou isso demonstra que esta amostra natildeo
possuiacutea o gene de resistecircncia
5 1 1 Gene blaKPC
Figura 7 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 881 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
A amostra A3 natildeo amplificou no primeiro momento entatildeo foi realizado
novamente a PCR e corrida de gel obtendo entatildeo a amplificaccedilatildeo da amostra como
apresentado na figura 8
45
Figura 8 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC da
mostra A3 estudada A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo de 881
pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 1 2 Gene 16S rRNA
Para a amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA utilizou-se o oligo universal Foram
amplificadas amostras que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 996 pb
Figura 9 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
46
Segundo Lu et al (2000) a digestatildeo com a enzima HaeIII deste amplicons de
16S rRNA devolveriam bandas com perfis entre 150 a 200 pb No gel abaixo eacute
possiacutevel evidenciar que este perfil ocorreu com o predomiacutenio de bandas na altura
de 200pb
Figura 10 Gel de agarose a 2 da digestatildeo do amplicon do gene 16S
rRNA das amostras com a enzima HaeIII evidenciando diversos fragmentos
proacuteximos a 200 pb A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo ribossomal
de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 2 Anaacutelises epidemioloacutegicas
5 2 1 Sexo
No total foram detectados 17 isolados de KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 onde a maior a prevalecircncia foi
detecatada em amostras de pacientes do sexo masculino (53) do que no sexo
feminino (47)
47
Figura 11 Isolado de KPC segundo sexo dos 17 pacientes investigados
no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 2 Desfecho cliacutenico
Em 17 isolados de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo
de 2010 aacute 2011 a porcentagem de pacientes que foram a oacutebito (59) foi maior que
a de pacientes que tiverm alta (41)
Figura 12 Isolado de KPC segundo desfecho cliacutenico dos 17 pacientes
investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
48
5 2 3 Local da coleta
Dos 17 episoacutedios detectados de infecccedilatildeo por KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 a infecccedilatildeo em swab retalfoi mais
frequente (47) seguida de ponta de cateacuteter (18) e secreccedilatildeo traqueal (12)
Figura 13 Isolados de KPC segundo local da coleta da amostra nos 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 4 Microorganismo
O microorganismo mais encontrado foi a Klebsiella pneumoniae (82)
seguida da Enterobacter clocae (12) e Serratia marcescens (6) dos 17 isolados
de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 Isto afirma o
fato de a sigla KPC ser utilizada de forma errocircnea aacute Klebsiella pneumoniae visto
que a evidecircncia dela eacute maior em relaccedilatildeo as outras cepas
49
Figura 14 Isolado de KPC segundo microrganismo encontrado em 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 5 Relaccedilotildees variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana e desfecho
cliacutenico
Tabela 6 ndash Distribuiccedilatildeo do perfil geneacutetico sexo coleta tipificaccedilatildeo de
microrganismos e anaacutelise da resistecircncia bacteriana segundo o desfecho
cliacutenico Brasiacutelia-DF 2010 a 2011
Variaacutevel Resultado
Desfecho
Alta Oacutebito
N N P
Gene 16S rRNA Positivo 7 1000 10 1000
NA Gene blaKPC Positivo 6 857 10 1000
Negativo 1 143 0 00 0218 Sexo Feminino 2 286 6 600
Masculino 5 714 4 400 0201 Local da coleta Fundo saco de
Douglas 1 143 0 00
Hemocultura 0 00 1 100 0463 Ponta de cateter 1 143 2 200
Sec TraquealBrocircnquica
0 00 1 100
50
Secreccedilatildeo traqueal 2 286 0 00
Swab retal 3 429 5 500
Urina 0 00 1 100
Microrganismo Enterobacter cloacae (KPC)
1 143 1 100
Klebsiella pneumoniae
6 857 8 800
0416 Serratia
marcescens 0 00 1 100
Teste de Hodge Hodge positivo 7 1000 10 1000
NA Amicacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 1 100 0848 resistente 0 00 1 100
sensiacutevel 2 286 3 300
Amoxicilina Aacutecido Clavulacircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Ampicilina Sulbactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ampicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Aztreonan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefazolina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Cefoperazona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Cefotaxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefoxitina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0509 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 2 286 4 400
Ceftazidima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cetriaxona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 3 429 5 500 0772 Cefalotina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ciprofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772
51
resistente 3 429 5 500
Claritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Clindamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Eritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Gentamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0942 resistente 2 286 3 300
sensiacutevel 1 143 2 200
Imipenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 0 00 2 200 0193 Resistente 1 143 3 300
sensiacutevel 2 286 0 00
Nitrofurantoiacutena sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Norfloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Oxacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Penicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Piperacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Rifampicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tetraciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Ticarcilina Aacutecido Clavulocircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0688 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 3 429 4 400
Tobramicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Trimetoprima Sulfametoxazol
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0112 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 2 286 0 00
Vancomicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tigeciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediario 0 00 1 100 0211 natildeo testado 1 143 4 400
resistente 2 286 0 00
52
Cefepime sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefuroxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Levofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Piperacilina Tazobactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Ertapenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Meropenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0223 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 1 143 0 00
Cefotetan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 sensiacutevel 0 00 1 100
Gemifloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 7 700 0585 natildeo testado 3 429 3 300
Desfecho
Alta Oacutebito
Meacutedia Erro
padratildeo Meacutedia Erro
padratildeo p
Idade 58 9 59 5 0991
Tempo Internaccedilatildeo (dias)
50 13 46 12 0571
n= 17 p(lt 005) NA natildeo se aplica
53
6 DISCUSSAtildeO
Nos uacuteltimos anos houve um aumento na incidecircncia de bacteacuterias
multirresistentes aos antimicrobianos no ambiente hospitalar tornando isto um
problema mundial de sauacutede puacuteblica (HULSCHER et al 2010) Quando se trata
principalmente de bacilos Gram negativos a frequumlecircncia destas bacteacuterias eacute ainda
maior em paiacuteses da Ameacuterica Latina quando comparada a paiacuteses desenvolvidos
(GALES etal 2012)
De acordo com dados do ldquoMeropenem Yearly Susceptibility Test Information
Collectionrdquo (MYSTIC) ocorreu nos Estados Unidos um aumento na susceptibilidade
de K pneumoniae nos uacuteltimos anos graccedilas a praacuteticas de controle de disseminaccedilatildeo
de amostras resistentes(RHOMBERG P R et al 2009) O aumento crescente da
prevalecircncia destes microrganismos foi proporcional ao aumento da dependecircncia do
uso de antibioacuteticos carbapenecircmicos considerados como a opccedilatildeo terapecircutica para o
tratamento de infecccedilotildees por bacilos Gram negativos multi-resistentes (LIVERMORE
2012) Isto afeta diretamente as opccedilotildees de tratamento sobrando poucas alternativas
para a terapecircutica que incluem colistina (polimixina E) e tigeciclina que apresentam
respectivamente problemas em termos de toxicidade e eficaacutecia (LIVERMORE et
al 2011) Um dos efeitos adversos mais importantes das poliminas B e E por
exemplo satildeo a neurotoxicidade e nefrotoxicidade (MENDES C A C et al2009 )
Devido agrave resistecircncia ser usualmente de natureza plasmidial e portanto de
maior disseminaccedilatildeo especialmente quando carreadas por K pneumoniae
microrganismo com uma notoacuteria capacidade para acumular e transferir plasmiacutedeos
com determinantes para resistecircncia o nuacutemero de casos detectados pelo
fenoacutetipogenoacutetipo blaKPC eacute bastante preocupante (MONTEIRO et al 2009)
Comparada com outras bacteacuterias hospitalares a transmissatildeo de clones
multirresistentes de K pneumoniae eacute maior e podem natildeo ser controladas pelos
meacutetodos de controle de infecccedilatildeo hospitalar (PAAUW et al 2007) A forma
plasmidial para transferecircncia da resistecircncia adicionada a este grande potencial para
disseminaccedilatildeo de clones resistentes eacute preocupante visto que apoacutes surtos muitas
vezes pode se tornar endecircmica Jaacute eacute uma realidade a disseminaccedilatildeo desta bacteacuteria
54
entre pacientes hospitais paiacuteses e ateacute mesmo continentes (WOODFORF et al
2010 ROGERS et al 2011)
As chances de surtos satildeo maiores em paiacuteses com poucos recursos devido agrave
maior carecircncia de praacuteticas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees hospitalares e o
uso irracional de antimicrobianos de forma empiacuterica e inadequada (KUMARASAMY
et al 2010) Ateacute o momento os mecanismos de resistecircncia aos cabapenecircmicos
geralmente encontrado eram a produccedilatildeo de ESBL (CTX-M) somada aacute perda de
porina (CARVALHAES et al 2010) Foi notado a partir do ano de 2008 um
aumento no nuacutemero de K pneumoniae produtoras de KPC-2 apresentando outra
forma de resistecircncia (GALES 2012)
Um estudo mostrou que o perfil do paciente colonizado ou infectado por KPC
foi de um paciente entre os 33 e os 82 anos de idade internado haacute mais de 1
semana no hospital A mortalidade geral nos uacuteltimos anos ficou em torno de 7
sendo que dos 77 pacientes estudados 32 (415) pacientes evoluiacuteram para oacutebito
evidenciando a alta morbi-mortalidade associada (ALVES A P et al 2013)
Em estudo com 2316 pacientes avaliados a populaccedilatildeo de sexo masculino foi
de 526 idade meacutedia global de 53 anos (mediana de 55 anos) permanecircncia meacutedia
de 58 dias (mediana de 3 dias) (OLIVEIRA A C et al 2010) Outros trabalhos
apresentaram ausecircncia de significacircncia entre sexoidade e o desenvolvimento de
infecccedilotildees por microrganismos resistentes (PERES-BOTA D et al 2003 COLPAN
A et al 2005 COELLO R et al 1997)
Outro estudo utilizou um total de 30 amostras sendo elas isoladas de urina
escarro secreccedilatildeo pleural ponta de cateter aspirado traqueal e hemocultura A mais
prevalente foi em urina (40) Entre as 30 cepas analisadas a maior porcentagem
foi da cepa Klebsiella pneumoniae (70) Enterobacter sp (133) Klebsiella
ozaenae (10) Escherichia coli (333) e Klebsiella oxytoca (333)
(DIENSTMANN R et al 2010) Nos Estados Unidos a enzima KPC jaacute se tornou
endecircmica Foi realizada uma pesquisa em dois hospitais de Nova York onde
testaram 602 amostras e 45 apresentaram algum mecanismo de resistecircncia
sendo apenas 33 confirmadas por biologia molecular como KPC-2 (BRATU et
al 2005)
55
Estudo sobre os tipos de ESBL feito no Japatildeo apresentou o tipo Toho-1 como
o mais prevalente nessa pesquisa Ateacute o ano de 2000 ano em que foi publicado tal
estudo este era o primeiro relatoacuterio no Japatildeo para identificar derivados de ESBLs
como tipo de SHV e TEM entre E coli e K pneumoniae Em especial o tipo SHV- 12
foi identificado com uma maior frequumlecircncia Estes resultados indicam que tipos
distintos de ESBLs que satildeo diferentes em sua especificidade de substrato e origem
geneacutetica coexistem no Japatildeo Isto mostra a importacircncia de caracterizar genoacutetipos
distintos de ESBLs e de estar em alerta continuamente para as tendecircncias de
ESBLs no Japatildeo aleacutem da necessidade de uma interpretaccedilatildeo uniforme utilizando as
diretrizes do CSLI para relatar cepas produtoras de ESBL Aleacutem da detecccedilatildeo de
ESBLs satildeo necessaacuterias mais informaccedilotildees tais como o perfil de sensibilidade
especiacutefica para diversas β-lactacircmicos e o local da infecccedilatildeo Esses fatores satildeo
essenciais para a escolha adequada de antibioacuteticos (YAGI T et al 2000)
No ano de 2004 uma pesquisa avaliou a produccedilatildeo de uma enzima de
hidroacutelise de carbapenecircmicos atraveacutes da teacutecnica de sequumlenciamento foi revelado
um novo membro da famiacutelia KPC designado KPC- 3 Pesquisadores encontraram
em um mutante de K pneumoniae uma substituiccedilatildeo de um gene associado com
resistecircncia a Imipenem mas essa substituiccedilatildeo foi considerada improvaacutevel na
contribuiccedilatildeo da resistecircncia aos carbapenecircmicos da espeacutecie estudada Aleacutem da
resistecircncia aos carbapenecircmicos estes isolados eram em sua maioria resistentes agraves
cefalosporinas penicilinas e aminoglicosiacutedeos Usando estudos de transformaccedilatildeo
conjugaccedilatildeo e hibridaccedilatildeo localizaram o alelo blaKPC em plasmiacutedeo aleacutem disso
mostraram que esse alelo tambeacutem carregava uma resistecircncia aos aminoglicosiacutedeos
A transferecircncia das enzimas KPCs foi demonstrada in vitro tanto neste como em
outros estudos pode ser que os plasmiacutedeos que fazem esta transferecircncia estavam
comeccedilando a se espalhar no ambiente cliacutenico resultando na multiresistecircncia dessas
estirpes (WOODFORD et al 2004)
O presente estudo apresentou um vieacutes quanto aos resultados dos testes de
susceptibilidade microbiana Observou-se que natildeo foi encontrado resultado deste
teste em algumas amostras o que natildeo cooperou para um estudo mais preciso
futuros estudos quanto agraves amostras e um melhor acompanhamento deste tipo de
patologia Poreacutem mesmo sem algumas amostras com este resultado disponiacutevel foi
56
confirmada a presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos
carbapenecircmicos por meio dos genes de resistecircncia blaKPC e 16S rRNA que as
amostras apresentaram em sua maioria serem portadoras Quanto aos resultados
estatiacutesticos nenhuma das variaacuteveis apresentou significacircncia estatiacutestica (p gt 005)
mostrando assim que estas variaacuteveis isoladas natildeo foram o fator determinante para
o desfecho cliacutenico de alta ou oacutebito
57
7 CONCLUSAtildeO
Os genes blaKPC e 16S rRNA foram caracterizados confirmando a a
presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos carbapenecircmicos
Houve uma maior prevalecircncia da cepa K pneumoniae e isto confirma outros
estudos que apresentam a maior prevalecircncia desta cepa em amostras com KPC
Aleacutem disso isso justifica a forma popular da K pneumoniae ser chamada de KPC
enquanto que na verdade KPC eacute uma enzima podendo estar presente em outras
cepas como Enterobacter clocae tambeacutem apresentada no presente estudo O
desfecho cliacutenico de oacutebitos maior que 50 eacute um possiacutevel indicador sobre a
necessidade de se realizar um teste raacutepido para identificaccedilatildeo de KPC visando
iniciar o mais raacutepido possiacutevel o tratamento afim de diminuir a mortalidade por esta
infecccedilatildeo
Nenhuma das variaacuteveis isoladamente estaacute relacionada ao desfecho cliacutenico
oacutebito ou alta pois natildeo apresentaram relevacircncia estatiacutestica O presente estudo
mostrou que haacute presenccedila da bacteacuteria nas amostras de pacientes do hospital
estudado podendo entatildeo afirmar que este tipo de bacteacuteria se encontra tambeacutem
presente em ambiente hospitalar O uso irracional de antimicrobiano eacute demonstrado
de forma indireta quando foi apresentado atraveacutes do Teste de Hodge Modificado
uma resistecircncia de 100 aos antibioacuteticos carbapenecircmicos Isto tambeacutem reflete na
terapecircutica sendo que pacientes portadores de bacteacuterias resistentes aos
antibioacuteticos carabepecircmicos tem uma escassa opccedilatildeo de tratamento e as opccedilotildees
apresentam problemas quanto agrave toxicidade e eficaacutecia
58
REFEREcircNCIAS
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Mecanismos
de resistecircncia bacteriana aos antimicrobianos Disponiacutevel em
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controleopas_
webmodulo3mec_sitiohtmgt Acesso em 25 de abril de 2014
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Nota teacutecnica nordm
012013 medidas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees por enterobacteacuterias
multiresistentes Acesso em 17 de abril de 2013
ALBA J et al Kinetics study of KPC-3 a plasmid-encoded class A
carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase Antimicrob Agents Chemother
Nov49(11)4760-2 2005
ALVES A P et al Nosocomial infections by KPC-producing enterobacteria in
a tertiary hospital in Southern Brazil Revista da AMRIGS Porto Alegre 57 (3) 213-
218 jul-set 2013
ALVES A et al Tipagem Geneacutetica de Microrganismos Lab De Diversidade
Microbiana Centro de Biologia Celular Dep de Biologia U de Aveiro 3810-193
Aveiro- 2003
BELL J M et Al Prevalence and significance of a negative extended-
spectrum beta-lactamase (ESBL) confirmation test result after a positive ESBL
screening test result for isolates of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae
results from the SENTRY Asia-Pacific Surveillance Program J Clin Microbiol
May45(5)1478-82 2007
BRATU S et al Detection of KPC carbapenem-hydrolyzing enzymes in
Enterobacter spp from Brooklyn New York Antimicrob Agents Chemother v 49 n
2 p 776-8 2005
59
BRATU S et al Emergence of KPC-possessing Klebsiella pneumoniae in
Brooklyn New York epidemiology and recommendations for detection Antimicrob
Agents Chemother v 49 n 7 p 3018-20 2005
BRATU S et al Rapid spread of carbapenem-resistant Klebsiella
pneumoniae in New York City Arch Intern Med v 165 p 1430-5 2005
CAMARGO C F et al Aplicaccedilatildeo das teacutecnicas de pcr e suas teacutecnicas
derivadas em diagnoacutestico molecular Disponiacutevel em
ltfileDUnB10C2BA20semestreArtigosPCR-
20CLEYTON20FLORENCIO20DE20CAMARGO20E20PAULO20ROB
ERTO20QUEIROZpdfgtgt Acesso em 08 de abril de 2014
CARVALHES C G et al Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting
carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive
results Journal of Antimicrobial Chemotherapy v 65 n2 p 249-251 2010
CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION- CDC Modified
Hodge Test for Carbapenemase Detection in Enterobacteriaceae 2004
CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE Methods for
dilutionantimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically Approved
standard M7ndashA7 7th ed CLSI Wayne PA 2011
COELLO R et al Risk factors for developing clinical infection with methicillin-
resistant Staphylococcus aureus (MRSA) amongst hospital patients initially only
colonized with MRSA J Hosp Infect 19973739-46
COLPAN A et al Evaluation of risk factors for mortality in intensive care
units A prospective study from a referral hospital in Turkey Am J Infect Control
200533(1)42-7
60
CORNAGLIA G et al Living with ESBLs Introduction Clinical Microbiology
and Infection 14 Suppl 1 1-2 2008
COTRIM E R et al Klebsiella pneumoniae carbapenemase ndash KPC em
Enterobacteriaceae o desafio das bacteacuterias multirresistentes Poacutes em revista do
centro universitaacuterio Newton Paiva 12012 - ediccedilatildeo 5 - issn 2176 7785
DESHPANDE L M et al Occurrence and characterization of
carbapenemase-producing Enterobacteacuteriaceae report from the SENTRY
Antimicrobial Surveillance Program (2000-2004) Microb Drug Resist 12(4)223-30
2006
DIAS D J A Estudos dos principais mecanismos de resistecircncia aos
antibioacuteticos β-lactacircmicos em bacteacuterias patogecircnicas gram negativas 2009 100 f
Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Geneacutetica Molecular e Biomedicina) ndash Faculdade de
Ciecircncias e Tecnologia Universidade de Nova Lisboa Lisboa
DIENSTMANN R et al Avaliaccedilatildeo fenotiacutepica da enzima Klebsiella
pneumoniae carbapenemase (KPC) em Enterobacteriaceae de ambiente hospitalar
J Bras Patol Med Lab v 46 n 1 p 23-27 fevereiro 2010
ENDIMIAMI A et al Emergence of blaKPC-containing Klebsiella
pneumoniae in a long-term acute care hospital a new challenge to our healthcare J
Antimicrob Chemother 64 1102-1110 Nov 2009
FALAGAS M E et al Extended-spectrum beta-lactamase producing
organisms The Journal of Hospital Infection 73 (4) pp 345-54 2009
FONTANA C et al Emergence of KPC-producing Klebsiella pneumoniae in
Italy BMC Rev Notes 3 40 2010
61
GALES A C et al Antimicrobial resistance among Gram-negative bacilli
isolated from Latin America results from Sentry Antimicrobial Surveillance Program
(Latin America 2008-2010) Diagnostic Microbiology and Infectious Disease v 3 n
4 p 354 -360 2012
GUPTA N et al Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Epidemiology
and Prevention HEALTHCARE EPIDEMIOLOGY Clinical Infectious Diseases
201153(1)60ndash67 Published by Oxford University Press on behalf of the Infectious
Diseases Society of America 2011
HARBOTTLE H et al Genetics of antimicrobial resistance Anim Biotechnol
n17 p111-124 2006
HENRIQUE W N et al RESISTEcircNCIA BACTERIANA Uniatildeo das
Faculdades Alfredo NasserInstituto de Ciecircncias da Sauacutede Disponiacutevel em lt
httpwwwfaculdadealfredonasseredubrfilespesquisaposter20HENRIQUE20
Wilker20Natividade20SANTIAGO20Silvania20CAVALCANTI20DSP
20ResistC3AAncia20Bacterianapdfgt Acesso em 17 marccedilo 2014
HULSCHER M E J I et al Antibiotic prescribing in hospital a social and
behavioral scientific approach The Lancet Infectious Diaseases v 10 n 3 p 167-
165 2010
KIDWAI M SAPRA P BHUSHAN KR Synthetic strategies and medicinal
properties of beta-lactams Curr Med Chem 1999 695-215
KUMARASAMY K K et al Emergence of a new antibiotic resistance
mechanism in India Pakistan and the UK a molecular biological and
epidemiological stuy The Lancet Infectious Diseases v10 n 9 p 597- 602 2010
LINCOPAN N et al Enterobacteacuteria producing extended-spectrum β-
lacatamases and IMP-1 Metalo-β-lactamases isolated from Brazilian hospitals J Med
62
Microbiol 7 1-3 2006
LINCOPAN N et al First Isolation of Metalo-β-Lacatamase-Producing
Multiresistant Klebsiella pneumoniae from a patient in Brazil J Clin Microbiol 43(1)
516-519 2005
LIVERMORE D M et al What remains against carbapenem- resistant
Enterobacteriaceae Evaluation of choramphenicol ciprofloxacin colistina
fosfomycin minocycline nitrofurantoin temocilin and tigecycline International
Journal of Antimicrobial Agents v 37 n 5 p 415- 459 2011
LIVERMORE D M Fourten years in resistance International Journal of
Antimicrobial Agents v 39 283- 294 2012
LIVERMORE D M Bacterial resistance to carbapenems Adv Exp Med Biol
1995 39025-47
LIVERMORE D M Bacterial resistance origins epidemiology and impact
Clin Infect Dis 36S11-S23 2003
LIVERMORE D M et al Carbapenemases a problem in waiting Curr
Opin Microbiol 2000 3489-95
LU et al Universal pcr for common bacterial pathogens J CLIN
MICROBIOL VOL 38 2000
LU et al Use of PCR with Universal Primers and Restriction Endonuclease
Digestions for Detection and Identification of Common Bacterial Pathogens in
Cerebrospinal Fluid Journal of Clinical Microbiology June 2000 p 2076ndash2080
MARSCHALL J Met al Presence of the KPC Carbapenemase Gene in
Enterobacteriaceae Causing Bacteremia and Its Correlation with In Vitro
Carbapenem Susceptibility J Clin Microbiol 47 239-241 Jan 2009
63
MARTINS WMBS et al Prevalecircncia do gene blaKPC em isolados cliacutenicos
de Enterobacteriaceae e natildeo fermentadores encontrados em amostras clinicas em
um hospital universitaacuterio do Recife X Jornada de ensino pesquisa e extensatildeo ndash
JEPEX 2010 ndash UFRPE Recife 18 a 22 de outubro
MENDES C A C et al Polimixinas Revisatildeo com ecircnfase na sua
nefrotoxicidade Rev Assoc Med Bras 2009 55(6) 752-9
MOHR J F 3rd Update on the efficacy and tolerability of meropenem in the
treatment of serious bacteacuterial infections Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S41-51
2008
MONTEIRO J et al First report of KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae
strains in Brazil Antimicrob Agents Chemother Jan53(1)333-4 2009
MOREIRA V C et al Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia a antibioacuteticos
Disponiacutevel em
lthttpwwwcpglsucgbr6mostraartigosSAUDEVANESSA20CARVALHO20M
OREIRApdfgt Acesso em 21 marccedilo 2014
NETIKUL T et al Emergence of novel blaKPC-12 and blaKPC-13 variants in
carbapenem non-susceptible Enterobacter cloacae a first report of blaKPC gene in
Thailand European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases May
S372 2011
NETO V A et al Antibioacuteticos na praacutetica Meacutedica 6ordf Ediccedilatildeo Editorial
SarverSP Brasil 2007
NICOLAU D P Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of
meropenem Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S32-40 2008
64
OLIVEIRA A C et al Resistecircncia bacteriana e mortalidade em um centro de
terapia intensiva Rev Latino-Am Enfermagem nov-dez 2010
PAAUW A et al Failure to control an outbreak of qnrA 1-positive multidrug-
resistant Enterobacter clocae despite adequate implementation of recommended
infection control measures Journal of Clinical Microbiology v 45 n 5 p 1420-1425
2007
PATERSON D L et al Extended-Spectrum Beta-Lactamases a Clinical
Update Clinical Microbiology Reviews v 18 p 657-686 2005
PEIRANO G et al Carbapenem-hydrolysing beta-lactamase KPC-2 in
Klebsiella pneumonia isolated in Rio de Janeiro Brazil J Antimicrob Chemother Nov
20 2009
PERES-BOTA D et al Are infections due to resistant pathogens associated
with worse outcome in critically ill patients J Infect 200347(4)307-16
PIDDOCK L J V Clinically relevant chromosomally encoded multidrug
resistance effl ux pumps in bacterial Clin Microbiol Rev n19 p382-402 2006
PITOUT J D D et al Emergence of Enterobacteriaceae producing
extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) in the community J Antimicrob
Chemother May 56 2005
POSSEBON M I et al Resistecircncia bacteriana aos carbapenecircmicos
Bacterial resitence to carbapenems RBM rev bras med60(6)378380-378-382
jun 2003
QUEENAN A M et al Carbapenemases the versatile beta-lactamases
Clin Microbiol Rev Jul20(3)440-58 2007
65
RHOMBERG P R et al Summary trends for the meropenem yearly
susceptibility test information collection program a 10- year experience in the United
States (1999-2008) Diagnostic Microbiology and Infectiois Disease v 65 n4 p
414-426 2009
ROBLEDO I E et al Detection of KPC in Acinetobacter spp in Puerto Rico
J Antimicrob Agents Chemother 54 1354-1357 Mar 2010
ROGERS B A et al Country-to-country transfer os patients and the risk of
multi-resistant bacterial infection Clinical Infectious Disease v53 n1 p49- 56
2011
SHAH A A et al Characteristics epidemiology and clinicalimportance of
emerging strains of Gram-negative bacilli producing extended-spectrum
betalactamases Research in Microbiology v 155 p 409-421 2004
TURNER P J Extended- Spectrum Beta-Lactamases Clinical Infectious
Diseases v 41 p 273-275 2005
WOLTER D J et al Phenotypic and Enzymatic Comparative Analysis
between the Novel KPC variant KPC-5 and Its Evolutionary Variants KPC-2 and
KPC-4 Antimicrob Agents Chemother Nov 17 2008
WOODFORD N et al Carbapenemases of Chryseobacterium
(Flavobacterium) meningosepticum distribution of blaB and characterization of a
novel Metalo-beta-lactamase gene blaB3 in the type strain NCTC 10016
Antimicrob Agents Chemother Jun44(6)1448-52 2000
WOODFORF N Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in
India Pakistan and the UK a molecular biological and epidemiological study The
Lancet Infectious Diseases v 10 n 9 p 597-602 2010
66
WOODFORD et al Outbreak of Klebsiella pneumoniae Producing a New
Carbapenem- Hydrolyzing Class A β-Lactamase KPC-3 in a New York Medical
Center Antimicrobial agents and chemotherapy Dec 2004 p 4793ndash4799 Vol 48
No 12
YAGI T et al A preliminary survey of extended-spectrum β-lactamases
(ESBLs) in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Japan
FEMS Microbiology Letters 184 (2000) 53-56
YIGIT H et al Novel carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase KPC-1 from
a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumonia J Antimicrob Agents
Chemother 45 (4) 1151-1161 (2001)
ZAVASCKI A P et al KPC-2- producing Enterobacter cloacae in two cities
from Southern Brazil Int J Antimicrob Agents Apr 28 2009
ZHANEL G G et al Comparative review of the carbapenecircmicos Drugs
67(7)1027-52 2007
67
ANEXOS
Sequumlecircncia do oligo blaKPC
Query 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
Query 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
Query 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
68
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
Query 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
Query 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
69
Query 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
Query 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
Query 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
70
Sbjct 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
Query 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
Query 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Sbjct 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
Query 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
71
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
Query 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
Query 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
72
Query 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
Query 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
Query 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
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|||||||
73
Sbjct 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
Query 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
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|||||||
Sbjct 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
Query 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Sbjct 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
Query 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
74
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
Query 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
Query 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
75
Query 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
Query 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
||||
Sbjct 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
LOCUS AF297554 1377 bp
DNA linear BCT 26-MAR-2001
DEFINITION Klebsiella pneumoniae carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
gene complete cds
ACCESSION AF297554
VERSION AF2975541 GI10121874
76
KEYWORDS
SOURCE Klebsiella pneumoniae
ORGANISM Klebsiella pneumoniae
Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Enterobacteriaceae Klebsiella
REFERENCE 1 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH QueenanAM
AndersonGJ Domenech-SanchezA
BiddleJW StewardCD
AlbertiS BushK and TenoverFC
TITLE Novel carbapenem-hydrolyzing beta-
lactamase KPC-1 from a
carbapenem-resistant strain of
Klebsiella pneumoniae
JOURNAL Antimicrob Agents Chemother 45 (4)
1151-1161 (2001)
PUBMED 11257029
REFERENCE 2 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH AndersonGJ and
TenoverFC
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (19-AUG-2000) Nosocomial
Pathogens Laboratory Branch
Centers for Disease Control and
Prevention 1600 Clifton Rd MS
G08 Atlanta GA 30333 USA
FEATURES LocationQualifiers
77
source 11377
organism=Klebsiella
pneumoniae
mol_type=genomic DNA
db_xref=taxon573
-35_signal 5560
-10_signal 7883
mRNA 921012
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
RBS 117122
CDS 1311012
note=blaKPC-1
codon_start=1
transl_table=11
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
protein_id=AAG134101
db_xref=GI10121875
translation=MSLYRRLVLLSCLSWPLAGFSATALTNLVAEPFAKLEQD
FGGSI
GVYAMDTGSGATVSYRAEERFPLCSSFKGFLAAAVLARSQQQAGLLDTPIRYG
KNALV
PWSPISEKYLTTGMTVAELSAAAVQYSDNAAANLLLKELGGPAGLTAFMRSIG
DTTFR
78
LDRWELELNSAIPSDARDTSSPRAVTESLQKLTLGSALAAPQRQQFVDWLKGN
TTGNH
RIRAAVPADWAVGDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTRAPNKDDK
HSEAV
IAAAARLALEGLGVNGQ
ORIGIN
1 cggggcagtt acagccgtta cagcctctgg
agagggagcg gcttgccgct cggtgataat
61 cccagctgta gcggcctgat tacatccggc
cgctacacct agctccacct tcaaacaagg
121 aatatcgttg atgtcactgt atcgccgtct
agttctgctg tcttgtctct catggccgct
181 ggctggcttt tctgccaccg cgctgaccaa
cctcgtcgcg gaaccattcg ctaaactcga
241 acaggacttt ggcggctcca tcggtgtgta
cgcgatggat accggctcag gcgcaactgt
301 aagttaccgc gctgaggagc gcttcccact
gtgcagctca ttcaagggct ttcttgctgc
361 cgctgtgctg gctcgcagcc agcagcaggc
cggcttgctg gacacaccca tccgttacgg
421 caaaaatgcg ctggttccgt ggtcacccat
ctcggaaaaa tatctgacaa caggcatgac
481 ggtggcggag ctgtccgcgg ccgccgtgca
atacagtgat aacgccgccg ccaatttgtt
541 gctgaaggag ttgggcggcc cggccgggct
gacggccttc atgcgctcta tcggcgatac
79
601 cacgttccgt ctggaccgct gggagctgga
gctgaactcc gccatcccaa gcgatgcgcg
661 cgatacctca tcgccgcgcg ccgtgacgga
aagcttacaa aaactgacac tgggctctgc
721 actggctgcg ccgcagcggc agcagtttgt
tgattggcta aagggaaaca cgaccggcaa
781 ccaccgcatc cgcgcggcgg tgccggcaga
ctgggcagtc ggagacaaaa ccggaacctg
841 cggagtgtat ggcacggcaa atgactatgc
cgtcgtctgg cccactgggc gcgcacctat
901 tgtgttggcc gtctacaccc gggcgcctaa
caaggatgac aagcacagcg aggccgtcat
961 cgccgctgcg gctagactcg cgctcgaggg
attgggcgtc aacgggcagt aaggctctga
1021 aaatcatcta ttggcccacc accgccgccc
ttgcgggcgg catggattac caaccactgt
1081 cacatttagg ctaggagtct gcgcggcaga
gccgtgtgac cggttttctg tagagcactg
1141 acgatggcgg cggcgctctc tgcaattggc
aaggcgtcgg cgccaaggat accaatcttg
1201 cggcgcgcgg cgtgttatga cgactggggt
gcatttgagc cgccccattt aaccttcgcc
1261 ctcacagata cgccattcgc ctcaaattta
gcgccatgca gacgagcttc cactcggctt
1321 gcaccttgtc caggcccctc atgctgaact
gacgcaatcc catcaccgcc ttgatca
80
ABSTRACT
Introduction Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) is an enzyme produced
by gram - negative bacteria (Enterobacteriaceae) which confers resistance to
carbapenem antibiotics meropenen ertapenen imipenem class widely used in the
treatment of infections involving Enterobacteriaceae This resistance is a major
cause of treatment failure due to beta-lactamases production of extended spectrum
(ESBL) by this bacterium most commonly resistance to beta-lactam antibiotics of
wide spectrum engine The identification of these Enterobacteriaceae can be made
by techniques of molecular identification of pathogens among them the Polymerase
Chain Reaction (PCR) which consists in the analysis of the amplification pattern of
repeated elements found in the bacterial genome allowing faster in getting results
when compared with other methods in addition to presenting high reliability simple
implementation and deployment depending on the application of the technique has
no trouble with the degradation of DNA Objective To characterize the resistance
genes of Enterobacteriaceae producing carbapenemases and epidemiological and
clinical features of patients admitted to a public hospital in the Federal District
aspects Materials and methods Cross-sectional study where susceptibility testing
of Enterobacteriaceae to antibiotics Carbapenems from biological materials collected
from patients admitted to the Hospital Regional da Asa Norte ( HRAN ) was
performed Molecular analysis of 16S rRNA genes and blaKPC using PCR in
addition to statistical analysis Results and Discussion Was detected region and
the ribosomal tested resistance gene confirming the microbial resistance Higher
prevalence of male patients (53 ) clinical outcome of death (59 ) site of infection
rectal swabs (47 ) Klebsiella pneumoniae was found more microorganism (82)
There was no statistical difference between the variables and the clinical outcome (p
was gt 005) Conclusion Through molecular characterization of genes and the
Universal blaKPC resistance confirmed the presence of Klebsiella pneumoniae
resistant to carbapenems P values were not significant (lt 005) so none of the
variables studied were the main reason the clinical outcome (discharge or death)
Keywords Klebsiella pneumoniae Carbapenemase Bacterial resistance to
antibiotics Extended-Spectrumβ-lactamases (ESBL) Polimerase Chain Reaction
(PCR)
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Accedilatildeo do szlig-lactacircmico sobre a bacteacuteria gram-positiva e gram-negativa
Figura 2 Divulgaccedilatildeo internacional de Klebsiella pneumoniae Carbapenemase
(KPC) produtoras de Enterobacteriaceae
Figura 3 Mecanismos de resistecircncia bacteriana
Figura 4 Etapas da Reaccedilatildeo de PCR
Figura 5 Mecanismo de semeamento de material bioloacutegico oriundos de pacientes
com suspeita de infecccedilatildeo por KPC
Figura 6 Interpretaccedilatildeo resultado do Teste de Hodge Modificado
Figura 7 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC das amostras dos
17 pacientes estudados
Figura 8 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC da mostra A3
estudada
Figura 9 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA das amostras
dos 17 pacientes estudados
Figura 10 Gel de agarose a 2 da digestatildeo do amplicon do gene 16S rRNA das
amostras com a enzima HaeIII evidenciando diversos fragmentos proacuteximos a 200
pb
Figura 11 Infecccedilatildeo por KPC segundo sexo dos 17 pacientes investigados no
HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
Figura 12Isolado de KPC segundo desfecho cliacutenico dos 17 pacientes investigados
no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
Figura 13 Isolados de KPC segundo local da coleta da amostra nos 17 pacientes
investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
Figura 14Isolado de KPC segundo microrganismo encontrado em 17 pacientes
investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Criteacuterios Interpretativos para testes de sensibilidade
Tabela 2 Nuacutemero de acesso ao GenBank dos alelos blaKPC e seus microrganismos
originais
Tabela 3 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do gene blaKPC
Tabela 4 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do gene
universal
Tabela 5 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da digestatildeo do gene universal
Tabela 6 - Distribuiccedilatildeo das variaacuteveis estudadas perfil geneacutetico sexo coleta
tipificaccedilatildeo de microrganismos e anaacutelise da resistecircncia bacteriana segundo o
desfecho cliacutenico Brasiacutelia-DF 2010 a 2012
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AmpC- Adenosina Monofosfato Ciacuteclico
BRMD- Bacteacuterias multirresistentes
CCIH- Comissatildeo de Controle de Infecccedilatildeo Hospitalar
CDC- Centers for Disease Control and Prevention
CIM- Concentraccedilatildeo Inibitoacuteria Miacutenima
CLSI- Clinical and Laboratory Standards Institute
DNA- Aacutecido Desoxirribonucleacuteico
E coli- Escherichia coli
ERIC-PCR - Enterobacterial Repet it ive Intergenic Consensus
ESBL- Beta-Lactamases de Espectro Estendido
Et al- e outros
ETP- Ertapenem
HRAN- Hospital Regional da Asa Norte
K ornithinolytica- Klebsiella ornithinolytica
K oxytoca- Klebsiella oxytoca
K planticola- Klebsiella planticola
K pneumoniae- Klebsiella pneumoniae
K terrigena- Klebsiella terrigena
KPC - Klebsiella pneumoniae produtora de Carbapenemase
KPCNEG- Bacilos Gram-Negativos Natildeo Fermentadores
KPCPOS- Bacilos Gram-Positivo Natildeo Fermentadores
MBL- metalo-beta-lactamases
MEM- Meropenem
NA- Natildeo se aplica
Oligo- Oligonucleotiacutedeos
PB- Pares de Bases
PBPs (Penicilim-Binding-Protein)- Proteiacutenas de ligaccedilatildeo agrave penicilina
PCR- Polymerase Chain Reaction (Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase)
PFGE - Pulsed-Field Gel Electrophoresis (Eletroforese em campo pulsado)
RAPD- Randomly Amplified Polymorphic DNA (DNA polimoacuterfico amplificado
aleatoriamente)
RFLPrsquos - ldquoRestriction Fragment Length Polymorphismsrdquo( polimorfismos de tamanho
de fragmentos de restriccedilatildeo)
THM- Teste de Hodge Modificado
TSA- Teste de Susceptibilidade aos Antibioacuteticos
UTI- Unidade de Terapia Intensiva
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 15
11 Klebsiella pneumoniae produtora de Carbapenemase (KPC) 15
1 2 Resistecircncia bacteriana 20
13 Anaacutelise geneacutetica de microrganismos 27
2 JUSTIFICATIVA 30
3 OBJETIVOS 31
31 Objetivo geral 31
32 Objetivos Especiacuteficos 31
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS 32
4 1 Coleta e transporte das amostras bioloacutegicas 32
4 2 Procedimentos para confirmaccedilatildeo de resistecircncia bacteriana por disco de
Ertapenem (adaptado CDC 2004) 32
4 2 1 Interpretaccedilatildeo dos Resultados 33
4 3 Teste de susceptibilidade aos antibioacuteticos 34
4 4Teste de Hodge Modificado (THM) (adaptado CDC 2004) 35
441 Controle de qualidade (CQ) 35
442 InterpretaccedilatildeoResultados 35
4 5 Extraccedilatildeo de DNA bacteriano 37
4 6 Iniciadores e reaccedilatildeo de PCR 38
4 7 Digestatildeo 41
4 8 Eletroforese em gel de agarose 41
4 9 Descarte de resiacuteduos 42
4 10 Aspectos epidemioloacutegicos e cliacutenicos 42
4 12 Anaacutelises estatiacutesticas 42
4 13 Preceitos eacuteticos 43
5 RESULTADOS 44
51 Anaacutelise molecular 44
5 1 1 Gene blaKPC 44
5 1 2 Gene 16S rRNA 45
5 2 Anaacutelises epidemioloacutegicas 46
5 2 1 Sexo 46
5 2 2 Desfecho cliacutenico 47
5 2 3 Local da coleta 48
5 2 4 Microrganismo 48
6 DISCUSSAtildeO 53
7 CONCLUSAtildeO 57
15
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC)
Klebsiella pneumoniae pertence aacute famiacutelia Enterobacteriaceae
encontrado em locais como aacutegua solo plantas e esgoto Satildeo encontradas cinco
espeacutecies K pneumoniae K oxytoca K planticola K terrigena e K ornithinolytica
O gecircnero Klebsiella eacute definido como contendo bacilos Gram-negativos natildeo moacuteveis
em forma de bastatildeo e geralmente encapsuladas que produzem lisina
descarboxilase mas natildeo produzem ornitina descarboxilase Provavelmente a
colonizaccedilatildeo em seres humanos ocorre por contato com as diferentes fontes
ambientais podendo ser encontrada colonizando a orofaringe e fezes de pessoas
sadias Pessoas imunocomprometidas a bacteacuteria encontra um ambiente favoraacutevel
para seu crescimento levando aos quadros de infecccedilatildeo (MOREIRA et al 2014)
A Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) eacute uma enzima produzida por
enterobacteacuterias gram-negativas sendo um mecanismo de resistecircncia aos antimi-
crobianos carbapenecircmicos meropenen ertapenen eou imipenen classe
amplamente utilizada no tratamento de infecccedilotildees envolvendo Enterobacteriaceae
Ela tambeacutem eacute capaz de inativar os agentes β-lactacircmicos cefalosporinas penicilinas
e o aztreonam (COTRIM et al 2012)
Devido agrave semelhanccedila estrutural e estereoquiacutemica os antibioacuteticos beta-
lactacircmicos possuem um mecanismo de accedilatildeo comum ao grupo Eles atuam inibindo
a siacutentese da parede celular bacteriana atraveacutes do mecanismo de bloqueio da
transpeptidaccedilatildeo responsaacutevel pela uniatildeo dos componentes individuais do
peptidoglicano conforme demonstrado na figura 1 (KIDWAI et al 1999)
A accedilatildeo destes antibioacuteticos eacute atraveacutes de ligaccedilotildees covalentes com as proteiacutenas
as Penicilim-Binding-Protein (proteiacutena de ligaccedilatildeo da penicilina- PBP ou PLP) que se
encontram presentes na membrana citoplasmaacutetica de todas as bacteacuterias Devido agraves
mutaccedilotildees ocorre uma induccedilatildeo na alteraccedilatildeo dessas proteiacutenas podendo determinar
uma diminuiccedilatildeo da afinidade dos beta-lactacircmicos agraves mesmas A accedilatildeo dos
carbapenecircmicos eacute atraveacutes da sua ligaccedilatildeo agraves PBPs presentes na parede bacteriana
especialmente as PBP1 e PBP2 provocando a lise osmoacutetica da bacteacuteria Aleacutem
disso eles tecircm uma facilidade na penetraccedilatildeo da bacteacuteria por meio dos canais
poriacutenicos presentes nas bacteacuterias gram-negativas induzindo um efeito poacutes-
16
antibioacutetico Quando comparados com outros beta-lactacircmicos os carbapenecircmicos
satildeo mais resistentes agrave hidroacutelise pela maioria das beta-lactamases tanto
cromossocircmicas como plasmiacutedicas (LIVERMORE 1995 LIVERMORE et al 2000)
Figura 1 Accedilatildeo do szlig-lactacircmico sobre a bacteacuteria gram-positiva e gram-
negativa Fonte
ltlthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controle
opas_webmodulo3gramn_lacta2htmgt (adaptado)
A bacteacuteria Klebsiella pneumoniae quando apresenta gene ESBL pode
expressar resistecircncia a ateacute 95 dos antimicrobianos existentes no acircmbito
farmacecircutico sendo a produccedilatildeo de beta-lactamases de espectro estendido (ESBL)
17
por esta bacteacuteria uma das principais causas de falha terapecircutica Existem outras
formas de resistecircncia emergentes de grande importacircncia como a produccedilatildeo de
beta-lactamases tipo adenosina monofosfato ciacuteclico (AmpC) que hidrolizam
cefoxitina as carbapenemases como as metalo-beta-lactamases (MBL) e
carbapenemases tipo KPC (MOREIRA et al 2014)
O mecanismo de resistecircncia mais comum aos antibioacuteticos beta-lactacircmicos de
amplo espectro eacute a produccedilatildeo de ESBL por enterobacteacuterias A accedilatildeo hidroliacutetica
apresentadas por estas enzimas pode conferir clinicamente resistecircncia ao
aztreonam cefalosporina e a todas as penicilinas (PATERSON et al 2005) As
ESBL satildeo enzimas mediadas por genes plasmidiais (transmissiacuteveis entre as
espeacutecies) Os principais microrganismos produtores de ESBL satildeo Klebsiella
pneumoniae (mais encontrada) Escherichia coli e Proteus mirabilis podendo ocorrer
em outros membros da famiacutelia Enterobacteriaceae e em alguns microrganismos natildeo
enteacutericos como Acinetobacter ssp (TURNER 2005) A importacircncia cliacutenica meacutedica
destes microrganismos portadores de ESBL eacute que graccedilas aacutes suas resistecircncias a
muitas classes de antimicrobianos o tratamento de infecccedilotildees eacute difiacutecil gerando um
aumento da morbidade e mortalidade dos pacientes (SHAH et al 2004)
A enzima KPC foi detectada pela primeira vez na Carolina do Norte Costa
Leste dos Estados Unidos no ano de 1996 em Klebsiella pneumoniae dando entatildeo
este nome a enzima Em pouco tempo ela disseminou por outras regiotildees e
recentemente tornou-se uma das preocupaccedilotildees quanto agrave sauacutede puacuteblica mundial
Os paiacuteses de onde KPCs tecircm sido relatados desde 2001 satildeo mostrados na figura 2
apresentando como os organismos tecircm agora sido disseminados amplamente pelo
mundo (NEIL GUPTA et al 2011)
18
Figura 2 Divulgaccedilatildeo internacional de Enterobacteriaceae produtora de
Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC)( NEIL GUPTA et al 2011)
Este mapa apresenta paiacuteses onde Enterobacteriaceae produtoras KPC de
foram descritos em relatoacuterios publicados disponiacuteveis a partir de 11 fevereiro de
2011 Os paiacuteses natildeo destacadas nesta figura tambeacutem podem apresentar a presenccedila
de Enterobacteriaceae produtoras de KPC poreacutem pode ter tido uma falta de
vigilacircncia sistemaacutetica para estes organismos ( NEIL GUPTA et al 2011)
No ano de 2005 foram registradas pela primeira vez essas bacteacuterias
produtoras de carbapenemases Apoacutes 6 anos deste primeiro relato elas passaram a
causar surtos mais graves em nosso paiacutes Em janeiro de 2011 foram notificados no
Distrito FederalBrasil 367 casos em um curto espaccedilo de tempo (01 a 08 de janeiro
de 2011) com 26 oacutebitos A maior parte destes casos (263 casos) foi identificada nas
unidades de terapia intensiva ndash UTI (COTRIM et al 2012)
O potencial de disseminaccedilatildeo da KPC eacute alto devido agrave grande capacidade de
transferecircncia do seu material geneacutetico e por conseguinte os genes de resistecircncia
O controle de epidemias eacute difiacutecil devido a esta caracteriacutestica de faacutecil disseminaccedilatildeo
preocupando os profissionais da aacuterea de sauacutede devido agrave dificuldade de tratamento
podendo resultar em um aumento das taxas de mortalidade Apesar da maior
19
frequumlecircncia em Klebsiella pneumoniae a KPC pode ser identificada em outras
bacteacuterias como a Enterobacter cloacae Citrobacter freundii Salmonella spp E coli
e Pseudomonas spp (DIENSTMANN et al 2010)
Os pacientes com comorbidades incluindo pacientes transplantados
neutropecircnicos em ventilaccedilatildeo mecacircnica em Unidade de Terapia Intensiva (UTI)
com longos periacuteodos de internaccedilatildeo que apresentam risco aumentado de infecccedilatildeo ou
colonizaccedilatildeo para bacteacuterias multirresistentes satildeo mais vulneraacuteveis a Klebsiella
pneumoniae produtora de KPC (COTRIM et al 2012)
Os sinais e sintomas apresentados por um indiviacuteduo infectado por KPC satildeo
febre ou hipotermia taquicardia piora do quadro respiratoacuterio e em casos mais
graves hipotensatildeo inchaccedilo e sepse Quanto ao siacutetio de infecccedilatildeo a bacteacuteria que
possui a enzima KPC pode causar pneumonia associada agrave ventilaccedilatildeo mecacircnica
infecccedilatildeo do trato urinaacuterio infecccedilatildeo de corrente sanguiacutenea infecccedilatildeo de partes moles
e outros tipos de infecccedilatildeo (COTRIM et al 2012)
Para desenvolver a infecccedilatildeo a colonizaccedilatildeo eacute um preacute-requisito poreacutem o
pacientes pode estar colonizado ou seja ser portadores de KPC e natildeo desenvolver
a infecccedilatildeo (ALVES et al 2013) A forma de transmissatildeo eacute basicamente por
contato com secreccedilatildeo ou excreccedilatildeo de pacientes infectados ou colonizados logo
fora do ambiente hospitalar a bacteacuteria natildeo representa perigo (COTRIM et al
2012)
As opccedilotildees terapecircuticas para o tratamento da Klebsiella pneumoniae eacute
dividida em Terapia Empiacuterica e Terapia apoacutes a determinaccedilatildeo do perfil de
sensibilidade A terapia empiacuterica para infecccedilotildees por enterobacteacuterias multirresistentes
se baseia na utilizaccedilatildeo de polimixina B ou polimixina E (Colistina) em associaccedilatildeo
com um (1) ou mais dos antimicrobianos da classe dos aminoglicosiacutedeos
(gentamicina ou amicacina) Carbapenecircmicos (meropenem ou doripenem) eou
tigeciclina (ANVISA 2013)
Recomenda-se usar sempre associaccedilotildees de dois ou trecircs antimicrobianos
sendo um deles a polimixina B ou a polimixina E (colistina) Deve-se evitar a
utilizaccedilatildeo de monoterapias pelo risco de raacutepido desenvolvimento de resistecircncia A
escolha do(s) faacutermaco(s) de associaccedilatildeo com polimixina B ou E deve se basear
preferencialmente no perfil de susceptibilidade esperado aos referidos
20
medicamentos das enterobacteacuterias resistentes aos carbapenecircmicos detectadas no
hospital ou na ausecircncia de dados locais na regiatildeo Deve-se considerar igualmente
o local de infecccedilatildeo e a penetraccedilatildeo esperada do antimicrobiano na escolha da droga
a ser utilizada na combinaccedilatildeo (ANVISA 2013)
Apoacutes a liberaccedilatildeo do perfil de sensibilidade deve-se adequar o uso dos
medicamentos Sempre que possiacutevel manter no miacutenimo 2 (dois) faacutermacos com
sensibilidade comprovada in vitro Natildeo havendo sensibilidade a um segundo
medicamento (suscetibilidade apenas agrave polimixina B ou E) recomenda-se manter a
terapia combinada de polimixina B ou E com carbapenecircmicos (meropenem ou
doripenem) ou tigeciclina na tentativa de ocorrecircncia de sinergismo entre elas
(ANVISA 2013)
Sugere-se aleacutem da determinaccedilatildeo das Concentraccedilotildees Inibitoacuterias Miacutenimas
(CIMs) para uma das polimixinas (B ou E) que tambeacutem sejam determinadas as
CIMs de tigeciclina e carbapenecircmicos (meropenem) bem como a consultoria de um
infectologista (ou Comissatildeo de Controle de Infecccedilatildeo Hospitalar- CCIH) para a
determinaccedilatildeo da terapia combinada com base na interpretaccedilatildeo do antibiograma
CIM e quadro cliacutenico do paciente No caso de resistecircncia agraves polimixinas
(concentraccedilotildees inibitoacuterias miacutenimas [CIMs] gt 2 mgL) recomenda-se a associaccedilatildeo de
dois ou trecircs do antimicrobianos sugeridos para a combinaccedilatildeo (ANVISA 2013)
A antissepsia eficiente do ambiente dos instrumentos ciruacutergicos e das matildeos
com o uso do aacutelcool a 70 eacute fundamental para a contenccedilatildeo de surtos Aleacutem disto
os pacientes contaminados devem permanecer isolados ateacute o controle da infecccedilatildeo
para evitar a disseminaccedilatildeo da bacteacuteria (COTRIM et al 2012)
1 2 Resistecircncia bacteriana
Hoje a disseminaccedilatildeo e a proliferaccedilatildeo das bacteacuterias resistentes estatildeo cada
dia mais presente As bacteacuterias multirresistentes (BRMD) poderatildeo levar agrave
humanidade a uma era poacutes-antibioacutetica resultando em uma ausecircncia de qualquer
opccedilatildeo de tratamento para os portadores destas cepas (HENRIQUE et al 2014)
Os fatores envolvidos na disseminaccedilatildeo desses patoacutegenos multirresistentes
satildeo diversos incluindo o uso irracional de antimicrobianos procedimentos invasivos
21
(cirurgias implantaccedilatildeo de proacuteteses meacutedicas e outros) e a transferecircncia de material
geneacutetico com a informaccedilatildeo de resistecircncia a antibioacuteticos entre as bacteacuterias
(DIENSTMANN et al 2010 ENDIMIAMI et al 2009 FONTANA et al 2010)
Com a praacutetica da antibioticoterapia principalmente em ambientes
nosocomiais os mecanismos de resistecircncia tornaram-se comuns Esses
mecanismos incluem alteraccedilatildeo na permeabilidade da membrana celular que
impede a entrada do antibioacutetico na ceacutelula bombeamento do antibioacutetico para fora da
mesma pelo mecanismo de efluxo mutaccedilatildeo geneacutetica que altera de alguma forma o
alvo do antibioacutetico e consequumlentemente natildeo afeta o funcionamento da bacteacuteria
bem como desenvolvimento da capacidade de degradar ou da inativaccedilatildeo do
antibioacutetico (COTRIM et al 2012) Estes mecanismos estatildeo representados na figura
3
Figura 3 Mecanismos de resistecircncia bacteriana Fonte
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controle
opas_webmodulo3pop_mecanismohtmgt
Um dos mais importantes mecanismos de resistecircncia eacute a alteraccedilatildeo do local-
alvo onde atua determinado antimicrobiano de modo a impedir a ocorrecircncia de
qualquer efeito inibitoacuterio ou bactericida As bacteacuterias podem adquirir um gene que
22
codifica um novo produto resistente aos antimicrobianos substituindo o alvo original
por exemplo o Staphylococcus aureus resistente agrave oxacilina e estafilococos
coagulase-negativos adquiriram o gene cromossocircmico Mec A e produzem uma PBP
ou PLP resistente aos β-lactacircmicos denominada 2a ou 2 que eacute suficiente para
manter a integridade da parede celular durante o crescimento quando outras PBPs
essenciais satildeo inativadas por antibimicrobianos β-lactacircmicos Como alternativa um
gene receacutem-adquirido pode atuar para modificar um alvo tomando-o menos
vulneraacutevel a determinado antimicrobiano Assim um gene transportado por
plasmiacutedeo ou por transposon codifica uma enzima que inativa os alvos ou altera a
ligaccedilatildeo dos antimicrobianos como ocorre com eritromicina e clindamicina (ANVISA
2007)
Em funccedilatildeo da bomba de efluxo pode variar a especificidade do antibioacutetico
Ele atua por meio do bombeamento ativo de antimicrobianos do meio intracelular
para o extracelular gerando uma resistecircncia bacteriana a determinados
antimicrobianos como eacute o caso da resistecircncia agraves tetraciclinas codificada por
plasmiacutedeos em Escherichia coli devido agrave presenccedila de proteiacutenas integrantes da
membrana plasmaacutetica bacteriana (PIDDOCK 2006)
O aumento da siacutentese de proteiacutenas eacute o principal responsaacutevel pela resistecircncia
antimicrobiana devido agraves vaacuterias mutaccedilotildees que ocorrem em seus repressores
transcricionais Estas mutaccedilotildees tambeacutem podem influenciar levando a um aumento
da eficiecircncia do transporte dos antibioacuteticos para o exterior da ceacutelula (HARBOTTLE
et al 2006)
A resistecircncia aos antibioacuteticos eacute frequumlentemente associada agrave alteraccedilatildeo
diminuiccedilatildeo da permeabilidade que ocorre na membrana externa das bacteacuterias gram-
negativas O fluxo de moleacuteculas para o interior da ceacutelula ocorre por caracteriacutesticas
peculiares como carga estrutura e dimensatildeo e atraveacutes de proteiacutenas de membrana
as quais formam canais Este percurso eacute utilizado pelos antibioacuteticos para atingir o
interior da ceacutelula bacteriana ou o espaccedilo periplasmaacutetico como eacute o caso dos
antibioacuteticos β-lactacircmicos Portanto a perda de funccedilatildeo destas proteiacutenas pode
efetivamente causar a diminuiccedilatildeo da susceptibilidade a vaacuterios antibioacuteticos
(LIVERMORE 2003)
23
Os mecanismos de resistecircncia que podem impedir a accedilatildeo de antimicrobianos
satildeo vaacuterios O faacutermaco atua de forma a inibir os processos essenciais a multiplicaccedilatildeo
e sobrevivecircncia da ceacutelula bacteriana como a membrana citoplasmaacutetica e
consequumlentemente bloqueando a siacutentese proteacuteica de aacutecidos nucleacuteicos e da parede
celular A resistecircncia bacteriana eacute um mecanismo natural de defesa Sendo assim
as bacteacuterias estatildeo em constante defesa e para cada novo faacutermaco desenvolvido as
bacteacuterias iratildeo desenvolver resistecircncia em algum momento (POSSEBON et al
2003)
O grupo de antibioacuteticos beta-lactacircmicos satildeo amplamente utilizado e se
encontram dentro da classe dos melhores agentes antimicrobianos com relevacircncia
cliacutenica No entanto o seu uso tem sido restringido devido a vaacuterios mecanismos de
resistecircncia O desenvolvimento dos carbapenecircmicos surgiu devido agrave proliferaccedilatildeo de
beta-lactamases mediadas por plasmiacutedeos e cromossomos (POSSEBON et al
2003)
A bacteacuteria KPC tem um gene chamado SHV-1 que tem a caracteriacutestica de
resistecircncia a quase todos os tipos de antimicrobianos inclusive os carbapenecircmicos
especiacuteficos para o tratamento de infecccedilotildees por bacteacuterias multiresistentes e
emergecircncias Mesmo com no seu coacutedigo geneacutetico a informaccedilatildeo necessaacuteria para o
desenvolvimento da resistecircncia a resistecircncia da bacteacuteria soacute eacute desenvolvida caso a
bacteacuteria entre em contato com o antibacteriano desencadeando todo o processo
nos casos de resistecircncia induzida comuns em KPC (MOREIRA et al 2014)
A resistecircncia bacteriana pode ser apresentada de forma intriacutenseca ou
adquirida A resistecircncia intriacutenseca faz parte das caracteriacutesticas fenotiacutepicas naturais
do microrganismo ou seja faz parte de sua heranccedila geneacutetica sendo transmitida
verticalmente a prole sem perda da caracteriacutestica A presenccedila ou ausecircncia do alvo
para a accedilatildeo da droga eacute o principal determinante deste tipo de resistecircncia
(MOREIRA et al 2014) Essa resistecircncia corresponde a uma caracteriacutestica de
espeacutecie bacteriana quando estes microrganismos satildeo naturalmente resistentes a
certo tipo de antibioacutetico Este processo eacute decorrente da ausecircncia de estruturas de
atuaccedilatildeo de antimicrobianos ou a impermeabilidade por parte de estruturas
perifeacutericas das bacteacuterias (HENRIQUE et al 2014)
24
A resistecircncia adquirida aos antibioacuteticos por sua vez ocorre quando haacute uma
da mutaccedilatildeo de genes reguladores ou estruturais aquisiccedilatildeo de genes de resistecircncia
veiculados por elementos geneacuteticos moacuteveis ou da combinaccedilatildeo entre eles Este
aparecimento de resistecircncia em uma espeacutecie bacteriana era anteriormente sensiacutevel
a droga e devido a um destes fatores se torna resistente O fenoacutetipo resultante
desta resistecircncia natildeo estaraacute presente nas ceacutelulas genitoras e sim nos indiviacuteduos de
uma linhagem bacteriana derivada de um organismo susceptiacutevel Os genes muitas
vezes satildeo adquiridos por meio de elementos moacuteveis como plasmiacutedeos e
transposons (MOREIRA et al 2014)
Entatildeo a resistecircncia adquirida ocorre por diversos mecanismos geneacuteticos tais
como produccedilatildeo de enzimas inativadoras interferecircncia com a entrada e acuacutemulo de
droga na bacteacuteria alteraccedilatildeo do receptor para accedilatildeo da droga via metaboacutelica
alternativa Eacute originada por meio de uma alteraccedilatildeo a niacutevel geneacutetico da ceacutelula de
natureza cromossocircmica pelos processos de mutaccedilatildeo transduccedilatildeo e transformaccedilatildeo
ou extra cromossocircmica (plasmidial) (HENRIQUE et al 2014)
Como todo antibioacutetico β-lactacircmicoos carbapenecircmicos tem como mecanismo
de accedilatildeo a inibiccedilatildeo da siacutentese proteacuteica atraveacutes da accedilatildeo de inibiccedilatildeo da parede
microbiana fazendo a ligaccedilatildeo e inativaccedilatildeo das proteiacutenas ligadoras de penicilinas
(NETO et al 2007)
Imipenem e meropenem antibioacuteticos pertencentes ao grupo dos
carbapenecircmicos possuem um amplo espectro de accedilatildeo in vitro incluindo atividade
contra cocos gram-positivos bacilos gram-negativos e bacteacuterias anaeroacutebias (MOHR
2008) Jaacute o ertapenem possui um espectro de accedilatildeo mais limitado que o os dois
antibioacuteticos anteriormente citados tendo uma eficiecircncia limitada contra os bacilos
gram-negativos natildeo fermentadores Um novo antibioacutetico carbapenecircmico ainda natildeo
disponiacutevel no Brasil doripenem possui uma atividade mais potente principalmente
contra Pseudomona aeruginosa devido ao seu mecanismo de accedilatildeo que combina os
espectros de accedilatildeo de imipenem e meropenem (ZHANEL et al 2007)
Devido as suas estabilidades espectro de accedilatildeo poucos relatos de
resistecircncia boa toleracircncia pelos pacientes com efeitos adversos mais comuns as
complicaccedilotildees no siacutetio da infusatildeo e toxicidade gastrintestinal estes antibioacuteticos
carbapenecircmicos tecircm sido considerados terapia de escolha (NICOLAU 2008) Como
25
uma resposta adaptativa das Enterobacteacuterias o iacutendice de resistecircncia aos
carbapenecircmicos tem aumentado nos uacuteltimos anos de forma proporcional ao seu
uso limitando imensamente as opccedilotildees terapecircuticas para as infecccedilotildees causadas por
estes microrganismos (FALAGAS et al 2009)
As enzimas produtoras de betalactamases hidrolisam o anel betalactacircmico
tornando este mecanismo de resistecircncia o mais importante Os dois grupos mais
preocupantes satildeo o grupo das betalactamases de aspecto ampliado e os da
carbapenemases que aleacutem de hidrolizar os carbapenecircmicos hidrolizam todas as
outras classes de betalactacircmicos Em enterobacteacuterias as carbapenemases mais
prevalentes satildeo codificadas por genes dos grupos blaKpc blaIMP blaVIM blaNdm
e blaOxa A ocorrecircncia de carbapenemases eacute mais frequentemente em bacteacuterias
gram-negativas fermentadoras da glicose conhecidas como enterobacteacuterias
predominantes nos gecircneros Klebsiella Serratia Citrobacter Enterobacter
Escherichia Samonella Proteus Morganella Podem ser encontradas tambeacutem em
bacteacuterias gram-negativas natildeo fermentadoras como espeacutecies de Acinetobacter e de
Pseudomonas (ALVES et al 2013)
Carbapenemases satildeo enzimas plasmiacutedio-mediados resistentes a todos
antibioacuteticos betalactacircmicos As bacteacuterias que possuem o gene blaKpC responsaacutevel
pela codificaccedilatildeo da produccedilatildeo de carbapenemases apresentam resistecircncia aos
antibioacuteticos betalactacircmicos impedindo a accedilatildeo destes antibioacuteticos contra infecccedilotildees
(ALVES et al 2013)
A transmissatildeo das carbapenemases a diferentes cepas de enterobacteacuterias se
daacute atraveacutes de plasmiacutedeos que satildeo pequenas moleacuteculas circulares de DNA com a
capacidade de se replicarem independentemente do DNA cromossocircmico
permitindo a troca de material geneacutetico entre gecircneros e espeacutecies diferentes de
enterobacteacuterias O raacutepido desenvolvimento de surtos em ambientes hospitalares eacute
explicado por essa disseminaccedilatildeo plasmidial (COTRIM et al 2012)
De acordo com o criteacuterio de interpretaccedilatildeo do Clinical and Laboratory
Standards Institute (CLSI 2009) a maioria das KPC isoladas natildeo apresenta
resistecircncia completa aos carbapenecircmicos (Imipenem e Meropenem apresentam
uma Concentraccedilatildeo Inibitoacuteria Miacutenima (CIM) de 2-8 μgmL) (COTRIM et al 2012)
26
Os mecanismos de resistecircncia capazes de impedir a accedilatildeo dos
carbapenecircmicos satildeo vaacuterios Poreacutem a degradaccedilatildeo de antibioacuteticos por enzimas
principalmente as carbapenemases constituem o principal mecanismo de
resistecircncia aos antibioacuteticos β-lactacircmicos (DIAS 2009) Devido a ampla atividade
hidroliacutetica agrave maioria dos antibioacuteticos β-lactacircmicos estes grupos de enzimas possuem
alta versatilidade (QUEENAM et al 2007)
Existem trecircs grandes classes moleculares de Ambler a qual as
carbapenemases pertencem denominadas classe A (serino-carbapenemases os
quais incluem membros designados SME IMI NMC GES e a famiacutelia das KPCs)
classe B(as metalo-β-lactamase incluem os tipos IMP e VIM) e classe D
(oxacilinases similares as da classe A e incluem as OXA e PSE) (DIAS 2009)
Dentre estes as mais importantes e prevalentes encontradas em plasmiacutedeos
de Klebsiella pneumoniae satildeo as KPC (DIENSTMANN et al 2010) Por meio de
estudos moleculares a enzima KPC jaacute foi documentada em diferentes bacteacuterias e
diferenciada em KPC-1 a 13 (NETIKUL et al 2011) No ano de 2009 foi realizada
uma pesquisa onde descreveram as seguintes carbapenemases KPC-1 em isolados
de Klebsiella pneumoniae KPC-2 em K pneumoniae K oxytoca Salmonella
enterica e em Enterobacter sp e KPC-3 em K pneumoniae e Enterobacter cloacae
(MONTEIRO et al 2009) As enzimas KPC-4 e KPC-5 foram encontradas em
isolados de Pseudomonas aeruginosa (PEIRANO et al 2009)
Foi observada uma correccedilatildeo da sequumlecircncia KPC-1 indicando que o gene
blaKPC-1 e blaKPC-2 satildeo idecircnticos Trecircs novas variantes blaKPC-3 blaKPC-4 e
blaKPC-5 satildeo resultados de mutaccedilotildees do gene estrutural da enzima KPC-2
(WOLTER et al 2008) apresentando diferentes perfis de hidroacutelise As enzimas
KPC-2 e KPC-3 possuem alta eficiecircncia em hidrolisar cefalotina cefaloridina e
nitrocefin poreacutem possuem uma menor eficiecircncia contra carbapenecircmicos e
cefotaxima (ALBA et al 2005) As enzimas KPC-5 e KPC-4 apresentam menor
hidroacutelise de carbapenecircmicos eacute do que em KPC-2 Em contrapartida possuem
melhor eficiecircncia contra ceftazidima e uma maior inibiccedilatildeo pelo aacutecido clavulacircnico
(WOLTER et al 2008)
27
13 Anaacutelise geneacutetica de microrganismos
Eacute de extrema importacircncia praacutetica natildeo soacute no aspecto cliacutenico mas tambeacutem na
fitopatologia biotecnologia e estudos ambientais a correta identificaccedilatildeo e
classificaccedilatildeo de microrganismos Os meacutetodos usados na diferenciaccedilatildeo de gecircneros
espeacutecies e estirpes de microrganismos podem ser divididos em meacutetodos fenotiacutepicos
(baseados em fenocircmenos bioquiacutemicos fisioloacutegicos e bioloacutegicos) e genotiacutepicos
(detectam polimorfismos ao niacutevel dos aacutecidos nucleacuteicos ou variaccedilatildeo aleacutelica ao niacutevel
de enzimas) (ALVES et al 2003)
Para este tipo de estudo existem alguns meacutetodos como o RFLPrsquos -
ldquoRestriction Fragment Length Polymorphismsrdquo (polimorfismos de tamanho de
fragmentos de restriccedilatildeo) rep-PCR (Meacutetodo de tipagem baseado na amplificaccedilatildeo via
PCR de elementos de DNA repetitivos presentes em genomas bacterianos) anaacutelise
de sequumlecircncias nucleotiacutedeas (discriminaccedilatildeo eou identificaccedilatildeo atraveacutes de sequumlecircncias
de DNA) PFGE - Pulsed-Field Gel Electrophoresis (Eletroforese em campo
pulsado) ( A L V E S et al 2003)
A diferenciaccedilatildeo clara da cepa e principalmente a alta reprodutibilidade devem
ser caracteriacutesticas de qualquer meacutetodo de tipagem geneacutetica Poreacutem nem todos os
meacutetodos moleculares de tipagem satildeo igualmente eficazes Sendo assim de acordo
com a finalidade pretendida (identificaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo custo reprodutibilidade
etc) eacute feita a escolha do meacutetodo a ser aplicado (A L V E S et al 2003)
O processo de identificaccedilatildeo fenotiacutepica de KPC entre os membros da famiacutelia
Enterobacteriaceae ainda eacute difiacutecil e os meacutetodos para a sua identificaccedilatildeo devem ser
revistos e ajustados Mesmo com o avanccedilo tecnoloacutegico natildeo existem ensaios que
combinam alta especificidade e sensibilidade na detecccedilatildeo destas enzimas Satildeo
diversas as metodologias usadas para rastreamento de KPC como por exemplo a
focalizaccedilatildeo isoeleacutetrica a teacutecnica de disco-difusatildeo E-test teste de Hodge
modificado dentre outros Aleacutem disso a pesquisa do gene blaKPC pode ser feita
pela Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) Os sistemas de automaccedilatildeo
existentes no entanto podem natildeo identificar com precisatildeo os isolados KPC
positivos (COTRIM et al 2012)
A identificaccedilatildeo blaKPC pelo PCR eacute um meacutetodo raacutepido preciso sensiacutevel e
altamente especiacutefico no entanto a PCR exige equipamento e conhecimentos
28
especializados em diagnoacutestico molecular dificultando ainda a utilizaccedilatildeo dele na
rotina dos laboratoacuterios de microbiologia (COTRIM et al 2012)
Em estudo de infecccedilotildees hospitalares identificaccedilatildeo molecular de patoacutegenos
bacterianos eacute bastante utilizada Para diferenciar carbapenemases tipo KPC a partir
de outros tipos como SME NMC-A-IMI e GES eacute necessaacuterio um exame molecular
As identificaccedilotildees do microrganismo juntamente com a triagem molecular iratildeo definir
um resultado mais especiacutefico podendo ser usado para identificar o antibioacutetico mais
adequado para o tratamento Poreacutem a principal desvantagem de alguns exames
baseados em PCR por exemplo eacute que devido agrave sua limitada capacidade de
multiplexaccedilatildeo eles distinguem apenas algumas variaccedilotildees (MOREIRA et al 2014)
Estatildeo descritas para a identificaccedilatildeo molecular de patoacutegenos pertencentes agrave
famiacutelia Enterobacteriaceae as teacutecnicas de PFGE RAPD (randomly amplified
polymorphic DNA) e ERIC-PCR (Enterobacterial Repet it ive Intergenic Consensus)
A PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) eacute considerada padratildeo ouro devido sua
alta capacidade de diferenciaccedilatildeo baseada na anaacutelise do perfil de restriccedilatildeo do DNA
genocircmico por meio de eletroforese Como desvantagem para a sua execuccedilatildeo eacute
necessaacuterios vaacuterios dias impedindo a tipagem de algumas cepas bacterianas devido
agrave degradaccedilatildeo do DNA aleacutem do alto custo empregado (MOREIRA et al 2014)
O meacutetodo baseado em ERIC-PCR tem sido bastante utilizado como uma
alternativa para a teacutecnica de PFGE Esta teacutecnica consiste na anaacutelise do padratildeo de
amplificaccedilatildeo de elementos repetidos encontrados no genoma bacteriano Isto
permite uma maior rapidez na obtenccedilatildeo de resultados quando comparada com o
PFGE aleacutem de alta reprodutibilidade simples execuccedilatildeo e implementaccedilatildeo baixo
custo e natildeo sem problemas com a degradaccedilatildeo do DNA (MOREIRA et al 2014)
A PCR eacute considerada uma teacutecnica de biologia molecular revolucionaacuteria que
consiste na siacutentese enzimaacutetica de coacutepias de aacutecidos nucleacuteicos Ela permitiu o raacutepido
desenvolvimento do estudo de sequumlecircncias de aacutecidos nucleacuteico Foi desenvolvida por
Kary Banks Mullis que ganhou o precircmio Nobel de quiacutemica de 1993 devido ao
desenvolvimento dessa teacutecnica em abril de 1983 (CAMARGO et al 2014)
Por meio de etapas de variaccedilatildeo de temperatura a teacutecnica de PCR promove a
duplicaccedilatildeo de cadeias de DNA in vitro A reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo de DNA por PCR
envolve o emprego de sequumlecircncias iniciadoras (primers) quatro nucleotiacutedeos
29
(dNTPrsquos) do DNA e uma DNA polimerase termoestaacutevel podendo assim obter-se a
partir de uma fita molde muitas coacutepias de uma sequumlecircncia especiacutefica de aacutecido
nucleacuteico O princiacutepio da PCR consiste na variaccedilatildeo de temperatura por ciclo
envolvendo trecircs etapas baacutesicas desnaturaccedilatildeo pareamento e amplificaccedilatildeo
(CAMARGO et al 2014)
A desnaturaccedilatildeo da fita molde de DNA eacute uma etapa com duraccedilatildeo entre 30
segundos a 1 minuto a temperatura entre 92 ordmC a 96 ordmC Apoacutes isso o pareamento de
dois iniciadores sinteacuteticos de composiccedilotildees distintas que funcionam como os
iniciadores da reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo liga-se agrave regiatildeo complementar da fita de
DNA alvo que sofreraacute a duplicaccedilatildeo Esta etapa tem duraccedilatildeo de 30 segundos a 1
minuto a temperatura entre 58 ordmC e 65 ordmC Por uacuteltimo a amplificaccedilatildeo por meio da
enzima Taq DNA polimerase das novas fitas de DNA se daacute a partir de cada um dos
iniciadores utilizando os quatro dNTPrsquos como substrato da reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo
Esta etapa possui duraccedilatildeo entre 45 segundos e 1 minuto a 72 ordmC Cada ciclo eacute
repetido em torno de 30 a 35 vezes e promove a amplificaccedilatildeo da regiatildeo alvo
determinada conforme o anelamento dos iniciadores sinteacuteticos de DNA (CAMARGO
et al 2014) Estas etapas estatildeo demonstradas na figura 4
Figura 4 Etapas da Reaccedilatildeo de PCR
30
2 JUSTIFICATIVA
No ano de 2010 no Distrito Federal foram identificados 111 pacientes com
suspeita de infecccedilatildeo por Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) e a
Secretaria de Sauacutede do Distrito Federal confirmaram ainda a morte de 18 pacientes
dentre os hospitais puacuteblicos e particulares Um desafio encontrado por ocasiatildeo do
surto infeccioso no Distrito Federal foi o de confirmar as KPCs por Reaccedilatildeo da
Polimerase em Cadeia sendo que as amostras foram enviadas com esta finalidade
para a Fiocruz no Rio de Janeiro
Pesquisas que possam contribuir na elaboraccedilatildeo de estrateacutegias preventivas e
de intervenccedilatildeo para infecccedilotildees causadas por enterobacteacuterias bem como contribuir
para gerar uma integraccedilatildeo beneacutefica entre a equipe acadecircmica e os serviccedilos de
sauacutede devem ser estimuladas Neste sentido o presente estudo permitiu escrutinar
os genes envolvidos na expressatildeo de carbapenemases presentes em espeacutecies de
enterobacteacuterias isoladas em ambiente hospitalar visto que elucidar genes de
resistecircncia de enterobacteacuterias aos antibioacuteticos carbapenecircmicos eacute o primeiro passo
para garantir um controle epidemioloacutegico efetivo para estes tipos de microorganismo
assim como sua associaccedilatildeo com surtos fatais particularmente em pacientes com
baixa imunidade
31
3 OBJETIVOS
31 Objetivo geral Caracterizar os genes de resistecircncia das
Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases e os aspectos epidemioloacutegicos de
pacientes internados em um hospital puacuteblico do Distrito Federal
32 Objetivos Especiacuteficos
Identificar genotipicamente a enzima KPC (Klebsiella pneumoniae
carbapenemase) de isolados de Klebsiella pneumoniae
Investigar aspectos epidemioloacutegicos dos pacientes portadores de
Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases
Identificar quais variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana influenciaram para o
desfecho oacutebito ou alta
Avaliar a susceptibilidade das Enterobacteacuterias aos antibioacuteticos
carbapenecircmicos dos pacientes em ambiente hospitalar
32
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
Trata-se de um estudo transversal onde foi realizado o teste de
susceptibilidade das enterobacteacuterias aos antibioacuteticos carbapenecircmicos a partir dos
materiais bioloacutegicos coletados dos pacientes internados no Hospital Regional da Asa
Norte (HRAN) e enviados ao Laboratoacuterio de Anaacutelises Cliacutenicas da mesma Instituiccedilatildeo
Os materiais bioloacutegicos investigados foram sangue aspirado traqueal ou brocircnquico
urina e cultura semi quantitativa de ponta de cateter venoso central O HRAN eacute um
hospital puacuteblico do Distrito Federal com 395 leitos sendo as cliacutenicas de internaccedilatildeo
Berccedilaacuterio Cirurgia Geral Cirurgia Plaacutestica Cliacutenica Meacutedica Ginecologia Maternidade
Pediatria Queimados UTI com atendimento a pacientes portadores de doenccedilas de
caraacuteter cliacutenico e ciruacutergico
4 1 Coleta e transporte das amostras bioloacutegicas
As amostras foram coletadas de pacientes internados no Hospital Regional da
Asa Norte (HRAN) com suspeitas de infecccedilatildeo por KPC A identificaccedilatildeo primaacuteria foi
realizada pelo Laboratoacuterio de Microbiologia do hospital de origem dos pacientes e os
demais procedimentos que foram utilizados na identificaccedilatildeo encontram-se descritos
abaixo
4 2 Procedimentos para confirmaccedilatildeo de resistecircncia bacteriana por
disco de ertapenem (adaptado CDC 2004)
Para diagnosticar amostra como portadora de bacteacuteria produtora de
carbapenemase foi realizado o teste com disco de ertapenem como forma de
triagem Inicialmente utilizou-se o swab contaminado com a amostra que foi
distribuiacuteda em uma pequena aacuterea da placa de aacutegar MacConkey para apoacutes o
crescimento ser realizada a pesquisa de colonizaccedilatildeo por enterobacteacuterias resistentes
aos carbapenecircmicos (Pesquisa de CRE) Procedeu-se a semeadura por teacutecnica
semi-quantitativaesgotamento com alccedila bacterioloacutegica na diluiccedilatildeo de 1100 O disco
de Ertapenem foi colocado na superfiacutecie da placa de MacConkey na junccedilatildeo dos dois
primeiros campos de semeadura conforme demonstrado na figura 5 Incubou a placa
33
em estufa aeroacutebia a 35ordmC por 24 e 48 horas e observou-se o halo de difusatildeo do
disco de Ertapenem na placa para proceder agrave leitura
O teste deixou de ser obrigatoacuterio apoacutes a modificaccedilatildeo dos criteacuterios
interpretativos para carbapenecircmicos para enterobacteacuterias publicados no suplemento
do CLSI 2010 M100-S20-U
Figura 5 Mecanismo de semeamento de material bioloacutegico oriundos de
pacientes com suspeita de infecccedilatildeo por KPC Fonte adaptado CDC 2004
4 2 1 Interpretaccedilatildeo dos resultados
Na ausecircncia de crescimento ateacute 24 horas (MacConkey) ou halo de difusatildeo
gt27 mm na placa deve-se reincubar as placas por mais 24 horas Quando for
ausente o crescimento apoacutes 48 horas ou halo de difusatildeo gt27 mm na placa libera-se
como enterobacteacuterias resistentes a carbapenecircmicos (KPCNEG)Havendo
crescimento de colocircnias na placa de MacConkey com halo lt 27 mm (apenas para
colocircnias com crescimento dentro do halo) deve-se reisolar e realizar identificaccedilatildeo e
antibiograma automatizado teste de sensibilidade por disco-difusatildeo e Teste de
Hodge Modificado (THM) Os isolados de enterobacteacuterias cujos testes comprovarem
a resistecircncia aos carbapanecircmicos testados (KPCPOS) foram reportado a Comissatildeo
de Controle de Infecccedilatildeo Hospitalar (CCIH) Jaacute osbacilos Gram-negativos natildeo
fermentadores natildeo foram reportados (KPCNEG) Para interpretaccedilatildeodos resultados
foram utilizados os valores conforme demonstrados na tabela 1
Tabela 1 Criteacuterios Interpretativos para testes de sensibilidade
ENTEROBACTEacuteRIAS
Disco difusatildeo (mm) MIC (microgml)
34
Antibioacutetico Sigla S I R S I R
Ertapenem 10
microg
ETP 22 19-
21
18 05 1 2
Meropenem 10
microg
MEM 23 20-
22
19 1 2 4
Fonte Manual Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)
2013
Os resultados que apresentaram resistecircncia ao antibioacutetico Ertapenem foram
considerados como suspeitos de contaminaccedilatildeo por KPC Fez-se o teste de
susceptibilidade aos antibioacuteticos (TSA) em aparelho automatizado MicroScan Walk
Away 96sl Dade Behring
4 3 Teste de susceptibilidade aos antibioacuteticos (adaptado CDC 2004)
A determinaccedilatildeo da susceptibilidade dos isolados foi feita pelo teste de
susceptibilidade aos antibioacuteticos (TSA) apoacutes cultura em meio de gelose simples
(INSA) para avaliaccedilatildeo da sua pureza e obtenccedilatildeo de colocircnias isoladas Para
preparaccedilatildeo de uma suspensatildeo bacteriana com turvaccedilatildeo aproximada de 05
McFarland (Dade BehringMicroScanregTurbidity Meter) ressuspendeu duas a cinco
colocircnias em 2ml de soro fisioloacutegico esteacuteril diluindo a 1100 em soro fisioloacutegico num
volume total de 10ml em seguida foi feita uma semeadura em duas placas
quadradas (120mm x 120mm) de Muller-Hinton Agar (INSA) por inundaccedilatildeo
Os discos de antibioacutetico carbapenecircmicos imipenem meropenem e
ertapenem (Biorad) foram aplicados com o auxiacutelio de um dispensador automaacutetico A
susceptibilidade das Enterobacteacuterias aos carbapenecircmicos foi definida de acordo
com o protocolo Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI 2011)
Para aquelas Enterobacteacuterias que apresentaram resistecircncia ao ertapenem
foram realizados o Teste de Hodge Modificado para Detecccedilatildeo de Enterobacteacuterias
Produtoras de Carbapenemases conforme descrito pelo Centers for Disease Control
and Prevention (CDC 2004)
35
4 4Teste de Hodge Modificado (THM) (adaptado CDC 2004)
Preparou-se uma suspensatildeo em salina esteacuteril com a cepa Escherichia coli
ATCC 25922 (padratildeo 05 de McFarland) Apoacutes isto diluiu a suspensatildeo 110 em
salina (05 ml da soluccedilatildeo de Ecoli ATCC 25922 + 45 ml salina)Foi entatildeo semeado
na superfiacutecie de uma placa de Agar Muller-Hinton com a suspensatildeo diluiacuteda de Ecoli
ATCC 25922 com auxilio de swab seco assegurando que houvesse uma
distribuiccedilatildeo uniforme cobrindo toda a superfiacutecie do Agar Deixou secar por 3 a 5
minutos em temperatura ambienteColocou-se o disco de ertapenem 10microg no centro
da placa e apoacutes isto fez-se uma estria linear da cepa a ser testada da borda do
disco ateacute a borda da placa utilizando uma alccedila calibrada 10 microl ou um swab Incubou
a placa na estufa em atmosfera aeroacutebia a 35 plusmn 2ordmC por 16 a 24 horas
441 Controle de qualidade (CQ)
Foi utilizado um CQ todos os dias em que se realizou o teste tendo como
controle Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1705- teste de Hodge modificado
positivo Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1706- teste de Hodge modificado
negativo
442 InterpretaccedilatildeoResultados
Apoacutes 16ndash24 horas de incubaccedilatildeo examinar as placas para verificar a presenccedila
de uma distorccedilatildeo no halo de inibiccedilatildeo do disco de ertapenem devido ao crescimento
realccedilado da cepa ATCC na intersecccedilatildeo do organismo teste e a Ecoli ATCC 25922
dentro dos limites do halo O THM positivo apresentaraacute presenccedila de distorccedilatildeo no
halo de inibiccedilatildeo de ertapenem devido ao crescimento da cepa Ecoli ATCC 25922 ao
longo da estria da cepa teste para dentro dos limites do halo de inibiccedilatildeo Jaacute o THM
negativo teraacute ausecircncia de crescimento da cepa Ecoli ATCC 5922 ao longo da estria
da cepa teste para dentro dos limites do halo de inibiccedilatildeo do disco de ertapenem
Este resultado estaacute representado na figura 6
36
Figura 6 Interpretaccedilatildeo resultado do Teste de Hodge Modificado
(adaptado CDC 2004) Teste positivo na estria da cepa teste na parte superior
da placa teste negativo na estria da cepa teste na parte inferior da placa
Tendo positivo como resultado o paciente era um provaacutevel contaminado por
KPC As amostras entatildeo foram encaminhadas para a Fundaccedilatildeo Osvaldo Cruz
(FIOCRUZ) para confirmaccedilatildeo final As amostras finalmente confirmadas como
positivas para KPC foram isoladas e guardadas no banco de cepas cliacutenicas do
hospital Apoacutes a autorizaccedilatildeo do CEP amostras das cepas foram transferidas para
meio de transporte Stuard em caixa teacutermica fechada em baixa temperatura e
levadas para o laboratoacuterio de microbiologia cliacutenica da universidade
No laboratoacuterio da universidade as amostras foram separadas e realizadas
repiques em meios MacConkey e incubadas por 24h As colocircnias caracteriacutesticas
foratildeo isoladas em caldo BHI e mantidas em shaker a 37oC por 2h Apoacutes isto foram
executadas as anaacutelises a seguir
Os isolados de Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases foram
submetidos agrave extraccedilatildeo de DNA e posterior sequumlenciamento para identificaccedilatildeo dos
genes de resistecircncia blaKPC de 1 a 13 e identificaccedilatildeo do gene universal Os
pacientes de onde os materiais bioloacutegicos contendo as Enterobacteacuterias produtoras
de carbapenemases foram os isolados foram investigados quanto aos aspectos
epidemioloacutegicos e cliacutenicos
37
4 5 Extraccedilatildeo de DNA bacteriano
A extraccedilatildeo de DNA bacteriano foi realizada utilizando o kit NucleoSpin
Plasmidreg (MN) Antes de iniciar a extraccedilatildeo foi feito a preparaccedilatildeo das soluccedilotildees
reagentes materiais e amostras (vortexando) colocou-se em banho-maria agrave 50ordmC o
tampatildeo AW Partiu-se de colocircnias isoladas cultivadas que sofreram passagem em
meio LB liacutequido por 12h Adicionou-se 15 mL da amostra no tubo eppendorf
centrifugou por 5 minutos descartou o sobrenadante (com cuidado para natildeo
descartar o Pellet) Repetiu-se este procedimento por mais trecircs vezes completando-
se o volume de 6mL Foram adicionados 250microL do tampatildeo Resuspension Buffer A1
encostando a ponteira no Pellet e misturando (este tampatildeo tem como funccedilatildeo
separar a formaccedilatildeo de grumos celulares) Apoacutes isso homogeneizou e vortexou os
tubos eppendorfs Apoacutes isso foram adicionados 250microL do tampatildeo Lysis Buffer A2
homogenizou e deixou descansar por 5 minutos (esta etapa eacute importante para a lise
da parede e da membrana celulares e liberaccedilatildeo do conteuacutedo da ceacutelula)
Passado o tempo de descanso foi adicionado 300microL do tampatildeo
Neutralization Buffer A3 homogeneizou e centrifugou por 10 minutos (este tampatildeo
iraacute retirar as proteiacutenas que envolvem o DNA e voltaraacute com o pH para proacuteximo de 8
impedindo que a soluccedilatildeo de lise facilite a quebra das ligaccedilotildees covalentes do aacutecido
nucleacuteico) Em seguida enumeraram-se os tubos contendo filtros com siacutelica
transferiu-se o sobrenadante para o filtro e centrifugou por 5 minutos Descartou-se
o que foi filtrado adicionou 500microL do tampatildeo AW (banho-maria) centrifugou por 2
minutos Novamente foi descartado o filtrado Adicionou-se 600microL do tampatildeo A4
centrifugou por 2 minutos e descartou o filtrado (os tampotildees AW e A4 contecircm
isotiocianato de guanidina em concentraccedilotildees crescentes para facilitar a adsorccedilatildeo
do DNA na siacutelica e retirada das outras biomoleacuteculas da amostra) Foi feita outra
centrifugaccedilatildeo com o tubo vazio Apoacutes isto o filtro foi trocado para outro eppendorf
definitivo onde foi adicionado 50microL do tampatildeo Elution Buffer AE (este tampatildeo
favorece a eluiccedilatildeo do DNA) centrifugou por 2 minutos descartou o filtro e
armazenou as amostras em freezer -20ordmC
38
4 6 Iniciadores e reaccedilatildeo de PCR
Os iniciadores universais para o gene blaKPC foram desenhados baseados
em sequumlecircncias conservadas apresentadas pelos sub-grupos de genes que
codificam a enzima carbapenemase de klebsiella pneumoniae (YIGIT et al 2001)
Baseado na sequumlecircncia para o blakpc-1 depositada no GenBank
(AF2975541) o oligonucleotiacutedio (oligo) iniciador direto (5-
ATGTCACTGTATCGCCGTC-3rsquo) foi desenhado para reconhecer a sequumlecircncia
blaKPC na posiccedilatildeo (131149) enquanto que o iniciador reverso (5-
TTACTGCCCGTTGACGCC-3rsquo) foi reconhecido na posiccedilatildeo (9951012) As anaacutelises
baseadas em alinhamento de sequumlecircncias mostraram que o par de iniciadores
blaKPC podem detectar os alelos de 1 a 13 do gene blaKPC conforme a tabela 2
Tabela 2 Nuacutemero de acesso ao GenBank dos alelos blaKPC e seus
microrganismos originais
Nuacutemero de
Acesso GenBank
Microrganismo Alvo
AF2975541 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-1
GU0862251 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-2
HQ2589341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-2-like
AB5577341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC -3
EU4473041 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-4
EU4002222 Pseudomonas
aeruginosa
blaKPC-5
EU5555341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-6
EU7297271 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-7
39
FJ2344121 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-8
FJ624872 Escherichia coli blaKPC-9
GQ1403481 Acinetobacter
baumannii
blaKPC-10
HM0669951 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-11
HQ3428891 Enterobacter cloacae blaKPC-12
HQ3428901 Enterobacter cloacae blaKPC-13
As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo de blaKPC foram realizadas em um
primeiro tempo de desnaturaccedilatildeo em que foi 94ordmC por 5 minutos seguido de 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 58 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 90 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 78ordmC por 8 minutos Aleacutem das amostras foi utilizado um
controle negativo
A PCR do blaKPC foi realizada utilizando os componentes para o volume da
reaccedilatildeo de 25 microL citados na tabela 3 A banda do tamanho do produto de PCR foi de
881 pares de bases (pb) o que corresponde ao plasmiacutedeo
Tabela 3 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do
gene blaKPC
Reagente Volume
DNA molde 4 microL
Tampatildeo Taq 25 microL
MgCl2 075 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP
2 microL
Oligo F 1 microL
Oligo R 1 microL
Taq DNA polimerase 05 microL
Aacutegua MiliQ 1335 microL
40
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
Baseado na sequumlecircncia para o gene 16S rRNA em que o oligonucleotiacutedio
Universal iniciador direto foward (5-CCAGCAGCCGCCGTAATACG-3rsquo) foi
desenhado para reconhecer a sequumlecircncia universal na posiccedilatildeo 1513 enquanto que o
iniciador reverso (5-ATCGGYTACCTTGTTACGACTTC-3rsquo) foi reconhecido na
posiccedilatildeo 1491 foram realizadas PCRrsquos As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo deste
gene foram realizadas nos seguinte tempos separaccedilatildeo 94ordmC por 10 minutos 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 55 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 120 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 72ordmC por 10 minutos
A PCR do gene 16S rRNA foi realizada utilizando os componentes para o
volume da reaccedilatildeo de 25microL citados na tabela 4 A banda do tamanho do produto de
PCR foi de 996 pb correspondente aacute regiatildeo ribossomal capaz de amplificar todas
as espeacutecies
Tabela 4Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do gene
universal
Reagente (quantidade
concentraccedilatildeo do estoque)
Volume
DNA molde 10 ng 4 microL
Tampatildeo Taq 10 x 25 microL
MgCl2 50mM 125 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP 25 mM
125 microL
Oligo F 10microM 05 microL
Oligo R 10microM 05 microL
Taq DNA polimerase 5UmicroL 04 microL
Aacutegua Miliq 146 microL
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
41
O termociclador utilizado para os experimentos foi o LifeTouch da BIOER
4 7 Digestatildeo
Para realizaccedilatildeo da digestatildeo foi utilizada a enzima BshF I (Hae III) EN- 1105
tamanho 7000 units concentraccedilatildeo 10 unitsmicroL fonte Bacillus sphaericus empresa
Jena bioscienceUtilizaram-se os componentes para o volume de 50microL da reaccedilatildeo
citados na tabela 5
Tabela 5 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da digestatildeo do gene
universal
Reagente Volume
Produto de PCR 10 microL
Enzima BshF I 01 microL
Tampatildeo (10x) 5 microL
Aacutegua Miliq 349 microL
Total (em cada ependorff) 50 microL
Valores para 1 digestatildeo
Os ependorffs foram colocados por 30 minutos em banho-maria a 37ordmC Apoacutes
isso fez-se a corrida das amostras em gel de agarose para verificaccedilatildeo do resultado
(LU et al 2000)
4 8 Eletroforese em gel de agarose
Os produtos de DNA PCR e digestatildeo foram analisados em gel de agarose
2 O tempo de corrida do gel eacute de aproximadamente 1hora e 30minutos sendo
que no comeccedilo foi usada agrave voltagem de 50 V e apoacutes comeccedilar a correr o gel
aumentou a voltagem para 100 v Utilizou-se o marcador de 100pb (pares de bases)
Foi adicionado 3microL de corante Bromophenol (que tem a funccedilatildeo de fazer uma ligaccedilatildeo
na amostra de DNA e permitir a visualizaccedilatildeo da corrida no gel de agarose) em 7microL
de amostra tanto de DNA quanto de PCR Para o preparo do gel foi utilizado TBE
42
(Tris- Aacutecido Boacuterico) agarose e brometo de etiacutedio (sua funccedilatildeo eacute de corante para o gel
e permitir a visualizaccedilatildeo do DNA quando colocado agrave luz ultravioleta) Para o oligo
blaKPC a banda da amplificaccedilatildeo foi em 881ppb correspondendo ao plasmiacutedeo Jaacute
o oligo Universal foi em 996 pb
4 9 Descarte de resiacuteduos
Todos os materiais utilizados nos ensaios foram de uso uacutenico e manipulados
em cacircmaras de seguranccedila bioloacutegica classe II Apoacutes o uso foram colocados em
soluccedilatildeo desinfetantes (hipoclorito a 1) e em seguida autoclavados a 127oC por 20
min em sacos apropriados para autoclavaccedilatildeo Apoacutes a finalizaccedilatildeo do ciclo de
esterilizaccedilatildeo os sacos contendo o material descartaacutevel foram colocados em
recipientes de coleta da empresa responsaacutevel pela coleta de materiais bioloacutegicos
produzidos no laboratoacuterio de microbiologia Todos os procedimentos seguiram a
normativa RDC-ANVISA 3062004 sobre o descarte de resiacuteduos de serviccedilo de
sauacutede
4 10 Aspectos epidemioloacutegicos e cliacutenicos
Os aspectos cliacutenicos e epidemioloacutegicos foram investigados por meio de
prontuaacuterios dos pacientes portadores de enterobacteacuterias produtoras de
carbapenemases e envolveram topografia mais provaacutevel do foco infeccioso a
enfermidade motivadora da internaccedilatildeo o desfecho cliacutenico a idade e o tempo de
internaccedilatildeo
4 12 Anaacutelises eepidemioloacutegicas
As anaacutelises foram realizadas com o pacote estatiacutestico SPSS versatildeo 200
Para verificar quais variaacuteveis referentes aos dados epidemioloacutegicos e
microbioloacutegicos influenciaram no desfecho verificou- se a diferenccedila meacutedia das
variaacuteveis idade e tempo de internaccedilatildeo em cada grupo O teste estatiacutestico utilizado foi
o teste t de Student apoacutes se executar o teste de normalidade de Shapiro-Wilk Para
as variaacuteveis sexo perfil microbioloacutegico das enterobacteacuterias produtoras de
43
carbapenemases foi avaliada a associaccedilatildeo com o desfecho por meio do teste Exato
de Fisher O niacutevel de significacircncia adotado foi de 5
4 13 Preceitos eacuteticos
Este projeto estaacute inserido em um projeto maior denominado ldquoEpidemiologia
cliacutenica e caracterizaccedilatildeo molecular do Acinetobacter Baumannii resistente a
antibioticoterapia em pacientes internado em hospitais do Sistema Uacutenico de Sauacutederdquo
que foi submetido ao Comitecirc de Eacutetica em Pesquisa da Secretaria do Estado de
Sauacutede do Distrito Federal (SESDF) e emitido parecer aprovado pelo protocolo nordm
23109 (anexo)
44
5 RESULTADOS
51 Anaacutelise molecular
Para a amplificaccedilatildeo com o oligo blaKPC foram amplificadas amostras
que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 881 pb correspondente ao
plasmiacutedeo A anaacutelise da amplificaccedilatildeo da regiatildeo do gene blaKPC mostrou que
apenas a amostra A10 natildeo amplificou isso demonstra que esta amostra natildeo
possuiacutea o gene de resistecircncia
5 1 1 Gene blaKPC
Figura 7 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 881 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
A amostra A3 natildeo amplificou no primeiro momento entatildeo foi realizado
novamente a PCR e corrida de gel obtendo entatildeo a amplificaccedilatildeo da amostra como
apresentado na figura 8
45
Figura 8 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC da
mostra A3 estudada A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo de 881
pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 1 2 Gene 16S rRNA
Para a amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA utilizou-se o oligo universal Foram
amplificadas amostras que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 996 pb
Figura 9 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
46
Segundo Lu et al (2000) a digestatildeo com a enzima HaeIII deste amplicons de
16S rRNA devolveriam bandas com perfis entre 150 a 200 pb No gel abaixo eacute
possiacutevel evidenciar que este perfil ocorreu com o predomiacutenio de bandas na altura
de 200pb
Figura 10 Gel de agarose a 2 da digestatildeo do amplicon do gene 16S
rRNA das amostras com a enzima HaeIII evidenciando diversos fragmentos
proacuteximos a 200 pb A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo ribossomal
de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 2 Anaacutelises epidemioloacutegicas
5 2 1 Sexo
No total foram detectados 17 isolados de KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 onde a maior a prevalecircncia foi
detecatada em amostras de pacientes do sexo masculino (53) do que no sexo
feminino (47)
47
Figura 11 Isolado de KPC segundo sexo dos 17 pacientes investigados
no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 2 Desfecho cliacutenico
Em 17 isolados de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo
de 2010 aacute 2011 a porcentagem de pacientes que foram a oacutebito (59) foi maior que
a de pacientes que tiverm alta (41)
Figura 12 Isolado de KPC segundo desfecho cliacutenico dos 17 pacientes
investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
48
5 2 3 Local da coleta
Dos 17 episoacutedios detectados de infecccedilatildeo por KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 a infecccedilatildeo em swab retalfoi mais
frequente (47) seguida de ponta de cateacuteter (18) e secreccedilatildeo traqueal (12)
Figura 13 Isolados de KPC segundo local da coleta da amostra nos 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 4 Microorganismo
O microorganismo mais encontrado foi a Klebsiella pneumoniae (82)
seguida da Enterobacter clocae (12) e Serratia marcescens (6) dos 17 isolados
de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 Isto afirma o
fato de a sigla KPC ser utilizada de forma errocircnea aacute Klebsiella pneumoniae visto
que a evidecircncia dela eacute maior em relaccedilatildeo as outras cepas
49
Figura 14 Isolado de KPC segundo microrganismo encontrado em 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 5 Relaccedilotildees variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana e desfecho
cliacutenico
Tabela 6 ndash Distribuiccedilatildeo do perfil geneacutetico sexo coleta tipificaccedilatildeo de
microrganismos e anaacutelise da resistecircncia bacteriana segundo o desfecho
cliacutenico Brasiacutelia-DF 2010 a 2011
Variaacutevel Resultado
Desfecho
Alta Oacutebito
N N P
Gene 16S rRNA Positivo 7 1000 10 1000
NA Gene blaKPC Positivo 6 857 10 1000
Negativo 1 143 0 00 0218 Sexo Feminino 2 286 6 600
Masculino 5 714 4 400 0201 Local da coleta Fundo saco de
Douglas 1 143 0 00
Hemocultura 0 00 1 100 0463 Ponta de cateter 1 143 2 200
Sec TraquealBrocircnquica
0 00 1 100
50
Secreccedilatildeo traqueal 2 286 0 00
Swab retal 3 429 5 500
Urina 0 00 1 100
Microrganismo Enterobacter cloacae (KPC)
1 143 1 100
Klebsiella pneumoniae
6 857 8 800
0416 Serratia
marcescens 0 00 1 100
Teste de Hodge Hodge positivo 7 1000 10 1000
NA Amicacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 1 100 0848 resistente 0 00 1 100
sensiacutevel 2 286 3 300
Amoxicilina Aacutecido Clavulacircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Ampicilina Sulbactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ampicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Aztreonan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefazolina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Cefoperazona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Cefotaxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefoxitina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0509 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 2 286 4 400
Ceftazidima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cetriaxona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 3 429 5 500 0772 Cefalotina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ciprofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772
51
resistente 3 429 5 500
Claritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Clindamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Eritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Gentamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0942 resistente 2 286 3 300
sensiacutevel 1 143 2 200
Imipenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 0 00 2 200 0193 Resistente 1 143 3 300
sensiacutevel 2 286 0 00
Nitrofurantoiacutena sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Norfloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Oxacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Penicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Piperacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Rifampicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tetraciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Ticarcilina Aacutecido Clavulocircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0688 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 3 429 4 400
Tobramicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Trimetoprima Sulfametoxazol
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0112 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 2 286 0 00
Vancomicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tigeciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediario 0 00 1 100 0211 natildeo testado 1 143 4 400
resistente 2 286 0 00
52
Cefepime sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefuroxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Levofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Piperacilina Tazobactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Ertapenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Meropenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0223 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 1 143 0 00
Cefotetan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 sensiacutevel 0 00 1 100
Gemifloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 7 700 0585 natildeo testado 3 429 3 300
Desfecho
Alta Oacutebito
Meacutedia Erro
padratildeo Meacutedia Erro
padratildeo p
Idade 58 9 59 5 0991
Tempo Internaccedilatildeo (dias)
50 13 46 12 0571
n= 17 p(lt 005) NA natildeo se aplica
53
6 DISCUSSAtildeO
Nos uacuteltimos anos houve um aumento na incidecircncia de bacteacuterias
multirresistentes aos antimicrobianos no ambiente hospitalar tornando isto um
problema mundial de sauacutede puacuteblica (HULSCHER et al 2010) Quando se trata
principalmente de bacilos Gram negativos a frequumlecircncia destas bacteacuterias eacute ainda
maior em paiacuteses da Ameacuterica Latina quando comparada a paiacuteses desenvolvidos
(GALES etal 2012)
De acordo com dados do ldquoMeropenem Yearly Susceptibility Test Information
Collectionrdquo (MYSTIC) ocorreu nos Estados Unidos um aumento na susceptibilidade
de K pneumoniae nos uacuteltimos anos graccedilas a praacuteticas de controle de disseminaccedilatildeo
de amostras resistentes(RHOMBERG P R et al 2009) O aumento crescente da
prevalecircncia destes microrganismos foi proporcional ao aumento da dependecircncia do
uso de antibioacuteticos carbapenecircmicos considerados como a opccedilatildeo terapecircutica para o
tratamento de infecccedilotildees por bacilos Gram negativos multi-resistentes (LIVERMORE
2012) Isto afeta diretamente as opccedilotildees de tratamento sobrando poucas alternativas
para a terapecircutica que incluem colistina (polimixina E) e tigeciclina que apresentam
respectivamente problemas em termos de toxicidade e eficaacutecia (LIVERMORE et
al 2011) Um dos efeitos adversos mais importantes das poliminas B e E por
exemplo satildeo a neurotoxicidade e nefrotoxicidade (MENDES C A C et al2009 )
Devido agrave resistecircncia ser usualmente de natureza plasmidial e portanto de
maior disseminaccedilatildeo especialmente quando carreadas por K pneumoniae
microrganismo com uma notoacuteria capacidade para acumular e transferir plasmiacutedeos
com determinantes para resistecircncia o nuacutemero de casos detectados pelo
fenoacutetipogenoacutetipo blaKPC eacute bastante preocupante (MONTEIRO et al 2009)
Comparada com outras bacteacuterias hospitalares a transmissatildeo de clones
multirresistentes de K pneumoniae eacute maior e podem natildeo ser controladas pelos
meacutetodos de controle de infecccedilatildeo hospitalar (PAAUW et al 2007) A forma
plasmidial para transferecircncia da resistecircncia adicionada a este grande potencial para
disseminaccedilatildeo de clones resistentes eacute preocupante visto que apoacutes surtos muitas
vezes pode se tornar endecircmica Jaacute eacute uma realidade a disseminaccedilatildeo desta bacteacuteria
54
entre pacientes hospitais paiacuteses e ateacute mesmo continentes (WOODFORF et al
2010 ROGERS et al 2011)
As chances de surtos satildeo maiores em paiacuteses com poucos recursos devido agrave
maior carecircncia de praacuteticas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees hospitalares e o
uso irracional de antimicrobianos de forma empiacuterica e inadequada (KUMARASAMY
et al 2010) Ateacute o momento os mecanismos de resistecircncia aos cabapenecircmicos
geralmente encontrado eram a produccedilatildeo de ESBL (CTX-M) somada aacute perda de
porina (CARVALHAES et al 2010) Foi notado a partir do ano de 2008 um
aumento no nuacutemero de K pneumoniae produtoras de KPC-2 apresentando outra
forma de resistecircncia (GALES 2012)
Um estudo mostrou que o perfil do paciente colonizado ou infectado por KPC
foi de um paciente entre os 33 e os 82 anos de idade internado haacute mais de 1
semana no hospital A mortalidade geral nos uacuteltimos anos ficou em torno de 7
sendo que dos 77 pacientes estudados 32 (415) pacientes evoluiacuteram para oacutebito
evidenciando a alta morbi-mortalidade associada (ALVES A P et al 2013)
Em estudo com 2316 pacientes avaliados a populaccedilatildeo de sexo masculino foi
de 526 idade meacutedia global de 53 anos (mediana de 55 anos) permanecircncia meacutedia
de 58 dias (mediana de 3 dias) (OLIVEIRA A C et al 2010) Outros trabalhos
apresentaram ausecircncia de significacircncia entre sexoidade e o desenvolvimento de
infecccedilotildees por microrganismos resistentes (PERES-BOTA D et al 2003 COLPAN
A et al 2005 COELLO R et al 1997)
Outro estudo utilizou um total de 30 amostras sendo elas isoladas de urina
escarro secreccedilatildeo pleural ponta de cateter aspirado traqueal e hemocultura A mais
prevalente foi em urina (40) Entre as 30 cepas analisadas a maior porcentagem
foi da cepa Klebsiella pneumoniae (70) Enterobacter sp (133) Klebsiella
ozaenae (10) Escherichia coli (333) e Klebsiella oxytoca (333)
(DIENSTMANN R et al 2010) Nos Estados Unidos a enzima KPC jaacute se tornou
endecircmica Foi realizada uma pesquisa em dois hospitais de Nova York onde
testaram 602 amostras e 45 apresentaram algum mecanismo de resistecircncia
sendo apenas 33 confirmadas por biologia molecular como KPC-2 (BRATU et
al 2005)
55
Estudo sobre os tipos de ESBL feito no Japatildeo apresentou o tipo Toho-1 como
o mais prevalente nessa pesquisa Ateacute o ano de 2000 ano em que foi publicado tal
estudo este era o primeiro relatoacuterio no Japatildeo para identificar derivados de ESBLs
como tipo de SHV e TEM entre E coli e K pneumoniae Em especial o tipo SHV- 12
foi identificado com uma maior frequumlecircncia Estes resultados indicam que tipos
distintos de ESBLs que satildeo diferentes em sua especificidade de substrato e origem
geneacutetica coexistem no Japatildeo Isto mostra a importacircncia de caracterizar genoacutetipos
distintos de ESBLs e de estar em alerta continuamente para as tendecircncias de
ESBLs no Japatildeo aleacutem da necessidade de uma interpretaccedilatildeo uniforme utilizando as
diretrizes do CSLI para relatar cepas produtoras de ESBL Aleacutem da detecccedilatildeo de
ESBLs satildeo necessaacuterias mais informaccedilotildees tais como o perfil de sensibilidade
especiacutefica para diversas β-lactacircmicos e o local da infecccedilatildeo Esses fatores satildeo
essenciais para a escolha adequada de antibioacuteticos (YAGI T et al 2000)
No ano de 2004 uma pesquisa avaliou a produccedilatildeo de uma enzima de
hidroacutelise de carbapenecircmicos atraveacutes da teacutecnica de sequumlenciamento foi revelado
um novo membro da famiacutelia KPC designado KPC- 3 Pesquisadores encontraram
em um mutante de K pneumoniae uma substituiccedilatildeo de um gene associado com
resistecircncia a Imipenem mas essa substituiccedilatildeo foi considerada improvaacutevel na
contribuiccedilatildeo da resistecircncia aos carbapenecircmicos da espeacutecie estudada Aleacutem da
resistecircncia aos carbapenecircmicos estes isolados eram em sua maioria resistentes agraves
cefalosporinas penicilinas e aminoglicosiacutedeos Usando estudos de transformaccedilatildeo
conjugaccedilatildeo e hibridaccedilatildeo localizaram o alelo blaKPC em plasmiacutedeo aleacutem disso
mostraram que esse alelo tambeacutem carregava uma resistecircncia aos aminoglicosiacutedeos
A transferecircncia das enzimas KPCs foi demonstrada in vitro tanto neste como em
outros estudos pode ser que os plasmiacutedeos que fazem esta transferecircncia estavam
comeccedilando a se espalhar no ambiente cliacutenico resultando na multiresistecircncia dessas
estirpes (WOODFORD et al 2004)
O presente estudo apresentou um vieacutes quanto aos resultados dos testes de
susceptibilidade microbiana Observou-se que natildeo foi encontrado resultado deste
teste em algumas amostras o que natildeo cooperou para um estudo mais preciso
futuros estudos quanto agraves amostras e um melhor acompanhamento deste tipo de
patologia Poreacutem mesmo sem algumas amostras com este resultado disponiacutevel foi
56
confirmada a presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos
carbapenecircmicos por meio dos genes de resistecircncia blaKPC e 16S rRNA que as
amostras apresentaram em sua maioria serem portadoras Quanto aos resultados
estatiacutesticos nenhuma das variaacuteveis apresentou significacircncia estatiacutestica (p gt 005)
mostrando assim que estas variaacuteveis isoladas natildeo foram o fator determinante para
o desfecho cliacutenico de alta ou oacutebito
57
7 CONCLUSAtildeO
Os genes blaKPC e 16S rRNA foram caracterizados confirmando a a
presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos carbapenecircmicos
Houve uma maior prevalecircncia da cepa K pneumoniae e isto confirma outros
estudos que apresentam a maior prevalecircncia desta cepa em amostras com KPC
Aleacutem disso isso justifica a forma popular da K pneumoniae ser chamada de KPC
enquanto que na verdade KPC eacute uma enzima podendo estar presente em outras
cepas como Enterobacter clocae tambeacutem apresentada no presente estudo O
desfecho cliacutenico de oacutebitos maior que 50 eacute um possiacutevel indicador sobre a
necessidade de se realizar um teste raacutepido para identificaccedilatildeo de KPC visando
iniciar o mais raacutepido possiacutevel o tratamento afim de diminuir a mortalidade por esta
infecccedilatildeo
Nenhuma das variaacuteveis isoladamente estaacute relacionada ao desfecho cliacutenico
oacutebito ou alta pois natildeo apresentaram relevacircncia estatiacutestica O presente estudo
mostrou que haacute presenccedila da bacteacuteria nas amostras de pacientes do hospital
estudado podendo entatildeo afirmar que este tipo de bacteacuteria se encontra tambeacutem
presente em ambiente hospitalar O uso irracional de antimicrobiano eacute demonstrado
de forma indireta quando foi apresentado atraveacutes do Teste de Hodge Modificado
uma resistecircncia de 100 aos antibioacuteticos carbapenecircmicos Isto tambeacutem reflete na
terapecircutica sendo que pacientes portadores de bacteacuterias resistentes aos
antibioacuteticos carabepecircmicos tem uma escassa opccedilatildeo de tratamento e as opccedilotildees
apresentam problemas quanto agrave toxicidade e eficaacutecia
58
REFEREcircNCIAS
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Mecanismos
de resistecircncia bacteriana aos antimicrobianos Disponiacutevel em
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controleopas_
webmodulo3mec_sitiohtmgt Acesso em 25 de abril de 2014
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Nota teacutecnica nordm
012013 medidas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees por enterobacteacuterias
multiresistentes Acesso em 17 de abril de 2013
ALBA J et al Kinetics study of KPC-3 a plasmid-encoded class A
carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase Antimicrob Agents Chemother
Nov49(11)4760-2 2005
ALVES A P et al Nosocomial infections by KPC-producing enterobacteria in
a tertiary hospital in Southern Brazil Revista da AMRIGS Porto Alegre 57 (3) 213-
218 jul-set 2013
ALVES A et al Tipagem Geneacutetica de Microrganismos Lab De Diversidade
Microbiana Centro de Biologia Celular Dep de Biologia U de Aveiro 3810-193
Aveiro- 2003
BELL J M et Al Prevalence and significance of a negative extended-
spectrum beta-lactamase (ESBL) confirmation test result after a positive ESBL
screening test result for isolates of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae
results from the SENTRY Asia-Pacific Surveillance Program J Clin Microbiol
May45(5)1478-82 2007
BRATU S et al Detection of KPC carbapenem-hydrolyzing enzymes in
Enterobacter spp from Brooklyn New York Antimicrob Agents Chemother v 49 n
2 p 776-8 2005
59
BRATU S et al Emergence of KPC-possessing Klebsiella pneumoniae in
Brooklyn New York epidemiology and recommendations for detection Antimicrob
Agents Chemother v 49 n 7 p 3018-20 2005
BRATU S et al Rapid spread of carbapenem-resistant Klebsiella
pneumoniae in New York City Arch Intern Med v 165 p 1430-5 2005
CAMARGO C F et al Aplicaccedilatildeo das teacutecnicas de pcr e suas teacutecnicas
derivadas em diagnoacutestico molecular Disponiacutevel em
ltfileDUnB10C2BA20semestreArtigosPCR-
20CLEYTON20FLORENCIO20DE20CAMARGO20E20PAULO20ROB
ERTO20QUEIROZpdfgtgt Acesso em 08 de abril de 2014
CARVALHES C G et al Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting
carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive
results Journal of Antimicrobial Chemotherapy v 65 n2 p 249-251 2010
CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION- CDC Modified
Hodge Test for Carbapenemase Detection in Enterobacteriaceae 2004
CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE Methods for
dilutionantimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically Approved
standard M7ndashA7 7th ed CLSI Wayne PA 2011
COELLO R et al Risk factors for developing clinical infection with methicillin-
resistant Staphylococcus aureus (MRSA) amongst hospital patients initially only
colonized with MRSA J Hosp Infect 19973739-46
COLPAN A et al Evaluation of risk factors for mortality in intensive care
units A prospective study from a referral hospital in Turkey Am J Infect Control
200533(1)42-7
60
CORNAGLIA G et al Living with ESBLs Introduction Clinical Microbiology
and Infection 14 Suppl 1 1-2 2008
COTRIM E R et al Klebsiella pneumoniae carbapenemase ndash KPC em
Enterobacteriaceae o desafio das bacteacuterias multirresistentes Poacutes em revista do
centro universitaacuterio Newton Paiva 12012 - ediccedilatildeo 5 - issn 2176 7785
DESHPANDE L M et al Occurrence and characterization of
carbapenemase-producing Enterobacteacuteriaceae report from the SENTRY
Antimicrobial Surveillance Program (2000-2004) Microb Drug Resist 12(4)223-30
2006
DIAS D J A Estudos dos principais mecanismos de resistecircncia aos
antibioacuteticos β-lactacircmicos em bacteacuterias patogecircnicas gram negativas 2009 100 f
Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Geneacutetica Molecular e Biomedicina) ndash Faculdade de
Ciecircncias e Tecnologia Universidade de Nova Lisboa Lisboa
DIENSTMANN R et al Avaliaccedilatildeo fenotiacutepica da enzima Klebsiella
pneumoniae carbapenemase (KPC) em Enterobacteriaceae de ambiente hospitalar
J Bras Patol Med Lab v 46 n 1 p 23-27 fevereiro 2010
ENDIMIAMI A et al Emergence of blaKPC-containing Klebsiella
pneumoniae in a long-term acute care hospital a new challenge to our healthcare J
Antimicrob Chemother 64 1102-1110 Nov 2009
FALAGAS M E et al Extended-spectrum beta-lactamase producing
organisms The Journal of Hospital Infection 73 (4) pp 345-54 2009
FONTANA C et al Emergence of KPC-producing Klebsiella pneumoniae in
Italy BMC Rev Notes 3 40 2010
61
GALES A C et al Antimicrobial resistance among Gram-negative bacilli
isolated from Latin America results from Sentry Antimicrobial Surveillance Program
(Latin America 2008-2010) Diagnostic Microbiology and Infectious Disease v 3 n
4 p 354 -360 2012
GUPTA N et al Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Epidemiology
and Prevention HEALTHCARE EPIDEMIOLOGY Clinical Infectious Diseases
201153(1)60ndash67 Published by Oxford University Press on behalf of the Infectious
Diseases Society of America 2011
HARBOTTLE H et al Genetics of antimicrobial resistance Anim Biotechnol
n17 p111-124 2006
HENRIQUE W N et al RESISTEcircNCIA BACTERIANA Uniatildeo das
Faculdades Alfredo NasserInstituto de Ciecircncias da Sauacutede Disponiacutevel em lt
httpwwwfaculdadealfredonasseredubrfilespesquisaposter20HENRIQUE20
Wilker20Natividade20SANTIAGO20Silvania20CAVALCANTI20DSP
20ResistC3AAncia20Bacterianapdfgt Acesso em 17 marccedilo 2014
HULSCHER M E J I et al Antibiotic prescribing in hospital a social and
behavioral scientific approach The Lancet Infectious Diaseases v 10 n 3 p 167-
165 2010
KIDWAI M SAPRA P BHUSHAN KR Synthetic strategies and medicinal
properties of beta-lactams Curr Med Chem 1999 695-215
KUMARASAMY K K et al Emergence of a new antibiotic resistance
mechanism in India Pakistan and the UK a molecular biological and
epidemiological stuy The Lancet Infectious Diseases v10 n 9 p 597- 602 2010
LINCOPAN N et al Enterobacteacuteria producing extended-spectrum β-
lacatamases and IMP-1 Metalo-β-lactamases isolated from Brazilian hospitals J Med
62
Microbiol 7 1-3 2006
LINCOPAN N et al First Isolation of Metalo-β-Lacatamase-Producing
Multiresistant Klebsiella pneumoniae from a patient in Brazil J Clin Microbiol 43(1)
516-519 2005
LIVERMORE D M et al What remains against carbapenem- resistant
Enterobacteriaceae Evaluation of choramphenicol ciprofloxacin colistina
fosfomycin minocycline nitrofurantoin temocilin and tigecycline International
Journal of Antimicrobial Agents v 37 n 5 p 415- 459 2011
LIVERMORE D M Fourten years in resistance International Journal of
Antimicrobial Agents v 39 283- 294 2012
LIVERMORE D M Bacterial resistance to carbapenems Adv Exp Med Biol
1995 39025-47
LIVERMORE D M Bacterial resistance origins epidemiology and impact
Clin Infect Dis 36S11-S23 2003
LIVERMORE D M et al Carbapenemases a problem in waiting Curr
Opin Microbiol 2000 3489-95
LU et al Universal pcr for common bacterial pathogens J CLIN
MICROBIOL VOL 38 2000
LU et al Use of PCR with Universal Primers and Restriction Endonuclease
Digestions for Detection and Identification of Common Bacterial Pathogens in
Cerebrospinal Fluid Journal of Clinical Microbiology June 2000 p 2076ndash2080
MARSCHALL J Met al Presence of the KPC Carbapenemase Gene in
Enterobacteriaceae Causing Bacteremia and Its Correlation with In Vitro
Carbapenem Susceptibility J Clin Microbiol 47 239-241 Jan 2009
63
MARTINS WMBS et al Prevalecircncia do gene blaKPC em isolados cliacutenicos
de Enterobacteriaceae e natildeo fermentadores encontrados em amostras clinicas em
um hospital universitaacuterio do Recife X Jornada de ensino pesquisa e extensatildeo ndash
JEPEX 2010 ndash UFRPE Recife 18 a 22 de outubro
MENDES C A C et al Polimixinas Revisatildeo com ecircnfase na sua
nefrotoxicidade Rev Assoc Med Bras 2009 55(6) 752-9
MOHR J F 3rd Update on the efficacy and tolerability of meropenem in the
treatment of serious bacteacuterial infections Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S41-51
2008
MONTEIRO J et al First report of KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae
strains in Brazil Antimicrob Agents Chemother Jan53(1)333-4 2009
MOREIRA V C et al Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia a antibioacuteticos
Disponiacutevel em
lthttpwwwcpglsucgbr6mostraartigosSAUDEVANESSA20CARVALHO20M
OREIRApdfgt Acesso em 21 marccedilo 2014
NETIKUL T et al Emergence of novel blaKPC-12 and blaKPC-13 variants in
carbapenem non-susceptible Enterobacter cloacae a first report of blaKPC gene in
Thailand European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases May
S372 2011
NETO V A et al Antibioacuteticos na praacutetica Meacutedica 6ordf Ediccedilatildeo Editorial
SarverSP Brasil 2007
NICOLAU D P Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of
meropenem Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S32-40 2008
64
OLIVEIRA A C et al Resistecircncia bacteriana e mortalidade em um centro de
terapia intensiva Rev Latino-Am Enfermagem nov-dez 2010
PAAUW A et al Failure to control an outbreak of qnrA 1-positive multidrug-
resistant Enterobacter clocae despite adequate implementation of recommended
infection control measures Journal of Clinical Microbiology v 45 n 5 p 1420-1425
2007
PATERSON D L et al Extended-Spectrum Beta-Lactamases a Clinical
Update Clinical Microbiology Reviews v 18 p 657-686 2005
PEIRANO G et al Carbapenem-hydrolysing beta-lactamase KPC-2 in
Klebsiella pneumonia isolated in Rio de Janeiro Brazil J Antimicrob Chemother Nov
20 2009
PERES-BOTA D et al Are infections due to resistant pathogens associated
with worse outcome in critically ill patients J Infect 200347(4)307-16
PIDDOCK L J V Clinically relevant chromosomally encoded multidrug
resistance effl ux pumps in bacterial Clin Microbiol Rev n19 p382-402 2006
PITOUT J D D et al Emergence of Enterobacteriaceae producing
extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) in the community J Antimicrob
Chemother May 56 2005
POSSEBON M I et al Resistecircncia bacteriana aos carbapenecircmicos
Bacterial resitence to carbapenems RBM rev bras med60(6)378380-378-382
jun 2003
QUEENAN A M et al Carbapenemases the versatile beta-lactamases
Clin Microbiol Rev Jul20(3)440-58 2007
65
RHOMBERG P R et al Summary trends for the meropenem yearly
susceptibility test information collection program a 10- year experience in the United
States (1999-2008) Diagnostic Microbiology and Infectiois Disease v 65 n4 p
414-426 2009
ROBLEDO I E et al Detection of KPC in Acinetobacter spp in Puerto Rico
J Antimicrob Agents Chemother 54 1354-1357 Mar 2010
ROGERS B A et al Country-to-country transfer os patients and the risk of
multi-resistant bacterial infection Clinical Infectious Disease v53 n1 p49- 56
2011
SHAH A A et al Characteristics epidemiology and clinicalimportance of
emerging strains of Gram-negative bacilli producing extended-spectrum
betalactamases Research in Microbiology v 155 p 409-421 2004
TURNER P J Extended- Spectrum Beta-Lactamases Clinical Infectious
Diseases v 41 p 273-275 2005
WOLTER D J et al Phenotypic and Enzymatic Comparative Analysis
between the Novel KPC variant KPC-5 and Its Evolutionary Variants KPC-2 and
KPC-4 Antimicrob Agents Chemother Nov 17 2008
WOODFORD N et al Carbapenemases of Chryseobacterium
(Flavobacterium) meningosepticum distribution of blaB and characterization of a
novel Metalo-beta-lactamase gene blaB3 in the type strain NCTC 10016
Antimicrob Agents Chemother Jun44(6)1448-52 2000
WOODFORF N Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in
India Pakistan and the UK a molecular biological and epidemiological study The
Lancet Infectious Diseases v 10 n 9 p 597-602 2010
66
WOODFORD et al Outbreak of Klebsiella pneumoniae Producing a New
Carbapenem- Hydrolyzing Class A β-Lactamase KPC-3 in a New York Medical
Center Antimicrobial agents and chemotherapy Dec 2004 p 4793ndash4799 Vol 48
No 12
YAGI T et al A preliminary survey of extended-spectrum β-lactamases
(ESBLs) in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Japan
FEMS Microbiology Letters 184 (2000) 53-56
YIGIT H et al Novel carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase KPC-1 from
a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumonia J Antimicrob Agents
Chemother 45 (4) 1151-1161 (2001)
ZAVASCKI A P et al KPC-2- producing Enterobacter cloacae in two cities
from Southern Brazil Int J Antimicrob Agents Apr 28 2009
ZHANEL G G et al Comparative review of the carbapenecircmicos Drugs
67(7)1027-52 2007
67
ANEXOS
Sequumlecircncia do oligo blaKPC
Query 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
Query 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
Query 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
68
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
Query 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
Query 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
69
Query 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
Query 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
Query 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
70
Sbjct 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
Query 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
Query 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
Query 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
71
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
Query 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
Query 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
72
Query 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
Query 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
Query 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
73
Sbjct 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
Query 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
Query 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
Query 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
74
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
Query 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
Query 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
75
Query 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
Query 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
||||
Sbjct 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
LOCUS AF297554 1377 bp
DNA linear BCT 26-MAR-2001
DEFINITION Klebsiella pneumoniae carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
gene complete cds
ACCESSION AF297554
VERSION AF2975541 GI10121874
76
KEYWORDS
SOURCE Klebsiella pneumoniae
ORGANISM Klebsiella pneumoniae
Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Enterobacteriaceae Klebsiella
REFERENCE 1 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH QueenanAM
AndersonGJ Domenech-SanchezA
BiddleJW StewardCD
AlbertiS BushK and TenoverFC
TITLE Novel carbapenem-hydrolyzing beta-
lactamase KPC-1 from a
carbapenem-resistant strain of
Klebsiella pneumoniae
JOURNAL Antimicrob Agents Chemother 45 (4)
1151-1161 (2001)
PUBMED 11257029
REFERENCE 2 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH AndersonGJ and
TenoverFC
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (19-AUG-2000) Nosocomial
Pathogens Laboratory Branch
Centers for Disease Control and
Prevention 1600 Clifton Rd MS
G08 Atlanta GA 30333 USA
FEATURES LocationQualifiers
77
source 11377
organism=Klebsiella
pneumoniae
mol_type=genomic DNA
db_xref=taxon573
-35_signal 5560
-10_signal 7883
mRNA 921012
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
RBS 117122
CDS 1311012
note=blaKPC-1
codon_start=1
transl_table=11
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
protein_id=AAG134101
db_xref=GI10121875
translation=MSLYRRLVLLSCLSWPLAGFSATALTNLVAEPFAKLEQD
FGGSI
GVYAMDTGSGATVSYRAEERFPLCSSFKGFLAAAVLARSQQQAGLLDTPIRYG
KNALV
PWSPISEKYLTTGMTVAELSAAAVQYSDNAAANLLLKELGGPAGLTAFMRSIG
DTTFR
78
LDRWELELNSAIPSDARDTSSPRAVTESLQKLTLGSALAAPQRQQFVDWLKGN
TTGNH
RIRAAVPADWAVGDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTRAPNKDDK
HSEAV
IAAAARLALEGLGVNGQ
ORIGIN
1 cggggcagtt acagccgtta cagcctctgg
agagggagcg gcttgccgct cggtgataat
61 cccagctgta gcggcctgat tacatccggc
cgctacacct agctccacct tcaaacaagg
121 aatatcgttg atgtcactgt atcgccgtct
agttctgctg tcttgtctct catggccgct
181 ggctggcttt tctgccaccg cgctgaccaa
cctcgtcgcg gaaccattcg ctaaactcga
241 acaggacttt ggcggctcca tcggtgtgta
cgcgatggat accggctcag gcgcaactgt
301 aagttaccgc gctgaggagc gcttcccact
gtgcagctca ttcaagggct ttcttgctgc
361 cgctgtgctg gctcgcagcc agcagcaggc
cggcttgctg gacacaccca tccgttacgg
421 caaaaatgcg ctggttccgt ggtcacccat
ctcggaaaaa tatctgacaa caggcatgac
481 ggtggcggag ctgtccgcgg ccgccgtgca
atacagtgat aacgccgccg ccaatttgtt
541 gctgaaggag ttgggcggcc cggccgggct
gacggccttc atgcgctcta tcggcgatac
79
601 cacgttccgt ctggaccgct gggagctgga
gctgaactcc gccatcccaa gcgatgcgcg
661 cgatacctca tcgccgcgcg ccgtgacgga
aagcttacaa aaactgacac tgggctctgc
721 actggctgcg ccgcagcggc agcagtttgt
tgattggcta aagggaaaca cgaccggcaa
781 ccaccgcatc cgcgcggcgg tgccggcaga
ctgggcagtc ggagacaaaa ccggaacctg
841 cggagtgtat ggcacggcaa atgactatgc
cgtcgtctgg cccactgggc gcgcacctat
901 tgtgttggcc gtctacaccc gggcgcctaa
caaggatgac aagcacagcg aggccgtcat
961 cgccgctgcg gctagactcg cgctcgaggg
attgggcgtc aacgggcagt aaggctctga
1021 aaatcatcta ttggcccacc accgccgccc
ttgcgggcgg catggattac caaccactgt
1081 cacatttagg ctaggagtct gcgcggcaga
gccgtgtgac cggttttctg tagagcactg
1141 acgatggcgg cggcgctctc tgcaattggc
aaggcgtcgg cgccaaggat accaatcttg
1201 cggcgcgcgg cgtgttatga cgactggggt
gcatttgagc cgccccattt aaccttcgcc
1261 ctcacagata cgccattcgc ctcaaattta
gcgccatgca gacgagcttc cactcggctt
1321 gcaccttgtc caggcccctc atgctgaact
gacgcaatcc catcaccgcc ttgatca
80
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Accedilatildeo do szlig-lactacircmico sobre a bacteacuteria gram-positiva e gram-negativa
Figura 2 Divulgaccedilatildeo internacional de Klebsiella pneumoniae Carbapenemase
(KPC) produtoras de Enterobacteriaceae
Figura 3 Mecanismos de resistecircncia bacteriana
Figura 4 Etapas da Reaccedilatildeo de PCR
Figura 5 Mecanismo de semeamento de material bioloacutegico oriundos de pacientes
com suspeita de infecccedilatildeo por KPC
Figura 6 Interpretaccedilatildeo resultado do Teste de Hodge Modificado
Figura 7 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC das amostras dos
17 pacientes estudados
Figura 8 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC da mostra A3
estudada
Figura 9 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA das amostras
dos 17 pacientes estudados
Figura 10 Gel de agarose a 2 da digestatildeo do amplicon do gene 16S rRNA das
amostras com a enzima HaeIII evidenciando diversos fragmentos proacuteximos a 200
pb
Figura 11 Infecccedilatildeo por KPC segundo sexo dos 17 pacientes investigados no
HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
Figura 12Isolado de KPC segundo desfecho cliacutenico dos 17 pacientes investigados
no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
Figura 13 Isolados de KPC segundo local da coleta da amostra nos 17 pacientes
investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
Figura 14Isolado de KPC segundo microrganismo encontrado em 17 pacientes
investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Criteacuterios Interpretativos para testes de sensibilidade
Tabela 2 Nuacutemero de acesso ao GenBank dos alelos blaKPC e seus microrganismos
originais
Tabela 3 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do gene blaKPC
Tabela 4 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do gene
universal
Tabela 5 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da digestatildeo do gene universal
Tabela 6 - Distribuiccedilatildeo das variaacuteveis estudadas perfil geneacutetico sexo coleta
tipificaccedilatildeo de microrganismos e anaacutelise da resistecircncia bacteriana segundo o
desfecho cliacutenico Brasiacutelia-DF 2010 a 2012
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AmpC- Adenosina Monofosfato Ciacuteclico
BRMD- Bacteacuterias multirresistentes
CCIH- Comissatildeo de Controle de Infecccedilatildeo Hospitalar
CDC- Centers for Disease Control and Prevention
CIM- Concentraccedilatildeo Inibitoacuteria Miacutenima
CLSI- Clinical and Laboratory Standards Institute
DNA- Aacutecido Desoxirribonucleacuteico
E coli- Escherichia coli
ERIC-PCR - Enterobacterial Repet it ive Intergenic Consensus
ESBL- Beta-Lactamases de Espectro Estendido
Et al- e outros
ETP- Ertapenem
HRAN- Hospital Regional da Asa Norte
K ornithinolytica- Klebsiella ornithinolytica
K oxytoca- Klebsiella oxytoca
K planticola- Klebsiella planticola
K pneumoniae- Klebsiella pneumoniae
K terrigena- Klebsiella terrigena
KPC - Klebsiella pneumoniae produtora de Carbapenemase
KPCNEG- Bacilos Gram-Negativos Natildeo Fermentadores
KPCPOS- Bacilos Gram-Positivo Natildeo Fermentadores
MBL- metalo-beta-lactamases
MEM- Meropenem
NA- Natildeo se aplica
Oligo- Oligonucleotiacutedeos
PB- Pares de Bases
PBPs (Penicilim-Binding-Protein)- Proteiacutenas de ligaccedilatildeo agrave penicilina
PCR- Polymerase Chain Reaction (Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase)
PFGE - Pulsed-Field Gel Electrophoresis (Eletroforese em campo pulsado)
RAPD- Randomly Amplified Polymorphic DNA (DNA polimoacuterfico amplificado
aleatoriamente)
RFLPrsquos - ldquoRestriction Fragment Length Polymorphismsrdquo( polimorfismos de tamanho
de fragmentos de restriccedilatildeo)
THM- Teste de Hodge Modificado
TSA- Teste de Susceptibilidade aos Antibioacuteticos
UTI- Unidade de Terapia Intensiva
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 15
11 Klebsiella pneumoniae produtora de Carbapenemase (KPC) 15
1 2 Resistecircncia bacteriana 20
13 Anaacutelise geneacutetica de microrganismos 27
2 JUSTIFICATIVA 30
3 OBJETIVOS 31
31 Objetivo geral 31
32 Objetivos Especiacuteficos 31
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS 32
4 1 Coleta e transporte das amostras bioloacutegicas 32
4 2 Procedimentos para confirmaccedilatildeo de resistecircncia bacteriana por disco de
Ertapenem (adaptado CDC 2004) 32
4 2 1 Interpretaccedilatildeo dos Resultados 33
4 3 Teste de susceptibilidade aos antibioacuteticos 34
4 4Teste de Hodge Modificado (THM) (adaptado CDC 2004) 35
441 Controle de qualidade (CQ) 35
442 InterpretaccedilatildeoResultados 35
4 5 Extraccedilatildeo de DNA bacteriano 37
4 6 Iniciadores e reaccedilatildeo de PCR 38
4 7 Digestatildeo 41
4 8 Eletroforese em gel de agarose 41
4 9 Descarte de resiacuteduos 42
4 10 Aspectos epidemioloacutegicos e cliacutenicos 42
4 12 Anaacutelises estatiacutesticas 42
4 13 Preceitos eacuteticos 43
5 RESULTADOS 44
51 Anaacutelise molecular 44
5 1 1 Gene blaKPC 44
5 1 2 Gene 16S rRNA 45
5 2 Anaacutelises epidemioloacutegicas 46
5 2 1 Sexo 46
5 2 2 Desfecho cliacutenico 47
5 2 3 Local da coleta 48
5 2 4 Microrganismo 48
6 DISCUSSAtildeO 53
7 CONCLUSAtildeO 57
15
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC)
Klebsiella pneumoniae pertence aacute famiacutelia Enterobacteriaceae
encontrado em locais como aacutegua solo plantas e esgoto Satildeo encontradas cinco
espeacutecies K pneumoniae K oxytoca K planticola K terrigena e K ornithinolytica
O gecircnero Klebsiella eacute definido como contendo bacilos Gram-negativos natildeo moacuteveis
em forma de bastatildeo e geralmente encapsuladas que produzem lisina
descarboxilase mas natildeo produzem ornitina descarboxilase Provavelmente a
colonizaccedilatildeo em seres humanos ocorre por contato com as diferentes fontes
ambientais podendo ser encontrada colonizando a orofaringe e fezes de pessoas
sadias Pessoas imunocomprometidas a bacteacuteria encontra um ambiente favoraacutevel
para seu crescimento levando aos quadros de infecccedilatildeo (MOREIRA et al 2014)
A Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) eacute uma enzima produzida por
enterobacteacuterias gram-negativas sendo um mecanismo de resistecircncia aos antimi-
crobianos carbapenecircmicos meropenen ertapenen eou imipenen classe
amplamente utilizada no tratamento de infecccedilotildees envolvendo Enterobacteriaceae
Ela tambeacutem eacute capaz de inativar os agentes β-lactacircmicos cefalosporinas penicilinas
e o aztreonam (COTRIM et al 2012)
Devido agrave semelhanccedila estrutural e estereoquiacutemica os antibioacuteticos beta-
lactacircmicos possuem um mecanismo de accedilatildeo comum ao grupo Eles atuam inibindo
a siacutentese da parede celular bacteriana atraveacutes do mecanismo de bloqueio da
transpeptidaccedilatildeo responsaacutevel pela uniatildeo dos componentes individuais do
peptidoglicano conforme demonstrado na figura 1 (KIDWAI et al 1999)
A accedilatildeo destes antibioacuteticos eacute atraveacutes de ligaccedilotildees covalentes com as proteiacutenas
as Penicilim-Binding-Protein (proteiacutena de ligaccedilatildeo da penicilina- PBP ou PLP) que se
encontram presentes na membrana citoplasmaacutetica de todas as bacteacuterias Devido agraves
mutaccedilotildees ocorre uma induccedilatildeo na alteraccedilatildeo dessas proteiacutenas podendo determinar
uma diminuiccedilatildeo da afinidade dos beta-lactacircmicos agraves mesmas A accedilatildeo dos
carbapenecircmicos eacute atraveacutes da sua ligaccedilatildeo agraves PBPs presentes na parede bacteriana
especialmente as PBP1 e PBP2 provocando a lise osmoacutetica da bacteacuteria Aleacutem
disso eles tecircm uma facilidade na penetraccedilatildeo da bacteacuteria por meio dos canais
poriacutenicos presentes nas bacteacuterias gram-negativas induzindo um efeito poacutes-
16
antibioacutetico Quando comparados com outros beta-lactacircmicos os carbapenecircmicos
satildeo mais resistentes agrave hidroacutelise pela maioria das beta-lactamases tanto
cromossocircmicas como plasmiacutedicas (LIVERMORE 1995 LIVERMORE et al 2000)
Figura 1 Accedilatildeo do szlig-lactacircmico sobre a bacteacuteria gram-positiva e gram-
negativa Fonte
ltlthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controle
opas_webmodulo3gramn_lacta2htmgt (adaptado)
A bacteacuteria Klebsiella pneumoniae quando apresenta gene ESBL pode
expressar resistecircncia a ateacute 95 dos antimicrobianos existentes no acircmbito
farmacecircutico sendo a produccedilatildeo de beta-lactamases de espectro estendido (ESBL)
17
por esta bacteacuteria uma das principais causas de falha terapecircutica Existem outras
formas de resistecircncia emergentes de grande importacircncia como a produccedilatildeo de
beta-lactamases tipo adenosina monofosfato ciacuteclico (AmpC) que hidrolizam
cefoxitina as carbapenemases como as metalo-beta-lactamases (MBL) e
carbapenemases tipo KPC (MOREIRA et al 2014)
O mecanismo de resistecircncia mais comum aos antibioacuteticos beta-lactacircmicos de
amplo espectro eacute a produccedilatildeo de ESBL por enterobacteacuterias A accedilatildeo hidroliacutetica
apresentadas por estas enzimas pode conferir clinicamente resistecircncia ao
aztreonam cefalosporina e a todas as penicilinas (PATERSON et al 2005) As
ESBL satildeo enzimas mediadas por genes plasmidiais (transmissiacuteveis entre as
espeacutecies) Os principais microrganismos produtores de ESBL satildeo Klebsiella
pneumoniae (mais encontrada) Escherichia coli e Proteus mirabilis podendo ocorrer
em outros membros da famiacutelia Enterobacteriaceae e em alguns microrganismos natildeo
enteacutericos como Acinetobacter ssp (TURNER 2005) A importacircncia cliacutenica meacutedica
destes microrganismos portadores de ESBL eacute que graccedilas aacutes suas resistecircncias a
muitas classes de antimicrobianos o tratamento de infecccedilotildees eacute difiacutecil gerando um
aumento da morbidade e mortalidade dos pacientes (SHAH et al 2004)
A enzima KPC foi detectada pela primeira vez na Carolina do Norte Costa
Leste dos Estados Unidos no ano de 1996 em Klebsiella pneumoniae dando entatildeo
este nome a enzima Em pouco tempo ela disseminou por outras regiotildees e
recentemente tornou-se uma das preocupaccedilotildees quanto agrave sauacutede puacuteblica mundial
Os paiacuteses de onde KPCs tecircm sido relatados desde 2001 satildeo mostrados na figura 2
apresentando como os organismos tecircm agora sido disseminados amplamente pelo
mundo (NEIL GUPTA et al 2011)
18
Figura 2 Divulgaccedilatildeo internacional de Enterobacteriaceae produtora de
Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC)( NEIL GUPTA et al 2011)
Este mapa apresenta paiacuteses onde Enterobacteriaceae produtoras KPC de
foram descritos em relatoacuterios publicados disponiacuteveis a partir de 11 fevereiro de
2011 Os paiacuteses natildeo destacadas nesta figura tambeacutem podem apresentar a presenccedila
de Enterobacteriaceae produtoras de KPC poreacutem pode ter tido uma falta de
vigilacircncia sistemaacutetica para estes organismos ( NEIL GUPTA et al 2011)
No ano de 2005 foram registradas pela primeira vez essas bacteacuterias
produtoras de carbapenemases Apoacutes 6 anos deste primeiro relato elas passaram a
causar surtos mais graves em nosso paiacutes Em janeiro de 2011 foram notificados no
Distrito FederalBrasil 367 casos em um curto espaccedilo de tempo (01 a 08 de janeiro
de 2011) com 26 oacutebitos A maior parte destes casos (263 casos) foi identificada nas
unidades de terapia intensiva ndash UTI (COTRIM et al 2012)
O potencial de disseminaccedilatildeo da KPC eacute alto devido agrave grande capacidade de
transferecircncia do seu material geneacutetico e por conseguinte os genes de resistecircncia
O controle de epidemias eacute difiacutecil devido a esta caracteriacutestica de faacutecil disseminaccedilatildeo
preocupando os profissionais da aacuterea de sauacutede devido agrave dificuldade de tratamento
podendo resultar em um aumento das taxas de mortalidade Apesar da maior
19
frequumlecircncia em Klebsiella pneumoniae a KPC pode ser identificada em outras
bacteacuterias como a Enterobacter cloacae Citrobacter freundii Salmonella spp E coli
e Pseudomonas spp (DIENSTMANN et al 2010)
Os pacientes com comorbidades incluindo pacientes transplantados
neutropecircnicos em ventilaccedilatildeo mecacircnica em Unidade de Terapia Intensiva (UTI)
com longos periacuteodos de internaccedilatildeo que apresentam risco aumentado de infecccedilatildeo ou
colonizaccedilatildeo para bacteacuterias multirresistentes satildeo mais vulneraacuteveis a Klebsiella
pneumoniae produtora de KPC (COTRIM et al 2012)
Os sinais e sintomas apresentados por um indiviacuteduo infectado por KPC satildeo
febre ou hipotermia taquicardia piora do quadro respiratoacuterio e em casos mais
graves hipotensatildeo inchaccedilo e sepse Quanto ao siacutetio de infecccedilatildeo a bacteacuteria que
possui a enzima KPC pode causar pneumonia associada agrave ventilaccedilatildeo mecacircnica
infecccedilatildeo do trato urinaacuterio infecccedilatildeo de corrente sanguiacutenea infecccedilatildeo de partes moles
e outros tipos de infecccedilatildeo (COTRIM et al 2012)
Para desenvolver a infecccedilatildeo a colonizaccedilatildeo eacute um preacute-requisito poreacutem o
pacientes pode estar colonizado ou seja ser portadores de KPC e natildeo desenvolver
a infecccedilatildeo (ALVES et al 2013) A forma de transmissatildeo eacute basicamente por
contato com secreccedilatildeo ou excreccedilatildeo de pacientes infectados ou colonizados logo
fora do ambiente hospitalar a bacteacuteria natildeo representa perigo (COTRIM et al
2012)
As opccedilotildees terapecircuticas para o tratamento da Klebsiella pneumoniae eacute
dividida em Terapia Empiacuterica e Terapia apoacutes a determinaccedilatildeo do perfil de
sensibilidade A terapia empiacuterica para infecccedilotildees por enterobacteacuterias multirresistentes
se baseia na utilizaccedilatildeo de polimixina B ou polimixina E (Colistina) em associaccedilatildeo
com um (1) ou mais dos antimicrobianos da classe dos aminoglicosiacutedeos
(gentamicina ou amicacina) Carbapenecircmicos (meropenem ou doripenem) eou
tigeciclina (ANVISA 2013)
Recomenda-se usar sempre associaccedilotildees de dois ou trecircs antimicrobianos
sendo um deles a polimixina B ou a polimixina E (colistina) Deve-se evitar a
utilizaccedilatildeo de monoterapias pelo risco de raacutepido desenvolvimento de resistecircncia A
escolha do(s) faacutermaco(s) de associaccedilatildeo com polimixina B ou E deve se basear
preferencialmente no perfil de susceptibilidade esperado aos referidos
20
medicamentos das enterobacteacuterias resistentes aos carbapenecircmicos detectadas no
hospital ou na ausecircncia de dados locais na regiatildeo Deve-se considerar igualmente
o local de infecccedilatildeo e a penetraccedilatildeo esperada do antimicrobiano na escolha da droga
a ser utilizada na combinaccedilatildeo (ANVISA 2013)
Apoacutes a liberaccedilatildeo do perfil de sensibilidade deve-se adequar o uso dos
medicamentos Sempre que possiacutevel manter no miacutenimo 2 (dois) faacutermacos com
sensibilidade comprovada in vitro Natildeo havendo sensibilidade a um segundo
medicamento (suscetibilidade apenas agrave polimixina B ou E) recomenda-se manter a
terapia combinada de polimixina B ou E com carbapenecircmicos (meropenem ou
doripenem) ou tigeciclina na tentativa de ocorrecircncia de sinergismo entre elas
(ANVISA 2013)
Sugere-se aleacutem da determinaccedilatildeo das Concentraccedilotildees Inibitoacuterias Miacutenimas
(CIMs) para uma das polimixinas (B ou E) que tambeacutem sejam determinadas as
CIMs de tigeciclina e carbapenecircmicos (meropenem) bem como a consultoria de um
infectologista (ou Comissatildeo de Controle de Infecccedilatildeo Hospitalar- CCIH) para a
determinaccedilatildeo da terapia combinada com base na interpretaccedilatildeo do antibiograma
CIM e quadro cliacutenico do paciente No caso de resistecircncia agraves polimixinas
(concentraccedilotildees inibitoacuterias miacutenimas [CIMs] gt 2 mgL) recomenda-se a associaccedilatildeo de
dois ou trecircs do antimicrobianos sugeridos para a combinaccedilatildeo (ANVISA 2013)
A antissepsia eficiente do ambiente dos instrumentos ciruacutergicos e das matildeos
com o uso do aacutelcool a 70 eacute fundamental para a contenccedilatildeo de surtos Aleacutem disto
os pacientes contaminados devem permanecer isolados ateacute o controle da infecccedilatildeo
para evitar a disseminaccedilatildeo da bacteacuteria (COTRIM et al 2012)
1 2 Resistecircncia bacteriana
Hoje a disseminaccedilatildeo e a proliferaccedilatildeo das bacteacuterias resistentes estatildeo cada
dia mais presente As bacteacuterias multirresistentes (BRMD) poderatildeo levar agrave
humanidade a uma era poacutes-antibioacutetica resultando em uma ausecircncia de qualquer
opccedilatildeo de tratamento para os portadores destas cepas (HENRIQUE et al 2014)
Os fatores envolvidos na disseminaccedilatildeo desses patoacutegenos multirresistentes
satildeo diversos incluindo o uso irracional de antimicrobianos procedimentos invasivos
21
(cirurgias implantaccedilatildeo de proacuteteses meacutedicas e outros) e a transferecircncia de material
geneacutetico com a informaccedilatildeo de resistecircncia a antibioacuteticos entre as bacteacuterias
(DIENSTMANN et al 2010 ENDIMIAMI et al 2009 FONTANA et al 2010)
Com a praacutetica da antibioticoterapia principalmente em ambientes
nosocomiais os mecanismos de resistecircncia tornaram-se comuns Esses
mecanismos incluem alteraccedilatildeo na permeabilidade da membrana celular que
impede a entrada do antibioacutetico na ceacutelula bombeamento do antibioacutetico para fora da
mesma pelo mecanismo de efluxo mutaccedilatildeo geneacutetica que altera de alguma forma o
alvo do antibioacutetico e consequumlentemente natildeo afeta o funcionamento da bacteacuteria
bem como desenvolvimento da capacidade de degradar ou da inativaccedilatildeo do
antibioacutetico (COTRIM et al 2012) Estes mecanismos estatildeo representados na figura
3
Figura 3 Mecanismos de resistecircncia bacteriana Fonte
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controle
opas_webmodulo3pop_mecanismohtmgt
Um dos mais importantes mecanismos de resistecircncia eacute a alteraccedilatildeo do local-
alvo onde atua determinado antimicrobiano de modo a impedir a ocorrecircncia de
qualquer efeito inibitoacuterio ou bactericida As bacteacuterias podem adquirir um gene que
22
codifica um novo produto resistente aos antimicrobianos substituindo o alvo original
por exemplo o Staphylococcus aureus resistente agrave oxacilina e estafilococos
coagulase-negativos adquiriram o gene cromossocircmico Mec A e produzem uma PBP
ou PLP resistente aos β-lactacircmicos denominada 2a ou 2 que eacute suficiente para
manter a integridade da parede celular durante o crescimento quando outras PBPs
essenciais satildeo inativadas por antibimicrobianos β-lactacircmicos Como alternativa um
gene receacutem-adquirido pode atuar para modificar um alvo tomando-o menos
vulneraacutevel a determinado antimicrobiano Assim um gene transportado por
plasmiacutedeo ou por transposon codifica uma enzima que inativa os alvos ou altera a
ligaccedilatildeo dos antimicrobianos como ocorre com eritromicina e clindamicina (ANVISA
2007)
Em funccedilatildeo da bomba de efluxo pode variar a especificidade do antibioacutetico
Ele atua por meio do bombeamento ativo de antimicrobianos do meio intracelular
para o extracelular gerando uma resistecircncia bacteriana a determinados
antimicrobianos como eacute o caso da resistecircncia agraves tetraciclinas codificada por
plasmiacutedeos em Escherichia coli devido agrave presenccedila de proteiacutenas integrantes da
membrana plasmaacutetica bacteriana (PIDDOCK 2006)
O aumento da siacutentese de proteiacutenas eacute o principal responsaacutevel pela resistecircncia
antimicrobiana devido agraves vaacuterias mutaccedilotildees que ocorrem em seus repressores
transcricionais Estas mutaccedilotildees tambeacutem podem influenciar levando a um aumento
da eficiecircncia do transporte dos antibioacuteticos para o exterior da ceacutelula (HARBOTTLE
et al 2006)
A resistecircncia aos antibioacuteticos eacute frequumlentemente associada agrave alteraccedilatildeo
diminuiccedilatildeo da permeabilidade que ocorre na membrana externa das bacteacuterias gram-
negativas O fluxo de moleacuteculas para o interior da ceacutelula ocorre por caracteriacutesticas
peculiares como carga estrutura e dimensatildeo e atraveacutes de proteiacutenas de membrana
as quais formam canais Este percurso eacute utilizado pelos antibioacuteticos para atingir o
interior da ceacutelula bacteriana ou o espaccedilo periplasmaacutetico como eacute o caso dos
antibioacuteticos β-lactacircmicos Portanto a perda de funccedilatildeo destas proteiacutenas pode
efetivamente causar a diminuiccedilatildeo da susceptibilidade a vaacuterios antibioacuteticos
(LIVERMORE 2003)
23
Os mecanismos de resistecircncia que podem impedir a accedilatildeo de antimicrobianos
satildeo vaacuterios O faacutermaco atua de forma a inibir os processos essenciais a multiplicaccedilatildeo
e sobrevivecircncia da ceacutelula bacteriana como a membrana citoplasmaacutetica e
consequumlentemente bloqueando a siacutentese proteacuteica de aacutecidos nucleacuteicos e da parede
celular A resistecircncia bacteriana eacute um mecanismo natural de defesa Sendo assim
as bacteacuterias estatildeo em constante defesa e para cada novo faacutermaco desenvolvido as
bacteacuterias iratildeo desenvolver resistecircncia em algum momento (POSSEBON et al
2003)
O grupo de antibioacuteticos beta-lactacircmicos satildeo amplamente utilizado e se
encontram dentro da classe dos melhores agentes antimicrobianos com relevacircncia
cliacutenica No entanto o seu uso tem sido restringido devido a vaacuterios mecanismos de
resistecircncia O desenvolvimento dos carbapenecircmicos surgiu devido agrave proliferaccedilatildeo de
beta-lactamases mediadas por plasmiacutedeos e cromossomos (POSSEBON et al
2003)
A bacteacuteria KPC tem um gene chamado SHV-1 que tem a caracteriacutestica de
resistecircncia a quase todos os tipos de antimicrobianos inclusive os carbapenecircmicos
especiacuteficos para o tratamento de infecccedilotildees por bacteacuterias multiresistentes e
emergecircncias Mesmo com no seu coacutedigo geneacutetico a informaccedilatildeo necessaacuteria para o
desenvolvimento da resistecircncia a resistecircncia da bacteacuteria soacute eacute desenvolvida caso a
bacteacuteria entre em contato com o antibacteriano desencadeando todo o processo
nos casos de resistecircncia induzida comuns em KPC (MOREIRA et al 2014)
A resistecircncia bacteriana pode ser apresentada de forma intriacutenseca ou
adquirida A resistecircncia intriacutenseca faz parte das caracteriacutesticas fenotiacutepicas naturais
do microrganismo ou seja faz parte de sua heranccedila geneacutetica sendo transmitida
verticalmente a prole sem perda da caracteriacutestica A presenccedila ou ausecircncia do alvo
para a accedilatildeo da droga eacute o principal determinante deste tipo de resistecircncia
(MOREIRA et al 2014) Essa resistecircncia corresponde a uma caracteriacutestica de
espeacutecie bacteriana quando estes microrganismos satildeo naturalmente resistentes a
certo tipo de antibioacutetico Este processo eacute decorrente da ausecircncia de estruturas de
atuaccedilatildeo de antimicrobianos ou a impermeabilidade por parte de estruturas
perifeacutericas das bacteacuterias (HENRIQUE et al 2014)
24
A resistecircncia adquirida aos antibioacuteticos por sua vez ocorre quando haacute uma
da mutaccedilatildeo de genes reguladores ou estruturais aquisiccedilatildeo de genes de resistecircncia
veiculados por elementos geneacuteticos moacuteveis ou da combinaccedilatildeo entre eles Este
aparecimento de resistecircncia em uma espeacutecie bacteriana era anteriormente sensiacutevel
a droga e devido a um destes fatores se torna resistente O fenoacutetipo resultante
desta resistecircncia natildeo estaraacute presente nas ceacutelulas genitoras e sim nos indiviacuteduos de
uma linhagem bacteriana derivada de um organismo susceptiacutevel Os genes muitas
vezes satildeo adquiridos por meio de elementos moacuteveis como plasmiacutedeos e
transposons (MOREIRA et al 2014)
Entatildeo a resistecircncia adquirida ocorre por diversos mecanismos geneacuteticos tais
como produccedilatildeo de enzimas inativadoras interferecircncia com a entrada e acuacutemulo de
droga na bacteacuteria alteraccedilatildeo do receptor para accedilatildeo da droga via metaboacutelica
alternativa Eacute originada por meio de uma alteraccedilatildeo a niacutevel geneacutetico da ceacutelula de
natureza cromossocircmica pelos processos de mutaccedilatildeo transduccedilatildeo e transformaccedilatildeo
ou extra cromossocircmica (plasmidial) (HENRIQUE et al 2014)
Como todo antibioacutetico β-lactacircmicoos carbapenecircmicos tem como mecanismo
de accedilatildeo a inibiccedilatildeo da siacutentese proteacuteica atraveacutes da accedilatildeo de inibiccedilatildeo da parede
microbiana fazendo a ligaccedilatildeo e inativaccedilatildeo das proteiacutenas ligadoras de penicilinas
(NETO et al 2007)
Imipenem e meropenem antibioacuteticos pertencentes ao grupo dos
carbapenecircmicos possuem um amplo espectro de accedilatildeo in vitro incluindo atividade
contra cocos gram-positivos bacilos gram-negativos e bacteacuterias anaeroacutebias (MOHR
2008) Jaacute o ertapenem possui um espectro de accedilatildeo mais limitado que o os dois
antibioacuteticos anteriormente citados tendo uma eficiecircncia limitada contra os bacilos
gram-negativos natildeo fermentadores Um novo antibioacutetico carbapenecircmico ainda natildeo
disponiacutevel no Brasil doripenem possui uma atividade mais potente principalmente
contra Pseudomona aeruginosa devido ao seu mecanismo de accedilatildeo que combina os
espectros de accedilatildeo de imipenem e meropenem (ZHANEL et al 2007)
Devido as suas estabilidades espectro de accedilatildeo poucos relatos de
resistecircncia boa toleracircncia pelos pacientes com efeitos adversos mais comuns as
complicaccedilotildees no siacutetio da infusatildeo e toxicidade gastrintestinal estes antibioacuteticos
carbapenecircmicos tecircm sido considerados terapia de escolha (NICOLAU 2008) Como
25
uma resposta adaptativa das Enterobacteacuterias o iacutendice de resistecircncia aos
carbapenecircmicos tem aumentado nos uacuteltimos anos de forma proporcional ao seu
uso limitando imensamente as opccedilotildees terapecircuticas para as infecccedilotildees causadas por
estes microrganismos (FALAGAS et al 2009)
As enzimas produtoras de betalactamases hidrolisam o anel betalactacircmico
tornando este mecanismo de resistecircncia o mais importante Os dois grupos mais
preocupantes satildeo o grupo das betalactamases de aspecto ampliado e os da
carbapenemases que aleacutem de hidrolizar os carbapenecircmicos hidrolizam todas as
outras classes de betalactacircmicos Em enterobacteacuterias as carbapenemases mais
prevalentes satildeo codificadas por genes dos grupos blaKpc blaIMP blaVIM blaNdm
e blaOxa A ocorrecircncia de carbapenemases eacute mais frequentemente em bacteacuterias
gram-negativas fermentadoras da glicose conhecidas como enterobacteacuterias
predominantes nos gecircneros Klebsiella Serratia Citrobacter Enterobacter
Escherichia Samonella Proteus Morganella Podem ser encontradas tambeacutem em
bacteacuterias gram-negativas natildeo fermentadoras como espeacutecies de Acinetobacter e de
Pseudomonas (ALVES et al 2013)
Carbapenemases satildeo enzimas plasmiacutedio-mediados resistentes a todos
antibioacuteticos betalactacircmicos As bacteacuterias que possuem o gene blaKpC responsaacutevel
pela codificaccedilatildeo da produccedilatildeo de carbapenemases apresentam resistecircncia aos
antibioacuteticos betalactacircmicos impedindo a accedilatildeo destes antibioacuteticos contra infecccedilotildees
(ALVES et al 2013)
A transmissatildeo das carbapenemases a diferentes cepas de enterobacteacuterias se
daacute atraveacutes de plasmiacutedeos que satildeo pequenas moleacuteculas circulares de DNA com a
capacidade de se replicarem independentemente do DNA cromossocircmico
permitindo a troca de material geneacutetico entre gecircneros e espeacutecies diferentes de
enterobacteacuterias O raacutepido desenvolvimento de surtos em ambientes hospitalares eacute
explicado por essa disseminaccedilatildeo plasmidial (COTRIM et al 2012)
De acordo com o criteacuterio de interpretaccedilatildeo do Clinical and Laboratory
Standards Institute (CLSI 2009) a maioria das KPC isoladas natildeo apresenta
resistecircncia completa aos carbapenecircmicos (Imipenem e Meropenem apresentam
uma Concentraccedilatildeo Inibitoacuteria Miacutenima (CIM) de 2-8 μgmL) (COTRIM et al 2012)
26
Os mecanismos de resistecircncia capazes de impedir a accedilatildeo dos
carbapenecircmicos satildeo vaacuterios Poreacutem a degradaccedilatildeo de antibioacuteticos por enzimas
principalmente as carbapenemases constituem o principal mecanismo de
resistecircncia aos antibioacuteticos β-lactacircmicos (DIAS 2009) Devido a ampla atividade
hidroliacutetica agrave maioria dos antibioacuteticos β-lactacircmicos estes grupos de enzimas possuem
alta versatilidade (QUEENAM et al 2007)
Existem trecircs grandes classes moleculares de Ambler a qual as
carbapenemases pertencem denominadas classe A (serino-carbapenemases os
quais incluem membros designados SME IMI NMC GES e a famiacutelia das KPCs)
classe B(as metalo-β-lactamase incluem os tipos IMP e VIM) e classe D
(oxacilinases similares as da classe A e incluem as OXA e PSE) (DIAS 2009)
Dentre estes as mais importantes e prevalentes encontradas em plasmiacutedeos
de Klebsiella pneumoniae satildeo as KPC (DIENSTMANN et al 2010) Por meio de
estudos moleculares a enzima KPC jaacute foi documentada em diferentes bacteacuterias e
diferenciada em KPC-1 a 13 (NETIKUL et al 2011) No ano de 2009 foi realizada
uma pesquisa onde descreveram as seguintes carbapenemases KPC-1 em isolados
de Klebsiella pneumoniae KPC-2 em K pneumoniae K oxytoca Salmonella
enterica e em Enterobacter sp e KPC-3 em K pneumoniae e Enterobacter cloacae
(MONTEIRO et al 2009) As enzimas KPC-4 e KPC-5 foram encontradas em
isolados de Pseudomonas aeruginosa (PEIRANO et al 2009)
Foi observada uma correccedilatildeo da sequumlecircncia KPC-1 indicando que o gene
blaKPC-1 e blaKPC-2 satildeo idecircnticos Trecircs novas variantes blaKPC-3 blaKPC-4 e
blaKPC-5 satildeo resultados de mutaccedilotildees do gene estrutural da enzima KPC-2
(WOLTER et al 2008) apresentando diferentes perfis de hidroacutelise As enzimas
KPC-2 e KPC-3 possuem alta eficiecircncia em hidrolisar cefalotina cefaloridina e
nitrocefin poreacutem possuem uma menor eficiecircncia contra carbapenecircmicos e
cefotaxima (ALBA et al 2005) As enzimas KPC-5 e KPC-4 apresentam menor
hidroacutelise de carbapenecircmicos eacute do que em KPC-2 Em contrapartida possuem
melhor eficiecircncia contra ceftazidima e uma maior inibiccedilatildeo pelo aacutecido clavulacircnico
(WOLTER et al 2008)
27
13 Anaacutelise geneacutetica de microrganismos
Eacute de extrema importacircncia praacutetica natildeo soacute no aspecto cliacutenico mas tambeacutem na
fitopatologia biotecnologia e estudos ambientais a correta identificaccedilatildeo e
classificaccedilatildeo de microrganismos Os meacutetodos usados na diferenciaccedilatildeo de gecircneros
espeacutecies e estirpes de microrganismos podem ser divididos em meacutetodos fenotiacutepicos
(baseados em fenocircmenos bioquiacutemicos fisioloacutegicos e bioloacutegicos) e genotiacutepicos
(detectam polimorfismos ao niacutevel dos aacutecidos nucleacuteicos ou variaccedilatildeo aleacutelica ao niacutevel
de enzimas) (ALVES et al 2003)
Para este tipo de estudo existem alguns meacutetodos como o RFLPrsquos -
ldquoRestriction Fragment Length Polymorphismsrdquo (polimorfismos de tamanho de
fragmentos de restriccedilatildeo) rep-PCR (Meacutetodo de tipagem baseado na amplificaccedilatildeo via
PCR de elementos de DNA repetitivos presentes em genomas bacterianos) anaacutelise
de sequumlecircncias nucleotiacutedeas (discriminaccedilatildeo eou identificaccedilatildeo atraveacutes de sequumlecircncias
de DNA) PFGE - Pulsed-Field Gel Electrophoresis (Eletroforese em campo
pulsado) ( A L V E S et al 2003)
A diferenciaccedilatildeo clara da cepa e principalmente a alta reprodutibilidade devem
ser caracteriacutesticas de qualquer meacutetodo de tipagem geneacutetica Poreacutem nem todos os
meacutetodos moleculares de tipagem satildeo igualmente eficazes Sendo assim de acordo
com a finalidade pretendida (identificaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo custo reprodutibilidade
etc) eacute feita a escolha do meacutetodo a ser aplicado (A L V E S et al 2003)
O processo de identificaccedilatildeo fenotiacutepica de KPC entre os membros da famiacutelia
Enterobacteriaceae ainda eacute difiacutecil e os meacutetodos para a sua identificaccedilatildeo devem ser
revistos e ajustados Mesmo com o avanccedilo tecnoloacutegico natildeo existem ensaios que
combinam alta especificidade e sensibilidade na detecccedilatildeo destas enzimas Satildeo
diversas as metodologias usadas para rastreamento de KPC como por exemplo a
focalizaccedilatildeo isoeleacutetrica a teacutecnica de disco-difusatildeo E-test teste de Hodge
modificado dentre outros Aleacutem disso a pesquisa do gene blaKPC pode ser feita
pela Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) Os sistemas de automaccedilatildeo
existentes no entanto podem natildeo identificar com precisatildeo os isolados KPC
positivos (COTRIM et al 2012)
A identificaccedilatildeo blaKPC pelo PCR eacute um meacutetodo raacutepido preciso sensiacutevel e
altamente especiacutefico no entanto a PCR exige equipamento e conhecimentos
28
especializados em diagnoacutestico molecular dificultando ainda a utilizaccedilatildeo dele na
rotina dos laboratoacuterios de microbiologia (COTRIM et al 2012)
Em estudo de infecccedilotildees hospitalares identificaccedilatildeo molecular de patoacutegenos
bacterianos eacute bastante utilizada Para diferenciar carbapenemases tipo KPC a partir
de outros tipos como SME NMC-A-IMI e GES eacute necessaacuterio um exame molecular
As identificaccedilotildees do microrganismo juntamente com a triagem molecular iratildeo definir
um resultado mais especiacutefico podendo ser usado para identificar o antibioacutetico mais
adequado para o tratamento Poreacutem a principal desvantagem de alguns exames
baseados em PCR por exemplo eacute que devido agrave sua limitada capacidade de
multiplexaccedilatildeo eles distinguem apenas algumas variaccedilotildees (MOREIRA et al 2014)
Estatildeo descritas para a identificaccedilatildeo molecular de patoacutegenos pertencentes agrave
famiacutelia Enterobacteriaceae as teacutecnicas de PFGE RAPD (randomly amplified
polymorphic DNA) e ERIC-PCR (Enterobacterial Repet it ive Intergenic Consensus)
A PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) eacute considerada padratildeo ouro devido sua
alta capacidade de diferenciaccedilatildeo baseada na anaacutelise do perfil de restriccedilatildeo do DNA
genocircmico por meio de eletroforese Como desvantagem para a sua execuccedilatildeo eacute
necessaacuterios vaacuterios dias impedindo a tipagem de algumas cepas bacterianas devido
agrave degradaccedilatildeo do DNA aleacutem do alto custo empregado (MOREIRA et al 2014)
O meacutetodo baseado em ERIC-PCR tem sido bastante utilizado como uma
alternativa para a teacutecnica de PFGE Esta teacutecnica consiste na anaacutelise do padratildeo de
amplificaccedilatildeo de elementos repetidos encontrados no genoma bacteriano Isto
permite uma maior rapidez na obtenccedilatildeo de resultados quando comparada com o
PFGE aleacutem de alta reprodutibilidade simples execuccedilatildeo e implementaccedilatildeo baixo
custo e natildeo sem problemas com a degradaccedilatildeo do DNA (MOREIRA et al 2014)
A PCR eacute considerada uma teacutecnica de biologia molecular revolucionaacuteria que
consiste na siacutentese enzimaacutetica de coacutepias de aacutecidos nucleacuteicos Ela permitiu o raacutepido
desenvolvimento do estudo de sequumlecircncias de aacutecidos nucleacuteico Foi desenvolvida por
Kary Banks Mullis que ganhou o precircmio Nobel de quiacutemica de 1993 devido ao
desenvolvimento dessa teacutecnica em abril de 1983 (CAMARGO et al 2014)
Por meio de etapas de variaccedilatildeo de temperatura a teacutecnica de PCR promove a
duplicaccedilatildeo de cadeias de DNA in vitro A reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo de DNA por PCR
envolve o emprego de sequumlecircncias iniciadoras (primers) quatro nucleotiacutedeos
29
(dNTPrsquos) do DNA e uma DNA polimerase termoestaacutevel podendo assim obter-se a
partir de uma fita molde muitas coacutepias de uma sequumlecircncia especiacutefica de aacutecido
nucleacuteico O princiacutepio da PCR consiste na variaccedilatildeo de temperatura por ciclo
envolvendo trecircs etapas baacutesicas desnaturaccedilatildeo pareamento e amplificaccedilatildeo
(CAMARGO et al 2014)
A desnaturaccedilatildeo da fita molde de DNA eacute uma etapa com duraccedilatildeo entre 30
segundos a 1 minuto a temperatura entre 92 ordmC a 96 ordmC Apoacutes isso o pareamento de
dois iniciadores sinteacuteticos de composiccedilotildees distintas que funcionam como os
iniciadores da reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo liga-se agrave regiatildeo complementar da fita de
DNA alvo que sofreraacute a duplicaccedilatildeo Esta etapa tem duraccedilatildeo de 30 segundos a 1
minuto a temperatura entre 58 ordmC e 65 ordmC Por uacuteltimo a amplificaccedilatildeo por meio da
enzima Taq DNA polimerase das novas fitas de DNA se daacute a partir de cada um dos
iniciadores utilizando os quatro dNTPrsquos como substrato da reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo
Esta etapa possui duraccedilatildeo entre 45 segundos e 1 minuto a 72 ordmC Cada ciclo eacute
repetido em torno de 30 a 35 vezes e promove a amplificaccedilatildeo da regiatildeo alvo
determinada conforme o anelamento dos iniciadores sinteacuteticos de DNA (CAMARGO
et al 2014) Estas etapas estatildeo demonstradas na figura 4
Figura 4 Etapas da Reaccedilatildeo de PCR
30
2 JUSTIFICATIVA
No ano de 2010 no Distrito Federal foram identificados 111 pacientes com
suspeita de infecccedilatildeo por Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) e a
Secretaria de Sauacutede do Distrito Federal confirmaram ainda a morte de 18 pacientes
dentre os hospitais puacuteblicos e particulares Um desafio encontrado por ocasiatildeo do
surto infeccioso no Distrito Federal foi o de confirmar as KPCs por Reaccedilatildeo da
Polimerase em Cadeia sendo que as amostras foram enviadas com esta finalidade
para a Fiocruz no Rio de Janeiro
Pesquisas que possam contribuir na elaboraccedilatildeo de estrateacutegias preventivas e
de intervenccedilatildeo para infecccedilotildees causadas por enterobacteacuterias bem como contribuir
para gerar uma integraccedilatildeo beneacutefica entre a equipe acadecircmica e os serviccedilos de
sauacutede devem ser estimuladas Neste sentido o presente estudo permitiu escrutinar
os genes envolvidos na expressatildeo de carbapenemases presentes em espeacutecies de
enterobacteacuterias isoladas em ambiente hospitalar visto que elucidar genes de
resistecircncia de enterobacteacuterias aos antibioacuteticos carbapenecircmicos eacute o primeiro passo
para garantir um controle epidemioloacutegico efetivo para estes tipos de microorganismo
assim como sua associaccedilatildeo com surtos fatais particularmente em pacientes com
baixa imunidade
31
3 OBJETIVOS
31 Objetivo geral Caracterizar os genes de resistecircncia das
Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases e os aspectos epidemioloacutegicos de
pacientes internados em um hospital puacuteblico do Distrito Federal
32 Objetivos Especiacuteficos
Identificar genotipicamente a enzima KPC (Klebsiella pneumoniae
carbapenemase) de isolados de Klebsiella pneumoniae
Investigar aspectos epidemioloacutegicos dos pacientes portadores de
Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases
Identificar quais variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana influenciaram para o
desfecho oacutebito ou alta
Avaliar a susceptibilidade das Enterobacteacuterias aos antibioacuteticos
carbapenecircmicos dos pacientes em ambiente hospitalar
32
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
Trata-se de um estudo transversal onde foi realizado o teste de
susceptibilidade das enterobacteacuterias aos antibioacuteticos carbapenecircmicos a partir dos
materiais bioloacutegicos coletados dos pacientes internados no Hospital Regional da Asa
Norte (HRAN) e enviados ao Laboratoacuterio de Anaacutelises Cliacutenicas da mesma Instituiccedilatildeo
Os materiais bioloacutegicos investigados foram sangue aspirado traqueal ou brocircnquico
urina e cultura semi quantitativa de ponta de cateter venoso central O HRAN eacute um
hospital puacuteblico do Distrito Federal com 395 leitos sendo as cliacutenicas de internaccedilatildeo
Berccedilaacuterio Cirurgia Geral Cirurgia Plaacutestica Cliacutenica Meacutedica Ginecologia Maternidade
Pediatria Queimados UTI com atendimento a pacientes portadores de doenccedilas de
caraacuteter cliacutenico e ciruacutergico
4 1 Coleta e transporte das amostras bioloacutegicas
As amostras foram coletadas de pacientes internados no Hospital Regional da
Asa Norte (HRAN) com suspeitas de infecccedilatildeo por KPC A identificaccedilatildeo primaacuteria foi
realizada pelo Laboratoacuterio de Microbiologia do hospital de origem dos pacientes e os
demais procedimentos que foram utilizados na identificaccedilatildeo encontram-se descritos
abaixo
4 2 Procedimentos para confirmaccedilatildeo de resistecircncia bacteriana por
disco de ertapenem (adaptado CDC 2004)
Para diagnosticar amostra como portadora de bacteacuteria produtora de
carbapenemase foi realizado o teste com disco de ertapenem como forma de
triagem Inicialmente utilizou-se o swab contaminado com a amostra que foi
distribuiacuteda em uma pequena aacuterea da placa de aacutegar MacConkey para apoacutes o
crescimento ser realizada a pesquisa de colonizaccedilatildeo por enterobacteacuterias resistentes
aos carbapenecircmicos (Pesquisa de CRE) Procedeu-se a semeadura por teacutecnica
semi-quantitativaesgotamento com alccedila bacterioloacutegica na diluiccedilatildeo de 1100 O disco
de Ertapenem foi colocado na superfiacutecie da placa de MacConkey na junccedilatildeo dos dois
primeiros campos de semeadura conforme demonstrado na figura 5 Incubou a placa
33
em estufa aeroacutebia a 35ordmC por 24 e 48 horas e observou-se o halo de difusatildeo do
disco de Ertapenem na placa para proceder agrave leitura
O teste deixou de ser obrigatoacuterio apoacutes a modificaccedilatildeo dos criteacuterios
interpretativos para carbapenecircmicos para enterobacteacuterias publicados no suplemento
do CLSI 2010 M100-S20-U
Figura 5 Mecanismo de semeamento de material bioloacutegico oriundos de
pacientes com suspeita de infecccedilatildeo por KPC Fonte adaptado CDC 2004
4 2 1 Interpretaccedilatildeo dos resultados
Na ausecircncia de crescimento ateacute 24 horas (MacConkey) ou halo de difusatildeo
gt27 mm na placa deve-se reincubar as placas por mais 24 horas Quando for
ausente o crescimento apoacutes 48 horas ou halo de difusatildeo gt27 mm na placa libera-se
como enterobacteacuterias resistentes a carbapenecircmicos (KPCNEG)Havendo
crescimento de colocircnias na placa de MacConkey com halo lt 27 mm (apenas para
colocircnias com crescimento dentro do halo) deve-se reisolar e realizar identificaccedilatildeo e
antibiograma automatizado teste de sensibilidade por disco-difusatildeo e Teste de
Hodge Modificado (THM) Os isolados de enterobacteacuterias cujos testes comprovarem
a resistecircncia aos carbapanecircmicos testados (KPCPOS) foram reportado a Comissatildeo
de Controle de Infecccedilatildeo Hospitalar (CCIH) Jaacute osbacilos Gram-negativos natildeo
fermentadores natildeo foram reportados (KPCNEG) Para interpretaccedilatildeodos resultados
foram utilizados os valores conforme demonstrados na tabela 1
Tabela 1 Criteacuterios Interpretativos para testes de sensibilidade
ENTEROBACTEacuteRIAS
Disco difusatildeo (mm) MIC (microgml)
34
Antibioacutetico Sigla S I R S I R
Ertapenem 10
microg
ETP 22 19-
21
18 05 1 2
Meropenem 10
microg
MEM 23 20-
22
19 1 2 4
Fonte Manual Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)
2013
Os resultados que apresentaram resistecircncia ao antibioacutetico Ertapenem foram
considerados como suspeitos de contaminaccedilatildeo por KPC Fez-se o teste de
susceptibilidade aos antibioacuteticos (TSA) em aparelho automatizado MicroScan Walk
Away 96sl Dade Behring
4 3 Teste de susceptibilidade aos antibioacuteticos (adaptado CDC 2004)
A determinaccedilatildeo da susceptibilidade dos isolados foi feita pelo teste de
susceptibilidade aos antibioacuteticos (TSA) apoacutes cultura em meio de gelose simples
(INSA) para avaliaccedilatildeo da sua pureza e obtenccedilatildeo de colocircnias isoladas Para
preparaccedilatildeo de uma suspensatildeo bacteriana com turvaccedilatildeo aproximada de 05
McFarland (Dade BehringMicroScanregTurbidity Meter) ressuspendeu duas a cinco
colocircnias em 2ml de soro fisioloacutegico esteacuteril diluindo a 1100 em soro fisioloacutegico num
volume total de 10ml em seguida foi feita uma semeadura em duas placas
quadradas (120mm x 120mm) de Muller-Hinton Agar (INSA) por inundaccedilatildeo
Os discos de antibioacutetico carbapenecircmicos imipenem meropenem e
ertapenem (Biorad) foram aplicados com o auxiacutelio de um dispensador automaacutetico A
susceptibilidade das Enterobacteacuterias aos carbapenecircmicos foi definida de acordo
com o protocolo Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI 2011)
Para aquelas Enterobacteacuterias que apresentaram resistecircncia ao ertapenem
foram realizados o Teste de Hodge Modificado para Detecccedilatildeo de Enterobacteacuterias
Produtoras de Carbapenemases conforme descrito pelo Centers for Disease Control
and Prevention (CDC 2004)
35
4 4Teste de Hodge Modificado (THM) (adaptado CDC 2004)
Preparou-se uma suspensatildeo em salina esteacuteril com a cepa Escherichia coli
ATCC 25922 (padratildeo 05 de McFarland) Apoacutes isto diluiu a suspensatildeo 110 em
salina (05 ml da soluccedilatildeo de Ecoli ATCC 25922 + 45 ml salina)Foi entatildeo semeado
na superfiacutecie de uma placa de Agar Muller-Hinton com a suspensatildeo diluiacuteda de Ecoli
ATCC 25922 com auxilio de swab seco assegurando que houvesse uma
distribuiccedilatildeo uniforme cobrindo toda a superfiacutecie do Agar Deixou secar por 3 a 5
minutos em temperatura ambienteColocou-se o disco de ertapenem 10microg no centro
da placa e apoacutes isto fez-se uma estria linear da cepa a ser testada da borda do
disco ateacute a borda da placa utilizando uma alccedila calibrada 10 microl ou um swab Incubou
a placa na estufa em atmosfera aeroacutebia a 35 plusmn 2ordmC por 16 a 24 horas
441 Controle de qualidade (CQ)
Foi utilizado um CQ todos os dias em que se realizou o teste tendo como
controle Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1705- teste de Hodge modificado
positivo Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1706- teste de Hodge modificado
negativo
442 InterpretaccedilatildeoResultados
Apoacutes 16ndash24 horas de incubaccedilatildeo examinar as placas para verificar a presenccedila
de uma distorccedilatildeo no halo de inibiccedilatildeo do disco de ertapenem devido ao crescimento
realccedilado da cepa ATCC na intersecccedilatildeo do organismo teste e a Ecoli ATCC 25922
dentro dos limites do halo O THM positivo apresentaraacute presenccedila de distorccedilatildeo no
halo de inibiccedilatildeo de ertapenem devido ao crescimento da cepa Ecoli ATCC 25922 ao
longo da estria da cepa teste para dentro dos limites do halo de inibiccedilatildeo Jaacute o THM
negativo teraacute ausecircncia de crescimento da cepa Ecoli ATCC 5922 ao longo da estria
da cepa teste para dentro dos limites do halo de inibiccedilatildeo do disco de ertapenem
Este resultado estaacute representado na figura 6
36
Figura 6 Interpretaccedilatildeo resultado do Teste de Hodge Modificado
(adaptado CDC 2004) Teste positivo na estria da cepa teste na parte superior
da placa teste negativo na estria da cepa teste na parte inferior da placa
Tendo positivo como resultado o paciente era um provaacutevel contaminado por
KPC As amostras entatildeo foram encaminhadas para a Fundaccedilatildeo Osvaldo Cruz
(FIOCRUZ) para confirmaccedilatildeo final As amostras finalmente confirmadas como
positivas para KPC foram isoladas e guardadas no banco de cepas cliacutenicas do
hospital Apoacutes a autorizaccedilatildeo do CEP amostras das cepas foram transferidas para
meio de transporte Stuard em caixa teacutermica fechada em baixa temperatura e
levadas para o laboratoacuterio de microbiologia cliacutenica da universidade
No laboratoacuterio da universidade as amostras foram separadas e realizadas
repiques em meios MacConkey e incubadas por 24h As colocircnias caracteriacutesticas
foratildeo isoladas em caldo BHI e mantidas em shaker a 37oC por 2h Apoacutes isto foram
executadas as anaacutelises a seguir
Os isolados de Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases foram
submetidos agrave extraccedilatildeo de DNA e posterior sequumlenciamento para identificaccedilatildeo dos
genes de resistecircncia blaKPC de 1 a 13 e identificaccedilatildeo do gene universal Os
pacientes de onde os materiais bioloacutegicos contendo as Enterobacteacuterias produtoras
de carbapenemases foram os isolados foram investigados quanto aos aspectos
epidemioloacutegicos e cliacutenicos
37
4 5 Extraccedilatildeo de DNA bacteriano
A extraccedilatildeo de DNA bacteriano foi realizada utilizando o kit NucleoSpin
Plasmidreg (MN) Antes de iniciar a extraccedilatildeo foi feito a preparaccedilatildeo das soluccedilotildees
reagentes materiais e amostras (vortexando) colocou-se em banho-maria agrave 50ordmC o
tampatildeo AW Partiu-se de colocircnias isoladas cultivadas que sofreram passagem em
meio LB liacutequido por 12h Adicionou-se 15 mL da amostra no tubo eppendorf
centrifugou por 5 minutos descartou o sobrenadante (com cuidado para natildeo
descartar o Pellet) Repetiu-se este procedimento por mais trecircs vezes completando-
se o volume de 6mL Foram adicionados 250microL do tampatildeo Resuspension Buffer A1
encostando a ponteira no Pellet e misturando (este tampatildeo tem como funccedilatildeo
separar a formaccedilatildeo de grumos celulares) Apoacutes isso homogeneizou e vortexou os
tubos eppendorfs Apoacutes isso foram adicionados 250microL do tampatildeo Lysis Buffer A2
homogenizou e deixou descansar por 5 minutos (esta etapa eacute importante para a lise
da parede e da membrana celulares e liberaccedilatildeo do conteuacutedo da ceacutelula)
Passado o tempo de descanso foi adicionado 300microL do tampatildeo
Neutralization Buffer A3 homogeneizou e centrifugou por 10 minutos (este tampatildeo
iraacute retirar as proteiacutenas que envolvem o DNA e voltaraacute com o pH para proacuteximo de 8
impedindo que a soluccedilatildeo de lise facilite a quebra das ligaccedilotildees covalentes do aacutecido
nucleacuteico) Em seguida enumeraram-se os tubos contendo filtros com siacutelica
transferiu-se o sobrenadante para o filtro e centrifugou por 5 minutos Descartou-se
o que foi filtrado adicionou 500microL do tampatildeo AW (banho-maria) centrifugou por 2
minutos Novamente foi descartado o filtrado Adicionou-se 600microL do tampatildeo A4
centrifugou por 2 minutos e descartou o filtrado (os tampotildees AW e A4 contecircm
isotiocianato de guanidina em concentraccedilotildees crescentes para facilitar a adsorccedilatildeo
do DNA na siacutelica e retirada das outras biomoleacuteculas da amostra) Foi feita outra
centrifugaccedilatildeo com o tubo vazio Apoacutes isto o filtro foi trocado para outro eppendorf
definitivo onde foi adicionado 50microL do tampatildeo Elution Buffer AE (este tampatildeo
favorece a eluiccedilatildeo do DNA) centrifugou por 2 minutos descartou o filtro e
armazenou as amostras em freezer -20ordmC
38
4 6 Iniciadores e reaccedilatildeo de PCR
Os iniciadores universais para o gene blaKPC foram desenhados baseados
em sequumlecircncias conservadas apresentadas pelos sub-grupos de genes que
codificam a enzima carbapenemase de klebsiella pneumoniae (YIGIT et al 2001)
Baseado na sequumlecircncia para o blakpc-1 depositada no GenBank
(AF2975541) o oligonucleotiacutedio (oligo) iniciador direto (5-
ATGTCACTGTATCGCCGTC-3rsquo) foi desenhado para reconhecer a sequumlecircncia
blaKPC na posiccedilatildeo (131149) enquanto que o iniciador reverso (5-
TTACTGCCCGTTGACGCC-3rsquo) foi reconhecido na posiccedilatildeo (9951012) As anaacutelises
baseadas em alinhamento de sequumlecircncias mostraram que o par de iniciadores
blaKPC podem detectar os alelos de 1 a 13 do gene blaKPC conforme a tabela 2
Tabela 2 Nuacutemero de acesso ao GenBank dos alelos blaKPC e seus
microrganismos originais
Nuacutemero de
Acesso GenBank
Microrganismo Alvo
AF2975541 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-1
GU0862251 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-2
HQ2589341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-2-like
AB5577341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC -3
EU4473041 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-4
EU4002222 Pseudomonas
aeruginosa
blaKPC-5
EU5555341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-6
EU7297271 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-7
39
FJ2344121 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-8
FJ624872 Escherichia coli blaKPC-9
GQ1403481 Acinetobacter
baumannii
blaKPC-10
HM0669951 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-11
HQ3428891 Enterobacter cloacae blaKPC-12
HQ3428901 Enterobacter cloacae blaKPC-13
As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo de blaKPC foram realizadas em um
primeiro tempo de desnaturaccedilatildeo em que foi 94ordmC por 5 minutos seguido de 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 58 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 90 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 78ordmC por 8 minutos Aleacutem das amostras foi utilizado um
controle negativo
A PCR do blaKPC foi realizada utilizando os componentes para o volume da
reaccedilatildeo de 25 microL citados na tabela 3 A banda do tamanho do produto de PCR foi de
881 pares de bases (pb) o que corresponde ao plasmiacutedeo
Tabela 3 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do
gene blaKPC
Reagente Volume
DNA molde 4 microL
Tampatildeo Taq 25 microL
MgCl2 075 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP
2 microL
Oligo F 1 microL
Oligo R 1 microL
Taq DNA polimerase 05 microL
Aacutegua MiliQ 1335 microL
40
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
Baseado na sequumlecircncia para o gene 16S rRNA em que o oligonucleotiacutedio
Universal iniciador direto foward (5-CCAGCAGCCGCCGTAATACG-3rsquo) foi
desenhado para reconhecer a sequumlecircncia universal na posiccedilatildeo 1513 enquanto que o
iniciador reverso (5-ATCGGYTACCTTGTTACGACTTC-3rsquo) foi reconhecido na
posiccedilatildeo 1491 foram realizadas PCRrsquos As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo deste
gene foram realizadas nos seguinte tempos separaccedilatildeo 94ordmC por 10 minutos 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 55 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 120 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 72ordmC por 10 minutos
A PCR do gene 16S rRNA foi realizada utilizando os componentes para o
volume da reaccedilatildeo de 25microL citados na tabela 4 A banda do tamanho do produto de
PCR foi de 996 pb correspondente aacute regiatildeo ribossomal capaz de amplificar todas
as espeacutecies
Tabela 4Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do gene
universal
Reagente (quantidade
concentraccedilatildeo do estoque)
Volume
DNA molde 10 ng 4 microL
Tampatildeo Taq 10 x 25 microL
MgCl2 50mM 125 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP 25 mM
125 microL
Oligo F 10microM 05 microL
Oligo R 10microM 05 microL
Taq DNA polimerase 5UmicroL 04 microL
Aacutegua Miliq 146 microL
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
41
O termociclador utilizado para os experimentos foi o LifeTouch da BIOER
4 7 Digestatildeo
Para realizaccedilatildeo da digestatildeo foi utilizada a enzima BshF I (Hae III) EN- 1105
tamanho 7000 units concentraccedilatildeo 10 unitsmicroL fonte Bacillus sphaericus empresa
Jena bioscienceUtilizaram-se os componentes para o volume de 50microL da reaccedilatildeo
citados na tabela 5
Tabela 5 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da digestatildeo do gene
universal
Reagente Volume
Produto de PCR 10 microL
Enzima BshF I 01 microL
Tampatildeo (10x) 5 microL
Aacutegua Miliq 349 microL
Total (em cada ependorff) 50 microL
Valores para 1 digestatildeo
Os ependorffs foram colocados por 30 minutos em banho-maria a 37ordmC Apoacutes
isso fez-se a corrida das amostras em gel de agarose para verificaccedilatildeo do resultado
(LU et al 2000)
4 8 Eletroforese em gel de agarose
Os produtos de DNA PCR e digestatildeo foram analisados em gel de agarose
2 O tempo de corrida do gel eacute de aproximadamente 1hora e 30minutos sendo
que no comeccedilo foi usada agrave voltagem de 50 V e apoacutes comeccedilar a correr o gel
aumentou a voltagem para 100 v Utilizou-se o marcador de 100pb (pares de bases)
Foi adicionado 3microL de corante Bromophenol (que tem a funccedilatildeo de fazer uma ligaccedilatildeo
na amostra de DNA e permitir a visualizaccedilatildeo da corrida no gel de agarose) em 7microL
de amostra tanto de DNA quanto de PCR Para o preparo do gel foi utilizado TBE
42
(Tris- Aacutecido Boacuterico) agarose e brometo de etiacutedio (sua funccedilatildeo eacute de corante para o gel
e permitir a visualizaccedilatildeo do DNA quando colocado agrave luz ultravioleta) Para o oligo
blaKPC a banda da amplificaccedilatildeo foi em 881ppb correspondendo ao plasmiacutedeo Jaacute
o oligo Universal foi em 996 pb
4 9 Descarte de resiacuteduos
Todos os materiais utilizados nos ensaios foram de uso uacutenico e manipulados
em cacircmaras de seguranccedila bioloacutegica classe II Apoacutes o uso foram colocados em
soluccedilatildeo desinfetantes (hipoclorito a 1) e em seguida autoclavados a 127oC por 20
min em sacos apropriados para autoclavaccedilatildeo Apoacutes a finalizaccedilatildeo do ciclo de
esterilizaccedilatildeo os sacos contendo o material descartaacutevel foram colocados em
recipientes de coleta da empresa responsaacutevel pela coleta de materiais bioloacutegicos
produzidos no laboratoacuterio de microbiologia Todos os procedimentos seguiram a
normativa RDC-ANVISA 3062004 sobre o descarte de resiacuteduos de serviccedilo de
sauacutede
4 10 Aspectos epidemioloacutegicos e cliacutenicos
Os aspectos cliacutenicos e epidemioloacutegicos foram investigados por meio de
prontuaacuterios dos pacientes portadores de enterobacteacuterias produtoras de
carbapenemases e envolveram topografia mais provaacutevel do foco infeccioso a
enfermidade motivadora da internaccedilatildeo o desfecho cliacutenico a idade e o tempo de
internaccedilatildeo
4 12 Anaacutelises eepidemioloacutegicas
As anaacutelises foram realizadas com o pacote estatiacutestico SPSS versatildeo 200
Para verificar quais variaacuteveis referentes aos dados epidemioloacutegicos e
microbioloacutegicos influenciaram no desfecho verificou- se a diferenccedila meacutedia das
variaacuteveis idade e tempo de internaccedilatildeo em cada grupo O teste estatiacutestico utilizado foi
o teste t de Student apoacutes se executar o teste de normalidade de Shapiro-Wilk Para
as variaacuteveis sexo perfil microbioloacutegico das enterobacteacuterias produtoras de
43
carbapenemases foi avaliada a associaccedilatildeo com o desfecho por meio do teste Exato
de Fisher O niacutevel de significacircncia adotado foi de 5
4 13 Preceitos eacuteticos
Este projeto estaacute inserido em um projeto maior denominado ldquoEpidemiologia
cliacutenica e caracterizaccedilatildeo molecular do Acinetobacter Baumannii resistente a
antibioticoterapia em pacientes internado em hospitais do Sistema Uacutenico de Sauacutederdquo
que foi submetido ao Comitecirc de Eacutetica em Pesquisa da Secretaria do Estado de
Sauacutede do Distrito Federal (SESDF) e emitido parecer aprovado pelo protocolo nordm
23109 (anexo)
44
5 RESULTADOS
51 Anaacutelise molecular
Para a amplificaccedilatildeo com o oligo blaKPC foram amplificadas amostras
que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 881 pb correspondente ao
plasmiacutedeo A anaacutelise da amplificaccedilatildeo da regiatildeo do gene blaKPC mostrou que
apenas a amostra A10 natildeo amplificou isso demonstra que esta amostra natildeo
possuiacutea o gene de resistecircncia
5 1 1 Gene blaKPC
Figura 7 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 881 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
A amostra A3 natildeo amplificou no primeiro momento entatildeo foi realizado
novamente a PCR e corrida de gel obtendo entatildeo a amplificaccedilatildeo da amostra como
apresentado na figura 8
45
Figura 8 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC da
mostra A3 estudada A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo de 881
pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 1 2 Gene 16S rRNA
Para a amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA utilizou-se o oligo universal Foram
amplificadas amostras que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 996 pb
Figura 9 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
46
Segundo Lu et al (2000) a digestatildeo com a enzima HaeIII deste amplicons de
16S rRNA devolveriam bandas com perfis entre 150 a 200 pb No gel abaixo eacute
possiacutevel evidenciar que este perfil ocorreu com o predomiacutenio de bandas na altura
de 200pb
Figura 10 Gel de agarose a 2 da digestatildeo do amplicon do gene 16S
rRNA das amostras com a enzima HaeIII evidenciando diversos fragmentos
proacuteximos a 200 pb A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo ribossomal
de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 2 Anaacutelises epidemioloacutegicas
5 2 1 Sexo
No total foram detectados 17 isolados de KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 onde a maior a prevalecircncia foi
detecatada em amostras de pacientes do sexo masculino (53) do que no sexo
feminino (47)
47
Figura 11 Isolado de KPC segundo sexo dos 17 pacientes investigados
no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 2 Desfecho cliacutenico
Em 17 isolados de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo
de 2010 aacute 2011 a porcentagem de pacientes que foram a oacutebito (59) foi maior que
a de pacientes que tiverm alta (41)
Figura 12 Isolado de KPC segundo desfecho cliacutenico dos 17 pacientes
investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
48
5 2 3 Local da coleta
Dos 17 episoacutedios detectados de infecccedilatildeo por KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 a infecccedilatildeo em swab retalfoi mais
frequente (47) seguida de ponta de cateacuteter (18) e secreccedilatildeo traqueal (12)
Figura 13 Isolados de KPC segundo local da coleta da amostra nos 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 4 Microorganismo
O microorganismo mais encontrado foi a Klebsiella pneumoniae (82)
seguida da Enterobacter clocae (12) e Serratia marcescens (6) dos 17 isolados
de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 Isto afirma o
fato de a sigla KPC ser utilizada de forma errocircnea aacute Klebsiella pneumoniae visto
que a evidecircncia dela eacute maior em relaccedilatildeo as outras cepas
49
Figura 14 Isolado de KPC segundo microrganismo encontrado em 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 5 Relaccedilotildees variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana e desfecho
cliacutenico
Tabela 6 ndash Distribuiccedilatildeo do perfil geneacutetico sexo coleta tipificaccedilatildeo de
microrganismos e anaacutelise da resistecircncia bacteriana segundo o desfecho
cliacutenico Brasiacutelia-DF 2010 a 2011
Variaacutevel Resultado
Desfecho
Alta Oacutebito
N N P
Gene 16S rRNA Positivo 7 1000 10 1000
NA Gene blaKPC Positivo 6 857 10 1000
Negativo 1 143 0 00 0218 Sexo Feminino 2 286 6 600
Masculino 5 714 4 400 0201 Local da coleta Fundo saco de
Douglas 1 143 0 00
Hemocultura 0 00 1 100 0463 Ponta de cateter 1 143 2 200
Sec TraquealBrocircnquica
0 00 1 100
50
Secreccedilatildeo traqueal 2 286 0 00
Swab retal 3 429 5 500
Urina 0 00 1 100
Microrganismo Enterobacter cloacae (KPC)
1 143 1 100
Klebsiella pneumoniae
6 857 8 800
0416 Serratia
marcescens 0 00 1 100
Teste de Hodge Hodge positivo 7 1000 10 1000
NA Amicacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 1 100 0848 resistente 0 00 1 100
sensiacutevel 2 286 3 300
Amoxicilina Aacutecido Clavulacircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Ampicilina Sulbactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ampicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Aztreonan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefazolina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Cefoperazona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Cefotaxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefoxitina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0509 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 2 286 4 400
Ceftazidima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cetriaxona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 3 429 5 500 0772 Cefalotina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ciprofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772
51
resistente 3 429 5 500
Claritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Clindamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Eritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Gentamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0942 resistente 2 286 3 300
sensiacutevel 1 143 2 200
Imipenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 0 00 2 200 0193 Resistente 1 143 3 300
sensiacutevel 2 286 0 00
Nitrofurantoiacutena sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Norfloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Oxacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Penicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Piperacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Rifampicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tetraciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Ticarcilina Aacutecido Clavulocircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0688 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 3 429 4 400
Tobramicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Trimetoprima Sulfametoxazol
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0112 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 2 286 0 00
Vancomicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tigeciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediario 0 00 1 100 0211 natildeo testado 1 143 4 400
resistente 2 286 0 00
52
Cefepime sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefuroxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Levofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Piperacilina Tazobactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Ertapenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Meropenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0223 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 1 143 0 00
Cefotetan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 sensiacutevel 0 00 1 100
Gemifloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 7 700 0585 natildeo testado 3 429 3 300
Desfecho
Alta Oacutebito
Meacutedia Erro
padratildeo Meacutedia Erro
padratildeo p
Idade 58 9 59 5 0991
Tempo Internaccedilatildeo (dias)
50 13 46 12 0571
n= 17 p(lt 005) NA natildeo se aplica
53
6 DISCUSSAtildeO
Nos uacuteltimos anos houve um aumento na incidecircncia de bacteacuterias
multirresistentes aos antimicrobianos no ambiente hospitalar tornando isto um
problema mundial de sauacutede puacuteblica (HULSCHER et al 2010) Quando se trata
principalmente de bacilos Gram negativos a frequumlecircncia destas bacteacuterias eacute ainda
maior em paiacuteses da Ameacuterica Latina quando comparada a paiacuteses desenvolvidos
(GALES etal 2012)
De acordo com dados do ldquoMeropenem Yearly Susceptibility Test Information
Collectionrdquo (MYSTIC) ocorreu nos Estados Unidos um aumento na susceptibilidade
de K pneumoniae nos uacuteltimos anos graccedilas a praacuteticas de controle de disseminaccedilatildeo
de amostras resistentes(RHOMBERG P R et al 2009) O aumento crescente da
prevalecircncia destes microrganismos foi proporcional ao aumento da dependecircncia do
uso de antibioacuteticos carbapenecircmicos considerados como a opccedilatildeo terapecircutica para o
tratamento de infecccedilotildees por bacilos Gram negativos multi-resistentes (LIVERMORE
2012) Isto afeta diretamente as opccedilotildees de tratamento sobrando poucas alternativas
para a terapecircutica que incluem colistina (polimixina E) e tigeciclina que apresentam
respectivamente problemas em termos de toxicidade e eficaacutecia (LIVERMORE et
al 2011) Um dos efeitos adversos mais importantes das poliminas B e E por
exemplo satildeo a neurotoxicidade e nefrotoxicidade (MENDES C A C et al2009 )
Devido agrave resistecircncia ser usualmente de natureza plasmidial e portanto de
maior disseminaccedilatildeo especialmente quando carreadas por K pneumoniae
microrganismo com uma notoacuteria capacidade para acumular e transferir plasmiacutedeos
com determinantes para resistecircncia o nuacutemero de casos detectados pelo
fenoacutetipogenoacutetipo blaKPC eacute bastante preocupante (MONTEIRO et al 2009)
Comparada com outras bacteacuterias hospitalares a transmissatildeo de clones
multirresistentes de K pneumoniae eacute maior e podem natildeo ser controladas pelos
meacutetodos de controle de infecccedilatildeo hospitalar (PAAUW et al 2007) A forma
plasmidial para transferecircncia da resistecircncia adicionada a este grande potencial para
disseminaccedilatildeo de clones resistentes eacute preocupante visto que apoacutes surtos muitas
vezes pode se tornar endecircmica Jaacute eacute uma realidade a disseminaccedilatildeo desta bacteacuteria
54
entre pacientes hospitais paiacuteses e ateacute mesmo continentes (WOODFORF et al
2010 ROGERS et al 2011)
As chances de surtos satildeo maiores em paiacuteses com poucos recursos devido agrave
maior carecircncia de praacuteticas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees hospitalares e o
uso irracional de antimicrobianos de forma empiacuterica e inadequada (KUMARASAMY
et al 2010) Ateacute o momento os mecanismos de resistecircncia aos cabapenecircmicos
geralmente encontrado eram a produccedilatildeo de ESBL (CTX-M) somada aacute perda de
porina (CARVALHAES et al 2010) Foi notado a partir do ano de 2008 um
aumento no nuacutemero de K pneumoniae produtoras de KPC-2 apresentando outra
forma de resistecircncia (GALES 2012)
Um estudo mostrou que o perfil do paciente colonizado ou infectado por KPC
foi de um paciente entre os 33 e os 82 anos de idade internado haacute mais de 1
semana no hospital A mortalidade geral nos uacuteltimos anos ficou em torno de 7
sendo que dos 77 pacientes estudados 32 (415) pacientes evoluiacuteram para oacutebito
evidenciando a alta morbi-mortalidade associada (ALVES A P et al 2013)
Em estudo com 2316 pacientes avaliados a populaccedilatildeo de sexo masculino foi
de 526 idade meacutedia global de 53 anos (mediana de 55 anos) permanecircncia meacutedia
de 58 dias (mediana de 3 dias) (OLIVEIRA A C et al 2010) Outros trabalhos
apresentaram ausecircncia de significacircncia entre sexoidade e o desenvolvimento de
infecccedilotildees por microrganismos resistentes (PERES-BOTA D et al 2003 COLPAN
A et al 2005 COELLO R et al 1997)
Outro estudo utilizou um total de 30 amostras sendo elas isoladas de urina
escarro secreccedilatildeo pleural ponta de cateter aspirado traqueal e hemocultura A mais
prevalente foi em urina (40) Entre as 30 cepas analisadas a maior porcentagem
foi da cepa Klebsiella pneumoniae (70) Enterobacter sp (133) Klebsiella
ozaenae (10) Escherichia coli (333) e Klebsiella oxytoca (333)
(DIENSTMANN R et al 2010) Nos Estados Unidos a enzima KPC jaacute se tornou
endecircmica Foi realizada uma pesquisa em dois hospitais de Nova York onde
testaram 602 amostras e 45 apresentaram algum mecanismo de resistecircncia
sendo apenas 33 confirmadas por biologia molecular como KPC-2 (BRATU et
al 2005)
55
Estudo sobre os tipos de ESBL feito no Japatildeo apresentou o tipo Toho-1 como
o mais prevalente nessa pesquisa Ateacute o ano de 2000 ano em que foi publicado tal
estudo este era o primeiro relatoacuterio no Japatildeo para identificar derivados de ESBLs
como tipo de SHV e TEM entre E coli e K pneumoniae Em especial o tipo SHV- 12
foi identificado com uma maior frequumlecircncia Estes resultados indicam que tipos
distintos de ESBLs que satildeo diferentes em sua especificidade de substrato e origem
geneacutetica coexistem no Japatildeo Isto mostra a importacircncia de caracterizar genoacutetipos
distintos de ESBLs e de estar em alerta continuamente para as tendecircncias de
ESBLs no Japatildeo aleacutem da necessidade de uma interpretaccedilatildeo uniforme utilizando as
diretrizes do CSLI para relatar cepas produtoras de ESBL Aleacutem da detecccedilatildeo de
ESBLs satildeo necessaacuterias mais informaccedilotildees tais como o perfil de sensibilidade
especiacutefica para diversas β-lactacircmicos e o local da infecccedilatildeo Esses fatores satildeo
essenciais para a escolha adequada de antibioacuteticos (YAGI T et al 2000)
No ano de 2004 uma pesquisa avaliou a produccedilatildeo de uma enzima de
hidroacutelise de carbapenecircmicos atraveacutes da teacutecnica de sequumlenciamento foi revelado
um novo membro da famiacutelia KPC designado KPC- 3 Pesquisadores encontraram
em um mutante de K pneumoniae uma substituiccedilatildeo de um gene associado com
resistecircncia a Imipenem mas essa substituiccedilatildeo foi considerada improvaacutevel na
contribuiccedilatildeo da resistecircncia aos carbapenecircmicos da espeacutecie estudada Aleacutem da
resistecircncia aos carbapenecircmicos estes isolados eram em sua maioria resistentes agraves
cefalosporinas penicilinas e aminoglicosiacutedeos Usando estudos de transformaccedilatildeo
conjugaccedilatildeo e hibridaccedilatildeo localizaram o alelo blaKPC em plasmiacutedeo aleacutem disso
mostraram que esse alelo tambeacutem carregava uma resistecircncia aos aminoglicosiacutedeos
A transferecircncia das enzimas KPCs foi demonstrada in vitro tanto neste como em
outros estudos pode ser que os plasmiacutedeos que fazem esta transferecircncia estavam
comeccedilando a se espalhar no ambiente cliacutenico resultando na multiresistecircncia dessas
estirpes (WOODFORD et al 2004)
O presente estudo apresentou um vieacutes quanto aos resultados dos testes de
susceptibilidade microbiana Observou-se que natildeo foi encontrado resultado deste
teste em algumas amostras o que natildeo cooperou para um estudo mais preciso
futuros estudos quanto agraves amostras e um melhor acompanhamento deste tipo de
patologia Poreacutem mesmo sem algumas amostras com este resultado disponiacutevel foi
56
confirmada a presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos
carbapenecircmicos por meio dos genes de resistecircncia blaKPC e 16S rRNA que as
amostras apresentaram em sua maioria serem portadoras Quanto aos resultados
estatiacutesticos nenhuma das variaacuteveis apresentou significacircncia estatiacutestica (p gt 005)
mostrando assim que estas variaacuteveis isoladas natildeo foram o fator determinante para
o desfecho cliacutenico de alta ou oacutebito
57
7 CONCLUSAtildeO
Os genes blaKPC e 16S rRNA foram caracterizados confirmando a a
presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos carbapenecircmicos
Houve uma maior prevalecircncia da cepa K pneumoniae e isto confirma outros
estudos que apresentam a maior prevalecircncia desta cepa em amostras com KPC
Aleacutem disso isso justifica a forma popular da K pneumoniae ser chamada de KPC
enquanto que na verdade KPC eacute uma enzima podendo estar presente em outras
cepas como Enterobacter clocae tambeacutem apresentada no presente estudo O
desfecho cliacutenico de oacutebitos maior que 50 eacute um possiacutevel indicador sobre a
necessidade de se realizar um teste raacutepido para identificaccedilatildeo de KPC visando
iniciar o mais raacutepido possiacutevel o tratamento afim de diminuir a mortalidade por esta
infecccedilatildeo
Nenhuma das variaacuteveis isoladamente estaacute relacionada ao desfecho cliacutenico
oacutebito ou alta pois natildeo apresentaram relevacircncia estatiacutestica O presente estudo
mostrou que haacute presenccedila da bacteacuteria nas amostras de pacientes do hospital
estudado podendo entatildeo afirmar que este tipo de bacteacuteria se encontra tambeacutem
presente em ambiente hospitalar O uso irracional de antimicrobiano eacute demonstrado
de forma indireta quando foi apresentado atraveacutes do Teste de Hodge Modificado
uma resistecircncia de 100 aos antibioacuteticos carbapenecircmicos Isto tambeacutem reflete na
terapecircutica sendo que pacientes portadores de bacteacuterias resistentes aos
antibioacuteticos carabepecircmicos tem uma escassa opccedilatildeo de tratamento e as opccedilotildees
apresentam problemas quanto agrave toxicidade e eficaacutecia
58
REFEREcircNCIAS
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Mecanismos
de resistecircncia bacteriana aos antimicrobianos Disponiacutevel em
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controleopas_
webmodulo3mec_sitiohtmgt Acesso em 25 de abril de 2014
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Nota teacutecnica nordm
012013 medidas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees por enterobacteacuterias
multiresistentes Acesso em 17 de abril de 2013
ALBA J et al Kinetics study of KPC-3 a plasmid-encoded class A
carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase Antimicrob Agents Chemother
Nov49(11)4760-2 2005
ALVES A P et al Nosocomial infections by KPC-producing enterobacteria in
a tertiary hospital in Southern Brazil Revista da AMRIGS Porto Alegre 57 (3) 213-
218 jul-set 2013
ALVES A et al Tipagem Geneacutetica de Microrganismos Lab De Diversidade
Microbiana Centro de Biologia Celular Dep de Biologia U de Aveiro 3810-193
Aveiro- 2003
BELL J M et Al Prevalence and significance of a negative extended-
spectrum beta-lactamase (ESBL) confirmation test result after a positive ESBL
screening test result for isolates of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae
results from the SENTRY Asia-Pacific Surveillance Program J Clin Microbiol
May45(5)1478-82 2007
BRATU S et al Detection of KPC carbapenem-hydrolyzing enzymes in
Enterobacter spp from Brooklyn New York Antimicrob Agents Chemother v 49 n
2 p 776-8 2005
59
BRATU S et al Emergence of KPC-possessing Klebsiella pneumoniae in
Brooklyn New York epidemiology and recommendations for detection Antimicrob
Agents Chemother v 49 n 7 p 3018-20 2005
BRATU S et al Rapid spread of carbapenem-resistant Klebsiella
pneumoniae in New York City Arch Intern Med v 165 p 1430-5 2005
CAMARGO C F et al Aplicaccedilatildeo das teacutecnicas de pcr e suas teacutecnicas
derivadas em diagnoacutestico molecular Disponiacutevel em
ltfileDUnB10C2BA20semestreArtigosPCR-
20CLEYTON20FLORENCIO20DE20CAMARGO20E20PAULO20ROB
ERTO20QUEIROZpdfgtgt Acesso em 08 de abril de 2014
CARVALHES C G et al Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting
carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive
results Journal of Antimicrobial Chemotherapy v 65 n2 p 249-251 2010
CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION- CDC Modified
Hodge Test for Carbapenemase Detection in Enterobacteriaceae 2004
CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE Methods for
dilutionantimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically Approved
standard M7ndashA7 7th ed CLSI Wayne PA 2011
COELLO R et al Risk factors for developing clinical infection with methicillin-
resistant Staphylococcus aureus (MRSA) amongst hospital patients initially only
colonized with MRSA J Hosp Infect 19973739-46
COLPAN A et al Evaluation of risk factors for mortality in intensive care
units A prospective study from a referral hospital in Turkey Am J Infect Control
200533(1)42-7
60
CORNAGLIA G et al Living with ESBLs Introduction Clinical Microbiology
and Infection 14 Suppl 1 1-2 2008
COTRIM E R et al Klebsiella pneumoniae carbapenemase ndash KPC em
Enterobacteriaceae o desafio das bacteacuterias multirresistentes Poacutes em revista do
centro universitaacuterio Newton Paiva 12012 - ediccedilatildeo 5 - issn 2176 7785
DESHPANDE L M et al Occurrence and characterization of
carbapenemase-producing Enterobacteacuteriaceae report from the SENTRY
Antimicrobial Surveillance Program (2000-2004) Microb Drug Resist 12(4)223-30
2006
DIAS D J A Estudos dos principais mecanismos de resistecircncia aos
antibioacuteticos β-lactacircmicos em bacteacuterias patogecircnicas gram negativas 2009 100 f
Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Geneacutetica Molecular e Biomedicina) ndash Faculdade de
Ciecircncias e Tecnologia Universidade de Nova Lisboa Lisboa
DIENSTMANN R et al Avaliaccedilatildeo fenotiacutepica da enzima Klebsiella
pneumoniae carbapenemase (KPC) em Enterobacteriaceae de ambiente hospitalar
J Bras Patol Med Lab v 46 n 1 p 23-27 fevereiro 2010
ENDIMIAMI A et al Emergence of blaKPC-containing Klebsiella
pneumoniae in a long-term acute care hospital a new challenge to our healthcare J
Antimicrob Chemother 64 1102-1110 Nov 2009
FALAGAS M E et al Extended-spectrum beta-lactamase producing
organisms The Journal of Hospital Infection 73 (4) pp 345-54 2009
FONTANA C et al Emergence of KPC-producing Klebsiella pneumoniae in
Italy BMC Rev Notes 3 40 2010
61
GALES A C et al Antimicrobial resistance among Gram-negative bacilli
isolated from Latin America results from Sentry Antimicrobial Surveillance Program
(Latin America 2008-2010) Diagnostic Microbiology and Infectious Disease v 3 n
4 p 354 -360 2012
GUPTA N et al Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Epidemiology
and Prevention HEALTHCARE EPIDEMIOLOGY Clinical Infectious Diseases
201153(1)60ndash67 Published by Oxford University Press on behalf of the Infectious
Diseases Society of America 2011
HARBOTTLE H et al Genetics of antimicrobial resistance Anim Biotechnol
n17 p111-124 2006
HENRIQUE W N et al RESISTEcircNCIA BACTERIANA Uniatildeo das
Faculdades Alfredo NasserInstituto de Ciecircncias da Sauacutede Disponiacutevel em lt
httpwwwfaculdadealfredonasseredubrfilespesquisaposter20HENRIQUE20
Wilker20Natividade20SANTIAGO20Silvania20CAVALCANTI20DSP
20ResistC3AAncia20Bacterianapdfgt Acesso em 17 marccedilo 2014
HULSCHER M E J I et al Antibiotic prescribing in hospital a social and
behavioral scientific approach The Lancet Infectious Diaseases v 10 n 3 p 167-
165 2010
KIDWAI M SAPRA P BHUSHAN KR Synthetic strategies and medicinal
properties of beta-lactams Curr Med Chem 1999 695-215
KUMARASAMY K K et al Emergence of a new antibiotic resistance
mechanism in India Pakistan and the UK a molecular biological and
epidemiological stuy The Lancet Infectious Diseases v10 n 9 p 597- 602 2010
LINCOPAN N et al Enterobacteacuteria producing extended-spectrum β-
lacatamases and IMP-1 Metalo-β-lactamases isolated from Brazilian hospitals J Med
62
Microbiol 7 1-3 2006
LINCOPAN N et al First Isolation of Metalo-β-Lacatamase-Producing
Multiresistant Klebsiella pneumoniae from a patient in Brazil J Clin Microbiol 43(1)
516-519 2005
LIVERMORE D M et al What remains against carbapenem- resistant
Enterobacteriaceae Evaluation of choramphenicol ciprofloxacin colistina
fosfomycin minocycline nitrofurantoin temocilin and tigecycline International
Journal of Antimicrobial Agents v 37 n 5 p 415- 459 2011
LIVERMORE D M Fourten years in resistance International Journal of
Antimicrobial Agents v 39 283- 294 2012
LIVERMORE D M Bacterial resistance to carbapenems Adv Exp Med Biol
1995 39025-47
LIVERMORE D M Bacterial resistance origins epidemiology and impact
Clin Infect Dis 36S11-S23 2003
LIVERMORE D M et al Carbapenemases a problem in waiting Curr
Opin Microbiol 2000 3489-95
LU et al Universal pcr for common bacterial pathogens J CLIN
MICROBIOL VOL 38 2000
LU et al Use of PCR with Universal Primers and Restriction Endonuclease
Digestions for Detection and Identification of Common Bacterial Pathogens in
Cerebrospinal Fluid Journal of Clinical Microbiology June 2000 p 2076ndash2080
MARSCHALL J Met al Presence of the KPC Carbapenemase Gene in
Enterobacteriaceae Causing Bacteremia and Its Correlation with In Vitro
Carbapenem Susceptibility J Clin Microbiol 47 239-241 Jan 2009
63
MARTINS WMBS et al Prevalecircncia do gene blaKPC em isolados cliacutenicos
de Enterobacteriaceae e natildeo fermentadores encontrados em amostras clinicas em
um hospital universitaacuterio do Recife X Jornada de ensino pesquisa e extensatildeo ndash
JEPEX 2010 ndash UFRPE Recife 18 a 22 de outubro
MENDES C A C et al Polimixinas Revisatildeo com ecircnfase na sua
nefrotoxicidade Rev Assoc Med Bras 2009 55(6) 752-9
MOHR J F 3rd Update on the efficacy and tolerability of meropenem in the
treatment of serious bacteacuterial infections Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S41-51
2008
MONTEIRO J et al First report of KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae
strains in Brazil Antimicrob Agents Chemother Jan53(1)333-4 2009
MOREIRA V C et al Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia a antibioacuteticos
Disponiacutevel em
lthttpwwwcpglsucgbr6mostraartigosSAUDEVANESSA20CARVALHO20M
OREIRApdfgt Acesso em 21 marccedilo 2014
NETIKUL T et al Emergence of novel blaKPC-12 and blaKPC-13 variants in
carbapenem non-susceptible Enterobacter cloacae a first report of blaKPC gene in
Thailand European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases May
S372 2011
NETO V A et al Antibioacuteticos na praacutetica Meacutedica 6ordf Ediccedilatildeo Editorial
SarverSP Brasil 2007
NICOLAU D P Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of
meropenem Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S32-40 2008
64
OLIVEIRA A C et al Resistecircncia bacteriana e mortalidade em um centro de
terapia intensiva Rev Latino-Am Enfermagem nov-dez 2010
PAAUW A et al Failure to control an outbreak of qnrA 1-positive multidrug-
resistant Enterobacter clocae despite adequate implementation of recommended
infection control measures Journal of Clinical Microbiology v 45 n 5 p 1420-1425
2007
PATERSON D L et al Extended-Spectrum Beta-Lactamases a Clinical
Update Clinical Microbiology Reviews v 18 p 657-686 2005
PEIRANO G et al Carbapenem-hydrolysing beta-lactamase KPC-2 in
Klebsiella pneumonia isolated in Rio de Janeiro Brazil J Antimicrob Chemother Nov
20 2009
PERES-BOTA D et al Are infections due to resistant pathogens associated
with worse outcome in critically ill patients J Infect 200347(4)307-16
PIDDOCK L J V Clinically relevant chromosomally encoded multidrug
resistance effl ux pumps in bacterial Clin Microbiol Rev n19 p382-402 2006
PITOUT J D D et al Emergence of Enterobacteriaceae producing
extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) in the community J Antimicrob
Chemother May 56 2005
POSSEBON M I et al Resistecircncia bacteriana aos carbapenecircmicos
Bacterial resitence to carbapenems RBM rev bras med60(6)378380-378-382
jun 2003
QUEENAN A M et al Carbapenemases the versatile beta-lactamases
Clin Microbiol Rev Jul20(3)440-58 2007
65
RHOMBERG P R et al Summary trends for the meropenem yearly
susceptibility test information collection program a 10- year experience in the United
States (1999-2008) Diagnostic Microbiology and Infectiois Disease v 65 n4 p
414-426 2009
ROBLEDO I E et al Detection of KPC in Acinetobacter spp in Puerto Rico
J Antimicrob Agents Chemother 54 1354-1357 Mar 2010
ROGERS B A et al Country-to-country transfer os patients and the risk of
multi-resistant bacterial infection Clinical Infectious Disease v53 n1 p49- 56
2011
SHAH A A et al Characteristics epidemiology and clinicalimportance of
emerging strains of Gram-negative bacilli producing extended-spectrum
betalactamases Research in Microbiology v 155 p 409-421 2004
TURNER P J Extended- Spectrum Beta-Lactamases Clinical Infectious
Diseases v 41 p 273-275 2005
WOLTER D J et al Phenotypic and Enzymatic Comparative Analysis
between the Novel KPC variant KPC-5 and Its Evolutionary Variants KPC-2 and
KPC-4 Antimicrob Agents Chemother Nov 17 2008
WOODFORD N et al Carbapenemases of Chryseobacterium
(Flavobacterium) meningosepticum distribution of blaB and characterization of a
novel Metalo-beta-lactamase gene blaB3 in the type strain NCTC 10016
Antimicrob Agents Chemother Jun44(6)1448-52 2000
WOODFORF N Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in
India Pakistan and the UK a molecular biological and epidemiological study The
Lancet Infectious Diseases v 10 n 9 p 597-602 2010
66
WOODFORD et al Outbreak of Klebsiella pneumoniae Producing a New
Carbapenem- Hydrolyzing Class A β-Lactamase KPC-3 in a New York Medical
Center Antimicrobial agents and chemotherapy Dec 2004 p 4793ndash4799 Vol 48
No 12
YAGI T et al A preliminary survey of extended-spectrum β-lactamases
(ESBLs) in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Japan
FEMS Microbiology Letters 184 (2000) 53-56
YIGIT H et al Novel carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase KPC-1 from
a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumonia J Antimicrob Agents
Chemother 45 (4) 1151-1161 (2001)
ZAVASCKI A P et al KPC-2- producing Enterobacter cloacae in two cities
from Southern Brazil Int J Antimicrob Agents Apr 28 2009
ZHANEL G G et al Comparative review of the carbapenecircmicos Drugs
67(7)1027-52 2007
67
ANEXOS
Sequumlecircncia do oligo blaKPC
Query 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
Query 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
Query 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
68
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
Query 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
Query 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
69
Query 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
Query 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
Query 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
70
Sbjct 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
Query 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
Query 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
Query 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
71
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
Query 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
Query 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
72
Query 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
Query 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
Query 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
73
Sbjct 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
Query 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
Query 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
Query 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
74
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
Query 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
Query 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
75
Query 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
Query 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
||||
Sbjct 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
LOCUS AF297554 1377 bp
DNA linear BCT 26-MAR-2001
DEFINITION Klebsiella pneumoniae carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
gene complete cds
ACCESSION AF297554
VERSION AF2975541 GI10121874
76
KEYWORDS
SOURCE Klebsiella pneumoniae
ORGANISM Klebsiella pneumoniae
Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Enterobacteriaceae Klebsiella
REFERENCE 1 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH QueenanAM
AndersonGJ Domenech-SanchezA
BiddleJW StewardCD
AlbertiS BushK and TenoverFC
TITLE Novel carbapenem-hydrolyzing beta-
lactamase KPC-1 from a
carbapenem-resistant strain of
Klebsiella pneumoniae
JOURNAL Antimicrob Agents Chemother 45 (4)
1151-1161 (2001)
PUBMED 11257029
REFERENCE 2 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH AndersonGJ and
TenoverFC
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (19-AUG-2000) Nosocomial
Pathogens Laboratory Branch
Centers for Disease Control and
Prevention 1600 Clifton Rd MS
G08 Atlanta GA 30333 USA
FEATURES LocationQualifiers
77
source 11377
organism=Klebsiella
pneumoniae
mol_type=genomic DNA
db_xref=taxon573
-35_signal 5560
-10_signal 7883
mRNA 921012
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
RBS 117122
CDS 1311012
note=blaKPC-1
codon_start=1
transl_table=11
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
protein_id=AAG134101
db_xref=GI10121875
translation=MSLYRRLVLLSCLSWPLAGFSATALTNLVAEPFAKLEQD
FGGSI
GVYAMDTGSGATVSYRAEERFPLCSSFKGFLAAAVLARSQQQAGLLDTPIRYG
KNALV
PWSPISEKYLTTGMTVAELSAAAVQYSDNAAANLLLKELGGPAGLTAFMRSIG
DTTFR
78
LDRWELELNSAIPSDARDTSSPRAVTESLQKLTLGSALAAPQRQQFVDWLKGN
TTGNH
RIRAAVPADWAVGDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTRAPNKDDK
HSEAV
IAAAARLALEGLGVNGQ
ORIGIN
1 cggggcagtt acagccgtta cagcctctgg
agagggagcg gcttgccgct cggtgataat
61 cccagctgta gcggcctgat tacatccggc
cgctacacct agctccacct tcaaacaagg
121 aatatcgttg atgtcactgt atcgccgtct
agttctgctg tcttgtctct catggccgct
181 ggctggcttt tctgccaccg cgctgaccaa
cctcgtcgcg gaaccattcg ctaaactcga
241 acaggacttt ggcggctcca tcggtgtgta
cgcgatggat accggctcag gcgcaactgt
301 aagttaccgc gctgaggagc gcttcccact
gtgcagctca ttcaagggct ttcttgctgc
361 cgctgtgctg gctcgcagcc agcagcaggc
cggcttgctg gacacaccca tccgttacgg
421 caaaaatgcg ctggttccgt ggtcacccat
ctcggaaaaa tatctgacaa caggcatgac
481 ggtggcggag ctgtccgcgg ccgccgtgca
atacagtgat aacgccgccg ccaatttgtt
541 gctgaaggag ttgggcggcc cggccgggct
gacggccttc atgcgctcta tcggcgatac
79
601 cacgttccgt ctggaccgct gggagctgga
gctgaactcc gccatcccaa gcgatgcgcg
661 cgatacctca tcgccgcgcg ccgtgacgga
aagcttacaa aaactgacac tgggctctgc
721 actggctgcg ccgcagcggc agcagtttgt
tgattggcta aagggaaaca cgaccggcaa
781 ccaccgcatc cgcgcggcgg tgccggcaga
ctgggcagtc ggagacaaaa ccggaacctg
841 cggagtgtat ggcacggcaa atgactatgc
cgtcgtctgg cccactgggc gcgcacctat
901 tgtgttggcc gtctacaccc gggcgcctaa
caaggatgac aagcacagcg aggccgtcat
961 cgccgctgcg gctagactcg cgctcgaggg
attgggcgtc aacgggcagt aaggctctga
1021 aaatcatcta ttggcccacc accgccgccc
ttgcgggcgg catggattac caaccactgt
1081 cacatttagg ctaggagtct gcgcggcaga
gccgtgtgac cggttttctg tagagcactg
1141 acgatggcgg cggcgctctc tgcaattggc
aaggcgtcgg cgccaaggat accaatcttg
1201 cggcgcgcgg cgtgttatga cgactggggt
gcatttgagc cgccccattt aaccttcgcc
1261 ctcacagata cgccattcgc ctcaaattta
gcgccatgca gacgagcttc cactcggctt
1321 gcaccttgtc caggcccctc atgctgaact
gacgcaatcc catcaccgcc ttgatca
80
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Criteacuterios Interpretativos para testes de sensibilidade
Tabela 2 Nuacutemero de acesso ao GenBank dos alelos blaKPC e seus microrganismos
originais
Tabela 3 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do gene blaKPC
Tabela 4 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do gene
universal
Tabela 5 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da digestatildeo do gene universal
Tabela 6 - Distribuiccedilatildeo das variaacuteveis estudadas perfil geneacutetico sexo coleta
tipificaccedilatildeo de microrganismos e anaacutelise da resistecircncia bacteriana segundo o
desfecho cliacutenico Brasiacutelia-DF 2010 a 2012
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AmpC- Adenosina Monofosfato Ciacuteclico
BRMD- Bacteacuterias multirresistentes
CCIH- Comissatildeo de Controle de Infecccedilatildeo Hospitalar
CDC- Centers for Disease Control and Prevention
CIM- Concentraccedilatildeo Inibitoacuteria Miacutenima
CLSI- Clinical and Laboratory Standards Institute
DNA- Aacutecido Desoxirribonucleacuteico
E coli- Escherichia coli
ERIC-PCR - Enterobacterial Repet it ive Intergenic Consensus
ESBL- Beta-Lactamases de Espectro Estendido
Et al- e outros
ETP- Ertapenem
HRAN- Hospital Regional da Asa Norte
K ornithinolytica- Klebsiella ornithinolytica
K oxytoca- Klebsiella oxytoca
K planticola- Klebsiella planticola
K pneumoniae- Klebsiella pneumoniae
K terrigena- Klebsiella terrigena
KPC - Klebsiella pneumoniae produtora de Carbapenemase
KPCNEG- Bacilos Gram-Negativos Natildeo Fermentadores
KPCPOS- Bacilos Gram-Positivo Natildeo Fermentadores
MBL- metalo-beta-lactamases
MEM- Meropenem
NA- Natildeo se aplica
Oligo- Oligonucleotiacutedeos
PB- Pares de Bases
PBPs (Penicilim-Binding-Protein)- Proteiacutenas de ligaccedilatildeo agrave penicilina
PCR- Polymerase Chain Reaction (Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase)
PFGE - Pulsed-Field Gel Electrophoresis (Eletroforese em campo pulsado)
RAPD- Randomly Amplified Polymorphic DNA (DNA polimoacuterfico amplificado
aleatoriamente)
RFLPrsquos - ldquoRestriction Fragment Length Polymorphismsrdquo( polimorfismos de tamanho
de fragmentos de restriccedilatildeo)
THM- Teste de Hodge Modificado
TSA- Teste de Susceptibilidade aos Antibioacuteticos
UTI- Unidade de Terapia Intensiva
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 15
11 Klebsiella pneumoniae produtora de Carbapenemase (KPC) 15
1 2 Resistecircncia bacteriana 20
13 Anaacutelise geneacutetica de microrganismos 27
2 JUSTIFICATIVA 30
3 OBJETIVOS 31
31 Objetivo geral 31
32 Objetivos Especiacuteficos 31
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS 32
4 1 Coleta e transporte das amostras bioloacutegicas 32
4 2 Procedimentos para confirmaccedilatildeo de resistecircncia bacteriana por disco de
Ertapenem (adaptado CDC 2004) 32
4 2 1 Interpretaccedilatildeo dos Resultados 33
4 3 Teste de susceptibilidade aos antibioacuteticos 34
4 4Teste de Hodge Modificado (THM) (adaptado CDC 2004) 35
441 Controle de qualidade (CQ) 35
442 InterpretaccedilatildeoResultados 35
4 5 Extraccedilatildeo de DNA bacteriano 37
4 6 Iniciadores e reaccedilatildeo de PCR 38
4 7 Digestatildeo 41
4 8 Eletroforese em gel de agarose 41
4 9 Descarte de resiacuteduos 42
4 10 Aspectos epidemioloacutegicos e cliacutenicos 42
4 12 Anaacutelises estatiacutesticas 42
4 13 Preceitos eacuteticos 43
5 RESULTADOS 44
51 Anaacutelise molecular 44
5 1 1 Gene blaKPC 44
5 1 2 Gene 16S rRNA 45
5 2 Anaacutelises epidemioloacutegicas 46
5 2 1 Sexo 46
5 2 2 Desfecho cliacutenico 47
5 2 3 Local da coleta 48
5 2 4 Microrganismo 48
6 DISCUSSAtildeO 53
7 CONCLUSAtildeO 57
15
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC)
Klebsiella pneumoniae pertence aacute famiacutelia Enterobacteriaceae
encontrado em locais como aacutegua solo plantas e esgoto Satildeo encontradas cinco
espeacutecies K pneumoniae K oxytoca K planticola K terrigena e K ornithinolytica
O gecircnero Klebsiella eacute definido como contendo bacilos Gram-negativos natildeo moacuteveis
em forma de bastatildeo e geralmente encapsuladas que produzem lisina
descarboxilase mas natildeo produzem ornitina descarboxilase Provavelmente a
colonizaccedilatildeo em seres humanos ocorre por contato com as diferentes fontes
ambientais podendo ser encontrada colonizando a orofaringe e fezes de pessoas
sadias Pessoas imunocomprometidas a bacteacuteria encontra um ambiente favoraacutevel
para seu crescimento levando aos quadros de infecccedilatildeo (MOREIRA et al 2014)
A Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) eacute uma enzima produzida por
enterobacteacuterias gram-negativas sendo um mecanismo de resistecircncia aos antimi-
crobianos carbapenecircmicos meropenen ertapenen eou imipenen classe
amplamente utilizada no tratamento de infecccedilotildees envolvendo Enterobacteriaceae
Ela tambeacutem eacute capaz de inativar os agentes β-lactacircmicos cefalosporinas penicilinas
e o aztreonam (COTRIM et al 2012)
Devido agrave semelhanccedila estrutural e estereoquiacutemica os antibioacuteticos beta-
lactacircmicos possuem um mecanismo de accedilatildeo comum ao grupo Eles atuam inibindo
a siacutentese da parede celular bacteriana atraveacutes do mecanismo de bloqueio da
transpeptidaccedilatildeo responsaacutevel pela uniatildeo dos componentes individuais do
peptidoglicano conforme demonstrado na figura 1 (KIDWAI et al 1999)
A accedilatildeo destes antibioacuteticos eacute atraveacutes de ligaccedilotildees covalentes com as proteiacutenas
as Penicilim-Binding-Protein (proteiacutena de ligaccedilatildeo da penicilina- PBP ou PLP) que se
encontram presentes na membrana citoplasmaacutetica de todas as bacteacuterias Devido agraves
mutaccedilotildees ocorre uma induccedilatildeo na alteraccedilatildeo dessas proteiacutenas podendo determinar
uma diminuiccedilatildeo da afinidade dos beta-lactacircmicos agraves mesmas A accedilatildeo dos
carbapenecircmicos eacute atraveacutes da sua ligaccedilatildeo agraves PBPs presentes na parede bacteriana
especialmente as PBP1 e PBP2 provocando a lise osmoacutetica da bacteacuteria Aleacutem
disso eles tecircm uma facilidade na penetraccedilatildeo da bacteacuteria por meio dos canais
poriacutenicos presentes nas bacteacuterias gram-negativas induzindo um efeito poacutes-
16
antibioacutetico Quando comparados com outros beta-lactacircmicos os carbapenecircmicos
satildeo mais resistentes agrave hidroacutelise pela maioria das beta-lactamases tanto
cromossocircmicas como plasmiacutedicas (LIVERMORE 1995 LIVERMORE et al 2000)
Figura 1 Accedilatildeo do szlig-lactacircmico sobre a bacteacuteria gram-positiva e gram-
negativa Fonte
ltlthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controle
opas_webmodulo3gramn_lacta2htmgt (adaptado)
A bacteacuteria Klebsiella pneumoniae quando apresenta gene ESBL pode
expressar resistecircncia a ateacute 95 dos antimicrobianos existentes no acircmbito
farmacecircutico sendo a produccedilatildeo de beta-lactamases de espectro estendido (ESBL)
17
por esta bacteacuteria uma das principais causas de falha terapecircutica Existem outras
formas de resistecircncia emergentes de grande importacircncia como a produccedilatildeo de
beta-lactamases tipo adenosina monofosfato ciacuteclico (AmpC) que hidrolizam
cefoxitina as carbapenemases como as metalo-beta-lactamases (MBL) e
carbapenemases tipo KPC (MOREIRA et al 2014)
O mecanismo de resistecircncia mais comum aos antibioacuteticos beta-lactacircmicos de
amplo espectro eacute a produccedilatildeo de ESBL por enterobacteacuterias A accedilatildeo hidroliacutetica
apresentadas por estas enzimas pode conferir clinicamente resistecircncia ao
aztreonam cefalosporina e a todas as penicilinas (PATERSON et al 2005) As
ESBL satildeo enzimas mediadas por genes plasmidiais (transmissiacuteveis entre as
espeacutecies) Os principais microrganismos produtores de ESBL satildeo Klebsiella
pneumoniae (mais encontrada) Escherichia coli e Proteus mirabilis podendo ocorrer
em outros membros da famiacutelia Enterobacteriaceae e em alguns microrganismos natildeo
enteacutericos como Acinetobacter ssp (TURNER 2005) A importacircncia cliacutenica meacutedica
destes microrganismos portadores de ESBL eacute que graccedilas aacutes suas resistecircncias a
muitas classes de antimicrobianos o tratamento de infecccedilotildees eacute difiacutecil gerando um
aumento da morbidade e mortalidade dos pacientes (SHAH et al 2004)
A enzima KPC foi detectada pela primeira vez na Carolina do Norte Costa
Leste dos Estados Unidos no ano de 1996 em Klebsiella pneumoniae dando entatildeo
este nome a enzima Em pouco tempo ela disseminou por outras regiotildees e
recentemente tornou-se uma das preocupaccedilotildees quanto agrave sauacutede puacuteblica mundial
Os paiacuteses de onde KPCs tecircm sido relatados desde 2001 satildeo mostrados na figura 2
apresentando como os organismos tecircm agora sido disseminados amplamente pelo
mundo (NEIL GUPTA et al 2011)
18
Figura 2 Divulgaccedilatildeo internacional de Enterobacteriaceae produtora de
Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC)( NEIL GUPTA et al 2011)
Este mapa apresenta paiacuteses onde Enterobacteriaceae produtoras KPC de
foram descritos em relatoacuterios publicados disponiacuteveis a partir de 11 fevereiro de
2011 Os paiacuteses natildeo destacadas nesta figura tambeacutem podem apresentar a presenccedila
de Enterobacteriaceae produtoras de KPC poreacutem pode ter tido uma falta de
vigilacircncia sistemaacutetica para estes organismos ( NEIL GUPTA et al 2011)
No ano de 2005 foram registradas pela primeira vez essas bacteacuterias
produtoras de carbapenemases Apoacutes 6 anos deste primeiro relato elas passaram a
causar surtos mais graves em nosso paiacutes Em janeiro de 2011 foram notificados no
Distrito FederalBrasil 367 casos em um curto espaccedilo de tempo (01 a 08 de janeiro
de 2011) com 26 oacutebitos A maior parte destes casos (263 casos) foi identificada nas
unidades de terapia intensiva ndash UTI (COTRIM et al 2012)
O potencial de disseminaccedilatildeo da KPC eacute alto devido agrave grande capacidade de
transferecircncia do seu material geneacutetico e por conseguinte os genes de resistecircncia
O controle de epidemias eacute difiacutecil devido a esta caracteriacutestica de faacutecil disseminaccedilatildeo
preocupando os profissionais da aacuterea de sauacutede devido agrave dificuldade de tratamento
podendo resultar em um aumento das taxas de mortalidade Apesar da maior
19
frequumlecircncia em Klebsiella pneumoniae a KPC pode ser identificada em outras
bacteacuterias como a Enterobacter cloacae Citrobacter freundii Salmonella spp E coli
e Pseudomonas spp (DIENSTMANN et al 2010)
Os pacientes com comorbidades incluindo pacientes transplantados
neutropecircnicos em ventilaccedilatildeo mecacircnica em Unidade de Terapia Intensiva (UTI)
com longos periacuteodos de internaccedilatildeo que apresentam risco aumentado de infecccedilatildeo ou
colonizaccedilatildeo para bacteacuterias multirresistentes satildeo mais vulneraacuteveis a Klebsiella
pneumoniae produtora de KPC (COTRIM et al 2012)
Os sinais e sintomas apresentados por um indiviacuteduo infectado por KPC satildeo
febre ou hipotermia taquicardia piora do quadro respiratoacuterio e em casos mais
graves hipotensatildeo inchaccedilo e sepse Quanto ao siacutetio de infecccedilatildeo a bacteacuteria que
possui a enzima KPC pode causar pneumonia associada agrave ventilaccedilatildeo mecacircnica
infecccedilatildeo do trato urinaacuterio infecccedilatildeo de corrente sanguiacutenea infecccedilatildeo de partes moles
e outros tipos de infecccedilatildeo (COTRIM et al 2012)
Para desenvolver a infecccedilatildeo a colonizaccedilatildeo eacute um preacute-requisito poreacutem o
pacientes pode estar colonizado ou seja ser portadores de KPC e natildeo desenvolver
a infecccedilatildeo (ALVES et al 2013) A forma de transmissatildeo eacute basicamente por
contato com secreccedilatildeo ou excreccedilatildeo de pacientes infectados ou colonizados logo
fora do ambiente hospitalar a bacteacuteria natildeo representa perigo (COTRIM et al
2012)
As opccedilotildees terapecircuticas para o tratamento da Klebsiella pneumoniae eacute
dividida em Terapia Empiacuterica e Terapia apoacutes a determinaccedilatildeo do perfil de
sensibilidade A terapia empiacuterica para infecccedilotildees por enterobacteacuterias multirresistentes
se baseia na utilizaccedilatildeo de polimixina B ou polimixina E (Colistina) em associaccedilatildeo
com um (1) ou mais dos antimicrobianos da classe dos aminoglicosiacutedeos
(gentamicina ou amicacina) Carbapenecircmicos (meropenem ou doripenem) eou
tigeciclina (ANVISA 2013)
Recomenda-se usar sempre associaccedilotildees de dois ou trecircs antimicrobianos
sendo um deles a polimixina B ou a polimixina E (colistina) Deve-se evitar a
utilizaccedilatildeo de monoterapias pelo risco de raacutepido desenvolvimento de resistecircncia A
escolha do(s) faacutermaco(s) de associaccedilatildeo com polimixina B ou E deve se basear
preferencialmente no perfil de susceptibilidade esperado aos referidos
20
medicamentos das enterobacteacuterias resistentes aos carbapenecircmicos detectadas no
hospital ou na ausecircncia de dados locais na regiatildeo Deve-se considerar igualmente
o local de infecccedilatildeo e a penetraccedilatildeo esperada do antimicrobiano na escolha da droga
a ser utilizada na combinaccedilatildeo (ANVISA 2013)
Apoacutes a liberaccedilatildeo do perfil de sensibilidade deve-se adequar o uso dos
medicamentos Sempre que possiacutevel manter no miacutenimo 2 (dois) faacutermacos com
sensibilidade comprovada in vitro Natildeo havendo sensibilidade a um segundo
medicamento (suscetibilidade apenas agrave polimixina B ou E) recomenda-se manter a
terapia combinada de polimixina B ou E com carbapenecircmicos (meropenem ou
doripenem) ou tigeciclina na tentativa de ocorrecircncia de sinergismo entre elas
(ANVISA 2013)
Sugere-se aleacutem da determinaccedilatildeo das Concentraccedilotildees Inibitoacuterias Miacutenimas
(CIMs) para uma das polimixinas (B ou E) que tambeacutem sejam determinadas as
CIMs de tigeciclina e carbapenecircmicos (meropenem) bem como a consultoria de um
infectologista (ou Comissatildeo de Controle de Infecccedilatildeo Hospitalar- CCIH) para a
determinaccedilatildeo da terapia combinada com base na interpretaccedilatildeo do antibiograma
CIM e quadro cliacutenico do paciente No caso de resistecircncia agraves polimixinas
(concentraccedilotildees inibitoacuterias miacutenimas [CIMs] gt 2 mgL) recomenda-se a associaccedilatildeo de
dois ou trecircs do antimicrobianos sugeridos para a combinaccedilatildeo (ANVISA 2013)
A antissepsia eficiente do ambiente dos instrumentos ciruacutergicos e das matildeos
com o uso do aacutelcool a 70 eacute fundamental para a contenccedilatildeo de surtos Aleacutem disto
os pacientes contaminados devem permanecer isolados ateacute o controle da infecccedilatildeo
para evitar a disseminaccedilatildeo da bacteacuteria (COTRIM et al 2012)
1 2 Resistecircncia bacteriana
Hoje a disseminaccedilatildeo e a proliferaccedilatildeo das bacteacuterias resistentes estatildeo cada
dia mais presente As bacteacuterias multirresistentes (BRMD) poderatildeo levar agrave
humanidade a uma era poacutes-antibioacutetica resultando em uma ausecircncia de qualquer
opccedilatildeo de tratamento para os portadores destas cepas (HENRIQUE et al 2014)
Os fatores envolvidos na disseminaccedilatildeo desses patoacutegenos multirresistentes
satildeo diversos incluindo o uso irracional de antimicrobianos procedimentos invasivos
21
(cirurgias implantaccedilatildeo de proacuteteses meacutedicas e outros) e a transferecircncia de material
geneacutetico com a informaccedilatildeo de resistecircncia a antibioacuteticos entre as bacteacuterias
(DIENSTMANN et al 2010 ENDIMIAMI et al 2009 FONTANA et al 2010)
Com a praacutetica da antibioticoterapia principalmente em ambientes
nosocomiais os mecanismos de resistecircncia tornaram-se comuns Esses
mecanismos incluem alteraccedilatildeo na permeabilidade da membrana celular que
impede a entrada do antibioacutetico na ceacutelula bombeamento do antibioacutetico para fora da
mesma pelo mecanismo de efluxo mutaccedilatildeo geneacutetica que altera de alguma forma o
alvo do antibioacutetico e consequumlentemente natildeo afeta o funcionamento da bacteacuteria
bem como desenvolvimento da capacidade de degradar ou da inativaccedilatildeo do
antibioacutetico (COTRIM et al 2012) Estes mecanismos estatildeo representados na figura
3
Figura 3 Mecanismos de resistecircncia bacteriana Fonte
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controle
opas_webmodulo3pop_mecanismohtmgt
Um dos mais importantes mecanismos de resistecircncia eacute a alteraccedilatildeo do local-
alvo onde atua determinado antimicrobiano de modo a impedir a ocorrecircncia de
qualquer efeito inibitoacuterio ou bactericida As bacteacuterias podem adquirir um gene que
22
codifica um novo produto resistente aos antimicrobianos substituindo o alvo original
por exemplo o Staphylococcus aureus resistente agrave oxacilina e estafilococos
coagulase-negativos adquiriram o gene cromossocircmico Mec A e produzem uma PBP
ou PLP resistente aos β-lactacircmicos denominada 2a ou 2 que eacute suficiente para
manter a integridade da parede celular durante o crescimento quando outras PBPs
essenciais satildeo inativadas por antibimicrobianos β-lactacircmicos Como alternativa um
gene receacutem-adquirido pode atuar para modificar um alvo tomando-o menos
vulneraacutevel a determinado antimicrobiano Assim um gene transportado por
plasmiacutedeo ou por transposon codifica uma enzima que inativa os alvos ou altera a
ligaccedilatildeo dos antimicrobianos como ocorre com eritromicina e clindamicina (ANVISA
2007)
Em funccedilatildeo da bomba de efluxo pode variar a especificidade do antibioacutetico
Ele atua por meio do bombeamento ativo de antimicrobianos do meio intracelular
para o extracelular gerando uma resistecircncia bacteriana a determinados
antimicrobianos como eacute o caso da resistecircncia agraves tetraciclinas codificada por
plasmiacutedeos em Escherichia coli devido agrave presenccedila de proteiacutenas integrantes da
membrana plasmaacutetica bacteriana (PIDDOCK 2006)
O aumento da siacutentese de proteiacutenas eacute o principal responsaacutevel pela resistecircncia
antimicrobiana devido agraves vaacuterias mutaccedilotildees que ocorrem em seus repressores
transcricionais Estas mutaccedilotildees tambeacutem podem influenciar levando a um aumento
da eficiecircncia do transporte dos antibioacuteticos para o exterior da ceacutelula (HARBOTTLE
et al 2006)
A resistecircncia aos antibioacuteticos eacute frequumlentemente associada agrave alteraccedilatildeo
diminuiccedilatildeo da permeabilidade que ocorre na membrana externa das bacteacuterias gram-
negativas O fluxo de moleacuteculas para o interior da ceacutelula ocorre por caracteriacutesticas
peculiares como carga estrutura e dimensatildeo e atraveacutes de proteiacutenas de membrana
as quais formam canais Este percurso eacute utilizado pelos antibioacuteticos para atingir o
interior da ceacutelula bacteriana ou o espaccedilo periplasmaacutetico como eacute o caso dos
antibioacuteticos β-lactacircmicos Portanto a perda de funccedilatildeo destas proteiacutenas pode
efetivamente causar a diminuiccedilatildeo da susceptibilidade a vaacuterios antibioacuteticos
(LIVERMORE 2003)
23
Os mecanismos de resistecircncia que podem impedir a accedilatildeo de antimicrobianos
satildeo vaacuterios O faacutermaco atua de forma a inibir os processos essenciais a multiplicaccedilatildeo
e sobrevivecircncia da ceacutelula bacteriana como a membrana citoplasmaacutetica e
consequumlentemente bloqueando a siacutentese proteacuteica de aacutecidos nucleacuteicos e da parede
celular A resistecircncia bacteriana eacute um mecanismo natural de defesa Sendo assim
as bacteacuterias estatildeo em constante defesa e para cada novo faacutermaco desenvolvido as
bacteacuterias iratildeo desenvolver resistecircncia em algum momento (POSSEBON et al
2003)
O grupo de antibioacuteticos beta-lactacircmicos satildeo amplamente utilizado e se
encontram dentro da classe dos melhores agentes antimicrobianos com relevacircncia
cliacutenica No entanto o seu uso tem sido restringido devido a vaacuterios mecanismos de
resistecircncia O desenvolvimento dos carbapenecircmicos surgiu devido agrave proliferaccedilatildeo de
beta-lactamases mediadas por plasmiacutedeos e cromossomos (POSSEBON et al
2003)
A bacteacuteria KPC tem um gene chamado SHV-1 que tem a caracteriacutestica de
resistecircncia a quase todos os tipos de antimicrobianos inclusive os carbapenecircmicos
especiacuteficos para o tratamento de infecccedilotildees por bacteacuterias multiresistentes e
emergecircncias Mesmo com no seu coacutedigo geneacutetico a informaccedilatildeo necessaacuteria para o
desenvolvimento da resistecircncia a resistecircncia da bacteacuteria soacute eacute desenvolvida caso a
bacteacuteria entre em contato com o antibacteriano desencadeando todo o processo
nos casos de resistecircncia induzida comuns em KPC (MOREIRA et al 2014)
A resistecircncia bacteriana pode ser apresentada de forma intriacutenseca ou
adquirida A resistecircncia intriacutenseca faz parte das caracteriacutesticas fenotiacutepicas naturais
do microrganismo ou seja faz parte de sua heranccedila geneacutetica sendo transmitida
verticalmente a prole sem perda da caracteriacutestica A presenccedila ou ausecircncia do alvo
para a accedilatildeo da droga eacute o principal determinante deste tipo de resistecircncia
(MOREIRA et al 2014) Essa resistecircncia corresponde a uma caracteriacutestica de
espeacutecie bacteriana quando estes microrganismos satildeo naturalmente resistentes a
certo tipo de antibioacutetico Este processo eacute decorrente da ausecircncia de estruturas de
atuaccedilatildeo de antimicrobianos ou a impermeabilidade por parte de estruturas
perifeacutericas das bacteacuterias (HENRIQUE et al 2014)
24
A resistecircncia adquirida aos antibioacuteticos por sua vez ocorre quando haacute uma
da mutaccedilatildeo de genes reguladores ou estruturais aquisiccedilatildeo de genes de resistecircncia
veiculados por elementos geneacuteticos moacuteveis ou da combinaccedilatildeo entre eles Este
aparecimento de resistecircncia em uma espeacutecie bacteriana era anteriormente sensiacutevel
a droga e devido a um destes fatores se torna resistente O fenoacutetipo resultante
desta resistecircncia natildeo estaraacute presente nas ceacutelulas genitoras e sim nos indiviacuteduos de
uma linhagem bacteriana derivada de um organismo susceptiacutevel Os genes muitas
vezes satildeo adquiridos por meio de elementos moacuteveis como plasmiacutedeos e
transposons (MOREIRA et al 2014)
Entatildeo a resistecircncia adquirida ocorre por diversos mecanismos geneacuteticos tais
como produccedilatildeo de enzimas inativadoras interferecircncia com a entrada e acuacutemulo de
droga na bacteacuteria alteraccedilatildeo do receptor para accedilatildeo da droga via metaboacutelica
alternativa Eacute originada por meio de uma alteraccedilatildeo a niacutevel geneacutetico da ceacutelula de
natureza cromossocircmica pelos processos de mutaccedilatildeo transduccedilatildeo e transformaccedilatildeo
ou extra cromossocircmica (plasmidial) (HENRIQUE et al 2014)
Como todo antibioacutetico β-lactacircmicoos carbapenecircmicos tem como mecanismo
de accedilatildeo a inibiccedilatildeo da siacutentese proteacuteica atraveacutes da accedilatildeo de inibiccedilatildeo da parede
microbiana fazendo a ligaccedilatildeo e inativaccedilatildeo das proteiacutenas ligadoras de penicilinas
(NETO et al 2007)
Imipenem e meropenem antibioacuteticos pertencentes ao grupo dos
carbapenecircmicos possuem um amplo espectro de accedilatildeo in vitro incluindo atividade
contra cocos gram-positivos bacilos gram-negativos e bacteacuterias anaeroacutebias (MOHR
2008) Jaacute o ertapenem possui um espectro de accedilatildeo mais limitado que o os dois
antibioacuteticos anteriormente citados tendo uma eficiecircncia limitada contra os bacilos
gram-negativos natildeo fermentadores Um novo antibioacutetico carbapenecircmico ainda natildeo
disponiacutevel no Brasil doripenem possui uma atividade mais potente principalmente
contra Pseudomona aeruginosa devido ao seu mecanismo de accedilatildeo que combina os
espectros de accedilatildeo de imipenem e meropenem (ZHANEL et al 2007)
Devido as suas estabilidades espectro de accedilatildeo poucos relatos de
resistecircncia boa toleracircncia pelos pacientes com efeitos adversos mais comuns as
complicaccedilotildees no siacutetio da infusatildeo e toxicidade gastrintestinal estes antibioacuteticos
carbapenecircmicos tecircm sido considerados terapia de escolha (NICOLAU 2008) Como
25
uma resposta adaptativa das Enterobacteacuterias o iacutendice de resistecircncia aos
carbapenecircmicos tem aumentado nos uacuteltimos anos de forma proporcional ao seu
uso limitando imensamente as opccedilotildees terapecircuticas para as infecccedilotildees causadas por
estes microrganismos (FALAGAS et al 2009)
As enzimas produtoras de betalactamases hidrolisam o anel betalactacircmico
tornando este mecanismo de resistecircncia o mais importante Os dois grupos mais
preocupantes satildeo o grupo das betalactamases de aspecto ampliado e os da
carbapenemases que aleacutem de hidrolizar os carbapenecircmicos hidrolizam todas as
outras classes de betalactacircmicos Em enterobacteacuterias as carbapenemases mais
prevalentes satildeo codificadas por genes dos grupos blaKpc blaIMP blaVIM blaNdm
e blaOxa A ocorrecircncia de carbapenemases eacute mais frequentemente em bacteacuterias
gram-negativas fermentadoras da glicose conhecidas como enterobacteacuterias
predominantes nos gecircneros Klebsiella Serratia Citrobacter Enterobacter
Escherichia Samonella Proteus Morganella Podem ser encontradas tambeacutem em
bacteacuterias gram-negativas natildeo fermentadoras como espeacutecies de Acinetobacter e de
Pseudomonas (ALVES et al 2013)
Carbapenemases satildeo enzimas plasmiacutedio-mediados resistentes a todos
antibioacuteticos betalactacircmicos As bacteacuterias que possuem o gene blaKpC responsaacutevel
pela codificaccedilatildeo da produccedilatildeo de carbapenemases apresentam resistecircncia aos
antibioacuteticos betalactacircmicos impedindo a accedilatildeo destes antibioacuteticos contra infecccedilotildees
(ALVES et al 2013)
A transmissatildeo das carbapenemases a diferentes cepas de enterobacteacuterias se
daacute atraveacutes de plasmiacutedeos que satildeo pequenas moleacuteculas circulares de DNA com a
capacidade de se replicarem independentemente do DNA cromossocircmico
permitindo a troca de material geneacutetico entre gecircneros e espeacutecies diferentes de
enterobacteacuterias O raacutepido desenvolvimento de surtos em ambientes hospitalares eacute
explicado por essa disseminaccedilatildeo plasmidial (COTRIM et al 2012)
De acordo com o criteacuterio de interpretaccedilatildeo do Clinical and Laboratory
Standards Institute (CLSI 2009) a maioria das KPC isoladas natildeo apresenta
resistecircncia completa aos carbapenecircmicos (Imipenem e Meropenem apresentam
uma Concentraccedilatildeo Inibitoacuteria Miacutenima (CIM) de 2-8 μgmL) (COTRIM et al 2012)
26
Os mecanismos de resistecircncia capazes de impedir a accedilatildeo dos
carbapenecircmicos satildeo vaacuterios Poreacutem a degradaccedilatildeo de antibioacuteticos por enzimas
principalmente as carbapenemases constituem o principal mecanismo de
resistecircncia aos antibioacuteticos β-lactacircmicos (DIAS 2009) Devido a ampla atividade
hidroliacutetica agrave maioria dos antibioacuteticos β-lactacircmicos estes grupos de enzimas possuem
alta versatilidade (QUEENAM et al 2007)
Existem trecircs grandes classes moleculares de Ambler a qual as
carbapenemases pertencem denominadas classe A (serino-carbapenemases os
quais incluem membros designados SME IMI NMC GES e a famiacutelia das KPCs)
classe B(as metalo-β-lactamase incluem os tipos IMP e VIM) e classe D
(oxacilinases similares as da classe A e incluem as OXA e PSE) (DIAS 2009)
Dentre estes as mais importantes e prevalentes encontradas em plasmiacutedeos
de Klebsiella pneumoniae satildeo as KPC (DIENSTMANN et al 2010) Por meio de
estudos moleculares a enzima KPC jaacute foi documentada em diferentes bacteacuterias e
diferenciada em KPC-1 a 13 (NETIKUL et al 2011) No ano de 2009 foi realizada
uma pesquisa onde descreveram as seguintes carbapenemases KPC-1 em isolados
de Klebsiella pneumoniae KPC-2 em K pneumoniae K oxytoca Salmonella
enterica e em Enterobacter sp e KPC-3 em K pneumoniae e Enterobacter cloacae
(MONTEIRO et al 2009) As enzimas KPC-4 e KPC-5 foram encontradas em
isolados de Pseudomonas aeruginosa (PEIRANO et al 2009)
Foi observada uma correccedilatildeo da sequumlecircncia KPC-1 indicando que o gene
blaKPC-1 e blaKPC-2 satildeo idecircnticos Trecircs novas variantes blaKPC-3 blaKPC-4 e
blaKPC-5 satildeo resultados de mutaccedilotildees do gene estrutural da enzima KPC-2
(WOLTER et al 2008) apresentando diferentes perfis de hidroacutelise As enzimas
KPC-2 e KPC-3 possuem alta eficiecircncia em hidrolisar cefalotina cefaloridina e
nitrocefin poreacutem possuem uma menor eficiecircncia contra carbapenecircmicos e
cefotaxima (ALBA et al 2005) As enzimas KPC-5 e KPC-4 apresentam menor
hidroacutelise de carbapenecircmicos eacute do que em KPC-2 Em contrapartida possuem
melhor eficiecircncia contra ceftazidima e uma maior inibiccedilatildeo pelo aacutecido clavulacircnico
(WOLTER et al 2008)
27
13 Anaacutelise geneacutetica de microrganismos
Eacute de extrema importacircncia praacutetica natildeo soacute no aspecto cliacutenico mas tambeacutem na
fitopatologia biotecnologia e estudos ambientais a correta identificaccedilatildeo e
classificaccedilatildeo de microrganismos Os meacutetodos usados na diferenciaccedilatildeo de gecircneros
espeacutecies e estirpes de microrganismos podem ser divididos em meacutetodos fenotiacutepicos
(baseados em fenocircmenos bioquiacutemicos fisioloacutegicos e bioloacutegicos) e genotiacutepicos
(detectam polimorfismos ao niacutevel dos aacutecidos nucleacuteicos ou variaccedilatildeo aleacutelica ao niacutevel
de enzimas) (ALVES et al 2003)
Para este tipo de estudo existem alguns meacutetodos como o RFLPrsquos -
ldquoRestriction Fragment Length Polymorphismsrdquo (polimorfismos de tamanho de
fragmentos de restriccedilatildeo) rep-PCR (Meacutetodo de tipagem baseado na amplificaccedilatildeo via
PCR de elementos de DNA repetitivos presentes em genomas bacterianos) anaacutelise
de sequumlecircncias nucleotiacutedeas (discriminaccedilatildeo eou identificaccedilatildeo atraveacutes de sequumlecircncias
de DNA) PFGE - Pulsed-Field Gel Electrophoresis (Eletroforese em campo
pulsado) ( A L V E S et al 2003)
A diferenciaccedilatildeo clara da cepa e principalmente a alta reprodutibilidade devem
ser caracteriacutesticas de qualquer meacutetodo de tipagem geneacutetica Poreacutem nem todos os
meacutetodos moleculares de tipagem satildeo igualmente eficazes Sendo assim de acordo
com a finalidade pretendida (identificaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo custo reprodutibilidade
etc) eacute feita a escolha do meacutetodo a ser aplicado (A L V E S et al 2003)
O processo de identificaccedilatildeo fenotiacutepica de KPC entre os membros da famiacutelia
Enterobacteriaceae ainda eacute difiacutecil e os meacutetodos para a sua identificaccedilatildeo devem ser
revistos e ajustados Mesmo com o avanccedilo tecnoloacutegico natildeo existem ensaios que
combinam alta especificidade e sensibilidade na detecccedilatildeo destas enzimas Satildeo
diversas as metodologias usadas para rastreamento de KPC como por exemplo a
focalizaccedilatildeo isoeleacutetrica a teacutecnica de disco-difusatildeo E-test teste de Hodge
modificado dentre outros Aleacutem disso a pesquisa do gene blaKPC pode ser feita
pela Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) Os sistemas de automaccedilatildeo
existentes no entanto podem natildeo identificar com precisatildeo os isolados KPC
positivos (COTRIM et al 2012)
A identificaccedilatildeo blaKPC pelo PCR eacute um meacutetodo raacutepido preciso sensiacutevel e
altamente especiacutefico no entanto a PCR exige equipamento e conhecimentos
28
especializados em diagnoacutestico molecular dificultando ainda a utilizaccedilatildeo dele na
rotina dos laboratoacuterios de microbiologia (COTRIM et al 2012)
Em estudo de infecccedilotildees hospitalares identificaccedilatildeo molecular de patoacutegenos
bacterianos eacute bastante utilizada Para diferenciar carbapenemases tipo KPC a partir
de outros tipos como SME NMC-A-IMI e GES eacute necessaacuterio um exame molecular
As identificaccedilotildees do microrganismo juntamente com a triagem molecular iratildeo definir
um resultado mais especiacutefico podendo ser usado para identificar o antibioacutetico mais
adequado para o tratamento Poreacutem a principal desvantagem de alguns exames
baseados em PCR por exemplo eacute que devido agrave sua limitada capacidade de
multiplexaccedilatildeo eles distinguem apenas algumas variaccedilotildees (MOREIRA et al 2014)
Estatildeo descritas para a identificaccedilatildeo molecular de patoacutegenos pertencentes agrave
famiacutelia Enterobacteriaceae as teacutecnicas de PFGE RAPD (randomly amplified
polymorphic DNA) e ERIC-PCR (Enterobacterial Repet it ive Intergenic Consensus)
A PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) eacute considerada padratildeo ouro devido sua
alta capacidade de diferenciaccedilatildeo baseada na anaacutelise do perfil de restriccedilatildeo do DNA
genocircmico por meio de eletroforese Como desvantagem para a sua execuccedilatildeo eacute
necessaacuterios vaacuterios dias impedindo a tipagem de algumas cepas bacterianas devido
agrave degradaccedilatildeo do DNA aleacutem do alto custo empregado (MOREIRA et al 2014)
O meacutetodo baseado em ERIC-PCR tem sido bastante utilizado como uma
alternativa para a teacutecnica de PFGE Esta teacutecnica consiste na anaacutelise do padratildeo de
amplificaccedilatildeo de elementos repetidos encontrados no genoma bacteriano Isto
permite uma maior rapidez na obtenccedilatildeo de resultados quando comparada com o
PFGE aleacutem de alta reprodutibilidade simples execuccedilatildeo e implementaccedilatildeo baixo
custo e natildeo sem problemas com a degradaccedilatildeo do DNA (MOREIRA et al 2014)
A PCR eacute considerada uma teacutecnica de biologia molecular revolucionaacuteria que
consiste na siacutentese enzimaacutetica de coacutepias de aacutecidos nucleacuteicos Ela permitiu o raacutepido
desenvolvimento do estudo de sequumlecircncias de aacutecidos nucleacuteico Foi desenvolvida por
Kary Banks Mullis que ganhou o precircmio Nobel de quiacutemica de 1993 devido ao
desenvolvimento dessa teacutecnica em abril de 1983 (CAMARGO et al 2014)
Por meio de etapas de variaccedilatildeo de temperatura a teacutecnica de PCR promove a
duplicaccedilatildeo de cadeias de DNA in vitro A reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo de DNA por PCR
envolve o emprego de sequumlecircncias iniciadoras (primers) quatro nucleotiacutedeos
29
(dNTPrsquos) do DNA e uma DNA polimerase termoestaacutevel podendo assim obter-se a
partir de uma fita molde muitas coacutepias de uma sequumlecircncia especiacutefica de aacutecido
nucleacuteico O princiacutepio da PCR consiste na variaccedilatildeo de temperatura por ciclo
envolvendo trecircs etapas baacutesicas desnaturaccedilatildeo pareamento e amplificaccedilatildeo
(CAMARGO et al 2014)
A desnaturaccedilatildeo da fita molde de DNA eacute uma etapa com duraccedilatildeo entre 30
segundos a 1 minuto a temperatura entre 92 ordmC a 96 ordmC Apoacutes isso o pareamento de
dois iniciadores sinteacuteticos de composiccedilotildees distintas que funcionam como os
iniciadores da reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo liga-se agrave regiatildeo complementar da fita de
DNA alvo que sofreraacute a duplicaccedilatildeo Esta etapa tem duraccedilatildeo de 30 segundos a 1
minuto a temperatura entre 58 ordmC e 65 ordmC Por uacuteltimo a amplificaccedilatildeo por meio da
enzima Taq DNA polimerase das novas fitas de DNA se daacute a partir de cada um dos
iniciadores utilizando os quatro dNTPrsquos como substrato da reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo
Esta etapa possui duraccedilatildeo entre 45 segundos e 1 minuto a 72 ordmC Cada ciclo eacute
repetido em torno de 30 a 35 vezes e promove a amplificaccedilatildeo da regiatildeo alvo
determinada conforme o anelamento dos iniciadores sinteacuteticos de DNA (CAMARGO
et al 2014) Estas etapas estatildeo demonstradas na figura 4
Figura 4 Etapas da Reaccedilatildeo de PCR
30
2 JUSTIFICATIVA
No ano de 2010 no Distrito Federal foram identificados 111 pacientes com
suspeita de infecccedilatildeo por Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) e a
Secretaria de Sauacutede do Distrito Federal confirmaram ainda a morte de 18 pacientes
dentre os hospitais puacuteblicos e particulares Um desafio encontrado por ocasiatildeo do
surto infeccioso no Distrito Federal foi o de confirmar as KPCs por Reaccedilatildeo da
Polimerase em Cadeia sendo que as amostras foram enviadas com esta finalidade
para a Fiocruz no Rio de Janeiro
Pesquisas que possam contribuir na elaboraccedilatildeo de estrateacutegias preventivas e
de intervenccedilatildeo para infecccedilotildees causadas por enterobacteacuterias bem como contribuir
para gerar uma integraccedilatildeo beneacutefica entre a equipe acadecircmica e os serviccedilos de
sauacutede devem ser estimuladas Neste sentido o presente estudo permitiu escrutinar
os genes envolvidos na expressatildeo de carbapenemases presentes em espeacutecies de
enterobacteacuterias isoladas em ambiente hospitalar visto que elucidar genes de
resistecircncia de enterobacteacuterias aos antibioacuteticos carbapenecircmicos eacute o primeiro passo
para garantir um controle epidemioloacutegico efetivo para estes tipos de microorganismo
assim como sua associaccedilatildeo com surtos fatais particularmente em pacientes com
baixa imunidade
31
3 OBJETIVOS
31 Objetivo geral Caracterizar os genes de resistecircncia das
Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases e os aspectos epidemioloacutegicos de
pacientes internados em um hospital puacuteblico do Distrito Federal
32 Objetivos Especiacuteficos
Identificar genotipicamente a enzima KPC (Klebsiella pneumoniae
carbapenemase) de isolados de Klebsiella pneumoniae
Investigar aspectos epidemioloacutegicos dos pacientes portadores de
Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases
Identificar quais variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana influenciaram para o
desfecho oacutebito ou alta
Avaliar a susceptibilidade das Enterobacteacuterias aos antibioacuteticos
carbapenecircmicos dos pacientes em ambiente hospitalar
32
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
Trata-se de um estudo transversal onde foi realizado o teste de
susceptibilidade das enterobacteacuterias aos antibioacuteticos carbapenecircmicos a partir dos
materiais bioloacutegicos coletados dos pacientes internados no Hospital Regional da Asa
Norte (HRAN) e enviados ao Laboratoacuterio de Anaacutelises Cliacutenicas da mesma Instituiccedilatildeo
Os materiais bioloacutegicos investigados foram sangue aspirado traqueal ou brocircnquico
urina e cultura semi quantitativa de ponta de cateter venoso central O HRAN eacute um
hospital puacuteblico do Distrito Federal com 395 leitos sendo as cliacutenicas de internaccedilatildeo
Berccedilaacuterio Cirurgia Geral Cirurgia Plaacutestica Cliacutenica Meacutedica Ginecologia Maternidade
Pediatria Queimados UTI com atendimento a pacientes portadores de doenccedilas de
caraacuteter cliacutenico e ciruacutergico
4 1 Coleta e transporte das amostras bioloacutegicas
As amostras foram coletadas de pacientes internados no Hospital Regional da
Asa Norte (HRAN) com suspeitas de infecccedilatildeo por KPC A identificaccedilatildeo primaacuteria foi
realizada pelo Laboratoacuterio de Microbiologia do hospital de origem dos pacientes e os
demais procedimentos que foram utilizados na identificaccedilatildeo encontram-se descritos
abaixo
4 2 Procedimentos para confirmaccedilatildeo de resistecircncia bacteriana por
disco de ertapenem (adaptado CDC 2004)
Para diagnosticar amostra como portadora de bacteacuteria produtora de
carbapenemase foi realizado o teste com disco de ertapenem como forma de
triagem Inicialmente utilizou-se o swab contaminado com a amostra que foi
distribuiacuteda em uma pequena aacuterea da placa de aacutegar MacConkey para apoacutes o
crescimento ser realizada a pesquisa de colonizaccedilatildeo por enterobacteacuterias resistentes
aos carbapenecircmicos (Pesquisa de CRE) Procedeu-se a semeadura por teacutecnica
semi-quantitativaesgotamento com alccedila bacterioloacutegica na diluiccedilatildeo de 1100 O disco
de Ertapenem foi colocado na superfiacutecie da placa de MacConkey na junccedilatildeo dos dois
primeiros campos de semeadura conforme demonstrado na figura 5 Incubou a placa
33
em estufa aeroacutebia a 35ordmC por 24 e 48 horas e observou-se o halo de difusatildeo do
disco de Ertapenem na placa para proceder agrave leitura
O teste deixou de ser obrigatoacuterio apoacutes a modificaccedilatildeo dos criteacuterios
interpretativos para carbapenecircmicos para enterobacteacuterias publicados no suplemento
do CLSI 2010 M100-S20-U
Figura 5 Mecanismo de semeamento de material bioloacutegico oriundos de
pacientes com suspeita de infecccedilatildeo por KPC Fonte adaptado CDC 2004
4 2 1 Interpretaccedilatildeo dos resultados
Na ausecircncia de crescimento ateacute 24 horas (MacConkey) ou halo de difusatildeo
gt27 mm na placa deve-se reincubar as placas por mais 24 horas Quando for
ausente o crescimento apoacutes 48 horas ou halo de difusatildeo gt27 mm na placa libera-se
como enterobacteacuterias resistentes a carbapenecircmicos (KPCNEG)Havendo
crescimento de colocircnias na placa de MacConkey com halo lt 27 mm (apenas para
colocircnias com crescimento dentro do halo) deve-se reisolar e realizar identificaccedilatildeo e
antibiograma automatizado teste de sensibilidade por disco-difusatildeo e Teste de
Hodge Modificado (THM) Os isolados de enterobacteacuterias cujos testes comprovarem
a resistecircncia aos carbapanecircmicos testados (KPCPOS) foram reportado a Comissatildeo
de Controle de Infecccedilatildeo Hospitalar (CCIH) Jaacute osbacilos Gram-negativos natildeo
fermentadores natildeo foram reportados (KPCNEG) Para interpretaccedilatildeodos resultados
foram utilizados os valores conforme demonstrados na tabela 1
Tabela 1 Criteacuterios Interpretativos para testes de sensibilidade
ENTEROBACTEacuteRIAS
Disco difusatildeo (mm) MIC (microgml)
34
Antibioacutetico Sigla S I R S I R
Ertapenem 10
microg
ETP 22 19-
21
18 05 1 2
Meropenem 10
microg
MEM 23 20-
22
19 1 2 4
Fonte Manual Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)
2013
Os resultados que apresentaram resistecircncia ao antibioacutetico Ertapenem foram
considerados como suspeitos de contaminaccedilatildeo por KPC Fez-se o teste de
susceptibilidade aos antibioacuteticos (TSA) em aparelho automatizado MicroScan Walk
Away 96sl Dade Behring
4 3 Teste de susceptibilidade aos antibioacuteticos (adaptado CDC 2004)
A determinaccedilatildeo da susceptibilidade dos isolados foi feita pelo teste de
susceptibilidade aos antibioacuteticos (TSA) apoacutes cultura em meio de gelose simples
(INSA) para avaliaccedilatildeo da sua pureza e obtenccedilatildeo de colocircnias isoladas Para
preparaccedilatildeo de uma suspensatildeo bacteriana com turvaccedilatildeo aproximada de 05
McFarland (Dade BehringMicroScanregTurbidity Meter) ressuspendeu duas a cinco
colocircnias em 2ml de soro fisioloacutegico esteacuteril diluindo a 1100 em soro fisioloacutegico num
volume total de 10ml em seguida foi feita uma semeadura em duas placas
quadradas (120mm x 120mm) de Muller-Hinton Agar (INSA) por inundaccedilatildeo
Os discos de antibioacutetico carbapenecircmicos imipenem meropenem e
ertapenem (Biorad) foram aplicados com o auxiacutelio de um dispensador automaacutetico A
susceptibilidade das Enterobacteacuterias aos carbapenecircmicos foi definida de acordo
com o protocolo Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI 2011)
Para aquelas Enterobacteacuterias que apresentaram resistecircncia ao ertapenem
foram realizados o Teste de Hodge Modificado para Detecccedilatildeo de Enterobacteacuterias
Produtoras de Carbapenemases conforme descrito pelo Centers for Disease Control
and Prevention (CDC 2004)
35
4 4Teste de Hodge Modificado (THM) (adaptado CDC 2004)
Preparou-se uma suspensatildeo em salina esteacuteril com a cepa Escherichia coli
ATCC 25922 (padratildeo 05 de McFarland) Apoacutes isto diluiu a suspensatildeo 110 em
salina (05 ml da soluccedilatildeo de Ecoli ATCC 25922 + 45 ml salina)Foi entatildeo semeado
na superfiacutecie de uma placa de Agar Muller-Hinton com a suspensatildeo diluiacuteda de Ecoli
ATCC 25922 com auxilio de swab seco assegurando que houvesse uma
distribuiccedilatildeo uniforme cobrindo toda a superfiacutecie do Agar Deixou secar por 3 a 5
minutos em temperatura ambienteColocou-se o disco de ertapenem 10microg no centro
da placa e apoacutes isto fez-se uma estria linear da cepa a ser testada da borda do
disco ateacute a borda da placa utilizando uma alccedila calibrada 10 microl ou um swab Incubou
a placa na estufa em atmosfera aeroacutebia a 35 plusmn 2ordmC por 16 a 24 horas
441 Controle de qualidade (CQ)
Foi utilizado um CQ todos os dias em que se realizou o teste tendo como
controle Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1705- teste de Hodge modificado
positivo Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1706- teste de Hodge modificado
negativo
442 InterpretaccedilatildeoResultados
Apoacutes 16ndash24 horas de incubaccedilatildeo examinar as placas para verificar a presenccedila
de uma distorccedilatildeo no halo de inibiccedilatildeo do disco de ertapenem devido ao crescimento
realccedilado da cepa ATCC na intersecccedilatildeo do organismo teste e a Ecoli ATCC 25922
dentro dos limites do halo O THM positivo apresentaraacute presenccedila de distorccedilatildeo no
halo de inibiccedilatildeo de ertapenem devido ao crescimento da cepa Ecoli ATCC 25922 ao
longo da estria da cepa teste para dentro dos limites do halo de inibiccedilatildeo Jaacute o THM
negativo teraacute ausecircncia de crescimento da cepa Ecoli ATCC 5922 ao longo da estria
da cepa teste para dentro dos limites do halo de inibiccedilatildeo do disco de ertapenem
Este resultado estaacute representado na figura 6
36
Figura 6 Interpretaccedilatildeo resultado do Teste de Hodge Modificado
(adaptado CDC 2004) Teste positivo na estria da cepa teste na parte superior
da placa teste negativo na estria da cepa teste na parte inferior da placa
Tendo positivo como resultado o paciente era um provaacutevel contaminado por
KPC As amostras entatildeo foram encaminhadas para a Fundaccedilatildeo Osvaldo Cruz
(FIOCRUZ) para confirmaccedilatildeo final As amostras finalmente confirmadas como
positivas para KPC foram isoladas e guardadas no banco de cepas cliacutenicas do
hospital Apoacutes a autorizaccedilatildeo do CEP amostras das cepas foram transferidas para
meio de transporte Stuard em caixa teacutermica fechada em baixa temperatura e
levadas para o laboratoacuterio de microbiologia cliacutenica da universidade
No laboratoacuterio da universidade as amostras foram separadas e realizadas
repiques em meios MacConkey e incubadas por 24h As colocircnias caracteriacutesticas
foratildeo isoladas em caldo BHI e mantidas em shaker a 37oC por 2h Apoacutes isto foram
executadas as anaacutelises a seguir
Os isolados de Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases foram
submetidos agrave extraccedilatildeo de DNA e posterior sequumlenciamento para identificaccedilatildeo dos
genes de resistecircncia blaKPC de 1 a 13 e identificaccedilatildeo do gene universal Os
pacientes de onde os materiais bioloacutegicos contendo as Enterobacteacuterias produtoras
de carbapenemases foram os isolados foram investigados quanto aos aspectos
epidemioloacutegicos e cliacutenicos
37
4 5 Extraccedilatildeo de DNA bacteriano
A extraccedilatildeo de DNA bacteriano foi realizada utilizando o kit NucleoSpin
Plasmidreg (MN) Antes de iniciar a extraccedilatildeo foi feito a preparaccedilatildeo das soluccedilotildees
reagentes materiais e amostras (vortexando) colocou-se em banho-maria agrave 50ordmC o
tampatildeo AW Partiu-se de colocircnias isoladas cultivadas que sofreram passagem em
meio LB liacutequido por 12h Adicionou-se 15 mL da amostra no tubo eppendorf
centrifugou por 5 minutos descartou o sobrenadante (com cuidado para natildeo
descartar o Pellet) Repetiu-se este procedimento por mais trecircs vezes completando-
se o volume de 6mL Foram adicionados 250microL do tampatildeo Resuspension Buffer A1
encostando a ponteira no Pellet e misturando (este tampatildeo tem como funccedilatildeo
separar a formaccedilatildeo de grumos celulares) Apoacutes isso homogeneizou e vortexou os
tubos eppendorfs Apoacutes isso foram adicionados 250microL do tampatildeo Lysis Buffer A2
homogenizou e deixou descansar por 5 minutos (esta etapa eacute importante para a lise
da parede e da membrana celulares e liberaccedilatildeo do conteuacutedo da ceacutelula)
Passado o tempo de descanso foi adicionado 300microL do tampatildeo
Neutralization Buffer A3 homogeneizou e centrifugou por 10 minutos (este tampatildeo
iraacute retirar as proteiacutenas que envolvem o DNA e voltaraacute com o pH para proacuteximo de 8
impedindo que a soluccedilatildeo de lise facilite a quebra das ligaccedilotildees covalentes do aacutecido
nucleacuteico) Em seguida enumeraram-se os tubos contendo filtros com siacutelica
transferiu-se o sobrenadante para o filtro e centrifugou por 5 minutos Descartou-se
o que foi filtrado adicionou 500microL do tampatildeo AW (banho-maria) centrifugou por 2
minutos Novamente foi descartado o filtrado Adicionou-se 600microL do tampatildeo A4
centrifugou por 2 minutos e descartou o filtrado (os tampotildees AW e A4 contecircm
isotiocianato de guanidina em concentraccedilotildees crescentes para facilitar a adsorccedilatildeo
do DNA na siacutelica e retirada das outras biomoleacuteculas da amostra) Foi feita outra
centrifugaccedilatildeo com o tubo vazio Apoacutes isto o filtro foi trocado para outro eppendorf
definitivo onde foi adicionado 50microL do tampatildeo Elution Buffer AE (este tampatildeo
favorece a eluiccedilatildeo do DNA) centrifugou por 2 minutos descartou o filtro e
armazenou as amostras em freezer -20ordmC
38
4 6 Iniciadores e reaccedilatildeo de PCR
Os iniciadores universais para o gene blaKPC foram desenhados baseados
em sequumlecircncias conservadas apresentadas pelos sub-grupos de genes que
codificam a enzima carbapenemase de klebsiella pneumoniae (YIGIT et al 2001)
Baseado na sequumlecircncia para o blakpc-1 depositada no GenBank
(AF2975541) o oligonucleotiacutedio (oligo) iniciador direto (5-
ATGTCACTGTATCGCCGTC-3rsquo) foi desenhado para reconhecer a sequumlecircncia
blaKPC na posiccedilatildeo (131149) enquanto que o iniciador reverso (5-
TTACTGCCCGTTGACGCC-3rsquo) foi reconhecido na posiccedilatildeo (9951012) As anaacutelises
baseadas em alinhamento de sequumlecircncias mostraram que o par de iniciadores
blaKPC podem detectar os alelos de 1 a 13 do gene blaKPC conforme a tabela 2
Tabela 2 Nuacutemero de acesso ao GenBank dos alelos blaKPC e seus
microrganismos originais
Nuacutemero de
Acesso GenBank
Microrganismo Alvo
AF2975541 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-1
GU0862251 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-2
HQ2589341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-2-like
AB5577341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC -3
EU4473041 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-4
EU4002222 Pseudomonas
aeruginosa
blaKPC-5
EU5555341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-6
EU7297271 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-7
39
FJ2344121 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-8
FJ624872 Escherichia coli blaKPC-9
GQ1403481 Acinetobacter
baumannii
blaKPC-10
HM0669951 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-11
HQ3428891 Enterobacter cloacae blaKPC-12
HQ3428901 Enterobacter cloacae blaKPC-13
As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo de blaKPC foram realizadas em um
primeiro tempo de desnaturaccedilatildeo em que foi 94ordmC por 5 minutos seguido de 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 58 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 90 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 78ordmC por 8 minutos Aleacutem das amostras foi utilizado um
controle negativo
A PCR do blaKPC foi realizada utilizando os componentes para o volume da
reaccedilatildeo de 25 microL citados na tabela 3 A banda do tamanho do produto de PCR foi de
881 pares de bases (pb) o que corresponde ao plasmiacutedeo
Tabela 3 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do
gene blaKPC
Reagente Volume
DNA molde 4 microL
Tampatildeo Taq 25 microL
MgCl2 075 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP
2 microL
Oligo F 1 microL
Oligo R 1 microL
Taq DNA polimerase 05 microL
Aacutegua MiliQ 1335 microL
40
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
Baseado na sequumlecircncia para o gene 16S rRNA em que o oligonucleotiacutedio
Universal iniciador direto foward (5-CCAGCAGCCGCCGTAATACG-3rsquo) foi
desenhado para reconhecer a sequumlecircncia universal na posiccedilatildeo 1513 enquanto que o
iniciador reverso (5-ATCGGYTACCTTGTTACGACTTC-3rsquo) foi reconhecido na
posiccedilatildeo 1491 foram realizadas PCRrsquos As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo deste
gene foram realizadas nos seguinte tempos separaccedilatildeo 94ordmC por 10 minutos 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 55 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 120 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 72ordmC por 10 minutos
A PCR do gene 16S rRNA foi realizada utilizando os componentes para o
volume da reaccedilatildeo de 25microL citados na tabela 4 A banda do tamanho do produto de
PCR foi de 996 pb correspondente aacute regiatildeo ribossomal capaz de amplificar todas
as espeacutecies
Tabela 4Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do gene
universal
Reagente (quantidade
concentraccedilatildeo do estoque)
Volume
DNA molde 10 ng 4 microL
Tampatildeo Taq 10 x 25 microL
MgCl2 50mM 125 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP 25 mM
125 microL
Oligo F 10microM 05 microL
Oligo R 10microM 05 microL
Taq DNA polimerase 5UmicroL 04 microL
Aacutegua Miliq 146 microL
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
41
O termociclador utilizado para os experimentos foi o LifeTouch da BIOER
4 7 Digestatildeo
Para realizaccedilatildeo da digestatildeo foi utilizada a enzima BshF I (Hae III) EN- 1105
tamanho 7000 units concentraccedilatildeo 10 unitsmicroL fonte Bacillus sphaericus empresa
Jena bioscienceUtilizaram-se os componentes para o volume de 50microL da reaccedilatildeo
citados na tabela 5
Tabela 5 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da digestatildeo do gene
universal
Reagente Volume
Produto de PCR 10 microL
Enzima BshF I 01 microL
Tampatildeo (10x) 5 microL
Aacutegua Miliq 349 microL
Total (em cada ependorff) 50 microL
Valores para 1 digestatildeo
Os ependorffs foram colocados por 30 minutos em banho-maria a 37ordmC Apoacutes
isso fez-se a corrida das amostras em gel de agarose para verificaccedilatildeo do resultado
(LU et al 2000)
4 8 Eletroforese em gel de agarose
Os produtos de DNA PCR e digestatildeo foram analisados em gel de agarose
2 O tempo de corrida do gel eacute de aproximadamente 1hora e 30minutos sendo
que no comeccedilo foi usada agrave voltagem de 50 V e apoacutes comeccedilar a correr o gel
aumentou a voltagem para 100 v Utilizou-se o marcador de 100pb (pares de bases)
Foi adicionado 3microL de corante Bromophenol (que tem a funccedilatildeo de fazer uma ligaccedilatildeo
na amostra de DNA e permitir a visualizaccedilatildeo da corrida no gel de agarose) em 7microL
de amostra tanto de DNA quanto de PCR Para o preparo do gel foi utilizado TBE
42
(Tris- Aacutecido Boacuterico) agarose e brometo de etiacutedio (sua funccedilatildeo eacute de corante para o gel
e permitir a visualizaccedilatildeo do DNA quando colocado agrave luz ultravioleta) Para o oligo
blaKPC a banda da amplificaccedilatildeo foi em 881ppb correspondendo ao plasmiacutedeo Jaacute
o oligo Universal foi em 996 pb
4 9 Descarte de resiacuteduos
Todos os materiais utilizados nos ensaios foram de uso uacutenico e manipulados
em cacircmaras de seguranccedila bioloacutegica classe II Apoacutes o uso foram colocados em
soluccedilatildeo desinfetantes (hipoclorito a 1) e em seguida autoclavados a 127oC por 20
min em sacos apropriados para autoclavaccedilatildeo Apoacutes a finalizaccedilatildeo do ciclo de
esterilizaccedilatildeo os sacos contendo o material descartaacutevel foram colocados em
recipientes de coleta da empresa responsaacutevel pela coleta de materiais bioloacutegicos
produzidos no laboratoacuterio de microbiologia Todos os procedimentos seguiram a
normativa RDC-ANVISA 3062004 sobre o descarte de resiacuteduos de serviccedilo de
sauacutede
4 10 Aspectos epidemioloacutegicos e cliacutenicos
Os aspectos cliacutenicos e epidemioloacutegicos foram investigados por meio de
prontuaacuterios dos pacientes portadores de enterobacteacuterias produtoras de
carbapenemases e envolveram topografia mais provaacutevel do foco infeccioso a
enfermidade motivadora da internaccedilatildeo o desfecho cliacutenico a idade e o tempo de
internaccedilatildeo
4 12 Anaacutelises eepidemioloacutegicas
As anaacutelises foram realizadas com o pacote estatiacutestico SPSS versatildeo 200
Para verificar quais variaacuteveis referentes aos dados epidemioloacutegicos e
microbioloacutegicos influenciaram no desfecho verificou- se a diferenccedila meacutedia das
variaacuteveis idade e tempo de internaccedilatildeo em cada grupo O teste estatiacutestico utilizado foi
o teste t de Student apoacutes se executar o teste de normalidade de Shapiro-Wilk Para
as variaacuteveis sexo perfil microbioloacutegico das enterobacteacuterias produtoras de
43
carbapenemases foi avaliada a associaccedilatildeo com o desfecho por meio do teste Exato
de Fisher O niacutevel de significacircncia adotado foi de 5
4 13 Preceitos eacuteticos
Este projeto estaacute inserido em um projeto maior denominado ldquoEpidemiologia
cliacutenica e caracterizaccedilatildeo molecular do Acinetobacter Baumannii resistente a
antibioticoterapia em pacientes internado em hospitais do Sistema Uacutenico de Sauacutederdquo
que foi submetido ao Comitecirc de Eacutetica em Pesquisa da Secretaria do Estado de
Sauacutede do Distrito Federal (SESDF) e emitido parecer aprovado pelo protocolo nordm
23109 (anexo)
44
5 RESULTADOS
51 Anaacutelise molecular
Para a amplificaccedilatildeo com o oligo blaKPC foram amplificadas amostras
que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 881 pb correspondente ao
plasmiacutedeo A anaacutelise da amplificaccedilatildeo da regiatildeo do gene blaKPC mostrou que
apenas a amostra A10 natildeo amplificou isso demonstra que esta amostra natildeo
possuiacutea o gene de resistecircncia
5 1 1 Gene blaKPC
Figura 7 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 881 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
A amostra A3 natildeo amplificou no primeiro momento entatildeo foi realizado
novamente a PCR e corrida de gel obtendo entatildeo a amplificaccedilatildeo da amostra como
apresentado na figura 8
45
Figura 8 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC da
mostra A3 estudada A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo de 881
pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 1 2 Gene 16S rRNA
Para a amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA utilizou-se o oligo universal Foram
amplificadas amostras que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 996 pb
Figura 9 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
46
Segundo Lu et al (2000) a digestatildeo com a enzima HaeIII deste amplicons de
16S rRNA devolveriam bandas com perfis entre 150 a 200 pb No gel abaixo eacute
possiacutevel evidenciar que este perfil ocorreu com o predomiacutenio de bandas na altura
de 200pb
Figura 10 Gel de agarose a 2 da digestatildeo do amplicon do gene 16S
rRNA das amostras com a enzima HaeIII evidenciando diversos fragmentos
proacuteximos a 200 pb A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo ribossomal
de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 2 Anaacutelises epidemioloacutegicas
5 2 1 Sexo
No total foram detectados 17 isolados de KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 onde a maior a prevalecircncia foi
detecatada em amostras de pacientes do sexo masculino (53) do que no sexo
feminino (47)
47
Figura 11 Isolado de KPC segundo sexo dos 17 pacientes investigados
no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 2 Desfecho cliacutenico
Em 17 isolados de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo
de 2010 aacute 2011 a porcentagem de pacientes que foram a oacutebito (59) foi maior que
a de pacientes que tiverm alta (41)
Figura 12 Isolado de KPC segundo desfecho cliacutenico dos 17 pacientes
investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
48
5 2 3 Local da coleta
Dos 17 episoacutedios detectados de infecccedilatildeo por KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 a infecccedilatildeo em swab retalfoi mais
frequente (47) seguida de ponta de cateacuteter (18) e secreccedilatildeo traqueal (12)
Figura 13 Isolados de KPC segundo local da coleta da amostra nos 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 4 Microorganismo
O microorganismo mais encontrado foi a Klebsiella pneumoniae (82)
seguida da Enterobacter clocae (12) e Serratia marcescens (6) dos 17 isolados
de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 Isto afirma o
fato de a sigla KPC ser utilizada de forma errocircnea aacute Klebsiella pneumoniae visto
que a evidecircncia dela eacute maior em relaccedilatildeo as outras cepas
49
Figura 14 Isolado de KPC segundo microrganismo encontrado em 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 5 Relaccedilotildees variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana e desfecho
cliacutenico
Tabela 6 ndash Distribuiccedilatildeo do perfil geneacutetico sexo coleta tipificaccedilatildeo de
microrganismos e anaacutelise da resistecircncia bacteriana segundo o desfecho
cliacutenico Brasiacutelia-DF 2010 a 2011
Variaacutevel Resultado
Desfecho
Alta Oacutebito
N N P
Gene 16S rRNA Positivo 7 1000 10 1000
NA Gene blaKPC Positivo 6 857 10 1000
Negativo 1 143 0 00 0218 Sexo Feminino 2 286 6 600
Masculino 5 714 4 400 0201 Local da coleta Fundo saco de
Douglas 1 143 0 00
Hemocultura 0 00 1 100 0463 Ponta de cateter 1 143 2 200
Sec TraquealBrocircnquica
0 00 1 100
50
Secreccedilatildeo traqueal 2 286 0 00
Swab retal 3 429 5 500
Urina 0 00 1 100
Microrganismo Enterobacter cloacae (KPC)
1 143 1 100
Klebsiella pneumoniae
6 857 8 800
0416 Serratia
marcescens 0 00 1 100
Teste de Hodge Hodge positivo 7 1000 10 1000
NA Amicacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 1 100 0848 resistente 0 00 1 100
sensiacutevel 2 286 3 300
Amoxicilina Aacutecido Clavulacircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Ampicilina Sulbactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ampicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Aztreonan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefazolina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Cefoperazona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Cefotaxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefoxitina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0509 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 2 286 4 400
Ceftazidima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cetriaxona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 3 429 5 500 0772 Cefalotina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ciprofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772
51
resistente 3 429 5 500
Claritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Clindamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Eritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Gentamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0942 resistente 2 286 3 300
sensiacutevel 1 143 2 200
Imipenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 0 00 2 200 0193 Resistente 1 143 3 300
sensiacutevel 2 286 0 00
Nitrofurantoiacutena sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Norfloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Oxacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Penicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Piperacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Rifampicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tetraciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Ticarcilina Aacutecido Clavulocircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0688 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 3 429 4 400
Tobramicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Trimetoprima Sulfametoxazol
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0112 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 2 286 0 00
Vancomicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tigeciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediario 0 00 1 100 0211 natildeo testado 1 143 4 400
resistente 2 286 0 00
52
Cefepime sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefuroxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Levofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Piperacilina Tazobactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Ertapenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Meropenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0223 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 1 143 0 00
Cefotetan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 sensiacutevel 0 00 1 100
Gemifloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 7 700 0585 natildeo testado 3 429 3 300
Desfecho
Alta Oacutebito
Meacutedia Erro
padratildeo Meacutedia Erro
padratildeo p
Idade 58 9 59 5 0991
Tempo Internaccedilatildeo (dias)
50 13 46 12 0571
n= 17 p(lt 005) NA natildeo se aplica
53
6 DISCUSSAtildeO
Nos uacuteltimos anos houve um aumento na incidecircncia de bacteacuterias
multirresistentes aos antimicrobianos no ambiente hospitalar tornando isto um
problema mundial de sauacutede puacuteblica (HULSCHER et al 2010) Quando se trata
principalmente de bacilos Gram negativos a frequumlecircncia destas bacteacuterias eacute ainda
maior em paiacuteses da Ameacuterica Latina quando comparada a paiacuteses desenvolvidos
(GALES etal 2012)
De acordo com dados do ldquoMeropenem Yearly Susceptibility Test Information
Collectionrdquo (MYSTIC) ocorreu nos Estados Unidos um aumento na susceptibilidade
de K pneumoniae nos uacuteltimos anos graccedilas a praacuteticas de controle de disseminaccedilatildeo
de amostras resistentes(RHOMBERG P R et al 2009) O aumento crescente da
prevalecircncia destes microrganismos foi proporcional ao aumento da dependecircncia do
uso de antibioacuteticos carbapenecircmicos considerados como a opccedilatildeo terapecircutica para o
tratamento de infecccedilotildees por bacilos Gram negativos multi-resistentes (LIVERMORE
2012) Isto afeta diretamente as opccedilotildees de tratamento sobrando poucas alternativas
para a terapecircutica que incluem colistina (polimixina E) e tigeciclina que apresentam
respectivamente problemas em termos de toxicidade e eficaacutecia (LIVERMORE et
al 2011) Um dos efeitos adversos mais importantes das poliminas B e E por
exemplo satildeo a neurotoxicidade e nefrotoxicidade (MENDES C A C et al2009 )
Devido agrave resistecircncia ser usualmente de natureza plasmidial e portanto de
maior disseminaccedilatildeo especialmente quando carreadas por K pneumoniae
microrganismo com uma notoacuteria capacidade para acumular e transferir plasmiacutedeos
com determinantes para resistecircncia o nuacutemero de casos detectados pelo
fenoacutetipogenoacutetipo blaKPC eacute bastante preocupante (MONTEIRO et al 2009)
Comparada com outras bacteacuterias hospitalares a transmissatildeo de clones
multirresistentes de K pneumoniae eacute maior e podem natildeo ser controladas pelos
meacutetodos de controle de infecccedilatildeo hospitalar (PAAUW et al 2007) A forma
plasmidial para transferecircncia da resistecircncia adicionada a este grande potencial para
disseminaccedilatildeo de clones resistentes eacute preocupante visto que apoacutes surtos muitas
vezes pode se tornar endecircmica Jaacute eacute uma realidade a disseminaccedilatildeo desta bacteacuteria
54
entre pacientes hospitais paiacuteses e ateacute mesmo continentes (WOODFORF et al
2010 ROGERS et al 2011)
As chances de surtos satildeo maiores em paiacuteses com poucos recursos devido agrave
maior carecircncia de praacuteticas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees hospitalares e o
uso irracional de antimicrobianos de forma empiacuterica e inadequada (KUMARASAMY
et al 2010) Ateacute o momento os mecanismos de resistecircncia aos cabapenecircmicos
geralmente encontrado eram a produccedilatildeo de ESBL (CTX-M) somada aacute perda de
porina (CARVALHAES et al 2010) Foi notado a partir do ano de 2008 um
aumento no nuacutemero de K pneumoniae produtoras de KPC-2 apresentando outra
forma de resistecircncia (GALES 2012)
Um estudo mostrou que o perfil do paciente colonizado ou infectado por KPC
foi de um paciente entre os 33 e os 82 anos de idade internado haacute mais de 1
semana no hospital A mortalidade geral nos uacuteltimos anos ficou em torno de 7
sendo que dos 77 pacientes estudados 32 (415) pacientes evoluiacuteram para oacutebito
evidenciando a alta morbi-mortalidade associada (ALVES A P et al 2013)
Em estudo com 2316 pacientes avaliados a populaccedilatildeo de sexo masculino foi
de 526 idade meacutedia global de 53 anos (mediana de 55 anos) permanecircncia meacutedia
de 58 dias (mediana de 3 dias) (OLIVEIRA A C et al 2010) Outros trabalhos
apresentaram ausecircncia de significacircncia entre sexoidade e o desenvolvimento de
infecccedilotildees por microrganismos resistentes (PERES-BOTA D et al 2003 COLPAN
A et al 2005 COELLO R et al 1997)
Outro estudo utilizou um total de 30 amostras sendo elas isoladas de urina
escarro secreccedilatildeo pleural ponta de cateter aspirado traqueal e hemocultura A mais
prevalente foi em urina (40) Entre as 30 cepas analisadas a maior porcentagem
foi da cepa Klebsiella pneumoniae (70) Enterobacter sp (133) Klebsiella
ozaenae (10) Escherichia coli (333) e Klebsiella oxytoca (333)
(DIENSTMANN R et al 2010) Nos Estados Unidos a enzima KPC jaacute se tornou
endecircmica Foi realizada uma pesquisa em dois hospitais de Nova York onde
testaram 602 amostras e 45 apresentaram algum mecanismo de resistecircncia
sendo apenas 33 confirmadas por biologia molecular como KPC-2 (BRATU et
al 2005)
55
Estudo sobre os tipos de ESBL feito no Japatildeo apresentou o tipo Toho-1 como
o mais prevalente nessa pesquisa Ateacute o ano de 2000 ano em que foi publicado tal
estudo este era o primeiro relatoacuterio no Japatildeo para identificar derivados de ESBLs
como tipo de SHV e TEM entre E coli e K pneumoniae Em especial o tipo SHV- 12
foi identificado com uma maior frequumlecircncia Estes resultados indicam que tipos
distintos de ESBLs que satildeo diferentes em sua especificidade de substrato e origem
geneacutetica coexistem no Japatildeo Isto mostra a importacircncia de caracterizar genoacutetipos
distintos de ESBLs e de estar em alerta continuamente para as tendecircncias de
ESBLs no Japatildeo aleacutem da necessidade de uma interpretaccedilatildeo uniforme utilizando as
diretrizes do CSLI para relatar cepas produtoras de ESBL Aleacutem da detecccedilatildeo de
ESBLs satildeo necessaacuterias mais informaccedilotildees tais como o perfil de sensibilidade
especiacutefica para diversas β-lactacircmicos e o local da infecccedilatildeo Esses fatores satildeo
essenciais para a escolha adequada de antibioacuteticos (YAGI T et al 2000)
No ano de 2004 uma pesquisa avaliou a produccedilatildeo de uma enzima de
hidroacutelise de carbapenecircmicos atraveacutes da teacutecnica de sequumlenciamento foi revelado
um novo membro da famiacutelia KPC designado KPC- 3 Pesquisadores encontraram
em um mutante de K pneumoniae uma substituiccedilatildeo de um gene associado com
resistecircncia a Imipenem mas essa substituiccedilatildeo foi considerada improvaacutevel na
contribuiccedilatildeo da resistecircncia aos carbapenecircmicos da espeacutecie estudada Aleacutem da
resistecircncia aos carbapenecircmicos estes isolados eram em sua maioria resistentes agraves
cefalosporinas penicilinas e aminoglicosiacutedeos Usando estudos de transformaccedilatildeo
conjugaccedilatildeo e hibridaccedilatildeo localizaram o alelo blaKPC em plasmiacutedeo aleacutem disso
mostraram que esse alelo tambeacutem carregava uma resistecircncia aos aminoglicosiacutedeos
A transferecircncia das enzimas KPCs foi demonstrada in vitro tanto neste como em
outros estudos pode ser que os plasmiacutedeos que fazem esta transferecircncia estavam
comeccedilando a se espalhar no ambiente cliacutenico resultando na multiresistecircncia dessas
estirpes (WOODFORD et al 2004)
O presente estudo apresentou um vieacutes quanto aos resultados dos testes de
susceptibilidade microbiana Observou-se que natildeo foi encontrado resultado deste
teste em algumas amostras o que natildeo cooperou para um estudo mais preciso
futuros estudos quanto agraves amostras e um melhor acompanhamento deste tipo de
patologia Poreacutem mesmo sem algumas amostras com este resultado disponiacutevel foi
56
confirmada a presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos
carbapenecircmicos por meio dos genes de resistecircncia blaKPC e 16S rRNA que as
amostras apresentaram em sua maioria serem portadoras Quanto aos resultados
estatiacutesticos nenhuma das variaacuteveis apresentou significacircncia estatiacutestica (p gt 005)
mostrando assim que estas variaacuteveis isoladas natildeo foram o fator determinante para
o desfecho cliacutenico de alta ou oacutebito
57
7 CONCLUSAtildeO
Os genes blaKPC e 16S rRNA foram caracterizados confirmando a a
presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos carbapenecircmicos
Houve uma maior prevalecircncia da cepa K pneumoniae e isto confirma outros
estudos que apresentam a maior prevalecircncia desta cepa em amostras com KPC
Aleacutem disso isso justifica a forma popular da K pneumoniae ser chamada de KPC
enquanto que na verdade KPC eacute uma enzima podendo estar presente em outras
cepas como Enterobacter clocae tambeacutem apresentada no presente estudo O
desfecho cliacutenico de oacutebitos maior que 50 eacute um possiacutevel indicador sobre a
necessidade de se realizar um teste raacutepido para identificaccedilatildeo de KPC visando
iniciar o mais raacutepido possiacutevel o tratamento afim de diminuir a mortalidade por esta
infecccedilatildeo
Nenhuma das variaacuteveis isoladamente estaacute relacionada ao desfecho cliacutenico
oacutebito ou alta pois natildeo apresentaram relevacircncia estatiacutestica O presente estudo
mostrou que haacute presenccedila da bacteacuteria nas amostras de pacientes do hospital
estudado podendo entatildeo afirmar que este tipo de bacteacuteria se encontra tambeacutem
presente em ambiente hospitalar O uso irracional de antimicrobiano eacute demonstrado
de forma indireta quando foi apresentado atraveacutes do Teste de Hodge Modificado
uma resistecircncia de 100 aos antibioacuteticos carbapenecircmicos Isto tambeacutem reflete na
terapecircutica sendo que pacientes portadores de bacteacuterias resistentes aos
antibioacuteticos carabepecircmicos tem uma escassa opccedilatildeo de tratamento e as opccedilotildees
apresentam problemas quanto agrave toxicidade e eficaacutecia
58
REFEREcircNCIAS
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Mecanismos
de resistecircncia bacteriana aos antimicrobianos Disponiacutevel em
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controleopas_
webmodulo3mec_sitiohtmgt Acesso em 25 de abril de 2014
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Nota teacutecnica nordm
012013 medidas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees por enterobacteacuterias
multiresistentes Acesso em 17 de abril de 2013
ALBA J et al Kinetics study of KPC-3 a plasmid-encoded class A
carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase Antimicrob Agents Chemother
Nov49(11)4760-2 2005
ALVES A P et al Nosocomial infections by KPC-producing enterobacteria in
a tertiary hospital in Southern Brazil Revista da AMRIGS Porto Alegre 57 (3) 213-
218 jul-set 2013
ALVES A et al Tipagem Geneacutetica de Microrganismos Lab De Diversidade
Microbiana Centro de Biologia Celular Dep de Biologia U de Aveiro 3810-193
Aveiro- 2003
BELL J M et Al Prevalence and significance of a negative extended-
spectrum beta-lactamase (ESBL) confirmation test result after a positive ESBL
screening test result for isolates of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae
results from the SENTRY Asia-Pacific Surveillance Program J Clin Microbiol
May45(5)1478-82 2007
BRATU S et al Detection of KPC carbapenem-hydrolyzing enzymes in
Enterobacter spp from Brooklyn New York Antimicrob Agents Chemother v 49 n
2 p 776-8 2005
59
BRATU S et al Emergence of KPC-possessing Klebsiella pneumoniae in
Brooklyn New York epidemiology and recommendations for detection Antimicrob
Agents Chemother v 49 n 7 p 3018-20 2005
BRATU S et al Rapid spread of carbapenem-resistant Klebsiella
pneumoniae in New York City Arch Intern Med v 165 p 1430-5 2005
CAMARGO C F et al Aplicaccedilatildeo das teacutecnicas de pcr e suas teacutecnicas
derivadas em diagnoacutestico molecular Disponiacutevel em
ltfileDUnB10C2BA20semestreArtigosPCR-
20CLEYTON20FLORENCIO20DE20CAMARGO20E20PAULO20ROB
ERTO20QUEIROZpdfgtgt Acesso em 08 de abril de 2014
CARVALHES C G et al Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting
carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive
results Journal of Antimicrobial Chemotherapy v 65 n2 p 249-251 2010
CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION- CDC Modified
Hodge Test for Carbapenemase Detection in Enterobacteriaceae 2004
CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE Methods for
dilutionantimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically Approved
standard M7ndashA7 7th ed CLSI Wayne PA 2011
COELLO R et al Risk factors for developing clinical infection with methicillin-
resistant Staphylococcus aureus (MRSA) amongst hospital patients initially only
colonized with MRSA J Hosp Infect 19973739-46
COLPAN A et al Evaluation of risk factors for mortality in intensive care
units A prospective study from a referral hospital in Turkey Am J Infect Control
200533(1)42-7
60
CORNAGLIA G et al Living with ESBLs Introduction Clinical Microbiology
and Infection 14 Suppl 1 1-2 2008
COTRIM E R et al Klebsiella pneumoniae carbapenemase ndash KPC em
Enterobacteriaceae o desafio das bacteacuterias multirresistentes Poacutes em revista do
centro universitaacuterio Newton Paiva 12012 - ediccedilatildeo 5 - issn 2176 7785
DESHPANDE L M et al Occurrence and characterization of
carbapenemase-producing Enterobacteacuteriaceae report from the SENTRY
Antimicrobial Surveillance Program (2000-2004) Microb Drug Resist 12(4)223-30
2006
DIAS D J A Estudos dos principais mecanismos de resistecircncia aos
antibioacuteticos β-lactacircmicos em bacteacuterias patogecircnicas gram negativas 2009 100 f
Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Geneacutetica Molecular e Biomedicina) ndash Faculdade de
Ciecircncias e Tecnologia Universidade de Nova Lisboa Lisboa
DIENSTMANN R et al Avaliaccedilatildeo fenotiacutepica da enzima Klebsiella
pneumoniae carbapenemase (KPC) em Enterobacteriaceae de ambiente hospitalar
J Bras Patol Med Lab v 46 n 1 p 23-27 fevereiro 2010
ENDIMIAMI A et al Emergence of blaKPC-containing Klebsiella
pneumoniae in a long-term acute care hospital a new challenge to our healthcare J
Antimicrob Chemother 64 1102-1110 Nov 2009
FALAGAS M E et al Extended-spectrum beta-lactamase producing
organisms The Journal of Hospital Infection 73 (4) pp 345-54 2009
FONTANA C et al Emergence of KPC-producing Klebsiella pneumoniae in
Italy BMC Rev Notes 3 40 2010
61
GALES A C et al Antimicrobial resistance among Gram-negative bacilli
isolated from Latin America results from Sentry Antimicrobial Surveillance Program
(Latin America 2008-2010) Diagnostic Microbiology and Infectious Disease v 3 n
4 p 354 -360 2012
GUPTA N et al Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Epidemiology
and Prevention HEALTHCARE EPIDEMIOLOGY Clinical Infectious Diseases
201153(1)60ndash67 Published by Oxford University Press on behalf of the Infectious
Diseases Society of America 2011
HARBOTTLE H et al Genetics of antimicrobial resistance Anim Biotechnol
n17 p111-124 2006
HENRIQUE W N et al RESISTEcircNCIA BACTERIANA Uniatildeo das
Faculdades Alfredo NasserInstituto de Ciecircncias da Sauacutede Disponiacutevel em lt
httpwwwfaculdadealfredonasseredubrfilespesquisaposter20HENRIQUE20
Wilker20Natividade20SANTIAGO20Silvania20CAVALCANTI20DSP
20ResistC3AAncia20Bacterianapdfgt Acesso em 17 marccedilo 2014
HULSCHER M E J I et al Antibiotic prescribing in hospital a social and
behavioral scientific approach The Lancet Infectious Diaseases v 10 n 3 p 167-
165 2010
KIDWAI M SAPRA P BHUSHAN KR Synthetic strategies and medicinal
properties of beta-lactams Curr Med Chem 1999 695-215
KUMARASAMY K K et al Emergence of a new antibiotic resistance
mechanism in India Pakistan and the UK a molecular biological and
epidemiological stuy The Lancet Infectious Diseases v10 n 9 p 597- 602 2010
LINCOPAN N et al Enterobacteacuteria producing extended-spectrum β-
lacatamases and IMP-1 Metalo-β-lactamases isolated from Brazilian hospitals J Med
62
Microbiol 7 1-3 2006
LINCOPAN N et al First Isolation of Metalo-β-Lacatamase-Producing
Multiresistant Klebsiella pneumoniae from a patient in Brazil J Clin Microbiol 43(1)
516-519 2005
LIVERMORE D M et al What remains against carbapenem- resistant
Enterobacteriaceae Evaluation of choramphenicol ciprofloxacin colistina
fosfomycin minocycline nitrofurantoin temocilin and tigecycline International
Journal of Antimicrobial Agents v 37 n 5 p 415- 459 2011
LIVERMORE D M Fourten years in resistance International Journal of
Antimicrobial Agents v 39 283- 294 2012
LIVERMORE D M Bacterial resistance to carbapenems Adv Exp Med Biol
1995 39025-47
LIVERMORE D M Bacterial resistance origins epidemiology and impact
Clin Infect Dis 36S11-S23 2003
LIVERMORE D M et al Carbapenemases a problem in waiting Curr
Opin Microbiol 2000 3489-95
LU et al Universal pcr for common bacterial pathogens J CLIN
MICROBIOL VOL 38 2000
LU et al Use of PCR with Universal Primers and Restriction Endonuclease
Digestions for Detection and Identification of Common Bacterial Pathogens in
Cerebrospinal Fluid Journal of Clinical Microbiology June 2000 p 2076ndash2080
MARSCHALL J Met al Presence of the KPC Carbapenemase Gene in
Enterobacteriaceae Causing Bacteremia and Its Correlation with In Vitro
Carbapenem Susceptibility J Clin Microbiol 47 239-241 Jan 2009
63
MARTINS WMBS et al Prevalecircncia do gene blaKPC em isolados cliacutenicos
de Enterobacteriaceae e natildeo fermentadores encontrados em amostras clinicas em
um hospital universitaacuterio do Recife X Jornada de ensino pesquisa e extensatildeo ndash
JEPEX 2010 ndash UFRPE Recife 18 a 22 de outubro
MENDES C A C et al Polimixinas Revisatildeo com ecircnfase na sua
nefrotoxicidade Rev Assoc Med Bras 2009 55(6) 752-9
MOHR J F 3rd Update on the efficacy and tolerability of meropenem in the
treatment of serious bacteacuterial infections Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S41-51
2008
MONTEIRO J et al First report of KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae
strains in Brazil Antimicrob Agents Chemother Jan53(1)333-4 2009
MOREIRA V C et al Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia a antibioacuteticos
Disponiacutevel em
lthttpwwwcpglsucgbr6mostraartigosSAUDEVANESSA20CARVALHO20M
OREIRApdfgt Acesso em 21 marccedilo 2014
NETIKUL T et al Emergence of novel blaKPC-12 and blaKPC-13 variants in
carbapenem non-susceptible Enterobacter cloacae a first report of blaKPC gene in
Thailand European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases May
S372 2011
NETO V A et al Antibioacuteticos na praacutetica Meacutedica 6ordf Ediccedilatildeo Editorial
SarverSP Brasil 2007
NICOLAU D P Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of
meropenem Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S32-40 2008
64
OLIVEIRA A C et al Resistecircncia bacteriana e mortalidade em um centro de
terapia intensiva Rev Latino-Am Enfermagem nov-dez 2010
PAAUW A et al Failure to control an outbreak of qnrA 1-positive multidrug-
resistant Enterobacter clocae despite adequate implementation of recommended
infection control measures Journal of Clinical Microbiology v 45 n 5 p 1420-1425
2007
PATERSON D L et al Extended-Spectrum Beta-Lactamases a Clinical
Update Clinical Microbiology Reviews v 18 p 657-686 2005
PEIRANO G et al Carbapenem-hydrolysing beta-lactamase KPC-2 in
Klebsiella pneumonia isolated in Rio de Janeiro Brazil J Antimicrob Chemother Nov
20 2009
PERES-BOTA D et al Are infections due to resistant pathogens associated
with worse outcome in critically ill patients J Infect 200347(4)307-16
PIDDOCK L J V Clinically relevant chromosomally encoded multidrug
resistance effl ux pumps in bacterial Clin Microbiol Rev n19 p382-402 2006
PITOUT J D D et al Emergence of Enterobacteriaceae producing
extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) in the community J Antimicrob
Chemother May 56 2005
POSSEBON M I et al Resistecircncia bacteriana aos carbapenecircmicos
Bacterial resitence to carbapenems RBM rev bras med60(6)378380-378-382
jun 2003
QUEENAN A M et al Carbapenemases the versatile beta-lactamases
Clin Microbiol Rev Jul20(3)440-58 2007
65
RHOMBERG P R et al Summary trends for the meropenem yearly
susceptibility test information collection program a 10- year experience in the United
States (1999-2008) Diagnostic Microbiology and Infectiois Disease v 65 n4 p
414-426 2009
ROBLEDO I E et al Detection of KPC in Acinetobacter spp in Puerto Rico
J Antimicrob Agents Chemother 54 1354-1357 Mar 2010
ROGERS B A et al Country-to-country transfer os patients and the risk of
multi-resistant bacterial infection Clinical Infectious Disease v53 n1 p49- 56
2011
SHAH A A et al Characteristics epidemiology and clinicalimportance of
emerging strains of Gram-negative bacilli producing extended-spectrum
betalactamases Research in Microbiology v 155 p 409-421 2004
TURNER P J Extended- Spectrum Beta-Lactamases Clinical Infectious
Diseases v 41 p 273-275 2005
WOLTER D J et al Phenotypic and Enzymatic Comparative Analysis
between the Novel KPC variant KPC-5 and Its Evolutionary Variants KPC-2 and
KPC-4 Antimicrob Agents Chemother Nov 17 2008
WOODFORD N et al Carbapenemases of Chryseobacterium
(Flavobacterium) meningosepticum distribution of blaB and characterization of a
novel Metalo-beta-lactamase gene blaB3 in the type strain NCTC 10016
Antimicrob Agents Chemother Jun44(6)1448-52 2000
WOODFORF N Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in
India Pakistan and the UK a molecular biological and epidemiological study The
Lancet Infectious Diseases v 10 n 9 p 597-602 2010
66
WOODFORD et al Outbreak of Klebsiella pneumoniae Producing a New
Carbapenem- Hydrolyzing Class A β-Lactamase KPC-3 in a New York Medical
Center Antimicrobial agents and chemotherapy Dec 2004 p 4793ndash4799 Vol 48
No 12
YAGI T et al A preliminary survey of extended-spectrum β-lactamases
(ESBLs) in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Japan
FEMS Microbiology Letters 184 (2000) 53-56
YIGIT H et al Novel carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase KPC-1 from
a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumonia J Antimicrob Agents
Chemother 45 (4) 1151-1161 (2001)
ZAVASCKI A P et al KPC-2- producing Enterobacter cloacae in two cities
from Southern Brazil Int J Antimicrob Agents Apr 28 2009
ZHANEL G G et al Comparative review of the carbapenecircmicos Drugs
67(7)1027-52 2007
67
ANEXOS
Sequumlecircncia do oligo blaKPC
Query 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
Query 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
Query 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
68
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
Query 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
Query 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
69
Query 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
Query 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
Query 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
70
Sbjct 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
Query 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 481
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ATTTGTT 540
Query 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 541
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GCGATAC 600
Query 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
71
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 601
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ATGCGCG 660
Query 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
Query 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
72
Query 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
Query 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
Query 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
73
Sbjct 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
Query 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
Query 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
Query 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
74
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
Query 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
Query 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
75
Query 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
Query 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
||||
Sbjct 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
LOCUS AF297554 1377 bp
DNA linear BCT 26-MAR-2001
DEFINITION Klebsiella pneumoniae carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
gene complete cds
ACCESSION AF297554
VERSION AF2975541 GI10121874
76
KEYWORDS
SOURCE Klebsiella pneumoniae
ORGANISM Klebsiella pneumoniae
Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Enterobacteriaceae Klebsiella
REFERENCE 1 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH QueenanAM
AndersonGJ Domenech-SanchezA
BiddleJW StewardCD
AlbertiS BushK and TenoverFC
TITLE Novel carbapenem-hydrolyzing beta-
lactamase KPC-1 from a
carbapenem-resistant strain of
Klebsiella pneumoniae
JOURNAL Antimicrob Agents Chemother 45 (4)
1151-1161 (2001)
PUBMED 11257029
REFERENCE 2 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH AndersonGJ and
TenoverFC
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (19-AUG-2000) Nosocomial
Pathogens Laboratory Branch
Centers for Disease Control and
Prevention 1600 Clifton Rd MS
G08 Atlanta GA 30333 USA
FEATURES LocationQualifiers
77
source 11377
organism=Klebsiella
pneumoniae
mol_type=genomic DNA
db_xref=taxon573
-35_signal 5560
-10_signal 7883
mRNA 921012
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
RBS 117122
CDS 1311012
note=blaKPC-1
codon_start=1
transl_table=11
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
protein_id=AAG134101
db_xref=GI10121875
translation=MSLYRRLVLLSCLSWPLAGFSATALTNLVAEPFAKLEQD
FGGSI
GVYAMDTGSGATVSYRAEERFPLCSSFKGFLAAAVLARSQQQAGLLDTPIRYG
KNALV
PWSPISEKYLTTGMTVAELSAAAVQYSDNAAANLLLKELGGPAGLTAFMRSIG
DTTFR
78
LDRWELELNSAIPSDARDTSSPRAVTESLQKLTLGSALAAPQRQQFVDWLKGN
TTGNH
RIRAAVPADWAVGDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTRAPNKDDK
HSEAV
IAAAARLALEGLGVNGQ
ORIGIN
1 cggggcagtt acagccgtta cagcctctgg
agagggagcg gcttgccgct cggtgataat
61 cccagctgta gcggcctgat tacatccggc
cgctacacct agctccacct tcaaacaagg
121 aatatcgttg atgtcactgt atcgccgtct
agttctgctg tcttgtctct catggccgct
181 ggctggcttt tctgccaccg cgctgaccaa
cctcgtcgcg gaaccattcg ctaaactcga
241 acaggacttt ggcggctcca tcggtgtgta
cgcgatggat accggctcag gcgcaactgt
301 aagttaccgc gctgaggagc gcttcccact
gtgcagctca ttcaagggct ttcttgctgc
361 cgctgtgctg gctcgcagcc agcagcaggc
cggcttgctg gacacaccca tccgttacgg
421 caaaaatgcg ctggttccgt ggtcacccat
ctcggaaaaa tatctgacaa caggcatgac
481 ggtggcggag ctgtccgcgg ccgccgtgca
atacagtgat aacgccgccg ccaatttgtt
541 gctgaaggag ttgggcggcc cggccgggct
gacggccttc atgcgctcta tcggcgatac
79
601 cacgttccgt ctggaccgct gggagctgga
gctgaactcc gccatcccaa gcgatgcgcg
661 cgatacctca tcgccgcgcg ccgtgacgga
aagcttacaa aaactgacac tgggctctgc
721 actggctgcg ccgcagcggc agcagtttgt
tgattggcta aagggaaaca cgaccggcaa
781 ccaccgcatc cgcgcggcgg tgccggcaga
ctgggcagtc ggagacaaaa ccggaacctg
841 cggagtgtat ggcacggcaa atgactatgc
cgtcgtctgg cccactgggc gcgcacctat
901 tgtgttggcc gtctacaccc gggcgcctaa
caaggatgac aagcacagcg aggccgtcat
961 cgccgctgcg gctagactcg cgctcgaggg
attgggcgtc aacgggcagt aaggctctga
1021 aaatcatcta ttggcccacc accgccgccc
ttgcgggcgg catggattac caaccactgt
1081 cacatttagg ctaggagtct gcgcggcaga
gccgtgtgac cggttttctg tagagcactg
1141 acgatggcgg cggcgctctc tgcaattggc
aaggcgtcgg cgccaaggat accaatcttg
1201 cggcgcgcgg cgtgttatga cgactggggt
gcatttgagc cgccccattt aaccttcgcc
1261 ctcacagata cgccattcgc ctcaaattta
gcgccatgca gacgagcttc cactcggctt
1321 gcaccttgtc caggcccctc atgctgaact
gacgcaatcc catcaccgcc ttgatca
80
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AmpC- Adenosina Monofosfato Ciacuteclico
BRMD- Bacteacuterias multirresistentes
CCIH- Comissatildeo de Controle de Infecccedilatildeo Hospitalar
CDC- Centers for Disease Control and Prevention
CIM- Concentraccedilatildeo Inibitoacuteria Miacutenima
CLSI- Clinical and Laboratory Standards Institute
DNA- Aacutecido Desoxirribonucleacuteico
E coli- Escherichia coli
ERIC-PCR - Enterobacterial Repet it ive Intergenic Consensus
ESBL- Beta-Lactamases de Espectro Estendido
Et al- e outros
ETP- Ertapenem
HRAN- Hospital Regional da Asa Norte
K ornithinolytica- Klebsiella ornithinolytica
K oxytoca- Klebsiella oxytoca
K planticola- Klebsiella planticola
K pneumoniae- Klebsiella pneumoniae
K terrigena- Klebsiella terrigena
KPC - Klebsiella pneumoniae produtora de Carbapenemase
KPCNEG- Bacilos Gram-Negativos Natildeo Fermentadores
KPCPOS- Bacilos Gram-Positivo Natildeo Fermentadores
MBL- metalo-beta-lactamases
MEM- Meropenem
NA- Natildeo se aplica
Oligo- Oligonucleotiacutedeos
PB- Pares de Bases
PBPs (Penicilim-Binding-Protein)- Proteiacutenas de ligaccedilatildeo agrave penicilina
PCR- Polymerase Chain Reaction (Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase)
PFGE - Pulsed-Field Gel Electrophoresis (Eletroforese em campo pulsado)
RAPD- Randomly Amplified Polymorphic DNA (DNA polimoacuterfico amplificado
aleatoriamente)
RFLPrsquos - ldquoRestriction Fragment Length Polymorphismsrdquo( polimorfismos de tamanho
de fragmentos de restriccedilatildeo)
THM- Teste de Hodge Modificado
TSA- Teste de Susceptibilidade aos Antibioacuteticos
UTI- Unidade de Terapia Intensiva
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 15
11 Klebsiella pneumoniae produtora de Carbapenemase (KPC) 15
1 2 Resistecircncia bacteriana 20
13 Anaacutelise geneacutetica de microrganismos 27
2 JUSTIFICATIVA 30
3 OBJETIVOS 31
31 Objetivo geral 31
32 Objetivos Especiacuteficos 31
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS 32
4 1 Coleta e transporte das amostras bioloacutegicas 32
4 2 Procedimentos para confirmaccedilatildeo de resistecircncia bacteriana por disco de
Ertapenem (adaptado CDC 2004) 32
4 2 1 Interpretaccedilatildeo dos Resultados 33
4 3 Teste de susceptibilidade aos antibioacuteticos 34
4 4Teste de Hodge Modificado (THM) (adaptado CDC 2004) 35
441 Controle de qualidade (CQ) 35
442 InterpretaccedilatildeoResultados 35
4 5 Extraccedilatildeo de DNA bacteriano 37
4 6 Iniciadores e reaccedilatildeo de PCR 38
4 7 Digestatildeo 41
4 8 Eletroforese em gel de agarose 41
4 9 Descarte de resiacuteduos 42
4 10 Aspectos epidemioloacutegicos e cliacutenicos 42
4 12 Anaacutelises estatiacutesticas 42
4 13 Preceitos eacuteticos 43
5 RESULTADOS 44
51 Anaacutelise molecular 44
5 1 1 Gene blaKPC 44
5 1 2 Gene 16S rRNA 45
5 2 Anaacutelises epidemioloacutegicas 46
5 2 1 Sexo 46
5 2 2 Desfecho cliacutenico 47
5 2 3 Local da coleta 48
5 2 4 Microrganismo 48
6 DISCUSSAtildeO 53
7 CONCLUSAtildeO 57
15
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC)
Klebsiella pneumoniae pertence aacute famiacutelia Enterobacteriaceae
encontrado em locais como aacutegua solo plantas e esgoto Satildeo encontradas cinco
espeacutecies K pneumoniae K oxytoca K planticola K terrigena e K ornithinolytica
O gecircnero Klebsiella eacute definido como contendo bacilos Gram-negativos natildeo moacuteveis
em forma de bastatildeo e geralmente encapsuladas que produzem lisina
descarboxilase mas natildeo produzem ornitina descarboxilase Provavelmente a
colonizaccedilatildeo em seres humanos ocorre por contato com as diferentes fontes
ambientais podendo ser encontrada colonizando a orofaringe e fezes de pessoas
sadias Pessoas imunocomprometidas a bacteacuteria encontra um ambiente favoraacutevel
para seu crescimento levando aos quadros de infecccedilatildeo (MOREIRA et al 2014)
A Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) eacute uma enzima produzida por
enterobacteacuterias gram-negativas sendo um mecanismo de resistecircncia aos antimi-
crobianos carbapenecircmicos meropenen ertapenen eou imipenen classe
amplamente utilizada no tratamento de infecccedilotildees envolvendo Enterobacteriaceae
Ela tambeacutem eacute capaz de inativar os agentes β-lactacircmicos cefalosporinas penicilinas
e o aztreonam (COTRIM et al 2012)
Devido agrave semelhanccedila estrutural e estereoquiacutemica os antibioacuteticos beta-
lactacircmicos possuem um mecanismo de accedilatildeo comum ao grupo Eles atuam inibindo
a siacutentese da parede celular bacteriana atraveacutes do mecanismo de bloqueio da
transpeptidaccedilatildeo responsaacutevel pela uniatildeo dos componentes individuais do
peptidoglicano conforme demonstrado na figura 1 (KIDWAI et al 1999)
A accedilatildeo destes antibioacuteticos eacute atraveacutes de ligaccedilotildees covalentes com as proteiacutenas
as Penicilim-Binding-Protein (proteiacutena de ligaccedilatildeo da penicilina- PBP ou PLP) que se
encontram presentes na membrana citoplasmaacutetica de todas as bacteacuterias Devido agraves
mutaccedilotildees ocorre uma induccedilatildeo na alteraccedilatildeo dessas proteiacutenas podendo determinar
uma diminuiccedilatildeo da afinidade dos beta-lactacircmicos agraves mesmas A accedilatildeo dos
carbapenecircmicos eacute atraveacutes da sua ligaccedilatildeo agraves PBPs presentes na parede bacteriana
especialmente as PBP1 e PBP2 provocando a lise osmoacutetica da bacteacuteria Aleacutem
disso eles tecircm uma facilidade na penetraccedilatildeo da bacteacuteria por meio dos canais
poriacutenicos presentes nas bacteacuterias gram-negativas induzindo um efeito poacutes-
16
antibioacutetico Quando comparados com outros beta-lactacircmicos os carbapenecircmicos
satildeo mais resistentes agrave hidroacutelise pela maioria das beta-lactamases tanto
cromossocircmicas como plasmiacutedicas (LIVERMORE 1995 LIVERMORE et al 2000)
Figura 1 Accedilatildeo do szlig-lactacircmico sobre a bacteacuteria gram-positiva e gram-
negativa Fonte
ltlthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controle
opas_webmodulo3gramn_lacta2htmgt (adaptado)
A bacteacuteria Klebsiella pneumoniae quando apresenta gene ESBL pode
expressar resistecircncia a ateacute 95 dos antimicrobianos existentes no acircmbito
farmacecircutico sendo a produccedilatildeo de beta-lactamases de espectro estendido (ESBL)
17
por esta bacteacuteria uma das principais causas de falha terapecircutica Existem outras
formas de resistecircncia emergentes de grande importacircncia como a produccedilatildeo de
beta-lactamases tipo adenosina monofosfato ciacuteclico (AmpC) que hidrolizam
cefoxitina as carbapenemases como as metalo-beta-lactamases (MBL) e
carbapenemases tipo KPC (MOREIRA et al 2014)
O mecanismo de resistecircncia mais comum aos antibioacuteticos beta-lactacircmicos de
amplo espectro eacute a produccedilatildeo de ESBL por enterobacteacuterias A accedilatildeo hidroliacutetica
apresentadas por estas enzimas pode conferir clinicamente resistecircncia ao
aztreonam cefalosporina e a todas as penicilinas (PATERSON et al 2005) As
ESBL satildeo enzimas mediadas por genes plasmidiais (transmissiacuteveis entre as
espeacutecies) Os principais microrganismos produtores de ESBL satildeo Klebsiella
pneumoniae (mais encontrada) Escherichia coli e Proteus mirabilis podendo ocorrer
em outros membros da famiacutelia Enterobacteriaceae e em alguns microrganismos natildeo
enteacutericos como Acinetobacter ssp (TURNER 2005) A importacircncia cliacutenica meacutedica
destes microrganismos portadores de ESBL eacute que graccedilas aacutes suas resistecircncias a
muitas classes de antimicrobianos o tratamento de infecccedilotildees eacute difiacutecil gerando um
aumento da morbidade e mortalidade dos pacientes (SHAH et al 2004)
A enzima KPC foi detectada pela primeira vez na Carolina do Norte Costa
Leste dos Estados Unidos no ano de 1996 em Klebsiella pneumoniae dando entatildeo
este nome a enzima Em pouco tempo ela disseminou por outras regiotildees e
recentemente tornou-se uma das preocupaccedilotildees quanto agrave sauacutede puacuteblica mundial
Os paiacuteses de onde KPCs tecircm sido relatados desde 2001 satildeo mostrados na figura 2
apresentando como os organismos tecircm agora sido disseminados amplamente pelo
mundo (NEIL GUPTA et al 2011)
18
Figura 2 Divulgaccedilatildeo internacional de Enterobacteriaceae produtora de
Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC)( NEIL GUPTA et al 2011)
Este mapa apresenta paiacuteses onde Enterobacteriaceae produtoras KPC de
foram descritos em relatoacuterios publicados disponiacuteveis a partir de 11 fevereiro de
2011 Os paiacuteses natildeo destacadas nesta figura tambeacutem podem apresentar a presenccedila
de Enterobacteriaceae produtoras de KPC poreacutem pode ter tido uma falta de
vigilacircncia sistemaacutetica para estes organismos ( NEIL GUPTA et al 2011)
No ano de 2005 foram registradas pela primeira vez essas bacteacuterias
produtoras de carbapenemases Apoacutes 6 anos deste primeiro relato elas passaram a
causar surtos mais graves em nosso paiacutes Em janeiro de 2011 foram notificados no
Distrito FederalBrasil 367 casos em um curto espaccedilo de tempo (01 a 08 de janeiro
de 2011) com 26 oacutebitos A maior parte destes casos (263 casos) foi identificada nas
unidades de terapia intensiva ndash UTI (COTRIM et al 2012)
O potencial de disseminaccedilatildeo da KPC eacute alto devido agrave grande capacidade de
transferecircncia do seu material geneacutetico e por conseguinte os genes de resistecircncia
O controle de epidemias eacute difiacutecil devido a esta caracteriacutestica de faacutecil disseminaccedilatildeo
preocupando os profissionais da aacuterea de sauacutede devido agrave dificuldade de tratamento
podendo resultar em um aumento das taxas de mortalidade Apesar da maior
19
frequumlecircncia em Klebsiella pneumoniae a KPC pode ser identificada em outras
bacteacuterias como a Enterobacter cloacae Citrobacter freundii Salmonella spp E coli
e Pseudomonas spp (DIENSTMANN et al 2010)
Os pacientes com comorbidades incluindo pacientes transplantados
neutropecircnicos em ventilaccedilatildeo mecacircnica em Unidade de Terapia Intensiva (UTI)
com longos periacuteodos de internaccedilatildeo que apresentam risco aumentado de infecccedilatildeo ou
colonizaccedilatildeo para bacteacuterias multirresistentes satildeo mais vulneraacuteveis a Klebsiella
pneumoniae produtora de KPC (COTRIM et al 2012)
Os sinais e sintomas apresentados por um indiviacuteduo infectado por KPC satildeo
febre ou hipotermia taquicardia piora do quadro respiratoacuterio e em casos mais
graves hipotensatildeo inchaccedilo e sepse Quanto ao siacutetio de infecccedilatildeo a bacteacuteria que
possui a enzima KPC pode causar pneumonia associada agrave ventilaccedilatildeo mecacircnica
infecccedilatildeo do trato urinaacuterio infecccedilatildeo de corrente sanguiacutenea infecccedilatildeo de partes moles
e outros tipos de infecccedilatildeo (COTRIM et al 2012)
Para desenvolver a infecccedilatildeo a colonizaccedilatildeo eacute um preacute-requisito poreacutem o
pacientes pode estar colonizado ou seja ser portadores de KPC e natildeo desenvolver
a infecccedilatildeo (ALVES et al 2013) A forma de transmissatildeo eacute basicamente por
contato com secreccedilatildeo ou excreccedilatildeo de pacientes infectados ou colonizados logo
fora do ambiente hospitalar a bacteacuteria natildeo representa perigo (COTRIM et al
2012)
As opccedilotildees terapecircuticas para o tratamento da Klebsiella pneumoniae eacute
dividida em Terapia Empiacuterica e Terapia apoacutes a determinaccedilatildeo do perfil de
sensibilidade A terapia empiacuterica para infecccedilotildees por enterobacteacuterias multirresistentes
se baseia na utilizaccedilatildeo de polimixina B ou polimixina E (Colistina) em associaccedilatildeo
com um (1) ou mais dos antimicrobianos da classe dos aminoglicosiacutedeos
(gentamicina ou amicacina) Carbapenecircmicos (meropenem ou doripenem) eou
tigeciclina (ANVISA 2013)
Recomenda-se usar sempre associaccedilotildees de dois ou trecircs antimicrobianos
sendo um deles a polimixina B ou a polimixina E (colistina) Deve-se evitar a
utilizaccedilatildeo de monoterapias pelo risco de raacutepido desenvolvimento de resistecircncia A
escolha do(s) faacutermaco(s) de associaccedilatildeo com polimixina B ou E deve se basear
preferencialmente no perfil de susceptibilidade esperado aos referidos
20
medicamentos das enterobacteacuterias resistentes aos carbapenecircmicos detectadas no
hospital ou na ausecircncia de dados locais na regiatildeo Deve-se considerar igualmente
o local de infecccedilatildeo e a penetraccedilatildeo esperada do antimicrobiano na escolha da droga
a ser utilizada na combinaccedilatildeo (ANVISA 2013)
Apoacutes a liberaccedilatildeo do perfil de sensibilidade deve-se adequar o uso dos
medicamentos Sempre que possiacutevel manter no miacutenimo 2 (dois) faacutermacos com
sensibilidade comprovada in vitro Natildeo havendo sensibilidade a um segundo
medicamento (suscetibilidade apenas agrave polimixina B ou E) recomenda-se manter a
terapia combinada de polimixina B ou E com carbapenecircmicos (meropenem ou
doripenem) ou tigeciclina na tentativa de ocorrecircncia de sinergismo entre elas
(ANVISA 2013)
Sugere-se aleacutem da determinaccedilatildeo das Concentraccedilotildees Inibitoacuterias Miacutenimas
(CIMs) para uma das polimixinas (B ou E) que tambeacutem sejam determinadas as
CIMs de tigeciclina e carbapenecircmicos (meropenem) bem como a consultoria de um
infectologista (ou Comissatildeo de Controle de Infecccedilatildeo Hospitalar- CCIH) para a
determinaccedilatildeo da terapia combinada com base na interpretaccedilatildeo do antibiograma
CIM e quadro cliacutenico do paciente No caso de resistecircncia agraves polimixinas
(concentraccedilotildees inibitoacuterias miacutenimas [CIMs] gt 2 mgL) recomenda-se a associaccedilatildeo de
dois ou trecircs do antimicrobianos sugeridos para a combinaccedilatildeo (ANVISA 2013)
A antissepsia eficiente do ambiente dos instrumentos ciruacutergicos e das matildeos
com o uso do aacutelcool a 70 eacute fundamental para a contenccedilatildeo de surtos Aleacutem disto
os pacientes contaminados devem permanecer isolados ateacute o controle da infecccedilatildeo
para evitar a disseminaccedilatildeo da bacteacuteria (COTRIM et al 2012)
1 2 Resistecircncia bacteriana
Hoje a disseminaccedilatildeo e a proliferaccedilatildeo das bacteacuterias resistentes estatildeo cada
dia mais presente As bacteacuterias multirresistentes (BRMD) poderatildeo levar agrave
humanidade a uma era poacutes-antibioacutetica resultando em uma ausecircncia de qualquer
opccedilatildeo de tratamento para os portadores destas cepas (HENRIQUE et al 2014)
Os fatores envolvidos na disseminaccedilatildeo desses patoacutegenos multirresistentes
satildeo diversos incluindo o uso irracional de antimicrobianos procedimentos invasivos
21
(cirurgias implantaccedilatildeo de proacuteteses meacutedicas e outros) e a transferecircncia de material
geneacutetico com a informaccedilatildeo de resistecircncia a antibioacuteticos entre as bacteacuterias
(DIENSTMANN et al 2010 ENDIMIAMI et al 2009 FONTANA et al 2010)
Com a praacutetica da antibioticoterapia principalmente em ambientes
nosocomiais os mecanismos de resistecircncia tornaram-se comuns Esses
mecanismos incluem alteraccedilatildeo na permeabilidade da membrana celular que
impede a entrada do antibioacutetico na ceacutelula bombeamento do antibioacutetico para fora da
mesma pelo mecanismo de efluxo mutaccedilatildeo geneacutetica que altera de alguma forma o
alvo do antibioacutetico e consequumlentemente natildeo afeta o funcionamento da bacteacuteria
bem como desenvolvimento da capacidade de degradar ou da inativaccedilatildeo do
antibioacutetico (COTRIM et al 2012) Estes mecanismos estatildeo representados na figura
3
Figura 3 Mecanismos de resistecircncia bacteriana Fonte
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controle
opas_webmodulo3pop_mecanismohtmgt
Um dos mais importantes mecanismos de resistecircncia eacute a alteraccedilatildeo do local-
alvo onde atua determinado antimicrobiano de modo a impedir a ocorrecircncia de
qualquer efeito inibitoacuterio ou bactericida As bacteacuterias podem adquirir um gene que
22
codifica um novo produto resistente aos antimicrobianos substituindo o alvo original
por exemplo o Staphylococcus aureus resistente agrave oxacilina e estafilococos
coagulase-negativos adquiriram o gene cromossocircmico Mec A e produzem uma PBP
ou PLP resistente aos β-lactacircmicos denominada 2a ou 2 que eacute suficiente para
manter a integridade da parede celular durante o crescimento quando outras PBPs
essenciais satildeo inativadas por antibimicrobianos β-lactacircmicos Como alternativa um
gene receacutem-adquirido pode atuar para modificar um alvo tomando-o menos
vulneraacutevel a determinado antimicrobiano Assim um gene transportado por
plasmiacutedeo ou por transposon codifica uma enzima que inativa os alvos ou altera a
ligaccedilatildeo dos antimicrobianos como ocorre com eritromicina e clindamicina (ANVISA
2007)
Em funccedilatildeo da bomba de efluxo pode variar a especificidade do antibioacutetico
Ele atua por meio do bombeamento ativo de antimicrobianos do meio intracelular
para o extracelular gerando uma resistecircncia bacteriana a determinados
antimicrobianos como eacute o caso da resistecircncia agraves tetraciclinas codificada por
plasmiacutedeos em Escherichia coli devido agrave presenccedila de proteiacutenas integrantes da
membrana plasmaacutetica bacteriana (PIDDOCK 2006)
O aumento da siacutentese de proteiacutenas eacute o principal responsaacutevel pela resistecircncia
antimicrobiana devido agraves vaacuterias mutaccedilotildees que ocorrem em seus repressores
transcricionais Estas mutaccedilotildees tambeacutem podem influenciar levando a um aumento
da eficiecircncia do transporte dos antibioacuteticos para o exterior da ceacutelula (HARBOTTLE
et al 2006)
A resistecircncia aos antibioacuteticos eacute frequumlentemente associada agrave alteraccedilatildeo
diminuiccedilatildeo da permeabilidade que ocorre na membrana externa das bacteacuterias gram-
negativas O fluxo de moleacuteculas para o interior da ceacutelula ocorre por caracteriacutesticas
peculiares como carga estrutura e dimensatildeo e atraveacutes de proteiacutenas de membrana
as quais formam canais Este percurso eacute utilizado pelos antibioacuteticos para atingir o
interior da ceacutelula bacteriana ou o espaccedilo periplasmaacutetico como eacute o caso dos
antibioacuteticos β-lactacircmicos Portanto a perda de funccedilatildeo destas proteiacutenas pode
efetivamente causar a diminuiccedilatildeo da susceptibilidade a vaacuterios antibioacuteticos
(LIVERMORE 2003)
23
Os mecanismos de resistecircncia que podem impedir a accedilatildeo de antimicrobianos
satildeo vaacuterios O faacutermaco atua de forma a inibir os processos essenciais a multiplicaccedilatildeo
e sobrevivecircncia da ceacutelula bacteriana como a membrana citoplasmaacutetica e
consequumlentemente bloqueando a siacutentese proteacuteica de aacutecidos nucleacuteicos e da parede
celular A resistecircncia bacteriana eacute um mecanismo natural de defesa Sendo assim
as bacteacuterias estatildeo em constante defesa e para cada novo faacutermaco desenvolvido as
bacteacuterias iratildeo desenvolver resistecircncia em algum momento (POSSEBON et al
2003)
O grupo de antibioacuteticos beta-lactacircmicos satildeo amplamente utilizado e se
encontram dentro da classe dos melhores agentes antimicrobianos com relevacircncia
cliacutenica No entanto o seu uso tem sido restringido devido a vaacuterios mecanismos de
resistecircncia O desenvolvimento dos carbapenecircmicos surgiu devido agrave proliferaccedilatildeo de
beta-lactamases mediadas por plasmiacutedeos e cromossomos (POSSEBON et al
2003)
A bacteacuteria KPC tem um gene chamado SHV-1 que tem a caracteriacutestica de
resistecircncia a quase todos os tipos de antimicrobianos inclusive os carbapenecircmicos
especiacuteficos para o tratamento de infecccedilotildees por bacteacuterias multiresistentes e
emergecircncias Mesmo com no seu coacutedigo geneacutetico a informaccedilatildeo necessaacuteria para o
desenvolvimento da resistecircncia a resistecircncia da bacteacuteria soacute eacute desenvolvida caso a
bacteacuteria entre em contato com o antibacteriano desencadeando todo o processo
nos casos de resistecircncia induzida comuns em KPC (MOREIRA et al 2014)
A resistecircncia bacteriana pode ser apresentada de forma intriacutenseca ou
adquirida A resistecircncia intriacutenseca faz parte das caracteriacutesticas fenotiacutepicas naturais
do microrganismo ou seja faz parte de sua heranccedila geneacutetica sendo transmitida
verticalmente a prole sem perda da caracteriacutestica A presenccedila ou ausecircncia do alvo
para a accedilatildeo da droga eacute o principal determinante deste tipo de resistecircncia
(MOREIRA et al 2014) Essa resistecircncia corresponde a uma caracteriacutestica de
espeacutecie bacteriana quando estes microrganismos satildeo naturalmente resistentes a
certo tipo de antibioacutetico Este processo eacute decorrente da ausecircncia de estruturas de
atuaccedilatildeo de antimicrobianos ou a impermeabilidade por parte de estruturas
perifeacutericas das bacteacuterias (HENRIQUE et al 2014)
24
A resistecircncia adquirida aos antibioacuteticos por sua vez ocorre quando haacute uma
da mutaccedilatildeo de genes reguladores ou estruturais aquisiccedilatildeo de genes de resistecircncia
veiculados por elementos geneacuteticos moacuteveis ou da combinaccedilatildeo entre eles Este
aparecimento de resistecircncia em uma espeacutecie bacteriana era anteriormente sensiacutevel
a droga e devido a um destes fatores se torna resistente O fenoacutetipo resultante
desta resistecircncia natildeo estaraacute presente nas ceacutelulas genitoras e sim nos indiviacuteduos de
uma linhagem bacteriana derivada de um organismo susceptiacutevel Os genes muitas
vezes satildeo adquiridos por meio de elementos moacuteveis como plasmiacutedeos e
transposons (MOREIRA et al 2014)
Entatildeo a resistecircncia adquirida ocorre por diversos mecanismos geneacuteticos tais
como produccedilatildeo de enzimas inativadoras interferecircncia com a entrada e acuacutemulo de
droga na bacteacuteria alteraccedilatildeo do receptor para accedilatildeo da droga via metaboacutelica
alternativa Eacute originada por meio de uma alteraccedilatildeo a niacutevel geneacutetico da ceacutelula de
natureza cromossocircmica pelos processos de mutaccedilatildeo transduccedilatildeo e transformaccedilatildeo
ou extra cromossocircmica (plasmidial) (HENRIQUE et al 2014)
Como todo antibioacutetico β-lactacircmicoos carbapenecircmicos tem como mecanismo
de accedilatildeo a inibiccedilatildeo da siacutentese proteacuteica atraveacutes da accedilatildeo de inibiccedilatildeo da parede
microbiana fazendo a ligaccedilatildeo e inativaccedilatildeo das proteiacutenas ligadoras de penicilinas
(NETO et al 2007)
Imipenem e meropenem antibioacuteticos pertencentes ao grupo dos
carbapenecircmicos possuem um amplo espectro de accedilatildeo in vitro incluindo atividade
contra cocos gram-positivos bacilos gram-negativos e bacteacuterias anaeroacutebias (MOHR
2008) Jaacute o ertapenem possui um espectro de accedilatildeo mais limitado que o os dois
antibioacuteticos anteriormente citados tendo uma eficiecircncia limitada contra os bacilos
gram-negativos natildeo fermentadores Um novo antibioacutetico carbapenecircmico ainda natildeo
disponiacutevel no Brasil doripenem possui uma atividade mais potente principalmente
contra Pseudomona aeruginosa devido ao seu mecanismo de accedilatildeo que combina os
espectros de accedilatildeo de imipenem e meropenem (ZHANEL et al 2007)
Devido as suas estabilidades espectro de accedilatildeo poucos relatos de
resistecircncia boa toleracircncia pelos pacientes com efeitos adversos mais comuns as
complicaccedilotildees no siacutetio da infusatildeo e toxicidade gastrintestinal estes antibioacuteticos
carbapenecircmicos tecircm sido considerados terapia de escolha (NICOLAU 2008) Como
25
uma resposta adaptativa das Enterobacteacuterias o iacutendice de resistecircncia aos
carbapenecircmicos tem aumentado nos uacuteltimos anos de forma proporcional ao seu
uso limitando imensamente as opccedilotildees terapecircuticas para as infecccedilotildees causadas por
estes microrganismos (FALAGAS et al 2009)
As enzimas produtoras de betalactamases hidrolisam o anel betalactacircmico
tornando este mecanismo de resistecircncia o mais importante Os dois grupos mais
preocupantes satildeo o grupo das betalactamases de aspecto ampliado e os da
carbapenemases que aleacutem de hidrolizar os carbapenecircmicos hidrolizam todas as
outras classes de betalactacircmicos Em enterobacteacuterias as carbapenemases mais
prevalentes satildeo codificadas por genes dos grupos blaKpc blaIMP blaVIM blaNdm
e blaOxa A ocorrecircncia de carbapenemases eacute mais frequentemente em bacteacuterias
gram-negativas fermentadoras da glicose conhecidas como enterobacteacuterias
predominantes nos gecircneros Klebsiella Serratia Citrobacter Enterobacter
Escherichia Samonella Proteus Morganella Podem ser encontradas tambeacutem em
bacteacuterias gram-negativas natildeo fermentadoras como espeacutecies de Acinetobacter e de
Pseudomonas (ALVES et al 2013)
Carbapenemases satildeo enzimas plasmiacutedio-mediados resistentes a todos
antibioacuteticos betalactacircmicos As bacteacuterias que possuem o gene blaKpC responsaacutevel
pela codificaccedilatildeo da produccedilatildeo de carbapenemases apresentam resistecircncia aos
antibioacuteticos betalactacircmicos impedindo a accedilatildeo destes antibioacuteticos contra infecccedilotildees
(ALVES et al 2013)
A transmissatildeo das carbapenemases a diferentes cepas de enterobacteacuterias se
daacute atraveacutes de plasmiacutedeos que satildeo pequenas moleacuteculas circulares de DNA com a
capacidade de se replicarem independentemente do DNA cromossocircmico
permitindo a troca de material geneacutetico entre gecircneros e espeacutecies diferentes de
enterobacteacuterias O raacutepido desenvolvimento de surtos em ambientes hospitalares eacute
explicado por essa disseminaccedilatildeo plasmidial (COTRIM et al 2012)
De acordo com o criteacuterio de interpretaccedilatildeo do Clinical and Laboratory
Standards Institute (CLSI 2009) a maioria das KPC isoladas natildeo apresenta
resistecircncia completa aos carbapenecircmicos (Imipenem e Meropenem apresentam
uma Concentraccedilatildeo Inibitoacuteria Miacutenima (CIM) de 2-8 μgmL) (COTRIM et al 2012)
26
Os mecanismos de resistecircncia capazes de impedir a accedilatildeo dos
carbapenecircmicos satildeo vaacuterios Poreacutem a degradaccedilatildeo de antibioacuteticos por enzimas
principalmente as carbapenemases constituem o principal mecanismo de
resistecircncia aos antibioacuteticos β-lactacircmicos (DIAS 2009) Devido a ampla atividade
hidroliacutetica agrave maioria dos antibioacuteticos β-lactacircmicos estes grupos de enzimas possuem
alta versatilidade (QUEENAM et al 2007)
Existem trecircs grandes classes moleculares de Ambler a qual as
carbapenemases pertencem denominadas classe A (serino-carbapenemases os
quais incluem membros designados SME IMI NMC GES e a famiacutelia das KPCs)
classe B(as metalo-β-lactamase incluem os tipos IMP e VIM) e classe D
(oxacilinases similares as da classe A e incluem as OXA e PSE) (DIAS 2009)
Dentre estes as mais importantes e prevalentes encontradas em plasmiacutedeos
de Klebsiella pneumoniae satildeo as KPC (DIENSTMANN et al 2010) Por meio de
estudos moleculares a enzima KPC jaacute foi documentada em diferentes bacteacuterias e
diferenciada em KPC-1 a 13 (NETIKUL et al 2011) No ano de 2009 foi realizada
uma pesquisa onde descreveram as seguintes carbapenemases KPC-1 em isolados
de Klebsiella pneumoniae KPC-2 em K pneumoniae K oxytoca Salmonella
enterica e em Enterobacter sp e KPC-3 em K pneumoniae e Enterobacter cloacae
(MONTEIRO et al 2009) As enzimas KPC-4 e KPC-5 foram encontradas em
isolados de Pseudomonas aeruginosa (PEIRANO et al 2009)
Foi observada uma correccedilatildeo da sequumlecircncia KPC-1 indicando que o gene
blaKPC-1 e blaKPC-2 satildeo idecircnticos Trecircs novas variantes blaKPC-3 blaKPC-4 e
blaKPC-5 satildeo resultados de mutaccedilotildees do gene estrutural da enzima KPC-2
(WOLTER et al 2008) apresentando diferentes perfis de hidroacutelise As enzimas
KPC-2 e KPC-3 possuem alta eficiecircncia em hidrolisar cefalotina cefaloridina e
nitrocefin poreacutem possuem uma menor eficiecircncia contra carbapenecircmicos e
cefotaxima (ALBA et al 2005) As enzimas KPC-5 e KPC-4 apresentam menor
hidroacutelise de carbapenecircmicos eacute do que em KPC-2 Em contrapartida possuem
melhor eficiecircncia contra ceftazidima e uma maior inibiccedilatildeo pelo aacutecido clavulacircnico
(WOLTER et al 2008)
27
13 Anaacutelise geneacutetica de microrganismos
Eacute de extrema importacircncia praacutetica natildeo soacute no aspecto cliacutenico mas tambeacutem na
fitopatologia biotecnologia e estudos ambientais a correta identificaccedilatildeo e
classificaccedilatildeo de microrganismos Os meacutetodos usados na diferenciaccedilatildeo de gecircneros
espeacutecies e estirpes de microrganismos podem ser divididos em meacutetodos fenotiacutepicos
(baseados em fenocircmenos bioquiacutemicos fisioloacutegicos e bioloacutegicos) e genotiacutepicos
(detectam polimorfismos ao niacutevel dos aacutecidos nucleacuteicos ou variaccedilatildeo aleacutelica ao niacutevel
de enzimas) (ALVES et al 2003)
Para este tipo de estudo existem alguns meacutetodos como o RFLPrsquos -
ldquoRestriction Fragment Length Polymorphismsrdquo (polimorfismos de tamanho de
fragmentos de restriccedilatildeo) rep-PCR (Meacutetodo de tipagem baseado na amplificaccedilatildeo via
PCR de elementos de DNA repetitivos presentes em genomas bacterianos) anaacutelise
de sequumlecircncias nucleotiacutedeas (discriminaccedilatildeo eou identificaccedilatildeo atraveacutes de sequumlecircncias
de DNA) PFGE - Pulsed-Field Gel Electrophoresis (Eletroforese em campo
pulsado) ( A L V E S et al 2003)
A diferenciaccedilatildeo clara da cepa e principalmente a alta reprodutibilidade devem
ser caracteriacutesticas de qualquer meacutetodo de tipagem geneacutetica Poreacutem nem todos os
meacutetodos moleculares de tipagem satildeo igualmente eficazes Sendo assim de acordo
com a finalidade pretendida (identificaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo custo reprodutibilidade
etc) eacute feita a escolha do meacutetodo a ser aplicado (A L V E S et al 2003)
O processo de identificaccedilatildeo fenotiacutepica de KPC entre os membros da famiacutelia
Enterobacteriaceae ainda eacute difiacutecil e os meacutetodos para a sua identificaccedilatildeo devem ser
revistos e ajustados Mesmo com o avanccedilo tecnoloacutegico natildeo existem ensaios que
combinam alta especificidade e sensibilidade na detecccedilatildeo destas enzimas Satildeo
diversas as metodologias usadas para rastreamento de KPC como por exemplo a
focalizaccedilatildeo isoeleacutetrica a teacutecnica de disco-difusatildeo E-test teste de Hodge
modificado dentre outros Aleacutem disso a pesquisa do gene blaKPC pode ser feita
pela Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) Os sistemas de automaccedilatildeo
existentes no entanto podem natildeo identificar com precisatildeo os isolados KPC
positivos (COTRIM et al 2012)
A identificaccedilatildeo blaKPC pelo PCR eacute um meacutetodo raacutepido preciso sensiacutevel e
altamente especiacutefico no entanto a PCR exige equipamento e conhecimentos
28
especializados em diagnoacutestico molecular dificultando ainda a utilizaccedilatildeo dele na
rotina dos laboratoacuterios de microbiologia (COTRIM et al 2012)
Em estudo de infecccedilotildees hospitalares identificaccedilatildeo molecular de patoacutegenos
bacterianos eacute bastante utilizada Para diferenciar carbapenemases tipo KPC a partir
de outros tipos como SME NMC-A-IMI e GES eacute necessaacuterio um exame molecular
As identificaccedilotildees do microrganismo juntamente com a triagem molecular iratildeo definir
um resultado mais especiacutefico podendo ser usado para identificar o antibioacutetico mais
adequado para o tratamento Poreacutem a principal desvantagem de alguns exames
baseados em PCR por exemplo eacute que devido agrave sua limitada capacidade de
multiplexaccedilatildeo eles distinguem apenas algumas variaccedilotildees (MOREIRA et al 2014)
Estatildeo descritas para a identificaccedilatildeo molecular de patoacutegenos pertencentes agrave
famiacutelia Enterobacteriaceae as teacutecnicas de PFGE RAPD (randomly amplified
polymorphic DNA) e ERIC-PCR (Enterobacterial Repet it ive Intergenic Consensus)
A PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) eacute considerada padratildeo ouro devido sua
alta capacidade de diferenciaccedilatildeo baseada na anaacutelise do perfil de restriccedilatildeo do DNA
genocircmico por meio de eletroforese Como desvantagem para a sua execuccedilatildeo eacute
necessaacuterios vaacuterios dias impedindo a tipagem de algumas cepas bacterianas devido
agrave degradaccedilatildeo do DNA aleacutem do alto custo empregado (MOREIRA et al 2014)
O meacutetodo baseado em ERIC-PCR tem sido bastante utilizado como uma
alternativa para a teacutecnica de PFGE Esta teacutecnica consiste na anaacutelise do padratildeo de
amplificaccedilatildeo de elementos repetidos encontrados no genoma bacteriano Isto
permite uma maior rapidez na obtenccedilatildeo de resultados quando comparada com o
PFGE aleacutem de alta reprodutibilidade simples execuccedilatildeo e implementaccedilatildeo baixo
custo e natildeo sem problemas com a degradaccedilatildeo do DNA (MOREIRA et al 2014)
A PCR eacute considerada uma teacutecnica de biologia molecular revolucionaacuteria que
consiste na siacutentese enzimaacutetica de coacutepias de aacutecidos nucleacuteicos Ela permitiu o raacutepido
desenvolvimento do estudo de sequumlecircncias de aacutecidos nucleacuteico Foi desenvolvida por
Kary Banks Mullis que ganhou o precircmio Nobel de quiacutemica de 1993 devido ao
desenvolvimento dessa teacutecnica em abril de 1983 (CAMARGO et al 2014)
Por meio de etapas de variaccedilatildeo de temperatura a teacutecnica de PCR promove a
duplicaccedilatildeo de cadeias de DNA in vitro A reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo de DNA por PCR
envolve o emprego de sequumlecircncias iniciadoras (primers) quatro nucleotiacutedeos
29
(dNTPrsquos) do DNA e uma DNA polimerase termoestaacutevel podendo assim obter-se a
partir de uma fita molde muitas coacutepias de uma sequumlecircncia especiacutefica de aacutecido
nucleacuteico O princiacutepio da PCR consiste na variaccedilatildeo de temperatura por ciclo
envolvendo trecircs etapas baacutesicas desnaturaccedilatildeo pareamento e amplificaccedilatildeo
(CAMARGO et al 2014)
A desnaturaccedilatildeo da fita molde de DNA eacute uma etapa com duraccedilatildeo entre 30
segundos a 1 minuto a temperatura entre 92 ordmC a 96 ordmC Apoacutes isso o pareamento de
dois iniciadores sinteacuteticos de composiccedilotildees distintas que funcionam como os
iniciadores da reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo liga-se agrave regiatildeo complementar da fita de
DNA alvo que sofreraacute a duplicaccedilatildeo Esta etapa tem duraccedilatildeo de 30 segundos a 1
minuto a temperatura entre 58 ordmC e 65 ordmC Por uacuteltimo a amplificaccedilatildeo por meio da
enzima Taq DNA polimerase das novas fitas de DNA se daacute a partir de cada um dos
iniciadores utilizando os quatro dNTPrsquos como substrato da reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo
Esta etapa possui duraccedilatildeo entre 45 segundos e 1 minuto a 72 ordmC Cada ciclo eacute
repetido em torno de 30 a 35 vezes e promove a amplificaccedilatildeo da regiatildeo alvo
determinada conforme o anelamento dos iniciadores sinteacuteticos de DNA (CAMARGO
et al 2014) Estas etapas estatildeo demonstradas na figura 4
Figura 4 Etapas da Reaccedilatildeo de PCR
30
2 JUSTIFICATIVA
No ano de 2010 no Distrito Federal foram identificados 111 pacientes com
suspeita de infecccedilatildeo por Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) e a
Secretaria de Sauacutede do Distrito Federal confirmaram ainda a morte de 18 pacientes
dentre os hospitais puacuteblicos e particulares Um desafio encontrado por ocasiatildeo do
surto infeccioso no Distrito Federal foi o de confirmar as KPCs por Reaccedilatildeo da
Polimerase em Cadeia sendo que as amostras foram enviadas com esta finalidade
para a Fiocruz no Rio de Janeiro
Pesquisas que possam contribuir na elaboraccedilatildeo de estrateacutegias preventivas e
de intervenccedilatildeo para infecccedilotildees causadas por enterobacteacuterias bem como contribuir
para gerar uma integraccedilatildeo beneacutefica entre a equipe acadecircmica e os serviccedilos de
sauacutede devem ser estimuladas Neste sentido o presente estudo permitiu escrutinar
os genes envolvidos na expressatildeo de carbapenemases presentes em espeacutecies de
enterobacteacuterias isoladas em ambiente hospitalar visto que elucidar genes de
resistecircncia de enterobacteacuterias aos antibioacuteticos carbapenecircmicos eacute o primeiro passo
para garantir um controle epidemioloacutegico efetivo para estes tipos de microorganismo
assim como sua associaccedilatildeo com surtos fatais particularmente em pacientes com
baixa imunidade
31
3 OBJETIVOS
31 Objetivo geral Caracterizar os genes de resistecircncia das
Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases e os aspectos epidemioloacutegicos de
pacientes internados em um hospital puacuteblico do Distrito Federal
32 Objetivos Especiacuteficos
Identificar genotipicamente a enzima KPC (Klebsiella pneumoniae
carbapenemase) de isolados de Klebsiella pneumoniae
Investigar aspectos epidemioloacutegicos dos pacientes portadores de
Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases
Identificar quais variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana influenciaram para o
desfecho oacutebito ou alta
Avaliar a susceptibilidade das Enterobacteacuterias aos antibioacuteticos
carbapenecircmicos dos pacientes em ambiente hospitalar
32
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
Trata-se de um estudo transversal onde foi realizado o teste de
susceptibilidade das enterobacteacuterias aos antibioacuteticos carbapenecircmicos a partir dos
materiais bioloacutegicos coletados dos pacientes internados no Hospital Regional da Asa
Norte (HRAN) e enviados ao Laboratoacuterio de Anaacutelises Cliacutenicas da mesma Instituiccedilatildeo
Os materiais bioloacutegicos investigados foram sangue aspirado traqueal ou brocircnquico
urina e cultura semi quantitativa de ponta de cateter venoso central O HRAN eacute um
hospital puacuteblico do Distrito Federal com 395 leitos sendo as cliacutenicas de internaccedilatildeo
Berccedilaacuterio Cirurgia Geral Cirurgia Plaacutestica Cliacutenica Meacutedica Ginecologia Maternidade
Pediatria Queimados UTI com atendimento a pacientes portadores de doenccedilas de
caraacuteter cliacutenico e ciruacutergico
4 1 Coleta e transporte das amostras bioloacutegicas
As amostras foram coletadas de pacientes internados no Hospital Regional da
Asa Norte (HRAN) com suspeitas de infecccedilatildeo por KPC A identificaccedilatildeo primaacuteria foi
realizada pelo Laboratoacuterio de Microbiologia do hospital de origem dos pacientes e os
demais procedimentos que foram utilizados na identificaccedilatildeo encontram-se descritos
abaixo
4 2 Procedimentos para confirmaccedilatildeo de resistecircncia bacteriana por
disco de ertapenem (adaptado CDC 2004)
Para diagnosticar amostra como portadora de bacteacuteria produtora de
carbapenemase foi realizado o teste com disco de ertapenem como forma de
triagem Inicialmente utilizou-se o swab contaminado com a amostra que foi
distribuiacuteda em uma pequena aacuterea da placa de aacutegar MacConkey para apoacutes o
crescimento ser realizada a pesquisa de colonizaccedilatildeo por enterobacteacuterias resistentes
aos carbapenecircmicos (Pesquisa de CRE) Procedeu-se a semeadura por teacutecnica
semi-quantitativaesgotamento com alccedila bacterioloacutegica na diluiccedilatildeo de 1100 O disco
de Ertapenem foi colocado na superfiacutecie da placa de MacConkey na junccedilatildeo dos dois
primeiros campos de semeadura conforme demonstrado na figura 5 Incubou a placa
33
em estufa aeroacutebia a 35ordmC por 24 e 48 horas e observou-se o halo de difusatildeo do
disco de Ertapenem na placa para proceder agrave leitura
O teste deixou de ser obrigatoacuterio apoacutes a modificaccedilatildeo dos criteacuterios
interpretativos para carbapenecircmicos para enterobacteacuterias publicados no suplemento
do CLSI 2010 M100-S20-U
Figura 5 Mecanismo de semeamento de material bioloacutegico oriundos de
pacientes com suspeita de infecccedilatildeo por KPC Fonte adaptado CDC 2004
4 2 1 Interpretaccedilatildeo dos resultados
Na ausecircncia de crescimento ateacute 24 horas (MacConkey) ou halo de difusatildeo
gt27 mm na placa deve-se reincubar as placas por mais 24 horas Quando for
ausente o crescimento apoacutes 48 horas ou halo de difusatildeo gt27 mm na placa libera-se
como enterobacteacuterias resistentes a carbapenecircmicos (KPCNEG)Havendo
crescimento de colocircnias na placa de MacConkey com halo lt 27 mm (apenas para
colocircnias com crescimento dentro do halo) deve-se reisolar e realizar identificaccedilatildeo e
antibiograma automatizado teste de sensibilidade por disco-difusatildeo e Teste de
Hodge Modificado (THM) Os isolados de enterobacteacuterias cujos testes comprovarem
a resistecircncia aos carbapanecircmicos testados (KPCPOS) foram reportado a Comissatildeo
de Controle de Infecccedilatildeo Hospitalar (CCIH) Jaacute osbacilos Gram-negativos natildeo
fermentadores natildeo foram reportados (KPCNEG) Para interpretaccedilatildeodos resultados
foram utilizados os valores conforme demonstrados na tabela 1
Tabela 1 Criteacuterios Interpretativos para testes de sensibilidade
ENTEROBACTEacuteRIAS
Disco difusatildeo (mm) MIC (microgml)
34
Antibioacutetico Sigla S I R S I R
Ertapenem 10
microg
ETP 22 19-
21
18 05 1 2
Meropenem 10
microg
MEM 23 20-
22
19 1 2 4
Fonte Manual Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)
2013
Os resultados que apresentaram resistecircncia ao antibioacutetico Ertapenem foram
considerados como suspeitos de contaminaccedilatildeo por KPC Fez-se o teste de
susceptibilidade aos antibioacuteticos (TSA) em aparelho automatizado MicroScan Walk
Away 96sl Dade Behring
4 3 Teste de susceptibilidade aos antibioacuteticos (adaptado CDC 2004)
A determinaccedilatildeo da susceptibilidade dos isolados foi feita pelo teste de
susceptibilidade aos antibioacuteticos (TSA) apoacutes cultura em meio de gelose simples
(INSA) para avaliaccedilatildeo da sua pureza e obtenccedilatildeo de colocircnias isoladas Para
preparaccedilatildeo de uma suspensatildeo bacteriana com turvaccedilatildeo aproximada de 05
McFarland (Dade BehringMicroScanregTurbidity Meter) ressuspendeu duas a cinco
colocircnias em 2ml de soro fisioloacutegico esteacuteril diluindo a 1100 em soro fisioloacutegico num
volume total de 10ml em seguida foi feita uma semeadura em duas placas
quadradas (120mm x 120mm) de Muller-Hinton Agar (INSA) por inundaccedilatildeo
Os discos de antibioacutetico carbapenecircmicos imipenem meropenem e
ertapenem (Biorad) foram aplicados com o auxiacutelio de um dispensador automaacutetico A
susceptibilidade das Enterobacteacuterias aos carbapenecircmicos foi definida de acordo
com o protocolo Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI 2011)
Para aquelas Enterobacteacuterias que apresentaram resistecircncia ao ertapenem
foram realizados o Teste de Hodge Modificado para Detecccedilatildeo de Enterobacteacuterias
Produtoras de Carbapenemases conforme descrito pelo Centers for Disease Control
and Prevention (CDC 2004)
35
4 4Teste de Hodge Modificado (THM) (adaptado CDC 2004)
Preparou-se uma suspensatildeo em salina esteacuteril com a cepa Escherichia coli
ATCC 25922 (padratildeo 05 de McFarland) Apoacutes isto diluiu a suspensatildeo 110 em
salina (05 ml da soluccedilatildeo de Ecoli ATCC 25922 + 45 ml salina)Foi entatildeo semeado
na superfiacutecie de uma placa de Agar Muller-Hinton com a suspensatildeo diluiacuteda de Ecoli
ATCC 25922 com auxilio de swab seco assegurando que houvesse uma
distribuiccedilatildeo uniforme cobrindo toda a superfiacutecie do Agar Deixou secar por 3 a 5
minutos em temperatura ambienteColocou-se o disco de ertapenem 10microg no centro
da placa e apoacutes isto fez-se uma estria linear da cepa a ser testada da borda do
disco ateacute a borda da placa utilizando uma alccedila calibrada 10 microl ou um swab Incubou
a placa na estufa em atmosfera aeroacutebia a 35 plusmn 2ordmC por 16 a 24 horas
441 Controle de qualidade (CQ)
Foi utilizado um CQ todos os dias em que se realizou o teste tendo como
controle Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1705- teste de Hodge modificado
positivo Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1706- teste de Hodge modificado
negativo
442 InterpretaccedilatildeoResultados
Apoacutes 16ndash24 horas de incubaccedilatildeo examinar as placas para verificar a presenccedila
de uma distorccedilatildeo no halo de inibiccedilatildeo do disco de ertapenem devido ao crescimento
realccedilado da cepa ATCC na intersecccedilatildeo do organismo teste e a Ecoli ATCC 25922
dentro dos limites do halo O THM positivo apresentaraacute presenccedila de distorccedilatildeo no
halo de inibiccedilatildeo de ertapenem devido ao crescimento da cepa Ecoli ATCC 25922 ao
longo da estria da cepa teste para dentro dos limites do halo de inibiccedilatildeo Jaacute o THM
negativo teraacute ausecircncia de crescimento da cepa Ecoli ATCC 5922 ao longo da estria
da cepa teste para dentro dos limites do halo de inibiccedilatildeo do disco de ertapenem
Este resultado estaacute representado na figura 6
36
Figura 6 Interpretaccedilatildeo resultado do Teste de Hodge Modificado
(adaptado CDC 2004) Teste positivo na estria da cepa teste na parte superior
da placa teste negativo na estria da cepa teste na parte inferior da placa
Tendo positivo como resultado o paciente era um provaacutevel contaminado por
KPC As amostras entatildeo foram encaminhadas para a Fundaccedilatildeo Osvaldo Cruz
(FIOCRUZ) para confirmaccedilatildeo final As amostras finalmente confirmadas como
positivas para KPC foram isoladas e guardadas no banco de cepas cliacutenicas do
hospital Apoacutes a autorizaccedilatildeo do CEP amostras das cepas foram transferidas para
meio de transporte Stuard em caixa teacutermica fechada em baixa temperatura e
levadas para o laboratoacuterio de microbiologia cliacutenica da universidade
No laboratoacuterio da universidade as amostras foram separadas e realizadas
repiques em meios MacConkey e incubadas por 24h As colocircnias caracteriacutesticas
foratildeo isoladas em caldo BHI e mantidas em shaker a 37oC por 2h Apoacutes isto foram
executadas as anaacutelises a seguir
Os isolados de Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases foram
submetidos agrave extraccedilatildeo de DNA e posterior sequumlenciamento para identificaccedilatildeo dos
genes de resistecircncia blaKPC de 1 a 13 e identificaccedilatildeo do gene universal Os
pacientes de onde os materiais bioloacutegicos contendo as Enterobacteacuterias produtoras
de carbapenemases foram os isolados foram investigados quanto aos aspectos
epidemioloacutegicos e cliacutenicos
37
4 5 Extraccedilatildeo de DNA bacteriano
A extraccedilatildeo de DNA bacteriano foi realizada utilizando o kit NucleoSpin
Plasmidreg (MN) Antes de iniciar a extraccedilatildeo foi feito a preparaccedilatildeo das soluccedilotildees
reagentes materiais e amostras (vortexando) colocou-se em banho-maria agrave 50ordmC o
tampatildeo AW Partiu-se de colocircnias isoladas cultivadas que sofreram passagem em
meio LB liacutequido por 12h Adicionou-se 15 mL da amostra no tubo eppendorf
centrifugou por 5 minutos descartou o sobrenadante (com cuidado para natildeo
descartar o Pellet) Repetiu-se este procedimento por mais trecircs vezes completando-
se o volume de 6mL Foram adicionados 250microL do tampatildeo Resuspension Buffer A1
encostando a ponteira no Pellet e misturando (este tampatildeo tem como funccedilatildeo
separar a formaccedilatildeo de grumos celulares) Apoacutes isso homogeneizou e vortexou os
tubos eppendorfs Apoacutes isso foram adicionados 250microL do tampatildeo Lysis Buffer A2
homogenizou e deixou descansar por 5 minutos (esta etapa eacute importante para a lise
da parede e da membrana celulares e liberaccedilatildeo do conteuacutedo da ceacutelula)
Passado o tempo de descanso foi adicionado 300microL do tampatildeo
Neutralization Buffer A3 homogeneizou e centrifugou por 10 minutos (este tampatildeo
iraacute retirar as proteiacutenas que envolvem o DNA e voltaraacute com o pH para proacuteximo de 8
impedindo que a soluccedilatildeo de lise facilite a quebra das ligaccedilotildees covalentes do aacutecido
nucleacuteico) Em seguida enumeraram-se os tubos contendo filtros com siacutelica
transferiu-se o sobrenadante para o filtro e centrifugou por 5 minutos Descartou-se
o que foi filtrado adicionou 500microL do tampatildeo AW (banho-maria) centrifugou por 2
minutos Novamente foi descartado o filtrado Adicionou-se 600microL do tampatildeo A4
centrifugou por 2 minutos e descartou o filtrado (os tampotildees AW e A4 contecircm
isotiocianato de guanidina em concentraccedilotildees crescentes para facilitar a adsorccedilatildeo
do DNA na siacutelica e retirada das outras biomoleacuteculas da amostra) Foi feita outra
centrifugaccedilatildeo com o tubo vazio Apoacutes isto o filtro foi trocado para outro eppendorf
definitivo onde foi adicionado 50microL do tampatildeo Elution Buffer AE (este tampatildeo
favorece a eluiccedilatildeo do DNA) centrifugou por 2 minutos descartou o filtro e
armazenou as amostras em freezer -20ordmC
38
4 6 Iniciadores e reaccedilatildeo de PCR
Os iniciadores universais para o gene blaKPC foram desenhados baseados
em sequumlecircncias conservadas apresentadas pelos sub-grupos de genes que
codificam a enzima carbapenemase de klebsiella pneumoniae (YIGIT et al 2001)
Baseado na sequumlecircncia para o blakpc-1 depositada no GenBank
(AF2975541) o oligonucleotiacutedio (oligo) iniciador direto (5-
ATGTCACTGTATCGCCGTC-3rsquo) foi desenhado para reconhecer a sequumlecircncia
blaKPC na posiccedilatildeo (131149) enquanto que o iniciador reverso (5-
TTACTGCCCGTTGACGCC-3rsquo) foi reconhecido na posiccedilatildeo (9951012) As anaacutelises
baseadas em alinhamento de sequumlecircncias mostraram que o par de iniciadores
blaKPC podem detectar os alelos de 1 a 13 do gene blaKPC conforme a tabela 2
Tabela 2 Nuacutemero de acesso ao GenBank dos alelos blaKPC e seus
microrganismos originais
Nuacutemero de
Acesso GenBank
Microrganismo Alvo
AF2975541 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-1
GU0862251 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-2
HQ2589341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-2-like
AB5577341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC -3
EU4473041 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-4
EU4002222 Pseudomonas
aeruginosa
blaKPC-5
EU5555341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-6
EU7297271 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-7
39
FJ2344121 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-8
FJ624872 Escherichia coli blaKPC-9
GQ1403481 Acinetobacter
baumannii
blaKPC-10
HM0669951 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-11
HQ3428891 Enterobacter cloacae blaKPC-12
HQ3428901 Enterobacter cloacae blaKPC-13
As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo de blaKPC foram realizadas em um
primeiro tempo de desnaturaccedilatildeo em que foi 94ordmC por 5 minutos seguido de 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 58 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 90 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 78ordmC por 8 minutos Aleacutem das amostras foi utilizado um
controle negativo
A PCR do blaKPC foi realizada utilizando os componentes para o volume da
reaccedilatildeo de 25 microL citados na tabela 3 A banda do tamanho do produto de PCR foi de
881 pares de bases (pb) o que corresponde ao plasmiacutedeo
Tabela 3 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do
gene blaKPC
Reagente Volume
DNA molde 4 microL
Tampatildeo Taq 25 microL
MgCl2 075 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP
2 microL
Oligo F 1 microL
Oligo R 1 microL
Taq DNA polimerase 05 microL
Aacutegua MiliQ 1335 microL
40
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
Baseado na sequumlecircncia para o gene 16S rRNA em que o oligonucleotiacutedio
Universal iniciador direto foward (5-CCAGCAGCCGCCGTAATACG-3rsquo) foi
desenhado para reconhecer a sequumlecircncia universal na posiccedilatildeo 1513 enquanto que o
iniciador reverso (5-ATCGGYTACCTTGTTACGACTTC-3rsquo) foi reconhecido na
posiccedilatildeo 1491 foram realizadas PCRrsquos As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo deste
gene foram realizadas nos seguinte tempos separaccedilatildeo 94ordmC por 10 minutos 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 55 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 120 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 72ordmC por 10 minutos
A PCR do gene 16S rRNA foi realizada utilizando os componentes para o
volume da reaccedilatildeo de 25microL citados na tabela 4 A banda do tamanho do produto de
PCR foi de 996 pb correspondente aacute regiatildeo ribossomal capaz de amplificar todas
as espeacutecies
Tabela 4Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do gene
universal
Reagente (quantidade
concentraccedilatildeo do estoque)
Volume
DNA molde 10 ng 4 microL
Tampatildeo Taq 10 x 25 microL
MgCl2 50mM 125 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP 25 mM
125 microL
Oligo F 10microM 05 microL
Oligo R 10microM 05 microL
Taq DNA polimerase 5UmicroL 04 microL
Aacutegua Miliq 146 microL
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
41
O termociclador utilizado para os experimentos foi o LifeTouch da BIOER
4 7 Digestatildeo
Para realizaccedilatildeo da digestatildeo foi utilizada a enzima BshF I (Hae III) EN- 1105
tamanho 7000 units concentraccedilatildeo 10 unitsmicroL fonte Bacillus sphaericus empresa
Jena bioscienceUtilizaram-se os componentes para o volume de 50microL da reaccedilatildeo
citados na tabela 5
Tabela 5 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da digestatildeo do gene
universal
Reagente Volume
Produto de PCR 10 microL
Enzima BshF I 01 microL
Tampatildeo (10x) 5 microL
Aacutegua Miliq 349 microL
Total (em cada ependorff) 50 microL
Valores para 1 digestatildeo
Os ependorffs foram colocados por 30 minutos em banho-maria a 37ordmC Apoacutes
isso fez-se a corrida das amostras em gel de agarose para verificaccedilatildeo do resultado
(LU et al 2000)
4 8 Eletroforese em gel de agarose
Os produtos de DNA PCR e digestatildeo foram analisados em gel de agarose
2 O tempo de corrida do gel eacute de aproximadamente 1hora e 30minutos sendo
que no comeccedilo foi usada agrave voltagem de 50 V e apoacutes comeccedilar a correr o gel
aumentou a voltagem para 100 v Utilizou-se o marcador de 100pb (pares de bases)
Foi adicionado 3microL de corante Bromophenol (que tem a funccedilatildeo de fazer uma ligaccedilatildeo
na amostra de DNA e permitir a visualizaccedilatildeo da corrida no gel de agarose) em 7microL
de amostra tanto de DNA quanto de PCR Para o preparo do gel foi utilizado TBE
42
(Tris- Aacutecido Boacuterico) agarose e brometo de etiacutedio (sua funccedilatildeo eacute de corante para o gel
e permitir a visualizaccedilatildeo do DNA quando colocado agrave luz ultravioleta) Para o oligo
blaKPC a banda da amplificaccedilatildeo foi em 881ppb correspondendo ao plasmiacutedeo Jaacute
o oligo Universal foi em 996 pb
4 9 Descarte de resiacuteduos
Todos os materiais utilizados nos ensaios foram de uso uacutenico e manipulados
em cacircmaras de seguranccedila bioloacutegica classe II Apoacutes o uso foram colocados em
soluccedilatildeo desinfetantes (hipoclorito a 1) e em seguida autoclavados a 127oC por 20
min em sacos apropriados para autoclavaccedilatildeo Apoacutes a finalizaccedilatildeo do ciclo de
esterilizaccedilatildeo os sacos contendo o material descartaacutevel foram colocados em
recipientes de coleta da empresa responsaacutevel pela coleta de materiais bioloacutegicos
produzidos no laboratoacuterio de microbiologia Todos os procedimentos seguiram a
normativa RDC-ANVISA 3062004 sobre o descarte de resiacuteduos de serviccedilo de
sauacutede
4 10 Aspectos epidemioloacutegicos e cliacutenicos
Os aspectos cliacutenicos e epidemioloacutegicos foram investigados por meio de
prontuaacuterios dos pacientes portadores de enterobacteacuterias produtoras de
carbapenemases e envolveram topografia mais provaacutevel do foco infeccioso a
enfermidade motivadora da internaccedilatildeo o desfecho cliacutenico a idade e o tempo de
internaccedilatildeo
4 12 Anaacutelises eepidemioloacutegicas
As anaacutelises foram realizadas com o pacote estatiacutestico SPSS versatildeo 200
Para verificar quais variaacuteveis referentes aos dados epidemioloacutegicos e
microbioloacutegicos influenciaram no desfecho verificou- se a diferenccedila meacutedia das
variaacuteveis idade e tempo de internaccedilatildeo em cada grupo O teste estatiacutestico utilizado foi
o teste t de Student apoacutes se executar o teste de normalidade de Shapiro-Wilk Para
as variaacuteveis sexo perfil microbioloacutegico das enterobacteacuterias produtoras de
43
carbapenemases foi avaliada a associaccedilatildeo com o desfecho por meio do teste Exato
de Fisher O niacutevel de significacircncia adotado foi de 5
4 13 Preceitos eacuteticos
Este projeto estaacute inserido em um projeto maior denominado ldquoEpidemiologia
cliacutenica e caracterizaccedilatildeo molecular do Acinetobacter Baumannii resistente a
antibioticoterapia em pacientes internado em hospitais do Sistema Uacutenico de Sauacutederdquo
que foi submetido ao Comitecirc de Eacutetica em Pesquisa da Secretaria do Estado de
Sauacutede do Distrito Federal (SESDF) e emitido parecer aprovado pelo protocolo nordm
23109 (anexo)
44
5 RESULTADOS
51 Anaacutelise molecular
Para a amplificaccedilatildeo com o oligo blaKPC foram amplificadas amostras
que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 881 pb correspondente ao
plasmiacutedeo A anaacutelise da amplificaccedilatildeo da regiatildeo do gene blaKPC mostrou que
apenas a amostra A10 natildeo amplificou isso demonstra que esta amostra natildeo
possuiacutea o gene de resistecircncia
5 1 1 Gene blaKPC
Figura 7 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 881 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
A amostra A3 natildeo amplificou no primeiro momento entatildeo foi realizado
novamente a PCR e corrida de gel obtendo entatildeo a amplificaccedilatildeo da amostra como
apresentado na figura 8
45
Figura 8 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC da
mostra A3 estudada A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo de 881
pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 1 2 Gene 16S rRNA
Para a amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA utilizou-se o oligo universal Foram
amplificadas amostras que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 996 pb
Figura 9 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
46
Segundo Lu et al (2000) a digestatildeo com a enzima HaeIII deste amplicons de
16S rRNA devolveriam bandas com perfis entre 150 a 200 pb No gel abaixo eacute
possiacutevel evidenciar que este perfil ocorreu com o predomiacutenio de bandas na altura
de 200pb
Figura 10 Gel de agarose a 2 da digestatildeo do amplicon do gene 16S
rRNA das amostras com a enzima HaeIII evidenciando diversos fragmentos
proacuteximos a 200 pb A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo ribossomal
de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 2 Anaacutelises epidemioloacutegicas
5 2 1 Sexo
No total foram detectados 17 isolados de KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 onde a maior a prevalecircncia foi
detecatada em amostras de pacientes do sexo masculino (53) do que no sexo
feminino (47)
47
Figura 11 Isolado de KPC segundo sexo dos 17 pacientes investigados
no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 2 Desfecho cliacutenico
Em 17 isolados de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo
de 2010 aacute 2011 a porcentagem de pacientes que foram a oacutebito (59) foi maior que
a de pacientes que tiverm alta (41)
Figura 12 Isolado de KPC segundo desfecho cliacutenico dos 17 pacientes
investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
48
5 2 3 Local da coleta
Dos 17 episoacutedios detectados de infecccedilatildeo por KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 a infecccedilatildeo em swab retalfoi mais
frequente (47) seguida de ponta de cateacuteter (18) e secreccedilatildeo traqueal (12)
Figura 13 Isolados de KPC segundo local da coleta da amostra nos 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 4 Microorganismo
O microorganismo mais encontrado foi a Klebsiella pneumoniae (82)
seguida da Enterobacter clocae (12) e Serratia marcescens (6) dos 17 isolados
de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 Isto afirma o
fato de a sigla KPC ser utilizada de forma errocircnea aacute Klebsiella pneumoniae visto
que a evidecircncia dela eacute maior em relaccedilatildeo as outras cepas
49
Figura 14 Isolado de KPC segundo microrganismo encontrado em 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 5 Relaccedilotildees variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana e desfecho
cliacutenico
Tabela 6 ndash Distribuiccedilatildeo do perfil geneacutetico sexo coleta tipificaccedilatildeo de
microrganismos e anaacutelise da resistecircncia bacteriana segundo o desfecho
cliacutenico Brasiacutelia-DF 2010 a 2011
Variaacutevel Resultado
Desfecho
Alta Oacutebito
N N P
Gene 16S rRNA Positivo 7 1000 10 1000
NA Gene blaKPC Positivo 6 857 10 1000
Negativo 1 143 0 00 0218 Sexo Feminino 2 286 6 600
Masculino 5 714 4 400 0201 Local da coleta Fundo saco de
Douglas 1 143 0 00
Hemocultura 0 00 1 100 0463 Ponta de cateter 1 143 2 200
Sec TraquealBrocircnquica
0 00 1 100
50
Secreccedilatildeo traqueal 2 286 0 00
Swab retal 3 429 5 500
Urina 0 00 1 100
Microrganismo Enterobacter cloacae (KPC)
1 143 1 100
Klebsiella pneumoniae
6 857 8 800
0416 Serratia
marcescens 0 00 1 100
Teste de Hodge Hodge positivo 7 1000 10 1000
NA Amicacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 1 100 0848 resistente 0 00 1 100
sensiacutevel 2 286 3 300
Amoxicilina Aacutecido Clavulacircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Ampicilina Sulbactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ampicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Aztreonan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefazolina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Cefoperazona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Cefotaxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefoxitina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0509 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 2 286 4 400
Ceftazidima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cetriaxona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 3 429 5 500 0772 Cefalotina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ciprofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772
51
resistente 3 429 5 500
Claritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Clindamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Eritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Gentamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0942 resistente 2 286 3 300
sensiacutevel 1 143 2 200
Imipenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 0 00 2 200 0193 Resistente 1 143 3 300
sensiacutevel 2 286 0 00
Nitrofurantoiacutena sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Norfloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Oxacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Penicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Piperacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Rifampicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tetraciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Ticarcilina Aacutecido Clavulocircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0688 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 3 429 4 400
Tobramicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Trimetoprima Sulfametoxazol
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0112 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 2 286 0 00
Vancomicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tigeciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediario 0 00 1 100 0211 natildeo testado 1 143 4 400
resistente 2 286 0 00
52
Cefepime sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefuroxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Levofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Piperacilina Tazobactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Ertapenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Meropenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0223 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 1 143 0 00
Cefotetan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 sensiacutevel 0 00 1 100
Gemifloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 7 700 0585 natildeo testado 3 429 3 300
Desfecho
Alta Oacutebito
Meacutedia Erro
padratildeo Meacutedia Erro
padratildeo p
Idade 58 9 59 5 0991
Tempo Internaccedilatildeo (dias)
50 13 46 12 0571
n= 17 p(lt 005) NA natildeo se aplica
53
6 DISCUSSAtildeO
Nos uacuteltimos anos houve um aumento na incidecircncia de bacteacuterias
multirresistentes aos antimicrobianos no ambiente hospitalar tornando isto um
problema mundial de sauacutede puacuteblica (HULSCHER et al 2010) Quando se trata
principalmente de bacilos Gram negativos a frequumlecircncia destas bacteacuterias eacute ainda
maior em paiacuteses da Ameacuterica Latina quando comparada a paiacuteses desenvolvidos
(GALES etal 2012)
De acordo com dados do ldquoMeropenem Yearly Susceptibility Test Information
Collectionrdquo (MYSTIC) ocorreu nos Estados Unidos um aumento na susceptibilidade
de K pneumoniae nos uacuteltimos anos graccedilas a praacuteticas de controle de disseminaccedilatildeo
de amostras resistentes(RHOMBERG P R et al 2009) O aumento crescente da
prevalecircncia destes microrganismos foi proporcional ao aumento da dependecircncia do
uso de antibioacuteticos carbapenecircmicos considerados como a opccedilatildeo terapecircutica para o
tratamento de infecccedilotildees por bacilos Gram negativos multi-resistentes (LIVERMORE
2012) Isto afeta diretamente as opccedilotildees de tratamento sobrando poucas alternativas
para a terapecircutica que incluem colistina (polimixina E) e tigeciclina que apresentam
respectivamente problemas em termos de toxicidade e eficaacutecia (LIVERMORE et
al 2011) Um dos efeitos adversos mais importantes das poliminas B e E por
exemplo satildeo a neurotoxicidade e nefrotoxicidade (MENDES C A C et al2009 )
Devido agrave resistecircncia ser usualmente de natureza plasmidial e portanto de
maior disseminaccedilatildeo especialmente quando carreadas por K pneumoniae
microrganismo com uma notoacuteria capacidade para acumular e transferir plasmiacutedeos
com determinantes para resistecircncia o nuacutemero de casos detectados pelo
fenoacutetipogenoacutetipo blaKPC eacute bastante preocupante (MONTEIRO et al 2009)
Comparada com outras bacteacuterias hospitalares a transmissatildeo de clones
multirresistentes de K pneumoniae eacute maior e podem natildeo ser controladas pelos
meacutetodos de controle de infecccedilatildeo hospitalar (PAAUW et al 2007) A forma
plasmidial para transferecircncia da resistecircncia adicionada a este grande potencial para
disseminaccedilatildeo de clones resistentes eacute preocupante visto que apoacutes surtos muitas
vezes pode se tornar endecircmica Jaacute eacute uma realidade a disseminaccedilatildeo desta bacteacuteria
54
entre pacientes hospitais paiacuteses e ateacute mesmo continentes (WOODFORF et al
2010 ROGERS et al 2011)
As chances de surtos satildeo maiores em paiacuteses com poucos recursos devido agrave
maior carecircncia de praacuteticas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees hospitalares e o
uso irracional de antimicrobianos de forma empiacuterica e inadequada (KUMARASAMY
et al 2010) Ateacute o momento os mecanismos de resistecircncia aos cabapenecircmicos
geralmente encontrado eram a produccedilatildeo de ESBL (CTX-M) somada aacute perda de
porina (CARVALHAES et al 2010) Foi notado a partir do ano de 2008 um
aumento no nuacutemero de K pneumoniae produtoras de KPC-2 apresentando outra
forma de resistecircncia (GALES 2012)
Um estudo mostrou que o perfil do paciente colonizado ou infectado por KPC
foi de um paciente entre os 33 e os 82 anos de idade internado haacute mais de 1
semana no hospital A mortalidade geral nos uacuteltimos anos ficou em torno de 7
sendo que dos 77 pacientes estudados 32 (415) pacientes evoluiacuteram para oacutebito
evidenciando a alta morbi-mortalidade associada (ALVES A P et al 2013)
Em estudo com 2316 pacientes avaliados a populaccedilatildeo de sexo masculino foi
de 526 idade meacutedia global de 53 anos (mediana de 55 anos) permanecircncia meacutedia
de 58 dias (mediana de 3 dias) (OLIVEIRA A C et al 2010) Outros trabalhos
apresentaram ausecircncia de significacircncia entre sexoidade e o desenvolvimento de
infecccedilotildees por microrganismos resistentes (PERES-BOTA D et al 2003 COLPAN
A et al 2005 COELLO R et al 1997)
Outro estudo utilizou um total de 30 amostras sendo elas isoladas de urina
escarro secreccedilatildeo pleural ponta de cateter aspirado traqueal e hemocultura A mais
prevalente foi em urina (40) Entre as 30 cepas analisadas a maior porcentagem
foi da cepa Klebsiella pneumoniae (70) Enterobacter sp (133) Klebsiella
ozaenae (10) Escherichia coli (333) e Klebsiella oxytoca (333)
(DIENSTMANN R et al 2010) Nos Estados Unidos a enzima KPC jaacute se tornou
endecircmica Foi realizada uma pesquisa em dois hospitais de Nova York onde
testaram 602 amostras e 45 apresentaram algum mecanismo de resistecircncia
sendo apenas 33 confirmadas por biologia molecular como KPC-2 (BRATU et
al 2005)
55
Estudo sobre os tipos de ESBL feito no Japatildeo apresentou o tipo Toho-1 como
o mais prevalente nessa pesquisa Ateacute o ano de 2000 ano em que foi publicado tal
estudo este era o primeiro relatoacuterio no Japatildeo para identificar derivados de ESBLs
como tipo de SHV e TEM entre E coli e K pneumoniae Em especial o tipo SHV- 12
foi identificado com uma maior frequumlecircncia Estes resultados indicam que tipos
distintos de ESBLs que satildeo diferentes em sua especificidade de substrato e origem
geneacutetica coexistem no Japatildeo Isto mostra a importacircncia de caracterizar genoacutetipos
distintos de ESBLs e de estar em alerta continuamente para as tendecircncias de
ESBLs no Japatildeo aleacutem da necessidade de uma interpretaccedilatildeo uniforme utilizando as
diretrizes do CSLI para relatar cepas produtoras de ESBL Aleacutem da detecccedilatildeo de
ESBLs satildeo necessaacuterias mais informaccedilotildees tais como o perfil de sensibilidade
especiacutefica para diversas β-lactacircmicos e o local da infecccedilatildeo Esses fatores satildeo
essenciais para a escolha adequada de antibioacuteticos (YAGI T et al 2000)
No ano de 2004 uma pesquisa avaliou a produccedilatildeo de uma enzima de
hidroacutelise de carbapenecircmicos atraveacutes da teacutecnica de sequumlenciamento foi revelado
um novo membro da famiacutelia KPC designado KPC- 3 Pesquisadores encontraram
em um mutante de K pneumoniae uma substituiccedilatildeo de um gene associado com
resistecircncia a Imipenem mas essa substituiccedilatildeo foi considerada improvaacutevel na
contribuiccedilatildeo da resistecircncia aos carbapenecircmicos da espeacutecie estudada Aleacutem da
resistecircncia aos carbapenecircmicos estes isolados eram em sua maioria resistentes agraves
cefalosporinas penicilinas e aminoglicosiacutedeos Usando estudos de transformaccedilatildeo
conjugaccedilatildeo e hibridaccedilatildeo localizaram o alelo blaKPC em plasmiacutedeo aleacutem disso
mostraram que esse alelo tambeacutem carregava uma resistecircncia aos aminoglicosiacutedeos
A transferecircncia das enzimas KPCs foi demonstrada in vitro tanto neste como em
outros estudos pode ser que os plasmiacutedeos que fazem esta transferecircncia estavam
comeccedilando a se espalhar no ambiente cliacutenico resultando na multiresistecircncia dessas
estirpes (WOODFORD et al 2004)
O presente estudo apresentou um vieacutes quanto aos resultados dos testes de
susceptibilidade microbiana Observou-se que natildeo foi encontrado resultado deste
teste em algumas amostras o que natildeo cooperou para um estudo mais preciso
futuros estudos quanto agraves amostras e um melhor acompanhamento deste tipo de
patologia Poreacutem mesmo sem algumas amostras com este resultado disponiacutevel foi
56
confirmada a presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos
carbapenecircmicos por meio dos genes de resistecircncia blaKPC e 16S rRNA que as
amostras apresentaram em sua maioria serem portadoras Quanto aos resultados
estatiacutesticos nenhuma das variaacuteveis apresentou significacircncia estatiacutestica (p gt 005)
mostrando assim que estas variaacuteveis isoladas natildeo foram o fator determinante para
o desfecho cliacutenico de alta ou oacutebito
57
7 CONCLUSAtildeO
Os genes blaKPC e 16S rRNA foram caracterizados confirmando a a
presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos carbapenecircmicos
Houve uma maior prevalecircncia da cepa K pneumoniae e isto confirma outros
estudos que apresentam a maior prevalecircncia desta cepa em amostras com KPC
Aleacutem disso isso justifica a forma popular da K pneumoniae ser chamada de KPC
enquanto que na verdade KPC eacute uma enzima podendo estar presente em outras
cepas como Enterobacter clocae tambeacutem apresentada no presente estudo O
desfecho cliacutenico de oacutebitos maior que 50 eacute um possiacutevel indicador sobre a
necessidade de se realizar um teste raacutepido para identificaccedilatildeo de KPC visando
iniciar o mais raacutepido possiacutevel o tratamento afim de diminuir a mortalidade por esta
infecccedilatildeo
Nenhuma das variaacuteveis isoladamente estaacute relacionada ao desfecho cliacutenico
oacutebito ou alta pois natildeo apresentaram relevacircncia estatiacutestica O presente estudo
mostrou que haacute presenccedila da bacteacuteria nas amostras de pacientes do hospital
estudado podendo entatildeo afirmar que este tipo de bacteacuteria se encontra tambeacutem
presente em ambiente hospitalar O uso irracional de antimicrobiano eacute demonstrado
de forma indireta quando foi apresentado atraveacutes do Teste de Hodge Modificado
uma resistecircncia de 100 aos antibioacuteticos carbapenecircmicos Isto tambeacutem reflete na
terapecircutica sendo que pacientes portadores de bacteacuterias resistentes aos
antibioacuteticos carabepecircmicos tem uma escassa opccedilatildeo de tratamento e as opccedilotildees
apresentam problemas quanto agrave toxicidade e eficaacutecia
58
REFEREcircNCIAS
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Mecanismos
de resistecircncia bacteriana aos antimicrobianos Disponiacutevel em
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controleopas_
webmodulo3mec_sitiohtmgt Acesso em 25 de abril de 2014
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Nota teacutecnica nordm
012013 medidas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees por enterobacteacuterias
multiresistentes Acesso em 17 de abril de 2013
ALBA J et al Kinetics study of KPC-3 a plasmid-encoded class A
carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase Antimicrob Agents Chemother
Nov49(11)4760-2 2005
ALVES A P et al Nosocomial infections by KPC-producing enterobacteria in
a tertiary hospital in Southern Brazil Revista da AMRIGS Porto Alegre 57 (3) 213-
218 jul-set 2013
ALVES A et al Tipagem Geneacutetica de Microrganismos Lab De Diversidade
Microbiana Centro de Biologia Celular Dep de Biologia U de Aveiro 3810-193
Aveiro- 2003
BELL J M et Al Prevalence and significance of a negative extended-
spectrum beta-lactamase (ESBL) confirmation test result after a positive ESBL
screening test result for isolates of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae
results from the SENTRY Asia-Pacific Surveillance Program J Clin Microbiol
May45(5)1478-82 2007
BRATU S et al Detection of KPC carbapenem-hydrolyzing enzymes in
Enterobacter spp from Brooklyn New York Antimicrob Agents Chemother v 49 n
2 p 776-8 2005
59
BRATU S et al Emergence of KPC-possessing Klebsiella pneumoniae in
Brooklyn New York epidemiology and recommendations for detection Antimicrob
Agents Chemother v 49 n 7 p 3018-20 2005
BRATU S et al Rapid spread of carbapenem-resistant Klebsiella
pneumoniae in New York City Arch Intern Med v 165 p 1430-5 2005
CAMARGO C F et al Aplicaccedilatildeo das teacutecnicas de pcr e suas teacutecnicas
derivadas em diagnoacutestico molecular Disponiacutevel em
ltfileDUnB10C2BA20semestreArtigosPCR-
20CLEYTON20FLORENCIO20DE20CAMARGO20E20PAULO20ROB
ERTO20QUEIROZpdfgtgt Acesso em 08 de abril de 2014
CARVALHES C G et al Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting
carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive
results Journal of Antimicrobial Chemotherapy v 65 n2 p 249-251 2010
CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION- CDC Modified
Hodge Test for Carbapenemase Detection in Enterobacteriaceae 2004
CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE Methods for
dilutionantimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically Approved
standard M7ndashA7 7th ed CLSI Wayne PA 2011
COELLO R et al Risk factors for developing clinical infection with methicillin-
resistant Staphylococcus aureus (MRSA) amongst hospital patients initially only
colonized with MRSA J Hosp Infect 19973739-46
COLPAN A et al Evaluation of risk factors for mortality in intensive care
units A prospective study from a referral hospital in Turkey Am J Infect Control
200533(1)42-7
60
CORNAGLIA G et al Living with ESBLs Introduction Clinical Microbiology
and Infection 14 Suppl 1 1-2 2008
COTRIM E R et al Klebsiella pneumoniae carbapenemase ndash KPC em
Enterobacteriaceae o desafio das bacteacuterias multirresistentes Poacutes em revista do
centro universitaacuterio Newton Paiva 12012 - ediccedilatildeo 5 - issn 2176 7785
DESHPANDE L M et al Occurrence and characterization of
carbapenemase-producing Enterobacteacuteriaceae report from the SENTRY
Antimicrobial Surveillance Program (2000-2004) Microb Drug Resist 12(4)223-30
2006
DIAS D J A Estudos dos principais mecanismos de resistecircncia aos
antibioacuteticos β-lactacircmicos em bacteacuterias patogecircnicas gram negativas 2009 100 f
Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Geneacutetica Molecular e Biomedicina) ndash Faculdade de
Ciecircncias e Tecnologia Universidade de Nova Lisboa Lisboa
DIENSTMANN R et al Avaliaccedilatildeo fenotiacutepica da enzima Klebsiella
pneumoniae carbapenemase (KPC) em Enterobacteriaceae de ambiente hospitalar
J Bras Patol Med Lab v 46 n 1 p 23-27 fevereiro 2010
ENDIMIAMI A et al Emergence of blaKPC-containing Klebsiella
pneumoniae in a long-term acute care hospital a new challenge to our healthcare J
Antimicrob Chemother 64 1102-1110 Nov 2009
FALAGAS M E et al Extended-spectrum beta-lactamase producing
organisms The Journal of Hospital Infection 73 (4) pp 345-54 2009
FONTANA C et al Emergence of KPC-producing Klebsiella pneumoniae in
Italy BMC Rev Notes 3 40 2010
61
GALES A C et al Antimicrobial resistance among Gram-negative bacilli
isolated from Latin America results from Sentry Antimicrobial Surveillance Program
(Latin America 2008-2010) Diagnostic Microbiology and Infectious Disease v 3 n
4 p 354 -360 2012
GUPTA N et al Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Epidemiology
and Prevention HEALTHCARE EPIDEMIOLOGY Clinical Infectious Diseases
201153(1)60ndash67 Published by Oxford University Press on behalf of the Infectious
Diseases Society of America 2011
HARBOTTLE H et al Genetics of antimicrobial resistance Anim Biotechnol
n17 p111-124 2006
HENRIQUE W N et al RESISTEcircNCIA BACTERIANA Uniatildeo das
Faculdades Alfredo NasserInstituto de Ciecircncias da Sauacutede Disponiacutevel em lt
httpwwwfaculdadealfredonasseredubrfilespesquisaposter20HENRIQUE20
Wilker20Natividade20SANTIAGO20Silvania20CAVALCANTI20DSP
20ResistC3AAncia20Bacterianapdfgt Acesso em 17 marccedilo 2014
HULSCHER M E J I et al Antibiotic prescribing in hospital a social and
behavioral scientific approach The Lancet Infectious Diaseases v 10 n 3 p 167-
165 2010
KIDWAI M SAPRA P BHUSHAN KR Synthetic strategies and medicinal
properties of beta-lactams Curr Med Chem 1999 695-215
KUMARASAMY K K et al Emergence of a new antibiotic resistance
mechanism in India Pakistan and the UK a molecular biological and
epidemiological stuy The Lancet Infectious Diseases v10 n 9 p 597- 602 2010
LINCOPAN N et al Enterobacteacuteria producing extended-spectrum β-
lacatamases and IMP-1 Metalo-β-lactamases isolated from Brazilian hospitals J Med
62
Microbiol 7 1-3 2006
LINCOPAN N et al First Isolation of Metalo-β-Lacatamase-Producing
Multiresistant Klebsiella pneumoniae from a patient in Brazil J Clin Microbiol 43(1)
516-519 2005
LIVERMORE D M et al What remains against carbapenem- resistant
Enterobacteriaceae Evaluation of choramphenicol ciprofloxacin colistina
fosfomycin minocycline nitrofurantoin temocilin and tigecycline International
Journal of Antimicrobial Agents v 37 n 5 p 415- 459 2011
LIVERMORE D M Fourten years in resistance International Journal of
Antimicrobial Agents v 39 283- 294 2012
LIVERMORE D M Bacterial resistance to carbapenems Adv Exp Med Biol
1995 39025-47
LIVERMORE D M Bacterial resistance origins epidemiology and impact
Clin Infect Dis 36S11-S23 2003
LIVERMORE D M et al Carbapenemases a problem in waiting Curr
Opin Microbiol 2000 3489-95
LU et al Universal pcr for common bacterial pathogens J CLIN
MICROBIOL VOL 38 2000
LU et al Use of PCR with Universal Primers and Restriction Endonuclease
Digestions for Detection and Identification of Common Bacterial Pathogens in
Cerebrospinal Fluid Journal of Clinical Microbiology June 2000 p 2076ndash2080
MARSCHALL J Met al Presence of the KPC Carbapenemase Gene in
Enterobacteriaceae Causing Bacteremia and Its Correlation with In Vitro
Carbapenem Susceptibility J Clin Microbiol 47 239-241 Jan 2009
63
MARTINS WMBS et al Prevalecircncia do gene blaKPC em isolados cliacutenicos
de Enterobacteriaceae e natildeo fermentadores encontrados em amostras clinicas em
um hospital universitaacuterio do Recife X Jornada de ensino pesquisa e extensatildeo ndash
JEPEX 2010 ndash UFRPE Recife 18 a 22 de outubro
MENDES C A C et al Polimixinas Revisatildeo com ecircnfase na sua
nefrotoxicidade Rev Assoc Med Bras 2009 55(6) 752-9
MOHR J F 3rd Update on the efficacy and tolerability of meropenem in the
treatment of serious bacteacuterial infections Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S41-51
2008
MONTEIRO J et al First report of KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae
strains in Brazil Antimicrob Agents Chemother Jan53(1)333-4 2009
MOREIRA V C et al Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia a antibioacuteticos
Disponiacutevel em
lthttpwwwcpglsucgbr6mostraartigosSAUDEVANESSA20CARVALHO20M
OREIRApdfgt Acesso em 21 marccedilo 2014
NETIKUL T et al Emergence of novel blaKPC-12 and blaKPC-13 variants in
carbapenem non-susceptible Enterobacter cloacae a first report of blaKPC gene in
Thailand European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases May
S372 2011
NETO V A et al Antibioacuteticos na praacutetica Meacutedica 6ordf Ediccedilatildeo Editorial
SarverSP Brasil 2007
NICOLAU D P Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of
meropenem Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S32-40 2008
64
OLIVEIRA A C et al Resistecircncia bacteriana e mortalidade em um centro de
terapia intensiva Rev Latino-Am Enfermagem nov-dez 2010
PAAUW A et al Failure to control an outbreak of qnrA 1-positive multidrug-
resistant Enterobacter clocae despite adequate implementation of recommended
infection control measures Journal of Clinical Microbiology v 45 n 5 p 1420-1425
2007
PATERSON D L et al Extended-Spectrum Beta-Lactamases a Clinical
Update Clinical Microbiology Reviews v 18 p 657-686 2005
PEIRANO G et al Carbapenem-hydrolysing beta-lactamase KPC-2 in
Klebsiella pneumonia isolated in Rio de Janeiro Brazil J Antimicrob Chemother Nov
20 2009
PERES-BOTA D et al Are infections due to resistant pathogens associated
with worse outcome in critically ill patients J Infect 200347(4)307-16
PIDDOCK L J V Clinically relevant chromosomally encoded multidrug
resistance effl ux pumps in bacterial Clin Microbiol Rev n19 p382-402 2006
PITOUT J D D et al Emergence of Enterobacteriaceae producing
extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) in the community J Antimicrob
Chemother May 56 2005
POSSEBON M I et al Resistecircncia bacteriana aos carbapenecircmicos
Bacterial resitence to carbapenems RBM rev bras med60(6)378380-378-382
jun 2003
QUEENAN A M et al Carbapenemases the versatile beta-lactamases
Clin Microbiol Rev Jul20(3)440-58 2007
65
RHOMBERG P R et al Summary trends for the meropenem yearly
susceptibility test information collection program a 10- year experience in the United
States (1999-2008) Diagnostic Microbiology and Infectiois Disease v 65 n4 p
414-426 2009
ROBLEDO I E et al Detection of KPC in Acinetobacter spp in Puerto Rico
J Antimicrob Agents Chemother 54 1354-1357 Mar 2010
ROGERS B A et al Country-to-country transfer os patients and the risk of
multi-resistant bacterial infection Clinical Infectious Disease v53 n1 p49- 56
2011
SHAH A A et al Characteristics epidemiology and clinicalimportance of
emerging strains of Gram-negative bacilli producing extended-spectrum
betalactamases Research in Microbiology v 155 p 409-421 2004
TURNER P J Extended- Spectrum Beta-Lactamases Clinical Infectious
Diseases v 41 p 273-275 2005
WOLTER D J et al Phenotypic and Enzymatic Comparative Analysis
between the Novel KPC variant KPC-5 and Its Evolutionary Variants KPC-2 and
KPC-4 Antimicrob Agents Chemother Nov 17 2008
WOODFORD N et al Carbapenemases of Chryseobacterium
(Flavobacterium) meningosepticum distribution of blaB and characterization of a
novel Metalo-beta-lactamase gene blaB3 in the type strain NCTC 10016
Antimicrob Agents Chemother Jun44(6)1448-52 2000
WOODFORF N Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in
India Pakistan and the UK a molecular biological and epidemiological study The
Lancet Infectious Diseases v 10 n 9 p 597-602 2010
66
WOODFORD et al Outbreak of Klebsiella pneumoniae Producing a New
Carbapenem- Hydrolyzing Class A β-Lactamase KPC-3 in a New York Medical
Center Antimicrobial agents and chemotherapy Dec 2004 p 4793ndash4799 Vol 48
No 12
YAGI T et al A preliminary survey of extended-spectrum β-lactamases
(ESBLs) in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Japan
FEMS Microbiology Letters 184 (2000) 53-56
YIGIT H et al Novel carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase KPC-1 from
a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumonia J Antimicrob Agents
Chemother 45 (4) 1151-1161 (2001)
ZAVASCKI A P et al KPC-2- producing Enterobacter cloacae in two cities
from Southern Brazil Int J Antimicrob Agents Apr 28 2009
ZHANEL G G et al Comparative review of the carbapenecircmicos Drugs
67(7)1027-52 2007
67
ANEXOS
Sequumlecircncia do oligo blaKPC
Query 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
Query 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
Query 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
68
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
Query 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
Query 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
69
Query 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
Query 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
Query 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
70
Sbjct 421
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GCATGAC 480
Query 481
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ATTTGTT 540
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|||||||
Sbjct 481
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ATTTGTT 540
Query 541
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GCGATAC 600
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Sbjct 541
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GCGATAC 600
Query 601
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71
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|||||||
Sbjct 601
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ATGCGCG 660
Query 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 661
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GCTCTGC 720
Query 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
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|||||||
Sbjct 721
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CCGGCAA 780
72
Query 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
Query 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
Query 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
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|||||||
73
Sbjct 901
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CCGTCAT 960
Query 961
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GCTCTGA 1020
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Sbjct 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
Query 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Sbjct 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
Query 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
74
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Sbjct 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
Query 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
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|||||||
Sbjct 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
Query 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
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Sbjct 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
75
Query 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Sbjct 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
Query 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
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||||
Sbjct 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
LOCUS AF297554 1377 bp
DNA linear BCT 26-MAR-2001
DEFINITION Klebsiella pneumoniae carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
gene complete cds
ACCESSION AF297554
VERSION AF2975541 GI10121874
76
KEYWORDS
SOURCE Klebsiella pneumoniae
ORGANISM Klebsiella pneumoniae
Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Enterobacteriaceae Klebsiella
REFERENCE 1 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH QueenanAM
AndersonGJ Domenech-SanchezA
BiddleJW StewardCD
AlbertiS BushK and TenoverFC
TITLE Novel carbapenem-hydrolyzing beta-
lactamase KPC-1 from a
carbapenem-resistant strain of
Klebsiella pneumoniae
JOURNAL Antimicrob Agents Chemother 45 (4)
1151-1161 (2001)
PUBMED 11257029
REFERENCE 2 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH AndersonGJ and
TenoverFC
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (19-AUG-2000) Nosocomial
Pathogens Laboratory Branch
Centers for Disease Control and
Prevention 1600 Clifton Rd MS
G08 Atlanta GA 30333 USA
FEATURES LocationQualifiers
77
source 11377
organism=Klebsiella
pneumoniae
mol_type=genomic DNA
db_xref=taxon573
-35_signal 5560
-10_signal 7883
mRNA 921012
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
RBS 117122
CDS 1311012
note=blaKPC-1
codon_start=1
transl_table=11
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
protein_id=AAG134101
db_xref=GI10121875
translation=MSLYRRLVLLSCLSWPLAGFSATALTNLVAEPFAKLEQD
FGGSI
GVYAMDTGSGATVSYRAEERFPLCSSFKGFLAAAVLARSQQQAGLLDTPIRYG
KNALV
PWSPISEKYLTTGMTVAELSAAAVQYSDNAAANLLLKELGGPAGLTAFMRSIG
DTTFR
78
LDRWELELNSAIPSDARDTSSPRAVTESLQKLTLGSALAAPQRQQFVDWLKGN
TTGNH
RIRAAVPADWAVGDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTRAPNKDDK
HSEAV
IAAAARLALEGLGVNGQ
ORIGIN
1 cggggcagtt acagccgtta cagcctctgg
agagggagcg gcttgccgct cggtgataat
61 cccagctgta gcggcctgat tacatccggc
cgctacacct agctccacct tcaaacaagg
121 aatatcgttg atgtcactgt atcgccgtct
agttctgctg tcttgtctct catggccgct
181 ggctggcttt tctgccaccg cgctgaccaa
cctcgtcgcg gaaccattcg ctaaactcga
241 acaggacttt ggcggctcca tcggtgtgta
cgcgatggat accggctcag gcgcaactgt
301 aagttaccgc gctgaggagc gcttcccact
gtgcagctca ttcaagggct ttcttgctgc
361 cgctgtgctg gctcgcagcc agcagcaggc
cggcttgctg gacacaccca tccgttacgg
421 caaaaatgcg ctggttccgt ggtcacccat
ctcggaaaaa tatctgacaa caggcatgac
481 ggtggcggag ctgtccgcgg ccgccgtgca
atacagtgat aacgccgccg ccaatttgtt
541 gctgaaggag ttgggcggcc cggccgggct
gacggccttc atgcgctcta tcggcgatac
79
601 cacgttccgt ctggaccgct gggagctgga
gctgaactcc gccatcccaa gcgatgcgcg
661 cgatacctca tcgccgcgcg ccgtgacgga
aagcttacaa aaactgacac tgggctctgc
721 actggctgcg ccgcagcggc agcagtttgt
tgattggcta aagggaaaca cgaccggcaa
781 ccaccgcatc cgcgcggcgg tgccggcaga
ctgggcagtc ggagacaaaa ccggaacctg
841 cggagtgtat ggcacggcaa atgactatgc
cgtcgtctgg cccactgggc gcgcacctat
901 tgtgttggcc gtctacaccc gggcgcctaa
caaggatgac aagcacagcg aggccgtcat
961 cgccgctgcg gctagactcg cgctcgaggg
attgggcgtc aacgggcagt aaggctctga
1021 aaatcatcta ttggcccacc accgccgccc
ttgcgggcgg catggattac caaccactgt
1081 cacatttagg ctaggagtct gcgcggcaga
gccgtgtgac cggttttctg tagagcactg
1141 acgatggcgg cggcgctctc tgcaattggc
aaggcgtcgg cgccaaggat accaatcttg
1201 cggcgcgcgg cgtgttatga cgactggggt
gcatttgagc cgccccattt aaccttcgcc
1261 ctcacagata cgccattcgc ctcaaattta
gcgccatgca gacgagcttc cactcggctt
1321 gcaccttgtc caggcccctc atgctgaact
gacgcaatcc catcaccgcc ttgatca
80
RFLPrsquos - ldquoRestriction Fragment Length Polymorphismsrdquo( polimorfismos de tamanho
de fragmentos de restriccedilatildeo)
THM- Teste de Hodge Modificado
TSA- Teste de Susceptibilidade aos Antibioacuteticos
UTI- Unidade de Terapia Intensiva
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 15
11 Klebsiella pneumoniae produtora de Carbapenemase (KPC) 15
1 2 Resistecircncia bacteriana 20
13 Anaacutelise geneacutetica de microrganismos 27
2 JUSTIFICATIVA 30
3 OBJETIVOS 31
31 Objetivo geral 31
32 Objetivos Especiacuteficos 31
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS 32
4 1 Coleta e transporte das amostras bioloacutegicas 32
4 2 Procedimentos para confirmaccedilatildeo de resistecircncia bacteriana por disco de
Ertapenem (adaptado CDC 2004) 32
4 2 1 Interpretaccedilatildeo dos Resultados 33
4 3 Teste de susceptibilidade aos antibioacuteticos 34
4 4Teste de Hodge Modificado (THM) (adaptado CDC 2004) 35
441 Controle de qualidade (CQ) 35
442 InterpretaccedilatildeoResultados 35
4 5 Extraccedilatildeo de DNA bacteriano 37
4 6 Iniciadores e reaccedilatildeo de PCR 38
4 7 Digestatildeo 41
4 8 Eletroforese em gel de agarose 41
4 9 Descarte de resiacuteduos 42
4 10 Aspectos epidemioloacutegicos e cliacutenicos 42
4 12 Anaacutelises estatiacutesticas 42
4 13 Preceitos eacuteticos 43
5 RESULTADOS 44
51 Anaacutelise molecular 44
5 1 1 Gene blaKPC 44
5 1 2 Gene 16S rRNA 45
5 2 Anaacutelises epidemioloacutegicas 46
5 2 1 Sexo 46
5 2 2 Desfecho cliacutenico 47
5 2 3 Local da coleta 48
5 2 4 Microrganismo 48
6 DISCUSSAtildeO 53
7 CONCLUSAtildeO 57
15
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC)
Klebsiella pneumoniae pertence aacute famiacutelia Enterobacteriaceae
encontrado em locais como aacutegua solo plantas e esgoto Satildeo encontradas cinco
espeacutecies K pneumoniae K oxytoca K planticola K terrigena e K ornithinolytica
O gecircnero Klebsiella eacute definido como contendo bacilos Gram-negativos natildeo moacuteveis
em forma de bastatildeo e geralmente encapsuladas que produzem lisina
descarboxilase mas natildeo produzem ornitina descarboxilase Provavelmente a
colonizaccedilatildeo em seres humanos ocorre por contato com as diferentes fontes
ambientais podendo ser encontrada colonizando a orofaringe e fezes de pessoas
sadias Pessoas imunocomprometidas a bacteacuteria encontra um ambiente favoraacutevel
para seu crescimento levando aos quadros de infecccedilatildeo (MOREIRA et al 2014)
A Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) eacute uma enzima produzida por
enterobacteacuterias gram-negativas sendo um mecanismo de resistecircncia aos antimi-
crobianos carbapenecircmicos meropenen ertapenen eou imipenen classe
amplamente utilizada no tratamento de infecccedilotildees envolvendo Enterobacteriaceae
Ela tambeacutem eacute capaz de inativar os agentes β-lactacircmicos cefalosporinas penicilinas
e o aztreonam (COTRIM et al 2012)
Devido agrave semelhanccedila estrutural e estereoquiacutemica os antibioacuteticos beta-
lactacircmicos possuem um mecanismo de accedilatildeo comum ao grupo Eles atuam inibindo
a siacutentese da parede celular bacteriana atraveacutes do mecanismo de bloqueio da
transpeptidaccedilatildeo responsaacutevel pela uniatildeo dos componentes individuais do
peptidoglicano conforme demonstrado na figura 1 (KIDWAI et al 1999)
A accedilatildeo destes antibioacuteticos eacute atraveacutes de ligaccedilotildees covalentes com as proteiacutenas
as Penicilim-Binding-Protein (proteiacutena de ligaccedilatildeo da penicilina- PBP ou PLP) que se
encontram presentes na membrana citoplasmaacutetica de todas as bacteacuterias Devido agraves
mutaccedilotildees ocorre uma induccedilatildeo na alteraccedilatildeo dessas proteiacutenas podendo determinar
uma diminuiccedilatildeo da afinidade dos beta-lactacircmicos agraves mesmas A accedilatildeo dos
carbapenecircmicos eacute atraveacutes da sua ligaccedilatildeo agraves PBPs presentes na parede bacteriana
especialmente as PBP1 e PBP2 provocando a lise osmoacutetica da bacteacuteria Aleacutem
disso eles tecircm uma facilidade na penetraccedilatildeo da bacteacuteria por meio dos canais
poriacutenicos presentes nas bacteacuterias gram-negativas induzindo um efeito poacutes-
16
antibioacutetico Quando comparados com outros beta-lactacircmicos os carbapenecircmicos
satildeo mais resistentes agrave hidroacutelise pela maioria das beta-lactamases tanto
cromossocircmicas como plasmiacutedicas (LIVERMORE 1995 LIVERMORE et al 2000)
Figura 1 Accedilatildeo do szlig-lactacircmico sobre a bacteacuteria gram-positiva e gram-
negativa Fonte
ltlthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controle
opas_webmodulo3gramn_lacta2htmgt (adaptado)
A bacteacuteria Klebsiella pneumoniae quando apresenta gene ESBL pode
expressar resistecircncia a ateacute 95 dos antimicrobianos existentes no acircmbito
farmacecircutico sendo a produccedilatildeo de beta-lactamases de espectro estendido (ESBL)
17
por esta bacteacuteria uma das principais causas de falha terapecircutica Existem outras
formas de resistecircncia emergentes de grande importacircncia como a produccedilatildeo de
beta-lactamases tipo adenosina monofosfato ciacuteclico (AmpC) que hidrolizam
cefoxitina as carbapenemases como as metalo-beta-lactamases (MBL) e
carbapenemases tipo KPC (MOREIRA et al 2014)
O mecanismo de resistecircncia mais comum aos antibioacuteticos beta-lactacircmicos de
amplo espectro eacute a produccedilatildeo de ESBL por enterobacteacuterias A accedilatildeo hidroliacutetica
apresentadas por estas enzimas pode conferir clinicamente resistecircncia ao
aztreonam cefalosporina e a todas as penicilinas (PATERSON et al 2005) As
ESBL satildeo enzimas mediadas por genes plasmidiais (transmissiacuteveis entre as
espeacutecies) Os principais microrganismos produtores de ESBL satildeo Klebsiella
pneumoniae (mais encontrada) Escherichia coli e Proteus mirabilis podendo ocorrer
em outros membros da famiacutelia Enterobacteriaceae e em alguns microrganismos natildeo
enteacutericos como Acinetobacter ssp (TURNER 2005) A importacircncia cliacutenica meacutedica
destes microrganismos portadores de ESBL eacute que graccedilas aacutes suas resistecircncias a
muitas classes de antimicrobianos o tratamento de infecccedilotildees eacute difiacutecil gerando um
aumento da morbidade e mortalidade dos pacientes (SHAH et al 2004)
A enzima KPC foi detectada pela primeira vez na Carolina do Norte Costa
Leste dos Estados Unidos no ano de 1996 em Klebsiella pneumoniae dando entatildeo
este nome a enzima Em pouco tempo ela disseminou por outras regiotildees e
recentemente tornou-se uma das preocupaccedilotildees quanto agrave sauacutede puacuteblica mundial
Os paiacuteses de onde KPCs tecircm sido relatados desde 2001 satildeo mostrados na figura 2
apresentando como os organismos tecircm agora sido disseminados amplamente pelo
mundo (NEIL GUPTA et al 2011)
18
Figura 2 Divulgaccedilatildeo internacional de Enterobacteriaceae produtora de
Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC)( NEIL GUPTA et al 2011)
Este mapa apresenta paiacuteses onde Enterobacteriaceae produtoras KPC de
foram descritos em relatoacuterios publicados disponiacuteveis a partir de 11 fevereiro de
2011 Os paiacuteses natildeo destacadas nesta figura tambeacutem podem apresentar a presenccedila
de Enterobacteriaceae produtoras de KPC poreacutem pode ter tido uma falta de
vigilacircncia sistemaacutetica para estes organismos ( NEIL GUPTA et al 2011)
No ano de 2005 foram registradas pela primeira vez essas bacteacuterias
produtoras de carbapenemases Apoacutes 6 anos deste primeiro relato elas passaram a
causar surtos mais graves em nosso paiacutes Em janeiro de 2011 foram notificados no
Distrito FederalBrasil 367 casos em um curto espaccedilo de tempo (01 a 08 de janeiro
de 2011) com 26 oacutebitos A maior parte destes casos (263 casos) foi identificada nas
unidades de terapia intensiva ndash UTI (COTRIM et al 2012)
O potencial de disseminaccedilatildeo da KPC eacute alto devido agrave grande capacidade de
transferecircncia do seu material geneacutetico e por conseguinte os genes de resistecircncia
O controle de epidemias eacute difiacutecil devido a esta caracteriacutestica de faacutecil disseminaccedilatildeo
preocupando os profissionais da aacuterea de sauacutede devido agrave dificuldade de tratamento
podendo resultar em um aumento das taxas de mortalidade Apesar da maior
19
frequumlecircncia em Klebsiella pneumoniae a KPC pode ser identificada em outras
bacteacuterias como a Enterobacter cloacae Citrobacter freundii Salmonella spp E coli
e Pseudomonas spp (DIENSTMANN et al 2010)
Os pacientes com comorbidades incluindo pacientes transplantados
neutropecircnicos em ventilaccedilatildeo mecacircnica em Unidade de Terapia Intensiva (UTI)
com longos periacuteodos de internaccedilatildeo que apresentam risco aumentado de infecccedilatildeo ou
colonizaccedilatildeo para bacteacuterias multirresistentes satildeo mais vulneraacuteveis a Klebsiella
pneumoniae produtora de KPC (COTRIM et al 2012)
Os sinais e sintomas apresentados por um indiviacuteduo infectado por KPC satildeo
febre ou hipotermia taquicardia piora do quadro respiratoacuterio e em casos mais
graves hipotensatildeo inchaccedilo e sepse Quanto ao siacutetio de infecccedilatildeo a bacteacuteria que
possui a enzima KPC pode causar pneumonia associada agrave ventilaccedilatildeo mecacircnica
infecccedilatildeo do trato urinaacuterio infecccedilatildeo de corrente sanguiacutenea infecccedilatildeo de partes moles
e outros tipos de infecccedilatildeo (COTRIM et al 2012)
Para desenvolver a infecccedilatildeo a colonizaccedilatildeo eacute um preacute-requisito poreacutem o
pacientes pode estar colonizado ou seja ser portadores de KPC e natildeo desenvolver
a infecccedilatildeo (ALVES et al 2013) A forma de transmissatildeo eacute basicamente por
contato com secreccedilatildeo ou excreccedilatildeo de pacientes infectados ou colonizados logo
fora do ambiente hospitalar a bacteacuteria natildeo representa perigo (COTRIM et al
2012)
As opccedilotildees terapecircuticas para o tratamento da Klebsiella pneumoniae eacute
dividida em Terapia Empiacuterica e Terapia apoacutes a determinaccedilatildeo do perfil de
sensibilidade A terapia empiacuterica para infecccedilotildees por enterobacteacuterias multirresistentes
se baseia na utilizaccedilatildeo de polimixina B ou polimixina E (Colistina) em associaccedilatildeo
com um (1) ou mais dos antimicrobianos da classe dos aminoglicosiacutedeos
(gentamicina ou amicacina) Carbapenecircmicos (meropenem ou doripenem) eou
tigeciclina (ANVISA 2013)
Recomenda-se usar sempre associaccedilotildees de dois ou trecircs antimicrobianos
sendo um deles a polimixina B ou a polimixina E (colistina) Deve-se evitar a
utilizaccedilatildeo de monoterapias pelo risco de raacutepido desenvolvimento de resistecircncia A
escolha do(s) faacutermaco(s) de associaccedilatildeo com polimixina B ou E deve se basear
preferencialmente no perfil de susceptibilidade esperado aos referidos
20
medicamentos das enterobacteacuterias resistentes aos carbapenecircmicos detectadas no
hospital ou na ausecircncia de dados locais na regiatildeo Deve-se considerar igualmente
o local de infecccedilatildeo e a penetraccedilatildeo esperada do antimicrobiano na escolha da droga
a ser utilizada na combinaccedilatildeo (ANVISA 2013)
Apoacutes a liberaccedilatildeo do perfil de sensibilidade deve-se adequar o uso dos
medicamentos Sempre que possiacutevel manter no miacutenimo 2 (dois) faacutermacos com
sensibilidade comprovada in vitro Natildeo havendo sensibilidade a um segundo
medicamento (suscetibilidade apenas agrave polimixina B ou E) recomenda-se manter a
terapia combinada de polimixina B ou E com carbapenecircmicos (meropenem ou
doripenem) ou tigeciclina na tentativa de ocorrecircncia de sinergismo entre elas
(ANVISA 2013)
Sugere-se aleacutem da determinaccedilatildeo das Concentraccedilotildees Inibitoacuterias Miacutenimas
(CIMs) para uma das polimixinas (B ou E) que tambeacutem sejam determinadas as
CIMs de tigeciclina e carbapenecircmicos (meropenem) bem como a consultoria de um
infectologista (ou Comissatildeo de Controle de Infecccedilatildeo Hospitalar- CCIH) para a
determinaccedilatildeo da terapia combinada com base na interpretaccedilatildeo do antibiograma
CIM e quadro cliacutenico do paciente No caso de resistecircncia agraves polimixinas
(concentraccedilotildees inibitoacuterias miacutenimas [CIMs] gt 2 mgL) recomenda-se a associaccedilatildeo de
dois ou trecircs do antimicrobianos sugeridos para a combinaccedilatildeo (ANVISA 2013)
A antissepsia eficiente do ambiente dos instrumentos ciruacutergicos e das matildeos
com o uso do aacutelcool a 70 eacute fundamental para a contenccedilatildeo de surtos Aleacutem disto
os pacientes contaminados devem permanecer isolados ateacute o controle da infecccedilatildeo
para evitar a disseminaccedilatildeo da bacteacuteria (COTRIM et al 2012)
1 2 Resistecircncia bacteriana
Hoje a disseminaccedilatildeo e a proliferaccedilatildeo das bacteacuterias resistentes estatildeo cada
dia mais presente As bacteacuterias multirresistentes (BRMD) poderatildeo levar agrave
humanidade a uma era poacutes-antibioacutetica resultando em uma ausecircncia de qualquer
opccedilatildeo de tratamento para os portadores destas cepas (HENRIQUE et al 2014)
Os fatores envolvidos na disseminaccedilatildeo desses patoacutegenos multirresistentes
satildeo diversos incluindo o uso irracional de antimicrobianos procedimentos invasivos
21
(cirurgias implantaccedilatildeo de proacuteteses meacutedicas e outros) e a transferecircncia de material
geneacutetico com a informaccedilatildeo de resistecircncia a antibioacuteticos entre as bacteacuterias
(DIENSTMANN et al 2010 ENDIMIAMI et al 2009 FONTANA et al 2010)
Com a praacutetica da antibioticoterapia principalmente em ambientes
nosocomiais os mecanismos de resistecircncia tornaram-se comuns Esses
mecanismos incluem alteraccedilatildeo na permeabilidade da membrana celular que
impede a entrada do antibioacutetico na ceacutelula bombeamento do antibioacutetico para fora da
mesma pelo mecanismo de efluxo mutaccedilatildeo geneacutetica que altera de alguma forma o
alvo do antibioacutetico e consequumlentemente natildeo afeta o funcionamento da bacteacuteria
bem como desenvolvimento da capacidade de degradar ou da inativaccedilatildeo do
antibioacutetico (COTRIM et al 2012) Estes mecanismos estatildeo representados na figura
3
Figura 3 Mecanismos de resistecircncia bacteriana Fonte
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controle
opas_webmodulo3pop_mecanismohtmgt
Um dos mais importantes mecanismos de resistecircncia eacute a alteraccedilatildeo do local-
alvo onde atua determinado antimicrobiano de modo a impedir a ocorrecircncia de
qualquer efeito inibitoacuterio ou bactericida As bacteacuterias podem adquirir um gene que
22
codifica um novo produto resistente aos antimicrobianos substituindo o alvo original
por exemplo o Staphylococcus aureus resistente agrave oxacilina e estafilococos
coagulase-negativos adquiriram o gene cromossocircmico Mec A e produzem uma PBP
ou PLP resistente aos β-lactacircmicos denominada 2a ou 2 que eacute suficiente para
manter a integridade da parede celular durante o crescimento quando outras PBPs
essenciais satildeo inativadas por antibimicrobianos β-lactacircmicos Como alternativa um
gene receacutem-adquirido pode atuar para modificar um alvo tomando-o menos
vulneraacutevel a determinado antimicrobiano Assim um gene transportado por
plasmiacutedeo ou por transposon codifica uma enzima que inativa os alvos ou altera a
ligaccedilatildeo dos antimicrobianos como ocorre com eritromicina e clindamicina (ANVISA
2007)
Em funccedilatildeo da bomba de efluxo pode variar a especificidade do antibioacutetico
Ele atua por meio do bombeamento ativo de antimicrobianos do meio intracelular
para o extracelular gerando uma resistecircncia bacteriana a determinados
antimicrobianos como eacute o caso da resistecircncia agraves tetraciclinas codificada por
plasmiacutedeos em Escherichia coli devido agrave presenccedila de proteiacutenas integrantes da
membrana plasmaacutetica bacteriana (PIDDOCK 2006)
O aumento da siacutentese de proteiacutenas eacute o principal responsaacutevel pela resistecircncia
antimicrobiana devido agraves vaacuterias mutaccedilotildees que ocorrem em seus repressores
transcricionais Estas mutaccedilotildees tambeacutem podem influenciar levando a um aumento
da eficiecircncia do transporte dos antibioacuteticos para o exterior da ceacutelula (HARBOTTLE
et al 2006)
A resistecircncia aos antibioacuteticos eacute frequumlentemente associada agrave alteraccedilatildeo
diminuiccedilatildeo da permeabilidade que ocorre na membrana externa das bacteacuterias gram-
negativas O fluxo de moleacuteculas para o interior da ceacutelula ocorre por caracteriacutesticas
peculiares como carga estrutura e dimensatildeo e atraveacutes de proteiacutenas de membrana
as quais formam canais Este percurso eacute utilizado pelos antibioacuteticos para atingir o
interior da ceacutelula bacteriana ou o espaccedilo periplasmaacutetico como eacute o caso dos
antibioacuteticos β-lactacircmicos Portanto a perda de funccedilatildeo destas proteiacutenas pode
efetivamente causar a diminuiccedilatildeo da susceptibilidade a vaacuterios antibioacuteticos
(LIVERMORE 2003)
23
Os mecanismos de resistecircncia que podem impedir a accedilatildeo de antimicrobianos
satildeo vaacuterios O faacutermaco atua de forma a inibir os processos essenciais a multiplicaccedilatildeo
e sobrevivecircncia da ceacutelula bacteriana como a membrana citoplasmaacutetica e
consequumlentemente bloqueando a siacutentese proteacuteica de aacutecidos nucleacuteicos e da parede
celular A resistecircncia bacteriana eacute um mecanismo natural de defesa Sendo assim
as bacteacuterias estatildeo em constante defesa e para cada novo faacutermaco desenvolvido as
bacteacuterias iratildeo desenvolver resistecircncia em algum momento (POSSEBON et al
2003)
O grupo de antibioacuteticos beta-lactacircmicos satildeo amplamente utilizado e se
encontram dentro da classe dos melhores agentes antimicrobianos com relevacircncia
cliacutenica No entanto o seu uso tem sido restringido devido a vaacuterios mecanismos de
resistecircncia O desenvolvimento dos carbapenecircmicos surgiu devido agrave proliferaccedilatildeo de
beta-lactamases mediadas por plasmiacutedeos e cromossomos (POSSEBON et al
2003)
A bacteacuteria KPC tem um gene chamado SHV-1 que tem a caracteriacutestica de
resistecircncia a quase todos os tipos de antimicrobianos inclusive os carbapenecircmicos
especiacuteficos para o tratamento de infecccedilotildees por bacteacuterias multiresistentes e
emergecircncias Mesmo com no seu coacutedigo geneacutetico a informaccedilatildeo necessaacuteria para o
desenvolvimento da resistecircncia a resistecircncia da bacteacuteria soacute eacute desenvolvida caso a
bacteacuteria entre em contato com o antibacteriano desencadeando todo o processo
nos casos de resistecircncia induzida comuns em KPC (MOREIRA et al 2014)
A resistecircncia bacteriana pode ser apresentada de forma intriacutenseca ou
adquirida A resistecircncia intriacutenseca faz parte das caracteriacutesticas fenotiacutepicas naturais
do microrganismo ou seja faz parte de sua heranccedila geneacutetica sendo transmitida
verticalmente a prole sem perda da caracteriacutestica A presenccedila ou ausecircncia do alvo
para a accedilatildeo da droga eacute o principal determinante deste tipo de resistecircncia
(MOREIRA et al 2014) Essa resistecircncia corresponde a uma caracteriacutestica de
espeacutecie bacteriana quando estes microrganismos satildeo naturalmente resistentes a
certo tipo de antibioacutetico Este processo eacute decorrente da ausecircncia de estruturas de
atuaccedilatildeo de antimicrobianos ou a impermeabilidade por parte de estruturas
perifeacutericas das bacteacuterias (HENRIQUE et al 2014)
24
A resistecircncia adquirida aos antibioacuteticos por sua vez ocorre quando haacute uma
da mutaccedilatildeo de genes reguladores ou estruturais aquisiccedilatildeo de genes de resistecircncia
veiculados por elementos geneacuteticos moacuteveis ou da combinaccedilatildeo entre eles Este
aparecimento de resistecircncia em uma espeacutecie bacteriana era anteriormente sensiacutevel
a droga e devido a um destes fatores se torna resistente O fenoacutetipo resultante
desta resistecircncia natildeo estaraacute presente nas ceacutelulas genitoras e sim nos indiviacuteduos de
uma linhagem bacteriana derivada de um organismo susceptiacutevel Os genes muitas
vezes satildeo adquiridos por meio de elementos moacuteveis como plasmiacutedeos e
transposons (MOREIRA et al 2014)
Entatildeo a resistecircncia adquirida ocorre por diversos mecanismos geneacuteticos tais
como produccedilatildeo de enzimas inativadoras interferecircncia com a entrada e acuacutemulo de
droga na bacteacuteria alteraccedilatildeo do receptor para accedilatildeo da droga via metaboacutelica
alternativa Eacute originada por meio de uma alteraccedilatildeo a niacutevel geneacutetico da ceacutelula de
natureza cromossocircmica pelos processos de mutaccedilatildeo transduccedilatildeo e transformaccedilatildeo
ou extra cromossocircmica (plasmidial) (HENRIQUE et al 2014)
Como todo antibioacutetico β-lactacircmicoos carbapenecircmicos tem como mecanismo
de accedilatildeo a inibiccedilatildeo da siacutentese proteacuteica atraveacutes da accedilatildeo de inibiccedilatildeo da parede
microbiana fazendo a ligaccedilatildeo e inativaccedilatildeo das proteiacutenas ligadoras de penicilinas
(NETO et al 2007)
Imipenem e meropenem antibioacuteticos pertencentes ao grupo dos
carbapenecircmicos possuem um amplo espectro de accedilatildeo in vitro incluindo atividade
contra cocos gram-positivos bacilos gram-negativos e bacteacuterias anaeroacutebias (MOHR
2008) Jaacute o ertapenem possui um espectro de accedilatildeo mais limitado que o os dois
antibioacuteticos anteriormente citados tendo uma eficiecircncia limitada contra os bacilos
gram-negativos natildeo fermentadores Um novo antibioacutetico carbapenecircmico ainda natildeo
disponiacutevel no Brasil doripenem possui uma atividade mais potente principalmente
contra Pseudomona aeruginosa devido ao seu mecanismo de accedilatildeo que combina os
espectros de accedilatildeo de imipenem e meropenem (ZHANEL et al 2007)
Devido as suas estabilidades espectro de accedilatildeo poucos relatos de
resistecircncia boa toleracircncia pelos pacientes com efeitos adversos mais comuns as
complicaccedilotildees no siacutetio da infusatildeo e toxicidade gastrintestinal estes antibioacuteticos
carbapenecircmicos tecircm sido considerados terapia de escolha (NICOLAU 2008) Como
25
uma resposta adaptativa das Enterobacteacuterias o iacutendice de resistecircncia aos
carbapenecircmicos tem aumentado nos uacuteltimos anos de forma proporcional ao seu
uso limitando imensamente as opccedilotildees terapecircuticas para as infecccedilotildees causadas por
estes microrganismos (FALAGAS et al 2009)
As enzimas produtoras de betalactamases hidrolisam o anel betalactacircmico
tornando este mecanismo de resistecircncia o mais importante Os dois grupos mais
preocupantes satildeo o grupo das betalactamases de aspecto ampliado e os da
carbapenemases que aleacutem de hidrolizar os carbapenecircmicos hidrolizam todas as
outras classes de betalactacircmicos Em enterobacteacuterias as carbapenemases mais
prevalentes satildeo codificadas por genes dos grupos blaKpc blaIMP blaVIM blaNdm
e blaOxa A ocorrecircncia de carbapenemases eacute mais frequentemente em bacteacuterias
gram-negativas fermentadoras da glicose conhecidas como enterobacteacuterias
predominantes nos gecircneros Klebsiella Serratia Citrobacter Enterobacter
Escherichia Samonella Proteus Morganella Podem ser encontradas tambeacutem em
bacteacuterias gram-negativas natildeo fermentadoras como espeacutecies de Acinetobacter e de
Pseudomonas (ALVES et al 2013)
Carbapenemases satildeo enzimas plasmiacutedio-mediados resistentes a todos
antibioacuteticos betalactacircmicos As bacteacuterias que possuem o gene blaKpC responsaacutevel
pela codificaccedilatildeo da produccedilatildeo de carbapenemases apresentam resistecircncia aos
antibioacuteticos betalactacircmicos impedindo a accedilatildeo destes antibioacuteticos contra infecccedilotildees
(ALVES et al 2013)
A transmissatildeo das carbapenemases a diferentes cepas de enterobacteacuterias se
daacute atraveacutes de plasmiacutedeos que satildeo pequenas moleacuteculas circulares de DNA com a
capacidade de se replicarem independentemente do DNA cromossocircmico
permitindo a troca de material geneacutetico entre gecircneros e espeacutecies diferentes de
enterobacteacuterias O raacutepido desenvolvimento de surtos em ambientes hospitalares eacute
explicado por essa disseminaccedilatildeo plasmidial (COTRIM et al 2012)
De acordo com o criteacuterio de interpretaccedilatildeo do Clinical and Laboratory
Standards Institute (CLSI 2009) a maioria das KPC isoladas natildeo apresenta
resistecircncia completa aos carbapenecircmicos (Imipenem e Meropenem apresentam
uma Concentraccedilatildeo Inibitoacuteria Miacutenima (CIM) de 2-8 μgmL) (COTRIM et al 2012)
26
Os mecanismos de resistecircncia capazes de impedir a accedilatildeo dos
carbapenecircmicos satildeo vaacuterios Poreacutem a degradaccedilatildeo de antibioacuteticos por enzimas
principalmente as carbapenemases constituem o principal mecanismo de
resistecircncia aos antibioacuteticos β-lactacircmicos (DIAS 2009) Devido a ampla atividade
hidroliacutetica agrave maioria dos antibioacuteticos β-lactacircmicos estes grupos de enzimas possuem
alta versatilidade (QUEENAM et al 2007)
Existem trecircs grandes classes moleculares de Ambler a qual as
carbapenemases pertencem denominadas classe A (serino-carbapenemases os
quais incluem membros designados SME IMI NMC GES e a famiacutelia das KPCs)
classe B(as metalo-β-lactamase incluem os tipos IMP e VIM) e classe D
(oxacilinases similares as da classe A e incluem as OXA e PSE) (DIAS 2009)
Dentre estes as mais importantes e prevalentes encontradas em plasmiacutedeos
de Klebsiella pneumoniae satildeo as KPC (DIENSTMANN et al 2010) Por meio de
estudos moleculares a enzima KPC jaacute foi documentada em diferentes bacteacuterias e
diferenciada em KPC-1 a 13 (NETIKUL et al 2011) No ano de 2009 foi realizada
uma pesquisa onde descreveram as seguintes carbapenemases KPC-1 em isolados
de Klebsiella pneumoniae KPC-2 em K pneumoniae K oxytoca Salmonella
enterica e em Enterobacter sp e KPC-3 em K pneumoniae e Enterobacter cloacae
(MONTEIRO et al 2009) As enzimas KPC-4 e KPC-5 foram encontradas em
isolados de Pseudomonas aeruginosa (PEIRANO et al 2009)
Foi observada uma correccedilatildeo da sequumlecircncia KPC-1 indicando que o gene
blaKPC-1 e blaKPC-2 satildeo idecircnticos Trecircs novas variantes blaKPC-3 blaKPC-4 e
blaKPC-5 satildeo resultados de mutaccedilotildees do gene estrutural da enzima KPC-2
(WOLTER et al 2008) apresentando diferentes perfis de hidroacutelise As enzimas
KPC-2 e KPC-3 possuem alta eficiecircncia em hidrolisar cefalotina cefaloridina e
nitrocefin poreacutem possuem uma menor eficiecircncia contra carbapenecircmicos e
cefotaxima (ALBA et al 2005) As enzimas KPC-5 e KPC-4 apresentam menor
hidroacutelise de carbapenecircmicos eacute do que em KPC-2 Em contrapartida possuem
melhor eficiecircncia contra ceftazidima e uma maior inibiccedilatildeo pelo aacutecido clavulacircnico
(WOLTER et al 2008)
27
13 Anaacutelise geneacutetica de microrganismos
Eacute de extrema importacircncia praacutetica natildeo soacute no aspecto cliacutenico mas tambeacutem na
fitopatologia biotecnologia e estudos ambientais a correta identificaccedilatildeo e
classificaccedilatildeo de microrganismos Os meacutetodos usados na diferenciaccedilatildeo de gecircneros
espeacutecies e estirpes de microrganismos podem ser divididos em meacutetodos fenotiacutepicos
(baseados em fenocircmenos bioquiacutemicos fisioloacutegicos e bioloacutegicos) e genotiacutepicos
(detectam polimorfismos ao niacutevel dos aacutecidos nucleacuteicos ou variaccedilatildeo aleacutelica ao niacutevel
de enzimas) (ALVES et al 2003)
Para este tipo de estudo existem alguns meacutetodos como o RFLPrsquos -
ldquoRestriction Fragment Length Polymorphismsrdquo (polimorfismos de tamanho de
fragmentos de restriccedilatildeo) rep-PCR (Meacutetodo de tipagem baseado na amplificaccedilatildeo via
PCR de elementos de DNA repetitivos presentes em genomas bacterianos) anaacutelise
de sequumlecircncias nucleotiacutedeas (discriminaccedilatildeo eou identificaccedilatildeo atraveacutes de sequumlecircncias
de DNA) PFGE - Pulsed-Field Gel Electrophoresis (Eletroforese em campo
pulsado) ( A L V E S et al 2003)
A diferenciaccedilatildeo clara da cepa e principalmente a alta reprodutibilidade devem
ser caracteriacutesticas de qualquer meacutetodo de tipagem geneacutetica Poreacutem nem todos os
meacutetodos moleculares de tipagem satildeo igualmente eficazes Sendo assim de acordo
com a finalidade pretendida (identificaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo custo reprodutibilidade
etc) eacute feita a escolha do meacutetodo a ser aplicado (A L V E S et al 2003)
O processo de identificaccedilatildeo fenotiacutepica de KPC entre os membros da famiacutelia
Enterobacteriaceae ainda eacute difiacutecil e os meacutetodos para a sua identificaccedilatildeo devem ser
revistos e ajustados Mesmo com o avanccedilo tecnoloacutegico natildeo existem ensaios que
combinam alta especificidade e sensibilidade na detecccedilatildeo destas enzimas Satildeo
diversas as metodologias usadas para rastreamento de KPC como por exemplo a
focalizaccedilatildeo isoeleacutetrica a teacutecnica de disco-difusatildeo E-test teste de Hodge
modificado dentre outros Aleacutem disso a pesquisa do gene blaKPC pode ser feita
pela Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) Os sistemas de automaccedilatildeo
existentes no entanto podem natildeo identificar com precisatildeo os isolados KPC
positivos (COTRIM et al 2012)
A identificaccedilatildeo blaKPC pelo PCR eacute um meacutetodo raacutepido preciso sensiacutevel e
altamente especiacutefico no entanto a PCR exige equipamento e conhecimentos
28
especializados em diagnoacutestico molecular dificultando ainda a utilizaccedilatildeo dele na
rotina dos laboratoacuterios de microbiologia (COTRIM et al 2012)
Em estudo de infecccedilotildees hospitalares identificaccedilatildeo molecular de patoacutegenos
bacterianos eacute bastante utilizada Para diferenciar carbapenemases tipo KPC a partir
de outros tipos como SME NMC-A-IMI e GES eacute necessaacuterio um exame molecular
As identificaccedilotildees do microrganismo juntamente com a triagem molecular iratildeo definir
um resultado mais especiacutefico podendo ser usado para identificar o antibioacutetico mais
adequado para o tratamento Poreacutem a principal desvantagem de alguns exames
baseados em PCR por exemplo eacute que devido agrave sua limitada capacidade de
multiplexaccedilatildeo eles distinguem apenas algumas variaccedilotildees (MOREIRA et al 2014)
Estatildeo descritas para a identificaccedilatildeo molecular de patoacutegenos pertencentes agrave
famiacutelia Enterobacteriaceae as teacutecnicas de PFGE RAPD (randomly amplified
polymorphic DNA) e ERIC-PCR (Enterobacterial Repet it ive Intergenic Consensus)
A PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) eacute considerada padratildeo ouro devido sua
alta capacidade de diferenciaccedilatildeo baseada na anaacutelise do perfil de restriccedilatildeo do DNA
genocircmico por meio de eletroforese Como desvantagem para a sua execuccedilatildeo eacute
necessaacuterios vaacuterios dias impedindo a tipagem de algumas cepas bacterianas devido
agrave degradaccedilatildeo do DNA aleacutem do alto custo empregado (MOREIRA et al 2014)
O meacutetodo baseado em ERIC-PCR tem sido bastante utilizado como uma
alternativa para a teacutecnica de PFGE Esta teacutecnica consiste na anaacutelise do padratildeo de
amplificaccedilatildeo de elementos repetidos encontrados no genoma bacteriano Isto
permite uma maior rapidez na obtenccedilatildeo de resultados quando comparada com o
PFGE aleacutem de alta reprodutibilidade simples execuccedilatildeo e implementaccedilatildeo baixo
custo e natildeo sem problemas com a degradaccedilatildeo do DNA (MOREIRA et al 2014)
A PCR eacute considerada uma teacutecnica de biologia molecular revolucionaacuteria que
consiste na siacutentese enzimaacutetica de coacutepias de aacutecidos nucleacuteicos Ela permitiu o raacutepido
desenvolvimento do estudo de sequumlecircncias de aacutecidos nucleacuteico Foi desenvolvida por
Kary Banks Mullis que ganhou o precircmio Nobel de quiacutemica de 1993 devido ao
desenvolvimento dessa teacutecnica em abril de 1983 (CAMARGO et al 2014)
Por meio de etapas de variaccedilatildeo de temperatura a teacutecnica de PCR promove a
duplicaccedilatildeo de cadeias de DNA in vitro A reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo de DNA por PCR
envolve o emprego de sequumlecircncias iniciadoras (primers) quatro nucleotiacutedeos
29
(dNTPrsquos) do DNA e uma DNA polimerase termoestaacutevel podendo assim obter-se a
partir de uma fita molde muitas coacutepias de uma sequumlecircncia especiacutefica de aacutecido
nucleacuteico O princiacutepio da PCR consiste na variaccedilatildeo de temperatura por ciclo
envolvendo trecircs etapas baacutesicas desnaturaccedilatildeo pareamento e amplificaccedilatildeo
(CAMARGO et al 2014)
A desnaturaccedilatildeo da fita molde de DNA eacute uma etapa com duraccedilatildeo entre 30
segundos a 1 minuto a temperatura entre 92 ordmC a 96 ordmC Apoacutes isso o pareamento de
dois iniciadores sinteacuteticos de composiccedilotildees distintas que funcionam como os
iniciadores da reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo liga-se agrave regiatildeo complementar da fita de
DNA alvo que sofreraacute a duplicaccedilatildeo Esta etapa tem duraccedilatildeo de 30 segundos a 1
minuto a temperatura entre 58 ordmC e 65 ordmC Por uacuteltimo a amplificaccedilatildeo por meio da
enzima Taq DNA polimerase das novas fitas de DNA se daacute a partir de cada um dos
iniciadores utilizando os quatro dNTPrsquos como substrato da reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo
Esta etapa possui duraccedilatildeo entre 45 segundos e 1 minuto a 72 ordmC Cada ciclo eacute
repetido em torno de 30 a 35 vezes e promove a amplificaccedilatildeo da regiatildeo alvo
determinada conforme o anelamento dos iniciadores sinteacuteticos de DNA (CAMARGO
et al 2014) Estas etapas estatildeo demonstradas na figura 4
Figura 4 Etapas da Reaccedilatildeo de PCR
30
2 JUSTIFICATIVA
No ano de 2010 no Distrito Federal foram identificados 111 pacientes com
suspeita de infecccedilatildeo por Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) e a
Secretaria de Sauacutede do Distrito Federal confirmaram ainda a morte de 18 pacientes
dentre os hospitais puacuteblicos e particulares Um desafio encontrado por ocasiatildeo do
surto infeccioso no Distrito Federal foi o de confirmar as KPCs por Reaccedilatildeo da
Polimerase em Cadeia sendo que as amostras foram enviadas com esta finalidade
para a Fiocruz no Rio de Janeiro
Pesquisas que possam contribuir na elaboraccedilatildeo de estrateacutegias preventivas e
de intervenccedilatildeo para infecccedilotildees causadas por enterobacteacuterias bem como contribuir
para gerar uma integraccedilatildeo beneacutefica entre a equipe acadecircmica e os serviccedilos de
sauacutede devem ser estimuladas Neste sentido o presente estudo permitiu escrutinar
os genes envolvidos na expressatildeo de carbapenemases presentes em espeacutecies de
enterobacteacuterias isoladas em ambiente hospitalar visto que elucidar genes de
resistecircncia de enterobacteacuterias aos antibioacuteticos carbapenecircmicos eacute o primeiro passo
para garantir um controle epidemioloacutegico efetivo para estes tipos de microorganismo
assim como sua associaccedilatildeo com surtos fatais particularmente em pacientes com
baixa imunidade
31
3 OBJETIVOS
31 Objetivo geral Caracterizar os genes de resistecircncia das
Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases e os aspectos epidemioloacutegicos de
pacientes internados em um hospital puacuteblico do Distrito Federal
32 Objetivos Especiacuteficos
Identificar genotipicamente a enzima KPC (Klebsiella pneumoniae
carbapenemase) de isolados de Klebsiella pneumoniae
Investigar aspectos epidemioloacutegicos dos pacientes portadores de
Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases
Identificar quais variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana influenciaram para o
desfecho oacutebito ou alta
Avaliar a susceptibilidade das Enterobacteacuterias aos antibioacuteticos
carbapenecircmicos dos pacientes em ambiente hospitalar
32
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
Trata-se de um estudo transversal onde foi realizado o teste de
susceptibilidade das enterobacteacuterias aos antibioacuteticos carbapenecircmicos a partir dos
materiais bioloacutegicos coletados dos pacientes internados no Hospital Regional da Asa
Norte (HRAN) e enviados ao Laboratoacuterio de Anaacutelises Cliacutenicas da mesma Instituiccedilatildeo
Os materiais bioloacutegicos investigados foram sangue aspirado traqueal ou brocircnquico
urina e cultura semi quantitativa de ponta de cateter venoso central O HRAN eacute um
hospital puacuteblico do Distrito Federal com 395 leitos sendo as cliacutenicas de internaccedilatildeo
Berccedilaacuterio Cirurgia Geral Cirurgia Plaacutestica Cliacutenica Meacutedica Ginecologia Maternidade
Pediatria Queimados UTI com atendimento a pacientes portadores de doenccedilas de
caraacuteter cliacutenico e ciruacutergico
4 1 Coleta e transporte das amostras bioloacutegicas
As amostras foram coletadas de pacientes internados no Hospital Regional da
Asa Norte (HRAN) com suspeitas de infecccedilatildeo por KPC A identificaccedilatildeo primaacuteria foi
realizada pelo Laboratoacuterio de Microbiologia do hospital de origem dos pacientes e os
demais procedimentos que foram utilizados na identificaccedilatildeo encontram-se descritos
abaixo
4 2 Procedimentos para confirmaccedilatildeo de resistecircncia bacteriana por
disco de ertapenem (adaptado CDC 2004)
Para diagnosticar amostra como portadora de bacteacuteria produtora de
carbapenemase foi realizado o teste com disco de ertapenem como forma de
triagem Inicialmente utilizou-se o swab contaminado com a amostra que foi
distribuiacuteda em uma pequena aacuterea da placa de aacutegar MacConkey para apoacutes o
crescimento ser realizada a pesquisa de colonizaccedilatildeo por enterobacteacuterias resistentes
aos carbapenecircmicos (Pesquisa de CRE) Procedeu-se a semeadura por teacutecnica
semi-quantitativaesgotamento com alccedila bacterioloacutegica na diluiccedilatildeo de 1100 O disco
de Ertapenem foi colocado na superfiacutecie da placa de MacConkey na junccedilatildeo dos dois
primeiros campos de semeadura conforme demonstrado na figura 5 Incubou a placa
33
em estufa aeroacutebia a 35ordmC por 24 e 48 horas e observou-se o halo de difusatildeo do
disco de Ertapenem na placa para proceder agrave leitura
O teste deixou de ser obrigatoacuterio apoacutes a modificaccedilatildeo dos criteacuterios
interpretativos para carbapenecircmicos para enterobacteacuterias publicados no suplemento
do CLSI 2010 M100-S20-U
Figura 5 Mecanismo de semeamento de material bioloacutegico oriundos de
pacientes com suspeita de infecccedilatildeo por KPC Fonte adaptado CDC 2004
4 2 1 Interpretaccedilatildeo dos resultados
Na ausecircncia de crescimento ateacute 24 horas (MacConkey) ou halo de difusatildeo
gt27 mm na placa deve-se reincubar as placas por mais 24 horas Quando for
ausente o crescimento apoacutes 48 horas ou halo de difusatildeo gt27 mm na placa libera-se
como enterobacteacuterias resistentes a carbapenecircmicos (KPCNEG)Havendo
crescimento de colocircnias na placa de MacConkey com halo lt 27 mm (apenas para
colocircnias com crescimento dentro do halo) deve-se reisolar e realizar identificaccedilatildeo e
antibiograma automatizado teste de sensibilidade por disco-difusatildeo e Teste de
Hodge Modificado (THM) Os isolados de enterobacteacuterias cujos testes comprovarem
a resistecircncia aos carbapanecircmicos testados (KPCPOS) foram reportado a Comissatildeo
de Controle de Infecccedilatildeo Hospitalar (CCIH) Jaacute osbacilos Gram-negativos natildeo
fermentadores natildeo foram reportados (KPCNEG) Para interpretaccedilatildeodos resultados
foram utilizados os valores conforme demonstrados na tabela 1
Tabela 1 Criteacuterios Interpretativos para testes de sensibilidade
ENTEROBACTEacuteRIAS
Disco difusatildeo (mm) MIC (microgml)
34
Antibioacutetico Sigla S I R S I R
Ertapenem 10
microg
ETP 22 19-
21
18 05 1 2
Meropenem 10
microg
MEM 23 20-
22
19 1 2 4
Fonte Manual Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)
2013
Os resultados que apresentaram resistecircncia ao antibioacutetico Ertapenem foram
considerados como suspeitos de contaminaccedilatildeo por KPC Fez-se o teste de
susceptibilidade aos antibioacuteticos (TSA) em aparelho automatizado MicroScan Walk
Away 96sl Dade Behring
4 3 Teste de susceptibilidade aos antibioacuteticos (adaptado CDC 2004)
A determinaccedilatildeo da susceptibilidade dos isolados foi feita pelo teste de
susceptibilidade aos antibioacuteticos (TSA) apoacutes cultura em meio de gelose simples
(INSA) para avaliaccedilatildeo da sua pureza e obtenccedilatildeo de colocircnias isoladas Para
preparaccedilatildeo de uma suspensatildeo bacteriana com turvaccedilatildeo aproximada de 05
McFarland (Dade BehringMicroScanregTurbidity Meter) ressuspendeu duas a cinco
colocircnias em 2ml de soro fisioloacutegico esteacuteril diluindo a 1100 em soro fisioloacutegico num
volume total de 10ml em seguida foi feita uma semeadura em duas placas
quadradas (120mm x 120mm) de Muller-Hinton Agar (INSA) por inundaccedilatildeo
Os discos de antibioacutetico carbapenecircmicos imipenem meropenem e
ertapenem (Biorad) foram aplicados com o auxiacutelio de um dispensador automaacutetico A
susceptibilidade das Enterobacteacuterias aos carbapenecircmicos foi definida de acordo
com o protocolo Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI 2011)
Para aquelas Enterobacteacuterias que apresentaram resistecircncia ao ertapenem
foram realizados o Teste de Hodge Modificado para Detecccedilatildeo de Enterobacteacuterias
Produtoras de Carbapenemases conforme descrito pelo Centers for Disease Control
and Prevention (CDC 2004)
35
4 4Teste de Hodge Modificado (THM) (adaptado CDC 2004)
Preparou-se uma suspensatildeo em salina esteacuteril com a cepa Escherichia coli
ATCC 25922 (padratildeo 05 de McFarland) Apoacutes isto diluiu a suspensatildeo 110 em
salina (05 ml da soluccedilatildeo de Ecoli ATCC 25922 + 45 ml salina)Foi entatildeo semeado
na superfiacutecie de uma placa de Agar Muller-Hinton com a suspensatildeo diluiacuteda de Ecoli
ATCC 25922 com auxilio de swab seco assegurando que houvesse uma
distribuiccedilatildeo uniforme cobrindo toda a superfiacutecie do Agar Deixou secar por 3 a 5
minutos em temperatura ambienteColocou-se o disco de ertapenem 10microg no centro
da placa e apoacutes isto fez-se uma estria linear da cepa a ser testada da borda do
disco ateacute a borda da placa utilizando uma alccedila calibrada 10 microl ou um swab Incubou
a placa na estufa em atmosfera aeroacutebia a 35 plusmn 2ordmC por 16 a 24 horas
441 Controle de qualidade (CQ)
Foi utilizado um CQ todos os dias em que se realizou o teste tendo como
controle Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1705- teste de Hodge modificado
positivo Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1706- teste de Hodge modificado
negativo
442 InterpretaccedilatildeoResultados
Apoacutes 16ndash24 horas de incubaccedilatildeo examinar as placas para verificar a presenccedila
de uma distorccedilatildeo no halo de inibiccedilatildeo do disco de ertapenem devido ao crescimento
realccedilado da cepa ATCC na intersecccedilatildeo do organismo teste e a Ecoli ATCC 25922
dentro dos limites do halo O THM positivo apresentaraacute presenccedila de distorccedilatildeo no
halo de inibiccedilatildeo de ertapenem devido ao crescimento da cepa Ecoli ATCC 25922 ao
longo da estria da cepa teste para dentro dos limites do halo de inibiccedilatildeo Jaacute o THM
negativo teraacute ausecircncia de crescimento da cepa Ecoli ATCC 5922 ao longo da estria
da cepa teste para dentro dos limites do halo de inibiccedilatildeo do disco de ertapenem
Este resultado estaacute representado na figura 6
36
Figura 6 Interpretaccedilatildeo resultado do Teste de Hodge Modificado
(adaptado CDC 2004) Teste positivo na estria da cepa teste na parte superior
da placa teste negativo na estria da cepa teste na parte inferior da placa
Tendo positivo como resultado o paciente era um provaacutevel contaminado por
KPC As amostras entatildeo foram encaminhadas para a Fundaccedilatildeo Osvaldo Cruz
(FIOCRUZ) para confirmaccedilatildeo final As amostras finalmente confirmadas como
positivas para KPC foram isoladas e guardadas no banco de cepas cliacutenicas do
hospital Apoacutes a autorizaccedilatildeo do CEP amostras das cepas foram transferidas para
meio de transporte Stuard em caixa teacutermica fechada em baixa temperatura e
levadas para o laboratoacuterio de microbiologia cliacutenica da universidade
No laboratoacuterio da universidade as amostras foram separadas e realizadas
repiques em meios MacConkey e incubadas por 24h As colocircnias caracteriacutesticas
foratildeo isoladas em caldo BHI e mantidas em shaker a 37oC por 2h Apoacutes isto foram
executadas as anaacutelises a seguir
Os isolados de Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases foram
submetidos agrave extraccedilatildeo de DNA e posterior sequumlenciamento para identificaccedilatildeo dos
genes de resistecircncia blaKPC de 1 a 13 e identificaccedilatildeo do gene universal Os
pacientes de onde os materiais bioloacutegicos contendo as Enterobacteacuterias produtoras
de carbapenemases foram os isolados foram investigados quanto aos aspectos
epidemioloacutegicos e cliacutenicos
37
4 5 Extraccedilatildeo de DNA bacteriano
A extraccedilatildeo de DNA bacteriano foi realizada utilizando o kit NucleoSpin
Plasmidreg (MN) Antes de iniciar a extraccedilatildeo foi feito a preparaccedilatildeo das soluccedilotildees
reagentes materiais e amostras (vortexando) colocou-se em banho-maria agrave 50ordmC o
tampatildeo AW Partiu-se de colocircnias isoladas cultivadas que sofreram passagem em
meio LB liacutequido por 12h Adicionou-se 15 mL da amostra no tubo eppendorf
centrifugou por 5 minutos descartou o sobrenadante (com cuidado para natildeo
descartar o Pellet) Repetiu-se este procedimento por mais trecircs vezes completando-
se o volume de 6mL Foram adicionados 250microL do tampatildeo Resuspension Buffer A1
encostando a ponteira no Pellet e misturando (este tampatildeo tem como funccedilatildeo
separar a formaccedilatildeo de grumos celulares) Apoacutes isso homogeneizou e vortexou os
tubos eppendorfs Apoacutes isso foram adicionados 250microL do tampatildeo Lysis Buffer A2
homogenizou e deixou descansar por 5 minutos (esta etapa eacute importante para a lise
da parede e da membrana celulares e liberaccedilatildeo do conteuacutedo da ceacutelula)
Passado o tempo de descanso foi adicionado 300microL do tampatildeo
Neutralization Buffer A3 homogeneizou e centrifugou por 10 minutos (este tampatildeo
iraacute retirar as proteiacutenas que envolvem o DNA e voltaraacute com o pH para proacuteximo de 8
impedindo que a soluccedilatildeo de lise facilite a quebra das ligaccedilotildees covalentes do aacutecido
nucleacuteico) Em seguida enumeraram-se os tubos contendo filtros com siacutelica
transferiu-se o sobrenadante para o filtro e centrifugou por 5 minutos Descartou-se
o que foi filtrado adicionou 500microL do tampatildeo AW (banho-maria) centrifugou por 2
minutos Novamente foi descartado o filtrado Adicionou-se 600microL do tampatildeo A4
centrifugou por 2 minutos e descartou o filtrado (os tampotildees AW e A4 contecircm
isotiocianato de guanidina em concentraccedilotildees crescentes para facilitar a adsorccedilatildeo
do DNA na siacutelica e retirada das outras biomoleacuteculas da amostra) Foi feita outra
centrifugaccedilatildeo com o tubo vazio Apoacutes isto o filtro foi trocado para outro eppendorf
definitivo onde foi adicionado 50microL do tampatildeo Elution Buffer AE (este tampatildeo
favorece a eluiccedilatildeo do DNA) centrifugou por 2 minutos descartou o filtro e
armazenou as amostras em freezer -20ordmC
38
4 6 Iniciadores e reaccedilatildeo de PCR
Os iniciadores universais para o gene blaKPC foram desenhados baseados
em sequumlecircncias conservadas apresentadas pelos sub-grupos de genes que
codificam a enzima carbapenemase de klebsiella pneumoniae (YIGIT et al 2001)
Baseado na sequumlecircncia para o blakpc-1 depositada no GenBank
(AF2975541) o oligonucleotiacutedio (oligo) iniciador direto (5-
ATGTCACTGTATCGCCGTC-3rsquo) foi desenhado para reconhecer a sequumlecircncia
blaKPC na posiccedilatildeo (131149) enquanto que o iniciador reverso (5-
TTACTGCCCGTTGACGCC-3rsquo) foi reconhecido na posiccedilatildeo (9951012) As anaacutelises
baseadas em alinhamento de sequumlecircncias mostraram que o par de iniciadores
blaKPC podem detectar os alelos de 1 a 13 do gene blaKPC conforme a tabela 2
Tabela 2 Nuacutemero de acesso ao GenBank dos alelos blaKPC e seus
microrganismos originais
Nuacutemero de
Acesso GenBank
Microrganismo Alvo
AF2975541 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-1
GU0862251 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-2
HQ2589341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-2-like
AB5577341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC -3
EU4473041 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-4
EU4002222 Pseudomonas
aeruginosa
blaKPC-5
EU5555341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-6
EU7297271 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-7
39
FJ2344121 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-8
FJ624872 Escherichia coli blaKPC-9
GQ1403481 Acinetobacter
baumannii
blaKPC-10
HM0669951 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-11
HQ3428891 Enterobacter cloacae blaKPC-12
HQ3428901 Enterobacter cloacae blaKPC-13
As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo de blaKPC foram realizadas em um
primeiro tempo de desnaturaccedilatildeo em que foi 94ordmC por 5 minutos seguido de 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 58 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 90 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 78ordmC por 8 minutos Aleacutem das amostras foi utilizado um
controle negativo
A PCR do blaKPC foi realizada utilizando os componentes para o volume da
reaccedilatildeo de 25 microL citados na tabela 3 A banda do tamanho do produto de PCR foi de
881 pares de bases (pb) o que corresponde ao plasmiacutedeo
Tabela 3 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do
gene blaKPC
Reagente Volume
DNA molde 4 microL
Tampatildeo Taq 25 microL
MgCl2 075 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP
2 microL
Oligo F 1 microL
Oligo R 1 microL
Taq DNA polimerase 05 microL
Aacutegua MiliQ 1335 microL
40
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
Baseado na sequumlecircncia para o gene 16S rRNA em que o oligonucleotiacutedio
Universal iniciador direto foward (5-CCAGCAGCCGCCGTAATACG-3rsquo) foi
desenhado para reconhecer a sequumlecircncia universal na posiccedilatildeo 1513 enquanto que o
iniciador reverso (5-ATCGGYTACCTTGTTACGACTTC-3rsquo) foi reconhecido na
posiccedilatildeo 1491 foram realizadas PCRrsquos As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo deste
gene foram realizadas nos seguinte tempos separaccedilatildeo 94ordmC por 10 minutos 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 55 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 120 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 72ordmC por 10 minutos
A PCR do gene 16S rRNA foi realizada utilizando os componentes para o
volume da reaccedilatildeo de 25microL citados na tabela 4 A banda do tamanho do produto de
PCR foi de 996 pb correspondente aacute regiatildeo ribossomal capaz de amplificar todas
as espeacutecies
Tabela 4Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do gene
universal
Reagente (quantidade
concentraccedilatildeo do estoque)
Volume
DNA molde 10 ng 4 microL
Tampatildeo Taq 10 x 25 microL
MgCl2 50mM 125 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP 25 mM
125 microL
Oligo F 10microM 05 microL
Oligo R 10microM 05 microL
Taq DNA polimerase 5UmicroL 04 microL
Aacutegua Miliq 146 microL
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
41
O termociclador utilizado para os experimentos foi o LifeTouch da BIOER
4 7 Digestatildeo
Para realizaccedilatildeo da digestatildeo foi utilizada a enzima BshF I (Hae III) EN- 1105
tamanho 7000 units concentraccedilatildeo 10 unitsmicroL fonte Bacillus sphaericus empresa
Jena bioscienceUtilizaram-se os componentes para o volume de 50microL da reaccedilatildeo
citados na tabela 5
Tabela 5 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da digestatildeo do gene
universal
Reagente Volume
Produto de PCR 10 microL
Enzima BshF I 01 microL
Tampatildeo (10x) 5 microL
Aacutegua Miliq 349 microL
Total (em cada ependorff) 50 microL
Valores para 1 digestatildeo
Os ependorffs foram colocados por 30 minutos em banho-maria a 37ordmC Apoacutes
isso fez-se a corrida das amostras em gel de agarose para verificaccedilatildeo do resultado
(LU et al 2000)
4 8 Eletroforese em gel de agarose
Os produtos de DNA PCR e digestatildeo foram analisados em gel de agarose
2 O tempo de corrida do gel eacute de aproximadamente 1hora e 30minutos sendo
que no comeccedilo foi usada agrave voltagem de 50 V e apoacutes comeccedilar a correr o gel
aumentou a voltagem para 100 v Utilizou-se o marcador de 100pb (pares de bases)
Foi adicionado 3microL de corante Bromophenol (que tem a funccedilatildeo de fazer uma ligaccedilatildeo
na amostra de DNA e permitir a visualizaccedilatildeo da corrida no gel de agarose) em 7microL
de amostra tanto de DNA quanto de PCR Para o preparo do gel foi utilizado TBE
42
(Tris- Aacutecido Boacuterico) agarose e brometo de etiacutedio (sua funccedilatildeo eacute de corante para o gel
e permitir a visualizaccedilatildeo do DNA quando colocado agrave luz ultravioleta) Para o oligo
blaKPC a banda da amplificaccedilatildeo foi em 881ppb correspondendo ao plasmiacutedeo Jaacute
o oligo Universal foi em 996 pb
4 9 Descarte de resiacuteduos
Todos os materiais utilizados nos ensaios foram de uso uacutenico e manipulados
em cacircmaras de seguranccedila bioloacutegica classe II Apoacutes o uso foram colocados em
soluccedilatildeo desinfetantes (hipoclorito a 1) e em seguida autoclavados a 127oC por 20
min em sacos apropriados para autoclavaccedilatildeo Apoacutes a finalizaccedilatildeo do ciclo de
esterilizaccedilatildeo os sacos contendo o material descartaacutevel foram colocados em
recipientes de coleta da empresa responsaacutevel pela coleta de materiais bioloacutegicos
produzidos no laboratoacuterio de microbiologia Todos os procedimentos seguiram a
normativa RDC-ANVISA 3062004 sobre o descarte de resiacuteduos de serviccedilo de
sauacutede
4 10 Aspectos epidemioloacutegicos e cliacutenicos
Os aspectos cliacutenicos e epidemioloacutegicos foram investigados por meio de
prontuaacuterios dos pacientes portadores de enterobacteacuterias produtoras de
carbapenemases e envolveram topografia mais provaacutevel do foco infeccioso a
enfermidade motivadora da internaccedilatildeo o desfecho cliacutenico a idade e o tempo de
internaccedilatildeo
4 12 Anaacutelises eepidemioloacutegicas
As anaacutelises foram realizadas com o pacote estatiacutestico SPSS versatildeo 200
Para verificar quais variaacuteveis referentes aos dados epidemioloacutegicos e
microbioloacutegicos influenciaram no desfecho verificou- se a diferenccedila meacutedia das
variaacuteveis idade e tempo de internaccedilatildeo em cada grupo O teste estatiacutestico utilizado foi
o teste t de Student apoacutes se executar o teste de normalidade de Shapiro-Wilk Para
as variaacuteveis sexo perfil microbioloacutegico das enterobacteacuterias produtoras de
43
carbapenemases foi avaliada a associaccedilatildeo com o desfecho por meio do teste Exato
de Fisher O niacutevel de significacircncia adotado foi de 5
4 13 Preceitos eacuteticos
Este projeto estaacute inserido em um projeto maior denominado ldquoEpidemiologia
cliacutenica e caracterizaccedilatildeo molecular do Acinetobacter Baumannii resistente a
antibioticoterapia em pacientes internado em hospitais do Sistema Uacutenico de Sauacutederdquo
que foi submetido ao Comitecirc de Eacutetica em Pesquisa da Secretaria do Estado de
Sauacutede do Distrito Federal (SESDF) e emitido parecer aprovado pelo protocolo nordm
23109 (anexo)
44
5 RESULTADOS
51 Anaacutelise molecular
Para a amplificaccedilatildeo com o oligo blaKPC foram amplificadas amostras
que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 881 pb correspondente ao
plasmiacutedeo A anaacutelise da amplificaccedilatildeo da regiatildeo do gene blaKPC mostrou que
apenas a amostra A10 natildeo amplificou isso demonstra que esta amostra natildeo
possuiacutea o gene de resistecircncia
5 1 1 Gene blaKPC
Figura 7 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 881 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
A amostra A3 natildeo amplificou no primeiro momento entatildeo foi realizado
novamente a PCR e corrida de gel obtendo entatildeo a amplificaccedilatildeo da amostra como
apresentado na figura 8
45
Figura 8 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC da
mostra A3 estudada A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo de 881
pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 1 2 Gene 16S rRNA
Para a amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA utilizou-se o oligo universal Foram
amplificadas amostras que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 996 pb
Figura 9 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
46
Segundo Lu et al (2000) a digestatildeo com a enzima HaeIII deste amplicons de
16S rRNA devolveriam bandas com perfis entre 150 a 200 pb No gel abaixo eacute
possiacutevel evidenciar que este perfil ocorreu com o predomiacutenio de bandas na altura
de 200pb
Figura 10 Gel de agarose a 2 da digestatildeo do amplicon do gene 16S
rRNA das amostras com a enzima HaeIII evidenciando diversos fragmentos
proacuteximos a 200 pb A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo ribossomal
de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 2 Anaacutelises epidemioloacutegicas
5 2 1 Sexo
No total foram detectados 17 isolados de KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 onde a maior a prevalecircncia foi
detecatada em amostras de pacientes do sexo masculino (53) do que no sexo
feminino (47)
47
Figura 11 Isolado de KPC segundo sexo dos 17 pacientes investigados
no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 2 Desfecho cliacutenico
Em 17 isolados de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo
de 2010 aacute 2011 a porcentagem de pacientes que foram a oacutebito (59) foi maior que
a de pacientes que tiverm alta (41)
Figura 12 Isolado de KPC segundo desfecho cliacutenico dos 17 pacientes
investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
48
5 2 3 Local da coleta
Dos 17 episoacutedios detectados de infecccedilatildeo por KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 a infecccedilatildeo em swab retalfoi mais
frequente (47) seguida de ponta de cateacuteter (18) e secreccedilatildeo traqueal (12)
Figura 13 Isolados de KPC segundo local da coleta da amostra nos 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 4 Microorganismo
O microorganismo mais encontrado foi a Klebsiella pneumoniae (82)
seguida da Enterobacter clocae (12) e Serratia marcescens (6) dos 17 isolados
de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 Isto afirma o
fato de a sigla KPC ser utilizada de forma errocircnea aacute Klebsiella pneumoniae visto
que a evidecircncia dela eacute maior em relaccedilatildeo as outras cepas
49
Figura 14 Isolado de KPC segundo microrganismo encontrado em 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 5 Relaccedilotildees variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana e desfecho
cliacutenico
Tabela 6 ndash Distribuiccedilatildeo do perfil geneacutetico sexo coleta tipificaccedilatildeo de
microrganismos e anaacutelise da resistecircncia bacteriana segundo o desfecho
cliacutenico Brasiacutelia-DF 2010 a 2011
Variaacutevel Resultado
Desfecho
Alta Oacutebito
N N P
Gene 16S rRNA Positivo 7 1000 10 1000
NA Gene blaKPC Positivo 6 857 10 1000
Negativo 1 143 0 00 0218 Sexo Feminino 2 286 6 600
Masculino 5 714 4 400 0201 Local da coleta Fundo saco de
Douglas 1 143 0 00
Hemocultura 0 00 1 100 0463 Ponta de cateter 1 143 2 200
Sec TraquealBrocircnquica
0 00 1 100
50
Secreccedilatildeo traqueal 2 286 0 00
Swab retal 3 429 5 500
Urina 0 00 1 100
Microrganismo Enterobacter cloacae (KPC)
1 143 1 100
Klebsiella pneumoniae
6 857 8 800
0416 Serratia
marcescens 0 00 1 100
Teste de Hodge Hodge positivo 7 1000 10 1000
NA Amicacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 1 100 0848 resistente 0 00 1 100
sensiacutevel 2 286 3 300
Amoxicilina Aacutecido Clavulacircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Ampicilina Sulbactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ampicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Aztreonan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefazolina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Cefoperazona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Cefotaxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefoxitina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0509 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 2 286 4 400
Ceftazidima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cetriaxona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 3 429 5 500 0772 Cefalotina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ciprofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772
51
resistente 3 429 5 500
Claritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Clindamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Eritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Gentamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0942 resistente 2 286 3 300
sensiacutevel 1 143 2 200
Imipenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 0 00 2 200 0193 Resistente 1 143 3 300
sensiacutevel 2 286 0 00
Nitrofurantoiacutena sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Norfloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Oxacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Penicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Piperacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Rifampicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tetraciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Ticarcilina Aacutecido Clavulocircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0688 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 3 429 4 400
Tobramicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Trimetoprima Sulfametoxazol
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0112 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 2 286 0 00
Vancomicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tigeciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediario 0 00 1 100 0211 natildeo testado 1 143 4 400
resistente 2 286 0 00
52
Cefepime sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefuroxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Levofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Piperacilina Tazobactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Ertapenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Meropenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0223 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 1 143 0 00
Cefotetan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 sensiacutevel 0 00 1 100
Gemifloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 7 700 0585 natildeo testado 3 429 3 300
Desfecho
Alta Oacutebito
Meacutedia Erro
padratildeo Meacutedia Erro
padratildeo p
Idade 58 9 59 5 0991
Tempo Internaccedilatildeo (dias)
50 13 46 12 0571
n= 17 p(lt 005) NA natildeo se aplica
53
6 DISCUSSAtildeO
Nos uacuteltimos anos houve um aumento na incidecircncia de bacteacuterias
multirresistentes aos antimicrobianos no ambiente hospitalar tornando isto um
problema mundial de sauacutede puacuteblica (HULSCHER et al 2010) Quando se trata
principalmente de bacilos Gram negativos a frequumlecircncia destas bacteacuterias eacute ainda
maior em paiacuteses da Ameacuterica Latina quando comparada a paiacuteses desenvolvidos
(GALES etal 2012)
De acordo com dados do ldquoMeropenem Yearly Susceptibility Test Information
Collectionrdquo (MYSTIC) ocorreu nos Estados Unidos um aumento na susceptibilidade
de K pneumoniae nos uacuteltimos anos graccedilas a praacuteticas de controle de disseminaccedilatildeo
de amostras resistentes(RHOMBERG P R et al 2009) O aumento crescente da
prevalecircncia destes microrganismos foi proporcional ao aumento da dependecircncia do
uso de antibioacuteticos carbapenecircmicos considerados como a opccedilatildeo terapecircutica para o
tratamento de infecccedilotildees por bacilos Gram negativos multi-resistentes (LIVERMORE
2012) Isto afeta diretamente as opccedilotildees de tratamento sobrando poucas alternativas
para a terapecircutica que incluem colistina (polimixina E) e tigeciclina que apresentam
respectivamente problemas em termos de toxicidade e eficaacutecia (LIVERMORE et
al 2011) Um dos efeitos adversos mais importantes das poliminas B e E por
exemplo satildeo a neurotoxicidade e nefrotoxicidade (MENDES C A C et al2009 )
Devido agrave resistecircncia ser usualmente de natureza plasmidial e portanto de
maior disseminaccedilatildeo especialmente quando carreadas por K pneumoniae
microrganismo com uma notoacuteria capacidade para acumular e transferir plasmiacutedeos
com determinantes para resistecircncia o nuacutemero de casos detectados pelo
fenoacutetipogenoacutetipo blaKPC eacute bastante preocupante (MONTEIRO et al 2009)
Comparada com outras bacteacuterias hospitalares a transmissatildeo de clones
multirresistentes de K pneumoniae eacute maior e podem natildeo ser controladas pelos
meacutetodos de controle de infecccedilatildeo hospitalar (PAAUW et al 2007) A forma
plasmidial para transferecircncia da resistecircncia adicionada a este grande potencial para
disseminaccedilatildeo de clones resistentes eacute preocupante visto que apoacutes surtos muitas
vezes pode se tornar endecircmica Jaacute eacute uma realidade a disseminaccedilatildeo desta bacteacuteria
54
entre pacientes hospitais paiacuteses e ateacute mesmo continentes (WOODFORF et al
2010 ROGERS et al 2011)
As chances de surtos satildeo maiores em paiacuteses com poucos recursos devido agrave
maior carecircncia de praacuteticas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees hospitalares e o
uso irracional de antimicrobianos de forma empiacuterica e inadequada (KUMARASAMY
et al 2010) Ateacute o momento os mecanismos de resistecircncia aos cabapenecircmicos
geralmente encontrado eram a produccedilatildeo de ESBL (CTX-M) somada aacute perda de
porina (CARVALHAES et al 2010) Foi notado a partir do ano de 2008 um
aumento no nuacutemero de K pneumoniae produtoras de KPC-2 apresentando outra
forma de resistecircncia (GALES 2012)
Um estudo mostrou que o perfil do paciente colonizado ou infectado por KPC
foi de um paciente entre os 33 e os 82 anos de idade internado haacute mais de 1
semana no hospital A mortalidade geral nos uacuteltimos anos ficou em torno de 7
sendo que dos 77 pacientes estudados 32 (415) pacientes evoluiacuteram para oacutebito
evidenciando a alta morbi-mortalidade associada (ALVES A P et al 2013)
Em estudo com 2316 pacientes avaliados a populaccedilatildeo de sexo masculino foi
de 526 idade meacutedia global de 53 anos (mediana de 55 anos) permanecircncia meacutedia
de 58 dias (mediana de 3 dias) (OLIVEIRA A C et al 2010) Outros trabalhos
apresentaram ausecircncia de significacircncia entre sexoidade e o desenvolvimento de
infecccedilotildees por microrganismos resistentes (PERES-BOTA D et al 2003 COLPAN
A et al 2005 COELLO R et al 1997)
Outro estudo utilizou um total de 30 amostras sendo elas isoladas de urina
escarro secreccedilatildeo pleural ponta de cateter aspirado traqueal e hemocultura A mais
prevalente foi em urina (40) Entre as 30 cepas analisadas a maior porcentagem
foi da cepa Klebsiella pneumoniae (70) Enterobacter sp (133) Klebsiella
ozaenae (10) Escherichia coli (333) e Klebsiella oxytoca (333)
(DIENSTMANN R et al 2010) Nos Estados Unidos a enzima KPC jaacute se tornou
endecircmica Foi realizada uma pesquisa em dois hospitais de Nova York onde
testaram 602 amostras e 45 apresentaram algum mecanismo de resistecircncia
sendo apenas 33 confirmadas por biologia molecular como KPC-2 (BRATU et
al 2005)
55
Estudo sobre os tipos de ESBL feito no Japatildeo apresentou o tipo Toho-1 como
o mais prevalente nessa pesquisa Ateacute o ano de 2000 ano em que foi publicado tal
estudo este era o primeiro relatoacuterio no Japatildeo para identificar derivados de ESBLs
como tipo de SHV e TEM entre E coli e K pneumoniae Em especial o tipo SHV- 12
foi identificado com uma maior frequumlecircncia Estes resultados indicam que tipos
distintos de ESBLs que satildeo diferentes em sua especificidade de substrato e origem
geneacutetica coexistem no Japatildeo Isto mostra a importacircncia de caracterizar genoacutetipos
distintos de ESBLs e de estar em alerta continuamente para as tendecircncias de
ESBLs no Japatildeo aleacutem da necessidade de uma interpretaccedilatildeo uniforme utilizando as
diretrizes do CSLI para relatar cepas produtoras de ESBL Aleacutem da detecccedilatildeo de
ESBLs satildeo necessaacuterias mais informaccedilotildees tais como o perfil de sensibilidade
especiacutefica para diversas β-lactacircmicos e o local da infecccedilatildeo Esses fatores satildeo
essenciais para a escolha adequada de antibioacuteticos (YAGI T et al 2000)
No ano de 2004 uma pesquisa avaliou a produccedilatildeo de uma enzima de
hidroacutelise de carbapenecircmicos atraveacutes da teacutecnica de sequumlenciamento foi revelado
um novo membro da famiacutelia KPC designado KPC- 3 Pesquisadores encontraram
em um mutante de K pneumoniae uma substituiccedilatildeo de um gene associado com
resistecircncia a Imipenem mas essa substituiccedilatildeo foi considerada improvaacutevel na
contribuiccedilatildeo da resistecircncia aos carbapenecircmicos da espeacutecie estudada Aleacutem da
resistecircncia aos carbapenecircmicos estes isolados eram em sua maioria resistentes agraves
cefalosporinas penicilinas e aminoglicosiacutedeos Usando estudos de transformaccedilatildeo
conjugaccedilatildeo e hibridaccedilatildeo localizaram o alelo blaKPC em plasmiacutedeo aleacutem disso
mostraram que esse alelo tambeacutem carregava uma resistecircncia aos aminoglicosiacutedeos
A transferecircncia das enzimas KPCs foi demonstrada in vitro tanto neste como em
outros estudos pode ser que os plasmiacutedeos que fazem esta transferecircncia estavam
comeccedilando a se espalhar no ambiente cliacutenico resultando na multiresistecircncia dessas
estirpes (WOODFORD et al 2004)
O presente estudo apresentou um vieacutes quanto aos resultados dos testes de
susceptibilidade microbiana Observou-se que natildeo foi encontrado resultado deste
teste em algumas amostras o que natildeo cooperou para um estudo mais preciso
futuros estudos quanto agraves amostras e um melhor acompanhamento deste tipo de
patologia Poreacutem mesmo sem algumas amostras com este resultado disponiacutevel foi
56
confirmada a presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos
carbapenecircmicos por meio dos genes de resistecircncia blaKPC e 16S rRNA que as
amostras apresentaram em sua maioria serem portadoras Quanto aos resultados
estatiacutesticos nenhuma das variaacuteveis apresentou significacircncia estatiacutestica (p gt 005)
mostrando assim que estas variaacuteveis isoladas natildeo foram o fator determinante para
o desfecho cliacutenico de alta ou oacutebito
57
7 CONCLUSAtildeO
Os genes blaKPC e 16S rRNA foram caracterizados confirmando a a
presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos carbapenecircmicos
Houve uma maior prevalecircncia da cepa K pneumoniae e isto confirma outros
estudos que apresentam a maior prevalecircncia desta cepa em amostras com KPC
Aleacutem disso isso justifica a forma popular da K pneumoniae ser chamada de KPC
enquanto que na verdade KPC eacute uma enzima podendo estar presente em outras
cepas como Enterobacter clocae tambeacutem apresentada no presente estudo O
desfecho cliacutenico de oacutebitos maior que 50 eacute um possiacutevel indicador sobre a
necessidade de se realizar um teste raacutepido para identificaccedilatildeo de KPC visando
iniciar o mais raacutepido possiacutevel o tratamento afim de diminuir a mortalidade por esta
infecccedilatildeo
Nenhuma das variaacuteveis isoladamente estaacute relacionada ao desfecho cliacutenico
oacutebito ou alta pois natildeo apresentaram relevacircncia estatiacutestica O presente estudo
mostrou que haacute presenccedila da bacteacuteria nas amostras de pacientes do hospital
estudado podendo entatildeo afirmar que este tipo de bacteacuteria se encontra tambeacutem
presente em ambiente hospitalar O uso irracional de antimicrobiano eacute demonstrado
de forma indireta quando foi apresentado atraveacutes do Teste de Hodge Modificado
uma resistecircncia de 100 aos antibioacuteticos carbapenecircmicos Isto tambeacutem reflete na
terapecircutica sendo que pacientes portadores de bacteacuterias resistentes aos
antibioacuteticos carabepecircmicos tem uma escassa opccedilatildeo de tratamento e as opccedilotildees
apresentam problemas quanto agrave toxicidade e eficaacutecia
58
REFEREcircNCIAS
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Mecanismos
de resistecircncia bacteriana aos antimicrobianos Disponiacutevel em
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controleopas_
webmodulo3mec_sitiohtmgt Acesso em 25 de abril de 2014
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Nota teacutecnica nordm
012013 medidas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees por enterobacteacuterias
multiresistentes Acesso em 17 de abril de 2013
ALBA J et al Kinetics study of KPC-3 a plasmid-encoded class A
carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase Antimicrob Agents Chemother
Nov49(11)4760-2 2005
ALVES A P et al Nosocomial infections by KPC-producing enterobacteria in
a tertiary hospital in Southern Brazil Revista da AMRIGS Porto Alegre 57 (3) 213-
218 jul-set 2013
ALVES A et al Tipagem Geneacutetica de Microrganismos Lab De Diversidade
Microbiana Centro de Biologia Celular Dep de Biologia U de Aveiro 3810-193
Aveiro- 2003
BELL J M et Al Prevalence and significance of a negative extended-
spectrum beta-lactamase (ESBL) confirmation test result after a positive ESBL
screening test result for isolates of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae
results from the SENTRY Asia-Pacific Surveillance Program J Clin Microbiol
May45(5)1478-82 2007
BRATU S et al Detection of KPC carbapenem-hydrolyzing enzymes in
Enterobacter spp from Brooklyn New York Antimicrob Agents Chemother v 49 n
2 p 776-8 2005
59
BRATU S et al Emergence of KPC-possessing Klebsiella pneumoniae in
Brooklyn New York epidemiology and recommendations for detection Antimicrob
Agents Chemother v 49 n 7 p 3018-20 2005
BRATU S et al Rapid spread of carbapenem-resistant Klebsiella
pneumoniae in New York City Arch Intern Med v 165 p 1430-5 2005
CAMARGO C F et al Aplicaccedilatildeo das teacutecnicas de pcr e suas teacutecnicas
derivadas em diagnoacutestico molecular Disponiacutevel em
ltfileDUnB10C2BA20semestreArtigosPCR-
20CLEYTON20FLORENCIO20DE20CAMARGO20E20PAULO20ROB
ERTO20QUEIROZpdfgtgt Acesso em 08 de abril de 2014
CARVALHES C G et al Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting
carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive
results Journal of Antimicrobial Chemotherapy v 65 n2 p 249-251 2010
CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION- CDC Modified
Hodge Test for Carbapenemase Detection in Enterobacteriaceae 2004
CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE Methods for
dilutionantimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically Approved
standard M7ndashA7 7th ed CLSI Wayne PA 2011
COELLO R et al Risk factors for developing clinical infection with methicillin-
resistant Staphylococcus aureus (MRSA) amongst hospital patients initially only
colonized with MRSA J Hosp Infect 19973739-46
COLPAN A et al Evaluation of risk factors for mortality in intensive care
units A prospective study from a referral hospital in Turkey Am J Infect Control
200533(1)42-7
60
CORNAGLIA G et al Living with ESBLs Introduction Clinical Microbiology
and Infection 14 Suppl 1 1-2 2008
COTRIM E R et al Klebsiella pneumoniae carbapenemase ndash KPC em
Enterobacteriaceae o desafio das bacteacuterias multirresistentes Poacutes em revista do
centro universitaacuterio Newton Paiva 12012 - ediccedilatildeo 5 - issn 2176 7785
DESHPANDE L M et al Occurrence and characterization of
carbapenemase-producing Enterobacteacuteriaceae report from the SENTRY
Antimicrobial Surveillance Program (2000-2004) Microb Drug Resist 12(4)223-30
2006
DIAS D J A Estudos dos principais mecanismos de resistecircncia aos
antibioacuteticos β-lactacircmicos em bacteacuterias patogecircnicas gram negativas 2009 100 f
Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Geneacutetica Molecular e Biomedicina) ndash Faculdade de
Ciecircncias e Tecnologia Universidade de Nova Lisboa Lisboa
DIENSTMANN R et al Avaliaccedilatildeo fenotiacutepica da enzima Klebsiella
pneumoniae carbapenemase (KPC) em Enterobacteriaceae de ambiente hospitalar
J Bras Patol Med Lab v 46 n 1 p 23-27 fevereiro 2010
ENDIMIAMI A et al Emergence of blaKPC-containing Klebsiella
pneumoniae in a long-term acute care hospital a new challenge to our healthcare J
Antimicrob Chemother 64 1102-1110 Nov 2009
FALAGAS M E et al Extended-spectrum beta-lactamase producing
organisms The Journal of Hospital Infection 73 (4) pp 345-54 2009
FONTANA C et al Emergence of KPC-producing Klebsiella pneumoniae in
Italy BMC Rev Notes 3 40 2010
61
GALES A C et al Antimicrobial resistance among Gram-negative bacilli
isolated from Latin America results from Sentry Antimicrobial Surveillance Program
(Latin America 2008-2010) Diagnostic Microbiology and Infectious Disease v 3 n
4 p 354 -360 2012
GUPTA N et al Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Epidemiology
and Prevention HEALTHCARE EPIDEMIOLOGY Clinical Infectious Diseases
201153(1)60ndash67 Published by Oxford University Press on behalf of the Infectious
Diseases Society of America 2011
HARBOTTLE H et al Genetics of antimicrobial resistance Anim Biotechnol
n17 p111-124 2006
HENRIQUE W N et al RESISTEcircNCIA BACTERIANA Uniatildeo das
Faculdades Alfredo NasserInstituto de Ciecircncias da Sauacutede Disponiacutevel em lt
httpwwwfaculdadealfredonasseredubrfilespesquisaposter20HENRIQUE20
Wilker20Natividade20SANTIAGO20Silvania20CAVALCANTI20DSP
20ResistC3AAncia20Bacterianapdfgt Acesso em 17 marccedilo 2014
HULSCHER M E J I et al Antibiotic prescribing in hospital a social and
behavioral scientific approach The Lancet Infectious Diaseases v 10 n 3 p 167-
165 2010
KIDWAI M SAPRA P BHUSHAN KR Synthetic strategies and medicinal
properties of beta-lactams Curr Med Chem 1999 695-215
KUMARASAMY K K et al Emergence of a new antibiotic resistance
mechanism in India Pakistan and the UK a molecular biological and
epidemiological stuy The Lancet Infectious Diseases v10 n 9 p 597- 602 2010
LINCOPAN N et al Enterobacteacuteria producing extended-spectrum β-
lacatamases and IMP-1 Metalo-β-lactamases isolated from Brazilian hospitals J Med
62
Microbiol 7 1-3 2006
LINCOPAN N et al First Isolation of Metalo-β-Lacatamase-Producing
Multiresistant Klebsiella pneumoniae from a patient in Brazil J Clin Microbiol 43(1)
516-519 2005
LIVERMORE D M et al What remains against carbapenem- resistant
Enterobacteriaceae Evaluation of choramphenicol ciprofloxacin colistina
fosfomycin minocycline nitrofurantoin temocilin and tigecycline International
Journal of Antimicrobial Agents v 37 n 5 p 415- 459 2011
LIVERMORE D M Fourten years in resistance International Journal of
Antimicrobial Agents v 39 283- 294 2012
LIVERMORE D M Bacterial resistance to carbapenems Adv Exp Med Biol
1995 39025-47
LIVERMORE D M Bacterial resistance origins epidemiology and impact
Clin Infect Dis 36S11-S23 2003
LIVERMORE D M et al Carbapenemases a problem in waiting Curr
Opin Microbiol 2000 3489-95
LU et al Universal pcr for common bacterial pathogens J CLIN
MICROBIOL VOL 38 2000
LU et al Use of PCR with Universal Primers and Restriction Endonuclease
Digestions for Detection and Identification of Common Bacterial Pathogens in
Cerebrospinal Fluid Journal of Clinical Microbiology June 2000 p 2076ndash2080
MARSCHALL J Met al Presence of the KPC Carbapenemase Gene in
Enterobacteriaceae Causing Bacteremia and Its Correlation with In Vitro
Carbapenem Susceptibility J Clin Microbiol 47 239-241 Jan 2009
63
MARTINS WMBS et al Prevalecircncia do gene blaKPC em isolados cliacutenicos
de Enterobacteriaceae e natildeo fermentadores encontrados em amostras clinicas em
um hospital universitaacuterio do Recife X Jornada de ensino pesquisa e extensatildeo ndash
JEPEX 2010 ndash UFRPE Recife 18 a 22 de outubro
MENDES C A C et al Polimixinas Revisatildeo com ecircnfase na sua
nefrotoxicidade Rev Assoc Med Bras 2009 55(6) 752-9
MOHR J F 3rd Update on the efficacy and tolerability of meropenem in the
treatment of serious bacteacuterial infections Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S41-51
2008
MONTEIRO J et al First report of KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae
strains in Brazil Antimicrob Agents Chemother Jan53(1)333-4 2009
MOREIRA V C et al Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia a antibioacuteticos
Disponiacutevel em
lthttpwwwcpglsucgbr6mostraartigosSAUDEVANESSA20CARVALHO20M
OREIRApdfgt Acesso em 21 marccedilo 2014
NETIKUL T et al Emergence of novel blaKPC-12 and blaKPC-13 variants in
carbapenem non-susceptible Enterobacter cloacae a first report of blaKPC gene in
Thailand European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases May
S372 2011
NETO V A et al Antibioacuteticos na praacutetica Meacutedica 6ordf Ediccedilatildeo Editorial
SarverSP Brasil 2007
NICOLAU D P Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of
meropenem Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S32-40 2008
64
OLIVEIRA A C et al Resistecircncia bacteriana e mortalidade em um centro de
terapia intensiva Rev Latino-Am Enfermagem nov-dez 2010
PAAUW A et al Failure to control an outbreak of qnrA 1-positive multidrug-
resistant Enterobacter clocae despite adequate implementation of recommended
infection control measures Journal of Clinical Microbiology v 45 n 5 p 1420-1425
2007
PATERSON D L et al Extended-Spectrum Beta-Lactamases a Clinical
Update Clinical Microbiology Reviews v 18 p 657-686 2005
PEIRANO G et al Carbapenem-hydrolysing beta-lactamase KPC-2 in
Klebsiella pneumonia isolated in Rio de Janeiro Brazil J Antimicrob Chemother Nov
20 2009
PERES-BOTA D et al Are infections due to resistant pathogens associated
with worse outcome in critically ill patients J Infect 200347(4)307-16
PIDDOCK L J V Clinically relevant chromosomally encoded multidrug
resistance effl ux pumps in bacterial Clin Microbiol Rev n19 p382-402 2006
PITOUT J D D et al Emergence of Enterobacteriaceae producing
extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) in the community J Antimicrob
Chemother May 56 2005
POSSEBON M I et al Resistecircncia bacteriana aos carbapenecircmicos
Bacterial resitence to carbapenems RBM rev bras med60(6)378380-378-382
jun 2003
QUEENAN A M et al Carbapenemases the versatile beta-lactamases
Clin Microbiol Rev Jul20(3)440-58 2007
65
RHOMBERG P R et al Summary trends for the meropenem yearly
susceptibility test information collection program a 10- year experience in the United
States (1999-2008) Diagnostic Microbiology and Infectiois Disease v 65 n4 p
414-426 2009
ROBLEDO I E et al Detection of KPC in Acinetobacter spp in Puerto Rico
J Antimicrob Agents Chemother 54 1354-1357 Mar 2010
ROGERS B A et al Country-to-country transfer os patients and the risk of
multi-resistant bacterial infection Clinical Infectious Disease v53 n1 p49- 56
2011
SHAH A A et al Characteristics epidemiology and clinicalimportance of
emerging strains of Gram-negative bacilli producing extended-spectrum
betalactamases Research in Microbiology v 155 p 409-421 2004
TURNER P J Extended- Spectrum Beta-Lactamases Clinical Infectious
Diseases v 41 p 273-275 2005
WOLTER D J et al Phenotypic and Enzymatic Comparative Analysis
between the Novel KPC variant KPC-5 and Its Evolutionary Variants KPC-2 and
KPC-4 Antimicrob Agents Chemother Nov 17 2008
WOODFORD N et al Carbapenemases of Chryseobacterium
(Flavobacterium) meningosepticum distribution of blaB and characterization of a
novel Metalo-beta-lactamase gene blaB3 in the type strain NCTC 10016
Antimicrob Agents Chemother Jun44(6)1448-52 2000
WOODFORF N Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in
India Pakistan and the UK a molecular biological and epidemiological study The
Lancet Infectious Diseases v 10 n 9 p 597-602 2010
66
WOODFORD et al Outbreak of Klebsiella pneumoniae Producing a New
Carbapenem- Hydrolyzing Class A β-Lactamase KPC-3 in a New York Medical
Center Antimicrobial agents and chemotherapy Dec 2004 p 4793ndash4799 Vol 48
No 12
YAGI T et al A preliminary survey of extended-spectrum β-lactamases
(ESBLs) in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Japan
FEMS Microbiology Letters 184 (2000) 53-56
YIGIT H et al Novel carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase KPC-1 from
a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumonia J Antimicrob Agents
Chemother 45 (4) 1151-1161 (2001)
ZAVASCKI A P et al KPC-2- producing Enterobacter cloacae in two cities
from Southern Brazil Int J Antimicrob Agents Apr 28 2009
ZHANEL G G et al Comparative review of the carbapenecircmicos Drugs
67(7)1027-52 2007
67
ANEXOS
Sequumlecircncia do oligo blaKPC
Query 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
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Sbjct 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
Query 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
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Sbjct 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
Query 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
68
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Sbjct 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
Query 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
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Sbjct 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
Query 241
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CAACTGT 300
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Sbjct 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
69
Query 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
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Sbjct 301
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TTGCTGC 360
Query 361
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GTTACGG 420
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Sbjct 361
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GTTACGG 420
Query 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
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70
Sbjct 421
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GCATGAC 480
Query 481
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Sbjct 481
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ATTTGTT 540
Query 541
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Sbjct 541
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GCGATAC 600
Query 601
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ATGCGCG 660
71
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Sbjct 601
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ATGCGCG 660
Query 661
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Sbjct 661
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GCTCTGC 720
Query 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
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Sbjct 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
72
Query 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
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Sbjct 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
Query 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
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Sbjct 841
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CACCTAT 900
Query 901
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73
Sbjct 901
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CCGTCAT 960
Query 961
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GCTCTGA 1020
Query 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
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Sbjct 1021
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CCACTGT 1080
Query 1081
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AGCACTG 1140
74
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Query 1141
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AATCTTG 1200
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Sbjct 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
Query 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
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Sbjct 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
75
Query 1261
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TCGGCTT 1320
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Sbjct 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
Query 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
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Sbjct 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
LOCUS AF297554 1377 bp
DNA linear BCT 26-MAR-2001
DEFINITION Klebsiella pneumoniae carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
gene complete cds
ACCESSION AF297554
VERSION AF2975541 GI10121874
76
KEYWORDS
SOURCE Klebsiella pneumoniae
ORGANISM Klebsiella pneumoniae
Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Enterobacteriaceae Klebsiella
REFERENCE 1 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH QueenanAM
AndersonGJ Domenech-SanchezA
BiddleJW StewardCD
AlbertiS BushK and TenoverFC
TITLE Novel carbapenem-hydrolyzing beta-
lactamase KPC-1 from a
carbapenem-resistant strain of
Klebsiella pneumoniae
JOURNAL Antimicrob Agents Chemother 45 (4)
1151-1161 (2001)
PUBMED 11257029
REFERENCE 2 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH AndersonGJ and
TenoverFC
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (19-AUG-2000) Nosocomial
Pathogens Laboratory Branch
Centers for Disease Control and
Prevention 1600 Clifton Rd MS
G08 Atlanta GA 30333 USA
FEATURES LocationQualifiers
77
source 11377
organism=Klebsiella
pneumoniae
mol_type=genomic DNA
db_xref=taxon573
-35_signal 5560
-10_signal 7883
mRNA 921012
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
RBS 117122
CDS 1311012
note=blaKPC-1
codon_start=1
transl_table=11
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
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FGGSI
GVYAMDTGSGATVSYRAEERFPLCSSFKGFLAAAVLARSQQQAGLLDTPIRYG
KNALV
PWSPISEKYLTTGMTVAELSAAAVQYSDNAAANLLLKELGGPAGLTAFMRSIG
DTTFR
78
LDRWELELNSAIPSDARDTSSPRAVTESLQKLTLGSALAAPQRQQFVDWLKGN
TTGNH
RIRAAVPADWAVGDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTRAPNKDDK
HSEAV
IAAAARLALEGLGVNGQ
ORIGIN
1 cggggcagtt acagccgtta cagcctctgg
agagggagcg gcttgccgct cggtgataat
61 cccagctgta gcggcctgat tacatccggc
cgctacacct agctccacct tcaaacaagg
121 aatatcgttg atgtcactgt atcgccgtct
agttctgctg tcttgtctct catggccgct
181 ggctggcttt tctgccaccg cgctgaccaa
cctcgtcgcg gaaccattcg ctaaactcga
241 acaggacttt ggcggctcca tcggtgtgta
cgcgatggat accggctcag gcgcaactgt
301 aagttaccgc gctgaggagc gcttcccact
gtgcagctca ttcaagggct ttcttgctgc
361 cgctgtgctg gctcgcagcc agcagcaggc
cggcttgctg gacacaccca tccgttacgg
421 caaaaatgcg ctggttccgt ggtcacccat
ctcggaaaaa tatctgacaa caggcatgac
481 ggtggcggag ctgtccgcgg ccgccgtgca
atacagtgat aacgccgccg ccaatttgtt
541 gctgaaggag ttgggcggcc cggccgggct
gacggccttc atgcgctcta tcggcgatac
79
601 cacgttccgt ctggaccgct gggagctgga
gctgaactcc gccatcccaa gcgatgcgcg
661 cgatacctca tcgccgcgcg ccgtgacgga
aagcttacaa aaactgacac tgggctctgc
721 actggctgcg ccgcagcggc agcagtttgt
tgattggcta aagggaaaca cgaccggcaa
781 ccaccgcatc cgcgcggcgg tgccggcaga
ctgggcagtc ggagacaaaa ccggaacctg
841 cggagtgtat ggcacggcaa atgactatgc
cgtcgtctgg cccactgggc gcgcacctat
901 tgtgttggcc gtctacaccc gggcgcctaa
caaggatgac aagcacagcg aggccgtcat
961 cgccgctgcg gctagactcg cgctcgaggg
attgggcgtc aacgggcagt aaggctctga
1021 aaatcatcta ttggcccacc accgccgccc
ttgcgggcgg catggattac caaccactgt
1081 cacatttagg ctaggagtct gcgcggcaga
gccgtgtgac cggttttctg tagagcactg
1141 acgatggcgg cggcgctctc tgcaattggc
aaggcgtcgg cgccaaggat accaatcttg
1201 cggcgcgcgg cgtgttatga cgactggggt
gcatttgagc cgccccattt aaccttcgcc
1261 ctcacagata cgccattcgc ctcaaattta
gcgccatgca gacgagcttc cactcggctt
1321 gcaccttgtc caggcccctc atgctgaact
gacgcaatcc catcaccgcc ttgatca
80
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 15
11 Klebsiella pneumoniae produtora de Carbapenemase (KPC) 15
1 2 Resistecircncia bacteriana 20
13 Anaacutelise geneacutetica de microrganismos 27
2 JUSTIFICATIVA 30
3 OBJETIVOS 31
31 Objetivo geral 31
32 Objetivos Especiacuteficos 31
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS 32
4 1 Coleta e transporte das amostras bioloacutegicas 32
4 2 Procedimentos para confirmaccedilatildeo de resistecircncia bacteriana por disco de
Ertapenem (adaptado CDC 2004) 32
4 2 1 Interpretaccedilatildeo dos Resultados 33
4 3 Teste de susceptibilidade aos antibioacuteticos 34
4 4Teste de Hodge Modificado (THM) (adaptado CDC 2004) 35
441 Controle de qualidade (CQ) 35
442 InterpretaccedilatildeoResultados 35
4 5 Extraccedilatildeo de DNA bacteriano 37
4 6 Iniciadores e reaccedilatildeo de PCR 38
4 7 Digestatildeo 41
4 8 Eletroforese em gel de agarose 41
4 9 Descarte de resiacuteduos 42
4 10 Aspectos epidemioloacutegicos e cliacutenicos 42
4 12 Anaacutelises estatiacutesticas 42
4 13 Preceitos eacuteticos 43
5 RESULTADOS 44
51 Anaacutelise molecular 44
5 1 1 Gene blaKPC 44
5 1 2 Gene 16S rRNA 45
5 2 Anaacutelises epidemioloacutegicas 46
5 2 1 Sexo 46
5 2 2 Desfecho cliacutenico 47
5 2 3 Local da coleta 48
5 2 4 Microrganismo 48
6 DISCUSSAtildeO 53
7 CONCLUSAtildeO 57
15
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC)
Klebsiella pneumoniae pertence aacute famiacutelia Enterobacteriaceae
encontrado em locais como aacutegua solo plantas e esgoto Satildeo encontradas cinco
espeacutecies K pneumoniae K oxytoca K planticola K terrigena e K ornithinolytica
O gecircnero Klebsiella eacute definido como contendo bacilos Gram-negativos natildeo moacuteveis
em forma de bastatildeo e geralmente encapsuladas que produzem lisina
descarboxilase mas natildeo produzem ornitina descarboxilase Provavelmente a
colonizaccedilatildeo em seres humanos ocorre por contato com as diferentes fontes
ambientais podendo ser encontrada colonizando a orofaringe e fezes de pessoas
sadias Pessoas imunocomprometidas a bacteacuteria encontra um ambiente favoraacutevel
para seu crescimento levando aos quadros de infecccedilatildeo (MOREIRA et al 2014)
A Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) eacute uma enzima produzida por
enterobacteacuterias gram-negativas sendo um mecanismo de resistecircncia aos antimi-
crobianos carbapenecircmicos meropenen ertapenen eou imipenen classe
amplamente utilizada no tratamento de infecccedilotildees envolvendo Enterobacteriaceae
Ela tambeacutem eacute capaz de inativar os agentes β-lactacircmicos cefalosporinas penicilinas
e o aztreonam (COTRIM et al 2012)
Devido agrave semelhanccedila estrutural e estereoquiacutemica os antibioacuteticos beta-
lactacircmicos possuem um mecanismo de accedilatildeo comum ao grupo Eles atuam inibindo
a siacutentese da parede celular bacteriana atraveacutes do mecanismo de bloqueio da
transpeptidaccedilatildeo responsaacutevel pela uniatildeo dos componentes individuais do
peptidoglicano conforme demonstrado na figura 1 (KIDWAI et al 1999)
A accedilatildeo destes antibioacuteticos eacute atraveacutes de ligaccedilotildees covalentes com as proteiacutenas
as Penicilim-Binding-Protein (proteiacutena de ligaccedilatildeo da penicilina- PBP ou PLP) que se
encontram presentes na membrana citoplasmaacutetica de todas as bacteacuterias Devido agraves
mutaccedilotildees ocorre uma induccedilatildeo na alteraccedilatildeo dessas proteiacutenas podendo determinar
uma diminuiccedilatildeo da afinidade dos beta-lactacircmicos agraves mesmas A accedilatildeo dos
carbapenecircmicos eacute atraveacutes da sua ligaccedilatildeo agraves PBPs presentes na parede bacteriana
especialmente as PBP1 e PBP2 provocando a lise osmoacutetica da bacteacuteria Aleacutem
disso eles tecircm uma facilidade na penetraccedilatildeo da bacteacuteria por meio dos canais
poriacutenicos presentes nas bacteacuterias gram-negativas induzindo um efeito poacutes-
16
antibioacutetico Quando comparados com outros beta-lactacircmicos os carbapenecircmicos
satildeo mais resistentes agrave hidroacutelise pela maioria das beta-lactamases tanto
cromossocircmicas como plasmiacutedicas (LIVERMORE 1995 LIVERMORE et al 2000)
Figura 1 Accedilatildeo do szlig-lactacircmico sobre a bacteacuteria gram-positiva e gram-
negativa Fonte
ltlthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controle
opas_webmodulo3gramn_lacta2htmgt (adaptado)
A bacteacuteria Klebsiella pneumoniae quando apresenta gene ESBL pode
expressar resistecircncia a ateacute 95 dos antimicrobianos existentes no acircmbito
farmacecircutico sendo a produccedilatildeo de beta-lactamases de espectro estendido (ESBL)
17
por esta bacteacuteria uma das principais causas de falha terapecircutica Existem outras
formas de resistecircncia emergentes de grande importacircncia como a produccedilatildeo de
beta-lactamases tipo adenosina monofosfato ciacuteclico (AmpC) que hidrolizam
cefoxitina as carbapenemases como as metalo-beta-lactamases (MBL) e
carbapenemases tipo KPC (MOREIRA et al 2014)
O mecanismo de resistecircncia mais comum aos antibioacuteticos beta-lactacircmicos de
amplo espectro eacute a produccedilatildeo de ESBL por enterobacteacuterias A accedilatildeo hidroliacutetica
apresentadas por estas enzimas pode conferir clinicamente resistecircncia ao
aztreonam cefalosporina e a todas as penicilinas (PATERSON et al 2005) As
ESBL satildeo enzimas mediadas por genes plasmidiais (transmissiacuteveis entre as
espeacutecies) Os principais microrganismos produtores de ESBL satildeo Klebsiella
pneumoniae (mais encontrada) Escherichia coli e Proteus mirabilis podendo ocorrer
em outros membros da famiacutelia Enterobacteriaceae e em alguns microrganismos natildeo
enteacutericos como Acinetobacter ssp (TURNER 2005) A importacircncia cliacutenica meacutedica
destes microrganismos portadores de ESBL eacute que graccedilas aacutes suas resistecircncias a
muitas classes de antimicrobianos o tratamento de infecccedilotildees eacute difiacutecil gerando um
aumento da morbidade e mortalidade dos pacientes (SHAH et al 2004)
A enzima KPC foi detectada pela primeira vez na Carolina do Norte Costa
Leste dos Estados Unidos no ano de 1996 em Klebsiella pneumoniae dando entatildeo
este nome a enzima Em pouco tempo ela disseminou por outras regiotildees e
recentemente tornou-se uma das preocupaccedilotildees quanto agrave sauacutede puacuteblica mundial
Os paiacuteses de onde KPCs tecircm sido relatados desde 2001 satildeo mostrados na figura 2
apresentando como os organismos tecircm agora sido disseminados amplamente pelo
mundo (NEIL GUPTA et al 2011)
18
Figura 2 Divulgaccedilatildeo internacional de Enterobacteriaceae produtora de
Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC)( NEIL GUPTA et al 2011)
Este mapa apresenta paiacuteses onde Enterobacteriaceae produtoras KPC de
foram descritos em relatoacuterios publicados disponiacuteveis a partir de 11 fevereiro de
2011 Os paiacuteses natildeo destacadas nesta figura tambeacutem podem apresentar a presenccedila
de Enterobacteriaceae produtoras de KPC poreacutem pode ter tido uma falta de
vigilacircncia sistemaacutetica para estes organismos ( NEIL GUPTA et al 2011)
No ano de 2005 foram registradas pela primeira vez essas bacteacuterias
produtoras de carbapenemases Apoacutes 6 anos deste primeiro relato elas passaram a
causar surtos mais graves em nosso paiacutes Em janeiro de 2011 foram notificados no
Distrito FederalBrasil 367 casos em um curto espaccedilo de tempo (01 a 08 de janeiro
de 2011) com 26 oacutebitos A maior parte destes casos (263 casos) foi identificada nas
unidades de terapia intensiva ndash UTI (COTRIM et al 2012)
O potencial de disseminaccedilatildeo da KPC eacute alto devido agrave grande capacidade de
transferecircncia do seu material geneacutetico e por conseguinte os genes de resistecircncia
O controle de epidemias eacute difiacutecil devido a esta caracteriacutestica de faacutecil disseminaccedilatildeo
preocupando os profissionais da aacuterea de sauacutede devido agrave dificuldade de tratamento
podendo resultar em um aumento das taxas de mortalidade Apesar da maior
19
frequumlecircncia em Klebsiella pneumoniae a KPC pode ser identificada em outras
bacteacuterias como a Enterobacter cloacae Citrobacter freundii Salmonella spp E coli
e Pseudomonas spp (DIENSTMANN et al 2010)
Os pacientes com comorbidades incluindo pacientes transplantados
neutropecircnicos em ventilaccedilatildeo mecacircnica em Unidade de Terapia Intensiva (UTI)
com longos periacuteodos de internaccedilatildeo que apresentam risco aumentado de infecccedilatildeo ou
colonizaccedilatildeo para bacteacuterias multirresistentes satildeo mais vulneraacuteveis a Klebsiella
pneumoniae produtora de KPC (COTRIM et al 2012)
Os sinais e sintomas apresentados por um indiviacuteduo infectado por KPC satildeo
febre ou hipotermia taquicardia piora do quadro respiratoacuterio e em casos mais
graves hipotensatildeo inchaccedilo e sepse Quanto ao siacutetio de infecccedilatildeo a bacteacuteria que
possui a enzima KPC pode causar pneumonia associada agrave ventilaccedilatildeo mecacircnica
infecccedilatildeo do trato urinaacuterio infecccedilatildeo de corrente sanguiacutenea infecccedilatildeo de partes moles
e outros tipos de infecccedilatildeo (COTRIM et al 2012)
Para desenvolver a infecccedilatildeo a colonizaccedilatildeo eacute um preacute-requisito poreacutem o
pacientes pode estar colonizado ou seja ser portadores de KPC e natildeo desenvolver
a infecccedilatildeo (ALVES et al 2013) A forma de transmissatildeo eacute basicamente por
contato com secreccedilatildeo ou excreccedilatildeo de pacientes infectados ou colonizados logo
fora do ambiente hospitalar a bacteacuteria natildeo representa perigo (COTRIM et al
2012)
As opccedilotildees terapecircuticas para o tratamento da Klebsiella pneumoniae eacute
dividida em Terapia Empiacuterica e Terapia apoacutes a determinaccedilatildeo do perfil de
sensibilidade A terapia empiacuterica para infecccedilotildees por enterobacteacuterias multirresistentes
se baseia na utilizaccedilatildeo de polimixina B ou polimixina E (Colistina) em associaccedilatildeo
com um (1) ou mais dos antimicrobianos da classe dos aminoglicosiacutedeos
(gentamicina ou amicacina) Carbapenecircmicos (meropenem ou doripenem) eou
tigeciclina (ANVISA 2013)
Recomenda-se usar sempre associaccedilotildees de dois ou trecircs antimicrobianos
sendo um deles a polimixina B ou a polimixina E (colistina) Deve-se evitar a
utilizaccedilatildeo de monoterapias pelo risco de raacutepido desenvolvimento de resistecircncia A
escolha do(s) faacutermaco(s) de associaccedilatildeo com polimixina B ou E deve se basear
preferencialmente no perfil de susceptibilidade esperado aos referidos
20
medicamentos das enterobacteacuterias resistentes aos carbapenecircmicos detectadas no
hospital ou na ausecircncia de dados locais na regiatildeo Deve-se considerar igualmente
o local de infecccedilatildeo e a penetraccedilatildeo esperada do antimicrobiano na escolha da droga
a ser utilizada na combinaccedilatildeo (ANVISA 2013)
Apoacutes a liberaccedilatildeo do perfil de sensibilidade deve-se adequar o uso dos
medicamentos Sempre que possiacutevel manter no miacutenimo 2 (dois) faacutermacos com
sensibilidade comprovada in vitro Natildeo havendo sensibilidade a um segundo
medicamento (suscetibilidade apenas agrave polimixina B ou E) recomenda-se manter a
terapia combinada de polimixina B ou E com carbapenecircmicos (meropenem ou
doripenem) ou tigeciclina na tentativa de ocorrecircncia de sinergismo entre elas
(ANVISA 2013)
Sugere-se aleacutem da determinaccedilatildeo das Concentraccedilotildees Inibitoacuterias Miacutenimas
(CIMs) para uma das polimixinas (B ou E) que tambeacutem sejam determinadas as
CIMs de tigeciclina e carbapenecircmicos (meropenem) bem como a consultoria de um
infectologista (ou Comissatildeo de Controle de Infecccedilatildeo Hospitalar- CCIH) para a
determinaccedilatildeo da terapia combinada com base na interpretaccedilatildeo do antibiograma
CIM e quadro cliacutenico do paciente No caso de resistecircncia agraves polimixinas
(concentraccedilotildees inibitoacuterias miacutenimas [CIMs] gt 2 mgL) recomenda-se a associaccedilatildeo de
dois ou trecircs do antimicrobianos sugeridos para a combinaccedilatildeo (ANVISA 2013)
A antissepsia eficiente do ambiente dos instrumentos ciruacutergicos e das matildeos
com o uso do aacutelcool a 70 eacute fundamental para a contenccedilatildeo de surtos Aleacutem disto
os pacientes contaminados devem permanecer isolados ateacute o controle da infecccedilatildeo
para evitar a disseminaccedilatildeo da bacteacuteria (COTRIM et al 2012)
1 2 Resistecircncia bacteriana
Hoje a disseminaccedilatildeo e a proliferaccedilatildeo das bacteacuterias resistentes estatildeo cada
dia mais presente As bacteacuterias multirresistentes (BRMD) poderatildeo levar agrave
humanidade a uma era poacutes-antibioacutetica resultando em uma ausecircncia de qualquer
opccedilatildeo de tratamento para os portadores destas cepas (HENRIQUE et al 2014)
Os fatores envolvidos na disseminaccedilatildeo desses patoacutegenos multirresistentes
satildeo diversos incluindo o uso irracional de antimicrobianos procedimentos invasivos
21
(cirurgias implantaccedilatildeo de proacuteteses meacutedicas e outros) e a transferecircncia de material
geneacutetico com a informaccedilatildeo de resistecircncia a antibioacuteticos entre as bacteacuterias
(DIENSTMANN et al 2010 ENDIMIAMI et al 2009 FONTANA et al 2010)
Com a praacutetica da antibioticoterapia principalmente em ambientes
nosocomiais os mecanismos de resistecircncia tornaram-se comuns Esses
mecanismos incluem alteraccedilatildeo na permeabilidade da membrana celular que
impede a entrada do antibioacutetico na ceacutelula bombeamento do antibioacutetico para fora da
mesma pelo mecanismo de efluxo mutaccedilatildeo geneacutetica que altera de alguma forma o
alvo do antibioacutetico e consequumlentemente natildeo afeta o funcionamento da bacteacuteria
bem como desenvolvimento da capacidade de degradar ou da inativaccedilatildeo do
antibioacutetico (COTRIM et al 2012) Estes mecanismos estatildeo representados na figura
3
Figura 3 Mecanismos de resistecircncia bacteriana Fonte
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controle
opas_webmodulo3pop_mecanismohtmgt
Um dos mais importantes mecanismos de resistecircncia eacute a alteraccedilatildeo do local-
alvo onde atua determinado antimicrobiano de modo a impedir a ocorrecircncia de
qualquer efeito inibitoacuterio ou bactericida As bacteacuterias podem adquirir um gene que
22
codifica um novo produto resistente aos antimicrobianos substituindo o alvo original
por exemplo o Staphylococcus aureus resistente agrave oxacilina e estafilococos
coagulase-negativos adquiriram o gene cromossocircmico Mec A e produzem uma PBP
ou PLP resistente aos β-lactacircmicos denominada 2a ou 2 que eacute suficiente para
manter a integridade da parede celular durante o crescimento quando outras PBPs
essenciais satildeo inativadas por antibimicrobianos β-lactacircmicos Como alternativa um
gene receacutem-adquirido pode atuar para modificar um alvo tomando-o menos
vulneraacutevel a determinado antimicrobiano Assim um gene transportado por
plasmiacutedeo ou por transposon codifica uma enzima que inativa os alvos ou altera a
ligaccedilatildeo dos antimicrobianos como ocorre com eritromicina e clindamicina (ANVISA
2007)
Em funccedilatildeo da bomba de efluxo pode variar a especificidade do antibioacutetico
Ele atua por meio do bombeamento ativo de antimicrobianos do meio intracelular
para o extracelular gerando uma resistecircncia bacteriana a determinados
antimicrobianos como eacute o caso da resistecircncia agraves tetraciclinas codificada por
plasmiacutedeos em Escherichia coli devido agrave presenccedila de proteiacutenas integrantes da
membrana plasmaacutetica bacteriana (PIDDOCK 2006)
O aumento da siacutentese de proteiacutenas eacute o principal responsaacutevel pela resistecircncia
antimicrobiana devido agraves vaacuterias mutaccedilotildees que ocorrem em seus repressores
transcricionais Estas mutaccedilotildees tambeacutem podem influenciar levando a um aumento
da eficiecircncia do transporte dos antibioacuteticos para o exterior da ceacutelula (HARBOTTLE
et al 2006)
A resistecircncia aos antibioacuteticos eacute frequumlentemente associada agrave alteraccedilatildeo
diminuiccedilatildeo da permeabilidade que ocorre na membrana externa das bacteacuterias gram-
negativas O fluxo de moleacuteculas para o interior da ceacutelula ocorre por caracteriacutesticas
peculiares como carga estrutura e dimensatildeo e atraveacutes de proteiacutenas de membrana
as quais formam canais Este percurso eacute utilizado pelos antibioacuteticos para atingir o
interior da ceacutelula bacteriana ou o espaccedilo periplasmaacutetico como eacute o caso dos
antibioacuteticos β-lactacircmicos Portanto a perda de funccedilatildeo destas proteiacutenas pode
efetivamente causar a diminuiccedilatildeo da susceptibilidade a vaacuterios antibioacuteticos
(LIVERMORE 2003)
23
Os mecanismos de resistecircncia que podem impedir a accedilatildeo de antimicrobianos
satildeo vaacuterios O faacutermaco atua de forma a inibir os processos essenciais a multiplicaccedilatildeo
e sobrevivecircncia da ceacutelula bacteriana como a membrana citoplasmaacutetica e
consequumlentemente bloqueando a siacutentese proteacuteica de aacutecidos nucleacuteicos e da parede
celular A resistecircncia bacteriana eacute um mecanismo natural de defesa Sendo assim
as bacteacuterias estatildeo em constante defesa e para cada novo faacutermaco desenvolvido as
bacteacuterias iratildeo desenvolver resistecircncia em algum momento (POSSEBON et al
2003)
O grupo de antibioacuteticos beta-lactacircmicos satildeo amplamente utilizado e se
encontram dentro da classe dos melhores agentes antimicrobianos com relevacircncia
cliacutenica No entanto o seu uso tem sido restringido devido a vaacuterios mecanismos de
resistecircncia O desenvolvimento dos carbapenecircmicos surgiu devido agrave proliferaccedilatildeo de
beta-lactamases mediadas por plasmiacutedeos e cromossomos (POSSEBON et al
2003)
A bacteacuteria KPC tem um gene chamado SHV-1 que tem a caracteriacutestica de
resistecircncia a quase todos os tipos de antimicrobianos inclusive os carbapenecircmicos
especiacuteficos para o tratamento de infecccedilotildees por bacteacuterias multiresistentes e
emergecircncias Mesmo com no seu coacutedigo geneacutetico a informaccedilatildeo necessaacuteria para o
desenvolvimento da resistecircncia a resistecircncia da bacteacuteria soacute eacute desenvolvida caso a
bacteacuteria entre em contato com o antibacteriano desencadeando todo o processo
nos casos de resistecircncia induzida comuns em KPC (MOREIRA et al 2014)
A resistecircncia bacteriana pode ser apresentada de forma intriacutenseca ou
adquirida A resistecircncia intriacutenseca faz parte das caracteriacutesticas fenotiacutepicas naturais
do microrganismo ou seja faz parte de sua heranccedila geneacutetica sendo transmitida
verticalmente a prole sem perda da caracteriacutestica A presenccedila ou ausecircncia do alvo
para a accedilatildeo da droga eacute o principal determinante deste tipo de resistecircncia
(MOREIRA et al 2014) Essa resistecircncia corresponde a uma caracteriacutestica de
espeacutecie bacteriana quando estes microrganismos satildeo naturalmente resistentes a
certo tipo de antibioacutetico Este processo eacute decorrente da ausecircncia de estruturas de
atuaccedilatildeo de antimicrobianos ou a impermeabilidade por parte de estruturas
perifeacutericas das bacteacuterias (HENRIQUE et al 2014)
24
A resistecircncia adquirida aos antibioacuteticos por sua vez ocorre quando haacute uma
da mutaccedilatildeo de genes reguladores ou estruturais aquisiccedilatildeo de genes de resistecircncia
veiculados por elementos geneacuteticos moacuteveis ou da combinaccedilatildeo entre eles Este
aparecimento de resistecircncia em uma espeacutecie bacteriana era anteriormente sensiacutevel
a droga e devido a um destes fatores se torna resistente O fenoacutetipo resultante
desta resistecircncia natildeo estaraacute presente nas ceacutelulas genitoras e sim nos indiviacuteduos de
uma linhagem bacteriana derivada de um organismo susceptiacutevel Os genes muitas
vezes satildeo adquiridos por meio de elementos moacuteveis como plasmiacutedeos e
transposons (MOREIRA et al 2014)
Entatildeo a resistecircncia adquirida ocorre por diversos mecanismos geneacuteticos tais
como produccedilatildeo de enzimas inativadoras interferecircncia com a entrada e acuacutemulo de
droga na bacteacuteria alteraccedilatildeo do receptor para accedilatildeo da droga via metaboacutelica
alternativa Eacute originada por meio de uma alteraccedilatildeo a niacutevel geneacutetico da ceacutelula de
natureza cromossocircmica pelos processos de mutaccedilatildeo transduccedilatildeo e transformaccedilatildeo
ou extra cromossocircmica (plasmidial) (HENRIQUE et al 2014)
Como todo antibioacutetico β-lactacircmicoos carbapenecircmicos tem como mecanismo
de accedilatildeo a inibiccedilatildeo da siacutentese proteacuteica atraveacutes da accedilatildeo de inibiccedilatildeo da parede
microbiana fazendo a ligaccedilatildeo e inativaccedilatildeo das proteiacutenas ligadoras de penicilinas
(NETO et al 2007)
Imipenem e meropenem antibioacuteticos pertencentes ao grupo dos
carbapenecircmicos possuem um amplo espectro de accedilatildeo in vitro incluindo atividade
contra cocos gram-positivos bacilos gram-negativos e bacteacuterias anaeroacutebias (MOHR
2008) Jaacute o ertapenem possui um espectro de accedilatildeo mais limitado que o os dois
antibioacuteticos anteriormente citados tendo uma eficiecircncia limitada contra os bacilos
gram-negativos natildeo fermentadores Um novo antibioacutetico carbapenecircmico ainda natildeo
disponiacutevel no Brasil doripenem possui uma atividade mais potente principalmente
contra Pseudomona aeruginosa devido ao seu mecanismo de accedilatildeo que combina os
espectros de accedilatildeo de imipenem e meropenem (ZHANEL et al 2007)
Devido as suas estabilidades espectro de accedilatildeo poucos relatos de
resistecircncia boa toleracircncia pelos pacientes com efeitos adversos mais comuns as
complicaccedilotildees no siacutetio da infusatildeo e toxicidade gastrintestinal estes antibioacuteticos
carbapenecircmicos tecircm sido considerados terapia de escolha (NICOLAU 2008) Como
25
uma resposta adaptativa das Enterobacteacuterias o iacutendice de resistecircncia aos
carbapenecircmicos tem aumentado nos uacuteltimos anos de forma proporcional ao seu
uso limitando imensamente as opccedilotildees terapecircuticas para as infecccedilotildees causadas por
estes microrganismos (FALAGAS et al 2009)
As enzimas produtoras de betalactamases hidrolisam o anel betalactacircmico
tornando este mecanismo de resistecircncia o mais importante Os dois grupos mais
preocupantes satildeo o grupo das betalactamases de aspecto ampliado e os da
carbapenemases que aleacutem de hidrolizar os carbapenecircmicos hidrolizam todas as
outras classes de betalactacircmicos Em enterobacteacuterias as carbapenemases mais
prevalentes satildeo codificadas por genes dos grupos blaKpc blaIMP blaVIM blaNdm
e blaOxa A ocorrecircncia de carbapenemases eacute mais frequentemente em bacteacuterias
gram-negativas fermentadoras da glicose conhecidas como enterobacteacuterias
predominantes nos gecircneros Klebsiella Serratia Citrobacter Enterobacter
Escherichia Samonella Proteus Morganella Podem ser encontradas tambeacutem em
bacteacuterias gram-negativas natildeo fermentadoras como espeacutecies de Acinetobacter e de
Pseudomonas (ALVES et al 2013)
Carbapenemases satildeo enzimas plasmiacutedio-mediados resistentes a todos
antibioacuteticos betalactacircmicos As bacteacuterias que possuem o gene blaKpC responsaacutevel
pela codificaccedilatildeo da produccedilatildeo de carbapenemases apresentam resistecircncia aos
antibioacuteticos betalactacircmicos impedindo a accedilatildeo destes antibioacuteticos contra infecccedilotildees
(ALVES et al 2013)
A transmissatildeo das carbapenemases a diferentes cepas de enterobacteacuterias se
daacute atraveacutes de plasmiacutedeos que satildeo pequenas moleacuteculas circulares de DNA com a
capacidade de se replicarem independentemente do DNA cromossocircmico
permitindo a troca de material geneacutetico entre gecircneros e espeacutecies diferentes de
enterobacteacuterias O raacutepido desenvolvimento de surtos em ambientes hospitalares eacute
explicado por essa disseminaccedilatildeo plasmidial (COTRIM et al 2012)
De acordo com o criteacuterio de interpretaccedilatildeo do Clinical and Laboratory
Standards Institute (CLSI 2009) a maioria das KPC isoladas natildeo apresenta
resistecircncia completa aos carbapenecircmicos (Imipenem e Meropenem apresentam
uma Concentraccedilatildeo Inibitoacuteria Miacutenima (CIM) de 2-8 μgmL) (COTRIM et al 2012)
26
Os mecanismos de resistecircncia capazes de impedir a accedilatildeo dos
carbapenecircmicos satildeo vaacuterios Poreacutem a degradaccedilatildeo de antibioacuteticos por enzimas
principalmente as carbapenemases constituem o principal mecanismo de
resistecircncia aos antibioacuteticos β-lactacircmicos (DIAS 2009) Devido a ampla atividade
hidroliacutetica agrave maioria dos antibioacuteticos β-lactacircmicos estes grupos de enzimas possuem
alta versatilidade (QUEENAM et al 2007)
Existem trecircs grandes classes moleculares de Ambler a qual as
carbapenemases pertencem denominadas classe A (serino-carbapenemases os
quais incluem membros designados SME IMI NMC GES e a famiacutelia das KPCs)
classe B(as metalo-β-lactamase incluem os tipos IMP e VIM) e classe D
(oxacilinases similares as da classe A e incluem as OXA e PSE) (DIAS 2009)
Dentre estes as mais importantes e prevalentes encontradas em plasmiacutedeos
de Klebsiella pneumoniae satildeo as KPC (DIENSTMANN et al 2010) Por meio de
estudos moleculares a enzima KPC jaacute foi documentada em diferentes bacteacuterias e
diferenciada em KPC-1 a 13 (NETIKUL et al 2011) No ano de 2009 foi realizada
uma pesquisa onde descreveram as seguintes carbapenemases KPC-1 em isolados
de Klebsiella pneumoniae KPC-2 em K pneumoniae K oxytoca Salmonella
enterica e em Enterobacter sp e KPC-3 em K pneumoniae e Enterobacter cloacae
(MONTEIRO et al 2009) As enzimas KPC-4 e KPC-5 foram encontradas em
isolados de Pseudomonas aeruginosa (PEIRANO et al 2009)
Foi observada uma correccedilatildeo da sequumlecircncia KPC-1 indicando que o gene
blaKPC-1 e blaKPC-2 satildeo idecircnticos Trecircs novas variantes blaKPC-3 blaKPC-4 e
blaKPC-5 satildeo resultados de mutaccedilotildees do gene estrutural da enzima KPC-2
(WOLTER et al 2008) apresentando diferentes perfis de hidroacutelise As enzimas
KPC-2 e KPC-3 possuem alta eficiecircncia em hidrolisar cefalotina cefaloridina e
nitrocefin poreacutem possuem uma menor eficiecircncia contra carbapenecircmicos e
cefotaxima (ALBA et al 2005) As enzimas KPC-5 e KPC-4 apresentam menor
hidroacutelise de carbapenecircmicos eacute do que em KPC-2 Em contrapartida possuem
melhor eficiecircncia contra ceftazidima e uma maior inibiccedilatildeo pelo aacutecido clavulacircnico
(WOLTER et al 2008)
27
13 Anaacutelise geneacutetica de microrganismos
Eacute de extrema importacircncia praacutetica natildeo soacute no aspecto cliacutenico mas tambeacutem na
fitopatologia biotecnologia e estudos ambientais a correta identificaccedilatildeo e
classificaccedilatildeo de microrganismos Os meacutetodos usados na diferenciaccedilatildeo de gecircneros
espeacutecies e estirpes de microrganismos podem ser divididos em meacutetodos fenotiacutepicos
(baseados em fenocircmenos bioquiacutemicos fisioloacutegicos e bioloacutegicos) e genotiacutepicos
(detectam polimorfismos ao niacutevel dos aacutecidos nucleacuteicos ou variaccedilatildeo aleacutelica ao niacutevel
de enzimas) (ALVES et al 2003)
Para este tipo de estudo existem alguns meacutetodos como o RFLPrsquos -
ldquoRestriction Fragment Length Polymorphismsrdquo (polimorfismos de tamanho de
fragmentos de restriccedilatildeo) rep-PCR (Meacutetodo de tipagem baseado na amplificaccedilatildeo via
PCR de elementos de DNA repetitivos presentes em genomas bacterianos) anaacutelise
de sequumlecircncias nucleotiacutedeas (discriminaccedilatildeo eou identificaccedilatildeo atraveacutes de sequumlecircncias
de DNA) PFGE - Pulsed-Field Gel Electrophoresis (Eletroforese em campo
pulsado) ( A L V E S et al 2003)
A diferenciaccedilatildeo clara da cepa e principalmente a alta reprodutibilidade devem
ser caracteriacutesticas de qualquer meacutetodo de tipagem geneacutetica Poreacutem nem todos os
meacutetodos moleculares de tipagem satildeo igualmente eficazes Sendo assim de acordo
com a finalidade pretendida (identificaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo custo reprodutibilidade
etc) eacute feita a escolha do meacutetodo a ser aplicado (A L V E S et al 2003)
O processo de identificaccedilatildeo fenotiacutepica de KPC entre os membros da famiacutelia
Enterobacteriaceae ainda eacute difiacutecil e os meacutetodos para a sua identificaccedilatildeo devem ser
revistos e ajustados Mesmo com o avanccedilo tecnoloacutegico natildeo existem ensaios que
combinam alta especificidade e sensibilidade na detecccedilatildeo destas enzimas Satildeo
diversas as metodologias usadas para rastreamento de KPC como por exemplo a
focalizaccedilatildeo isoeleacutetrica a teacutecnica de disco-difusatildeo E-test teste de Hodge
modificado dentre outros Aleacutem disso a pesquisa do gene blaKPC pode ser feita
pela Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) Os sistemas de automaccedilatildeo
existentes no entanto podem natildeo identificar com precisatildeo os isolados KPC
positivos (COTRIM et al 2012)
A identificaccedilatildeo blaKPC pelo PCR eacute um meacutetodo raacutepido preciso sensiacutevel e
altamente especiacutefico no entanto a PCR exige equipamento e conhecimentos
28
especializados em diagnoacutestico molecular dificultando ainda a utilizaccedilatildeo dele na
rotina dos laboratoacuterios de microbiologia (COTRIM et al 2012)
Em estudo de infecccedilotildees hospitalares identificaccedilatildeo molecular de patoacutegenos
bacterianos eacute bastante utilizada Para diferenciar carbapenemases tipo KPC a partir
de outros tipos como SME NMC-A-IMI e GES eacute necessaacuterio um exame molecular
As identificaccedilotildees do microrganismo juntamente com a triagem molecular iratildeo definir
um resultado mais especiacutefico podendo ser usado para identificar o antibioacutetico mais
adequado para o tratamento Poreacutem a principal desvantagem de alguns exames
baseados em PCR por exemplo eacute que devido agrave sua limitada capacidade de
multiplexaccedilatildeo eles distinguem apenas algumas variaccedilotildees (MOREIRA et al 2014)
Estatildeo descritas para a identificaccedilatildeo molecular de patoacutegenos pertencentes agrave
famiacutelia Enterobacteriaceae as teacutecnicas de PFGE RAPD (randomly amplified
polymorphic DNA) e ERIC-PCR (Enterobacterial Repet it ive Intergenic Consensus)
A PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) eacute considerada padratildeo ouro devido sua
alta capacidade de diferenciaccedilatildeo baseada na anaacutelise do perfil de restriccedilatildeo do DNA
genocircmico por meio de eletroforese Como desvantagem para a sua execuccedilatildeo eacute
necessaacuterios vaacuterios dias impedindo a tipagem de algumas cepas bacterianas devido
agrave degradaccedilatildeo do DNA aleacutem do alto custo empregado (MOREIRA et al 2014)
O meacutetodo baseado em ERIC-PCR tem sido bastante utilizado como uma
alternativa para a teacutecnica de PFGE Esta teacutecnica consiste na anaacutelise do padratildeo de
amplificaccedilatildeo de elementos repetidos encontrados no genoma bacteriano Isto
permite uma maior rapidez na obtenccedilatildeo de resultados quando comparada com o
PFGE aleacutem de alta reprodutibilidade simples execuccedilatildeo e implementaccedilatildeo baixo
custo e natildeo sem problemas com a degradaccedilatildeo do DNA (MOREIRA et al 2014)
A PCR eacute considerada uma teacutecnica de biologia molecular revolucionaacuteria que
consiste na siacutentese enzimaacutetica de coacutepias de aacutecidos nucleacuteicos Ela permitiu o raacutepido
desenvolvimento do estudo de sequumlecircncias de aacutecidos nucleacuteico Foi desenvolvida por
Kary Banks Mullis que ganhou o precircmio Nobel de quiacutemica de 1993 devido ao
desenvolvimento dessa teacutecnica em abril de 1983 (CAMARGO et al 2014)
Por meio de etapas de variaccedilatildeo de temperatura a teacutecnica de PCR promove a
duplicaccedilatildeo de cadeias de DNA in vitro A reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo de DNA por PCR
envolve o emprego de sequumlecircncias iniciadoras (primers) quatro nucleotiacutedeos
29
(dNTPrsquos) do DNA e uma DNA polimerase termoestaacutevel podendo assim obter-se a
partir de uma fita molde muitas coacutepias de uma sequumlecircncia especiacutefica de aacutecido
nucleacuteico O princiacutepio da PCR consiste na variaccedilatildeo de temperatura por ciclo
envolvendo trecircs etapas baacutesicas desnaturaccedilatildeo pareamento e amplificaccedilatildeo
(CAMARGO et al 2014)
A desnaturaccedilatildeo da fita molde de DNA eacute uma etapa com duraccedilatildeo entre 30
segundos a 1 minuto a temperatura entre 92 ordmC a 96 ordmC Apoacutes isso o pareamento de
dois iniciadores sinteacuteticos de composiccedilotildees distintas que funcionam como os
iniciadores da reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo liga-se agrave regiatildeo complementar da fita de
DNA alvo que sofreraacute a duplicaccedilatildeo Esta etapa tem duraccedilatildeo de 30 segundos a 1
minuto a temperatura entre 58 ordmC e 65 ordmC Por uacuteltimo a amplificaccedilatildeo por meio da
enzima Taq DNA polimerase das novas fitas de DNA se daacute a partir de cada um dos
iniciadores utilizando os quatro dNTPrsquos como substrato da reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo
Esta etapa possui duraccedilatildeo entre 45 segundos e 1 minuto a 72 ordmC Cada ciclo eacute
repetido em torno de 30 a 35 vezes e promove a amplificaccedilatildeo da regiatildeo alvo
determinada conforme o anelamento dos iniciadores sinteacuteticos de DNA (CAMARGO
et al 2014) Estas etapas estatildeo demonstradas na figura 4
Figura 4 Etapas da Reaccedilatildeo de PCR
30
2 JUSTIFICATIVA
No ano de 2010 no Distrito Federal foram identificados 111 pacientes com
suspeita de infecccedilatildeo por Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) e a
Secretaria de Sauacutede do Distrito Federal confirmaram ainda a morte de 18 pacientes
dentre os hospitais puacuteblicos e particulares Um desafio encontrado por ocasiatildeo do
surto infeccioso no Distrito Federal foi o de confirmar as KPCs por Reaccedilatildeo da
Polimerase em Cadeia sendo que as amostras foram enviadas com esta finalidade
para a Fiocruz no Rio de Janeiro
Pesquisas que possam contribuir na elaboraccedilatildeo de estrateacutegias preventivas e
de intervenccedilatildeo para infecccedilotildees causadas por enterobacteacuterias bem como contribuir
para gerar uma integraccedilatildeo beneacutefica entre a equipe acadecircmica e os serviccedilos de
sauacutede devem ser estimuladas Neste sentido o presente estudo permitiu escrutinar
os genes envolvidos na expressatildeo de carbapenemases presentes em espeacutecies de
enterobacteacuterias isoladas em ambiente hospitalar visto que elucidar genes de
resistecircncia de enterobacteacuterias aos antibioacuteticos carbapenecircmicos eacute o primeiro passo
para garantir um controle epidemioloacutegico efetivo para estes tipos de microorganismo
assim como sua associaccedilatildeo com surtos fatais particularmente em pacientes com
baixa imunidade
31
3 OBJETIVOS
31 Objetivo geral Caracterizar os genes de resistecircncia das
Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases e os aspectos epidemioloacutegicos de
pacientes internados em um hospital puacuteblico do Distrito Federal
32 Objetivos Especiacuteficos
Identificar genotipicamente a enzima KPC (Klebsiella pneumoniae
carbapenemase) de isolados de Klebsiella pneumoniae
Investigar aspectos epidemioloacutegicos dos pacientes portadores de
Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases
Identificar quais variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana influenciaram para o
desfecho oacutebito ou alta
Avaliar a susceptibilidade das Enterobacteacuterias aos antibioacuteticos
carbapenecircmicos dos pacientes em ambiente hospitalar
32
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
Trata-se de um estudo transversal onde foi realizado o teste de
susceptibilidade das enterobacteacuterias aos antibioacuteticos carbapenecircmicos a partir dos
materiais bioloacutegicos coletados dos pacientes internados no Hospital Regional da Asa
Norte (HRAN) e enviados ao Laboratoacuterio de Anaacutelises Cliacutenicas da mesma Instituiccedilatildeo
Os materiais bioloacutegicos investigados foram sangue aspirado traqueal ou brocircnquico
urina e cultura semi quantitativa de ponta de cateter venoso central O HRAN eacute um
hospital puacuteblico do Distrito Federal com 395 leitos sendo as cliacutenicas de internaccedilatildeo
Berccedilaacuterio Cirurgia Geral Cirurgia Plaacutestica Cliacutenica Meacutedica Ginecologia Maternidade
Pediatria Queimados UTI com atendimento a pacientes portadores de doenccedilas de
caraacuteter cliacutenico e ciruacutergico
4 1 Coleta e transporte das amostras bioloacutegicas
As amostras foram coletadas de pacientes internados no Hospital Regional da
Asa Norte (HRAN) com suspeitas de infecccedilatildeo por KPC A identificaccedilatildeo primaacuteria foi
realizada pelo Laboratoacuterio de Microbiologia do hospital de origem dos pacientes e os
demais procedimentos que foram utilizados na identificaccedilatildeo encontram-se descritos
abaixo
4 2 Procedimentos para confirmaccedilatildeo de resistecircncia bacteriana por
disco de ertapenem (adaptado CDC 2004)
Para diagnosticar amostra como portadora de bacteacuteria produtora de
carbapenemase foi realizado o teste com disco de ertapenem como forma de
triagem Inicialmente utilizou-se o swab contaminado com a amostra que foi
distribuiacuteda em uma pequena aacuterea da placa de aacutegar MacConkey para apoacutes o
crescimento ser realizada a pesquisa de colonizaccedilatildeo por enterobacteacuterias resistentes
aos carbapenecircmicos (Pesquisa de CRE) Procedeu-se a semeadura por teacutecnica
semi-quantitativaesgotamento com alccedila bacterioloacutegica na diluiccedilatildeo de 1100 O disco
de Ertapenem foi colocado na superfiacutecie da placa de MacConkey na junccedilatildeo dos dois
primeiros campos de semeadura conforme demonstrado na figura 5 Incubou a placa
33
em estufa aeroacutebia a 35ordmC por 24 e 48 horas e observou-se o halo de difusatildeo do
disco de Ertapenem na placa para proceder agrave leitura
O teste deixou de ser obrigatoacuterio apoacutes a modificaccedilatildeo dos criteacuterios
interpretativos para carbapenecircmicos para enterobacteacuterias publicados no suplemento
do CLSI 2010 M100-S20-U
Figura 5 Mecanismo de semeamento de material bioloacutegico oriundos de
pacientes com suspeita de infecccedilatildeo por KPC Fonte adaptado CDC 2004
4 2 1 Interpretaccedilatildeo dos resultados
Na ausecircncia de crescimento ateacute 24 horas (MacConkey) ou halo de difusatildeo
gt27 mm na placa deve-se reincubar as placas por mais 24 horas Quando for
ausente o crescimento apoacutes 48 horas ou halo de difusatildeo gt27 mm na placa libera-se
como enterobacteacuterias resistentes a carbapenecircmicos (KPCNEG)Havendo
crescimento de colocircnias na placa de MacConkey com halo lt 27 mm (apenas para
colocircnias com crescimento dentro do halo) deve-se reisolar e realizar identificaccedilatildeo e
antibiograma automatizado teste de sensibilidade por disco-difusatildeo e Teste de
Hodge Modificado (THM) Os isolados de enterobacteacuterias cujos testes comprovarem
a resistecircncia aos carbapanecircmicos testados (KPCPOS) foram reportado a Comissatildeo
de Controle de Infecccedilatildeo Hospitalar (CCIH) Jaacute osbacilos Gram-negativos natildeo
fermentadores natildeo foram reportados (KPCNEG) Para interpretaccedilatildeodos resultados
foram utilizados os valores conforme demonstrados na tabela 1
Tabela 1 Criteacuterios Interpretativos para testes de sensibilidade
ENTEROBACTEacuteRIAS
Disco difusatildeo (mm) MIC (microgml)
34
Antibioacutetico Sigla S I R S I R
Ertapenem 10
microg
ETP 22 19-
21
18 05 1 2
Meropenem 10
microg
MEM 23 20-
22
19 1 2 4
Fonte Manual Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)
2013
Os resultados que apresentaram resistecircncia ao antibioacutetico Ertapenem foram
considerados como suspeitos de contaminaccedilatildeo por KPC Fez-se o teste de
susceptibilidade aos antibioacuteticos (TSA) em aparelho automatizado MicroScan Walk
Away 96sl Dade Behring
4 3 Teste de susceptibilidade aos antibioacuteticos (adaptado CDC 2004)
A determinaccedilatildeo da susceptibilidade dos isolados foi feita pelo teste de
susceptibilidade aos antibioacuteticos (TSA) apoacutes cultura em meio de gelose simples
(INSA) para avaliaccedilatildeo da sua pureza e obtenccedilatildeo de colocircnias isoladas Para
preparaccedilatildeo de uma suspensatildeo bacteriana com turvaccedilatildeo aproximada de 05
McFarland (Dade BehringMicroScanregTurbidity Meter) ressuspendeu duas a cinco
colocircnias em 2ml de soro fisioloacutegico esteacuteril diluindo a 1100 em soro fisioloacutegico num
volume total de 10ml em seguida foi feita uma semeadura em duas placas
quadradas (120mm x 120mm) de Muller-Hinton Agar (INSA) por inundaccedilatildeo
Os discos de antibioacutetico carbapenecircmicos imipenem meropenem e
ertapenem (Biorad) foram aplicados com o auxiacutelio de um dispensador automaacutetico A
susceptibilidade das Enterobacteacuterias aos carbapenecircmicos foi definida de acordo
com o protocolo Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI 2011)
Para aquelas Enterobacteacuterias que apresentaram resistecircncia ao ertapenem
foram realizados o Teste de Hodge Modificado para Detecccedilatildeo de Enterobacteacuterias
Produtoras de Carbapenemases conforme descrito pelo Centers for Disease Control
and Prevention (CDC 2004)
35
4 4Teste de Hodge Modificado (THM) (adaptado CDC 2004)
Preparou-se uma suspensatildeo em salina esteacuteril com a cepa Escherichia coli
ATCC 25922 (padratildeo 05 de McFarland) Apoacutes isto diluiu a suspensatildeo 110 em
salina (05 ml da soluccedilatildeo de Ecoli ATCC 25922 + 45 ml salina)Foi entatildeo semeado
na superfiacutecie de uma placa de Agar Muller-Hinton com a suspensatildeo diluiacuteda de Ecoli
ATCC 25922 com auxilio de swab seco assegurando que houvesse uma
distribuiccedilatildeo uniforme cobrindo toda a superfiacutecie do Agar Deixou secar por 3 a 5
minutos em temperatura ambienteColocou-se o disco de ertapenem 10microg no centro
da placa e apoacutes isto fez-se uma estria linear da cepa a ser testada da borda do
disco ateacute a borda da placa utilizando uma alccedila calibrada 10 microl ou um swab Incubou
a placa na estufa em atmosfera aeroacutebia a 35 plusmn 2ordmC por 16 a 24 horas
441 Controle de qualidade (CQ)
Foi utilizado um CQ todos os dias em que se realizou o teste tendo como
controle Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1705- teste de Hodge modificado
positivo Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1706- teste de Hodge modificado
negativo
442 InterpretaccedilatildeoResultados
Apoacutes 16ndash24 horas de incubaccedilatildeo examinar as placas para verificar a presenccedila
de uma distorccedilatildeo no halo de inibiccedilatildeo do disco de ertapenem devido ao crescimento
realccedilado da cepa ATCC na intersecccedilatildeo do organismo teste e a Ecoli ATCC 25922
dentro dos limites do halo O THM positivo apresentaraacute presenccedila de distorccedilatildeo no
halo de inibiccedilatildeo de ertapenem devido ao crescimento da cepa Ecoli ATCC 25922 ao
longo da estria da cepa teste para dentro dos limites do halo de inibiccedilatildeo Jaacute o THM
negativo teraacute ausecircncia de crescimento da cepa Ecoli ATCC 5922 ao longo da estria
da cepa teste para dentro dos limites do halo de inibiccedilatildeo do disco de ertapenem
Este resultado estaacute representado na figura 6
36
Figura 6 Interpretaccedilatildeo resultado do Teste de Hodge Modificado
(adaptado CDC 2004) Teste positivo na estria da cepa teste na parte superior
da placa teste negativo na estria da cepa teste na parte inferior da placa
Tendo positivo como resultado o paciente era um provaacutevel contaminado por
KPC As amostras entatildeo foram encaminhadas para a Fundaccedilatildeo Osvaldo Cruz
(FIOCRUZ) para confirmaccedilatildeo final As amostras finalmente confirmadas como
positivas para KPC foram isoladas e guardadas no banco de cepas cliacutenicas do
hospital Apoacutes a autorizaccedilatildeo do CEP amostras das cepas foram transferidas para
meio de transporte Stuard em caixa teacutermica fechada em baixa temperatura e
levadas para o laboratoacuterio de microbiologia cliacutenica da universidade
No laboratoacuterio da universidade as amostras foram separadas e realizadas
repiques em meios MacConkey e incubadas por 24h As colocircnias caracteriacutesticas
foratildeo isoladas em caldo BHI e mantidas em shaker a 37oC por 2h Apoacutes isto foram
executadas as anaacutelises a seguir
Os isolados de Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases foram
submetidos agrave extraccedilatildeo de DNA e posterior sequumlenciamento para identificaccedilatildeo dos
genes de resistecircncia blaKPC de 1 a 13 e identificaccedilatildeo do gene universal Os
pacientes de onde os materiais bioloacutegicos contendo as Enterobacteacuterias produtoras
de carbapenemases foram os isolados foram investigados quanto aos aspectos
epidemioloacutegicos e cliacutenicos
37
4 5 Extraccedilatildeo de DNA bacteriano
A extraccedilatildeo de DNA bacteriano foi realizada utilizando o kit NucleoSpin
Plasmidreg (MN) Antes de iniciar a extraccedilatildeo foi feito a preparaccedilatildeo das soluccedilotildees
reagentes materiais e amostras (vortexando) colocou-se em banho-maria agrave 50ordmC o
tampatildeo AW Partiu-se de colocircnias isoladas cultivadas que sofreram passagem em
meio LB liacutequido por 12h Adicionou-se 15 mL da amostra no tubo eppendorf
centrifugou por 5 minutos descartou o sobrenadante (com cuidado para natildeo
descartar o Pellet) Repetiu-se este procedimento por mais trecircs vezes completando-
se o volume de 6mL Foram adicionados 250microL do tampatildeo Resuspension Buffer A1
encostando a ponteira no Pellet e misturando (este tampatildeo tem como funccedilatildeo
separar a formaccedilatildeo de grumos celulares) Apoacutes isso homogeneizou e vortexou os
tubos eppendorfs Apoacutes isso foram adicionados 250microL do tampatildeo Lysis Buffer A2
homogenizou e deixou descansar por 5 minutos (esta etapa eacute importante para a lise
da parede e da membrana celulares e liberaccedilatildeo do conteuacutedo da ceacutelula)
Passado o tempo de descanso foi adicionado 300microL do tampatildeo
Neutralization Buffer A3 homogeneizou e centrifugou por 10 minutos (este tampatildeo
iraacute retirar as proteiacutenas que envolvem o DNA e voltaraacute com o pH para proacuteximo de 8
impedindo que a soluccedilatildeo de lise facilite a quebra das ligaccedilotildees covalentes do aacutecido
nucleacuteico) Em seguida enumeraram-se os tubos contendo filtros com siacutelica
transferiu-se o sobrenadante para o filtro e centrifugou por 5 minutos Descartou-se
o que foi filtrado adicionou 500microL do tampatildeo AW (banho-maria) centrifugou por 2
minutos Novamente foi descartado o filtrado Adicionou-se 600microL do tampatildeo A4
centrifugou por 2 minutos e descartou o filtrado (os tampotildees AW e A4 contecircm
isotiocianato de guanidina em concentraccedilotildees crescentes para facilitar a adsorccedilatildeo
do DNA na siacutelica e retirada das outras biomoleacuteculas da amostra) Foi feita outra
centrifugaccedilatildeo com o tubo vazio Apoacutes isto o filtro foi trocado para outro eppendorf
definitivo onde foi adicionado 50microL do tampatildeo Elution Buffer AE (este tampatildeo
favorece a eluiccedilatildeo do DNA) centrifugou por 2 minutos descartou o filtro e
armazenou as amostras em freezer -20ordmC
38
4 6 Iniciadores e reaccedilatildeo de PCR
Os iniciadores universais para o gene blaKPC foram desenhados baseados
em sequumlecircncias conservadas apresentadas pelos sub-grupos de genes que
codificam a enzima carbapenemase de klebsiella pneumoniae (YIGIT et al 2001)
Baseado na sequumlecircncia para o blakpc-1 depositada no GenBank
(AF2975541) o oligonucleotiacutedio (oligo) iniciador direto (5-
ATGTCACTGTATCGCCGTC-3rsquo) foi desenhado para reconhecer a sequumlecircncia
blaKPC na posiccedilatildeo (131149) enquanto que o iniciador reverso (5-
TTACTGCCCGTTGACGCC-3rsquo) foi reconhecido na posiccedilatildeo (9951012) As anaacutelises
baseadas em alinhamento de sequumlecircncias mostraram que o par de iniciadores
blaKPC podem detectar os alelos de 1 a 13 do gene blaKPC conforme a tabela 2
Tabela 2 Nuacutemero de acesso ao GenBank dos alelos blaKPC e seus
microrganismos originais
Nuacutemero de
Acesso GenBank
Microrganismo Alvo
AF2975541 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-1
GU0862251 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-2
HQ2589341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-2-like
AB5577341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC -3
EU4473041 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-4
EU4002222 Pseudomonas
aeruginosa
blaKPC-5
EU5555341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-6
EU7297271 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-7
39
FJ2344121 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-8
FJ624872 Escherichia coli blaKPC-9
GQ1403481 Acinetobacter
baumannii
blaKPC-10
HM0669951 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-11
HQ3428891 Enterobacter cloacae blaKPC-12
HQ3428901 Enterobacter cloacae blaKPC-13
As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo de blaKPC foram realizadas em um
primeiro tempo de desnaturaccedilatildeo em que foi 94ordmC por 5 minutos seguido de 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 58 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 90 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 78ordmC por 8 minutos Aleacutem das amostras foi utilizado um
controle negativo
A PCR do blaKPC foi realizada utilizando os componentes para o volume da
reaccedilatildeo de 25 microL citados na tabela 3 A banda do tamanho do produto de PCR foi de
881 pares de bases (pb) o que corresponde ao plasmiacutedeo
Tabela 3 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do
gene blaKPC
Reagente Volume
DNA molde 4 microL
Tampatildeo Taq 25 microL
MgCl2 075 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP
2 microL
Oligo F 1 microL
Oligo R 1 microL
Taq DNA polimerase 05 microL
Aacutegua MiliQ 1335 microL
40
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
Baseado na sequumlecircncia para o gene 16S rRNA em que o oligonucleotiacutedio
Universal iniciador direto foward (5-CCAGCAGCCGCCGTAATACG-3rsquo) foi
desenhado para reconhecer a sequumlecircncia universal na posiccedilatildeo 1513 enquanto que o
iniciador reverso (5-ATCGGYTACCTTGTTACGACTTC-3rsquo) foi reconhecido na
posiccedilatildeo 1491 foram realizadas PCRrsquos As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo deste
gene foram realizadas nos seguinte tempos separaccedilatildeo 94ordmC por 10 minutos 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 55 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 120 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 72ordmC por 10 minutos
A PCR do gene 16S rRNA foi realizada utilizando os componentes para o
volume da reaccedilatildeo de 25microL citados na tabela 4 A banda do tamanho do produto de
PCR foi de 996 pb correspondente aacute regiatildeo ribossomal capaz de amplificar todas
as espeacutecies
Tabela 4Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do gene
universal
Reagente (quantidade
concentraccedilatildeo do estoque)
Volume
DNA molde 10 ng 4 microL
Tampatildeo Taq 10 x 25 microL
MgCl2 50mM 125 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP 25 mM
125 microL
Oligo F 10microM 05 microL
Oligo R 10microM 05 microL
Taq DNA polimerase 5UmicroL 04 microL
Aacutegua Miliq 146 microL
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
41
O termociclador utilizado para os experimentos foi o LifeTouch da BIOER
4 7 Digestatildeo
Para realizaccedilatildeo da digestatildeo foi utilizada a enzima BshF I (Hae III) EN- 1105
tamanho 7000 units concentraccedilatildeo 10 unitsmicroL fonte Bacillus sphaericus empresa
Jena bioscienceUtilizaram-se os componentes para o volume de 50microL da reaccedilatildeo
citados na tabela 5
Tabela 5 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da digestatildeo do gene
universal
Reagente Volume
Produto de PCR 10 microL
Enzima BshF I 01 microL
Tampatildeo (10x) 5 microL
Aacutegua Miliq 349 microL
Total (em cada ependorff) 50 microL
Valores para 1 digestatildeo
Os ependorffs foram colocados por 30 minutos em banho-maria a 37ordmC Apoacutes
isso fez-se a corrida das amostras em gel de agarose para verificaccedilatildeo do resultado
(LU et al 2000)
4 8 Eletroforese em gel de agarose
Os produtos de DNA PCR e digestatildeo foram analisados em gel de agarose
2 O tempo de corrida do gel eacute de aproximadamente 1hora e 30minutos sendo
que no comeccedilo foi usada agrave voltagem de 50 V e apoacutes comeccedilar a correr o gel
aumentou a voltagem para 100 v Utilizou-se o marcador de 100pb (pares de bases)
Foi adicionado 3microL de corante Bromophenol (que tem a funccedilatildeo de fazer uma ligaccedilatildeo
na amostra de DNA e permitir a visualizaccedilatildeo da corrida no gel de agarose) em 7microL
de amostra tanto de DNA quanto de PCR Para o preparo do gel foi utilizado TBE
42
(Tris- Aacutecido Boacuterico) agarose e brometo de etiacutedio (sua funccedilatildeo eacute de corante para o gel
e permitir a visualizaccedilatildeo do DNA quando colocado agrave luz ultravioleta) Para o oligo
blaKPC a banda da amplificaccedilatildeo foi em 881ppb correspondendo ao plasmiacutedeo Jaacute
o oligo Universal foi em 996 pb
4 9 Descarte de resiacuteduos
Todos os materiais utilizados nos ensaios foram de uso uacutenico e manipulados
em cacircmaras de seguranccedila bioloacutegica classe II Apoacutes o uso foram colocados em
soluccedilatildeo desinfetantes (hipoclorito a 1) e em seguida autoclavados a 127oC por 20
min em sacos apropriados para autoclavaccedilatildeo Apoacutes a finalizaccedilatildeo do ciclo de
esterilizaccedilatildeo os sacos contendo o material descartaacutevel foram colocados em
recipientes de coleta da empresa responsaacutevel pela coleta de materiais bioloacutegicos
produzidos no laboratoacuterio de microbiologia Todos os procedimentos seguiram a
normativa RDC-ANVISA 3062004 sobre o descarte de resiacuteduos de serviccedilo de
sauacutede
4 10 Aspectos epidemioloacutegicos e cliacutenicos
Os aspectos cliacutenicos e epidemioloacutegicos foram investigados por meio de
prontuaacuterios dos pacientes portadores de enterobacteacuterias produtoras de
carbapenemases e envolveram topografia mais provaacutevel do foco infeccioso a
enfermidade motivadora da internaccedilatildeo o desfecho cliacutenico a idade e o tempo de
internaccedilatildeo
4 12 Anaacutelises eepidemioloacutegicas
As anaacutelises foram realizadas com o pacote estatiacutestico SPSS versatildeo 200
Para verificar quais variaacuteveis referentes aos dados epidemioloacutegicos e
microbioloacutegicos influenciaram no desfecho verificou- se a diferenccedila meacutedia das
variaacuteveis idade e tempo de internaccedilatildeo em cada grupo O teste estatiacutestico utilizado foi
o teste t de Student apoacutes se executar o teste de normalidade de Shapiro-Wilk Para
as variaacuteveis sexo perfil microbioloacutegico das enterobacteacuterias produtoras de
43
carbapenemases foi avaliada a associaccedilatildeo com o desfecho por meio do teste Exato
de Fisher O niacutevel de significacircncia adotado foi de 5
4 13 Preceitos eacuteticos
Este projeto estaacute inserido em um projeto maior denominado ldquoEpidemiologia
cliacutenica e caracterizaccedilatildeo molecular do Acinetobacter Baumannii resistente a
antibioticoterapia em pacientes internado em hospitais do Sistema Uacutenico de Sauacutederdquo
que foi submetido ao Comitecirc de Eacutetica em Pesquisa da Secretaria do Estado de
Sauacutede do Distrito Federal (SESDF) e emitido parecer aprovado pelo protocolo nordm
23109 (anexo)
44
5 RESULTADOS
51 Anaacutelise molecular
Para a amplificaccedilatildeo com o oligo blaKPC foram amplificadas amostras
que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 881 pb correspondente ao
plasmiacutedeo A anaacutelise da amplificaccedilatildeo da regiatildeo do gene blaKPC mostrou que
apenas a amostra A10 natildeo amplificou isso demonstra que esta amostra natildeo
possuiacutea o gene de resistecircncia
5 1 1 Gene blaKPC
Figura 7 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 881 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
A amostra A3 natildeo amplificou no primeiro momento entatildeo foi realizado
novamente a PCR e corrida de gel obtendo entatildeo a amplificaccedilatildeo da amostra como
apresentado na figura 8
45
Figura 8 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC da
mostra A3 estudada A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo de 881
pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 1 2 Gene 16S rRNA
Para a amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA utilizou-se o oligo universal Foram
amplificadas amostras que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 996 pb
Figura 9 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
46
Segundo Lu et al (2000) a digestatildeo com a enzima HaeIII deste amplicons de
16S rRNA devolveriam bandas com perfis entre 150 a 200 pb No gel abaixo eacute
possiacutevel evidenciar que este perfil ocorreu com o predomiacutenio de bandas na altura
de 200pb
Figura 10 Gel de agarose a 2 da digestatildeo do amplicon do gene 16S
rRNA das amostras com a enzima HaeIII evidenciando diversos fragmentos
proacuteximos a 200 pb A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo ribossomal
de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 2 Anaacutelises epidemioloacutegicas
5 2 1 Sexo
No total foram detectados 17 isolados de KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 onde a maior a prevalecircncia foi
detecatada em amostras de pacientes do sexo masculino (53) do que no sexo
feminino (47)
47
Figura 11 Isolado de KPC segundo sexo dos 17 pacientes investigados
no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 2 Desfecho cliacutenico
Em 17 isolados de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo
de 2010 aacute 2011 a porcentagem de pacientes que foram a oacutebito (59) foi maior que
a de pacientes que tiverm alta (41)
Figura 12 Isolado de KPC segundo desfecho cliacutenico dos 17 pacientes
investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
48
5 2 3 Local da coleta
Dos 17 episoacutedios detectados de infecccedilatildeo por KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 a infecccedilatildeo em swab retalfoi mais
frequente (47) seguida de ponta de cateacuteter (18) e secreccedilatildeo traqueal (12)
Figura 13 Isolados de KPC segundo local da coleta da amostra nos 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 4 Microorganismo
O microorganismo mais encontrado foi a Klebsiella pneumoniae (82)
seguida da Enterobacter clocae (12) e Serratia marcescens (6) dos 17 isolados
de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 Isto afirma o
fato de a sigla KPC ser utilizada de forma errocircnea aacute Klebsiella pneumoniae visto
que a evidecircncia dela eacute maior em relaccedilatildeo as outras cepas
49
Figura 14 Isolado de KPC segundo microrganismo encontrado em 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 5 Relaccedilotildees variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana e desfecho
cliacutenico
Tabela 6 ndash Distribuiccedilatildeo do perfil geneacutetico sexo coleta tipificaccedilatildeo de
microrganismos e anaacutelise da resistecircncia bacteriana segundo o desfecho
cliacutenico Brasiacutelia-DF 2010 a 2011
Variaacutevel Resultado
Desfecho
Alta Oacutebito
N N P
Gene 16S rRNA Positivo 7 1000 10 1000
NA Gene blaKPC Positivo 6 857 10 1000
Negativo 1 143 0 00 0218 Sexo Feminino 2 286 6 600
Masculino 5 714 4 400 0201 Local da coleta Fundo saco de
Douglas 1 143 0 00
Hemocultura 0 00 1 100 0463 Ponta de cateter 1 143 2 200
Sec TraquealBrocircnquica
0 00 1 100
50
Secreccedilatildeo traqueal 2 286 0 00
Swab retal 3 429 5 500
Urina 0 00 1 100
Microrganismo Enterobacter cloacae (KPC)
1 143 1 100
Klebsiella pneumoniae
6 857 8 800
0416 Serratia
marcescens 0 00 1 100
Teste de Hodge Hodge positivo 7 1000 10 1000
NA Amicacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 1 100 0848 resistente 0 00 1 100
sensiacutevel 2 286 3 300
Amoxicilina Aacutecido Clavulacircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Ampicilina Sulbactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ampicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Aztreonan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefazolina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Cefoperazona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Cefotaxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefoxitina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0509 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 2 286 4 400
Ceftazidima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cetriaxona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 3 429 5 500 0772 Cefalotina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ciprofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772
51
resistente 3 429 5 500
Claritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Clindamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Eritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Gentamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0942 resistente 2 286 3 300
sensiacutevel 1 143 2 200
Imipenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 0 00 2 200 0193 Resistente 1 143 3 300
sensiacutevel 2 286 0 00
Nitrofurantoiacutena sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Norfloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Oxacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Penicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Piperacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Rifampicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tetraciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Ticarcilina Aacutecido Clavulocircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0688 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 3 429 4 400
Tobramicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Trimetoprima Sulfametoxazol
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0112 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 2 286 0 00
Vancomicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tigeciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediario 0 00 1 100 0211 natildeo testado 1 143 4 400
resistente 2 286 0 00
52
Cefepime sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefuroxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Levofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Piperacilina Tazobactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Ertapenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Meropenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0223 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 1 143 0 00
Cefotetan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 sensiacutevel 0 00 1 100
Gemifloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 7 700 0585 natildeo testado 3 429 3 300
Desfecho
Alta Oacutebito
Meacutedia Erro
padratildeo Meacutedia Erro
padratildeo p
Idade 58 9 59 5 0991
Tempo Internaccedilatildeo (dias)
50 13 46 12 0571
n= 17 p(lt 005) NA natildeo se aplica
53
6 DISCUSSAtildeO
Nos uacuteltimos anos houve um aumento na incidecircncia de bacteacuterias
multirresistentes aos antimicrobianos no ambiente hospitalar tornando isto um
problema mundial de sauacutede puacuteblica (HULSCHER et al 2010) Quando se trata
principalmente de bacilos Gram negativos a frequumlecircncia destas bacteacuterias eacute ainda
maior em paiacuteses da Ameacuterica Latina quando comparada a paiacuteses desenvolvidos
(GALES etal 2012)
De acordo com dados do ldquoMeropenem Yearly Susceptibility Test Information
Collectionrdquo (MYSTIC) ocorreu nos Estados Unidos um aumento na susceptibilidade
de K pneumoniae nos uacuteltimos anos graccedilas a praacuteticas de controle de disseminaccedilatildeo
de amostras resistentes(RHOMBERG P R et al 2009) O aumento crescente da
prevalecircncia destes microrganismos foi proporcional ao aumento da dependecircncia do
uso de antibioacuteticos carbapenecircmicos considerados como a opccedilatildeo terapecircutica para o
tratamento de infecccedilotildees por bacilos Gram negativos multi-resistentes (LIVERMORE
2012) Isto afeta diretamente as opccedilotildees de tratamento sobrando poucas alternativas
para a terapecircutica que incluem colistina (polimixina E) e tigeciclina que apresentam
respectivamente problemas em termos de toxicidade e eficaacutecia (LIVERMORE et
al 2011) Um dos efeitos adversos mais importantes das poliminas B e E por
exemplo satildeo a neurotoxicidade e nefrotoxicidade (MENDES C A C et al2009 )
Devido agrave resistecircncia ser usualmente de natureza plasmidial e portanto de
maior disseminaccedilatildeo especialmente quando carreadas por K pneumoniae
microrganismo com uma notoacuteria capacidade para acumular e transferir plasmiacutedeos
com determinantes para resistecircncia o nuacutemero de casos detectados pelo
fenoacutetipogenoacutetipo blaKPC eacute bastante preocupante (MONTEIRO et al 2009)
Comparada com outras bacteacuterias hospitalares a transmissatildeo de clones
multirresistentes de K pneumoniae eacute maior e podem natildeo ser controladas pelos
meacutetodos de controle de infecccedilatildeo hospitalar (PAAUW et al 2007) A forma
plasmidial para transferecircncia da resistecircncia adicionada a este grande potencial para
disseminaccedilatildeo de clones resistentes eacute preocupante visto que apoacutes surtos muitas
vezes pode se tornar endecircmica Jaacute eacute uma realidade a disseminaccedilatildeo desta bacteacuteria
54
entre pacientes hospitais paiacuteses e ateacute mesmo continentes (WOODFORF et al
2010 ROGERS et al 2011)
As chances de surtos satildeo maiores em paiacuteses com poucos recursos devido agrave
maior carecircncia de praacuteticas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees hospitalares e o
uso irracional de antimicrobianos de forma empiacuterica e inadequada (KUMARASAMY
et al 2010) Ateacute o momento os mecanismos de resistecircncia aos cabapenecircmicos
geralmente encontrado eram a produccedilatildeo de ESBL (CTX-M) somada aacute perda de
porina (CARVALHAES et al 2010) Foi notado a partir do ano de 2008 um
aumento no nuacutemero de K pneumoniae produtoras de KPC-2 apresentando outra
forma de resistecircncia (GALES 2012)
Um estudo mostrou que o perfil do paciente colonizado ou infectado por KPC
foi de um paciente entre os 33 e os 82 anos de idade internado haacute mais de 1
semana no hospital A mortalidade geral nos uacuteltimos anos ficou em torno de 7
sendo que dos 77 pacientes estudados 32 (415) pacientes evoluiacuteram para oacutebito
evidenciando a alta morbi-mortalidade associada (ALVES A P et al 2013)
Em estudo com 2316 pacientes avaliados a populaccedilatildeo de sexo masculino foi
de 526 idade meacutedia global de 53 anos (mediana de 55 anos) permanecircncia meacutedia
de 58 dias (mediana de 3 dias) (OLIVEIRA A C et al 2010) Outros trabalhos
apresentaram ausecircncia de significacircncia entre sexoidade e o desenvolvimento de
infecccedilotildees por microrganismos resistentes (PERES-BOTA D et al 2003 COLPAN
A et al 2005 COELLO R et al 1997)
Outro estudo utilizou um total de 30 amostras sendo elas isoladas de urina
escarro secreccedilatildeo pleural ponta de cateter aspirado traqueal e hemocultura A mais
prevalente foi em urina (40) Entre as 30 cepas analisadas a maior porcentagem
foi da cepa Klebsiella pneumoniae (70) Enterobacter sp (133) Klebsiella
ozaenae (10) Escherichia coli (333) e Klebsiella oxytoca (333)
(DIENSTMANN R et al 2010) Nos Estados Unidos a enzima KPC jaacute se tornou
endecircmica Foi realizada uma pesquisa em dois hospitais de Nova York onde
testaram 602 amostras e 45 apresentaram algum mecanismo de resistecircncia
sendo apenas 33 confirmadas por biologia molecular como KPC-2 (BRATU et
al 2005)
55
Estudo sobre os tipos de ESBL feito no Japatildeo apresentou o tipo Toho-1 como
o mais prevalente nessa pesquisa Ateacute o ano de 2000 ano em que foi publicado tal
estudo este era o primeiro relatoacuterio no Japatildeo para identificar derivados de ESBLs
como tipo de SHV e TEM entre E coli e K pneumoniae Em especial o tipo SHV- 12
foi identificado com uma maior frequumlecircncia Estes resultados indicam que tipos
distintos de ESBLs que satildeo diferentes em sua especificidade de substrato e origem
geneacutetica coexistem no Japatildeo Isto mostra a importacircncia de caracterizar genoacutetipos
distintos de ESBLs e de estar em alerta continuamente para as tendecircncias de
ESBLs no Japatildeo aleacutem da necessidade de uma interpretaccedilatildeo uniforme utilizando as
diretrizes do CSLI para relatar cepas produtoras de ESBL Aleacutem da detecccedilatildeo de
ESBLs satildeo necessaacuterias mais informaccedilotildees tais como o perfil de sensibilidade
especiacutefica para diversas β-lactacircmicos e o local da infecccedilatildeo Esses fatores satildeo
essenciais para a escolha adequada de antibioacuteticos (YAGI T et al 2000)
No ano de 2004 uma pesquisa avaliou a produccedilatildeo de uma enzima de
hidroacutelise de carbapenecircmicos atraveacutes da teacutecnica de sequumlenciamento foi revelado
um novo membro da famiacutelia KPC designado KPC- 3 Pesquisadores encontraram
em um mutante de K pneumoniae uma substituiccedilatildeo de um gene associado com
resistecircncia a Imipenem mas essa substituiccedilatildeo foi considerada improvaacutevel na
contribuiccedilatildeo da resistecircncia aos carbapenecircmicos da espeacutecie estudada Aleacutem da
resistecircncia aos carbapenecircmicos estes isolados eram em sua maioria resistentes agraves
cefalosporinas penicilinas e aminoglicosiacutedeos Usando estudos de transformaccedilatildeo
conjugaccedilatildeo e hibridaccedilatildeo localizaram o alelo blaKPC em plasmiacutedeo aleacutem disso
mostraram que esse alelo tambeacutem carregava uma resistecircncia aos aminoglicosiacutedeos
A transferecircncia das enzimas KPCs foi demonstrada in vitro tanto neste como em
outros estudos pode ser que os plasmiacutedeos que fazem esta transferecircncia estavam
comeccedilando a se espalhar no ambiente cliacutenico resultando na multiresistecircncia dessas
estirpes (WOODFORD et al 2004)
O presente estudo apresentou um vieacutes quanto aos resultados dos testes de
susceptibilidade microbiana Observou-se que natildeo foi encontrado resultado deste
teste em algumas amostras o que natildeo cooperou para um estudo mais preciso
futuros estudos quanto agraves amostras e um melhor acompanhamento deste tipo de
patologia Poreacutem mesmo sem algumas amostras com este resultado disponiacutevel foi
56
confirmada a presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos
carbapenecircmicos por meio dos genes de resistecircncia blaKPC e 16S rRNA que as
amostras apresentaram em sua maioria serem portadoras Quanto aos resultados
estatiacutesticos nenhuma das variaacuteveis apresentou significacircncia estatiacutestica (p gt 005)
mostrando assim que estas variaacuteveis isoladas natildeo foram o fator determinante para
o desfecho cliacutenico de alta ou oacutebito
57
7 CONCLUSAtildeO
Os genes blaKPC e 16S rRNA foram caracterizados confirmando a a
presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos carbapenecircmicos
Houve uma maior prevalecircncia da cepa K pneumoniae e isto confirma outros
estudos que apresentam a maior prevalecircncia desta cepa em amostras com KPC
Aleacutem disso isso justifica a forma popular da K pneumoniae ser chamada de KPC
enquanto que na verdade KPC eacute uma enzima podendo estar presente em outras
cepas como Enterobacter clocae tambeacutem apresentada no presente estudo O
desfecho cliacutenico de oacutebitos maior que 50 eacute um possiacutevel indicador sobre a
necessidade de se realizar um teste raacutepido para identificaccedilatildeo de KPC visando
iniciar o mais raacutepido possiacutevel o tratamento afim de diminuir a mortalidade por esta
infecccedilatildeo
Nenhuma das variaacuteveis isoladamente estaacute relacionada ao desfecho cliacutenico
oacutebito ou alta pois natildeo apresentaram relevacircncia estatiacutestica O presente estudo
mostrou que haacute presenccedila da bacteacuteria nas amostras de pacientes do hospital
estudado podendo entatildeo afirmar que este tipo de bacteacuteria se encontra tambeacutem
presente em ambiente hospitalar O uso irracional de antimicrobiano eacute demonstrado
de forma indireta quando foi apresentado atraveacutes do Teste de Hodge Modificado
uma resistecircncia de 100 aos antibioacuteticos carbapenecircmicos Isto tambeacutem reflete na
terapecircutica sendo que pacientes portadores de bacteacuterias resistentes aos
antibioacuteticos carabepecircmicos tem uma escassa opccedilatildeo de tratamento e as opccedilotildees
apresentam problemas quanto agrave toxicidade e eficaacutecia
58
REFEREcircNCIAS
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Mecanismos
de resistecircncia bacteriana aos antimicrobianos Disponiacutevel em
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controleopas_
webmodulo3mec_sitiohtmgt Acesso em 25 de abril de 2014
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Nota teacutecnica nordm
012013 medidas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees por enterobacteacuterias
multiresistentes Acesso em 17 de abril de 2013
ALBA J et al Kinetics study of KPC-3 a plasmid-encoded class A
carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase Antimicrob Agents Chemother
Nov49(11)4760-2 2005
ALVES A P et al Nosocomial infections by KPC-producing enterobacteria in
a tertiary hospital in Southern Brazil Revista da AMRIGS Porto Alegre 57 (3) 213-
218 jul-set 2013
ALVES A et al Tipagem Geneacutetica de Microrganismos Lab De Diversidade
Microbiana Centro de Biologia Celular Dep de Biologia U de Aveiro 3810-193
Aveiro- 2003
BELL J M et Al Prevalence and significance of a negative extended-
spectrum beta-lactamase (ESBL) confirmation test result after a positive ESBL
screening test result for isolates of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae
results from the SENTRY Asia-Pacific Surveillance Program J Clin Microbiol
May45(5)1478-82 2007
BRATU S et al Detection of KPC carbapenem-hydrolyzing enzymes in
Enterobacter spp from Brooklyn New York Antimicrob Agents Chemother v 49 n
2 p 776-8 2005
59
BRATU S et al Emergence of KPC-possessing Klebsiella pneumoniae in
Brooklyn New York epidemiology and recommendations for detection Antimicrob
Agents Chemother v 49 n 7 p 3018-20 2005
BRATU S et al Rapid spread of carbapenem-resistant Klebsiella
pneumoniae in New York City Arch Intern Med v 165 p 1430-5 2005
CAMARGO C F et al Aplicaccedilatildeo das teacutecnicas de pcr e suas teacutecnicas
derivadas em diagnoacutestico molecular Disponiacutevel em
ltfileDUnB10C2BA20semestreArtigosPCR-
20CLEYTON20FLORENCIO20DE20CAMARGO20E20PAULO20ROB
ERTO20QUEIROZpdfgtgt Acesso em 08 de abril de 2014
CARVALHES C G et al Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting
carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive
results Journal of Antimicrobial Chemotherapy v 65 n2 p 249-251 2010
CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION- CDC Modified
Hodge Test for Carbapenemase Detection in Enterobacteriaceae 2004
CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE Methods for
dilutionantimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically Approved
standard M7ndashA7 7th ed CLSI Wayne PA 2011
COELLO R et al Risk factors for developing clinical infection with methicillin-
resistant Staphylococcus aureus (MRSA) amongst hospital patients initially only
colonized with MRSA J Hosp Infect 19973739-46
COLPAN A et al Evaluation of risk factors for mortality in intensive care
units A prospective study from a referral hospital in Turkey Am J Infect Control
200533(1)42-7
60
CORNAGLIA G et al Living with ESBLs Introduction Clinical Microbiology
and Infection 14 Suppl 1 1-2 2008
COTRIM E R et al Klebsiella pneumoniae carbapenemase ndash KPC em
Enterobacteriaceae o desafio das bacteacuterias multirresistentes Poacutes em revista do
centro universitaacuterio Newton Paiva 12012 - ediccedilatildeo 5 - issn 2176 7785
DESHPANDE L M et al Occurrence and characterization of
carbapenemase-producing Enterobacteacuteriaceae report from the SENTRY
Antimicrobial Surveillance Program (2000-2004) Microb Drug Resist 12(4)223-30
2006
DIAS D J A Estudos dos principais mecanismos de resistecircncia aos
antibioacuteticos β-lactacircmicos em bacteacuterias patogecircnicas gram negativas 2009 100 f
Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Geneacutetica Molecular e Biomedicina) ndash Faculdade de
Ciecircncias e Tecnologia Universidade de Nova Lisboa Lisboa
DIENSTMANN R et al Avaliaccedilatildeo fenotiacutepica da enzima Klebsiella
pneumoniae carbapenemase (KPC) em Enterobacteriaceae de ambiente hospitalar
J Bras Patol Med Lab v 46 n 1 p 23-27 fevereiro 2010
ENDIMIAMI A et al Emergence of blaKPC-containing Klebsiella
pneumoniae in a long-term acute care hospital a new challenge to our healthcare J
Antimicrob Chemother 64 1102-1110 Nov 2009
FALAGAS M E et al Extended-spectrum beta-lactamase producing
organisms The Journal of Hospital Infection 73 (4) pp 345-54 2009
FONTANA C et al Emergence of KPC-producing Klebsiella pneumoniae in
Italy BMC Rev Notes 3 40 2010
61
GALES A C et al Antimicrobial resistance among Gram-negative bacilli
isolated from Latin America results from Sentry Antimicrobial Surveillance Program
(Latin America 2008-2010) Diagnostic Microbiology and Infectious Disease v 3 n
4 p 354 -360 2012
GUPTA N et al Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Epidemiology
and Prevention HEALTHCARE EPIDEMIOLOGY Clinical Infectious Diseases
201153(1)60ndash67 Published by Oxford University Press on behalf of the Infectious
Diseases Society of America 2011
HARBOTTLE H et al Genetics of antimicrobial resistance Anim Biotechnol
n17 p111-124 2006
HENRIQUE W N et al RESISTEcircNCIA BACTERIANA Uniatildeo das
Faculdades Alfredo NasserInstituto de Ciecircncias da Sauacutede Disponiacutevel em lt
httpwwwfaculdadealfredonasseredubrfilespesquisaposter20HENRIQUE20
Wilker20Natividade20SANTIAGO20Silvania20CAVALCANTI20DSP
20ResistC3AAncia20Bacterianapdfgt Acesso em 17 marccedilo 2014
HULSCHER M E J I et al Antibiotic prescribing in hospital a social and
behavioral scientific approach The Lancet Infectious Diaseases v 10 n 3 p 167-
165 2010
KIDWAI M SAPRA P BHUSHAN KR Synthetic strategies and medicinal
properties of beta-lactams Curr Med Chem 1999 695-215
KUMARASAMY K K et al Emergence of a new antibiotic resistance
mechanism in India Pakistan and the UK a molecular biological and
epidemiological stuy The Lancet Infectious Diseases v10 n 9 p 597- 602 2010
LINCOPAN N et al Enterobacteacuteria producing extended-spectrum β-
lacatamases and IMP-1 Metalo-β-lactamases isolated from Brazilian hospitals J Med
62
Microbiol 7 1-3 2006
LINCOPAN N et al First Isolation of Metalo-β-Lacatamase-Producing
Multiresistant Klebsiella pneumoniae from a patient in Brazil J Clin Microbiol 43(1)
516-519 2005
LIVERMORE D M et al What remains against carbapenem- resistant
Enterobacteriaceae Evaluation of choramphenicol ciprofloxacin colistina
fosfomycin minocycline nitrofurantoin temocilin and tigecycline International
Journal of Antimicrobial Agents v 37 n 5 p 415- 459 2011
LIVERMORE D M Fourten years in resistance International Journal of
Antimicrobial Agents v 39 283- 294 2012
LIVERMORE D M Bacterial resistance to carbapenems Adv Exp Med Biol
1995 39025-47
LIVERMORE D M Bacterial resistance origins epidemiology and impact
Clin Infect Dis 36S11-S23 2003
LIVERMORE D M et al Carbapenemases a problem in waiting Curr
Opin Microbiol 2000 3489-95
LU et al Universal pcr for common bacterial pathogens J CLIN
MICROBIOL VOL 38 2000
LU et al Use of PCR with Universal Primers and Restriction Endonuclease
Digestions for Detection and Identification of Common Bacterial Pathogens in
Cerebrospinal Fluid Journal of Clinical Microbiology June 2000 p 2076ndash2080
MARSCHALL J Met al Presence of the KPC Carbapenemase Gene in
Enterobacteriaceae Causing Bacteremia and Its Correlation with In Vitro
Carbapenem Susceptibility J Clin Microbiol 47 239-241 Jan 2009
63
MARTINS WMBS et al Prevalecircncia do gene blaKPC em isolados cliacutenicos
de Enterobacteriaceae e natildeo fermentadores encontrados em amostras clinicas em
um hospital universitaacuterio do Recife X Jornada de ensino pesquisa e extensatildeo ndash
JEPEX 2010 ndash UFRPE Recife 18 a 22 de outubro
MENDES C A C et al Polimixinas Revisatildeo com ecircnfase na sua
nefrotoxicidade Rev Assoc Med Bras 2009 55(6) 752-9
MOHR J F 3rd Update on the efficacy and tolerability of meropenem in the
treatment of serious bacteacuterial infections Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S41-51
2008
MONTEIRO J et al First report of KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae
strains in Brazil Antimicrob Agents Chemother Jan53(1)333-4 2009
MOREIRA V C et al Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia a antibioacuteticos
Disponiacutevel em
lthttpwwwcpglsucgbr6mostraartigosSAUDEVANESSA20CARVALHO20M
OREIRApdfgt Acesso em 21 marccedilo 2014
NETIKUL T et al Emergence of novel blaKPC-12 and blaKPC-13 variants in
carbapenem non-susceptible Enterobacter cloacae a first report of blaKPC gene in
Thailand European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases May
S372 2011
NETO V A et al Antibioacuteticos na praacutetica Meacutedica 6ordf Ediccedilatildeo Editorial
SarverSP Brasil 2007
NICOLAU D P Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of
meropenem Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S32-40 2008
64
OLIVEIRA A C et al Resistecircncia bacteriana e mortalidade em um centro de
terapia intensiva Rev Latino-Am Enfermagem nov-dez 2010
PAAUW A et al Failure to control an outbreak of qnrA 1-positive multidrug-
resistant Enterobacter clocae despite adequate implementation of recommended
infection control measures Journal of Clinical Microbiology v 45 n 5 p 1420-1425
2007
PATERSON D L et al Extended-Spectrum Beta-Lactamases a Clinical
Update Clinical Microbiology Reviews v 18 p 657-686 2005
PEIRANO G et al Carbapenem-hydrolysing beta-lactamase KPC-2 in
Klebsiella pneumonia isolated in Rio de Janeiro Brazil J Antimicrob Chemother Nov
20 2009
PERES-BOTA D et al Are infections due to resistant pathogens associated
with worse outcome in critically ill patients J Infect 200347(4)307-16
PIDDOCK L J V Clinically relevant chromosomally encoded multidrug
resistance effl ux pumps in bacterial Clin Microbiol Rev n19 p382-402 2006
PITOUT J D D et al Emergence of Enterobacteriaceae producing
extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) in the community J Antimicrob
Chemother May 56 2005
POSSEBON M I et al Resistecircncia bacteriana aos carbapenecircmicos
Bacterial resitence to carbapenems RBM rev bras med60(6)378380-378-382
jun 2003
QUEENAN A M et al Carbapenemases the versatile beta-lactamases
Clin Microbiol Rev Jul20(3)440-58 2007
65
RHOMBERG P R et al Summary trends for the meropenem yearly
susceptibility test information collection program a 10- year experience in the United
States (1999-2008) Diagnostic Microbiology and Infectiois Disease v 65 n4 p
414-426 2009
ROBLEDO I E et al Detection of KPC in Acinetobacter spp in Puerto Rico
J Antimicrob Agents Chemother 54 1354-1357 Mar 2010
ROGERS B A et al Country-to-country transfer os patients and the risk of
multi-resistant bacterial infection Clinical Infectious Disease v53 n1 p49- 56
2011
SHAH A A et al Characteristics epidemiology and clinicalimportance of
emerging strains of Gram-negative bacilli producing extended-spectrum
betalactamases Research in Microbiology v 155 p 409-421 2004
TURNER P J Extended- Spectrum Beta-Lactamases Clinical Infectious
Diseases v 41 p 273-275 2005
WOLTER D J et al Phenotypic and Enzymatic Comparative Analysis
between the Novel KPC variant KPC-5 and Its Evolutionary Variants KPC-2 and
KPC-4 Antimicrob Agents Chemother Nov 17 2008
WOODFORD N et al Carbapenemases of Chryseobacterium
(Flavobacterium) meningosepticum distribution of blaB and characterization of a
novel Metalo-beta-lactamase gene blaB3 in the type strain NCTC 10016
Antimicrob Agents Chemother Jun44(6)1448-52 2000
WOODFORF N Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in
India Pakistan and the UK a molecular biological and epidemiological study The
Lancet Infectious Diseases v 10 n 9 p 597-602 2010
66
WOODFORD et al Outbreak of Klebsiella pneumoniae Producing a New
Carbapenem- Hydrolyzing Class A β-Lactamase KPC-3 in a New York Medical
Center Antimicrobial agents and chemotherapy Dec 2004 p 4793ndash4799 Vol 48
No 12
YAGI T et al A preliminary survey of extended-spectrum β-lactamases
(ESBLs) in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Japan
FEMS Microbiology Letters 184 (2000) 53-56
YIGIT H et al Novel carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase KPC-1 from
a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumonia J Antimicrob Agents
Chemother 45 (4) 1151-1161 (2001)
ZAVASCKI A P et al KPC-2- producing Enterobacter cloacae in two cities
from Southern Brazil Int J Antimicrob Agents Apr 28 2009
ZHANEL G G et al Comparative review of the carbapenecircmicos Drugs
67(7)1027-52 2007
67
ANEXOS
Sequumlecircncia do oligo blaKPC
Query 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
Query 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
Query 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
68
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
Query 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
Query 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
69
Query 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
Query 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
Query 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
70
Sbjct 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
Query 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
Query 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
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Sbjct 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
Query 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
71
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Sbjct 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
Query 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
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Sbjct 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
Query 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
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Sbjct 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
72
Query 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
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Sbjct 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
Query 841
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Sbjct 841
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CACCTAT 900
Query 901
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73
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Query 961
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GCTCTGA 1020
Query 1021
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Query 1081
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74
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AATCTTG 1200
Query 1201
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CTTCGCC 1260
75
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TCGGCTT 1320
Query 1321
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GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
LOCUS AF297554 1377 bp
DNA linear BCT 26-MAR-2001
DEFINITION Klebsiella pneumoniae carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
gene complete cds
ACCESSION AF297554
VERSION AF2975541 GI10121874
76
KEYWORDS
SOURCE Klebsiella pneumoniae
ORGANISM Klebsiella pneumoniae
Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Enterobacteriaceae Klebsiella
REFERENCE 1 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH QueenanAM
AndersonGJ Domenech-SanchezA
BiddleJW StewardCD
AlbertiS BushK and TenoverFC
TITLE Novel carbapenem-hydrolyzing beta-
lactamase KPC-1 from a
carbapenem-resistant strain of
Klebsiella pneumoniae
JOURNAL Antimicrob Agents Chemother 45 (4)
1151-1161 (2001)
PUBMED 11257029
REFERENCE 2 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH AndersonGJ and
TenoverFC
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (19-AUG-2000) Nosocomial
Pathogens Laboratory Branch
Centers for Disease Control and
Prevention 1600 Clifton Rd MS
G08 Atlanta GA 30333 USA
FEATURES LocationQualifiers
77
source 11377
organism=Klebsiella
pneumoniae
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db_xref=taxon573
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-10_signal 7883
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hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
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CDS 1311012
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codon_start=1
transl_table=11
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
protein_id=AAG134101
db_xref=GI10121875
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KNALV
PWSPISEKYLTTGMTVAELSAAAVQYSDNAAANLLLKELGGPAGLTAFMRSIG
DTTFR
78
LDRWELELNSAIPSDARDTSSPRAVTESLQKLTLGSALAAPQRQQFVDWLKGN
TTGNH
RIRAAVPADWAVGDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTRAPNKDDK
HSEAV
IAAAARLALEGLGVNGQ
ORIGIN
1 cggggcagtt acagccgtta cagcctctgg
agagggagcg gcttgccgct cggtgataat
61 cccagctgta gcggcctgat tacatccggc
cgctacacct agctccacct tcaaacaagg
121 aatatcgttg atgtcactgt atcgccgtct
agttctgctg tcttgtctct catggccgct
181 ggctggcttt tctgccaccg cgctgaccaa
cctcgtcgcg gaaccattcg ctaaactcga
241 acaggacttt ggcggctcca tcggtgtgta
cgcgatggat accggctcag gcgcaactgt
301 aagttaccgc gctgaggagc gcttcccact
gtgcagctca ttcaagggct ttcttgctgc
361 cgctgtgctg gctcgcagcc agcagcaggc
cggcttgctg gacacaccca tccgttacgg
421 caaaaatgcg ctggttccgt ggtcacccat
ctcggaaaaa tatctgacaa caggcatgac
481 ggtggcggag ctgtccgcgg ccgccgtgca
atacagtgat aacgccgccg ccaatttgtt
541 gctgaaggag ttgggcggcc cggccgggct
gacggccttc atgcgctcta tcggcgatac
79
601 cacgttccgt ctggaccgct gggagctgga
gctgaactcc gccatcccaa gcgatgcgcg
661 cgatacctca tcgccgcgcg ccgtgacgga
aagcttacaa aaactgacac tgggctctgc
721 actggctgcg ccgcagcggc agcagtttgt
tgattggcta aagggaaaca cgaccggcaa
781 ccaccgcatc cgcgcggcgg tgccggcaga
ctgggcagtc ggagacaaaa ccggaacctg
841 cggagtgtat ggcacggcaa atgactatgc
cgtcgtctgg cccactgggc gcgcacctat
901 tgtgttggcc gtctacaccc gggcgcctaa
caaggatgac aagcacagcg aggccgtcat
961 cgccgctgcg gctagactcg cgctcgaggg
attgggcgtc aacgggcagt aaggctctga
1021 aaatcatcta ttggcccacc accgccgccc
ttgcgggcgg catggattac caaccactgt
1081 cacatttagg ctaggagtct gcgcggcaga
gccgtgtgac cggttttctg tagagcactg
1141 acgatggcgg cggcgctctc tgcaattggc
aaggcgtcgg cgccaaggat accaatcttg
1201 cggcgcgcgg cgtgttatga cgactggggt
gcatttgagc cgccccattt aaccttcgcc
1261 ctcacagata cgccattcgc ctcaaattta
gcgccatgca gacgagcttc cactcggctt
1321 gcaccttgtc caggcccctc atgctgaact
gacgcaatcc catcaccgcc ttgatca
80
51 Anaacutelise molecular 44
5 1 1 Gene blaKPC 44
5 1 2 Gene 16S rRNA 45
5 2 Anaacutelises epidemioloacutegicas 46
5 2 1 Sexo 46
5 2 2 Desfecho cliacutenico 47
5 2 3 Local da coleta 48
5 2 4 Microrganismo 48
6 DISCUSSAtildeO 53
7 CONCLUSAtildeO 57
15
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC)
Klebsiella pneumoniae pertence aacute famiacutelia Enterobacteriaceae
encontrado em locais como aacutegua solo plantas e esgoto Satildeo encontradas cinco
espeacutecies K pneumoniae K oxytoca K planticola K terrigena e K ornithinolytica
O gecircnero Klebsiella eacute definido como contendo bacilos Gram-negativos natildeo moacuteveis
em forma de bastatildeo e geralmente encapsuladas que produzem lisina
descarboxilase mas natildeo produzem ornitina descarboxilase Provavelmente a
colonizaccedilatildeo em seres humanos ocorre por contato com as diferentes fontes
ambientais podendo ser encontrada colonizando a orofaringe e fezes de pessoas
sadias Pessoas imunocomprometidas a bacteacuteria encontra um ambiente favoraacutevel
para seu crescimento levando aos quadros de infecccedilatildeo (MOREIRA et al 2014)
A Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) eacute uma enzima produzida por
enterobacteacuterias gram-negativas sendo um mecanismo de resistecircncia aos antimi-
crobianos carbapenecircmicos meropenen ertapenen eou imipenen classe
amplamente utilizada no tratamento de infecccedilotildees envolvendo Enterobacteriaceae
Ela tambeacutem eacute capaz de inativar os agentes β-lactacircmicos cefalosporinas penicilinas
e o aztreonam (COTRIM et al 2012)
Devido agrave semelhanccedila estrutural e estereoquiacutemica os antibioacuteticos beta-
lactacircmicos possuem um mecanismo de accedilatildeo comum ao grupo Eles atuam inibindo
a siacutentese da parede celular bacteriana atraveacutes do mecanismo de bloqueio da
transpeptidaccedilatildeo responsaacutevel pela uniatildeo dos componentes individuais do
peptidoglicano conforme demonstrado na figura 1 (KIDWAI et al 1999)
A accedilatildeo destes antibioacuteticos eacute atraveacutes de ligaccedilotildees covalentes com as proteiacutenas
as Penicilim-Binding-Protein (proteiacutena de ligaccedilatildeo da penicilina- PBP ou PLP) que se
encontram presentes na membrana citoplasmaacutetica de todas as bacteacuterias Devido agraves
mutaccedilotildees ocorre uma induccedilatildeo na alteraccedilatildeo dessas proteiacutenas podendo determinar
uma diminuiccedilatildeo da afinidade dos beta-lactacircmicos agraves mesmas A accedilatildeo dos
carbapenecircmicos eacute atraveacutes da sua ligaccedilatildeo agraves PBPs presentes na parede bacteriana
especialmente as PBP1 e PBP2 provocando a lise osmoacutetica da bacteacuteria Aleacutem
disso eles tecircm uma facilidade na penetraccedilatildeo da bacteacuteria por meio dos canais
poriacutenicos presentes nas bacteacuterias gram-negativas induzindo um efeito poacutes-
16
antibioacutetico Quando comparados com outros beta-lactacircmicos os carbapenecircmicos
satildeo mais resistentes agrave hidroacutelise pela maioria das beta-lactamases tanto
cromossocircmicas como plasmiacutedicas (LIVERMORE 1995 LIVERMORE et al 2000)
Figura 1 Accedilatildeo do szlig-lactacircmico sobre a bacteacuteria gram-positiva e gram-
negativa Fonte
ltlthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controle
opas_webmodulo3gramn_lacta2htmgt (adaptado)
A bacteacuteria Klebsiella pneumoniae quando apresenta gene ESBL pode
expressar resistecircncia a ateacute 95 dos antimicrobianos existentes no acircmbito
farmacecircutico sendo a produccedilatildeo de beta-lactamases de espectro estendido (ESBL)
17
por esta bacteacuteria uma das principais causas de falha terapecircutica Existem outras
formas de resistecircncia emergentes de grande importacircncia como a produccedilatildeo de
beta-lactamases tipo adenosina monofosfato ciacuteclico (AmpC) que hidrolizam
cefoxitina as carbapenemases como as metalo-beta-lactamases (MBL) e
carbapenemases tipo KPC (MOREIRA et al 2014)
O mecanismo de resistecircncia mais comum aos antibioacuteticos beta-lactacircmicos de
amplo espectro eacute a produccedilatildeo de ESBL por enterobacteacuterias A accedilatildeo hidroliacutetica
apresentadas por estas enzimas pode conferir clinicamente resistecircncia ao
aztreonam cefalosporina e a todas as penicilinas (PATERSON et al 2005) As
ESBL satildeo enzimas mediadas por genes plasmidiais (transmissiacuteveis entre as
espeacutecies) Os principais microrganismos produtores de ESBL satildeo Klebsiella
pneumoniae (mais encontrada) Escherichia coli e Proteus mirabilis podendo ocorrer
em outros membros da famiacutelia Enterobacteriaceae e em alguns microrganismos natildeo
enteacutericos como Acinetobacter ssp (TURNER 2005) A importacircncia cliacutenica meacutedica
destes microrganismos portadores de ESBL eacute que graccedilas aacutes suas resistecircncias a
muitas classes de antimicrobianos o tratamento de infecccedilotildees eacute difiacutecil gerando um
aumento da morbidade e mortalidade dos pacientes (SHAH et al 2004)
A enzima KPC foi detectada pela primeira vez na Carolina do Norte Costa
Leste dos Estados Unidos no ano de 1996 em Klebsiella pneumoniae dando entatildeo
este nome a enzima Em pouco tempo ela disseminou por outras regiotildees e
recentemente tornou-se uma das preocupaccedilotildees quanto agrave sauacutede puacuteblica mundial
Os paiacuteses de onde KPCs tecircm sido relatados desde 2001 satildeo mostrados na figura 2
apresentando como os organismos tecircm agora sido disseminados amplamente pelo
mundo (NEIL GUPTA et al 2011)
18
Figura 2 Divulgaccedilatildeo internacional de Enterobacteriaceae produtora de
Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC)( NEIL GUPTA et al 2011)
Este mapa apresenta paiacuteses onde Enterobacteriaceae produtoras KPC de
foram descritos em relatoacuterios publicados disponiacuteveis a partir de 11 fevereiro de
2011 Os paiacuteses natildeo destacadas nesta figura tambeacutem podem apresentar a presenccedila
de Enterobacteriaceae produtoras de KPC poreacutem pode ter tido uma falta de
vigilacircncia sistemaacutetica para estes organismos ( NEIL GUPTA et al 2011)
No ano de 2005 foram registradas pela primeira vez essas bacteacuterias
produtoras de carbapenemases Apoacutes 6 anos deste primeiro relato elas passaram a
causar surtos mais graves em nosso paiacutes Em janeiro de 2011 foram notificados no
Distrito FederalBrasil 367 casos em um curto espaccedilo de tempo (01 a 08 de janeiro
de 2011) com 26 oacutebitos A maior parte destes casos (263 casos) foi identificada nas
unidades de terapia intensiva ndash UTI (COTRIM et al 2012)
O potencial de disseminaccedilatildeo da KPC eacute alto devido agrave grande capacidade de
transferecircncia do seu material geneacutetico e por conseguinte os genes de resistecircncia
O controle de epidemias eacute difiacutecil devido a esta caracteriacutestica de faacutecil disseminaccedilatildeo
preocupando os profissionais da aacuterea de sauacutede devido agrave dificuldade de tratamento
podendo resultar em um aumento das taxas de mortalidade Apesar da maior
19
frequumlecircncia em Klebsiella pneumoniae a KPC pode ser identificada em outras
bacteacuterias como a Enterobacter cloacae Citrobacter freundii Salmonella spp E coli
e Pseudomonas spp (DIENSTMANN et al 2010)
Os pacientes com comorbidades incluindo pacientes transplantados
neutropecircnicos em ventilaccedilatildeo mecacircnica em Unidade de Terapia Intensiva (UTI)
com longos periacuteodos de internaccedilatildeo que apresentam risco aumentado de infecccedilatildeo ou
colonizaccedilatildeo para bacteacuterias multirresistentes satildeo mais vulneraacuteveis a Klebsiella
pneumoniae produtora de KPC (COTRIM et al 2012)
Os sinais e sintomas apresentados por um indiviacuteduo infectado por KPC satildeo
febre ou hipotermia taquicardia piora do quadro respiratoacuterio e em casos mais
graves hipotensatildeo inchaccedilo e sepse Quanto ao siacutetio de infecccedilatildeo a bacteacuteria que
possui a enzima KPC pode causar pneumonia associada agrave ventilaccedilatildeo mecacircnica
infecccedilatildeo do trato urinaacuterio infecccedilatildeo de corrente sanguiacutenea infecccedilatildeo de partes moles
e outros tipos de infecccedilatildeo (COTRIM et al 2012)
Para desenvolver a infecccedilatildeo a colonizaccedilatildeo eacute um preacute-requisito poreacutem o
pacientes pode estar colonizado ou seja ser portadores de KPC e natildeo desenvolver
a infecccedilatildeo (ALVES et al 2013) A forma de transmissatildeo eacute basicamente por
contato com secreccedilatildeo ou excreccedilatildeo de pacientes infectados ou colonizados logo
fora do ambiente hospitalar a bacteacuteria natildeo representa perigo (COTRIM et al
2012)
As opccedilotildees terapecircuticas para o tratamento da Klebsiella pneumoniae eacute
dividida em Terapia Empiacuterica e Terapia apoacutes a determinaccedilatildeo do perfil de
sensibilidade A terapia empiacuterica para infecccedilotildees por enterobacteacuterias multirresistentes
se baseia na utilizaccedilatildeo de polimixina B ou polimixina E (Colistina) em associaccedilatildeo
com um (1) ou mais dos antimicrobianos da classe dos aminoglicosiacutedeos
(gentamicina ou amicacina) Carbapenecircmicos (meropenem ou doripenem) eou
tigeciclina (ANVISA 2013)
Recomenda-se usar sempre associaccedilotildees de dois ou trecircs antimicrobianos
sendo um deles a polimixina B ou a polimixina E (colistina) Deve-se evitar a
utilizaccedilatildeo de monoterapias pelo risco de raacutepido desenvolvimento de resistecircncia A
escolha do(s) faacutermaco(s) de associaccedilatildeo com polimixina B ou E deve se basear
preferencialmente no perfil de susceptibilidade esperado aos referidos
20
medicamentos das enterobacteacuterias resistentes aos carbapenecircmicos detectadas no
hospital ou na ausecircncia de dados locais na regiatildeo Deve-se considerar igualmente
o local de infecccedilatildeo e a penetraccedilatildeo esperada do antimicrobiano na escolha da droga
a ser utilizada na combinaccedilatildeo (ANVISA 2013)
Apoacutes a liberaccedilatildeo do perfil de sensibilidade deve-se adequar o uso dos
medicamentos Sempre que possiacutevel manter no miacutenimo 2 (dois) faacutermacos com
sensibilidade comprovada in vitro Natildeo havendo sensibilidade a um segundo
medicamento (suscetibilidade apenas agrave polimixina B ou E) recomenda-se manter a
terapia combinada de polimixina B ou E com carbapenecircmicos (meropenem ou
doripenem) ou tigeciclina na tentativa de ocorrecircncia de sinergismo entre elas
(ANVISA 2013)
Sugere-se aleacutem da determinaccedilatildeo das Concentraccedilotildees Inibitoacuterias Miacutenimas
(CIMs) para uma das polimixinas (B ou E) que tambeacutem sejam determinadas as
CIMs de tigeciclina e carbapenecircmicos (meropenem) bem como a consultoria de um
infectologista (ou Comissatildeo de Controle de Infecccedilatildeo Hospitalar- CCIH) para a
determinaccedilatildeo da terapia combinada com base na interpretaccedilatildeo do antibiograma
CIM e quadro cliacutenico do paciente No caso de resistecircncia agraves polimixinas
(concentraccedilotildees inibitoacuterias miacutenimas [CIMs] gt 2 mgL) recomenda-se a associaccedilatildeo de
dois ou trecircs do antimicrobianos sugeridos para a combinaccedilatildeo (ANVISA 2013)
A antissepsia eficiente do ambiente dos instrumentos ciruacutergicos e das matildeos
com o uso do aacutelcool a 70 eacute fundamental para a contenccedilatildeo de surtos Aleacutem disto
os pacientes contaminados devem permanecer isolados ateacute o controle da infecccedilatildeo
para evitar a disseminaccedilatildeo da bacteacuteria (COTRIM et al 2012)
1 2 Resistecircncia bacteriana
Hoje a disseminaccedilatildeo e a proliferaccedilatildeo das bacteacuterias resistentes estatildeo cada
dia mais presente As bacteacuterias multirresistentes (BRMD) poderatildeo levar agrave
humanidade a uma era poacutes-antibioacutetica resultando em uma ausecircncia de qualquer
opccedilatildeo de tratamento para os portadores destas cepas (HENRIQUE et al 2014)
Os fatores envolvidos na disseminaccedilatildeo desses patoacutegenos multirresistentes
satildeo diversos incluindo o uso irracional de antimicrobianos procedimentos invasivos
21
(cirurgias implantaccedilatildeo de proacuteteses meacutedicas e outros) e a transferecircncia de material
geneacutetico com a informaccedilatildeo de resistecircncia a antibioacuteticos entre as bacteacuterias
(DIENSTMANN et al 2010 ENDIMIAMI et al 2009 FONTANA et al 2010)
Com a praacutetica da antibioticoterapia principalmente em ambientes
nosocomiais os mecanismos de resistecircncia tornaram-se comuns Esses
mecanismos incluem alteraccedilatildeo na permeabilidade da membrana celular que
impede a entrada do antibioacutetico na ceacutelula bombeamento do antibioacutetico para fora da
mesma pelo mecanismo de efluxo mutaccedilatildeo geneacutetica que altera de alguma forma o
alvo do antibioacutetico e consequumlentemente natildeo afeta o funcionamento da bacteacuteria
bem como desenvolvimento da capacidade de degradar ou da inativaccedilatildeo do
antibioacutetico (COTRIM et al 2012) Estes mecanismos estatildeo representados na figura
3
Figura 3 Mecanismos de resistecircncia bacteriana Fonte
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controle
opas_webmodulo3pop_mecanismohtmgt
Um dos mais importantes mecanismos de resistecircncia eacute a alteraccedilatildeo do local-
alvo onde atua determinado antimicrobiano de modo a impedir a ocorrecircncia de
qualquer efeito inibitoacuterio ou bactericida As bacteacuterias podem adquirir um gene que
22
codifica um novo produto resistente aos antimicrobianos substituindo o alvo original
por exemplo o Staphylococcus aureus resistente agrave oxacilina e estafilococos
coagulase-negativos adquiriram o gene cromossocircmico Mec A e produzem uma PBP
ou PLP resistente aos β-lactacircmicos denominada 2a ou 2 que eacute suficiente para
manter a integridade da parede celular durante o crescimento quando outras PBPs
essenciais satildeo inativadas por antibimicrobianos β-lactacircmicos Como alternativa um
gene receacutem-adquirido pode atuar para modificar um alvo tomando-o menos
vulneraacutevel a determinado antimicrobiano Assim um gene transportado por
plasmiacutedeo ou por transposon codifica uma enzima que inativa os alvos ou altera a
ligaccedilatildeo dos antimicrobianos como ocorre com eritromicina e clindamicina (ANVISA
2007)
Em funccedilatildeo da bomba de efluxo pode variar a especificidade do antibioacutetico
Ele atua por meio do bombeamento ativo de antimicrobianos do meio intracelular
para o extracelular gerando uma resistecircncia bacteriana a determinados
antimicrobianos como eacute o caso da resistecircncia agraves tetraciclinas codificada por
plasmiacutedeos em Escherichia coli devido agrave presenccedila de proteiacutenas integrantes da
membrana plasmaacutetica bacteriana (PIDDOCK 2006)
O aumento da siacutentese de proteiacutenas eacute o principal responsaacutevel pela resistecircncia
antimicrobiana devido agraves vaacuterias mutaccedilotildees que ocorrem em seus repressores
transcricionais Estas mutaccedilotildees tambeacutem podem influenciar levando a um aumento
da eficiecircncia do transporte dos antibioacuteticos para o exterior da ceacutelula (HARBOTTLE
et al 2006)
A resistecircncia aos antibioacuteticos eacute frequumlentemente associada agrave alteraccedilatildeo
diminuiccedilatildeo da permeabilidade que ocorre na membrana externa das bacteacuterias gram-
negativas O fluxo de moleacuteculas para o interior da ceacutelula ocorre por caracteriacutesticas
peculiares como carga estrutura e dimensatildeo e atraveacutes de proteiacutenas de membrana
as quais formam canais Este percurso eacute utilizado pelos antibioacuteticos para atingir o
interior da ceacutelula bacteriana ou o espaccedilo periplasmaacutetico como eacute o caso dos
antibioacuteticos β-lactacircmicos Portanto a perda de funccedilatildeo destas proteiacutenas pode
efetivamente causar a diminuiccedilatildeo da susceptibilidade a vaacuterios antibioacuteticos
(LIVERMORE 2003)
23
Os mecanismos de resistecircncia que podem impedir a accedilatildeo de antimicrobianos
satildeo vaacuterios O faacutermaco atua de forma a inibir os processos essenciais a multiplicaccedilatildeo
e sobrevivecircncia da ceacutelula bacteriana como a membrana citoplasmaacutetica e
consequumlentemente bloqueando a siacutentese proteacuteica de aacutecidos nucleacuteicos e da parede
celular A resistecircncia bacteriana eacute um mecanismo natural de defesa Sendo assim
as bacteacuterias estatildeo em constante defesa e para cada novo faacutermaco desenvolvido as
bacteacuterias iratildeo desenvolver resistecircncia em algum momento (POSSEBON et al
2003)
O grupo de antibioacuteticos beta-lactacircmicos satildeo amplamente utilizado e se
encontram dentro da classe dos melhores agentes antimicrobianos com relevacircncia
cliacutenica No entanto o seu uso tem sido restringido devido a vaacuterios mecanismos de
resistecircncia O desenvolvimento dos carbapenecircmicos surgiu devido agrave proliferaccedilatildeo de
beta-lactamases mediadas por plasmiacutedeos e cromossomos (POSSEBON et al
2003)
A bacteacuteria KPC tem um gene chamado SHV-1 que tem a caracteriacutestica de
resistecircncia a quase todos os tipos de antimicrobianos inclusive os carbapenecircmicos
especiacuteficos para o tratamento de infecccedilotildees por bacteacuterias multiresistentes e
emergecircncias Mesmo com no seu coacutedigo geneacutetico a informaccedilatildeo necessaacuteria para o
desenvolvimento da resistecircncia a resistecircncia da bacteacuteria soacute eacute desenvolvida caso a
bacteacuteria entre em contato com o antibacteriano desencadeando todo o processo
nos casos de resistecircncia induzida comuns em KPC (MOREIRA et al 2014)
A resistecircncia bacteriana pode ser apresentada de forma intriacutenseca ou
adquirida A resistecircncia intriacutenseca faz parte das caracteriacutesticas fenotiacutepicas naturais
do microrganismo ou seja faz parte de sua heranccedila geneacutetica sendo transmitida
verticalmente a prole sem perda da caracteriacutestica A presenccedila ou ausecircncia do alvo
para a accedilatildeo da droga eacute o principal determinante deste tipo de resistecircncia
(MOREIRA et al 2014) Essa resistecircncia corresponde a uma caracteriacutestica de
espeacutecie bacteriana quando estes microrganismos satildeo naturalmente resistentes a
certo tipo de antibioacutetico Este processo eacute decorrente da ausecircncia de estruturas de
atuaccedilatildeo de antimicrobianos ou a impermeabilidade por parte de estruturas
perifeacutericas das bacteacuterias (HENRIQUE et al 2014)
24
A resistecircncia adquirida aos antibioacuteticos por sua vez ocorre quando haacute uma
da mutaccedilatildeo de genes reguladores ou estruturais aquisiccedilatildeo de genes de resistecircncia
veiculados por elementos geneacuteticos moacuteveis ou da combinaccedilatildeo entre eles Este
aparecimento de resistecircncia em uma espeacutecie bacteriana era anteriormente sensiacutevel
a droga e devido a um destes fatores se torna resistente O fenoacutetipo resultante
desta resistecircncia natildeo estaraacute presente nas ceacutelulas genitoras e sim nos indiviacuteduos de
uma linhagem bacteriana derivada de um organismo susceptiacutevel Os genes muitas
vezes satildeo adquiridos por meio de elementos moacuteveis como plasmiacutedeos e
transposons (MOREIRA et al 2014)
Entatildeo a resistecircncia adquirida ocorre por diversos mecanismos geneacuteticos tais
como produccedilatildeo de enzimas inativadoras interferecircncia com a entrada e acuacutemulo de
droga na bacteacuteria alteraccedilatildeo do receptor para accedilatildeo da droga via metaboacutelica
alternativa Eacute originada por meio de uma alteraccedilatildeo a niacutevel geneacutetico da ceacutelula de
natureza cromossocircmica pelos processos de mutaccedilatildeo transduccedilatildeo e transformaccedilatildeo
ou extra cromossocircmica (plasmidial) (HENRIQUE et al 2014)
Como todo antibioacutetico β-lactacircmicoos carbapenecircmicos tem como mecanismo
de accedilatildeo a inibiccedilatildeo da siacutentese proteacuteica atraveacutes da accedilatildeo de inibiccedilatildeo da parede
microbiana fazendo a ligaccedilatildeo e inativaccedilatildeo das proteiacutenas ligadoras de penicilinas
(NETO et al 2007)
Imipenem e meropenem antibioacuteticos pertencentes ao grupo dos
carbapenecircmicos possuem um amplo espectro de accedilatildeo in vitro incluindo atividade
contra cocos gram-positivos bacilos gram-negativos e bacteacuterias anaeroacutebias (MOHR
2008) Jaacute o ertapenem possui um espectro de accedilatildeo mais limitado que o os dois
antibioacuteticos anteriormente citados tendo uma eficiecircncia limitada contra os bacilos
gram-negativos natildeo fermentadores Um novo antibioacutetico carbapenecircmico ainda natildeo
disponiacutevel no Brasil doripenem possui uma atividade mais potente principalmente
contra Pseudomona aeruginosa devido ao seu mecanismo de accedilatildeo que combina os
espectros de accedilatildeo de imipenem e meropenem (ZHANEL et al 2007)
Devido as suas estabilidades espectro de accedilatildeo poucos relatos de
resistecircncia boa toleracircncia pelos pacientes com efeitos adversos mais comuns as
complicaccedilotildees no siacutetio da infusatildeo e toxicidade gastrintestinal estes antibioacuteticos
carbapenecircmicos tecircm sido considerados terapia de escolha (NICOLAU 2008) Como
25
uma resposta adaptativa das Enterobacteacuterias o iacutendice de resistecircncia aos
carbapenecircmicos tem aumentado nos uacuteltimos anos de forma proporcional ao seu
uso limitando imensamente as opccedilotildees terapecircuticas para as infecccedilotildees causadas por
estes microrganismos (FALAGAS et al 2009)
As enzimas produtoras de betalactamases hidrolisam o anel betalactacircmico
tornando este mecanismo de resistecircncia o mais importante Os dois grupos mais
preocupantes satildeo o grupo das betalactamases de aspecto ampliado e os da
carbapenemases que aleacutem de hidrolizar os carbapenecircmicos hidrolizam todas as
outras classes de betalactacircmicos Em enterobacteacuterias as carbapenemases mais
prevalentes satildeo codificadas por genes dos grupos blaKpc blaIMP blaVIM blaNdm
e blaOxa A ocorrecircncia de carbapenemases eacute mais frequentemente em bacteacuterias
gram-negativas fermentadoras da glicose conhecidas como enterobacteacuterias
predominantes nos gecircneros Klebsiella Serratia Citrobacter Enterobacter
Escherichia Samonella Proteus Morganella Podem ser encontradas tambeacutem em
bacteacuterias gram-negativas natildeo fermentadoras como espeacutecies de Acinetobacter e de
Pseudomonas (ALVES et al 2013)
Carbapenemases satildeo enzimas plasmiacutedio-mediados resistentes a todos
antibioacuteticos betalactacircmicos As bacteacuterias que possuem o gene blaKpC responsaacutevel
pela codificaccedilatildeo da produccedilatildeo de carbapenemases apresentam resistecircncia aos
antibioacuteticos betalactacircmicos impedindo a accedilatildeo destes antibioacuteticos contra infecccedilotildees
(ALVES et al 2013)
A transmissatildeo das carbapenemases a diferentes cepas de enterobacteacuterias se
daacute atraveacutes de plasmiacutedeos que satildeo pequenas moleacuteculas circulares de DNA com a
capacidade de se replicarem independentemente do DNA cromossocircmico
permitindo a troca de material geneacutetico entre gecircneros e espeacutecies diferentes de
enterobacteacuterias O raacutepido desenvolvimento de surtos em ambientes hospitalares eacute
explicado por essa disseminaccedilatildeo plasmidial (COTRIM et al 2012)
De acordo com o criteacuterio de interpretaccedilatildeo do Clinical and Laboratory
Standards Institute (CLSI 2009) a maioria das KPC isoladas natildeo apresenta
resistecircncia completa aos carbapenecircmicos (Imipenem e Meropenem apresentam
uma Concentraccedilatildeo Inibitoacuteria Miacutenima (CIM) de 2-8 μgmL) (COTRIM et al 2012)
26
Os mecanismos de resistecircncia capazes de impedir a accedilatildeo dos
carbapenecircmicos satildeo vaacuterios Poreacutem a degradaccedilatildeo de antibioacuteticos por enzimas
principalmente as carbapenemases constituem o principal mecanismo de
resistecircncia aos antibioacuteticos β-lactacircmicos (DIAS 2009) Devido a ampla atividade
hidroliacutetica agrave maioria dos antibioacuteticos β-lactacircmicos estes grupos de enzimas possuem
alta versatilidade (QUEENAM et al 2007)
Existem trecircs grandes classes moleculares de Ambler a qual as
carbapenemases pertencem denominadas classe A (serino-carbapenemases os
quais incluem membros designados SME IMI NMC GES e a famiacutelia das KPCs)
classe B(as metalo-β-lactamase incluem os tipos IMP e VIM) e classe D
(oxacilinases similares as da classe A e incluem as OXA e PSE) (DIAS 2009)
Dentre estes as mais importantes e prevalentes encontradas em plasmiacutedeos
de Klebsiella pneumoniae satildeo as KPC (DIENSTMANN et al 2010) Por meio de
estudos moleculares a enzima KPC jaacute foi documentada em diferentes bacteacuterias e
diferenciada em KPC-1 a 13 (NETIKUL et al 2011) No ano de 2009 foi realizada
uma pesquisa onde descreveram as seguintes carbapenemases KPC-1 em isolados
de Klebsiella pneumoniae KPC-2 em K pneumoniae K oxytoca Salmonella
enterica e em Enterobacter sp e KPC-3 em K pneumoniae e Enterobacter cloacae
(MONTEIRO et al 2009) As enzimas KPC-4 e KPC-5 foram encontradas em
isolados de Pseudomonas aeruginosa (PEIRANO et al 2009)
Foi observada uma correccedilatildeo da sequumlecircncia KPC-1 indicando que o gene
blaKPC-1 e blaKPC-2 satildeo idecircnticos Trecircs novas variantes blaKPC-3 blaKPC-4 e
blaKPC-5 satildeo resultados de mutaccedilotildees do gene estrutural da enzima KPC-2
(WOLTER et al 2008) apresentando diferentes perfis de hidroacutelise As enzimas
KPC-2 e KPC-3 possuem alta eficiecircncia em hidrolisar cefalotina cefaloridina e
nitrocefin poreacutem possuem uma menor eficiecircncia contra carbapenecircmicos e
cefotaxima (ALBA et al 2005) As enzimas KPC-5 e KPC-4 apresentam menor
hidroacutelise de carbapenecircmicos eacute do que em KPC-2 Em contrapartida possuem
melhor eficiecircncia contra ceftazidima e uma maior inibiccedilatildeo pelo aacutecido clavulacircnico
(WOLTER et al 2008)
27
13 Anaacutelise geneacutetica de microrganismos
Eacute de extrema importacircncia praacutetica natildeo soacute no aspecto cliacutenico mas tambeacutem na
fitopatologia biotecnologia e estudos ambientais a correta identificaccedilatildeo e
classificaccedilatildeo de microrganismos Os meacutetodos usados na diferenciaccedilatildeo de gecircneros
espeacutecies e estirpes de microrganismos podem ser divididos em meacutetodos fenotiacutepicos
(baseados em fenocircmenos bioquiacutemicos fisioloacutegicos e bioloacutegicos) e genotiacutepicos
(detectam polimorfismos ao niacutevel dos aacutecidos nucleacuteicos ou variaccedilatildeo aleacutelica ao niacutevel
de enzimas) (ALVES et al 2003)
Para este tipo de estudo existem alguns meacutetodos como o RFLPrsquos -
ldquoRestriction Fragment Length Polymorphismsrdquo (polimorfismos de tamanho de
fragmentos de restriccedilatildeo) rep-PCR (Meacutetodo de tipagem baseado na amplificaccedilatildeo via
PCR de elementos de DNA repetitivos presentes em genomas bacterianos) anaacutelise
de sequumlecircncias nucleotiacutedeas (discriminaccedilatildeo eou identificaccedilatildeo atraveacutes de sequumlecircncias
de DNA) PFGE - Pulsed-Field Gel Electrophoresis (Eletroforese em campo
pulsado) ( A L V E S et al 2003)
A diferenciaccedilatildeo clara da cepa e principalmente a alta reprodutibilidade devem
ser caracteriacutesticas de qualquer meacutetodo de tipagem geneacutetica Poreacutem nem todos os
meacutetodos moleculares de tipagem satildeo igualmente eficazes Sendo assim de acordo
com a finalidade pretendida (identificaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo custo reprodutibilidade
etc) eacute feita a escolha do meacutetodo a ser aplicado (A L V E S et al 2003)
O processo de identificaccedilatildeo fenotiacutepica de KPC entre os membros da famiacutelia
Enterobacteriaceae ainda eacute difiacutecil e os meacutetodos para a sua identificaccedilatildeo devem ser
revistos e ajustados Mesmo com o avanccedilo tecnoloacutegico natildeo existem ensaios que
combinam alta especificidade e sensibilidade na detecccedilatildeo destas enzimas Satildeo
diversas as metodologias usadas para rastreamento de KPC como por exemplo a
focalizaccedilatildeo isoeleacutetrica a teacutecnica de disco-difusatildeo E-test teste de Hodge
modificado dentre outros Aleacutem disso a pesquisa do gene blaKPC pode ser feita
pela Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) Os sistemas de automaccedilatildeo
existentes no entanto podem natildeo identificar com precisatildeo os isolados KPC
positivos (COTRIM et al 2012)
A identificaccedilatildeo blaKPC pelo PCR eacute um meacutetodo raacutepido preciso sensiacutevel e
altamente especiacutefico no entanto a PCR exige equipamento e conhecimentos
28
especializados em diagnoacutestico molecular dificultando ainda a utilizaccedilatildeo dele na
rotina dos laboratoacuterios de microbiologia (COTRIM et al 2012)
Em estudo de infecccedilotildees hospitalares identificaccedilatildeo molecular de patoacutegenos
bacterianos eacute bastante utilizada Para diferenciar carbapenemases tipo KPC a partir
de outros tipos como SME NMC-A-IMI e GES eacute necessaacuterio um exame molecular
As identificaccedilotildees do microrganismo juntamente com a triagem molecular iratildeo definir
um resultado mais especiacutefico podendo ser usado para identificar o antibioacutetico mais
adequado para o tratamento Poreacutem a principal desvantagem de alguns exames
baseados em PCR por exemplo eacute que devido agrave sua limitada capacidade de
multiplexaccedilatildeo eles distinguem apenas algumas variaccedilotildees (MOREIRA et al 2014)
Estatildeo descritas para a identificaccedilatildeo molecular de patoacutegenos pertencentes agrave
famiacutelia Enterobacteriaceae as teacutecnicas de PFGE RAPD (randomly amplified
polymorphic DNA) e ERIC-PCR (Enterobacterial Repet it ive Intergenic Consensus)
A PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) eacute considerada padratildeo ouro devido sua
alta capacidade de diferenciaccedilatildeo baseada na anaacutelise do perfil de restriccedilatildeo do DNA
genocircmico por meio de eletroforese Como desvantagem para a sua execuccedilatildeo eacute
necessaacuterios vaacuterios dias impedindo a tipagem de algumas cepas bacterianas devido
agrave degradaccedilatildeo do DNA aleacutem do alto custo empregado (MOREIRA et al 2014)
O meacutetodo baseado em ERIC-PCR tem sido bastante utilizado como uma
alternativa para a teacutecnica de PFGE Esta teacutecnica consiste na anaacutelise do padratildeo de
amplificaccedilatildeo de elementos repetidos encontrados no genoma bacteriano Isto
permite uma maior rapidez na obtenccedilatildeo de resultados quando comparada com o
PFGE aleacutem de alta reprodutibilidade simples execuccedilatildeo e implementaccedilatildeo baixo
custo e natildeo sem problemas com a degradaccedilatildeo do DNA (MOREIRA et al 2014)
A PCR eacute considerada uma teacutecnica de biologia molecular revolucionaacuteria que
consiste na siacutentese enzimaacutetica de coacutepias de aacutecidos nucleacuteicos Ela permitiu o raacutepido
desenvolvimento do estudo de sequumlecircncias de aacutecidos nucleacuteico Foi desenvolvida por
Kary Banks Mullis que ganhou o precircmio Nobel de quiacutemica de 1993 devido ao
desenvolvimento dessa teacutecnica em abril de 1983 (CAMARGO et al 2014)
Por meio de etapas de variaccedilatildeo de temperatura a teacutecnica de PCR promove a
duplicaccedilatildeo de cadeias de DNA in vitro A reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo de DNA por PCR
envolve o emprego de sequumlecircncias iniciadoras (primers) quatro nucleotiacutedeos
29
(dNTPrsquos) do DNA e uma DNA polimerase termoestaacutevel podendo assim obter-se a
partir de uma fita molde muitas coacutepias de uma sequumlecircncia especiacutefica de aacutecido
nucleacuteico O princiacutepio da PCR consiste na variaccedilatildeo de temperatura por ciclo
envolvendo trecircs etapas baacutesicas desnaturaccedilatildeo pareamento e amplificaccedilatildeo
(CAMARGO et al 2014)
A desnaturaccedilatildeo da fita molde de DNA eacute uma etapa com duraccedilatildeo entre 30
segundos a 1 minuto a temperatura entre 92 ordmC a 96 ordmC Apoacutes isso o pareamento de
dois iniciadores sinteacuteticos de composiccedilotildees distintas que funcionam como os
iniciadores da reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo liga-se agrave regiatildeo complementar da fita de
DNA alvo que sofreraacute a duplicaccedilatildeo Esta etapa tem duraccedilatildeo de 30 segundos a 1
minuto a temperatura entre 58 ordmC e 65 ordmC Por uacuteltimo a amplificaccedilatildeo por meio da
enzima Taq DNA polimerase das novas fitas de DNA se daacute a partir de cada um dos
iniciadores utilizando os quatro dNTPrsquos como substrato da reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo
Esta etapa possui duraccedilatildeo entre 45 segundos e 1 minuto a 72 ordmC Cada ciclo eacute
repetido em torno de 30 a 35 vezes e promove a amplificaccedilatildeo da regiatildeo alvo
determinada conforme o anelamento dos iniciadores sinteacuteticos de DNA (CAMARGO
et al 2014) Estas etapas estatildeo demonstradas na figura 4
Figura 4 Etapas da Reaccedilatildeo de PCR
30
2 JUSTIFICATIVA
No ano de 2010 no Distrito Federal foram identificados 111 pacientes com
suspeita de infecccedilatildeo por Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) e a
Secretaria de Sauacutede do Distrito Federal confirmaram ainda a morte de 18 pacientes
dentre os hospitais puacuteblicos e particulares Um desafio encontrado por ocasiatildeo do
surto infeccioso no Distrito Federal foi o de confirmar as KPCs por Reaccedilatildeo da
Polimerase em Cadeia sendo que as amostras foram enviadas com esta finalidade
para a Fiocruz no Rio de Janeiro
Pesquisas que possam contribuir na elaboraccedilatildeo de estrateacutegias preventivas e
de intervenccedilatildeo para infecccedilotildees causadas por enterobacteacuterias bem como contribuir
para gerar uma integraccedilatildeo beneacutefica entre a equipe acadecircmica e os serviccedilos de
sauacutede devem ser estimuladas Neste sentido o presente estudo permitiu escrutinar
os genes envolvidos na expressatildeo de carbapenemases presentes em espeacutecies de
enterobacteacuterias isoladas em ambiente hospitalar visto que elucidar genes de
resistecircncia de enterobacteacuterias aos antibioacuteticos carbapenecircmicos eacute o primeiro passo
para garantir um controle epidemioloacutegico efetivo para estes tipos de microorganismo
assim como sua associaccedilatildeo com surtos fatais particularmente em pacientes com
baixa imunidade
31
3 OBJETIVOS
31 Objetivo geral Caracterizar os genes de resistecircncia das
Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases e os aspectos epidemioloacutegicos de
pacientes internados em um hospital puacuteblico do Distrito Federal
32 Objetivos Especiacuteficos
Identificar genotipicamente a enzima KPC (Klebsiella pneumoniae
carbapenemase) de isolados de Klebsiella pneumoniae
Investigar aspectos epidemioloacutegicos dos pacientes portadores de
Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases
Identificar quais variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana influenciaram para o
desfecho oacutebito ou alta
Avaliar a susceptibilidade das Enterobacteacuterias aos antibioacuteticos
carbapenecircmicos dos pacientes em ambiente hospitalar
32
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
Trata-se de um estudo transversal onde foi realizado o teste de
susceptibilidade das enterobacteacuterias aos antibioacuteticos carbapenecircmicos a partir dos
materiais bioloacutegicos coletados dos pacientes internados no Hospital Regional da Asa
Norte (HRAN) e enviados ao Laboratoacuterio de Anaacutelises Cliacutenicas da mesma Instituiccedilatildeo
Os materiais bioloacutegicos investigados foram sangue aspirado traqueal ou brocircnquico
urina e cultura semi quantitativa de ponta de cateter venoso central O HRAN eacute um
hospital puacuteblico do Distrito Federal com 395 leitos sendo as cliacutenicas de internaccedilatildeo
Berccedilaacuterio Cirurgia Geral Cirurgia Plaacutestica Cliacutenica Meacutedica Ginecologia Maternidade
Pediatria Queimados UTI com atendimento a pacientes portadores de doenccedilas de
caraacuteter cliacutenico e ciruacutergico
4 1 Coleta e transporte das amostras bioloacutegicas
As amostras foram coletadas de pacientes internados no Hospital Regional da
Asa Norte (HRAN) com suspeitas de infecccedilatildeo por KPC A identificaccedilatildeo primaacuteria foi
realizada pelo Laboratoacuterio de Microbiologia do hospital de origem dos pacientes e os
demais procedimentos que foram utilizados na identificaccedilatildeo encontram-se descritos
abaixo
4 2 Procedimentos para confirmaccedilatildeo de resistecircncia bacteriana por
disco de ertapenem (adaptado CDC 2004)
Para diagnosticar amostra como portadora de bacteacuteria produtora de
carbapenemase foi realizado o teste com disco de ertapenem como forma de
triagem Inicialmente utilizou-se o swab contaminado com a amostra que foi
distribuiacuteda em uma pequena aacuterea da placa de aacutegar MacConkey para apoacutes o
crescimento ser realizada a pesquisa de colonizaccedilatildeo por enterobacteacuterias resistentes
aos carbapenecircmicos (Pesquisa de CRE) Procedeu-se a semeadura por teacutecnica
semi-quantitativaesgotamento com alccedila bacterioloacutegica na diluiccedilatildeo de 1100 O disco
de Ertapenem foi colocado na superfiacutecie da placa de MacConkey na junccedilatildeo dos dois
primeiros campos de semeadura conforme demonstrado na figura 5 Incubou a placa
33
em estufa aeroacutebia a 35ordmC por 24 e 48 horas e observou-se o halo de difusatildeo do
disco de Ertapenem na placa para proceder agrave leitura
O teste deixou de ser obrigatoacuterio apoacutes a modificaccedilatildeo dos criteacuterios
interpretativos para carbapenecircmicos para enterobacteacuterias publicados no suplemento
do CLSI 2010 M100-S20-U
Figura 5 Mecanismo de semeamento de material bioloacutegico oriundos de
pacientes com suspeita de infecccedilatildeo por KPC Fonte adaptado CDC 2004
4 2 1 Interpretaccedilatildeo dos resultados
Na ausecircncia de crescimento ateacute 24 horas (MacConkey) ou halo de difusatildeo
gt27 mm na placa deve-se reincubar as placas por mais 24 horas Quando for
ausente o crescimento apoacutes 48 horas ou halo de difusatildeo gt27 mm na placa libera-se
como enterobacteacuterias resistentes a carbapenecircmicos (KPCNEG)Havendo
crescimento de colocircnias na placa de MacConkey com halo lt 27 mm (apenas para
colocircnias com crescimento dentro do halo) deve-se reisolar e realizar identificaccedilatildeo e
antibiograma automatizado teste de sensibilidade por disco-difusatildeo e Teste de
Hodge Modificado (THM) Os isolados de enterobacteacuterias cujos testes comprovarem
a resistecircncia aos carbapanecircmicos testados (KPCPOS) foram reportado a Comissatildeo
de Controle de Infecccedilatildeo Hospitalar (CCIH) Jaacute osbacilos Gram-negativos natildeo
fermentadores natildeo foram reportados (KPCNEG) Para interpretaccedilatildeodos resultados
foram utilizados os valores conforme demonstrados na tabela 1
Tabela 1 Criteacuterios Interpretativos para testes de sensibilidade
ENTEROBACTEacuteRIAS
Disco difusatildeo (mm) MIC (microgml)
34
Antibioacutetico Sigla S I R S I R
Ertapenem 10
microg
ETP 22 19-
21
18 05 1 2
Meropenem 10
microg
MEM 23 20-
22
19 1 2 4
Fonte Manual Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)
2013
Os resultados que apresentaram resistecircncia ao antibioacutetico Ertapenem foram
considerados como suspeitos de contaminaccedilatildeo por KPC Fez-se o teste de
susceptibilidade aos antibioacuteticos (TSA) em aparelho automatizado MicroScan Walk
Away 96sl Dade Behring
4 3 Teste de susceptibilidade aos antibioacuteticos (adaptado CDC 2004)
A determinaccedilatildeo da susceptibilidade dos isolados foi feita pelo teste de
susceptibilidade aos antibioacuteticos (TSA) apoacutes cultura em meio de gelose simples
(INSA) para avaliaccedilatildeo da sua pureza e obtenccedilatildeo de colocircnias isoladas Para
preparaccedilatildeo de uma suspensatildeo bacteriana com turvaccedilatildeo aproximada de 05
McFarland (Dade BehringMicroScanregTurbidity Meter) ressuspendeu duas a cinco
colocircnias em 2ml de soro fisioloacutegico esteacuteril diluindo a 1100 em soro fisioloacutegico num
volume total de 10ml em seguida foi feita uma semeadura em duas placas
quadradas (120mm x 120mm) de Muller-Hinton Agar (INSA) por inundaccedilatildeo
Os discos de antibioacutetico carbapenecircmicos imipenem meropenem e
ertapenem (Biorad) foram aplicados com o auxiacutelio de um dispensador automaacutetico A
susceptibilidade das Enterobacteacuterias aos carbapenecircmicos foi definida de acordo
com o protocolo Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI 2011)
Para aquelas Enterobacteacuterias que apresentaram resistecircncia ao ertapenem
foram realizados o Teste de Hodge Modificado para Detecccedilatildeo de Enterobacteacuterias
Produtoras de Carbapenemases conforme descrito pelo Centers for Disease Control
and Prevention (CDC 2004)
35
4 4Teste de Hodge Modificado (THM) (adaptado CDC 2004)
Preparou-se uma suspensatildeo em salina esteacuteril com a cepa Escherichia coli
ATCC 25922 (padratildeo 05 de McFarland) Apoacutes isto diluiu a suspensatildeo 110 em
salina (05 ml da soluccedilatildeo de Ecoli ATCC 25922 + 45 ml salina)Foi entatildeo semeado
na superfiacutecie de uma placa de Agar Muller-Hinton com a suspensatildeo diluiacuteda de Ecoli
ATCC 25922 com auxilio de swab seco assegurando que houvesse uma
distribuiccedilatildeo uniforme cobrindo toda a superfiacutecie do Agar Deixou secar por 3 a 5
minutos em temperatura ambienteColocou-se o disco de ertapenem 10microg no centro
da placa e apoacutes isto fez-se uma estria linear da cepa a ser testada da borda do
disco ateacute a borda da placa utilizando uma alccedila calibrada 10 microl ou um swab Incubou
a placa na estufa em atmosfera aeroacutebia a 35 plusmn 2ordmC por 16 a 24 horas
441 Controle de qualidade (CQ)
Foi utilizado um CQ todos os dias em que se realizou o teste tendo como
controle Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1705- teste de Hodge modificado
positivo Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1706- teste de Hodge modificado
negativo
442 InterpretaccedilatildeoResultados
Apoacutes 16ndash24 horas de incubaccedilatildeo examinar as placas para verificar a presenccedila
de uma distorccedilatildeo no halo de inibiccedilatildeo do disco de ertapenem devido ao crescimento
realccedilado da cepa ATCC na intersecccedilatildeo do organismo teste e a Ecoli ATCC 25922
dentro dos limites do halo O THM positivo apresentaraacute presenccedila de distorccedilatildeo no
halo de inibiccedilatildeo de ertapenem devido ao crescimento da cepa Ecoli ATCC 25922 ao
longo da estria da cepa teste para dentro dos limites do halo de inibiccedilatildeo Jaacute o THM
negativo teraacute ausecircncia de crescimento da cepa Ecoli ATCC 5922 ao longo da estria
da cepa teste para dentro dos limites do halo de inibiccedilatildeo do disco de ertapenem
Este resultado estaacute representado na figura 6
36
Figura 6 Interpretaccedilatildeo resultado do Teste de Hodge Modificado
(adaptado CDC 2004) Teste positivo na estria da cepa teste na parte superior
da placa teste negativo na estria da cepa teste na parte inferior da placa
Tendo positivo como resultado o paciente era um provaacutevel contaminado por
KPC As amostras entatildeo foram encaminhadas para a Fundaccedilatildeo Osvaldo Cruz
(FIOCRUZ) para confirmaccedilatildeo final As amostras finalmente confirmadas como
positivas para KPC foram isoladas e guardadas no banco de cepas cliacutenicas do
hospital Apoacutes a autorizaccedilatildeo do CEP amostras das cepas foram transferidas para
meio de transporte Stuard em caixa teacutermica fechada em baixa temperatura e
levadas para o laboratoacuterio de microbiologia cliacutenica da universidade
No laboratoacuterio da universidade as amostras foram separadas e realizadas
repiques em meios MacConkey e incubadas por 24h As colocircnias caracteriacutesticas
foratildeo isoladas em caldo BHI e mantidas em shaker a 37oC por 2h Apoacutes isto foram
executadas as anaacutelises a seguir
Os isolados de Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases foram
submetidos agrave extraccedilatildeo de DNA e posterior sequumlenciamento para identificaccedilatildeo dos
genes de resistecircncia blaKPC de 1 a 13 e identificaccedilatildeo do gene universal Os
pacientes de onde os materiais bioloacutegicos contendo as Enterobacteacuterias produtoras
de carbapenemases foram os isolados foram investigados quanto aos aspectos
epidemioloacutegicos e cliacutenicos
37
4 5 Extraccedilatildeo de DNA bacteriano
A extraccedilatildeo de DNA bacteriano foi realizada utilizando o kit NucleoSpin
Plasmidreg (MN) Antes de iniciar a extraccedilatildeo foi feito a preparaccedilatildeo das soluccedilotildees
reagentes materiais e amostras (vortexando) colocou-se em banho-maria agrave 50ordmC o
tampatildeo AW Partiu-se de colocircnias isoladas cultivadas que sofreram passagem em
meio LB liacutequido por 12h Adicionou-se 15 mL da amostra no tubo eppendorf
centrifugou por 5 minutos descartou o sobrenadante (com cuidado para natildeo
descartar o Pellet) Repetiu-se este procedimento por mais trecircs vezes completando-
se o volume de 6mL Foram adicionados 250microL do tampatildeo Resuspension Buffer A1
encostando a ponteira no Pellet e misturando (este tampatildeo tem como funccedilatildeo
separar a formaccedilatildeo de grumos celulares) Apoacutes isso homogeneizou e vortexou os
tubos eppendorfs Apoacutes isso foram adicionados 250microL do tampatildeo Lysis Buffer A2
homogenizou e deixou descansar por 5 minutos (esta etapa eacute importante para a lise
da parede e da membrana celulares e liberaccedilatildeo do conteuacutedo da ceacutelula)
Passado o tempo de descanso foi adicionado 300microL do tampatildeo
Neutralization Buffer A3 homogeneizou e centrifugou por 10 minutos (este tampatildeo
iraacute retirar as proteiacutenas que envolvem o DNA e voltaraacute com o pH para proacuteximo de 8
impedindo que a soluccedilatildeo de lise facilite a quebra das ligaccedilotildees covalentes do aacutecido
nucleacuteico) Em seguida enumeraram-se os tubos contendo filtros com siacutelica
transferiu-se o sobrenadante para o filtro e centrifugou por 5 minutos Descartou-se
o que foi filtrado adicionou 500microL do tampatildeo AW (banho-maria) centrifugou por 2
minutos Novamente foi descartado o filtrado Adicionou-se 600microL do tampatildeo A4
centrifugou por 2 minutos e descartou o filtrado (os tampotildees AW e A4 contecircm
isotiocianato de guanidina em concentraccedilotildees crescentes para facilitar a adsorccedilatildeo
do DNA na siacutelica e retirada das outras biomoleacuteculas da amostra) Foi feita outra
centrifugaccedilatildeo com o tubo vazio Apoacutes isto o filtro foi trocado para outro eppendorf
definitivo onde foi adicionado 50microL do tampatildeo Elution Buffer AE (este tampatildeo
favorece a eluiccedilatildeo do DNA) centrifugou por 2 minutos descartou o filtro e
armazenou as amostras em freezer -20ordmC
38
4 6 Iniciadores e reaccedilatildeo de PCR
Os iniciadores universais para o gene blaKPC foram desenhados baseados
em sequumlecircncias conservadas apresentadas pelos sub-grupos de genes que
codificam a enzima carbapenemase de klebsiella pneumoniae (YIGIT et al 2001)
Baseado na sequumlecircncia para o blakpc-1 depositada no GenBank
(AF2975541) o oligonucleotiacutedio (oligo) iniciador direto (5-
ATGTCACTGTATCGCCGTC-3rsquo) foi desenhado para reconhecer a sequumlecircncia
blaKPC na posiccedilatildeo (131149) enquanto que o iniciador reverso (5-
TTACTGCCCGTTGACGCC-3rsquo) foi reconhecido na posiccedilatildeo (9951012) As anaacutelises
baseadas em alinhamento de sequumlecircncias mostraram que o par de iniciadores
blaKPC podem detectar os alelos de 1 a 13 do gene blaKPC conforme a tabela 2
Tabela 2 Nuacutemero de acesso ao GenBank dos alelos blaKPC e seus
microrganismos originais
Nuacutemero de
Acesso GenBank
Microrganismo Alvo
AF2975541 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-1
GU0862251 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-2
HQ2589341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-2-like
AB5577341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC -3
EU4473041 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-4
EU4002222 Pseudomonas
aeruginosa
blaKPC-5
EU5555341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-6
EU7297271 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-7
39
FJ2344121 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-8
FJ624872 Escherichia coli blaKPC-9
GQ1403481 Acinetobacter
baumannii
blaKPC-10
HM0669951 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-11
HQ3428891 Enterobacter cloacae blaKPC-12
HQ3428901 Enterobacter cloacae blaKPC-13
As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo de blaKPC foram realizadas em um
primeiro tempo de desnaturaccedilatildeo em que foi 94ordmC por 5 minutos seguido de 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 58 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 90 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 78ordmC por 8 minutos Aleacutem das amostras foi utilizado um
controle negativo
A PCR do blaKPC foi realizada utilizando os componentes para o volume da
reaccedilatildeo de 25 microL citados na tabela 3 A banda do tamanho do produto de PCR foi de
881 pares de bases (pb) o que corresponde ao plasmiacutedeo
Tabela 3 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do
gene blaKPC
Reagente Volume
DNA molde 4 microL
Tampatildeo Taq 25 microL
MgCl2 075 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP
2 microL
Oligo F 1 microL
Oligo R 1 microL
Taq DNA polimerase 05 microL
Aacutegua MiliQ 1335 microL
40
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
Baseado na sequumlecircncia para o gene 16S rRNA em que o oligonucleotiacutedio
Universal iniciador direto foward (5-CCAGCAGCCGCCGTAATACG-3rsquo) foi
desenhado para reconhecer a sequumlecircncia universal na posiccedilatildeo 1513 enquanto que o
iniciador reverso (5-ATCGGYTACCTTGTTACGACTTC-3rsquo) foi reconhecido na
posiccedilatildeo 1491 foram realizadas PCRrsquos As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo deste
gene foram realizadas nos seguinte tempos separaccedilatildeo 94ordmC por 10 minutos 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 55 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 120 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 72ordmC por 10 minutos
A PCR do gene 16S rRNA foi realizada utilizando os componentes para o
volume da reaccedilatildeo de 25microL citados na tabela 4 A banda do tamanho do produto de
PCR foi de 996 pb correspondente aacute regiatildeo ribossomal capaz de amplificar todas
as espeacutecies
Tabela 4Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do gene
universal
Reagente (quantidade
concentraccedilatildeo do estoque)
Volume
DNA molde 10 ng 4 microL
Tampatildeo Taq 10 x 25 microL
MgCl2 50mM 125 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP 25 mM
125 microL
Oligo F 10microM 05 microL
Oligo R 10microM 05 microL
Taq DNA polimerase 5UmicroL 04 microL
Aacutegua Miliq 146 microL
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
41
O termociclador utilizado para os experimentos foi o LifeTouch da BIOER
4 7 Digestatildeo
Para realizaccedilatildeo da digestatildeo foi utilizada a enzima BshF I (Hae III) EN- 1105
tamanho 7000 units concentraccedilatildeo 10 unitsmicroL fonte Bacillus sphaericus empresa
Jena bioscienceUtilizaram-se os componentes para o volume de 50microL da reaccedilatildeo
citados na tabela 5
Tabela 5 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da digestatildeo do gene
universal
Reagente Volume
Produto de PCR 10 microL
Enzima BshF I 01 microL
Tampatildeo (10x) 5 microL
Aacutegua Miliq 349 microL
Total (em cada ependorff) 50 microL
Valores para 1 digestatildeo
Os ependorffs foram colocados por 30 minutos em banho-maria a 37ordmC Apoacutes
isso fez-se a corrida das amostras em gel de agarose para verificaccedilatildeo do resultado
(LU et al 2000)
4 8 Eletroforese em gel de agarose
Os produtos de DNA PCR e digestatildeo foram analisados em gel de agarose
2 O tempo de corrida do gel eacute de aproximadamente 1hora e 30minutos sendo
que no comeccedilo foi usada agrave voltagem de 50 V e apoacutes comeccedilar a correr o gel
aumentou a voltagem para 100 v Utilizou-se o marcador de 100pb (pares de bases)
Foi adicionado 3microL de corante Bromophenol (que tem a funccedilatildeo de fazer uma ligaccedilatildeo
na amostra de DNA e permitir a visualizaccedilatildeo da corrida no gel de agarose) em 7microL
de amostra tanto de DNA quanto de PCR Para o preparo do gel foi utilizado TBE
42
(Tris- Aacutecido Boacuterico) agarose e brometo de etiacutedio (sua funccedilatildeo eacute de corante para o gel
e permitir a visualizaccedilatildeo do DNA quando colocado agrave luz ultravioleta) Para o oligo
blaKPC a banda da amplificaccedilatildeo foi em 881ppb correspondendo ao plasmiacutedeo Jaacute
o oligo Universal foi em 996 pb
4 9 Descarte de resiacuteduos
Todos os materiais utilizados nos ensaios foram de uso uacutenico e manipulados
em cacircmaras de seguranccedila bioloacutegica classe II Apoacutes o uso foram colocados em
soluccedilatildeo desinfetantes (hipoclorito a 1) e em seguida autoclavados a 127oC por 20
min em sacos apropriados para autoclavaccedilatildeo Apoacutes a finalizaccedilatildeo do ciclo de
esterilizaccedilatildeo os sacos contendo o material descartaacutevel foram colocados em
recipientes de coleta da empresa responsaacutevel pela coleta de materiais bioloacutegicos
produzidos no laboratoacuterio de microbiologia Todos os procedimentos seguiram a
normativa RDC-ANVISA 3062004 sobre o descarte de resiacuteduos de serviccedilo de
sauacutede
4 10 Aspectos epidemioloacutegicos e cliacutenicos
Os aspectos cliacutenicos e epidemioloacutegicos foram investigados por meio de
prontuaacuterios dos pacientes portadores de enterobacteacuterias produtoras de
carbapenemases e envolveram topografia mais provaacutevel do foco infeccioso a
enfermidade motivadora da internaccedilatildeo o desfecho cliacutenico a idade e o tempo de
internaccedilatildeo
4 12 Anaacutelises eepidemioloacutegicas
As anaacutelises foram realizadas com o pacote estatiacutestico SPSS versatildeo 200
Para verificar quais variaacuteveis referentes aos dados epidemioloacutegicos e
microbioloacutegicos influenciaram no desfecho verificou- se a diferenccedila meacutedia das
variaacuteveis idade e tempo de internaccedilatildeo em cada grupo O teste estatiacutestico utilizado foi
o teste t de Student apoacutes se executar o teste de normalidade de Shapiro-Wilk Para
as variaacuteveis sexo perfil microbioloacutegico das enterobacteacuterias produtoras de
43
carbapenemases foi avaliada a associaccedilatildeo com o desfecho por meio do teste Exato
de Fisher O niacutevel de significacircncia adotado foi de 5
4 13 Preceitos eacuteticos
Este projeto estaacute inserido em um projeto maior denominado ldquoEpidemiologia
cliacutenica e caracterizaccedilatildeo molecular do Acinetobacter Baumannii resistente a
antibioticoterapia em pacientes internado em hospitais do Sistema Uacutenico de Sauacutederdquo
que foi submetido ao Comitecirc de Eacutetica em Pesquisa da Secretaria do Estado de
Sauacutede do Distrito Federal (SESDF) e emitido parecer aprovado pelo protocolo nordm
23109 (anexo)
44
5 RESULTADOS
51 Anaacutelise molecular
Para a amplificaccedilatildeo com o oligo blaKPC foram amplificadas amostras
que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 881 pb correspondente ao
plasmiacutedeo A anaacutelise da amplificaccedilatildeo da regiatildeo do gene blaKPC mostrou que
apenas a amostra A10 natildeo amplificou isso demonstra que esta amostra natildeo
possuiacutea o gene de resistecircncia
5 1 1 Gene blaKPC
Figura 7 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 881 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
A amostra A3 natildeo amplificou no primeiro momento entatildeo foi realizado
novamente a PCR e corrida de gel obtendo entatildeo a amplificaccedilatildeo da amostra como
apresentado na figura 8
45
Figura 8 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC da
mostra A3 estudada A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo de 881
pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 1 2 Gene 16S rRNA
Para a amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA utilizou-se o oligo universal Foram
amplificadas amostras que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 996 pb
Figura 9 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
46
Segundo Lu et al (2000) a digestatildeo com a enzima HaeIII deste amplicons de
16S rRNA devolveriam bandas com perfis entre 150 a 200 pb No gel abaixo eacute
possiacutevel evidenciar que este perfil ocorreu com o predomiacutenio de bandas na altura
de 200pb
Figura 10 Gel de agarose a 2 da digestatildeo do amplicon do gene 16S
rRNA das amostras com a enzima HaeIII evidenciando diversos fragmentos
proacuteximos a 200 pb A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo ribossomal
de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 2 Anaacutelises epidemioloacutegicas
5 2 1 Sexo
No total foram detectados 17 isolados de KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 onde a maior a prevalecircncia foi
detecatada em amostras de pacientes do sexo masculino (53) do que no sexo
feminino (47)
47
Figura 11 Isolado de KPC segundo sexo dos 17 pacientes investigados
no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 2 Desfecho cliacutenico
Em 17 isolados de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo
de 2010 aacute 2011 a porcentagem de pacientes que foram a oacutebito (59) foi maior que
a de pacientes que tiverm alta (41)
Figura 12 Isolado de KPC segundo desfecho cliacutenico dos 17 pacientes
investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
48
5 2 3 Local da coleta
Dos 17 episoacutedios detectados de infecccedilatildeo por KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 a infecccedilatildeo em swab retalfoi mais
frequente (47) seguida de ponta de cateacuteter (18) e secreccedilatildeo traqueal (12)
Figura 13 Isolados de KPC segundo local da coleta da amostra nos 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 4 Microorganismo
O microorganismo mais encontrado foi a Klebsiella pneumoniae (82)
seguida da Enterobacter clocae (12) e Serratia marcescens (6) dos 17 isolados
de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 Isto afirma o
fato de a sigla KPC ser utilizada de forma errocircnea aacute Klebsiella pneumoniae visto
que a evidecircncia dela eacute maior em relaccedilatildeo as outras cepas
49
Figura 14 Isolado de KPC segundo microrganismo encontrado em 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 5 Relaccedilotildees variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana e desfecho
cliacutenico
Tabela 6 ndash Distribuiccedilatildeo do perfil geneacutetico sexo coleta tipificaccedilatildeo de
microrganismos e anaacutelise da resistecircncia bacteriana segundo o desfecho
cliacutenico Brasiacutelia-DF 2010 a 2011
Variaacutevel Resultado
Desfecho
Alta Oacutebito
N N P
Gene 16S rRNA Positivo 7 1000 10 1000
NA Gene blaKPC Positivo 6 857 10 1000
Negativo 1 143 0 00 0218 Sexo Feminino 2 286 6 600
Masculino 5 714 4 400 0201 Local da coleta Fundo saco de
Douglas 1 143 0 00
Hemocultura 0 00 1 100 0463 Ponta de cateter 1 143 2 200
Sec TraquealBrocircnquica
0 00 1 100
50
Secreccedilatildeo traqueal 2 286 0 00
Swab retal 3 429 5 500
Urina 0 00 1 100
Microrganismo Enterobacter cloacae (KPC)
1 143 1 100
Klebsiella pneumoniae
6 857 8 800
0416 Serratia
marcescens 0 00 1 100
Teste de Hodge Hodge positivo 7 1000 10 1000
NA Amicacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 1 100 0848 resistente 0 00 1 100
sensiacutevel 2 286 3 300
Amoxicilina Aacutecido Clavulacircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Ampicilina Sulbactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ampicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Aztreonan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefazolina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Cefoperazona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Cefotaxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefoxitina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0509 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 2 286 4 400
Ceftazidima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cetriaxona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 3 429 5 500 0772 Cefalotina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ciprofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772
51
resistente 3 429 5 500
Claritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Clindamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Eritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Gentamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0942 resistente 2 286 3 300
sensiacutevel 1 143 2 200
Imipenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 0 00 2 200 0193 Resistente 1 143 3 300
sensiacutevel 2 286 0 00
Nitrofurantoiacutena sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Norfloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Oxacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Penicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Piperacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Rifampicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tetraciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Ticarcilina Aacutecido Clavulocircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0688 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 3 429 4 400
Tobramicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Trimetoprima Sulfametoxazol
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0112 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 2 286 0 00
Vancomicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tigeciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediario 0 00 1 100 0211 natildeo testado 1 143 4 400
resistente 2 286 0 00
52
Cefepime sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefuroxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Levofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Piperacilina Tazobactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Ertapenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Meropenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0223 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 1 143 0 00
Cefotetan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 sensiacutevel 0 00 1 100
Gemifloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 7 700 0585 natildeo testado 3 429 3 300
Desfecho
Alta Oacutebito
Meacutedia Erro
padratildeo Meacutedia Erro
padratildeo p
Idade 58 9 59 5 0991
Tempo Internaccedilatildeo (dias)
50 13 46 12 0571
n= 17 p(lt 005) NA natildeo se aplica
53
6 DISCUSSAtildeO
Nos uacuteltimos anos houve um aumento na incidecircncia de bacteacuterias
multirresistentes aos antimicrobianos no ambiente hospitalar tornando isto um
problema mundial de sauacutede puacuteblica (HULSCHER et al 2010) Quando se trata
principalmente de bacilos Gram negativos a frequumlecircncia destas bacteacuterias eacute ainda
maior em paiacuteses da Ameacuterica Latina quando comparada a paiacuteses desenvolvidos
(GALES etal 2012)
De acordo com dados do ldquoMeropenem Yearly Susceptibility Test Information
Collectionrdquo (MYSTIC) ocorreu nos Estados Unidos um aumento na susceptibilidade
de K pneumoniae nos uacuteltimos anos graccedilas a praacuteticas de controle de disseminaccedilatildeo
de amostras resistentes(RHOMBERG P R et al 2009) O aumento crescente da
prevalecircncia destes microrganismos foi proporcional ao aumento da dependecircncia do
uso de antibioacuteticos carbapenecircmicos considerados como a opccedilatildeo terapecircutica para o
tratamento de infecccedilotildees por bacilos Gram negativos multi-resistentes (LIVERMORE
2012) Isto afeta diretamente as opccedilotildees de tratamento sobrando poucas alternativas
para a terapecircutica que incluem colistina (polimixina E) e tigeciclina que apresentam
respectivamente problemas em termos de toxicidade e eficaacutecia (LIVERMORE et
al 2011) Um dos efeitos adversos mais importantes das poliminas B e E por
exemplo satildeo a neurotoxicidade e nefrotoxicidade (MENDES C A C et al2009 )
Devido agrave resistecircncia ser usualmente de natureza plasmidial e portanto de
maior disseminaccedilatildeo especialmente quando carreadas por K pneumoniae
microrganismo com uma notoacuteria capacidade para acumular e transferir plasmiacutedeos
com determinantes para resistecircncia o nuacutemero de casos detectados pelo
fenoacutetipogenoacutetipo blaKPC eacute bastante preocupante (MONTEIRO et al 2009)
Comparada com outras bacteacuterias hospitalares a transmissatildeo de clones
multirresistentes de K pneumoniae eacute maior e podem natildeo ser controladas pelos
meacutetodos de controle de infecccedilatildeo hospitalar (PAAUW et al 2007) A forma
plasmidial para transferecircncia da resistecircncia adicionada a este grande potencial para
disseminaccedilatildeo de clones resistentes eacute preocupante visto que apoacutes surtos muitas
vezes pode se tornar endecircmica Jaacute eacute uma realidade a disseminaccedilatildeo desta bacteacuteria
54
entre pacientes hospitais paiacuteses e ateacute mesmo continentes (WOODFORF et al
2010 ROGERS et al 2011)
As chances de surtos satildeo maiores em paiacuteses com poucos recursos devido agrave
maior carecircncia de praacuteticas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees hospitalares e o
uso irracional de antimicrobianos de forma empiacuterica e inadequada (KUMARASAMY
et al 2010) Ateacute o momento os mecanismos de resistecircncia aos cabapenecircmicos
geralmente encontrado eram a produccedilatildeo de ESBL (CTX-M) somada aacute perda de
porina (CARVALHAES et al 2010) Foi notado a partir do ano de 2008 um
aumento no nuacutemero de K pneumoniae produtoras de KPC-2 apresentando outra
forma de resistecircncia (GALES 2012)
Um estudo mostrou que o perfil do paciente colonizado ou infectado por KPC
foi de um paciente entre os 33 e os 82 anos de idade internado haacute mais de 1
semana no hospital A mortalidade geral nos uacuteltimos anos ficou em torno de 7
sendo que dos 77 pacientes estudados 32 (415) pacientes evoluiacuteram para oacutebito
evidenciando a alta morbi-mortalidade associada (ALVES A P et al 2013)
Em estudo com 2316 pacientes avaliados a populaccedilatildeo de sexo masculino foi
de 526 idade meacutedia global de 53 anos (mediana de 55 anos) permanecircncia meacutedia
de 58 dias (mediana de 3 dias) (OLIVEIRA A C et al 2010) Outros trabalhos
apresentaram ausecircncia de significacircncia entre sexoidade e o desenvolvimento de
infecccedilotildees por microrganismos resistentes (PERES-BOTA D et al 2003 COLPAN
A et al 2005 COELLO R et al 1997)
Outro estudo utilizou um total de 30 amostras sendo elas isoladas de urina
escarro secreccedilatildeo pleural ponta de cateter aspirado traqueal e hemocultura A mais
prevalente foi em urina (40) Entre as 30 cepas analisadas a maior porcentagem
foi da cepa Klebsiella pneumoniae (70) Enterobacter sp (133) Klebsiella
ozaenae (10) Escherichia coli (333) e Klebsiella oxytoca (333)
(DIENSTMANN R et al 2010) Nos Estados Unidos a enzima KPC jaacute se tornou
endecircmica Foi realizada uma pesquisa em dois hospitais de Nova York onde
testaram 602 amostras e 45 apresentaram algum mecanismo de resistecircncia
sendo apenas 33 confirmadas por biologia molecular como KPC-2 (BRATU et
al 2005)
55
Estudo sobre os tipos de ESBL feito no Japatildeo apresentou o tipo Toho-1 como
o mais prevalente nessa pesquisa Ateacute o ano de 2000 ano em que foi publicado tal
estudo este era o primeiro relatoacuterio no Japatildeo para identificar derivados de ESBLs
como tipo de SHV e TEM entre E coli e K pneumoniae Em especial o tipo SHV- 12
foi identificado com uma maior frequumlecircncia Estes resultados indicam que tipos
distintos de ESBLs que satildeo diferentes em sua especificidade de substrato e origem
geneacutetica coexistem no Japatildeo Isto mostra a importacircncia de caracterizar genoacutetipos
distintos de ESBLs e de estar em alerta continuamente para as tendecircncias de
ESBLs no Japatildeo aleacutem da necessidade de uma interpretaccedilatildeo uniforme utilizando as
diretrizes do CSLI para relatar cepas produtoras de ESBL Aleacutem da detecccedilatildeo de
ESBLs satildeo necessaacuterias mais informaccedilotildees tais como o perfil de sensibilidade
especiacutefica para diversas β-lactacircmicos e o local da infecccedilatildeo Esses fatores satildeo
essenciais para a escolha adequada de antibioacuteticos (YAGI T et al 2000)
No ano de 2004 uma pesquisa avaliou a produccedilatildeo de uma enzima de
hidroacutelise de carbapenecircmicos atraveacutes da teacutecnica de sequumlenciamento foi revelado
um novo membro da famiacutelia KPC designado KPC- 3 Pesquisadores encontraram
em um mutante de K pneumoniae uma substituiccedilatildeo de um gene associado com
resistecircncia a Imipenem mas essa substituiccedilatildeo foi considerada improvaacutevel na
contribuiccedilatildeo da resistecircncia aos carbapenecircmicos da espeacutecie estudada Aleacutem da
resistecircncia aos carbapenecircmicos estes isolados eram em sua maioria resistentes agraves
cefalosporinas penicilinas e aminoglicosiacutedeos Usando estudos de transformaccedilatildeo
conjugaccedilatildeo e hibridaccedilatildeo localizaram o alelo blaKPC em plasmiacutedeo aleacutem disso
mostraram que esse alelo tambeacutem carregava uma resistecircncia aos aminoglicosiacutedeos
A transferecircncia das enzimas KPCs foi demonstrada in vitro tanto neste como em
outros estudos pode ser que os plasmiacutedeos que fazem esta transferecircncia estavam
comeccedilando a se espalhar no ambiente cliacutenico resultando na multiresistecircncia dessas
estirpes (WOODFORD et al 2004)
O presente estudo apresentou um vieacutes quanto aos resultados dos testes de
susceptibilidade microbiana Observou-se que natildeo foi encontrado resultado deste
teste em algumas amostras o que natildeo cooperou para um estudo mais preciso
futuros estudos quanto agraves amostras e um melhor acompanhamento deste tipo de
patologia Poreacutem mesmo sem algumas amostras com este resultado disponiacutevel foi
56
confirmada a presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos
carbapenecircmicos por meio dos genes de resistecircncia blaKPC e 16S rRNA que as
amostras apresentaram em sua maioria serem portadoras Quanto aos resultados
estatiacutesticos nenhuma das variaacuteveis apresentou significacircncia estatiacutestica (p gt 005)
mostrando assim que estas variaacuteveis isoladas natildeo foram o fator determinante para
o desfecho cliacutenico de alta ou oacutebito
57
7 CONCLUSAtildeO
Os genes blaKPC e 16S rRNA foram caracterizados confirmando a a
presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos carbapenecircmicos
Houve uma maior prevalecircncia da cepa K pneumoniae e isto confirma outros
estudos que apresentam a maior prevalecircncia desta cepa em amostras com KPC
Aleacutem disso isso justifica a forma popular da K pneumoniae ser chamada de KPC
enquanto que na verdade KPC eacute uma enzima podendo estar presente em outras
cepas como Enterobacter clocae tambeacutem apresentada no presente estudo O
desfecho cliacutenico de oacutebitos maior que 50 eacute um possiacutevel indicador sobre a
necessidade de se realizar um teste raacutepido para identificaccedilatildeo de KPC visando
iniciar o mais raacutepido possiacutevel o tratamento afim de diminuir a mortalidade por esta
infecccedilatildeo
Nenhuma das variaacuteveis isoladamente estaacute relacionada ao desfecho cliacutenico
oacutebito ou alta pois natildeo apresentaram relevacircncia estatiacutestica O presente estudo
mostrou que haacute presenccedila da bacteacuteria nas amostras de pacientes do hospital
estudado podendo entatildeo afirmar que este tipo de bacteacuteria se encontra tambeacutem
presente em ambiente hospitalar O uso irracional de antimicrobiano eacute demonstrado
de forma indireta quando foi apresentado atraveacutes do Teste de Hodge Modificado
uma resistecircncia de 100 aos antibioacuteticos carbapenecircmicos Isto tambeacutem reflete na
terapecircutica sendo que pacientes portadores de bacteacuterias resistentes aos
antibioacuteticos carabepecircmicos tem uma escassa opccedilatildeo de tratamento e as opccedilotildees
apresentam problemas quanto agrave toxicidade e eficaacutecia
58
REFEREcircNCIAS
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Mecanismos
de resistecircncia bacteriana aos antimicrobianos Disponiacutevel em
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controleopas_
webmodulo3mec_sitiohtmgt Acesso em 25 de abril de 2014
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Nota teacutecnica nordm
012013 medidas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees por enterobacteacuterias
multiresistentes Acesso em 17 de abril de 2013
ALBA J et al Kinetics study of KPC-3 a plasmid-encoded class A
carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase Antimicrob Agents Chemother
Nov49(11)4760-2 2005
ALVES A P et al Nosocomial infections by KPC-producing enterobacteria in
a tertiary hospital in Southern Brazil Revista da AMRIGS Porto Alegre 57 (3) 213-
218 jul-set 2013
ALVES A et al Tipagem Geneacutetica de Microrganismos Lab De Diversidade
Microbiana Centro de Biologia Celular Dep de Biologia U de Aveiro 3810-193
Aveiro- 2003
BELL J M et Al Prevalence and significance of a negative extended-
spectrum beta-lactamase (ESBL) confirmation test result after a positive ESBL
screening test result for isolates of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae
results from the SENTRY Asia-Pacific Surveillance Program J Clin Microbiol
May45(5)1478-82 2007
BRATU S et al Detection of KPC carbapenem-hydrolyzing enzymes in
Enterobacter spp from Brooklyn New York Antimicrob Agents Chemother v 49 n
2 p 776-8 2005
59
BRATU S et al Emergence of KPC-possessing Klebsiella pneumoniae in
Brooklyn New York epidemiology and recommendations for detection Antimicrob
Agents Chemother v 49 n 7 p 3018-20 2005
BRATU S et al Rapid spread of carbapenem-resistant Klebsiella
pneumoniae in New York City Arch Intern Med v 165 p 1430-5 2005
CAMARGO C F et al Aplicaccedilatildeo das teacutecnicas de pcr e suas teacutecnicas
derivadas em diagnoacutestico molecular Disponiacutevel em
ltfileDUnB10C2BA20semestreArtigosPCR-
20CLEYTON20FLORENCIO20DE20CAMARGO20E20PAULO20ROB
ERTO20QUEIROZpdfgtgt Acesso em 08 de abril de 2014
CARVALHES C G et al Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting
carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive
results Journal of Antimicrobial Chemotherapy v 65 n2 p 249-251 2010
CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION- CDC Modified
Hodge Test for Carbapenemase Detection in Enterobacteriaceae 2004
CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE Methods for
dilutionantimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically Approved
standard M7ndashA7 7th ed CLSI Wayne PA 2011
COELLO R et al Risk factors for developing clinical infection with methicillin-
resistant Staphylococcus aureus (MRSA) amongst hospital patients initially only
colonized with MRSA J Hosp Infect 19973739-46
COLPAN A et al Evaluation of risk factors for mortality in intensive care
units A prospective study from a referral hospital in Turkey Am J Infect Control
200533(1)42-7
60
CORNAGLIA G et al Living with ESBLs Introduction Clinical Microbiology
and Infection 14 Suppl 1 1-2 2008
COTRIM E R et al Klebsiella pneumoniae carbapenemase ndash KPC em
Enterobacteriaceae o desafio das bacteacuterias multirresistentes Poacutes em revista do
centro universitaacuterio Newton Paiva 12012 - ediccedilatildeo 5 - issn 2176 7785
DESHPANDE L M et al Occurrence and characterization of
carbapenemase-producing Enterobacteacuteriaceae report from the SENTRY
Antimicrobial Surveillance Program (2000-2004) Microb Drug Resist 12(4)223-30
2006
DIAS D J A Estudos dos principais mecanismos de resistecircncia aos
antibioacuteticos β-lactacircmicos em bacteacuterias patogecircnicas gram negativas 2009 100 f
Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Geneacutetica Molecular e Biomedicina) ndash Faculdade de
Ciecircncias e Tecnologia Universidade de Nova Lisboa Lisboa
DIENSTMANN R et al Avaliaccedilatildeo fenotiacutepica da enzima Klebsiella
pneumoniae carbapenemase (KPC) em Enterobacteriaceae de ambiente hospitalar
J Bras Patol Med Lab v 46 n 1 p 23-27 fevereiro 2010
ENDIMIAMI A et al Emergence of blaKPC-containing Klebsiella
pneumoniae in a long-term acute care hospital a new challenge to our healthcare J
Antimicrob Chemother 64 1102-1110 Nov 2009
FALAGAS M E et al Extended-spectrum beta-lactamase producing
organisms The Journal of Hospital Infection 73 (4) pp 345-54 2009
FONTANA C et al Emergence of KPC-producing Klebsiella pneumoniae in
Italy BMC Rev Notes 3 40 2010
61
GALES A C et al Antimicrobial resistance among Gram-negative bacilli
isolated from Latin America results from Sentry Antimicrobial Surveillance Program
(Latin America 2008-2010) Diagnostic Microbiology and Infectious Disease v 3 n
4 p 354 -360 2012
GUPTA N et al Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Epidemiology
and Prevention HEALTHCARE EPIDEMIOLOGY Clinical Infectious Diseases
201153(1)60ndash67 Published by Oxford University Press on behalf of the Infectious
Diseases Society of America 2011
HARBOTTLE H et al Genetics of antimicrobial resistance Anim Biotechnol
n17 p111-124 2006
HENRIQUE W N et al RESISTEcircNCIA BACTERIANA Uniatildeo das
Faculdades Alfredo NasserInstituto de Ciecircncias da Sauacutede Disponiacutevel em lt
httpwwwfaculdadealfredonasseredubrfilespesquisaposter20HENRIQUE20
Wilker20Natividade20SANTIAGO20Silvania20CAVALCANTI20DSP
20ResistC3AAncia20Bacterianapdfgt Acesso em 17 marccedilo 2014
HULSCHER M E J I et al Antibiotic prescribing in hospital a social and
behavioral scientific approach The Lancet Infectious Diaseases v 10 n 3 p 167-
165 2010
KIDWAI M SAPRA P BHUSHAN KR Synthetic strategies and medicinal
properties of beta-lactams Curr Med Chem 1999 695-215
KUMARASAMY K K et al Emergence of a new antibiotic resistance
mechanism in India Pakistan and the UK a molecular biological and
epidemiological stuy The Lancet Infectious Diseases v10 n 9 p 597- 602 2010
LINCOPAN N et al Enterobacteacuteria producing extended-spectrum β-
lacatamases and IMP-1 Metalo-β-lactamases isolated from Brazilian hospitals J Med
62
Microbiol 7 1-3 2006
LINCOPAN N et al First Isolation of Metalo-β-Lacatamase-Producing
Multiresistant Klebsiella pneumoniae from a patient in Brazil J Clin Microbiol 43(1)
516-519 2005
LIVERMORE D M et al What remains against carbapenem- resistant
Enterobacteriaceae Evaluation of choramphenicol ciprofloxacin colistina
fosfomycin minocycline nitrofurantoin temocilin and tigecycline International
Journal of Antimicrobial Agents v 37 n 5 p 415- 459 2011
LIVERMORE D M Fourten years in resistance International Journal of
Antimicrobial Agents v 39 283- 294 2012
LIVERMORE D M Bacterial resistance to carbapenems Adv Exp Med Biol
1995 39025-47
LIVERMORE D M Bacterial resistance origins epidemiology and impact
Clin Infect Dis 36S11-S23 2003
LIVERMORE D M et al Carbapenemases a problem in waiting Curr
Opin Microbiol 2000 3489-95
LU et al Universal pcr for common bacterial pathogens J CLIN
MICROBIOL VOL 38 2000
LU et al Use of PCR with Universal Primers and Restriction Endonuclease
Digestions for Detection and Identification of Common Bacterial Pathogens in
Cerebrospinal Fluid Journal of Clinical Microbiology June 2000 p 2076ndash2080
MARSCHALL J Met al Presence of the KPC Carbapenemase Gene in
Enterobacteriaceae Causing Bacteremia and Its Correlation with In Vitro
Carbapenem Susceptibility J Clin Microbiol 47 239-241 Jan 2009
63
MARTINS WMBS et al Prevalecircncia do gene blaKPC em isolados cliacutenicos
de Enterobacteriaceae e natildeo fermentadores encontrados em amostras clinicas em
um hospital universitaacuterio do Recife X Jornada de ensino pesquisa e extensatildeo ndash
JEPEX 2010 ndash UFRPE Recife 18 a 22 de outubro
MENDES C A C et al Polimixinas Revisatildeo com ecircnfase na sua
nefrotoxicidade Rev Assoc Med Bras 2009 55(6) 752-9
MOHR J F 3rd Update on the efficacy and tolerability of meropenem in the
treatment of serious bacteacuterial infections Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S41-51
2008
MONTEIRO J et al First report of KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae
strains in Brazil Antimicrob Agents Chemother Jan53(1)333-4 2009
MOREIRA V C et al Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia a antibioacuteticos
Disponiacutevel em
lthttpwwwcpglsucgbr6mostraartigosSAUDEVANESSA20CARVALHO20M
OREIRApdfgt Acesso em 21 marccedilo 2014
NETIKUL T et al Emergence of novel blaKPC-12 and blaKPC-13 variants in
carbapenem non-susceptible Enterobacter cloacae a first report of blaKPC gene in
Thailand European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases May
S372 2011
NETO V A et al Antibioacuteticos na praacutetica Meacutedica 6ordf Ediccedilatildeo Editorial
SarverSP Brasil 2007
NICOLAU D P Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of
meropenem Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S32-40 2008
64
OLIVEIRA A C et al Resistecircncia bacteriana e mortalidade em um centro de
terapia intensiva Rev Latino-Am Enfermagem nov-dez 2010
PAAUW A et al Failure to control an outbreak of qnrA 1-positive multidrug-
resistant Enterobacter clocae despite adequate implementation of recommended
infection control measures Journal of Clinical Microbiology v 45 n 5 p 1420-1425
2007
PATERSON D L et al Extended-Spectrum Beta-Lactamases a Clinical
Update Clinical Microbiology Reviews v 18 p 657-686 2005
PEIRANO G et al Carbapenem-hydrolysing beta-lactamase KPC-2 in
Klebsiella pneumonia isolated in Rio de Janeiro Brazil J Antimicrob Chemother Nov
20 2009
PERES-BOTA D et al Are infections due to resistant pathogens associated
with worse outcome in critically ill patients J Infect 200347(4)307-16
PIDDOCK L J V Clinically relevant chromosomally encoded multidrug
resistance effl ux pumps in bacterial Clin Microbiol Rev n19 p382-402 2006
PITOUT J D D et al Emergence of Enterobacteriaceae producing
extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) in the community J Antimicrob
Chemother May 56 2005
POSSEBON M I et al Resistecircncia bacteriana aos carbapenecircmicos
Bacterial resitence to carbapenems RBM rev bras med60(6)378380-378-382
jun 2003
QUEENAN A M et al Carbapenemases the versatile beta-lactamases
Clin Microbiol Rev Jul20(3)440-58 2007
65
RHOMBERG P R et al Summary trends for the meropenem yearly
susceptibility test information collection program a 10- year experience in the United
States (1999-2008) Diagnostic Microbiology and Infectiois Disease v 65 n4 p
414-426 2009
ROBLEDO I E et al Detection of KPC in Acinetobacter spp in Puerto Rico
J Antimicrob Agents Chemother 54 1354-1357 Mar 2010
ROGERS B A et al Country-to-country transfer os patients and the risk of
multi-resistant bacterial infection Clinical Infectious Disease v53 n1 p49- 56
2011
SHAH A A et al Characteristics epidemiology and clinicalimportance of
emerging strains of Gram-negative bacilli producing extended-spectrum
betalactamases Research in Microbiology v 155 p 409-421 2004
TURNER P J Extended- Spectrum Beta-Lactamases Clinical Infectious
Diseases v 41 p 273-275 2005
WOLTER D J et al Phenotypic and Enzymatic Comparative Analysis
between the Novel KPC variant KPC-5 and Its Evolutionary Variants KPC-2 and
KPC-4 Antimicrob Agents Chemother Nov 17 2008
WOODFORD N et al Carbapenemases of Chryseobacterium
(Flavobacterium) meningosepticum distribution of blaB and characterization of a
novel Metalo-beta-lactamase gene blaB3 in the type strain NCTC 10016
Antimicrob Agents Chemother Jun44(6)1448-52 2000
WOODFORF N Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in
India Pakistan and the UK a molecular biological and epidemiological study The
Lancet Infectious Diseases v 10 n 9 p 597-602 2010
66
WOODFORD et al Outbreak of Klebsiella pneumoniae Producing a New
Carbapenem- Hydrolyzing Class A β-Lactamase KPC-3 in a New York Medical
Center Antimicrobial agents and chemotherapy Dec 2004 p 4793ndash4799 Vol 48
No 12
YAGI T et al A preliminary survey of extended-spectrum β-lactamases
(ESBLs) in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Japan
FEMS Microbiology Letters 184 (2000) 53-56
YIGIT H et al Novel carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase KPC-1 from
a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumonia J Antimicrob Agents
Chemother 45 (4) 1151-1161 (2001)
ZAVASCKI A P et al KPC-2- producing Enterobacter cloacae in two cities
from Southern Brazil Int J Antimicrob Agents Apr 28 2009
ZHANEL G G et al Comparative review of the carbapenecircmicos Drugs
67(7)1027-52 2007
67
ANEXOS
Sequumlecircncia do oligo blaKPC
Query 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
Query 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
Query 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
68
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
Query 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
Query 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
69
Query 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
Query 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
Query 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
70
Sbjct 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
Query 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
Query 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
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Sbjct 541
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GCGATAC 600
Query 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
71
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Sbjct 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
Query 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
Query 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
72
Query 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
Query 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
Query 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
73
Sbjct 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
Query 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
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|||||||
Sbjct 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
Query 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
Query 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
74
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
Query 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
Query 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
75
Query 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
Query 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
||||
Sbjct 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
LOCUS AF297554 1377 bp
DNA linear BCT 26-MAR-2001
DEFINITION Klebsiella pneumoniae carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
gene complete cds
ACCESSION AF297554
VERSION AF2975541 GI10121874
76
KEYWORDS
SOURCE Klebsiella pneumoniae
ORGANISM Klebsiella pneumoniae
Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Enterobacteriaceae Klebsiella
REFERENCE 1 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH QueenanAM
AndersonGJ Domenech-SanchezA
BiddleJW StewardCD
AlbertiS BushK and TenoverFC
TITLE Novel carbapenem-hydrolyzing beta-
lactamase KPC-1 from a
carbapenem-resistant strain of
Klebsiella pneumoniae
JOURNAL Antimicrob Agents Chemother 45 (4)
1151-1161 (2001)
PUBMED 11257029
REFERENCE 2 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH AndersonGJ and
TenoverFC
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (19-AUG-2000) Nosocomial
Pathogens Laboratory Branch
Centers for Disease Control and
Prevention 1600 Clifton Rd MS
G08 Atlanta GA 30333 USA
FEATURES LocationQualifiers
77
source 11377
organism=Klebsiella
pneumoniae
mol_type=genomic DNA
db_xref=taxon573
-35_signal 5560
-10_signal 7883
mRNA 921012
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
RBS 117122
CDS 1311012
note=blaKPC-1
codon_start=1
transl_table=11
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
protein_id=AAG134101
db_xref=GI10121875
translation=MSLYRRLVLLSCLSWPLAGFSATALTNLVAEPFAKLEQD
FGGSI
GVYAMDTGSGATVSYRAEERFPLCSSFKGFLAAAVLARSQQQAGLLDTPIRYG
KNALV
PWSPISEKYLTTGMTVAELSAAAVQYSDNAAANLLLKELGGPAGLTAFMRSIG
DTTFR
78
LDRWELELNSAIPSDARDTSSPRAVTESLQKLTLGSALAAPQRQQFVDWLKGN
TTGNH
RIRAAVPADWAVGDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTRAPNKDDK
HSEAV
IAAAARLALEGLGVNGQ
ORIGIN
1 cggggcagtt acagccgtta cagcctctgg
agagggagcg gcttgccgct cggtgataat
61 cccagctgta gcggcctgat tacatccggc
cgctacacct agctccacct tcaaacaagg
121 aatatcgttg atgtcactgt atcgccgtct
agttctgctg tcttgtctct catggccgct
181 ggctggcttt tctgccaccg cgctgaccaa
cctcgtcgcg gaaccattcg ctaaactcga
241 acaggacttt ggcggctcca tcggtgtgta
cgcgatggat accggctcag gcgcaactgt
301 aagttaccgc gctgaggagc gcttcccact
gtgcagctca ttcaagggct ttcttgctgc
361 cgctgtgctg gctcgcagcc agcagcaggc
cggcttgctg gacacaccca tccgttacgg
421 caaaaatgcg ctggttccgt ggtcacccat
ctcggaaaaa tatctgacaa caggcatgac
481 ggtggcggag ctgtccgcgg ccgccgtgca
atacagtgat aacgccgccg ccaatttgtt
541 gctgaaggag ttgggcggcc cggccgggct
gacggccttc atgcgctcta tcggcgatac
79
601 cacgttccgt ctggaccgct gggagctgga
gctgaactcc gccatcccaa gcgatgcgcg
661 cgatacctca tcgccgcgcg ccgtgacgga
aagcttacaa aaactgacac tgggctctgc
721 actggctgcg ccgcagcggc agcagtttgt
tgattggcta aagggaaaca cgaccggcaa
781 ccaccgcatc cgcgcggcgg tgccggcaga
ctgggcagtc ggagacaaaa ccggaacctg
841 cggagtgtat ggcacggcaa atgactatgc
cgtcgtctgg cccactgggc gcgcacctat
901 tgtgttggcc gtctacaccc gggcgcctaa
caaggatgac aagcacagcg aggccgtcat
961 cgccgctgcg gctagactcg cgctcgaggg
attgggcgtc aacgggcagt aaggctctga
1021 aaatcatcta ttggcccacc accgccgccc
ttgcgggcgg catggattac caaccactgt
1081 cacatttagg ctaggagtct gcgcggcaga
gccgtgtgac cggttttctg tagagcactg
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aaggcgtcgg cgccaaggat accaatcttg
1201 cggcgcgcgg cgtgttatga cgactggggt
gcatttgagc cgccccattt aaccttcgcc
1261 ctcacagata cgccattcgc ctcaaattta
gcgccatgca gacgagcttc cactcggctt
1321 gcaccttgtc caggcccctc atgctgaact
gacgcaatcc catcaccgcc ttgatca
80
15
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC)
Klebsiella pneumoniae pertence aacute famiacutelia Enterobacteriaceae
encontrado em locais como aacutegua solo plantas e esgoto Satildeo encontradas cinco
espeacutecies K pneumoniae K oxytoca K planticola K terrigena e K ornithinolytica
O gecircnero Klebsiella eacute definido como contendo bacilos Gram-negativos natildeo moacuteveis
em forma de bastatildeo e geralmente encapsuladas que produzem lisina
descarboxilase mas natildeo produzem ornitina descarboxilase Provavelmente a
colonizaccedilatildeo em seres humanos ocorre por contato com as diferentes fontes
ambientais podendo ser encontrada colonizando a orofaringe e fezes de pessoas
sadias Pessoas imunocomprometidas a bacteacuteria encontra um ambiente favoraacutevel
para seu crescimento levando aos quadros de infecccedilatildeo (MOREIRA et al 2014)
A Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) eacute uma enzima produzida por
enterobacteacuterias gram-negativas sendo um mecanismo de resistecircncia aos antimi-
crobianos carbapenecircmicos meropenen ertapenen eou imipenen classe
amplamente utilizada no tratamento de infecccedilotildees envolvendo Enterobacteriaceae
Ela tambeacutem eacute capaz de inativar os agentes β-lactacircmicos cefalosporinas penicilinas
e o aztreonam (COTRIM et al 2012)
Devido agrave semelhanccedila estrutural e estereoquiacutemica os antibioacuteticos beta-
lactacircmicos possuem um mecanismo de accedilatildeo comum ao grupo Eles atuam inibindo
a siacutentese da parede celular bacteriana atraveacutes do mecanismo de bloqueio da
transpeptidaccedilatildeo responsaacutevel pela uniatildeo dos componentes individuais do
peptidoglicano conforme demonstrado na figura 1 (KIDWAI et al 1999)
A accedilatildeo destes antibioacuteticos eacute atraveacutes de ligaccedilotildees covalentes com as proteiacutenas
as Penicilim-Binding-Protein (proteiacutena de ligaccedilatildeo da penicilina- PBP ou PLP) que se
encontram presentes na membrana citoplasmaacutetica de todas as bacteacuterias Devido agraves
mutaccedilotildees ocorre uma induccedilatildeo na alteraccedilatildeo dessas proteiacutenas podendo determinar
uma diminuiccedilatildeo da afinidade dos beta-lactacircmicos agraves mesmas A accedilatildeo dos
carbapenecircmicos eacute atraveacutes da sua ligaccedilatildeo agraves PBPs presentes na parede bacteriana
especialmente as PBP1 e PBP2 provocando a lise osmoacutetica da bacteacuteria Aleacutem
disso eles tecircm uma facilidade na penetraccedilatildeo da bacteacuteria por meio dos canais
poriacutenicos presentes nas bacteacuterias gram-negativas induzindo um efeito poacutes-
16
antibioacutetico Quando comparados com outros beta-lactacircmicos os carbapenecircmicos
satildeo mais resistentes agrave hidroacutelise pela maioria das beta-lactamases tanto
cromossocircmicas como plasmiacutedicas (LIVERMORE 1995 LIVERMORE et al 2000)
Figura 1 Accedilatildeo do szlig-lactacircmico sobre a bacteacuteria gram-positiva e gram-
negativa Fonte
ltlthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controle
opas_webmodulo3gramn_lacta2htmgt (adaptado)
A bacteacuteria Klebsiella pneumoniae quando apresenta gene ESBL pode
expressar resistecircncia a ateacute 95 dos antimicrobianos existentes no acircmbito
farmacecircutico sendo a produccedilatildeo de beta-lactamases de espectro estendido (ESBL)
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por esta bacteacuteria uma das principais causas de falha terapecircutica Existem outras
formas de resistecircncia emergentes de grande importacircncia como a produccedilatildeo de
beta-lactamases tipo adenosina monofosfato ciacuteclico (AmpC) que hidrolizam
cefoxitina as carbapenemases como as metalo-beta-lactamases (MBL) e
carbapenemases tipo KPC (MOREIRA et al 2014)
O mecanismo de resistecircncia mais comum aos antibioacuteticos beta-lactacircmicos de
amplo espectro eacute a produccedilatildeo de ESBL por enterobacteacuterias A accedilatildeo hidroliacutetica
apresentadas por estas enzimas pode conferir clinicamente resistecircncia ao
aztreonam cefalosporina e a todas as penicilinas (PATERSON et al 2005) As
ESBL satildeo enzimas mediadas por genes plasmidiais (transmissiacuteveis entre as
espeacutecies) Os principais microrganismos produtores de ESBL satildeo Klebsiella
pneumoniae (mais encontrada) Escherichia coli e Proteus mirabilis podendo ocorrer
em outros membros da famiacutelia Enterobacteriaceae e em alguns microrganismos natildeo
enteacutericos como Acinetobacter ssp (TURNER 2005) A importacircncia cliacutenica meacutedica
destes microrganismos portadores de ESBL eacute que graccedilas aacutes suas resistecircncias a
muitas classes de antimicrobianos o tratamento de infecccedilotildees eacute difiacutecil gerando um
aumento da morbidade e mortalidade dos pacientes (SHAH et al 2004)
A enzima KPC foi detectada pela primeira vez na Carolina do Norte Costa
Leste dos Estados Unidos no ano de 1996 em Klebsiella pneumoniae dando entatildeo
este nome a enzima Em pouco tempo ela disseminou por outras regiotildees e
recentemente tornou-se uma das preocupaccedilotildees quanto agrave sauacutede puacuteblica mundial
Os paiacuteses de onde KPCs tecircm sido relatados desde 2001 satildeo mostrados na figura 2
apresentando como os organismos tecircm agora sido disseminados amplamente pelo
mundo (NEIL GUPTA et al 2011)
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Figura 2 Divulgaccedilatildeo internacional de Enterobacteriaceae produtora de
Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC)( NEIL GUPTA et al 2011)
Este mapa apresenta paiacuteses onde Enterobacteriaceae produtoras KPC de
foram descritos em relatoacuterios publicados disponiacuteveis a partir de 11 fevereiro de
2011 Os paiacuteses natildeo destacadas nesta figura tambeacutem podem apresentar a presenccedila
de Enterobacteriaceae produtoras de KPC poreacutem pode ter tido uma falta de
vigilacircncia sistemaacutetica para estes organismos ( NEIL GUPTA et al 2011)
No ano de 2005 foram registradas pela primeira vez essas bacteacuterias
produtoras de carbapenemases Apoacutes 6 anos deste primeiro relato elas passaram a
causar surtos mais graves em nosso paiacutes Em janeiro de 2011 foram notificados no
Distrito FederalBrasil 367 casos em um curto espaccedilo de tempo (01 a 08 de janeiro
de 2011) com 26 oacutebitos A maior parte destes casos (263 casos) foi identificada nas
unidades de terapia intensiva ndash UTI (COTRIM et al 2012)
O potencial de disseminaccedilatildeo da KPC eacute alto devido agrave grande capacidade de
transferecircncia do seu material geneacutetico e por conseguinte os genes de resistecircncia
O controle de epidemias eacute difiacutecil devido a esta caracteriacutestica de faacutecil disseminaccedilatildeo
preocupando os profissionais da aacuterea de sauacutede devido agrave dificuldade de tratamento
podendo resultar em um aumento das taxas de mortalidade Apesar da maior
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frequumlecircncia em Klebsiella pneumoniae a KPC pode ser identificada em outras
bacteacuterias como a Enterobacter cloacae Citrobacter freundii Salmonella spp E coli
e Pseudomonas spp (DIENSTMANN et al 2010)
Os pacientes com comorbidades incluindo pacientes transplantados
neutropecircnicos em ventilaccedilatildeo mecacircnica em Unidade de Terapia Intensiva (UTI)
com longos periacuteodos de internaccedilatildeo que apresentam risco aumentado de infecccedilatildeo ou
colonizaccedilatildeo para bacteacuterias multirresistentes satildeo mais vulneraacuteveis a Klebsiella
pneumoniae produtora de KPC (COTRIM et al 2012)
Os sinais e sintomas apresentados por um indiviacuteduo infectado por KPC satildeo
febre ou hipotermia taquicardia piora do quadro respiratoacuterio e em casos mais
graves hipotensatildeo inchaccedilo e sepse Quanto ao siacutetio de infecccedilatildeo a bacteacuteria que
possui a enzima KPC pode causar pneumonia associada agrave ventilaccedilatildeo mecacircnica
infecccedilatildeo do trato urinaacuterio infecccedilatildeo de corrente sanguiacutenea infecccedilatildeo de partes moles
e outros tipos de infecccedilatildeo (COTRIM et al 2012)
Para desenvolver a infecccedilatildeo a colonizaccedilatildeo eacute um preacute-requisito poreacutem o
pacientes pode estar colonizado ou seja ser portadores de KPC e natildeo desenvolver
a infecccedilatildeo (ALVES et al 2013) A forma de transmissatildeo eacute basicamente por
contato com secreccedilatildeo ou excreccedilatildeo de pacientes infectados ou colonizados logo
fora do ambiente hospitalar a bacteacuteria natildeo representa perigo (COTRIM et al
2012)
As opccedilotildees terapecircuticas para o tratamento da Klebsiella pneumoniae eacute
dividida em Terapia Empiacuterica e Terapia apoacutes a determinaccedilatildeo do perfil de
sensibilidade A terapia empiacuterica para infecccedilotildees por enterobacteacuterias multirresistentes
se baseia na utilizaccedilatildeo de polimixina B ou polimixina E (Colistina) em associaccedilatildeo
com um (1) ou mais dos antimicrobianos da classe dos aminoglicosiacutedeos
(gentamicina ou amicacina) Carbapenecircmicos (meropenem ou doripenem) eou
tigeciclina (ANVISA 2013)
Recomenda-se usar sempre associaccedilotildees de dois ou trecircs antimicrobianos
sendo um deles a polimixina B ou a polimixina E (colistina) Deve-se evitar a
utilizaccedilatildeo de monoterapias pelo risco de raacutepido desenvolvimento de resistecircncia A
escolha do(s) faacutermaco(s) de associaccedilatildeo com polimixina B ou E deve se basear
preferencialmente no perfil de susceptibilidade esperado aos referidos
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medicamentos das enterobacteacuterias resistentes aos carbapenecircmicos detectadas no
hospital ou na ausecircncia de dados locais na regiatildeo Deve-se considerar igualmente
o local de infecccedilatildeo e a penetraccedilatildeo esperada do antimicrobiano na escolha da droga
a ser utilizada na combinaccedilatildeo (ANVISA 2013)
Apoacutes a liberaccedilatildeo do perfil de sensibilidade deve-se adequar o uso dos
medicamentos Sempre que possiacutevel manter no miacutenimo 2 (dois) faacutermacos com
sensibilidade comprovada in vitro Natildeo havendo sensibilidade a um segundo
medicamento (suscetibilidade apenas agrave polimixina B ou E) recomenda-se manter a
terapia combinada de polimixina B ou E com carbapenecircmicos (meropenem ou
doripenem) ou tigeciclina na tentativa de ocorrecircncia de sinergismo entre elas
(ANVISA 2013)
Sugere-se aleacutem da determinaccedilatildeo das Concentraccedilotildees Inibitoacuterias Miacutenimas
(CIMs) para uma das polimixinas (B ou E) que tambeacutem sejam determinadas as
CIMs de tigeciclina e carbapenecircmicos (meropenem) bem como a consultoria de um
infectologista (ou Comissatildeo de Controle de Infecccedilatildeo Hospitalar- CCIH) para a
determinaccedilatildeo da terapia combinada com base na interpretaccedilatildeo do antibiograma
CIM e quadro cliacutenico do paciente No caso de resistecircncia agraves polimixinas
(concentraccedilotildees inibitoacuterias miacutenimas [CIMs] gt 2 mgL) recomenda-se a associaccedilatildeo de
dois ou trecircs do antimicrobianos sugeridos para a combinaccedilatildeo (ANVISA 2013)
A antissepsia eficiente do ambiente dos instrumentos ciruacutergicos e das matildeos
com o uso do aacutelcool a 70 eacute fundamental para a contenccedilatildeo de surtos Aleacutem disto
os pacientes contaminados devem permanecer isolados ateacute o controle da infecccedilatildeo
para evitar a disseminaccedilatildeo da bacteacuteria (COTRIM et al 2012)
1 2 Resistecircncia bacteriana
Hoje a disseminaccedilatildeo e a proliferaccedilatildeo das bacteacuterias resistentes estatildeo cada
dia mais presente As bacteacuterias multirresistentes (BRMD) poderatildeo levar agrave
humanidade a uma era poacutes-antibioacutetica resultando em uma ausecircncia de qualquer
opccedilatildeo de tratamento para os portadores destas cepas (HENRIQUE et al 2014)
Os fatores envolvidos na disseminaccedilatildeo desses patoacutegenos multirresistentes
satildeo diversos incluindo o uso irracional de antimicrobianos procedimentos invasivos
21
(cirurgias implantaccedilatildeo de proacuteteses meacutedicas e outros) e a transferecircncia de material
geneacutetico com a informaccedilatildeo de resistecircncia a antibioacuteticos entre as bacteacuterias
(DIENSTMANN et al 2010 ENDIMIAMI et al 2009 FONTANA et al 2010)
Com a praacutetica da antibioticoterapia principalmente em ambientes
nosocomiais os mecanismos de resistecircncia tornaram-se comuns Esses
mecanismos incluem alteraccedilatildeo na permeabilidade da membrana celular que
impede a entrada do antibioacutetico na ceacutelula bombeamento do antibioacutetico para fora da
mesma pelo mecanismo de efluxo mutaccedilatildeo geneacutetica que altera de alguma forma o
alvo do antibioacutetico e consequumlentemente natildeo afeta o funcionamento da bacteacuteria
bem como desenvolvimento da capacidade de degradar ou da inativaccedilatildeo do
antibioacutetico (COTRIM et al 2012) Estes mecanismos estatildeo representados na figura
3
Figura 3 Mecanismos de resistecircncia bacteriana Fonte
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controle
opas_webmodulo3pop_mecanismohtmgt
Um dos mais importantes mecanismos de resistecircncia eacute a alteraccedilatildeo do local-
alvo onde atua determinado antimicrobiano de modo a impedir a ocorrecircncia de
qualquer efeito inibitoacuterio ou bactericida As bacteacuterias podem adquirir um gene que
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codifica um novo produto resistente aos antimicrobianos substituindo o alvo original
por exemplo o Staphylococcus aureus resistente agrave oxacilina e estafilococos
coagulase-negativos adquiriram o gene cromossocircmico Mec A e produzem uma PBP
ou PLP resistente aos β-lactacircmicos denominada 2a ou 2 que eacute suficiente para
manter a integridade da parede celular durante o crescimento quando outras PBPs
essenciais satildeo inativadas por antibimicrobianos β-lactacircmicos Como alternativa um
gene receacutem-adquirido pode atuar para modificar um alvo tomando-o menos
vulneraacutevel a determinado antimicrobiano Assim um gene transportado por
plasmiacutedeo ou por transposon codifica uma enzima que inativa os alvos ou altera a
ligaccedilatildeo dos antimicrobianos como ocorre com eritromicina e clindamicina (ANVISA
2007)
Em funccedilatildeo da bomba de efluxo pode variar a especificidade do antibioacutetico
Ele atua por meio do bombeamento ativo de antimicrobianos do meio intracelular
para o extracelular gerando uma resistecircncia bacteriana a determinados
antimicrobianos como eacute o caso da resistecircncia agraves tetraciclinas codificada por
plasmiacutedeos em Escherichia coli devido agrave presenccedila de proteiacutenas integrantes da
membrana plasmaacutetica bacteriana (PIDDOCK 2006)
O aumento da siacutentese de proteiacutenas eacute o principal responsaacutevel pela resistecircncia
antimicrobiana devido agraves vaacuterias mutaccedilotildees que ocorrem em seus repressores
transcricionais Estas mutaccedilotildees tambeacutem podem influenciar levando a um aumento
da eficiecircncia do transporte dos antibioacuteticos para o exterior da ceacutelula (HARBOTTLE
et al 2006)
A resistecircncia aos antibioacuteticos eacute frequumlentemente associada agrave alteraccedilatildeo
diminuiccedilatildeo da permeabilidade que ocorre na membrana externa das bacteacuterias gram-
negativas O fluxo de moleacuteculas para o interior da ceacutelula ocorre por caracteriacutesticas
peculiares como carga estrutura e dimensatildeo e atraveacutes de proteiacutenas de membrana
as quais formam canais Este percurso eacute utilizado pelos antibioacuteticos para atingir o
interior da ceacutelula bacteriana ou o espaccedilo periplasmaacutetico como eacute o caso dos
antibioacuteticos β-lactacircmicos Portanto a perda de funccedilatildeo destas proteiacutenas pode
efetivamente causar a diminuiccedilatildeo da susceptibilidade a vaacuterios antibioacuteticos
(LIVERMORE 2003)
23
Os mecanismos de resistecircncia que podem impedir a accedilatildeo de antimicrobianos
satildeo vaacuterios O faacutermaco atua de forma a inibir os processos essenciais a multiplicaccedilatildeo
e sobrevivecircncia da ceacutelula bacteriana como a membrana citoplasmaacutetica e
consequumlentemente bloqueando a siacutentese proteacuteica de aacutecidos nucleacuteicos e da parede
celular A resistecircncia bacteriana eacute um mecanismo natural de defesa Sendo assim
as bacteacuterias estatildeo em constante defesa e para cada novo faacutermaco desenvolvido as
bacteacuterias iratildeo desenvolver resistecircncia em algum momento (POSSEBON et al
2003)
O grupo de antibioacuteticos beta-lactacircmicos satildeo amplamente utilizado e se
encontram dentro da classe dos melhores agentes antimicrobianos com relevacircncia
cliacutenica No entanto o seu uso tem sido restringido devido a vaacuterios mecanismos de
resistecircncia O desenvolvimento dos carbapenecircmicos surgiu devido agrave proliferaccedilatildeo de
beta-lactamases mediadas por plasmiacutedeos e cromossomos (POSSEBON et al
2003)
A bacteacuteria KPC tem um gene chamado SHV-1 que tem a caracteriacutestica de
resistecircncia a quase todos os tipos de antimicrobianos inclusive os carbapenecircmicos
especiacuteficos para o tratamento de infecccedilotildees por bacteacuterias multiresistentes e
emergecircncias Mesmo com no seu coacutedigo geneacutetico a informaccedilatildeo necessaacuteria para o
desenvolvimento da resistecircncia a resistecircncia da bacteacuteria soacute eacute desenvolvida caso a
bacteacuteria entre em contato com o antibacteriano desencadeando todo o processo
nos casos de resistecircncia induzida comuns em KPC (MOREIRA et al 2014)
A resistecircncia bacteriana pode ser apresentada de forma intriacutenseca ou
adquirida A resistecircncia intriacutenseca faz parte das caracteriacutesticas fenotiacutepicas naturais
do microrganismo ou seja faz parte de sua heranccedila geneacutetica sendo transmitida
verticalmente a prole sem perda da caracteriacutestica A presenccedila ou ausecircncia do alvo
para a accedilatildeo da droga eacute o principal determinante deste tipo de resistecircncia
(MOREIRA et al 2014) Essa resistecircncia corresponde a uma caracteriacutestica de
espeacutecie bacteriana quando estes microrganismos satildeo naturalmente resistentes a
certo tipo de antibioacutetico Este processo eacute decorrente da ausecircncia de estruturas de
atuaccedilatildeo de antimicrobianos ou a impermeabilidade por parte de estruturas
perifeacutericas das bacteacuterias (HENRIQUE et al 2014)
24
A resistecircncia adquirida aos antibioacuteticos por sua vez ocorre quando haacute uma
da mutaccedilatildeo de genes reguladores ou estruturais aquisiccedilatildeo de genes de resistecircncia
veiculados por elementos geneacuteticos moacuteveis ou da combinaccedilatildeo entre eles Este
aparecimento de resistecircncia em uma espeacutecie bacteriana era anteriormente sensiacutevel
a droga e devido a um destes fatores se torna resistente O fenoacutetipo resultante
desta resistecircncia natildeo estaraacute presente nas ceacutelulas genitoras e sim nos indiviacuteduos de
uma linhagem bacteriana derivada de um organismo susceptiacutevel Os genes muitas
vezes satildeo adquiridos por meio de elementos moacuteveis como plasmiacutedeos e
transposons (MOREIRA et al 2014)
Entatildeo a resistecircncia adquirida ocorre por diversos mecanismos geneacuteticos tais
como produccedilatildeo de enzimas inativadoras interferecircncia com a entrada e acuacutemulo de
droga na bacteacuteria alteraccedilatildeo do receptor para accedilatildeo da droga via metaboacutelica
alternativa Eacute originada por meio de uma alteraccedilatildeo a niacutevel geneacutetico da ceacutelula de
natureza cromossocircmica pelos processos de mutaccedilatildeo transduccedilatildeo e transformaccedilatildeo
ou extra cromossocircmica (plasmidial) (HENRIQUE et al 2014)
Como todo antibioacutetico β-lactacircmicoos carbapenecircmicos tem como mecanismo
de accedilatildeo a inibiccedilatildeo da siacutentese proteacuteica atraveacutes da accedilatildeo de inibiccedilatildeo da parede
microbiana fazendo a ligaccedilatildeo e inativaccedilatildeo das proteiacutenas ligadoras de penicilinas
(NETO et al 2007)
Imipenem e meropenem antibioacuteticos pertencentes ao grupo dos
carbapenecircmicos possuem um amplo espectro de accedilatildeo in vitro incluindo atividade
contra cocos gram-positivos bacilos gram-negativos e bacteacuterias anaeroacutebias (MOHR
2008) Jaacute o ertapenem possui um espectro de accedilatildeo mais limitado que o os dois
antibioacuteticos anteriormente citados tendo uma eficiecircncia limitada contra os bacilos
gram-negativos natildeo fermentadores Um novo antibioacutetico carbapenecircmico ainda natildeo
disponiacutevel no Brasil doripenem possui uma atividade mais potente principalmente
contra Pseudomona aeruginosa devido ao seu mecanismo de accedilatildeo que combina os
espectros de accedilatildeo de imipenem e meropenem (ZHANEL et al 2007)
Devido as suas estabilidades espectro de accedilatildeo poucos relatos de
resistecircncia boa toleracircncia pelos pacientes com efeitos adversos mais comuns as
complicaccedilotildees no siacutetio da infusatildeo e toxicidade gastrintestinal estes antibioacuteticos
carbapenecircmicos tecircm sido considerados terapia de escolha (NICOLAU 2008) Como
25
uma resposta adaptativa das Enterobacteacuterias o iacutendice de resistecircncia aos
carbapenecircmicos tem aumentado nos uacuteltimos anos de forma proporcional ao seu
uso limitando imensamente as opccedilotildees terapecircuticas para as infecccedilotildees causadas por
estes microrganismos (FALAGAS et al 2009)
As enzimas produtoras de betalactamases hidrolisam o anel betalactacircmico
tornando este mecanismo de resistecircncia o mais importante Os dois grupos mais
preocupantes satildeo o grupo das betalactamases de aspecto ampliado e os da
carbapenemases que aleacutem de hidrolizar os carbapenecircmicos hidrolizam todas as
outras classes de betalactacircmicos Em enterobacteacuterias as carbapenemases mais
prevalentes satildeo codificadas por genes dos grupos blaKpc blaIMP blaVIM blaNdm
e blaOxa A ocorrecircncia de carbapenemases eacute mais frequentemente em bacteacuterias
gram-negativas fermentadoras da glicose conhecidas como enterobacteacuterias
predominantes nos gecircneros Klebsiella Serratia Citrobacter Enterobacter
Escherichia Samonella Proteus Morganella Podem ser encontradas tambeacutem em
bacteacuterias gram-negativas natildeo fermentadoras como espeacutecies de Acinetobacter e de
Pseudomonas (ALVES et al 2013)
Carbapenemases satildeo enzimas plasmiacutedio-mediados resistentes a todos
antibioacuteticos betalactacircmicos As bacteacuterias que possuem o gene blaKpC responsaacutevel
pela codificaccedilatildeo da produccedilatildeo de carbapenemases apresentam resistecircncia aos
antibioacuteticos betalactacircmicos impedindo a accedilatildeo destes antibioacuteticos contra infecccedilotildees
(ALVES et al 2013)
A transmissatildeo das carbapenemases a diferentes cepas de enterobacteacuterias se
daacute atraveacutes de plasmiacutedeos que satildeo pequenas moleacuteculas circulares de DNA com a
capacidade de se replicarem independentemente do DNA cromossocircmico
permitindo a troca de material geneacutetico entre gecircneros e espeacutecies diferentes de
enterobacteacuterias O raacutepido desenvolvimento de surtos em ambientes hospitalares eacute
explicado por essa disseminaccedilatildeo plasmidial (COTRIM et al 2012)
De acordo com o criteacuterio de interpretaccedilatildeo do Clinical and Laboratory
Standards Institute (CLSI 2009) a maioria das KPC isoladas natildeo apresenta
resistecircncia completa aos carbapenecircmicos (Imipenem e Meropenem apresentam
uma Concentraccedilatildeo Inibitoacuteria Miacutenima (CIM) de 2-8 μgmL) (COTRIM et al 2012)
26
Os mecanismos de resistecircncia capazes de impedir a accedilatildeo dos
carbapenecircmicos satildeo vaacuterios Poreacutem a degradaccedilatildeo de antibioacuteticos por enzimas
principalmente as carbapenemases constituem o principal mecanismo de
resistecircncia aos antibioacuteticos β-lactacircmicos (DIAS 2009) Devido a ampla atividade
hidroliacutetica agrave maioria dos antibioacuteticos β-lactacircmicos estes grupos de enzimas possuem
alta versatilidade (QUEENAM et al 2007)
Existem trecircs grandes classes moleculares de Ambler a qual as
carbapenemases pertencem denominadas classe A (serino-carbapenemases os
quais incluem membros designados SME IMI NMC GES e a famiacutelia das KPCs)
classe B(as metalo-β-lactamase incluem os tipos IMP e VIM) e classe D
(oxacilinases similares as da classe A e incluem as OXA e PSE) (DIAS 2009)
Dentre estes as mais importantes e prevalentes encontradas em plasmiacutedeos
de Klebsiella pneumoniae satildeo as KPC (DIENSTMANN et al 2010) Por meio de
estudos moleculares a enzima KPC jaacute foi documentada em diferentes bacteacuterias e
diferenciada em KPC-1 a 13 (NETIKUL et al 2011) No ano de 2009 foi realizada
uma pesquisa onde descreveram as seguintes carbapenemases KPC-1 em isolados
de Klebsiella pneumoniae KPC-2 em K pneumoniae K oxytoca Salmonella
enterica e em Enterobacter sp e KPC-3 em K pneumoniae e Enterobacter cloacae
(MONTEIRO et al 2009) As enzimas KPC-4 e KPC-5 foram encontradas em
isolados de Pseudomonas aeruginosa (PEIRANO et al 2009)
Foi observada uma correccedilatildeo da sequumlecircncia KPC-1 indicando que o gene
blaKPC-1 e blaKPC-2 satildeo idecircnticos Trecircs novas variantes blaKPC-3 blaKPC-4 e
blaKPC-5 satildeo resultados de mutaccedilotildees do gene estrutural da enzima KPC-2
(WOLTER et al 2008) apresentando diferentes perfis de hidroacutelise As enzimas
KPC-2 e KPC-3 possuem alta eficiecircncia em hidrolisar cefalotina cefaloridina e
nitrocefin poreacutem possuem uma menor eficiecircncia contra carbapenecircmicos e
cefotaxima (ALBA et al 2005) As enzimas KPC-5 e KPC-4 apresentam menor
hidroacutelise de carbapenecircmicos eacute do que em KPC-2 Em contrapartida possuem
melhor eficiecircncia contra ceftazidima e uma maior inibiccedilatildeo pelo aacutecido clavulacircnico
(WOLTER et al 2008)
27
13 Anaacutelise geneacutetica de microrganismos
Eacute de extrema importacircncia praacutetica natildeo soacute no aspecto cliacutenico mas tambeacutem na
fitopatologia biotecnologia e estudos ambientais a correta identificaccedilatildeo e
classificaccedilatildeo de microrganismos Os meacutetodos usados na diferenciaccedilatildeo de gecircneros
espeacutecies e estirpes de microrganismos podem ser divididos em meacutetodos fenotiacutepicos
(baseados em fenocircmenos bioquiacutemicos fisioloacutegicos e bioloacutegicos) e genotiacutepicos
(detectam polimorfismos ao niacutevel dos aacutecidos nucleacuteicos ou variaccedilatildeo aleacutelica ao niacutevel
de enzimas) (ALVES et al 2003)
Para este tipo de estudo existem alguns meacutetodos como o RFLPrsquos -
ldquoRestriction Fragment Length Polymorphismsrdquo (polimorfismos de tamanho de
fragmentos de restriccedilatildeo) rep-PCR (Meacutetodo de tipagem baseado na amplificaccedilatildeo via
PCR de elementos de DNA repetitivos presentes em genomas bacterianos) anaacutelise
de sequumlecircncias nucleotiacutedeas (discriminaccedilatildeo eou identificaccedilatildeo atraveacutes de sequumlecircncias
de DNA) PFGE - Pulsed-Field Gel Electrophoresis (Eletroforese em campo
pulsado) ( A L V E S et al 2003)
A diferenciaccedilatildeo clara da cepa e principalmente a alta reprodutibilidade devem
ser caracteriacutesticas de qualquer meacutetodo de tipagem geneacutetica Poreacutem nem todos os
meacutetodos moleculares de tipagem satildeo igualmente eficazes Sendo assim de acordo
com a finalidade pretendida (identificaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo custo reprodutibilidade
etc) eacute feita a escolha do meacutetodo a ser aplicado (A L V E S et al 2003)
O processo de identificaccedilatildeo fenotiacutepica de KPC entre os membros da famiacutelia
Enterobacteriaceae ainda eacute difiacutecil e os meacutetodos para a sua identificaccedilatildeo devem ser
revistos e ajustados Mesmo com o avanccedilo tecnoloacutegico natildeo existem ensaios que
combinam alta especificidade e sensibilidade na detecccedilatildeo destas enzimas Satildeo
diversas as metodologias usadas para rastreamento de KPC como por exemplo a
focalizaccedilatildeo isoeleacutetrica a teacutecnica de disco-difusatildeo E-test teste de Hodge
modificado dentre outros Aleacutem disso a pesquisa do gene blaKPC pode ser feita
pela Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) Os sistemas de automaccedilatildeo
existentes no entanto podem natildeo identificar com precisatildeo os isolados KPC
positivos (COTRIM et al 2012)
A identificaccedilatildeo blaKPC pelo PCR eacute um meacutetodo raacutepido preciso sensiacutevel e
altamente especiacutefico no entanto a PCR exige equipamento e conhecimentos
28
especializados em diagnoacutestico molecular dificultando ainda a utilizaccedilatildeo dele na
rotina dos laboratoacuterios de microbiologia (COTRIM et al 2012)
Em estudo de infecccedilotildees hospitalares identificaccedilatildeo molecular de patoacutegenos
bacterianos eacute bastante utilizada Para diferenciar carbapenemases tipo KPC a partir
de outros tipos como SME NMC-A-IMI e GES eacute necessaacuterio um exame molecular
As identificaccedilotildees do microrganismo juntamente com a triagem molecular iratildeo definir
um resultado mais especiacutefico podendo ser usado para identificar o antibioacutetico mais
adequado para o tratamento Poreacutem a principal desvantagem de alguns exames
baseados em PCR por exemplo eacute que devido agrave sua limitada capacidade de
multiplexaccedilatildeo eles distinguem apenas algumas variaccedilotildees (MOREIRA et al 2014)
Estatildeo descritas para a identificaccedilatildeo molecular de patoacutegenos pertencentes agrave
famiacutelia Enterobacteriaceae as teacutecnicas de PFGE RAPD (randomly amplified
polymorphic DNA) e ERIC-PCR (Enterobacterial Repet it ive Intergenic Consensus)
A PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) eacute considerada padratildeo ouro devido sua
alta capacidade de diferenciaccedilatildeo baseada na anaacutelise do perfil de restriccedilatildeo do DNA
genocircmico por meio de eletroforese Como desvantagem para a sua execuccedilatildeo eacute
necessaacuterios vaacuterios dias impedindo a tipagem de algumas cepas bacterianas devido
agrave degradaccedilatildeo do DNA aleacutem do alto custo empregado (MOREIRA et al 2014)
O meacutetodo baseado em ERIC-PCR tem sido bastante utilizado como uma
alternativa para a teacutecnica de PFGE Esta teacutecnica consiste na anaacutelise do padratildeo de
amplificaccedilatildeo de elementos repetidos encontrados no genoma bacteriano Isto
permite uma maior rapidez na obtenccedilatildeo de resultados quando comparada com o
PFGE aleacutem de alta reprodutibilidade simples execuccedilatildeo e implementaccedilatildeo baixo
custo e natildeo sem problemas com a degradaccedilatildeo do DNA (MOREIRA et al 2014)
A PCR eacute considerada uma teacutecnica de biologia molecular revolucionaacuteria que
consiste na siacutentese enzimaacutetica de coacutepias de aacutecidos nucleacuteicos Ela permitiu o raacutepido
desenvolvimento do estudo de sequumlecircncias de aacutecidos nucleacuteico Foi desenvolvida por
Kary Banks Mullis que ganhou o precircmio Nobel de quiacutemica de 1993 devido ao
desenvolvimento dessa teacutecnica em abril de 1983 (CAMARGO et al 2014)
Por meio de etapas de variaccedilatildeo de temperatura a teacutecnica de PCR promove a
duplicaccedilatildeo de cadeias de DNA in vitro A reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo de DNA por PCR
envolve o emprego de sequumlecircncias iniciadoras (primers) quatro nucleotiacutedeos
29
(dNTPrsquos) do DNA e uma DNA polimerase termoestaacutevel podendo assim obter-se a
partir de uma fita molde muitas coacutepias de uma sequumlecircncia especiacutefica de aacutecido
nucleacuteico O princiacutepio da PCR consiste na variaccedilatildeo de temperatura por ciclo
envolvendo trecircs etapas baacutesicas desnaturaccedilatildeo pareamento e amplificaccedilatildeo
(CAMARGO et al 2014)
A desnaturaccedilatildeo da fita molde de DNA eacute uma etapa com duraccedilatildeo entre 30
segundos a 1 minuto a temperatura entre 92 ordmC a 96 ordmC Apoacutes isso o pareamento de
dois iniciadores sinteacuteticos de composiccedilotildees distintas que funcionam como os
iniciadores da reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo liga-se agrave regiatildeo complementar da fita de
DNA alvo que sofreraacute a duplicaccedilatildeo Esta etapa tem duraccedilatildeo de 30 segundos a 1
minuto a temperatura entre 58 ordmC e 65 ordmC Por uacuteltimo a amplificaccedilatildeo por meio da
enzima Taq DNA polimerase das novas fitas de DNA se daacute a partir de cada um dos
iniciadores utilizando os quatro dNTPrsquos como substrato da reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo
Esta etapa possui duraccedilatildeo entre 45 segundos e 1 minuto a 72 ordmC Cada ciclo eacute
repetido em torno de 30 a 35 vezes e promove a amplificaccedilatildeo da regiatildeo alvo
determinada conforme o anelamento dos iniciadores sinteacuteticos de DNA (CAMARGO
et al 2014) Estas etapas estatildeo demonstradas na figura 4
Figura 4 Etapas da Reaccedilatildeo de PCR
30
2 JUSTIFICATIVA
No ano de 2010 no Distrito Federal foram identificados 111 pacientes com
suspeita de infecccedilatildeo por Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) e a
Secretaria de Sauacutede do Distrito Federal confirmaram ainda a morte de 18 pacientes
dentre os hospitais puacuteblicos e particulares Um desafio encontrado por ocasiatildeo do
surto infeccioso no Distrito Federal foi o de confirmar as KPCs por Reaccedilatildeo da
Polimerase em Cadeia sendo que as amostras foram enviadas com esta finalidade
para a Fiocruz no Rio de Janeiro
Pesquisas que possam contribuir na elaboraccedilatildeo de estrateacutegias preventivas e
de intervenccedilatildeo para infecccedilotildees causadas por enterobacteacuterias bem como contribuir
para gerar uma integraccedilatildeo beneacutefica entre a equipe acadecircmica e os serviccedilos de
sauacutede devem ser estimuladas Neste sentido o presente estudo permitiu escrutinar
os genes envolvidos na expressatildeo de carbapenemases presentes em espeacutecies de
enterobacteacuterias isoladas em ambiente hospitalar visto que elucidar genes de
resistecircncia de enterobacteacuterias aos antibioacuteticos carbapenecircmicos eacute o primeiro passo
para garantir um controle epidemioloacutegico efetivo para estes tipos de microorganismo
assim como sua associaccedilatildeo com surtos fatais particularmente em pacientes com
baixa imunidade
31
3 OBJETIVOS
31 Objetivo geral Caracterizar os genes de resistecircncia das
Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases e os aspectos epidemioloacutegicos de
pacientes internados em um hospital puacuteblico do Distrito Federal
32 Objetivos Especiacuteficos
Identificar genotipicamente a enzima KPC (Klebsiella pneumoniae
carbapenemase) de isolados de Klebsiella pneumoniae
Investigar aspectos epidemioloacutegicos dos pacientes portadores de
Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases
Identificar quais variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana influenciaram para o
desfecho oacutebito ou alta
Avaliar a susceptibilidade das Enterobacteacuterias aos antibioacuteticos
carbapenecircmicos dos pacientes em ambiente hospitalar
32
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
Trata-se de um estudo transversal onde foi realizado o teste de
susceptibilidade das enterobacteacuterias aos antibioacuteticos carbapenecircmicos a partir dos
materiais bioloacutegicos coletados dos pacientes internados no Hospital Regional da Asa
Norte (HRAN) e enviados ao Laboratoacuterio de Anaacutelises Cliacutenicas da mesma Instituiccedilatildeo
Os materiais bioloacutegicos investigados foram sangue aspirado traqueal ou brocircnquico
urina e cultura semi quantitativa de ponta de cateter venoso central O HRAN eacute um
hospital puacuteblico do Distrito Federal com 395 leitos sendo as cliacutenicas de internaccedilatildeo
Berccedilaacuterio Cirurgia Geral Cirurgia Plaacutestica Cliacutenica Meacutedica Ginecologia Maternidade
Pediatria Queimados UTI com atendimento a pacientes portadores de doenccedilas de
caraacuteter cliacutenico e ciruacutergico
4 1 Coleta e transporte das amostras bioloacutegicas
As amostras foram coletadas de pacientes internados no Hospital Regional da
Asa Norte (HRAN) com suspeitas de infecccedilatildeo por KPC A identificaccedilatildeo primaacuteria foi
realizada pelo Laboratoacuterio de Microbiologia do hospital de origem dos pacientes e os
demais procedimentos que foram utilizados na identificaccedilatildeo encontram-se descritos
abaixo
4 2 Procedimentos para confirmaccedilatildeo de resistecircncia bacteriana por
disco de ertapenem (adaptado CDC 2004)
Para diagnosticar amostra como portadora de bacteacuteria produtora de
carbapenemase foi realizado o teste com disco de ertapenem como forma de
triagem Inicialmente utilizou-se o swab contaminado com a amostra que foi
distribuiacuteda em uma pequena aacuterea da placa de aacutegar MacConkey para apoacutes o
crescimento ser realizada a pesquisa de colonizaccedilatildeo por enterobacteacuterias resistentes
aos carbapenecircmicos (Pesquisa de CRE) Procedeu-se a semeadura por teacutecnica
semi-quantitativaesgotamento com alccedila bacterioloacutegica na diluiccedilatildeo de 1100 O disco
de Ertapenem foi colocado na superfiacutecie da placa de MacConkey na junccedilatildeo dos dois
primeiros campos de semeadura conforme demonstrado na figura 5 Incubou a placa
33
em estufa aeroacutebia a 35ordmC por 24 e 48 horas e observou-se o halo de difusatildeo do
disco de Ertapenem na placa para proceder agrave leitura
O teste deixou de ser obrigatoacuterio apoacutes a modificaccedilatildeo dos criteacuterios
interpretativos para carbapenecircmicos para enterobacteacuterias publicados no suplemento
do CLSI 2010 M100-S20-U
Figura 5 Mecanismo de semeamento de material bioloacutegico oriundos de
pacientes com suspeita de infecccedilatildeo por KPC Fonte adaptado CDC 2004
4 2 1 Interpretaccedilatildeo dos resultados
Na ausecircncia de crescimento ateacute 24 horas (MacConkey) ou halo de difusatildeo
gt27 mm na placa deve-se reincubar as placas por mais 24 horas Quando for
ausente o crescimento apoacutes 48 horas ou halo de difusatildeo gt27 mm na placa libera-se
como enterobacteacuterias resistentes a carbapenecircmicos (KPCNEG)Havendo
crescimento de colocircnias na placa de MacConkey com halo lt 27 mm (apenas para
colocircnias com crescimento dentro do halo) deve-se reisolar e realizar identificaccedilatildeo e
antibiograma automatizado teste de sensibilidade por disco-difusatildeo e Teste de
Hodge Modificado (THM) Os isolados de enterobacteacuterias cujos testes comprovarem
a resistecircncia aos carbapanecircmicos testados (KPCPOS) foram reportado a Comissatildeo
de Controle de Infecccedilatildeo Hospitalar (CCIH) Jaacute osbacilos Gram-negativos natildeo
fermentadores natildeo foram reportados (KPCNEG) Para interpretaccedilatildeodos resultados
foram utilizados os valores conforme demonstrados na tabela 1
Tabela 1 Criteacuterios Interpretativos para testes de sensibilidade
ENTEROBACTEacuteRIAS
Disco difusatildeo (mm) MIC (microgml)
34
Antibioacutetico Sigla S I R S I R
Ertapenem 10
microg
ETP 22 19-
21
18 05 1 2
Meropenem 10
microg
MEM 23 20-
22
19 1 2 4
Fonte Manual Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)
2013
Os resultados que apresentaram resistecircncia ao antibioacutetico Ertapenem foram
considerados como suspeitos de contaminaccedilatildeo por KPC Fez-se o teste de
susceptibilidade aos antibioacuteticos (TSA) em aparelho automatizado MicroScan Walk
Away 96sl Dade Behring
4 3 Teste de susceptibilidade aos antibioacuteticos (adaptado CDC 2004)
A determinaccedilatildeo da susceptibilidade dos isolados foi feita pelo teste de
susceptibilidade aos antibioacuteticos (TSA) apoacutes cultura em meio de gelose simples
(INSA) para avaliaccedilatildeo da sua pureza e obtenccedilatildeo de colocircnias isoladas Para
preparaccedilatildeo de uma suspensatildeo bacteriana com turvaccedilatildeo aproximada de 05
McFarland (Dade BehringMicroScanregTurbidity Meter) ressuspendeu duas a cinco
colocircnias em 2ml de soro fisioloacutegico esteacuteril diluindo a 1100 em soro fisioloacutegico num
volume total de 10ml em seguida foi feita uma semeadura em duas placas
quadradas (120mm x 120mm) de Muller-Hinton Agar (INSA) por inundaccedilatildeo
Os discos de antibioacutetico carbapenecircmicos imipenem meropenem e
ertapenem (Biorad) foram aplicados com o auxiacutelio de um dispensador automaacutetico A
susceptibilidade das Enterobacteacuterias aos carbapenecircmicos foi definida de acordo
com o protocolo Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI 2011)
Para aquelas Enterobacteacuterias que apresentaram resistecircncia ao ertapenem
foram realizados o Teste de Hodge Modificado para Detecccedilatildeo de Enterobacteacuterias
Produtoras de Carbapenemases conforme descrito pelo Centers for Disease Control
and Prevention (CDC 2004)
35
4 4Teste de Hodge Modificado (THM) (adaptado CDC 2004)
Preparou-se uma suspensatildeo em salina esteacuteril com a cepa Escherichia coli
ATCC 25922 (padratildeo 05 de McFarland) Apoacutes isto diluiu a suspensatildeo 110 em
salina (05 ml da soluccedilatildeo de Ecoli ATCC 25922 + 45 ml salina)Foi entatildeo semeado
na superfiacutecie de uma placa de Agar Muller-Hinton com a suspensatildeo diluiacuteda de Ecoli
ATCC 25922 com auxilio de swab seco assegurando que houvesse uma
distribuiccedilatildeo uniforme cobrindo toda a superfiacutecie do Agar Deixou secar por 3 a 5
minutos em temperatura ambienteColocou-se o disco de ertapenem 10microg no centro
da placa e apoacutes isto fez-se uma estria linear da cepa a ser testada da borda do
disco ateacute a borda da placa utilizando uma alccedila calibrada 10 microl ou um swab Incubou
a placa na estufa em atmosfera aeroacutebia a 35 plusmn 2ordmC por 16 a 24 horas
441 Controle de qualidade (CQ)
Foi utilizado um CQ todos os dias em que se realizou o teste tendo como
controle Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1705- teste de Hodge modificado
positivo Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1706- teste de Hodge modificado
negativo
442 InterpretaccedilatildeoResultados
Apoacutes 16ndash24 horas de incubaccedilatildeo examinar as placas para verificar a presenccedila
de uma distorccedilatildeo no halo de inibiccedilatildeo do disco de ertapenem devido ao crescimento
realccedilado da cepa ATCC na intersecccedilatildeo do organismo teste e a Ecoli ATCC 25922
dentro dos limites do halo O THM positivo apresentaraacute presenccedila de distorccedilatildeo no
halo de inibiccedilatildeo de ertapenem devido ao crescimento da cepa Ecoli ATCC 25922 ao
longo da estria da cepa teste para dentro dos limites do halo de inibiccedilatildeo Jaacute o THM
negativo teraacute ausecircncia de crescimento da cepa Ecoli ATCC 5922 ao longo da estria
da cepa teste para dentro dos limites do halo de inibiccedilatildeo do disco de ertapenem
Este resultado estaacute representado na figura 6
36
Figura 6 Interpretaccedilatildeo resultado do Teste de Hodge Modificado
(adaptado CDC 2004) Teste positivo na estria da cepa teste na parte superior
da placa teste negativo na estria da cepa teste na parte inferior da placa
Tendo positivo como resultado o paciente era um provaacutevel contaminado por
KPC As amostras entatildeo foram encaminhadas para a Fundaccedilatildeo Osvaldo Cruz
(FIOCRUZ) para confirmaccedilatildeo final As amostras finalmente confirmadas como
positivas para KPC foram isoladas e guardadas no banco de cepas cliacutenicas do
hospital Apoacutes a autorizaccedilatildeo do CEP amostras das cepas foram transferidas para
meio de transporte Stuard em caixa teacutermica fechada em baixa temperatura e
levadas para o laboratoacuterio de microbiologia cliacutenica da universidade
No laboratoacuterio da universidade as amostras foram separadas e realizadas
repiques em meios MacConkey e incubadas por 24h As colocircnias caracteriacutesticas
foratildeo isoladas em caldo BHI e mantidas em shaker a 37oC por 2h Apoacutes isto foram
executadas as anaacutelises a seguir
Os isolados de Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases foram
submetidos agrave extraccedilatildeo de DNA e posterior sequumlenciamento para identificaccedilatildeo dos
genes de resistecircncia blaKPC de 1 a 13 e identificaccedilatildeo do gene universal Os
pacientes de onde os materiais bioloacutegicos contendo as Enterobacteacuterias produtoras
de carbapenemases foram os isolados foram investigados quanto aos aspectos
epidemioloacutegicos e cliacutenicos
37
4 5 Extraccedilatildeo de DNA bacteriano
A extraccedilatildeo de DNA bacteriano foi realizada utilizando o kit NucleoSpin
Plasmidreg (MN) Antes de iniciar a extraccedilatildeo foi feito a preparaccedilatildeo das soluccedilotildees
reagentes materiais e amostras (vortexando) colocou-se em banho-maria agrave 50ordmC o
tampatildeo AW Partiu-se de colocircnias isoladas cultivadas que sofreram passagem em
meio LB liacutequido por 12h Adicionou-se 15 mL da amostra no tubo eppendorf
centrifugou por 5 minutos descartou o sobrenadante (com cuidado para natildeo
descartar o Pellet) Repetiu-se este procedimento por mais trecircs vezes completando-
se o volume de 6mL Foram adicionados 250microL do tampatildeo Resuspension Buffer A1
encostando a ponteira no Pellet e misturando (este tampatildeo tem como funccedilatildeo
separar a formaccedilatildeo de grumos celulares) Apoacutes isso homogeneizou e vortexou os
tubos eppendorfs Apoacutes isso foram adicionados 250microL do tampatildeo Lysis Buffer A2
homogenizou e deixou descansar por 5 minutos (esta etapa eacute importante para a lise
da parede e da membrana celulares e liberaccedilatildeo do conteuacutedo da ceacutelula)
Passado o tempo de descanso foi adicionado 300microL do tampatildeo
Neutralization Buffer A3 homogeneizou e centrifugou por 10 minutos (este tampatildeo
iraacute retirar as proteiacutenas que envolvem o DNA e voltaraacute com o pH para proacuteximo de 8
impedindo que a soluccedilatildeo de lise facilite a quebra das ligaccedilotildees covalentes do aacutecido
nucleacuteico) Em seguida enumeraram-se os tubos contendo filtros com siacutelica
transferiu-se o sobrenadante para o filtro e centrifugou por 5 minutos Descartou-se
o que foi filtrado adicionou 500microL do tampatildeo AW (banho-maria) centrifugou por 2
minutos Novamente foi descartado o filtrado Adicionou-se 600microL do tampatildeo A4
centrifugou por 2 minutos e descartou o filtrado (os tampotildees AW e A4 contecircm
isotiocianato de guanidina em concentraccedilotildees crescentes para facilitar a adsorccedilatildeo
do DNA na siacutelica e retirada das outras biomoleacuteculas da amostra) Foi feita outra
centrifugaccedilatildeo com o tubo vazio Apoacutes isto o filtro foi trocado para outro eppendorf
definitivo onde foi adicionado 50microL do tampatildeo Elution Buffer AE (este tampatildeo
favorece a eluiccedilatildeo do DNA) centrifugou por 2 minutos descartou o filtro e
armazenou as amostras em freezer -20ordmC
38
4 6 Iniciadores e reaccedilatildeo de PCR
Os iniciadores universais para o gene blaKPC foram desenhados baseados
em sequumlecircncias conservadas apresentadas pelos sub-grupos de genes que
codificam a enzima carbapenemase de klebsiella pneumoniae (YIGIT et al 2001)
Baseado na sequumlecircncia para o blakpc-1 depositada no GenBank
(AF2975541) o oligonucleotiacutedio (oligo) iniciador direto (5-
ATGTCACTGTATCGCCGTC-3rsquo) foi desenhado para reconhecer a sequumlecircncia
blaKPC na posiccedilatildeo (131149) enquanto que o iniciador reverso (5-
TTACTGCCCGTTGACGCC-3rsquo) foi reconhecido na posiccedilatildeo (9951012) As anaacutelises
baseadas em alinhamento de sequumlecircncias mostraram que o par de iniciadores
blaKPC podem detectar os alelos de 1 a 13 do gene blaKPC conforme a tabela 2
Tabela 2 Nuacutemero de acesso ao GenBank dos alelos blaKPC e seus
microrganismos originais
Nuacutemero de
Acesso GenBank
Microrganismo Alvo
AF2975541 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-1
GU0862251 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-2
HQ2589341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-2-like
AB5577341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC -3
EU4473041 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-4
EU4002222 Pseudomonas
aeruginosa
blaKPC-5
EU5555341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-6
EU7297271 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-7
39
FJ2344121 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-8
FJ624872 Escherichia coli blaKPC-9
GQ1403481 Acinetobacter
baumannii
blaKPC-10
HM0669951 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-11
HQ3428891 Enterobacter cloacae blaKPC-12
HQ3428901 Enterobacter cloacae blaKPC-13
As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo de blaKPC foram realizadas em um
primeiro tempo de desnaturaccedilatildeo em que foi 94ordmC por 5 minutos seguido de 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 58 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 90 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 78ordmC por 8 minutos Aleacutem das amostras foi utilizado um
controle negativo
A PCR do blaKPC foi realizada utilizando os componentes para o volume da
reaccedilatildeo de 25 microL citados na tabela 3 A banda do tamanho do produto de PCR foi de
881 pares de bases (pb) o que corresponde ao plasmiacutedeo
Tabela 3 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do
gene blaKPC
Reagente Volume
DNA molde 4 microL
Tampatildeo Taq 25 microL
MgCl2 075 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP
2 microL
Oligo F 1 microL
Oligo R 1 microL
Taq DNA polimerase 05 microL
Aacutegua MiliQ 1335 microL
40
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
Baseado na sequumlecircncia para o gene 16S rRNA em que o oligonucleotiacutedio
Universal iniciador direto foward (5-CCAGCAGCCGCCGTAATACG-3rsquo) foi
desenhado para reconhecer a sequumlecircncia universal na posiccedilatildeo 1513 enquanto que o
iniciador reverso (5-ATCGGYTACCTTGTTACGACTTC-3rsquo) foi reconhecido na
posiccedilatildeo 1491 foram realizadas PCRrsquos As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo deste
gene foram realizadas nos seguinte tempos separaccedilatildeo 94ordmC por 10 minutos 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 55 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 120 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 72ordmC por 10 minutos
A PCR do gene 16S rRNA foi realizada utilizando os componentes para o
volume da reaccedilatildeo de 25microL citados na tabela 4 A banda do tamanho do produto de
PCR foi de 996 pb correspondente aacute regiatildeo ribossomal capaz de amplificar todas
as espeacutecies
Tabela 4Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do gene
universal
Reagente (quantidade
concentraccedilatildeo do estoque)
Volume
DNA molde 10 ng 4 microL
Tampatildeo Taq 10 x 25 microL
MgCl2 50mM 125 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP 25 mM
125 microL
Oligo F 10microM 05 microL
Oligo R 10microM 05 microL
Taq DNA polimerase 5UmicroL 04 microL
Aacutegua Miliq 146 microL
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
41
O termociclador utilizado para os experimentos foi o LifeTouch da BIOER
4 7 Digestatildeo
Para realizaccedilatildeo da digestatildeo foi utilizada a enzima BshF I (Hae III) EN- 1105
tamanho 7000 units concentraccedilatildeo 10 unitsmicroL fonte Bacillus sphaericus empresa
Jena bioscienceUtilizaram-se os componentes para o volume de 50microL da reaccedilatildeo
citados na tabela 5
Tabela 5 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da digestatildeo do gene
universal
Reagente Volume
Produto de PCR 10 microL
Enzima BshF I 01 microL
Tampatildeo (10x) 5 microL
Aacutegua Miliq 349 microL
Total (em cada ependorff) 50 microL
Valores para 1 digestatildeo
Os ependorffs foram colocados por 30 minutos em banho-maria a 37ordmC Apoacutes
isso fez-se a corrida das amostras em gel de agarose para verificaccedilatildeo do resultado
(LU et al 2000)
4 8 Eletroforese em gel de agarose
Os produtos de DNA PCR e digestatildeo foram analisados em gel de agarose
2 O tempo de corrida do gel eacute de aproximadamente 1hora e 30minutos sendo
que no comeccedilo foi usada agrave voltagem de 50 V e apoacutes comeccedilar a correr o gel
aumentou a voltagem para 100 v Utilizou-se o marcador de 100pb (pares de bases)
Foi adicionado 3microL de corante Bromophenol (que tem a funccedilatildeo de fazer uma ligaccedilatildeo
na amostra de DNA e permitir a visualizaccedilatildeo da corrida no gel de agarose) em 7microL
de amostra tanto de DNA quanto de PCR Para o preparo do gel foi utilizado TBE
42
(Tris- Aacutecido Boacuterico) agarose e brometo de etiacutedio (sua funccedilatildeo eacute de corante para o gel
e permitir a visualizaccedilatildeo do DNA quando colocado agrave luz ultravioleta) Para o oligo
blaKPC a banda da amplificaccedilatildeo foi em 881ppb correspondendo ao plasmiacutedeo Jaacute
o oligo Universal foi em 996 pb
4 9 Descarte de resiacuteduos
Todos os materiais utilizados nos ensaios foram de uso uacutenico e manipulados
em cacircmaras de seguranccedila bioloacutegica classe II Apoacutes o uso foram colocados em
soluccedilatildeo desinfetantes (hipoclorito a 1) e em seguida autoclavados a 127oC por 20
min em sacos apropriados para autoclavaccedilatildeo Apoacutes a finalizaccedilatildeo do ciclo de
esterilizaccedilatildeo os sacos contendo o material descartaacutevel foram colocados em
recipientes de coleta da empresa responsaacutevel pela coleta de materiais bioloacutegicos
produzidos no laboratoacuterio de microbiologia Todos os procedimentos seguiram a
normativa RDC-ANVISA 3062004 sobre o descarte de resiacuteduos de serviccedilo de
sauacutede
4 10 Aspectos epidemioloacutegicos e cliacutenicos
Os aspectos cliacutenicos e epidemioloacutegicos foram investigados por meio de
prontuaacuterios dos pacientes portadores de enterobacteacuterias produtoras de
carbapenemases e envolveram topografia mais provaacutevel do foco infeccioso a
enfermidade motivadora da internaccedilatildeo o desfecho cliacutenico a idade e o tempo de
internaccedilatildeo
4 12 Anaacutelises eepidemioloacutegicas
As anaacutelises foram realizadas com o pacote estatiacutestico SPSS versatildeo 200
Para verificar quais variaacuteveis referentes aos dados epidemioloacutegicos e
microbioloacutegicos influenciaram no desfecho verificou- se a diferenccedila meacutedia das
variaacuteveis idade e tempo de internaccedilatildeo em cada grupo O teste estatiacutestico utilizado foi
o teste t de Student apoacutes se executar o teste de normalidade de Shapiro-Wilk Para
as variaacuteveis sexo perfil microbioloacutegico das enterobacteacuterias produtoras de
43
carbapenemases foi avaliada a associaccedilatildeo com o desfecho por meio do teste Exato
de Fisher O niacutevel de significacircncia adotado foi de 5
4 13 Preceitos eacuteticos
Este projeto estaacute inserido em um projeto maior denominado ldquoEpidemiologia
cliacutenica e caracterizaccedilatildeo molecular do Acinetobacter Baumannii resistente a
antibioticoterapia em pacientes internado em hospitais do Sistema Uacutenico de Sauacutederdquo
que foi submetido ao Comitecirc de Eacutetica em Pesquisa da Secretaria do Estado de
Sauacutede do Distrito Federal (SESDF) e emitido parecer aprovado pelo protocolo nordm
23109 (anexo)
44
5 RESULTADOS
51 Anaacutelise molecular
Para a amplificaccedilatildeo com o oligo blaKPC foram amplificadas amostras
que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 881 pb correspondente ao
plasmiacutedeo A anaacutelise da amplificaccedilatildeo da regiatildeo do gene blaKPC mostrou que
apenas a amostra A10 natildeo amplificou isso demonstra que esta amostra natildeo
possuiacutea o gene de resistecircncia
5 1 1 Gene blaKPC
Figura 7 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 881 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
A amostra A3 natildeo amplificou no primeiro momento entatildeo foi realizado
novamente a PCR e corrida de gel obtendo entatildeo a amplificaccedilatildeo da amostra como
apresentado na figura 8
45
Figura 8 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC da
mostra A3 estudada A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo de 881
pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 1 2 Gene 16S rRNA
Para a amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA utilizou-se o oligo universal Foram
amplificadas amostras que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 996 pb
Figura 9 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
46
Segundo Lu et al (2000) a digestatildeo com a enzima HaeIII deste amplicons de
16S rRNA devolveriam bandas com perfis entre 150 a 200 pb No gel abaixo eacute
possiacutevel evidenciar que este perfil ocorreu com o predomiacutenio de bandas na altura
de 200pb
Figura 10 Gel de agarose a 2 da digestatildeo do amplicon do gene 16S
rRNA das amostras com a enzima HaeIII evidenciando diversos fragmentos
proacuteximos a 200 pb A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo ribossomal
de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 2 Anaacutelises epidemioloacutegicas
5 2 1 Sexo
No total foram detectados 17 isolados de KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 onde a maior a prevalecircncia foi
detecatada em amostras de pacientes do sexo masculino (53) do que no sexo
feminino (47)
47
Figura 11 Isolado de KPC segundo sexo dos 17 pacientes investigados
no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 2 Desfecho cliacutenico
Em 17 isolados de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo
de 2010 aacute 2011 a porcentagem de pacientes que foram a oacutebito (59) foi maior que
a de pacientes que tiverm alta (41)
Figura 12 Isolado de KPC segundo desfecho cliacutenico dos 17 pacientes
investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
48
5 2 3 Local da coleta
Dos 17 episoacutedios detectados de infecccedilatildeo por KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 a infecccedilatildeo em swab retalfoi mais
frequente (47) seguida de ponta de cateacuteter (18) e secreccedilatildeo traqueal (12)
Figura 13 Isolados de KPC segundo local da coleta da amostra nos 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 4 Microorganismo
O microorganismo mais encontrado foi a Klebsiella pneumoniae (82)
seguida da Enterobacter clocae (12) e Serratia marcescens (6) dos 17 isolados
de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 Isto afirma o
fato de a sigla KPC ser utilizada de forma errocircnea aacute Klebsiella pneumoniae visto
que a evidecircncia dela eacute maior em relaccedilatildeo as outras cepas
49
Figura 14 Isolado de KPC segundo microrganismo encontrado em 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 5 Relaccedilotildees variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana e desfecho
cliacutenico
Tabela 6 ndash Distribuiccedilatildeo do perfil geneacutetico sexo coleta tipificaccedilatildeo de
microrganismos e anaacutelise da resistecircncia bacteriana segundo o desfecho
cliacutenico Brasiacutelia-DF 2010 a 2011
Variaacutevel Resultado
Desfecho
Alta Oacutebito
N N P
Gene 16S rRNA Positivo 7 1000 10 1000
NA Gene blaKPC Positivo 6 857 10 1000
Negativo 1 143 0 00 0218 Sexo Feminino 2 286 6 600
Masculino 5 714 4 400 0201 Local da coleta Fundo saco de
Douglas 1 143 0 00
Hemocultura 0 00 1 100 0463 Ponta de cateter 1 143 2 200
Sec TraquealBrocircnquica
0 00 1 100
50
Secreccedilatildeo traqueal 2 286 0 00
Swab retal 3 429 5 500
Urina 0 00 1 100
Microrganismo Enterobacter cloacae (KPC)
1 143 1 100
Klebsiella pneumoniae
6 857 8 800
0416 Serratia
marcescens 0 00 1 100
Teste de Hodge Hodge positivo 7 1000 10 1000
NA Amicacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 1 100 0848 resistente 0 00 1 100
sensiacutevel 2 286 3 300
Amoxicilina Aacutecido Clavulacircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Ampicilina Sulbactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ampicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Aztreonan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefazolina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Cefoperazona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Cefotaxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefoxitina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0509 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 2 286 4 400
Ceftazidima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cetriaxona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 3 429 5 500 0772 Cefalotina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ciprofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772
51
resistente 3 429 5 500
Claritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Clindamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Eritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Gentamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0942 resistente 2 286 3 300
sensiacutevel 1 143 2 200
Imipenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 0 00 2 200 0193 Resistente 1 143 3 300
sensiacutevel 2 286 0 00
Nitrofurantoiacutena sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Norfloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Oxacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Penicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Piperacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Rifampicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tetraciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Ticarcilina Aacutecido Clavulocircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0688 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 3 429 4 400
Tobramicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Trimetoprima Sulfametoxazol
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0112 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 2 286 0 00
Vancomicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tigeciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediario 0 00 1 100 0211 natildeo testado 1 143 4 400
resistente 2 286 0 00
52
Cefepime sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefuroxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Levofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Piperacilina Tazobactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Ertapenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Meropenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0223 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 1 143 0 00
Cefotetan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 sensiacutevel 0 00 1 100
Gemifloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 7 700 0585 natildeo testado 3 429 3 300
Desfecho
Alta Oacutebito
Meacutedia Erro
padratildeo Meacutedia Erro
padratildeo p
Idade 58 9 59 5 0991
Tempo Internaccedilatildeo (dias)
50 13 46 12 0571
n= 17 p(lt 005) NA natildeo se aplica
53
6 DISCUSSAtildeO
Nos uacuteltimos anos houve um aumento na incidecircncia de bacteacuterias
multirresistentes aos antimicrobianos no ambiente hospitalar tornando isto um
problema mundial de sauacutede puacuteblica (HULSCHER et al 2010) Quando se trata
principalmente de bacilos Gram negativos a frequumlecircncia destas bacteacuterias eacute ainda
maior em paiacuteses da Ameacuterica Latina quando comparada a paiacuteses desenvolvidos
(GALES etal 2012)
De acordo com dados do ldquoMeropenem Yearly Susceptibility Test Information
Collectionrdquo (MYSTIC) ocorreu nos Estados Unidos um aumento na susceptibilidade
de K pneumoniae nos uacuteltimos anos graccedilas a praacuteticas de controle de disseminaccedilatildeo
de amostras resistentes(RHOMBERG P R et al 2009) O aumento crescente da
prevalecircncia destes microrganismos foi proporcional ao aumento da dependecircncia do
uso de antibioacuteticos carbapenecircmicos considerados como a opccedilatildeo terapecircutica para o
tratamento de infecccedilotildees por bacilos Gram negativos multi-resistentes (LIVERMORE
2012) Isto afeta diretamente as opccedilotildees de tratamento sobrando poucas alternativas
para a terapecircutica que incluem colistina (polimixina E) e tigeciclina que apresentam
respectivamente problemas em termos de toxicidade e eficaacutecia (LIVERMORE et
al 2011) Um dos efeitos adversos mais importantes das poliminas B e E por
exemplo satildeo a neurotoxicidade e nefrotoxicidade (MENDES C A C et al2009 )
Devido agrave resistecircncia ser usualmente de natureza plasmidial e portanto de
maior disseminaccedilatildeo especialmente quando carreadas por K pneumoniae
microrganismo com uma notoacuteria capacidade para acumular e transferir plasmiacutedeos
com determinantes para resistecircncia o nuacutemero de casos detectados pelo
fenoacutetipogenoacutetipo blaKPC eacute bastante preocupante (MONTEIRO et al 2009)
Comparada com outras bacteacuterias hospitalares a transmissatildeo de clones
multirresistentes de K pneumoniae eacute maior e podem natildeo ser controladas pelos
meacutetodos de controle de infecccedilatildeo hospitalar (PAAUW et al 2007) A forma
plasmidial para transferecircncia da resistecircncia adicionada a este grande potencial para
disseminaccedilatildeo de clones resistentes eacute preocupante visto que apoacutes surtos muitas
vezes pode se tornar endecircmica Jaacute eacute uma realidade a disseminaccedilatildeo desta bacteacuteria
54
entre pacientes hospitais paiacuteses e ateacute mesmo continentes (WOODFORF et al
2010 ROGERS et al 2011)
As chances de surtos satildeo maiores em paiacuteses com poucos recursos devido agrave
maior carecircncia de praacuteticas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees hospitalares e o
uso irracional de antimicrobianos de forma empiacuterica e inadequada (KUMARASAMY
et al 2010) Ateacute o momento os mecanismos de resistecircncia aos cabapenecircmicos
geralmente encontrado eram a produccedilatildeo de ESBL (CTX-M) somada aacute perda de
porina (CARVALHAES et al 2010) Foi notado a partir do ano de 2008 um
aumento no nuacutemero de K pneumoniae produtoras de KPC-2 apresentando outra
forma de resistecircncia (GALES 2012)
Um estudo mostrou que o perfil do paciente colonizado ou infectado por KPC
foi de um paciente entre os 33 e os 82 anos de idade internado haacute mais de 1
semana no hospital A mortalidade geral nos uacuteltimos anos ficou em torno de 7
sendo que dos 77 pacientes estudados 32 (415) pacientes evoluiacuteram para oacutebito
evidenciando a alta morbi-mortalidade associada (ALVES A P et al 2013)
Em estudo com 2316 pacientes avaliados a populaccedilatildeo de sexo masculino foi
de 526 idade meacutedia global de 53 anos (mediana de 55 anos) permanecircncia meacutedia
de 58 dias (mediana de 3 dias) (OLIVEIRA A C et al 2010) Outros trabalhos
apresentaram ausecircncia de significacircncia entre sexoidade e o desenvolvimento de
infecccedilotildees por microrganismos resistentes (PERES-BOTA D et al 2003 COLPAN
A et al 2005 COELLO R et al 1997)
Outro estudo utilizou um total de 30 amostras sendo elas isoladas de urina
escarro secreccedilatildeo pleural ponta de cateter aspirado traqueal e hemocultura A mais
prevalente foi em urina (40) Entre as 30 cepas analisadas a maior porcentagem
foi da cepa Klebsiella pneumoniae (70) Enterobacter sp (133) Klebsiella
ozaenae (10) Escherichia coli (333) e Klebsiella oxytoca (333)
(DIENSTMANN R et al 2010) Nos Estados Unidos a enzima KPC jaacute se tornou
endecircmica Foi realizada uma pesquisa em dois hospitais de Nova York onde
testaram 602 amostras e 45 apresentaram algum mecanismo de resistecircncia
sendo apenas 33 confirmadas por biologia molecular como KPC-2 (BRATU et
al 2005)
55
Estudo sobre os tipos de ESBL feito no Japatildeo apresentou o tipo Toho-1 como
o mais prevalente nessa pesquisa Ateacute o ano de 2000 ano em que foi publicado tal
estudo este era o primeiro relatoacuterio no Japatildeo para identificar derivados de ESBLs
como tipo de SHV e TEM entre E coli e K pneumoniae Em especial o tipo SHV- 12
foi identificado com uma maior frequumlecircncia Estes resultados indicam que tipos
distintos de ESBLs que satildeo diferentes em sua especificidade de substrato e origem
geneacutetica coexistem no Japatildeo Isto mostra a importacircncia de caracterizar genoacutetipos
distintos de ESBLs e de estar em alerta continuamente para as tendecircncias de
ESBLs no Japatildeo aleacutem da necessidade de uma interpretaccedilatildeo uniforme utilizando as
diretrizes do CSLI para relatar cepas produtoras de ESBL Aleacutem da detecccedilatildeo de
ESBLs satildeo necessaacuterias mais informaccedilotildees tais como o perfil de sensibilidade
especiacutefica para diversas β-lactacircmicos e o local da infecccedilatildeo Esses fatores satildeo
essenciais para a escolha adequada de antibioacuteticos (YAGI T et al 2000)
No ano de 2004 uma pesquisa avaliou a produccedilatildeo de uma enzima de
hidroacutelise de carbapenecircmicos atraveacutes da teacutecnica de sequumlenciamento foi revelado
um novo membro da famiacutelia KPC designado KPC- 3 Pesquisadores encontraram
em um mutante de K pneumoniae uma substituiccedilatildeo de um gene associado com
resistecircncia a Imipenem mas essa substituiccedilatildeo foi considerada improvaacutevel na
contribuiccedilatildeo da resistecircncia aos carbapenecircmicos da espeacutecie estudada Aleacutem da
resistecircncia aos carbapenecircmicos estes isolados eram em sua maioria resistentes agraves
cefalosporinas penicilinas e aminoglicosiacutedeos Usando estudos de transformaccedilatildeo
conjugaccedilatildeo e hibridaccedilatildeo localizaram o alelo blaKPC em plasmiacutedeo aleacutem disso
mostraram que esse alelo tambeacutem carregava uma resistecircncia aos aminoglicosiacutedeos
A transferecircncia das enzimas KPCs foi demonstrada in vitro tanto neste como em
outros estudos pode ser que os plasmiacutedeos que fazem esta transferecircncia estavam
comeccedilando a se espalhar no ambiente cliacutenico resultando na multiresistecircncia dessas
estirpes (WOODFORD et al 2004)
O presente estudo apresentou um vieacutes quanto aos resultados dos testes de
susceptibilidade microbiana Observou-se que natildeo foi encontrado resultado deste
teste em algumas amostras o que natildeo cooperou para um estudo mais preciso
futuros estudos quanto agraves amostras e um melhor acompanhamento deste tipo de
patologia Poreacutem mesmo sem algumas amostras com este resultado disponiacutevel foi
56
confirmada a presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos
carbapenecircmicos por meio dos genes de resistecircncia blaKPC e 16S rRNA que as
amostras apresentaram em sua maioria serem portadoras Quanto aos resultados
estatiacutesticos nenhuma das variaacuteveis apresentou significacircncia estatiacutestica (p gt 005)
mostrando assim que estas variaacuteveis isoladas natildeo foram o fator determinante para
o desfecho cliacutenico de alta ou oacutebito
57
7 CONCLUSAtildeO
Os genes blaKPC e 16S rRNA foram caracterizados confirmando a a
presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos carbapenecircmicos
Houve uma maior prevalecircncia da cepa K pneumoniae e isto confirma outros
estudos que apresentam a maior prevalecircncia desta cepa em amostras com KPC
Aleacutem disso isso justifica a forma popular da K pneumoniae ser chamada de KPC
enquanto que na verdade KPC eacute uma enzima podendo estar presente em outras
cepas como Enterobacter clocae tambeacutem apresentada no presente estudo O
desfecho cliacutenico de oacutebitos maior que 50 eacute um possiacutevel indicador sobre a
necessidade de se realizar um teste raacutepido para identificaccedilatildeo de KPC visando
iniciar o mais raacutepido possiacutevel o tratamento afim de diminuir a mortalidade por esta
infecccedilatildeo
Nenhuma das variaacuteveis isoladamente estaacute relacionada ao desfecho cliacutenico
oacutebito ou alta pois natildeo apresentaram relevacircncia estatiacutestica O presente estudo
mostrou que haacute presenccedila da bacteacuteria nas amostras de pacientes do hospital
estudado podendo entatildeo afirmar que este tipo de bacteacuteria se encontra tambeacutem
presente em ambiente hospitalar O uso irracional de antimicrobiano eacute demonstrado
de forma indireta quando foi apresentado atraveacutes do Teste de Hodge Modificado
uma resistecircncia de 100 aos antibioacuteticos carbapenecircmicos Isto tambeacutem reflete na
terapecircutica sendo que pacientes portadores de bacteacuterias resistentes aos
antibioacuteticos carabepecircmicos tem uma escassa opccedilatildeo de tratamento e as opccedilotildees
apresentam problemas quanto agrave toxicidade e eficaacutecia
58
REFEREcircNCIAS
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Mecanismos
de resistecircncia bacteriana aos antimicrobianos Disponiacutevel em
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controleopas_
webmodulo3mec_sitiohtmgt Acesso em 25 de abril de 2014
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Nota teacutecnica nordm
012013 medidas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees por enterobacteacuterias
multiresistentes Acesso em 17 de abril de 2013
ALBA J et al Kinetics study of KPC-3 a plasmid-encoded class A
carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase Antimicrob Agents Chemother
Nov49(11)4760-2 2005
ALVES A P et al Nosocomial infections by KPC-producing enterobacteria in
a tertiary hospital in Southern Brazil Revista da AMRIGS Porto Alegre 57 (3) 213-
218 jul-set 2013
ALVES A et al Tipagem Geneacutetica de Microrganismos Lab De Diversidade
Microbiana Centro de Biologia Celular Dep de Biologia U de Aveiro 3810-193
Aveiro- 2003
BELL J M et Al Prevalence and significance of a negative extended-
spectrum beta-lactamase (ESBL) confirmation test result after a positive ESBL
screening test result for isolates of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae
results from the SENTRY Asia-Pacific Surveillance Program J Clin Microbiol
May45(5)1478-82 2007
BRATU S et al Detection of KPC carbapenem-hydrolyzing enzymes in
Enterobacter spp from Brooklyn New York Antimicrob Agents Chemother v 49 n
2 p 776-8 2005
59
BRATU S et al Emergence of KPC-possessing Klebsiella pneumoniae in
Brooklyn New York epidemiology and recommendations for detection Antimicrob
Agents Chemother v 49 n 7 p 3018-20 2005
BRATU S et al Rapid spread of carbapenem-resistant Klebsiella
pneumoniae in New York City Arch Intern Med v 165 p 1430-5 2005
CAMARGO C F et al Aplicaccedilatildeo das teacutecnicas de pcr e suas teacutecnicas
derivadas em diagnoacutestico molecular Disponiacutevel em
ltfileDUnB10C2BA20semestreArtigosPCR-
20CLEYTON20FLORENCIO20DE20CAMARGO20E20PAULO20ROB
ERTO20QUEIROZpdfgtgt Acesso em 08 de abril de 2014
CARVALHES C G et al Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting
carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive
results Journal of Antimicrobial Chemotherapy v 65 n2 p 249-251 2010
CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION- CDC Modified
Hodge Test for Carbapenemase Detection in Enterobacteriaceae 2004
CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE Methods for
dilutionantimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically Approved
standard M7ndashA7 7th ed CLSI Wayne PA 2011
COELLO R et al Risk factors for developing clinical infection with methicillin-
resistant Staphylococcus aureus (MRSA) amongst hospital patients initially only
colonized with MRSA J Hosp Infect 19973739-46
COLPAN A et al Evaluation of risk factors for mortality in intensive care
units A prospective study from a referral hospital in Turkey Am J Infect Control
200533(1)42-7
60
CORNAGLIA G et al Living with ESBLs Introduction Clinical Microbiology
and Infection 14 Suppl 1 1-2 2008
COTRIM E R et al Klebsiella pneumoniae carbapenemase ndash KPC em
Enterobacteriaceae o desafio das bacteacuterias multirresistentes Poacutes em revista do
centro universitaacuterio Newton Paiva 12012 - ediccedilatildeo 5 - issn 2176 7785
DESHPANDE L M et al Occurrence and characterization of
carbapenemase-producing Enterobacteacuteriaceae report from the SENTRY
Antimicrobial Surveillance Program (2000-2004) Microb Drug Resist 12(4)223-30
2006
DIAS D J A Estudos dos principais mecanismos de resistecircncia aos
antibioacuteticos β-lactacircmicos em bacteacuterias patogecircnicas gram negativas 2009 100 f
Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Geneacutetica Molecular e Biomedicina) ndash Faculdade de
Ciecircncias e Tecnologia Universidade de Nova Lisboa Lisboa
DIENSTMANN R et al Avaliaccedilatildeo fenotiacutepica da enzima Klebsiella
pneumoniae carbapenemase (KPC) em Enterobacteriaceae de ambiente hospitalar
J Bras Patol Med Lab v 46 n 1 p 23-27 fevereiro 2010
ENDIMIAMI A et al Emergence of blaKPC-containing Klebsiella
pneumoniae in a long-term acute care hospital a new challenge to our healthcare J
Antimicrob Chemother 64 1102-1110 Nov 2009
FALAGAS M E et al Extended-spectrum beta-lactamase producing
organisms The Journal of Hospital Infection 73 (4) pp 345-54 2009
FONTANA C et al Emergence of KPC-producing Klebsiella pneumoniae in
Italy BMC Rev Notes 3 40 2010
61
GALES A C et al Antimicrobial resistance among Gram-negative bacilli
isolated from Latin America results from Sentry Antimicrobial Surveillance Program
(Latin America 2008-2010) Diagnostic Microbiology and Infectious Disease v 3 n
4 p 354 -360 2012
GUPTA N et al Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Epidemiology
and Prevention HEALTHCARE EPIDEMIOLOGY Clinical Infectious Diseases
201153(1)60ndash67 Published by Oxford University Press on behalf of the Infectious
Diseases Society of America 2011
HARBOTTLE H et al Genetics of antimicrobial resistance Anim Biotechnol
n17 p111-124 2006
HENRIQUE W N et al RESISTEcircNCIA BACTERIANA Uniatildeo das
Faculdades Alfredo NasserInstituto de Ciecircncias da Sauacutede Disponiacutevel em lt
httpwwwfaculdadealfredonasseredubrfilespesquisaposter20HENRIQUE20
Wilker20Natividade20SANTIAGO20Silvania20CAVALCANTI20DSP
20ResistC3AAncia20Bacterianapdfgt Acesso em 17 marccedilo 2014
HULSCHER M E J I et al Antibiotic prescribing in hospital a social and
behavioral scientific approach The Lancet Infectious Diaseases v 10 n 3 p 167-
165 2010
KIDWAI M SAPRA P BHUSHAN KR Synthetic strategies and medicinal
properties of beta-lactams Curr Med Chem 1999 695-215
KUMARASAMY K K et al Emergence of a new antibiotic resistance
mechanism in India Pakistan and the UK a molecular biological and
epidemiological stuy The Lancet Infectious Diseases v10 n 9 p 597- 602 2010
LINCOPAN N et al Enterobacteacuteria producing extended-spectrum β-
lacatamases and IMP-1 Metalo-β-lactamases isolated from Brazilian hospitals J Med
62
Microbiol 7 1-3 2006
LINCOPAN N et al First Isolation of Metalo-β-Lacatamase-Producing
Multiresistant Klebsiella pneumoniae from a patient in Brazil J Clin Microbiol 43(1)
516-519 2005
LIVERMORE D M et al What remains against carbapenem- resistant
Enterobacteriaceae Evaluation of choramphenicol ciprofloxacin colistina
fosfomycin minocycline nitrofurantoin temocilin and tigecycline International
Journal of Antimicrobial Agents v 37 n 5 p 415- 459 2011
LIVERMORE D M Fourten years in resistance International Journal of
Antimicrobial Agents v 39 283- 294 2012
LIVERMORE D M Bacterial resistance to carbapenems Adv Exp Med Biol
1995 39025-47
LIVERMORE D M Bacterial resistance origins epidemiology and impact
Clin Infect Dis 36S11-S23 2003
LIVERMORE D M et al Carbapenemases a problem in waiting Curr
Opin Microbiol 2000 3489-95
LU et al Universal pcr for common bacterial pathogens J CLIN
MICROBIOL VOL 38 2000
LU et al Use of PCR with Universal Primers and Restriction Endonuclease
Digestions for Detection and Identification of Common Bacterial Pathogens in
Cerebrospinal Fluid Journal of Clinical Microbiology June 2000 p 2076ndash2080
MARSCHALL J Met al Presence of the KPC Carbapenemase Gene in
Enterobacteriaceae Causing Bacteremia and Its Correlation with In Vitro
Carbapenem Susceptibility J Clin Microbiol 47 239-241 Jan 2009
63
MARTINS WMBS et al Prevalecircncia do gene blaKPC em isolados cliacutenicos
de Enterobacteriaceae e natildeo fermentadores encontrados em amostras clinicas em
um hospital universitaacuterio do Recife X Jornada de ensino pesquisa e extensatildeo ndash
JEPEX 2010 ndash UFRPE Recife 18 a 22 de outubro
MENDES C A C et al Polimixinas Revisatildeo com ecircnfase na sua
nefrotoxicidade Rev Assoc Med Bras 2009 55(6) 752-9
MOHR J F 3rd Update on the efficacy and tolerability of meropenem in the
treatment of serious bacteacuterial infections Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S41-51
2008
MONTEIRO J et al First report of KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae
strains in Brazil Antimicrob Agents Chemother Jan53(1)333-4 2009
MOREIRA V C et al Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia a antibioacuteticos
Disponiacutevel em
lthttpwwwcpglsucgbr6mostraartigosSAUDEVANESSA20CARVALHO20M
OREIRApdfgt Acesso em 21 marccedilo 2014
NETIKUL T et al Emergence of novel blaKPC-12 and blaKPC-13 variants in
carbapenem non-susceptible Enterobacter cloacae a first report of blaKPC gene in
Thailand European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases May
S372 2011
NETO V A et al Antibioacuteticos na praacutetica Meacutedica 6ordf Ediccedilatildeo Editorial
SarverSP Brasil 2007
NICOLAU D P Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of
meropenem Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S32-40 2008
64
OLIVEIRA A C et al Resistecircncia bacteriana e mortalidade em um centro de
terapia intensiva Rev Latino-Am Enfermagem nov-dez 2010
PAAUW A et al Failure to control an outbreak of qnrA 1-positive multidrug-
resistant Enterobacter clocae despite adequate implementation of recommended
infection control measures Journal of Clinical Microbiology v 45 n 5 p 1420-1425
2007
PATERSON D L et al Extended-Spectrum Beta-Lactamases a Clinical
Update Clinical Microbiology Reviews v 18 p 657-686 2005
PEIRANO G et al Carbapenem-hydrolysing beta-lactamase KPC-2 in
Klebsiella pneumonia isolated in Rio de Janeiro Brazil J Antimicrob Chemother Nov
20 2009
PERES-BOTA D et al Are infections due to resistant pathogens associated
with worse outcome in critically ill patients J Infect 200347(4)307-16
PIDDOCK L J V Clinically relevant chromosomally encoded multidrug
resistance effl ux pumps in bacterial Clin Microbiol Rev n19 p382-402 2006
PITOUT J D D et al Emergence of Enterobacteriaceae producing
extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) in the community J Antimicrob
Chemother May 56 2005
POSSEBON M I et al Resistecircncia bacteriana aos carbapenecircmicos
Bacterial resitence to carbapenems RBM rev bras med60(6)378380-378-382
jun 2003
QUEENAN A M et al Carbapenemases the versatile beta-lactamases
Clin Microbiol Rev Jul20(3)440-58 2007
65
RHOMBERG P R et al Summary trends for the meropenem yearly
susceptibility test information collection program a 10- year experience in the United
States (1999-2008) Diagnostic Microbiology and Infectiois Disease v 65 n4 p
414-426 2009
ROBLEDO I E et al Detection of KPC in Acinetobacter spp in Puerto Rico
J Antimicrob Agents Chemother 54 1354-1357 Mar 2010
ROGERS B A et al Country-to-country transfer os patients and the risk of
multi-resistant bacterial infection Clinical Infectious Disease v53 n1 p49- 56
2011
SHAH A A et al Characteristics epidemiology and clinicalimportance of
emerging strains of Gram-negative bacilli producing extended-spectrum
betalactamases Research in Microbiology v 155 p 409-421 2004
TURNER P J Extended- Spectrum Beta-Lactamases Clinical Infectious
Diseases v 41 p 273-275 2005
WOLTER D J et al Phenotypic and Enzymatic Comparative Analysis
between the Novel KPC variant KPC-5 and Its Evolutionary Variants KPC-2 and
KPC-4 Antimicrob Agents Chemother Nov 17 2008
WOODFORD N et al Carbapenemases of Chryseobacterium
(Flavobacterium) meningosepticum distribution of blaB and characterization of a
novel Metalo-beta-lactamase gene blaB3 in the type strain NCTC 10016
Antimicrob Agents Chemother Jun44(6)1448-52 2000
WOODFORF N Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in
India Pakistan and the UK a molecular biological and epidemiological study The
Lancet Infectious Diseases v 10 n 9 p 597-602 2010
66
WOODFORD et al Outbreak of Klebsiella pneumoniae Producing a New
Carbapenem- Hydrolyzing Class A β-Lactamase KPC-3 in a New York Medical
Center Antimicrobial agents and chemotherapy Dec 2004 p 4793ndash4799 Vol 48
No 12
YAGI T et al A preliminary survey of extended-spectrum β-lactamases
(ESBLs) in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Japan
FEMS Microbiology Letters 184 (2000) 53-56
YIGIT H et al Novel carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase KPC-1 from
a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumonia J Antimicrob Agents
Chemother 45 (4) 1151-1161 (2001)
ZAVASCKI A P et al KPC-2- producing Enterobacter cloacae in two cities
from Southern Brazil Int J Antimicrob Agents Apr 28 2009
ZHANEL G G et al Comparative review of the carbapenecircmicos Drugs
67(7)1027-52 2007
67
ANEXOS
Sequumlecircncia do oligo blaKPC
Query 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
Query 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
Query 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
68
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
Query 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
Query 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
69
Query 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
Query 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
Query 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
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|||||||
70
Sbjct 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
Query 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
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Sbjct 481
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ATTTGTT 540
Query 541
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GCGATAC 600
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Sbjct 541
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GCGATAC 600
Query 601
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71
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|||||||
Sbjct 601
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ATGCGCG 660
Query 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Sbjct 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
Query 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
72
Query 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
Query 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
Query 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
73
Sbjct 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
Query 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
Query 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
Query 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
74
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
Query 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
Query 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
75
Query 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
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|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
Query 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
||||
Sbjct 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
LOCUS AF297554 1377 bp
DNA linear BCT 26-MAR-2001
DEFINITION Klebsiella pneumoniae carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
gene complete cds
ACCESSION AF297554
VERSION AF2975541 GI10121874
76
KEYWORDS
SOURCE Klebsiella pneumoniae
ORGANISM Klebsiella pneumoniae
Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Enterobacteriaceae Klebsiella
REFERENCE 1 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH QueenanAM
AndersonGJ Domenech-SanchezA
BiddleJW StewardCD
AlbertiS BushK and TenoverFC
TITLE Novel carbapenem-hydrolyzing beta-
lactamase KPC-1 from a
carbapenem-resistant strain of
Klebsiella pneumoniae
JOURNAL Antimicrob Agents Chemother 45 (4)
1151-1161 (2001)
PUBMED 11257029
REFERENCE 2 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH AndersonGJ and
TenoverFC
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (19-AUG-2000) Nosocomial
Pathogens Laboratory Branch
Centers for Disease Control and
Prevention 1600 Clifton Rd MS
G08 Atlanta GA 30333 USA
FEATURES LocationQualifiers
77
source 11377
organism=Klebsiella
pneumoniae
mol_type=genomic DNA
db_xref=taxon573
-35_signal 5560
-10_signal 7883
mRNA 921012
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
RBS 117122
CDS 1311012
note=blaKPC-1
codon_start=1
transl_table=11
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
protein_id=AAG134101
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translation=MSLYRRLVLLSCLSWPLAGFSATALTNLVAEPFAKLEQD
FGGSI
GVYAMDTGSGATVSYRAEERFPLCSSFKGFLAAAVLARSQQQAGLLDTPIRYG
KNALV
PWSPISEKYLTTGMTVAELSAAAVQYSDNAAANLLLKELGGPAGLTAFMRSIG
DTTFR
78
LDRWELELNSAIPSDARDTSSPRAVTESLQKLTLGSALAAPQRQQFVDWLKGN
TTGNH
RIRAAVPADWAVGDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTRAPNKDDK
HSEAV
IAAAARLALEGLGVNGQ
ORIGIN
1 cggggcagtt acagccgtta cagcctctgg
agagggagcg gcttgccgct cggtgataat
61 cccagctgta gcggcctgat tacatccggc
cgctacacct agctccacct tcaaacaagg
121 aatatcgttg atgtcactgt atcgccgtct
agttctgctg tcttgtctct catggccgct
181 ggctggcttt tctgccaccg cgctgaccaa
cctcgtcgcg gaaccattcg ctaaactcga
241 acaggacttt ggcggctcca tcggtgtgta
cgcgatggat accggctcag gcgcaactgt
301 aagttaccgc gctgaggagc gcttcccact
gtgcagctca ttcaagggct ttcttgctgc
361 cgctgtgctg gctcgcagcc agcagcaggc
cggcttgctg gacacaccca tccgttacgg
421 caaaaatgcg ctggttccgt ggtcacccat
ctcggaaaaa tatctgacaa caggcatgac
481 ggtggcggag ctgtccgcgg ccgccgtgca
atacagtgat aacgccgccg ccaatttgtt
541 gctgaaggag ttgggcggcc cggccgggct
gacggccttc atgcgctcta tcggcgatac
79
601 cacgttccgt ctggaccgct gggagctgga
gctgaactcc gccatcccaa gcgatgcgcg
661 cgatacctca tcgccgcgcg ccgtgacgga
aagcttacaa aaactgacac tgggctctgc
721 actggctgcg ccgcagcggc agcagtttgt
tgattggcta aagggaaaca cgaccggcaa
781 ccaccgcatc cgcgcggcgg tgccggcaga
ctgggcagtc ggagacaaaa ccggaacctg
841 cggagtgtat ggcacggcaa atgactatgc
cgtcgtctgg cccactgggc gcgcacctat
901 tgtgttggcc gtctacaccc gggcgcctaa
caaggatgac aagcacagcg aggccgtcat
961 cgccgctgcg gctagactcg cgctcgaggg
attgggcgtc aacgggcagt aaggctctga
1021 aaatcatcta ttggcccacc accgccgccc
ttgcgggcgg catggattac caaccactgt
1081 cacatttagg ctaggagtct gcgcggcaga
gccgtgtgac cggttttctg tagagcactg
1141 acgatggcgg cggcgctctc tgcaattggc
aaggcgtcgg cgccaaggat accaatcttg
1201 cggcgcgcgg cgtgttatga cgactggggt
gcatttgagc cgccccattt aaccttcgcc
1261 ctcacagata cgccattcgc ctcaaattta
gcgccatgca gacgagcttc cactcggctt
1321 gcaccttgtc caggcccctc atgctgaact
gacgcaatcc catcaccgcc ttgatca
80
16
antibioacutetico Quando comparados com outros beta-lactacircmicos os carbapenecircmicos
satildeo mais resistentes agrave hidroacutelise pela maioria das beta-lactamases tanto
cromossocircmicas como plasmiacutedicas (LIVERMORE 1995 LIVERMORE et al 2000)
Figura 1 Accedilatildeo do szlig-lactacircmico sobre a bacteacuteria gram-positiva e gram-
negativa Fonte
ltlthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controle
opas_webmodulo3gramn_lacta2htmgt (adaptado)
A bacteacuteria Klebsiella pneumoniae quando apresenta gene ESBL pode
expressar resistecircncia a ateacute 95 dos antimicrobianos existentes no acircmbito
farmacecircutico sendo a produccedilatildeo de beta-lactamases de espectro estendido (ESBL)
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por esta bacteacuteria uma das principais causas de falha terapecircutica Existem outras
formas de resistecircncia emergentes de grande importacircncia como a produccedilatildeo de
beta-lactamases tipo adenosina monofosfato ciacuteclico (AmpC) que hidrolizam
cefoxitina as carbapenemases como as metalo-beta-lactamases (MBL) e
carbapenemases tipo KPC (MOREIRA et al 2014)
O mecanismo de resistecircncia mais comum aos antibioacuteticos beta-lactacircmicos de
amplo espectro eacute a produccedilatildeo de ESBL por enterobacteacuterias A accedilatildeo hidroliacutetica
apresentadas por estas enzimas pode conferir clinicamente resistecircncia ao
aztreonam cefalosporina e a todas as penicilinas (PATERSON et al 2005) As
ESBL satildeo enzimas mediadas por genes plasmidiais (transmissiacuteveis entre as
espeacutecies) Os principais microrganismos produtores de ESBL satildeo Klebsiella
pneumoniae (mais encontrada) Escherichia coli e Proteus mirabilis podendo ocorrer
em outros membros da famiacutelia Enterobacteriaceae e em alguns microrganismos natildeo
enteacutericos como Acinetobacter ssp (TURNER 2005) A importacircncia cliacutenica meacutedica
destes microrganismos portadores de ESBL eacute que graccedilas aacutes suas resistecircncias a
muitas classes de antimicrobianos o tratamento de infecccedilotildees eacute difiacutecil gerando um
aumento da morbidade e mortalidade dos pacientes (SHAH et al 2004)
A enzima KPC foi detectada pela primeira vez na Carolina do Norte Costa
Leste dos Estados Unidos no ano de 1996 em Klebsiella pneumoniae dando entatildeo
este nome a enzima Em pouco tempo ela disseminou por outras regiotildees e
recentemente tornou-se uma das preocupaccedilotildees quanto agrave sauacutede puacuteblica mundial
Os paiacuteses de onde KPCs tecircm sido relatados desde 2001 satildeo mostrados na figura 2
apresentando como os organismos tecircm agora sido disseminados amplamente pelo
mundo (NEIL GUPTA et al 2011)
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Figura 2 Divulgaccedilatildeo internacional de Enterobacteriaceae produtora de
Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC)( NEIL GUPTA et al 2011)
Este mapa apresenta paiacuteses onde Enterobacteriaceae produtoras KPC de
foram descritos em relatoacuterios publicados disponiacuteveis a partir de 11 fevereiro de
2011 Os paiacuteses natildeo destacadas nesta figura tambeacutem podem apresentar a presenccedila
de Enterobacteriaceae produtoras de KPC poreacutem pode ter tido uma falta de
vigilacircncia sistemaacutetica para estes organismos ( NEIL GUPTA et al 2011)
No ano de 2005 foram registradas pela primeira vez essas bacteacuterias
produtoras de carbapenemases Apoacutes 6 anos deste primeiro relato elas passaram a
causar surtos mais graves em nosso paiacutes Em janeiro de 2011 foram notificados no
Distrito FederalBrasil 367 casos em um curto espaccedilo de tempo (01 a 08 de janeiro
de 2011) com 26 oacutebitos A maior parte destes casos (263 casos) foi identificada nas
unidades de terapia intensiva ndash UTI (COTRIM et al 2012)
O potencial de disseminaccedilatildeo da KPC eacute alto devido agrave grande capacidade de
transferecircncia do seu material geneacutetico e por conseguinte os genes de resistecircncia
O controle de epidemias eacute difiacutecil devido a esta caracteriacutestica de faacutecil disseminaccedilatildeo
preocupando os profissionais da aacuterea de sauacutede devido agrave dificuldade de tratamento
podendo resultar em um aumento das taxas de mortalidade Apesar da maior
19
frequumlecircncia em Klebsiella pneumoniae a KPC pode ser identificada em outras
bacteacuterias como a Enterobacter cloacae Citrobacter freundii Salmonella spp E coli
e Pseudomonas spp (DIENSTMANN et al 2010)
Os pacientes com comorbidades incluindo pacientes transplantados
neutropecircnicos em ventilaccedilatildeo mecacircnica em Unidade de Terapia Intensiva (UTI)
com longos periacuteodos de internaccedilatildeo que apresentam risco aumentado de infecccedilatildeo ou
colonizaccedilatildeo para bacteacuterias multirresistentes satildeo mais vulneraacuteveis a Klebsiella
pneumoniae produtora de KPC (COTRIM et al 2012)
Os sinais e sintomas apresentados por um indiviacuteduo infectado por KPC satildeo
febre ou hipotermia taquicardia piora do quadro respiratoacuterio e em casos mais
graves hipotensatildeo inchaccedilo e sepse Quanto ao siacutetio de infecccedilatildeo a bacteacuteria que
possui a enzima KPC pode causar pneumonia associada agrave ventilaccedilatildeo mecacircnica
infecccedilatildeo do trato urinaacuterio infecccedilatildeo de corrente sanguiacutenea infecccedilatildeo de partes moles
e outros tipos de infecccedilatildeo (COTRIM et al 2012)
Para desenvolver a infecccedilatildeo a colonizaccedilatildeo eacute um preacute-requisito poreacutem o
pacientes pode estar colonizado ou seja ser portadores de KPC e natildeo desenvolver
a infecccedilatildeo (ALVES et al 2013) A forma de transmissatildeo eacute basicamente por
contato com secreccedilatildeo ou excreccedilatildeo de pacientes infectados ou colonizados logo
fora do ambiente hospitalar a bacteacuteria natildeo representa perigo (COTRIM et al
2012)
As opccedilotildees terapecircuticas para o tratamento da Klebsiella pneumoniae eacute
dividida em Terapia Empiacuterica e Terapia apoacutes a determinaccedilatildeo do perfil de
sensibilidade A terapia empiacuterica para infecccedilotildees por enterobacteacuterias multirresistentes
se baseia na utilizaccedilatildeo de polimixina B ou polimixina E (Colistina) em associaccedilatildeo
com um (1) ou mais dos antimicrobianos da classe dos aminoglicosiacutedeos
(gentamicina ou amicacina) Carbapenecircmicos (meropenem ou doripenem) eou
tigeciclina (ANVISA 2013)
Recomenda-se usar sempre associaccedilotildees de dois ou trecircs antimicrobianos
sendo um deles a polimixina B ou a polimixina E (colistina) Deve-se evitar a
utilizaccedilatildeo de monoterapias pelo risco de raacutepido desenvolvimento de resistecircncia A
escolha do(s) faacutermaco(s) de associaccedilatildeo com polimixina B ou E deve se basear
preferencialmente no perfil de susceptibilidade esperado aos referidos
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medicamentos das enterobacteacuterias resistentes aos carbapenecircmicos detectadas no
hospital ou na ausecircncia de dados locais na regiatildeo Deve-se considerar igualmente
o local de infecccedilatildeo e a penetraccedilatildeo esperada do antimicrobiano na escolha da droga
a ser utilizada na combinaccedilatildeo (ANVISA 2013)
Apoacutes a liberaccedilatildeo do perfil de sensibilidade deve-se adequar o uso dos
medicamentos Sempre que possiacutevel manter no miacutenimo 2 (dois) faacutermacos com
sensibilidade comprovada in vitro Natildeo havendo sensibilidade a um segundo
medicamento (suscetibilidade apenas agrave polimixina B ou E) recomenda-se manter a
terapia combinada de polimixina B ou E com carbapenecircmicos (meropenem ou
doripenem) ou tigeciclina na tentativa de ocorrecircncia de sinergismo entre elas
(ANVISA 2013)
Sugere-se aleacutem da determinaccedilatildeo das Concentraccedilotildees Inibitoacuterias Miacutenimas
(CIMs) para uma das polimixinas (B ou E) que tambeacutem sejam determinadas as
CIMs de tigeciclina e carbapenecircmicos (meropenem) bem como a consultoria de um
infectologista (ou Comissatildeo de Controle de Infecccedilatildeo Hospitalar- CCIH) para a
determinaccedilatildeo da terapia combinada com base na interpretaccedilatildeo do antibiograma
CIM e quadro cliacutenico do paciente No caso de resistecircncia agraves polimixinas
(concentraccedilotildees inibitoacuterias miacutenimas [CIMs] gt 2 mgL) recomenda-se a associaccedilatildeo de
dois ou trecircs do antimicrobianos sugeridos para a combinaccedilatildeo (ANVISA 2013)
A antissepsia eficiente do ambiente dos instrumentos ciruacutergicos e das matildeos
com o uso do aacutelcool a 70 eacute fundamental para a contenccedilatildeo de surtos Aleacutem disto
os pacientes contaminados devem permanecer isolados ateacute o controle da infecccedilatildeo
para evitar a disseminaccedilatildeo da bacteacuteria (COTRIM et al 2012)
1 2 Resistecircncia bacteriana
Hoje a disseminaccedilatildeo e a proliferaccedilatildeo das bacteacuterias resistentes estatildeo cada
dia mais presente As bacteacuterias multirresistentes (BRMD) poderatildeo levar agrave
humanidade a uma era poacutes-antibioacutetica resultando em uma ausecircncia de qualquer
opccedilatildeo de tratamento para os portadores destas cepas (HENRIQUE et al 2014)
Os fatores envolvidos na disseminaccedilatildeo desses patoacutegenos multirresistentes
satildeo diversos incluindo o uso irracional de antimicrobianos procedimentos invasivos
21
(cirurgias implantaccedilatildeo de proacuteteses meacutedicas e outros) e a transferecircncia de material
geneacutetico com a informaccedilatildeo de resistecircncia a antibioacuteticos entre as bacteacuterias
(DIENSTMANN et al 2010 ENDIMIAMI et al 2009 FONTANA et al 2010)
Com a praacutetica da antibioticoterapia principalmente em ambientes
nosocomiais os mecanismos de resistecircncia tornaram-se comuns Esses
mecanismos incluem alteraccedilatildeo na permeabilidade da membrana celular que
impede a entrada do antibioacutetico na ceacutelula bombeamento do antibioacutetico para fora da
mesma pelo mecanismo de efluxo mutaccedilatildeo geneacutetica que altera de alguma forma o
alvo do antibioacutetico e consequumlentemente natildeo afeta o funcionamento da bacteacuteria
bem como desenvolvimento da capacidade de degradar ou da inativaccedilatildeo do
antibioacutetico (COTRIM et al 2012) Estes mecanismos estatildeo representados na figura
3
Figura 3 Mecanismos de resistecircncia bacteriana Fonte
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controle
opas_webmodulo3pop_mecanismohtmgt
Um dos mais importantes mecanismos de resistecircncia eacute a alteraccedilatildeo do local-
alvo onde atua determinado antimicrobiano de modo a impedir a ocorrecircncia de
qualquer efeito inibitoacuterio ou bactericida As bacteacuterias podem adquirir um gene que
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codifica um novo produto resistente aos antimicrobianos substituindo o alvo original
por exemplo o Staphylococcus aureus resistente agrave oxacilina e estafilococos
coagulase-negativos adquiriram o gene cromossocircmico Mec A e produzem uma PBP
ou PLP resistente aos β-lactacircmicos denominada 2a ou 2 que eacute suficiente para
manter a integridade da parede celular durante o crescimento quando outras PBPs
essenciais satildeo inativadas por antibimicrobianos β-lactacircmicos Como alternativa um
gene receacutem-adquirido pode atuar para modificar um alvo tomando-o menos
vulneraacutevel a determinado antimicrobiano Assim um gene transportado por
plasmiacutedeo ou por transposon codifica uma enzima que inativa os alvos ou altera a
ligaccedilatildeo dos antimicrobianos como ocorre com eritromicina e clindamicina (ANVISA
2007)
Em funccedilatildeo da bomba de efluxo pode variar a especificidade do antibioacutetico
Ele atua por meio do bombeamento ativo de antimicrobianos do meio intracelular
para o extracelular gerando uma resistecircncia bacteriana a determinados
antimicrobianos como eacute o caso da resistecircncia agraves tetraciclinas codificada por
plasmiacutedeos em Escherichia coli devido agrave presenccedila de proteiacutenas integrantes da
membrana plasmaacutetica bacteriana (PIDDOCK 2006)
O aumento da siacutentese de proteiacutenas eacute o principal responsaacutevel pela resistecircncia
antimicrobiana devido agraves vaacuterias mutaccedilotildees que ocorrem em seus repressores
transcricionais Estas mutaccedilotildees tambeacutem podem influenciar levando a um aumento
da eficiecircncia do transporte dos antibioacuteticos para o exterior da ceacutelula (HARBOTTLE
et al 2006)
A resistecircncia aos antibioacuteticos eacute frequumlentemente associada agrave alteraccedilatildeo
diminuiccedilatildeo da permeabilidade que ocorre na membrana externa das bacteacuterias gram-
negativas O fluxo de moleacuteculas para o interior da ceacutelula ocorre por caracteriacutesticas
peculiares como carga estrutura e dimensatildeo e atraveacutes de proteiacutenas de membrana
as quais formam canais Este percurso eacute utilizado pelos antibioacuteticos para atingir o
interior da ceacutelula bacteriana ou o espaccedilo periplasmaacutetico como eacute o caso dos
antibioacuteticos β-lactacircmicos Portanto a perda de funccedilatildeo destas proteiacutenas pode
efetivamente causar a diminuiccedilatildeo da susceptibilidade a vaacuterios antibioacuteticos
(LIVERMORE 2003)
23
Os mecanismos de resistecircncia que podem impedir a accedilatildeo de antimicrobianos
satildeo vaacuterios O faacutermaco atua de forma a inibir os processos essenciais a multiplicaccedilatildeo
e sobrevivecircncia da ceacutelula bacteriana como a membrana citoplasmaacutetica e
consequumlentemente bloqueando a siacutentese proteacuteica de aacutecidos nucleacuteicos e da parede
celular A resistecircncia bacteriana eacute um mecanismo natural de defesa Sendo assim
as bacteacuterias estatildeo em constante defesa e para cada novo faacutermaco desenvolvido as
bacteacuterias iratildeo desenvolver resistecircncia em algum momento (POSSEBON et al
2003)
O grupo de antibioacuteticos beta-lactacircmicos satildeo amplamente utilizado e se
encontram dentro da classe dos melhores agentes antimicrobianos com relevacircncia
cliacutenica No entanto o seu uso tem sido restringido devido a vaacuterios mecanismos de
resistecircncia O desenvolvimento dos carbapenecircmicos surgiu devido agrave proliferaccedilatildeo de
beta-lactamases mediadas por plasmiacutedeos e cromossomos (POSSEBON et al
2003)
A bacteacuteria KPC tem um gene chamado SHV-1 que tem a caracteriacutestica de
resistecircncia a quase todos os tipos de antimicrobianos inclusive os carbapenecircmicos
especiacuteficos para o tratamento de infecccedilotildees por bacteacuterias multiresistentes e
emergecircncias Mesmo com no seu coacutedigo geneacutetico a informaccedilatildeo necessaacuteria para o
desenvolvimento da resistecircncia a resistecircncia da bacteacuteria soacute eacute desenvolvida caso a
bacteacuteria entre em contato com o antibacteriano desencadeando todo o processo
nos casos de resistecircncia induzida comuns em KPC (MOREIRA et al 2014)
A resistecircncia bacteriana pode ser apresentada de forma intriacutenseca ou
adquirida A resistecircncia intriacutenseca faz parte das caracteriacutesticas fenotiacutepicas naturais
do microrganismo ou seja faz parte de sua heranccedila geneacutetica sendo transmitida
verticalmente a prole sem perda da caracteriacutestica A presenccedila ou ausecircncia do alvo
para a accedilatildeo da droga eacute o principal determinante deste tipo de resistecircncia
(MOREIRA et al 2014) Essa resistecircncia corresponde a uma caracteriacutestica de
espeacutecie bacteriana quando estes microrganismos satildeo naturalmente resistentes a
certo tipo de antibioacutetico Este processo eacute decorrente da ausecircncia de estruturas de
atuaccedilatildeo de antimicrobianos ou a impermeabilidade por parte de estruturas
perifeacutericas das bacteacuterias (HENRIQUE et al 2014)
24
A resistecircncia adquirida aos antibioacuteticos por sua vez ocorre quando haacute uma
da mutaccedilatildeo de genes reguladores ou estruturais aquisiccedilatildeo de genes de resistecircncia
veiculados por elementos geneacuteticos moacuteveis ou da combinaccedilatildeo entre eles Este
aparecimento de resistecircncia em uma espeacutecie bacteriana era anteriormente sensiacutevel
a droga e devido a um destes fatores se torna resistente O fenoacutetipo resultante
desta resistecircncia natildeo estaraacute presente nas ceacutelulas genitoras e sim nos indiviacuteduos de
uma linhagem bacteriana derivada de um organismo susceptiacutevel Os genes muitas
vezes satildeo adquiridos por meio de elementos moacuteveis como plasmiacutedeos e
transposons (MOREIRA et al 2014)
Entatildeo a resistecircncia adquirida ocorre por diversos mecanismos geneacuteticos tais
como produccedilatildeo de enzimas inativadoras interferecircncia com a entrada e acuacutemulo de
droga na bacteacuteria alteraccedilatildeo do receptor para accedilatildeo da droga via metaboacutelica
alternativa Eacute originada por meio de uma alteraccedilatildeo a niacutevel geneacutetico da ceacutelula de
natureza cromossocircmica pelos processos de mutaccedilatildeo transduccedilatildeo e transformaccedilatildeo
ou extra cromossocircmica (plasmidial) (HENRIQUE et al 2014)
Como todo antibioacutetico β-lactacircmicoos carbapenecircmicos tem como mecanismo
de accedilatildeo a inibiccedilatildeo da siacutentese proteacuteica atraveacutes da accedilatildeo de inibiccedilatildeo da parede
microbiana fazendo a ligaccedilatildeo e inativaccedilatildeo das proteiacutenas ligadoras de penicilinas
(NETO et al 2007)
Imipenem e meropenem antibioacuteticos pertencentes ao grupo dos
carbapenecircmicos possuem um amplo espectro de accedilatildeo in vitro incluindo atividade
contra cocos gram-positivos bacilos gram-negativos e bacteacuterias anaeroacutebias (MOHR
2008) Jaacute o ertapenem possui um espectro de accedilatildeo mais limitado que o os dois
antibioacuteticos anteriormente citados tendo uma eficiecircncia limitada contra os bacilos
gram-negativos natildeo fermentadores Um novo antibioacutetico carbapenecircmico ainda natildeo
disponiacutevel no Brasil doripenem possui uma atividade mais potente principalmente
contra Pseudomona aeruginosa devido ao seu mecanismo de accedilatildeo que combina os
espectros de accedilatildeo de imipenem e meropenem (ZHANEL et al 2007)
Devido as suas estabilidades espectro de accedilatildeo poucos relatos de
resistecircncia boa toleracircncia pelos pacientes com efeitos adversos mais comuns as
complicaccedilotildees no siacutetio da infusatildeo e toxicidade gastrintestinal estes antibioacuteticos
carbapenecircmicos tecircm sido considerados terapia de escolha (NICOLAU 2008) Como
25
uma resposta adaptativa das Enterobacteacuterias o iacutendice de resistecircncia aos
carbapenecircmicos tem aumentado nos uacuteltimos anos de forma proporcional ao seu
uso limitando imensamente as opccedilotildees terapecircuticas para as infecccedilotildees causadas por
estes microrganismos (FALAGAS et al 2009)
As enzimas produtoras de betalactamases hidrolisam o anel betalactacircmico
tornando este mecanismo de resistecircncia o mais importante Os dois grupos mais
preocupantes satildeo o grupo das betalactamases de aspecto ampliado e os da
carbapenemases que aleacutem de hidrolizar os carbapenecircmicos hidrolizam todas as
outras classes de betalactacircmicos Em enterobacteacuterias as carbapenemases mais
prevalentes satildeo codificadas por genes dos grupos blaKpc blaIMP blaVIM blaNdm
e blaOxa A ocorrecircncia de carbapenemases eacute mais frequentemente em bacteacuterias
gram-negativas fermentadoras da glicose conhecidas como enterobacteacuterias
predominantes nos gecircneros Klebsiella Serratia Citrobacter Enterobacter
Escherichia Samonella Proteus Morganella Podem ser encontradas tambeacutem em
bacteacuterias gram-negativas natildeo fermentadoras como espeacutecies de Acinetobacter e de
Pseudomonas (ALVES et al 2013)
Carbapenemases satildeo enzimas plasmiacutedio-mediados resistentes a todos
antibioacuteticos betalactacircmicos As bacteacuterias que possuem o gene blaKpC responsaacutevel
pela codificaccedilatildeo da produccedilatildeo de carbapenemases apresentam resistecircncia aos
antibioacuteticos betalactacircmicos impedindo a accedilatildeo destes antibioacuteticos contra infecccedilotildees
(ALVES et al 2013)
A transmissatildeo das carbapenemases a diferentes cepas de enterobacteacuterias se
daacute atraveacutes de plasmiacutedeos que satildeo pequenas moleacuteculas circulares de DNA com a
capacidade de se replicarem independentemente do DNA cromossocircmico
permitindo a troca de material geneacutetico entre gecircneros e espeacutecies diferentes de
enterobacteacuterias O raacutepido desenvolvimento de surtos em ambientes hospitalares eacute
explicado por essa disseminaccedilatildeo plasmidial (COTRIM et al 2012)
De acordo com o criteacuterio de interpretaccedilatildeo do Clinical and Laboratory
Standards Institute (CLSI 2009) a maioria das KPC isoladas natildeo apresenta
resistecircncia completa aos carbapenecircmicos (Imipenem e Meropenem apresentam
uma Concentraccedilatildeo Inibitoacuteria Miacutenima (CIM) de 2-8 μgmL) (COTRIM et al 2012)
26
Os mecanismos de resistecircncia capazes de impedir a accedilatildeo dos
carbapenecircmicos satildeo vaacuterios Poreacutem a degradaccedilatildeo de antibioacuteticos por enzimas
principalmente as carbapenemases constituem o principal mecanismo de
resistecircncia aos antibioacuteticos β-lactacircmicos (DIAS 2009) Devido a ampla atividade
hidroliacutetica agrave maioria dos antibioacuteticos β-lactacircmicos estes grupos de enzimas possuem
alta versatilidade (QUEENAM et al 2007)
Existem trecircs grandes classes moleculares de Ambler a qual as
carbapenemases pertencem denominadas classe A (serino-carbapenemases os
quais incluem membros designados SME IMI NMC GES e a famiacutelia das KPCs)
classe B(as metalo-β-lactamase incluem os tipos IMP e VIM) e classe D
(oxacilinases similares as da classe A e incluem as OXA e PSE) (DIAS 2009)
Dentre estes as mais importantes e prevalentes encontradas em plasmiacutedeos
de Klebsiella pneumoniae satildeo as KPC (DIENSTMANN et al 2010) Por meio de
estudos moleculares a enzima KPC jaacute foi documentada em diferentes bacteacuterias e
diferenciada em KPC-1 a 13 (NETIKUL et al 2011) No ano de 2009 foi realizada
uma pesquisa onde descreveram as seguintes carbapenemases KPC-1 em isolados
de Klebsiella pneumoniae KPC-2 em K pneumoniae K oxytoca Salmonella
enterica e em Enterobacter sp e KPC-3 em K pneumoniae e Enterobacter cloacae
(MONTEIRO et al 2009) As enzimas KPC-4 e KPC-5 foram encontradas em
isolados de Pseudomonas aeruginosa (PEIRANO et al 2009)
Foi observada uma correccedilatildeo da sequumlecircncia KPC-1 indicando que o gene
blaKPC-1 e blaKPC-2 satildeo idecircnticos Trecircs novas variantes blaKPC-3 blaKPC-4 e
blaKPC-5 satildeo resultados de mutaccedilotildees do gene estrutural da enzima KPC-2
(WOLTER et al 2008) apresentando diferentes perfis de hidroacutelise As enzimas
KPC-2 e KPC-3 possuem alta eficiecircncia em hidrolisar cefalotina cefaloridina e
nitrocefin poreacutem possuem uma menor eficiecircncia contra carbapenecircmicos e
cefotaxima (ALBA et al 2005) As enzimas KPC-5 e KPC-4 apresentam menor
hidroacutelise de carbapenecircmicos eacute do que em KPC-2 Em contrapartida possuem
melhor eficiecircncia contra ceftazidima e uma maior inibiccedilatildeo pelo aacutecido clavulacircnico
(WOLTER et al 2008)
27
13 Anaacutelise geneacutetica de microrganismos
Eacute de extrema importacircncia praacutetica natildeo soacute no aspecto cliacutenico mas tambeacutem na
fitopatologia biotecnologia e estudos ambientais a correta identificaccedilatildeo e
classificaccedilatildeo de microrganismos Os meacutetodos usados na diferenciaccedilatildeo de gecircneros
espeacutecies e estirpes de microrganismos podem ser divididos em meacutetodos fenotiacutepicos
(baseados em fenocircmenos bioquiacutemicos fisioloacutegicos e bioloacutegicos) e genotiacutepicos
(detectam polimorfismos ao niacutevel dos aacutecidos nucleacuteicos ou variaccedilatildeo aleacutelica ao niacutevel
de enzimas) (ALVES et al 2003)
Para este tipo de estudo existem alguns meacutetodos como o RFLPrsquos -
ldquoRestriction Fragment Length Polymorphismsrdquo (polimorfismos de tamanho de
fragmentos de restriccedilatildeo) rep-PCR (Meacutetodo de tipagem baseado na amplificaccedilatildeo via
PCR de elementos de DNA repetitivos presentes em genomas bacterianos) anaacutelise
de sequumlecircncias nucleotiacutedeas (discriminaccedilatildeo eou identificaccedilatildeo atraveacutes de sequumlecircncias
de DNA) PFGE - Pulsed-Field Gel Electrophoresis (Eletroforese em campo
pulsado) ( A L V E S et al 2003)
A diferenciaccedilatildeo clara da cepa e principalmente a alta reprodutibilidade devem
ser caracteriacutesticas de qualquer meacutetodo de tipagem geneacutetica Poreacutem nem todos os
meacutetodos moleculares de tipagem satildeo igualmente eficazes Sendo assim de acordo
com a finalidade pretendida (identificaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo custo reprodutibilidade
etc) eacute feita a escolha do meacutetodo a ser aplicado (A L V E S et al 2003)
O processo de identificaccedilatildeo fenotiacutepica de KPC entre os membros da famiacutelia
Enterobacteriaceae ainda eacute difiacutecil e os meacutetodos para a sua identificaccedilatildeo devem ser
revistos e ajustados Mesmo com o avanccedilo tecnoloacutegico natildeo existem ensaios que
combinam alta especificidade e sensibilidade na detecccedilatildeo destas enzimas Satildeo
diversas as metodologias usadas para rastreamento de KPC como por exemplo a
focalizaccedilatildeo isoeleacutetrica a teacutecnica de disco-difusatildeo E-test teste de Hodge
modificado dentre outros Aleacutem disso a pesquisa do gene blaKPC pode ser feita
pela Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) Os sistemas de automaccedilatildeo
existentes no entanto podem natildeo identificar com precisatildeo os isolados KPC
positivos (COTRIM et al 2012)
A identificaccedilatildeo blaKPC pelo PCR eacute um meacutetodo raacutepido preciso sensiacutevel e
altamente especiacutefico no entanto a PCR exige equipamento e conhecimentos
28
especializados em diagnoacutestico molecular dificultando ainda a utilizaccedilatildeo dele na
rotina dos laboratoacuterios de microbiologia (COTRIM et al 2012)
Em estudo de infecccedilotildees hospitalares identificaccedilatildeo molecular de patoacutegenos
bacterianos eacute bastante utilizada Para diferenciar carbapenemases tipo KPC a partir
de outros tipos como SME NMC-A-IMI e GES eacute necessaacuterio um exame molecular
As identificaccedilotildees do microrganismo juntamente com a triagem molecular iratildeo definir
um resultado mais especiacutefico podendo ser usado para identificar o antibioacutetico mais
adequado para o tratamento Poreacutem a principal desvantagem de alguns exames
baseados em PCR por exemplo eacute que devido agrave sua limitada capacidade de
multiplexaccedilatildeo eles distinguem apenas algumas variaccedilotildees (MOREIRA et al 2014)
Estatildeo descritas para a identificaccedilatildeo molecular de patoacutegenos pertencentes agrave
famiacutelia Enterobacteriaceae as teacutecnicas de PFGE RAPD (randomly amplified
polymorphic DNA) e ERIC-PCR (Enterobacterial Repet it ive Intergenic Consensus)
A PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) eacute considerada padratildeo ouro devido sua
alta capacidade de diferenciaccedilatildeo baseada na anaacutelise do perfil de restriccedilatildeo do DNA
genocircmico por meio de eletroforese Como desvantagem para a sua execuccedilatildeo eacute
necessaacuterios vaacuterios dias impedindo a tipagem de algumas cepas bacterianas devido
agrave degradaccedilatildeo do DNA aleacutem do alto custo empregado (MOREIRA et al 2014)
O meacutetodo baseado em ERIC-PCR tem sido bastante utilizado como uma
alternativa para a teacutecnica de PFGE Esta teacutecnica consiste na anaacutelise do padratildeo de
amplificaccedilatildeo de elementos repetidos encontrados no genoma bacteriano Isto
permite uma maior rapidez na obtenccedilatildeo de resultados quando comparada com o
PFGE aleacutem de alta reprodutibilidade simples execuccedilatildeo e implementaccedilatildeo baixo
custo e natildeo sem problemas com a degradaccedilatildeo do DNA (MOREIRA et al 2014)
A PCR eacute considerada uma teacutecnica de biologia molecular revolucionaacuteria que
consiste na siacutentese enzimaacutetica de coacutepias de aacutecidos nucleacuteicos Ela permitiu o raacutepido
desenvolvimento do estudo de sequumlecircncias de aacutecidos nucleacuteico Foi desenvolvida por
Kary Banks Mullis que ganhou o precircmio Nobel de quiacutemica de 1993 devido ao
desenvolvimento dessa teacutecnica em abril de 1983 (CAMARGO et al 2014)
Por meio de etapas de variaccedilatildeo de temperatura a teacutecnica de PCR promove a
duplicaccedilatildeo de cadeias de DNA in vitro A reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo de DNA por PCR
envolve o emprego de sequumlecircncias iniciadoras (primers) quatro nucleotiacutedeos
29
(dNTPrsquos) do DNA e uma DNA polimerase termoestaacutevel podendo assim obter-se a
partir de uma fita molde muitas coacutepias de uma sequumlecircncia especiacutefica de aacutecido
nucleacuteico O princiacutepio da PCR consiste na variaccedilatildeo de temperatura por ciclo
envolvendo trecircs etapas baacutesicas desnaturaccedilatildeo pareamento e amplificaccedilatildeo
(CAMARGO et al 2014)
A desnaturaccedilatildeo da fita molde de DNA eacute uma etapa com duraccedilatildeo entre 30
segundos a 1 minuto a temperatura entre 92 ordmC a 96 ordmC Apoacutes isso o pareamento de
dois iniciadores sinteacuteticos de composiccedilotildees distintas que funcionam como os
iniciadores da reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo liga-se agrave regiatildeo complementar da fita de
DNA alvo que sofreraacute a duplicaccedilatildeo Esta etapa tem duraccedilatildeo de 30 segundos a 1
minuto a temperatura entre 58 ordmC e 65 ordmC Por uacuteltimo a amplificaccedilatildeo por meio da
enzima Taq DNA polimerase das novas fitas de DNA se daacute a partir de cada um dos
iniciadores utilizando os quatro dNTPrsquos como substrato da reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo
Esta etapa possui duraccedilatildeo entre 45 segundos e 1 minuto a 72 ordmC Cada ciclo eacute
repetido em torno de 30 a 35 vezes e promove a amplificaccedilatildeo da regiatildeo alvo
determinada conforme o anelamento dos iniciadores sinteacuteticos de DNA (CAMARGO
et al 2014) Estas etapas estatildeo demonstradas na figura 4
Figura 4 Etapas da Reaccedilatildeo de PCR
30
2 JUSTIFICATIVA
No ano de 2010 no Distrito Federal foram identificados 111 pacientes com
suspeita de infecccedilatildeo por Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) e a
Secretaria de Sauacutede do Distrito Federal confirmaram ainda a morte de 18 pacientes
dentre os hospitais puacuteblicos e particulares Um desafio encontrado por ocasiatildeo do
surto infeccioso no Distrito Federal foi o de confirmar as KPCs por Reaccedilatildeo da
Polimerase em Cadeia sendo que as amostras foram enviadas com esta finalidade
para a Fiocruz no Rio de Janeiro
Pesquisas que possam contribuir na elaboraccedilatildeo de estrateacutegias preventivas e
de intervenccedilatildeo para infecccedilotildees causadas por enterobacteacuterias bem como contribuir
para gerar uma integraccedilatildeo beneacutefica entre a equipe acadecircmica e os serviccedilos de
sauacutede devem ser estimuladas Neste sentido o presente estudo permitiu escrutinar
os genes envolvidos na expressatildeo de carbapenemases presentes em espeacutecies de
enterobacteacuterias isoladas em ambiente hospitalar visto que elucidar genes de
resistecircncia de enterobacteacuterias aos antibioacuteticos carbapenecircmicos eacute o primeiro passo
para garantir um controle epidemioloacutegico efetivo para estes tipos de microorganismo
assim como sua associaccedilatildeo com surtos fatais particularmente em pacientes com
baixa imunidade
31
3 OBJETIVOS
31 Objetivo geral Caracterizar os genes de resistecircncia das
Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases e os aspectos epidemioloacutegicos de
pacientes internados em um hospital puacuteblico do Distrito Federal
32 Objetivos Especiacuteficos
Identificar genotipicamente a enzima KPC (Klebsiella pneumoniae
carbapenemase) de isolados de Klebsiella pneumoniae
Investigar aspectos epidemioloacutegicos dos pacientes portadores de
Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases
Identificar quais variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana influenciaram para o
desfecho oacutebito ou alta
Avaliar a susceptibilidade das Enterobacteacuterias aos antibioacuteticos
carbapenecircmicos dos pacientes em ambiente hospitalar
32
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
Trata-se de um estudo transversal onde foi realizado o teste de
susceptibilidade das enterobacteacuterias aos antibioacuteticos carbapenecircmicos a partir dos
materiais bioloacutegicos coletados dos pacientes internados no Hospital Regional da Asa
Norte (HRAN) e enviados ao Laboratoacuterio de Anaacutelises Cliacutenicas da mesma Instituiccedilatildeo
Os materiais bioloacutegicos investigados foram sangue aspirado traqueal ou brocircnquico
urina e cultura semi quantitativa de ponta de cateter venoso central O HRAN eacute um
hospital puacuteblico do Distrito Federal com 395 leitos sendo as cliacutenicas de internaccedilatildeo
Berccedilaacuterio Cirurgia Geral Cirurgia Plaacutestica Cliacutenica Meacutedica Ginecologia Maternidade
Pediatria Queimados UTI com atendimento a pacientes portadores de doenccedilas de
caraacuteter cliacutenico e ciruacutergico
4 1 Coleta e transporte das amostras bioloacutegicas
As amostras foram coletadas de pacientes internados no Hospital Regional da
Asa Norte (HRAN) com suspeitas de infecccedilatildeo por KPC A identificaccedilatildeo primaacuteria foi
realizada pelo Laboratoacuterio de Microbiologia do hospital de origem dos pacientes e os
demais procedimentos que foram utilizados na identificaccedilatildeo encontram-se descritos
abaixo
4 2 Procedimentos para confirmaccedilatildeo de resistecircncia bacteriana por
disco de ertapenem (adaptado CDC 2004)
Para diagnosticar amostra como portadora de bacteacuteria produtora de
carbapenemase foi realizado o teste com disco de ertapenem como forma de
triagem Inicialmente utilizou-se o swab contaminado com a amostra que foi
distribuiacuteda em uma pequena aacuterea da placa de aacutegar MacConkey para apoacutes o
crescimento ser realizada a pesquisa de colonizaccedilatildeo por enterobacteacuterias resistentes
aos carbapenecircmicos (Pesquisa de CRE) Procedeu-se a semeadura por teacutecnica
semi-quantitativaesgotamento com alccedila bacterioloacutegica na diluiccedilatildeo de 1100 O disco
de Ertapenem foi colocado na superfiacutecie da placa de MacConkey na junccedilatildeo dos dois
primeiros campos de semeadura conforme demonstrado na figura 5 Incubou a placa
33
em estufa aeroacutebia a 35ordmC por 24 e 48 horas e observou-se o halo de difusatildeo do
disco de Ertapenem na placa para proceder agrave leitura
O teste deixou de ser obrigatoacuterio apoacutes a modificaccedilatildeo dos criteacuterios
interpretativos para carbapenecircmicos para enterobacteacuterias publicados no suplemento
do CLSI 2010 M100-S20-U
Figura 5 Mecanismo de semeamento de material bioloacutegico oriundos de
pacientes com suspeita de infecccedilatildeo por KPC Fonte adaptado CDC 2004
4 2 1 Interpretaccedilatildeo dos resultados
Na ausecircncia de crescimento ateacute 24 horas (MacConkey) ou halo de difusatildeo
gt27 mm na placa deve-se reincubar as placas por mais 24 horas Quando for
ausente o crescimento apoacutes 48 horas ou halo de difusatildeo gt27 mm na placa libera-se
como enterobacteacuterias resistentes a carbapenecircmicos (KPCNEG)Havendo
crescimento de colocircnias na placa de MacConkey com halo lt 27 mm (apenas para
colocircnias com crescimento dentro do halo) deve-se reisolar e realizar identificaccedilatildeo e
antibiograma automatizado teste de sensibilidade por disco-difusatildeo e Teste de
Hodge Modificado (THM) Os isolados de enterobacteacuterias cujos testes comprovarem
a resistecircncia aos carbapanecircmicos testados (KPCPOS) foram reportado a Comissatildeo
de Controle de Infecccedilatildeo Hospitalar (CCIH) Jaacute osbacilos Gram-negativos natildeo
fermentadores natildeo foram reportados (KPCNEG) Para interpretaccedilatildeodos resultados
foram utilizados os valores conforme demonstrados na tabela 1
Tabela 1 Criteacuterios Interpretativos para testes de sensibilidade
ENTEROBACTEacuteRIAS
Disco difusatildeo (mm) MIC (microgml)
34
Antibioacutetico Sigla S I R S I R
Ertapenem 10
microg
ETP 22 19-
21
18 05 1 2
Meropenem 10
microg
MEM 23 20-
22
19 1 2 4
Fonte Manual Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)
2013
Os resultados que apresentaram resistecircncia ao antibioacutetico Ertapenem foram
considerados como suspeitos de contaminaccedilatildeo por KPC Fez-se o teste de
susceptibilidade aos antibioacuteticos (TSA) em aparelho automatizado MicroScan Walk
Away 96sl Dade Behring
4 3 Teste de susceptibilidade aos antibioacuteticos (adaptado CDC 2004)
A determinaccedilatildeo da susceptibilidade dos isolados foi feita pelo teste de
susceptibilidade aos antibioacuteticos (TSA) apoacutes cultura em meio de gelose simples
(INSA) para avaliaccedilatildeo da sua pureza e obtenccedilatildeo de colocircnias isoladas Para
preparaccedilatildeo de uma suspensatildeo bacteriana com turvaccedilatildeo aproximada de 05
McFarland (Dade BehringMicroScanregTurbidity Meter) ressuspendeu duas a cinco
colocircnias em 2ml de soro fisioloacutegico esteacuteril diluindo a 1100 em soro fisioloacutegico num
volume total de 10ml em seguida foi feita uma semeadura em duas placas
quadradas (120mm x 120mm) de Muller-Hinton Agar (INSA) por inundaccedilatildeo
Os discos de antibioacutetico carbapenecircmicos imipenem meropenem e
ertapenem (Biorad) foram aplicados com o auxiacutelio de um dispensador automaacutetico A
susceptibilidade das Enterobacteacuterias aos carbapenecircmicos foi definida de acordo
com o protocolo Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI 2011)
Para aquelas Enterobacteacuterias que apresentaram resistecircncia ao ertapenem
foram realizados o Teste de Hodge Modificado para Detecccedilatildeo de Enterobacteacuterias
Produtoras de Carbapenemases conforme descrito pelo Centers for Disease Control
and Prevention (CDC 2004)
35
4 4Teste de Hodge Modificado (THM) (adaptado CDC 2004)
Preparou-se uma suspensatildeo em salina esteacuteril com a cepa Escherichia coli
ATCC 25922 (padratildeo 05 de McFarland) Apoacutes isto diluiu a suspensatildeo 110 em
salina (05 ml da soluccedilatildeo de Ecoli ATCC 25922 + 45 ml salina)Foi entatildeo semeado
na superfiacutecie de uma placa de Agar Muller-Hinton com a suspensatildeo diluiacuteda de Ecoli
ATCC 25922 com auxilio de swab seco assegurando que houvesse uma
distribuiccedilatildeo uniforme cobrindo toda a superfiacutecie do Agar Deixou secar por 3 a 5
minutos em temperatura ambienteColocou-se o disco de ertapenem 10microg no centro
da placa e apoacutes isto fez-se uma estria linear da cepa a ser testada da borda do
disco ateacute a borda da placa utilizando uma alccedila calibrada 10 microl ou um swab Incubou
a placa na estufa em atmosfera aeroacutebia a 35 plusmn 2ordmC por 16 a 24 horas
441 Controle de qualidade (CQ)
Foi utilizado um CQ todos os dias em que se realizou o teste tendo como
controle Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1705- teste de Hodge modificado
positivo Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1706- teste de Hodge modificado
negativo
442 InterpretaccedilatildeoResultados
Apoacutes 16ndash24 horas de incubaccedilatildeo examinar as placas para verificar a presenccedila
de uma distorccedilatildeo no halo de inibiccedilatildeo do disco de ertapenem devido ao crescimento
realccedilado da cepa ATCC na intersecccedilatildeo do organismo teste e a Ecoli ATCC 25922
dentro dos limites do halo O THM positivo apresentaraacute presenccedila de distorccedilatildeo no
halo de inibiccedilatildeo de ertapenem devido ao crescimento da cepa Ecoli ATCC 25922 ao
longo da estria da cepa teste para dentro dos limites do halo de inibiccedilatildeo Jaacute o THM
negativo teraacute ausecircncia de crescimento da cepa Ecoli ATCC 5922 ao longo da estria
da cepa teste para dentro dos limites do halo de inibiccedilatildeo do disco de ertapenem
Este resultado estaacute representado na figura 6
36
Figura 6 Interpretaccedilatildeo resultado do Teste de Hodge Modificado
(adaptado CDC 2004) Teste positivo na estria da cepa teste na parte superior
da placa teste negativo na estria da cepa teste na parte inferior da placa
Tendo positivo como resultado o paciente era um provaacutevel contaminado por
KPC As amostras entatildeo foram encaminhadas para a Fundaccedilatildeo Osvaldo Cruz
(FIOCRUZ) para confirmaccedilatildeo final As amostras finalmente confirmadas como
positivas para KPC foram isoladas e guardadas no banco de cepas cliacutenicas do
hospital Apoacutes a autorizaccedilatildeo do CEP amostras das cepas foram transferidas para
meio de transporte Stuard em caixa teacutermica fechada em baixa temperatura e
levadas para o laboratoacuterio de microbiologia cliacutenica da universidade
No laboratoacuterio da universidade as amostras foram separadas e realizadas
repiques em meios MacConkey e incubadas por 24h As colocircnias caracteriacutesticas
foratildeo isoladas em caldo BHI e mantidas em shaker a 37oC por 2h Apoacutes isto foram
executadas as anaacutelises a seguir
Os isolados de Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases foram
submetidos agrave extraccedilatildeo de DNA e posterior sequumlenciamento para identificaccedilatildeo dos
genes de resistecircncia blaKPC de 1 a 13 e identificaccedilatildeo do gene universal Os
pacientes de onde os materiais bioloacutegicos contendo as Enterobacteacuterias produtoras
de carbapenemases foram os isolados foram investigados quanto aos aspectos
epidemioloacutegicos e cliacutenicos
37
4 5 Extraccedilatildeo de DNA bacteriano
A extraccedilatildeo de DNA bacteriano foi realizada utilizando o kit NucleoSpin
Plasmidreg (MN) Antes de iniciar a extraccedilatildeo foi feito a preparaccedilatildeo das soluccedilotildees
reagentes materiais e amostras (vortexando) colocou-se em banho-maria agrave 50ordmC o
tampatildeo AW Partiu-se de colocircnias isoladas cultivadas que sofreram passagem em
meio LB liacutequido por 12h Adicionou-se 15 mL da amostra no tubo eppendorf
centrifugou por 5 minutos descartou o sobrenadante (com cuidado para natildeo
descartar o Pellet) Repetiu-se este procedimento por mais trecircs vezes completando-
se o volume de 6mL Foram adicionados 250microL do tampatildeo Resuspension Buffer A1
encostando a ponteira no Pellet e misturando (este tampatildeo tem como funccedilatildeo
separar a formaccedilatildeo de grumos celulares) Apoacutes isso homogeneizou e vortexou os
tubos eppendorfs Apoacutes isso foram adicionados 250microL do tampatildeo Lysis Buffer A2
homogenizou e deixou descansar por 5 minutos (esta etapa eacute importante para a lise
da parede e da membrana celulares e liberaccedilatildeo do conteuacutedo da ceacutelula)
Passado o tempo de descanso foi adicionado 300microL do tampatildeo
Neutralization Buffer A3 homogeneizou e centrifugou por 10 minutos (este tampatildeo
iraacute retirar as proteiacutenas que envolvem o DNA e voltaraacute com o pH para proacuteximo de 8
impedindo que a soluccedilatildeo de lise facilite a quebra das ligaccedilotildees covalentes do aacutecido
nucleacuteico) Em seguida enumeraram-se os tubos contendo filtros com siacutelica
transferiu-se o sobrenadante para o filtro e centrifugou por 5 minutos Descartou-se
o que foi filtrado adicionou 500microL do tampatildeo AW (banho-maria) centrifugou por 2
minutos Novamente foi descartado o filtrado Adicionou-se 600microL do tampatildeo A4
centrifugou por 2 minutos e descartou o filtrado (os tampotildees AW e A4 contecircm
isotiocianato de guanidina em concentraccedilotildees crescentes para facilitar a adsorccedilatildeo
do DNA na siacutelica e retirada das outras biomoleacuteculas da amostra) Foi feita outra
centrifugaccedilatildeo com o tubo vazio Apoacutes isto o filtro foi trocado para outro eppendorf
definitivo onde foi adicionado 50microL do tampatildeo Elution Buffer AE (este tampatildeo
favorece a eluiccedilatildeo do DNA) centrifugou por 2 minutos descartou o filtro e
armazenou as amostras em freezer -20ordmC
38
4 6 Iniciadores e reaccedilatildeo de PCR
Os iniciadores universais para o gene blaKPC foram desenhados baseados
em sequumlecircncias conservadas apresentadas pelos sub-grupos de genes que
codificam a enzima carbapenemase de klebsiella pneumoniae (YIGIT et al 2001)
Baseado na sequumlecircncia para o blakpc-1 depositada no GenBank
(AF2975541) o oligonucleotiacutedio (oligo) iniciador direto (5-
ATGTCACTGTATCGCCGTC-3rsquo) foi desenhado para reconhecer a sequumlecircncia
blaKPC na posiccedilatildeo (131149) enquanto que o iniciador reverso (5-
TTACTGCCCGTTGACGCC-3rsquo) foi reconhecido na posiccedilatildeo (9951012) As anaacutelises
baseadas em alinhamento de sequumlecircncias mostraram que o par de iniciadores
blaKPC podem detectar os alelos de 1 a 13 do gene blaKPC conforme a tabela 2
Tabela 2 Nuacutemero de acesso ao GenBank dos alelos blaKPC e seus
microrganismos originais
Nuacutemero de
Acesso GenBank
Microrganismo Alvo
AF2975541 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-1
GU0862251 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-2
HQ2589341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-2-like
AB5577341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC -3
EU4473041 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-4
EU4002222 Pseudomonas
aeruginosa
blaKPC-5
EU5555341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-6
EU7297271 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-7
39
FJ2344121 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-8
FJ624872 Escherichia coli blaKPC-9
GQ1403481 Acinetobacter
baumannii
blaKPC-10
HM0669951 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-11
HQ3428891 Enterobacter cloacae blaKPC-12
HQ3428901 Enterobacter cloacae blaKPC-13
As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo de blaKPC foram realizadas em um
primeiro tempo de desnaturaccedilatildeo em que foi 94ordmC por 5 minutos seguido de 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 58 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 90 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 78ordmC por 8 minutos Aleacutem das amostras foi utilizado um
controle negativo
A PCR do blaKPC foi realizada utilizando os componentes para o volume da
reaccedilatildeo de 25 microL citados na tabela 3 A banda do tamanho do produto de PCR foi de
881 pares de bases (pb) o que corresponde ao plasmiacutedeo
Tabela 3 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do
gene blaKPC
Reagente Volume
DNA molde 4 microL
Tampatildeo Taq 25 microL
MgCl2 075 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP
2 microL
Oligo F 1 microL
Oligo R 1 microL
Taq DNA polimerase 05 microL
Aacutegua MiliQ 1335 microL
40
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
Baseado na sequumlecircncia para o gene 16S rRNA em que o oligonucleotiacutedio
Universal iniciador direto foward (5-CCAGCAGCCGCCGTAATACG-3rsquo) foi
desenhado para reconhecer a sequumlecircncia universal na posiccedilatildeo 1513 enquanto que o
iniciador reverso (5-ATCGGYTACCTTGTTACGACTTC-3rsquo) foi reconhecido na
posiccedilatildeo 1491 foram realizadas PCRrsquos As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo deste
gene foram realizadas nos seguinte tempos separaccedilatildeo 94ordmC por 10 minutos 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 55 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 120 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 72ordmC por 10 minutos
A PCR do gene 16S rRNA foi realizada utilizando os componentes para o
volume da reaccedilatildeo de 25microL citados na tabela 4 A banda do tamanho do produto de
PCR foi de 996 pb correspondente aacute regiatildeo ribossomal capaz de amplificar todas
as espeacutecies
Tabela 4Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do gene
universal
Reagente (quantidade
concentraccedilatildeo do estoque)
Volume
DNA molde 10 ng 4 microL
Tampatildeo Taq 10 x 25 microL
MgCl2 50mM 125 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP 25 mM
125 microL
Oligo F 10microM 05 microL
Oligo R 10microM 05 microL
Taq DNA polimerase 5UmicroL 04 microL
Aacutegua Miliq 146 microL
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
41
O termociclador utilizado para os experimentos foi o LifeTouch da BIOER
4 7 Digestatildeo
Para realizaccedilatildeo da digestatildeo foi utilizada a enzima BshF I (Hae III) EN- 1105
tamanho 7000 units concentraccedilatildeo 10 unitsmicroL fonte Bacillus sphaericus empresa
Jena bioscienceUtilizaram-se os componentes para o volume de 50microL da reaccedilatildeo
citados na tabela 5
Tabela 5 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da digestatildeo do gene
universal
Reagente Volume
Produto de PCR 10 microL
Enzima BshF I 01 microL
Tampatildeo (10x) 5 microL
Aacutegua Miliq 349 microL
Total (em cada ependorff) 50 microL
Valores para 1 digestatildeo
Os ependorffs foram colocados por 30 minutos em banho-maria a 37ordmC Apoacutes
isso fez-se a corrida das amostras em gel de agarose para verificaccedilatildeo do resultado
(LU et al 2000)
4 8 Eletroforese em gel de agarose
Os produtos de DNA PCR e digestatildeo foram analisados em gel de agarose
2 O tempo de corrida do gel eacute de aproximadamente 1hora e 30minutos sendo
que no comeccedilo foi usada agrave voltagem de 50 V e apoacutes comeccedilar a correr o gel
aumentou a voltagem para 100 v Utilizou-se o marcador de 100pb (pares de bases)
Foi adicionado 3microL de corante Bromophenol (que tem a funccedilatildeo de fazer uma ligaccedilatildeo
na amostra de DNA e permitir a visualizaccedilatildeo da corrida no gel de agarose) em 7microL
de amostra tanto de DNA quanto de PCR Para o preparo do gel foi utilizado TBE
42
(Tris- Aacutecido Boacuterico) agarose e brometo de etiacutedio (sua funccedilatildeo eacute de corante para o gel
e permitir a visualizaccedilatildeo do DNA quando colocado agrave luz ultravioleta) Para o oligo
blaKPC a banda da amplificaccedilatildeo foi em 881ppb correspondendo ao plasmiacutedeo Jaacute
o oligo Universal foi em 996 pb
4 9 Descarte de resiacuteduos
Todos os materiais utilizados nos ensaios foram de uso uacutenico e manipulados
em cacircmaras de seguranccedila bioloacutegica classe II Apoacutes o uso foram colocados em
soluccedilatildeo desinfetantes (hipoclorito a 1) e em seguida autoclavados a 127oC por 20
min em sacos apropriados para autoclavaccedilatildeo Apoacutes a finalizaccedilatildeo do ciclo de
esterilizaccedilatildeo os sacos contendo o material descartaacutevel foram colocados em
recipientes de coleta da empresa responsaacutevel pela coleta de materiais bioloacutegicos
produzidos no laboratoacuterio de microbiologia Todos os procedimentos seguiram a
normativa RDC-ANVISA 3062004 sobre o descarte de resiacuteduos de serviccedilo de
sauacutede
4 10 Aspectos epidemioloacutegicos e cliacutenicos
Os aspectos cliacutenicos e epidemioloacutegicos foram investigados por meio de
prontuaacuterios dos pacientes portadores de enterobacteacuterias produtoras de
carbapenemases e envolveram topografia mais provaacutevel do foco infeccioso a
enfermidade motivadora da internaccedilatildeo o desfecho cliacutenico a idade e o tempo de
internaccedilatildeo
4 12 Anaacutelises eepidemioloacutegicas
As anaacutelises foram realizadas com o pacote estatiacutestico SPSS versatildeo 200
Para verificar quais variaacuteveis referentes aos dados epidemioloacutegicos e
microbioloacutegicos influenciaram no desfecho verificou- se a diferenccedila meacutedia das
variaacuteveis idade e tempo de internaccedilatildeo em cada grupo O teste estatiacutestico utilizado foi
o teste t de Student apoacutes se executar o teste de normalidade de Shapiro-Wilk Para
as variaacuteveis sexo perfil microbioloacutegico das enterobacteacuterias produtoras de
43
carbapenemases foi avaliada a associaccedilatildeo com o desfecho por meio do teste Exato
de Fisher O niacutevel de significacircncia adotado foi de 5
4 13 Preceitos eacuteticos
Este projeto estaacute inserido em um projeto maior denominado ldquoEpidemiologia
cliacutenica e caracterizaccedilatildeo molecular do Acinetobacter Baumannii resistente a
antibioticoterapia em pacientes internado em hospitais do Sistema Uacutenico de Sauacutederdquo
que foi submetido ao Comitecirc de Eacutetica em Pesquisa da Secretaria do Estado de
Sauacutede do Distrito Federal (SESDF) e emitido parecer aprovado pelo protocolo nordm
23109 (anexo)
44
5 RESULTADOS
51 Anaacutelise molecular
Para a amplificaccedilatildeo com o oligo blaKPC foram amplificadas amostras
que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 881 pb correspondente ao
plasmiacutedeo A anaacutelise da amplificaccedilatildeo da regiatildeo do gene blaKPC mostrou que
apenas a amostra A10 natildeo amplificou isso demonstra que esta amostra natildeo
possuiacutea o gene de resistecircncia
5 1 1 Gene blaKPC
Figura 7 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 881 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
A amostra A3 natildeo amplificou no primeiro momento entatildeo foi realizado
novamente a PCR e corrida de gel obtendo entatildeo a amplificaccedilatildeo da amostra como
apresentado na figura 8
45
Figura 8 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC da
mostra A3 estudada A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo de 881
pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 1 2 Gene 16S rRNA
Para a amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA utilizou-se o oligo universal Foram
amplificadas amostras que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 996 pb
Figura 9 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
46
Segundo Lu et al (2000) a digestatildeo com a enzima HaeIII deste amplicons de
16S rRNA devolveriam bandas com perfis entre 150 a 200 pb No gel abaixo eacute
possiacutevel evidenciar que este perfil ocorreu com o predomiacutenio de bandas na altura
de 200pb
Figura 10 Gel de agarose a 2 da digestatildeo do amplicon do gene 16S
rRNA das amostras com a enzima HaeIII evidenciando diversos fragmentos
proacuteximos a 200 pb A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo ribossomal
de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 2 Anaacutelises epidemioloacutegicas
5 2 1 Sexo
No total foram detectados 17 isolados de KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 onde a maior a prevalecircncia foi
detecatada em amostras de pacientes do sexo masculino (53) do que no sexo
feminino (47)
47
Figura 11 Isolado de KPC segundo sexo dos 17 pacientes investigados
no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 2 Desfecho cliacutenico
Em 17 isolados de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo
de 2010 aacute 2011 a porcentagem de pacientes que foram a oacutebito (59) foi maior que
a de pacientes que tiverm alta (41)
Figura 12 Isolado de KPC segundo desfecho cliacutenico dos 17 pacientes
investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
48
5 2 3 Local da coleta
Dos 17 episoacutedios detectados de infecccedilatildeo por KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 a infecccedilatildeo em swab retalfoi mais
frequente (47) seguida de ponta de cateacuteter (18) e secreccedilatildeo traqueal (12)
Figura 13 Isolados de KPC segundo local da coleta da amostra nos 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 4 Microorganismo
O microorganismo mais encontrado foi a Klebsiella pneumoniae (82)
seguida da Enterobacter clocae (12) e Serratia marcescens (6) dos 17 isolados
de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 Isto afirma o
fato de a sigla KPC ser utilizada de forma errocircnea aacute Klebsiella pneumoniae visto
que a evidecircncia dela eacute maior em relaccedilatildeo as outras cepas
49
Figura 14 Isolado de KPC segundo microrganismo encontrado em 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 5 Relaccedilotildees variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana e desfecho
cliacutenico
Tabela 6 ndash Distribuiccedilatildeo do perfil geneacutetico sexo coleta tipificaccedilatildeo de
microrganismos e anaacutelise da resistecircncia bacteriana segundo o desfecho
cliacutenico Brasiacutelia-DF 2010 a 2011
Variaacutevel Resultado
Desfecho
Alta Oacutebito
N N P
Gene 16S rRNA Positivo 7 1000 10 1000
NA Gene blaKPC Positivo 6 857 10 1000
Negativo 1 143 0 00 0218 Sexo Feminino 2 286 6 600
Masculino 5 714 4 400 0201 Local da coleta Fundo saco de
Douglas 1 143 0 00
Hemocultura 0 00 1 100 0463 Ponta de cateter 1 143 2 200
Sec TraquealBrocircnquica
0 00 1 100
50
Secreccedilatildeo traqueal 2 286 0 00
Swab retal 3 429 5 500
Urina 0 00 1 100
Microrganismo Enterobacter cloacae (KPC)
1 143 1 100
Klebsiella pneumoniae
6 857 8 800
0416 Serratia
marcescens 0 00 1 100
Teste de Hodge Hodge positivo 7 1000 10 1000
NA Amicacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 1 100 0848 resistente 0 00 1 100
sensiacutevel 2 286 3 300
Amoxicilina Aacutecido Clavulacircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Ampicilina Sulbactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ampicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Aztreonan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefazolina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Cefoperazona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Cefotaxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefoxitina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0509 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 2 286 4 400
Ceftazidima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cetriaxona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 3 429 5 500 0772 Cefalotina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ciprofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772
51
resistente 3 429 5 500
Claritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Clindamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Eritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Gentamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0942 resistente 2 286 3 300
sensiacutevel 1 143 2 200
Imipenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 0 00 2 200 0193 Resistente 1 143 3 300
sensiacutevel 2 286 0 00
Nitrofurantoiacutena sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Norfloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Oxacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Penicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Piperacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Rifampicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tetraciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Ticarcilina Aacutecido Clavulocircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0688 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 3 429 4 400
Tobramicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Trimetoprima Sulfametoxazol
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0112 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 2 286 0 00
Vancomicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tigeciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediario 0 00 1 100 0211 natildeo testado 1 143 4 400
resistente 2 286 0 00
52
Cefepime sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefuroxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Levofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Piperacilina Tazobactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Ertapenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Meropenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0223 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 1 143 0 00
Cefotetan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 sensiacutevel 0 00 1 100
Gemifloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 7 700 0585 natildeo testado 3 429 3 300
Desfecho
Alta Oacutebito
Meacutedia Erro
padratildeo Meacutedia Erro
padratildeo p
Idade 58 9 59 5 0991
Tempo Internaccedilatildeo (dias)
50 13 46 12 0571
n= 17 p(lt 005) NA natildeo se aplica
53
6 DISCUSSAtildeO
Nos uacuteltimos anos houve um aumento na incidecircncia de bacteacuterias
multirresistentes aos antimicrobianos no ambiente hospitalar tornando isto um
problema mundial de sauacutede puacuteblica (HULSCHER et al 2010) Quando se trata
principalmente de bacilos Gram negativos a frequumlecircncia destas bacteacuterias eacute ainda
maior em paiacuteses da Ameacuterica Latina quando comparada a paiacuteses desenvolvidos
(GALES etal 2012)
De acordo com dados do ldquoMeropenem Yearly Susceptibility Test Information
Collectionrdquo (MYSTIC) ocorreu nos Estados Unidos um aumento na susceptibilidade
de K pneumoniae nos uacuteltimos anos graccedilas a praacuteticas de controle de disseminaccedilatildeo
de amostras resistentes(RHOMBERG P R et al 2009) O aumento crescente da
prevalecircncia destes microrganismos foi proporcional ao aumento da dependecircncia do
uso de antibioacuteticos carbapenecircmicos considerados como a opccedilatildeo terapecircutica para o
tratamento de infecccedilotildees por bacilos Gram negativos multi-resistentes (LIVERMORE
2012) Isto afeta diretamente as opccedilotildees de tratamento sobrando poucas alternativas
para a terapecircutica que incluem colistina (polimixina E) e tigeciclina que apresentam
respectivamente problemas em termos de toxicidade e eficaacutecia (LIVERMORE et
al 2011) Um dos efeitos adversos mais importantes das poliminas B e E por
exemplo satildeo a neurotoxicidade e nefrotoxicidade (MENDES C A C et al2009 )
Devido agrave resistecircncia ser usualmente de natureza plasmidial e portanto de
maior disseminaccedilatildeo especialmente quando carreadas por K pneumoniae
microrganismo com uma notoacuteria capacidade para acumular e transferir plasmiacutedeos
com determinantes para resistecircncia o nuacutemero de casos detectados pelo
fenoacutetipogenoacutetipo blaKPC eacute bastante preocupante (MONTEIRO et al 2009)
Comparada com outras bacteacuterias hospitalares a transmissatildeo de clones
multirresistentes de K pneumoniae eacute maior e podem natildeo ser controladas pelos
meacutetodos de controle de infecccedilatildeo hospitalar (PAAUW et al 2007) A forma
plasmidial para transferecircncia da resistecircncia adicionada a este grande potencial para
disseminaccedilatildeo de clones resistentes eacute preocupante visto que apoacutes surtos muitas
vezes pode se tornar endecircmica Jaacute eacute uma realidade a disseminaccedilatildeo desta bacteacuteria
54
entre pacientes hospitais paiacuteses e ateacute mesmo continentes (WOODFORF et al
2010 ROGERS et al 2011)
As chances de surtos satildeo maiores em paiacuteses com poucos recursos devido agrave
maior carecircncia de praacuteticas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees hospitalares e o
uso irracional de antimicrobianos de forma empiacuterica e inadequada (KUMARASAMY
et al 2010) Ateacute o momento os mecanismos de resistecircncia aos cabapenecircmicos
geralmente encontrado eram a produccedilatildeo de ESBL (CTX-M) somada aacute perda de
porina (CARVALHAES et al 2010) Foi notado a partir do ano de 2008 um
aumento no nuacutemero de K pneumoniae produtoras de KPC-2 apresentando outra
forma de resistecircncia (GALES 2012)
Um estudo mostrou que o perfil do paciente colonizado ou infectado por KPC
foi de um paciente entre os 33 e os 82 anos de idade internado haacute mais de 1
semana no hospital A mortalidade geral nos uacuteltimos anos ficou em torno de 7
sendo que dos 77 pacientes estudados 32 (415) pacientes evoluiacuteram para oacutebito
evidenciando a alta morbi-mortalidade associada (ALVES A P et al 2013)
Em estudo com 2316 pacientes avaliados a populaccedilatildeo de sexo masculino foi
de 526 idade meacutedia global de 53 anos (mediana de 55 anos) permanecircncia meacutedia
de 58 dias (mediana de 3 dias) (OLIVEIRA A C et al 2010) Outros trabalhos
apresentaram ausecircncia de significacircncia entre sexoidade e o desenvolvimento de
infecccedilotildees por microrganismos resistentes (PERES-BOTA D et al 2003 COLPAN
A et al 2005 COELLO R et al 1997)
Outro estudo utilizou um total de 30 amostras sendo elas isoladas de urina
escarro secreccedilatildeo pleural ponta de cateter aspirado traqueal e hemocultura A mais
prevalente foi em urina (40) Entre as 30 cepas analisadas a maior porcentagem
foi da cepa Klebsiella pneumoniae (70) Enterobacter sp (133) Klebsiella
ozaenae (10) Escherichia coli (333) e Klebsiella oxytoca (333)
(DIENSTMANN R et al 2010) Nos Estados Unidos a enzima KPC jaacute se tornou
endecircmica Foi realizada uma pesquisa em dois hospitais de Nova York onde
testaram 602 amostras e 45 apresentaram algum mecanismo de resistecircncia
sendo apenas 33 confirmadas por biologia molecular como KPC-2 (BRATU et
al 2005)
55
Estudo sobre os tipos de ESBL feito no Japatildeo apresentou o tipo Toho-1 como
o mais prevalente nessa pesquisa Ateacute o ano de 2000 ano em que foi publicado tal
estudo este era o primeiro relatoacuterio no Japatildeo para identificar derivados de ESBLs
como tipo de SHV e TEM entre E coli e K pneumoniae Em especial o tipo SHV- 12
foi identificado com uma maior frequumlecircncia Estes resultados indicam que tipos
distintos de ESBLs que satildeo diferentes em sua especificidade de substrato e origem
geneacutetica coexistem no Japatildeo Isto mostra a importacircncia de caracterizar genoacutetipos
distintos de ESBLs e de estar em alerta continuamente para as tendecircncias de
ESBLs no Japatildeo aleacutem da necessidade de uma interpretaccedilatildeo uniforme utilizando as
diretrizes do CSLI para relatar cepas produtoras de ESBL Aleacutem da detecccedilatildeo de
ESBLs satildeo necessaacuterias mais informaccedilotildees tais como o perfil de sensibilidade
especiacutefica para diversas β-lactacircmicos e o local da infecccedilatildeo Esses fatores satildeo
essenciais para a escolha adequada de antibioacuteticos (YAGI T et al 2000)
No ano de 2004 uma pesquisa avaliou a produccedilatildeo de uma enzima de
hidroacutelise de carbapenecircmicos atraveacutes da teacutecnica de sequumlenciamento foi revelado
um novo membro da famiacutelia KPC designado KPC- 3 Pesquisadores encontraram
em um mutante de K pneumoniae uma substituiccedilatildeo de um gene associado com
resistecircncia a Imipenem mas essa substituiccedilatildeo foi considerada improvaacutevel na
contribuiccedilatildeo da resistecircncia aos carbapenecircmicos da espeacutecie estudada Aleacutem da
resistecircncia aos carbapenecircmicos estes isolados eram em sua maioria resistentes agraves
cefalosporinas penicilinas e aminoglicosiacutedeos Usando estudos de transformaccedilatildeo
conjugaccedilatildeo e hibridaccedilatildeo localizaram o alelo blaKPC em plasmiacutedeo aleacutem disso
mostraram que esse alelo tambeacutem carregava uma resistecircncia aos aminoglicosiacutedeos
A transferecircncia das enzimas KPCs foi demonstrada in vitro tanto neste como em
outros estudos pode ser que os plasmiacutedeos que fazem esta transferecircncia estavam
comeccedilando a se espalhar no ambiente cliacutenico resultando na multiresistecircncia dessas
estirpes (WOODFORD et al 2004)
O presente estudo apresentou um vieacutes quanto aos resultados dos testes de
susceptibilidade microbiana Observou-se que natildeo foi encontrado resultado deste
teste em algumas amostras o que natildeo cooperou para um estudo mais preciso
futuros estudos quanto agraves amostras e um melhor acompanhamento deste tipo de
patologia Poreacutem mesmo sem algumas amostras com este resultado disponiacutevel foi
56
confirmada a presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos
carbapenecircmicos por meio dos genes de resistecircncia blaKPC e 16S rRNA que as
amostras apresentaram em sua maioria serem portadoras Quanto aos resultados
estatiacutesticos nenhuma das variaacuteveis apresentou significacircncia estatiacutestica (p gt 005)
mostrando assim que estas variaacuteveis isoladas natildeo foram o fator determinante para
o desfecho cliacutenico de alta ou oacutebito
57
7 CONCLUSAtildeO
Os genes blaKPC e 16S rRNA foram caracterizados confirmando a a
presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos carbapenecircmicos
Houve uma maior prevalecircncia da cepa K pneumoniae e isto confirma outros
estudos que apresentam a maior prevalecircncia desta cepa em amostras com KPC
Aleacutem disso isso justifica a forma popular da K pneumoniae ser chamada de KPC
enquanto que na verdade KPC eacute uma enzima podendo estar presente em outras
cepas como Enterobacter clocae tambeacutem apresentada no presente estudo O
desfecho cliacutenico de oacutebitos maior que 50 eacute um possiacutevel indicador sobre a
necessidade de se realizar um teste raacutepido para identificaccedilatildeo de KPC visando
iniciar o mais raacutepido possiacutevel o tratamento afim de diminuir a mortalidade por esta
infecccedilatildeo
Nenhuma das variaacuteveis isoladamente estaacute relacionada ao desfecho cliacutenico
oacutebito ou alta pois natildeo apresentaram relevacircncia estatiacutestica O presente estudo
mostrou que haacute presenccedila da bacteacuteria nas amostras de pacientes do hospital
estudado podendo entatildeo afirmar que este tipo de bacteacuteria se encontra tambeacutem
presente em ambiente hospitalar O uso irracional de antimicrobiano eacute demonstrado
de forma indireta quando foi apresentado atraveacutes do Teste de Hodge Modificado
uma resistecircncia de 100 aos antibioacuteticos carbapenecircmicos Isto tambeacutem reflete na
terapecircutica sendo que pacientes portadores de bacteacuterias resistentes aos
antibioacuteticos carabepecircmicos tem uma escassa opccedilatildeo de tratamento e as opccedilotildees
apresentam problemas quanto agrave toxicidade e eficaacutecia
58
REFEREcircNCIAS
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Mecanismos
de resistecircncia bacteriana aos antimicrobianos Disponiacutevel em
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controleopas_
webmodulo3mec_sitiohtmgt Acesso em 25 de abril de 2014
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Nota teacutecnica nordm
012013 medidas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees por enterobacteacuterias
multiresistentes Acesso em 17 de abril de 2013
ALBA J et al Kinetics study of KPC-3 a plasmid-encoded class A
carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase Antimicrob Agents Chemother
Nov49(11)4760-2 2005
ALVES A P et al Nosocomial infections by KPC-producing enterobacteria in
a tertiary hospital in Southern Brazil Revista da AMRIGS Porto Alegre 57 (3) 213-
218 jul-set 2013
ALVES A et al Tipagem Geneacutetica de Microrganismos Lab De Diversidade
Microbiana Centro de Biologia Celular Dep de Biologia U de Aveiro 3810-193
Aveiro- 2003
BELL J M et Al Prevalence and significance of a negative extended-
spectrum beta-lactamase (ESBL) confirmation test result after a positive ESBL
screening test result for isolates of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae
results from the SENTRY Asia-Pacific Surveillance Program J Clin Microbiol
May45(5)1478-82 2007
BRATU S et al Detection of KPC carbapenem-hydrolyzing enzymes in
Enterobacter spp from Brooklyn New York Antimicrob Agents Chemother v 49 n
2 p 776-8 2005
59
BRATU S et al Emergence of KPC-possessing Klebsiella pneumoniae in
Brooklyn New York epidemiology and recommendations for detection Antimicrob
Agents Chemother v 49 n 7 p 3018-20 2005
BRATU S et al Rapid spread of carbapenem-resistant Klebsiella
pneumoniae in New York City Arch Intern Med v 165 p 1430-5 2005
CAMARGO C F et al Aplicaccedilatildeo das teacutecnicas de pcr e suas teacutecnicas
derivadas em diagnoacutestico molecular Disponiacutevel em
ltfileDUnB10C2BA20semestreArtigosPCR-
20CLEYTON20FLORENCIO20DE20CAMARGO20E20PAULO20ROB
ERTO20QUEIROZpdfgtgt Acesso em 08 de abril de 2014
CARVALHES C G et al Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting
carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive
results Journal of Antimicrobial Chemotherapy v 65 n2 p 249-251 2010
CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION- CDC Modified
Hodge Test for Carbapenemase Detection in Enterobacteriaceae 2004
CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE Methods for
dilutionantimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically Approved
standard M7ndashA7 7th ed CLSI Wayne PA 2011
COELLO R et al Risk factors for developing clinical infection with methicillin-
resistant Staphylococcus aureus (MRSA) amongst hospital patients initially only
colonized with MRSA J Hosp Infect 19973739-46
COLPAN A et al Evaluation of risk factors for mortality in intensive care
units A prospective study from a referral hospital in Turkey Am J Infect Control
200533(1)42-7
60
CORNAGLIA G et al Living with ESBLs Introduction Clinical Microbiology
and Infection 14 Suppl 1 1-2 2008
COTRIM E R et al Klebsiella pneumoniae carbapenemase ndash KPC em
Enterobacteriaceae o desafio das bacteacuterias multirresistentes Poacutes em revista do
centro universitaacuterio Newton Paiva 12012 - ediccedilatildeo 5 - issn 2176 7785
DESHPANDE L M et al Occurrence and characterization of
carbapenemase-producing Enterobacteacuteriaceae report from the SENTRY
Antimicrobial Surveillance Program (2000-2004) Microb Drug Resist 12(4)223-30
2006
DIAS D J A Estudos dos principais mecanismos de resistecircncia aos
antibioacuteticos β-lactacircmicos em bacteacuterias patogecircnicas gram negativas 2009 100 f
Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Geneacutetica Molecular e Biomedicina) ndash Faculdade de
Ciecircncias e Tecnologia Universidade de Nova Lisboa Lisboa
DIENSTMANN R et al Avaliaccedilatildeo fenotiacutepica da enzima Klebsiella
pneumoniae carbapenemase (KPC) em Enterobacteriaceae de ambiente hospitalar
J Bras Patol Med Lab v 46 n 1 p 23-27 fevereiro 2010
ENDIMIAMI A et al Emergence of blaKPC-containing Klebsiella
pneumoniae in a long-term acute care hospital a new challenge to our healthcare J
Antimicrob Chemother 64 1102-1110 Nov 2009
FALAGAS M E et al Extended-spectrum beta-lactamase producing
organisms The Journal of Hospital Infection 73 (4) pp 345-54 2009
FONTANA C et al Emergence of KPC-producing Klebsiella pneumoniae in
Italy BMC Rev Notes 3 40 2010
61
GALES A C et al Antimicrobial resistance among Gram-negative bacilli
isolated from Latin America results from Sentry Antimicrobial Surveillance Program
(Latin America 2008-2010) Diagnostic Microbiology and Infectious Disease v 3 n
4 p 354 -360 2012
GUPTA N et al Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Epidemiology
and Prevention HEALTHCARE EPIDEMIOLOGY Clinical Infectious Diseases
201153(1)60ndash67 Published by Oxford University Press on behalf of the Infectious
Diseases Society of America 2011
HARBOTTLE H et al Genetics of antimicrobial resistance Anim Biotechnol
n17 p111-124 2006
HENRIQUE W N et al RESISTEcircNCIA BACTERIANA Uniatildeo das
Faculdades Alfredo NasserInstituto de Ciecircncias da Sauacutede Disponiacutevel em lt
httpwwwfaculdadealfredonasseredubrfilespesquisaposter20HENRIQUE20
Wilker20Natividade20SANTIAGO20Silvania20CAVALCANTI20DSP
20ResistC3AAncia20Bacterianapdfgt Acesso em 17 marccedilo 2014
HULSCHER M E J I et al Antibiotic prescribing in hospital a social and
behavioral scientific approach The Lancet Infectious Diaseases v 10 n 3 p 167-
165 2010
KIDWAI M SAPRA P BHUSHAN KR Synthetic strategies and medicinal
properties of beta-lactams Curr Med Chem 1999 695-215
KUMARASAMY K K et al Emergence of a new antibiotic resistance
mechanism in India Pakistan and the UK a molecular biological and
epidemiological stuy The Lancet Infectious Diseases v10 n 9 p 597- 602 2010
LINCOPAN N et al Enterobacteacuteria producing extended-spectrum β-
lacatamases and IMP-1 Metalo-β-lactamases isolated from Brazilian hospitals J Med
62
Microbiol 7 1-3 2006
LINCOPAN N et al First Isolation of Metalo-β-Lacatamase-Producing
Multiresistant Klebsiella pneumoniae from a patient in Brazil J Clin Microbiol 43(1)
516-519 2005
LIVERMORE D M et al What remains against carbapenem- resistant
Enterobacteriaceae Evaluation of choramphenicol ciprofloxacin colistina
fosfomycin minocycline nitrofurantoin temocilin and tigecycline International
Journal of Antimicrobial Agents v 37 n 5 p 415- 459 2011
LIVERMORE D M Fourten years in resistance International Journal of
Antimicrobial Agents v 39 283- 294 2012
LIVERMORE D M Bacterial resistance to carbapenems Adv Exp Med Biol
1995 39025-47
LIVERMORE D M Bacterial resistance origins epidemiology and impact
Clin Infect Dis 36S11-S23 2003
LIVERMORE D M et al Carbapenemases a problem in waiting Curr
Opin Microbiol 2000 3489-95
LU et al Universal pcr for common bacterial pathogens J CLIN
MICROBIOL VOL 38 2000
LU et al Use of PCR with Universal Primers and Restriction Endonuclease
Digestions for Detection and Identification of Common Bacterial Pathogens in
Cerebrospinal Fluid Journal of Clinical Microbiology June 2000 p 2076ndash2080
MARSCHALL J Met al Presence of the KPC Carbapenemase Gene in
Enterobacteriaceae Causing Bacteremia and Its Correlation with In Vitro
Carbapenem Susceptibility J Clin Microbiol 47 239-241 Jan 2009
63
MARTINS WMBS et al Prevalecircncia do gene blaKPC em isolados cliacutenicos
de Enterobacteriaceae e natildeo fermentadores encontrados em amostras clinicas em
um hospital universitaacuterio do Recife X Jornada de ensino pesquisa e extensatildeo ndash
JEPEX 2010 ndash UFRPE Recife 18 a 22 de outubro
MENDES C A C et al Polimixinas Revisatildeo com ecircnfase na sua
nefrotoxicidade Rev Assoc Med Bras 2009 55(6) 752-9
MOHR J F 3rd Update on the efficacy and tolerability of meropenem in the
treatment of serious bacteacuterial infections Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S41-51
2008
MONTEIRO J et al First report of KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae
strains in Brazil Antimicrob Agents Chemother Jan53(1)333-4 2009
MOREIRA V C et al Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia a antibioacuteticos
Disponiacutevel em
lthttpwwwcpglsucgbr6mostraartigosSAUDEVANESSA20CARVALHO20M
OREIRApdfgt Acesso em 21 marccedilo 2014
NETIKUL T et al Emergence of novel blaKPC-12 and blaKPC-13 variants in
carbapenem non-susceptible Enterobacter cloacae a first report of blaKPC gene in
Thailand European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases May
S372 2011
NETO V A et al Antibioacuteticos na praacutetica Meacutedica 6ordf Ediccedilatildeo Editorial
SarverSP Brasil 2007
NICOLAU D P Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of
meropenem Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S32-40 2008
64
OLIVEIRA A C et al Resistecircncia bacteriana e mortalidade em um centro de
terapia intensiva Rev Latino-Am Enfermagem nov-dez 2010
PAAUW A et al Failure to control an outbreak of qnrA 1-positive multidrug-
resistant Enterobacter clocae despite adequate implementation of recommended
infection control measures Journal of Clinical Microbiology v 45 n 5 p 1420-1425
2007
PATERSON D L et al Extended-Spectrum Beta-Lactamases a Clinical
Update Clinical Microbiology Reviews v 18 p 657-686 2005
PEIRANO G et al Carbapenem-hydrolysing beta-lactamase KPC-2 in
Klebsiella pneumonia isolated in Rio de Janeiro Brazil J Antimicrob Chemother Nov
20 2009
PERES-BOTA D et al Are infections due to resistant pathogens associated
with worse outcome in critically ill patients J Infect 200347(4)307-16
PIDDOCK L J V Clinically relevant chromosomally encoded multidrug
resistance effl ux pumps in bacterial Clin Microbiol Rev n19 p382-402 2006
PITOUT J D D et al Emergence of Enterobacteriaceae producing
extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) in the community J Antimicrob
Chemother May 56 2005
POSSEBON M I et al Resistecircncia bacteriana aos carbapenecircmicos
Bacterial resitence to carbapenems RBM rev bras med60(6)378380-378-382
jun 2003
QUEENAN A M et al Carbapenemases the versatile beta-lactamases
Clin Microbiol Rev Jul20(3)440-58 2007
65
RHOMBERG P R et al Summary trends for the meropenem yearly
susceptibility test information collection program a 10- year experience in the United
States (1999-2008) Diagnostic Microbiology and Infectiois Disease v 65 n4 p
414-426 2009
ROBLEDO I E et al Detection of KPC in Acinetobacter spp in Puerto Rico
J Antimicrob Agents Chemother 54 1354-1357 Mar 2010
ROGERS B A et al Country-to-country transfer os patients and the risk of
multi-resistant bacterial infection Clinical Infectious Disease v53 n1 p49- 56
2011
SHAH A A et al Characteristics epidemiology and clinicalimportance of
emerging strains of Gram-negative bacilli producing extended-spectrum
betalactamases Research in Microbiology v 155 p 409-421 2004
TURNER P J Extended- Spectrum Beta-Lactamases Clinical Infectious
Diseases v 41 p 273-275 2005
WOLTER D J et al Phenotypic and Enzymatic Comparative Analysis
between the Novel KPC variant KPC-5 and Its Evolutionary Variants KPC-2 and
KPC-4 Antimicrob Agents Chemother Nov 17 2008
WOODFORD N et al Carbapenemases of Chryseobacterium
(Flavobacterium) meningosepticum distribution of blaB and characterization of a
novel Metalo-beta-lactamase gene blaB3 in the type strain NCTC 10016
Antimicrob Agents Chemother Jun44(6)1448-52 2000
WOODFORF N Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in
India Pakistan and the UK a molecular biological and epidemiological study The
Lancet Infectious Diseases v 10 n 9 p 597-602 2010
66
WOODFORD et al Outbreak of Klebsiella pneumoniae Producing a New
Carbapenem- Hydrolyzing Class A β-Lactamase KPC-3 in a New York Medical
Center Antimicrobial agents and chemotherapy Dec 2004 p 4793ndash4799 Vol 48
No 12
YAGI T et al A preliminary survey of extended-spectrum β-lactamases
(ESBLs) in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Japan
FEMS Microbiology Letters 184 (2000) 53-56
YIGIT H et al Novel carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase KPC-1 from
a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumonia J Antimicrob Agents
Chemother 45 (4) 1151-1161 (2001)
ZAVASCKI A P et al KPC-2- producing Enterobacter cloacae in two cities
from Southern Brazil Int J Antimicrob Agents Apr 28 2009
ZHANEL G G et al Comparative review of the carbapenecircmicos Drugs
67(7)1027-52 2007
67
ANEXOS
Sequumlecircncia do oligo blaKPC
Query 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
Query 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
Query 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
68
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
Query 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
Query 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
69
Query 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
Query 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
Query 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
70
Sbjct 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
Query 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
Query 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
Query 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
71
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
Query 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
Query 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
72
Query 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
Query 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
Query 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
73
Sbjct 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
Query 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
Query 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
Query 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
74
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
Query 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
Query 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
75
Query 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Sbjct 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
Query 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
||||
Sbjct 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
LOCUS AF297554 1377 bp
DNA linear BCT 26-MAR-2001
DEFINITION Klebsiella pneumoniae carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
gene complete cds
ACCESSION AF297554
VERSION AF2975541 GI10121874
76
KEYWORDS
SOURCE Klebsiella pneumoniae
ORGANISM Klebsiella pneumoniae
Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Enterobacteriaceae Klebsiella
REFERENCE 1 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH QueenanAM
AndersonGJ Domenech-SanchezA
BiddleJW StewardCD
AlbertiS BushK and TenoverFC
TITLE Novel carbapenem-hydrolyzing beta-
lactamase KPC-1 from a
carbapenem-resistant strain of
Klebsiella pneumoniae
JOURNAL Antimicrob Agents Chemother 45 (4)
1151-1161 (2001)
PUBMED 11257029
REFERENCE 2 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH AndersonGJ and
TenoverFC
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (19-AUG-2000) Nosocomial
Pathogens Laboratory Branch
Centers for Disease Control and
Prevention 1600 Clifton Rd MS
G08 Atlanta GA 30333 USA
FEATURES LocationQualifiers
77
source 11377
organism=Klebsiella
pneumoniae
mol_type=genomic DNA
db_xref=taxon573
-35_signal 5560
-10_signal 7883
mRNA 921012
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
RBS 117122
CDS 1311012
note=blaKPC-1
codon_start=1
transl_table=11
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
protein_id=AAG134101
db_xref=GI10121875
translation=MSLYRRLVLLSCLSWPLAGFSATALTNLVAEPFAKLEQD
FGGSI
GVYAMDTGSGATVSYRAEERFPLCSSFKGFLAAAVLARSQQQAGLLDTPIRYG
KNALV
PWSPISEKYLTTGMTVAELSAAAVQYSDNAAANLLLKELGGPAGLTAFMRSIG
DTTFR
78
LDRWELELNSAIPSDARDTSSPRAVTESLQKLTLGSALAAPQRQQFVDWLKGN
TTGNH
RIRAAVPADWAVGDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTRAPNKDDK
HSEAV
IAAAARLALEGLGVNGQ
ORIGIN
1 cggggcagtt acagccgtta cagcctctgg
agagggagcg gcttgccgct cggtgataat
61 cccagctgta gcggcctgat tacatccggc
cgctacacct agctccacct tcaaacaagg
121 aatatcgttg atgtcactgt atcgccgtct
agttctgctg tcttgtctct catggccgct
181 ggctggcttt tctgccaccg cgctgaccaa
cctcgtcgcg gaaccattcg ctaaactcga
241 acaggacttt ggcggctcca tcggtgtgta
cgcgatggat accggctcag gcgcaactgt
301 aagttaccgc gctgaggagc gcttcccact
gtgcagctca ttcaagggct ttcttgctgc
361 cgctgtgctg gctcgcagcc agcagcaggc
cggcttgctg gacacaccca tccgttacgg
421 caaaaatgcg ctggttccgt ggtcacccat
ctcggaaaaa tatctgacaa caggcatgac
481 ggtggcggag ctgtccgcgg ccgccgtgca
atacagtgat aacgccgccg ccaatttgtt
541 gctgaaggag ttgggcggcc cggccgggct
gacggccttc atgcgctcta tcggcgatac
79
601 cacgttccgt ctggaccgct gggagctgga
gctgaactcc gccatcccaa gcgatgcgcg
661 cgatacctca tcgccgcgcg ccgtgacgga
aagcttacaa aaactgacac tgggctctgc
721 actggctgcg ccgcagcggc agcagtttgt
tgattggcta aagggaaaca cgaccggcaa
781 ccaccgcatc cgcgcggcgg tgccggcaga
ctgggcagtc ggagacaaaa ccggaacctg
841 cggagtgtat ggcacggcaa atgactatgc
cgtcgtctgg cccactgggc gcgcacctat
901 tgtgttggcc gtctacaccc gggcgcctaa
caaggatgac aagcacagcg aggccgtcat
961 cgccgctgcg gctagactcg cgctcgaggg
attgggcgtc aacgggcagt aaggctctga
1021 aaatcatcta ttggcccacc accgccgccc
ttgcgggcgg catggattac caaccactgt
1081 cacatttagg ctaggagtct gcgcggcaga
gccgtgtgac cggttttctg tagagcactg
1141 acgatggcgg cggcgctctc tgcaattggc
aaggcgtcgg cgccaaggat accaatcttg
1201 cggcgcgcgg cgtgttatga cgactggggt
gcatttgagc cgccccattt aaccttcgcc
1261 ctcacagata cgccattcgc ctcaaattta
gcgccatgca gacgagcttc cactcggctt
1321 gcaccttgtc caggcccctc atgctgaact
gacgcaatcc catcaccgcc ttgatca
80
17
por esta bacteacuteria uma das principais causas de falha terapecircutica Existem outras
formas de resistecircncia emergentes de grande importacircncia como a produccedilatildeo de
beta-lactamases tipo adenosina monofosfato ciacuteclico (AmpC) que hidrolizam
cefoxitina as carbapenemases como as metalo-beta-lactamases (MBL) e
carbapenemases tipo KPC (MOREIRA et al 2014)
O mecanismo de resistecircncia mais comum aos antibioacuteticos beta-lactacircmicos de
amplo espectro eacute a produccedilatildeo de ESBL por enterobacteacuterias A accedilatildeo hidroliacutetica
apresentadas por estas enzimas pode conferir clinicamente resistecircncia ao
aztreonam cefalosporina e a todas as penicilinas (PATERSON et al 2005) As
ESBL satildeo enzimas mediadas por genes plasmidiais (transmissiacuteveis entre as
espeacutecies) Os principais microrganismos produtores de ESBL satildeo Klebsiella
pneumoniae (mais encontrada) Escherichia coli e Proteus mirabilis podendo ocorrer
em outros membros da famiacutelia Enterobacteriaceae e em alguns microrganismos natildeo
enteacutericos como Acinetobacter ssp (TURNER 2005) A importacircncia cliacutenica meacutedica
destes microrganismos portadores de ESBL eacute que graccedilas aacutes suas resistecircncias a
muitas classes de antimicrobianos o tratamento de infecccedilotildees eacute difiacutecil gerando um
aumento da morbidade e mortalidade dos pacientes (SHAH et al 2004)
A enzima KPC foi detectada pela primeira vez na Carolina do Norte Costa
Leste dos Estados Unidos no ano de 1996 em Klebsiella pneumoniae dando entatildeo
este nome a enzima Em pouco tempo ela disseminou por outras regiotildees e
recentemente tornou-se uma das preocupaccedilotildees quanto agrave sauacutede puacuteblica mundial
Os paiacuteses de onde KPCs tecircm sido relatados desde 2001 satildeo mostrados na figura 2
apresentando como os organismos tecircm agora sido disseminados amplamente pelo
mundo (NEIL GUPTA et al 2011)
18
Figura 2 Divulgaccedilatildeo internacional de Enterobacteriaceae produtora de
Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC)( NEIL GUPTA et al 2011)
Este mapa apresenta paiacuteses onde Enterobacteriaceae produtoras KPC de
foram descritos em relatoacuterios publicados disponiacuteveis a partir de 11 fevereiro de
2011 Os paiacuteses natildeo destacadas nesta figura tambeacutem podem apresentar a presenccedila
de Enterobacteriaceae produtoras de KPC poreacutem pode ter tido uma falta de
vigilacircncia sistemaacutetica para estes organismos ( NEIL GUPTA et al 2011)
No ano de 2005 foram registradas pela primeira vez essas bacteacuterias
produtoras de carbapenemases Apoacutes 6 anos deste primeiro relato elas passaram a
causar surtos mais graves em nosso paiacutes Em janeiro de 2011 foram notificados no
Distrito FederalBrasil 367 casos em um curto espaccedilo de tempo (01 a 08 de janeiro
de 2011) com 26 oacutebitos A maior parte destes casos (263 casos) foi identificada nas
unidades de terapia intensiva ndash UTI (COTRIM et al 2012)
O potencial de disseminaccedilatildeo da KPC eacute alto devido agrave grande capacidade de
transferecircncia do seu material geneacutetico e por conseguinte os genes de resistecircncia
O controle de epidemias eacute difiacutecil devido a esta caracteriacutestica de faacutecil disseminaccedilatildeo
preocupando os profissionais da aacuterea de sauacutede devido agrave dificuldade de tratamento
podendo resultar em um aumento das taxas de mortalidade Apesar da maior
19
frequumlecircncia em Klebsiella pneumoniae a KPC pode ser identificada em outras
bacteacuterias como a Enterobacter cloacae Citrobacter freundii Salmonella spp E coli
e Pseudomonas spp (DIENSTMANN et al 2010)
Os pacientes com comorbidades incluindo pacientes transplantados
neutropecircnicos em ventilaccedilatildeo mecacircnica em Unidade de Terapia Intensiva (UTI)
com longos periacuteodos de internaccedilatildeo que apresentam risco aumentado de infecccedilatildeo ou
colonizaccedilatildeo para bacteacuterias multirresistentes satildeo mais vulneraacuteveis a Klebsiella
pneumoniae produtora de KPC (COTRIM et al 2012)
Os sinais e sintomas apresentados por um indiviacuteduo infectado por KPC satildeo
febre ou hipotermia taquicardia piora do quadro respiratoacuterio e em casos mais
graves hipotensatildeo inchaccedilo e sepse Quanto ao siacutetio de infecccedilatildeo a bacteacuteria que
possui a enzima KPC pode causar pneumonia associada agrave ventilaccedilatildeo mecacircnica
infecccedilatildeo do trato urinaacuterio infecccedilatildeo de corrente sanguiacutenea infecccedilatildeo de partes moles
e outros tipos de infecccedilatildeo (COTRIM et al 2012)
Para desenvolver a infecccedilatildeo a colonizaccedilatildeo eacute um preacute-requisito poreacutem o
pacientes pode estar colonizado ou seja ser portadores de KPC e natildeo desenvolver
a infecccedilatildeo (ALVES et al 2013) A forma de transmissatildeo eacute basicamente por
contato com secreccedilatildeo ou excreccedilatildeo de pacientes infectados ou colonizados logo
fora do ambiente hospitalar a bacteacuteria natildeo representa perigo (COTRIM et al
2012)
As opccedilotildees terapecircuticas para o tratamento da Klebsiella pneumoniae eacute
dividida em Terapia Empiacuterica e Terapia apoacutes a determinaccedilatildeo do perfil de
sensibilidade A terapia empiacuterica para infecccedilotildees por enterobacteacuterias multirresistentes
se baseia na utilizaccedilatildeo de polimixina B ou polimixina E (Colistina) em associaccedilatildeo
com um (1) ou mais dos antimicrobianos da classe dos aminoglicosiacutedeos
(gentamicina ou amicacina) Carbapenecircmicos (meropenem ou doripenem) eou
tigeciclina (ANVISA 2013)
Recomenda-se usar sempre associaccedilotildees de dois ou trecircs antimicrobianos
sendo um deles a polimixina B ou a polimixina E (colistina) Deve-se evitar a
utilizaccedilatildeo de monoterapias pelo risco de raacutepido desenvolvimento de resistecircncia A
escolha do(s) faacutermaco(s) de associaccedilatildeo com polimixina B ou E deve se basear
preferencialmente no perfil de susceptibilidade esperado aos referidos
20
medicamentos das enterobacteacuterias resistentes aos carbapenecircmicos detectadas no
hospital ou na ausecircncia de dados locais na regiatildeo Deve-se considerar igualmente
o local de infecccedilatildeo e a penetraccedilatildeo esperada do antimicrobiano na escolha da droga
a ser utilizada na combinaccedilatildeo (ANVISA 2013)
Apoacutes a liberaccedilatildeo do perfil de sensibilidade deve-se adequar o uso dos
medicamentos Sempre que possiacutevel manter no miacutenimo 2 (dois) faacutermacos com
sensibilidade comprovada in vitro Natildeo havendo sensibilidade a um segundo
medicamento (suscetibilidade apenas agrave polimixina B ou E) recomenda-se manter a
terapia combinada de polimixina B ou E com carbapenecircmicos (meropenem ou
doripenem) ou tigeciclina na tentativa de ocorrecircncia de sinergismo entre elas
(ANVISA 2013)
Sugere-se aleacutem da determinaccedilatildeo das Concentraccedilotildees Inibitoacuterias Miacutenimas
(CIMs) para uma das polimixinas (B ou E) que tambeacutem sejam determinadas as
CIMs de tigeciclina e carbapenecircmicos (meropenem) bem como a consultoria de um
infectologista (ou Comissatildeo de Controle de Infecccedilatildeo Hospitalar- CCIH) para a
determinaccedilatildeo da terapia combinada com base na interpretaccedilatildeo do antibiograma
CIM e quadro cliacutenico do paciente No caso de resistecircncia agraves polimixinas
(concentraccedilotildees inibitoacuterias miacutenimas [CIMs] gt 2 mgL) recomenda-se a associaccedilatildeo de
dois ou trecircs do antimicrobianos sugeridos para a combinaccedilatildeo (ANVISA 2013)
A antissepsia eficiente do ambiente dos instrumentos ciruacutergicos e das matildeos
com o uso do aacutelcool a 70 eacute fundamental para a contenccedilatildeo de surtos Aleacutem disto
os pacientes contaminados devem permanecer isolados ateacute o controle da infecccedilatildeo
para evitar a disseminaccedilatildeo da bacteacuteria (COTRIM et al 2012)
1 2 Resistecircncia bacteriana
Hoje a disseminaccedilatildeo e a proliferaccedilatildeo das bacteacuterias resistentes estatildeo cada
dia mais presente As bacteacuterias multirresistentes (BRMD) poderatildeo levar agrave
humanidade a uma era poacutes-antibioacutetica resultando em uma ausecircncia de qualquer
opccedilatildeo de tratamento para os portadores destas cepas (HENRIQUE et al 2014)
Os fatores envolvidos na disseminaccedilatildeo desses patoacutegenos multirresistentes
satildeo diversos incluindo o uso irracional de antimicrobianos procedimentos invasivos
21
(cirurgias implantaccedilatildeo de proacuteteses meacutedicas e outros) e a transferecircncia de material
geneacutetico com a informaccedilatildeo de resistecircncia a antibioacuteticos entre as bacteacuterias
(DIENSTMANN et al 2010 ENDIMIAMI et al 2009 FONTANA et al 2010)
Com a praacutetica da antibioticoterapia principalmente em ambientes
nosocomiais os mecanismos de resistecircncia tornaram-se comuns Esses
mecanismos incluem alteraccedilatildeo na permeabilidade da membrana celular que
impede a entrada do antibioacutetico na ceacutelula bombeamento do antibioacutetico para fora da
mesma pelo mecanismo de efluxo mutaccedilatildeo geneacutetica que altera de alguma forma o
alvo do antibioacutetico e consequumlentemente natildeo afeta o funcionamento da bacteacuteria
bem como desenvolvimento da capacidade de degradar ou da inativaccedilatildeo do
antibioacutetico (COTRIM et al 2012) Estes mecanismos estatildeo representados na figura
3
Figura 3 Mecanismos de resistecircncia bacteriana Fonte
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controle
opas_webmodulo3pop_mecanismohtmgt
Um dos mais importantes mecanismos de resistecircncia eacute a alteraccedilatildeo do local-
alvo onde atua determinado antimicrobiano de modo a impedir a ocorrecircncia de
qualquer efeito inibitoacuterio ou bactericida As bacteacuterias podem adquirir um gene que
22
codifica um novo produto resistente aos antimicrobianos substituindo o alvo original
por exemplo o Staphylococcus aureus resistente agrave oxacilina e estafilococos
coagulase-negativos adquiriram o gene cromossocircmico Mec A e produzem uma PBP
ou PLP resistente aos β-lactacircmicos denominada 2a ou 2 que eacute suficiente para
manter a integridade da parede celular durante o crescimento quando outras PBPs
essenciais satildeo inativadas por antibimicrobianos β-lactacircmicos Como alternativa um
gene receacutem-adquirido pode atuar para modificar um alvo tomando-o menos
vulneraacutevel a determinado antimicrobiano Assim um gene transportado por
plasmiacutedeo ou por transposon codifica uma enzima que inativa os alvos ou altera a
ligaccedilatildeo dos antimicrobianos como ocorre com eritromicina e clindamicina (ANVISA
2007)
Em funccedilatildeo da bomba de efluxo pode variar a especificidade do antibioacutetico
Ele atua por meio do bombeamento ativo de antimicrobianos do meio intracelular
para o extracelular gerando uma resistecircncia bacteriana a determinados
antimicrobianos como eacute o caso da resistecircncia agraves tetraciclinas codificada por
plasmiacutedeos em Escherichia coli devido agrave presenccedila de proteiacutenas integrantes da
membrana plasmaacutetica bacteriana (PIDDOCK 2006)
O aumento da siacutentese de proteiacutenas eacute o principal responsaacutevel pela resistecircncia
antimicrobiana devido agraves vaacuterias mutaccedilotildees que ocorrem em seus repressores
transcricionais Estas mutaccedilotildees tambeacutem podem influenciar levando a um aumento
da eficiecircncia do transporte dos antibioacuteticos para o exterior da ceacutelula (HARBOTTLE
et al 2006)
A resistecircncia aos antibioacuteticos eacute frequumlentemente associada agrave alteraccedilatildeo
diminuiccedilatildeo da permeabilidade que ocorre na membrana externa das bacteacuterias gram-
negativas O fluxo de moleacuteculas para o interior da ceacutelula ocorre por caracteriacutesticas
peculiares como carga estrutura e dimensatildeo e atraveacutes de proteiacutenas de membrana
as quais formam canais Este percurso eacute utilizado pelos antibioacuteticos para atingir o
interior da ceacutelula bacteriana ou o espaccedilo periplasmaacutetico como eacute o caso dos
antibioacuteticos β-lactacircmicos Portanto a perda de funccedilatildeo destas proteiacutenas pode
efetivamente causar a diminuiccedilatildeo da susceptibilidade a vaacuterios antibioacuteticos
(LIVERMORE 2003)
23
Os mecanismos de resistecircncia que podem impedir a accedilatildeo de antimicrobianos
satildeo vaacuterios O faacutermaco atua de forma a inibir os processos essenciais a multiplicaccedilatildeo
e sobrevivecircncia da ceacutelula bacteriana como a membrana citoplasmaacutetica e
consequumlentemente bloqueando a siacutentese proteacuteica de aacutecidos nucleacuteicos e da parede
celular A resistecircncia bacteriana eacute um mecanismo natural de defesa Sendo assim
as bacteacuterias estatildeo em constante defesa e para cada novo faacutermaco desenvolvido as
bacteacuterias iratildeo desenvolver resistecircncia em algum momento (POSSEBON et al
2003)
O grupo de antibioacuteticos beta-lactacircmicos satildeo amplamente utilizado e se
encontram dentro da classe dos melhores agentes antimicrobianos com relevacircncia
cliacutenica No entanto o seu uso tem sido restringido devido a vaacuterios mecanismos de
resistecircncia O desenvolvimento dos carbapenecircmicos surgiu devido agrave proliferaccedilatildeo de
beta-lactamases mediadas por plasmiacutedeos e cromossomos (POSSEBON et al
2003)
A bacteacuteria KPC tem um gene chamado SHV-1 que tem a caracteriacutestica de
resistecircncia a quase todos os tipos de antimicrobianos inclusive os carbapenecircmicos
especiacuteficos para o tratamento de infecccedilotildees por bacteacuterias multiresistentes e
emergecircncias Mesmo com no seu coacutedigo geneacutetico a informaccedilatildeo necessaacuteria para o
desenvolvimento da resistecircncia a resistecircncia da bacteacuteria soacute eacute desenvolvida caso a
bacteacuteria entre em contato com o antibacteriano desencadeando todo o processo
nos casos de resistecircncia induzida comuns em KPC (MOREIRA et al 2014)
A resistecircncia bacteriana pode ser apresentada de forma intriacutenseca ou
adquirida A resistecircncia intriacutenseca faz parte das caracteriacutesticas fenotiacutepicas naturais
do microrganismo ou seja faz parte de sua heranccedila geneacutetica sendo transmitida
verticalmente a prole sem perda da caracteriacutestica A presenccedila ou ausecircncia do alvo
para a accedilatildeo da droga eacute o principal determinante deste tipo de resistecircncia
(MOREIRA et al 2014) Essa resistecircncia corresponde a uma caracteriacutestica de
espeacutecie bacteriana quando estes microrganismos satildeo naturalmente resistentes a
certo tipo de antibioacutetico Este processo eacute decorrente da ausecircncia de estruturas de
atuaccedilatildeo de antimicrobianos ou a impermeabilidade por parte de estruturas
perifeacutericas das bacteacuterias (HENRIQUE et al 2014)
24
A resistecircncia adquirida aos antibioacuteticos por sua vez ocorre quando haacute uma
da mutaccedilatildeo de genes reguladores ou estruturais aquisiccedilatildeo de genes de resistecircncia
veiculados por elementos geneacuteticos moacuteveis ou da combinaccedilatildeo entre eles Este
aparecimento de resistecircncia em uma espeacutecie bacteriana era anteriormente sensiacutevel
a droga e devido a um destes fatores se torna resistente O fenoacutetipo resultante
desta resistecircncia natildeo estaraacute presente nas ceacutelulas genitoras e sim nos indiviacuteduos de
uma linhagem bacteriana derivada de um organismo susceptiacutevel Os genes muitas
vezes satildeo adquiridos por meio de elementos moacuteveis como plasmiacutedeos e
transposons (MOREIRA et al 2014)
Entatildeo a resistecircncia adquirida ocorre por diversos mecanismos geneacuteticos tais
como produccedilatildeo de enzimas inativadoras interferecircncia com a entrada e acuacutemulo de
droga na bacteacuteria alteraccedilatildeo do receptor para accedilatildeo da droga via metaboacutelica
alternativa Eacute originada por meio de uma alteraccedilatildeo a niacutevel geneacutetico da ceacutelula de
natureza cromossocircmica pelos processos de mutaccedilatildeo transduccedilatildeo e transformaccedilatildeo
ou extra cromossocircmica (plasmidial) (HENRIQUE et al 2014)
Como todo antibioacutetico β-lactacircmicoos carbapenecircmicos tem como mecanismo
de accedilatildeo a inibiccedilatildeo da siacutentese proteacuteica atraveacutes da accedilatildeo de inibiccedilatildeo da parede
microbiana fazendo a ligaccedilatildeo e inativaccedilatildeo das proteiacutenas ligadoras de penicilinas
(NETO et al 2007)
Imipenem e meropenem antibioacuteticos pertencentes ao grupo dos
carbapenecircmicos possuem um amplo espectro de accedilatildeo in vitro incluindo atividade
contra cocos gram-positivos bacilos gram-negativos e bacteacuterias anaeroacutebias (MOHR
2008) Jaacute o ertapenem possui um espectro de accedilatildeo mais limitado que o os dois
antibioacuteticos anteriormente citados tendo uma eficiecircncia limitada contra os bacilos
gram-negativos natildeo fermentadores Um novo antibioacutetico carbapenecircmico ainda natildeo
disponiacutevel no Brasil doripenem possui uma atividade mais potente principalmente
contra Pseudomona aeruginosa devido ao seu mecanismo de accedilatildeo que combina os
espectros de accedilatildeo de imipenem e meropenem (ZHANEL et al 2007)
Devido as suas estabilidades espectro de accedilatildeo poucos relatos de
resistecircncia boa toleracircncia pelos pacientes com efeitos adversos mais comuns as
complicaccedilotildees no siacutetio da infusatildeo e toxicidade gastrintestinal estes antibioacuteticos
carbapenecircmicos tecircm sido considerados terapia de escolha (NICOLAU 2008) Como
25
uma resposta adaptativa das Enterobacteacuterias o iacutendice de resistecircncia aos
carbapenecircmicos tem aumentado nos uacuteltimos anos de forma proporcional ao seu
uso limitando imensamente as opccedilotildees terapecircuticas para as infecccedilotildees causadas por
estes microrganismos (FALAGAS et al 2009)
As enzimas produtoras de betalactamases hidrolisam o anel betalactacircmico
tornando este mecanismo de resistecircncia o mais importante Os dois grupos mais
preocupantes satildeo o grupo das betalactamases de aspecto ampliado e os da
carbapenemases que aleacutem de hidrolizar os carbapenecircmicos hidrolizam todas as
outras classes de betalactacircmicos Em enterobacteacuterias as carbapenemases mais
prevalentes satildeo codificadas por genes dos grupos blaKpc blaIMP blaVIM blaNdm
e blaOxa A ocorrecircncia de carbapenemases eacute mais frequentemente em bacteacuterias
gram-negativas fermentadoras da glicose conhecidas como enterobacteacuterias
predominantes nos gecircneros Klebsiella Serratia Citrobacter Enterobacter
Escherichia Samonella Proteus Morganella Podem ser encontradas tambeacutem em
bacteacuterias gram-negativas natildeo fermentadoras como espeacutecies de Acinetobacter e de
Pseudomonas (ALVES et al 2013)
Carbapenemases satildeo enzimas plasmiacutedio-mediados resistentes a todos
antibioacuteticos betalactacircmicos As bacteacuterias que possuem o gene blaKpC responsaacutevel
pela codificaccedilatildeo da produccedilatildeo de carbapenemases apresentam resistecircncia aos
antibioacuteticos betalactacircmicos impedindo a accedilatildeo destes antibioacuteticos contra infecccedilotildees
(ALVES et al 2013)
A transmissatildeo das carbapenemases a diferentes cepas de enterobacteacuterias se
daacute atraveacutes de plasmiacutedeos que satildeo pequenas moleacuteculas circulares de DNA com a
capacidade de se replicarem independentemente do DNA cromossocircmico
permitindo a troca de material geneacutetico entre gecircneros e espeacutecies diferentes de
enterobacteacuterias O raacutepido desenvolvimento de surtos em ambientes hospitalares eacute
explicado por essa disseminaccedilatildeo plasmidial (COTRIM et al 2012)
De acordo com o criteacuterio de interpretaccedilatildeo do Clinical and Laboratory
Standards Institute (CLSI 2009) a maioria das KPC isoladas natildeo apresenta
resistecircncia completa aos carbapenecircmicos (Imipenem e Meropenem apresentam
uma Concentraccedilatildeo Inibitoacuteria Miacutenima (CIM) de 2-8 μgmL) (COTRIM et al 2012)
26
Os mecanismos de resistecircncia capazes de impedir a accedilatildeo dos
carbapenecircmicos satildeo vaacuterios Poreacutem a degradaccedilatildeo de antibioacuteticos por enzimas
principalmente as carbapenemases constituem o principal mecanismo de
resistecircncia aos antibioacuteticos β-lactacircmicos (DIAS 2009) Devido a ampla atividade
hidroliacutetica agrave maioria dos antibioacuteticos β-lactacircmicos estes grupos de enzimas possuem
alta versatilidade (QUEENAM et al 2007)
Existem trecircs grandes classes moleculares de Ambler a qual as
carbapenemases pertencem denominadas classe A (serino-carbapenemases os
quais incluem membros designados SME IMI NMC GES e a famiacutelia das KPCs)
classe B(as metalo-β-lactamase incluem os tipos IMP e VIM) e classe D
(oxacilinases similares as da classe A e incluem as OXA e PSE) (DIAS 2009)
Dentre estes as mais importantes e prevalentes encontradas em plasmiacutedeos
de Klebsiella pneumoniae satildeo as KPC (DIENSTMANN et al 2010) Por meio de
estudos moleculares a enzima KPC jaacute foi documentada em diferentes bacteacuterias e
diferenciada em KPC-1 a 13 (NETIKUL et al 2011) No ano de 2009 foi realizada
uma pesquisa onde descreveram as seguintes carbapenemases KPC-1 em isolados
de Klebsiella pneumoniae KPC-2 em K pneumoniae K oxytoca Salmonella
enterica e em Enterobacter sp e KPC-3 em K pneumoniae e Enterobacter cloacae
(MONTEIRO et al 2009) As enzimas KPC-4 e KPC-5 foram encontradas em
isolados de Pseudomonas aeruginosa (PEIRANO et al 2009)
Foi observada uma correccedilatildeo da sequumlecircncia KPC-1 indicando que o gene
blaKPC-1 e blaKPC-2 satildeo idecircnticos Trecircs novas variantes blaKPC-3 blaKPC-4 e
blaKPC-5 satildeo resultados de mutaccedilotildees do gene estrutural da enzima KPC-2
(WOLTER et al 2008) apresentando diferentes perfis de hidroacutelise As enzimas
KPC-2 e KPC-3 possuem alta eficiecircncia em hidrolisar cefalotina cefaloridina e
nitrocefin poreacutem possuem uma menor eficiecircncia contra carbapenecircmicos e
cefotaxima (ALBA et al 2005) As enzimas KPC-5 e KPC-4 apresentam menor
hidroacutelise de carbapenecircmicos eacute do que em KPC-2 Em contrapartida possuem
melhor eficiecircncia contra ceftazidima e uma maior inibiccedilatildeo pelo aacutecido clavulacircnico
(WOLTER et al 2008)
27
13 Anaacutelise geneacutetica de microrganismos
Eacute de extrema importacircncia praacutetica natildeo soacute no aspecto cliacutenico mas tambeacutem na
fitopatologia biotecnologia e estudos ambientais a correta identificaccedilatildeo e
classificaccedilatildeo de microrganismos Os meacutetodos usados na diferenciaccedilatildeo de gecircneros
espeacutecies e estirpes de microrganismos podem ser divididos em meacutetodos fenotiacutepicos
(baseados em fenocircmenos bioquiacutemicos fisioloacutegicos e bioloacutegicos) e genotiacutepicos
(detectam polimorfismos ao niacutevel dos aacutecidos nucleacuteicos ou variaccedilatildeo aleacutelica ao niacutevel
de enzimas) (ALVES et al 2003)
Para este tipo de estudo existem alguns meacutetodos como o RFLPrsquos -
ldquoRestriction Fragment Length Polymorphismsrdquo (polimorfismos de tamanho de
fragmentos de restriccedilatildeo) rep-PCR (Meacutetodo de tipagem baseado na amplificaccedilatildeo via
PCR de elementos de DNA repetitivos presentes em genomas bacterianos) anaacutelise
de sequumlecircncias nucleotiacutedeas (discriminaccedilatildeo eou identificaccedilatildeo atraveacutes de sequumlecircncias
de DNA) PFGE - Pulsed-Field Gel Electrophoresis (Eletroforese em campo
pulsado) ( A L V E S et al 2003)
A diferenciaccedilatildeo clara da cepa e principalmente a alta reprodutibilidade devem
ser caracteriacutesticas de qualquer meacutetodo de tipagem geneacutetica Poreacutem nem todos os
meacutetodos moleculares de tipagem satildeo igualmente eficazes Sendo assim de acordo
com a finalidade pretendida (identificaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo custo reprodutibilidade
etc) eacute feita a escolha do meacutetodo a ser aplicado (A L V E S et al 2003)
O processo de identificaccedilatildeo fenotiacutepica de KPC entre os membros da famiacutelia
Enterobacteriaceae ainda eacute difiacutecil e os meacutetodos para a sua identificaccedilatildeo devem ser
revistos e ajustados Mesmo com o avanccedilo tecnoloacutegico natildeo existem ensaios que
combinam alta especificidade e sensibilidade na detecccedilatildeo destas enzimas Satildeo
diversas as metodologias usadas para rastreamento de KPC como por exemplo a
focalizaccedilatildeo isoeleacutetrica a teacutecnica de disco-difusatildeo E-test teste de Hodge
modificado dentre outros Aleacutem disso a pesquisa do gene blaKPC pode ser feita
pela Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) Os sistemas de automaccedilatildeo
existentes no entanto podem natildeo identificar com precisatildeo os isolados KPC
positivos (COTRIM et al 2012)
A identificaccedilatildeo blaKPC pelo PCR eacute um meacutetodo raacutepido preciso sensiacutevel e
altamente especiacutefico no entanto a PCR exige equipamento e conhecimentos
28
especializados em diagnoacutestico molecular dificultando ainda a utilizaccedilatildeo dele na
rotina dos laboratoacuterios de microbiologia (COTRIM et al 2012)
Em estudo de infecccedilotildees hospitalares identificaccedilatildeo molecular de patoacutegenos
bacterianos eacute bastante utilizada Para diferenciar carbapenemases tipo KPC a partir
de outros tipos como SME NMC-A-IMI e GES eacute necessaacuterio um exame molecular
As identificaccedilotildees do microrganismo juntamente com a triagem molecular iratildeo definir
um resultado mais especiacutefico podendo ser usado para identificar o antibioacutetico mais
adequado para o tratamento Poreacutem a principal desvantagem de alguns exames
baseados em PCR por exemplo eacute que devido agrave sua limitada capacidade de
multiplexaccedilatildeo eles distinguem apenas algumas variaccedilotildees (MOREIRA et al 2014)
Estatildeo descritas para a identificaccedilatildeo molecular de patoacutegenos pertencentes agrave
famiacutelia Enterobacteriaceae as teacutecnicas de PFGE RAPD (randomly amplified
polymorphic DNA) e ERIC-PCR (Enterobacterial Repet it ive Intergenic Consensus)
A PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) eacute considerada padratildeo ouro devido sua
alta capacidade de diferenciaccedilatildeo baseada na anaacutelise do perfil de restriccedilatildeo do DNA
genocircmico por meio de eletroforese Como desvantagem para a sua execuccedilatildeo eacute
necessaacuterios vaacuterios dias impedindo a tipagem de algumas cepas bacterianas devido
agrave degradaccedilatildeo do DNA aleacutem do alto custo empregado (MOREIRA et al 2014)
O meacutetodo baseado em ERIC-PCR tem sido bastante utilizado como uma
alternativa para a teacutecnica de PFGE Esta teacutecnica consiste na anaacutelise do padratildeo de
amplificaccedilatildeo de elementos repetidos encontrados no genoma bacteriano Isto
permite uma maior rapidez na obtenccedilatildeo de resultados quando comparada com o
PFGE aleacutem de alta reprodutibilidade simples execuccedilatildeo e implementaccedilatildeo baixo
custo e natildeo sem problemas com a degradaccedilatildeo do DNA (MOREIRA et al 2014)
A PCR eacute considerada uma teacutecnica de biologia molecular revolucionaacuteria que
consiste na siacutentese enzimaacutetica de coacutepias de aacutecidos nucleacuteicos Ela permitiu o raacutepido
desenvolvimento do estudo de sequumlecircncias de aacutecidos nucleacuteico Foi desenvolvida por
Kary Banks Mullis que ganhou o precircmio Nobel de quiacutemica de 1993 devido ao
desenvolvimento dessa teacutecnica em abril de 1983 (CAMARGO et al 2014)
Por meio de etapas de variaccedilatildeo de temperatura a teacutecnica de PCR promove a
duplicaccedilatildeo de cadeias de DNA in vitro A reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo de DNA por PCR
envolve o emprego de sequumlecircncias iniciadoras (primers) quatro nucleotiacutedeos
29
(dNTPrsquos) do DNA e uma DNA polimerase termoestaacutevel podendo assim obter-se a
partir de uma fita molde muitas coacutepias de uma sequumlecircncia especiacutefica de aacutecido
nucleacuteico O princiacutepio da PCR consiste na variaccedilatildeo de temperatura por ciclo
envolvendo trecircs etapas baacutesicas desnaturaccedilatildeo pareamento e amplificaccedilatildeo
(CAMARGO et al 2014)
A desnaturaccedilatildeo da fita molde de DNA eacute uma etapa com duraccedilatildeo entre 30
segundos a 1 minuto a temperatura entre 92 ordmC a 96 ordmC Apoacutes isso o pareamento de
dois iniciadores sinteacuteticos de composiccedilotildees distintas que funcionam como os
iniciadores da reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo liga-se agrave regiatildeo complementar da fita de
DNA alvo que sofreraacute a duplicaccedilatildeo Esta etapa tem duraccedilatildeo de 30 segundos a 1
minuto a temperatura entre 58 ordmC e 65 ordmC Por uacuteltimo a amplificaccedilatildeo por meio da
enzima Taq DNA polimerase das novas fitas de DNA se daacute a partir de cada um dos
iniciadores utilizando os quatro dNTPrsquos como substrato da reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo
Esta etapa possui duraccedilatildeo entre 45 segundos e 1 minuto a 72 ordmC Cada ciclo eacute
repetido em torno de 30 a 35 vezes e promove a amplificaccedilatildeo da regiatildeo alvo
determinada conforme o anelamento dos iniciadores sinteacuteticos de DNA (CAMARGO
et al 2014) Estas etapas estatildeo demonstradas na figura 4
Figura 4 Etapas da Reaccedilatildeo de PCR
30
2 JUSTIFICATIVA
No ano de 2010 no Distrito Federal foram identificados 111 pacientes com
suspeita de infecccedilatildeo por Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) e a
Secretaria de Sauacutede do Distrito Federal confirmaram ainda a morte de 18 pacientes
dentre os hospitais puacuteblicos e particulares Um desafio encontrado por ocasiatildeo do
surto infeccioso no Distrito Federal foi o de confirmar as KPCs por Reaccedilatildeo da
Polimerase em Cadeia sendo que as amostras foram enviadas com esta finalidade
para a Fiocruz no Rio de Janeiro
Pesquisas que possam contribuir na elaboraccedilatildeo de estrateacutegias preventivas e
de intervenccedilatildeo para infecccedilotildees causadas por enterobacteacuterias bem como contribuir
para gerar uma integraccedilatildeo beneacutefica entre a equipe acadecircmica e os serviccedilos de
sauacutede devem ser estimuladas Neste sentido o presente estudo permitiu escrutinar
os genes envolvidos na expressatildeo de carbapenemases presentes em espeacutecies de
enterobacteacuterias isoladas em ambiente hospitalar visto que elucidar genes de
resistecircncia de enterobacteacuterias aos antibioacuteticos carbapenecircmicos eacute o primeiro passo
para garantir um controle epidemioloacutegico efetivo para estes tipos de microorganismo
assim como sua associaccedilatildeo com surtos fatais particularmente em pacientes com
baixa imunidade
31
3 OBJETIVOS
31 Objetivo geral Caracterizar os genes de resistecircncia das
Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases e os aspectos epidemioloacutegicos de
pacientes internados em um hospital puacuteblico do Distrito Federal
32 Objetivos Especiacuteficos
Identificar genotipicamente a enzima KPC (Klebsiella pneumoniae
carbapenemase) de isolados de Klebsiella pneumoniae
Investigar aspectos epidemioloacutegicos dos pacientes portadores de
Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases
Identificar quais variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana influenciaram para o
desfecho oacutebito ou alta
Avaliar a susceptibilidade das Enterobacteacuterias aos antibioacuteticos
carbapenecircmicos dos pacientes em ambiente hospitalar
32
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
Trata-se de um estudo transversal onde foi realizado o teste de
susceptibilidade das enterobacteacuterias aos antibioacuteticos carbapenecircmicos a partir dos
materiais bioloacutegicos coletados dos pacientes internados no Hospital Regional da Asa
Norte (HRAN) e enviados ao Laboratoacuterio de Anaacutelises Cliacutenicas da mesma Instituiccedilatildeo
Os materiais bioloacutegicos investigados foram sangue aspirado traqueal ou brocircnquico
urina e cultura semi quantitativa de ponta de cateter venoso central O HRAN eacute um
hospital puacuteblico do Distrito Federal com 395 leitos sendo as cliacutenicas de internaccedilatildeo
Berccedilaacuterio Cirurgia Geral Cirurgia Plaacutestica Cliacutenica Meacutedica Ginecologia Maternidade
Pediatria Queimados UTI com atendimento a pacientes portadores de doenccedilas de
caraacuteter cliacutenico e ciruacutergico
4 1 Coleta e transporte das amostras bioloacutegicas
As amostras foram coletadas de pacientes internados no Hospital Regional da
Asa Norte (HRAN) com suspeitas de infecccedilatildeo por KPC A identificaccedilatildeo primaacuteria foi
realizada pelo Laboratoacuterio de Microbiologia do hospital de origem dos pacientes e os
demais procedimentos que foram utilizados na identificaccedilatildeo encontram-se descritos
abaixo
4 2 Procedimentos para confirmaccedilatildeo de resistecircncia bacteriana por
disco de ertapenem (adaptado CDC 2004)
Para diagnosticar amostra como portadora de bacteacuteria produtora de
carbapenemase foi realizado o teste com disco de ertapenem como forma de
triagem Inicialmente utilizou-se o swab contaminado com a amostra que foi
distribuiacuteda em uma pequena aacuterea da placa de aacutegar MacConkey para apoacutes o
crescimento ser realizada a pesquisa de colonizaccedilatildeo por enterobacteacuterias resistentes
aos carbapenecircmicos (Pesquisa de CRE) Procedeu-se a semeadura por teacutecnica
semi-quantitativaesgotamento com alccedila bacterioloacutegica na diluiccedilatildeo de 1100 O disco
de Ertapenem foi colocado na superfiacutecie da placa de MacConkey na junccedilatildeo dos dois
primeiros campos de semeadura conforme demonstrado na figura 5 Incubou a placa
33
em estufa aeroacutebia a 35ordmC por 24 e 48 horas e observou-se o halo de difusatildeo do
disco de Ertapenem na placa para proceder agrave leitura
O teste deixou de ser obrigatoacuterio apoacutes a modificaccedilatildeo dos criteacuterios
interpretativos para carbapenecircmicos para enterobacteacuterias publicados no suplemento
do CLSI 2010 M100-S20-U
Figura 5 Mecanismo de semeamento de material bioloacutegico oriundos de
pacientes com suspeita de infecccedilatildeo por KPC Fonte adaptado CDC 2004
4 2 1 Interpretaccedilatildeo dos resultados
Na ausecircncia de crescimento ateacute 24 horas (MacConkey) ou halo de difusatildeo
gt27 mm na placa deve-se reincubar as placas por mais 24 horas Quando for
ausente o crescimento apoacutes 48 horas ou halo de difusatildeo gt27 mm na placa libera-se
como enterobacteacuterias resistentes a carbapenecircmicos (KPCNEG)Havendo
crescimento de colocircnias na placa de MacConkey com halo lt 27 mm (apenas para
colocircnias com crescimento dentro do halo) deve-se reisolar e realizar identificaccedilatildeo e
antibiograma automatizado teste de sensibilidade por disco-difusatildeo e Teste de
Hodge Modificado (THM) Os isolados de enterobacteacuterias cujos testes comprovarem
a resistecircncia aos carbapanecircmicos testados (KPCPOS) foram reportado a Comissatildeo
de Controle de Infecccedilatildeo Hospitalar (CCIH) Jaacute osbacilos Gram-negativos natildeo
fermentadores natildeo foram reportados (KPCNEG) Para interpretaccedilatildeodos resultados
foram utilizados os valores conforme demonstrados na tabela 1
Tabela 1 Criteacuterios Interpretativos para testes de sensibilidade
ENTEROBACTEacuteRIAS
Disco difusatildeo (mm) MIC (microgml)
34
Antibioacutetico Sigla S I R S I R
Ertapenem 10
microg
ETP 22 19-
21
18 05 1 2
Meropenem 10
microg
MEM 23 20-
22
19 1 2 4
Fonte Manual Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)
2013
Os resultados que apresentaram resistecircncia ao antibioacutetico Ertapenem foram
considerados como suspeitos de contaminaccedilatildeo por KPC Fez-se o teste de
susceptibilidade aos antibioacuteticos (TSA) em aparelho automatizado MicroScan Walk
Away 96sl Dade Behring
4 3 Teste de susceptibilidade aos antibioacuteticos (adaptado CDC 2004)
A determinaccedilatildeo da susceptibilidade dos isolados foi feita pelo teste de
susceptibilidade aos antibioacuteticos (TSA) apoacutes cultura em meio de gelose simples
(INSA) para avaliaccedilatildeo da sua pureza e obtenccedilatildeo de colocircnias isoladas Para
preparaccedilatildeo de uma suspensatildeo bacteriana com turvaccedilatildeo aproximada de 05
McFarland (Dade BehringMicroScanregTurbidity Meter) ressuspendeu duas a cinco
colocircnias em 2ml de soro fisioloacutegico esteacuteril diluindo a 1100 em soro fisioloacutegico num
volume total de 10ml em seguida foi feita uma semeadura em duas placas
quadradas (120mm x 120mm) de Muller-Hinton Agar (INSA) por inundaccedilatildeo
Os discos de antibioacutetico carbapenecircmicos imipenem meropenem e
ertapenem (Biorad) foram aplicados com o auxiacutelio de um dispensador automaacutetico A
susceptibilidade das Enterobacteacuterias aos carbapenecircmicos foi definida de acordo
com o protocolo Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI 2011)
Para aquelas Enterobacteacuterias que apresentaram resistecircncia ao ertapenem
foram realizados o Teste de Hodge Modificado para Detecccedilatildeo de Enterobacteacuterias
Produtoras de Carbapenemases conforme descrito pelo Centers for Disease Control
and Prevention (CDC 2004)
35
4 4Teste de Hodge Modificado (THM) (adaptado CDC 2004)
Preparou-se uma suspensatildeo em salina esteacuteril com a cepa Escherichia coli
ATCC 25922 (padratildeo 05 de McFarland) Apoacutes isto diluiu a suspensatildeo 110 em
salina (05 ml da soluccedilatildeo de Ecoli ATCC 25922 + 45 ml salina)Foi entatildeo semeado
na superfiacutecie de uma placa de Agar Muller-Hinton com a suspensatildeo diluiacuteda de Ecoli
ATCC 25922 com auxilio de swab seco assegurando que houvesse uma
distribuiccedilatildeo uniforme cobrindo toda a superfiacutecie do Agar Deixou secar por 3 a 5
minutos em temperatura ambienteColocou-se o disco de ertapenem 10microg no centro
da placa e apoacutes isto fez-se uma estria linear da cepa a ser testada da borda do
disco ateacute a borda da placa utilizando uma alccedila calibrada 10 microl ou um swab Incubou
a placa na estufa em atmosfera aeroacutebia a 35 plusmn 2ordmC por 16 a 24 horas
441 Controle de qualidade (CQ)
Foi utilizado um CQ todos os dias em que se realizou o teste tendo como
controle Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1705- teste de Hodge modificado
positivo Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1706- teste de Hodge modificado
negativo
442 InterpretaccedilatildeoResultados
Apoacutes 16ndash24 horas de incubaccedilatildeo examinar as placas para verificar a presenccedila
de uma distorccedilatildeo no halo de inibiccedilatildeo do disco de ertapenem devido ao crescimento
realccedilado da cepa ATCC na intersecccedilatildeo do organismo teste e a Ecoli ATCC 25922
dentro dos limites do halo O THM positivo apresentaraacute presenccedila de distorccedilatildeo no
halo de inibiccedilatildeo de ertapenem devido ao crescimento da cepa Ecoli ATCC 25922 ao
longo da estria da cepa teste para dentro dos limites do halo de inibiccedilatildeo Jaacute o THM
negativo teraacute ausecircncia de crescimento da cepa Ecoli ATCC 5922 ao longo da estria
da cepa teste para dentro dos limites do halo de inibiccedilatildeo do disco de ertapenem
Este resultado estaacute representado na figura 6
36
Figura 6 Interpretaccedilatildeo resultado do Teste de Hodge Modificado
(adaptado CDC 2004) Teste positivo na estria da cepa teste na parte superior
da placa teste negativo na estria da cepa teste na parte inferior da placa
Tendo positivo como resultado o paciente era um provaacutevel contaminado por
KPC As amostras entatildeo foram encaminhadas para a Fundaccedilatildeo Osvaldo Cruz
(FIOCRUZ) para confirmaccedilatildeo final As amostras finalmente confirmadas como
positivas para KPC foram isoladas e guardadas no banco de cepas cliacutenicas do
hospital Apoacutes a autorizaccedilatildeo do CEP amostras das cepas foram transferidas para
meio de transporte Stuard em caixa teacutermica fechada em baixa temperatura e
levadas para o laboratoacuterio de microbiologia cliacutenica da universidade
No laboratoacuterio da universidade as amostras foram separadas e realizadas
repiques em meios MacConkey e incubadas por 24h As colocircnias caracteriacutesticas
foratildeo isoladas em caldo BHI e mantidas em shaker a 37oC por 2h Apoacutes isto foram
executadas as anaacutelises a seguir
Os isolados de Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases foram
submetidos agrave extraccedilatildeo de DNA e posterior sequumlenciamento para identificaccedilatildeo dos
genes de resistecircncia blaKPC de 1 a 13 e identificaccedilatildeo do gene universal Os
pacientes de onde os materiais bioloacutegicos contendo as Enterobacteacuterias produtoras
de carbapenemases foram os isolados foram investigados quanto aos aspectos
epidemioloacutegicos e cliacutenicos
37
4 5 Extraccedilatildeo de DNA bacteriano
A extraccedilatildeo de DNA bacteriano foi realizada utilizando o kit NucleoSpin
Plasmidreg (MN) Antes de iniciar a extraccedilatildeo foi feito a preparaccedilatildeo das soluccedilotildees
reagentes materiais e amostras (vortexando) colocou-se em banho-maria agrave 50ordmC o
tampatildeo AW Partiu-se de colocircnias isoladas cultivadas que sofreram passagem em
meio LB liacutequido por 12h Adicionou-se 15 mL da amostra no tubo eppendorf
centrifugou por 5 minutos descartou o sobrenadante (com cuidado para natildeo
descartar o Pellet) Repetiu-se este procedimento por mais trecircs vezes completando-
se o volume de 6mL Foram adicionados 250microL do tampatildeo Resuspension Buffer A1
encostando a ponteira no Pellet e misturando (este tampatildeo tem como funccedilatildeo
separar a formaccedilatildeo de grumos celulares) Apoacutes isso homogeneizou e vortexou os
tubos eppendorfs Apoacutes isso foram adicionados 250microL do tampatildeo Lysis Buffer A2
homogenizou e deixou descansar por 5 minutos (esta etapa eacute importante para a lise
da parede e da membrana celulares e liberaccedilatildeo do conteuacutedo da ceacutelula)
Passado o tempo de descanso foi adicionado 300microL do tampatildeo
Neutralization Buffer A3 homogeneizou e centrifugou por 10 minutos (este tampatildeo
iraacute retirar as proteiacutenas que envolvem o DNA e voltaraacute com o pH para proacuteximo de 8
impedindo que a soluccedilatildeo de lise facilite a quebra das ligaccedilotildees covalentes do aacutecido
nucleacuteico) Em seguida enumeraram-se os tubos contendo filtros com siacutelica
transferiu-se o sobrenadante para o filtro e centrifugou por 5 minutos Descartou-se
o que foi filtrado adicionou 500microL do tampatildeo AW (banho-maria) centrifugou por 2
minutos Novamente foi descartado o filtrado Adicionou-se 600microL do tampatildeo A4
centrifugou por 2 minutos e descartou o filtrado (os tampotildees AW e A4 contecircm
isotiocianato de guanidina em concentraccedilotildees crescentes para facilitar a adsorccedilatildeo
do DNA na siacutelica e retirada das outras biomoleacuteculas da amostra) Foi feita outra
centrifugaccedilatildeo com o tubo vazio Apoacutes isto o filtro foi trocado para outro eppendorf
definitivo onde foi adicionado 50microL do tampatildeo Elution Buffer AE (este tampatildeo
favorece a eluiccedilatildeo do DNA) centrifugou por 2 minutos descartou o filtro e
armazenou as amostras em freezer -20ordmC
38
4 6 Iniciadores e reaccedilatildeo de PCR
Os iniciadores universais para o gene blaKPC foram desenhados baseados
em sequumlecircncias conservadas apresentadas pelos sub-grupos de genes que
codificam a enzima carbapenemase de klebsiella pneumoniae (YIGIT et al 2001)
Baseado na sequumlecircncia para o blakpc-1 depositada no GenBank
(AF2975541) o oligonucleotiacutedio (oligo) iniciador direto (5-
ATGTCACTGTATCGCCGTC-3rsquo) foi desenhado para reconhecer a sequumlecircncia
blaKPC na posiccedilatildeo (131149) enquanto que o iniciador reverso (5-
TTACTGCCCGTTGACGCC-3rsquo) foi reconhecido na posiccedilatildeo (9951012) As anaacutelises
baseadas em alinhamento de sequumlecircncias mostraram que o par de iniciadores
blaKPC podem detectar os alelos de 1 a 13 do gene blaKPC conforme a tabela 2
Tabela 2 Nuacutemero de acesso ao GenBank dos alelos blaKPC e seus
microrganismos originais
Nuacutemero de
Acesso GenBank
Microrganismo Alvo
AF2975541 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-1
GU0862251 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-2
HQ2589341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-2-like
AB5577341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC -3
EU4473041 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-4
EU4002222 Pseudomonas
aeruginosa
blaKPC-5
EU5555341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-6
EU7297271 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-7
39
FJ2344121 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-8
FJ624872 Escherichia coli blaKPC-9
GQ1403481 Acinetobacter
baumannii
blaKPC-10
HM0669951 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-11
HQ3428891 Enterobacter cloacae blaKPC-12
HQ3428901 Enterobacter cloacae blaKPC-13
As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo de blaKPC foram realizadas em um
primeiro tempo de desnaturaccedilatildeo em que foi 94ordmC por 5 minutos seguido de 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 58 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 90 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 78ordmC por 8 minutos Aleacutem das amostras foi utilizado um
controle negativo
A PCR do blaKPC foi realizada utilizando os componentes para o volume da
reaccedilatildeo de 25 microL citados na tabela 3 A banda do tamanho do produto de PCR foi de
881 pares de bases (pb) o que corresponde ao plasmiacutedeo
Tabela 3 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do
gene blaKPC
Reagente Volume
DNA molde 4 microL
Tampatildeo Taq 25 microL
MgCl2 075 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP
2 microL
Oligo F 1 microL
Oligo R 1 microL
Taq DNA polimerase 05 microL
Aacutegua MiliQ 1335 microL
40
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
Baseado na sequumlecircncia para o gene 16S rRNA em que o oligonucleotiacutedio
Universal iniciador direto foward (5-CCAGCAGCCGCCGTAATACG-3rsquo) foi
desenhado para reconhecer a sequumlecircncia universal na posiccedilatildeo 1513 enquanto que o
iniciador reverso (5-ATCGGYTACCTTGTTACGACTTC-3rsquo) foi reconhecido na
posiccedilatildeo 1491 foram realizadas PCRrsquos As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo deste
gene foram realizadas nos seguinte tempos separaccedilatildeo 94ordmC por 10 minutos 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 55 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 120 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 72ordmC por 10 minutos
A PCR do gene 16S rRNA foi realizada utilizando os componentes para o
volume da reaccedilatildeo de 25microL citados na tabela 4 A banda do tamanho do produto de
PCR foi de 996 pb correspondente aacute regiatildeo ribossomal capaz de amplificar todas
as espeacutecies
Tabela 4Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do gene
universal
Reagente (quantidade
concentraccedilatildeo do estoque)
Volume
DNA molde 10 ng 4 microL
Tampatildeo Taq 10 x 25 microL
MgCl2 50mM 125 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP 25 mM
125 microL
Oligo F 10microM 05 microL
Oligo R 10microM 05 microL
Taq DNA polimerase 5UmicroL 04 microL
Aacutegua Miliq 146 microL
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
41
O termociclador utilizado para os experimentos foi o LifeTouch da BIOER
4 7 Digestatildeo
Para realizaccedilatildeo da digestatildeo foi utilizada a enzima BshF I (Hae III) EN- 1105
tamanho 7000 units concentraccedilatildeo 10 unitsmicroL fonte Bacillus sphaericus empresa
Jena bioscienceUtilizaram-se os componentes para o volume de 50microL da reaccedilatildeo
citados na tabela 5
Tabela 5 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da digestatildeo do gene
universal
Reagente Volume
Produto de PCR 10 microL
Enzima BshF I 01 microL
Tampatildeo (10x) 5 microL
Aacutegua Miliq 349 microL
Total (em cada ependorff) 50 microL
Valores para 1 digestatildeo
Os ependorffs foram colocados por 30 minutos em banho-maria a 37ordmC Apoacutes
isso fez-se a corrida das amostras em gel de agarose para verificaccedilatildeo do resultado
(LU et al 2000)
4 8 Eletroforese em gel de agarose
Os produtos de DNA PCR e digestatildeo foram analisados em gel de agarose
2 O tempo de corrida do gel eacute de aproximadamente 1hora e 30minutos sendo
que no comeccedilo foi usada agrave voltagem de 50 V e apoacutes comeccedilar a correr o gel
aumentou a voltagem para 100 v Utilizou-se o marcador de 100pb (pares de bases)
Foi adicionado 3microL de corante Bromophenol (que tem a funccedilatildeo de fazer uma ligaccedilatildeo
na amostra de DNA e permitir a visualizaccedilatildeo da corrida no gel de agarose) em 7microL
de amostra tanto de DNA quanto de PCR Para o preparo do gel foi utilizado TBE
42
(Tris- Aacutecido Boacuterico) agarose e brometo de etiacutedio (sua funccedilatildeo eacute de corante para o gel
e permitir a visualizaccedilatildeo do DNA quando colocado agrave luz ultravioleta) Para o oligo
blaKPC a banda da amplificaccedilatildeo foi em 881ppb correspondendo ao plasmiacutedeo Jaacute
o oligo Universal foi em 996 pb
4 9 Descarte de resiacuteduos
Todos os materiais utilizados nos ensaios foram de uso uacutenico e manipulados
em cacircmaras de seguranccedila bioloacutegica classe II Apoacutes o uso foram colocados em
soluccedilatildeo desinfetantes (hipoclorito a 1) e em seguida autoclavados a 127oC por 20
min em sacos apropriados para autoclavaccedilatildeo Apoacutes a finalizaccedilatildeo do ciclo de
esterilizaccedilatildeo os sacos contendo o material descartaacutevel foram colocados em
recipientes de coleta da empresa responsaacutevel pela coleta de materiais bioloacutegicos
produzidos no laboratoacuterio de microbiologia Todos os procedimentos seguiram a
normativa RDC-ANVISA 3062004 sobre o descarte de resiacuteduos de serviccedilo de
sauacutede
4 10 Aspectos epidemioloacutegicos e cliacutenicos
Os aspectos cliacutenicos e epidemioloacutegicos foram investigados por meio de
prontuaacuterios dos pacientes portadores de enterobacteacuterias produtoras de
carbapenemases e envolveram topografia mais provaacutevel do foco infeccioso a
enfermidade motivadora da internaccedilatildeo o desfecho cliacutenico a idade e o tempo de
internaccedilatildeo
4 12 Anaacutelises eepidemioloacutegicas
As anaacutelises foram realizadas com o pacote estatiacutestico SPSS versatildeo 200
Para verificar quais variaacuteveis referentes aos dados epidemioloacutegicos e
microbioloacutegicos influenciaram no desfecho verificou- se a diferenccedila meacutedia das
variaacuteveis idade e tempo de internaccedilatildeo em cada grupo O teste estatiacutestico utilizado foi
o teste t de Student apoacutes se executar o teste de normalidade de Shapiro-Wilk Para
as variaacuteveis sexo perfil microbioloacutegico das enterobacteacuterias produtoras de
43
carbapenemases foi avaliada a associaccedilatildeo com o desfecho por meio do teste Exato
de Fisher O niacutevel de significacircncia adotado foi de 5
4 13 Preceitos eacuteticos
Este projeto estaacute inserido em um projeto maior denominado ldquoEpidemiologia
cliacutenica e caracterizaccedilatildeo molecular do Acinetobacter Baumannii resistente a
antibioticoterapia em pacientes internado em hospitais do Sistema Uacutenico de Sauacutederdquo
que foi submetido ao Comitecirc de Eacutetica em Pesquisa da Secretaria do Estado de
Sauacutede do Distrito Federal (SESDF) e emitido parecer aprovado pelo protocolo nordm
23109 (anexo)
44
5 RESULTADOS
51 Anaacutelise molecular
Para a amplificaccedilatildeo com o oligo blaKPC foram amplificadas amostras
que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 881 pb correspondente ao
plasmiacutedeo A anaacutelise da amplificaccedilatildeo da regiatildeo do gene blaKPC mostrou que
apenas a amostra A10 natildeo amplificou isso demonstra que esta amostra natildeo
possuiacutea o gene de resistecircncia
5 1 1 Gene blaKPC
Figura 7 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 881 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
A amostra A3 natildeo amplificou no primeiro momento entatildeo foi realizado
novamente a PCR e corrida de gel obtendo entatildeo a amplificaccedilatildeo da amostra como
apresentado na figura 8
45
Figura 8 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC da
mostra A3 estudada A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo de 881
pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 1 2 Gene 16S rRNA
Para a amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA utilizou-se o oligo universal Foram
amplificadas amostras que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 996 pb
Figura 9 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
46
Segundo Lu et al (2000) a digestatildeo com a enzima HaeIII deste amplicons de
16S rRNA devolveriam bandas com perfis entre 150 a 200 pb No gel abaixo eacute
possiacutevel evidenciar que este perfil ocorreu com o predomiacutenio de bandas na altura
de 200pb
Figura 10 Gel de agarose a 2 da digestatildeo do amplicon do gene 16S
rRNA das amostras com a enzima HaeIII evidenciando diversos fragmentos
proacuteximos a 200 pb A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo ribossomal
de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 2 Anaacutelises epidemioloacutegicas
5 2 1 Sexo
No total foram detectados 17 isolados de KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 onde a maior a prevalecircncia foi
detecatada em amostras de pacientes do sexo masculino (53) do que no sexo
feminino (47)
47
Figura 11 Isolado de KPC segundo sexo dos 17 pacientes investigados
no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 2 Desfecho cliacutenico
Em 17 isolados de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo
de 2010 aacute 2011 a porcentagem de pacientes que foram a oacutebito (59) foi maior que
a de pacientes que tiverm alta (41)
Figura 12 Isolado de KPC segundo desfecho cliacutenico dos 17 pacientes
investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
48
5 2 3 Local da coleta
Dos 17 episoacutedios detectados de infecccedilatildeo por KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 a infecccedilatildeo em swab retalfoi mais
frequente (47) seguida de ponta de cateacuteter (18) e secreccedilatildeo traqueal (12)
Figura 13 Isolados de KPC segundo local da coleta da amostra nos 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 4 Microorganismo
O microorganismo mais encontrado foi a Klebsiella pneumoniae (82)
seguida da Enterobacter clocae (12) e Serratia marcescens (6) dos 17 isolados
de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 Isto afirma o
fato de a sigla KPC ser utilizada de forma errocircnea aacute Klebsiella pneumoniae visto
que a evidecircncia dela eacute maior em relaccedilatildeo as outras cepas
49
Figura 14 Isolado de KPC segundo microrganismo encontrado em 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 5 Relaccedilotildees variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana e desfecho
cliacutenico
Tabela 6 ndash Distribuiccedilatildeo do perfil geneacutetico sexo coleta tipificaccedilatildeo de
microrganismos e anaacutelise da resistecircncia bacteriana segundo o desfecho
cliacutenico Brasiacutelia-DF 2010 a 2011
Variaacutevel Resultado
Desfecho
Alta Oacutebito
N N P
Gene 16S rRNA Positivo 7 1000 10 1000
NA Gene blaKPC Positivo 6 857 10 1000
Negativo 1 143 0 00 0218 Sexo Feminino 2 286 6 600
Masculino 5 714 4 400 0201 Local da coleta Fundo saco de
Douglas 1 143 0 00
Hemocultura 0 00 1 100 0463 Ponta de cateter 1 143 2 200
Sec TraquealBrocircnquica
0 00 1 100
50
Secreccedilatildeo traqueal 2 286 0 00
Swab retal 3 429 5 500
Urina 0 00 1 100
Microrganismo Enterobacter cloacae (KPC)
1 143 1 100
Klebsiella pneumoniae
6 857 8 800
0416 Serratia
marcescens 0 00 1 100
Teste de Hodge Hodge positivo 7 1000 10 1000
NA Amicacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 1 100 0848 resistente 0 00 1 100
sensiacutevel 2 286 3 300
Amoxicilina Aacutecido Clavulacircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Ampicilina Sulbactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ampicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Aztreonan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefazolina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Cefoperazona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Cefotaxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefoxitina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0509 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 2 286 4 400
Ceftazidima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cetriaxona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 3 429 5 500 0772 Cefalotina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ciprofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772
51
resistente 3 429 5 500
Claritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Clindamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Eritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Gentamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0942 resistente 2 286 3 300
sensiacutevel 1 143 2 200
Imipenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 0 00 2 200 0193 Resistente 1 143 3 300
sensiacutevel 2 286 0 00
Nitrofurantoiacutena sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Norfloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Oxacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Penicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Piperacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Rifampicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tetraciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Ticarcilina Aacutecido Clavulocircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0688 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 3 429 4 400
Tobramicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Trimetoprima Sulfametoxazol
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0112 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 2 286 0 00
Vancomicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tigeciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediario 0 00 1 100 0211 natildeo testado 1 143 4 400
resistente 2 286 0 00
52
Cefepime sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefuroxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Levofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Piperacilina Tazobactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Ertapenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Meropenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0223 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 1 143 0 00
Cefotetan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 sensiacutevel 0 00 1 100
Gemifloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 7 700 0585 natildeo testado 3 429 3 300
Desfecho
Alta Oacutebito
Meacutedia Erro
padratildeo Meacutedia Erro
padratildeo p
Idade 58 9 59 5 0991
Tempo Internaccedilatildeo (dias)
50 13 46 12 0571
n= 17 p(lt 005) NA natildeo se aplica
53
6 DISCUSSAtildeO
Nos uacuteltimos anos houve um aumento na incidecircncia de bacteacuterias
multirresistentes aos antimicrobianos no ambiente hospitalar tornando isto um
problema mundial de sauacutede puacuteblica (HULSCHER et al 2010) Quando se trata
principalmente de bacilos Gram negativos a frequumlecircncia destas bacteacuterias eacute ainda
maior em paiacuteses da Ameacuterica Latina quando comparada a paiacuteses desenvolvidos
(GALES etal 2012)
De acordo com dados do ldquoMeropenem Yearly Susceptibility Test Information
Collectionrdquo (MYSTIC) ocorreu nos Estados Unidos um aumento na susceptibilidade
de K pneumoniae nos uacuteltimos anos graccedilas a praacuteticas de controle de disseminaccedilatildeo
de amostras resistentes(RHOMBERG P R et al 2009) O aumento crescente da
prevalecircncia destes microrganismos foi proporcional ao aumento da dependecircncia do
uso de antibioacuteticos carbapenecircmicos considerados como a opccedilatildeo terapecircutica para o
tratamento de infecccedilotildees por bacilos Gram negativos multi-resistentes (LIVERMORE
2012) Isto afeta diretamente as opccedilotildees de tratamento sobrando poucas alternativas
para a terapecircutica que incluem colistina (polimixina E) e tigeciclina que apresentam
respectivamente problemas em termos de toxicidade e eficaacutecia (LIVERMORE et
al 2011) Um dos efeitos adversos mais importantes das poliminas B e E por
exemplo satildeo a neurotoxicidade e nefrotoxicidade (MENDES C A C et al2009 )
Devido agrave resistecircncia ser usualmente de natureza plasmidial e portanto de
maior disseminaccedilatildeo especialmente quando carreadas por K pneumoniae
microrganismo com uma notoacuteria capacidade para acumular e transferir plasmiacutedeos
com determinantes para resistecircncia o nuacutemero de casos detectados pelo
fenoacutetipogenoacutetipo blaKPC eacute bastante preocupante (MONTEIRO et al 2009)
Comparada com outras bacteacuterias hospitalares a transmissatildeo de clones
multirresistentes de K pneumoniae eacute maior e podem natildeo ser controladas pelos
meacutetodos de controle de infecccedilatildeo hospitalar (PAAUW et al 2007) A forma
plasmidial para transferecircncia da resistecircncia adicionada a este grande potencial para
disseminaccedilatildeo de clones resistentes eacute preocupante visto que apoacutes surtos muitas
vezes pode se tornar endecircmica Jaacute eacute uma realidade a disseminaccedilatildeo desta bacteacuteria
54
entre pacientes hospitais paiacuteses e ateacute mesmo continentes (WOODFORF et al
2010 ROGERS et al 2011)
As chances de surtos satildeo maiores em paiacuteses com poucos recursos devido agrave
maior carecircncia de praacuteticas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees hospitalares e o
uso irracional de antimicrobianos de forma empiacuterica e inadequada (KUMARASAMY
et al 2010) Ateacute o momento os mecanismos de resistecircncia aos cabapenecircmicos
geralmente encontrado eram a produccedilatildeo de ESBL (CTX-M) somada aacute perda de
porina (CARVALHAES et al 2010) Foi notado a partir do ano de 2008 um
aumento no nuacutemero de K pneumoniae produtoras de KPC-2 apresentando outra
forma de resistecircncia (GALES 2012)
Um estudo mostrou que o perfil do paciente colonizado ou infectado por KPC
foi de um paciente entre os 33 e os 82 anos de idade internado haacute mais de 1
semana no hospital A mortalidade geral nos uacuteltimos anos ficou em torno de 7
sendo que dos 77 pacientes estudados 32 (415) pacientes evoluiacuteram para oacutebito
evidenciando a alta morbi-mortalidade associada (ALVES A P et al 2013)
Em estudo com 2316 pacientes avaliados a populaccedilatildeo de sexo masculino foi
de 526 idade meacutedia global de 53 anos (mediana de 55 anos) permanecircncia meacutedia
de 58 dias (mediana de 3 dias) (OLIVEIRA A C et al 2010) Outros trabalhos
apresentaram ausecircncia de significacircncia entre sexoidade e o desenvolvimento de
infecccedilotildees por microrganismos resistentes (PERES-BOTA D et al 2003 COLPAN
A et al 2005 COELLO R et al 1997)
Outro estudo utilizou um total de 30 amostras sendo elas isoladas de urina
escarro secreccedilatildeo pleural ponta de cateter aspirado traqueal e hemocultura A mais
prevalente foi em urina (40) Entre as 30 cepas analisadas a maior porcentagem
foi da cepa Klebsiella pneumoniae (70) Enterobacter sp (133) Klebsiella
ozaenae (10) Escherichia coli (333) e Klebsiella oxytoca (333)
(DIENSTMANN R et al 2010) Nos Estados Unidos a enzima KPC jaacute se tornou
endecircmica Foi realizada uma pesquisa em dois hospitais de Nova York onde
testaram 602 amostras e 45 apresentaram algum mecanismo de resistecircncia
sendo apenas 33 confirmadas por biologia molecular como KPC-2 (BRATU et
al 2005)
55
Estudo sobre os tipos de ESBL feito no Japatildeo apresentou o tipo Toho-1 como
o mais prevalente nessa pesquisa Ateacute o ano de 2000 ano em que foi publicado tal
estudo este era o primeiro relatoacuterio no Japatildeo para identificar derivados de ESBLs
como tipo de SHV e TEM entre E coli e K pneumoniae Em especial o tipo SHV- 12
foi identificado com uma maior frequumlecircncia Estes resultados indicam que tipos
distintos de ESBLs que satildeo diferentes em sua especificidade de substrato e origem
geneacutetica coexistem no Japatildeo Isto mostra a importacircncia de caracterizar genoacutetipos
distintos de ESBLs e de estar em alerta continuamente para as tendecircncias de
ESBLs no Japatildeo aleacutem da necessidade de uma interpretaccedilatildeo uniforme utilizando as
diretrizes do CSLI para relatar cepas produtoras de ESBL Aleacutem da detecccedilatildeo de
ESBLs satildeo necessaacuterias mais informaccedilotildees tais como o perfil de sensibilidade
especiacutefica para diversas β-lactacircmicos e o local da infecccedilatildeo Esses fatores satildeo
essenciais para a escolha adequada de antibioacuteticos (YAGI T et al 2000)
No ano de 2004 uma pesquisa avaliou a produccedilatildeo de uma enzima de
hidroacutelise de carbapenecircmicos atraveacutes da teacutecnica de sequumlenciamento foi revelado
um novo membro da famiacutelia KPC designado KPC- 3 Pesquisadores encontraram
em um mutante de K pneumoniae uma substituiccedilatildeo de um gene associado com
resistecircncia a Imipenem mas essa substituiccedilatildeo foi considerada improvaacutevel na
contribuiccedilatildeo da resistecircncia aos carbapenecircmicos da espeacutecie estudada Aleacutem da
resistecircncia aos carbapenecircmicos estes isolados eram em sua maioria resistentes agraves
cefalosporinas penicilinas e aminoglicosiacutedeos Usando estudos de transformaccedilatildeo
conjugaccedilatildeo e hibridaccedilatildeo localizaram o alelo blaKPC em plasmiacutedeo aleacutem disso
mostraram que esse alelo tambeacutem carregava uma resistecircncia aos aminoglicosiacutedeos
A transferecircncia das enzimas KPCs foi demonstrada in vitro tanto neste como em
outros estudos pode ser que os plasmiacutedeos que fazem esta transferecircncia estavam
comeccedilando a se espalhar no ambiente cliacutenico resultando na multiresistecircncia dessas
estirpes (WOODFORD et al 2004)
O presente estudo apresentou um vieacutes quanto aos resultados dos testes de
susceptibilidade microbiana Observou-se que natildeo foi encontrado resultado deste
teste em algumas amostras o que natildeo cooperou para um estudo mais preciso
futuros estudos quanto agraves amostras e um melhor acompanhamento deste tipo de
patologia Poreacutem mesmo sem algumas amostras com este resultado disponiacutevel foi
56
confirmada a presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos
carbapenecircmicos por meio dos genes de resistecircncia blaKPC e 16S rRNA que as
amostras apresentaram em sua maioria serem portadoras Quanto aos resultados
estatiacutesticos nenhuma das variaacuteveis apresentou significacircncia estatiacutestica (p gt 005)
mostrando assim que estas variaacuteveis isoladas natildeo foram o fator determinante para
o desfecho cliacutenico de alta ou oacutebito
57
7 CONCLUSAtildeO
Os genes blaKPC e 16S rRNA foram caracterizados confirmando a a
presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos carbapenecircmicos
Houve uma maior prevalecircncia da cepa K pneumoniae e isto confirma outros
estudos que apresentam a maior prevalecircncia desta cepa em amostras com KPC
Aleacutem disso isso justifica a forma popular da K pneumoniae ser chamada de KPC
enquanto que na verdade KPC eacute uma enzima podendo estar presente em outras
cepas como Enterobacter clocae tambeacutem apresentada no presente estudo O
desfecho cliacutenico de oacutebitos maior que 50 eacute um possiacutevel indicador sobre a
necessidade de se realizar um teste raacutepido para identificaccedilatildeo de KPC visando
iniciar o mais raacutepido possiacutevel o tratamento afim de diminuir a mortalidade por esta
infecccedilatildeo
Nenhuma das variaacuteveis isoladamente estaacute relacionada ao desfecho cliacutenico
oacutebito ou alta pois natildeo apresentaram relevacircncia estatiacutestica O presente estudo
mostrou que haacute presenccedila da bacteacuteria nas amostras de pacientes do hospital
estudado podendo entatildeo afirmar que este tipo de bacteacuteria se encontra tambeacutem
presente em ambiente hospitalar O uso irracional de antimicrobiano eacute demonstrado
de forma indireta quando foi apresentado atraveacutes do Teste de Hodge Modificado
uma resistecircncia de 100 aos antibioacuteticos carbapenecircmicos Isto tambeacutem reflete na
terapecircutica sendo que pacientes portadores de bacteacuterias resistentes aos
antibioacuteticos carabepecircmicos tem uma escassa opccedilatildeo de tratamento e as opccedilotildees
apresentam problemas quanto agrave toxicidade e eficaacutecia
58
REFEREcircNCIAS
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Mecanismos
de resistecircncia bacteriana aos antimicrobianos Disponiacutevel em
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controleopas_
webmodulo3mec_sitiohtmgt Acesso em 25 de abril de 2014
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Nota teacutecnica nordm
012013 medidas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees por enterobacteacuterias
multiresistentes Acesso em 17 de abril de 2013
ALBA J et al Kinetics study of KPC-3 a plasmid-encoded class A
carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase Antimicrob Agents Chemother
Nov49(11)4760-2 2005
ALVES A P et al Nosocomial infections by KPC-producing enterobacteria in
a tertiary hospital in Southern Brazil Revista da AMRIGS Porto Alegre 57 (3) 213-
218 jul-set 2013
ALVES A et al Tipagem Geneacutetica de Microrganismos Lab De Diversidade
Microbiana Centro de Biologia Celular Dep de Biologia U de Aveiro 3810-193
Aveiro- 2003
BELL J M et Al Prevalence and significance of a negative extended-
spectrum beta-lactamase (ESBL) confirmation test result after a positive ESBL
screening test result for isolates of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae
results from the SENTRY Asia-Pacific Surveillance Program J Clin Microbiol
May45(5)1478-82 2007
BRATU S et al Detection of KPC carbapenem-hydrolyzing enzymes in
Enterobacter spp from Brooklyn New York Antimicrob Agents Chemother v 49 n
2 p 776-8 2005
59
BRATU S et al Emergence of KPC-possessing Klebsiella pneumoniae in
Brooklyn New York epidemiology and recommendations for detection Antimicrob
Agents Chemother v 49 n 7 p 3018-20 2005
BRATU S et al Rapid spread of carbapenem-resistant Klebsiella
pneumoniae in New York City Arch Intern Med v 165 p 1430-5 2005
CAMARGO C F et al Aplicaccedilatildeo das teacutecnicas de pcr e suas teacutecnicas
derivadas em diagnoacutestico molecular Disponiacutevel em
ltfileDUnB10C2BA20semestreArtigosPCR-
20CLEYTON20FLORENCIO20DE20CAMARGO20E20PAULO20ROB
ERTO20QUEIROZpdfgtgt Acesso em 08 de abril de 2014
CARVALHES C G et al Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting
carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive
results Journal of Antimicrobial Chemotherapy v 65 n2 p 249-251 2010
CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION- CDC Modified
Hodge Test for Carbapenemase Detection in Enterobacteriaceae 2004
CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE Methods for
dilutionantimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically Approved
standard M7ndashA7 7th ed CLSI Wayne PA 2011
COELLO R et al Risk factors for developing clinical infection with methicillin-
resistant Staphylococcus aureus (MRSA) amongst hospital patients initially only
colonized with MRSA J Hosp Infect 19973739-46
COLPAN A et al Evaluation of risk factors for mortality in intensive care
units A prospective study from a referral hospital in Turkey Am J Infect Control
200533(1)42-7
60
CORNAGLIA G et al Living with ESBLs Introduction Clinical Microbiology
and Infection 14 Suppl 1 1-2 2008
COTRIM E R et al Klebsiella pneumoniae carbapenemase ndash KPC em
Enterobacteriaceae o desafio das bacteacuterias multirresistentes Poacutes em revista do
centro universitaacuterio Newton Paiva 12012 - ediccedilatildeo 5 - issn 2176 7785
DESHPANDE L M et al Occurrence and characterization of
carbapenemase-producing Enterobacteacuteriaceae report from the SENTRY
Antimicrobial Surveillance Program (2000-2004) Microb Drug Resist 12(4)223-30
2006
DIAS D J A Estudos dos principais mecanismos de resistecircncia aos
antibioacuteticos β-lactacircmicos em bacteacuterias patogecircnicas gram negativas 2009 100 f
Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Geneacutetica Molecular e Biomedicina) ndash Faculdade de
Ciecircncias e Tecnologia Universidade de Nova Lisboa Lisboa
DIENSTMANN R et al Avaliaccedilatildeo fenotiacutepica da enzima Klebsiella
pneumoniae carbapenemase (KPC) em Enterobacteriaceae de ambiente hospitalar
J Bras Patol Med Lab v 46 n 1 p 23-27 fevereiro 2010
ENDIMIAMI A et al Emergence of blaKPC-containing Klebsiella
pneumoniae in a long-term acute care hospital a new challenge to our healthcare J
Antimicrob Chemother 64 1102-1110 Nov 2009
FALAGAS M E et al Extended-spectrum beta-lactamase producing
organisms The Journal of Hospital Infection 73 (4) pp 345-54 2009
FONTANA C et al Emergence of KPC-producing Klebsiella pneumoniae in
Italy BMC Rev Notes 3 40 2010
61
GALES A C et al Antimicrobial resistance among Gram-negative bacilli
isolated from Latin America results from Sentry Antimicrobial Surveillance Program
(Latin America 2008-2010) Diagnostic Microbiology and Infectious Disease v 3 n
4 p 354 -360 2012
GUPTA N et al Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Epidemiology
and Prevention HEALTHCARE EPIDEMIOLOGY Clinical Infectious Diseases
201153(1)60ndash67 Published by Oxford University Press on behalf of the Infectious
Diseases Society of America 2011
HARBOTTLE H et al Genetics of antimicrobial resistance Anim Biotechnol
n17 p111-124 2006
HENRIQUE W N et al RESISTEcircNCIA BACTERIANA Uniatildeo das
Faculdades Alfredo NasserInstituto de Ciecircncias da Sauacutede Disponiacutevel em lt
httpwwwfaculdadealfredonasseredubrfilespesquisaposter20HENRIQUE20
Wilker20Natividade20SANTIAGO20Silvania20CAVALCANTI20DSP
20ResistC3AAncia20Bacterianapdfgt Acesso em 17 marccedilo 2014
HULSCHER M E J I et al Antibiotic prescribing in hospital a social and
behavioral scientific approach The Lancet Infectious Diaseases v 10 n 3 p 167-
165 2010
KIDWAI M SAPRA P BHUSHAN KR Synthetic strategies and medicinal
properties of beta-lactams Curr Med Chem 1999 695-215
KUMARASAMY K K et al Emergence of a new antibiotic resistance
mechanism in India Pakistan and the UK a molecular biological and
epidemiological stuy The Lancet Infectious Diseases v10 n 9 p 597- 602 2010
LINCOPAN N et al Enterobacteacuteria producing extended-spectrum β-
lacatamases and IMP-1 Metalo-β-lactamases isolated from Brazilian hospitals J Med
62
Microbiol 7 1-3 2006
LINCOPAN N et al First Isolation of Metalo-β-Lacatamase-Producing
Multiresistant Klebsiella pneumoniae from a patient in Brazil J Clin Microbiol 43(1)
516-519 2005
LIVERMORE D M et al What remains against carbapenem- resistant
Enterobacteriaceae Evaluation of choramphenicol ciprofloxacin colistina
fosfomycin minocycline nitrofurantoin temocilin and tigecycline International
Journal of Antimicrobial Agents v 37 n 5 p 415- 459 2011
LIVERMORE D M Fourten years in resistance International Journal of
Antimicrobial Agents v 39 283- 294 2012
LIVERMORE D M Bacterial resistance to carbapenems Adv Exp Med Biol
1995 39025-47
LIVERMORE D M Bacterial resistance origins epidemiology and impact
Clin Infect Dis 36S11-S23 2003
LIVERMORE D M et al Carbapenemases a problem in waiting Curr
Opin Microbiol 2000 3489-95
LU et al Universal pcr for common bacterial pathogens J CLIN
MICROBIOL VOL 38 2000
LU et al Use of PCR with Universal Primers and Restriction Endonuclease
Digestions for Detection and Identification of Common Bacterial Pathogens in
Cerebrospinal Fluid Journal of Clinical Microbiology June 2000 p 2076ndash2080
MARSCHALL J Met al Presence of the KPC Carbapenemase Gene in
Enterobacteriaceae Causing Bacteremia and Its Correlation with In Vitro
Carbapenem Susceptibility J Clin Microbiol 47 239-241 Jan 2009
63
MARTINS WMBS et al Prevalecircncia do gene blaKPC em isolados cliacutenicos
de Enterobacteriaceae e natildeo fermentadores encontrados em amostras clinicas em
um hospital universitaacuterio do Recife X Jornada de ensino pesquisa e extensatildeo ndash
JEPEX 2010 ndash UFRPE Recife 18 a 22 de outubro
MENDES C A C et al Polimixinas Revisatildeo com ecircnfase na sua
nefrotoxicidade Rev Assoc Med Bras 2009 55(6) 752-9
MOHR J F 3rd Update on the efficacy and tolerability of meropenem in the
treatment of serious bacteacuterial infections Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S41-51
2008
MONTEIRO J et al First report of KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae
strains in Brazil Antimicrob Agents Chemother Jan53(1)333-4 2009
MOREIRA V C et al Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia a antibioacuteticos
Disponiacutevel em
lthttpwwwcpglsucgbr6mostraartigosSAUDEVANESSA20CARVALHO20M
OREIRApdfgt Acesso em 21 marccedilo 2014
NETIKUL T et al Emergence of novel blaKPC-12 and blaKPC-13 variants in
carbapenem non-susceptible Enterobacter cloacae a first report of blaKPC gene in
Thailand European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases May
S372 2011
NETO V A et al Antibioacuteticos na praacutetica Meacutedica 6ordf Ediccedilatildeo Editorial
SarverSP Brasil 2007
NICOLAU D P Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of
meropenem Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S32-40 2008
64
OLIVEIRA A C et al Resistecircncia bacteriana e mortalidade em um centro de
terapia intensiva Rev Latino-Am Enfermagem nov-dez 2010
PAAUW A et al Failure to control an outbreak of qnrA 1-positive multidrug-
resistant Enterobacter clocae despite adequate implementation of recommended
infection control measures Journal of Clinical Microbiology v 45 n 5 p 1420-1425
2007
PATERSON D L et al Extended-Spectrum Beta-Lactamases a Clinical
Update Clinical Microbiology Reviews v 18 p 657-686 2005
PEIRANO G et al Carbapenem-hydrolysing beta-lactamase KPC-2 in
Klebsiella pneumonia isolated in Rio de Janeiro Brazil J Antimicrob Chemother Nov
20 2009
PERES-BOTA D et al Are infections due to resistant pathogens associated
with worse outcome in critically ill patients J Infect 200347(4)307-16
PIDDOCK L J V Clinically relevant chromosomally encoded multidrug
resistance effl ux pumps in bacterial Clin Microbiol Rev n19 p382-402 2006
PITOUT J D D et al Emergence of Enterobacteriaceae producing
extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) in the community J Antimicrob
Chemother May 56 2005
POSSEBON M I et al Resistecircncia bacteriana aos carbapenecircmicos
Bacterial resitence to carbapenems RBM rev bras med60(6)378380-378-382
jun 2003
QUEENAN A M et al Carbapenemases the versatile beta-lactamases
Clin Microbiol Rev Jul20(3)440-58 2007
65
RHOMBERG P R et al Summary trends for the meropenem yearly
susceptibility test information collection program a 10- year experience in the United
States (1999-2008) Diagnostic Microbiology and Infectiois Disease v 65 n4 p
414-426 2009
ROBLEDO I E et al Detection of KPC in Acinetobacter spp in Puerto Rico
J Antimicrob Agents Chemother 54 1354-1357 Mar 2010
ROGERS B A et al Country-to-country transfer os patients and the risk of
multi-resistant bacterial infection Clinical Infectious Disease v53 n1 p49- 56
2011
SHAH A A et al Characteristics epidemiology and clinicalimportance of
emerging strains of Gram-negative bacilli producing extended-spectrum
betalactamases Research in Microbiology v 155 p 409-421 2004
TURNER P J Extended- Spectrum Beta-Lactamases Clinical Infectious
Diseases v 41 p 273-275 2005
WOLTER D J et al Phenotypic and Enzymatic Comparative Analysis
between the Novel KPC variant KPC-5 and Its Evolutionary Variants KPC-2 and
KPC-4 Antimicrob Agents Chemother Nov 17 2008
WOODFORD N et al Carbapenemases of Chryseobacterium
(Flavobacterium) meningosepticum distribution of blaB and characterization of a
novel Metalo-beta-lactamase gene blaB3 in the type strain NCTC 10016
Antimicrob Agents Chemother Jun44(6)1448-52 2000
WOODFORF N Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in
India Pakistan and the UK a molecular biological and epidemiological study The
Lancet Infectious Diseases v 10 n 9 p 597-602 2010
66
WOODFORD et al Outbreak of Klebsiella pneumoniae Producing a New
Carbapenem- Hydrolyzing Class A β-Lactamase KPC-3 in a New York Medical
Center Antimicrobial agents and chemotherapy Dec 2004 p 4793ndash4799 Vol 48
No 12
YAGI T et al A preliminary survey of extended-spectrum β-lactamases
(ESBLs) in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Japan
FEMS Microbiology Letters 184 (2000) 53-56
YIGIT H et al Novel carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase KPC-1 from
a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumonia J Antimicrob Agents
Chemother 45 (4) 1151-1161 (2001)
ZAVASCKI A P et al KPC-2- producing Enterobacter cloacae in two cities
from Southern Brazil Int J Antimicrob Agents Apr 28 2009
ZHANEL G G et al Comparative review of the carbapenecircmicos Drugs
67(7)1027-52 2007
67
ANEXOS
Sequumlecircncia do oligo blaKPC
Query 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
Query 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
Query 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
68
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
Query 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
Query 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
69
Query 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
Query 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
Query 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
70
Sbjct 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
Query 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
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Sbjct 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
Query 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
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Sbjct 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
Query 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
71
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Sbjct 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
Query 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
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Sbjct 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
Query 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
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Sbjct 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
72
Query 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
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Sbjct 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
Query 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
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Sbjct 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
Query 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
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73
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CCGTCAT 960
Query 961
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GCTCTGA 1020
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GCTCTGA 1020
Query 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
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Sbjct 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
Query 1081
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AGCACTG 1140
74
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Sbjct 1081
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AGCACTG 1140
Query 1141
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Sbjct 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
Query 1201
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CTTCGCC 1260
75
Query 1261
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TCGGCTT 1320
Query 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
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||||
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GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
LOCUS AF297554 1377 bp
DNA linear BCT 26-MAR-2001
DEFINITION Klebsiella pneumoniae carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
gene complete cds
ACCESSION AF297554
VERSION AF2975541 GI10121874
76
KEYWORDS
SOURCE Klebsiella pneumoniae
ORGANISM Klebsiella pneumoniae
Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Enterobacteriaceae Klebsiella
REFERENCE 1 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH QueenanAM
AndersonGJ Domenech-SanchezA
BiddleJW StewardCD
AlbertiS BushK and TenoverFC
TITLE Novel carbapenem-hydrolyzing beta-
lactamase KPC-1 from a
carbapenem-resistant strain of
Klebsiella pneumoniae
JOURNAL Antimicrob Agents Chemother 45 (4)
1151-1161 (2001)
PUBMED 11257029
REFERENCE 2 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH AndersonGJ and
TenoverFC
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (19-AUG-2000) Nosocomial
Pathogens Laboratory Branch
Centers for Disease Control and
Prevention 1600 Clifton Rd MS
G08 Atlanta GA 30333 USA
FEATURES LocationQualifiers
77
source 11377
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pneumoniae
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-10_signal 7883
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hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
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product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
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translation=MSLYRRLVLLSCLSWPLAGFSATALTNLVAEPFAKLEQD
FGGSI
GVYAMDTGSGATVSYRAEERFPLCSSFKGFLAAAVLARSQQQAGLLDTPIRYG
KNALV
PWSPISEKYLTTGMTVAELSAAAVQYSDNAAANLLLKELGGPAGLTAFMRSIG
DTTFR
78
LDRWELELNSAIPSDARDTSSPRAVTESLQKLTLGSALAAPQRQQFVDWLKGN
TTGNH
RIRAAVPADWAVGDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTRAPNKDDK
HSEAV
IAAAARLALEGLGVNGQ
ORIGIN
1 cggggcagtt acagccgtta cagcctctgg
agagggagcg gcttgccgct cggtgataat
61 cccagctgta gcggcctgat tacatccggc
cgctacacct agctccacct tcaaacaagg
121 aatatcgttg atgtcactgt atcgccgtct
agttctgctg tcttgtctct catggccgct
181 ggctggcttt tctgccaccg cgctgaccaa
cctcgtcgcg gaaccattcg ctaaactcga
241 acaggacttt ggcggctcca tcggtgtgta
cgcgatggat accggctcag gcgcaactgt
301 aagttaccgc gctgaggagc gcttcccact
gtgcagctca ttcaagggct ttcttgctgc
361 cgctgtgctg gctcgcagcc agcagcaggc
cggcttgctg gacacaccca tccgttacgg
421 caaaaatgcg ctggttccgt ggtcacccat
ctcggaaaaa tatctgacaa caggcatgac
481 ggtggcggag ctgtccgcgg ccgccgtgca
atacagtgat aacgccgccg ccaatttgtt
541 gctgaaggag ttgggcggcc cggccgggct
gacggccttc atgcgctcta tcggcgatac
79
601 cacgttccgt ctggaccgct gggagctgga
gctgaactcc gccatcccaa gcgatgcgcg
661 cgatacctca tcgccgcgcg ccgtgacgga
aagcttacaa aaactgacac tgggctctgc
721 actggctgcg ccgcagcggc agcagtttgt
tgattggcta aagggaaaca cgaccggcaa
781 ccaccgcatc cgcgcggcgg tgccggcaga
ctgggcagtc ggagacaaaa ccggaacctg
841 cggagtgtat ggcacggcaa atgactatgc
cgtcgtctgg cccactgggc gcgcacctat
901 tgtgttggcc gtctacaccc gggcgcctaa
caaggatgac aagcacagcg aggccgtcat
961 cgccgctgcg gctagactcg cgctcgaggg
attgggcgtc aacgggcagt aaggctctga
1021 aaatcatcta ttggcccacc accgccgccc
ttgcgggcgg catggattac caaccactgt
1081 cacatttagg ctaggagtct gcgcggcaga
gccgtgtgac cggttttctg tagagcactg
1141 acgatggcgg cggcgctctc tgcaattggc
aaggcgtcgg cgccaaggat accaatcttg
1201 cggcgcgcgg cgtgttatga cgactggggt
gcatttgagc cgccccattt aaccttcgcc
1261 ctcacagata cgccattcgc ctcaaattta
gcgccatgca gacgagcttc cactcggctt
1321 gcaccttgtc caggcccctc atgctgaact
gacgcaatcc catcaccgcc ttgatca
80
18
Figura 2 Divulgaccedilatildeo internacional de Enterobacteriaceae produtora de
Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC)( NEIL GUPTA et al 2011)
Este mapa apresenta paiacuteses onde Enterobacteriaceae produtoras KPC de
foram descritos em relatoacuterios publicados disponiacuteveis a partir de 11 fevereiro de
2011 Os paiacuteses natildeo destacadas nesta figura tambeacutem podem apresentar a presenccedila
de Enterobacteriaceae produtoras de KPC poreacutem pode ter tido uma falta de
vigilacircncia sistemaacutetica para estes organismos ( NEIL GUPTA et al 2011)
No ano de 2005 foram registradas pela primeira vez essas bacteacuterias
produtoras de carbapenemases Apoacutes 6 anos deste primeiro relato elas passaram a
causar surtos mais graves em nosso paiacutes Em janeiro de 2011 foram notificados no
Distrito FederalBrasil 367 casos em um curto espaccedilo de tempo (01 a 08 de janeiro
de 2011) com 26 oacutebitos A maior parte destes casos (263 casos) foi identificada nas
unidades de terapia intensiva ndash UTI (COTRIM et al 2012)
O potencial de disseminaccedilatildeo da KPC eacute alto devido agrave grande capacidade de
transferecircncia do seu material geneacutetico e por conseguinte os genes de resistecircncia
O controle de epidemias eacute difiacutecil devido a esta caracteriacutestica de faacutecil disseminaccedilatildeo
preocupando os profissionais da aacuterea de sauacutede devido agrave dificuldade de tratamento
podendo resultar em um aumento das taxas de mortalidade Apesar da maior
19
frequumlecircncia em Klebsiella pneumoniae a KPC pode ser identificada em outras
bacteacuterias como a Enterobacter cloacae Citrobacter freundii Salmonella spp E coli
e Pseudomonas spp (DIENSTMANN et al 2010)
Os pacientes com comorbidades incluindo pacientes transplantados
neutropecircnicos em ventilaccedilatildeo mecacircnica em Unidade de Terapia Intensiva (UTI)
com longos periacuteodos de internaccedilatildeo que apresentam risco aumentado de infecccedilatildeo ou
colonizaccedilatildeo para bacteacuterias multirresistentes satildeo mais vulneraacuteveis a Klebsiella
pneumoniae produtora de KPC (COTRIM et al 2012)
Os sinais e sintomas apresentados por um indiviacuteduo infectado por KPC satildeo
febre ou hipotermia taquicardia piora do quadro respiratoacuterio e em casos mais
graves hipotensatildeo inchaccedilo e sepse Quanto ao siacutetio de infecccedilatildeo a bacteacuteria que
possui a enzima KPC pode causar pneumonia associada agrave ventilaccedilatildeo mecacircnica
infecccedilatildeo do trato urinaacuterio infecccedilatildeo de corrente sanguiacutenea infecccedilatildeo de partes moles
e outros tipos de infecccedilatildeo (COTRIM et al 2012)
Para desenvolver a infecccedilatildeo a colonizaccedilatildeo eacute um preacute-requisito poreacutem o
pacientes pode estar colonizado ou seja ser portadores de KPC e natildeo desenvolver
a infecccedilatildeo (ALVES et al 2013) A forma de transmissatildeo eacute basicamente por
contato com secreccedilatildeo ou excreccedilatildeo de pacientes infectados ou colonizados logo
fora do ambiente hospitalar a bacteacuteria natildeo representa perigo (COTRIM et al
2012)
As opccedilotildees terapecircuticas para o tratamento da Klebsiella pneumoniae eacute
dividida em Terapia Empiacuterica e Terapia apoacutes a determinaccedilatildeo do perfil de
sensibilidade A terapia empiacuterica para infecccedilotildees por enterobacteacuterias multirresistentes
se baseia na utilizaccedilatildeo de polimixina B ou polimixina E (Colistina) em associaccedilatildeo
com um (1) ou mais dos antimicrobianos da classe dos aminoglicosiacutedeos
(gentamicina ou amicacina) Carbapenecircmicos (meropenem ou doripenem) eou
tigeciclina (ANVISA 2013)
Recomenda-se usar sempre associaccedilotildees de dois ou trecircs antimicrobianos
sendo um deles a polimixina B ou a polimixina E (colistina) Deve-se evitar a
utilizaccedilatildeo de monoterapias pelo risco de raacutepido desenvolvimento de resistecircncia A
escolha do(s) faacutermaco(s) de associaccedilatildeo com polimixina B ou E deve se basear
preferencialmente no perfil de susceptibilidade esperado aos referidos
20
medicamentos das enterobacteacuterias resistentes aos carbapenecircmicos detectadas no
hospital ou na ausecircncia de dados locais na regiatildeo Deve-se considerar igualmente
o local de infecccedilatildeo e a penetraccedilatildeo esperada do antimicrobiano na escolha da droga
a ser utilizada na combinaccedilatildeo (ANVISA 2013)
Apoacutes a liberaccedilatildeo do perfil de sensibilidade deve-se adequar o uso dos
medicamentos Sempre que possiacutevel manter no miacutenimo 2 (dois) faacutermacos com
sensibilidade comprovada in vitro Natildeo havendo sensibilidade a um segundo
medicamento (suscetibilidade apenas agrave polimixina B ou E) recomenda-se manter a
terapia combinada de polimixina B ou E com carbapenecircmicos (meropenem ou
doripenem) ou tigeciclina na tentativa de ocorrecircncia de sinergismo entre elas
(ANVISA 2013)
Sugere-se aleacutem da determinaccedilatildeo das Concentraccedilotildees Inibitoacuterias Miacutenimas
(CIMs) para uma das polimixinas (B ou E) que tambeacutem sejam determinadas as
CIMs de tigeciclina e carbapenecircmicos (meropenem) bem como a consultoria de um
infectologista (ou Comissatildeo de Controle de Infecccedilatildeo Hospitalar- CCIH) para a
determinaccedilatildeo da terapia combinada com base na interpretaccedilatildeo do antibiograma
CIM e quadro cliacutenico do paciente No caso de resistecircncia agraves polimixinas
(concentraccedilotildees inibitoacuterias miacutenimas [CIMs] gt 2 mgL) recomenda-se a associaccedilatildeo de
dois ou trecircs do antimicrobianos sugeridos para a combinaccedilatildeo (ANVISA 2013)
A antissepsia eficiente do ambiente dos instrumentos ciruacutergicos e das matildeos
com o uso do aacutelcool a 70 eacute fundamental para a contenccedilatildeo de surtos Aleacutem disto
os pacientes contaminados devem permanecer isolados ateacute o controle da infecccedilatildeo
para evitar a disseminaccedilatildeo da bacteacuteria (COTRIM et al 2012)
1 2 Resistecircncia bacteriana
Hoje a disseminaccedilatildeo e a proliferaccedilatildeo das bacteacuterias resistentes estatildeo cada
dia mais presente As bacteacuterias multirresistentes (BRMD) poderatildeo levar agrave
humanidade a uma era poacutes-antibioacutetica resultando em uma ausecircncia de qualquer
opccedilatildeo de tratamento para os portadores destas cepas (HENRIQUE et al 2014)
Os fatores envolvidos na disseminaccedilatildeo desses patoacutegenos multirresistentes
satildeo diversos incluindo o uso irracional de antimicrobianos procedimentos invasivos
21
(cirurgias implantaccedilatildeo de proacuteteses meacutedicas e outros) e a transferecircncia de material
geneacutetico com a informaccedilatildeo de resistecircncia a antibioacuteticos entre as bacteacuterias
(DIENSTMANN et al 2010 ENDIMIAMI et al 2009 FONTANA et al 2010)
Com a praacutetica da antibioticoterapia principalmente em ambientes
nosocomiais os mecanismos de resistecircncia tornaram-se comuns Esses
mecanismos incluem alteraccedilatildeo na permeabilidade da membrana celular que
impede a entrada do antibioacutetico na ceacutelula bombeamento do antibioacutetico para fora da
mesma pelo mecanismo de efluxo mutaccedilatildeo geneacutetica que altera de alguma forma o
alvo do antibioacutetico e consequumlentemente natildeo afeta o funcionamento da bacteacuteria
bem como desenvolvimento da capacidade de degradar ou da inativaccedilatildeo do
antibioacutetico (COTRIM et al 2012) Estes mecanismos estatildeo representados na figura
3
Figura 3 Mecanismos de resistecircncia bacteriana Fonte
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controle
opas_webmodulo3pop_mecanismohtmgt
Um dos mais importantes mecanismos de resistecircncia eacute a alteraccedilatildeo do local-
alvo onde atua determinado antimicrobiano de modo a impedir a ocorrecircncia de
qualquer efeito inibitoacuterio ou bactericida As bacteacuterias podem adquirir um gene que
22
codifica um novo produto resistente aos antimicrobianos substituindo o alvo original
por exemplo o Staphylococcus aureus resistente agrave oxacilina e estafilococos
coagulase-negativos adquiriram o gene cromossocircmico Mec A e produzem uma PBP
ou PLP resistente aos β-lactacircmicos denominada 2a ou 2 que eacute suficiente para
manter a integridade da parede celular durante o crescimento quando outras PBPs
essenciais satildeo inativadas por antibimicrobianos β-lactacircmicos Como alternativa um
gene receacutem-adquirido pode atuar para modificar um alvo tomando-o menos
vulneraacutevel a determinado antimicrobiano Assim um gene transportado por
plasmiacutedeo ou por transposon codifica uma enzima que inativa os alvos ou altera a
ligaccedilatildeo dos antimicrobianos como ocorre com eritromicina e clindamicina (ANVISA
2007)
Em funccedilatildeo da bomba de efluxo pode variar a especificidade do antibioacutetico
Ele atua por meio do bombeamento ativo de antimicrobianos do meio intracelular
para o extracelular gerando uma resistecircncia bacteriana a determinados
antimicrobianos como eacute o caso da resistecircncia agraves tetraciclinas codificada por
plasmiacutedeos em Escherichia coli devido agrave presenccedila de proteiacutenas integrantes da
membrana plasmaacutetica bacteriana (PIDDOCK 2006)
O aumento da siacutentese de proteiacutenas eacute o principal responsaacutevel pela resistecircncia
antimicrobiana devido agraves vaacuterias mutaccedilotildees que ocorrem em seus repressores
transcricionais Estas mutaccedilotildees tambeacutem podem influenciar levando a um aumento
da eficiecircncia do transporte dos antibioacuteticos para o exterior da ceacutelula (HARBOTTLE
et al 2006)
A resistecircncia aos antibioacuteticos eacute frequumlentemente associada agrave alteraccedilatildeo
diminuiccedilatildeo da permeabilidade que ocorre na membrana externa das bacteacuterias gram-
negativas O fluxo de moleacuteculas para o interior da ceacutelula ocorre por caracteriacutesticas
peculiares como carga estrutura e dimensatildeo e atraveacutes de proteiacutenas de membrana
as quais formam canais Este percurso eacute utilizado pelos antibioacuteticos para atingir o
interior da ceacutelula bacteriana ou o espaccedilo periplasmaacutetico como eacute o caso dos
antibioacuteticos β-lactacircmicos Portanto a perda de funccedilatildeo destas proteiacutenas pode
efetivamente causar a diminuiccedilatildeo da susceptibilidade a vaacuterios antibioacuteticos
(LIVERMORE 2003)
23
Os mecanismos de resistecircncia que podem impedir a accedilatildeo de antimicrobianos
satildeo vaacuterios O faacutermaco atua de forma a inibir os processos essenciais a multiplicaccedilatildeo
e sobrevivecircncia da ceacutelula bacteriana como a membrana citoplasmaacutetica e
consequumlentemente bloqueando a siacutentese proteacuteica de aacutecidos nucleacuteicos e da parede
celular A resistecircncia bacteriana eacute um mecanismo natural de defesa Sendo assim
as bacteacuterias estatildeo em constante defesa e para cada novo faacutermaco desenvolvido as
bacteacuterias iratildeo desenvolver resistecircncia em algum momento (POSSEBON et al
2003)
O grupo de antibioacuteticos beta-lactacircmicos satildeo amplamente utilizado e se
encontram dentro da classe dos melhores agentes antimicrobianos com relevacircncia
cliacutenica No entanto o seu uso tem sido restringido devido a vaacuterios mecanismos de
resistecircncia O desenvolvimento dos carbapenecircmicos surgiu devido agrave proliferaccedilatildeo de
beta-lactamases mediadas por plasmiacutedeos e cromossomos (POSSEBON et al
2003)
A bacteacuteria KPC tem um gene chamado SHV-1 que tem a caracteriacutestica de
resistecircncia a quase todos os tipos de antimicrobianos inclusive os carbapenecircmicos
especiacuteficos para o tratamento de infecccedilotildees por bacteacuterias multiresistentes e
emergecircncias Mesmo com no seu coacutedigo geneacutetico a informaccedilatildeo necessaacuteria para o
desenvolvimento da resistecircncia a resistecircncia da bacteacuteria soacute eacute desenvolvida caso a
bacteacuteria entre em contato com o antibacteriano desencadeando todo o processo
nos casos de resistecircncia induzida comuns em KPC (MOREIRA et al 2014)
A resistecircncia bacteriana pode ser apresentada de forma intriacutenseca ou
adquirida A resistecircncia intriacutenseca faz parte das caracteriacutesticas fenotiacutepicas naturais
do microrganismo ou seja faz parte de sua heranccedila geneacutetica sendo transmitida
verticalmente a prole sem perda da caracteriacutestica A presenccedila ou ausecircncia do alvo
para a accedilatildeo da droga eacute o principal determinante deste tipo de resistecircncia
(MOREIRA et al 2014) Essa resistecircncia corresponde a uma caracteriacutestica de
espeacutecie bacteriana quando estes microrganismos satildeo naturalmente resistentes a
certo tipo de antibioacutetico Este processo eacute decorrente da ausecircncia de estruturas de
atuaccedilatildeo de antimicrobianos ou a impermeabilidade por parte de estruturas
perifeacutericas das bacteacuterias (HENRIQUE et al 2014)
24
A resistecircncia adquirida aos antibioacuteticos por sua vez ocorre quando haacute uma
da mutaccedilatildeo de genes reguladores ou estruturais aquisiccedilatildeo de genes de resistecircncia
veiculados por elementos geneacuteticos moacuteveis ou da combinaccedilatildeo entre eles Este
aparecimento de resistecircncia em uma espeacutecie bacteriana era anteriormente sensiacutevel
a droga e devido a um destes fatores se torna resistente O fenoacutetipo resultante
desta resistecircncia natildeo estaraacute presente nas ceacutelulas genitoras e sim nos indiviacuteduos de
uma linhagem bacteriana derivada de um organismo susceptiacutevel Os genes muitas
vezes satildeo adquiridos por meio de elementos moacuteveis como plasmiacutedeos e
transposons (MOREIRA et al 2014)
Entatildeo a resistecircncia adquirida ocorre por diversos mecanismos geneacuteticos tais
como produccedilatildeo de enzimas inativadoras interferecircncia com a entrada e acuacutemulo de
droga na bacteacuteria alteraccedilatildeo do receptor para accedilatildeo da droga via metaboacutelica
alternativa Eacute originada por meio de uma alteraccedilatildeo a niacutevel geneacutetico da ceacutelula de
natureza cromossocircmica pelos processos de mutaccedilatildeo transduccedilatildeo e transformaccedilatildeo
ou extra cromossocircmica (plasmidial) (HENRIQUE et al 2014)
Como todo antibioacutetico β-lactacircmicoos carbapenecircmicos tem como mecanismo
de accedilatildeo a inibiccedilatildeo da siacutentese proteacuteica atraveacutes da accedilatildeo de inibiccedilatildeo da parede
microbiana fazendo a ligaccedilatildeo e inativaccedilatildeo das proteiacutenas ligadoras de penicilinas
(NETO et al 2007)
Imipenem e meropenem antibioacuteticos pertencentes ao grupo dos
carbapenecircmicos possuem um amplo espectro de accedilatildeo in vitro incluindo atividade
contra cocos gram-positivos bacilos gram-negativos e bacteacuterias anaeroacutebias (MOHR
2008) Jaacute o ertapenem possui um espectro de accedilatildeo mais limitado que o os dois
antibioacuteticos anteriormente citados tendo uma eficiecircncia limitada contra os bacilos
gram-negativos natildeo fermentadores Um novo antibioacutetico carbapenecircmico ainda natildeo
disponiacutevel no Brasil doripenem possui uma atividade mais potente principalmente
contra Pseudomona aeruginosa devido ao seu mecanismo de accedilatildeo que combina os
espectros de accedilatildeo de imipenem e meropenem (ZHANEL et al 2007)
Devido as suas estabilidades espectro de accedilatildeo poucos relatos de
resistecircncia boa toleracircncia pelos pacientes com efeitos adversos mais comuns as
complicaccedilotildees no siacutetio da infusatildeo e toxicidade gastrintestinal estes antibioacuteticos
carbapenecircmicos tecircm sido considerados terapia de escolha (NICOLAU 2008) Como
25
uma resposta adaptativa das Enterobacteacuterias o iacutendice de resistecircncia aos
carbapenecircmicos tem aumentado nos uacuteltimos anos de forma proporcional ao seu
uso limitando imensamente as opccedilotildees terapecircuticas para as infecccedilotildees causadas por
estes microrganismos (FALAGAS et al 2009)
As enzimas produtoras de betalactamases hidrolisam o anel betalactacircmico
tornando este mecanismo de resistecircncia o mais importante Os dois grupos mais
preocupantes satildeo o grupo das betalactamases de aspecto ampliado e os da
carbapenemases que aleacutem de hidrolizar os carbapenecircmicos hidrolizam todas as
outras classes de betalactacircmicos Em enterobacteacuterias as carbapenemases mais
prevalentes satildeo codificadas por genes dos grupos blaKpc blaIMP blaVIM blaNdm
e blaOxa A ocorrecircncia de carbapenemases eacute mais frequentemente em bacteacuterias
gram-negativas fermentadoras da glicose conhecidas como enterobacteacuterias
predominantes nos gecircneros Klebsiella Serratia Citrobacter Enterobacter
Escherichia Samonella Proteus Morganella Podem ser encontradas tambeacutem em
bacteacuterias gram-negativas natildeo fermentadoras como espeacutecies de Acinetobacter e de
Pseudomonas (ALVES et al 2013)
Carbapenemases satildeo enzimas plasmiacutedio-mediados resistentes a todos
antibioacuteticos betalactacircmicos As bacteacuterias que possuem o gene blaKpC responsaacutevel
pela codificaccedilatildeo da produccedilatildeo de carbapenemases apresentam resistecircncia aos
antibioacuteticos betalactacircmicos impedindo a accedilatildeo destes antibioacuteticos contra infecccedilotildees
(ALVES et al 2013)
A transmissatildeo das carbapenemases a diferentes cepas de enterobacteacuterias se
daacute atraveacutes de plasmiacutedeos que satildeo pequenas moleacuteculas circulares de DNA com a
capacidade de se replicarem independentemente do DNA cromossocircmico
permitindo a troca de material geneacutetico entre gecircneros e espeacutecies diferentes de
enterobacteacuterias O raacutepido desenvolvimento de surtos em ambientes hospitalares eacute
explicado por essa disseminaccedilatildeo plasmidial (COTRIM et al 2012)
De acordo com o criteacuterio de interpretaccedilatildeo do Clinical and Laboratory
Standards Institute (CLSI 2009) a maioria das KPC isoladas natildeo apresenta
resistecircncia completa aos carbapenecircmicos (Imipenem e Meropenem apresentam
uma Concentraccedilatildeo Inibitoacuteria Miacutenima (CIM) de 2-8 μgmL) (COTRIM et al 2012)
26
Os mecanismos de resistecircncia capazes de impedir a accedilatildeo dos
carbapenecircmicos satildeo vaacuterios Poreacutem a degradaccedilatildeo de antibioacuteticos por enzimas
principalmente as carbapenemases constituem o principal mecanismo de
resistecircncia aos antibioacuteticos β-lactacircmicos (DIAS 2009) Devido a ampla atividade
hidroliacutetica agrave maioria dos antibioacuteticos β-lactacircmicos estes grupos de enzimas possuem
alta versatilidade (QUEENAM et al 2007)
Existem trecircs grandes classes moleculares de Ambler a qual as
carbapenemases pertencem denominadas classe A (serino-carbapenemases os
quais incluem membros designados SME IMI NMC GES e a famiacutelia das KPCs)
classe B(as metalo-β-lactamase incluem os tipos IMP e VIM) e classe D
(oxacilinases similares as da classe A e incluem as OXA e PSE) (DIAS 2009)
Dentre estes as mais importantes e prevalentes encontradas em plasmiacutedeos
de Klebsiella pneumoniae satildeo as KPC (DIENSTMANN et al 2010) Por meio de
estudos moleculares a enzima KPC jaacute foi documentada em diferentes bacteacuterias e
diferenciada em KPC-1 a 13 (NETIKUL et al 2011) No ano de 2009 foi realizada
uma pesquisa onde descreveram as seguintes carbapenemases KPC-1 em isolados
de Klebsiella pneumoniae KPC-2 em K pneumoniae K oxytoca Salmonella
enterica e em Enterobacter sp e KPC-3 em K pneumoniae e Enterobacter cloacae
(MONTEIRO et al 2009) As enzimas KPC-4 e KPC-5 foram encontradas em
isolados de Pseudomonas aeruginosa (PEIRANO et al 2009)
Foi observada uma correccedilatildeo da sequumlecircncia KPC-1 indicando que o gene
blaKPC-1 e blaKPC-2 satildeo idecircnticos Trecircs novas variantes blaKPC-3 blaKPC-4 e
blaKPC-5 satildeo resultados de mutaccedilotildees do gene estrutural da enzima KPC-2
(WOLTER et al 2008) apresentando diferentes perfis de hidroacutelise As enzimas
KPC-2 e KPC-3 possuem alta eficiecircncia em hidrolisar cefalotina cefaloridina e
nitrocefin poreacutem possuem uma menor eficiecircncia contra carbapenecircmicos e
cefotaxima (ALBA et al 2005) As enzimas KPC-5 e KPC-4 apresentam menor
hidroacutelise de carbapenecircmicos eacute do que em KPC-2 Em contrapartida possuem
melhor eficiecircncia contra ceftazidima e uma maior inibiccedilatildeo pelo aacutecido clavulacircnico
(WOLTER et al 2008)
27
13 Anaacutelise geneacutetica de microrganismos
Eacute de extrema importacircncia praacutetica natildeo soacute no aspecto cliacutenico mas tambeacutem na
fitopatologia biotecnologia e estudos ambientais a correta identificaccedilatildeo e
classificaccedilatildeo de microrganismos Os meacutetodos usados na diferenciaccedilatildeo de gecircneros
espeacutecies e estirpes de microrganismos podem ser divididos em meacutetodos fenotiacutepicos
(baseados em fenocircmenos bioquiacutemicos fisioloacutegicos e bioloacutegicos) e genotiacutepicos
(detectam polimorfismos ao niacutevel dos aacutecidos nucleacuteicos ou variaccedilatildeo aleacutelica ao niacutevel
de enzimas) (ALVES et al 2003)
Para este tipo de estudo existem alguns meacutetodos como o RFLPrsquos -
ldquoRestriction Fragment Length Polymorphismsrdquo (polimorfismos de tamanho de
fragmentos de restriccedilatildeo) rep-PCR (Meacutetodo de tipagem baseado na amplificaccedilatildeo via
PCR de elementos de DNA repetitivos presentes em genomas bacterianos) anaacutelise
de sequumlecircncias nucleotiacutedeas (discriminaccedilatildeo eou identificaccedilatildeo atraveacutes de sequumlecircncias
de DNA) PFGE - Pulsed-Field Gel Electrophoresis (Eletroforese em campo
pulsado) ( A L V E S et al 2003)
A diferenciaccedilatildeo clara da cepa e principalmente a alta reprodutibilidade devem
ser caracteriacutesticas de qualquer meacutetodo de tipagem geneacutetica Poreacutem nem todos os
meacutetodos moleculares de tipagem satildeo igualmente eficazes Sendo assim de acordo
com a finalidade pretendida (identificaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo custo reprodutibilidade
etc) eacute feita a escolha do meacutetodo a ser aplicado (A L V E S et al 2003)
O processo de identificaccedilatildeo fenotiacutepica de KPC entre os membros da famiacutelia
Enterobacteriaceae ainda eacute difiacutecil e os meacutetodos para a sua identificaccedilatildeo devem ser
revistos e ajustados Mesmo com o avanccedilo tecnoloacutegico natildeo existem ensaios que
combinam alta especificidade e sensibilidade na detecccedilatildeo destas enzimas Satildeo
diversas as metodologias usadas para rastreamento de KPC como por exemplo a
focalizaccedilatildeo isoeleacutetrica a teacutecnica de disco-difusatildeo E-test teste de Hodge
modificado dentre outros Aleacutem disso a pesquisa do gene blaKPC pode ser feita
pela Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) Os sistemas de automaccedilatildeo
existentes no entanto podem natildeo identificar com precisatildeo os isolados KPC
positivos (COTRIM et al 2012)
A identificaccedilatildeo blaKPC pelo PCR eacute um meacutetodo raacutepido preciso sensiacutevel e
altamente especiacutefico no entanto a PCR exige equipamento e conhecimentos
28
especializados em diagnoacutestico molecular dificultando ainda a utilizaccedilatildeo dele na
rotina dos laboratoacuterios de microbiologia (COTRIM et al 2012)
Em estudo de infecccedilotildees hospitalares identificaccedilatildeo molecular de patoacutegenos
bacterianos eacute bastante utilizada Para diferenciar carbapenemases tipo KPC a partir
de outros tipos como SME NMC-A-IMI e GES eacute necessaacuterio um exame molecular
As identificaccedilotildees do microrganismo juntamente com a triagem molecular iratildeo definir
um resultado mais especiacutefico podendo ser usado para identificar o antibioacutetico mais
adequado para o tratamento Poreacutem a principal desvantagem de alguns exames
baseados em PCR por exemplo eacute que devido agrave sua limitada capacidade de
multiplexaccedilatildeo eles distinguem apenas algumas variaccedilotildees (MOREIRA et al 2014)
Estatildeo descritas para a identificaccedilatildeo molecular de patoacutegenos pertencentes agrave
famiacutelia Enterobacteriaceae as teacutecnicas de PFGE RAPD (randomly amplified
polymorphic DNA) e ERIC-PCR (Enterobacterial Repet it ive Intergenic Consensus)
A PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) eacute considerada padratildeo ouro devido sua
alta capacidade de diferenciaccedilatildeo baseada na anaacutelise do perfil de restriccedilatildeo do DNA
genocircmico por meio de eletroforese Como desvantagem para a sua execuccedilatildeo eacute
necessaacuterios vaacuterios dias impedindo a tipagem de algumas cepas bacterianas devido
agrave degradaccedilatildeo do DNA aleacutem do alto custo empregado (MOREIRA et al 2014)
O meacutetodo baseado em ERIC-PCR tem sido bastante utilizado como uma
alternativa para a teacutecnica de PFGE Esta teacutecnica consiste na anaacutelise do padratildeo de
amplificaccedilatildeo de elementos repetidos encontrados no genoma bacteriano Isto
permite uma maior rapidez na obtenccedilatildeo de resultados quando comparada com o
PFGE aleacutem de alta reprodutibilidade simples execuccedilatildeo e implementaccedilatildeo baixo
custo e natildeo sem problemas com a degradaccedilatildeo do DNA (MOREIRA et al 2014)
A PCR eacute considerada uma teacutecnica de biologia molecular revolucionaacuteria que
consiste na siacutentese enzimaacutetica de coacutepias de aacutecidos nucleacuteicos Ela permitiu o raacutepido
desenvolvimento do estudo de sequumlecircncias de aacutecidos nucleacuteico Foi desenvolvida por
Kary Banks Mullis que ganhou o precircmio Nobel de quiacutemica de 1993 devido ao
desenvolvimento dessa teacutecnica em abril de 1983 (CAMARGO et al 2014)
Por meio de etapas de variaccedilatildeo de temperatura a teacutecnica de PCR promove a
duplicaccedilatildeo de cadeias de DNA in vitro A reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo de DNA por PCR
envolve o emprego de sequumlecircncias iniciadoras (primers) quatro nucleotiacutedeos
29
(dNTPrsquos) do DNA e uma DNA polimerase termoestaacutevel podendo assim obter-se a
partir de uma fita molde muitas coacutepias de uma sequumlecircncia especiacutefica de aacutecido
nucleacuteico O princiacutepio da PCR consiste na variaccedilatildeo de temperatura por ciclo
envolvendo trecircs etapas baacutesicas desnaturaccedilatildeo pareamento e amplificaccedilatildeo
(CAMARGO et al 2014)
A desnaturaccedilatildeo da fita molde de DNA eacute uma etapa com duraccedilatildeo entre 30
segundos a 1 minuto a temperatura entre 92 ordmC a 96 ordmC Apoacutes isso o pareamento de
dois iniciadores sinteacuteticos de composiccedilotildees distintas que funcionam como os
iniciadores da reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo liga-se agrave regiatildeo complementar da fita de
DNA alvo que sofreraacute a duplicaccedilatildeo Esta etapa tem duraccedilatildeo de 30 segundos a 1
minuto a temperatura entre 58 ordmC e 65 ordmC Por uacuteltimo a amplificaccedilatildeo por meio da
enzima Taq DNA polimerase das novas fitas de DNA se daacute a partir de cada um dos
iniciadores utilizando os quatro dNTPrsquos como substrato da reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo
Esta etapa possui duraccedilatildeo entre 45 segundos e 1 minuto a 72 ordmC Cada ciclo eacute
repetido em torno de 30 a 35 vezes e promove a amplificaccedilatildeo da regiatildeo alvo
determinada conforme o anelamento dos iniciadores sinteacuteticos de DNA (CAMARGO
et al 2014) Estas etapas estatildeo demonstradas na figura 4
Figura 4 Etapas da Reaccedilatildeo de PCR
30
2 JUSTIFICATIVA
No ano de 2010 no Distrito Federal foram identificados 111 pacientes com
suspeita de infecccedilatildeo por Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) e a
Secretaria de Sauacutede do Distrito Federal confirmaram ainda a morte de 18 pacientes
dentre os hospitais puacuteblicos e particulares Um desafio encontrado por ocasiatildeo do
surto infeccioso no Distrito Federal foi o de confirmar as KPCs por Reaccedilatildeo da
Polimerase em Cadeia sendo que as amostras foram enviadas com esta finalidade
para a Fiocruz no Rio de Janeiro
Pesquisas que possam contribuir na elaboraccedilatildeo de estrateacutegias preventivas e
de intervenccedilatildeo para infecccedilotildees causadas por enterobacteacuterias bem como contribuir
para gerar uma integraccedilatildeo beneacutefica entre a equipe acadecircmica e os serviccedilos de
sauacutede devem ser estimuladas Neste sentido o presente estudo permitiu escrutinar
os genes envolvidos na expressatildeo de carbapenemases presentes em espeacutecies de
enterobacteacuterias isoladas em ambiente hospitalar visto que elucidar genes de
resistecircncia de enterobacteacuterias aos antibioacuteticos carbapenecircmicos eacute o primeiro passo
para garantir um controle epidemioloacutegico efetivo para estes tipos de microorganismo
assim como sua associaccedilatildeo com surtos fatais particularmente em pacientes com
baixa imunidade
31
3 OBJETIVOS
31 Objetivo geral Caracterizar os genes de resistecircncia das
Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases e os aspectos epidemioloacutegicos de
pacientes internados em um hospital puacuteblico do Distrito Federal
32 Objetivos Especiacuteficos
Identificar genotipicamente a enzima KPC (Klebsiella pneumoniae
carbapenemase) de isolados de Klebsiella pneumoniae
Investigar aspectos epidemioloacutegicos dos pacientes portadores de
Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases
Identificar quais variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana influenciaram para o
desfecho oacutebito ou alta
Avaliar a susceptibilidade das Enterobacteacuterias aos antibioacuteticos
carbapenecircmicos dos pacientes em ambiente hospitalar
32
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
Trata-se de um estudo transversal onde foi realizado o teste de
susceptibilidade das enterobacteacuterias aos antibioacuteticos carbapenecircmicos a partir dos
materiais bioloacutegicos coletados dos pacientes internados no Hospital Regional da Asa
Norte (HRAN) e enviados ao Laboratoacuterio de Anaacutelises Cliacutenicas da mesma Instituiccedilatildeo
Os materiais bioloacutegicos investigados foram sangue aspirado traqueal ou brocircnquico
urina e cultura semi quantitativa de ponta de cateter venoso central O HRAN eacute um
hospital puacuteblico do Distrito Federal com 395 leitos sendo as cliacutenicas de internaccedilatildeo
Berccedilaacuterio Cirurgia Geral Cirurgia Plaacutestica Cliacutenica Meacutedica Ginecologia Maternidade
Pediatria Queimados UTI com atendimento a pacientes portadores de doenccedilas de
caraacuteter cliacutenico e ciruacutergico
4 1 Coleta e transporte das amostras bioloacutegicas
As amostras foram coletadas de pacientes internados no Hospital Regional da
Asa Norte (HRAN) com suspeitas de infecccedilatildeo por KPC A identificaccedilatildeo primaacuteria foi
realizada pelo Laboratoacuterio de Microbiologia do hospital de origem dos pacientes e os
demais procedimentos que foram utilizados na identificaccedilatildeo encontram-se descritos
abaixo
4 2 Procedimentos para confirmaccedilatildeo de resistecircncia bacteriana por
disco de ertapenem (adaptado CDC 2004)
Para diagnosticar amostra como portadora de bacteacuteria produtora de
carbapenemase foi realizado o teste com disco de ertapenem como forma de
triagem Inicialmente utilizou-se o swab contaminado com a amostra que foi
distribuiacuteda em uma pequena aacuterea da placa de aacutegar MacConkey para apoacutes o
crescimento ser realizada a pesquisa de colonizaccedilatildeo por enterobacteacuterias resistentes
aos carbapenecircmicos (Pesquisa de CRE) Procedeu-se a semeadura por teacutecnica
semi-quantitativaesgotamento com alccedila bacterioloacutegica na diluiccedilatildeo de 1100 O disco
de Ertapenem foi colocado na superfiacutecie da placa de MacConkey na junccedilatildeo dos dois
primeiros campos de semeadura conforme demonstrado na figura 5 Incubou a placa
33
em estufa aeroacutebia a 35ordmC por 24 e 48 horas e observou-se o halo de difusatildeo do
disco de Ertapenem na placa para proceder agrave leitura
O teste deixou de ser obrigatoacuterio apoacutes a modificaccedilatildeo dos criteacuterios
interpretativos para carbapenecircmicos para enterobacteacuterias publicados no suplemento
do CLSI 2010 M100-S20-U
Figura 5 Mecanismo de semeamento de material bioloacutegico oriundos de
pacientes com suspeita de infecccedilatildeo por KPC Fonte adaptado CDC 2004
4 2 1 Interpretaccedilatildeo dos resultados
Na ausecircncia de crescimento ateacute 24 horas (MacConkey) ou halo de difusatildeo
gt27 mm na placa deve-se reincubar as placas por mais 24 horas Quando for
ausente o crescimento apoacutes 48 horas ou halo de difusatildeo gt27 mm na placa libera-se
como enterobacteacuterias resistentes a carbapenecircmicos (KPCNEG)Havendo
crescimento de colocircnias na placa de MacConkey com halo lt 27 mm (apenas para
colocircnias com crescimento dentro do halo) deve-se reisolar e realizar identificaccedilatildeo e
antibiograma automatizado teste de sensibilidade por disco-difusatildeo e Teste de
Hodge Modificado (THM) Os isolados de enterobacteacuterias cujos testes comprovarem
a resistecircncia aos carbapanecircmicos testados (KPCPOS) foram reportado a Comissatildeo
de Controle de Infecccedilatildeo Hospitalar (CCIH) Jaacute osbacilos Gram-negativos natildeo
fermentadores natildeo foram reportados (KPCNEG) Para interpretaccedilatildeodos resultados
foram utilizados os valores conforme demonstrados na tabela 1
Tabela 1 Criteacuterios Interpretativos para testes de sensibilidade
ENTEROBACTEacuteRIAS
Disco difusatildeo (mm) MIC (microgml)
34
Antibioacutetico Sigla S I R S I R
Ertapenem 10
microg
ETP 22 19-
21
18 05 1 2
Meropenem 10
microg
MEM 23 20-
22
19 1 2 4
Fonte Manual Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)
2013
Os resultados que apresentaram resistecircncia ao antibioacutetico Ertapenem foram
considerados como suspeitos de contaminaccedilatildeo por KPC Fez-se o teste de
susceptibilidade aos antibioacuteticos (TSA) em aparelho automatizado MicroScan Walk
Away 96sl Dade Behring
4 3 Teste de susceptibilidade aos antibioacuteticos (adaptado CDC 2004)
A determinaccedilatildeo da susceptibilidade dos isolados foi feita pelo teste de
susceptibilidade aos antibioacuteticos (TSA) apoacutes cultura em meio de gelose simples
(INSA) para avaliaccedilatildeo da sua pureza e obtenccedilatildeo de colocircnias isoladas Para
preparaccedilatildeo de uma suspensatildeo bacteriana com turvaccedilatildeo aproximada de 05
McFarland (Dade BehringMicroScanregTurbidity Meter) ressuspendeu duas a cinco
colocircnias em 2ml de soro fisioloacutegico esteacuteril diluindo a 1100 em soro fisioloacutegico num
volume total de 10ml em seguida foi feita uma semeadura em duas placas
quadradas (120mm x 120mm) de Muller-Hinton Agar (INSA) por inundaccedilatildeo
Os discos de antibioacutetico carbapenecircmicos imipenem meropenem e
ertapenem (Biorad) foram aplicados com o auxiacutelio de um dispensador automaacutetico A
susceptibilidade das Enterobacteacuterias aos carbapenecircmicos foi definida de acordo
com o protocolo Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI 2011)
Para aquelas Enterobacteacuterias que apresentaram resistecircncia ao ertapenem
foram realizados o Teste de Hodge Modificado para Detecccedilatildeo de Enterobacteacuterias
Produtoras de Carbapenemases conforme descrito pelo Centers for Disease Control
and Prevention (CDC 2004)
35
4 4Teste de Hodge Modificado (THM) (adaptado CDC 2004)
Preparou-se uma suspensatildeo em salina esteacuteril com a cepa Escherichia coli
ATCC 25922 (padratildeo 05 de McFarland) Apoacutes isto diluiu a suspensatildeo 110 em
salina (05 ml da soluccedilatildeo de Ecoli ATCC 25922 + 45 ml salina)Foi entatildeo semeado
na superfiacutecie de uma placa de Agar Muller-Hinton com a suspensatildeo diluiacuteda de Ecoli
ATCC 25922 com auxilio de swab seco assegurando que houvesse uma
distribuiccedilatildeo uniforme cobrindo toda a superfiacutecie do Agar Deixou secar por 3 a 5
minutos em temperatura ambienteColocou-se o disco de ertapenem 10microg no centro
da placa e apoacutes isto fez-se uma estria linear da cepa a ser testada da borda do
disco ateacute a borda da placa utilizando uma alccedila calibrada 10 microl ou um swab Incubou
a placa na estufa em atmosfera aeroacutebia a 35 plusmn 2ordmC por 16 a 24 horas
441 Controle de qualidade (CQ)
Foi utilizado um CQ todos os dias em que se realizou o teste tendo como
controle Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1705- teste de Hodge modificado
positivo Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1706- teste de Hodge modificado
negativo
442 InterpretaccedilatildeoResultados
Apoacutes 16ndash24 horas de incubaccedilatildeo examinar as placas para verificar a presenccedila
de uma distorccedilatildeo no halo de inibiccedilatildeo do disco de ertapenem devido ao crescimento
realccedilado da cepa ATCC na intersecccedilatildeo do organismo teste e a Ecoli ATCC 25922
dentro dos limites do halo O THM positivo apresentaraacute presenccedila de distorccedilatildeo no
halo de inibiccedilatildeo de ertapenem devido ao crescimento da cepa Ecoli ATCC 25922 ao
longo da estria da cepa teste para dentro dos limites do halo de inibiccedilatildeo Jaacute o THM
negativo teraacute ausecircncia de crescimento da cepa Ecoli ATCC 5922 ao longo da estria
da cepa teste para dentro dos limites do halo de inibiccedilatildeo do disco de ertapenem
Este resultado estaacute representado na figura 6
36
Figura 6 Interpretaccedilatildeo resultado do Teste de Hodge Modificado
(adaptado CDC 2004) Teste positivo na estria da cepa teste na parte superior
da placa teste negativo na estria da cepa teste na parte inferior da placa
Tendo positivo como resultado o paciente era um provaacutevel contaminado por
KPC As amostras entatildeo foram encaminhadas para a Fundaccedilatildeo Osvaldo Cruz
(FIOCRUZ) para confirmaccedilatildeo final As amostras finalmente confirmadas como
positivas para KPC foram isoladas e guardadas no banco de cepas cliacutenicas do
hospital Apoacutes a autorizaccedilatildeo do CEP amostras das cepas foram transferidas para
meio de transporte Stuard em caixa teacutermica fechada em baixa temperatura e
levadas para o laboratoacuterio de microbiologia cliacutenica da universidade
No laboratoacuterio da universidade as amostras foram separadas e realizadas
repiques em meios MacConkey e incubadas por 24h As colocircnias caracteriacutesticas
foratildeo isoladas em caldo BHI e mantidas em shaker a 37oC por 2h Apoacutes isto foram
executadas as anaacutelises a seguir
Os isolados de Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases foram
submetidos agrave extraccedilatildeo de DNA e posterior sequumlenciamento para identificaccedilatildeo dos
genes de resistecircncia blaKPC de 1 a 13 e identificaccedilatildeo do gene universal Os
pacientes de onde os materiais bioloacutegicos contendo as Enterobacteacuterias produtoras
de carbapenemases foram os isolados foram investigados quanto aos aspectos
epidemioloacutegicos e cliacutenicos
37
4 5 Extraccedilatildeo de DNA bacteriano
A extraccedilatildeo de DNA bacteriano foi realizada utilizando o kit NucleoSpin
Plasmidreg (MN) Antes de iniciar a extraccedilatildeo foi feito a preparaccedilatildeo das soluccedilotildees
reagentes materiais e amostras (vortexando) colocou-se em banho-maria agrave 50ordmC o
tampatildeo AW Partiu-se de colocircnias isoladas cultivadas que sofreram passagem em
meio LB liacutequido por 12h Adicionou-se 15 mL da amostra no tubo eppendorf
centrifugou por 5 minutos descartou o sobrenadante (com cuidado para natildeo
descartar o Pellet) Repetiu-se este procedimento por mais trecircs vezes completando-
se o volume de 6mL Foram adicionados 250microL do tampatildeo Resuspension Buffer A1
encostando a ponteira no Pellet e misturando (este tampatildeo tem como funccedilatildeo
separar a formaccedilatildeo de grumos celulares) Apoacutes isso homogeneizou e vortexou os
tubos eppendorfs Apoacutes isso foram adicionados 250microL do tampatildeo Lysis Buffer A2
homogenizou e deixou descansar por 5 minutos (esta etapa eacute importante para a lise
da parede e da membrana celulares e liberaccedilatildeo do conteuacutedo da ceacutelula)
Passado o tempo de descanso foi adicionado 300microL do tampatildeo
Neutralization Buffer A3 homogeneizou e centrifugou por 10 minutos (este tampatildeo
iraacute retirar as proteiacutenas que envolvem o DNA e voltaraacute com o pH para proacuteximo de 8
impedindo que a soluccedilatildeo de lise facilite a quebra das ligaccedilotildees covalentes do aacutecido
nucleacuteico) Em seguida enumeraram-se os tubos contendo filtros com siacutelica
transferiu-se o sobrenadante para o filtro e centrifugou por 5 minutos Descartou-se
o que foi filtrado adicionou 500microL do tampatildeo AW (banho-maria) centrifugou por 2
minutos Novamente foi descartado o filtrado Adicionou-se 600microL do tampatildeo A4
centrifugou por 2 minutos e descartou o filtrado (os tampotildees AW e A4 contecircm
isotiocianato de guanidina em concentraccedilotildees crescentes para facilitar a adsorccedilatildeo
do DNA na siacutelica e retirada das outras biomoleacuteculas da amostra) Foi feita outra
centrifugaccedilatildeo com o tubo vazio Apoacutes isto o filtro foi trocado para outro eppendorf
definitivo onde foi adicionado 50microL do tampatildeo Elution Buffer AE (este tampatildeo
favorece a eluiccedilatildeo do DNA) centrifugou por 2 minutos descartou o filtro e
armazenou as amostras em freezer -20ordmC
38
4 6 Iniciadores e reaccedilatildeo de PCR
Os iniciadores universais para o gene blaKPC foram desenhados baseados
em sequumlecircncias conservadas apresentadas pelos sub-grupos de genes que
codificam a enzima carbapenemase de klebsiella pneumoniae (YIGIT et al 2001)
Baseado na sequumlecircncia para o blakpc-1 depositada no GenBank
(AF2975541) o oligonucleotiacutedio (oligo) iniciador direto (5-
ATGTCACTGTATCGCCGTC-3rsquo) foi desenhado para reconhecer a sequumlecircncia
blaKPC na posiccedilatildeo (131149) enquanto que o iniciador reverso (5-
TTACTGCCCGTTGACGCC-3rsquo) foi reconhecido na posiccedilatildeo (9951012) As anaacutelises
baseadas em alinhamento de sequumlecircncias mostraram que o par de iniciadores
blaKPC podem detectar os alelos de 1 a 13 do gene blaKPC conforme a tabela 2
Tabela 2 Nuacutemero de acesso ao GenBank dos alelos blaKPC e seus
microrganismos originais
Nuacutemero de
Acesso GenBank
Microrganismo Alvo
AF2975541 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-1
GU0862251 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-2
HQ2589341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-2-like
AB5577341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC -3
EU4473041 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-4
EU4002222 Pseudomonas
aeruginosa
blaKPC-5
EU5555341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-6
EU7297271 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-7
39
FJ2344121 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-8
FJ624872 Escherichia coli blaKPC-9
GQ1403481 Acinetobacter
baumannii
blaKPC-10
HM0669951 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-11
HQ3428891 Enterobacter cloacae blaKPC-12
HQ3428901 Enterobacter cloacae blaKPC-13
As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo de blaKPC foram realizadas em um
primeiro tempo de desnaturaccedilatildeo em que foi 94ordmC por 5 minutos seguido de 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 58 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 90 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 78ordmC por 8 minutos Aleacutem das amostras foi utilizado um
controle negativo
A PCR do blaKPC foi realizada utilizando os componentes para o volume da
reaccedilatildeo de 25 microL citados na tabela 3 A banda do tamanho do produto de PCR foi de
881 pares de bases (pb) o que corresponde ao plasmiacutedeo
Tabela 3 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do
gene blaKPC
Reagente Volume
DNA molde 4 microL
Tampatildeo Taq 25 microL
MgCl2 075 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP
2 microL
Oligo F 1 microL
Oligo R 1 microL
Taq DNA polimerase 05 microL
Aacutegua MiliQ 1335 microL
40
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
Baseado na sequumlecircncia para o gene 16S rRNA em que o oligonucleotiacutedio
Universal iniciador direto foward (5-CCAGCAGCCGCCGTAATACG-3rsquo) foi
desenhado para reconhecer a sequumlecircncia universal na posiccedilatildeo 1513 enquanto que o
iniciador reverso (5-ATCGGYTACCTTGTTACGACTTC-3rsquo) foi reconhecido na
posiccedilatildeo 1491 foram realizadas PCRrsquos As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo deste
gene foram realizadas nos seguinte tempos separaccedilatildeo 94ordmC por 10 minutos 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 55 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 120 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 72ordmC por 10 minutos
A PCR do gene 16S rRNA foi realizada utilizando os componentes para o
volume da reaccedilatildeo de 25microL citados na tabela 4 A banda do tamanho do produto de
PCR foi de 996 pb correspondente aacute regiatildeo ribossomal capaz de amplificar todas
as espeacutecies
Tabela 4Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do gene
universal
Reagente (quantidade
concentraccedilatildeo do estoque)
Volume
DNA molde 10 ng 4 microL
Tampatildeo Taq 10 x 25 microL
MgCl2 50mM 125 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP 25 mM
125 microL
Oligo F 10microM 05 microL
Oligo R 10microM 05 microL
Taq DNA polimerase 5UmicroL 04 microL
Aacutegua Miliq 146 microL
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
41
O termociclador utilizado para os experimentos foi o LifeTouch da BIOER
4 7 Digestatildeo
Para realizaccedilatildeo da digestatildeo foi utilizada a enzima BshF I (Hae III) EN- 1105
tamanho 7000 units concentraccedilatildeo 10 unitsmicroL fonte Bacillus sphaericus empresa
Jena bioscienceUtilizaram-se os componentes para o volume de 50microL da reaccedilatildeo
citados na tabela 5
Tabela 5 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da digestatildeo do gene
universal
Reagente Volume
Produto de PCR 10 microL
Enzima BshF I 01 microL
Tampatildeo (10x) 5 microL
Aacutegua Miliq 349 microL
Total (em cada ependorff) 50 microL
Valores para 1 digestatildeo
Os ependorffs foram colocados por 30 minutos em banho-maria a 37ordmC Apoacutes
isso fez-se a corrida das amostras em gel de agarose para verificaccedilatildeo do resultado
(LU et al 2000)
4 8 Eletroforese em gel de agarose
Os produtos de DNA PCR e digestatildeo foram analisados em gel de agarose
2 O tempo de corrida do gel eacute de aproximadamente 1hora e 30minutos sendo
que no comeccedilo foi usada agrave voltagem de 50 V e apoacutes comeccedilar a correr o gel
aumentou a voltagem para 100 v Utilizou-se o marcador de 100pb (pares de bases)
Foi adicionado 3microL de corante Bromophenol (que tem a funccedilatildeo de fazer uma ligaccedilatildeo
na amostra de DNA e permitir a visualizaccedilatildeo da corrida no gel de agarose) em 7microL
de amostra tanto de DNA quanto de PCR Para o preparo do gel foi utilizado TBE
42
(Tris- Aacutecido Boacuterico) agarose e brometo de etiacutedio (sua funccedilatildeo eacute de corante para o gel
e permitir a visualizaccedilatildeo do DNA quando colocado agrave luz ultravioleta) Para o oligo
blaKPC a banda da amplificaccedilatildeo foi em 881ppb correspondendo ao plasmiacutedeo Jaacute
o oligo Universal foi em 996 pb
4 9 Descarte de resiacuteduos
Todos os materiais utilizados nos ensaios foram de uso uacutenico e manipulados
em cacircmaras de seguranccedila bioloacutegica classe II Apoacutes o uso foram colocados em
soluccedilatildeo desinfetantes (hipoclorito a 1) e em seguida autoclavados a 127oC por 20
min em sacos apropriados para autoclavaccedilatildeo Apoacutes a finalizaccedilatildeo do ciclo de
esterilizaccedilatildeo os sacos contendo o material descartaacutevel foram colocados em
recipientes de coleta da empresa responsaacutevel pela coleta de materiais bioloacutegicos
produzidos no laboratoacuterio de microbiologia Todos os procedimentos seguiram a
normativa RDC-ANVISA 3062004 sobre o descarte de resiacuteduos de serviccedilo de
sauacutede
4 10 Aspectos epidemioloacutegicos e cliacutenicos
Os aspectos cliacutenicos e epidemioloacutegicos foram investigados por meio de
prontuaacuterios dos pacientes portadores de enterobacteacuterias produtoras de
carbapenemases e envolveram topografia mais provaacutevel do foco infeccioso a
enfermidade motivadora da internaccedilatildeo o desfecho cliacutenico a idade e o tempo de
internaccedilatildeo
4 12 Anaacutelises eepidemioloacutegicas
As anaacutelises foram realizadas com o pacote estatiacutestico SPSS versatildeo 200
Para verificar quais variaacuteveis referentes aos dados epidemioloacutegicos e
microbioloacutegicos influenciaram no desfecho verificou- se a diferenccedila meacutedia das
variaacuteveis idade e tempo de internaccedilatildeo em cada grupo O teste estatiacutestico utilizado foi
o teste t de Student apoacutes se executar o teste de normalidade de Shapiro-Wilk Para
as variaacuteveis sexo perfil microbioloacutegico das enterobacteacuterias produtoras de
43
carbapenemases foi avaliada a associaccedilatildeo com o desfecho por meio do teste Exato
de Fisher O niacutevel de significacircncia adotado foi de 5
4 13 Preceitos eacuteticos
Este projeto estaacute inserido em um projeto maior denominado ldquoEpidemiologia
cliacutenica e caracterizaccedilatildeo molecular do Acinetobacter Baumannii resistente a
antibioticoterapia em pacientes internado em hospitais do Sistema Uacutenico de Sauacutederdquo
que foi submetido ao Comitecirc de Eacutetica em Pesquisa da Secretaria do Estado de
Sauacutede do Distrito Federal (SESDF) e emitido parecer aprovado pelo protocolo nordm
23109 (anexo)
44
5 RESULTADOS
51 Anaacutelise molecular
Para a amplificaccedilatildeo com o oligo blaKPC foram amplificadas amostras
que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 881 pb correspondente ao
plasmiacutedeo A anaacutelise da amplificaccedilatildeo da regiatildeo do gene blaKPC mostrou que
apenas a amostra A10 natildeo amplificou isso demonstra que esta amostra natildeo
possuiacutea o gene de resistecircncia
5 1 1 Gene blaKPC
Figura 7 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 881 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
A amostra A3 natildeo amplificou no primeiro momento entatildeo foi realizado
novamente a PCR e corrida de gel obtendo entatildeo a amplificaccedilatildeo da amostra como
apresentado na figura 8
45
Figura 8 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC da
mostra A3 estudada A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo de 881
pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 1 2 Gene 16S rRNA
Para a amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA utilizou-se o oligo universal Foram
amplificadas amostras que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 996 pb
Figura 9 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
46
Segundo Lu et al (2000) a digestatildeo com a enzima HaeIII deste amplicons de
16S rRNA devolveriam bandas com perfis entre 150 a 200 pb No gel abaixo eacute
possiacutevel evidenciar que este perfil ocorreu com o predomiacutenio de bandas na altura
de 200pb
Figura 10 Gel de agarose a 2 da digestatildeo do amplicon do gene 16S
rRNA das amostras com a enzima HaeIII evidenciando diversos fragmentos
proacuteximos a 200 pb A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo ribossomal
de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 2 Anaacutelises epidemioloacutegicas
5 2 1 Sexo
No total foram detectados 17 isolados de KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 onde a maior a prevalecircncia foi
detecatada em amostras de pacientes do sexo masculino (53) do que no sexo
feminino (47)
47
Figura 11 Isolado de KPC segundo sexo dos 17 pacientes investigados
no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 2 Desfecho cliacutenico
Em 17 isolados de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo
de 2010 aacute 2011 a porcentagem de pacientes que foram a oacutebito (59) foi maior que
a de pacientes que tiverm alta (41)
Figura 12 Isolado de KPC segundo desfecho cliacutenico dos 17 pacientes
investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
48
5 2 3 Local da coleta
Dos 17 episoacutedios detectados de infecccedilatildeo por KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 a infecccedilatildeo em swab retalfoi mais
frequente (47) seguida de ponta de cateacuteter (18) e secreccedilatildeo traqueal (12)
Figura 13 Isolados de KPC segundo local da coleta da amostra nos 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 4 Microorganismo
O microorganismo mais encontrado foi a Klebsiella pneumoniae (82)
seguida da Enterobacter clocae (12) e Serratia marcescens (6) dos 17 isolados
de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 Isto afirma o
fato de a sigla KPC ser utilizada de forma errocircnea aacute Klebsiella pneumoniae visto
que a evidecircncia dela eacute maior em relaccedilatildeo as outras cepas
49
Figura 14 Isolado de KPC segundo microrganismo encontrado em 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 5 Relaccedilotildees variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana e desfecho
cliacutenico
Tabela 6 ndash Distribuiccedilatildeo do perfil geneacutetico sexo coleta tipificaccedilatildeo de
microrganismos e anaacutelise da resistecircncia bacteriana segundo o desfecho
cliacutenico Brasiacutelia-DF 2010 a 2011
Variaacutevel Resultado
Desfecho
Alta Oacutebito
N N P
Gene 16S rRNA Positivo 7 1000 10 1000
NA Gene blaKPC Positivo 6 857 10 1000
Negativo 1 143 0 00 0218 Sexo Feminino 2 286 6 600
Masculino 5 714 4 400 0201 Local da coleta Fundo saco de
Douglas 1 143 0 00
Hemocultura 0 00 1 100 0463 Ponta de cateter 1 143 2 200
Sec TraquealBrocircnquica
0 00 1 100
50
Secreccedilatildeo traqueal 2 286 0 00
Swab retal 3 429 5 500
Urina 0 00 1 100
Microrganismo Enterobacter cloacae (KPC)
1 143 1 100
Klebsiella pneumoniae
6 857 8 800
0416 Serratia
marcescens 0 00 1 100
Teste de Hodge Hodge positivo 7 1000 10 1000
NA Amicacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 1 100 0848 resistente 0 00 1 100
sensiacutevel 2 286 3 300
Amoxicilina Aacutecido Clavulacircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Ampicilina Sulbactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ampicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Aztreonan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefazolina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Cefoperazona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Cefotaxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefoxitina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0509 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 2 286 4 400
Ceftazidima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cetriaxona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 3 429 5 500 0772 Cefalotina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ciprofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772
51
resistente 3 429 5 500
Claritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Clindamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Eritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Gentamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0942 resistente 2 286 3 300
sensiacutevel 1 143 2 200
Imipenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 0 00 2 200 0193 Resistente 1 143 3 300
sensiacutevel 2 286 0 00
Nitrofurantoiacutena sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Norfloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Oxacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Penicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Piperacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Rifampicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tetraciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Ticarcilina Aacutecido Clavulocircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0688 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 3 429 4 400
Tobramicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Trimetoprima Sulfametoxazol
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0112 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 2 286 0 00
Vancomicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tigeciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediario 0 00 1 100 0211 natildeo testado 1 143 4 400
resistente 2 286 0 00
52
Cefepime sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefuroxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Levofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Piperacilina Tazobactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Ertapenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Meropenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0223 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 1 143 0 00
Cefotetan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 sensiacutevel 0 00 1 100
Gemifloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 7 700 0585 natildeo testado 3 429 3 300
Desfecho
Alta Oacutebito
Meacutedia Erro
padratildeo Meacutedia Erro
padratildeo p
Idade 58 9 59 5 0991
Tempo Internaccedilatildeo (dias)
50 13 46 12 0571
n= 17 p(lt 005) NA natildeo se aplica
53
6 DISCUSSAtildeO
Nos uacuteltimos anos houve um aumento na incidecircncia de bacteacuterias
multirresistentes aos antimicrobianos no ambiente hospitalar tornando isto um
problema mundial de sauacutede puacuteblica (HULSCHER et al 2010) Quando se trata
principalmente de bacilos Gram negativos a frequumlecircncia destas bacteacuterias eacute ainda
maior em paiacuteses da Ameacuterica Latina quando comparada a paiacuteses desenvolvidos
(GALES etal 2012)
De acordo com dados do ldquoMeropenem Yearly Susceptibility Test Information
Collectionrdquo (MYSTIC) ocorreu nos Estados Unidos um aumento na susceptibilidade
de K pneumoniae nos uacuteltimos anos graccedilas a praacuteticas de controle de disseminaccedilatildeo
de amostras resistentes(RHOMBERG P R et al 2009) O aumento crescente da
prevalecircncia destes microrganismos foi proporcional ao aumento da dependecircncia do
uso de antibioacuteticos carbapenecircmicos considerados como a opccedilatildeo terapecircutica para o
tratamento de infecccedilotildees por bacilos Gram negativos multi-resistentes (LIVERMORE
2012) Isto afeta diretamente as opccedilotildees de tratamento sobrando poucas alternativas
para a terapecircutica que incluem colistina (polimixina E) e tigeciclina que apresentam
respectivamente problemas em termos de toxicidade e eficaacutecia (LIVERMORE et
al 2011) Um dos efeitos adversos mais importantes das poliminas B e E por
exemplo satildeo a neurotoxicidade e nefrotoxicidade (MENDES C A C et al2009 )
Devido agrave resistecircncia ser usualmente de natureza plasmidial e portanto de
maior disseminaccedilatildeo especialmente quando carreadas por K pneumoniae
microrganismo com uma notoacuteria capacidade para acumular e transferir plasmiacutedeos
com determinantes para resistecircncia o nuacutemero de casos detectados pelo
fenoacutetipogenoacutetipo blaKPC eacute bastante preocupante (MONTEIRO et al 2009)
Comparada com outras bacteacuterias hospitalares a transmissatildeo de clones
multirresistentes de K pneumoniae eacute maior e podem natildeo ser controladas pelos
meacutetodos de controle de infecccedilatildeo hospitalar (PAAUW et al 2007) A forma
plasmidial para transferecircncia da resistecircncia adicionada a este grande potencial para
disseminaccedilatildeo de clones resistentes eacute preocupante visto que apoacutes surtos muitas
vezes pode se tornar endecircmica Jaacute eacute uma realidade a disseminaccedilatildeo desta bacteacuteria
54
entre pacientes hospitais paiacuteses e ateacute mesmo continentes (WOODFORF et al
2010 ROGERS et al 2011)
As chances de surtos satildeo maiores em paiacuteses com poucos recursos devido agrave
maior carecircncia de praacuteticas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees hospitalares e o
uso irracional de antimicrobianos de forma empiacuterica e inadequada (KUMARASAMY
et al 2010) Ateacute o momento os mecanismos de resistecircncia aos cabapenecircmicos
geralmente encontrado eram a produccedilatildeo de ESBL (CTX-M) somada aacute perda de
porina (CARVALHAES et al 2010) Foi notado a partir do ano de 2008 um
aumento no nuacutemero de K pneumoniae produtoras de KPC-2 apresentando outra
forma de resistecircncia (GALES 2012)
Um estudo mostrou que o perfil do paciente colonizado ou infectado por KPC
foi de um paciente entre os 33 e os 82 anos de idade internado haacute mais de 1
semana no hospital A mortalidade geral nos uacuteltimos anos ficou em torno de 7
sendo que dos 77 pacientes estudados 32 (415) pacientes evoluiacuteram para oacutebito
evidenciando a alta morbi-mortalidade associada (ALVES A P et al 2013)
Em estudo com 2316 pacientes avaliados a populaccedilatildeo de sexo masculino foi
de 526 idade meacutedia global de 53 anos (mediana de 55 anos) permanecircncia meacutedia
de 58 dias (mediana de 3 dias) (OLIVEIRA A C et al 2010) Outros trabalhos
apresentaram ausecircncia de significacircncia entre sexoidade e o desenvolvimento de
infecccedilotildees por microrganismos resistentes (PERES-BOTA D et al 2003 COLPAN
A et al 2005 COELLO R et al 1997)
Outro estudo utilizou um total de 30 amostras sendo elas isoladas de urina
escarro secreccedilatildeo pleural ponta de cateter aspirado traqueal e hemocultura A mais
prevalente foi em urina (40) Entre as 30 cepas analisadas a maior porcentagem
foi da cepa Klebsiella pneumoniae (70) Enterobacter sp (133) Klebsiella
ozaenae (10) Escherichia coli (333) e Klebsiella oxytoca (333)
(DIENSTMANN R et al 2010) Nos Estados Unidos a enzima KPC jaacute se tornou
endecircmica Foi realizada uma pesquisa em dois hospitais de Nova York onde
testaram 602 amostras e 45 apresentaram algum mecanismo de resistecircncia
sendo apenas 33 confirmadas por biologia molecular como KPC-2 (BRATU et
al 2005)
55
Estudo sobre os tipos de ESBL feito no Japatildeo apresentou o tipo Toho-1 como
o mais prevalente nessa pesquisa Ateacute o ano de 2000 ano em que foi publicado tal
estudo este era o primeiro relatoacuterio no Japatildeo para identificar derivados de ESBLs
como tipo de SHV e TEM entre E coli e K pneumoniae Em especial o tipo SHV- 12
foi identificado com uma maior frequumlecircncia Estes resultados indicam que tipos
distintos de ESBLs que satildeo diferentes em sua especificidade de substrato e origem
geneacutetica coexistem no Japatildeo Isto mostra a importacircncia de caracterizar genoacutetipos
distintos de ESBLs e de estar em alerta continuamente para as tendecircncias de
ESBLs no Japatildeo aleacutem da necessidade de uma interpretaccedilatildeo uniforme utilizando as
diretrizes do CSLI para relatar cepas produtoras de ESBL Aleacutem da detecccedilatildeo de
ESBLs satildeo necessaacuterias mais informaccedilotildees tais como o perfil de sensibilidade
especiacutefica para diversas β-lactacircmicos e o local da infecccedilatildeo Esses fatores satildeo
essenciais para a escolha adequada de antibioacuteticos (YAGI T et al 2000)
No ano de 2004 uma pesquisa avaliou a produccedilatildeo de uma enzima de
hidroacutelise de carbapenecircmicos atraveacutes da teacutecnica de sequumlenciamento foi revelado
um novo membro da famiacutelia KPC designado KPC- 3 Pesquisadores encontraram
em um mutante de K pneumoniae uma substituiccedilatildeo de um gene associado com
resistecircncia a Imipenem mas essa substituiccedilatildeo foi considerada improvaacutevel na
contribuiccedilatildeo da resistecircncia aos carbapenecircmicos da espeacutecie estudada Aleacutem da
resistecircncia aos carbapenecircmicos estes isolados eram em sua maioria resistentes agraves
cefalosporinas penicilinas e aminoglicosiacutedeos Usando estudos de transformaccedilatildeo
conjugaccedilatildeo e hibridaccedilatildeo localizaram o alelo blaKPC em plasmiacutedeo aleacutem disso
mostraram que esse alelo tambeacutem carregava uma resistecircncia aos aminoglicosiacutedeos
A transferecircncia das enzimas KPCs foi demonstrada in vitro tanto neste como em
outros estudos pode ser que os plasmiacutedeos que fazem esta transferecircncia estavam
comeccedilando a se espalhar no ambiente cliacutenico resultando na multiresistecircncia dessas
estirpes (WOODFORD et al 2004)
O presente estudo apresentou um vieacutes quanto aos resultados dos testes de
susceptibilidade microbiana Observou-se que natildeo foi encontrado resultado deste
teste em algumas amostras o que natildeo cooperou para um estudo mais preciso
futuros estudos quanto agraves amostras e um melhor acompanhamento deste tipo de
patologia Poreacutem mesmo sem algumas amostras com este resultado disponiacutevel foi
56
confirmada a presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos
carbapenecircmicos por meio dos genes de resistecircncia blaKPC e 16S rRNA que as
amostras apresentaram em sua maioria serem portadoras Quanto aos resultados
estatiacutesticos nenhuma das variaacuteveis apresentou significacircncia estatiacutestica (p gt 005)
mostrando assim que estas variaacuteveis isoladas natildeo foram o fator determinante para
o desfecho cliacutenico de alta ou oacutebito
57
7 CONCLUSAtildeO
Os genes blaKPC e 16S rRNA foram caracterizados confirmando a a
presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos carbapenecircmicos
Houve uma maior prevalecircncia da cepa K pneumoniae e isto confirma outros
estudos que apresentam a maior prevalecircncia desta cepa em amostras com KPC
Aleacutem disso isso justifica a forma popular da K pneumoniae ser chamada de KPC
enquanto que na verdade KPC eacute uma enzima podendo estar presente em outras
cepas como Enterobacter clocae tambeacutem apresentada no presente estudo O
desfecho cliacutenico de oacutebitos maior que 50 eacute um possiacutevel indicador sobre a
necessidade de se realizar um teste raacutepido para identificaccedilatildeo de KPC visando
iniciar o mais raacutepido possiacutevel o tratamento afim de diminuir a mortalidade por esta
infecccedilatildeo
Nenhuma das variaacuteveis isoladamente estaacute relacionada ao desfecho cliacutenico
oacutebito ou alta pois natildeo apresentaram relevacircncia estatiacutestica O presente estudo
mostrou que haacute presenccedila da bacteacuteria nas amostras de pacientes do hospital
estudado podendo entatildeo afirmar que este tipo de bacteacuteria se encontra tambeacutem
presente em ambiente hospitalar O uso irracional de antimicrobiano eacute demonstrado
de forma indireta quando foi apresentado atraveacutes do Teste de Hodge Modificado
uma resistecircncia de 100 aos antibioacuteticos carbapenecircmicos Isto tambeacutem reflete na
terapecircutica sendo que pacientes portadores de bacteacuterias resistentes aos
antibioacuteticos carabepecircmicos tem uma escassa opccedilatildeo de tratamento e as opccedilotildees
apresentam problemas quanto agrave toxicidade e eficaacutecia
58
REFEREcircNCIAS
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Mecanismos
de resistecircncia bacteriana aos antimicrobianos Disponiacutevel em
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controleopas_
webmodulo3mec_sitiohtmgt Acesso em 25 de abril de 2014
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Nota teacutecnica nordm
012013 medidas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees por enterobacteacuterias
multiresistentes Acesso em 17 de abril de 2013
ALBA J et al Kinetics study of KPC-3 a plasmid-encoded class A
carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase Antimicrob Agents Chemother
Nov49(11)4760-2 2005
ALVES A P et al Nosocomial infections by KPC-producing enterobacteria in
a tertiary hospital in Southern Brazil Revista da AMRIGS Porto Alegre 57 (3) 213-
218 jul-set 2013
ALVES A et al Tipagem Geneacutetica de Microrganismos Lab De Diversidade
Microbiana Centro de Biologia Celular Dep de Biologia U de Aveiro 3810-193
Aveiro- 2003
BELL J M et Al Prevalence and significance of a negative extended-
spectrum beta-lactamase (ESBL) confirmation test result after a positive ESBL
screening test result for isolates of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae
results from the SENTRY Asia-Pacific Surveillance Program J Clin Microbiol
May45(5)1478-82 2007
BRATU S et al Detection of KPC carbapenem-hydrolyzing enzymes in
Enterobacter spp from Brooklyn New York Antimicrob Agents Chemother v 49 n
2 p 776-8 2005
59
BRATU S et al Emergence of KPC-possessing Klebsiella pneumoniae in
Brooklyn New York epidemiology and recommendations for detection Antimicrob
Agents Chemother v 49 n 7 p 3018-20 2005
BRATU S et al Rapid spread of carbapenem-resistant Klebsiella
pneumoniae in New York City Arch Intern Med v 165 p 1430-5 2005
CAMARGO C F et al Aplicaccedilatildeo das teacutecnicas de pcr e suas teacutecnicas
derivadas em diagnoacutestico molecular Disponiacutevel em
ltfileDUnB10C2BA20semestreArtigosPCR-
20CLEYTON20FLORENCIO20DE20CAMARGO20E20PAULO20ROB
ERTO20QUEIROZpdfgtgt Acesso em 08 de abril de 2014
CARVALHES C G et al Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting
carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive
results Journal of Antimicrobial Chemotherapy v 65 n2 p 249-251 2010
CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION- CDC Modified
Hodge Test for Carbapenemase Detection in Enterobacteriaceae 2004
CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE Methods for
dilutionantimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically Approved
standard M7ndashA7 7th ed CLSI Wayne PA 2011
COELLO R et al Risk factors for developing clinical infection with methicillin-
resistant Staphylococcus aureus (MRSA) amongst hospital patients initially only
colonized with MRSA J Hosp Infect 19973739-46
COLPAN A et al Evaluation of risk factors for mortality in intensive care
units A prospective study from a referral hospital in Turkey Am J Infect Control
200533(1)42-7
60
CORNAGLIA G et al Living with ESBLs Introduction Clinical Microbiology
and Infection 14 Suppl 1 1-2 2008
COTRIM E R et al Klebsiella pneumoniae carbapenemase ndash KPC em
Enterobacteriaceae o desafio das bacteacuterias multirresistentes Poacutes em revista do
centro universitaacuterio Newton Paiva 12012 - ediccedilatildeo 5 - issn 2176 7785
DESHPANDE L M et al Occurrence and characterization of
carbapenemase-producing Enterobacteacuteriaceae report from the SENTRY
Antimicrobial Surveillance Program (2000-2004) Microb Drug Resist 12(4)223-30
2006
DIAS D J A Estudos dos principais mecanismos de resistecircncia aos
antibioacuteticos β-lactacircmicos em bacteacuterias patogecircnicas gram negativas 2009 100 f
Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Geneacutetica Molecular e Biomedicina) ndash Faculdade de
Ciecircncias e Tecnologia Universidade de Nova Lisboa Lisboa
DIENSTMANN R et al Avaliaccedilatildeo fenotiacutepica da enzima Klebsiella
pneumoniae carbapenemase (KPC) em Enterobacteriaceae de ambiente hospitalar
J Bras Patol Med Lab v 46 n 1 p 23-27 fevereiro 2010
ENDIMIAMI A et al Emergence of blaKPC-containing Klebsiella
pneumoniae in a long-term acute care hospital a new challenge to our healthcare J
Antimicrob Chemother 64 1102-1110 Nov 2009
FALAGAS M E et al Extended-spectrum beta-lactamase producing
organisms The Journal of Hospital Infection 73 (4) pp 345-54 2009
FONTANA C et al Emergence of KPC-producing Klebsiella pneumoniae in
Italy BMC Rev Notes 3 40 2010
61
GALES A C et al Antimicrobial resistance among Gram-negative bacilli
isolated from Latin America results from Sentry Antimicrobial Surveillance Program
(Latin America 2008-2010) Diagnostic Microbiology and Infectious Disease v 3 n
4 p 354 -360 2012
GUPTA N et al Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Epidemiology
and Prevention HEALTHCARE EPIDEMIOLOGY Clinical Infectious Diseases
201153(1)60ndash67 Published by Oxford University Press on behalf of the Infectious
Diseases Society of America 2011
HARBOTTLE H et al Genetics of antimicrobial resistance Anim Biotechnol
n17 p111-124 2006
HENRIQUE W N et al RESISTEcircNCIA BACTERIANA Uniatildeo das
Faculdades Alfredo NasserInstituto de Ciecircncias da Sauacutede Disponiacutevel em lt
httpwwwfaculdadealfredonasseredubrfilespesquisaposter20HENRIQUE20
Wilker20Natividade20SANTIAGO20Silvania20CAVALCANTI20DSP
20ResistC3AAncia20Bacterianapdfgt Acesso em 17 marccedilo 2014
HULSCHER M E J I et al Antibiotic prescribing in hospital a social and
behavioral scientific approach The Lancet Infectious Diaseases v 10 n 3 p 167-
165 2010
KIDWAI M SAPRA P BHUSHAN KR Synthetic strategies and medicinal
properties of beta-lactams Curr Med Chem 1999 695-215
KUMARASAMY K K et al Emergence of a new antibiotic resistance
mechanism in India Pakistan and the UK a molecular biological and
epidemiological stuy The Lancet Infectious Diseases v10 n 9 p 597- 602 2010
LINCOPAN N et al Enterobacteacuteria producing extended-spectrum β-
lacatamases and IMP-1 Metalo-β-lactamases isolated from Brazilian hospitals J Med
62
Microbiol 7 1-3 2006
LINCOPAN N et al First Isolation of Metalo-β-Lacatamase-Producing
Multiresistant Klebsiella pneumoniae from a patient in Brazil J Clin Microbiol 43(1)
516-519 2005
LIVERMORE D M et al What remains against carbapenem- resistant
Enterobacteriaceae Evaluation of choramphenicol ciprofloxacin colistina
fosfomycin minocycline nitrofurantoin temocilin and tigecycline International
Journal of Antimicrobial Agents v 37 n 5 p 415- 459 2011
LIVERMORE D M Fourten years in resistance International Journal of
Antimicrobial Agents v 39 283- 294 2012
LIVERMORE D M Bacterial resistance to carbapenems Adv Exp Med Biol
1995 39025-47
LIVERMORE D M Bacterial resistance origins epidemiology and impact
Clin Infect Dis 36S11-S23 2003
LIVERMORE D M et al Carbapenemases a problem in waiting Curr
Opin Microbiol 2000 3489-95
LU et al Universal pcr for common bacterial pathogens J CLIN
MICROBIOL VOL 38 2000
LU et al Use of PCR with Universal Primers and Restriction Endonuclease
Digestions for Detection and Identification of Common Bacterial Pathogens in
Cerebrospinal Fluid Journal of Clinical Microbiology June 2000 p 2076ndash2080
MARSCHALL J Met al Presence of the KPC Carbapenemase Gene in
Enterobacteriaceae Causing Bacteremia and Its Correlation with In Vitro
Carbapenem Susceptibility J Clin Microbiol 47 239-241 Jan 2009
63
MARTINS WMBS et al Prevalecircncia do gene blaKPC em isolados cliacutenicos
de Enterobacteriaceae e natildeo fermentadores encontrados em amostras clinicas em
um hospital universitaacuterio do Recife X Jornada de ensino pesquisa e extensatildeo ndash
JEPEX 2010 ndash UFRPE Recife 18 a 22 de outubro
MENDES C A C et al Polimixinas Revisatildeo com ecircnfase na sua
nefrotoxicidade Rev Assoc Med Bras 2009 55(6) 752-9
MOHR J F 3rd Update on the efficacy and tolerability of meropenem in the
treatment of serious bacteacuterial infections Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S41-51
2008
MONTEIRO J et al First report of KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae
strains in Brazil Antimicrob Agents Chemother Jan53(1)333-4 2009
MOREIRA V C et al Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia a antibioacuteticos
Disponiacutevel em
lthttpwwwcpglsucgbr6mostraartigosSAUDEVANESSA20CARVALHO20M
OREIRApdfgt Acesso em 21 marccedilo 2014
NETIKUL T et al Emergence of novel blaKPC-12 and blaKPC-13 variants in
carbapenem non-susceptible Enterobacter cloacae a first report of blaKPC gene in
Thailand European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases May
S372 2011
NETO V A et al Antibioacuteticos na praacutetica Meacutedica 6ordf Ediccedilatildeo Editorial
SarverSP Brasil 2007
NICOLAU D P Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of
meropenem Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S32-40 2008
64
OLIVEIRA A C et al Resistecircncia bacteriana e mortalidade em um centro de
terapia intensiva Rev Latino-Am Enfermagem nov-dez 2010
PAAUW A et al Failure to control an outbreak of qnrA 1-positive multidrug-
resistant Enterobacter clocae despite adequate implementation of recommended
infection control measures Journal of Clinical Microbiology v 45 n 5 p 1420-1425
2007
PATERSON D L et al Extended-Spectrum Beta-Lactamases a Clinical
Update Clinical Microbiology Reviews v 18 p 657-686 2005
PEIRANO G et al Carbapenem-hydrolysing beta-lactamase KPC-2 in
Klebsiella pneumonia isolated in Rio de Janeiro Brazil J Antimicrob Chemother Nov
20 2009
PERES-BOTA D et al Are infections due to resistant pathogens associated
with worse outcome in critically ill patients J Infect 200347(4)307-16
PIDDOCK L J V Clinically relevant chromosomally encoded multidrug
resistance effl ux pumps in bacterial Clin Microbiol Rev n19 p382-402 2006
PITOUT J D D et al Emergence of Enterobacteriaceae producing
extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) in the community J Antimicrob
Chemother May 56 2005
POSSEBON M I et al Resistecircncia bacteriana aos carbapenecircmicos
Bacterial resitence to carbapenems RBM rev bras med60(6)378380-378-382
jun 2003
QUEENAN A M et al Carbapenemases the versatile beta-lactamases
Clin Microbiol Rev Jul20(3)440-58 2007
65
RHOMBERG P R et al Summary trends for the meropenem yearly
susceptibility test information collection program a 10- year experience in the United
States (1999-2008) Diagnostic Microbiology and Infectiois Disease v 65 n4 p
414-426 2009
ROBLEDO I E et al Detection of KPC in Acinetobacter spp in Puerto Rico
J Antimicrob Agents Chemother 54 1354-1357 Mar 2010
ROGERS B A et al Country-to-country transfer os patients and the risk of
multi-resistant bacterial infection Clinical Infectious Disease v53 n1 p49- 56
2011
SHAH A A et al Characteristics epidemiology and clinicalimportance of
emerging strains of Gram-negative bacilli producing extended-spectrum
betalactamases Research in Microbiology v 155 p 409-421 2004
TURNER P J Extended- Spectrum Beta-Lactamases Clinical Infectious
Diseases v 41 p 273-275 2005
WOLTER D J et al Phenotypic and Enzymatic Comparative Analysis
between the Novel KPC variant KPC-5 and Its Evolutionary Variants KPC-2 and
KPC-4 Antimicrob Agents Chemother Nov 17 2008
WOODFORD N et al Carbapenemases of Chryseobacterium
(Flavobacterium) meningosepticum distribution of blaB and characterization of a
novel Metalo-beta-lactamase gene blaB3 in the type strain NCTC 10016
Antimicrob Agents Chemother Jun44(6)1448-52 2000
WOODFORF N Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in
India Pakistan and the UK a molecular biological and epidemiological study The
Lancet Infectious Diseases v 10 n 9 p 597-602 2010
66
WOODFORD et al Outbreak of Klebsiella pneumoniae Producing a New
Carbapenem- Hydrolyzing Class A β-Lactamase KPC-3 in a New York Medical
Center Antimicrobial agents and chemotherapy Dec 2004 p 4793ndash4799 Vol 48
No 12
YAGI T et al A preliminary survey of extended-spectrum β-lactamases
(ESBLs) in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Japan
FEMS Microbiology Letters 184 (2000) 53-56
YIGIT H et al Novel carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase KPC-1 from
a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumonia J Antimicrob Agents
Chemother 45 (4) 1151-1161 (2001)
ZAVASCKI A P et al KPC-2- producing Enterobacter cloacae in two cities
from Southern Brazil Int J Antimicrob Agents Apr 28 2009
ZHANEL G G et al Comparative review of the carbapenecircmicos Drugs
67(7)1027-52 2007
67
ANEXOS
Sequumlecircncia do oligo blaKPC
Query 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
Query 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
Query 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
68
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
Query 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
Query 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
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Sbjct 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
69
Query 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
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Sbjct 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
Query 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
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Sbjct 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
Query 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
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70
Sbjct 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
Query 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
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Sbjct 481
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ATTTGTT 540
Query 541
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GCGATAC 600
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Sbjct 541
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GCGATAC 600
Query 601
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71
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|||||||
Sbjct 601
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ATGCGCG 660
Query 661
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GCTCTGC 720
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Sbjct 661
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GCTCTGC 720
Query 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
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Sbjct 721
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CCGGCAA 780
72
Query 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
Query 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
Query 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
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|||||||
73
Sbjct 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
Query 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
Query 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
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Sbjct 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
Query 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
74
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
Query 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
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|||||||
Sbjct 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
Query 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
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|||||||
Sbjct 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
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75
Query 1261
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|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
Query 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
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|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
||||
Sbjct 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
LOCUS AF297554 1377 bp
DNA linear BCT 26-MAR-2001
DEFINITION Klebsiella pneumoniae carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
gene complete cds
ACCESSION AF297554
VERSION AF2975541 GI10121874
76
KEYWORDS
SOURCE Klebsiella pneumoniae
ORGANISM Klebsiella pneumoniae
Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Enterobacteriaceae Klebsiella
REFERENCE 1 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH QueenanAM
AndersonGJ Domenech-SanchezA
BiddleJW StewardCD
AlbertiS BushK and TenoverFC
TITLE Novel carbapenem-hydrolyzing beta-
lactamase KPC-1 from a
carbapenem-resistant strain of
Klebsiella pneumoniae
JOURNAL Antimicrob Agents Chemother 45 (4)
1151-1161 (2001)
PUBMED 11257029
REFERENCE 2 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH AndersonGJ and
TenoverFC
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (19-AUG-2000) Nosocomial
Pathogens Laboratory Branch
Centers for Disease Control and
Prevention 1600 Clifton Rd MS
G08 Atlanta GA 30333 USA
FEATURES LocationQualifiers
77
source 11377
organism=Klebsiella
pneumoniae
mol_type=genomic DNA
db_xref=taxon573
-35_signal 5560
-10_signal 7883
mRNA 921012
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
RBS 117122
CDS 1311012
note=blaKPC-1
codon_start=1
transl_table=11
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
protein_id=AAG134101
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translation=MSLYRRLVLLSCLSWPLAGFSATALTNLVAEPFAKLEQD
FGGSI
GVYAMDTGSGATVSYRAEERFPLCSSFKGFLAAAVLARSQQQAGLLDTPIRYG
KNALV
PWSPISEKYLTTGMTVAELSAAAVQYSDNAAANLLLKELGGPAGLTAFMRSIG
DTTFR
78
LDRWELELNSAIPSDARDTSSPRAVTESLQKLTLGSALAAPQRQQFVDWLKGN
TTGNH
RIRAAVPADWAVGDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTRAPNKDDK
HSEAV
IAAAARLALEGLGVNGQ
ORIGIN
1 cggggcagtt acagccgtta cagcctctgg
agagggagcg gcttgccgct cggtgataat
61 cccagctgta gcggcctgat tacatccggc
cgctacacct agctccacct tcaaacaagg
121 aatatcgttg atgtcactgt atcgccgtct
agttctgctg tcttgtctct catggccgct
181 ggctggcttt tctgccaccg cgctgaccaa
cctcgtcgcg gaaccattcg ctaaactcga
241 acaggacttt ggcggctcca tcggtgtgta
cgcgatggat accggctcag gcgcaactgt
301 aagttaccgc gctgaggagc gcttcccact
gtgcagctca ttcaagggct ttcttgctgc
361 cgctgtgctg gctcgcagcc agcagcaggc
cggcttgctg gacacaccca tccgttacgg
421 caaaaatgcg ctggttccgt ggtcacccat
ctcggaaaaa tatctgacaa caggcatgac
481 ggtggcggag ctgtccgcgg ccgccgtgca
atacagtgat aacgccgccg ccaatttgtt
541 gctgaaggag ttgggcggcc cggccgggct
gacggccttc atgcgctcta tcggcgatac
79
601 cacgttccgt ctggaccgct gggagctgga
gctgaactcc gccatcccaa gcgatgcgcg
661 cgatacctca tcgccgcgcg ccgtgacgga
aagcttacaa aaactgacac tgggctctgc
721 actggctgcg ccgcagcggc agcagtttgt
tgattggcta aagggaaaca cgaccggcaa
781 ccaccgcatc cgcgcggcgg tgccggcaga
ctgggcagtc ggagacaaaa ccggaacctg
841 cggagtgtat ggcacggcaa atgactatgc
cgtcgtctgg cccactgggc gcgcacctat
901 tgtgttggcc gtctacaccc gggcgcctaa
caaggatgac aagcacagcg aggccgtcat
961 cgccgctgcg gctagactcg cgctcgaggg
attgggcgtc aacgggcagt aaggctctga
1021 aaatcatcta ttggcccacc accgccgccc
ttgcgggcgg catggattac caaccactgt
1081 cacatttagg ctaggagtct gcgcggcaga
gccgtgtgac cggttttctg tagagcactg
1141 acgatggcgg cggcgctctc tgcaattggc
aaggcgtcgg cgccaaggat accaatcttg
1201 cggcgcgcgg cgtgttatga cgactggggt
gcatttgagc cgccccattt aaccttcgcc
1261 ctcacagata cgccattcgc ctcaaattta
gcgccatgca gacgagcttc cactcggctt
1321 gcaccttgtc caggcccctc atgctgaact
gacgcaatcc catcaccgcc ttgatca
80
19
frequumlecircncia em Klebsiella pneumoniae a KPC pode ser identificada em outras
bacteacuterias como a Enterobacter cloacae Citrobacter freundii Salmonella spp E coli
e Pseudomonas spp (DIENSTMANN et al 2010)
Os pacientes com comorbidades incluindo pacientes transplantados
neutropecircnicos em ventilaccedilatildeo mecacircnica em Unidade de Terapia Intensiva (UTI)
com longos periacuteodos de internaccedilatildeo que apresentam risco aumentado de infecccedilatildeo ou
colonizaccedilatildeo para bacteacuterias multirresistentes satildeo mais vulneraacuteveis a Klebsiella
pneumoniae produtora de KPC (COTRIM et al 2012)
Os sinais e sintomas apresentados por um indiviacuteduo infectado por KPC satildeo
febre ou hipotermia taquicardia piora do quadro respiratoacuterio e em casos mais
graves hipotensatildeo inchaccedilo e sepse Quanto ao siacutetio de infecccedilatildeo a bacteacuteria que
possui a enzima KPC pode causar pneumonia associada agrave ventilaccedilatildeo mecacircnica
infecccedilatildeo do trato urinaacuterio infecccedilatildeo de corrente sanguiacutenea infecccedilatildeo de partes moles
e outros tipos de infecccedilatildeo (COTRIM et al 2012)
Para desenvolver a infecccedilatildeo a colonizaccedilatildeo eacute um preacute-requisito poreacutem o
pacientes pode estar colonizado ou seja ser portadores de KPC e natildeo desenvolver
a infecccedilatildeo (ALVES et al 2013) A forma de transmissatildeo eacute basicamente por
contato com secreccedilatildeo ou excreccedilatildeo de pacientes infectados ou colonizados logo
fora do ambiente hospitalar a bacteacuteria natildeo representa perigo (COTRIM et al
2012)
As opccedilotildees terapecircuticas para o tratamento da Klebsiella pneumoniae eacute
dividida em Terapia Empiacuterica e Terapia apoacutes a determinaccedilatildeo do perfil de
sensibilidade A terapia empiacuterica para infecccedilotildees por enterobacteacuterias multirresistentes
se baseia na utilizaccedilatildeo de polimixina B ou polimixina E (Colistina) em associaccedilatildeo
com um (1) ou mais dos antimicrobianos da classe dos aminoglicosiacutedeos
(gentamicina ou amicacina) Carbapenecircmicos (meropenem ou doripenem) eou
tigeciclina (ANVISA 2013)
Recomenda-se usar sempre associaccedilotildees de dois ou trecircs antimicrobianos
sendo um deles a polimixina B ou a polimixina E (colistina) Deve-se evitar a
utilizaccedilatildeo de monoterapias pelo risco de raacutepido desenvolvimento de resistecircncia A
escolha do(s) faacutermaco(s) de associaccedilatildeo com polimixina B ou E deve se basear
preferencialmente no perfil de susceptibilidade esperado aos referidos
20
medicamentos das enterobacteacuterias resistentes aos carbapenecircmicos detectadas no
hospital ou na ausecircncia de dados locais na regiatildeo Deve-se considerar igualmente
o local de infecccedilatildeo e a penetraccedilatildeo esperada do antimicrobiano na escolha da droga
a ser utilizada na combinaccedilatildeo (ANVISA 2013)
Apoacutes a liberaccedilatildeo do perfil de sensibilidade deve-se adequar o uso dos
medicamentos Sempre que possiacutevel manter no miacutenimo 2 (dois) faacutermacos com
sensibilidade comprovada in vitro Natildeo havendo sensibilidade a um segundo
medicamento (suscetibilidade apenas agrave polimixina B ou E) recomenda-se manter a
terapia combinada de polimixina B ou E com carbapenecircmicos (meropenem ou
doripenem) ou tigeciclina na tentativa de ocorrecircncia de sinergismo entre elas
(ANVISA 2013)
Sugere-se aleacutem da determinaccedilatildeo das Concentraccedilotildees Inibitoacuterias Miacutenimas
(CIMs) para uma das polimixinas (B ou E) que tambeacutem sejam determinadas as
CIMs de tigeciclina e carbapenecircmicos (meropenem) bem como a consultoria de um
infectologista (ou Comissatildeo de Controle de Infecccedilatildeo Hospitalar- CCIH) para a
determinaccedilatildeo da terapia combinada com base na interpretaccedilatildeo do antibiograma
CIM e quadro cliacutenico do paciente No caso de resistecircncia agraves polimixinas
(concentraccedilotildees inibitoacuterias miacutenimas [CIMs] gt 2 mgL) recomenda-se a associaccedilatildeo de
dois ou trecircs do antimicrobianos sugeridos para a combinaccedilatildeo (ANVISA 2013)
A antissepsia eficiente do ambiente dos instrumentos ciruacutergicos e das matildeos
com o uso do aacutelcool a 70 eacute fundamental para a contenccedilatildeo de surtos Aleacutem disto
os pacientes contaminados devem permanecer isolados ateacute o controle da infecccedilatildeo
para evitar a disseminaccedilatildeo da bacteacuteria (COTRIM et al 2012)
1 2 Resistecircncia bacteriana
Hoje a disseminaccedilatildeo e a proliferaccedilatildeo das bacteacuterias resistentes estatildeo cada
dia mais presente As bacteacuterias multirresistentes (BRMD) poderatildeo levar agrave
humanidade a uma era poacutes-antibioacutetica resultando em uma ausecircncia de qualquer
opccedilatildeo de tratamento para os portadores destas cepas (HENRIQUE et al 2014)
Os fatores envolvidos na disseminaccedilatildeo desses patoacutegenos multirresistentes
satildeo diversos incluindo o uso irracional de antimicrobianos procedimentos invasivos
21
(cirurgias implantaccedilatildeo de proacuteteses meacutedicas e outros) e a transferecircncia de material
geneacutetico com a informaccedilatildeo de resistecircncia a antibioacuteticos entre as bacteacuterias
(DIENSTMANN et al 2010 ENDIMIAMI et al 2009 FONTANA et al 2010)
Com a praacutetica da antibioticoterapia principalmente em ambientes
nosocomiais os mecanismos de resistecircncia tornaram-se comuns Esses
mecanismos incluem alteraccedilatildeo na permeabilidade da membrana celular que
impede a entrada do antibioacutetico na ceacutelula bombeamento do antibioacutetico para fora da
mesma pelo mecanismo de efluxo mutaccedilatildeo geneacutetica que altera de alguma forma o
alvo do antibioacutetico e consequumlentemente natildeo afeta o funcionamento da bacteacuteria
bem como desenvolvimento da capacidade de degradar ou da inativaccedilatildeo do
antibioacutetico (COTRIM et al 2012) Estes mecanismos estatildeo representados na figura
3
Figura 3 Mecanismos de resistecircncia bacteriana Fonte
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controle
opas_webmodulo3pop_mecanismohtmgt
Um dos mais importantes mecanismos de resistecircncia eacute a alteraccedilatildeo do local-
alvo onde atua determinado antimicrobiano de modo a impedir a ocorrecircncia de
qualquer efeito inibitoacuterio ou bactericida As bacteacuterias podem adquirir um gene que
22
codifica um novo produto resistente aos antimicrobianos substituindo o alvo original
por exemplo o Staphylococcus aureus resistente agrave oxacilina e estafilococos
coagulase-negativos adquiriram o gene cromossocircmico Mec A e produzem uma PBP
ou PLP resistente aos β-lactacircmicos denominada 2a ou 2 que eacute suficiente para
manter a integridade da parede celular durante o crescimento quando outras PBPs
essenciais satildeo inativadas por antibimicrobianos β-lactacircmicos Como alternativa um
gene receacutem-adquirido pode atuar para modificar um alvo tomando-o menos
vulneraacutevel a determinado antimicrobiano Assim um gene transportado por
plasmiacutedeo ou por transposon codifica uma enzima que inativa os alvos ou altera a
ligaccedilatildeo dos antimicrobianos como ocorre com eritromicina e clindamicina (ANVISA
2007)
Em funccedilatildeo da bomba de efluxo pode variar a especificidade do antibioacutetico
Ele atua por meio do bombeamento ativo de antimicrobianos do meio intracelular
para o extracelular gerando uma resistecircncia bacteriana a determinados
antimicrobianos como eacute o caso da resistecircncia agraves tetraciclinas codificada por
plasmiacutedeos em Escherichia coli devido agrave presenccedila de proteiacutenas integrantes da
membrana plasmaacutetica bacteriana (PIDDOCK 2006)
O aumento da siacutentese de proteiacutenas eacute o principal responsaacutevel pela resistecircncia
antimicrobiana devido agraves vaacuterias mutaccedilotildees que ocorrem em seus repressores
transcricionais Estas mutaccedilotildees tambeacutem podem influenciar levando a um aumento
da eficiecircncia do transporte dos antibioacuteticos para o exterior da ceacutelula (HARBOTTLE
et al 2006)
A resistecircncia aos antibioacuteticos eacute frequumlentemente associada agrave alteraccedilatildeo
diminuiccedilatildeo da permeabilidade que ocorre na membrana externa das bacteacuterias gram-
negativas O fluxo de moleacuteculas para o interior da ceacutelula ocorre por caracteriacutesticas
peculiares como carga estrutura e dimensatildeo e atraveacutes de proteiacutenas de membrana
as quais formam canais Este percurso eacute utilizado pelos antibioacuteticos para atingir o
interior da ceacutelula bacteriana ou o espaccedilo periplasmaacutetico como eacute o caso dos
antibioacuteticos β-lactacircmicos Portanto a perda de funccedilatildeo destas proteiacutenas pode
efetivamente causar a diminuiccedilatildeo da susceptibilidade a vaacuterios antibioacuteticos
(LIVERMORE 2003)
23
Os mecanismos de resistecircncia que podem impedir a accedilatildeo de antimicrobianos
satildeo vaacuterios O faacutermaco atua de forma a inibir os processos essenciais a multiplicaccedilatildeo
e sobrevivecircncia da ceacutelula bacteriana como a membrana citoplasmaacutetica e
consequumlentemente bloqueando a siacutentese proteacuteica de aacutecidos nucleacuteicos e da parede
celular A resistecircncia bacteriana eacute um mecanismo natural de defesa Sendo assim
as bacteacuterias estatildeo em constante defesa e para cada novo faacutermaco desenvolvido as
bacteacuterias iratildeo desenvolver resistecircncia em algum momento (POSSEBON et al
2003)
O grupo de antibioacuteticos beta-lactacircmicos satildeo amplamente utilizado e se
encontram dentro da classe dos melhores agentes antimicrobianos com relevacircncia
cliacutenica No entanto o seu uso tem sido restringido devido a vaacuterios mecanismos de
resistecircncia O desenvolvimento dos carbapenecircmicos surgiu devido agrave proliferaccedilatildeo de
beta-lactamases mediadas por plasmiacutedeos e cromossomos (POSSEBON et al
2003)
A bacteacuteria KPC tem um gene chamado SHV-1 que tem a caracteriacutestica de
resistecircncia a quase todos os tipos de antimicrobianos inclusive os carbapenecircmicos
especiacuteficos para o tratamento de infecccedilotildees por bacteacuterias multiresistentes e
emergecircncias Mesmo com no seu coacutedigo geneacutetico a informaccedilatildeo necessaacuteria para o
desenvolvimento da resistecircncia a resistecircncia da bacteacuteria soacute eacute desenvolvida caso a
bacteacuteria entre em contato com o antibacteriano desencadeando todo o processo
nos casos de resistecircncia induzida comuns em KPC (MOREIRA et al 2014)
A resistecircncia bacteriana pode ser apresentada de forma intriacutenseca ou
adquirida A resistecircncia intriacutenseca faz parte das caracteriacutesticas fenotiacutepicas naturais
do microrganismo ou seja faz parte de sua heranccedila geneacutetica sendo transmitida
verticalmente a prole sem perda da caracteriacutestica A presenccedila ou ausecircncia do alvo
para a accedilatildeo da droga eacute o principal determinante deste tipo de resistecircncia
(MOREIRA et al 2014) Essa resistecircncia corresponde a uma caracteriacutestica de
espeacutecie bacteriana quando estes microrganismos satildeo naturalmente resistentes a
certo tipo de antibioacutetico Este processo eacute decorrente da ausecircncia de estruturas de
atuaccedilatildeo de antimicrobianos ou a impermeabilidade por parte de estruturas
perifeacutericas das bacteacuterias (HENRIQUE et al 2014)
24
A resistecircncia adquirida aos antibioacuteticos por sua vez ocorre quando haacute uma
da mutaccedilatildeo de genes reguladores ou estruturais aquisiccedilatildeo de genes de resistecircncia
veiculados por elementos geneacuteticos moacuteveis ou da combinaccedilatildeo entre eles Este
aparecimento de resistecircncia em uma espeacutecie bacteriana era anteriormente sensiacutevel
a droga e devido a um destes fatores se torna resistente O fenoacutetipo resultante
desta resistecircncia natildeo estaraacute presente nas ceacutelulas genitoras e sim nos indiviacuteduos de
uma linhagem bacteriana derivada de um organismo susceptiacutevel Os genes muitas
vezes satildeo adquiridos por meio de elementos moacuteveis como plasmiacutedeos e
transposons (MOREIRA et al 2014)
Entatildeo a resistecircncia adquirida ocorre por diversos mecanismos geneacuteticos tais
como produccedilatildeo de enzimas inativadoras interferecircncia com a entrada e acuacutemulo de
droga na bacteacuteria alteraccedilatildeo do receptor para accedilatildeo da droga via metaboacutelica
alternativa Eacute originada por meio de uma alteraccedilatildeo a niacutevel geneacutetico da ceacutelula de
natureza cromossocircmica pelos processos de mutaccedilatildeo transduccedilatildeo e transformaccedilatildeo
ou extra cromossocircmica (plasmidial) (HENRIQUE et al 2014)
Como todo antibioacutetico β-lactacircmicoos carbapenecircmicos tem como mecanismo
de accedilatildeo a inibiccedilatildeo da siacutentese proteacuteica atraveacutes da accedilatildeo de inibiccedilatildeo da parede
microbiana fazendo a ligaccedilatildeo e inativaccedilatildeo das proteiacutenas ligadoras de penicilinas
(NETO et al 2007)
Imipenem e meropenem antibioacuteticos pertencentes ao grupo dos
carbapenecircmicos possuem um amplo espectro de accedilatildeo in vitro incluindo atividade
contra cocos gram-positivos bacilos gram-negativos e bacteacuterias anaeroacutebias (MOHR
2008) Jaacute o ertapenem possui um espectro de accedilatildeo mais limitado que o os dois
antibioacuteticos anteriormente citados tendo uma eficiecircncia limitada contra os bacilos
gram-negativos natildeo fermentadores Um novo antibioacutetico carbapenecircmico ainda natildeo
disponiacutevel no Brasil doripenem possui uma atividade mais potente principalmente
contra Pseudomona aeruginosa devido ao seu mecanismo de accedilatildeo que combina os
espectros de accedilatildeo de imipenem e meropenem (ZHANEL et al 2007)
Devido as suas estabilidades espectro de accedilatildeo poucos relatos de
resistecircncia boa toleracircncia pelos pacientes com efeitos adversos mais comuns as
complicaccedilotildees no siacutetio da infusatildeo e toxicidade gastrintestinal estes antibioacuteticos
carbapenecircmicos tecircm sido considerados terapia de escolha (NICOLAU 2008) Como
25
uma resposta adaptativa das Enterobacteacuterias o iacutendice de resistecircncia aos
carbapenecircmicos tem aumentado nos uacuteltimos anos de forma proporcional ao seu
uso limitando imensamente as opccedilotildees terapecircuticas para as infecccedilotildees causadas por
estes microrganismos (FALAGAS et al 2009)
As enzimas produtoras de betalactamases hidrolisam o anel betalactacircmico
tornando este mecanismo de resistecircncia o mais importante Os dois grupos mais
preocupantes satildeo o grupo das betalactamases de aspecto ampliado e os da
carbapenemases que aleacutem de hidrolizar os carbapenecircmicos hidrolizam todas as
outras classes de betalactacircmicos Em enterobacteacuterias as carbapenemases mais
prevalentes satildeo codificadas por genes dos grupos blaKpc blaIMP blaVIM blaNdm
e blaOxa A ocorrecircncia de carbapenemases eacute mais frequentemente em bacteacuterias
gram-negativas fermentadoras da glicose conhecidas como enterobacteacuterias
predominantes nos gecircneros Klebsiella Serratia Citrobacter Enterobacter
Escherichia Samonella Proteus Morganella Podem ser encontradas tambeacutem em
bacteacuterias gram-negativas natildeo fermentadoras como espeacutecies de Acinetobacter e de
Pseudomonas (ALVES et al 2013)
Carbapenemases satildeo enzimas plasmiacutedio-mediados resistentes a todos
antibioacuteticos betalactacircmicos As bacteacuterias que possuem o gene blaKpC responsaacutevel
pela codificaccedilatildeo da produccedilatildeo de carbapenemases apresentam resistecircncia aos
antibioacuteticos betalactacircmicos impedindo a accedilatildeo destes antibioacuteticos contra infecccedilotildees
(ALVES et al 2013)
A transmissatildeo das carbapenemases a diferentes cepas de enterobacteacuterias se
daacute atraveacutes de plasmiacutedeos que satildeo pequenas moleacuteculas circulares de DNA com a
capacidade de se replicarem independentemente do DNA cromossocircmico
permitindo a troca de material geneacutetico entre gecircneros e espeacutecies diferentes de
enterobacteacuterias O raacutepido desenvolvimento de surtos em ambientes hospitalares eacute
explicado por essa disseminaccedilatildeo plasmidial (COTRIM et al 2012)
De acordo com o criteacuterio de interpretaccedilatildeo do Clinical and Laboratory
Standards Institute (CLSI 2009) a maioria das KPC isoladas natildeo apresenta
resistecircncia completa aos carbapenecircmicos (Imipenem e Meropenem apresentam
uma Concentraccedilatildeo Inibitoacuteria Miacutenima (CIM) de 2-8 μgmL) (COTRIM et al 2012)
26
Os mecanismos de resistecircncia capazes de impedir a accedilatildeo dos
carbapenecircmicos satildeo vaacuterios Poreacutem a degradaccedilatildeo de antibioacuteticos por enzimas
principalmente as carbapenemases constituem o principal mecanismo de
resistecircncia aos antibioacuteticos β-lactacircmicos (DIAS 2009) Devido a ampla atividade
hidroliacutetica agrave maioria dos antibioacuteticos β-lactacircmicos estes grupos de enzimas possuem
alta versatilidade (QUEENAM et al 2007)
Existem trecircs grandes classes moleculares de Ambler a qual as
carbapenemases pertencem denominadas classe A (serino-carbapenemases os
quais incluem membros designados SME IMI NMC GES e a famiacutelia das KPCs)
classe B(as metalo-β-lactamase incluem os tipos IMP e VIM) e classe D
(oxacilinases similares as da classe A e incluem as OXA e PSE) (DIAS 2009)
Dentre estes as mais importantes e prevalentes encontradas em plasmiacutedeos
de Klebsiella pneumoniae satildeo as KPC (DIENSTMANN et al 2010) Por meio de
estudos moleculares a enzima KPC jaacute foi documentada em diferentes bacteacuterias e
diferenciada em KPC-1 a 13 (NETIKUL et al 2011) No ano de 2009 foi realizada
uma pesquisa onde descreveram as seguintes carbapenemases KPC-1 em isolados
de Klebsiella pneumoniae KPC-2 em K pneumoniae K oxytoca Salmonella
enterica e em Enterobacter sp e KPC-3 em K pneumoniae e Enterobacter cloacae
(MONTEIRO et al 2009) As enzimas KPC-4 e KPC-5 foram encontradas em
isolados de Pseudomonas aeruginosa (PEIRANO et al 2009)
Foi observada uma correccedilatildeo da sequumlecircncia KPC-1 indicando que o gene
blaKPC-1 e blaKPC-2 satildeo idecircnticos Trecircs novas variantes blaKPC-3 blaKPC-4 e
blaKPC-5 satildeo resultados de mutaccedilotildees do gene estrutural da enzima KPC-2
(WOLTER et al 2008) apresentando diferentes perfis de hidroacutelise As enzimas
KPC-2 e KPC-3 possuem alta eficiecircncia em hidrolisar cefalotina cefaloridina e
nitrocefin poreacutem possuem uma menor eficiecircncia contra carbapenecircmicos e
cefotaxima (ALBA et al 2005) As enzimas KPC-5 e KPC-4 apresentam menor
hidroacutelise de carbapenecircmicos eacute do que em KPC-2 Em contrapartida possuem
melhor eficiecircncia contra ceftazidima e uma maior inibiccedilatildeo pelo aacutecido clavulacircnico
(WOLTER et al 2008)
27
13 Anaacutelise geneacutetica de microrganismos
Eacute de extrema importacircncia praacutetica natildeo soacute no aspecto cliacutenico mas tambeacutem na
fitopatologia biotecnologia e estudos ambientais a correta identificaccedilatildeo e
classificaccedilatildeo de microrganismos Os meacutetodos usados na diferenciaccedilatildeo de gecircneros
espeacutecies e estirpes de microrganismos podem ser divididos em meacutetodos fenotiacutepicos
(baseados em fenocircmenos bioquiacutemicos fisioloacutegicos e bioloacutegicos) e genotiacutepicos
(detectam polimorfismos ao niacutevel dos aacutecidos nucleacuteicos ou variaccedilatildeo aleacutelica ao niacutevel
de enzimas) (ALVES et al 2003)
Para este tipo de estudo existem alguns meacutetodos como o RFLPrsquos -
ldquoRestriction Fragment Length Polymorphismsrdquo (polimorfismos de tamanho de
fragmentos de restriccedilatildeo) rep-PCR (Meacutetodo de tipagem baseado na amplificaccedilatildeo via
PCR de elementos de DNA repetitivos presentes em genomas bacterianos) anaacutelise
de sequumlecircncias nucleotiacutedeas (discriminaccedilatildeo eou identificaccedilatildeo atraveacutes de sequumlecircncias
de DNA) PFGE - Pulsed-Field Gel Electrophoresis (Eletroforese em campo
pulsado) ( A L V E S et al 2003)
A diferenciaccedilatildeo clara da cepa e principalmente a alta reprodutibilidade devem
ser caracteriacutesticas de qualquer meacutetodo de tipagem geneacutetica Poreacutem nem todos os
meacutetodos moleculares de tipagem satildeo igualmente eficazes Sendo assim de acordo
com a finalidade pretendida (identificaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo custo reprodutibilidade
etc) eacute feita a escolha do meacutetodo a ser aplicado (A L V E S et al 2003)
O processo de identificaccedilatildeo fenotiacutepica de KPC entre os membros da famiacutelia
Enterobacteriaceae ainda eacute difiacutecil e os meacutetodos para a sua identificaccedilatildeo devem ser
revistos e ajustados Mesmo com o avanccedilo tecnoloacutegico natildeo existem ensaios que
combinam alta especificidade e sensibilidade na detecccedilatildeo destas enzimas Satildeo
diversas as metodologias usadas para rastreamento de KPC como por exemplo a
focalizaccedilatildeo isoeleacutetrica a teacutecnica de disco-difusatildeo E-test teste de Hodge
modificado dentre outros Aleacutem disso a pesquisa do gene blaKPC pode ser feita
pela Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) Os sistemas de automaccedilatildeo
existentes no entanto podem natildeo identificar com precisatildeo os isolados KPC
positivos (COTRIM et al 2012)
A identificaccedilatildeo blaKPC pelo PCR eacute um meacutetodo raacutepido preciso sensiacutevel e
altamente especiacutefico no entanto a PCR exige equipamento e conhecimentos
28
especializados em diagnoacutestico molecular dificultando ainda a utilizaccedilatildeo dele na
rotina dos laboratoacuterios de microbiologia (COTRIM et al 2012)
Em estudo de infecccedilotildees hospitalares identificaccedilatildeo molecular de patoacutegenos
bacterianos eacute bastante utilizada Para diferenciar carbapenemases tipo KPC a partir
de outros tipos como SME NMC-A-IMI e GES eacute necessaacuterio um exame molecular
As identificaccedilotildees do microrganismo juntamente com a triagem molecular iratildeo definir
um resultado mais especiacutefico podendo ser usado para identificar o antibioacutetico mais
adequado para o tratamento Poreacutem a principal desvantagem de alguns exames
baseados em PCR por exemplo eacute que devido agrave sua limitada capacidade de
multiplexaccedilatildeo eles distinguem apenas algumas variaccedilotildees (MOREIRA et al 2014)
Estatildeo descritas para a identificaccedilatildeo molecular de patoacutegenos pertencentes agrave
famiacutelia Enterobacteriaceae as teacutecnicas de PFGE RAPD (randomly amplified
polymorphic DNA) e ERIC-PCR (Enterobacterial Repet it ive Intergenic Consensus)
A PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) eacute considerada padratildeo ouro devido sua
alta capacidade de diferenciaccedilatildeo baseada na anaacutelise do perfil de restriccedilatildeo do DNA
genocircmico por meio de eletroforese Como desvantagem para a sua execuccedilatildeo eacute
necessaacuterios vaacuterios dias impedindo a tipagem de algumas cepas bacterianas devido
agrave degradaccedilatildeo do DNA aleacutem do alto custo empregado (MOREIRA et al 2014)
O meacutetodo baseado em ERIC-PCR tem sido bastante utilizado como uma
alternativa para a teacutecnica de PFGE Esta teacutecnica consiste na anaacutelise do padratildeo de
amplificaccedilatildeo de elementos repetidos encontrados no genoma bacteriano Isto
permite uma maior rapidez na obtenccedilatildeo de resultados quando comparada com o
PFGE aleacutem de alta reprodutibilidade simples execuccedilatildeo e implementaccedilatildeo baixo
custo e natildeo sem problemas com a degradaccedilatildeo do DNA (MOREIRA et al 2014)
A PCR eacute considerada uma teacutecnica de biologia molecular revolucionaacuteria que
consiste na siacutentese enzimaacutetica de coacutepias de aacutecidos nucleacuteicos Ela permitiu o raacutepido
desenvolvimento do estudo de sequumlecircncias de aacutecidos nucleacuteico Foi desenvolvida por
Kary Banks Mullis que ganhou o precircmio Nobel de quiacutemica de 1993 devido ao
desenvolvimento dessa teacutecnica em abril de 1983 (CAMARGO et al 2014)
Por meio de etapas de variaccedilatildeo de temperatura a teacutecnica de PCR promove a
duplicaccedilatildeo de cadeias de DNA in vitro A reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo de DNA por PCR
envolve o emprego de sequumlecircncias iniciadoras (primers) quatro nucleotiacutedeos
29
(dNTPrsquos) do DNA e uma DNA polimerase termoestaacutevel podendo assim obter-se a
partir de uma fita molde muitas coacutepias de uma sequumlecircncia especiacutefica de aacutecido
nucleacuteico O princiacutepio da PCR consiste na variaccedilatildeo de temperatura por ciclo
envolvendo trecircs etapas baacutesicas desnaturaccedilatildeo pareamento e amplificaccedilatildeo
(CAMARGO et al 2014)
A desnaturaccedilatildeo da fita molde de DNA eacute uma etapa com duraccedilatildeo entre 30
segundos a 1 minuto a temperatura entre 92 ordmC a 96 ordmC Apoacutes isso o pareamento de
dois iniciadores sinteacuteticos de composiccedilotildees distintas que funcionam como os
iniciadores da reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo liga-se agrave regiatildeo complementar da fita de
DNA alvo que sofreraacute a duplicaccedilatildeo Esta etapa tem duraccedilatildeo de 30 segundos a 1
minuto a temperatura entre 58 ordmC e 65 ordmC Por uacuteltimo a amplificaccedilatildeo por meio da
enzima Taq DNA polimerase das novas fitas de DNA se daacute a partir de cada um dos
iniciadores utilizando os quatro dNTPrsquos como substrato da reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo
Esta etapa possui duraccedilatildeo entre 45 segundos e 1 minuto a 72 ordmC Cada ciclo eacute
repetido em torno de 30 a 35 vezes e promove a amplificaccedilatildeo da regiatildeo alvo
determinada conforme o anelamento dos iniciadores sinteacuteticos de DNA (CAMARGO
et al 2014) Estas etapas estatildeo demonstradas na figura 4
Figura 4 Etapas da Reaccedilatildeo de PCR
30
2 JUSTIFICATIVA
No ano de 2010 no Distrito Federal foram identificados 111 pacientes com
suspeita de infecccedilatildeo por Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) e a
Secretaria de Sauacutede do Distrito Federal confirmaram ainda a morte de 18 pacientes
dentre os hospitais puacuteblicos e particulares Um desafio encontrado por ocasiatildeo do
surto infeccioso no Distrito Federal foi o de confirmar as KPCs por Reaccedilatildeo da
Polimerase em Cadeia sendo que as amostras foram enviadas com esta finalidade
para a Fiocruz no Rio de Janeiro
Pesquisas que possam contribuir na elaboraccedilatildeo de estrateacutegias preventivas e
de intervenccedilatildeo para infecccedilotildees causadas por enterobacteacuterias bem como contribuir
para gerar uma integraccedilatildeo beneacutefica entre a equipe acadecircmica e os serviccedilos de
sauacutede devem ser estimuladas Neste sentido o presente estudo permitiu escrutinar
os genes envolvidos na expressatildeo de carbapenemases presentes em espeacutecies de
enterobacteacuterias isoladas em ambiente hospitalar visto que elucidar genes de
resistecircncia de enterobacteacuterias aos antibioacuteticos carbapenecircmicos eacute o primeiro passo
para garantir um controle epidemioloacutegico efetivo para estes tipos de microorganismo
assim como sua associaccedilatildeo com surtos fatais particularmente em pacientes com
baixa imunidade
31
3 OBJETIVOS
31 Objetivo geral Caracterizar os genes de resistecircncia das
Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases e os aspectos epidemioloacutegicos de
pacientes internados em um hospital puacuteblico do Distrito Federal
32 Objetivos Especiacuteficos
Identificar genotipicamente a enzima KPC (Klebsiella pneumoniae
carbapenemase) de isolados de Klebsiella pneumoniae
Investigar aspectos epidemioloacutegicos dos pacientes portadores de
Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases
Identificar quais variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana influenciaram para o
desfecho oacutebito ou alta
Avaliar a susceptibilidade das Enterobacteacuterias aos antibioacuteticos
carbapenecircmicos dos pacientes em ambiente hospitalar
32
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
Trata-se de um estudo transversal onde foi realizado o teste de
susceptibilidade das enterobacteacuterias aos antibioacuteticos carbapenecircmicos a partir dos
materiais bioloacutegicos coletados dos pacientes internados no Hospital Regional da Asa
Norte (HRAN) e enviados ao Laboratoacuterio de Anaacutelises Cliacutenicas da mesma Instituiccedilatildeo
Os materiais bioloacutegicos investigados foram sangue aspirado traqueal ou brocircnquico
urina e cultura semi quantitativa de ponta de cateter venoso central O HRAN eacute um
hospital puacuteblico do Distrito Federal com 395 leitos sendo as cliacutenicas de internaccedilatildeo
Berccedilaacuterio Cirurgia Geral Cirurgia Plaacutestica Cliacutenica Meacutedica Ginecologia Maternidade
Pediatria Queimados UTI com atendimento a pacientes portadores de doenccedilas de
caraacuteter cliacutenico e ciruacutergico
4 1 Coleta e transporte das amostras bioloacutegicas
As amostras foram coletadas de pacientes internados no Hospital Regional da
Asa Norte (HRAN) com suspeitas de infecccedilatildeo por KPC A identificaccedilatildeo primaacuteria foi
realizada pelo Laboratoacuterio de Microbiologia do hospital de origem dos pacientes e os
demais procedimentos que foram utilizados na identificaccedilatildeo encontram-se descritos
abaixo
4 2 Procedimentos para confirmaccedilatildeo de resistecircncia bacteriana por
disco de ertapenem (adaptado CDC 2004)
Para diagnosticar amostra como portadora de bacteacuteria produtora de
carbapenemase foi realizado o teste com disco de ertapenem como forma de
triagem Inicialmente utilizou-se o swab contaminado com a amostra que foi
distribuiacuteda em uma pequena aacuterea da placa de aacutegar MacConkey para apoacutes o
crescimento ser realizada a pesquisa de colonizaccedilatildeo por enterobacteacuterias resistentes
aos carbapenecircmicos (Pesquisa de CRE) Procedeu-se a semeadura por teacutecnica
semi-quantitativaesgotamento com alccedila bacterioloacutegica na diluiccedilatildeo de 1100 O disco
de Ertapenem foi colocado na superfiacutecie da placa de MacConkey na junccedilatildeo dos dois
primeiros campos de semeadura conforme demonstrado na figura 5 Incubou a placa
33
em estufa aeroacutebia a 35ordmC por 24 e 48 horas e observou-se o halo de difusatildeo do
disco de Ertapenem na placa para proceder agrave leitura
O teste deixou de ser obrigatoacuterio apoacutes a modificaccedilatildeo dos criteacuterios
interpretativos para carbapenecircmicos para enterobacteacuterias publicados no suplemento
do CLSI 2010 M100-S20-U
Figura 5 Mecanismo de semeamento de material bioloacutegico oriundos de
pacientes com suspeita de infecccedilatildeo por KPC Fonte adaptado CDC 2004
4 2 1 Interpretaccedilatildeo dos resultados
Na ausecircncia de crescimento ateacute 24 horas (MacConkey) ou halo de difusatildeo
gt27 mm na placa deve-se reincubar as placas por mais 24 horas Quando for
ausente o crescimento apoacutes 48 horas ou halo de difusatildeo gt27 mm na placa libera-se
como enterobacteacuterias resistentes a carbapenecircmicos (KPCNEG)Havendo
crescimento de colocircnias na placa de MacConkey com halo lt 27 mm (apenas para
colocircnias com crescimento dentro do halo) deve-se reisolar e realizar identificaccedilatildeo e
antibiograma automatizado teste de sensibilidade por disco-difusatildeo e Teste de
Hodge Modificado (THM) Os isolados de enterobacteacuterias cujos testes comprovarem
a resistecircncia aos carbapanecircmicos testados (KPCPOS) foram reportado a Comissatildeo
de Controle de Infecccedilatildeo Hospitalar (CCIH) Jaacute osbacilos Gram-negativos natildeo
fermentadores natildeo foram reportados (KPCNEG) Para interpretaccedilatildeodos resultados
foram utilizados os valores conforme demonstrados na tabela 1
Tabela 1 Criteacuterios Interpretativos para testes de sensibilidade
ENTEROBACTEacuteRIAS
Disco difusatildeo (mm) MIC (microgml)
34
Antibioacutetico Sigla S I R S I R
Ertapenem 10
microg
ETP 22 19-
21
18 05 1 2
Meropenem 10
microg
MEM 23 20-
22
19 1 2 4
Fonte Manual Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)
2013
Os resultados que apresentaram resistecircncia ao antibioacutetico Ertapenem foram
considerados como suspeitos de contaminaccedilatildeo por KPC Fez-se o teste de
susceptibilidade aos antibioacuteticos (TSA) em aparelho automatizado MicroScan Walk
Away 96sl Dade Behring
4 3 Teste de susceptibilidade aos antibioacuteticos (adaptado CDC 2004)
A determinaccedilatildeo da susceptibilidade dos isolados foi feita pelo teste de
susceptibilidade aos antibioacuteticos (TSA) apoacutes cultura em meio de gelose simples
(INSA) para avaliaccedilatildeo da sua pureza e obtenccedilatildeo de colocircnias isoladas Para
preparaccedilatildeo de uma suspensatildeo bacteriana com turvaccedilatildeo aproximada de 05
McFarland (Dade BehringMicroScanregTurbidity Meter) ressuspendeu duas a cinco
colocircnias em 2ml de soro fisioloacutegico esteacuteril diluindo a 1100 em soro fisioloacutegico num
volume total de 10ml em seguida foi feita uma semeadura em duas placas
quadradas (120mm x 120mm) de Muller-Hinton Agar (INSA) por inundaccedilatildeo
Os discos de antibioacutetico carbapenecircmicos imipenem meropenem e
ertapenem (Biorad) foram aplicados com o auxiacutelio de um dispensador automaacutetico A
susceptibilidade das Enterobacteacuterias aos carbapenecircmicos foi definida de acordo
com o protocolo Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI 2011)
Para aquelas Enterobacteacuterias que apresentaram resistecircncia ao ertapenem
foram realizados o Teste de Hodge Modificado para Detecccedilatildeo de Enterobacteacuterias
Produtoras de Carbapenemases conforme descrito pelo Centers for Disease Control
and Prevention (CDC 2004)
35
4 4Teste de Hodge Modificado (THM) (adaptado CDC 2004)
Preparou-se uma suspensatildeo em salina esteacuteril com a cepa Escherichia coli
ATCC 25922 (padratildeo 05 de McFarland) Apoacutes isto diluiu a suspensatildeo 110 em
salina (05 ml da soluccedilatildeo de Ecoli ATCC 25922 + 45 ml salina)Foi entatildeo semeado
na superfiacutecie de uma placa de Agar Muller-Hinton com a suspensatildeo diluiacuteda de Ecoli
ATCC 25922 com auxilio de swab seco assegurando que houvesse uma
distribuiccedilatildeo uniforme cobrindo toda a superfiacutecie do Agar Deixou secar por 3 a 5
minutos em temperatura ambienteColocou-se o disco de ertapenem 10microg no centro
da placa e apoacutes isto fez-se uma estria linear da cepa a ser testada da borda do
disco ateacute a borda da placa utilizando uma alccedila calibrada 10 microl ou um swab Incubou
a placa na estufa em atmosfera aeroacutebia a 35 plusmn 2ordmC por 16 a 24 horas
441 Controle de qualidade (CQ)
Foi utilizado um CQ todos os dias em que se realizou o teste tendo como
controle Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1705- teste de Hodge modificado
positivo Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1706- teste de Hodge modificado
negativo
442 InterpretaccedilatildeoResultados
Apoacutes 16ndash24 horas de incubaccedilatildeo examinar as placas para verificar a presenccedila
de uma distorccedilatildeo no halo de inibiccedilatildeo do disco de ertapenem devido ao crescimento
realccedilado da cepa ATCC na intersecccedilatildeo do organismo teste e a Ecoli ATCC 25922
dentro dos limites do halo O THM positivo apresentaraacute presenccedila de distorccedilatildeo no
halo de inibiccedilatildeo de ertapenem devido ao crescimento da cepa Ecoli ATCC 25922 ao
longo da estria da cepa teste para dentro dos limites do halo de inibiccedilatildeo Jaacute o THM
negativo teraacute ausecircncia de crescimento da cepa Ecoli ATCC 5922 ao longo da estria
da cepa teste para dentro dos limites do halo de inibiccedilatildeo do disco de ertapenem
Este resultado estaacute representado na figura 6
36
Figura 6 Interpretaccedilatildeo resultado do Teste de Hodge Modificado
(adaptado CDC 2004) Teste positivo na estria da cepa teste na parte superior
da placa teste negativo na estria da cepa teste na parte inferior da placa
Tendo positivo como resultado o paciente era um provaacutevel contaminado por
KPC As amostras entatildeo foram encaminhadas para a Fundaccedilatildeo Osvaldo Cruz
(FIOCRUZ) para confirmaccedilatildeo final As amostras finalmente confirmadas como
positivas para KPC foram isoladas e guardadas no banco de cepas cliacutenicas do
hospital Apoacutes a autorizaccedilatildeo do CEP amostras das cepas foram transferidas para
meio de transporte Stuard em caixa teacutermica fechada em baixa temperatura e
levadas para o laboratoacuterio de microbiologia cliacutenica da universidade
No laboratoacuterio da universidade as amostras foram separadas e realizadas
repiques em meios MacConkey e incubadas por 24h As colocircnias caracteriacutesticas
foratildeo isoladas em caldo BHI e mantidas em shaker a 37oC por 2h Apoacutes isto foram
executadas as anaacutelises a seguir
Os isolados de Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases foram
submetidos agrave extraccedilatildeo de DNA e posterior sequumlenciamento para identificaccedilatildeo dos
genes de resistecircncia blaKPC de 1 a 13 e identificaccedilatildeo do gene universal Os
pacientes de onde os materiais bioloacutegicos contendo as Enterobacteacuterias produtoras
de carbapenemases foram os isolados foram investigados quanto aos aspectos
epidemioloacutegicos e cliacutenicos
37
4 5 Extraccedilatildeo de DNA bacteriano
A extraccedilatildeo de DNA bacteriano foi realizada utilizando o kit NucleoSpin
Plasmidreg (MN) Antes de iniciar a extraccedilatildeo foi feito a preparaccedilatildeo das soluccedilotildees
reagentes materiais e amostras (vortexando) colocou-se em banho-maria agrave 50ordmC o
tampatildeo AW Partiu-se de colocircnias isoladas cultivadas que sofreram passagem em
meio LB liacutequido por 12h Adicionou-se 15 mL da amostra no tubo eppendorf
centrifugou por 5 minutos descartou o sobrenadante (com cuidado para natildeo
descartar o Pellet) Repetiu-se este procedimento por mais trecircs vezes completando-
se o volume de 6mL Foram adicionados 250microL do tampatildeo Resuspension Buffer A1
encostando a ponteira no Pellet e misturando (este tampatildeo tem como funccedilatildeo
separar a formaccedilatildeo de grumos celulares) Apoacutes isso homogeneizou e vortexou os
tubos eppendorfs Apoacutes isso foram adicionados 250microL do tampatildeo Lysis Buffer A2
homogenizou e deixou descansar por 5 minutos (esta etapa eacute importante para a lise
da parede e da membrana celulares e liberaccedilatildeo do conteuacutedo da ceacutelula)
Passado o tempo de descanso foi adicionado 300microL do tampatildeo
Neutralization Buffer A3 homogeneizou e centrifugou por 10 minutos (este tampatildeo
iraacute retirar as proteiacutenas que envolvem o DNA e voltaraacute com o pH para proacuteximo de 8
impedindo que a soluccedilatildeo de lise facilite a quebra das ligaccedilotildees covalentes do aacutecido
nucleacuteico) Em seguida enumeraram-se os tubos contendo filtros com siacutelica
transferiu-se o sobrenadante para o filtro e centrifugou por 5 minutos Descartou-se
o que foi filtrado adicionou 500microL do tampatildeo AW (banho-maria) centrifugou por 2
minutos Novamente foi descartado o filtrado Adicionou-se 600microL do tampatildeo A4
centrifugou por 2 minutos e descartou o filtrado (os tampotildees AW e A4 contecircm
isotiocianato de guanidina em concentraccedilotildees crescentes para facilitar a adsorccedilatildeo
do DNA na siacutelica e retirada das outras biomoleacuteculas da amostra) Foi feita outra
centrifugaccedilatildeo com o tubo vazio Apoacutes isto o filtro foi trocado para outro eppendorf
definitivo onde foi adicionado 50microL do tampatildeo Elution Buffer AE (este tampatildeo
favorece a eluiccedilatildeo do DNA) centrifugou por 2 minutos descartou o filtro e
armazenou as amostras em freezer -20ordmC
38
4 6 Iniciadores e reaccedilatildeo de PCR
Os iniciadores universais para o gene blaKPC foram desenhados baseados
em sequumlecircncias conservadas apresentadas pelos sub-grupos de genes que
codificam a enzima carbapenemase de klebsiella pneumoniae (YIGIT et al 2001)
Baseado na sequumlecircncia para o blakpc-1 depositada no GenBank
(AF2975541) o oligonucleotiacutedio (oligo) iniciador direto (5-
ATGTCACTGTATCGCCGTC-3rsquo) foi desenhado para reconhecer a sequumlecircncia
blaKPC na posiccedilatildeo (131149) enquanto que o iniciador reverso (5-
TTACTGCCCGTTGACGCC-3rsquo) foi reconhecido na posiccedilatildeo (9951012) As anaacutelises
baseadas em alinhamento de sequumlecircncias mostraram que o par de iniciadores
blaKPC podem detectar os alelos de 1 a 13 do gene blaKPC conforme a tabela 2
Tabela 2 Nuacutemero de acesso ao GenBank dos alelos blaKPC e seus
microrganismos originais
Nuacutemero de
Acesso GenBank
Microrganismo Alvo
AF2975541 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-1
GU0862251 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-2
HQ2589341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-2-like
AB5577341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC -3
EU4473041 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-4
EU4002222 Pseudomonas
aeruginosa
blaKPC-5
EU5555341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-6
EU7297271 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-7
39
FJ2344121 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-8
FJ624872 Escherichia coli blaKPC-9
GQ1403481 Acinetobacter
baumannii
blaKPC-10
HM0669951 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-11
HQ3428891 Enterobacter cloacae blaKPC-12
HQ3428901 Enterobacter cloacae blaKPC-13
As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo de blaKPC foram realizadas em um
primeiro tempo de desnaturaccedilatildeo em que foi 94ordmC por 5 minutos seguido de 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 58 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 90 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 78ordmC por 8 minutos Aleacutem das amostras foi utilizado um
controle negativo
A PCR do blaKPC foi realizada utilizando os componentes para o volume da
reaccedilatildeo de 25 microL citados na tabela 3 A banda do tamanho do produto de PCR foi de
881 pares de bases (pb) o que corresponde ao plasmiacutedeo
Tabela 3 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do
gene blaKPC
Reagente Volume
DNA molde 4 microL
Tampatildeo Taq 25 microL
MgCl2 075 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP
2 microL
Oligo F 1 microL
Oligo R 1 microL
Taq DNA polimerase 05 microL
Aacutegua MiliQ 1335 microL
40
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
Baseado na sequumlecircncia para o gene 16S rRNA em que o oligonucleotiacutedio
Universal iniciador direto foward (5-CCAGCAGCCGCCGTAATACG-3rsquo) foi
desenhado para reconhecer a sequumlecircncia universal na posiccedilatildeo 1513 enquanto que o
iniciador reverso (5-ATCGGYTACCTTGTTACGACTTC-3rsquo) foi reconhecido na
posiccedilatildeo 1491 foram realizadas PCRrsquos As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo deste
gene foram realizadas nos seguinte tempos separaccedilatildeo 94ordmC por 10 minutos 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 55 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 120 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 72ordmC por 10 minutos
A PCR do gene 16S rRNA foi realizada utilizando os componentes para o
volume da reaccedilatildeo de 25microL citados na tabela 4 A banda do tamanho do produto de
PCR foi de 996 pb correspondente aacute regiatildeo ribossomal capaz de amplificar todas
as espeacutecies
Tabela 4Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do gene
universal
Reagente (quantidade
concentraccedilatildeo do estoque)
Volume
DNA molde 10 ng 4 microL
Tampatildeo Taq 10 x 25 microL
MgCl2 50mM 125 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP 25 mM
125 microL
Oligo F 10microM 05 microL
Oligo R 10microM 05 microL
Taq DNA polimerase 5UmicroL 04 microL
Aacutegua Miliq 146 microL
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
41
O termociclador utilizado para os experimentos foi o LifeTouch da BIOER
4 7 Digestatildeo
Para realizaccedilatildeo da digestatildeo foi utilizada a enzima BshF I (Hae III) EN- 1105
tamanho 7000 units concentraccedilatildeo 10 unitsmicroL fonte Bacillus sphaericus empresa
Jena bioscienceUtilizaram-se os componentes para o volume de 50microL da reaccedilatildeo
citados na tabela 5
Tabela 5 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da digestatildeo do gene
universal
Reagente Volume
Produto de PCR 10 microL
Enzima BshF I 01 microL
Tampatildeo (10x) 5 microL
Aacutegua Miliq 349 microL
Total (em cada ependorff) 50 microL
Valores para 1 digestatildeo
Os ependorffs foram colocados por 30 minutos em banho-maria a 37ordmC Apoacutes
isso fez-se a corrida das amostras em gel de agarose para verificaccedilatildeo do resultado
(LU et al 2000)
4 8 Eletroforese em gel de agarose
Os produtos de DNA PCR e digestatildeo foram analisados em gel de agarose
2 O tempo de corrida do gel eacute de aproximadamente 1hora e 30minutos sendo
que no comeccedilo foi usada agrave voltagem de 50 V e apoacutes comeccedilar a correr o gel
aumentou a voltagem para 100 v Utilizou-se o marcador de 100pb (pares de bases)
Foi adicionado 3microL de corante Bromophenol (que tem a funccedilatildeo de fazer uma ligaccedilatildeo
na amostra de DNA e permitir a visualizaccedilatildeo da corrida no gel de agarose) em 7microL
de amostra tanto de DNA quanto de PCR Para o preparo do gel foi utilizado TBE
42
(Tris- Aacutecido Boacuterico) agarose e brometo de etiacutedio (sua funccedilatildeo eacute de corante para o gel
e permitir a visualizaccedilatildeo do DNA quando colocado agrave luz ultravioleta) Para o oligo
blaKPC a banda da amplificaccedilatildeo foi em 881ppb correspondendo ao plasmiacutedeo Jaacute
o oligo Universal foi em 996 pb
4 9 Descarte de resiacuteduos
Todos os materiais utilizados nos ensaios foram de uso uacutenico e manipulados
em cacircmaras de seguranccedila bioloacutegica classe II Apoacutes o uso foram colocados em
soluccedilatildeo desinfetantes (hipoclorito a 1) e em seguida autoclavados a 127oC por 20
min em sacos apropriados para autoclavaccedilatildeo Apoacutes a finalizaccedilatildeo do ciclo de
esterilizaccedilatildeo os sacos contendo o material descartaacutevel foram colocados em
recipientes de coleta da empresa responsaacutevel pela coleta de materiais bioloacutegicos
produzidos no laboratoacuterio de microbiologia Todos os procedimentos seguiram a
normativa RDC-ANVISA 3062004 sobre o descarte de resiacuteduos de serviccedilo de
sauacutede
4 10 Aspectos epidemioloacutegicos e cliacutenicos
Os aspectos cliacutenicos e epidemioloacutegicos foram investigados por meio de
prontuaacuterios dos pacientes portadores de enterobacteacuterias produtoras de
carbapenemases e envolveram topografia mais provaacutevel do foco infeccioso a
enfermidade motivadora da internaccedilatildeo o desfecho cliacutenico a idade e o tempo de
internaccedilatildeo
4 12 Anaacutelises eepidemioloacutegicas
As anaacutelises foram realizadas com o pacote estatiacutestico SPSS versatildeo 200
Para verificar quais variaacuteveis referentes aos dados epidemioloacutegicos e
microbioloacutegicos influenciaram no desfecho verificou- se a diferenccedila meacutedia das
variaacuteveis idade e tempo de internaccedilatildeo em cada grupo O teste estatiacutestico utilizado foi
o teste t de Student apoacutes se executar o teste de normalidade de Shapiro-Wilk Para
as variaacuteveis sexo perfil microbioloacutegico das enterobacteacuterias produtoras de
43
carbapenemases foi avaliada a associaccedilatildeo com o desfecho por meio do teste Exato
de Fisher O niacutevel de significacircncia adotado foi de 5
4 13 Preceitos eacuteticos
Este projeto estaacute inserido em um projeto maior denominado ldquoEpidemiologia
cliacutenica e caracterizaccedilatildeo molecular do Acinetobacter Baumannii resistente a
antibioticoterapia em pacientes internado em hospitais do Sistema Uacutenico de Sauacutederdquo
que foi submetido ao Comitecirc de Eacutetica em Pesquisa da Secretaria do Estado de
Sauacutede do Distrito Federal (SESDF) e emitido parecer aprovado pelo protocolo nordm
23109 (anexo)
44
5 RESULTADOS
51 Anaacutelise molecular
Para a amplificaccedilatildeo com o oligo blaKPC foram amplificadas amostras
que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 881 pb correspondente ao
plasmiacutedeo A anaacutelise da amplificaccedilatildeo da regiatildeo do gene blaKPC mostrou que
apenas a amostra A10 natildeo amplificou isso demonstra que esta amostra natildeo
possuiacutea o gene de resistecircncia
5 1 1 Gene blaKPC
Figura 7 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 881 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
A amostra A3 natildeo amplificou no primeiro momento entatildeo foi realizado
novamente a PCR e corrida de gel obtendo entatildeo a amplificaccedilatildeo da amostra como
apresentado na figura 8
45
Figura 8 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC da
mostra A3 estudada A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo de 881
pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 1 2 Gene 16S rRNA
Para a amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA utilizou-se o oligo universal Foram
amplificadas amostras que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 996 pb
Figura 9 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
46
Segundo Lu et al (2000) a digestatildeo com a enzima HaeIII deste amplicons de
16S rRNA devolveriam bandas com perfis entre 150 a 200 pb No gel abaixo eacute
possiacutevel evidenciar que este perfil ocorreu com o predomiacutenio de bandas na altura
de 200pb
Figura 10 Gel de agarose a 2 da digestatildeo do amplicon do gene 16S
rRNA das amostras com a enzima HaeIII evidenciando diversos fragmentos
proacuteximos a 200 pb A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo ribossomal
de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 2 Anaacutelises epidemioloacutegicas
5 2 1 Sexo
No total foram detectados 17 isolados de KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 onde a maior a prevalecircncia foi
detecatada em amostras de pacientes do sexo masculino (53) do que no sexo
feminino (47)
47
Figura 11 Isolado de KPC segundo sexo dos 17 pacientes investigados
no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 2 Desfecho cliacutenico
Em 17 isolados de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo
de 2010 aacute 2011 a porcentagem de pacientes que foram a oacutebito (59) foi maior que
a de pacientes que tiverm alta (41)
Figura 12 Isolado de KPC segundo desfecho cliacutenico dos 17 pacientes
investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
48
5 2 3 Local da coleta
Dos 17 episoacutedios detectados de infecccedilatildeo por KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 a infecccedilatildeo em swab retalfoi mais
frequente (47) seguida de ponta de cateacuteter (18) e secreccedilatildeo traqueal (12)
Figura 13 Isolados de KPC segundo local da coleta da amostra nos 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 4 Microorganismo
O microorganismo mais encontrado foi a Klebsiella pneumoniae (82)
seguida da Enterobacter clocae (12) e Serratia marcescens (6) dos 17 isolados
de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 Isto afirma o
fato de a sigla KPC ser utilizada de forma errocircnea aacute Klebsiella pneumoniae visto
que a evidecircncia dela eacute maior em relaccedilatildeo as outras cepas
49
Figura 14 Isolado de KPC segundo microrganismo encontrado em 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 5 Relaccedilotildees variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana e desfecho
cliacutenico
Tabela 6 ndash Distribuiccedilatildeo do perfil geneacutetico sexo coleta tipificaccedilatildeo de
microrganismos e anaacutelise da resistecircncia bacteriana segundo o desfecho
cliacutenico Brasiacutelia-DF 2010 a 2011
Variaacutevel Resultado
Desfecho
Alta Oacutebito
N N P
Gene 16S rRNA Positivo 7 1000 10 1000
NA Gene blaKPC Positivo 6 857 10 1000
Negativo 1 143 0 00 0218 Sexo Feminino 2 286 6 600
Masculino 5 714 4 400 0201 Local da coleta Fundo saco de
Douglas 1 143 0 00
Hemocultura 0 00 1 100 0463 Ponta de cateter 1 143 2 200
Sec TraquealBrocircnquica
0 00 1 100
50
Secreccedilatildeo traqueal 2 286 0 00
Swab retal 3 429 5 500
Urina 0 00 1 100
Microrganismo Enterobacter cloacae (KPC)
1 143 1 100
Klebsiella pneumoniae
6 857 8 800
0416 Serratia
marcescens 0 00 1 100
Teste de Hodge Hodge positivo 7 1000 10 1000
NA Amicacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 1 100 0848 resistente 0 00 1 100
sensiacutevel 2 286 3 300
Amoxicilina Aacutecido Clavulacircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Ampicilina Sulbactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ampicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Aztreonan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefazolina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Cefoperazona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Cefotaxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefoxitina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0509 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 2 286 4 400
Ceftazidima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cetriaxona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 3 429 5 500 0772 Cefalotina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ciprofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772
51
resistente 3 429 5 500
Claritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Clindamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Eritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Gentamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0942 resistente 2 286 3 300
sensiacutevel 1 143 2 200
Imipenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 0 00 2 200 0193 Resistente 1 143 3 300
sensiacutevel 2 286 0 00
Nitrofurantoiacutena sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Norfloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Oxacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Penicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Piperacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Rifampicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tetraciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Ticarcilina Aacutecido Clavulocircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0688 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 3 429 4 400
Tobramicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Trimetoprima Sulfametoxazol
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0112 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 2 286 0 00
Vancomicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tigeciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediario 0 00 1 100 0211 natildeo testado 1 143 4 400
resistente 2 286 0 00
52
Cefepime sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefuroxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Levofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Piperacilina Tazobactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Ertapenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Meropenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0223 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 1 143 0 00
Cefotetan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 sensiacutevel 0 00 1 100
Gemifloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 7 700 0585 natildeo testado 3 429 3 300
Desfecho
Alta Oacutebito
Meacutedia Erro
padratildeo Meacutedia Erro
padratildeo p
Idade 58 9 59 5 0991
Tempo Internaccedilatildeo (dias)
50 13 46 12 0571
n= 17 p(lt 005) NA natildeo se aplica
53
6 DISCUSSAtildeO
Nos uacuteltimos anos houve um aumento na incidecircncia de bacteacuterias
multirresistentes aos antimicrobianos no ambiente hospitalar tornando isto um
problema mundial de sauacutede puacuteblica (HULSCHER et al 2010) Quando se trata
principalmente de bacilos Gram negativos a frequumlecircncia destas bacteacuterias eacute ainda
maior em paiacuteses da Ameacuterica Latina quando comparada a paiacuteses desenvolvidos
(GALES etal 2012)
De acordo com dados do ldquoMeropenem Yearly Susceptibility Test Information
Collectionrdquo (MYSTIC) ocorreu nos Estados Unidos um aumento na susceptibilidade
de K pneumoniae nos uacuteltimos anos graccedilas a praacuteticas de controle de disseminaccedilatildeo
de amostras resistentes(RHOMBERG P R et al 2009) O aumento crescente da
prevalecircncia destes microrganismos foi proporcional ao aumento da dependecircncia do
uso de antibioacuteticos carbapenecircmicos considerados como a opccedilatildeo terapecircutica para o
tratamento de infecccedilotildees por bacilos Gram negativos multi-resistentes (LIVERMORE
2012) Isto afeta diretamente as opccedilotildees de tratamento sobrando poucas alternativas
para a terapecircutica que incluem colistina (polimixina E) e tigeciclina que apresentam
respectivamente problemas em termos de toxicidade e eficaacutecia (LIVERMORE et
al 2011) Um dos efeitos adversos mais importantes das poliminas B e E por
exemplo satildeo a neurotoxicidade e nefrotoxicidade (MENDES C A C et al2009 )
Devido agrave resistecircncia ser usualmente de natureza plasmidial e portanto de
maior disseminaccedilatildeo especialmente quando carreadas por K pneumoniae
microrganismo com uma notoacuteria capacidade para acumular e transferir plasmiacutedeos
com determinantes para resistecircncia o nuacutemero de casos detectados pelo
fenoacutetipogenoacutetipo blaKPC eacute bastante preocupante (MONTEIRO et al 2009)
Comparada com outras bacteacuterias hospitalares a transmissatildeo de clones
multirresistentes de K pneumoniae eacute maior e podem natildeo ser controladas pelos
meacutetodos de controle de infecccedilatildeo hospitalar (PAAUW et al 2007) A forma
plasmidial para transferecircncia da resistecircncia adicionada a este grande potencial para
disseminaccedilatildeo de clones resistentes eacute preocupante visto que apoacutes surtos muitas
vezes pode se tornar endecircmica Jaacute eacute uma realidade a disseminaccedilatildeo desta bacteacuteria
54
entre pacientes hospitais paiacuteses e ateacute mesmo continentes (WOODFORF et al
2010 ROGERS et al 2011)
As chances de surtos satildeo maiores em paiacuteses com poucos recursos devido agrave
maior carecircncia de praacuteticas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees hospitalares e o
uso irracional de antimicrobianos de forma empiacuterica e inadequada (KUMARASAMY
et al 2010) Ateacute o momento os mecanismos de resistecircncia aos cabapenecircmicos
geralmente encontrado eram a produccedilatildeo de ESBL (CTX-M) somada aacute perda de
porina (CARVALHAES et al 2010) Foi notado a partir do ano de 2008 um
aumento no nuacutemero de K pneumoniae produtoras de KPC-2 apresentando outra
forma de resistecircncia (GALES 2012)
Um estudo mostrou que o perfil do paciente colonizado ou infectado por KPC
foi de um paciente entre os 33 e os 82 anos de idade internado haacute mais de 1
semana no hospital A mortalidade geral nos uacuteltimos anos ficou em torno de 7
sendo que dos 77 pacientes estudados 32 (415) pacientes evoluiacuteram para oacutebito
evidenciando a alta morbi-mortalidade associada (ALVES A P et al 2013)
Em estudo com 2316 pacientes avaliados a populaccedilatildeo de sexo masculino foi
de 526 idade meacutedia global de 53 anos (mediana de 55 anos) permanecircncia meacutedia
de 58 dias (mediana de 3 dias) (OLIVEIRA A C et al 2010) Outros trabalhos
apresentaram ausecircncia de significacircncia entre sexoidade e o desenvolvimento de
infecccedilotildees por microrganismos resistentes (PERES-BOTA D et al 2003 COLPAN
A et al 2005 COELLO R et al 1997)
Outro estudo utilizou um total de 30 amostras sendo elas isoladas de urina
escarro secreccedilatildeo pleural ponta de cateter aspirado traqueal e hemocultura A mais
prevalente foi em urina (40) Entre as 30 cepas analisadas a maior porcentagem
foi da cepa Klebsiella pneumoniae (70) Enterobacter sp (133) Klebsiella
ozaenae (10) Escherichia coli (333) e Klebsiella oxytoca (333)
(DIENSTMANN R et al 2010) Nos Estados Unidos a enzima KPC jaacute se tornou
endecircmica Foi realizada uma pesquisa em dois hospitais de Nova York onde
testaram 602 amostras e 45 apresentaram algum mecanismo de resistecircncia
sendo apenas 33 confirmadas por biologia molecular como KPC-2 (BRATU et
al 2005)
55
Estudo sobre os tipos de ESBL feito no Japatildeo apresentou o tipo Toho-1 como
o mais prevalente nessa pesquisa Ateacute o ano de 2000 ano em que foi publicado tal
estudo este era o primeiro relatoacuterio no Japatildeo para identificar derivados de ESBLs
como tipo de SHV e TEM entre E coli e K pneumoniae Em especial o tipo SHV- 12
foi identificado com uma maior frequumlecircncia Estes resultados indicam que tipos
distintos de ESBLs que satildeo diferentes em sua especificidade de substrato e origem
geneacutetica coexistem no Japatildeo Isto mostra a importacircncia de caracterizar genoacutetipos
distintos de ESBLs e de estar em alerta continuamente para as tendecircncias de
ESBLs no Japatildeo aleacutem da necessidade de uma interpretaccedilatildeo uniforme utilizando as
diretrizes do CSLI para relatar cepas produtoras de ESBL Aleacutem da detecccedilatildeo de
ESBLs satildeo necessaacuterias mais informaccedilotildees tais como o perfil de sensibilidade
especiacutefica para diversas β-lactacircmicos e o local da infecccedilatildeo Esses fatores satildeo
essenciais para a escolha adequada de antibioacuteticos (YAGI T et al 2000)
No ano de 2004 uma pesquisa avaliou a produccedilatildeo de uma enzima de
hidroacutelise de carbapenecircmicos atraveacutes da teacutecnica de sequumlenciamento foi revelado
um novo membro da famiacutelia KPC designado KPC- 3 Pesquisadores encontraram
em um mutante de K pneumoniae uma substituiccedilatildeo de um gene associado com
resistecircncia a Imipenem mas essa substituiccedilatildeo foi considerada improvaacutevel na
contribuiccedilatildeo da resistecircncia aos carbapenecircmicos da espeacutecie estudada Aleacutem da
resistecircncia aos carbapenecircmicos estes isolados eram em sua maioria resistentes agraves
cefalosporinas penicilinas e aminoglicosiacutedeos Usando estudos de transformaccedilatildeo
conjugaccedilatildeo e hibridaccedilatildeo localizaram o alelo blaKPC em plasmiacutedeo aleacutem disso
mostraram que esse alelo tambeacutem carregava uma resistecircncia aos aminoglicosiacutedeos
A transferecircncia das enzimas KPCs foi demonstrada in vitro tanto neste como em
outros estudos pode ser que os plasmiacutedeos que fazem esta transferecircncia estavam
comeccedilando a se espalhar no ambiente cliacutenico resultando na multiresistecircncia dessas
estirpes (WOODFORD et al 2004)
O presente estudo apresentou um vieacutes quanto aos resultados dos testes de
susceptibilidade microbiana Observou-se que natildeo foi encontrado resultado deste
teste em algumas amostras o que natildeo cooperou para um estudo mais preciso
futuros estudos quanto agraves amostras e um melhor acompanhamento deste tipo de
patologia Poreacutem mesmo sem algumas amostras com este resultado disponiacutevel foi
56
confirmada a presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos
carbapenecircmicos por meio dos genes de resistecircncia blaKPC e 16S rRNA que as
amostras apresentaram em sua maioria serem portadoras Quanto aos resultados
estatiacutesticos nenhuma das variaacuteveis apresentou significacircncia estatiacutestica (p gt 005)
mostrando assim que estas variaacuteveis isoladas natildeo foram o fator determinante para
o desfecho cliacutenico de alta ou oacutebito
57
7 CONCLUSAtildeO
Os genes blaKPC e 16S rRNA foram caracterizados confirmando a a
presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos carbapenecircmicos
Houve uma maior prevalecircncia da cepa K pneumoniae e isto confirma outros
estudos que apresentam a maior prevalecircncia desta cepa em amostras com KPC
Aleacutem disso isso justifica a forma popular da K pneumoniae ser chamada de KPC
enquanto que na verdade KPC eacute uma enzima podendo estar presente em outras
cepas como Enterobacter clocae tambeacutem apresentada no presente estudo O
desfecho cliacutenico de oacutebitos maior que 50 eacute um possiacutevel indicador sobre a
necessidade de se realizar um teste raacutepido para identificaccedilatildeo de KPC visando
iniciar o mais raacutepido possiacutevel o tratamento afim de diminuir a mortalidade por esta
infecccedilatildeo
Nenhuma das variaacuteveis isoladamente estaacute relacionada ao desfecho cliacutenico
oacutebito ou alta pois natildeo apresentaram relevacircncia estatiacutestica O presente estudo
mostrou que haacute presenccedila da bacteacuteria nas amostras de pacientes do hospital
estudado podendo entatildeo afirmar que este tipo de bacteacuteria se encontra tambeacutem
presente em ambiente hospitalar O uso irracional de antimicrobiano eacute demonstrado
de forma indireta quando foi apresentado atraveacutes do Teste de Hodge Modificado
uma resistecircncia de 100 aos antibioacuteticos carbapenecircmicos Isto tambeacutem reflete na
terapecircutica sendo que pacientes portadores de bacteacuterias resistentes aos
antibioacuteticos carabepecircmicos tem uma escassa opccedilatildeo de tratamento e as opccedilotildees
apresentam problemas quanto agrave toxicidade e eficaacutecia
58
REFEREcircNCIAS
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Mecanismos
de resistecircncia bacteriana aos antimicrobianos Disponiacutevel em
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controleopas_
webmodulo3mec_sitiohtmgt Acesso em 25 de abril de 2014
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Nota teacutecnica nordm
012013 medidas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees por enterobacteacuterias
multiresistentes Acesso em 17 de abril de 2013
ALBA J et al Kinetics study of KPC-3 a plasmid-encoded class A
carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase Antimicrob Agents Chemother
Nov49(11)4760-2 2005
ALVES A P et al Nosocomial infections by KPC-producing enterobacteria in
a tertiary hospital in Southern Brazil Revista da AMRIGS Porto Alegre 57 (3) 213-
218 jul-set 2013
ALVES A et al Tipagem Geneacutetica de Microrganismos Lab De Diversidade
Microbiana Centro de Biologia Celular Dep de Biologia U de Aveiro 3810-193
Aveiro- 2003
BELL J M et Al Prevalence and significance of a negative extended-
spectrum beta-lactamase (ESBL) confirmation test result after a positive ESBL
screening test result for isolates of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae
results from the SENTRY Asia-Pacific Surveillance Program J Clin Microbiol
May45(5)1478-82 2007
BRATU S et al Detection of KPC carbapenem-hydrolyzing enzymes in
Enterobacter spp from Brooklyn New York Antimicrob Agents Chemother v 49 n
2 p 776-8 2005
59
BRATU S et al Emergence of KPC-possessing Klebsiella pneumoniae in
Brooklyn New York epidemiology and recommendations for detection Antimicrob
Agents Chemother v 49 n 7 p 3018-20 2005
BRATU S et al Rapid spread of carbapenem-resistant Klebsiella
pneumoniae in New York City Arch Intern Med v 165 p 1430-5 2005
CAMARGO C F et al Aplicaccedilatildeo das teacutecnicas de pcr e suas teacutecnicas
derivadas em diagnoacutestico molecular Disponiacutevel em
ltfileDUnB10C2BA20semestreArtigosPCR-
20CLEYTON20FLORENCIO20DE20CAMARGO20E20PAULO20ROB
ERTO20QUEIROZpdfgtgt Acesso em 08 de abril de 2014
CARVALHES C G et al Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting
carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive
results Journal of Antimicrobial Chemotherapy v 65 n2 p 249-251 2010
CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION- CDC Modified
Hodge Test for Carbapenemase Detection in Enterobacteriaceae 2004
CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE Methods for
dilutionantimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically Approved
standard M7ndashA7 7th ed CLSI Wayne PA 2011
COELLO R et al Risk factors for developing clinical infection with methicillin-
resistant Staphylococcus aureus (MRSA) amongst hospital patients initially only
colonized with MRSA J Hosp Infect 19973739-46
COLPAN A et al Evaluation of risk factors for mortality in intensive care
units A prospective study from a referral hospital in Turkey Am J Infect Control
200533(1)42-7
60
CORNAGLIA G et al Living with ESBLs Introduction Clinical Microbiology
and Infection 14 Suppl 1 1-2 2008
COTRIM E R et al Klebsiella pneumoniae carbapenemase ndash KPC em
Enterobacteriaceae o desafio das bacteacuterias multirresistentes Poacutes em revista do
centro universitaacuterio Newton Paiva 12012 - ediccedilatildeo 5 - issn 2176 7785
DESHPANDE L M et al Occurrence and characterization of
carbapenemase-producing Enterobacteacuteriaceae report from the SENTRY
Antimicrobial Surveillance Program (2000-2004) Microb Drug Resist 12(4)223-30
2006
DIAS D J A Estudos dos principais mecanismos de resistecircncia aos
antibioacuteticos β-lactacircmicos em bacteacuterias patogecircnicas gram negativas 2009 100 f
Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Geneacutetica Molecular e Biomedicina) ndash Faculdade de
Ciecircncias e Tecnologia Universidade de Nova Lisboa Lisboa
DIENSTMANN R et al Avaliaccedilatildeo fenotiacutepica da enzima Klebsiella
pneumoniae carbapenemase (KPC) em Enterobacteriaceae de ambiente hospitalar
J Bras Patol Med Lab v 46 n 1 p 23-27 fevereiro 2010
ENDIMIAMI A et al Emergence of blaKPC-containing Klebsiella
pneumoniae in a long-term acute care hospital a new challenge to our healthcare J
Antimicrob Chemother 64 1102-1110 Nov 2009
FALAGAS M E et al Extended-spectrum beta-lactamase producing
organisms The Journal of Hospital Infection 73 (4) pp 345-54 2009
FONTANA C et al Emergence of KPC-producing Klebsiella pneumoniae in
Italy BMC Rev Notes 3 40 2010
61
GALES A C et al Antimicrobial resistance among Gram-negative bacilli
isolated from Latin America results from Sentry Antimicrobial Surveillance Program
(Latin America 2008-2010) Diagnostic Microbiology and Infectious Disease v 3 n
4 p 354 -360 2012
GUPTA N et al Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Epidemiology
and Prevention HEALTHCARE EPIDEMIOLOGY Clinical Infectious Diseases
201153(1)60ndash67 Published by Oxford University Press on behalf of the Infectious
Diseases Society of America 2011
HARBOTTLE H et al Genetics of antimicrobial resistance Anim Biotechnol
n17 p111-124 2006
HENRIQUE W N et al RESISTEcircNCIA BACTERIANA Uniatildeo das
Faculdades Alfredo NasserInstituto de Ciecircncias da Sauacutede Disponiacutevel em lt
httpwwwfaculdadealfredonasseredubrfilespesquisaposter20HENRIQUE20
Wilker20Natividade20SANTIAGO20Silvania20CAVALCANTI20DSP
20ResistC3AAncia20Bacterianapdfgt Acesso em 17 marccedilo 2014
HULSCHER M E J I et al Antibiotic prescribing in hospital a social and
behavioral scientific approach The Lancet Infectious Diaseases v 10 n 3 p 167-
165 2010
KIDWAI M SAPRA P BHUSHAN KR Synthetic strategies and medicinal
properties of beta-lactams Curr Med Chem 1999 695-215
KUMARASAMY K K et al Emergence of a new antibiotic resistance
mechanism in India Pakistan and the UK a molecular biological and
epidemiological stuy The Lancet Infectious Diseases v10 n 9 p 597- 602 2010
LINCOPAN N et al Enterobacteacuteria producing extended-spectrum β-
lacatamases and IMP-1 Metalo-β-lactamases isolated from Brazilian hospitals J Med
62
Microbiol 7 1-3 2006
LINCOPAN N et al First Isolation of Metalo-β-Lacatamase-Producing
Multiresistant Klebsiella pneumoniae from a patient in Brazil J Clin Microbiol 43(1)
516-519 2005
LIVERMORE D M et al What remains against carbapenem- resistant
Enterobacteriaceae Evaluation of choramphenicol ciprofloxacin colistina
fosfomycin minocycline nitrofurantoin temocilin and tigecycline International
Journal of Antimicrobial Agents v 37 n 5 p 415- 459 2011
LIVERMORE D M Fourten years in resistance International Journal of
Antimicrobial Agents v 39 283- 294 2012
LIVERMORE D M Bacterial resistance to carbapenems Adv Exp Med Biol
1995 39025-47
LIVERMORE D M Bacterial resistance origins epidemiology and impact
Clin Infect Dis 36S11-S23 2003
LIVERMORE D M et al Carbapenemases a problem in waiting Curr
Opin Microbiol 2000 3489-95
LU et al Universal pcr for common bacterial pathogens J CLIN
MICROBIOL VOL 38 2000
LU et al Use of PCR with Universal Primers and Restriction Endonuclease
Digestions for Detection and Identification of Common Bacterial Pathogens in
Cerebrospinal Fluid Journal of Clinical Microbiology June 2000 p 2076ndash2080
MARSCHALL J Met al Presence of the KPC Carbapenemase Gene in
Enterobacteriaceae Causing Bacteremia and Its Correlation with In Vitro
Carbapenem Susceptibility J Clin Microbiol 47 239-241 Jan 2009
63
MARTINS WMBS et al Prevalecircncia do gene blaKPC em isolados cliacutenicos
de Enterobacteriaceae e natildeo fermentadores encontrados em amostras clinicas em
um hospital universitaacuterio do Recife X Jornada de ensino pesquisa e extensatildeo ndash
JEPEX 2010 ndash UFRPE Recife 18 a 22 de outubro
MENDES C A C et al Polimixinas Revisatildeo com ecircnfase na sua
nefrotoxicidade Rev Assoc Med Bras 2009 55(6) 752-9
MOHR J F 3rd Update on the efficacy and tolerability of meropenem in the
treatment of serious bacteacuterial infections Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S41-51
2008
MONTEIRO J et al First report of KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae
strains in Brazil Antimicrob Agents Chemother Jan53(1)333-4 2009
MOREIRA V C et al Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia a antibioacuteticos
Disponiacutevel em
lthttpwwwcpglsucgbr6mostraartigosSAUDEVANESSA20CARVALHO20M
OREIRApdfgt Acesso em 21 marccedilo 2014
NETIKUL T et al Emergence of novel blaKPC-12 and blaKPC-13 variants in
carbapenem non-susceptible Enterobacter cloacae a first report of blaKPC gene in
Thailand European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases May
S372 2011
NETO V A et al Antibioacuteticos na praacutetica Meacutedica 6ordf Ediccedilatildeo Editorial
SarverSP Brasil 2007
NICOLAU D P Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of
meropenem Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S32-40 2008
64
OLIVEIRA A C et al Resistecircncia bacteriana e mortalidade em um centro de
terapia intensiva Rev Latino-Am Enfermagem nov-dez 2010
PAAUW A et al Failure to control an outbreak of qnrA 1-positive multidrug-
resistant Enterobacter clocae despite adequate implementation of recommended
infection control measures Journal of Clinical Microbiology v 45 n 5 p 1420-1425
2007
PATERSON D L et al Extended-Spectrum Beta-Lactamases a Clinical
Update Clinical Microbiology Reviews v 18 p 657-686 2005
PEIRANO G et al Carbapenem-hydrolysing beta-lactamase KPC-2 in
Klebsiella pneumonia isolated in Rio de Janeiro Brazil J Antimicrob Chemother Nov
20 2009
PERES-BOTA D et al Are infections due to resistant pathogens associated
with worse outcome in critically ill patients J Infect 200347(4)307-16
PIDDOCK L J V Clinically relevant chromosomally encoded multidrug
resistance effl ux pumps in bacterial Clin Microbiol Rev n19 p382-402 2006
PITOUT J D D et al Emergence of Enterobacteriaceae producing
extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) in the community J Antimicrob
Chemother May 56 2005
POSSEBON M I et al Resistecircncia bacteriana aos carbapenecircmicos
Bacterial resitence to carbapenems RBM rev bras med60(6)378380-378-382
jun 2003
QUEENAN A M et al Carbapenemases the versatile beta-lactamases
Clin Microbiol Rev Jul20(3)440-58 2007
65
RHOMBERG P R et al Summary trends for the meropenem yearly
susceptibility test information collection program a 10- year experience in the United
States (1999-2008) Diagnostic Microbiology and Infectiois Disease v 65 n4 p
414-426 2009
ROBLEDO I E et al Detection of KPC in Acinetobacter spp in Puerto Rico
J Antimicrob Agents Chemother 54 1354-1357 Mar 2010
ROGERS B A et al Country-to-country transfer os patients and the risk of
multi-resistant bacterial infection Clinical Infectious Disease v53 n1 p49- 56
2011
SHAH A A et al Characteristics epidemiology and clinicalimportance of
emerging strains of Gram-negative bacilli producing extended-spectrum
betalactamases Research in Microbiology v 155 p 409-421 2004
TURNER P J Extended- Spectrum Beta-Lactamases Clinical Infectious
Diseases v 41 p 273-275 2005
WOLTER D J et al Phenotypic and Enzymatic Comparative Analysis
between the Novel KPC variant KPC-5 and Its Evolutionary Variants KPC-2 and
KPC-4 Antimicrob Agents Chemother Nov 17 2008
WOODFORD N et al Carbapenemases of Chryseobacterium
(Flavobacterium) meningosepticum distribution of blaB and characterization of a
novel Metalo-beta-lactamase gene blaB3 in the type strain NCTC 10016
Antimicrob Agents Chemother Jun44(6)1448-52 2000
WOODFORF N Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in
India Pakistan and the UK a molecular biological and epidemiological study The
Lancet Infectious Diseases v 10 n 9 p 597-602 2010
66
WOODFORD et al Outbreak of Klebsiella pneumoniae Producing a New
Carbapenem- Hydrolyzing Class A β-Lactamase KPC-3 in a New York Medical
Center Antimicrobial agents and chemotherapy Dec 2004 p 4793ndash4799 Vol 48
No 12
YAGI T et al A preliminary survey of extended-spectrum β-lactamases
(ESBLs) in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Japan
FEMS Microbiology Letters 184 (2000) 53-56
YIGIT H et al Novel carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase KPC-1 from
a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumonia J Antimicrob Agents
Chemother 45 (4) 1151-1161 (2001)
ZAVASCKI A P et al KPC-2- producing Enterobacter cloacae in two cities
from Southern Brazil Int J Antimicrob Agents Apr 28 2009
ZHANEL G G et al Comparative review of the carbapenecircmicos Drugs
67(7)1027-52 2007
67
ANEXOS
Sequumlecircncia do oligo blaKPC
Query 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
Query 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
Query 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
68
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
Query 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
Query 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
69
Query 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
Query 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
Query 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
70
Sbjct 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
Query 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
Query 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Sbjct 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
Query 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
71
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
Query 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
Query 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
72
Query 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
Query 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
Query 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
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|||||||
73
Sbjct 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
Query 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
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|||||||
Sbjct 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
Query 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Sbjct 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
Query 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
74
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Sbjct 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
Query 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
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|||||||
Sbjct 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
Query 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
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Sbjct 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
75
Query 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Sbjct 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
Query 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
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||||
Sbjct 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
LOCUS AF297554 1377 bp
DNA linear BCT 26-MAR-2001
DEFINITION Klebsiella pneumoniae carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
gene complete cds
ACCESSION AF297554
VERSION AF2975541 GI10121874
76
KEYWORDS
SOURCE Klebsiella pneumoniae
ORGANISM Klebsiella pneumoniae
Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Enterobacteriaceae Klebsiella
REFERENCE 1 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH QueenanAM
AndersonGJ Domenech-SanchezA
BiddleJW StewardCD
AlbertiS BushK and TenoverFC
TITLE Novel carbapenem-hydrolyzing beta-
lactamase KPC-1 from a
carbapenem-resistant strain of
Klebsiella pneumoniae
JOURNAL Antimicrob Agents Chemother 45 (4)
1151-1161 (2001)
PUBMED 11257029
REFERENCE 2 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH AndersonGJ and
TenoverFC
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (19-AUG-2000) Nosocomial
Pathogens Laboratory Branch
Centers for Disease Control and
Prevention 1600 Clifton Rd MS
G08 Atlanta GA 30333 USA
FEATURES LocationQualifiers
77
source 11377
organism=Klebsiella
pneumoniae
mol_type=genomic DNA
db_xref=taxon573
-35_signal 5560
-10_signal 7883
mRNA 921012
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
RBS 117122
CDS 1311012
note=blaKPC-1
codon_start=1
transl_table=11
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
protein_id=AAG134101
db_xref=GI10121875
translation=MSLYRRLVLLSCLSWPLAGFSATALTNLVAEPFAKLEQD
FGGSI
GVYAMDTGSGATVSYRAEERFPLCSSFKGFLAAAVLARSQQQAGLLDTPIRYG
KNALV
PWSPISEKYLTTGMTVAELSAAAVQYSDNAAANLLLKELGGPAGLTAFMRSIG
DTTFR
78
LDRWELELNSAIPSDARDTSSPRAVTESLQKLTLGSALAAPQRQQFVDWLKGN
TTGNH
RIRAAVPADWAVGDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTRAPNKDDK
HSEAV
IAAAARLALEGLGVNGQ
ORIGIN
1 cggggcagtt acagccgtta cagcctctgg
agagggagcg gcttgccgct cggtgataat
61 cccagctgta gcggcctgat tacatccggc
cgctacacct agctccacct tcaaacaagg
121 aatatcgttg atgtcactgt atcgccgtct
agttctgctg tcttgtctct catggccgct
181 ggctggcttt tctgccaccg cgctgaccaa
cctcgtcgcg gaaccattcg ctaaactcga
241 acaggacttt ggcggctcca tcggtgtgta
cgcgatggat accggctcag gcgcaactgt
301 aagttaccgc gctgaggagc gcttcccact
gtgcagctca ttcaagggct ttcttgctgc
361 cgctgtgctg gctcgcagcc agcagcaggc
cggcttgctg gacacaccca tccgttacgg
421 caaaaatgcg ctggttccgt ggtcacccat
ctcggaaaaa tatctgacaa caggcatgac
481 ggtggcggag ctgtccgcgg ccgccgtgca
atacagtgat aacgccgccg ccaatttgtt
541 gctgaaggag ttgggcggcc cggccgggct
gacggccttc atgcgctcta tcggcgatac
79
601 cacgttccgt ctggaccgct gggagctgga
gctgaactcc gccatcccaa gcgatgcgcg
661 cgatacctca tcgccgcgcg ccgtgacgga
aagcttacaa aaactgacac tgggctctgc
721 actggctgcg ccgcagcggc agcagtttgt
tgattggcta aagggaaaca cgaccggcaa
781 ccaccgcatc cgcgcggcgg tgccggcaga
ctgggcagtc ggagacaaaa ccggaacctg
841 cggagtgtat ggcacggcaa atgactatgc
cgtcgtctgg cccactgggc gcgcacctat
901 tgtgttggcc gtctacaccc gggcgcctaa
caaggatgac aagcacagcg aggccgtcat
961 cgccgctgcg gctagactcg cgctcgaggg
attgggcgtc aacgggcagt aaggctctga
1021 aaatcatcta ttggcccacc accgccgccc
ttgcgggcgg catggattac caaccactgt
1081 cacatttagg ctaggagtct gcgcggcaga
gccgtgtgac cggttttctg tagagcactg
1141 acgatggcgg cggcgctctc tgcaattggc
aaggcgtcgg cgccaaggat accaatcttg
1201 cggcgcgcgg cgtgttatga cgactggggt
gcatttgagc cgccccattt aaccttcgcc
1261 ctcacagata cgccattcgc ctcaaattta
gcgccatgca gacgagcttc cactcggctt
1321 gcaccttgtc caggcccctc atgctgaact
gacgcaatcc catcaccgcc ttgatca
80
20
medicamentos das enterobacteacuterias resistentes aos carbapenecircmicos detectadas no
hospital ou na ausecircncia de dados locais na regiatildeo Deve-se considerar igualmente
o local de infecccedilatildeo e a penetraccedilatildeo esperada do antimicrobiano na escolha da droga
a ser utilizada na combinaccedilatildeo (ANVISA 2013)
Apoacutes a liberaccedilatildeo do perfil de sensibilidade deve-se adequar o uso dos
medicamentos Sempre que possiacutevel manter no miacutenimo 2 (dois) faacutermacos com
sensibilidade comprovada in vitro Natildeo havendo sensibilidade a um segundo
medicamento (suscetibilidade apenas agrave polimixina B ou E) recomenda-se manter a
terapia combinada de polimixina B ou E com carbapenecircmicos (meropenem ou
doripenem) ou tigeciclina na tentativa de ocorrecircncia de sinergismo entre elas
(ANVISA 2013)
Sugere-se aleacutem da determinaccedilatildeo das Concentraccedilotildees Inibitoacuterias Miacutenimas
(CIMs) para uma das polimixinas (B ou E) que tambeacutem sejam determinadas as
CIMs de tigeciclina e carbapenecircmicos (meropenem) bem como a consultoria de um
infectologista (ou Comissatildeo de Controle de Infecccedilatildeo Hospitalar- CCIH) para a
determinaccedilatildeo da terapia combinada com base na interpretaccedilatildeo do antibiograma
CIM e quadro cliacutenico do paciente No caso de resistecircncia agraves polimixinas
(concentraccedilotildees inibitoacuterias miacutenimas [CIMs] gt 2 mgL) recomenda-se a associaccedilatildeo de
dois ou trecircs do antimicrobianos sugeridos para a combinaccedilatildeo (ANVISA 2013)
A antissepsia eficiente do ambiente dos instrumentos ciruacutergicos e das matildeos
com o uso do aacutelcool a 70 eacute fundamental para a contenccedilatildeo de surtos Aleacutem disto
os pacientes contaminados devem permanecer isolados ateacute o controle da infecccedilatildeo
para evitar a disseminaccedilatildeo da bacteacuteria (COTRIM et al 2012)
1 2 Resistecircncia bacteriana
Hoje a disseminaccedilatildeo e a proliferaccedilatildeo das bacteacuterias resistentes estatildeo cada
dia mais presente As bacteacuterias multirresistentes (BRMD) poderatildeo levar agrave
humanidade a uma era poacutes-antibioacutetica resultando em uma ausecircncia de qualquer
opccedilatildeo de tratamento para os portadores destas cepas (HENRIQUE et al 2014)
Os fatores envolvidos na disseminaccedilatildeo desses patoacutegenos multirresistentes
satildeo diversos incluindo o uso irracional de antimicrobianos procedimentos invasivos
21
(cirurgias implantaccedilatildeo de proacuteteses meacutedicas e outros) e a transferecircncia de material
geneacutetico com a informaccedilatildeo de resistecircncia a antibioacuteticos entre as bacteacuterias
(DIENSTMANN et al 2010 ENDIMIAMI et al 2009 FONTANA et al 2010)
Com a praacutetica da antibioticoterapia principalmente em ambientes
nosocomiais os mecanismos de resistecircncia tornaram-se comuns Esses
mecanismos incluem alteraccedilatildeo na permeabilidade da membrana celular que
impede a entrada do antibioacutetico na ceacutelula bombeamento do antibioacutetico para fora da
mesma pelo mecanismo de efluxo mutaccedilatildeo geneacutetica que altera de alguma forma o
alvo do antibioacutetico e consequumlentemente natildeo afeta o funcionamento da bacteacuteria
bem como desenvolvimento da capacidade de degradar ou da inativaccedilatildeo do
antibioacutetico (COTRIM et al 2012) Estes mecanismos estatildeo representados na figura
3
Figura 3 Mecanismos de resistecircncia bacteriana Fonte
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controle
opas_webmodulo3pop_mecanismohtmgt
Um dos mais importantes mecanismos de resistecircncia eacute a alteraccedilatildeo do local-
alvo onde atua determinado antimicrobiano de modo a impedir a ocorrecircncia de
qualquer efeito inibitoacuterio ou bactericida As bacteacuterias podem adquirir um gene que
22
codifica um novo produto resistente aos antimicrobianos substituindo o alvo original
por exemplo o Staphylococcus aureus resistente agrave oxacilina e estafilococos
coagulase-negativos adquiriram o gene cromossocircmico Mec A e produzem uma PBP
ou PLP resistente aos β-lactacircmicos denominada 2a ou 2 que eacute suficiente para
manter a integridade da parede celular durante o crescimento quando outras PBPs
essenciais satildeo inativadas por antibimicrobianos β-lactacircmicos Como alternativa um
gene receacutem-adquirido pode atuar para modificar um alvo tomando-o menos
vulneraacutevel a determinado antimicrobiano Assim um gene transportado por
plasmiacutedeo ou por transposon codifica uma enzima que inativa os alvos ou altera a
ligaccedilatildeo dos antimicrobianos como ocorre com eritromicina e clindamicina (ANVISA
2007)
Em funccedilatildeo da bomba de efluxo pode variar a especificidade do antibioacutetico
Ele atua por meio do bombeamento ativo de antimicrobianos do meio intracelular
para o extracelular gerando uma resistecircncia bacteriana a determinados
antimicrobianos como eacute o caso da resistecircncia agraves tetraciclinas codificada por
plasmiacutedeos em Escherichia coli devido agrave presenccedila de proteiacutenas integrantes da
membrana plasmaacutetica bacteriana (PIDDOCK 2006)
O aumento da siacutentese de proteiacutenas eacute o principal responsaacutevel pela resistecircncia
antimicrobiana devido agraves vaacuterias mutaccedilotildees que ocorrem em seus repressores
transcricionais Estas mutaccedilotildees tambeacutem podem influenciar levando a um aumento
da eficiecircncia do transporte dos antibioacuteticos para o exterior da ceacutelula (HARBOTTLE
et al 2006)
A resistecircncia aos antibioacuteticos eacute frequumlentemente associada agrave alteraccedilatildeo
diminuiccedilatildeo da permeabilidade que ocorre na membrana externa das bacteacuterias gram-
negativas O fluxo de moleacuteculas para o interior da ceacutelula ocorre por caracteriacutesticas
peculiares como carga estrutura e dimensatildeo e atraveacutes de proteiacutenas de membrana
as quais formam canais Este percurso eacute utilizado pelos antibioacuteticos para atingir o
interior da ceacutelula bacteriana ou o espaccedilo periplasmaacutetico como eacute o caso dos
antibioacuteticos β-lactacircmicos Portanto a perda de funccedilatildeo destas proteiacutenas pode
efetivamente causar a diminuiccedilatildeo da susceptibilidade a vaacuterios antibioacuteticos
(LIVERMORE 2003)
23
Os mecanismos de resistecircncia que podem impedir a accedilatildeo de antimicrobianos
satildeo vaacuterios O faacutermaco atua de forma a inibir os processos essenciais a multiplicaccedilatildeo
e sobrevivecircncia da ceacutelula bacteriana como a membrana citoplasmaacutetica e
consequumlentemente bloqueando a siacutentese proteacuteica de aacutecidos nucleacuteicos e da parede
celular A resistecircncia bacteriana eacute um mecanismo natural de defesa Sendo assim
as bacteacuterias estatildeo em constante defesa e para cada novo faacutermaco desenvolvido as
bacteacuterias iratildeo desenvolver resistecircncia em algum momento (POSSEBON et al
2003)
O grupo de antibioacuteticos beta-lactacircmicos satildeo amplamente utilizado e se
encontram dentro da classe dos melhores agentes antimicrobianos com relevacircncia
cliacutenica No entanto o seu uso tem sido restringido devido a vaacuterios mecanismos de
resistecircncia O desenvolvimento dos carbapenecircmicos surgiu devido agrave proliferaccedilatildeo de
beta-lactamases mediadas por plasmiacutedeos e cromossomos (POSSEBON et al
2003)
A bacteacuteria KPC tem um gene chamado SHV-1 que tem a caracteriacutestica de
resistecircncia a quase todos os tipos de antimicrobianos inclusive os carbapenecircmicos
especiacuteficos para o tratamento de infecccedilotildees por bacteacuterias multiresistentes e
emergecircncias Mesmo com no seu coacutedigo geneacutetico a informaccedilatildeo necessaacuteria para o
desenvolvimento da resistecircncia a resistecircncia da bacteacuteria soacute eacute desenvolvida caso a
bacteacuteria entre em contato com o antibacteriano desencadeando todo o processo
nos casos de resistecircncia induzida comuns em KPC (MOREIRA et al 2014)
A resistecircncia bacteriana pode ser apresentada de forma intriacutenseca ou
adquirida A resistecircncia intriacutenseca faz parte das caracteriacutesticas fenotiacutepicas naturais
do microrganismo ou seja faz parte de sua heranccedila geneacutetica sendo transmitida
verticalmente a prole sem perda da caracteriacutestica A presenccedila ou ausecircncia do alvo
para a accedilatildeo da droga eacute o principal determinante deste tipo de resistecircncia
(MOREIRA et al 2014) Essa resistecircncia corresponde a uma caracteriacutestica de
espeacutecie bacteriana quando estes microrganismos satildeo naturalmente resistentes a
certo tipo de antibioacutetico Este processo eacute decorrente da ausecircncia de estruturas de
atuaccedilatildeo de antimicrobianos ou a impermeabilidade por parte de estruturas
perifeacutericas das bacteacuterias (HENRIQUE et al 2014)
24
A resistecircncia adquirida aos antibioacuteticos por sua vez ocorre quando haacute uma
da mutaccedilatildeo de genes reguladores ou estruturais aquisiccedilatildeo de genes de resistecircncia
veiculados por elementos geneacuteticos moacuteveis ou da combinaccedilatildeo entre eles Este
aparecimento de resistecircncia em uma espeacutecie bacteriana era anteriormente sensiacutevel
a droga e devido a um destes fatores se torna resistente O fenoacutetipo resultante
desta resistecircncia natildeo estaraacute presente nas ceacutelulas genitoras e sim nos indiviacuteduos de
uma linhagem bacteriana derivada de um organismo susceptiacutevel Os genes muitas
vezes satildeo adquiridos por meio de elementos moacuteveis como plasmiacutedeos e
transposons (MOREIRA et al 2014)
Entatildeo a resistecircncia adquirida ocorre por diversos mecanismos geneacuteticos tais
como produccedilatildeo de enzimas inativadoras interferecircncia com a entrada e acuacutemulo de
droga na bacteacuteria alteraccedilatildeo do receptor para accedilatildeo da droga via metaboacutelica
alternativa Eacute originada por meio de uma alteraccedilatildeo a niacutevel geneacutetico da ceacutelula de
natureza cromossocircmica pelos processos de mutaccedilatildeo transduccedilatildeo e transformaccedilatildeo
ou extra cromossocircmica (plasmidial) (HENRIQUE et al 2014)
Como todo antibioacutetico β-lactacircmicoos carbapenecircmicos tem como mecanismo
de accedilatildeo a inibiccedilatildeo da siacutentese proteacuteica atraveacutes da accedilatildeo de inibiccedilatildeo da parede
microbiana fazendo a ligaccedilatildeo e inativaccedilatildeo das proteiacutenas ligadoras de penicilinas
(NETO et al 2007)
Imipenem e meropenem antibioacuteticos pertencentes ao grupo dos
carbapenecircmicos possuem um amplo espectro de accedilatildeo in vitro incluindo atividade
contra cocos gram-positivos bacilos gram-negativos e bacteacuterias anaeroacutebias (MOHR
2008) Jaacute o ertapenem possui um espectro de accedilatildeo mais limitado que o os dois
antibioacuteticos anteriormente citados tendo uma eficiecircncia limitada contra os bacilos
gram-negativos natildeo fermentadores Um novo antibioacutetico carbapenecircmico ainda natildeo
disponiacutevel no Brasil doripenem possui uma atividade mais potente principalmente
contra Pseudomona aeruginosa devido ao seu mecanismo de accedilatildeo que combina os
espectros de accedilatildeo de imipenem e meropenem (ZHANEL et al 2007)
Devido as suas estabilidades espectro de accedilatildeo poucos relatos de
resistecircncia boa toleracircncia pelos pacientes com efeitos adversos mais comuns as
complicaccedilotildees no siacutetio da infusatildeo e toxicidade gastrintestinal estes antibioacuteticos
carbapenecircmicos tecircm sido considerados terapia de escolha (NICOLAU 2008) Como
25
uma resposta adaptativa das Enterobacteacuterias o iacutendice de resistecircncia aos
carbapenecircmicos tem aumentado nos uacuteltimos anos de forma proporcional ao seu
uso limitando imensamente as opccedilotildees terapecircuticas para as infecccedilotildees causadas por
estes microrganismos (FALAGAS et al 2009)
As enzimas produtoras de betalactamases hidrolisam o anel betalactacircmico
tornando este mecanismo de resistecircncia o mais importante Os dois grupos mais
preocupantes satildeo o grupo das betalactamases de aspecto ampliado e os da
carbapenemases que aleacutem de hidrolizar os carbapenecircmicos hidrolizam todas as
outras classes de betalactacircmicos Em enterobacteacuterias as carbapenemases mais
prevalentes satildeo codificadas por genes dos grupos blaKpc blaIMP blaVIM blaNdm
e blaOxa A ocorrecircncia de carbapenemases eacute mais frequentemente em bacteacuterias
gram-negativas fermentadoras da glicose conhecidas como enterobacteacuterias
predominantes nos gecircneros Klebsiella Serratia Citrobacter Enterobacter
Escherichia Samonella Proteus Morganella Podem ser encontradas tambeacutem em
bacteacuterias gram-negativas natildeo fermentadoras como espeacutecies de Acinetobacter e de
Pseudomonas (ALVES et al 2013)
Carbapenemases satildeo enzimas plasmiacutedio-mediados resistentes a todos
antibioacuteticos betalactacircmicos As bacteacuterias que possuem o gene blaKpC responsaacutevel
pela codificaccedilatildeo da produccedilatildeo de carbapenemases apresentam resistecircncia aos
antibioacuteticos betalactacircmicos impedindo a accedilatildeo destes antibioacuteticos contra infecccedilotildees
(ALVES et al 2013)
A transmissatildeo das carbapenemases a diferentes cepas de enterobacteacuterias se
daacute atraveacutes de plasmiacutedeos que satildeo pequenas moleacuteculas circulares de DNA com a
capacidade de se replicarem independentemente do DNA cromossocircmico
permitindo a troca de material geneacutetico entre gecircneros e espeacutecies diferentes de
enterobacteacuterias O raacutepido desenvolvimento de surtos em ambientes hospitalares eacute
explicado por essa disseminaccedilatildeo plasmidial (COTRIM et al 2012)
De acordo com o criteacuterio de interpretaccedilatildeo do Clinical and Laboratory
Standards Institute (CLSI 2009) a maioria das KPC isoladas natildeo apresenta
resistecircncia completa aos carbapenecircmicos (Imipenem e Meropenem apresentam
uma Concentraccedilatildeo Inibitoacuteria Miacutenima (CIM) de 2-8 μgmL) (COTRIM et al 2012)
26
Os mecanismos de resistecircncia capazes de impedir a accedilatildeo dos
carbapenecircmicos satildeo vaacuterios Poreacutem a degradaccedilatildeo de antibioacuteticos por enzimas
principalmente as carbapenemases constituem o principal mecanismo de
resistecircncia aos antibioacuteticos β-lactacircmicos (DIAS 2009) Devido a ampla atividade
hidroliacutetica agrave maioria dos antibioacuteticos β-lactacircmicos estes grupos de enzimas possuem
alta versatilidade (QUEENAM et al 2007)
Existem trecircs grandes classes moleculares de Ambler a qual as
carbapenemases pertencem denominadas classe A (serino-carbapenemases os
quais incluem membros designados SME IMI NMC GES e a famiacutelia das KPCs)
classe B(as metalo-β-lactamase incluem os tipos IMP e VIM) e classe D
(oxacilinases similares as da classe A e incluem as OXA e PSE) (DIAS 2009)
Dentre estes as mais importantes e prevalentes encontradas em plasmiacutedeos
de Klebsiella pneumoniae satildeo as KPC (DIENSTMANN et al 2010) Por meio de
estudos moleculares a enzima KPC jaacute foi documentada em diferentes bacteacuterias e
diferenciada em KPC-1 a 13 (NETIKUL et al 2011) No ano de 2009 foi realizada
uma pesquisa onde descreveram as seguintes carbapenemases KPC-1 em isolados
de Klebsiella pneumoniae KPC-2 em K pneumoniae K oxytoca Salmonella
enterica e em Enterobacter sp e KPC-3 em K pneumoniae e Enterobacter cloacae
(MONTEIRO et al 2009) As enzimas KPC-4 e KPC-5 foram encontradas em
isolados de Pseudomonas aeruginosa (PEIRANO et al 2009)
Foi observada uma correccedilatildeo da sequumlecircncia KPC-1 indicando que o gene
blaKPC-1 e blaKPC-2 satildeo idecircnticos Trecircs novas variantes blaKPC-3 blaKPC-4 e
blaKPC-5 satildeo resultados de mutaccedilotildees do gene estrutural da enzima KPC-2
(WOLTER et al 2008) apresentando diferentes perfis de hidroacutelise As enzimas
KPC-2 e KPC-3 possuem alta eficiecircncia em hidrolisar cefalotina cefaloridina e
nitrocefin poreacutem possuem uma menor eficiecircncia contra carbapenecircmicos e
cefotaxima (ALBA et al 2005) As enzimas KPC-5 e KPC-4 apresentam menor
hidroacutelise de carbapenecircmicos eacute do que em KPC-2 Em contrapartida possuem
melhor eficiecircncia contra ceftazidima e uma maior inibiccedilatildeo pelo aacutecido clavulacircnico
(WOLTER et al 2008)
27
13 Anaacutelise geneacutetica de microrganismos
Eacute de extrema importacircncia praacutetica natildeo soacute no aspecto cliacutenico mas tambeacutem na
fitopatologia biotecnologia e estudos ambientais a correta identificaccedilatildeo e
classificaccedilatildeo de microrganismos Os meacutetodos usados na diferenciaccedilatildeo de gecircneros
espeacutecies e estirpes de microrganismos podem ser divididos em meacutetodos fenotiacutepicos
(baseados em fenocircmenos bioquiacutemicos fisioloacutegicos e bioloacutegicos) e genotiacutepicos
(detectam polimorfismos ao niacutevel dos aacutecidos nucleacuteicos ou variaccedilatildeo aleacutelica ao niacutevel
de enzimas) (ALVES et al 2003)
Para este tipo de estudo existem alguns meacutetodos como o RFLPrsquos -
ldquoRestriction Fragment Length Polymorphismsrdquo (polimorfismos de tamanho de
fragmentos de restriccedilatildeo) rep-PCR (Meacutetodo de tipagem baseado na amplificaccedilatildeo via
PCR de elementos de DNA repetitivos presentes em genomas bacterianos) anaacutelise
de sequumlecircncias nucleotiacutedeas (discriminaccedilatildeo eou identificaccedilatildeo atraveacutes de sequumlecircncias
de DNA) PFGE - Pulsed-Field Gel Electrophoresis (Eletroforese em campo
pulsado) ( A L V E S et al 2003)
A diferenciaccedilatildeo clara da cepa e principalmente a alta reprodutibilidade devem
ser caracteriacutesticas de qualquer meacutetodo de tipagem geneacutetica Poreacutem nem todos os
meacutetodos moleculares de tipagem satildeo igualmente eficazes Sendo assim de acordo
com a finalidade pretendida (identificaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo custo reprodutibilidade
etc) eacute feita a escolha do meacutetodo a ser aplicado (A L V E S et al 2003)
O processo de identificaccedilatildeo fenotiacutepica de KPC entre os membros da famiacutelia
Enterobacteriaceae ainda eacute difiacutecil e os meacutetodos para a sua identificaccedilatildeo devem ser
revistos e ajustados Mesmo com o avanccedilo tecnoloacutegico natildeo existem ensaios que
combinam alta especificidade e sensibilidade na detecccedilatildeo destas enzimas Satildeo
diversas as metodologias usadas para rastreamento de KPC como por exemplo a
focalizaccedilatildeo isoeleacutetrica a teacutecnica de disco-difusatildeo E-test teste de Hodge
modificado dentre outros Aleacutem disso a pesquisa do gene blaKPC pode ser feita
pela Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) Os sistemas de automaccedilatildeo
existentes no entanto podem natildeo identificar com precisatildeo os isolados KPC
positivos (COTRIM et al 2012)
A identificaccedilatildeo blaKPC pelo PCR eacute um meacutetodo raacutepido preciso sensiacutevel e
altamente especiacutefico no entanto a PCR exige equipamento e conhecimentos
28
especializados em diagnoacutestico molecular dificultando ainda a utilizaccedilatildeo dele na
rotina dos laboratoacuterios de microbiologia (COTRIM et al 2012)
Em estudo de infecccedilotildees hospitalares identificaccedilatildeo molecular de patoacutegenos
bacterianos eacute bastante utilizada Para diferenciar carbapenemases tipo KPC a partir
de outros tipos como SME NMC-A-IMI e GES eacute necessaacuterio um exame molecular
As identificaccedilotildees do microrganismo juntamente com a triagem molecular iratildeo definir
um resultado mais especiacutefico podendo ser usado para identificar o antibioacutetico mais
adequado para o tratamento Poreacutem a principal desvantagem de alguns exames
baseados em PCR por exemplo eacute que devido agrave sua limitada capacidade de
multiplexaccedilatildeo eles distinguem apenas algumas variaccedilotildees (MOREIRA et al 2014)
Estatildeo descritas para a identificaccedilatildeo molecular de patoacutegenos pertencentes agrave
famiacutelia Enterobacteriaceae as teacutecnicas de PFGE RAPD (randomly amplified
polymorphic DNA) e ERIC-PCR (Enterobacterial Repet it ive Intergenic Consensus)
A PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) eacute considerada padratildeo ouro devido sua
alta capacidade de diferenciaccedilatildeo baseada na anaacutelise do perfil de restriccedilatildeo do DNA
genocircmico por meio de eletroforese Como desvantagem para a sua execuccedilatildeo eacute
necessaacuterios vaacuterios dias impedindo a tipagem de algumas cepas bacterianas devido
agrave degradaccedilatildeo do DNA aleacutem do alto custo empregado (MOREIRA et al 2014)
O meacutetodo baseado em ERIC-PCR tem sido bastante utilizado como uma
alternativa para a teacutecnica de PFGE Esta teacutecnica consiste na anaacutelise do padratildeo de
amplificaccedilatildeo de elementos repetidos encontrados no genoma bacteriano Isto
permite uma maior rapidez na obtenccedilatildeo de resultados quando comparada com o
PFGE aleacutem de alta reprodutibilidade simples execuccedilatildeo e implementaccedilatildeo baixo
custo e natildeo sem problemas com a degradaccedilatildeo do DNA (MOREIRA et al 2014)
A PCR eacute considerada uma teacutecnica de biologia molecular revolucionaacuteria que
consiste na siacutentese enzimaacutetica de coacutepias de aacutecidos nucleacuteicos Ela permitiu o raacutepido
desenvolvimento do estudo de sequumlecircncias de aacutecidos nucleacuteico Foi desenvolvida por
Kary Banks Mullis que ganhou o precircmio Nobel de quiacutemica de 1993 devido ao
desenvolvimento dessa teacutecnica em abril de 1983 (CAMARGO et al 2014)
Por meio de etapas de variaccedilatildeo de temperatura a teacutecnica de PCR promove a
duplicaccedilatildeo de cadeias de DNA in vitro A reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo de DNA por PCR
envolve o emprego de sequumlecircncias iniciadoras (primers) quatro nucleotiacutedeos
29
(dNTPrsquos) do DNA e uma DNA polimerase termoestaacutevel podendo assim obter-se a
partir de uma fita molde muitas coacutepias de uma sequumlecircncia especiacutefica de aacutecido
nucleacuteico O princiacutepio da PCR consiste na variaccedilatildeo de temperatura por ciclo
envolvendo trecircs etapas baacutesicas desnaturaccedilatildeo pareamento e amplificaccedilatildeo
(CAMARGO et al 2014)
A desnaturaccedilatildeo da fita molde de DNA eacute uma etapa com duraccedilatildeo entre 30
segundos a 1 minuto a temperatura entre 92 ordmC a 96 ordmC Apoacutes isso o pareamento de
dois iniciadores sinteacuteticos de composiccedilotildees distintas que funcionam como os
iniciadores da reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo liga-se agrave regiatildeo complementar da fita de
DNA alvo que sofreraacute a duplicaccedilatildeo Esta etapa tem duraccedilatildeo de 30 segundos a 1
minuto a temperatura entre 58 ordmC e 65 ordmC Por uacuteltimo a amplificaccedilatildeo por meio da
enzima Taq DNA polimerase das novas fitas de DNA se daacute a partir de cada um dos
iniciadores utilizando os quatro dNTPrsquos como substrato da reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo
Esta etapa possui duraccedilatildeo entre 45 segundos e 1 minuto a 72 ordmC Cada ciclo eacute
repetido em torno de 30 a 35 vezes e promove a amplificaccedilatildeo da regiatildeo alvo
determinada conforme o anelamento dos iniciadores sinteacuteticos de DNA (CAMARGO
et al 2014) Estas etapas estatildeo demonstradas na figura 4
Figura 4 Etapas da Reaccedilatildeo de PCR
30
2 JUSTIFICATIVA
No ano de 2010 no Distrito Federal foram identificados 111 pacientes com
suspeita de infecccedilatildeo por Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) e a
Secretaria de Sauacutede do Distrito Federal confirmaram ainda a morte de 18 pacientes
dentre os hospitais puacuteblicos e particulares Um desafio encontrado por ocasiatildeo do
surto infeccioso no Distrito Federal foi o de confirmar as KPCs por Reaccedilatildeo da
Polimerase em Cadeia sendo que as amostras foram enviadas com esta finalidade
para a Fiocruz no Rio de Janeiro
Pesquisas que possam contribuir na elaboraccedilatildeo de estrateacutegias preventivas e
de intervenccedilatildeo para infecccedilotildees causadas por enterobacteacuterias bem como contribuir
para gerar uma integraccedilatildeo beneacutefica entre a equipe acadecircmica e os serviccedilos de
sauacutede devem ser estimuladas Neste sentido o presente estudo permitiu escrutinar
os genes envolvidos na expressatildeo de carbapenemases presentes em espeacutecies de
enterobacteacuterias isoladas em ambiente hospitalar visto que elucidar genes de
resistecircncia de enterobacteacuterias aos antibioacuteticos carbapenecircmicos eacute o primeiro passo
para garantir um controle epidemioloacutegico efetivo para estes tipos de microorganismo
assim como sua associaccedilatildeo com surtos fatais particularmente em pacientes com
baixa imunidade
31
3 OBJETIVOS
31 Objetivo geral Caracterizar os genes de resistecircncia das
Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases e os aspectos epidemioloacutegicos de
pacientes internados em um hospital puacuteblico do Distrito Federal
32 Objetivos Especiacuteficos
Identificar genotipicamente a enzima KPC (Klebsiella pneumoniae
carbapenemase) de isolados de Klebsiella pneumoniae
Investigar aspectos epidemioloacutegicos dos pacientes portadores de
Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases
Identificar quais variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana influenciaram para o
desfecho oacutebito ou alta
Avaliar a susceptibilidade das Enterobacteacuterias aos antibioacuteticos
carbapenecircmicos dos pacientes em ambiente hospitalar
32
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
Trata-se de um estudo transversal onde foi realizado o teste de
susceptibilidade das enterobacteacuterias aos antibioacuteticos carbapenecircmicos a partir dos
materiais bioloacutegicos coletados dos pacientes internados no Hospital Regional da Asa
Norte (HRAN) e enviados ao Laboratoacuterio de Anaacutelises Cliacutenicas da mesma Instituiccedilatildeo
Os materiais bioloacutegicos investigados foram sangue aspirado traqueal ou brocircnquico
urina e cultura semi quantitativa de ponta de cateter venoso central O HRAN eacute um
hospital puacuteblico do Distrito Federal com 395 leitos sendo as cliacutenicas de internaccedilatildeo
Berccedilaacuterio Cirurgia Geral Cirurgia Plaacutestica Cliacutenica Meacutedica Ginecologia Maternidade
Pediatria Queimados UTI com atendimento a pacientes portadores de doenccedilas de
caraacuteter cliacutenico e ciruacutergico
4 1 Coleta e transporte das amostras bioloacutegicas
As amostras foram coletadas de pacientes internados no Hospital Regional da
Asa Norte (HRAN) com suspeitas de infecccedilatildeo por KPC A identificaccedilatildeo primaacuteria foi
realizada pelo Laboratoacuterio de Microbiologia do hospital de origem dos pacientes e os
demais procedimentos que foram utilizados na identificaccedilatildeo encontram-se descritos
abaixo
4 2 Procedimentos para confirmaccedilatildeo de resistecircncia bacteriana por
disco de ertapenem (adaptado CDC 2004)
Para diagnosticar amostra como portadora de bacteacuteria produtora de
carbapenemase foi realizado o teste com disco de ertapenem como forma de
triagem Inicialmente utilizou-se o swab contaminado com a amostra que foi
distribuiacuteda em uma pequena aacuterea da placa de aacutegar MacConkey para apoacutes o
crescimento ser realizada a pesquisa de colonizaccedilatildeo por enterobacteacuterias resistentes
aos carbapenecircmicos (Pesquisa de CRE) Procedeu-se a semeadura por teacutecnica
semi-quantitativaesgotamento com alccedila bacterioloacutegica na diluiccedilatildeo de 1100 O disco
de Ertapenem foi colocado na superfiacutecie da placa de MacConkey na junccedilatildeo dos dois
primeiros campos de semeadura conforme demonstrado na figura 5 Incubou a placa
33
em estufa aeroacutebia a 35ordmC por 24 e 48 horas e observou-se o halo de difusatildeo do
disco de Ertapenem na placa para proceder agrave leitura
O teste deixou de ser obrigatoacuterio apoacutes a modificaccedilatildeo dos criteacuterios
interpretativos para carbapenecircmicos para enterobacteacuterias publicados no suplemento
do CLSI 2010 M100-S20-U
Figura 5 Mecanismo de semeamento de material bioloacutegico oriundos de
pacientes com suspeita de infecccedilatildeo por KPC Fonte adaptado CDC 2004
4 2 1 Interpretaccedilatildeo dos resultados
Na ausecircncia de crescimento ateacute 24 horas (MacConkey) ou halo de difusatildeo
gt27 mm na placa deve-se reincubar as placas por mais 24 horas Quando for
ausente o crescimento apoacutes 48 horas ou halo de difusatildeo gt27 mm na placa libera-se
como enterobacteacuterias resistentes a carbapenecircmicos (KPCNEG)Havendo
crescimento de colocircnias na placa de MacConkey com halo lt 27 mm (apenas para
colocircnias com crescimento dentro do halo) deve-se reisolar e realizar identificaccedilatildeo e
antibiograma automatizado teste de sensibilidade por disco-difusatildeo e Teste de
Hodge Modificado (THM) Os isolados de enterobacteacuterias cujos testes comprovarem
a resistecircncia aos carbapanecircmicos testados (KPCPOS) foram reportado a Comissatildeo
de Controle de Infecccedilatildeo Hospitalar (CCIH) Jaacute osbacilos Gram-negativos natildeo
fermentadores natildeo foram reportados (KPCNEG) Para interpretaccedilatildeodos resultados
foram utilizados os valores conforme demonstrados na tabela 1
Tabela 1 Criteacuterios Interpretativos para testes de sensibilidade
ENTEROBACTEacuteRIAS
Disco difusatildeo (mm) MIC (microgml)
34
Antibioacutetico Sigla S I R S I R
Ertapenem 10
microg
ETP 22 19-
21
18 05 1 2
Meropenem 10
microg
MEM 23 20-
22
19 1 2 4
Fonte Manual Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)
2013
Os resultados que apresentaram resistecircncia ao antibioacutetico Ertapenem foram
considerados como suspeitos de contaminaccedilatildeo por KPC Fez-se o teste de
susceptibilidade aos antibioacuteticos (TSA) em aparelho automatizado MicroScan Walk
Away 96sl Dade Behring
4 3 Teste de susceptibilidade aos antibioacuteticos (adaptado CDC 2004)
A determinaccedilatildeo da susceptibilidade dos isolados foi feita pelo teste de
susceptibilidade aos antibioacuteticos (TSA) apoacutes cultura em meio de gelose simples
(INSA) para avaliaccedilatildeo da sua pureza e obtenccedilatildeo de colocircnias isoladas Para
preparaccedilatildeo de uma suspensatildeo bacteriana com turvaccedilatildeo aproximada de 05
McFarland (Dade BehringMicroScanregTurbidity Meter) ressuspendeu duas a cinco
colocircnias em 2ml de soro fisioloacutegico esteacuteril diluindo a 1100 em soro fisioloacutegico num
volume total de 10ml em seguida foi feita uma semeadura em duas placas
quadradas (120mm x 120mm) de Muller-Hinton Agar (INSA) por inundaccedilatildeo
Os discos de antibioacutetico carbapenecircmicos imipenem meropenem e
ertapenem (Biorad) foram aplicados com o auxiacutelio de um dispensador automaacutetico A
susceptibilidade das Enterobacteacuterias aos carbapenecircmicos foi definida de acordo
com o protocolo Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI 2011)
Para aquelas Enterobacteacuterias que apresentaram resistecircncia ao ertapenem
foram realizados o Teste de Hodge Modificado para Detecccedilatildeo de Enterobacteacuterias
Produtoras de Carbapenemases conforme descrito pelo Centers for Disease Control
and Prevention (CDC 2004)
35
4 4Teste de Hodge Modificado (THM) (adaptado CDC 2004)
Preparou-se uma suspensatildeo em salina esteacuteril com a cepa Escherichia coli
ATCC 25922 (padratildeo 05 de McFarland) Apoacutes isto diluiu a suspensatildeo 110 em
salina (05 ml da soluccedilatildeo de Ecoli ATCC 25922 + 45 ml salina)Foi entatildeo semeado
na superfiacutecie de uma placa de Agar Muller-Hinton com a suspensatildeo diluiacuteda de Ecoli
ATCC 25922 com auxilio de swab seco assegurando que houvesse uma
distribuiccedilatildeo uniforme cobrindo toda a superfiacutecie do Agar Deixou secar por 3 a 5
minutos em temperatura ambienteColocou-se o disco de ertapenem 10microg no centro
da placa e apoacutes isto fez-se uma estria linear da cepa a ser testada da borda do
disco ateacute a borda da placa utilizando uma alccedila calibrada 10 microl ou um swab Incubou
a placa na estufa em atmosfera aeroacutebia a 35 plusmn 2ordmC por 16 a 24 horas
441 Controle de qualidade (CQ)
Foi utilizado um CQ todos os dias em que se realizou o teste tendo como
controle Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1705- teste de Hodge modificado
positivo Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1706- teste de Hodge modificado
negativo
442 InterpretaccedilatildeoResultados
Apoacutes 16ndash24 horas de incubaccedilatildeo examinar as placas para verificar a presenccedila
de uma distorccedilatildeo no halo de inibiccedilatildeo do disco de ertapenem devido ao crescimento
realccedilado da cepa ATCC na intersecccedilatildeo do organismo teste e a Ecoli ATCC 25922
dentro dos limites do halo O THM positivo apresentaraacute presenccedila de distorccedilatildeo no
halo de inibiccedilatildeo de ertapenem devido ao crescimento da cepa Ecoli ATCC 25922 ao
longo da estria da cepa teste para dentro dos limites do halo de inibiccedilatildeo Jaacute o THM
negativo teraacute ausecircncia de crescimento da cepa Ecoli ATCC 5922 ao longo da estria
da cepa teste para dentro dos limites do halo de inibiccedilatildeo do disco de ertapenem
Este resultado estaacute representado na figura 6
36
Figura 6 Interpretaccedilatildeo resultado do Teste de Hodge Modificado
(adaptado CDC 2004) Teste positivo na estria da cepa teste na parte superior
da placa teste negativo na estria da cepa teste na parte inferior da placa
Tendo positivo como resultado o paciente era um provaacutevel contaminado por
KPC As amostras entatildeo foram encaminhadas para a Fundaccedilatildeo Osvaldo Cruz
(FIOCRUZ) para confirmaccedilatildeo final As amostras finalmente confirmadas como
positivas para KPC foram isoladas e guardadas no banco de cepas cliacutenicas do
hospital Apoacutes a autorizaccedilatildeo do CEP amostras das cepas foram transferidas para
meio de transporte Stuard em caixa teacutermica fechada em baixa temperatura e
levadas para o laboratoacuterio de microbiologia cliacutenica da universidade
No laboratoacuterio da universidade as amostras foram separadas e realizadas
repiques em meios MacConkey e incubadas por 24h As colocircnias caracteriacutesticas
foratildeo isoladas em caldo BHI e mantidas em shaker a 37oC por 2h Apoacutes isto foram
executadas as anaacutelises a seguir
Os isolados de Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases foram
submetidos agrave extraccedilatildeo de DNA e posterior sequumlenciamento para identificaccedilatildeo dos
genes de resistecircncia blaKPC de 1 a 13 e identificaccedilatildeo do gene universal Os
pacientes de onde os materiais bioloacutegicos contendo as Enterobacteacuterias produtoras
de carbapenemases foram os isolados foram investigados quanto aos aspectos
epidemioloacutegicos e cliacutenicos
37
4 5 Extraccedilatildeo de DNA bacteriano
A extraccedilatildeo de DNA bacteriano foi realizada utilizando o kit NucleoSpin
Plasmidreg (MN) Antes de iniciar a extraccedilatildeo foi feito a preparaccedilatildeo das soluccedilotildees
reagentes materiais e amostras (vortexando) colocou-se em banho-maria agrave 50ordmC o
tampatildeo AW Partiu-se de colocircnias isoladas cultivadas que sofreram passagem em
meio LB liacutequido por 12h Adicionou-se 15 mL da amostra no tubo eppendorf
centrifugou por 5 minutos descartou o sobrenadante (com cuidado para natildeo
descartar o Pellet) Repetiu-se este procedimento por mais trecircs vezes completando-
se o volume de 6mL Foram adicionados 250microL do tampatildeo Resuspension Buffer A1
encostando a ponteira no Pellet e misturando (este tampatildeo tem como funccedilatildeo
separar a formaccedilatildeo de grumos celulares) Apoacutes isso homogeneizou e vortexou os
tubos eppendorfs Apoacutes isso foram adicionados 250microL do tampatildeo Lysis Buffer A2
homogenizou e deixou descansar por 5 minutos (esta etapa eacute importante para a lise
da parede e da membrana celulares e liberaccedilatildeo do conteuacutedo da ceacutelula)
Passado o tempo de descanso foi adicionado 300microL do tampatildeo
Neutralization Buffer A3 homogeneizou e centrifugou por 10 minutos (este tampatildeo
iraacute retirar as proteiacutenas que envolvem o DNA e voltaraacute com o pH para proacuteximo de 8
impedindo que a soluccedilatildeo de lise facilite a quebra das ligaccedilotildees covalentes do aacutecido
nucleacuteico) Em seguida enumeraram-se os tubos contendo filtros com siacutelica
transferiu-se o sobrenadante para o filtro e centrifugou por 5 minutos Descartou-se
o que foi filtrado adicionou 500microL do tampatildeo AW (banho-maria) centrifugou por 2
minutos Novamente foi descartado o filtrado Adicionou-se 600microL do tampatildeo A4
centrifugou por 2 minutos e descartou o filtrado (os tampotildees AW e A4 contecircm
isotiocianato de guanidina em concentraccedilotildees crescentes para facilitar a adsorccedilatildeo
do DNA na siacutelica e retirada das outras biomoleacuteculas da amostra) Foi feita outra
centrifugaccedilatildeo com o tubo vazio Apoacutes isto o filtro foi trocado para outro eppendorf
definitivo onde foi adicionado 50microL do tampatildeo Elution Buffer AE (este tampatildeo
favorece a eluiccedilatildeo do DNA) centrifugou por 2 minutos descartou o filtro e
armazenou as amostras em freezer -20ordmC
38
4 6 Iniciadores e reaccedilatildeo de PCR
Os iniciadores universais para o gene blaKPC foram desenhados baseados
em sequumlecircncias conservadas apresentadas pelos sub-grupos de genes que
codificam a enzima carbapenemase de klebsiella pneumoniae (YIGIT et al 2001)
Baseado na sequumlecircncia para o blakpc-1 depositada no GenBank
(AF2975541) o oligonucleotiacutedio (oligo) iniciador direto (5-
ATGTCACTGTATCGCCGTC-3rsquo) foi desenhado para reconhecer a sequumlecircncia
blaKPC na posiccedilatildeo (131149) enquanto que o iniciador reverso (5-
TTACTGCCCGTTGACGCC-3rsquo) foi reconhecido na posiccedilatildeo (9951012) As anaacutelises
baseadas em alinhamento de sequumlecircncias mostraram que o par de iniciadores
blaKPC podem detectar os alelos de 1 a 13 do gene blaKPC conforme a tabela 2
Tabela 2 Nuacutemero de acesso ao GenBank dos alelos blaKPC e seus
microrganismos originais
Nuacutemero de
Acesso GenBank
Microrganismo Alvo
AF2975541 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-1
GU0862251 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-2
HQ2589341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-2-like
AB5577341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC -3
EU4473041 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-4
EU4002222 Pseudomonas
aeruginosa
blaKPC-5
EU5555341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-6
EU7297271 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-7
39
FJ2344121 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-8
FJ624872 Escherichia coli blaKPC-9
GQ1403481 Acinetobacter
baumannii
blaKPC-10
HM0669951 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-11
HQ3428891 Enterobacter cloacae blaKPC-12
HQ3428901 Enterobacter cloacae blaKPC-13
As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo de blaKPC foram realizadas em um
primeiro tempo de desnaturaccedilatildeo em que foi 94ordmC por 5 minutos seguido de 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 58 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 90 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 78ordmC por 8 minutos Aleacutem das amostras foi utilizado um
controle negativo
A PCR do blaKPC foi realizada utilizando os componentes para o volume da
reaccedilatildeo de 25 microL citados na tabela 3 A banda do tamanho do produto de PCR foi de
881 pares de bases (pb) o que corresponde ao plasmiacutedeo
Tabela 3 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do
gene blaKPC
Reagente Volume
DNA molde 4 microL
Tampatildeo Taq 25 microL
MgCl2 075 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP
2 microL
Oligo F 1 microL
Oligo R 1 microL
Taq DNA polimerase 05 microL
Aacutegua MiliQ 1335 microL
40
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
Baseado na sequumlecircncia para o gene 16S rRNA em que o oligonucleotiacutedio
Universal iniciador direto foward (5-CCAGCAGCCGCCGTAATACG-3rsquo) foi
desenhado para reconhecer a sequumlecircncia universal na posiccedilatildeo 1513 enquanto que o
iniciador reverso (5-ATCGGYTACCTTGTTACGACTTC-3rsquo) foi reconhecido na
posiccedilatildeo 1491 foram realizadas PCRrsquos As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo deste
gene foram realizadas nos seguinte tempos separaccedilatildeo 94ordmC por 10 minutos 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 55 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 120 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 72ordmC por 10 minutos
A PCR do gene 16S rRNA foi realizada utilizando os componentes para o
volume da reaccedilatildeo de 25microL citados na tabela 4 A banda do tamanho do produto de
PCR foi de 996 pb correspondente aacute regiatildeo ribossomal capaz de amplificar todas
as espeacutecies
Tabela 4Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do gene
universal
Reagente (quantidade
concentraccedilatildeo do estoque)
Volume
DNA molde 10 ng 4 microL
Tampatildeo Taq 10 x 25 microL
MgCl2 50mM 125 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP 25 mM
125 microL
Oligo F 10microM 05 microL
Oligo R 10microM 05 microL
Taq DNA polimerase 5UmicroL 04 microL
Aacutegua Miliq 146 microL
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
41
O termociclador utilizado para os experimentos foi o LifeTouch da BIOER
4 7 Digestatildeo
Para realizaccedilatildeo da digestatildeo foi utilizada a enzima BshF I (Hae III) EN- 1105
tamanho 7000 units concentraccedilatildeo 10 unitsmicroL fonte Bacillus sphaericus empresa
Jena bioscienceUtilizaram-se os componentes para o volume de 50microL da reaccedilatildeo
citados na tabela 5
Tabela 5 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da digestatildeo do gene
universal
Reagente Volume
Produto de PCR 10 microL
Enzima BshF I 01 microL
Tampatildeo (10x) 5 microL
Aacutegua Miliq 349 microL
Total (em cada ependorff) 50 microL
Valores para 1 digestatildeo
Os ependorffs foram colocados por 30 minutos em banho-maria a 37ordmC Apoacutes
isso fez-se a corrida das amostras em gel de agarose para verificaccedilatildeo do resultado
(LU et al 2000)
4 8 Eletroforese em gel de agarose
Os produtos de DNA PCR e digestatildeo foram analisados em gel de agarose
2 O tempo de corrida do gel eacute de aproximadamente 1hora e 30minutos sendo
que no comeccedilo foi usada agrave voltagem de 50 V e apoacutes comeccedilar a correr o gel
aumentou a voltagem para 100 v Utilizou-se o marcador de 100pb (pares de bases)
Foi adicionado 3microL de corante Bromophenol (que tem a funccedilatildeo de fazer uma ligaccedilatildeo
na amostra de DNA e permitir a visualizaccedilatildeo da corrida no gel de agarose) em 7microL
de amostra tanto de DNA quanto de PCR Para o preparo do gel foi utilizado TBE
42
(Tris- Aacutecido Boacuterico) agarose e brometo de etiacutedio (sua funccedilatildeo eacute de corante para o gel
e permitir a visualizaccedilatildeo do DNA quando colocado agrave luz ultravioleta) Para o oligo
blaKPC a banda da amplificaccedilatildeo foi em 881ppb correspondendo ao plasmiacutedeo Jaacute
o oligo Universal foi em 996 pb
4 9 Descarte de resiacuteduos
Todos os materiais utilizados nos ensaios foram de uso uacutenico e manipulados
em cacircmaras de seguranccedila bioloacutegica classe II Apoacutes o uso foram colocados em
soluccedilatildeo desinfetantes (hipoclorito a 1) e em seguida autoclavados a 127oC por 20
min em sacos apropriados para autoclavaccedilatildeo Apoacutes a finalizaccedilatildeo do ciclo de
esterilizaccedilatildeo os sacos contendo o material descartaacutevel foram colocados em
recipientes de coleta da empresa responsaacutevel pela coleta de materiais bioloacutegicos
produzidos no laboratoacuterio de microbiologia Todos os procedimentos seguiram a
normativa RDC-ANVISA 3062004 sobre o descarte de resiacuteduos de serviccedilo de
sauacutede
4 10 Aspectos epidemioloacutegicos e cliacutenicos
Os aspectos cliacutenicos e epidemioloacutegicos foram investigados por meio de
prontuaacuterios dos pacientes portadores de enterobacteacuterias produtoras de
carbapenemases e envolveram topografia mais provaacutevel do foco infeccioso a
enfermidade motivadora da internaccedilatildeo o desfecho cliacutenico a idade e o tempo de
internaccedilatildeo
4 12 Anaacutelises eepidemioloacutegicas
As anaacutelises foram realizadas com o pacote estatiacutestico SPSS versatildeo 200
Para verificar quais variaacuteveis referentes aos dados epidemioloacutegicos e
microbioloacutegicos influenciaram no desfecho verificou- se a diferenccedila meacutedia das
variaacuteveis idade e tempo de internaccedilatildeo em cada grupo O teste estatiacutestico utilizado foi
o teste t de Student apoacutes se executar o teste de normalidade de Shapiro-Wilk Para
as variaacuteveis sexo perfil microbioloacutegico das enterobacteacuterias produtoras de
43
carbapenemases foi avaliada a associaccedilatildeo com o desfecho por meio do teste Exato
de Fisher O niacutevel de significacircncia adotado foi de 5
4 13 Preceitos eacuteticos
Este projeto estaacute inserido em um projeto maior denominado ldquoEpidemiologia
cliacutenica e caracterizaccedilatildeo molecular do Acinetobacter Baumannii resistente a
antibioticoterapia em pacientes internado em hospitais do Sistema Uacutenico de Sauacutederdquo
que foi submetido ao Comitecirc de Eacutetica em Pesquisa da Secretaria do Estado de
Sauacutede do Distrito Federal (SESDF) e emitido parecer aprovado pelo protocolo nordm
23109 (anexo)
44
5 RESULTADOS
51 Anaacutelise molecular
Para a amplificaccedilatildeo com o oligo blaKPC foram amplificadas amostras
que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 881 pb correspondente ao
plasmiacutedeo A anaacutelise da amplificaccedilatildeo da regiatildeo do gene blaKPC mostrou que
apenas a amostra A10 natildeo amplificou isso demonstra que esta amostra natildeo
possuiacutea o gene de resistecircncia
5 1 1 Gene blaKPC
Figura 7 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 881 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
A amostra A3 natildeo amplificou no primeiro momento entatildeo foi realizado
novamente a PCR e corrida de gel obtendo entatildeo a amplificaccedilatildeo da amostra como
apresentado na figura 8
45
Figura 8 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC da
mostra A3 estudada A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo de 881
pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 1 2 Gene 16S rRNA
Para a amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA utilizou-se o oligo universal Foram
amplificadas amostras que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 996 pb
Figura 9 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
46
Segundo Lu et al (2000) a digestatildeo com a enzima HaeIII deste amplicons de
16S rRNA devolveriam bandas com perfis entre 150 a 200 pb No gel abaixo eacute
possiacutevel evidenciar que este perfil ocorreu com o predomiacutenio de bandas na altura
de 200pb
Figura 10 Gel de agarose a 2 da digestatildeo do amplicon do gene 16S
rRNA das amostras com a enzima HaeIII evidenciando diversos fragmentos
proacuteximos a 200 pb A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo ribossomal
de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 2 Anaacutelises epidemioloacutegicas
5 2 1 Sexo
No total foram detectados 17 isolados de KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 onde a maior a prevalecircncia foi
detecatada em amostras de pacientes do sexo masculino (53) do que no sexo
feminino (47)
47
Figura 11 Isolado de KPC segundo sexo dos 17 pacientes investigados
no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 2 Desfecho cliacutenico
Em 17 isolados de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo
de 2010 aacute 2011 a porcentagem de pacientes que foram a oacutebito (59) foi maior que
a de pacientes que tiverm alta (41)
Figura 12 Isolado de KPC segundo desfecho cliacutenico dos 17 pacientes
investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
48
5 2 3 Local da coleta
Dos 17 episoacutedios detectados de infecccedilatildeo por KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 a infecccedilatildeo em swab retalfoi mais
frequente (47) seguida de ponta de cateacuteter (18) e secreccedilatildeo traqueal (12)
Figura 13 Isolados de KPC segundo local da coleta da amostra nos 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 4 Microorganismo
O microorganismo mais encontrado foi a Klebsiella pneumoniae (82)
seguida da Enterobacter clocae (12) e Serratia marcescens (6) dos 17 isolados
de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 Isto afirma o
fato de a sigla KPC ser utilizada de forma errocircnea aacute Klebsiella pneumoniae visto
que a evidecircncia dela eacute maior em relaccedilatildeo as outras cepas
49
Figura 14 Isolado de KPC segundo microrganismo encontrado em 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 5 Relaccedilotildees variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana e desfecho
cliacutenico
Tabela 6 ndash Distribuiccedilatildeo do perfil geneacutetico sexo coleta tipificaccedilatildeo de
microrganismos e anaacutelise da resistecircncia bacteriana segundo o desfecho
cliacutenico Brasiacutelia-DF 2010 a 2011
Variaacutevel Resultado
Desfecho
Alta Oacutebito
N N P
Gene 16S rRNA Positivo 7 1000 10 1000
NA Gene blaKPC Positivo 6 857 10 1000
Negativo 1 143 0 00 0218 Sexo Feminino 2 286 6 600
Masculino 5 714 4 400 0201 Local da coleta Fundo saco de
Douglas 1 143 0 00
Hemocultura 0 00 1 100 0463 Ponta de cateter 1 143 2 200
Sec TraquealBrocircnquica
0 00 1 100
50
Secreccedilatildeo traqueal 2 286 0 00
Swab retal 3 429 5 500
Urina 0 00 1 100
Microrganismo Enterobacter cloacae (KPC)
1 143 1 100
Klebsiella pneumoniae
6 857 8 800
0416 Serratia
marcescens 0 00 1 100
Teste de Hodge Hodge positivo 7 1000 10 1000
NA Amicacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 1 100 0848 resistente 0 00 1 100
sensiacutevel 2 286 3 300
Amoxicilina Aacutecido Clavulacircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Ampicilina Sulbactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ampicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Aztreonan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefazolina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Cefoperazona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Cefotaxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefoxitina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0509 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 2 286 4 400
Ceftazidima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cetriaxona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 3 429 5 500 0772 Cefalotina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ciprofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772
51
resistente 3 429 5 500
Claritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Clindamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Eritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Gentamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0942 resistente 2 286 3 300
sensiacutevel 1 143 2 200
Imipenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 0 00 2 200 0193 Resistente 1 143 3 300
sensiacutevel 2 286 0 00
Nitrofurantoiacutena sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Norfloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Oxacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Penicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Piperacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Rifampicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tetraciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Ticarcilina Aacutecido Clavulocircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0688 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 3 429 4 400
Tobramicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Trimetoprima Sulfametoxazol
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0112 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 2 286 0 00
Vancomicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tigeciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediario 0 00 1 100 0211 natildeo testado 1 143 4 400
resistente 2 286 0 00
52
Cefepime sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefuroxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Levofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Piperacilina Tazobactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Ertapenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Meropenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0223 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 1 143 0 00
Cefotetan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 sensiacutevel 0 00 1 100
Gemifloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 7 700 0585 natildeo testado 3 429 3 300
Desfecho
Alta Oacutebito
Meacutedia Erro
padratildeo Meacutedia Erro
padratildeo p
Idade 58 9 59 5 0991
Tempo Internaccedilatildeo (dias)
50 13 46 12 0571
n= 17 p(lt 005) NA natildeo se aplica
53
6 DISCUSSAtildeO
Nos uacuteltimos anos houve um aumento na incidecircncia de bacteacuterias
multirresistentes aos antimicrobianos no ambiente hospitalar tornando isto um
problema mundial de sauacutede puacuteblica (HULSCHER et al 2010) Quando se trata
principalmente de bacilos Gram negativos a frequumlecircncia destas bacteacuterias eacute ainda
maior em paiacuteses da Ameacuterica Latina quando comparada a paiacuteses desenvolvidos
(GALES etal 2012)
De acordo com dados do ldquoMeropenem Yearly Susceptibility Test Information
Collectionrdquo (MYSTIC) ocorreu nos Estados Unidos um aumento na susceptibilidade
de K pneumoniae nos uacuteltimos anos graccedilas a praacuteticas de controle de disseminaccedilatildeo
de amostras resistentes(RHOMBERG P R et al 2009) O aumento crescente da
prevalecircncia destes microrganismos foi proporcional ao aumento da dependecircncia do
uso de antibioacuteticos carbapenecircmicos considerados como a opccedilatildeo terapecircutica para o
tratamento de infecccedilotildees por bacilos Gram negativos multi-resistentes (LIVERMORE
2012) Isto afeta diretamente as opccedilotildees de tratamento sobrando poucas alternativas
para a terapecircutica que incluem colistina (polimixina E) e tigeciclina que apresentam
respectivamente problemas em termos de toxicidade e eficaacutecia (LIVERMORE et
al 2011) Um dos efeitos adversos mais importantes das poliminas B e E por
exemplo satildeo a neurotoxicidade e nefrotoxicidade (MENDES C A C et al2009 )
Devido agrave resistecircncia ser usualmente de natureza plasmidial e portanto de
maior disseminaccedilatildeo especialmente quando carreadas por K pneumoniae
microrganismo com uma notoacuteria capacidade para acumular e transferir plasmiacutedeos
com determinantes para resistecircncia o nuacutemero de casos detectados pelo
fenoacutetipogenoacutetipo blaKPC eacute bastante preocupante (MONTEIRO et al 2009)
Comparada com outras bacteacuterias hospitalares a transmissatildeo de clones
multirresistentes de K pneumoniae eacute maior e podem natildeo ser controladas pelos
meacutetodos de controle de infecccedilatildeo hospitalar (PAAUW et al 2007) A forma
plasmidial para transferecircncia da resistecircncia adicionada a este grande potencial para
disseminaccedilatildeo de clones resistentes eacute preocupante visto que apoacutes surtos muitas
vezes pode se tornar endecircmica Jaacute eacute uma realidade a disseminaccedilatildeo desta bacteacuteria
54
entre pacientes hospitais paiacuteses e ateacute mesmo continentes (WOODFORF et al
2010 ROGERS et al 2011)
As chances de surtos satildeo maiores em paiacuteses com poucos recursos devido agrave
maior carecircncia de praacuteticas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees hospitalares e o
uso irracional de antimicrobianos de forma empiacuterica e inadequada (KUMARASAMY
et al 2010) Ateacute o momento os mecanismos de resistecircncia aos cabapenecircmicos
geralmente encontrado eram a produccedilatildeo de ESBL (CTX-M) somada aacute perda de
porina (CARVALHAES et al 2010) Foi notado a partir do ano de 2008 um
aumento no nuacutemero de K pneumoniae produtoras de KPC-2 apresentando outra
forma de resistecircncia (GALES 2012)
Um estudo mostrou que o perfil do paciente colonizado ou infectado por KPC
foi de um paciente entre os 33 e os 82 anos de idade internado haacute mais de 1
semana no hospital A mortalidade geral nos uacuteltimos anos ficou em torno de 7
sendo que dos 77 pacientes estudados 32 (415) pacientes evoluiacuteram para oacutebito
evidenciando a alta morbi-mortalidade associada (ALVES A P et al 2013)
Em estudo com 2316 pacientes avaliados a populaccedilatildeo de sexo masculino foi
de 526 idade meacutedia global de 53 anos (mediana de 55 anos) permanecircncia meacutedia
de 58 dias (mediana de 3 dias) (OLIVEIRA A C et al 2010) Outros trabalhos
apresentaram ausecircncia de significacircncia entre sexoidade e o desenvolvimento de
infecccedilotildees por microrganismos resistentes (PERES-BOTA D et al 2003 COLPAN
A et al 2005 COELLO R et al 1997)
Outro estudo utilizou um total de 30 amostras sendo elas isoladas de urina
escarro secreccedilatildeo pleural ponta de cateter aspirado traqueal e hemocultura A mais
prevalente foi em urina (40) Entre as 30 cepas analisadas a maior porcentagem
foi da cepa Klebsiella pneumoniae (70) Enterobacter sp (133) Klebsiella
ozaenae (10) Escherichia coli (333) e Klebsiella oxytoca (333)
(DIENSTMANN R et al 2010) Nos Estados Unidos a enzima KPC jaacute se tornou
endecircmica Foi realizada uma pesquisa em dois hospitais de Nova York onde
testaram 602 amostras e 45 apresentaram algum mecanismo de resistecircncia
sendo apenas 33 confirmadas por biologia molecular como KPC-2 (BRATU et
al 2005)
55
Estudo sobre os tipos de ESBL feito no Japatildeo apresentou o tipo Toho-1 como
o mais prevalente nessa pesquisa Ateacute o ano de 2000 ano em que foi publicado tal
estudo este era o primeiro relatoacuterio no Japatildeo para identificar derivados de ESBLs
como tipo de SHV e TEM entre E coli e K pneumoniae Em especial o tipo SHV- 12
foi identificado com uma maior frequumlecircncia Estes resultados indicam que tipos
distintos de ESBLs que satildeo diferentes em sua especificidade de substrato e origem
geneacutetica coexistem no Japatildeo Isto mostra a importacircncia de caracterizar genoacutetipos
distintos de ESBLs e de estar em alerta continuamente para as tendecircncias de
ESBLs no Japatildeo aleacutem da necessidade de uma interpretaccedilatildeo uniforme utilizando as
diretrizes do CSLI para relatar cepas produtoras de ESBL Aleacutem da detecccedilatildeo de
ESBLs satildeo necessaacuterias mais informaccedilotildees tais como o perfil de sensibilidade
especiacutefica para diversas β-lactacircmicos e o local da infecccedilatildeo Esses fatores satildeo
essenciais para a escolha adequada de antibioacuteticos (YAGI T et al 2000)
No ano de 2004 uma pesquisa avaliou a produccedilatildeo de uma enzima de
hidroacutelise de carbapenecircmicos atraveacutes da teacutecnica de sequumlenciamento foi revelado
um novo membro da famiacutelia KPC designado KPC- 3 Pesquisadores encontraram
em um mutante de K pneumoniae uma substituiccedilatildeo de um gene associado com
resistecircncia a Imipenem mas essa substituiccedilatildeo foi considerada improvaacutevel na
contribuiccedilatildeo da resistecircncia aos carbapenecircmicos da espeacutecie estudada Aleacutem da
resistecircncia aos carbapenecircmicos estes isolados eram em sua maioria resistentes agraves
cefalosporinas penicilinas e aminoglicosiacutedeos Usando estudos de transformaccedilatildeo
conjugaccedilatildeo e hibridaccedilatildeo localizaram o alelo blaKPC em plasmiacutedeo aleacutem disso
mostraram que esse alelo tambeacutem carregava uma resistecircncia aos aminoglicosiacutedeos
A transferecircncia das enzimas KPCs foi demonstrada in vitro tanto neste como em
outros estudos pode ser que os plasmiacutedeos que fazem esta transferecircncia estavam
comeccedilando a se espalhar no ambiente cliacutenico resultando na multiresistecircncia dessas
estirpes (WOODFORD et al 2004)
O presente estudo apresentou um vieacutes quanto aos resultados dos testes de
susceptibilidade microbiana Observou-se que natildeo foi encontrado resultado deste
teste em algumas amostras o que natildeo cooperou para um estudo mais preciso
futuros estudos quanto agraves amostras e um melhor acompanhamento deste tipo de
patologia Poreacutem mesmo sem algumas amostras com este resultado disponiacutevel foi
56
confirmada a presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos
carbapenecircmicos por meio dos genes de resistecircncia blaKPC e 16S rRNA que as
amostras apresentaram em sua maioria serem portadoras Quanto aos resultados
estatiacutesticos nenhuma das variaacuteveis apresentou significacircncia estatiacutestica (p gt 005)
mostrando assim que estas variaacuteveis isoladas natildeo foram o fator determinante para
o desfecho cliacutenico de alta ou oacutebito
57
7 CONCLUSAtildeO
Os genes blaKPC e 16S rRNA foram caracterizados confirmando a a
presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos carbapenecircmicos
Houve uma maior prevalecircncia da cepa K pneumoniae e isto confirma outros
estudos que apresentam a maior prevalecircncia desta cepa em amostras com KPC
Aleacutem disso isso justifica a forma popular da K pneumoniae ser chamada de KPC
enquanto que na verdade KPC eacute uma enzima podendo estar presente em outras
cepas como Enterobacter clocae tambeacutem apresentada no presente estudo O
desfecho cliacutenico de oacutebitos maior que 50 eacute um possiacutevel indicador sobre a
necessidade de se realizar um teste raacutepido para identificaccedilatildeo de KPC visando
iniciar o mais raacutepido possiacutevel o tratamento afim de diminuir a mortalidade por esta
infecccedilatildeo
Nenhuma das variaacuteveis isoladamente estaacute relacionada ao desfecho cliacutenico
oacutebito ou alta pois natildeo apresentaram relevacircncia estatiacutestica O presente estudo
mostrou que haacute presenccedila da bacteacuteria nas amostras de pacientes do hospital
estudado podendo entatildeo afirmar que este tipo de bacteacuteria se encontra tambeacutem
presente em ambiente hospitalar O uso irracional de antimicrobiano eacute demonstrado
de forma indireta quando foi apresentado atraveacutes do Teste de Hodge Modificado
uma resistecircncia de 100 aos antibioacuteticos carbapenecircmicos Isto tambeacutem reflete na
terapecircutica sendo que pacientes portadores de bacteacuterias resistentes aos
antibioacuteticos carabepecircmicos tem uma escassa opccedilatildeo de tratamento e as opccedilotildees
apresentam problemas quanto agrave toxicidade e eficaacutecia
58
REFEREcircNCIAS
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Mecanismos
de resistecircncia bacteriana aos antimicrobianos Disponiacutevel em
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controleopas_
webmodulo3mec_sitiohtmgt Acesso em 25 de abril de 2014
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Nota teacutecnica nordm
012013 medidas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees por enterobacteacuterias
multiresistentes Acesso em 17 de abril de 2013
ALBA J et al Kinetics study of KPC-3 a plasmid-encoded class A
carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase Antimicrob Agents Chemother
Nov49(11)4760-2 2005
ALVES A P et al Nosocomial infections by KPC-producing enterobacteria in
a tertiary hospital in Southern Brazil Revista da AMRIGS Porto Alegre 57 (3) 213-
218 jul-set 2013
ALVES A et al Tipagem Geneacutetica de Microrganismos Lab De Diversidade
Microbiana Centro de Biologia Celular Dep de Biologia U de Aveiro 3810-193
Aveiro- 2003
BELL J M et Al Prevalence and significance of a negative extended-
spectrum beta-lactamase (ESBL) confirmation test result after a positive ESBL
screening test result for isolates of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae
results from the SENTRY Asia-Pacific Surveillance Program J Clin Microbiol
May45(5)1478-82 2007
BRATU S et al Detection of KPC carbapenem-hydrolyzing enzymes in
Enterobacter spp from Brooklyn New York Antimicrob Agents Chemother v 49 n
2 p 776-8 2005
59
BRATU S et al Emergence of KPC-possessing Klebsiella pneumoniae in
Brooklyn New York epidemiology and recommendations for detection Antimicrob
Agents Chemother v 49 n 7 p 3018-20 2005
BRATU S et al Rapid spread of carbapenem-resistant Klebsiella
pneumoniae in New York City Arch Intern Med v 165 p 1430-5 2005
CAMARGO C F et al Aplicaccedilatildeo das teacutecnicas de pcr e suas teacutecnicas
derivadas em diagnoacutestico molecular Disponiacutevel em
ltfileDUnB10C2BA20semestreArtigosPCR-
20CLEYTON20FLORENCIO20DE20CAMARGO20E20PAULO20ROB
ERTO20QUEIROZpdfgtgt Acesso em 08 de abril de 2014
CARVALHES C G et al Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting
carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive
results Journal of Antimicrobial Chemotherapy v 65 n2 p 249-251 2010
CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION- CDC Modified
Hodge Test for Carbapenemase Detection in Enterobacteriaceae 2004
CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE Methods for
dilutionantimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically Approved
standard M7ndashA7 7th ed CLSI Wayne PA 2011
COELLO R et al Risk factors for developing clinical infection with methicillin-
resistant Staphylococcus aureus (MRSA) amongst hospital patients initially only
colonized with MRSA J Hosp Infect 19973739-46
COLPAN A et al Evaluation of risk factors for mortality in intensive care
units A prospective study from a referral hospital in Turkey Am J Infect Control
200533(1)42-7
60
CORNAGLIA G et al Living with ESBLs Introduction Clinical Microbiology
and Infection 14 Suppl 1 1-2 2008
COTRIM E R et al Klebsiella pneumoniae carbapenemase ndash KPC em
Enterobacteriaceae o desafio das bacteacuterias multirresistentes Poacutes em revista do
centro universitaacuterio Newton Paiva 12012 - ediccedilatildeo 5 - issn 2176 7785
DESHPANDE L M et al Occurrence and characterization of
carbapenemase-producing Enterobacteacuteriaceae report from the SENTRY
Antimicrobial Surveillance Program (2000-2004) Microb Drug Resist 12(4)223-30
2006
DIAS D J A Estudos dos principais mecanismos de resistecircncia aos
antibioacuteticos β-lactacircmicos em bacteacuterias patogecircnicas gram negativas 2009 100 f
Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Geneacutetica Molecular e Biomedicina) ndash Faculdade de
Ciecircncias e Tecnologia Universidade de Nova Lisboa Lisboa
DIENSTMANN R et al Avaliaccedilatildeo fenotiacutepica da enzima Klebsiella
pneumoniae carbapenemase (KPC) em Enterobacteriaceae de ambiente hospitalar
J Bras Patol Med Lab v 46 n 1 p 23-27 fevereiro 2010
ENDIMIAMI A et al Emergence of blaKPC-containing Klebsiella
pneumoniae in a long-term acute care hospital a new challenge to our healthcare J
Antimicrob Chemother 64 1102-1110 Nov 2009
FALAGAS M E et al Extended-spectrum beta-lactamase producing
organisms The Journal of Hospital Infection 73 (4) pp 345-54 2009
FONTANA C et al Emergence of KPC-producing Klebsiella pneumoniae in
Italy BMC Rev Notes 3 40 2010
61
GALES A C et al Antimicrobial resistance among Gram-negative bacilli
isolated from Latin America results from Sentry Antimicrobial Surveillance Program
(Latin America 2008-2010) Diagnostic Microbiology and Infectious Disease v 3 n
4 p 354 -360 2012
GUPTA N et al Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Epidemiology
and Prevention HEALTHCARE EPIDEMIOLOGY Clinical Infectious Diseases
201153(1)60ndash67 Published by Oxford University Press on behalf of the Infectious
Diseases Society of America 2011
HARBOTTLE H et al Genetics of antimicrobial resistance Anim Biotechnol
n17 p111-124 2006
HENRIQUE W N et al RESISTEcircNCIA BACTERIANA Uniatildeo das
Faculdades Alfredo NasserInstituto de Ciecircncias da Sauacutede Disponiacutevel em lt
httpwwwfaculdadealfredonasseredubrfilespesquisaposter20HENRIQUE20
Wilker20Natividade20SANTIAGO20Silvania20CAVALCANTI20DSP
20ResistC3AAncia20Bacterianapdfgt Acesso em 17 marccedilo 2014
HULSCHER M E J I et al Antibiotic prescribing in hospital a social and
behavioral scientific approach The Lancet Infectious Diaseases v 10 n 3 p 167-
165 2010
KIDWAI M SAPRA P BHUSHAN KR Synthetic strategies and medicinal
properties of beta-lactams Curr Med Chem 1999 695-215
KUMARASAMY K K et al Emergence of a new antibiotic resistance
mechanism in India Pakistan and the UK a molecular biological and
epidemiological stuy The Lancet Infectious Diseases v10 n 9 p 597- 602 2010
LINCOPAN N et al Enterobacteacuteria producing extended-spectrum β-
lacatamases and IMP-1 Metalo-β-lactamases isolated from Brazilian hospitals J Med
62
Microbiol 7 1-3 2006
LINCOPAN N et al First Isolation of Metalo-β-Lacatamase-Producing
Multiresistant Klebsiella pneumoniae from a patient in Brazil J Clin Microbiol 43(1)
516-519 2005
LIVERMORE D M et al What remains against carbapenem- resistant
Enterobacteriaceae Evaluation of choramphenicol ciprofloxacin colistina
fosfomycin minocycline nitrofurantoin temocilin and tigecycline International
Journal of Antimicrobial Agents v 37 n 5 p 415- 459 2011
LIVERMORE D M Fourten years in resistance International Journal of
Antimicrobial Agents v 39 283- 294 2012
LIVERMORE D M Bacterial resistance to carbapenems Adv Exp Med Biol
1995 39025-47
LIVERMORE D M Bacterial resistance origins epidemiology and impact
Clin Infect Dis 36S11-S23 2003
LIVERMORE D M et al Carbapenemases a problem in waiting Curr
Opin Microbiol 2000 3489-95
LU et al Universal pcr for common bacterial pathogens J CLIN
MICROBIOL VOL 38 2000
LU et al Use of PCR with Universal Primers and Restriction Endonuclease
Digestions for Detection and Identification of Common Bacterial Pathogens in
Cerebrospinal Fluid Journal of Clinical Microbiology June 2000 p 2076ndash2080
MARSCHALL J Met al Presence of the KPC Carbapenemase Gene in
Enterobacteriaceae Causing Bacteremia and Its Correlation with In Vitro
Carbapenem Susceptibility J Clin Microbiol 47 239-241 Jan 2009
63
MARTINS WMBS et al Prevalecircncia do gene blaKPC em isolados cliacutenicos
de Enterobacteriaceae e natildeo fermentadores encontrados em amostras clinicas em
um hospital universitaacuterio do Recife X Jornada de ensino pesquisa e extensatildeo ndash
JEPEX 2010 ndash UFRPE Recife 18 a 22 de outubro
MENDES C A C et al Polimixinas Revisatildeo com ecircnfase na sua
nefrotoxicidade Rev Assoc Med Bras 2009 55(6) 752-9
MOHR J F 3rd Update on the efficacy and tolerability of meropenem in the
treatment of serious bacteacuterial infections Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S41-51
2008
MONTEIRO J et al First report of KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae
strains in Brazil Antimicrob Agents Chemother Jan53(1)333-4 2009
MOREIRA V C et al Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia a antibioacuteticos
Disponiacutevel em
lthttpwwwcpglsucgbr6mostraartigosSAUDEVANESSA20CARVALHO20M
OREIRApdfgt Acesso em 21 marccedilo 2014
NETIKUL T et al Emergence of novel blaKPC-12 and blaKPC-13 variants in
carbapenem non-susceptible Enterobacter cloacae a first report of blaKPC gene in
Thailand European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases May
S372 2011
NETO V A et al Antibioacuteticos na praacutetica Meacutedica 6ordf Ediccedilatildeo Editorial
SarverSP Brasil 2007
NICOLAU D P Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of
meropenem Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S32-40 2008
64
OLIVEIRA A C et al Resistecircncia bacteriana e mortalidade em um centro de
terapia intensiva Rev Latino-Am Enfermagem nov-dez 2010
PAAUW A et al Failure to control an outbreak of qnrA 1-positive multidrug-
resistant Enterobacter clocae despite adequate implementation of recommended
infection control measures Journal of Clinical Microbiology v 45 n 5 p 1420-1425
2007
PATERSON D L et al Extended-Spectrum Beta-Lactamases a Clinical
Update Clinical Microbiology Reviews v 18 p 657-686 2005
PEIRANO G et al Carbapenem-hydrolysing beta-lactamase KPC-2 in
Klebsiella pneumonia isolated in Rio de Janeiro Brazil J Antimicrob Chemother Nov
20 2009
PERES-BOTA D et al Are infections due to resistant pathogens associated
with worse outcome in critically ill patients J Infect 200347(4)307-16
PIDDOCK L J V Clinically relevant chromosomally encoded multidrug
resistance effl ux pumps in bacterial Clin Microbiol Rev n19 p382-402 2006
PITOUT J D D et al Emergence of Enterobacteriaceae producing
extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) in the community J Antimicrob
Chemother May 56 2005
POSSEBON M I et al Resistecircncia bacteriana aos carbapenecircmicos
Bacterial resitence to carbapenems RBM rev bras med60(6)378380-378-382
jun 2003
QUEENAN A M et al Carbapenemases the versatile beta-lactamases
Clin Microbiol Rev Jul20(3)440-58 2007
65
RHOMBERG P R et al Summary trends for the meropenem yearly
susceptibility test information collection program a 10- year experience in the United
States (1999-2008) Diagnostic Microbiology and Infectiois Disease v 65 n4 p
414-426 2009
ROBLEDO I E et al Detection of KPC in Acinetobacter spp in Puerto Rico
J Antimicrob Agents Chemother 54 1354-1357 Mar 2010
ROGERS B A et al Country-to-country transfer os patients and the risk of
multi-resistant bacterial infection Clinical Infectious Disease v53 n1 p49- 56
2011
SHAH A A et al Characteristics epidemiology and clinicalimportance of
emerging strains of Gram-negative bacilli producing extended-spectrum
betalactamases Research in Microbiology v 155 p 409-421 2004
TURNER P J Extended- Spectrum Beta-Lactamases Clinical Infectious
Diseases v 41 p 273-275 2005
WOLTER D J et al Phenotypic and Enzymatic Comparative Analysis
between the Novel KPC variant KPC-5 and Its Evolutionary Variants KPC-2 and
KPC-4 Antimicrob Agents Chemother Nov 17 2008
WOODFORD N et al Carbapenemases of Chryseobacterium
(Flavobacterium) meningosepticum distribution of blaB and characterization of a
novel Metalo-beta-lactamase gene blaB3 in the type strain NCTC 10016
Antimicrob Agents Chemother Jun44(6)1448-52 2000
WOODFORF N Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in
India Pakistan and the UK a molecular biological and epidemiological study The
Lancet Infectious Diseases v 10 n 9 p 597-602 2010
66
WOODFORD et al Outbreak of Klebsiella pneumoniae Producing a New
Carbapenem- Hydrolyzing Class A β-Lactamase KPC-3 in a New York Medical
Center Antimicrobial agents and chemotherapy Dec 2004 p 4793ndash4799 Vol 48
No 12
YAGI T et al A preliminary survey of extended-spectrum β-lactamases
(ESBLs) in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Japan
FEMS Microbiology Letters 184 (2000) 53-56
YIGIT H et al Novel carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase KPC-1 from
a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumonia J Antimicrob Agents
Chemother 45 (4) 1151-1161 (2001)
ZAVASCKI A P et al KPC-2- producing Enterobacter cloacae in two cities
from Southern Brazil Int J Antimicrob Agents Apr 28 2009
ZHANEL G G et al Comparative review of the carbapenecircmicos Drugs
67(7)1027-52 2007
67
ANEXOS
Sequumlecircncia do oligo blaKPC
Query 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
Query 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
Query 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
68
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
Query 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
Query 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
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Sbjct 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
69
Query 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
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Sbjct 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
Query 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Sbjct 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
Query 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
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70
Sbjct 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
Query 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
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Sbjct 481
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ATTTGTT 540
Query 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
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Sbjct 541
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GCGATAC 600
Query 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
71
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|||||||
Sbjct 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
Query 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
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Sbjct 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
Query 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
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|||||||
Sbjct 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
72
Query 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
Query 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
Query 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
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|||||||
73
Sbjct 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
Query 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
Query 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Sbjct 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
Query 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
74
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
Query 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
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|||||||
Sbjct 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
Query 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
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|||||||
Sbjct 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
75
Query 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
Query 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
||||
Sbjct 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
LOCUS AF297554 1377 bp
DNA linear BCT 26-MAR-2001
DEFINITION Klebsiella pneumoniae carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
gene complete cds
ACCESSION AF297554
VERSION AF2975541 GI10121874
76
KEYWORDS
SOURCE Klebsiella pneumoniae
ORGANISM Klebsiella pneumoniae
Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Enterobacteriaceae Klebsiella
REFERENCE 1 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH QueenanAM
AndersonGJ Domenech-SanchezA
BiddleJW StewardCD
AlbertiS BushK and TenoverFC
TITLE Novel carbapenem-hydrolyzing beta-
lactamase KPC-1 from a
carbapenem-resistant strain of
Klebsiella pneumoniae
JOURNAL Antimicrob Agents Chemother 45 (4)
1151-1161 (2001)
PUBMED 11257029
REFERENCE 2 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH AndersonGJ and
TenoverFC
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (19-AUG-2000) Nosocomial
Pathogens Laboratory Branch
Centers for Disease Control and
Prevention 1600 Clifton Rd MS
G08 Atlanta GA 30333 USA
FEATURES LocationQualifiers
77
source 11377
organism=Klebsiella
pneumoniae
mol_type=genomic DNA
db_xref=taxon573
-35_signal 5560
-10_signal 7883
mRNA 921012
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
RBS 117122
CDS 1311012
note=blaKPC-1
codon_start=1
transl_table=11
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
protein_id=AAG134101
db_xref=GI10121875
translation=MSLYRRLVLLSCLSWPLAGFSATALTNLVAEPFAKLEQD
FGGSI
GVYAMDTGSGATVSYRAEERFPLCSSFKGFLAAAVLARSQQQAGLLDTPIRYG
KNALV
PWSPISEKYLTTGMTVAELSAAAVQYSDNAAANLLLKELGGPAGLTAFMRSIG
DTTFR
78
LDRWELELNSAIPSDARDTSSPRAVTESLQKLTLGSALAAPQRQQFVDWLKGN
TTGNH
RIRAAVPADWAVGDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTRAPNKDDK
HSEAV
IAAAARLALEGLGVNGQ
ORIGIN
1 cggggcagtt acagccgtta cagcctctgg
agagggagcg gcttgccgct cggtgataat
61 cccagctgta gcggcctgat tacatccggc
cgctacacct agctccacct tcaaacaagg
121 aatatcgttg atgtcactgt atcgccgtct
agttctgctg tcttgtctct catggccgct
181 ggctggcttt tctgccaccg cgctgaccaa
cctcgtcgcg gaaccattcg ctaaactcga
241 acaggacttt ggcggctcca tcggtgtgta
cgcgatggat accggctcag gcgcaactgt
301 aagttaccgc gctgaggagc gcttcccact
gtgcagctca ttcaagggct ttcttgctgc
361 cgctgtgctg gctcgcagcc agcagcaggc
cggcttgctg gacacaccca tccgttacgg
421 caaaaatgcg ctggttccgt ggtcacccat
ctcggaaaaa tatctgacaa caggcatgac
481 ggtggcggag ctgtccgcgg ccgccgtgca
atacagtgat aacgccgccg ccaatttgtt
541 gctgaaggag ttgggcggcc cggccgggct
gacggccttc atgcgctcta tcggcgatac
79
601 cacgttccgt ctggaccgct gggagctgga
gctgaactcc gccatcccaa gcgatgcgcg
661 cgatacctca tcgccgcgcg ccgtgacgga
aagcttacaa aaactgacac tgggctctgc
721 actggctgcg ccgcagcggc agcagtttgt
tgattggcta aagggaaaca cgaccggcaa
781 ccaccgcatc cgcgcggcgg tgccggcaga
ctgggcagtc ggagacaaaa ccggaacctg
841 cggagtgtat ggcacggcaa atgactatgc
cgtcgtctgg cccactgggc gcgcacctat
901 tgtgttggcc gtctacaccc gggcgcctaa
caaggatgac aagcacagcg aggccgtcat
961 cgccgctgcg gctagactcg cgctcgaggg
attgggcgtc aacgggcagt aaggctctga
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gacgcaatcc catcaccgcc ttgatca
80
21
(cirurgias implantaccedilatildeo de proacuteteses meacutedicas e outros) e a transferecircncia de material
geneacutetico com a informaccedilatildeo de resistecircncia a antibioacuteticos entre as bacteacuterias
(DIENSTMANN et al 2010 ENDIMIAMI et al 2009 FONTANA et al 2010)
Com a praacutetica da antibioticoterapia principalmente em ambientes
nosocomiais os mecanismos de resistecircncia tornaram-se comuns Esses
mecanismos incluem alteraccedilatildeo na permeabilidade da membrana celular que
impede a entrada do antibioacutetico na ceacutelula bombeamento do antibioacutetico para fora da
mesma pelo mecanismo de efluxo mutaccedilatildeo geneacutetica que altera de alguma forma o
alvo do antibioacutetico e consequumlentemente natildeo afeta o funcionamento da bacteacuteria
bem como desenvolvimento da capacidade de degradar ou da inativaccedilatildeo do
antibioacutetico (COTRIM et al 2012) Estes mecanismos estatildeo representados na figura
3
Figura 3 Mecanismos de resistecircncia bacteriana Fonte
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controle
opas_webmodulo3pop_mecanismohtmgt
Um dos mais importantes mecanismos de resistecircncia eacute a alteraccedilatildeo do local-
alvo onde atua determinado antimicrobiano de modo a impedir a ocorrecircncia de
qualquer efeito inibitoacuterio ou bactericida As bacteacuterias podem adquirir um gene que
22
codifica um novo produto resistente aos antimicrobianos substituindo o alvo original
por exemplo o Staphylococcus aureus resistente agrave oxacilina e estafilococos
coagulase-negativos adquiriram o gene cromossocircmico Mec A e produzem uma PBP
ou PLP resistente aos β-lactacircmicos denominada 2a ou 2 que eacute suficiente para
manter a integridade da parede celular durante o crescimento quando outras PBPs
essenciais satildeo inativadas por antibimicrobianos β-lactacircmicos Como alternativa um
gene receacutem-adquirido pode atuar para modificar um alvo tomando-o menos
vulneraacutevel a determinado antimicrobiano Assim um gene transportado por
plasmiacutedeo ou por transposon codifica uma enzima que inativa os alvos ou altera a
ligaccedilatildeo dos antimicrobianos como ocorre com eritromicina e clindamicina (ANVISA
2007)
Em funccedilatildeo da bomba de efluxo pode variar a especificidade do antibioacutetico
Ele atua por meio do bombeamento ativo de antimicrobianos do meio intracelular
para o extracelular gerando uma resistecircncia bacteriana a determinados
antimicrobianos como eacute o caso da resistecircncia agraves tetraciclinas codificada por
plasmiacutedeos em Escherichia coli devido agrave presenccedila de proteiacutenas integrantes da
membrana plasmaacutetica bacteriana (PIDDOCK 2006)
O aumento da siacutentese de proteiacutenas eacute o principal responsaacutevel pela resistecircncia
antimicrobiana devido agraves vaacuterias mutaccedilotildees que ocorrem em seus repressores
transcricionais Estas mutaccedilotildees tambeacutem podem influenciar levando a um aumento
da eficiecircncia do transporte dos antibioacuteticos para o exterior da ceacutelula (HARBOTTLE
et al 2006)
A resistecircncia aos antibioacuteticos eacute frequumlentemente associada agrave alteraccedilatildeo
diminuiccedilatildeo da permeabilidade que ocorre na membrana externa das bacteacuterias gram-
negativas O fluxo de moleacuteculas para o interior da ceacutelula ocorre por caracteriacutesticas
peculiares como carga estrutura e dimensatildeo e atraveacutes de proteiacutenas de membrana
as quais formam canais Este percurso eacute utilizado pelos antibioacuteticos para atingir o
interior da ceacutelula bacteriana ou o espaccedilo periplasmaacutetico como eacute o caso dos
antibioacuteticos β-lactacircmicos Portanto a perda de funccedilatildeo destas proteiacutenas pode
efetivamente causar a diminuiccedilatildeo da susceptibilidade a vaacuterios antibioacuteticos
(LIVERMORE 2003)
23
Os mecanismos de resistecircncia que podem impedir a accedilatildeo de antimicrobianos
satildeo vaacuterios O faacutermaco atua de forma a inibir os processos essenciais a multiplicaccedilatildeo
e sobrevivecircncia da ceacutelula bacteriana como a membrana citoplasmaacutetica e
consequumlentemente bloqueando a siacutentese proteacuteica de aacutecidos nucleacuteicos e da parede
celular A resistecircncia bacteriana eacute um mecanismo natural de defesa Sendo assim
as bacteacuterias estatildeo em constante defesa e para cada novo faacutermaco desenvolvido as
bacteacuterias iratildeo desenvolver resistecircncia em algum momento (POSSEBON et al
2003)
O grupo de antibioacuteticos beta-lactacircmicos satildeo amplamente utilizado e se
encontram dentro da classe dos melhores agentes antimicrobianos com relevacircncia
cliacutenica No entanto o seu uso tem sido restringido devido a vaacuterios mecanismos de
resistecircncia O desenvolvimento dos carbapenecircmicos surgiu devido agrave proliferaccedilatildeo de
beta-lactamases mediadas por plasmiacutedeos e cromossomos (POSSEBON et al
2003)
A bacteacuteria KPC tem um gene chamado SHV-1 que tem a caracteriacutestica de
resistecircncia a quase todos os tipos de antimicrobianos inclusive os carbapenecircmicos
especiacuteficos para o tratamento de infecccedilotildees por bacteacuterias multiresistentes e
emergecircncias Mesmo com no seu coacutedigo geneacutetico a informaccedilatildeo necessaacuteria para o
desenvolvimento da resistecircncia a resistecircncia da bacteacuteria soacute eacute desenvolvida caso a
bacteacuteria entre em contato com o antibacteriano desencadeando todo o processo
nos casos de resistecircncia induzida comuns em KPC (MOREIRA et al 2014)
A resistecircncia bacteriana pode ser apresentada de forma intriacutenseca ou
adquirida A resistecircncia intriacutenseca faz parte das caracteriacutesticas fenotiacutepicas naturais
do microrganismo ou seja faz parte de sua heranccedila geneacutetica sendo transmitida
verticalmente a prole sem perda da caracteriacutestica A presenccedila ou ausecircncia do alvo
para a accedilatildeo da droga eacute o principal determinante deste tipo de resistecircncia
(MOREIRA et al 2014) Essa resistecircncia corresponde a uma caracteriacutestica de
espeacutecie bacteriana quando estes microrganismos satildeo naturalmente resistentes a
certo tipo de antibioacutetico Este processo eacute decorrente da ausecircncia de estruturas de
atuaccedilatildeo de antimicrobianos ou a impermeabilidade por parte de estruturas
perifeacutericas das bacteacuterias (HENRIQUE et al 2014)
24
A resistecircncia adquirida aos antibioacuteticos por sua vez ocorre quando haacute uma
da mutaccedilatildeo de genes reguladores ou estruturais aquisiccedilatildeo de genes de resistecircncia
veiculados por elementos geneacuteticos moacuteveis ou da combinaccedilatildeo entre eles Este
aparecimento de resistecircncia em uma espeacutecie bacteriana era anteriormente sensiacutevel
a droga e devido a um destes fatores se torna resistente O fenoacutetipo resultante
desta resistecircncia natildeo estaraacute presente nas ceacutelulas genitoras e sim nos indiviacuteduos de
uma linhagem bacteriana derivada de um organismo susceptiacutevel Os genes muitas
vezes satildeo adquiridos por meio de elementos moacuteveis como plasmiacutedeos e
transposons (MOREIRA et al 2014)
Entatildeo a resistecircncia adquirida ocorre por diversos mecanismos geneacuteticos tais
como produccedilatildeo de enzimas inativadoras interferecircncia com a entrada e acuacutemulo de
droga na bacteacuteria alteraccedilatildeo do receptor para accedilatildeo da droga via metaboacutelica
alternativa Eacute originada por meio de uma alteraccedilatildeo a niacutevel geneacutetico da ceacutelula de
natureza cromossocircmica pelos processos de mutaccedilatildeo transduccedilatildeo e transformaccedilatildeo
ou extra cromossocircmica (plasmidial) (HENRIQUE et al 2014)
Como todo antibioacutetico β-lactacircmicoos carbapenecircmicos tem como mecanismo
de accedilatildeo a inibiccedilatildeo da siacutentese proteacuteica atraveacutes da accedilatildeo de inibiccedilatildeo da parede
microbiana fazendo a ligaccedilatildeo e inativaccedilatildeo das proteiacutenas ligadoras de penicilinas
(NETO et al 2007)
Imipenem e meropenem antibioacuteticos pertencentes ao grupo dos
carbapenecircmicos possuem um amplo espectro de accedilatildeo in vitro incluindo atividade
contra cocos gram-positivos bacilos gram-negativos e bacteacuterias anaeroacutebias (MOHR
2008) Jaacute o ertapenem possui um espectro de accedilatildeo mais limitado que o os dois
antibioacuteticos anteriormente citados tendo uma eficiecircncia limitada contra os bacilos
gram-negativos natildeo fermentadores Um novo antibioacutetico carbapenecircmico ainda natildeo
disponiacutevel no Brasil doripenem possui uma atividade mais potente principalmente
contra Pseudomona aeruginosa devido ao seu mecanismo de accedilatildeo que combina os
espectros de accedilatildeo de imipenem e meropenem (ZHANEL et al 2007)
Devido as suas estabilidades espectro de accedilatildeo poucos relatos de
resistecircncia boa toleracircncia pelos pacientes com efeitos adversos mais comuns as
complicaccedilotildees no siacutetio da infusatildeo e toxicidade gastrintestinal estes antibioacuteticos
carbapenecircmicos tecircm sido considerados terapia de escolha (NICOLAU 2008) Como
25
uma resposta adaptativa das Enterobacteacuterias o iacutendice de resistecircncia aos
carbapenecircmicos tem aumentado nos uacuteltimos anos de forma proporcional ao seu
uso limitando imensamente as opccedilotildees terapecircuticas para as infecccedilotildees causadas por
estes microrganismos (FALAGAS et al 2009)
As enzimas produtoras de betalactamases hidrolisam o anel betalactacircmico
tornando este mecanismo de resistecircncia o mais importante Os dois grupos mais
preocupantes satildeo o grupo das betalactamases de aspecto ampliado e os da
carbapenemases que aleacutem de hidrolizar os carbapenecircmicos hidrolizam todas as
outras classes de betalactacircmicos Em enterobacteacuterias as carbapenemases mais
prevalentes satildeo codificadas por genes dos grupos blaKpc blaIMP blaVIM blaNdm
e blaOxa A ocorrecircncia de carbapenemases eacute mais frequentemente em bacteacuterias
gram-negativas fermentadoras da glicose conhecidas como enterobacteacuterias
predominantes nos gecircneros Klebsiella Serratia Citrobacter Enterobacter
Escherichia Samonella Proteus Morganella Podem ser encontradas tambeacutem em
bacteacuterias gram-negativas natildeo fermentadoras como espeacutecies de Acinetobacter e de
Pseudomonas (ALVES et al 2013)
Carbapenemases satildeo enzimas plasmiacutedio-mediados resistentes a todos
antibioacuteticos betalactacircmicos As bacteacuterias que possuem o gene blaKpC responsaacutevel
pela codificaccedilatildeo da produccedilatildeo de carbapenemases apresentam resistecircncia aos
antibioacuteticos betalactacircmicos impedindo a accedilatildeo destes antibioacuteticos contra infecccedilotildees
(ALVES et al 2013)
A transmissatildeo das carbapenemases a diferentes cepas de enterobacteacuterias se
daacute atraveacutes de plasmiacutedeos que satildeo pequenas moleacuteculas circulares de DNA com a
capacidade de se replicarem independentemente do DNA cromossocircmico
permitindo a troca de material geneacutetico entre gecircneros e espeacutecies diferentes de
enterobacteacuterias O raacutepido desenvolvimento de surtos em ambientes hospitalares eacute
explicado por essa disseminaccedilatildeo plasmidial (COTRIM et al 2012)
De acordo com o criteacuterio de interpretaccedilatildeo do Clinical and Laboratory
Standards Institute (CLSI 2009) a maioria das KPC isoladas natildeo apresenta
resistecircncia completa aos carbapenecircmicos (Imipenem e Meropenem apresentam
uma Concentraccedilatildeo Inibitoacuteria Miacutenima (CIM) de 2-8 μgmL) (COTRIM et al 2012)
26
Os mecanismos de resistecircncia capazes de impedir a accedilatildeo dos
carbapenecircmicos satildeo vaacuterios Poreacutem a degradaccedilatildeo de antibioacuteticos por enzimas
principalmente as carbapenemases constituem o principal mecanismo de
resistecircncia aos antibioacuteticos β-lactacircmicos (DIAS 2009) Devido a ampla atividade
hidroliacutetica agrave maioria dos antibioacuteticos β-lactacircmicos estes grupos de enzimas possuem
alta versatilidade (QUEENAM et al 2007)
Existem trecircs grandes classes moleculares de Ambler a qual as
carbapenemases pertencem denominadas classe A (serino-carbapenemases os
quais incluem membros designados SME IMI NMC GES e a famiacutelia das KPCs)
classe B(as metalo-β-lactamase incluem os tipos IMP e VIM) e classe D
(oxacilinases similares as da classe A e incluem as OXA e PSE) (DIAS 2009)
Dentre estes as mais importantes e prevalentes encontradas em plasmiacutedeos
de Klebsiella pneumoniae satildeo as KPC (DIENSTMANN et al 2010) Por meio de
estudos moleculares a enzima KPC jaacute foi documentada em diferentes bacteacuterias e
diferenciada em KPC-1 a 13 (NETIKUL et al 2011) No ano de 2009 foi realizada
uma pesquisa onde descreveram as seguintes carbapenemases KPC-1 em isolados
de Klebsiella pneumoniae KPC-2 em K pneumoniae K oxytoca Salmonella
enterica e em Enterobacter sp e KPC-3 em K pneumoniae e Enterobacter cloacae
(MONTEIRO et al 2009) As enzimas KPC-4 e KPC-5 foram encontradas em
isolados de Pseudomonas aeruginosa (PEIRANO et al 2009)
Foi observada uma correccedilatildeo da sequumlecircncia KPC-1 indicando que o gene
blaKPC-1 e blaKPC-2 satildeo idecircnticos Trecircs novas variantes blaKPC-3 blaKPC-4 e
blaKPC-5 satildeo resultados de mutaccedilotildees do gene estrutural da enzima KPC-2
(WOLTER et al 2008) apresentando diferentes perfis de hidroacutelise As enzimas
KPC-2 e KPC-3 possuem alta eficiecircncia em hidrolisar cefalotina cefaloridina e
nitrocefin poreacutem possuem uma menor eficiecircncia contra carbapenecircmicos e
cefotaxima (ALBA et al 2005) As enzimas KPC-5 e KPC-4 apresentam menor
hidroacutelise de carbapenecircmicos eacute do que em KPC-2 Em contrapartida possuem
melhor eficiecircncia contra ceftazidima e uma maior inibiccedilatildeo pelo aacutecido clavulacircnico
(WOLTER et al 2008)
27
13 Anaacutelise geneacutetica de microrganismos
Eacute de extrema importacircncia praacutetica natildeo soacute no aspecto cliacutenico mas tambeacutem na
fitopatologia biotecnologia e estudos ambientais a correta identificaccedilatildeo e
classificaccedilatildeo de microrganismos Os meacutetodos usados na diferenciaccedilatildeo de gecircneros
espeacutecies e estirpes de microrganismos podem ser divididos em meacutetodos fenotiacutepicos
(baseados em fenocircmenos bioquiacutemicos fisioloacutegicos e bioloacutegicos) e genotiacutepicos
(detectam polimorfismos ao niacutevel dos aacutecidos nucleacuteicos ou variaccedilatildeo aleacutelica ao niacutevel
de enzimas) (ALVES et al 2003)
Para este tipo de estudo existem alguns meacutetodos como o RFLPrsquos -
ldquoRestriction Fragment Length Polymorphismsrdquo (polimorfismos de tamanho de
fragmentos de restriccedilatildeo) rep-PCR (Meacutetodo de tipagem baseado na amplificaccedilatildeo via
PCR de elementos de DNA repetitivos presentes em genomas bacterianos) anaacutelise
de sequumlecircncias nucleotiacutedeas (discriminaccedilatildeo eou identificaccedilatildeo atraveacutes de sequumlecircncias
de DNA) PFGE - Pulsed-Field Gel Electrophoresis (Eletroforese em campo
pulsado) ( A L V E S et al 2003)
A diferenciaccedilatildeo clara da cepa e principalmente a alta reprodutibilidade devem
ser caracteriacutesticas de qualquer meacutetodo de tipagem geneacutetica Poreacutem nem todos os
meacutetodos moleculares de tipagem satildeo igualmente eficazes Sendo assim de acordo
com a finalidade pretendida (identificaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo custo reprodutibilidade
etc) eacute feita a escolha do meacutetodo a ser aplicado (A L V E S et al 2003)
O processo de identificaccedilatildeo fenotiacutepica de KPC entre os membros da famiacutelia
Enterobacteriaceae ainda eacute difiacutecil e os meacutetodos para a sua identificaccedilatildeo devem ser
revistos e ajustados Mesmo com o avanccedilo tecnoloacutegico natildeo existem ensaios que
combinam alta especificidade e sensibilidade na detecccedilatildeo destas enzimas Satildeo
diversas as metodologias usadas para rastreamento de KPC como por exemplo a
focalizaccedilatildeo isoeleacutetrica a teacutecnica de disco-difusatildeo E-test teste de Hodge
modificado dentre outros Aleacutem disso a pesquisa do gene blaKPC pode ser feita
pela Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) Os sistemas de automaccedilatildeo
existentes no entanto podem natildeo identificar com precisatildeo os isolados KPC
positivos (COTRIM et al 2012)
A identificaccedilatildeo blaKPC pelo PCR eacute um meacutetodo raacutepido preciso sensiacutevel e
altamente especiacutefico no entanto a PCR exige equipamento e conhecimentos
28
especializados em diagnoacutestico molecular dificultando ainda a utilizaccedilatildeo dele na
rotina dos laboratoacuterios de microbiologia (COTRIM et al 2012)
Em estudo de infecccedilotildees hospitalares identificaccedilatildeo molecular de patoacutegenos
bacterianos eacute bastante utilizada Para diferenciar carbapenemases tipo KPC a partir
de outros tipos como SME NMC-A-IMI e GES eacute necessaacuterio um exame molecular
As identificaccedilotildees do microrganismo juntamente com a triagem molecular iratildeo definir
um resultado mais especiacutefico podendo ser usado para identificar o antibioacutetico mais
adequado para o tratamento Poreacutem a principal desvantagem de alguns exames
baseados em PCR por exemplo eacute que devido agrave sua limitada capacidade de
multiplexaccedilatildeo eles distinguem apenas algumas variaccedilotildees (MOREIRA et al 2014)
Estatildeo descritas para a identificaccedilatildeo molecular de patoacutegenos pertencentes agrave
famiacutelia Enterobacteriaceae as teacutecnicas de PFGE RAPD (randomly amplified
polymorphic DNA) e ERIC-PCR (Enterobacterial Repet it ive Intergenic Consensus)
A PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) eacute considerada padratildeo ouro devido sua
alta capacidade de diferenciaccedilatildeo baseada na anaacutelise do perfil de restriccedilatildeo do DNA
genocircmico por meio de eletroforese Como desvantagem para a sua execuccedilatildeo eacute
necessaacuterios vaacuterios dias impedindo a tipagem de algumas cepas bacterianas devido
agrave degradaccedilatildeo do DNA aleacutem do alto custo empregado (MOREIRA et al 2014)
O meacutetodo baseado em ERIC-PCR tem sido bastante utilizado como uma
alternativa para a teacutecnica de PFGE Esta teacutecnica consiste na anaacutelise do padratildeo de
amplificaccedilatildeo de elementos repetidos encontrados no genoma bacteriano Isto
permite uma maior rapidez na obtenccedilatildeo de resultados quando comparada com o
PFGE aleacutem de alta reprodutibilidade simples execuccedilatildeo e implementaccedilatildeo baixo
custo e natildeo sem problemas com a degradaccedilatildeo do DNA (MOREIRA et al 2014)
A PCR eacute considerada uma teacutecnica de biologia molecular revolucionaacuteria que
consiste na siacutentese enzimaacutetica de coacutepias de aacutecidos nucleacuteicos Ela permitiu o raacutepido
desenvolvimento do estudo de sequumlecircncias de aacutecidos nucleacuteico Foi desenvolvida por
Kary Banks Mullis que ganhou o precircmio Nobel de quiacutemica de 1993 devido ao
desenvolvimento dessa teacutecnica em abril de 1983 (CAMARGO et al 2014)
Por meio de etapas de variaccedilatildeo de temperatura a teacutecnica de PCR promove a
duplicaccedilatildeo de cadeias de DNA in vitro A reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo de DNA por PCR
envolve o emprego de sequumlecircncias iniciadoras (primers) quatro nucleotiacutedeos
29
(dNTPrsquos) do DNA e uma DNA polimerase termoestaacutevel podendo assim obter-se a
partir de uma fita molde muitas coacutepias de uma sequumlecircncia especiacutefica de aacutecido
nucleacuteico O princiacutepio da PCR consiste na variaccedilatildeo de temperatura por ciclo
envolvendo trecircs etapas baacutesicas desnaturaccedilatildeo pareamento e amplificaccedilatildeo
(CAMARGO et al 2014)
A desnaturaccedilatildeo da fita molde de DNA eacute uma etapa com duraccedilatildeo entre 30
segundos a 1 minuto a temperatura entre 92 ordmC a 96 ordmC Apoacutes isso o pareamento de
dois iniciadores sinteacuteticos de composiccedilotildees distintas que funcionam como os
iniciadores da reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo liga-se agrave regiatildeo complementar da fita de
DNA alvo que sofreraacute a duplicaccedilatildeo Esta etapa tem duraccedilatildeo de 30 segundos a 1
minuto a temperatura entre 58 ordmC e 65 ordmC Por uacuteltimo a amplificaccedilatildeo por meio da
enzima Taq DNA polimerase das novas fitas de DNA se daacute a partir de cada um dos
iniciadores utilizando os quatro dNTPrsquos como substrato da reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo
Esta etapa possui duraccedilatildeo entre 45 segundos e 1 minuto a 72 ordmC Cada ciclo eacute
repetido em torno de 30 a 35 vezes e promove a amplificaccedilatildeo da regiatildeo alvo
determinada conforme o anelamento dos iniciadores sinteacuteticos de DNA (CAMARGO
et al 2014) Estas etapas estatildeo demonstradas na figura 4
Figura 4 Etapas da Reaccedilatildeo de PCR
30
2 JUSTIFICATIVA
No ano de 2010 no Distrito Federal foram identificados 111 pacientes com
suspeita de infecccedilatildeo por Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) e a
Secretaria de Sauacutede do Distrito Federal confirmaram ainda a morte de 18 pacientes
dentre os hospitais puacuteblicos e particulares Um desafio encontrado por ocasiatildeo do
surto infeccioso no Distrito Federal foi o de confirmar as KPCs por Reaccedilatildeo da
Polimerase em Cadeia sendo que as amostras foram enviadas com esta finalidade
para a Fiocruz no Rio de Janeiro
Pesquisas que possam contribuir na elaboraccedilatildeo de estrateacutegias preventivas e
de intervenccedilatildeo para infecccedilotildees causadas por enterobacteacuterias bem como contribuir
para gerar uma integraccedilatildeo beneacutefica entre a equipe acadecircmica e os serviccedilos de
sauacutede devem ser estimuladas Neste sentido o presente estudo permitiu escrutinar
os genes envolvidos na expressatildeo de carbapenemases presentes em espeacutecies de
enterobacteacuterias isoladas em ambiente hospitalar visto que elucidar genes de
resistecircncia de enterobacteacuterias aos antibioacuteticos carbapenecircmicos eacute o primeiro passo
para garantir um controle epidemioloacutegico efetivo para estes tipos de microorganismo
assim como sua associaccedilatildeo com surtos fatais particularmente em pacientes com
baixa imunidade
31
3 OBJETIVOS
31 Objetivo geral Caracterizar os genes de resistecircncia das
Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases e os aspectos epidemioloacutegicos de
pacientes internados em um hospital puacuteblico do Distrito Federal
32 Objetivos Especiacuteficos
Identificar genotipicamente a enzima KPC (Klebsiella pneumoniae
carbapenemase) de isolados de Klebsiella pneumoniae
Investigar aspectos epidemioloacutegicos dos pacientes portadores de
Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases
Identificar quais variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana influenciaram para o
desfecho oacutebito ou alta
Avaliar a susceptibilidade das Enterobacteacuterias aos antibioacuteticos
carbapenecircmicos dos pacientes em ambiente hospitalar
32
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
Trata-se de um estudo transversal onde foi realizado o teste de
susceptibilidade das enterobacteacuterias aos antibioacuteticos carbapenecircmicos a partir dos
materiais bioloacutegicos coletados dos pacientes internados no Hospital Regional da Asa
Norte (HRAN) e enviados ao Laboratoacuterio de Anaacutelises Cliacutenicas da mesma Instituiccedilatildeo
Os materiais bioloacutegicos investigados foram sangue aspirado traqueal ou brocircnquico
urina e cultura semi quantitativa de ponta de cateter venoso central O HRAN eacute um
hospital puacuteblico do Distrito Federal com 395 leitos sendo as cliacutenicas de internaccedilatildeo
Berccedilaacuterio Cirurgia Geral Cirurgia Plaacutestica Cliacutenica Meacutedica Ginecologia Maternidade
Pediatria Queimados UTI com atendimento a pacientes portadores de doenccedilas de
caraacuteter cliacutenico e ciruacutergico
4 1 Coleta e transporte das amostras bioloacutegicas
As amostras foram coletadas de pacientes internados no Hospital Regional da
Asa Norte (HRAN) com suspeitas de infecccedilatildeo por KPC A identificaccedilatildeo primaacuteria foi
realizada pelo Laboratoacuterio de Microbiologia do hospital de origem dos pacientes e os
demais procedimentos que foram utilizados na identificaccedilatildeo encontram-se descritos
abaixo
4 2 Procedimentos para confirmaccedilatildeo de resistecircncia bacteriana por
disco de ertapenem (adaptado CDC 2004)
Para diagnosticar amostra como portadora de bacteacuteria produtora de
carbapenemase foi realizado o teste com disco de ertapenem como forma de
triagem Inicialmente utilizou-se o swab contaminado com a amostra que foi
distribuiacuteda em uma pequena aacuterea da placa de aacutegar MacConkey para apoacutes o
crescimento ser realizada a pesquisa de colonizaccedilatildeo por enterobacteacuterias resistentes
aos carbapenecircmicos (Pesquisa de CRE) Procedeu-se a semeadura por teacutecnica
semi-quantitativaesgotamento com alccedila bacterioloacutegica na diluiccedilatildeo de 1100 O disco
de Ertapenem foi colocado na superfiacutecie da placa de MacConkey na junccedilatildeo dos dois
primeiros campos de semeadura conforme demonstrado na figura 5 Incubou a placa
33
em estufa aeroacutebia a 35ordmC por 24 e 48 horas e observou-se o halo de difusatildeo do
disco de Ertapenem na placa para proceder agrave leitura
O teste deixou de ser obrigatoacuterio apoacutes a modificaccedilatildeo dos criteacuterios
interpretativos para carbapenecircmicos para enterobacteacuterias publicados no suplemento
do CLSI 2010 M100-S20-U
Figura 5 Mecanismo de semeamento de material bioloacutegico oriundos de
pacientes com suspeita de infecccedilatildeo por KPC Fonte adaptado CDC 2004
4 2 1 Interpretaccedilatildeo dos resultados
Na ausecircncia de crescimento ateacute 24 horas (MacConkey) ou halo de difusatildeo
gt27 mm na placa deve-se reincubar as placas por mais 24 horas Quando for
ausente o crescimento apoacutes 48 horas ou halo de difusatildeo gt27 mm na placa libera-se
como enterobacteacuterias resistentes a carbapenecircmicos (KPCNEG)Havendo
crescimento de colocircnias na placa de MacConkey com halo lt 27 mm (apenas para
colocircnias com crescimento dentro do halo) deve-se reisolar e realizar identificaccedilatildeo e
antibiograma automatizado teste de sensibilidade por disco-difusatildeo e Teste de
Hodge Modificado (THM) Os isolados de enterobacteacuterias cujos testes comprovarem
a resistecircncia aos carbapanecircmicos testados (KPCPOS) foram reportado a Comissatildeo
de Controle de Infecccedilatildeo Hospitalar (CCIH) Jaacute osbacilos Gram-negativos natildeo
fermentadores natildeo foram reportados (KPCNEG) Para interpretaccedilatildeodos resultados
foram utilizados os valores conforme demonstrados na tabela 1
Tabela 1 Criteacuterios Interpretativos para testes de sensibilidade
ENTEROBACTEacuteRIAS
Disco difusatildeo (mm) MIC (microgml)
34
Antibioacutetico Sigla S I R S I R
Ertapenem 10
microg
ETP 22 19-
21
18 05 1 2
Meropenem 10
microg
MEM 23 20-
22
19 1 2 4
Fonte Manual Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)
2013
Os resultados que apresentaram resistecircncia ao antibioacutetico Ertapenem foram
considerados como suspeitos de contaminaccedilatildeo por KPC Fez-se o teste de
susceptibilidade aos antibioacuteticos (TSA) em aparelho automatizado MicroScan Walk
Away 96sl Dade Behring
4 3 Teste de susceptibilidade aos antibioacuteticos (adaptado CDC 2004)
A determinaccedilatildeo da susceptibilidade dos isolados foi feita pelo teste de
susceptibilidade aos antibioacuteticos (TSA) apoacutes cultura em meio de gelose simples
(INSA) para avaliaccedilatildeo da sua pureza e obtenccedilatildeo de colocircnias isoladas Para
preparaccedilatildeo de uma suspensatildeo bacteriana com turvaccedilatildeo aproximada de 05
McFarland (Dade BehringMicroScanregTurbidity Meter) ressuspendeu duas a cinco
colocircnias em 2ml de soro fisioloacutegico esteacuteril diluindo a 1100 em soro fisioloacutegico num
volume total de 10ml em seguida foi feita uma semeadura em duas placas
quadradas (120mm x 120mm) de Muller-Hinton Agar (INSA) por inundaccedilatildeo
Os discos de antibioacutetico carbapenecircmicos imipenem meropenem e
ertapenem (Biorad) foram aplicados com o auxiacutelio de um dispensador automaacutetico A
susceptibilidade das Enterobacteacuterias aos carbapenecircmicos foi definida de acordo
com o protocolo Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI 2011)
Para aquelas Enterobacteacuterias que apresentaram resistecircncia ao ertapenem
foram realizados o Teste de Hodge Modificado para Detecccedilatildeo de Enterobacteacuterias
Produtoras de Carbapenemases conforme descrito pelo Centers for Disease Control
and Prevention (CDC 2004)
35
4 4Teste de Hodge Modificado (THM) (adaptado CDC 2004)
Preparou-se uma suspensatildeo em salina esteacuteril com a cepa Escherichia coli
ATCC 25922 (padratildeo 05 de McFarland) Apoacutes isto diluiu a suspensatildeo 110 em
salina (05 ml da soluccedilatildeo de Ecoli ATCC 25922 + 45 ml salina)Foi entatildeo semeado
na superfiacutecie de uma placa de Agar Muller-Hinton com a suspensatildeo diluiacuteda de Ecoli
ATCC 25922 com auxilio de swab seco assegurando que houvesse uma
distribuiccedilatildeo uniforme cobrindo toda a superfiacutecie do Agar Deixou secar por 3 a 5
minutos em temperatura ambienteColocou-se o disco de ertapenem 10microg no centro
da placa e apoacutes isto fez-se uma estria linear da cepa a ser testada da borda do
disco ateacute a borda da placa utilizando uma alccedila calibrada 10 microl ou um swab Incubou
a placa na estufa em atmosfera aeroacutebia a 35 plusmn 2ordmC por 16 a 24 horas
441 Controle de qualidade (CQ)
Foi utilizado um CQ todos os dias em que se realizou o teste tendo como
controle Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1705- teste de Hodge modificado
positivo Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1706- teste de Hodge modificado
negativo
442 InterpretaccedilatildeoResultados
Apoacutes 16ndash24 horas de incubaccedilatildeo examinar as placas para verificar a presenccedila
de uma distorccedilatildeo no halo de inibiccedilatildeo do disco de ertapenem devido ao crescimento
realccedilado da cepa ATCC na intersecccedilatildeo do organismo teste e a Ecoli ATCC 25922
dentro dos limites do halo O THM positivo apresentaraacute presenccedila de distorccedilatildeo no
halo de inibiccedilatildeo de ertapenem devido ao crescimento da cepa Ecoli ATCC 25922 ao
longo da estria da cepa teste para dentro dos limites do halo de inibiccedilatildeo Jaacute o THM
negativo teraacute ausecircncia de crescimento da cepa Ecoli ATCC 5922 ao longo da estria
da cepa teste para dentro dos limites do halo de inibiccedilatildeo do disco de ertapenem
Este resultado estaacute representado na figura 6
36
Figura 6 Interpretaccedilatildeo resultado do Teste de Hodge Modificado
(adaptado CDC 2004) Teste positivo na estria da cepa teste na parte superior
da placa teste negativo na estria da cepa teste na parte inferior da placa
Tendo positivo como resultado o paciente era um provaacutevel contaminado por
KPC As amostras entatildeo foram encaminhadas para a Fundaccedilatildeo Osvaldo Cruz
(FIOCRUZ) para confirmaccedilatildeo final As amostras finalmente confirmadas como
positivas para KPC foram isoladas e guardadas no banco de cepas cliacutenicas do
hospital Apoacutes a autorizaccedilatildeo do CEP amostras das cepas foram transferidas para
meio de transporte Stuard em caixa teacutermica fechada em baixa temperatura e
levadas para o laboratoacuterio de microbiologia cliacutenica da universidade
No laboratoacuterio da universidade as amostras foram separadas e realizadas
repiques em meios MacConkey e incubadas por 24h As colocircnias caracteriacutesticas
foratildeo isoladas em caldo BHI e mantidas em shaker a 37oC por 2h Apoacutes isto foram
executadas as anaacutelises a seguir
Os isolados de Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases foram
submetidos agrave extraccedilatildeo de DNA e posterior sequumlenciamento para identificaccedilatildeo dos
genes de resistecircncia blaKPC de 1 a 13 e identificaccedilatildeo do gene universal Os
pacientes de onde os materiais bioloacutegicos contendo as Enterobacteacuterias produtoras
de carbapenemases foram os isolados foram investigados quanto aos aspectos
epidemioloacutegicos e cliacutenicos
37
4 5 Extraccedilatildeo de DNA bacteriano
A extraccedilatildeo de DNA bacteriano foi realizada utilizando o kit NucleoSpin
Plasmidreg (MN) Antes de iniciar a extraccedilatildeo foi feito a preparaccedilatildeo das soluccedilotildees
reagentes materiais e amostras (vortexando) colocou-se em banho-maria agrave 50ordmC o
tampatildeo AW Partiu-se de colocircnias isoladas cultivadas que sofreram passagem em
meio LB liacutequido por 12h Adicionou-se 15 mL da amostra no tubo eppendorf
centrifugou por 5 minutos descartou o sobrenadante (com cuidado para natildeo
descartar o Pellet) Repetiu-se este procedimento por mais trecircs vezes completando-
se o volume de 6mL Foram adicionados 250microL do tampatildeo Resuspension Buffer A1
encostando a ponteira no Pellet e misturando (este tampatildeo tem como funccedilatildeo
separar a formaccedilatildeo de grumos celulares) Apoacutes isso homogeneizou e vortexou os
tubos eppendorfs Apoacutes isso foram adicionados 250microL do tampatildeo Lysis Buffer A2
homogenizou e deixou descansar por 5 minutos (esta etapa eacute importante para a lise
da parede e da membrana celulares e liberaccedilatildeo do conteuacutedo da ceacutelula)
Passado o tempo de descanso foi adicionado 300microL do tampatildeo
Neutralization Buffer A3 homogeneizou e centrifugou por 10 minutos (este tampatildeo
iraacute retirar as proteiacutenas que envolvem o DNA e voltaraacute com o pH para proacuteximo de 8
impedindo que a soluccedilatildeo de lise facilite a quebra das ligaccedilotildees covalentes do aacutecido
nucleacuteico) Em seguida enumeraram-se os tubos contendo filtros com siacutelica
transferiu-se o sobrenadante para o filtro e centrifugou por 5 minutos Descartou-se
o que foi filtrado adicionou 500microL do tampatildeo AW (banho-maria) centrifugou por 2
minutos Novamente foi descartado o filtrado Adicionou-se 600microL do tampatildeo A4
centrifugou por 2 minutos e descartou o filtrado (os tampotildees AW e A4 contecircm
isotiocianato de guanidina em concentraccedilotildees crescentes para facilitar a adsorccedilatildeo
do DNA na siacutelica e retirada das outras biomoleacuteculas da amostra) Foi feita outra
centrifugaccedilatildeo com o tubo vazio Apoacutes isto o filtro foi trocado para outro eppendorf
definitivo onde foi adicionado 50microL do tampatildeo Elution Buffer AE (este tampatildeo
favorece a eluiccedilatildeo do DNA) centrifugou por 2 minutos descartou o filtro e
armazenou as amostras em freezer -20ordmC
38
4 6 Iniciadores e reaccedilatildeo de PCR
Os iniciadores universais para o gene blaKPC foram desenhados baseados
em sequumlecircncias conservadas apresentadas pelos sub-grupos de genes que
codificam a enzima carbapenemase de klebsiella pneumoniae (YIGIT et al 2001)
Baseado na sequumlecircncia para o blakpc-1 depositada no GenBank
(AF2975541) o oligonucleotiacutedio (oligo) iniciador direto (5-
ATGTCACTGTATCGCCGTC-3rsquo) foi desenhado para reconhecer a sequumlecircncia
blaKPC na posiccedilatildeo (131149) enquanto que o iniciador reverso (5-
TTACTGCCCGTTGACGCC-3rsquo) foi reconhecido na posiccedilatildeo (9951012) As anaacutelises
baseadas em alinhamento de sequumlecircncias mostraram que o par de iniciadores
blaKPC podem detectar os alelos de 1 a 13 do gene blaKPC conforme a tabela 2
Tabela 2 Nuacutemero de acesso ao GenBank dos alelos blaKPC e seus
microrganismos originais
Nuacutemero de
Acesso GenBank
Microrganismo Alvo
AF2975541 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-1
GU0862251 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-2
HQ2589341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-2-like
AB5577341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC -3
EU4473041 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-4
EU4002222 Pseudomonas
aeruginosa
blaKPC-5
EU5555341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-6
EU7297271 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-7
39
FJ2344121 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-8
FJ624872 Escherichia coli blaKPC-9
GQ1403481 Acinetobacter
baumannii
blaKPC-10
HM0669951 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-11
HQ3428891 Enterobacter cloacae blaKPC-12
HQ3428901 Enterobacter cloacae blaKPC-13
As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo de blaKPC foram realizadas em um
primeiro tempo de desnaturaccedilatildeo em que foi 94ordmC por 5 minutos seguido de 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 58 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 90 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 78ordmC por 8 minutos Aleacutem das amostras foi utilizado um
controle negativo
A PCR do blaKPC foi realizada utilizando os componentes para o volume da
reaccedilatildeo de 25 microL citados na tabela 3 A banda do tamanho do produto de PCR foi de
881 pares de bases (pb) o que corresponde ao plasmiacutedeo
Tabela 3 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do
gene blaKPC
Reagente Volume
DNA molde 4 microL
Tampatildeo Taq 25 microL
MgCl2 075 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP
2 microL
Oligo F 1 microL
Oligo R 1 microL
Taq DNA polimerase 05 microL
Aacutegua MiliQ 1335 microL
40
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
Baseado na sequumlecircncia para o gene 16S rRNA em que o oligonucleotiacutedio
Universal iniciador direto foward (5-CCAGCAGCCGCCGTAATACG-3rsquo) foi
desenhado para reconhecer a sequumlecircncia universal na posiccedilatildeo 1513 enquanto que o
iniciador reverso (5-ATCGGYTACCTTGTTACGACTTC-3rsquo) foi reconhecido na
posiccedilatildeo 1491 foram realizadas PCRrsquos As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo deste
gene foram realizadas nos seguinte tempos separaccedilatildeo 94ordmC por 10 minutos 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 55 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 120 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 72ordmC por 10 minutos
A PCR do gene 16S rRNA foi realizada utilizando os componentes para o
volume da reaccedilatildeo de 25microL citados na tabela 4 A banda do tamanho do produto de
PCR foi de 996 pb correspondente aacute regiatildeo ribossomal capaz de amplificar todas
as espeacutecies
Tabela 4Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do gene
universal
Reagente (quantidade
concentraccedilatildeo do estoque)
Volume
DNA molde 10 ng 4 microL
Tampatildeo Taq 10 x 25 microL
MgCl2 50mM 125 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP 25 mM
125 microL
Oligo F 10microM 05 microL
Oligo R 10microM 05 microL
Taq DNA polimerase 5UmicroL 04 microL
Aacutegua Miliq 146 microL
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
41
O termociclador utilizado para os experimentos foi o LifeTouch da BIOER
4 7 Digestatildeo
Para realizaccedilatildeo da digestatildeo foi utilizada a enzima BshF I (Hae III) EN- 1105
tamanho 7000 units concentraccedilatildeo 10 unitsmicroL fonte Bacillus sphaericus empresa
Jena bioscienceUtilizaram-se os componentes para o volume de 50microL da reaccedilatildeo
citados na tabela 5
Tabela 5 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da digestatildeo do gene
universal
Reagente Volume
Produto de PCR 10 microL
Enzima BshF I 01 microL
Tampatildeo (10x) 5 microL
Aacutegua Miliq 349 microL
Total (em cada ependorff) 50 microL
Valores para 1 digestatildeo
Os ependorffs foram colocados por 30 minutos em banho-maria a 37ordmC Apoacutes
isso fez-se a corrida das amostras em gel de agarose para verificaccedilatildeo do resultado
(LU et al 2000)
4 8 Eletroforese em gel de agarose
Os produtos de DNA PCR e digestatildeo foram analisados em gel de agarose
2 O tempo de corrida do gel eacute de aproximadamente 1hora e 30minutos sendo
que no comeccedilo foi usada agrave voltagem de 50 V e apoacutes comeccedilar a correr o gel
aumentou a voltagem para 100 v Utilizou-se o marcador de 100pb (pares de bases)
Foi adicionado 3microL de corante Bromophenol (que tem a funccedilatildeo de fazer uma ligaccedilatildeo
na amostra de DNA e permitir a visualizaccedilatildeo da corrida no gel de agarose) em 7microL
de amostra tanto de DNA quanto de PCR Para o preparo do gel foi utilizado TBE
42
(Tris- Aacutecido Boacuterico) agarose e brometo de etiacutedio (sua funccedilatildeo eacute de corante para o gel
e permitir a visualizaccedilatildeo do DNA quando colocado agrave luz ultravioleta) Para o oligo
blaKPC a banda da amplificaccedilatildeo foi em 881ppb correspondendo ao plasmiacutedeo Jaacute
o oligo Universal foi em 996 pb
4 9 Descarte de resiacuteduos
Todos os materiais utilizados nos ensaios foram de uso uacutenico e manipulados
em cacircmaras de seguranccedila bioloacutegica classe II Apoacutes o uso foram colocados em
soluccedilatildeo desinfetantes (hipoclorito a 1) e em seguida autoclavados a 127oC por 20
min em sacos apropriados para autoclavaccedilatildeo Apoacutes a finalizaccedilatildeo do ciclo de
esterilizaccedilatildeo os sacos contendo o material descartaacutevel foram colocados em
recipientes de coleta da empresa responsaacutevel pela coleta de materiais bioloacutegicos
produzidos no laboratoacuterio de microbiologia Todos os procedimentos seguiram a
normativa RDC-ANVISA 3062004 sobre o descarte de resiacuteduos de serviccedilo de
sauacutede
4 10 Aspectos epidemioloacutegicos e cliacutenicos
Os aspectos cliacutenicos e epidemioloacutegicos foram investigados por meio de
prontuaacuterios dos pacientes portadores de enterobacteacuterias produtoras de
carbapenemases e envolveram topografia mais provaacutevel do foco infeccioso a
enfermidade motivadora da internaccedilatildeo o desfecho cliacutenico a idade e o tempo de
internaccedilatildeo
4 12 Anaacutelises eepidemioloacutegicas
As anaacutelises foram realizadas com o pacote estatiacutestico SPSS versatildeo 200
Para verificar quais variaacuteveis referentes aos dados epidemioloacutegicos e
microbioloacutegicos influenciaram no desfecho verificou- se a diferenccedila meacutedia das
variaacuteveis idade e tempo de internaccedilatildeo em cada grupo O teste estatiacutestico utilizado foi
o teste t de Student apoacutes se executar o teste de normalidade de Shapiro-Wilk Para
as variaacuteveis sexo perfil microbioloacutegico das enterobacteacuterias produtoras de
43
carbapenemases foi avaliada a associaccedilatildeo com o desfecho por meio do teste Exato
de Fisher O niacutevel de significacircncia adotado foi de 5
4 13 Preceitos eacuteticos
Este projeto estaacute inserido em um projeto maior denominado ldquoEpidemiologia
cliacutenica e caracterizaccedilatildeo molecular do Acinetobacter Baumannii resistente a
antibioticoterapia em pacientes internado em hospitais do Sistema Uacutenico de Sauacutederdquo
que foi submetido ao Comitecirc de Eacutetica em Pesquisa da Secretaria do Estado de
Sauacutede do Distrito Federal (SESDF) e emitido parecer aprovado pelo protocolo nordm
23109 (anexo)
44
5 RESULTADOS
51 Anaacutelise molecular
Para a amplificaccedilatildeo com o oligo blaKPC foram amplificadas amostras
que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 881 pb correspondente ao
plasmiacutedeo A anaacutelise da amplificaccedilatildeo da regiatildeo do gene blaKPC mostrou que
apenas a amostra A10 natildeo amplificou isso demonstra que esta amostra natildeo
possuiacutea o gene de resistecircncia
5 1 1 Gene blaKPC
Figura 7 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 881 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
A amostra A3 natildeo amplificou no primeiro momento entatildeo foi realizado
novamente a PCR e corrida de gel obtendo entatildeo a amplificaccedilatildeo da amostra como
apresentado na figura 8
45
Figura 8 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC da
mostra A3 estudada A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo de 881
pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 1 2 Gene 16S rRNA
Para a amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA utilizou-se o oligo universal Foram
amplificadas amostras que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 996 pb
Figura 9 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
46
Segundo Lu et al (2000) a digestatildeo com a enzima HaeIII deste amplicons de
16S rRNA devolveriam bandas com perfis entre 150 a 200 pb No gel abaixo eacute
possiacutevel evidenciar que este perfil ocorreu com o predomiacutenio de bandas na altura
de 200pb
Figura 10 Gel de agarose a 2 da digestatildeo do amplicon do gene 16S
rRNA das amostras com a enzima HaeIII evidenciando diversos fragmentos
proacuteximos a 200 pb A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo ribossomal
de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 2 Anaacutelises epidemioloacutegicas
5 2 1 Sexo
No total foram detectados 17 isolados de KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 onde a maior a prevalecircncia foi
detecatada em amostras de pacientes do sexo masculino (53) do que no sexo
feminino (47)
47
Figura 11 Isolado de KPC segundo sexo dos 17 pacientes investigados
no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 2 Desfecho cliacutenico
Em 17 isolados de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo
de 2010 aacute 2011 a porcentagem de pacientes que foram a oacutebito (59) foi maior que
a de pacientes que tiverm alta (41)
Figura 12 Isolado de KPC segundo desfecho cliacutenico dos 17 pacientes
investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
48
5 2 3 Local da coleta
Dos 17 episoacutedios detectados de infecccedilatildeo por KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 a infecccedilatildeo em swab retalfoi mais
frequente (47) seguida de ponta de cateacuteter (18) e secreccedilatildeo traqueal (12)
Figura 13 Isolados de KPC segundo local da coleta da amostra nos 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 4 Microorganismo
O microorganismo mais encontrado foi a Klebsiella pneumoniae (82)
seguida da Enterobacter clocae (12) e Serratia marcescens (6) dos 17 isolados
de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 Isto afirma o
fato de a sigla KPC ser utilizada de forma errocircnea aacute Klebsiella pneumoniae visto
que a evidecircncia dela eacute maior em relaccedilatildeo as outras cepas
49
Figura 14 Isolado de KPC segundo microrganismo encontrado em 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 5 Relaccedilotildees variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana e desfecho
cliacutenico
Tabela 6 ndash Distribuiccedilatildeo do perfil geneacutetico sexo coleta tipificaccedilatildeo de
microrganismos e anaacutelise da resistecircncia bacteriana segundo o desfecho
cliacutenico Brasiacutelia-DF 2010 a 2011
Variaacutevel Resultado
Desfecho
Alta Oacutebito
N N P
Gene 16S rRNA Positivo 7 1000 10 1000
NA Gene blaKPC Positivo 6 857 10 1000
Negativo 1 143 0 00 0218 Sexo Feminino 2 286 6 600
Masculino 5 714 4 400 0201 Local da coleta Fundo saco de
Douglas 1 143 0 00
Hemocultura 0 00 1 100 0463 Ponta de cateter 1 143 2 200
Sec TraquealBrocircnquica
0 00 1 100
50
Secreccedilatildeo traqueal 2 286 0 00
Swab retal 3 429 5 500
Urina 0 00 1 100
Microrganismo Enterobacter cloacae (KPC)
1 143 1 100
Klebsiella pneumoniae
6 857 8 800
0416 Serratia
marcescens 0 00 1 100
Teste de Hodge Hodge positivo 7 1000 10 1000
NA Amicacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 1 100 0848 resistente 0 00 1 100
sensiacutevel 2 286 3 300
Amoxicilina Aacutecido Clavulacircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Ampicilina Sulbactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ampicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Aztreonan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefazolina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Cefoperazona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Cefotaxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefoxitina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0509 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 2 286 4 400
Ceftazidima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cetriaxona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 3 429 5 500 0772 Cefalotina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ciprofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772
51
resistente 3 429 5 500
Claritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Clindamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Eritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Gentamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0942 resistente 2 286 3 300
sensiacutevel 1 143 2 200
Imipenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 0 00 2 200 0193 Resistente 1 143 3 300
sensiacutevel 2 286 0 00
Nitrofurantoiacutena sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Norfloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Oxacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Penicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Piperacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Rifampicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tetraciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Ticarcilina Aacutecido Clavulocircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0688 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 3 429 4 400
Tobramicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Trimetoprima Sulfametoxazol
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0112 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 2 286 0 00
Vancomicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tigeciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediario 0 00 1 100 0211 natildeo testado 1 143 4 400
resistente 2 286 0 00
52
Cefepime sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefuroxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Levofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Piperacilina Tazobactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Ertapenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Meropenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0223 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 1 143 0 00
Cefotetan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 sensiacutevel 0 00 1 100
Gemifloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 7 700 0585 natildeo testado 3 429 3 300
Desfecho
Alta Oacutebito
Meacutedia Erro
padratildeo Meacutedia Erro
padratildeo p
Idade 58 9 59 5 0991
Tempo Internaccedilatildeo (dias)
50 13 46 12 0571
n= 17 p(lt 005) NA natildeo se aplica
53
6 DISCUSSAtildeO
Nos uacuteltimos anos houve um aumento na incidecircncia de bacteacuterias
multirresistentes aos antimicrobianos no ambiente hospitalar tornando isto um
problema mundial de sauacutede puacuteblica (HULSCHER et al 2010) Quando se trata
principalmente de bacilos Gram negativos a frequumlecircncia destas bacteacuterias eacute ainda
maior em paiacuteses da Ameacuterica Latina quando comparada a paiacuteses desenvolvidos
(GALES etal 2012)
De acordo com dados do ldquoMeropenem Yearly Susceptibility Test Information
Collectionrdquo (MYSTIC) ocorreu nos Estados Unidos um aumento na susceptibilidade
de K pneumoniae nos uacuteltimos anos graccedilas a praacuteticas de controle de disseminaccedilatildeo
de amostras resistentes(RHOMBERG P R et al 2009) O aumento crescente da
prevalecircncia destes microrganismos foi proporcional ao aumento da dependecircncia do
uso de antibioacuteticos carbapenecircmicos considerados como a opccedilatildeo terapecircutica para o
tratamento de infecccedilotildees por bacilos Gram negativos multi-resistentes (LIVERMORE
2012) Isto afeta diretamente as opccedilotildees de tratamento sobrando poucas alternativas
para a terapecircutica que incluem colistina (polimixina E) e tigeciclina que apresentam
respectivamente problemas em termos de toxicidade e eficaacutecia (LIVERMORE et
al 2011) Um dos efeitos adversos mais importantes das poliminas B e E por
exemplo satildeo a neurotoxicidade e nefrotoxicidade (MENDES C A C et al2009 )
Devido agrave resistecircncia ser usualmente de natureza plasmidial e portanto de
maior disseminaccedilatildeo especialmente quando carreadas por K pneumoniae
microrganismo com uma notoacuteria capacidade para acumular e transferir plasmiacutedeos
com determinantes para resistecircncia o nuacutemero de casos detectados pelo
fenoacutetipogenoacutetipo blaKPC eacute bastante preocupante (MONTEIRO et al 2009)
Comparada com outras bacteacuterias hospitalares a transmissatildeo de clones
multirresistentes de K pneumoniae eacute maior e podem natildeo ser controladas pelos
meacutetodos de controle de infecccedilatildeo hospitalar (PAAUW et al 2007) A forma
plasmidial para transferecircncia da resistecircncia adicionada a este grande potencial para
disseminaccedilatildeo de clones resistentes eacute preocupante visto que apoacutes surtos muitas
vezes pode se tornar endecircmica Jaacute eacute uma realidade a disseminaccedilatildeo desta bacteacuteria
54
entre pacientes hospitais paiacuteses e ateacute mesmo continentes (WOODFORF et al
2010 ROGERS et al 2011)
As chances de surtos satildeo maiores em paiacuteses com poucos recursos devido agrave
maior carecircncia de praacuteticas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees hospitalares e o
uso irracional de antimicrobianos de forma empiacuterica e inadequada (KUMARASAMY
et al 2010) Ateacute o momento os mecanismos de resistecircncia aos cabapenecircmicos
geralmente encontrado eram a produccedilatildeo de ESBL (CTX-M) somada aacute perda de
porina (CARVALHAES et al 2010) Foi notado a partir do ano de 2008 um
aumento no nuacutemero de K pneumoniae produtoras de KPC-2 apresentando outra
forma de resistecircncia (GALES 2012)
Um estudo mostrou que o perfil do paciente colonizado ou infectado por KPC
foi de um paciente entre os 33 e os 82 anos de idade internado haacute mais de 1
semana no hospital A mortalidade geral nos uacuteltimos anos ficou em torno de 7
sendo que dos 77 pacientes estudados 32 (415) pacientes evoluiacuteram para oacutebito
evidenciando a alta morbi-mortalidade associada (ALVES A P et al 2013)
Em estudo com 2316 pacientes avaliados a populaccedilatildeo de sexo masculino foi
de 526 idade meacutedia global de 53 anos (mediana de 55 anos) permanecircncia meacutedia
de 58 dias (mediana de 3 dias) (OLIVEIRA A C et al 2010) Outros trabalhos
apresentaram ausecircncia de significacircncia entre sexoidade e o desenvolvimento de
infecccedilotildees por microrganismos resistentes (PERES-BOTA D et al 2003 COLPAN
A et al 2005 COELLO R et al 1997)
Outro estudo utilizou um total de 30 amostras sendo elas isoladas de urina
escarro secreccedilatildeo pleural ponta de cateter aspirado traqueal e hemocultura A mais
prevalente foi em urina (40) Entre as 30 cepas analisadas a maior porcentagem
foi da cepa Klebsiella pneumoniae (70) Enterobacter sp (133) Klebsiella
ozaenae (10) Escherichia coli (333) e Klebsiella oxytoca (333)
(DIENSTMANN R et al 2010) Nos Estados Unidos a enzima KPC jaacute se tornou
endecircmica Foi realizada uma pesquisa em dois hospitais de Nova York onde
testaram 602 amostras e 45 apresentaram algum mecanismo de resistecircncia
sendo apenas 33 confirmadas por biologia molecular como KPC-2 (BRATU et
al 2005)
55
Estudo sobre os tipos de ESBL feito no Japatildeo apresentou o tipo Toho-1 como
o mais prevalente nessa pesquisa Ateacute o ano de 2000 ano em que foi publicado tal
estudo este era o primeiro relatoacuterio no Japatildeo para identificar derivados de ESBLs
como tipo de SHV e TEM entre E coli e K pneumoniae Em especial o tipo SHV- 12
foi identificado com uma maior frequumlecircncia Estes resultados indicam que tipos
distintos de ESBLs que satildeo diferentes em sua especificidade de substrato e origem
geneacutetica coexistem no Japatildeo Isto mostra a importacircncia de caracterizar genoacutetipos
distintos de ESBLs e de estar em alerta continuamente para as tendecircncias de
ESBLs no Japatildeo aleacutem da necessidade de uma interpretaccedilatildeo uniforme utilizando as
diretrizes do CSLI para relatar cepas produtoras de ESBL Aleacutem da detecccedilatildeo de
ESBLs satildeo necessaacuterias mais informaccedilotildees tais como o perfil de sensibilidade
especiacutefica para diversas β-lactacircmicos e o local da infecccedilatildeo Esses fatores satildeo
essenciais para a escolha adequada de antibioacuteticos (YAGI T et al 2000)
No ano de 2004 uma pesquisa avaliou a produccedilatildeo de uma enzima de
hidroacutelise de carbapenecircmicos atraveacutes da teacutecnica de sequumlenciamento foi revelado
um novo membro da famiacutelia KPC designado KPC- 3 Pesquisadores encontraram
em um mutante de K pneumoniae uma substituiccedilatildeo de um gene associado com
resistecircncia a Imipenem mas essa substituiccedilatildeo foi considerada improvaacutevel na
contribuiccedilatildeo da resistecircncia aos carbapenecircmicos da espeacutecie estudada Aleacutem da
resistecircncia aos carbapenecircmicos estes isolados eram em sua maioria resistentes agraves
cefalosporinas penicilinas e aminoglicosiacutedeos Usando estudos de transformaccedilatildeo
conjugaccedilatildeo e hibridaccedilatildeo localizaram o alelo blaKPC em plasmiacutedeo aleacutem disso
mostraram que esse alelo tambeacutem carregava uma resistecircncia aos aminoglicosiacutedeos
A transferecircncia das enzimas KPCs foi demonstrada in vitro tanto neste como em
outros estudos pode ser que os plasmiacutedeos que fazem esta transferecircncia estavam
comeccedilando a se espalhar no ambiente cliacutenico resultando na multiresistecircncia dessas
estirpes (WOODFORD et al 2004)
O presente estudo apresentou um vieacutes quanto aos resultados dos testes de
susceptibilidade microbiana Observou-se que natildeo foi encontrado resultado deste
teste em algumas amostras o que natildeo cooperou para um estudo mais preciso
futuros estudos quanto agraves amostras e um melhor acompanhamento deste tipo de
patologia Poreacutem mesmo sem algumas amostras com este resultado disponiacutevel foi
56
confirmada a presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos
carbapenecircmicos por meio dos genes de resistecircncia blaKPC e 16S rRNA que as
amostras apresentaram em sua maioria serem portadoras Quanto aos resultados
estatiacutesticos nenhuma das variaacuteveis apresentou significacircncia estatiacutestica (p gt 005)
mostrando assim que estas variaacuteveis isoladas natildeo foram o fator determinante para
o desfecho cliacutenico de alta ou oacutebito
57
7 CONCLUSAtildeO
Os genes blaKPC e 16S rRNA foram caracterizados confirmando a a
presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos carbapenecircmicos
Houve uma maior prevalecircncia da cepa K pneumoniae e isto confirma outros
estudos que apresentam a maior prevalecircncia desta cepa em amostras com KPC
Aleacutem disso isso justifica a forma popular da K pneumoniae ser chamada de KPC
enquanto que na verdade KPC eacute uma enzima podendo estar presente em outras
cepas como Enterobacter clocae tambeacutem apresentada no presente estudo O
desfecho cliacutenico de oacutebitos maior que 50 eacute um possiacutevel indicador sobre a
necessidade de se realizar um teste raacutepido para identificaccedilatildeo de KPC visando
iniciar o mais raacutepido possiacutevel o tratamento afim de diminuir a mortalidade por esta
infecccedilatildeo
Nenhuma das variaacuteveis isoladamente estaacute relacionada ao desfecho cliacutenico
oacutebito ou alta pois natildeo apresentaram relevacircncia estatiacutestica O presente estudo
mostrou que haacute presenccedila da bacteacuteria nas amostras de pacientes do hospital
estudado podendo entatildeo afirmar que este tipo de bacteacuteria se encontra tambeacutem
presente em ambiente hospitalar O uso irracional de antimicrobiano eacute demonstrado
de forma indireta quando foi apresentado atraveacutes do Teste de Hodge Modificado
uma resistecircncia de 100 aos antibioacuteticos carbapenecircmicos Isto tambeacutem reflete na
terapecircutica sendo que pacientes portadores de bacteacuterias resistentes aos
antibioacuteticos carabepecircmicos tem uma escassa opccedilatildeo de tratamento e as opccedilotildees
apresentam problemas quanto agrave toxicidade e eficaacutecia
58
REFEREcircNCIAS
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Mecanismos
de resistecircncia bacteriana aos antimicrobianos Disponiacutevel em
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controleopas_
webmodulo3mec_sitiohtmgt Acesso em 25 de abril de 2014
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Nota teacutecnica nordm
012013 medidas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees por enterobacteacuterias
multiresistentes Acesso em 17 de abril de 2013
ALBA J et al Kinetics study of KPC-3 a plasmid-encoded class A
carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase Antimicrob Agents Chemother
Nov49(11)4760-2 2005
ALVES A P et al Nosocomial infections by KPC-producing enterobacteria in
a tertiary hospital in Southern Brazil Revista da AMRIGS Porto Alegre 57 (3) 213-
218 jul-set 2013
ALVES A et al Tipagem Geneacutetica de Microrganismos Lab De Diversidade
Microbiana Centro de Biologia Celular Dep de Biologia U de Aveiro 3810-193
Aveiro- 2003
BELL J M et Al Prevalence and significance of a negative extended-
spectrum beta-lactamase (ESBL) confirmation test result after a positive ESBL
screening test result for isolates of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae
results from the SENTRY Asia-Pacific Surveillance Program J Clin Microbiol
May45(5)1478-82 2007
BRATU S et al Detection of KPC carbapenem-hydrolyzing enzymes in
Enterobacter spp from Brooklyn New York Antimicrob Agents Chemother v 49 n
2 p 776-8 2005
59
BRATU S et al Emergence of KPC-possessing Klebsiella pneumoniae in
Brooklyn New York epidemiology and recommendations for detection Antimicrob
Agents Chemother v 49 n 7 p 3018-20 2005
BRATU S et al Rapid spread of carbapenem-resistant Klebsiella
pneumoniae in New York City Arch Intern Med v 165 p 1430-5 2005
CAMARGO C F et al Aplicaccedilatildeo das teacutecnicas de pcr e suas teacutecnicas
derivadas em diagnoacutestico molecular Disponiacutevel em
ltfileDUnB10C2BA20semestreArtigosPCR-
20CLEYTON20FLORENCIO20DE20CAMARGO20E20PAULO20ROB
ERTO20QUEIROZpdfgtgt Acesso em 08 de abril de 2014
CARVALHES C G et al Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting
carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive
results Journal of Antimicrobial Chemotherapy v 65 n2 p 249-251 2010
CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION- CDC Modified
Hodge Test for Carbapenemase Detection in Enterobacteriaceae 2004
CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE Methods for
dilutionantimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically Approved
standard M7ndashA7 7th ed CLSI Wayne PA 2011
COELLO R et al Risk factors for developing clinical infection with methicillin-
resistant Staphylococcus aureus (MRSA) amongst hospital patients initially only
colonized with MRSA J Hosp Infect 19973739-46
COLPAN A et al Evaluation of risk factors for mortality in intensive care
units A prospective study from a referral hospital in Turkey Am J Infect Control
200533(1)42-7
60
CORNAGLIA G et al Living with ESBLs Introduction Clinical Microbiology
and Infection 14 Suppl 1 1-2 2008
COTRIM E R et al Klebsiella pneumoniae carbapenemase ndash KPC em
Enterobacteriaceae o desafio das bacteacuterias multirresistentes Poacutes em revista do
centro universitaacuterio Newton Paiva 12012 - ediccedilatildeo 5 - issn 2176 7785
DESHPANDE L M et al Occurrence and characterization of
carbapenemase-producing Enterobacteacuteriaceae report from the SENTRY
Antimicrobial Surveillance Program (2000-2004) Microb Drug Resist 12(4)223-30
2006
DIAS D J A Estudos dos principais mecanismos de resistecircncia aos
antibioacuteticos β-lactacircmicos em bacteacuterias patogecircnicas gram negativas 2009 100 f
Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Geneacutetica Molecular e Biomedicina) ndash Faculdade de
Ciecircncias e Tecnologia Universidade de Nova Lisboa Lisboa
DIENSTMANN R et al Avaliaccedilatildeo fenotiacutepica da enzima Klebsiella
pneumoniae carbapenemase (KPC) em Enterobacteriaceae de ambiente hospitalar
J Bras Patol Med Lab v 46 n 1 p 23-27 fevereiro 2010
ENDIMIAMI A et al Emergence of blaKPC-containing Klebsiella
pneumoniae in a long-term acute care hospital a new challenge to our healthcare J
Antimicrob Chemother 64 1102-1110 Nov 2009
FALAGAS M E et al Extended-spectrum beta-lactamase producing
organisms The Journal of Hospital Infection 73 (4) pp 345-54 2009
FONTANA C et al Emergence of KPC-producing Klebsiella pneumoniae in
Italy BMC Rev Notes 3 40 2010
61
GALES A C et al Antimicrobial resistance among Gram-negative bacilli
isolated from Latin America results from Sentry Antimicrobial Surveillance Program
(Latin America 2008-2010) Diagnostic Microbiology and Infectious Disease v 3 n
4 p 354 -360 2012
GUPTA N et al Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Epidemiology
and Prevention HEALTHCARE EPIDEMIOLOGY Clinical Infectious Diseases
201153(1)60ndash67 Published by Oxford University Press on behalf of the Infectious
Diseases Society of America 2011
HARBOTTLE H et al Genetics of antimicrobial resistance Anim Biotechnol
n17 p111-124 2006
HENRIQUE W N et al RESISTEcircNCIA BACTERIANA Uniatildeo das
Faculdades Alfredo NasserInstituto de Ciecircncias da Sauacutede Disponiacutevel em lt
httpwwwfaculdadealfredonasseredubrfilespesquisaposter20HENRIQUE20
Wilker20Natividade20SANTIAGO20Silvania20CAVALCANTI20DSP
20ResistC3AAncia20Bacterianapdfgt Acesso em 17 marccedilo 2014
HULSCHER M E J I et al Antibiotic prescribing in hospital a social and
behavioral scientific approach The Lancet Infectious Diaseases v 10 n 3 p 167-
165 2010
KIDWAI M SAPRA P BHUSHAN KR Synthetic strategies and medicinal
properties of beta-lactams Curr Med Chem 1999 695-215
KUMARASAMY K K et al Emergence of a new antibiotic resistance
mechanism in India Pakistan and the UK a molecular biological and
epidemiological stuy The Lancet Infectious Diseases v10 n 9 p 597- 602 2010
LINCOPAN N et al Enterobacteacuteria producing extended-spectrum β-
lacatamases and IMP-1 Metalo-β-lactamases isolated from Brazilian hospitals J Med
62
Microbiol 7 1-3 2006
LINCOPAN N et al First Isolation of Metalo-β-Lacatamase-Producing
Multiresistant Klebsiella pneumoniae from a patient in Brazil J Clin Microbiol 43(1)
516-519 2005
LIVERMORE D M et al What remains against carbapenem- resistant
Enterobacteriaceae Evaluation of choramphenicol ciprofloxacin colistina
fosfomycin minocycline nitrofurantoin temocilin and tigecycline International
Journal of Antimicrobial Agents v 37 n 5 p 415- 459 2011
LIVERMORE D M Fourten years in resistance International Journal of
Antimicrobial Agents v 39 283- 294 2012
LIVERMORE D M Bacterial resistance to carbapenems Adv Exp Med Biol
1995 39025-47
LIVERMORE D M Bacterial resistance origins epidemiology and impact
Clin Infect Dis 36S11-S23 2003
LIVERMORE D M et al Carbapenemases a problem in waiting Curr
Opin Microbiol 2000 3489-95
LU et al Universal pcr for common bacterial pathogens J CLIN
MICROBIOL VOL 38 2000
LU et al Use of PCR with Universal Primers and Restriction Endonuclease
Digestions for Detection and Identification of Common Bacterial Pathogens in
Cerebrospinal Fluid Journal of Clinical Microbiology June 2000 p 2076ndash2080
MARSCHALL J Met al Presence of the KPC Carbapenemase Gene in
Enterobacteriaceae Causing Bacteremia and Its Correlation with In Vitro
Carbapenem Susceptibility J Clin Microbiol 47 239-241 Jan 2009
63
MARTINS WMBS et al Prevalecircncia do gene blaKPC em isolados cliacutenicos
de Enterobacteriaceae e natildeo fermentadores encontrados em amostras clinicas em
um hospital universitaacuterio do Recife X Jornada de ensino pesquisa e extensatildeo ndash
JEPEX 2010 ndash UFRPE Recife 18 a 22 de outubro
MENDES C A C et al Polimixinas Revisatildeo com ecircnfase na sua
nefrotoxicidade Rev Assoc Med Bras 2009 55(6) 752-9
MOHR J F 3rd Update on the efficacy and tolerability of meropenem in the
treatment of serious bacteacuterial infections Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S41-51
2008
MONTEIRO J et al First report of KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae
strains in Brazil Antimicrob Agents Chemother Jan53(1)333-4 2009
MOREIRA V C et al Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia a antibioacuteticos
Disponiacutevel em
lthttpwwwcpglsucgbr6mostraartigosSAUDEVANESSA20CARVALHO20M
OREIRApdfgt Acesso em 21 marccedilo 2014
NETIKUL T et al Emergence of novel blaKPC-12 and blaKPC-13 variants in
carbapenem non-susceptible Enterobacter cloacae a first report of blaKPC gene in
Thailand European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases May
S372 2011
NETO V A et al Antibioacuteticos na praacutetica Meacutedica 6ordf Ediccedilatildeo Editorial
SarverSP Brasil 2007
NICOLAU D P Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of
meropenem Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S32-40 2008
64
OLIVEIRA A C et al Resistecircncia bacteriana e mortalidade em um centro de
terapia intensiva Rev Latino-Am Enfermagem nov-dez 2010
PAAUW A et al Failure to control an outbreak of qnrA 1-positive multidrug-
resistant Enterobacter clocae despite adequate implementation of recommended
infection control measures Journal of Clinical Microbiology v 45 n 5 p 1420-1425
2007
PATERSON D L et al Extended-Spectrum Beta-Lactamases a Clinical
Update Clinical Microbiology Reviews v 18 p 657-686 2005
PEIRANO G et al Carbapenem-hydrolysing beta-lactamase KPC-2 in
Klebsiella pneumonia isolated in Rio de Janeiro Brazil J Antimicrob Chemother Nov
20 2009
PERES-BOTA D et al Are infections due to resistant pathogens associated
with worse outcome in critically ill patients J Infect 200347(4)307-16
PIDDOCK L J V Clinically relevant chromosomally encoded multidrug
resistance effl ux pumps in bacterial Clin Microbiol Rev n19 p382-402 2006
PITOUT J D D et al Emergence of Enterobacteriaceae producing
extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) in the community J Antimicrob
Chemother May 56 2005
POSSEBON M I et al Resistecircncia bacteriana aos carbapenecircmicos
Bacterial resitence to carbapenems RBM rev bras med60(6)378380-378-382
jun 2003
QUEENAN A M et al Carbapenemases the versatile beta-lactamases
Clin Microbiol Rev Jul20(3)440-58 2007
65
RHOMBERG P R et al Summary trends for the meropenem yearly
susceptibility test information collection program a 10- year experience in the United
States (1999-2008) Diagnostic Microbiology and Infectiois Disease v 65 n4 p
414-426 2009
ROBLEDO I E et al Detection of KPC in Acinetobacter spp in Puerto Rico
J Antimicrob Agents Chemother 54 1354-1357 Mar 2010
ROGERS B A et al Country-to-country transfer os patients and the risk of
multi-resistant bacterial infection Clinical Infectious Disease v53 n1 p49- 56
2011
SHAH A A et al Characteristics epidemiology and clinicalimportance of
emerging strains of Gram-negative bacilli producing extended-spectrum
betalactamases Research in Microbiology v 155 p 409-421 2004
TURNER P J Extended- Spectrum Beta-Lactamases Clinical Infectious
Diseases v 41 p 273-275 2005
WOLTER D J et al Phenotypic and Enzymatic Comparative Analysis
between the Novel KPC variant KPC-5 and Its Evolutionary Variants KPC-2 and
KPC-4 Antimicrob Agents Chemother Nov 17 2008
WOODFORD N et al Carbapenemases of Chryseobacterium
(Flavobacterium) meningosepticum distribution of blaB and characterization of a
novel Metalo-beta-lactamase gene blaB3 in the type strain NCTC 10016
Antimicrob Agents Chemother Jun44(6)1448-52 2000
WOODFORF N Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in
India Pakistan and the UK a molecular biological and epidemiological study The
Lancet Infectious Diseases v 10 n 9 p 597-602 2010
66
WOODFORD et al Outbreak of Klebsiella pneumoniae Producing a New
Carbapenem- Hydrolyzing Class A β-Lactamase KPC-3 in a New York Medical
Center Antimicrobial agents and chemotherapy Dec 2004 p 4793ndash4799 Vol 48
No 12
YAGI T et al A preliminary survey of extended-spectrum β-lactamases
(ESBLs) in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Japan
FEMS Microbiology Letters 184 (2000) 53-56
YIGIT H et al Novel carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase KPC-1 from
a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumonia J Antimicrob Agents
Chemother 45 (4) 1151-1161 (2001)
ZAVASCKI A P et al KPC-2- producing Enterobacter cloacae in two cities
from Southern Brazil Int J Antimicrob Agents Apr 28 2009
ZHANEL G G et al Comparative review of the carbapenecircmicos Drugs
67(7)1027-52 2007
67
ANEXOS
Sequumlecircncia do oligo blaKPC
Query 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
Query 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
Query 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
68
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
Query 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
Query 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
69
Query 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
Query 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
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Sbjct 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
Query 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
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70
Sbjct 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
Query 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
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Sbjct 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
Query 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
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GCGATAC 600
Query 601
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ATGCGCG 660
71
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Sbjct 601
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ATGCGCG 660
Query 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
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Sbjct 661
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GCTCTGC 720
Query 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
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Sbjct 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
72
Query 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
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CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
Query 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
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CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
Query 901
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73
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CCGTCAT 960
Query 961
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GCTCTGA 1020
Query 1021
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CCACTGT 1080
Query 1081
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74
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AATCTTG 1200
Query 1201
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CTTCGCC 1260
75
Query 1261
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TCGGCTT 1320
Query 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
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GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
LOCUS AF297554 1377 bp
DNA linear BCT 26-MAR-2001
DEFINITION Klebsiella pneumoniae carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
gene complete cds
ACCESSION AF297554
VERSION AF2975541 GI10121874
76
KEYWORDS
SOURCE Klebsiella pneumoniae
ORGANISM Klebsiella pneumoniae
Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Enterobacteriaceae Klebsiella
REFERENCE 1 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH QueenanAM
AndersonGJ Domenech-SanchezA
BiddleJW StewardCD
AlbertiS BushK and TenoverFC
TITLE Novel carbapenem-hydrolyzing beta-
lactamase KPC-1 from a
carbapenem-resistant strain of
Klebsiella pneumoniae
JOURNAL Antimicrob Agents Chemother 45 (4)
1151-1161 (2001)
PUBMED 11257029
REFERENCE 2 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH AndersonGJ and
TenoverFC
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (19-AUG-2000) Nosocomial
Pathogens Laboratory Branch
Centers for Disease Control and
Prevention 1600 Clifton Rd MS
G08 Atlanta GA 30333 USA
FEATURES LocationQualifiers
77
source 11377
organism=Klebsiella
pneumoniae
mol_type=genomic DNA
db_xref=taxon573
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-10_signal 7883
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hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
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CDS 1311012
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product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
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translation=MSLYRRLVLLSCLSWPLAGFSATALTNLVAEPFAKLEQD
FGGSI
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KNALV
PWSPISEKYLTTGMTVAELSAAAVQYSDNAAANLLLKELGGPAGLTAFMRSIG
DTTFR
78
LDRWELELNSAIPSDARDTSSPRAVTESLQKLTLGSALAAPQRQQFVDWLKGN
TTGNH
RIRAAVPADWAVGDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTRAPNKDDK
HSEAV
IAAAARLALEGLGVNGQ
ORIGIN
1 cggggcagtt acagccgtta cagcctctgg
agagggagcg gcttgccgct cggtgataat
61 cccagctgta gcggcctgat tacatccggc
cgctacacct agctccacct tcaaacaagg
121 aatatcgttg atgtcactgt atcgccgtct
agttctgctg tcttgtctct catggccgct
181 ggctggcttt tctgccaccg cgctgaccaa
cctcgtcgcg gaaccattcg ctaaactcga
241 acaggacttt ggcggctcca tcggtgtgta
cgcgatggat accggctcag gcgcaactgt
301 aagttaccgc gctgaggagc gcttcccact
gtgcagctca ttcaagggct ttcttgctgc
361 cgctgtgctg gctcgcagcc agcagcaggc
cggcttgctg gacacaccca tccgttacgg
421 caaaaatgcg ctggttccgt ggtcacccat
ctcggaaaaa tatctgacaa caggcatgac
481 ggtggcggag ctgtccgcgg ccgccgtgca
atacagtgat aacgccgccg ccaatttgtt
541 gctgaaggag ttgggcggcc cggccgggct
gacggccttc atgcgctcta tcggcgatac
79
601 cacgttccgt ctggaccgct gggagctgga
gctgaactcc gccatcccaa gcgatgcgcg
661 cgatacctca tcgccgcgcg ccgtgacgga
aagcttacaa aaactgacac tgggctctgc
721 actggctgcg ccgcagcggc agcagtttgt
tgattggcta aagggaaaca cgaccggcaa
781 ccaccgcatc cgcgcggcgg tgccggcaga
ctgggcagtc ggagacaaaa ccggaacctg
841 cggagtgtat ggcacggcaa atgactatgc
cgtcgtctgg cccactgggc gcgcacctat
901 tgtgttggcc gtctacaccc gggcgcctaa
caaggatgac aagcacagcg aggccgtcat
961 cgccgctgcg gctagactcg cgctcgaggg
attgggcgtc aacgggcagt aaggctctga
1021 aaatcatcta ttggcccacc accgccgccc
ttgcgggcgg catggattac caaccactgt
1081 cacatttagg ctaggagtct gcgcggcaga
gccgtgtgac cggttttctg tagagcactg
1141 acgatggcgg cggcgctctc tgcaattggc
aaggcgtcgg cgccaaggat accaatcttg
1201 cggcgcgcgg cgtgttatga cgactggggt
gcatttgagc cgccccattt aaccttcgcc
1261 ctcacagata cgccattcgc ctcaaattta
gcgccatgca gacgagcttc cactcggctt
1321 gcaccttgtc caggcccctc atgctgaact
gacgcaatcc catcaccgcc ttgatca
80
22
codifica um novo produto resistente aos antimicrobianos substituindo o alvo original
por exemplo o Staphylococcus aureus resistente agrave oxacilina e estafilococos
coagulase-negativos adquiriram o gene cromossocircmico Mec A e produzem uma PBP
ou PLP resistente aos β-lactacircmicos denominada 2a ou 2 que eacute suficiente para
manter a integridade da parede celular durante o crescimento quando outras PBPs
essenciais satildeo inativadas por antibimicrobianos β-lactacircmicos Como alternativa um
gene receacutem-adquirido pode atuar para modificar um alvo tomando-o menos
vulneraacutevel a determinado antimicrobiano Assim um gene transportado por
plasmiacutedeo ou por transposon codifica uma enzima que inativa os alvos ou altera a
ligaccedilatildeo dos antimicrobianos como ocorre com eritromicina e clindamicina (ANVISA
2007)
Em funccedilatildeo da bomba de efluxo pode variar a especificidade do antibioacutetico
Ele atua por meio do bombeamento ativo de antimicrobianos do meio intracelular
para o extracelular gerando uma resistecircncia bacteriana a determinados
antimicrobianos como eacute o caso da resistecircncia agraves tetraciclinas codificada por
plasmiacutedeos em Escherichia coli devido agrave presenccedila de proteiacutenas integrantes da
membrana plasmaacutetica bacteriana (PIDDOCK 2006)
O aumento da siacutentese de proteiacutenas eacute o principal responsaacutevel pela resistecircncia
antimicrobiana devido agraves vaacuterias mutaccedilotildees que ocorrem em seus repressores
transcricionais Estas mutaccedilotildees tambeacutem podem influenciar levando a um aumento
da eficiecircncia do transporte dos antibioacuteticos para o exterior da ceacutelula (HARBOTTLE
et al 2006)
A resistecircncia aos antibioacuteticos eacute frequumlentemente associada agrave alteraccedilatildeo
diminuiccedilatildeo da permeabilidade que ocorre na membrana externa das bacteacuterias gram-
negativas O fluxo de moleacuteculas para o interior da ceacutelula ocorre por caracteriacutesticas
peculiares como carga estrutura e dimensatildeo e atraveacutes de proteiacutenas de membrana
as quais formam canais Este percurso eacute utilizado pelos antibioacuteticos para atingir o
interior da ceacutelula bacteriana ou o espaccedilo periplasmaacutetico como eacute o caso dos
antibioacuteticos β-lactacircmicos Portanto a perda de funccedilatildeo destas proteiacutenas pode
efetivamente causar a diminuiccedilatildeo da susceptibilidade a vaacuterios antibioacuteticos
(LIVERMORE 2003)
23
Os mecanismos de resistecircncia que podem impedir a accedilatildeo de antimicrobianos
satildeo vaacuterios O faacutermaco atua de forma a inibir os processos essenciais a multiplicaccedilatildeo
e sobrevivecircncia da ceacutelula bacteriana como a membrana citoplasmaacutetica e
consequumlentemente bloqueando a siacutentese proteacuteica de aacutecidos nucleacuteicos e da parede
celular A resistecircncia bacteriana eacute um mecanismo natural de defesa Sendo assim
as bacteacuterias estatildeo em constante defesa e para cada novo faacutermaco desenvolvido as
bacteacuterias iratildeo desenvolver resistecircncia em algum momento (POSSEBON et al
2003)
O grupo de antibioacuteticos beta-lactacircmicos satildeo amplamente utilizado e se
encontram dentro da classe dos melhores agentes antimicrobianos com relevacircncia
cliacutenica No entanto o seu uso tem sido restringido devido a vaacuterios mecanismos de
resistecircncia O desenvolvimento dos carbapenecircmicos surgiu devido agrave proliferaccedilatildeo de
beta-lactamases mediadas por plasmiacutedeos e cromossomos (POSSEBON et al
2003)
A bacteacuteria KPC tem um gene chamado SHV-1 que tem a caracteriacutestica de
resistecircncia a quase todos os tipos de antimicrobianos inclusive os carbapenecircmicos
especiacuteficos para o tratamento de infecccedilotildees por bacteacuterias multiresistentes e
emergecircncias Mesmo com no seu coacutedigo geneacutetico a informaccedilatildeo necessaacuteria para o
desenvolvimento da resistecircncia a resistecircncia da bacteacuteria soacute eacute desenvolvida caso a
bacteacuteria entre em contato com o antibacteriano desencadeando todo o processo
nos casos de resistecircncia induzida comuns em KPC (MOREIRA et al 2014)
A resistecircncia bacteriana pode ser apresentada de forma intriacutenseca ou
adquirida A resistecircncia intriacutenseca faz parte das caracteriacutesticas fenotiacutepicas naturais
do microrganismo ou seja faz parte de sua heranccedila geneacutetica sendo transmitida
verticalmente a prole sem perda da caracteriacutestica A presenccedila ou ausecircncia do alvo
para a accedilatildeo da droga eacute o principal determinante deste tipo de resistecircncia
(MOREIRA et al 2014) Essa resistecircncia corresponde a uma caracteriacutestica de
espeacutecie bacteriana quando estes microrganismos satildeo naturalmente resistentes a
certo tipo de antibioacutetico Este processo eacute decorrente da ausecircncia de estruturas de
atuaccedilatildeo de antimicrobianos ou a impermeabilidade por parte de estruturas
perifeacutericas das bacteacuterias (HENRIQUE et al 2014)
24
A resistecircncia adquirida aos antibioacuteticos por sua vez ocorre quando haacute uma
da mutaccedilatildeo de genes reguladores ou estruturais aquisiccedilatildeo de genes de resistecircncia
veiculados por elementos geneacuteticos moacuteveis ou da combinaccedilatildeo entre eles Este
aparecimento de resistecircncia em uma espeacutecie bacteriana era anteriormente sensiacutevel
a droga e devido a um destes fatores se torna resistente O fenoacutetipo resultante
desta resistecircncia natildeo estaraacute presente nas ceacutelulas genitoras e sim nos indiviacuteduos de
uma linhagem bacteriana derivada de um organismo susceptiacutevel Os genes muitas
vezes satildeo adquiridos por meio de elementos moacuteveis como plasmiacutedeos e
transposons (MOREIRA et al 2014)
Entatildeo a resistecircncia adquirida ocorre por diversos mecanismos geneacuteticos tais
como produccedilatildeo de enzimas inativadoras interferecircncia com a entrada e acuacutemulo de
droga na bacteacuteria alteraccedilatildeo do receptor para accedilatildeo da droga via metaboacutelica
alternativa Eacute originada por meio de uma alteraccedilatildeo a niacutevel geneacutetico da ceacutelula de
natureza cromossocircmica pelos processos de mutaccedilatildeo transduccedilatildeo e transformaccedilatildeo
ou extra cromossocircmica (plasmidial) (HENRIQUE et al 2014)
Como todo antibioacutetico β-lactacircmicoos carbapenecircmicos tem como mecanismo
de accedilatildeo a inibiccedilatildeo da siacutentese proteacuteica atraveacutes da accedilatildeo de inibiccedilatildeo da parede
microbiana fazendo a ligaccedilatildeo e inativaccedilatildeo das proteiacutenas ligadoras de penicilinas
(NETO et al 2007)
Imipenem e meropenem antibioacuteticos pertencentes ao grupo dos
carbapenecircmicos possuem um amplo espectro de accedilatildeo in vitro incluindo atividade
contra cocos gram-positivos bacilos gram-negativos e bacteacuterias anaeroacutebias (MOHR
2008) Jaacute o ertapenem possui um espectro de accedilatildeo mais limitado que o os dois
antibioacuteticos anteriormente citados tendo uma eficiecircncia limitada contra os bacilos
gram-negativos natildeo fermentadores Um novo antibioacutetico carbapenecircmico ainda natildeo
disponiacutevel no Brasil doripenem possui uma atividade mais potente principalmente
contra Pseudomona aeruginosa devido ao seu mecanismo de accedilatildeo que combina os
espectros de accedilatildeo de imipenem e meropenem (ZHANEL et al 2007)
Devido as suas estabilidades espectro de accedilatildeo poucos relatos de
resistecircncia boa toleracircncia pelos pacientes com efeitos adversos mais comuns as
complicaccedilotildees no siacutetio da infusatildeo e toxicidade gastrintestinal estes antibioacuteticos
carbapenecircmicos tecircm sido considerados terapia de escolha (NICOLAU 2008) Como
25
uma resposta adaptativa das Enterobacteacuterias o iacutendice de resistecircncia aos
carbapenecircmicos tem aumentado nos uacuteltimos anos de forma proporcional ao seu
uso limitando imensamente as opccedilotildees terapecircuticas para as infecccedilotildees causadas por
estes microrganismos (FALAGAS et al 2009)
As enzimas produtoras de betalactamases hidrolisam o anel betalactacircmico
tornando este mecanismo de resistecircncia o mais importante Os dois grupos mais
preocupantes satildeo o grupo das betalactamases de aspecto ampliado e os da
carbapenemases que aleacutem de hidrolizar os carbapenecircmicos hidrolizam todas as
outras classes de betalactacircmicos Em enterobacteacuterias as carbapenemases mais
prevalentes satildeo codificadas por genes dos grupos blaKpc blaIMP blaVIM blaNdm
e blaOxa A ocorrecircncia de carbapenemases eacute mais frequentemente em bacteacuterias
gram-negativas fermentadoras da glicose conhecidas como enterobacteacuterias
predominantes nos gecircneros Klebsiella Serratia Citrobacter Enterobacter
Escherichia Samonella Proteus Morganella Podem ser encontradas tambeacutem em
bacteacuterias gram-negativas natildeo fermentadoras como espeacutecies de Acinetobacter e de
Pseudomonas (ALVES et al 2013)
Carbapenemases satildeo enzimas plasmiacutedio-mediados resistentes a todos
antibioacuteticos betalactacircmicos As bacteacuterias que possuem o gene blaKpC responsaacutevel
pela codificaccedilatildeo da produccedilatildeo de carbapenemases apresentam resistecircncia aos
antibioacuteticos betalactacircmicos impedindo a accedilatildeo destes antibioacuteticos contra infecccedilotildees
(ALVES et al 2013)
A transmissatildeo das carbapenemases a diferentes cepas de enterobacteacuterias se
daacute atraveacutes de plasmiacutedeos que satildeo pequenas moleacuteculas circulares de DNA com a
capacidade de se replicarem independentemente do DNA cromossocircmico
permitindo a troca de material geneacutetico entre gecircneros e espeacutecies diferentes de
enterobacteacuterias O raacutepido desenvolvimento de surtos em ambientes hospitalares eacute
explicado por essa disseminaccedilatildeo plasmidial (COTRIM et al 2012)
De acordo com o criteacuterio de interpretaccedilatildeo do Clinical and Laboratory
Standards Institute (CLSI 2009) a maioria das KPC isoladas natildeo apresenta
resistecircncia completa aos carbapenecircmicos (Imipenem e Meropenem apresentam
uma Concentraccedilatildeo Inibitoacuteria Miacutenima (CIM) de 2-8 μgmL) (COTRIM et al 2012)
26
Os mecanismos de resistecircncia capazes de impedir a accedilatildeo dos
carbapenecircmicos satildeo vaacuterios Poreacutem a degradaccedilatildeo de antibioacuteticos por enzimas
principalmente as carbapenemases constituem o principal mecanismo de
resistecircncia aos antibioacuteticos β-lactacircmicos (DIAS 2009) Devido a ampla atividade
hidroliacutetica agrave maioria dos antibioacuteticos β-lactacircmicos estes grupos de enzimas possuem
alta versatilidade (QUEENAM et al 2007)
Existem trecircs grandes classes moleculares de Ambler a qual as
carbapenemases pertencem denominadas classe A (serino-carbapenemases os
quais incluem membros designados SME IMI NMC GES e a famiacutelia das KPCs)
classe B(as metalo-β-lactamase incluem os tipos IMP e VIM) e classe D
(oxacilinases similares as da classe A e incluem as OXA e PSE) (DIAS 2009)
Dentre estes as mais importantes e prevalentes encontradas em plasmiacutedeos
de Klebsiella pneumoniae satildeo as KPC (DIENSTMANN et al 2010) Por meio de
estudos moleculares a enzima KPC jaacute foi documentada em diferentes bacteacuterias e
diferenciada em KPC-1 a 13 (NETIKUL et al 2011) No ano de 2009 foi realizada
uma pesquisa onde descreveram as seguintes carbapenemases KPC-1 em isolados
de Klebsiella pneumoniae KPC-2 em K pneumoniae K oxytoca Salmonella
enterica e em Enterobacter sp e KPC-3 em K pneumoniae e Enterobacter cloacae
(MONTEIRO et al 2009) As enzimas KPC-4 e KPC-5 foram encontradas em
isolados de Pseudomonas aeruginosa (PEIRANO et al 2009)
Foi observada uma correccedilatildeo da sequumlecircncia KPC-1 indicando que o gene
blaKPC-1 e blaKPC-2 satildeo idecircnticos Trecircs novas variantes blaKPC-3 blaKPC-4 e
blaKPC-5 satildeo resultados de mutaccedilotildees do gene estrutural da enzima KPC-2
(WOLTER et al 2008) apresentando diferentes perfis de hidroacutelise As enzimas
KPC-2 e KPC-3 possuem alta eficiecircncia em hidrolisar cefalotina cefaloridina e
nitrocefin poreacutem possuem uma menor eficiecircncia contra carbapenecircmicos e
cefotaxima (ALBA et al 2005) As enzimas KPC-5 e KPC-4 apresentam menor
hidroacutelise de carbapenecircmicos eacute do que em KPC-2 Em contrapartida possuem
melhor eficiecircncia contra ceftazidima e uma maior inibiccedilatildeo pelo aacutecido clavulacircnico
(WOLTER et al 2008)
27
13 Anaacutelise geneacutetica de microrganismos
Eacute de extrema importacircncia praacutetica natildeo soacute no aspecto cliacutenico mas tambeacutem na
fitopatologia biotecnologia e estudos ambientais a correta identificaccedilatildeo e
classificaccedilatildeo de microrganismos Os meacutetodos usados na diferenciaccedilatildeo de gecircneros
espeacutecies e estirpes de microrganismos podem ser divididos em meacutetodos fenotiacutepicos
(baseados em fenocircmenos bioquiacutemicos fisioloacutegicos e bioloacutegicos) e genotiacutepicos
(detectam polimorfismos ao niacutevel dos aacutecidos nucleacuteicos ou variaccedilatildeo aleacutelica ao niacutevel
de enzimas) (ALVES et al 2003)
Para este tipo de estudo existem alguns meacutetodos como o RFLPrsquos -
ldquoRestriction Fragment Length Polymorphismsrdquo (polimorfismos de tamanho de
fragmentos de restriccedilatildeo) rep-PCR (Meacutetodo de tipagem baseado na amplificaccedilatildeo via
PCR de elementos de DNA repetitivos presentes em genomas bacterianos) anaacutelise
de sequumlecircncias nucleotiacutedeas (discriminaccedilatildeo eou identificaccedilatildeo atraveacutes de sequumlecircncias
de DNA) PFGE - Pulsed-Field Gel Electrophoresis (Eletroforese em campo
pulsado) ( A L V E S et al 2003)
A diferenciaccedilatildeo clara da cepa e principalmente a alta reprodutibilidade devem
ser caracteriacutesticas de qualquer meacutetodo de tipagem geneacutetica Poreacutem nem todos os
meacutetodos moleculares de tipagem satildeo igualmente eficazes Sendo assim de acordo
com a finalidade pretendida (identificaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo custo reprodutibilidade
etc) eacute feita a escolha do meacutetodo a ser aplicado (A L V E S et al 2003)
O processo de identificaccedilatildeo fenotiacutepica de KPC entre os membros da famiacutelia
Enterobacteriaceae ainda eacute difiacutecil e os meacutetodos para a sua identificaccedilatildeo devem ser
revistos e ajustados Mesmo com o avanccedilo tecnoloacutegico natildeo existem ensaios que
combinam alta especificidade e sensibilidade na detecccedilatildeo destas enzimas Satildeo
diversas as metodologias usadas para rastreamento de KPC como por exemplo a
focalizaccedilatildeo isoeleacutetrica a teacutecnica de disco-difusatildeo E-test teste de Hodge
modificado dentre outros Aleacutem disso a pesquisa do gene blaKPC pode ser feita
pela Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) Os sistemas de automaccedilatildeo
existentes no entanto podem natildeo identificar com precisatildeo os isolados KPC
positivos (COTRIM et al 2012)
A identificaccedilatildeo blaKPC pelo PCR eacute um meacutetodo raacutepido preciso sensiacutevel e
altamente especiacutefico no entanto a PCR exige equipamento e conhecimentos
28
especializados em diagnoacutestico molecular dificultando ainda a utilizaccedilatildeo dele na
rotina dos laboratoacuterios de microbiologia (COTRIM et al 2012)
Em estudo de infecccedilotildees hospitalares identificaccedilatildeo molecular de patoacutegenos
bacterianos eacute bastante utilizada Para diferenciar carbapenemases tipo KPC a partir
de outros tipos como SME NMC-A-IMI e GES eacute necessaacuterio um exame molecular
As identificaccedilotildees do microrganismo juntamente com a triagem molecular iratildeo definir
um resultado mais especiacutefico podendo ser usado para identificar o antibioacutetico mais
adequado para o tratamento Poreacutem a principal desvantagem de alguns exames
baseados em PCR por exemplo eacute que devido agrave sua limitada capacidade de
multiplexaccedilatildeo eles distinguem apenas algumas variaccedilotildees (MOREIRA et al 2014)
Estatildeo descritas para a identificaccedilatildeo molecular de patoacutegenos pertencentes agrave
famiacutelia Enterobacteriaceae as teacutecnicas de PFGE RAPD (randomly amplified
polymorphic DNA) e ERIC-PCR (Enterobacterial Repet it ive Intergenic Consensus)
A PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) eacute considerada padratildeo ouro devido sua
alta capacidade de diferenciaccedilatildeo baseada na anaacutelise do perfil de restriccedilatildeo do DNA
genocircmico por meio de eletroforese Como desvantagem para a sua execuccedilatildeo eacute
necessaacuterios vaacuterios dias impedindo a tipagem de algumas cepas bacterianas devido
agrave degradaccedilatildeo do DNA aleacutem do alto custo empregado (MOREIRA et al 2014)
O meacutetodo baseado em ERIC-PCR tem sido bastante utilizado como uma
alternativa para a teacutecnica de PFGE Esta teacutecnica consiste na anaacutelise do padratildeo de
amplificaccedilatildeo de elementos repetidos encontrados no genoma bacteriano Isto
permite uma maior rapidez na obtenccedilatildeo de resultados quando comparada com o
PFGE aleacutem de alta reprodutibilidade simples execuccedilatildeo e implementaccedilatildeo baixo
custo e natildeo sem problemas com a degradaccedilatildeo do DNA (MOREIRA et al 2014)
A PCR eacute considerada uma teacutecnica de biologia molecular revolucionaacuteria que
consiste na siacutentese enzimaacutetica de coacutepias de aacutecidos nucleacuteicos Ela permitiu o raacutepido
desenvolvimento do estudo de sequumlecircncias de aacutecidos nucleacuteico Foi desenvolvida por
Kary Banks Mullis que ganhou o precircmio Nobel de quiacutemica de 1993 devido ao
desenvolvimento dessa teacutecnica em abril de 1983 (CAMARGO et al 2014)
Por meio de etapas de variaccedilatildeo de temperatura a teacutecnica de PCR promove a
duplicaccedilatildeo de cadeias de DNA in vitro A reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo de DNA por PCR
envolve o emprego de sequumlecircncias iniciadoras (primers) quatro nucleotiacutedeos
29
(dNTPrsquos) do DNA e uma DNA polimerase termoestaacutevel podendo assim obter-se a
partir de uma fita molde muitas coacutepias de uma sequumlecircncia especiacutefica de aacutecido
nucleacuteico O princiacutepio da PCR consiste na variaccedilatildeo de temperatura por ciclo
envolvendo trecircs etapas baacutesicas desnaturaccedilatildeo pareamento e amplificaccedilatildeo
(CAMARGO et al 2014)
A desnaturaccedilatildeo da fita molde de DNA eacute uma etapa com duraccedilatildeo entre 30
segundos a 1 minuto a temperatura entre 92 ordmC a 96 ordmC Apoacutes isso o pareamento de
dois iniciadores sinteacuteticos de composiccedilotildees distintas que funcionam como os
iniciadores da reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo liga-se agrave regiatildeo complementar da fita de
DNA alvo que sofreraacute a duplicaccedilatildeo Esta etapa tem duraccedilatildeo de 30 segundos a 1
minuto a temperatura entre 58 ordmC e 65 ordmC Por uacuteltimo a amplificaccedilatildeo por meio da
enzima Taq DNA polimerase das novas fitas de DNA se daacute a partir de cada um dos
iniciadores utilizando os quatro dNTPrsquos como substrato da reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo
Esta etapa possui duraccedilatildeo entre 45 segundos e 1 minuto a 72 ordmC Cada ciclo eacute
repetido em torno de 30 a 35 vezes e promove a amplificaccedilatildeo da regiatildeo alvo
determinada conforme o anelamento dos iniciadores sinteacuteticos de DNA (CAMARGO
et al 2014) Estas etapas estatildeo demonstradas na figura 4
Figura 4 Etapas da Reaccedilatildeo de PCR
30
2 JUSTIFICATIVA
No ano de 2010 no Distrito Federal foram identificados 111 pacientes com
suspeita de infecccedilatildeo por Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) e a
Secretaria de Sauacutede do Distrito Federal confirmaram ainda a morte de 18 pacientes
dentre os hospitais puacuteblicos e particulares Um desafio encontrado por ocasiatildeo do
surto infeccioso no Distrito Federal foi o de confirmar as KPCs por Reaccedilatildeo da
Polimerase em Cadeia sendo que as amostras foram enviadas com esta finalidade
para a Fiocruz no Rio de Janeiro
Pesquisas que possam contribuir na elaboraccedilatildeo de estrateacutegias preventivas e
de intervenccedilatildeo para infecccedilotildees causadas por enterobacteacuterias bem como contribuir
para gerar uma integraccedilatildeo beneacutefica entre a equipe acadecircmica e os serviccedilos de
sauacutede devem ser estimuladas Neste sentido o presente estudo permitiu escrutinar
os genes envolvidos na expressatildeo de carbapenemases presentes em espeacutecies de
enterobacteacuterias isoladas em ambiente hospitalar visto que elucidar genes de
resistecircncia de enterobacteacuterias aos antibioacuteticos carbapenecircmicos eacute o primeiro passo
para garantir um controle epidemioloacutegico efetivo para estes tipos de microorganismo
assim como sua associaccedilatildeo com surtos fatais particularmente em pacientes com
baixa imunidade
31
3 OBJETIVOS
31 Objetivo geral Caracterizar os genes de resistecircncia das
Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases e os aspectos epidemioloacutegicos de
pacientes internados em um hospital puacuteblico do Distrito Federal
32 Objetivos Especiacuteficos
Identificar genotipicamente a enzima KPC (Klebsiella pneumoniae
carbapenemase) de isolados de Klebsiella pneumoniae
Investigar aspectos epidemioloacutegicos dos pacientes portadores de
Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases
Identificar quais variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana influenciaram para o
desfecho oacutebito ou alta
Avaliar a susceptibilidade das Enterobacteacuterias aos antibioacuteticos
carbapenecircmicos dos pacientes em ambiente hospitalar
32
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
Trata-se de um estudo transversal onde foi realizado o teste de
susceptibilidade das enterobacteacuterias aos antibioacuteticos carbapenecircmicos a partir dos
materiais bioloacutegicos coletados dos pacientes internados no Hospital Regional da Asa
Norte (HRAN) e enviados ao Laboratoacuterio de Anaacutelises Cliacutenicas da mesma Instituiccedilatildeo
Os materiais bioloacutegicos investigados foram sangue aspirado traqueal ou brocircnquico
urina e cultura semi quantitativa de ponta de cateter venoso central O HRAN eacute um
hospital puacuteblico do Distrito Federal com 395 leitos sendo as cliacutenicas de internaccedilatildeo
Berccedilaacuterio Cirurgia Geral Cirurgia Plaacutestica Cliacutenica Meacutedica Ginecologia Maternidade
Pediatria Queimados UTI com atendimento a pacientes portadores de doenccedilas de
caraacuteter cliacutenico e ciruacutergico
4 1 Coleta e transporte das amostras bioloacutegicas
As amostras foram coletadas de pacientes internados no Hospital Regional da
Asa Norte (HRAN) com suspeitas de infecccedilatildeo por KPC A identificaccedilatildeo primaacuteria foi
realizada pelo Laboratoacuterio de Microbiologia do hospital de origem dos pacientes e os
demais procedimentos que foram utilizados na identificaccedilatildeo encontram-se descritos
abaixo
4 2 Procedimentos para confirmaccedilatildeo de resistecircncia bacteriana por
disco de ertapenem (adaptado CDC 2004)
Para diagnosticar amostra como portadora de bacteacuteria produtora de
carbapenemase foi realizado o teste com disco de ertapenem como forma de
triagem Inicialmente utilizou-se o swab contaminado com a amostra que foi
distribuiacuteda em uma pequena aacuterea da placa de aacutegar MacConkey para apoacutes o
crescimento ser realizada a pesquisa de colonizaccedilatildeo por enterobacteacuterias resistentes
aos carbapenecircmicos (Pesquisa de CRE) Procedeu-se a semeadura por teacutecnica
semi-quantitativaesgotamento com alccedila bacterioloacutegica na diluiccedilatildeo de 1100 O disco
de Ertapenem foi colocado na superfiacutecie da placa de MacConkey na junccedilatildeo dos dois
primeiros campos de semeadura conforme demonstrado na figura 5 Incubou a placa
33
em estufa aeroacutebia a 35ordmC por 24 e 48 horas e observou-se o halo de difusatildeo do
disco de Ertapenem na placa para proceder agrave leitura
O teste deixou de ser obrigatoacuterio apoacutes a modificaccedilatildeo dos criteacuterios
interpretativos para carbapenecircmicos para enterobacteacuterias publicados no suplemento
do CLSI 2010 M100-S20-U
Figura 5 Mecanismo de semeamento de material bioloacutegico oriundos de
pacientes com suspeita de infecccedilatildeo por KPC Fonte adaptado CDC 2004
4 2 1 Interpretaccedilatildeo dos resultados
Na ausecircncia de crescimento ateacute 24 horas (MacConkey) ou halo de difusatildeo
gt27 mm na placa deve-se reincubar as placas por mais 24 horas Quando for
ausente o crescimento apoacutes 48 horas ou halo de difusatildeo gt27 mm na placa libera-se
como enterobacteacuterias resistentes a carbapenecircmicos (KPCNEG)Havendo
crescimento de colocircnias na placa de MacConkey com halo lt 27 mm (apenas para
colocircnias com crescimento dentro do halo) deve-se reisolar e realizar identificaccedilatildeo e
antibiograma automatizado teste de sensibilidade por disco-difusatildeo e Teste de
Hodge Modificado (THM) Os isolados de enterobacteacuterias cujos testes comprovarem
a resistecircncia aos carbapanecircmicos testados (KPCPOS) foram reportado a Comissatildeo
de Controle de Infecccedilatildeo Hospitalar (CCIH) Jaacute osbacilos Gram-negativos natildeo
fermentadores natildeo foram reportados (KPCNEG) Para interpretaccedilatildeodos resultados
foram utilizados os valores conforme demonstrados na tabela 1
Tabela 1 Criteacuterios Interpretativos para testes de sensibilidade
ENTEROBACTEacuteRIAS
Disco difusatildeo (mm) MIC (microgml)
34
Antibioacutetico Sigla S I R S I R
Ertapenem 10
microg
ETP 22 19-
21
18 05 1 2
Meropenem 10
microg
MEM 23 20-
22
19 1 2 4
Fonte Manual Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)
2013
Os resultados que apresentaram resistecircncia ao antibioacutetico Ertapenem foram
considerados como suspeitos de contaminaccedilatildeo por KPC Fez-se o teste de
susceptibilidade aos antibioacuteticos (TSA) em aparelho automatizado MicroScan Walk
Away 96sl Dade Behring
4 3 Teste de susceptibilidade aos antibioacuteticos (adaptado CDC 2004)
A determinaccedilatildeo da susceptibilidade dos isolados foi feita pelo teste de
susceptibilidade aos antibioacuteticos (TSA) apoacutes cultura em meio de gelose simples
(INSA) para avaliaccedilatildeo da sua pureza e obtenccedilatildeo de colocircnias isoladas Para
preparaccedilatildeo de uma suspensatildeo bacteriana com turvaccedilatildeo aproximada de 05
McFarland (Dade BehringMicroScanregTurbidity Meter) ressuspendeu duas a cinco
colocircnias em 2ml de soro fisioloacutegico esteacuteril diluindo a 1100 em soro fisioloacutegico num
volume total de 10ml em seguida foi feita uma semeadura em duas placas
quadradas (120mm x 120mm) de Muller-Hinton Agar (INSA) por inundaccedilatildeo
Os discos de antibioacutetico carbapenecircmicos imipenem meropenem e
ertapenem (Biorad) foram aplicados com o auxiacutelio de um dispensador automaacutetico A
susceptibilidade das Enterobacteacuterias aos carbapenecircmicos foi definida de acordo
com o protocolo Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI 2011)
Para aquelas Enterobacteacuterias que apresentaram resistecircncia ao ertapenem
foram realizados o Teste de Hodge Modificado para Detecccedilatildeo de Enterobacteacuterias
Produtoras de Carbapenemases conforme descrito pelo Centers for Disease Control
and Prevention (CDC 2004)
35
4 4Teste de Hodge Modificado (THM) (adaptado CDC 2004)
Preparou-se uma suspensatildeo em salina esteacuteril com a cepa Escherichia coli
ATCC 25922 (padratildeo 05 de McFarland) Apoacutes isto diluiu a suspensatildeo 110 em
salina (05 ml da soluccedilatildeo de Ecoli ATCC 25922 + 45 ml salina)Foi entatildeo semeado
na superfiacutecie de uma placa de Agar Muller-Hinton com a suspensatildeo diluiacuteda de Ecoli
ATCC 25922 com auxilio de swab seco assegurando que houvesse uma
distribuiccedilatildeo uniforme cobrindo toda a superfiacutecie do Agar Deixou secar por 3 a 5
minutos em temperatura ambienteColocou-se o disco de ertapenem 10microg no centro
da placa e apoacutes isto fez-se uma estria linear da cepa a ser testada da borda do
disco ateacute a borda da placa utilizando uma alccedila calibrada 10 microl ou um swab Incubou
a placa na estufa em atmosfera aeroacutebia a 35 plusmn 2ordmC por 16 a 24 horas
441 Controle de qualidade (CQ)
Foi utilizado um CQ todos os dias em que se realizou o teste tendo como
controle Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1705- teste de Hodge modificado
positivo Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1706- teste de Hodge modificado
negativo
442 InterpretaccedilatildeoResultados
Apoacutes 16ndash24 horas de incubaccedilatildeo examinar as placas para verificar a presenccedila
de uma distorccedilatildeo no halo de inibiccedilatildeo do disco de ertapenem devido ao crescimento
realccedilado da cepa ATCC na intersecccedilatildeo do organismo teste e a Ecoli ATCC 25922
dentro dos limites do halo O THM positivo apresentaraacute presenccedila de distorccedilatildeo no
halo de inibiccedilatildeo de ertapenem devido ao crescimento da cepa Ecoli ATCC 25922 ao
longo da estria da cepa teste para dentro dos limites do halo de inibiccedilatildeo Jaacute o THM
negativo teraacute ausecircncia de crescimento da cepa Ecoli ATCC 5922 ao longo da estria
da cepa teste para dentro dos limites do halo de inibiccedilatildeo do disco de ertapenem
Este resultado estaacute representado na figura 6
36
Figura 6 Interpretaccedilatildeo resultado do Teste de Hodge Modificado
(adaptado CDC 2004) Teste positivo na estria da cepa teste na parte superior
da placa teste negativo na estria da cepa teste na parte inferior da placa
Tendo positivo como resultado o paciente era um provaacutevel contaminado por
KPC As amostras entatildeo foram encaminhadas para a Fundaccedilatildeo Osvaldo Cruz
(FIOCRUZ) para confirmaccedilatildeo final As amostras finalmente confirmadas como
positivas para KPC foram isoladas e guardadas no banco de cepas cliacutenicas do
hospital Apoacutes a autorizaccedilatildeo do CEP amostras das cepas foram transferidas para
meio de transporte Stuard em caixa teacutermica fechada em baixa temperatura e
levadas para o laboratoacuterio de microbiologia cliacutenica da universidade
No laboratoacuterio da universidade as amostras foram separadas e realizadas
repiques em meios MacConkey e incubadas por 24h As colocircnias caracteriacutesticas
foratildeo isoladas em caldo BHI e mantidas em shaker a 37oC por 2h Apoacutes isto foram
executadas as anaacutelises a seguir
Os isolados de Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases foram
submetidos agrave extraccedilatildeo de DNA e posterior sequumlenciamento para identificaccedilatildeo dos
genes de resistecircncia blaKPC de 1 a 13 e identificaccedilatildeo do gene universal Os
pacientes de onde os materiais bioloacutegicos contendo as Enterobacteacuterias produtoras
de carbapenemases foram os isolados foram investigados quanto aos aspectos
epidemioloacutegicos e cliacutenicos
37
4 5 Extraccedilatildeo de DNA bacteriano
A extraccedilatildeo de DNA bacteriano foi realizada utilizando o kit NucleoSpin
Plasmidreg (MN) Antes de iniciar a extraccedilatildeo foi feito a preparaccedilatildeo das soluccedilotildees
reagentes materiais e amostras (vortexando) colocou-se em banho-maria agrave 50ordmC o
tampatildeo AW Partiu-se de colocircnias isoladas cultivadas que sofreram passagem em
meio LB liacutequido por 12h Adicionou-se 15 mL da amostra no tubo eppendorf
centrifugou por 5 minutos descartou o sobrenadante (com cuidado para natildeo
descartar o Pellet) Repetiu-se este procedimento por mais trecircs vezes completando-
se o volume de 6mL Foram adicionados 250microL do tampatildeo Resuspension Buffer A1
encostando a ponteira no Pellet e misturando (este tampatildeo tem como funccedilatildeo
separar a formaccedilatildeo de grumos celulares) Apoacutes isso homogeneizou e vortexou os
tubos eppendorfs Apoacutes isso foram adicionados 250microL do tampatildeo Lysis Buffer A2
homogenizou e deixou descansar por 5 minutos (esta etapa eacute importante para a lise
da parede e da membrana celulares e liberaccedilatildeo do conteuacutedo da ceacutelula)
Passado o tempo de descanso foi adicionado 300microL do tampatildeo
Neutralization Buffer A3 homogeneizou e centrifugou por 10 minutos (este tampatildeo
iraacute retirar as proteiacutenas que envolvem o DNA e voltaraacute com o pH para proacuteximo de 8
impedindo que a soluccedilatildeo de lise facilite a quebra das ligaccedilotildees covalentes do aacutecido
nucleacuteico) Em seguida enumeraram-se os tubos contendo filtros com siacutelica
transferiu-se o sobrenadante para o filtro e centrifugou por 5 minutos Descartou-se
o que foi filtrado adicionou 500microL do tampatildeo AW (banho-maria) centrifugou por 2
minutos Novamente foi descartado o filtrado Adicionou-se 600microL do tampatildeo A4
centrifugou por 2 minutos e descartou o filtrado (os tampotildees AW e A4 contecircm
isotiocianato de guanidina em concentraccedilotildees crescentes para facilitar a adsorccedilatildeo
do DNA na siacutelica e retirada das outras biomoleacuteculas da amostra) Foi feita outra
centrifugaccedilatildeo com o tubo vazio Apoacutes isto o filtro foi trocado para outro eppendorf
definitivo onde foi adicionado 50microL do tampatildeo Elution Buffer AE (este tampatildeo
favorece a eluiccedilatildeo do DNA) centrifugou por 2 minutos descartou o filtro e
armazenou as amostras em freezer -20ordmC
38
4 6 Iniciadores e reaccedilatildeo de PCR
Os iniciadores universais para o gene blaKPC foram desenhados baseados
em sequumlecircncias conservadas apresentadas pelos sub-grupos de genes que
codificam a enzima carbapenemase de klebsiella pneumoniae (YIGIT et al 2001)
Baseado na sequumlecircncia para o blakpc-1 depositada no GenBank
(AF2975541) o oligonucleotiacutedio (oligo) iniciador direto (5-
ATGTCACTGTATCGCCGTC-3rsquo) foi desenhado para reconhecer a sequumlecircncia
blaKPC na posiccedilatildeo (131149) enquanto que o iniciador reverso (5-
TTACTGCCCGTTGACGCC-3rsquo) foi reconhecido na posiccedilatildeo (9951012) As anaacutelises
baseadas em alinhamento de sequumlecircncias mostraram que o par de iniciadores
blaKPC podem detectar os alelos de 1 a 13 do gene blaKPC conforme a tabela 2
Tabela 2 Nuacutemero de acesso ao GenBank dos alelos blaKPC e seus
microrganismos originais
Nuacutemero de
Acesso GenBank
Microrganismo Alvo
AF2975541 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-1
GU0862251 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-2
HQ2589341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-2-like
AB5577341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC -3
EU4473041 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-4
EU4002222 Pseudomonas
aeruginosa
blaKPC-5
EU5555341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-6
EU7297271 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-7
39
FJ2344121 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-8
FJ624872 Escherichia coli blaKPC-9
GQ1403481 Acinetobacter
baumannii
blaKPC-10
HM0669951 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-11
HQ3428891 Enterobacter cloacae blaKPC-12
HQ3428901 Enterobacter cloacae blaKPC-13
As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo de blaKPC foram realizadas em um
primeiro tempo de desnaturaccedilatildeo em que foi 94ordmC por 5 minutos seguido de 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 58 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 90 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 78ordmC por 8 minutos Aleacutem das amostras foi utilizado um
controle negativo
A PCR do blaKPC foi realizada utilizando os componentes para o volume da
reaccedilatildeo de 25 microL citados na tabela 3 A banda do tamanho do produto de PCR foi de
881 pares de bases (pb) o que corresponde ao plasmiacutedeo
Tabela 3 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do
gene blaKPC
Reagente Volume
DNA molde 4 microL
Tampatildeo Taq 25 microL
MgCl2 075 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP
2 microL
Oligo F 1 microL
Oligo R 1 microL
Taq DNA polimerase 05 microL
Aacutegua MiliQ 1335 microL
40
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
Baseado na sequumlecircncia para o gene 16S rRNA em que o oligonucleotiacutedio
Universal iniciador direto foward (5-CCAGCAGCCGCCGTAATACG-3rsquo) foi
desenhado para reconhecer a sequumlecircncia universal na posiccedilatildeo 1513 enquanto que o
iniciador reverso (5-ATCGGYTACCTTGTTACGACTTC-3rsquo) foi reconhecido na
posiccedilatildeo 1491 foram realizadas PCRrsquos As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo deste
gene foram realizadas nos seguinte tempos separaccedilatildeo 94ordmC por 10 minutos 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 55 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 120 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 72ordmC por 10 minutos
A PCR do gene 16S rRNA foi realizada utilizando os componentes para o
volume da reaccedilatildeo de 25microL citados na tabela 4 A banda do tamanho do produto de
PCR foi de 996 pb correspondente aacute regiatildeo ribossomal capaz de amplificar todas
as espeacutecies
Tabela 4Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do gene
universal
Reagente (quantidade
concentraccedilatildeo do estoque)
Volume
DNA molde 10 ng 4 microL
Tampatildeo Taq 10 x 25 microL
MgCl2 50mM 125 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP 25 mM
125 microL
Oligo F 10microM 05 microL
Oligo R 10microM 05 microL
Taq DNA polimerase 5UmicroL 04 microL
Aacutegua Miliq 146 microL
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
41
O termociclador utilizado para os experimentos foi o LifeTouch da BIOER
4 7 Digestatildeo
Para realizaccedilatildeo da digestatildeo foi utilizada a enzima BshF I (Hae III) EN- 1105
tamanho 7000 units concentraccedilatildeo 10 unitsmicroL fonte Bacillus sphaericus empresa
Jena bioscienceUtilizaram-se os componentes para o volume de 50microL da reaccedilatildeo
citados na tabela 5
Tabela 5 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da digestatildeo do gene
universal
Reagente Volume
Produto de PCR 10 microL
Enzima BshF I 01 microL
Tampatildeo (10x) 5 microL
Aacutegua Miliq 349 microL
Total (em cada ependorff) 50 microL
Valores para 1 digestatildeo
Os ependorffs foram colocados por 30 minutos em banho-maria a 37ordmC Apoacutes
isso fez-se a corrida das amostras em gel de agarose para verificaccedilatildeo do resultado
(LU et al 2000)
4 8 Eletroforese em gel de agarose
Os produtos de DNA PCR e digestatildeo foram analisados em gel de agarose
2 O tempo de corrida do gel eacute de aproximadamente 1hora e 30minutos sendo
que no comeccedilo foi usada agrave voltagem de 50 V e apoacutes comeccedilar a correr o gel
aumentou a voltagem para 100 v Utilizou-se o marcador de 100pb (pares de bases)
Foi adicionado 3microL de corante Bromophenol (que tem a funccedilatildeo de fazer uma ligaccedilatildeo
na amostra de DNA e permitir a visualizaccedilatildeo da corrida no gel de agarose) em 7microL
de amostra tanto de DNA quanto de PCR Para o preparo do gel foi utilizado TBE
42
(Tris- Aacutecido Boacuterico) agarose e brometo de etiacutedio (sua funccedilatildeo eacute de corante para o gel
e permitir a visualizaccedilatildeo do DNA quando colocado agrave luz ultravioleta) Para o oligo
blaKPC a banda da amplificaccedilatildeo foi em 881ppb correspondendo ao plasmiacutedeo Jaacute
o oligo Universal foi em 996 pb
4 9 Descarte de resiacuteduos
Todos os materiais utilizados nos ensaios foram de uso uacutenico e manipulados
em cacircmaras de seguranccedila bioloacutegica classe II Apoacutes o uso foram colocados em
soluccedilatildeo desinfetantes (hipoclorito a 1) e em seguida autoclavados a 127oC por 20
min em sacos apropriados para autoclavaccedilatildeo Apoacutes a finalizaccedilatildeo do ciclo de
esterilizaccedilatildeo os sacos contendo o material descartaacutevel foram colocados em
recipientes de coleta da empresa responsaacutevel pela coleta de materiais bioloacutegicos
produzidos no laboratoacuterio de microbiologia Todos os procedimentos seguiram a
normativa RDC-ANVISA 3062004 sobre o descarte de resiacuteduos de serviccedilo de
sauacutede
4 10 Aspectos epidemioloacutegicos e cliacutenicos
Os aspectos cliacutenicos e epidemioloacutegicos foram investigados por meio de
prontuaacuterios dos pacientes portadores de enterobacteacuterias produtoras de
carbapenemases e envolveram topografia mais provaacutevel do foco infeccioso a
enfermidade motivadora da internaccedilatildeo o desfecho cliacutenico a idade e o tempo de
internaccedilatildeo
4 12 Anaacutelises eepidemioloacutegicas
As anaacutelises foram realizadas com o pacote estatiacutestico SPSS versatildeo 200
Para verificar quais variaacuteveis referentes aos dados epidemioloacutegicos e
microbioloacutegicos influenciaram no desfecho verificou- se a diferenccedila meacutedia das
variaacuteveis idade e tempo de internaccedilatildeo em cada grupo O teste estatiacutestico utilizado foi
o teste t de Student apoacutes se executar o teste de normalidade de Shapiro-Wilk Para
as variaacuteveis sexo perfil microbioloacutegico das enterobacteacuterias produtoras de
43
carbapenemases foi avaliada a associaccedilatildeo com o desfecho por meio do teste Exato
de Fisher O niacutevel de significacircncia adotado foi de 5
4 13 Preceitos eacuteticos
Este projeto estaacute inserido em um projeto maior denominado ldquoEpidemiologia
cliacutenica e caracterizaccedilatildeo molecular do Acinetobacter Baumannii resistente a
antibioticoterapia em pacientes internado em hospitais do Sistema Uacutenico de Sauacutederdquo
que foi submetido ao Comitecirc de Eacutetica em Pesquisa da Secretaria do Estado de
Sauacutede do Distrito Federal (SESDF) e emitido parecer aprovado pelo protocolo nordm
23109 (anexo)
44
5 RESULTADOS
51 Anaacutelise molecular
Para a amplificaccedilatildeo com o oligo blaKPC foram amplificadas amostras
que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 881 pb correspondente ao
plasmiacutedeo A anaacutelise da amplificaccedilatildeo da regiatildeo do gene blaKPC mostrou que
apenas a amostra A10 natildeo amplificou isso demonstra que esta amostra natildeo
possuiacutea o gene de resistecircncia
5 1 1 Gene blaKPC
Figura 7 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 881 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
A amostra A3 natildeo amplificou no primeiro momento entatildeo foi realizado
novamente a PCR e corrida de gel obtendo entatildeo a amplificaccedilatildeo da amostra como
apresentado na figura 8
45
Figura 8 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC da
mostra A3 estudada A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo de 881
pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 1 2 Gene 16S rRNA
Para a amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA utilizou-se o oligo universal Foram
amplificadas amostras que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 996 pb
Figura 9 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
46
Segundo Lu et al (2000) a digestatildeo com a enzima HaeIII deste amplicons de
16S rRNA devolveriam bandas com perfis entre 150 a 200 pb No gel abaixo eacute
possiacutevel evidenciar que este perfil ocorreu com o predomiacutenio de bandas na altura
de 200pb
Figura 10 Gel de agarose a 2 da digestatildeo do amplicon do gene 16S
rRNA das amostras com a enzima HaeIII evidenciando diversos fragmentos
proacuteximos a 200 pb A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo ribossomal
de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 2 Anaacutelises epidemioloacutegicas
5 2 1 Sexo
No total foram detectados 17 isolados de KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 onde a maior a prevalecircncia foi
detecatada em amostras de pacientes do sexo masculino (53) do que no sexo
feminino (47)
47
Figura 11 Isolado de KPC segundo sexo dos 17 pacientes investigados
no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 2 Desfecho cliacutenico
Em 17 isolados de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo
de 2010 aacute 2011 a porcentagem de pacientes que foram a oacutebito (59) foi maior que
a de pacientes que tiverm alta (41)
Figura 12 Isolado de KPC segundo desfecho cliacutenico dos 17 pacientes
investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
48
5 2 3 Local da coleta
Dos 17 episoacutedios detectados de infecccedilatildeo por KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 a infecccedilatildeo em swab retalfoi mais
frequente (47) seguida de ponta de cateacuteter (18) e secreccedilatildeo traqueal (12)
Figura 13 Isolados de KPC segundo local da coleta da amostra nos 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 4 Microorganismo
O microorganismo mais encontrado foi a Klebsiella pneumoniae (82)
seguida da Enterobacter clocae (12) e Serratia marcescens (6) dos 17 isolados
de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 Isto afirma o
fato de a sigla KPC ser utilizada de forma errocircnea aacute Klebsiella pneumoniae visto
que a evidecircncia dela eacute maior em relaccedilatildeo as outras cepas
49
Figura 14 Isolado de KPC segundo microrganismo encontrado em 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 5 Relaccedilotildees variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana e desfecho
cliacutenico
Tabela 6 ndash Distribuiccedilatildeo do perfil geneacutetico sexo coleta tipificaccedilatildeo de
microrganismos e anaacutelise da resistecircncia bacteriana segundo o desfecho
cliacutenico Brasiacutelia-DF 2010 a 2011
Variaacutevel Resultado
Desfecho
Alta Oacutebito
N N P
Gene 16S rRNA Positivo 7 1000 10 1000
NA Gene blaKPC Positivo 6 857 10 1000
Negativo 1 143 0 00 0218 Sexo Feminino 2 286 6 600
Masculino 5 714 4 400 0201 Local da coleta Fundo saco de
Douglas 1 143 0 00
Hemocultura 0 00 1 100 0463 Ponta de cateter 1 143 2 200
Sec TraquealBrocircnquica
0 00 1 100
50
Secreccedilatildeo traqueal 2 286 0 00
Swab retal 3 429 5 500
Urina 0 00 1 100
Microrganismo Enterobacter cloacae (KPC)
1 143 1 100
Klebsiella pneumoniae
6 857 8 800
0416 Serratia
marcescens 0 00 1 100
Teste de Hodge Hodge positivo 7 1000 10 1000
NA Amicacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 1 100 0848 resistente 0 00 1 100
sensiacutevel 2 286 3 300
Amoxicilina Aacutecido Clavulacircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Ampicilina Sulbactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ampicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Aztreonan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefazolina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Cefoperazona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Cefotaxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefoxitina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0509 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 2 286 4 400
Ceftazidima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cetriaxona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 3 429 5 500 0772 Cefalotina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ciprofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772
51
resistente 3 429 5 500
Claritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Clindamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Eritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Gentamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0942 resistente 2 286 3 300
sensiacutevel 1 143 2 200
Imipenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 0 00 2 200 0193 Resistente 1 143 3 300
sensiacutevel 2 286 0 00
Nitrofurantoiacutena sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Norfloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Oxacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Penicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Piperacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Rifampicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tetraciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Ticarcilina Aacutecido Clavulocircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0688 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 3 429 4 400
Tobramicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Trimetoprima Sulfametoxazol
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0112 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 2 286 0 00
Vancomicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tigeciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediario 0 00 1 100 0211 natildeo testado 1 143 4 400
resistente 2 286 0 00
52
Cefepime sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefuroxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Levofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Piperacilina Tazobactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Ertapenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Meropenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0223 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 1 143 0 00
Cefotetan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 sensiacutevel 0 00 1 100
Gemifloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 7 700 0585 natildeo testado 3 429 3 300
Desfecho
Alta Oacutebito
Meacutedia Erro
padratildeo Meacutedia Erro
padratildeo p
Idade 58 9 59 5 0991
Tempo Internaccedilatildeo (dias)
50 13 46 12 0571
n= 17 p(lt 005) NA natildeo se aplica
53
6 DISCUSSAtildeO
Nos uacuteltimos anos houve um aumento na incidecircncia de bacteacuterias
multirresistentes aos antimicrobianos no ambiente hospitalar tornando isto um
problema mundial de sauacutede puacuteblica (HULSCHER et al 2010) Quando se trata
principalmente de bacilos Gram negativos a frequumlecircncia destas bacteacuterias eacute ainda
maior em paiacuteses da Ameacuterica Latina quando comparada a paiacuteses desenvolvidos
(GALES etal 2012)
De acordo com dados do ldquoMeropenem Yearly Susceptibility Test Information
Collectionrdquo (MYSTIC) ocorreu nos Estados Unidos um aumento na susceptibilidade
de K pneumoniae nos uacuteltimos anos graccedilas a praacuteticas de controle de disseminaccedilatildeo
de amostras resistentes(RHOMBERG P R et al 2009) O aumento crescente da
prevalecircncia destes microrganismos foi proporcional ao aumento da dependecircncia do
uso de antibioacuteticos carbapenecircmicos considerados como a opccedilatildeo terapecircutica para o
tratamento de infecccedilotildees por bacilos Gram negativos multi-resistentes (LIVERMORE
2012) Isto afeta diretamente as opccedilotildees de tratamento sobrando poucas alternativas
para a terapecircutica que incluem colistina (polimixina E) e tigeciclina que apresentam
respectivamente problemas em termos de toxicidade e eficaacutecia (LIVERMORE et
al 2011) Um dos efeitos adversos mais importantes das poliminas B e E por
exemplo satildeo a neurotoxicidade e nefrotoxicidade (MENDES C A C et al2009 )
Devido agrave resistecircncia ser usualmente de natureza plasmidial e portanto de
maior disseminaccedilatildeo especialmente quando carreadas por K pneumoniae
microrganismo com uma notoacuteria capacidade para acumular e transferir plasmiacutedeos
com determinantes para resistecircncia o nuacutemero de casos detectados pelo
fenoacutetipogenoacutetipo blaKPC eacute bastante preocupante (MONTEIRO et al 2009)
Comparada com outras bacteacuterias hospitalares a transmissatildeo de clones
multirresistentes de K pneumoniae eacute maior e podem natildeo ser controladas pelos
meacutetodos de controle de infecccedilatildeo hospitalar (PAAUW et al 2007) A forma
plasmidial para transferecircncia da resistecircncia adicionada a este grande potencial para
disseminaccedilatildeo de clones resistentes eacute preocupante visto que apoacutes surtos muitas
vezes pode se tornar endecircmica Jaacute eacute uma realidade a disseminaccedilatildeo desta bacteacuteria
54
entre pacientes hospitais paiacuteses e ateacute mesmo continentes (WOODFORF et al
2010 ROGERS et al 2011)
As chances de surtos satildeo maiores em paiacuteses com poucos recursos devido agrave
maior carecircncia de praacuteticas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees hospitalares e o
uso irracional de antimicrobianos de forma empiacuterica e inadequada (KUMARASAMY
et al 2010) Ateacute o momento os mecanismos de resistecircncia aos cabapenecircmicos
geralmente encontrado eram a produccedilatildeo de ESBL (CTX-M) somada aacute perda de
porina (CARVALHAES et al 2010) Foi notado a partir do ano de 2008 um
aumento no nuacutemero de K pneumoniae produtoras de KPC-2 apresentando outra
forma de resistecircncia (GALES 2012)
Um estudo mostrou que o perfil do paciente colonizado ou infectado por KPC
foi de um paciente entre os 33 e os 82 anos de idade internado haacute mais de 1
semana no hospital A mortalidade geral nos uacuteltimos anos ficou em torno de 7
sendo que dos 77 pacientes estudados 32 (415) pacientes evoluiacuteram para oacutebito
evidenciando a alta morbi-mortalidade associada (ALVES A P et al 2013)
Em estudo com 2316 pacientes avaliados a populaccedilatildeo de sexo masculino foi
de 526 idade meacutedia global de 53 anos (mediana de 55 anos) permanecircncia meacutedia
de 58 dias (mediana de 3 dias) (OLIVEIRA A C et al 2010) Outros trabalhos
apresentaram ausecircncia de significacircncia entre sexoidade e o desenvolvimento de
infecccedilotildees por microrganismos resistentes (PERES-BOTA D et al 2003 COLPAN
A et al 2005 COELLO R et al 1997)
Outro estudo utilizou um total de 30 amostras sendo elas isoladas de urina
escarro secreccedilatildeo pleural ponta de cateter aspirado traqueal e hemocultura A mais
prevalente foi em urina (40) Entre as 30 cepas analisadas a maior porcentagem
foi da cepa Klebsiella pneumoniae (70) Enterobacter sp (133) Klebsiella
ozaenae (10) Escherichia coli (333) e Klebsiella oxytoca (333)
(DIENSTMANN R et al 2010) Nos Estados Unidos a enzima KPC jaacute se tornou
endecircmica Foi realizada uma pesquisa em dois hospitais de Nova York onde
testaram 602 amostras e 45 apresentaram algum mecanismo de resistecircncia
sendo apenas 33 confirmadas por biologia molecular como KPC-2 (BRATU et
al 2005)
55
Estudo sobre os tipos de ESBL feito no Japatildeo apresentou o tipo Toho-1 como
o mais prevalente nessa pesquisa Ateacute o ano de 2000 ano em que foi publicado tal
estudo este era o primeiro relatoacuterio no Japatildeo para identificar derivados de ESBLs
como tipo de SHV e TEM entre E coli e K pneumoniae Em especial o tipo SHV- 12
foi identificado com uma maior frequumlecircncia Estes resultados indicam que tipos
distintos de ESBLs que satildeo diferentes em sua especificidade de substrato e origem
geneacutetica coexistem no Japatildeo Isto mostra a importacircncia de caracterizar genoacutetipos
distintos de ESBLs e de estar em alerta continuamente para as tendecircncias de
ESBLs no Japatildeo aleacutem da necessidade de uma interpretaccedilatildeo uniforme utilizando as
diretrizes do CSLI para relatar cepas produtoras de ESBL Aleacutem da detecccedilatildeo de
ESBLs satildeo necessaacuterias mais informaccedilotildees tais como o perfil de sensibilidade
especiacutefica para diversas β-lactacircmicos e o local da infecccedilatildeo Esses fatores satildeo
essenciais para a escolha adequada de antibioacuteticos (YAGI T et al 2000)
No ano de 2004 uma pesquisa avaliou a produccedilatildeo de uma enzima de
hidroacutelise de carbapenecircmicos atraveacutes da teacutecnica de sequumlenciamento foi revelado
um novo membro da famiacutelia KPC designado KPC- 3 Pesquisadores encontraram
em um mutante de K pneumoniae uma substituiccedilatildeo de um gene associado com
resistecircncia a Imipenem mas essa substituiccedilatildeo foi considerada improvaacutevel na
contribuiccedilatildeo da resistecircncia aos carbapenecircmicos da espeacutecie estudada Aleacutem da
resistecircncia aos carbapenecircmicos estes isolados eram em sua maioria resistentes agraves
cefalosporinas penicilinas e aminoglicosiacutedeos Usando estudos de transformaccedilatildeo
conjugaccedilatildeo e hibridaccedilatildeo localizaram o alelo blaKPC em plasmiacutedeo aleacutem disso
mostraram que esse alelo tambeacutem carregava uma resistecircncia aos aminoglicosiacutedeos
A transferecircncia das enzimas KPCs foi demonstrada in vitro tanto neste como em
outros estudos pode ser que os plasmiacutedeos que fazem esta transferecircncia estavam
comeccedilando a se espalhar no ambiente cliacutenico resultando na multiresistecircncia dessas
estirpes (WOODFORD et al 2004)
O presente estudo apresentou um vieacutes quanto aos resultados dos testes de
susceptibilidade microbiana Observou-se que natildeo foi encontrado resultado deste
teste em algumas amostras o que natildeo cooperou para um estudo mais preciso
futuros estudos quanto agraves amostras e um melhor acompanhamento deste tipo de
patologia Poreacutem mesmo sem algumas amostras com este resultado disponiacutevel foi
56
confirmada a presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos
carbapenecircmicos por meio dos genes de resistecircncia blaKPC e 16S rRNA que as
amostras apresentaram em sua maioria serem portadoras Quanto aos resultados
estatiacutesticos nenhuma das variaacuteveis apresentou significacircncia estatiacutestica (p gt 005)
mostrando assim que estas variaacuteveis isoladas natildeo foram o fator determinante para
o desfecho cliacutenico de alta ou oacutebito
57
7 CONCLUSAtildeO
Os genes blaKPC e 16S rRNA foram caracterizados confirmando a a
presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos carbapenecircmicos
Houve uma maior prevalecircncia da cepa K pneumoniae e isto confirma outros
estudos que apresentam a maior prevalecircncia desta cepa em amostras com KPC
Aleacutem disso isso justifica a forma popular da K pneumoniae ser chamada de KPC
enquanto que na verdade KPC eacute uma enzima podendo estar presente em outras
cepas como Enterobacter clocae tambeacutem apresentada no presente estudo O
desfecho cliacutenico de oacutebitos maior que 50 eacute um possiacutevel indicador sobre a
necessidade de se realizar um teste raacutepido para identificaccedilatildeo de KPC visando
iniciar o mais raacutepido possiacutevel o tratamento afim de diminuir a mortalidade por esta
infecccedilatildeo
Nenhuma das variaacuteveis isoladamente estaacute relacionada ao desfecho cliacutenico
oacutebito ou alta pois natildeo apresentaram relevacircncia estatiacutestica O presente estudo
mostrou que haacute presenccedila da bacteacuteria nas amostras de pacientes do hospital
estudado podendo entatildeo afirmar que este tipo de bacteacuteria se encontra tambeacutem
presente em ambiente hospitalar O uso irracional de antimicrobiano eacute demonstrado
de forma indireta quando foi apresentado atraveacutes do Teste de Hodge Modificado
uma resistecircncia de 100 aos antibioacuteticos carbapenecircmicos Isto tambeacutem reflete na
terapecircutica sendo que pacientes portadores de bacteacuterias resistentes aos
antibioacuteticos carabepecircmicos tem uma escassa opccedilatildeo de tratamento e as opccedilotildees
apresentam problemas quanto agrave toxicidade e eficaacutecia
58
REFEREcircNCIAS
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Mecanismos
de resistecircncia bacteriana aos antimicrobianos Disponiacutevel em
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controleopas_
webmodulo3mec_sitiohtmgt Acesso em 25 de abril de 2014
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Nota teacutecnica nordm
012013 medidas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees por enterobacteacuterias
multiresistentes Acesso em 17 de abril de 2013
ALBA J et al Kinetics study of KPC-3 a plasmid-encoded class A
carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase Antimicrob Agents Chemother
Nov49(11)4760-2 2005
ALVES A P et al Nosocomial infections by KPC-producing enterobacteria in
a tertiary hospital in Southern Brazil Revista da AMRIGS Porto Alegre 57 (3) 213-
218 jul-set 2013
ALVES A et al Tipagem Geneacutetica de Microrganismos Lab De Diversidade
Microbiana Centro de Biologia Celular Dep de Biologia U de Aveiro 3810-193
Aveiro- 2003
BELL J M et Al Prevalence and significance of a negative extended-
spectrum beta-lactamase (ESBL) confirmation test result after a positive ESBL
screening test result for isolates of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae
results from the SENTRY Asia-Pacific Surveillance Program J Clin Microbiol
May45(5)1478-82 2007
BRATU S et al Detection of KPC carbapenem-hydrolyzing enzymes in
Enterobacter spp from Brooklyn New York Antimicrob Agents Chemother v 49 n
2 p 776-8 2005
59
BRATU S et al Emergence of KPC-possessing Klebsiella pneumoniae in
Brooklyn New York epidemiology and recommendations for detection Antimicrob
Agents Chemother v 49 n 7 p 3018-20 2005
BRATU S et al Rapid spread of carbapenem-resistant Klebsiella
pneumoniae in New York City Arch Intern Med v 165 p 1430-5 2005
CAMARGO C F et al Aplicaccedilatildeo das teacutecnicas de pcr e suas teacutecnicas
derivadas em diagnoacutestico molecular Disponiacutevel em
ltfileDUnB10C2BA20semestreArtigosPCR-
20CLEYTON20FLORENCIO20DE20CAMARGO20E20PAULO20ROB
ERTO20QUEIROZpdfgtgt Acesso em 08 de abril de 2014
CARVALHES C G et al Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting
carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive
results Journal of Antimicrobial Chemotherapy v 65 n2 p 249-251 2010
CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION- CDC Modified
Hodge Test for Carbapenemase Detection in Enterobacteriaceae 2004
CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE Methods for
dilutionantimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically Approved
standard M7ndashA7 7th ed CLSI Wayne PA 2011
COELLO R et al Risk factors for developing clinical infection with methicillin-
resistant Staphylococcus aureus (MRSA) amongst hospital patients initially only
colonized with MRSA J Hosp Infect 19973739-46
COLPAN A et al Evaluation of risk factors for mortality in intensive care
units A prospective study from a referral hospital in Turkey Am J Infect Control
200533(1)42-7
60
CORNAGLIA G et al Living with ESBLs Introduction Clinical Microbiology
and Infection 14 Suppl 1 1-2 2008
COTRIM E R et al Klebsiella pneumoniae carbapenemase ndash KPC em
Enterobacteriaceae o desafio das bacteacuterias multirresistentes Poacutes em revista do
centro universitaacuterio Newton Paiva 12012 - ediccedilatildeo 5 - issn 2176 7785
DESHPANDE L M et al Occurrence and characterization of
carbapenemase-producing Enterobacteacuteriaceae report from the SENTRY
Antimicrobial Surveillance Program (2000-2004) Microb Drug Resist 12(4)223-30
2006
DIAS D J A Estudos dos principais mecanismos de resistecircncia aos
antibioacuteticos β-lactacircmicos em bacteacuterias patogecircnicas gram negativas 2009 100 f
Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Geneacutetica Molecular e Biomedicina) ndash Faculdade de
Ciecircncias e Tecnologia Universidade de Nova Lisboa Lisboa
DIENSTMANN R et al Avaliaccedilatildeo fenotiacutepica da enzima Klebsiella
pneumoniae carbapenemase (KPC) em Enterobacteriaceae de ambiente hospitalar
J Bras Patol Med Lab v 46 n 1 p 23-27 fevereiro 2010
ENDIMIAMI A et al Emergence of blaKPC-containing Klebsiella
pneumoniae in a long-term acute care hospital a new challenge to our healthcare J
Antimicrob Chemother 64 1102-1110 Nov 2009
FALAGAS M E et al Extended-spectrum beta-lactamase producing
organisms The Journal of Hospital Infection 73 (4) pp 345-54 2009
FONTANA C et al Emergence of KPC-producing Klebsiella pneumoniae in
Italy BMC Rev Notes 3 40 2010
61
GALES A C et al Antimicrobial resistance among Gram-negative bacilli
isolated from Latin America results from Sentry Antimicrobial Surveillance Program
(Latin America 2008-2010) Diagnostic Microbiology and Infectious Disease v 3 n
4 p 354 -360 2012
GUPTA N et al Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Epidemiology
and Prevention HEALTHCARE EPIDEMIOLOGY Clinical Infectious Diseases
201153(1)60ndash67 Published by Oxford University Press on behalf of the Infectious
Diseases Society of America 2011
HARBOTTLE H et al Genetics of antimicrobial resistance Anim Biotechnol
n17 p111-124 2006
HENRIQUE W N et al RESISTEcircNCIA BACTERIANA Uniatildeo das
Faculdades Alfredo NasserInstituto de Ciecircncias da Sauacutede Disponiacutevel em lt
httpwwwfaculdadealfredonasseredubrfilespesquisaposter20HENRIQUE20
Wilker20Natividade20SANTIAGO20Silvania20CAVALCANTI20DSP
20ResistC3AAncia20Bacterianapdfgt Acesso em 17 marccedilo 2014
HULSCHER M E J I et al Antibiotic prescribing in hospital a social and
behavioral scientific approach The Lancet Infectious Diaseases v 10 n 3 p 167-
165 2010
KIDWAI M SAPRA P BHUSHAN KR Synthetic strategies and medicinal
properties of beta-lactams Curr Med Chem 1999 695-215
KUMARASAMY K K et al Emergence of a new antibiotic resistance
mechanism in India Pakistan and the UK a molecular biological and
epidemiological stuy The Lancet Infectious Diseases v10 n 9 p 597- 602 2010
LINCOPAN N et al Enterobacteacuteria producing extended-spectrum β-
lacatamases and IMP-1 Metalo-β-lactamases isolated from Brazilian hospitals J Med
62
Microbiol 7 1-3 2006
LINCOPAN N et al First Isolation of Metalo-β-Lacatamase-Producing
Multiresistant Klebsiella pneumoniae from a patient in Brazil J Clin Microbiol 43(1)
516-519 2005
LIVERMORE D M et al What remains against carbapenem- resistant
Enterobacteriaceae Evaluation of choramphenicol ciprofloxacin colistina
fosfomycin minocycline nitrofurantoin temocilin and tigecycline International
Journal of Antimicrobial Agents v 37 n 5 p 415- 459 2011
LIVERMORE D M Fourten years in resistance International Journal of
Antimicrobial Agents v 39 283- 294 2012
LIVERMORE D M Bacterial resistance to carbapenems Adv Exp Med Biol
1995 39025-47
LIVERMORE D M Bacterial resistance origins epidemiology and impact
Clin Infect Dis 36S11-S23 2003
LIVERMORE D M et al Carbapenemases a problem in waiting Curr
Opin Microbiol 2000 3489-95
LU et al Universal pcr for common bacterial pathogens J CLIN
MICROBIOL VOL 38 2000
LU et al Use of PCR with Universal Primers and Restriction Endonuclease
Digestions for Detection and Identification of Common Bacterial Pathogens in
Cerebrospinal Fluid Journal of Clinical Microbiology June 2000 p 2076ndash2080
MARSCHALL J Met al Presence of the KPC Carbapenemase Gene in
Enterobacteriaceae Causing Bacteremia and Its Correlation with In Vitro
Carbapenem Susceptibility J Clin Microbiol 47 239-241 Jan 2009
63
MARTINS WMBS et al Prevalecircncia do gene blaKPC em isolados cliacutenicos
de Enterobacteriaceae e natildeo fermentadores encontrados em amostras clinicas em
um hospital universitaacuterio do Recife X Jornada de ensino pesquisa e extensatildeo ndash
JEPEX 2010 ndash UFRPE Recife 18 a 22 de outubro
MENDES C A C et al Polimixinas Revisatildeo com ecircnfase na sua
nefrotoxicidade Rev Assoc Med Bras 2009 55(6) 752-9
MOHR J F 3rd Update on the efficacy and tolerability of meropenem in the
treatment of serious bacteacuterial infections Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S41-51
2008
MONTEIRO J et al First report of KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae
strains in Brazil Antimicrob Agents Chemother Jan53(1)333-4 2009
MOREIRA V C et al Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia a antibioacuteticos
Disponiacutevel em
lthttpwwwcpglsucgbr6mostraartigosSAUDEVANESSA20CARVALHO20M
OREIRApdfgt Acesso em 21 marccedilo 2014
NETIKUL T et al Emergence of novel blaKPC-12 and blaKPC-13 variants in
carbapenem non-susceptible Enterobacter cloacae a first report of blaKPC gene in
Thailand European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases May
S372 2011
NETO V A et al Antibioacuteticos na praacutetica Meacutedica 6ordf Ediccedilatildeo Editorial
SarverSP Brasil 2007
NICOLAU D P Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of
meropenem Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S32-40 2008
64
OLIVEIRA A C et al Resistecircncia bacteriana e mortalidade em um centro de
terapia intensiva Rev Latino-Am Enfermagem nov-dez 2010
PAAUW A et al Failure to control an outbreak of qnrA 1-positive multidrug-
resistant Enterobacter clocae despite adequate implementation of recommended
infection control measures Journal of Clinical Microbiology v 45 n 5 p 1420-1425
2007
PATERSON D L et al Extended-Spectrum Beta-Lactamases a Clinical
Update Clinical Microbiology Reviews v 18 p 657-686 2005
PEIRANO G et al Carbapenem-hydrolysing beta-lactamase KPC-2 in
Klebsiella pneumonia isolated in Rio de Janeiro Brazil J Antimicrob Chemother Nov
20 2009
PERES-BOTA D et al Are infections due to resistant pathogens associated
with worse outcome in critically ill patients J Infect 200347(4)307-16
PIDDOCK L J V Clinically relevant chromosomally encoded multidrug
resistance effl ux pumps in bacterial Clin Microbiol Rev n19 p382-402 2006
PITOUT J D D et al Emergence of Enterobacteriaceae producing
extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) in the community J Antimicrob
Chemother May 56 2005
POSSEBON M I et al Resistecircncia bacteriana aos carbapenecircmicos
Bacterial resitence to carbapenems RBM rev bras med60(6)378380-378-382
jun 2003
QUEENAN A M et al Carbapenemases the versatile beta-lactamases
Clin Microbiol Rev Jul20(3)440-58 2007
65
RHOMBERG P R et al Summary trends for the meropenem yearly
susceptibility test information collection program a 10- year experience in the United
States (1999-2008) Diagnostic Microbiology and Infectiois Disease v 65 n4 p
414-426 2009
ROBLEDO I E et al Detection of KPC in Acinetobacter spp in Puerto Rico
J Antimicrob Agents Chemother 54 1354-1357 Mar 2010
ROGERS B A et al Country-to-country transfer os patients and the risk of
multi-resistant bacterial infection Clinical Infectious Disease v53 n1 p49- 56
2011
SHAH A A et al Characteristics epidemiology and clinicalimportance of
emerging strains of Gram-negative bacilli producing extended-spectrum
betalactamases Research in Microbiology v 155 p 409-421 2004
TURNER P J Extended- Spectrum Beta-Lactamases Clinical Infectious
Diseases v 41 p 273-275 2005
WOLTER D J et al Phenotypic and Enzymatic Comparative Analysis
between the Novel KPC variant KPC-5 and Its Evolutionary Variants KPC-2 and
KPC-4 Antimicrob Agents Chemother Nov 17 2008
WOODFORD N et al Carbapenemases of Chryseobacterium
(Flavobacterium) meningosepticum distribution of blaB and characterization of a
novel Metalo-beta-lactamase gene blaB3 in the type strain NCTC 10016
Antimicrob Agents Chemother Jun44(6)1448-52 2000
WOODFORF N Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in
India Pakistan and the UK a molecular biological and epidemiological study The
Lancet Infectious Diseases v 10 n 9 p 597-602 2010
66
WOODFORD et al Outbreak of Klebsiella pneumoniae Producing a New
Carbapenem- Hydrolyzing Class A β-Lactamase KPC-3 in a New York Medical
Center Antimicrobial agents and chemotherapy Dec 2004 p 4793ndash4799 Vol 48
No 12
YAGI T et al A preliminary survey of extended-spectrum β-lactamases
(ESBLs) in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Japan
FEMS Microbiology Letters 184 (2000) 53-56
YIGIT H et al Novel carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase KPC-1 from
a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumonia J Antimicrob Agents
Chemother 45 (4) 1151-1161 (2001)
ZAVASCKI A P et al KPC-2- producing Enterobacter cloacae in two cities
from Southern Brazil Int J Antimicrob Agents Apr 28 2009
ZHANEL G G et al Comparative review of the carbapenecircmicos Drugs
67(7)1027-52 2007
67
ANEXOS
Sequumlecircncia do oligo blaKPC
Query 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
Query 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
Query 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
68
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
Query 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
Query 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
69
Query 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
Query 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
Query 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
70
Sbjct 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
Query 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
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|||||||
Sbjct 481
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ATTTGTT 540
Query 541
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GCGATAC 600
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Sbjct 541
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GCGATAC 600
Query 601
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71
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Sbjct 601
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ATGCGCG 660
Query 661
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GCTCTGC 720
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 661
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GCTCTGC 720
Query 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
72
Query 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
Query 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
Query 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
73
Sbjct 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
Query 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
Query 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
Query 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
74
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Sbjct 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
Query 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
Query 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
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Sbjct 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
75
Query 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Sbjct 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
Query 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
||||
Sbjct 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
LOCUS AF297554 1377 bp
DNA linear BCT 26-MAR-2001
DEFINITION Klebsiella pneumoniae carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
gene complete cds
ACCESSION AF297554
VERSION AF2975541 GI10121874
76
KEYWORDS
SOURCE Klebsiella pneumoniae
ORGANISM Klebsiella pneumoniae
Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Enterobacteriaceae Klebsiella
REFERENCE 1 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH QueenanAM
AndersonGJ Domenech-SanchezA
BiddleJW StewardCD
AlbertiS BushK and TenoverFC
TITLE Novel carbapenem-hydrolyzing beta-
lactamase KPC-1 from a
carbapenem-resistant strain of
Klebsiella pneumoniae
JOURNAL Antimicrob Agents Chemother 45 (4)
1151-1161 (2001)
PUBMED 11257029
REFERENCE 2 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH AndersonGJ and
TenoverFC
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (19-AUG-2000) Nosocomial
Pathogens Laboratory Branch
Centers for Disease Control and
Prevention 1600 Clifton Rd MS
G08 Atlanta GA 30333 USA
FEATURES LocationQualifiers
77
source 11377
organism=Klebsiella
pneumoniae
mol_type=genomic DNA
db_xref=taxon573
-35_signal 5560
-10_signal 7883
mRNA 921012
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
RBS 117122
CDS 1311012
note=blaKPC-1
codon_start=1
transl_table=11
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
protein_id=AAG134101
db_xref=GI10121875
translation=MSLYRRLVLLSCLSWPLAGFSATALTNLVAEPFAKLEQD
FGGSI
GVYAMDTGSGATVSYRAEERFPLCSSFKGFLAAAVLARSQQQAGLLDTPIRYG
KNALV
PWSPISEKYLTTGMTVAELSAAAVQYSDNAAANLLLKELGGPAGLTAFMRSIG
DTTFR
78
LDRWELELNSAIPSDARDTSSPRAVTESLQKLTLGSALAAPQRQQFVDWLKGN
TTGNH
RIRAAVPADWAVGDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTRAPNKDDK
HSEAV
IAAAARLALEGLGVNGQ
ORIGIN
1 cggggcagtt acagccgtta cagcctctgg
agagggagcg gcttgccgct cggtgataat
61 cccagctgta gcggcctgat tacatccggc
cgctacacct agctccacct tcaaacaagg
121 aatatcgttg atgtcactgt atcgccgtct
agttctgctg tcttgtctct catggccgct
181 ggctggcttt tctgccaccg cgctgaccaa
cctcgtcgcg gaaccattcg ctaaactcga
241 acaggacttt ggcggctcca tcggtgtgta
cgcgatggat accggctcag gcgcaactgt
301 aagttaccgc gctgaggagc gcttcccact
gtgcagctca ttcaagggct ttcttgctgc
361 cgctgtgctg gctcgcagcc agcagcaggc
cggcttgctg gacacaccca tccgttacgg
421 caaaaatgcg ctggttccgt ggtcacccat
ctcggaaaaa tatctgacaa caggcatgac
481 ggtggcggag ctgtccgcgg ccgccgtgca
atacagtgat aacgccgccg ccaatttgtt
541 gctgaaggag ttgggcggcc cggccgggct
gacggccttc atgcgctcta tcggcgatac
79
601 cacgttccgt ctggaccgct gggagctgga
gctgaactcc gccatcccaa gcgatgcgcg
661 cgatacctca tcgccgcgcg ccgtgacgga
aagcttacaa aaactgacac tgggctctgc
721 actggctgcg ccgcagcggc agcagtttgt
tgattggcta aagggaaaca cgaccggcaa
781 ccaccgcatc cgcgcggcgg tgccggcaga
ctgggcagtc ggagacaaaa ccggaacctg
841 cggagtgtat ggcacggcaa atgactatgc
cgtcgtctgg cccactgggc gcgcacctat
901 tgtgttggcc gtctacaccc gggcgcctaa
caaggatgac aagcacagcg aggccgtcat
961 cgccgctgcg gctagactcg cgctcgaggg
attgggcgtc aacgggcagt aaggctctga
1021 aaatcatcta ttggcccacc accgccgccc
ttgcgggcgg catggattac caaccactgt
1081 cacatttagg ctaggagtct gcgcggcaga
gccgtgtgac cggttttctg tagagcactg
1141 acgatggcgg cggcgctctc tgcaattggc
aaggcgtcgg cgccaaggat accaatcttg
1201 cggcgcgcgg cgtgttatga cgactggggt
gcatttgagc cgccccattt aaccttcgcc
1261 ctcacagata cgccattcgc ctcaaattta
gcgccatgca gacgagcttc cactcggctt
1321 gcaccttgtc caggcccctc atgctgaact
gacgcaatcc catcaccgcc ttgatca
80
23
Os mecanismos de resistecircncia que podem impedir a accedilatildeo de antimicrobianos
satildeo vaacuterios O faacutermaco atua de forma a inibir os processos essenciais a multiplicaccedilatildeo
e sobrevivecircncia da ceacutelula bacteriana como a membrana citoplasmaacutetica e
consequumlentemente bloqueando a siacutentese proteacuteica de aacutecidos nucleacuteicos e da parede
celular A resistecircncia bacteriana eacute um mecanismo natural de defesa Sendo assim
as bacteacuterias estatildeo em constante defesa e para cada novo faacutermaco desenvolvido as
bacteacuterias iratildeo desenvolver resistecircncia em algum momento (POSSEBON et al
2003)
O grupo de antibioacuteticos beta-lactacircmicos satildeo amplamente utilizado e se
encontram dentro da classe dos melhores agentes antimicrobianos com relevacircncia
cliacutenica No entanto o seu uso tem sido restringido devido a vaacuterios mecanismos de
resistecircncia O desenvolvimento dos carbapenecircmicos surgiu devido agrave proliferaccedilatildeo de
beta-lactamases mediadas por plasmiacutedeos e cromossomos (POSSEBON et al
2003)
A bacteacuteria KPC tem um gene chamado SHV-1 que tem a caracteriacutestica de
resistecircncia a quase todos os tipos de antimicrobianos inclusive os carbapenecircmicos
especiacuteficos para o tratamento de infecccedilotildees por bacteacuterias multiresistentes e
emergecircncias Mesmo com no seu coacutedigo geneacutetico a informaccedilatildeo necessaacuteria para o
desenvolvimento da resistecircncia a resistecircncia da bacteacuteria soacute eacute desenvolvida caso a
bacteacuteria entre em contato com o antibacteriano desencadeando todo o processo
nos casos de resistecircncia induzida comuns em KPC (MOREIRA et al 2014)
A resistecircncia bacteriana pode ser apresentada de forma intriacutenseca ou
adquirida A resistecircncia intriacutenseca faz parte das caracteriacutesticas fenotiacutepicas naturais
do microrganismo ou seja faz parte de sua heranccedila geneacutetica sendo transmitida
verticalmente a prole sem perda da caracteriacutestica A presenccedila ou ausecircncia do alvo
para a accedilatildeo da droga eacute o principal determinante deste tipo de resistecircncia
(MOREIRA et al 2014) Essa resistecircncia corresponde a uma caracteriacutestica de
espeacutecie bacteriana quando estes microrganismos satildeo naturalmente resistentes a
certo tipo de antibioacutetico Este processo eacute decorrente da ausecircncia de estruturas de
atuaccedilatildeo de antimicrobianos ou a impermeabilidade por parte de estruturas
perifeacutericas das bacteacuterias (HENRIQUE et al 2014)
24
A resistecircncia adquirida aos antibioacuteticos por sua vez ocorre quando haacute uma
da mutaccedilatildeo de genes reguladores ou estruturais aquisiccedilatildeo de genes de resistecircncia
veiculados por elementos geneacuteticos moacuteveis ou da combinaccedilatildeo entre eles Este
aparecimento de resistecircncia em uma espeacutecie bacteriana era anteriormente sensiacutevel
a droga e devido a um destes fatores se torna resistente O fenoacutetipo resultante
desta resistecircncia natildeo estaraacute presente nas ceacutelulas genitoras e sim nos indiviacuteduos de
uma linhagem bacteriana derivada de um organismo susceptiacutevel Os genes muitas
vezes satildeo adquiridos por meio de elementos moacuteveis como plasmiacutedeos e
transposons (MOREIRA et al 2014)
Entatildeo a resistecircncia adquirida ocorre por diversos mecanismos geneacuteticos tais
como produccedilatildeo de enzimas inativadoras interferecircncia com a entrada e acuacutemulo de
droga na bacteacuteria alteraccedilatildeo do receptor para accedilatildeo da droga via metaboacutelica
alternativa Eacute originada por meio de uma alteraccedilatildeo a niacutevel geneacutetico da ceacutelula de
natureza cromossocircmica pelos processos de mutaccedilatildeo transduccedilatildeo e transformaccedilatildeo
ou extra cromossocircmica (plasmidial) (HENRIQUE et al 2014)
Como todo antibioacutetico β-lactacircmicoos carbapenecircmicos tem como mecanismo
de accedilatildeo a inibiccedilatildeo da siacutentese proteacuteica atraveacutes da accedilatildeo de inibiccedilatildeo da parede
microbiana fazendo a ligaccedilatildeo e inativaccedilatildeo das proteiacutenas ligadoras de penicilinas
(NETO et al 2007)
Imipenem e meropenem antibioacuteticos pertencentes ao grupo dos
carbapenecircmicos possuem um amplo espectro de accedilatildeo in vitro incluindo atividade
contra cocos gram-positivos bacilos gram-negativos e bacteacuterias anaeroacutebias (MOHR
2008) Jaacute o ertapenem possui um espectro de accedilatildeo mais limitado que o os dois
antibioacuteticos anteriormente citados tendo uma eficiecircncia limitada contra os bacilos
gram-negativos natildeo fermentadores Um novo antibioacutetico carbapenecircmico ainda natildeo
disponiacutevel no Brasil doripenem possui uma atividade mais potente principalmente
contra Pseudomona aeruginosa devido ao seu mecanismo de accedilatildeo que combina os
espectros de accedilatildeo de imipenem e meropenem (ZHANEL et al 2007)
Devido as suas estabilidades espectro de accedilatildeo poucos relatos de
resistecircncia boa toleracircncia pelos pacientes com efeitos adversos mais comuns as
complicaccedilotildees no siacutetio da infusatildeo e toxicidade gastrintestinal estes antibioacuteticos
carbapenecircmicos tecircm sido considerados terapia de escolha (NICOLAU 2008) Como
25
uma resposta adaptativa das Enterobacteacuterias o iacutendice de resistecircncia aos
carbapenecircmicos tem aumentado nos uacuteltimos anos de forma proporcional ao seu
uso limitando imensamente as opccedilotildees terapecircuticas para as infecccedilotildees causadas por
estes microrganismos (FALAGAS et al 2009)
As enzimas produtoras de betalactamases hidrolisam o anel betalactacircmico
tornando este mecanismo de resistecircncia o mais importante Os dois grupos mais
preocupantes satildeo o grupo das betalactamases de aspecto ampliado e os da
carbapenemases que aleacutem de hidrolizar os carbapenecircmicos hidrolizam todas as
outras classes de betalactacircmicos Em enterobacteacuterias as carbapenemases mais
prevalentes satildeo codificadas por genes dos grupos blaKpc blaIMP blaVIM blaNdm
e blaOxa A ocorrecircncia de carbapenemases eacute mais frequentemente em bacteacuterias
gram-negativas fermentadoras da glicose conhecidas como enterobacteacuterias
predominantes nos gecircneros Klebsiella Serratia Citrobacter Enterobacter
Escherichia Samonella Proteus Morganella Podem ser encontradas tambeacutem em
bacteacuterias gram-negativas natildeo fermentadoras como espeacutecies de Acinetobacter e de
Pseudomonas (ALVES et al 2013)
Carbapenemases satildeo enzimas plasmiacutedio-mediados resistentes a todos
antibioacuteticos betalactacircmicos As bacteacuterias que possuem o gene blaKpC responsaacutevel
pela codificaccedilatildeo da produccedilatildeo de carbapenemases apresentam resistecircncia aos
antibioacuteticos betalactacircmicos impedindo a accedilatildeo destes antibioacuteticos contra infecccedilotildees
(ALVES et al 2013)
A transmissatildeo das carbapenemases a diferentes cepas de enterobacteacuterias se
daacute atraveacutes de plasmiacutedeos que satildeo pequenas moleacuteculas circulares de DNA com a
capacidade de se replicarem independentemente do DNA cromossocircmico
permitindo a troca de material geneacutetico entre gecircneros e espeacutecies diferentes de
enterobacteacuterias O raacutepido desenvolvimento de surtos em ambientes hospitalares eacute
explicado por essa disseminaccedilatildeo plasmidial (COTRIM et al 2012)
De acordo com o criteacuterio de interpretaccedilatildeo do Clinical and Laboratory
Standards Institute (CLSI 2009) a maioria das KPC isoladas natildeo apresenta
resistecircncia completa aos carbapenecircmicos (Imipenem e Meropenem apresentam
uma Concentraccedilatildeo Inibitoacuteria Miacutenima (CIM) de 2-8 μgmL) (COTRIM et al 2012)
26
Os mecanismos de resistecircncia capazes de impedir a accedilatildeo dos
carbapenecircmicos satildeo vaacuterios Poreacutem a degradaccedilatildeo de antibioacuteticos por enzimas
principalmente as carbapenemases constituem o principal mecanismo de
resistecircncia aos antibioacuteticos β-lactacircmicos (DIAS 2009) Devido a ampla atividade
hidroliacutetica agrave maioria dos antibioacuteticos β-lactacircmicos estes grupos de enzimas possuem
alta versatilidade (QUEENAM et al 2007)
Existem trecircs grandes classes moleculares de Ambler a qual as
carbapenemases pertencem denominadas classe A (serino-carbapenemases os
quais incluem membros designados SME IMI NMC GES e a famiacutelia das KPCs)
classe B(as metalo-β-lactamase incluem os tipos IMP e VIM) e classe D
(oxacilinases similares as da classe A e incluem as OXA e PSE) (DIAS 2009)
Dentre estes as mais importantes e prevalentes encontradas em plasmiacutedeos
de Klebsiella pneumoniae satildeo as KPC (DIENSTMANN et al 2010) Por meio de
estudos moleculares a enzima KPC jaacute foi documentada em diferentes bacteacuterias e
diferenciada em KPC-1 a 13 (NETIKUL et al 2011) No ano de 2009 foi realizada
uma pesquisa onde descreveram as seguintes carbapenemases KPC-1 em isolados
de Klebsiella pneumoniae KPC-2 em K pneumoniae K oxytoca Salmonella
enterica e em Enterobacter sp e KPC-3 em K pneumoniae e Enterobacter cloacae
(MONTEIRO et al 2009) As enzimas KPC-4 e KPC-5 foram encontradas em
isolados de Pseudomonas aeruginosa (PEIRANO et al 2009)
Foi observada uma correccedilatildeo da sequumlecircncia KPC-1 indicando que o gene
blaKPC-1 e blaKPC-2 satildeo idecircnticos Trecircs novas variantes blaKPC-3 blaKPC-4 e
blaKPC-5 satildeo resultados de mutaccedilotildees do gene estrutural da enzima KPC-2
(WOLTER et al 2008) apresentando diferentes perfis de hidroacutelise As enzimas
KPC-2 e KPC-3 possuem alta eficiecircncia em hidrolisar cefalotina cefaloridina e
nitrocefin poreacutem possuem uma menor eficiecircncia contra carbapenecircmicos e
cefotaxima (ALBA et al 2005) As enzimas KPC-5 e KPC-4 apresentam menor
hidroacutelise de carbapenecircmicos eacute do que em KPC-2 Em contrapartida possuem
melhor eficiecircncia contra ceftazidima e uma maior inibiccedilatildeo pelo aacutecido clavulacircnico
(WOLTER et al 2008)
27
13 Anaacutelise geneacutetica de microrganismos
Eacute de extrema importacircncia praacutetica natildeo soacute no aspecto cliacutenico mas tambeacutem na
fitopatologia biotecnologia e estudos ambientais a correta identificaccedilatildeo e
classificaccedilatildeo de microrganismos Os meacutetodos usados na diferenciaccedilatildeo de gecircneros
espeacutecies e estirpes de microrganismos podem ser divididos em meacutetodos fenotiacutepicos
(baseados em fenocircmenos bioquiacutemicos fisioloacutegicos e bioloacutegicos) e genotiacutepicos
(detectam polimorfismos ao niacutevel dos aacutecidos nucleacuteicos ou variaccedilatildeo aleacutelica ao niacutevel
de enzimas) (ALVES et al 2003)
Para este tipo de estudo existem alguns meacutetodos como o RFLPrsquos -
ldquoRestriction Fragment Length Polymorphismsrdquo (polimorfismos de tamanho de
fragmentos de restriccedilatildeo) rep-PCR (Meacutetodo de tipagem baseado na amplificaccedilatildeo via
PCR de elementos de DNA repetitivos presentes em genomas bacterianos) anaacutelise
de sequumlecircncias nucleotiacutedeas (discriminaccedilatildeo eou identificaccedilatildeo atraveacutes de sequumlecircncias
de DNA) PFGE - Pulsed-Field Gel Electrophoresis (Eletroforese em campo
pulsado) ( A L V E S et al 2003)
A diferenciaccedilatildeo clara da cepa e principalmente a alta reprodutibilidade devem
ser caracteriacutesticas de qualquer meacutetodo de tipagem geneacutetica Poreacutem nem todos os
meacutetodos moleculares de tipagem satildeo igualmente eficazes Sendo assim de acordo
com a finalidade pretendida (identificaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo custo reprodutibilidade
etc) eacute feita a escolha do meacutetodo a ser aplicado (A L V E S et al 2003)
O processo de identificaccedilatildeo fenotiacutepica de KPC entre os membros da famiacutelia
Enterobacteriaceae ainda eacute difiacutecil e os meacutetodos para a sua identificaccedilatildeo devem ser
revistos e ajustados Mesmo com o avanccedilo tecnoloacutegico natildeo existem ensaios que
combinam alta especificidade e sensibilidade na detecccedilatildeo destas enzimas Satildeo
diversas as metodologias usadas para rastreamento de KPC como por exemplo a
focalizaccedilatildeo isoeleacutetrica a teacutecnica de disco-difusatildeo E-test teste de Hodge
modificado dentre outros Aleacutem disso a pesquisa do gene blaKPC pode ser feita
pela Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) Os sistemas de automaccedilatildeo
existentes no entanto podem natildeo identificar com precisatildeo os isolados KPC
positivos (COTRIM et al 2012)
A identificaccedilatildeo blaKPC pelo PCR eacute um meacutetodo raacutepido preciso sensiacutevel e
altamente especiacutefico no entanto a PCR exige equipamento e conhecimentos
28
especializados em diagnoacutestico molecular dificultando ainda a utilizaccedilatildeo dele na
rotina dos laboratoacuterios de microbiologia (COTRIM et al 2012)
Em estudo de infecccedilotildees hospitalares identificaccedilatildeo molecular de patoacutegenos
bacterianos eacute bastante utilizada Para diferenciar carbapenemases tipo KPC a partir
de outros tipos como SME NMC-A-IMI e GES eacute necessaacuterio um exame molecular
As identificaccedilotildees do microrganismo juntamente com a triagem molecular iratildeo definir
um resultado mais especiacutefico podendo ser usado para identificar o antibioacutetico mais
adequado para o tratamento Poreacutem a principal desvantagem de alguns exames
baseados em PCR por exemplo eacute que devido agrave sua limitada capacidade de
multiplexaccedilatildeo eles distinguem apenas algumas variaccedilotildees (MOREIRA et al 2014)
Estatildeo descritas para a identificaccedilatildeo molecular de patoacutegenos pertencentes agrave
famiacutelia Enterobacteriaceae as teacutecnicas de PFGE RAPD (randomly amplified
polymorphic DNA) e ERIC-PCR (Enterobacterial Repet it ive Intergenic Consensus)
A PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) eacute considerada padratildeo ouro devido sua
alta capacidade de diferenciaccedilatildeo baseada na anaacutelise do perfil de restriccedilatildeo do DNA
genocircmico por meio de eletroforese Como desvantagem para a sua execuccedilatildeo eacute
necessaacuterios vaacuterios dias impedindo a tipagem de algumas cepas bacterianas devido
agrave degradaccedilatildeo do DNA aleacutem do alto custo empregado (MOREIRA et al 2014)
O meacutetodo baseado em ERIC-PCR tem sido bastante utilizado como uma
alternativa para a teacutecnica de PFGE Esta teacutecnica consiste na anaacutelise do padratildeo de
amplificaccedilatildeo de elementos repetidos encontrados no genoma bacteriano Isto
permite uma maior rapidez na obtenccedilatildeo de resultados quando comparada com o
PFGE aleacutem de alta reprodutibilidade simples execuccedilatildeo e implementaccedilatildeo baixo
custo e natildeo sem problemas com a degradaccedilatildeo do DNA (MOREIRA et al 2014)
A PCR eacute considerada uma teacutecnica de biologia molecular revolucionaacuteria que
consiste na siacutentese enzimaacutetica de coacutepias de aacutecidos nucleacuteicos Ela permitiu o raacutepido
desenvolvimento do estudo de sequumlecircncias de aacutecidos nucleacuteico Foi desenvolvida por
Kary Banks Mullis que ganhou o precircmio Nobel de quiacutemica de 1993 devido ao
desenvolvimento dessa teacutecnica em abril de 1983 (CAMARGO et al 2014)
Por meio de etapas de variaccedilatildeo de temperatura a teacutecnica de PCR promove a
duplicaccedilatildeo de cadeias de DNA in vitro A reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo de DNA por PCR
envolve o emprego de sequumlecircncias iniciadoras (primers) quatro nucleotiacutedeos
29
(dNTPrsquos) do DNA e uma DNA polimerase termoestaacutevel podendo assim obter-se a
partir de uma fita molde muitas coacutepias de uma sequumlecircncia especiacutefica de aacutecido
nucleacuteico O princiacutepio da PCR consiste na variaccedilatildeo de temperatura por ciclo
envolvendo trecircs etapas baacutesicas desnaturaccedilatildeo pareamento e amplificaccedilatildeo
(CAMARGO et al 2014)
A desnaturaccedilatildeo da fita molde de DNA eacute uma etapa com duraccedilatildeo entre 30
segundos a 1 minuto a temperatura entre 92 ordmC a 96 ordmC Apoacutes isso o pareamento de
dois iniciadores sinteacuteticos de composiccedilotildees distintas que funcionam como os
iniciadores da reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo liga-se agrave regiatildeo complementar da fita de
DNA alvo que sofreraacute a duplicaccedilatildeo Esta etapa tem duraccedilatildeo de 30 segundos a 1
minuto a temperatura entre 58 ordmC e 65 ordmC Por uacuteltimo a amplificaccedilatildeo por meio da
enzima Taq DNA polimerase das novas fitas de DNA se daacute a partir de cada um dos
iniciadores utilizando os quatro dNTPrsquos como substrato da reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo
Esta etapa possui duraccedilatildeo entre 45 segundos e 1 minuto a 72 ordmC Cada ciclo eacute
repetido em torno de 30 a 35 vezes e promove a amplificaccedilatildeo da regiatildeo alvo
determinada conforme o anelamento dos iniciadores sinteacuteticos de DNA (CAMARGO
et al 2014) Estas etapas estatildeo demonstradas na figura 4
Figura 4 Etapas da Reaccedilatildeo de PCR
30
2 JUSTIFICATIVA
No ano de 2010 no Distrito Federal foram identificados 111 pacientes com
suspeita de infecccedilatildeo por Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) e a
Secretaria de Sauacutede do Distrito Federal confirmaram ainda a morte de 18 pacientes
dentre os hospitais puacuteblicos e particulares Um desafio encontrado por ocasiatildeo do
surto infeccioso no Distrito Federal foi o de confirmar as KPCs por Reaccedilatildeo da
Polimerase em Cadeia sendo que as amostras foram enviadas com esta finalidade
para a Fiocruz no Rio de Janeiro
Pesquisas que possam contribuir na elaboraccedilatildeo de estrateacutegias preventivas e
de intervenccedilatildeo para infecccedilotildees causadas por enterobacteacuterias bem como contribuir
para gerar uma integraccedilatildeo beneacutefica entre a equipe acadecircmica e os serviccedilos de
sauacutede devem ser estimuladas Neste sentido o presente estudo permitiu escrutinar
os genes envolvidos na expressatildeo de carbapenemases presentes em espeacutecies de
enterobacteacuterias isoladas em ambiente hospitalar visto que elucidar genes de
resistecircncia de enterobacteacuterias aos antibioacuteticos carbapenecircmicos eacute o primeiro passo
para garantir um controle epidemioloacutegico efetivo para estes tipos de microorganismo
assim como sua associaccedilatildeo com surtos fatais particularmente em pacientes com
baixa imunidade
31
3 OBJETIVOS
31 Objetivo geral Caracterizar os genes de resistecircncia das
Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases e os aspectos epidemioloacutegicos de
pacientes internados em um hospital puacuteblico do Distrito Federal
32 Objetivos Especiacuteficos
Identificar genotipicamente a enzima KPC (Klebsiella pneumoniae
carbapenemase) de isolados de Klebsiella pneumoniae
Investigar aspectos epidemioloacutegicos dos pacientes portadores de
Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases
Identificar quais variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana influenciaram para o
desfecho oacutebito ou alta
Avaliar a susceptibilidade das Enterobacteacuterias aos antibioacuteticos
carbapenecircmicos dos pacientes em ambiente hospitalar
32
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
Trata-se de um estudo transversal onde foi realizado o teste de
susceptibilidade das enterobacteacuterias aos antibioacuteticos carbapenecircmicos a partir dos
materiais bioloacutegicos coletados dos pacientes internados no Hospital Regional da Asa
Norte (HRAN) e enviados ao Laboratoacuterio de Anaacutelises Cliacutenicas da mesma Instituiccedilatildeo
Os materiais bioloacutegicos investigados foram sangue aspirado traqueal ou brocircnquico
urina e cultura semi quantitativa de ponta de cateter venoso central O HRAN eacute um
hospital puacuteblico do Distrito Federal com 395 leitos sendo as cliacutenicas de internaccedilatildeo
Berccedilaacuterio Cirurgia Geral Cirurgia Plaacutestica Cliacutenica Meacutedica Ginecologia Maternidade
Pediatria Queimados UTI com atendimento a pacientes portadores de doenccedilas de
caraacuteter cliacutenico e ciruacutergico
4 1 Coleta e transporte das amostras bioloacutegicas
As amostras foram coletadas de pacientes internados no Hospital Regional da
Asa Norte (HRAN) com suspeitas de infecccedilatildeo por KPC A identificaccedilatildeo primaacuteria foi
realizada pelo Laboratoacuterio de Microbiologia do hospital de origem dos pacientes e os
demais procedimentos que foram utilizados na identificaccedilatildeo encontram-se descritos
abaixo
4 2 Procedimentos para confirmaccedilatildeo de resistecircncia bacteriana por
disco de ertapenem (adaptado CDC 2004)
Para diagnosticar amostra como portadora de bacteacuteria produtora de
carbapenemase foi realizado o teste com disco de ertapenem como forma de
triagem Inicialmente utilizou-se o swab contaminado com a amostra que foi
distribuiacuteda em uma pequena aacuterea da placa de aacutegar MacConkey para apoacutes o
crescimento ser realizada a pesquisa de colonizaccedilatildeo por enterobacteacuterias resistentes
aos carbapenecircmicos (Pesquisa de CRE) Procedeu-se a semeadura por teacutecnica
semi-quantitativaesgotamento com alccedila bacterioloacutegica na diluiccedilatildeo de 1100 O disco
de Ertapenem foi colocado na superfiacutecie da placa de MacConkey na junccedilatildeo dos dois
primeiros campos de semeadura conforme demonstrado na figura 5 Incubou a placa
33
em estufa aeroacutebia a 35ordmC por 24 e 48 horas e observou-se o halo de difusatildeo do
disco de Ertapenem na placa para proceder agrave leitura
O teste deixou de ser obrigatoacuterio apoacutes a modificaccedilatildeo dos criteacuterios
interpretativos para carbapenecircmicos para enterobacteacuterias publicados no suplemento
do CLSI 2010 M100-S20-U
Figura 5 Mecanismo de semeamento de material bioloacutegico oriundos de
pacientes com suspeita de infecccedilatildeo por KPC Fonte adaptado CDC 2004
4 2 1 Interpretaccedilatildeo dos resultados
Na ausecircncia de crescimento ateacute 24 horas (MacConkey) ou halo de difusatildeo
gt27 mm na placa deve-se reincubar as placas por mais 24 horas Quando for
ausente o crescimento apoacutes 48 horas ou halo de difusatildeo gt27 mm na placa libera-se
como enterobacteacuterias resistentes a carbapenecircmicos (KPCNEG)Havendo
crescimento de colocircnias na placa de MacConkey com halo lt 27 mm (apenas para
colocircnias com crescimento dentro do halo) deve-se reisolar e realizar identificaccedilatildeo e
antibiograma automatizado teste de sensibilidade por disco-difusatildeo e Teste de
Hodge Modificado (THM) Os isolados de enterobacteacuterias cujos testes comprovarem
a resistecircncia aos carbapanecircmicos testados (KPCPOS) foram reportado a Comissatildeo
de Controle de Infecccedilatildeo Hospitalar (CCIH) Jaacute osbacilos Gram-negativos natildeo
fermentadores natildeo foram reportados (KPCNEG) Para interpretaccedilatildeodos resultados
foram utilizados os valores conforme demonstrados na tabela 1
Tabela 1 Criteacuterios Interpretativos para testes de sensibilidade
ENTEROBACTEacuteRIAS
Disco difusatildeo (mm) MIC (microgml)
34
Antibioacutetico Sigla S I R S I R
Ertapenem 10
microg
ETP 22 19-
21
18 05 1 2
Meropenem 10
microg
MEM 23 20-
22
19 1 2 4
Fonte Manual Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)
2013
Os resultados que apresentaram resistecircncia ao antibioacutetico Ertapenem foram
considerados como suspeitos de contaminaccedilatildeo por KPC Fez-se o teste de
susceptibilidade aos antibioacuteticos (TSA) em aparelho automatizado MicroScan Walk
Away 96sl Dade Behring
4 3 Teste de susceptibilidade aos antibioacuteticos (adaptado CDC 2004)
A determinaccedilatildeo da susceptibilidade dos isolados foi feita pelo teste de
susceptibilidade aos antibioacuteticos (TSA) apoacutes cultura em meio de gelose simples
(INSA) para avaliaccedilatildeo da sua pureza e obtenccedilatildeo de colocircnias isoladas Para
preparaccedilatildeo de uma suspensatildeo bacteriana com turvaccedilatildeo aproximada de 05
McFarland (Dade BehringMicroScanregTurbidity Meter) ressuspendeu duas a cinco
colocircnias em 2ml de soro fisioloacutegico esteacuteril diluindo a 1100 em soro fisioloacutegico num
volume total de 10ml em seguida foi feita uma semeadura em duas placas
quadradas (120mm x 120mm) de Muller-Hinton Agar (INSA) por inundaccedilatildeo
Os discos de antibioacutetico carbapenecircmicos imipenem meropenem e
ertapenem (Biorad) foram aplicados com o auxiacutelio de um dispensador automaacutetico A
susceptibilidade das Enterobacteacuterias aos carbapenecircmicos foi definida de acordo
com o protocolo Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI 2011)
Para aquelas Enterobacteacuterias que apresentaram resistecircncia ao ertapenem
foram realizados o Teste de Hodge Modificado para Detecccedilatildeo de Enterobacteacuterias
Produtoras de Carbapenemases conforme descrito pelo Centers for Disease Control
and Prevention (CDC 2004)
35
4 4Teste de Hodge Modificado (THM) (adaptado CDC 2004)
Preparou-se uma suspensatildeo em salina esteacuteril com a cepa Escherichia coli
ATCC 25922 (padratildeo 05 de McFarland) Apoacutes isto diluiu a suspensatildeo 110 em
salina (05 ml da soluccedilatildeo de Ecoli ATCC 25922 + 45 ml salina)Foi entatildeo semeado
na superfiacutecie de uma placa de Agar Muller-Hinton com a suspensatildeo diluiacuteda de Ecoli
ATCC 25922 com auxilio de swab seco assegurando que houvesse uma
distribuiccedilatildeo uniforme cobrindo toda a superfiacutecie do Agar Deixou secar por 3 a 5
minutos em temperatura ambienteColocou-se o disco de ertapenem 10microg no centro
da placa e apoacutes isto fez-se uma estria linear da cepa a ser testada da borda do
disco ateacute a borda da placa utilizando uma alccedila calibrada 10 microl ou um swab Incubou
a placa na estufa em atmosfera aeroacutebia a 35 plusmn 2ordmC por 16 a 24 horas
441 Controle de qualidade (CQ)
Foi utilizado um CQ todos os dias em que se realizou o teste tendo como
controle Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1705- teste de Hodge modificado
positivo Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1706- teste de Hodge modificado
negativo
442 InterpretaccedilatildeoResultados
Apoacutes 16ndash24 horas de incubaccedilatildeo examinar as placas para verificar a presenccedila
de uma distorccedilatildeo no halo de inibiccedilatildeo do disco de ertapenem devido ao crescimento
realccedilado da cepa ATCC na intersecccedilatildeo do organismo teste e a Ecoli ATCC 25922
dentro dos limites do halo O THM positivo apresentaraacute presenccedila de distorccedilatildeo no
halo de inibiccedilatildeo de ertapenem devido ao crescimento da cepa Ecoli ATCC 25922 ao
longo da estria da cepa teste para dentro dos limites do halo de inibiccedilatildeo Jaacute o THM
negativo teraacute ausecircncia de crescimento da cepa Ecoli ATCC 5922 ao longo da estria
da cepa teste para dentro dos limites do halo de inibiccedilatildeo do disco de ertapenem
Este resultado estaacute representado na figura 6
36
Figura 6 Interpretaccedilatildeo resultado do Teste de Hodge Modificado
(adaptado CDC 2004) Teste positivo na estria da cepa teste na parte superior
da placa teste negativo na estria da cepa teste na parte inferior da placa
Tendo positivo como resultado o paciente era um provaacutevel contaminado por
KPC As amostras entatildeo foram encaminhadas para a Fundaccedilatildeo Osvaldo Cruz
(FIOCRUZ) para confirmaccedilatildeo final As amostras finalmente confirmadas como
positivas para KPC foram isoladas e guardadas no banco de cepas cliacutenicas do
hospital Apoacutes a autorizaccedilatildeo do CEP amostras das cepas foram transferidas para
meio de transporte Stuard em caixa teacutermica fechada em baixa temperatura e
levadas para o laboratoacuterio de microbiologia cliacutenica da universidade
No laboratoacuterio da universidade as amostras foram separadas e realizadas
repiques em meios MacConkey e incubadas por 24h As colocircnias caracteriacutesticas
foratildeo isoladas em caldo BHI e mantidas em shaker a 37oC por 2h Apoacutes isto foram
executadas as anaacutelises a seguir
Os isolados de Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases foram
submetidos agrave extraccedilatildeo de DNA e posterior sequumlenciamento para identificaccedilatildeo dos
genes de resistecircncia blaKPC de 1 a 13 e identificaccedilatildeo do gene universal Os
pacientes de onde os materiais bioloacutegicos contendo as Enterobacteacuterias produtoras
de carbapenemases foram os isolados foram investigados quanto aos aspectos
epidemioloacutegicos e cliacutenicos
37
4 5 Extraccedilatildeo de DNA bacteriano
A extraccedilatildeo de DNA bacteriano foi realizada utilizando o kit NucleoSpin
Plasmidreg (MN) Antes de iniciar a extraccedilatildeo foi feito a preparaccedilatildeo das soluccedilotildees
reagentes materiais e amostras (vortexando) colocou-se em banho-maria agrave 50ordmC o
tampatildeo AW Partiu-se de colocircnias isoladas cultivadas que sofreram passagem em
meio LB liacutequido por 12h Adicionou-se 15 mL da amostra no tubo eppendorf
centrifugou por 5 minutos descartou o sobrenadante (com cuidado para natildeo
descartar o Pellet) Repetiu-se este procedimento por mais trecircs vezes completando-
se o volume de 6mL Foram adicionados 250microL do tampatildeo Resuspension Buffer A1
encostando a ponteira no Pellet e misturando (este tampatildeo tem como funccedilatildeo
separar a formaccedilatildeo de grumos celulares) Apoacutes isso homogeneizou e vortexou os
tubos eppendorfs Apoacutes isso foram adicionados 250microL do tampatildeo Lysis Buffer A2
homogenizou e deixou descansar por 5 minutos (esta etapa eacute importante para a lise
da parede e da membrana celulares e liberaccedilatildeo do conteuacutedo da ceacutelula)
Passado o tempo de descanso foi adicionado 300microL do tampatildeo
Neutralization Buffer A3 homogeneizou e centrifugou por 10 minutos (este tampatildeo
iraacute retirar as proteiacutenas que envolvem o DNA e voltaraacute com o pH para proacuteximo de 8
impedindo que a soluccedilatildeo de lise facilite a quebra das ligaccedilotildees covalentes do aacutecido
nucleacuteico) Em seguida enumeraram-se os tubos contendo filtros com siacutelica
transferiu-se o sobrenadante para o filtro e centrifugou por 5 minutos Descartou-se
o que foi filtrado adicionou 500microL do tampatildeo AW (banho-maria) centrifugou por 2
minutos Novamente foi descartado o filtrado Adicionou-se 600microL do tampatildeo A4
centrifugou por 2 minutos e descartou o filtrado (os tampotildees AW e A4 contecircm
isotiocianato de guanidina em concentraccedilotildees crescentes para facilitar a adsorccedilatildeo
do DNA na siacutelica e retirada das outras biomoleacuteculas da amostra) Foi feita outra
centrifugaccedilatildeo com o tubo vazio Apoacutes isto o filtro foi trocado para outro eppendorf
definitivo onde foi adicionado 50microL do tampatildeo Elution Buffer AE (este tampatildeo
favorece a eluiccedilatildeo do DNA) centrifugou por 2 minutos descartou o filtro e
armazenou as amostras em freezer -20ordmC
38
4 6 Iniciadores e reaccedilatildeo de PCR
Os iniciadores universais para o gene blaKPC foram desenhados baseados
em sequumlecircncias conservadas apresentadas pelos sub-grupos de genes que
codificam a enzima carbapenemase de klebsiella pneumoniae (YIGIT et al 2001)
Baseado na sequumlecircncia para o blakpc-1 depositada no GenBank
(AF2975541) o oligonucleotiacutedio (oligo) iniciador direto (5-
ATGTCACTGTATCGCCGTC-3rsquo) foi desenhado para reconhecer a sequumlecircncia
blaKPC na posiccedilatildeo (131149) enquanto que o iniciador reverso (5-
TTACTGCCCGTTGACGCC-3rsquo) foi reconhecido na posiccedilatildeo (9951012) As anaacutelises
baseadas em alinhamento de sequumlecircncias mostraram que o par de iniciadores
blaKPC podem detectar os alelos de 1 a 13 do gene blaKPC conforme a tabela 2
Tabela 2 Nuacutemero de acesso ao GenBank dos alelos blaKPC e seus
microrganismos originais
Nuacutemero de
Acesso GenBank
Microrganismo Alvo
AF2975541 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-1
GU0862251 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-2
HQ2589341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-2-like
AB5577341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC -3
EU4473041 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-4
EU4002222 Pseudomonas
aeruginosa
blaKPC-5
EU5555341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-6
EU7297271 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-7
39
FJ2344121 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-8
FJ624872 Escherichia coli blaKPC-9
GQ1403481 Acinetobacter
baumannii
blaKPC-10
HM0669951 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-11
HQ3428891 Enterobacter cloacae blaKPC-12
HQ3428901 Enterobacter cloacae blaKPC-13
As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo de blaKPC foram realizadas em um
primeiro tempo de desnaturaccedilatildeo em que foi 94ordmC por 5 minutos seguido de 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 58 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 90 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 78ordmC por 8 minutos Aleacutem das amostras foi utilizado um
controle negativo
A PCR do blaKPC foi realizada utilizando os componentes para o volume da
reaccedilatildeo de 25 microL citados na tabela 3 A banda do tamanho do produto de PCR foi de
881 pares de bases (pb) o que corresponde ao plasmiacutedeo
Tabela 3 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do
gene blaKPC
Reagente Volume
DNA molde 4 microL
Tampatildeo Taq 25 microL
MgCl2 075 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP
2 microL
Oligo F 1 microL
Oligo R 1 microL
Taq DNA polimerase 05 microL
Aacutegua MiliQ 1335 microL
40
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
Baseado na sequumlecircncia para o gene 16S rRNA em que o oligonucleotiacutedio
Universal iniciador direto foward (5-CCAGCAGCCGCCGTAATACG-3rsquo) foi
desenhado para reconhecer a sequumlecircncia universal na posiccedilatildeo 1513 enquanto que o
iniciador reverso (5-ATCGGYTACCTTGTTACGACTTC-3rsquo) foi reconhecido na
posiccedilatildeo 1491 foram realizadas PCRrsquos As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo deste
gene foram realizadas nos seguinte tempos separaccedilatildeo 94ordmC por 10 minutos 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 55 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 120 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 72ordmC por 10 minutos
A PCR do gene 16S rRNA foi realizada utilizando os componentes para o
volume da reaccedilatildeo de 25microL citados na tabela 4 A banda do tamanho do produto de
PCR foi de 996 pb correspondente aacute regiatildeo ribossomal capaz de amplificar todas
as espeacutecies
Tabela 4Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do gene
universal
Reagente (quantidade
concentraccedilatildeo do estoque)
Volume
DNA molde 10 ng 4 microL
Tampatildeo Taq 10 x 25 microL
MgCl2 50mM 125 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP 25 mM
125 microL
Oligo F 10microM 05 microL
Oligo R 10microM 05 microL
Taq DNA polimerase 5UmicroL 04 microL
Aacutegua Miliq 146 microL
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
41
O termociclador utilizado para os experimentos foi o LifeTouch da BIOER
4 7 Digestatildeo
Para realizaccedilatildeo da digestatildeo foi utilizada a enzima BshF I (Hae III) EN- 1105
tamanho 7000 units concentraccedilatildeo 10 unitsmicroL fonte Bacillus sphaericus empresa
Jena bioscienceUtilizaram-se os componentes para o volume de 50microL da reaccedilatildeo
citados na tabela 5
Tabela 5 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da digestatildeo do gene
universal
Reagente Volume
Produto de PCR 10 microL
Enzima BshF I 01 microL
Tampatildeo (10x) 5 microL
Aacutegua Miliq 349 microL
Total (em cada ependorff) 50 microL
Valores para 1 digestatildeo
Os ependorffs foram colocados por 30 minutos em banho-maria a 37ordmC Apoacutes
isso fez-se a corrida das amostras em gel de agarose para verificaccedilatildeo do resultado
(LU et al 2000)
4 8 Eletroforese em gel de agarose
Os produtos de DNA PCR e digestatildeo foram analisados em gel de agarose
2 O tempo de corrida do gel eacute de aproximadamente 1hora e 30minutos sendo
que no comeccedilo foi usada agrave voltagem de 50 V e apoacutes comeccedilar a correr o gel
aumentou a voltagem para 100 v Utilizou-se o marcador de 100pb (pares de bases)
Foi adicionado 3microL de corante Bromophenol (que tem a funccedilatildeo de fazer uma ligaccedilatildeo
na amostra de DNA e permitir a visualizaccedilatildeo da corrida no gel de agarose) em 7microL
de amostra tanto de DNA quanto de PCR Para o preparo do gel foi utilizado TBE
42
(Tris- Aacutecido Boacuterico) agarose e brometo de etiacutedio (sua funccedilatildeo eacute de corante para o gel
e permitir a visualizaccedilatildeo do DNA quando colocado agrave luz ultravioleta) Para o oligo
blaKPC a banda da amplificaccedilatildeo foi em 881ppb correspondendo ao plasmiacutedeo Jaacute
o oligo Universal foi em 996 pb
4 9 Descarte de resiacuteduos
Todos os materiais utilizados nos ensaios foram de uso uacutenico e manipulados
em cacircmaras de seguranccedila bioloacutegica classe II Apoacutes o uso foram colocados em
soluccedilatildeo desinfetantes (hipoclorito a 1) e em seguida autoclavados a 127oC por 20
min em sacos apropriados para autoclavaccedilatildeo Apoacutes a finalizaccedilatildeo do ciclo de
esterilizaccedilatildeo os sacos contendo o material descartaacutevel foram colocados em
recipientes de coleta da empresa responsaacutevel pela coleta de materiais bioloacutegicos
produzidos no laboratoacuterio de microbiologia Todos os procedimentos seguiram a
normativa RDC-ANVISA 3062004 sobre o descarte de resiacuteduos de serviccedilo de
sauacutede
4 10 Aspectos epidemioloacutegicos e cliacutenicos
Os aspectos cliacutenicos e epidemioloacutegicos foram investigados por meio de
prontuaacuterios dos pacientes portadores de enterobacteacuterias produtoras de
carbapenemases e envolveram topografia mais provaacutevel do foco infeccioso a
enfermidade motivadora da internaccedilatildeo o desfecho cliacutenico a idade e o tempo de
internaccedilatildeo
4 12 Anaacutelises eepidemioloacutegicas
As anaacutelises foram realizadas com o pacote estatiacutestico SPSS versatildeo 200
Para verificar quais variaacuteveis referentes aos dados epidemioloacutegicos e
microbioloacutegicos influenciaram no desfecho verificou- se a diferenccedila meacutedia das
variaacuteveis idade e tempo de internaccedilatildeo em cada grupo O teste estatiacutestico utilizado foi
o teste t de Student apoacutes se executar o teste de normalidade de Shapiro-Wilk Para
as variaacuteveis sexo perfil microbioloacutegico das enterobacteacuterias produtoras de
43
carbapenemases foi avaliada a associaccedilatildeo com o desfecho por meio do teste Exato
de Fisher O niacutevel de significacircncia adotado foi de 5
4 13 Preceitos eacuteticos
Este projeto estaacute inserido em um projeto maior denominado ldquoEpidemiologia
cliacutenica e caracterizaccedilatildeo molecular do Acinetobacter Baumannii resistente a
antibioticoterapia em pacientes internado em hospitais do Sistema Uacutenico de Sauacutederdquo
que foi submetido ao Comitecirc de Eacutetica em Pesquisa da Secretaria do Estado de
Sauacutede do Distrito Federal (SESDF) e emitido parecer aprovado pelo protocolo nordm
23109 (anexo)
44
5 RESULTADOS
51 Anaacutelise molecular
Para a amplificaccedilatildeo com o oligo blaKPC foram amplificadas amostras
que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 881 pb correspondente ao
plasmiacutedeo A anaacutelise da amplificaccedilatildeo da regiatildeo do gene blaKPC mostrou que
apenas a amostra A10 natildeo amplificou isso demonstra que esta amostra natildeo
possuiacutea o gene de resistecircncia
5 1 1 Gene blaKPC
Figura 7 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 881 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
A amostra A3 natildeo amplificou no primeiro momento entatildeo foi realizado
novamente a PCR e corrida de gel obtendo entatildeo a amplificaccedilatildeo da amostra como
apresentado na figura 8
45
Figura 8 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC da
mostra A3 estudada A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo de 881
pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 1 2 Gene 16S rRNA
Para a amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA utilizou-se o oligo universal Foram
amplificadas amostras que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 996 pb
Figura 9 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
46
Segundo Lu et al (2000) a digestatildeo com a enzima HaeIII deste amplicons de
16S rRNA devolveriam bandas com perfis entre 150 a 200 pb No gel abaixo eacute
possiacutevel evidenciar que este perfil ocorreu com o predomiacutenio de bandas na altura
de 200pb
Figura 10 Gel de agarose a 2 da digestatildeo do amplicon do gene 16S
rRNA das amostras com a enzima HaeIII evidenciando diversos fragmentos
proacuteximos a 200 pb A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo ribossomal
de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 2 Anaacutelises epidemioloacutegicas
5 2 1 Sexo
No total foram detectados 17 isolados de KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 onde a maior a prevalecircncia foi
detecatada em amostras de pacientes do sexo masculino (53) do que no sexo
feminino (47)
47
Figura 11 Isolado de KPC segundo sexo dos 17 pacientes investigados
no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 2 Desfecho cliacutenico
Em 17 isolados de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo
de 2010 aacute 2011 a porcentagem de pacientes que foram a oacutebito (59) foi maior que
a de pacientes que tiverm alta (41)
Figura 12 Isolado de KPC segundo desfecho cliacutenico dos 17 pacientes
investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
48
5 2 3 Local da coleta
Dos 17 episoacutedios detectados de infecccedilatildeo por KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 a infecccedilatildeo em swab retalfoi mais
frequente (47) seguida de ponta de cateacuteter (18) e secreccedilatildeo traqueal (12)
Figura 13 Isolados de KPC segundo local da coleta da amostra nos 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 4 Microorganismo
O microorganismo mais encontrado foi a Klebsiella pneumoniae (82)
seguida da Enterobacter clocae (12) e Serratia marcescens (6) dos 17 isolados
de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 Isto afirma o
fato de a sigla KPC ser utilizada de forma errocircnea aacute Klebsiella pneumoniae visto
que a evidecircncia dela eacute maior em relaccedilatildeo as outras cepas
49
Figura 14 Isolado de KPC segundo microrganismo encontrado em 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 5 Relaccedilotildees variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana e desfecho
cliacutenico
Tabela 6 ndash Distribuiccedilatildeo do perfil geneacutetico sexo coleta tipificaccedilatildeo de
microrganismos e anaacutelise da resistecircncia bacteriana segundo o desfecho
cliacutenico Brasiacutelia-DF 2010 a 2011
Variaacutevel Resultado
Desfecho
Alta Oacutebito
N N P
Gene 16S rRNA Positivo 7 1000 10 1000
NA Gene blaKPC Positivo 6 857 10 1000
Negativo 1 143 0 00 0218 Sexo Feminino 2 286 6 600
Masculino 5 714 4 400 0201 Local da coleta Fundo saco de
Douglas 1 143 0 00
Hemocultura 0 00 1 100 0463 Ponta de cateter 1 143 2 200
Sec TraquealBrocircnquica
0 00 1 100
50
Secreccedilatildeo traqueal 2 286 0 00
Swab retal 3 429 5 500
Urina 0 00 1 100
Microrganismo Enterobacter cloacae (KPC)
1 143 1 100
Klebsiella pneumoniae
6 857 8 800
0416 Serratia
marcescens 0 00 1 100
Teste de Hodge Hodge positivo 7 1000 10 1000
NA Amicacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 1 100 0848 resistente 0 00 1 100
sensiacutevel 2 286 3 300
Amoxicilina Aacutecido Clavulacircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Ampicilina Sulbactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ampicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Aztreonan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefazolina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Cefoperazona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Cefotaxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefoxitina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0509 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 2 286 4 400
Ceftazidima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cetriaxona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 3 429 5 500 0772 Cefalotina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ciprofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772
51
resistente 3 429 5 500
Claritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Clindamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Eritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Gentamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0942 resistente 2 286 3 300
sensiacutevel 1 143 2 200
Imipenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 0 00 2 200 0193 Resistente 1 143 3 300
sensiacutevel 2 286 0 00
Nitrofurantoiacutena sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Norfloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Oxacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Penicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Piperacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Rifampicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tetraciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Ticarcilina Aacutecido Clavulocircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0688 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 3 429 4 400
Tobramicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Trimetoprima Sulfametoxazol
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0112 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 2 286 0 00
Vancomicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tigeciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediario 0 00 1 100 0211 natildeo testado 1 143 4 400
resistente 2 286 0 00
52
Cefepime sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefuroxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Levofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Piperacilina Tazobactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Ertapenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Meropenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0223 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 1 143 0 00
Cefotetan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 sensiacutevel 0 00 1 100
Gemifloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 7 700 0585 natildeo testado 3 429 3 300
Desfecho
Alta Oacutebito
Meacutedia Erro
padratildeo Meacutedia Erro
padratildeo p
Idade 58 9 59 5 0991
Tempo Internaccedilatildeo (dias)
50 13 46 12 0571
n= 17 p(lt 005) NA natildeo se aplica
53
6 DISCUSSAtildeO
Nos uacuteltimos anos houve um aumento na incidecircncia de bacteacuterias
multirresistentes aos antimicrobianos no ambiente hospitalar tornando isto um
problema mundial de sauacutede puacuteblica (HULSCHER et al 2010) Quando se trata
principalmente de bacilos Gram negativos a frequumlecircncia destas bacteacuterias eacute ainda
maior em paiacuteses da Ameacuterica Latina quando comparada a paiacuteses desenvolvidos
(GALES etal 2012)
De acordo com dados do ldquoMeropenem Yearly Susceptibility Test Information
Collectionrdquo (MYSTIC) ocorreu nos Estados Unidos um aumento na susceptibilidade
de K pneumoniae nos uacuteltimos anos graccedilas a praacuteticas de controle de disseminaccedilatildeo
de amostras resistentes(RHOMBERG P R et al 2009) O aumento crescente da
prevalecircncia destes microrganismos foi proporcional ao aumento da dependecircncia do
uso de antibioacuteticos carbapenecircmicos considerados como a opccedilatildeo terapecircutica para o
tratamento de infecccedilotildees por bacilos Gram negativos multi-resistentes (LIVERMORE
2012) Isto afeta diretamente as opccedilotildees de tratamento sobrando poucas alternativas
para a terapecircutica que incluem colistina (polimixina E) e tigeciclina que apresentam
respectivamente problemas em termos de toxicidade e eficaacutecia (LIVERMORE et
al 2011) Um dos efeitos adversos mais importantes das poliminas B e E por
exemplo satildeo a neurotoxicidade e nefrotoxicidade (MENDES C A C et al2009 )
Devido agrave resistecircncia ser usualmente de natureza plasmidial e portanto de
maior disseminaccedilatildeo especialmente quando carreadas por K pneumoniae
microrganismo com uma notoacuteria capacidade para acumular e transferir plasmiacutedeos
com determinantes para resistecircncia o nuacutemero de casos detectados pelo
fenoacutetipogenoacutetipo blaKPC eacute bastante preocupante (MONTEIRO et al 2009)
Comparada com outras bacteacuterias hospitalares a transmissatildeo de clones
multirresistentes de K pneumoniae eacute maior e podem natildeo ser controladas pelos
meacutetodos de controle de infecccedilatildeo hospitalar (PAAUW et al 2007) A forma
plasmidial para transferecircncia da resistecircncia adicionada a este grande potencial para
disseminaccedilatildeo de clones resistentes eacute preocupante visto que apoacutes surtos muitas
vezes pode se tornar endecircmica Jaacute eacute uma realidade a disseminaccedilatildeo desta bacteacuteria
54
entre pacientes hospitais paiacuteses e ateacute mesmo continentes (WOODFORF et al
2010 ROGERS et al 2011)
As chances de surtos satildeo maiores em paiacuteses com poucos recursos devido agrave
maior carecircncia de praacuteticas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees hospitalares e o
uso irracional de antimicrobianos de forma empiacuterica e inadequada (KUMARASAMY
et al 2010) Ateacute o momento os mecanismos de resistecircncia aos cabapenecircmicos
geralmente encontrado eram a produccedilatildeo de ESBL (CTX-M) somada aacute perda de
porina (CARVALHAES et al 2010) Foi notado a partir do ano de 2008 um
aumento no nuacutemero de K pneumoniae produtoras de KPC-2 apresentando outra
forma de resistecircncia (GALES 2012)
Um estudo mostrou que o perfil do paciente colonizado ou infectado por KPC
foi de um paciente entre os 33 e os 82 anos de idade internado haacute mais de 1
semana no hospital A mortalidade geral nos uacuteltimos anos ficou em torno de 7
sendo que dos 77 pacientes estudados 32 (415) pacientes evoluiacuteram para oacutebito
evidenciando a alta morbi-mortalidade associada (ALVES A P et al 2013)
Em estudo com 2316 pacientes avaliados a populaccedilatildeo de sexo masculino foi
de 526 idade meacutedia global de 53 anos (mediana de 55 anos) permanecircncia meacutedia
de 58 dias (mediana de 3 dias) (OLIVEIRA A C et al 2010) Outros trabalhos
apresentaram ausecircncia de significacircncia entre sexoidade e o desenvolvimento de
infecccedilotildees por microrganismos resistentes (PERES-BOTA D et al 2003 COLPAN
A et al 2005 COELLO R et al 1997)
Outro estudo utilizou um total de 30 amostras sendo elas isoladas de urina
escarro secreccedilatildeo pleural ponta de cateter aspirado traqueal e hemocultura A mais
prevalente foi em urina (40) Entre as 30 cepas analisadas a maior porcentagem
foi da cepa Klebsiella pneumoniae (70) Enterobacter sp (133) Klebsiella
ozaenae (10) Escherichia coli (333) e Klebsiella oxytoca (333)
(DIENSTMANN R et al 2010) Nos Estados Unidos a enzima KPC jaacute se tornou
endecircmica Foi realizada uma pesquisa em dois hospitais de Nova York onde
testaram 602 amostras e 45 apresentaram algum mecanismo de resistecircncia
sendo apenas 33 confirmadas por biologia molecular como KPC-2 (BRATU et
al 2005)
55
Estudo sobre os tipos de ESBL feito no Japatildeo apresentou o tipo Toho-1 como
o mais prevalente nessa pesquisa Ateacute o ano de 2000 ano em que foi publicado tal
estudo este era o primeiro relatoacuterio no Japatildeo para identificar derivados de ESBLs
como tipo de SHV e TEM entre E coli e K pneumoniae Em especial o tipo SHV- 12
foi identificado com uma maior frequumlecircncia Estes resultados indicam que tipos
distintos de ESBLs que satildeo diferentes em sua especificidade de substrato e origem
geneacutetica coexistem no Japatildeo Isto mostra a importacircncia de caracterizar genoacutetipos
distintos de ESBLs e de estar em alerta continuamente para as tendecircncias de
ESBLs no Japatildeo aleacutem da necessidade de uma interpretaccedilatildeo uniforme utilizando as
diretrizes do CSLI para relatar cepas produtoras de ESBL Aleacutem da detecccedilatildeo de
ESBLs satildeo necessaacuterias mais informaccedilotildees tais como o perfil de sensibilidade
especiacutefica para diversas β-lactacircmicos e o local da infecccedilatildeo Esses fatores satildeo
essenciais para a escolha adequada de antibioacuteticos (YAGI T et al 2000)
No ano de 2004 uma pesquisa avaliou a produccedilatildeo de uma enzima de
hidroacutelise de carbapenecircmicos atraveacutes da teacutecnica de sequumlenciamento foi revelado
um novo membro da famiacutelia KPC designado KPC- 3 Pesquisadores encontraram
em um mutante de K pneumoniae uma substituiccedilatildeo de um gene associado com
resistecircncia a Imipenem mas essa substituiccedilatildeo foi considerada improvaacutevel na
contribuiccedilatildeo da resistecircncia aos carbapenecircmicos da espeacutecie estudada Aleacutem da
resistecircncia aos carbapenecircmicos estes isolados eram em sua maioria resistentes agraves
cefalosporinas penicilinas e aminoglicosiacutedeos Usando estudos de transformaccedilatildeo
conjugaccedilatildeo e hibridaccedilatildeo localizaram o alelo blaKPC em plasmiacutedeo aleacutem disso
mostraram que esse alelo tambeacutem carregava uma resistecircncia aos aminoglicosiacutedeos
A transferecircncia das enzimas KPCs foi demonstrada in vitro tanto neste como em
outros estudos pode ser que os plasmiacutedeos que fazem esta transferecircncia estavam
comeccedilando a se espalhar no ambiente cliacutenico resultando na multiresistecircncia dessas
estirpes (WOODFORD et al 2004)
O presente estudo apresentou um vieacutes quanto aos resultados dos testes de
susceptibilidade microbiana Observou-se que natildeo foi encontrado resultado deste
teste em algumas amostras o que natildeo cooperou para um estudo mais preciso
futuros estudos quanto agraves amostras e um melhor acompanhamento deste tipo de
patologia Poreacutem mesmo sem algumas amostras com este resultado disponiacutevel foi
56
confirmada a presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos
carbapenecircmicos por meio dos genes de resistecircncia blaKPC e 16S rRNA que as
amostras apresentaram em sua maioria serem portadoras Quanto aos resultados
estatiacutesticos nenhuma das variaacuteveis apresentou significacircncia estatiacutestica (p gt 005)
mostrando assim que estas variaacuteveis isoladas natildeo foram o fator determinante para
o desfecho cliacutenico de alta ou oacutebito
57
7 CONCLUSAtildeO
Os genes blaKPC e 16S rRNA foram caracterizados confirmando a a
presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos carbapenecircmicos
Houve uma maior prevalecircncia da cepa K pneumoniae e isto confirma outros
estudos que apresentam a maior prevalecircncia desta cepa em amostras com KPC
Aleacutem disso isso justifica a forma popular da K pneumoniae ser chamada de KPC
enquanto que na verdade KPC eacute uma enzima podendo estar presente em outras
cepas como Enterobacter clocae tambeacutem apresentada no presente estudo O
desfecho cliacutenico de oacutebitos maior que 50 eacute um possiacutevel indicador sobre a
necessidade de se realizar um teste raacutepido para identificaccedilatildeo de KPC visando
iniciar o mais raacutepido possiacutevel o tratamento afim de diminuir a mortalidade por esta
infecccedilatildeo
Nenhuma das variaacuteveis isoladamente estaacute relacionada ao desfecho cliacutenico
oacutebito ou alta pois natildeo apresentaram relevacircncia estatiacutestica O presente estudo
mostrou que haacute presenccedila da bacteacuteria nas amostras de pacientes do hospital
estudado podendo entatildeo afirmar que este tipo de bacteacuteria se encontra tambeacutem
presente em ambiente hospitalar O uso irracional de antimicrobiano eacute demonstrado
de forma indireta quando foi apresentado atraveacutes do Teste de Hodge Modificado
uma resistecircncia de 100 aos antibioacuteticos carbapenecircmicos Isto tambeacutem reflete na
terapecircutica sendo que pacientes portadores de bacteacuterias resistentes aos
antibioacuteticos carabepecircmicos tem uma escassa opccedilatildeo de tratamento e as opccedilotildees
apresentam problemas quanto agrave toxicidade e eficaacutecia
58
REFEREcircNCIAS
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Mecanismos
de resistecircncia bacteriana aos antimicrobianos Disponiacutevel em
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controleopas_
webmodulo3mec_sitiohtmgt Acesso em 25 de abril de 2014
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Nota teacutecnica nordm
012013 medidas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees por enterobacteacuterias
multiresistentes Acesso em 17 de abril de 2013
ALBA J et al Kinetics study of KPC-3 a plasmid-encoded class A
carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase Antimicrob Agents Chemother
Nov49(11)4760-2 2005
ALVES A P et al Nosocomial infections by KPC-producing enterobacteria in
a tertiary hospital in Southern Brazil Revista da AMRIGS Porto Alegre 57 (3) 213-
218 jul-set 2013
ALVES A et al Tipagem Geneacutetica de Microrganismos Lab De Diversidade
Microbiana Centro de Biologia Celular Dep de Biologia U de Aveiro 3810-193
Aveiro- 2003
BELL J M et Al Prevalence and significance of a negative extended-
spectrum beta-lactamase (ESBL) confirmation test result after a positive ESBL
screening test result for isolates of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae
results from the SENTRY Asia-Pacific Surveillance Program J Clin Microbiol
May45(5)1478-82 2007
BRATU S et al Detection of KPC carbapenem-hydrolyzing enzymes in
Enterobacter spp from Brooklyn New York Antimicrob Agents Chemother v 49 n
2 p 776-8 2005
59
BRATU S et al Emergence of KPC-possessing Klebsiella pneumoniae in
Brooklyn New York epidemiology and recommendations for detection Antimicrob
Agents Chemother v 49 n 7 p 3018-20 2005
BRATU S et al Rapid spread of carbapenem-resistant Klebsiella
pneumoniae in New York City Arch Intern Med v 165 p 1430-5 2005
CAMARGO C F et al Aplicaccedilatildeo das teacutecnicas de pcr e suas teacutecnicas
derivadas em diagnoacutestico molecular Disponiacutevel em
ltfileDUnB10C2BA20semestreArtigosPCR-
20CLEYTON20FLORENCIO20DE20CAMARGO20E20PAULO20ROB
ERTO20QUEIROZpdfgtgt Acesso em 08 de abril de 2014
CARVALHES C G et al Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting
carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive
results Journal of Antimicrobial Chemotherapy v 65 n2 p 249-251 2010
CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION- CDC Modified
Hodge Test for Carbapenemase Detection in Enterobacteriaceae 2004
CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE Methods for
dilutionantimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically Approved
standard M7ndashA7 7th ed CLSI Wayne PA 2011
COELLO R et al Risk factors for developing clinical infection with methicillin-
resistant Staphylococcus aureus (MRSA) amongst hospital patients initially only
colonized with MRSA J Hosp Infect 19973739-46
COLPAN A et al Evaluation of risk factors for mortality in intensive care
units A prospective study from a referral hospital in Turkey Am J Infect Control
200533(1)42-7
60
CORNAGLIA G et al Living with ESBLs Introduction Clinical Microbiology
and Infection 14 Suppl 1 1-2 2008
COTRIM E R et al Klebsiella pneumoniae carbapenemase ndash KPC em
Enterobacteriaceae o desafio das bacteacuterias multirresistentes Poacutes em revista do
centro universitaacuterio Newton Paiva 12012 - ediccedilatildeo 5 - issn 2176 7785
DESHPANDE L M et al Occurrence and characterization of
carbapenemase-producing Enterobacteacuteriaceae report from the SENTRY
Antimicrobial Surveillance Program (2000-2004) Microb Drug Resist 12(4)223-30
2006
DIAS D J A Estudos dos principais mecanismos de resistecircncia aos
antibioacuteticos β-lactacircmicos em bacteacuterias patogecircnicas gram negativas 2009 100 f
Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Geneacutetica Molecular e Biomedicina) ndash Faculdade de
Ciecircncias e Tecnologia Universidade de Nova Lisboa Lisboa
DIENSTMANN R et al Avaliaccedilatildeo fenotiacutepica da enzima Klebsiella
pneumoniae carbapenemase (KPC) em Enterobacteriaceae de ambiente hospitalar
J Bras Patol Med Lab v 46 n 1 p 23-27 fevereiro 2010
ENDIMIAMI A et al Emergence of blaKPC-containing Klebsiella
pneumoniae in a long-term acute care hospital a new challenge to our healthcare J
Antimicrob Chemother 64 1102-1110 Nov 2009
FALAGAS M E et al Extended-spectrum beta-lactamase producing
organisms The Journal of Hospital Infection 73 (4) pp 345-54 2009
FONTANA C et al Emergence of KPC-producing Klebsiella pneumoniae in
Italy BMC Rev Notes 3 40 2010
61
GALES A C et al Antimicrobial resistance among Gram-negative bacilli
isolated from Latin America results from Sentry Antimicrobial Surveillance Program
(Latin America 2008-2010) Diagnostic Microbiology and Infectious Disease v 3 n
4 p 354 -360 2012
GUPTA N et al Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Epidemiology
and Prevention HEALTHCARE EPIDEMIOLOGY Clinical Infectious Diseases
201153(1)60ndash67 Published by Oxford University Press on behalf of the Infectious
Diseases Society of America 2011
HARBOTTLE H et al Genetics of antimicrobial resistance Anim Biotechnol
n17 p111-124 2006
HENRIQUE W N et al RESISTEcircNCIA BACTERIANA Uniatildeo das
Faculdades Alfredo NasserInstituto de Ciecircncias da Sauacutede Disponiacutevel em lt
httpwwwfaculdadealfredonasseredubrfilespesquisaposter20HENRIQUE20
Wilker20Natividade20SANTIAGO20Silvania20CAVALCANTI20DSP
20ResistC3AAncia20Bacterianapdfgt Acesso em 17 marccedilo 2014
HULSCHER M E J I et al Antibiotic prescribing in hospital a social and
behavioral scientific approach The Lancet Infectious Diaseases v 10 n 3 p 167-
165 2010
KIDWAI M SAPRA P BHUSHAN KR Synthetic strategies and medicinal
properties of beta-lactams Curr Med Chem 1999 695-215
KUMARASAMY K K et al Emergence of a new antibiotic resistance
mechanism in India Pakistan and the UK a molecular biological and
epidemiological stuy The Lancet Infectious Diseases v10 n 9 p 597- 602 2010
LINCOPAN N et al Enterobacteacuteria producing extended-spectrum β-
lacatamases and IMP-1 Metalo-β-lactamases isolated from Brazilian hospitals J Med
62
Microbiol 7 1-3 2006
LINCOPAN N et al First Isolation of Metalo-β-Lacatamase-Producing
Multiresistant Klebsiella pneumoniae from a patient in Brazil J Clin Microbiol 43(1)
516-519 2005
LIVERMORE D M et al What remains against carbapenem- resistant
Enterobacteriaceae Evaluation of choramphenicol ciprofloxacin colistina
fosfomycin minocycline nitrofurantoin temocilin and tigecycline International
Journal of Antimicrobial Agents v 37 n 5 p 415- 459 2011
LIVERMORE D M Fourten years in resistance International Journal of
Antimicrobial Agents v 39 283- 294 2012
LIVERMORE D M Bacterial resistance to carbapenems Adv Exp Med Biol
1995 39025-47
LIVERMORE D M Bacterial resistance origins epidemiology and impact
Clin Infect Dis 36S11-S23 2003
LIVERMORE D M et al Carbapenemases a problem in waiting Curr
Opin Microbiol 2000 3489-95
LU et al Universal pcr for common bacterial pathogens J CLIN
MICROBIOL VOL 38 2000
LU et al Use of PCR with Universal Primers and Restriction Endonuclease
Digestions for Detection and Identification of Common Bacterial Pathogens in
Cerebrospinal Fluid Journal of Clinical Microbiology June 2000 p 2076ndash2080
MARSCHALL J Met al Presence of the KPC Carbapenemase Gene in
Enterobacteriaceae Causing Bacteremia and Its Correlation with In Vitro
Carbapenem Susceptibility J Clin Microbiol 47 239-241 Jan 2009
63
MARTINS WMBS et al Prevalecircncia do gene blaKPC em isolados cliacutenicos
de Enterobacteriaceae e natildeo fermentadores encontrados em amostras clinicas em
um hospital universitaacuterio do Recife X Jornada de ensino pesquisa e extensatildeo ndash
JEPEX 2010 ndash UFRPE Recife 18 a 22 de outubro
MENDES C A C et al Polimixinas Revisatildeo com ecircnfase na sua
nefrotoxicidade Rev Assoc Med Bras 2009 55(6) 752-9
MOHR J F 3rd Update on the efficacy and tolerability of meropenem in the
treatment of serious bacteacuterial infections Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S41-51
2008
MONTEIRO J et al First report of KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae
strains in Brazil Antimicrob Agents Chemother Jan53(1)333-4 2009
MOREIRA V C et al Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia a antibioacuteticos
Disponiacutevel em
lthttpwwwcpglsucgbr6mostraartigosSAUDEVANESSA20CARVALHO20M
OREIRApdfgt Acesso em 21 marccedilo 2014
NETIKUL T et al Emergence of novel blaKPC-12 and blaKPC-13 variants in
carbapenem non-susceptible Enterobacter cloacae a first report of blaKPC gene in
Thailand European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases May
S372 2011
NETO V A et al Antibioacuteticos na praacutetica Meacutedica 6ordf Ediccedilatildeo Editorial
SarverSP Brasil 2007
NICOLAU D P Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of
meropenem Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S32-40 2008
64
OLIVEIRA A C et al Resistecircncia bacteriana e mortalidade em um centro de
terapia intensiva Rev Latino-Am Enfermagem nov-dez 2010
PAAUW A et al Failure to control an outbreak of qnrA 1-positive multidrug-
resistant Enterobacter clocae despite adequate implementation of recommended
infection control measures Journal of Clinical Microbiology v 45 n 5 p 1420-1425
2007
PATERSON D L et al Extended-Spectrum Beta-Lactamases a Clinical
Update Clinical Microbiology Reviews v 18 p 657-686 2005
PEIRANO G et al Carbapenem-hydrolysing beta-lactamase KPC-2 in
Klebsiella pneumonia isolated in Rio de Janeiro Brazil J Antimicrob Chemother Nov
20 2009
PERES-BOTA D et al Are infections due to resistant pathogens associated
with worse outcome in critically ill patients J Infect 200347(4)307-16
PIDDOCK L J V Clinically relevant chromosomally encoded multidrug
resistance effl ux pumps in bacterial Clin Microbiol Rev n19 p382-402 2006
PITOUT J D D et al Emergence of Enterobacteriaceae producing
extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) in the community J Antimicrob
Chemother May 56 2005
POSSEBON M I et al Resistecircncia bacteriana aos carbapenecircmicos
Bacterial resitence to carbapenems RBM rev bras med60(6)378380-378-382
jun 2003
QUEENAN A M et al Carbapenemases the versatile beta-lactamases
Clin Microbiol Rev Jul20(3)440-58 2007
65
RHOMBERG P R et al Summary trends for the meropenem yearly
susceptibility test information collection program a 10- year experience in the United
States (1999-2008) Diagnostic Microbiology and Infectiois Disease v 65 n4 p
414-426 2009
ROBLEDO I E et al Detection of KPC in Acinetobacter spp in Puerto Rico
J Antimicrob Agents Chemother 54 1354-1357 Mar 2010
ROGERS B A et al Country-to-country transfer os patients and the risk of
multi-resistant bacterial infection Clinical Infectious Disease v53 n1 p49- 56
2011
SHAH A A et al Characteristics epidemiology and clinicalimportance of
emerging strains of Gram-negative bacilli producing extended-spectrum
betalactamases Research in Microbiology v 155 p 409-421 2004
TURNER P J Extended- Spectrum Beta-Lactamases Clinical Infectious
Diseases v 41 p 273-275 2005
WOLTER D J et al Phenotypic and Enzymatic Comparative Analysis
between the Novel KPC variant KPC-5 and Its Evolutionary Variants KPC-2 and
KPC-4 Antimicrob Agents Chemother Nov 17 2008
WOODFORD N et al Carbapenemases of Chryseobacterium
(Flavobacterium) meningosepticum distribution of blaB and characterization of a
novel Metalo-beta-lactamase gene blaB3 in the type strain NCTC 10016
Antimicrob Agents Chemother Jun44(6)1448-52 2000
WOODFORF N Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in
India Pakistan and the UK a molecular biological and epidemiological study The
Lancet Infectious Diseases v 10 n 9 p 597-602 2010
66
WOODFORD et al Outbreak of Klebsiella pneumoniae Producing a New
Carbapenem- Hydrolyzing Class A β-Lactamase KPC-3 in a New York Medical
Center Antimicrobial agents and chemotherapy Dec 2004 p 4793ndash4799 Vol 48
No 12
YAGI T et al A preliminary survey of extended-spectrum β-lactamases
(ESBLs) in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Japan
FEMS Microbiology Letters 184 (2000) 53-56
YIGIT H et al Novel carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase KPC-1 from
a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumonia J Antimicrob Agents
Chemother 45 (4) 1151-1161 (2001)
ZAVASCKI A P et al KPC-2- producing Enterobacter cloacae in two cities
from Southern Brazil Int J Antimicrob Agents Apr 28 2009
ZHANEL G G et al Comparative review of the carbapenecircmicos Drugs
67(7)1027-52 2007
67
ANEXOS
Sequumlecircncia do oligo blaKPC
Query 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
Query 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
Query 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
68
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
Query 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
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|||||||
Sbjct 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
Query 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
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Sbjct 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
69
Query 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
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|||||||
Sbjct 301
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TTGCTGC 360
Query 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
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GTTACGG 420
Query 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
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70
Sbjct 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
Query 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
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Sbjct 481
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ATTTGTT 540
Query 541
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GCGATAC 600
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GCGATAC 600
Query 601
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71
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Sbjct 601
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ATGCGCG 660
Query 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
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Sbjct 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
Query 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
72
Query 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
Query 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
Query 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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73
Sbjct 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
Query 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
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Sbjct 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
Query 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Sbjct 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
Query 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
74
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
Query 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
Query 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
75
Query 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
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Sbjct 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
Query 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
||||
Sbjct 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
LOCUS AF297554 1377 bp
DNA linear BCT 26-MAR-2001
DEFINITION Klebsiella pneumoniae carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
gene complete cds
ACCESSION AF297554
VERSION AF2975541 GI10121874
76
KEYWORDS
SOURCE Klebsiella pneumoniae
ORGANISM Klebsiella pneumoniae
Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Enterobacteriaceae Klebsiella
REFERENCE 1 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH QueenanAM
AndersonGJ Domenech-SanchezA
BiddleJW StewardCD
AlbertiS BushK and TenoverFC
TITLE Novel carbapenem-hydrolyzing beta-
lactamase KPC-1 from a
carbapenem-resistant strain of
Klebsiella pneumoniae
JOURNAL Antimicrob Agents Chemother 45 (4)
1151-1161 (2001)
PUBMED 11257029
REFERENCE 2 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH AndersonGJ and
TenoverFC
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (19-AUG-2000) Nosocomial
Pathogens Laboratory Branch
Centers for Disease Control and
Prevention 1600 Clifton Rd MS
G08 Atlanta GA 30333 USA
FEATURES LocationQualifiers
77
source 11377
organism=Klebsiella
pneumoniae
mol_type=genomic DNA
db_xref=taxon573
-35_signal 5560
-10_signal 7883
mRNA 921012
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
RBS 117122
CDS 1311012
note=blaKPC-1
codon_start=1
transl_table=11
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
protein_id=AAG134101
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translation=MSLYRRLVLLSCLSWPLAGFSATALTNLVAEPFAKLEQD
FGGSI
GVYAMDTGSGATVSYRAEERFPLCSSFKGFLAAAVLARSQQQAGLLDTPIRYG
KNALV
PWSPISEKYLTTGMTVAELSAAAVQYSDNAAANLLLKELGGPAGLTAFMRSIG
DTTFR
78
LDRWELELNSAIPSDARDTSSPRAVTESLQKLTLGSALAAPQRQQFVDWLKGN
TTGNH
RIRAAVPADWAVGDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTRAPNKDDK
HSEAV
IAAAARLALEGLGVNGQ
ORIGIN
1 cggggcagtt acagccgtta cagcctctgg
agagggagcg gcttgccgct cggtgataat
61 cccagctgta gcggcctgat tacatccggc
cgctacacct agctccacct tcaaacaagg
121 aatatcgttg atgtcactgt atcgccgtct
agttctgctg tcttgtctct catggccgct
181 ggctggcttt tctgccaccg cgctgaccaa
cctcgtcgcg gaaccattcg ctaaactcga
241 acaggacttt ggcggctcca tcggtgtgta
cgcgatggat accggctcag gcgcaactgt
301 aagttaccgc gctgaggagc gcttcccact
gtgcagctca ttcaagggct ttcttgctgc
361 cgctgtgctg gctcgcagcc agcagcaggc
cggcttgctg gacacaccca tccgttacgg
421 caaaaatgcg ctggttccgt ggtcacccat
ctcggaaaaa tatctgacaa caggcatgac
481 ggtggcggag ctgtccgcgg ccgccgtgca
atacagtgat aacgccgccg ccaatttgtt
541 gctgaaggag ttgggcggcc cggccgggct
gacggccttc atgcgctcta tcggcgatac
79
601 cacgttccgt ctggaccgct gggagctgga
gctgaactcc gccatcccaa gcgatgcgcg
661 cgatacctca tcgccgcgcg ccgtgacgga
aagcttacaa aaactgacac tgggctctgc
721 actggctgcg ccgcagcggc agcagtttgt
tgattggcta aagggaaaca cgaccggcaa
781 ccaccgcatc cgcgcggcgg tgccggcaga
ctgggcagtc ggagacaaaa ccggaacctg
841 cggagtgtat ggcacggcaa atgactatgc
cgtcgtctgg cccactgggc gcgcacctat
901 tgtgttggcc gtctacaccc gggcgcctaa
caaggatgac aagcacagcg aggccgtcat
961 cgccgctgcg gctagactcg cgctcgaggg
attgggcgtc aacgggcagt aaggctctga
1021 aaatcatcta ttggcccacc accgccgccc
ttgcgggcgg catggattac caaccactgt
1081 cacatttagg ctaggagtct gcgcggcaga
gccgtgtgac cggttttctg tagagcactg
1141 acgatggcgg cggcgctctc tgcaattggc
aaggcgtcgg cgccaaggat accaatcttg
1201 cggcgcgcgg cgtgttatga cgactggggt
gcatttgagc cgccccattt aaccttcgcc
1261 ctcacagata cgccattcgc ctcaaattta
gcgccatgca gacgagcttc cactcggctt
1321 gcaccttgtc caggcccctc atgctgaact
gacgcaatcc catcaccgcc ttgatca
80
24
A resistecircncia adquirida aos antibioacuteticos por sua vez ocorre quando haacute uma
da mutaccedilatildeo de genes reguladores ou estruturais aquisiccedilatildeo de genes de resistecircncia
veiculados por elementos geneacuteticos moacuteveis ou da combinaccedilatildeo entre eles Este
aparecimento de resistecircncia em uma espeacutecie bacteriana era anteriormente sensiacutevel
a droga e devido a um destes fatores se torna resistente O fenoacutetipo resultante
desta resistecircncia natildeo estaraacute presente nas ceacutelulas genitoras e sim nos indiviacuteduos de
uma linhagem bacteriana derivada de um organismo susceptiacutevel Os genes muitas
vezes satildeo adquiridos por meio de elementos moacuteveis como plasmiacutedeos e
transposons (MOREIRA et al 2014)
Entatildeo a resistecircncia adquirida ocorre por diversos mecanismos geneacuteticos tais
como produccedilatildeo de enzimas inativadoras interferecircncia com a entrada e acuacutemulo de
droga na bacteacuteria alteraccedilatildeo do receptor para accedilatildeo da droga via metaboacutelica
alternativa Eacute originada por meio de uma alteraccedilatildeo a niacutevel geneacutetico da ceacutelula de
natureza cromossocircmica pelos processos de mutaccedilatildeo transduccedilatildeo e transformaccedilatildeo
ou extra cromossocircmica (plasmidial) (HENRIQUE et al 2014)
Como todo antibioacutetico β-lactacircmicoos carbapenecircmicos tem como mecanismo
de accedilatildeo a inibiccedilatildeo da siacutentese proteacuteica atraveacutes da accedilatildeo de inibiccedilatildeo da parede
microbiana fazendo a ligaccedilatildeo e inativaccedilatildeo das proteiacutenas ligadoras de penicilinas
(NETO et al 2007)
Imipenem e meropenem antibioacuteticos pertencentes ao grupo dos
carbapenecircmicos possuem um amplo espectro de accedilatildeo in vitro incluindo atividade
contra cocos gram-positivos bacilos gram-negativos e bacteacuterias anaeroacutebias (MOHR
2008) Jaacute o ertapenem possui um espectro de accedilatildeo mais limitado que o os dois
antibioacuteticos anteriormente citados tendo uma eficiecircncia limitada contra os bacilos
gram-negativos natildeo fermentadores Um novo antibioacutetico carbapenecircmico ainda natildeo
disponiacutevel no Brasil doripenem possui uma atividade mais potente principalmente
contra Pseudomona aeruginosa devido ao seu mecanismo de accedilatildeo que combina os
espectros de accedilatildeo de imipenem e meropenem (ZHANEL et al 2007)
Devido as suas estabilidades espectro de accedilatildeo poucos relatos de
resistecircncia boa toleracircncia pelos pacientes com efeitos adversos mais comuns as
complicaccedilotildees no siacutetio da infusatildeo e toxicidade gastrintestinal estes antibioacuteticos
carbapenecircmicos tecircm sido considerados terapia de escolha (NICOLAU 2008) Como
25
uma resposta adaptativa das Enterobacteacuterias o iacutendice de resistecircncia aos
carbapenecircmicos tem aumentado nos uacuteltimos anos de forma proporcional ao seu
uso limitando imensamente as opccedilotildees terapecircuticas para as infecccedilotildees causadas por
estes microrganismos (FALAGAS et al 2009)
As enzimas produtoras de betalactamases hidrolisam o anel betalactacircmico
tornando este mecanismo de resistecircncia o mais importante Os dois grupos mais
preocupantes satildeo o grupo das betalactamases de aspecto ampliado e os da
carbapenemases que aleacutem de hidrolizar os carbapenecircmicos hidrolizam todas as
outras classes de betalactacircmicos Em enterobacteacuterias as carbapenemases mais
prevalentes satildeo codificadas por genes dos grupos blaKpc blaIMP blaVIM blaNdm
e blaOxa A ocorrecircncia de carbapenemases eacute mais frequentemente em bacteacuterias
gram-negativas fermentadoras da glicose conhecidas como enterobacteacuterias
predominantes nos gecircneros Klebsiella Serratia Citrobacter Enterobacter
Escherichia Samonella Proteus Morganella Podem ser encontradas tambeacutem em
bacteacuterias gram-negativas natildeo fermentadoras como espeacutecies de Acinetobacter e de
Pseudomonas (ALVES et al 2013)
Carbapenemases satildeo enzimas plasmiacutedio-mediados resistentes a todos
antibioacuteticos betalactacircmicos As bacteacuterias que possuem o gene blaKpC responsaacutevel
pela codificaccedilatildeo da produccedilatildeo de carbapenemases apresentam resistecircncia aos
antibioacuteticos betalactacircmicos impedindo a accedilatildeo destes antibioacuteticos contra infecccedilotildees
(ALVES et al 2013)
A transmissatildeo das carbapenemases a diferentes cepas de enterobacteacuterias se
daacute atraveacutes de plasmiacutedeos que satildeo pequenas moleacuteculas circulares de DNA com a
capacidade de se replicarem independentemente do DNA cromossocircmico
permitindo a troca de material geneacutetico entre gecircneros e espeacutecies diferentes de
enterobacteacuterias O raacutepido desenvolvimento de surtos em ambientes hospitalares eacute
explicado por essa disseminaccedilatildeo plasmidial (COTRIM et al 2012)
De acordo com o criteacuterio de interpretaccedilatildeo do Clinical and Laboratory
Standards Institute (CLSI 2009) a maioria das KPC isoladas natildeo apresenta
resistecircncia completa aos carbapenecircmicos (Imipenem e Meropenem apresentam
uma Concentraccedilatildeo Inibitoacuteria Miacutenima (CIM) de 2-8 μgmL) (COTRIM et al 2012)
26
Os mecanismos de resistecircncia capazes de impedir a accedilatildeo dos
carbapenecircmicos satildeo vaacuterios Poreacutem a degradaccedilatildeo de antibioacuteticos por enzimas
principalmente as carbapenemases constituem o principal mecanismo de
resistecircncia aos antibioacuteticos β-lactacircmicos (DIAS 2009) Devido a ampla atividade
hidroliacutetica agrave maioria dos antibioacuteticos β-lactacircmicos estes grupos de enzimas possuem
alta versatilidade (QUEENAM et al 2007)
Existem trecircs grandes classes moleculares de Ambler a qual as
carbapenemases pertencem denominadas classe A (serino-carbapenemases os
quais incluem membros designados SME IMI NMC GES e a famiacutelia das KPCs)
classe B(as metalo-β-lactamase incluem os tipos IMP e VIM) e classe D
(oxacilinases similares as da classe A e incluem as OXA e PSE) (DIAS 2009)
Dentre estes as mais importantes e prevalentes encontradas em plasmiacutedeos
de Klebsiella pneumoniae satildeo as KPC (DIENSTMANN et al 2010) Por meio de
estudos moleculares a enzima KPC jaacute foi documentada em diferentes bacteacuterias e
diferenciada em KPC-1 a 13 (NETIKUL et al 2011) No ano de 2009 foi realizada
uma pesquisa onde descreveram as seguintes carbapenemases KPC-1 em isolados
de Klebsiella pneumoniae KPC-2 em K pneumoniae K oxytoca Salmonella
enterica e em Enterobacter sp e KPC-3 em K pneumoniae e Enterobacter cloacae
(MONTEIRO et al 2009) As enzimas KPC-4 e KPC-5 foram encontradas em
isolados de Pseudomonas aeruginosa (PEIRANO et al 2009)
Foi observada uma correccedilatildeo da sequumlecircncia KPC-1 indicando que o gene
blaKPC-1 e blaKPC-2 satildeo idecircnticos Trecircs novas variantes blaKPC-3 blaKPC-4 e
blaKPC-5 satildeo resultados de mutaccedilotildees do gene estrutural da enzima KPC-2
(WOLTER et al 2008) apresentando diferentes perfis de hidroacutelise As enzimas
KPC-2 e KPC-3 possuem alta eficiecircncia em hidrolisar cefalotina cefaloridina e
nitrocefin poreacutem possuem uma menor eficiecircncia contra carbapenecircmicos e
cefotaxima (ALBA et al 2005) As enzimas KPC-5 e KPC-4 apresentam menor
hidroacutelise de carbapenecircmicos eacute do que em KPC-2 Em contrapartida possuem
melhor eficiecircncia contra ceftazidima e uma maior inibiccedilatildeo pelo aacutecido clavulacircnico
(WOLTER et al 2008)
27
13 Anaacutelise geneacutetica de microrganismos
Eacute de extrema importacircncia praacutetica natildeo soacute no aspecto cliacutenico mas tambeacutem na
fitopatologia biotecnologia e estudos ambientais a correta identificaccedilatildeo e
classificaccedilatildeo de microrganismos Os meacutetodos usados na diferenciaccedilatildeo de gecircneros
espeacutecies e estirpes de microrganismos podem ser divididos em meacutetodos fenotiacutepicos
(baseados em fenocircmenos bioquiacutemicos fisioloacutegicos e bioloacutegicos) e genotiacutepicos
(detectam polimorfismos ao niacutevel dos aacutecidos nucleacuteicos ou variaccedilatildeo aleacutelica ao niacutevel
de enzimas) (ALVES et al 2003)
Para este tipo de estudo existem alguns meacutetodos como o RFLPrsquos -
ldquoRestriction Fragment Length Polymorphismsrdquo (polimorfismos de tamanho de
fragmentos de restriccedilatildeo) rep-PCR (Meacutetodo de tipagem baseado na amplificaccedilatildeo via
PCR de elementos de DNA repetitivos presentes em genomas bacterianos) anaacutelise
de sequumlecircncias nucleotiacutedeas (discriminaccedilatildeo eou identificaccedilatildeo atraveacutes de sequumlecircncias
de DNA) PFGE - Pulsed-Field Gel Electrophoresis (Eletroforese em campo
pulsado) ( A L V E S et al 2003)
A diferenciaccedilatildeo clara da cepa e principalmente a alta reprodutibilidade devem
ser caracteriacutesticas de qualquer meacutetodo de tipagem geneacutetica Poreacutem nem todos os
meacutetodos moleculares de tipagem satildeo igualmente eficazes Sendo assim de acordo
com a finalidade pretendida (identificaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo custo reprodutibilidade
etc) eacute feita a escolha do meacutetodo a ser aplicado (A L V E S et al 2003)
O processo de identificaccedilatildeo fenotiacutepica de KPC entre os membros da famiacutelia
Enterobacteriaceae ainda eacute difiacutecil e os meacutetodos para a sua identificaccedilatildeo devem ser
revistos e ajustados Mesmo com o avanccedilo tecnoloacutegico natildeo existem ensaios que
combinam alta especificidade e sensibilidade na detecccedilatildeo destas enzimas Satildeo
diversas as metodologias usadas para rastreamento de KPC como por exemplo a
focalizaccedilatildeo isoeleacutetrica a teacutecnica de disco-difusatildeo E-test teste de Hodge
modificado dentre outros Aleacutem disso a pesquisa do gene blaKPC pode ser feita
pela Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) Os sistemas de automaccedilatildeo
existentes no entanto podem natildeo identificar com precisatildeo os isolados KPC
positivos (COTRIM et al 2012)
A identificaccedilatildeo blaKPC pelo PCR eacute um meacutetodo raacutepido preciso sensiacutevel e
altamente especiacutefico no entanto a PCR exige equipamento e conhecimentos
28
especializados em diagnoacutestico molecular dificultando ainda a utilizaccedilatildeo dele na
rotina dos laboratoacuterios de microbiologia (COTRIM et al 2012)
Em estudo de infecccedilotildees hospitalares identificaccedilatildeo molecular de patoacutegenos
bacterianos eacute bastante utilizada Para diferenciar carbapenemases tipo KPC a partir
de outros tipos como SME NMC-A-IMI e GES eacute necessaacuterio um exame molecular
As identificaccedilotildees do microrganismo juntamente com a triagem molecular iratildeo definir
um resultado mais especiacutefico podendo ser usado para identificar o antibioacutetico mais
adequado para o tratamento Poreacutem a principal desvantagem de alguns exames
baseados em PCR por exemplo eacute que devido agrave sua limitada capacidade de
multiplexaccedilatildeo eles distinguem apenas algumas variaccedilotildees (MOREIRA et al 2014)
Estatildeo descritas para a identificaccedilatildeo molecular de patoacutegenos pertencentes agrave
famiacutelia Enterobacteriaceae as teacutecnicas de PFGE RAPD (randomly amplified
polymorphic DNA) e ERIC-PCR (Enterobacterial Repet it ive Intergenic Consensus)
A PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) eacute considerada padratildeo ouro devido sua
alta capacidade de diferenciaccedilatildeo baseada na anaacutelise do perfil de restriccedilatildeo do DNA
genocircmico por meio de eletroforese Como desvantagem para a sua execuccedilatildeo eacute
necessaacuterios vaacuterios dias impedindo a tipagem de algumas cepas bacterianas devido
agrave degradaccedilatildeo do DNA aleacutem do alto custo empregado (MOREIRA et al 2014)
O meacutetodo baseado em ERIC-PCR tem sido bastante utilizado como uma
alternativa para a teacutecnica de PFGE Esta teacutecnica consiste na anaacutelise do padratildeo de
amplificaccedilatildeo de elementos repetidos encontrados no genoma bacteriano Isto
permite uma maior rapidez na obtenccedilatildeo de resultados quando comparada com o
PFGE aleacutem de alta reprodutibilidade simples execuccedilatildeo e implementaccedilatildeo baixo
custo e natildeo sem problemas com a degradaccedilatildeo do DNA (MOREIRA et al 2014)
A PCR eacute considerada uma teacutecnica de biologia molecular revolucionaacuteria que
consiste na siacutentese enzimaacutetica de coacutepias de aacutecidos nucleacuteicos Ela permitiu o raacutepido
desenvolvimento do estudo de sequumlecircncias de aacutecidos nucleacuteico Foi desenvolvida por
Kary Banks Mullis que ganhou o precircmio Nobel de quiacutemica de 1993 devido ao
desenvolvimento dessa teacutecnica em abril de 1983 (CAMARGO et al 2014)
Por meio de etapas de variaccedilatildeo de temperatura a teacutecnica de PCR promove a
duplicaccedilatildeo de cadeias de DNA in vitro A reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo de DNA por PCR
envolve o emprego de sequumlecircncias iniciadoras (primers) quatro nucleotiacutedeos
29
(dNTPrsquos) do DNA e uma DNA polimerase termoestaacutevel podendo assim obter-se a
partir de uma fita molde muitas coacutepias de uma sequumlecircncia especiacutefica de aacutecido
nucleacuteico O princiacutepio da PCR consiste na variaccedilatildeo de temperatura por ciclo
envolvendo trecircs etapas baacutesicas desnaturaccedilatildeo pareamento e amplificaccedilatildeo
(CAMARGO et al 2014)
A desnaturaccedilatildeo da fita molde de DNA eacute uma etapa com duraccedilatildeo entre 30
segundos a 1 minuto a temperatura entre 92 ordmC a 96 ordmC Apoacutes isso o pareamento de
dois iniciadores sinteacuteticos de composiccedilotildees distintas que funcionam como os
iniciadores da reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo liga-se agrave regiatildeo complementar da fita de
DNA alvo que sofreraacute a duplicaccedilatildeo Esta etapa tem duraccedilatildeo de 30 segundos a 1
minuto a temperatura entre 58 ordmC e 65 ordmC Por uacuteltimo a amplificaccedilatildeo por meio da
enzima Taq DNA polimerase das novas fitas de DNA se daacute a partir de cada um dos
iniciadores utilizando os quatro dNTPrsquos como substrato da reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo
Esta etapa possui duraccedilatildeo entre 45 segundos e 1 minuto a 72 ordmC Cada ciclo eacute
repetido em torno de 30 a 35 vezes e promove a amplificaccedilatildeo da regiatildeo alvo
determinada conforme o anelamento dos iniciadores sinteacuteticos de DNA (CAMARGO
et al 2014) Estas etapas estatildeo demonstradas na figura 4
Figura 4 Etapas da Reaccedilatildeo de PCR
30
2 JUSTIFICATIVA
No ano de 2010 no Distrito Federal foram identificados 111 pacientes com
suspeita de infecccedilatildeo por Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) e a
Secretaria de Sauacutede do Distrito Federal confirmaram ainda a morte de 18 pacientes
dentre os hospitais puacuteblicos e particulares Um desafio encontrado por ocasiatildeo do
surto infeccioso no Distrito Federal foi o de confirmar as KPCs por Reaccedilatildeo da
Polimerase em Cadeia sendo que as amostras foram enviadas com esta finalidade
para a Fiocruz no Rio de Janeiro
Pesquisas que possam contribuir na elaboraccedilatildeo de estrateacutegias preventivas e
de intervenccedilatildeo para infecccedilotildees causadas por enterobacteacuterias bem como contribuir
para gerar uma integraccedilatildeo beneacutefica entre a equipe acadecircmica e os serviccedilos de
sauacutede devem ser estimuladas Neste sentido o presente estudo permitiu escrutinar
os genes envolvidos na expressatildeo de carbapenemases presentes em espeacutecies de
enterobacteacuterias isoladas em ambiente hospitalar visto que elucidar genes de
resistecircncia de enterobacteacuterias aos antibioacuteticos carbapenecircmicos eacute o primeiro passo
para garantir um controle epidemioloacutegico efetivo para estes tipos de microorganismo
assim como sua associaccedilatildeo com surtos fatais particularmente em pacientes com
baixa imunidade
31
3 OBJETIVOS
31 Objetivo geral Caracterizar os genes de resistecircncia das
Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases e os aspectos epidemioloacutegicos de
pacientes internados em um hospital puacuteblico do Distrito Federal
32 Objetivos Especiacuteficos
Identificar genotipicamente a enzima KPC (Klebsiella pneumoniae
carbapenemase) de isolados de Klebsiella pneumoniae
Investigar aspectos epidemioloacutegicos dos pacientes portadores de
Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases
Identificar quais variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana influenciaram para o
desfecho oacutebito ou alta
Avaliar a susceptibilidade das Enterobacteacuterias aos antibioacuteticos
carbapenecircmicos dos pacientes em ambiente hospitalar
32
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
Trata-se de um estudo transversal onde foi realizado o teste de
susceptibilidade das enterobacteacuterias aos antibioacuteticos carbapenecircmicos a partir dos
materiais bioloacutegicos coletados dos pacientes internados no Hospital Regional da Asa
Norte (HRAN) e enviados ao Laboratoacuterio de Anaacutelises Cliacutenicas da mesma Instituiccedilatildeo
Os materiais bioloacutegicos investigados foram sangue aspirado traqueal ou brocircnquico
urina e cultura semi quantitativa de ponta de cateter venoso central O HRAN eacute um
hospital puacuteblico do Distrito Federal com 395 leitos sendo as cliacutenicas de internaccedilatildeo
Berccedilaacuterio Cirurgia Geral Cirurgia Plaacutestica Cliacutenica Meacutedica Ginecologia Maternidade
Pediatria Queimados UTI com atendimento a pacientes portadores de doenccedilas de
caraacuteter cliacutenico e ciruacutergico
4 1 Coleta e transporte das amostras bioloacutegicas
As amostras foram coletadas de pacientes internados no Hospital Regional da
Asa Norte (HRAN) com suspeitas de infecccedilatildeo por KPC A identificaccedilatildeo primaacuteria foi
realizada pelo Laboratoacuterio de Microbiologia do hospital de origem dos pacientes e os
demais procedimentos que foram utilizados na identificaccedilatildeo encontram-se descritos
abaixo
4 2 Procedimentos para confirmaccedilatildeo de resistecircncia bacteriana por
disco de ertapenem (adaptado CDC 2004)
Para diagnosticar amostra como portadora de bacteacuteria produtora de
carbapenemase foi realizado o teste com disco de ertapenem como forma de
triagem Inicialmente utilizou-se o swab contaminado com a amostra que foi
distribuiacuteda em uma pequena aacuterea da placa de aacutegar MacConkey para apoacutes o
crescimento ser realizada a pesquisa de colonizaccedilatildeo por enterobacteacuterias resistentes
aos carbapenecircmicos (Pesquisa de CRE) Procedeu-se a semeadura por teacutecnica
semi-quantitativaesgotamento com alccedila bacterioloacutegica na diluiccedilatildeo de 1100 O disco
de Ertapenem foi colocado na superfiacutecie da placa de MacConkey na junccedilatildeo dos dois
primeiros campos de semeadura conforme demonstrado na figura 5 Incubou a placa
33
em estufa aeroacutebia a 35ordmC por 24 e 48 horas e observou-se o halo de difusatildeo do
disco de Ertapenem na placa para proceder agrave leitura
O teste deixou de ser obrigatoacuterio apoacutes a modificaccedilatildeo dos criteacuterios
interpretativos para carbapenecircmicos para enterobacteacuterias publicados no suplemento
do CLSI 2010 M100-S20-U
Figura 5 Mecanismo de semeamento de material bioloacutegico oriundos de
pacientes com suspeita de infecccedilatildeo por KPC Fonte adaptado CDC 2004
4 2 1 Interpretaccedilatildeo dos resultados
Na ausecircncia de crescimento ateacute 24 horas (MacConkey) ou halo de difusatildeo
gt27 mm na placa deve-se reincubar as placas por mais 24 horas Quando for
ausente o crescimento apoacutes 48 horas ou halo de difusatildeo gt27 mm na placa libera-se
como enterobacteacuterias resistentes a carbapenecircmicos (KPCNEG)Havendo
crescimento de colocircnias na placa de MacConkey com halo lt 27 mm (apenas para
colocircnias com crescimento dentro do halo) deve-se reisolar e realizar identificaccedilatildeo e
antibiograma automatizado teste de sensibilidade por disco-difusatildeo e Teste de
Hodge Modificado (THM) Os isolados de enterobacteacuterias cujos testes comprovarem
a resistecircncia aos carbapanecircmicos testados (KPCPOS) foram reportado a Comissatildeo
de Controle de Infecccedilatildeo Hospitalar (CCIH) Jaacute osbacilos Gram-negativos natildeo
fermentadores natildeo foram reportados (KPCNEG) Para interpretaccedilatildeodos resultados
foram utilizados os valores conforme demonstrados na tabela 1
Tabela 1 Criteacuterios Interpretativos para testes de sensibilidade
ENTEROBACTEacuteRIAS
Disco difusatildeo (mm) MIC (microgml)
34
Antibioacutetico Sigla S I R S I R
Ertapenem 10
microg
ETP 22 19-
21
18 05 1 2
Meropenem 10
microg
MEM 23 20-
22
19 1 2 4
Fonte Manual Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)
2013
Os resultados que apresentaram resistecircncia ao antibioacutetico Ertapenem foram
considerados como suspeitos de contaminaccedilatildeo por KPC Fez-se o teste de
susceptibilidade aos antibioacuteticos (TSA) em aparelho automatizado MicroScan Walk
Away 96sl Dade Behring
4 3 Teste de susceptibilidade aos antibioacuteticos (adaptado CDC 2004)
A determinaccedilatildeo da susceptibilidade dos isolados foi feita pelo teste de
susceptibilidade aos antibioacuteticos (TSA) apoacutes cultura em meio de gelose simples
(INSA) para avaliaccedilatildeo da sua pureza e obtenccedilatildeo de colocircnias isoladas Para
preparaccedilatildeo de uma suspensatildeo bacteriana com turvaccedilatildeo aproximada de 05
McFarland (Dade BehringMicroScanregTurbidity Meter) ressuspendeu duas a cinco
colocircnias em 2ml de soro fisioloacutegico esteacuteril diluindo a 1100 em soro fisioloacutegico num
volume total de 10ml em seguida foi feita uma semeadura em duas placas
quadradas (120mm x 120mm) de Muller-Hinton Agar (INSA) por inundaccedilatildeo
Os discos de antibioacutetico carbapenecircmicos imipenem meropenem e
ertapenem (Biorad) foram aplicados com o auxiacutelio de um dispensador automaacutetico A
susceptibilidade das Enterobacteacuterias aos carbapenecircmicos foi definida de acordo
com o protocolo Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI 2011)
Para aquelas Enterobacteacuterias que apresentaram resistecircncia ao ertapenem
foram realizados o Teste de Hodge Modificado para Detecccedilatildeo de Enterobacteacuterias
Produtoras de Carbapenemases conforme descrito pelo Centers for Disease Control
and Prevention (CDC 2004)
35
4 4Teste de Hodge Modificado (THM) (adaptado CDC 2004)
Preparou-se uma suspensatildeo em salina esteacuteril com a cepa Escherichia coli
ATCC 25922 (padratildeo 05 de McFarland) Apoacutes isto diluiu a suspensatildeo 110 em
salina (05 ml da soluccedilatildeo de Ecoli ATCC 25922 + 45 ml salina)Foi entatildeo semeado
na superfiacutecie de uma placa de Agar Muller-Hinton com a suspensatildeo diluiacuteda de Ecoli
ATCC 25922 com auxilio de swab seco assegurando que houvesse uma
distribuiccedilatildeo uniforme cobrindo toda a superfiacutecie do Agar Deixou secar por 3 a 5
minutos em temperatura ambienteColocou-se o disco de ertapenem 10microg no centro
da placa e apoacutes isto fez-se uma estria linear da cepa a ser testada da borda do
disco ateacute a borda da placa utilizando uma alccedila calibrada 10 microl ou um swab Incubou
a placa na estufa em atmosfera aeroacutebia a 35 plusmn 2ordmC por 16 a 24 horas
441 Controle de qualidade (CQ)
Foi utilizado um CQ todos os dias em que se realizou o teste tendo como
controle Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1705- teste de Hodge modificado
positivo Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1706- teste de Hodge modificado
negativo
442 InterpretaccedilatildeoResultados
Apoacutes 16ndash24 horas de incubaccedilatildeo examinar as placas para verificar a presenccedila
de uma distorccedilatildeo no halo de inibiccedilatildeo do disco de ertapenem devido ao crescimento
realccedilado da cepa ATCC na intersecccedilatildeo do organismo teste e a Ecoli ATCC 25922
dentro dos limites do halo O THM positivo apresentaraacute presenccedila de distorccedilatildeo no
halo de inibiccedilatildeo de ertapenem devido ao crescimento da cepa Ecoli ATCC 25922 ao
longo da estria da cepa teste para dentro dos limites do halo de inibiccedilatildeo Jaacute o THM
negativo teraacute ausecircncia de crescimento da cepa Ecoli ATCC 5922 ao longo da estria
da cepa teste para dentro dos limites do halo de inibiccedilatildeo do disco de ertapenem
Este resultado estaacute representado na figura 6
36
Figura 6 Interpretaccedilatildeo resultado do Teste de Hodge Modificado
(adaptado CDC 2004) Teste positivo na estria da cepa teste na parte superior
da placa teste negativo na estria da cepa teste na parte inferior da placa
Tendo positivo como resultado o paciente era um provaacutevel contaminado por
KPC As amostras entatildeo foram encaminhadas para a Fundaccedilatildeo Osvaldo Cruz
(FIOCRUZ) para confirmaccedilatildeo final As amostras finalmente confirmadas como
positivas para KPC foram isoladas e guardadas no banco de cepas cliacutenicas do
hospital Apoacutes a autorizaccedilatildeo do CEP amostras das cepas foram transferidas para
meio de transporte Stuard em caixa teacutermica fechada em baixa temperatura e
levadas para o laboratoacuterio de microbiologia cliacutenica da universidade
No laboratoacuterio da universidade as amostras foram separadas e realizadas
repiques em meios MacConkey e incubadas por 24h As colocircnias caracteriacutesticas
foratildeo isoladas em caldo BHI e mantidas em shaker a 37oC por 2h Apoacutes isto foram
executadas as anaacutelises a seguir
Os isolados de Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases foram
submetidos agrave extraccedilatildeo de DNA e posterior sequumlenciamento para identificaccedilatildeo dos
genes de resistecircncia blaKPC de 1 a 13 e identificaccedilatildeo do gene universal Os
pacientes de onde os materiais bioloacutegicos contendo as Enterobacteacuterias produtoras
de carbapenemases foram os isolados foram investigados quanto aos aspectos
epidemioloacutegicos e cliacutenicos
37
4 5 Extraccedilatildeo de DNA bacteriano
A extraccedilatildeo de DNA bacteriano foi realizada utilizando o kit NucleoSpin
Plasmidreg (MN) Antes de iniciar a extraccedilatildeo foi feito a preparaccedilatildeo das soluccedilotildees
reagentes materiais e amostras (vortexando) colocou-se em banho-maria agrave 50ordmC o
tampatildeo AW Partiu-se de colocircnias isoladas cultivadas que sofreram passagem em
meio LB liacutequido por 12h Adicionou-se 15 mL da amostra no tubo eppendorf
centrifugou por 5 minutos descartou o sobrenadante (com cuidado para natildeo
descartar o Pellet) Repetiu-se este procedimento por mais trecircs vezes completando-
se o volume de 6mL Foram adicionados 250microL do tampatildeo Resuspension Buffer A1
encostando a ponteira no Pellet e misturando (este tampatildeo tem como funccedilatildeo
separar a formaccedilatildeo de grumos celulares) Apoacutes isso homogeneizou e vortexou os
tubos eppendorfs Apoacutes isso foram adicionados 250microL do tampatildeo Lysis Buffer A2
homogenizou e deixou descansar por 5 minutos (esta etapa eacute importante para a lise
da parede e da membrana celulares e liberaccedilatildeo do conteuacutedo da ceacutelula)
Passado o tempo de descanso foi adicionado 300microL do tampatildeo
Neutralization Buffer A3 homogeneizou e centrifugou por 10 minutos (este tampatildeo
iraacute retirar as proteiacutenas que envolvem o DNA e voltaraacute com o pH para proacuteximo de 8
impedindo que a soluccedilatildeo de lise facilite a quebra das ligaccedilotildees covalentes do aacutecido
nucleacuteico) Em seguida enumeraram-se os tubos contendo filtros com siacutelica
transferiu-se o sobrenadante para o filtro e centrifugou por 5 minutos Descartou-se
o que foi filtrado adicionou 500microL do tampatildeo AW (banho-maria) centrifugou por 2
minutos Novamente foi descartado o filtrado Adicionou-se 600microL do tampatildeo A4
centrifugou por 2 minutos e descartou o filtrado (os tampotildees AW e A4 contecircm
isotiocianato de guanidina em concentraccedilotildees crescentes para facilitar a adsorccedilatildeo
do DNA na siacutelica e retirada das outras biomoleacuteculas da amostra) Foi feita outra
centrifugaccedilatildeo com o tubo vazio Apoacutes isto o filtro foi trocado para outro eppendorf
definitivo onde foi adicionado 50microL do tampatildeo Elution Buffer AE (este tampatildeo
favorece a eluiccedilatildeo do DNA) centrifugou por 2 minutos descartou o filtro e
armazenou as amostras em freezer -20ordmC
38
4 6 Iniciadores e reaccedilatildeo de PCR
Os iniciadores universais para o gene blaKPC foram desenhados baseados
em sequumlecircncias conservadas apresentadas pelos sub-grupos de genes que
codificam a enzima carbapenemase de klebsiella pneumoniae (YIGIT et al 2001)
Baseado na sequumlecircncia para o blakpc-1 depositada no GenBank
(AF2975541) o oligonucleotiacutedio (oligo) iniciador direto (5-
ATGTCACTGTATCGCCGTC-3rsquo) foi desenhado para reconhecer a sequumlecircncia
blaKPC na posiccedilatildeo (131149) enquanto que o iniciador reverso (5-
TTACTGCCCGTTGACGCC-3rsquo) foi reconhecido na posiccedilatildeo (9951012) As anaacutelises
baseadas em alinhamento de sequumlecircncias mostraram que o par de iniciadores
blaKPC podem detectar os alelos de 1 a 13 do gene blaKPC conforme a tabela 2
Tabela 2 Nuacutemero de acesso ao GenBank dos alelos blaKPC e seus
microrganismos originais
Nuacutemero de
Acesso GenBank
Microrganismo Alvo
AF2975541 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-1
GU0862251 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-2
HQ2589341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-2-like
AB5577341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC -3
EU4473041 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-4
EU4002222 Pseudomonas
aeruginosa
blaKPC-5
EU5555341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-6
EU7297271 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-7
39
FJ2344121 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-8
FJ624872 Escherichia coli blaKPC-9
GQ1403481 Acinetobacter
baumannii
blaKPC-10
HM0669951 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-11
HQ3428891 Enterobacter cloacae blaKPC-12
HQ3428901 Enterobacter cloacae blaKPC-13
As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo de blaKPC foram realizadas em um
primeiro tempo de desnaturaccedilatildeo em que foi 94ordmC por 5 minutos seguido de 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 58 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 90 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 78ordmC por 8 minutos Aleacutem das amostras foi utilizado um
controle negativo
A PCR do blaKPC foi realizada utilizando os componentes para o volume da
reaccedilatildeo de 25 microL citados na tabela 3 A banda do tamanho do produto de PCR foi de
881 pares de bases (pb) o que corresponde ao plasmiacutedeo
Tabela 3 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do
gene blaKPC
Reagente Volume
DNA molde 4 microL
Tampatildeo Taq 25 microL
MgCl2 075 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP
2 microL
Oligo F 1 microL
Oligo R 1 microL
Taq DNA polimerase 05 microL
Aacutegua MiliQ 1335 microL
40
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
Baseado na sequumlecircncia para o gene 16S rRNA em que o oligonucleotiacutedio
Universal iniciador direto foward (5-CCAGCAGCCGCCGTAATACG-3rsquo) foi
desenhado para reconhecer a sequumlecircncia universal na posiccedilatildeo 1513 enquanto que o
iniciador reverso (5-ATCGGYTACCTTGTTACGACTTC-3rsquo) foi reconhecido na
posiccedilatildeo 1491 foram realizadas PCRrsquos As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo deste
gene foram realizadas nos seguinte tempos separaccedilatildeo 94ordmC por 10 minutos 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 55 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 120 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 72ordmC por 10 minutos
A PCR do gene 16S rRNA foi realizada utilizando os componentes para o
volume da reaccedilatildeo de 25microL citados na tabela 4 A banda do tamanho do produto de
PCR foi de 996 pb correspondente aacute regiatildeo ribossomal capaz de amplificar todas
as espeacutecies
Tabela 4Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do gene
universal
Reagente (quantidade
concentraccedilatildeo do estoque)
Volume
DNA molde 10 ng 4 microL
Tampatildeo Taq 10 x 25 microL
MgCl2 50mM 125 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP 25 mM
125 microL
Oligo F 10microM 05 microL
Oligo R 10microM 05 microL
Taq DNA polimerase 5UmicroL 04 microL
Aacutegua Miliq 146 microL
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
41
O termociclador utilizado para os experimentos foi o LifeTouch da BIOER
4 7 Digestatildeo
Para realizaccedilatildeo da digestatildeo foi utilizada a enzima BshF I (Hae III) EN- 1105
tamanho 7000 units concentraccedilatildeo 10 unitsmicroL fonte Bacillus sphaericus empresa
Jena bioscienceUtilizaram-se os componentes para o volume de 50microL da reaccedilatildeo
citados na tabela 5
Tabela 5 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da digestatildeo do gene
universal
Reagente Volume
Produto de PCR 10 microL
Enzima BshF I 01 microL
Tampatildeo (10x) 5 microL
Aacutegua Miliq 349 microL
Total (em cada ependorff) 50 microL
Valores para 1 digestatildeo
Os ependorffs foram colocados por 30 minutos em banho-maria a 37ordmC Apoacutes
isso fez-se a corrida das amostras em gel de agarose para verificaccedilatildeo do resultado
(LU et al 2000)
4 8 Eletroforese em gel de agarose
Os produtos de DNA PCR e digestatildeo foram analisados em gel de agarose
2 O tempo de corrida do gel eacute de aproximadamente 1hora e 30minutos sendo
que no comeccedilo foi usada agrave voltagem de 50 V e apoacutes comeccedilar a correr o gel
aumentou a voltagem para 100 v Utilizou-se o marcador de 100pb (pares de bases)
Foi adicionado 3microL de corante Bromophenol (que tem a funccedilatildeo de fazer uma ligaccedilatildeo
na amostra de DNA e permitir a visualizaccedilatildeo da corrida no gel de agarose) em 7microL
de amostra tanto de DNA quanto de PCR Para o preparo do gel foi utilizado TBE
42
(Tris- Aacutecido Boacuterico) agarose e brometo de etiacutedio (sua funccedilatildeo eacute de corante para o gel
e permitir a visualizaccedilatildeo do DNA quando colocado agrave luz ultravioleta) Para o oligo
blaKPC a banda da amplificaccedilatildeo foi em 881ppb correspondendo ao plasmiacutedeo Jaacute
o oligo Universal foi em 996 pb
4 9 Descarte de resiacuteduos
Todos os materiais utilizados nos ensaios foram de uso uacutenico e manipulados
em cacircmaras de seguranccedila bioloacutegica classe II Apoacutes o uso foram colocados em
soluccedilatildeo desinfetantes (hipoclorito a 1) e em seguida autoclavados a 127oC por 20
min em sacos apropriados para autoclavaccedilatildeo Apoacutes a finalizaccedilatildeo do ciclo de
esterilizaccedilatildeo os sacos contendo o material descartaacutevel foram colocados em
recipientes de coleta da empresa responsaacutevel pela coleta de materiais bioloacutegicos
produzidos no laboratoacuterio de microbiologia Todos os procedimentos seguiram a
normativa RDC-ANVISA 3062004 sobre o descarte de resiacuteduos de serviccedilo de
sauacutede
4 10 Aspectos epidemioloacutegicos e cliacutenicos
Os aspectos cliacutenicos e epidemioloacutegicos foram investigados por meio de
prontuaacuterios dos pacientes portadores de enterobacteacuterias produtoras de
carbapenemases e envolveram topografia mais provaacutevel do foco infeccioso a
enfermidade motivadora da internaccedilatildeo o desfecho cliacutenico a idade e o tempo de
internaccedilatildeo
4 12 Anaacutelises eepidemioloacutegicas
As anaacutelises foram realizadas com o pacote estatiacutestico SPSS versatildeo 200
Para verificar quais variaacuteveis referentes aos dados epidemioloacutegicos e
microbioloacutegicos influenciaram no desfecho verificou- se a diferenccedila meacutedia das
variaacuteveis idade e tempo de internaccedilatildeo em cada grupo O teste estatiacutestico utilizado foi
o teste t de Student apoacutes se executar o teste de normalidade de Shapiro-Wilk Para
as variaacuteveis sexo perfil microbioloacutegico das enterobacteacuterias produtoras de
43
carbapenemases foi avaliada a associaccedilatildeo com o desfecho por meio do teste Exato
de Fisher O niacutevel de significacircncia adotado foi de 5
4 13 Preceitos eacuteticos
Este projeto estaacute inserido em um projeto maior denominado ldquoEpidemiologia
cliacutenica e caracterizaccedilatildeo molecular do Acinetobacter Baumannii resistente a
antibioticoterapia em pacientes internado em hospitais do Sistema Uacutenico de Sauacutederdquo
que foi submetido ao Comitecirc de Eacutetica em Pesquisa da Secretaria do Estado de
Sauacutede do Distrito Federal (SESDF) e emitido parecer aprovado pelo protocolo nordm
23109 (anexo)
44
5 RESULTADOS
51 Anaacutelise molecular
Para a amplificaccedilatildeo com o oligo blaKPC foram amplificadas amostras
que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 881 pb correspondente ao
plasmiacutedeo A anaacutelise da amplificaccedilatildeo da regiatildeo do gene blaKPC mostrou que
apenas a amostra A10 natildeo amplificou isso demonstra que esta amostra natildeo
possuiacutea o gene de resistecircncia
5 1 1 Gene blaKPC
Figura 7 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 881 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
A amostra A3 natildeo amplificou no primeiro momento entatildeo foi realizado
novamente a PCR e corrida de gel obtendo entatildeo a amplificaccedilatildeo da amostra como
apresentado na figura 8
45
Figura 8 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC da
mostra A3 estudada A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo de 881
pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 1 2 Gene 16S rRNA
Para a amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA utilizou-se o oligo universal Foram
amplificadas amostras que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 996 pb
Figura 9 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
46
Segundo Lu et al (2000) a digestatildeo com a enzima HaeIII deste amplicons de
16S rRNA devolveriam bandas com perfis entre 150 a 200 pb No gel abaixo eacute
possiacutevel evidenciar que este perfil ocorreu com o predomiacutenio de bandas na altura
de 200pb
Figura 10 Gel de agarose a 2 da digestatildeo do amplicon do gene 16S
rRNA das amostras com a enzima HaeIII evidenciando diversos fragmentos
proacuteximos a 200 pb A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo ribossomal
de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 2 Anaacutelises epidemioloacutegicas
5 2 1 Sexo
No total foram detectados 17 isolados de KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 onde a maior a prevalecircncia foi
detecatada em amostras de pacientes do sexo masculino (53) do que no sexo
feminino (47)
47
Figura 11 Isolado de KPC segundo sexo dos 17 pacientes investigados
no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 2 Desfecho cliacutenico
Em 17 isolados de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo
de 2010 aacute 2011 a porcentagem de pacientes que foram a oacutebito (59) foi maior que
a de pacientes que tiverm alta (41)
Figura 12 Isolado de KPC segundo desfecho cliacutenico dos 17 pacientes
investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
48
5 2 3 Local da coleta
Dos 17 episoacutedios detectados de infecccedilatildeo por KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 a infecccedilatildeo em swab retalfoi mais
frequente (47) seguida de ponta de cateacuteter (18) e secreccedilatildeo traqueal (12)
Figura 13 Isolados de KPC segundo local da coleta da amostra nos 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 4 Microorganismo
O microorganismo mais encontrado foi a Klebsiella pneumoniae (82)
seguida da Enterobacter clocae (12) e Serratia marcescens (6) dos 17 isolados
de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 Isto afirma o
fato de a sigla KPC ser utilizada de forma errocircnea aacute Klebsiella pneumoniae visto
que a evidecircncia dela eacute maior em relaccedilatildeo as outras cepas
49
Figura 14 Isolado de KPC segundo microrganismo encontrado em 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 5 Relaccedilotildees variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana e desfecho
cliacutenico
Tabela 6 ndash Distribuiccedilatildeo do perfil geneacutetico sexo coleta tipificaccedilatildeo de
microrganismos e anaacutelise da resistecircncia bacteriana segundo o desfecho
cliacutenico Brasiacutelia-DF 2010 a 2011
Variaacutevel Resultado
Desfecho
Alta Oacutebito
N N P
Gene 16S rRNA Positivo 7 1000 10 1000
NA Gene blaKPC Positivo 6 857 10 1000
Negativo 1 143 0 00 0218 Sexo Feminino 2 286 6 600
Masculino 5 714 4 400 0201 Local da coleta Fundo saco de
Douglas 1 143 0 00
Hemocultura 0 00 1 100 0463 Ponta de cateter 1 143 2 200
Sec TraquealBrocircnquica
0 00 1 100
50
Secreccedilatildeo traqueal 2 286 0 00
Swab retal 3 429 5 500
Urina 0 00 1 100
Microrganismo Enterobacter cloacae (KPC)
1 143 1 100
Klebsiella pneumoniae
6 857 8 800
0416 Serratia
marcescens 0 00 1 100
Teste de Hodge Hodge positivo 7 1000 10 1000
NA Amicacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 1 100 0848 resistente 0 00 1 100
sensiacutevel 2 286 3 300
Amoxicilina Aacutecido Clavulacircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Ampicilina Sulbactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ampicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Aztreonan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefazolina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Cefoperazona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Cefotaxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefoxitina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0509 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 2 286 4 400
Ceftazidima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cetriaxona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 3 429 5 500 0772 Cefalotina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ciprofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772
51
resistente 3 429 5 500
Claritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Clindamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Eritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Gentamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0942 resistente 2 286 3 300
sensiacutevel 1 143 2 200
Imipenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 0 00 2 200 0193 Resistente 1 143 3 300
sensiacutevel 2 286 0 00
Nitrofurantoiacutena sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Norfloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Oxacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Penicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Piperacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Rifampicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tetraciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Ticarcilina Aacutecido Clavulocircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0688 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 3 429 4 400
Tobramicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Trimetoprima Sulfametoxazol
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0112 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 2 286 0 00
Vancomicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tigeciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediario 0 00 1 100 0211 natildeo testado 1 143 4 400
resistente 2 286 0 00
52
Cefepime sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefuroxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Levofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Piperacilina Tazobactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Ertapenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Meropenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0223 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 1 143 0 00
Cefotetan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 sensiacutevel 0 00 1 100
Gemifloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 7 700 0585 natildeo testado 3 429 3 300
Desfecho
Alta Oacutebito
Meacutedia Erro
padratildeo Meacutedia Erro
padratildeo p
Idade 58 9 59 5 0991
Tempo Internaccedilatildeo (dias)
50 13 46 12 0571
n= 17 p(lt 005) NA natildeo se aplica
53
6 DISCUSSAtildeO
Nos uacuteltimos anos houve um aumento na incidecircncia de bacteacuterias
multirresistentes aos antimicrobianos no ambiente hospitalar tornando isto um
problema mundial de sauacutede puacuteblica (HULSCHER et al 2010) Quando se trata
principalmente de bacilos Gram negativos a frequumlecircncia destas bacteacuterias eacute ainda
maior em paiacuteses da Ameacuterica Latina quando comparada a paiacuteses desenvolvidos
(GALES etal 2012)
De acordo com dados do ldquoMeropenem Yearly Susceptibility Test Information
Collectionrdquo (MYSTIC) ocorreu nos Estados Unidos um aumento na susceptibilidade
de K pneumoniae nos uacuteltimos anos graccedilas a praacuteticas de controle de disseminaccedilatildeo
de amostras resistentes(RHOMBERG P R et al 2009) O aumento crescente da
prevalecircncia destes microrganismos foi proporcional ao aumento da dependecircncia do
uso de antibioacuteticos carbapenecircmicos considerados como a opccedilatildeo terapecircutica para o
tratamento de infecccedilotildees por bacilos Gram negativos multi-resistentes (LIVERMORE
2012) Isto afeta diretamente as opccedilotildees de tratamento sobrando poucas alternativas
para a terapecircutica que incluem colistina (polimixina E) e tigeciclina que apresentam
respectivamente problemas em termos de toxicidade e eficaacutecia (LIVERMORE et
al 2011) Um dos efeitos adversos mais importantes das poliminas B e E por
exemplo satildeo a neurotoxicidade e nefrotoxicidade (MENDES C A C et al2009 )
Devido agrave resistecircncia ser usualmente de natureza plasmidial e portanto de
maior disseminaccedilatildeo especialmente quando carreadas por K pneumoniae
microrganismo com uma notoacuteria capacidade para acumular e transferir plasmiacutedeos
com determinantes para resistecircncia o nuacutemero de casos detectados pelo
fenoacutetipogenoacutetipo blaKPC eacute bastante preocupante (MONTEIRO et al 2009)
Comparada com outras bacteacuterias hospitalares a transmissatildeo de clones
multirresistentes de K pneumoniae eacute maior e podem natildeo ser controladas pelos
meacutetodos de controle de infecccedilatildeo hospitalar (PAAUW et al 2007) A forma
plasmidial para transferecircncia da resistecircncia adicionada a este grande potencial para
disseminaccedilatildeo de clones resistentes eacute preocupante visto que apoacutes surtos muitas
vezes pode se tornar endecircmica Jaacute eacute uma realidade a disseminaccedilatildeo desta bacteacuteria
54
entre pacientes hospitais paiacuteses e ateacute mesmo continentes (WOODFORF et al
2010 ROGERS et al 2011)
As chances de surtos satildeo maiores em paiacuteses com poucos recursos devido agrave
maior carecircncia de praacuteticas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees hospitalares e o
uso irracional de antimicrobianos de forma empiacuterica e inadequada (KUMARASAMY
et al 2010) Ateacute o momento os mecanismos de resistecircncia aos cabapenecircmicos
geralmente encontrado eram a produccedilatildeo de ESBL (CTX-M) somada aacute perda de
porina (CARVALHAES et al 2010) Foi notado a partir do ano de 2008 um
aumento no nuacutemero de K pneumoniae produtoras de KPC-2 apresentando outra
forma de resistecircncia (GALES 2012)
Um estudo mostrou que o perfil do paciente colonizado ou infectado por KPC
foi de um paciente entre os 33 e os 82 anos de idade internado haacute mais de 1
semana no hospital A mortalidade geral nos uacuteltimos anos ficou em torno de 7
sendo que dos 77 pacientes estudados 32 (415) pacientes evoluiacuteram para oacutebito
evidenciando a alta morbi-mortalidade associada (ALVES A P et al 2013)
Em estudo com 2316 pacientes avaliados a populaccedilatildeo de sexo masculino foi
de 526 idade meacutedia global de 53 anos (mediana de 55 anos) permanecircncia meacutedia
de 58 dias (mediana de 3 dias) (OLIVEIRA A C et al 2010) Outros trabalhos
apresentaram ausecircncia de significacircncia entre sexoidade e o desenvolvimento de
infecccedilotildees por microrganismos resistentes (PERES-BOTA D et al 2003 COLPAN
A et al 2005 COELLO R et al 1997)
Outro estudo utilizou um total de 30 amostras sendo elas isoladas de urina
escarro secreccedilatildeo pleural ponta de cateter aspirado traqueal e hemocultura A mais
prevalente foi em urina (40) Entre as 30 cepas analisadas a maior porcentagem
foi da cepa Klebsiella pneumoniae (70) Enterobacter sp (133) Klebsiella
ozaenae (10) Escherichia coli (333) e Klebsiella oxytoca (333)
(DIENSTMANN R et al 2010) Nos Estados Unidos a enzima KPC jaacute se tornou
endecircmica Foi realizada uma pesquisa em dois hospitais de Nova York onde
testaram 602 amostras e 45 apresentaram algum mecanismo de resistecircncia
sendo apenas 33 confirmadas por biologia molecular como KPC-2 (BRATU et
al 2005)
55
Estudo sobre os tipos de ESBL feito no Japatildeo apresentou o tipo Toho-1 como
o mais prevalente nessa pesquisa Ateacute o ano de 2000 ano em que foi publicado tal
estudo este era o primeiro relatoacuterio no Japatildeo para identificar derivados de ESBLs
como tipo de SHV e TEM entre E coli e K pneumoniae Em especial o tipo SHV- 12
foi identificado com uma maior frequumlecircncia Estes resultados indicam que tipos
distintos de ESBLs que satildeo diferentes em sua especificidade de substrato e origem
geneacutetica coexistem no Japatildeo Isto mostra a importacircncia de caracterizar genoacutetipos
distintos de ESBLs e de estar em alerta continuamente para as tendecircncias de
ESBLs no Japatildeo aleacutem da necessidade de uma interpretaccedilatildeo uniforme utilizando as
diretrizes do CSLI para relatar cepas produtoras de ESBL Aleacutem da detecccedilatildeo de
ESBLs satildeo necessaacuterias mais informaccedilotildees tais como o perfil de sensibilidade
especiacutefica para diversas β-lactacircmicos e o local da infecccedilatildeo Esses fatores satildeo
essenciais para a escolha adequada de antibioacuteticos (YAGI T et al 2000)
No ano de 2004 uma pesquisa avaliou a produccedilatildeo de uma enzima de
hidroacutelise de carbapenecircmicos atraveacutes da teacutecnica de sequumlenciamento foi revelado
um novo membro da famiacutelia KPC designado KPC- 3 Pesquisadores encontraram
em um mutante de K pneumoniae uma substituiccedilatildeo de um gene associado com
resistecircncia a Imipenem mas essa substituiccedilatildeo foi considerada improvaacutevel na
contribuiccedilatildeo da resistecircncia aos carbapenecircmicos da espeacutecie estudada Aleacutem da
resistecircncia aos carbapenecircmicos estes isolados eram em sua maioria resistentes agraves
cefalosporinas penicilinas e aminoglicosiacutedeos Usando estudos de transformaccedilatildeo
conjugaccedilatildeo e hibridaccedilatildeo localizaram o alelo blaKPC em plasmiacutedeo aleacutem disso
mostraram que esse alelo tambeacutem carregava uma resistecircncia aos aminoglicosiacutedeos
A transferecircncia das enzimas KPCs foi demonstrada in vitro tanto neste como em
outros estudos pode ser que os plasmiacutedeos que fazem esta transferecircncia estavam
comeccedilando a se espalhar no ambiente cliacutenico resultando na multiresistecircncia dessas
estirpes (WOODFORD et al 2004)
O presente estudo apresentou um vieacutes quanto aos resultados dos testes de
susceptibilidade microbiana Observou-se que natildeo foi encontrado resultado deste
teste em algumas amostras o que natildeo cooperou para um estudo mais preciso
futuros estudos quanto agraves amostras e um melhor acompanhamento deste tipo de
patologia Poreacutem mesmo sem algumas amostras com este resultado disponiacutevel foi
56
confirmada a presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos
carbapenecircmicos por meio dos genes de resistecircncia blaKPC e 16S rRNA que as
amostras apresentaram em sua maioria serem portadoras Quanto aos resultados
estatiacutesticos nenhuma das variaacuteveis apresentou significacircncia estatiacutestica (p gt 005)
mostrando assim que estas variaacuteveis isoladas natildeo foram o fator determinante para
o desfecho cliacutenico de alta ou oacutebito
57
7 CONCLUSAtildeO
Os genes blaKPC e 16S rRNA foram caracterizados confirmando a a
presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos carbapenecircmicos
Houve uma maior prevalecircncia da cepa K pneumoniae e isto confirma outros
estudos que apresentam a maior prevalecircncia desta cepa em amostras com KPC
Aleacutem disso isso justifica a forma popular da K pneumoniae ser chamada de KPC
enquanto que na verdade KPC eacute uma enzima podendo estar presente em outras
cepas como Enterobacter clocae tambeacutem apresentada no presente estudo O
desfecho cliacutenico de oacutebitos maior que 50 eacute um possiacutevel indicador sobre a
necessidade de se realizar um teste raacutepido para identificaccedilatildeo de KPC visando
iniciar o mais raacutepido possiacutevel o tratamento afim de diminuir a mortalidade por esta
infecccedilatildeo
Nenhuma das variaacuteveis isoladamente estaacute relacionada ao desfecho cliacutenico
oacutebito ou alta pois natildeo apresentaram relevacircncia estatiacutestica O presente estudo
mostrou que haacute presenccedila da bacteacuteria nas amostras de pacientes do hospital
estudado podendo entatildeo afirmar que este tipo de bacteacuteria se encontra tambeacutem
presente em ambiente hospitalar O uso irracional de antimicrobiano eacute demonstrado
de forma indireta quando foi apresentado atraveacutes do Teste de Hodge Modificado
uma resistecircncia de 100 aos antibioacuteticos carbapenecircmicos Isto tambeacutem reflete na
terapecircutica sendo que pacientes portadores de bacteacuterias resistentes aos
antibioacuteticos carabepecircmicos tem uma escassa opccedilatildeo de tratamento e as opccedilotildees
apresentam problemas quanto agrave toxicidade e eficaacutecia
58
REFEREcircNCIAS
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Mecanismos
de resistecircncia bacteriana aos antimicrobianos Disponiacutevel em
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controleopas_
webmodulo3mec_sitiohtmgt Acesso em 25 de abril de 2014
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Nota teacutecnica nordm
012013 medidas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees por enterobacteacuterias
multiresistentes Acesso em 17 de abril de 2013
ALBA J et al Kinetics study of KPC-3 a plasmid-encoded class A
carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase Antimicrob Agents Chemother
Nov49(11)4760-2 2005
ALVES A P et al Nosocomial infections by KPC-producing enterobacteria in
a tertiary hospital in Southern Brazil Revista da AMRIGS Porto Alegre 57 (3) 213-
218 jul-set 2013
ALVES A et al Tipagem Geneacutetica de Microrganismos Lab De Diversidade
Microbiana Centro de Biologia Celular Dep de Biologia U de Aveiro 3810-193
Aveiro- 2003
BELL J M et Al Prevalence and significance of a negative extended-
spectrum beta-lactamase (ESBL) confirmation test result after a positive ESBL
screening test result for isolates of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae
results from the SENTRY Asia-Pacific Surveillance Program J Clin Microbiol
May45(5)1478-82 2007
BRATU S et al Detection of KPC carbapenem-hydrolyzing enzymes in
Enterobacter spp from Brooklyn New York Antimicrob Agents Chemother v 49 n
2 p 776-8 2005
59
BRATU S et al Emergence of KPC-possessing Klebsiella pneumoniae in
Brooklyn New York epidemiology and recommendations for detection Antimicrob
Agents Chemother v 49 n 7 p 3018-20 2005
BRATU S et al Rapid spread of carbapenem-resistant Klebsiella
pneumoniae in New York City Arch Intern Med v 165 p 1430-5 2005
CAMARGO C F et al Aplicaccedilatildeo das teacutecnicas de pcr e suas teacutecnicas
derivadas em diagnoacutestico molecular Disponiacutevel em
ltfileDUnB10C2BA20semestreArtigosPCR-
20CLEYTON20FLORENCIO20DE20CAMARGO20E20PAULO20ROB
ERTO20QUEIROZpdfgtgt Acesso em 08 de abril de 2014
CARVALHES C G et al Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting
carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive
results Journal of Antimicrobial Chemotherapy v 65 n2 p 249-251 2010
CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION- CDC Modified
Hodge Test for Carbapenemase Detection in Enterobacteriaceae 2004
CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE Methods for
dilutionantimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically Approved
standard M7ndashA7 7th ed CLSI Wayne PA 2011
COELLO R et al Risk factors for developing clinical infection with methicillin-
resistant Staphylococcus aureus (MRSA) amongst hospital patients initially only
colonized with MRSA J Hosp Infect 19973739-46
COLPAN A et al Evaluation of risk factors for mortality in intensive care
units A prospective study from a referral hospital in Turkey Am J Infect Control
200533(1)42-7
60
CORNAGLIA G et al Living with ESBLs Introduction Clinical Microbiology
and Infection 14 Suppl 1 1-2 2008
COTRIM E R et al Klebsiella pneumoniae carbapenemase ndash KPC em
Enterobacteriaceae o desafio das bacteacuterias multirresistentes Poacutes em revista do
centro universitaacuterio Newton Paiva 12012 - ediccedilatildeo 5 - issn 2176 7785
DESHPANDE L M et al Occurrence and characterization of
carbapenemase-producing Enterobacteacuteriaceae report from the SENTRY
Antimicrobial Surveillance Program (2000-2004) Microb Drug Resist 12(4)223-30
2006
DIAS D J A Estudos dos principais mecanismos de resistecircncia aos
antibioacuteticos β-lactacircmicos em bacteacuterias patogecircnicas gram negativas 2009 100 f
Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Geneacutetica Molecular e Biomedicina) ndash Faculdade de
Ciecircncias e Tecnologia Universidade de Nova Lisboa Lisboa
DIENSTMANN R et al Avaliaccedilatildeo fenotiacutepica da enzima Klebsiella
pneumoniae carbapenemase (KPC) em Enterobacteriaceae de ambiente hospitalar
J Bras Patol Med Lab v 46 n 1 p 23-27 fevereiro 2010
ENDIMIAMI A et al Emergence of blaKPC-containing Klebsiella
pneumoniae in a long-term acute care hospital a new challenge to our healthcare J
Antimicrob Chemother 64 1102-1110 Nov 2009
FALAGAS M E et al Extended-spectrum beta-lactamase producing
organisms The Journal of Hospital Infection 73 (4) pp 345-54 2009
FONTANA C et al Emergence of KPC-producing Klebsiella pneumoniae in
Italy BMC Rev Notes 3 40 2010
61
GALES A C et al Antimicrobial resistance among Gram-negative bacilli
isolated from Latin America results from Sentry Antimicrobial Surveillance Program
(Latin America 2008-2010) Diagnostic Microbiology and Infectious Disease v 3 n
4 p 354 -360 2012
GUPTA N et al Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Epidemiology
and Prevention HEALTHCARE EPIDEMIOLOGY Clinical Infectious Diseases
201153(1)60ndash67 Published by Oxford University Press on behalf of the Infectious
Diseases Society of America 2011
HARBOTTLE H et al Genetics of antimicrobial resistance Anim Biotechnol
n17 p111-124 2006
HENRIQUE W N et al RESISTEcircNCIA BACTERIANA Uniatildeo das
Faculdades Alfredo NasserInstituto de Ciecircncias da Sauacutede Disponiacutevel em lt
httpwwwfaculdadealfredonasseredubrfilespesquisaposter20HENRIQUE20
Wilker20Natividade20SANTIAGO20Silvania20CAVALCANTI20DSP
20ResistC3AAncia20Bacterianapdfgt Acesso em 17 marccedilo 2014
HULSCHER M E J I et al Antibiotic prescribing in hospital a social and
behavioral scientific approach The Lancet Infectious Diaseases v 10 n 3 p 167-
165 2010
KIDWAI M SAPRA P BHUSHAN KR Synthetic strategies and medicinal
properties of beta-lactams Curr Med Chem 1999 695-215
KUMARASAMY K K et al Emergence of a new antibiotic resistance
mechanism in India Pakistan and the UK a molecular biological and
epidemiological stuy The Lancet Infectious Diseases v10 n 9 p 597- 602 2010
LINCOPAN N et al Enterobacteacuteria producing extended-spectrum β-
lacatamases and IMP-1 Metalo-β-lactamases isolated from Brazilian hospitals J Med
62
Microbiol 7 1-3 2006
LINCOPAN N et al First Isolation of Metalo-β-Lacatamase-Producing
Multiresistant Klebsiella pneumoniae from a patient in Brazil J Clin Microbiol 43(1)
516-519 2005
LIVERMORE D M et al What remains against carbapenem- resistant
Enterobacteriaceae Evaluation of choramphenicol ciprofloxacin colistina
fosfomycin minocycline nitrofurantoin temocilin and tigecycline International
Journal of Antimicrobial Agents v 37 n 5 p 415- 459 2011
LIVERMORE D M Fourten years in resistance International Journal of
Antimicrobial Agents v 39 283- 294 2012
LIVERMORE D M Bacterial resistance to carbapenems Adv Exp Med Biol
1995 39025-47
LIVERMORE D M Bacterial resistance origins epidemiology and impact
Clin Infect Dis 36S11-S23 2003
LIVERMORE D M et al Carbapenemases a problem in waiting Curr
Opin Microbiol 2000 3489-95
LU et al Universal pcr for common bacterial pathogens J CLIN
MICROBIOL VOL 38 2000
LU et al Use of PCR with Universal Primers and Restriction Endonuclease
Digestions for Detection and Identification of Common Bacterial Pathogens in
Cerebrospinal Fluid Journal of Clinical Microbiology June 2000 p 2076ndash2080
MARSCHALL J Met al Presence of the KPC Carbapenemase Gene in
Enterobacteriaceae Causing Bacteremia and Its Correlation with In Vitro
Carbapenem Susceptibility J Clin Microbiol 47 239-241 Jan 2009
63
MARTINS WMBS et al Prevalecircncia do gene blaKPC em isolados cliacutenicos
de Enterobacteriaceae e natildeo fermentadores encontrados em amostras clinicas em
um hospital universitaacuterio do Recife X Jornada de ensino pesquisa e extensatildeo ndash
JEPEX 2010 ndash UFRPE Recife 18 a 22 de outubro
MENDES C A C et al Polimixinas Revisatildeo com ecircnfase na sua
nefrotoxicidade Rev Assoc Med Bras 2009 55(6) 752-9
MOHR J F 3rd Update on the efficacy and tolerability of meropenem in the
treatment of serious bacteacuterial infections Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S41-51
2008
MONTEIRO J et al First report of KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae
strains in Brazil Antimicrob Agents Chemother Jan53(1)333-4 2009
MOREIRA V C et al Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia a antibioacuteticos
Disponiacutevel em
lthttpwwwcpglsucgbr6mostraartigosSAUDEVANESSA20CARVALHO20M
OREIRApdfgt Acesso em 21 marccedilo 2014
NETIKUL T et al Emergence of novel blaKPC-12 and blaKPC-13 variants in
carbapenem non-susceptible Enterobacter cloacae a first report of blaKPC gene in
Thailand European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases May
S372 2011
NETO V A et al Antibioacuteticos na praacutetica Meacutedica 6ordf Ediccedilatildeo Editorial
SarverSP Brasil 2007
NICOLAU D P Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of
meropenem Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S32-40 2008
64
OLIVEIRA A C et al Resistecircncia bacteriana e mortalidade em um centro de
terapia intensiva Rev Latino-Am Enfermagem nov-dez 2010
PAAUW A et al Failure to control an outbreak of qnrA 1-positive multidrug-
resistant Enterobacter clocae despite adequate implementation of recommended
infection control measures Journal of Clinical Microbiology v 45 n 5 p 1420-1425
2007
PATERSON D L et al Extended-Spectrum Beta-Lactamases a Clinical
Update Clinical Microbiology Reviews v 18 p 657-686 2005
PEIRANO G et al Carbapenem-hydrolysing beta-lactamase KPC-2 in
Klebsiella pneumonia isolated in Rio de Janeiro Brazil J Antimicrob Chemother Nov
20 2009
PERES-BOTA D et al Are infections due to resistant pathogens associated
with worse outcome in critically ill patients J Infect 200347(4)307-16
PIDDOCK L J V Clinically relevant chromosomally encoded multidrug
resistance effl ux pumps in bacterial Clin Microbiol Rev n19 p382-402 2006
PITOUT J D D et al Emergence of Enterobacteriaceae producing
extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) in the community J Antimicrob
Chemother May 56 2005
POSSEBON M I et al Resistecircncia bacteriana aos carbapenecircmicos
Bacterial resitence to carbapenems RBM rev bras med60(6)378380-378-382
jun 2003
QUEENAN A M et al Carbapenemases the versatile beta-lactamases
Clin Microbiol Rev Jul20(3)440-58 2007
65
RHOMBERG P R et al Summary trends for the meropenem yearly
susceptibility test information collection program a 10- year experience in the United
States (1999-2008) Diagnostic Microbiology and Infectiois Disease v 65 n4 p
414-426 2009
ROBLEDO I E et al Detection of KPC in Acinetobacter spp in Puerto Rico
J Antimicrob Agents Chemother 54 1354-1357 Mar 2010
ROGERS B A et al Country-to-country transfer os patients and the risk of
multi-resistant bacterial infection Clinical Infectious Disease v53 n1 p49- 56
2011
SHAH A A et al Characteristics epidemiology and clinicalimportance of
emerging strains of Gram-negative bacilli producing extended-spectrum
betalactamases Research in Microbiology v 155 p 409-421 2004
TURNER P J Extended- Spectrum Beta-Lactamases Clinical Infectious
Diseases v 41 p 273-275 2005
WOLTER D J et al Phenotypic and Enzymatic Comparative Analysis
between the Novel KPC variant KPC-5 and Its Evolutionary Variants KPC-2 and
KPC-4 Antimicrob Agents Chemother Nov 17 2008
WOODFORD N et al Carbapenemases of Chryseobacterium
(Flavobacterium) meningosepticum distribution of blaB and characterization of a
novel Metalo-beta-lactamase gene blaB3 in the type strain NCTC 10016
Antimicrob Agents Chemother Jun44(6)1448-52 2000
WOODFORF N Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in
India Pakistan and the UK a molecular biological and epidemiological study The
Lancet Infectious Diseases v 10 n 9 p 597-602 2010
66
WOODFORD et al Outbreak of Klebsiella pneumoniae Producing a New
Carbapenem- Hydrolyzing Class A β-Lactamase KPC-3 in a New York Medical
Center Antimicrobial agents and chemotherapy Dec 2004 p 4793ndash4799 Vol 48
No 12
YAGI T et al A preliminary survey of extended-spectrum β-lactamases
(ESBLs) in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Japan
FEMS Microbiology Letters 184 (2000) 53-56
YIGIT H et al Novel carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase KPC-1 from
a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumonia J Antimicrob Agents
Chemother 45 (4) 1151-1161 (2001)
ZAVASCKI A P et al KPC-2- producing Enterobacter cloacae in two cities
from Southern Brazil Int J Antimicrob Agents Apr 28 2009
ZHANEL G G et al Comparative review of the carbapenecircmicos Drugs
67(7)1027-52 2007
67
ANEXOS
Sequumlecircncia do oligo blaKPC
Query 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
Query 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
Query 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
68
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
Query 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
Query 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
69
Query 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
Query 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
Query 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
70
Sbjct 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
Query 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
Query 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
Query 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
71
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
Query 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
Query 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
72
Query 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
Query 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
Query 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
73
Sbjct 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
Query 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
Query 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
Query 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
74
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
Query 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
Query 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
75
Query 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
Query 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
||||
Sbjct 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
LOCUS AF297554 1377 bp
DNA linear BCT 26-MAR-2001
DEFINITION Klebsiella pneumoniae carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
gene complete cds
ACCESSION AF297554
VERSION AF2975541 GI10121874
76
KEYWORDS
SOURCE Klebsiella pneumoniae
ORGANISM Klebsiella pneumoniae
Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Enterobacteriaceae Klebsiella
REFERENCE 1 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH QueenanAM
AndersonGJ Domenech-SanchezA
BiddleJW StewardCD
AlbertiS BushK and TenoverFC
TITLE Novel carbapenem-hydrolyzing beta-
lactamase KPC-1 from a
carbapenem-resistant strain of
Klebsiella pneumoniae
JOURNAL Antimicrob Agents Chemother 45 (4)
1151-1161 (2001)
PUBMED 11257029
REFERENCE 2 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH AndersonGJ and
TenoverFC
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (19-AUG-2000) Nosocomial
Pathogens Laboratory Branch
Centers for Disease Control and
Prevention 1600 Clifton Rd MS
G08 Atlanta GA 30333 USA
FEATURES LocationQualifiers
77
source 11377
organism=Klebsiella
pneumoniae
mol_type=genomic DNA
db_xref=taxon573
-35_signal 5560
-10_signal 7883
mRNA 921012
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
RBS 117122
CDS 1311012
note=blaKPC-1
codon_start=1
transl_table=11
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
protein_id=AAG134101
db_xref=GI10121875
translation=MSLYRRLVLLSCLSWPLAGFSATALTNLVAEPFAKLEQD
FGGSI
GVYAMDTGSGATVSYRAEERFPLCSSFKGFLAAAVLARSQQQAGLLDTPIRYG
KNALV
PWSPISEKYLTTGMTVAELSAAAVQYSDNAAANLLLKELGGPAGLTAFMRSIG
DTTFR
78
LDRWELELNSAIPSDARDTSSPRAVTESLQKLTLGSALAAPQRQQFVDWLKGN
TTGNH
RIRAAVPADWAVGDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTRAPNKDDK
HSEAV
IAAAARLALEGLGVNGQ
ORIGIN
1 cggggcagtt acagccgtta cagcctctgg
agagggagcg gcttgccgct cggtgataat
61 cccagctgta gcggcctgat tacatccggc
cgctacacct agctccacct tcaaacaagg
121 aatatcgttg atgtcactgt atcgccgtct
agttctgctg tcttgtctct catggccgct
181 ggctggcttt tctgccaccg cgctgaccaa
cctcgtcgcg gaaccattcg ctaaactcga
241 acaggacttt ggcggctcca tcggtgtgta
cgcgatggat accggctcag gcgcaactgt
301 aagttaccgc gctgaggagc gcttcccact
gtgcagctca ttcaagggct ttcttgctgc
361 cgctgtgctg gctcgcagcc agcagcaggc
cggcttgctg gacacaccca tccgttacgg
421 caaaaatgcg ctggttccgt ggtcacccat
ctcggaaaaa tatctgacaa caggcatgac
481 ggtggcggag ctgtccgcgg ccgccgtgca
atacagtgat aacgccgccg ccaatttgtt
541 gctgaaggag ttgggcggcc cggccgggct
gacggccttc atgcgctcta tcggcgatac
79
601 cacgttccgt ctggaccgct gggagctgga
gctgaactcc gccatcccaa gcgatgcgcg
661 cgatacctca tcgccgcgcg ccgtgacgga
aagcttacaa aaactgacac tgggctctgc
721 actggctgcg ccgcagcggc agcagtttgt
tgattggcta aagggaaaca cgaccggcaa
781 ccaccgcatc cgcgcggcgg tgccggcaga
ctgggcagtc ggagacaaaa ccggaacctg
841 cggagtgtat ggcacggcaa atgactatgc
cgtcgtctgg cccactgggc gcgcacctat
901 tgtgttggcc gtctacaccc gggcgcctaa
caaggatgac aagcacagcg aggccgtcat
961 cgccgctgcg gctagactcg cgctcgaggg
attgggcgtc aacgggcagt aaggctctga
1021 aaatcatcta ttggcccacc accgccgccc
ttgcgggcgg catggattac caaccactgt
1081 cacatttagg ctaggagtct gcgcggcaga
gccgtgtgac cggttttctg tagagcactg
1141 acgatggcgg cggcgctctc tgcaattggc
aaggcgtcgg cgccaaggat accaatcttg
1201 cggcgcgcgg cgtgttatga cgactggggt
gcatttgagc cgccccattt aaccttcgcc
1261 ctcacagata cgccattcgc ctcaaattta
gcgccatgca gacgagcttc cactcggctt
1321 gcaccttgtc caggcccctc atgctgaact
gacgcaatcc catcaccgcc ttgatca
80
25
uma resposta adaptativa das Enterobacteacuterias o iacutendice de resistecircncia aos
carbapenecircmicos tem aumentado nos uacuteltimos anos de forma proporcional ao seu
uso limitando imensamente as opccedilotildees terapecircuticas para as infecccedilotildees causadas por
estes microrganismos (FALAGAS et al 2009)
As enzimas produtoras de betalactamases hidrolisam o anel betalactacircmico
tornando este mecanismo de resistecircncia o mais importante Os dois grupos mais
preocupantes satildeo o grupo das betalactamases de aspecto ampliado e os da
carbapenemases que aleacutem de hidrolizar os carbapenecircmicos hidrolizam todas as
outras classes de betalactacircmicos Em enterobacteacuterias as carbapenemases mais
prevalentes satildeo codificadas por genes dos grupos blaKpc blaIMP blaVIM blaNdm
e blaOxa A ocorrecircncia de carbapenemases eacute mais frequentemente em bacteacuterias
gram-negativas fermentadoras da glicose conhecidas como enterobacteacuterias
predominantes nos gecircneros Klebsiella Serratia Citrobacter Enterobacter
Escherichia Samonella Proteus Morganella Podem ser encontradas tambeacutem em
bacteacuterias gram-negativas natildeo fermentadoras como espeacutecies de Acinetobacter e de
Pseudomonas (ALVES et al 2013)
Carbapenemases satildeo enzimas plasmiacutedio-mediados resistentes a todos
antibioacuteticos betalactacircmicos As bacteacuterias que possuem o gene blaKpC responsaacutevel
pela codificaccedilatildeo da produccedilatildeo de carbapenemases apresentam resistecircncia aos
antibioacuteticos betalactacircmicos impedindo a accedilatildeo destes antibioacuteticos contra infecccedilotildees
(ALVES et al 2013)
A transmissatildeo das carbapenemases a diferentes cepas de enterobacteacuterias se
daacute atraveacutes de plasmiacutedeos que satildeo pequenas moleacuteculas circulares de DNA com a
capacidade de se replicarem independentemente do DNA cromossocircmico
permitindo a troca de material geneacutetico entre gecircneros e espeacutecies diferentes de
enterobacteacuterias O raacutepido desenvolvimento de surtos em ambientes hospitalares eacute
explicado por essa disseminaccedilatildeo plasmidial (COTRIM et al 2012)
De acordo com o criteacuterio de interpretaccedilatildeo do Clinical and Laboratory
Standards Institute (CLSI 2009) a maioria das KPC isoladas natildeo apresenta
resistecircncia completa aos carbapenecircmicos (Imipenem e Meropenem apresentam
uma Concentraccedilatildeo Inibitoacuteria Miacutenima (CIM) de 2-8 μgmL) (COTRIM et al 2012)
26
Os mecanismos de resistecircncia capazes de impedir a accedilatildeo dos
carbapenecircmicos satildeo vaacuterios Poreacutem a degradaccedilatildeo de antibioacuteticos por enzimas
principalmente as carbapenemases constituem o principal mecanismo de
resistecircncia aos antibioacuteticos β-lactacircmicos (DIAS 2009) Devido a ampla atividade
hidroliacutetica agrave maioria dos antibioacuteticos β-lactacircmicos estes grupos de enzimas possuem
alta versatilidade (QUEENAM et al 2007)
Existem trecircs grandes classes moleculares de Ambler a qual as
carbapenemases pertencem denominadas classe A (serino-carbapenemases os
quais incluem membros designados SME IMI NMC GES e a famiacutelia das KPCs)
classe B(as metalo-β-lactamase incluem os tipos IMP e VIM) e classe D
(oxacilinases similares as da classe A e incluem as OXA e PSE) (DIAS 2009)
Dentre estes as mais importantes e prevalentes encontradas em plasmiacutedeos
de Klebsiella pneumoniae satildeo as KPC (DIENSTMANN et al 2010) Por meio de
estudos moleculares a enzima KPC jaacute foi documentada em diferentes bacteacuterias e
diferenciada em KPC-1 a 13 (NETIKUL et al 2011) No ano de 2009 foi realizada
uma pesquisa onde descreveram as seguintes carbapenemases KPC-1 em isolados
de Klebsiella pneumoniae KPC-2 em K pneumoniae K oxytoca Salmonella
enterica e em Enterobacter sp e KPC-3 em K pneumoniae e Enterobacter cloacae
(MONTEIRO et al 2009) As enzimas KPC-4 e KPC-5 foram encontradas em
isolados de Pseudomonas aeruginosa (PEIRANO et al 2009)
Foi observada uma correccedilatildeo da sequumlecircncia KPC-1 indicando que o gene
blaKPC-1 e blaKPC-2 satildeo idecircnticos Trecircs novas variantes blaKPC-3 blaKPC-4 e
blaKPC-5 satildeo resultados de mutaccedilotildees do gene estrutural da enzima KPC-2
(WOLTER et al 2008) apresentando diferentes perfis de hidroacutelise As enzimas
KPC-2 e KPC-3 possuem alta eficiecircncia em hidrolisar cefalotina cefaloridina e
nitrocefin poreacutem possuem uma menor eficiecircncia contra carbapenecircmicos e
cefotaxima (ALBA et al 2005) As enzimas KPC-5 e KPC-4 apresentam menor
hidroacutelise de carbapenecircmicos eacute do que em KPC-2 Em contrapartida possuem
melhor eficiecircncia contra ceftazidima e uma maior inibiccedilatildeo pelo aacutecido clavulacircnico
(WOLTER et al 2008)
27
13 Anaacutelise geneacutetica de microrganismos
Eacute de extrema importacircncia praacutetica natildeo soacute no aspecto cliacutenico mas tambeacutem na
fitopatologia biotecnologia e estudos ambientais a correta identificaccedilatildeo e
classificaccedilatildeo de microrganismos Os meacutetodos usados na diferenciaccedilatildeo de gecircneros
espeacutecies e estirpes de microrganismos podem ser divididos em meacutetodos fenotiacutepicos
(baseados em fenocircmenos bioquiacutemicos fisioloacutegicos e bioloacutegicos) e genotiacutepicos
(detectam polimorfismos ao niacutevel dos aacutecidos nucleacuteicos ou variaccedilatildeo aleacutelica ao niacutevel
de enzimas) (ALVES et al 2003)
Para este tipo de estudo existem alguns meacutetodos como o RFLPrsquos -
ldquoRestriction Fragment Length Polymorphismsrdquo (polimorfismos de tamanho de
fragmentos de restriccedilatildeo) rep-PCR (Meacutetodo de tipagem baseado na amplificaccedilatildeo via
PCR de elementos de DNA repetitivos presentes em genomas bacterianos) anaacutelise
de sequumlecircncias nucleotiacutedeas (discriminaccedilatildeo eou identificaccedilatildeo atraveacutes de sequumlecircncias
de DNA) PFGE - Pulsed-Field Gel Electrophoresis (Eletroforese em campo
pulsado) ( A L V E S et al 2003)
A diferenciaccedilatildeo clara da cepa e principalmente a alta reprodutibilidade devem
ser caracteriacutesticas de qualquer meacutetodo de tipagem geneacutetica Poreacutem nem todos os
meacutetodos moleculares de tipagem satildeo igualmente eficazes Sendo assim de acordo
com a finalidade pretendida (identificaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo custo reprodutibilidade
etc) eacute feita a escolha do meacutetodo a ser aplicado (A L V E S et al 2003)
O processo de identificaccedilatildeo fenotiacutepica de KPC entre os membros da famiacutelia
Enterobacteriaceae ainda eacute difiacutecil e os meacutetodos para a sua identificaccedilatildeo devem ser
revistos e ajustados Mesmo com o avanccedilo tecnoloacutegico natildeo existem ensaios que
combinam alta especificidade e sensibilidade na detecccedilatildeo destas enzimas Satildeo
diversas as metodologias usadas para rastreamento de KPC como por exemplo a
focalizaccedilatildeo isoeleacutetrica a teacutecnica de disco-difusatildeo E-test teste de Hodge
modificado dentre outros Aleacutem disso a pesquisa do gene blaKPC pode ser feita
pela Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) Os sistemas de automaccedilatildeo
existentes no entanto podem natildeo identificar com precisatildeo os isolados KPC
positivos (COTRIM et al 2012)
A identificaccedilatildeo blaKPC pelo PCR eacute um meacutetodo raacutepido preciso sensiacutevel e
altamente especiacutefico no entanto a PCR exige equipamento e conhecimentos
28
especializados em diagnoacutestico molecular dificultando ainda a utilizaccedilatildeo dele na
rotina dos laboratoacuterios de microbiologia (COTRIM et al 2012)
Em estudo de infecccedilotildees hospitalares identificaccedilatildeo molecular de patoacutegenos
bacterianos eacute bastante utilizada Para diferenciar carbapenemases tipo KPC a partir
de outros tipos como SME NMC-A-IMI e GES eacute necessaacuterio um exame molecular
As identificaccedilotildees do microrganismo juntamente com a triagem molecular iratildeo definir
um resultado mais especiacutefico podendo ser usado para identificar o antibioacutetico mais
adequado para o tratamento Poreacutem a principal desvantagem de alguns exames
baseados em PCR por exemplo eacute que devido agrave sua limitada capacidade de
multiplexaccedilatildeo eles distinguem apenas algumas variaccedilotildees (MOREIRA et al 2014)
Estatildeo descritas para a identificaccedilatildeo molecular de patoacutegenos pertencentes agrave
famiacutelia Enterobacteriaceae as teacutecnicas de PFGE RAPD (randomly amplified
polymorphic DNA) e ERIC-PCR (Enterobacterial Repet it ive Intergenic Consensus)
A PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) eacute considerada padratildeo ouro devido sua
alta capacidade de diferenciaccedilatildeo baseada na anaacutelise do perfil de restriccedilatildeo do DNA
genocircmico por meio de eletroforese Como desvantagem para a sua execuccedilatildeo eacute
necessaacuterios vaacuterios dias impedindo a tipagem de algumas cepas bacterianas devido
agrave degradaccedilatildeo do DNA aleacutem do alto custo empregado (MOREIRA et al 2014)
O meacutetodo baseado em ERIC-PCR tem sido bastante utilizado como uma
alternativa para a teacutecnica de PFGE Esta teacutecnica consiste na anaacutelise do padratildeo de
amplificaccedilatildeo de elementos repetidos encontrados no genoma bacteriano Isto
permite uma maior rapidez na obtenccedilatildeo de resultados quando comparada com o
PFGE aleacutem de alta reprodutibilidade simples execuccedilatildeo e implementaccedilatildeo baixo
custo e natildeo sem problemas com a degradaccedilatildeo do DNA (MOREIRA et al 2014)
A PCR eacute considerada uma teacutecnica de biologia molecular revolucionaacuteria que
consiste na siacutentese enzimaacutetica de coacutepias de aacutecidos nucleacuteicos Ela permitiu o raacutepido
desenvolvimento do estudo de sequumlecircncias de aacutecidos nucleacuteico Foi desenvolvida por
Kary Banks Mullis que ganhou o precircmio Nobel de quiacutemica de 1993 devido ao
desenvolvimento dessa teacutecnica em abril de 1983 (CAMARGO et al 2014)
Por meio de etapas de variaccedilatildeo de temperatura a teacutecnica de PCR promove a
duplicaccedilatildeo de cadeias de DNA in vitro A reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo de DNA por PCR
envolve o emprego de sequumlecircncias iniciadoras (primers) quatro nucleotiacutedeos
29
(dNTPrsquos) do DNA e uma DNA polimerase termoestaacutevel podendo assim obter-se a
partir de uma fita molde muitas coacutepias de uma sequumlecircncia especiacutefica de aacutecido
nucleacuteico O princiacutepio da PCR consiste na variaccedilatildeo de temperatura por ciclo
envolvendo trecircs etapas baacutesicas desnaturaccedilatildeo pareamento e amplificaccedilatildeo
(CAMARGO et al 2014)
A desnaturaccedilatildeo da fita molde de DNA eacute uma etapa com duraccedilatildeo entre 30
segundos a 1 minuto a temperatura entre 92 ordmC a 96 ordmC Apoacutes isso o pareamento de
dois iniciadores sinteacuteticos de composiccedilotildees distintas que funcionam como os
iniciadores da reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo liga-se agrave regiatildeo complementar da fita de
DNA alvo que sofreraacute a duplicaccedilatildeo Esta etapa tem duraccedilatildeo de 30 segundos a 1
minuto a temperatura entre 58 ordmC e 65 ordmC Por uacuteltimo a amplificaccedilatildeo por meio da
enzima Taq DNA polimerase das novas fitas de DNA se daacute a partir de cada um dos
iniciadores utilizando os quatro dNTPrsquos como substrato da reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo
Esta etapa possui duraccedilatildeo entre 45 segundos e 1 minuto a 72 ordmC Cada ciclo eacute
repetido em torno de 30 a 35 vezes e promove a amplificaccedilatildeo da regiatildeo alvo
determinada conforme o anelamento dos iniciadores sinteacuteticos de DNA (CAMARGO
et al 2014) Estas etapas estatildeo demonstradas na figura 4
Figura 4 Etapas da Reaccedilatildeo de PCR
30
2 JUSTIFICATIVA
No ano de 2010 no Distrito Federal foram identificados 111 pacientes com
suspeita de infecccedilatildeo por Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) e a
Secretaria de Sauacutede do Distrito Federal confirmaram ainda a morte de 18 pacientes
dentre os hospitais puacuteblicos e particulares Um desafio encontrado por ocasiatildeo do
surto infeccioso no Distrito Federal foi o de confirmar as KPCs por Reaccedilatildeo da
Polimerase em Cadeia sendo que as amostras foram enviadas com esta finalidade
para a Fiocruz no Rio de Janeiro
Pesquisas que possam contribuir na elaboraccedilatildeo de estrateacutegias preventivas e
de intervenccedilatildeo para infecccedilotildees causadas por enterobacteacuterias bem como contribuir
para gerar uma integraccedilatildeo beneacutefica entre a equipe acadecircmica e os serviccedilos de
sauacutede devem ser estimuladas Neste sentido o presente estudo permitiu escrutinar
os genes envolvidos na expressatildeo de carbapenemases presentes em espeacutecies de
enterobacteacuterias isoladas em ambiente hospitalar visto que elucidar genes de
resistecircncia de enterobacteacuterias aos antibioacuteticos carbapenecircmicos eacute o primeiro passo
para garantir um controle epidemioloacutegico efetivo para estes tipos de microorganismo
assim como sua associaccedilatildeo com surtos fatais particularmente em pacientes com
baixa imunidade
31
3 OBJETIVOS
31 Objetivo geral Caracterizar os genes de resistecircncia das
Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases e os aspectos epidemioloacutegicos de
pacientes internados em um hospital puacuteblico do Distrito Federal
32 Objetivos Especiacuteficos
Identificar genotipicamente a enzima KPC (Klebsiella pneumoniae
carbapenemase) de isolados de Klebsiella pneumoniae
Investigar aspectos epidemioloacutegicos dos pacientes portadores de
Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases
Identificar quais variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana influenciaram para o
desfecho oacutebito ou alta
Avaliar a susceptibilidade das Enterobacteacuterias aos antibioacuteticos
carbapenecircmicos dos pacientes em ambiente hospitalar
32
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
Trata-se de um estudo transversal onde foi realizado o teste de
susceptibilidade das enterobacteacuterias aos antibioacuteticos carbapenecircmicos a partir dos
materiais bioloacutegicos coletados dos pacientes internados no Hospital Regional da Asa
Norte (HRAN) e enviados ao Laboratoacuterio de Anaacutelises Cliacutenicas da mesma Instituiccedilatildeo
Os materiais bioloacutegicos investigados foram sangue aspirado traqueal ou brocircnquico
urina e cultura semi quantitativa de ponta de cateter venoso central O HRAN eacute um
hospital puacuteblico do Distrito Federal com 395 leitos sendo as cliacutenicas de internaccedilatildeo
Berccedilaacuterio Cirurgia Geral Cirurgia Plaacutestica Cliacutenica Meacutedica Ginecologia Maternidade
Pediatria Queimados UTI com atendimento a pacientes portadores de doenccedilas de
caraacuteter cliacutenico e ciruacutergico
4 1 Coleta e transporte das amostras bioloacutegicas
As amostras foram coletadas de pacientes internados no Hospital Regional da
Asa Norte (HRAN) com suspeitas de infecccedilatildeo por KPC A identificaccedilatildeo primaacuteria foi
realizada pelo Laboratoacuterio de Microbiologia do hospital de origem dos pacientes e os
demais procedimentos que foram utilizados na identificaccedilatildeo encontram-se descritos
abaixo
4 2 Procedimentos para confirmaccedilatildeo de resistecircncia bacteriana por
disco de ertapenem (adaptado CDC 2004)
Para diagnosticar amostra como portadora de bacteacuteria produtora de
carbapenemase foi realizado o teste com disco de ertapenem como forma de
triagem Inicialmente utilizou-se o swab contaminado com a amostra que foi
distribuiacuteda em uma pequena aacuterea da placa de aacutegar MacConkey para apoacutes o
crescimento ser realizada a pesquisa de colonizaccedilatildeo por enterobacteacuterias resistentes
aos carbapenecircmicos (Pesquisa de CRE) Procedeu-se a semeadura por teacutecnica
semi-quantitativaesgotamento com alccedila bacterioloacutegica na diluiccedilatildeo de 1100 O disco
de Ertapenem foi colocado na superfiacutecie da placa de MacConkey na junccedilatildeo dos dois
primeiros campos de semeadura conforme demonstrado na figura 5 Incubou a placa
33
em estufa aeroacutebia a 35ordmC por 24 e 48 horas e observou-se o halo de difusatildeo do
disco de Ertapenem na placa para proceder agrave leitura
O teste deixou de ser obrigatoacuterio apoacutes a modificaccedilatildeo dos criteacuterios
interpretativos para carbapenecircmicos para enterobacteacuterias publicados no suplemento
do CLSI 2010 M100-S20-U
Figura 5 Mecanismo de semeamento de material bioloacutegico oriundos de
pacientes com suspeita de infecccedilatildeo por KPC Fonte adaptado CDC 2004
4 2 1 Interpretaccedilatildeo dos resultados
Na ausecircncia de crescimento ateacute 24 horas (MacConkey) ou halo de difusatildeo
gt27 mm na placa deve-se reincubar as placas por mais 24 horas Quando for
ausente o crescimento apoacutes 48 horas ou halo de difusatildeo gt27 mm na placa libera-se
como enterobacteacuterias resistentes a carbapenecircmicos (KPCNEG)Havendo
crescimento de colocircnias na placa de MacConkey com halo lt 27 mm (apenas para
colocircnias com crescimento dentro do halo) deve-se reisolar e realizar identificaccedilatildeo e
antibiograma automatizado teste de sensibilidade por disco-difusatildeo e Teste de
Hodge Modificado (THM) Os isolados de enterobacteacuterias cujos testes comprovarem
a resistecircncia aos carbapanecircmicos testados (KPCPOS) foram reportado a Comissatildeo
de Controle de Infecccedilatildeo Hospitalar (CCIH) Jaacute osbacilos Gram-negativos natildeo
fermentadores natildeo foram reportados (KPCNEG) Para interpretaccedilatildeodos resultados
foram utilizados os valores conforme demonstrados na tabela 1
Tabela 1 Criteacuterios Interpretativos para testes de sensibilidade
ENTEROBACTEacuteRIAS
Disco difusatildeo (mm) MIC (microgml)
34
Antibioacutetico Sigla S I R S I R
Ertapenem 10
microg
ETP 22 19-
21
18 05 1 2
Meropenem 10
microg
MEM 23 20-
22
19 1 2 4
Fonte Manual Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)
2013
Os resultados que apresentaram resistecircncia ao antibioacutetico Ertapenem foram
considerados como suspeitos de contaminaccedilatildeo por KPC Fez-se o teste de
susceptibilidade aos antibioacuteticos (TSA) em aparelho automatizado MicroScan Walk
Away 96sl Dade Behring
4 3 Teste de susceptibilidade aos antibioacuteticos (adaptado CDC 2004)
A determinaccedilatildeo da susceptibilidade dos isolados foi feita pelo teste de
susceptibilidade aos antibioacuteticos (TSA) apoacutes cultura em meio de gelose simples
(INSA) para avaliaccedilatildeo da sua pureza e obtenccedilatildeo de colocircnias isoladas Para
preparaccedilatildeo de uma suspensatildeo bacteriana com turvaccedilatildeo aproximada de 05
McFarland (Dade BehringMicroScanregTurbidity Meter) ressuspendeu duas a cinco
colocircnias em 2ml de soro fisioloacutegico esteacuteril diluindo a 1100 em soro fisioloacutegico num
volume total de 10ml em seguida foi feita uma semeadura em duas placas
quadradas (120mm x 120mm) de Muller-Hinton Agar (INSA) por inundaccedilatildeo
Os discos de antibioacutetico carbapenecircmicos imipenem meropenem e
ertapenem (Biorad) foram aplicados com o auxiacutelio de um dispensador automaacutetico A
susceptibilidade das Enterobacteacuterias aos carbapenecircmicos foi definida de acordo
com o protocolo Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI 2011)
Para aquelas Enterobacteacuterias que apresentaram resistecircncia ao ertapenem
foram realizados o Teste de Hodge Modificado para Detecccedilatildeo de Enterobacteacuterias
Produtoras de Carbapenemases conforme descrito pelo Centers for Disease Control
and Prevention (CDC 2004)
35
4 4Teste de Hodge Modificado (THM) (adaptado CDC 2004)
Preparou-se uma suspensatildeo em salina esteacuteril com a cepa Escherichia coli
ATCC 25922 (padratildeo 05 de McFarland) Apoacutes isto diluiu a suspensatildeo 110 em
salina (05 ml da soluccedilatildeo de Ecoli ATCC 25922 + 45 ml salina)Foi entatildeo semeado
na superfiacutecie de uma placa de Agar Muller-Hinton com a suspensatildeo diluiacuteda de Ecoli
ATCC 25922 com auxilio de swab seco assegurando que houvesse uma
distribuiccedilatildeo uniforme cobrindo toda a superfiacutecie do Agar Deixou secar por 3 a 5
minutos em temperatura ambienteColocou-se o disco de ertapenem 10microg no centro
da placa e apoacutes isto fez-se uma estria linear da cepa a ser testada da borda do
disco ateacute a borda da placa utilizando uma alccedila calibrada 10 microl ou um swab Incubou
a placa na estufa em atmosfera aeroacutebia a 35 plusmn 2ordmC por 16 a 24 horas
441 Controle de qualidade (CQ)
Foi utilizado um CQ todos os dias em que se realizou o teste tendo como
controle Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1705- teste de Hodge modificado
positivo Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1706- teste de Hodge modificado
negativo
442 InterpretaccedilatildeoResultados
Apoacutes 16ndash24 horas de incubaccedilatildeo examinar as placas para verificar a presenccedila
de uma distorccedilatildeo no halo de inibiccedilatildeo do disco de ertapenem devido ao crescimento
realccedilado da cepa ATCC na intersecccedilatildeo do organismo teste e a Ecoli ATCC 25922
dentro dos limites do halo O THM positivo apresentaraacute presenccedila de distorccedilatildeo no
halo de inibiccedilatildeo de ertapenem devido ao crescimento da cepa Ecoli ATCC 25922 ao
longo da estria da cepa teste para dentro dos limites do halo de inibiccedilatildeo Jaacute o THM
negativo teraacute ausecircncia de crescimento da cepa Ecoli ATCC 5922 ao longo da estria
da cepa teste para dentro dos limites do halo de inibiccedilatildeo do disco de ertapenem
Este resultado estaacute representado na figura 6
36
Figura 6 Interpretaccedilatildeo resultado do Teste de Hodge Modificado
(adaptado CDC 2004) Teste positivo na estria da cepa teste na parte superior
da placa teste negativo na estria da cepa teste na parte inferior da placa
Tendo positivo como resultado o paciente era um provaacutevel contaminado por
KPC As amostras entatildeo foram encaminhadas para a Fundaccedilatildeo Osvaldo Cruz
(FIOCRUZ) para confirmaccedilatildeo final As amostras finalmente confirmadas como
positivas para KPC foram isoladas e guardadas no banco de cepas cliacutenicas do
hospital Apoacutes a autorizaccedilatildeo do CEP amostras das cepas foram transferidas para
meio de transporte Stuard em caixa teacutermica fechada em baixa temperatura e
levadas para o laboratoacuterio de microbiologia cliacutenica da universidade
No laboratoacuterio da universidade as amostras foram separadas e realizadas
repiques em meios MacConkey e incubadas por 24h As colocircnias caracteriacutesticas
foratildeo isoladas em caldo BHI e mantidas em shaker a 37oC por 2h Apoacutes isto foram
executadas as anaacutelises a seguir
Os isolados de Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases foram
submetidos agrave extraccedilatildeo de DNA e posterior sequumlenciamento para identificaccedilatildeo dos
genes de resistecircncia blaKPC de 1 a 13 e identificaccedilatildeo do gene universal Os
pacientes de onde os materiais bioloacutegicos contendo as Enterobacteacuterias produtoras
de carbapenemases foram os isolados foram investigados quanto aos aspectos
epidemioloacutegicos e cliacutenicos
37
4 5 Extraccedilatildeo de DNA bacteriano
A extraccedilatildeo de DNA bacteriano foi realizada utilizando o kit NucleoSpin
Plasmidreg (MN) Antes de iniciar a extraccedilatildeo foi feito a preparaccedilatildeo das soluccedilotildees
reagentes materiais e amostras (vortexando) colocou-se em banho-maria agrave 50ordmC o
tampatildeo AW Partiu-se de colocircnias isoladas cultivadas que sofreram passagem em
meio LB liacutequido por 12h Adicionou-se 15 mL da amostra no tubo eppendorf
centrifugou por 5 minutos descartou o sobrenadante (com cuidado para natildeo
descartar o Pellet) Repetiu-se este procedimento por mais trecircs vezes completando-
se o volume de 6mL Foram adicionados 250microL do tampatildeo Resuspension Buffer A1
encostando a ponteira no Pellet e misturando (este tampatildeo tem como funccedilatildeo
separar a formaccedilatildeo de grumos celulares) Apoacutes isso homogeneizou e vortexou os
tubos eppendorfs Apoacutes isso foram adicionados 250microL do tampatildeo Lysis Buffer A2
homogenizou e deixou descansar por 5 minutos (esta etapa eacute importante para a lise
da parede e da membrana celulares e liberaccedilatildeo do conteuacutedo da ceacutelula)
Passado o tempo de descanso foi adicionado 300microL do tampatildeo
Neutralization Buffer A3 homogeneizou e centrifugou por 10 minutos (este tampatildeo
iraacute retirar as proteiacutenas que envolvem o DNA e voltaraacute com o pH para proacuteximo de 8
impedindo que a soluccedilatildeo de lise facilite a quebra das ligaccedilotildees covalentes do aacutecido
nucleacuteico) Em seguida enumeraram-se os tubos contendo filtros com siacutelica
transferiu-se o sobrenadante para o filtro e centrifugou por 5 minutos Descartou-se
o que foi filtrado adicionou 500microL do tampatildeo AW (banho-maria) centrifugou por 2
minutos Novamente foi descartado o filtrado Adicionou-se 600microL do tampatildeo A4
centrifugou por 2 minutos e descartou o filtrado (os tampotildees AW e A4 contecircm
isotiocianato de guanidina em concentraccedilotildees crescentes para facilitar a adsorccedilatildeo
do DNA na siacutelica e retirada das outras biomoleacuteculas da amostra) Foi feita outra
centrifugaccedilatildeo com o tubo vazio Apoacutes isto o filtro foi trocado para outro eppendorf
definitivo onde foi adicionado 50microL do tampatildeo Elution Buffer AE (este tampatildeo
favorece a eluiccedilatildeo do DNA) centrifugou por 2 minutos descartou o filtro e
armazenou as amostras em freezer -20ordmC
38
4 6 Iniciadores e reaccedilatildeo de PCR
Os iniciadores universais para o gene blaKPC foram desenhados baseados
em sequumlecircncias conservadas apresentadas pelos sub-grupos de genes que
codificam a enzima carbapenemase de klebsiella pneumoniae (YIGIT et al 2001)
Baseado na sequumlecircncia para o blakpc-1 depositada no GenBank
(AF2975541) o oligonucleotiacutedio (oligo) iniciador direto (5-
ATGTCACTGTATCGCCGTC-3rsquo) foi desenhado para reconhecer a sequumlecircncia
blaKPC na posiccedilatildeo (131149) enquanto que o iniciador reverso (5-
TTACTGCCCGTTGACGCC-3rsquo) foi reconhecido na posiccedilatildeo (9951012) As anaacutelises
baseadas em alinhamento de sequumlecircncias mostraram que o par de iniciadores
blaKPC podem detectar os alelos de 1 a 13 do gene blaKPC conforme a tabela 2
Tabela 2 Nuacutemero de acesso ao GenBank dos alelos blaKPC e seus
microrganismos originais
Nuacutemero de
Acesso GenBank
Microrganismo Alvo
AF2975541 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-1
GU0862251 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-2
HQ2589341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-2-like
AB5577341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC -3
EU4473041 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-4
EU4002222 Pseudomonas
aeruginosa
blaKPC-5
EU5555341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-6
EU7297271 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-7
39
FJ2344121 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-8
FJ624872 Escherichia coli blaKPC-9
GQ1403481 Acinetobacter
baumannii
blaKPC-10
HM0669951 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-11
HQ3428891 Enterobacter cloacae blaKPC-12
HQ3428901 Enterobacter cloacae blaKPC-13
As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo de blaKPC foram realizadas em um
primeiro tempo de desnaturaccedilatildeo em que foi 94ordmC por 5 minutos seguido de 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 58 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 90 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 78ordmC por 8 minutos Aleacutem das amostras foi utilizado um
controle negativo
A PCR do blaKPC foi realizada utilizando os componentes para o volume da
reaccedilatildeo de 25 microL citados na tabela 3 A banda do tamanho do produto de PCR foi de
881 pares de bases (pb) o que corresponde ao plasmiacutedeo
Tabela 3 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do
gene blaKPC
Reagente Volume
DNA molde 4 microL
Tampatildeo Taq 25 microL
MgCl2 075 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP
2 microL
Oligo F 1 microL
Oligo R 1 microL
Taq DNA polimerase 05 microL
Aacutegua MiliQ 1335 microL
40
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
Baseado na sequumlecircncia para o gene 16S rRNA em que o oligonucleotiacutedio
Universal iniciador direto foward (5-CCAGCAGCCGCCGTAATACG-3rsquo) foi
desenhado para reconhecer a sequumlecircncia universal na posiccedilatildeo 1513 enquanto que o
iniciador reverso (5-ATCGGYTACCTTGTTACGACTTC-3rsquo) foi reconhecido na
posiccedilatildeo 1491 foram realizadas PCRrsquos As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo deste
gene foram realizadas nos seguinte tempos separaccedilatildeo 94ordmC por 10 minutos 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 55 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 120 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 72ordmC por 10 minutos
A PCR do gene 16S rRNA foi realizada utilizando os componentes para o
volume da reaccedilatildeo de 25microL citados na tabela 4 A banda do tamanho do produto de
PCR foi de 996 pb correspondente aacute regiatildeo ribossomal capaz de amplificar todas
as espeacutecies
Tabela 4Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do gene
universal
Reagente (quantidade
concentraccedilatildeo do estoque)
Volume
DNA molde 10 ng 4 microL
Tampatildeo Taq 10 x 25 microL
MgCl2 50mM 125 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP 25 mM
125 microL
Oligo F 10microM 05 microL
Oligo R 10microM 05 microL
Taq DNA polimerase 5UmicroL 04 microL
Aacutegua Miliq 146 microL
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
41
O termociclador utilizado para os experimentos foi o LifeTouch da BIOER
4 7 Digestatildeo
Para realizaccedilatildeo da digestatildeo foi utilizada a enzima BshF I (Hae III) EN- 1105
tamanho 7000 units concentraccedilatildeo 10 unitsmicroL fonte Bacillus sphaericus empresa
Jena bioscienceUtilizaram-se os componentes para o volume de 50microL da reaccedilatildeo
citados na tabela 5
Tabela 5 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da digestatildeo do gene
universal
Reagente Volume
Produto de PCR 10 microL
Enzima BshF I 01 microL
Tampatildeo (10x) 5 microL
Aacutegua Miliq 349 microL
Total (em cada ependorff) 50 microL
Valores para 1 digestatildeo
Os ependorffs foram colocados por 30 minutos em banho-maria a 37ordmC Apoacutes
isso fez-se a corrida das amostras em gel de agarose para verificaccedilatildeo do resultado
(LU et al 2000)
4 8 Eletroforese em gel de agarose
Os produtos de DNA PCR e digestatildeo foram analisados em gel de agarose
2 O tempo de corrida do gel eacute de aproximadamente 1hora e 30minutos sendo
que no comeccedilo foi usada agrave voltagem de 50 V e apoacutes comeccedilar a correr o gel
aumentou a voltagem para 100 v Utilizou-se o marcador de 100pb (pares de bases)
Foi adicionado 3microL de corante Bromophenol (que tem a funccedilatildeo de fazer uma ligaccedilatildeo
na amostra de DNA e permitir a visualizaccedilatildeo da corrida no gel de agarose) em 7microL
de amostra tanto de DNA quanto de PCR Para o preparo do gel foi utilizado TBE
42
(Tris- Aacutecido Boacuterico) agarose e brometo de etiacutedio (sua funccedilatildeo eacute de corante para o gel
e permitir a visualizaccedilatildeo do DNA quando colocado agrave luz ultravioleta) Para o oligo
blaKPC a banda da amplificaccedilatildeo foi em 881ppb correspondendo ao plasmiacutedeo Jaacute
o oligo Universal foi em 996 pb
4 9 Descarte de resiacuteduos
Todos os materiais utilizados nos ensaios foram de uso uacutenico e manipulados
em cacircmaras de seguranccedila bioloacutegica classe II Apoacutes o uso foram colocados em
soluccedilatildeo desinfetantes (hipoclorito a 1) e em seguida autoclavados a 127oC por 20
min em sacos apropriados para autoclavaccedilatildeo Apoacutes a finalizaccedilatildeo do ciclo de
esterilizaccedilatildeo os sacos contendo o material descartaacutevel foram colocados em
recipientes de coleta da empresa responsaacutevel pela coleta de materiais bioloacutegicos
produzidos no laboratoacuterio de microbiologia Todos os procedimentos seguiram a
normativa RDC-ANVISA 3062004 sobre o descarte de resiacuteduos de serviccedilo de
sauacutede
4 10 Aspectos epidemioloacutegicos e cliacutenicos
Os aspectos cliacutenicos e epidemioloacutegicos foram investigados por meio de
prontuaacuterios dos pacientes portadores de enterobacteacuterias produtoras de
carbapenemases e envolveram topografia mais provaacutevel do foco infeccioso a
enfermidade motivadora da internaccedilatildeo o desfecho cliacutenico a idade e o tempo de
internaccedilatildeo
4 12 Anaacutelises eepidemioloacutegicas
As anaacutelises foram realizadas com o pacote estatiacutestico SPSS versatildeo 200
Para verificar quais variaacuteveis referentes aos dados epidemioloacutegicos e
microbioloacutegicos influenciaram no desfecho verificou- se a diferenccedila meacutedia das
variaacuteveis idade e tempo de internaccedilatildeo em cada grupo O teste estatiacutestico utilizado foi
o teste t de Student apoacutes se executar o teste de normalidade de Shapiro-Wilk Para
as variaacuteveis sexo perfil microbioloacutegico das enterobacteacuterias produtoras de
43
carbapenemases foi avaliada a associaccedilatildeo com o desfecho por meio do teste Exato
de Fisher O niacutevel de significacircncia adotado foi de 5
4 13 Preceitos eacuteticos
Este projeto estaacute inserido em um projeto maior denominado ldquoEpidemiologia
cliacutenica e caracterizaccedilatildeo molecular do Acinetobacter Baumannii resistente a
antibioticoterapia em pacientes internado em hospitais do Sistema Uacutenico de Sauacutederdquo
que foi submetido ao Comitecirc de Eacutetica em Pesquisa da Secretaria do Estado de
Sauacutede do Distrito Federal (SESDF) e emitido parecer aprovado pelo protocolo nordm
23109 (anexo)
44
5 RESULTADOS
51 Anaacutelise molecular
Para a amplificaccedilatildeo com o oligo blaKPC foram amplificadas amostras
que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 881 pb correspondente ao
plasmiacutedeo A anaacutelise da amplificaccedilatildeo da regiatildeo do gene blaKPC mostrou que
apenas a amostra A10 natildeo amplificou isso demonstra que esta amostra natildeo
possuiacutea o gene de resistecircncia
5 1 1 Gene blaKPC
Figura 7 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 881 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
A amostra A3 natildeo amplificou no primeiro momento entatildeo foi realizado
novamente a PCR e corrida de gel obtendo entatildeo a amplificaccedilatildeo da amostra como
apresentado na figura 8
45
Figura 8 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC da
mostra A3 estudada A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo de 881
pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 1 2 Gene 16S rRNA
Para a amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA utilizou-se o oligo universal Foram
amplificadas amostras que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 996 pb
Figura 9 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
46
Segundo Lu et al (2000) a digestatildeo com a enzima HaeIII deste amplicons de
16S rRNA devolveriam bandas com perfis entre 150 a 200 pb No gel abaixo eacute
possiacutevel evidenciar que este perfil ocorreu com o predomiacutenio de bandas na altura
de 200pb
Figura 10 Gel de agarose a 2 da digestatildeo do amplicon do gene 16S
rRNA das amostras com a enzima HaeIII evidenciando diversos fragmentos
proacuteximos a 200 pb A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo ribossomal
de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 2 Anaacutelises epidemioloacutegicas
5 2 1 Sexo
No total foram detectados 17 isolados de KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 onde a maior a prevalecircncia foi
detecatada em amostras de pacientes do sexo masculino (53) do que no sexo
feminino (47)
47
Figura 11 Isolado de KPC segundo sexo dos 17 pacientes investigados
no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 2 Desfecho cliacutenico
Em 17 isolados de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo
de 2010 aacute 2011 a porcentagem de pacientes que foram a oacutebito (59) foi maior que
a de pacientes que tiverm alta (41)
Figura 12 Isolado de KPC segundo desfecho cliacutenico dos 17 pacientes
investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
48
5 2 3 Local da coleta
Dos 17 episoacutedios detectados de infecccedilatildeo por KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 a infecccedilatildeo em swab retalfoi mais
frequente (47) seguida de ponta de cateacuteter (18) e secreccedilatildeo traqueal (12)
Figura 13 Isolados de KPC segundo local da coleta da amostra nos 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 4 Microorganismo
O microorganismo mais encontrado foi a Klebsiella pneumoniae (82)
seguida da Enterobacter clocae (12) e Serratia marcescens (6) dos 17 isolados
de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 Isto afirma o
fato de a sigla KPC ser utilizada de forma errocircnea aacute Klebsiella pneumoniae visto
que a evidecircncia dela eacute maior em relaccedilatildeo as outras cepas
49
Figura 14 Isolado de KPC segundo microrganismo encontrado em 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 5 Relaccedilotildees variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana e desfecho
cliacutenico
Tabela 6 ndash Distribuiccedilatildeo do perfil geneacutetico sexo coleta tipificaccedilatildeo de
microrganismos e anaacutelise da resistecircncia bacteriana segundo o desfecho
cliacutenico Brasiacutelia-DF 2010 a 2011
Variaacutevel Resultado
Desfecho
Alta Oacutebito
N N P
Gene 16S rRNA Positivo 7 1000 10 1000
NA Gene blaKPC Positivo 6 857 10 1000
Negativo 1 143 0 00 0218 Sexo Feminino 2 286 6 600
Masculino 5 714 4 400 0201 Local da coleta Fundo saco de
Douglas 1 143 0 00
Hemocultura 0 00 1 100 0463 Ponta de cateter 1 143 2 200
Sec TraquealBrocircnquica
0 00 1 100
50
Secreccedilatildeo traqueal 2 286 0 00
Swab retal 3 429 5 500
Urina 0 00 1 100
Microrganismo Enterobacter cloacae (KPC)
1 143 1 100
Klebsiella pneumoniae
6 857 8 800
0416 Serratia
marcescens 0 00 1 100
Teste de Hodge Hodge positivo 7 1000 10 1000
NA Amicacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 1 100 0848 resistente 0 00 1 100
sensiacutevel 2 286 3 300
Amoxicilina Aacutecido Clavulacircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Ampicilina Sulbactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ampicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Aztreonan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefazolina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Cefoperazona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Cefotaxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefoxitina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0509 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 2 286 4 400
Ceftazidima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cetriaxona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 3 429 5 500 0772 Cefalotina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ciprofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772
51
resistente 3 429 5 500
Claritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Clindamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Eritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Gentamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0942 resistente 2 286 3 300
sensiacutevel 1 143 2 200
Imipenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 0 00 2 200 0193 Resistente 1 143 3 300
sensiacutevel 2 286 0 00
Nitrofurantoiacutena sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Norfloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Oxacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Penicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Piperacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Rifampicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tetraciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Ticarcilina Aacutecido Clavulocircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0688 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 3 429 4 400
Tobramicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Trimetoprima Sulfametoxazol
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0112 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 2 286 0 00
Vancomicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tigeciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediario 0 00 1 100 0211 natildeo testado 1 143 4 400
resistente 2 286 0 00
52
Cefepime sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefuroxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Levofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Piperacilina Tazobactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Ertapenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Meropenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0223 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 1 143 0 00
Cefotetan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 sensiacutevel 0 00 1 100
Gemifloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 7 700 0585 natildeo testado 3 429 3 300
Desfecho
Alta Oacutebito
Meacutedia Erro
padratildeo Meacutedia Erro
padratildeo p
Idade 58 9 59 5 0991
Tempo Internaccedilatildeo (dias)
50 13 46 12 0571
n= 17 p(lt 005) NA natildeo se aplica
53
6 DISCUSSAtildeO
Nos uacuteltimos anos houve um aumento na incidecircncia de bacteacuterias
multirresistentes aos antimicrobianos no ambiente hospitalar tornando isto um
problema mundial de sauacutede puacuteblica (HULSCHER et al 2010) Quando se trata
principalmente de bacilos Gram negativos a frequumlecircncia destas bacteacuterias eacute ainda
maior em paiacuteses da Ameacuterica Latina quando comparada a paiacuteses desenvolvidos
(GALES etal 2012)
De acordo com dados do ldquoMeropenem Yearly Susceptibility Test Information
Collectionrdquo (MYSTIC) ocorreu nos Estados Unidos um aumento na susceptibilidade
de K pneumoniae nos uacuteltimos anos graccedilas a praacuteticas de controle de disseminaccedilatildeo
de amostras resistentes(RHOMBERG P R et al 2009) O aumento crescente da
prevalecircncia destes microrganismos foi proporcional ao aumento da dependecircncia do
uso de antibioacuteticos carbapenecircmicos considerados como a opccedilatildeo terapecircutica para o
tratamento de infecccedilotildees por bacilos Gram negativos multi-resistentes (LIVERMORE
2012) Isto afeta diretamente as opccedilotildees de tratamento sobrando poucas alternativas
para a terapecircutica que incluem colistina (polimixina E) e tigeciclina que apresentam
respectivamente problemas em termos de toxicidade e eficaacutecia (LIVERMORE et
al 2011) Um dos efeitos adversos mais importantes das poliminas B e E por
exemplo satildeo a neurotoxicidade e nefrotoxicidade (MENDES C A C et al2009 )
Devido agrave resistecircncia ser usualmente de natureza plasmidial e portanto de
maior disseminaccedilatildeo especialmente quando carreadas por K pneumoniae
microrganismo com uma notoacuteria capacidade para acumular e transferir plasmiacutedeos
com determinantes para resistecircncia o nuacutemero de casos detectados pelo
fenoacutetipogenoacutetipo blaKPC eacute bastante preocupante (MONTEIRO et al 2009)
Comparada com outras bacteacuterias hospitalares a transmissatildeo de clones
multirresistentes de K pneumoniae eacute maior e podem natildeo ser controladas pelos
meacutetodos de controle de infecccedilatildeo hospitalar (PAAUW et al 2007) A forma
plasmidial para transferecircncia da resistecircncia adicionada a este grande potencial para
disseminaccedilatildeo de clones resistentes eacute preocupante visto que apoacutes surtos muitas
vezes pode se tornar endecircmica Jaacute eacute uma realidade a disseminaccedilatildeo desta bacteacuteria
54
entre pacientes hospitais paiacuteses e ateacute mesmo continentes (WOODFORF et al
2010 ROGERS et al 2011)
As chances de surtos satildeo maiores em paiacuteses com poucos recursos devido agrave
maior carecircncia de praacuteticas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees hospitalares e o
uso irracional de antimicrobianos de forma empiacuterica e inadequada (KUMARASAMY
et al 2010) Ateacute o momento os mecanismos de resistecircncia aos cabapenecircmicos
geralmente encontrado eram a produccedilatildeo de ESBL (CTX-M) somada aacute perda de
porina (CARVALHAES et al 2010) Foi notado a partir do ano de 2008 um
aumento no nuacutemero de K pneumoniae produtoras de KPC-2 apresentando outra
forma de resistecircncia (GALES 2012)
Um estudo mostrou que o perfil do paciente colonizado ou infectado por KPC
foi de um paciente entre os 33 e os 82 anos de idade internado haacute mais de 1
semana no hospital A mortalidade geral nos uacuteltimos anos ficou em torno de 7
sendo que dos 77 pacientes estudados 32 (415) pacientes evoluiacuteram para oacutebito
evidenciando a alta morbi-mortalidade associada (ALVES A P et al 2013)
Em estudo com 2316 pacientes avaliados a populaccedilatildeo de sexo masculino foi
de 526 idade meacutedia global de 53 anos (mediana de 55 anos) permanecircncia meacutedia
de 58 dias (mediana de 3 dias) (OLIVEIRA A C et al 2010) Outros trabalhos
apresentaram ausecircncia de significacircncia entre sexoidade e o desenvolvimento de
infecccedilotildees por microrganismos resistentes (PERES-BOTA D et al 2003 COLPAN
A et al 2005 COELLO R et al 1997)
Outro estudo utilizou um total de 30 amostras sendo elas isoladas de urina
escarro secreccedilatildeo pleural ponta de cateter aspirado traqueal e hemocultura A mais
prevalente foi em urina (40) Entre as 30 cepas analisadas a maior porcentagem
foi da cepa Klebsiella pneumoniae (70) Enterobacter sp (133) Klebsiella
ozaenae (10) Escherichia coli (333) e Klebsiella oxytoca (333)
(DIENSTMANN R et al 2010) Nos Estados Unidos a enzima KPC jaacute se tornou
endecircmica Foi realizada uma pesquisa em dois hospitais de Nova York onde
testaram 602 amostras e 45 apresentaram algum mecanismo de resistecircncia
sendo apenas 33 confirmadas por biologia molecular como KPC-2 (BRATU et
al 2005)
55
Estudo sobre os tipos de ESBL feito no Japatildeo apresentou o tipo Toho-1 como
o mais prevalente nessa pesquisa Ateacute o ano de 2000 ano em que foi publicado tal
estudo este era o primeiro relatoacuterio no Japatildeo para identificar derivados de ESBLs
como tipo de SHV e TEM entre E coli e K pneumoniae Em especial o tipo SHV- 12
foi identificado com uma maior frequumlecircncia Estes resultados indicam que tipos
distintos de ESBLs que satildeo diferentes em sua especificidade de substrato e origem
geneacutetica coexistem no Japatildeo Isto mostra a importacircncia de caracterizar genoacutetipos
distintos de ESBLs e de estar em alerta continuamente para as tendecircncias de
ESBLs no Japatildeo aleacutem da necessidade de uma interpretaccedilatildeo uniforme utilizando as
diretrizes do CSLI para relatar cepas produtoras de ESBL Aleacutem da detecccedilatildeo de
ESBLs satildeo necessaacuterias mais informaccedilotildees tais como o perfil de sensibilidade
especiacutefica para diversas β-lactacircmicos e o local da infecccedilatildeo Esses fatores satildeo
essenciais para a escolha adequada de antibioacuteticos (YAGI T et al 2000)
No ano de 2004 uma pesquisa avaliou a produccedilatildeo de uma enzima de
hidroacutelise de carbapenecircmicos atraveacutes da teacutecnica de sequumlenciamento foi revelado
um novo membro da famiacutelia KPC designado KPC- 3 Pesquisadores encontraram
em um mutante de K pneumoniae uma substituiccedilatildeo de um gene associado com
resistecircncia a Imipenem mas essa substituiccedilatildeo foi considerada improvaacutevel na
contribuiccedilatildeo da resistecircncia aos carbapenecircmicos da espeacutecie estudada Aleacutem da
resistecircncia aos carbapenecircmicos estes isolados eram em sua maioria resistentes agraves
cefalosporinas penicilinas e aminoglicosiacutedeos Usando estudos de transformaccedilatildeo
conjugaccedilatildeo e hibridaccedilatildeo localizaram o alelo blaKPC em plasmiacutedeo aleacutem disso
mostraram que esse alelo tambeacutem carregava uma resistecircncia aos aminoglicosiacutedeos
A transferecircncia das enzimas KPCs foi demonstrada in vitro tanto neste como em
outros estudos pode ser que os plasmiacutedeos que fazem esta transferecircncia estavam
comeccedilando a se espalhar no ambiente cliacutenico resultando na multiresistecircncia dessas
estirpes (WOODFORD et al 2004)
O presente estudo apresentou um vieacutes quanto aos resultados dos testes de
susceptibilidade microbiana Observou-se que natildeo foi encontrado resultado deste
teste em algumas amostras o que natildeo cooperou para um estudo mais preciso
futuros estudos quanto agraves amostras e um melhor acompanhamento deste tipo de
patologia Poreacutem mesmo sem algumas amostras com este resultado disponiacutevel foi
56
confirmada a presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos
carbapenecircmicos por meio dos genes de resistecircncia blaKPC e 16S rRNA que as
amostras apresentaram em sua maioria serem portadoras Quanto aos resultados
estatiacutesticos nenhuma das variaacuteveis apresentou significacircncia estatiacutestica (p gt 005)
mostrando assim que estas variaacuteveis isoladas natildeo foram o fator determinante para
o desfecho cliacutenico de alta ou oacutebito
57
7 CONCLUSAtildeO
Os genes blaKPC e 16S rRNA foram caracterizados confirmando a a
presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos carbapenecircmicos
Houve uma maior prevalecircncia da cepa K pneumoniae e isto confirma outros
estudos que apresentam a maior prevalecircncia desta cepa em amostras com KPC
Aleacutem disso isso justifica a forma popular da K pneumoniae ser chamada de KPC
enquanto que na verdade KPC eacute uma enzima podendo estar presente em outras
cepas como Enterobacter clocae tambeacutem apresentada no presente estudo O
desfecho cliacutenico de oacutebitos maior que 50 eacute um possiacutevel indicador sobre a
necessidade de se realizar um teste raacutepido para identificaccedilatildeo de KPC visando
iniciar o mais raacutepido possiacutevel o tratamento afim de diminuir a mortalidade por esta
infecccedilatildeo
Nenhuma das variaacuteveis isoladamente estaacute relacionada ao desfecho cliacutenico
oacutebito ou alta pois natildeo apresentaram relevacircncia estatiacutestica O presente estudo
mostrou que haacute presenccedila da bacteacuteria nas amostras de pacientes do hospital
estudado podendo entatildeo afirmar que este tipo de bacteacuteria se encontra tambeacutem
presente em ambiente hospitalar O uso irracional de antimicrobiano eacute demonstrado
de forma indireta quando foi apresentado atraveacutes do Teste de Hodge Modificado
uma resistecircncia de 100 aos antibioacuteticos carbapenecircmicos Isto tambeacutem reflete na
terapecircutica sendo que pacientes portadores de bacteacuterias resistentes aos
antibioacuteticos carabepecircmicos tem uma escassa opccedilatildeo de tratamento e as opccedilotildees
apresentam problemas quanto agrave toxicidade e eficaacutecia
58
REFEREcircNCIAS
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Mecanismos
de resistecircncia bacteriana aos antimicrobianos Disponiacutevel em
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controleopas_
webmodulo3mec_sitiohtmgt Acesso em 25 de abril de 2014
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Nota teacutecnica nordm
012013 medidas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees por enterobacteacuterias
multiresistentes Acesso em 17 de abril de 2013
ALBA J et al Kinetics study of KPC-3 a plasmid-encoded class A
carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase Antimicrob Agents Chemother
Nov49(11)4760-2 2005
ALVES A P et al Nosocomial infections by KPC-producing enterobacteria in
a tertiary hospital in Southern Brazil Revista da AMRIGS Porto Alegre 57 (3) 213-
218 jul-set 2013
ALVES A et al Tipagem Geneacutetica de Microrganismos Lab De Diversidade
Microbiana Centro de Biologia Celular Dep de Biologia U de Aveiro 3810-193
Aveiro- 2003
BELL J M et Al Prevalence and significance of a negative extended-
spectrum beta-lactamase (ESBL) confirmation test result after a positive ESBL
screening test result for isolates of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae
results from the SENTRY Asia-Pacific Surveillance Program J Clin Microbiol
May45(5)1478-82 2007
BRATU S et al Detection of KPC carbapenem-hydrolyzing enzymes in
Enterobacter spp from Brooklyn New York Antimicrob Agents Chemother v 49 n
2 p 776-8 2005
59
BRATU S et al Emergence of KPC-possessing Klebsiella pneumoniae in
Brooklyn New York epidemiology and recommendations for detection Antimicrob
Agents Chemother v 49 n 7 p 3018-20 2005
BRATU S et al Rapid spread of carbapenem-resistant Klebsiella
pneumoniae in New York City Arch Intern Med v 165 p 1430-5 2005
CAMARGO C F et al Aplicaccedilatildeo das teacutecnicas de pcr e suas teacutecnicas
derivadas em diagnoacutestico molecular Disponiacutevel em
ltfileDUnB10C2BA20semestreArtigosPCR-
20CLEYTON20FLORENCIO20DE20CAMARGO20E20PAULO20ROB
ERTO20QUEIROZpdfgtgt Acesso em 08 de abril de 2014
CARVALHES C G et al Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting
carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive
results Journal of Antimicrobial Chemotherapy v 65 n2 p 249-251 2010
CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION- CDC Modified
Hodge Test for Carbapenemase Detection in Enterobacteriaceae 2004
CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE Methods for
dilutionantimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically Approved
standard M7ndashA7 7th ed CLSI Wayne PA 2011
COELLO R et al Risk factors for developing clinical infection with methicillin-
resistant Staphylococcus aureus (MRSA) amongst hospital patients initially only
colonized with MRSA J Hosp Infect 19973739-46
COLPAN A et al Evaluation of risk factors for mortality in intensive care
units A prospective study from a referral hospital in Turkey Am J Infect Control
200533(1)42-7
60
CORNAGLIA G et al Living with ESBLs Introduction Clinical Microbiology
and Infection 14 Suppl 1 1-2 2008
COTRIM E R et al Klebsiella pneumoniae carbapenemase ndash KPC em
Enterobacteriaceae o desafio das bacteacuterias multirresistentes Poacutes em revista do
centro universitaacuterio Newton Paiva 12012 - ediccedilatildeo 5 - issn 2176 7785
DESHPANDE L M et al Occurrence and characterization of
carbapenemase-producing Enterobacteacuteriaceae report from the SENTRY
Antimicrobial Surveillance Program (2000-2004) Microb Drug Resist 12(4)223-30
2006
DIAS D J A Estudos dos principais mecanismos de resistecircncia aos
antibioacuteticos β-lactacircmicos em bacteacuterias patogecircnicas gram negativas 2009 100 f
Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Geneacutetica Molecular e Biomedicina) ndash Faculdade de
Ciecircncias e Tecnologia Universidade de Nova Lisboa Lisboa
DIENSTMANN R et al Avaliaccedilatildeo fenotiacutepica da enzima Klebsiella
pneumoniae carbapenemase (KPC) em Enterobacteriaceae de ambiente hospitalar
J Bras Patol Med Lab v 46 n 1 p 23-27 fevereiro 2010
ENDIMIAMI A et al Emergence of blaKPC-containing Klebsiella
pneumoniae in a long-term acute care hospital a new challenge to our healthcare J
Antimicrob Chemother 64 1102-1110 Nov 2009
FALAGAS M E et al Extended-spectrum beta-lactamase producing
organisms The Journal of Hospital Infection 73 (4) pp 345-54 2009
FONTANA C et al Emergence of KPC-producing Klebsiella pneumoniae in
Italy BMC Rev Notes 3 40 2010
61
GALES A C et al Antimicrobial resistance among Gram-negative bacilli
isolated from Latin America results from Sentry Antimicrobial Surveillance Program
(Latin America 2008-2010) Diagnostic Microbiology and Infectious Disease v 3 n
4 p 354 -360 2012
GUPTA N et al Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Epidemiology
and Prevention HEALTHCARE EPIDEMIOLOGY Clinical Infectious Diseases
201153(1)60ndash67 Published by Oxford University Press on behalf of the Infectious
Diseases Society of America 2011
HARBOTTLE H et al Genetics of antimicrobial resistance Anim Biotechnol
n17 p111-124 2006
HENRIQUE W N et al RESISTEcircNCIA BACTERIANA Uniatildeo das
Faculdades Alfredo NasserInstituto de Ciecircncias da Sauacutede Disponiacutevel em lt
httpwwwfaculdadealfredonasseredubrfilespesquisaposter20HENRIQUE20
Wilker20Natividade20SANTIAGO20Silvania20CAVALCANTI20DSP
20ResistC3AAncia20Bacterianapdfgt Acesso em 17 marccedilo 2014
HULSCHER M E J I et al Antibiotic prescribing in hospital a social and
behavioral scientific approach The Lancet Infectious Diaseases v 10 n 3 p 167-
165 2010
KIDWAI M SAPRA P BHUSHAN KR Synthetic strategies and medicinal
properties of beta-lactams Curr Med Chem 1999 695-215
KUMARASAMY K K et al Emergence of a new antibiotic resistance
mechanism in India Pakistan and the UK a molecular biological and
epidemiological stuy The Lancet Infectious Diseases v10 n 9 p 597- 602 2010
LINCOPAN N et al Enterobacteacuteria producing extended-spectrum β-
lacatamases and IMP-1 Metalo-β-lactamases isolated from Brazilian hospitals J Med
62
Microbiol 7 1-3 2006
LINCOPAN N et al First Isolation of Metalo-β-Lacatamase-Producing
Multiresistant Klebsiella pneumoniae from a patient in Brazil J Clin Microbiol 43(1)
516-519 2005
LIVERMORE D M et al What remains against carbapenem- resistant
Enterobacteriaceae Evaluation of choramphenicol ciprofloxacin colistina
fosfomycin minocycline nitrofurantoin temocilin and tigecycline International
Journal of Antimicrobial Agents v 37 n 5 p 415- 459 2011
LIVERMORE D M Fourten years in resistance International Journal of
Antimicrobial Agents v 39 283- 294 2012
LIVERMORE D M Bacterial resistance to carbapenems Adv Exp Med Biol
1995 39025-47
LIVERMORE D M Bacterial resistance origins epidemiology and impact
Clin Infect Dis 36S11-S23 2003
LIVERMORE D M et al Carbapenemases a problem in waiting Curr
Opin Microbiol 2000 3489-95
LU et al Universal pcr for common bacterial pathogens J CLIN
MICROBIOL VOL 38 2000
LU et al Use of PCR with Universal Primers and Restriction Endonuclease
Digestions for Detection and Identification of Common Bacterial Pathogens in
Cerebrospinal Fluid Journal of Clinical Microbiology June 2000 p 2076ndash2080
MARSCHALL J Met al Presence of the KPC Carbapenemase Gene in
Enterobacteriaceae Causing Bacteremia and Its Correlation with In Vitro
Carbapenem Susceptibility J Clin Microbiol 47 239-241 Jan 2009
63
MARTINS WMBS et al Prevalecircncia do gene blaKPC em isolados cliacutenicos
de Enterobacteriaceae e natildeo fermentadores encontrados em amostras clinicas em
um hospital universitaacuterio do Recife X Jornada de ensino pesquisa e extensatildeo ndash
JEPEX 2010 ndash UFRPE Recife 18 a 22 de outubro
MENDES C A C et al Polimixinas Revisatildeo com ecircnfase na sua
nefrotoxicidade Rev Assoc Med Bras 2009 55(6) 752-9
MOHR J F 3rd Update on the efficacy and tolerability of meropenem in the
treatment of serious bacteacuterial infections Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S41-51
2008
MONTEIRO J et al First report of KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae
strains in Brazil Antimicrob Agents Chemother Jan53(1)333-4 2009
MOREIRA V C et al Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia a antibioacuteticos
Disponiacutevel em
lthttpwwwcpglsucgbr6mostraartigosSAUDEVANESSA20CARVALHO20M
OREIRApdfgt Acesso em 21 marccedilo 2014
NETIKUL T et al Emergence of novel blaKPC-12 and blaKPC-13 variants in
carbapenem non-susceptible Enterobacter cloacae a first report of blaKPC gene in
Thailand European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases May
S372 2011
NETO V A et al Antibioacuteticos na praacutetica Meacutedica 6ordf Ediccedilatildeo Editorial
SarverSP Brasil 2007
NICOLAU D P Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of
meropenem Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S32-40 2008
64
OLIVEIRA A C et al Resistecircncia bacteriana e mortalidade em um centro de
terapia intensiva Rev Latino-Am Enfermagem nov-dez 2010
PAAUW A et al Failure to control an outbreak of qnrA 1-positive multidrug-
resistant Enterobacter clocae despite adequate implementation of recommended
infection control measures Journal of Clinical Microbiology v 45 n 5 p 1420-1425
2007
PATERSON D L et al Extended-Spectrum Beta-Lactamases a Clinical
Update Clinical Microbiology Reviews v 18 p 657-686 2005
PEIRANO G et al Carbapenem-hydrolysing beta-lactamase KPC-2 in
Klebsiella pneumonia isolated in Rio de Janeiro Brazil J Antimicrob Chemother Nov
20 2009
PERES-BOTA D et al Are infections due to resistant pathogens associated
with worse outcome in critically ill patients J Infect 200347(4)307-16
PIDDOCK L J V Clinically relevant chromosomally encoded multidrug
resistance effl ux pumps in bacterial Clin Microbiol Rev n19 p382-402 2006
PITOUT J D D et al Emergence of Enterobacteriaceae producing
extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) in the community J Antimicrob
Chemother May 56 2005
POSSEBON M I et al Resistecircncia bacteriana aos carbapenecircmicos
Bacterial resitence to carbapenems RBM rev bras med60(6)378380-378-382
jun 2003
QUEENAN A M et al Carbapenemases the versatile beta-lactamases
Clin Microbiol Rev Jul20(3)440-58 2007
65
RHOMBERG P R et al Summary trends for the meropenem yearly
susceptibility test information collection program a 10- year experience in the United
States (1999-2008) Diagnostic Microbiology and Infectiois Disease v 65 n4 p
414-426 2009
ROBLEDO I E et al Detection of KPC in Acinetobacter spp in Puerto Rico
J Antimicrob Agents Chemother 54 1354-1357 Mar 2010
ROGERS B A et al Country-to-country transfer os patients and the risk of
multi-resistant bacterial infection Clinical Infectious Disease v53 n1 p49- 56
2011
SHAH A A et al Characteristics epidemiology and clinicalimportance of
emerging strains of Gram-negative bacilli producing extended-spectrum
betalactamases Research in Microbiology v 155 p 409-421 2004
TURNER P J Extended- Spectrum Beta-Lactamases Clinical Infectious
Diseases v 41 p 273-275 2005
WOLTER D J et al Phenotypic and Enzymatic Comparative Analysis
between the Novel KPC variant KPC-5 and Its Evolutionary Variants KPC-2 and
KPC-4 Antimicrob Agents Chemother Nov 17 2008
WOODFORD N et al Carbapenemases of Chryseobacterium
(Flavobacterium) meningosepticum distribution of blaB and characterization of a
novel Metalo-beta-lactamase gene blaB3 in the type strain NCTC 10016
Antimicrob Agents Chemother Jun44(6)1448-52 2000
WOODFORF N Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in
India Pakistan and the UK a molecular biological and epidemiological study The
Lancet Infectious Diseases v 10 n 9 p 597-602 2010
66
WOODFORD et al Outbreak of Klebsiella pneumoniae Producing a New
Carbapenem- Hydrolyzing Class A β-Lactamase KPC-3 in a New York Medical
Center Antimicrobial agents and chemotherapy Dec 2004 p 4793ndash4799 Vol 48
No 12
YAGI T et al A preliminary survey of extended-spectrum β-lactamases
(ESBLs) in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Japan
FEMS Microbiology Letters 184 (2000) 53-56
YIGIT H et al Novel carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase KPC-1 from
a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumonia J Antimicrob Agents
Chemother 45 (4) 1151-1161 (2001)
ZAVASCKI A P et al KPC-2- producing Enterobacter cloacae in two cities
from Southern Brazil Int J Antimicrob Agents Apr 28 2009
ZHANEL G G et al Comparative review of the carbapenecircmicos Drugs
67(7)1027-52 2007
67
ANEXOS
Sequumlecircncia do oligo blaKPC
Query 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
Query 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
Query 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
68
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
Query 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
Query 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
69
Query 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
Query 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
Query 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
70
Sbjct 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
Query 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
Query 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
Query 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
71
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Sbjct 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
Query 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
Query 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
72
Query 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
Query 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
Query 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
73
Sbjct 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
Query 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
Query 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
Query 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
74
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
Query 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
Query 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
75
Query 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
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Sbjct 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
Query 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
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Sbjct 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
LOCUS AF297554 1377 bp
DNA linear BCT 26-MAR-2001
DEFINITION Klebsiella pneumoniae carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
gene complete cds
ACCESSION AF297554
VERSION AF2975541 GI10121874
76
KEYWORDS
SOURCE Klebsiella pneumoniae
ORGANISM Klebsiella pneumoniae
Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Enterobacteriaceae Klebsiella
REFERENCE 1 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH QueenanAM
AndersonGJ Domenech-SanchezA
BiddleJW StewardCD
AlbertiS BushK and TenoverFC
TITLE Novel carbapenem-hydrolyzing beta-
lactamase KPC-1 from a
carbapenem-resistant strain of
Klebsiella pneumoniae
JOURNAL Antimicrob Agents Chemother 45 (4)
1151-1161 (2001)
PUBMED 11257029
REFERENCE 2 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH AndersonGJ and
TenoverFC
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (19-AUG-2000) Nosocomial
Pathogens Laboratory Branch
Centers for Disease Control and
Prevention 1600 Clifton Rd MS
G08 Atlanta GA 30333 USA
FEATURES LocationQualifiers
77
source 11377
organism=Klebsiella
pneumoniae
mol_type=genomic DNA
db_xref=taxon573
-35_signal 5560
-10_signal 7883
mRNA 921012
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
RBS 117122
CDS 1311012
note=blaKPC-1
codon_start=1
transl_table=11
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
protein_id=AAG134101
db_xref=GI10121875
translation=MSLYRRLVLLSCLSWPLAGFSATALTNLVAEPFAKLEQD
FGGSI
GVYAMDTGSGATVSYRAEERFPLCSSFKGFLAAAVLARSQQQAGLLDTPIRYG
KNALV
PWSPISEKYLTTGMTVAELSAAAVQYSDNAAANLLLKELGGPAGLTAFMRSIG
DTTFR
78
LDRWELELNSAIPSDARDTSSPRAVTESLQKLTLGSALAAPQRQQFVDWLKGN
TTGNH
RIRAAVPADWAVGDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTRAPNKDDK
HSEAV
IAAAARLALEGLGVNGQ
ORIGIN
1 cggggcagtt acagccgtta cagcctctgg
agagggagcg gcttgccgct cggtgataat
61 cccagctgta gcggcctgat tacatccggc
cgctacacct agctccacct tcaaacaagg
121 aatatcgttg atgtcactgt atcgccgtct
agttctgctg tcttgtctct catggccgct
181 ggctggcttt tctgccaccg cgctgaccaa
cctcgtcgcg gaaccattcg ctaaactcga
241 acaggacttt ggcggctcca tcggtgtgta
cgcgatggat accggctcag gcgcaactgt
301 aagttaccgc gctgaggagc gcttcccact
gtgcagctca ttcaagggct ttcttgctgc
361 cgctgtgctg gctcgcagcc agcagcaggc
cggcttgctg gacacaccca tccgttacgg
421 caaaaatgcg ctggttccgt ggtcacccat
ctcggaaaaa tatctgacaa caggcatgac
481 ggtggcggag ctgtccgcgg ccgccgtgca
atacagtgat aacgccgccg ccaatttgtt
541 gctgaaggag ttgggcggcc cggccgggct
gacggccttc atgcgctcta tcggcgatac
79
601 cacgttccgt ctggaccgct gggagctgga
gctgaactcc gccatcccaa gcgatgcgcg
661 cgatacctca tcgccgcgcg ccgtgacgga
aagcttacaa aaactgacac tgggctctgc
721 actggctgcg ccgcagcggc agcagtttgt
tgattggcta aagggaaaca cgaccggcaa
781 ccaccgcatc cgcgcggcgg tgccggcaga
ctgggcagtc ggagacaaaa ccggaacctg
841 cggagtgtat ggcacggcaa atgactatgc
cgtcgtctgg cccactgggc gcgcacctat
901 tgtgttggcc gtctacaccc gggcgcctaa
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961 cgccgctgcg gctagactcg cgctcgaggg
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1021 aaatcatcta ttggcccacc accgccgccc
ttgcgggcgg catggattac caaccactgt
1081 cacatttagg ctaggagtct gcgcggcaga
gccgtgtgac cggttttctg tagagcactg
1141 acgatggcgg cggcgctctc tgcaattggc
aaggcgtcgg cgccaaggat accaatcttg
1201 cggcgcgcgg cgtgttatga cgactggggt
gcatttgagc cgccccattt aaccttcgcc
1261 ctcacagata cgccattcgc ctcaaattta
gcgccatgca gacgagcttc cactcggctt
1321 gcaccttgtc caggcccctc atgctgaact
gacgcaatcc catcaccgcc ttgatca
80
26
Os mecanismos de resistecircncia capazes de impedir a accedilatildeo dos
carbapenecircmicos satildeo vaacuterios Poreacutem a degradaccedilatildeo de antibioacuteticos por enzimas
principalmente as carbapenemases constituem o principal mecanismo de
resistecircncia aos antibioacuteticos β-lactacircmicos (DIAS 2009) Devido a ampla atividade
hidroliacutetica agrave maioria dos antibioacuteticos β-lactacircmicos estes grupos de enzimas possuem
alta versatilidade (QUEENAM et al 2007)
Existem trecircs grandes classes moleculares de Ambler a qual as
carbapenemases pertencem denominadas classe A (serino-carbapenemases os
quais incluem membros designados SME IMI NMC GES e a famiacutelia das KPCs)
classe B(as metalo-β-lactamase incluem os tipos IMP e VIM) e classe D
(oxacilinases similares as da classe A e incluem as OXA e PSE) (DIAS 2009)
Dentre estes as mais importantes e prevalentes encontradas em plasmiacutedeos
de Klebsiella pneumoniae satildeo as KPC (DIENSTMANN et al 2010) Por meio de
estudos moleculares a enzima KPC jaacute foi documentada em diferentes bacteacuterias e
diferenciada em KPC-1 a 13 (NETIKUL et al 2011) No ano de 2009 foi realizada
uma pesquisa onde descreveram as seguintes carbapenemases KPC-1 em isolados
de Klebsiella pneumoniae KPC-2 em K pneumoniae K oxytoca Salmonella
enterica e em Enterobacter sp e KPC-3 em K pneumoniae e Enterobacter cloacae
(MONTEIRO et al 2009) As enzimas KPC-4 e KPC-5 foram encontradas em
isolados de Pseudomonas aeruginosa (PEIRANO et al 2009)
Foi observada uma correccedilatildeo da sequumlecircncia KPC-1 indicando que o gene
blaKPC-1 e blaKPC-2 satildeo idecircnticos Trecircs novas variantes blaKPC-3 blaKPC-4 e
blaKPC-5 satildeo resultados de mutaccedilotildees do gene estrutural da enzima KPC-2
(WOLTER et al 2008) apresentando diferentes perfis de hidroacutelise As enzimas
KPC-2 e KPC-3 possuem alta eficiecircncia em hidrolisar cefalotina cefaloridina e
nitrocefin poreacutem possuem uma menor eficiecircncia contra carbapenecircmicos e
cefotaxima (ALBA et al 2005) As enzimas KPC-5 e KPC-4 apresentam menor
hidroacutelise de carbapenecircmicos eacute do que em KPC-2 Em contrapartida possuem
melhor eficiecircncia contra ceftazidima e uma maior inibiccedilatildeo pelo aacutecido clavulacircnico
(WOLTER et al 2008)
27
13 Anaacutelise geneacutetica de microrganismos
Eacute de extrema importacircncia praacutetica natildeo soacute no aspecto cliacutenico mas tambeacutem na
fitopatologia biotecnologia e estudos ambientais a correta identificaccedilatildeo e
classificaccedilatildeo de microrganismos Os meacutetodos usados na diferenciaccedilatildeo de gecircneros
espeacutecies e estirpes de microrganismos podem ser divididos em meacutetodos fenotiacutepicos
(baseados em fenocircmenos bioquiacutemicos fisioloacutegicos e bioloacutegicos) e genotiacutepicos
(detectam polimorfismos ao niacutevel dos aacutecidos nucleacuteicos ou variaccedilatildeo aleacutelica ao niacutevel
de enzimas) (ALVES et al 2003)
Para este tipo de estudo existem alguns meacutetodos como o RFLPrsquos -
ldquoRestriction Fragment Length Polymorphismsrdquo (polimorfismos de tamanho de
fragmentos de restriccedilatildeo) rep-PCR (Meacutetodo de tipagem baseado na amplificaccedilatildeo via
PCR de elementos de DNA repetitivos presentes em genomas bacterianos) anaacutelise
de sequumlecircncias nucleotiacutedeas (discriminaccedilatildeo eou identificaccedilatildeo atraveacutes de sequumlecircncias
de DNA) PFGE - Pulsed-Field Gel Electrophoresis (Eletroforese em campo
pulsado) ( A L V E S et al 2003)
A diferenciaccedilatildeo clara da cepa e principalmente a alta reprodutibilidade devem
ser caracteriacutesticas de qualquer meacutetodo de tipagem geneacutetica Poreacutem nem todos os
meacutetodos moleculares de tipagem satildeo igualmente eficazes Sendo assim de acordo
com a finalidade pretendida (identificaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo custo reprodutibilidade
etc) eacute feita a escolha do meacutetodo a ser aplicado (A L V E S et al 2003)
O processo de identificaccedilatildeo fenotiacutepica de KPC entre os membros da famiacutelia
Enterobacteriaceae ainda eacute difiacutecil e os meacutetodos para a sua identificaccedilatildeo devem ser
revistos e ajustados Mesmo com o avanccedilo tecnoloacutegico natildeo existem ensaios que
combinam alta especificidade e sensibilidade na detecccedilatildeo destas enzimas Satildeo
diversas as metodologias usadas para rastreamento de KPC como por exemplo a
focalizaccedilatildeo isoeleacutetrica a teacutecnica de disco-difusatildeo E-test teste de Hodge
modificado dentre outros Aleacutem disso a pesquisa do gene blaKPC pode ser feita
pela Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) Os sistemas de automaccedilatildeo
existentes no entanto podem natildeo identificar com precisatildeo os isolados KPC
positivos (COTRIM et al 2012)
A identificaccedilatildeo blaKPC pelo PCR eacute um meacutetodo raacutepido preciso sensiacutevel e
altamente especiacutefico no entanto a PCR exige equipamento e conhecimentos
28
especializados em diagnoacutestico molecular dificultando ainda a utilizaccedilatildeo dele na
rotina dos laboratoacuterios de microbiologia (COTRIM et al 2012)
Em estudo de infecccedilotildees hospitalares identificaccedilatildeo molecular de patoacutegenos
bacterianos eacute bastante utilizada Para diferenciar carbapenemases tipo KPC a partir
de outros tipos como SME NMC-A-IMI e GES eacute necessaacuterio um exame molecular
As identificaccedilotildees do microrganismo juntamente com a triagem molecular iratildeo definir
um resultado mais especiacutefico podendo ser usado para identificar o antibioacutetico mais
adequado para o tratamento Poreacutem a principal desvantagem de alguns exames
baseados em PCR por exemplo eacute que devido agrave sua limitada capacidade de
multiplexaccedilatildeo eles distinguem apenas algumas variaccedilotildees (MOREIRA et al 2014)
Estatildeo descritas para a identificaccedilatildeo molecular de patoacutegenos pertencentes agrave
famiacutelia Enterobacteriaceae as teacutecnicas de PFGE RAPD (randomly amplified
polymorphic DNA) e ERIC-PCR (Enterobacterial Repet it ive Intergenic Consensus)
A PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) eacute considerada padratildeo ouro devido sua
alta capacidade de diferenciaccedilatildeo baseada na anaacutelise do perfil de restriccedilatildeo do DNA
genocircmico por meio de eletroforese Como desvantagem para a sua execuccedilatildeo eacute
necessaacuterios vaacuterios dias impedindo a tipagem de algumas cepas bacterianas devido
agrave degradaccedilatildeo do DNA aleacutem do alto custo empregado (MOREIRA et al 2014)
O meacutetodo baseado em ERIC-PCR tem sido bastante utilizado como uma
alternativa para a teacutecnica de PFGE Esta teacutecnica consiste na anaacutelise do padratildeo de
amplificaccedilatildeo de elementos repetidos encontrados no genoma bacteriano Isto
permite uma maior rapidez na obtenccedilatildeo de resultados quando comparada com o
PFGE aleacutem de alta reprodutibilidade simples execuccedilatildeo e implementaccedilatildeo baixo
custo e natildeo sem problemas com a degradaccedilatildeo do DNA (MOREIRA et al 2014)
A PCR eacute considerada uma teacutecnica de biologia molecular revolucionaacuteria que
consiste na siacutentese enzimaacutetica de coacutepias de aacutecidos nucleacuteicos Ela permitiu o raacutepido
desenvolvimento do estudo de sequumlecircncias de aacutecidos nucleacuteico Foi desenvolvida por
Kary Banks Mullis que ganhou o precircmio Nobel de quiacutemica de 1993 devido ao
desenvolvimento dessa teacutecnica em abril de 1983 (CAMARGO et al 2014)
Por meio de etapas de variaccedilatildeo de temperatura a teacutecnica de PCR promove a
duplicaccedilatildeo de cadeias de DNA in vitro A reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo de DNA por PCR
envolve o emprego de sequumlecircncias iniciadoras (primers) quatro nucleotiacutedeos
29
(dNTPrsquos) do DNA e uma DNA polimerase termoestaacutevel podendo assim obter-se a
partir de uma fita molde muitas coacutepias de uma sequumlecircncia especiacutefica de aacutecido
nucleacuteico O princiacutepio da PCR consiste na variaccedilatildeo de temperatura por ciclo
envolvendo trecircs etapas baacutesicas desnaturaccedilatildeo pareamento e amplificaccedilatildeo
(CAMARGO et al 2014)
A desnaturaccedilatildeo da fita molde de DNA eacute uma etapa com duraccedilatildeo entre 30
segundos a 1 minuto a temperatura entre 92 ordmC a 96 ordmC Apoacutes isso o pareamento de
dois iniciadores sinteacuteticos de composiccedilotildees distintas que funcionam como os
iniciadores da reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo liga-se agrave regiatildeo complementar da fita de
DNA alvo que sofreraacute a duplicaccedilatildeo Esta etapa tem duraccedilatildeo de 30 segundos a 1
minuto a temperatura entre 58 ordmC e 65 ordmC Por uacuteltimo a amplificaccedilatildeo por meio da
enzima Taq DNA polimerase das novas fitas de DNA se daacute a partir de cada um dos
iniciadores utilizando os quatro dNTPrsquos como substrato da reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo
Esta etapa possui duraccedilatildeo entre 45 segundos e 1 minuto a 72 ordmC Cada ciclo eacute
repetido em torno de 30 a 35 vezes e promove a amplificaccedilatildeo da regiatildeo alvo
determinada conforme o anelamento dos iniciadores sinteacuteticos de DNA (CAMARGO
et al 2014) Estas etapas estatildeo demonstradas na figura 4
Figura 4 Etapas da Reaccedilatildeo de PCR
30
2 JUSTIFICATIVA
No ano de 2010 no Distrito Federal foram identificados 111 pacientes com
suspeita de infecccedilatildeo por Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) e a
Secretaria de Sauacutede do Distrito Federal confirmaram ainda a morte de 18 pacientes
dentre os hospitais puacuteblicos e particulares Um desafio encontrado por ocasiatildeo do
surto infeccioso no Distrito Federal foi o de confirmar as KPCs por Reaccedilatildeo da
Polimerase em Cadeia sendo que as amostras foram enviadas com esta finalidade
para a Fiocruz no Rio de Janeiro
Pesquisas que possam contribuir na elaboraccedilatildeo de estrateacutegias preventivas e
de intervenccedilatildeo para infecccedilotildees causadas por enterobacteacuterias bem como contribuir
para gerar uma integraccedilatildeo beneacutefica entre a equipe acadecircmica e os serviccedilos de
sauacutede devem ser estimuladas Neste sentido o presente estudo permitiu escrutinar
os genes envolvidos na expressatildeo de carbapenemases presentes em espeacutecies de
enterobacteacuterias isoladas em ambiente hospitalar visto que elucidar genes de
resistecircncia de enterobacteacuterias aos antibioacuteticos carbapenecircmicos eacute o primeiro passo
para garantir um controle epidemioloacutegico efetivo para estes tipos de microorganismo
assim como sua associaccedilatildeo com surtos fatais particularmente em pacientes com
baixa imunidade
31
3 OBJETIVOS
31 Objetivo geral Caracterizar os genes de resistecircncia das
Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases e os aspectos epidemioloacutegicos de
pacientes internados em um hospital puacuteblico do Distrito Federal
32 Objetivos Especiacuteficos
Identificar genotipicamente a enzima KPC (Klebsiella pneumoniae
carbapenemase) de isolados de Klebsiella pneumoniae
Investigar aspectos epidemioloacutegicos dos pacientes portadores de
Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases
Identificar quais variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana influenciaram para o
desfecho oacutebito ou alta
Avaliar a susceptibilidade das Enterobacteacuterias aos antibioacuteticos
carbapenecircmicos dos pacientes em ambiente hospitalar
32
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
Trata-se de um estudo transversal onde foi realizado o teste de
susceptibilidade das enterobacteacuterias aos antibioacuteticos carbapenecircmicos a partir dos
materiais bioloacutegicos coletados dos pacientes internados no Hospital Regional da Asa
Norte (HRAN) e enviados ao Laboratoacuterio de Anaacutelises Cliacutenicas da mesma Instituiccedilatildeo
Os materiais bioloacutegicos investigados foram sangue aspirado traqueal ou brocircnquico
urina e cultura semi quantitativa de ponta de cateter venoso central O HRAN eacute um
hospital puacuteblico do Distrito Federal com 395 leitos sendo as cliacutenicas de internaccedilatildeo
Berccedilaacuterio Cirurgia Geral Cirurgia Plaacutestica Cliacutenica Meacutedica Ginecologia Maternidade
Pediatria Queimados UTI com atendimento a pacientes portadores de doenccedilas de
caraacuteter cliacutenico e ciruacutergico
4 1 Coleta e transporte das amostras bioloacutegicas
As amostras foram coletadas de pacientes internados no Hospital Regional da
Asa Norte (HRAN) com suspeitas de infecccedilatildeo por KPC A identificaccedilatildeo primaacuteria foi
realizada pelo Laboratoacuterio de Microbiologia do hospital de origem dos pacientes e os
demais procedimentos que foram utilizados na identificaccedilatildeo encontram-se descritos
abaixo
4 2 Procedimentos para confirmaccedilatildeo de resistecircncia bacteriana por
disco de ertapenem (adaptado CDC 2004)
Para diagnosticar amostra como portadora de bacteacuteria produtora de
carbapenemase foi realizado o teste com disco de ertapenem como forma de
triagem Inicialmente utilizou-se o swab contaminado com a amostra que foi
distribuiacuteda em uma pequena aacuterea da placa de aacutegar MacConkey para apoacutes o
crescimento ser realizada a pesquisa de colonizaccedilatildeo por enterobacteacuterias resistentes
aos carbapenecircmicos (Pesquisa de CRE) Procedeu-se a semeadura por teacutecnica
semi-quantitativaesgotamento com alccedila bacterioloacutegica na diluiccedilatildeo de 1100 O disco
de Ertapenem foi colocado na superfiacutecie da placa de MacConkey na junccedilatildeo dos dois
primeiros campos de semeadura conforme demonstrado na figura 5 Incubou a placa
33
em estufa aeroacutebia a 35ordmC por 24 e 48 horas e observou-se o halo de difusatildeo do
disco de Ertapenem na placa para proceder agrave leitura
O teste deixou de ser obrigatoacuterio apoacutes a modificaccedilatildeo dos criteacuterios
interpretativos para carbapenecircmicos para enterobacteacuterias publicados no suplemento
do CLSI 2010 M100-S20-U
Figura 5 Mecanismo de semeamento de material bioloacutegico oriundos de
pacientes com suspeita de infecccedilatildeo por KPC Fonte adaptado CDC 2004
4 2 1 Interpretaccedilatildeo dos resultados
Na ausecircncia de crescimento ateacute 24 horas (MacConkey) ou halo de difusatildeo
gt27 mm na placa deve-se reincubar as placas por mais 24 horas Quando for
ausente o crescimento apoacutes 48 horas ou halo de difusatildeo gt27 mm na placa libera-se
como enterobacteacuterias resistentes a carbapenecircmicos (KPCNEG)Havendo
crescimento de colocircnias na placa de MacConkey com halo lt 27 mm (apenas para
colocircnias com crescimento dentro do halo) deve-se reisolar e realizar identificaccedilatildeo e
antibiograma automatizado teste de sensibilidade por disco-difusatildeo e Teste de
Hodge Modificado (THM) Os isolados de enterobacteacuterias cujos testes comprovarem
a resistecircncia aos carbapanecircmicos testados (KPCPOS) foram reportado a Comissatildeo
de Controle de Infecccedilatildeo Hospitalar (CCIH) Jaacute osbacilos Gram-negativos natildeo
fermentadores natildeo foram reportados (KPCNEG) Para interpretaccedilatildeodos resultados
foram utilizados os valores conforme demonstrados na tabela 1
Tabela 1 Criteacuterios Interpretativos para testes de sensibilidade
ENTEROBACTEacuteRIAS
Disco difusatildeo (mm) MIC (microgml)
34
Antibioacutetico Sigla S I R S I R
Ertapenem 10
microg
ETP 22 19-
21
18 05 1 2
Meropenem 10
microg
MEM 23 20-
22
19 1 2 4
Fonte Manual Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)
2013
Os resultados que apresentaram resistecircncia ao antibioacutetico Ertapenem foram
considerados como suspeitos de contaminaccedilatildeo por KPC Fez-se o teste de
susceptibilidade aos antibioacuteticos (TSA) em aparelho automatizado MicroScan Walk
Away 96sl Dade Behring
4 3 Teste de susceptibilidade aos antibioacuteticos (adaptado CDC 2004)
A determinaccedilatildeo da susceptibilidade dos isolados foi feita pelo teste de
susceptibilidade aos antibioacuteticos (TSA) apoacutes cultura em meio de gelose simples
(INSA) para avaliaccedilatildeo da sua pureza e obtenccedilatildeo de colocircnias isoladas Para
preparaccedilatildeo de uma suspensatildeo bacteriana com turvaccedilatildeo aproximada de 05
McFarland (Dade BehringMicroScanregTurbidity Meter) ressuspendeu duas a cinco
colocircnias em 2ml de soro fisioloacutegico esteacuteril diluindo a 1100 em soro fisioloacutegico num
volume total de 10ml em seguida foi feita uma semeadura em duas placas
quadradas (120mm x 120mm) de Muller-Hinton Agar (INSA) por inundaccedilatildeo
Os discos de antibioacutetico carbapenecircmicos imipenem meropenem e
ertapenem (Biorad) foram aplicados com o auxiacutelio de um dispensador automaacutetico A
susceptibilidade das Enterobacteacuterias aos carbapenecircmicos foi definida de acordo
com o protocolo Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI 2011)
Para aquelas Enterobacteacuterias que apresentaram resistecircncia ao ertapenem
foram realizados o Teste de Hodge Modificado para Detecccedilatildeo de Enterobacteacuterias
Produtoras de Carbapenemases conforme descrito pelo Centers for Disease Control
and Prevention (CDC 2004)
35
4 4Teste de Hodge Modificado (THM) (adaptado CDC 2004)
Preparou-se uma suspensatildeo em salina esteacuteril com a cepa Escherichia coli
ATCC 25922 (padratildeo 05 de McFarland) Apoacutes isto diluiu a suspensatildeo 110 em
salina (05 ml da soluccedilatildeo de Ecoli ATCC 25922 + 45 ml salina)Foi entatildeo semeado
na superfiacutecie de uma placa de Agar Muller-Hinton com a suspensatildeo diluiacuteda de Ecoli
ATCC 25922 com auxilio de swab seco assegurando que houvesse uma
distribuiccedilatildeo uniforme cobrindo toda a superfiacutecie do Agar Deixou secar por 3 a 5
minutos em temperatura ambienteColocou-se o disco de ertapenem 10microg no centro
da placa e apoacutes isto fez-se uma estria linear da cepa a ser testada da borda do
disco ateacute a borda da placa utilizando uma alccedila calibrada 10 microl ou um swab Incubou
a placa na estufa em atmosfera aeroacutebia a 35 plusmn 2ordmC por 16 a 24 horas
441 Controle de qualidade (CQ)
Foi utilizado um CQ todos os dias em que se realizou o teste tendo como
controle Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1705- teste de Hodge modificado
positivo Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1706- teste de Hodge modificado
negativo
442 InterpretaccedilatildeoResultados
Apoacutes 16ndash24 horas de incubaccedilatildeo examinar as placas para verificar a presenccedila
de uma distorccedilatildeo no halo de inibiccedilatildeo do disco de ertapenem devido ao crescimento
realccedilado da cepa ATCC na intersecccedilatildeo do organismo teste e a Ecoli ATCC 25922
dentro dos limites do halo O THM positivo apresentaraacute presenccedila de distorccedilatildeo no
halo de inibiccedilatildeo de ertapenem devido ao crescimento da cepa Ecoli ATCC 25922 ao
longo da estria da cepa teste para dentro dos limites do halo de inibiccedilatildeo Jaacute o THM
negativo teraacute ausecircncia de crescimento da cepa Ecoli ATCC 5922 ao longo da estria
da cepa teste para dentro dos limites do halo de inibiccedilatildeo do disco de ertapenem
Este resultado estaacute representado na figura 6
36
Figura 6 Interpretaccedilatildeo resultado do Teste de Hodge Modificado
(adaptado CDC 2004) Teste positivo na estria da cepa teste na parte superior
da placa teste negativo na estria da cepa teste na parte inferior da placa
Tendo positivo como resultado o paciente era um provaacutevel contaminado por
KPC As amostras entatildeo foram encaminhadas para a Fundaccedilatildeo Osvaldo Cruz
(FIOCRUZ) para confirmaccedilatildeo final As amostras finalmente confirmadas como
positivas para KPC foram isoladas e guardadas no banco de cepas cliacutenicas do
hospital Apoacutes a autorizaccedilatildeo do CEP amostras das cepas foram transferidas para
meio de transporte Stuard em caixa teacutermica fechada em baixa temperatura e
levadas para o laboratoacuterio de microbiologia cliacutenica da universidade
No laboratoacuterio da universidade as amostras foram separadas e realizadas
repiques em meios MacConkey e incubadas por 24h As colocircnias caracteriacutesticas
foratildeo isoladas em caldo BHI e mantidas em shaker a 37oC por 2h Apoacutes isto foram
executadas as anaacutelises a seguir
Os isolados de Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases foram
submetidos agrave extraccedilatildeo de DNA e posterior sequumlenciamento para identificaccedilatildeo dos
genes de resistecircncia blaKPC de 1 a 13 e identificaccedilatildeo do gene universal Os
pacientes de onde os materiais bioloacutegicos contendo as Enterobacteacuterias produtoras
de carbapenemases foram os isolados foram investigados quanto aos aspectos
epidemioloacutegicos e cliacutenicos
37
4 5 Extraccedilatildeo de DNA bacteriano
A extraccedilatildeo de DNA bacteriano foi realizada utilizando o kit NucleoSpin
Plasmidreg (MN) Antes de iniciar a extraccedilatildeo foi feito a preparaccedilatildeo das soluccedilotildees
reagentes materiais e amostras (vortexando) colocou-se em banho-maria agrave 50ordmC o
tampatildeo AW Partiu-se de colocircnias isoladas cultivadas que sofreram passagem em
meio LB liacutequido por 12h Adicionou-se 15 mL da amostra no tubo eppendorf
centrifugou por 5 minutos descartou o sobrenadante (com cuidado para natildeo
descartar o Pellet) Repetiu-se este procedimento por mais trecircs vezes completando-
se o volume de 6mL Foram adicionados 250microL do tampatildeo Resuspension Buffer A1
encostando a ponteira no Pellet e misturando (este tampatildeo tem como funccedilatildeo
separar a formaccedilatildeo de grumos celulares) Apoacutes isso homogeneizou e vortexou os
tubos eppendorfs Apoacutes isso foram adicionados 250microL do tampatildeo Lysis Buffer A2
homogenizou e deixou descansar por 5 minutos (esta etapa eacute importante para a lise
da parede e da membrana celulares e liberaccedilatildeo do conteuacutedo da ceacutelula)
Passado o tempo de descanso foi adicionado 300microL do tampatildeo
Neutralization Buffer A3 homogeneizou e centrifugou por 10 minutos (este tampatildeo
iraacute retirar as proteiacutenas que envolvem o DNA e voltaraacute com o pH para proacuteximo de 8
impedindo que a soluccedilatildeo de lise facilite a quebra das ligaccedilotildees covalentes do aacutecido
nucleacuteico) Em seguida enumeraram-se os tubos contendo filtros com siacutelica
transferiu-se o sobrenadante para o filtro e centrifugou por 5 minutos Descartou-se
o que foi filtrado adicionou 500microL do tampatildeo AW (banho-maria) centrifugou por 2
minutos Novamente foi descartado o filtrado Adicionou-se 600microL do tampatildeo A4
centrifugou por 2 minutos e descartou o filtrado (os tampotildees AW e A4 contecircm
isotiocianato de guanidina em concentraccedilotildees crescentes para facilitar a adsorccedilatildeo
do DNA na siacutelica e retirada das outras biomoleacuteculas da amostra) Foi feita outra
centrifugaccedilatildeo com o tubo vazio Apoacutes isto o filtro foi trocado para outro eppendorf
definitivo onde foi adicionado 50microL do tampatildeo Elution Buffer AE (este tampatildeo
favorece a eluiccedilatildeo do DNA) centrifugou por 2 minutos descartou o filtro e
armazenou as amostras em freezer -20ordmC
38
4 6 Iniciadores e reaccedilatildeo de PCR
Os iniciadores universais para o gene blaKPC foram desenhados baseados
em sequumlecircncias conservadas apresentadas pelos sub-grupos de genes que
codificam a enzima carbapenemase de klebsiella pneumoniae (YIGIT et al 2001)
Baseado na sequumlecircncia para o blakpc-1 depositada no GenBank
(AF2975541) o oligonucleotiacutedio (oligo) iniciador direto (5-
ATGTCACTGTATCGCCGTC-3rsquo) foi desenhado para reconhecer a sequumlecircncia
blaKPC na posiccedilatildeo (131149) enquanto que o iniciador reverso (5-
TTACTGCCCGTTGACGCC-3rsquo) foi reconhecido na posiccedilatildeo (9951012) As anaacutelises
baseadas em alinhamento de sequumlecircncias mostraram que o par de iniciadores
blaKPC podem detectar os alelos de 1 a 13 do gene blaKPC conforme a tabela 2
Tabela 2 Nuacutemero de acesso ao GenBank dos alelos blaKPC e seus
microrganismos originais
Nuacutemero de
Acesso GenBank
Microrganismo Alvo
AF2975541 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-1
GU0862251 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-2
HQ2589341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-2-like
AB5577341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC -3
EU4473041 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-4
EU4002222 Pseudomonas
aeruginosa
blaKPC-5
EU5555341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-6
EU7297271 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-7
39
FJ2344121 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-8
FJ624872 Escherichia coli blaKPC-9
GQ1403481 Acinetobacter
baumannii
blaKPC-10
HM0669951 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-11
HQ3428891 Enterobacter cloacae blaKPC-12
HQ3428901 Enterobacter cloacae blaKPC-13
As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo de blaKPC foram realizadas em um
primeiro tempo de desnaturaccedilatildeo em que foi 94ordmC por 5 minutos seguido de 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 58 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 90 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 78ordmC por 8 minutos Aleacutem das amostras foi utilizado um
controle negativo
A PCR do blaKPC foi realizada utilizando os componentes para o volume da
reaccedilatildeo de 25 microL citados na tabela 3 A banda do tamanho do produto de PCR foi de
881 pares de bases (pb) o que corresponde ao plasmiacutedeo
Tabela 3 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do
gene blaKPC
Reagente Volume
DNA molde 4 microL
Tampatildeo Taq 25 microL
MgCl2 075 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP
2 microL
Oligo F 1 microL
Oligo R 1 microL
Taq DNA polimerase 05 microL
Aacutegua MiliQ 1335 microL
40
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
Baseado na sequumlecircncia para o gene 16S rRNA em que o oligonucleotiacutedio
Universal iniciador direto foward (5-CCAGCAGCCGCCGTAATACG-3rsquo) foi
desenhado para reconhecer a sequumlecircncia universal na posiccedilatildeo 1513 enquanto que o
iniciador reverso (5-ATCGGYTACCTTGTTACGACTTC-3rsquo) foi reconhecido na
posiccedilatildeo 1491 foram realizadas PCRrsquos As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo deste
gene foram realizadas nos seguinte tempos separaccedilatildeo 94ordmC por 10 minutos 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 55 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 120 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 72ordmC por 10 minutos
A PCR do gene 16S rRNA foi realizada utilizando os componentes para o
volume da reaccedilatildeo de 25microL citados na tabela 4 A banda do tamanho do produto de
PCR foi de 996 pb correspondente aacute regiatildeo ribossomal capaz de amplificar todas
as espeacutecies
Tabela 4Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do gene
universal
Reagente (quantidade
concentraccedilatildeo do estoque)
Volume
DNA molde 10 ng 4 microL
Tampatildeo Taq 10 x 25 microL
MgCl2 50mM 125 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP 25 mM
125 microL
Oligo F 10microM 05 microL
Oligo R 10microM 05 microL
Taq DNA polimerase 5UmicroL 04 microL
Aacutegua Miliq 146 microL
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
41
O termociclador utilizado para os experimentos foi o LifeTouch da BIOER
4 7 Digestatildeo
Para realizaccedilatildeo da digestatildeo foi utilizada a enzima BshF I (Hae III) EN- 1105
tamanho 7000 units concentraccedilatildeo 10 unitsmicroL fonte Bacillus sphaericus empresa
Jena bioscienceUtilizaram-se os componentes para o volume de 50microL da reaccedilatildeo
citados na tabela 5
Tabela 5 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da digestatildeo do gene
universal
Reagente Volume
Produto de PCR 10 microL
Enzima BshF I 01 microL
Tampatildeo (10x) 5 microL
Aacutegua Miliq 349 microL
Total (em cada ependorff) 50 microL
Valores para 1 digestatildeo
Os ependorffs foram colocados por 30 minutos em banho-maria a 37ordmC Apoacutes
isso fez-se a corrida das amostras em gel de agarose para verificaccedilatildeo do resultado
(LU et al 2000)
4 8 Eletroforese em gel de agarose
Os produtos de DNA PCR e digestatildeo foram analisados em gel de agarose
2 O tempo de corrida do gel eacute de aproximadamente 1hora e 30minutos sendo
que no comeccedilo foi usada agrave voltagem de 50 V e apoacutes comeccedilar a correr o gel
aumentou a voltagem para 100 v Utilizou-se o marcador de 100pb (pares de bases)
Foi adicionado 3microL de corante Bromophenol (que tem a funccedilatildeo de fazer uma ligaccedilatildeo
na amostra de DNA e permitir a visualizaccedilatildeo da corrida no gel de agarose) em 7microL
de amostra tanto de DNA quanto de PCR Para o preparo do gel foi utilizado TBE
42
(Tris- Aacutecido Boacuterico) agarose e brometo de etiacutedio (sua funccedilatildeo eacute de corante para o gel
e permitir a visualizaccedilatildeo do DNA quando colocado agrave luz ultravioleta) Para o oligo
blaKPC a banda da amplificaccedilatildeo foi em 881ppb correspondendo ao plasmiacutedeo Jaacute
o oligo Universal foi em 996 pb
4 9 Descarte de resiacuteduos
Todos os materiais utilizados nos ensaios foram de uso uacutenico e manipulados
em cacircmaras de seguranccedila bioloacutegica classe II Apoacutes o uso foram colocados em
soluccedilatildeo desinfetantes (hipoclorito a 1) e em seguida autoclavados a 127oC por 20
min em sacos apropriados para autoclavaccedilatildeo Apoacutes a finalizaccedilatildeo do ciclo de
esterilizaccedilatildeo os sacos contendo o material descartaacutevel foram colocados em
recipientes de coleta da empresa responsaacutevel pela coleta de materiais bioloacutegicos
produzidos no laboratoacuterio de microbiologia Todos os procedimentos seguiram a
normativa RDC-ANVISA 3062004 sobre o descarte de resiacuteduos de serviccedilo de
sauacutede
4 10 Aspectos epidemioloacutegicos e cliacutenicos
Os aspectos cliacutenicos e epidemioloacutegicos foram investigados por meio de
prontuaacuterios dos pacientes portadores de enterobacteacuterias produtoras de
carbapenemases e envolveram topografia mais provaacutevel do foco infeccioso a
enfermidade motivadora da internaccedilatildeo o desfecho cliacutenico a idade e o tempo de
internaccedilatildeo
4 12 Anaacutelises eepidemioloacutegicas
As anaacutelises foram realizadas com o pacote estatiacutestico SPSS versatildeo 200
Para verificar quais variaacuteveis referentes aos dados epidemioloacutegicos e
microbioloacutegicos influenciaram no desfecho verificou- se a diferenccedila meacutedia das
variaacuteveis idade e tempo de internaccedilatildeo em cada grupo O teste estatiacutestico utilizado foi
o teste t de Student apoacutes se executar o teste de normalidade de Shapiro-Wilk Para
as variaacuteveis sexo perfil microbioloacutegico das enterobacteacuterias produtoras de
43
carbapenemases foi avaliada a associaccedilatildeo com o desfecho por meio do teste Exato
de Fisher O niacutevel de significacircncia adotado foi de 5
4 13 Preceitos eacuteticos
Este projeto estaacute inserido em um projeto maior denominado ldquoEpidemiologia
cliacutenica e caracterizaccedilatildeo molecular do Acinetobacter Baumannii resistente a
antibioticoterapia em pacientes internado em hospitais do Sistema Uacutenico de Sauacutederdquo
que foi submetido ao Comitecirc de Eacutetica em Pesquisa da Secretaria do Estado de
Sauacutede do Distrito Federal (SESDF) e emitido parecer aprovado pelo protocolo nordm
23109 (anexo)
44
5 RESULTADOS
51 Anaacutelise molecular
Para a amplificaccedilatildeo com o oligo blaKPC foram amplificadas amostras
que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 881 pb correspondente ao
plasmiacutedeo A anaacutelise da amplificaccedilatildeo da regiatildeo do gene blaKPC mostrou que
apenas a amostra A10 natildeo amplificou isso demonstra que esta amostra natildeo
possuiacutea o gene de resistecircncia
5 1 1 Gene blaKPC
Figura 7 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 881 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
A amostra A3 natildeo amplificou no primeiro momento entatildeo foi realizado
novamente a PCR e corrida de gel obtendo entatildeo a amplificaccedilatildeo da amostra como
apresentado na figura 8
45
Figura 8 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC da
mostra A3 estudada A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo de 881
pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 1 2 Gene 16S rRNA
Para a amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA utilizou-se o oligo universal Foram
amplificadas amostras que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 996 pb
Figura 9 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
46
Segundo Lu et al (2000) a digestatildeo com a enzima HaeIII deste amplicons de
16S rRNA devolveriam bandas com perfis entre 150 a 200 pb No gel abaixo eacute
possiacutevel evidenciar que este perfil ocorreu com o predomiacutenio de bandas na altura
de 200pb
Figura 10 Gel de agarose a 2 da digestatildeo do amplicon do gene 16S
rRNA das amostras com a enzima HaeIII evidenciando diversos fragmentos
proacuteximos a 200 pb A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo ribossomal
de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 2 Anaacutelises epidemioloacutegicas
5 2 1 Sexo
No total foram detectados 17 isolados de KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 onde a maior a prevalecircncia foi
detecatada em amostras de pacientes do sexo masculino (53) do que no sexo
feminino (47)
47
Figura 11 Isolado de KPC segundo sexo dos 17 pacientes investigados
no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 2 Desfecho cliacutenico
Em 17 isolados de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo
de 2010 aacute 2011 a porcentagem de pacientes que foram a oacutebito (59) foi maior que
a de pacientes que tiverm alta (41)
Figura 12 Isolado de KPC segundo desfecho cliacutenico dos 17 pacientes
investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
48
5 2 3 Local da coleta
Dos 17 episoacutedios detectados de infecccedilatildeo por KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 a infecccedilatildeo em swab retalfoi mais
frequente (47) seguida de ponta de cateacuteter (18) e secreccedilatildeo traqueal (12)
Figura 13 Isolados de KPC segundo local da coleta da amostra nos 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 4 Microorganismo
O microorganismo mais encontrado foi a Klebsiella pneumoniae (82)
seguida da Enterobacter clocae (12) e Serratia marcescens (6) dos 17 isolados
de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 Isto afirma o
fato de a sigla KPC ser utilizada de forma errocircnea aacute Klebsiella pneumoniae visto
que a evidecircncia dela eacute maior em relaccedilatildeo as outras cepas
49
Figura 14 Isolado de KPC segundo microrganismo encontrado em 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 5 Relaccedilotildees variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana e desfecho
cliacutenico
Tabela 6 ndash Distribuiccedilatildeo do perfil geneacutetico sexo coleta tipificaccedilatildeo de
microrganismos e anaacutelise da resistecircncia bacteriana segundo o desfecho
cliacutenico Brasiacutelia-DF 2010 a 2011
Variaacutevel Resultado
Desfecho
Alta Oacutebito
N N P
Gene 16S rRNA Positivo 7 1000 10 1000
NA Gene blaKPC Positivo 6 857 10 1000
Negativo 1 143 0 00 0218 Sexo Feminino 2 286 6 600
Masculino 5 714 4 400 0201 Local da coleta Fundo saco de
Douglas 1 143 0 00
Hemocultura 0 00 1 100 0463 Ponta de cateter 1 143 2 200
Sec TraquealBrocircnquica
0 00 1 100
50
Secreccedilatildeo traqueal 2 286 0 00
Swab retal 3 429 5 500
Urina 0 00 1 100
Microrganismo Enterobacter cloacae (KPC)
1 143 1 100
Klebsiella pneumoniae
6 857 8 800
0416 Serratia
marcescens 0 00 1 100
Teste de Hodge Hodge positivo 7 1000 10 1000
NA Amicacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 1 100 0848 resistente 0 00 1 100
sensiacutevel 2 286 3 300
Amoxicilina Aacutecido Clavulacircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Ampicilina Sulbactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ampicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Aztreonan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefazolina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Cefoperazona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Cefotaxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefoxitina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0509 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 2 286 4 400
Ceftazidima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cetriaxona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 3 429 5 500 0772 Cefalotina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ciprofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772
51
resistente 3 429 5 500
Claritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Clindamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Eritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Gentamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0942 resistente 2 286 3 300
sensiacutevel 1 143 2 200
Imipenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 0 00 2 200 0193 Resistente 1 143 3 300
sensiacutevel 2 286 0 00
Nitrofurantoiacutena sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Norfloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Oxacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Penicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Piperacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Rifampicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tetraciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Ticarcilina Aacutecido Clavulocircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0688 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 3 429 4 400
Tobramicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Trimetoprima Sulfametoxazol
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0112 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 2 286 0 00
Vancomicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tigeciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediario 0 00 1 100 0211 natildeo testado 1 143 4 400
resistente 2 286 0 00
52
Cefepime sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefuroxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Levofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Piperacilina Tazobactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Ertapenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Meropenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0223 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 1 143 0 00
Cefotetan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 sensiacutevel 0 00 1 100
Gemifloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 7 700 0585 natildeo testado 3 429 3 300
Desfecho
Alta Oacutebito
Meacutedia Erro
padratildeo Meacutedia Erro
padratildeo p
Idade 58 9 59 5 0991
Tempo Internaccedilatildeo (dias)
50 13 46 12 0571
n= 17 p(lt 005) NA natildeo se aplica
53
6 DISCUSSAtildeO
Nos uacuteltimos anos houve um aumento na incidecircncia de bacteacuterias
multirresistentes aos antimicrobianos no ambiente hospitalar tornando isto um
problema mundial de sauacutede puacuteblica (HULSCHER et al 2010) Quando se trata
principalmente de bacilos Gram negativos a frequumlecircncia destas bacteacuterias eacute ainda
maior em paiacuteses da Ameacuterica Latina quando comparada a paiacuteses desenvolvidos
(GALES etal 2012)
De acordo com dados do ldquoMeropenem Yearly Susceptibility Test Information
Collectionrdquo (MYSTIC) ocorreu nos Estados Unidos um aumento na susceptibilidade
de K pneumoniae nos uacuteltimos anos graccedilas a praacuteticas de controle de disseminaccedilatildeo
de amostras resistentes(RHOMBERG P R et al 2009) O aumento crescente da
prevalecircncia destes microrganismos foi proporcional ao aumento da dependecircncia do
uso de antibioacuteticos carbapenecircmicos considerados como a opccedilatildeo terapecircutica para o
tratamento de infecccedilotildees por bacilos Gram negativos multi-resistentes (LIVERMORE
2012) Isto afeta diretamente as opccedilotildees de tratamento sobrando poucas alternativas
para a terapecircutica que incluem colistina (polimixina E) e tigeciclina que apresentam
respectivamente problemas em termos de toxicidade e eficaacutecia (LIVERMORE et
al 2011) Um dos efeitos adversos mais importantes das poliminas B e E por
exemplo satildeo a neurotoxicidade e nefrotoxicidade (MENDES C A C et al2009 )
Devido agrave resistecircncia ser usualmente de natureza plasmidial e portanto de
maior disseminaccedilatildeo especialmente quando carreadas por K pneumoniae
microrganismo com uma notoacuteria capacidade para acumular e transferir plasmiacutedeos
com determinantes para resistecircncia o nuacutemero de casos detectados pelo
fenoacutetipogenoacutetipo blaKPC eacute bastante preocupante (MONTEIRO et al 2009)
Comparada com outras bacteacuterias hospitalares a transmissatildeo de clones
multirresistentes de K pneumoniae eacute maior e podem natildeo ser controladas pelos
meacutetodos de controle de infecccedilatildeo hospitalar (PAAUW et al 2007) A forma
plasmidial para transferecircncia da resistecircncia adicionada a este grande potencial para
disseminaccedilatildeo de clones resistentes eacute preocupante visto que apoacutes surtos muitas
vezes pode se tornar endecircmica Jaacute eacute uma realidade a disseminaccedilatildeo desta bacteacuteria
54
entre pacientes hospitais paiacuteses e ateacute mesmo continentes (WOODFORF et al
2010 ROGERS et al 2011)
As chances de surtos satildeo maiores em paiacuteses com poucos recursos devido agrave
maior carecircncia de praacuteticas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees hospitalares e o
uso irracional de antimicrobianos de forma empiacuterica e inadequada (KUMARASAMY
et al 2010) Ateacute o momento os mecanismos de resistecircncia aos cabapenecircmicos
geralmente encontrado eram a produccedilatildeo de ESBL (CTX-M) somada aacute perda de
porina (CARVALHAES et al 2010) Foi notado a partir do ano de 2008 um
aumento no nuacutemero de K pneumoniae produtoras de KPC-2 apresentando outra
forma de resistecircncia (GALES 2012)
Um estudo mostrou que o perfil do paciente colonizado ou infectado por KPC
foi de um paciente entre os 33 e os 82 anos de idade internado haacute mais de 1
semana no hospital A mortalidade geral nos uacuteltimos anos ficou em torno de 7
sendo que dos 77 pacientes estudados 32 (415) pacientes evoluiacuteram para oacutebito
evidenciando a alta morbi-mortalidade associada (ALVES A P et al 2013)
Em estudo com 2316 pacientes avaliados a populaccedilatildeo de sexo masculino foi
de 526 idade meacutedia global de 53 anos (mediana de 55 anos) permanecircncia meacutedia
de 58 dias (mediana de 3 dias) (OLIVEIRA A C et al 2010) Outros trabalhos
apresentaram ausecircncia de significacircncia entre sexoidade e o desenvolvimento de
infecccedilotildees por microrganismos resistentes (PERES-BOTA D et al 2003 COLPAN
A et al 2005 COELLO R et al 1997)
Outro estudo utilizou um total de 30 amostras sendo elas isoladas de urina
escarro secreccedilatildeo pleural ponta de cateter aspirado traqueal e hemocultura A mais
prevalente foi em urina (40) Entre as 30 cepas analisadas a maior porcentagem
foi da cepa Klebsiella pneumoniae (70) Enterobacter sp (133) Klebsiella
ozaenae (10) Escherichia coli (333) e Klebsiella oxytoca (333)
(DIENSTMANN R et al 2010) Nos Estados Unidos a enzima KPC jaacute se tornou
endecircmica Foi realizada uma pesquisa em dois hospitais de Nova York onde
testaram 602 amostras e 45 apresentaram algum mecanismo de resistecircncia
sendo apenas 33 confirmadas por biologia molecular como KPC-2 (BRATU et
al 2005)
55
Estudo sobre os tipos de ESBL feito no Japatildeo apresentou o tipo Toho-1 como
o mais prevalente nessa pesquisa Ateacute o ano de 2000 ano em que foi publicado tal
estudo este era o primeiro relatoacuterio no Japatildeo para identificar derivados de ESBLs
como tipo de SHV e TEM entre E coli e K pneumoniae Em especial o tipo SHV- 12
foi identificado com uma maior frequumlecircncia Estes resultados indicam que tipos
distintos de ESBLs que satildeo diferentes em sua especificidade de substrato e origem
geneacutetica coexistem no Japatildeo Isto mostra a importacircncia de caracterizar genoacutetipos
distintos de ESBLs e de estar em alerta continuamente para as tendecircncias de
ESBLs no Japatildeo aleacutem da necessidade de uma interpretaccedilatildeo uniforme utilizando as
diretrizes do CSLI para relatar cepas produtoras de ESBL Aleacutem da detecccedilatildeo de
ESBLs satildeo necessaacuterias mais informaccedilotildees tais como o perfil de sensibilidade
especiacutefica para diversas β-lactacircmicos e o local da infecccedilatildeo Esses fatores satildeo
essenciais para a escolha adequada de antibioacuteticos (YAGI T et al 2000)
No ano de 2004 uma pesquisa avaliou a produccedilatildeo de uma enzima de
hidroacutelise de carbapenecircmicos atraveacutes da teacutecnica de sequumlenciamento foi revelado
um novo membro da famiacutelia KPC designado KPC- 3 Pesquisadores encontraram
em um mutante de K pneumoniae uma substituiccedilatildeo de um gene associado com
resistecircncia a Imipenem mas essa substituiccedilatildeo foi considerada improvaacutevel na
contribuiccedilatildeo da resistecircncia aos carbapenecircmicos da espeacutecie estudada Aleacutem da
resistecircncia aos carbapenecircmicos estes isolados eram em sua maioria resistentes agraves
cefalosporinas penicilinas e aminoglicosiacutedeos Usando estudos de transformaccedilatildeo
conjugaccedilatildeo e hibridaccedilatildeo localizaram o alelo blaKPC em plasmiacutedeo aleacutem disso
mostraram que esse alelo tambeacutem carregava uma resistecircncia aos aminoglicosiacutedeos
A transferecircncia das enzimas KPCs foi demonstrada in vitro tanto neste como em
outros estudos pode ser que os plasmiacutedeos que fazem esta transferecircncia estavam
comeccedilando a se espalhar no ambiente cliacutenico resultando na multiresistecircncia dessas
estirpes (WOODFORD et al 2004)
O presente estudo apresentou um vieacutes quanto aos resultados dos testes de
susceptibilidade microbiana Observou-se que natildeo foi encontrado resultado deste
teste em algumas amostras o que natildeo cooperou para um estudo mais preciso
futuros estudos quanto agraves amostras e um melhor acompanhamento deste tipo de
patologia Poreacutem mesmo sem algumas amostras com este resultado disponiacutevel foi
56
confirmada a presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos
carbapenecircmicos por meio dos genes de resistecircncia blaKPC e 16S rRNA que as
amostras apresentaram em sua maioria serem portadoras Quanto aos resultados
estatiacutesticos nenhuma das variaacuteveis apresentou significacircncia estatiacutestica (p gt 005)
mostrando assim que estas variaacuteveis isoladas natildeo foram o fator determinante para
o desfecho cliacutenico de alta ou oacutebito
57
7 CONCLUSAtildeO
Os genes blaKPC e 16S rRNA foram caracterizados confirmando a a
presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos carbapenecircmicos
Houve uma maior prevalecircncia da cepa K pneumoniae e isto confirma outros
estudos que apresentam a maior prevalecircncia desta cepa em amostras com KPC
Aleacutem disso isso justifica a forma popular da K pneumoniae ser chamada de KPC
enquanto que na verdade KPC eacute uma enzima podendo estar presente em outras
cepas como Enterobacter clocae tambeacutem apresentada no presente estudo O
desfecho cliacutenico de oacutebitos maior que 50 eacute um possiacutevel indicador sobre a
necessidade de se realizar um teste raacutepido para identificaccedilatildeo de KPC visando
iniciar o mais raacutepido possiacutevel o tratamento afim de diminuir a mortalidade por esta
infecccedilatildeo
Nenhuma das variaacuteveis isoladamente estaacute relacionada ao desfecho cliacutenico
oacutebito ou alta pois natildeo apresentaram relevacircncia estatiacutestica O presente estudo
mostrou que haacute presenccedila da bacteacuteria nas amostras de pacientes do hospital
estudado podendo entatildeo afirmar que este tipo de bacteacuteria se encontra tambeacutem
presente em ambiente hospitalar O uso irracional de antimicrobiano eacute demonstrado
de forma indireta quando foi apresentado atraveacutes do Teste de Hodge Modificado
uma resistecircncia de 100 aos antibioacuteticos carbapenecircmicos Isto tambeacutem reflete na
terapecircutica sendo que pacientes portadores de bacteacuterias resistentes aos
antibioacuteticos carabepecircmicos tem uma escassa opccedilatildeo de tratamento e as opccedilotildees
apresentam problemas quanto agrave toxicidade e eficaacutecia
58
REFEREcircNCIAS
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Mecanismos
de resistecircncia bacteriana aos antimicrobianos Disponiacutevel em
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controleopas_
webmodulo3mec_sitiohtmgt Acesso em 25 de abril de 2014
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Nota teacutecnica nordm
012013 medidas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees por enterobacteacuterias
multiresistentes Acesso em 17 de abril de 2013
ALBA J et al Kinetics study of KPC-3 a plasmid-encoded class A
carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase Antimicrob Agents Chemother
Nov49(11)4760-2 2005
ALVES A P et al Nosocomial infections by KPC-producing enterobacteria in
a tertiary hospital in Southern Brazil Revista da AMRIGS Porto Alegre 57 (3) 213-
218 jul-set 2013
ALVES A et al Tipagem Geneacutetica de Microrganismos Lab De Diversidade
Microbiana Centro de Biologia Celular Dep de Biologia U de Aveiro 3810-193
Aveiro- 2003
BELL J M et Al Prevalence and significance of a negative extended-
spectrum beta-lactamase (ESBL) confirmation test result after a positive ESBL
screening test result for isolates of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae
results from the SENTRY Asia-Pacific Surveillance Program J Clin Microbiol
May45(5)1478-82 2007
BRATU S et al Detection of KPC carbapenem-hydrolyzing enzymes in
Enterobacter spp from Brooklyn New York Antimicrob Agents Chemother v 49 n
2 p 776-8 2005
59
BRATU S et al Emergence of KPC-possessing Klebsiella pneumoniae in
Brooklyn New York epidemiology and recommendations for detection Antimicrob
Agents Chemother v 49 n 7 p 3018-20 2005
BRATU S et al Rapid spread of carbapenem-resistant Klebsiella
pneumoniae in New York City Arch Intern Med v 165 p 1430-5 2005
CAMARGO C F et al Aplicaccedilatildeo das teacutecnicas de pcr e suas teacutecnicas
derivadas em diagnoacutestico molecular Disponiacutevel em
ltfileDUnB10C2BA20semestreArtigosPCR-
20CLEYTON20FLORENCIO20DE20CAMARGO20E20PAULO20ROB
ERTO20QUEIROZpdfgtgt Acesso em 08 de abril de 2014
CARVALHES C G et al Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting
carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive
results Journal of Antimicrobial Chemotherapy v 65 n2 p 249-251 2010
CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION- CDC Modified
Hodge Test for Carbapenemase Detection in Enterobacteriaceae 2004
CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE Methods for
dilutionantimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically Approved
standard M7ndashA7 7th ed CLSI Wayne PA 2011
COELLO R et al Risk factors for developing clinical infection with methicillin-
resistant Staphylococcus aureus (MRSA) amongst hospital patients initially only
colonized with MRSA J Hosp Infect 19973739-46
COLPAN A et al Evaluation of risk factors for mortality in intensive care
units A prospective study from a referral hospital in Turkey Am J Infect Control
200533(1)42-7
60
CORNAGLIA G et al Living with ESBLs Introduction Clinical Microbiology
and Infection 14 Suppl 1 1-2 2008
COTRIM E R et al Klebsiella pneumoniae carbapenemase ndash KPC em
Enterobacteriaceae o desafio das bacteacuterias multirresistentes Poacutes em revista do
centro universitaacuterio Newton Paiva 12012 - ediccedilatildeo 5 - issn 2176 7785
DESHPANDE L M et al Occurrence and characterization of
carbapenemase-producing Enterobacteacuteriaceae report from the SENTRY
Antimicrobial Surveillance Program (2000-2004) Microb Drug Resist 12(4)223-30
2006
DIAS D J A Estudos dos principais mecanismos de resistecircncia aos
antibioacuteticos β-lactacircmicos em bacteacuterias patogecircnicas gram negativas 2009 100 f
Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Geneacutetica Molecular e Biomedicina) ndash Faculdade de
Ciecircncias e Tecnologia Universidade de Nova Lisboa Lisboa
DIENSTMANN R et al Avaliaccedilatildeo fenotiacutepica da enzima Klebsiella
pneumoniae carbapenemase (KPC) em Enterobacteriaceae de ambiente hospitalar
J Bras Patol Med Lab v 46 n 1 p 23-27 fevereiro 2010
ENDIMIAMI A et al Emergence of blaKPC-containing Klebsiella
pneumoniae in a long-term acute care hospital a new challenge to our healthcare J
Antimicrob Chemother 64 1102-1110 Nov 2009
FALAGAS M E et al Extended-spectrum beta-lactamase producing
organisms The Journal of Hospital Infection 73 (4) pp 345-54 2009
FONTANA C et al Emergence of KPC-producing Klebsiella pneumoniae in
Italy BMC Rev Notes 3 40 2010
61
GALES A C et al Antimicrobial resistance among Gram-negative bacilli
isolated from Latin America results from Sentry Antimicrobial Surveillance Program
(Latin America 2008-2010) Diagnostic Microbiology and Infectious Disease v 3 n
4 p 354 -360 2012
GUPTA N et al Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Epidemiology
and Prevention HEALTHCARE EPIDEMIOLOGY Clinical Infectious Diseases
201153(1)60ndash67 Published by Oxford University Press on behalf of the Infectious
Diseases Society of America 2011
HARBOTTLE H et al Genetics of antimicrobial resistance Anim Biotechnol
n17 p111-124 2006
HENRIQUE W N et al RESISTEcircNCIA BACTERIANA Uniatildeo das
Faculdades Alfredo NasserInstituto de Ciecircncias da Sauacutede Disponiacutevel em lt
httpwwwfaculdadealfredonasseredubrfilespesquisaposter20HENRIQUE20
Wilker20Natividade20SANTIAGO20Silvania20CAVALCANTI20DSP
20ResistC3AAncia20Bacterianapdfgt Acesso em 17 marccedilo 2014
HULSCHER M E J I et al Antibiotic prescribing in hospital a social and
behavioral scientific approach The Lancet Infectious Diaseases v 10 n 3 p 167-
165 2010
KIDWAI M SAPRA P BHUSHAN KR Synthetic strategies and medicinal
properties of beta-lactams Curr Med Chem 1999 695-215
KUMARASAMY K K et al Emergence of a new antibiotic resistance
mechanism in India Pakistan and the UK a molecular biological and
epidemiological stuy The Lancet Infectious Diseases v10 n 9 p 597- 602 2010
LINCOPAN N et al Enterobacteacuteria producing extended-spectrum β-
lacatamases and IMP-1 Metalo-β-lactamases isolated from Brazilian hospitals J Med
62
Microbiol 7 1-3 2006
LINCOPAN N et al First Isolation of Metalo-β-Lacatamase-Producing
Multiresistant Klebsiella pneumoniae from a patient in Brazil J Clin Microbiol 43(1)
516-519 2005
LIVERMORE D M et al What remains against carbapenem- resistant
Enterobacteriaceae Evaluation of choramphenicol ciprofloxacin colistina
fosfomycin minocycline nitrofurantoin temocilin and tigecycline International
Journal of Antimicrobial Agents v 37 n 5 p 415- 459 2011
LIVERMORE D M Fourten years in resistance International Journal of
Antimicrobial Agents v 39 283- 294 2012
LIVERMORE D M Bacterial resistance to carbapenems Adv Exp Med Biol
1995 39025-47
LIVERMORE D M Bacterial resistance origins epidemiology and impact
Clin Infect Dis 36S11-S23 2003
LIVERMORE D M et al Carbapenemases a problem in waiting Curr
Opin Microbiol 2000 3489-95
LU et al Universal pcr for common bacterial pathogens J CLIN
MICROBIOL VOL 38 2000
LU et al Use of PCR with Universal Primers and Restriction Endonuclease
Digestions for Detection and Identification of Common Bacterial Pathogens in
Cerebrospinal Fluid Journal of Clinical Microbiology June 2000 p 2076ndash2080
MARSCHALL J Met al Presence of the KPC Carbapenemase Gene in
Enterobacteriaceae Causing Bacteremia and Its Correlation with In Vitro
Carbapenem Susceptibility J Clin Microbiol 47 239-241 Jan 2009
63
MARTINS WMBS et al Prevalecircncia do gene blaKPC em isolados cliacutenicos
de Enterobacteriaceae e natildeo fermentadores encontrados em amostras clinicas em
um hospital universitaacuterio do Recife X Jornada de ensino pesquisa e extensatildeo ndash
JEPEX 2010 ndash UFRPE Recife 18 a 22 de outubro
MENDES C A C et al Polimixinas Revisatildeo com ecircnfase na sua
nefrotoxicidade Rev Assoc Med Bras 2009 55(6) 752-9
MOHR J F 3rd Update on the efficacy and tolerability of meropenem in the
treatment of serious bacteacuterial infections Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S41-51
2008
MONTEIRO J et al First report of KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae
strains in Brazil Antimicrob Agents Chemother Jan53(1)333-4 2009
MOREIRA V C et al Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia a antibioacuteticos
Disponiacutevel em
lthttpwwwcpglsucgbr6mostraartigosSAUDEVANESSA20CARVALHO20M
OREIRApdfgt Acesso em 21 marccedilo 2014
NETIKUL T et al Emergence of novel blaKPC-12 and blaKPC-13 variants in
carbapenem non-susceptible Enterobacter cloacae a first report of blaKPC gene in
Thailand European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases May
S372 2011
NETO V A et al Antibioacuteticos na praacutetica Meacutedica 6ordf Ediccedilatildeo Editorial
SarverSP Brasil 2007
NICOLAU D P Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of
meropenem Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S32-40 2008
64
OLIVEIRA A C et al Resistecircncia bacteriana e mortalidade em um centro de
terapia intensiva Rev Latino-Am Enfermagem nov-dez 2010
PAAUW A et al Failure to control an outbreak of qnrA 1-positive multidrug-
resistant Enterobacter clocae despite adequate implementation of recommended
infection control measures Journal of Clinical Microbiology v 45 n 5 p 1420-1425
2007
PATERSON D L et al Extended-Spectrum Beta-Lactamases a Clinical
Update Clinical Microbiology Reviews v 18 p 657-686 2005
PEIRANO G et al Carbapenem-hydrolysing beta-lactamase KPC-2 in
Klebsiella pneumonia isolated in Rio de Janeiro Brazil J Antimicrob Chemother Nov
20 2009
PERES-BOTA D et al Are infections due to resistant pathogens associated
with worse outcome in critically ill patients J Infect 200347(4)307-16
PIDDOCK L J V Clinically relevant chromosomally encoded multidrug
resistance effl ux pumps in bacterial Clin Microbiol Rev n19 p382-402 2006
PITOUT J D D et al Emergence of Enterobacteriaceae producing
extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) in the community J Antimicrob
Chemother May 56 2005
POSSEBON M I et al Resistecircncia bacteriana aos carbapenecircmicos
Bacterial resitence to carbapenems RBM rev bras med60(6)378380-378-382
jun 2003
QUEENAN A M et al Carbapenemases the versatile beta-lactamases
Clin Microbiol Rev Jul20(3)440-58 2007
65
RHOMBERG P R et al Summary trends for the meropenem yearly
susceptibility test information collection program a 10- year experience in the United
States (1999-2008) Diagnostic Microbiology and Infectiois Disease v 65 n4 p
414-426 2009
ROBLEDO I E et al Detection of KPC in Acinetobacter spp in Puerto Rico
J Antimicrob Agents Chemother 54 1354-1357 Mar 2010
ROGERS B A et al Country-to-country transfer os patients and the risk of
multi-resistant bacterial infection Clinical Infectious Disease v53 n1 p49- 56
2011
SHAH A A et al Characteristics epidemiology and clinicalimportance of
emerging strains of Gram-negative bacilli producing extended-spectrum
betalactamases Research in Microbiology v 155 p 409-421 2004
TURNER P J Extended- Spectrum Beta-Lactamases Clinical Infectious
Diseases v 41 p 273-275 2005
WOLTER D J et al Phenotypic and Enzymatic Comparative Analysis
between the Novel KPC variant KPC-5 and Its Evolutionary Variants KPC-2 and
KPC-4 Antimicrob Agents Chemother Nov 17 2008
WOODFORD N et al Carbapenemases of Chryseobacterium
(Flavobacterium) meningosepticum distribution of blaB and characterization of a
novel Metalo-beta-lactamase gene blaB3 in the type strain NCTC 10016
Antimicrob Agents Chemother Jun44(6)1448-52 2000
WOODFORF N Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in
India Pakistan and the UK a molecular biological and epidemiological study The
Lancet Infectious Diseases v 10 n 9 p 597-602 2010
66
WOODFORD et al Outbreak of Klebsiella pneumoniae Producing a New
Carbapenem- Hydrolyzing Class A β-Lactamase KPC-3 in a New York Medical
Center Antimicrobial agents and chemotherapy Dec 2004 p 4793ndash4799 Vol 48
No 12
YAGI T et al A preliminary survey of extended-spectrum β-lactamases
(ESBLs) in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Japan
FEMS Microbiology Letters 184 (2000) 53-56
YIGIT H et al Novel carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase KPC-1 from
a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumonia J Antimicrob Agents
Chemother 45 (4) 1151-1161 (2001)
ZAVASCKI A P et al KPC-2- producing Enterobacter cloacae in two cities
from Southern Brazil Int J Antimicrob Agents Apr 28 2009
ZHANEL G G et al Comparative review of the carbapenecircmicos Drugs
67(7)1027-52 2007
67
ANEXOS
Sequumlecircncia do oligo blaKPC
Query 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
Query 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
Query 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
68
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
Query 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
Query 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
69
Query 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
Query 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
Query 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
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|||||||
70
Sbjct 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
Query 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
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Sbjct 481
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ATTTGTT 540
Query 541
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GCGATAC 600
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Sbjct 541
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GCGATAC 600
Query 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
71
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Sbjct 601
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ATGCGCG 660
Query 661
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GCTCTGC 720
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Sbjct 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
Query 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Sbjct 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
72
Query 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
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|||||||
Sbjct 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
Query 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
Query 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
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|||||||
73
Sbjct 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
Query 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
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|||||||
Sbjct 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
Query 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
Query 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
74
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
Query 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
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|||||||
Sbjct 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
Query 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
75
Query 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Sbjct 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
Query 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
||||
Sbjct 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
LOCUS AF297554 1377 bp
DNA linear BCT 26-MAR-2001
DEFINITION Klebsiella pneumoniae carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
gene complete cds
ACCESSION AF297554
VERSION AF2975541 GI10121874
76
KEYWORDS
SOURCE Klebsiella pneumoniae
ORGANISM Klebsiella pneumoniae
Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Enterobacteriaceae Klebsiella
REFERENCE 1 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH QueenanAM
AndersonGJ Domenech-SanchezA
BiddleJW StewardCD
AlbertiS BushK and TenoverFC
TITLE Novel carbapenem-hydrolyzing beta-
lactamase KPC-1 from a
carbapenem-resistant strain of
Klebsiella pneumoniae
JOURNAL Antimicrob Agents Chemother 45 (4)
1151-1161 (2001)
PUBMED 11257029
REFERENCE 2 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH AndersonGJ and
TenoverFC
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (19-AUG-2000) Nosocomial
Pathogens Laboratory Branch
Centers for Disease Control and
Prevention 1600 Clifton Rd MS
G08 Atlanta GA 30333 USA
FEATURES LocationQualifiers
77
source 11377
organism=Klebsiella
pneumoniae
mol_type=genomic DNA
db_xref=taxon573
-35_signal 5560
-10_signal 7883
mRNA 921012
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
RBS 117122
CDS 1311012
note=blaKPC-1
codon_start=1
transl_table=11
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
protein_id=AAG134101
db_xref=GI10121875
translation=MSLYRRLVLLSCLSWPLAGFSATALTNLVAEPFAKLEQD
FGGSI
GVYAMDTGSGATVSYRAEERFPLCSSFKGFLAAAVLARSQQQAGLLDTPIRYG
KNALV
PWSPISEKYLTTGMTVAELSAAAVQYSDNAAANLLLKELGGPAGLTAFMRSIG
DTTFR
78
LDRWELELNSAIPSDARDTSSPRAVTESLQKLTLGSALAAPQRQQFVDWLKGN
TTGNH
RIRAAVPADWAVGDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTRAPNKDDK
HSEAV
IAAAARLALEGLGVNGQ
ORIGIN
1 cggggcagtt acagccgtta cagcctctgg
agagggagcg gcttgccgct cggtgataat
61 cccagctgta gcggcctgat tacatccggc
cgctacacct agctccacct tcaaacaagg
121 aatatcgttg atgtcactgt atcgccgtct
agttctgctg tcttgtctct catggccgct
181 ggctggcttt tctgccaccg cgctgaccaa
cctcgtcgcg gaaccattcg ctaaactcga
241 acaggacttt ggcggctcca tcggtgtgta
cgcgatggat accggctcag gcgcaactgt
301 aagttaccgc gctgaggagc gcttcccact
gtgcagctca ttcaagggct ttcttgctgc
361 cgctgtgctg gctcgcagcc agcagcaggc
cggcttgctg gacacaccca tccgttacgg
421 caaaaatgcg ctggttccgt ggtcacccat
ctcggaaaaa tatctgacaa caggcatgac
481 ggtggcggag ctgtccgcgg ccgccgtgca
atacagtgat aacgccgccg ccaatttgtt
541 gctgaaggag ttgggcggcc cggccgggct
gacggccttc atgcgctcta tcggcgatac
79
601 cacgttccgt ctggaccgct gggagctgga
gctgaactcc gccatcccaa gcgatgcgcg
661 cgatacctca tcgccgcgcg ccgtgacgga
aagcttacaa aaactgacac tgggctctgc
721 actggctgcg ccgcagcggc agcagtttgt
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781 ccaccgcatc cgcgcggcgg tgccggcaga
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961 cgccgctgcg gctagactcg cgctcgaggg
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1201 cggcgcgcgg cgtgttatga cgactggggt
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1261 ctcacagata cgccattcgc ctcaaattta
gcgccatgca gacgagcttc cactcggctt
1321 gcaccttgtc caggcccctc atgctgaact
gacgcaatcc catcaccgcc ttgatca
80
27
13 Anaacutelise geneacutetica de microrganismos
Eacute de extrema importacircncia praacutetica natildeo soacute no aspecto cliacutenico mas tambeacutem na
fitopatologia biotecnologia e estudos ambientais a correta identificaccedilatildeo e
classificaccedilatildeo de microrganismos Os meacutetodos usados na diferenciaccedilatildeo de gecircneros
espeacutecies e estirpes de microrganismos podem ser divididos em meacutetodos fenotiacutepicos
(baseados em fenocircmenos bioquiacutemicos fisioloacutegicos e bioloacutegicos) e genotiacutepicos
(detectam polimorfismos ao niacutevel dos aacutecidos nucleacuteicos ou variaccedilatildeo aleacutelica ao niacutevel
de enzimas) (ALVES et al 2003)
Para este tipo de estudo existem alguns meacutetodos como o RFLPrsquos -
ldquoRestriction Fragment Length Polymorphismsrdquo (polimorfismos de tamanho de
fragmentos de restriccedilatildeo) rep-PCR (Meacutetodo de tipagem baseado na amplificaccedilatildeo via
PCR de elementos de DNA repetitivos presentes em genomas bacterianos) anaacutelise
de sequumlecircncias nucleotiacutedeas (discriminaccedilatildeo eou identificaccedilatildeo atraveacutes de sequumlecircncias
de DNA) PFGE - Pulsed-Field Gel Electrophoresis (Eletroforese em campo
pulsado) ( A L V E S et al 2003)
A diferenciaccedilatildeo clara da cepa e principalmente a alta reprodutibilidade devem
ser caracteriacutesticas de qualquer meacutetodo de tipagem geneacutetica Poreacutem nem todos os
meacutetodos moleculares de tipagem satildeo igualmente eficazes Sendo assim de acordo
com a finalidade pretendida (identificaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo custo reprodutibilidade
etc) eacute feita a escolha do meacutetodo a ser aplicado (A L V E S et al 2003)
O processo de identificaccedilatildeo fenotiacutepica de KPC entre os membros da famiacutelia
Enterobacteriaceae ainda eacute difiacutecil e os meacutetodos para a sua identificaccedilatildeo devem ser
revistos e ajustados Mesmo com o avanccedilo tecnoloacutegico natildeo existem ensaios que
combinam alta especificidade e sensibilidade na detecccedilatildeo destas enzimas Satildeo
diversas as metodologias usadas para rastreamento de KPC como por exemplo a
focalizaccedilatildeo isoeleacutetrica a teacutecnica de disco-difusatildeo E-test teste de Hodge
modificado dentre outros Aleacutem disso a pesquisa do gene blaKPC pode ser feita
pela Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) Os sistemas de automaccedilatildeo
existentes no entanto podem natildeo identificar com precisatildeo os isolados KPC
positivos (COTRIM et al 2012)
A identificaccedilatildeo blaKPC pelo PCR eacute um meacutetodo raacutepido preciso sensiacutevel e
altamente especiacutefico no entanto a PCR exige equipamento e conhecimentos
28
especializados em diagnoacutestico molecular dificultando ainda a utilizaccedilatildeo dele na
rotina dos laboratoacuterios de microbiologia (COTRIM et al 2012)
Em estudo de infecccedilotildees hospitalares identificaccedilatildeo molecular de patoacutegenos
bacterianos eacute bastante utilizada Para diferenciar carbapenemases tipo KPC a partir
de outros tipos como SME NMC-A-IMI e GES eacute necessaacuterio um exame molecular
As identificaccedilotildees do microrganismo juntamente com a triagem molecular iratildeo definir
um resultado mais especiacutefico podendo ser usado para identificar o antibioacutetico mais
adequado para o tratamento Poreacutem a principal desvantagem de alguns exames
baseados em PCR por exemplo eacute que devido agrave sua limitada capacidade de
multiplexaccedilatildeo eles distinguem apenas algumas variaccedilotildees (MOREIRA et al 2014)
Estatildeo descritas para a identificaccedilatildeo molecular de patoacutegenos pertencentes agrave
famiacutelia Enterobacteriaceae as teacutecnicas de PFGE RAPD (randomly amplified
polymorphic DNA) e ERIC-PCR (Enterobacterial Repet it ive Intergenic Consensus)
A PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) eacute considerada padratildeo ouro devido sua
alta capacidade de diferenciaccedilatildeo baseada na anaacutelise do perfil de restriccedilatildeo do DNA
genocircmico por meio de eletroforese Como desvantagem para a sua execuccedilatildeo eacute
necessaacuterios vaacuterios dias impedindo a tipagem de algumas cepas bacterianas devido
agrave degradaccedilatildeo do DNA aleacutem do alto custo empregado (MOREIRA et al 2014)
O meacutetodo baseado em ERIC-PCR tem sido bastante utilizado como uma
alternativa para a teacutecnica de PFGE Esta teacutecnica consiste na anaacutelise do padratildeo de
amplificaccedilatildeo de elementos repetidos encontrados no genoma bacteriano Isto
permite uma maior rapidez na obtenccedilatildeo de resultados quando comparada com o
PFGE aleacutem de alta reprodutibilidade simples execuccedilatildeo e implementaccedilatildeo baixo
custo e natildeo sem problemas com a degradaccedilatildeo do DNA (MOREIRA et al 2014)
A PCR eacute considerada uma teacutecnica de biologia molecular revolucionaacuteria que
consiste na siacutentese enzimaacutetica de coacutepias de aacutecidos nucleacuteicos Ela permitiu o raacutepido
desenvolvimento do estudo de sequumlecircncias de aacutecidos nucleacuteico Foi desenvolvida por
Kary Banks Mullis que ganhou o precircmio Nobel de quiacutemica de 1993 devido ao
desenvolvimento dessa teacutecnica em abril de 1983 (CAMARGO et al 2014)
Por meio de etapas de variaccedilatildeo de temperatura a teacutecnica de PCR promove a
duplicaccedilatildeo de cadeias de DNA in vitro A reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo de DNA por PCR
envolve o emprego de sequumlecircncias iniciadoras (primers) quatro nucleotiacutedeos
29
(dNTPrsquos) do DNA e uma DNA polimerase termoestaacutevel podendo assim obter-se a
partir de uma fita molde muitas coacutepias de uma sequumlecircncia especiacutefica de aacutecido
nucleacuteico O princiacutepio da PCR consiste na variaccedilatildeo de temperatura por ciclo
envolvendo trecircs etapas baacutesicas desnaturaccedilatildeo pareamento e amplificaccedilatildeo
(CAMARGO et al 2014)
A desnaturaccedilatildeo da fita molde de DNA eacute uma etapa com duraccedilatildeo entre 30
segundos a 1 minuto a temperatura entre 92 ordmC a 96 ordmC Apoacutes isso o pareamento de
dois iniciadores sinteacuteticos de composiccedilotildees distintas que funcionam como os
iniciadores da reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo liga-se agrave regiatildeo complementar da fita de
DNA alvo que sofreraacute a duplicaccedilatildeo Esta etapa tem duraccedilatildeo de 30 segundos a 1
minuto a temperatura entre 58 ordmC e 65 ordmC Por uacuteltimo a amplificaccedilatildeo por meio da
enzima Taq DNA polimerase das novas fitas de DNA se daacute a partir de cada um dos
iniciadores utilizando os quatro dNTPrsquos como substrato da reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo
Esta etapa possui duraccedilatildeo entre 45 segundos e 1 minuto a 72 ordmC Cada ciclo eacute
repetido em torno de 30 a 35 vezes e promove a amplificaccedilatildeo da regiatildeo alvo
determinada conforme o anelamento dos iniciadores sinteacuteticos de DNA (CAMARGO
et al 2014) Estas etapas estatildeo demonstradas na figura 4
Figura 4 Etapas da Reaccedilatildeo de PCR
30
2 JUSTIFICATIVA
No ano de 2010 no Distrito Federal foram identificados 111 pacientes com
suspeita de infecccedilatildeo por Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) e a
Secretaria de Sauacutede do Distrito Federal confirmaram ainda a morte de 18 pacientes
dentre os hospitais puacuteblicos e particulares Um desafio encontrado por ocasiatildeo do
surto infeccioso no Distrito Federal foi o de confirmar as KPCs por Reaccedilatildeo da
Polimerase em Cadeia sendo que as amostras foram enviadas com esta finalidade
para a Fiocruz no Rio de Janeiro
Pesquisas que possam contribuir na elaboraccedilatildeo de estrateacutegias preventivas e
de intervenccedilatildeo para infecccedilotildees causadas por enterobacteacuterias bem como contribuir
para gerar uma integraccedilatildeo beneacutefica entre a equipe acadecircmica e os serviccedilos de
sauacutede devem ser estimuladas Neste sentido o presente estudo permitiu escrutinar
os genes envolvidos na expressatildeo de carbapenemases presentes em espeacutecies de
enterobacteacuterias isoladas em ambiente hospitalar visto que elucidar genes de
resistecircncia de enterobacteacuterias aos antibioacuteticos carbapenecircmicos eacute o primeiro passo
para garantir um controle epidemioloacutegico efetivo para estes tipos de microorganismo
assim como sua associaccedilatildeo com surtos fatais particularmente em pacientes com
baixa imunidade
31
3 OBJETIVOS
31 Objetivo geral Caracterizar os genes de resistecircncia das
Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases e os aspectos epidemioloacutegicos de
pacientes internados em um hospital puacuteblico do Distrito Federal
32 Objetivos Especiacuteficos
Identificar genotipicamente a enzima KPC (Klebsiella pneumoniae
carbapenemase) de isolados de Klebsiella pneumoniae
Investigar aspectos epidemioloacutegicos dos pacientes portadores de
Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases
Identificar quais variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana influenciaram para o
desfecho oacutebito ou alta
Avaliar a susceptibilidade das Enterobacteacuterias aos antibioacuteticos
carbapenecircmicos dos pacientes em ambiente hospitalar
32
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
Trata-se de um estudo transversal onde foi realizado o teste de
susceptibilidade das enterobacteacuterias aos antibioacuteticos carbapenecircmicos a partir dos
materiais bioloacutegicos coletados dos pacientes internados no Hospital Regional da Asa
Norte (HRAN) e enviados ao Laboratoacuterio de Anaacutelises Cliacutenicas da mesma Instituiccedilatildeo
Os materiais bioloacutegicos investigados foram sangue aspirado traqueal ou brocircnquico
urina e cultura semi quantitativa de ponta de cateter venoso central O HRAN eacute um
hospital puacuteblico do Distrito Federal com 395 leitos sendo as cliacutenicas de internaccedilatildeo
Berccedilaacuterio Cirurgia Geral Cirurgia Plaacutestica Cliacutenica Meacutedica Ginecologia Maternidade
Pediatria Queimados UTI com atendimento a pacientes portadores de doenccedilas de
caraacuteter cliacutenico e ciruacutergico
4 1 Coleta e transporte das amostras bioloacutegicas
As amostras foram coletadas de pacientes internados no Hospital Regional da
Asa Norte (HRAN) com suspeitas de infecccedilatildeo por KPC A identificaccedilatildeo primaacuteria foi
realizada pelo Laboratoacuterio de Microbiologia do hospital de origem dos pacientes e os
demais procedimentos que foram utilizados na identificaccedilatildeo encontram-se descritos
abaixo
4 2 Procedimentos para confirmaccedilatildeo de resistecircncia bacteriana por
disco de ertapenem (adaptado CDC 2004)
Para diagnosticar amostra como portadora de bacteacuteria produtora de
carbapenemase foi realizado o teste com disco de ertapenem como forma de
triagem Inicialmente utilizou-se o swab contaminado com a amostra que foi
distribuiacuteda em uma pequena aacuterea da placa de aacutegar MacConkey para apoacutes o
crescimento ser realizada a pesquisa de colonizaccedilatildeo por enterobacteacuterias resistentes
aos carbapenecircmicos (Pesquisa de CRE) Procedeu-se a semeadura por teacutecnica
semi-quantitativaesgotamento com alccedila bacterioloacutegica na diluiccedilatildeo de 1100 O disco
de Ertapenem foi colocado na superfiacutecie da placa de MacConkey na junccedilatildeo dos dois
primeiros campos de semeadura conforme demonstrado na figura 5 Incubou a placa
33
em estufa aeroacutebia a 35ordmC por 24 e 48 horas e observou-se o halo de difusatildeo do
disco de Ertapenem na placa para proceder agrave leitura
O teste deixou de ser obrigatoacuterio apoacutes a modificaccedilatildeo dos criteacuterios
interpretativos para carbapenecircmicos para enterobacteacuterias publicados no suplemento
do CLSI 2010 M100-S20-U
Figura 5 Mecanismo de semeamento de material bioloacutegico oriundos de
pacientes com suspeita de infecccedilatildeo por KPC Fonte adaptado CDC 2004
4 2 1 Interpretaccedilatildeo dos resultados
Na ausecircncia de crescimento ateacute 24 horas (MacConkey) ou halo de difusatildeo
gt27 mm na placa deve-se reincubar as placas por mais 24 horas Quando for
ausente o crescimento apoacutes 48 horas ou halo de difusatildeo gt27 mm na placa libera-se
como enterobacteacuterias resistentes a carbapenecircmicos (KPCNEG)Havendo
crescimento de colocircnias na placa de MacConkey com halo lt 27 mm (apenas para
colocircnias com crescimento dentro do halo) deve-se reisolar e realizar identificaccedilatildeo e
antibiograma automatizado teste de sensibilidade por disco-difusatildeo e Teste de
Hodge Modificado (THM) Os isolados de enterobacteacuterias cujos testes comprovarem
a resistecircncia aos carbapanecircmicos testados (KPCPOS) foram reportado a Comissatildeo
de Controle de Infecccedilatildeo Hospitalar (CCIH) Jaacute osbacilos Gram-negativos natildeo
fermentadores natildeo foram reportados (KPCNEG) Para interpretaccedilatildeodos resultados
foram utilizados os valores conforme demonstrados na tabela 1
Tabela 1 Criteacuterios Interpretativos para testes de sensibilidade
ENTEROBACTEacuteRIAS
Disco difusatildeo (mm) MIC (microgml)
34
Antibioacutetico Sigla S I R S I R
Ertapenem 10
microg
ETP 22 19-
21
18 05 1 2
Meropenem 10
microg
MEM 23 20-
22
19 1 2 4
Fonte Manual Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)
2013
Os resultados que apresentaram resistecircncia ao antibioacutetico Ertapenem foram
considerados como suspeitos de contaminaccedilatildeo por KPC Fez-se o teste de
susceptibilidade aos antibioacuteticos (TSA) em aparelho automatizado MicroScan Walk
Away 96sl Dade Behring
4 3 Teste de susceptibilidade aos antibioacuteticos (adaptado CDC 2004)
A determinaccedilatildeo da susceptibilidade dos isolados foi feita pelo teste de
susceptibilidade aos antibioacuteticos (TSA) apoacutes cultura em meio de gelose simples
(INSA) para avaliaccedilatildeo da sua pureza e obtenccedilatildeo de colocircnias isoladas Para
preparaccedilatildeo de uma suspensatildeo bacteriana com turvaccedilatildeo aproximada de 05
McFarland (Dade BehringMicroScanregTurbidity Meter) ressuspendeu duas a cinco
colocircnias em 2ml de soro fisioloacutegico esteacuteril diluindo a 1100 em soro fisioloacutegico num
volume total de 10ml em seguida foi feita uma semeadura em duas placas
quadradas (120mm x 120mm) de Muller-Hinton Agar (INSA) por inundaccedilatildeo
Os discos de antibioacutetico carbapenecircmicos imipenem meropenem e
ertapenem (Biorad) foram aplicados com o auxiacutelio de um dispensador automaacutetico A
susceptibilidade das Enterobacteacuterias aos carbapenecircmicos foi definida de acordo
com o protocolo Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI 2011)
Para aquelas Enterobacteacuterias que apresentaram resistecircncia ao ertapenem
foram realizados o Teste de Hodge Modificado para Detecccedilatildeo de Enterobacteacuterias
Produtoras de Carbapenemases conforme descrito pelo Centers for Disease Control
and Prevention (CDC 2004)
35
4 4Teste de Hodge Modificado (THM) (adaptado CDC 2004)
Preparou-se uma suspensatildeo em salina esteacuteril com a cepa Escherichia coli
ATCC 25922 (padratildeo 05 de McFarland) Apoacutes isto diluiu a suspensatildeo 110 em
salina (05 ml da soluccedilatildeo de Ecoli ATCC 25922 + 45 ml salina)Foi entatildeo semeado
na superfiacutecie de uma placa de Agar Muller-Hinton com a suspensatildeo diluiacuteda de Ecoli
ATCC 25922 com auxilio de swab seco assegurando que houvesse uma
distribuiccedilatildeo uniforme cobrindo toda a superfiacutecie do Agar Deixou secar por 3 a 5
minutos em temperatura ambienteColocou-se o disco de ertapenem 10microg no centro
da placa e apoacutes isto fez-se uma estria linear da cepa a ser testada da borda do
disco ateacute a borda da placa utilizando uma alccedila calibrada 10 microl ou um swab Incubou
a placa na estufa em atmosfera aeroacutebia a 35 plusmn 2ordmC por 16 a 24 horas
441 Controle de qualidade (CQ)
Foi utilizado um CQ todos os dias em que se realizou o teste tendo como
controle Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1705- teste de Hodge modificado
positivo Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1706- teste de Hodge modificado
negativo
442 InterpretaccedilatildeoResultados
Apoacutes 16ndash24 horas de incubaccedilatildeo examinar as placas para verificar a presenccedila
de uma distorccedilatildeo no halo de inibiccedilatildeo do disco de ertapenem devido ao crescimento
realccedilado da cepa ATCC na intersecccedilatildeo do organismo teste e a Ecoli ATCC 25922
dentro dos limites do halo O THM positivo apresentaraacute presenccedila de distorccedilatildeo no
halo de inibiccedilatildeo de ertapenem devido ao crescimento da cepa Ecoli ATCC 25922 ao
longo da estria da cepa teste para dentro dos limites do halo de inibiccedilatildeo Jaacute o THM
negativo teraacute ausecircncia de crescimento da cepa Ecoli ATCC 5922 ao longo da estria
da cepa teste para dentro dos limites do halo de inibiccedilatildeo do disco de ertapenem
Este resultado estaacute representado na figura 6
36
Figura 6 Interpretaccedilatildeo resultado do Teste de Hodge Modificado
(adaptado CDC 2004) Teste positivo na estria da cepa teste na parte superior
da placa teste negativo na estria da cepa teste na parte inferior da placa
Tendo positivo como resultado o paciente era um provaacutevel contaminado por
KPC As amostras entatildeo foram encaminhadas para a Fundaccedilatildeo Osvaldo Cruz
(FIOCRUZ) para confirmaccedilatildeo final As amostras finalmente confirmadas como
positivas para KPC foram isoladas e guardadas no banco de cepas cliacutenicas do
hospital Apoacutes a autorizaccedilatildeo do CEP amostras das cepas foram transferidas para
meio de transporte Stuard em caixa teacutermica fechada em baixa temperatura e
levadas para o laboratoacuterio de microbiologia cliacutenica da universidade
No laboratoacuterio da universidade as amostras foram separadas e realizadas
repiques em meios MacConkey e incubadas por 24h As colocircnias caracteriacutesticas
foratildeo isoladas em caldo BHI e mantidas em shaker a 37oC por 2h Apoacutes isto foram
executadas as anaacutelises a seguir
Os isolados de Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases foram
submetidos agrave extraccedilatildeo de DNA e posterior sequumlenciamento para identificaccedilatildeo dos
genes de resistecircncia blaKPC de 1 a 13 e identificaccedilatildeo do gene universal Os
pacientes de onde os materiais bioloacutegicos contendo as Enterobacteacuterias produtoras
de carbapenemases foram os isolados foram investigados quanto aos aspectos
epidemioloacutegicos e cliacutenicos
37
4 5 Extraccedilatildeo de DNA bacteriano
A extraccedilatildeo de DNA bacteriano foi realizada utilizando o kit NucleoSpin
Plasmidreg (MN) Antes de iniciar a extraccedilatildeo foi feito a preparaccedilatildeo das soluccedilotildees
reagentes materiais e amostras (vortexando) colocou-se em banho-maria agrave 50ordmC o
tampatildeo AW Partiu-se de colocircnias isoladas cultivadas que sofreram passagem em
meio LB liacutequido por 12h Adicionou-se 15 mL da amostra no tubo eppendorf
centrifugou por 5 minutos descartou o sobrenadante (com cuidado para natildeo
descartar o Pellet) Repetiu-se este procedimento por mais trecircs vezes completando-
se o volume de 6mL Foram adicionados 250microL do tampatildeo Resuspension Buffer A1
encostando a ponteira no Pellet e misturando (este tampatildeo tem como funccedilatildeo
separar a formaccedilatildeo de grumos celulares) Apoacutes isso homogeneizou e vortexou os
tubos eppendorfs Apoacutes isso foram adicionados 250microL do tampatildeo Lysis Buffer A2
homogenizou e deixou descansar por 5 minutos (esta etapa eacute importante para a lise
da parede e da membrana celulares e liberaccedilatildeo do conteuacutedo da ceacutelula)
Passado o tempo de descanso foi adicionado 300microL do tampatildeo
Neutralization Buffer A3 homogeneizou e centrifugou por 10 minutos (este tampatildeo
iraacute retirar as proteiacutenas que envolvem o DNA e voltaraacute com o pH para proacuteximo de 8
impedindo que a soluccedilatildeo de lise facilite a quebra das ligaccedilotildees covalentes do aacutecido
nucleacuteico) Em seguida enumeraram-se os tubos contendo filtros com siacutelica
transferiu-se o sobrenadante para o filtro e centrifugou por 5 minutos Descartou-se
o que foi filtrado adicionou 500microL do tampatildeo AW (banho-maria) centrifugou por 2
minutos Novamente foi descartado o filtrado Adicionou-se 600microL do tampatildeo A4
centrifugou por 2 minutos e descartou o filtrado (os tampotildees AW e A4 contecircm
isotiocianato de guanidina em concentraccedilotildees crescentes para facilitar a adsorccedilatildeo
do DNA na siacutelica e retirada das outras biomoleacuteculas da amostra) Foi feita outra
centrifugaccedilatildeo com o tubo vazio Apoacutes isto o filtro foi trocado para outro eppendorf
definitivo onde foi adicionado 50microL do tampatildeo Elution Buffer AE (este tampatildeo
favorece a eluiccedilatildeo do DNA) centrifugou por 2 minutos descartou o filtro e
armazenou as amostras em freezer -20ordmC
38
4 6 Iniciadores e reaccedilatildeo de PCR
Os iniciadores universais para o gene blaKPC foram desenhados baseados
em sequumlecircncias conservadas apresentadas pelos sub-grupos de genes que
codificam a enzima carbapenemase de klebsiella pneumoniae (YIGIT et al 2001)
Baseado na sequumlecircncia para o blakpc-1 depositada no GenBank
(AF2975541) o oligonucleotiacutedio (oligo) iniciador direto (5-
ATGTCACTGTATCGCCGTC-3rsquo) foi desenhado para reconhecer a sequumlecircncia
blaKPC na posiccedilatildeo (131149) enquanto que o iniciador reverso (5-
TTACTGCCCGTTGACGCC-3rsquo) foi reconhecido na posiccedilatildeo (9951012) As anaacutelises
baseadas em alinhamento de sequumlecircncias mostraram que o par de iniciadores
blaKPC podem detectar os alelos de 1 a 13 do gene blaKPC conforme a tabela 2
Tabela 2 Nuacutemero de acesso ao GenBank dos alelos blaKPC e seus
microrganismos originais
Nuacutemero de
Acesso GenBank
Microrganismo Alvo
AF2975541 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-1
GU0862251 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-2
HQ2589341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-2-like
AB5577341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC -3
EU4473041 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-4
EU4002222 Pseudomonas
aeruginosa
blaKPC-5
EU5555341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-6
EU7297271 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-7
39
FJ2344121 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-8
FJ624872 Escherichia coli blaKPC-9
GQ1403481 Acinetobacter
baumannii
blaKPC-10
HM0669951 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-11
HQ3428891 Enterobacter cloacae blaKPC-12
HQ3428901 Enterobacter cloacae blaKPC-13
As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo de blaKPC foram realizadas em um
primeiro tempo de desnaturaccedilatildeo em que foi 94ordmC por 5 minutos seguido de 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 58 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 90 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 78ordmC por 8 minutos Aleacutem das amostras foi utilizado um
controle negativo
A PCR do blaKPC foi realizada utilizando os componentes para o volume da
reaccedilatildeo de 25 microL citados na tabela 3 A banda do tamanho do produto de PCR foi de
881 pares de bases (pb) o que corresponde ao plasmiacutedeo
Tabela 3 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do
gene blaKPC
Reagente Volume
DNA molde 4 microL
Tampatildeo Taq 25 microL
MgCl2 075 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP
2 microL
Oligo F 1 microL
Oligo R 1 microL
Taq DNA polimerase 05 microL
Aacutegua MiliQ 1335 microL
40
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
Baseado na sequumlecircncia para o gene 16S rRNA em que o oligonucleotiacutedio
Universal iniciador direto foward (5-CCAGCAGCCGCCGTAATACG-3rsquo) foi
desenhado para reconhecer a sequumlecircncia universal na posiccedilatildeo 1513 enquanto que o
iniciador reverso (5-ATCGGYTACCTTGTTACGACTTC-3rsquo) foi reconhecido na
posiccedilatildeo 1491 foram realizadas PCRrsquos As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo deste
gene foram realizadas nos seguinte tempos separaccedilatildeo 94ordmC por 10 minutos 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 55 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 120 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 72ordmC por 10 minutos
A PCR do gene 16S rRNA foi realizada utilizando os componentes para o
volume da reaccedilatildeo de 25microL citados na tabela 4 A banda do tamanho do produto de
PCR foi de 996 pb correspondente aacute regiatildeo ribossomal capaz de amplificar todas
as espeacutecies
Tabela 4Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do gene
universal
Reagente (quantidade
concentraccedilatildeo do estoque)
Volume
DNA molde 10 ng 4 microL
Tampatildeo Taq 10 x 25 microL
MgCl2 50mM 125 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP 25 mM
125 microL
Oligo F 10microM 05 microL
Oligo R 10microM 05 microL
Taq DNA polimerase 5UmicroL 04 microL
Aacutegua Miliq 146 microL
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
41
O termociclador utilizado para os experimentos foi o LifeTouch da BIOER
4 7 Digestatildeo
Para realizaccedilatildeo da digestatildeo foi utilizada a enzima BshF I (Hae III) EN- 1105
tamanho 7000 units concentraccedilatildeo 10 unitsmicroL fonte Bacillus sphaericus empresa
Jena bioscienceUtilizaram-se os componentes para o volume de 50microL da reaccedilatildeo
citados na tabela 5
Tabela 5 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da digestatildeo do gene
universal
Reagente Volume
Produto de PCR 10 microL
Enzima BshF I 01 microL
Tampatildeo (10x) 5 microL
Aacutegua Miliq 349 microL
Total (em cada ependorff) 50 microL
Valores para 1 digestatildeo
Os ependorffs foram colocados por 30 minutos em banho-maria a 37ordmC Apoacutes
isso fez-se a corrida das amostras em gel de agarose para verificaccedilatildeo do resultado
(LU et al 2000)
4 8 Eletroforese em gel de agarose
Os produtos de DNA PCR e digestatildeo foram analisados em gel de agarose
2 O tempo de corrida do gel eacute de aproximadamente 1hora e 30minutos sendo
que no comeccedilo foi usada agrave voltagem de 50 V e apoacutes comeccedilar a correr o gel
aumentou a voltagem para 100 v Utilizou-se o marcador de 100pb (pares de bases)
Foi adicionado 3microL de corante Bromophenol (que tem a funccedilatildeo de fazer uma ligaccedilatildeo
na amostra de DNA e permitir a visualizaccedilatildeo da corrida no gel de agarose) em 7microL
de amostra tanto de DNA quanto de PCR Para o preparo do gel foi utilizado TBE
42
(Tris- Aacutecido Boacuterico) agarose e brometo de etiacutedio (sua funccedilatildeo eacute de corante para o gel
e permitir a visualizaccedilatildeo do DNA quando colocado agrave luz ultravioleta) Para o oligo
blaKPC a banda da amplificaccedilatildeo foi em 881ppb correspondendo ao plasmiacutedeo Jaacute
o oligo Universal foi em 996 pb
4 9 Descarte de resiacuteduos
Todos os materiais utilizados nos ensaios foram de uso uacutenico e manipulados
em cacircmaras de seguranccedila bioloacutegica classe II Apoacutes o uso foram colocados em
soluccedilatildeo desinfetantes (hipoclorito a 1) e em seguida autoclavados a 127oC por 20
min em sacos apropriados para autoclavaccedilatildeo Apoacutes a finalizaccedilatildeo do ciclo de
esterilizaccedilatildeo os sacos contendo o material descartaacutevel foram colocados em
recipientes de coleta da empresa responsaacutevel pela coleta de materiais bioloacutegicos
produzidos no laboratoacuterio de microbiologia Todos os procedimentos seguiram a
normativa RDC-ANVISA 3062004 sobre o descarte de resiacuteduos de serviccedilo de
sauacutede
4 10 Aspectos epidemioloacutegicos e cliacutenicos
Os aspectos cliacutenicos e epidemioloacutegicos foram investigados por meio de
prontuaacuterios dos pacientes portadores de enterobacteacuterias produtoras de
carbapenemases e envolveram topografia mais provaacutevel do foco infeccioso a
enfermidade motivadora da internaccedilatildeo o desfecho cliacutenico a idade e o tempo de
internaccedilatildeo
4 12 Anaacutelises eepidemioloacutegicas
As anaacutelises foram realizadas com o pacote estatiacutestico SPSS versatildeo 200
Para verificar quais variaacuteveis referentes aos dados epidemioloacutegicos e
microbioloacutegicos influenciaram no desfecho verificou- se a diferenccedila meacutedia das
variaacuteveis idade e tempo de internaccedilatildeo em cada grupo O teste estatiacutestico utilizado foi
o teste t de Student apoacutes se executar o teste de normalidade de Shapiro-Wilk Para
as variaacuteveis sexo perfil microbioloacutegico das enterobacteacuterias produtoras de
43
carbapenemases foi avaliada a associaccedilatildeo com o desfecho por meio do teste Exato
de Fisher O niacutevel de significacircncia adotado foi de 5
4 13 Preceitos eacuteticos
Este projeto estaacute inserido em um projeto maior denominado ldquoEpidemiologia
cliacutenica e caracterizaccedilatildeo molecular do Acinetobacter Baumannii resistente a
antibioticoterapia em pacientes internado em hospitais do Sistema Uacutenico de Sauacutederdquo
que foi submetido ao Comitecirc de Eacutetica em Pesquisa da Secretaria do Estado de
Sauacutede do Distrito Federal (SESDF) e emitido parecer aprovado pelo protocolo nordm
23109 (anexo)
44
5 RESULTADOS
51 Anaacutelise molecular
Para a amplificaccedilatildeo com o oligo blaKPC foram amplificadas amostras
que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 881 pb correspondente ao
plasmiacutedeo A anaacutelise da amplificaccedilatildeo da regiatildeo do gene blaKPC mostrou que
apenas a amostra A10 natildeo amplificou isso demonstra que esta amostra natildeo
possuiacutea o gene de resistecircncia
5 1 1 Gene blaKPC
Figura 7 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 881 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
A amostra A3 natildeo amplificou no primeiro momento entatildeo foi realizado
novamente a PCR e corrida de gel obtendo entatildeo a amplificaccedilatildeo da amostra como
apresentado na figura 8
45
Figura 8 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC da
mostra A3 estudada A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo de 881
pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 1 2 Gene 16S rRNA
Para a amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA utilizou-se o oligo universal Foram
amplificadas amostras que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 996 pb
Figura 9 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
46
Segundo Lu et al (2000) a digestatildeo com a enzima HaeIII deste amplicons de
16S rRNA devolveriam bandas com perfis entre 150 a 200 pb No gel abaixo eacute
possiacutevel evidenciar que este perfil ocorreu com o predomiacutenio de bandas na altura
de 200pb
Figura 10 Gel de agarose a 2 da digestatildeo do amplicon do gene 16S
rRNA das amostras com a enzima HaeIII evidenciando diversos fragmentos
proacuteximos a 200 pb A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo ribossomal
de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 2 Anaacutelises epidemioloacutegicas
5 2 1 Sexo
No total foram detectados 17 isolados de KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 onde a maior a prevalecircncia foi
detecatada em amostras de pacientes do sexo masculino (53) do que no sexo
feminino (47)
47
Figura 11 Isolado de KPC segundo sexo dos 17 pacientes investigados
no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 2 Desfecho cliacutenico
Em 17 isolados de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo
de 2010 aacute 2011 a porcentagem de pacientes que foram a oacutebito (59) foi maior que
a de pacientes que tiverm alta (41)
Figura 12 Isolado de KPC segundo desfecho cliacutenico dos 17 pacientes
investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
48
5 2 3 Local da coleta
Dos 17 episoacutedios detectados de infecccedilatildeo por KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 a infecccedilatildeo em swab retalfoi mais
frequente (47) seguida de ponta de cateacuteter (18) e secreccedilatildeo traqueal (12)
Figura 13 Isolados de KPC segundo local da coleta da amostra nos 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 4 Microorganismo
O microorganismo mais encontrado foi a Klebsiella pneumoniae (82)
seguida da Enterobacter clocae (12) e Serratia marcescens (6) dos 17 isolados
de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 Isto afirma o
fato de a sigla KPC ser utilizada de forma errocircnea aacute Klebsiella pneumoniae visto
que a evidecircncia dela eacute maior em relaccedilatildeo as outras cepas
49
Figura 14 Isolado de KPC segundo microrganismo encontrado em 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 5 Relaccedilotildees variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana e desfecho
cliacutenico
Tabela 6 ndash Distribuiccedilatildeo do perfil geneacutetico sexo coleta tipificaccedilatildeo de
microrganismos e anaacutelise da resistecircncia bacteriana segundo o desfecho
cliacutenico Brasiacutelia-DF 2010 a 2011
Variaacutevel Resultado
Desfecho
Alta Oacutebito
N N P
Gene 16S rRNA Positivo 7 1000 10 1000
NA Gene blaKPC Positivo 6 857 10 1000
Negativo 1 143 0 00 0218 Sexo Feminino 2 286 6 600
Masculino 5 714 4 400 0201 Local da coleta Fundo saco de
Douglas 1 143 0 00
Hemocultura 0 00 1 100 0463 Ponta de cateter 1 143 2 200
Sec TraquealBrocircnquica
0 00 1 100
50
Secreccedilatildeo traqueal 2 286 0 00
Swab retal 3 429 5 500
Urina 0 00 1 100
Microrganismo Enterobacter cloacae (KPC)
1 143 1 100
Klebsiella pneumoniae
6 857 8 800
0416 Serratia
marcescens 0 00 1 100
Teste de Hodge Hodge positivo 7 1000 10 1000
NA Amicacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 1 100 0848 resistente 0 00 1 100
sensiacutevel 2 286 3 300
Amoxicilina Aacutecido Clavulacircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Ampicilina Sulbactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ampicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Aztreonan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefazolina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Cefoperazona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Cefotaxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefoxitina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0509 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 2 286 4 400
Ceftazidima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cetriaxona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 3 429 5 500 0772 Cefalotina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ciprofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772
51
resistente 3 429 5 500
Claritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Clindamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Eritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Gentamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0942 resistente 2 286 3 300
sensiacutevel 1 143 2 200
Imipenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 0 00 2 200 0193 Resistente 1 143 3 300
sensiacutevel 2 286 0 00
Nitrofurantoiacutena sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Norfloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Oxacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Penicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Piperacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Rifampicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tetraciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Ticarcilina Aacutecido Clavulocircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0688 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 3 429 4 400
Tobramicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Trimetoprima Sulfametoxazol
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0112 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 2 286 0 00
Vancomicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tigeciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediario 0 00 1 100 0211 natildeo testado 1 143 4 400
resistente 2 286 0 00
52
Cefepime sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefuroxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Levofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Piperacilina Tazobactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Ertapenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Meropenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0223 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 1 143 0 00
Cefotetan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 sensiacutevel 0 00 1 100
Gemifloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 7 700 0585 natildeo testado 3 429 3 300
Desfecho
Alta Oacutebito
Meacutedia Erro
padratildeo Meacutedia Erro
padratildeo p
Idade 58 9 59 5 0991
Tempo Internaccedilatildeo (dias)
50 13 46 12 0571
n= 17 p(lt 005) NA natildeo se aplica
53
6 DISCUSSAtildeO
Nos uacuteltimos anos houve um aumento na incidecircncia de bacteacuterias
multirresistentes aos antimicrobianos no ambiente hospitalar tornando isto um
problema mundial de sauacutede puacuteblica (HULSCHER et al 2010) Quando se trata
principalmente de bacilos Gram negativos a frequumlecircncia destas bacteacuterias eacute ainda
maior em paiacuteses da Ameacuterica Latina quando comparada a paiacuteses desenvolvidos
(GALES etal 2012)
De acordo com dados do ldquoMeropenem Yearly Susceptibility Test Information
Collectionrdquo (MYSTIC) ocorreu nos Estados Unidos um aumento na susceptibilidade
de K pneumoniae nos uacuteltimos anos graccedilas a praacuteticas de controle de disseminaccedilatildeo
de amostras resistentes(RHOMBERG P R et al 2009) O aumento crescente da
prevalecircncia destes microrganismos foi proporcional ao aumento da dependecircncia do
uso de antibioacuteticos carbapenecircmicos considerados como a opccedilatildeo terapecircutica para o
tratamento de infecccedilotildees por bacilos Gram negativos multi-resistentes (LIVERMORE
2012) Isto afeta diretamente as opccedilotildees de tratamento sobrando poucas alternativas
para a terapecircutica que incluem colistina (polimixina E) e tigeciclina que apresentam
respectivamente problemas em termos de toxicidade e eficaacutecia (LIVERMORE et
al 2011) Um dos efeitos adversos mais importantes das poliminas B e E por
exemplo satildeo a neurotoxicidade e nefrotoxicidade (MENDES C A C et al2009 )
Devido agrave resistecircncia ser usualmente de natureza plasmidial e portanto de
maior disseminaccedilatildeo especialmente quando carreadas por K pneumoniae
microrganismo com uma notoacuteria capacidade para acumular e transferir plasmiacutedeos
com determinantes para resistecircncia o nuacutemero de casos detectados pelo
fenoacutetipogenoacutetipo blaKPC eacute bastante preocupante (MONTEIRO et al 2009)
Comparada com outras bacteacuterias hospitalares a transmissatildeo de clones
multirresistentes de K pneumoniae eacute maior e podem natildeo ser controladas pelos
meacutetodos de controle de infecccedilatildeo hospitalar (PAAUW et al 2007) A forma
plasmidial para transferecircncia da resistecircncia adicionada a este grande potencial para
disseminaccedilatildeo de clones resistentes eacute preocupante visto que apoacutes surtos muitas
vezes pode se tornar endecircmica Jaacute eacute uma realidade a disseminaccedilatildeo desta bacteacuteria
54
entre pacientes hospitais paiacuteses e ateacute mesmo continentes (WOODFORF et al
2010 ROGERS et al 2011)
As chances de surtos satildeo maiores em paiacuteses com poucos recursos devido agrave
maior carecircncia de praacuteticas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees hospitalares e o
uso irracional de antimicrobianos de forma empiacuterica e inadequada (KUMARASAMY
et al 2010) Ateacute o momento os mecanismos de resistecircncia aos cabapenecircmicos
geralmente encontrado eram a produccedilatildeo de ESBL (CTX-M) somada aacute perda de
porina (CARVALHAES et al 2010) Foi notado a partir do ano de 2008 um
aumento no nuacutemero de K pneumoniae produtoras de KPC-2 apresentando outra
forma de resistecircncia (GALES 2012)
Um estudo mostrou que o perfil do paciente colonizado ou infectado por KPC
foi de um paciente entre os 33 e os 82 anos de idade internado haacute mais de 1
semana no hospital A mortalidade geral nos uacuteltimos anos ficou em torno de 7
sendo que dos 77 pacientes estudados 32 (415) pacientes evoluiacuteram para oacutebito
evidenciando a alta morbi-mortalidade associada (ALVES A P et al 2013)
Em estudo com 2316 pacientes avaliados a populaccedilatildeo de sexo masculino foi
de 526 idade meacutedia global de 53 anos (mediana de 55 anos) permanecircncia meacutedia
de 58 dias (mediana de 3 dias) (OLIVEIRA A C et al 2010) Outros trabalhos
apresentaram ausecircncia de significacircncia entre sexoidade e o desenvolvimento de
infecccedilotildees por microrganismos resistentes (PERES-BOTA D et al 2003 COLPAN
A et al 2005 COELLO R et al 1997)
Outro estudo utilizou um total de 30 amostras sendo elas isoladas de urina
escarro secreccedilatildeo pleural ponta de cateter aspirado traqueal e hemocultura A mais
prevalente foi em urina (40) Entre as 30 cepas analisadas a maior porcentagem
foi da cepa Klebsiella pneumoniae (70) Enterobacter sp (133) Klebsiella
ozaenae (10) Escherichia coli (333) e Klebsiella oxytoca (333)
(DIENSTMANN R et al 2010) Nos Estados Unidos a enzima KPC jaacute se tornou
endecircmica Foi realizada uma pesquisa em dois hospitais de Nova York onde
testaram 602 amostras e 45 apresentaram algum mecanismo de resistecircncia
sendo apenas 33 confirmadas por biologia molecular como KPC-2 (BRATU et
al 2005)
55
Estudo sobre os tipos de ESBL feito no Japatildeo apresentou o tipo Toho-1 como
o mais prevalente nessa pesquisa Ateacute o ano de 2000 ano em que foi publicado tal
estudo este era o primeiro relatoacuterio no Japatildeo para identificar derivados de ESBLs
como tipo de SHV e TEM entre E coli e K pneumoniae Em especial o tipo SHV- 12
foi identificado com uma maior frequumlecircncia Estes resultados indicam que tipos
distintos de ESBLs que satildeo diferentes em sua especificidade de substrato e origem
geneacutetica coexistem no Japatildeo Isto mostra a importacircncia de caracterizar genoacutetipos
distintos de ESBLs e de estar em alerta continuamente para as tendecircncias de
ESBLs no Japatildeo aleacutem da necessidade de uma interpretaccedilatildeo uniforme utilizando as
diretrizes do CSLI para relatar cepas produtoras de ESBL Aleacutem da detecccedilatildeo de
ESBLs satildeo necessaacuterias mais informaccedilotildees tais como o perfil de sensibilidade
especiacutefica para diversas β-lactacircmicos e o local da infecccedilatildeo Esses fatores satildeo
essenciais para a escolha adequada de antibioacuteticos (YAGI T et al 2000)
No ano de 2004 uma pesquisa avaliou a produccedilatildeo de uma enzima de
hidroacutelise de carbapenecircmicos atraveacutes da teacutecnica de sequumlenciamento foi revelado
um novo membro da famiacutelia KPC designado KPC- 3 Pesquisadores encontraram
em um mutante de K pneumoniae uma substituiccedilatildeo de um gene associado com
resistecircncia a Imipenem mas essa substituiccedilatildeo foi considerada improvaacutevel na
contribuiccedilatildeo da resistecircncia aos carbapenecircmicos da espeacutecie estudada Aleacutem da
resistecircncia aos carbapenecircmicos estes isolados eram em sua maioria resistentes agraves
cefalosporinas penicilinas e aminoglicosiacutedeos Usando estudos de transformaccedilatildeo
conjugaccedilatildeo e hibridaccedilatildeo localizaram o alelo blaKPC em plasmiacutedeo aleacutem disso
mostraram que esse alelo tambeacutem carregava uma resistecircncia aos aminoglicosiacutedeos
A transferecircncia das enzimas KPCs foi demonstrada in vitro tanto neste como em
outros estudos pode ser que os plasmiacutedeos que fazem esta transferecircncia estavam
comeccedilando a se espalhar no ambiente cliacutenico resultando na multiresistecircncia dessas
estirpes (WOODFORD et al 2004)
O presente estudo apresentou um vieacutes quanto aos resultados dos testes de
susceptibilidade microbiana Observou-se que natildeo foi encontrado resultado deste
teste em algumas amostras o que natildeo cooperou para um estudo mais preciso
futuros estudos quanto agraves amostras e um melhor acompanhamento deste tipo de
patologia Poreacutem mesmo sem algumas amostras com este resultado disponiacutevel foi
56
confirmada a presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos
carbapenecircmicos por meio dos genes de resistecircncia blaKPC e 16S rRNA que as
amostras apresentaram em sua maioria serem portadoras Quanto aos resultados
estatiacutesticos nenhuma das variaacuteveis apresentou significacircncia estatiacutestica (p gt 005)
mostrando assim que estas variaacuteveis isoladas natildeo foram o fator determinante para
o desfecho cliacutenico de alta ou oacutebito
57
7 CONCLUSAtildeO
Os genes blaKPC e 16S rRNA foram caracterizados confirmando a a
presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos carbapenecircmicos
Houve uma maior prevalecircncia da cepa K pneumoniae e isto confirma outros
estudos que apresentam a maior prevalecircncia desta cepa em amostras com KPC
Aleacutem disso isso justifica a forma popular da K pneumoniae ser chamada de KPC
enquanto que na verdade KPC eacute uma enzima podendo estar presente em outras
cepas como Enterobacter clocae tambeacutem apresentada no presente estudo O
desfecho cliacutenico de oacutebitos maior que 50 eacute um possiacutevel indicador sobre a
necessidade de se realizar um teste raacutepido para identificaccedilatildeo de KPC visando
iniciar o mais raacutepido possiacutevel o tratamento afim de diminuir a mortalidade por esta
infecccedilatildeo
Nenhuma das variaacuteveis isoladamente estaacute relacionada ao desfecho cliacutenico
oacutebito ou alta pois natildeo apresentaram relevacircncia estatiacutestica O presente estudo
mostrou que haacute presenccedila da bacteacuteria nas amostras de pacientes do hospital
estudado podendo entatildeo afirmar que este tipo de bacteacuteria se encontra tambeacutem
presente em ambiente hospitalar O uso irracional de antimicrobiano eacute demonstrado
de forma indireta quando foi apresentado atraveacutes do Teste de Hodge Modificado
uma resistecircncia de 100 aos antibioacuteticos carbapenecircmicos Isto tambeacutem reflete na
terapecircutica sendo que pacientes portadores de bacteacuterias resistentes aos
antibioacuteticos carabepecircmicos tem uma escassa opccedilatildeo de tratamento e as opccedilotildees
apresentam problemas quanto agrave toxicidade e eficaacutecia
58
REFEREcircNCIAS
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Mecanismos
de resistecircncia bacteriana aos antimicrobianos Disponiacutevel em
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controleopas_
webmodulo3mec_sitiohtmgt Acesso em 25 de abril de 2014
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Nota teacutecnica nordm
012013 medidas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees por enterobacteacuterias
multiresistentes Acesso em 17 de abril de 2013
ALBA J et al Kinetics study of KPC-3 a plasmid-encoded class A
carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase Antimicrob Agents Chemother
Nov49(11)4760-2 2005
ALVES A P et al Nosocomial infections by KPC-producing enterobacteria in
a tertiary hospital in Southern Brazil Revista da AMRIGS Porto Alegre 57 (3) 213-
218 jul-set 2013
ALVES A et al Tipagem Geneacutetica de Microrganismos Lab De Diversidade
Microbiana Centro de Biologia Celular Dep de Biologia U de Aveiro 3810-193
Aveiro- 2003
BELL J M et Al Prevalence and significance of a negative extended-
spectrum beta-lactamase (ESBL) confirmation test result after a positive ESBL
screening test result for isolates of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae
results from the SENTRY Asia-Pacific Surveillance Program J Clin Microbiol
May45(5)1478-82 2007
BRATU S et al Detection of KPC carbapenem-hydrolyzing enzymes in
Enterobacter spp from Brooklyn New York Antimicrob Agents Chemother v 49 n
2 p 776-8 2005
59
BRATU S et al Emergence of KPC-possessing Klebsiella pneumoniae in
Brooklyn New York epidemiology and recommendations for detection Antimicrob
Agents Chemother v 49 n 7 p 3018-20 2005
BRATU S et al Rapid spread of carbapenem-resistant Klebsiella
pneumoniae in New York City Arch Intern Med v 165 p 1430-5 2005
CAMARGO C F et al Aplicaccedilatildeo das teacutecnicas de pcr e suas teacutecnicas
derivadas em diagnoacutestico molecular Disponiacutevel em
ltfileDUnB10C2BA20semestreArtigosPCR-
20CLEYTON20FLORENCIO20DE20CAMARGO20E20PAULO20ROB
ERTO20QUEIROZpdfgtgt Acesso em 08 de abril de 2014
CARVALHES C G et al Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting
carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive
results Journal of Antimicrobial Chemotherapy v 65 n2 p 249-251 2010
CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION- CDC Modified
Hodge Test for Carbapenemase Detection in Enterobacteriaceae 2004
CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE Methods for
dilutionantimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically Approved
standard M7ndashA7 7th ed CLSI Wayne PA 2011
COELLO R et al Risk factors for developing clinical infection with methicillin-
resistant Staphylococcus aureus (MRSA) amongst hospital patients initially only
colonized with MRSA J Hosp Infect 19973739-46
COLPAN A et al Evaluation of risk factors for mortality in intensive care
units A prospective study from a referral hospital in Turkey Am J Infect Control
200533(1)42-7
60
CORNAGLIA G et al Living with ESBLs Introduction Clinical Microbiology
and Infection 14 Suppl 1 1-2 2008
COTRIM E R et al Klebsiella pneumoniae carbapenemase ndash KPC em
Enterobacteriaceae o desafio das bacteacuterias multirresistentes Poacutes em revista do
centro universitaacuterio Newton Paiva 12012 - ediccedilatildeo 5 - issn 2176 7785
DESHPANDE L M et al Occurrence and characterization of
carbapenemase-producing Enterobacteacuteriaceae report from the SENTRY
Antimicrobial Surveillance Program (2000-2004) Microb Drug Resist 12(4)223-30
2006
DIAS D J A Estudos dos principais mecanismos de resistecircncia aos
antibioacuteticos β-lactacircmicos em bacteacuterias patogecircnicas gram negativas 2009 100 f
Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Geneacutetica Molecular e Biomedicina) ndash Faculdade de
Ciecircncias e Tecnologia Universidade de Nova Lisboa Lisboa
DIENSTMANN R et al Avaliaccedilatildeo fenotiacutepica da enzima Klebsiella
pneumoniae carbapenemase (KPC) em Enterobacteriaceae de ambiente hospitalar
J Bras Patol Med Lab v 46 n 1 p 23-27 fevereiro 2010
ENDIMIAMI A et al Emergence of blaKPC-containing Klebsiella
pneumoniae in a long-term acute care hospital a new challenge to our healthcare J
Antimicrob Chemother 64 1102-1110 Nov 2009
FALAGAS M E et al Extended-spectrum beta-lactamase producing
organisms The Journal of Hospital Infection 73 (4) pp 345-54 2009
FONTANA C et al Emergence of KPC-producing Klebsiella pneumoniae in
Italy BMC Rev Notes 3 40 2010
61
GALES A C et al Antimicrobial resistance among Gram-negative bacilli
isolated from Latin America results from Sentry Antimicrobial Surveillance Program
(Latin America 2008-2010) Diagnostic Microbiology and Infectious Disease v 3 n
4 p 354 -360 2012
GUPTA N et al Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Epidemiology
and Prevention HEALTHCARE EPIDEMIOLOGY Clinical Infectious Diseases
201153(1)60ndash67 Published by Oxford University Press on behalf of the Infectious
Diseases Society of America 2011
HARBOTTLE H et al Genetics of antimicrobial resistance Anim Biotechnol
n17 p111-124 2006
HENRIQUE W N et al RESISTEcircNCIA BACTERIANA Uniatildeo das
Faculdades Alfredo NasserInstituto de Ciecircncias da Sauacutede Disponiacutevel em lt
httpwwwfaculdadealfredonasseredubrfilespesquisaposter20HENRIQUE20
Wilker20Natividade20SANTIAGO20Silvania20CAVALCANTI20DSP
20ResistC3AAncia20Bacterianapdfgt Acesso em 17 marccedilo 2014
HULSCHER M E J I et al Antibiotic prescribing in hospital a social and
behavioral scientific approach The Lancet Infectious Diaseases v 10 n 3 p 167-
165 2010
KIDWAI M SAPRA P BHUSHAN KR Synthetic strategies and medicinal
properties of beta-lactams Curr Med Chem 1999 695-215
KUMARASAMY K K et al Emergence of a new antibiotic resistance
mechanism in India Pakistan and the UK a molecular biological and
epidemiological stuy The Lancet Infectious Diseases v10 n 9 p 597- 602 2010
LINCOPAN N et al Enterobacteacuteria producing extended-spectrum β-
lacatamases and IMP-1 Metalo-β-lactamases isolated from Brazilian hospitals J Med
62
Microbiol 7 1-3 2006
LINCOPAN N et al First Isolation of Metalo-β-Lacatamase-Producing
Multiresistant Klebsiella pneumoniae from a patient in Brazil J Clin Microbiol 43(1)
516-519 2005
LIVERMORE D M et al What remains against carbapenem- resistant
Enterobacteriaceae Evaluation of choramphenicol ciprofloxacin colistina
fosfomycin minocycline nitrofurantoin temocilin and tigecycline International
Journal of Antimicrobial Agents v 37 n 5 p 415- 459 2011
LIVERMORE D M Fourten years in resistance International Journal of
Antimicrobial Agents v 39 283- 294 2012
LIVERMORE D M Bacterial resistance to carbapenems Adv Exp Med Biol
1995 39025-47
LIVERMORE D M Bacterial resistance origins epidemiology and impact
Clin Infect Dis 36S11-S23 2003
LIVERMORE D M et al Carbapenemases a problem in waiting Curr
Opin Microbiol 2000 3489-95
LU et al Universal pcr for common bacterial pathogens J CLIN
MICROBIOL VOL 38 2000
LU et al Use of PCR with Universal Primers and Restriction Endonuclease
Digestions for Detection and Identification of Common Bacterial Pathogens in
Cerebrospinal Fluid Journal of Clinical Microbiology June 2000 p 2076ndash2080
MARSCHALL J Met al Presence of the KPC Carbapenemase Gene in
Enterobacteriaceae Causing Bacteremia and Its Correlation with In Vitro
Carbapenem Susceptibility J Clin Microbiol 47 239-241 Jan 2009
63
MARTINS WMBS et al Prevalecircncia do gene blaKPC em isolados cliacutenicos
de Enterobacteriaceae e natildeo fermentadores encontrados em amostras clinicas em
um hospital universitaacuterio do Recife X Jornada de ensino pesquisa e extensatildeo ndash
JEPEX 2010 ndash UFRPE Recife 18 a 22 de outubro
MENDES C A C et al Polimixinas Revisatildeo com ecircnfase na sua
nefrotoxicidade Rev Assoc Med Bras 2009 55(6) 752-9
MOHR J F 3rd Update on the efficacy and tolerability of meropenem in the
treatment of serious bacteacuterial infections Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S41-51
2008
MONTEIRO J et al First report of KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae
strains in Brazil Antimicrob Agents Chemother Jan53(1)333-4 2009
MOREIRA V C et al Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia a antibioacuteticos
Disponiacutevel em
lthttpwwwcpglsucgbr6mostraartigosSAUDEVANESSA20CARVALHO20M
OREIRApdfgt Acesso em 21 marccedilo 2014
NETIKUL T et al Emergence of novel blaKPC-12 and blaKPC-13 variants in
carbapenem non-susceptible Enterobacter cloacae a first report of blaKPC gene in
Thailand European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases May
S372 2011
NETO V A et al Antibioacuteticos na praacutetica Meacutedica 6ordf Ediccedilatildeo Editorial
SarverSP Brasil 2007
NICOLAU D P Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of
meropenem Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S32-40 2008
64
OLIVEIRA A C et al Resistecircncia bacteriana e mortalidade em um centro de
terapia intensiva Rev Latino-Am Enfermagem nov-dez 2010
PAAUW A et al Failure to control an outbreak of qnrA 1-positive multidrug-
resistant Enterobacter clocae despite adequate implementation of recommended
infection control measures Journal of Clinical Microbiology v 45 n 5 p 1420-1425
2007
PATERSON D L et al Extended-Spectrum Beta-Lactamases a Clinical
Update Clinical Microbiology Reviews v 18 p 657-686 2005
PEIRANO G et al Carbapenem-hydrolysing beta-lactamase KPC-2 in
Klebsiella pneumonia isolated in Rio de Janeiro Brazil J Antimicrob Chemother Nov
20 2009
PERES-BOTA D et al Are infections due to resistant pathogens associated
with worse outcome in critically ill patients J Infect 200347(4)307-16
PIDDOCK L J V Clinically relevant chromosomally encoded multidrug
resistance effl ux pumps in bacterial Clin Microbiol Rev n19 p382-402 2006
PITOUT J D D et al Emergence of Enterobacteriaceae producing
extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) in the community J Antimicrob
Chemother May 56 2005
POSSEBON M I et al Resistecircncia bacteriana aos carbapenecircmicos
Bacterial resitence to carbapenems RBM rev bras med60(6)378380-378-382
jun 2003
QUEENAN A M et al Carbapenemases the versatile beta-lactamases
Clin Microbiol Rev Jul20(3)440-58 2007
65
RHOMBERG P R et al Summary trends for the meropenem yearly
susceptibility test information collection program a 10- year experience in the United
States (1999-2008) Diagnostic Microbiology and Infectiois Disease v 65 n4 p
414-426 2009
ROBLEDO I E et al Detection of KPC in Acinetobacter spp in Puerto Rico
J Antimicrob Agents Chemother 54 1354-1357 Mar 2010
ROGERS B A et al Country-to-country transfer os patients and the risk of
multi-resistant bacterial infection Clinical Infectious Disease v53 n1 p49- 56
2011
SHAH A A et al Characteristics epidemiology and clinicalimportance of
emerging strains of Gram-negative bacilli producing extended-spectrum
betalactamases Research in Microbiology v 155 p 409-421 2004
TURNER P J Extended- Spectrum Beta-Lactamases Clinical Infectious
Diseases v 41 p 273-275 2005
WOLTER D J et al Phenotypic and Enzymatic Comparative Analysis
between the Novel KPC variant KPC-5 and Its Evolutionary Variants KPC-2 and
KPC-4 Antimicrob Agents Chemother Nov 17 2008
WOODFORD N et al Carbapenemases of Chryseobacterium
(Flavobacterium) meningosepticum distribution of blaB and characterization of a
novel Metalo-beta-lactamase gene blaB3 in the type strain NCTC 10016
Antimicrob Agents Chemother Jun44(6)1448-52 2000
WOODFORF N Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in
India Pakistan and the UK a molecular biological and epidemiological study The
Lancet Infectious Diseases v 10 n 9 p 597-602 2010
66
WOODFORD et al Outbreak of Klebsiella pneumoniae Producing a New
Carbapenem- Hydrolyzing Class A β-Lactamase KPC-3 in a New York Medical
Center Antimicrobial agents and chemotherapy Dec 2004 p 4793ndash4799 Vol 48
No 12
YAGI T et al A preliminary survey of extended-spectrum β-lactamases
(ESBLs) in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Japan
FEMS Microbiology Letters 184 (2000) 53-56
YIGIT H et al Novel carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase KPC-1 from
a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumonia J Antimicrob Agents
Chemother 45 (4) 1151-1161 (2001)
ZAVASCKI A P et al KPC-2- producing Enterobacter cloacae in two cities
from Southern Brazil Int J Antimicrob Agents Apr 28 2009
ZHANEL G G et al Comparative review of the carbapenecircmicos Drugs
67(7)1027-52 2007
67
ANEXOS
Sequumlecircncia do oligo blaKPC
Query 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
Query 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
Query 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
68
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
Query 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
Query 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
69
Query 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
Query 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
Query 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
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|||||||
70
Sbjct 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
Query 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
Query 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
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|||||||
Sbjct 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
Query 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
71
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
Query 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
Query 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
72
Query 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
Query 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
Query 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
73
Sbjct 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
Query 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
Query 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
Query 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
74
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
Query 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
Query 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
75
Query 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
Query 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
||||
Sbjct 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
LOCUS AF297554 1377 bp
DNA linear BCT 26-MAR-2001
DEFINITION Klebsiella pneumoniae carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
gene complete cds
ACCESSION AF297554
VERSION AF2975541 GI10121874
76
KEYWORDS
SOURCE Klebsiella pneumoniae
ORGANISM Klebsiella pneumoniae
Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Enterobacteriaceae Klebsiella
REFERENCE 1 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH QueenanAM
AndersonGJ Domenech-SanchezA
BiddleJW StewardCD
AlbertiS BushK and TenoverFC
TITLE Novel carbapenem-hydrolyzing beta-
lactamase KPC-1 from a
carbapenem-resistant strain of
Klebsiella pneumoniae
JOURNAL Antimicrob Agents Chemother 45 (4)
1151-1161 (2001)
PUBMED 11257029
REFERENCE 2 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH AndersonGJ and
TenoverFC
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (19-AUG-2000) Nosocomial
Pathogens Laboratory Branch
Centers for Disease Control and
Prevention 1600 Clifton Rd MS
G08 Atlanta GA 30333 USA
FEATURES LocationQualifiers
77
source 11377
organism=Klebsiella
pneumoniae
mol_type=genomic DNA
db_xref=taxon573
-35_signal 5560
-10_signal 7883
mRNA 921012
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
RBS 117122
CDS 1311012
note=blaKPC-1
codon_start=1
transl_table=11
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
protein_id=AAG134101
db_xref=GI10121875
translation=MSLYRRLVLLSCLSWPLAGFSATALTNLVAEPFAKLEQD
FGGSI
GVYAMDTGSGATVSYRAEERFPLCSSFKGFLAAAVLARSQQQAGLLDTPIRYG
KNALV
PWSPISEKYLTTGMTVAELSAAAVQYSDNAAANLLLKELGGPAGLTAFMRSIG
DTTFR
78
LDRWELELNSAIPSDARDTSSPRAVTESLQKLTLGSALAAPQRQQFVDWLKGN
TTGNH
RIRAAVPADWAVGDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTRAPNKDDK
HSEAV
IAAAARLALEGLGVNGQ
ORIGIN
1 cggggcagtt acagccgtta cagcctctgg
agagggagcg gcttgccgct cggtgataat
61 cccagctgta gcggcctgat tacatccggc
cgctacacct agctccacct tcaaacaagg
121 aatatcgttg atgtcactgt atcgccgtct
agttctgctg tcttgtctct catggccgct
181 ggctggcttt tctgccaccg cgctgaccaa
cctcgtcgcg gaaccattcg ctaaactcga
241 acaggacttt ggcggctcca tcggtgtgta
cgcgatggat accggctcag gcgcaactgt
301 aagttaccgc gctgaggagc gcttcccact
gtgcagctca ttcaagggct ttcttgctgc
361 cgctgtgctg gctcgcagcc agcagcaggc
cggcttgctg gacacaccca tccgttacgg
421 caaaaatgcg ctggttccgt ggtcacccat
ctcggaaaaa tatctgacaa caggcatgac
481 ggtggcggag ctgtccgcgg ccgccgtgca
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541 gctgaaggag ttgggcggcc cggccgggct
gacggccttc atgcgctcta tcggcgatac
79
601 cacgttccgt ctggaccgct gggagctgga
gctgaactcc gccatcccaa gcgatgcgcg
661 cgatacctca tcgccgcgcg ccgtgacgga
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901 tgtgttggcc gtctacaccc gggcgcctaa
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1321 gcaccttgtc caggcccctc atgctgaact
gacgcaatcc catcaccgcc ttgatca
80
28
especializados em diagnoacutestico molecular dificultando ainda a utilizaccedilatildeo dele na
rotina dos laboratoacuterios de microbiologia (COTRIM et al 2012)
Em estudo de infecccedilotildees hospitalares identificaccedilatildeo molecular de patoacutegenos
bacterianos eacute bastante utilizada Para diferenciar carbapenemases tipo KPC a partir
de outros tipos como SME NMC-A-IMI e GES eacute necessaacuterio um exame molecular
As identificaccedilotildees do microrganismo juntamente com a triagem molecular iratildeo definir
um resultado mais especiacutefico podendo ser usado para identificar o antibioacutetico mais
adequado para o tratamento Poreacutem a principal desvantagem de alguns exames
baseados em PCR por exemplo eacute que devido agrave sua limitada capacidade de
multiplexaccedilatildeo eles distinguem apenas algumas variaccedilotildees (MOREIRA et al 2014)
Estatildeo descritas para a identificaccedilatildeo molecular de patoacutegenos pertencentes agrave
famiacutelia Enterobacteriaceae as teacutecnicas de PFGE RAPD (randomly amplified
polymorphic DNA) e ERIC-PCR (Enterobacterial Repet it ive Intergenic Consensus)
A PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) eacute considerada padratildeo ouro devido sua
alta capacidade de diferenciaccedilatildeo baseada na anaacutelise do perfil de restriccedilatildeo do DNA
genocircmico por meio de eletroforese Como desvantagem para a sua execuccedilatildeo eacute
necessaacuterios vaacuterios dias impedindo a tipagem de algumas cepas bacterianas devido
agrave degradaccedilatildeo do DNA aleacutem do alto custo empregado (MOREIRA et al 2014)
O meacutetodo baseado em ERIC-PCR tem sido bastante utilizado como uma
alternativa para a teacutecnica de PFGE Esta teacutecnica consiste na anaacutelise do padratildeo de
amplificaccedilatildeo de elementos repetidos encontrados no genoma bacteriano Isto
permite uma maior rapidez na obtenccedilatildeo de resultados quando comparada com o
PFGE aleacutem de alta reprodutibilidade simples execuccedilatildeo e implementaccedilatildeo baixo
custo e natildeo sem problemas com a degradaccedilatildeo do DNA (MOREIRA et al 2014)
A PCR eacute considerada uma teacutecnica de biologia molecular revolucionaacuteria que
consiste na siacutentese enzimaacutetica de coacutepias de aacutecidos nucleacuteicos Ela permitiu o raacutepido
desenvolvimento do estudo de sequumlecircncias de aacutecidos nucleacuteico Foi desenvolvida por
Kary Banks Mullis que ganhou o precircmio Nobel de quiacutemica de 1993 devido ao
desenvolvimento dessa teacutecnica em abril de 1983 (CAMARGO et al 2014)
Por meio de etapas de variaccedilatildeo de temperatura a teacutecnica de PCR promove a
duplicaccedilatildeo de cadeias de DNA in vitro A reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo de DNA por PCR
envolve o emprego de sequumlecircncias iniciadoras (primers) quatro nucleotiacutedeos
29
(dNTPrsquos) do DNA e uma DNA polimerase termoestaacutevel podendo assim obter-se a
partir de uma fita molde muitas coacutepias de uma sequumlecircncia especiacutefica de aacutecido
nucleacuteico O princiacutepio da PCR consiste na variaccedilatildeo de temperatura por ciclo
envolvendo trecircs etapas baacutesicas desnaturaccedilatildeo pareamento e amplificaccedilatildeo
(CAMARGO et al 2014)
A desnaturaccedilatildeo da fita molde de DNA eacute uma etapa com duraccedilatildeo entre 30
segundos a 1 minuto a temperatura entre 92 ordmC a 96 ordmC Apoacutes isso o pareamento de
dois iniciadores sinteacuteticos de composiccedilotildees distintas que funcionam como os
iniciadores da reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo liga-se agrave regiatildeo complementar da fita de
DNA alvo que sofreraacute a duplicaccedilatildeo Esta etapa tem duraccedilatildeo de 30 segundos a 1
minuto a temperatura entre 58 ordmC e 65 ordmC Por uacuteltimo a amplificaccedilatildeo por meio da
enzima Taq DNA polimerase das novas fitas de DNA se daacute a partir de cada um dos
iniciadores utilizando os quatro dNTPrsquos como substrato da reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo
Esta etapa possui duraccedilatildeo entre 45 segundos e 1 minuto a 72 ordmC Cada ciclo eacute
repetido em torno de 30 a 35 vezes e promove a amplificaccedilatildeo da regiatildeo alvo
determinada conforme o anelamento dos iniciadores sinteacuteticos de DNA (CAMARGO
et al 2014) Estas etapas estatildeo demonstradas na figura 4
Figura 4 Etapas da Reaccedilatildeo de PCR
30
2 JUSTIFICATIVA
No ano de 2010 no Distrito Federal foram identificados 111 pacientes com
suspeita de infecccedilatildeo por Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) e a
Secretaria de Sauacutede do Distrito Federal confirmaram ainda a morte de 18 pacientes
dentre os hospitais puacuteblicos e particulares Um desafio encontrado por ocasiatildeo do
surto infeccioso no Distrito Federal foi o de confirmar as KPCs por Reaccedilatildeo da
Polimerase em Cadeia sendo que as amostras foram enviadas com esta finalidade
para a Fiocruz no Rio de Janeiro
Pesquisas que possam contribuir na elaboraccedilatildeo de estrateacutegias preventivas e
de intervenccedilatildeo para infecccedilotildees causadas por enterobacteacuterias bem como contribuir
para gerar uma integraccedilatildeo beneacutefica entre a equipe acadecircmica e os serviccedilos de
sauacutede devem ser estimuladas Neste sentido o presente estudo permitiu escrutinar
os genes envolvidos na expressatildeo de carbapenemases presentes em espeacutecies de
enterobacteacuterias isoladas em ambiente hospitalar visto que elucidar genes de
resistecircncia de enterobacteacuterias aos antibioacuteticos carbapenecircmicos eacute o primeiro passo
para garantir um controle epidemioloacutegico efetivo para estes tipos de microorganismo
assim como sua associaccedilatildeo com surtos fatais particularmente em pacientes com
baixa imunidade
31
3 OBJETIVOS
31 Objetivo geral Caracterizar os genes de resistecircncia das
Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases e os aspectos epidemioloacutegicos de
pacientes internados em um hospital puacuteblico do Distrito Federal
32 Objetivos Especiacuteficos
Identificar genotipicamente a enzima KPC (Klebsiella pneumoniae
carbapenemase) de isolados de Klebsiella pneumoniae
Investigar aspectos epidemioloacutegicos dos pacientes portadores de
Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases
Identificar quais variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana influenciaram para o
desfecho oacutebito ou alta
Avaliar a susceptibilidade das Enterobacteacuterias aos antibioacuteticos
carbapenecircmicos dos pacientes em ambiente hospitalar
32
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
Trata-se de um estudo transversal onde foi realizado o teste de
susceptibilidade das enterobacteacuterias aos antibioacuteticos carbapenecircmicos a partir dos
materiais bioloacutegicos coletados dos pacientes internados no Hospital Regional da Asa
Norte (HRAN) e enviados ao Laboratoacuterio de Anaacutelises Cliacutenicas da mesma Instituiccedilatildeo
Os materiais bioloacutegicos investigados foram sangue aspirado traqueal ou brocircnquico
urina e cultura semi quantitativa de ponta de cateter venoso central O HRAN eacute um
hospital puacuteblico do Distrito Federal com 395 leitos sendo as cliacutenicas de internaccedilatildeo
Berccedilaacuterio Cirurgia Geral Cirurgia Plaacutestica Cliacutenica Meacutedica Ginecologia Maternidade
Pediatria Queimados UTI com atendimento a pacientes portadores de doenccedilas de
caraacuteter cliacutenico e ciruacutergico
4 1 Coleta e transporte das amostras bioloacutegicas
As amostras foram coletadas de pacientes internados no Hospital Regional da
Asa Norte (HRAN) com suspeitas de infecccedilatildeo por KPC A identificaccedilatildeo primaacuteria foi
realizada pelo Laboratoacuterio de Microbiologia do hospital de origem dos pacientes e os
demais procedimentos que foram utilizados na identificaccedilatildeo encontram-se descritos
abaixo
4 2 Procedimentos para confirmaccedilatildeo de resistecircncia bacteriana por
disco de ertapenem (adaptado CDC 2004)
Para diagnosticar amostra como portadora de bacteacuteria produtora de
carbapenemase foi realizado o teste com disco de ertapenem como forma de
triagem Inicialmente utilizou-se o swab contaminado com a amostra que foi
distribuiacuteda em uma pequena aacuterea da placa de aacutegar MacConkey para apoacutes o
crescimento ser realizada a pesquisa de colonizaccedilatildeo por enterobacteacuterias resistentes
aos carbapenecircmicos (Pesquisa de CRE) Procedeu-se a semeadura por teacutecnica
semi-quantitativaesgotamento com alccedila bacterioloacutegica na diluiccedilatildeo de 1100 O disco
de Ertapenem foi colocado na superfiacutecie da placa de MacConkey na junccedilatildeo dos dois
primeiros campos de semeadura conforme demonstrado na figura 5 Incubou a placa
33
em estufa aeroacutebia a 35ordmC por 24 e 48 horas e observou-se o halo de difusatildeo do
disco de Ertapenem na placa para proceder agrave leitura
O teste deixou de ser obrigatoacuterio apoacutes a modificaccedilatildeo dos criteacuterios
interpretativos para carbapenecircmicos para enterobacteacuterias publicados no suplemento
do CLSI 2010 M100-S20-U
Figura 5 Mecanismo de semeamento de material bioloacutegico oriundos de
pacientes com suspeita de infecccedilatildeo por KPC Fonte adaptado CDC 2004
4 2 1 Interpretaccedilatildeo dos resultados
Na ausecircncia de crescimento ateacute 24 horas (MacConkey) ou halo de difusatildeo
gt27 mm na placa deve-se reincubar as placas por mais 24 horas Quando for
ausente o crescimento apoacutes 48 horas ou halo de difusatildeo gt27 mm na placa libera-se
como enterobacteacuterias resistentes a carbapenecircmicos (KPCNEG)Havendo
crescimento de colocircnias na placa de MacConkey com halo lt 27 mm (apenas para
colocircnias com crescimento dentro do halo) deve-se reisolar e realizar identificaccedilatildeo e
antibiograma automatizado teste de sensibilidade por disco-difusatildeo e Teste de
Hodge Modificado (THM) Os isolados de enterobacteacuterias cujos testes comprovarem
a resistecircncia aos carbapanecircmicos testados (KPCPOS) foram reportado a Comissatildeo
de Controle de Infecccedilatildeo Hospitalar (CCIH) Jaacute osbacilos Gram-negativos natildeo
fermentadores natildeo foram reportados (KPCNEG) Para interpretaccedilatildeodos resultados
foram utilizados os valores conforme demonstrados na tabela 1
Tabela 1 Criteacuterios Interpretativos para testes de sensibilidade
ENTEROBACTEacuteRIAS
Disco difusatildeo (mm) MIC (microgml)
34
Antibioacutetico Sigla S I R S I R
Ertapenem 10
microg
ETP 22 19-
21
18 05 1 2
Meropenem 10
microg
MEM 23 20-
22
19 1 2 4
Fonte Manual Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)
2013
Os resultados que apresentaram resistecircncia ao antibioacutetico Ertapenem foram
considerados como suspeitos de contaminaccedilatildeo por KPC Fez-se o teste de
susceptibilidade aos antibioacuteticos (TSA) em aparelho automatizado MicroScan Walk
Away 96sl Dade Behring
4 3 Teste de susceptibilidade aos antibioacuteticos (adaptado CDC 2004)
A determinaccedilatildeo da susceptibilidade dos isolados foi feita pelo teste de
susceptibilidade aos antibioacuteticos (TSA) apoacutes cultura em meio de gelose simples
(INSA) para avaliaccedilatildeo da sua pureza e obtenccedilatildeo de colocircnias isoladas Para
preparaccedilatildeo de uma suspensatildeo bacteriana com turvaccedilatildeo aproximada de 05
McFarland (Dade BehringMicroScanregTurbidity Meter) ressuspendeu duas a cinco
colocircnias em 2ml de soro fisioloacutegico esteacuteril diluindo a 1100 em soro fisioloacutegico num
volume total de 10ml em seguida foi feita uma semeadura em duas placas
quadradas (120mm x 120mm) de Muller-Hinton Agar (INSA) por inundaccedilatildeo
Os discos de antibioacutetico carbapenecircmicos imipenem meropenem e
ertapenem (Biorad) foram aplicados com o auxiacutelio de um dispensador automaacutetico A
susceptibilidade das Enterobacteacuterias aos carbapenecircmicos foi definida de acordo
com o protocolo Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI 2011)
Para aquelas Enterobacteacuterias que apresentaram resistecircncia ao ertapenem
foram realizados o Teste de Hodge Modificado para Detecccedilatildeo de Enterobacteacuterias
Produtoras de Carbapenemases conforme descrito pelo Centers for Disease Control
and Prevention (CDC 2004)
35
4 4Teste de Hodge Modificado (THM) (adaptado CDC 2004)
Preparou-se uma suspensatildeo em salina esteacuteril com a cepa Escherichia coli
ATCC 25922 (padratildeo 05 de McFarland) Apoacutes isto diluiu a suspensatildeo 110 em
salina (05 ml da soluccedilatildeo de Ecoli ATCC 25922 + 45 ml salina)Foi entatildeo semeado
na superfiacutecie de uma placa de Agar Muller-Hinton com a suspensatildeo diluiacuteda de Ecoli
ATCC 25922 com auxilio de swab seco assegurando que houvesse uma
distribuiccedilatildeo uniforme cobrindo toda a superfiacutecie do Agar Deixou secar por 3 a 5
minutos em temperatura ambienteColocou-se o disco de ertapenem 10microg no centro
da placa e apoacutes isto fez-se uma estria linear da cepa a ser testada da borda do
disco ateacute a borda da placa utilizando uma alccedila calibrada 10 microl ou um swab Incubou
a placa na estufa em atmosfera aeroacutebia a 35 plusmn 2ordmC por 16 a 24 horas
441 Controle de qualidade (CQ)
Foi utilizado um CQ todos os dias em que se realizou o teste tendo como
controle Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1705- teste de Hodge modificado
positivo Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1706- teste de Hodge modificado
negativo
442 InterpretaccedilatildeoResultados
Apoacutes 16ndash24 horas de incubaccedilatildeo examinar as placas para verificar a presenccedila
de uma distorccedilatildeo no halo de inibiccedilatildeo do disco de ertapenem devido ao crescimento
realccedilado da cepa ATCC na intersecccedilatildeo do organismo teste e a Ecoli ATCC 25922
dentro dos limites do halo O THM positivo apresentaraacute presenccedila de distorccedilatildeo no
halo de inibiccedilatildeo de ertapenem devido ao crescimento da cepa Ecoli ATCC 25922 ao
longo da estria da cepa teste para dentro dos limites do halo de inibiccedilatildeo Jaacute o THM
negativo teraacute ausecircncia de crescimento da cepa Ecoli ATCC 5922 ao longo da estria
da cepa teste para dentro dos limites do halo de inibiccedilatildeo do disco de ertapenem
Este resultado estaacute representado na figura 6
36
Figura 6 Interpretaccedilatildeo resultado do Teste de Hodge Modificado
(adaptado CDC 2004) Teste positivo na estria da cepa teste na parte superior
da placa teste negativo na estria da cepa teste na parte inferior da placa
Tendo positivo como resultado o paciente era um provaacutevel contaminado por
KPC As amostras entatildeo foram encaminhadas para a Fundaccedilatildeo Osvaldo Cruz
(FIOCRUZ) para confirmaccedilatildeo final As amostras finalmente confirmadas como
positivas para KPC foram isoladas e guardadas no banco de cepas cliacutenicas do
hospital Apoacutes a autorizaccedilatildeo do CEP amostras das cepas foram transferidas para
meio de transporte Stuard em caixa teacutermica fechada em baixa temperatura e
levadas para o laboratoacuterio de microbiologia cliacutenica da universidade
No laboratoacuterio da universidade as amostras foram separadas e realizadas
repiques em meios MacConkey e incubadas por 24h As colocircnias caracteriacutesticas
foratildeo isoladas em caldo BHI e mantidas em shaker a 37oC por 2h Apoacutes isto foram
executadas as anaacutelises a seguir
Os isolados de Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases foram
submetidos agrave extraccedilatildeo de DNA e posterior sequumlenciamento para identificaccedilatildeo dos
genes de resistecircncia blaKPC de 1 a 13 e identificaccedilatildeo do gene universal Os
pacientes de onde os materiais bioloacutegicos contendo as Enterobacteacuterias produtoras
de carbapenemases foram os isolados foram investigados quanto aos aspectos
epidemioloacutegicos e cliacutenicos
37
4 5 Extraccedilatildeo de DNA bacteriano
A extraccedilatildeo de DNA bacteriano foi realizada utilizando o kit NucleoSpin
Plasmidreg (MN) Antes de iniciar a extraccedilatildeo foi feito a preparaccedilatildeo das soluccedilotildees
reagentes materiais e amostras (vortexando) colocou-se em banho-maria agrave 50ordmC o
tampatildeo AW Partiu-se de colocircnias isoladas cultivadas que sofreram passagem em
meio LB liacutequido por 12h Adicionou-se 15 mL da amostra no tubo eppendorf
centrifugou por 5 minutos descartou o sobrenadante (com cuidado para natildeo
descartar o Pellet) Repetiu-se este procedimento por mais trecircs vezes completando-
se o volume de 6mL Foram adicionados 250microL do tampatildeo Resuspension Buffer A1
encostando a ponteira no Pellet e misturando (este tampatildeo tem como funccedilatildeo
separar a formaccedilatildeo de grumos celulares) Apoacutes isso homogeneizou e vortexou os
tubos eppendorfs Apoacutes isso foram adicionados 250microL do tampatildeo Lysis Buffer A2
homogenizou e deixou descansar por 5 minutos (esta etapa eacute importante para a lise
da parede e da membrana celulares e liberaccedilatildeo do conteuacutedo da ceacutelula)
Passado o tempo de descanso foi adicionado 300microL do tampatildeo
Neutralization Buffer A3 homogeneizou e centrifugou por 10 minutos (este tampatildeo
iraacute retirar as proteiacutenas que envolvem o DNA e voltaraacute com o pH para proacuteximo de 8
impedindo que a soluccedilatildeo de lise facilite a quebra das ligaccedilotildees covalentes do aacutecido
nucleacuteico) Em seguida enumeraram-se os tubos contendo filtros com siacutelica
transferiu-se o sobrenadante para o filtro e centrifugou por 5 minutos Descartou-se
o que foi filtrado adicionou 500microL do tampatildeo AW (banho-maria) centrifugou por 2
minutos Novamente foi descartado o filtrado Adicionou-se 600microL do tampatildeo A4
centrifugou por 2 minutos e descartou o filtrado (os tampotildees AW e A4 contecircm
isotiocianato de guanidina em concentraccedilotildees crescentes para facilitar a adsorccedilatildeo
do DNA na siacutelica e retirada das outras biomoleacuteculas da amostra) Foi feita outra
centrifugaccedilatildeo com o tubo vazio Apoacutes isto o filtro foi trocado para outro eppendorf
definitivo onde foi adicionado 50microL do tampatildeo Elution Buffer AE (este tampatildeo
favorece a eluiccedilatildeo do DNA) centrifugou por 2 minutos descartou o filtro e
armazenou as amostras em freezer -20ordmC
38
4 6 Iniciadores e reaccedilatildeo de PCR
Os iniciadores universais para o gene blaKPC foram desenhados baseados
em sequumlecircncias conservadas apresentadas pelos sub-grupos de genes que
codificam a enzima carbapenemase de klebsiella pneumoniae (YIGIT et al 2001)
Baseado na sequumlecircncia para o blakpc-1 depositada no GenBank
(AF2975541) o oligonucleotiacutedio (oligo) iniciador direto (5-
ATGTCACTGTATCGCCGTC-3rsquo) foi desenhado para reconhecer a sequumlecircncia
blaKPC na posiccedilatildeo (131149) enquanto que o iniciador reverso (5-
TTACTGCCCGTTGACGCC-3rsquo) foi reconhecido na posiccedilatildeo (9951012) As anaacutelises
baseadas em alinhamento de sequumlecircncias mostraram que o par de iniciadores
blaKPC podem detectar os alelos de 1 a 13 do gene blaKPC conforme a tabela 2
Tabela 2 Nuacutemero de acesso ao GenBank dos alelos blaKPC e seus
microrganismos originais
Nuacutemero de
Acesso GenBank
Microrganismo Alvo
AF2975541 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-1
GU0862251 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-2
HQ2589341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-2-like
AB5577341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC -3
EU4473041 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-4
EU4002222 Pseudomonas
aeruginosa
blaKPC-5
EU5555341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-6
EU7297271 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-7
39
FJ2344121 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-8
FJ624872 Escherichia coli blaKPC-9
GQ1403481 Acinetobacter
baumannii
blaKPC-10
HM0669951 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-11
HQ3428891 Enterobacter cloacae blaKPC-12
HQ3428901 Enterobacter cloacae blaKPC-13
As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo de blaKPC foram realizadas em um
primeiro tempo de desnaturaccedilatildeo em que foi 94ordmC por 5 minutos seguido de 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 58 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 90 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 78ordmC por 8 minutos Aleacutem das amostras foi utilizado um
controle negativo
A PCR do blaKPC foi realizada utilizando os componentes para o volume da
reaccedilatildeo de 25 microL citados na tabela 3 A banda do tamanho do produto de PCR foi de
881 pares de bases (pb) o que corresponde ao plasmiacutedeo
Tabela 3 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do
gene blaKPC
Reagente Volume
DNA molde 4 microL
Tampatildeo Taq 25 microL
MgCl2 075 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP
2 microL
Oligo F 1 microL
Oligo R 1 microL
Taq DNA polimerase 05 microL
Aacutegua MiliQ 1335 microL
40
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
Baseado na sequumlecircncia para o gene 16S rRNA em que o oligonucleotiacutedio
Universal iniciador direto foward (5-CCAGCAGCCGCCGTAATACG-3rsquo) foi
desenhado para reconhecer a sequumlecircncia universal na posiccedilatildeo 1513 enquanto que o
iniciador reverso (5-ATCGGYTACCTTGTTACGACTTC-3rsquo) foi reconhecido na
posiccedilatildeo 1491 foram realizadas PCRrsquos As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo deste
gene foram realizadas nos seguinte tempos separaccedilatildeo 94ordmC por 10 minutos 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 55 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 120 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 72ordmC por 10 minutos
A PCR do gene 16S rRNA foi realizada utilizando os componentes para o
volume da reaccedilatildeo de 25microL citados na tabela 4 A banda do tamanho do produto de
PCR foi de 996 pb correspondente aacute regiatildeo ribossomal capaz de amplificar todas
as espeacutecies
Tabela 4Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do gene
universal
Reagente (quantidade
concentraccedilatildeo do estoque)
Volume
DNA molde 10 ng 4 microL
Tampatildeo Taq 10 x 25 microL
MgCl2 50mM 125 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP 25 mM
125 microL
Oligo F 10microM 05 microL
Oligo R 10microM 05 microL
Taq DNA polimerase 5UmicroL 04 microL
Aacutegua Miliq 146 microL
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
41
O termociclador utilizado para os experimentos foi o LifeTouch da BIOER
4 7 Digestatildeo
Para realizaccedilatildeo da digestatildeo foi utilizada a enzima BshF I (Hae III) EN- 1105
tamanho 7000 units concentraccedilatildeo 10 unitsmicroL fonte Bacillus sphaericus empresa
Jena bioscienceUtilizaram-se os componentes para o volume de 50microL da reaccedilatildeo
citados na tabela 5
Tabela 5 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da digestatildeo do gene
universal
Reagente Volume
Produto de PCR 10 microL
Enzima BshF I 01 microL
Tampatildeo (10x) 5 microL
Aacutegua Miliq 349 microL
Total (em cada ependorff) 50 microL
Valores para 1 digestatildeo
Os ependorffs foram colocados por 30 minutos em banho-maria a 37ordmC Apoacutes
isso fez-se a corrida das amostras em gel de agarose para verificaccedilatildeo do resultado
(LU et al 2000)
4 8 Eletroforese em gel de agarose
Os produtos de DNA PCR e digestatildeo foram analisados em gel de agarose
2 O tempo de corrida do gel eacute de aproximadamente 1hora e 30minutos sendo
que no comeccedilo foi usada agrave voltagem de 50 V e apoacutes comeccedilar a correr o gel
aumentou a voltagem para 100 v Utilizou-se o marcador de 100pb (pares de bases)
Foi adicionado 3microL de corante Bromophenol (que tem a funccedilatildeo de fazer uma ligaccedilatildeo
na amostra de DNA e permitir a visualizaccedilatildeo da corrida no gel de agarose) em 7microL
de amostra tanto de DNA quanto de PCR Para o preparo do gel foi utilizado TBE
42
(Tris- Aacutecido Boacuterico) agarose e brometo de etiacutedio (sua funccedilatildeo eacute de corante para o gel
e permitir a visualizaccedilatildeo do DNA quando colocado agrave luz ultravioleta) Para o oligo
blaKPC a banda da amplificaccedilatildeo foi em 881ppb correspondendo ao plasmiacutedeo Jaacute
o oligo Universal foi em 996 pb
4 9 Descarte de resiacuteduos
Todos os materiais utilizados nos ensaios foram de uso uacutenico e manipulados
em cacircmaras de seguranccedila bioloacutegica classe II Apoacutes o uso foram colocados em
soluccedilatildeo desinfetantes (hipoclorito a 1) e em seguida autoclavados a 127oC por 20
min em sacos apropriados para autoclavaccedilatildeo Apoacutes a finalizaccedilatildeo do ciclo de
esterilizaccedilatildeo os sacos contendo o material descartaacutevel foram colocados em
recipientes de coleta da empresa responsaacutevel pela coleta de materiais bioloacutegicos
produzidos no laboratoacuterio de microbiologia Todos os procedimentos seguiram a
normativa RDC-ANVISA 3062004 sobre o descarte de resiacuteduos de serviccedilo de
sauacutede
4 10 Aspectos epidemioloacutegicos e cliacutenicos
Os aspectos cliacutenicos e epidemioloacutegicos foram investigados por meio de
prontuaacuterios dos pacientes portadores de enterobacteacuterias produtoras de
carbapenemases e envolveram topografia mais provaacutevel do foco infeccioso a
enfermidade motivadora da internaccedilatildeo o desfecho cliacutenico a idade e o tempo de
internaccedilatildeo
4 12 Anaacutelises eepidemioloacutegicas
As anaacutelises foram realizadas com o pacote estatiacutestico SPSS versatildeo 200
Para verificar quais variaacuteveis referentes aos dados epidemioloacutegicos e
microbioloacutegicos influenciaram no desfecho verificou- se a diferenccedila meacutedia das
variaacuteveis idade e tempo de internaccedilatildeo em cada grupo O teste estatiacutestico utilizado foi
o teste t de Student apoacutes se executar o teste de normalidade de Shapiro-Wilk Para
as variaacuteveis sexo perfil microbioloacutegico das enterobacteacuterias produtoras de
43
carbapenemases foi avaliada a associaccedilatildeo com o desfecho por meio do teste Exato
de Fisher O niacutevel de significacircncia adotado foi de 5
4 13 Preceitos eacuteticos
Este projeto estaacute inserido em um projeto maior denominado ldquoEpidemiologia
cliacutenica e caracterizaccedilatildeo molecular do Acinetobacter Baumannii resistente a
antibioticoterapia em pacientes internado em hospitais do Sistema Uacutenico de Sauacutederdquo
que foi submetido ao Comitecirc de Eacutetica em Pesquisa da Secretaria do Estado de
Sauacutede do Distrito Federal (SESDF) e emitido parecer aprovado pelo protocolo nordm
23109 (anexo)
44
5 RESULTADOS
51 Anaacutelise molecular
Para a amplificaccedilatildeo com o oligo blaKPC foram amplificadas amostras
que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 881 pb correspondente ao
plasmiacutedeo A anaacutelise da amplificaccedilatildeo da regiatildeo do gene blaKPC mostrou que
apenas a amostra A10 natildeo amplificou isso demonstra que esta amostra natildeo
possuiacutea o gene de resistecircncia
5 1 1 Gene blaKPC
Figura 7 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 881 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
A amostra A3 natildeo amplificou no primeiro momento entatildeo foi realizado
novamente a PCR e corrida de gel obtendo entatildeo a amplificaccedilatildeo da amostra como
apresentado na figura 8
45
Figura 8 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC da
mostra A3 estudada A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo de 881
pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 1 2 Gene 16S rRNA
Para a amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA utilizou-se o oligo universal Foram
amplificadas amostras que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 996 pb
Figura 9 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
46
Segundo Lu et al (2000) a digestatildeo com a enzima HaeIII deste amplicons de
16S rRNA devolveriam bandas com perfis entre 150 a 200 pb No gel abaixo eacute
possiacutevel evidenciar que este perfil ocorreu com o predomiacutenio de bandas na altura
de 200pb
Figura 10 Gel de agarose a 2 da digestatildeo do amplicon do gene 16S
rRNA das amostras com a enzima HaeIII evidenciando diversos fragmentos
proacuteximos a 200 pb A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo ribossomal
de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 2 Anaacutelises epidemioloacutegicas
5 2 1 Sexo
No total foram detectados 17 isolados de KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 onde a maior a prevalecircncia foi
detecatada em amostras de pacientes do sexo masculino (53) do que no sexo
feminino (47)
47
Figura 11 Isolado de KPC segundo sexo dos 17 pacientes investigados
no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 2 Desfecho cliacutenico
Em 17 isolados de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo
de 2010 aacute 2011 a porcentagem de pacientes que foram a oacutebito (59) foi maior que
a de pacientes que tiverm alta (41)
Figura 12 Isolado de KPC segundo desfecho cliacutenico dos 17 pacientes
investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
48
5 2 3 Local da coleta
Dos 17 episoacutedios detectados de infecccedilatildeo por KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 a infecccedilatildeo em swab retalfoi mais
frequente (47) seguida de ponta de cateacuteter (18) e secreccedilatildeo traqueal (12)
Figura 13 Isolados de KPC segundo local da coleta da amostra nos 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 4 Microorganismo
O microorganismo mais encontrado foi a Klebsiella pneumoniae (82)
seguida da Enterobacter clocae (12) e Serratia marcescens (6) dos 17 isolados
de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 Isto afirma o
fato de a sigla KPC ser utilizada de forma errocircnea aacute Klebsiella pneumoniae visto
que a evidecircncia dela eacute maior em relaccedilatildeo as outras cepas
49
Figura 14 Isolado de KPC segundo microrganismo encontrado em 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 5 Relaccedilotildees variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana e desfecho
cliacutenico
Tabela 6 ndash Distribuiccedilatildeo do perfil geneacutetico sexo coleta tipificaccedilatildeo de
microrganismos e anaacutelise da resistecircncia bacteriana segundo o desfecho
cliacutenico Brasiacutelia-DF 2010 a 2011
Variaacutevel Resultado
Desfecho
Alta Oacutebito
N N P
Gene 16S rRNA Positivo 7 1000 10 1000
NA Gene blaKPC Positivo 6 857 10 1000
Negativo 1 143 0 00 0218 Sexo Feminino 2 286 6 600
Masculino 5 714 4 400 0201 Local da coleta Fundo saco de
Douglas 1 143 0 00
Hemocultura 0 00 1 100 0463 Ponta de cateter 1 143 2 200
Sec TraquealBrocircnquica
0 00 1 100
50
Secreccedilatildeo traqueal 2 286 0 00
Swab retal 3 429 5 500
Urina 0 00 1 100
Microrganismo Enterobacter cloacae (KPC)
1 143 1 100
Klebsiella pneumoniae
6 857 8 800
0416 Serratia
marcescens 0 00 1 100
Teste de Hodge Hodge positivo 7 1000 10 1000
NA Amicacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 1 100 0848 resistente 0 00 1 100
sensiacutevel 2 286 3 300
Amoxicilina Aacutecido Clavulacircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Ampicilina Sulbactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ampicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Aztreonan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefazolina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Cefoperazona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Cefotaxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefoxitina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0509 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 2 286 4 400
Ceftazidima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cetriaxona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 3 429 5 500 0772 Cefalotina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ciprofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772
51
resistente 3 429 5 500
Claritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Clindamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Eritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Gentamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0942 resistente 2 286 3 300
sensiacutevel 1 143 2 200
Imipenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 0 00 2 200 0193 Resistente 1 143 3 300
sensiacutevel 2 286 0 00
Nitrofurantoiacutena sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Norfloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Oxacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Penicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Piperacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Rifampicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tetraciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Ticarcilina Aacutecido Clavulocircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0688 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 3 429 4 400
Tobramicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Trimetoprima Sulfametoxazol
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0112 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 2 286 0 00
Vancomicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tigeciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediario 0 00 1 100 0211 natildeo testado 1 143 4 400
resistente 2 286 0 00
52
Cefepime sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefuroxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Levofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Piperacilina Tazobactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Ertapenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Meropenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0223 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 1 143 0 00
Cefotetan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 sensiacutevel 0 00 1 100
Gemifloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 7 700 0585 natildeo testado 3 429 3 300
Desfecho
Alta Oacutebito
Meacutedia Erro
padratildeo Meacutedia Erro
padratildeo p
Idade 58 9 59 5 0991
Tempo Internaccedilatildeo (dias)
50 13 46 12 0571
n= 17 p(lt 005) NA natildeo se aplica
53
6 DISCUSSAtildeO
Nos uacuteltimos anos houve um aumento na incidecircncia de bacteacuterias
multirresistentes aos antimicrobianos no ambiente hospitalar tornando isto um
problema mundial de sauacutede puacuteblica (HULSCHER et al 2010) Quando se trata
principalmente de bacilos Gram negativos a frequumlecircncia destas bacteacuterias eacute ainda
maior em paiacuteses da Ameacuterica Latina quando comparada a paiacuteses desenvolvidos
(GALES etal 2012)
De acordo com dados do ldquoMeropenem Yearly Susceptibility Test Information
Collectionrdquo (MYSTIC) ocorreu nos Estados Unidos um aumento na susceptibilidade
de K pneumoniae nos uacuteltimos anos graccedilas a praacuteticas de controle de disseminaccedilatildeo
de amostras resistentes(RHOMBERG P R et al 2009) O aumento crescente da
prevalecircncia destes microrganismos foi proporcional ao aumento da dependecircncia do
uso de antibioacuteticos carbapenecircmicos considerados como a opccedilatildeo terapecircutica para o
tratamento de infecccedilotildees por bacilos Gram negativos multi-resistentes (LIVERMORE
2012) Isto afeta diretamente as opccedilotildees de tratamento sobrando poucas alternativas
para a terapecircutica que incluem colistina (polimixina E) e tigeciclina que apresentam
respectivamente problemas em termos de toxicidade e eficaacutecia (LIVERMORE et
al 2011) Um dos efeitos adversos mais importantes das poliminas B e E por
exemplo satildeo a neurotoxicidade e nefrotoxicidade (MENDES C A C et al2009 )
Devido agrave resistecircncia ser usualmente de natureza plasmidial e portanto de
maior disseminaccedilatildeo especialmente quando carreadas por K pneumoniae
microrganismo com uma notoacuteria capacidade para acumular e transferir plasmiacutedeos
com determinantes para resistecircncia o nuacutemero de casos detectados pelo
fenoacutetipogenoacutetipo blaKPC eacute bastante preocupante (MONTEIRO et al 2009)
Comparada com outras bacteacuterias hospitalares a transmissatildeo de clones
multirresistentes de K pneumoniae eacute maior e podem natildeo ser controladas pelos
meacutetodos de controle de infecccedilatildeo hospitalar (PAAUW et al 2007) A forma
plasmidial para transferecircncia da resistecircncia adicionada a este grande potencial para
disseminaccedilatildeo de clones resistentes eacute preocupante visto que apoacutes surtos muitas
vezes pode se tornar endecircmica Jaacute eacute uma realidade a disseminaccedilatildeo desta bacteacuteria
54
entre pacientes hospitais paiacuteses e ateacute mesmo continentes (WOODFORF et al
2010 ROGERS et al 2011)
As chances de surtos satildeo maiores em paiacuteses com poucos recursos devido agrave
maior carecircncia de praacuteticas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees hospitalares e o
uso irracional de antimicrobianos de forma empiacuterica e inadequada (KUMARASAMY
et al 2010) Ateacute o momento os mecanismos de resistecircncia aos cabapenecircmicos
geralmente encontrado eram a produccedilatildeo de ESBL (CTX-M) somada aacute perda de
porina (CARVALHAES et al 2010) Foi notado a partir do ano de 2008 um
aumento no nuacutemero de K pneumoniae produtoras de KPC-2 apresentando outra
forma de resistecircncia (GALES 2012)
Um estudo mostrou que o perfil do paciente colonizado ou infectado por KPC
foi de um paciente entre os 33 e os 82 anos de idade internado haacute mais de 1
semana no hospital A mortalidade geral nos uacuteltimos anos ficou em torno de 7
sendo que dos 77 pacientes estudados 32 (415) pacientes evoluiacuteram para oacutebito
evidenciando a alta morbi-mortalidade associada (ALVES A P et al 2013)
Em estudo com 2316 pacientes avaliados a populaccedilatildeo de sexo masculino foi
de 526 idade meacutedia global de 53 anos (mediana de 55 anos) permanecircncia meacutedia
de 58 dias (mediana de 3 dias) (OLIVEIRA A C et al 2010) Outros trabalhos
apresentaram ausecircncia de significacircncia entre sexoidade e o desenvolvimento de
infecccedilotildees por microrganismos resistentes (PERES-BOTA D et al 2003 COLPAN
A et al 2005 COELLO R et al 1997)
Outro estudo utilizou um total de 30 amostras sendo elas isoladas de urina
escarro secreccedilatildeo pleural ponta de cateter aspirado traqueal e hemocultura A mais
prevalente foi em urina (40) Entre as 30 cepas analisadas a maior porcentagem
foi da cepa Klebsiella pneumoniae (70) Enterobacter sp (133) Klebsiella
ozaenae (10) Escherichia coli (333) e Klebsiella oxytoca (333)
(DIENSTMANN R et al 2010) Nos Estados Unidos a enzima KPC jaacute se tornou
endecircmica Foi realizada uma pesquisa em dois hospitais de Nova York onde
testaram 602 amostras e 45 apresentaram algum mecanismo de resistecircncia
sendo apenas 33 confirmadas por biologia molecular como KPC-2 (BRATU et
al 2005)
55
Estudo sobre os tipos de ESBL feito no Japatildeo apresentou o tipo Toho-1 como
o mais prevalente nessa pesquisa Ateacute o ano de 2000 ano em que foi publicado tal
estudo este era o primeiro relatoacuterio no Japatildeo para identificar derivados de ESBLs
como tipo de SHV e TEM entre E coli e K pneumoniae Em especial o tipo SHV- 12
foi identificado com uma maior frequumlecircncia Estes resultados indicam que tipos
distintos de ESBLs que satildeo diferentes em sua especificidade de substrato e origem
geneacutetica coexistem no Japatildeo Isto mostra a importacircncia de caracterizar genoacutetipos
distintos de ESBLs e de estar em alerta continuamente para as tendecircncias de
ESBLs no Japatildeo aleacutem da necessidade de uma interpretaccedilatildeo uniforme utilizando as
diretrizes do CSLI para relatar cepas produtoras de ESBL Aleacutem da detecccedilatildeo de
ESBLs satildeo necessaacuterias mais informaccedilotildees tais como o perfil de sensibilidade
especiacutefica para diversas β-lactacircmicos e o local da infecccedilatildeo Esses fatores satildeo
essenciais para a escolha adequada de antibioacuteticos (YAGI T et al 2000)
No ano de 2004 uma pesquisa avaliou a produccedilatildeo de uma enzima de
hidroacutelise de carbapenecircmicos atraveacutes da teacutecnica de sequumlenciamento foi revelado
um novo membro da famiacutelia KPC designado KPC- 3 Pesquisadores encontraram
em um mutante de K pneumoniae uma substituiccedilatildeo de um gene associado com
resistecircncia a Imipenem mas essa substituiccedilatildeo foi considerada improvaacutevel na
contribuiccedilatildeo da resistecircncia aos carbapenecircmicos da espeacutecie estudada Aleacutem da
resistecircncia aos carbapenecircmicos estes isolados eram em sua maioria resistentes agraves
cefalosporinas penicilinas e aminoglicosiacutedeos Usando estudos de transformaccedilatildeo
conjugaccedilatildeo e hibridaccedilatildeo localizaram o alelo blaKPC em plasmiacutedeo aleacutem disso
mostraram que esse alelo tambeacutem carregava uma resistecircncia aos aminoglicosiacutedeos
A transferecircncia das enzimas KPCs foi demonstrada in vitro tanto neste como em
outros estudos pode ser que os plasmiacutedeos que fazem esta transferecircncia estavam
comeccedilando a se espalhar no ambiente cliacutenico resultando na multiresistecircncia dessas
estirpes (WOODFORD et al 2004)
O presente estudo apresentou um vieacutes quanto aos resultados dos testes de
susceptibilidade microbiana Observou-se que natildeo foi encontrado resultado deste
teste em algumas amostras o que natildeo cooperou para um estudo mais preciso
futuros estudos quanto agraves amostras e um melhor acompanhamento deste tipo de
patologia Poreacutem mesmo sem algumas amostras com este resultado disponiacutevel foi
56
confirmada a presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos
carbapenecircmicos por meio dos genes de resistecircncia blaKPC e 16S rRNA que as
amostras apresentaram em sua maioria serem portadoras Quanto aos resultados
estatiacutesticos nenhuma das variaacuteveis apresentou significacircncia estatiacutestica (p gt 005)
mostrando assim que estas variaacuteveis isoladas natildeo foram o fator determinante para
o desfecho cliacutenico de alta ou oacutebito
57
7 CONCLUSAtildeO
Os genes blaKPC e 16S rRNA foram caracterizados confirmando a a
presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos carbapenecircmicos
Houve uma maior prevalecircncia da cepa K pneumoniae e isto confirma outros
estudos que apresentam a maior prevalecircncia desta cepa em amostras com KPC
Aleacutem disso isso justifica a forma popular da K pneumoniae ser chamada de KPC
enquanto que na verdade KPC eacute uma enzima podendo estar presente em outras
cepas como Enterobacter clocae tambeacutem apresentada no presente estudo O
desfecho cliacutenico de oacutebitos maior que 50 eacute um possiacutevel indicador sobre a
necessidade de se realizar um teste raacutepido para identificaccedilatildeo de KPC visando
iniciar o mais raacutepido possiacutevel o tratamento afim de diminuir a mortalidade por esta
infecccedilatildeo
Nenhuma das variaacuteveis isoladamente estaacute relacionada ao desfecho cliacutenico
oacutebito ou alta pois natildeo apresentaram relevacircncia estatiacutestica O presente estudo
mostrou que haacute presenccedila da bacteacuteria nas amostras de pacientes do hospital
estudado podendo entatildeo afirmar que este tipo de bacteacuteria se encontra tambeacutem
presente em ambiente hospitalar O uso irracional de antimicrobiano eacute demonstrado
de forma indireta quando foi apresentado atraveacutes do Teste de Hodge Modificado
uma resistecircncia de 100 aos antibioacuteticos carbapenecircmicos Isto tambeacutem reflete na
terapecircutica sendo que pacientes portadores de bacteacuterias resistentes aos
antibioacuteticos carabepecircmicos tem uma escassa opccedilatildeo de tratamento e as opccedilotildees
apresentam problemas quanto agrave toxicidade e eficaacutecia
58
REFEREcircNCIAS
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Mecanismos
de resistecircncia bacteriana aos antimicrobianos Disponiacutevel em
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controleopas_
webmodulo3mec_sitiohtmgt Acesso em 25 de abril de 2014
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Nota teacutecnica nordm
012013 medidas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees por enterobacteacuterias
multiresistentes Acesso em 17 de abril de 2013
ALBA J et al Kinetics study of KPC-3 a plasmid-encoded class A
carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase Antimicrob Agents Chemother
Nov49(11)4760-2 2005
ALVES A P et al Nosocomial infections by KPC-producing enterobacteria in
a tertiary hospital in Southern Brazil Revista da AMRIGS Porto Alegre 57 (3) 213-
218 jul-set 2013
ALVES A et al Tipagem Geneacutetica de Microrganismos Lab De Diversidade
Microbiana Centro de Biologia Celular Dep de Biologia U de Aveiro 3810-193
Aveiro- 2003
BELL J M et Al Prevalence and significance of a negative extended-
spectrum beta-lactamase (ESBL) confirmation test result after a positive ESBL
screening test result for isolates of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae
results from the SENTRY Asia-Pacific Surveillance Program J Clin Microbiol
May45(5)1478-82 2007
BRATU S et al Detection of KPC carbapenem-hydrolyzing enzymes in
Enterobacter spp from Brooklyn New York Antimicrob Agents Chemother v 49 n
2 p 776-8 2005
59
BRATU S et al Emergence of KPC-possessing Klebsiella pneumoniae in
Brooklyn New York epidemiology and recommendations for detection Antimicrob
Agents Chemother v 49 n 7 p 3018-20 2005
BRATU S et al Rapid spread of carbapenem-resistant Klebsiella
pneumoniae in New York City Arch Intern Med v 165 p 1430-5 2005
CAMARGO C F et al Aplicaccedilatildeo das teacutecnicas de pcr e suas teacutecnicas
derivadas em diagnoacutestico molecular Disponiacutevel em
ltfileDUnB10C2BA20semestreArtigosPCR-
20CLEYTON20FLORENCIO20DE20CAMARGO20E20PAULO20ROB
ERTO20QUEIROZpdfgtgt Acesso em 08 de abril de 2014
CARVALHES C G et al Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting
carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive
results Journal of Antimicrobial Chemotherapy v 65 n2 p 249-251 2010
CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION- CDC Modified
Hodge Test for Carbapenemase Detection in Enterobacteriaceae 2004
CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE Methods for
dilutionantimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically Approved
standard M7ndashA7 7th ed CLSI Wayne PA 2011
COELLO R et al Risk factors for developing clinical infection with methicillin-
resistant Staphylococcus aureus (MRSA) amongst hospital patients initially only
colonized with MRSA J Hosp Infect 19973739-46
COLPAN A et al Evaluation of risk factors for mortality in intensive care
units A prospective study from a referral hospital in Turkey Am J Infect Control
200533(1)42-7
60
CORNAGLIA G et al Living with ESBLs Introduction Clinical Microbiology
and Infection 14 Suppl 1 1-2 2008
COTRIM E R et al Klebsiella pneumoniae carbapenemase ndash KPC em
Enterobacteriaceae o desafio das bacteacuterias multirresistentes Poacutes em revista do
centro universitaacuterio Newton Paiva 12012 - ediccedilatildeo 5 - issn 2176 7785
DESHPANDE L M et al Occurrence and characterization of
carbapenemase-producing Enterobacteacuteriaceae report from the SENTRY
Antimicrobial Surveillance Program (2000-2004) Microb Drug Resist 12(4)223-30
2006
DIAS D J A Estudos dos principais mecanismos de resistecircncia aos
antibioacuteticos β-lactacircmicos em bacteacuterias patogecircnicas gram negativas 2009 100 f
Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Geneacutetica Molecular e Biomedicina) ndash Faculdade de
Ciecircncias e Tecnologia Universidade de Nova Lisboa Lisboa
DIENSTMANN R et al Avaliaccedilatildeo fenotiacutepica da enzima Klebsiella
pneumoniae carbapenemase (KPC) em Enterobacteriaceae de ambiente hospitalar
J Bras Patol Med Lab v 46 n 1 p 23-27 fevereiro 2010
ENDIMIAMI A et al Emergence of blaKPC-containing Klebsiella
pneumoniae in a long-term acute care hospital a new challenge to our healthcare J
Antimicrob Chemother 64 1102-1110 Nov 2009
FALAGAS M E et al Extended-spectrum beta-lactamase producing
organisms The Journal of Hospital Infection 73 (4) pp 345-54 2009
FONTANA C et al Emergence of KPC-producing Klebsiella pneumoniae in
Italy BMC Rev Notes 3 40 2010
61
GALES A C et al Antimicrobial resistance among Gram-negative bacilli
isolated from Latin America results from Sentry Antimicrobial Surveillance Program
(Latin America 2008-2010) Diagnostic Microbiology and Infectious Disease v 3 n
4 p 354 -360 2012
GUPTA N et al Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Epidemiology
and Prevention HEALTHCARE EPIDEMIOLOGY Clinical Infectious Diseases
201153(1)60ndash67 Published by Oxford University Press on behalf of the Infectious
Diseases Society of America 2011
HARBOTTLE H et al Genetics of antimicrobial resistance Anim Biotechnol
n17 p111-124 2006
HENRIQUE W N et al RESISTEcircNCIA BACTERIANA Uniatildeo das
Faculdades Alfredo NasserInstituto de Ciecircncias da Sauacutede Disponiacutevel em lt
httpwwwfaculdadealfredonasseredubrfilespesquisaposter20HENRIQUE20
Wilker20Natividade20SANTIAGO20Silvania20CAVALCANTI20DSP
20ResistC3AAncia20Bacterianapdfgt Acesso em 17 marccedilo 2014
HULSCHER M E J I et al Antibiotic prescribing in hospital a social and
behavioral scientific approach The Lancet Infectious Diaseases v 10 n 3 p 167-
165 2010
KIDWAI M SAPRA P BHUSHAN KR Synthetic strategies and medicinal
properties of beta-lactams Curr Med Chem 1999 695-215
KUMARASAMY K K et al Emergence of a new antibiotic resistance
mechanism in India Pakistan and the UK a molecular biological and
epidemiological stuy The Lancet Infectious Diseases v10 n 9 p 597- 602 2010
LINCOPAN N et al Enterobacteacuteria producing extended-spectrum β-
lacatamases and IMP-1 Metalo-β-lactamases isolated from Brazilian hospitals J Med
62
Microbiol 7 1-3 2006
LINCOPAN N et al First Isolation of Metalo-β-Lacatamase-Producing
Multiresistant Klebsiella pneumoniae from a patient in Brazil J Clin Microbiol 43(1)
516-519 2005
LIVERMORE D M et al What remains against carbapenem- resistant
Enterobacteriaceae Evaluation of choramphenicol ciprofloxacin colistina
fosfomycin minocycline nitrofurantoin temocilin and tigecycline International
Journal of Antimicrobial Agents v 37 n 5 p 415- 459 2011
LIVERMORE D M Fourten years in resistance International Journal of
Antimicrobial Agents v 39 283- 294 2012
LIVERMORE D M Bacterial resistance to carbapenems Adv Exp Med Biol
1995 39025-47
LIVERMORE D M Bacterial resistance origins epidemiology and impact
Clin Infect Dis 36S11-S23 2003
LIVERMORE D M et al Carbapenemases a problem in waiting Curr
Opin Microbiol 2000 3489-95
LU et al Universal pcr for common bacterial pathogens J CLIN
MICROBIOL VOL 38 2000
LU et al Use of PCR with Universal Primers and Restriction Endonuclease
Digestions for Detection and Identification of Common Bacterial Pathogens in
Cerebrospinal Fluid Journal of Clinical Microbiology June 2000 p 2076ndash2080
MARSCHALL J Met al Presence of the KPC Carbapenemase Gene in
Enterobacteriaceae Causing Bacteremia and Its Correlation with In Vitro
Carbapenem Susceptibility J Clin Microbiol 47 239-241 Jan 2009
63
MARTINS WMBS et al Prevalecircncia do gene blaKPC em isolados cliacutenicos
de Enterobacteriaceae e natildeo fermentadores encontrados em amostras clinicas em
um hospital universitaacuterio do Recife X Jornada de ensino pesquisa e extensatildeo ndash
JEPEX 2010 ndash UFRPE Recife 18 a 22 de outubro
MENDES C A C et al Polimixinas Revisatildeo com ecircnfase na sua
nefrotoxicidade Rev Assoc Med Bras 2009 55(6) 752-9
MOHR J F 3rd Update on the efficacy and tolerability of meropenem in the
treatment of serious bacteacuterial infections Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S41-51
2008
MONTEIRO J et al First report of KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae
strains in Brazil Antimicrob Agents Chemother Jan53(1)333-4 2009
MOREIRA V C et al Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia a antibioacuteticos
Disponiacutevel em
lthttpwwwcpglsucgbr6mostraartigosSAUDEVANESSA20CARVALHO20M
OREIRApdfgt Acesso em 21 marccedilo 2014
NETIKUL T et al Emergence of novel blaKPC-12 and blaKPC-13 variants in
carbapenem non-susceptible Enterobacter cloacae a first report of blaKPC gene in
Thailand European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases May
S372 2011
NETO V A et al Antibioacuteticos na praacutetica Meacutedica 6ordf Ediccedilatildeo Editorial
SarverSP Brasil 2007
NICOLAU D P Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of
meropenem Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S32-40 2008
64
OLIVEIRA A C et al Resistecircncia bacteriana e mortalidade em um centro de
terapia intensiva Rev Latino-Am Enfermagem nov-dez 2010
PAAUW A et al Failure to control an outbreak of qnrA 1-positive multidrug-
resistant Enterobacter clocae despite adequate implementation of recommended
infection control measures Journal of Clinical Microbiology v 45 n 5 p 1420-1425
2007
PATERSON D L et al Extended-Spectrum Beta-Lactamases a Clinical
Update Clinical Microbiology Reviews v 18 p 657-686 2005
PEIRANO G et al Carbapenem-hydrolysing beta-lactamase KPC-2 in
Klebsiella pneumonia isolated in Rio de Janeiro Brazil J Antimicrob Chemother Nov
20 2009
PERES-BOTA D et al Are infections due to resistant pathogens associated
with worse outcome in critically ill patients J Infect 200347(4)307-16
PIDDOCK L J V Clinically relevant chromosomally encoded multidrug
resistance effl ux pumps in bacterial Clin Microbiol Rev n19 p382-402 2006
PITOUT J D D et al Emergence of Enterobacteriaceae producing
extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) in the community J Antimicrob
Chemother May 56 2005
POSSEBON M I et al Resistecircncia bacteriana aos carbapenecircmicos
Bacterial resitence to carbapenems RBM rev bras med60(6)378380-378-382
jun 2003
QUEENAN A M et al Carbapenemases the versatile beta-lactamases
Clin Microbiol Rev Jul20(3)440-58 2007
65
RHOMBERG P R et al Summary trends for the meropenem yearly
susceptibility test information collection program a 10- year experience in the United
States (1999-2008) Diagnostic Microbiology and Infectiois Disease v 65 n4 p
414-426 2009
ROBLEDO I E et al Detection of KPC in Acinetobacter spp in Puerto Rico
J Antimicrob Agents Chemother 54 1354-1357 Mar 2010
ROGERS B A et al Country-to-country transfer os patients and the risk of
multi-resistant bacterial infection Clinical Infectious Disease v53 n1 p49- 56
2011
SHAH A A et al Characteristics epidemiology and clinicalimportance of
emerging strains of Gram-negative bacilli producing extended-spectrum
betalactamases Research in Microbiology v 155 p 409-421 2004
TURNER P J Extended- Spectrum Beta-Lactamases Clinical Infectious
Diseases v 41 p 273-275 2005
WOLTER D J et al Phenotypic and Enzymatic Comparative Analysis
between the Novel KPC variant KPC-5 and Its Evolutionary Variants KPC-2 and
KPC-4 Antimicrob Agents Chemother Nov 17 2008
WOODFORD N et al Carbapenemases of Chryseobacterium
(Flavobacterium) meningosepticum distribution of blaB and characterization of a
novel Metalo-beta-lactamase gene blaB3 in the type strain NCTC 10016
Antimicrob Agents Chemother Jun44(6)1448-52 2000
WOODFORF N Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in
India Pakistan and the UK a molecular biological and epidemiological study The
Lancet Infectious Diseases v 10 n 9 p 597-602 2010
66
WOODFORD et al Outbreak of Klebsiella pneumoniae Producing a New
Carbapenem- Hydrolyzing Class A β-Lactamase KPC-3 in a New York Medical
Center Antimicrobial agents and chemotherapy Dec 2004 p 4793ndash4799 Vol 48
No 12
YAGI T et al A preliminary survey of extended-spectrum β-lactamases
(ESBLs) in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Japan
FEMS Microbiology Letters 184 (2000) 53-56
YIGIT H et al Novel carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase KPC-1 from
a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumonia J Antimicrob Agents
Chemother 45 (4) 1151-1161 (2001)
ZAVASCKI A P et al KPC-2- producing Enterobacter cloacae in two cities
from Southern Brazil Int J Antimicrob Agents Apr 28 2009
ZHANEL G G et al Comparative review of the carbapenecircmicos Drugs
67(7)1027-52 2007
67
ANEXOS
Sequumlecircncia do oligo blaKPC
Query 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
Query 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
Query 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
68
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
Query 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
Query 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
69
Query 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
Query 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
Query 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
70
Sbjct 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
Query 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
Query 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
Query 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
71
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
Query 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
Query 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
72
Query 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
Query 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
Query 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
73
Sbjct 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
Query 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
Query 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
Query 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
74
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
Query 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
Query 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
75
Query 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Sbjct 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
Query 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
||||
Sbjct 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
LOCUS AF297554 1377 bp
DNA linear BCT 26-MAR-2001
DEFINITION Klebsiella pneumoniae carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
gene complete cds
ACCESSION AF297554
VERSION AF2975541 GI10121874
76
KEYWORDS
SOURCE Klebsiella pneumoniae
ORGANISM Klebsiella pneumoniae
Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Enterobacteriaceae Klebsiella
REFERENCE 1 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH QueenanAM
AndersonGJ Domenech-SanchezA
BiddleJW StewardCD
AlbertiS BushK and TenoverFC
TITLE Novel carbapenem-hydrolyzing beta-
lactamase KPC-1 from a
carbapenem-resistant strain of
Klebsiella pneumoniae
JOURNAL Antimicrob Agents Chemother 45 (4)
1151-1161 (2001)
PUBMED 11257029
REFERENCE 2 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH AndersonGJ and
TenoverFC
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (19-AUG-2000) Nosocomial
Pathogens Laboratory Branch
Centers for Disease Control and
Prevention 1600 Clifton Rd MS
G08 Atlanta GA 30333 USA
FEATURES LocationQualifiers
77
source 11377
organism=Klebsiella
pneumoniae
mol_type=genomic DNA
db_xref=taxon573
-35_signal 5560
-10_signal 7883
mRNA 921012
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
RBS 117122
CDS 1311012
note=blaKPC-1
codon_start=1
transl_table=11
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
protein_id=AAG134101
db_xref=GI10121875
translation=MSLYRRLVLLSCLSWPLAGFSATALTNLVAEPFAKLEQD
FGGSI
GVYAMDTGSGATVSYRAEERFPLCSSFKGFLAAAVLARSQQQAGLLDTPIRYG
KNALV
PWSPISEKYLTTGMTVAELSAAAVQYSDNAAANLLLKELGGPAGLTAFMRSIG
DTTFR
78
LDRWELELNSAIPSDARDTSSPRAVTESLQKLTLGSALAAPQRQQFVDWLKGN
TTGNH
RIRAAVPADWAVGDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTRAPNKDDK
HSEAV
IAAAARLALEGLGVNGQ
ORIGIN
1 cggggcagtt acagccgtta cagcctctgg
agagggagcg gcttgccgct cggtgataat
61 cccagctgta gcggcctgat tacatccggc
cgctacacct agctccacct tcaaacaagg
121 aatatcgttg atgtcactgt atcgccgtct
agttctgctg tcttgtctct catggccgct
181 ggctggcttt tctgccaccg cgctgaccaa
cctcgtcgcg gaaccattcg ctaaactcga
241 acaggacttt ggcggctcca tcggtgtgta
cgcgatggat accggctcag gcgcaactgt
301 aagttaccgc gctgaggagc gcttcccact
gtgcagctca ttcaagggct ttcttgctgc
361 cgctgtgctg gctcgcagcc agcagcaggc
cggcttgctg gacacaccca tccgttacgg
421 caaaaatgcg ctggttccgt ggtcacccat
ctcggaaaaa tatctgacaa caggcatgac
481 ggtggcggag ctgtccgcgg ccgccgtgca
atacagtgat aacgccgccg ccaatttgtt
541 gctgaaggag ttgggcggcc cggccgggct
gacggccttc atgcgctcta tcggcgatac
79
601 cacgttccgt ctggaccgct gggagctgga
gctgaactcc gccatcccaa gcgatgcgcg
661 cgatacctca tcgccgcgcg ccgtgacgga
aagcttacaa aaactgacac tgggctctgc
721 actggctgcg ccgcagcggc agcagtttgt
tgattggcta aagggaaaca cgaccggcaa
781 ccaccgcatc cgcgcggcgg tgccggcaga
ctgggcagtc ggagacaaaa ccggaacctg
841 cggagtgtat ggcacggcaa atgactatgc
cgtcgtctgg cccactgggc gcgcacctat
901 tgtgttggcc gtctacaccc gggcgcctaa
caaggatgac aagcacagcg aggccgtcat
961 cgccgctgcg gctagactcg cgctcgaggg
attgggcgtc aacgggcagt aaggctctga
1021 aaatcatcta ttggcccacc accgccgccc
ttgcgggcgg catggattac caaccactgt
1081 cacatttagg ctaggagtct gcgcggcaga
gccgtgtgac cggttttctg tagagcactg
1141 acgatggcgg cggcgctctc tgcaattggc
aaggcgtcgg cgccaaggat accaatcttg
1201 cggcgcgcgg cgtgttatga cgactggggt
gcatttgagc cgccccattt aaccttcgcc
1261 ctcacagata cgccattcgc ctcaaattta
gcgccatgca gacgagcttc cactcggctt
1321 gcaccttgtc caggcccctc atgctgaact
gacgcaatcc catcaccgcc ttgatca
80
29
(dNTPrsquos) do DNA e uma DNA polimerase termoestaacutevel podendo assim obter-se a
partir de uma fita molde muitas coacutepias de uma sequumlecircncia especiacutefica de aacutecido
nucleacuteico O princiacutepio da PCR consiste na variaccedilatildeo de temperatura por ciclo
envolvendo trecircs etapas baacutesicas desnaturaccedilatildeo pareamento e amplificaccedilatildeo
(CAMARGO et al 2014)
A desnaturaccedilatildeo da fita molde de DNA eacute uma etapa com duraccedilatildeo entre 30
segundos a 1 minuto a temperatura entre 92 ordmC a 96 ordmC Apoacutes isso o pareamento de
dois iniciadores sinteacuteticos de composiccedilotildees distintas que funcionam como os
iniciadores da reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo liga-se agrave regiatildeo complementar da fita de
DNA alvo que sofreraacute a duplicaccedilatildeo Esta etapa tem duraccedilatildeo de 30 segundos a 1
minuto a temperatura entre 58 ordmC e 65 ordmC Por uacuteltimo a amplificaccedilatildeo por meio da
enzima Taq DNA polimerase das novas fitas de DNA se daacute a partir de cada um dos
iniciadores utilizando os quatro dNTPrsquos como substrato da reaccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo
Esta etapa possui duraccedilatildeo entre 45 segundos e 1 minuto a 72 ordmC Cada ciclo eacute
repetido em torno de 30 a 35 vezes e promove a amplificaccedilatildeo da regiatildeo alvo
determinada conforme o anelamento dos iniciadores sinteacuteticos de DNA (CAMARGO
et al 2014) Estas etapas estatildeo demonstradas na figura 4
Figura 4 Etapas da Reaccedilatildeo de PCR
30
2 JUSTIFICATIVA
No ano de 2010 no Distrito Federal foram identificados 111 pacientes com
suspeita de infecccedilatildeo por Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) e a
Secretaria de Sauacutede do Distrito Federal confirmaram ainda a morte de 18 pacientes
dentre os hospitais puacuteblicos e particulares Um desafio encontrado por ocasiatildeo do
surto infeccioso no Distrito Federal foi o de confirmar as KPCs por Reaccedilatildeo da
Polimerase em Cadeia sendo que as amostras foram enviadas com esta finalidade
para a Fiocruz no Rio de Janeiro
Pesquisas que possam contribuir na elaboraccedilatildeo de estrateacutegias preventivas e
de intervenccedilatildeo para infecccedilotildees causadas por enterobacteacuterias bem como contribuir
para gerar uma integraccedilatildeo beneacutefica entre a equipe acadecircmica e os serviccedilos de
sauacutede devem ser estimuladas Neste sentido o presente estudo permitiu escrutinar
os genes envolvidos na expressatildeo de carbapenemases presentes em espeacutecies de
enterobacteacuterias isoladas em ambiente hospitalar visto que elucidar genes de
resistecircncia de enterobacteacuterias aos antibioacuteticos carbapenecircmicos eacute o primeiro passo
para garantir um controle epidemioloacutegico efetivo para estes tipos de microorganismo
assim como sua associaccedilatildeo com surtos fatais particularmente em pacientes com
baixa imunidade
31
3 OBJETIVOS
31 Objetivo geral Caracterizar os genes de resistecircncia das
Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases e os aspectos epidemioloacutegicos de
pacientes internados em um hospital puacuteblico do Distrito Federal
32 Objetivos Especiacuteficos
Identificar genotipicamente a enzima KPC (Klebsiella pneumoniae
carbapenemase) de isolados de Klebsiella pneumoniae
Investigar aspectos epidemioloacutegicos dos pacientes portadores de
Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases
Identificar quais variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana influenciaram para o
desfecho oacutebito ou alta
Avaliar a susceptibilidade das Enterobacteacuterias aos antibioacuteticos
carbapenecircmicos dos pacientes em ambiente hospitalar
32
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
Trata-se de um estudo transversal onde foi realizado o teste de
susceptibilidade das enterobacteacuterias aos antibioacuteticos carbapenecircmicos a partir dos
materiais bioloacutegicos coletados dos pacientes internados no Hospital Regional da Asa
Norte (HRAN) e enviados ao Laboratoacuterio de Anaacutelises Cliacutenicas da mesma Instituiccedilatildeo
Os materiais bioloacutegicos investigados foram sangue aspirado traqueal ou brocircnquico
urina e cultura semi quantitativa de ponta de cateter venoso central O HRAN eacute um
hospital puacuteblico do Distrito Federal com 395 leitos sendo as cliacutenicas de internaccedilatildeo
Berccedilaacuterio Cirurgia Geral Cirurgia Plaacutestica Cliacutenica Meacutedica Ginecologia Maternidade
Pediatria Queimados UTI com atendimento a pacientes portadores de doenccedilas de
caraacuteter cliacutenico e ciruacutergico
4 1 Coleta e transporte das amostras bioloacutegicas
As amostras foram coletadas de pacientes internados no Hospital Regional da
Asa Norte (HRAN) com suspeitas de infecccedilatildeo por KPC A identificaccedilatildeo primaacuteria foi
realizada pelo Laboratoacuterio de Microbiologia do hospital de origem dos pacientes e os
demais procedimentos que foram utilizados na identificaccedilatildeo encontram-se descritos
abaixo
4 2 Procedimentos para confirmaccedilatildeo de resistecircncia bacteriana por
disco de ertapenem (adaptado CDC 2004)
Para diagnosticar amostra como portadora de bacteacuteria produtora de
carbapenemase foi realizado o teste com disco de ertapenem como forma de
triagem Inicialmente utilizou-se o swab contaminado com a amostra que foi
distribuiacuteda em uma pequena aacuterea da placa de aacutegar MacConkey para apoacutes o
crescimento ser realizada a pesquisa de colonizaccedilatildeo por enterobacteacuterias resistentes
aos carbapenecircmicos (Pesquisa de CRE) Procedeu-se a semeadura por teacutecnica
semi-quantitativaesgotamento com alccedila bacterioloacutegica na diluiccedilatildeo de 1100 O disco
de Ertapenem foi colocado na superfiacutecie da placa de MacConkey na junccedilatildeo dos dois
primeiros campos de semeadura conforme demonstrado na figura 5 Incubou a placa
33
em estufa aeroacutebia a 35ordmC por 24 e 48 horas e observou-se o halo de difusatildeo do
disco de Ertapenem na placa para proceder agrave leitura
O teste deixou de ser obrigatoacuterio apoacutes a modificaccedilatildeo dos criteacuterios
interpretativos para carbapenecircmicos para enterobacteacuterias publicados no suplemento
do CLSI 2010 M100-S20-U
Figura 5 Mecanismo de semeamento de material bioloacutegico oriundos de
pacientes com suspeita de infecccedilatildeo por KPC Fonte adaptado CDC 2004
4 2 1 Interpretaccedilatildeo dos resultados
Na ausecircncia de crescimento ateacute 24 horas (MacConkey) ou halo de difusatildeo
gt27 mm na placa deve-se reincubar as placas por mais 24 horas Quando for
ausente o crescimento apoacutes 48 horas ou halo de difusatildeo gt27 mm na placa libera-se
como enterobacteacuterias resistentes a carbapenecircmicos (KPCNEG)Havendo
crescimento de colocircnias na placa de MacConkey com halo lt 27 mm (apenas para
colocircnias com crescimento dentro do halo) deve-se reisolar e realizar identificaccedilatildeo e
antibiograma automatizado teste de sensibilidade por disco-difusatildeo e Teste de
Hodge Modificado (THM) Os isolados de enterobacteacuterias cujos testes comprovarem
a resistecircncia aos carbapanecircmicos testados (KPCPOS) foram reportado a Comissatildeo
de Controle de Infecccedilatildeo Hospitalar (CCIH) Jaacute osbacilos Gram-negativos natildeo
fermentadores natildeo foram reportados (KPCNEG) Para interpretaccedilatildeodos resultados
foram utilizados os valores conforme demonstrados na tabela 1
Tabela 1 Criteacuterios Interpretativos para testes de sensibilidade
ENTEROBACTEacuteRIAS
Disco difusatildeo (mm) MIC (microgml)
34
Antibioacutetico Sigla S I R S I R
Ertapenem 10
microg
ETP 22 19-
21
18 05 1 2
Meropenem 10
microg
MEM 23 20-
22
19 1 2 4
Fonte Manual Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)
2013
Os resultados que apresentaram resistecircncia ao antibioacutetico Ertapenem foram
considerados como suspeitos de contaminaccedilatildeo por KPC Fez-se o teste de
susceptibilidade aos antibioacuteticos (TSA) em aparelho automatizado MicroScan Walk
Away 96sl Dade Behring
4 3 Teste de susceptibilidade aos antibioacuteticos (adaptado CDC 2004)
A determinaccedilatildeo da susceptibilidade dos isolados foi feita pelo teste de
susceptibilidade aos antibioacuteticos (TSA) apoacutes cultura em meio de gelose simples
(INSA) para avaliaccedilatildeo da sua pureza e obtenccedilatildeo de colocircnias isoladas Para
preparaccedilatildeo de uma suspensatildeo bacteriana com turvaccedilatildeo aproximada de 05
McFarland (Dade BehringMicroScanregTurbidity Meter) ressuspendeu duas a cinco
colocircnias em 2ml de soro fisioloacutegico esteacuteril diluindo a 1100 em soro fisioloacutegico num
volume total de 10ml em seguida foi feita uma semeadura em duas placas
quadradas (120mm x 120mm) de Muller-Hinton Agar (INSA) por inundaccedilatildeo
Os discos de antibioacutetico carbapenecircmicos imipenem meropenem e
ertapenem (Biorad) foram aplicados com o auxiacutelio de um dispensador automaacutetico A
susceptibilidade das Enterobacteacuterias aos carbapenecircmicos foi definida de acordo
com o protocolo Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI 2011)
Para aquelas Enterobacteacuterias que apresentaram resistecircncia ao ertapenem
foram realizados o Teste de Hodge Modificado para Detecccedilatildeo de Enterobacteacuterias
Produtoras de Carbapenemases conforme descrito pelo Centers for Disease Control
and Prevention (CDC 2004)
35
4 4Teste de Hodge Modificado (THM) (adaptado CDC 2004)
Preparou-se uma suspensatildeo em salina esteacuteril com a cepa Escherichia coli
ATCC 25922 (padratildeo 05 de McFarland) Apoacutes isto diluiu a suspensatildeo 110 em
salina (05 ml da soluccedilatildeo de Ecoli ATCC 25922 + 45 ml salina)Foi entatildeo semeado
na superfiacutecie de uma placa de Agar Muller-Hinton com a suspensatildeo diluiacuteda de Ecoli
ATCC 25922 com auxilio de swab seco assegurando que houvesse uma
distribuiccedilatildeo uniforme cobrindo toda a superfiacutecie do Agar Deixou secar por 3 a 5
minutos em temperatura ambienteColocou-se o disco de ertapenem 10microg no centro
da placa e apoacutes isto fez-se uma estria linear da cepa a ser testada da borda do
disco ateacute a borda da placa utilizando uma alccedila calibrada 10 microl ou um swab Incubou
a placa na estufa em atmosfera aeroacutebia a 35 plusmn 2ordmC por 16 a 24 horas
441 Controle de qualidade (CQ)
Foi utilizado um CQ todos os dias em que se realizou o teste tendo como
controle Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1705- teste de Hodge modificado
positivo Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1706- teste de Hodge modificado
negativo
442 InterpretaccedilatildeoResultados
Apoacutes 16ndash24 horas de incubaccedilatildeo examinar as placas para verificar a presenccedila
de uma distorccedilatildeo no halo de inibiccedilatildeo do disco de ertapenem devido ao crescimento
realccedilado da cepa ATCC na intersecccedilatildeo do organismo teste e a Ecoli ATCC 25922
dentro dos limites do halo O THM positivo apresentaraacute presenccedila de distorccedilatildeo no
halo de inibiccedilatildeo de ertapenem devido ao crescimento da cepa Ecoli ATCC 25922 ao
longo da estria da cepa teste para dentro dos limites do halo de inibiccedilatildeo Jaacute o THM
negativo teraacute ausecircncia de crescimento da cepa Ecoli ATCC 5922 ao longo da estria
da cepa teste para dentro dos limites do halo de inibiccedilatildeo do disco de ertapenem
Este resultado estaacute representado na figura 6
36
Figura 6 Interpretaccedilatildeo resultado do Teste de Hodge Modificado
(adaptado CDC 2004) Teste positivo na estria da cepa teste na parte superior
da placa teste negativo na estria da cepa teste na parte inferior da placa
Tendo positivo como resultado o paciente era um provaacutevel contaminado por
KPC As amostras entatildeo foram encaminhadas para a Fundaccedilatildeo Osvaldo Cruz
(FIOCRUZ) para confirmaccedilatildeo final As amostras finalmente confirmadas como
positivas para KPC foram isoladas e guardadas no banco de cepas cliacutenicas do
hospital Apoacutes a autorizaccedilatildeo do CEP amostras das cepas foram transferidas para
meio de transporte Stuard em caixa teacutermica fechada em baixa temperatura e
levadas para o laboratoacuterio de microbiologia cliacutenica da universidade
No laboratoacuterio da universidade as amostras foram separadas e realizadas
repiques em meios MacConkey e incubadas por 24h As colocircnias caracteriacutesticas
foratildeo isoladas em caldo BHI e mantidas em shaker a 37oC por 2h Apoacutes isto foram
executadas as anaacutelises a seguir
Os isolados de Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases foram
submetidos agrave extraccedilatildeo de DNA e posterior sequumlenciamento para identificaccedilatildeo dos
genes de resistecircncia blaKPC de 1 a 13 e identificaccedilatildeo do gene universal Os
pacientes de onde os materiais bioloacutegicos contendo as Enterobacteacuterias produtoras
de carbapenemases foram os isolados foram investigados quanto aos aspectos
epidemioloacutegicos e cliacutenicos
37
4 5 Extraccedilatildeo de DNA bacteriano
A extraccedilatildeo de DNA bacteriano foi realizada utilizando o kit NucleoSpin
Plasmidreg (MN) Antes de iniciar a extraccedilatildeo foi feito a preparaccedilatildeo das soluccedilotildees
reagentes materiais e amostras (vortexando) colocou-se em banho-maria agrave 50ordmC o
tampatildeo AW Partiu-se de colocircnias isoladas cultivadas que sofreram passagem em
meio LB liacutequido por 12h Adicionou-se 15 mL da amostra no tubo eppendorf
centrifugou por 5 minutos descartou o sobrenadante (com cuidado para natildeo
descartar o Pellet) Repetiu-se este procedimento por mais trecircs vezes completando-
se o volume de 6mL Foram adicionados 250microL do tampatildeo Resuspension Buffer A1
encostando a ponteira no Pellet e misturando (este tampatildeo tem como funccedilatildeo
separar a formaccedilatildeo de grumos celulares) Apoacutes isso homogeneizou e vortexou os
tubos eppendorfs Apoacutes isso foram adicionados 250microL do tampatildeo Lysis Buffer A2
homogenizou e deixou descansar por 5 minutos (esta etapa eacute importante para a lise
da parede e da membrana celulares e liberaccedilatildeo do conteuacutedo da ceacutelula)
Passado o tempo de descanso foi adicionado 300microL do tampatildeo
Neutralization Buffer A3 homogeneizou e centrifugou por 10 minutos (este tampatildeo
iraacute retirar as proteiacutenas que envolvem o DNA e voltaraacute com o pH para proacuteximo de 8
impedindo que a soluccedilatildeo de lise facilite a quebra das ligaccedilotildees covalentes do aacutecido
nucleacuteico) Em seguida enumeraram-se os tubos contendo filtros com siacutelica
transferiu-se o sobrenadante para o filtro e centrifugou por 5 minutos Descartou-se
o que foi filtrado adicionou 500microL do tampatildeo AW (banho-maria) centrifugou por 2
minutos Novamente foi descartado o filtrado Adicionou-se 600microL do tampatildeo A4
centrifugou por 2 minutos e descartou o filtrado (os tampotildees AW e A4 contecircm
isotiocianato de guanidina em concentraccedilotildees crescentes para facilitar a adsorccedilatildeo
do DNA na siacutelica e retirada das outras biomoleacuteculas da amostra) Foi feita outra
centrifugaccedilatildeo com o tubo vazio Apoacutes isto o filtro foi trocado para outro eppendorf
definitivo onde foi adicionado 50microL do tampatildeo Elution Buffer AE (este tampatildeo
favorece a eluiccedilatildeo do DNA) centrifugou por 2 minutos descartou o filtro e
armazenou as amostras em freezer -20ordmC
38
4 6 Iniciadores e reaccedilatildeo de PCR
Os iniciadores universais para o gene blaKPC foram desenhados baseados
em sequumlecircncias conservadas apresentadas pelos sub-grupos de genes que
codificam a enzima carbapenemase de klebsiella pneumoniae (YIGIT et al 2001)
Baseado na sequumlecircncia para o blakpc-1 depositada no GenBank
(AF2975541) o oligonucleotiacutedio (oligo) iniciador direto (5-
ATGTCACTGTATCGCCGTC-3rsquo) foi desenhado para reconhecer a sequumlecircncia
blaKPC na posiccedilatildeo (131149) enquanto que o iniciador reverso (5-
TTACTGCCCGTTGACGCC-3rsquo) foi reconhecido na posiccedilatildeo (9951012) As anaacutelises
baseadas em alinhamento de sequumlecircncias mostraram que o par de iniciadores
blaKPC podem detectar os alelos de 1 a 13 do gene blaKPC conforme a tabela 2
Tabela 2 Nuacutemero de acesso ao GenBank dos alelos blaKPC e seus
microrganismos originais
Nuacutemero de
Acesso GenBank
Microrganismo Alvo
AF2975541 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-1
GU0862251 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-2
HQ2589341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-2-like
AB5577341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC -3
EU4473041 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-4
EU4002222 Pseudomonas
aeruginosa
blaKPC-5
EU5555341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-6
EU7297271 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-7
39
FJ2344121 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-8
FJ624872 Escherichia coli blaKPC-9
GQ1403481 Acinetobacter
baumannii
blaKPC-10
HM0669951 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-11
HQ3428891 Enterobacter cloacae blaKPC-12
HQ3428901 Enterobacter cloacae blaKPC-13
As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo de blaKPC foram realizadas em um
primeiro tempo de desnaturaccedilatildeo em que foi 94ordmC por 5 minutos seguido de 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 58 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 90 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 78ordmC por 8 minutos Aleacutem das amostras foi utilizado um
controle negativo
A PCR do blaKPC foi realizada utilizando os componentes para o volume da
reaccedilatildeo de 25 microL citados na tabela 3 A banda do tamanho do produto de PCR foi de
881 pares de bases (pb) o que corresponde ao plasmiacutedeo
Tabela 3 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do
gene blaKPC
Reagente Volume
DNA molde 4 microL
Tampatildeo Taq 25 microL
MgCl2 075 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP
2 microL
Oligo F 1 microL
Oligo R 1 microL
Taq DNA polimerase 05 microL
Aacutegua MiliQ 1335 microL
40
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
Baseado na sequumlecircncia para o gene 16S rRNA em que o oligonucleotiacutedio
Universal iniciador direto foward (5-CCAGCAGCCGCCGTAATACG-3rsquo) foi
desenhado para reconhecer a sequumlecircncia universal na posiccedilatildeo 1513 enquanto que o
iniciador reverso (5-ATCGGYTACCTTGTTACGACTTC-3rsquo) foi reconhecido na
posiccedilatildeo 1491 foram realizadas PCRrsquos As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo deste
gene foram realizadas nos seguinte tempos separaccedilatildeo 94ordmC por 10 minutos 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 55 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 120 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 72ordmC por 10 minutos
A PCR do gene 16S rRNA foi realizada utilizando os componentes para o
volume da reaccedilatildeo de 25microL citados na tabela 4 A banda do tamanho do produto de
PCR foi de 996 pb correspondente aacute regiatildeo ribossomal capaz de amplificar todas
as espeacutecies
Tabela 4Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do gene
universal
Reagente (quantidade
concentraccedilatildeo do estoque)
Volume
DNA molde 10 ng 4 microL
Tampatildeo Taq 10 x 25 microL
MgCl2 50mM 125 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP 25 mM
125 microL
Oligo F 10microM 05 microL
Oligo R 10microM 05 microL
Taq DNA polimerase 5UmicroL 04 microL
Aacutegua Miliq 146 microL
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
41
O termociclador utilizado para os experimentos foi o LifeTouch da BIOER
4 7 Digestatildeo
Para realizaccedilatildeo da digestatildeo foi utilizada a enzima BshF I (Hae III) EN- 1105
tamanho 7000 units concentraccedilatildeo 10 unitsmicroL fonte Bacillus sphaericus empresa
Jena bioscienceUtilizaram-se os componentes para o volume de 50microL da reaccedilatildeo
citados na tabela 5
Tabela 5 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da digestatildeo do gene
universal
Reagente Volume
Produto de PCR 10 microL
Enzima BshF I 01 microL
Tampatildeo (10x) 5 microL
Aacutegua Miliq 349 microL
Total (em cada ependorff) 50 microL
Valores para 1 digestatildeo
Os ependorffs foram colocados por 30 minutos em banho-maria a 37ordmC Apoacutes
isso fez-se a corrida das amostras em gel de agarose para verificaccedilatildeo do resultado
(LU et al 2000)
4 8 Eletroforese em gel de agarose
Os produtos de DNA PCR e digestatildeo foram analisados em gel de agarose
2 O tempo de corrida do gel eacute de aproximadamente 1hora e 30minutos sendo
que no comeccedilo foi usada agrave voltagem de 50 V e apoacutes comeccedilar a correr o gel
aumentou a voltagem para 100 v Utilizou-se o marcador de 100pb (pares de bases)
Foi adicionado 3microL de corante Bromophenol (que tem a funccedilatildeo de fazer uma ligaccedilatildeo
na amostra de DNA e permitir a visualizaccedilatildeo da corrida no gel de agarose) em 7microL
de amostra tanto de DNA quanto de PCR Para o preparo do gel foi utilizado TBE
42
(Tris- Aacutecido Boacuterico) agarose e brometo de etiacutedio (sua funccedilatildeo eacute de corante para o gel
e permitir a visualizaccedilatildeo do DNA quando colocado agrave luz ultravioleta) Para o oligo
blaKPC a banda da amplificaccedilatildeo foi em 881ppb correspondendo ao plasmiacutedeo Jaacute
o oligo Universal foi em 996 pb
4 9 Descarte de resiacuteduos
Todos os materiais utilizados nos ensaios foram de uso uacutenico e manipulados
em cacircmaras de seguranccedila bioloacutegica classe II Apoacutes o uso foram colocados em
soluccedilatildeo desinfetantes (hipoclorito a 1) e em seguida autoclavados a 127oC por 20
min em sacos apropriados para autoclavaccedilatildeo Apoacutes a finalizaccedilatildeo do ciclo de
esterilizaccedilatildeo os sacos contendo o material descartaacutevel foram colocados em
recipientes de coleta da empresa responsaacutevel pela coleta de materiais bioloacutegicos
produzidos no laboratoacuterio de microbiologia Todos os procedimentos seguiram a
normativa RDC-ANVISA 3062004 sobre o descarte de resiacuteduos de serviccedilo de
sauacutede
4 10 Aspectos epidemioloacutegicos e cliacutenicos
Os aspectos cliacutenicos e epidemioloacutegicos foram investigados por meio de
prontuaacuterios dos pacientes portadores de enterobacteacuterias produtoras de
carbapenemases e envolveram topografia mais provaacutevel do foco infeccioso a
enfermidade motivadora da internaccedilatildeo o desfecho cliacutenico a idade e o tempo de
internaccedilatildeo
4 12 Anaacutelises eepidemioloacutegicas
As anaacutelises foram realizadas com o pacote estatiacutestico SPSS versatildeo 200
Para verificar quais variaacuteveis referentes aos dados epidemioloacutegicos e
microbioloacutegicos influenciaram no desfecho verificou- se a diferenccedila meacutedia das
variaacuteveis idade e tempo de internaccedilatildeo em cada grupo O teste estatiacutestico utilizado foi
o teste t de Student apoacutes se executar o teste de normalidade de Shapiro-Wilk Para
as variaacuteveis sexo perfil microbioloacutegico das enterobacteacuterias produtoras de
43
carbapenemases foi avaliada a associaccedilatildeo com o desfecho por meio do teste Exato
de Fisher O niacutevel de significacircncia adotado foi de 5
4 13 Preceitos eacuteticos
Este projeto estaacute inserido em um projeto maior denominado ldquoEpidemiologia
cliacutenica e caracterizaccedilatildeo molecular do Acinetobacter Baumannii resistente a
antibioticoterapia em pacientes internado em hospitais do Sistema Uacutenico de Sauacutederdquo
que foi submetido ao Comitecirc de Eacutetica em Pesquisa da Secretaria do Estado de
Sauacutede do Distrito Federal (SESDF) e emitido parecer aprovado pelo protocolo nordm
23109 (anexo)
44
5 RESULTADOS
51 Anaacutelise molecular
Para a amplificaccedilatildeo com o oligo blaKPC foram amplificadas amostras
que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 881 pb correspondente ao
plasmiacutedeo A anaacutelise da amplificaccedilatildeo da regiatildeo do gene blaKPC mostrou que
apenas a amostra A10 natildeo amplificou isso demonstra que esta amostra natildeo
possuiacutea o gene de resistecircncia
5 1 1 Gene blaKPC
Figura 7 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 881 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
A amostra A3 natildeo amplificou no primeiro momento entatildeo foi realizado
novamente a PCR e corrida de gel obtendo entatildeo a amplificaccedilatildeo da amostra como
apresentado na figura 8
45
Figura 8 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC da
mostra A3 estudada A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo de 881
pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 1 2 Gene 16S rRNA
Para a amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA utilizou-se o oligo universal Foram
amplificadas amostras que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 996 pb
Figura 9 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
46
Segundo Lu et al (2000) a digestatildeo com a enzima HaeIII deste amplicons de
16S rRNA devolveriam bandas com perfis entre 150 a 200 pb No gel abaixo eacute
possiacutevel evidenciar que este perfil ocorreu com o predomiacutenio de bandas na altura
de 200pb
Figura 10 Gel de agarose a 2 da digestatildeo do amplicon do gene 16S
rRNA das amostras com a enzima HaeIII evidenciando diversos fragmentos
proacuteximos a 200 pb A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo ribossomal
de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 2 Anaacutelises epidemioloacutegicas
5 2 1 Sexo
No total foram detectados 17 isolados de KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 onde a maior a prevalecircncia foi
detecatada em amostras de pacientes do sexo masculino (53) do que no sexo
feminino (47)
47
Figura 11 Isolado de KPC segundo sexo dos 17 pacientes investigados
no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 2 Desfecho cliacutenico
Em 17 isolados de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo
de 2010 aacute 2011 a porcentagem de pacientes que foram a oacutebito (59) foi maior que
a de pacientes que tiverm alta (41)
Figura 12 Isolado de KPC segundo desfecho cliacutenico dos 17 pacientes
investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
48
5 2 3 Local da coleta
Dos 17 episoacutedios detectados de infecccedilatildeo por KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 a infecccedilatildeo em swab retalfoi mais
frequente (47) seguida de ponta de cateacuteter (18) e secreccedilatildeo traqueal (12)
Figura 13 Isolados de KPC segundo local da coleta da amostra nos 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 4 Microorganismo
O microorganismo mais encontrado foi a Klebsiella pneumoniae (82)
seguida da Enterobacter clocae (12) e Serratia marcescens (6) dos 17 isolados
de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 Isto afirma o
fato de a sigla KPC ser utilizada de forma errocircnea aacute Klebsiella pneumoniae visto
que a evidecircncia dela eacute maior em relaccedilatildeo as outras cepas
49
Figura 14 Isolado de KPC segundo microrganismo encontrado em 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 5 Relaccedilotildees variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana e desfecho
cliacutenico
Tabela 6 ndash Distribuiccedilatildeo do perfil geneacutetico sexo coleta tipificaccedilatildeo de
microrganismos e anaacutelise da resistecircncia bacteriana segundo o desfecho
cliacutenico Brasiacutelia-DF 2010 a 2011
Variaacutevel Resultado
Desfecho
Alta Oacutebito
N N P
Gene 16S rRNA Positivo 7 1000 10 1000
NA Gene blaKPC Positivo 6 857 10 1000
Negativo 1 143 0 00 0218 Sexo Feminino 2 286 6 600
Masculino 5 714 4 400 0201 Local da coleta Fundo saco de
Douglas 1 143 0 00
Hemocultura 0 00 1 100 0463 Ponta de cateter 1 143 2 200
Sec TraquealBrocircnquica
0 00 1 100
50
Secreccedilatildeo traqueal 2 286 0 00
Swab retal 3 429 5 500
Urina 0 00 1 100
Microrganismo Enterobacter cloacae (KPC)
1 143 1 100
Klebsiella pneumoniae
6 857 8 800
0416 Serratia
marcescens 0 00 1 100
Teste de Hodge Hodge positivo 7 1000 10 1000
NA Amicacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 1 100 0848 resistente 0 00 1 100
sensiacutevel 2 286 3 300
Amoxicilina Aacutecido Clavulacircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Ampicilina Sulbactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ampicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Aztreonan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefazolina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Cefoperazona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Cefotaxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefoxitina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0509 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 2 286 4 400
Ceftazidima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cetriaxona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 3 429 5 500 0772 Cefalotina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ciprofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772
51
resistente 3 429 5 500
Claritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Clindamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Eritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Gentamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0942 resistente 2 286 3 300
sensiacutevel 1 143 2 200
Imipenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 0 00 2 200 0193 Resistente 1 143 3 300
sensiacutevel 2 286 0 00
Nitrofurantoiacutena sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Norfloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Oxacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Penicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Piperacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Rifampicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tetraciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Ticarcilina Aacutecido Clavulocircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0688 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 3 429 4 400
Tobramicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Trimetoprima Sulfametoxazol
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0112 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 2 286 0 00
Vancomicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tigeciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediario 0 00 1 100 0211 natildeo testado 1 143 4 400
resistente 2 286 0 00
52
Cefepime sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefuroxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Levofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Piperacilina Tazobactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Ertapenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Meropenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0223 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 1 143 0 00
Cefotetan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 sensiacutevel 0 00 1 100
Gemifloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 7 700 0585 natildeo testado 3 429 3 300
Desfecho
Alta Oacutebito
Meacutedia Erro
padratildeo Meacutedia Erro
padratildeo p
Idade 58 9 59 5 0991
Tempo Internaccedilatildeo (dias)
50 13 46 12 0571
n= 17 p(lt 005) NA natildeo se aplica
53
6 DISCUSSAtildeO
Nos uacuteltimos anos houve um aumento na incidecircncia de bacteacuterias
multirresistentes aos antimicrobianos no ambiente hospitalar tornando isto um
problema mundial de sauacutede puacuteblica (HULSCHER et al 2010) Quando se trata
principalmente de bacilos Gram negativos a frequumlecircncia destas bacteacuterias eacute ainda
maior em paiacuteses da Ameacuterica Latina quando comparada a paiacuteses desenvolvidos
(GALES etal 2012)
De acordo com dados do ldquoMeropenem Yearly Susceptibility Test Information
Collectionrdquo (MYSTIC) ocorreu nos Estados Unidos um aumento na susceptibilidade
de K pneumoniae nos uacuteltimos anos graccedilas a praacuteticas de controle de disseminaccedilatildeo
de amostras resistentes(RHOMBERG P R et al 2009) O aumento crescente da
prevalecircncia destes microrganismos foi proporcional ao aumento da dependecircncia do
uso de antibioacuteticos carbapenecircmicos considerados como a opccedilatildeo terapecircutica para o
tratamento de infecccedilotildees por bacilos Gram negativos multi-resistentes (LIVERMORE
2012) Isto afeta diretamente as opccedilotildees de tratamento sobrando poucas alternativas
para a terapecircutica que incluem colistina (polimixina E) e tigeciclina que apresentam
respectivamente problemas em termos de toxicidade e eficaacutecia (LIVERMORE et
al 2011) Um dos efeitos adversos mais importantes das poliminas B e E por
exemplo satildeo a neurotoxicidade e nefrotoxicidade (MENDES C A C et al2009 )
Devido agrave resistecircncia ser usualmente de natureza plasmidial e portanto de
maior disseminaccedilatildeo especialmente quando carreadas por K pneumoniae
microrganismo com uma notoacuteria capacidade para acumular e transferir plasmiacutedeos
com determinantes para resistecircncia o nuacutemero de casos detectados pelo
fenoacutetipogenoacutetipo blaKPC eacute bastante preocupante (MONTEIRO et al 2009)
Comparada com outras bacteacuterias hospitalares a transmissatildeo de clones
multirresistentes de K pneumoniae eacute maior e podem natildeo ser controladas pelos
meacutetodos de controle de infecccedilatildeo hospitalar (PAAUW et al 2007) A forma
plasmidial para transferecircncia da resistecircncia adicionada a este grande potencial para
disseminaccedilatildeo de clones resistentes eacute preocupante visto que apoacutes surtos muitas
vezes pode se tornar endecircmica Jaacute eacute uma realidade a disseminaccedilatildeo desta bacteacuteria
54
entre pacientes hospitais paiacuteses e ateacute mesmo continentes (WOODFORF et al
2010 ROGERS et al 2011)
As chances de surtos satildeo maiores em paiacuteses com poucos recursos devido agrave
maior carecircncia de praacuteticas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees hospitalares e o
uso irracional de antimicrobianos de forma empiacuterica e inadequada (KUMARASAMY
et al 2010) Ateacute o momento os mecanismos de resistecircncia aos cabapenecircmicos
geralmente encontrado eram a produccedilatildeo de ESBL (CTX-M) somada aacute perda de
porina (CARVALHAES et al 2010) Foi notado a partir do ano de 2008 um
aumento no nuacutemero de K pneumoniae produtoras de KPC-2 apresentando outra
forma de resistecircncia (GALES 2012)
Um estudo mostrou que o perfil do paciente colonizado ou infectado por KPC
foi de um paciente entre os 33 e os 82 anos de idade internado haacute mais de 1
semana no hospital A mortalidade geral nos uacuteltimos anos ficou em torno de 7
sendo que dos 77 pacientes estudados 32 (415) pacientes evoluiacuteram para oacutebito
evidenciando a alta morbi-mortalidade associada (ALVES A P et al 2013)
Em estudo com 2316 pacientes avaliados a populaccedilatildeo de sexo masculino foi
de 526 idade meacutedia global de 53 anos (mediana de 55 anos) permanecircncia meacutedia
de 58 dias (mediana de 3 dias) (OLIVEIRA A C et al 2010) Outros trabalhos
apresentaram ausecircncia de significacircncia entre sexoidade e o desenvolvimento de
infecccedilotildees por microrganismos resistentes (PERES-BOTA D et al 2003 COLPAN
A et al 2005 COELLO R et al 1997)
Outro estudo utilizou um total de 30 amostras sendo elas isoladas de urina
escarro secreccedilatildeo pleural ponta de cateter aspirado traqueal e hemocultura A mais
prevalente foi em urina (40) Entre as 30 cepas analisadas a maior porcentagem
foi da cepa Klebsiella pneumoniae (70) Enterobacter sp (133) Klebsiella
ozaenae (10) Escherichia coli (333) e Klebsiella oxytoca (333)
(DIENSTMANN R et al 2010) Nos Estados Unidos a enzima KPC jaacute se tornou
endecircmica Foi realizada uma pesquisa em dois hospitais de Nova York onde
testaram 602 amostras e 45 apresentaram algum mecanismo de resistecircncia
sendo apenas 33 confirmadas por biologia molecular como KPC-2 (BRATU et
al 2005)
55
Estudo sobre os tipos de ESBL feito no Japatildeo apresentou o tipo Toho-1 como
o mais prevalente nessa pesquisa Ateacute o ano de 2000 ano em que foi publicado tal
estudo este era o primeiro relatoacuterio no Japatildeo para identificar derivados de ESBLs
como tipo de SHV e TEM entre E coli e K pneumoniae Em especial o tipo SHV- 12
foi identificado com uma maior frequumlecircncia Estes resultados indicam que tipos
distintos de ESBLs que satildeo diferentes em sua especificidade de substrato e origem
geneacutetica coexistem no Japatildeo Isto mostra a importacircncia de caracterizar genoacutetipos
distintos de ESBLs e de estar em alerta continuamente para as tendecircncias de
ESBLs no Japatildeo aleacutem da necessidade de uma interpretaccedilatildeo uniforme utilizando as
diretrizes do CSLI para relatar cepas produtoras de ESBL Aleacutem da detecccedilatildeo de
ESBLs satildeo necessaacuterias mais informaccedilotildees tais como o perfil de sensibilidade
especiacutefica para diversas β-lactacircmicos e o local da infecccedilatildeo Esses fatores satildeo
essenciais para a escolha adequada de antibioacuteticos (YAGI T et al 2000)
No ano de 2004 uma pesquisa avaliou a produccedilatildeo de uma enzima de
hidroacutelise de carbapenecircmicos atraveacutes da teacutecnica de sequumlenciamento foi revelado
um novo membro da famiacutelia KPC designado KPC- 3 Pesquisadores encontraram
em um mutante de K pneumoniae uma substituiccedilatildeo de um gene associado com
resistecircncia a Imipenem mas essa substituiccedilatildeo foi considerada improvaacutevel na
contribuiccedilatildeo da resistecircncia aos carbapenecircmicos da espeacutecie estudada Aleacutem da
resistecircncia aos carbapenecircmicos estes isolados eram em sua maioria resistentes agraves
cefalosporinas penicilinas e aminoglicosiacutedeos Usando estudos de transformaccedilatildeo
conjugaccedilatildeo e hibridaccedilatildeo localizaram o alelo blaKPC em plasmiacutedeo aleacutem disso
mostraram que esse alelo tambeacutem carregava uma resistecircncia aos aminoglicosiacutedeos
A transferecircncia das enzimas KPCs foi demonstrada in vitro tanto neste como em
outros estudos pode ser que os plasmiacutedeos que fazem esta transferecircncia estavam
comeccedilando a se espalhar no ambiente cliacutenico resultando na multiresistecircncia dessas
estirpes (WOODFORD et al 2004)
O presente estudo apresentou um vieacutes quanto aos resultados dos testes de
susceptibilidade microbiana Observou-se que natildeo foi encontrado resultado deste
teste em algumas amostras o que natildeo cooperou para um estudo mais preciso
futuros estudos quanto agraves amostras e um melhor acompanhamento deste tipo de
patologia Poreacutem mesmo sem algumas amostras com este resultado disponiacutevel foi
56
confirmada a presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos
carbapenecircmicos por meio dos genes de resistecircncia blaKPC e 16S rRNA que as
amostras apresentaram em sua maioria serem portadoras Quanto aos resultados
estatiacutesticos nenhuma das variaacuteveis apresentou significacircncia estatiacutestica (p gt 005)
mostrando assim que estas variaacuteveis isoladas natildeo foram o fator determinante para
o desfecho cliacutenico de alta ou oacutebito
57
7 CONCLUSAtildeO
Os genes blaKPC e 16S rRNA foram caracterizados confirmando a a
presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos carbapenecircmicos
Houve uma maior prevalecircncia da cepa K pneumoniae e isto confirma outros
estudos que apresentam a maior prevalecircncia desta cepa em amostras com KPC
Aleacutem disso isso justifica a forma popular da K pneumoniae ser chamada de KPC
enquanto que na verdade KPC eacute uma enzima podendo estar presente em outras
cepas como Enterobacter clocae tambeacutem apresentada no presente estudo O
desfecho cliacutenico de oacutebitos maior que 50 eacute um possiacutevel indicador sobre a
necessidade de se realizar um teste raacutepido para identificaccedilatildeo de KPC visando
iniciar o mais raacutepido possiacutevel o tratamento afim de diminuir a mortalidade por esta
infecccedilatildeo
Nenhuma das variaacuteveis isoladamente estaacute relacionada ao desfecho cliacutenico
oacutebito ou alta pois natildeo apresentaram relevacircncia estatiacutestica O presente estudo
mostrou que haacute presenccedila da bacteacuteria nas amostras de pacientes do hospital
estudado podendo entatildeo afirmar que este tipo de bacteacuteria se encontra tambeacutem
presente em ambiente hospitalar O uso irracional de antimicrobiano eacute demonstrado
de forma indireta quando foi apresentado atraveacutes do Teste de Hodge Modificado
uma resistecircncia de 100 aos antibioacuteticos carbapenecircmicos Isto tambeacutem reflete na
terapecircutica sendo que pacientes portadores de bacteacuterias resistentes aos
antibioacuteticos carabepecircmicos tem uma escassa opccedilatildeo de tratamento e as opccedilotildees
apresentam problemas quanto agrave toxicidade e eficaacutecia
58
REFEREcircNCIAS
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Mecanismos
de resistecircncia bacteriana aos antimicrobianos Disponiacutevel em
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controleopas_
webmodulo3mec_sitiohtmgt Acesso em 25 de abril de 2014
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Nota teacutecnica nordm
012013 medidas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees por enterobacteacuterias
multiresistentes Acesso em 17 de abril de 2013
ALBA J et al Kinetics study of KPC-3 a plasmid-encoded class A
carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase Antimicrob Agents Chemother
Nov49(11)4760-2 2005
ALVES A P et al Nosocomial infections by KPC-producing enterobacteria in
a tertiary hospital in Southern Brazil Revista da AMRIGS Porto Alegre 57 (3) 213-
218 jul-set 2013
ALVES A et al Tipagem Geneacutetica de Microrganismos Lab De Diversidade
Microbiana Centro de Biologia Celular Dep de Biologia U de Aveiro 3810-193
Aveiro- 2003
BELL J M et Al Prevalence and significance of a negative extended-
spectrum beta-lactamase (ESBL) confirmation test result after a positive ESBL
screening test result for isolates of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae
results from the SENTRY Asia-Pacific Surveillance Program J Clin Microbiol
May45(5)1478-82 2007
BRATU S et al Detection of KPC carbapenem-hydrolyzing enzymes in
Enterobacter spp from Brooklyn New York Antimicrob Agents Chemother v 49 n
2 p 776-8 2005
59
BRATU S et al Emergence of KPC-possessing Klebsiella pneumoniae in
Brooklyn New York epidemiology and recommendations for detection Antimicrob
Agents Chemother v 49 n 7 p 3018-20 2005
BRATU S et al Rapid spread of carbapenem-resistant Klebsiella
pneumoniae in New York City Arch Intern Med v 165 p 1430-5 2005
CAMARGO C F et al Aplicaccedilatildeo das teacutecnicas de pcr e suas teacutecnicas
derivadas em diagnoacutestico molecular Disponiacutevel em
ltfileDUnB10C2BA20semestreArtigosPCR-
20CLEYTON20FLORENCIO20DE20CAMARGO20E20PAULO20ROB
ERTO20QUEIROZpdfgtgt Acesso em 08 de abril de 2014
CARVALHES C G et al Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting
carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive
results Journal of Antimicrobial Chemotherapy v 65 n2 p 249-251 2010
CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION- CDC Modified
Hodge Test for Carbapenemase Detection in Enterobacteriaceae 2004
CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE Methods for
dilutionantimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically Approved
standard M7ndashA7 7th ed CLSI Wayne PA 2011
COELLO R et al Risk factors for developing clinical infection with methicillin-
resistant Staphylococcus aureus (MRSA) amongst hospital patients initially only
colonized with MRSA J Hosp Infect 19973739-46
COLPAN A et al Evaluation of risk factors for mortality in intensive care
units A prospective study from a referral hospital in Turkey Am J Infect Control
200533(1)42-7
60
CORNAGLIA G et al Living with ESBLs Introduction Clinical Microbiology
and Infection 14 Suppl 1 1-2 2008
COTRIM E R et al Klebsiella pneumoniae carbapenemase ndash KPC em
Enterobacteriaceae o desafio das bacteacuterias multirresistentes Poacutes em revista do
centro universitaacuterio Newton Paiva 12012 - ediccedilatildeo 5 - issn 2176 7785
DESHPANDE L M et al Occurrence and characterization of
carbapenemase-producing Enterobacteacuteriaceae report from the SENTRY
Antimicrobial Surveillance Program (2000-2004) Microb Drug Resist 12(4)223-30
2006
DIAS D J A Estudos dos principais mecanismos de resistecircncia aos
antibioacuteticos β-lactacircmicos em bacteacuterias patogecircnicas gram negativas 2009 100 f
Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Geneacutetica Molecular e Biomedicina) ndash Faculdade de
Ciecircncias e Tecnologia Universidade de Nova Lisboa Lisboa
DIENSTMANN R et al Avaliaccedilatildeo fenotiacutepica da enzima Klebsiella
pneumoniae carbapenemase (KPC) em Enterobacteriaceae de ambiente hospitalar
J Bras Patol Med Lab v 46 n 1 p 23-27 fevereiro 2010
ENDIMIAMI A et al Emergence of blaKPC-containing Klebsiella
pneumoniae in a long-term acute care hospital a new challenge to our healthcare J
Antimicrob Chemother 64 1102-1110 Nov 2009
FALAGAS M E et al Extended-spectrum beta-lactamase producing
organisms The Journal of Hospital Infection 73 (4) pp 345-54 2009
FONTANA C et al Emergence of KPC-producing Klebsiella pneumoniae in
Italy BMC Rev Notes 3 40 2010
61
GALES A C et al Antimicrobial resistance among Gram-negative bacilli
isolated from Latin America results from Sentry Antimicrobial Surveillance Program
(Latin America 2008-2010) Diagnostic Microbiology and Infectious Disease v 3 n
4 p 354 -360 2012
GUPTA N et al Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Epidemiology
and Prevention HEALTHCARE EPIDEMIOLOGY Clinical Infectious Diseases
201153(1)60ndash67 Published by Oxford University Press on behalf of the Infectious
Diseases Society of America 2011
HARBOTTLE H et al Genetics of antimicrobial resistance Anim Biotechnol
n17 p111-124 2006
HENRIQUE W N et al RESISTEcircNCIA BACTERIANA Uniatildeo das
Faculdades Alfredo NasserInstituto de Ciecircncias da Sauacutede Disponiacutevel em lt
httpwwwfaculdadealfredonasseredubrfilespesquisaposter20HENRIQUE20
Wilker20Natividade20SANTIAGO20Silvania20CAVALCANTI20DSP
20ResistC3AAncia20Bacterianapdfgt Acesso em 17 marccedilo 2014
HULSCHER M E J I et al Antibiotic prescribing in hospital a social and
behavioral scientific approach The Lancet Infectious Diaseases v 10 n 3 p 167-
165 2010
KIDWAI M SAPRA P BHUSHAN KR Synthetic strategies and medicinal
properties of beta-lactams Curr Med Chem 1999 695-215
KUMARASAMY K K et al Emergence of a new antibiotic resistance
mechanism in India Pakistan and the UK a molecular biological and
epidemiological stuy The Lancet Infectious Diseases v10 n 9 p 597- 602 2010
LINCOPAN N et al Enterobacteacuteria producing extended-spectrum β-
lacatamases and IMP-1 Metalo-β-lactamases isolated from Brazilian hospitals J Med
62
Microbiol 7 1-3 2006
LINCOPAN N et al First Isolation of Metalo-β-Lacatamase-Producing
Multiresistant Klebsiella pneumoniae from a patient in Brazil J Clin Microbiol 43(1)
516-519 2005
LIVERMORE D M et al What remains against carbapenem- resistant
Enterobacteriaceae Evaluation of choramphenicol ciprofloxacin colistina
fosfomycin minocycline nitrofurantoin temocilin and tigecycline International
Journal of Antimicrobial Agents v 37 n 5 p 415- 459 2011
LIVERMORE D M Fourten years in resistance International Journal of
Antimicrobial Agents v 39 283- 294 2012
LIVERMORE D M Bacterial resistance to carbapenems Adv Exp Med Biol
1995 39025-47
LIVERMORE D M Bacterial resistance origins epidemiology and impact
Clin Infect Dis 36S11-S23 2003
LIVERMORE D M et al Carbapenemases a problem in waiting Curr
Opin Microbiol 2000 3489-95
LU et al Universal pcr for common bacterial pathogens J CLIN
MICROBIOL VOL 38 2000
LU et al Use of PCR with Universal Primers and Restriction Endonuclease
Digestions for Detection and Identification of Common Bacterial Pathogens in
Cerebrospinal Fluid Journal of Clinical Microbiology June 2000 p 2076ndash2080
MARSCHALL J Met al Presence of the KPC Carbapenemase Gene in
Enterobacteriaceae Causing Bacteremia and Its Correlation with In Vitro
Carbapenem Susceptibility J Clin Microbiol 47 239-241 Jan 2009
63
MARTINS WMBS et al Prevalecircncia do gene blaKPC em isolados cliacutenicos
de Enterobacteriaceae e natildeo fermentadores encontrados em amostras clinicas em
um hospital universitaacuterio do Recife X Jornada de ensino pesquisa e extensatildeo ndash
JEPEX 2010 ndash UFRPE Recife 18 a 22 de outubro
MENDES C A C et al Polimixinas Revisatildeo com ecircnfase na sua
nefrotoxicidade Rev Assoc Med Bras 2009 55(6) 752-9
MOHR J F 3rd Update on the efficacy and tolerability of meropenem in the
treatment of serious bacteacuterial infections Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S41-51
2008
MONTEIRO J et al First report of KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae
strains in Brazil Antimicrob Agents Chemother Jan53(1)333-4 2009
MOREIRA V C et al Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia a antibioacuteticos
Disponiacutevel em
lthttpwwwcpglsucgbr6mostraartigosSAUDEVANESSA20CARVALHO20M
OREIRApdfgt Acesso em 21 marccedilo 2014
NETIKUL T et al Emergence of novel blaKPC-12 and blaKPC-13 variants in
carbapenem non-susceptible Enterobacter cloacae a first report of blaKPC gene in
Thailand European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases May
S372 2011
NETO V A et al Antibioacuteticos na praacutetica Meacutedica 6ordf Ediccedilatildeo Editorial
SarverSP Brasil 2007
NICOLAU D P Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of
meropenem Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S32-40 2008
64
OLIVEIRA A C et al Resistecircncia bacteriana e mortalidade em um centro de
terapia intensiva Rev Latino-Am Enfermagem nov-dez 2010
PAAUW A et al Failure to control an outbreak of qnrA 1-positive multidrug-
resistant Enterobacter clocae despite adequate implementation of recommended
infection control measures Journal of Clinical Microbiology v 45 n 5 p 1420-1425
2007
PATERSON D L et al Extended-Spectrum Beta-Lactamases a Clinical
Update Clinical Microbiology Reviews v 18 p 657-686 2005
PEIRANO G et al Carbapenem-hydrolysing beta-lactamase KPC-2 in
Klebsiella pneumonia isolated in Rio de Janeiro Brazil J Antimicrob Chemother Nov
20 2009
PERES-BOTA D et al Are infections due to resistant pathogens associated
with worse outcome in critically ill patients J Infect 200347(4)307-16
PIDDOCK L J V Clinically relevant chromosomally encoded multidrug
resistance effl ux pumps in bacterial Clin Microbiol Rev n19 p382-402 2006
PITOUT J D D et al Emergence of Enterobacteriaceae producing
extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) in the community J Antimicrob
Chemother May 56 2005
POSSEBON M I et al Resistecircncia bacteriana aos carbapenecircmicos
Bacterial resitence to carbapenems RBM rev bras med60(6)378380-378-382
jun 2003
QUEENAN A M et al Carbapenemases the versatile beta-lactamases
Clin Microbiol Rev Jul20(3)440-58 2007
65
RHOMBERG P R et al Summary trends for the meropenem yearly
susceptibility test information collection program a 10- year experience in the United
States (1999-2008) Diagnostic Microbiology and Infectiois Disease v 65 n4 p
414-426 2009
ROBLEDO I E et al Detection of KPC in Acinetobacter spp in Puerto Rico
J Antimicrob Agents Chemother 54 1354-1357 Mar 2010
ROGERS B A et al Country-to-country transfer os patients and the risk of
multi-resistant bacterial infection Clinical Infectious Disease v53 n1 p49- 56
2011
SHAH A A et al Characteristics epidemiology and clinicalimportance of
emerging strains of Gram-negative bacilli producing extended-spectrum
betalactamases Research in Microbiology v 155 p 409-421 2004
TURNER P J Extended- Spectrum Beta-Lactamases Clinical Infectious
Diseases v 41 p 273-275 2005
WOLTER D J et al Phenotypic and Enzymatic Comparative Analysis
between the Novel KPC variant KPC-5 and Its Evolutionary Variants KPC-2 and
KPC-4 Antimicrob Agents Chemother Nov 17 2008
WOODFORD N et al Carbapenemases of Chryseobacterium
(Flavobacterium) meningosepticum distribution of blaB and characterization of a
novel Metalo-beta-lactamase gene blaB3 in the type strain NCTC 10016
Antimicrob Agents Chemother Jun44(6)1448-52 2000
WOODFORF N Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in
India Pakistan and the UK a molecular biological and epidemiological study The
Lancet Infectious Diseases v 10 n 9 p 597-602 2010
66
WOODFORD et al Outbreak of Klebsiella pneumoniae Producing a New
Carbapenem- Hydrolyzing Class A β-Lactamase KPC-3 in a New York Medical
Center Antimicrobial agents and chemotherapy Dec 2004 p 4793ndash4799 Vol 48
No 12
YAGI T et al A preliminary survey of extended-spectrum β-lactamases
(ESBLs) in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Japan
FEMS Microbiology Letters 184 (2000) 53-56
YIGIT H et al Novel carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase KPC-1 from
a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumonia J Antimicrob Agents
Chemother 45 (4) 1151-1161 (2001)
ZAVASCKI A P et al KPC-2- producing Enterobacter cloacae in two cities
from Southern Brazil Int J Antimicrob Agents Apr 28 2009
ZHANEL G G et al Comparative review of the carbapenecircmicos Drugs
67(7)1027-52 2007
67
ANEXOS
Sequumlecircncia do oligo blaKPC
Query 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
Query 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
Query 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
68
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
Query 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
Query 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
69
Query 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
Query 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
Query 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
70
Sbjct 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
Query 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
Query 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
Query 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
71
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
Query 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
Query 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
72
Query 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
Query 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
Query 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
73
Sbjct 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
Query 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
Query 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
Query 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
74
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
Query 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
Query 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
75
Query 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
Query 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
||||
Sbjct 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
LOCUS AF297554 1377 bp
DNA linear BCT 26-MAR-2001
DEFINITION Klebsiella pneumoniae carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
gene complete cds
ACCESSION AF297554
VERSION AF2975541 GI10121874
76
KEYWORDS
SOURCE Klebsiella pneumoniae
ORGANISM Klebsiella pneumoniae
Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Enterobacteriaceae Klebsiella
REFERENCE 1 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH QueenanAM
AndersonGJ Domenech-SanchezA
BiddleJW StewardCD
AlbertiS BushK and TenoverFC
TITLE Novel carbapenem-hydrolyzing beta-
lactamase KPC-1 from a
carbapenem-resistant strain of
Klebsiella pneumoniae
JOURNAL Antimicrob Agents Chemother 45 (4)
1151-1161 (2001)
PUBMED 11257029
REFERENCE 2 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH AndersonGJ and
TenoverFC
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (19-AUG-2000) Nosocomial
Pathogens Laboratory Branch
Centers for Disease Control and
Prevention 1600 Clifton Rd MS
G08 Atlanta GA 30333 USA
FEATURES LocationQualifiers
77
source 11377
organism=Klebsiella
pneumoniae
mol_type=genomic DNA
db_xref=taxon573
-35_signal 5560
-10_signal 7883
mRNA 921012
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
RBS 117122
CDS 1311012
note=blaKPC-1
codon_start=1
transl_table=11
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
protein_id=AAG134101
db_xref=GI10121875
translation=MSLYRRLVLLSCLSWPLAGFSATALTNLVAEPFAKLEQD
FGGSI
GVYAMDTGSGATVSYRAEERFPLCSSFKGFLAAAVLARSQQQAGLLDTPIRYG
KNALV
PWSPISEKYLTTGMTVAELSAAAVQYSDNAAANLLLKELGGPAGLTAFMRSIG
DTTFR
78
LDRWELELNSAIPSDARDTSSPRAVTESLQKLTLGSALAAPQRQQFVDWLKGN
TTGNH
RIRAAVPADWAVGDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTRAPNKDDK
HSEAV
IAAAARLALEGLGVNGQ
ORIGIN
1 cggggcagtt acagccgtta cagcctctgg
agagggagcg gcttgccgct cggtgataat
61 cccagctgta gcggcctgat tacatccggc
cgctacacct agctccacct tcaaacaagg
121 aatatcgttg atgtcactgt atcgccgtct
agttctgctg tcttgtctct catggccgct
181 ggctggcttt tctgccaccg cgctgaccaa
cctcgtcgcg gaaccattcg ctaaactcga
241 acaggacttt ggcggctcca tcggtgtgta
cgcgatggat accggctcag gcgcaactgt
301 aagttaccgc gctgaggagc gcttcccact
gtgcagctca ttcaagggct ttcttgctgc
361 cgctgtgctg gctcgcagcc agcagcaggc
cggcttgctg gacacaccca tccgttacgg
421 caaaaatgcg ctggttccgt ggtcacccat
ctcggaaaaa tatctgacaa caggcatgac
481 ggtggcggag ctgtccgcgg ccgccgtgca
atacagtgat aacgccgccg ccaatttgtt
541 gctgaaggag ttgggcggcc cggccgggct
gacggccttc atgcgctcta tcggcgatac
79
601 cacgttccgt ctggaccgct gggagctgga
gctgaactcc gccatcccaa gcgatgcgcg
661 cgatacctca tcgccgcgcg ccgtgacgga
aagcttacaa aaactgacac tgggctctgc
721 actggctgcg ccgcagcggc agcagtttgt
tgattggcta aagggaaaca cgaccggcaa
781 ccaccgcatc cgcgcggcgg tgccggcaga
ctgggcagtc ggagacaaaa ccggaacctg
841 cggagtgtat ggcacggcaa atgactatgc
cgtcgtctgg cccactgggc gcgcacctat
901 tgtgttggcc gtctacaccc gggcgcctaa
caaggatgac aagcacagcg aggccgtcat
961 cgccgctgcg gctagactcg cgctcgaggg
attgggcgtc aacgggcagt aaggctctga
1021 aaatcatcta ttggcccacc accgccgccc
ttgcgggcgg catggattac caaccactgt
1081 cacatttagg ctaggagtct gcgcggcaga
gccgtgtgac cggttttctg tagagcactg
1141 acgatggcgg cggcgctctc tgcaattggc
aaggcgtcgg cgccaaggat accaatcttg
1201 cggcgcgcgg cgtgttatga cgactggggt
gcatttgagc cgccccattt aaccttcgcc
1261 ctcacagata cgccattcgc ctcaaattta
gcgccatgca gacgagcttc cactcggctt
1321 gcaccttgtc caggcccctc atgctgaact
gacgcaatcc catcaccgcc ttgatca
80
30
2 JUSTIFICATIVA
No ano de 2010 no Distrito Federal foram identificados 111 pacientes com
suspeita de infecccedilatildeo por Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) e a
Secretaria de Sauacutede do Distrito Federal confirmaram ainda a morte de 18 pacientes
dentre os hospitais puacuteblicos e particulares Um desafio encontrado por ocasiatildeo do
surto infeccioso no Distrito Federal foi o de confirmar as KPCs por Reaccedilatildeo da
Polimerase em Cadeia sendo que as amostras foram enviadas com esta finalidade
para a Fiocruz no Rio de Janeiro
Pesquisas que possam contribuir na elaboraccedilatildeo de estrateacutegias preventivas e
de intervenccedilatildeo para infecccedilotildees causadas por enterobacteacuterias bem como contribuir
para gerar uma integraccedilatildeo beneacutefica entre a equipe acadecircmica e os serviccedilos de
sauacutede devem ser estimuladas Neste sentido o presente estudo permitiu escrutinar
os genes envolvidos na expressatildeo de carbapenemases presentes em espeacutecies de
enterobacteacuterias isoladas em ambiente hospitalar visto que elucidar genes de
resistecircncia de enterobacteacuterias aos antibioacuteticos carbapenecircmicos eacute o primeiro passo
para garantir um controle epidemioloacutegico efetivo para estes tipos de microorganismo
assim como sua associaccedilatildeo com surtos fatais particularmente em pacientes com
baixa imunidade
31
3 OBJETIVOS
31 Objetivo geral Caracterizar os genes de resistecircncia das
Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases e os aspectos epidemioloacutegicos de
pacientes internados em um hospital puacuteblico do Distrito Federal
32 Objetivos Especiacuteficos
Identificar genotipicamente a enzima KPC (Klebsiella pneumoniae
carbapenemase) de isolados de Klebsiella pneumoniae
Investigar aspectos epidemioloacutegicos dos pacientes portadores de
Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases
Identificar quais variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana influenciaram para o
desfecho oacutebito ou alta
Avaliar a susceptibilidade das Enterobacteacuterias aos antibioacuteticos
carbapenecircmicos dos pacientes em ambiente hospitalar
32
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
Trata-se de um estudo transversal onde foi realizado o teste de
susceptibilidade das enterobacteacuterias aos antibioacuteticos carbapenecircmicos a partir dos
materiais bioloacutegicos coletados dos pacientes internados no Hospital Regional da Asa
Norte (HRAN) e enviados ao Laboratoacuterio de Anaacutelises Cliacutenicas da mesma Instituiccedilatildeo
Os materiais bioloacutegicos investigados foram sangue aspirado traqueal ou brocircnquico
urina e cultura semi quantitativa de ponta de cateter venoso central O HRAN eacute um
hospital puacuteblico do Distrito Federal com 395 leitos sendo as cliacutenicas de internaccedilatildeo
Berccedilaacuterio Cirurgia Geral Cirurgia Plaacutestica Cliacutenica Meacutedica Ginecologia Maternidade
Pediatria Queimados UTI com atendimento a pacientes portadores de doenccedilas de
caraacuteter cliacutenico e ciruacutergico
4 1 Coleta e transporte das amostras bioloacutegicas
As amostras foram coletadas de pacientes internados no Hospital Regional da
Asa Norte (HRAN) com suspeitas de infecccedilatildeo por KPC A identificaccedilatildeo primaacuteria foi
realizada pelo Laboratoacuterio de Microbiologia do hospital de origem dos pacientes e os
demais procedimentos que foram utilizados na identificaccedilatildeo encontram-se descritos
abaixo
4 2 Procedimentos para confirmaccedilatildeo de resistecircncia bacteriana por
disco de ertapenem (adaptado CDC 2004)
Para diagnosticar amostra como portadora de bacteacuteria produtora de
carbapenemase foi realizado o teste com disco de ertapenem como forma de
triagem Inicialmente utilizou-se o swab contaminado com a amostra que foi
distribuiacuteda em uma pequena aacuterea da placa de aacutegar MacConkey para apoacutes o
crescimento ser realizada a pesquisa de colonizaccedilatildeo por enterobacteacuterias resistentes
aos carbapenecircmicos (Pesquisa de CRE) Procedeu-se a semeadura por teacutecnica
semi-quantitativaesgotamento com alccedila bacterioloacutegica na diluiccedilatildeo de 1100 O disco
de Ertapenem foi colocado na superfiacutecie da placa de MacConkey na junccedilatildeo dos dois
primeiros campos de semeadura conforme demonstrado na figura 5 Incubou a placa
33
em estufa aeroacutebia a 35ordmC por 24 e 48 horas e observou-se o halo de difusatildeo do
disco de Ertapenem na placa para proceder agrave leitura
O teste deixou de ser obrigatoacuterio apoacutes a modificaccedilatildeo dos criteacuterios
interpretativos para carbapenecircmicos para enterobacteacuterias publicados no suplemento
do CLSI 2010 M100-S20-U
Figura 5 Mecanismo de semeamento de material bioloacutegico oriundos de
pacientes com suspeita de infecccedilatildeo por KPC Fonte adaptado CDC 2004
4 2 1 Interpretaccedilatildeo dos resultados
Na ausecircncia de crescimento ateacute 24 horas (MacConkey) ou halo de difusatildeo
gt27 mm na placa deve-se reincubar as placas por mais 24 horas Quando for
ausente o crescimento apoacutes 48 horas ou halo de difusatildeo gt27 mm na placa libera-se
como enterobacteacuterias resistentes a carbapenecircmicos (KPCNEG)Havendo
crescimento de colocircnias na placa de MacConkey com halo lt 27 mm (apenas para
colocircnias com crescimento dentro do halo) deve-se reisolar e realizar identificaccedilatildeo e
antibiograma automatizado teste de sensibilidade por disco-difusatildeo e Teste de
Hodge Modificado (THM) Os isolados de enterobacteacuterias cujos testes comprovarem
a resistecircncia aos carbapanecircmicos testados (KPCPOS) foram reportado a Comissatildeo
de Controle de Infecccedilatildeo Hospitalar (CCIH) Jaacute osbacilos Gram-negativos natildeo
fermentadores natildeo foram reportados (KPCNEG) Para interpretaccedilatildeodos resultados
foram utilizados os valores conforme demonstrados na tabela 1
Tabela 1 Criteacuterios Interpretativos para testes de sensibilidade
ENTEROBACTEacuteRIAS
Disco difusatildeo (mm) MIC (microgml)
34
Antibioacutetico Sigla S I R S I R
Ertapenem 10
microg
ETP 22 19-
21
18 05 1 2
Meropenem 10
microg
MEM 23 20-
22
19 1 2 4
Fonte Manual Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)
2013
Os resultados que apresentaram resistecircncia ao antibioacutetico Ertapenem foram
considerados como suspeitos de contaminaccedilatildeo por KPC Fez-se o teste de
susceptibilidade aos antibioacuteticos (TSA) em aparelho automatizado MicroScan Walk
Away 96sl Dade Behring
4 3 Teste de susceptibilidade aos antibioacuteticos (adaptado CDC 2004)
A determinaccedilatildeo da susceptibilidade dos isolados foi feita pelo teste de
susceptibilidade aos antibioacuteticos (TSA) apoacutes cultura em meio de gelose simples
(INSA) para avaliaccedilatildeo da sua pureza e obtenccedilatildeo de colocircnias isoladas Para
preparaccedilatildeo de uma suspensatildeo bacteriana com turvaccedilatildeo aproximada de 05
McFarland (Dade BehringMicroScanregTurbidity Meter) ressuspendeu duas a cinco
colocircnias em 2ml de soro fisioloacutegico esteacuteril diluindo a 1100 em soro fisioloacutegico num
volume total de 10ml em seguida foi feita uma semeadura em duas placas
quadradas (120mm x 120mm) de Muller-Hinton Agar (INSA) por inundaccedilatildeo
Os discos de antibioacutetico carbapenecircmicos imipenem meropenem e
ertapenem (Biorad) foram aplicados com o auxiacutelio de um dispensador automaacutetico A
susceptibilidade das Enterobacteacuterias aos carbapenecircmicos foi definida de acordo
com o protocolo Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI 2011)
Para aquelas Enterobacteacuterias que apresentaram resistecircncia ao ertapenem
foram realizados o Teste de Hodge Modificado para Detecccedilatildeo de Enterobacteacuterias
Produtoras de Carbapenemases conforme descrito pelo Centers for Disease Control
and Prevention (CDC 2004)
35
4 4Teste de Hodge Modificado (THM) (adaptado CDC 2004)
Preparou-se uma suspensatildeo em salina esteacuteril com a cepa Escherichia coli
ATCC 25922 (padratildeo 05 de McFarland) Apoacutes isto diluiu a suspensatildeo 110 em
salina (05 ml da soluccedilatildeo de Ecoli ATCC 25922 + 45 ml salina)Foi entatildeo semeado
na superfiacutecie de uma placa de Agar Muller-Hinton com a suspensatildeo diluiacuteda de Ecoli
ATCC 25922 com auxilio de swab seco assegurando que houvesse uma
distribuiccedilatildeo uniforme cobrindo toda a superfiacutecie do Agar Deixou secar por 3 a 5
minutos em temperatura ambienteColocou-se o disco de ertapenem 10microg no centro
da placa e apoacutes isto fez-se uma estria linear da cepa a ser testada da borda do
disco ateacute a borda da placa utilizando uma alccedila calibrada 10 microl ou um swab Incubou
a placa na estufa em atmosfera aeroacutebia a 35 plusmn 2ordmC por 16 a 24 horas
441 Controle de qualidade (CQ)
Foi utilizado um CQ todos os dias em que se realizou o teste tendo como
controle Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1705- teste de Hodge modificado
positivo Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1706- teste de Hodge modificado
negativo
442 InterpretaccedilatildeoResultados
Apoacutes 16ndash24 horas de incubaccedilatildeo examinar as placas para verificar a presenccedila
de uma distorccedilatildeo no halo de inibiccedilatildeo do disco de ertapenem devido ao crescimento
realccedilado da cepa ATCC na intersecccedilatildeo do organismo teste e a Ecoli ATCC 25922
dentro dos limites do halo O THM positivo apresentaraacute presenccedila de distorccedilatildeo no
halo de inibiccedilatildeo de ertapenem devido ao crescimento da cepa Ecoli ATCC 25922 ao
longo da estria da cepa teste para dentro dos limites do halo de inibiccedilatildeo Jaacute o THM
negativo teraacute ausecircncia de crescimento da cepa Ecoli ATCC 5922 ao longo da estria
da cepa teste para dentro dos limites do halo de inibiccedilatildeo do disco de ertapenem
Este resultado estaacute representado na figura 6
36
Figura 6 Interpretaccedilatildeo resultado do Teste de Hodge Modificado
(adaptado CDC 2004) Teste positivo na estria da cepa teste na parte superior
da placa teste negativo na estria da cepa teste na parte inferior da placa
Tendo positivo como resultado o paciente era um provaacutevel contaminado por
KPC As amostras entatildeo foram encaminhadas para a Fundaccedilatildeo Osvaldo Cruz
(FIOCRUZ) para confirmaccedilatildeo final As amostras finalmente confirmadas como
positivas para KPC foram isoladas e guardadas no banco de cepas cliacutenicas do
hospital Apoacutes a autorizaccedilatildeo do CEP amostras das cepas foram transferidas para
meio de transporte Stuard em caixa teacutermica fechada em baixa temperatura e
levadas para o laboratoacuterio de microbiologia cliacutenica da universidade
No laboratoacuterio da universidade as amostras foram separadas e realizadas
repiques em meios MacConkey e incubadas por 24h As colocircnias caracteriacutesticas
foratildeo isoladas em caldo BHI e mantidas em shaker a 37oC por 2h Apoacutes isto foram
executadas as anaacutelises a seguir
Os isolados de Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases foram
submetidos agrave extraccedilatildeo de DNA e posterior sequumlenciamento para identificaccedilatildeo dos
genes de resistecircncia blaKPC de 1 a 13 e identificaccedilatildeo do gene universal Os
pacientes de onde os materiais bioloacutegicos contendo as Enterobacteacuterias produtoras
de carbapenemases foram os isolados foram investigados quanto aos aspectos
epidemioloacutegicos e cliacutenicos
37
4 5 Extraccedilatildeo de DNA bacteriano
A extraccedilatildeo de DNA bacteriano foi realizada utilizando o kit NucleoSpin
Plasmidreg (MN) Antes de iniciar a extraccedilatildeo foi feito a preparaccedilatildeo das soluccedilotildees
reagentes materiais e amostras (vortexando) colocou-se em banho-maria agrave 50ordmC o
tampatildeo AW Partiu-se de colocircnias isoladas cultivadas que sofreram passagem em
meio LB liacutequido por 12h Adicionou-se 15 mL da amostra no tubo eppendorf
centrifugou por 5 minutos descartou o sobrenadante (com cuidado para natildeo
descartar o Pellet) Repetiu-se este procedimento por mais trecircs vezes completando-
se o volume de 6mL Foram adicionados 250microL do tampatildeo Resuspension Buffer A1
encostando a ponteira no Pellet e misturando (este tampatildeo tem como funccedilatildeo
separar a formaccedilatildeo de grumos celulares) Apoacutes isso homogeneizou e vortexou os
tubos eppendorfs Apoacutes isso foram adicionados 250microL do tampatildeo Lysis Buffer A2
homogenizou e deixou descansar por 5 minutos (esta etapa eacute importante para a lise
da parede e da membrana celulares e liberaccedilatildeo do conteuacutedo da ceacutelula)
Passado o tempo de descanso foi adicionado 300microL do tampatildeo
Neutralization Buffer A3 homogeneizou e centrifugou por 10 minutos (este tampatildeo
iraacute retirar as proteiacutenas que envolvem o DNA e voltaraacute com o pH para proacuteximo de 8
impedindo que a soluccedilatildeo de lise facilite a quebra das ligaccedilotildees covalentes do aacutecido
nucleacuteico) Em seguida enumeraram-se os tubos contendo filtros com siacutelica
transferiu-se o sobrenadante para o filtro e centrifugou por 5 minutos Descartou-se
o que foi filtrado adicionou 500microL do tampatildeo AW (banho-maria) centrifugou por 2
minutos Novamente foi descartado o filtrado Adicionou-se 600microL do tampatildeo A4
centrifugou por 2 minutos e descartou o filtrado (os tampotildees AW e A4 contecircm
isotiocianato de guanidina em concentraccedilotildees crescentes para facilitar a adsorccedilatildeo
do DNA na siacutelica e retirada das outras biomoleacuteculas da amostra) Foi feita outra
centrifugaccedilatildeo com o tubo vazio Apoacutes isto o filtro foi trocado para outro eppendorf
definitivo onde foi adicionado 50microL do tampatildeo Elution Buffer AE (este tampatildeo
favorece a eluiccedilatildeo do DNA) centrifugou por 2 minutos descartou o filtro e
armazenou as amostras em freezer -20ordmC
38
4 6 Iniciadores e reaccedilatildeo de PCR
Os iniciadores universais para o gene blaKPC foram desenhados baseados
em sequumlecircncias conservadas apresentadas pelos sub-grupos de genes que
codificam a enzima carbapenemase de klebsiella pneumoniae (YIGIT et al 2001)
Baseado na sequumlecircncia para o blakpc-1 depositada no GenBank
(AF2975541) o oligonucleotiacutedio (oligo) iniciador direto (5-
ATGTCACTGTATCGCCGTC-3rsquo) foi desenhado para reconhecer a sequumlecircncia
blaKPC na posiccedilatildeo (131149) enquanto que o iniciador reverso (5-
TTACTGCCCGTTGACGCC-3rsquo) foi reconhecido na posiccedilatildeo (9951012) As anaacutelises
baseadas em alinhamento de sequumlecircncias mostraram que o par de iniciadores
blaKPC podem detectar os alelos de 1 a 13 do gene blaKPC conforme a tabela 2
Tabela 2 Nuacutemero de acesso ao GenBank dos alelos blaKPC e seus
microrganismos originais
Nuacutemero de
Acesso GenBank
Microrganismo Alvo
AF2975541 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-1
GU0862251 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-2
HQ2589341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-2-like
AB5577341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC -3
EU4473041 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-4
EU4002222 Pseudomonas
aeruginosa
blaKPC-5
EU5555341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-6
EU7297271 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-7
39
FJ2344121 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-8
FJ624872 Escherichia coli blaKPC-9
GQ1403481 Acinetobacter
baumannii
blaKPC-10
HM0669951 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-11
HQ3428891 Enterobacter cloacae blaKPC-12
HQ3428901 Enterobacter cloacae blaKPC-13
As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo de blaKPC foram realizadas em um
primeiro tempo de desnaturaccedilatildeo em que foi 94ordmC por 5 minutos seguido de 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 58 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 90 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 78ordmC por 8 minutos Aleacutem das amostras foi utilizado um
controle negativo
A PCR do blaKPC foi realizada utilizando os componentes para o volume da
reaccedilatildeo de 25 microL citados na tabela 3 A banda do tamanho do produto de PCR foi de
881 pares de bases (pb) o que corresponde ao plasmiacutedeo
Tabela 3 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do
gene blaKPC
Reagente Volume
DNA molde 4 microL
Tampatildeo Taq 25 microL
MgCl2 075 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP
2 microL
Oligo F 1 microL
Oligo R 1 microL
Taq DNA polimerase 05 microL
Aacutegua MiliQ 1335 microL
40
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
Baseado na sequumlecircncia para o gene 16S rRNA em que o oligonucleotiacutedio
Universal iniciador direto foward (5-CCAGCAGCCGCCGTAATACG-3rsquo) foi
desenhado para reconhecer a sequumlecircncia universal na posiccedilatildeo 1513 enquanto que o
iniciador reverso (5-ATCGGYTACCTTGTTACGACTTC-3rsquo) foi reconhecido na
posiccedilatildeo 1491 foram realizadas PCRrsquos As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo deste
gene foram realizadas nos seguinte tempos separaccedilatildeo 94ordmC por 10 minutos 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 55 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 120 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 72ordmC por 10 minutos
A PCR do gene 16S rRNA foi realizada utilizando os componentes para o
volume da reaccedilatildeo de 25microL citados na tabela 4 A banda do tamanho do produto de
PCR foi de 996 pb correspondente aacute regiatildeo ribossomal capaz de amplificar todas
as espeacutecies
Tabela 4Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do gene
universal
Reagente (quantidade
concentraccedilatildeo do estoque)
Volume
DNA molde 10 ng 4 microL
Tampatildeo Taq 10 x 25 microL
MgCl2 50mM 125 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP 25 mM
125 microL
Oligo F 10microM 05 microL
Oligo R 10microM 05 microL
Taq DNA polimerase 5UmicroL 04 microL
Aacutegua Miliq 146 microL
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
41
O termociclador utilizado para os experimentos foi o LifeTouch da BIOER
4 7 Digestatildeo
Para realizaccedilatildeo da digestatildeo foi utilizada a enzima BshF I (Hae III) EN- 1105
tamanho 7000 units concentraccedilatildeo 10 unitsmicroL fonte Bacillus sphaericus empresa
Jena bioscienceUtilizaram-se os componentes para o volume de 50microL da reaccedilatildeo
citados na tabela 5
Tabela 5 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da digestatildeo do gene
universal
Reagente Volume
Produto de PCR 10 microL
Enzima BshF I 01 microL
Tampatildeo (10x) 5 microL
Aacutegua Miliq 349 microL
Total (em cada ependorff) 50 microL
Valores para 1 digestatildeo
Os ependorffs foram colocados por 30 minutos em banho-maria a 37ordmC Apoacutes
isso fez-se a corrida das amostras em gel de agarose para verificaccedilatildeo do resultado
(LU et al 2000)
4 8 Eletroforese em gel de agarose
Os produtos de DNA PCR e digestatildeo foram analisados em gel de agarose
2 O tempo de corrida do gel eacute de aproximadamente 1hora e 30minutos sendo
que no comeccedilo foi usada agrave voltagem de 50 V e apoacutes comeccedilar a correr o gel
aumentou a voltagem para 100 v Utilizou-se o marcador de 100pb (pares de bases)
Foi adicionado 3microL de corante Bromophenol (que tem a funccedilatildeo de fazer uma ligaccedilatildeo
na amostra de DNA e permitir a visualizaccedilatildeo da corrida no gel de agarose) em 7microL
de amostra tanto de DNA quanto de PCR Para o preparo do gel foi utilizado TBE
42
(Tris- Aacutecido Boacuterico) agarose e brometo de etiacutedio (sua funccedilatildeo eacute de corante para o gel
e permitir a visualizaccedilatildeo do DNA quando colocado agrave luz ultravioleta) Para o oligo
blaKPC a banda da amplificaccedilatildeo foi em 881ppb correspondendo ao plasmiacutedeo Jaacute
o oligo Universal foi em 996 pb
4 9 Descarte de resiacuteduos
Todos os materiais utilizados nos ensaios foram de uso uacutenico e manipulados
em cacircmaras de seguranccedila bioloacutegica classe II Apoacutes o uso foram colocados em
soluccedilatildeo desinfetantes (hipoclorito a 1) e em seguida autoclavados a 127oC por 20
min em sacos apropriados para autoclavaccedilatildeo Apoacutes a finalizaccedilatildeo do ciclo de
esterilizaccedilatildeo os sacos contendo o material descartaacutevel foram colocados em
recipientes de coleta da empresa responsaacutevel pela coleta de materiais bioloacutegicos
produzidos no laboratoacuterio de microbiologia Todos os procedimentos seguiram a
normativa RDC-ANVISA 3062004 sobre o descarte de resiacuteduos de serviccedilo de
sauacutede
4 10 Aspectos epidemioloacutegicos e cliacutenicos
Os aspectos cliacutenicos e epidemioloacutegicos foram investigados por meio de
prontuaacuterios dos pacientes portadores de enterobacteacuterias produtoras de
carbapenemases e envolveram topografia mais provaacutevel do foco infeccioso a
enfermidade motivadora da internaccedilatildeo o desfecho cliacutenico a idade e o tempo de
internaccedilatildeo
4 12 Anaacutelises eepidemioloacutegicas
As anaacutelises foram realizadas com o pacote estatiacutestico SPSS versatildeo 200
Para verificar quais variaacuteveis referentes aos dados epidemioloacutegicos e
microbioloacutegicos influenciaram no desfecho verificou- se a diferenccedila meacutedia das
variaacuteveis idade e tempo de internaccedilatildeo em cada grupo O teste estatiacutestico utilizado foi
o teste t de Student apoacutes se executar o teste de normalidade de Shapiro-Wilk Para
as variaacuteveis sexo perfil microbioloacutegico das enterobacteacuterias produtoras de
43
carbapenemases foi avaliada a associaccedilatildeo com o desfecho por meio do teste Exato
de Fisher O niacutevel de significacircncia adotado foi de 5
4 13 Preceitos eacuteticos
Este projeto estaacute inserido em um projeto maior denominado ldquoEpidemiologia
cliacutenica e caracterizaccedilatildeo molecular do Acinetobacter Baumannii resistente a
antibioticoterapia em pacientes internado em hospitais do Sistema Uacutenico de Sauacutederdquo
que foi submetido ao Comitecirc de Eacutetica em Pesquisa da Secretaria do Estado de
Sauacutede do Distrito Federal (SESDF) e emitido parecer aprovado pelo protocolo nordm
23109 (anexo)
44
5 RESULTADOS
51 Anaacutelise molecular
Para a amplificaccedilatildeo com o oligo blaKPC foram amplificadas amostras
que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 881 pb correspondente ao
plasmiacutedeo A anaacutelise da amplificaccedilatildeo da regiatildeo do gene blaKPC mostrou que
apenas a amostra A10 natildeo amplificou isso demonstra que esta amostra natildeo
possuiacutea o gene de resistecircncia
5 1 1 Gene blaKPC
Figura 7 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 881 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
A amostra A3 natildeo amplificou no primeiro momento entatildeo foi realizado
novamente a PCR e corrida de gel obtendo entatildeo a amplificaccedilatildeo da amostra como
apresentado na figura 8
45
Figura 8 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC da
mostra A3 estudada A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo de 881
pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 1 2 Gene 16S rRNA
Para a amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA utilizou-se o oligo universal Foram
amplificadas amostras que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 996 pb
Figura 9 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
46
Segundo Lu et al (2000) a digestatildeo com a enzima HaeIII deste amplicons de
16S rRNA devolveriam bandas com perfis entre 150 a 200 pb No gel abaixo eacute
possiacutevel evidenciar que este perfil ocorreu com o predomiacutenio de bandas na altura
de 200pb
Figura 10 Gel de agarose a 2 da digestatildeo do amplicon do gene 16S
rRNA das amostras com a enzima HaeIII evidenciando diversos fragmentos
proacuteximos a 200 pb A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo ribossomal
de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 2 Anaacutelises epidemioloacutegicas
5 2 1 Sexo
No total foram detectados 17 isolados de KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 onde a maior a prevalecircncia foi
detecatada em amostras de pacientes do sexo masculino (53) do que no sexo
feminino (47)
47
Figura 11 Isolado de KPC segundo sexo dos 17 pacientes investigados
no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 2 Desfecho cliacutenico
Em 17 isolados de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo
de 2010 aacute 2011 a porcentagem de pacientes que foram a oacutebito (59) foi maior que
a de pacientes que tiverm alta (41)
Figura 12 Isolado de KPC segundo desfecho cliacutenico dos 17 pacientes
investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
48
5 2 3 Local da coleta
Dos 17 episoacutedios detectados de infecccedilatildeo por KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 a infecccedilatildeo em swab retalfoi mais
frequente (47) seguida de ponta de cateacuteter (18) e secreccedilatildeo traqueal (12)
Figura 13 Isolados de KPC segundo local da coleta da amostra nos 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 4 Microorganismo
O microorganismo mais encontrado foi a Klebsiella pneumoniae (82)
seguida da Enterobacter clocae (12) e Serratia marcescens (6) dos 17 isolados
de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 Isto afirma o
fato de a sigla KPC ser utilizada de forma errocircnea aacute Klebsiella pneumoniae visto
que a evidecircncia dela eacute maior em relaccedilatildeo as outras cepas
49
Figura 14 Isolado de KPC segundo microrganismo encontrado em 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 5 Relaccedilotildees variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana e desfecho
cliacutenico
Tabela 6 ndash Distribuiccedilatildeo do perfil geneacutetico sexo coleta tipificaccedilatildeo de
microrganismos e anaacutelise da resistecircncia bacteriana segundo o desfecho
cliacutenico Brasiacutelia-DF 2010 a 2011
Variaacutevel Resultado
Desfecho
Alta Oacutebito
N N P
Gene 16S rRNA Positivo 7 1000 10 1000
NA Gene blaKPC Positivo 6 857 10 1000
Negativo 1 143 0 00 0218 Sexo Feminino 2 286 6 600
Masculino 5 714 4 400 0201 Local da coleta Fundo saco de
Douglas 1 143 0 00
Hemocultura 0 00 1 100 0463 Ponta de cateter 1 143 2 200
Sec TraquealBrocircnquica
0 00 1 100
50
Secreccedilatildeo traqueal 2 286 0 00
Swab retal 3 429 5 500
Urina 0 00 1 100
Microrganismo Enterobacter cloacae (KPC)
1 143 1 100
Klebsiella pneumoniae
6 857 8 800
0416 Serratia
marcescens 0 00 1 100
Teste de Hodge Hodge positivo 7 1000 10 1000
NA Amicacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 1 100 0848 resistente 0 00 1 100
sensiacutevel 2 286 3 300
Amoxicilina Aacutecido Clavulacircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Ampicilina Sulbactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ampicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Aztreonan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefazolina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Cefoperazona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Cefotaxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefoxitina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0509 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 2 286 4 400
Ceftazidima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cetriaxona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 3 429 5 500 0772 Cefalotina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ciprofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772
51
resistente 3 429 5 500
Claritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Clindamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Eritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Gentamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0942 resistente 2 286 3 300
sensiacutevel 1 143 2 200
Imipenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 0 00 2 200 0193 Resistente 1 143 3 300
sensiacutevel 2 286 0 00
Nitrofurantoiacutena sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Norfloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Oxacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Penicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Piperacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Rifampicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tetraciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Ticarcilina Aacutecido Clavulocircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0688 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 3 429 4 400
Tobramicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Trimetoprima Sulfametoxazol
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0112 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 2 286 0 00
Vancomicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tigeciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediario 0 00 1 100 0211 natildeo testado 1 143 4 400
resistente 2 286 0 00
52
Cefepime sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefuroxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Levofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Piperacilina Tazobactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Ertapenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Meropenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0223 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 1 143 0 00
Cefotetan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 sensiacutevel 0 00 1 100
Gemifloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 7 700 0585 natildeo testado 3 429 3 300
Desfecho
Alta Oacutebito
Meacutedia Erro
padratildeo Meacutedia Erro
padratildeo p
Idade 58 9 59 5 0991
Tempo Internaccedilatildeo (dias)
50 13 46 12 0571
n= 17 p(lt 005) NA natildeo se aplica
53
6 DISCUSSAtildeO
Nos uacuteltimos anos houve um aumento na incidecircncia de bacteacuterias
multirresistentes aos antimicrobianos no ambiente hospitalar tornando isto um
problema mundial de sauacutede puacuteblica (HULSCHER et al 2010) Quando se trata
principalmente de bacilos Gram negativos a frequumlecircncia destas bacteacuterias eacute ainda
maior em paiacuteses da Ameacuterica Latina quando comparada a paiacuteses desenvolvidos
(GALES etal 2012)
De acordo com dados do ldquoMeropenem Yearly Susceptibility Test Information
Collectionrdquo (MYSTIC) ocorreu nos Estados Unidos um aumento na susceptibilidade
de K pneumoniae nos uacuteltimos anos graccedilas a praacuteticas de controle de disseminaccedilatildeo
de amostras resistentes(RHOMBERG P R et al 2009) O aumento crescente da
prevalecircncia destes microrganismos foi proporcional ao aumento da dependecircncia do
uso de antibioacuteticos carbapenecircmicos considerados como a opccedilatildeo terapecircutica para o
tratamento de infecccedilotildees por bacilos Gram negativos multi-resistentes (LIVERMORE
2012) Isto afeta diretamente as opccedilotildees de tratamento sobrando poucas alternativas
para a terapecircutica que incluem colistina (polimixina E) e tigeciclina que apresentam
respectivamente problemas em termos de toxicidade e eficaacutecia (LIVERMORE et
al 2011) Um dos efeitos adversos mais importantes das poliminas B e E por
exemplo satildeo a neurotoxicidade e nefrotoxicidade (MENDES C A C et al2009 )
Devido agrave resistecircncia ser usualmente de natureza plasmidial e portanto de
maior disseminaccedilatildeo especialmente quando carreadas por K pneumoniae
microrganismo com uma notoacuteria capacidade para acumular e transferir plasmiacutedeos
com determinantes para resistecircncia o nuacutemero de casos detectados pelo
fenoacutetipogenoacutetipo blaKPC eacute bastante preocupante (MONTEIRO et al 2009)
Comparada com outras bacteacuterias hospitalares a transmissatildeo de clones
multirresistentes de K pneumoniae eacute maior e podem natildeo ser controladas pelos
meacutetodos de controle de infecccedilatildeo hospitalar (PAAUW et al 2007) A forma
plasmidial para transferecircncia da resistecircncia adicionada a este grande potencial para
disseminaccedilatildeo de clones resistentes eacute preocupante visto que apoacutes surtos muitas
vezes pode se tornar endecircmica Jaacute eacute uma realidade a disseminaccedilatildeo desta bacteacuteria
54
entre pacientes hospitais paiacuteses e ateacute mesmo continentes (WOODFORF et al
2010 ROGERS et al 2011)
As chances de surtos satildeo maiores em paiacuteses com poucos recursos devido agrave
maior carecircncia de praacuteticas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees hospitalares e o
uso irracional de antimicrobianos de forma empiacuterica e inadequada (KUMARASAMY
et al 2010) Ateacute o momento os mecanismos de resistecircncia aos cabapenecircmicos
geralmente encontrado eram a produccedilatildeo de ESBL (CTX-M) somada aacute perda de
porina (CARVALHAES et al 2010) Foi notado a partir do ano de 2008 um
aumento no nuacutemero de K pneumoniae produtoras de KPC-2 apresentando outra
forma de resistecircncia (GALES 2012)
Um estudo mostrou que o perfil do paciente colonizado ou infectado por KPC
foi de um paciente entre os 33 e os 82 anos de idade internado haacute mais de 1
semana no hospital A mortalidade geral nos uacuteltimos anos ficou em torno de 7
sendo que dos 77 pacientes estudados 32 (415) pacientes evoluiacuteram para oacutebito
evidenciando a alta morbi-mortalidade associada (ALVES A P et al 2013)
Em estudo com 2316 pacientes avaliados a populaccedilatildeo de sexo masculino foi
de 526 idade meacutedia global de 53 anos (mediana de 55 anos) permanecircncia meacutedia
de 58 dias (mediana de 3 dias) (OLIVEIRA A C et al 2010) Outros trabalhos
apresentaram ausecircncia de significacircncia entre sexoidade e o desenvolvimento de
infecccedilotildees por microrganismos resistentes (PERES-BOTA D et al 2003 COLPAN
A et al 2005 COELLO R et al 1997)
Outro estudo utilizou um total de 30 amostras sendo elas isoladas de urina
escarro secreccedilatildeo pleural ponta de cateter aspirado traqueal e hemocultura A mais
prevalente foi em urina (40) Entre as 30 cepas analisadas a maior porcentagem
foi da cepa Klebsiella pneumoniae (70) Enterobacter sp (133) Klebsiella
ozaenae (10) Escherichia coli (333) e Klebsiella oxytoca (333)
(DIENSTMANN R et al 2010) Nos Estados Unidos a enzima KPC jaacute se tornou
endecircmica Foi realizada uma pesquisa em dois hospitais de Nova York onde
testaram 602 amostras e 45 apresentaram algum mecanismo de resistecircncia
sendo apenas 33 confirmadas por biologia molecular como KPC-2 (BRATU et
al 2005)
55
Estudo sobre os tipos de ESBL feito no Japatildeo apresentou o tipo Toho-1 como
o mais prevalente nessa pesquisa Ateacute o ano de 2000 ano em que foi publicado tal
estudo este era o primeiro relatoacuterio no Japatildeo para identificar derivados de ESBLs
como tipo de SHV e TEM entre E coli e K pneumoniae Em especial o tipo SHV- 12
foi identificado com uma maior frequumlecircncia Estes resultados indicam que tipos
distintos de ESBLs que satildeo diferentes em sua especificidade de substrato e origem
geneacutetica coexistem no Japatildeo Isto mostra a importacircncia de caracterizar genoacutetipos
distintos de ESBLs e de estar em alerta continuamente para as tendecircncias de
ESBLs no Japatildeo aleacutem da necessidade de uma interpretaccedilatildeo uniforme utilizando as
diretrizes do CSLI para relatar cepas produtoras de ESBL Aleacutem da detecccedilatildeo de
ESBLs satildeo necessaacuterias mais informaccedilotildees tais como o perfil de sensibilidade
especiacutefica para diversas β-lactacircmicos e o local da infecccedilatildeo Esses fatores satildeo
essenciais para a escolha adequada de antibioacuteticos (YAGI T et al 2000)
No ano de 2004 uma pesquisa avaliou a produccedilatildeo de uma enzima de
hidroacutelise de carbapenecircmicos atraveacutes da teacutecnica de sequumlenciamento foi revelado
um novo membro da famiacutelia KPC designado KPC- 3 Pesquisadores encontraram
em um mutante de K pneumoniae uma substituiccedilatildeo de um gene associado com
resistecircncia a Imipenem mas essa substituiccedilatildeo foi considerada improvaacutevel na
contribuiccedilatildeo da resistecircncia aos carbapenecircmicos da espeacutecie estudada Aleacutem da
resistecircncia aos carbapenecircmicos estes isolados eram em sua maioria resistentes agraves
cefalosporinas penicilinas e aminoglicosiacutedeos Usando estudos de transformaccedilatildeo
conjugaccedilatildeo e hibridaccedilatildeo localizaram o alelo blaKPC em plasmiacutedeo aleacutem disso
mostraram que esse alelo tambeacutem carregava uma resistecircncia aos aminoglicosiacutedeos
A transferecircncia das enzimas KPCs foi demonstrada in vitro tanto neste como em
outros estudos pode ser que os plasmiacutedeos que fazem esta transferecircncia estavam
comeccedilando a se espalhar no ambiente cliacutenico resultando na multiresistecircncia dessas
estirpes (WOODFORD et al 2004)
O presente estudo apresentou um vieacutes quanto aos resultados dos testes de
susceptibilidade microbiana Observou-se que natildeo foi encontrado resultado deste
teste em algumas amostras o que natildeo cooperou para um estudo mais preciso
futuros estudos quanto agraves amostras e um melhor acompanhamento deste tipo de
patologia Poreacutem mesmo sem algumas amostras com este resultado disponiacutevel foi
56
confirmada a presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos
carbapenecircmicos por meio dos genes de resistecircncia blaKPC e 16S rRNA que as
amostras apresentaram em sua maioria serem portadoras Quanto aos resultados
estatiacutesticos nenhuma das variaacuteveis apresentou significacircncia estatiacutestica (p gt 005)
mostrando assim que estas variaacuteveis isoladas natildeo foram o fator determinante para
o desfecho cliacutenico de alta ou oacutebito
57
7 CONCLUSAtildeO
Os genes blaKPC e 16S rRNA foram caracterizados confirmando a a
presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos carbapenecircmicos
Houve uma maior prevalecircncia da cepa K pneumoniae e isto confirma outros
estudos que apresentam a maior prevalecircncia desta cepa em amostras com KPC
Aleacutem disso isso justifica a forma popular da K pneumoniae ser chamada de KPC
enquanto que na verdade KPC eacute uma enzima podendo estar presente em outras
cepas como Enterobacter clocae tambeacutem apresentada no presente estudo O
desfecho cliacutenico de oacutebitos maior que 50 eacute um possiacutevel indicador sobre a
necessidade de se realizar um teste raacutepido para identificaccedilatildeo de KPC visando
iniciar o mais raacutepido possiacutevel o tratamento afim de diminuir a mortalidade por esta
infecccedilatildeo
Nenhuma das variaacuteveis isoladamente estaacute relacionada ao desfecho cliacutenico
oacutebito ou alta pois natildeo apresentaram relevacircncia estatiacutestica O presente estudo
mostrou que haacute presenccedila da bacteacuteria nas amostras de pacientes do hospital
estudado podendo entatildeo afirmar que este tipo de bacteacuteria se encontra tambeacutem
presente em ambiente hospitalar O uso irracional de antimicrobiano eacute demonstrado
de forma indireta quando foi apresentado atraveacutes do Teste de Hodge Modificado
uma resistecircncia de 100 aos antibioacuteticos carbapenecircmicos Isto tambeacutem reflete na
terapecircutica sendo que pacientes portadores de bacteacuterias resistentes aos
antibioacuteticos carabepecircmicos tem uma escassa opccedilatildeo de tratamento e as opccedilotildees
apresentam problemas quanto agrave toxicidade e eficaacutecia
58
REFEREcircNCIAS
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Mecanismos
de resistecircncia bacteriana aos antimicrobianos Disponiacutevel em
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controleopas_
webmodulo3mec_sitiohtmgt Acesso em 25 de abril de 2014
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Nota teacutecnica nordm
012013 medidas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees por enterobacteacuterias
multiresistentes Acesso em 17 de abril de 2013
ALBA J et al Kinetics study of KPC-3 a plasmid-encoded class A
carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase Antimicrob Agents Chemother
Nov49(11)4760-2 2005
ALVES A P et al Nosocomial infections by KPC-producing enterobacteria in
a tertiary hospital in Southern Brazil Revista da AMRIGS Porto Alegre 57 (3) 213-
218 jul-set 2013
ALVES A et al Tipagem Geneacutetica de Microrganismos Lab De Diversidade
Microbiana Centro de Biologia Celular Dep de Biologia U de Aveiro 3810-193
Aveiro- 2003
BELL J M et Al Prevalence and significance of a negative extended-
spectrum beta-lactamase (ESBL) confirmation test result after a positive ESBL
screening test result for isolates of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae
results from the SENTRY Asia-Pacific Surveillance Program J Clin Microbiol
May45(5)1478-82 2007
BRATU S et al Detection of KPC carbapenem-hydrolyzing enzymes in
Enterobacter spp from Brooklyn New York Antimicrob Agents Chemother v 49 n
2 p 776-8 2005
59
BRATU S et al Emergence of KPC-possessing Klebsiella pneumoniae in
Brooklyn New York epidemiology and recommendations for detection Antimicrob
Agents Chemother v 49 n 7 p 3018-20 2005
BRATU S et al Rapid spread of carbapenem-resistant Klebsiella
pneumoniae in New York City Arch Intern Med v 165 p 1430-5 2005
CAMARGO C F et al Aplicaccedilatildeo das teacutecnicas de pcr e suas teacutecnicas
derivadas em diagnoacutestico molecular Disponiacutevel em
ltfileDUnB10C2BA20semestreArtigosPCR-
20CLEYTON20FLORENCIO20DE20CAMARGO20E20PAULO20ROB
ERTO20QUEIROZpdfgtgt Acesso em 08 de abril de 2014
CARVALHES C G et al Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting
carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive
results Journal of Antimicrobial Chemotherapy v 65 n2 p 249-251 2010
CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION- CDC Modified
Hodge Test for Carbapenemase Detection in Enterobacteriaceae 2004
CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE Methods for
dilutionantimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically Approved
standard M7ndashA7 7th ed CLSI Wayne PA 2011
COELLO R et al Risk factors for developing clinical infection with methicillin-
resistant Staphylococcus aureus (MRSA) amongst hospital patients initially only
colonized with MRSA J Hosp Infect 19973739-46
COLPAN A et al Evaluation of risk factors for mortality in intensive care
units A prospective study from a referral hospital in Turkey Am J Infect Control
200533(1)42-7
60
CORNAGLIA G et al Living with ESBLs Introduction Clinical Microbiology
and Infection 14 Suppl 1 1-2 2008
COTRIM E R et al Klebsiella pneumoniae carbapenemase ndash KPC em
Enterobacteriaceae o desafio das bacteacuterias multirresistentes Poacutes em revista do
centro universitaacuterio Newton Paiva 12012 - ediccedilatildeo 5 - issn 2176 7785
DESHPANDE L M et al Occurrence and characterization of
carbapenemase-producing Enterobacteacuteriaceae report from the SENTRY
Antimicrobial Surveillance Program (2000-2004) Microb Drug Resist 12(4)223-30
2006
DIAS D J A Estudos dos principais mecanismos de resistecircncia aos
antibioacuteticos β-lactacircmicos em bacteacuterias patogecircnicas gram negativas 2009 100 f
Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Geneacutetica Molecular e Biomedicina) ndash Faculdade de
Ciecircncias e Tecnologia Universidade de Nova Lisboa Lisboa
DIENSTMANN R et al Avaliaccedilatildeo fenotiacutepica da enzima Klebsiella
pneumoniae carbapenemase (KPC) em Enterobacteriaceae de ambiente hospitalar
J Bras Patol Med Lab v 46 n 1 p 23-27 fevereiro 2010
ENDIMIAMI A et al Emergence of blaKPC-containing Klebsiella
pneumoniae in a long-term acute care hospital a new challenge to our healthcare J
Antimicrob Chemother 64 1102-1110 Nov 2009
FALAGAS M E et al Extended-spectrum beta-lactamase producing
organisms The Journal of Hospital Infection 73 (4) pp 345-54 2009
FONTANA C et al Emergence of KPC-producing Klebsiella pneumoniae in
Italy BMC Rev Notes 3 40 2010
61
GALES A C et al Antimicrobial resistance among Gram-negative bacilli
isolated from Latin America results from Sentry Antimicrobial Surveillance Program
(Latin America 2008-2010) Diagnostic Microbiology and Infectious Disease v 3 n
4 p 354 -360 2012
GUPTA N et al Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Epidemiology
and Prevention HEALTHCARE EPIDEMIOLOGY Clinical Infectious Diseases
201153(1)60ndash67 Published by Oxford University Press on behalf of the Infectious
Diseases Society of America 2011
HARBOTTLE H et al Genetics of antimicrobial resistance Anim Biotechnol
n17 p111-124 2006
HENRIQUE W N et al RESISTEcircNCIA BACTERIANA Uniatildeo das
Faculdades Alfredo NasserInstituto de Ciecircncias da Sauacutede Disponiacutevel em lt
httpwwwfaculdadealfredonasseredubrfilespesquisaposter20HENRIQUE20
Wilker20Natividade20SANTIAGO20Silvania20CAVALCANTI20DSP
20ResistC3AAncia20Bacterianapdfgt Acesso em 17 marccedilo 2014
HULSCHER M E J I et al Antibiotic prescribing in hospital a social and
behavioral scientific approach The Lancet Infectious Diaseases v 10 n 3 p 167-
165 2010
KIDWAI M SAPRA P BHUSHAN KR Synthetic strategies and medicinal
properties of beta-lactams Curr Med Chem 1999 695-215
KUMARASAMY K K et al Emergence of a new antibiotic resistance
mechanism in India Pakistan and the UK a molecular biological and
epidemiological stuy The Lancet Infectious Diseases v10 n 9 p 597- 602 2010
LINCOPAN N et al Enterobacteacuteria producing extended-spectrum β-
lacatamases and IMP-1 Metalo-β-lactamases isolated from Brazilian hospitals J Med
62
Microbiol 7 1-3 2006
LINCOPAN N et al First Isolation of Metalo-β-Lacatamase-Producing
Multiresistant Klebsiella pneumoniae from a patient in Brazil J Clin Microbiol 43(1)
516-519 2005
LIVERMORE D M et al What remains against carbapenem- resistant
Enterobacteriaceae Evaluation of choramphenicol ciprofloxacin colistina
fosfomycin minocycline nitrofurantoin temocilin and tigecycline International
Journal of Antimicrobial Agents v 37 n 5 p 415- 459 2011
LIVERMORE D M Fourten years in resistance International Journal of
Antimicrobial Agents v 39 283- 294 2012
LIVERMORE D M Bacterial resistance to carbapenems Adv Exp Med Biol
1995 39025-47
LIVERMORE D M Bacterial resistance origins epidemiology and impact
Clin Infect Dis 36S11-S23 2003
LIVERMORE D M et al Carbapenemases a problem in waiting Curr
Opin Microbiol 2000 3489-95
LU et al Universal pcr for common bacterial pathogens J CLIN
MICROBIOL VOL 38 2000
LU et al Use of PCR with Universal Primers and Restriction Endonuclease
Digestions for Detection and Identification of Common Bacterial Pathogens in
Cerebrospinal Fluid Journal of Clinical Microbiology June 2000 p 2076ndash2080
MARSCHALL J Met al Presence of the KPC Carbapenemase Gene in
Enterobacteriaceae Causing Bacteremia and Its Correlation with In Vitro
Carbapenem Susceptibility J Clin Microbiol 47 239-241 Jan 2009
63
MARTINS WMBS et al Prevalecircncia do gene blaKPC em isolados cliacutenicos
de Enterobacteriaceae e natildeo fermentadores encontrados em amostras clinicas em
um hospital universitaacuterio do Recife X Jornada de ensino pesquisa e extensatildeo ndash
JEPEX 2010 ndash UFRPE Recife 18 a 22 de outubro
MENDES C A C et al Polimixinas Revisatildeo com ecircnfase na sua
nefrotoxicidade Rev Assoc Med Bras 2009 55(6) 752-9
MOHR J F 3rd Update on the efficacy and tolerability of meropenem in the
treatment of serious bacteacuterial infections Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S41-51
2008
MONTEIRO J et al First report of KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae
strains in Brazil Antimicrob Agents Chemother Jan53(1)333-4 2009
MOREIRA V C et al Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia a antibioacuteticos
Disponiacutevel em
lthttpwwwcpglsucgbr6mostraartigosSAUDEVANESSA20CARVALHO20M
OREIRApdfgt Acesso em 21 marccedilo 2014
NETIKUL T et al Emergence of novel blaKPC-12 and blaKPC-13 variants in
carbapenem non-susceptible Enterobacter cloacae a first report of blaKPC gene in
Thailand European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases May
S372 2011
NETO V A et al Antibioacuteticos na praacutetica Meacutedica 6ordf Ediccedilatildeo Editorial
SarverSP Brasil 2007
NICOLAU D P Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of
meropenem Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S32-40 2008
64
OLIVEIRA A C et al Resistecircncia bacteriana e mortalidade em um centro de
terapia intensiva Rev Latino-Am Enfermagem nov-dez 2010
PAAUW A et al Failure to control an outbreak of qnrA 1-positive multidrug-
resistant Enterobacter clocae despite adequate implementation of recommended
infection control measures Journal of Clinical Microbiology v 45 n 5 p 1420-1425
2007
PATERSON D L et al Extended-Spectrum Beta-Lactamases a Clinical
Update Clinical Microbiology Reviews v 18 p 657-686 2005
PEIRANO G et al Carbapenem-hydrolysing beta-lactamase KPC-2 in
Klebsiella pneumonia isolated in Rio de Janeiro Brazil J Antimicrob Chemother Nov
20 2009
PERES-BOTA D et al Are infections due to resistant pathogens associated
with worse outcome in critically ill patients J Infect 200347(4)307-16
PIDDOCK L J V Clinically relevant chromosomally encoded multidrug
resistance effl ux pumps in bacterial Clin Microbiol Rev n19 p382-402 2006
PITOUT J D D et al Emergence of Enterobacteriaceae producing
extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) in the community J Antimicrob
Chemother May 56 2005
POSSEBON M I et al Resistecircncia bacteriana aos carbapenecircmicos
Bacterial resitence to carbapenems RBM rev bras med60(6)378380-378-382
jun 2003
QUEENAN A M et al Carbapenemases the versatile beta-lactamases
Clin Microbiol Rev Jul20(3)440-58 2007
65
RHOMBERG P R et al Summary trends for the meropenem yearly
susceptibility test information collection program a 10- year experience in the United
States (1999-2008) Diagnostic Microbiology and Infectiois Disease v 65 n4 p
414-426 2009
ROBLEDO I E et al Detection of KPC in Acinetobacter spp in Puerto Rico
J Antimicrob Agents Chemother 54 1354-1357 Mar 2010
ROGERS B A et al Country-to-country transfer os patients and the risk of
multi-resistant bacterial infection Clinical Infectious Disease v53 n1 p49- 56
2011
SHAH A A et al Characteristics epidemiology and clinicalimportance of
emerging strains of Gram-negative bacilli producing extended-spectrum
betalactamases Research in Microbiology v 155 p 409-421 2004
TURNER P J Extended- Spectrum Beta-Lactamases Clinical Infectious
Diseases v 41 p 273-275 2005
WOLTER D J et al Phenotypic and Enzymatic Comparative Analysis
between the Novel KPC variant KPC-5 and Its Evolutionary Variants KPC-2 and
KPC-4 Antimicrob Agents Chemother Nov 17 2008
WOODFORD N et al Carbapenemases of Chryseobacterium
(Flavobacterium) meningosepticum distribution of blaB and characterization of a
novel Metalo-beta-lactamase gene blaB3 in the type strain NCTC 10016
Antimicrob Agents Chemother Jun44(6)1448-52 2000
WOODFORF N Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in
India Pakistan and the UK a molecular biological and epidemiological study The
Lancet Infectious Diseases v 10 n 9 p 597-602 2010
66
WOODFORD et al Outbreak of Klebsiella pneumoniae Producing a New
Carbapenem- Hydrolyzing Class A β-Lactamase KPC-3 in a New York Medical
Center Antimicrobial agents and chemotherapy Dec 2004 p 4793ndash4799 Vol 48
No 12
YAGI T et al A preliminary survey of extended-spectrum β-lactamases
(ESBLs) in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Japan
FEMS Microbiology Letters 184 (2000) 53-56
YIGIT H et al Novel carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase KPC-1 from
a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumonia J Antimicrob Agents
Chemother 45 (4) 1151-1161 (2001)
ZAVASCKI A P et al KPC-2- producing Enterobacter cloacae in two cities
from Southern Brazil Int J Antimicrob Agents Apr 28 2009
ZHANEL G G et al Comparative review of the carbapenecircmicos Drugs
67(7)1027-52 2007
67
ANEXOS
Sequumlecircncia do oligo blaKPC
Query 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
Query 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
Query 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
68
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
Query 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
Query 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
69
Query 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
Query 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
Query 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
70
Sbjct 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
Query 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
Query 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
Query 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
71
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Sbjct 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
Query 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
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|||||||
Sbjct 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
Query 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
72
Query 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
Query 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
Query 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
73
Sbjct 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
Query 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
Query 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
Query 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
74
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
Query 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
Query 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
75
Query 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
Query 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
||||
Sbjct 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
LOCUS AF297554 1377 bp
DNA linear BCT 26-MAR-2001
DEFINITION Klebsiella pneumoniae carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
gene complete cds
ACCESSION AF297554
VERSION AF2975541 GI10121874
76
KEYWORDS
SOURCE Klebsiella pneumoniae
ORGANISM Klebsiella pneumoniae
Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Enterobacteriaceae Klebsiella
REFERENCE 1 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH QueenanAM
AndersonGJ Domenech-SanchezA
BiddleJW StewardCD
AlbertiS BushK and TenoverFC
TITLE Novel carbapenem-hydrolyzing beta-
lactamase KPC-1 from a
carbapenem-resistant strain of
Klebsiella pneumoniae
JOURNAL Antimicrob Agents Chemother 45 (4)
1151-1161 (2001)
PUBMED 11257029
REFERENCE 2 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH AndersonGJ and
TenoverFC
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (19-AUG-2000) Nosocomial
Pathogens Laboratory Branch
Centers for Disease Control and
Prevention 1600 Clifton Rd MS
G08 Atlanta GA 30333 USA
FEATURES LocationQualifiers
77
source 11377
organism=Klebsiella
pneumoniae
mol_type=genomic DNA
db_xref=taxon573
-35_signal 5560
-10_signal 7883
mRNA 921012
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
RBS 117122
CDS 1311012
note=blaKPC-1
codon_start=1
transl_table=11
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
protein_id=AAG134101
db_xref=GI10121875
translation=MSLYRRLVLLSCLSWPLAGFSATALTNLVAEPFAKLEQD
FGGSI
GVYAMDTGSGATVSYRAEERFPLCSSFKGFLAAAVLARSQQQAGLLDTPIRYG
KNALV
PWSPISEKYLTTGMTVAELSAAAVQYSDNAAANLLLKELGGPAGLTAFMRSIG
DTTFR
78
LDRWELELNSAIPSDARDTSSPRAVTESLQKLTLGSALAAPQRQQFVDWLKGN
TTGNH
RIRAAVPADWAVGDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTRAPNKDDK
HSEAV
IAAAARLALEGLGVNGQ
ORIGIN
1 cggggcagtt acagccgtta cagcctctgg
agagggagcg gcttgccgct cggtgataat
61 cccagctgta gcggcctgat tacatccggc
cgctacacct agctccacct tcaaacaagg
121 aatatcgttg atgtcactgt atcgccgtct
agttctgctg tcttgtctct catggccgct
181 ggctggcttt tctgccaccg cgctgaccaa
cctcgtcgcg gaaccattcg ctaaactcga
241 acaggacttt ggcggctcca tcggtgtgta
cgcgatggat accggctcag gcgcaactgt
301 aagttaccgc gctgaggagc gcttcccact
gtgcagctca ttcaagggct ttcttgctgc
361 cgctgtgctg gctcgcagcc agcagcaggc
cggcttgctg gacacaccca tccgttacgg
421 caaaaatgcg ctggttccgt ggtcacccat
ctcggaaaaa tatctgacaa caggcatgac
481 ggtggcggag ctgtccgcgg ccgccgtgca
atacagtgat aacgccgccg ccaatttgtt
541 gctgaaggag ttgggcggcc cggccgggct
gacggccttc atgcgctcta tcggcgatac
79
601 cacgttccgt ctggaccgct gggagctgga
gctgaactcc gccatcccaa gcgatgcgcg
661 cgatacctca tcgccgcgcg ccgtgacgga
aagcttacaa aaactgacac tgggctctgc
721 actggctgcg ccgcagcggc agcagtttgt
tgattggcta aagggaaaca cgaccggcaa
781 ccaccgcatc cgcgcggcgg tgccggcaga
ctgggcagtc ggagacaaaa ccggaacctg
841 cggagtgtat ggcacggcaa atgactatgc
cgtcgtctgg cccactgggc gcgcacctat
901 tgtgttggcc gtctacaccc gggcgcctaa
caaggatgac aagcacagcg aggccgtcat
961 cgccgctgcg gctagactcg cgctcgaggg
attgggcgtc aacgggcagt aaggctctga
1021 aaatcatcta ttggcccacc accgccgccc
ttgcgggcgg catggattac caaccactgt
1081 cacatttagg ctaggagtct gcgcggcaga
gccgtgtgac cggttttctg tagagcactg
1141 acgatggcgg cggcgctctc tgcaattggc
aaggcgtcgg cgccaaggat accaatcttg
1201 cggcgcgcgg cgtgttatga cgactggggt
gcatttgagc cgccccattt aaccttcgcc
1261 ctcacagata cgccattcgc ctcaaattta
gcgccatgca gacgagcttc cactcggctt
1321 gcaccttgtc caggcccctc atgctgaact
gacgcaatcc catcaccgcc ttgatca
80
31
3 OBJETIVOS
31 Objetivo geral Caracterizar os genes de resistecircncia das
Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases e os aspectos epidemioloacutegicos de
pacientes internados em um hospital puacuteblico do Distrito Federal
32 Objetivos Especiacuteficos
Identificar genotipicamente a enzima KPC (Klebsiella pneumoniae
carbapenemase) de isolados de Klebsiella pneumoniae
Investigar aspectos epidemioloacutegicos dos pacientes portadores de
Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases
Identificar quais variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana influenciaram para o
desfecho oacutebito ou alta
Avaliar a susceptibilidade das Enterobacteacuterias aos antibioacuteticos
carbapenecircmicos dos pacientes em ambiente hospitalar
32
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
Trata-se de um estudo transversal onde foi realizado o teste de
susceptibilidade das enterobacteacuterias aos antibioacuteticos carbapenecircmicos a partir dos
materiais bioloacutegicos coletados dos pacientes internados no Hospital Regional da Asa
Norte (HRAN) e enviados ao Laboratoacuterio de Anaacutelises Cliacutenicas da mesma Instituiccedilatildeo
Os materiais bioloacutegicos investigados foram sangue aspirado traqueal ou brocircnquico
urina e cultura semi quantitativa de ponta de cateter venoso central O HRAN eacute um
hospital puacuteblico do Distrito Federal com 395 leitos sendo as cliacutenicas de internaccedilatildeo
Berccedilaacuterio Cirurgia Geral Cirurgia Plaacutestica Cliacutenica Meacutedica Ginecologia Maternidade
Pediatria Queimados UTI com atendimento a pacientes portadores de doenccedilas de
caraacuteter cliacutenico e ciruacutergico
4 1 Coleta e transporte das amostras bioloacutegicas
As amostras foram coletadas de pacientes internados no Hospital Regional da
Asa Norte (HRAN) com suspeitas de infecccedilatildeo por KPC A identificaccedilatildeo primaacuteria foi
realizada pelo Laboratoacuterio de Microbiologia do hospital de origem dos pacientes e os
demais procedimentos que foram utilizados na identificaccedilatildeo encontram-se descritos
abaixo
4 2 Procedimentos para confirmaccedilatildeo de resistecircncia bacteriana por
disco de ertapenem (adaptado CDC 2004)
Para diagnosticar amostra como portadora de bacteacuteria produtora de
carbapenemase foi realizado o teste com disco de ertapenem como forma de
triagem Inicialmente utilizou-se o swab contaminado com a amostra que foi
distribuiacuteda em uma pequena aacuterea da placa de aacutegar MacConkey para apoacutes o
crescimento ser realizada a pesquisa de colonizaccedilatildeo por enterobacteacuterias resistentes
aos carbapenecircmicos (Pesquisa de CRE) Procedeu-se a semeadura por teacutecnica
semi-quantitativaesgotamento com alccedila bacterioloacutegica na diluiccedilatildeo de 1100 O disco
de Ertapenem foi colocado na superfiacutecie da placa de MacConkey na junccedilatildeo dos dois
primeiros campos de semeadura conforme demonstrado na figura 5 Incubou a placa
33
em estufa aeroacutebia a 35ordmC por 24 e 48 horas e observou-se o halo de difusatildeo do
disco de Ertapenem na placa para proceder agrave leitura
O teste deixou de ser obrigatoacuterio apoacutes a modificaccedilatildeo dos criteacuterios
interpretativos para carbapenecircmicos para enterobacteacuterias publicados no suplemento
do CLSI 2010 M100-S20-U
Figura 5 Mecanismo de semeamento de material bioloacutegico oriundos de
pacientes com suspeita de infecccedilatildeo por KPC Fonte adaptado CDC 2004
4 2 1 Interpretaccedilatildeo dos resultados
Na ausecircncia de crescimento ateacute 24 horas (MacConkey) ou halo de difusatildeo
gt27 mm na placa deve-se reincubar as placas por mais 24 horas Quando for
ausente o crescimento apoacutes 48 horas ou halo de difusatildeo gt27 mm na placa libera-se
como enterobacteacuterias resistentes a carbapenecircmicos (KPCNEG)Havendo
crescimento de colocircnias na placa de MacConkey com halo lt 27 mm (apenas para
colocircnias com crescimento dentro do halo) deve-se reisolar e realizar identificaccedilatildeo e
antibiograma automatizado teste de sensibilidade por disco-difusatildeo e Teste de
Hodge Modificado (THM) Os isolados de enterobacteacuterias cujos testes comprovarem
a resistecircncia aos carbapanecircmicos testados (KPCPOS) foram reportado a Comissatildeo
de Controle de Infecccedilatildeo Hospitalar (CCIH) Jaacute osbacilos Gram-negativos natildeo
fermentadores natildeo foram reportados (KPCNEG) Para interpretaccedilatildeodos resultados
foram utilizados os valores conforme demonstrados na tabela 1
Tabela 1 Criteacuterios Interpretativos para testes de sensibilidade
ENTEROBACTEacuteRIAS
Disco difusatildeo (mm) MIC (microgml)
34
Antibioacutetico Sigla S I R S I R
Ertapenem 10
microg
ETP 22 19-
21
18 05 1 2
Meropenem 10
microg
MEM 23 20-
22
19 1 2 4
Fonte Manual Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)
2013
Os resultados que apresentaram resistecircncia ao antibioacutetico Ertapenem foram
considerados como suspeitos de contaminaccedilatildeo por KPC Fez-se o teste de
susceptibilidade aos antibioacuteticos (TSA) em aparelho automatizado MicroScan Walk
Away 96sl Dade Behring
4 3 Teste de susceptibilidade aos antibioacuteticos (adaptado CDC 2004)
A determinaccedilatildeo da susceptibilidade dos isolados foi feita pelo teste de
susceptibilidade aos antibioacuteticos (TSA) apoacutes cultura em meio de gelose simples
(INSA) para avaliaccedilatildeo da sua pureza e obtenccedilatildeo de colocircnias isoladas Para
preparaccedilatildeo de uma suspensatildeo bacteriana com turvaccedilatildeo aproximada de 05
McFarland (Dade BehringMicroScanregTurbidity Meter) ressuspendeu duas a cinco
colocircnias em 2ml de soro fisioloacutegico esteacuteril diluindo a 1100 em soro fisioloacutegico num
volume total de 10ml em seguida foi feita uma semeadura em duas placas
quadradas (120mm x 120mm) de Muller-Hinton Agar (INSA) por inundaccedilatildeo
Os discos de antibioacutetico carbapenecircmicos imipenem meropenem e
ertapenem (Biorad) foram aplicados com o auxiacutelio de um dispensador automaacutetico A
susceptibilidade das Enterobacteacuterias aos carbapenecircmicos foi definida de acordo
com o protocolo Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI 2011)
Para aquelas Enterobacteacuterias que apresentaram resistecircncia ao ertapenem
foram realizados o Teste de Hodge Modificado para Detecccedilatildeo de Enterobacteacuterias
Produtoras de Carbapenemases conforme descrito pelo Centers for Disease Control
and Prevention (CDC 2004)
35
4 4Teste de Hodge Modificado (THM) (adaptado CDC 2004)
Preparou-se uma suspensatildeo em salina esteacuteril com a cepa Escherichia coli
ATCC 25922 (padratildeo 05 de McFarland) Apoacutes isto diluiu a suspensatildeo 110 em
salina (05 ml da soluccedilatildeo de Ecoli ATCC 25922 + 45 ml salina)Foi entatildeo semeado
na superfiacutecie de uma placa de Agar Muller-Hinton com a suspensatildeo diluiacuteda de Ecoli
ATCC 25922 com auxilio de swab seco assegurando que houvesse uma
distribuiccedilatildeo uniforme cobrindo toda a superfiacutecie do Agar Deixou secar por 3 a 5
minutos em temperatura ambienteColocou-se o disco de ertapenem 10microg no centro
da placa e apoacutes isto fez-se uma estria linear da cepa a ser testada da borda do
disco ateacute a borda da placa utilizando uma alccedila calibrada 10 microl ou um swab Incubou
a placa na estufa em atmosfera aeroacutebia a 35 plusmn 2ordmC por 16 a 24 horas
441 Controle de qualidade (CQ)
Foi utilizado um CQ todos os dias em que se realizou o teste tendo como
controle Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1705- teste de Hodge modificado
positivo Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1706- teste de Hodge modificado
negativo
442 InterpretaccedilatildeoResultados
Apoacutes 16ndash24 horas de incubaccedilatildeo examinar as placas para verificar a presenccedila
de uma distorccedilatildeo no halo de inibiccedilatildeo do disco de ertapenem devido ao crescimento
realccedilado da cepa ATCC na intersecccedilatildeo do organismo teste e a Ecoli ATCC 25922
dentro dos limites do halo O THM positivo apresentaraacute presenccedila de distorccedilatildeo no
halo de inibiccedilatildeo de ertapenem devido ao crescimento da cepa Ecoli ATCC 25922 ao
longo da estria da cepa teste para dentro dos limites do halo de inibiccedilatildeo Jaacute o THM
negativo teraacute ausecircncia de crescimento da cepa Ecoli ATCC 5922 ao longo da estria
da cepa teste para dentro dos limites do halo de inibiccedilatildeo do disco de ertapenem
Este resultado estaacute representado na figura 6
36
Figura 6 Interpretaccedilatildeo resultado do Teste de Hodge Modificado
(adaptado CDC 2004) Teste positivo na estria da cepa teste na parte superior
da placa teste negativo na estria da cepa teste na parte inferior da placa
Tendo positivo como resultado o paciente era um provaacutevel contaminado por
KPC As amostras entatildeo foram encaminhadas para a Fundaccedilatildeo Osvaldo Cruz
(FIOCRUZ) para confirmaccedilatildeo final As amostras finalmente confirmadas como
positivas para KPC foram isoladas e guardadas no banco de cepas cliacutenicas do
hospital Apoacutes a autorizaccedilatildeo do CEP amostras das cepas foram transferidas para
meio de transporte Stuard em caixa teacutermica fechada em baixa temperatura e
levadas para o laboratoacuterio de microbiologia cliacutenica da universidade
No laboratoacuterio da universidade as amostras foram separadas e realizadas
repiques em meios MacConkey e incubadas por 24h As colocircnias caracteriacutesticas
foratildeo isoladas em caldo BHI e mantidas em shaker a 37oC por 2h Apoacutes isto foram
executadas as anaacutelises a seguir
Os isolados de Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases foram
submetidos agrave extraccedilatildeo de DNA e posterior sequumlenciamento para identificaccedilatildeo dos
genes de resistecircncia blaKPC de 1 a 13 e identificaccedilatildeo do gene universal Os
pacientes de onde os materiais bioloacutegicos contendo as Enterobacteacuterias produtoras
de carbapenemases foram os isolados foram investigados quanto aos aspectos
epidemioloacutegicos e cliacutenicos
37
4 5 Extraccedilatildeo de DNA bacteriano
A extraccedilatildeo de DNA bacteriano foi realizada utilizando o kit NucleoSpin
Plasmidreg (MN) Antes de iniciar a extraccedilatildeo foi feito a preparaccedilatildeo das soluccedilotildees
reagentes materiais e amostras (vortexando) colocou-se em banho-maria agrave 50ordmC o
tampatildeo AW Partiu-se de colocircnias isoladas cultivadas que sofreram passagem em
meio LB liacutequido por 12h Adicionou-se 15 mL da amostra no tubo eppendorf
centrifugou por 5 minutos descartou o sobrenadante (com cuidado para natildeo
descartar o Pellet) Repetiu-se este procedimento por mais trecircs vezes completando-
se o volume de 6mL Foram adicionados 250microL do tampatildeo Resuspension Buffer A1
encostando a ponteira no Pellet e misturando (este tampatildeo tem como funccedilatildeo
separar a formaccedilatildeo de grumos celulares) Apoacutes isso homogeneizou e vortexou os
tubos eppendorfs Apoacutes isso foram adicionados 250microL do tampatildeo Lysis Buffer A2
homogenizou e deixou descansar por 5 minutos (esta etapa eacute importante para a lise
da parede e da membrana celulares e liberaccedilatildeo do conteuacutedo da ceacutelula)
Passado o tempo de descanso foi adicionado 300microL do tampatildeo
Neutralization Buffer A3 homogeneizou e centrifugou por 10 minutos (este tampatildeo
iraacute retirar as proteiacutenas que envolvem o DNA e voltaraacute com o pH para proacuteximo de 8
impedindo que a soluccedilatildeo de lise facilite a quebra das ligaccedilotildees covalentes do aacutecido
nucleacuteico) Em seguida enumeraram-se os tubos contendo filtros com siacutelica
transferiu-se o sobrenadante para o filtro e centrifugou por 5 minutos Descartou-se
o que foi filtrado adicionou 500microL do tampatildeo AW (banho-maria) centrifugou por 2
minutos Novamente foi descartado o filtrado Adicionou-se 600microL do tampatildeo A4
centrifugou por 2 minutos e descartou o filtrado (os tampotildees AW e A4 contecircm
isotiocianato de guanidina em concentraccedilotildees crescentes para facilitar a adsorccedilatildeo
do DNA na siacutelica e retirada das outras biomoleacuteculas da amostra) Foi feita outra
centrifugaccedilatildeo com o tubo vazio Apoacutes isto o filtro foi trocado para outro eppendorf
definitivo onde foi adicionado 50microL do tampatildeo Elution Buffer AE (este tampatildeo
favorece a eluiccedilatildeo do DNA) centrifugou por 2 minutos descartou o filtro e
armazenou as amostras em freezer -20ordmC
38
4 6 Iniciadores e reaccedilatildeo de PCR
Os iniciadores universais para o gene blaKPC foram desenhados baseados
em sequumlecircncias conservadas apresentadas pelos sub-grupos de genes que
codificam a enzima carbapenemase de klebsiella pneumoniae (YIGIT et al 2001)
Baseado na sequumlecircncia para o blakpc-1 depositada no GenBank
(AF2975541) o oligonucleotiacutedio (oligo) iniciador direto (5-
ATGTCACTGTATCGCCGTC-3rsquo) foi desenhado para reconhecer a sequumlecircncia
blaKPC na posiccedilatildeo (131149) enquanto que o iniciador reverso (5-
TTACTGCCCGTTGACGCC-3rsquo) foi reconhecido na posiccedilatildeo (9951012) As anaacutelises
baseadas em alinhamento de sequumlecircncias mostraram que o par de iniciadores
blaKPC podem detectar os alelos de 1 a 13 do gene blaKPC conforme a tabela 2
Tabela 2 Nuacutemero de acesso ao GenBank dos alelos blaKPC e seus
microrganismos originais
Nuacutemero de
Acesso GenBank
Microrganismo Alvo
AF2975541 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-1
GU0862251 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-2
HQ2589341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-2-like
AB5577341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC -3
EU4473041 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-4
EU4002222 Pseudomonas
aeruginosa
blaKPC-5
EU5555341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-6
EU7297271 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-7
39
FJ2344121 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-8
FJ624872 Escherichia coli blaKPC-9
GQ1403481 Acinetobacter
baumannii
blaKPC-10
HM0669951 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-11
HQ3428891 Enterobacter cloacae blaKPC-12
HQ3428901 Enterobacter cloacae blaKPC-13
As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo de blaKPC foram realizadas em um
primeiro tempo de desnaturaccedilatildeo em que foi 94ordmC por 5 minutos seguido de 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 58 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 90 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 78ordmC por 8 minutos Aleacutem das amostras foi utilizado um
controle negativo
A PCR do blaKPC foi realizada utilizando os componentes para o volume da
reaccedilatildeo de 25 microL citados na tabela 3 A banda do tamanho do produto de PCR foi de
881 pares de bases (pb) o que corresponde ao plasmiacutedeo
Tabela 3 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do
gene blaKPC
Reagente Volume
DNA molde 4 microL
Tampatildeo Taq 25 microL
MgCl2 075 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP
2 microL
Oligo F 1 microL
Oligo R 1 microL
Taq DNA polimerase 05 microL
Aacutegua MiliQ 1335 microL
40
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
Baseado na sequumlecircncia para o gene 16S rRNA em que o oligonucleotiacutedio
Universal iniciador direto foward (5-CCAGCAGCCGCCGTAATACG-3rsquo) foi
desenhado para reconhecer a sequumlecircncia universal na posiccedilatildeo 1513 enquanto que o
iniciador reverso (5-ATCGGYTACCTTGTTACGACTTC-3rsquo) foi reconhecido na
posiccedilatildeo 1491 foram realizadas PCRrsquos As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo deste
gene foram realizadas nos seguinte tempos separaccedilatildeo 94ordmC por 10 minutos 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 55 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 120 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 72ordmC por 10 minutos
A PCR do gene 16S rRNA foi realizada utilizando os componentes para o
volume da reaccedilatildeo de 25microL citados na tabela 4 A banda do tamanho do produto de
PCR foi de 996 pb correspondente aacute regiatildeo ribossomal capaz de amplificar todas
as espeacutecies
Tabela 4Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do gene
universal
Reagente (quantidade
concentraccedilatildeo do estoque)
Volume
DNA molde 10 ng 4 microL
Tampatildeo Taq 10 x 25 microL
MgCl2 50mM 125 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP 25 mM
125 microL
Oligo F 10microM 05 microL
Oligo R 10microM 05 microL
Taq DNA polimerase 5UmicroL 04 microL
Aacutegua Miliq 146 microL
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
41
O termociclador utilizado para os experimentos foi o LifeTouch da BIOER
4 7 Digestatildeo
Para realizaccedilatildeo da digestatildeo foi utilizada a enzima BshF I (Hae III) EN- 1105
tamanho 7000 units concentraccedilatildeo 10 unitsmicroL fonte Bacillus sphaericus empresa
Jena bioscienceUtilizaram-se os componentes para o volume de 50microL da reaccedilatildeo
citados na tabela 5
Tabela 5 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da digestatildeo do gene
universal
Reagente Volume
Produto de PCR 10 microL
Enzima BshF I 01 microL
Tampatildeo (10x) 5 microL
Aacutegua Miliq 349 microL
Total (em cada ependorff) 50 microL
Valores para 1 digestatildeo
Os ependorffs foram colocados por 30 minutos em banho-maria a 37ordmC Apoacutes
isso fez-se a corrida das amostras em gel de agarose para verificaccedilatildeo do resultado
(LU et al 2000)
4 8 Eletroforese em gel de agarose
Os produtos de DNA PCR e digestatildeo foram analisados em gel de agarose
2 O tempo de corrida do gel eacute de aproximadamente 1hora e 30minutos sendo
que no comeccedilo foi usada agrave voltagem de 50 V e apoacutes comeccedilar a correr o gel
aumentou a voltagem para 100 v Utilizou-se o marcador de 100pb (pares de bases)
Foi adicionado 3microL de corante Bromophenol (que tem a funccedilatildeo de fazer uma ligaccedilatildeo
na amostra de DNA e permitir a visualizaccedilatildeo da corrida no gel de agarose) em 7microL
de amostra tanto de DNA quanto de PCR Para o preparo do gel foi utilizado TBE
42
(Tris- Aacutecido Boacuterico) agarose e brometo de etiacutedio (sua funccedilatildeo eacute de corante para o gel
e permitir a visualizaccedilatildeo do DNA quando colocado agrave luz ultravioleta) Para o oligo
blaKPC a banda da amplificaccedilatildeo foi em 881ppb correspondendo ao plasmiacutedeo Jaacute
o oligo Universal foi em 996 pb
4 9 Descarte de resiacuteduos
Todos os materiais utilizados nos ensaios foram de uso uacutenico e manipulados
em cacircmaras de seguranccedila bioloacutegica classe II Apoacutes o uso foram colocados em
soluccedilatildeo desinfetantes (hipoclorito a 1) e em seguida autoclavados a 127oC por 20
min em sacos apropriados para autoclavaccedilatildeo Apoacutes a finalizaccedilatildeo do ciclo de
esterilizaccedilatildeo os sacos contendo o material descartaacutevel foram colocados em
recipientes de coleta da empresa responsaacutevel pela coleta de materiais bioloacutegicos
produzidos no laboratoacuterio de microbiologia Todos os procedimentos seguiram a
normativa RDC-ANVISA 3062004 sobre o descarte de resiacuteduos de serviccedilo de
sauacutede
4 10 Aspectos epidemioloacutegicos e cliacutenicos
Os aspectos cliacutenicos e epidemioloacutegicos foram investigados por meio de
prontuaacuterios dos pacientes portadores de enterobacteacuterias produtoras de
carbapenemases e envolveram topografia mais provaacutevel do foco infeccioso a
enfermidade motivadora da internaccedilatildeo o desfecho cliacutenico a idade e o tempo de
internaccedilatildeo
4 12 Anaacutelises eepidemioloacutegicas
As anaacutelises foram realizadas com o pacote estatiacutestico SPSS versatildeo 200
Para verificar quais variaacuteveis referentes aos dados epidemioloacutegicos e
microbioloacutegicos influenciaram no desfecho verificou- se a diferenccedila meacutedia das
variaacuteveis idade e tempo de internaccedilatildeo em cada grupo O teste estatiacutestico utilizado foi
o teste t de Student apoacutes se executar o teste de normalidade de Shapiro-Wilk Para
as variaacuteveis sexo perfil microbioloacutegico das enterobacteacuterias produtoras de
43
carbapenemases foi avaliada a associaccedilatildeo com o desfecho por meio do teste Exato
de Fisher O niacutevel de significacircncia adotado foi de 5
4 13 Preceitos eacuteticos
Este projeto estaacute inserido em um projeto maior denominado ldquoEpidemiologia
cliacutenica e caracterizaccedilatildeo molecular do Acinetobacter Baumannii resistente a
antibioticoterapia em pacientes internado em hospitais do Sistema Uacutenico de Sauacutederdquo
que foi submetido ao Comitecirc de Eacutetica em Pesquisa da Secretaria do Estado de
Sauacutede do Distrito Federal (SESDF) e emitido parecer aprovado pelo protocolo nordm
23109 (anexo)
44
5 RESULTADOS
51 Anaacutelise molecular
Para a amplificaccedilatildeo com o oligo blaKPC foram amplificadas amostras
que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 881 pb correspondente ao
plasmiacutedeo A anaacutelise da amplificaccedilatildeo da regiatildeo do gene blaKPC mostrou que
apenas a amostra A10 natildeo amplificou isso demonstra que esta amostra natildeo
possuiacutea o gene de resistecircncia
5 1 1 Gene blaKPC
Figura 7 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 881 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
A amostra A3 natildeo amplificou no primeiro momento entatildeo foi realizado
novamente a PCR e corrida de gel obtendo entatildeo a amplificaccedilatildeo da amostra como
apresentado na figura 8
45
Figura 8 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC da
mostra A3 estudada A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo de 881
pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 1 2 Gene 16S rRNA
Para a amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA utilizou-se o oligo universal Foram
amplificadas amostras que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 996 pb
Figura 9 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
46
Segundo Lu et al (2000) a digestatildeo com a enzima HaeIII deste amplicons de
16S rRNA devolveriam bandas com perfis entre 150 a 200 pb No gel abaixo eacute
possiacutevel evidenciar que este perfil ocorreu com o predomiacutenio de bandas na altura
de 200pb
Figura 10 Gel de agarose a 2 da digestatildeo do amplicon do gene 16S
rRNA das amostras com a enzima HaeIII evidenciando diversos fragmentos
proacuteximos a 200 pb A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo ribossomal
de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 2 Anaacutelises epidemioloacutegicas
5 2 1 Sexo
No total foram detectados 17 isolados de KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 onde a maior a prevalecircncia foi
detecatada em amostras de pacientes do sexo masculino (53) do que no sexo
feminino (47)
47
Figura 11 Isolado de KPC segundo sexo dos 17 pacientes investigados
no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 2 Desfecho cliacutenico
Em 17 isolados de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo
de 2010 aacute 2011 a porcentagem de pacientes que foram a oacutebito (59) foi maior que
a de pacientes que tiverm alta (41)
Figura 12 Isolado de KPC segundo desfecho cliacutenico dos 17 pacientes
investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
48
5 2 3 Local da coleta
Dos 17 episoacutedios detectados de infecccedilatildeo por KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 a infecccedilatildeo em swab retalfoi mais
frequente (47) seguida de ponta de cateacuteter (18) e secreccedilatildeo traqueal (12)
Figura 13 Isolados de KPC segundo local da coleta da amostra nos 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 4 Microorganismo
O microorganismo mais encontrado foi a Klebsiella pneumoniae (82)
seguida da Enterobacter clocae (12) e Serratia marcescens (6) dos 17 isolados
de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 Isto afirma o
fato de a sigla KPC ser utilizada de forma errocircnea aacute Klebsiella pneumoniae visto
que a evidecircncia dela eacute maior em relaccedilatildeo as outras cepas
49
Figura 14 Isolado de KPC segundo microrganismo encontrado em 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 5 Relaccedilotildees variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana e desfecho
cliacutenico
Tabela 6 ndash Distribuiccedilatildeo do perfil geneacutetico sexo coleta tipificaccedilatildeo de
microrganismos e anaacutelise da resistecircncia bacteriana segundo o desfecho
cliacutenico Brasiacutelia-DF 2010 a 2011
Variaacutevel Resultado
Desfecho
Alta Oacutebito
N N P
Gene 16S rRNA Positivo 7 1000 10 1000
NA Gene blaKPC Positivo 6 857 10 1000
Negativo 1 143 0 00 0218 Sexo Feminino 2 286 6 600
Masculino 5 714 4 400 0201 Local da coleta Fundo saco de
Douglas 1 143 0 00
Hemocultura 0 00 1 100 0463 Ponta de cateter 1 143 2 200
Sec TraquealBrocircnquica
0 00 1 100
50
Secreccedilatildeo traqueal 2 286 0 00
Swab retal 3 429 5 500
Urina 0 00 1 100
Microrganismo Enterobacter cloacae (KPC)
1 143 1 100
Klebsiella pneumoniae
6 857 8 800
0416 Serratia
marcescens 0 00 1 100
Teste de Hodge Hodge positivo 7 1000 10 1000
NA Amicacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 1 100 0848 resistente 0 00 1 100
sensiacutevel 2 286 3 300
Amoxicilina Aacutecido Clavulacircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Ampicilina Sulbactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ampicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Aztreonan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefazolina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Cefoperazona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Cefotaxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefoxitina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0509 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 2 286 4 400
Ceftazidima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cetriaxona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 3 429 5 500 0772 Cefalotina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ciprofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772
51
resistente 3 429 5 500
Claritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Clindamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Eritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Gentamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0942 resistente 2 286 3 300
sensiacutevel 1 143 2 200
Imipenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 0 00 2 200 0193 Resistente 1 143 3 300
sensiacutevel 2 286 0 00
Nitrofurantoiacutena sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Norfloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Oxacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Penicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Piperacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Rifampicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tetraciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Ticarcilina Aacutecido Clavulocircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0688 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 3 429 4 400
Tobramicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Trimetoprima Sulfametoxazol
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0112 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 2 286 0 00
Vancomicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tigeciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediario 0 00 1 100 0211 natildeo testado 1 143 4 400
resistente 2 286 0 00
52
Cefepime sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefuroxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Levofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Piperacilina Tazobactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Ertapenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Meropenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0223 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 1 143 0 00
Cefotetan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 sensiacutevel 0 00 1 100
Gemifloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 7 700 0585 natildeo testado 3 429 3 300
Desfecho
Alta Oacutebito
Meacutedia Erro
padratildeo Meacutedia Erro
padratildeo p
Idade 58 9 59 5 0991
Tempo Internaccedilatildeo (dias)
50 13 46 12 0571
n= 17 p(lt 005) NA natildeo se aplica
53
6 DISCUSSAtildeO
Nos uacuteltimos anos houve um aumento na incidecircncia de bacteacuterias
multirresistentes aos antimicrobianos no ambiente hospitalar tornando isto um
problema mundial de sauacutede puacuteblica (HULSCHER et al 2010) Quando se trata
principalmente de bacilos Gram negativos a frequumlecircncia destas bacteacuterias eacute ainda
maior em paiacuteses da Ameacuterica Latina quando comparada a paiacuteses desenvolvidos
(GALES etal 2012)
De acordo com dados do ldquoMeropenem Yearly Susceptibility Test Information
Collectionrdquo (MYSTIC) ocorreu nos Estados Unidos um aumento na susceptibilidade
de K pneumoniae nos uacuteltimos anos graccedilas a praacuteticas de controle de disseminaccedilatildeo
de amostras resistentes(RHOMBERG P R et al 2009) O aumento crescente da
prevalecircncia destes microrganismos foi proporcional ao aumento da dependecircncia do
uso de antibioacuteticos carbapenecircmicos considerados como a opccedilatildeo terapecircutica para o
tratamento de infecccedilotildees por bacilos Gram negativos multi-resistentes (LIVERMORE
2012) Isto afeta diretamente as opccedilotildees de tratamento sobrando poucas alternativas
para a terapecircutica que incluem colistina (polimixina E) e tigeciclina que apresentam
respectivamente problemas em termos de toxicidade e eficaacutecia (LIVERMORE et
al 2011) Um dos efeitos adversos mais importantes das poliminas B e E por
exemplo satildeo a neurotoxicidade e nefrotoxicidade (MENDES C A C et al2009 )
Devido agrave resistecircncia ser usualmente de natureza plasmidial e portanto de
maior disseminaccedilatildeo especialmente quando carreadas por K pneumoniae
microrganismo com uma notoacuteria capacidade para acumular e transferir plasmiacutedeos
com determinantes para resistecircncia o nuacutemero de casos detectados pelo
fenoacutetipogenoacutetipo blaKPC eacute bastante preocupante (MONTEIRO et al 2009)
Comparada com outras bacteacuterias hospitalares a transmissatildeo de clones
multirresistentes de K pneumoniae eacute maior e podem natildeo ser controladas pelos
meacutetodos de controle de infecccedilatildeo hospitalar (PAAUW et al 2007) A forma
plasmidial para transferecircncia da resistecircncia adicionada a este grande potencial para
disseminaccedilatildeo de clones resistentes eacute preocupante visto que apoacutes surtos muitas
vezes pode se tornar endecircmica Jaacute eacute uma realidade a disseminaccedilatildeo desta bacteacuteria
54
entre pacientes hospitais paiacuteses e ateacute mesmo continentes (WOODFORF et al
2010 ROGERS et al 2011)
As chances de surtos satildeo maiores em paiacuteses com poucos recursos devido agrave
maior carecircncia de praacuteticas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees hospitalares e o
uso irracional de antimicrobianos de forma empiacuterica e inadequada (KUMARASAMY
et al 2010) Ateacute o momento os mecanismos de resistecircncia aos cabapenecircmicos
geralmente encontrado eram a produccedilatildeo de ESBL (CTX-M) somada aacute perda de
porina (CARVALHAES et al 2010) Foi notado a partir do ano de 2008 um
aumento no nuacutemero de K pneumoniae produtoras de KPC-2 apresentando outra
forma de resistecircncia (GALES 2012)
Um estudo mostrou que o perfil do paciente colonizado ou infectado por KPC
foi de um paciente entre os 33 e os 82 anos de idade internado haacute mais de 1
semana no hospital A mortalidade geral nos uacuteltimos anos ficou em torno de 7
sendo que dos 77 pacientes estudados 32 (415) pacientes evoluiacuteram para oacutebito
evidenciando a alta morbi-mortalidade associada (ALVES A P et al 2013)
Em estudo com 2316 pacientes avaliados a populaccedilatildeo de sexo masculino foi
de 526 idade meacutedia global de 53 anos (mediana de 55 anos) permanecircncia meacutedia
de 58 dias (mediana de 3 dias) (OLIVEIRA A C et al 2010) Outros trabalhos
apresentaram ausecircncia de significacircncia entre sexoidade e o desenvolvimento de
infecccedilotildees por microrganismos resistentes (PERES-BOTA D et al 2003 COLPAN
A et al 2005 COELLO R et al 1997)
Outro estudo utilizou um total de 30 amostras sendo elas isoladas de urina
escarro secreccedilatildeo pleural ponta de cateter aspirado traqueal e hemocultura A mais
prevalente foi em urina (40) Entre as 30 cepas analisadas a maior porcentagem
foi da cepa Klebsiella pneumoniae (70) Enterobacter sp (133) Klebsiella
ozaenae (10) Escherichia coli (333) e Klebsiella oxytoca (333)
(DIENSTMANN R et al 2010) Nos Estados Unidos a enzima KPC jaacute se tornou
endecircmica Foi realizada uma pesquisa em dois hospitais de Nova York onde
testaram 602 amostras e 45 apresentaram algum mecanismo de resistecircncia
sendo apenas 33 confirmadas por biologia molecular como KPC-2 (BRATU et
al 2005)
55
Estudo sobre os tipos de ESBL feito no Japatildeo apresentou o tipo Toho-1 como
o mais prevalente nessa pesquisa Ateacute o ano de 2000 ano em que foi publicado tal
estudo este era o primeiro relatoacuterio no Japatildeo para identificar derivados de ESBLs
como tipo de SHV e TEM entre E coli e K pneumoniae Em especial o tipo SHV- 12
foi identificado com uma maior frequumlecircncia Estes resultados indicam que tipos
distintos de ESBLs que satildeo diferentes em sua especificidade de substrato e origem
geneacutetica coexistem no Japatildeo Isto mostra a importacircncia de caracterizar genoacutetipos
distintos de ESBLs e de estar em alerta continuamente para as tendecircncias de
ESBLs no Japatildeo aleacutem da necessidade de uma interpretaccedilatildeo uniforme utilizando as
diretrizes do CSLI para relatar cepas produtoras de ESBL Aleacutem da detecccedilatildeo de
ESBLs satildeo necessaacuterias mais informaccedilotildees tais como o perfil de sensibilidade
especiacutefica para diversas β-lactacircmicos e o local da infecccedilatildeo Esses fatores satildeo
essenciais para a escolha adequada de antibioacuteticos (YAGI T et al 2000)
No ano de 2004 uma pesquisa avaliou a produccedilatildeo de uma enzima de
hidroacutelise de carbapenecircmicos atraveacutes da teacutecnica de sequumlenciamento foi revelado
um novo membro da famiacutelia KPC designado KPC- 3 Pesquisadores encontraram
em um mutante de K pneumoniae uma substituiccedilatildeo de um gene associado com
resistecircncia a Imipenem mas essa substituiccedilatildeo foi considerada improvaacutevel na
contribuiccedilatildeo da resistecircncia aos carbapenecircmicos da espeacutecie estudada Aleacutem da
resistecircncia aos carbapenecircmicos estes isolados eram em sua maioria resistentes agraves
cefalosporinas penicilinas e aminoglicosiacutedeos Usando estudos de transformaccedilatildeo
conjugaccedilatildeo e hibridaccedilatildeo localizaram o alelo blaKPC em plasmiacutedeo aleacutem disso
mostraram que esse alelo tambeacutem carregava uma resistecircncia aos aminoglicosiacutedeos
A transferecircncia das enzimas KPCs foi demonstrada in vitro tanto neste como em
outros estudos pode ser que os plasmiacutedeos que fazem esta transferecircncia estavam
comeccedilando a se espalhar no ambiente cliacutenico resultando na multiresistecircncia dessas
estirpes (WOODFORD et al 2004)
O presente estudo apresentou um vieacutes quanto aos resultados dos testes de
susceptibilidade microbiana Observou-se que natildeo foi encontrado resultado deste
teste em algumas amostras o que natildeo cooperou para um estudo mais preciso
futuros estudos quanto agraves amostras e um melhor acompanhamento deste tipo de
patologia Poreacutem mesmo sem algumas amostras com este resultado disponiacutevel foi
56
confirmada a presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos
carbapenecircmicos por meio dos genes de resistecircncia blaKPC e 16S rRNA que as
amostras apresentaram em sua maioria serem portadoras Quanto aos resultados
estatiacutesticos nenhuma das variaacuteveis apresentou significacircncia estatiacutestica (p gt 005)
mostrando assim que estas variaacuteveis isoladas natildeo foram o fator determinante para
o desfecho cliacutenico de alta ou oacutebito
57
7 CONCLUSAtildeO
Os genes blaKPC e 16S rRNA foram caracterizados confirmando a a
presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos carbapenecircmicos
Houve uma maior prevalecircncia da cepa K pneumoniae e isto confirma outros
estudos que apresentam a maior prevalecircncia desta cepa em amostras com KPC
Aleacutem disso isso justifica a forma popular da K pneumoniae ser chamada de KPC
enquanto que na verdade KPC eacute uma enzima podendo estar presente em outras
cepas como Enterobacter clocae tambeacutem apresentada no presente estudo O
desfecho cliacutenico de oacutebitos maior que 50 eacute um possiacutevel indicador sobre a
necessidade de se realizar um teste raacutepido para identificaccedilatildeo de KPC visando
iniciar o mais raacutepido possiacutevel o tratamento afim de diminuir a mortalidade por esta
infecccedilatildeo
Nenhuma das variaacuteveis isoladamente estaacute relacionada ao desfecho cliacutenico
oacutebito ou alta pois natildeo apresentaram relevacircncia estatiacutestica O presente estudo
mostrou que haacute presenccedila da bacteacuteria nas amostras de pacientes do hospital
estudado podendo entatildeo afirmar que este tipo de bacteacuteria se encontra tambeacutem
presente em ambiente hospitalar O uso irracional de antimicrobiano eacute demonstrado
de forma indireta quando foi apresentado atraveacutes do Teste de Hodge Modificado
uma resistecircncia de 100 aos antibioacuteticos carbapenecircmicos Isto tambeacutem reflete na
terapecircutica sendo que pacientes portadores de bacteacuterias resistentes aos
antibioacuteticos carabepecircmicos tem uma escassa opccedilatildeo de tratamento e as opccedilotildees
apresentam problemas quanto agrave toxicidade e eficaacutecia
58
REFEREcircNCIAS
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Mecanismos
de resistecircncia bacteriana aos antimicrobianos Disponiacutevel em
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controleopas_
webmodulo3mec_sitiohtmgt Acesso em 25 de abril de 2014
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Nota teacutecnica nordm
012013 medidas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees por enterobacteacuterias
multiresistentes Acesso em 17 de abril de 2013
ALBA J et al Kinetics study of KPC-3 a plasmid-encoded class A
carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase Antimicrob Agents Chemother
Nov49(11)4760-2 2005
ALVES A P et al Nosocomial infections by KPC-producing enterobacteria in
a tertiary hospital in Southern Brazil Revista da AMRIGS Porto Alegre 57 (3) 213-
218 jul-set 2013
ALVES A et al Tipagem Geneacutetica de Microrganismos Lab De Diversidade
Microbiana Centro de Biologia Celular Dep de Biologia U de Aveiro 3810-193
Aveiro- 2003
BELL J M et Al Prevalence and significance of a negative extended-
spectrum beta-lactamase (ESBL) confirmation test result after a positive ESBL
screening test result for isolates of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae
results from the SENTRY Asia-Pacific Surveillance Program J Clin Microbiol
May45(5)1478-82 2007
BRATU S et al Detection of KPC carbapenem-hydrolyzing enzymes in
Enterobacter spp from Brooklyn New York Antimicrob Agents Chemother v 49 n
2 p 776-8 2005
59
BRATU S et al Emergence of KPC-possessing Klebsiella pneumoniae in
Brooklyn New York epidemiology and recommendations for detection Antimicrob
Agents Chemother v 49 n 7 p 3018-20 2005
BRATU S et al Rapid spread of carbapenem-resistant Klebsiella
pneumoniae in New York City Arch Intern Med v 165 p 1430-5 2005
CAMARGO C F et al Aplicaccedilatildeo das teacutecnicas de pcr e suas teacutecnicas
derivadas em diagnoacutestico molecular Disponiacutevel em
ltfileDUnB10C2BA20semestreArtigosPCR-
20CLEYTON20FLORENCIO20DE20CAMARGO20E20PAULO20ROB
ERTO20QUEIROZpdfgtgt Acesso em 08 de abril de 2014
CARVALHES C G et al Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting
carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive
results Journal of Antimicrobial Chemotherapy v 65 n2 p 249-251 2010
CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION- CDC Modified
Hodge Test for Carbapenemase Detection in Enterobacteriaceae 2004
CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE Methods for
dilutionantimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically Approved
standard M7ndashA7 7th ed CLSI Wayne PA 2011
COELLO R et al Risk factors for developing clinical infection with methicillin-
resistant Staphylococcus aureus (MRSA) amongst hospital patients initially only
colonized with MRSA J Hosp Infect 19973739-46
COLPAN A et al Evaluation of risk factors for mortality in intensive care
units A prospective study from a referral hospital in Turkey Am J Infect Control
200533(1)42-7
60
CORNAGLIA G et al Living with ESBLs Introduction Clinical Microbiology
and Infection 14 Suppl 1 1-2 2008
COTRIM E R et al Klebsiella pneumoniae carbapenemase ndash KPC em
Enterobacteriaceae o desafio das bacteacuterias multirresistentes Poacutes em revista do
centro universitaacuterio Newton Paiva 12012 - ediccedilatildeo 5 - issn 2176 7785
DESHPANDE L M et al Occurrence and characterization of
carbapenemase-producing Enterobacteacuteriaceae report from the SENTRY
Antimicrobial Surveillance Program (2000-2004) Microb Drug Resist 12(4)223-30
2006
DIAS D J A Estudos dos principais mecanismos de resistecircncia aos
antibioacuteticos β-lactacircmicos em bacteacuterias patogecircnicas gram negativas 2009 100 f
Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Geneacutetica Molecular e Biomedicina) ndash Faculdade de
Ciecircncias e Tecnologia Universidade de Nova Lisboa Lisboa
DIENSTMANN R et al Avaliaccedilatildeo fenotiacutepica da enzima Klebsiella
pneumoniae carbapenemase (KPC) em Enterobacteriaceae de ambiente hospitalar
J Bras Patol Med Lab v 46 n 1 p 23-27 fevereiro 2010
ENDIMIAMI A et al Emergence of blaKPC-containing Klebsiella
pneumoniae in a long-term acute care hospital a new challenge to our healthcare J
Antimicrob Chemother 64 1102-1110 Nov 2009
FALAGAS M E et al Extended-spectrum beta-lactamase producing
organisms The Journal of Hospital Infection 73 (4) pp 345-54 2009
FONTANA C et al Emergence of KPC-producing Klebsiella pneumoniae in
Italy BMC Rev Notes 3 40 2010
61
GALES A C et al Antimicrobial resistance among Gram-negative bacilli
isolated from Latin America results from Sentry Antimicrobial Surveillance Program
(Latin America 2008-2010) Diagnostic Microbiology and Infectious Disease v 3 n
4 p 354 -360 2012
GUPTA N et al Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Epidemiology
and Prevention HEALTHCARE EPIDEMIOLOGY Clinical Infectious Diseases
201153(1)60ndash67 Published by Oxford University Press on behalf of the Infectious
Diseases Society of America 2011
HARBOTTLE H et al Genetics of antimicrobial resistance Anim Biotechnol
n17 p111-124 2006
HENRIQUE W N et al RESISTEcircNCIA BACTERIANA Uniatildeo das
Faculdades Alfredo NasserInstituto de Ciecircncias da Sauacutede Disponiacutevel em lt
httpwwwfaculdadealfredonasseredubrfilespesquisaposter20HENRIQUE20
Wilker20Natividade20SANTIAGO20Silvania20CAVALCANTI20DSP
20ResistC3AAncia20Bacterianapdfgt Acesso em 17 marccedilo 2014
HULSCHER M E J I et al Antibiotic prescribing in hospital a social and
behavioral scientific approach The Lancet Infectious Diaseases v 10 n 3 p 167-
165 2010
KIDWAI M SAPRA P BHUSHAN KR Synthetic strategies and medicinal
properties of beta-lactams Curr Med Chem 1999 695-215
KUMARASAMY K K et al Emergence of a new antibiotic resistance
mechanism in India Pakistan and the UK a molecular biological and
epidemiological stuy The Lancet Infectious Diseases v10 n 9 p 597- 602 2010
LINCOPAN N et al Enterobacteacuteria producing extended-spectrum β-
lacatamases and IMP-1 Metalo-β-lactamases isolated from Brazilian hospitals J Med
62
Microbiol 7 1-3 2006
LINCOPAN N et al First Isolation of Metalo-β-Lacatamase-Producing
Multiresistant Klebsiella pneumoniae from a patient in Brazil J Clin Microbiol 43(1)
516-519 2005
LIVERMORE D M et al What remains against carbapenem- resistant
Enterobacteriaceae Evaluation of choramphenicol ciprofloxacin colistina
fosfomycin minocycline nitrofurantoin temocilin and tigecycline International
Journal of Antimicrobial Agents v 37 n 5 p 415- 459 2011
LIVERMORE D M Fourten years in resistance International Journal of
Antimicrobial Agents v 39 283- 294 2012
LIVERMORE D M Bacterial resistance to carbapenems Adv Exp Med Biol
1995 39025-47
LIVERMORE D M Bacterial resistance origins epidemiology and impact
Clin Infect Dis 36S11-S23 2003
LIVERMORE D M et al Carbapenemases a problem in waiting Curr
Opin Microbiol 2000 3489-95
LU et al Universal pcr for common bacterial pathogens J CLIN
MICROBIOL VOL 38 2000
LU et al Use of PCR with Universal Primers and Restriction Endonuclease
Digestions for Detection and Identification of Common Bacterial Pathogens in
Cerebrospinal Fluid Journal of Clinical Microbiology June 2000 p 2076ndash2080
MARSCHALL J Met al Presence of the KPC Carbapenemase Gene in
Enterobacteriaceae Causing Bacteremia and Its Correlation with In Vitro
Carbapenem Susceptibility J Clin Microbiol 47 239-241 Jan 2009
63
MARTINS WMBS et al Prevalecircncia do gene blaKPC em isolados cliacutenicos
de Enterobacteriaceae e natildeo fermentadores encontrados em amostras clinicas em
um hospital universitaacuterio do Recife X Jornada de ensino pesquisa e extensatildeo ndash
JEPEX 2010 ndash UFRPE Recife 18 a 22 de outubro
MENDES C A C et al Polimixinas Revisatildeo com ecircnfase na sua
nefrotoxicidade Rev Assoc Med Bras 2009 55(6) 752-9
MOHR J F 3rd Update on the efficacy and tolerability of meropenem in the
treatment of serious bacteacuterial infections Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S41-51
2008
MONTEIRO J et al First report of KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae
strains in Brazil Antimicrob Agents Chemother Jan53(1)333-4 2009
MOREIRA V C et al Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia a antibioacuteticos
Disponiacutevel em
lthttpwwwcpglsucgbr6mostraartigosSAUDEVANESSA20CARVALHO20M
OREIRApdfgt Acesso em 21 marccedilo 2014
NETIKUL T et al Emergence of novel blaKPC-12 and blaKPC-13 variants in
carbapenem non-susceptible Enterobacter cloacae a first report of blaKPC gene in
Thailand European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases May
S372 2011
NETO V A et al Antibioacuteticos na praacutetica Meacutedica 6ordf Ediccedilatildeo Editorial
SarverSP Brasil 2007
NICOLAU D P Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of
meropenem Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S32-40 2008
64
OLIVEIRA A C et al Resistecircncia bacteriana e mortalidade em um centro de
terapia intensiva Rev Latino-Am Enfermagem nov-dez 2010
PAAUW A et al Failure to control an outbreak of qnrA 1-positive multidrug-
resistant Enterobacter clocae despite adequate implementation of recommended
infection control measures Journal of Clinical Microbiology v 45 n 5 p 1420-1425
2007
PATERSON D L et al Extended-Spectrum Beta-Lactamases a Clinical
Update Clinical Microbiology Reviews v 18 p 657-686 2005
PEIRANO G et al Carbapenem-hydrolysing beta-lactamase KPC-2 in
Klebsiella pneumonia isolated in Rio de Janeiro Brazil J Antimicrob Chemother Nov
20 2009
PERES-BOTA D et al Are infections due to resistant pathogens associated
with worse outcome in critically ill patients J Infect 200347(4)307-16
PIDDOCK L J V Clinically relevant chromosomally encoded multidrug
resistance effl ux pumps in bacterial Clin Microbiol Rev n19 p382-402 2006
PITOUT J D D et al Emergence of Enterobacteriaceae producing
extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) in the community J Antimicrob
Chemother May 56 2005
POSSEBON M I et al Resistecircncia bacteriana aos carbapenecircmicos
Bacterial resitence to carbapenems RBM rev bras med60(6)378380-378-382
jun 2003
QUEENAN A M et al Carbapenemases the versatile beta-lactamases
Clin Microbiol Rev Jul20(3)440-58 2007
65
RHOMBERG P R et al Summary trends for the meropenem yearly
susceptibility test information collection program a 10- year experience in the United
States (1999-2008) Diagnostic Microbiology and Infectiois Disease v 65 n4 p
414-426 2009
ROBLEDO I E et al Detection of KPC in Acinetobacter spp in Puerto Rico
J Antimicrob Agents Chemother 54 1354-1357 Mar 2010
ROGERS B A et al Country-to-country transfer os patients and the risk of
multi-resistant bacterial infection Clinical Infectious Disease v53 n1 p49- 56
2011
SHAH A A et al Characteristics epidemiology and clinicalimportance of
emerging strains of Gram-negative bacilli producing extended-spectrum
betalactamases Research in Microbiology v 155 p 409-421 2004
TURNER P J Extended- Spectrum Beta-Lactamases Clinical Infectious
Diseases v 41 p 273-275 2005
WOLTER D J et al Phenotypic and Enzymatic Comparative Analysis
between the Novel KPC variant KPC-5 and Its Evolutionary Variants KPC-2 and
KPC-4 Antimicrob Agents Chemother Nov 17 2008
WOODFORD N et al Carbapenemases of Chryseobacterium
(Flavobacterium) meningosepticum distribution of blaB and characterization of a
novel Metalo-beta-lactamase gene blaB3 in the type strain NCTC 10016
Antimicrob Agents Chemother Jun44(6)1448-52 2000
WOODFORF N Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in
India Pakistan and the UK a molecular biological and epidemiological study The
Lancet Infectious Diseases v 10 n 9 p 597-602 2010
66
WOODFORD et al Outbreak of Klebsiella pneumoniae Producing a New
Carbapenem- Hydrolyzing Class A β-Lactamase KPC-3 in a New York Medical
Center Antimicrobial agents and chemotherapy Dec 2004 p 4793ndash4799 Vol 48
No 12
YAGI T et al A preliminary survey of extended-spectrum β-lactamases
(ESBLs) in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Japan
FEMS Microbiology Letters 184 (2000) 53-56
YIGIT H et al Novel carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase KPC-1 from
a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumonia J Antimicrob Agents
Chemother 45 (4) 1151-1161 (2001)
ZAVASCKI A P et al KPC-2- producing Enterobacter cloacae in two cities
from Southern Brazil Int J Antimicrob Agents Apr 28 2009
ZHANEL G G et al Comparative review of the carbapenecircmicos Drugs
67(7)1027-52 2007
67
ANEXOS
Sequumlecircncia do oligo blaKPC
Query 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
Query 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
Query 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
68
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
Query 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
Query 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
69
Query 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
Query 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
Query 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
70
Sbjct 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
Query 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
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|||||||
Sbjct 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
Query 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
Query 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
71
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Sbjct 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
Query 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
Query 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
72
Query 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
Query 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
Query 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
73
Sbjct 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
Query 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
Query 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
Query 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
74
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
Query 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
Query 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
75
Query 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
Query 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
||||
Sbjct 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
LOCUS AF297554 1377 bp
DNA linear BCT 26-MAR-2001
DEFINITION Klebsiella pneumoniae carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
gene complete cds
ACCESSION AF297554
VERSION AF2975541 GI10121874
76
KEYWORDS
SOURCE Klebsiella pneumoniae
ORGANISM Klebsiella pneumoniae
Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Enterobacteriaceae Klebsiella
REFERENCE 1 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH QueenanAM
AndersonGJ Domenech-SanchezA
BiddleJW StewardCD
AlbertiS BushK and TenoverFC
TITLE Novel carbapenem-hydrolyzing beta-
lactamase KPC-1 from a
carbapenem-resistant strain of
Klebsiella pneumoniae
JOURNAL Antimicrob Agents Chemother 45 (4)
1151-1161 (2001)
PUBMED 11257029
REFERENCE 2 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH AndersonGJ and
TenoverFC
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (19-AUG-2000) Nosocomial
Pathogens Laboratory Branch
Centers for Disease Control and
Prevention 1600 Clifton Rd MS
G08 Atlanta GA 30333 USA
FEATURES LocationQualifiers
77
source 11377
organism=Klebsiella
pneumoniae
mol_type=genomic DNA
db_xref=taxon573
-35_signal 5560
-10_signal 7883
mRNA 921012
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
RBS 117122
CDS 1311012
note=blaKPC-1
codon_start=1
transl_table=11
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
protein_id=AAG134101
db_xref=GI10121875
translation=MSLYRRLVLLSCLSWPLAGFSATALTNLVAEPFAKLEQD
FGGSI
GVYAMDTGSGATVSYRAEERFPLCSSFKGFLAAAVLARSQQQAGLLDTPIRYG
KNALV
PWSPISEKYLTTGMTVAELSAAAVQYSDNAAANLLLKELGGPAGLTAFMRSIG
DTTFR
78
LDRWELELNSAIPSDARDTSSPRAVTESLQKLTLGSALAAPQRQQFVDWLKGN
TTGNH
RIRAAVPADWAVGDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTRAPNKDDK
HSEAV
IAAAARLALEGLGVNGQ
ORIGIN
1 cggggcagtt acagccgtta cagcctctgg
agagggagcg gcttgccgct cggtgataat
61 cccagctgta gcggcctgat tacatccggc
cgctacacct agctccacct tcaaacaagg
121 aatatcgttg atgtcactgt atcgccgtct
agttctgctg tcttgtctct catggccgct
181 ggctggcttt tctgccaccg cgctgaccaa
cctcgtcgcg gaaccattcg ctaaactcga
241 acaggacttt ggcggctcca tcggtgtgta
cgcgatggat accggctcag gcgcaactgt
301 aagttaccgc gctgaggagc gcttcccact
gtgcagctca ttcaagggct ttcttgctgc
361 cgctgtgctg gctcgcagcc agcagcaggc
cggcttgctg gacacaccca tccgttacgg
421 caaaaatgcg ctggttccgt ggtcacccat
ctcggaaaaa tatctgacaa caggcatgac
481 ggtggcggag ctgtccgcgg ccgccgtgca
atacagtgat aacgccgccg ccaatttgtt
541 gctgaaggag ttgggcggcc cggccgggct
gacggccttc atgcgctcta tcggcgatac
79
601 cacgttccgt ctggaccgct gggagctgga
gctgaactcc gccatcccaa gcgatgcgcg
661 cgatacctca tcgccgcgcg ccgtgacgga
aagcttacaa aaactgacac tgggctctgc
721 actggctgcg ccgcagcggc agcagtttgt
tgattggcta aagggaaaca cgaccggcaa
781 ccaccgcatc cgcgcggcgg tgccggcaga
ctgggcagtc ggagacaaaa ccggaacctg
841 cggagtgtat ggcacggcaa atgactatgc
cgtcgtctgg cccactgggc gcgcacctat
901 tgtgttggcc gtctacaccc gggcgcctaa
caaggatgac aagcacagcg aggccgtcat
961 cgccgctgcg gctagactcg cgctcgaggg
attgggcgtc aacgggcagt aaggctctga
1021 aaatcatcta ttggcccacc accgccgccc
ttgcgggcgg catggattac caaccactgt
1081 cacatttagg ctaggagtct gcgcggcaga
gccgtgtgac cggttttctg tagagcactg
1141 acgatggcgg cggcgctctc tgcaattggc
aaggcgtcgg cgccaaggat accaatcttg
1201 cggcgcgcgg cgtgttatga cgactggggt
gcatttgagc cgccccattt aaccttcgcc
1261 ctcacagata cgccattcgc ctcaaattta
gcgccatgca gacgagcttc cactcggctt
1321 gcaccttgtc caggcccctc atgctgaact
gacgcaatcc catcaccgcc ttgatca
80
32
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
Trata-se de um estudo transversal onde foi realizado o teste de
susceptibilidade das enterobacteacuterias aos antibioacuteticos carbapenecircmicos a partir dos
materiais bioloacutegicos coletados dos pacientes internados no Hospital Regional da Asa
Norte (HRAN) e enviados ao Laboratoacuterio de Anaacutelises Cliacutenicas da mesma Instituiccedilatildeo
Os materiais bioloacutegicos investigados foram sangue aspirado traqueal ou brocircnquico
urina e cultura semi quantitativa de ponta de cateter venoso central O HRAN eacute um
hospital puacuteblico do Distrito Federal com 395 leitos sendo as cliacutenicas de internaccedilatildeo
Berccedilaacuterio Cirurgia Geral Cirurgia Plaacutestica Cliacutenica Meacutedica Ginecologia Maternidade
Pediatria Queimados UTI com atendimento a pacientes portadores de doenccedilas de
caraacuteter cliacutenico e ciruacutergico
4 1 Coleta e transporte das amostras bioloacutegicas
As amostras foram coletadas de pacientes internados no Hospital Regional da
Asa Norte (HRAN) com suspeitas de infecccedilatildeo por KPC A identificaccedilatildeo primaacuteria foi
realizada pelo Laboratoacuterio de Microbiologia do hospital de origem dos pacientes e os
demais procedimentos que foram utilizados na identificaccedilatildeo encontram-se descritos
abaixo
4 2 Procedimentos para confirmaccedilatildeo de resistecircncia bacteriana por
disco de ertapenem (adaptado CDC 2004)
Para diagnosticar amostra como portadora de bacteacuteria produtora de
carbapenemase foi realizado o teste com disco de ertapenem como forma de
triagem Inicialmente utilizou-se o swab contaminado com a amostra que foi
distribuiacuteda em uma pequena aacuterea da placa de aacutegar MacConkey para apoacutes o
crescimento ser realizada a pesquisa de colonizaccedilatildeo por enterobacteacuterias resistentes
aos carbapenecircmicos (Pesquisa de CRE) Procedeu-se a semeadura por teacutecnica
semi-quantitativaesgotamento com alccedila bacterioloacutegica na diluiccedilatildeo de 1100 O disco
de Ertapenem foi colocado na superfiacutecie da placa de MacConkey na junccedilatildeo dos dois
primeiros campos de semeadura conforme demonstrado na figura 5 Incubou a placa
33
em estufa aeroacutebia a 35ordmC por 24 e 48 horas e observou-se o halo de difusatildeo do
disco de Ertapenem na placa para proceder agrave leitura
O teste deixou de ser obrigatoacuterio apoacutes a modificaccedilatildeo dos criteacuterios
interpretativos para carbapenecircmicos para enterobacteacuterias publicados no suplemento
do CLSI 2010 M100-S20-U
Figura 5 Mecanismo de semeamento de material bioloacutegico oriundos de
pacientes com suspeita de infecccedilatildeo por KPC Fonte adaptado CDC 2004
4 2 1 Interpretaccedilatildeo dos resultados
Na ausecircncia de crescimento ateacute 24 horas (MacConkey) ou halo de difusatildeo
gt27 mm na placa deve-se reincubar as placas por mais 24 horas Quando for
ausente o crescimento apoacutes 48 horas ou halo de difusatildeo gt27 mm na placa libera-se
como enterobacteacuterias resistentes a carbapenecircmicos (KPCNEG)Havendo
crescimento de colocircnias na placa de MacConkey com halo lt 27 mm (apenas para
colocircnias com crescimento dentro do halo) deve-se reisolar e realizar identificaccedilatildeo e
antibiograma automatizado teste de sensibilidade por disco-difusatildeo e Teste de
Hodge Modificado (THM) Os isolados de enterobacteacuterias cujos testes comprovarem
a resistecircncia aos carbapanecircmicos testados (KPCPOS) foram reportado a Comissatildeo
de Controle de Infecccedilatildeo Hospitalar (CCIH) Jaacute osbacilos Gram-negativos natildeo
fermentadores natildeo foram reportados (KPCNEG) Para interpretaccedilatildeodos resultados
foram utilizados os valores conforme demonstrados na tabela 1
Tabela 1 Criteacuterios Interpretativos para testes de sensibilidade
ENTEROBACTEacuteRIAS
Disco difusatildeo (mm) MIC (microgml)
34
Antibioacutetico Sigla S I R S I R
Ertapenem 10
microg
ETP 22 19-
21
18 05 1 2
Meropenem 10
microg
MEM 23 20-
22
19 1 2 4
Fonte Manual Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)
2013
Os resultados que apresentaram resistecircncia ao antibioacutetico Ertapenem foram
considerados como suspeitos de contaminaccedilatildeo por KPC Fez-se o teste de
susceptibilidade aos antibioacuteticos (TSA) em aparelho automatizado MicroScan Walk
Away 96sl Dade Behring
4 3 Teste de susceptibilidade aos antibioacuteticos (adaptado CDC 2004)
A determinaccedilatildeo da susceptibilidade dos isolados foi feita pelo teste de
susceptibilidade aos antibioacuteticos (TSA) apoacutes cultura em meio de gelose simples
(INSA) para avaliaccedilatildeo da sua pureza e obtenccedilatildeo de colocircnias isoladas Para
preparaccedilatildeo de uma suspensatildeo bacteriana com turvaccedilatildeo aproximada de 05
McFarland (Dade BehringMicroScanregTurbidity Meter) ressuspendeu duas a cinco
colocircnias em 2ml de soro fisioloacutegico esteacuteril diluindo a 1100 em soro fisioloacutegico num
volume total de 10ml em seguida foi feita uma semeadura em duas placas
quadradas (120mm x 120mm) de Muller-Hinton Agar (INSA) por inundaccedilatildeo
Os discos de antibioacutetico carbapenecircmicos imipenem meropenem e
ertapenem (Biorad) foram aplicados com o auxiacutelio de um dispensador automaacutetico A
susceptibilidade das Enterobacteacuterias aos carbapenecircmicos foi definida de acordo
com o protocolo Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI 2011)
Para aquelas Enterobacteacuterias que apresentaram resistecircncia ao ertapenem
foram realizados o Teste de Hodge Modificado para Detecccedilatildeo de Enterobacteacuterias
Produtoras de Carbapenemases conforme descrito pelo Centers for Disease Control
and Prevention (CDC 2004)
35
4 4Teste de Hodge Modificado (THM) (adaptado CDC 2004)
Preparou-se uma suspensatildeo em salina esteacuteril com a cepa Escherichia coli
ATCC 25922 (padratildeo 05 de McFarland) Apoacutes isto diluiu a suspensatildeo 110 em
salina (05 ml da soluccedilatildeo de Ecoli ATCC 25922 + 45 ml salina)Foi entatildeo semeado
na superfiacutecie de uma placa de Agar Muller-Hinton com a suspensatildeo diluiacuteda de Ecoli
ATCC 25922 com auxilio de swab seco assegurando que houvesse uma
distribuiccedilatildeo uniforme cobrindo toda a superfiacutecie do Agar Deixou secar por 3 a 5
minutos em temperatura ambienteColocou-se o disco de ertapenem 10microg no centro
da placa e apoacutes isto fez-se uma estria linear da cepa a ser testada da borda do
disco ateacute a borda da placa utilizando uma alccedila calibrada 10 microl ou um swab Incubou
a placa na estufa em atmosfera aeroacutebia a 35 plusmn 2ordmC por 16 a 24 horas
441 Controle de qualidade (CQ)
Foi utilizado um CQ todos os dias em que se realizou o teste tendo como
controle Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1705- teste de Hodge modificado
positivo Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1706- teste de Hodge modificado
negativo
442 InterpretaccedilatildeoResultados
Apoacutes 16ndash24 horas de incubaccedilatildeo examinar as placas para verificar a presenccedila
de uma distorccedilatildeo no halo de inibiccedilatildeo do disco de ertapenem devido ao crescimento
realccedilado da cepa ATCC na intersecccedilatildeo do organismo teste e a Ecoli ATCC 25922
dentro dos limites do halo O THM positivo apresentaraacute presenccedila de distorccedilatildeo no
halo de inibiccedilatildeo de ertapenem devido ao crescimento da cepa Ecoli ATCC 25922 ao
longo da estria da cepa teste para dentro dos limites do halo de inibiccedilatildeo Jaacute o THM
negativo teraacute ausecircncia de crescimento da cepa Ecoli ATCC 5922 ao longo da estria
da cepa teste para dentro dos limites do halo de inibiccedilatildeo do disco de ertapenem
Este resultado estaacute representado na figura 6
36
Figura 6 Interpretaccedilatildeo resultado do Teste de Hodge Modificado
(adaptado CDC 2004) Teste positivo na estria da cepa teste na parte superior
da placa teste negativo na estria da cepa teste na parte inferior da placa
Tendo positivo como resultado o paciente era um provaacutevel contaminado por
KPC As amostras entatildeo foram encaminhadas para a Fundaccedilatildeo Osvaldo Cruz
(FIOCRUZ) para confirmaccedilatildeo final As amostras finalmente confirmadas como
positivas para KPC foram isoladas e guardadas no banco de cepas cliacutenicas do
hospital Apoacutes a autorizaccedilatildeo do CEP amostras das cepas foram transferidas para
meio de transporte Stuard em caixa teacutermica fechada em baixa temperatura e
levadas para o laboratoacuterio de microbiologia cliacutenica da universidade
No laboratoacuterio da universidade as amostras foram separadas e realizadas
repiques em meios MacConkey e incubadas por 24h As colocircnias caracteriacutesticas
foratildeo isoladas em caldo BHI e mantidas em shaker a 37oC por 2h Apoacutes isto foram
executadas as anaacutelises a seguir
Os isolados de Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases foram
submetidos agrave extraccedilatildeo de DNA e posterior sequumlenciamento para identificaccedilatildeo dos
genes de resistecircncia blaKPC de 1 a 13 e identificaccedilatildeo do gene universal Os
pacientes de onde os materiais bioloacutegicos contendo as Enterobacteacuterias produtoras
de carbapenemases foram os isolados foram investigados quanto aos aspectos
epidemioloacutegicos e cliacutenicos
37
4 5 Extraccedilatildeo de DNA bacteriano
A extraccedilatildeo de DNA bacteriano foi realizada utilizando o kit NucleoSpin
Plasmidreg (MN) Antes de iniciar a extraccedilatildeo foi feito a preparaccedilatildeo das soluccedilotildees
reagentes materiais e amostras (vortexando) colocou-se em banho-maria agrave 50ordmC o
tampatildeo AW Partiu-se de colocircnias isoladas cultivadas que sofreram passagem em
meio LB liacutequido por 12h Adicionou-se 15 mL da amostra no tubo eppendorf
centrifugou por 5 minutos descartou o sobrenadante (com cuidado para natildeo
descartar o Pellet) Repetiu-se este procedimento por mais trecircs vezes completando-
se o volume de 6mL Foram adicionados 250microL do tampatildeo Resuspension Buffer A1
encostando a ponteira no Pellet e misturando (este tampatildeo tem como funccedilatildeo
separar a formaccedilatildeo de grumos celulares) Apoacutes isso homogeneizou e vortexou os
tubos eppendorfs Apoacutes isso foram adicionados 250microL do tampatildeo Lysis Buffer A2
homogenizou e deixou descansar por 5 minutos (esta etapa eacute importante para a lise
da parede e da membrana celulares e liberaccedilatildeo do conteuacutedo da ceacutelula)
Passado o tempo de descanso foi adicionado 300microL do tampatildeo
Neutralization Buffer A3 homogeneizou e centrifugou por 10 minutos (este tampatildeo
iraacute retirar as proteiacutenas que envolvem o DNA e voltaraacute com o pH para proacuteximo de 8
impedindo que a soluccedilatildeo de lise facilite a quebra das ligaccedilotildees covalentes do aacutecido
nucleacuteico) Em seguida enumeraram-se os tubos contendo filtros com siacutelica
transferiu-se o sobrenadante para o filtro e centrifugou por 5 minutos Descartou-se
o que foi filtrado adicionou 500microL do tampatildeo AW (banho-maria) centrifugou por 2
minutos Novamente foi descartado o filtrado Adicionou-se 600microL do tampatildeo A4
centrifugou por 2 minutos e descartou o filtrado (os tampotildees AW e A4 contecircm
isotiocianato de guanidina em concentraccedilotildees crescentes para facilitar a adsorccedilatildeo
do DNA na siacutelica e retirada das outras biomoleacuteculas da amostra) Foi feita outra
centrifugaccedilatildeo com o tubo vazio Apoacutes isto o filtro foi trocado para outro eppendorf
definitivo onde foi adicionado 50microL do tampatildeo Elution Buffer AE (este tampatildeo
favorece a eluiccedilatildeo do DNA) centrifugou por 2 minutos descartou o filtro e
armazenou as amostras em freezer -20ordmC
38
4 6 Iniciadores e reaccedilatildeo de PCR
Os iniciadores universais para o gene blaKPC foram desenhados baseados
em sequumlecircncias conservadas apresentadas pelos sub-grupos de genes que
codificam a enzima carbapenemase de klebsiella pneumoniae (YIGIT et al 2001)
Baseado na sequumlecircncia para o blakpc-1 depositada no GenBank
(AF2975541) o oligonucleotiacutedio (oligo) iniciador direto (5-
ATGTCACTGTATCGCCGTC-3rsquo) foi desenhado para reconhecer a sequumlecircncia
blaKPC na posiccedilatildeo (131149) enquanto que o iniciador reverso (5-
TTACTGCCCGTTGACGCC-3rsquo) foi reconhecido na posiccedilatildeo (9951012) As anaacutelises
baseadas em alinhamento de sequumlecircncias mostraram que o par de iniciadores
blaKPC podem detectar os alelos de 1 a 13 do gene blaKPC conforme a tabela 2
Tabela 2 Nuacutemero de acesso ao GenBank dos alelos blaKPC e seus
microrganismos originais
Nuacutemero de
Acesso GenBank
Microrganismo Alvo
AF2975541 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-1
GU0862251 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-2
HQ2589341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-2-like
AB5577341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC -3
EU4473041 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-4
EU4002222 Pseudomonas
aeruginosa
blaKPC-5
EU5555341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-6
EU7297271 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-7
39
FJ2344121 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-8
FJ624872 Escherichia coli blaKPC-9
GQ1403481 Acinetobacter
baumannii
blaKPC-10
HM0669951 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-11
HQ3428891 Enterobacter cloacae blaKPC-12
HQ3428901 Enterobacter cloacae blaKPC-13
As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo de blaKPC foram realizadas em um
primeiro tempo de desnaturaccedilatildeo em que foi 94ordmC por 5 minutos seguido de 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 58 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 90 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 78ordmC por 8 minutos Aleacutem das amostras foi utilizado um
controle negativo
A PCR do blaKPC foi realizada utilizando os componentes para o volume da
reaccedilatildeo de 25 microL citados na tabela 3 A banda do tamanho do produto de PCR foi de
881 pares de bases (pb) o que corresponde ao plasmiacutedeo
Tabela 3 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do
gene blaKPC
Reagente Volume
DNA molde 4 microL
Tampatildeo Taq 25 microL
MgCl2 075 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP
2 microL
Oligo F 1 microL
Oligo R 1 microL
Taq DNA polimerase 05 microL
Aacutegua MiliQ 1335 microL
40
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
Baseado na sequumlecircncia para o gene 16S rRNA em que o oligonucleotiacutedio
Universal iniciador direto foward (5-CCAGCAGCCGCCGTAATACG-3rsquo) foi
desenhado para reconhecer a sequumlecircncia universal na posiccedilatildeo 1513 enquanto que o
iniciador reverso (5-ATCGGYTACCTTGTTACGACTTC-3rsquo) foi reconhecido na
posiccedilatildeo 1491 foram realizadas PCRrsquos As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo deste
gene foram realizadas nos seguinte tempos separaccedilatildeo 94ordmC por 10 minutos 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 55 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 120 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 72ordmC por 10 minutos
A PCR do gene 16S rRNA foi realizada utilizando os componentes para o
volume da reaccedilatildeo de 25microL citados na tabela 4 A banda do tamanho do produto de
PCR foi de 996 pb correspondente aacute regiatildeo ribossomal capaz de amplificar todas
as espeacutecies
Tabela 4Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do gene
universal
Reagente (quantidade
concentraccedilatildeo do estoque)
Volume
DNA molde 10 ng 4 microL
Tampatildeo Taq 10 x 25 microL
MgCl2 50mM 125 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP 25 mM
125 microL
Oligo F 10microM 05 microL
Oligo R 10microM 05 microL
Taq DNA polimerase 5UmicroL 04 microL
Aacutegua Miliq 146 microL
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
41
O termociclador utilizado para os experimentos foi o LifeTouch da BIOER
4 7 Digestatildeo
Para realizaccedilatildeo da digestatildeo foi utilizada a enzima BshF I (Hae III) EN- 1105
tamanho 7000 units concentraccedilatildeo 10 unitsmicroL fonte Bacillus sphaericus empresa
Jena bioscienceUtilizaram-se os componentes para o volume de 50microL da reaccedilatildeo
citados na tabela 5
Tabela 5 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da digestatildeo do gene
universal
Reagente Volume
Produto de PCR 10 microL
Enzima BshF I 01 microL
Tampatildeo (10x) 5 microL
Aacutegua Miliq 349 microL
Total (em cada ependorff) 50 microL
Valores para 1 digestatildeo
Os ependorffs foram colocados por 30 minutos em banho-maria a 37ordmC Apoacutes
isso fez-se a corrida das amostras em gel de agarose para verificaccedilatildeo do resultado
(LU et al 2000)
4 8 Eletroforese em gel de agarose
Os produtos de DNA PCR e digestatildeo foram analisados em gel de agarose
2 O tempo de corrida do gel eacute de aproximadamente 1hora e 30minutos sendo
que no comeccedilo foi usada agrave voltagem de 50 V e apoacutes comeccedilar a correr o gel
aumentou a voltagem para 100 v Utilizou-se o marcador de 100pb (pares de bases)
Foi adicionado 3microL de corante Bromophenol (que tem a funccedilatildeo de fazer uma ligaccedilatildeo
na amostra de DNA e permitir a visualizaccedilatildeo da corrida no gel de agarose) em 7microL
de amostra tanto de DNA quanto de PCR Para o preparo do gel foi utilizado TBE
42
(Tris- Aacutecido Boacuterico) agarose e brometo de etiacutedio (sua funccedilatildeo eacute de corante para o gel
e permitir a visualizaccedilatildeo do DNA quando colocado agrave luz ultravioleta) Para o oligo
blaKPC a banda da amplificaccedilatildeo foi em 881ppb correspondendo ao plasmiacutedeo Jaacute
o oligo Universal foi em 996 pb
4 9 Descarte de resiacuteduos
Todos os materiais utilizados nos ensaios foram de uso uacutenico e manipulados
em cacircmaras de seguranccedila bioloacutegica classe II Apoacutes o uso foram colocados em
soluccedilatildeo desinfetantes (hipoclorito a 1) e em seguida autoclavados a 127oC por 20
min em sacos apropriados para autoclavaccedilatildeo Apoacutes a finalizaccedilatildeo do ciclo de
esterilizaccedilatildeo os sacos contendo o material descartaacutevel foram colocados em
recipientes de coleta da empresa responsaacutevel pela coleta de materiais bioloacutegicos
produzidos no laboratoacuterio de microbiologia Todos os procedimentos seguiram a
normativa RDC-ANVISA 3062004 sobre o descarte de resiacuteduos de serviccedilo de
sauacutede
4 10 Aspectos epidemioloacutegicos e cliacutenicos
Os aspectos cliacutenicos e epidemioloacutegicos foram investigados por meio de
prontuaacuterios dos pacientes portadores de enterobacteacuterias produtoras de
carbapenemases e envolveram topografia mais provaacutevel do foco infeccioso a
enfermidade motivadora da internaccedilatildeo o desfecho cliacutenico a idade e o tempo de
internaccedilatildeo
4 12 Anaacutelises eepidemioloacutegicas
As anaacutelises foram realizadas com o pacote estatiacutestico SPSS versatildeo 200
Para verificar quais variaacuteveis referentes aos dados epidemioloacutegicos e
microbioloacutegicos influenciaram no desfecho verificou- se a diferenccedila meacutedia das
variaacuteveis idade e tempo de internaccedilatildeo em cada grupo O teste estatiacutestico utilizado foi
o teste t de Student apoacutes se executar o teste de normalidade de Shapiro-Wilk Para
as variaacuteveis sexo perfil microbioloacutegico das enterobacteacuterias produtoras de
43
carbapenemases foi avaliada a associaccedilatildeo com o desfecho por meio do teste Exato
de Fisher O niacutevel de significacircncia adotado foi de 5
4 13 Preceitos eacuteticos
Este projeto estaacute inserido em um projeto maior denominado ldquoEpidemiologia
cliacutenica e caracterizaccedilatildeo molecular do Acinetobacter Baumannii resistente a
antibioticoterapia em pacientes internado em hospitais do Sistema Uacutenico de Sauacutederdquo
que foi submetido ao Comitecirc de Eacutetica em Pesquisa da Secretaria do Estado de
Sauacutede do Distrito Federal (SESDF) e emitido parecer aprovado pelo protocolo nordm
23109 (anexo)
44
5 RESULTADOS
51 Anaacutelise molecular
Para a amplificaccedilatildeo com o oligo blaKPC foram amplificadas amostras
que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 881 pb correspondente ao
plasmiacutedeo A anaacutelise da amplificaccedilatildeo da regiatildeo do gene blaKPC mostrou que
apenas a amostra A10 natildeo amplificou isso demonstra que esta amostra natildeo
possuiacutea o gene de resistecircncia
5 1 1 Gene blaKPC
Figura 7 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 881 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
A amostra A3 natildeo amplificou no primeiro momento entatildeo foi realizado
novamente a PCR e corrida de gel obtendo entatildeo a amplificaccedilatildeo da amostra como
apresentado na figura 8
45
Figura 8 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC da
mostra A3 estudada A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo de 881
pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 1 2 Gene 16S rRNA
Para a amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA utilizou-se o oligo universal Foram
amplificadas amostras que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 996 pb
Figura 9 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
46
Segundo Lu et al (2000) a digestatildeo com a enzima HaeIII deste amplicons de
16S rRNA devolveriam bandas com perfis entre 150 a 200 pb No gel abaixo eacute
possiacutevel evidenciar que este perfil ocorreu com o predomiacutenio de bandas na altura
de 200pb
Figura 10 Gel de agarose a 2 da digestatildeo do amplicon do gene 16S
rRNA das amostras com a enzima HaeIII evidenciando diversos fragmentos
proacuteximos a 200 pb A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo ribossomal
de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 2 Anaacutelises epidemioloacutegicas
5 2 1 Sexo
No total foram detectados 17 isolados de KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 onde a maior a prevalecircncia foi
detecatada em amostras de pacientes do sexo masculino (53) do que no sexo
feminino (47)
47
Figura 11 Isolado de KPC segundo sexo dos 17 pacientes investigados
no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 2 Desfecho cliacutenico
Em 17 isolados de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo
de 2010 aacute 2011 a porcentagem de pacientes que foram a oacutebito (59) foi maior que
a de pacientes que tiverm alta (41)
Figura 12 Isolado de KPC segundo desfecho cliacutenico dos 17 pacientes
investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
48
5 2 3 Local da coleta
Dos 17 episoacutedios detectados de infecccedilatildeo por KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 a infecccedilatildeo em swab retalfoi mais
frequente (47) seguida de ponta de cateacuteter (18) e secreccedilatildeo traqueal (12)
Figura 13 Isolados de KPC segundo local da coleta da amostra nos 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 4 Microorganismo
O microorganismo mais encontrado foi a Klebsiella pneumoniae (82)
seguida da Enterobacter clocae (12) e Serratia marcescens (6) dos 17 isolados
de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 Isto afirma o
fato de a sigla KPC ser utilizada de forma errocircnea aacute Klebsiella pneumoniae visto
que a evidecircncia dela eacute maior em relaccedilatildeo as outras cepas
49
Figura 14 Isolado de KPC segundo microrganismo encontrado em 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 5 Relaccedilotildees variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana e desfecho
cliacutenico
Tabela 6 ndash Distribuiccedilatildeo do perfil geneacutetico sexo coleta tipificaccedilatildeo de
microrganismos e anaacutelise da resistecircncia bacteriana segundo o desfecho
cliacutenico Brasiacutelia-DF 2010 a 2011
Variaacutevel Resultado
Desfecho
Alta Oacutebito
N N P
Gene 16S rRNA Positivo 7 1000 10 1000
NA Gene blaKPC Positivo 6 857 10 1000
Negativo 1 143 0 00 0218 Sexo Feminino 2 286 6 600
Masculino 5 714 4 400 0201 Local da coleta Fundo saco de
Douglas 1 143 0 00
Hemocultura 0 00 1 100 0463 Ponta de cateter 1 143 2 200
Sec TraquealBrocircnquica
0 00 1 100
50
Secreccedilatildeo traqueal 2 286 0 00
Swab retal 3 429 5 500
Urina 0 00 1 100
Microrganismo Enterobacter cloacae (KPC)
1 143 1 100
Klebsiella pneumoniae
6 857 8 800
0416 Serratia
marcescens 0 00 1 100
Teste de Hodge Hodge positivo 7 1000 10 1000
NA Amicacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 1 100 0848 resistente 0 00 1 100
sensiacutevel 2 286 3 300
Amoxicilina Aacutecido Clavulacircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Ampicilina Sulbactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ampicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Aztreonan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefazolina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Cefoperazona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Cefotaxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefoxitina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0509 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 2 286 4 400
Ceftazidima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cetriaxona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 3 429 5 500 0772 Cefalotina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ciprofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772
51
resistente 3 429 5 500
Claritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Clindamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Eritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Gentamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0942 resistente 2 286 3 300
sensiacutevel 1 143 2 200
Imipenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 0 00 2 200 0193 Resistente 1 143 3 300
sensiacutevel 2 286 0 00
Nitrofurantoiacutena sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Norfloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Oxacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Penicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Piperacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Rifampicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tetraciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Ticarcilina Aacutecido Clavulocircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0688 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 3 429 4 400
Tobramicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Trimetoprima Sulfametoxazol
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0112 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 2 286 0 00
Vancomicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tigeciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediario 0 00 1 100 0211 natildeo testado 1 143 4 400
resistente 2 286 0 00
52
Cefepime sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefuroxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Levofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Piperacilina Tazobactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Ertapenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Meropenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0223 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 1 143 0 00
Cefotetan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 sensiacutevel 0 00 1 100
Gemifloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 7 700 0585 natildeo testado 3 429 3 300
Desfecho
Alta Oacutebito
Meacutedia Erro
padratildeo Meacutedia Erro
padratildeo p
Idade 58 9 59 5 0991
Tempo Internaccedilatildeo (dias)
50 13 46 12 0571
n= 17 p(lt 005) NA natildeo se aplica
53
6 DISCUSSAtildeO
Nos uacuteltimos anos houve um aumento na incidecircncia de bacteacuterias
multirresistentes aos antimicrobianos no ambiente hospitalar tornando isto um
problema mundial de sauacutede puacuteblica (HULSCHER et al 2010) Quando se trata
principalmente de bacilos Gram negativos a frequumlecircncia destas bacteacuterias eacute ainda
maior em paiacuteses da Ameacuterica Latina quando comparada a paiacuteses desenvolvidos
(GALES etal 2012)
De acordo com dados do ldquoMeropenem Yearly Susceptibility Test Information
Collectionrdquo (MYSTIC) ocorreu nos Estados Unidos um aumento na susceptibilidade
de K pneumoniae nos uacuteltimos anos graccedilas a praacuteticas de controle de disseminaccedilatildeo
de amostras resistentes(RHOMBERG P R et al 2009) O aumento crescente da
prevalecircncia destes microrganismos foi proporcional ao aumento da dependecircncia do
uso de antibioacuteticos carbapenecircmicos considerados como a opccedilatildeo terapecircutica para o
tratamento de infecccedilotildees por bacilos Gram negativos multi-resistentes (LIVERMORE
2012) Isto afeta diretamente as opccedilotildees de tratamento sobrando poucas alternativas
para a terapecircutica que incluem colistina (polimixina E) e tigeciclina que apresentam
respectivamente problemas em termos de toxicidade e eficaacutecia (LIVERMORE et
al 2011) Um dos efeitos adversos mais importantes das poliminas B e E por
exemplo satildeo a neurotoxicidade e nefrotoxicidade (MENDES C A C et al2009 )
Devido agrave resistecircncia ser usualmente de natureza plasmidial e portanto de
maior disseminaccedilatildeo especialmente quando carreadas por K pneumoniae
microrganismo com uma notoacuteria capacidade para acumular e transferir plasmiacutedeos
com determinantes para resistecircncia o nuacutemero de casos detectados pelo
fenoacutetipogenoacutetipo blaKPC eacute bastante preocupante (MONTEIRO et al 2009)
Comparada com outras bacteacuterias hospitalares a transmissatildeo de clones
multirresistentes de K pneumoniae eacute maior e podem natildeo ser controladas pelos
meacutetodos de controle de infecccedilatildeo hospitalar (PAAUW et al 2007) A forma
plasmidial para transferecircncia da resistecircncia adicionada a este grande potencial para
disseminaccedilatildeo de clones resistentes eacute preocupante visto que apoacutes surtos muitas
vezes pode se tornar endecircmica Jaacute eacute uma realidade a disseminaccedilatildeo desta bacteacuteria
54
entre pacientes hospitais paiacuteses e ateacute mesmo continentes (WOODFORF et al
2010 ROGERS et al 2011)
As chances de surtos satildeo maiores em paiacuteses com poucos recursos devido agrave
maior carecircncia de praacuteticas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees hospitalares e o
uso irracional de antimicrobianos de forma empiacuterica e inadequada (KUMARASAMY
et al 2010) Ateacute o momento os mecanismos de resistecircncia aos cabapenecircmicos
geralmente encontrado eram a produccedilatildeo de ESBL (CTX-M) somada aacute perda de
porina (CARVALHAES et al 2010) Foi notado a partir do ano de 2008 um
aumento no nuacutemero de K pneumoniae produtoras de KPC-2 apresentando outra
forma de resistecircncia (GALES 2012)
Um estudo mostrou que o perfil do paciente colonizado ou infectado por KPC
foi de um paciente entre os 33 e os 82 anos de idade internado haacute mais de 1
semana no hospital A mortalidade geral nos uacuteltimos anos ficou em torno de 7
sendo que dos 77 pacientes estudados 32 (415) pacientes evoluiacuteram para oacutebito
evidenciando a alta morbi-mortalidade associada (ALVES A P et al 2013)
Em estudo com 2316 pacientes avaliados a populaccedilatildeo de sexo masculino foi
de 526 idade meacutedia global de 53 anos (mediana de 55 anos) permanecircncia meacutedia
de 58 dias (mediana de 3 dias) (OLIVEIRA A C et al 2010) Outros trabalhos
apresentaram ausecircncia de significacircncia entre sexoidade e o desenvolvimento de
infecccedilotildees por microrganismos resistentes (PERES-BOTA D et al 2003 COLPAN
A et al 2005 COELLO R et al 1997)
Outro estudo utilizou um total de 30 amostras sendo elas isoladas de urina
escarro secreccedilatildeo pleural ponta de cateter aspirado traqueal e hemocultura A mais
prevalente foi em urina (40) Entre as 30 cepas analisadas a maior porcentagem
foi da cepa Klebsiella pneumoniae (70) Enterobacter sp (133) Klebsiella
ozaenae (10) Escherichia coli (333) e Klebsiella oxytoca (333)
(DIENSTMANN R et al 2010) Nos Estados Unidos a enzima KPC jaacute se tornou
endecircmica Foi realizada uma pesquisa em dois hospitais de Nova York onde
testaram 602 amostras e 45 apresentaram algum mecanismo de resistecircncia
sendo apenas 33 confirmadas por biologia molecular como KPC-2 (BRATU et
al 2005)
55
Estudo sobre os tipos de ESBL feito no Japatildeo apresentou o tipo Toho-1 como
o mais prevalente nessa pesquisa Ateacute o ano de 2000 ano em que foi publicado tal
estudo este era o primeiro relatoacuterio no Japatildeo para identificar derivados de ESBLs
como tipo de SHV e TEM entre E coli e K pneumoniae Em especial o tipo SHV- 12
foi identificado com uma maior frequumlecircncia Estes resultados indicam que tipos
distintos de ESBLs que satildeo diferentes em sua especificidade de substrato e origem
geneacutetica coexistem no Japatildeo Isto mostra a importacircncia de caracterizar genoacutetipos
distintos de ESBLs e de estar em alerta continuamente para as tendecircncias de
ESBLs no Japatildeo aleacutem da necessidade de uma interpretaccedilatildeo uniforme utilizando as
diretrizes do CSLI para relatar cepas produtoras de ESBL Aleacutem da detecccedilatildeo de
ESBLs satildeo necessaacuterias mais informaccedilotildees tais como o perfil de sensibilidade
especiacutefica para diversas β-lactacircmicos e o local da infecccedilatildeo Esses fatores satildeo
essenciais para a escolha adequada de antibioacuteticos (YAGI T et al 2000)
No ano de 2004 uma pesquisa avaliou a produccedilatildeo de uma enzima de
hidroacutelise de carbapenecircmicos atraveacutes da teacutecnica de sequumlenciamento foi revelado
um novo membro da famiacutelia KPC designado KPC- 3 Pesquisadores encontraram
em um mutante de K pneumoniae uma substituiccedilatildeo de um gene associado com
resistecircncia a Imipenem mas essa substituiccedilatildeo foi considerada improvaacutevel na
contribuiccedilatildeo da resistecircncia aos carbapenecircmicos da espeacutecie estudada Aleacutem da
resistecircncia aos carbapenecircmicos estes isolados eram em sua maioria resistentes agraves
cefalosporinas penicilinas e aminoglicosiacutedeos Usando estudos de transformaccedilatildeo
conjugaccedilatildeo e hibridaccedilatildeo localizaram o alelo blaKPC em plasmiacutedeo aleacutem disso
mostraram que esse alelo tambeacutem carregava uma resistecircncia aos aminoglicosiacutedeos
A transferecircncia das enzimas KPCs foi demonstrada in vitro tanto neste como em
outros estudos pode ser que os plasmiacutedeos que fazem esta transferecircncia estavam
comeccedilando a se espalhar no ambiente cliacutenico resultando na multiresistecircncia dessas
estirpes (WOODFORD et al 2004)
O presente estudo apresentou um vieacutes quanto aos resultados dos testes de
susceptibilidade microbiana Observou-se que natildeo foi encontrado resultado deste
teste em algumas amostras o que natildeo cooperou para um estudo mais preciso
futuros estudos quanto agraves amostras e um melhor acompanhamento deste tipo de
patologia Poreacutem mesmo sem algumas amostras com este resultado disponiacutevel foi
56
confirmada a presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos
carbapenecircmicos por meio dos genes de resistecircncia blaKPC e 16S rRNA que as
amostras apresentaram em sua maioria serem portadoras Quanto aos resultados
estatiacutesticos nenhuma das variaacuteveis apresentou significacircncia estatiacutestica (p gt 005)
mostrando assim que estas variaacuteveis isoladas natildeo foram o fator determinante para
o desfecho cliacutenico de alta ou oacutebito
57
7 CONCLUSAtildeO
Os genes blaKPC e 16S rRNA foram caracterizados confirmando a a
presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos carbapenecircmicos
Houve uma maior prevalecircncia da cepa K pneumoniae e isto confirma outros
estudos que apresentam a maior prevalecircncia desta cepa em amostras com KPC
Aleacutem disso isso justifica a forma popular da K pneumoniae ser chamada de KPC
enquanto que na verdade KPC eacute uma enzima podendo estar presente em outras
cepas como Enterobacter clocae tambeacutem apresentada no presente estudo O
desfecho cliacutenico de oacutebitos maior que 50 eacute um possiacutevel indicador sobre a
necessidade de se realizar um teste raacutepido para identificaccedilatildeo de KPC visando
iniciar o mais raacutepido possiacutevel o tratamento afim de diminuir a mortalidade por esta
infecccedilatildeo
Nenhuma das variaacuteveis isoladamente estaacute relacionada ao desfecho cliacutenico
oacutebito ou alta pois natildeo apresentaram relevacircncia estatiacutestica O presente estudo
mostrou que haacute presenccedila da bacteacuteria nas amostras de pacientes do hospital
estudado podendo entatildeo afirmar que este tipo de bacteacuteria se encontra tambeacutem
presente em ambiente hospitalar O uso irracional de antimicrobiano eacute demonstrado
de forma indireta quando foi apresentado atraveacutes do Teste de Hodge Modificado
uma resistecircncia de 100 aos antibioacuteticos carbapenecircmicos Isto tambeacutem reflete na
terapecircutica sendo que pacientes portadores de bacteacuterias resistentes aos
antibioacuteticos carabepecircmicos tem uma escassa opccedilatildeo de tratamento e as opccedilotildees
apresentam problemas quanto agrave toxicidade e eficaacutecia
58
REFEREcircNCIAS
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Mecanismos
de resistecircncia bacteriana aos antimicrobianos Disponiacutevel em
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controleopas_
webmodulo3mec_sitiohtmgt Acesso em 25 de abril de 2014
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Nota teacutecnica nordm
012013 medidas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees por enterobacteacuterias
multiresistentes Acesso em 17 de abril de 2013
ALBA J et al Kinetics study of KPC-3 a plasmid-encoded class A
carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase Antimicrob Agents Chemother
Nov49(11)4760-2 2005
ALVES A P et al Nosocomial infections by KPC-producing enterobacteria in
a tertiary hospital in Southern Brazil Revista da AMRIGS Porto Alegre 57 (3) 213-
218 jul-set 2013
ALVES A et al Tipagem Geneacutetica de Microrganismos Lab De Diversidade
Microbiana Centro de Biologia Celular Dep de Biologia U de Aveiro 3810-193
Aveiro- 2003
BELL J M et Al Prevalence and significance of a negative extended-
spectrum beta-lactamase (ESBL) confirmation test result after a positive ESBL
screening test result for isolates of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae
results from the SENTRY Asia-Pacific Surveillance Program J Clin Microbiol
May45(5)1478-82 2007
BRATU S et al Detection of KPC carbapenem-hydrolyzing enzymes in
Enterobacter spp from Brooklyn New York Antimicrob Agents Chemother v 49 n
2 p 776-8 2005
59
BRATU S et al Emergence of KPC-possessing Klebsiella pneumoniae in
Brooklyn New York epidemiology and recommendations for detection Antimicrob
Agents Chemother v 49 n 7 p 3018-20 2005
BRATU S et al Rapid spread of carbapenem-resistant Klebsiella
pneumoniae in New York City Arch Intern Med v 165 p 1430-5 2005
CAMARGO C F et al Aplicaccedilatildeo das teacutecnicas de pcr e suas teacutecnicas
derivadas em diagnoacutestico molecular Disponiacutevel em
ltfileDUnB10C2BA20semestreArtigosPCR-
20CLEYTON20FLORENCIO20DE20CAMARGO20E20PAULO20ROB
ERTO20QUEIROZpdfgtgt Acesso em 08 de abril de 2014
CARVALHES C G et al Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting
carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive
results Journal of Antimicrobial Chemotherapy v 65 n2 p 249-251 2010
CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION- CDC Modified
Hodge Test for Carbapenemase Detection in Enterobacteriaceae 2004
CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE Methods for
dilutionantimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically Approved
standard M7ndashA7 7th ed CLSI Wayne PA 2011
COELLO R et al Risk factors for developing clinical infection with methicillin-
resistant Staphylococcus aureus (MRSA) amongst hospital patients initially only
colonized with MRSA J Hosp Infect 19973739-46
COLPAN A et al Evaluation of risk factors for mortality in intensive care
units A prospective study from a referral hospital in Turkey Am J Infect Control
200533(1)42-7
60
CORNAGLIA G et al Living with ESBLs Introduction Clinical Microbiology
and Infection 14 Suppl 1 1-2 2008
COTRIM E R et al Klebsiella pneumoniae carbapenemase ndash KPC em
Enterobacteriaceae o desafio das bacteacuterias multirresistentes Poacutes em revista do
centro universitaacuterio Newton Paiva 12012 - ediccedilatildeo 5 - issn 2176 7785
DESHPANDE L M et al Occurrence and characterization of
carbapenemase-producing Enterobacteacuteriaceae report from the SENTRY
Antimicrobial Surveillance Program (2000-2004) Microb Drug Resist 12(4)223-30
2006
DIAS D J A Estudos dos principais mecanismos de resistecircncia aos
antibioacuteticos β-lactacircmicos em bacteacuterias patogecircnicas gram negativas 2009 100 f
Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Geneacutetica Molecular e Biomedicina) ndash Faculdade de
Ciecircncias e Tecnologia Universidade de Nova Lisboa Lisboa
DIENSTMANN R et al Avaliaccedilatildeo fenotiacutepica da enzima Klebsiella
pneumoniae carbapenemase (KPC) em Enterobacteriaceae de ambiente hospitalar
J Bras Patol Med Lab v 46 n 1 p 23-27 fevereiro 2010
ENDIMIAMI A et al Emergence of blaKPC-containing Klebsiella
pneumoniae in a long-term acute care hospital a new challenge to our healthcare J
Antimicrob Chemother 64 1102-1110 Nov 2009
FALAGAS M E et al Extended-spectrum beta-lactamase producing
organisms The Journal of Hospital Infection 73 (4) pp 345-54 2009
FONTANA C et al Emergence of KPC-producing Klebsiella pneumoniae in
Italy BMC Rev Notes 3 40 2010
61
GALES A C et al Antimicrobial resistance among Gram-negative bacilli
isolated from Latin America results from Sentry Antimicrobial Surveillance Program
(Latin America 2008-2010) Diagnostic Microbiology and Infectious Disease v 3 n
4 p 354 -360 2012
GUPTA N et al Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Epidemiology
and Prevention HEALTHCARE EPIDEMIOLOGY Clinical Infectious Diseases
201153(1)60ndash67 Published by Oxford University Press on behalf of the Infectious
Diseases Society of America 2011
HARBOTTLE H et al Genetics of antimicrobial resistance Anim Biotechnol
n17 p111-124 2006
HENRIQUE W N et al RESISTEcircNCIA BACTERIANA Uniatildeo das
Faculdades Alfredo NasserInstituto de Ciecircncias da Sauacutede Disponiacutevel em lt
httpwwwfaculdadealfredonasseredubrfilespesquisaposter20HENRIQUE20
Wilker20Natividade20SANTIAGO20Silvania20CAVALCANTI20DSP
20ResistC3AAncia20Bacterianapdfgt Acesso em 17 marccedilo 2014
HULSCHER M E J I et al Antibiotic prescribing in hospital a social and
behavioral scientific approach The Lancet Infectious Diaseases v 10 n 3 p 167-
165 2010
KIDWAI M SAPRA P BHUSHAN KR Synthetic strategies and medicinal
properties of beta-lactams Curr Med Chem 1999 695-215
KUMARASAMY K K et al Emergence of a new antibiotic resistance
mechanism in India Pakistan and the UK a molecular biological and
epidemiological stuy The Lancet Infectious Diseases v10 n 9 p 597- 602 2010
LINCOPAN N et al Enterobacteacuteria producing extended-spectrum β-
lacatamases and IMP-1 Metalo-β-lactamases isolated from Brazilian hospitals J Med
62
Microbiol 7 1-3 2006
LINCOPAN N et al First Isolation of Metalo-β-Lacatamase-Producing
Multiresistant Klebsiella pneumoniae from a patient in Brazil J Clin Microbiol 43(1)
516-519 2005
LIVERMORE D M et al What remains against carbapenem- resistant
Enterobacteriaceae Evaluation of choramphenicol ciprofloxacin colistina
fosfomycin minocycline nitrofurantoin temocilin and tigecycline International
Journal of Antimicrobial Agents v 37 n 5 p 415- 459 2011
LIVERMORE D M Fourten years in resistance International Journal of
Antimicrobial Agents v 39 283- 294 2012
LIVERMORE D M Bacterial resistance to carbapenems Adv Exp Med Biol
1995 39025-47
LIVERMORE D M Bacterial resistance origins epidemiology and impact
Clin Infect Dis 36S11-S23 2003
LIVERMORE D M et al Carbapenemases a problem in waiting Curr
Opin Microbiol 2000 3489-95
LU et al Universal pcr for common bacterial pathogens J CLIN
MICROBIOL VOL 38 2000
LU et al Use of PCR with Universal Primers and Restriction Endonuclease
Digestions for Detection and Identification of Common Bacterial Pathogens in
Cerebrospinal Fluid Journal of Clinical Microbiology June 2000 p 2076ndash2080
MARSCHALL J Met al Presence of the KPC Carbapenemase Gene in
Enterobacteriaceae Causing Bacteremia and Its Correlation with In Vitro
Carbapenem Susceptibility J Clin Microbiol 47 239-241 Jan 2009
63
MARTINS WMBS et al Prevalecircncia do gene blaKPC em isolados cliacutenicos
de Enterobacteriaceae e natildeo fermentadores encontrados em amostras clinicas em
um hospital universitaacuterio do Recife X Jornada de ensino pesquisa e extensatildeo ndash
JEPEX 2010 ndash UFRPE Recife 18 a 22 de outubro
MENDES C A C et al Polimixinas Revisatildeo com ecircnfase na sua
nefrotoxicidade Rev Assoc Med Bras 2009 55(6) 752-9
MOHR J F 3rd Update on the efficacy and tolerability of meropenem in the
treatment of serious bacteacuterial infections Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S41-51
2008
MONTEIRO J et al First report of KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae
strains in Brazil Antimicrob Agents Chemother Jan53(1)333-4 2009
MOREIRA V C et al Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia a antibioacuteticos
Disponiacutevel em
lthttpwwwcpglsucgbr6mostraartigosSAUDEVANESSA20CARVALHO20M
OREIRApdfgt Acesso em 21 marccedilo 2014
NETIKUL T et al Emergence of novel blaKPC-12 and blaKPC-13 variants in
carbapenem non-susceptible Enterobacter cloacae a first report of blaKPC gene in
Thailand European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases May
S372 2011
NETO V A et al Antibioacuteticos na praacutetica Meacutedica 6ordf Ediccedilatildeo Editorial
SarverSP Brasil 2007
NICOLAU D P Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of
meropenem Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S32-40 2008
64
OLIVEIRA A C et al Resistecircncia bacteriana e mortalidade em um centro de
terapia intensiva Rev Latino-Am Enfermagem nov-dez 2010
PAAUW A et al Failure to control an outbreak of qnrA 1-positive multidrug-
resistant Enterobacter clocae despite adequate implementation of recommended
infection control measures Journal of Clinical Microbiology v 45 n 5 p 1420-1425
2007
PATERSON D L et al Extended-Spectrum Beta-Lactamases a Clinical
Update Clinical Microbiology Reviews v 18 p 657-686 2005
PEIRANO G et al Carbapenem-hydrolysing beta-lactamase KPC-2 in
Klebsiella pneumonia isolated in Rio de Janeiro Brazil J Antimicrob Chemother Nov
20 2009
PERES-BOTA D et al Are infections due to resistant pathogens associated
with worse outcome in critically ill patients J Infect 200347(4)307-16
PIDDOCK L J V Clinically relevant chromosomally encoded multidrug
resistance effl ux pumps in bacterial Clin Microbiol Rev n19 p382-402 2006
PITOUT J D D et al Emergence of Enterobacteriaceae producing
extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) in the community J Antimicrob
Chemother May 56 2005
POSSEBON M I et al Resistecircncia bacteriana aos carbapenecircmicos
Bacterial resitence to carbapenems RBM rev bras med60(6)378380-378-382
jun 2003
QUEENAN A M et al Carbapenemases the versatile beta-lactamases
Clin Microbiol Rev Jul20(3)440-58 2007
65
RHOMBERG P R et al Summary trends for the meropenem yearly
susceptibility test information collection program a 10- year experience in the United
States (1999-2008) Diagnostic Microbiology and Infectiois Disease v 65 n4 p
414-426 2009
ROBLEDO I E et al Detection of KPC in Acinetobacter spp in Puerto Rico
J Antimicrob Agents Chemother 54 1354-1357 Mar 2010
ROGERS B A et al Country-to-country transfer os patients and the risk of
multi-resistant bacterial infection Clinical Infectious Disease v53 n1 p49- 56
2011
SHAH A A et al Characteristics epidemiology and clinicalimportance of
emerging strains of Gram-negative bacilli producing extended-spectrum
betalactamases Research in Microbiology v 155 p 409-421 2004
TURNER P J Extended- Spectrum Beta-Lactamases Clinical Infectious
Diseases v 41 p 273-275 2005
WOLTER D J et al Phenotypic and Enzymatic Comparative Analysis
between the Novel KPC variant KPC-5 and Its Evolutionary Variants KPC-2 and
KPC-4 Antimicrob Agents Chemother Nov 17 2008
WOODFORD N et al Carbapenemases of Chryseobacterium
(Flavobacterium) meningosepticum distribution of blaB and characterization of a
novel Metalo-beta-lactamase gene blaB3 in the type strain NCTC 10016
Antimicrob Agents Chemother Jun44(6)1448-52 2000
WOODFORF N Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in
India Pakistan and the UK a molecular biological and epidemiological study The
Lancet Infectious Diseases v 10 n 9 p 597-602 2010
66
WOODFORD et al Outbreak of Klebsiella pneumoniae Producing a New
Carbapenem- Hydrolyzing Class A β-Lactamase KPC-3 in a New York Medical
Center Antimicrobial agents and chemotherapy Dec 2004 p 4793ndash4799 Vol 48
No 12
YAGI T et al A preliminary survey of extended-spectrum β-lactamases
(ESBLs) in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Japan
FEMS Microbiology Letters 184 (2000) 53-56
YIGIT H et al Novel carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase KPC-1 from
a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumonia J Antimicrob Agents
Chemother 45 (4) 1151-1161 (2001)
ZAVASCKI A P et al KPC-2- producing Enterobacter cloacae in two cities
from Southern Brazil Int J Antimicrob Agents Apr 28 2009
ZHANEL G G et al Comparative review of the carbapenecircmicos Drugs
67(7)1027-52 2007
67
ANEXOS
Sequumlecircncia do oligo blaKPC
Query 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
Query 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
Query 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
68
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
Query 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
Query 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
69
Query 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
Query 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
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Sbjct 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
Query 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
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|||||||
70
Sbjct 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
Query 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
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Sbjct 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
Query 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
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Sbjct 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
Query 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
71
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Sbjct 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
Query 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
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Sbjct 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
Query 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
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Sbjct 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
72
Query 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
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|||||||
Sbjct 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
Query 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
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Sbjct 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
Query 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
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73
Sbjct 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
Query 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
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Sbjct 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
Query 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
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Sbjct 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
Query 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
74
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Sbjct 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
Query 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
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Sbjct 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
Query 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
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Sbjct 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
75
Query 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
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Sbjct 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
Query 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
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||||
Sbjct 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
LOCUS AF297554 1377 bp
DNA linear BCT 26-MAR-2001
DEFINITION Klebsiella pneumoniae carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
gene complete cds
ACCESSION AF297554
VERSION AF2975541 GI10121874
76
KEYWORDS
SOURCE Klebsiella pneumoniae
ORGANISM Klebsiella pneumoniae
Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Enterobacteriaceae Klebsiella
REFERENCE 1 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH QueenanAM
AndersonGJ Domenech-SanchezA
BiddleJW StewardCD
AlbertiS BushK and TenoverFC
TITLE Novel carbapenem-hydrolyzing beta-
lactamase KPC-1 from a
carbapenem-resistant strain of
Klebsiella pneumoniae
JOURNAL Antimicrob Agents Chemother 45 (4)
1151-1161 (2001)
PUBMED 11257029
REFERENCE 2 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH AndersonGJ and
TenoverFC
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (19-AUG-2000) Nosocomial
Pathogens Laboratory Branch
Centers for Disease Control and
Prevention 1600 Clifton Rd MS
G08 Atlanta GA 30333 USA
FEATURES LocationQualifiers
77
source 11377
organism=Klebsiella
pneumoniae
mol_type=genomic DNA
db_xref=taxon573
-35_signal 5560
-10_signal 7883
mRNA 921012
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
RBS 117122
CDS 1311012
note=blaKPC-1
codon_start=1
transl_table=11
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
protein_id=AAG134101
db_xref=GI10121875
translation=MSLYRRLVLLSCLSWPLAGFSATALTNLVAEPFAKLEQD
FGGSI
GVYAMDTGSGATVSYRAEERFPLCSSFKGFLAAAVLARSQQQAGLLDTPIRYG
KNALV
PWSPISEKYLTTGMTVAELSAAAVQYSDNAAANLLLKELGGPAGLTAFMRSIG
DTTFR
78
LDRWELELNSAIPSDARDTSSPRAVTESLQKLTLGSALAAPQRQQFVDWLKGN
TTGNH
RIRAAVPADWAVGDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTRAPNKDDK
HSEAV
IAAAARLALEGLGVNGQ
ORIGIN
1 cggggcagtt acagccgtta cagcctctgg
agagggagcg gcttgccgct cggtgataat
61 cccagctgta gcggcctgat tacatccggc
cgctacacct agctccacct tcaaacaagg
121 aatatcgttg atgtcactgt atcgccgtct
agttctgctg tcttgtctct catggccgct
181 ggctggcttt tctgccaccg cgctgaccaa
cctcgtcgcg gaaccattcg ctaaactcga
241 acaggacttt ggcggctcca tcggtgtgta
cgcgatggat accggctcag gcgcaactgt
301 aagttaccgc gctgaggagc gcttcccact
gtgcagctca ttcaagggct ttcttgctgc
361 cgctgtgctg gctcgcagcc agcagcaggc
cggcttgctg gacacaccca tccgttacgg
421 caaaaatgcg ctggttccgt ggtcacccat
ctcggaaaaa tatctgacaa caggcatgac
481 ggtggcggag ctgtccgcgg ccgccgtgca
atacagtgat aacgccgccg ccaatttgtt
541 gctgaaggag ttgggcggcc cggccgggct
gacggccttc atgcgctcta tcggcgatac
79
601 cacgttccgt ctggaccgct gggagctgga
gctgaactcc gccatcccaa gcgatgcgcg
661 cgatacctca tcgccgcgcg ccgtgacgga
aagcttacaa aaactgacac tgggctctgc
721 actggctgcg ccgcagcggc agcagtttgt
tgattggcta aagggaaaca cgaccggcaa
781 ccaccgcatc cgcgcggcgg tgccggcaga
ctgggcagtc ggagacaaaa ccggaacctg
841 cggagtgtat ggcacggcaa atgactatgc
cgtcgtctgg cccactgggc gcgcacctat
901 tgtgttggcc gtctacaccc gggcgcctaa
caaggatgac aagcacagcg aggccgtcat
961 cgccgctgcg gctagactcg cgctcgaggg
attgggcgtc aacgggcagt aaggctctga
1021 aaatcatcta ttggcccacc accgccgccc
ttgcgggcgg catggattac caaccactgt
1081 cacatttagg ctaggagtct gcgcggcaga
gccgtgtgac cggttttctg tagagcactg
1141 acgatggcgg cggcgctctc tgcaattggc
aaggcgtcgg cgccaaggat accaatcttg
1201 cggcgcgcgg cgtgttatga cgactggggt
gcatttgagc cgccccattt aaccttcgcc
1261 ctcacagata cgccattcgc ctcaaattta
gcgccatgca gacgagcttc cactcggctt
1321 gcaccttgtc caggcccctc atgctgaact
gacgcaatcc catcaccgcc ttgatca
80
33
em estufa aeroacutebia a 35ordmC por 24 e 48 horas e observou-se o halo de difusatildeo do
disco de Ertapenem na placa para proceder agrave leitura
O teste deixou de ser obrigatoacuterio apoacutes a modificaccedilatildeo dos criteacuterios
interpretativos para carbapenecircmicos para enterobacteacuterias publicados no suplemento
do CLSI 2010 M100-S20-U
Figura 5 Mecanismo de semeamento de material bioloacutegico oriundos de
pacientes com suspeita de infecccedilatildeo por KPC Fonte adaptado CDC 2004
4 2 1 Interpretaccedilatildeo dos resultados
Na ausecircncia de crescimento ateacute 24 horas (MacConkey) ou halo de difusatildeo
gt27 mm na placa deve-se reincubar as placas por mais 24 horas Quando for
ausente o crescimento apoacutes 48 horas ou halo de difusatildeo gt27 mm na placa libera-se
como enterobacteacuterias resistentes a carbapenecircmicos (KPCNEG)Havendo
crescimento de colocircnias na placa de MacConkey com halo lt 27 mm (apenas para
colocircnias com crescimento dentro do halo) deve-se reisolar e realizar identificaccedilatildeo e
antibiograma automatizado teste de sensibilidade por disco-difusatildeo e Teste de
Hodge Modificado (THM) Os isolados de enterobacteacuterias cujos testes comprovarem
a resistecircncia aos carbapanecircmicos testados (KPCPOS) foram reportado a Comissatildeo
de Controle de Infecccedilatildeo Hospitalar (CCIH) Jaacute osbacilos Gram-negativos natildeo
fermentadores natildeo foram reportados (KPCNEG) Para interpretaccedilatildeodos resultados
foram utilizados os valores conforme demonstrados na tabela 1
Tabela 1 Criteacuterios Interpretativos para testes de sensibilidade
ENTEROBACTEacuteRIAS
Disco difusatildeo (mm) MIC (microgml)
34
Antibioacutetico Sigla S I R S I R
Ertapenem 10
microg
ETP 22 19-
21
18 05 1 2
Meropenem 10
microg
MEM 23 20-
22
19 1 2 4
Fonte Manual Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)
2013
Os resultados que apresentaram resistecircncia ao antibioacutetico Ertapenem foram
considerados como suspeitos de contaminaccedilatildeo por KPC Fez-se o teste de
susceptibilidade aos antibioacuteticos (TSA) em aparelho automatizado MicroScan Walk
Away 96sl Dade Behring
4 3 Teste de susceptibilidade aos antibioacuteticos (adaptado CDC 2004)
A determinaccedilatildeo da susceptibilidade dos isolados foi feita pelo teste de
susceptibilidade aos antibioacuteticos (TSA) apoacutes cultura em meio de gelose simples
(INSA) para avaliaccedilatildeo da sua pureza e obtenccedilatildeo de colocircnias isoladas Para
preparaccedilatildeo de uma suspensatildeo bacteriana com turvaccedilatildeo aproximada de 05
McFarland (Dade BehringMicroScanregTurbidity Meter) ressuspendeu duas a cinco
colocircnias em 2ml de soro fisioloacutegico esteacuteril diluindo a 1100 em soro fisioloacutegico num
volume total de 10ml em seguida foi feita uma semeadura em duas placas
quadradas (120mm x 120mm) de Muller-Hinton Agar (INSA) por inundaccedilatildeo
Os discos de antibioacutetico carbapenecircmicos imipenem meropenem e
ertapenem (Biorad) foram aplicados com o auxiacutelio de um dispensador automaacutetico A
susceptibilidade das Enterobacteacuterias aos carbapenecircmicos foi definida de acordo
com o protocolo Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI 2011)
Para aquelas Enterobacteacuterias que apresentaram resistecircncia ao ertapenem
foram realizados o Teste de Hodge Modificado para Detecccedilatildeo de Enterobacteacuterias
Produtoras de Carbapenemases conforme descrito pelo Centers for Disease Control
and Prevention (CDC 2004)
35
4 4Teste de Hodge Modificado (THM) (adaptado CDC 2004)
Preparou-se uma suspensatildeo em salina esteacuteril com a cepa Escherichia coli
ATCC 25922 (padratildeo 05 de McFarland) Apoacutes isto diluiu a suspensatildeo 110 em
salina (05 ml da soluccedilatildeo de Ecoli ATCC 25922 + 45 ml salina)Foi entatildeo semeado
na superfiacutecie de uma placa de Agar Muller-Hinton com a suspensatildeo diluiacuteda de Ecoli
ATCC 25922 com auxilio de swab seco assegurando que houvesse uma
distribuiccedilatildeo uniforme cobrindo toda a superfiacutecie do Agar Deixou secar por 3 a 5
minutos em temperatura ambienteColocou-se o disco de ertapenem 10microg no centro
da placa e apoacutes isto fez-se uma estria linear da cepa a ser testada da borda do
disco ateacute a borda da placa utilizando uma alccedila calibrada 10 microl ou um swab Incubou
a placa na estufa em atmosfera aeroacutebia a 35 plusmn 2ordmC por 16 a 24 horas
441 Controle de qualidade (CQ)
Foi utilizado um CQ todos os dias em que se realizou o teste tendo como
controle Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1705- teste de Hodge modificado
positivo Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1706- teste de Hodge modificado
negativo
442 InterpretaccedilatildeoResultados
Apoacutes 16ndash24 horas de incubaccedilatildeo examinar as placas para verificar a presenccedila
de uma distorccedilatildeo no halo de inibiccedilatildeo do disco de ertapenem devido ao crescimento
realccedilado da cepa ATCC na intersecccedilatildeo do organismo teste e a Ecoli ATCC 25922
dentro dos limites do halo O THM positivo apresentaraacute presenccedila de distorccedilatildeo no
halo de inibiccedilatildeo de ertapenem devido ao crescimento da cepa Ecoli ATCC 25922 ao
longo da estria da cepa teste para dentro dos limites do halo de inibiccedilatildeo Jaacute o THM
negativo teraacute ausecircncia de crescimento da cepa Ecoli ATCC 5922 ao longo da estria
da cepa teste para dentro dos limites do halo de inibiccedilatildeo do disco de ertapenem
Este resultado estaacute representado na figura 6
36
Figura 6 Interpretaccedilatildeo resultado do Teste de Hodge Modificado
(adaptado CDC 2004) Teste positivo na estria da cepa teste na parte superior
da placa teste negativo na estria da cepa teste na parte inferior da placa
Tendo positivo como resultado o paciente era um provaacutevel contaminado por
KPC As amostras entatildeo foram encaminhadas para a Fundaccedilatildeo Osvaldo Cruz
(FIOCRUZ) para confirmaccedilatildeo final As amostras finalmente confirmadas como
positivas para KPC foram isoladas e guardadas no banco de cepas cliacutenicas do
hospital Apoacutes a autorizaccedilatildeo do CEP amostras das cepas foram transferidas para
meio de transporte Stuard em caixa teacutermica fechada em baixa temperatura e
levadas para o laboratoacuterio de microbiologia cliacutenica da universidade
No laboratoacuterio da universidade as amostras foram separadas e realizadas
repiques em meios MacConkey e incubadas por 24h As colocircnias caracteriacutesticas
foratildeo isoladas em caldo BHI e mantidas em shaker a 37oC por 2h Apoacutes isto foram
executadas as anaacutelises a seguir
Os isolados de Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases foram
submetidos agrave extraccedilatildeo de DNA e posterior sequumlenciamento para identificaccedilatildeo dos
genes de resistecircncia blaKPC de 1 a 13 e identificaccedilatildeo do gene universal Os
pacientes de onde os materiais bioloacutegicos contendo as Enterobacteacuterias produtoras
de carbapenemases foram os isolados foram investigados quanto aos aspectos
epidemioloacutegicos e cliacutenicos
37
4 5 Extraccedilatildeo de DNA bacteriano
A extraccedilatildeo de DNA bacteriano foi realizada utilizando o kit NucleoSpin
Plasmidreg (MN) Antes de iniciar a extraccedilatildeo foi feito a preparaccedilatildeo das soluccedilotildees
reagentes materiais e amostras (vortexando) colocou-se em banho-maria agrave 50ordmC o
tampatildeo AW Partiu-se de colocircnias isoladas cultivadas que sofreram passagem em
meio LB liacutequido por 12h Adicionou-se 15 mL da amostra no tubo eppendorf
centrifugou por 5 minutos descartou o sobrenadante (com cuidado para natildeo
descartar o Pellet) Repetiu-se este procedimento por mais trecircs vezes completando-
se o volume de 6mL Foram adicionados 250microL do tampatildeo Resuspension Buffer A1
encostando a ponteira no Pellet e misturando (este tampatildeo tem como funccedilatildeo
separar a formaccedilatildeo de grumos celulares) Apoacutes isso homogeneizou e vortexou os
tubos eppendorfs Apoacutes isso foram adicionados 250microL do tampatildeo Lysis Buffer A2
homogenizou e deixou descansar por 5 minutos (esta etapa eacute importante para a lise
da parede e da membrana celulares e liberaccedilatildeo do conteuacutedo da ceacutelula)
Passado o tempo de descanso foi adicionado 300microL do tampatildeo
Neutralization Buffer A3 homogeneizou e centrifugou por 10 minutos (este tampatildeo
iraacute retirar as proteiacutenas que envolvem o DNA e voltaraacute com o pH para proacuteximo de 8
impedindo que a soluccedilatildeo de lise facilite a quebra das ligaccedilotildees covalentes do aacutecido
nucleacuteico) Em seguida enumeraram-se os tubos contendo filtros com siacutelica
transferiu-se o sobrenadante para o filtro e centrifugou por 5 minutos Descartou-se
o que foi filtrado adicionou 500microL do tampatildeo AW (banho-maria) centrifugou por 2
minutos Novamente foi descartado o filtrado Adicionou-se 600microL do tampatildeo A4
centrifugou por 2 minutos e descartou o filtrado (os tampotildees AW e A4 contecircm
isotiocianato de guanidina em concentraccedilotildees crescentes para facilitar a adsorccedilatildeo
do DNA na siacutelica e retirada das outras biomoleacuteculas da amostra) Foi feita outra
centrifugaccedilatildeo com o tubo vazio Apoacutes isto o filtro foi trocado para outro eppendorf
definitivo onde foi adicionado 50microL do tampatildeo Elution Buffer AE (este tampatildeo
favorece a eluiccedilatildeo do DNA) centrifugou por 2 minutos descartou o filtro e
armazenou as amostras em freezer -20ordmC
38
4 6 Iniciadores e reaccedilatildeo de PCR
Os iniciadores universais para o gene blaKPC foram desenhados baseados
em sequumlecircncias conservadas apresentadas pelos sub-grupos de genes que
codificam a enzima carbapenemase de klebsiella pneumoniae (YIGIT et al 2001)
Baseado na sequumlecircncia para o blakpc-1 depositada no GenBank
(AF2975541) o oligonucleotiacutedio (oligo) iniciador direto (5-
ATGTCACTGTATCGCCGTC-3rsquo) foi desenhado para reconhecer a sequumlecircncia
blaKPC na posiccedilatildeo (131149) enquanto que o iniciador reverso (5-
TTACTGCCCGTTGACGCC-3rsquo) foi reconhecido na posiccedilatildeo (9951012) As anaacutelises
baseadas em alinhamento de sequumlecircncias mostraram que o par de iniciadores
blaKPC podem detectar os alelos de 1 a 13 do gene blaKPC conforme a tabela 2
Tabela 2 Nuacutemero de acesso ao GenBank dos alelos blaKPC e seus
microrganismos originais
Nuacutemero de
Acesso GenBank
Microrganismo Alvo
AF2975541 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-1
GU0862251 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-2
HQ2589341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-2-like
AB5577341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC -3
EU4473041 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-4
EU4002222 Pseudomonas
aeruginosa
blaKPC-5
EU5555341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-6
EU7297271 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-7
39
FJ2344121 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-8
FJ624872 Escherichia coli blaKPC-9
GQ1403481 Acinetobacter
baumannii
blaKPC-10
HM0669951 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-11
HQ3428891 Enterobacter cloacae blaKPC-12
HQ3428901 Enterobacter cloacae blaKPC-13
As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo de blaKPC foram realizadas em um
primeiro tempo de desnaturaccedilatildeo em que foi 94ordmC por 5 minutos seguido de 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 58 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 90 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 78ordmC por 8 minutos Aleacutem das amostras foi utilizado um
controle negativo
A PCR do blaKPC foi realizada utilizando os componentes para o volume da
reaccedilatildeo de 25 microL citados na tabela 3 A banda do tamanho do produto de PCR foi de
881 pares de bases (pb) o que corresponde ao plasmiacutedeo
Tabela 3 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do
gene blaKPC
Reagente Volume
DNA molde 4 microL
Tampatildeo Taq 25 microL
MgCl2 075 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP
2 microL
Oligo F 1 microL
Oligo R 1 microL
Taq DNA polimerase 05 microL
Aacutegua MiliQ 1335 microL
40
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
Baseado na sequumlecircncia para o gene 16S rRNA em que o oligonucleotiacutedio
Universal iniciador direto foward (5-CCAGCAGCCGCCGTAATACG-3rsquo) foi
desenhado para reconhecer a sequumlecircncia universal na posiccedilatildeo 1513 enquanto que o
iniciador reverso (5-ATCGGYTACCTTGTTACGACTTC-3rsquo) foi reconhecido na
posiccedilatildeo 1491 foram realizadas PCRrsquos As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo deste
gene foram realizadas nos seguinte tempos separaccedilatildeo 94ordmC por 10 minutos 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 55 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 120 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 72ordmC por 10 minutos
A PCR do gene 16S rRNA foi realizada utilizando os componentes para o
volume da reaccedilatildeo de 25microL citados na tabela 4 A banda do tamanho do produto de
PCR foi de 996 pb correspondente aacute regiatildeo ribossomal capaz de amplificar todas
as espeacutecies
Tabela 4Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do gene
universal
Reagente (quantidade
concentraccedilatildeo do estoque)
Volume
DNA molde 10 ng 4 microL
Tampatildeo Taq 10 x 25 microL
MgCl2 50mM 125 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP 25 mM
125 microL
Oligo F 10microM 05 microL
Oligo R 10microM 05 microL
Taq DNA polimerase 5UmicroL 04 microL
Aacutegua Miliq 146 microL
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
41
O termociclador utilizado para os experimentos foi o LifeTouch da BIOER
4 7 Digestatildeo
Para realizaccedilatildeo da digestatildeo foi utilizada a enzima BshF I (Hae III) EN- 1105
tamanho 7000 units concentraccedilatildeo 10 unitsmicroL fonte Bacillus sphaericus empresa
Jena bioscienceUtilizaram-se os componentes para o volume de 50microL da reaccedilatildeo
citados na tabela 5
Tabela 5 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da digestatildeo do gene
universal
Reagente Volume
Produto de PCR 10 microL
Enzima BshF I 01 microL
Tampatildeo (10x) 5 microL
Aacutegua Miliq 349 microL
Total (em cada ependorff) 50 microL
Valores para 1 digestatildeo
Os ependorffs foram colocados por 30 minutos em banho-maria a 37ordmC Apoacutes
isso fez-se a corrida das amostras em gel de agarose para verificaccedilatildeo do resultado
(LU et al 2000)
4 8 Eletroforese em gel de agarose
Os produtos de DNA PCR e digestatildeo foram analisados em gel de agarose
2 O tempo de corrida do gel eacute de aproximadamente 1hora e 30minutos sendo
que no comeccedilo foi usada agrave voltagem de 50 V e apoacutes comeccedilar a correr o gel
aumentou a voltagem para 100 v Utilizou-se o marcador de 100pb (pares de bases)
Foi adicionado 3microL de corante Bromophenol (que tem a funccedilatildeo de fazer uma ligaccedilatildeo
na amostra de DNA e permitir a visualizaccedilatildeo da corrida no gel de agarose) em 7microL
de amostra tanto de DNA quanto de PCR Para o preparo do gel foi utilizado TBE
42
(Tris- Aacutecido Boacuterico) agarose e brometo de etiacutedio (sua funccedilatildeo eacute de corante para o gel
e permitir a visualizaccedilatildeo do DNA quando colocado agrave luz ultravioleta) Para o oligo
blaKPC a banda da amplificaccedilatildeo foi em 881ppb correspondendo ao plasmiacutedeo Jaacute
o oligo Universal foi em 996 pb
4 9 Descarte de resiacuteduos
Todos os materiais utilizados nos ensaios foram de uso uacutenico e manipulados
em cacircmaras de seguranccedila bioloacutegica classe II Apoacutes o uso foram colocados em
soluccedilatildeo desinfetantes (hipoclorito a 1) e em seguida autoclavados a 127oC por 20
min em sacos apropriados para autoclavaccedilatildeo Apoacutes a finalizaccedilatildeo do ciclo de
esterilizaccedilatildeo os sacos contendo o material descartaacutevel foram colocados em
recipientes de coleta da empresa responsaacutevel pela coleta de materiais bioloacutegicos
produzidos no laboratoacuterio de microbiologia Todos os procedimentos seguiram a
normativa RDC-ANVISA 3062004 sobre o descarte de resiacuteduos de serviccedilo de
sauacutede
4 10 Aspectos epidemioloacutegicos e cliacutenicos
Os aspectos cliacutenicos e epidemioloacutegicos foram investigados por meio de
prontuaacuterios dos pacientes portadores de enterobacteacuterias produtoras de
carbapenemases e envolveram topografia mais provaacutevel do foco infeccioso a
enfermidade motivadora da internaccedilatildeo o desfecho cliacutenico a idade e o tempo de
internaccedilatildeo
4 12 Anaacutelises eepidemioloacutegicas
As anaacutelises foram realizadas com o pacote estatiacutestico SPSS versatildeo 200
Para verificar quais variaacuteveis referentes aos dados epidemioloacutegicos e
microbioloacutegicos influenciaram no desfecho verificou- se a diferenccedila meacutedia das
variaacuteveis idade e tempo de internaccedilatildeo em cada grupo O teste estatiacutestico utilizado foi
o teste t de Student apoacutes se executar o teste de normalidade de Shapiro-Wilk Para
as variaacuteveis sexo perfil microbioloacutegico das enterobacteacuterias produtoras de
43
carbapenemases foi avaliada a associaccedilatildeo com o desfecho por meio do teste Exato
de Fisher O niacutevel de significacircncia adotado foi de 5
4 13 Preceitos eacuteticos
Este projeto estaacute inserido em um projeto maior denominado ldquoEpidemiologia
cliacutenica e caracterizaccedilatildeo molecular do Acinetobacter Baumannii resistente a
antibioticoterapia em pacientes internado em hospitais do Sistema Uacutenico de Sauacutederdquo
que foi submetido ao Comitecirc de Eacutetica em Pesquisa da Secretaria do Estado de
Sauacutede do Distrito Federal (SESDF) e emitido parecer aprovado pelo protocolo nordm
23109 (anexo)
44
5 RESULTADOS
51 Anaacutelise molecular
Para a amplificaccedilatildeo com o oligo blaKPC foram amplificadas amostras
que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 881 pb correspondente ao
plasmiacutedeo A anaacutelise da amplificaccedilatildeo da regiatildeo do gene blaKPC mostrou que
apenas a amostra A10 natildeo amplificou isso demonstra que esta amostra natildeo
possuiacutea o gene de resistecircncia
5 1 1 Gene blaKPC
Figura 7 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 881 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
A amostra A3 natildeo amplificou no primeiro momento entatildeo foi realizado
novamente a PCR e corrida de gel obtendo entatildeo a amplificaccedilatildeo da amostra como
apresentado na figura 8
45
Figura 8 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC da
mostra A3 estudada A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo de 881
pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 1 2 Gene 16S rRNA
Para a amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA utilizou-se o oligo universal Foram
amplificadas amostras que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 996 pb
Figura 9 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
46
Segundo Lu et al (2000) a digestatildeo com a enzima HaeIII deste amplicons de
16S rRNA devolveriam bandas com perfis entre 150 a 200 pb No gel abaixo eacute
possiacutevel evidenciar que este perfil ocorreu com o predomiacutenio de bandas na altura
de 200pb
Figura 10 Gel de agarose a 2 da digestatildeo do amplicon do gene 16S
rRNA das amostras com a enzima HaeIII evidenciando diversos fragmentos
proacuteximos a 200 pb A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo ribossomal
de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 2 Anaacutelises epidemioloacutegicas
5 2 1 Sexo
No total foram detectados 17 isolados de KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 onde a maior a prevalecircncia foi
detecatada em amostras de pacientes do sexo masculino (53) do que no sexo
feminino (47)
47
Figura 11 Isolado de KPC segundo sexo dos 17 pacientes investigados
no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 2 Desfecho cliacutenico
Em 17 isolados de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo
de 2010 aacute 2011 a porcentagem de pacientes que foram a oacutebito (59) foi maior que
a de pacientes que tiverm alta (41)
Figura 12 Isolado de KPC segundo desfecho cliacutenico dos 17 pacientes
investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
48
5 2 3 Local da coleta
Dos 17 episoacutedios detectados de infecccedilatildeo por KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 a infecccedilatildeo em swab retalfoi mais
frequente (47) seguida de ponta de cateacuteter (18) e secreccedilatildeo traqueal (12)
Figura 13 Isolados de KPC segundo local da coleta da amostra nos 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 4 Microorganismo
O microorganismo mais encontrado foi a Klebsiella pneumoniae (82)
seguida da Enterobacter clocae (12) e Serratia marcescens (6) dos 17 isolados
de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 Isto afirma o
fato de a sigla KPC ser utilizada de forma errocircnea aacute Klebsiella pneumoniae visto
que a evidecircncia dela eacute maior em relaccedilatildeo as outras cepas
49
Figura 14 Isolado de KPC segundo microrganismo encontrado em 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 5 Relaccedilotildees variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana e desfecho
cliacutenico
Tabela 6 ndash Distribuiccedilatildeo do perfil geneacutetico sexo coleta tipificaccedilatildeo de
microrganismos e anaacutelise da resistecircncia bacteriana segundo o desfecho
cliacutenico Brasiacutelia-DF 2010 a 2011
Variaacutevel Resultado
Desfecho
Alta Oacutebito
N N P
Gene 16S rRNA Positivo 7 1000 10 1000
NA Gene blaKPC Positivo 6 857 10 1000
Negativo 1 143 0 00 0218 Sexo Feminino 2 286 6 600
Masculino 5 714 4 400 0201 Local da coleta Fundo saco de
Douglas 1 143 0 00
Hemocultura 0 00 1 100 0463 Ponta de cateter 1 143 2 200
Sec TraquealBrocircnquica
0 00 1 100
50
Secreccedilatildeo traqueal 2 286 0 00
Swab retal 3 429 5 500
Urina 0 00 1 100
Microrganismo Enterobacter cloacae (KPC)
1 143 1 100
Klebsiella pneumoniae
6 857 8 800
0416 Serratia
marcescens 0 00 1 100
Teste de Hodge Hodge positivo 7 1000 10 1000
NA Amicacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 1 100 0848 resistente 0 00 1 100
sensiacutevel 2 286 3 300
Amoxicilina Aacutecido Clavulacircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Ampicilina Sulbactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ampicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Aztreonan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefazolina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Cefoperazona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Cefotaxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefoxitina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0509 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 2 286 4 400
Ceftazidima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cetriaxona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 3 429 5 500 0772 Cefalotina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ciprofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772
51
resistente 3 429 5 500
Claritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Clindamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Eritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Gentamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0942 resistente 2 286 3 300
sensiacutevel 1 143 2 200
Imipenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 0 00 2 200 0193 Resistente 1 143 3 300
sensiacutevel 2 286 0 00
Nitrofurantoiacutena sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Norfloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Oxacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Penicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Piperacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Rifampicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tetraciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Ticarcilina Aacutecido Clavulocircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0688 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 3 429 4 400
Tobramicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Trimetoprima Sulfametoxazol
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0112 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 2 286 0 00
Vancomicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tigeciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediario 0 00 1 100 0211 natildeo testado 1 143 4 400
resistente 2 286 0 00
52
Cefepime sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefuroxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Levofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Piperacilina Tazobactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Ertapenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Meropenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0223 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 1 143 0 00
Cefotetan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 sensiacutevel 0 00 1 100
Gemifloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 7 700 0585 natildeo testado 3 429 3 300
Desfecho
Alta Oacutebito
Meacutedia Erro
padratildeo Meacutedia Erro
padratildeo p
Idade 58 9 59 5 0991
Tempo Internaccedilatildeo (dias)
50 13 46 12 0571
n= 17 p(lt 005) NA natildeo se aplica
53
6 DISCUSSAtildeO
Nos uacuteltimos anos houve um aumento na incidecircncia de bacteacuterias
multirresistentes aos antimicrobianos no ambiente hospitalar tornando isto um
problema mundial de sauacutede puacuteblica (HULSCHER et al 2010) Quando se trata
principalmente de bacilos Gram negativos a frequumlecircncia destas bacteacuterias eacute ainda
maior em paiacuteses da Ameacuterica Latina quando comparada a paiacuteses desenvolvidos
(GALES etal 2012)
De acordo com dados do ldquoMeropenem Yearly Susceptibility Test Information
Collectionrdquo (MYSTIC) ocorreu nos Estados Unidos um aumento na susceptibilidade
de K pneumoniae nos uacuteltimos anos graccedilas a praacuteticas de controle de disseminaccedilatildeo
de amostras resistentes(RHOMBERG P R et al 2009) O aumento crescente da
prevalecircncia destes microrganismos foi proporcional ao aumento da dependecircncia do
uso de antibioacuteticos carbapenecircmicos considerados como a opccedilatildeo terapecircutica para o
tratamento de infecccedilotildees por bacilos Gram negativos multi-resistentes (LIVERMORE
2012) Isto afeta diretamente as opccedilotildees de tratamento sobrando poucas alternativas
para a terapecircutica que incluem colistina (polimixina E) e tigeciclina que apresentam
respectivamente problemas em termos de toxicidade e eficaacutecia (LIVERMORE et
al 2011) Um dos efeitos adversos mais importantes das poliminas B e E por
exemplo satildeo a neurotoxicidade e nefrotoxicidade (MENDES C A C et al2009 )
Devido agrave resistecircncia ser usualmente de natureza plasmidial e portanto de
maior disseminaccedilatildeo especialmente quando carreadas por K pneumoniae
microrganismo com uma notoacuteria capacidade para acumular e transferir plasmiacutedeos
com determinantes para resistecircncia o nuacutemero de casos detectados pelo
fenoacutetipogenoacutetipo blaKPC eacute bastante preocupante (MONTEIRO et al 2009)
Comparada com outras bacteacuterias hospitalares a transmissatildeo de clones
multirresistentes de K pneumoniae eacute maior e podem natildeo ser controladas pelos
meacutetodos de controle de infecccedilatildeo hospitalar (PAAUW et al 2007) A forma
plasmidial para transferecircncia da resistecircncia adicionada a este grande potencial para
disseminaccedilatildeo de clones resistentes eacute preocupante visto que apoacutes surtos muitas
vezes pode se tornar endecircmica Jaacute eacute uma realidade a disseminaccedilatildeo desta bacteacuteria
54
entre pacientes hospitais paiacuteses e ateacute mesmo continentes (WOODFORF et al
2010 ROGERS et al 2011)
As chances de surtos satildeo maiores em paiacuteses com poucos recursos devido agrave
maior carecircncia de praacuteticas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees hospitalares e o
uso irracional de antimicrobianos de forma empiacuterica e inadequada (KUMARASAMY
et al 2010) Ateacute o momento os mecanismos de resistecircncia aos cabapenecircmicos
geralmente encontrado eram a produccedilatildeo de ESBL (CTX-M) somada aacute perda de
porina (CARVALHAES et al 2010) Foi notado a partir do ano de 2008 um
aumento no nuacutemero de K pneumoniae produtoras de KPC-2 apresentando outra
forma de resistecircncia (GALES 2012)
Um estudo mostrou que o perfil do paciente colonizado ou infectado por KPC
foi de um paciente entre os 33 e os 82 anos de idade internado haacute mais de 1
semana no hospital A mortalidade geral nos uacuteltimos anos ficou em torno de 7
sendo que dos 77 pacientes estudados 32 (415) pacientes evoluiacuteram para oacutebito
evidenciando a alta morbi-mortalidade associada (ALVES A P et al 2013)
Em estudo com 2316 pacientes avaliados a populaccedilatildeo de sexo masculino foi
de 526 idade meacutedia global de 53 anos (mediana de 55 anos) permanecircncia meacutedia
de 58 dias (mediana de 3 dias) (OLIVEIRA A C et al 2010) Outros trabalhos
apresentaram ausecircncia de significacircncia entre sexoidade e o desenvolvimento de
infecccedilotildees por microrganismos resistentes (PERES-BOTA D et al 2003 COLPAN
A et al 2005 COELLO R et al 1997)
Outro estudo utilizou um total de 30 amostras sendo elas isoladas de urina
escarro secreccedilatildeo pleural ponta de cateter aspirado traqueal e hemocultura A mais
prevalente foi em urina (40) Entre as 30 cepas analisadas a maior porcentagem
foi da cepa Klebsiella pneumoniae (70) Enterobacter sp (133) Klebsiella
ozaenae (10) Escherichia coli (333) e Klebsiella oxytoca (333)
(DIENSTMANN R et al 2010) Nos Estados Unidos a enzima KPC jaacute se tornou
endecircmica Foi realizada uma pesquisa em dois hospitais de Nova York onde
testaram 602 amostras e 45 apresentaram algum mecanismo de resistecircncia
sendo apenas 33 confirmadas por biologia molecular como KPC-2 (BRATU et
al 2005)
55
Estudo sobre os tipos de ESBL feito no Japatildeo apresentou o tipo Toho-1 como
o mais prevalente nessa pesquisa Ateacute o ano de 2000 ano em que foi publicado tal
estudo este era o primeiro relatoacuterio no Japatildeo para identificar derivados de ESBLs
como tipo de SHV e TEM entre E coli e K pneumoniae Em especial o tipo SHV- 12
foi identificado com uma maior frequumlecircncia Estes resultados indicam que tipos
distintos de ESBLs que satildeo diferentes em sua especificidade de substrato e origem
geneacutetica coexistem no Japatildeo Isto mostra a importacircncia de caracterizar genoacutetipos
distintos de ESBLs e de estar em alerta continuamente para as tendecircncias de
ESBLs no Japatildeo aleacutem da necessidade de uma interpretaccedilatildeo uniforme utilizando as
diretrizes do CSLI para relatar cepas produtoras de ESBL Aleacutem da detecccedilatildeo de
ESBLs satildeo necessaacuterias mais informaccedilotildees tais como o perfil de sensibilidade
especiacutefica para diversas β-lactacircmicos e o local da infecccedilatildeo Esses fatores satildeo
essenciais para a escolha adequada de antibioacuteticos (YAGI T et al 2000)
No ano de 2004 uma pesquisa avaliou a produccedilatildeo de uma enzima de
hidroacutelise de carbapenecircmicos atraveacutes da teacutecnica de sequumlenciamento foi revelado
um novo membro da famiacutelia KPC designado KPC- 3 Pesquisadores encontraram
em um mutante de K pneumoniae uma substituiccedilatildeo de um gene associado com
resistecircncia a Imipenem mas essa substituiccedilatildeo foi considerada improvaacutevel na
contribuiccedilatildeo da resistecircncia aos carbapenecircmicos da espeacutecie estudada Aleacutem da
resistecircncia aos carbapenecircmicos estes isolados eram em sua maioria resistentes agraves
cefalosporinas penicilinas e aminoglicosiacutedeos Usando estudos de transformaccedilatildeo
conjugaccedilatildeo e hibridaccedilatildeo localizaram o alelo blaKPC em plasmiacutedeo aleacutem disso
mostraram que esse alelo tambeacutem carregava uma resistecircncia aos aminoglicosiacutedeos
A transferecircncia das enzimas KPCs foi demonstrada in vitro tanto neste como em
outros estudos pode ser que os plasmiacutedeos que fazem esta transferecircncia estavam
comeccedilando a se espalhar no ambiente cliacutenico resultando na multiresistecircncia dessas
estirpes (WOODFORD et al 2004)
O presente estudo apresentou um vieacutes quanto aos resultados dos testes de
susceptibilidade microbiana Observou-se que natildeo foi encontrado resultado deste
teste em algumas amostras o que natildeo cooperou para um estudo mais preciso
futuros estudos quanto agraves amostras e um melhor acompanhamento deste tipo de
patologia Poreacutem mesmo sem algumas amostras com este resultado disponiacutevel foi
56
confirmada a presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos
carbapenecircmicos por meio dos genes de resistecircncia blaKPC e 16S rRNA que as
amostras apresentaram em sua maioria serem portadoras Quanto aos resultados
estatiacutesticos nenhuma das variaacuteveis apresentou significacircncia estatiacutestica (p gt 005)
mostrando assim que estas variaacuteveis isoladas natildeo foram o fator determinante para
o desfecho cliacutenico de alta ou oacutebito
57
7 CONCLUSAtildeO
Os genes blaKPC e 16S rRNA foram caracterizados confirmando a a
presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos carbapenecircmicos
Houve uma maior prevalecircncia da cepa K pneumoniae e isto confirma outros
estudos que apresentam a maior prevalecircncia desta cepa em amostras com KPC
Aleacutem disso isso justifica a forma popular da K pneumoniae ser chamada de KPC
enquanto que na verdade KPC eacute uma enzima podendo estar presente em outras
cepas como Enterobacter clocae tambeacutem apresentada no presente estudo O
desfecho cliacutenico de oacutebitos maior que 50 eacute um possiacutevel indicador sobre a
necessidade de se realizar um teste raacutepido para identificaccedilatildeo de KPC visando
iniciar o mais raacutepido possiacutevel o tratamento afim de diminuir a mortalidade por esta
infecccedilatildeo
Nenhuma das variaacuteveis isoladamente estaacute relacionada ao desfecho cliacutenico
oacutebito ou alta pois natildeo apresentaram relevacircncia estatiacutestica O presente estudo
mostrou que haacute presenccedila da bacteacuteria nas amostras de pacientes do hospital
estudado podendo entatildeo afirmar que este tipo de bacteacuteria se encontra tambeacutem
presente em ambiente hospitalar O uso irracional de antimicrobiano eacute demonstrado
de forma indireta quando foi apresentado atraveacutes do Teste de Hodge Modificado
uma resistecircncia de 100 aos antibioacuteticos carbapenecircmicos Isto tambeacutem reflete na
terapecircutica sendo que pacientes portadores de bacteacuterias resistentes aos
antibioacuteticos carabepecircmicos tem uma escassa opccedilatildeo de tratamento e as opccedilotildees
apresentam problemas quanto agrave toxicidade e eficaacutecia
58
REFEREcircNCIAS
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Mecanismos
de resistecircncia bacteriana aos antimicrobianos Disponiacutevel em
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controleopas_
webmodulo3mec_sitiohtmgt Acesso em 25 de abril de 2014
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Nota teacutecnica nordm
012013 medidas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees por enterobacteacuterias
multiresistentes Acesso em 17 de abril de 2013
ALBA J et al Kinetics study of KPC-3 a plasmid-encoded class A
carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase Antimicrob Agents Chemother
Nov49(11)4760-2 2005
ALVES A P et al Nosocomial infections by KPC-producing enterobacteria in
a tertiary hospital in Southern Brazil Revista da AMRIGS Porto Alegre 57 (3) 213-
218 jul-set 2013
ALVES A et al Tipagem Geneacutetica de Microrganismos Lab De Diversidade
Microbiana Centro de Biologia Celular Dep de Biologia U de Aveiro 3810-193
Aveiro- 2003
BELL J M et Al Prevalence and significance of a negative extended-
spectrum beta-lactamase (ESBL) confirmation test result after a positive ESBL
screening test result for isolates of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae
results from the SENTRY Asia-Pacific Surveillance Program J Clin Microbiol
May45(5)1478-82 2007
BRATU S et al Detection of KPC carbapenem-hydrolyzing enzymes in
Enterobacter spp from Brooklyn New York Antimicrob Agents Chemother v 49 n
2 p 776-8 2005
59
BRATU S et al Emergence of KPC-possessing Klebsiella pneumoniae in
Brooklyn New York epidemiology and recommendations for detection Antimicrob
Agents Chemother v 49 n 7 p 3018-20 2005
BRATU S et al Rapid spread of carbapenem-resistant Klebsiella
pneumoniae in New York City Arch Intern Med v 165 p 1430-5 2005
CAMARGO C F et al Aplicaccedilatildeo das teacutecnicas de pcr e suas teacutecnicas
derivadas em diagnoacutestico molecular Disponiacutevel em
ltfileDUnB10C2BA20semestreArtigosPCR-
20CLEYTON20FLORENCIO20DE20CAMARGO20E20PAULO20ROB
ERTO20QUEIROZpdfgtgt Acesso em 08 de abril de 2014
CARVALHES C G et al Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting
carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive
results Journal of Antimicrobial Chemotherapy v 65 n2 p 249-251 2010
CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION- CDC Modified
Hodge Test for Carbapenemase Detection in Enterobacteriaceae 2004
CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE Methods for
dilutionantimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically Approved
standard M7ndashA7 7th ed CLSI Wayne PA 2011
COELLO R et al Risk factors for developing clinical infection with methicillin-
resistant Staphylococcus aureus (MRSA) amongst hospital patients initially only
colonized with MRSA J Hosp Infect 19973739-46
COLPAN A et al Evaluation of risk factors for mortality in intensive care
units A prospective study from a referral hospital in Turkey Am J Infect Control
200533(1)42-7
60
CORNAGLIA G et al Living with ESBLs Introduction Clinical Microbiology
and Infection 14 Suppl 1 1-2 2008
COTRIM E R et al Klebsiella pneumoniae carbapenemase ndash KPC em
Enterobacteriaceae o desafio das bacteacuterias multirresistentes Poacutes em revista do
centro universitaacuterio Newton Paiva 12012 - ediccedilatildeo 5 - issn 2176 7785
DESHPANDE L M et al Occurrence and characterization of
carbapenemase-producing Enterobacteacuteriaceae report from the SENTRY
Antimicrobial Surveillance Program (2000-2004) Microb Drug Resist 12(4)223-30
2006
DIAS D J A Estudos dos principais mecanismos de resistecircncia aos
antibioacuteticos β-lactacircmicos em bacteacuterias patogecircnicas gram negativas 2009 100 f
Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Geneacutetica Molecular e Biomedicina) ndash Faculdade de
Ciecircncias e Tecnologia Universidade de Nova Lisboa Lisboa
DIENSTMANN R et al Avaliaccedilatildeo fenotiacutepica da enzima Klebsiella
pneumoniae carbapenemase (KPC) em Enterobacteriaceae de ambiente hospitalar
J Bras Patol Med Lab v 46 n 1 p 23-27 fevereiro 2010
ENDIMIAMI A et al Emergence of blaKPC-containing Klebsiella
pneumoniae in a long-term acute care hospital a new challenge to our healthcare J
Antimicrob Chemother 64 1102-1110 Nov 2009
FALAGAS M E et al Extended-spectrum beta-lactamase producing
organisms The Journal of Hospital Infection 73 (4) pp 345-54 2009
FONTANA C et al Emergence of KPC-producing Klebsiella pneumoniae in
Italy BMC Rev Notes 3 40 2010
61
GALES A C et al Antimicrobial resistance among Gram-negative bacilli
isolated from Latin America results from Sentry Antimicrobial Surveillance Program
(Latin America 2008-2010) Diagnostic Microbiology and Infectious Disease v 3 n
4 p 354 -360 2012
GUPTA N et al Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Epidemiology
and Prevention HEALTHCARE EPIDEMIOLOGY Clinical Infectious Diseases
201153(1)60ndash67 Published by Oxford University Press on behalf of the Infectious
Diseases Society of America 2011
HARBOTTLE H et al Genetics of antimicrobial resistance Anim Biotechnol
n17 p111-124 2006
HENRIQUE W N et al RESISTEcircNCIA BACTERIANA Uniatildeo das
Faculdades Alfredo NasserInstituto de Ciecircncias da Sauacutede Disponiacutevel em lt
httpwwwfaculdadealfredonasseredubrfilespesquisaposter20HENRIQUE20
Wilker20Natividade20SANTIAGO20Silvania20CAVALCANTI20DSP
20ResistC3AAncia20Bacterianapdfgt Acesso em 17 marccedilo 2014
HULSCHER M E J I et al Antibiotic prescribing in hospital a social and
behavioral scientific approach The Lancet Infectious Diaseases v 10 n 3 p 167-
165 2010
KIDWAI M SAPRA P BHUSHAN KR Synthetic strategies and medicinal
properties of beta-lactams Curr Med Chem 1999 695-215
KUMARASAMY K K et al Emergence of a new antibiotic resistance
mechanism in India Pakistan and the UK a molecular biological and
epidemiological stuy The Lancet Infectious Diseases v10 n 9 p 597- 602 2010
LINCOPAN N et al Enterobacteacuteria producing extended-spectrum β-
lacatamases and IMP-1 Metalo-β-lactamases isolated from Brazilian hospitals J Med
62
Microbiol 7 1-3 2006
LINCOPAN N et al First Isolation of Metalo-β-Lacatamase-Producing
Multiresistant Klebsiella pneumoniae from a patient in Brazil J Clin Microbiol 43(1)
516-519 2005
LIVERMORE D M et al What remains against carbapenem- resistant
Enterobacteriaceae Evaluation of choramphenicol ciprofloxacin colistina
fosfomycin minocycline nitrofurantoin temocilin and tigecycline International
Journal of Antimicrobial Agents v 37 n 5 p 415- 459 2011
LIVERMORE D M Fourten years in resistance International Journal of
Antimicrobial Agents v 39 283- 294 2012
LIVERMORE D M Bacterial resistance to carbapenems Adv Exp Med Biol
1995 39025-47
LIVERMORE D M Bacterial resistance origins epidemiology and impact
Clin Infect Dis 36S11-S23 2003
LIVERMORE D M et al Carbapenemases a problem in waiting Curr
Opin Microbiol 2000 3489-95
LU et al Universal pcr for common bacterial pathogens J CLIN
MICROBIOL VOL 38 2000
LU et al Use of PCR with Universal Primers and Restriction Endonuclease
Digestions for Detection and Identification of Common Bacterial Pathogens in
Cerebrospinal Fluid Journal of Clinical Microbiology June 2000 p 2076ndash2080
MARSCHALL J Met al Presence of the KPC Carbapenemase Gene in
Enterobacteriaceae Causing Bacteremia and Its Correlation with In Vitro
Carbapenem Susceptibility J Clin Microbiol 47 239-241 Jan 2009
63
MARTINS WMBS et al Prevalecircncia do gene blaKPC em isolados cliacutenicos
de Enterobacteriaceae e natildeo fermentadores encontrados em amostras clinicas em
um hospital universitaacuterio do Recife X Jornada de ensino pesquisa e extensatildeo ndash
JEPEX 2010 ndash UFRPE Recife 18 a 22 de outubro
MENDES C A C et al Polimixinas Revisatildeo com ecircnfase na sua
nefrotoxicidade Rev Assoc Med Bras 2009 55(6) 752-9
MOHR J F 3rd Update on the efficacy and tolerability of meropenem in the
treatment of serious bacteacuterial infections Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S41-51
2008
MONTEIRO J et al First report of KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae
strains in Brazil Antimicrob Agents Chemother Jan53(1)333-4 2009
MOREIRA V C et al Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia a antibioacuteticos
Disponiacutevel em
lthttpwwwcpglsucgbr6mostraartigosSAUDEVANESSA20CARVALHO20M
OREIRApdfgt Acesso em 21 marccedilo 2014
NETIKUL T et al Emergence of novel blaKPC-12 and blaKPC-13 variants in
carbapenem non-susceptible Enterobacter cloacae a first report of blaKPC gene in
Thailand European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases May
S372 2011
NETO V A et al Antibioacuteticos na praacutetica Meacutedica 6ordf Ediccedilatildeo Editorial
SarverSP Brasil 2007
NICOLAU D P Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of
meropenem Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S32-40 2008
64
OLIVEIRA A C et al Resistecircncia bacteriana e mortalidade em um centro de
terapia intensiva Rev Latino-Am Enfermagem nov-dez 2010
PAAUW A et al Failure to control an outbreak of qnrA 1-positive multidrug-
resistant Enterobacter clocae despite adequate implementation of recommended
infection control measures Journal of Clinical Microbiology v 45 n 5 p 1420-1425
2007
PATERSON D L et al Extended-Spectrum Beta-Lactamases a Clinical
Update Clinical Microbiology Reviews v 18 p 657-686 2005
PEIRANO G et al Carbapenem-hydrolysing beta-lactamase KPC-2 in
Klebsiella pneumonia isolated in Rio de Janeiro Brazil J Antimicrob Chemother Nov
20 2009
PERES-BOTA D et al Are infections due to resistant pathogens associated
with worse outcome in critically ill patients J Infect 200347(4)307-16
PIDDOCK L J V Clinically relevant chromosomally encoded multidrug
resistance effl ux pumps in bacterial Clin Microbiol Rev n19 p382-402 2006
PITOUT J D D et al Emergence of Enterobacteriaceae producing
extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) in the community J Antimicrob
Chemother May 56 2005
POSSEBON M I et al Resistecircncia bacteriana aos carbapenecircmicos
Bacterial resitence to carbapenems RBM rev bras med60(6)378380-378-382
jun 2003
QUEENAN A M et al Carbapenemases the versatile beta-lactamases
Clin Microbiol Rev Jul20(3)440-58 2007
65
RHOMBERG P R et al Summary trends for the meropenem yearly
susceptibility test information collection program a 10- year experience in the United
States (1999-2008) Diagnostic Microbiology and Infectiois Disease v 65 n4 p
414-426 2009
ROBLEDO I E et al Detection of KPC in Acinetobacter spp in Puerto Rico
J Antimicrob Agents Chemother 54 1354-1357 Mar 2010
ROGERS B A et al Country-to-country transfer os patients and the risk of
multi-resistant bacterial infection Clinical Infectious Disease v53 n1 p49- 56
2011
SHAH A A et al Characteristics epidemiology and clinicalimportance of
emerging strains of Gram-negative bacilli producing extended-spectrum
betalactamases Research in Microbiology v 155 p 409-421 2004
TURNER P J Extended- Spectrum Beta-Lactamases Clinical Infectious
Diseases v 41 p 273-275 2005
WOLTER D J et al Phenotypic and Enzymatic Comparative Analysis
between the Novel KPC variant KPC-5 and Its Evolutionary Variants KPC-2 and
KPC-4 Antimicrob Agents Chemother Nov 17 2008
WOODFORD N et al Carbapenemases of Chryseobacterium
(Flavobacterium) meningosepticum distribution of blaB and characterization of a
novel Metalo-beta-lactamase gene blaB3 in the type strain NCTC 10016
Antimicrob Agents Chemother Jun44(6)1448-52 2000
WOODFORF N Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in
India Pakistan and the UK a molecular biological and epidemiological study The
Lancet Infectious Diseases v 10 n 9 p 597-602 2010
66
WOODFORD et al Outbreak of Klebsiella pneumoniae Producing a New
Carbapenem- Hydrolyzing Class A β-Lactamase KPC-3 in a New York Medical
Center Antimicrobial agents and chemotherapy Dec 2004 p 4793ndash4799 Vol 48
No 12
YAGI T et al A preliminary survey of extended-spectrum β-lactamases
(ESBLs) in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Japan
FEMS Microbiology Letters 184 (2000) 53-56
YIGIT H et al Novel carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase KPC-1 from
a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumonia J Antimicrob Agents
Chemother 45 (4) 1151-1161 (2001)
ZAVASCKI A P et al KPC-2- producing Enterobacter cloacae in two cities
from Southern Brazil Int J Antimicrob Agents Apr 28 2009
ZHANEL G G et al Comparative review of the carbapenecircmicos Drugs
67(7)1027-52 2007
67
ANEXOS
Sequumlecircncia do oligo blaKPC
Query 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
Query 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
Query 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
68
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
Query 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
Query 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
69
Query 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
Query 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
Query 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
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|||||||
70
Sbjct 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
Query 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
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Sbjct 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
Query 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Sbjct 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
Query 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
71
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Sbjct 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
Query 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
Query 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
72
Query 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
Query 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
Query 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
73
Sbjct 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
Query 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Sbjct 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
Query 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
Query 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
74
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
Query 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
Query 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
75
Query 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Sbjct 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
Query 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
||||
Sbjct 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
LOCUS AF297554 1377 bp
DNA linear BCT 26-MAR-2001
DEFINITION Klebsiella pneumoniae carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
gene complete cds
ACCESSION AF297554
VERSION AF2975541 GI10121874
76
KEYWORDS
SOURCE Klebsiella pneumoniae
ORGANISM Klebsiella pneumoniae
Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Enterobacteriaceae Klebsiella
REFERENCE 1 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH QueenanAM
AndersonGJ Domenech-SanchezA
BiddleJW StewardCD
AlbertiS BushK and TenoverFC
TITLE Novel carbapenem-hydrolyzing beta-
lactamase KPC-1 from a
carbapenem-resistant strain of
Klebsiella pneumoniae
JOURNAL Antimicrob Agents Chemother 45 (4)
1151-1161 (2001)
PUBMED 11257029
REFERENCE 2 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH AndersonGJ and
TenoverFC
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (19-AUG-2000) Nosocomial
Pathogens Laboratory Branch
Centers for Disease Control and
Prevention 1600 Clifton Rd MS
G08 Atlanta GA 30333 USA
FEATURES LocationQualifiers
77
source 11377
organism=Klebsiella
pneumoniae
mol_type=genomic DNA
db_xref=taxon573
-35_signal 5560
-10_signal 7883
mRNA 921012
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
RBS 117122
CDS 1311012
note=blaKPC-1
codon_start=1
transl_table=11
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
protein_id=AAG134101
db_xref=GI10121875
translation=MSLYRRLVLLSCLSWPLAGFSATALTNLVAEPFAKLEQD
FGGSI
GVYAMDTGSGATVSYRAEERFPLCSSFKGFLAAAVLARSQQQAGLLDTPIRYG
KNALV
PWSPISEKYLTTGMTVAELSAAAVQYSDNAAANLLLKELGGPAGLTAFMRSIG
DTTFR
78
LDRWELELNSAIPSDARDTSSPRAVTESLQKLTLGSALAAPQRQQFVDWLKGN
TTGNH
RIRAAVPADWAVGDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTRAPNKDDK
HSEAV
IAAAARLALEGLGVNGQ
ORIGIN
1 cggggcagtt acagccgtta cagcctctgg
agagggagcg gcttgccgct cggtgataat
61 cccagctgta gcggcctgat tacatccggc
cgctacacct agctccacct tcaaacaagg
121 aatatcgttg atgtcactgt atcgccgtct
agttctgctg tcttgtctct catggccgct
181 ggctggcttt tctgccaccg cgctgaccaa
cctcgtcgcg gaaccattcg ctaaactcga
241 acaggacttt ggcggctcca tcggtgtgta
cgcgatggat accggctcag gcgcaactgt
301 aagttaccgc gctgaggagc gcttcccact
gtgcagctca ttcaagggct ttcttgctgc
361 cgctgtgctg gctcgcagcc agcagcaggc
cggcttgctg gacacaccca tccgttacgg
421 caaaaatgcg ctggttccgt ggtcacccat
ctcggaaaaa tatctgacaa caggcatgac
481 ggtggcggag ctgtccgcgg ccgccgtgca
atacagtgat aacgccgccg ccaatttgtt
541 gctgaaggag ttgggcggcc cggccgggct
gacggccttc atgcgctcta tcggcgatac
79
601 cacgttccgt ctggaccgct gggagctgga
gctgaactcc gccatcccaa gcgatgcgcg
661 cgatacctca tcgccgcgcg ccgtgacgga
aagcttacaa aaactgacac tgggctctgc
721 actggctgcg ccgcagcggc agcagtttgt
tgattggcta aagggaaaca cgaccggcaa
781 ccaccgcatc cgcgcggcgg tgccggcaga
ctgggcagtc ggagacaaaa ccggaacctg
841 cggagtgtat ggcacggcaa atgactatgc
cgtcgtctgg cccactgggc gcgcacctat
901 tgtgttggcc gtctacaccc gggcgcctaa
caaggatgac aagcacagcg aggccgtcat
961 cgccgctgcg gctagactcg cgctcgaggg
attgggcgtc aacgggcagt aaggctctga
1021 aaatcatcta ttggcccacc accgccgccc
ttgcgggcgg catggattac caaccactgt
1081 cacatttagg ctaggagtct gcgcggcaga
gccgtgtgac cggttttctg tagagcactg
1141 acgatggcgg cggcgctctc tgcaattggc
aaggcgtcgg cgccaaggat accaatcttg
1201 cggcgcgcgg cgtgttatga cgactggggt
gcatttgagc cgccccattt aaccttcgcc
1261 ctcacagata cgccattcgc ctcaaattta
gcgccatgca gacgagcttc cactcggctt
1321 gcaccttgtc caggcccctc atgctgaact
gacgcaatcc catcaccgcc ttgatca
80
34
Antibioacutetico Sigla S I R S I R
Ertapenem 10
microg
ETP 22 19-
21
18 05 1 2
Meropenem 10
microg
MEM 23 20-
22
19 1 2 4
Fonte Manual Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)
2013
Os resultados que apresentaram resistecircncia ao antibioacutetico Ertapenem foram
considerados como suspeitos de contaminaccedilatildeo por KPC Fez-se o teste de
susceptibilidade aos antibioacuteticos (TSA) em aparelho automatizado MicroScan Walk
Away 96sl Dade Behring
4 3 Teste de susceptibilidade aos antibioacuteticos (adaptado CDC 2004)
A determinaccedilatildeo da susceptibilidade dos isolados foi feita pelo teste de
susceptibilidade aos antibioacuteticos (TSA) apoacutes cultura em meio de gelose simples
(INSA) para avaliaccedilatildeo da sua pureza e obtenccedilatildeo de colocircnias isoladas Para
preparaccedilatildeo de uma suspensatildeo bacteriana com turvaccedilatildeo aproximada de 05
McFarland (Dade BehringMicroScanregTurbidity Meter) ressuspendeu duas a cinco
colocircnias em 2ml de soro fisioloacutegico esteacuteril diluindo a 1100 em soro fisioloacutegico num
volume total de 10ml em seguida foi feita uma semeadura em duas placas
quadradas (120mm x 120mm) de Muller-Hinton Agar (INSA) por inundaccedilatildeo
Os discos de antibioacutetico carbapenecircmicos imipenem meropenem e
ertapenem (Biorad) foram aplicados com o auxiacutelio de um dispensador automaacutetico A
susceptibilidade das Enterobacteacuterias aos carbapenecircmicos foi definida de acordo
com o protocolo Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI 2011)
Para aquelas Enterobacteacuterias que apresentaram resistecircncia ao ertapenem
foram realizados o Teste de Hodge Modificado para Detecccedilatildeo de Enterobacteacuterias
Produtoras de Carbapenemases conforme descrito pelo Centers for Disease Control
and Prevention (CDC 2004)
35
4 4Teste de Hodge Modificado (THM) (adaptado CDC 2004)
Preparou-se uma suspensatildeo em salina esteacuteril com a cepa Escherichia coli
ATCC 25922 (padratildeo 05 de McFarland) Apoacutes isto diluiu a suspensatildeo 110 em
salina (05 ml da soluccedilatildeo de Ecoli ATCC 25922 + 45 ml salina)Foi entatildeo semeado
na superfiacutecie de uma placa de Agar Muller-Hinton com a suspensatildeo diluiacuteda de Ecoli
ATCC 25922 com auxilio de swab seco assegurando que houvesse uma
distribuiccedilatildeo uniforme cobrindo toda a superfiacutecie do Agar Deixou secar por 3 a 5
minutos em temperatura ambienteColocou-se o disco de ertapenem 10microg no centro
da placa e apoacutes isto fez-se uma estria linear da cepa a ser testada da borda do
disco ateacute a borda da placa utilizando uma alccedila calibrada 10 microl ou um swab Incubou
a placa na estufa em atmosfera aeroacutebia a 35 plusmn 2ordmC por 16 a 24 horas
441 Controle de qualidade (CQ)
Foi utilizado um CQ todos os dias em que se realizou o teste tendo como
controle Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1705- teste de Hodge modificado
positivo Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1706- teste de Hodge modificado
negativo
442 InterpretaccedilatildeoResultados
Apoacutes 16ndash24 horas de incubaccedilatildeo examinar as placas para verificar a presenccedila
de uma distorccedilatildeo no halo de inibiccedilatildeo do disco de ertapenem devido ao crescimento
realccedilado da cepa ATCC na intersecccedilatildeo do organismo teste e a Ecoli ATCC 25922
dentro dos limites do halo O THM positivo apresentaraacute presenccedila de distorccedilatildeo no
halo de inibiccedilatildeo de ertapenem devido ao crescimento da cepa Ecoli ATCC 25922 ao
longo da estria da cepa teste para dentro dos limites do halo de inibiccedilatildeo Jaacute o THM
negativo teraacute ausecircncia de crescimento da cepa Ecoli ATCC 5922 ao longo da estria
da cepa teste para dentro dos limites do halo de inibiccedilatildeo do disco de ertapenem
Este resultado estaacute representado na figura 6
36
Figura 6 Interpretaccedilatildeo resultado do Teste de Hodge Modificado
(adaptado CDC 2004) Teste positivo na estria da cepa teste na parte superior
da placa teste negativo na estria da cepa teste na parte inferior da placa
Tendo positivo como resultado o paciente era um provaacutevel contaminado por
KPC As amostras entatildeo foram encaminhadas para a Fundaccedilatildeo Osvaldo Cruz
(FIOCRUZ) para confirmaccedilatildeo final As amostras finalmente confirmadas como
positivas para KPC foram isoladas e guardadas no banco de cepas cliacutenicas do
hospital Apoacutes a autorizaccedilatildeo do CEP amostras das cepas foram transferidas para
meio de transporte Stuard em caixa teacutermica fechada em baixa temperatura e
levadas para o laboratoacuterio de microbiologia cliacutenica da universidade
No laboratoacuterio da universidade as amostras foram separadas e realizadas
repiques em meios MacConkey e incubadas por 24h As colocircnias caracteriacutesticas
foratildeo isoladas em caldo BHI e mantidas em shaker a 37oC por 2h Apoacutes isto foram
executadas as anaacutelises a seguir
Os isolados de Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases foram
submetidos agrave extraccedilatildeo de DNA e posterior sequumlenciamento para identificaccedilatildeo dos
genes de resistecircncia blaKPC de 1 a 13 e identificaccedilatildeo do gene universal Os
pacientes de onde os materiais bioloacutegicos contendo as Enterobacteacuterias produtoras
de carbapenemases foram os isolados foram investigados quanto aos aspectos
epidemioloacutegicos e cliacutenicos
37
4 5 Extraccedilatildeo de DNA bacteriano
A extraccedilatildeo de DNA bacteriano foi realizada utilizando o kit NucleoSpin
Plasmidreg (MN) Antes de iniciar a extraccedilatildeo foi feito a preparaccedilatildeo das soluccedilotildees
reagentes materiais e amostras (vortexando) colocou-se em banho-maria agrave 50ordmC o
tampatildeo AW Partiu-se de colocircnias isoladas cultivadas que sofreram passagem em
meio LB liacutequido por 12h Adicionou-se 15 mL da amostra no tubo eppendorf
centrifugou por 5 minutos descartou o sobrenadante (com cuidado para natildeo
descartar o Pellet) Repetiu-se este procedimento por mais trecircs vezes completando-
se o volume de 6mL Foram adicionados 250microL do tampatildeo Resuspension Buffer A1
encostando a ponteira no Pellet e misturando (este tampatildeo tem como funccedilatildeo
separar a formaccedilatildeo de grumos celulares) Apoacutes isso homogeneizou e vortexou os
tubos eppendorfs Apoacutes isso foram adicionados 250microL do tampatildeo Lysis Buffer A2
homogenizou e deixou descansar por 5 minutos (esta etapa eacute importante para a lise
da parede e da membrana celulares e liberaccedilatildeo do conteuacutedo da ceacutelula)
Passado o tempo de descanso foi adicionado 300microL do tampatildeo
Neutralization Buffer A3 homogeneizou e centrifugou por 10 minutos (este tampatildeo
iraacute retirar as proteiacutenas que envolvem o DNA e voltaraacute com o pH para proacuteximo de 8
impedindo que a soluccedilatildeo de lise facilite a quebra das ligaccedilotildees covalentes do aacutecido
nucleacuteico) Em seguida enumeraram-se os tubos contendo filtros com siacutelica
transferiu-se o sobrenadante para o filtro e centrifugou por 5 minutos Descartou-se
o que foi filtrado adicionou 500microL do tampatildeo AW (banho-maria) centrifugou por 2
minutos Novamente foi descartado o filtrado Adicionou-se 600microL do tampatildeo A4
centrifugou por 2 minutos e descartou o filtrado (os tampotildees AW e A4 contecircm
isotiocianato de guanidina em concentraccedilotildees crescentes para facilitar a adsorccedilatildeo
do DNA na siacutelica e retirada das outras biomoleacuteculas da amostra) Foi feita outra
centrifugaccedilatildeo com o tubo vazio Apoacutes isto o filtro foi trocado para outro eppendorf
definitivo onde foi adicionado 50microL do tampatildeo Elution Buffer AE (este tampatildeo
favorece a eluiccedilatildeo do DNA) centrifugou por 2 minutos descartou o filtro e
armazenou as amostras em freezer -20ordmC
38
4 6 Iniciadores e reaccedilatildeo de PCR
Os iniciadores universais para o gene blaKPC foram desenhados baseados
em sequumlecircncias conservadas apresentadas pelos sub-grupos de genes que
codificam a enzima carbapenemase de klebsiella pneumoniae (YIGIT et al 2001)
Baseado na sequumlecircncia para o blakpc-1 depositada no GenBank
(AF2975541) o oligonucleotiacutedio (oligo) iniciador direto (5-
ATGTCACTGTATCGCCGTC-3rsquo) foi desenhado para reconhecer a sequumlecircncia
blaKPC na posiccedilatildeo (131149) enquanto que o iniciador reverso (5-
TTACTGCCCGTTGACGCC-3rsquo) foi reconhecido na posiccedilatildeo (9951012) As anaacutelises
baseadas em alinhamento de sequumlecircncias mostraram que o par de iniciadores
blaKPC podem detectar os alelos de 1 a 13 do gene blaKPC conforme a tabela 2
Tabela 2 Nuacutemero de acesso ao GenBank dos alelos blaKPC e seus
microrganismos originais
Nuacutemero de
Acesso GenBank
Microrganismo Alvo
AF2975541 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-1
GU0862251 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-2
HQ2589341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-2-like
AB5577341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC -3
EU4473041 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-4
EU4002222 Pseudomonas
aeruginosa
blaKPC-5
EU5555341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-6
EU7297271 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-7
39
FJ2344121 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-8
FJ624872 Escherichia coli blaKPC-9
GQ1403481 Acinetobacter
baumannii
blaKPC-10
HM0669951 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-11
HQ3428891 Enterobacter cloacae blaKPC-12
HQ3428901 Enterobacter cloacae blaKPC-13
As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo de blaKPC foram realizadas em um
primeiro tempo de desnaturaccedilatildeo em que foi 94ordmC por 5 minutos seguido de 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 58 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 90 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 78ordmC por 8 minutos Aleacutem das amostras foi utilizado um
controle negativo
A PCR do blaKPC foi realizada utilizando os componentes para o volume da
reaccedilatildeo de 25 microL citados na tabela 3 A banda do tamanho do produto de PCR foi de
881 pares de bases (pb) o que corresponde ao plasmiacutedeo
Tabela 3 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do
gene blaKPC
Reagente Volume
DNA molde 4 microL
Tampatildeo Taq 25 microL
MgCl2 075 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP
2 microL
Oligo F 1 microL
Oligo R 1 microL
Taq DNA polimerase 05 microL
Aacutegua MiliQ 1335 microL
40
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
Baseado na sequumlecircncia para o gene 16S rRNA em que o oligonucleotiacutedio
Universal iniciador direto foward (5-CCAGCAGCCGCCGTAATACG-3rsquo) foi
desenhado para reconhecer a sequumlecircncia universal na posiccedilatildeo 1513 enquanto que o
iniciador reverso (5-ATCGGYTACCTTGTTACGACTTC-3rsquo) foi reconhecido na
posiccedilatildeo 1491 foram realizadas PCRrsquos As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo deste
gene foram realizadas nos seguinte tempos separaccedilatildeo 94ordmC por 10 minutos 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 55 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 120 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 72ordmC por 10 minutos
A PCR do gene 16S rRNA foi realizada utilizando os componentes para o
volume da reaccedilatildeo de 25microL citados na tabela 4 A banda do tamanho do produto de
PCR foi de 996 pb correspondente aacute regiatildeo ribossomal capaz de amplificar todas
as espeacutecies
Tabela 4Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do gene
universal
Reagente (quantidade
concentraccedilatildeo do estoque)
Volume
DNA molde 10 ng 4 microL
Tampatildeo Taq 10 x 25 microL
MgCl2 50mM 125 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP 25 mM
125 microL
Oligo F 10microM 05 microL
Oligo R 10microM 05 microL
Taq DNA polimerase 5UmicroL 04 microL
Aacutegua Miliq 146 microL
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
41
O termociclador utilizado para os experimentos foi o LifeTouch da BIOER
4 7 Digestatildeo
Para realizaccedilatildeo da digestatildeo foi utilizada a enzima BshF I (Hae III) EN- 1105
tamanho 7000 units concentraccedilatildeo 10 unitsmicroL fonte Bacillus sphaericus empresa
Jena bioscienceUtilizaram-se os componentes para o volume de 50microL da reaccedilatildeo
citados na tabela 5
Tabela 5 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da digestatildeo do gene
universal
Reagente Volume
Produto de PCR 10 microL
Enzima BshF I 01 microL
Tampatildeo (10x) 5 microL
Aacutegua Miliq 349 microL
Total (em cada ependorff) 50 microL
Valores para 1 digestatildeo
Os ependorffs foram colocados por 30 minutos em banho-maria a 37ordmC Apoacutes
isso fez-se a corrida das amostras em gel de agarose para verificaccedilatildeo do resultado
(LU et al 2000)
4 8 Eletroforese em gel de agarose
Os produtos de DNA PCR e digestatildeo foram analisados em gel de agarose
2 O tempo de corrida do gel eacute de aproximadamente 1hora e 30minutos sendo
que no comeccedilo foi usada agrave voltagem de 50 V e apoacutes comeccedilar a correr o gel
aumentou a voltagem para 100 v Utilizou-se o marcador de 100pb (pares de bases)
Foi adicionado 3microL de corante Bromophenol (que tem a funccedilatildeo de fazer uma ligaccedilatildeo
na amostra de DNA e permitir a visualizaccedilatildeo da corrida no gel de agarose) em 7microL
de amostra tanto de DNA quanto de PCR Para o preparo do gel foi utilizado TBE
42
(Tris- Aacutecido Boacuterico) agarose e brometo de etiacutedio (sua funccedilatildeo eacute de corante para o gel
e permitir a visualizaccedilatildeo do DNA quando colocado agrave luz ultravioleta) Para o oligo
blaKPC a banda da amplificaccedilatildeo foi em 881ppb correspondendo ao plasmiacutedeo Jaacute
o oligo Universal foi em 996 pb
4 9 Descarte de resiacuteduos
Todos os materiais utilizados nos ensaios foram de uso uacutenico e manipulados
em cacircmaras de seguranccedila bioloacutegica classe II Apoacutes o uso foram colocados em
soluccedilatildeo desinfetantes (hipoclorito a 1) e em seguida autoclavados a 127oC por 20
min em sacos apropriados para autoclavaccedilatildeo Apoacutes a finalizaccedilatildeo do ciclo de
esterilizaccedilatildeo os sacos contendo o material descartaacutevel foram colocados em
recipientes de coleta da empresa responsaacutevel pela coleta de materiais bioloacutegicos
produzidos no laboratoacuterio de microbiologia Todos os procedimentos seguiram a
normativa RDC-ANVISA 3062004 sobre o descarte de resiacuteduos de serviccedilo de
sauacutede
4 10 Aspectos epidemioloacutegicos e cliacutenicos
Os aspectos cliacutenicos e epidemioloacutegicos foram investigados por meio de
prontuaacuterios dos pacientes portadores de enterobacteacuterias produtoras de
carbapenemases e envolveram topografia mais provaacutevel do foco infeccioso a
enfermidade motivadora da internaccedilatildeo o desfecho cliacutenico a idade e o tempo de
internaccedilatildeo
4 12 Anaacutelises eepidemioloacutegicas
As anaacutelises foram realizadas com o pacote estatiacutestico SPSS versatildeo 200
Para verificar quais variaacuteveis referentes aos dados epidemioloacutegicos e
microbioloacutegicos influenciaram no desfecho verificou- se a diferenccedila meacutedia das
variaacuteveis idade e tempo de internaccedilatildeo em cada grupo O teste estatiacutestico utilizado foi
o teste t de Student apoacutes se executar o teste de normalidade de Shapiro-Wilk Para
as variaacuteveis sexo perfil microbioloacutegico das enterobacteacuterias produtoras de
43
carbapenemases foi avaliada a associaccedilatildeo com o desfecho por meio do teste Exato
de Fisher O niacutevel de significacircncia adotado foi de 5
4 13 Preceitos eacuteticos
Este projeto estaacute inserido em um projeto maior denominado ldquoEpidemiologia
cliacutenica e caracterizaccedilatildeo molecular do Acinetobacter Baumannii resistente a
antibioticoterapia em pacientes internado em hospitais do Sistema Uacutenico de Sauacutederdquo
que foi submetido ao Comitecirc de Eacutetica em Pesquisa da Secretaria do Estado de
Sauacutede do Distrito Federal (SESDF) e emitido parecer aprovado pelo protocolo nordm
23109 (anexo)
44
5 RESULTADOS
51 Anaacutelise molecular
Para a amplificaccedilatildeo com o oligo blaKPC foram amplificadas amostras
que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 881 pb correspondente ao
plasmiacutedeo A anaacutelise da amplificaccedilatildeo da regiatildeo do gene blaKPC mostrou que
apenas a amostra A10 natildeo amplificou isso demonstra que esta amostra natildeo
possuiacutea o gene de resistecircncia
5 1 1 Gene blaKPC
Figura 7 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 881 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
A amostra A3 natildeo amplificou no primeiro momento entatildeo foi realizado
novamente a PCR e corrida de gel obtendo entatildeo a amplificaccedilatildeo da amostra como
apresentado na figura 8
45
Figura 8 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC da
mostra A3 estudada A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo de 881
pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 1 2 Gene 16S rRNA
Para a amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA utilizou-se o oligo universal Foram
amplificadas amostras que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 996 pb
Figura 9 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
46
Segundo Lu et al (2000) a digestatildeo com a enzima HaeIII deste amplicons de
16S rRNA devolveriam bandas com perfis entre 150 a 200 pb No gel abaixo eacute
possiacutevel evidenciar que este perfil ocorreu com o predomiacutenio de bandas na altura
de 200pb
Figura 10 Gel de agarose a 2 da digestatildeo do amplicon do gene 16S
rRNA das amostras com a enzima HaeIII evidenciando diversos fragmentos
proacuteximos a 200 pb A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo ribossomal
de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 2 Anaacutelises epidemioloacutegicas
5 2 1 Sexo
No total foram detectados 17 isolados de KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 onde a maior a prevalecircncia foi
detecatada em amostras de pacientes do sexo masculino (53) do que no sexo
feminino (47)
47
Figura 11 Isolado de KPC segundo sexo dos 17 pacientes investigados
no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 2 Desfecho cliacutenico
Em 17 isolados de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo
de 2010 aacute 2011 a porcentagem de pacientes que foram a oacutebito (59) foi maior que
a de pacientes que tiverm alta (41)
Figura 12 Isolado de KPC segundo desfecho cliacutenico dos 17 pacientes
investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
48
5 2 3 Local da coleta
Dos 17 episoacutedios detectados de infecccedilatildeo por KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 a infecccedilatildeo em swab retalfoi mais
frequente (47) seguida de ponta de cateacuteter (18) e secreccedilatildeo traqueal (12)
Figura 13 Isolados de KPC segundo local da coleta da amostra nos 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 4 Microorganismo
O microorganismo mais encontrado foi a Klebsiella pneumoniae (82)
seguida da Enterobacter clocae (12) e Serratia marcescens (6) dos 17 isolados
de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 Isto afirma o
fato de a sigla KPC ser utilizada de forma errocircnea aacute Klebsiella pneumoniae visto
que a evidecircncia dela eacute maior em relaccedilatildeo as outras cepas
49
Figura 14 Isolado de KPC segundo microrganismo encontrado em 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 5 Relaccedilotildees variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana e desfecho
cliacutenico
Tabela 6 ndash Distribuiccedilatildeo do perfil geneacutetico sexo coleta tipificaccedilatildeo de
microrganismos e anaacutelise da resistecircncia bacteriana segundo o desfecho
cliacutenico Brasiacutelia-DF 2010 a 2011
Variaacutevel Resultado
Desfecho
Alta Oacutebito
N N P
Gene 16S rRNA Positivo 7 1000 10 1000
NA Gene blaKPC Positivo 6 857 10 1000
Negativo 1 143 0 00 0218 Sexo Feminino 2 286 6 600
Masculino 5 714 4 400 0201 Local da coleta Fundo saco de
Douglas 1 143 0 00
Hemocultura 0 00 1 100 0463 Ponta de cateter 1 143 2 200
Sec TraquealBrocircnquica
0 00 1 100
50
Secreccedilatildeo traqueal 2 286 0 00
Swab retal 3 429 5 500
Urina 0 00 1 100
Microrganismo Enterobacter cloacae (KPC)
1 143 1 100
Klebsiella pneumoniae
6 857 8 800
0416 Serratia
marcescens 0 00 1 100
Teste de Hodge Hodge positivo 7 1000 10 1000
NA Amicacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 1 100 0848 resistente 0 00 1 100
sensiacutevel 2 286 3 300
Amoxicilina Aacutecido Clavulacircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Ampicilina Sulbactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ampicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Aztreonan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefazolina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Cefoperazona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Cefotaxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefoxitina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0509 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 2 286 4 400
Ceftazidima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cetriaxona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 3 429 5 500 0772 Cefalotina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ciprofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772
51
resistente 3 429 5 500
Claritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Clindamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Eritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Gentamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0942 resistente 2 286 3 300
sensiacutevel 1 143 2 200
Imipenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 0 00 2 200 0193 Resistente 1 143 3 300
sensiacutevel 2 286 0 00
Nitrofurantoiacutena sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Norfloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Oxacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Penicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Piperacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Rifampicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tetraciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Ticarcilina Aacutecido Clavulocircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0688 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 3 429 4 400
Tobramicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Trimetoprima Sulfametoxazol
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0112 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 2 286 0 00
Vancomicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tigeciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediario 0 00 1 100 0211 natildeo testado 1 143 4 400
resistente 2 286 0 00
52
Cefepime sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefuroxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Levofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Piperacilina Tazobactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Ertapenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Meropenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0223 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 1 143 0 00
Cefotetan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 sensiacutevel 0 00 1 100
Gemifloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 7 700 0585 natildeo testado 3 429 3 300
Desfecho
Alta Oacutebito
Meacutedia Erro
padratildeo Meacutedia Erro
padratildeo p
Idade 58 9 59 5 0991
Tempo Internaccedilatildeo (dias)
50 13 46 12 0571
n= 17 p(lt 005) NA natildeo se aplica
53
6 DISCUSSAtildeO
Nos uacuteltimos anos houve um aumento na incidecircncia de bacteacuterias
multirresistentes aos antimicrobianos no ambiente hospitalar tornando isto um
problema mundial de sauacutede puacuteblica (HULSCHER et al 2010) Quando se trata
principalmente de bacilos Gram negativos a frequumlecircncia destas bacteacuterias eacute ainda
maior em paiacuteses da Ameacuterica Latina quando comparada a paiacuteses desenvolvidos
(GALES etal 2012)
De acordo com dados do ldquoMeropenem Yearly Susceptibility Test Information
Collectionrdquo (MYSTIC) ocorreu nos Estados Unidos um aumento na susceptibilidade
de K pneumoniae nos uacuteltimos anos graccedilas a praacuteticas de controle de disseminaccedilatildeo
de amostras resistentes(RHOMBERG P R et al 2009) O aumento crescente da
prevalecircncia destes microrganismos foi proporcional ao aumento da dependecircncia do
uso de antibioacuteticos carbapenecircmicos considerados como a opccedilatildeo terapecircutica para o
tratamento de infecccedilotildees por bacilos Gram negativos multi-resistentes (LIVERMORE
2012) Isto afeta diretamente as opccedilotildees de tratamento sobrando poucas alternativas
para a terapecircutica que incluem colistina (polimixina E) e tigeciclina que apresentam
respectivamente problemas em termos de toxicidade e eficaacutecia (LIVERMORE et
al 2011) Um dos efeitos adversos mais importantes das poliminas B e E por
exemplo satildeo a neurotoxicidade e nefrotoxicidade (MENDES C A C et al2009 )
Devido agrave resistecircncia ser usualmente de natureza plasmidial e portanto de
maior disseminaccedilatildeo especialmente quando carreadas por K pneumoniae
microrganismo com uma notoacuteria capacidade para acumular e transferir plasmiacutedeos
com determinantes para resistecircncia o nuacutemero de casos detectados pelo
fenoacutetipogenoacutetipo blaKPC eacute bastante preocupante (MONTEIRO et al 2009)
Comparada com outras bacteacuterias hospitalares a transmissatildeo de clones
multirresistentes de K pneumoniae eacute maior e podem natildeo ser controladas pelos
meacutetodos de controle de infecccedilatildeo hospitalar (PAAUW et al 2007) A forma
plasmidial para transferecircncia da resistecircncia adicionada a este grande potencial para
disseminaccedilatildeo de clones resistentes eacute preocupante visto que apoacutes surtos muitas
vezes pode se tornar endecircmica Jaacute eacute uma realidade a disseminaccedilatildeo desta bacteacuteria
54
entre pacientes hospitais paiacuteses e ateacute mesmo continentes (WOODFORF et al
2010 ROGERS et al 2011)
As chances de surtos satildeo maiores em paiacuteses com poucos recursos devido agrave
maior carecircncia de praacuteticas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees hospitalares e o
uso irracional de antimicrobianos de forma empiacuterica e inadequada (KUMARASAMY
et al 2010) Ateacute o momento os mecanismos de resistecircncia aos cabapenecircmicos
geralmente encontrado eram a produccedilatildeo de ESBL (CTX-M) somada aacute perda de
porina (CARVALHAES et al 2010) Foi notado a partir do ano de 2008 um
aumento no nuacutemero de K pneumoniae produtoras de KPC-2 apresentando outra
forma de resistecircncia (GALES 2012)
Um estudo mostrou que o perfil do paciente colonizado ou infectado por KPC
foi de um paciente entre os 33 e os 82 anos de idade internado haacute mais de 1
semana no hospital A mortalidade geral nos uacuteltimos anos ficou em torno de 7
sendo que dos 77 pacientes estudados 32 (415) pacientes evoluiacuteram para oacutebito
evidenciando a alta morbi-mortalidade associada (ALVES A P et al 2013)
Em estudo com 2316 pacientes avaliados a populaccedilatildeo de sexo masculino foi
de 526 idade meacutedia global de 53 anos (mediana de 55 anos) permanecircncia meacutedia
de 58 dias (mediana de 3 dias) (OLIVEIRA A C et al 2010) Outros trabalhos
apresentaram ausecircncia de significacircncia entre sexoidade e o desenvolvimento de
infecccedilotildees por microrganismos resistentes (PERES-BOTA D et al 2003 COLPAN
A et al 2005 COELLO R et al 1997)
Outro estudo utilizou um total de 30 amostras sendo elas isoladas de urina
escarro secreccedilatildeo pleural ponta de cateter aspirado traqueal e hemocultura A mais
prevalente foi em urina (40) Entre as 30 cepas analisadas a maior porcentagem
foi da cepa Klebsiella pneumoniae (70) Enterobacter sp (133) Klebsiella
ozaenae (10) Escherichia coli (333) e Klebsiella oxytoca (333)
(DIENSTMANN R et al 2010) Nos Estados Unidos a enzima KPC jaacute se tornou
endecircmica Foi realizada uma pesquisa em dois hospitais de Nova York onde
testaram 602 amostras e 45 apresentaram algum mecanismo de resistecircncia
sendo apenas 33 confirmadas por biologia molecular como KPC-2 (BRATU et
al 2005)
55
Estudo sobre os tipos de ESBL feito no Japatildeo apresentou o tipo Toho-1 como
o mais prevalente nessa pesquisa Ateacute o ano de 2000 ano em que foi publicado tal
estudo este era o primeiro relatoacuterio no Japatildeo para identificar derivados de ESBLs
como tipo de SHV e TEM entre E coli e K pneumoniae Em especial o tipo SHV- 12
foi identificado com uma maior frequumlecircncia Estes resultados indicam que tipos
distintos de ESBLs que satildeo diferentes em sua especificidade de substrato e origem
geneacutetica coexistem no Japatildeo Isto mostra a importacircncia de caracterizar genoacutetipos
distintos de ESBLs e de estar em alerta continuamente para as tendecircncias de
ESBLs no Japatildeo aleacutem da necessidade de uma interpretaccedilatildeo uniforme utilizando as
diretrizes do CSLI para relatar cepas produtoras de ESBL Aleacutem da detecccedilatildeo de
ESBLs satildeo necessaacuterias mais informaccedilotildees tais como o perfil de sensibilidade
especiacutefica para diversas β-lactacircmicos e o local da infecccedilatildeo Esses fatores satildeo
essenciais para a escolha adequada de antibioacuteticos (YAGI T et al 2000)
No ano de 2004 uma pesquisa avaliou a produccedilatildeo de uma enzima de
hidroacutelise de carbapenecircmicos atraveacutes da teacutecnica de sequumlenciamento foi revelado
um novo membro da famiacutelia KPC designado KPC- 3 Pesquisadores encontraram
em um mutante de K pneumoniae uma substituiccedilatildeo de um gene associado com
resistecircncia a Imipenem mas essa substituiccedilatildeo foi considerada improvaacutevel na
contribuiccedilatildeo da resistecircncia aos carbapenecircmicos da espeacutecie estudada Aleacutem da
resistecircncia aos carbapenecircmicos estes isolados eram em sua maioria resistentes agraves
cefalosporinas penicilinas e aminoglicosiacutedeos Usando estudos de transformaccedilatildeo
conjugaccedilatildeo e hibridaccedilatildeo localizaram o alelo blaKPC em plasmiacutedeo aleacutem disso
mostraram que esse alelo tambeacutem carregava uma resistecircncia aos aminoglicosiacutedeos
A transferecircncia das enzimas KPCs foi demonstrada in vitro tanto neste como em
outros estudos pode ser que os plasmiacutedeos que fazem esta transferecircncia estavam
comeccedilando a se espalhar no ambiente cliacutenico resultando na multiresistecircncia dessas
estirpes (WOODFORD et al 2004)
O presente estudo apresentou um vieacutes quanto aos resultados dos testes de
susceptibilidade microbiana Observou-se que natildeo foi encontrado resultado deste
teste em algumas amostras o que natildeo cooperou para um estudo mais preciso
futuros estudos quanto agraves amostras e um melhor acompanhamento deste tipo de
patologia Poreacutem mesmo sem algumas amostras com este resultado disponiacutevel foi
56
confirmada a presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos
carbapenecircmicos por meio dos genes de resistecircncia blaKPC e 16S rRNA que as
amostras apresentaram em sua maioria serem portadoras Quanto aos resultados
estatiacutesticos nenhuma das variaacuteveis apresentou significacircncia estatiacutestica (p gt 005)
mostrando assim que estas variaacuteveis isoladas natildeo foram o fator determinante para
o desfecho cliacutenico de alta ou oacutebito
57
7 CONCLUSAtildeO
Os genes blaKPC e 16S rRNA foram caracterizados confirmando a a
presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos carbapenecircmicos
Houve uma maior prevalecircncia da cepa K pneumoniae e isto confirma outros
estudos que apresentam a maior prevalecircncia desta cepa em amostras com KPC
Aleacutem disso isso justifica a forma popular da K pneumoniae ser chamada de KPC
enquanto que na verdade KPC eacute uma enzima podendo estar presente em outras
cepas como Enterobacter clocae tambeacutem apresentada no presente estudo O
desfecho cliacutenico de oacutebitos maior que 50 eacute um possiacutevel indicador sobre a
necessidade de se realizar um teste raacutepido para identificaccedilatildeo de KPC visando
iniciar o mais raacutepido possiacutevel o tratamento afim de diminuir a mortalidade por esta
infecccedilatildeo
Nenhuma das variaacuteveis isoladamente estaacute relacionada ao desfecho cliacutenico
oacutebito ou alta pois natildeo apresentaram relevacircncia estatiacutestica O presente estudo
mostrou que haacute presenccedila da bacteacuteria nas amostras de pacientes do hospital
estudado podendo entatildeo afirmar que este tipo de bacteacuteria se encontra tambeacutem
presente em ambiente hospitalar O uso irracional de antimicrobiano eacute demonstrado
de forma indireta quando foi apresentado atraveacutes do Teste de Hodge Modificado
uma resistecircncia de 100 aos antibioacuteticos carbapenecircmicos Isto tambeacutem reflete na
terapecircutica sendo que pacientes portadores de bacteacuterias resistentes aos
antibioacuteticos carabepecircmicos tem uma escassa opccedilatildeo de tratamento e as opccedilotildees
apresentam problemas quanto agrave toxicidade e eficaacutecia
58
REFEREcircNCIAS
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Mecanismos
de resistecircncia bacteriana aos antimicrobianos Disponiacutevel em
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controleopas_
webmodulo3mec_sitiohtmgt Acesso em 25 de abril de 2014
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Nota teacutecnica nordm
012013 medidas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees por enterobacteacuterias
multiresistentes Acesso em 17 de abril de 2013
ALBA J et al Kinetics study of KPC-3 a plasmid-encoded class A
carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase Antimicrob Agents Chemother
Nov49(11)4760-2 2005
ALVES A P et al Nosocomial infections by KPC-producing enterobacteria in
a tertiary hospital in Southern Brazil Revista da AMRIGS Porto Alegre 57 (3) 213-
218 jul-set 2013
ALVES A et al Tipagem Geneacutetica de Microrganismos Lab De Diversidade
Microbiana Centro de Biologia Celular Dep de Biologia U de Aveiro 3810-193
Aveiro- 2003
BELL J M et Al Prevalence and significance of a negative extended-
spectrum beta-lactamase (ESBL) confirmation test result after a positive ESBL
screening test result for isolates of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae
results from the SENTRY Asia-Pacific Surveillance Program J Clin Microbiol
May45(5)1478-82 2007
BRATU S et al Detection of KPC carbapenem-hydrolyzing enzymes in
Enterobacter spp from Brooklyn New York Antimicrob Agents Chemother v 49 n
2 p 776-8 2005
59
BRATU S et al Emergence of KPC-possessing Klebsiella pneumoniae in
Brooklyn New York epidemiology and recommendations for detection Antimicrob
Agents Chemother v 49 n 7 p 3018-20 2005
BRATU S et al Rapid spread of carbapenem-resistant Klebsiella
pneumoniae in New York City Arch Intern Med v 165 p 1430-5 2005
CAMARGO C F et al Aplicaccedilatildeo das teacutecnicas de pcr e suas teacutecnicas
derivadas em diagnoacutestico molecular Disponiacutevel em
ltfileDUnB10C2BA20semestreArtigosPCR-
20CLEYTON20FLORENCIO20DE20CAMARGO20E20PAULO20ROB
ERTO20QUEIROZpdfgtgt Acesso em 08 de abril de 2014
CARVALHES C G et al Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting
carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive
results Journal of Antimicrobial Chemotherapy v 65 n2 p 249-251 2010
CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION- CDC Modified
Hodge Test for Carbapenemase Detection in Enterobacteriaceae 2004
CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE Methods for
dilutionantimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically Approved
standard M7ndashA7 7th ed CLSI Wayne PA 2011
COELLO R et al Risk factors for developing clinical infection with methicillin-
resistant Staphylococcus aureus (MRSA) amongst hospital patients initially only
colonized with MRSA J Hosp Infect 19973739-46
COLPAN A et al Evaluation of risk factors for mortality in intensive care
units A prospective study from a referral hospital in Turkey Am J Infect Control
200533(1)42-7
60
CORNAGLIA G et al Living with ESBLs Introduction Clinical Microbiology
and Infection 14 Suppl 1 1-2 2008
COTRIM E R et al Klebsiella pneumoniae carbapenemase ndash KPC em
Enterobacteriaceae o desafio das bacteacuterias multirresistentes Poacutes em revista do
centro universitaacuterio Newton Paiva 12012 - ediccedilatildeo 5 - issn 2176 7785
DESHPANDE L M et al Occurrence and characterization of
carbapenemase-producing Enterobacteacuteriaceae report from the SENTRY
Antimicrobial Surveillance Program (2000-2004) Microb Drug Resist 12(4)223-30
2006
DIAS D J A Estudos dos principais mecanismos de resistecircncia aos
antibioacuteticos β-lactacircmicos em bacteacuterias patogecircnicas gram negativas 2009 100 f
Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Geneacutetica Molecular e Biomedicina) ndash Faculdade de
Ciecircncias e Tecnologia Universidade de Nova Lisboa Lisboa
DIENSTMANN R et al Avaliaccedilatildeo fenotiacutepica da enzima Klebsiella
pneumoniae carbapenemase (KPC) em Enterobacteriaceae de ambiente hospitalar
J Bras Patol Med Lab v 46 n 1 p 23-27 fevereiro 2010
ENDIMIAMI A et al Emergence of blaKPC-containing Klebsiella
pneumoniae in a long-term acute care hospital a new challenge to our healthcare J
Antimicrob Chemother 64 1102-1110 Nov 2009
FALAGAS M E et al Extended-spectrum beta-lactamase producing
organisms The Journal of Hospital Infection 73 (4) pp 345-54 2009
FONTANA C et al Emergence of KPC-producing Klebsiella pneumoniae in
Italy BMC Rev Notes 3 40 2010
61
GALES A C et al Antimicrobial resistance among Gram-negative bacilli
isolated from Latin America results from Sentry Antimicrobial Surveillance Program
(Latin America 2008-2010) Diagnostic Microbiology and Infectious Disease v 3 n
4 p 354 -360 2012
GUPTA N et al Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Epidemiology
and Prevention HEALTHCARE EPIDEMIOLOGY Clinical Infectious Diseases
201153(1)60ndash67 Published by Oxford University Press on behalf of the Infectious
Diseases Society of America 2011
HARBOTTLE H et al Genetics of antimicrobial resistance Anim Biotechnol
n17 p111-124 2006
HENRIQUE W N et al RESISTEcircNCIA BACTERIANA Uniatildeo das
Faculdades Alfredo NasserInstituto de Ciecircncias da Sauacutede Disponiacutevel em lt
httpwwwfaculdadealfredonasseredubrfilespesquisaposter20HENRIQUE20
Wilker20Natividade20SANTIAGO20Silvania20CAVALCANTI20DSP
20ResistC3AAncia20Bacterianapdfgt Acesso em 17 marccedilo 2014
HULSCHER M E J I et al Antibiotic prescribing in hospital a social and
behavioral scientific approach The Lancet Infectious Diaseases v 10 n 3 p 167-
165 2010
KIDWAI M SAPRA P BHUSHAN KR Synthetic strategies and medicinal
properties of beta-lactams Curr Med Chem 1999 695-215
KUMARASAMY K K et al Emergence of a new antibiotic resistance
mechanism in India Pakistan and the UK a molecular biological and
epidemiological stuy The Lancet Infectious Diseases v10 n 9 p 597- 602 2010
LINCOPAN N et al Enterobacteacuteria producing extended-spectrum β-
lacatamases and IMP-1 Metalo-β-lactamases isolated from Brazilian hospitals J Med
62
Microbiol 7 1-3 2006
LINCOPAN N et al First Isolation of Metalo-β-Lacatamase-Producing
Multiresistant Klebsiella pneumoniae from a patient in Brazil J Clin Microbiol 43(1)
516-519 2005
LIVERMORE D M et al What remains against carbapenem- resistant
Enterobacteriaceae Evaluation of choramphenicol ciprofloxacin colistina
fosfomycin minocycline nitrofurantoin temocilin and tigecycline International
Journal of Antimicrobial Agents v 37 n 5 p 415- 459 2011
LIVERMORE D M Fourten years in resistance International Journal of
Antimicrobial Agents v 39 283- 294 2012
LIVERMORE D M Bacterial resistance to carbapenems Adv Exp Med Biol
1995 39025-47
LIVERMORE D M Bacterial resistance origins epidemiology and impact
Clin Infect Dis 36S11-S23 2003
LIVERMORE D M et al Carbapenemases a problem in waiting Curr
Opin Microbiol 2000 3489-95
LU et al Universal pcr for common bacterial pathogens J CLIN
MICROBIOL VOL 38 2000
LU et al Use of PCR with Universal Primers and Restriction Endonuclease
Digestions for Detection and Identification of Common Bacterial Pathogens in
Cerebrospinal Fluid Journal of Clinical Microbiology June 2000 p 2076ndash2080
MARSCHALL J Met al Presence of the KPC Carbapenemase Gene in
Enterobacteriaceae Causing Bacteremia and Its Correlation with In Vitro
Carbapenem Susceptibility J Clin Microbiol 47 239-241 Jan 2009
63
MARTINS WMBS et al Prevalecircncia do gene blaKPC em isolados cliacutenicos
de Enterobacteriaceae e natildeo fermentadores encontrados em amostras clinicas em
um hospital universitaacuterio do Recife X Jornada de ensino pesquisa e extensatildeo ndash
JEPEX 2010 ndash UFRPE Recife 18 a 22 de outubro
MENDES C A C et al Polimixinas Revisatildeo com ecircnfase na sua
nefrotoxicidade Rev Assoc Med Bras 2009 55(6) 752-9
MOHR J F 3rd Update on the efficacy and tolerability of meropenem in the
treatment of serious bacteacuterial infections Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S41-51
2008
MONTEIRO J et al First report of KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae
strains in Brazil Antimicrob Agents Chemother Jan53(1)333-4 2009
MOREIRA V C et al Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia a antibioacuteticos
Disponiacutevel em
lthttpwwwcpglsucgbr6mostraartigosSAUDEVANESSA20CARVALHO20M
OREIRApdfgt Acesso em 21 marccedilo 2014
NETIKUL T et al Emergence of novel blaKPC-12 and blaKPC-13 variants in
carbapenem non-susceptible Enterobacter cloacae a first report of blaKPC gene in
Thailand European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases May
S372 2011
NETO V A et al Antibioacuteticos na praacutetica Meacutedica 6ordf Ediccedilatildeo Editorial
SarverSP Brasil 2007
NICOLAU D P Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of
meropenem Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S32-40 2008
64
OLIVEIRA A C et al Resistecircncia bacteriana e mortalidade em um centro de
terapia intensiva Rev Latino-Am Enfermagem nov-dez 2010
PAAUW A et al Failure to control an outbreak of qnrA 1-positive multidrug-
resistant Enterobacter clocae despite adequate implementation of recommended
infection control measures Journal of Clinical Microbiology v 45 n 5 p 1420-1425
2007
PATERSON D L et al Extended-Spectrum Beta-Lactamases a Clinical
Update Clinical Microbiology Reviews v 18 p 657-686 2005
PEIRANO G et al Carbapenem-hydrolysing beta-lactamase KPC-2 in
Klebsiella pneumonia isolated in Rio de Janeiro Brazil J Antimicrob Chemother Nov
20 2009
PERES-BOTA D et al Are infections due to resistant pathogens associated
with worse outcome in critically ill patients J Infect 200347(4)307-16
PIDDOCK L J V Clinically relevant chromosomally encoded multidrug
resistance effl ux pumps in bacterial Clin Microbiol Rev n19 p382-402 2006
PITOUT J D D et al Emergence of Enterobacteriaceae producing
extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) in the community J Antimicrob
Chemother May 56 2005
POSSEBON M I et al Resistecircncia bacteriana aos carbapenecircmicos
Bacterial resitence to carbapenems RBM rev bras med60(6)378380-378-382
jun 2003
QUEENAN A M et al Carbapenemases the versatile beta-lactamases
Clin Microbiol Rev Jul20(3)440-58 2007
65
RHOMBERG P R et al Summary trends for the meropenem yearly
susceptibility test information collection program a 10- year experience in the United
States (1999-2008) Diagnostic Microbiology and Infectiois Disease v 65 n4 p
414-426 2009
ROBLEDO I E et al Detection of KPC in Acinetobacter spp in Puerto Rico
J Antimicrob Agents Chemother 54 1354-1357 Mar 2010
ROGERS B A et al Country-to-country transfer os patients and the risk of
multi-resistant bacterial infection Clinical Infectious Disease v53 n1 p49- 56
2011
SHAH A A et al Characteristics epidemiology and clinicalimportance of
emerging strains of Gram-negative bacilli producing extended-spectrum
betalactamases Research in Microbiology v 155 p 409-421 2004
TURNER P J Extended- Spectrum Beta-Lactamases Clinical Infectious
Diseases v 41 p 273-275 2005
WOLTER D J et al Phenotypic and Enzymatic Comparative Analysis
between the Novel KPC variant KPC-5 and Its Evolutionary Variants KPC-2 and
KPC-4 Antimicrob Agents Chemother Nov 17 2008
WOODFORD N et al Carbapenemases of Chryseobacterium
(Flavobacterium) meningosepticum distribution of blaB and characterization of a
novel Metalo-beta-lactamase gene blaB3 in the type strain NCTC 10016
Antimicrob Agents Chemother Jun44(6)1448-52 2000
WOODFORF N Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in
India Pakistan and the UK a molecular biological and epidemiological study The
Lancet Infectious Diseases v 10 n 9 p 597-602 2010
66
WOODFORD et al Outbreak of Klebsiella pneumoniae Producing a New
Carbapenem- Hydrolyzing Class A β-Lactamase KPC-3 in a New York Medical
Center Antimicrobial agents and chemotherapy Dec 2004 p 4793ndash4799 Vol 48
No 12
YAGI T et al A preliminary survey of extended-spectrum β-lactamases
(ESBLs) in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Japan
FEMS Microbiology Letters 184 (2000) 53-56
YIGIT H et al Novel carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase KPC-1 from
a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumonia J Antimicrob Agents
Chemother 45 (4) 1151-1161 (2001)
ZAVASCKI A P et al KPC-2- producing Enterobacter cloacae in two cities
from Southern Brazil Int J Antimicrob Agents Apr 28 2009
ZHANEL G G et al Comparative review of the carbapenecircmicos Drugs
67(7)1027-52 2007
67
ANEXOS
Sequumlecircncia do oligo blaKPC
Query 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
Query 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
Query 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
68
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
Query 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
Query 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
69
Query 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
Query 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
Query 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
70
Sbjct 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
Query 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
Query 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
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Sbjct 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
Query 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
71
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|||||||
Sbjct 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
Query 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
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|||||||
Sbjct 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
Query 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
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|||||||
Sbjct 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
72
Query 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
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Sbjct 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
Query 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
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|||||||
Sbjct 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
Query 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
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73
Sbjct 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
Query 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
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Sbjct 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
Query 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
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Sbjct 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
Query 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
74
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Sbjct 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
Query 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
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Sbjct 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
Query 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
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Sbjct 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
75
Query 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
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Sbjct 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
Query 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
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Sbjct 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
LOCUS AF297554 1377 bp
DNA linear BCT 26-MAR-2001
DEFINITION Klebsiella pneumoniae carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
gene complete cds
ACCESSION AF297554
VERSION AF2975541 GI10121874
76
KEYWORDS
SOURCE Klebsiella pneumoniae
ORGANISM Klebsiella pneumoniae
Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Enterobacteriaceae Klebsiella
REFERENCE 1 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH QueenanAM
AndersonGJ Domenech-SanchezA
BiddleJW StewardCD
AlbertiS BushK and TenoverFC
TITLE Novel carbapenem-hydrolyzing beta-
lactamase KPC-1 from a
carbapenem-resistant strain of
Klebsiella pneumoniae
JOURNAL Antimicrob Agents Chemother 45 (4)
1151-1161 (2001)
PUBMED 11257029
REFERENCE 2 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH AndersonGJ and
TenoverFC
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (19-AUG-2000) Nosocomial
Pathogens Laboratory Branch
Centers for Disease Control and
Prevention 1600 Clifton Rd MS
G08 Atlanta GA 30333 USA
FEATURES LocationQualifiers
77
source 11377
organism=Klebsiella
pneumoniae
mol_type=genomic DNA
db_xref=taxon573
-35_signal 5560
-10_signal 7883
mRNA 921012
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
RBS 117122
CDS 1311012
note=blaKPC-1
codon_start=1
transl_table=11
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
protein_id=AAG134101
db_xref=GI10121875
translation=MSLYRRLVLLSCLSWPLAGFSATALTNLVAEPFAKLEQD
FGGSI
GVYAMDTGSGATVSYRAEERFPLCSSFKGFLAAAVLARSQQQAGLLDTPIRYG
KNALV
PWSPISEKYLTTGMTVAELSAAAVQYSDNAAANLLLKELGGPAGLTAFMRSIG
DTTFR
78
LDRWELELNSAIPSDARDTSSPRAVTESLQKLTLGSALAAPQRQQFVDWLKGN
TTGNH
RIRAAVPADWAVGDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTRAPNKDDK
HSEAV
IAAAARLALEGLGVNGQ
ORIGIN
1 cggggcagtt acagccgtta cagcctctgg
agagggagcg gcttgccgct cggtgataat
61 cccagctgta gcggcctgat tacatccggc
cgctacacct agctccacct tcaaacaagg
121 aatatcgttg atgtcactgt atcgccgtct
agttctgctg tcttgtctct catggccgct
181 ggctggcttt tctgccaccg cgctgaccaa
cctcgtcgcg gaaccattcg ctaaactcga
241 acaggacttt ggcggctcca tcggtgtgta
cgcgatggat accggctcag gcgcaactgt
301 aagttaccgc gctgaggagc gcttcccact
gtgcagctca ttcaagggct ttcttgctgc
361 cgctgtgctg gctcgcagcc agcagcaggc
cggcttgctg gacacaccca tccgttacgg
421 caaaaatgcg ctggttccgt ggtcacccat
ctcggaaaaa tatctgacaa caggcatgac
481 ggtggcggag ctgtccgcgg ccgccgtgca
atacagtgat aacgccgccg ccaatttgtt
541 gctgaaggag ttgggcggcc cggccgggct
gacggccttc atgcgctcta tcggcgatac
79
601 cacgttccgt ctggaccgct gggagctgga
gctgaactcc gccatcccaa gcgatgcgcg
661 cgatacctca tcgccgcgcg ccgtgacgga
aagcttacaa aaactgacac tgggctctgc
721 actggctgcg ccgcagcggc agcagtttgt
tgattggcta aagggaaaca cgaccggcaa
781 ccaccgcatc cgcgcggcgg tgccggcaga
ctgggcagtc ggagacaaaa ccggaacctg
841 cggagtgtat ggcacggcaa atgactatgc
cgtcgtctgg cccactgggc gcgcacctat
901 tgtgttggcc gtctacaccc gggcgcctaa
caaggatgac aagcacagcg aggccgtcat
961 cgccgctgcg gctagactcg cgctcgaggg
attgggcgtc aacgggcagt aaggctctga
1021 aaatcatcta ttggcccacc accgccgccc
ttgcgggcgg catggattac caaccactgt
1081 cacatttagg ctaggagtct gcgcggcaga
gccgtgtgac cggttttctg tagagcactg
1141 acgatggcgg cggcgctctc tgcaattggc
aaggcgtcgg cgccaaggat accaatcttg
1201 cggcgcgcgg cgtgttatga cgactggggt
gcatttgagc cgccccattt aaccttcgcc
1261 ctcacagata cgccattcgc ctcaaattta
gcgccatgca gacgagcttc cactcggctt
1321 gcaccttgtc caggcccctc atgctgaact
gacgcaatcc catcaccgcc ttgatca
80
35
4 4Teste de Hodge Modificado (THM) (adaptado CDC 2004)
Preparou-se uma suspensatildeo em salina esteacuteril com a cepa Escherichia coli
ATCC 25922 (padratildeo 05 de McFarland) Apoacutes isto diluiu a suspensatildeo 110 em
salina (05 ml da soluccedilatildeo de Ecoli ATCC 25922 + 45 ml salina)Foi entatildeo semeado
na superfiacutecie de uma placa de Agar Muller-Hinton com a suspensatildeo diluiacuteda de Ecoli
ATCC 25922 com auxilio de swab seco assegurando que houvesse uma
distribuiccedilatildeo uniforme cobrindo toda a superfiacutecie do Agar Deixou secar por 3 a 5
minutos em temperatura ambienteColocou-se o disco de ertapenem 10microg no centro
da placa e apoacutes isto fez-se uma estria linear da cepa a ser testada da borda do
disco ateacute a borda da placa utilizando uma alccedila calibrada 10 microl ou um swab Incubou
a placa na estufa em atmosfera aeroacutebia a 35 plusmn 2ordmC por 16 a 24 horas
441 Controle de qualidade (CQ)
Foi utilizado um CQ todos os dias em que se realizou o teste tendo como
controle Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1705- teste de Hodge modificado
positivo Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1706- teste de Hodge modificado
negativo
442 InterpretaccedilatildeoResultados
Apoacutes 16ndash24 horas de incubaccedilatildeo examinar as placas para verificar a presenccedila
de uma distorccedilatildeo no halo de inibiccedilatildeo do disco de ertapenem devido ao crescimento
realccedilado da cepa ATCC na intersecccedilatildeo do organismo teste e a Ecoli ATCC 25922
dentro dos limites do halo O THM positivo apresentaraacute presenccedila de distorccedilatildeo no
halo de inibiccedilatildeo de ertapenem devido ao crescimento da cepa Ecoli ATCC 25922 ao
longo da estria da cepa teste para dentro dos limites do halo de inibiccedilatildeo Jaacute o THM
negativo teraacute ausecircncia de crescimento da cepa Ecoli ATCC 5922 ao longo da estria
da cepa teste para dentro dos limites do halo de inibiccedilatildeo do disco de ertapenem
Este resultado estaacute representado na figura 6
36
Figura 6 Interpretaccedilatildeo resultado do Teste de Hodge Modificado
(adaptado CDC 2004) Teste positivo na estria da cepa teste na parte superior
da placa teste negativo na estria da cepa teste na parte inferior da placa
Tendo positivo como resultado o paciente era um provaacutevel contaminado por
KPC As amostras entatildeo foram encaminhadas para a Fundaccedilatildeo Osvaldo Cruz
(FIOCRUZ) para confirmaccedilatildeo final As amostras finalmente confirmadas como
positivas para KPC foram isoladas e guardadas no banco de cepas cliacutenicas do
hospital Apoacutes a autorizaccedilatildeo do CEP amostras das cepas foram transferidas para
meio de transporte Stuard em caixa teacutermica fechada em baixa temperatura e
levadas para o laboratoacuterio de microbiologia cliacutenica da universidade
No laboratoacuterio da universidade as amostras foram separadas e realizadas
repiques em meios MacConkey e incubadas por 24h As colocircnias caracteriacutesticas
foratildeo isoladas em caldo BHI e mantidas em shaker a 37oC por 2h Apoacutes isto foram
executadas as anaacutelises a seguir
Os isolados de Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases foram
submetidos agrave extraccedilatildeo de DNA e posterior sequumlenciamento para identificaccedilatildeo dos
genes de resistecircncia blaKPC de 1 a 13 e identificaccedilatildeo do gene universal Os
pacientes de onde os materiais bioloacutegicos contendo as Enterobacteacuterias produtoras
de carbapenemases foram os isolados foram investigados quanto aos aspectos
epidemioloacutegicos e cliacutenicos
37
4 5 Extraccedilatildeo de DNA bacteriano
A extraccedilatildeo de DNA bacteriano foi realizada utilizando o kit NucleoSpin
Plasmidreg (MN) Antes de iniciar a extraccedilatildeo foi feito a preparaccedilatildeo das soluccedilotildees
reagentes materiais e amostras (vortexando) colocou-se em banho-maria agrave 50ordmC o
tampatildeo AW Partiu-se de colocircnias isoladas cultivadas que sofreram passagem em
meio LB liacutequido por 12h Adicionou-se 15 mL da amostra no tubo eppendorf
centrifugou por 5 minutos descartou o sobrenadante (com cuidado para natildeo
descartar o Pellet) Repetiu-se este procedimento por mais trecircs vezes completando-
se o volume de 6mL Foram adicionados 250microL do tampatildeo Resuspension Buffer A1
encostando a ponteira no Pellet e misturando (este tampatildeo tem como funccedilatildeo
separar a formaccedilatildeo de grumos celulares) Apoacutes isso homogeneizou e vortexou os
tubos eppendorfs Apoacutes isso foram adicionados 250microL do tampatildeo Lysis Buffer A2
homogenizou e deixou descansar por 5 minutos (esta etapa eacute importante para a lise
da parede e da membrana celulares e liberaccedilatildeo do conteuacutedo da ceacutelula)
Passado o tempo de descanso foi adicionado 300microL do tampatildeo
Neutralization Buffer A3 homogeneizou e centrifugou por 10 minutos (este tampatildeo
iraacute retirar as proteiacutenas que envolvem o DNA e voltaraacute com o pH para proacuteximo de 8
impedindo que a soluccedilatildeo de lise facilite a quebra das ligaccedilotildees covalentes do aacutecido
nucleacuteico) Em seguida enumeraram-se os tubos contendo filtros com siacutelica
transferiu-se o sobrenadante para o filtro e centrifugou por 5 minutos Descartou-se
o que foi filtrado adicionou 500microL do tampatildeo AW (banho-maria) centrifugou por 2
minutos Novamente foi descartado o filtrado Adicionou-se 600microL do tampatildeo A4
centrifugou por 2 minutos e descartou o filtrado (os tampotildees AW e A4 contecircm
isotiocianato de guanidina em concentraccedilotildees crescentes para facilitar a adsorccedilatildeo
do DNA na siacutelica e retirada das outras biomoleacuteculas da amostra) Foi feita outra
centrifugaccedilatildeo com o tubo vazio Apoacutes isto o filtro foi trocado para outro eppendorf
definitivo onde foi adicionado 50microL do tampatildeo Elution Buffer AE (este tampatildeo
favorece a eluiccedilatildeo do DNA) centrifugou por 2 minutos descartou o filtro e
armazenou as amostras em freezer -20ordmC
38
4 6 Iniciadores e reaccedilatildeo de PCR
Os iniciadores universais para o gene blaKPC foram desenhados baseados
em sequumlecircncias conservadas apresentadas pelos sub-grupos de genes que
codificam a enzima carbapenemase de klebsiella pneumoniae (YIGIT et al 2001)
Baseado na sequumlecircncia para o blakpc-1 depositada no GenBank
(AF2975541) o oligonucleotiacutedio (oligo) iniciador direto (5-
ATGTCACTGTATCGCCGTC-3rsquo) foi desenhado para reconhecer a sequumlecircncia
blaKPC na posiccedilatildeo (131149) enquanto que o iniciador reverso (5-
TTACTGCCCGTTGACGCC-3rsquo) foi reconhecido na posiccedilatildeo (9951012) As anaacutelises
baseadas em alinhamento de sequumlecircncias mostraram que o par de iniciadores
blaKPC podem detectar os alelos de 1 a 13 do gene blaKPC conforme a tabela 2
Tabela 2 Nuacutemero de acesso ao GenBank dos alelos blaKPC e seus
microrganismos originais
Nuacutemero de
Acesso GenBank
Microrganismo Alvo
AF2975541 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-1
GU0862251 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-2
HQ2589341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-2-like
AB5577341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC -3
EU4473041 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-4
EU4002222 Pseudomonas
aeruginosa
blaKPC-5
EU5555341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-6
EU7297271 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-7
39
FJ2344121 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-8
FJ624872 Escherichia coli blaKPC-9
GQ1403481 Acinetobacter
baumannii
blaKPC-10
HM0669951 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-11
HQ3428891 Enterobacter cloacae blaKPC-12
HQ3428901 Enterobacter cloacae blaKPC-13
As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo de blaKPC foram realizadas em um
primeiro tempo de desnaturaccedilatildeo em que foi 94ordmC por 5 minutos seguido de 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 58 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 90 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 78ordmC por 8 minutos Aleacutem das amostras foi utilizado um
controle negativo
A PCR do blaKPC foi realizada utilizando os componentes para o volume da
reaccedilatildeo de 25 microL citados na tabela 3 A banda do tamanho do produto de PCR foi de
881 pares de bases (pb) o que corresponde ao plasmiacutedeo
Tabela 3 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do
gene blaKPC
Reagente Volume
DNA molde 4 microL
Tampatildeo Taq 25 microL
MgCl2 075 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP
2 microL
Oligo F 1 microL
Oligo R 1 microL
Taq DNA polimerase 05 microL
Aacutegua MiliQ 1335 microL
40
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
Baseado na sequumlecircncia para o gene 16S rRNA em que o oligonucleotiacutedio
Universal iniciador direto foward (5-CCAGCAGCCGCCGTAATACG-3rsquo) foi
desenhado para reconhecer a sequumlecircncia universal na posiccedilatildeo 1513 enquanto que o
iniciador reverso (5-ATCGGYTACCTTGTTACGACTTC-3rsquo) foi reconhecido na
posiccedilatildeo 1491 foram realizadas PCRrsquos As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo deste
gene foram realizadas nos seguinte tempos separaccedilatildeo 94ordmC por 10 minutos 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 55 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 120 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 72ordmC por 10 minutos
A PCR do gene 16S rRNA foi realizada utilizando os componentes para o
volume da reaccedilatildeo de 25microL citados na tabela 4 A banda do tamanho do produto de
PCR foi de 996 pb correspondente aacute regiatildeo ribossomal capaz de amplificar todas
as espeacutecies
Tabela 4Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do gene
universal
Reagente (quantidade
concentraccedilatildeo do estoque)
Volume
DNA molde 10 ng 4 microL
Tampatildeo Taq 10 x 25 microL
MgCl2 50mM 125 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP 25 mM
125 microL
Oligo F 10microM 05 microL
Oligo R 10microM 05 microL
Taq DNA polimerase 5UmicroL 04 microL
Aacutegua Miliq 146 microL
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
41
O termociclador utilizado para os experimentos foi o LifeTouch da BIOER
4 7 Digestatildeo
Para realizaccedilatildeo da digestatildeo foi utilizada a enzima BshF I (Hae III) EN- 1105
tamanho 7000 units concentraccedilatildeo 10 unitsmicroL fonte Bacillus sphaericus empresa
Jena bioscienceUtilizaram-se os componentes para o volume de 50microL da reaccedilatildeo
citados na tabela 5
Tabela 5 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da digestatildeo do gene
universal
Reagente Volume
Produto de PCR 10 microL
Enzima BshF I 01 microL
Tampatildeo (10x) 5 microL
Aacutegua Miliq 349 microL
Total (em cada ependorff) 50 microL
Valores para 1 digestatildeo
Os ependorffs foram colocados por 30 minutos em banho-maria a 37ordmC Apoacutes
isso fez-se a corrida das amostras em gel de agarose para verificaccedilatildeo do resultado
(LU et al 2000)
4 8 Eletroforese em gel de agarose
Os produtos de DNA PCR e digestatildeo foram analisados em gel de agarose
2 O tempo de corrida do gel eacute de aproximadamente 1hora e 30minutos sendo
que no comeccedilo foi usada agrave voltagem de 50 V e apoacutes comeccedilar a correr o gel
aumentou a voltagem para 100 v Utilizou-se o marcador de 100pb (pares de bases)
Foi adicionado 3microL de corante Bromophenol (que tem a funccedilatildeo de fazer uma ligaccedilatildeo
na amostra de DNA e permitir a visualizaccedilatildeo da corrida no gel de agarose) em 7microL
de amostra tanto de DNA quanto de PCR Para o preparo do gel foi utilizado TBE
42
(Tris- Aacutecido Boacuterico) agarose e brometo de etiacutedio (sua funccedilatildeo eacute de corante para o gel
e permitir a visualizaccedilatildeo do DNA quando colocado agrave luz ultravioleta) Para o oligo
blaKPC a banda da amplificaccedilatildeo foi em 881ppb correspondendo ao plasmiacutedeo Jaacute
o oligo Universal foi em 996 pb
4 9 Descarte de resiacuteduos
Todos os materiais utilizados nos ensaios foram de uso uacutenico e manipulados
em cacircmaras de seguranccedila bioloacutegica classe II Apoacutes o uso foram colocados em
soluccedilatildeo desinfetantes (hipoclorito a 1) e em seguida autoclavados a 127oC por 20
min em sacos apropriados para autoclavaccedilatildeo Apoacutes a finalizaccedilatildeo do ciclo de
esterilizaccedilatildeo os sacos contendo o material descartaacutevel foram colocados em
recipientes de coleta da empresa responsaacutevel pela coleta de materiais bioloacutegicos
produzidos no laboratoacuterio de microbiologia Todos os procedimentos seguiram a
normativa RDC-ANVISA 3062004 sobre o descarte de resiacuteduos de serviccedilo de
sauacutede
4 10 Aspectos epidemioloacutegicos e cliacutenicos
Os aspectos cliacutenicos e epidemioloacutegicos foram investigados por meio de
prontuaacuterios dos pacientes portadores de enterobacteacuterias produtoras de
carbapenemases e envolveram topografia mais provaacutevel do foco infeccioso a
enfermidade motivadora da internaccedilatildeo o desfecho cliacutenico a idade e o tempo de
internaccedilatildeo
4 12 Anaacutelises eepidemioloacutegicas
As anaacutelises foram realizadas com o pacote estatiacutestico SPSS versatildeo 200
Para verificar quais variaacuteveis referentes aos dados epidemioloacutegicos e
microbioloacutegicos influenciaram no desfecho verificou- se a diferenccedila meacutedia das
variaacuteveis idade e tempo de internaccedilatildeo em cada grupo O teste estatiacutestico utilizado foi
o teste t de Student apoacutes se executar o teste de normalidade de Shapiro-Wilk Para
as variaacuteveis sexo perfil microbioloacutegico das enterobacteacuterias produtoras de
43
carbapenemases foi avaliada a associaccedilatildeo com o desfecho por meio do teste Exato
de Fisher O niacutevel de significacircncia adotado foi de 5
4 13 Preceitos eacuteticos
Este projeto estaacute inserido em um projeto maior denominado ldquoEpidemiologia
cliacutenica e caracterizaccedilatildeo molecular do Acinetobacter Baumannii resistente a
antibioticoterapia em pacientes internado em hospitais do Sistema Uacutenico de Sauacutederdquo
que foi submetido ao Comitecirc de Eacutetica em Pesquisa da Secretaria do Estado de
Sauacutede do Distrito Federal (SESDF) e emitido parecer aprovado pelo protocolo nordm
23109 (anexo)
44
5 RESULTADOS
51 Anaacutelise molecular
Para a amplificaccedilatildeo com o oligo blaKPC foram amplificadas amostras
que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 881 pb correspondente ao
plasmiacutedeo A anaacutelise da amplificaccedilatildeo da regiatildeo do gene blaKPC mostrou que
apenas a amostra A10 natildeo amplificou isso demonstra que esta amostra natildeo
possuiacutea o gene de resistecircncia
5 1 1 Gene blaKPC
Figura 7 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 881 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
A amostra A3 natildeo amplificou no primeiro momento entatildeo foi realizado
novamente a PCR e corrida de gel obtendo entatildeo a amplificaccedilatildeo da amostra como
apresentado na figura 8
45
Figura 8 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC da
mostra A3 estudada A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo de 881
pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 1 2 Gene 16S rRNA
Para a amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA utilizou-se o oligo universal Foram
amplificadas amostras que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 996 pb
Figura 9 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
46
Segundo Lu et al (2000) a digestatildeo com a enzima HaeIII deste amplicons de
16S rRNA devolveriam bandas com perfis entre 150 a 200 pb No gel abaixo eacute
possiacutevel evidenciar que este perfil ocorreu com o predomiacutenio de bandas na altura
de 200pb
Figura 10 Gel de agarose a 2 da digestatildeo do amplicon do gene 16S
rRNA das amostras com a enzima HaeIII evidenciando diversos fragmentos
proacuteximos a 200 pb A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo ribossomal
de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 2 Anaacutelises epidemioloacutegicas
5 2 1 Sexo
No total foram detectados 17 isolados de KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 onde a maior a prevalecircncia foi
detecatada em amostras de pacientes do sexo masculino (53) do que no sexo
feminino (47)
47
Figura 11 Isolado de KPC segundo sexo dos 17 pacientes investigados
no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 2 Desfecho cliacutenico
Em 17 isolados de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo
de 2010 aacute 2011 a porcentagem de pacientes que foram a oacutebito (59) foi maior que
a de pacientes que tiverm alta (41)
Figura 12 Isolado de KPC segundo desfecho cliacutenico dos 17 pacientes
investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
48
5 2 3 Local da coleta
Dos 17 episoacutedios detectados de infecccedilatildeo por KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 a infecccedilatildeo em swab retalfoi mais
frequente (47) seguida de ponta de cateacuteter (18) e secreccedilatildeo traqueal (12)
Figura 13 Isolados de KPC segundo local da coleta da amostra nos 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 4 Microorganismo
O microorganismo mais encontrado foi a Klebsiella pneumoniae (82)
seguida da Enterobacter clocae (12) e Serratia marcescens (6) dos 17 isolados
de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 Isto afirma o
fato de a sigla KPC ser utilizada de forma errocircnea aacute Klebsiella pneumoniae visto
que a evidecircncia dela eacute maior em relaccedilatildeo as outras cepas
49
Figura 14 Isolado de KPC segundo microrganismo encontrado em 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 5 Relaccedilotildees variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana e desfecho
cliacutenico
Tabela 6 ndash Distribuiccedilatildeo do perfil geneacutetico sexo coleta tipificaccedilatildeo de
microrganismos e anaacutelise da resistecircncia bacteriana segundo o desfecho
cliacutenico Brasiacutelia-DF 2010 a 2011
Variaacutevel Resultado
Desfecho
Alta Oacutebito
N N P
Gene 16S rRNA Positivo 7 1000 10 1000
NA Gene blaKPC Positivo 6 857 10 1000
Negativo 1 143 0 00 0218 Sexo Feminino 2 286 6 600
Masculino 5 714 4 400 0201 Local da coleta Fundo saco de
Douglas 1 143 0 00
Hemocultura 0 00 1 100 0463 Ponta de cateter 1 143 2 200
Sec TraquealBrocircnquica
0 00 1 100
50
Secreccedilatildeo traqueal 2 286 0 00
Swab retal 3 429 5 500
Urina 0 00 1 100
Microrganismo Enterobacter cloacae (KPC)
1 143 1 100
Klebsiella pneumoniae
6 857 8 800
0416 Serratia
marcescens 0 00 1 100
Teste de Hodge Hodge positivo 7 1000 10 1000
NA Amicacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 1 100 0848 resistente 0 00 1 100
sensiacutevel 2 286 3 300
Amoxicilina Aacutecido Clavulacircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Ampicilina Sulbactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ampicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Aztreonan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefazolina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Cefoperazona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Cefotaxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefoxitina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0509 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 2 286 4 400
Ceftazidima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cetriaxona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 3 429 5 500 0772 Cefalotina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ciprofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772
51
resistente 3 429 5 500
Claritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Clindamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Eritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Gentamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0942 resistente 2 286 3 300
sensiacutevel 1 143 2 200
Imipenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 0 00 2 200 0193 Resistente 1 143 3 300
sensiacutevel 2 286 0 00
Nitrofurantoiacutena sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Norfloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Oxacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Penicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Piperacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Rifampicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tetraciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Ticarcilina Aacutecido Clavulocircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0688 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 3 429 4 400
Tobramicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Trimetoprima Sulfametoxazol
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0112 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 2 286 0 00
Vancomicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tigeciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediario 0 00 1 100 0211 natildeo testado 1 143 4 400
resistente 2 286 0 00
52
Cefepime sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefuroxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Levofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Piperacilina Tazobactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Ertapenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Meropenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0223 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 1 143 0 00
Cefotetan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 sensiacutevel 0 00 1 100
Gemifloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 7 700 0585 natildeo testado 3 429 3 300
Desfecho
Alta Oacutebito
Meacutedia Erro
padratildeo Meacutedia Erro
padratildeo p
Idade 58 9 59 5 0991
Tempo Internaccedilatildeo (dias)
50 13 46 12 0571
n= 17 p(lt 005) NA natildeo se aplica
53
6 DISCUSSAtildeO
Nos uacuteltimos anos houve um aumento na incidecircncia de bacteacuterias
multirresistentes aos antimicrobianos no ambiente hospitalar tornando isto um
problema mundial de sauacutede puacuteblica (HULSCHER et al 2010) Quando se trata
principalmente de bacilos Gram negativos a frequumlecircncia destas bacteacuterias eacute ainda
maior em paiacuteses da Ameacuterica Latina quando comparada a paiacuteses desenvolvidos
(GALES etal 2012)
De acordo com dados do ldquoMeropenem Yearly Susceptibility Test Information
Collectionrdquo (MYSTIC) ocorreu nos Estados Unidos um aumento na susceptibilidade
de K pneumoniae nos uacuteltimos anos graccedilas a praacuteticas de controle de disseminaccedilatildeo
de amostras resistentes(RHOMBERG P R et al 2009) O aumento crescente da
prevalecircncia destes microrganismos foi proporcional ao aumento da dependecircncia do
uso de antibioacuteticos carbapenecircmicos considerados como a opccedilatildeo terapecircutica para o
tratamento de infecccedilotildees por bacilos Gram negativos multi-resistentes (LIVERMORE
2012) Isto afeta diretamente as opccedilotildees de tratamento sobrando poucas alternativas
para a terapecircutica que incluem colistina (polimixina E) e tigeciclina que apresentam
respectivamente problemas em termos de toxicidade e eficaacutecia (LIVERMORE et
al 2011) Um dos efeitos adversos mais importantes das poliminas B e E por
exemplo satildeo a neurotoxicidade e nefrotoxicidade (MENDES C A C et al2009 )
Devido agrave resistecircncia ser usualmente de natureza plasmidial e portanto de
maior disseminaccedilatildeo especialmente quando carreadas por K pneumoniae
microrganismo com uma notoacuteria capacidade para acumular e transferir plasmiacutedeos
com determinantes para resistecircncia o nuacutemero de casos detectados pelo
fenoacutetipogenoacutetipo blaKPC eacute bastante preocupante (MONTEIRO et al 2009)
Comparada com outras bacteacuterias hospitalares a transmissatildeo de clones
multirresistentes de K pneumoniae eacute maior e podem natildeo ser controladas pelos
meacutetodos de controle de infecccedilatildeo hospitalar (PAAUW et al 2007) A forma
plasmidial para transferecircncia da resistecircncia adicionada a este grande potencial para
disseminaccedilatildeo de clones resistentes eacute preocupante visto que apoacutes surtos muitas
vezes pode se tornar endecircmica Jaacute eacute uma realidade a disseminaccedilatildeo desta bacteacuteria
54
entre pacientes hospitais paiacuteses e ateacute mesmo continentes (WOODFORF et al
2010 ROGERS et al 2011)
As chances de surtos satildeo maiores em paiacuteses com poucos recursos devido agrave
maior carecircncia de praacuteticas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees hospitalares e o
uso irracional de antimicrobianos de forma empiacuterica e inadequada (KUMARASAMY
et al 2010) Ateacute o momento os mecanismos de resistecircncia aos cabapenecircmicos
geralmente encontrado eram a produccedilatildeo de ESBL (CTX-M) somada aacute perda de
porina (CARVALHAES et al 2010) Foi notado a partir do ano de 2008 um
aumento no nuacutemero de K pneumoniae produtoras de KPC-2 apresentando outra
forma de resistecircncia (GALES 2012)
Um estudo mostrou que o perfil do paciente colonizado ou infectado por KPC
foi de um paciente entre os 33 e os 82 anos de idade internado haacute mais de 1
semana no hospital A mortalidade geral nos uacuteltimos anos ficou em torno de 7
sendo que dos 77 pacientes estudados 32 (415) pacientes evoluiacuteram para oacutebito
evidenciando a alta morbi-mortalidade associada (ALVES A P et al 2013)
Em estudo com 2316 pacientes avaliados a populaccedilatildeo de sexo masculino foi
de 526 idade meacutedia global de 53 anos (mediana de 55 anos) permanecircncia meacutedia
de 58 dias (mediana de 3 dias) (OLIVEIRA A C et al 2010) Outros trabalhos
apresentaram ausecircncia de significacircncia entre sexoidade e o desenvolvimento de
infecccedilotildees por microrganismos resistentes (PERES-BOTA D et al 2003 COLPAN
A et al 2005 COELLO R et al 1997)
Outro estudo utilizou um total de 30 amostras sendo elas isoladas de urina
escarro secreccedilatildeo pleural ponta de cateter aspirado traqueal e hemocultura A mais
prevalente foi em urina (40) Entre as 30 cepas analisadas a maior porcentagem
foi da cepa Klebsiella pneumoniae (70) Enterobacter sp (133) Klebsiella
ozaenae (10) Escherichia coli (333) e Klebsiella oxytoca (333)
(DIENSTMANN R et al 2010) Nos Estados Unidos a enzima KPC jaacute se tornou
endecircmica Foi realizada uma pesquisa em dois hospitais de Nova York onde
testaram 602 amostras e 45 apresentaram algum mecanismo de resistecircncia
sendo apenas 33 confirmadas por biologia molecular como KPC-2 (BRATU et
al 2005)
55
Estudo sobre os tipos de ESBL feito no Japatildeo apresentou o tipo Toho-1 como
o mais prevalente nessa pesquisa Ateacute o ano de 2000 ano em que foi publicado tal
estudo este era o primeiro relatoacuterio no Japatildeo para identificar derivados de ESBLs
como tipo de SHV e TEM entre E coli e K pneumoniae Em especial o tipo SHV- 12
foi identificado com uma maior frequumlecircncia Estes resultados indicam que tipos
distintos de ESBLs que satildeo diferentes em sua especificidade de substrato e origem
geneacutetica coexistem no Japatildeo Isto mostra a importacircncia de caracterizar genoacutetipos
distintos de ESBLs e de estar em alerta continuamente para as tendecircncias de
ESBLs no Japatildeo aleacutem da necessidade de uma interpretaccedilatildeo uniforme utilizando as
diretrizes do CSLI para relatar cepas produtoras de ESBL Aleacutem da detecccedilatildeo de
ESBLs satildeo necessaacuterias mais informaccedilotildees tais como o perfil de sensibilidade
especiacutefica para diversas β-lactacircmicos e o local da infecccedilatildeo Esses fatores satildeo
essenciais para a escolha adequada de antibioacuteticos (YAGI T et al 2000)
No ano de 2004 uma pesquisa avaliou a produccedilatildeo de uma enzima de
hidroacutelise de carbapenecircmicos atraveacutes da teacutecnica de sequumlenciamento foi revelado
um novo membro da famiacutelia KPC designado KPC- 3 Pesquisadores encontraram
em um mutante de K pneumoniae uma substituiccedilatildeo de um gene associado com
resistecircncia a Imipenem mas essa substituiccedilatildeo foi considerada improvaacutevel na
contribuiccedilatildeo da resistecircncia aos carbapenecircmicos da espeacutecie estudada Aleacutem da
resistecircncia aos carbapenecircmicos estes isolados eram em sua maioria resistentes agraves
cefalosporinas penicilinas e aminoglicosiacutedeos Usando estudos de transformaccedilatildeo
conjugaccedilatildeo e hibridaccedilatildeo localizaram o alelo blaKPC em plasmiacutedeo aleacutem disso
mostraram que esse alelo tambeacutem carregava uma resistecircncia aos aminoglicosiacutedeos
A transferecircncia das enzimas KPCs foi demonstrada in vitro tanto neste como em
outros estudos pode ser que os plasmiacutedeos que fazem esta transferecircncia estavam
comeccedilando a se espalhar no ambiente cliacutenico resultando na multiresistecircncia dessas
estirpes (WOODFORD et al 2004)
O presente estudo apresentou um vieacutes quanto aos resultados dos testes de
susceptibilidade microbiana Observou-se que natildeo foi encontrado resultado deste
teste em algumas amostras o que natildeo cooperou para um estudo mais preciso
futuros estudos quanto agraves amostras e um melhor acompanhamento deste tipo de
patologia Poreacutem mesmo sem algumas amostras com este resultado disponiacutevel foi
56
confirmada a presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos
carbapenecircmicos por meio dos genes de resistecircncia blaKPC e 16S rRNA que as
amostras apresentaram em sua maioria serem portadoras Quanto aos resultados
estatiacutesticos nenhuma das variaacuteveis apresentou significacircncia estatiacutestica (p gt 005)
mostrando assim que estas variaacuteveis isoladas natildeo foram o fator determinante para
o desfecho cliacutenico de alta ou oacutebito
57
7 CONCLUSAtildeO
Os genes blaKPC e 16S rRNA foram caracterizados confirmando a a
presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos carbapenecircmicos
Houve uma maior prevalecircncia da cepa K pneumoniae e isto confirma outros
estudos que apresentam a maior prevalecircncia desta cepa em amostras com KPC
Aleacutem disso isso justifica a forma popular da K pneumoniae ser chamada de KPC
enquanto que na verdade KPC eacute uma enzima podendo estar presente em outras
cepas como Enterobacter clocae tambeacutem apresentada no presente estudo O
desfecho cliacutenico de oacutebitos maior que 50 eacute um possiacutevel indicador sobre a
necessidade de se realizar um teste raacutepido para identificaccedilatildeo de KPC visando
iniciar o mais raacutepido possiacutevel o tratamento afim de diminuir a mortalidade por esta
infecccedilatildeo
Nenhuma das variaacuteveis isoladamente estaacute relacionada ao desfecho cliacutenico
oacutebito ou alta pois natildeo apresentaram relevacircncia estatiacutestica O presente estudo
mostrou que haacute presenccedila da bacteacuteria nas amostras de pacientes do hospital
estudado podendo entatildeo afirmar que este tipo de bacteacuteria se encontra tambeacutem
presente em ambiente hospitalar O uso irracional de antimicrobiano eacute demonstrado
de forma indireta quando foi apresentado atraveacutes do Teste de Hodge Modificado
uma resistecircncia de 100 aos antibioacuteticos carbapenecircmicos Isto tambeacutem reflete na
terapecircutica sendo que pacientes portadores de bacteacuterias resistentes aos
antibioacuteticos carabepecircmicos tem uma escassa opccedilatildeo de tratamento e as opccedilotildees
apresentam problemas quanto agrave toxicidade e eficaacutecia
58
REFEREcircNCIAS
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Mecanismos
de resistecircncia bacteriana aos antimicrobianos Disponiacutevel em
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controleopas_
webmodulo3mec_sitiohtmgt Acesso em 25 de abril de 2014
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Nota teacutecnica nordm
012013 medidas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees por enterobacteacuterias
multiresistentes Acesso em 17 de abril de 2013
ALBA J et al Kinetics study of KPC-3 a plasmid-encoded class A
carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase Antimicrob Agents Chemother
Nov49(11)4760-2 2005
ALVES A P et al Nosocomial infections by KPC-producing enterobacteria in
a tertiary hospital in Southern Brazil Revista da AMRIGS Porto Alegre 57 (3) 213-
218 jul-set 2013
ALVES A et al Tipagem Geneacutetica de Microrganismos Lab De Diversidade
Microbiana Centro de Biologia Celular Dep de Biologia U de Aveiro 3810-193
Aveiro- 2003
BELL J M et Al Prevalence and significance of a negative extended-
spectrum beta-lactamase (ESBL) confirmation test result after a positive ESBL
screening test result for isolates of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae
results from the SENTRY Asia-Pacific Surveillance Program J Clin Microbiol
May45(5)1478-82 2007
BRATU S et al Detection of KPC carbapenem-hydrolyzing enzymes in
Enterobacter spp from Brooklyn New York Antimicrob Agents Chemother v 49 n
2 p 776-8 2005
59
BRATU S et al Emergence of KPC-possessing Klebsiella pneumoniae in
Brooklyn New York epidemiology and recommendations for detection Antimicrob
Agents Chemother v 49 n 7 p 3018-20 2005
BRATU S et al Rapid spread of carbapenem-resistant Klebsiella
pneumoniae in New York City Arch Intern Med v 165 p 1430-5 2005
CAMARGO C F et al Aplicaccedilatildeo das teacutecnicas de pcr e suas teacutecnicas
derivadas em diagnoacutestico molecular Disponiacutevel em
ltfileDUnB10C2BA20semestreArtigosPCR-
20CLEYTON20FLORENCIO20DE20CAMARGO20E20PAULO20ROB
ERTO20QUEIROZpdfgtgt Acesso em 08 de abril de 2014
CARVALHES C G et al Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting
carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive
results Journal of Antimicrobial Chemotherapy v 65 n2 p 249-251 2010
CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION- CDC Modified
Hodge Test for Carbapenemase Detection in Enterobacteriaceae 2004
CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE Methods for
dilutionantimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically Approved
standard M7ndashA7 7th ed CLSI Wayne PA 2011
COELLO R et al Risk factors for developing clinical infection with methicillin-
resistant Staphylococcus aureus (MRSA) amongst hospital patients initially only
colonized with MRSA J Hosp Infect 19973739-46
COLPAN A et al Evaluation of risk factors for mortality in intensive care
units A prospective study from a referral hospital in Turkey Am J Infect Control
200533(1)42-7
60
CORNAGLIA G et al Living with ESBLs Introduction Clinical Microbiology
and Infection 14 Suppl 1 1-2 2008
COTRIM E R et al Klebsiella pneumoniae carbapenemase ndash KPC em
Enterobacteriaceae o desafio das bacteacuterias multirresistentes Poacutes em revista do
centro universitaacuterio Newton Paiva 12012 - ediccedilatildeo 5 - issn 2176 7785
DESHPANDE L M et al Occurrence and characterization of
carbapenemase-producing Enterobacteacuteriaceae report from the SENTRY
Antimicrobial Surveillance Program (2000-2004) Microb Drug Resist 12(4)223-30
2006
DIAS D J A Estudos dos principais mecanismos de resistecircncia aos
antibioacuteticos β-lactacircmicos em bacteacuterias patogecircnicas gram negativas 2009 100 f
Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Geneacutetica Molecular e Biomedicina) ndash Faculdade de
Ciecircncias e Tecnologia Universidade de Nova Lisboa Lisboa
DIENSTMANN R et al Avaliaccedilatildeo fenotiacutepica da enzima Klebsiella
pneumoniae carbapenemase (KPC) em Enterobacteriaceae de ambiente hospitalar
J Bras Patol Med Lab v 46 n 1 p 23-27 fevereiro 2010
ENDIMIAMI A et al Emergence of blaKPC-containing Klebsiella
pneumoniae in a long-term acute care hospital a new challenge to our healthcare J
Antimicrob Chemother 64 1102-1110 Nov 2009
FALAGAS M E et al Extended-spectrum beta-lactamase producing
organisms The Journal of Hospital Infection 73 (4) pp 345-54 2009
FONTANA C et al Emergence of KPC-producing Klebsiella pneumoniae in
Italy BMC Rev Notes 3 40 2010
61
GALES A C et al Antimicrobial resistance among Gram-negative bacilli
isolated from Latin America results from Sentry Antimicrobial Surveillance Program
(Latin America 2008-2010) Diagnostic Microbiology and Infectious Disease v 3 n
4 p 354 -360 2012
GUPTA N et al Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Epidemiology
and Prevention HEALTHCARE EPIDEMIOLOGY Clinical Infectious Diseases
201153(1)60ndash67 Published by Oxford University Press on behalf of the Infectious
Diseases Society of America 2011
HARBOTTLE H et al Genetics of antimicrobial resistance Anim Biotechnol
n17 p111-124 2006
HENRIQUE W N et al RESISTEcircNCIA BACTERIANA Uniatildeo das
Faculdades Alfredo NasserInstituto de Ciecircncias da Sauacutede Disponiacutevel em lt
httpwwwfaculdadealfredonasseredubrfilespesquisaposter20HENRIQUE20
Wilker20Natividade20SANTIAGO20Silvania20CAVALCANTI20DSP
20ResistC3AAncia20Bacterianapdfgt Acesso em 17 marccedilo 2014
HULSCHER M E J I et al Antibiotic prescribing in hospital a social and
behavioral scientific approach The Lancet Infectious Diaseases v 10 n 3 p 167-
165 2010
KIDWAI M SAPRA P BHUSHAN KR Synthetic strategies and medicinal
properties of beta-lactams Curr Med Chem 1999 695-215
KUMARASAMY K K et al Emergence of a new antibiotic resistance
mechanism in India Pakistan and the UK a molecular biological and
epidemiological stuy The Lancet Infectious Diseases v10 n 9 p 597- 602 2010
LINCOPAN N et al Enterobacteacuteria producing extended-spectrum β-
lacatamases and IMP-1 Metalo-β-lactamases isolated from Brazilian hospitals J Med
62
Microbiol 7 1-3 2006
LINCOPAN N et al First Isolation of Metalo-β-Lacatamase-Producing
Multiresistant Klebsiella pneumoniae from a patient in Brazil J Clin Microbiol 43(1)
516-519 2005
LIVERMORE D M et al What remains against carbapenem- resistant
Enterobacteriaceae Evaluation of choramphenicol ciprofloxacin colistina
fosfomycin minocycline nitrofurantoin temocilin and tigecycline International
Journal of Antimicrobial Agents v 37 n 5 p 415- 459 2011
LIVERMORE D M Fourten years in resistance International Journal of
Antimicrobial Agents v 39 283- 294 2012
LIVERMORE D M Bacterial resistance to carbapenems Adv Exp Med Biol
1995 39025-47
LIVERMORE D M Bacterial resistance origins epidemiology and impact
Clin Infect Dis 36S11-S23 2003
LIVERMORE D M et al Carbapenemases a problem in waiting Curr
Opin Microbiol 2000 3489-95
LU et al Universal pcr for common bacterial pathogens J CLIN
MICROBIOL VOL 38 2000
LU et al Use of PCR with Universal Primers and Restriction Endonuclease
Digestions for Detection and Identification of Common Bacterial Pathogens in
Cerebrospinal Fluid Journal of Clinical Microbiology June 2000 p 2076ndash2080
MARSCHALL J Met al Presence of the KPC Carbapenemase Gene in
Enterobacteriaceae Causing Bacteremia and Its Correlation with In Vitro
Carbapenem Susceptibility J Clin Microbiol 47 239-241 Jan 2009
63
MARTINS WMBS et al Prevalecircncia do gene blaKPC em isolados cliacutenicos
de Enterobacteriaceae e natildeo fermentadores encontrados em amostras clinicas em
um hospital universitaacuterio do Recife X Jornada de ensino pesquisa e extensatildeo ndash
JEPEX 2010 ndash UFRPE Recife 18 a 22 de outubro
MENDES C A C et al Polimixinas Revisatildeo com ecircnfase na sua
nefrotoxicidade Rev Assoc Med Bras 2009 55(6) 752-9
MOHR J F 3rd Update on the efficacy and tolerability of meropenem in the
treatment of serious bacteacuterial infections Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S41-51
2008
MONTEIRO J et al First report of KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae
strains in Brazil Antimicrob Agents Chemother Jan53(1)333-4 2009
MOREIRA V C et al Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia a antibioacuteticos
Disponiacutevel em
lthttpwwwcpglsucgbr6mostraartigosSAUDEVANESSA20CARVALHO20M
OREIRApdfgt Acesso em 21 marccedilo 2014
NETIKUL T et al Emergence of novel blaKPC-12 and blaKPC-13 variants in
carbapenem non-susceptible Enterobacter cloacae a first report of blaKPC gene in
Thailand European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases May
S372 2011
NETO V A et al Antibioacuteticos na praacutetica Meacutedica 6ordf Ediccedilatildeo Editorial
SarverSP Brasil 2007
NICOLAU D P Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of
meropenem Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S32-40 2008
64
OLIVEIRA A C et al Resistecircncia bacteriana e mortalidade em um centro de
terapia intensiva Rev Latino-Am Enfermagem nov-dez 2010
PAAUW A et al Failure to control an outbreak of qnrA 1-positive multidrug-
resistant Enterobacter clocae despite adequate implementation of recommended
infection control measures Journal of Clinical Microbiology v 45 n 5 p 1420-1425
2007
PATERSON D L et al Extended-Spectrum Beta-Lactamases a Clinical
Update Clinical Microbiology Reviews v 18 p 657-686 2005
PEIRANO G et al Carbapenem-hydrolysing beta-lactamase KPC-2 in
Klebsiella pneumonia isolated in Rio de Janeiro Brazil J Antimicrob Chemother Nov
20 2009
PERES-BOTA D et al Are infections due to resistant pathogens associated
with worse outcome in critically ill patients J Infect 200347(4)307-16
PIDDOCK L J V Clinically relevant chromosomally encoded multidrug
resistance effl ux pumps in bacterial Clin Microbiol Rev n19 p382-402 2006
PITOUT J D D et al Emergence of Enterobacteriaceae producing
extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) in the community J Antimicrob
Chemother May 56 2005
POSSEBON M I et al Resistecircncia bacteriana aos carbapenecircmicos
Bacterial resitence to carbapenems RBM rev bras med60(6)378380-378-382
jun 2003
QUEENAN A M et al Carbapenemases the versatile beta-lactamases
Clin Microbiol Rev Jul20(3)440-58 2007
65
RHOMBERG P R et al Summary trends for the meropenem yearly
susceptibility test information collection program a 10- year experience in the United
States (1999-2008) Diagnostic Microbiology and Infectiois Disease v 65 n4 p
414-426 2009
ROBLEDO I E et al Detection of KPC in Acinetobacter spp in Puerto Rico
J Antimicrob Agents Chemother 54 1354-1357 Mar 2010
ROGERS B A et al Country-to-country transfer os patients and the risk of
multi-resistant bacterial infection Clinical Infectious Disease v53 n1 p49- 56
2011
SHAH A A et al Characteristics epidemiology and clinicalimportance of
emerging strains of Gram-negative bacilli producing extended-spectrum
betalactamases Research in Microbiology v 155 p 409-421 2004
TURNER P J Extended- Spectrum Beta-Lactamases Clinical Infectious
Diseases v 41 p 273-275 2005
WOLTER D J et al Phenotypic and Enzymatic Comparative Analysis
between the Novel KPC variant KPC-5 and Its Evolutionary Variants KPC-2 and
KPC-4 Antimicrob Agents Chemother Nov 17 2008
WOODFORD N et al Carbapenemases of Chryseobacterium
(Flavobacterium) meningosepticum distribution of blaB and characterization of a
novel Metalo-beta-lactamase gene blaB3 in the type strain NCTC 10016
Antimicrob Agents Chemother Jun44(6)1448-52 2000
WOODFORF N Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in
India Pakistan and the UK a molecular biological and epidemiological study The
Lancet Infectious Diseases v 10 n 9 p 597-602 2010
66
WOODFORD et al Outbreak of Klebsiella pneumoniae Producing a New
Carbapenem- Hydrolyzing Class A β-Lactamase KPC-3 in a New York Medical
Center Antimicrobial agents and chemotherapy Dec 2004 p 4793ndash4799 Vol 48
No 12
YAGI T et al A preliminary survey of extended-spectrum β-lactamases
(ESBLs) in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Japan
FEMS Microbiology Letters 184 (2000) 53-56
YIGIT H et al Novel carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase KPC-1 from
a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumonia J Antimicrob Agents
Chemother 45 (4) 1151-1161 (2001)
ZAVASCKI A P et al KPC-2- producing Enterobacter cloacae in two cities
from Southern Brazil Int J Antimicrob Agents Apr 28 2009
ZHANEL G G et al Comparative review of the carbapenecircmicos Drugs
67(7)1027-52 2007
67
ANEXOS
Sequumlecircncia do oligo blaKPC
Query 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
Query 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
Query 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
68
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
Query 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
Query 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
69
Query 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
Query 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
Query 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
70
Sbjct 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
Query 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
Query 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
Query 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
71
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
Query 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
Query 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
72
Query 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
Query 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
Query 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
73
Sbjct 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
Query 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
Query 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
Query 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
74
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
Query 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
Query 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
75
Query 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
Query 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
||||
Sbjct 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
LOCUS AF297554 1377 bp
DNA linear BCT 26-MAR-2001
DEFINITION Klebsiella pneumoniae carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
gene complete cds
ACCESSION AF297554
VERSION AF2975541 GI10121874
76
KEYWORDS
SOURCE Klebsiella pneumoniae
ORGANISM Klebsiella pneumoniae
Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Enterobacteriaceae Klebsiella
REFERENCE 1 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH QueenanAM
AndersonGJ Domenech-SanchezA
BiddleJW StewardCD
AlbertiS BushK and TenoverFC
TITLE Novel carbapenem-hydrolyzing beta-
lactamase KPC-1 from a
carbapenem-resistant strain of
Klebsiella pneumoniae
JOURNAL Antimicrob Agents Chemother 45 (4)
1151-1161 (2001)
PUBMED 11257029
REFERENCE 2 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH AndersonGJ and
TenoverFC
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (19-AUG-2000) Nosocomial
Pathogens Laboratory Branch
Centers for Disease Control and
Prevention 1600 Clifton Rd MS
G08 Atlanta GA 30333 USA
FEATURES LocationQualifiers
77
source 11377
organism=Klebsiella
pneumoniae
mol_type=genomic DNA
db_xref=taxon573
-35_signal 5560
-10_signal 7883
mRNA 921012
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
RBS 117122
CDS 1311012
note=blaKPC-1
codon_start=1
transl_table=11
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
protein_id=AAG134101
db_xref=GI10121875
translation=MSLYRRLVLLSCLSWPLAGFSATALTNLVAEPFAKLEQD
FGGSI
GVYAMDTGSGATVSYRAEERFPLCSSFKGFLAAAVLARSQQQAGLLDTPIRYG
KNALV
PWSPISEKYLTTGMTVAELSAAAVQYSDNAAANLLLKELGGPAGLTAFMRSIG
DTTFR
78
LDRWELELNSAIPSDARDTSSPRAVTESLQKLTLGSALAAPQRQQFVDWLKGN
TTGNH
RIRAAVPADWAVGDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTRAPNKDDK
HSEAV
IAAAARLALEGLGVNGQ
ORIGIN
1 cggggcagtt acagccgtta cagcctctgg
agagggagcg gcttgccgct cggtgataat
61 cccagctgta gcggcctgat tacatccggc
cgctacacct agctccacct tcaaacaagg
121 aatatcgttg atgtcactgt atcgccgtct
agttctgctg tcttgtctct catggccgct
181 ggctggcttt tctgccaccg cgctgaccaa
cctcgtcgcg gaaccattcg ctaaactcga
241 acaggacttt ggcggctcca tcggtgtgta
cgcgatggat accggctcag gcgcaactgt
301 aagttaccgc gctgaggagc gcttcccact
gtgcagctca ttcaagggct ttcttgctgc
361 cgctgtgctg gctcgcagcc agcagcaggc
cggcttgctg gacacaccca tccgttacgg
421 caaaaatgcg ctggttccgt ggtcacccat
ctcggaaaaa tatctgacaa caggcatgac
481 ggtggcggag ctgtccgcgg ccgccgtgca
atacagtgat aacgccgccg ccaatttgtt
541 gctgaaggag ttgggcggcc cggccgggct
gacggccttc atgcgctcta tcggcgatac
79
601 cacgttccgt ctggaccgct gggagctgga
gctgaactcc gccatcccaa gcgatgcgcg
661 cgatacctca tcgccgcgcg ccgtgacgga
aagcttacaa aaactgacac tgggctctgc
721 actggctgcg ccgcagcggc agcagtttgt
tgattggcta aagggaaaca cgaccggcaa
781 ccaccgcatc cgcgcggcgg tgccggcaga
ctgggcagtc ggagacaaaa ccggaacctg
841 cggagtgtat ggcacggcaa atgactatgc
cgtcgtctgg cccactgggc gcgcacctat
901 tgtgttggcc gtctacaccc gggcgcctaa
caaggatgac aagcacagcg aggccgtcat
961 cgccgctgcg gctagactcg cgctcgaggg
attgggcgtc aacgggcagt aaggctctga
1021 aaatcatcta ttggcccacc accgccgccc
ttgcgggcgg catggattac caaccactgt
1081 cacatttagg ctaggagtct gcgcggcaga
gccgtgtgac cggttttctg tagagcactg
1141 acgatggcgg cggcgctctc tgcaattggc
aaggcgtcgg cgccaaggat accaatcttg
1201 cggcgcgcgg cgtgttatga cgactggggt
gcatttgagc cgccccattt aaccttcgcc
1261 ctcacagata cgccattcgc ctcaaattta
gcgccatgca gacgagcttc cactcggctt
1321 gcaccttgtc caggcccctc atgctgaact
gacgcaatcc catcaccgcc ttgatca
80
36
Figura 6 Interpretaccedilatildeo resultado do Teste de Hodge Modificado
(adaptado CDC 2004) Teste positivo na estria da cepa teste na parte superior
da placa teste negativo na estria da cepa teste na parte inferior da placa
Tendo positivo como resultado o paciente era um provaacutevel contaminado por
KPC As amostras entatildeo foram encaminhadas para a Fundaccedilatildeo Osvaldo Cruz
(FIOCRUZ) para confirmaccedilatildeo final As amostras finalmente confirmadas como
positivas para KPC foram isoladas e guardadas no banco de cepas cliacutenicas do
hospital Apoacutes a autorizaccedilatildeo do CEP amostras das cepas foram transferidas para
meio de transporte Stuard em caixa teacutermica fechada em baixa temperatura e
levadas para o laboratoacuterio de microbiologia cliacutenica da universidade
No laboratoacuterio da universidade as amostras foram separadas e realizadas
repiques em meios MacConkey e incubadas por 24h As colocircnias caracteriacutesticas
foratildeo isoladas em caldo BHI e mantidas em shaker a 37oC por 2h Apoacutes isto foram
executadas as anaacutelises a seguir
Os isolados de Enterobacteacuterias produtoras de carbapenemases foram
submetidos agrave extraccedilatildeo de DNA e posterior sequumlenciamento para identificaccedilatildeo dos
genes de resistecircncia blaKPC de 1 a 13 e identificaccedilatildeo do gene universal Os
pacientes de onde os materiais bioloacutegicos contendo as Enterobacteacuterias produtoras
de carbapenemases foram os isolados foram investigados quanto aos aspectos
epidemioloacutegicos e cliacutenicos
37
4 5 Extraccedilatildeo de DNA bacteriano
A extraccedilatildeo de DNA bacteriano foi realizada utilizando o kit NucleoSpin
Plasmidreg (MN) Antes de iniciar a extraccedilatildeo foi feito a preparaccedilatildeo das soluccedilotildees
reagentes materiais e amostras (vortexando) colocou-se em banho-maria agrave 50ordmC o
tampatildeo AW Partiu-se de colocircnias isoladas cultivadas que sofreram passagem em
meio LB liacutequido por 12h Adicionou-se 15 mL da amostra no tubo eppendorf
centrifugou por 5 minutos descartou o sobrenadante (com cuidado para natildeo
descartar o Pellet) Repetiu-se este procedimento por mais trecircs vezes completando-
se o volume de 6mL Foram adicionados 250microL do tampatildeo Resuspension Buffer A1
encostando a ponteira no Pellet e misturando (este tampatildeo tem como funccedilatildeo
separar a formaccedilatildeo de grumos celulares) Apoacutes isso homogeneizou e vortexou os
tubos eppendorfs Apoacutes isso foram adicionados 250microL do tampatildeo Lysis Buffer A2
homogenizou e deixou descansar por 5 minutos (esta etapa eacute importante para a lise
da parede e da membrana celulares e liberaccedilatildeo do conteuacutedo da ceacutelula)
Passado o tempo de descanso foi adicionado 300microL do tampatildeo
Neutralization Buffer A3 homogeneizou e centrifugou por 10 minutos (este tampatildeo
iraacute retirar as proteiacutenas que envolvem o DNA e voltaraacute com o pH para proacuteximo de 8
impedindo que a soluccedilatildeo de lise facilite a quebra das ligaccedilotildees covalentes do aacutecido
nucleacuteico) Em seguida enumeraram-se os tubos contendo filtros com siacutelica
transferiu-se o sobrenadante para o filtro e centrifugou por 5 minutos Descartou-se
o que foi filtrado adicionou 500microL do tampatildeo AW (banho-maria) centrifugou por 2
minutos Novamente foi descartado o filtrado Adicionou-se 600microL do tampatildeo A4
centrifugou por 2 minutos e descartou o filtrado (os tampotildees AW e A4 contecircm
isotiocianato de guanidina em concentraccedilotildees crescentes para facilitar a adsorccedilatildeo
do DNA na siacutelica e retirada das outras biomoleacuteculas da amostra) Foi feita outra
centrifugaccedilatildeo com o tubo vazio Apoacutes isto o filtro foi trocado para outro eppendorf
definitivo onde foi adicionado 50microL do tampatildeo Elution Buffer AE (este tampatildeo
favorece a eluiccedilatildeo do DNA) centrifugou por 2 minutos descartou o filtro e
armazenou as amostras em freezer -20ordmC
38
4 6 Iniciadores e reaccedilatildeo de PCR
Os iniciadores universais para o gene blaKPC foram desenhados baseados
em sequumlecircncias conservadas apresentadas pelos sub-grupos de genes que
codificam a enzima carbapenemase de klebsiella pneumoniae (YIGIT et al 2001)
Baseado na sequumlecircncia para o blakpc-1 depositada no GenBank
(AF2975541) o oligonucleotiacutedio (oligo) iniciador direto (5-
ATGTCACTGTATCGCCGTC-3rsquo) foi desenhado para reconhecer a sequumlecircncia
blaKPC na posiccedilatildeo (131149) enquanto que o iniciador reverso (5-
TTACTGCCCGTTGACGCC-3rsquo) foi reconhecido na posiccedilatildeo (9951012) As anaacutelises
baseadas em alinhamento de sequumlecircncias mostraram que o par de iniciadores
blaKPC podem detectar os alelos de 1 a 13 do gene blaKPC conforme a tabela 2
Tabela 2 Nuacutemero de acesso ao GenBank dos alelos blaKPC e seus
microrganismos originais
Nuacutemero de
Acesso GenBank
Microrganismo Alvo
AF2975541 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-1
GU0862251 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-2
HQ2589341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-2-like
AB5577341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC -3
EU4473041 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-4
EU4002222 Pseudomonas
aeruginosa
blaKPC-5
EU5555341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-6
EU7297271 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-7
39
FJ2344121 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-8
FJ624872 Escherichia coli blaKPC-9
GQ1403481 Acinetobacter
baumannii
blaKPC-10
HM0669951 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-11
HQ3428891 Enterobacter cloacae blaKPC-12
HQ3428901 Enterobacter cloacae blaKPC-13
As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo de blaKPC foram realizadas em um
primeiro tempo de desnaturaccedilatildeo em que foi 94ordmC por 5 minutos seguido de 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 58 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 90 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 78ordmC por 8 minutos Aleacutem das amostras foi utilizado um
controle negativo
A PCR do blaKPC foi realizada utilizando os componentes para o volume da
reaccedilatildeo de 25 microL citados na tabela 3 A banda do tamanho do produto de PCR foi de
881 pares de bases (pb) o que corresponde ao plasmiacutedeo
Tabela 3 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do
gene blaKPC
Reagente Volume
DNA molde 4 microL
Tampatildeo Taq 25 microL
MgCl2 075 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP
2 microL
Oligo F 1 microL
Oligo R 1 microL
Taq DNA polimerase 05 microL
Aacutegua MiliQ 1335 microL
40
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
Baseado na sequumlecircncia para o gene 16S rRNA em que o oligonucleotiacutedio
Universal iniciador direto foward (5-CCAGCAGCCGCCGTAATACG-3rsquo) foi
desenhado para reconhecer a sequumlecircncia universal na posiccedilatildeo 1513 enquanto que o
iniciador reverso (5-ATCGGYTACCTTGTTACGACTTC-3rsquo) foi reconhecido na
posiccedilatildeo 1491 foram realizadas PCRrsquos As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo deste
gene foram realizadas nos seguinte tempos separaccedilatildeo 94ordmC por 10 minutos 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 55 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 120 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 72ordmC por 10 minutos
A PCR do gene 16S rRNA foi realizada utilizando os componentes para o
volume da reaccedilatildeo de 25microL citados na tabela 4 A banda do tamanho do produto de
PCR foi de 996 pb correspondente aacute regiatildeo ribossomal capaz de amplificar todas
as espeacutecies
Tabela 4Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do gene
universal
Reagente (quantidade
concentraccedilatildeo do estoque)
Volume
DNA molde 10 ng 4 microL
Tampatildeo Taq 10 x 25 microL
MgCl2 50mM 125 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP 25 mM
125 microL
Oligo F 10microM 05 microL
Oligo R 10microM 05 microL
Taq DNA polimerase 5UmicroL 04 microL
Aacutegua Miliq 146 microL
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
41
O termociclador utilizado para os experimentos foi o LifeTouch da BIOER
4 7 Digestatildeo
Para realizaccedilatildeo da digestatildeo foi utilizada a enzima BshF I (Hae III) EN- 1105
tamanho 7000 units concentraccedilatildeo 10 unitsmicroL fonte Bacillus sphaericus empresa
Jena bioscienceUtilizaram-se os componentes para o volume de 50microL da reaccedilatildeo
citados na tabela 5
Tabela 5 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da digestatildeo do gene
universal
Reagente Volume
Produto de PCR 10 microL
Enzima BshF I 01 microL
Tampatildeo (10x) 5 microL
Aacutegua Miliq 349 microL
Total (em cada ependorff) 50 microL
Valores para 1 digestatildeo
Os ependorffs foram colocados por 30 minutos em banho-maria a 37ordmC Apoacutes
isso fez-se a corrida das amostras em gel de agarose para verificaccedilatildeo do resultado
(LU et al 2000)
4 8 Eletroforese em gel de agarose
Os produtos de DNA PCR e digestatildeo foram analisados em gel de agarose
2 O tempo de corrida do gel eacute de aproximadamente 1hora e 30minutos sendo
que no comeccedilo foi usada agrave voltagem de 50 V e apoacutes comeccedilar a correr o gel
aumentou a voltagem para 100 v Utilizou-se o marcador de 100pb (pares de bases)
Foi adicionado 3microL de corante Bromophenol (que tem a funccedilatildeo de fazer uma ligaccedilatildeo
na amostra de DNA e permitir a visualizaccedilatildeo da corrida no gel de agarose) em 7microL
de amostra tanto de DNA quanto de PCR Para o preparo do gel foi utilizado TBE
42
(Tris- Aacutecido Boacuterico) agarose e brometo de etiacutedio (sua funccedilatildeo eacute de corante para o gel
e permitir a visualizaccedilatildeo do DNA quando colocado agrave luz ultravioleta) Para o oligo
blaKPC a banda da amplificaccedilatildeo foi em 881ppb correspondendo ao plasmiacutedeo Jaacute
o oligo Universal foi em 996 pb
4 9 Descarte de resiacuteduos
Todos os materiais utilizados nos ensaios foram de uso uacutenico e manipulados
em cacircmaras de seguranccedila bioloacutegica classe II Apoacutes o uso foram colocados em
soluccedilatildeo desinfetantes (hipoclorito a 1) e em seguida autoclavados a 127oC por 20
min em sacos apropriados para autoclavaccedilatildeo Apoacutes a finalizaccedilatildeo do ciclo de
esterilizaccedilatildeo os sacos contendo o material descartaacutevel foram colocados em
recipientes de coleta da empresa responsaacutevel pela coleta de materiais bioloacutegicos
produzidos no laboratoacuterio de microbiologia Todos os procedimentos seguiram a
normativa RDC-ANVISA 3062004 sobre o descarte de resiacuteduos de serviccedilo de
sauacutede
4 10 Aspectos epidemioloacutegicos e cliacutenicos
Os aspectos cliacutenicos e epidemioloacutegicos foram investigados por meio de
prontuaacuterios dos pacientes portadores de enterobacteacuterias produtoras de
carbapenemases e envolveram topografia mais provaacutevel do foco infeccioso a
enfermidade motivadora da internaccedilatildeo o desfecho cliacutenico a idade e o tempo de
internaccedilatildeo
4 12 Anaacutelises eepidemioloacutegicas
As anaacutelises foram realizadas com o pacote estatiacutestico SPSS versatildeo 200
Para verificar quais variaacuteveis referentes aos dados epidemioloacutegicos e
microbioloacutegicos influenciaram no desfecho verificou- se a diferenccedila meacutedia das
variaacuteveis idade e tempo de internaccedilatildeo em cada grupo O teste estatiacutestico utilizado foi
o teste t de Student apoacutes se executar o teste de normalidade de Shapiro-Wilk Para
as variaacuteveis sexo perfil microbioloacutegico das enterobacteacuterias produtoras de
43
carbapenemases foi avaliada a associaccedilatildeo com o desfecho por meio do teste Exato
de Fisher O niacutevel de significacircncia adotado foi de 5
4 13 Preceitos eacuteticos
Este projeto estaacute inserido em um projeto maior denominado ldquoEpidemiologia
cliacutenica e caracterizaccedilatildeo molecular do Acinetobacter Baumannii resistente a
antibioticoterapia em pacientes internado em hospitais do Sistema Uacutenico de Sauacutederdquo
que foi submetido ao Comitecirc de Eacutetica em Pesquisa da Secretaria do Estado de
Sauacutede do Distrito Federal (SESDF) e emitido parecer aprovado pelo protocolo nordm
23109 (anexo)
44
5 RESULTADOS
51 Anaacutelise molecular
Para a amplificaccedilatildeo com o oligo blaKPC foram amplificadas amostras
que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 881 pb correspondente ao
plasmiacutedeo A anaacutelise da amplificaccedilatildeo da regiatildeo do gene blaKPC mostrou que
apenas a amostra A10 natildeo amplificou isso demonstra que esta amostra natildeo
possuiacutea o gene de resistecircncia
5 1 1 Gene blaKPC
Figura 7 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 881 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
A amostra A3 natildeo amplificou no primeiro momento entatildeo foi realizado
novamente a PCR e corrida de gel obtendo entatildeo a amplificaccedilatildeo da amostra como
apresentado na figura 8
45
Figura 8 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC da
mostra A3 estudada A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo de 881
pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 1 2 Gene 16S rRNA
Para a amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA utilizou-se o oligo universal Foram
amplificadas amostras que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 996 pb
Figura 9 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
46
Segundo Lu et al (2000) a digestatildeo com a enzima HaeIII deste amplicons de
16S rRNA devolveriam bandas com perfis entre 150 a 200 pb No gel abaixo eacute
possiacutevel evidenciar que este perfil ocorreu com o predomiacutenio de bandas na altura
de 200pb
Figura 10 Gel de agarose a 2 da digestatildeo do amplicon do gene 16S
rRNA das amostras com a enzima HaeIII evidenciando diversos fragmentos
proacuteximos a 200 pb A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo ribossomal
de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 2 Anaacutelises epidemioloacutegicas
5 2 1 Sexo
No total foram detectados 17 isolados de KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 onde a maior a prevalecircncia foi
detecatada em amostras de pacientes do sexo masculino (53) do que no sexo
feminino (47)
47
Figura 11 Isolado de KPC segundo sexo dos 17 pacientes investigados
no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 2 Desfecho cliacutenico
Em 17 isolados de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo
de 2010 aacute 2011 a porcentagem de pacientes que foram a oacutebito (59) foi maior que
a de pacientes que tiverm alta (41)
Figura 12 Isolado de KPC segundo desfecho cliacutenico dos 17 pacientes
investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
48
5 2 3 Local da coleta
Dos 17 episoacutedios detectados de infecccedilatildeo por KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 a infecccedilatildeo em swab retalfoi mais
frequente (47) seguida de ponta de cateacuteter (18) e secreccedilatildeo traqueal (12)
Figura 13 Isolados de KPC segundo local da coleta da amostra nos 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 4 Microorganismo
O microorganismo mais encontrado foi a Klebsiella pneumoniae (82)
seguida da Enterobacter clocae (12) e Serratia marcescens (6) dos 17 isolados
de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 Isto afirma o
fato de a sigla KPC ser utilizada de forma errocircnea aacute Klebsiella pneumoniae visto
que a evidecircncia dela eacute maior em relaccedilatildeo as outras cepas
49
Figura 14 Isolado de KPC segundo microrganismo encontrado em 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 5 Relaccedilotildees variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana e desfecho
cliacutenico
Tabela 6 ndash Distribuiccedilatildeo do perfil geneacutetico sexo coleta tipificaccedilatildeo de
microrganismos e anaacutelise da resistecircncia bacteriana segundo o desfecho
cliacutenico Brasiacutelia-DF 2010 a 2011
Variaacutevel Resultado
Desfecho
Alta Oacutebito
N N P
Gene 16S rRNA Positivo 7 1000 10 1000
NA Gene blaKPC Positivo 6 857 10 1000
Negativo 1 143 0 00 0218 Sexo Feminino 2 286 6 600
Masculino 5 714 4 400 0201 Local da coleta Fundo saco de
Douglas 1 143 0 00
Hemocultura 0 00 1 100 0463 Ponta de cateter 1 143 2 200
Sec TraquealBrocircnquica
0 00 1 100
50
Secreccedilatildeo traqueal 2 286 0 00
Swab retal 3 429 5 500
Urina 0 00 1 100
Microrganismo Enterobacter cloacae (KPC)
1 143 1 100
Klebsiella pneumoniae
6 857 8 800
0416 Serratia
marcescens 0 00 1 100
Teste de Hodge Hodge positivo 7 1000 10 1000
NA Amicacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 1 100 0848 resistente 0 00 1 100
sensiacutevel 2 286 3 300
Amoxicilina Aacutecido Clavulacircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Ampicilina Sulbactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ampicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Aztreonan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefazolina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Cefoperazona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Cefotaxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefoxitina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0509 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 2 286 4 400
Ceftazidima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cetriaxona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 3 429 5 500 0772 Cefalotina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ciprofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772
51
resistente 3 429 5 500
Claritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Clindamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Eritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Gentamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0942 resistente 2 286 3 300
sensiacutevel 1 143 2 200
Imipenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 0 00 2 200 0193 Resistente 1 143 3 300
sensiacutevel 2 286 0 00
Nitrofurantoiacutena sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Norfloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Oxacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Penicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Piperacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Rifampicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tetraciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Ticarcilina Aacutecido Clavulocircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0688 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 3 429 4 400
Tobramicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Trimetoprima Sulfametoxazol
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0112 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 2 286 0 00
Vancomicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tigeciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediario 0 00 1 100 0211 natildeo testado 1 143 4 400
resistente 2 286 0 00
52
Cefepime sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefuroxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Levofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Piperacilina Tazobactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Ertapenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Meropenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0223 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 1 143 0 00
Cefotetan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 sensiacutevel 0 00 1 100
Gemifloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 7 700 0585 natildeo testado 3 429 3 300
Desfecho
Alta Oacutebito
Meacutedia Erro
padratildeo Meacutedia Erro
padratildeo p
Idade 58 9 59 5 0991
Tempo Internaccedilatildeo (dias)
50 13 46 12 0571
n= 17 p(lt 005) NA natildeo se aplica
53
6 DISCUSSAtildeO
Nos uacuteltimos anos houve um aumento na incidecircncia de bacteacuterias
multirresistentes aos antimicrobianos no ambiente hospitalar tornando isto um
problema mundial de sauacutede puacuteblica (HULSCHER et al 2010) Quando se trata
principalmente de bacilos Gram negativos a frequumlecircncia destas bacteacuterias eacute ainda
maior em paiacuteses da Ameacuterica Latina quando comparada a paiacuteses desenvolvidos
(GALES etal 2012)
De acordo com dados do ldquoMeropenem Yearly Susceptibility Test Information
Collectionrdquo (MYSTIC) ocorreu nos Estados Unidos um aumento na susceptibilidade
de K pneumoniae nos uacuteltimos anos graccedilas a praacuteticas de controle de disseminaccedilatildeo
de amostras resistentes(RHOMBERG P R et al 2009) O aumento crescente da
prevalecircncia destes microrganismos foi proporcional ao aumento da dependecircncia do
uso de antibioacuteticos carbapenecircmicos considerados como a opccedilatildeo terapecircutica para o
tratamento de infecccedilotildees por bacilos Gram negativos multi-resistentes (LIVERMORE
2012) Isto afeta diretamente as opccedilotildees de tratamento sobrando poucas alternativas
para a terapecircutica que incluem colistina (polimixina E) e tigeciclina que apresentam
respectivamente problemas em termos de toxicidade e eficaacutecia (LIVERMORE et
al 2011) Um dos efeitos adversos mais importantes das poliminas B e E por
exemplo satildeo a neurotoxicidade e nefrotoxicidade (MENDES C A C et al2009 )
Devido agrave resistecircncia ser usualmente de natureza plasmidial e portanto de
maior disseminaccedilatildeo especialmente quando carreadas por K pneumoniae
microrganismo com uma notoacuteria capacidade para acumular e transferir plasmiacutedeos
com determinantes para resistecircncia o nuacutemero de casos detectados pelo
fenoacutetipogenoacutetipo blaKPC eacute bastante preocupante (MONTEIRO et al 2009)
Comparada com outras bacteacuterias hospitalares a transmissatildeo de clones
multirresistentes de K pneumoniae eacute maior e podem natildeo ser controladas pelos
meacutetodos de controle de infecccedilatildeo hospitalar (PAAUW et al 2007) A forma
plasmidial para transferecircncia da resistecircncia adicionada a este grande potencial para
disseminaccedilatildeo de clones resistentes eacute preocupante visto que apoacutes surtos muitas
vezes pode se tornar endecircmica Jaacute eacute uma realidade a disseminaccedilatildeo desta bacteacuteria
54
entre pacientes hospitais paiacuteses e ateacute mesmo continentes (WOODFORF et al
2010 ROGERS et al 2011)
As chances de surtos satildeo maiores em paiacuteses com poucos recursos devido agrave
maior carecircncia de praacuteticas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees hospitalares e o
uso irracional de antimicrobianos de forma empiacuterica e inadequada (KUMARASAMY
et al 2010) Ateacute o momento os mecanismos de resistecircncia aos cabapenecircmicos
geralmente encontrado eram a produccedilatildeo de ESBL (CTX-M) somada aacute perda de
porina (CARVALHAES et al 2010) Foi notado a partir do ano de 2008 um
aumento no nuacutemero de K pneumoniae produtoras de KPC-2 apresentando outra
forma de resistecircncia (GALES 2012)
Um estudo mostrou que o perfil do paciente colonizado ou infectado por KPC
foi de um paciente entre os 33 e os 82 anos de idade internado haacute mais de 1
semana no hospital A mortalidade geral nos uacuteltimos anos ficou em torno de 7
sendo que dos 77 pacientes estudados 32 (415) pacientes evoluiacuteram para oacutebito
evidenciando a alta morbi-mortalidade associada (ALVES A P et al 2013)
Em estudo com 2316 pacientes avaliados a populaccedilatildeo de sexo masculino foi
de 526 idade meacutedia global de 53 anos (mediana de 55 anos) permanecircncia meacutedia
de 58 dias (mediana de 3 dias) (OLIVEIRA A C et al 2010) Outros trabalhos
apresentaram ausecircncia de significacircncia entre sexoidade e o desenvolvimento de
infecccedilotildees por microrganismos resistentes (PERES-BOTA D et al 2003 COLPAN
A et al 2005 COELLO R et al 1997)
Outro estudo utilizou um total de 30 amostras sendo elas isoladas de urina
escarro secreccedilatildeo pleural ponta de cateter aspirado traqueal e hemocultura A mais
prevalente foi em urina (40) Entre as 30 cepas analisadas a maior porcentagem
foi da cepa Klebsiella pneumoniae (70) Enterobacter sp (133) Klebsiella
ozaenae (10) Escherichia coli (333) e Klebsiella oxytoca (333)
(DIENSTMANN R et al 2010) Nos Estados Unidos a enzima KPC jaacute se tornou
endecircmica Foi realizada uma pesquisa em dois hospitais de Nova York onde
testaram 602 amostras e 45 apresentaram algum mecanismo de resistecircncia
sendo apenas 33 confirmadas por biologia molecular como KPC-2 (BRATU et
al 2005)
55
Estudo sobre os tipos de ESBL feito no Japatildeo apresentou o tipo Toho-1 como
o mais prevalente nessa pesquisa Ateacute o ano de 2000 ano em que foi publicado tal
estudo este era o primeiro relatoacuterio no Japatildeo para identificar derivados de ESBLs
como tipo de SHV e TEM entre E coli e K pneumoniae Em especial o tipo SHV- 12
foi identificado com uma maior frequumlecircncia Estes resultados indicam que tipos
distintos de ESBLs que satildeo diferentes em sua especificidade de substrato e origem
geneacutetica coexistem no Japatildeo Isto mostra a importacircncia de caracterizar genoacutetipos
distintos de ESBLs e de estar em alerta continuamente para as tendecircncias de
ESBLs no Japatildeo aleacutem da necessidade de uma interpretaccedilatildeo uniforme utilizando as
diretrizes do CSLI para relatar cepas produtoras de ESBL Aleacutem da detecccedilatildeo de
ESBLs satildeo necessaacuterias mais informaccedilotildees tais como o perfil de sensibilidade
especiacutefica para diversas β-lactacircmicos e o local da infecccedilatildeo Esses fatores satildeo
essenciais para a escolha adequada de antibioacuteticos (YAGI T et al 2000)
No ano de 2004 uma pesquisa avaliou a produccedilatildeo de uma enzima de
hidroacutelise de carbapenecircmicos atraveacutes da teacutecnica de sequumlenciamento foi revelado
um novo membro da famiacutelia KPC designado KPC- 3 Pesquisadores encontraram
em um mutante de K pneumoniae uma substituiccedilatildeo de um gene associado com
resistecircncia a Imipenem mas essa substituiccedilatildeo foi considerada improvaacutevel na
contribuiccedilatildeo da resistecircncia aos carbapenecircmicos da espeacutecie estudada Aleacutem da
resistecircncia aos carbapenecircmicos estes isolados eram em sua maioria resistentes agraves
cefalosporinas penicilinas e aminoglicosiacutedeos Usando estudos de transformaccedilatildeo
conjugaccedilatildeo e hibridaccedilatildeo localizaram o alelo blaKPC em plasmiacutedeo aleacutem disso
mostraram que esse alelo tambeacutem carregava uma resistecircncia aos aminoglicosiacutedeos
A transferecircncia das enzimas KPCs foi demonstrada in vitro tanto neste como em
outros estudos pode ser que os plasmiacutedeos que fazem esta transferecircncia estavam
comeccedilando a se espalhar no ambiente cliacutenico resultando na multiresistecircncia dessas
estirpes (WOODFORD et al 2004)
O presente estudo apresentou um vieacutes quanto aos resultados dos testes de
susceptibilidade microbiana Observou-se que natildeo foi encontrado resultado deste
teste em algumas amostras o que natildeo cooperou para um estudo mais preciso
futuros estudos quanto agraves amostras e um melhor acompanhamento deste tipo de
patologia Poreacutem mesmo sem algumas amostras com este resultado disponiacutevel foi
56
confirmada a presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos
carbapenecircmicos por meio dos genes de resistecircncia blaKPC e 16S rRNA que as
amostras apresentaram em sua maioria serem portadoras Quanto aos resultados
estatiacutesticos nenhuma das variaacuteveis apresentou significacircncia estatiacutestica (p gt 005)
mostrando assim que estas variaacuteveis isoladas natildeo foram o fator determinante para
o desfecho cliacutenico de alta ou oacutebito
57
7 CONCLUSAtildeO
Os genes blaKPC e 16S rRNA foram caracterizados confirmando a a
presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos carbapenecircmicos
Houve uma maior prevalecircncia da cepa K pneumoniae e isto confirma outros
estudos que apresentam a maior prevalecircncia desta cepa em amostras com KPC
Aleacutem disso isso justifica a forma popular da K pneumoniae ser chamada de KPC
enquanto que na verdade KPC eacute uma enzima podendo estar presente em outras
cepas como Enterobacter clocae tambeacutem apresentada no presente estudo O
desfecho cliacutenico de oacutebitos maior que 50 eacute um possiacutevel indicador sobre a
necessidade de se realizar um teste raacutepido para identificaccedilatildeo de KPC visando
iniciar o mais raacutepido possiacutevel o tratamento afim de diminuir a mortalidade por esta
infecccedilatildeo
Nenhuma das variaacuteveis isoladamente estaacute relacionada ao desfecho cliacutenico
oacutebito ou alta pois natildeo apresentaram relevacircncia estatiacutestica O presente estudo
mostrou que haacute presenccedila da bacteacuteria nas amostras de pacientes do hospital
estudado podendo entatildeo afirmar que este tipo de bacteacuteria se encontra tambeacutem
presente em ambiente hospitalar O uso irracional de antimicrobiano eacute demonstrado
de forma indireta quando foi apresentado atraveacutes do Teste de Hodge Modificado
uma resistecircncia de 100 aos antibioacuteticos carbapenecircmicos Isto tambeacutem reflete na
terapecircutica sendo que pacientes portadores de bacteacuterias resistentes aos
antibioacuteticos carabepecircmicos tem uma escassa opccedilatildeo de tratamento e as opccedilotildees
apresentam problemas quanto agrave toxicidade e eficaacutecia
58
REFEREcircNCIAS
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Mecanismos
de resistecircncia bacteriana aos antimicrobianos Disponiacutevel em
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controleopas_
webmodulo3mec_sitiohtmgt Acesso em 25 de abril de 2014
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Nota teacutecnica nordm
012013 medidas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees por enterobacteacuterias
multiresistentes Acesso em 17 de abril de 2013
ALBA J et al Kinetics study of KPC-3 a plasmid-encoded class A
carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase Antimicrob Agents Chemother
Nov49(11)4760-2 2005
ALVES A P et al Nosocomial infections by KPC-producing enterobacteria in
a tertiary hospital in Southern Brazil Revista da AMRIGS Porto Alegre 57 (3) 213-
218 jul-set 2013
ALVES A et al Tipagem Geneacutetica de Microrganismos Lab De Diversidade
Microbiana Centro de Biologia Celular Dep de Biologia U de Aveiro 3810-193
Aveiro- 2003
BELL J M et Al Prevalence and significance of a negative extended-
spectrum beta-lactamase (ESBL) confirmation test result after a positive ESBL
screening test result for isolates of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae
results from the SENTRY Asia-Pacific Surveillance Program J Clin Microbiol
May45(5)1478-82 2007
BRATU S et al Detection of KPC carbapenem-hydrolyzing enzymes in
Enterobacter spp from Brooklyn New York Antimicrob Agents Chemother v 49 n
2 p 776-8 2005
59
BRATU S et al Emergence of KPC-possessing Klebsiella pneumoniae in
Brooklyn New York epidemiology and recommendations for detection Antimicrob
Agents Chemother v 49 n 7 p 3018-20 2005
BRATU S et al Rapid spread of carbapenem-resistant Klebsiella
pneumoniae in New York City Arch Intern Med v 165 p 1430-5 2005
CAMARGO C F et al Aplicaccedilatildeo das teacutecnicas de pcr e suas teacutecnicas
derivadas em diagnoacutestico molecular Disponiacutevel em
ltfileDUnB10C2BA20semestreArtigosPCR-
20CLEYTON20FLORENCIO20DE20CAMARGO20E20PAULO20ROB
ERTO20QUEIROZpdfgtgt Acesso em 08 de abril de 2014
CARVALHES C G et al Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting
carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive
results Journal of Antimicrobial Chemotherapy v 65 n2 p 249-251 2010
CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION- CDC Modified
Hodge Test for Carbapenemase Detection in Enterobacteriaceae 2004
CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE Methods for
dilutionantimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically Approved
standard M7ndashA7 7th ed CLSI Wayne PA 2011
COELLO R et al Risk factors for developing clinical infection with methicillin-
resistant Staphylococcus aureus (MRSA) amongst hospital patients initially only
colonized with MRSA J Hosp Infect 19973739-46
COLPAN A et al Evaluation of risk factors for mortality in intensive care
units A prospective study from a referral hospital in Turkey Am J Infect Control
200533(1)42-7
60
CORNAGLIA G et al Living with ESBLs Introduction Clinical Microbiology
and Infection 14 Suppl 1 1-2 2008
COTRIM E R et al Klebsiella pneumoniae carbapenemase ndash KPC em
Enterobacteriaceae o desafio das bacteacuterias multirresistentes Poacutes em revista do
centro universitaacuterio Newton Paiva 12012 - ediccedilatildeo 5 - issn 2176 7785
DESHPANDE L M et al Occurrence and characterization of
carbapenemase-producing Enterobacteacuteriaceae report from the SENTRY
Antimicrobial Surveillance Program (2000-2004) Microb Drug Resist 12(4)223-30
2006
DIAS D J A Estudos dos principais mecanismos de resistecircncia aos
antibioacuteticos β-lactacircmicos em bacteacuterias patogecircnicas gram negativas 2009 100 f
Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Geneacutetica Molecular e Biomedicina) ndash Faculdade de
Ciecircncias e Tecnologia Universidade de Nova Lisboa Lisboa
DIENSTMANN R et al Avaliaccedilatildeo fenotiacutepica da enzima Klebsiella
pneumoniae carbapenemase (KPC) em Enterobacteriaceae de ambiente hospitalar
J Bras Patol Med Lab v 46 n 1 p 23-27 fevereiro 2010
ENDIMIAMI A et al Emergence of blaKPC-containing Klebsiella
pneumoniae in a long-term acute care hospital a new challenge to our healthcare J
Antimicrob Chemother 64 1102-1110 Nov 2009
FALAGAS M E et al Extended-spectrum beta-lactamase producing
organisms The Journal of Hospital Infection 73 (4) pp 345-54 2009
FONTANA C et al Emergence of KPC-producing Klebsiella pneumoniae in
Italy BMC Rev Notes 3 40 2010
61
GALES A C et al Antimicrobial resistance among Gram-negative bacilli
isolated from Latin America results from Sentry Antimicrobial Surveillance Program
(Latin America 2008-2010) Diagnostic Microbiology and Infectious Disease v 3 n
4 p 354 -360 2012
GUPTA N et al Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Epidemiology
and Prevention HEALTHCARE EPIDEMIOLOGY Clinical Infectious Diseases
201153(1)60ndash67 Published by Oxford University Press on behalf of the Infectious
Diseases Society of America 2011
HARBOTTLE H et al Genetics of antimicrobial resistance Anim Biotechnol
n17 p111-124 2006
HENRIQUE W N et al RESISTEcircNCIA BACTERIANA Uniatildeo das
Faculdades Alfredo NasserInstituto de Ciecircncias da Sauacutede Disponiacutevel em lt
httpwwwfaculdadealfredonasseredubrfilespesquisaposter20HENRIQUE20
Wilker20Natividade20SANTIAGO20Silvania20CAVALCANTI20DSP
20ResistC3AAncia20Bacterianapdfgt Acesso em 17 marccedilo 2014
HULSCHER M E J I et al Antibiotic prescribing in hospital a social and
behavioral scientific approach The Lancet Infectious Diaseases v 10 n 3 p 167-
165 2010
KIDWAI M SAPRA P BHUSHAN KR Synthetic strategies and medicinal
properties of beta-lactams Curr Med Chem 1999 695-215
KUMARASAMY K K et al Emergence of a new antibiotic resistance
mechanism in India Pakistan and the UK a molecular biological and
epidemiological stuy The Lancet Infectious Diseases v10 n 9 p 597- 602 2010
LINCOPAN N et al Enterobacteacuteria producing extended-spectrum β-
lacatamases and IMP-1 Metalo-β-lactamases isolated from Brazilian hospitals J Med
62
Microbiol 7 1-3 2006
LINCOPAN N et al First Isolation of Metalo-β-Lacatamase-Producing
Multiresistant Klebsiella pneumoniae from a patient in Brazil J Clin Microbiol 43(1)
516-519 2005
LIVERMORE D M et al What remains against carbapenem- resistant
Enterobacteriaceae Evaluation of choramphenicol ciprofloxacin colistina
fosfomycin minocycline nitrofurantoin temocilin and tigecycline International
Journal of Antimicrobial Agents v 37 n 5 p 415- 459 2011
LIVERMORE D M Fourten years in resistance International Journal of
Antimicrobial Agents v 39 283- 294 2012
LIVERMORE D M Bacterial resistance to carbapenems Adv Exp Med Biol
1995 39025-47
LIVERMORE D M Bacterial resistance origins epidemiology and impact
Clin Infect Dis 36S11-S23 2003
LIVERMORE D M et al Carbapenemases a problem in waiting Curr
Opin Microbiol 2000 3489-95
LU et al Universal pcr for common bacterial pathogens J CLIN
MICROBIOL VOL 38 2000
LU et al Use of PCR with Universal Primers and Restriction Endonuclease
Digestions for Detection and Identification of Common Bacterial Pathogens in
Cerebrospinal Fluid Journal of Clinical Microbiology June 2000 p 2076ndash2080
MARSCHALL J Met al Presence of the KPC Carbapenemase Gene in
Enterobacteriaceae Causing Bacteremia and Its Correlation with In Vitro
Carbapenem Susceptibility J Clin Microbiol 47 239-241 Jan 2009
63
MARTINS WMBS et al Prevalecircncia do gene blaKPC em isolados cliacutenicos
de Enterobacteriaceae e natildeo fermentadores encontrados em amostras clinicas em
um hospital universitaacuterio do Recife X Jornada de ensino pesquisa e extensatildeo ndash
JEPEX 2010 ndash UFRPE Recife 18 a 22 de outubro
MENDES C A C et al Polimixinas Revisatildeo com ecircnfase na sua
nefrotoxicidade Rev Assoc Med Bras 2009 55(6) 752-9
MOHR J F 3rd Update on the efficacy and tolerability of meropenem in the
treatment of serious bacteacuterial infections Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S41-51
2008
MONTEIRO J et al First report of KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae
strains in Brazil Antimicrob Agents Chemother Jan53(1)333-4 2009
MOREIRA V C et al Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia a antibioacuteticos
Disponiacutevel em
lthttpwwwcpglsucgbr6mostraartigosSAUDEVANESSA20CARVALHO20M
OREIRApdfgt Acesso em 21 marccedilo 2014
NETIKUL T et al Emergence of novel blaKPC-12 and blaKPC-13 variants in
carbapenem non-susceptible Enterobacter cloacae a first report of blaKPC gene in
Thailand European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases May
S372 2011
NETO V A et al Antibioacuteticos na praacutetica Meacutedica 6ordf Ediccedilatildeo Editorial
SarverSP Brasil 2007
NICOLAU D P Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of
meropenem Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S32-40 2008
64
OLIVEIRA A C et al Resistecircncia bacteriana e mortalidade em um centro de
terapia intensiva Rev Latino-Am Enfermagem nov-dez 2010
PAAUW A et al Failure to control an outbreak of qnrA 1-positive multidrug-
resistant Enterobacter clocae despite adequate implementation of recommended
infection control measures Journal of Clinical Microbiology v 45 n 5 p 1420-1425
2007
PATERSON D L et al Extended-Spectrum Beta-Lactamases a Clinical
Update Clinical Microbiology Reviews v 18 p 657-686 2005
PEIRANO G et al Carbapenem-hydrolysing beta-lactamase KPC-2 in
Klebsiella pneumonia isolated in Rio de Janeiro Brazil J Antimicrob Chemother Nov
20 2009
PERES-BOTA D et al Are infections due to resistant pathogens associated
with worse outcome in critically ill patients J Infect 200347(4)307-16
PIDDOCK L J V Clinically relevant chromosomally encoded multidrug
resistance effl ux pumps in bacterial Clin Microbiol Rev n19 p382-402 2006
PITOUT J D D et al Emergence of Enterobacteriaceae producing
extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) in the community J Antimicrob
Chemother May 56 2005
POSSEBON M I et al Resistecircncia bacteriana aos carbapenecircmicos
Bacterial resitence to carbapenems RBM rev bras med60(6)378380-378-382
jun 2003
QUEENAN A M et al Carbapenemases the versatile beta-lactamases
Clin Microbiol Rev Jul20(3)440-58 2007
65
RHOMBERG P R et al Summary trends for the meropenem yearly
susceptibility test information collection program a 10- year experience in the United
States (1999-2008) Diagnostic Microbiology and Infectiois Disease v 65 n4 p
414-426 2009
ROBLEDO I E et al Detection of KPC in Acinetobacter spp in Puerto Rico
J Antimicrob Agents Chemother 54 1354-1357 Mar 2010
ROGERS B A et al Country-to-country transfer os patients and the risk of
multi-resistant bacterial infection Clinical Infectious Disease v53 n1 p49- 56
2011
SHAH A A et al Characteristics epidemiology and clinicalimportance of
emerging strains of Gram-negative bacilli producing extended-spectrum
betalactamases Research in Microbiology v 155 p 409-421 2004
TURNER P J Extended- Spectrum Beta-Lactamases Clinical Infectious
Diseases v 41 p 273-275 2005
WOLTER D J et al Phenotypic and Enzymatic Comparative Analysis
between the Novel KPC variant KPC-5 and Its Evolutionary Variants KPC-2 and
KPC-4 Antimicrob Agents Chemother Nov 17 2008
WOODFORD N et al Carbapenemases of Chryseobacterium
(Flavobacterium) meningosepticum distribution of blaB and characterization of a
novel Metalo-beta-lactamase gene blaB3 in the type strain NCTC 10016
Antimicrob Agents Chemother Jun44(6)1448-52 2000
WOODFORF N Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in
India Pakistan and the UK a molecular biological and epidemiological study The
Lancet Infectious Diseases v 10 n 9 p 597-602 2010
66
WOODFORD et al Outbreak of Klebsiella pneumoniae Producing a New
Carbapenem- Hydrolyzing Class A β-Lactamase KPC-3 in a New York Medical
Center Antimicrobial agents and chemotherapy Dec 2004 p 4793ndash4799 Vol 48
No 12
YAGI T et al A preliminary survey of extended-spectrum β-lactamases
(ESBLs) in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Japan
FEMS Microbiology Letters 184 (2000) 53-56
YIGIT H et al Novel carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase KPC-1 from
a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumonia J Antimicrob Agents
Chemother 45 (4) 1151-1161 (2001)
ZAVASCKI A P et al KPC-2- producing Enterobacter cloacae in two cities
from Southern Brazil Int J Antimicrob Agents Apr 28 2009
ZHANEL G G et al Comparative review of the carbapenecircmicos Drugs
67(7)1027-52 2007
67
ANEXOS
Sequumlecircncia do oligo blaKPC
Query 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
Query 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
Query 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
68
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
Query 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
Query 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
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Sbjct 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
69
Query 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
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Sbjct 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
Query 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
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Sbjct 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
Query 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
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70
Sbjct 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
Query 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
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Sbjct 481
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ATTTGTT 540
Query 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
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Sbjct 541
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GCGATAC 600
Query 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
71
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|||||||
Sbjct 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
Query 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
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Sbjct 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
Query 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
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|||||||
Sbjct 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
72
Query 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
Query 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
Query 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
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|||||||
73
Sbjct 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
Query 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
Query 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Sbjct 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
Query 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
74
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
Query 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
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|||||||
Sbjct 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
Query 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
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|||||||
Sbjct 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
75
Query 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
Query 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
||||
Sbjct 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
LOCUS AF297554 1377 bp
DNA linear BCT 26-MAR-2001
DEFINITION Klebsiella pneumoniae carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
gene complete cds
ACCESSION AF297554
VERSION AF2975541 GI10121874
76
KEYWORDS
SOURCE Klebsiella pneumoniae
ORGANISM Klebsiella pneumoniae
Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Enterobacteriaceae Klebsiella
REFERENCE 1 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH QueenanAM
AndersonGJ Domenech-SanchezA
BiddleJW StewardCD
AlbertiS BushK and TenoverFC
TITLE Novel carbapenem-hydrolyzing beta-
lactamase KPC-1 from a
carbapenem-resistant strain of
Klebsiella pneumoniae
JOURNAL Antimicrob Agents Chemother 45 (4)
1151-1161 (2001)
PUBMED 11257029
REFERENCE 2 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH AndersonGJ and
TenoverFC
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (19-AUG-2000) Nosocomial
Pathogens Laboratory Branch
Centers for Disease Control and
Prevention 1600 Clifton Rd MS
G08 Atlanta GA 30333 USA
FEATURES LocationQualifiers
77
source 11377
organism=Klebsiella
pneumoniae
mol_type=genomic DNA
db_xref=taxon573
-35_signal 5560
-10_signal 7883
mRNA 921012
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
RBS 117122
CDS 1311012
note=blaKPC-1
codon_start=1
transl_table=11
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
protein_id=AAG134101
db_xref=GI10121875
translation=MSLYRRLVLLSCLSWPLAGFSATALTNLVAEPFAKLEQD
FGGSI
GVYAMDTGSGATVSYRAEERFPLCSSFKGFLAAAVLARSQQQAGLLDTPIRYG
KNALV
PWSPISEKYLTTGMTVAELSAAAVQYSDNAAANLLLKELGGPAGLTAFMRSIG
DTTFR
78
LDRWELELNSAIPSDARDTSSPRAVTESLQKLTLGSALAAPQRQQFVDWLKGN
TTGNH
RIRAAVPADWAVGDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTRAPNKDDK
HSEAV
IAAAARLALEGLGVNGQ
ORIGIN
1 cggggcagtt acagccgtta cagcctctgg
agagggagcg gcttgccgct cggtgataat
61 cccagctgta gcggcctgat tacatccggc
cgctacacct agctccacct tcaaacaagg
121 aatatcgttg atgtcactgt atcgccgtct
agttctgctg tcttgtctct catggccgct
181 ggctggcttt tctgccaccg cgctgaccaa
cctcgtcgcg gaaccattcg ctaaactcga
241 acaggacttt ggcggctcca tcggtgtgta
cgcgatggat accggctcag gcgcaactgt
301 aagttaccgc gctgaggagc gcttcccact
gtgcagctca ttcaagggct ttcttgctgc
361 cgctgtgctg gctcgcagcc agcagcaggc
cggcttgctg gacacaccca tccgttacgg
421 caaaaatgcg ctggttccgt ggtcacccat
ctcggaaaaa tatctgacaa caggcatgac
481 ggtggcggag ctgtccgcgg ccgccgtgca
atacagtgat aacgccgccg ccaatttgtt
541 gctgaaggag ttgggcggcc cggccgggct
gacggccttc atgcgctcta tcggcgatac
79
601 cacgttccgt ctggaccgct gggagctgga
gctgaactcc gccatcccaa gcgatgcgcg
661 cgatacctca tcgccgcgcg ccgtgacgga
aagcttacaa aaactgacac tgggctctgc
721 actggctgcg ccgcagcggc agcagtttgt
tgattggcta aagggaaaca cgaccggcaa
781 ccaccgcatc cgcgcggcgg tgccggcaga
ctgggcagtc ggagacaaaa ccggaacctg
841 cggagtgtat ggcacggcaa atgactatgc
cgtcgtctgg cccactgggc gcgcacctat
901 tgtgttggcc gtctacaccc gggcgcctaa
caaggatgac aagcacagcg aggccgtcat
961 cgccgctgcg gctagactcg cgctcgaggg
attgggcgtc aacgggcagt aaggctctga
1021 aaatcatcta ttggcccacc accgccgccc
ttgcgggcgg catggattac caaccactgt
1081 cacatttagg ctaggagtct gcgcggcaga
gccgtgtgac cggttttctg tagagcactg
1141 acgatggcgg cggcgctctc tgcaattggc
aaggcgtcgg cgccaaggat accaatcttg
1201 cggcgcgcgg cgtgttatga cgactggggt
gcatttgagc cgccccattt aaccttcgcc
1261 ctcacagata cgccattcgc ctcaaattta
gcgccatgca gacgagcttc cactcggctt
1321 gcaccttgtc caggcccctc atgctgaact
gacgcaatcc catcaccgcc ttgatca
80
37
4 5 Extraccedilatildeo de DNA bacteriano
A extraccedilatildeo de DNA bacteriano foi realizada utilizando o kit NucleoSpin
Plasmidreg (MN) Antes de iniciar a extraccedilatildeo foi feito a preparaccedilatildeo das soluccedilotildees
reagentes materiais e amostras (vortexando) colocou-se em banho-maria agrave 50ordmC o
tampatildeo AW Partiu-se de colocircnias isoladas cultivadas que sofreram passagem em
meio LB liacutequido por 12h Adicionou-se 15 mL da amostra no tubo eppendorf
centrifugou por 5 minutos descartou o sobrenadante (com cuidado para natildeo
descartar o Pellet) Repetiu-se este procedimento por mais trecircs vezes completando-
se o volume de 6mL Foram adicionados 250microL do tampatildeo Resuspension Buffer A1
encostando a ponteira no Pellet e misturando (este tampatildeo tem como funccedilatildeo
separar a formaccedilatildeo de grumos celulares) Apoacutes isso homogeneizou e vortexou os
tubos eppendorfs Apoacutes isso foram adicionados 250microL do tampatildeo Lysis Buffer A2
homogenizou e deixou descansar por 5 minutos (esta etapa eacute importante para a lise
da parede e da membrana celulares e liberaccedilatildeo do conteuacutedo da ceacutelula)
Passado o tempo de descanso foi adicionado 300microL do tampatildeo
Neutralization Buffer A3 homogeneizou e centrifugou por 10 minutos (este tampatildeo
iraacute retirar as proteiacutenas que envolvem o DNA e voltaraacute com o pH para proacuteximo de 8
impedindo que a soluccedilatildeo de lise facilite a quebra das ligaccedilotildees covalentes do aacutecido
nucleacuteico) Em seguida enumeraram-se os tubos contendo filtros com siacutelica
transferiu-se o sobrenadante para o filtro e centrifugou por 5 minutos Descartou-se
o que foi filtrado adicionou 500microL do tampatildeo AW (banho-maria) centrifugou por 2
minutos Novamente foi descartado o filtrado Adicionou-se 600microL do tampatildeo A4
centrifugou por 2 minutos e descartou o filtrado (os tampotildees AW e A4 contecircm
isotiocianato de guanidina em concentraccedilotildees crescentes para facilitar a adsorccedilatildeo
do DNA na siacutelica e retirada das outras biomoleacuteculas da amostra) Foi feita outra
centrifugaccedilatildeo com o tubo vazio Apoacutes isto o filtro foi trocado para outro eppendorf
definitivo onde foi adicionado 50microL do tampatildeo Elution Buffer AE (este tampatildeo
favorece a eluiccedilatildeo do DNA) centrifugou por 2 minutos descartou o filtro e
armazenou as amostras em freezer -20ordmC
38
4 6 Iniciadores e reaccedilatildeo de PCR
Os iniciadores universais para o gene blaKPC foram desenhados baseados
em sequumlecircncias conservadas apresentadas pelos sub-grupos de genes que
codificam a enzima carbapenemase de klebsiella pneumoniae (YIGIT et al 2001)
Baseado na sequumlecircncia para o blakpc-1 depositada no GenBank
(AF2975541) o oligonucleotiacutedio (oligo) iniciador direto (5-
ATGTCACTGTATCGCCGTC-3rsquo) foi desenhado para reconhecer a sequumlecircncia
blaKPC na posiccedilatildeo (131149) enquanto que o iniciador reverso (5-
TTACTGCCCGTTGACGCC-3rsquo) foi reconhecido na posiccedilatildeo (9951012) As anaacutelises
baseadas em alinhamento de sequumlecircncias mostraram que o par de iniciadores
blaKPC podem detectar os alelos de 1 a 13 do gene blaKPC conforme a tabela 2
Tabela 2 Nuacutemero de acesso ao GenBank dos alelos blaKPC e seus
microrganismos originais
Nuacutemero de
Acesso GenBank
Microrganismo Alvo
AF2975541 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-1
GU0862251 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-2
HQ2589341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-2-like
AB5577341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC -3
EU4473041 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-4
EU4002222 Pseudomonas
aeruginosa
blaKPC-5
EU5555341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-6
EU7297271 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-7
39
FJ2344121 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-8
FJ624872 Escherichia coli blaKPC-9
GQ1403481 Acinetobacter
baumannii
blaKPC-10
HM0669951 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-11
HQ3428891 Enterobacter cloacae blaKPC-12
HQ3428901 Enterobacter cloacae blaKPC-13
As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo de blaKPC foram realizadas em um
primeiro tempo de desnaturaccedilatildeo em que foi 94ordmC por 5 minutos seguido de 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 58 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 90 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 78ordmC por 8 minutos Aleacutem das amostras foi utilizado um
controle negativo
A PCR do blaKPC foi realizada utilizando os componentes para o volume da
reaccedilatildeo de 25 microL citados na tabela 3 A banda do tamanho do produto de PCR foi de
881 pares de bases (pb) o que corresponde ao plasmiacutedeo
Tabela 3 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do
gene blaKPC
Reagente Volume
DNA molde 4 microL
Tampatildeo Taq 25 microL
MgCl2 075 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP
2 microL
Oligo F 1 microL
Oligo R 1 microL
Taq DNA polimerase 05 microL
Aacutegua MiliQ 1335 microL
40
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
Baseado na sequumlecircncia para o gene 16S rRNA em que o oligonucleotiacutedio
Universal iniciador direto foward (5-CCAGCAGCCGCCGTAATACG-3rsquo) foi
desenhado para reconhecer a sequumlecircncia universal na posiccedilatildeo 1513 enquanto que o
iniciador reverso (5-ATCGGYTACCTTGTTACGACTTC-3rsquo) foi reconhecido na
posiccedilatildeo 1491 foram realizadas PCRrsquos As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo deste
gene foram realizadas nos seguinte tempos separaccedilatildeo 94ordmC por 10 minutos 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 55 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 120 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 72ordmC por 10 minutos
A PCR do gene 16S rRNA foi realizada utilizando os componentes para o
volume da reaccedilatildeo de 25microL citados na tabela 4 A banda do tamanho do produto de
PCR foi de 996 pb correspondente aacute regiatildeo ribossomal capaz de amplificar todas
as espeacutecies
Tabela 4Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do gene
universal
Reagente (quantidade
concentraccedilatildeo do estoque)
Volume
DNA molde 10 ng 4 microL
Tampatildeo Taq 10 x 25 microL
MgCl2 50mM 125 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP 25 mM
125 microL
Oligo F 10microM 05 microL
Oligo R 10microM 05 microL
Taq DNA polimerase 5UmicroL 04 microL
Aacutegua Miliq 146 microL
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
41
O termociclador utilizado para os experimentos foi o LifeTouch da BIOER
4 7 Digestatildeo
Para realizaccedilatildeo da digestatildeo foi utilizada a enzima BshF I (Hae III) EN- 1105
tamanho 7000 units concentraccedilatildeo 10 unitsmicroL fonte Bacillus sphaericus empresa
Jena bioscienceUtilizaram-se os componentes para o volume de 50microL da reaccedilatildeo
citados na tabela 5
Tabela 5 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da digestatildeo do gene
universal
Reagente Volume
Produto de PCR 10 microL
Enzima BshF I 01 microL
Tampatildeo (10x) 5 microL
Aacutegua Miliq 349 microL
Total (em cada ependorff) 50 microL
Valores para 1 digestatildeo
Os ependorffs foram colocados por 30 minutos em banho-maria a 37ordmC Apoacutes
isso fez-se a corrida das amostras em gel de agarose para verificaccedilatildeo do resultado
(LU et al 2000)
4 8 Eletroforese em gel de agarose
Os produtos de DNA PCR e digestatildeo foram analisados em gel de agarose
2 O tempo de corrida do gel eacute de aproximadamente 1hora e 30minutos sendo
que no comeccedilo foi usada agrave voltagem de 50 V e apoacutes comeccedilar a correr o gel
aumentou a voltagem para 100 v Utilizou-se o marcador de 100pb (pares de bases)
Foi adicionado 3microL de corante Bromophenol (que tem a funccedilatildeo de fazer uma ligaccedilatildeo
na amostra de DNA e permitir a visualizaccedilatildeo da corrida no gel de agarose) em 7microL
de amostra tanto de DNA quanto de PCR Para o preparo do gel foi utilizado TBE
42
(Tris- Aacutecido Boacuterico) agarose e brometo de etiacutedio (sua funccedilatildeo eacute de corante para o gel
e permitir a visualizaccedilatildeo do DNA quando colocado agrave luz ultravioleta) Para o oligo
blaKPC a banda da amplificaccedilatildeo foi em 881ppb correspondendo ao plasmiacutedeo Jaacute
o oligo Universal foi em 996 pb
4 9 Descarte de resiacuteduos
Todos os materiais utilizados nos ensaios foram de uso uacutenico e manipulados
em cacircmaras de seguranccedila bioloacutegica classe II Apoacutes o uso foram colocados em
soluccedilatildeo desinfetantes (hipoclorito a 1) e em seguida autoclavados a 127oC por 20
min em sacos apropriados para autoclavaccedilatildeo Apoacutes a finalizaccedilatildeo do ciclo de
esterilizaccedilatildeo os sacos contendo o material descartaacutevel foram colocados em
recipientes de coleta da empresa responsaacutevel pela coleta de materiais bioloacutegicos
produzidos no laboratoacuterio de microbiologia Todos os procedimentos seguiram a
normativa RDC-ANVISA 3062004 sobre o descarte de resiacuteduos de serviccedilo de
sauacutede
4 10 Aspectos epidemioloacutegicos e cliacutenicos
Os aspectos cliacutenicos e epidemioloacutegicos foram investigados por meio de
prontuaacuterios dos pacientes portadores de enterobacteacuterias produtoras de
carbapenemases e envolveram topografia mais provaacutevel do foco infeccioso a
enfermidade motivadora da internaccedilatildeo o desfecho cliacutenico a idade e o tempo de
internaccedilatildeo
4 12 Anaacutelises eepidemioloacutegicas
As anaacutelises foram realizadas com o pacote estatiacutestico SPSS versatildeo 200
Para verificar quais variaacuteveis referentes aos dados epidemioloacutegicos e
microbioloacutegicos influenciaram no desfecho verificou- se a diferenccedila meacutedia das
variaacuteveis idade e tempo de internaccedilatildeo em cada grupo O teste estatiacutestico utilizado foi
o teste t de Student apoacutes se executar o teste de normalidade de Shapiro-Wilk Para
as variaacuteveis sexo perfil microbioloacutegico das enterobacteacuterias produtoras de
43
carbapenemases foi avaliada a associaccedilatildeo com o desfecho por meio do teste Exato
de Fisher O niacutevel de significacircncia adotado foi de 5
4 13 Preceitos eacuteticos
Este projeto estaacute inserido em um projeto maior denominado ldquoEpidemiologia
cliacutenica e caracterizaccedilatildeo molecular do Acinetobacter Baumannii resistente a
antibioticoterapia em pacientes internado em hospitais do Sistema Uacutenico de Sauacutederdquo
que foi submetido ao Comitecirc de Eacutetica em Pesquisa da Secretaria do Estado de
Sauacutede do Distrito Federal (SESDF) e emitido parecer aprovado pelo protocolo nordm
23109 (anexo)
44
5 RESULTADOS
51 Anaacutelise molecular
Para a amplificaccedilatildeo com o oligo blaKPC foram amplificadas amostras
que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 881 pb correspondente ao
plasmiacutedeo A anaacutelise da amplificaccedilatildeo da regiatildeo do gene blaKPC mostrou que
apenas a amostra A10 natildeo amplificou isso demonstra que esta amostra natildeo
possuiacutea o gene de resistecircncia
5 1 1 Gene blaKPC
Figura 7 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 881 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
A amostra A3 natildeo amplificou no primeiro momento entatildeo foi realizado
novamente a PCR e corrida de gel obtendo entatildeo a amplificaccedilatildeo da amostra como
apresentado na figura 8
45
Figura 8 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC da
mostra A3 estudada A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo de 881
pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 1 2 Gene 16S rRNA
Para a amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA utilizou-se o oligo universal Foram
amplificadas amostras que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 996 pb
Figura 9 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
46
Segundo Lu et al (2000) a digestatildeo com a enzima HaeIII deste amplicons de
16S rRNA devolveriam bandas com perfis entre 150 a 200 pb No gel abaixo eacute
possiacutevel evidenciar que este perfil ocorreu com o predomiacutenio de bandas na altura
de 200pb
Figura 10 Gel de agarose a 2 da digestatildeo do amplicon do gene 16S
rRNA das amostras com a enzima HaeIII evidenciando diversos fragmentos
proacuteximos a 200 pb A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo ribossomal
de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 2 Anaacutelises epidemioloacutegicas
5 2 1 Sexo
No total foram detectados 17 isolados de KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 onde a maior a prevalecircncia foi
detecatada em amostras de pacientes do sexo masculino (53) do que no sexo
feminino (47)
47
Figura 11 Isolado de KPC segundo sexo dos 17 pacientes investigados
no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 2 Desfecho cliacutenico
Em 17 isolados de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo
de 2010 aacute 2011 a porcentagem de pacientes que foram a oacutebito (59) foi maior que
a de pacientes que tiverm alta (41)
Figura 12 Isolado de KPC segundo desfecho cliacutenico dos 17 pacientes
investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
48
5 2 3 Local da coleta
Dos 17 episoacutedios detectados de infecccedilatildeo por KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 a infecccedilatildeo em swab retalfoi mais
frequente (47) seguida de ponta de cateacuteter (18) e secreccedilatildeo traqueal (12)
Figura 13 Isolados de KPC segundo local da coleta da amostra nos 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 4 Microorganismo
O microorganismo mais encontrado foi a Klebsiella pneumoniae (82)
seguida da Enterobacter clocae (12) e Serratia marcescens (6) dos 17 isolados
de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 Isto afirma o
fato de a sigla KPC ser utilizada de forma errocircnea aacute Klebsiella pneumoniae visto
que a evidecircncia dela eacute maior em relaccedilatildeo as outras cepas
49
Figura 14 Isolado de KPC segundo microrganismo encontrado em 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 5 Relaccedilotildees variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana e desfecho
cliacutenico
Tabela 6 ndash Distribuiccedilatildeo do perfil geneacutetico sexo coleta tipificaccedilatildeo de
microrganismos e anaacutelise da resistecircncia bacteriana segundo o desfecho
cliacutenico Brasiacutelia-DF 2010 a 2011
Variaacutevel Resultado
Desfecho
Alta Oacutebito
N N P
Gene 16S rRNA Positivo 7 1000 10 1000
NA Gene blaKPC Positivo 6 857 10 1000
Negativo 1 143 0 00 0218 Sexo Feminino 2 286 6 600
Masculino 5 714 4 400 0201 Local da coleta Fundo saco de
Douglas 1 143 0 00
Hemocultura 0 00 1 100 0463 Ponta de cateter 1 143 2 200
Sec TraquealBrocircnquica
0 00 1 100
50
Secreccedilatildeo traqueal 2 286 0 00
Swab retal 3 429 5 500
Urina 0 00 1 100
Microrganismo Enterobacter cloacae (KPC)
1 143 1 100
Klebsiella pneumoniae
6 857 8 800
0416 Serratia
marcescens 0 00 1 100
Teste de Hodge Hodge positivo 7 1000 10 1000
NA Amicacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 1 100 0848 resistente 0 00 1 100
sensiacutevel 2 286 3 300
Amoxicilina Aacutecido Clavulacircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Ampicilina Sulbactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ampicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Aztreonan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefazolina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Cefoperazona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Cefotaxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefoxitina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0509 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 2 286 4 400
Ceftazidima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cetriaxona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 3 429 5 500 0772 Cefalotina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ciprofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772
51
resistente 3 429 5 500
Claritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Clindamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Eritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Gentamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0942 resistente 2 286 3 300
sensiacutevel 1 143 2 200
Imipenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 0 00 2 200 0193 Resistente 1 143 3 300
sensiacutevel 2 286 0 00
Nitrofurantoiacutena sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Norfloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Oxacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Penicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Piperacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Rifampicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tetraciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Ticarcilina Aacutecido Clavulocircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0688 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 3 429 4 400
Tobramicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Trimetoprima Sulfametoxazol
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0112 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 2 286 0 00
Vancomicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tigeciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediario 0 00 1 100 0211 natildeo testado 1 143 4 400
resistente 2 286 0 00
52
Cefepime sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefuroxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Levofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Piperacilina Tazobactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Ertapenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Meropenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0223 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 1 143 0 00
Cefotetan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 sensiacutevel 0 00 1 100
Gemifloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 7 700 0585 natildeo testado 3 429 3 300
Desfecho
Alta Oacutebito
Meacutedia Erro
padratildeo Meacutedia Erro
padratildeo p
Idade 58 9 59 5 0991
Tempo Internaccedilatildeo (dias)
50 13 46 12 0571
n= 17 p(lt 005) NA natildeo se aplica
53
6 DISCUSSAtildeO
Nos uacuteltimos anos houve um aumento na incidecircncia de bacteacuterias
multirresistentes aos antimicrobianos no ambiente hospitalar tornando isto um
problema mundial de sauacutede puacuteblica (HULSCHER et al 2010) Quando se trata
principalmente de bacilos Gram negativos a frequumlecircncia destas bacteacuterias eacute ainda
maior em paiacuteses da Ameacuterica Latina quando comparada a paiacuteses desenvolvidos
(GALES etal 2012)
De acordo com dados do ldquoMeropenem Yearly Susceptibility Test Information
Collectionrdquo (MYSTIC) ocorreu nos Estados Unidos um aumento na susceptibilidade
de K pneumoniae nos uacuteltimos anos graccedilas a praacuteticas de controle de disseminaccedilatildeo
de amostras resistentes(RHOMBERG P R et al 2009) O aumento crescente da
prevalecircncia destes microrganismos foi proporcional ao aumento da dependecircncia do
uso de antibioacuteticos carbapenecircmicos considerados como a opccedilatildeo terapecircutica para o
tratamento de infecccedilotildees por bacilos Gram negativos multi-resistentes (LIVERMORE
2012) Isto afeta diretamente as opccedilotildees de tratamento sobrando poucas alternativas
para a terapecircutica que incluem colistina (polimixina E) e tigeciclina que apresentam
respectivamente problemas em termos de toxicidade e eficaacutecia (LIVERMORE et
al 2011) Um dos efeitos adversos mais importantes das poliminas B e E por
exemplo satildeo a neurotoxicidade e nefrotoxicidade (MENDES C A C et al2009 )
Devido agrave resistecircncia ser usualmente de natureza plasmidial e portanto de
maior disseminaccedilatildeo especialmente quando carreadas por K pneumoniae
microrganismo com uma notoacuteria capacidade para acumular e transferir plasmiacutedeos
com determinantes para resistecircncia o nuacutemero de casos detectados pelo
fenoacutetipogenoacutetipo blaKPC eacute bastante preocupante (MONTEIRO et al 2009)
Comparada com outras bacteacuterias hospitalares a transmissatildeo de clones
multirresistentes de K pneumoniae eacute maior e podem natildeo ser controladas pelos
meacutetodos de controle de infecccedilatildeo hospitalar (PAAUW et al 2007) A forma
plasmidial para transferecircncia da resistecircncia adicionada a este grande potencial para
disseminaccedilatildeo de clones resistentes eacute preocupante visto que apoacutes surtos muitas
vezes pode se tornar endecircmica Jaacute eacute uma realidade a disseminaccedilatildeo desta bacteacuteria
54
entre pacientes hospitais paiacuteses e ateacute mesmo continentes (WOODFORF et al
2010 ROGERS et al 2011)
As chances de surtos satildeo maiores em paiacuteses com poucos recursos devido agrave
maior carecircncia de praacuteticas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees hospitalares e o
uso irracional de antimicrobianos de forma empiacuterica e inadequada (KUMARASAMY
et al 2010) Ateacute o momento os mecanismos de resistecircncia aos cabapenecircmicos
geralmente encontrado eram a produccedilatildeo de ESBL (CTX-M) somada aacute perda de
porina (CARVALHAES et al 2010) Foi notado a partir do ano de 2008 um
aumento no nuacutemero de K pneumoniae produtoras de KPC-2 apresentando outra
forma de resistecircncia (GALES 2012)
Um estudo mostrou que o perfil do paciente colonizado ou infectado por KPC
foi de um paciente entre os 33 e os 82 anos de idade internado haacute mais de 1
semana no hospital A mortalidade geral nos uacuteltimos anos ficou em torno de 7
sendo que dos 77 pacientes estudados 32 (415) pacientes evoluiacuteram para oacutebito
evidenciando a alta morbi-mortalidade associada (ALVES A P et al 2013)
Em estudo com 2316 pacientes avaliados a populaccedilatildeo de sexo masculino foi
de 526 idade meacutedia global de 53 anos (mediana de 55 anos) permanecircncia meacutedia
de 58 dias (mediana de 3 dias) (OLIVEIRA A C et al 2010) Outros trabalhos
apresentaram ausecircncia de significacircncia entre sexoidade e o desenvolvimento de
infecccedilotildees por microrganismos resistentes (PERES-BOTA D et al 2003 COLPAN
A et al 2005 COELLO R et al 1997)
Outro estudo utilizou um total de 30 amostras sendo elas isoladas de urina
escarro secreccedilatildeo pleural ponta de cateter aspirado traqueal e hemocultura A mais
prevalente foi em urina (40) Entre as 30 cepas analisadas a maior porcentagem
foi da cepa Klebsiella pneumoniae (70) Enterobacter sp (133) Klebsiella
ozaenae (10) Escherichia coli (333) e Klebsiella oxytoca (333)
(DIENSTMANN R et al 2010) Nos Estados Unidos a enzima KPC jaacute se tornou
endecircmica Foi realizada uma pesquisa em dois hospitais de Nova York onde
testaram 602 amostras e 45 apresentaram algum mecanismo de resistecircncia
sendo apenas 33 confirmadas por biologia molecular como KPC-2 (BRATU et
al 2005)
55
Estudo sobre os tipos de ESBL feito no Japatildeo apresentou o tipo Toho-1 como
o mais prevalente nessa pesquisa Ateacute o ano de 2000 ano em que foi publicado tal
estudo este era o primeiro relatoacuterio no Japatildeo para identificar derivados de ESBLs
como tipo de SHV e TEM entre E coli e K pneumoniae Em especial o tipo SHV- 12
foi identificado com uma maior frequumlecircncia Estes resultados indicam que tipos
distintos de ESBLs que satildeo diferentes em sua especificidade de substrato e origem
geneacutetica coexistem no Japatildeo Isto mostra a importacircncia de caracterizar genoacutetipos
distintos de ESBLs e de estar em alerta continuamente para as tendecircncias de
ESBLs no Japatildeo aleacutem da necessidade de uma interpretaccedilatildeo uniforme utilizando as
diretrizes do CSLI para relatar cepas produtoras de ESBL Aleacutem da detecccedilatildeo de
ESBLs satildeo necessaacuterias mais informaccedilotildees tais como o perfil de sensibilidade
especiacutefica para diversas β-lactacircmicos e o local da infecccedilatildeo Esses fatores satildeo
essenciais para a escolha adequada de antibioacuteticos (YAGI T et al 2000)
No ano de 2004 uma pesquisa avaliou a produccedilatildeo de uma enzima de
hidroacutelise de carbapenecircmicos atraveacutes da teacutecnica de sequumlenciamento foi revelado
um novo membro da famiacutelia KPC designado KPC- 3 Pesquisadores encontraram
em um mutante de K pneumoniae uma substituiccedilatildeo de um gene associado com
resistecircncia a Imipenem mas essa substituiccedilatildeo foi considerada improvaacutevel na
contribuiccedilatildeo da resistecircncia aos carbapenecircmicos da espeacutecie estudada Aleacutem da
resistecircncia aos carbapenecircmicos estes isolados eram em sua maioria resistentes agraves
cefalosporinas penicilinas e aminoglicosiacutedeos Usando estudos de transformaccedilatildeo
conjugaccedilatildeo e hibridaccedilatildeo localizaram o alelo blaKPC em plasmiacutedeo aleacutem disso
mostraram que esse alelo tambeacutem carregava uma resistecircncia aos aminoglicosiacutedeos
A transferecircncia das enzimas KPCs foi demonstrada in vitro tanto neste como em
outros estudos pode ser que os plasmiacutedeos que fazem esta transferecircncia estavam
comeccedilando a se espalhar no ambiente cliacutenico resultando na multiresistecircncia dessas
estirpes (WOODFORD et al 2004)
O presente estudo apresentou um vieacutes quanto aos resultados dos testes de
susceptibilidade microbiana Observou-se que natildeo foi encontrado resultado deste
teste em algumas amostras o que natildeo cooperou para um estudo mais preciso
futuros estudos quanto agraves amostras e um melhor acompanhamento deste tipo de
patologia Poreacutem mesmo sem algumas amostras com este resultado disponiacutevel foi
56
confirmada a presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos
carbapenecircmicos por meio dos genes de resistecircncia blaKPC e 16S rRNA que as
amostras apresentaram em sua maioria serem portadoras Quanto aos resultados
estatiacutesticos nenhuma das variaacuteveis apresentou significacircncia estatiacutestica (p gt 005)
mostrando assim que estas variaacuteveis isoladas natildeo foram o fator determinante para
o desfecho cliacutenico de alta ou oacutebito
57
7 CONCLUSAtildeO
Os genes blaKPC e 16S rRNA foram caracterizados confirmando a a
presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos carbapenecircmicos
Houve uma maior prevalecircncia da cepa K pneumoniae e isto confirma outros
estudos que apresentam a maior prevalecircncia desta cepa em amostras com KPC
Aleacutem disso isso justifica a forma popular da K pneumoniae ser chamada de KPC
enquanto que na verdade KPC eacute uma enzima podendo estar presente em outras
cepas como Enterobacter clocae tambeacutem apresentada no presente estudo O
desfecho cliacutenico de oacutebitos maior que 50 eacute um possiacutevel indicador sobre a
necessidade de se realizar um teste raacutepido para identificaccedilatildeo de KPC visando
iniciar o mais raacutepido possiacutevel o tratamento afim de diminuir a mortalidade por esta
infecccedilatildeo
Nenhuma das variaacuteveis isoladamente estaacute relacionada ao desfecho cliacutenico
oacutebito ou alta pois natildeo apresentaram relevacircncia estatiacutestica O presente estudo
mostrou que haacute presenccedila da bacteacuteria nas amostras de pacientes do hospital
estudado podendo entatildeo afirmar que este tipo de bacteacuteria se encontra tambeacutem
presente em ambiente hospitalar O uso irracional de antimicrobiano eacute demonstrado
de forma indireta quando foi apresentado atraveacutes do Teste de Hodge Modificado
uma resistecircncia de 100 aos antibioacuteticos carbapenecircmicos Isto tambeacutem reflete na
terapecircutica sendo que pacientes portadores de bacteacuterias resistentes aos
antibioacuteticos carabepecircmicos tem uma escassa opccedilatildeo de tratamento e as opccedilotildees
apresentam problemas quanto agrave toxicidade e eficaacutecia
58
REFEREcircNCIAS
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Mecanismos
de resistecircncia bacteriana aos antimicrobianos Disponiacutevel em
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controleopas_
webmodulo3mec_sitiohtmgt Acesso em 25 de abril de 2014
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Nota teacutecnica nordm
012013 medidas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees por enterobacteacuterias
multiresistentes Acesso em 17 de abril de 2013
ALBA J et al Kinetics study of KPC-3 a plasmid-encoded class A
carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase Antimicrob Agents Chemother
Nov49(11)4760-2 2005
ALVES A P et al Nosocomial infections by KPC-producing enterobacteria in
a tertiary hospital in Southern Brazil Revista da AMRIGS Porto Alegre 57 (3) 213-
218 jul-set 2013
ALVES A et al Tipagem Geneacutetica de Microrganismos Lab De Diversidade
Microbiana Centro de Biologia Celular Dep de Biologia U de Aveiro 3810-193
Aveiro- 2003
BELL J M et Al Prevalence and significance of a negative extended-
spectrum beta-lactamase (ESBL) confirmation test result after a positive ESBL
screening test result for isolates of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae
results from the SENTRY Asia-Pacific Surveillance Program J Clin Microbiol
May45(5)1478-82 2007
BRATU S et al Detection of KPC carbapenem-hydrolyzing enzymes in
Enterobacter spp from Brooklyn New York Antimicrob Agents Chemother v 49 n
2 p 776-8 2005
59
BRATU S et al Emergence of KPC-possessing Klebsiella pneumoniae in
Brooklyn New York epidemiology and recommendations for detection Antimicrob
Agents Chemother v 49 n 7 p 3018-20 2005
BRATU S et al Rapid spread of carbapenem-resistant Klebsiella
pneumoniae in New York City Arch Intern Med v 165 p 1430-5 2005
CAMARGO C F et al Aplicaccedilatildeo das teacutecnicas de pcr e suas teacutecnicas
derivadas em diagnoacutestico molecular Disponiacutevel em
ltfileDUnB10C2BA20semestreArtigosPCR-
20CLEYTON20FLORENCIO20DE20CAMARGO20E20PAULO20ROB
ERTO20QUEIROZpdfgtgt Acesso em 08 de abril de 2014
CARVALHES C G et al Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting
carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive
results Journal of Antimicrobial Chemotherapy v 65 n2 p 249-251 2010
CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION- CDC Modified
Hodge Test for Carbapenemase Detection in Enterobacteriaceae 2004
CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE Methods for
dilutionantimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically Approved
standard M7ndashA7 7th ed CLSI Wayne PA 2011
COELLO R et al Risk factors for developing clinical infection with methicillin-
resistant Staphylococcus aureus (MRSA) amongst hospital patients initially only
colonized with MRSA J Hosp Infect 19973739-46
COLPAN A et al Evaluation of risk factors for mortality in intensive care
units A prospective study from a referral hospital in Turkey Am J Infect Control
200533(1)42-7
60
CORNAGLIA G et al Living with ESBLs Introduction Clinical Microbiology
and Infection 14 Suppl 1 1-2 2008
COTRIM E R et al Klebsiella pneumoniae carbapenemase ndash KPC em
Enterobacteriaceae o desafio das bacteacuterias multirresistentes Poacutes em revista do
centro universitaacuterio Newton Paiva 12012 - ediccedilatildeo 5 - issn 2176 7785
DESHPANDE L M et al Occurrence and characterization of
carbapenemase-producing Enterobacteacuteriaceae report from the SENTRY
Antimicrobial Surveillance Program (2000-2004) Microb Drug Resist 12(4)223-30
2006
DIAS D J A Estudos dos principais mecanismos de resistecircncia aos
antibioacuteticos β-lactacircmicos em bacteacuterias patogecircnicas gram negativas 2009 100 f
Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Geneacutetica Molecular e Biomedicina) ndash Faculdade de
Ciecircncias e Tecnologia Universidade de Nova Lisboa Lisboa
DIENSTMANN R et al Avaliaccedilatildeo fenotiacutepica da enzima Klebsiella
pneumoniae carbapenemase (KPC) em Enterobacteriaceae de ambiente hospitalar
J Bras Patol Med Lab v 46 n 1 p 23-27 fevereiro 2010
ENDIMIAMI A et al Emergence of blaKPC-containing Klebsiella
pneumoniae in a long-term acute care hospital a new challenge to our healthcare J
Antimicrob Chemother 64 1102-1110 Nov 2009
FALAGAS M E et al Extended-spectrum beta-lactamase producing
organisms The Journal of Hospital Infection 73 (4) pp 345-54 2009
FONTANA C et al Emergence of KPC-producing Klebsiella pneumoniae in
Italy BMC Rev Notes 3 40 2010
61
GALES A C et al Antimicrobial resistance among Gram-negative bacilli
isolated from Latin America results from Sentry Antimicrobial Surveillance Program
(Latin America 2008-2010) Diagnostic Microbiology and Infectious Disease v 3 n
4 p 354 -360 2012
GUPTA N et al Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Epidemiology
and Prevention HEALTHCARE EPIDEMIOLOGY Clinical Infectious Diseases
201153(1)60ndash67 Published by Oxford University Press on behalf of the Infectious
Diseases Society of America 2011
HARBOTTLE H et al Genetics of antimicrobial resistance Anim Biotechnol
n17 p111-124 2006
HENRIQUE W N et al RESISTEcircNCIA BACTERIANA Uniatildeo das
Faculdades Alfredo NasserInstituto de Ciecircncias da Sauacutede Disponiacutevel em lt
httpwwwfaculdadealfredonasseredubrfilespesquisaposter20HENRIQUE20
Wilker20Natividade20SANTIAGO20Silvania20CAVALCANTI20DSP
20ResistC3AAncia20Bacterianapdfgt Acesso em 17 marccedilo 2014
HULSCHER M E J I et al Antibiotic prescribing in hospital a social and
behavioral scientific approach The Lancet Infectious Diaseases v 10 n 3 p 167-
165 2010
KIDWAI M SAPRA P BHUSHAN KR Synthetic strategies and medicinal
properties of beta-lactams Curr Med Chem 1999 695-215
KUMARASAMY K K et al Emergence of a new antibiotic resistance
mechanism in India Pakistan and the UK a molecular biological and
epidemiological stuy The Lancet Infectious Diseases v10 n 9 p 597- 602 2010
LINCOPAN N et al Enterobacteacuteria producing extended-spectrum β-
lacatamases and IMP-1 Metalo-β-lactamases isolated from Brazilian hospitals J Med
62
Microbiol 7 1-3 2006
LINCOPAN N et al First Isolation of Metalo-β-Lacatamase-Producing
Multiresistant Klebsiella pneumoniae from a patient in Brazil J Clin Microbiol 43(1)
516-519 2005
LIVERMORE D M et al What remains against carbapenem- resistant
Enterobacteriaceae Evaluation of choramphenicol ciprofloxacin colistina
fosfomycin minocycline nitrofurantoin temocilin and tigecycline International
Journal of Antimicrobial Agents v 37 n 5 p 415- 459 2011
LIVERMORE D M Fourten years in resistance International Journal of
Antimicrobial Agents v 39 283- 294 2012
LIVERMORE D M Bacterial resistance to carbapenems Adv Exp Med Biol
1995 39025-47
LIVERMORE D M Bacterial resistance origins epidemiology and impact
Clin Infect Dis 36S11-S23 2003
LIVERMORE D M et al Carbapenemases a problem in waiting Curr
Opin Microbiol 2000 3489-95
LU et al Universal pcr for common bacterial pathogens J CLIN
MICROBIOL VOL 38 2000
LU et al Use of PCR with Universal Primers and Restriction Endonuclease
Digestions for Detection and Identification of Common Bacterial Pathogens in
Cerebrospinal Fluid Journal of Clinical Microbiology June 2000 p 2076ndash2080
MARSCHALL J Met al Presence of the KPC Carbapenemase Gene in
Enterobacteriaceae Causing Bacteremia and Its Correlation with In Vitro
Carbapenem Susceptibility J Clin Microbiol 47 239-241 Jan 2009
63
MARTINS WMBS et al Prevalecircncia do gene blaKPC em isolados cliacutenicos
de Enterobacteriaceae e natildeo fermentadores encontrados em amostras clinicas em
um hospital universitaacuterio do Recife X Jornada de ensino pesquisa e extensatildeo ndash
JEPEX 2010 ndash UFRPE Recife 18 a 22 de outubro
MENDES C A C et al Polimixinas Revisatildeo com ecircnfase na sua
nefrotoxicidade Rev Assoc Med Bras 2009 55(6) 752-9
MOHR J F 3rd Update on the efficacy and tolerability of meropenem in the
treatment of serious bacteacuterial infections Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S41-51
2008
MONTEIRO J et al First report of KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae
strains in Brazil Antimicrob Agents Chemother Jan53(1)333-4 2009
MOREIRA V C et al Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia a antibioacuteticos
Disponiacutevel em
lthttpwwwcpglsucgbr6mostraartigosSAUDEVANESSA20CARVALHO20M
OREIRApdfgt Acesso em 21 marccedilo 2014
NETIKUL T et al Emergence of novel blaKPC-12 and blaKPC-13 variants in
carbapenem non-susceptible Enterobacter cloacae a first report of blaKPC gene in
Thailand European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases May
S372 2011
NETO V A et al Antibioacuteticos na praacutetica Meacutedica 6ordf Ediccedilatildeo Editorial
SarverSP Brasil 2007
NICOLAU D P Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of
meropenem Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S32-40 2008
64
OLIVEIRA A C et al Resistecircncia bacteriana e mortalidade em um centro de
terapia intensiva Rev Latino-Am Enfermagem nov-dez 2010
PAAUW A et al Failure to control an outbreak of qnrA 1-positive multidrug-
resistant Enterobacter clocae despite adequate implementation of recommended
infection control measures Journal of Clinical Microbiology v 45 n 5 p 1420-1425
2007
PATERSON D L et al Extended-Spectrum Beta-Lactamases a Clinical
Update Clinical Microbiology Reviews v 18 p 657-686 2005
PEIRANO G et al Carbapenem-hydrolysing beta-lactamase KPC-2 in
Klebsiella pneumonia isolated in Rio de Janeiro Brazil J Antimicrob Chemother Nov
20 2009
PERES-BOTA D et al Are infections due to resistant pathogens associated
with worse outcome in critically ill patients J Infect 200347(4)307-16
PIDDOCK L J V Clinically relevant chromosomally encoded multidrug
resistance effl ux pumps in bacterial Clin Microbiol Rev n19 p382-402 2006
PITOUT J D D et al Emergence of Enterobacteriaceae producing
extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) in the community J Antimicrob
Chemother May 56 2005
POSSEBON M I et al Resistecircncia bacteriana aos carbapenecircmicos
Bacterial resitence to carbapenems RBM rev bras med60(6)378380-378-382
jun 2003
QUEENAN A M et al Carbapenemases the versatile beta-lactamases
Clin Microbiol Rev Jul20(3)440-58 2007
65
RHOMBERG P R et al Summary trends for the meropenem yearly
susceptibility test information collection program a 10- year experience in the United
States (1999-2008) Diagnostic Microbiology and Infectiois Disease v 65 n4 p
414-426 2009
ROBLEDO I E et al Detection of KPC in Acinetobacter spp in Puerto Rico
J Antimicrob Agents Chemother 54 1354-1357 Mar 2010
ROGERS B A et al Country-to-country transfer os patients and the risk of
multi-resistant bacterial infection Clinical Infectious Disease v53 n1 p49- 56
2011
SHAH A A et al Characteristics epidemiology and clinicalimportance of
emerging strains of Gram-negative bacilli producing extended-spectrum
betalactamases Research in Microbiology v 155 p 409-421 2004
TURNER P J Extended- Spectrum Beta-Lactamases Clinical Infectious
Diseases v 41 p 273-275 2005
WOLTER D J et al Phenotypic and Enzymatic Comparative Analysis
between the Novel KPC variant KPC-5 and Its Evolutionary Variants KPC-2 and
KPC-4 Antimicrob Agents Chemother Nov 17 2008
WOODFORD N et al Carbapenemases of Chryseobacterium
(Flavobacterium) meningosepticum distribution of blaB and characterization of a
novel Metalo-beta-lactamase gene blaB3 in the type strain NCTC 10016
Antimicrob Agents Chemother Jun44(6)1448-52 2000
WOODFORF N Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in
India Pakistan and the UK a molecular biological and epidemiological study The
Lancet Infectious Diseases v 10 n 9 p 597-602 2010
66
WOODFORD et al Outbreak of Klebsiella pneumoniae Producing a New
Carbapenem- Hydrolyzing Class A β-Lactamase KPC-3 in a New York Medical
Center Antimicrobial agents and chemotherapy Dec 2004 p 4793ndash4799 Vol 48
No 12
YAGI T et al A preliminary survey of extended-spectrum β-lactamases
(ESBLs) in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Japan
FEMS Microbiology Letters 184 (2000) 53-56
YIGIT H et al Novel carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase KPC-1 from
a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumonia J Antimicrob Agents
Chemother 45 (4) 1151-1161 (2001)
ZAVASCKI A P et al KPC-2- producing Enterobacter cloacae in two cities
from Southern Brazil Int J Antimicrob Agents Apr 28 2009
ZHANEL G G et al Comparative review of the carbapenecircmicos Drugs
67(7)1027-52 2007
67
ANEXOS
Sequumlecircncia do oligo blaKPC
Query 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
Query 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
Query 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
68
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
Query 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
Query 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
69
Query 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
Query 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
Query 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
70
Sbjct 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
Query 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
Query 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
Query 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
71
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
Query 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
Query 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
72
Query 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
Query 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
Query 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
73
Sbjct 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
Query 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
Query 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
Query 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
74
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|||||||
Sbjct 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
Query 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
Query 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
75
Query 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
Query 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
||||
Sbjct 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
LOCUS AF297554 1377 bp
DNA linear BCT 26-MAR-2001
DEFINITION Klebsiella pneumoniae carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
gene complete cds
ACCESSION AF297554
VERSION AF2975541 GI10121874
76
KEYWORDS
SOURCE Klebsiella pneumoniae
ORGANISM Klebsiella pneumoniae
Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Enterobacteriaceae Klebsiella
REFERENCE 1 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH QueenanAM
AndersonGJ Domenech-SanchezA
BiddleJW StewardCD
AlbertiS BushK and TenoverFC
TITLE Novel carbapenem-hydrolyzing beta-
lactamase KPC-1 from a
carbapenem-resistant strain of
Klebsiella pneumoniae
JOURNAL Antimicrob Agents Chemother 45 (4)
1151-1161 (2001)
PUBMED 11257029
REFERENCE 2 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH AndersonGJ and
TenoverFC
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (19-AUG-2000) Nosocomial
Pathogens Laboratory Branch
Centers for Disease Control and
Prevention 1600 Clifton Rd MS
G08 Atlanta GA 30333 USA
FEATURES LocationQualifiers
77
source 11377
organism=Klebsiella
pneumoniae
mol_type=genomic DNA
db_xref=taxon573
-35_signal 5560
-10_signal 7883
mRNA 921012
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
RBS 117122
CDS 1311012
note=blaKPC-1
codon_start=1
transl_table=11
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
protein_id=AAG134101
db_xref=GI10121875
translation=MSLYRRLVLLSCLSWPLAGFSATALTNLVAEPFAKLEQD
FGGSI
GVYAMDTGSGATVSYRAEERFPLCSSFKGFLAAAVLARSQQQAGLLDTPIRYG
KNALV
PWSPISEKYLTTGMTVAELSAAAVQYSDNAAANLLLKELGGPAGLTAFMRSIG
DTTFR
78
LDRWELELNSAIPSDARDTSSPRAVTESLQKLTLGSALAAPQRQQFVDWLKGN
TTGNH
RIRAAVPADWAVGDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTRAPNKDDK
HSEAV
IAAAARLALEGLGVNGQ
ORIGIN
1 cggggcagtt acagccgtta cagcctctgg
agagggagcg gcttgccgct cggtgataat
61 cccagctgta gcggcctgat tacatccggc
cgctacacct agctccacct tcaaacaagg
121 aatatcgttg atgtcactgt atcgccgtct
agttctgctg tcttgtctct catggccgct
181 ggctggcttt tctgccaccg cgctgaccaa
cctcgtcgcg gaaccattcg ctaaactcga
241 acaggacttt ggcggctcca tcggtgtgta
cgcgatggat accggctcag gcgcaactgt
301 aagttaccgc gctgaggagc gcttcccact
gtgcagctca ttcaagggct ttcttgctgc
361 cgctgtgctg gctcgcagcc agcagcaggc
cggcttgctg gacacaccca tccgttacgg
421 caaaaatgcg ctggttccgt ggtcacccat
ctcggaaaaa tatctgacaa caggcatgac
481 ggtggcggag ctgtccgcgg ccgccgtgca
atacagtgat aacgccgccg ccaatttgtt
541 gctgaaggag ttgggcggcc cggccgggct
gacggccttc atgcgctcta tcggcgatac
79
601 cacgttccgt ctggaccgct gggagctgga
gctgaactcc gccatcccaa gcgatgcgcg
661 cgatacctca tcgccgcgcg ccgtgacgga
aagcttacaa aaactgacac tgggctctgc
721 actggctgcg ccgcagcggc agcagtttgt
tgattggcta aagggaaaca cgaccggcaa
781 ccaccgcatc cgcgcggcgg tgccggcaga
ctgggcagtc ggagacaaaa ccggaacctg
841 cggagtgtat ggcacggcaa atgactatgc
cgtcgtctgg cccactgggc gcgcacctat
901 tgtgttggcc gtctacaccc gggcgcctaa
caaggatgac aagcacagcg aggccgtcat
961 cgccgctgcg gctagactcg cgctcgaggg
attgggcgtc aacgggcagt aaggctctga
1021 aaatcatcta ttggcccacc accgccgccc
ttgcgggcgg catggattac caaccactgt
1081 cacatttagg ctaggagtct gcgcggcaga
gccgtgtgac cggttttctg tagagcactg
1141 acgatggcgg cggcgctctc tgcaattggc
aaggcgtcgg cgccaaggat accaatcttg
1201 cggcgcgcgg cgtgttatga cgactggggt
gcatttgagc cgccccattt aaccttcgcc
1261 ctcacagata cgccattcgc ctcaaattta
gcgccatgca gacgagcttc cactcggctt
1321 gcaccttgtc caggcccctc atgctgaact
gacgcaatcc catcaccgcc ttgatca
80
38
4 6 Iniciadores e reaccedilatildeo de PCR
Os iniciadores universais para o gene blaKPC foram desenhados baseados
em sequumlecircncias conservadas apresentadas pelos sub-grupos de genes que
codificam a enzima carbapenemase de klebsiella pneumoniae (YIGIT et al 2001)
Baseado na sequumlecircncia para o blakpc-1 depositada no GenBank
(AF2975541) o oligonucleotiacutedio (oligo) iniciador direto (5-
ATGTCACTGTATCGCCGTC-3rsquo) foi desenhado para reconhecer a sequumlecircncia
blaKPC na posiccedilatildeo (131149) enquanto que o iniciador reverso (5-
TTACTGCCCGTTGACGCC-3rsquo) foi reconhecido na posiccedilatildeo (9951012) As anaacutelises
baseadas em alinhamento de sequumlecircncias mostraram que o par de iniciadores
blaKPC podem detectar os alelos de 1 a 13 do gene blaKPC conforme a tabela 2
Tabela 2 Nuacutemero de acesso ao GenBank dos alelos blaKPC e seus
microrganismos originais
Nuacutemero de
Acesso GenBank
Microrganismo Alvo
AF2975541 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-1
GU0862251 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-2
HQ2589341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-2-like
AB5577341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC -3
EU4473041 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-4
EU4002222 Pseudomonas
aeruginosa
blaKPC-5
EU5555341 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-6
EU7297271 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-7
39
FJ2344121 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-8
FJ624872 Escherichia coli blaKPC-9
GQ1403481 Acinetobacter
baumannii
blaKPC-10
HM0669951 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-11
HQ3428891 Enterobacter cloacae blaKPC-12
HQ3428901 Enterobacter cloacae blaKPC-13
As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo de blaKPC foram realizadas em um
primeiro tempo de desnaturaccedilatildeo em que foi 94ordmC por 5 minutos seguido de 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 58 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 90 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 78ordmC por 8 minutos Aleacutem das amostras foi utilizado um
controle negativo
A PCR do blaKPC foi realizada utilizando os componentes para o volume da
reaccedilatildeo de 25 microL citados na tabela 3 A banda do tamanho do produto de PCR foi de
881 pares de bases (pb) o que corresponde ao plasmiacutedeo
Tabela 3 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do
gene blaKPC
Reagente Volume
DNA molde 4 microL
Tampatildeo Taq 25 microL
MgCl2 075 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP
2 microL
Oligo F 1 microL
Oligo R 1 microL
Taq DNA polimerase 05 microL
Aacutegua MiliQ 1335 microL
40
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
Baseado na sequumlecircncia para o gene 16S rRNA em que o oligonucleotiacutedio
Universal iniciador direto foward (5-CCAGCAGCCGCCGTAATACG-3rsquo) foi
desenhado para reconhecer a sequumlecircncia universal na posiccedilatildeo 1513 enquanto que o
iniciador reverso (5-ATCGGYTACCTTGTTACGACTTC-3rsquo) foi reconhecido na
posiccedilatildeo 1491 foram realizadas PCRrsquos As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo deste
gene foram realizadas nos seguinte tempos separaccedilatildeo 94ordmC por 10 minutos 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 55 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 120 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 72ordmC por 10 minutos
A PCR do gene 16S rRNA foi realizada utilizando os componentes para o
volume da reaccedilatildeo de 25microL citados na tabela 4 A banda do tamanho do produto de
PCR foi de 996 pb correspondente aacute regiatildeo ribossomal capaz de amplificar todas
as espeacutecies
Tabela 4Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do gene
universal
Reagente (quantidade
concentraccedilatildeo do estoque)
Volume
DNA molde 10 ng 4 microL
Tampatildeo Taq 10 x 25 microL
MgCl2 50mM 125 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP 25 mM
125 microL
Oligo F 10microM 05 microL
Oligo R 10microM 05 microL
Taq DNA polimerase 5UmicroL 04 microL
Aacutegua Miliq 146 microL
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
41
O termociclador utilizado para os experimentos foi o LifeTouch da BIOER
4 7 Digestatildeo
Para realizaccedilatildeo da digestatildeo foi utilizada a enzima BshF I (Hae III) EN- 1105
tamanho 7000 units concentraccedilatildeo 10 unitsmicroL fonte Bacillus sphaericus empresa
Jena bioscienceUtilizaram-se os componentes para o volume de 50microL da reaccedilatildeo
citados na tabela 5
Tabela 5 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da digestatildeo do gene
universal
Reagente Volume
Produto de PCR 10 microL
Enzima BshF I 01 microL
Tampatildeo (10x) 5 microL
Aacutegua Miliq 349 microL
Total (em cada ependorff) 50 microL
Valores para 1 digestatildeo
Os ependorffs foram colocados por 30 minutos em banho-maria a 37ordmC Apoacutes
isso fez-se a corrida das amostras em gel de agarose para verificaccedilatildeo do resultado
(LU et al 2000)
4 8 Eletroforese em gel de agarose
Os produtos de DNA PCR e digestatildeo foram analisados em gel de agarose
2 O tempo de corrida do gel eacute de aproximadamente 1hora e 30minutos sendo
que no comeccedilo foi usada agrave voltagem de 50 V e apoacutes comeccedilar a correr o gel
aumentou a voltagem para 100 v Utilizou-se o marcador de 100pb (pares de bases)
Foi adicionado 3microL de corante Bromophenol (que tem a funccedilatildeo de fazer uma ligaccedilatildeo
na amostra de DNA e permitir a visualizaccedilatildeo da corrida no gel de agarose) em 7microL
de amostra tanto de DNA quanto de PCR Para o preparo do gel foi utilizado TBE
42
(Tris- Aacutecido Boacuterico) agarose e brometo de etiacutedio (sua funccedilatildeo eacute de corante para o gel
e permitir a visualizaccedilatildeo do DNA quando colocado agrave luz ultravioleta) Para o oligo
blaKPC a banda da amplificaccedilatildeo foi em 881ppb correspondendo ao plasmiacutedeo Jaacute
o oligo Universal foi em 996 pb
4 9 Descarte de resiacuteduos
Todos os materiais utilizados nos ensaios foram de uso uacutenico e manipulados
em cacircmaras de seguranccedila bioloacutegica classe II Apoacutes o uso foram colocados em
soluccedilatildeo desinfetantes (hipoclorito a 1) e em seguida autoclavados a 127oC por 20
min em sacos apropriados para autoclavaccedilatildeo Apoacutes a finalizaccedilatildeo do ciclo de
esterilizaccedilatildeo os sacos contendo o material descartaacutevel foram colocados em
recipientes de coleta da empresa responsaacutevel pela coleta de materiais bioloacutegicos
produzidos no laboratoacuterio de microbiologia Todos os procedimentos seguiram a
normativa RDC-ANVISA 3062004 sobre o descarte de resiacuteduos de serviccedilo de
sauacutede
4 10 Aspectos epidemioloacutegicos e cliacutenicos
Os aspectos cliacutenicos e epidemioloacutegicos foram investigados por meio de
prontuaacuterios dos pacientes portadores de enterobacteacuterias produtoras de
carbapenemases e envolveram topografia mais provaacutevel do foco infeccioso a
enfermidade motivadora da internaccedilatildeo o desfecho cliacutenico a idade e o tempo de
internaccedilatildeo
4 12 Anaacutelises eepidemioloacutegicas
As anaacutelises foram realizadas com o pacote estatiacutestico SPSS versatildeo 200
Para verificar quais variaacuteveis referentes aos dados epidemioloacutegicos e
microbioloacutegicos influenciaram no desfecho verificou- se a diferenccedila meacutedia das
variaacuteveis idade e tempo de internaccedilatildeo em cada grupo O teste estatiacutestico utilizado foi
o teste t de Student apoacutes se executar o teste de normalidade de Shapiro-Wilk Para
as variaacuteveis sexo perfil microbioloacutegico das enterobacteacuterias produtoras de
43
carbapenemases foi avaliada a associaccedilatildeo com o desfecho por meio do teste Exato
de Fisher O niacutevel de significacircncia adotado foi de 5
4 13 Preceitos eacuteticos
Este projeto estaacute inserido em um projeto maior denominado ldquoEpidemiologia
cliacutenica e caracterizaccedilatildeo molecular do Acinetobacter Baumannii resistente a
antibioticoterapia em pacientes internado em hospitais do Sistema Uacutenico de Sauacutederdquo
que foi submetido ao Comitecirc de Eacutetica em Pesquisa da Secretaria do Estado de
Sauacutede do Distrito Federal (SESDF) e emitido parecer aprovado pelo protocolo nordm
23109 (anexo)
44
5 RESULTADOS
51 Anaacutelise molecular
Para a amplificaccedilatildeo com o oligo blaKPC foram amplificadas amostras
que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 881 pb correspondente ao
plasmiacutedeo A anaacutelise da amplificaccedilatildeo da regiatildeo do gene blaKPC mostrou que
apenas a amostra A10 natildeo amplificou isso demonstra que esta amostra natildeo
possuiacutea o gene de resistecircncia
5 1 1 Gene blaKPC
Figura 7 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 881 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
A amostra A3 natildeo amplificou no primeiro momento entatildeo foi realizado
novamente a PCR e corrida de gel obtendo entatildeo a amplificaccedilatildeo da amostra como
apresentado na figura 8
45
Figura 8 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC da
mostra A3 estudada A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo de 881
pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 1 2 Gene 16S rRNA
Para a amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA utilizou-se o oligo universal Foram
amplificadas amostras que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 996 pb
Figura 9 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
46
Segundo Lu et al (2000) a digestatildeo com a enzima HaeIII deste amplicons de
16S rRNA devolveriam bandas com perfis entre 150 a 200 pb No gel abaixo eacute
possiacutevel evidenciar que este perfil ocorreu com o predomiacutenio de bandas na altura
de 200pb
Figura 10 Gel de agarose a 2 da digestatildeo do amplicon do gene 16S
rRNA das amostras com a enzima HaeIII evidenciando diversos fragmentos
proacuteximos a 200 pb A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo ribossomal
de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 2 Anaacutelises epidemioloacutegicas
5 2 1 Sexo
No total foram detectados 17 isolados de KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 onde a maior a prevalecircncia foi
detecatada em amostras de pacientes do sexo masculino (53) do que no sexo
feminino (47)
47
Figura 11 Isolado de KPC segundo sexo dos 17 pacientes investigados
no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 2 Desfecho cliacutenico
Em 17 isolados de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo
de 2010 aacute 2011 a porcentagem de pacientes que foram a oacutebito (59) foi maior que
a de pacientes que tiverm alta (41)
Figura 12 Isolado de KPC segundo desfecho cliacutenico dos 17 pacientes
investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
48
5 2 3 Local da coleta
Dos 17 episoacutedios detectados de infecccedilatildeo por KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 a infecccedilatildeo em swab retalfoi mais
frequente (47) seguida de ponta de cateacuteter (18) e secreccedilatildeo traqueal (12)
Figura 13 Isolados de KPC segundo local da coleta da amostra nos 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 4 Microorganismo
O microorganismo mais encontrado foi a Klebsiella pneumoniae (82)
seguida da Enterobacter clocae (12) e Serratia marcescens (6) dos 17 isolados
de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 Isto afirma o
fato de a sigla KPC ser utilizada de forma errocircnea aacute Klebsiella pneumoniae visto
que a evidecircncia dela eacute maior em relaccedilatildeo as outras cepas
49
Figura 14 Isolado de KPC segundo microrganismo encontrado em 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 5 Relaccedilotildees variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana e desfecho
cliacutenico
Tabela 6 ndash Distribuiccedilatildeo do perfil geneacutetico sexo coleta tipificaccedilatildeo de
microrganismos e anaacutelise da resistecircncia bacteriana segundo o desfecho
cliacutenico Brasiacutelia-DF 2010 a 2011
Variaacutevel Resultado
Desfecho
Alta Oacutebito
N N P
Gene 16S rRNA Positivo 7 1000 10 1000
NA Gene blaKPC Positivo 6 857 10 1000
Negativo 1 143 0 00 0218 Sexo Feminino 2 286 6 600
Masculino 5 714 4 400 0201 Local da coleta Fundo saco de
Douglas 1 143 0 00
Hemocultura 0 00 1 100 0463 Ponta de cateter 1 143 2 200
Sec TraquealBrocircnquica
0 00 1 100
50
Secreccedilatildeo traqueal 2 286 0 00
Swab retal 3 429 5 500
Urina 0 00 1 100
Microrganismo Enterobacter cloacae (KPC)
1 143 1 100
Klebsiella pneumoniae
6 857 8 800
0416 Serratia
marcescens 0 00 1 100
Teste de Hodge Hodge positivo 7 1000 10 1000
NA Amicacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 1 100 0848 resistente 0 00 1 100
sensiacutevel 2 286 3 300
Amoxicilina Aacutecido Clavulacircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Ampicilina Sulbactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ampicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Aztreonan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefazolina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Cefoperazona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Cefotaxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefoxitina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0509 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 2 286 4 400
Ceftazidima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cetriaxona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 3 429 5 500 0772 Cefalotina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ciprofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772
51
resistente 3 429 5 500
Claritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Clindamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Eritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Gentamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0942 resistente 2 286 3 300
sensiacutevel 1 143 2 200
Imipenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 0 00 2 200 0193 Resistente 1 143 3 300
sensiacutevel 2 286 0 00
Nitrofurantoiacutena sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Norfloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Oxacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Penicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Piperacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Rifampicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tetraciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Ticarcilina Aacutecido Clavulocircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0688 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 3 429 4 400
Tobramicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Trimetoprima Sulfametoxazol
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0112 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 2 286 0 00
Vancomicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tigeciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediario 0 00 1 100 0211 natildeo testado 1 143 4 400
resistente 2 286 0 00
52
Cefepime sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefuroxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Levofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Piperacilina Tazobactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Ertapenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Meropenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0223 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 1 143 0 00
Cefotetan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 sensiacutevel 0 00 1 100
Gemifloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 7 700 0585 natildeo testado 3 429 3 300
Desfecho
Alta Oacutebito
Meacutedia Erro
padratildeo Meacutedia Erro
padratildeo p
Idade 58 9 59 5 0991
Tempo Internaccedilatildeo (dias)
50 13 46 12 0571
n= 17 p(lt 005) NA natildeo se aplica
53
6 DISCUSSAtildeO
Nos uacuteltimos anos houve um aumento na incidecircncia de bacteacuterias
multirresistentes aos antimicrobianos no ambiente hospitalar tornando isto um
problema mundial de sauacutede puacuteblica (HULSCHER et al 2010) Quando se trata
principalmente de bacilos Gram negativos a frequumlecircncia destas bacteacuterias eacute ainda
maior em paiacuteses da Ameacuterica Latina quando comparada a paiacuteses desenvolvidos
(GALES etal 2012)
De acordo com dados do ldquoMeropenem Yearly Susceptibility Test Information
Collectionrdquo (MYSTIC) ocorreu nos Estados Unidos um aumento na susceptibilidade
de K pneumoniae nos uacuteltimos anos graccedilas a praacuteticas de controle de disseminaccedilatildeo
de amostras resistentes(RHOMBERG P R et al 2009) O aumento crescente da
prevalecircncia destes microrganismos foi proporcional ao aumento da dependecircncia do
uso de antibioacuteticos carbapenecircmicos considerados como a opccedilatildeo terapecircutica para o
tratamento de infecccedilotildees por bacilos Gram negativos multi-resistentes (LIVERMORE
2012) Isto afeta diretamente as opccedilotildees de tratamento sobrando poucas alternativas
para a terapecircutica que incluem colistina (polimixina E) e tigeciclina que apresentam
respectivamente problemas em termos de toxicidade e eficaacutecia (LIVERMORE et
al 2011) Um dos efeitos adversos mais importantes das poliminas B e E por
exemplo satildeo a neurotoxicidade e nefrotoxicidade (MENDES C A C et al2009 )
Devido agrave resistecircncia ser usualmente de natureza plasmidial e portanto de
maior disseminaccedilatildeo especialmente quando carreadas por K pneumoniae
microrganismo com uma notoacuteria capacidade para acumular e transferir plasmiacutedeos
com determinantes para resistecircncia o nuacutemero de casos detectados pelo
fenoacutetipogenoacutetipo blaKPC eacute bastante preocupante (MONTEIRO et al 2009)
Comparada com outras bacteacuterias hospitalares a transmissatildeo de clones
multirresistentes de K pneumoniae eacute maior e podem natildeo ser controladas pelos
meacutetodos de controle de infecccedilatildeo hospitalar (PAAUW et al 2007) A forma
plasmidial para transferecircncia da resistecircncia adicionada a este grande potencial para
disseminaccedilatildeo de clones resistentes eacute preocupante visto que apoacutes surtos muitas
vezes pode se tornar endecircmica Jaacute eacute uma realidade a disseminaccedilatildeo desta bacteacuteria
54
entre pacientes hospitais paiacuteses e ateacute mesmo continentes (WOODFORF et al
2010 ROGERS et al 2011)
As chances de surtos satildeo maiores em paiacuteses com poucos recursos devido agrave
maior carecircncia de praacuteticas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees hospitalares e o
uso irracional de antimicrobianos de forma empiacuterica e inadequada (KUMARASAMY
et al 2010) Ateacute o momento os mecanismos de resistecircncia aos cabapenecircmicos
geralmente encontrado eram a produccedilatildeo de ESBL (CTX-M) somada aacute perda de
porina (CARVALHAES et al 2010) Foi notado a partir do ano de 2008 um
aumento no nuacutemero de K pneumoniae produtoras de KPC-2 apresentando outra
forma de resistecircncia (GALES 2012)
Um estudo mostrou que o perfil do paciente colonizado ou infectado por KPC
foi de um paciente entre os 33 e os 82 anos de idade internado haacute mais de 1
semana no hospital A mortalidade geral nos uacuteltimos anos ficou em torno de 7
sendo que dos 77 pacientes estudados 32 (415) pacientes evoluiacuteram para oacutebito
evidenciando a alta morbi-mortalidade associada (ALVES A P et al 2013)
Em estudo com 2316 pacientes avaliados a populaccedilatildeo de sexo masculino foi
de 526 idade meacutedia global de 53 anos (mediana de 55 anos) permanecircncia meacutedia
de 58 dias (mediana de 3 dias) (OLIVEIRA A C et al 2010) Outros trabalhos
apresentaram ausecircncia de significacircncia entre sexoidade e o desenvolvimento de
infecccedilotildees por microrganismos resistentes (PERES-BOTA D et al 2003 COLPAN
A et al 2005 COELLO R et al 1997)
Outro estudo utilizou um total de 30 amostras sendo elas isoladas de urina
escarro secreccedilatildeo pleural ponta de cateter aspirado traqueal e hemocultura A mais
prevalente foi em urina (40) Entre as 30 cepas analisadas a maior porcentagem
foi da cepa Klebsiella pneumoniae (70) Enterobacter sp (133) Klebsiella
ozaenae (10) Escherichia coli (333) e Klebsiella oxytoca (333)
(DIENSTMANN R et al 2010) Nos Estados Unidos a enzima KPC jaacute se tornou
endecircmica Foi realizada uma pesquisa em dois hospitais de Nova York onde
testaram 602 amostras e 45 apresentaram algum mecanismo de resistecircncia
sendo apenas 33 confirmadas por biologia molecular como KPC-2 (BRATU et
al 2005)
55
Estudo sobre os tipos de ESBL feito no Japatildeo apresentou o tipo Toho-1 como
o mais prevalente nessa pesquisa Ateacute o ano de 2000 ano em que foi publicado tal
estudo este era o primeiro relatoacuterio no Japatildeo para identificar derivados de ESBLs
como tipo de SHV e TEM entre E coli e K pneumoniae Em especial o tipo SHV- 12
foi identificado com uma maior frequumlecircncia Estes resultados indicam que tipos
distintos de ESBLs que satildeo diferentes em sua especificidade de substrato e origem
geneacutetica coexistem no Japatildeo Isto mostra a importacircncia de caracterizar genoacutetipos
distintos de ESBLs e de estar em alerta continuamente para as tendecircncias de
ESBLs no Japatildeo aleacutem da necessidade de uma interpretaccedilatildeo uniforme utilizando as
diretrizes do CSLI para relatar cepas produtoras de ESBL Aleacutem da detecccedilatildeo de
ESBLs satildeo necessaacuterias mais informaccedilotildees tais como o perfil de sensibilidade
especiacutefica para diversas β-lactacircmicos e o local da infecccedilatildeo Esses fatores satildeo
essenciais para a escolha adequada de antibioacuteticos (YAGI T et al 2000)
No ano de 2004 uma pesquisa avaliou a produccedilatildeo de uma enzima de
hidroacutelise de carbapenecircmicos atraveacutes da teacutecnica de sequumlenciamento foi revelado
um novo membro da famiacutelia KPC designado KPC- 3 Pesquisadores encontraram
em um mutante de K pneumoniae uma substituiccedilatildeo de um gene associado com
resistecircncia a Imipenem mas essa substituiccedilatildeo foi considerada improvaacutevel na
contribuiccedilatildeo da resistecircncia aos carbapenecircmicos da espeacutecie estudada Aleacutem da
resistecircncia aos carbapenecircmicos estes isolados eram em sua maioria resistentes agraves
cefalosporinas penicilinas e aminoglicosiacutedeos Usando estudos de transformaccedilatildeo
conjugaccedilatildeo e hibridaccedilatildeo localizaram o alelo blaKPC em plasmiacutedeo aleacutem disso
mostraram que esse alelo tambeacutem carregava uma resistecircncia aos aminoglicosiacutedeos
A transferecircncia das enzimas KPCs foi demonstrada in vitro tanto neste como em
outros estudos pode ser que os plasmiacutedeos que fazem esta transferecircncia estavam
comeccedilando a se espalhar no ambiente cliacutenico resultando na multiresistecircncia dessas
estirpes (WOODFORD et al 2004)
O presente estudo apresentou um vieacutes quanto aos resultados dos testes de
susceptibilidade microbiana Observou-se que natildeo foi encontrado resultado deste
teste em algumas amostras o que natildeo cooperou para um estudo mais preciso
futuros estudos quanto agraves amostras e um melhor acompanhamento deste tipo de
patologia Poreacutem mesmo sem algumas amostras com este resultado disponiacutevel foi
56
confirmada a presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos
carbapenecircmicos por meio dos genes de resistecircncia blaKPC e 16S rRNA que as
amostras apresentaram em sua maioria serem portadoras Quanto aos resultados
estatiacutesticos nenhuma das variaacuteveis apresentou significacircncia estatiacutestica (p gt 005)
mostrando assim que estas variaacuteveis isoladas natildeo foram o fator determinante para
o desfecho cliacutenico de alta ou oacutebito
57
7 CONCLUSAtildeO
Os genes blaKPC e 16S rRNA foram caracterizados confirmando a a
presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos carbapenecircmicos
Houve uma maior prevalecircncia da cepa K pneumoniae e isto confirma outros
estudos que apresentam a maior prevalecircncia desta cepa em amostras com KPC
Aleacutem disso isso justifica a forma popular da K pneumoniae ser chamada de KPC
enquanto que na verdade KPC eacute uma enzima podendo estar presente em outras
cepas como Enterobacter clocae tambeacutem apresentada no presente estudo O
desfecho cliacutenico de oacutebitos maior que 50 eacute um possiacutevel indicador sobre a
necessidade de se realizar um teste raacutepido para identificaccedilatildeo de KPC visando
iniciar o mais raacutepido possiacutevel o tratamento afim de diminuir a mortalidade por esta
infecccedilatildeo
Nenhuma das variaacuteveis isoladamente estaacute relacionada ao desfecho cliacutenico
oacutebito ou alta pois natildeo apresentaram relevacircncia estatiacutestica O presente estudo
mostrou que haacute presenccedila da bacteacuteria nas amostras de pacientes do hospital
estudado podendo entatildeo afirmar que este tipo de bacteacuteria se encontra tambeacutem
presente em ambiente hospitalar O uso irracional de antimicrobiano eacute demonstrado
de forma indireta quando foi apresentado atraveacutes do Teste de Hodge Modificado
uma resistecircncia de 100 aos antibioacuteticos carbapenecircmicos Isto tambeacutem reflete na
terapecircutica sendo que pacientes portadores de bacteacuterias resistentes aos
antibioacuteticos carabepecircmicos tem uma escassa opccedilatildeo de tratamento e as opccedilotildees
apresentam problemas quanto agrave toxicidade e eficaacutecia
58
REFEREcircNCIAS
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Mecanismos
de resistecircncia bacteriana aos antimicrobianos Disponiacutevel em
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controleopas_
webmodulo3mec_sitiohtmgt Acesso em 25 de abril de 2014
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Nota teacutecnica nordm
012013 medidas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees por enterobacteacuterias
multiresistentes Acesso em 17 de abril de 2013
ALBA J et al Kinetics study of KPC-3 a plasmid-encoded class A
carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase Antimicrob Agents Chemother
Nov49(11)4760-2 2005
ALVES A P et al Nosocomial infections by KPC-producing enterobacteria in
a tertiary hospital in Southern Brazil Revista da AMRIGS Porto Alegre 57 (3) 213-
218 jul-set 2013
ALVES A et al Tipagem Geneacutetica de Microrganismos Lab De Diversidade
Microbiana Centro de Biologia Celular Dep de Biologia U de Aveiro 3810-193
Aveiro- 2003
BELL J M et Al Prevalence and significance of a negative extended-
spectrum beta-lactamase (ESBL) confirmation test result after a positive ESBL
screening test result for isolates of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae
results from the SENTRY Asia-Pacific Surveillance Program J Clin Microbiol
May45(5)1478-82 2007
BRATU S et al Detection of KPC carbapenem-hydrolyzing enzymes in
Enterobacter spp from Brooklyn New York Antimicrob Agents Chemother v 49 n
2 p 776-8 2005
59
BRATU S et al Emergence of KPC-possessing Klebsiella pneumoniae in
Brooklyn New York epidemiology and recommendations for detection Antimicrob
Agents Chemother v 49 n 7 p 3018-20 2005
BRATU S et al Rapid spread of carbapenem-resistant Klebsiella
pneumoniae in New York City Arch Intern Med v 165 p 1430-5 2005
CAMARGO C F et al Aplicaccedilatildeo das teacutecnicas de pcr e suas teacutecnicas
derivadas em diagnoacutestico molecular Disponiacutevel em
ltfileDUnB10C2BA20semestreArtigosPCR-
20CLEYTON20FLORENCIO20DE20CAMARGO20E20PAULO20ROB
ERTO20QUEIROZpdfgtgt Acesso em 08 de abril de 2014
CARVALHES C G et al Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting
carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive
results Journal of Antimicrobial Chemotherapy v 65 n2 p 249-251 2010
CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION- CDC Modified
Hodge Test for Carbapenemase Detection in Enterobacteriaceae 2004
CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE Methods for
dilutionantimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically Approved
standard M7ndashA7 7th ed CLSI Wayne PA 2011
COELLO R et al Risk factors for developing clinical infection with methicillin-
resistant Staphylococcus aureus (MRSA) amongst hospital patients initially only
colonized with MRSA J Hosp Infect 19973739-46
COLPAN A et al Evaluation of risk factors for mortality in intensive care
units A prospective study from a referral hospital in Turkey Am J Infect Control
200533(1)42-7
60
CORNAGLIA G et al Living with ESBLs Introduction Clinical Microbiology
and Infection 14 Suppl 1 1-2 2008
COTRIM E R et al Klebsiella pneumoniae carbapenemase ndash KPC em
Enterobacteriaceae o desafio das bacteacuterias multirresistentes Poacutes em revista do
centro universitaacuterio Newton Paiva 12012 - ediccedilatildeo 5 - issn 2176 7785
DESHPANDE L M et al Occurrence and characterization of
carbapenemase-producing Enterobacteacuteriaceae report from the SENTRY
Antimicrobial Surveillance Program (2000-2004) Microb Drug Resist 12(4)223-30
2006
DIAS D J A Estudos dos principais mecanismos de resistecircncia aos
antibioacuteticos β-lactacircmicos em bacteacuterias patogecircnicas gram negativas 2009 100 f
Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Geneacutetica Molecular e Biomedicina) ndash Faculdade de
Ciecircncias e Tecnologia Universidade de Nova Lisboa Lisboa
DIENSTMANN R et al Avaliaccedilatildeo fenotiacutepica da enzima Klebsiella
pneumoniae carbapenemase (KPC) em Enterobacteriaceae de ambiente hospitalar
J Bras Patol Med Lab v 46 n 1 p 23-27 fevereiro 2010
ENDIMIAMI A et al Emergence of blaKPC-containing Klebsiella
pneumoniae in a long-term acute care hospital a new challenge to our healthcare J
Antimicrob Chemother 64 1102-1110 Nov 2009
FALAGAS M E et al Extended-spectrum beta-lactamase producing
organisms The Journal of Hospital Infection 73 (4) pp 345-54 2009
FONTANA C et al Emergence of KPC-producing Klebsiella pneumoniae in
Italy BMC Rev Notes 3 40 2010
61
GALES A C et al Antimicrobial resistance among Gram-negative bacilli
isolated from Latin America results from Sentry Antimicrobial Surveillance Program
(Latin America 2008-2010) Diagnostic Microbiology and Infectious Disease v 3 n
4 p 354 -360 2012
GUPTA N et al Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Epidemiology
and Prevention HEALTHCARE EPIDEMIOLOGY Clinical Infectious Diseases
201153(1)60ndash67 Published by Oxford University Press on behalf of the Infectious
Diseases Society of America 2011
HARBOTTLE H et al Genetics of antimicrobial resistance Anim Biotechnol
n17 p111-124 2006
HENRIQUE W N et al RESISTEcircNCIA BACTERIANA Uniatildeo das
Faculdades Alfredo NasserInstituto de Ciecircncias da Sauacutede Disponiacutevel em lt
httpwwwfaculdadealfredonasseredubrfilespesquisaposter20HENRIQUE20
Wilker20Natividade20SANTIAGO20Silvania20CAVALCANTI20DSP
20ResistC3AAncia20Bacterianapdfgt Acesso em 17 marccedilo 2014
HULSCHER M E J I et al Antibiotic prescribing in hospital a social and
behavioral scientific approach The Lancet Infectious Diaseases v 10 n 3 p 167-
165 2010
KIDWAI M SAPRA P BHUSHAN KR Synthetic strategies and medicinal
properties of beta-lactams Curr Med Chem 1999 695-215
KUMARASAMY K K et al Emergence of a new antibiotic resistance
mechanism in India Pakistan and the UK a molecular biological and
epidemiological stuy The Lancet Infectious Diseases v10 n 9 p 597- 602 2010
LINCOPAN N et al Enterobacteacuteria producing extended-spectrum β-
lacatamases and IMP-1 Metalo-β-lactamases isolated from Brazilian hospitals J Med
62
Microbiol 7 1-3 2006
LINCOPAN N et al First Isolation of Metalo-β-Lacatamase-Producing
Multiresistant Klebsiella pneumoniae from a patient in Brazil J Clin Microbiol 43(1)
516-519 2005
LIVERMORE D M et al What remains against carbapenem- resistant
Enterobacteriaceae Evaluation of choramphenicol ciprofloxacin colistina
fosfomycin minocycline nitrofurantoin temocilin and tigecycline International
Journal of Antimicrobial Agents v 37 n 5 p 415- 459 2011
LIVERMORE D M Fourten years in resistance International Journal of
Antimicrobial Agents v 39 283- 294 2012
LIVERMORE D M Bacterial resistance to carbapenems Adv Exp Med Biol
1995 39025-47
LIVERMORE D M Bacterial resistance origins epidemiology and impact
Clin Infect Dis 36S11-S23 2003
LIVERMORE D M et al Carbapenemases a problem in waiting Curr
Opin Microbiol 2000 3489-95
LU et al Universal pcr for common bacterial pathogens J CLIN
MICROBIOL VOL 38 2000
LU et al Use of PCR with Universal Primers and Restriction Endonuclease
Digestions for Detection and Identification of Common Bacterial Pathogens in
Cerebrospinal Fluid Journal of Clinical Microbiology June 2000 p 2076ndash2080
MARSCHALL J Met al Presence of the KPC Carbapenemase Gene in
Enterobacteriaceae Causing Bacteremia and Its Correlation with In Vitro
Carbapenem Susceptibility J Clin Microbiol 47 239-241 Jan 2009
63
MARTINS WMBS et al Prevalecircncia do gene blaKPC em isolados cliacutenicos
de Enterobacteriaceae e natildeo fermentadores encontrados em amostras clinicas em
um hospital universitaacuterio do Recife X Jornada de ensino pesquisa e extensatildeo ndash
JEPEX 2010 ndash UFRPE Recife 18 a 22 de outubro
MENDES C A C et al Polimixinas Revisatildeo com ecircnfase na sua
nefrotoxicidade Rev Assoc Med Bras 2009 55(6) 752-9
MOHR J F 3rd Update on the efficacy and tolerability of meropenem in the
treatment of serious bacteacuterial infections Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S41-51
2008
MONTEIRO J et al First report of KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae
strains in Brazil Antimicrob Agents Chemother Jan53(1)333-4 2009
MOREIRA V C et al Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia a antibioacuteticos
Disponiacutevel em
lthttpwwwcpglsucgbr6mostraartigosSAUDEVANESSA20CARVALHO20M
OREIRApdfgt Acesso em 21 marccedilo 2014
NETIKUL T et al Emergence of novel blaKPC-12 and blaKPC-13 variants in
carbapenem non-susceptible Enterobacter cloacae a first report of blaKPC gene in
Thailand European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases May
S372 2011
NETO V A et al Antibioacuteticos na praacutetica Meacutedica 6ordf Ediccedilatildeo Editorial
SarverSP Brasil 2007
NICOLAU D P Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of
meropenem Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S32-40 2008
64
OLIVEIRA A C et al Resistecircncia bacteriana e mortalidade em um centro de
terapia intensiva Rev Latino-Am Enfermagem nov-dez 2010
PAAUW A et al Failure to control an outbreak of qnrA 1-positive multidrug-
resistant Enterobacter clocae despite adequate implementation of recommended
infection control measures Journal of Clinical Microbiology v 45 n 5 p 1420-1425
2007
PATERSON D L et al Extended-Spectrum Beta-Lactamases a Clinical
Update Clinical Microbiology Reviews v 18 p 657-686 2005
PEIRANO G et al Carbapenem-hydrolysing beta-lactamase KPC-2 in
Klebsiella pneumonia isolated in Rio de Janeiro Brazil J Antimicrob Chemother Nov
20 2009
PERES-BOTA D et al Are infections due to resistant pathogens associated
with worse outcome in critically ill patients J Infect 200347(4)307-16
PIDDOCK L J V Clinically relevant chromosomally encoded multidrug
resistance effl ux pumps in bacterial Clin Microbiol Rev n19 p382-402 2006
PITOUT J D D et al Emergence of Enterobacteriaceae producing
extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) in the community J Antimicrob
Chemother May 56 2005
POSSEBON M I et al Resistecircncia bacteriana aos carbapenecircmicos
Bacterial resitence to carbapenems RBM rev bras med60(6)378380-378-382
jun 2003
QUEENAN A M et al Carbapenemases the versatile beta-lactamases
Clin Microbiol Rev Jul20(3)440-58 2007
65
RHOMBERG P R et al Summary trends for the meropenem yearly
susceptibility test information collection program a 10- year experience in the United
States (1999-2008) Diagnostic Microbiology and Infectiois Disease v 65 n4 p
414-426 2009
ROBLEDO I E et al Detection of KPC in Acinetobacter spp in Puerto Rico
J Antimicrob Agents Chemother 54 1354-1357 Mar 2010
ROGERS B A et al Country-to-country transfer os patients and the risk of
multi-resistant bacterial infection Clinical Infectious Disease v53 n1 p49- 56
2011
SHAH A A et al Characteristics epidemiology and clinicalimportance of
emerging strains of Gram-negative bacilli producing extended-spectrum
betalactamases Research in Microbiology v 155 p 409-421 2004
TURNER P J Extended- Spectrum Beta-Lactamases Clinical Infectious
Diseases v 41 p 273-275 2005
WOLTER D J et al Phenotypic and Enzymatic Comparative Analysis
between the Novel KPC variant KPC-5 and Its Evolutionary Variants KPC-2 and
KPC-4 Antimicrob Agents Chemother Nov 17 2008
WOODFORD N et al Carbapenemases of Chryseobacterium
(Flavobacterium) meningosepticum distribution of blaB and characterization of a
novel Metalo-beta-lactamase gene blaB3 in the type strain NCTC 10016
Antimicrob Agents Chemother Jun44(6)1448-52 2000
WOODFORF N Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in
India Pakistan and the UK a molecular biological and epidemiological study The
Lancet Infectious Diseases v 10 n 9 p 597-602 2010
66
WOODFORD et al Outbreak of Klebsiella pneumoniae Producing a New
Carbapenem- Hydrolyzing Class A β-Lactamase KPC-3 in a New York Medical
Center Antimicrobial agents and chemotherapy Dec 2004 p 4793ndash4799 Vol 48
No 12
YAGI T et al A preliminary survey of extended-spectrum β-lactamases
(ESBLs) in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Japan
FEMS Microbiology Letters 184 (2000) 53-56
YIGIT H et al Novel carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase KPC-1 from
a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumonia J Antimicrob Agents
Chemother 45 (4) 1151-1161 (2001)
ZAVASCKI A P et al KPC-2- producing Enterobacter cloacae in two cities
from Southern Brazil Int J Antimicrob Agents Apr 28 2009
ZHANEL G G et al Comparative review of the carbapenecircmicos Drugs
67(7)1027-52 2007
67
ANEXOS
Sequumlecircncia do oligo blaKPC
Query 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
Query 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
Query 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
68
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
Query 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
Query 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
69
Query 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
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|||||||
Sbjct 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
Query 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
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Sbjct 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
Query 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
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70
Sbjct 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
Query 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
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Sbjct 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
Query 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
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Sbjct 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
Query 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
71
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Sbjct 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
Query 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
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Sbjct 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
Query 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
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Sbjct 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
72
Query 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
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Sbjct 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
Query 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
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Sbjct 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
Query 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
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73
Sbjct 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
Query 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
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Sbjct 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
Query 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
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Sbjct 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
Query 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
74
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Sbjct 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
Query 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
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Sbjct 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
Query 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
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Sbjct 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
75
Query 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
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Sbjct 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
Query 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
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Sbjct 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
LOCUS AF297554 1377 bp
DNA linear BCT 26-MAR-2001
DEFINITION Klebsiella pneumoniae carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
gene complete cds
ACCESSION AF297554
VERSION AF2975541 GI10121874
76
KEYWORDS
SOURCE Klebsiella pneumoniae
ORGANISM Klebsiella pneumoniae
Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Enterobacteriaceae Klebsiella
REFERENCE 1 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH QueenanAM
AndersonGJ Domenech-SanchezA
BiddleJW StewardCD
AlbertiS BushK and TenoverFC
TITLE Novel carbapenem-hydrolyzing beta-
lactamase KPC-1 from a
carbapenem-resistant strain of
Klebsiella pneumoniae
JOURNAL Antimicrob Agents Chemother 45 (4)
1151-1161 (2001)
PUBMED 11257029
REFERENCE 2 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH AndersonGJ and
TenoverFC
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (19-AUG-2000) Nosocomial
Pathogens Laboratory Branch
Centers for Disease Control and
Prevention 1600 Clifton Rd MS
G08 Atlanta GA 30333 USA
FEATURES LocationQualifiers
77
source 11377
organism=Klebsiella
pneumoniae
mol_type=genomic DNA
db_xref=taxon573
-35_signal 5560
-10_signal 7883
mRNA 921012
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
RBS 117122
CDS 1311012
note=blaKPC-1
codon_start=1
transl_table=11
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
protein_id=AAG134101
db_xref=GI10121875
translation=MSLYRRLVLLSCLSWPLAGFSATALTNLVAEPFAKLEQD
FGGSI
GVYAMDTGSGATVSYRAEERFPLCSSFKGFLAAAVLARSQQQAGLLDTPIRYG
KNALV
PWSPISEKYLTTGMTVAELSAAAVQYSDNAAANLLLKELGGPAGLTAFMRSIG
DTTFR
78
LDRWELELNSAIPSDARDTSSPRAVTESLQKLTLGSALAAPQRQQFVDWLKGN
TTGNH
RIRAAVPADWAVGDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTRAPNKDDK
HSEAV
IAAAARLALEGLGVNGQ
ORIGIN
1 cggggcagtt acagccgtta cagcctctgg
agagggagcg gcttgccgct cggtgataat
61 cccagctgta gcggcctgat tacatccggc
cgctacacct agctccacct tcaaacaagg
121 aatatcgttg atgtcactgt atcgccgtct
agttctgctg tcttgtctct catggccgct
181 ggctggcttt tctgccaccg cgctgaccaa
cctcgtcgcg gaaccattcg ctaaactcga
241 acaggacttt ggcggctcca tcggtgtgta
cgcgatggat accggctcag gcgcaactgt
301 aagttaccgc gctgaggagc gcttcccact
gtgcagctca ttcaagggct ttcttgctgc
361 cgctgtgctg gctcgcagcc agcagcaggc
cggcttgctg gacacaccca tccgttacgg
421 caaaaatgcg ctggttccgt ggtcacccat
ctcggaaaaa tatctgacaa caggcatgac
481 ggtggcggag ctgtccgcgg ccgccgtgca
atacagtgat aacgccgccg ccaatttgtt
541 gctgaaggag ttgggcggcc cggccgggct
gacggccttc atgcgctcta tcggcgatac
79
601 cacgttccgt ctggaccgct gggagctgga
gctgaactcc gccatcccaa gcgatgcgcg
661 cgatacctca tcgccgcgcg ccgtgacgga
aagcttacaa aaactgacac tgggctctgc
721 actggctgcg ccgcagcggc agcagtttgt
tgattggcta aagggaaaca cgaccggcaa
781 ccaccgcatc cgcgcggcgg tgccggcaga
ctgggcagtc ggagacaaaa ccggaacctg
841 cggagtgtat ggcacggcaa atgactatgc
cgtcgtctgg cccactgggc gcgcacctat
901 tgtgttggcc gtctacaccc gggcgcctaa
caaggatgac aagcacagcg aggccgtcat
961 cgccgctgcg gctagactcg cgctcgaggg
attgggcgtc aacgggcagt aaggctctga
1021 aaatcatcta ttggcccacc accgccgccc
ttgcgggcgg catggattac caaccactgt
1081 cacatttagg ctaggagtct gcgcggcaga
gccgtgtgac cggttttctg tagagcactg
1141 acgatggcgg cggcgctctc tgcaattggc
aaggcgtcgg cgccaaggat accaatcttg
1201 cggcgcgcgg cgtgttatga cgactggggt
gcatttgagc cgccccattt aaccttcgcc
1261 ctcacagata cgccattcgc ctcaaattta
gcgccatgca gacgagcttc cactcggctt
1321 gcaccttgtc caggcccctc atgctgaact
gacgcaatcc catcaccgcc ttgatca
80
39
FJ2344121 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-8
FJ624872 Escherichia coli blaKPC-9
GQ1403481 Acinetobacter
baumannii
blaKPC-10
HM0669951 Klebsiella
pneumoniae
blaKPC-11
HQ3428891 Enterobacter cloacae blaKPC-12
HQ3428901 Enterobacter cloacae blaKPC-13
As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo de blaKPC foram realizadas em um
primeiro tempo de desnaturaccedilatildeo em que foi 94ordmC por 5 minutos seguido de 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 58 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 90 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 78ordmC por 8 minutos Aleacutem das amostras foi utilizado um
controle negativo
A PCR do blaKPC foi realizada utilizando os componentes para o volume da
reaccedilatildeo de 25 microL citados na tabela 3 A banda do tamanho do produto de PCR foi de
881 pares de bases (pb) o que corresponde ao plasmiacutedeo
Tabela 3 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do
gene blaKPC
Reagente Volume
DNA molde 4 microL
Tampatildeo Taq 25 microL
MgCl2 075 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP
2 microL
Oligo F 1 microL
Oligo R 1 microL
Taq DNA polimerase 05 microL
Aacutegua MiliQ 1335 microL
40
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
Baseado na sequumlecircncia para o gene 16S rRNA em que o oligonucleotiacutedio
Universal iniciador direto foward (5-CCAGCAGCCGCCGTAATACG-3rsquo) foi
desenhado para reconhecer a sequumlecircncia universal na posiccedilatildeo 1513 enquanto que o
iniciador reverso (5-ATCGGYTACCTTGTTACGACTTC-3rsquo) foi reconhecido na
posiccedilatildeo 1491 foram realizadas PCRrsquos As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo deste
gene foram realizadas nos seguinte tempos separaccedilatildeo 94ordmC por 10 minutos 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 55 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 120 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 72ordmC por 10 minutos
A PCR do gene 16S rRNA foi realizada utilizando os componentes para o
volume da reaccedilatildeo de 25microL citados na tabela 4 A banda do tamanho do produto de
PCR foi de 996 pb correspondente aacute regiatildeo ribossomal capaz de amplificar todas
as espeacutecies
Tabela 4Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do gene
universal
Reagente (quantidade
concentraccedilatildeo do estoque)
Volume
DNA molde 10 ng 4 microL
Tampatildeo Taq 10 x 25 microL
MgCl2 50mM 125 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP 25 mM
125 microL
Oligo F 10microM 05 microL
Oligo R 10microM 05 microL
Taq DNA polimerase 5UmicroL 04 microL
Aacutegua Miliq 146 microL
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
41
O termociclador utilizado para os experimentos foi o LifeTouch da BIOER
4 7 Digestatildeo
Para realizaccedilatildeo da digestatildeo foi utilizada a enzima BshF I (Hae III) EN- 1105
tamanho 7000 units concentraccedilatildeo 10 unitsmicroL fonte Bacillus sphaericus empresa
Jena bioscienceUtilizaram-se os componentes para o volume de 50microL da reaccedilatildeo
citados na tabela 5
Tabela 5 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da digestatildeo do gene
universal
Reagente Volume
Produto de PCR 10 microL
Enzima BshF I 01 microL
Tampatildeo (10x) 5 microL
Aacutegua Miliq 349 microL
Total (em cada ependorff) 50 microL
Valores para 1 digestatildeo
Os ependorffs foram colocados por 30 minutos em banho-maria a 37ordmC Apoacutes
isso fez-se a corrida das amostras em gel de agarose para verificaccedilatildeo do resultado
(LU et al 2000)
4 8 Eletroforese em gel de agarose
Os produtos de DNA PCR e digestatildeo foram analisados em gel de agarose
2 O tempo de corrida do gel eacute de aproximadamente 1hora e 30minutos sendo
que no comeccedilo foi usada agrave voltagem de 50 V e apoacutes comeccedilar a correr o gel
aumentou a voltagem para 100 v Utilizou-se o marcador de 100pb (pares de bases)
Foi adicionado 3microL de corante Bromophenol (que tem a funccedilatildeo de fazer uma ligaccedilatildeo
na amostra de DNA e permitir a visualizaccedilatildeo da corrida no gel de agarose) em 7microL
de amostra tanto de DNA quanto de PCR Para o preparo do gel foi utilizado TBE
42
(Tris- Aacutecido Boacuterico) agarose e brometo de etiacutedio (sua funccedilatildeo eacute de corante para o gel
e permitir a visualizaccedilatildeo do DNA quando colocado agrave luz ultravioleta) Para o oligo
blaKPC a banda da amplificaccedilatildeo foi em 881ppb correspondendo ao plasmiacutedeo Jaacute
o oligo Universal foi em 996 pb
4 9 Descarte de resiacuteduos
Todos os materiais utilizados nos ensaios foram de uso uacutenico e manipulados
em cacircmaras de seguranccedila bioloacutegica classe II Apoacutes o uso foram colocados em
soluccedilatildeo desinfetantes (hipoclorito a 1) e em seguida autoclavados a 127oC por 20
min em sacos apropriados para autoclavaccedilatildeo Apoacutes a finalizaccedilatildeo do ciclo de
esterilizaccedilatildeo os sacos contendo o material descartaacutevel foram colocados em
recipientes de coleta da empresa responsaacutevel pela coleta de materiais bioloacutegicos
produzidos no laboratoacuterio de microbiologia Todos os procedimentos seguiram a
normativa RDC-ANVISA 3062004 sobre o descarte de resiacuteduos de serviccedilo de
sauacutede
4 10 Aspectos epidemioloacutegicos e cliacutenicos
Os aspectos cliacutenicos e epidemioloacutegicos foram investigados por meio de
prontuaacuterios dos pacientes portadores de enterobacteacuterias produtoras de
carbapenemases e envolveram topografia mais provaacutevel do foco infeccioso a
enfermidade motivadora da internaccedilatildeo o desfecho cliacutenico a idade e o tempo de
internaccedilatildeo
4 12 Anaacutelises eepidemioloacutegicas
As anaacutelises foram realizadas com o pacote estatiacutestico SPSS versatildeo 200
Para verificar quais variaacuteveis referentes aos dados epidemioloacutegicos e
microbioloacutegicos influenciaram no desfecho verificou- se a diferenccedila meacutedia das
variaacuteveis idade e tempo de internaccedilatildeo em cada grupo O teste estatiacutestico utilizado foi
o teste t de Student apoacutes se executar o teste de normalidade de Shapiro-Wilk Para
as variaacuteveis sexo perfil microbioloacutegico das enterobacteacuterias produtoras de
43
carbapenemases foi avaliada a associaccedilatildeo com o desfecho por meio do teste Exato
de Fisher O niacutevel de significacircncia adotado foi de 5
4 13 Preceitos eacuteticos
Este projeto estaacute inserido em um projeto maior denominado ldquoEpidemiologia
cliacutenica e caracterizaccedilatildeo molecular do Acinetobacter Baumannii resistente a
antibioticoterapia em pacientes internado em hospitais do Sistema Uacutenico de Sauacutederdquo
que foi submetido ao Comitecirc de Eacutetica em Pesquisa da Secretaria do Estado de
Sauacutede do Distrito Federal (SESDF) e emitido parecer aprovado pelo protocolo nordm
23109 (anexo)
44
5 RESULTADOS
51 Anaacutelise molecular
Para a amplificaccedilatildeo com o oligo blaKPC foram amplificadas amostras
que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 881 pb correspondente ao
plasmiacutedeo A anaacutelise da amplificaccedilatildeo da regiatildeo do gene blaKPC mostrou que
apenas a amostra A10 natildeo amplificou isso demonstra que esta amostra natildeo
possuiacutea o gene de resistecircncia
5 1 1 Gene blaKPC
Figura 7 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 881 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
A amostra A3 natildeo amplificou no primeiro momento entatildeo foi realizado
novamente a PCR e corrida de gel obtendo entatildeo a amplificaccedilatildeo da amostra como
apresentado na figura 8
45
Figura 8 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC da
mostra A3 estudada A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo de 881
pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 1 2 Gene 16S rRNA
Para a amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA utilizou-se o oligo universal Foram
amplificadas amostras que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 996 pb
Figura 9 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
46
Segundo Lu et al (2000) a digestatildeo com a enzima HaeIII deste amplicons de
16S rRNA devolveriam bandas com perfis entre 150 a 200 pb No gel abaixo eacute
possiacutevel evidenciar que este perfil ocorreu com o predomiacutenio de bandas na altura
de 200pb
Figura 10 Gel de agarose a 2 da digestatildeo do amplicon do gene 16S
rRNA das amostras com a enzima HaeIII evidenciando diversos fragmentos
proacuteximos a 200 pb A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo ribossomal
de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 2 Anaacutelises epidemioloacutegicas
5 2 1 Sexo
No total foram detectados 17 isolados de KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 onde a maior a prevalecircncia foi
detecatada em amostras de pacientes do sexo masculino (53) do que no sexo
feminino (47)
47
Figura 11 Isolado de KPC segundo sexo dos 17 pacientes investigados
no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 2 Desfecho cliacutenico
Em 17 isolados de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo
de 2010 aacute 2011 a porcentagem de pacientes que foram a oacutebito (59) foi maior que
a de pacientes que tiverm alta (41)
Figura 12 Isolado de KPC segundo desfecho cliacutenico dos 17 pacientes
investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
48
5 2 3 Local da coleta
Dos 17 episoacutedios detectados de infecccedilatildeo por KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 a infecccedilatildeo em swab retalfoi mais
frequente (47) seguida de ponta de cateacuteter (18) e secreccedilatildeo traqueal (12)
Figura 13 Isolados de KPC segundo local da coleta da amostra nos 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 4 Microorganismo
O microorganismo mais encontrado foi a Klebsiella pneumoniae (82)
seguida da Enterobacter clocae (12) e Serratia marcescens (6) dos 17 isolados
de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 Isto afirma o
fato de a sigla KPC ser utilizada de forma errocircnea aacute Klebsiella pneumoniae visto
que a evidecircncia dela eacute maior em relaccedilatildeo as outras cepas
49
Figura 14 Isolado de KPC segundo microrganismo encontrado em 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 5 Relaccedilotildees variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana e desfecho
cliacutenico
Tabela 6 ndash Distribuiccedilatildeo do perfil geneacutetico sexo coleta tipificaccedilatildeo de
microrganismos e anaacutelise da resistecircncia bacteriana segundo o desfecho
cliacutenico Brasiacutelia-DF 2010 a 2011
Variaacutevel Resultado
Desfecho
Alta Oacutebito
N N P
Gene 16S rRNA Positivo 7 1000 10 1000
NA Gene blaKPC Positivo 6 857 10 1000
Negativo 1 143 0 00 0218 Sexo Feminino 2 286 6 600
Masculino 5 714 4 400 0201 Local da coleta Fundo saco de
Douglas 1 143 0 00
Hemocultura 0 00 1 100 0463 Ponta de cateter 1 143 2 200
Sec TraquealBrocircnquica
0 00 1 100
50
Secreccedilatildeo traqueal 2 286 0 00
Swab retal 3 429 5 500
Urina 0 00 1 100
Microrganismo Enterobacter cloacae (KPC)
1 143 1 100
Klebsiella pneumoniae
6 857 8 800
0416 Serratia
marcescens 0 00 1 100
Teste de Hodge Hodge positivo 7 1000 10 1000
NA Amicacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 1 100 0848 resistente 0 00 1 100
sensiacutevel 2 286 3 300
Amoxicilina Aacutecido Clavulacircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Ampicilina Sulbactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ampicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Aztreonan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefazolina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Cefoperazona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Cefotaxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefoxitina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0509 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 2 286 4 400
Ceftazidima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cetriaxona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 3 429 5 500 0772 Cefalotina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ciprofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772
51
resistente 3 429 5 500
Claritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Clindamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Eritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Gentamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0942 resistente 2 286 3 300
sensiacutevel 1 143 2 200
Imipenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 0 00 2 200 0193 Resistente 1 143 3 300
sensiacutevel 2 286 0 00
Nitrofurantoiacutena sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Norfloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Oxacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Penicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Piperacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Rifampicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tetraciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Ticarcilina Aacutecido Clavulocircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0688 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 3 429 4 400
Tobramicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Trimetoprima Sulfametoxazol
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0112 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 2 286 0 00
Vancomicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tigeciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediario 0 00 1 100 0211 natildeo testado 1 143 4 400
resistente 2 286 0 00
52
Cefepime sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefuroxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Levofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Piperacilina Tazobactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Ertapenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Meropenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0223 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 1 143 0 00
Cefotetan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 sensiacutevel 0 00 1 100
Gemifloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 7 700 0585 natildeo testado 3 429 3 300
Desfecho
Alta Oacutebito
Meacutedia Erro
padratildeo Meacutedia Erro
padratildeo p
Idade 58 9 59 5 0991
Tempo Internaccedilatildeo (dias)
50 13 46 12 0571
n= 17 p(lt 005) NA natildeo se aplica
53
6 DISCUSSAtildeO
Nos uacuteltimos anos houve um aumento na incidecircncia de bacteacuterias
multirresistentes aos antimicrobianos no ambiente hospitalar tornando isto um
problema mundial de sauacutede puacuteblica (HULSCHER et al 2010) Quando se trata
principalmente de bacilos Gram negativos a frequumlecircncia destas bacteacuterias eacute ainda
maior em paiacuteses da Ameacuterica Latina quando comparada a paiacuteses desenvolvidos
(GALES etal 2012)
De acordo com dados do ldquoMeropenem Yearly Susceptibility Test Information
Collectionrdquo (MYSTIC) ocorreu nos Estados Unidos um aumento na susceptibilidade
de K pneumoniae nos uacuteltimos anos graccedilas a praacuteticas de controle de disseminaccedilatildeo
de amostras resistentes(RHOMBERG P R et al 2009) O aumento crescente da
prevalecircncia destes microrganismos foi proporcional ao aumento da dependecircncia do
uso de antibioacuteticos carbapenecircmicos considerados como a opccedilatildeo terapecircutica para o
tratamento de infecccedilotildees por bacilos Gram negativos multi-resistentes (LIVERMORE
2012) Isto afeta diretamente as opccedilotildees de tratamento sobrando poucas alternativas
para a terapecircutica que incluem colistina (polimixina E) e tigeciclina que apresentam
respectivamente problemas em termos de toxicidade e eficaacutecia (LIVERMORE et
al 2011) Um dos efeitos adversos mais importantes das poliminas B e E por
exemplo satildeo a neurotoxicidade e nefrotoxicidade (MENDES C A C et al2009 )
Devido agrave resistecircncia ser usualmente de natureza plasmidial e portanto de
maior disseminaccedilatildeo especialmente quando carreadas por K pneumoniae
microrganismo com uma notoacuteria capacidade para acumular e transferir plasmiacutedeos
com determinantes para resistecircncia o nuacutemero de casos detectados pelo
fenoacutetipogenoacutetipo blaKPC eacute bastante preocupante (MONTEIRO et al 2009)
Comparada com outras bacteacuterias hospitalares a transmissatildeo de clones
multirresistentes de K pneumoniae eacute maior e podem natildeo ser controladas pelos
meacutetodos de controle de infecccedilatildeo hospitalar (PAAUW et al 2007) A forma
plasmidial para transferecircncia da resistecircncia adicionada a este grande potencial para
disseminaccedilatildeo de clones resistentes eacute preocupante visto que apoacutes surtos muitas
vezes pode se tornar endecircmica Jaacute eacute uma realidade a disseminaccedilatildeo desta bacteacuteria
54
entre pacientes hospitais paiacuteses e ateacute mesmo continentes (WOODFORF et al
2010 ROGERS et al 2011)
As chances de surtos satildeo maiores em paiacuteses com poucos recursos devido agrave
maior carecircncia de praacuteticas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees hospitalares e o
uso irracional de antimicrobianos de forma empiacuterica e inadequada (KUMARASAMY
et al 2010) Ateacute o momento os mecanismos de resistecircncia aos cabapenecircmicos
geralmente encontrado eram a produccedilatildeo de ESBL (CTX-M) somada aacute perda de
porina (CARVALHAES et al 2010) Foi notado a partir do ano de 2008 um
aumento no nuacutemero de K pneumoniae produtoras de KPC-2 apresentando outra
forma de resistecircncia (GALES 2012)
Um estudo mostrou que o perfil do paciente colonizado ou infectado por KPC
foi de um paciente entre os 33 e os 82 anos de idade internado haacute mais de 1
semana no hospital A mortalidade geral nos uacuteltimos anos ficou em torno de 7
sendo que dos 77 pacientes estudados 32 (415) pacientes evoluiacuteram para oacutebito
evidenciando a alta morbi-mortalidade associada (ALVES A P et al 2013)
Em estudo com 2316 pacientes avaliados a populaccedilatildeo de sexo masculino foi
de 526 idade meacutedia global de 53 anos (mediana de 55 anos) permanecircncia meacutedia
de 58 dias (mediana de 3 dias) (OLIVEIRA A C et al 2010) Outros trabalhos
apresentaram ausecircncia de significacircncia entre sexoidade e o desenvolvimento de
infecccedilotildees por microrganismos resistentes (PERES-BOTA D et al 2003 COLPAN
A et al 2005 COELLO R et al 1997)
Outro estudo utilizou um total de 30 amostras sendo elas isoladas de urina
escarro secreccedilatildeo pleural ponta de cateter aspirado traqueal e hemocultura A mais
prevalente foi em urina (40) Entre as 30 cepas analisadas a maior porcentagem
foi da cepa Klebsiella pneumoniae (70) Enterobacter sp (133) Klebsiella
ozaenae (10) Escherichia coli (333) e Klebsiella oxytoca (333)
(DIENSTMANN R et al 2010) Nos Estados Unidos a enzima KPC jaacute se tornou
endecircmica Foi realizada uma pesquisa em dois hospitais de Nova York onde
testaram 602 amostras e 45 apresentaram algum mecanismo de resistecircncia
sendo apenas 33 confirmadas por biologia molecular como KPC-2 (BRATU et
al 2005)
55
Estudo sobre os tipos de ESBL feito no Japatildeo apresentou o tipo Toho-1 como
o mais prevalente nessa pesquisa Ateacute o ano de 2000 ano em que foi publicado tal
estudo este era o primeiro relatoacuterio no Japatildeo para identificar derivados de ESBLs
como tipo de SHV e TEM entre E coli e K pneumoniae Em especial o tipo SHV- 12
foi identificado com uma maior frequumlecircncia Estes resultados indicam que tipos
distintos de ESBLs que satildeo diferentes em sua especificidade de substrato e origem
geneacutetica coexistem no Japatildeo Isto mostra a importacircncia de caracterizar genoacutetipos
distintos de ESBLs e de estar em alerta continuamente para as tendecircncias de
ESBLs no Japatildeo aleacutem da necessidade de uma interpretaccedilatildeo uniforme utilizando as
diretrizes do CSLI para relatar cepas produtoras de ESBL Aleacutem da detecccedilatildeo de
ESBLs satildeo necessaacuterias mais informaccedilotildees tais como o perfil de sensibilidade
especiacutefica para diversas β-lactacircmicos e o local da infecccedilatildeo Esses fatores satildeo
essenciais para a escolha adequada de antibioacuteticos (YAGI T et al 2000)
No ano de 2004 uma pesquisa avaliou a produccedilatildeo de uma enzima de
hidroacutelise de carbapenecircmicos atraveacutes da teacutecnica de sequumlenciamento foi revelado
um novo membro da famiacutelia KPC designado KPC- 3 Pesquisadores encontraram
em um mutante de K pneumoniae uma substituiccedilatildeo de um gene associado com
resistecircncia a Imipenem mas essa substituiccedilatildeo foi considerada improvaacutevel na
contribuiccedilatildeo da resistecircncia aos carbapenecircmicos da espeacutecie estudada Aleacutem da
resistecircncia aos carbapenecircmicos estes isolados eram em sua maioria resistentes agraves
cefalosporinas penicilinas e aminoglicosiacutedeos Usando estudos de transformaccedilatildeo
conjugaccedilatildeo e hibridaccedilatildeo localizaram o alelo blaKPC em plasmiacutedeo aleacutem disso
mostraram que esse alelo tambeacutem carregava uma resistecircncia aos aminoglicosiacutedeos
A transferecircncia das enzimas KPCs foi demonstrada in vitro tanto neste como em
outros estudos pode ser que os plasmiacutedeos que fazem esta transferecircncia estavam
comeccedilando a se espalhar no ambiente cliacutenico resultando na multiresistecircncia dessas
estirpes (WOODFORD et al 2004)
O presente estudo apresentou um vieacutes quanto aos resultados dos testes de
susceptibilidade microbiana Observou-se que natildeo foi encontrado resultado deste
teste em algumas amostras o que natildeo cooperou para um estudo mais preciso
futuros estudos quanto agraves amostras e um melhor acompanhamento deste tipo de
patologia Poreacutem mesmo sem algumas amostras com este resultado disponiacutevel foi
56
confirmada a presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos
carbapenecircmicos por meio dos genes de resistecircncia blaKPC e 16S rRNA que as
amostras apresentaram em sua maioria serem portadoras Quanto aos resultados
estatiacutesticos nenhuma das variaacuteveis apresentou significacircncia estatiacutestica (p gt 005)
mostrando assim que estas variaacuteveis isoladas natildeo foram o fator determinante para
o desfecho cliacutenico de alta ou oacutebito
57
7 CONCLUSAtildeO
Os genes blaKPC e 16S rRNA foram caracterizados confirmando a a
presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos carbapenecircmicos
Houve uma maior prevalecircncia da cepa K pneumoniae e isto confirma outros
estudos que apresentam a maior prevalecircncia desta cepa em amostras com KPC
Aleacutem disso isso justifica a forma popular da K pneumoniae ser chamada de KPC
enquanto que na verdade KPC eacute uma enzima podendo estar presente em outras
cepas como Enterobacter clocae tambeacutem apresentada no presente estudo O
desfecho cliacutenico de oacutebitos maior que 50 eacute um possiacutevel indicador sobre a
necessidade de se realizar um teste raacutepido para identificaccedilatildeo de KPC visando
iniciar o mais raacutepido possiacutevel o tratamento afim de diminuir a mortalidade por esta
infecccedilatildeo
Nenhuma das variaacuteveis isoladamente estaacute relacionada ao desfecho cliacutenico
oacutebito ou alta pois natildeo apresentaram relevacircncia estatiacutestica O presente estudo
mostrou que haacute presenccedila da bacteacuteria nas amostras de pacientes do hospital
estudado podendo entatildeo afirmar que este tipo de bacteacuteria se encontra tambeacutem
presente em ambiente hospitalar O uso irracional de antimicrobiano eacute demonstrado
de forma indireta quando foi apresentado atraveacutes do Teste de Hodge Modificado
uma resistecircncia de 100 aos antibioacuteticos carbapenecircmicos Isto tambeacutem reflete na
terapecircutica sendo que pacientes portadores de bacteacuterias resistentes aos
antibioacuteticos carabepecircmicos tem uma escassa opccedilatildeo de tratamento e as opccedilotildees
apresentam problemas quanto agrave toxicidade e eficaacutecia
58
REFEREcircNCIAS
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Mecanismos
de resistecircncia bacteriana aos antimicrobianos Disponiacutevel em
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controleopas_
webmodulo3mec_sitiohtmgt Acesso em 25 de abril de 2014
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Nota teacutecnica nordm
012013 medidas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees por enterobacteacuterias
multiresistentes Acesso em 17 de abril de 2013
ALBA J et al Kinetics study of KPC-3 a plasmid-encoded class A
carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase Antimicrob Agents Chemother
Nov49(11)4760-2 2005
ALVES A P et al Nosocomial infections by KPC-producing enterobacteria in
a tertiary hospital in Southern Brazil Revista da AMRIGS Porto Alegre 57 (3) 213-
218 jul-set 2013
ALVES A et al Tipagem Geneacutetica de Microrganismos Lab De Diversidade
Microbiana Centro de Biologia Celular Dep de Biologia U de Aveiro 3810-193
Aveiro- 2003
BELL J M et Al Prevalence and significance of a negative extended-
spectrum beta-lactamase (ESBL) confirmation test result after a positive ESBL
screening test result for isolates of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae
results from the SENTRY Asia-Pacific Surveillance Program J Clin Microbiol
May45(5)1478-82 2007
BRATU S et al Detection of KPC carbapenem-hydrolyzing enzymes in
Enterobacter spp from Brooklyn New York Antimicrob Agents Chemother v 49 n
2 p 776-8 2005
59
BRATU S et al Emergence of KPC-possessing Klebsiella pneumoniae in
Brooklyn New York epidemiology and recommendations for detection Antimicrob
Agents Chemother v 49 n 7 p 3018-20 2005
BRATU S et al Rapid spread of carbapenem-resistant Klebsiella
pneumoniae in New York City Arch Intern Med v 165 p 1430-5 2005
CAMARGO C F et al Aplicaccedilatildeo das teacutecnicas de pcr e suas teacutecnicas
derivadas em diagnoacutestico molecular Disponiacutevel em
ltfileDUnB10C2BA20semestreArtigosPCR-
20CLEYTON20FLORENCIO20DE20CAMARGO20E20PAULO20ROB
ERTO20QUEIROZpdfgtgt Acesso em 08 de abril de 2014
CARVALHES C G et al Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting
carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive
results Journal of Antimicrobial Chemotherapy v 65 n2 p 249-251 2010
CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION- CDC Modified
Hodge Test for Carbapenemase Detection in Enterobacteriaceae 2004
CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE Methods for
dilutionantimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically Approved
standard M7ndashA7 7th ed CLSI Wayne PA 2011
COELLO R et al Risk factors for developing clinical infection with methicillin-
resistant Staphylococcus aureus (MRSA) amongst hospital patients initially only
colonized with MRSA J Hosp Infect 19973739-46
COLPAN A et al Evaluation of risk factors for mortality in intensive care
units A prospective study from a referral hospital in Turkey Am J Infect Control
200533(1)42-7
60
CORNAGLIA G et al Living with ESBLs Introduction Clinical Microbiology
and Infection 14 Suppl 1 1-2 2008
COTRIM E R et al Klebsiella pneumoniae carbapenemase ndash KPC em
Enterobacteriaceae o desafio das bacteacuterias multirresistentes Poacutes em revista do
centro universitaacuterio Newton Paiva 12012 - ediccedilatildeo 5 - issn 2176 7785
DESHPANDE L M et al Occurrence and characterization of
carbapenemase-producing Enterobacteacuteriaceae report from the SENTRY
Antimicrobial Surveillance Program (2000-2004) Microb Drug Resist 12(4)223-30
2006
DIAS D J A Estudos dos principais mecanismos de resistecircncia aos
antibioacuteticos β-lactacircmicos em bacteacuterias patogecircnicas gram negativas 2009 100 f
Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Geneacutetica Molecular e Biomedicina) ndash Faculdade de
Ciecircncias e Tecnologia Universidade de Nova Lisboa Lisboa
DIENSTMANN R et al Avaliaccedilatildeo fenotiacutepica da enzima Klebsiella
pneumoniae carbapenemase (KPC) em Enterobacteriaceae de ambiente hospitalar
J Bras Patol Med Lab v 46 n 1 p 23-27 fevereiro 2010
ENDIMIAMI A et al Emergence of blaKPC-containing Klebsiella
pneumoniae in a long-term acute care hospital a new challenge to our healthcare J
Antimicrob Chemother 64 1102-1110 Nov 2009
FALAGAS M E et al Extended-spectrum beta-lactamase producing
organisms The Journal of Hospital Infection 73 (4) pp 345-54 2009
FONTANA C et al Emergence of KPC-producing Klebsiella pneumoniae in
Italy BMC Rev Notes 3 40 2010
61
GALES A C et al Antimicrobial resistance among Gram-negative bacilli
isolated from Latin America results from Sentry Antimicrobial Surveillance Program
(Latin America 2008-2010) Diagnostic Microbiology and Infectious Disease v 3 n
4 p 354 -360 2012
GUPTA N et al Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Epidemiology
and Prevention HEALTHCARE EPIDEMIOLOGY Clinical Infectious Diseases
201153(1)60ndash67 Published by Oxford University Press on behalf of the Infectious
Diseases Society of America 2011
HARBOTTLE H et al Genetics of antimicrobial resistance Anim Biotechnol
n17 p111-124 2006
HENRIQUE W N et al RESISTEcircNCIA BACTERIANA Uniatildeo das
Faculdades Alfredo NasserInstituto de Ciecircncias da Sauacutede Disponiacutevel em lt
httpwwwfaculdadealfredonasseredubrfilespesquisaposter20HENRIQUE20
Wilker20Natividade20SANTIAGO20Silvania20CAVALCANTI20DSP
20ResistC3AAncia20Bacterianapdfgt Acesso em 17 marccedilo 2014
HULSCHER M E J I et al Antibiotic prescribing in hospital a social and
behavioral scientific approach The Lancet Infectious Diaseases v 10 n 3 p 167-
165 2010
KIDWAI M SAPRA P BHUSHAN KR Synthetic strategies and medicinal
properties of beta-lactams Curr Med Chem 1999 695-215
KUMARASAMY K K et al Emergence of a new antibiotic resistance
mechanism in India Pakistan and the UK a molecular biological and
epidemiological stuy The Lancet Infectious Diseases v10 n 9 p 597- 602 2010
LINCOPAN N et al Enterobacteacuteria producing extended-spectrum β-
lacatamases and IMP-1 Metalo-β-lactamases isolated from Brazilian hospitals J Med
62
Microbiol 7 1-3 2006
LINCOPAN N et al First Isolation of Metalo-β-Lacatamase-Producing
Multiresistant Klebsiella pneumoniae from a patient in Brazil J Clin Microbiol 43(1)
516-519 2005
LIVERMORE D M et al What remains against carbapenem- resistant
Enterobacteriaceae Evaluation of choramphenicol ciprofloxacin colistina
fosfomycin minocycline nitrofurantoin temocilin and tigecycline International
Journal of Antimicrobial Agents v 37 n 5 p 415- 459 2011
LIVERMORE D M Fourten years in resistance International Journal of
Antimicrobial Agents v 39 283- 294 2012
LIVERMORE D M Bacterial resistance to carbapenems Adv Exp Med Biol
1995 39025-47
LIVERMORE D M Bacterial resistance origins epidemiology and impact
Clin Infect Dis 36S11-S23 2003
LIVERMORE D M et al Carbapenemases a problem in waiting Curr
Opin Microbiol 2000 3489-95
LU et al Universal pcr for common bacterial pathogens J CLIN
MICROBIOL VOL 38 2000
LU et al Use of PCR with Universal Primers and Restriction Endonuclease
Digestions for Detection and Identification of Common Bacterial Pathogens in
Cerebrospinal Fluid Journal of Clinical Microbiology June 2000 p 2076ndash2080
MARSCHALL J Met al Presence of the KPC Carbapenemase Gene in
Enterobacteriaceae Causing Bacteremia and Its Correlation with In Vitro
Carbapenem Susceptibility J Clin Microbiol 47 239-241 Jan 2009
63
MARTINS WMBS et al Prevalecircncia do gene blaKPC em isolados cliacutenicos
de Enterobacteriaceae e natildeo fermentadores encontrados em amostras clinicas em
um hospital universitaacuterio do Recife X Jornada de ensino pesquisa e extensatildeo ndash
JEPEX 2010 ndash UFRPE Recife 18 a 22 de outubro
MENDES C A C et al Polimixinas Revisatildeo com ecircnfase na sua
nefrotoxicidade Rev Assoc Med Bras 2009 55(6) 752-9
MOHR J F 3rd Update on the efficacy and tolerability of meropenem in the
treatment of serious bacteacuterial infections Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S41-51
2008
MONTEIRO J et al First report of KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae
strains in Brazil Antimicrob Agents Chemother Jan53(1)333-4 2009
MOREIRA V C et al Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia a antibioacuteticos
Disponiacutevel em
lthttpwwwcpglsucgbr6mostraartigosSAUDEVANESSA20CARVALHO20M
OREIRApdfgt Acesso em 21 marccedilo 2014
NETIKUL T et al Emergence of novel blaKPC-12 and blaKPC-13 variants in
carbapenem non-susceptible Enterobacter cloacae a first report of blaKPC gene in
Thailand European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases May
S372 2011
NETO V A et al Antibioacuteticos na praacutetica Meacutedica 6ordf Ediccedilatildeo Editorial
SarverSP Brasil 2007
NICOLAU D P Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of
meropenem Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S32-40 2008
64
OLIVEIRA A C et al Resistecircncia bacteriana e mortalidade em um centro de
terapia intensiva Rev Latino-Am Enfermagem nov-dez 2010
PAAUW A et al Failure to control an outbreak of qnrA 1-positive multidrug-
resistant Enterobacter clocae despite adequate implementation of recommended
infection control measures Journal of Clinical Microbiology v 45 n 5 p 1420-1425
2007
PATERSON D L et al Extended-Spectrum Beta-Lactamases a Clinical
Update Clinical Microbiology Reviews v 18 p 657-686 2005
PEIRANO G et al Carbapenem-hydrolysing beta-lactamase KPC-2 in
Klebsiella pneumonia isolated in Rio de Janeiro Brazil J Antimicrob Chemother Nov
20 2009
PERES-BOTA D et al Are infections due to resistant pathogens associated
with worse outcome in critically ill patients J Infect 200347(4)307-16
PIDDOCK L J V Clinically relevant chromosomally encoded multidrug
resistance effl ux pumps in bacterial Clin Microbiol Rev n19 p382-402 2006
PITOUT J D D et al Emergence of Enterobacteriaceae producing
extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) in the community J Antimicrob
Chemother May 56 2005
POSSEBON M I et al Resistecircncia bacteriana aos carbapenecircmicos
Bacterial resitence to carbapenems RBM rev bras med60(6)378380-378-382
jun 2003
QUEENAN A M et al Carbapenemases the versatile beta-lactamases
Clin Microbiol Rev Jul20(3)440-58 2007
65
RHOMBERG P R et al Summary trends for the meropenem yearly
susceptibility test information collection program a 10- year experience in the United
States (1999-2008) Diagnostic Microbiology and Infectiois Disease v 65 n4 p
414-426 2009
ROBLEDO I E et al Detection of KPC in Acinetobacter spp in Puerto Rico
J Antimicrob Agents Chemother 54 1354-1357 Mar 2010
ROGERS B A et al Country-to-country transfer os patients and the risk of
multi-resistant bacterial infection Clinical Infectious Disease v53 n1 p49- 56
2011
SHAH A A et al Characteristics epidemiology and clinicalimportance of
emerging strains of Gram-negative bacilli producing extended-spectrum
betalactamases Research in Microbiology v 155 p 409-421 2004
TURNER P J Extended- Spectrum Beta-Lactamases Clinical Infectious
Diseases v 41 p 273-275 2005
WOLTER D J et al Phenotypic and Enzymatic Comparative Analysis
between the Novel KPC variant KPC-5 and Its Evolutionary Variants KPC-2 and
KPC-4 Antimicrob Agents Chemother Nov 17 2008
WOODFORD N et al Carbapenemases of Chryseobacterium
(Flavobacterium) meningosepticum distribution of blaB and characterization of a
novel Metalo-beta-lactamase gene blaB3 in the type strain NCTC 10016
Antimicrob Agents Chemother Jun44(6)1448-52 2000
WOODFORF N Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in
India Pakistan and the UK a molecular biological and epidemiological study The
Lancet Infectious Diseases v 10 n 9 p 597-602 2010
66
WOODFORD et al Outbreak of Klebsiella pneumoniae Producing a New
Carbapenem- Hydrolyzing Class A β-Lactamase KPC-3 in a New York Medical
Center Antimicrobial agents and chemotherapy Dec 2004 p 4793ndash4799 Vol 48
No 12
YAGI T et al A preliminary survey of extended-spectrum β-lactamases
(ESBLs) in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Japan
FEMS Microbiology Letters 184 (2000) 53-56
YIGIT H et al Novel carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase KPC-1 from
a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumonia J Antimicrob Agents
Chemother 45 (4) 1151-1161 (2001)
ZAVASCKI A P et al KPC-2- producing Enterobacter cloacae in two cities
from Southern Brazil Int J Antimicrob Agents Apr 28 2009
ZHANEL G G et al Comparative review of the carbapenecircmicos Drugs
67(7)1027-52 2007
67
ANEXOS
Sequumlecircncia do oligo blaKPC
Query 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
Query 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
Query 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
68
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Sbjct 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
Query 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
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Sbjct 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
Query 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Sbjct 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
69
Query 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
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|||||||
Sbjct 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
Query 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Sbjct 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
Query 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
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|||||||
70
Sbjct 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
Query 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
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Sbjct 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
Query 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
Query 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
71
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
Query 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
Query 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
72
Query 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
Query 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
Query 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
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|||||||
73
Sbjct 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
Query 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
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Sbjct 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
Query 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
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Sbjct 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
Query 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
74
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Sbjct 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
Query 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
Query 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
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|||||||
Sbjct 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
75
Query 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
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Sbjct 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
Query 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
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||||
Sbjct 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
LOCUS AF297554 1377 bp
DNA linear BCT 26-MAR-2001
DEFINITION Klebsiella pneumoniae carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
gene complete cds
ACCESSION AF297554
VERSION AF2975541 GI10121874
76
KEYWORDS
SOURCE Klebsiella pneumoniae
ORGANISM Klebsiella pneumoniae
Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Enterobacteriaceae Klebsiella
REFERENCE 1 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH QueenanAM
AndersonGJ Domenech-SanchezA
BiddleJW StewardCD
AlbertiS BushK and TenoverFC
TITLE Novel carbapenem-hydrolyzing beta-
lactamase KPC-1 from a
carbapenem-resistant strain of
Klebsiella pneumoniae
JOURNAL Antimicrob Agents Chemother 45 (4)
1151-1161 (2001)
PUBMED 11257029
REFERENCE 2 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH AndersonGJ and
TenoverFC
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (19-AUG-2000) Nosocomial
Pathogens Laboratory Branch
Centers for Disease Control and
Prevention 1600 Clifton Rd MS
G08 Atlanta GA 30333 USA
FEATURES LocationQualifiers
77
source 11377
organism=Klebsiella
pneumoniae
mol_type=genomic DNA
db_xref=taxon573
-35_signal 5560
-10_signal 7883
mRNA 921012
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
RBS 117122
CDS 1311012
note=blaKPC-1
codon_start=1
transl_table=11
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
protein_id=AAG134101
db_xref=GI10121875
translation=MSLYRRLVLLSCLSWPLAGFSATALTNLVAEPFAKLEQD
FGGSI
GVYAMDTGSGATVSYRAEERFPLCSSFKGFLAAAVLARSQQQAGLLDTPIRYG
KNALV
PWSPISEKYLTTGMTVAELSAAAVQYSDNAAANLLLKELGGPAGLTAFMRSIG
DTTFR
78
LDRWELELNSAIPSDARDTSSPRAVTESLQKLTLGSALAAPQRQQFVDWLKGN
TTGNH
RIRAAVPADWAVGDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTRAPNKDDK
HSEAV
IAAAARLALEGLGVNGQ
ORIGIN
1 cggggcagtt acagccgtta cagcctctgg
agagggagcg gcttgccgct cggtgataat
61 cccagctgta gcggcctgat tacatccggc
cgctacacct agctccacct tcaaacaagg
121 aatatcgttg atgtcactgt atcgccgtct
agttctgctg tcttgtctct catggccgct
181 ggctggcttt tctgccaccg cgctgaccaa
cctcgtcgcg gaaccattcg ctaaactcga
241 acaggacttt ggcggctcca tcggtgtgta
cgcgatggat accggctcag gcgcaactgt
301 aagttaccgc gctgaggagc gcttcccact
gtgcagctca ttcaagggct ttcttgctgc
361 cgctgtgctg gctcgcagcc agcagcaggc
cggcttgctg gacacaccca tccgttacgg
421 caaaaatgcg ctggttccgt ggtcacccat
ctcggaaaaa tatctgacaa caggcatgac
481 ggtggcggag ctgtccgcgg ccgccgtgca
atacagtgat aacgccgccg ccaatttgtt
541 gctgaaggag ttgggcggcc cggccgggct
gacggccttc atgcgctcta tcggcgatac
79
601 cacgttccgt ctggaccgct gggagctgga
gctgaactcc gccatcccaa gcgatgcgcg
661 cgatacctca tcgccgcgcg ccgtgacgga
aagcttacaa aaactgacac tgggctctgc
721 actggctgcg ccgcagcggc agcagtttgt
tgattggcta aagggaaaca cgaccggcaa
781 ccaccgcatc cgcgcggcgg tgccggcaga
ctgggcagtc ggagacaaaa ccggaacctg
841 cggagtgtat ggcacggcaa atgactatgc
cgtcgtctgg cccactgggc gcgcacctat
901 tgtgttggcc gtctacaccc gggcgcctaa
caaggatgac aagcacagcg aggccgtcat
961 cgccgctgcg gctagactcg cgctcgaggg
attgggcgtc aacgggcagt aaggctctga
1021 aaatcatcta ttggcccacc accgccgccc
ttgcgggcgg catggattac caaccactgt
1081 cacatttagg ctaggagtct gcgcggcaga
gccgtgtgac cggttttctg tagagcactg
1141 acgatggcgg cggcgctctc tgcaattggc
aaggcgtcgg cgccaaggat accaatcttg
1201 cggcgcgcgg cgtgttatga cgactggggt
gcatttgagc cgccccattt aaccttcgcc
1261 ctcacagata cgccattcgc ctcaaattta
gcgccatgca gacgagcttc cactcggctt
1321 gcaccttgtc caggcccctc atgctgaact
gacgcaatcc catcaccgcc ttgatca
80
40
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
Baseado na sequumlecircncia para o gene 16S rRNA em que o oligonucleotiacutedio
Universal iniciador direto foward (5-CCAGCAGCCGCCGTAATACG-3rsquo) foi
desenhado para reconhecer a sequumlecircncia universal na posiccedilatildeo 1513 enquanto que o
iniciador reverso (5-ATCGGYTACCTTGTTACGACTTC-3rsquo) foi reconhecido na
posiccedilatildeo 1491 foram realizadas PCRrsquos As reaccedilotildees de PCR para a detecccedilatildeo deste
gene foram realizadas nos seguinte tempos separaccedilatildeo 94ordmC por 10 minutos 30
ciclos utilizando nos passos de desnaturaccedilatildeo anelamento e polimerizaccedilatildeo com os
respectivos comandos 94 ordmC por 60 s 55 ordmC por 60 s e 72 ordmC por 120 s Por uacuteltimo
no processo de extensatildeo 72ordmC por 10 minutos
A PCR do gene 16S rRNA foi realizada utilizando os componentes para o
volume da reaccedilatildeo de 25microL citados na tabela 4 A banda do tamanho do produto de
PCR foi de 996 pb correspondente aacute regiatildeo ribossomal capaz de amplificar todas
as espeacutecies
Tabela 4Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR do gene
universal
Reagente (quantidade
concentraccedilatildeo do estoque)
Volume
DNA molde 10 ng 4 microL
Tampatildeo Taq 10 x 25 microL
MgCl2 50mM 125 microL
Mistura dos 4 nucleotiacutedeos-
dNTP 25 mM
125 microL
Oligo F 10microM 05 microL
Oligo R 10microM 05 microL
Taq DNA polimerase 5UmicroL 04 microL
Aacutegua Miliq 146 microL
Total (em cada ependorff) 25 microL
Todos exceto o Controle Negativo (CN)
41
O termociclador utilizado para os experimentos foi o LifeTouch da BIOER
4 7 Digestatildeo
Para realizaccedilatildeo da digestatildeo foi utilizada a enzima BshF I (Hae III) EN- 1105
tamanho 7000 units concentraccedilatildeo 10 unitsmicroL fonte Bacillus sphaericus empresa
Jena bioscienceUtilizaram-se os componentes para o volume de 50microL da reaccedilatildeo
citados na tabela 5
Tabela 5 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da digestatildeo do gene
universal
Reagente Volume
Produto de PCR 10 microL
Enzima BshF I 01 microL
Tampatildeo (10x) 5 microL
Aacutegua Miliq 349 microL
Total (em cada ependorff) 50 microL
Valores para 1 digestatildeo
Os ependorffs foram colocados por 30 minutos em banho-maria a 37ordmC Apoacutes
isso fez-se a corrida das amostras em gel de agarose para verificaccedilatildeo do resultado
(LU et al 2000)
4 8 Eletroforese em gel de agarose
Os produtos de DNA PCR e digestatildeo foram analisados em gel de agarose
2 O tempo de corrida do gel eacute de aproximadamente 1hora e 30minutos sendo
que no comeccedilo foi usada agrave voltagem de 50 V e apoacutes comeccedilar a correr o gel
aumentou a voltagem para 100 v Utilizou-se o marcador de 100pb (pares de bases)
Foi adicionado 3microL de corante Bromophenol (que tem a funccedilatildeo de fazer uma ligaccedilatildeo
na amostra de DNA e permitir a visualizaccedilatildeo da corrida no gel de agarose) em 7microL
de amostra tanto de DNA quanto de PCR Para o preparo do gel foi utilizado TBE
42
(Tris- Aacutecido Boacuterico) agarose e brometo de etiacutedio (sua funccedilatildeo eacute de corante para o gel
e permitir a visualizaccedilatildeo do DNA quando colocado agrave luz ultravioleta) Para o oligo
blaKPC a banda da amplificaccedilatildeo foi em 881ppb correspondendo ao plasmiacutedeo Jaacute
o oligo Universal foi em 996 pb
4 9 Descarte de resiacuteduos
Todos os materiais utilizados nos ensaios foram de uso uacutenico e manipulados
em cacircmaras de seguranccedila bioloacutegica classe II Apoacutes o uso foram colocados em
soluccedilatildeo desinfetantes (hipoclorito a 1) e em seguida autoclavados a 127oC por 20
min em sacos apropriados para autoclavaccedilatildeo Apoacutes a finalizaccedilatildeo do ciclo de
esterilizaccedilatildeo os sacos contendo o material descartaacutevel foram colocados em
recipientes de coleta da empresa responsaacutevel pela coleta de materiais bioloacutegicos
produzidos no laboratoacuterio de microbiologia Todos os procedimentos seguiram a
normativa RDC-ANVISA 3062004 sobre o descarte de resiacuteduos de serviccedilo de
sauacutede
4 10 Aspectos epidemioloacutegicos e cliacutenicos
Os aspectos cliacutenicos e epidemioloacutegicos foram investigados por meio de
prontuaacuterios dos pacientes portadores de enterobacteacuterias produtoras de
carbapenemases e envolveram topografia mais provaacutevel do foco infeccioso a
enfermidade motivadora da internaccedilatildeo o desfecho cliacutenico a idade e o tempo de
internaccedilatildeo
4 12 Anaacutelises eepidemioloacutegicas
As anaacutelises foram realizadas com o pacote estatiacutestico SPSS versatildeo 200
Para verificar quais variaacuteveis referentes aos dados epidemioloacutegicos e
microbioloacutegicos influenciaram no desfecho verificou- se a diferenccedila meacutedia das
variaacuteveis idade e tempo de internaccedilatildeo em cada grupo O teste estatiacutestico utilizado foi
o teste t de Student apoacutes se executar o teste de normalidade de Shapiro-Wilk Para
as variaacuteveis sexo perfil microbioloacutegico das enterobacteacuterias produtoras de
43
carbapenemases foi avaliada a associaccedilatildeo com o desfecho por meio do teste Exato
de Fisher O niacutevel de significacircncia adotado foi de 5
4 13 Preceitos eacuteticos
Este projeto estaacute inserido em um projeto maior denominado ldquoEpidemiologia
cliacutenica e caracterizaccedilatildeo molecular do Acinetobacter Baumannii resistente a
antibioticoterapia em pacientes internado em hospitais do Sistema Uacutenico de Sauacutederdquo
que foi submetido ao Comitecirc de Eacutetica em Pesquisa da Secretaria do Estado de
Sauacutede do Distrito Federal (SESDF) e emitido parecer aprovado pelo protocolo nordm
23109 (anexo)
44
5 RESULTADOS
51 Anaacutelise molecular
Para a amplificaccedilatildeo com o oligo blaKPC foram amplificadas amostras
que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 881 pb correspondente ao
plasmiacutedeo A anaacutelise da amplificaccedilatildeo da regiatildeo do gene blaKPC mostrou que
apenas a amostra A10 natildeo amplificou isso demonstra que esta amostra natildeo
possuiacutea o gene de resistecircncia
5 1 1 Gene blaKPC
Figura 7 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 881 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
A amostra A3 natildeo amplificou no primeiro momento entatildeo foi realizado
novamente a PCR e corrida de gel obtendo entatildeo a amplificaccedilatildeo da amostra como
apresentado na figura 8
45
Figura 8 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC da
mostra A3 estudada A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo de 881
pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 1 2 Gene 16S rRNA
Para a amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA utilizou-se o oligo universal Foram
amplificadas amostras que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 996 pb
Figura 9 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
46
Segundo Lu et al (2000) a digestatildeo com a enzima HaeIII deste amplicons de
16S rRNA devolveriam bandas com perfis entre 150 a 200 pb No gel abaixo eacute
possiacutevel evidenciar que este perfil ocorreu com o predomiacutenio de bandas na altura
de 200pb
Figura 10 Gel de agarose a 2 da digestatildeo do amplicon do gene 16S
rRNA das amostras com a enzima HaeIII evidenciando diversos fragmentos
proacuteximos a 200 pb A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo ribossomal
de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 2 Anaacutelises epidemioloacutegicas
5 2 1 Sexo
No total foram detectados 17 isolados de KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 onde a maior a prevalecircncia foi
detecatada em amostras de pacientes do sexo masculino (53) do que no sexo
feminino (47)
47
Figura 11 Isolado de KPC segundo sexo dos 17 pacientes investigados
no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 2 Desfecho cliacutenico
Em 17 isolados de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo
de 2010 aacute 2011 a porcentagem de pacientes que foram a oacutebito (59) foi maior que
a de pacientes que tiverm alta (41)
Figura 12 Isolado de KPC segundo desfecho cliacutenico dos 17 pacientes
investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
48
5 2 3 Local da coleta
Dos 17 episoacutedios detectados de infecccedilatildeo por KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 a infecccedilatildeo em swab retalfoi mais
frequente (47) seguida de ponta de cateacuteter (18) e secreccedilatildeo traqueal (12)
Figura 13 Isolados de KPC segundo local da coleta da amostra nos 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 4 Microorganismo
O microorganismo mais encontrado foi a Klebsiella pneumoniae (82)
seguida da Enterobacter clocae (12) e Serratia marcescens (6) dos 17 isolados
de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 Isto afirma o
fato de a sigla KPC ser utilizada de forma errocircnea aacute Klebsiella pneumoniae visto
que a evidecircncia dela eacute maior em relaccedilatildeo as outras cepas
49
Figura 14 Isolado de KPC segundo microrganismo encontrado em 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 5 Relaccedilotildees variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana e desfecho
cliacutenico
Tabela 6 ndash Distribuiccedilatildeo do perfil geneacutetico sexo coleta tipificaccedilatildeo de
microrganismos e anaacutelise da resistecircncia bacteriana segundo o desfecho
cliacutenico Brasiacutelia-DF 2010 a 2011
Variaacutevel Resultado
Desfecho
Alta Oacutebito
N N P
Gene 16S rRNA Positivo 7 1000 10 1000
NA Gene blaKPC Positivo 6 857 10 1000
Negativo 1 143 0 00 0218 Sexo Feminino 2 286 6 600
Masculino 5 714 4 400 0201 Local da coleta Fundo saco de
Douglas 1 143 0 00
Hemocultura 0 00 1 100 0463 Ponta de cateter 1 143 2 200
Sec TraquealBrocircnquica
0 00 1 100
50
Secreccedilatildeo traqueal 2 286 0 00
Swab retal 3 429 5 500
Urina 0 00 1 100
Microrganismo Enterobacter cloacae (KPC)
1 143 1 100
Klebsiella pneumoniae
6 857 8 800
0416 Serratia
marcescens 0 00 1 100
Teste de Hodge Hodge positivo 7 1000 10 1000
NA Amicacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 1 100 0848 resistente 0 00 1 100
sensiacutevel 2 286 3 300
Amoxicilina Aacutecido Clavulacircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Ampicilina Sulbactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ampicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Aztreonan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefazolina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Cefoperazona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Cefotaxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefoxitina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0509 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 2 286 4 400
Ceftazidima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cetriaxona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 3 429 5 500 0772 Cefalotina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ciprofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772
51
resistente 3 429 5 500
Claritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Clindamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Eritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Gentamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0942 resistente 2 286 3 300
sensiacutevel 1 143 2 200
Imipenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 0 00 2 200 0193 Resistente 1 143 3 300
sensiacutevel 2 286 0 00
Nitrofurantoiacutena sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Norfloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Oxacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Penicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Piperacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Rifampicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tetraciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Ticarcilina Aacutecido Clavulocircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0688 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 3 429 4 400
Tobramicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Trimetoprima Sulfametoxazol
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0112 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 2 286 0 00
Vancomicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tigeciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediario 0 00 1 100 0211 natildeo testado 1 143 4 400
resistente 2 286 0 00
52
Cefepime sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefuroxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Levofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Piperacilina Tazobactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Ertapenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Meropenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0223 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 1 143 0 00
Cefotetan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 sensiacutevel 0 00 1 100
Gemifloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 7 700 0585 natildeo testado 3 429 3 300
Desfecho
Alta Oacutebito
Meacutedia Erro
padratildeo Meacutedia Erro
padratildeo p
Idade 58 9 59 5 0991
Tempo Internaccedilatildeo (dias)
50 13 46 12 0571
n= 17 p(lt 005) NA natildeo se aplica
53
6 DISCUSSAtildeO
Nos uacuteltimos anos houve um aumento na incidecircncia de bacteacuterias
multirresistentes aos antimicrobianos no ambiente hospitalar tornando isto um
problema mundial de sauacutede puacuteblica (HULSCHER et al 2010) Quando se trata
principalmente de bacilos Gram negativos a frequumlecircncia destas bacteacuterias eacute ainda
maior em paiacuteses da Ameacuterica Latina quando comparada a paiacuteses desenvolvidos
(GALES etal 2012)
De acordo com dados do ldquoMeropenem Yearly Susceptibility Test Information
Collectionrdquo (MYSTIC) ocorreu nos Estados Unidos um aumento na susceptibilidade
de K pneumoniae nos uacuteltimos anos graccedilas a praacuteticas de controle de disseminaccedilatildeo
de amostras resistentes(RHOMBERG P R et al 2009) O aumento crescente da
prevalecircncia destes microrganismos foi proporcional ao aumento da dependecircncia do
uso de antibioacuteticos carbapenecircmicos considerados como a opccedilatildeo terapecircutica para o
tratamento de infecccedilotildees por bacilos Gram negativos multi-resistentes (LIVERMORE
2012) Isto afeta diretamente as opccedilotildees de tratamento sobrando poucas alternativas
para a terapecircutica que incluem colistina (polimixina E) e tigeciclina que apresentam
respectivamente problemas em termos de toxicidade e eficaacutecia (LIVERMORE et
al 2011) Um dos efeitos adversos mais importantes das poliminas B e E por
exemplo satildeo a neurotoxicidade e nefrotoxicidade (MENDES C A C et al2009 )
Devido agrave resistecircncia ser usualmente de natureza plasmidial e portanto de
maior disseminaccedilatildeo especialmente quando carreadas por K pneumoniae
microrganismo com uma notoacuteria capacidade para acumular e transferir plasmiacutedeos
com determinantes para resistecircncia o nuacutemero de casos detectados pelo
fenoacutetipogenoacutetipo blaKPC eacute bastante preocupante (MONTEIRO et al 2009)
Comparada com outras bacteacuterias hospitalares a transmissatildeo de clones
multirresistentes de K pneumoniae eacute maior e podem natildeo ser controladas pelos
meacutetodos de controle de infecccedilatildeo hospitalar (PAAUW et al 2007) A forma
plasmidial para transferecircncia da resistecircncia adicionada a este grande potencial para
disseminaccedilatildeo de clones resistentes eacute preocupante visto que apoacutes surtos muitas
vezes pode se tornar endecircmica Jaacute eacute uma realidade a disseminaccedilatildeo desta bacteacuteria
54
entre pacientes hospitais paiacuteses e ateacute mesmo continentes (WOODFORF et al
2010 ROGERS et al 2011)
As chances de surtos satildeo maiores em paiacuteses com poucos recursos devido agrave
maior carecircncia de praacuteticas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees hospitalares e o
uso irracional de antimicrobianos de forma empiacuterica e inadequada (KUMARASAMY
et al 2010) Ateacute o momento os mecanismos de resistecircncia aos cabapenecircmicos
geralmente encontrado eram a produccedilatildeo de ESBL (CTX-M) somada aacute perda de
porina (CARVALHAES et al 2010) Foi notado a partir do ano de 2008 um
aumento no nuacutemero de K pneumoniae produtoras de KPC-2 apresentando outra
forma de resistecircncia (GALES 2012)
Um estudo mostrou que o perfil do paciente colonizado ou infectado por KPC
foi de um paciente entre os 33 e os 82 anos de idade internado haacute mais de 1
semana no hospital A mortalidade geral nos uacuteltimos anos ficou em torno de 7
sendo que dos 77 pacientes estudados 32 (415) pacientes evoluiacuteram para oacutebito
evidenciando a alta morbi-mortalidade associada (ALVES A P et al 2013)
Em estudo com 2316 pacientes avaliados a populaccedilatildeo de sexo masculino foi
de 526 idade meacutedia global de 53 anos (mediana de 55 anos) permanecircncia meacutedia
de 58 dias (mediana de 3 dias) (OLIVEIRA A C et al 2010) Outros trabalhos
apresentaram ausecircncia de significacircncia entre sexoidade e o desenvolvimento de
infecccedilotildees por microrganismos resistentes (PERES-BOTA D et al 2003 COLPAN
A et al 2005 COELLO R et al 1997)
Outro estudo utilizou um total de 30 amostras sendo elas isoladas de urina
escarro secreccedilatildeo pleural ponta de cateter aspirado traqueal e hemocultura A mais
prevalente foi em urina (40) Entre as 30 cepas analisadas a maior porcentagem
foi da cepa Klebsiella pneumoniae (70) Enterobacter sp (133) Klebsiella
ozaenae (10) Escherichia coli (333) e Klebsiella oxytoca (333)
(DIENSTMANN R et al 2010) Nos Estados Unidos a enzima KPC jaacute se tornou
endecircmica Foi realizada uma pesquisa em dois hospitais de Nova York onde
testaram 602 amostras e 45 apresentaram algum mecanismo de resistecircncia
sendo apenas 33 confirmadas por biologia molecular como KPC-2 (BRATU et
al 2005)
55
Estudo sobre os tipos de ESBL feito no Japatildeo apresentou o tipo Toho-1 como
o mais prevalente nessa pesquisa Ateacute o ano de 2000 ano em que foi publicado tal
estudo este era o primeiro relatoacuterio no Japatildeo para identificar derivados de ESBLs
como tipo de SHV e TEM entre E coli e K pneumoniae Em especial o tipo SHV- 12
foi identificado com uma maior frequumlecircncia Estes resultados indicam que tipos
distintos de ESBLs que satildeo diferentes em sua especificidade de substrato e origem
geneacutetica coexistem no Japatildeo Isto mostra a importacircncia de caracterizar genoacutetipos
distintos de ESBLs e de estar em alerta continuamente para as tendecircncias de
ESBLs no Japatildeo aleacutem da necessidade de uma interpretaccedilatildeo uniforme utilizando as
diretrizes do CSLI para relatar cepas produtoras de ESBL Aleacutem da detecccedilatildeo de
ESBLs satildeo necessaacuterias mais informaccedilotildees tais como o perfil de sensibilidade
especiacutefica para diversas β-lactacircmicos e o local da infecccedilatildeo Esses fatores satildeo
essenciais para a escolha adequada de antibioacuteticos (YAGI T et al 2000)
No ano de 2004 uma pesquisa avaliou a produccedilatildeo de uma enzima de
hidroacutelise de carbapenecircmicos atraveacutes da teacutecnica de sequumlenciamento foi revelado
um novo membro da famiacutelia KPC designado KPC- 3 Pesquisadores encontraram
em um mutante de K pneumoniae uma substituiccedilatildeo de um gene associado com
resistecircncia a Imipenem mas essa substituiccedilatildeo foi considerada improvaacutevel na
contribuiccedilatildeo da resistecircncia aos carbapenecircmicos da espeacutecie estudada Aleacutem da
resistecircncia aos carbapenecircmicos estes isolados eram em sua maioria resistentes agraves
cefalosporinas penicilinas e aminoglicosiacutedeos Usando estudos de transformaccedilatildeo
conjugaccedilatildeo e hibridaccedilatildeo localizaram o alelo blaKPC em plasmiacutedeo aleacutem disso
mostraram que esse alelo tambeacutem carregava uma resistecircncia aos aminoglicosiacutedeos
A transferecircncia das enzimas KPCs foi demonstrada in vitro tanto neste como em
outros estudos pode ser que os plasmiacutedeos que fazem esta transferecircncia estavam
comeccedilando a se espalhar no ambiente cliacutenico resultando na multiresistecircncia dessas
estirpes (WOODFORD et al 2004)
O presente estudo apresentou um vieacutes quanto aos resultados dos testes de
susceptibilidade microbiana Observou-se que natildeo foi encontrado resultado deste
teste em algumas amostras o que natildeo cooperou para um estudo mais preciso
futuros estudos quanto agraves amostras e um melhor acompanhamento deste tipo de
patologia Poreacutem mesmo sem algumas amostras com este resultado disponiacutevel foi
56
confirmada a presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos
carbapenecircmicos por meio dos genes de resistecircncia blaKPC e 16S rRNA que as
amostras apresentaram em sua maioria serem portadoras Quanto aos resultados
estatiacutesticos nenhuma das variaacuteveis apresentou significacircncia estatiacutestica (p gt 005)
mostrando assim que estas variaacuteveis isoladas natildeo foram o fator determinante para
o desfecho cliacutenico de alta ou oacutebito
57
7 CONCLUSAtildeO
Os genes blaKPC e 16S rRNA foram caracterizados confirmando a a
presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos carbapenecircmicos
Houve uma maior prevalecircncia da cepa K pneumoniae e isto confirma outros
estudos que apresentam a maior prevalecircncia desta cepa em amostras com KPC
Aleacutem disso isso justifica a forma popular da K pneumoniae ser chamada de KPC
enquanto que na verdade KPC eacute uma enzima podendo estar presente em outras
cepas como Enterobacter clocae tambeacutem apresentada no presente estudo O
desfecho cliacutenico de oacutebitos maior que 50 eacute um possiacutevel indicador sobre a
necessidade de se realizar um teste raacutepido para identificaccedilatildeo de KPC visando
iniciar o mais raacutepido possiacutevel o tratamento afim de diminuir a mortalidade por esta
infecccedilatildeo
Nenhuma das variaacuteveis isoladamente estaacute relacionada ao desfecho cliacutenico
oacutebito ou alta pois natildeo apresentaram relevacircncia estatiacutestica O presente estudo
mostrou que haacute presenccedila da bacteacuteria nas amostras de pacientes do hospital
estudado podendo entatildeo afirmar que este tipo de bacteacuteria se encontra tambeacutem
presente em ambiente hospitalar O uso irracional de antimicrobiano eacute demonstrado
de forma indireta quando foi apresentado atraveacutes do Teste de Hodge Modificado
uma resistecircncia de 100 aos antibioacuteticos carbapenecircmicos Isto tambeacutem reflete na
terapecircutica sendo que pacientes portadores de bacteacuterias resistentes aos
antibioacuteticos carabepecircmicos tem uma escassa opccedilatildeo de tratamento e as opccedilotildees
apresentam problemas quanto agrave toxicidade e eficaacutecia
58
REFEREcircNCIAS
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Mecanismos
de resistecircncia bacteriana aos antimicrobianos Disponiacutevel em
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controleopas_
webmodulo3mec_sitiohtmgt Acesso em 25 de abril de 2014
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Nota teacutecnica nordm
012013 medidas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees por enterobacteacuterias
multiresistentes Acesso em 17 de abril de 2013
ALBA J et al Kinetics study of KPC-3 a plasmid-encoded class A
carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase Antimicrob Agents Chemother
Nov49(11)4760-2 2005
ALVES A P et al Nosocomial infections by KPC-producing enterobacteria in
a tertiary hospital in Southern Brazil Revista da AMRIGS Porto Alegre 57 (3) 213-
218 jul-set 2013
ALVES A et al Tipagem Geneacutetica de Microrganismos Lab De Diversidade
Microbiana Centro de Biologia Celular Dep de Biologia U de Aveiro 3810-193
Aveiro- 2003
BELL J M et Al Prevalence and significance of a negative extended-
spectrum beta-lactamase (ESBL) confirmation test result after a positive ESBL
screening test result for isolates of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae
results from the SENTRY Asia-Pacific Surveillance Program J Clin Microbiol
May45(5)1478-82 2007
BRATU S et al Detection of KPC carbapenem-hydrolyzing enzymes in
Enterobacter spp from Brooklyn New York Antimicrob Agents Chemother v 49 n
2 p 776-8 2005
59
BRATU S et al Emergence of KPC-possessing Klebsiella pneumoniae in
Brooklyn New York epidemiology and recommendations for detection Antimicrob
Agents Chemother v 49 n 7 p 3018-20 2005
BRATU S et al Rapid spread of carbapenem-resistant Klebsiella
pneumoniae in New York City Arch Intern Med v 165 p 1430-5 2005
CAMARGO C F et al Aplicaccedilatildeo das teacutecnicas de pcr e suas teacutecnicas
derivadas em diagnoacutestico molecular Disponiacutevel em
ltfileDUnB10C2BA20semestreArtigosPCR-
20CLEYTON20FLORENCIO20DE20CAMARGO20E20PAULO20ROB
ERTO20QUEIROZpdfgtgt Acesso em 08 de abril de 2014
CARVALHES C G et al Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting
carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive
results Journal of Antimicrobial Chemotherapy v 65 n2 p 249-251 2010
CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION- CDC Modified
Hodge Test for Carbapenemase Detection in Enterobacteriaceae 2004
CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE Methods for
dilutionantimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically Approved
standard M7ndashA7 7th ed CLSI Wayne PA 2011
COELLO R et al Risk factors for developing clinical infection with methicillin-
resistant Staphylococcus aureus (MRSA) amongst hospital patients initially only
colonized with MRSA J Hosp Infect 19973739-46
COLPAN A et al Evaluation of risk factors for mortality in intensive care
units A prospective study from a referral hospital in Turkey Am J Infect Control
200533(1)42-7
60
CORNAGLIA G et al Living with ESBLs Introduction Clinical Microbiology
and Infection 14 Suppl 1 1-2 2008
COTRIM E R et al Klebsiella pneumoniae carbapenemase ndash KPC em
Enterobacteriaceae o desafio das bacteacuterias multirresistentes Poacutes em revista do
centro universitaacuterio Newton Paiva 12012 - ediccedilatildeo 5 - issn 2176 7785
DESHPANDE L M et al Occurrence and characterization of
carbapenemase-producing Enterobacteacuteriaceae report from the SENTRY
Antimicrobial Surveillance Program (2000-2004) Microb Drug Resist 12(4)223-30
2006
DIAS D J A Estudos dos principais mecanismos de resistecircncia aos
antibioacuteticos β-lactacircmicos em bacteacuterias patogecircnicas gram negativas 2009 100 f
Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Geneacutetica Molecular e Biomedicina) ndash Faculdade de
Ciecircncias e Tecnologia Universidade de Nova Lisboa Lisboa
DIENSTMANN R et al Avaliaccedilatildeo fenotiacutepica da enzima Klebsiella
pneumoniae carbapenemase (KPC) em Enterobacteriaceae de ambiente hospitalar
J Bras Patol Med Lab v 46 n 1 p 23-27 fevereiro 2010
ENDIMIAMI A et al Emergence of blaKPC-containing Klebsiella
pneumoniae in a long-term acute care hospital a new challenge to our healthcare J
Antimicrob Chemother 64 1102-1110 Nov 2009
FALAGAS M E et al Extended-spectrum beta-lactamase producing
organisms The Journal of Hospital Infection 73 (4) pp 345-54 2009
FONTANA C et al Emergence of KPC-producing Klebsiella pneumoniae in
Italy BMC Rev Notes 3 40 2010
61
GALES A C et al Antimicrobial resistance among Gram-negative bacilli
isolated from Latin America results from Sentry Antimicrobial Surveillance Program
(Latin America 2008-2010) Diagnostic Microbiology and Infectious Disease v 3 n
4 p 354 -360 2012
GUPTA N et al Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Epidemiology
and Prevention HEALTHCARE EPIDEMIOLOGY Clinical Infectious Diseases
201153(1)60ndash67 Published by Oxford University Press on behalf of the Infectious
Diseases Society of America 2011
HARBOTTLE H et al Genetics of antimicrobial resistance Anim Biotechnol
n17 p111-124 2006
HENRIQUE W N et al RESISTEcircNCIA BACTERIANA Uniatildeo das
Faculdades Alfredo NasserInstituto de Ciecircncias da Sauacutede Disponiacutevel em lt
httpwwwfaculdadealfredonasseredubrfilespesquisaposter20HENRIQUE20
Wilker20Natividade20SANTIAGO20Silvania20CAVALCANTI20DSP
20ResistC3AAncia20Bacterianapdfgt Acesso em 17 marccedilo 2014
HULSCHER M E J I et al Antibiotic prescribing in hospital a social and
behavioral scientific approach The Lancet Infectious Diaseases v 10 n 3 p 167-
165 2010
KIDWAI M SAPRA P BHUSHAN KR Synthetic strategies and medicinal
properties of beta-lactams Curr Med Chem 1999 695-215
KUMARASAMY K K et al Emergence of a new antibiotic resistance
mechanism in India Pakistan and the UK a molecular biological and
epidemiological stuy The Lancet Infectious Diseases v10 n 9 p 597- 602 2010
LINCOPAN N et al Enterobacteacuteria producing extended-spectrum β-
lacatamases and IMP-1 Metalo-β-lactamases isolated from Brazilian hospitals J Med
62
Microbiol 7 1-3 2006
LINCOPAN N et al First Isolation of Metalo-β-Lacatamase-Producing
Multiresistant Klebsiella pneumoniae from a patient in Brazil J Clin Microbiol 43(1)
516-519 2005
LIVERMORE D M et al What remains against carbapenem- resistant
Enterobacteriaceae Evaluation of choramphenicol ciprofloxacin colistina
fosfomycin minocycline nitrofurantoin temocilin and tigecycline International
Journal of Antimicrobial Agents v 37 n 5 p 415- 459 2011
LIVERMORE D M Fourten years in resistance International Journal of
Antimicrobial Agents v 39 283- 294 2012
LIVERMORE D M Bacterial resistance to carbapenems Adv Exp Med Biol
1995 39025-47
LIVERMORE D M Bacterial resistance origins epidemiology and impact
Clin Infect Dis 36S11-S23 2003
LIVERMORE D M et al Carbapenemases a problem in waiting Curr
Opin Microbiol 2000 3489-95
LU et al Universal pcr for common bacterial pathogens J CLIN
MICROBIOL VOL 38 2000
LU et al Use of PCR with Universal Primers and Restriction Endonuclease
Digestions for Detection and Identification of Common Bacterial Pathogens in
Cerebrospinal Fluid Journal of Clinical Microbiology June 2000 p 2076ndash2080
MARSCHALL J Met al Presence of the KPC Carbapenemase Gene in
Enterobacteriaceae Causing Bacteremia and Its Correlation with In Vitro
Carbapenem Susceptibility J Clin Microbiol 47 239-241 Jan 2009
63
MARTINS WMBS et al Prevalecircncia do gene blaKPC em isolados cliacutenicos
de Enterobacteriaceae e natildeo fermentadores encontrados em amostras clinicas em
um hospital universitaacuterio do Recife X Jornada de ensino pesquisa e extensatildeo ndash
JEPEX 2010 ndash UFRPE Recife 18 a 22 de outubro
MENDES C A C et al Polimixinas Revisatildeo com ecircnfase na sua
nefrotoxicidade Rev Assoc Med Bras 2009 55(6) 752-9
MOHR J F 3rd Update on the efficacy and tolerability of meropenem in the
treatment of serious bacteacuterial infections Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S41-51
2008
MONTEIRO J et al First report of KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae
strains in Brazil Antimicrob Agents Chemother Jan53(1)333-4 2009
MOREIRA V C et al Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia a antibioacuteticos
Disponiacutevel em
lthttpwwwcpglsucgbr6mostraartigosSAUDEVANESSA20CARVALHO20M
OREIRApdfgt Acesso em 21 marccedilo 2014
NETIKUL T et al Emergence of novel blaKPC-12 and blaKPC-13 variants in
carbapenem non-susceptible Enterobacter cloacae a first report of blaKPC gene in
Thailand European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases May
S372 2011
NETO V A et al Antibioacuteticos na praacutetica Meacutedica 6ordf Ediccedilatildeo Editorial
SarverSP Brasil 2007
NICOLAU D P Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of
meropenem Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S32-40 2008
64
OLIVEIRA A C et al Resistecircncia bacteriana e mortalidade em um centro de
terapia intensiva Rev Latino-Am Enfermagem nov-dez 2010
PAAUW A et al Failure to control an outbreak of qnrA 1-positive multidrug-
resistant Enterobacter clocae despite adequate implementation of recommended
infection control measures Journal of Clinical Microbiology v 45 n 5 p 1420-1425
2007
PATERSON D L et al Extended-Spectrum Beta-Lactamases a Clinical
Update Clinical Microbiology Reviews v 18 p 657-686 2005
PEIRANO G et al Carbapenem-hydrolysing beta-lactamase KPC-2 in
Klebsiella pneumonia isolated in Rio de Janeiro Brazil J Antimicrob Chemother Nov
20 2009
PERES-BOTA D et al Are infections due to resistant pathogens associated
with worse outcome in critically ill patients J Infect 200347(4)307-16
PIDDOCK L J V Clinically relevant chromosomally encoded multidrug
resistance effl ux pumps in bacterial Clin Microbiol Rev n19 p382-402 2006
PITOUT J D D et al Emergence of Enterobacteriaceae producing
extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) in the community J Antimicrob
Chemother May 56 2005
POSSEBON M I et al Resistecircncia bacteriana aos carbapenecircmicos
Bacterial resitence to carbapenems RBM rev bras med60(6)378380-378-382
jun 2003
QUEENAN A M et al Carbapenemases the versatile beta-lactamases
Clin Microbiol Rev Jul20(3)440-58 2007
65
RHOMBERG P R et al Summary trends for the meropenem yearly
susceptibility test information collection program a 10- year experience in the United
States (1999-2008) Diagnostic Microbiology and Infectiois Disease v 65 n4 p
414-426 2009
ROBLEDO I E et al Detection of KPC in Acinetobacter spp in Puerto Rico
J Antimicrob Agents Chemother 54 1354-1357 Mar 2010
ROGERS B A et al Country-to-country transfer os patients and the risk of
multi-resistant bacterial infection Clinical Infectious Disease v53 n1 p49- 56
2011
SHAH A A et al Characteristics epidemiology and clinicalimportance of
emerging strains of Gram-negative bacilli producing extended-spectrum
betalactamases Research in Microbiology v 155 p 409-421 2004
TURNER P J Extended- Spectrum Beta-Lactamases Clinical Infectious
Diseases v 41 p 273-275 2005
WOLTER D J et al Phenotypic and Enzymatic Comparative Analysis
between the Novel KPC variant KPC-5 and Its Evolutionary Variants KPC-2 and
KPC-4 Antimicrob Agents Chemother Nov 17 2008
WOODFORD N et al Carbapenemases of Chryseobacterium
(Flavobacterium) meningosepticum distribution of blaB and characterization of a
novel Metalo-beta-lactamase gene blaB3 in the type strain NCTC 10016
Antimicrob Agents Chemother Jun44(6)1448-52 2000
WOODFORF N Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in
India Pakistan and the UK a molecular biological and epidemiological study The
Lancet Infectious Diseases v 10 n 9 p 597-602 2010
66
WOODFORD et al Outbreak of Klebsiella pneumoniae Producing a New
Carbapenem- Hydrolyzing Class A β-Lactamase KPC-3 in a New York Medical
Center Antimicrobial agents and chemotherapy Dec 2004 p 4793ndash4799 Vol 48
No 12
YAGI T et al A preliminary survey of extended-spectrum β-lactamases
(ESBLs) in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Japan
FEMS Microbiology Letters 184 (2000) 53-56
YIGIT H et al Novel carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase KPC-1 from
a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumonia J Antimicrob Agents
Chemother 45 (4) 1151-1161 (2001)
ZAVASCKI A P et al KPC-2- producing Enterobacter cloacae in two cities
from Southern Brazil Int J Antimicrob Agents Apr 28 2009
ZHANEL G G et al Comparative review of the carbapenecircmicos Drugs
67(7)1027-52 2007
67
ANEXOS
Sequumlecircncia do oligo blaKPC
Query 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
Query 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
Query 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
68
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
Query 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
Query 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
69
Query 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
Query 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
Query 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
70
Sbjct 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
Query 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
Query 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
Query 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
71
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
Query 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
Query 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
72
Query 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
Query 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
Query 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
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|||||||
73
Sbjct 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
Query 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
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Sbjct 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
Query 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
Query 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
74
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Sbjct 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
Query 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
Query 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
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|||||||
Sbjct 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
75
Query 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
Query 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
||||
Sbjct 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
LOCUS AF297554 1377 bp
DNA linear BCT 26-MAR-2001
DEFINITION Klebsiella pneumoniae carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
gene complete cds
ACCESSION AF297554
VERSION AF2975541 GI10121874
76
KEYWORDS
SOURCE Klebsiella pneumoniae
ORGANISM Klebsiella pneumoniae
Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Enterobacteriaceae Klebsiella
REFERENCE 1 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH QueenanAM
AndersonGJ Domenech-SanchezA
BiddleJW StewardCD
AlbertiS BushK and TenoverFC
TITLE Novel carbapenem-hydrolyzing beta-
lactamase KPC-1 from a
carbapenem-resistant strain of
Klebsiella pneumoniae
JOURNAL Antimicrob Agents Chemother 45 (4)
1151-1161 (2001)
PUBMED 11257029
REFERENCE 2 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH AndersonGJ and
TenoverFC
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (19-AUG-2000) Nosocomial
Pathogens Laboratory Branch
Centers for Disease Control and
Prevention 1600 Clifton Rd MS
G08 Atlanta GA 30333 USA
FEATURES LocationQualifiers
77
source 11377
organism=Klebsiella
pneumoniae
mol_type=genomic DNA
db_xref=taxon573
-35_signal 5560
-10_signal 7883
mRNA 921012
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
RBS 117122
CDS 1311012
note=blaKPC-1
codon_start=1
transl_table=11
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
protein_id=AAG134101
db_xref=GI10121875
translation=MSLYRRLVLLSCLSWPLAGFSATALTNLVAEPFAKLEQD
FGGSI
GVYAMDTGSGATVSYRAEERFPLCSSFKGFLAAAVLARSQQQAGLLDTPIRYG
KNALV
PWSPISEKYLTTGMTVAELSAAAVQYSDNAAANLLLKELGGPAGLTAFMRSIG
DTTFR
78
LDRWELELNSAIPSDARDTSSPRAVTESLQKLTLGSALAAPQRQQFVDWLKGN
TTGNH
RIRAAVPADWAVGDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTRAPNKDDK
HSEAV
IAAAARLALEGLGVNGQ
ORIGIN
1 cggggcagtt acagccgtta cagcctctgg
agagggagcg gcttgccgct cggtgataat
61 cccagctgta gcggcctgat tacatccggc
cgctacacct agctccacct tcaaacaagg
121 aatatcgttg atgtcactgt atcgccgtct
agttctgctg tcttgtctct catggccgct
181 ggctggcttt tctgccaccg cgctgaccaa
cctcgtcgcg gaaccattcg ctaaactcga
241 acaggacttt ggcggctcca tcggtgtgta
cgcgatggat accggctcag gcgcaactgt
301 aagttaccgc gctgaggagc gcttcccact
gtgcagctca ttcaagggct ttcttgctgc
361 cgctgtgctg gctcgcagcc agcagcaggc
cggcttgctg gacacaccca tccgttacgg
421 caaaaatgcg ctggttccgt ggtcacccat
ctcggaaaaa tatctgacaa caggcatgac
481 ggtggcggag ctgtccgcgg ccgccgtgca
atacagtgat aacgccgccg ccaatttgtt
541 gctgaaggag ttgggcggcc cggccgggct
gacggccttc atgcgctcta tcggcgatac
79
601 cacgttccgt ctggaccgct gggagctgga
gctgaactcc gccatcccaa gcgatgcgcg
661 cgatacctca tcgccgcgcg ccgtgacgga
aagcttacaa aaactgacac tgggctctgc
721 actggctgcg ccgcagcggc agcagtttgt
tgattggcta aagggaaaca cgaccggcaa
781 ccaccgcatc cgcgcggcgg tgccggcaga
ctgggcagtc ggagacaaaa ccggaacctg
841 cggagtgtat ggcacggcaa atgactatgc
cgtcgtctgg cccactgggc gcgcacctat
901 tgtgttggcc gtctacaccc gggcgcctaa
caaggatgac aagcacagcg aggccgtcat
961 cgccgctgcg gctagactcg cgctcgaggg
attgggcgtc aacgggcagt aaggctctga
1021 aaatcatcta ttggcccacc accgccgccc
ttgcgggcgg catggattac caaccactgt
1081 cacatttagg ctaggagtct gcgcggcaga
gccgtgtgac cggttttctg tagagcactg
1141 acgatggcgg cggcgctctc tgcaattggc
aaggcgtcgg cgccaaggat accaatcttg
1201 cggcgcgcgg cgtgttatga cgactggggt
gcatttgagc cgccccattt aaccttcgcc
1261 ctcacagata cgccattcgc ctcaaattta
gcgccatgca gacgagcttc cactcggctt
1321 gcaccttgtc caggcccctc atgctgaact
gacgcaatcc catcaccgcc ttgatca
80
41
O termociclador utilizado para os experimentos foi o LifeTouch da BIOER
4 7 Digestatildeo
Para realizaccedilatildeo da digestatildeo foi utilizada a enzima BshF I (Hae III) EN- 1105
tamanho 7000 units concentraccedilatildeo 10 unitsmicroL fonte Bacillus sphaericus empresa
Jena bioscienceUtilizaram-se os componentes para o volume de 50microL da reaccedilatildeo
citados na tabela 5
Tabela 5 Reagentes utilizados para realizaccedilatildeo da digestatildeo do gene
universal
Reagente Volume
Produto de PCR 10 microL
Enzima BshF I 01 microL
Tampatildeo (10x) 5 microL
Aacutegua Miliq 349 microL
Total (em cada ependorff) 50 microL
Valores para 1 digestatildeo
Os ependorffs foram colocados por 30 minutos em banho-maria a 37ordmC Apoacutes
isso fez-se a corrida das amostras em gel de agarose para verificaccedilatildeo do resultado
(LU et al 2000)
4 8 Eletroforese em gel de agarose
Os produtos de DNA PCR e digestatildeo foram analisados em gel de agarose
2 O tempo de corrida do gel eacute de aproximadamente 1hora e 30minutos sendo
que no comeccedilo foi usada agrave voltagem de 50 V e apoacutes comeccedilar a correr o gel
aumentou a voltagem para 100 v Utilizou-se o marcador de 100pb (pares de bases)
Foi adicionado 3microL de corante Bromophenol (que tem a funccedilatildeo de fazer uma ligaccedilatildeo
na amostra de DNA e permitir a visualizaccedilatildeo da corrida no gel de agarose) em 7microL
de amostra tanto de DNA quanto de PCR Para o preparo do gel foi utilizado TBE
42
(Tris- Aacutecido Boacuterico) agarose e brometo de etiacutedio (sua funccedilatildeo eacute de corante para o gel
e permitir a visualizaccedilatildeo do DNA quando colocado agrave luz ultravioleta) Para o oligo
blaKPC a banda da amplificaccedilatildeo foi em 881ppb correspondendo ao plasmiacutedeo Jaacute
o oligo Universal foi em 996 pb
4 9 Descarte de resiacuteduos
Todos os materiais utilizados nos ensaios foram de uso uacutenico e manipulados
em cacircmaras de seguranccedila bioloacutegica classe II Apoacutes o uso foram colocados em
soluccedilatildeo desinfetantes (hipoclorito a 1) e em seguida autoclavados a 127oC por 20
min em sacos apropriados para autoclavaccedilatildeo Apoacutes a finalizaccedilatildeo do ciclo de
esterilizaccedilatildeo os sacos contendo o material descartaacutevel foram colocados em
recipientes de coleta da empresa responsaacutevel pela coleta de materiais bioloacutegicos
produzidos no laboratoacuterio de microbiologia Todos os procedimentos seguiram a
normativa RDC-ANVISA 3062004 sobre o descarte de resiacuteduos de serviccedilo de
sauacutede
4 10 Aspectos epidemioloacutegicos e cliacutenicos
Os aspectos cliacutenicos e epidemioloacutegicos foram investigados por meio de
prontuaacuterios dos pacientes portadores de enterobacteacuterias produtoras de
carbapenemases e envolveram topografia mais provaacutevel do foco infeccioso a
enfermidade motivadora da internaccedilatildeo o desfecho cliacutenico a idade e o tempo de
internaccedilatildeo
4 12 Anaacutelises eepidemioloacutegicas
As anaacutelises foram realizadas com o pacote estatiacutestico SPSS versatildeo 200
Para verificar quais variaacuteveis referentes aos dados epidemioloacutegicos e
microbioloacutegicos influenciaram no desfecho verificou- se a diferenccedila meacutedia das
variaacuteveis idade e tempo de internaccedilatildeo em cada grupo O teste estatiacutestico utilizado foi
o teste t de Student apoacutes se executar o teste de normalidade de Shapiro-Wilk Para
as variaacuteveis sexo perfil microbioloacutegico das enterobacteacuterias produtoras de
43
carbapenemases foi avaliada a associaccedilatildeo com o desfecho por meio do teste Exato
de Fisher O niacutevel de significacircncia adotado foi de 5
4 13 Preceitos eacuteticos
Este projeto estaacute inserido em um projeto maior denominado ldquoEpidemiologia
cliacutenica e caracterizaccedilatildeo molecular do Acinetobacter Baumannii resistente a
antibioticoterapia em pacientes internado em hospitais do Sistema Uacutenico de Sauacutederdquo
que foi submetido ao Comitecirc de Eacutetica em Pesquisa da Secretaria do Estado de
Sauacutede do Distrito Federal (SESDF) e emitido parecer aprovado pelo protocolo nordm
23109 (anexo)
44
5 RESULTADOS
51 Anaacutelise molecular
Para a amplificaccedilatildeo com o oligo blaKPC foram amplificadas amostras
que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 881 pb correspondente ao
plasmiacutedeo A anaacutelise da amplificaccedilatildeo da regiatildeo do gene blaKPC mostrou que
apenas a amostra A10 natildeo amplificou isso demonstra que esta amostra natildeo
possuiacutea o gene de resistecircncia
5 1 1 Gene blaKPC
Figura 7 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 881 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
A amostra A3 natildeo amplificou no primeiro momento entatildeo foi realizado
novamente a PCR e corrida de gel obtendo entatildeo a amplificaccedilatildeo da amostra como
apresentado na figura 8
45
Figura 8 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC da
mostra A3 estudada A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo de 881
pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 1 2 Gene 16S rRNA
Para a amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA utilizou-se o oligo universal Foram
amplificadas amostras que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 996 pb
Figura 9 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
46
Segundo Lu et al (2000) a digestatildeo com a enzima HaeIII deste amplicons de
16S rRNA devolveriam bandas com perfis entre 150 a 200 pb No gel abaixo eacute
possiacutevel evidenciar que este perfil ocorreu com o predomiacutenio de bandas na altura
de 200pb
Figura 10 Gel de agarose a 2 da digestatildeo do amplicon do gene 16S
rRNA das amostras com a enzima HaeIII evidenciando diversos fragmentos
proacuteximos a 200 pb A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo ribossomal
de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 2 Anaacutelises epidemioloacutegicas
5 2 1 Sexo
No total foram detectados 17 isolados de KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 onde a maior a prevalecircncia foi
detecatada em amostras de pacientes do sexo masculino (53) do que no sexo
feminino (47)
47
Figura 11 Isolado de KPC segundo sexo dos 17 pacientes investigados
no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 2 Desfecho cliacutenico
Em 17 isolados de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo
de 2010 aacute 2011 a porcentagem de pacientes que foram a oacutebito (59) foi maior que
a de pacientes que tiverm alta (41)
Figura 12 Isolado de KPC segundo desfecho cliacutenico dos 17 pacientes
investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
48
5 2 3 Local da coleta
Dos 17 episoacutedios detectados de infecccedilatildeo por KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 a infecccedilatildeo em swab retalfoi mais
frequente (47) seguida de ponta de cateacuteter (18) e secreccedilatildeo traqueal (12)
Figura 13 Isolados de KPC segundo local da coleta da amostra nos 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 4 Microorganismo
O microorganismo mais encontrado foi a Klebsiella pneumoniae (82)
seguida da Enterobacter clocae (12) e Serratia marcescens (6) dos 17 isolados
de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 Isto afirma o
fato de a sigla KPC ser utilizada de forma errocircnea aacute Klebsiella pneumoniae visto
que a evidecircncia dela eacute maior em relaccedilatildeo as outras cepas
49
Figura 14 Isolado de KPC segundo microrganismo encontrado em 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 5 Relaccedilotildees variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana e desfecho
cliacutenico
Tabela 6 ndash Distribuiccedilatildeo do perfil geneacutetico sexo coleta tipificaccedilatildeo de
microrganismos e anaacutelise da resistecircncia bacteriana segundo o desfecho
cliacutenico Brasiacutelia-DF 2010 a 2011
Variaacutevel Resultado
Desfecho
Alta Oacutebito
N N P
Gene 16S rRNA Positivo 7 1000 10 1000
NA Gene blaKPC Positivo 6 857 10 1000
Negativo 1 143 0 00 0218 Sexo Feminino 2 286 6 600
Masculino 5 714 4 400 0201 Local da coleta Fundo saco de
Douglas 1 143 0 00
Hemocultura 0 00 1 100 0463 Ponta de cateter 1 143 2 200
Sec TraquealBrocircnquica
0 00 1 100
50
Secreccedilatildeo traqueal 2 286 0 00
Swab retal 3 429 5 500
Urina 0 00 1 100
Microrganismo Enterobacter cloacae (KPC)
1 143 1 100
Klebsiella pneumoniae
6 857 8 800
0416 Serratia
marcescens 0 00 1 100
Teste de Hodge Hodge positivo 7 1000 10 1000
NA Amicacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 1 100 0848 resistente 0 00 1 100
sensiacutevel 2 286 3 300
Amoxicilina Aacutecido Clavulacircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Ampicilina Sulbactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ampicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Aztreonan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefazolina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Cefoperazona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Cefotaxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefoxitina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0509 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 2 286 4 400
Ceftazidima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cetriaxona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 3 429 5 500 0772 Cefalotina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ciprofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772
51
resistente 3 429 5 500
Claritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Clindamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Eritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Gentamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0942 resistente 2 286 3 300
sensiacutevel 1 143 2 200
Imipenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 0 00 2 200 0193 Resistente 1 143 3 300
sensiacutevel 2 286 0 00
Nitrofurantoiacutena sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Norfloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Oxacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Penicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Piperacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Rifampicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tetraciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Ticarcilina Aacutecido Clavulocircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0688 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 3 429 4 400
Tobramicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Trimetoprima Sulfametoxazol
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0112 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 2 286 0 00
Vancomicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tigeciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediario 0 00 1 100 0211 natildeo testado 1 143 4 400
resistente 2 286 0 00
52
Cefepime sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefuroxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Levofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Piperacilina Tazobactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Ertapenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Meropenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0223 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 1 143 0 00
Cefotetan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 sensiacutevel 0 00 1 100
Gemifloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 7 700 0585 natildeo testado 3 429 3 300
Desfecho
Alta Oacutebito
Meacutedia Erro
padratildeo Meacutedia Erro
padratildeo p
Idade 58 9 59 5 0991
Tempo Internaccedilatildeo (dias)
50 13 46 12 0571
n= 17 p(lt 005) NA natildeo se aplica
53
6 DISCUSSAtildeO
Nos uacuteltimos anos houve um aumento na incidecircncia de bacteacuterias
multirresistentes aos antimicrobianos no ambiente hospitalar tornando isto um
problema mundial de sauacutede puacuteblica (HULSCHER et al 2010) Quando se trata
principalmente de bacilos Gram negativos a frequumlecircncia destas bacteacuterias eacute ainda
maior em paiacuteses da Ameacuterica Latina quando comparada a paiacuteses desenvolvidos
(GALES etal 2012)
De acordo com dados do ldquoMeropenem Yearly Susceptibility Test Information
Collectionrdquo (MYSTIC) ocorreu nos Estados Unidos um aumento na susceptibilidade
de K pneumoniae nos uacuteltimos anos graccedilas a praacuteticas de controle de disseminaccedilatildeo
de amostras resistentes(RHOMBERG P R et al 2009) O aumento crescente da
prevalecircncia destes microrganismos foi proporcional ao aumento da dependecircncia do
uso de antibioacuteticos carbapenecircmicos considerados como a opccedilatildeo terapecircutica para o
tratamento de infecccedilotildees por bacilos Gram negativos multi-resistentes (LIVERMORE
2012) Isto afeta diretamente as opccedilotildees de tratamento sobrando poucas alternativas
para a terapecircutica que incluem colistina (polimixina E) e tigeciclina que apresentam
respectivamente problemas em termos de toxicidade e eficaacutecia (LIVERMORE et
al 2011) Um dos efeitos adversos mais importantes das poliminas B e E por
exemplo satildeo a neurotoxicidade e nefrotoxicidade (MENDES C A C et al2009 )
Devido agrave resistecircncia ser usualmente de natureza plasmidial e portanto de
maior disseminaccedilatildeo especialmente quando carreadas por K pneumoniae
microrganismo com uma notoacuteria capacidade para acumular e transferir plasmiacutedeos
com determinantes para resistecircncia o nuacutemero de casos detectados pelo
fenoacutetipogenoacutetipo blaKPC eacute bastante preocupante (MONTEIRO et al 2009)
Comparada com outras bacteacuterias hospitalares a transmissatildeo de clones
multirresistentes de K pneumoniae eacute maior e podem natildeo ser controladas pelos
meacutetodos de controle de infecccedilatildeo hospitalar (PAAUW et al 2007) A forma
plasmidial para transferecircncia da resistecircncia adicionada a este grande potencial para
disseminaccedilatildeo de clones resistentes eacute preocupante visto que apoacutes surtos muitas
vezes pode se tornar endecircmica Jaacute eacute uma realidade a disseminaccedilatildeo desta bacteacuteria
54
entre pacientes hospitais paiacuteses e ateacute mesmo continentes (WOODFORF et al
2010 ROGERS et al 2011)
As chances de surtos satildeo maiores em paiacuteses com poucos recursos devido agrave
maior carecircncia de praacuteticas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees hospitalares e o
uso irracional de antimicrobianos de forma empiacuterica e inadequada (KUMARASAMY
et al 2010) Ateacute o momento os mecanismos de resistecircncia aos cabapenecircmicos
geralmente encontrado eram a produccedilatildeo de ESBL (CTX-M) somada aacute perda de
porina (CARVALHAES et al 2010) Foi notado a partir do ano de 2008 um
aumento no nuacutemero de K pneumoniae produtoras de KPC-2 apresentando outra
forma de resistecircncia (GALES 2012)
Um estudo mostrou que o perfil do paciente colonizado ou infectado por KPC
foi de um paciente entre os 33 e os 82 anos de idade internado haacute mais de 1
semana no hospital A mortalidade geral nos uacuteltimos anos ficou em torno de 7
sendo que dos 77 pacientes estudados 32 (415) pacientes evoluiacuteram para oacutebito
evidenciando a alta morbi-mortalidade associada (ALVES A P et al 2013)
Em estudo com 2316 pacientes avaliados a populaccedilatildeo de sexo masculino foi
de 526 idade meacutedia global de 53 anos (mediana de 55 anos) permanecircncia meacutedia
de 58 dias (mediana de 3 dias) (OLIVEIRA A C et al 2010) Outros trabalhos
apresentaram ausecircncia de significacircncia entre sexoidade e o desenvolvimento de
infecccedilotildees por microrganismos resistentes (PERES-BOTA D et al 2003 COLPAN
A et al 2005 COELLO R et al 1997)
Outro estudo utilizou um total de 30 amostras sendo elas isoladas de urina
escarro secreccedilatildeo pleural ponta de cateter aspirado traqueal e hemocultura A mais
prevalente foi em urina (40) Entre as 30 cepas analisadas a maior porcentagem
foi da cepa Klebsiella pneumoniae (70) Enterobacter sp (133) Klebsiella
ozaenae (10) Escherichia coli (333) e Klebsiella oxytoca (333)
(DIENSTMANN R et al 2010) Nos Estados Unidos a enzima KPC jaacute se tornou
endecircmica Foi realizada uma pesquisa em dois hospitais de Nova York onde
testaram 602 amostras e 45 apresentaram algum mecanismo de resistecircncia
sendo apenas 33 confirmadas por biologia molecular como KPC-2 (BRATU et
al 2005)
55
Estudo sobre os tipos de ESBL feito no Japatildeo apresentou o tipo Toho-1 como
o mais prevalente nessa pesquisa Ateacute o ano de 2000 ano em que foi publicado tal
estudo este era o primeiro relatoacuterio no Japatildeo para identificar derivados de ESBLs
como tipo de SHV e TEM entre E coli e K pneumoniae Em especial o tipo SHV- 12
foi identificado com uma maior frequumlecircncia Estes resultados indicam que tipos
distintos de ESBLs que satildeo diferentes em sua especificidade de substrato e origem
geneacutetica coexistem no Japatildeo Isto mostra a importacircncia de caracterizar genoacutetipos
distintos de ESBLs e de estar em alerta continuamente para as tendecircncias de
ESBLs no Japatildeo aleacutem da necessidade de uma interpretaccedilatildeo uniforme utilizando as
diretrizes do CSLI para relatar cepas produtoras de ESBL Aleacutem da detecccedilatildeo de
ESBLs satildeo necessaacuterias mais informaccedilotildees tais como o perfil de sensibilidade
especiacutefica para diversas β-lactacircmicos e o local da infecccedilatildeo Esses fatores satildeo
essenciais para a escolha adequada de antibioacuteticos (YAGI T et al 2000)
No ano de 2004 uma pesquisa avaliou a produccedilatildeo de uma enzima de
hidroacutelise de carbapenecircmicos atraveacutes da teacutecnica de sequumlenciamento foi revelado
um novo membro da famiacutelia KPC designado KPC- 3 Pesquisadores encontraram
em um mutante de K pneumoniae uma substituiccedilatildeo de um gene associado com
resistecircncia a Imipenem mas essa substituiccedilatildeo foi considerada improvaacutevel na
contribuiccedilatildeo da resistecircncia aos carbapenecircmicos da espeacutecie estudada Aleacutem da
resistecircncia aos carbapenecircmicos estes isolados eram em sua maioria resistentes agraves
cefalosporinas penicilinas e aminoglicosiacutedeos Usando estudos de transformaccedilatildeo
conjugaccedilatildeo e hibridaccedilatildeo localizaram o alelo blaKPC em plasmiacutedeo aleacutem disso
mostraram que esse alelo tambeacutem carregava uma resistecircncia aos aminoglicosiacutedeos
A transferecircncia das enzimas KPCs foi demonstrada in vitro tanto neste como em
outros estudos pode ser que os plasmiacutedeos que fazem esta transferecircncia estavam
comeccedilando a se espalhar no ambiente cliacutenico resultando na multiresistecircncia dessas
estirpes (WOODFORD et al 2004)
O presente estudo apresentou um vieacutes quanto aos resultados dos testes de
susceptibilidade microbiana Observou-se que natildeo foi encontrado resultado deste
teste em algumas amostras o que natildeo cooperou para um estudo mais preciso
futuros estudos quanto agraves amostras e um melhor acompanhamento deste tipo de
patologia Poreacutem mesmo sem algumas amostras com este resultado disponiacutevel foi
56
confirmada a presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos
carbapenecircmicos por meio dos genes de resistecircncia blaKPC e 16S rRNA que as
amostras apresentaram em sua maioria serem portadoras Quanto aos resultados
estatiacutesticos nenhuma das variaacuteveis apresentou significacircncia estatiacutestica (p gt 005)
mostrando assim que estas variaacuteveis isoladas natildeo foram o fator determinante para
o desfecho cliacutenico de alta ou oacutebito
57
7 CONCLUSAtildeO
Os genes blaKPC e 16S rRNA foram caracterizados confirmando a a
presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos carbapenecircmicos
Houve uma maior prevalecircncia da cepa K pneumoniae e isto confirma outros
estudos que apresentam a maior prevalecircncia desta cepa em amostras com KPC
Aleacutem disso isso justifica a forma popular da K pneumoniae ser chamada de KPC
enquanto que na verdade KPC eacute uma enzima podendo estar presente em outras
cepas como Enterobacter clocae tambeacutem apresentada no presente estudo O
desfecho cliacutenico de oacutebitos maior que 50 eacute um possiacutevel indicador sobre a
necessidade de se realizar um teste raacutepido para identificaccedilatildeo de KPC visando
iniciar o mais raacutepido possiacutevel o tratamento afim de diminuir a mortalidade por esta
infecccedilatildeo
Nenhuma das variaacuteveis isoladamente estaacute relacionada ao desfecho cliacutenico
oacutebito ou alta pois natildeo apresentaram relevacircncia estatiacutestica O presente estudo
mostrou que haacute presenccedila da bacteacuteria nas amostras de pacientes do hospital
estudado podendo entatildeo afirmar que este tipo de bacteacuteria se encontra tambeacutem
presente em ambiente hospitalar O uso irracional de antimicrobiano eacute demonstrado
de forma indireta quando foi apresentado atraveacutes do Teste de Hodge Modificado
uma resistecircncia de 100 aos antibioacuteticos carbapenecircmicos Isto tambeacutem reflete na
terapecircutica sendo que pacientes portadores de bacteacuterias resistentes aos
antibioacuteticos carabepecircmicos tem uma escassa opccedilatildeo de tratamento e as opccedilotildees
apresentam problemas quanto agrave toxicidade e eficaacutecia
58
REFEREcircNCIAS
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Mecanismos
de resistecircncia bacteriana aos antimicrobianos Disponiacutevel em
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controleopas_
webmodulo3mec_sitiohtmgt Acesso em 25 de abril de 2014
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Nota teacutecnica nordm
012013 medidas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees por enterobacteacuterias
multiresistentes Acesso em 17 de abril de 2013
ALBA J et al Kinetics study of KPC-3 a plasmid-encoded class A
carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase Antimicrob Agents Chemother
Nov49(11)4760-2 2005
ALVES A P et al Nosocomial infections by KPC-producing enterobacteria in
a tertiary hospital in Southern Brazil Revista da AMRIGS Porto Alegre 57 (3) 213-
218 jul-set 2013
ALVES A et al Tipagem Geneacutetica de Microrganismos Lab De Diversidade
Microbiana Centro de Biologia Celular Dep de Biologia U de Aveiro 3810-193
Aveiro- 2003
BELL J M et Al Prevalence and significance of a negative extended-
spectrum beta-lactamase (ESBL) confirmation test result after a positive ESBL
screening test result for isolates of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae
results from the SENTRY Asia-Pacific Surveillance Program J Clin Microbiol
May45(5)1478-82 2007
BRATU S et al Detection of KPC carbapenem-hydrolyzing enzymes in
Enterobacter spp from Brooklyn New York Antimicrob Agents Chemother v 49 n
2 p 776-8 2005
59
BRATU S et al Emergence of KPC-possessing Klebsiella pneumoniae in
Brooklyn New York epidemiology and recommendations for detection Antimicrob
Agents Chemother v 49 n 7 p 3018-20 2005
BRATU S et al Rapid spread of carbapenem-resistant Klebsiella
pneumoniae in New York City Arch Intern Med v 165 p 1430-5 2005
CAMARGO C F et al Aplicaccedilatildeo das teacutecnicas de pcr e suas teacutecnicas
derivadas em diagnoacutestico molecular Disponiacutevel em
ltfileDUnB10C2BA20semestreArtigosPCR-
20CLEYTON20FLORENCIO20DE20CAMARGO20E20PAULO20ROB
ERTO20QUEIROZpdfgtgt Acesso em 08 de abril de 2014
CARVALHES C G et al Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting
carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive
results Journal of Antimicrobial Chemotherapy v 65 n2 p 249-251 2010
CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION- CDC Modified
Hodge Test for Carbapenemase Detection in Enterobacteriaceae 2004
CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE Methods for
dilutionantimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically Approved
standard M7ndashA7 7th ed CLSI Wayne PA 2011
COELLO R et al Risk factors for developing clinical infection with methicillin-
resistant Staphylococcus aureus (MRSA) amongst hospital patients initially only
colonized with MRSA J Hosp Infect 19973739-46
COLPAN A et al Evaluation of risk factors for mortality in intensive care
units A prospective study from a referral hospital in Turkey Am J Infect Control
200533(1)42-7
60
CORNAGLIA G et al Living with ESBLs Introduction Clinical Microbiology
and Infection 14 Suppl 1 1-2 2008
COTRIM E R et al Klebsiella pneumoniae carbapenemase ndash KPC em
Enterobacteriaceae o desafio das bacteacuterias multirresistentes Poacutes em revista do
centro universitaacuterio Newton Paiva 12012 - ediccedilatildeo 5 - issn 2176 7785
DESHPANDE L M et al Occurrence and characterization of
carbapenemase-producing Enterobacteacuteriaceae report from the SENTRY
Antimicrobial Surveillance Program (2000-2004) Microb Drug Resist 12(4)223-30
2006
DIAS D J A Estudos dos principais mecanismos de resistecircncia aos
antibioacuteticos β-lactacircmicos em bacteacuterias patogecircnicas gram negativas 2009 100 f
Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Geneacutetica Molecular e Biomedicina) ndash Faculdade de
Ciecircncias e Tecnologia Universidade de Nova Lisboa Lisboa
DIENSTMANN R et al Avaliaccedilatildeo fenotiacutepica da enzima Klebsiella
pneumoniae carbapenemase (KPC) em Enterobacteriaceae de ambiente hospitalar
J Bras Patol Med Lab v 46 n 1 p 23-27 fevereiro 2010
ENDIMIAMI A et al Emergence of blaKPC-containing Klebsiella
pneumoniae in a long-term acute care hospital a new challenge to our healthcare J
Antimicrob Chemother 64 1102-1110 Nov 2009
FALAGAS M E et al Extended-spectrum beta-lactamase producing
organisms The Journal of Hospital Infection 73 (4) pp 345-54 2009
FONTANA C et al Emergence of KPC-producing Klebsiella pneumoniae in
Italy BMC Rev Notes 3 40 2010
61
GALES A C et al Antimicrobial resistance among Gram-negative bacilli
isolated from Latin America results from Sentry Antimicrobial Surveillance Program
(Latin America 2008-2010) Diagnostic Microbiology and Infectious Disease v 3 n
4 p 354 -360 2012
GUPTA N et al Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Epidemiology
and Prevention HEALTHCARE EPIDEMIOLOGY Clinical Infectious Diseases
201153(1)60ndash67 Published by Oxford University Press on behalf of the Infectious
Diseases Society of America 2011
HARBOTTLE H et al Genetics of antimicrobial resistance Anim Biotechnol
n17 p111-124 2006
HENRIQUE W N et al RESISTEcircNCIA BACTERIANA Uniatildeo das
Faculdades Alfredo NasserInstituto de Ciecircncias da Sauacutede Disponiacutevel em lt
httpwwwfaculdadealfredonasseredubrfilespesquisaposter20HENRIQUE20
Wilker20Natividade20SANTIAGO20Silvania20CAVALCANTI20DSP
20ResistC3AAncia20Bacterianapdfgt Acesso em 17 marccedilo 2014
HULSCHER M E J I et al Antibiotic prescribing in hospital a social and
behavioral scientific approach The Lancet Infectious Diaseases v 10 n 3 p 167-
165 2010
KIDWAI M SAPRA P BHUSHAN KR Synthetic strategies and medicinal
properties of beta-lactams Curr Med Chem 1999 695-215
KUMARASAMY K K et al Emergence of a new antibiotic resistance
mechanism in India Pakistan and the UK a molecular biological and
epidemiological stuy The Lancet Infectious Diseases v10 n 9 p 597- 602 2010
LINCOPAN N et al Enterobacteacuteria producing extended-spectrum β-
lacatamases and IMP-1 Metalo-β-lactamases isolated from Brazilian hospitals J Med
62
Microbiol 7 1-3 2006
LINCOPAN N et al First Isolation of Metalo-β-Lacatamase-Producing
Multiresistant Klebsiella pneumoniae from a patient in Brazil J Clin Microbiol 43(1)
516-519 2005
LIVERMORE D M et al What remains against carbapenem- resistant
Enterobacteriaceae Evaluation of choramphenicol ciprofloxacin colistina
fosfomycin minocycline nitrofurantoin temocilin and tigecycline International
Journal of Antimicrobial Agents v 37 n 5 p 415- 459 2011
LIVERMORE D M Fourten years in resistance International Journal of
Antimicrobial Agents v 39 283- 294 2012
LIVERMORE D M Bacterial resistance to carbapenems Adv Exp Med Biol
1995 39025-47
LIVERMORE D M Bacterial resistance origins epidemiology and impact
Clin Infect Dis 36S11-S23 2003
LIVERMORE D M et al Carbapenemases a problem in waiting Curr
Opin Microbiol 2000 3489-95
LU et al Universal pcr for common bacterial pathogens J CLIN
MICROBIOL VOL 38 2000
LU et al Use of PCR with Universal Primers and Restriction Endonuclease
Digestions for Detection and Identification of Common Bacterial Pathogens in
Cerebrospinal Fluid Journal of Clinical Microbiology June 2000 p 2076ndash2080
MARSCHALL J Met al Presence of the KPC Carbapenemase Gene in
Enterobacteriaceae Causing Bacteremia and Its Correlation with In Vitro
Carbapenem Susceptibility J Clin Microbiol 47 239-241 Jan 2009
63
MARTINS WMBS et al Prevalecircncia do gene blaKPC em isolados cliacutenicos
de Enterobacteriaceae e natildeo fermentadores encontrados em amostras clinicas em
um hospital universitaacuterio do Recife X Jornada de ensino pesquisa e extensatildeo ndash
JEPEX 2010 ndash UFRPE Recife 18 a 22 de outubro
MENDES C A C et al Polimixinas Revisatildeo com ecircnfase na sua
nefrotoxicidade Rev Assoc Med Bras 2009 55(6) 752-9
MOHR J F 3rd Update on the efficacy and tolerability of meropenem in the
treatment of serious bacteacuterial infections Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S41-51
2008
MONTEIRO J et al First report of KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae
strains in Brazil Antimicrob Agents Chemother Jan53(1)333-4 2009
MOREIRA V C et al Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia a antibioacuteticos
Disponiacutevel em
lthttpwwwcpglsucgbr6mostraartigosSAUDEVANESSA20CARVALHO20M
OREIRApdfgt Acesso em 21 marccedilo 2014
NETIKUL T et al Emergence of novel blaKPC-12 and blaKPC-13 variants in
carbapenem non-susceptible Enterobacter cloacae a first report of blaKPC gene in
Thailand European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases May
S372 2011
NETO V A et al Antibioacuteticos na praacutetica Meacutedica 6ordf Ediccedilatildeo Editorial
SarverSP Brasil 2007
NICOLAU D P Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of
meropenem Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S32-40 2008
64
OLIVEIRA A C et al Resistecircncia bacteriana e mortalidade em um centro de
terapia intensiva Rev Latino-Am Enfermagem nov-dez 2010
PAAUW A et al Failure to control an outbreak of qnrA 1-positive multidrug-
resistant Enterobacter clocae despite adequate implementation of recommended
infection control measures Journal of Clinical Microbiology v 45 n 5 p 1420-1425
2007
PATERSON D L et al Extended-Spectrum Beta-Lactamases a Clinical
Update Clinical Microbiology Reviews v 18 p 657-686 2005
PEIRANO G et al Carbapenem-hydrolysing beta-lactamase KPC-2 in
Klebsiella pneumonia isolated in Rio de Janeiro Brazil J Antimicrob Chemother Nov
20 2009
PERES-BOTA D et al Are infections due to resistant pathogens associated
with worse outcome in critically ill patients J Infect 200347(4)307-16
PIDDOCK L J V Clinically relevant chromosomally encoded multidrug
resistance effl ux pumps in bacterial Clin Microbiol Rev n19 p382-402 2006
PITOUT J D D et al Emergence of Enterobacteriaceae producing
extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) in the community J Antimicrob
Chemother May 56 2005
POSSEBON M I et al Resistecircncia bacteriana aos carbapenecircmicos
Bacterial resitence to carbapenems RBM rev bras med60(6)378380-378-382
jun 2003
QUEENAN A M et al Carbapenemases the versatile beta-lactamases
Clin Microbiol Rev Jul20(3)440-58 2007
65
RHOMBERG P R et al Summary trends for the meropenem yearly
susceptibility test information collection program a 10- year experience in the United
States (1999-2008) Diagnostic Microbiology and Infectiois Disease v 65 n4 p
414-426 2009
ROBLEDO I E et al Detection of KPC in Acinetobacter spp in Puerto Rico
J Antimicrob Agents Chemother 54 1354-1357 Mar 2010
ROGERS B A et al Country-to-country transfer os patients and the risk of
multi-resistant bacterial infection Clinical Infectious Disease v53 n1 p49- 56
2011
SHAH A A et al Characteristics epidemiology and clinicalimportance of
emerging strains of Gram-negative bacilli producing extended-spectrum
betalactamases Research in Microbiology v 155 p 409-421 2004
TURNER P J Extended- Spectrum Beta-Lactamases Clinical Infectious
Diseases v 41 p 273-275 2005
WOLTER D J et al Phenotypic and Enzymatic Comparative Analysis
between the Novel KPC variant KPC-5 and Its Evolutionary Variants KPC-2 and
KPC-4 Antimicrob Agents Chemother Nov 17 2008
WOODFORD N et al Carbapenemases of Chryseobacterium
(Flavobacterium) meningosepticum distribution of blaB and characterization of a
novel Metalo-beta-lactamase gene blaB3 in the type strain NCTC 10016
Antimicrob Agents Chemother Jun44(6)1448-52 2000
WOODFORF N Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in
India Pakistan and the UK a molecular biological and epidemiological study The
Lancet Infectious Diseases v 10 n 9 p 597-602 2010
66
WOODFORD et al Outbreak of Klebsiella pneumoniae Producing a New
Carbapenem- Hydrolyzing Class A β-Lactamase KPC-3 in a New York Medical
Center Antimicrobial agents and chemotherapy Dec 2004 p 4793ndash4799 Vol 48
No 12
YAGI T et al A preliminary survey of extended-spectrum β-lactamases
(ESBLs) in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Japan
FEMS Microbiology Letters 184 (2000) 53-56
YIGIT H et al Novel carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase KPC-1 from
a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumonia J Antimicrob Agents
Chemother 45 (4) 1151-1161 (2001)
ZAVASCKI A P et al KPC-2- producing Enterobacter cloacae in two cities
from Southern Brazil Int J Antimicrob Agents Apr 28 2009
ZHANEL G G et al Comparative review of the carbapenecircmicos Drugs
67(7)1027-52 2007
67
ANEXOS
Sequumlecircncia do oligo blaKPC
Query 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
Query 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
Query 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
68
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|||||||
Sbjct 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
Query 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
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|||||||
Sbjct 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
Query 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
69
Query 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
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|||||||
Sbjct 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
Query 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Sbjct 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
Query 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
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|||||||
70
Sbjct 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
Query 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
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Sbjct 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
Query 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
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Sbjct 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
Query 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
71
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Sbjct 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
Query 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
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|||||||
Sbjct 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
Query 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
72
Query 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
Query 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Sbjct 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
Query 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
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|||||||
73
Sbjct 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
Query 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
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Sbjct 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
Query 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
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Sbjct 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
Query 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
74
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Sbjct 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
Query 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
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|||||||
Sbjct 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
Query 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
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Sbjct 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
75
Query 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
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Sbjct 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
Query 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
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||||
Sbjct 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
LOCUS AF297554 1377 bp
DNA linear BCT 26-MAR-2001
DEFINITION Klebsiella pneumoniae carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
gene complete cds
ACCESSION AF297554
VERSION AF2975541 GI10121874
76
KEYWORDS
SOURCE Klebsiella pneumoniae
ORGANISM Klebsiella pneumoniae
Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Enterobacteriaceae Klebsiella
REFERENCE 1 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH QueenanAM
AndersonGJ Domenech-SanchezA
BiddleJW StewardCD
AlbertiS BushK and TenoverFC
TITLE Novel carbapenem-hydrolyzing beta-
lactamase KPC-1 from a
carbapenem-resistant strain of
Klebsiella pneumoniae
JOURNAL Antimicrob Agents Chemother 45 (4)
1151-1161 (2001)
PUBMED 11257029
REFERENCE 2 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH AndersonGJ and
TenoverFC
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (19-AUG-2000) Nosocomial
Pathogens Laboratory Branch
Centers for Disease Control and
Prevention 1600 Clifton Rd MS
G08 Atlanta GA 30333 USA
FEATURES LocationQualifiers
77
source 11377
organism=Klebsiella
pneumoniae
mol_type=genomic DNA
db_xref=taxon573
-35_signal 5560
-10_signal 7883
mRNA 921012
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
RBS 117122
CDS 1311012
note=blaKPC-1
codon_start=1
transl_table=11
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
protein_id=AAG134101
db_xref=GI10121875
translation=MSLYRRLVLLSCLSWPLAGFSATALTNLVAEPFAKLEQD
FGGSI
GVYAMDTGSGATVSYRAEERFPLCSSFKGFLAAAVLARSQQQAGLLDTPIRYG
KNALV
PWSPISEKYLTTGMTVAELSAAAVQYSDNAAANLLLKELGGPAGLTAFMRSIG
DTTFR
78
LDRWELELNSAIPSDARDTSSPRAVTESLQKLTLGSALAAPQRQQFVDWLKGN
TTGNH
RIRAAVPADWAVGDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTRAPNKDDK
HSEAV
IAAAARLALEGLGVNGQ
ORIGIN
1 cggggcagtt acagccgtta cagcctctgg
agagggagcg gcttgccgct cggtgataat
61 cccagctgta gcggcctgat tacatccggc
cgctacacct agctccacct tcaaacaagg
121 aatatcgttg atgtcactgt atcgccgtct
agttctgctg tcttgtctct catggccgct
181 ggctggcttt tctgccaccg cgctgaccaa
cctcgtcgcg gaaccattcg ctaaactcga
241 acaggacttt ggcggctcca tcggtgtgta
cgcgatggat accggctcag gcgcaactgt
301 aagttaccgc gctgaggagc gcttcccact
gtgcagctca ttcaagggct ttcttgctgc
361 cgctgtgctg gctcgcagcc agcagcaggc
cggcttgctg gacacaccca tccgttacgg
421 caaaaatgcg ctggttccgt ggtcacccat
ctcggaaaaa tatctgacaa caggcatgac
481 ggtggcggag ctgtccgcgg ccgccgtgca
atacagtgat aacgccgccg ccaatttgtt
541 gctgaaggag ttgggcggcc cggccgggct
gacggccttc atgcgctcta tcggcgatac
79
601 cacgttccgt ctggaccgct gggagctgga
gctgaactcc gccatcccaa gcgatgcgcg
661 cgatacctca tcgccgcgcg ccgtgacgga
aagcttacaa aaactgacac tgggctctgc
721 actggctgcg ccgcagcggc agcagtttgt
tgattggcta aagggaaaca cgaccggcaa
781 ccaccgcatc cgcgcggcgg tgccggcaga
ctgggcagtc ggagacaaaa ccggaacctg
841 cggagtgtat ggcacggcaa atgactatgc
cgtcgtctgg cccactgggc gcgcacctat
901 tgtgttggcc gtctacaccc gggcgcctaa
caaggatgac aagcacagcg aggccgtcat
961 cgccgctgcg gctagactcg cgctcgaggg
attgggcgtc aacgggcagt aaggctctga
1021 aaatcatcta ttggcccacc accgccgccc
ttgcgggcgg catggattac caaccactgt
1081 cacatttagg ctaggagtct gcgcggcaga
gccgtgtgac cggttttctg tagagcactg
1141 acgatggcgg cggcgctctc tgcaattggc
aaggcgtcgg cgccaaggat accaatcttg
1201 cggcgcgcgg cgtgttatga cgactggggt
gcatttgagc cgccccattt aaccttcgcc
1261 ctcacagata cgccattcgc ctcaaattta
gcgccatgca gacgagcttc cactcggctt
1321 gcaccttgtc caggcccctc atgctgaact
gacgcaatcc catcaccgcc ttgatca
80
42
(Tris- Aacutecido Boacuterico) agarose e brometo de etiacutedio (sua funccedilatildeo eacute de corante para o gel
e permitir a visualizaccedilatildeo do DNA quando colocado agrave luz ultravioleta) Para o oligo
blaKPC a banda da amplificaccedilatildeo foi em 881ppb correspondendo ao plasmiacutedeo Jaacute
o oligo Universal foi em 996 pb
4 9 Descarte de resiacuteduos
Todos os materiais utilizados nos ensaios foram de uso uacutenico e manipulados
em cacircmaras de seguranccedila bioloacutegica classe II Apoacutes o uso foram colocados em
soluccedilatildeo desinfetantes (hipoclorito a 1) e em seguida autoclavados a 127oC por 20
min em sacos apropriados para autoclavaccedilatildeo Apoacutes a finalizaccedilatildeo do ciclo de
esterilizaccedilatildeo os sacos contendo o material descartaacutevel foram colocados em
recipientes de coleta da empresa responsaacutevel pela coleta de materiais bioloacutegicos
produzidos no laboratoacuterio de microbiologia Todos os procedimentos seguiram a
normativa RDC-ANVISA 3062004 sobre o descarte de resiacuteduos de serviccedilo de
sauacutede
4 10 Aspectos epidemioloacutegicos e cliacutenicos
Os aspectos cliacutenicos e epidemioloacutegicos foram investigados por meio de
prontuaacuterios dos pacientes portadores de enterobacteacuterias produtoras de
carbapenemases e envolveram topografia mais provaacutevel do foco infeccioso a
enfermidade motivadora da internaccedilatildeo o desfecho cliacutenico a idade e o tempo de
internaccedilatildeo
4 12 Anaacutelises eepidemioloacutegicas
As anaacutelises foram realizadas com o pacote estatiacutestico SPSS versatildeo 200
Para verificar quais variaacuteveis referentes aos dados epidemioloacutegicos e
microbioloacutegicos influenciaram no desfecho verificou- se a diferenccedila meacutedia das
variaacuteveis idade e tempo de internaccedilatildeo em cada grupo O teste estatiacutestico utilizado foi
o teste t de Student apoacutes se executar o teste de normalidade de Shapiro-Wilk Para
as variaacuteveis sexo perfil microbioloacutegico das enterobacteacuterias produtoras de
43
carbapenemases foi avaliada a associaccedilatildeo com o desfecho por meio do teste Exato
de Fisher O niacutevel de significacircncia adotado foi de 5
4 13 Preceitos eacuteticos
Este projeto estaacute inserido em um projeto maior denominado ldquoEpidemiologia
cliacutenica e caracterizaccedilatildeo molecular do Acinetobacter Baumannii resistente a
antibioticoterapia em pacientes internado em hospitais do Sistema Uacutenico de Sauacutederdquo
que foi submetido ao Comitecirc de Eacutetica em Pesquisa da Secretaria do Estado de
Sauacutede do Distrito Federal (SESDF) e emitido parecer aprovado pelo protocolo nordm
23109 (anexo)
44
5 RESULTADOS
51 Anaacutelise molecular
Para a amplificaccedilatildeo com o oligo blaKPC foram amplificadas amostras
que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 881 pb correspondente ao
plasmiacutedeo A anaacutelise da amplificaccedilatildeo da regiatildeo do gene blaKPC mostrou que
apenas a amostra A10 natildeo amplificou isso demonstra que esta amostra natildeo
possuiacutea o gene de resistecircncia
5 1 1 Gene blaKPC
Figura 7 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 881 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
A amostra A3 natildeo amplificou no primeiro momento entatildeo foi realizado
novamente a PCR e corrida de gel obtendo entatildeo a amplificaccedilatildeo da amostra como
apresentado na figura 8
45
Figura 8 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC da
mostra A3 estudada A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo de 881
pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 1 2 Gene 16S rRNA
Para a amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA utilizou-se o oligo universal Foram
amplificadas amostras que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 996 pb
Figura 9 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
46
Segundo Lu et al (2000) a digestatildeo com a enzima HaeIII deste amplicons de
16S rRNA devolveriam bandas com perfis entre 150 a 200 pb No gel abaixo eacute
possiacutevel evidenciar que este perfil ocorreu com o predomiacutenio de bandas na altura
de 200pb
Figura 10 Gel de agarose a 2 da digestatildeo do amplicon do gene 16S
rRNA das amostras com a enzima HaeIII evidenciando diversos fragmentos
proacuteximos a 200 pb A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo ribossomal
de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 2 Anaacutelises epidemioloacutegicas
5 2 1 Sexo
No total foram detectados 17 isolados de KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 onde a maior a prevalecircncia foi
detecatada em amostras de pacientes do sexo masculino (53) do que no sexo
feminino (47)
47
Figura 11 Isolado de KPC segundo sexo dos 17 pacientes investigados
no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 2 Desfecho cliacutenico
Em 17 isolados de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo
de 2010 aacute 2011 a porcentagem de pacientes que foram a oacutebito (59) foi maior que
a de pacientes que tiverm alta (41)
Figura 12 Isolado de KPC segundo desfecho cliacutenico dos 17 pacientes
investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
48
5 2 3 Local da coleta
Dos 17 episoacutedios detectados de infecccedilatildeo por KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 a infecccedilatildeo em swab retalfoi mais
frequente (47) seguida de ponta de cateacuteter (18) e secreccedilatildeo traqueal (12)
Figura 13 Isolados de KPC segundo local da coleta da amostra nos 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 4 Microorganismo
O microorganismo mais encontrado foi a Klebsiella pneumoniae (82)
seguida da Enterobacter clocae (12) e Serratia marcescens (6) dos 17 isolados
de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 Isto afirma o
fato de a sigla KPC ser utilizada de forma errocircnea aacute Klebsiella pneumoniae visto
que a evidecircncia dela eacute maior em relaccedilatildeo as outras cepas
49
Figura 14 Isolado de KPC segundo microrganismo encontrado em 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 5 Relaccedilotildees variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana e desfecho
cliacutenico
Tabela 6 ndash Distribuiccedilatildeo do perfil geneacutetico sexo coleta tipificaccedilatildeo de
microrganismos e anaacutelise da resistecircncia bacteriana segundo o desfecho
cliacutenico Brasiacutelia-DF 2010 a 2011
Variaacutevel Resultado
Desfecho
Alta Oacutebito
N N P
Gene 16S rRNA Positivo 7 1000 10 1000
NA Gene blaKPC Positivo 6 857 10 1000
Negativo 1 143 0 00 0218 Sexo Feminino 2 286 6 600
Masculino 5 714 4 400 0201 Local da coleta Fundo saco de
Douglas 1 143 0 00
Hemocultura 0 00 1 100 0463 Ponta de cateter 1 143 2 200
Sec TraquealBrocircnquica
0 00 1 100
50
Secreccedilatildeo traqueal 2 286 0 00
Swab retal 3 429 5 500
Urina 0 00 1 100
Microrganismo Enterobacter cloacae (KPC)
1 143 1 100
Klebsiella pneumoniae
6 857 8 800
0416 Serratia
marcescens 0 00 1 100
Teste de Hodge Hodge positivo 7 1000 10 1000
NA Amicacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 1 100 0848 resistente 0 00 1 100
sensiacutevel 2 286 3 300
Amoxicilina Aacutecido Clavulacircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Ampicilina Sulbactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ampicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Aztreonan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefazolina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Cefoperazona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Cefotaxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefoxitina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0509 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 2 286 4 400
Ceftazidima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cetriaxona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 3 429 5 500 0772 Cefalotina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ciprofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772
51
resistente 3 429 5 500
Claritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Clindamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Eritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Gentamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0942 resistente 2 286 3 300
sensiacutevel 1 143 2 200
Imipenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 0 00 2 200 0193 Resistente 1 143 3 300
sensiacutevel 2 286 0 00
Nitrofurantoiacutena sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Norfloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Oxacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Penicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Piperacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Rifampicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tetraciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Ticarcilina Aacutecido Clavulocircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0688 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 3 429 4 400
Tobramicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Trimetoprima Sulfametoxazol
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0112 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 2 286 0 00
Vancomicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tigeciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediario 0 00 1 100 0211 natildeo testado 1 143 4 400
resistente 2 286 0 00
52
Cefepime sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefuroxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Levofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Piperacilina Tazobactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Ertapenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Meropenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0223 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 1 143 0 00
Cefotetan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 sensiacutevel 0 00 1 100
Gemifloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 7 700 0585 natildeo testado 3 429 3 300
Desfecho
Alta Oacutebito
Meacutedia Erro
padratildeo Meacutedia Erro
padratildeo p
Idade 58 9 59 5 0991
Tempo Internaccedilatildeo (dias)
50 13 46 12 0571
n= 17 p(lt 005) NA natildeo se aplica
53
6 DISCUSSAtildeO
Nos uacuteltimos anos houve um aumento na incidecircncia de bacteacuterias
multirresistentes aos antimicrobianos no ambiente hospitalar tornando isto um
problema mundial de sauacutede puacuteblica (HULSCHER et al 2010) Quando se trata
principalmente de bacilos Gram negativos a frequumlecircncia destas bacteacuterias eacute ainda
maior em paiacuteses da Ameacuterica Latina quando comparada a paiacuteses desenvolvidos
(GALES etal 2012)
De acordo com dados do ldquoMeropenem Yearly Susceptibility Test Information
Collectionrdquo (MYSTIC) ocorreu nos Estados Unidos um aumento na susceptibilidade
de K pneumoniae nos uacuteltimos anos graccedilas a praacuteticas de controle de disseminaccedilatildeo
de amostras resistentes(RHOMBERG P R et al 2009) O aumento crescente da
prevalecircncia destes microrganismos foi proporcional ao aumento da dependecircncia do
uso de antibioacuteticos carbapenecircmicos considerados como a opccedilatildeo terapecircutica para o
tratamento de infecccedilotildees por bacilos Gram negativos multi-resistentes (LIVERMORE
2012) Isto afeta diretamente as opccedilotildees de tratamento sobrando poucas alternativas
para a terapecircutica que incluem colistina (polimixina E) e tigeciclina que apresentam
respectivamente problemas em termos de toxicidade e eficaacutecia (LIVERMORE et
al 2011) Um dos efeitos adversos mais importantes das poliminas B e E por
exemplo satildeo a neurotoxicidade e nefrotoxicidade (MENDES C A C et al2009 )
Devido agrave resistecircncia ser usualmente de natureza plasmidial e portanto de
maior disseminaccedilatildeo especialmente quando carreadas por K pneumoniae
microrganismo com uma notoacuteria capacidade para acumular e transferir plasmiacutedeos
com determinantes para resistecircncia o nuacutemero de casos detectados pelo
fenoacutetipogenoacutetipo blaKPC eacute bastante preocupante (MONTEIRO et al 2009)
Comparada com outras bacteacuterias hospitalares a transmissatildeo de clones
multirresistentes de K pneumoniae eacute maior e podem natildeo ser controladas pelos
meacutetodos de controle de infecccedilatildeo hospitalar (PAAUW et al 2007) A forma
plasmidial para transferecircncia da resistecircncia adicionada a este grande potencial para
disseminaccedilatildeo de clones resistentes eacute preocupante visto que apoacutes surtos muitas
vezes pode se tornar endecircmica Jaacute eacute uma realidade a disseminaccedilatildeo desta bacteacuteria
54
entre pacientes hospitais paiacuteses e ateacute mesmo continentes (WOODFORF et al
2010 ROGERS et al 2011)
As chances de surtos satildeo maiores em paiacuteses com poucos recursos devido agrave
maior carecircncia de praacuteticas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees hospitalares e o
uso irracional de antimicrobianos de forma empiacuterica e inadequada (KUMARASAMY
et al 2010) Ateacute o momento os mecanismos de resistecircncia aos cabapenecircmicos
geralmente encontrado eram a produccedilatildeo de ESBL (CTX-M) somada aacute perda de
porina (CARVALHAES et al 2010) Foi notado a partir do ano de 2008 um
aumento no nuacutemero de K pneumoniae produtoras de KPC-2 apresentando outra
forma de resistecircncia (GALES 2012)
Um estudo mostrou que o perfil do paciente colonizado ou infectado por KPC
foi de um paciente entre os 33 e os 82 anos de idade internado haacute mais de 1
semana no hospital A mortalidade geral nos uacuteltimos anos ficou em torno de 7
sendo que dos 77 pacientes estudados 32 (415) pacientes evoluiacuteram para oacutebito
evidenciando a alta morbi-mortalidade associada (ALVES A P et al 2013)
Em estudo com 2316 pacientes avaliados a populaccedilatildeo de sexo masculino foi
de 526 idade meacutedia global de 53 anos (mediana de 55 anos) permanecircncia meacutedia
de 58 dias (mediana de 3 dias) (OLIVEIRA A C et al 2010) Outros trabalhos
apresentaram ausecircncia de significacircncia entre sexoidade e o desenvolvimento de
infecccedilotildees por microrganismos resistentes (PERES-BOTA D et al 2003 COLPAN
A et al 2005 COELLO R et al 1997)
Outro estudo utilizou um total de 30 amostras sendo elas isoladas de urina
escarro secreccedilatildeo pleural ponta de cateter aspirado traqueal e hemocultura A mais
prevalente foi em urina (40) Entre as 30 cepas analisadas a maior porcentagem
foi da cepa Klebsiella pneumoniae (70) Enterobacter sp (133) Klebsiella
ozaenae (10) Escherichia coli (333) e Klebsiella oxytoca (333)
(DIENSTMANN R et al 2010) Nos Estados Unidos a enzima KPC jaacute se tornou
endecircmica Foi realizada uma pesquisa em dois hospitais de Nova York onde
testaram 602 amostras e 45 apresentaram algum mecanismo de resistecircncia
sendo apenas 33 confirmadas por biologia molecular como KPC-2 (BRATU et
al 2005)
55
Estudo sobre os tipos de ESBL feito no Japatildeo apresentou o tipo Toho-1 como
o mais prevalente nessa pesquisa Ateacute o ano de 2000 ano em que foi publicado tal
estudo este era o primeiro relatoacuterio no Japatildeo para identificar derivados de ESBLs
como tipo de SHV e TEM entre E coli e K pneumoniae Em especial o tipo SHV- 12
foi identificado com uma maior frequumlecircncia Estes resultados indicam que tipos
distintos de ESBLs que satildeo diferentes em sua especificidade de substrato e origem
geneacutetica coexistem no Japatildeo Isto mostra a importacircncia de caracterizar genoacutetipos
distintos de ESBLs e de estar em alerta continuamente para as tendecircncias de
ESBLs no Japatildeo aleacutem da necessidade de uma interpretaccedilatildeo uniforme utilizando as
diretrizes do CSLI para relatar cepas produtoras de ESBL Aleacutem da detecccedilatildeo de
ESBLs satildeo necessaacuterias mais informaccedilotildees tais como o perfil de sensibilidade
especiacutefica para diversas β-lactacircmicos e o local da infecccedilatildeo Esses fatores satildeo
essenciais para a escolha adequada de antibioacuteticos (YAGI T et al 2000)
No ano de 2004 uma pesquisa avaliou a produccedilatildeo de uma enzima de
hidroacutelise de carbapenecircmicos atraveacutes da teacutecnica de sequumlenciamento foi revelado
um novo membro da famiacutelia KPC designado KPC- 3 Pesquisadores encontraram
em um mutante de K pneumoniae uma substituiccedilatildeo de um gene associado com
resistecircncia a Imipenem mas essa substituiccedilatildeo foi considerada improvaacutevel na
contribuiccedilatildeo da resistecircncia aos carbapenecircmicos da espeacutecie estudada Aleacutem da
resistecircncia aos carbapenecircmicos estes isolados eram em sua maioria resistentes agraves
cefalosporinas penicilinas e aminoglicosiacutedeos Usando estudos de transformaccedilatildeo
conjugaccedilatildeo e hibridaccedilatildeo localizaram o alelo blaKPC em plasmiacutedeo aleacutem disso
mostraram que esse alelo tambeacutem carregava uma resistecircncia aos aminoglicosiacutedeos
A transferecircncia das enzimas KPCs foi demonstrada in vitro tanto neste como em
outros estudos pode ser que os plasmiacutedeos que fazem esta transferecircncia estavam
comeccedilando a se espalhar no ambiente cliacutenico resultando na multiresistecircncia dessas
estirpes (WOODFORD et al 2004)
O presente estudo apresentou um vieacutes quanto aos resultados dos testes de
susceptibilidade microbiana Observou-se que natildeo foi encontrado resultado deste
teste em algumas amostras o que natildeo cooperou para um estudo mais preciso
futuros estudos quanto agraves amostras e um melhor acompanhamento deste tipo de
patologia Poreacutem mesmo sem algumas amostras com este resultado disponiacutevel foi
56
confirmada a presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos
carbapenecircmicos por meio dos genes de resistecircncia blaKPC e 16S rRNA que as
amostras apresentaram em sua maioria serem portadoras Quanto aos resultados
estatiacutesticos nenhuma das variaacuteveis apresentou significacircncia estatiacutestica (p gt 005)
mostrando assim que estas variaacuteveis isoladas natildeo foram o fator determinante para
o desfecho cliacutenico de alta ou oacutebito
57
7 CONCLUSAtildeO
Os genes blaKPC e 16S rRNA foram caracterizados confirmando a a
presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos carbapenecircmicos
Houve uma maior prevalecircncia da cepa K pneumoniae e isto confirma outros
estudos que apresentam a maior prevalecircncia desta cepa em amostras com KPC
Aleacutem disso isso justifica a forma popular da K pneumoniae ser chamada de KPC
enquanto que na verdade KPC eacute uma enzima podendo estar presente em outras
cepas como Enterobacter clocae tambeacutem apresentada no presente estudo O
desfecho cliacutenico de oacutebitos maior que 50 eacute um possiacutevel indicador sobre a
necessidade de se realizar um teste raacutepido para identificaccedilatildeo de KPC visando
iniciar o mais raacutepido possiacutevel o tratamento afim de diminuir a mortalidade por esta
infecccedilatildeo
Nenhuma das variaacuteveis isoladamente estaacute relacionada ao desfecho cliacutenico
oacutebito ou alta pois natildeo apresentaram relevacircncia estatiacutestica O presente estudo
mostrou que haacute presenccedila da bacteacuteria nas amostras de pacientes do hospital
estudado podendo entatildeo afirmar que este tipo de bacteacuteria se encontra tambeacutem
presente em ambiente hospitalar O uso irracional de antimicrobiano eacute demonstrado
de forma indireta quando foi apresentado atraveacutes do Teste de Hodge Modificado
uma resistecircncia de 100 aos antibioacuteticos carbapenecircmicos Isto tambeacutem reflete na
terapecircutica sendo que pacientes portadores de bacteacuterias resistentes aos
antibioacuteticos carabepecircmicos tem uma escassa opccedilatildeo de tratamento e as opccedilotildees
apresentam problemas quanto agrave toxicidade e eficaacutecia
58
REFEREcircNCIAS
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Mecanismos
de resistecircncia bacteriana aos antimicrobianos Disponiacutevel em
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controleopas_
webmodulo3mec_sitiohtmgt Acesso em 25 de abril de 2014
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Nota teacutecnica nordm
012013 medidas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees por enterobacteacuterias
multiresistentes Acesso em 17 de abril de 2013
ALBA J et al Kinetics study of KPC-3 a plasmid-encoded class A
carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase Antimicrob Agents Chemother
Nov49(11)4760-2 2005
ALVES A P et al Nosocomial infections by KPC-producing enterobacteria in
a tertiary hospital in Southern Brazil Revista da AMRIGS Porto Alegre 57 (3) 213-
218 jul-set 2013
ALVES A et al Tipagem Geneacutetica de Microrganismos Lab De Diversidade
Microbiana Centro de Biologia Celular Dep de Biologia U de Aveiro 3810-193
Aveiro- 2003
BELL J M et Al Prevalence and significance of a negative extended-
spectrum beta-lactamase (ESBL) confirmation test result after a positive ESBL
screening test result for isolates of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae
results from the SENTRY Asia-Pacific Surveillance Program J Clin Microbiol
May45(5)1478-82 2007
BRATU S et al Detection of KPC carbapenem-hydrolyzing enzymes in
Enterobacter spp from Brooklyn New York Antimicrob Agents Chemother v 49 n
2 p 776-8 2005
59
BRATU S et al Emergence of KPC-possessing Klebsiella pneumoniae in
Brooklyn New York epidemiology and recommendations for detection Antimicrob
Agents Chemother v 49 n 7 p 3018-20 2005
BRATU S et al Rapid spread of carbapenem-resistant Klebsiella
pneumoniae in New York City Arch Intern Med v 165 p 1430-5 2005
CAMARGO C F et al Aplicaccedilatildeo das teacutecnicas de pcr e suas teacutecnicas
derivadas em diagnoacutestico molecular Disponiacutevel em
ltfileDUnB10C2BA20semestreArtigosPCR-
20CLEYTON20FLORENCIO20DE20CAMARGO20E20PAULO20ROB
ERTO20QUEIROZpdfgtgt Acesso em 08 de abril de 2014
CARVALHES C G et al Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting
carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive
results Journal of Antimicrobial Chemotherapy v 65 n2 p 249-251 2010
CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION- CDC Modified
Hodge Test for Carbapenemase Detection in Enterobacteriaceae 2004
CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE Methods for
dilutionantimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically Approved
standard M7ndashA7 7th ed CLSI Wayne PA 2011
COELLO R et al Risk factors for developing clinical infection with methicillin-
resistant Staphylococcus aureus (MRSA) amongst hospital patients initially only
colonized with MRSA J Hosp Infect 19973739-46
COLPAN A et al Evaluation of risk factors for mortality in intensive care
units A prospective study from a referral hospital in Turkey Am J Infect Control
200533(1)42-7
60
CORNAGLIA G et al Living with ESBLs Introduction Clinical Microbiology
and Infection 14 Suppl 1 1-2 2008
COTRIM E R et al Klebsiella pneumoniae carbapenemase ndash KPC em
Enterobacteriaceae o desafio das bacteacuterias multirresistentes Poacutes em revista do
centro universitaacuterio Newton Paiva 12012 - ediccedilatildeo 5 - issn 2176 7785
DESHPANDE L M et al Occurrence and characterization of
carbapenemase-producing Enterobacteacuteriaceae report from the SENTRY
Antimicrobial Surveillance Program (2000-2004) Microb Drug Resist 12(4)223-30
2006
DIAS D J A Estudos dos principais mecanismos de resistecircncia aos
antibioacuteticos β-lactacircmicos em bacteacuterias patogecircnicas gram negativas 2009 100 f
Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Geneacutetica Molecular e Biomedicina) ndash Faculdade de
Ciecircncias e Tecnologia Universidade de Nova Lisboa Lisboa
DIENSTMANN R et al Avaliaccedilatildeo fenotiacutepica da enzima Klebsiella
pneumoniae carbapenemase (KPC) em Enterobacteriaceae de ambiente hospitalar
J Bras Patol Med Lab v 46 n 1 p 23-27 fevereiro 2010
ENDIMIAMI A et al Emergence of blaKPC-containing Klebsiella
pneumoniae in a long-term acute care hospital a new challenge to our healthcare J
Antimicrob Chemother 64 1102-1110 Nov 2009
FALAGAS M E et al Extended-spectrum beta-lactamase producing
organisms The Journal of Hospital Infection 73 (4) pp 345-54 2009
FONTANA C et al Emergence of KPC-producing Klebsiella pneumoniae in
Italy BMC Rev Notes 3 40 2010
61
GALES A C et al Antimicrobial resistance among Gram-negative bacilli
isolated from Latin America results from Sentry Antimicrobial Surveillance Program
(Latin America 2008-2010) Diagnostic Microbiology and Infectious Disease v 3 n
4 p 354 -360 2012
GUPTA N et al Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Epidemiology
and Prevention HEALTHCARE EPIDEMIOLOGY Clinical Infectious Diseases
201153(1)60ndash67 Published by Oxford University Press on behalf of the Infectious
Diseases Society of America 2011
HARBOTTLE H et al Genetics of antimicrobial resistance Anim Biotechnol
n17 p111-124 2006
HENRIQUE W N et al RESISTEcircNCIA BACTERIANA Uniatildeo das
Faculdades Alfredo NasserInstituto de Ciecircncias da Sauacutede Disponiacutevel em lt
httpwwwfaculdadealfredonasseredubrfilespesquisaposter20HENRIQUE20
Wilker20Natividade20SANTIAGO20Silvania20CAVALCANTI20DSP
20ResistC3AAncia20Bacterianapdfgt Acesso em 17 marccedilo 2014
HULSCHER M E J I et al Antibiotic prescribing in hospital a social and
behavioral scientific approach The Lancet Infectious Diaseases v 10 n 3 p 167-
165 2010
KIDWAI M SAPRA P BHUSHAN KR Synthetic strategies and medicinal
properties of beta-lactams Curr Med Chem 1999 695-215
KUMARASAMY K K et al Emergence of a new antibiotic resistance
mechanism in India Pakistan and the UK a molecular biological and
epidemiological stuy The Lancet Infectious Diseases v10 n 9 p 597- 602 2010
LINCOPAN N et al Enterobacteacuteria producing extended-spectrum β-
lacatamases and IMP-1 Metalo-β-lactamases isolated from Brazilian hospitals J Med
62
Microbiol 7 1-3 2006
LINCOPAN N et al First Isolation of Metalo-β-Lacatamase-Producing
Multiresistant Klebsiella pneumoniae from a patient in Brazil J Clin Microbiol 43(1)
516-519 2005
LIVERMORE D M et al What remains against carbapenem- resistant
Enterobacteriaceae Evaluation of choramphenicol ciprofloxacin colistina
fosfomycin minocycline nitrofurantoin temocilin and tigecycline International
Journal of Antimicrobial Agents v 37 n 5 p 415- 459 2011
LIVERMORE D M Fourten years in resistance International Journal of
Antimicrobial Agents v 39 283- 294 2012
LIVERMORE D M Bacterial resistance to carbapenems Adv Exp Med Biol
1995 39025-47
LIVERMORE D M Bacterial resistance origins epidemiology and impact
Clin Infect Dis 36S11-S23 2003
LIVERMORE D M et al Carbapenemases a problem in waiting Curr
Opin Microbiol 2000 3489-95
LU et al Universal pcr for common bacterial pathogens J CLIN
MICROBIOL VOL 38 2000
LU et al Use of PCR with Universal Primers and Restriction Endonuclease
Digestions for Detection and Identification of Common Bacterial Pathogens in
Cerebrospinal Fluid Journal of Clinical Microbiology June 2000 p 2076ndash2080
MARSCHALL J Met al Presence of the KPC Carbapenemase Gene in
Enterobacteriaceae Causing Bacteremia and Its Correlation with In Vitro
Carbapenem Susceptibility J Clin Microbiol 47 239-241 Jan 2009
63
MARTINS WMBS et al Prevalecircncia do gene blaKPC em isolados cliacutenicos
de Enterobacteriaceae e natildeo fermentadores encontrados em amostras clinicas em
um hospital universitaacuterio do Recife X Jornada de ensino pesquisa e extensatildeo ndash
JEPEX 2010 ndash UFRPE Recife 18 a 22 de outubro
MENDES C A C et al Polimixinas Revisatildeo com ecircnfase na sua
nefrotoxicidade Rev Assoc Med Bras 2009 55(6) 752-9
MOHR J F 3rd Update on the efficacy and tolerability of meropenem in the
treatment of serious bacteacuterial infections Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S41-51
2008
MONTEIRO J et al First report of KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae
strains in Brazil Antimicrob Agents Chemother Jan53(1)333-4 2009
MOREIRA V C et al Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia a antibioacuteticos
Disponiacutevel em
lthttpwwwcpglsucgbr6mostraartigosSAUDEVANESSA20CARVALHO20M
OREIRApdfgt Acesso em 21 marccedilo 2014
NETIKUL T et al Emergence of novel blaKPC-12 and blaKPC-13 variants in
carbapenem non-susceptible Enterobacter cloacae a first report of blaKPC gene in
Thailand European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases May
S372 2011
NETO V A et al Antibioacuteticos na praacutetica Meacutedica 6ordf Ediccedilatildeo Editorial
SarverSP Brasil 2007
NICOLAU D P Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of
meropenem Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S32-40 2008
64
OLIVEIRA A C et al Resistecircncia bacteriana e mortalidade em um centro de
terapia intensiva Rev Latino-Am Enfermagem nov-dez 2010
PAAUW A et al Failure to control an outbreak of qnrA 1-positive multidrug-
resistant Enterobacter clocae despite adequate implementation of recommended
infection control measures Journal of Clinical Microbiology v 45 n 5 p 1420-1425
2007
PATERSON D L et al Extended-Spectrum Beta-Lactamases a Clinical
Update Clinical Microbiology Reviews v 18 p 657-686 2005
PEIRANO G et al Carbapenem-hydrolysing beta-lactamase KPC-2 in
Klebsiella pneumonia isolated in Rio de Janeiro Brazil J Antimicrob Chemother Nov
20 2009
PERES-BOTA D et al Are infections due to resistant pathogens associated
with worse outcome in critically ill patients J Infect 200347(4)307-16
PIDDOCK L J V Clinically relevant chromosomally encoded multidrug
resistance effl ux pumps in bacterial Clin Microbiol Rev n19 p382-402 2006
PITOUT J D D et al Emergence of Enterobacteriaceae producing
extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) in the community J Antimicrob
Chemother May 56 2005
POSSEBON M I et al Resistecircncia bacteriana aos carbapenecircmicos
Bacterial resitence to carbapenems RBM rev bras med60(6)378380-378-382
jun 2003
QUEENAN A M et al Carbapenemases the versatile beta-lactamases
Clin Microbiol Rev Jul20(3)440-58 2007
65
RHOMBERG P R et al Summary trends for the meropenem yearly
susceptibility test information collection program a 10- year experience in the United
States (1999-2008) Diagnostic Microbiology and Infectiois Disease v 65 n4 p
414-426 2009
ROBLEDO I E et al Detection of KPC in Acinetobacter spp in Puerto Rico
J Antimicrob Agents Chemother 54 1354-1357 Mar 2010
ROGERS B A et al Country-to-country transfer os patients and the risk of
multi-resistant bacterial infection Clinical Infectious Disease v53 n1 p49- 56
2011
SHAH A A et al Characteristics epidemiology and clinicalimportance of
emerging strains of Gram-negative bacilli producing extended-spectrum
betalactamases Research in Microbiology v 155 p 409-421 2004
TURNER P J Extended- Spectrum Beta-Lactamases Clinical Infectious
Diseases v 41 p 273-275 2005
WOLTER D J et al Phenotypic and Enzymatic Comparative Analysis
between the Novel KPC variant KPC-5 and Its Evolutionary Variants KPC-2 and
KPC-4 Antimicrob Agents Chemother Nov 17 2008
WOODFORD N et al Carbapenemases of Chryseobacterium
(Flavobacterium) meningosepticum distribution of blaB and characterization of a
novel Metalo-beta-lactamase gene blaB3 in the type strain NCTC 10016
Antimicrob Agents Chemother Jun44(6)1448-52 2000
WOODFORF N Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in
India Pakistan and the UK a molecular biological and epidemiological study The
Lancet Infectious Diseases v 10 n 9 p 597-602 2010
66
WOODFORD et al Outbreak of Klebsiella pneumoniae Producing a New
Carbapenem- Hydrolyzing Class A β-Lactamase KPC-3 in a New York Medical
Center Antimicrobial agents and chemotherapy Dec 2004 p 4793ndash4799 Vol 48
No 12
YAGI T et al A preliminary survey of extended-spectrum β-lactamases
(ESBLs) in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Japan
FEMS Microbiology Letters 184 (2000) 53-56
YIGIT H et al Novel carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase KPC-1 from
a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumonia J Antimicrob Agents
Chemother 45 (4) 1151-1161 (2001)
ZAVASCKI A P et al KPC-2- producing Enterobacter cloacae in two cities
from Southern Brazil Int J Antimicrob Agents Apr 28 2009
ZHANEL G G et al Comparative review of the carbapenecircmicos Drugs
67(7)1027-52 2007
67
ANEXOS
Sequumlecircncia do oligo blaKPC
Query 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
Query 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
Query 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
68
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
Query 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
Query 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
69
Query 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
Query 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
Query 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
70
Sbjct 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
Query 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
Query 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
Query 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
71
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
Query 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
Query 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
72
Query 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
Query 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
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|||||||
Sbjct 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
Query 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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73
Sbjct 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
Query 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Sbjct 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
Query 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
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Sbjct 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
Query 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
74
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Sbjct 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
Query 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
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Sbjct 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
Query 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
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|||||||
Sbjct 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
75
Query 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
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|||||||
Sbjct 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
Query 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
||||
Sbjct 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
LOCUS AF297554 1377 bp
DNA linear BCT 26-MAR-2001
DEFINITION Klebsiella pneumoniae carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
gene complete cds
ACCESSION AF297554
VERSION AF2975541 GI10121874
76
KEYWORDS
SOURCE Klebsiella pneumoniae
ORGANISM Klebsiella pneumoniae
Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Enterobacteriaceae Klebsiella
REFERENCE 1 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH QueenanAM
AndersonGJ Domenech-SanchezA
BiddleJW StewardCD
AlbertiS BushK and TenoverFC
TITLE Novel carbapenem-hydrolyzing beta-
lactamase KPC-1 from a
carbapenem-resistant strain of
Klebsiella pneumoniae
JOURNAL Antimicrob Agents Chemother 45 (4)
1151-1161 (2001)
PUBMED 11257029
REFERENCE 2 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH AndersonGJ and
TenoverFC
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (19-AUG-2000) Nosocomial
Pathogens Laboratory Branch
Centers for Disease Control and
Prevention 1600 Clifton Rd MS
G08 Atlanta GA 30333 USA
FEATURES LocationQualifiers
77
source 11377
organism=Klebsiella
pneumoniae
mol_type=genomic DNA
db_xref=taxon573
-35_signal 5560
-10_signal 7883
mRNA 921012
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
RBS 117122
CDS 1311012
note=blaKPC-1
codon_start=1
transl_table=11
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
protein_id=AAG134101
db_xref=GI10121875
translation=MSLYRRLVLLSCLSWPLAGFSATALTNLVAEPFAKLEQD
FGGSI
GVYAMDTGSGATVSYRAEERFPLCSSFKGFLAAAVLARSQQQAGLLDTPIRYG
KNALV
PWSPISEKYLTTGMTVAELSAAAVQYSDNAAANLLLKELGGPAGLTAFMRSIG
DTTFR
78
LDRWELELNSAIPSDARDTSSPRAVTESLQKLTLGSALAAPQRQQFVDWLKGN
TTGNH
RIRAAVPADWAVGDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTRAPNKDDK
HSEAV
IAAAARLALEGLGVNGQ
ORIGIN
1 cggggcagtt acagccgtta cagcctctgg
agagggagcg gcttgccgct cggtgataat
61 cccagctgta gcggcctgat tacatccggc
cgctacacct agctccacct tcaaacaagg
121 aatatcgttg atgtcactgt atcgccgtct
agttctgctg tcttgtctct catggccgct
181 ggctggcttt tctgccaccg cgctgaccaa
cctcgtcgcg gaaccattcg ctaaactcga
241 acaggacttt ggcggctcca tcggtgtgta
cgcgatggat accggctcag gcgcaactgt
301 aagttaccgc gctgaggagc gcttcccact
gtgcagctca ttcaagggct ttcttgctgc
361 cgctgtgctg gctcgcagcc agcagcaggc
cggcttgctg gacacaccca tccgttacgg
421 caaaaatgcg ctggttccgt ggtcacccat
ctcggaaaaa tatctgacaa caggcatgac
481 ggtggcggag ctgtccgcgg ccgccgtgca
atacagtgat aacgccgccg ccaatttgtt
541 gctgaaggag ttgggcggcc cggccgggct
gacggccttc atgcgctcta tcggcgatac
79
601 cacgttccgt ctggaccgct gggagctgga
gctgaactcc gccatcccaa gcgatgcgcg
661 cgatacctca tcgccgcgcg ccgtgacgga
aagcttacaa aaactgacac tgggctctgc
721 actggctgcg ccgcagcggc agcagtttgt
tgattggcta aagggaaaca cgaccggcaa
781 ccaccgcatc cgcgcggcgg tgccggcaga
ctgggcagtc ggagacaaaa ccggaacctg
841 cggagtgtat ggcacggcaa atgactatgc
cgtcgtctgg cccactgggc gcgcacctat
901 tgtgttggcc gtctacaccc gggcgcctaa
caaggatgac aagcacagcg aggccgtcat
961 cgccgctgcg gctagactcg cgctcgaggg
attgggcgtc aacgggcagt aaggctctga
1021 aaatcatcta ttggcccacc accgccgccc
ttgcgggcgg catggattac caaccactgt
1081 cacatttagg ctaggagtct gcgcggcaga
gccgtgtgac cggttttctg tagagcactg
1141 acgatggcgg cggcgctctc tgcaattggc
aaggcgtcgg cgccaaggat accaatcttg
1201 cggcgcgcgg cgtgttatga cgactggggt
gcatttgagc cgccccattt aaccttcgcc
1261 ctcacagata cgccattcgc ctcaaattta
gcgccatgca gacgagcttc cactcggctt
1321 gcaccttgtc caggcccctc atgctgaact
gacgcaatcc catcaccgcc ttgatca
80
43
carbapenemases foi avaliada a associaccedilatildeo com o desfecho por meio do teste Exato
de Fisher O niacutevel de significacircncia adotado foi de 5
4 13 Preceitos eacuteticos
Este projeto estaacute inserido em um projeto maior denominado ldquoEpidemiologia
cliacutenica e caracterizaccedilatildeo molecular do Acinetobacter Baumannii resistente a
antibioticoterapia em pacientes internado em hospitais do Sistema Uacutenico de Sauacutederdquo
que foi submetido ao Comitecirc de Eacutetica em Pesquisa da Secretaria do Estado de
Sauacutede do Distrito Federal (SESDF) e emitido parecer aprovado pelo protocolo nordm
23109 (anexo)
44
5 RESULTADOS
51 Anaacutelise molecular
Para a amplificaccedilatildeo com o oligo blaKPC foram amplificadas amostras
que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 881 pb correspondente ao
plasmiacutedeo A anaacutelise da amplificaccedilatildeo da regiatildeo do gene blaKPC mostrou que
apenas a amostra A10 natildeo amplificou isso demonstra que esta amostra natildeo
possuiacutea o gene de resistecircncia
5 1 1 Gene blaKPC
Figura 7 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 881 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
A amostra A3 natildeo amplificou no primeiro momento entatildeo foi realizado
novamente a PCR e corrida de gel obtendo entatildeo a amplificaccedilatildeo da amostra como
apresentado na figura 8
45
Figura 8 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC da
mostra A3 estudada A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo de 881
pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 1 2 Gene 16S rRNA
Para a amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA utilizou-se o oligo universal Foram
amplificadas amostras que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 996 pb
Figura 9 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
46
Segundo Lu et al (2000) a digestatildeo com a enzima HaeIII deste amplicons de
16S rRNA devolveriam bandas com perfis entre 150 a 200 pb No gel abaixo eacute
possiacutevel evidenciar que este perfil ocorreu com o predomiacutenio de bandas na altura
de 200pb
Figura 10 Gel de agarose a 2 da digestatildeo do amplicon do gene 16S
rRNA das amostras com a enzima HaeIII evidenciando diversos fragmentos
proacuteximos a 200 pb A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo ribossomal
de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 2 Anaacutelises epidemioloacutegicas
5 2 1 Sexo
No total foram detectados 17 isolados de KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 onde a maior a prevalecircncia foi
detecatada em amostras de pacientes do sexo masculino (53) do que no sexo
feminino (47)
47
Figura 11 Isolado de KPC segundo sexo dos 17 pacientes investigados
no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 2 Desfecho cliacutenico
Em 17 isolados de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo
de 2010 aacute 2011 a porcentagem de pacientes que foram a oacutebito (59) foi maior que
a de pacientes que tiverm alta (41)
Figura 12 Isolado de KPC segundo desfecho cliacutenico dos 17 pacientes
investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
48
5 2 3 Local da coleta
Dos 17 episoacutedios detectados de infecccedilatildeo por KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 a infecccedilatildeo em swab retalfoi mais
frequente (47) seguida de ponta de cateacuteter (18) e secreccedilatildeo traqueal (12)
Figura 13 Isolados de KPC segundo local da coleta da amostra nos 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 4 Microorganismo
O microorganismo mais encontrado foi a Klebsiella pneumoniae (82)
seguida da Enterobacter clocae (12) e Serratia marcescens (6) dos 17 isolados
de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 Isto afirma o
fato de a sigla KPC ser utilizada de forma errocircnea aacute Klebsiella pneumoniae visto
que a evidecircncia dela eacute maior em relaccedilatildeo as outras cepas
49
Figura 14 Isolado de KPC segundo microrganismo encontrado em 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 5 Relaccedilotildees variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana e desfecho
cliacutenico
Tabela 6 ndash Distribuiccedilatildeo do perfil geneacutetico sexo coleta tipificaccedilatildeo de
microrganismos e anaacutelise da resistecircncia bacteriana segundo o desfecho
cliacutenico Brasiacutelia-DF 2010 a 2011
Variaacutevel Resultado
Desfecho
Alta Oacutebito
N N P
Gene 16S rRNA Positivo 7 1000 10 1000
NA Gene blaKPC Positivo 6 857 10 1000
Negativo 1 143 0 00 0218 Sexo Feminino 2 286 6 600
Masculino 5 714 4 400 0201 Local da coleta Fundo saco de
Douglas 1 143 0 00
Hemocultura 0 00 1 100 0463 Ponta de cateter 1 143 2 200
Sec TraquealBrocircnquica
0 00 1 100
50
Secreccedilatildeo traqueal 2 286 0 00
Swab retal 3 429 5 500
Urina 0 00 1 100
Microrganismo Enterobacter cloacae (KPC)
1 143 1 100
Klebsiella pneumoniae
6 857 8 800
0416 Serratia
marcescens 0 00 1 100
Teste de Hodge Hodge positivo 7 1000 10 1000
NA Amicacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 1 100 0848 resistente 0 00 1 100
sensiacutevel 2 286 3 300
Amoxicilina Aacutecido Clavulacircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Ampicilina Sulbactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ampicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Aztreonan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefazolina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Cefoperazona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Cefotaxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefoxitina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0509 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 2 286 4 400
Ceftazidima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cetriaxona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 3 429 5 500 0772 Cefalotina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ciprofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772
51
resistente 3 429 5 500
Claritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Clindamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Eritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Gentamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0942 resistente 2 286 3 300
sensiacutevel 1 143 2 200
Imipenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 0 00 2 200 0193 Resistente 1 143 3 300
sensiacutevel 2 286 0 00
Nitrofurantoiacutena sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Norfloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Oxacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Penicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Piperacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Rifampicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tetraciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Ticarcilina Aacutecido Clavulocircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0688 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 3 429 4 400
Tobramicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Trimetoprima Sulfametoxazol
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0112 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 2 286 0 00
Vancomicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tigeciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediario 0 00 1 100 0211 natildeo testado 1 143 4 400
resistente 2 286 0 00
52
Cefepime sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefuroxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Levofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Piperacilina Tazobactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Ertapenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Meropenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0223 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 1 143 0 00
Cefotetan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 sensiacutevel 0 00 1 100
Gemifloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 7 700 0585 natildeo testado 3 429 3 300
Desfecho
Alta Oacutebito
Meacutedia Erro
padratildeo Meacutedia Erro
padratildeo p
Idade 58 9 59 5 0991
Tempo Internaccedilatildeo (dias)
50 13 46 12 0571
n= 17 p(lt 005) NA natildeo se aplica
53
6 DISCUSSAtildeO
Nos uacuteltimos anos houve um aumento na incidecircncia de bacteacuterias
multirresistentes aos antimicrobianos no ambiente hospitalar tornando isto um
problema mundial de sauacutede puacuteblica (HULSCHER et al 2010) Quando se trata
principalmente de bacilos Gram negativos a frequumlecircncia destas bacteacuterias eacute ainda
maior em paiacuteses da Ameacuterica Latina quando comparada a paiacuteses desenvolvidos
(GALES etal 2012)
De acordo com dados do ldquoMeropenem Yearly Susceptibility Test Information
Collectionrdquo (MYSTIC) ocorreu nos Estados Unidos um aumento na susceptibilidade
de K pneumoniae nos uacuteltimos anos graccedilas a praacuteticas de controle de disseminaccedilatildeo
de amostras resistentes(RHOMBERG P R et al 2009) O aumento crescente da
prevalecircncia destes microrganismos foi proporcional ao aumento da dependecircncia do
uso de antibioacuteticos carbapenecircmicos considerados como a opccedilatildeo terapecircutica para o
tratamento de infecccedilotildees por bacilos Gram negativos multi-resistentes (LIVERMORE
2012) Isto afeta diretamente as opccedilotildees de tratamento sobrando poucas alternativas
para a terapecircutica que incluem colistina (polimixina E) e tigeciclina que apresentam
respectivamente problemas em termos de toxicidade e eficaacutecia (LIVERMORE et
al 2011) Um dos efeitos adversos mais importantes das poliminas B e E por
exemplo satildeo a neurotoxicidade e nefrotoxicidade (MENDES C A C et al2009 )
Devido agrave resistecircncia ser usualmente de natureza plasmidial e portanto de
maior disseminaccedilatildeo especialmente quando carreadas por K pneumoniae
microrganismo com uma notoacuteria capacidade para acumular e transferir plasmiacutedeos
com determinantes para resistecircncia o nuacutemero de casos detectados pelo
fenoacutetipogenoacutetipo blaKPC eacute bastante preocupante (MONTEIRO et al 2009)
Comparada com outras bacteacuterias hospitalares a transmissatildeo de clones
multirresistentes de K pneumoniae eacute maior e podem natildeo ser controladas pelos
meacutetodos de controle de infecccedilatildeo hospitalar (PAAUW et al 2007) A forma
plasmidial para transferecircncia da resistecircncia adicionada a este grande potencial para
disseminaccedilatildeo de clones resistentes eacute preocupante visto que apoacutes surtos muitas
vezes pode se tornar endecircmica Jaacute eacute uma realidade a disseminaccedilatildeo desta bacteacuteria
54
entre pacientes hospitais paiacuteses e ateacute mesmo continentes (WOODFORF et al
2010 ROGERS et al 2011)
As chances de surtos satildeo maiores em paiacuteses com poucos recursos devido agrave
maior carecircncia de praacuteticas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees hospitalares e o
uso irracional de antimicrobianos de forma empiacuterica e inadequada (KUMARASAMY
et al 2010) Ateacute o momento os mecanismos de resistecircncia aos cabapenecircmicos
geralmente encontrado eram a produccedilatildeo de ESBL (CTX-M) somada aacute perda de
porina (CARVALHAES et al 2010) Foi notado a partir do ano de 2008 um
aumento no nuacutemero de K pneumoniae produtoras de KPC-2 apresentando outra
forma de resistecircncia (GALES 2012)
Um estudo mostrou que o perfil do paciente colonizado ou infectado por KPC
foi de um paciente entre os 33 e os 82 anos de idade internado haacute mais de 1
semana no hospital A mortalidade geral nos uacuteltimos anos ficou em torno de 7
sendo que dos 77 pacientes estudados 32 (415) pacientes evoluiacuteram para oacutebito
evidenciando a alta morbi-mortalidade associada (ALVES A P et al 2013)
Em estudo com 2316 pacientes avaliados a populaccedilatildeo de sexo masculino foi
de 526 idade meacutedia global de 53 anos (mediana de 55 anos) permanecircncia meacutedia
de 58 dias (mediana de 3 dias) (OLIVEIRA A C et al 2010) Outros trabalhos
apresentaram ausecircncia de significacircncia entre sexoidade e o desenvolvimento de
infecccedilotildees por microrganismos resistentes (PERES-BOTA D et al 2003 COLPAN
A et al 2005 COELLO R et al 1997)
Outro estudo utilizou um total de 30 amostras sendo elas isoladas de urina
escarro secreccedilatildeo pleural ponta de cateter aspirado traqueal e hemocultura A mais
prevalente foi em urina (40) Entre as 30 cepas analisadas a maior porcentagem
foi da cepa Klebsiella pneumoniae (70) Enterobacter sp (133) Klebsiella
ozaenae (10) Escherichia coli (333) e Klebsiella oxytoca (333)
(DIENSTMANN R et al 2010) Nos Estados Unidos a enzima KPC jaacute se tornou
endecircmica Foi realizada uma pesquisa em dois hospitais de Nova York onde
testaram 602 amostras e 45 apresentaram algum mecanismo de resistecircncia
sendo apenas 33 confirmadas por biologia molecular como KPC-2 (BRATU et
al 2005)
55
Estudo sobre os tipos de ESBL feito no Japatildeo apresentou o tipo Toho-1 como
o mais prevalente nessa pesquisa Ateacute o ano de 2000 ano em que foi publicado tal
estudo este era o primeiro relatoacuterio no Japatildeo para identificar derivados de ESBLs
como tipo de SHV e TEM entre E coli e K pneumoniae Em especial o tipo SHV- 12
foi identificado com uma maior frequumlecircncia Estes resultados indicam que tipos
distintos de ESBLs que satildeo diferentes em sua especificidade de substrato e origem
geneacutetica coexistem no Japatildeo Isto mostra a importacircncia de caracterizar genoacutetipos
distintos de ESBLs e de estar em alerta continuamente para as tendecircncias de
ESBLs no Japatildeo aleacutem da necessidade de uma interpretaccedilatildeo uniforme utilizando as
diretrizes do CSLI para relatar cepas produtoras de ESBL Aleacutem da detecccedilatildeo de
ESBLs satildeo necessaacuterias mais informaccedilotildees tais como o perfil de sensibilidade
especiacutefica para diversas β-lactacircmicos e o local da infecccedilatildeo Esses fatores satildeo
essenciais para a escolha adequada de antibioacuteticos (YAGI T et al 2000)
No ano de 2004 uma pesquisa avaliou a produccedilatildeo de uma enzima de
hidroacutelise de carbapenecircmicos atraveacutes da teacutecnica de sequumlenciamento foi revelado
um novo membro da famiacutelia KPC designado KPC- 3 Pesquisadores encontraram
em um mutante de K pneumoniae uma substituiccedilatildeo de um gene associado com
resistecircncia a Imipenem mas essa substituiccedilatildeo foi considerada improvaacutevel na
contribuiccedilatildeo da resistecircncia aos carbapenecircmicos da espeacutecie estudada Aleacutem da
resistecircncia aos carbapenecircmicos estes isolados eram em sua maioria resistentes agraves
cefalosporinas penicilinas e aminoglicosiacutedeos Usando estudos de transformaccedilatildeo
conjugaccedilatildeo e hibridaccedilatildeo localizaram o alelo blaKPC em plasmiacutedeo aleacutem disso
mostraram que esse alelo tambeacutem carregava uma resistecircncia aos aminoglicosiacutedeos
A transferecircncia das enzimas KPCs foi demonstrada in vitro tanto neste como em
outros estudos pode ser que os plasmiacutedeos que fazem esta transferecircncia estavam
comeccedilando a se espalhar no ambiente cliacutenico resultando na multiresistecircncia dessas
estirpes (WOODFORD et al 2004)
O presente estudo apresentou um vieacutes quanto aos resultados dos testes de
susceptibilidade microbiana Observou-se que natildeo foi encontrado resultado deste
teste em algumas amostras o que natildeo cooperou para um estudo mais preciso
futuros estudos quanto agraves amostras e um melhor acompanhamento deste tipo de
patologia Poreacutem mesmo sem algumas amostras com este resultado disponiacutevel foi
56
confirmada a presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos
carbapenecircmicos por meio dos genes de resistecircncia blaKPC e 16S rRNA que as
amostras apresentaram em sua maioria serem portadoras Quanto aos resultados
estatiacutesticos nenhuma das variaacuteveis apresentou significacircncia estatiacutestica (p gt 005)
mostrando assim que estas variaacuteveis isoladas natildeo foram o fator determinante para
o desfecho cliacutenico de alta ou oacutebito
57
7 CONCLUSAtildeO
Os genes blaKPC e 16S rRNA foram caracterizados confirmando a a
presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos carbapenecircmicos
Houve uma maior prevalecircncia da cepa K pneumoniae e isto confirma outros
estudos que apresentam a maior prevalecircncia desta cepa em amostras com KPC
Aleacutem disso isso justifica a forma popular da K pneumoniae ser chamada de KPC
enquanto que na verdade KPC eacute uma enzima podendo estar presente em outras
cepas como Enterobacter clocae tambeacutem apresentada no presente estudo O
desfecho cliacutenico de oacutebitos maior que 50 eacute um possiacutevel indicador sobre a
necessidade de se realizar um teste raacutepido para identificaccedilatildeo de KPC visando
iniciar o mais raacutepido possiacutevel o tratamento afim de diminuir a mortalidade por esta
infecccedilatildeo
Nenhuma das variaacuteveis isoladamente estaacute relacionada ao desfecho cliacutenico
oacutebito ou alta pois natildeo apresentaram relevacircncia estatiacutestica O presente estudo
mostrou que haacute presenccedila da bacteacuteria nas amostras de pacientes do hospital
estudado podendo entatildeo afirmar que este tipo de bacteacuteria se encontra tambeacutem
presente em ambiente hospitalar O uso irracional de antimicrobiano eacute demonstrado
de forma indireta quando foi apresentado atraveacutes do Teste de Hodge Modificado
uma resistecircncia de 100 aos antibioacuteticos carbapenecircmicos Isto tambeacutem reflete na
terapecircutica sendo que pacientes portadores de bacteacuterias resistentes aos
antibioacuteticos carabepecircmicos tem uma escassa opccedilatildeo de tratamento e as opccedilotildees
apresentam problemas quanto agrave toxicidade e eficaacutecia
58
REFEREcircNCIAS
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Mecanismos
de resistecircncia bacteriana aos antimicrobianos Disponiacutevel em
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controleopas_
webmodulo3mec_sitiohtmgt Acesso em 25 de abril de 2014
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Nota teacutecnica nordm
012013 medidas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees por enterobacteacuterias
multiresistentes Acesso em 17 de abril de 2013
ALBA J et al Kinetics study of KPC-3 a plasmid-encoded class A
carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase Antimicrob Agents Chemother
Nov49(11)4760-2 2005
ALVES A P et al Nosocomial infections by KPC-producing enterobacteria in
a tertiary hospital in Southern Brazil Revista da AMRIGS Porto Alegre 57 (3) 213-
218 jul-set 2013
ALVES A et al Tipagem Geneacutetica de Microrganismos Lab De Diversidade
Microbiana Centro de Biologia Celular Dep de Biologia U de Aveiro 3810-193
Aveiro- 2003
BELL J M et Al Prevalence and significance of a negative extended-
spectrum beta-lactamase (ESBL) confirmation test result after a positive ESBL
screening test result for isolates of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae
results from the SENTRY Asia-Pacific Surveillance Program J Clin Microbiol
May45(5)1478-82 2007
BRATU S et al Detection of KPC carbapenem-hydrolyzing enzymes in
Enterobacter spp from Brooklyn New York Antimicrob Agents Chemother v 49 n
2 p 776-8 2005
59
BRATU S et al Emergence of KPC-possessing Klebsiella pneumoniae in
Brooklyn New York epidemiology and recommendations for detection Antimicrob
Agents Chemother v 49 n 7 p 3018-20 2005
BRATU S et al Rapid spread of carbapenem-resistant Klebsiella
pneumoniae in New York City Arch Intern Med v 165 p 1430-5 2005
CAMARGO C F et al Aplicaccedilatildeo das teacutecnicas de pcr e suas teacutecnicas
derivadas em diagnoacutestico molecular Disponiacutevel em
ltfileDUnB10C2BA20semestreArtigosPCR-
20CLEYTON20FLORENCIO20DE20CAMARGO20E20PAULO20ROB
ERTO20QUEIROZpdfgtgt Acesso em 08 de abril de 2014
CARVALHES C G et al Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting
carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive
results Journal of Antimicrobial Chemotherapy v 65 n2 p 249-251 2010
CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION- CDC Modified
Hodge Test for Carbapenemase Detection in Enterobacteriaceae 2004
CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE Methods for
dilutionantimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically Approved
standard M7ndashA7 7th ed CLSI Wayne PA 2011
COELLO R et al Risk factors for developing clinical infection with methicillin-
resistant Staphylococcus aureus (MRSA) amongst hospital patients initially only
colonized with MRSA J Hosp Infect 19973739-46
COLPAN A et al Evaluation of risk factors for mortality in intensive care
units A prospective study from a referral hospital in Turkey Am J Infect Control
200533(1)42-7
60
CORNAGLIA G et al Living with ESBLs Introduction Clinical Microbiology
and Infection 14 Suppl 1 1-2 2008
COTRIM E R et al Klebsiella pneumoniae carbapenemase ndash KPC em
Enterobacteriaceae o desafio das bacteacuterias multirresistentes Poacutes em revista do
centro universitaacuterio Newton Paiva 12012 - ediccedilatildeo 5 - issn 2176 7785
DESHPANDE L M et al Occurrence and characterization of
carbapenemase-producing Enterobacteacuteriaceae report from the SENTRY
Antimicrobial Surveillance Program (2000-2004) Microb Drug Resist 12(4)223-30
2006
DIAS D J A Estudos dos principais mecanismos de resistecircncia aos
antibioacuteticos β-lactacircmicos em bacteacuterias patogecircnicas gram negativas 2009 100 f
Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Geneacutetica Molecular e Biomedicina) ndash Faculdade de
Ciecircncias e Tecnologia Universidade de Nova Lisboa Lisboa
DIENSTMANN R et al Avaliaccedilatildeo fenotiacutepica da enzima Klebsiella
pneumoniae carbapenemase (KPC) em Enterobacteriaceae de ambiente hospitalar
J Bras Patol Med Lab v 46 n 1 p 23-27 fevereiro 2010
ENDIMIAMI A et al Emergence of blaKPC-containing Klebsiella
pneumoniae in a long-term acute care hospital a new challenge to our healthcare J
Antimicrob Chemother 64 1102-1110 Nov 2009
FALAGAS M E et al Extended-spectrum beta-lactamase producing
organisms The Journal of Hospital Infection 73 (4) pp 345-54 2009
FONTANA C et al Emergence of KPC-producing Klebsiella pneumoniae in
Italy BMC Rev Notes 3 40 2010
61
GALES A C et al Antimicrobial resistance among Gram-negative bacilli
isolated from Latin America results from Sentry Antimicrobial Surveillance Program
(Latin America 2008-2010) Diagnostic Microbiology and Infectious Disease v 3 n
4 p 354 -360 2012
GUPTA N et al Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Epidemiology
and Prevention HEALTHCARE EPIDEMIOLOGY Clinical Infectious Diseases
201153(1)60ndash67 Published by Oxford University Press on behalf of the Infectious
Diseases Society of America 2011
HARBOTTLE H et al Genetics of antimicrobial resistance Anim Biotechnol
n17 p111-124 2006
HENRIQUE W N et al RESISTEcircNCIA BACTERIANA Uniatildeo das
Faculdades Alfredo NasserInstituto de Ciecircncias da Sauacutede Disponiacutevel em lt
httpwwwfaculdadealfredonasseredubrfilespesquisaposter20HENRIQUE20
Wilker20Natividade20SANTIAGO20Silvania20CAVALCANTI20DSP
20ResistC3AAncia20Bacterianapdfgt Acesso em 17 marccedilo 2014
HULSCHER M E J I et al Antibiotic prescribing in hospital a social and
behavioral scientific approach The Lancet Infectious Diaseases v 10 n 3 p 167-
165 2010
KIDWAI M SAPRA P BHUSHAN KR Synthetic strategies and medicinal
properties of beta-lactams Curr Med Chem 1999 695-215
KUMARASAMY K K et al Emergence of a new antibiotic resistance
mechanism in India Pakistan and the UK a molecular biological and
epidemiological stuy The Lancet Infectious Diseases v10 n 9 p 597- 602 2010
LINCOPAN N et al Enterobacteacuteria producing extended-spectrum β-
lacatamases and IMP-1 Metalo-β-lactamases isolated from Brazilian hospitals J Med
62
Microbiol 7 1-3 2006
LINCOPAN N et al First Isolation of Metalo-β-Lacatamase-Producing
Multiresistant Klebsiella pneumoniae from a patient in Brazil J Clin Microbiol 43(1)
516-519 2005
LIVERMORE D M et al What remains against carbapenem- resistant
Enterobacteriaceae Evaluation of choramphenicol ciprofloxacin colistina
fosfomycin minocycline nitrofurantoin temocilin and tigecycline International
Journal of Antimicrobial Agents v 37 n 5 p 415- 459 2011
LIVERMORE D M Fourten years in resistance International Journal of
Antimicrobial Agents v 39 283- 294 2012
LIVERMORE D M Bacterial resistance to carbapenems Adv Exp Med Biol
1995 39025-47
LIVERMORE D M Bacterial resistance origins epidemiology and impact
Clin Infect Dis 36S11-S23 2003
LIVERMORE D M et al Carbapenemases a problem in waiting Curr
Opin Microbiol 2000 3489-95
LU et al Universal pcr for common bacterial pathogens J CLIN
MICROBIOL VOL 38 2000
LU et al Use of PCR with Universal Primers and Restriction Endonuclease
Digestions for Detection and Identification of Common Bacterial Pathogens in
Cerebrospinal Fluid Journal of Clinical Microbiology June 2000 p 2076ndash2080
MARSCHALL J Met al Presence of the KPC Carbapenemase Gene in
Enterobacteriaceae Causing Bacteremia and Its Correlation with In Vitro
Carbapenem Susceptibility J Clin Microbiol 47 239-241 Jan 2009
63
MARTINS WMBS et al Prevalecircncia do gene blaKPC em isolados cliacutenicos
de Enterobacteriaceae e natildeo fermentadores encontrados em amostras clinicas em
um hospital universitaacuterio do Recife X Jornada de ensino pesquisa e extensatildeo ndash
JEPEX 2010 ndash UFRPE Recife 18 a 22 de outubro
MENDES C A C et al Polimixinas Revisatildeo com ecircnfase na sua
nefrotoxicidade Rev Assoc Med Bras 2009 55(6) 752-9
MOHR J F 3rd Update on the efficacy and tolerability of meropenem in the
treatment of serious bacteacuterial infections Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S41-51
2008
MONTEIRO J et al First report of KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae
strains in Brazil Antimicrob Agents Chemother Jan53(1)333-4 2009
MOREIRA V C et al Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia a antibioacuteticos
Disponiacutevel em
lthttpwwwcpglsucgbr6mostraartigosSAUDEVANESSA20CARVALHO20M
OREIRApdfgt Acesso em 21 marccedilo 2014
NETIKUL T et al Emergence of novel blaKPC-12 and blaKPC-13 variants in
carbapenem non-susceptible Enterobacter cloacae a first report of blaKPC gene in
Thailand European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases May
S372 2011
NETO V A et al Antibioacuteticos na praacutetica Meacutedica 6ordf Ediccedilatildeo Editorial
SarverSP Brasil 2007
NICOLAU D P Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of
meropenem Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S32-40 2008
64
OLIVEIRA A C et al Resistecircncia bacteriana e mortalidade em um centro de
terapia intensiva Rev Latino-Am Enfermagem nov-dez 2010
PAAUW A et al Failure to control an outbreak of qnrA 1-positive multidrug-
resistant Enterobacter clocae despite adequate implementation of recommended
infection control measures Journal of Clinical Microbiology v 45 n 5 p 1420-1425
2007
PATERSON D L et al Extended-Spectrum Beta-Lactamases a Clinical
Update Clinical Microbiology Reviews v 18 p 657-686 2005
PEIRANO G et al Carbapenem-hydrolysing beta-lactamase KPC-2 in
Klebsiella pneumonia isolated in Rio de Janeiro Brazil J Antimicrob Chemother Nov
20 2009
PERES-BOTA D et al Are infections due to resistant pathogens associated
with worse outcome in critically ill patients J Infect 200347(4)307-16
PIDDOCK L J V Clinically relevant chromosomally encoded multidrug
resistance effl ux pumps in bacterial Clin Microbiol Rev n19 p382-402 2006
PITOUT J D D et al Emergence of Enterobacteriaceae producing
extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) in the community J Antimicrob
Chemother May 56 2005
POSSEBON M I et al Resistecircncia bacteriana aos carbapenecircmicos
Bacterial resitence to carbapenems RBM rev bras med60(6)378380-378-382
jun 2003
QUEENAN A M et al Carbapenemases the versatile beta-lactamases
Clin Microbiol Rev Jul20(3)440-58 2007
65
RHOMBERG P R et al Summary trends for the meropenem yearly
susceptibility test information collection program a 10- year experience in the United
States (1999-2008) Diagnostic Microbiology and Infectiois Disease v 65 n4 p
414-426 2009
ROBLEDO I E et al Detection of KPC in Acinetobacter spp in Puerto Rico
J Antimicrob Agents Chemother 54 1354-1357 Mar 2010
ROGERS B A et al Country-to-country transfer os patients and the risk of
multi-resistant bacterial infection Clinical Infectious Disease v53 n1 p49- 56
2011
SHAH A A et al Characteristics epidemiology and clinicalimportance of
emerging strains of Gram-negative bacilli producing extended-spectrum
betalactamases Research in Microbiology v 155 p 409-421 2004
TURNER P J Extended- Spectrum Beta-Lactamases Clinical Infectious
Diseases v 41 p 273-275 2005
WOLTER D J et al Phenotypic and Enzymatic Comparative Analysis
between the Novel KPC variant KPC-5 and Its Evolutionary Variants KPC-2 and
KPC-4 Antimicrob Agents Chemother Nov 17 2008
WOODFORD N et al Carbapenemases of Chryseobacterium
(Flavobacterium) meningosepticum distribution of blaB and characterization of a
novel Metalo-beta-lactamase gene blaB3 in the type strain NCTC 10016
Antimicrob Agents Chemother Jun44(6)1448-52 2000
WOODFORF N Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in
India Pakistan and the UK a molecular biological and epidemiological study The
Lancet Infectious Diseases v 10 n 9 p 597-602 2010
66
WOODFORD et al Outbreak of Klebsiella pneumoniae Producing a New
Carbapenem- Hydrolyzing Class A β-Lactamase KPC-3 in a New York Medical
Center Antimicrobial agents and chemotherapy Dec 2004 p 4793ndash4799 Vol 48
No 12
YAGI T et al A preliminary survey of extended-spectrum β-lactamases
(ESBLs) in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Japan
FEMS Microbiology Letters 184 (2000) 53-56
YIGIT H et al Novel carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase KPC-1 from
a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumonia J Antimicrob Agents
Chemother 45 (4) 1151-1161 (2001)
ZAVASCKI A P et al KPC-2- producing Enterobacter cloacae in two cities
from Southern Brazil Int J Antimicrob Agents Apr 28 2009
ZHANEL G G et al Comparative review of the carbapenecircmicos Drugs
67(7)1027-52 2007
67
ANEXOS
Sequumlecircncia do oligo blaKPC
Query 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
Query 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
Query 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
68
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
Query 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
Query 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
69
Query 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
Query 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
Query 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
70
Sbjct 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
Query 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
Query 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
Query 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
71
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Sbjct 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
Query 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
Query 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
72
Query 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
Query 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
Query 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
73
Sbjct 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
Query 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
Query 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
Query 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
74
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
Query 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
Query 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
75
Query 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
Query 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
||||
Sbjct 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
LOCUS AF297554 1377 bp
DNA linear BCT 26-MAR-2001
DEFINITION Klebsiella pneumoniae carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
gene complete cds
ACCESSION AF297554
VERSION AF2975541 GI10121874
76
KEYWORDS
SOURCE Klebsiella pneumoniae
ORGANISM Klebsiella pneumoniae
Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Enterobacteriaceae Klebsiella
REFERENCE 1 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH QueenanAM
AndersonGJ Domenech-SanchezA
BiddleJW StewardCD
AlbertiS BushK and TenoverFC
TITLE Novel carbapenem-hydrolyzing beta-
lactamase KPC-1 from a
carbapenem-resistant strain of
Klebsiella pneumoniae
JOURNAL Antimicrob Agents Chemother 45 (4)
1151-1161 (2001)
PUBMED 11257029
REFERENCE 2 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH AndersonGJ and
TenoverFC
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (19-AUG-2000) Nosocomial
Pathogens Laboratory Branch
Centers for Disease Control and
Prevention 1600 Clifton Rd MS
G08 Atlanta GA 30333 USA
FEATURES LocationQualifiers
77
source 11377
organism=Klebsiella
pneumoniae
mol_type=genomic DNA
db_xref=taxon573
-35_signal 5560
-10_signal 7883
mRNA 921012
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
RBS 117122
CDS 1311012
note=blaKPC-1
codon_start=1
transl_table=11
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
protein_id=AAG134101
db_xref=GI10121875
translation=MSLYRRLVLLSCLSWPLAGFSATALTNLVAEPFAKLEQD
FGGSI
GVYAMDTGSGATVSYRAEERFPLCSSFKGFLAAAVLARSQQQAGLLDTPIRYG
KNALV
PWSPISEKYLTTGMTVAELSAAAVQYSDNAAANLLLKELGGPAGLTAFMRSIG
DTTFR
78
LDRWELELNSAIPSDARDTSSPRAVTESLQKLTLGSALAAPQRQQFVDWLKGN
TTGNH
RIRAAVPADWAVGDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTRAPNKDDK
HSEAV
IAAAARLALEGLGVNGQ
ORIGIN
1 cggggcagtt acagccgtta cagcctctgg
agagggagcg gcttgccgct cggtgataat
61 cccagctgta gcggcctgat tacatccggc
cgctacacct agctccacct tcaaacaagg
121 aatatcgttg atgtcactgt atcgccgtct
agttctgctg tcttgtctct catggccgct
181 ggctggcttt tctgccaccg cgctgaccaa
cctcgtcgcg gaaccattcg ctaaactcga
241 acaggacttt ggcggctcca tcggtgtgta
cgcgatggat accggctcag gcgcaactgt
301 aagttaccgc gctgaggagc gcttcccact
gtgcagctca ttcaagggct ttcttgctgc
361 cgctgtgctg gctcgcagcc agcagcaggc
cggcttgctg gacacaccca tccgttacgg
421 caaaaatgcg ctggttccgt ggtcacccat
ctcggaaaaa tatctgacaa caggcatgac
481 ggtggcggag ctgtccgcgg ccgccgtgca
atacagtgat aacgccgccg ccaatttgtt
541 gctgaaggag ttgggcggcc cggccgggct
gacggccttc atgcgctcta tcggcgatac
79
601 cacgttccgt ctggaccgct gggagctgga
gctgaactcc gccatcccaa gcgatgcgcg
661 cgatacctca tcgccgcgcg ccgtgacgga
aagcttacaa aaactgacac tgggctctgc
721 actggctgcg ccgcagcggc agcagtttgt
tgattggcta aagggaaaca cgaccggcaa
781 ccaccgcatc cgcgcggcgg tgccggcaga
ctgggcagtc ggagacaaaa ccggaacctg
841 cggagtgtat ggcacggcaa atgactatgc
cgtcgtctgg cccactgggc gcgcacctat
901 tgtgttggcc gtctacaccc gggcgcctaa
caaggatgac aagcacagcg aggccgtcat
961 cgccgctgcg gctagactcg cgctcgaggg
attgggcgtc aacgggcagt aaggctctga
1021 aaatcatcta ttggcccacc accgccgccc
ttgcgggcgg catggattac caaccactgt
1081 cacatttagg ctaggagtct gcgcggcaga
gccgtgtgac cggttttctg tagagcactg
1141 acgatggcgg cggcgctctc tgcaattggc
aaggcgtcgg cgccaaggat accaatcttg
1201 cggcgcgcgg cgtgttatga cgactggggt
gcatttgagc cgccccattt aaccttcgcc
1261 ctcacagata cgccattcgc ctcaaattta
gcgccatgca gacgagcttc cactcggctt
1321 gcaccttgtc caggcccctc atgctgaact
gacgcaatcc catcaccgcc ttgatca
80
44
5 RESULTADOS
51 Anaacutelise molecular
Para a amplificaccedilatildeo com o oligo blaKPC foram amplificadas amostras
que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 881 pb correspondente ao
plasmiacutedeo A anaacutelise da amplificaccedilatildeo da regiatildeo do gene blaKPC mostrou que
apenas a amostra A10 natildeo amplificou isso demonstra que esta amostra natildeo
possuiacutea o gene de resistecircncia
5 1 1 Gene blaKPC
Figura 7 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 881 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
A amostra A3 natildeo amplificou no primeiro momento entatildeo foi realizado
novamente a PCR e corrida de gel obtendo entatildeo a amplificaccedilatildeo da amostra como
apresentado na figura 8
45
Figura 8 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC da
mostra A3 estudada A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo de 881
pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 1 2 Gene 16S rRNA
Para a amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA utilizou-se o oligo universal Foram
amplificadas amostras que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 996 pb
Figura 9 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
46
Segundo Lu et al (2000) a digestatildeo com a enzima HaeIII deste amplicons de
16S rRNA devolveriam bandas com perfis entre 150 a 200 pb No gel abaixo eacute
possiacutevel evidenciar que este perfil ocorreu com o predomiacutenio de bandas na altura
de 200pb
Figura 10 Gel de agarose a 2 da digestatildeo do amplicon do gene 16S
rRNA das amostras com a enzima HaeIII evidenciando diversos fragmentos
proacuteximos a 200 pb A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo ribossomal
de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 2 Anaacutelises epidemioloacutegicas
5 2 1 Sexo
No total foram detectados 17 isolados de KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 onde a maior a prevalecircncia foi
detecatada em amostras de pacientes do sexo masculino (53) do que no sexo
feminino (47)
47
Figura 11 Isolado de KPC segundo sexo dos 17 pacientes investigados
no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 2 Desfecho cliacutenico
Em 17 isolados de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo
de 2010 aacute 2011 a porcentagem de pacientes que foram a oacutebito (59) foi maior que
a de pacientes que tiverm alta (41)
Figura 12 Isolado de KPC segundo desfecho cliacutenico dos 17 pacientes
investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
48
5 2 3 Local da coleta
Dos 17 episoacutedios detectados de infecccedilatildeo por KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 a infecccedilatildeo em swab retalfoi mais
frequente (47) seguida de ponta de cateacuteter (18) e secreccedilatildeo traqueal (12)
Figura 13 Isolados de KPC segundo local da coleta da amostra nos 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 4 Microorganismo
O microorganismo mais encontrado foi a Klebsiella pneumoniae (82)
seguida da Enterobacter clocae (12) e Serratia marcescens (6) dos 17 isolados
de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 Isto afirma o
fato de a sigla KPC ser utilizada de forma errocircnea aacute Klebsiella pneumoniae visto
que a evidecircncia dela eacute maior em relaccedilatildeo as outras cepas
49
Figura 14 Isolado de KPC segundo microrganismo encontrado em 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 5 Relaccedilotildees variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana e desfecho
cliacutenico
Tabela 6 ndash Distribuiccedilatildeo do perfil geneacutetico sexo coleta tipificaccedilatildeo de
microrganismos e anaacutelise da resistecircncia bacteriana segundo o desfecho
cliacutenico Brasiacutelia-DF 2010 a 2011
Variaacutevel Resultado
Desfecho
Alta Oacutebito
N N P
Gene 16S rRNA Positivo 7 1000 10 1000
NA Gene blaKPC Positivo 6 857 10 1000
Negativo 1 143 0 00 0218 Sexo Feminino 2 286 6 600
Masculino 5 714 4 400 0201 Local da coleta Fundo saco de
Douglas 1 143 0 00
Hemocultura 0 00 1 100 0463 Ponta de cateter 1 143 2 200
Sec TraquealBrocircnquica
0 00 1 100
50
Secreccedilatildeo traqueal 2 286 0 00
Swab retal 3 429 5 500
Urina 0 00 1 100
Microrganismo Enterobacter cloacae (KPC)
1 143 1 100
Klebsiella pneumoniae
6 857 8 800
0416 Serratia
marcescens 0 00 1 100
Teste de Hodge Hodge positivo 7 1000 10 1000
NA Amicacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 1 100 0848 resistente 0 00 1 100
sensiacutevel 2 286 3 300
Amoxicilina Aacutecido Clavulacircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Ampicilina Sulbactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ampicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Aztreonan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefazolina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Cefoperazona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Cefotaxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefoxitina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0509 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 2 286 4 400
Ceftazidima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cetriaxona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 3 429 5 500 0772 Cefalotina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ciprofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772
51
resistente 3 429 5 500
Claritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Clindamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Eritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Gentamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0942 resistente 2 286 3 300
sensiacutevel 1 143 2 200
Imipenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 0 00 2 200 0193 Resistente 1 143 3 300
sensiacutevel 2 286 0 00
Nitrofurantoiacutena sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Norfloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Oxacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Penicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Piperacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Rifampicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tetraciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Ticarcilina Aacutecido Clavulocircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0688 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 3 429 4 400
Tobramicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Trimetoprima Sulfametoxazol
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0112 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 2 286 0 00
Vancomicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tigeciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediario 0 00 1 100 0211 natildeo testado 1 143 4 400
resistente 2 286 0 00
52
Cefepime sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefuroxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Levofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Piperacilina Tazobactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Ertapenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Meropenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0223 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 1 143 0 00
Cefotetan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 sensiacutevel 0 00 1 100
Gemifloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 7 700 0585 natildeo testado 3 429 3 300
Desfecho
Alta Oacutebito
Meacutedia Erro
padratildeo Meacutedia Erro
padratildeo p
Idade 58 9 59 5 0991
Tempo Internaccedilatildeo (dias)
50 13 46 12 0571
n= 17 p(lt 005) NA natildeo se aplica
53
6 DISCUSSAtildeO
Nos uacuteltimos anos houve um aumento na incidecircncia de bacteacuterias
multirresistentes aos antimicrobianos no ambiente hospitalar tornando isto um
problema mundial de sauacutede puacuteblica (HULSCHER et al 2010) Quando se trata
principalmente de bacilos Gram negativos a frequumlecircncia destas bacteacuterias eacute ainda
maior em paiacuteses da Ameacuterica Latina quando comparada a paiacuteses desenvolvidos
(GALES etal 2012)
De acordo com dados do ldquoMeropenem Yearly Susceptibility Test Information
Collectionrdquo (MYSTIC) ocorreu nos Estados Unidos um aumento na susceptibilidade
de K pneumoniae nos uacuteltimos anos graccedilas a praacuteticas de controle de disseminaccedilatildeo
de amostras resistentes(RHOMBERG P R et al 2009) O aumento crescente da
prevalecircncia destes microrganismos foi proporcional ao aumento da dependecircncia do
uso de antibioacuteticos carbapenecircmicos considerados como a opccedilatildeo terapecircutica para o
tratamento de infecccedilotildees por bacilos Gram negativos multi-resistentes (LIVERMORE
2012) Isto afeta diretamente as opccedilotildees de tratamento sobrando poucas alternativas
para a terapecircutica que incluem colistina (polimixina E) e tigeciclina que apresentam
respectivamente problemas em termos de toxicidade e eficaacutecia (LIVERMORE et
al 2011) Um dos efeitos adversos mais importantes das poliminas B e E por
exemplo satildeo a neurotoxicidade e nefrotoxicidade (MENDES C A C et al2009 )
Devido agrave resistecircncia ser usualmente de natureza plasmidial e portanto de
maior disseminaccedilatildeo especialmente quando carreadas por K pneumoniae
microrganismo com uma notoacuteria capacidade para acumular e transferir plasmiacutedeos
com determinantes para resistecircncia o nuacutemero de casos detectados pelo
fenoacutetipogenoacutetipo blaKPC eacute bastante preocupante (MONTEIRO et al 2009)
Comparada com outras bacteacuterias hospitalares a transmissatildeo de clones
multirresistentes de K pneumoniae eacute maior e podem natildeo ser controladas pelos
meacutetodos de controle de infecccedilatildeo hospitalar (PAAUW et al 2007) A forma
plasmidial para transferecircncia da resistecircncia adicionada a este grande potencial para
disseminaccedilatildeo de clones resistentes eacute preocupante visto que apoacutes surtos muitas
vezes pode se tornar endecircmica Jaacute eacute uma realidade a disseminaccedilatildeo desta bacteacuteria
54
entre pacientes hospitais paiacuteses e ateacute mesmo continentes (WOODFORF et al
2010 ROGERS et al 2011)
As chances de surtos satildeo maiores em paiacuteses com poucos recursos devido agrave
maior carecircncia de praacuteticas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees hospitalares e o
uso irracional de antimicrobianos de forma empiacuterica e inadequada (KUMARASAMY
et al 2010) Ateacute o momento os mecanismos de resistecircncia aos cabapenecircmicos
geralmente encontrado eram a produccedilatildeo de ESBL (CTX-M) somada aacute perda de
porina (CARVALHAES et al 2010) Foi notado a partir do ano de 2008 um
aumento no nuacutemero de K pneumoniae produtoras de KPC-2 apresentando outra
forma de resistecircncia (GALES 2012)
Um estudo mostrou que o perfil do paciente colonizado ou infectado por KPC
foi de um paciente entre os 33 e os 82 anos de idade internado haacute mais de 1
semana no hospital A mortalidade geral nos uacuteltimos anos ficou em torno de 7
sendo que dos 77 pacientes estudados 32 (415) pacientes evoluiacuteram para oacutebito
evidenciando a alta morbi-mortalidade associada (ALVES A P et al 2013)
Em estudo com 2316 pacientes avaliados a populaccedilatildeo de sexo masculino foi
de 526 idade meacutedia global de 53 anos (mediana de 55 anos) permanecircncia meacutedia
de 58 dias (mediana de 3 dias) (OLIVEIRA A C et al 2010) Outros trabalhos
apresentaram ausecircncia de significacircncia entre sexoidade e o desenvolvimento de
infecccedilotildees por microrganismos resistentes (PERES-BOTA D et al 2003 COLPAN
A et al 2005 COELLO R et al 1997)
Outro estudo utilizou um total de 30 amostras sendo elas isoladas de urina
escarro secreccedilatildeo pleural ponta de cateter aspirado traqueal e hemocultura A mais
prevalente foi em urina (40) Entre as 30 cepas analisadas a maior porcentagem
foi da cepa Klebsiella pneumoniae (70) Enterobacter sp (133) Klebsiella
ozaenae (10) Escherichia coli (333) e Klebsiella oxytoca (333)
(DIENSTMANN R et al 2010) Nos Estados Unidos a enzima KPC jaacute se tornou
endecircmica Foi realizada uma pesquisa em dois hospitais de Nova York onde
testaram 602 amostras e 45 apresentaram algum mecanismo de resistecircncia
sendo apenas 33 confirmadas por biologia molecular como KPC-2 (BRATU et
al 2005)
55
Estudo sobre os tipos de ESBL feito no Japatildeo apresentou o tipo Toho-1 como
o mais prevalente nessa pesquisa Ateacute o ano de 2000 ano em que foi publicado tal
estudo este era o primeiro relatoacuterio no Japatildeo para identificar derivados de ESBLs
como tipo de SHV e TEM entre E coli e K pneumoniae Em especial o tipo SHV- 12
foi identificado com uma maior frequumlecircncia Estes resultados indicam que tipos
distintos de ESBLs que satildeo diferentes em sua especificidade de substrato e origem
geneacutetica coexistem no Japatildeo Isto mostra a importacircncia de caracterizar genoacutetipos
distintos de ESBLs e de estar em alerta continuamente para as tendecircncias de
ESBLs no Japatildeo aleacutem da necessidade de uma interpretaccedilatildeo uniforme utilizando as
diretrizes do CSLI para relatar cepas produtoras de ESBL Aleacutem da detecccedilatildeo de
ESBLs satildeo necessaacuterias mais informaccedilotildees tais como o perfil de sensibilidade
especiacutefica para diversas β-lactacircmicos e o local da infecccedilatildeo Esses fatores satildeo
essenciais para a escolha adequada de antibioacuteticos (YAGI T et al 2000)
No ano de 2004 uma pesquisa avaliou a produccedilatildeo de uma enzima de
hidroacutelise de carbapenecircmicos atraveacutes da teacutecnica de sequumlenciamento foi revelado
um novo membro da famiacutelia KPC designado KPC- 3 Pesquisadores encontraram
em um mutante de K pneumoniae uma substituiccedilatildeo de um gene associado com
resistecircncia a Imipenem mas essa substituiccedilatildeo foi considerada improvaacutevel na
contribuiccedilatildeo da resistecircncia aos carbapenecircmicos da espeacutecie estudada Aleacutem da
resistecircncia aos carbapenecircmicos estes isolados eram em sua maioria resistentes agraves
cefalosporinas penicilinas e aminoglicosiacutedeos Usando estudos de transformaccedilatildeo
conjugaccedilatildeo e hibridaccedilatildeo localizaram o alelo blaKPC em plasmiacutedeo aleacutem disso
mostraram que esse alelo tambeacutem carregava uma resistecircncia aos aminoglicosiacutedeos
A transferecircncia das enzimas KPCs foi demonstrada in vitro tanto neste como em
outros estudos pode ser que os plasmiacutedeos que fazem esta transferecircncia estavam
comeccedilando a se espalhar no ambiente cliacutenico resultando na multiresistecircncia dessas
estirpes (WOODFORD et al 2004)
O presente estudo apresentou um vieacutes quanto aos resultados dos testes de
susceptibilidade microbiana Observou-se que natildeo foi encontrado resultado deste
teste em algumas amostras o que natildeo cooperou para um estudo mais preciso
futuros estudos quanto agraves amostras e um melhor acompanhamento deste tipo de
patologia Poreacutem mesmo sem algumas amostras com este resultado disponiacutevel foi
56
confirmada a presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos
carbapenecircmicos por meio dos genes de resistecircncia blaKPC e 16S rRNA que as
amostras apresentaram em sua maioria serem portadoras Quanto aos resultados
estatiacutesticos nenhuma das variaacuteveis apresentou significacircncia estatiacutestica (p gt 005)
mostrando assim que estas variaacuteveis isoladas natildeo foram o fator determinante para
o desfecho cliacutenico de alta ou oacutebito
57
7 CONCLUSAtildeO
Os genes blaKPC e 16S rRNA foram caracterizados confirmando a a
presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos carbapenecircmicos
Houve uma maior prevalecircncia da cepa K pneumoniae e isto confirma outros
estudos que apresentam a maior prevalecircncia desta cepa em amostras com KPC
Aleacutem disso isso justifica a forma popular da K pneumoniae ser chamada de KPC
enquanto que na verdade KPC eacute uma enzima podendo estar presente em outras
cepas como Enterobacter clocae tambeacutem apresentada no presente estudo O
desfecho cliacutenico de oacutebitos maior que 50 eacute um possiacutevel indicador sobre a
necessidade de se realizar um teste raacutepido para identificaccedilatildeo de KPC visando
iniciar o mais raacutepido possiacutevel o tratamento afim de diminuir a mortalidade por esta
infecccedilatildeo
Nenhuma das variaacuteveis isoladamente estaacute relacionada ao desfecho cliacutenico
oacutebito ou alta pois natildeo apresentaram relevacircncia estatiacutestica O presente estudo
mostrou que haacute presenccedila da bacteacuteria nas amostras de pacientes do hospital
estudado podendo entatildeo afirmar que este tipo de bacteacuteria se encontra tambeacutem
presente em ambiente hospitalar O uso irracional de antimicrobiano eacute demonstrado
de forma indireta quando foi apresentado atraveacutes do Teste de Hodge Modificado
uma resistecircncia de 100 aos antibioacuteticos carbapenecircmicos Isto tambeacutem reflete na
terapecircutica sendo que pacientes portadores de bacteacuterias resistentes aos
antibioacuteticos carabepecircmicos tem uma escassa opccedilatildeo de tratamento e as opccedilotildees
apresentam problemas quanto agrave toxicidade e eficaacutecia
58
REFEREcircNCIAS
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Mecanismos
de resistecircncia bacteriana aos antimicrobianos Disponiacutevel em
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controleopas_
webmodulo3mec_sitiohtmgt Acesso em 25 de abril de 2014
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Nota teacutecnica nordm
012013 medidas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees por enterobacteacuterias
multiresistentes Acesso em 17 de abril de 2013
ALBA J et al Kinetics study of KPC-3 a plasmid-encoded class A
carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase Antimicrob Agents Chemother
Nov49(11)4760-2 2005
ALVES A P et al Nosocomial infections by KPC-producing enterobacteria in
a tertiary hospital in Southern Brazil Revista da AMRIGS Porto Alegre 57 (3) 213-
218 jul-set 2013
ALVES A et al Tipagem Geneacutetica de Microrganismos Lab De Diversidade
Microbiana Centro de Biologia Celular Dep de Biologia U de Aveiro 3810-193
Aveiro- 2003
BELL J M et Al Prevalence and significance of a negative extended-
spectrum beta-lactamase (ESBL) confirmation test result after a positive ESBL
screening test result for isolates of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae
results from the SENTRY Asia-Pacific Surveillance Program J Clin Microbiol
May45(5)1478-82 2007
BRATU S et al Detection of KPC carbapenem-hydrolyzing enzymes in
Enterobacter spp from Brooklyn New York Antimicrob Agents Chemother v 49 n
2 p 776-8 2005
59
BRATU S et al Emergence of KPC-possessing Klebsiella pneumoniae in
Brooklyn New York epidemiology and recommendations for detection Antimicrob
Agents Chemother v 49 n 7 p 3018-20 2005
BRATU S et al Rapid spread of carbapenem-resistant Klebsiella
pneumoniae in New York City Arch Intern Med v 165 p 1430-5 2005
CAMARGO C F et al Aplicaccedilatildeo das teacutecnicas de pcr e suas teacutecnicas
derivadas em diagnoacutestico molecular Disponiacutevel em
ltfileDUnB10C2BA20semestreArtigosPCR-
20CLEYTON20FLORENCIO20DE20CAMARGO20E20PAULO20ROB
ERTO20QUEIROZpdfgtgt Acesso em 08 de abril de 2014
CARVALHES C G et al Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting
carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive
results Journal of Antimicrobial Chemotherapy v 65 n2 p 249-251 2010
CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION- CDC Modified
Hodge Test for Carbapenemase Detection in Enterobacteriaceae 2004
CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE Methods for
dilutionantimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically Approved
standard M7ndashA7 7th ed CLSI Wayne PA 2011
COELLO R et al Risk factors for developing clinical infection with methicillin-
resistant Staphylococcus aureus (MRSA) amongst hospital patients initially only
colonized with MRSA J Hosp Infect 19973739-46
COLPAN A et al Evaluation of risk factors for mortality in intensive care
units A prospective study from a referral hospital in Turkey Am J Infect Control
200533(1)42-7
60
CORNAGLIA G et al Living with ESBLs Introduction Clinical Microbiology
and Infection 14 Suppl 1 1-2 2008
COTRIM E R et al Klebsiella pneumoniae carbapenemase ndash KPC em
Enterobacteriaceae o desafio das bacteacuterias multirresistentes Poacutes em revista do
centro universitaacuterio Newton Paiva 12012 - ediccedilatildeo 5 - issn 2176 7785
DESHPANDE L M et al Occurrence and characterization of
carbapenemase-producing Enterobacteacuteriaceae report from the SENTRY
Antimicrobial Surveillance Program (2000-2004) Microb Drug Resist 12(4)223-30
2006
DIAS D J A Estudos dos principais mecanismos de resistecircncia aos
antibioacuteticos β-lactacircmicos em bacteacuterias patogecircnicas gram negativas 2009 100 f
Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Geneacutetica Molecular e Biomedicina) ndash Faculdade de
Ciecircncias e Tecnologia Universidade de Nova Lisboa Lisboa
DIENSTMANN R et al Avaliaccedilatildeo fenotiacutepica da enzima Klebsiella
pneumoniae carbapenemase (KPC) em Enterobacteriaceae de ambiente hospitalar
J Bras Patol Med Lab v 46 n 1 p 23-27 fevereiro 2010
ENDIMIAMI A et al Emergence of blaKPC-containing Klebsiella
pneumoniae in a long-term acute care hospital a new challenge to our healthcare J
Antimicrob Chemother 64 1102-1110 Nov 2009
FALAGAS M E et al Extended-spectrum beta-lactamase producing
organisms The Journal of Hospital Infection 73 (4) pp 345-54 2009
FONTANA C et al Emergence of KPC-producing Klebsiella pneumoniae in
Italy BMC Rev Notes 3 40 2010
61
GALES A C et al Antimicrobial resistance among Gram-negative bacilli
isolated from Latin America results from Sentry Antimicrobial Surveillance Program
(Latin America 2008-2010) Diagnostic Microbiology and Infectious Disease v 3 n
4 p 354 -360 2012
GUPTA N et al Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Epidemiology
and Prevention HEALTHCARE EPIDEMIOLOGY Clinical Infectious Diseases
201153(1)60ndash67 Published by Oxford University Press on behalf of the Infectious
Diseases Society of America 2011
HARBOTTLE H et al Genetics of antimicrobial resistance Anim Biotechnol
n17 p111-124 2006
HENRIQUE W N et al RESISTEcircNCIA BACTERIANA Uniatildeo das
Faculdades Alfredo NasserInstituto de Ciecircncias da Sauacutede Disponiacutevel em lt
httpwwwfaculdadealfredonasseredubrfilespesquisaposter20HENRIQUE20
Wilker20Natividade20SANTIAGO20Silvania20CAVALCANTI20DSP
20ResistC3AAncia20Bacterianapdfgt Acesso em 17 marccedilo 2014
HULSCHER M E J I et al Antibiotic prescribing in hospital a social and
behavioral scientific approach The Lancet Infectious Diaseases v 10 n 3 p 167-
165 2010
KIDWAI M SAPRA P BHUSHAN KR Synthetic strategies and medicinal
properties of beta-lactams Curr Med Chem 1999 695-215
KUMARASAMY K K et al Emergence of a new antibiotic resistance
mechanism in India Pakistan and the UK a molecular biological and
epidemiological stuy The Lancet Infectious Diseases v10 n 9 p 597- 602 2010
LINCOPAN N et al Enterobacteacuteria producing extended-spectrum β-
lacatamases and IMP-1 Metalo-β-lactamases isolated from Brazilian hospitals J Med
62
Microbiol 7 1-3 2006
LINCOPAN N et al First Isolation of Metalo-β-Lacatamase-Producing
Multiresistant Klebsiella pneumoniae from a patient in Brazil J Clin Microbiol 43(1)
516-519 2005
LIVERMORE D M et al What remains against carbapenem- resistant
Enterobacteriaceae Evaluation of choramphenicol ciprofloxacin colistina
fosfomycin minocycline nitrofurantoin temocilin and tigecycline International
Journal of Antimicrobial Agents v 37 n 5 p 415- 459 2011
LIVERMORE D M Fourten years in resistance International Journal of
Antimicrobial Agents v 39 283- 294 2012
LIVERMORE D M Bacterial resistance to carbapenems Adv Exp Med Biol
1995 39025-47
LIVERMORE D M Bacterial resistance origins epidemiology and impact
Clin Infect Dis 36S11-S23 2003
LIVERMORE D M et al Carbapenemases a problem in waiting Curr
Opin Microbiol 2000 3489-95
LU et al Universal pcr for common bacterial pathogens J CLIN
MICROBIOL VOL 38 2000
LU et al Use of PCR with Universal Primers and Restriction Endonuclease
Digestions for Detection and Identification of Common Bacterial Pathogens in
Cerebrospinal Fluid Journal of Clinical Microbiology June 2000 p 2076ndash2080
MARSCHALL J Met al Presence of the KPC Carbapenemase Gene in
Enterobacteriaceae Causing Bacteremia and Its Correlation with In Vitro
Carbapenem Susceptibility J Clin Microbiol 47 239-241 Jan 2009
63
MARTINS WMBS et al Prevalecircncia do gene blaKPC em isolados cliacutenicos
de Enterobacteriaceae e natildeo fermentadores encontrados em amostras clinicas em
um hospital universitaacuterio do Recife X Jornada de ensino pesquisa e extensatildeo ndash
JEPEX 2010 ndash UFRPE Recife 18 a 22 de outubro
MENDES C A C et al Polimixinas Revisatildeo com ecircnfase na sua
nefrotoxicidade Rev Assoc Med Bras 2009 55(6) 752-9
MOHR J F 3rd Update on the efficacy and tolerability of meropenem in the
treatment of serious bacteacuterial infections Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S41-51
2008
MONTEIRO J et al First report of KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae
strains in Brazil Antimicrob Agents Chemother Jan53(1)333-4 2009
MOREIRA V C et al Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia a antibioacuteticos
Disponiacutevel em
lthttpwwwcpglsucgbr6mostraartigosSAUDEVANESSA20CARVALHO20M
OREIRApdfgt Acesso em 21 marccedilo 2014
NETIKUL T et al Emergence of novel blaKPC-12 and blaKPC-13 variants in
carbapenem non-susceptible Enterobacter cloacae a first report of blaKPC gene in
Thailand European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases May
S372 2011
NETO V A et al Antibioacuteticos na praacutetica Meacutedica 6ordf Ediccedilatildeo Editorial
SarverSP Brasil 2007
NICOLAU D P Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of
meropenem Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S32-40 2008
64
OLIVEIRA A C et al Resistecircncia bacteriana e mortalidade em um centro de
terapia intensiva Rev Latino-Am Enfermagem nov-dez 2010
PAAUW A et al Failure to control an outbreak of qnrA 1-positive multidrug-
resistant Enterobacter clocae despite adequate implementation of recommended
infection control measures Journal of Clinical Microbiology v 45 n 5 p 1420-1425
2007
PATERSON D L et al Extended-Spectrum Beta-Lactamases a Clinical
Update Clinical Microbiology Reviews v 18 p 657-686 2005
PEIRANO G et al Carbapenem-hydrolysing beta-lactamase KPC-2 in
Klebsiella pneumonia isolated in Rio de Janeiro Brazil J Antimicrob Chemother Nov
20 2009
PERES-BOTA D et al Are infections due to resistant pathogens associated
with worse outcome in critically ill patients J Infect 200347(4)307-16
PIDDOCK L J V Clinically relevant chromosomally encoded multidrug
resistance effl ux pumps in bacterial Clin Microbiol Rev n19 p382-402 2006
PITOUT J D D et al Emergence of Enterobacteriaceae producing
extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) in the community J Antimicrob
Chemother May 56 2005
POSSEBON M I et al Resistecircncia bacteriana aos carbapenecircmicos
Bacterial resitence to carbapenems RBM rev bras med60(6)378380-378-382
jun 2003
QUEENAN A M et al Carbapenemases the versatile beta-lactamases
Clin Microbiol Rev Jul20(3)440-58 2007
65
RHOMBERG P R et al Summary trends for the meropenem yearly
susceptibility test information collection program a 10- year experience in the United
States (1999-2008) Diagnostic Microbiology and Infectiois Disease v 65 n4 p
414-426 2009
ROBLEDO I E et al Detection of KPC in Acinetobacter spp in Puerto Rico
J Antimicrob Agents Chemother 54 1354-1357 Mar 2010
ROGERS B A et al Country-to-country transfer os patients and the risk of
multi-resistant bacterial infection Clinical Infectious Disease v53 n1 p49- 56
2011
SHAH A A et al Characteristics epidemiology and clinicalimportance of
emerging strains of Gram-negative bacilli producing extended-spectrum
betalactamases Research in Microbiology v 155 p 409-421 2004
TURNER P J Extended- Spectrum Beta-Lactamases Clinical Infectious
Diseases v 41 p 273-275 2005
WOLTER D J et al Phenotypic and Enzymatic Comparative Analysis
between the Novel KPC variant KPC-5 and Its Evolutionary Variants KPC-2 and
KPC-4 Antimicrob Agents Chemother Nov 17 2008
WOODFORD N et al Carbapenemases of Chryseobacterium
(Flavobacterium) meningosepticum distribution of blaB and characterization of a
novel Metalo-beta-lactamase gene blaB3 in the type strain NCTC 10016
Antimicrob Agents Chemother Jun44(6)1448-52 2000
WOODFORF N Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in
India Pakistan and the UK a molecular biological and epidemiological study The
Lancet Infectious Diseases v 10 n 9 p 597-602 2010
66
WOODFORD et al Outbreak of Klebsiella pneumoniae Producing a New
Carbapenem- Hydrolyzing Class A β-Lactamase KPC-3 in a New York Medical
Center Antimicrobial agents and chemotherapy Dec 2004 p 4793ndash4799 Vol 48
No 12
YAGI T et al A preliminary survey of extended-spectrum β-lactamases
(ESBLs) in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Japan
FEMS Microbiology Letters 184 (2000) 53-56
YIGIT H et al Novel carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase KPC-1 from
a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumonia J Antimicrob Agents
Chemother 45 (4) 1151-1161 (2001)
ZAVASCKI A P et al KPC-2- producing Enterobacter cloacae in two cities
from Southern Brazil Int J Antimicrob Agents Apr 28 2009
ZHANEL G G et al Comparative review of the carbapenecircmicos Drugs
67(7)1027-52 2007
67
ANEXOS
Sequumlecircncia do oligo blaKPC
Query 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
Query 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
Query 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
68
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
Query 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
Query 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
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Sbjct 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
69
Query 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
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Sbjct 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
Query 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
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Sbjct 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
Query 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
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70
Sbjct 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
Query 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
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Sbjct 481
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ATTTGTT 540
Query 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
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Sbjct 541
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GCGATAC 600
Query 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
71
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|||||||
Sbjct 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
Query 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
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Sbjct 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
Query 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
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|||||||
Sbjct 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
72
Query 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
Query 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
Query 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
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|||||||
73
Sbjct 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
Query 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
Query 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Sbjct 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
Query 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
74
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
Query 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
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|||||||
Sbjct 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
Query 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
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|||||||
Sbjct 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
75
Query 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
Query 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
||||
Sbjct 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
LOCUS AF297554 1377 bp
DNA linear BCT 26-MAR-2001
DEFINITION Klebsiella pneumoniae carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
gene complete cds
ACCESSION AF297554
VERSION AF2975541 GI10121874
76
KEYWORDS
SOURCE Klebsiella pneumoniae
ORGANISM Klebsiella pneumoniae
Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Enterobacteriaceae Klebsiella
REFERENCE 1 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH QueenanAM
AndersonGJ Domenech-SanchezA
BiddleJW StewardCD
AlbertiS BushK and TenoverFC
TITLE Novel carbapenem-hydrolyzing beta-
lactamase KPC-1 from a
carbapenem-resistant strain of
Klebsiella pneumoniae
JOURNAL Antimicrob Agents Chemother 45 (4)
1151-1161 (2001)
PUBMED 11257029
REFERENCE 2 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH AndersonGJ and
TenoverFC
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (19-AUG-2000) Nosocomial
Pathogens Laboratory Branch
Centers for Disease Control and
Prevention 1600 Clifton Rd MS
G08 Atlanta GA 30333 USA
FEATURES LocationQualifiers
77
source 11377
organism=Klebsiella
pneumoniae
mol_type=genomic DNA
db_xref=taxon573
-35_signal 5560
-10_signal 7883
mRNA 921012
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
RBS 117122
CDS 1311012
note=blaKPC-1
codon_start=1
transl_table=11
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
protein_id=AAG134101
db_xref=GI10121875
translation=MSLYRRLVLLSCLSWPLAGFSATALTNLVAEPFAKLEQD
FGGSI
GVYAMDTGSGATVSYRAEERFPLCSSFKGFLAAAVLARSQQQAGLLDTPIRYG
KNALV
PWSPISEKYLTTGMTVAELSAAAVQYSDNAAANLLLKELGGPAGLTAFMRSIG
DTTFR
78
LDRWELELNSAIPSDARDTSSPRAVTESLQKLTLGSALAAPQRQQFVDWLKGN
TTGNH
RIRAAVPADWAVGDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTRAPNKDDK
HSEAV
IAAAARLALEGLGVNGQ
ORIGIN
1 cggggcagtt acagccgtta cagcctctgg
agagggagcg gcttgccgct cggtgataat
61 cccagctgta gcggcctgat tacatccggc
cgctacacct agctccacct tcaaacaagg
121 aatatcgttg atgtcactgt atcgccgtct
agttctgctg tcttgtctct catggccgct
181 ggctggcttt tctgccaccg cgctgaccaa
cctcgtcgcg gaaccattcg ctaaactcga
241 acaggacttt ggcggctcca tcggtgtgta
cgcgatggat accggctcag gcgcaactgt
301 aagttaccgc gctgaggagc gcttcccact
gtgcagctca ttcaagggct ttcttgctgc
361 cgctgtgctg gctcgcagcc agcagcaggc
cggcttgctg gacacaccca tccgttacgg
421 caaaaatgcg ctggttccgt ggtcacccat
ctcggaaaaa tatctgacaa caggcatgac
481 ggtggcggag ctgtccgcgg ccgccgtgca
atacagtgat aacgccgccg ccaatttgtt
541 gctgaaggag ttgggcggcc cggccgggct
gacggccttc atgcgctcta tcggcgatac
79
601 cacgttccgt ctggaccgct gggagctgga
gctgaactcc gccatcccaa gcgatgcgcg
661 cgatacctca tcgccgcgcg ccgtgacgga
aagcttacaa aaactgacac tgggctctgc
721 actggctgcg ccgcagcggc agcagtttgt
tgattggcta aagggaaaca cgaccggcaa
781 ccaccgcatc cgcgcggcgg tgccggcaga
ctgggcagtc ggagacaaaa ccggaacctg
841 cggagtgtat ggcacggcaa atgactatgc
cgtcgtctgg cccactgggc gcgcacctat
901 tgtgttggcc gtctacaccc gggcgcctaa
caaggatgac aagcacagcg aggccgtcat
961 cgccgctgcg gctagactcg cgctcgaggg
attgggcgtc aacgggcagt aaggctctga
1021 aaatcatcta ttggcccacc accgccgccc
ttgcgggcgg catggattac caaccactgt
1081 cacatttagg ctaggagtct gcgcggcaga
gccgtgtgac cggttttctg tagagcactg
1141 acgatggcgg cggcgctctc tgcaattggc
aaggcgtcgg cgccaaggat accaatcttg
1201 cggcgcgcgg cgtgttatga cgactggggt
gcatttgagc cgccccattt aaccttcgcc
1261 ctcacagata cgccattcgc ctcaaattta
gcgccatgca gacgagcttc cactcggctt
1321 gcaccttgtc caggcccctc atgctgaact
gacgcaatcc catcaccgcc ttgatca
80
45
Figura 8 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene blaKPC da
mostra A3 estudada A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo de 881
pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 1 2 Gene 16S rRNA
Para a amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA utilizou-se o oligo universal Foram
amplificadas amostras que devolveram bandas de amplificaccedilatildeo na altura de 996 pb
Figura 9 Gel de agarose a 2 da amplificaccedilatildeo do gene 16S rRNA das
amostras dos 17 pacientes estudados A banda amplificada corresponde a
uma regiatildeo de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
46
Segundo Lu et al (2000) a digestatildeo com a enzima HaeIII deste amplicons de
16S rRNA devolveriam bandas com perfis entre 150 a 200 pb No gel abaixo eacute
possiacutevel evidenciar que este perfil ocorreu com o predomiacutenio de bandas na altura
de 200pb
Figura 10 Gel de agarose a 2 da digestatildeo do amplicon do gene 16S
rRNA das amostras com a enzima HaeIII evidenciando diversos fragmentos
proacuteximos a 200 pb A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo ribossomal
de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 2 Anaacutelises epidemioloacutegicas
5 2 1 Sexo
No total foram detectados 17 isolados de KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 onde a maior a prevalecircncia foi
detecatada em amostras de pacientes do sexo masculino (53) do que no sexo
feminino (47)
47
Figura 11 Isolado de KPC segundo sexo dos 17 pacientes investigados
no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 2 Desfecho cliacutenico
Em 17 isolados de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo
de 2010 aacute 2011 a porcentagem de pacientes que foram a oacutebito (59) foi maior que
a de pacientes que tiverm alta (41)
Figura 12 Isolado de KPC segundo desfecho cliacutenico dos 17 pacientes
investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
48
5 2 3 Local da coleta
Dos 17 episoacutedios detectados de infecccedilatildeo por KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 a infecccedilatildeo em swab retalfoi mais
frequente (47) seguida de ponta de cateacuteter (18) e secreccedilatildeo traqueal (12)
Figura 13 Isolados de KPC segundo local da coleta da amostra nos 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 4 Microorganismo
O microorganismo mais encontrado foi a Klebsiella pneumoniae (82)
seguida da Enterobacter clocae (12) e Serratia marcescens (6) dos 17 isolados
de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 Isto afirma o
fato de a sigla KPC ser utilizada de forma errocircnea aacute Klebsiella pneumoniae visto
que a evidecircncia dela eacute maior em relaccedilatildeo as outras cepas
49
Figura 14 Isolado de KPC segundo microrganismo encontrado em 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 5 Relaccedilotildees variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana e desfecho
cliacutenico
Tabela 6 ndash Distribuiccedilatildeo do perfil geneacutetico sexo coleta tipificaccedilatildeo de
microrganismos e anaacutelise da resistecircncia bacteriana segundo o desfecho
cliacutenico Brasiacutelia-DF 2010 a 2011
Variaacutevel Resultado
Desfecho
Alta Oacutebito
N N P
Gene 16S rRNA Positivo 7 1000 10 1000
NA Gene blaKPC Positivo 6 857 10 1000
Negativo 1 143 0 00 0218 Sexo Feminino 2 286 6 600
Masculino 5 714 4 400 0201 Local da coleta Fundo saco de
Douglas 1 143 0 00
Hemocultura 0 00 1 100 0463 Ponta de cateter 1 143 2 200
Sec TraquealBrocircnquica
0 00 1 100
50
Secreccedilatildeo traqueal 2 286 0 00
Swab retal 3 429 5 500
Urina 0 00 1 100
Microrganismo Enterobacter cloacae (KPC)
1 143 1 100
Klebsiella pneumoniae
6 857 8 800
0416 Serratia
marcescens 0 00 1 100
Teste de Hodge Hodge positivo 7 1000 10 1000
NA Amicacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 1 100 0848 resistente 0 00 1 100
sensiacutevel 2 286 3 300
Amoxicilina Aacutecido Clavulacircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Ampicilina Sulbactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ampicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Aztreonan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefazolina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Cefoperazona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Cefotaxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefoxitina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0509 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 2 286 4 400
Ceftazidima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cetriaxona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 3 429 5 500 0772 Cefalotina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ciprofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772
51
resistente 3 429 5 500
Claritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Clindamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Eritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Gentamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0942 resistente 2 286 3 300
sensiacutevel 1 143 2 200
Imipenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 0 00 2 200 0193 Resistente 1 143 3 300
sensiacutevel 2 286 0 00
Nitrofurantoiacutena sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Norfloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Oxacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Penicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Piperacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Rifampicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tetraciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Ticarcilina Aacutecido Clavulocircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0688 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 3 429 4 400
Tobramicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Trimetoprima Sulfametoxazol
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0112 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 2 286 0 00
Vancomicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tigeciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediario 0 00 1 100 0211 natildeo testado 1 143 4 400
resistente 2 286 0 00
52
Cefepime sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefuroxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Levofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Piperacilina Tazobactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Ertapenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Meropenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0223 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 1 143 0 00
Cefotetan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 sensiacutevel 0 00 1 100
Gemifloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 7 700 0585 natildeo testado 3 429 3 300
Desfecho
Alta Oacutebito
Meacutedia Erro
padratildeo Meacutedia Erro
padratildeo p
Idade 58 9 59 5 0991
Tempo Internaccedilatildeo (dias)
50 13 46 12 0571
n= 17 p(lt 005) NA natildeo se aplica
53
6 DISCUSSAtildeO
Nos uacuteltimos anos houve um aumento na incidecircncia de bacteacuterias
multirresistentes aos antimicrobianos no ambiente hospitalar tornando isto um
problema mundial de sauacutede puacuteblica (HULSCHER et al 2010) Quando se trata
principalmente de bacilos Gram negativos a frequumlecircncia destas bacteacuterias eacute ainda
maior em paiacuteses da Ameacuterica Latina quando comparada a paiacuteses desenvolvidos
(GALES etal 2012)
De acordo com dados do ldquoMeropenem Yearly Susceptibility Test Information
Collectionrdquo (MYSTIC) ocorreu nos Estados Unidos um aumento na susceptibilidade
de K pneumoniae nos uacuteltimos anos graccedilas a praacuteticas de controle de disseminaccedilatildeo
de amostras resistentes(RHOMBERG P R et al 2009) O aumento crescente da
prevalecircncia destes microrganismos foi proporcional ao aumento da dependecircncia do
uso de antibioacuteticos carbapenecircmicos considerados como a opccedilatildeo terapecircutica para o
tratamento de infecccedilotildees por bacilos Gram negativos multi-resistentes (LIVERMORE
2012) Isto afeta diretamente as opccedilotildees de tratamento sobrando poucas alternativas
para a terapecircutica que incluem colistina (polimixina E) e tigeciclina que apresentam
respectivamente problemas em termos de toxicidade e eficaacutecia (LIVERMORE et
al 2011) Um dos efeitos adversos mais importantes das poliminas B e E por
exemplo satildeo a neurotoxicidade e nefrotoxicidade (MENDES C A C et al2009 )
Devido agrave resistecircncia ser usualmente de natureza plasmidial e portanto de
maior disseminaccedilatildeo especialmente quando carreadas por K pneumoniae
microrganismo com uma notoacuteria capacidade para acumular e transferir plasmiacutedeos
com determinantes para resistecircncia o nuacutemero de casos detectados pelo
fenoacutetipogenoacutetipo blaKPC eacute bastante preocupante (MONTEIRO et al 2009)
Comparada com outras bacteacuterias hospitalares a transmissatildeo de clones
multirresistentes de K pneumoniae eacute maior e podem natildeo ser controladas pelos
meacutetodos de controle de infecccedilatildeo hospitalar (PAAUW et al 2007) A forma
plasmidial para transferecircncia da resistecircncia adicionada a este grande potencial para
disseminaccedilatildeo de clones resistentes eacute preocupante visto que apoacutes surtos muitas
vezes pode se tornar endecircmica Jaacute eacute uma realidade a disseminaccedilatildeo desta bacteacuteria
54
entre pacientes hospitais paiacuteses e ateacute mesmo continentes (WOODFORF et al
2010 ROGERS et al 2011)
As chances de surtos satildeo maiores em paiacuteses com poucos recursos devido agrave
maior carecircncia de praacuteticas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees hospitalares e o
uso irracional de antimicrobianos de forma empiacuterica e inadequada (KUMARASAMY
et al 2010) Ateacute o momento os mecanismos de resistecircncia aos cabapenecircmicos
geralmente encontrado eram a produccedilatildeo de ESBL (CTX-M) somada aacute perda de
porina (CARVALHAES et al 2010) Foi notado a partir do ano de 2008 um
aumento no nuacutemero de K pneumoniae produtoras de KPC-2 apresentando outra
forma de resistecircncia (GALES 2012)
Um estudo mostrou que o perfil do paciente colonizado ou infectado por KPC
foi de um paciente entre os 33 e os 82 anos de idade internado haacute mais de 1
semana no hospital A mortalidade geral nos uacuteltimos anos ficou em torno de 7
sendo que dos 77 pacientes estudados 32 (415) pacientes evoluiacuteram para oacutebito
evidenciando a alta morbi-mortalidade associada (ALVES A P et al 2013)
Em estudo com 2316 pacientes avaliados a populaccedilatildeo de sexo masculino foi
de 526 idade meacutedia global de 53 anos (mediana de 55 anos) permanecircncia meacutedia
de 58 dias (mediana de 3 dias) (OLIVEIRA A C et al 2010) Outros trabalhos
apresentaram ausecircncia de significacircncia entre sexoidade e o desenvolvimento de
infecccedilotildees por microrganismos resistentes (PERES-BOTA D et al 2003 COLPAN
A et al 2005 COELLO R et al 1997)
Outro estudo utilizou um total de 30 amostras sendo elas isoladas de urina
escarro secreccedilatildeo pleural ponta de cateter aspirado traqueal e hemocultura A mais
prevalente foi em urina (40) Entre as 30 cepas analisadas a maior porcentagem
foi da cepa Klebsiella pneumoniae (70) Enterobacter sp (133) Klebsiella
ozaenae (10) Escherichia coli (333) e Klebsiella oxytoca (333)
(DIENSTMANN R et al 2010) Nos Estados Unidos a enzima KPC jaacute se tornou
endecircmica Foi realizada uma pesquisa em dois hospitais de Nova York onde
testaram 602 amostras e 45 apresentaram algum mecanismo de resistecircncia
sendo apenas 33 confirmadas por biologia molecular como KPC-2 (BRATU et
al 2005)
55
Estudo sobre os tipos de ESBL feito no Japatildeo apresentou o tipo Toho-1 como
o mais prevalente nessa pesquisa Ateacute o ano de 2000 ano em que foi publicado tal
estudo este era o primeiro relatoacuterio no Japatildeo para identificar derivados de ESBLs
como tipo de SHV e TEM entre E coli e K pneumoniae Em especial o tipo SHV- 12
foi identificado com uma maior frequumlecircncia Estes resultados indicam que tipos
distintos de ESBLs que satildeo diferentes em sua especificidade de substrato e origem
geneacutetica coexistem no Japatildeo Isto mostra a importacircncia de caracterizar genoacutetipos
distintos de ESBLs e de estar em alerta continuamente para as tendecircncias de
ESBLs no Japatildeo aleacutem da necessidade de uma interpretaccedilatildeo uniforme utilizando as
diretrizes do CSLI para relatar cepas produtoras de ESBL Aleacutem da detecccedilatildeo de
ESBLs satildeo necessaacuterias mais informaccedilotildees tais como o perfil de sensibilidade
especiacutefica para diversas β-lactacircmicos e o local da infecccedilatildeo Esses fatores satildeo
essenciais para a escolha adequada de antibioacuteticos (YAGI T et al 2000)
No ano de 2004 uma pesquisa avaliou a produccedilatildeo de uma enzima de
hidroacutelise de carbapenecircmicos atraveacutes da teacutecnica de sequumlenciamento foi revelado
um novo membro da famiacutelia KPC designado KPC- 3 Pesquisadores encontraram
em um mutante de K pneumoniae uma substituiccedilatildeo de um gene associado com
resistecircncia a Imipenem mas essa substituiccedilatildeo foi considerada improvaacutevel na
contribuiccedilatildeo da resistecircncia aos carbapenecircmicos da espeacutecie estudada Aleacutem da
resistecircncia aos carbapenecircmicos estes isolados eram em sua maioria resistentes agraves
cefalosporinas penicilinas e aminoglicosiacutedeos Usando estudos de transformaccedilatildeo
conjugaccedilatildeo e hibridaccedilatildeo localizaram o alelo blaKPC em plasmiacutedeo aleacutem disso
mostraram que esse alelo tambeacutem carregava uma resistecircncia aos aminoglicosiacutedeos
A transferecircncia das enzimas KPCs foi demonstrada in vitro tanto neste como em
outros estudos pode ser que os plasmiacutedeos que fazem esta transferecircncia estavam
comeccedilando a se espalhar no ambiente cliacutenico resultando na multiresistecircncia dessas
estirpes (WOODFORD et al 2004)
O presente estudo apresentou um vieacutes quanto aos resultados dos testes de
susceptibilidade microbiana Observou-se que natildeo foi encontrado resultado deste
teste em algumas amostras o que natildeo cooperou para um estudo mais preciso
futuros estudos quanto agraves amostras e um melhor acompanhamento deste tipo de
patologia Poreacutem mesmo sem algumas amostras com este resultado disponiacutevel foi
56
confirmada a presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos
carbapenecircmicos por meio dos genes de resistecircncia blaKPC e 16S rRNA que as
amostras apresentaram em sua maioria serem portadoras Quanto aos resultados
estatiacutesticos nenhuma das variaacuteveis apresentou significacircncia estatiacutestica (p gt 005)
mostrando assim que estas variaacuteveis isoladas natildeo foram o fator determinante para
o desfecho cliacutenico de alta ou oacutebito
57
7 CONCLUSAtildeO
Os genes blaKPC e 16S rRNA foram caracterizados confirmando a a
presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos carbapenecircmicos
Houve uma maior prevalecircncia da cepa K pneumoniae e isto confirma outros
estudos que apresentam a maior prevalecircncia desta cepa em amostras com KPC
Aleacutem disso isso justifica a forma popular da K pneumoniae ser chamada de KPC
enquanto que na verdade KPC eacute uma enzima podendo estar presente em outras
cepas como Enterobacter clocae tambeacutem apresentada no presente estudo O
desfecho cliacutenico de oacutebitos maior que 50 eacute um possiacutevel indicador sobre a
necessidade de se realizar um teste raacutepido para identificaccedilatildeo de KPC visando
iniciar o mais raacutepido possiacutevel o tratamento afim de diminuir a mortalidade por esta
infecccedilatildeo
Nenhuma das variaacuteveis isoladamente estaacute relacionada ao desfecho cliacutenico
oacutebito ou alta pois natildeo apresentaram relevacircncia estatiacutestica O presente estudo
mostrou que haacute presenccedila da bacteacuteria nas amostras de pacientes do hospital
estudado podendo entatildeo afirmar que este tipo de bacteacuteria se encontra tambeacutem
presente em ambiente hospitalar O uso irracional de antimicrobiano eacute demonstrado
de forma indireta quando foi apresentado atraveacutes do Teste de Hodge Modificado
uma resistecircncia de 100 aos antibioacuteticos carbapenecircmicos Isto tambeacutem reflete na
terapecircutica sendo que pacientes portadores de bacteacuterias resistentes aos
antibioacuteticos carabepecircmicos tem uma escassa opccedilatildeo de tratamento e as opccedilotildees
apresentam problemas quanto agrave toxicidade e eficaacutecia
58
REFEREcircNCIAS
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Mecanismos
de resistecircncia bacteriana aos antimicrobianos Disponiacutevel em
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controleopas_
webmodulo3mec_sitiohtmgt Acesso em 25 de abril de 2014
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Nota teacutecnica nordm
012013 medidas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees por enterobacteacuterias
multiresistentes Acesso em 17 de abril de 2013
ALBA J et al Kinetics study of KPC-3 a plasmid-encoded class A
carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase Antimicrob Agents Chemother
Nov49(11)4760-2 2005
ALVES A P et al Nosocomial infections by KPC-producing enterobacteria in
a tertiary hospital in Southern Brazil Revista da AMRIGS Porto Alegre 57 (3) 213-
218 jul-set 2013
ALVES A et al Tipagem Geneacutetica de Microrganismos Lab De Diversidade
Microbiana Centro de Biologia Celular Dep de Biologia U de Aveiro 3810-193
Aveiro- 2003
BELL J M et Al Prevalence and significance of a negative extended-
spectrum beta-lactamase (ESBL) confirmation test result after a positive ESBL
screening test result for isolates of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae
results from the SENTRY Asia-Pacific Surveillance Program J Clin Microbiol
May45(5)1478-82 2007
BRATU S et al Detection of KPC carbapenem-hydrolyzing enzymes in
Enterobacter spp from Brooklyn New York Antimicrob Agents Chemother v 49 n
2 p 776-8 2005
59
BRATU S et al Emergence of KPC-possessing Klebsiella pneumoniae in
Brooklyn New York epidemiology and recommendations for detection Antimicrob
Agents Chemother v 49 n 7 p 3018-20 2005
BRATU S et al Rapid spread of carbapenem-resistant Klebsiella
pneumoniae in New York City Arch Intern Med v 165 p 1430-5 2005
CAMARGO C F et al Aplicaccedilatildeo das teacutecnicas de pcr e suas teacutecnicas
derivadas em diagnoacutestico molecular Disponiacutevel em
ltfileDUnB10C2BA20semestreArtigosPCR-
20CLEYTON20FLORENCIO20DE20CAMARGO20E20PAULO20ROB
ERTO20QUEIROZpdfgtgt Acesso em 08 de abril de 2014
CARVALHES C G et al Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting
carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive
results Journal of Antimicrobial Chemotherapy v 65 n2 p 249-251 2010
CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION- CDC Modified
Hodge Test for Carbapenemase Detection in Enterobacteriaceae 2004
CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE Methods for
dilutionantimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically Approved
standard M7ndashA7 7th ed CLSI Wayne PA 2011
COELLO R et al Risk factors for developing clinical infection with methicillin-
resistant Staphylococcus aureus (MRSA) amongst hospital patients initially only
colonized with MRSA J Hosp Infect 19973739-46
COLPAN A et al Evaluation of risk factors for mortality in intensive care
units A prospective study from a referral hospital in Turkey Am J Infect Control
200533(1)42-7
60
CORNAGLIA G et al Living with ESBLs Introduction Clinical Microbiology
and Infection 14 Suppl 1 1-2 2008
COTRIM E R et al Klebsiella pneumoniae carbapenemase ndash KPC em
Enterobacteriaceae o desafio das bacteacuterias multirresistentes Poacutes em revista do
centro universitaacuterio Newton Paiva 12012 - ediccedilatildeo 5 - issn 2176 7785
DESHPANDE L M et al Occurrence and characterization of
carbapenemase-producing Enterobacteacuteriaceae report from the SENTRY
Antimicrobial Surveillance Program (2000-2004) Microb Drug Resist 12(4)223-30
2006
DIAS D J A Estudos dos principais mecanismos de resistecircncia aos
antibioacuteticos β-lactacircmicos em bacteacuterias patogecircnicas gram negativas 2009 100 f
Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Geneacutetica Molecular e Biomedicina) ndash Faculdade de
Ciecircncias e Tecnologia Universidade de Nova Lisboa Lisboa
DIENSTMANN R et al Avaliaccedilatildeo fenotiacutepica da enzima Klebsiella
pneumoniae carbapenemase (KPC) em Enterobacteriaceae de ambiente hospitalar
J Bras Patol Med Lab v 46 n 1 p 23-27 fevereiro 2010
ENDIMIAMI A et al Emergence of blaKPC-containing Klebsiella
pneumoniae in a long-term acute care hospital a new challenge to our healthcare J
Antimicrob Chemother 64 1102-1110 Nov 2009
FALAGAS M E et al Extended-spectrum beta-lactamase producing
organisms The Journal of Hospital Infection 73 (4) pp 345-54 2009
FONTANA C et al Emergence of KPC-producing Klebsiella pneumoniae in
Italy BMC Rev Notes 3 40 2010
61
GALES A C et al Antimicrobial resistance among Gram-negative bacilli
isolated from Latin America results from Sentry Antimicrobial Surveillance Program
(Latin America 2008-2010) Diagnostic Microbiology and Infectious Disease v 3 n
4 p 354 -360 2012
GUPTA N et al Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Epidemiology
and Prevention HEALTHCARE EPIDEMIOLOGY Clinical Infectious Diseases
201153(1)60ndash67 Published by Oxford University Press on behalf of the Infectious
Diseases Society of America 2011
HARBOTTLE H et al Genetics of antimicrobial resistance Anim Biotechnol
n17 p111-124 2006
HENRIQUE W N et al RESISTEcircNCIA BACTERIANA Uniatildeo das
Faculdades Alfredo NasserInstituto de Ciecircncias da Sauacutede Disponiacutevel em lt
httpwwwfaculdadealfredonasseredubrfilespesquisaposter20HENRIQUE20
Wilker20Natividade20SANTIAGO20Silvania20CAVALCANTI20DSP
20ResistC3AAncia20Bacterianapdfgt Acesso em 17 marccedilo 2014
HULSCHER M E J I et al Antibiotic prescribing in hospital a social and
behavioral scientific approach The Lancet Infectious Diaseases v 10 n 3 p 167-
165 2010
KIDWAI M SAPRA P BHUSHAN KR Synthetic strategies and medicinal
properties of beta-lactams Curr Med Chem 1999 695-215
KUMARASAMY K K et al Emergence of a new antibiotic resistance
mechanism in India Pakistan and the UK a molecular biological and
epidemiological stuy The Lancet Infectious Diseases v10 n 9 p 597- 602 2010
LINCOPAN N et al Enterobacteacuteria producing extended-spectrum β-
lacatamases and IMP-1 Metalo-β-lactamases isolated from Brazilian hospitals J Med
62
Microbiol 7 1-3 2006
LINCOPAN N et al First Isolation of Metalo-β-Lacatamase-Producing
Multiresistant Klebsiella pneumoniae from a patient in Brazil J Clin Microbiol 43(1)
516-519 2005
LIVERMORE D M et al What remains against carbapenem- resistant
Enterobacteriaceae Evaluation of choramphenicol ciprofloxacin colistina
fosfomycin minocycline nitrofurantoin temocilin and tigecycline International
Journal of Antimicrobial Agents v 37 n 5 p 415- 459 2011
LIVERMORE D M Fourten years in resistance International Journal of
Antimicrobial Agents v 39 283- 294 2012
LIVERMORE D M Bacterial resistance to carbapenems Adv Exp Med Biol
1995 39025-47
LIVERMORE D M Bacterial resistance origins epidemiology and impact
Clin Infect Dis 36S11-S23 2003
LIVERMORE D M et al Carbapenemases a problem in waiting Curr
Opin Microbiol 2000 3489-95
LU et al Universal pcr for common bacterial pathogens J CLIN
MICROBIOL VOL 38 2000
LU et al Use of PCR with Universal Primers and Restriction Endonuclease
Digestions for Detection and Identification of Common Bacterial Pathogens in
Cerebrospinal Fluid Journal of Clinical Microbiology June 2000 p 2076ndash2080
MARSCHALL J Met al Presence of the KPC Carbapenemase Gene in
Enterobacteriaceae Causing Bacteremia and Its Correlation with In Vitro
Carbapenem Susceptibility J Clin Microbiol 47 239-241 Jan 2009
63
MARTINS WMBS et al Prevalecircncia do gene blaKPC em isolados cliacutenicos
de Enterobacteriaceae e natildeo fermentadores encontrados em amostras clinicas em
um hospital universitaacuterio do Recife X Jornada de ensino pesquisa e extensatildeo ndash
JEPEX 2010 ndash UFRPE Recife 18 a 22 de outubro
MENDES C A C et al Polimixinas Revisatildeo com ecircnfase na sua
nefrotoxicidade Rev Assoc Med Bras 2009 55(6) 752-9
MOHR J F 3rd Update on the efficacy and tolerability of meropenem in the
treatment of serious bacteacuterial infections Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S41-51
2008
MONTEIRO J et al First report of KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae
strains in Brazil Antimicrob Agents Chemother Jan53(1)333-4 2009
MOREIRA V C et al Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia a antibioacuteticos
Disponiacutevel em
lthttpwwwcpglsucgbr6mostraartigosSAUDEVANESSA20CARVALHO20M
OREIRApdfgt Acesso em 21 marccedilo 2014
NETIKUL T et al Emergence of novel blaKPC-12 and blaKPC-13 variants in
carbapenem non-susceptible Enterobacter cloacae a first report of blaKPC gene in
Thailand European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases May
S372 2011
NETO V A et al Antibioacuteticos na praacutetica Meacutedica 6ordf Ediccedilatildeo Editorial
SarverSP Brasil 2007
NICOLAU D P Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of
meropenem Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S32-40 2008
64
OLIVEIRA A C et al Resistecircncia bacteriana e mortalidade em um centro de
terapia intensiva Rev Latino-Am Enfermagem nov-dez 2010
PAAUW A et al Failure to control an outbreak of qnrA 1-positive multidrug-
resistant Enterobacter clocae despite adequate implementation of recommended
infection control measures Journal of Clinical Microbiology v 45 n 5 p 1420-1425
2007
PATERSON D L et al Extended-Spectrum Beta-Lactamases a Clinical
Update Clinical Microbiology Reviews v 18 p 657-686 2005
PEIRANO G et al Carbapenem-hydrolysing beta-lactamase KPC-2 in
Klebsiella pneumonia isolated in Rio de Janeiro Brazil J Antimicrob Chemother Nov
20 2009
PERES-BOTA D et al Are infections due to resistant pathogens associated
with worse outcome in critically ill patients J Infect 200347(4)307-16
PIDDOCK L J V Clinically relevant chromosomally encoded multidrug
resistance effl ux pumps in bacterial Clin Microbiol Rev n19 p382-402 2006
PITOUT J D D et al Emergence of Enterobacteriaceae producing
extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) in the community J Antimicrob
Chemother May 56 2005
POSSEBON M I et al Resistecircncia bacteriana aos carbapenecircmicos
Bacterial resitence to carbapenems RBM rev bras med60(6)378380-378-382
jun 2003
QUEENAN A M et al Carbapenemases the versatile beta-lactamases
Clin Microbiol Rev Jul20(3)440-58 2007
65
RHOMBERG P R et al Summary trends for the meropenem yearly
susceptibility test information collection program a 10- year experience in the United
States (1999-2008) Diagnostic Microbiology and Infectiois Disease v 65 n4 p
414-426 2009
ROBLEDO I E et al Detection of KPC in Acinetobacter spp in Puerto Rico
J Antimicrob Agents Chemother 54 1354-1357 Mar 2010
ROGERS B A et al Country-to-country transfer os patients and the risk of
multi-resistant bacterial infection Clinical Infectious Disease v53 n1 p49- 56
2011
SHAH A A et al Characteristics epidemiology and clinicalimportance of
emerging strains of Gram-negative bacilli producing extended-spectrum
betalactamases Research in Microbiology v 155 p 409-421 2004
TURNER P J Extended- Spectrum Beta-Lactamases Clinical Infectious
Diseases v 41 p 273-275 2005
WOLTER D J et al Phenotypic and Enzymatic Comparative Analysis
between the Novel KPC variant KPC-5 and Its Evolutionary Variants KPC-2 and
KPC-4 Antimicrob Agents Chemother Nov 17 2008
WOODFORD N et al Carbapenemases of Chryseobacterium
(Flavobacterium) meningosepticum distribution of blaB and characterization of a
novel Metalo-beta-lactamase gene blaB3 in the type strain NCTC 10016
Antimicrob Agents Chemother Jun44(6)1448-52 2000
WOODFORF N Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in
India Pakistan and the UK a molecular biological and epidemiological study The
Lancet Infectious Diseases v 10 n 9 p 597-602 2010
66
WOODFORD et al Outbreak of Klebsiella pneumoniae Producing a New
Carbapenem- Hydrolyzing Class A β-Lactamase KPC-3 in a New York Medical
Center Antimicrobial agents and chemotherapy Dec 2004 p 4793ndash4799 Vol 48
No 12
YAGI T et al A preliminary survey of extended-spectrum β-lactamases
(ESBLs) in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Japan
FEMS Microbiology Letters 184 (2000) 53-56
YIGIT H et al Novel carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase KPC-1 from
a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumonia J Antimicrob Agents
Chemother 45 (4) 1151-1161 (2001)
ZAVASCKI A P et al KPC-2- producing Enterobacter cloacae in two cities
from Southern Brazil Int J Antimicrob Agents Apr 28 2009
ZHANEL G G et al Comparative review of the carbapenecircmicos Drugs
67(7)1027-52 2007
67
ANEXOS
Sequumlecircncia do oligo blaKPC
Query 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
Query 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
Query 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
68
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
Query 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
Query 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
69
Query 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
Query 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
Query 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
70
Sbjct 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
Query 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
Query 541
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GCGATAC 600
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
Query 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
71
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
Query 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
Query 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
72
Query 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
Query 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
Query 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
73
Sbjct 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
Query 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
Query 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
Query 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
74
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
Query 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
Query 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
75
Query 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
Query 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
||||
Sbjct 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
LOCUS AF297554 1377 bp
DNA linear BCT 26-MAR-2001
DEFINITION Klebsiella pneumoniae carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
gene complete cds
ACCESSION AF297554
VERSION AF2975541 GI10121874
76
KEYWORDS
SOURCE Klebsiella pneumoniae
ORGANISM Klebsiella pneumoniae
Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Enterobacteriaceae Klebsiella
REFERENCE 1 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH QueenanAM
AndersonGJ Domenech-SanchezA
BiddleJW StewardCD
AlbertiS BushK and TenoverFC
TITLE Novel carbapenem-hydrolyzing beta-
lactamase KPC-1 from a
carbapenem-resistant strain of
Klebsiella pneumoniae
JOURNAL Antimicrob Agents Chemother 45 (4)
1151-1161 (2001)
PUBMED 11257029
REFERENCE 2 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH AndersonGJ and
TenoverFC
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (19-AUG-2000) Nosocomial
Pathogens Laboratory Branch
Centers for Disease Control and
Prevention 1600 Clifton Rd MS
G08 Atlanta GA 30333 USA
FEATURES LocationQualifiers
77
source 11377
organism=Klebsiella
pneumoniae
mol_type=genomic DNA
db_xref=taxon573
-35_signal 5560
-10_signal 7883
mRNA 921012
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
RBS 117122
CDS 1311012
note=blaKPC-1
codon_start=1
transl_table=11
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
protein_id=AAG134101
db_xref=GI10121875
translation=MSLYRRLVLLSCLSWPLAGFSATALTNLVAEPFAKLEQD
FGGSI
GVYAMDTGSGATVSYRAEERFPLCSSFKGFLAAAVLARSQQQAGLLDTPIRYG
KNALV
PWSPISEKYLTTGMTVAELSAAAVQYSDNAAANLLLKELGGPAGLTAFMRSIG
DTTFR
78
LDRWELELNSAIPSDARDTSSPRAVTESLQKLTLGSALAAPQRQQFVDWLKGN
TTGNH
RIRAAVPADWAVGDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTRAPNKDDK
HSEAV
IAAAARLALEGLGVNGQ
ORIGIN
1 cggggcagtt acagccgtta cagcctctgg
agagggagcg gcttgccgct cggtgataat
61 cccagctgta gcggcctgat tacatccggc
cgctacacct agctccacct tcaaacaagg
121 aatatcgttg atgtcactgt atcgccgtct
agttctgctg tcttgtctct catggccgct
181 ggctggcttt tctgccaccg cgctgaccaa
cctcgtcgcg gaaccattcg ctaaactcga
241 acaggacttt ggcggctcca tcggtgtgta
cgcgatggat accggctcag gcgcaactgt
301 aagttaccgc gctgaggagc gcttcccact
gtgcagctca ttcaagggct ttcttgctgc
361 cgctgtgctg gctcgcagcc agcagcaggc
cggcttgctg gacacaccca tccgttacgg
421 caaaaatgcg ctggttccgt ggtcacccat
ctcggaaaaa tatctgacaa caggcatgac
481 ggtggcggag ctgtccgcgg ccgccgtgca
atacagtgat aacgccgccg ccaatttgtt
541 gctgaaggag ttgggcggcc cggccgggct
gacggccttc atgcgctcta tcggcgatac
79
601 cacgttccgt ctggaccgct gggagctgga
gctgaactcc gccatcccaa gcgatgcgcg
661 cgatacctca tcgccgcgcg ccgtgacgga
aagcttacaa aaactgacac tgggctctgc
721 actggctgcg ccgcagcggc agcagtttgt
tgattggcta aagggaaaca cgaccggcaa
781 ccaccgcatc cgcgcggcgg tgccggcaga
ctgggcagtc ggagacaaaa ccggaacctg
841 cggagtgtat ggcacggcaa atgactatgc
cgtcgtctgg cccactgggc gcgcacctat
901 tgtgttggcc gtctacaccc gggcgcctaa
caaggatgac aagcacagcg aggccgtcat
961 cgccgctgcg gctagactcg cgctcgaggg
attgggcgtc aacgggcagt aaggctctga
1021 aaatcatcta ttggcccacc accgccgccc
ttgcgggcgg catggattac caaccactgt
1081 cacatttagg ctaggagtct gcgcggcaga
gccgtgtgac cggttttctg tagagcactg
1141 acgatggcgg cggcgctctc tgcaattggc
aaggcgtcgg cgccaaggat accaatcttg
1201 cggcgcgcgg cgtgttatga cgactggggt
gcatttgagc cgccccattt aaccttcgcc
1261 ctcacagata cgccattcgc ctcaaattta
gcgccatgca gacgagcttc cactcggctt
1321 gcaccttgtc caggcccctc atgctgaact
gacgcaatcc catcaccgcc ttgatca
80
46
Segundo Lu et al (2000) a digestatildeo com a enzima HaeIII deste amplicons de
16S rRNA devolveriam bandas com perfis entre 150 a 200 pb No gel abaixo eacute
possiacutevel evidenciar que este perfil ocorreu com o predomiacutenio de bandas na altura
de 200pb
Figura 10 Gel de agarose a 2 da digestatildeo do amplicon do gene 16S
rRNA das amostras com a enzima HaeIII evidenciando diversos fragmentos
proacuteximos a 200 pb A banda amplificada corresponde a uma regiatildeo ribossomal
de 996 pb Marcador = Marcador de 100pb CN= controle negativo
5 2 Anaacutelises epidemioloacutegicas
5 2 1 Sexo
No total foram detectados 17 isolados de KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 onde a maior a prevalecircncia foi
detecatada em amostras de pacientes do sexo masculino (53) do que no sexo
feminino (47)
47
Figura 11 Isolado de KPC segundo sexo dos 17 pacientes investigados
no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 2 Desfecho cliacutenico
Em 17 isolados de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo
de 2010 aacute 2011 a porcentagem de pacientes que foram a oacutebito (59) foi maior que
a de pacientes que tiverm alta (41)
Figura 12 Isolado de KPC segundo desfecho cliacutenico dos 17 pacientes
investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
48
5 2 3 Local da coleta
Dos 17 episoacutedios detectados de infecccedilatildeo por KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 a infecccedilatildeo em swab retalfoi mais
frequente (47) seguida de ponta de cateacuteter (18) e secreccedilatildeo traqueal (12)
Figura 13 Isolados de KPC segundo local da coleta da amostra nos 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 4 Microorganismo
O microorganismo mais encontrado foi a Klebsiella pneumoniae (82)
seguida da Enterobacter clocae (12) e Serratia marcescens (6) dos 17 isolados
de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 Isto afirma o
fato de a sigla KPC ser utilizada de forma errocircnea aacute Klebsiella pneumoniae visto
que a evidecircncia dela eacute maior em relaccedilatildeo as outras cepas
49
Figura 14 Isolado de KPC segundo microrganismo encontrado em 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 5 Relaccedilotildees variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana e desfecho
cliacutenico
Tabela 6 ndash Distribuiccedilatildeo do perfil geneacutetico sexo coleta tipificaccedilatildeo de
microrganismos e anaacutelise da resistecircncia bacteriana segundo o desfecho
cliacutenico Brasiacutelia-DF 2010 a 2011
Variaacutevel Resultado
Desfecho
Alta Oacutebito
N N P
Gene 16S rRNA Positivo 7 1000 10 1000
NA Gene blaKPC Positivo 6 857 10 1000
Negativo 1 143 0 00 0218 Sexo Feminino 2 286 6 600
Masculino 5 714 4 400 0201 Local da coleta Fundo saco de
Douglas 1 143 0 00
Hemocultura 0 00 1 100 0463 Ponta de cateter 1 143 2 200
Sec TraquealBrocircnquica
0 00 1 100
50
Secreccedilatildeo traqueal 2 286 0 00
Swab retal 3 429 5 500
Urina 0 00 1 100
Microrganismo Enterobacter cloacae (KPC)
1 143 1 100
Klebsiella pneumoniae
6 857 8 800
0416 Serratia
marcescens 0 00 1 100
Teste de Hodge Hodge positivo 7 1000 10 1000
NA Amicacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 1 100 0848 resistente 0 00 1 100
sensiacutevel 2 286 3 300
Amoxicilina Aacutecido Clavulacircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Ampicilina Sulbactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ampicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Aztreonan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefazolina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Cefoperazona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Cefotaxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefoxitina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0509 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 2 286 4 400
Ceftazidima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cetriaxona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 3 429 5 500 0772 Cefalotina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ciprofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772
51
resistente 3 429 5 500
Claritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Clindamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Eritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Gentamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0942 resistente 2 286 3 300
sensiacutevel 1 143 2 200
Imipenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 0 00 2 200 0193 Resistente 1 143 3 300
sensiacutevel 2 286 0 00
Nitrofurantoiacutena sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Norfloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Oxacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Penicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Piperacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Rifampicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tetraciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Ticarcilina Aacutecido Clavulocircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0688 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 3 429 4 400
Tobramicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Trimetoprima Sulfametoxazol
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0112 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 2 286 0 00
Vancomicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tigeciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediario 0 00 1 100 0211 natildeo testado 1 143 4 400
resistente 2 286 0 00
52
Cefepime sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefuroxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Levofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Piperacilina Tazobactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Ertapenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Meropenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0223 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 1 143 0 00
Cefotetan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 sensiacutevel 0 00 1 100
Gemifloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 7 700 0585 natildeo testado 3 429 3 300
Desfecho
Alta Oacutebito
Meacutedia Erro
padratildeo Meacutedia Erro
padratildeo p
Idade 58 9 59 5 0991
Tempo Internaccedilatildeo (dias)
50 13 46 12 0571
n= 17 p(lt 005) NA natildeo se aplica
53
6 DISCUSSAtildeO
Nos uacuteltimos anos houve um aumento na incidecircncia de bacteacuterias
multirresistentes aos antimicrobianos no ambiente hospitalar tornando isto um
problema mundial de sauacutede puacuteblica (HULSCHER et al 2010) Quando se trata
principalmente de bacilos Gram negativos a frequumlecircncia destas bacteacuterias eacute ainda
maior em paiacuteses da Ameacuterica Latina quando comparada a paiacuteses desenvolvidos
(GALES etal 2012)
De acordo com dados do ldquoMeropenem Yearly Susceptibility Test Information
Collectionrdquo (MYSTIC) ocorreu nos Estados Unidos um aumento na susceptibilidade
de K pneumoniae nos uacuteltimos anos graccedilas a praacuteticas de controle de disseminaccedilatildeo
de amostras resistentes(RHOMBERG P R et al 2009) O aumento crescente da
prevalecircncia destes microrganismos foi proporcional ao aumento da dependecircncia do
uso de antibioacuteticos carbapenecircmicos considerados como a opccedilatildeo terapecircutica para o
tratamento de infecccedilotildees por bacilos Gram negativos multi-resistentes (LIVERMORE
2012) Isto afeta diretamente as opccedilotildees de tratamento sobrando poucas alternativas
para a terapecircutica que incluem colistina (polimixina E) e tigeciclina que apresentam
respectivamente problemas em termos de toxicidade e eficaacutecia (LIVERMORE et
al 2011) Um dos efeitos adversos mais importantes das poliminas B e E por
exemplo satildeo a neurotoxicidade e nefrotoxicidade (MENDES C A C et al2009 )
Devido agrave resistecircncia ser usualmente de natureza plasmidial e portanto de
maior disseminaccedilatildeo especialmente quando carreadas por K pneumoniae
microrganismo com uma notoacuteria capacidade para acumular e transferir plasmiacutedeos
com determinantes para resistecircncia o nuacutemero de casos detectados pelo
fenoacutetipogenoacutetipo blaKPC eacute bastante preocupante (MONTEIRO et al 2009)
Comparada com outras bacteacuterias hospitalares a transmissatildeo de clones
multirresistentes de K pneumoniae eacute maior e podem natildeo ser controladas pelos
meacutetodos de controle de infecccedilatildeo hospitalar (PAAUW et al 2007) A forma
plasmidial para transferecircncia da resistecircncia adicionada a este grande potencial para
disseminaccedilatildeo de clones resistentes eacute preocupante visto que apoacutes surtos muitas
vezes pode se tornar endecircmica Jaacute eacute uma realidade a disseminaccedilatildeo desta bacteacuteria
54
entre pacientes hospitais paiacuteses e ateacute mesmo continentes (WOODFORF et al
2010 ROGERS et al 2011)
As chances de surtos satildeo maiores em paiacuteses com poucos recursos devido agrave
maior carecircncia de praacuteticas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees hospitalares e o
uso irracional de antimicrobianos de forma empiacuterica e inadequada (KUMARASAMY
et al 2010) Ateacute o momento os mecanismos de resistecircncia aos cabapenecircmicos
geralmente encontrado eram a produccedilatildeo de ESBL (CTX-M) somada aacute perda de
porina (CARVALHAES et al 2010) Foi notado a partir do ano de 2008 um
aumento no nuacutemero de K pneumoniae produtoras de KPC-2 apresentando outra
forma de resistecircncia (GALES 2012)
Um estudo mostrou que o perfil do paciente colonizado ou infectado por KPC
foi de um paciente entre os 33 e os 82 anos de idade internado haacute mais de 1
semana no hospital A mortalidade geral nos uacuteltimos anos ficou em torno de 7
sendo que dos 77 pacientes estudados 32 (415) pacientes evoluiacuteram para oacutebito
evidenciando a alta morbi-mortalidade associada (ALVES A P et al 2013)
Em estudo com 2316 pacientes avaliados a populaccedilatildeo de sexo masculino foi
de 526 idade meacutedia global de 53 anos (mediana de 55 anos) permanecircncia meacutedia
de 58 dias (mediana de 3 dias) (OLIVEIRA A C et al 2010) Outros trabalhos
apresentaram ausecircncia de significacircncia entre sexoidade e o desenvolvimento de
infecccedilotildees por microrganismos resistentes (PERES-BOTA D et al 2003 COLPAN
A et al 2005 COELLO R et al 1997)
Outro estudo utilizou um total de 30 amostras sendo elas isoladas de urina
escarro secreccedilatildeo pleural ponta de cateter aspirado traqueal e hemocultura A mais
prevalente foi em urina (40) Entre as 30 cepas analisadas a maior porcentagem
foi da cepa Klebsiella pneumoniae (70) Enterobacter sp (133) Klebsiella
ozaenae (10) Escherichia coli (333) e Klebsiella oxytoca (333)
(DIENSTMANN R et al 2010) Nos Estados Unidos a enzima KPC jaacute se tornou
endecircmica Foi realizada uma pesquisa em dois hospitais de Nova York onde
testaram 602 amostras e 45 apresentaram algum mecanismo de resistecircncia
sendo apenas 33 confirmadas por biologia molecular como KPC-2 (BRATU et
al 2005)
55
Estudo sobre os tipos de ESBL feito no Japatildeo apresentou o tipo Toho-1 como
o mais prevalente nessa pesquisa Ateacute o ano de 2000 ano em que foi publicado tal
estudo este era o primeiro relatoacuterio no Japatildeo para identificar derivados de ESBLs
como tipo de SHV e TEM entre E coli e K pneumoniae Em especial o tipo SHV- 12
foi identificado com uma maior frequumlecircncia Estes resultados indicam que tipos
distintos de ESBLs que satildeo diferentes em sua especificidade de substrato e origem
geneacutetica coexistem no Japatildeo Isto mostra a importacircncia de caracterizar genoacutetipos
distintos de ESBLs e de estar em alerta continuamente para as tendecircncias de
ESBLs no Japatildeo aleacutem da necessidade de uma interpretaccedilatildeo uniforme utilizando as
diretrizes do CSLI para relatar cepas produtoras de ESBL Aleacutem da detecccedilatildeo de
ESBLs satildeo necessaacuterias mais informaccedilotildees tais como o perfil de sensibilidade
especiacutefica para diversas β-lactacircmicos e o local da infecccedilatildeo Esses fatores satildeo
essenciais para a escolha adequada de antibioacuteticos (YAGI T et al 2000)
No ano de 2004 uma pesquisa avaliou a produccedilatildeo de uma enzima de
hidroacutelise de carbapenecircmicos atraveacutes da teacutecnica de sequumlenciamento foi revelado
um novo membro da famiacutelia KPC designado KPC- 3 Pesquisadores encontraram
em um mutante de K pneumoniae uma substituiccedilatildeo de um gene associado com
resistecircncia a Imipenem mas essa substituiccedilatildeo foi considerada improvaacutevel na
contribuiccedilatildeo da resistecircncia aos carbapenecircmicos da espeacutecie estudada Aleacutem da
resistecircncia aos carbapenecircmicos estes isolados eram em sua maioria resistentes agraves
cefalosporinas penicilinas e aminoglicosiacutedeos Usando estudos de transformaccedilatildeo
conjugaccedilatildeo e hibridaccedilatildeo localizaram o alelo blaKPC em plasmiacutedeo aleacutem disso
mostraram que esse alelo tambeacutem carregava uma resistecircncia aos aminoglicosiacutedeos
A transferecircncia das enzimas KPCs foi demonstrada in vitro tanto neste como em
outros estudos pode ser que os plasmiacutedeos que fazem esta transferecircncia estavam
comeccedilando a se espalhar no ambiente cliacutenico resultando na multiresistecircncia dessas
estirpes (WOODFORD et al 2004)
O presente estudo apresentou um vieacutes quanto aos resultados dos testes de
susceptibilidade microbiana Observou-se que natildeo foi encontrado resultado deste
teste em algumas amostras o que natildeo cooperou para um estudo mais preciso
futuros estudos quanto agraves amostras e um melhor acompanhamento deste tipo de
patologia Poreacutem mesmo sem algumas amostras com este resultado disponiacutevel foi
56
confirmada a presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos
carbapenecircmicos por meio dos genes de resistecircncia blaKPC e 16S rRNA que as
amostras apresentaram em sua maioria serem portadoras Quanto aos resultados
estatiacutesticos nenhuma das variaacuteveis apresentou significacircncia estatiacutestica (p gt 005)
mostrando assim que estas variaacuteveis isoladas natildeo foram o fator determinante para
o desfecho cliacutenico de alta ou oacutebito
57
7 CONCLUSAtildeO
Os genes blaKPC e 16S rRNA foram caracterizados confirmando a a
presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos carbapenecircmicos
Houve uma maior prevalecircncia da cepa K pneumoniae e isto confirma outros
estudos que apresentam a maior prevalecircncia desta cepa em amostras com KPC
Aleacutem disso isso justifica a forma popular da K pneumoniae ser chamada de KPC
enquanto que na verdade KPC eacute uma enzima podendo estar presente em outras
cepas como Enterobacter clocae tambeacutem apresentada no presente estudo O
desfecho cliacutenico de oacutebitos maior que 50 eacute um possiacutevel indicador sobre a
necessidade de se realizar um teste raacutepido para identificaccedilatildeo de KPC visando
iniciar o mais raacutepido possiacutevel o tratamento afim de diminuir a mortalidade por esta
infecccedilatildeo
Nenhuma das variaacuteveis isoladamente estaacute relacionada ao desfecho cliacutenico
oacutebito ou alta pois natildeo apresentaram relevacircncia estatiacutestica O presente estudo
mostrou que haacute presenccedila da bacteacuteria nas amostras de pacientes do hospital
estudado podendo entatildeo afirmar que este tipo de bacteacuteria se encontra tambeacutem
presente em ambiente hospitalar O uso irracional de antimicrobiano eacute demonstrado
de forma indireta quando foi apresentado atraveacutes do Teste de Hodge Modificado
uma resistecircncia de 100 aos antibioacuteticos carbapenecircmicos Isto tambeacutem reflete na
terapecircutica sendo que pacientes portadores de bacteacuterias resistentes aos
antibioacuteticos carabepecircmicos tem uma escassa opccedilatildeo de tratamento e as opccedilotildees
apresentam problemas quanto agrave toxicidade e eficaacutecia
58
REFEREcircNCIAS
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Mecanismos
de resistecircncia bacteriana aos antimicrobianos Disponiacutevel em
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controleopas_
webmodulo3mec_sitiohtmgt Acesso em 25 de abril de 2014
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Nota teacutecnica nordm
012013 medidas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees por enterobacteacuterias
multiresistentes Acesso em 17 de abril de 2013
ALBA J et al Kinetics study of KPC-3 a plasmid-encoded class A
carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase Antimicrob Agents Chemother
Nov49(11)4760-2 2005
ALVES A P et al Nosocomial infections by KPC-producing enterobacteria in
a tertiary hospital in Southern Brazil Revista da AMRIGS Porto Alegre 57 (3) 213-
218 jul-set 2013
ALVES A et al Tipagem Geneacutetica de Microrganismos Lab De Diversidade
Microbiana Centro de Biologia Celular Dep de Biologia U de Aveiro 3810-193
Aveiro- 2003
BELL J M et Al Prevalence and significance of a negative extended-
spectrum beta-lactamase (ESBL) confirmation test result after a positive ESBL
screening test result for isolates of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae
results from the SENTRY Asia-Pacific Surveillance Program J Clin Microbiol
May45(5)1478-82 2007
BRATU S et al Detection of KPC carbapenem-hydrolyzing enzymes in
Enterobacter spp from Brooklyn New York Antimicrob Agents Chemother v 49 n
2 p 776-8 2005
59
BRATU S et al Emergence of KPC-possessing Klebsiella pneumoniae in
Brooklyn New York epidemiology and recommendations for detection Antimicrob
Agents Chemother v 49 n 7 p 3018-20 2005
BRATU S et al Rapid spread of carbapenem-resistant Klebsiella
pneumoniae in New York City Arch Intern Med v 165 p 1430-5 2005
CAMARGO C F et al Aplicaccedilatildeo das teacutecnicas de pcr e suas teacutecnicas
derivadas em diagnoacutestico molecular Disponiacutevel em
ltfileDUnB10C2BA20semestreArtigosPCR-
20CLEYTON20FLORENCIO20DE20CAMARGO20E20PAULO20ROB
ERTO20QUEIROZpdfgtgt Acesso em 08 de abril de 2014
CARVALHES C G et al Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting
carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive
results Journal of Antimicrobial Chemotherapy v 65 n2 p 249-251 2010
CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION- CDC Modified
Hodge Test for Carbapenemase Detection in Enterobacteriaceae 2004
CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE Methods for
dilutionantimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically Approved
standard M7ndashA7 7th ed CLSI Wayne PA 2011
COELLO R et al Risk factors for developing clinical infection with methicillin-
resistant Staphylococcus aureus (MRSA) amongst hospital patients initially only
colonized with MRSA J Hosp Infect 19973739-46
COLPAN A et al Evaluation of risk factors for mortality in intensive care
units A prospective study from a referral hospital in Turkey Am J Infect Control
200533(1)42-7
60
CORNAGLIA G et al Living with ESBLs Introduction Clinical Microbiology
and Infection 14 Suppl 1 1-2 2008
COTRIM E R et al Klebsiella pneumoniae carbapenemase ndash KPC em
Enterobacteriaceae o desafio das bacteacuterias multirresistentes Poacutes em revista do
centro universitaacuterio Newton Paiva 12012 - ediccedilatildeo 5 - issn 2176 7785
DESHPANDE L M et al Occurrence and characterization of
carbapenemase-producing Enterobacteacuteriaceae report from the SENTRY
Antimicrobial Surveillance Program (2000-2004) Microb Drug Resist 12(4)223-30
2006
DIAS D J A Estudos dos principais mecanismos de resistecircncia aos
antibioacuteticos β-lactacircmicos em bacteacuterias patogecircnicas gram negativas 2009 100 f
Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Geneacutetica Molecular e Biomedicina) ndash Faculdade de
Ciecircncias e Tecnologia Universidade de Nova Lisboa Lisboa
DIENSTMANN R et al Avaliaccedilatildeo fenotiacutepica da enzima Klebsiella
pneumoniae carbapenemase (KPC) em Enterobacteriaceae de ambiente hospitalar
J Bras Patol Med Lab v 46 n 1 p 23-27 fevereiro 2010
ENDIMIAMI A et al Emergence of blaKPC-containing Klebsiella
pneumoniae in a long-term acute care hospital a new challenge to our healthcare J
Antimicrob Chemother 64 1102-1110 Nov 2009
FALAGAS M E et al Extended-spectrum beta-lactamase producing
organisms The Journal of Hospital Infection 73 (4) pp 345-54 2009
FONTANA C et al Emergence of KPC-producing Klebsiella pneumoniae in
Italy BMC Rev Notes 3 40 2010
61
GALES A C et al Antimicrobial resistance among Gram-negative bacilli
isolated from Latin America results from Sentry Antimicrobial Surveillance Program
(Latin America 2008-2010) Diagnostic Microbiology and Infectious Disease v 3 n
4 p 354 -360 2012
GUPTA N et al Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Epidemiology
and Prevention HEALTHCARE EPIDEMIOLOGY Clinical Infectious Diseases
201153(1)60ndash67 Published by Oxford University Press on behalf of the Infectious
Diseases Society of America 2011
HARBOTTLE H et al Genetics of antimicrobial resistance Anim Biotechnol
n17 p111-124 2006
HENRIQUE W N et al RESISTEcircNCIA BACTERIANA Uniatildeo das
Faculdades Alfredo NasserInstituto de Ciecircncias da Sauacutede Disponiacutevel em lt
httpwwwfaculdadealfredonasseredubrfilespesquisaposter20HENRIQUE20
Wilker20Natividade20SANTIAGO20Silvania20CAVALCANTI20DSP
20ResistC3AAncia20Bacterianapdfgt Acesso em 17 marccedilo 2014
HULSCHER M E J I et al Antibiotic prescribing in hospital a social and
behavioral scientific approach The Lancet Infectious Diaseases v 10 n 3 p 167-
165 2010
KIDWAI M SAPRA P BHUSHAN KR Synthetic strategies and medicinal
properties of beta-lactams Curr Med Chem 1999 695-215
KUMARASAMY K K et al Emergence of a new antibiotic resistance
mechanism in India Pakistan and the UK a molecular biological and
epidemiological stuy The Lancet Infectious Diseases v10 n 9 p 597- 602 2010
LINCOPAN N et al Enterobacteacuteria producing extended-spectrum β-
lacatamases and IMP-1 Metalo-β-lactamases isolated from Brazilian hospitals J Med
62
Microbiol 7 1-3 2006
LINCOPAN N et al First Isolation of Metalo-β-Lacatamase-Producing
Multiresistant Klebsiella pneumoniae from a patient in Brazil J Clin Microbiol 43(1)
516-519 2005
LIVERMORE D M et al What remains against carbapenem- resistant
Enterobacteriaceae Evaluation of choramphenicol ciprofloxacin colistina
fosfomycin minocycline nitrofurantoin temocilin and tigecycline International
Journal of Antimicrobial Agents v 37 n 5 p 415- 459 2011
LIVERMORE D M Fourten years in resistance International Journal of
Antimicrobial Agents v 39 283- 294 2012
LIVERMORE D M Bacterial resistance to carbapenems Adv Exp Med Biol
1995 39025-47
LIVERMORE D M Bacterial resistance origins epidemiology and impact
Clin Infect Dis 36S11-S23 2003
LIVERMORE D M et al Carbapenemases a problem in waiting Curr
Opin Microbiol 2000 3489-95
LU et al Universal pcr for common bacterial pathogens J CLIN
MICROBIOL VOL 38 2000
LU et al Use of PCR with Universal Primers and Restriction Endonuclease
Digestions for Detection and Identification of Common Bacterial Pathogens in
Cerebrospinal Fluid Journal of Clinical Microbiology June 2000 p 2076ndash2080
MARSCHALL J Met al Presence of the KPC Carbapenemase Gene in
Enterobacteriaceae Causing Bacteremia and Its Correlation with In Vitro
Carbapenem Susceptibility J Clin Microbiol 47 239-241 Jan 2009
63
MARTINS WMBS et al Prevalecircncia do gene blaKPC em isolados cliacutenicos
de Enterobacteriaceae e natildeo fermentadores encontrados em amostras clinicas em
um hospital universitaacuterio do Recife X Jornada de ensino pesquisa e extensatildeo ndash
JEPEX 2010 ndash UFRPE Recife 18 a 22 de outubro
MENDES C A C et al Polimixinas Revisatildeo com ecircnfase na sua
nefrotoxicidade Rev Assoc Med Bras 2009 55(6) 752-9
MOHR J F 3rd Update on the efficacy and tolerability of meropenem in the
treatment of serious bacteacuterial infections Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S41-51
2008
MONTEIRO J et al First report of KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae
strains in Brazil Antimicrob Agents Chemother Jan53(1)333-4 2009
MOREIRA V C et al Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia a antibioacuteticos
Disponiacutevel em
lthttpwwwcpglsucgbr6mostraartigosSAUDEVANESSA20CARVALHO20M
OREIRApdfgt Acesso em 21 marccedilo 2014
NETIKUL T et al Emergence of novel blaKPC-12 and blaKPC-13 variants in
carbapenem non-susceptible Enterobacter cloacae a first report of blaKPC gene in
Thailand European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases May
S372 2011
NETO V A et al Antibioacuteticos na praacutetica Meacutedica 6ordf Ediccedilatildeo Editorial
SarverSP Brasil 2007
NICOLAU D P Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of
meropenem Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S32-40 2008
64
OLIVEIRA A C et al Resistecircncia bacteriana e mortalidade em um centro de
terapia intensiva Rev Latino-Am Enfermagem nov-dez 2010
PAAUW A et al Failure to control an outbreak of qnrA 1-positive multidrug-
resistant Enterobacter clocae despite adequate implementation of recommended
infection control measures Journal of Clinical Microbiology v 45 n 5 p 1420-1425
2007
PATERSON D L et al Extended-Spectrum Beta-Lactamases a Clinical
Update Clinical Microbiology Reviews v 18 p 657-686 2005
PEIRANO G et al Carbapenem-hydrolysing beta-lactamase KPC-2 in
Klebsiella pneumonia isolated in Rio de Janeiro Brazil J Antimicrob Chemother Nov
20 2009
PERES-BOTA D et al Are infections due to resistant pathogens associated
with worse outcome in critically ill patients J Infect 200347(4)307-16
PIDDOCK L J V Clinically relevant chromosomally encoded multidrug
resistance effl ux pumps in bacterial Clin Microbiol Rev n19 p382-402 2006
PITOUT J D D et al Emergence of Enterobacteriaceae producing
extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) in the community J Antimicrob
Chemother May 56 2005
POSSEBON M I et al Resistecircncia bacteriana aos carbapenecircmicos
Bacterial resitence to carbapenems RBM rev bras med60(6)378380-378-382
jun 2003
QUEENAN A M et al Carbapenemases the versatile beta-lactamases
Clin Microbiol Rev Jul20(3)440-58 2007
65
RHOMBERG P R et al Summary trends for the meropenem yearly
susceptibility test information collection program a 10- year experience in the United
States (1999-2008) Diagnostic Microbiology and Infectiois Disease v 65 n4 p
414-426 2009
ROBLEDO I E et al Detection of KPC in Acinetobacter spp in Puerto Rico
J Antimicrob Agents Chemother 54 1354-1357 Mar 2010
ROGERS B A et al Country-to-country transfer os patients and the risk of
multi-resistant bacterial infection Clinical Infectious Disease v53 n1 p49- 56
2011
SHAH A A et al Characteristics epidemiology and clinicalimportance of
emerging strains of Gram-negative bacilli producing extended-spectrum
betalactamases Research in Microbiology v 155 p 409-421 2004
TURNER P J Extended- Spectrum Beta-Lactamases Clinical Infectious
Diseases v 41 p 273-275 2005
WOLTER D J et al Phenotypic and Enzymatic Comparative Analysis
between the Novel KPC variant KPC-5 and Its Evolutionary Variants KPC-2 and
KPC-4 Antimicrob Agents Chemother Nov 17 2008
WOODFORD N et al Carbapenemases of Chryseobacterium
(Flavobacterium) meningosepticum distribution of blaB and characterization of a
novel Metalo-beta-lactamase gene blaB3 in the type strain NCTC 10016
Antimicrob Agents Chemother Jun44(6)1448-52 2000
WOODFORF N Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in
India Pakistan and the UK a molecular biological and epidemiological study The
Lancet Infectious Diseases v 10 n 9 p 597-602 2010
66
WOODFORD et al Outbreak of Klebsiella pneumoniae Producing a New
Carbapenem- Hydrolyzing Class A β-Lactamase KPC-3 in a New York Medical
Center Antimicrobial agents and chemotherapy Dec 2004 p 4793ndash4799 Vol 48
No 12
YAGI T et al A preliminary survey of extended-spectrum β-lactamases
(ESBLs) in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Japan
FEMS Microbiology Letters 184 (2000) 53-56
YIGIT H et al Novel carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase KPC-1 from
a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumonia J Antimicrob Agents
Chemother 45 (4) 1151-1161 (2001)
ZAVASCKI A P et al KPC-2- producing Enterobacter cloacae in two cities
from Southern Brazil Int J Antimicrob Agents Apr 28 2009
ZHANEL G G et al Comparative review of the carbapenecircmicos Drugs
67(7)1027-52 2007
67
ANEXOS
Sequumlecircncia do oligo blaKPC
Query 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
Query 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
Query 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
68
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
Query 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
Query 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
69
Query 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
Query 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
Query 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
70
Sbjct 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
Query 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
Query 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
Query 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
71
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
Query 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
Query 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
72
Query 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
Query 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
Query 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
73
Sbjct 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
Query 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
Query 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
Query 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
74
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
Query 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
Query 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
75
Query 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
Query 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
||||
Sbjct 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
LOCUS AF297554 1377 bp
DNA linear BCT 26-MAR-2001
DEFINITION Klebsiella pneumoniae carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
gene complete cds
ACCESSION AF297554
VERSION AF2975541 GI10121874
76
KEYWORDS
SOURCE Klebsiella pneumoniae
ORGANISM Klebsiella pneumoniae
Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Enterobacteriaceae Klebsiella
REFERENCE 1 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH QueenanAM
AndersonGJ Domenech-SanchezA
BiddleJW StewardCD
AlbertiS BushK and TenoverFC
TITLE Novel carbapenem-hydrolyzing beta-
lactamase KPC-1 from a
carbapenem-resistant strain of
Klebsiella pneumoniae
JOURNAL Antimicrob Agents Chemother 45 (4)
1151-1161 (2001)
PUBMED 11257029
REFERENCE 2 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH AndersonGJ and
TenoverFC
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (19-AUG-2000) Nosocomial
Pathogens Laboratory Branch
Centers for Disease Control and
Prevention 1600 Clifton Rd MS
G08 Atlanta GA 30333 USA
FEATURES LocationQualifiers
77
source 11377
organism=Klebsiella
pneumoniae
mol_type=genomic DNA
db_xref=taxon573
-35_signal 5560
-10_signal 7883
mRNA 921012
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
RBS 117122
CDS 1311012
note=blaKPC-1
codon_start=1
transl_table=11
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
protein_id=AAG134101
db_xref=GI10121875
translation=MSLYRRLVLLSCLSWPLAGFSATALTNLVAEPFAKLEQD
FGGSI
GVYAMDTGSGATVSYRAEERFPLCSSFKGFLAAAVLARSQQQAGLLDTPIRYG
KNALV
PWSPISEKYLTTGMTVAELSAAAVQYSDNAAANLLLKELGGPAGLTAFMRSIG
DTTFR
78
LDRWELELNSAIPSDARDTSSPRAVTESLQKLTLGSALAAPQRQQFVDWLKGN
TTGNH
RIRAAVPADWAVGDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTRAPNKDDK
HSEAV
IAAAARLALEGLGVNGQ
ORIGIN
1 cggggcagtt acagccgtta cagcctctgg
agagggagcg gcttgccgct cggtgataat
61 cccagctgta gcggcctgat tacatccggc
cgctacacct agctccacct tcaaacaagg
121 aatatcgttg atgtcactgt atcgccgtct
agttctgctg tcttgtctct catggccgct
181 ggctggcttt tctgccaccg cgctgaccaa
cctcgtcgcg gaaccattcg ctaaactcga
241 acaggacttt ggcggctcca tcggtgtgta
cgcgatggat accggctcag gcgcaactgt
301 aagttaccgc gctgaggagc gcttcccact
gtgcagctca ttcaagggct ttcttgctgc
361 cgctgtgctg gctcgcagcc agcagcaggc
cggcttgctg gacacaccca tccgttacgg
421 caaaaatgcg ctggttccgt ggtcacccat
ctcggaaaaa tatctgacaa caggcatgac
481 ggtggcggag ctgtccgcgg ccgccgtgca
atacagtgat aacgccgccg ccaatttgtt
541 gctgaaggag ttgggcggcc cggccgggct
gacggccttc atgcgctcta tcggcgatac
79
601 cacgttccgt ctggaccgct gggagctgga
gctgaactcc gccatcccaa gcgatgcgcg
661 cgatacctca tcgccgcgcg ccgtgacgga
aagcttacaa aaactgacac tgggctctgc
721 actggctgcg ccgcagcggc agcagtttgt
tgattggcta aagggaaaca cgaccggcaa
781 ccaccgcatc cgcgcggcgg tgccggcaga
ctgggcagtc ggagacaaaa ccggaacctg
841 cggagtgtat ggcacggcaa atgactatgc
cgtcgtctgg cccactgggc gcgcacctat
901 tgtgttggcc gtctacaccc gggcgcctaa
caaggatgac aagcacagcg aggccgtcat
961 cgccgctgcg gctagactcg cgctcgaggg
attgggcgtc aacgggcagt aaggctctga
1021 aaatcatcta ttggcccacc accgccgccc
ttgcgggcgg catggattac caaccactgt
1081 cacatttagg ctaggagtct gcgcggcaga
gccgtgtgac cggttttctg tagagcactg
1141 acgatggcgg cggcgctctc tgcaattggc
aaggcgtcgg cgccaaggat accaatcttg
1201 cggcgcgcgg cgtgttatga cgactggggt
gcatttgagc cgccccattt aaccttcgcc
1261 ctcacagata cgccattcgc ctcaaattta
gcgccatgca gacgagcttc cactcggctt
1321 gcaccttgtc caggcccctc atgctgaact
gacgcaatcc catcaccgcc ttgatca
80
47
Figura 11 Isolado de KPC segundo sexo dos 17 pacientes investigados
no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 2 Desfecho cliacutenico
Em 17 isolados de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo
de 2010 aacute 2011 a porcentagem de pacientes que foram a oacutebito (59) foi maior que
a de pacientes que tiverm alta (41)
Figura 12 Isolado de KPC segundo desfecho cliacutenico dos 17 pacientes
investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
48
5 2 3 Local da coleta
Dos 17 episoacutedios detectados de infecccedilatildeo por KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 a infecccedilatildeo em swab retalfoi mais
frequente (47) seguida de ponta de cateacuteter (18) e secreccedilatildeo traqueal (12)
Figura 13 Isolados de KPC segundo local da coleta da amostra nos 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 4 Microorganismo
O microorganismo mais encontrado foi a Klebsiella pneumoniae (82)
seguida da Enterobacter clocae (12) e Serratia marcescens (6) dos 17 isolados
de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 Isto afirma o
fato de a sigla KPC ser utilizada de forma errocircnea aacute Klebsiella pneumoniae visto
que a evidecircncia dela eacute maior em relaccedilatildeo as outras cepas
49
Figura 14 Isolado de KPC segundo microrganismo encontrado em 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 5 Relaccedilotildees variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana e desfecho
cliacutenico
Tabela 6 ndash Distribuiccedilatildeo do perfil geneacutetico sexo coleta tipificaccedilatildeo de
microrganismos e anaacutelise da resistecircncia bacteriana segundo o desfecho
cliacutenico Brasiacutelia-DF 2010 a 2011
Variaacutevel Resultado
Desfecho
Alta Oacutebito
N N P
Gene 16S rRNA Positivo 7 1000 10 1000
NA Gene blaKPC Positivo 6 857 10 1000
Negativo 1 143 0 00 0218 Sexo Feminino 2 286 6 600
Masculino 5 714 4 400 0201 Local da coleta Fundo saco de
Douglas 1 143 0 00
Hemocultura 0 00 1 100 0463 Ponta de cateter 1 143 2 200
Sec TraquealBrocircnquica
0 00 1 100
50
Secreccedilatildeo traqueal 2 286 0 00
Swab retal 3 429 5 500
Urina 0 00 1 100
Microrganismo Enterobacter cloacae (KPC)
1 143 1 100
Klebsiella pneumoniae
6 857 8 800
0416 Serratia
marcescens 0 00 1 100
Teste de Hodge Hodge positivo 7 1000 10 1000
NA Amicacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 1 100 0848 resistente 0 00 1 100
sensiacutevel 2 286 3 300
Amoxicilina Aacutecido Clavulacircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Ampicilina Sulbactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ampicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Aztreonan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefazolina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Cefoperazona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Cefotaxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefoxitina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0509 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 2 286 4 400
Ceftazidima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cetriaxona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 3 429 5 500 0772 Cefalotina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ciprofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772
51
resistente 3 429 5 500
Claritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Clindamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Eritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Gentamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0942 resistente 2 286 3 300
sensiacutevel 1 143 2 200
Imipenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 0 00 2 200 0193 Resistente 1 143 3 300
sensiacutevel 2 286 0 00
Nitrofurantoiacutena sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Norfloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Oxacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Penicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Piperacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Rifampicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tetraciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Ticarcilina Aacutecido Clavulocircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0688 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 3 429 4 400
Tobramicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Trimetoprima Sulfametoxazol
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0112 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 2 286 0 00
Vancomicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tigeciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediario 0 00 1 100 0211 natildeo testado 1 143 4 400
resistente 2 286 0 00
52
Cefepime sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefuroxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Levofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Piperacilina Tazobactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Ertapenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Meropenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0223 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 1 143 0 00
Cefotetan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 sensiacutevel 0 00 1 100
Gemifloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 7 700 0585 natildeo testado 3 429 3 300
Desfecho
Alta Oacutebito
Meacutedia Erro
padratildeo Meacutedia Erro
padratildeo p
Idade 58 9 59 5 0991
Tempo Internaccedilatildeo (dias)
50 13 46 12 0571
n= 17 p(lt 005) NA natildeo se aplica
53
6 DISCUSSAtildeO
Nos uacuteltimos anos houve um aumento na incidecircncia de bacteacuterias
multirresistentes aos antimicrobianos no ambiente hospitalar tornando isto um
problema mundial de sauacutede puacuteblica (HULSCHER et al 2010) Quando se trata
principalmente de bacilos Gram negativos a frequumlecircncia destas bacteacuterias eacute ainda
maior em paiacuteses da Ameacuterica Latina quando comparada a paiacuteses desenvolvidos
(GALES etal 2012)
De acordo com dados do ldquoMeropenem Yearly Susceptibility Test Information
Collectionrdquo (MYSTIC) ocorreu nos Estados Unidos um aumento na susceptibilidade
de K pneumoniae nos uacuteltimos anos graccedilas a praacuteticas de controle de disseminaccedilatildeo
de amostras resistentes(RHOMBERG P R et al 2009) O aumento crescente da
prevalecircncia destes microrganismos foi proporcional ao aumento da dependecircncia do
uso de antibioacuteticos carbapenecircmicos considerados como a opccedilatildeo terapecircutica para o
tratamento de infecccedilotildees por bacilos Gram negativos multi-resistentes (LIVERMORE
2012) Isto afeta diretamente as opccedilotildees de tratamento sobrando poucas alternativas
para a terapecircutica que incluem colistina (polimixina E) e tigeciclina que apresentam
respectivamente problemas em termos de toxicidade e eficaacutecia (LIVERMORE et
al 2011) Um dos efeitos adversos mais importantes das poliminas B e E por
exemplo satildeo a neurotoxicidade e nefrotoxicidade (MENDES C A C et al2009 )
Devido agrave resistecircncia ser usualmente de natureza plasmidial e portanto de
maior disseminaccedilatildeo especialmente quando carreadas por K pneumoniae
microrganismo com uma notoacuteria capacidade para acumular e transferir plasmiacutedeos
com determinantes para resistecircncia o nuacutemero de casos detectados pelo
fenoacutetipogenoacutetipo blaKPC eacute bastante preocupante (MONTEIRO et al 2009)
Comparada com outras bacteacuterias hospitalares a transmissatildeo de clones
multirresistentes de K pneumoniae eacute maior e podem natildeo ser controladas pelos
meacutetodos de controle de infecccedilatildeo hospitalar (PAAUW et al 2007) A forma
plasmidial para transferecircncia da resistecircncia adicionada a este grande potencial para
disseminaccedilatildeo de clones resistentes eacute preocupante visto que apoacutes surtos muitas
vezes pode se tornar endecircmica Jaacute eacute uma realidade a disseminaccedilatildeo desta bacteacuteria
54
entre pacientes hospitais paiacuteses e ateacute mesmo continentes (WOODFORF et al
2010 ROGERS et al 2011)
As chances de surtos satildeo maiores em paiacuteses com poucos recursos devido agrave
maior carecircncia de praacuteticas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees hospitalares e o
uso irracional de antimicrobianos de forma empiacuterica e inadequada (KUMARASAMY
et al 2010) Ateacute o momento os mecanismos de resistecircncia aos cabapenecircmicos
geralmente encontrado eram a produccedilatildeo de ESBL (CTX-M) somada aacute perda de
porina (CARVALHAES et al 2010) Foi notado a partir do ano de 2008 um
aumento no nuacutemero de K pneumoniae produtoras de KPC-2 apresentando outra
forma de resistecircncia (GALES 2012)
Um estudo mostrou que o perfil do paciente colonizado ou infectado por KPC
foi de um paciente entre os 33 e os 82 anos de idade internado haacute mais de 1
semana no hospital A mortalidade geral nos uacuteltimos anos ficou em torno de 7
sendo que dos 77 pacientes estudados 32 (415) pacientes evoluiacuteram para oacutebito
evidenciando a alta morbi-mortalidade associada (ALVES A P et al 2013)
Em estudo com 2316 pacientes avaliados a populaccedilatildeo de sexo masculino foi
de 526 idade meacutedia global de 53 anos (mediana de 55 anos) permanecircncia meacutedia
de 58 dias (mediana de 3 dias) (OLIVEIRA A C et al 2010) Outros trabalhos
apresentaram ausecircncia de significacircncia entre sexoidade e o desenvolvimento de
infecccedilotildees por microrganismos resistentes (PERES-BOTA D et al 2003 COLPAN
A et al 2005 COELLO R et al 1997)
Outro estudo utilizou um total de 30 amostras sendo elas isoladas de urina
escarro secreccedilatildeo pleural ponta de cateter aspirado traqueal e hemocultura A mais
prevalente foi em urina (40) Entre as 30 cepas analisadas a maior porcentagem
foi da cepa Klebsiella pneumoniae (70) Enterobacter sp (133) Klebsiella
ozaenae (10) Escherichia coli (333) e Klebsiella oxytoca (333)
(DIENSTMANN R et al 2010) Nos Estados Unidos a enzima KPC jaacute se tornou
endecircmica Foi realizada uma pesquisa em dois hospitais de Nova York onde
testaram 602 amostras e 45 apresentaram algum mecanismo de resistecircncia
sendo apenas 33 confirmadas por biologia molecular como KPC-2 (BRATU et
al 2005)
55
Estudo sobre os tipos de ESBL feito no Japatildeo apresentou o tipo Toho-1 como
o mais prevalente nessa pesquisa Ateacute o ano de 2000 ano em que foi publicado tal
estudo este era o primeiro relatoacuterio no Japatildeo para identificar derivados de ESBLs
como tipo de SHV e TEM entre E coli e K pneumoniae Em especial o tipo SHV- 12
foi identificado com uma maior frequumlecircncia Estes resultados indicam que tipos
distintos de ESBLs que satildeo diferentes em sua especificidade de substrato e origem
geneacutetica coexistem no Japatildeo Isto mostra a importacircncia de caracterizar genoacutetipos
distintos de ESBLs e de estar em alerta continuamente para as tendecircncias de
ESBLs no Japatildeo aleacutem da necessidade de uma interpretaccedilatildeo uniforme utilizando as
diretrizes do CSLI para relatar cepas produtoras de ESBL Aleacutem da detecccedilatildeo de
ESBLs satildeo necessaacuterias mais informaccedilotildees tais como o perfil de sensibilidade
especiacutefica para diversas β-lactacircmicos e o local da infecccedilatildeo Esses fatores satildeo
essenciais para a escolha adequada de antibioacuteticos (YAGI T et al 2000)
No ano de 2004 uma pesquisa avaliou a produccedilatildeo de uma enzima de
hidroacutelise de carbapenecircmicos atraveacutes da teacutecnica de sequumlenciamento foi revelado
um novo membro da famiacutelia KPC designado KPC- 3 Pesquisadores encontraram
em um mutante de K pneumoniae uma substituiccedilatildeo de um gene associado com
resistecircncia a Imipenem mas essa substituiccedilatildeo foi considerada improvaacutevel na
contribuiccedilatildeo da resistecircncia aos carbapenecircmicos da espeacutecie estudada Aleacutem da
resistecircncia aos carbapenecircmicos estes isolados eram em sua maioria resistentes agraves
cefalosporinas penicilinas e aminoglicosiacutedeos Usando estudos de transformaccedilatildeo
conjugaccedilatildeo e hibridaccedilatildeo localizaram o alelo blaKPC em plasmiacutedeo aleacutem disso
mostraram que esse alelo tambeacutem carregava uma resistecircncia aos aminoglicosiacutedeos
A transferecircncia das enzimas KPCs foi demonstrada in vitro tanto neste como em
outros estudos pode ser que os plasmiacutedeos que fazem esta transferecircncia estavam
comeccedilando a se espalhar no ambiente cliacutenico resultando na multiresistecircncia dessas
estirpes (WOODFORD et al 2004)
O presente estudo apresentou um vieacutes quanto aos resultados dos testes de
susceptibilidade microbiana Observou-se que natildeo foi encontrado resultado deste
teste em algumas amostras o que natildeo cooperou para um estudo mais preciso
futuros estudos quanto agraves amostras e um melhor acompanhamento deste tipo de
patologia Poreacutem mesmo sem algumas amostras com este resultado disponiacutevel foi
56
confirmada a presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos
carbapenecircmicos por meio dos genes de resistecircncia blaKPC e 16S rRNA que as
amostras apresentaram em sua maioria serem portadoras Quanto aos resultados
estatiacutesticos nenhuma das variaacuteveis apresentou significacircncia estatiacutestica (p gt 005)
mostrando assim que estas variaacuteveis isoladas natildeo foram o fator determinante para
o desfecho cliacutenico de alta ou oacutebito
57
7 CONCLUSAtildeO
Os genes blaKPC e 16S rRNA foram caracterizados confirmando a a
presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos carbapenecircmicos
Houve uma maior prevalecircncia da cepa K pneumoniae e isto confirma outros
estudos que apresentam a maior prevalecircncia desta cepa em amostras com KPC
Aleacutem disso isso justifica a forma popular da K pneumoniae ser chamada de KPC
enquanto que na verdade KPC eacute uma enzima podendo estar presente em outras
cepas como Enterobacter clocae tambeacutem apresentada no presente estudo O
desfecho cliacutenico de oacutebitos maior que 50 eacute um possiacutevel indicador sobre a
necessidade de se realizar um teste raacutepido para identificaccedilatildeo de KPC visando
iniciar o mais raacutepido possiacutevel o tratamento afim de diminuir a mortalidade por esta
infecccedilatildeo
Nenhuma das variaacuteveis isoladamente estaacute relacionada ao desfecho cliacutenico
oacutebito ou alta pois natildeo apresentaram relevacircncia estatiacutestica O presente estudo
mostrou que haacute presenccedila da bacteacuteria nas amostras de pacientes do hospital
estudado podendo entatildeo afirmar que este tipo de bacteacuteria se encontra tambeacutem
presente em ambiente hospitalar O uso irracional de antimicrobiano eacute demonstrado
de forma indireta quando foi apresentado atraveacutes do Teste de Hodge Modificado
uma resistecircncia de 100 aos antibioacuteticos carbapenecircmicos Isto tambeacutem reflete na
terapecircutica sendo que pacientes portadores de bacteacuterias resistentes aos
antibioacuteticos carabepecircmicos tem uma escassa opccedilatildeo de tratamento e as opccedilotildees
apresentam problemas quanto agrave toxicidade e eficaacutecia
58
REFEREcircNCIAS
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Mecanismos
de resistecircncia bacteriana aos antimicrobianos Disponiacutevel em
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controleopas_
webmodulo3mec_sitiohtmgt Acesso em 25 de abril de 2014
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Nota teacutecnica nordm
012013 medidas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees por enterobacteacuterias
multiresistentes Acesso em 17 de abril de 2013
ALBA J et al Kinetics study of KPC-3 a plasmid-encoded class A
carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase Antimicrob Agents Chemother
Nov49(11)4760-2 2005
ALVES A P et al Nosocomial infections by KPC-producing enterobacteria in
a tertiary hospital in Southern Brazil Revista da AMRIGS Porto Alegre 57 (3) 213-
218 jul-set 2013
ALVES A et al Tipagem Geneacutetica de Microrganismos Lab De Diversidade
Microbiana Centro de Biologia Celular Dep de Biologia U de Aveiro 3810-193
Aveiro- 2003
BELL J M et Al Prevalence and significance of a negative extended-
spectrum beta-lactamase (ESBL) confirmation test result after a positive ESBL
screening test result for isolates of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae
results from the SENTRY Asia-Pacific Surveillance Program J Clin Microbiol
May45(5)1478-82 2007
BRATU S et al Detection of KPC carbapenem-hydrolyzing enzymes in
Enterobacter spp from Brooklyn New York Antimicrob Agents Chemother v 49 n
2 p 776-8 2005
59
BRATU S et al Emergence of KPC-possessing Klebsiella pneumoniae in
Brooklyn New York epidemiology and recommendations for detection Antimicrob
Agents Chemother v 49 n 7 p 3018-20 2005
BRATU S et al Rapid spread of carbapenem-resistant Klebsiella
pneumoniae in New York City Arch Intern Med v 165 p 1430-5 2005
CAMARGO C F et al Aplicaccedilatildeo das teacutecnicas de pcr e suas teacutecnicas
derivadas em diagnoacutestico molecular Disponiacutevel em
ltfileDUnB10C2BA20semestreArtigosPCR-
20CLEYTON20FLORENCIO20DE20CAMARGO20E20PAULO20ROB
ERTO20QUEIROZpdfgtgt Acesso em 08 de abril de 2014
CARVALHES C G et al Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting
carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive
results Journal of Antimicrobial Chemotherapy v 65 n2 p 249-251 2010
CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION- CDC Modified
Hodge Test for Carbapenemase Detection in Enterobacteriaceae 2004
CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE Methods for
dilutionantimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically Approved
standard M7ndashA7 7th ed CLSI Wayne PA 2011
COELLO R et al Risk factors for developing clinical infection with methicillin-
resistant Staphylococcus aureus (MRSA) amongst hospital patients initially only
colonized with MRSA J Hosp Infect 19973739-46
COLPAN A et al Evaluation of risk factors for mortality in intensive care
units A prospective study from a referral hospital in Turkey Am J Infect Control
200533(1)42-7
60
CORNAGLIA G et al Living with ESBLs Introduction Clinical Microbiology
and Infection 14 Suppl 1 1-2 2008
COTRIM E R et al Klebsiella pneumoniae carbapenemase ndash KPC em
Enterobacteriaceae o desafio das bacteacuterias multirresistentes Poacutes em revista do
centro universitaacuterio Newton Paiva 12012 - ediccedilatildeo 5 - issn 2176 7785
DESHPANDE L M et al Occurrence and characterization of
carbapenemase-producing Enterobacteacuteriaceae report from the SENTRY
Antimicrobial Surveillance Program (2000-2004) Microb Drug Resist 12(4)223-30
2006
DIAS D J A Estudos dos principais mecanismos de resistecircncia aos
antibioacuteticos β-lactacircmicos em bacteacuterias patogecircnicas gram negativas 2009 100 f
Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Geneacutetica Molecular e Biomedicina) ndash Faculdade de
Ciecircncias e Tecnologia Universidade de Nova Lisboa Lisboa
DIENSTMANN R et al Avaliaccedilatildeo fenotiacutepica da enzima Klebsiella
pneumoniae carbapenemase (KPC) em Enterobacteriaceae de ambiente hospitalar
J Bras Patol Med Lab v 46 n 1 p 23-27 fevereiro 2010
ENDIMIAMI A et al Emergence of blaKPC-containing Klebsiella
pneumoniae in a long-term acute care hospital a new challenge to our healthcare J
Antimicrob Chemother 64 1102-1110 Nov 2009
FALAGAS M E et al Extended-spectrum beta-lactamase producing
organisms The Journal of Hospital Infection 73 (4) pp 345-54 2009
FONTANA C et al Emergence of KPC-producing Klebsiella pneumoniae in
Italy BMC Rev Notes 3 40 2010
61
GALES A C et al Antimicrobial resistance among Gram-negative bacilli
isolated from Latin America results from Sentry Antimicrobial Surveillance Program
(Latin America 2008-2010) Diagnostic Microbiology and Infectious Disease v 3 n
4 p 354 -360 2012
GUPTA N et al Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Epidemiology
and Prevention HEALTHCARE EPIDEMIOLOGY Clinical Infectious Diseases
201153(1)60ndash67 Published by Oxford University Press on behalf of the Infectious
Diseases Society of America 2011
HARBOTTLE H et al Genetics of antimicrobial resistance Anim Biotechnol
n17 p111-124 2006
HENRIQUE W N et al RESISTEcircNCIA BACTERIANA Uniatildeo das
Faculdades Alfredo NasserInstituto de Ciecircncias da Sauacutede Disponiacutevel em lt
httpwwwfaculdadealfredonasseredubrfilespesquisaposter20HENRIQUE20
Wilker20Natividade20SANTIAGO20Silvania20CAVALCANTI20DSP
20ResistC3AAncia20Bacterianapdfgt Acesso em 17 marccedilo 2014
HULSCHER M E J I et al Antibiotic prescribing in hospital a social and
behavioral scientific approach The Lancet Infectious Diaseases v 10 n 3 p 167-
165 2010
KIDWAI M SAPRA P BHUSHAN KR Synthetic strategies and medicinal
properties of beta-lactams Curr Med Chem 1999 695-215
KUMARASAMY K K et al Emergence of a new antibiotic resistance
mechanism in India Pakistan and the UK a molecular biological and
epidemiological stuy The Lancet Infectious Diseases v10 n 9 p 597- 602 2010
LINCOPAN N et al Enterobacteacuteria producing extended-spectrum β-
lacatamases and IMP-1 Metalo-β-lactamases isolated from Brazilian hospitals J Med
62
Microbiol 7 1-3 2006
LINCOPAN N et al First Isolation of Metalo-β-Lacatamase-Producing
Multiresistant Klebsiella pneumoniae from a patient in Brazil J Clin Microbiol 43(1)
516-519 2005
LIVERMORE D M et al What remains against carbapenem- resistant
Enterobacteriaceae Evaluation of choramphenicol ciprofloxacin colistina
fosfomycin minocycline nitrofurantoin temocilin and tigecycline International
Journal of Antimicrobial Agents v 37 n 5 p 415- 459 2011
LIVERMORE D M Fourten years in resistance International Journal of
Antimicrobial Agents v 39 283- 294 2012
LIVERMORE D M Bacterial resistance to carbapenems Adv Exp Med Biol
1995 39025-47
LIVERMORE D M Bacterial resistance origins epidemiology and impact
Clin Infect Dis 36S11-S23 2003
LIVERMORE D M et al Carbapenemases a problem in waiting Curr
Opin Microbiol 2000 3489-95
LU et al Universal pcr for common bacterial pathogens J CLIN
MICROBIOL VOL 38 2000
LU et al Use of PCR with Universal Primers and Restriction Endonuclease
Digestions for Detection and Identification of Common Bacterial Pathogens in
Cerebrospinal Fluid Journal of Clinical Microbiology June 2000 p 2076ndash2080
MARSCHALL J Met al Presence of the KPC Carbapenemase Gene in
Enterobacteriaceae Causing Bacteremia and Its Correlation with In Vitro
Carbapenem Susceptibility J Clin Microbiol 47 239-241 Jan 2009
63
MARTINS WMBS et al Prevalecircncia do gene blaKPC em isolados cliacutenicos
de Enterobacteriaceae e natildeo fermentadores encontrados em amostras clinicas em
um hospital universitaacuterio do Recife X Jornada de ensino pesquisa e extensatildeo ndash
JEPEX 2010 ndash UFRPE Recife 18 a 22 de outubro
MENDES C A C et al Polimixinas Revisatildeo com ecircnfase na sua
nefrotoxicidade Rev Assoc Med Bras 2009 55(6) 752-9
MOHR J F 3rd Update on the efficacy and tolerability of meropenem in the
treatment of serious bacteacuterial infections Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S41-51
2008
MONTEIRO J et al First report of KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae
strains in Brazil Antimicrob Agents Chemother Jan53(1)333-4 2009
MOREIRA V C et al Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia a antibioacuteticos
Disponiacutevel em
lthttpwwwcpglsucgbr6mostraartigosSAUDEVANESSA20CARVALHO20M
OREIRApdfgt Acesso em 21 marccedilo 2014
NETIKUL T et al Emergence of novel blaKPC-12 and blaKPC-13 variants in
carbapenem non-susceptible Enterobacter cloacae a first report of blaKPC gene in
Thailand European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases May
S372 2011
NETO V A et al Antibioacuteticos na praacutetica Meacutedica 6ordf Ediccedilatildeo Editorial
SarverSP Brasil 2007
NICOLAU D P Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of
meropenem Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S32-40 2008
64
OLIVEIRA A C et al Resistecircncia bacteriana e mortalidade em um centro de
terapia intensiva Rev Latino-Am Enfermagem nov-dez 2010
PAAUW A et al Failure to control an outbreak of qnrA 1-positive multidrug-
resistant Enterobacter clocae despite adequate implementation of recommended
infection control measures Journal of Clinical Microbiology v 45 n 5 p 1420-1425
2007
PATERSON D L et al Extended-Spectrum Beta-Lactamases a Clinical
Update Clinical Microbiology Reviews v 18 p 657-686 2005
PEIRANO G et al Carbapenem-hydrolysing beta-lactamase KPC-2 in
Klebsiella pneumonia isolated in Rio de Janeiro Brazil J Antimicrob Chemother Nov
20 2009
PERES-BOTA D et al Are infections due to resistant pathogens associated
with worse outcome in critically ill patients J Infect 200347(4)307-16
PIDDOCK L J V Clinically relevant chromosomally encoded multidrug
resistance effl ux pumps in bacterial Clin Microbiol Rev n19 p382-402 2006
PITOUT J D D et al Emergence of Enterobacteriaceae producing
extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) in the community J Antimicrob
Chemother May 56 2005
POSSEBON M I et al Resistecircncia bacteriana aos carbapenecircmicos
Bacterial resitence to carbapenems RBM rev bras med60(6)378380-378-382
jun 2003
QUEENAN A M et al Carbapenemases the versatile beta-lactamases
Clin Microbiol Rev Jul20(3)440-58 2007
65
RHOMBERG P R et al Summary trends for the meropenem yearly
susceptibility test information collection program a 10- year experience in the United
States (1999-2008) Diagnostic Microbiology and Infectiois Disease v 65 n4 p
414-426 2009
ROBLEDO I E et al Detection of KPC in Acinetobacter spp in Puerto Rico
J Antimicrob Agents Chemother 54 1354-1357 Mar 2010
ROGERS B A et al Country-to-country transfer os patients and the risk of
multi-resistant bacterial infection Clinical Infectious Disease v53 n1 p49- 56
2011
SHAH A A et al Characteristics epidemiology and clinicalimportance of
emerging strains of Gram-negative bacilli producing extended-spectrum
betalactamases Research in Microbiology v 155 p 409-421 2004
TURNER P J Extended- Spectrum Beta-Lactamases Clinical Infectious
Diseases v 41 p 273-275 2005
WOLTER D J et al Phenotypic and Enzymatic Comparative Analysis
between the Novel KPC variant KPC-5 and Its Evolutionary Variants KPC-2 and
KPC-4 Antimicrob Agents Chemother Nov 17 2008
WOODFORD N et al Carbapenemases of Chryseobacterium
(Flavobacterium) meningosepticum distribution of blaB and characterization of a
novel Metalo-beta-lactamase gene blaB3 in the type strain NCTC 10016
Antimicrob Agents Chemother Jun44(6)1448-52 2000
WOODFORF N Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in
India Pakistan and the UK a molecular biological and epidemiological study The
Lancet Infectious Diseases v 10 n 9 p 597-602 2010
66
WOODFORD et al Outbreak of Klebsiella pneumoniae Producing a New
Carbapenem- Hydrolyzing Class A β-Lactamase KPC-3 in a New York Medical
Center Antimicrobial agents and chemotherapy Dec 2004 p 4793ndash4799 Vol 48
No 12
YAGI T et al A preliminary survey of extended-spectrum β-lactamases
(ESBLs) in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Japan
FEMS Microbiology Letters 184 (2000) 53-56
YIGIT H et al Novel carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase KPC-1 from
a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumonia J Antimicrob Agents
Chemother 45 (4) 1151-1161 (2001)
ZAVASCKI A P et al KPC-2- producing Enterobacter cloacae in two cities
from Southern Brazil Int J Antimicrob Agents Apr 28 2009
ZHANEL G G et al Comparative review of the carbapenecircmicos Drugs
67(7)1027-52 2007
67
ANEXOS
Sequumlecircncia do oligo blaKPC
Query 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
Query 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
Query 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
68
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
Query 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
Query 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
69
Query 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
Query 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
Query 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
70
Sbjct 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
Query 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
Query 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 541
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GCGATAC 600
Query 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
71
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
Query 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
Query 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
72
Query 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
Query 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
Query 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
73
Sbjct 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
Query 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
Query 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
Query 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
74
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
Query 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
Query 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
75
Query 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
Query 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
||||
Sbjct 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
LOCUS AF297554 1377 bp
DNA linear BCT 26-MAR-2001
DEFINITION Klebsiella pneumoniae carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
gene complete cds
ACCESSION AF297554
VERSION AF2975541 GI10121874
76
KEYWORDS
SOURCE Klebsiella pneumoniae
ORGANISM Klebsiella pneumoniae
Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Enterobacteriaceae Klebsiella
REFERENCE 1 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH QueenanAM
AndersonGJ Domenech-SanchezA
BiddleJW StewardCD
AlbertiS BushK and TenoverFC
TITLE Novel carbapenem-hydrolyzing beta-
lactamase KPC-1 from a
carbapenem-resistant strain of
Klebsiella pneumoniae
JOURNAL Antimicrob Agents Chemother 45 (4)
1151-1161 (2001)
PUBMED 11257029
REFERENCE 2 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH AndersonGJ and
TenoverFC
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (19-AUG-2000) Nosocomial
Pathogens Laboratory Branch
Centers for Disease Control and
Prevention 1600 Clifton Rd MS
G08 Atlanta GA 30333 USA
FEATURES LocationQualifiers
77
source 11377
organism=Klebsiella
pneumoniae
mol_type=genomic DNA
db_xref=taxon573
-35_signal 5560
-10_signal 7883
mRNA 921012
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
RBS 117122
CDS 1311012
note=blaKPC-1
codon_start=1
transl_table=11
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
protein_id=AAG134101
db_xref=GI10121875
translation=MSLYRRLVLLSCLSWPLAGFSATALTNLVAEPFAKLEQD
FGGSI
GVYAMDTGSGATVSYRAEERFPLCSSFKGFLAAAVLARSQQQAGLLDTPIRYG
KNALV
PWSPISEKYLTTGMTVAELSAAAVQYSDNAAANLLLKELGGPAGLTAFMRSIG
DTTFR
78
LDRWELELNSAIPSDARDTSSPRAVTESLQKLTLGSALAAPQRQQFVDWLKGN
TTGNH
RIRAAVPADWAVGDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTRAPNKDDK
HSEAV
IAAAARLALEGLGVNGQ
ORIGIN
1 cggggcagtt acagccgtta cagcctctgg
agagggagcg gcttgccgct cggtgataat
61 cccagctgta gcggcctgat tacatccggc
cgctacacct agctccacct tcaaacaagg
121 aatatcgttg atgtcactgt atcgccgtct
agttctgctg tcttgtctct catggccgct
181 ggctggcttt tctgccaccg cgctgaccaa
cctcgtcgcg gaaccattcg ctaaactcga
241 acaggacttt ggcggctcca tcggtgtgta
cgcgatggat accggctcag gcgcaactgt
301 aagttaccgc gctgaggagc gcttcccact
gtgcagctca ttcaagggct ttcttgctgc
361 cgctgtgctg gctcgcagcc agcagcaggc
cggcttgctg gacacaccca tccgttacgg
421 caaaaatgcg ctggttccgt ggtcacccat
ctcggaaaaa tatctgacaa caggcatgac
481 ggtggcggag ctgtccgcgg ccgccgtgca
atacagtgat aacgccgccg ccaatttgtt
541 gctgaaggag ttgggcggcc cggccgggct
gacggccttc atgcgctcta tcggcgatac
79
601 cacgttccgt ctggaccgct gggagctgga
gctgaactcc gccatcccaa gcgatgcgcg
661 cgatacctca tcgccgcgcg ccgtgacgga
aagcttacaa aaactgacac tgggctctgc
721 actggctgcg ccgcagcggc agcagtttgt
tgattggcta aagggaaaca cgaccggcaa
781 ccaccgcatc cgcgcggcgg tgccggcaga
ctgggcagtc ggagacaaaa ccggaacctg
841 cggagtgtat ggcacggcaa atgactatgc
cgtcgtctgg cccactgggc gcgcacctat
901 tgtgttggcc gtctacaccc gggcgcctaa
caaggatgac aagcacagcg aggccgtcat
961 cgccgctgcg gctagactcg cgctcgaggg
attgggcgtc aacgggcagt aaggctctga
1021 aaatcatcta ttggcccacc accgccgccc
ttgcgggcgg catggattac caaccactgt
1081 cacatttagg ctaggagtct gcgcggcaga
gccgtgtgac cggttttctg tagagcactg
1141 acgatggcgg cggcgctctc tgcaattggc
aaggcgtcgg cgccaaggat accaatcttg
1201 cggcgcgcgg cgtgttatga cgactggggt
gcatttgagc cgccccattt aaccttcgcc
1261 ctcacagata cgccattcgc ctcaaattta
gcgccatgca gacgagcttc cactcggctt
1321 gcaccttgtc caggcccctc atgctgaact
gacgcaatcc catcaccgcc ttgatca
80
48
5 2 3 Local da coleta
Dos 17 episoacutedios detectados de infecccedilatildeo por KPC resistecircntes aos
carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 a infecccedilatildeo em swab retalfoi mais
frequente (47) seguida de ponta de cateacuteter (18) e secreccedilatildeo traqueal (12)
Figura 13 Isolados de KPC segundo local da coleta da amostra nos 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 4 Microorganismo
O microorganismo mais encontrado foi a Klebsiella pneumoniae (82)
seguida da Enterobacter clocae (12) e Serratia marcescens (6) dos 17 isolados
de KPC resistecircntes aos carbapenecircmicos no periacuteodo de 2010 aacute 2011 Isto afirma o
fato de a sigla KPC ser utilizada de forma errocircnea aacute Klebsiella pneumoniae visto
que a evidecircncia dela eacute maior em relaccedilatildeo as outras cepas
49
Figura 14 Isolado de KPC segundo microrganismo encontrado em 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 5 Relaccedilotildees variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana e desfecho
cliacutenico
Tabela 6 ndash Distribuiccedilatildeo do perfil geneacutetico sexo coleta tipificaccedilatildeo de
microrganismos e anaacutelise da resistecircncia bacteriana segundo o desfecho
cliacutenico Brasiacutelia-DF 2010 a 2011
Variaacutevel Resultado
Desfecho
Alta Oacutebito
N N P
Gene 16S rRNA Positivo 7 1000 10 1000
NA Gene blaKPC Positivo 6 857 10 1000
Negativo 1 143 0 00 0218 Sexo Feminino 2 286 6 600
Masculino 5 714 4 400 0201 Local da coleta Fundo saco de
Douglas 1 143 0 00
Hemocultura 0 00 1 100 0463 Ponta de cateter 1 143 2 200
Sec TraquealBrocircnquica
0 00 1 100
50
Secreccedilatildeo traqueal 2 286 0 00
Swab retal 3 429 5 500
Urina 0 00 1 100
Microrganismo Enterobacter cloacae (KPC)
1 143 1 100
Klebsiella pneumoniae
6 857 8 800
0416 Serratia
marcescens 0 00 1 100
Teste de Hodge Hodge positivo 7 1000 10 1000
NA Amicacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 1 100 0848 resistente 0 00 1 100
sensiacutevel 2 286 3 300
Amoxicilina Aacutecido Clavulacircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Ampicilina Sulbactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ampicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Aztreonan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefazolina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Cefoperazona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Cefotaxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefoxitina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0509 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 2 286 4 400
Ceftazidima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cetriaxona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 3 429 5 500 0772 Cefalotina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ciprofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772
51
resistente 3 429 5 500
Claritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Clindamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Eritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Gentamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0942 resistente 2 286 3 300
sensiacutevel 1 143 2 200
Imipenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 0 00 2 200 0193 Resistente 1 143 3 300
sensiacutevel 2 286 0 00
Nitrofurantoiacutena sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Norfloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Oxacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Penicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Piperacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Rifampicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tetraciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Ticarcilina Aacutecido Clavulocircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0688 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 3 429 4 400
Tobramicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Trimetoprima Sulfametoxazol
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0112 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 2 286 0 00
Vancomicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tigeciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediario 0 00 1 100 0211 natildeo testado 1 143 4 400
resistente 2 286 0 00
52
Cefepime sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefuroxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Levofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Piperacilina Tazobactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Ertapenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Meropenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0223 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 1 143 0 00
Cefotetan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 sensiacutevel 0 00 1 100
Gemifloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 7 700 0585 natildeo testado 3 429 3 300
Desfecho
Alta Oacutebito
Meacutedia Erro
padratildeo Meacutedia Erro
padratildeo p
Idade 58 9 59 5 0991
Tempo Internaccedilatildeo (dias)
50 13 46 12 0571
n= 17 p(lt 005) NA natildeo se aplica
53
6 DISCUSSAtildeO
Nos uacuteltimos anos houve um aumento na incidecircncia de bacteacuterias
multirresistentes aos antimicrobianos no ambiente hospitalar tornando isto um
problema mundial de sauacutede puacuteblica (HULSCHER et al 2010) Quando se trata
principalmente de bacilos Gram negativos a frequumlecircncia destas bacteacuterias eacute ainda
maior em paiacuteses da Ameacuterica Latina quando comparada a paiacuteses desenvolvidos
(GALES etal 2012)
De acordo com dados do ldquoMeropenem Yearly Susceptibility Test Information
Collectionrdquo (MYSTIC) ocorreu nos Estados Unidos um aumento na susceptibilidade
de K pneumoniae nos uacuteltimos anos graccedilas a praacuteticas de controle de disseminaccedilatildeo
de amostras resistentes(RHOMBERG P R et al 2009) O aumento crescente da
prevalecircncia destes microrganismos foi proporcional ao aumento da dependecircncia do
uso de antibioacuteticos carbapenecircmicos considerados como a opccedilatildeo terapecircutica para o
tratamento de infecccedilotildees por bacilos Gram negativos multi-resistentes (LIVERMORE
2012) Isto afeta diretamente as opccedilotildees de tratamento sobrando poucas alternativas
para a terapecircutica que incluem colistina (polimixina E) e tigeciclina que apresentam
respectivamente problemas em termos de toxicidade e eficaacutecia (LIVERMORE et
al 2011) Um dos efeitos adversos mais importantes das poliminas B e E por
exemplo satildeo a neurotoxicidade e nefrotoxicidade (MENDES C A C et al2009 )
Devido agrave resistecircncia ser usualmente de natureza plasmidial e portanto de
maior disseminaccedilatildeo especialmente quando carreadas por K pneumoniae
microrganismo com uma notoacuteria capacidade para acumular e transferir plasmiacutedeos
com determinantes para resistecircncia o nuacutemero de casos detectados pelo
fenoacutetipogenoacutetipo blaKPC eacute bastante preocupante (MONTEIRO et al 2009)
Comparada com outras bacteacuterias hospitalares a transmissatildeo de clones
multirresistentes de K pneumoniae eacute maior e podem natildeo ser controladas pelos
meacutetodos de controle de infecccedilatildeo hospitalar (PAAUW et al 2007) A forma
plasmidial para transferecircncia da resistecircncia adicionada a este grande potencial para
disseminaccedilatildeo de clones resistentes eacute preocupante visto que apoacutes surtos muitas
vezes pode se tornar endecircmica Jaacute eacute uma realidade a disseminaccedilatildeo desta bacteacuteria
54
entre pacientes hospitais paiacuteses e ateacute mesmo continentes (WOODFORF et al
2010 ROGERS et al 2011)
As chances de surtos satildeo maiores em paiacuteses com poucos recursos devido agrave
maior carecircncia de praacuteticas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees hospitalares e o
uso irracional de antimicrobianos de forma empiacuterica e inadequada (KUMARASAMY
et al 2010) Ateacute o momento os mecanismos de resistecircncia aos cabapenecircmicos
geralmente encontrado eram a produccedilatildeo de ESBL (CTX-M) somada aacute perda de
porina (CARVALHAES et al 2010) Foi notado a partir do ano de 2008 um
aumento no nuacutemero de K pneumoniae produtoras de KPC-2 apresentando outra
forma de resistecircncia (GALES 2012)
Um estudo mostrou que o perfil do paciente colonizado ou infectado por KPC
foi de um paciente entre os 33 e os 82 anos de idade internado haacute mais de 1
semana no hospital A mortalidade geral nos uacuteltimos anos ficou em torno de 7
sendo que dos 77 pacientes estudados 32 (415) pacientes evoluiacuteram para oacutebito
evidenciando a alta morbi-mortalidade associada (ALVES A P et al 2013)
Em estudo com 2316 pacientes avaliados a populaccedilatildeo de sexo masculino foi
de 526 idade meacutedia global de 53 anos (mediana de 55 anos) permanecircncia meacutedia
de 58 dias (mediana de 3 dias) (OLIVEIRA A C et al 2010) Outros trabalhos
apresentaram ausecircncia de significacircncia entre sexoidade e o desenvolvimento de
infecccedilotildees por microrganismos resistentes (PERES-BOTA D et al 2003 COLPAN
A et al 2005 COELLO R et al 1997)
Outro estudo utilizou um total de 30 amostras sendo elas isoladas de urina
escarro secreccedilatildeo pleural ponta de cateter aspirado traqueal e hemocultura A mais
prevalente foi em urina (40) Entre as 30 cepas analisadas a maior porcentagem
foi da cepa Klebsiella pneumoniae (70) Enterobacter sp (133) Klebsiella
ozaenae (10) Escherichia coli (333) e Klebsiella oxytoca (333)
(DIENSTMANN R et al 2010) Nos Estados Unidos a enzima KPC jaacute se tornou
endecircmica Foi realizada uma pesquisa em dois hospitais de Nova York onde
testaram 602 amostras e 45 apresentaram algum mecanismo de resistecircncia
sendo apenas 33 confirmadas por biologia molecular como KPC-2 (BRATU et
al 2005)
55
Estudo sobre os tipos de ESBL feito no Japatildeo apresentou o tipo Toho-1 como
o mais prevalente nessa pesquisa Ateacute o ano de 2000 ano em que foi publicado tal
estudo este era o primeiro relatoacuterio no Japatildeo para identificar derivados de ESBLs
como tipo de SHV e TEM entre E coli e K pneumoniae Em especial o tipo SHV- 12
foi identificado com uma maior frequumlecircncia Estes resultados indicam que tipos
distintos de ESBLs que satildeo diferentes em sua especificidade de substrato e origem
geneacutetica coexistem no Japatildeo Isto mostra a importacircncia de caracterizar genoacutetipos
distintos de ESBLs e de estar em alerta continuamente para as tendecircncias de
ESBLs no Japatildeo aleacutem da necessidade de uma interpretaccedilatildeo uniforme utilizando as
diretrizes do CSLI para relatar cepas produtoras de ESBL Aleacutem da detecccedilatildeo de
ESBLs satildeo necessaacuterias mais informaccedilotildees tais como o perfil de sensibilidade
especiacutefica para diversas β-lactacircmicos e o local da infecccedilatildeo Esses fatores satildeo
essenciais para a escolha adequada de antibioacuteticos (YAGI T et al 2000)
No ano de 2004 uma pesquisa avaliou a produccedilatildeo de uma enzima de
hidroacutelise de carbapenecircmicos atraveacutes da teacutecnica de sequumlenciamento foi revelado
um novo membro da famiacutelia KPC designado KPC- 3 Pesquisadores encontraram
em um mutante de K pneumoniae uma substituiccedilatildeo de um gene associado com
resistecircncia a Imipenem mas essa substituiccedilatildeo foi considerada improvaacutevel na
contribuiccedilatildeo da resistecircncia aos carbapenecircmicos da espeacutecie estudada Aleacutem da
resistecircncia aos carbapenecircmicos estes isolados eram em sua maioria resistentes agraves
cefalosporinas penicilinas e aminoglicosiacutedeos Usando estudos de transformaccedilatildeo
conjugaccedilatildeo e hibridaccedilatildeo localizaram o alelo blaKPC em plasmiacutedeo aleacutem disso
mostraram que esse alelo tambeacutem carregava uma resistecircncia aos aminoglicosiacutedeos
A transferecircncia das enzimas KPCs foi demonstrada in vitro tanto neste como em
outros estudos pode ser que os plasmiacutedeos que fazem esta transferecircncia estavam
comeccedilando a se espalhar no ambiente cliacutenico resultando na multiresistecircncia dessas
estirpes (WOODFORD et al 2004)
O presente estudo apresentou um vieacutes quanto aos resultados dos testes de
susceptibilidade microbiana Observou-se que natildeo foi encontrado resultado deste
teste em algumas amostras o que natildeo cooperou para um estudo mais preciso
futuros estudos quanto agraves amostras e um melhor acompanhamento deste tipo de
patologia Poreacutem mesmo sem algumas amostras com este resultado disponiacutevel foi
56
confirmada a presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos
carbapenecircmicos por meio dos genes de resistecircncia blaKPC e 16S rRNA que as
amostras apresentaram em sua maioria serem portadoras Quanto aos resultados
estatiacutesticos nenhuma das variaacuteveis apresentou significacircncia estatiacutestica (p gt 005)
mostrando assim que estas variaacuteveis isoladas natildeo foram o fator determinante para
o desfecho cliacutenico de alta ou oacutebito
57
7 CONCLUSAtildeO
Os genes blaKPC e 16S rRNA foram caracterizados confirmando a a
presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos carbapenecircmicos
Houve uma maior prevalecircncia da cepa K pneumoniae e isto confirma outros
estudos que apresentam a maior prevalecircncia desta cepa em amostras com KPC
Aleacutem disso isso justifica a forma popular da K pneumoniae ser chamada de KPC
enquanto que na verdade KPC eacute uma enzima podendo estar presente em outras
cepas como Enterobacter clocae tambeacutem apresentada no presente estudo O
desfecho cliacutenico de oacutebitos maior que 50 eacute um possiacutevel indicador sobre a
necessidade de se realizar um teste raacutepido para identificaccedilatildeo de KPC visando
iniciar o mais raacutepido possiacutevel o tratamento afim de diminuir a mortalidade por esta
infecccedilatildeo
Nenhuma das variaacuteveis isoladamente estaacute relacionada ao desfecho cliacutenico
oacutebito ou alta pois natildeo apresentaram relevacircncia estatiacutestica O presente estudo
mostrou que haacute presenccedila da bacteacuteria nas amostras de pacientes do hospital
estudado podendo entatildeo afirmar que este tipo de bacteacuteria se encontra tambeacutem
presente em ambiente hospitalar O uso irracional de antimicrobiano eacute demonstrado
de forma indireta quando foi apresentado atraveacutes do Teste de Hodge Modificado
uma resistecircncia de 100 aos antibioacuteticos carbapenecircmicos Isto tambeacutem reflete na
terapecircutica sendo que pacientes portadores de bacteacuterias resistentes aos
antibioacuteticos carabepecircmicos tem uma escassa opccedilatildeo de tratamento e as opccedilotildees
apresentam problemas quanto agrave toxicidade e eficaacutecia
58
REFEREcircNCIAS
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Mecanismos
de resistecircncia bacteriana aos antimicrobianos Disponiacutevel em
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controleopas_
webmodulo3mec_sitiohtmgt Acesso em 25 de abril de 2014
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Nota teacutecnica nordm
012013 medidas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees por enterobacteacuterias
multiresistentes Acesso em 17 de abril de 2013
ALBA J et al Kinetics study of KPC-3 a plasmid-encoded class A
carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase Antimicrob Agents Chemother
Nov49(11)4760-2 2005
ALVES A P et al Nosocomial infections by KPC-producing enterobacteria in
a tertiary hospital in Southern Brazil Revista da AMRIGS Porto Alegre 57 (3) 213-
218 jul-set 2013
ALVES A et al Tipagem Geneacutetica de Microrganismos Lab De Diversidade
Microbiana Centro de Biologia Celular Dep de Biologia U de Aveiro 3810-193
Aveiro- 2003
BELL J M et Al Prevalence and significance of a negative extended-
spectrum beta-lactamase (ESBL) confirmation test result after a positive ESBL
screening test result for isolates of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae
results from the SENTRY Asia-Pacific Surveillance Program J Clin Microbiol
May45(5)1478-82 2007
BRATU S et al Detection of KPC carbapenem-hydrolyzing enzymes in
Enterobacter spp from Brooklyn New York Antimicrob Agents Chemother v 49 n
2 p 776-8 2005
59
BRATU S et al Emergence of KPC-possessing Klebsiella pneumoniae in
Brooklyn New York epidemiology and recommendations for detection Antimicrob
Agents Chemother v 49 n 7 p 3018-20 2005
BRATU S et al Rapid spread of carbapenem-resistant Klebsiella
pneumoniae in New York City Arch Intern Med v 165 p 1430-5 2005
CAMARGO C F et al Aplicaccedilatildeo das teacutecnicas de pcr e suas teacutecnicas
derivadas em diagnoacutestico molecular Disponiacutevel em
ltfileDUnB10C2BA20semestreArtigosPCR-
20CLEYTON20FLORENCIO20DE20CAMARGO20E20PAULO20ROB
ERTO20QUEIROZpdfgtgt Acesso em 08 de abril de 2014
CARVALHES C G et al Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting
carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive
results Journal of Antimicrobial Chemotherapy v 65 n2 p 249-251 2010
CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION- CDC Modified
Hodge Test for Carbapenemase Detection in Enterobacteriaceae 2004
CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE Methods for
dilutionantimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically Approved
standard M7ndashA7 7th ed CLSI Wayne PA 2011
COELLO R et al Risk factors for developing clinical infection with methicillin-
resistant Staphylococcus aureus (MRSA) amongst hospital patients initially only
colonized with MRSA J Hosp Infect 19973739-46
COLPAN A et al Evaluation of risk factors for mortality in intensive care
units A prospective study from a referral hospital in Turkey Am J Infect Control
200533(1)42-7
60
CORNAGLIA G et al Living with ESBLs Introduction Clinical Microbiology
and Infection 14 Suppl 1 1-2 2008
COTRIM E R et al Klebsiella pneumoniae carbapenemase ndash KPC em
Enterobacteriaceae o desafio das bacteacuterias multirresistentes Poacutes em revista do
centro universitaacuterio Newton Paiva 12012 - ediccedilatildeo 5 - issn 2176 7785
DESHPANDE L M et al Occurrence and characterization of
carbapenemase-producing Enterobacteacuteriaceae report from the SENTRY
Antimicrobial Surveillance Program (2000-2004) Microb Drug Resist 12(4)223-30
2006
DIAS D J A Estudos dos principais mecanismos de resistecircncia aos
antibioacuteticos β-lactacircmicos em bacteacuterias patogecircnicas gram negativas 2009 100 f
Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Geneacutetica Molecular e Biomedicina) ndash Faculdade de
Ciecircncias e Tecnologia Universidade de Nova Lisboa Lisboa
DIENSTMANN R et al Avaliaccedilatildeo fenotiacutepica da enzima Klebsiella
pneumoniae carbapenemase (KPC) em Enterobacteriaceae de ambiente hospitalar
J Bras Patol Med Lab v 46 n 1 p 23-27 fevereiro 2010
ENDIMIAMI A et al Emergence of blaKPC-containing Klebsiella
pneumoniae in a long-term acute care hospital a new challenge to our healthcare J
Antimicrob Chemother 64 1102-1110 Nov 2009
FALAGAS M E et al Extended-spectrum beta-lactamase producing
organisms The Journal of Hospital Infection 73 (4) pp 345-54 2009
FONTANA C et al Emergence of KPC-producing Klebsiella pneumoniae in
Italy BMC Rev Notes 3 40 2010
61
GALES A C et al Antimicrobial resistance among Gram-negative bacilli
isolated from Latin America results from Sentry Antimicrobial Surveillance Program
(Latin America 2008-2010) Diagnostic Microbiology and Infectious Disease v 3 n
4 p 354 -360 2012
GUPTA N et al Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Epidemiology
and Prevention HEALTHCARE EPIDEMIOLOGY Clinical Infectious Diseases
201153(1)60ndash67 Published by Oxford University Press on behalf of the Infectious
Diseases Society of America 2011
HARBOTTLE H et al Genetics of antimicrobial resistance Anim Biotechnol
n17 p111-124 2006
HENRIQUE W N et al RESISTEcircNCIA BACTERIANA Uniatildeo das
Faculdades Alfredo NasserInstituto de Ciecircncias da Sauacutede Disponiacutevel em lt
httpwwwfaculdadealfredonasseredubrfilespesquisaposter20HENRIQUE20
Wilker20Natividade20SANTIAGO20Silvania20CAVALCANTI20DSP
20ResistC3AAncia20Bacterianapdfgt Acesso em 17 marccedilo 2014
HULSCHER M E J I et al Antibiotic prescribing in hospital a social and
behavioral scientific approach The Lancet Infectious Diaseases v 10 n 3 p 167-
165 2010
KIDWAI M SAPRA P BHUSHAN KR Synthetic strategies and medicinal
properties of beta-lactams Curr Med Chem 1999 695-215
KUMARASAMY K K et al Emergence of a new antibiotic resistance
mechanism in India Pakistan and the UK a molecular biological and
epidemiological stuy The Lancet Infectious Diseases v10 n 9 p 597- 602 2010
LINCOPAN N et al Enterobacteacuteria producing extended-spectrum β-
lacatamases and IMP-1 Metalo-β-lactamases isolated from Brazilian hospitals J Med
62
Microbiol 7 1-3 2006
LINCOPAN N et al First Isolation of Metalo-β-Lacatamase-Producing
Multiresistant Klebsiella pneumoniae from a patient in Brazil J Clin Microbiol 43(1)
516-519 2005
LIVERMORE D M et al What remains against carbapenem- resistant
Enterobacteriaceae Evaluation of choramphenicol ciprofloxacin colistina
fosfomycin minocycline nitrofurantoin temocilin and tigecycline International
Journal of Antimicrobial Agents v 37 n 5 p 415- 459 2011
LIVERMORE D M Fourten years in resistance International Journal of
Antimicrobial Agents v 39 283- 294 2012
LIVERMORE D M Bacterial resistance to carbapenems Adv Exp Med Biol
1995 39025-47
LIVERMORE D M Bacterial resistance origins epidemiology and impact
Clin Infect Dis 36S11-S23 2003
LIVERMORE D M et al Carbapenemases a problem in waiting Curr
Opin Microbiol 2000 3489-95
LU et al Universal pcr for common bacterial pathogens J CLIN
MICROBIOL VOL 38 2000
LU et al Use of PCR with Universal Primers and Restriction Endonuclease
Digestions for Detection and Identification of Common Bacterial Pathogens in
Cerebrospinal Fluid Journal of Clinical Microbiology June 2000 p 2076ndash2080
MARSCHALL J Met al Presence of the KPC Carbapenemase Gene in
Enterobacteriaceae Causing Bacteremia and Its Correlation with In Vitro
Carbapenem Susceptibility J Clin Microbiol 47 239-241 Jan 2009
63
MARTINS WMBS et al Prevalecircncia do gene blaKPC em isolados cliacutenicos
de Enterobacteriaceae e natildeo fermentadores encontrados em amostras clinicas em
um hospital universitaacuterio do Recife X Jornada de ensino pesquisa e extensatildeo ndash
JEPEX 2010 ndash UFRPE Recife 18 a 22 de outubro
MENDES C A C et al Polimixinas Revisatildeo com ecircnfase na sua
nefrotoxicidade Rev Assoc Med Bras 2009 55(6) 752-9
MOHR J F 3rd Update on the efficacy and tolerability of meropenem in the
treatment of serious bacteacuterial infections Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S41-51
2008
MONTEIRO J et al First report of KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae
strains in Brazil Antimicrob Agents Chemother Jan53(1)333-4 2009
MOREIRA V C et al Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia a antibioacuteticos
Disponiacutevel em
lthttpwwwcpglsucgbr6mostraartigosSAUDEVANESSA20CARVALHO20M
OREIRApdfgt Acesso em 21 marccedilo 2014
NETIKUL T et al Emergence of novel blaKPC-12 and blaKPC-13 variants in
carbapenem non-susceptible Enterobacter cloacae a first report of blaKPC gene in
Thailand European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases May
S372 2011
NETO V A et al Antibioacuteticos na praacutetica Meacutedica 6ordf Ediccedilatildeo Editorial
SarverSP Brasil 2007
NICOLAU D P Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of
meropenem Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S32-40 2008
64
OLIVEIRA A C et al Resistecircncia bacteriana e mortalidade em um centro de
terapia intensiva Rev Latino-Am Enfermagem nov-dez 2010
PAAUW A et al Failure to control an outbreak of qnrA 1-positive multidrug-
resistant Enterobacter clocae despite adequate implementation of recommended
infection control measures Journal of Clinical Microbiology v 45 n 5 p 1420-1425
2007
PATERSON D L et al Extended-Spectrum Beta-Lactamases a Clinical
Update Clinical Microbiology Reviews v 18 p 657-686 2005
PEIRANO G et al Carbapenem-hydrolysing beta-lactamase KPC-2 in
Klebsiella pneumonia isolated in Rio de Janeiro Brazil J Antimicrob Chemother Nov
20 2009
PERES-BOTA D et al Are infections due to resistant pathogens associated
with worse outcome in critically ill patients J Infect 200347(4)307-16
PIDDOCK L J V Clinically relevant chromosomally encoded multidrug
resistance effl ux pumps in bacterial Clin Microbiol Rev n19 p382-402 2006
PITOUT J D D et al Emergence of Enterobacteriaceae producing
extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) in the community J Antimicrob
Chemother May 56 2005
POSSEBON M I et al Resistecircncia bacteriana aos carbapenecircmicos
Bacterial resitence to carbapenems RBM rev bras med60(6)378380-378-382
jun 2003
QUEENAN A M et al Carbapenemases the versatile beta-lactamases
Clin Microbiol Rev Jul20(3)440-58 2007
65
RHOMBERG P R et al Summary trends for the meropenem yearly
susceptibility test information collection program a 10- year experience in the United
States (1999-2008) Diagnostic Microbiology and Infectiois Disease v 65 n4 p
414-426 2009
ROBLEDO I E et al Detection of KPC in Acinetobacter spp in Puerto Rico
J Antimicrob Agents Chemother 54 1354-1357 Mar 2010
ROGERS B A et al Country-to-country transfer os patients and the risk of
multi-resistant bacterial infection Clinical Infectious Disease v53 n1 p49- 56
2011
SHAH A A et al Characteristics epidemiology and clinicalimportance of
emerging strains of Gram-negative bacilli producing extended-spectrum
betalactamases Research in Microbiology v 155 p 409-421 2004
TURNER P J Extended- Spectrum Beta-Lactamases Clinical Infectious
Diseases v 41 p 273-275 2005
WOLTER D J et al Phenotypic and Enzymatic Comparative Analysis
between the Novel KPC variant KPC-5 and Its Evolutionary Variants KPC-2 and
KPC-4 Antimicrob Agents Chemother Nov 17 2008
WOODFORD N et al Carbapenemases of Chryseobacterium
(Flavobacterium) meningosepticum distribution of blaB and characterization of a
novel Metalo-beta-lactamase gene blaB3 in the type strain NCTC 10016
Antimicrob Agents Chemother Jun44(6)1448-52 2000
WOODFORF N Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in
India Pakistan and the UK a molecular biological and epidemiological study The
Lancet Infectious Diseases v 10 n 9 p 597-602 2010
66
WOODFORD et al Outbreak of Klebsiella pneumoniae Producing a New
Carbapenem- Hydrolyzing Class A β-Lactamase KPC-3 in a New York Medical
Center Antimicrobial agents and chemotherapy Dec 2004 p 4793ndash4799 Vol 48
No 12
YAGI T et al A preliminary survey of extended-spectrum β-lactamases
(ESBLs) in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Japan
FEMS Microbiology Letters 184 (2000) 53-56
YIGIT H et al Novel carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase KPC-1 from
a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumonia J Antimicrob Agents
Chemother 45 (4) 1151-1161 (2001)
ZAVASCKI A P et al KPC-2- producing Enterobacter cloacae in two cities
from Southern Brazil Int J Antimicrob Agents Apr 28 2009
ZHANEL G G et al Comparative review of the carbapenecircmicos Drugs
67(7)1027-52 2007
67
ANEXOS
Sequumlecircncia do oligo blaKPC
Query 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
Query 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
Query 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
68
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
Query 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
Query 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
69
Query 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
Query 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
Query 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
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|||||||
70
Sbjct 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
Query 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
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Sbjct 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
Query 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
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Sbjct 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
Query 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
71
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Sbjct 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
Query 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Sbjct 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
Query 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
72
Query 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
Query 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
Query 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
73
Sbjct 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
Query 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
Query 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
Query 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
74
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
Query 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
Query 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
75
Query 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
Query 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
||||
Sbjct 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
LOCUS AF297554 1377 bp
DNA linear BCT 26-MAR-2001
DEFINITION Klebsiella pneumoniae carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
gene complete cds
ACCESSION AF297554
VERSION AF2975541 GI10121874
76
KEYWORDS
SOURCE Klebsiella pneumoniae
ORGANISM Klebsiella pneumoniae
Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Enterobacteriaceae Klebsiella
REFERENCE 1 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH QueenanAM
AndersonGJ Domenech-SanchezA
BiddleJW StewardCD
AlbertiS BushK and TenoverFC
TITLE Novel carbapenem-hydrolyzing beta-
lactamase KPC-1 from a
carbapenem-resistant strain of
Klebsiella pneumoniae
JOURNAL Antimicrob Agents Chemother 45 (4)
1151-1161 (2001)
PUBMED 11257029
REFERENCE 2 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH AndersonGJ and
TenoverFC
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (19-AUG-2000) Nosocomial
Pathogens Laboratory Branch
Centers for Disease Control and
Prevention 1600 Clifton Rd MS
G08 Atlanta GA 30333 USA
FEATURES LocationQualifiers
77
source 11377
organism=Klebsiella
pneumoniae
mol_type=genomic DNA
db_xref=taxon573
-35_signal 5560
-10_signal 7883
mRNA 921012
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
RBS 117122
CDS 1311012
note=blaKPC-1
codon_start=1
transl_table=11
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
protein_id=AAG134101
db_xref=GI10121875
translation=MSLYRRLVLLSCLSWPLAGFSATALTNLVAEPFAKLEQD
FGGSI
GVYAMDTGSGATVSYRAEERFPLCSSFKGFLAAAVLARSQQQAGLLDTPIRYG
KNALV
PWSPISEKYLTTGMTVAELSAAAVQYSDNAAANLLLKELGGPAGLTAFMRSIG
DTTFR
78
LDRWELELNSAIPSDARDTSSPRAVTESLQKLTLGSALAAPQRQQFVDWLKGN
TTGNH
RIRAAVPADWAVGDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTRAPNKDDK
HSEAV
IAAAARLALEGLGVNGQ
ORIGIN
1 cggggcagtt acagccgtta cagcctctgg
agagggagcg gcttgccgct cggtgataat
61 cccagctgta gcggcctgat tacatccggc
cgctacacct agctccacct tcaaacaagg
121 aatatcgttg atgtcactgt atcgccgtct
agttctgctg tcttgtctct catggccgct
181 ggctggcttt tctgccaccg cgctgaccaa
cctcgtcgcg gaaccattcg ctaaactcga
241 acaggacttt ggcggctcca tcggtgtgta
cgcgatggat accggctcag gcgcaactgt
301 aagttaccgc gctgaggagc gcttcccact
gtgcagctca ttcaagggct ttcttgctgc
361 cgctgtgctg gctcgcagcc agcagcaggc
cggcttgctg gacacaccca tccgttacgg
421 caaaaatgcg ctggttccgt ggtcacccat
ctcggaaaaa tatctgacaa caggcatgac
481 ggtggcggag ctgtccgcgg ccgccgtgca
atacagtgat aacgccgccg ccaatttgtt
541 gctgaaggag ttgggcggcc cggccgggct
gacggccttc atgcgctcta tcggcgatac
79
601 cacgttccgt ctggaccgct gggagctgga
gctgaactcc gccatcccaa gcgatgcgcg
661 cgatacctca tcgccgcgcg ccgtgacgga
aagcttacaa aaactgacac tgggctctgc
721 actggctgcg ccgcagcggc agcagtttgt
tgattggcta aagggaaaca cgaccggcaa
781 ccaccgcatc cgcgcggcgg tgccggcaga
ctgggcagtc ggagacaaaa ccggaacctg
841 cggagtgtat ggcacggcaa atgactatgc
cgtcgtctgg cccactgggc gcgcacctat
901 tgtgttggcc gtctacaccc gggcgcctaa
caaggatgac aagcacagcg aggccgtcat
961 cgccgctgcg gctagactcg cgctcgaggg
attgggcgtc aacgggcagt aaggctctga
1021 aaatcatcta ttggcccacc accgccgccc
ttgcgggcgg catggattac caaccactgt
1081 cacatttagg ctaggagtct gcgcggcaga
gccgtgtgac cggttttctg tagagcactg
1141 acgatggcgg cggcgctctc tgcaattggc
aaggcgtcgg cgccaaggat accaatcttg
1201 cggcgcgcgg cgtgttatga cgactggggt
gcatttgagc cgccccattt aaccttcgcc
1261 ctcacagata cgccattcgc ctcaaattta
gcgccatgca gacgagcttc cactcggctt
1321 gcaccttgtc caggcccctc atgctgaact
gacgcaatcc catcaccgcc ttgatca
80
49
Figura 14 Isolado de KPC segundo microrganismo encontrado em 17
pacientes investigados no HRAN no periacuteodo de 2010 aacute 2011
5 2 5 Relaccedilotildees variaacuteveis relativas agrave infecccedilatildeo bacteriana e desfecho
cliacutenico
Tabela 6 ndash Distribuiccedilatildeo do perfil geneacutetico sexo coleta tipificaccedilatildeo de
microrganismos e anaacutelise da resistecircncia bacteriana segundo o desfecho
cliacutenico Brasiacutelia-DF 2010 a 2011
Variaacutevel Resultado
Desfecho
Alta Oacutebito
N N P
Gene 16S rRNA Positivo 7 1000 10 1000
NA Gene blaKPC Positivo 6 857 10 1000
Negativo 1 143 0 00 0218 Sexo Feminino 2 286 6 600
Masculino 5 714 4 400 0201 Local da coleta Fundo saco de
Douglas 1 143 0 00
Hemocultura 0 00 1 100 0463 Ponta de cateter 1 143 2 200
Sec TraquealBrocircnquica
0 00 1 100
50
Secreccedilatildeo traqueal 2 286 0 00
Swab retal 3 429 5 500
Urina 0 00 1 100
Microrganismo Enterobacter cloacae (KPC)
1 143 1 100
Klebsiella pneumoniae
6 857 8 800
0416 Serratia
marcescens 0 00 1 100
Teste de Hodge Hodge positivo 7 1000 10 1000
NA Amicacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 1 100 0848 resistente 0 00 1 100
sensiacutevel 2 286 3 300
Amoxicilina Aacutecido Clavulacircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Ampicilina Sulbactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ampicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Aztreonan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefazolina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Cefoperazona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Cefotaxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefoxitina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0509 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 2 286 4 400
Ceftazidima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cetriaxona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 3 429 5 500 0772 Cefalotina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ciprofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772
51
resistente 3 429 5 500
Claritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Clindamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Eritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Gentamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0942 resistente 2 286 3 300
sensiacutevel 1 143 2 200
Imipenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 0 00 2 200 0193 Resistente 1 143 3 300
sensiacutevel 2 286 0 00
Nitrofurantoiacutena sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Norfloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Oxacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Penicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Piperacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Rifampicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tetraciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Ticarcilina Aacutecido Clavulocircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0688 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 3 429 4 400
Tobramicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Trimetoprima Sulfametoxazol
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0112 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 2 286 0 00
Vancomicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tigeciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediario 0 00 1 100 0211 natildeo testado 1 143 4 400
resistente 2 286 0 00
52
Cefepime sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefuroxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Levofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Piperacilina Tazobactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Ertapenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Meropenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0223 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 1 143 0 00
Cefotetan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 sensiacutevel 0 00 1 100
Gemifloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 7 700 0585 natildeo testado 3 429 3 300
Desfecho
Alta Oacutebito
Meacutedia Erro
padratildeo Meacutedia Erro
padratildeo p
Idade 58 9 59 5 0991
Tempo Internaccedilatildeo (dias)
50 13 46 12 0571
n= 17 p(lt 005) NA natildeo se aplica
53
6 DISCUSSAtildeO
Nos uacuteltimos anos houve um aumento na incidecircncia de bacteacuterias
multirresistentes aos antimicrobianos no ambiente hospitalar tornando isto um
problema mundial de sauacutede puacuteblica (HULSCHER et al 2010) Quando se trata
principalmente de bacilos Gram negativos a frequumlecircncia destas bacteacuterias eacute ainda
maior em paiacuteses da Ameacuterica Latina quando comparada a paiacuteses desenvolvidos
(GALES etal 2012)
De acordo com dados do ldquoMeropenem Yearly Susceptibility Test Information
Collectionrdquo (MYSTIC) ocorreu nos Estados Unidos um aumento na susceptibilidade
de K pneumoniae nos uacuteltimos anos graccedilas a praacuteticas de controle de disseminaccedilatildeo
de amostras resistentes(RHOMBERG P R et al 2009) O aumento crescente da
prevalecircncia destes microrganismos foi proporcional ao aumento da dependecircncia do
uso de antibioacuteticos carbapenecircmicos considerados como a opccedilatildeo terapecircutica para o
tratamento de infecccedilotildees por bacilos Gram negativos multi-resistentes (LIVERMORE
2012) Isto afeta diretamente as opccedilotildees de tratamento sobrando poucas alternativas
para a terapecircutica que incluem colistina (polimixina E) e tigeciclina que apresentam
respectivamente problemas em termos de toxicidade e eficaacutecia (LIVERMORE et
al 2011) Um dos efeitos adversos mais importantes das poliminas B e E por
exemplo satildeo a neurotoxicidade e nefrotoxicidade (MENDES C A C et al2009 )
Devido agrave resistecircncia ser usualmente de natureza plasmidial e portanto de
maior disseminaccedilatildeo especialmente quando carreadas por K pneumoniae
microrganismo com uma notoacuteria capacidade para acumular e transferir plasmiacutedeos
com determinantes para resistecircncia o nuacutemero de casos detectados pelo
fenoacutetipogenoacutetipo blaKPC eacute bastante preocupante (MONTEIRO et al 2009)
Comparada com outras bacteacuterias hospitalares a transmissatildeo de clones
multirresistentes de K pneumoniae eacute maior e podem natildeo ser controladas pelos
meacutetodos de controle de infecccedilatildeo hospitalar (PAAUW et al 2007) A forma
plasmidial para transferecircncia da resistecircncia adicionada a este grande potencial para
disseminaccedilatildeo de clones resistentes eacute preocupante visto que apoacutes surtos muitas
vezes pode se tornar endecircmica Jaacute eacute uma realidade a disseminaccedilatildeo desta bacteacuteria
54
entre pacientes hospitais paiacuteses e ateacute mesmo continentes (WOODFORF et al
2010 ROGERS et al 2011)
As chances de surtos satildeo maiores em paiacuteses com poucos recursos devido agrave
maior carecircncia de praacuteticas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees hospitalares e o
uso irracional de antimicrobianos de forma empiacuterica e inadequada (KUMARASAMY
et al 2010) Ateacute o momento os mecanismos de resistecircncia aos cabapenecircmicos
geralmente encontrado eram a produccedilatildeo de ESBL (CTX-M) somada aacute perda de
porina (CARVALHAES et al 2010) Foi notado a partir do ano de 2008 um
aumento no nuacutemero de K pneumoniae produtoras de KPC-2 apresentando outra
forma de resistecircncia (GALES 2012)
Um estudo mostrou que o perfil do paciente colonizado ou infectado por KPC
foi de um paciente entre os 33 e os 82 anos de idade internado haacute mais de 1
semana no hospital A mortalidade geral nos uacuteltimos anos ficou em torno de 7
sendo que dos 77 pacientes estudados 32 (415) pacientes evoluiacuteram para oacutebito
evidenciando a alta morbi-mortalidade associada (ALVES A P et al 2013)
Em estudo com 2316 pacientes avaliados a populaccedilatildeo de sexo masculino foi
de 526 idade meacutedia global de 53 anos (mediana de 55 anos) permanecircncia meacutedia
de 58 dias (mediana de 3 dias) (OLIVEIRA A C et al 2010) Outros trabalhos
apresentaram ausecircncia de significacircncia entre sexoidade e o desenvolvimento de
infecccedilotildees por microrganismos resistentes (PERES-BOTA D et al 2003 COLPAN
A et al 2005 COELLO R et al 1997)
Outro estudo utilizou um total de 30 amostras sendo elas isoladas de urina
escarro secreccedilatildeo pleural ponta de cateter aspirado traqueal e hemocultura A mais
prevalente foi em urina (40) Entre as 30 cepas analisadas a maior porcentagem
foi da cepa Klebsiella pneumoniae (70) Enterobacter sp (133) Klebsiella
ozaenae (10) Escherichia coli (333) e Klebsiella oxytoca (333)
(DIENSTMANN R et al 2010) Nos Estados Unidos a enzima KPC jaacute se tornou
endecircmica Foi realizada uma pesquisa em dois hospitais de Nova York onde
testaram 602 amostras e 45 apresentaram algum mecanismo de resistecircncia
sendo apenas 33 confirmadas por biologia molecular como KPC-2 (BRATU et
al 2005)
55
Estudo sobre os tipos de ESBL feito no Japatildeo apresentou o tipo Toho-1 como
o mais prevalente nessa pesquisa Ateacute o ano de 2000 ano em que foi publicado tal
estudo este era o primeiro relatoacuterio no Japatildeo para identificar derivados de ESBLs
como tipo de SHV e TEM entre E coli e K pneumoniae Em especial o tipo SHV- 12
foi identificado com uma maior frequumlecircncia Estes resultados indicam que tipos
distintos de ESBLs que satildeo diferentes em sua especificidade de substrato e origem
geneacutetica coexistem no Japatildeo Isto mostra a importacircncia de caracterizar genoacutetipos
distintos de ESBLs e de estar em alerta continuamente para as tendecircncias de
ESBLs no Japatildeo aleacutem da necessidade de uma interpretaccedilatildeo uniforme utilizando as
diretrizes do CSLI para relatar cepas produtoras de ESBL Aleacutem da detecccedilatildeo de
ESBLs satildeo necessaacuterias mais informaccedilotildees tais como o perfil de sensibilidade
especiacutefica para diversas β-lactacircmicos e o local da infecccedilatildeo Esses fatores satildeo
essenciais para a escolha adequada de antibioacuteticos (YAGI T et al 2000)
No ano de 2004 uma pesquisa avaliou a produccedilatildeo de uma enzima de
hidroacutelise de carbapenecircmicos atraveacutes da teacutecnica de sequumlenciamento foi revelado
um novo membro da famiacutelia KPC designado KPC- 3 Pesquisadores encontraram
em um mutante de K pneumoniae uma substituiccedilatildeo de um gene associado com
resistecircncia a Imipenem mas essa substituiccedilatildeo foi considerada improvaacutevel na
contribuiccedilatildeo da resistecircncia aos carbapenecircmicos da espeacutecie estudada Aleacutem da
resistecircncia aos carbapenecircmicos estes isolados eram em sua maioria resistentes agraves
cefalosporinas penicilinas e aminoglicosiacutedeos Usando estudos de transformaccedilatildeo
conjugaccedilatildeo e hibridaccedilatildeo localizaram o alelo blaKPC em plasmiacutedeo aleacutem disso
mostraram que esse alelo tambeacutem carregava uma resistecircncia aos aminoglicosiacutedeos
A transferecircncia das enzimas KPCs foi demonstrada in vitro tanto neste como em
outros estudos pode ser que os plasmiacutedeos que fazem esta transferecircncia estavam
comeccedilando a se espalhar no ambiente cliacutenico resultando na multiresistecircncia dessas
estirpes (WOODFORD et al 2004)
O presente estudo apresentou um vieacutes quanto aos resultados dos testes de
susceptibilidade microbiana Observou-se que natildeo foi encontrado resultado deste
teste em algumas amostras o que natildeo cooperou para um estudo mais preciso
futuros estudos quanto agraves amostras e um melhor acompanhamento deste tipo de
patologia Poreacutem mesmo sem algumas amostras com este resultado disponiacutevel foi
56
confirmada a presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos
carbapenecircmicos por meio dos genes de resistecircncia blaKPC e 16S rRNA que as
amostras apresentaram em sua maioria serem portadoras Quanto aos resultados
estatiacutesticos nenhuma das variaacuteveis apresentou significacircncia estatiacutestica (p gt 005)
mostrando assim que estas variaacuteveis isoladas natildeo foram o fator determinante para
o desfecho cliacutenico de alta ou oacutebito
57
7 CONCLUSAtildeO
Os genes blaKPC e 16S rRNA foram caracterizados confirmando a a
presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos carbapenecircmicos
Houve uma maior prevalecircncia da cepa K pneumoniae e isto confirma outros
estudos que apresentam a maior prevalecircncia desta cepa em amostras com KPC
Aleacutem disso isso justifica a forma popular da K pneumoniae ser chamada de KPC
enquanto que na verdade KPC eacute uma enzima podendo estar presente em outras
cepas como Enterobacter clocae tambeacutem apresentada no presente estudo O
desfecho cliacutenico de oacutebitos maior que 50 eacute um possiacutevel indicador sobre a
necessidade de se realizar um teste raacutepido para identificaccedilatildeo de KPC visando
iniciar o mais raacutepido possiacutevel o tratamento afim de diminuir a mortalidade por esta
infecccedilatildeo
Nenhuma das variaacuteveis isoladamente estaacute relacionada ao desfecho cliacutenico
oacutebito ou alta pois natildeo apresentaram relevacircncia estatiacutestica O presente estudo
mostrou que haacute presenccedila da bacteacuteria nas amostras de pacientes do hospital
estudado podendo entatildeo afirmar que este tipo de bacteacuteria se encontra tambeacutem
presente em ambiente hospitalar O uso irracional de antimicrobiano eacute demonstrado
de forma indireta quando foi apresentado atraveacutes do Teste de Hodge Modificado
uma resistecircncia de 100 aos antibioacuteticos carbapenecircmicos Isto tambeacutem reflete na
terapecircutica sendo que pacientes portadores de bacteacuterias resistentes aos
antibioacuteticos carabepecircmicos tem uma escassa opccedilatildeo de tratamento e as opccedilotildees
apresentam problemas quanto agrave toxicidade e eficaacutecia
58
REFEREcircNCIAS
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Mecanismos
de resistecircncia bacteriana aos antimicrobianos Disponiacutevel em
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controleopas_
webmodulo3mec_sitiohtmgt Acesso em 25 de abril de 2014
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Nota teacutecnica nordm
012013 medidas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees por enterobacteacuterias
multiresistentes Acesso em 17 de abril de 2013
ALBA J et al Kinetics study of KPC-3 a plasmid-encoded class A
carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase Antimicrob Agents Chemother
Nov49(11)4760-2 2005
ALVES A P et al Nosocomial infections by KPC-producing enterobacteria in
a tertiary hospital in Southern Brazil Revista da AMRIGS Porto Alegre 57 (3) 213-
218 jul-set 2013
ALVES A et al Tipagem Geneacutetica de Microrganismos Lab De Diversidade
Microbiana Centro de Biologia Celular Dep de Biologia U de Aveiro 3810-193
Aveiro- 2003
BELL J M et Al Prevalence and significance of a negative extended-
spectrum beta-lactamase (ESBL) confirmation test result after a positive ESBL
screening test result for isolates of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae
results from the SENTRY Asia-Pacific Surveillance Program J Clin Microbiol
May45(5)1478-82 2007
BRATU S et al Detection of KPC carbapenem-hydrolyzing enzymes in
Enterobacter spp from Brooklyn New York Antimicrob Agents Chemother v 49 n
2 p 776-8 2005
59
BRATU S et al Emergence of KPC-possessing Klebsiella pneumoniae in
Brooklyn New York epidemiology and recommendations for detection Antimicrob
Agents Chemother v 49 n 7 p 3018-20 2005
BRATU S et al Rapid spread of carbapenem-resistant Klebsiella
pneumoniae in New York City Arch Intern Med v 165 p 1430-5 2005
CAMARGO C F et al Aplicaccedilatildeo das teacutecnicas de pcr e suas teacutecnicas
derivadas em diagnoacutestico molecular Disponiacutevel em
ltfileDUnB10C2BA20semestreArtigosPCR-
20CLEYTON20FLORENCIO20DE20CAMARGO20E20PAULO20ROB
ERTO20QUEIROZpdfgtgt Acesso em 08 de abril de 2014
CARVALHES C G et al Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting
carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive
results Journal of Antimicrobial Chemotherapy v 65 n2 p 249-251 2010
CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION- CDC Modified
Hodge Test for Carbapenemase Detection in Enterobacteriaceae 2004
CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE Methods for
dilutionantimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically Approved
standard M7ndashA7 7th ed CLSI Wayne PA 2011
COELLO R et al Risk factors for developing clinical infection with methicillin-
resistant Staphylococcus aureus (MRSA) amongst hospital patients initially only
colonized with MRSA J Hosp Infect 19973739-46
COLPAN A et al Evaluation of risk factors for mortality in intensive care
units A prospective study from a referral hospital in Turkey Am J Infect Control
200533(1)42-7
60
CORNAGLIA G et al Living with ESBLs Introduction Clinical Microbiology
and Infection 14 Suppl 1 1-2 2008
COTRIM E R et al Klebsiella pneumoniae carbapenemase ndash KPC em
Enterobacteriaceae o desafio das bacteacuterias multirresistentes Poacutes em revista do
centro universitaacuterio Newton Paiva 12012 - ediccedilatildeo 5 - issn 2176 7785
DESHPANDE L M et al Occurrence and characterization of
carbapenemase-producing Enterobacteacuteriaceae report from the SENTRY
Antimicrobial Surveillance Program (2000-2004) Microb Drug Resist 12(4)223-30
2006
DIAS D J A Estudos dos principais mecanismos de resistecircncia aos
antibioacuteticos β-lactacircmicos em bacteacuterias patogecircnicas gram negativas 2009 100 f
Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Geneacutetica Molecular e Biomedicina) ndash Faculdade de
Ciecircncias e Tecnologia Universidade de Nova Lisboa Lisboa
DIENSTMANN R et al Avaliaccedilatildeo fenotiacutepica da enzima Klebsiella
pneumoniae carbapenemase (KPC) em Enterobacteriaceae de ambiente hospitalar
J Bras Patol Med Lab v 46 n 1 p 23-27 fevereiro 2010
ENDIMIAMI A et al Emergence of blaKPC-containing Klebsiella
pneumoniae in a long-term acute care hospital a new challenge to our healthcare J
Antimicrob Chemother 64 1102-1110 Nov 2009
FALAGAS M E et al Extended-spectrum beta-lactamase producing
organisms The Journal of Hospital Infection 73 (4) pp 345-54 2009
FONTANA C et al Emergence of KPC-producing Klebsiella pneumoniae in
Italy BMC Rev Notes 3 40 2010
61
GALES A C et al Antimicrobial resistance among Gram-negative bacilli
isolated from Latin America results from Sentry Antimicrobial Surveillance Program
(Latin America 2008-2010) Diagnostic Microbiology and Infectious Disease v 3 n
4 p 354 -360 2012
GUPTA N et al Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Epidemiology
and Prevention HEALTHCARE EPIDEMIOLOGY Clinical Infectious Diseases
201153(1)60ndash67 Published by Oxford University Press on behalf of the Infectious
Diseases Society of America 2011
HARBOTTLE H et al Genetics of antimicrobial resistance Anim Biotechnol
n17 p111-124 2006
HENRIQUE W N et al RESISTEcircNCIA BACTERIANA Uniatildeo das
Faculdades Alfredo NasserInstituto de Ciecircncias da Sauacutede Disponiacutevel em lt
httpwwwfaculdadealfredonasseredubrfilespesquisaposter20HENRIQUE20
Wilker20Natividade20SANTIAGO20Silvania20CAVALCANTI20DSP
20ResistC3AAncia20Bacterianapdfgt Acesso em 17 marccedilo 2014
HULSCHER M E J I et al Antibiotic prescribing in hospital a social and
behavioral scientific approach The Lancet Infectious Diaseases v 10 n 3 p 167-
165 2010
KIDWAI M SAPRA P BHUSHAN KR Synthetic strategies and medicinal
properties of beta-lactams Curr Med Chem 1999 695-215
KUMARASAMY K K et al Emergence of a new antibiotic resistance
mechanism in India Pakistan and the UK a molecular biological and
epidemiological stuy The Lancet Infectious Diseases v10 n 9 p 597- 602 2010
LINCOPAN N et al Enterobacteacuteria producing extended-spectrum β-
lacatamases and IMP-1 Metalo-β-lactamases isolated from Brazilian hospitals J Med
62
Microbiol 7 1-3 2006
LINCOPAN N et al First Isolation of Metalo-β-Lacatamase-Producing
Multiresistant Klebsiella pneumoniae from a patient in Brazil J Clin Microbiol 43(1)
516-519 2005
LIVERMORE D M et al What remains against carbapenem- resistant
Enterobacteriaceae Evaluation of choramphenicol ciprofloxacin colistina
fosfomycin minocycline nitrofurantoin temocilin and tigecycline International
Journal of Antimicrobial Agents v 37 n 5 p 415- 459 2011
LIVERMORE D M Fourten years in resistance International Journal of
Antimicrobial Agents v 39 283- 294 2012
LIVERMORE D M Bacterial resistance to carbapenems Adv Exp Med Biol
1995 39025-47
LIVERMORE D M Bacterial resistance origins epidemiology and impact
Clin Infect Dis 36S11-S23 2003
LIVERMORE D M et al Carbapenemases a problem in waiting Curr
Opin Microbiol 2000 3489-95
LU et al Universal pcr for common bacterial pathogens J CLIN
MICROBIOL VOL 38 2000
LU et al Use of PCR with Universal Primers and Restriction Endonuclease
Digestions for Detection and Identification of Common Bacterial Pathogens in
Cerebrospinal Fluid Journal of Clinical Microbiology June 2000 p 2076ndash2080
MARSCHALL J Met al Presence of the KPC Carbapenemase Gene in
Enterobacteriaceae Causing Bacteremia and Its Correlation with In Vitro
Carbapenem Susceptibility J Clin Microbiol 47 239-241 Jan 2009
63
MARTINS WMBS et al Prevalecircncia do gene blaKPC em isolados cliacutenicos
de Enterobacteriaceae e natildeo fermentadores encontrados em amostras clinicas em
um hospital universitaacuterio do Recife X Jornada de ensino pesquisa e extensatildeo ndash
JEPEX 2010 ndash UFRPE Recife 18 a 22 de outubro
MENDES C A C et al Polimixinas Revisatildeo com ecircnfase na sua
nefrotoxicidade Rev Assoc Med Bras 2009 55(6) 752-9
MOHR J F 3rd Update on the efficacy and tolerability of meropenem in the
treatment of serious bacteacuterial infections Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S41-51
2008
MONTEIRO J et al First report of KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae
strains in Brazil Antimicrob Agents Chemother Jan53(1)333-4 2009
MOREIRA V C et al Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia a antibioacuteticos
Disponiacutevel em
lthttpwwwcpglsucgbr6mostraartigosSAUDEVANESSA20CARVALHO20M
OREIRApdfgt Acesso em 21 marccedilo 2014
NETIKUL T et al Emergence of novel blaKPC-12 and blaKPC-13 variants in
carbapenem non-susceptible Enterobacter cloacae a first report of blaKPC gene in
Thailand European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases May
S372 2011
NETO V A et al Antibioacuteticos na praacutetica Meacutedica 6ordf Ediccedilatildeo Editorial
SarverSP Brasil 2007
NICOLAU D P Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of
meropenem Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S32-40 2008
64
OLIVEIRA A C et al Resistecircncia bacteriana e mortalidade em um centro de
terapia intensiva Rev Latino-Am Enfermagem nov-dez 2010
PAAUW A et al Failure to control an outbreak of qnrA 1-positive multidrug-
resistant Enterobacter clocae despite adequate implementation of recommended
infection control measures Journal of Clinical Microbiology v 45 n 5 p 1420-1425
2007
PATERSON D L et al Extended-Spectrum Beta-Lactamases a Clinical
Update Clinical Microbiology Reviews v 18 p 657-686 2005
PEIRANO G et al Carbapenem-hydrolysing beta-lactamase KPC-2 in
Klebsiella pneumonia isolated in Rio de Janeiro Brazil J Antimicrob Chemother Nov
20 2009
PERES-BOTA D et al Are infections due to resistant pathogens associated
with worse outcome in critically ill patients J Infect 200347(4)307-16
PIDDOCK L J V Clinically relevant chromosomally encoded multidrug
resistance effl ux pumps in bacterial Clin Microbiol Rev n19 p382-402 2006
PITOUT J D D et al Emergence of Enterobacteriaceae producing
extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) in the community J Antimicrob
Chemother May 56 2005
POSSEBON M I et al Resistecircncia bacteriana aos carbapenecircmicos
Bacterial resitence to carbapenems RBM rev bras med60(6)378380-378-382
jun 2003
QUEENAN A M et al Carbapenemases the versatile beta-lactamases
Clin Microbiol Rev Jul20(3)440-58 2007
65
RHOMBERG P R et al Summary trends for the meropenem yearly
susceptibility test information collection program a 10- year experience in the United
States (1999-2008) Diagnostic Microbiology and Infectiois Disease v 65 n4 p
414-426 2009
ROBLEDO I E et al Detection of KPC in Acinetobacter spp in Puerto Rico
J Antimicrob Agents Chemother 54 1354-1357 Mar 2010
ROGERS B A et al Country-to-country transfer os patients and the risk of
multi-resistant bacterial infection Clinical Infectious Disease v53 n1 p49- 56
2011
SHAH A A et al Characteristics epidemiology and clinicalimportance of
emerging strains of Gram-negative bacilli producing extended-spectrum
betalactamases Research in Microbiology v 155 p 409-421 2004
TURNER P J Extended- Spectrum Beta-Lactamases Clinical Infectious
Diseases v 41 p 273-275 2005
WOLTER D J et al Phenotypic and Enzymatic Comparative Analysis
between the Novel KPC variant KPC-5 and Its Evolutionary Variants KPC-2 and
KPC-4 Antimicrob Agents Chemother Nov 17 2008
WOODFORD N et al Carbapenemases of Chryseobacterium
(Flavobacterium) meningosepticum distribution of blaB and characterization of a
novel Metalo-beta-lactamase gene blaB3 in the type strain NCTC 10016
Antimicrob Agents Chemother Jun44(6)1448-52 2000
WOODFORF N Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in
India Pakistan and the UK a molecular biological and epidemiological study The
Lancet Infectious Diseases v 10 n 9 p 597-602 2010
66
WOODFORD et al Outbreak of Klebsiella pneumoniae Producing a New
Carbapenem- Hydrolyzing Class A β-Lactamase KPC-3 in a New York Medical
Center Antimicrobial agents and chemotherapy Dec 2004 p 4793ndash4799 Vol 48
No 12
YAGI T et al A preliminary survey of extended-spectrum β-lactamases
(ESBLs) in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Japan
FEMS Microbiology Letters 184 (2000) 53-56
YIGIT H et al Novel carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase KPC-1 from
a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumonia J Antimicrob Agents
Chemother 45 (4) 1151-1161 (2001)
ZAVASCKI A P et al KPC-2- producing Enterobacter cloacae in two cities
from Southern Brazil Int J Antimicrob Agents Apr 28 2009
ZHANEL G G et al Comparative review of the carbapenecircmicos Drugs
67(7)1027-52 2007
67
ANEXOS
Sequumlecircncia do oligo blaKPC
Query 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
Query 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
Query 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
68
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
Query 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
Query 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
69
Query 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
Query 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
Query 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
70
Sbjct 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
Query 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
Query 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
Query 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
71
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
Query 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
Query 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
72
Query 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
Query 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
Query 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
73
Sbjct 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
Query 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
Query 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
Query 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
74
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
Query 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
Query 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
75
Query 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
Query 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
||||
Sbjct 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
LOCUS AF297554 1377 bp
DNA linear BCT 26-MAR-2001
DEFINITION Klebsiella pneumoniae carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
gene complete cds
ACCESSION AF297554
VERSION AF2975541 GI10121874
76
KEYWORDS
SOURCE Klebsiella pneumoniae
ORGANISM Klebsiella pneumoniae
Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Enterobacteriaceae Klebsiella
REFERENCE 1 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH QueenanAM
AndersonGJ Domenech-SanchezA
BiddleJW StewardCD
AlbertiS BushK and TenoverFC
TITLE Novel carbapenem-hydrolyzing beta-
lactamase KPC-1 from a
carbapenem-resistant strain of
Klebsiella pneumoniae
JOURNAL Antimicrob Agents Chemother 45 (4)
1151-1161 (2001)
PUBMED 11257029
REFERENCE 2 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH AndersonGJ and
TenoverFC
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (19-AUG-2000) Nosocomial
Pathogens Laboratory Branch
Centers for Disease Control and
Prevention 1600 Clifton Rd MS
G08 Atlanta GA 30333 USA
FEATURES LocationQualifiers
77
source 11377
organism=Klebsiella
pneumoniae
mol_type=genomic DNA
db_xref=taxon573
-35_signal 5560
-10_signal 7883
mRNA 921012
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
RBS 117122
CDS 1311012
note=blaKPC-1
codon_start=1
transl_table=11
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
protein_id=AAG134101
db_xref=GI10121875
translation=MSLYRRLVLLSCLSWPLAGFSATALTNLVAEPFAKLEQD
FGGSI
GVYAMDTGSGATVSYRAEERFPLCSSFKGFLAAAVLARSQQQAGLLDTPIRYG
KNALV
PWSPISEKYLTTGMTVAELSAAAVQYSDNAAANLLLKELGGPAGLTAFMRSIG
DTTFR
78
LDRWELELNSAIPSDARDTSSPRAVTESLQKLTLGSALAAPQRQQFVDWLKGN
TTGNH
RIRAAVPADWAVGDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTRAPNKDDK
HSEAV
IAAAARLALEGLGVNGQ
ORIGIN
1 cggggcagtt acagccgtta cagcctctgg
agagggagcg gcttgccgct cggtgataat
61 cccagctgta gcggcctgat tacatccggc
cgctacacct agctccacct tcaaacaagg
121 aatatcgttg atgtcactgt atcgccgtct
agttctgctg tcttgtctct catggccgct
181 ggctggcttt tctgccaccg cgctgaccaa
cctcgtcgcg gaaccattcg ctaaactcga
241 acaggacttt ggcggctcca tcggtgtgta
cgcgatggat accggctcag gcgcaactgt
301 aagttaccgc gctgaggagc gcttcccact
gtgcagctca ttcaagggct ttcttgctgc
361 cgctgtgctg gctcgcagcc agcagcaggc
cggcttgctg gacacaccca tccgttacgg
421 caaaaatgcg ctggttccgt ggtcacccat
ctcggaaaaa tatctgacaa caggcatgac
481 ggtggcggag ctgtccgcgg ccgccgtgca
atacagtgat aacgccgccg ccaatttgtt
541 gctgaaggag ttgggcggcc cggccgggct
gacggccttc atgcgctcta tcggcgatac
79
601 cacgttccgt ctggaccgct gggagctgga
gctgaactcc gccatcccaa gcgatgcgcg
661 cgatacctca tcgccgcgcg ccgtgacgga
aagcttacaa aaactgacac tgggctctgc
721 actggctgcg ccgcagcggc agcagtttgt
tgattggcta aagggaaaca cgaccggcaa
781 ccaccgcatc cgcgcggcgg tgccggcaga
ctgggcagtc ggagacaaaa ccggaacctg
841 cggagtgtat ggcacggcaa atgactatgc
cgtcgtctgg cccactgggc gcgcacctat
901 tgtgttggcc gtctacaccc gggcgcctaa
caaggatgac aagcacagcg aggccgtcat
961 cgccgctgcg gctagactcg cgctcgaggg
attgggcgtc aacgggcagt aaggctctga
1021 aaatcatcta ttggcccacc accgccgccc
ttgcgggcgg catggattac caaccactgt
1081 cacatttagg ctaggagtct gcgcggcaga
gccgtgtgac cggttttctg tagagcactg
1141 acgatggcgg cggcgctctc tgcaattggc
aaggcgtcgg cgccaaggat accaatcttg
1201 cggcgcgcgg cgtgttatga cgactggggt
gcatttgagc cgccccattt aaccttcgcc
1261 ctcacagata cgccattcgc ctcaaattta
gcgccatgca gacgagcttc cactcggctt
1321 gcaccttgtc caggcccctc atgctgaact
gacgcaatcc catcaccgcc ttgatca
80
50
Secreccedilatildeo traqueal 2 286 0 00
Swab retal 3 429 5 500
Urina 0 00 1 100
Microrganismo Enterobacter cloacae (KPC)
1 143 1 100
Klebsiella pneumoniae
6 857 8 800
0416 Serratia
marcescens 0 00 1 100
Teste de Hodge Hodge positivo 7 1000 10 1000
NA Amicacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 1 100 0848 resistente 0 00 1 100
sensiacutevel 2 286 3 300
Amoxicilina Aacutecido Clavulacircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Ampicilina Sulbactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ampicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Aztreonan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefazolina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 0 00 1 100 0688 resistente 3 429 4 400
Cefoperazona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Cefotaxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefoxitina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0509 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 2 286 4 400
Ceftazidima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cetriaxona sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 3 429 5 500 0772 Cefalotina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Ciprofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772
51
resistente 3 429 5 500
Claritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Clindamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Eritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Gentamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0942 resistente 2 286 3 300
sensiacutevel 1 143 2 200
Imipenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 0 00 2 200 0193 Resistente 1 143 3 300
sensiacutevel 2 286 0 00
Nitrofurantoiacutena sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Norfloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Oxacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Penicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Piperacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Rifampicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tetraciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Ticarcilina Aacutecido Clavulocircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0688 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 3 429 4 400
Tobramicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Trimetoprima Sulfametoxazol
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0112 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 2 286 0 00
Vancomicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tigeciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediario 0 00 1 100 0211 natildeo testado 1 143 4 400
resistente 2 286 0 00
52
Cefepime sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefuroxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Levofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Piperacilina Tazobactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Ertapenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Meropenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0223 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 1 143 0 00
Cefotetan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 sensiacutevel 0 00 1 100
Gemifloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 7 700 0585 natildeo testado 3 429 3 300
Desfecho
Alta Oacutebito
Meacutedia Erro
padratildeo Meacutedia Erro
padratildeo p
Idade 58 9 59 5 0991
Tempo Internaccedilatildeo (dias)
50 13 46 12 0571
n= 17 p(lt 005) NA natildeo se aplica
53
6 DISCUSSAtildeO
Nos uacuteltimos anos houve um aumento na incidecircncia de bacteacuterias
multirresistentes aos antimicrobianos no ambiente hospitalar tornando isto um
problema mundial de sauacutede puacuteblica (HULSCHER et al 2010) Quando se trata
principalmente de bacilos Gram negativos a frequumlecircncia destas bacteacuterias eacute ainda
maior em paiacuteses da Ameacuterica Latina quando comparada a paiacuteses desenvolvidos
(GALES etal 2012)
De acordo com dados do ldquoMeropenem Yearly Susceptibility Test Information
Collectionrdquo (MYSTIC) ocorreu nos Estados Unidos um aumento na susceptibilidade
de K pneumoniae nos uacuteltimos anos graccedilas a praacuteticas de controle de disseminaccedilatildeo
de amostras resistentes(RHOMBERG P R et al 2009) O aumento crescente da
prevalecircncia destes microrganismos foi proporcional ao aumento da dependecircncia do
uso de antibioacuteticos carbapenecircmicos considerados como a opccedilatildeo terapecircutica para o
tratamento de infecccedilotildees por bacilos Gram negativos multi-resistentes (LIVERMORE
2012) Isto afeta diretamente as opccedilotildees de tratamento sobrando poucas alternativas
para a terapecircutica que incluem colistina (polimixina E) e tigeciclina que apresentam
respectivamente problemas em termos de toxicidade e eficaacutecia (LIVERMORE et
al 2011) Um dos efeitos adversos mais importantes das poliminas B e E por
exemplo satildeo a neurotoxicidade e nefrotoxicidade (MENDES C A C et al2009 )
Devido agrave resistecircncia ser usualmente de natureza plasmidial e portanto de
maior disseminaccedilatildeo especialmente quando carreadas por K pneumoniae
microrganismo com uma notoacuteria capacidade para acumular e transferir plasmiacutedeos
com determinantes para resistecircncia o nuacutemero de casos detectados pelo
fenoacutetipogenoacutetipo blaKPC eacute bastante preocupante (MONTEIRO et al 2009)
Comparada com outras bacteacuterias hospitalares a transmissatildeo de clones
multirresistentes de K pneumoniae eacute maior e podem natildeo ser controladas pelos
meacutetodos de controle de infecccedilatildeo hospitalar (PAAUW et al 2007) A forma
plasmidial para transferecircncia da resistecircncia adicionada a este grande potencial para
disseminaccedilatildeo de clones resistentes eacute preocupante visto que apoacutes surtos muitas
vezes pode se tornar endecircmica Jaacute eacute uma realidade a disseminaccedilatildeo desta bacteacuteria
54
entre pacientes hospitais paiacuteses e ateacute mesmo continentes (WOODFORF et al
2010 ROGERS et al 2011)
As chances de surtos satildeo maiores em paiacuteses com poucos recursos devido agrave
maior carecircncia de praacuteticas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees hospitalares e o
uso irracional de antimicrobianos de forma empiacuterica e inadequada (KUMARASAMY
et al 2010) Ateacute o momento os mecanismos de resistecircncia aos cabapenecircmicos
geralmente encontrado eram a produccedilatildeo de ESBL (CTX-M) somada aacute perda de
porina (CARVALHAES et al 2010) Foi notado a partir do ano de 2008 um
aumento no nuacutemero de K pneumoniae produtoras de KPC-2 apresentando outra
forma de resistecircncia (GALES 2012)
Um estudo mostrou que o perfil do paciente colonizado ou infectado por KPC
foi de um paciente entre os 33 e os 82 anos de idade internado haacute mais de 1
semana no hospital A mortalidade geral nos uacuteltimos anos ficou em torno de 7
sendo que dos 77 pacientes estudados 32 (415) pacientes evoluiacuteram para oacutebito
evidenciando a alta morbi-mortalidade associada (ALVES A P et al 2013)
Em estudo com 2316 pacientes avaliados a populaccedilatildeo de sexo masculino foi
de 526 idade meacutedia global de 53 anos (mediana de 55 anos) permanecircncia meacutedia
de 58 dias (mediana de 3 dias) (OLIVEIRA A C et al 2010) Outros trabalhos
apresentaram ausecircncia de significacircncia entre sexoidade e o desenvolvimento de
infecccedilotildees por microrganismos resistentes (PERES-BOTA D et al 2003 COLPAN
A et al 2005 COELLO R et al 1997)
Outro estudo utilizou um total de 30 amostras sendo elas isoladas de urina
escarro secreccedilatildeo pleural ponta de cateter aspirado traqueal e hemocultura A mais
prevalente foi em urina (40) Entre as 30 cepas analisadas a maior porcentagem
foi da cepa Klebsiella pneumoniae (70) Enterobacter sp (133) Klebsiella
ozaenae (10) Escherichia coli (333) e Klebsiella oxytoca (333)
(DIENSTMANN R et al 2010) Nos Estados Unidos a enzima KPC jaacute se tornou
endecircmica Foi realizada uma pesquisa em dois hospitais de Nova York onde
testaram 602 amostras e 45 apresentaram algum mecanismo de resistecircncia
sendo apenas 33 confirmadas por biologia molecular como KPC-2 (BRATU et
al 2005)
55
Estudo sobre os tipos de ESBL feito no Japatildeo apresentou o tipo Toho-1 como
o mais prevalente nessa pesquisa Ateacute o ano de 2000 ano em que foi publicado tal
estudo este era o primeiro relatoacuterio no Japatildeo para identificar derivados de ESBLs
como tipo de SHV e TEM entre E coli e K pneumoniae Em especial o tipo SHV- 12
foi identificado com uma maior frequumlecircncia Estes resultados indicam que tipos
distintos de ESBLs que satildeo diferentes em sua especificidade de substrato e origem
geneacutetica coexistem no Japatildeo Isto mostra a importacircncia de caracterizar genoacutetipos
distintos de ESBLs e de estar em alerta continuamente para as tendecircncias de
ESBLs no Japatildeo aleacutem da necessidade de uma interpretaccedilatildeo uniforme utilizando as
diretrizes do CSLI para relatar cepas produtoras de ESBL Aleacutem da detecccedilatildeo de
ESBLs satildeo necessaacuterias mais informaccedilotildees tais como o perfil de sensibilidade
especiacutefica para diversas β-lactacircmicos e o local da infecccedilatildeo Esses fatores satildeo
essenciais para a escolha adequada de antibioacuteticos (YAGI T et al 2000)
No ano de 2004 uma pesquisa avaliou a produccedilatildeo de uma enzima de
hidroacutelise de carbapenecircmicos atraveacutes da teacutecnica de sequumlenciamento foi revelado
um novo membro da famiacutelia KPC designado KPC- 3 Pesquisadores encontraram
em um mutante de K pneumoniae uma substituiccedilatildeo de um gene associado com
resistecircncia a Imipenem mas essa substituiccedilatildeo foi considerada improvaacutevel na
contribuiccedilatildeo da resistecircncia aos carbapenecircmicos da espeacutecie estudada Aleacutem da
resistecircncia aos carbapenecircmicos estes isolados eram em sua maioria resistentes agraves
cefalosporinas penicilinas e aminoglicosiacutedeos Usando estudos de transformaccedilatildeo
conjugaccedilatildeo e hibridaccedilatildeo localizaram o alelo blaKPC em plasmiacutedeo aleacutem disso
mostraram que esse alelo tambeacutem carregava uma resistecircncia aos aminoglicosiacutedeos
A transferecircncia das enzimas KPCs foi demonstrada in vitro tanto neste como em
outros estudos pode ser que os plasmiacutedeos que fazem esta transferecircncia estavam
comeccedilando a se espalhar no ambiente cliacutenico resultando na multiresistecircncia dessas
estirpes (WOODFORD et al 2004)
O presente estudo apresentou um vieacutes quanto aos resultados dos testes de
susceptibilidade microbiana Observou-se que natildeo foi encontrado resultado deste
teste em algumas amostras o que natildeo cooperou para um estudo mais preciso
futuros estudos quanto agraves amostras e um melhor acompanhamento deste tipo de
patologia Poreacutem mesmo sem algumas amostras com este resultado disponiacutevel foi
56
confirmada a presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos
carbapenecircmicos por meio dos genes de resistecircncia blaKPC e 16S rRNA que as
amostras apresentaram em sua maioria serem portadoras Quanto aos resultados
estatiacutesticos nenhuma das variaacuteveis apresentou significacircncia estatiacutestica (p gt 005)
mostrando assim que estas variaacuteveis isoladas natildeo foram o fator determinante para
o desfecho cliacutenico de alta ou oacutebito
57
7 CONCLUSAtildeO
Os genes blaKPC e 16S rRNA foram caracterizados confirmando a a
presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos carbapenecircmicos
Houve uma maior prevalecircncia da cepa K pneumoniae e isto confirma outros
estudos que apresentam a maior prevalecircncia desta cepa em amostras com KPC
Aleacutem disso isso justifica a forma popular da K pneumoniae ser chamada de KPC
enquanto que na verdade KPC eacute uma enzima podendo estar presente em outras
cepas como Enterobacter clocae tambeacutem apresentada no presente estudo O
desfecho cliacutenico de oacutebitos maior que 50 eacute um possiacutevel indicador sobre a
necessidade de se realizar um teste raacutepido para identificaccedilatildeo de KPC visando
iniciar o mais raacutepido possiacutevel o tratamento afim de diminuir a mortalidade por esta
infecccedilatildeo
Nenhuma das variaacuteveis isoladamente estaacute relacionada ao desfecho cliacutenico
oacutebito ou alta pois natildeo apresentaram relevacircncia estatiacutestica O presente estudo
mostrou que haacute presenccedila da bacteacuteria nas amostras de pacientes do hospital
estudado podendo entatildeo afirmar que este tipo de bacteacuteria se encontra tambeacutem
presente em ambiente hospitalar O uso irracional de antimicrobiano eacute demonstrado
de forma indireta quando foi apresentado atraveacutes do Teste de Hodge Modificado
uma resistecircncia de 100 aos antibioacuteticos carbapenecircmicos Isto tambeacutem reflete na
terapecircutica sendo que pacientes portadores de bacteacuterias resistentes aos
antibioacuteticos carabepecircmicos tem uma escassa opccedilatildeo de tratamento e as opccedilotildees
apresentam problemas quanto agrave toxicidade e eficaacutecia
58
REFEREcircNCIAS
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Mecanismos
de resistecircncia bacteriana aos antimicrobianos Disponiacutevel em
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controleopas_
webmodulo3mec_sitiohtmgt Acesso em 25 de abril de 2014
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Nota teacutecnica nordm
012013 medidas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees por enterobacteacuterias
multiresistentes Acesso em 17 de abril de 2013
ALBA J et al Kinetics study of KPC-3 a plasmid-encoded class A
carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase Antimicrob Agents Chemother
Nov49(11)4760-2 2005
ALVES A P et al Nosocomial infections by KPC-producing enterobacteria in
a tertiary hospital in Southern Brazil Revista da AMRIGS Porto Alegre 57 (3) 213-
218 jul-set 2013
ALVES A et al Tipagem Geneacutetica de Microrganismos Lab De Diversidade
Microbiana Centro de Biologia Celular Dep de Biologia U de Aveiro 3810-193
Aveiro- 2003
BELL J M et Al Prevalence and significance of a negative extended-
spectrum beta-lactamase (ESBL) confirmation test result after a positive ESBL
screening test result for isolates of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae
results from the SENTRY Asia-Pacific Surveillance Program J Clin Microbiol
May45(5)1478-82 2007
BRATU S et al Detection of KPC carbapenem-hydrolyzing enzymes in
Enterobacter spp from Brooklyn New York Antimicrob Agents Chemother v 49 n
2 p 776-8 2005
59
BRATU S et al Emergence of KPC-possessing Klebsiella pneumoniae in
Brooklyn New York epidemiology and recommendations for detection Antimicrob
Agents Chemother v 49 n 7 p 3018-20 2005
BRATU S et al Rapid spread of carbapenem-resistant Klebsiella
pneumoniae in New York City Arch Intern Med v 165 p 1430-5 2005
CAMARGO C F et al Aplicaccedilatildeo das teacutecnicas de pcr e suas teacutecnicas
derivadas em diagnoacutestico molecular Disponiacutevel em
ltfileDUnB10C2BA20semestreArtigosPCR-
20CLEYTON20FLORENCIO20DE20CAMARGO20E20PAULO20ROB
ERTO20QUEIROZpdfgtgt Acesso em 08 de abril de 2014
CARVALHES C G et al Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting
carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive
results Journal of Antimicrobial Chemotherapy v 65 n2 p 249-251 2010
CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION- CDC Modified
Hodge Test for Carbapenemase Detection in Enterobacteriaceae 2004
CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE Methods for
dilutionantimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically Approved
standard M7ndashA7 7th ed CLSI Wayne PA 2011
COELLO R et al Risk factors for developing clinical infection with methicillin-
resistant Staphylococcus aureus (MRSA) amongst hospital patients initially only
colonized with MRSA J Hosp Infect 19973739-46
COLPAN A et al Evaluation of risk factors for mortality in intensive care
units A prospective study from a referral hospital in Turkey Am J Infect Control
200533(1)42-7
60
CORNAGLIA G et al Living with ESBLs Introduction Clinical Microbiology
and Infection 14 Suppl 1 1-2 2008
COTRIM E R et al Klebsiella pneumoniae carbapenemase ndash KPC em
Enterobacteriaceae o desafio das bacteacuterias multirresistentes Poacutes em revista do
centro universitaacuterio Newton Paiva 12012 - ediccedilatildeo 5 - issn 2176 7785
DESHPANDE L M et al Occurrence and characterization of
carbapenemase-producing Enterobacteacuteriaceae report from the SENTRY
Antimicrobial Surveillance Program (2000-2004) Microb Drug Resist 12(4)223-30
2006
DIAS D J A Estudos dos principais mecanismos de resistecircncia aos
antibioacuteticos β-lactacircmicos em bacteacuterias patogecircnicas gram negativas 2009 100 f
Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Geneacutetica Molecular e Biomedicina) ndash Faculdade de
Ciecircncias e Tecnologia Universidade de Nova Lisboa Lisboa
DIENSTMANN R et al Avaliaccedilatildeo fenotiacutepica da enzima Klebsiella
pneumoniae carbapenemase (KPC) em Enterobacteriaceae de ambiente hospitalar
J Bras Patol Med Lab v 46 n 1 p 23-27 fevereiro 2010
ENDIMIAMI A et al Emergence of blaKPC-containing Klebsiella
pneumoniae in a long-term acute care hospital a new challenge to our healthcare J
Antimicrob Chemother 64 1102-1110 Nov 2009
FALAGAS M E et al Extended-spectrum beta-lactamase producing
organisms The Journal of Hospital Infection 73 (4) pp 345-54 2009
FONTANA C et al Emergence of KPC-producing Klebsiella pneumoniae in
Italy BMC Rev Notes 3 40 2010
61
GALES A C et al Antimicrobial resistance among Gram-negative bacilli
isolated from Latin America results from Sentry Antimicrobial Surveillance Program
(Latin America 2008-2010) Diagnostic Microbiology and Infectious Disease v 3 n
4 p 354 -360 2012
GUPTA N et al Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Epidemiology
and Prevention HEALTHCARE EPIDEMIOLOGY Clinical Infectious Diseases
201153(1)60ndash67 Published by Oxford University Press on behalf of the Infectious
Diseases Society of America 2011
HARBOTTLE H et al Genetics of antimicrobial resistance Anim Biotechnol
n17 p111-124 2006
HENRIQUE W N et al RESISTEcircNCIA BACTERIANA Uniatildeo das
Faculdades Alfredo NasserInstituto de Ciecircncias da Sauacutede Disponiacutevel em lt
httpwwwfaculdadealfredonasseredubrfilespesquisaposter20HENRIQUE20
Wilker20Natividade20SANTIAGO20Silvania20CAVALCANTI20DSP
20ResistC3AAncia20Bacterianapdfgt Acesso em 17 marccedilo 2014
HULSCHER M E J I et al Antibiotic prescribing in hospital a social and
behavioral scientific approach The Lancet Infectious Diaseases v 10 n 3 p 167-
165 2010
KIDWAI M SAPRA P BHUSHAN KR Synthetic strategies and medicinal
properties of beta-lactams Curr Med Chem 1999 695-215
KUMARASAMY K K et al Emergence of a new antibiotic resistance
mechanism in India Pakistan and the UK a molecular biological and
epidemiological stuy The Lancet Infectious Diseases v10 n 9 p 597- 602 2010
LINCOPAN N et al Enterobacteacuteria producing extended-spectrum β-
lacatamases and IMP-1 Metalo-β-lactamases isolated from Brazilian hospitals J Med
62
Microbiol 7 1-3 2006
LINCOPAN N et al First Isolation of Metalo-β-Lacatamase-Producing
Multiresistant Klebsiella pneumoniae from a patient in Brazil J Clin Microbiol 43(1)
516-519 2005
LIVERMORE D M et al What remains against carbapenem- resistant
Enterobacteriaceae Evaluation of choramphenicol ciprofloxacin colistina
fosfomycin minocycline nitrofurantoin temocilin and tigecycline International
Journal of Antimicrobial Agents v 37 n 5 p 415- 459 2011
LIVERMORE D M Fourten years in resistance International Journal of
Antimicrobial Agents v 39 283- 294 2012
LIVERMORE D M Bacterial resistance to carbapenems Adv Exp Med Biol
1995 39025-47
LIVERMORE D M Bacterial resistance origins epidemiology and impact
Clin Infect Dis 36S11-S23 2003
LIVERMORE D M et al Carbapenemases a problem in waiting Curr
Opin Microbiol 2000 3489-95
LU et al Universal pcr for common bacterial pathogens J CLIN
MICROBIOL VOL 38 2000
LU et al Use of PCR with Universal Primers and Restriction Endonuclease
Digestions for Detection and Identification of Common Bacterial Pathogens in
Cerebrospinal Fluid Journal of Clinical Microbiology June 2000 p 2076ndash2080
MARSCHALL J Met al Presence of the KPC Carbapenemase Gene in
Enterobacteriaceae Causing Bacteremia and Its Correlation with In Vitro
Carbapenem Susceptibility J Clin Microbiol 47 239-241 Jan 2009
63
MARTINS WMBS et al Prevalecircncia do gene blaKPC em isolados cliacutenicos
de Enterobacteriaceae e natildeo fermentadores encontrados em amostras clinicas em
um hospital universitaacuterio do Recife X Jornada de ensino pesquisa e extensatildeo ndash
JEPEX 2010 ndash UFRPE Recife 18 a 22 de outubro
MENDES C A C et al Polimixinas Revisatildeo com ecircnfase na sua
nefrotoxicidade Rev Assoc Med Bras 2009 55(6) 752-9
MOHR J F 3rd Update on the efficacy and tolerability of meropenem in the
treatment of serious bacteacuterial infections Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S41-51
2008
MONTEIRO J et al First report of KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae
strains in Brazil Antimicrob Agents Chemother Jan53(1)333-4 2009
MOREIRA V C et al Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia a antibioacuteticos
Disponiacutevel em
lthttpwwwcpglsucgbr6mostraartigosSAUDEVANESSA20CARVALHO20M
OREIRApdfgt Acesso em 21 marccedilo 2014
NETIKUL T et al Emergence of novel blaKPC-12 and blaKPC-13 variants in
carbapenem non-susceptible Enterobacter cloacae a first report of blaKPC gene in
Thailand European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases May
S372 2011
NETO V A et al Antibioacuteticos na praacutetica Meacutedica 6ordf Ediccedilatildeo Editorial
SarverSP Brasil 2007
NICOLAU D P Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of
meropenem Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S32-40 2008
64
OLIVEIRA A C et al Resistecircncia bacteriana e mortalidade em um centro de
terapia intensiva Rev Latino-Am Enfermagem nov-dez 2010
PAAUW A et al Failure to control an outbreak of qnrA 1-positive multidrug-
resistant Enterobacter clocae despite adequate implementation of recommended
infection control measures Journal of Clinical Microbiology v 45 n 5 p 1420-1425
2007
PATERSON D L et al Extended-Spectrum Beta-Lactamases a Clinical
Update Clinical Microbiology Reviews v 18 p 657-686 2005
PEIRANO G et al Carbapenem-hydrolysing beta-lactamase KPC-2 in
Klebsiella pneumonia isolated in Rio de Janeiro Brazil J Antimicrob Chemother Nov
20 2009
PERES-BOTA D et al Are infections due to resistant pathogens associated
with worse outcome in critically ill patients J Infect 200347(4)307-16
PIDDOCK L J V Clinically relevant chromosomally encoded multidrug
resistance effl ux pumps in bacterial Clin Microbiol Rev n19 p382-402 2006
PITOUT J D D et al Emergence of Enterobacteriaceae producing
extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) in the community J Antimicrob
Chemother May 56 2005
POSSEBON M I et al Resistecircncia bacteriana aos carbapenecircmicos
Bacterial resitence to carbapenems RBM rev bras med60(6)378380-378-382
jun 2003
QUEENAN A M et al Carbapenemases the versatile beta-lactamases
Clin Microbiol Rev Jul20(3)440-58 2007
65
RHOMBERG P R et al Summary trends for the meropenem yearly
susceptibility test information collection program a 10- year experience in the United
States (1999-2008) Diagnostic Microbiology and Infectiois Disease v 65 n4 p
414-426 2009
ROBLEDO I E et al Detection of KPC in Acinetobacter spp in Puerto Rico
J Antimicrob Agents Chemother 54 1354-1357 Mar 2010
ROGERS B A et al Country-to-country transfer os patients and the risk of
multi-resistant bacterial infection Clinical Infectious Disease v53 n1 p49- 56
2011
SHAH A A et al Characteristics epidemiology and clinicalimportance of
emerging strains of Gram-negative bacilli producing extended-spectrum
betalactamases Research in Microbiology v 155 p 409-421 2004
TURNER P J Extended- Spectrum Beta-Lactamases Clinical Infectious
Diseases v 41 p 273-275 2005
WOLTER D J et al Phenotypic and Enzymatic Comparative Analysis
between the Novel KPC variant KPC-5 and Its Evolutionary Variants KPC-2 and
KPC-4 Antimicrob Agents Chemother Nov 17 2008
WOODFORD N et al Carbapenemases of Chryseobacterium
(Flavobacterium) meningosepticum distribution of blaB and characterization of a
novel Metalo-beta-lactamase gene blaB3 in the type strain NCTC 10016
Antimicrob Agents Chemother Jun44(6)1448-52 2000
WOODFORF N Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in
India Pakistan and the UK a molecular biological and epidemiological study The
Lancet Infectious Diseases v 10 n 9 p 597-602 2010
66
WOODFORD et al Outbreak of Klebsiella pneumoniae Producing a New
Carbapenem- Hydrolyzing Class A β-Lactamase KPC-3 in a New York Medical
Center Antimicrobial agents and chemotherapy Dec 2004 p 4793ndash4799 Vol 48
No 12
YAGI T et al A preliminary survey of extended-spectrum β-lactamases
(ESBLs) in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Japan
FEMS Microbiology Letters 184 (2000) 53-56
YIGIT H et al Novel carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase KPC-1 from
a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumonia J Antimicrob Agents
Chemother 45 (4) 1151-1161 (2001)
ZAVASCKI A P et al KPC-2- producing Enterobacter cloacae in two cities
from Southern Brazil Int J Antimicrob Agents Apr 28 2009
ZHANEL G G et al Comparative review of the carbapenecircmicos Drugs
67(7)1027-52 2007
67
ANEXOS
Sequumlecircncia do oligo blaKPC
Query 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
Query 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
Query 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
68
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
Query 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
Query 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
69
Query 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
Query 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
Query 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
70
Sbjct 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
Query 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
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|||||||
Sbjct 481
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ATTTGTT 540
Query 541
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GCGATAC 600
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Sbjct 541
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GCGATAC 600
Query 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
71
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Sbjct 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
Query 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
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Sbjct 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
Query 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
72
Query 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
Query 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
Query 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
73
Sbjct 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
Query 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
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|||||||
Sbjct 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
Query 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
Query 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
74
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
Query 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
Query 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
75
Query 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
Query 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
||||
Sbjct 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
LOCUS AF297554 1377 bp
DNA linear BCT 26-MAR-2001
DEFINITION Klebsiella pneumoniae carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
gene complete cds
ACCESSION AF297554
VERSION AF2975541 GI10121874
76
KEYWORDS
SOURCE Klebsiella pneumoniae
ORGANISM Klebsiella pneumoniae
Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Enterobacteriaceae Klebsiella
REFERENCE 1 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH QueenanAM
AndersonGJ Domenech-SanchezA
BiddleJW StewardCD
AlbertiS BushK and TenoverFC
TITLE Novel carbapenem-hydrolyzing beta-
lactamase KPC-1 from a
carbapenem-resistant strain of
Klebsiella pneumoniae
JOURNAL Antimicrob Agents Chemother 45 (4)
1151-1161 (2001)
PUBMED 11257029
REFERENCE 2 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH AndersonGJ and
TenoverFC
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (19-AUG-2000) Nosocomial
Pathogens Laboratory Branch
Centers for Disease Control and
Prevention 1600 Clifton Rd MS
G08 Atlanta GA 30333 USA
FEATURES LocationQualifiers
77
source 11377
organism=Klebsiella
pneumoniae
mol_type=genomic DNA
db_xref=taxon573
-35_signal 5560
-10_signal 7883
mRNA 921012
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
RBS 117122
CDS 1311012
note=blaKPC-1
codon_start=1
transl_table=11
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
protein_id=AAG134101
db_xref=GI10121875
translation=MSLYRRLVLLSCLSWPLAGFSATALTNLVAEPFAKLEQD
FGGSI
GVYAMDTGSGATVSYRAEERFPLCSSFKGFLAAAVLARSQQQAGLLDTPIRYG
KNALV
PWSPISEKYLTTGMTVAELSAAAVQYSDNAAANLLLKELGGPAGLTAFMRSIG
DTTFR
78
LDRWELELNSAIPSDARDTSSPRAVTESLQKLTLGSALAAPQRQQFVDWLKGN
TTGNH
RIRAAVPADWAVGDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTRAPNKDDK
HSEAV
IAAAARLALEGLGVNGQ
ORIGIN
1 cggggcagtt acagccgtta cagcctctgg
agagggagcg gcttgccgct cggtgataat
61 cccagctgta gcggcctgat tacatccggc
cgctacacct agctccacct tcaaacaagg
121 aatatcgttg atgtcactgt atcgccgtct
agttctgctg tcttgtctct catggccgct
181 ggctggcttt tctgccaccg cgctgaccaa
cctcgtcgcg gaaccattcg ctaaactcga
241 acaggacttt ggcggctcca tcggtgtgta
cgcgatggat accggctcag gcgcaactgt
301 aagttaccgc gctgaggagc gcttcccact
gtgcagctca ttcaagggct ttcttgctgc
361 cgctgtgctg gctcgcagcc agcagcaggc
cggcttgctg gacacaccca tccgttacgg
421 caaaaatgcg ctggttccgt ggtcacccat
ctcggaaaaa tatctgacaa caggcatgac
481 ggtggcggag ctgtccgcgg ccgccgtgca
atacagtgat aacgccgccg ccaatttgtt
541 gctgaaggag ttgggcggcc cggccgggct
gacggccttc atgcgctcta tcggcgatac
79
601 cacgttccgt ctggaccgct gggagctgga
gctgaactcc gccatcccaa gcgatgcgcg
661 cgatacctca tcgccgcgcg ccgtgacgga
aagcttacaa aaactgacac tgggctctgc
721 actggctgcg ccgcagcggc agcagtttgt
tgattggcta aagggaaaca cgaccggcaa
781 ccaccgcatc cgcgcggcgg tgccggcaga
ctgggcagtc ggagacaaaa ccggaacctg
841 cggagtgtat ggcacggcaa atgactatgc
cgtcgtctgg cccactgggc gcgcacctat
901 tgtgttggcc gtctacaccc gggcgcctaa
caaggatgac aagcacagcg aggccgtcat
961 cgccgctgcg gctagactcg cgctcgaggg
attgggcgtc aacgggcagt aaggctctga
1021 aaatcatcta ttggcccacc accgccgccc
ttgcgggcgg catggattac caaccactgt
1081 cacatttagg ctaggagtct gcgcggcaga
gccgtgtgac cggttttctg tagagcactg
1141 acgatggcgg cggcgctctc tgcaattggc
aaggcgtcgg cgccaaggat accaatcttg
1201 cggcgcgcgg cgtgttatga cgactggggt
gcatttgagc cgccccattt aaccttcgcc
1261 ctcacagata cgccattcgc ctcaaattta
gcgccatgca gacgagcttc cactcggctt
1321 gcaccttgtc caggcccctc atgctgaact
gacgcaatcc catcaccgcc ttgatca
80
51
resistente 3 429 5 500
Claritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Clindamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Eritromicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Gentamicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0942 resistente 2 286 3 300
sensiacutevel 1 143 2 200
Imipenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 0 00 2 200 0193 Resistente 1 143 3 300
sensiacutevel 2 286 0 00
Nitrofurantoiacutena sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 resistente 0 00 1 100
Norfloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Oxacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Penicilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Piperacilina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Rifampicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tetraciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Ticarcilina Aacutecido Clavulocircnico
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0688 natildeo testado 0 00 1 100
resistente 3 429 4 400
Tobramicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Trimetoprima Sulfametoxazol
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0112 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 2 286 0 00
Vancomicina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 natildeo testado 3 429 5 500
Tigeciclina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediario 0 00 1 100 0211 natildeo testado 1 143 4 400
resistente 2 286 0 00
52
Cefepime sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefuroxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Levofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Piperacilina Tazobactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Ertapenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Meropenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0223 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 1 143 0 00
Cefotetan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 sensiacutevel 0 00 1 100
Gemifloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 7 700 0585 natildeo testado 3 429 3 300
Desfecho
Alta Oacutebito
Meacutedia Erro
padratildeo Meacutedia Erro
padratildeo p
Idade 58 9 59 5 0991
Tempo Internaccedilatildeo (dias)
50 13 46 12 0571
n= 17 p(lt 005) NA natildeo se aplica
53
6 DISCUSSAtildeO
Nos uacuteltimos anos houve um aumento na incidecircncia de bacteacuterias
multirresistentes aos antimicrobianos no ambiente hospitalar tornando isto um
problema mundial de sauacutede puacuteblica (HULSCHER et al 2010) Quando se trata
principalmente de bacilos Gram negativos a frequumlecircncia destas bacteacuterias eacute ainda
maior em paiacuteses da Ameacuterica Latina quando comparada a paiacuteses desenvolvidos
(GALES etal 2012)
De acordo com dados do ldquoMeropenem Yearly Susceptibility Test Information
Collectionrdquo (MYSTIC) ocorreu nos Estados Unidos um aumento na susceptibilidade
de K pneumoniae nos uacuteltimos anos graccedilas a praacuteticas de controle de disseminaccedilatildeo
de amostras resistentes(RHOMBERG P R et al 2009) O aumento crescente da
prevalecircncia destes microrganismos foi proporcional ao aumento da dependecircncia do
uso de antibioacuteticos carbapenecircmicos considerados como a opccedilatildeo terapecircutica para o
tratamento de infecccedilotildees por bacilos Gram negativos multi-resistentes (LIVERMORE
2012) Isto afeta diretamente as opccedilotildees de tratamento sobrando poucas alternativas
para a terapecircutica que incluem colistina (polimixina E) e tigeciclina que apresentam
respectivamente problemas em termos de toxicidade e eficaacutecia (LIVERMORE et
al 2011) Um dos efeitos adversos mais importantes das poliminas B e E por
exemplo satildeo a neurotoxicidade e nefrotoxicidade (MENDES C A C et al2009 )
Devido agrave resistecircncia ser usualmente de natureza plasmidial e portanto de
maior disseminaccedilatildeo especialmente quando carreadas por K pneumoniae
microrganismo com uma notoacuteria capacidade para acumular e transferir plasmiacutedeos
com determinantes para resistecircncia o nuacutemero de casos detectados pelo
fenoacutetipogenoacutetipo blaKPC eacute bastante preocupante (MONTEIRO et al 2009)
Comparada com outras bacteacuterias hospitalares a transmissatildeo de clones
multirresistentes de K pneumoniae eacute maior e podem natildeo ser controladas pelos
meacutetodos de controle de infecccedilatildeo hospitalar (PAAUW et al 2007) A forma
plasmidial para transferecircncia da resistecircncia adicionada a este grande potencial para
disseminaccedilatildeo de clones resistentes eacute preocupante visto que apoacutes surtos muitas
vezes pode se tornar endecircmica Jaacute eacute uma realidade a disseminaccedilatildeo desta bacteacuteria
54
entre pacientes hospitais paiacuteses e ateacute mesmo continentes (WOODFORF et al
2010 ROGERS et al 2011)
As chances de surtos satildeo maiores em paiacuteses com poucos recursos devido agrave
maior carecircncia de praacuteticas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees hospitalares e o
uso irracional de antimicrobianos de forma empiacuterica e inadequada (KUMARASAMY
et al 2010) Ateacute o momento os mecanismos de resistecircncia aos cabapenecircmicos
geralmente encontrado eram a produccedilatildeo de ESBL (CTX-M) somada aacute perda de
porina (CARVALHAES et al 2010) Foi notado a partir do ano de 2008 um
aumento no nuacutemero de K pneumoniae produtoras de KPC-2 apresentando outra
forma de resistecircncia (GALES 2012)
Um estudo mostrou que o perfil do paciente colonizado ou infectado por KPC
foi de um paciente entre os 33 e os 82 anos de idade internado haacute mais de 1
semana no hospital A mortalidade geral nos uacuteltimos anos ficou em torno de 7
sendo que dos 77 pacientes estudados 32 (415) pacientes evoluiacuteram para oacutebito
evidenciando a alta morbi-mortalidade associada (ALVES A P et al 2013)
Em estudo com 2316 pacientes avaliados a populaccedilatildeo de sexo masculino foi
de 526 idade meacutedia global de 53 anos (mediana de 55 anos) permanecircncia meacutedia
de 58 dias (mediana de 3 dias) (OLIVEIRA A C et al 2010) Outros trabalhos
apresentaram ausecircncia de significacircncia entre sexoidade e o desenvolvimento de
infecccedilotildees por microrganismos resistentes (PERES-BOTA D et al 2003 COLPAN
A et al 2005 COELLO R et al 1997)
Outro estudo utilizou um total de 30 amostras sendo elas isoladas de urina
escarro secreccedilatildeo pleural ponta de cateter aspirado traqueal e hemocultura A mais
prevalente foi em urina (40) Entre as 30 cepas analisadas a maior porcentagem
foi da cepa Klebsiella pneumoniae (70) Enterobacter sp (133) Klebsiella
ozaenae (10) Escherichia coli (333) e Klebsiella oxytoca (333)
(DIENSTMANN R et al 2010) Nos Estados Unidos a enzima KPC jaacute se tornou
endecircmica Foi realizada uma pesquisa em dois hospitais de Nova York onde
testaram 602 amostras e 45 apresentaram algum mecanismo de resistecircncia
sendo apenas 33 confirmadas por biologia molecular como KPC-2 (BRATU et
al 2005)
55
Estudo sobre os tipos de ESBL feito no Japatildeo apresentou o tipo Toho-1 como
o mais prevalente nessa pesquisa Ateacute o ano de 2000 ano em que foi publicado tal
estudo este era o primeiro relatoacuterio no Japatildeo para identificar derivados de ESBLs
como tipo de SHV e TEM entre E coli e K pneumoniae Em especial o tipo SHV- 12
foi identificado com uma maior frequumlecircncia Estes resultados indicam que tipos
distintos de ESBLs que satildeo diferentes em sua especificidade de substrato e origem
geneacutetica coexistem no Japatildeo Isto mostra a importacircncia de caracterizar genoacutetipos
distintos de ESBLs e de estar em alerta continuamente para as tendecircncias de
ESBLs no Japatildeo aleacutem da necessidade de uma interpretaccedilatildeo uniforme utilizando as
diretrizes do CSLI para relatar cepas produtoras de ESBL Aleacutem da detecccedilatildeo de
ESBLs satildeo necessaacuterias mais informaccedilotildees tais como o perfil de sensibilidade
especiacutefica para diversas β-lactacircmicos e o local da infecccedilatildeo Esses fatores satildeo
essenciais para a escolha adequada de antibioacuteticos (YAGI T et al 2000)
No ano de 2004 uma pesquisa avaliou a produccedilatildeo de uma enzima de
hidroacutelise de carbapenecircmicos atraveacutes da teacutecnica de sequumlenciamento foi revelado
um novo membro da famiacutelia KPC designado KPC- 3 Pesquisadores encontraram
em um mutante de K pneumoniae uma substituiccedilatildeo de um gene associado com
resistecircncia a Imipenem mas essa substituiccedilatildeo foi considerada improvaacutevel na
contribuiccedilatildeo da resistecircncia aos carbapenecircmicos da espeacutecie estudada Aleacutem da
resistecircncia aos carbapenecircmicos estes isolados eram em sua maioria resistentes agraves
cefalosporinas penicilinas e aminoglicosiacutedeos Usando estudos de transformaccedilatildeo
conjugaccedilatildeo e hibridaccedilatildeo localizaram o alelo blaKPC em plasmiacutedeo aleacutem disso
mostraram que esse alelo tambeacutem carregava uma resistecircncia aos aminoglicosiacutedeos
A transferecircncia das enzimas KPCs foi demonstrada in vitro tanto neste como em
outros estudos pode ser que os plasmiacutedeos que fazem esta transferecircncia estavam
comeccedilando a se espalhar no ambiente cliacutenico resultando na multiresistecircncia dessas
estirpes (WOODFORD et al 2004)
O presente estudo apresentou um vieacutes quanto aos resultados dos testes de
susceptibilidade microbiana Observou-se que natildeo foi encontrado resultado deste
teste em algumas amostras o que natildeo cooperou para um estudo mais preciso
futuros estudos quanto agraves amostras e um melhor acompanhamento deste tipo de
patologia Poreacutem mesmo sem algumas amostras com este resultado disponiacutevel foi
56
confirmada a presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos
carbapenecircmicos por meio dos genes de resistecircncia blaKPC e 16S rRNA que as
amostras apresentaram em sua maioria serem portadoras Quanto aos resultados
estatiacutesticos nenhuma das variaacuteveis apresentou significacircncia estatiacutestica (p gt 005)
mostrando assim que estas variaacuteveis isoladas natildeo foram o fator determinante para
o desfecho cliacutenico de alta ou oacutebito
57
7 CONCLUSAtildeO
Os genes blaKPC e 16S rRNA foram caracterizados confirmando a a
presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos carbapenecircmicos
Houve uma maior prevalecircncia da cepa K pneumoniae e isto confirma outros
estudos que apresentam a maior prevalecircncia desta cepa em amostras com KPC
Aleacutem disso isso justifica a forma popular da K pneumoniae ser chamada de KPC
enquanto que na verdade KPC eacute uma enzima podendo estar presente em outras
cepas como Enterobacter clocae tambeacutem apresentada no presente estudo O
desfecho cliacutenico de oacutebitos maior que 50 eacute um possiacutevel indicador sobre a
necessidade de se realizar um teste raacutepido para identificaccedilatildeo de KPC visando
iniciar o mais raacutepido possiacutevel o tratamento afim de diminuir a mortalidade por esta
infecccedilatildeo
Nenhuma das variaacuteveis isoladamente estaacute relacionada ao desfecho cliacutenico
oacutebito ou alta pois natildeo apresentaram relevacircncia estatiacutestica O presente estudo
mostrou que haacute presenccedila da bacteacuteria nas amostras de pacientes do hospital
estudado podendo entatildeo afirmar que este tipo de bacteacuteria se encontra tambeacutem
presente em ambiente hospitalar O uso irracional de antimicrobiano eacute demonstrado
de forma indireta quando foi apresentado atraveacutes do Teste de Hodge Modificado
uma resistecircncia de 100 aos antibioacuteticos carbapenecircmicos Isto tambeacutem reflete na
terapecircutica sendo que pacientes portadores de bacteacuterias resistentes aos
antibioacuteticos carabepecircmicos tem uma escassa opccedilatildeo de tratamento e as opccedilotildees
apresentam problemas quanto agrave toxicidade e eficaacutecia
58
REFEREcircNCIAS
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Mecanismos
de resistecircncia bacteriana aos antimicrobianos Disponiacutevel em
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controleopas_
webmodulo3mec_sitiohtmgt Acesso em 25 de abril de 2014
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Nota teacutecnica nordm
012013 medidas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees por enterobacteacuterias
multiresistentes Acesso em 17 de abril de 2013
ALBA J et al Kinetics study of KPC-3 a plasmid-encoded class A
carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase Antimicrob Agents Chemother
Nov49(11)4760-2 2005
ALVES A P et al Nosocomial infections by KPC-producing enterobacteria in
a tertiary hospital in Southern Brazil Revista da AMRIGS Porto Alegre 57 (3) 213-
218 jul-set 2013
ALVES A et al Tipagem Geneacutetica de Microrganismos Lab De Diversidade
Microbiana Centro de Biologia Celular Dep de Biologia U de Aveiro 3810-193
Aveiro- 2003
BELL J M et Al Prevalence and significance of a negative extended-
spectrum beta-lactamase (ESBL) confirmation test result after a positive ESBL
screening test result for isolates of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae
results from the SENTRY Asia-Pacific Surveillance Program J Clin Microbiol
May45(5)1478-82 2007
BRATU S et al Detection of KPC carbapenem-hydrolyzing enzymes in
Enterobacter spp from Brooklyn New York Antimicrob Agents Chemother v 49 n
2 p 776-8 2005
59
BRATU S et al Emergence of KPC-possessing Klebsiella pneumoniae in
Brooklyn New York epidemiology and recommendations for detection Antimicrob
Agents Chemother v 49 n 7 p 3018-20 2005
BRATU S et al Rapid spread of carbapenem-resistant Klebsiella
pneumoniae in New York City Arch Intern Med v 165 p 1430-5 2005
CAMARGO C F et al Aplicaccedilatildeo das teacutecnicas de pcr e suas teacutecnicas
derivadas em diagnoacutestico molecular Disponiacutevel em
ltfileDUnB10C2BA20semestreArtigosPCR-
20CLEYTON20FLORENCIO20DE20CAMARGO20E20PAULO20ROB
ERTO20QUEIROZpdfgtgt Acesso em 08 de abril de 2014
CARVALHES C G et al Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting
carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive
results Journal of Antimicrobial Chemotherapy v 65 n2 p 249-251 2010
CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION- CDC Modified
Hodge Test for Carbapenemase Detection in Enterobacteriaceae 2004
CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE Methods for
dilutionantimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically Approved
standard M7ndashA7 7th ed CLSI Wayne PA 2011
COELLO R et al Risk factors for developing clinical infection with methicillin-
resistant Staphylococcus aureus (MRSA) amongst hospital patients initially only
colonized with MRSA J Hosp Infect 19973739-46
COLPAN A et al Evaluation of risk factors for mortality in intensive care
units A prospective study from a referral hospital in Turkey Am J Infect Control
200533(1)42-7
60
CORNAGLIA G et al Living with ESBLs Introduction Clinical Microbiology
and Infection 14 Suppl 1 1-2 2008
COTRIM E R et al Klebsiella pneumoniae carbapenemase ndash KPC em
Enterobacteriaceae o desafio das bacteacuterias multirresistentes Poacutes em revista do
centro universitaacuterio Newton Paiva 12012 - ediccedilatildeo 5 - issn 2176 7785
DESHPANDE L M et al Occurrence and characterization of
carbapenemase-producing Enterobacteacuteriaceae report from the SENTRY
Antimicrobial Surveillance Program (2000-2004) Microb Drug Resist 12(4)223-30
2006
DIAS D J A Estudos dos principais mecanismos de resistecircncia aos
antibioacuteticos β-lactacircmicos em bacteacuterias patogecircnicas gram negativas 2009 100 f
Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Geneacutetica Molecular e Biomedicina) ndash Faculdade de
Ciecircncias e Tecnologia Universidade de Nova Lisboa Lisboa
DIENSTMANN R et al Avaliaccedilatildeo fenotiacutepica da enzima Klebsiella
pneumoniae carbapenemase (KPC) em Enterobacteriaceae de ambiente hospitalar
J Bras Patol Med Lab v 46 n 1 p 23-27 fevereiro 2010
ENDIMIAMI A et al Emergence of blaKPC-containing Klebsiella
pneumoniae in a long-term acute care hospital a new challenge to our healthcare J
Antimicrob Chemother 64 1102-1110 Nov 2009
FALAGAS M E et al Extended-spectrum beta-lactamase producing
organisms The Journal of Hospital Infection 73 (4) pp 345-54 2009
FONTANA C et al Emergence of KPC-producing Klebsiella pneumoniae in
Italy BMC Rev Notes 3 40 2010
61
GALES A C et al Antimicrobial resistance among Gram-negative bacilli
isolated from Latin America results from Sentry Antimicrobial Surveillance Program
(Latin America 2008-2010) Diagnostic Microbiology and Infectious Disease v 3 n
4 p 354 -360 2012
GUPTA N et al Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Epidemiology
and Prevention HEALTHCARE EPIDEMIOLOGY Clinical Infectious Diseases
201153(1)60ndash67 Published by Oxford University Press on behalf of the Infectious
Diseases Society of America 2011
HARBOTTLE H et al Genetics of antimicrobial resistance Anim Biotechnol
n17 p111-124 2006
HENRIQUE W N et al RESISTEcircNCIA BACTERIANA Uniatildeo das
Faculdades Alfredo NasserInstituto de Ciecircncias da Sauacutede Disponiacutevel em lt
httpwwwfaculdadealfredonasseredubrfilespesquisaposter20HENRIQUE20
Wilker20Natividade20SANTIAGO20Silvania20CAVALCANTI20DSP
20ResistC3AAncia20Bacterianapdfgt Acesso em 17 marccedilo 2014
HULSCHER M E J I et al Antibiotic prescribing in hospital a social and
behavioral scientific approach The Lancet Infectious Diaseases v 10 n 3 p 167-
165 2010
KIDWAI M SAPRA P BHUSHAN KR Synthetic strategies and medicinal
properties of beta-lactams Curr Med Chem 1999 695-215
KUMARASAMY K K et al Emergence of a new antibiotic resistance
mechanism in India Pakistan and the UK a molecular biological and
epidemiological stuy The Lancet Infectious Diseases v10 n 9 p 597- 602 2010
LINCOPAN N et al Enterobacteacuteria producing extended-spectrum β-
lacatamases and IMP-1 Metalo-β-lactamases isolated from Brazilian hospitals J Med
62
Microbiol 7 1-3 2006
LINCOPAN N et al First Isolation of Metalo-β-Lacatamase-Producing
Multiresistant Klebsiella pneumoniae from a patient in Brazil J Clin Microbiol 43(1)
516-519 2005
LIVERMORE D M et al What remains against carbapenem- resistant
Enterobacteriaceae Evaluation of choramphenicol ciprofloxacin colistina
fosfomycin minocycline nitrofurantoin temocilin and tigecycline International
Journal of Antimicrobial Agents v 37 n 5 p 415- 459 2011
LIVERMORE D M Fourten years in resistance International Journal of
Antimicrobial Agents v 39 283- 294 2012
LIVERMORE D M Bacterial resistance to carbapenems Adv Exp Med Biol
1995 39025-47
LIVERMORE D M Bacterial resistance origins epidemiology and impact
Clin Infect Dis 36S11-S23 2003
LIVERMORE D M et al Carbapenemases a problem in waiting Curr
Opin Microbiol 2000 3489-95
LU et al Universal pcr for common bacterial pathogens J CLIN
MICROBIOL VOL 38 2000
LU et al Use of PCR with Universal Primers and Restriction Endonuclease
Digestions for Detection and Identification of Common Bacterial Pathogens in
Cerebrospinal Fluid Journal of Clinical Microbiology June 2000 p 2076ndash2080
MARSCHALL J Met al Presence of the KPC Carbapenemase Gene in
Enterobacteriaceae Causing Bacteremia and Its Correlation with In Vitro
Carbapenem Susceptibility J Clin Microbiol 47 239-241 Jan 2009
63
MARTINS WMBS et al Prevalecircncia do gene blaKPC em isolados cliacutenicos
de Enterobacteriaceae e natildeo fermentadores encontrados em amostras clinicas em
um hospital universitaacuterio do Recife X Jornada de ensino pesquisa e extensatildeo ndash
JEPEX 2010 ndash UFRPE Recife 18 a 22 de outubro
MENDES C A C et al Polimixinas Revisatildeo com ecircnfase na sua
nefrotoxicidade Rev Assoc Med Bras 2009 55(6) 752-9
MOHR J F 3rd Update on the efficacy and tolerability of meropenem in the
treatment of serious bacteacuterial infections Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S41-51
2008
MONTEIRO J et al First report of KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae
strains in Brazil Antimicrob Agents Chemother Jan53(1)333-4 2009
MOREIRA V C et al Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia a antibioacuteticos
Disponiacutevel em
lthttpwwwcpglsucgbr6mostraartigosSAUDEVANESSA20CARVALHO20M
OREIRApdfgt Acesso em 21 marccedilo 2014
NETIKUL T et al Emergence of novel blaKPC-12 and blaKPC-13 variants in
carbapenem non-susceptible Enterobacter cloacae a first report of blaKPC gene in
Thailand European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases May
S372 2011
NETO V A et al Antibioacuteticos na praacutetica Meacutedica 6ordf Ediccedilatildeo Editorial
SarverSP Brasil 2007
NICOLAU D P Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of
meropenem Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S32-40 2008
64
OLIVEIRA A C et al Resistecircncia bacteriana e mortalidade em um centro de
terapia intensiva Rev Latino-Am Enfermagem nov-dez 2010
PAAUW A et al Failure to control an outbreak of qnrA 1-positive multidrug-
resistant Enterobacter clocae despite adequate implementation of recommended
infection control measures Journal of Clinical Microbiology v 45 n 5 p 1420-1425
2007
PATERSON D L et al Extended-Spectrum Beta-Lactamases a Clinical
Update Clinical Microbiology Reviews v 18 p 657-686 2005
PEIRANO G et al Carbapenem-hydrolysing beta-lactamase KPC-2 in
Klebsiella pneumonia isolated in Rio de Janeiro Brazil J Antimicrob Chemother Nov
20 2009
PERES-BOTA D et al Are infections due to resistant pathogens associated
with worse outcome in critically ill patients J Infect 200347(4)307-16
PIDDOCK L J V Clinically relevant chromosomally encoded multidrug
resistance effl ux pumps in bacterial Clin Microbiol Rev n19 p382-402 2006
PITOUT J D D et al Emergence of Enterobacteriaceae producing
extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) in the community J Antimicrob
Chemother May 56 2005
POSSEBON M I et al Resistecircncia bacteriana aos carbapenecircmicos
Bacterial resitence to carbapenems RBM rev bras med60(6)378380-378-382
jun 2003
QUEENAN A M et al Carbapenemases the versatile beta-lactamases
Clin Microbiol Rev Jul20(3)440-58 2007
65
RHOMBERG P R et al Summary trends for the meropenem yearly
susceptibility test information collection program a 10- year experience in the United
States (1999-2008) Diagnostic Microbiology and Infectiois Disease v 65 n4 p
414-426 2009
ROBLEDO I E et al Detection of KPC in Acinetobacter spp in Puerto Rico
J Antimicrob Agents Chemother 54 1354-1357 Mar 2010
ROGERS B A et al Country-to-country transfer os patients and the risk of
multi-resistant bacterial infection Clinical Infectious Disease v53 n1 p49- 56
2011
SHAH A A et al Characteristics epidemiology and clinicalimportance of
emerging strains of Gram-negative bacilli producing extended-spectrum
betalactamases Research in Microbiology v 155 p 409-421 2004
TURNER P J Extended- Spectrum Beta-Lactamases Clinical Infectious
Diseases v 41 p 273-275 2005
WOLTER D J et al Phenotypic and Enzymatic Comparative Analysis
between the Novel KPC variant KPC-5 and Its Evolutionary Variants KPC-2 and
KPC-4 Antimicrob Agents Chemother Nov 17 2008
WOODFORD N et al Carbapenemases of Chryseobacterium
(Flavobacterium) meningosepticum distribution of blaB and characterization of a
novel Metalo-beta-lactamase gene blaB3 in the type strain NCTC 10016
Antimicrob Agents Chemother Jun44(6)1448-52 2000
WOODFORF N Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in
India Pakistan and the UK a molecular biological and epidemiological study The
Lancet Infectious Diseases v 10 n 9 p 597-602 2010
66
WOODFORD et al Outbreak of Klebsiella pneumoniae Producing a New
Carbapenem- Hydrolyzing Class A β-Lactamase KPC-3 in a New York Medical
Center Antimicrobial agents and chemotherapy Dec 2004 p 4793ndash4799 Vol 48
No 12
YAGI T et al A preliminary survey of extended-spectrum β-lactamases
(ESBLs) in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Japan
FEMS Microbiology Letters 184 (2000) 53-56
YIGIT H et al Novel carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase KPC-1 from
a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumonia J Antimicrob Agents
Chemother 45 (4) 1151-1161 (2001)
ZAVASCKI A P et al KPC-2- producing Enterobacter cloacae in two cities
from Southern Brazil Int J Antimicrob Agents Apr 28 2009
ZHANEL G G et al Comparative review of the carbapenecircmicos Drugs
67(7)1027-52 2007
67
ANEXOS
Sequumlecircncia do oligo blaKPC
Query 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
Query 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
Query 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
68
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
Query 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
Query 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
69
Query 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
Query 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
Query 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
70
Sbjct 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
Query 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 481
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ATTTGTT 540
Query 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 541
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GCGATAC 600
Query 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
71
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
Query 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
Query 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
72
Query 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
Query 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
Query 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
73
Sbjct 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
Query 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
Query 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
Query 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
74
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
Query 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
Query 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
75
Query 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Sbjct 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
Query 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
||||
Sbjct 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
LOCUS AF297554 1377 bp
DNA linear BCT 26-MAR-2001
DEFINITION Klebsiella pneumoniae carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
gene complete cds
ACCESSION AF297554
VERSION AF2975541 GI10121874
76
KEYWORDS
SOURCE Klebsiella pneumoniae
ORGANISM Klebsiella pneumoniae
Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Enterobacteriaceae Klebsiella
REFERENCE 1 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH QueenanAM
AndersonGJ Domenech-SanchezA
BiddleJW StewardCD
AlbertiS BushK and TenoverFC
TITLE Novel carbapenem-hydrolyzing beta-
lactamase KPC-1 from a
carbapenem-resistant strain of
Klebsiella pneumoniae
JOURNAL Antimicrob Agents Chemother 45 (4)
1151-1161 (2001)
PUBMED 11257029
REFERENCE 2 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH AndersonGJ and
TenoverFC
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (19-AUG-2000) Nosocomial
Pathogens Laboratory Branch
Centers for Disease Control and
Prevention 1600 Clifton Rd MS
G08 Atlanta GA 30333 USA
FEATURES LocationQualifiers
77
source 11377
organism=Klebsiella
pneumoniae
mol_type=genomic DNA
db_xref=taxon573
-35_signal 5560
-10_signal 7883
mRNA 921012
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
RBS 117122
CDS 1311012
note=blaKPC-1
codon_start=1
transl_table=11
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
protein_id=AAG134101
db_xref=GI10121875
translation=MSLYRRLVLLSCLSWPLAGFSATALTNLVAEPFAKLEQD
FGGSI
GVYAMDTGSGATVSYRAEERFPLCSSFKGFLAAAVLARSQQQAGLLDTPIRYG
KNALV
PWSPISEKYLTTGMTVAELSAAAVQYSDNAAANLLLKELGGPAGLTAFMRSIG
DTTFR
78
LDRWELELNSAIPSDARDTSSPRAVTESLQKLTLGSALAAPQRQQFVDWLKGN
TTGNH
RIRAAVPADWAVGDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTRAPNKDDK
HSEAV
IAAAARLALEGLGVNGQ
ORIGIN
1 cggggcagtt acagccgtta cagcctctgg
agagggagcg gcttgccgct cggtgataat
61 cccagctgta gcggcctgat tacatccggc
cgctacacct agctccacct tcaaacaagg
121 aatatcgttg atgtcactgt atcgccgtct
agttctgctg tcttgtctct catggccgct
181 ggctggcttt tctgccaccg cgctgaccaa
cctcgtcgcg gaaccattcg ctaaactcga
241 acaggacttt ggcggctcca tcggtgtgta
cgcgatggat accggctcag gcgcaactgt
301 aagttaccgc gctgaggagc gcttcccact
gtgcagctca ttcaagggct ttcttgctgc
361 cgctgtgctg gctcgcagcc agcagcaggc
cggcttgctg gacacaccca tccgttacgg
421 caaaaatgcg ctggttccgt ggtcacccat
ctcggaaaaa tatctgacaa caggcatgac
481 ggtggcggag ctgtccgcgg ccgccgtgca
atacagtgat aacgccgccg ccaatttgtt
541 gctgaaggag ttgggcggcc cggccgggct
gacggccttc atgcgctcta tcggcgatac
79
601 cacgttccgt ctggaccgct gggagctgga
gctgaactcc gccatcccaa gcgatgcgcg
661 cgatacctca tcgccgcgcg ccgtgacgga
aagcttacaa aaactgacac tgggctctgc
721 actggctgcg ccgcagcggc agcagtttgt
tgattggcta aagggaaaca cgaccggcaa
781 ccaccgcatc cgcgcggcgg tgccggcaga
ctgggcagtc ggagacaaaa ccggaacctg
841 cggagtgtat ggcacggcaa atgactatgc
cgtcgtctgg cccactgggc gcgcacctat
901 tgtgttggcc gtctacaccc gggcgcctaa
caaggatgac aagcacagcg aggccgtcat
961 cgccgctgcg gctagactcg cgctcgaggg
attgggcgtc aacgggcagt aaggctctga
1021 aaatcatcta ttggcccacc accgccgccc
ttgcgggcgg catggattac caaccactgt
1081 cacatttagg ctaggagtct gcgcggcaga
gccgtgtgac cggttttctg tagagcactg
1141 acgatggcgg cggcgctctc tgcaattggc
aaggcgtcgg cgccaaggat accaatcttg
1201 cggcgcgcgg cgtgttatga cgactggggt
gcatttgagc cgccccattt aaccttcgcc
1261 ctcacagata cgccattcgc ctcaaattta
gcgccatgca gacgagcttc cactcggctt
1321 gcaccttgtc caggcccctc atgctgaact
gacgcaatcc catcaccgcc ttgatca
80
52
Cefepime sem informaccedilatildeo 4 571 5 500 0772 resistente 3 429 5 500
Cefuroxima sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Levofloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Piperacilina Tazobactam
sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0381 resistente 2 286 5 500
Ertapenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
resistente 2 286 5 500 0381 sensiacutevel 1 143 0 00
Meropenem sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
intermediaacuterio 1 143 0 00 0223 resistente 1 143 5 500
sensiacutevel 1 143 0 00
Cefotetan sem informaccedilatildeo 4 571 5 500
natildeo testado 3 429 4 400 0688 sensiacutevel 0 00 1 100
Gemifloxacina sem informaccedilatildeo 4 571 7 700 0585 natildeo testado 3 429 3 300
Desfecho
Alta Oacutebito
Meacutedia Erro
padratildeo Meacutedia Erro
padratildeo p
Idade 58 9 59 5 0991
Tempo Internaccedilatildeo (dias)
50 13 46 12 0571
n= 17 p(lt 005) NA natildeo se aplica
53
6 DISCUSSAtildeO
Nos uacuteltimos anos houve um aumento na incidecircncia de bacteacuterias
multirresistentes aos antimicrobianos no ambiente hospitalar tornando isto um
problema mundial de sauacutede puacuteblica (HULSCHER et al 2010) Quando se trata
principalmente de bacilos Gram negativos a frequumlecircncia destas bacteacuterias eacute ainda
maior em paiacuteses da Ameacuterica Latina quando comparada a paiacuteses desenvolvidos
(GALES etal 2012)
De acordo com dados do ldquoMeropenem Yearly Susceptibility Test Information
Collectionrdquo (MYSTIC) ocorreu nos Estados Unidos um aumento na susceptibilidade
de K pneumoniae nos uacuteltimos anos graccedilas a praacuteticas de controle de disseminaccedilatildeo
de amostras resistentes(RHOMBERG P R et al 2009) O aumento crescente da
prevalecircncia destes microrganismos foi proporcional ao aumento da dependecircncia do
uso de antibioacuteticos carbapenecircmicos considerados como a opccedilatildeo terapecircutica para o
tratamento de infecccedilotildees por bacilos Gram negativos multi-resistentes (LIVERMORE
2012) Isto afeta diretamente as opccedilotildees de tratamento sobrando poucas alternativas
para a terapecircutica que incluem colistina (polimixina E) e tigeciclina que apresentam
respectivamente problemas em termos de toxicidade e eficaacutecia (LIVERMORE et
al 2011) Um dos efeitos adversos mais importantes das poliminas B e E por
exemplo satildeo a neurotoxicidade e nefrotoxicidade (MENDES C A C et al2009 )
Devido agrave resistecircncia ser usualmente de natureza plasmidial e portanto de
maior disseminaccedilatildeo especialmente quando carreadas por K pneumoniae
microrganismo com uma notoacuteria capacidade para acumular e transferir plasmiacutedeos
com determinantes para resistecircncia o nuacutemero de casos detectados pelo
fenoacutetipogenoacutetipo blaKPC eacute bastante preocupante (MONTEIRO et al 2009)
Comparada com outras bacteacuterias hospitalares a transmissatildeo de clones
multirresistentes de K pneumoniae eacute maior e podem natildeo ser controladas pelos
meacutetodos de controle de infecccedilatildeo hospitalar (PAAUW et al 2007) A forma
plasmidial para transferecircncia da resistecircncia adicionada a este grande potencial para
disseminaccedilatildeo de clones resistentes eacute preocupante visto que apoacutes surtos muitas
vezes pode se tornar endecircmica Jaacute eacute uma realidade a disseminaccedilatildeo desta bacteacuteria
54
entre pacientes hospitais paiacuteses e ateacute mesmo continentes (WOODFORF et al
2010 ROGERS et al 2011)
As chances de surtos satildeo maiores em paiacuteses com poucos recursos devido agrave
maior carecircncia de praacuteticas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees hospitalares e o
uso irracional de antimicrobianos de forma empiacuterica e inadequada (KUMARASAMY
et al 2010) Ateacute o momento os mecanismos de resistecircncia aos cabapenecircmicos
geralmente encontrado eram a produccedilatildeo de ESBL (CTX-M) somada aacute perda de
porina (CARVALHAES et al 2010) Foi notado a partir do ano de 2008 um
aumento no nuacutemero de K pneumoniae produtoras de KPC-2 apresentando outra
forma de resistecircncia (GALES 2012)
Um estudo mostrou que o perfil do paciente colonizado ou infectado por KPC
foi de um paciente entre os 33 e os 82 anos de idade internado haacute mais de 1
semana no hospital A mortalidade geral nos uacuteltimos anos ficou em torno de 7
sendo que dos 77 pacientes estudados 32 (415) pacientes evoluiacuteram para oacutebito
evidenciando a alta morbi-mortalidade associada (ALVES A P et al 2013)
Em estudo com 2316 pacientes avaliados a populaccedilatildeo de sexo masculino foi
de 526 idade meacutedia global de 53 anos (mediana de 55 anos) permanecircncia meacutedia
de 58 dias (mediana de 3 dias) (OLIVEIRA A C et al 2010) Outros trabalhos
apresentaram ausecircncia de significacircncia entre sexoidade e o desenvolvimento de
infecccedilotildees por microrganismos resistentes (PERES-BOTA D et al 2003 COLPAN
A et al 2005 COELLO R et al 1997)
Outro estudo utilizou um total de 30 amostras sendo elas isoladas de urina
escarro secreccedilatildeo pleural ponta de cateter aspirado traqueal e hemocultura A mais
prevalente foi em urina (40) Entre as 30 cepas analisadas a maior porcentagem
foi da cepa Klebsiella pneumoniae (70) Enterobacter sp (133) Klebsiella
ozaenae (10) Escherichia coli (333) e Klebsiella oxytoca (333)
(DIENSTMANN R et al 2010) Nos Estados Unidos a enzima KPC jaacute se tornou
endecircmica Foi realizada uma pesquisa em dois hospitais de Nova York onde
testaram 602 amostras e 45 apresentaram algum mecanismo de resistecircncia
sendo apenas 33 confirmadas por biologia molecular como KPC-2 (BRATU et
al 2005)
55
Estudo sobre os tipos de ESBL feito no Japatildeo apresentou o tipo Toho-1 como
o mais prevalente nessa pesquisa Ateacute o ano de 2000 ano em que foi publicado tal
estudo este era o primeiro relatoacuterio no Japatildeo para identificar derivados de ESBLs
como tipo de SHV e TEM entre E coli e K pneumoniae Em especial o tipo SHV- 12
foi identificado com uma maior frequumlecircncia Estes resultados indicam que tipos
distintos de ESBLs que satildeo diferentes em sua especificidade de substrato e origem
geneacutetica coexistem no Japatildeo Isto mostra a importacircncia de caracterizar genoacutetipos
distintos de ESBLs e de estar em alerta continuamente para as tendecircncias de
ESBLs no Japatildeo aleacutem da necessidade de uma interpretaccedilatildeo uniforme utilizando as
diretrizes do CSLI para relatar cepas produtoras de ESBL Aleacutem da detecccedilatildeo de
ESBLs satildeo necessaacuterias mais informaccedilotildees tais como o perfil de sensibilidade
especiacutefica para diversas β-lactacircmicos e o local da infecccedilatildeo Esses fatores satildeo
essenciais para a escolha adequada de antibioacuteticos (YAGI T et al 2000)
No ano de 2004 uma pesquisa avaliou a produccedilatildeo de uma enzima de
hidroacutelise de carbapenecircmicos atraveacutes da teacutecnica de sequumlenciamento foi revelado
um novo membro da famiacutelia KPC designado KPC- 3 Pesquisadores encontraram
em um mutante de K pneumoniae uma substituiccedilatildeo de um gene associado com
resistecircncia a Imipenem mas essa substituiccedilatildeo foi considerada improvaacutevel na
contribuiccedilatildeo da resistecircncia aos carbapenecircmicos da espeacutecie estudada Aleacutem da
resistecircncia aos carbapenecircmicos estes isolados eram em sua maioria resistentes agraves
cefalosporinas penicilinas e aminoglicosiacutedeos Usando estudos de transformaccedilatildeo
conjugaccedilatildeo e hibridaccedilatildeo localizaram o alelo blaKPC em plasmiacutedeo aleacutem disso
mostraram que esse alelo tambeacutem carregava uma resistecircncia aos aminoglicosiacutedeos
A transferecircncia das enzimas KPCs foi demonstrada in vitro tanto neste como em
outros estudos pode ser que os plasmiacutedeos que fazem esta transferecircncia estavam
comeccedilando a se espalhar no ambiente cliacutenico resultando na multiresistecircncia dessas
estirpes (WOODFORD et al 2004)
O presente estudo apresentou um vieacutes quanto aos resultados dos testes de
susceptibilidade microbiana Observou-se que natildeo foi encontrado resultado deste
teste em algumas amostras o que natildeo cooperou para um estudo mais preciso
futuros estudos quanto agraves amostras e um melhor acompanhamento deste tipo de
patologia Poreacutem mesmo sem algumas amostras com este resultado disponiacutevel foi
56
confirmada a presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos
carbapenecircmicos por meio dos genes de resistecircncia blaKPC e 16S rRNA que as
amostras apresentaram em sua maioria serem portadoras Quanto aos resultados
estatiacutesticos nenhuma das variaacuteveis apresentou significacircncia estatiacutestica (p gt 005)
mostrando assim que estas variaacuteveis isoladas natildeo foram o fator determinante para
o desfecho cliacutenico de alta ou oacutebito
57
7 CONCLUSAtildeO
Os genes blaKPC e 16S rRNA foram caracterizados confirmando a a
presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos carbapenecircmicos
Houve uma maior prevalecircncia da cepa K pneumoniae e isto confirma outros
estudos que apresentam a maior prevalecircncia desta cepa em amostras com KPC
Aleacutem disso isso justifica a forma popular da K pneumoniae ser chamada de KPC
enquanto que na verdade KPC eacute uma enzima podendo estar presente em outras
cepas como Enterobacter clocae tambeacutem apresentada no presente estudo O
desfecho cliacutenico de oacutebitos maior que 50 eacute um possiacutevel indicador sobre a
necessidade de se realizar um teste raacutepido para identificaccedilatildeo de KPC visando
iniciar o mais raacutepido possiacutevel o tratamento afim de diminuir a mortalidade por esta
infecccedilatildeo
Nenhuma das variaacuteveis isoladamente estaacute relacionada ao desfecho cliacutenico
oacutebito ou alta pois natildeo apresentaram relevacircncia estatiacutestica O presente estudo
mostrou que haacute presenccedila da bacteacuteria nas amostras de pacientes do hospital
estudado podendo entatildeo afirmar que este tipo de bacteacuteria se encontra tambeacutem
presente em ambiente hospitalar O uso irracional de antimicrobiano eacute demonstrado
de forma indireta quando foi apresentado atraveacutes do Teste de Hodge Modificado
uma resistecircncia de 100 aos antibioacuteticos carbapenecircmicos Isto tambeacutem reflete na
terapecircutica sendo que pacientes portadores de bacteacuterias resistentes aos
antibioacuteticos carabepecircmicos tem uma escassa opccedilatildeo de tratamento e as opccedilotildees
apresentam problemas quanto agrave toxicidade e eficaacutecia
58
REFEREcircNCIAS
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Mecanismos
de resistecircncia bacteriana aos antimicrobianos Disponiacutevel em
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controleopas_
webmodulo3mec_sitiohtmgt Acesso em 25 de abril de 2014
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Nota teacutecnica nordm
012013 medidas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees por enterobacteacuterias
multiresistentes Acesso em 17 de abril de 2013
ALBA J et al Kinetics study of KPC-3 a plasmid-encoded class A
carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase Antimicrob Agents Chemother
Nov49(11)4760-2 2005
ALVES A P et al Nosocomial infections by KPC-producing enterobacteria in
a tertiary hospital in Southern Brazil Revista da AMRIGS Porto Alegre 57 (3) 213-
218 jul-set 2013
ALVES A et al Tipagem Geneacutetica de Microrganismos Lab De Diversidade
Microbiana Centro de Biologia Celular Dep de Biologia U de Aveiro 3810-193
Aveiro- 2003
BELL J M et Al Prevalence and significance of a negative extended-
spectrum beta-lactamase (ESBL) confirmation test result after a positive ESBL
screening test result for isolates of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae
results from the SENTRY Asia-Pacific Surveillance Program J Clin Microbiol
May45(5)1478-82 2007
BRATU S et al Detection of KPC carbapenem-hydrolyzing enzymes in
Enterobacter spp from Brooklyn New York Antimicrob Agents Chemother v 49 n
2 p 776-8 2005
59
BRATU S et al Emergence of KPC-possessing Klebsiella pneumoniae in
Brooklyn New York epidemiology and recommendations for detection Antimicrob
Agents Chemother v 49 n 7 p 3018-20 2005
BRATU S et al Rapid spread of carbapenem-resistant Klebsiella
pneumoniae in New York City Arch Intern Med v 165 p 1430-5 2005
CAMARGO C F et al Aplicaccedilatildeo das teacutecnicas de pcr e suas teacutecnicas
derivadas em diagnoacutestico molecular Disponiacutevel em
ltfileDUnB10C2BA20semestreArtigosPCR-
20CLEYTON20FLORENCIO20DE20CAMARGO20E20PAULO20ROB
ERTO20QUEIROZpdfgtgt Acesso em 08 de abril de 2014
CARVALHES C G et al Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting
carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive
results Journal of Antimicrobial Chemotherapy v 65 n2 p 249-251 2010
CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION- CDC Modified
Hodge Test for Carbapenemase Detection in Enterobacteriaceae 2004
CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE Methods for
dilutionantimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically Approved
standard M7ndashA7 7th ed CLSI Wayne PA 2011
COELLO R et al Risk factors for developing clinical infection with methicillin-
resistant Staphylococcus aureus (MRSA) amongst hospital patients initially only
colonized with MRSA J Hosp Infect 19973739-46
COLPAN A et al Evaluation of risk factors for mortality in intensive care
units A prospective study from a referral hospital in Turkey Am J Infect Control
200533(1)42-7
60
CORNAGLIA G et al Living with ESBLs Introduction Clinical Microbiology
and Infection 14 Suppl 1 1-2 2008
COTRIM E R et al Klebsiella pneumoniae carbapenemase ndash KPC em
Enterobacteriaceae o desafio das bacteacuterias multirresistentes Poacutes em revista do
centro universitaacuterio Newton Paiva 12012 - ediccedilatildeo 5 - issn 2176 7785
DESHPANDE L M et al Occurrence and characterization of
carbapenemase-producing Enterobacteacuteriaceae report from the SENTRY
Antimicrobial Surveillance Program (2000-2004) Microb Drug Resist 12(4)223-30
2006
DIAS D J A Estudos dos principais mecanismos de resistecircncia aos
antibioacuteticos β-lactacircmicos em bacteacuterias patogecircnicas gram negativas 2009 100 f
Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Geneacutetica Molecular e Biomedicina) ndash Faculdade de
Ciecircncias e Tecnologia Universidade de Nova Lisboa Lisboa
DIENSTMANN R et al Avaliaccedilatildeo fenotiacutepica da enzima Klebsiella
pneumoniae carbapenemase (KPC) em Enterobacteriaceae de ambiente hospitalar
J Bras Patol Med Lab v 46 n 1 p 23-27 fevereiro 2010
ENDIMIAMI A et al Emergence of blaKPC-containing Klebsiella
pneumoniae in a long-term acute care hospital a new challenge to our healthcare J
Antimicrob Chemother 64 1102-1110 Nov 2009
FALAGAS M E et al Extended-spectrum beta-lactamase producing
organisms The Journal of Hospital Infection 73 (4) pp 345-54 2009
FONTANA C et al Emergence of KPC-producing Klebsiella pneumoniae in
Italy BMC Rev Notes 3 40 2010
61
GALES A C et al Antimicrobial resistance among Gram-negative bacilli
isolated from Latin America results from Sentry Antimicrobial Surveillance Program
(Latin America 2008-2010) Diagnostic Microbiology and Infectious Disease v 3 n
4 p 354 -360 2012
GUPTA N et al Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Epidemiology
and Prevention HEALTHCARE EPIDEMIOLOGY Clinical Infectious Diseases
201153(1)60ndash67 Published by Oxford University Press on behalf of the Infectious
Diseases Society of America 2011
HARBOTTLE H et al Genetics of antimicrobial resistance Anim Biotechnol
n17 p111-124 2006
HENRIQUE W N et al RESISTEcircNCIA BACTERIANA Uniatildeo das
Faculdades Alfredo NasserInstituto de Ciecircncias da Sauacutede Disponiacutevel em lt
httpwwwfaculdadealfredonasseredubrfilespesquisaposter20HENRIQUE20
Wilker20Natividade20SANTIAGO20Silvania20CAVALCANTI20DSP
20ResistC3AAncia20Bacterianapdfgt Acesso em 17 marccedilo 2014
HULSCHER M E J I et al Antibiotic prescribing in hospital a social and
behavioral scientific approach The Lancet Infectious Diaseases v 10 n 3 p 167-
165 2010
KIDWAI M SAPRA P BHUSHAN KR Synthetic strategies and medicinal
properties of beta-lactams Curr Med Chem 1999 695-215
KUMARASAMY K K et al Emergence of a new antibiotic resistance
mechanism in India Pakistan and the UK a molecular biological and
epidemiological stuy The Lancet Infectious Diseases v10 n 9 p 597- 602 2010
LINCOPAN N et al Enterobacteacuteria producing extended-spectrum β-
lacatamases and IMP-1 Metalo-β-lactamases isolated from Brazilian hospitals J Med
62
Microbiol 7 1-3 2006
LINCOPAN N et al First Isolation of Metalo-β-Lacatamase-Producing
Multiresistant Klebsiella pneumoniae from a patient in Brazil J Clin Microbiol 43(1)
516-519 2005
LIVERMORE D M et al What remains against carbapenem- resistant
Enterobacteriaceae Evaluation of choramphenicol ciprofloxacin colistina
fosfomycin minocycline nitrofurantoin temocilin and tigecycline International
Journal of Antimicrobial Agents v 37 n 5 p 415- 459 2011
LIVERMORE D M Fourten years in resistance International Journal of
Antimicrobial Agents v 39 283- 294 2012
LIVERMORE D M Bacterial resistance to carbapenems Adv Exp Med Biol
1995 39025-47
LIVERMORE D M Bacterial resistance origins epidemiology and impact
Clin Infect Dis 36S11-S23 2003
LIVERMORE D M et al Carbapenemases a problem in waiting Curr
Opin Microbiol 2000 3489-95
LU et al Universal pcr for common bacterial pathogens J CLIN
MICROBIOL VOL 38 2000
LU et al Use of PCR with Universal Primers and Restriction Endonuclease
Digestions for Detection and Identification of Common Bacterial Pathogens in
Cerebrospinal Fluid Journal of Clinical Microbiology June 2000 p 2076ndash2080
MARSCHALL J Met al Presence of the KPC Carbapenemase Gene in
Enterobacteriaceae Causing Bacteremia and Its Correlation with In Vitro
Carbapenem Susceptibility J Clin Microbiol 47 239-241 Jan 2009
63
MARTINS WMBS et al Prevalecircncia do gene blaKPC em isolados cliacutenicos
de Enterobacteriaceae e natildeo fermentadores encontrados em amostras clinicas em
um hospital universitaacuterio do Recife X Jornada de ensino pesquisa e extensatildeo ndash
JEPEX 2010 ndash UFRPE Recife 18 a 22 de outubro
MENDES C A C et al Polimixinas Revisatildeo com ecircnfase na sua
nefrotoxicidade Rev Assoc Med Bras 2009 55(6) 752-9
MOHR J F 3rd Update on the efficacy and tolerability of meropenem in the
treatment of serious bacteacuterial infections Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S41-51
2008
MONTEIRO J et al First report of KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae
strains in Brazil Antimicrob Agents Chemother Jan53(1)333-4 2009
MOREIRA V C et al Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia a antibioacuteticos
Disponiacutevel em
lthttpwwwcpglsucgbr6mostraartigosSAUDEVANESSA20CARVALHO20M
OREIRApdfgt Acesso em 21 marccedilo 2014
NETIKUL T et al Emergence of novel blaKPC-12 and blaKPC-13 variants in
carbapenem non-susceptible Enterobacter cloacae a first report of blaKPC gene in
Thailand European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases May
S372 2011
NETO V A et al Antibioacuteticos na praacutetica Meacutedica 6ordf Ediccedilatildeo Editorial
SarverSP Brasil 2007
NICOLAU D P Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of
meropenem Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S32-40 2008
64
OLIVEIRA A C et al Resistecircncia bacteriana e mortalidade em um centro de
terapia intensiva Rev Latino-Am Enfermagem nov-dez 2010
PAAUW A et al Failure to control an outbreak of qnrA 1-positive multidrug-
resistant Enterobacter clocae despite adequate implementation of recommended
infection control measures Journal of Clinical Microbiology v 45 n 5 p 1420-1425
2007
PATERSON D L et al Extended-Spectrum Beta-Lactamases a Clinical
Update Clinical Microbiology Reviews v 18 p 657-686 2005
PEIRANO G et al Carbapenem-hydrolysing beta-lactamase KPC-2 in
Klebsiella pneumonia isolated in Rio de Janeiro Brazil J Antimicrob Chemother Nov
20 2009
PERES-BOTA D et al Are infections due to resistant pathogens associated
with worse outcome in critically ill patients J Infect 200347(4)307-16
PIDDOCK L J V Clinically relevant chromosomally encoded multidrug
resistance effl ux pumps in bacterial Clin Microbiol Rev n19 p382-402 2006
PITOUT J D D et al Emergence of Enterobacteriaceae producing
extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) in the community J Antimicrob
Chemother May 56 2005
POSSEBON M I et al Resistecircncia bacteriana aos carbapenecircmicos
Bacterial resitence to carbapenems RBM rev bras med60(6)378380-378-382
jun 2003
QUEENAN A M et al Carbapenemases the versatile beta-lactamases
Clin Microbiol Rev Jul20(3)440-58 2007
65
RHOMBERG P R et al Summary trends for the meropenem yearly
susceptibility test information collection program a 10- year experience in the United
States (1999-2008) Diagnostic Microbiology and Infectiois Disease v 65 n4 p
414-426 2009
ROBLEDO I E et al Detection of KPC in Acinetobacter spp in Puerto Rico
J Antimicrob Agents Chemother 54 1354-1357 Mar 2010
ROGERS B A et al Country-to-country transfer os patients and the risk of
multi-resistant bacterial infection Clinical Infectious Disease v53 n1 p49- 56
2011
SHAH A A et al Characteristics epidemiology and clinicalimportance of
emerging strains of Gram-negative bacilli producing extended-spectrum
betalactamases Research in Microbiology v 155 p 409-421 2004
TURNER P J Extended- Spectrum Beta-Lactamases Clinical Infectious
Diseases v 41 p 273-275 2005
WOLTER D J et al Phenotypic and Enzymatic Comparative Analysis
between the Novel KPC variant KPC-5 and Its Evolutionary Variants KPC-2 and
KPC-4 Antimicrob Agents Chemother Nov 17 2008
WOODFORD N et al Carbapenemases of Chryseobacterium
(Flavobacterium) meningosepticum distribution of blaB and characterization of a
novel Metalo-beta-lactamase gene blaB3 in the type strain NCTC 10016
Antimicrob Agents Chemother Jun44(6)1448-52 2000
WOODFORF N Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in
India Pakistan and the UK a molecular biological and epidemiological study The
Lancet Infectious Diseases v 10 n 9 p 597-602 2010
66
WOODFORD et al Outbreak of Klebsiella pneumoniae Producing a New
Carbapenem- Hydrolyzing Class A β-Lactamase KPC-3 in a New York Medical
Center Antimicrobial agents and chemotherapy Dec 2004 p 4793ndash4799 Vol 48
No 12
YAGI T et al A preliminary survey of extended-spectrum β-lactamases
(ESBLs) in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Japan
FEMS Microbiology Letters 184 (2000) 53-56
YIGIT H et al Novel carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase KPC-1 from
a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumonia J Antimicrob Agents
Chemother 45 (4) 1151-1161 (2001)
ZAVASCKI A P et al KPC-2- producing Enterobacter cloacae in two cities
from Southern Brazil Int J Antimicrob Agents Apr 28 2009
ZHANEL G G et al Comparative review of the carbapenecircmicos Drugs
67(7)1027-52 2007
67
ANEXOS
Sequumlecircncia do oligo blaKPC
Query 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
Query 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
Query 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
68
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
Query 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
Query 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
69
Query 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
Query 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Sbjct 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
Query 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
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|||||||
70
Sbjct 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
Query 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
Query 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
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|||||||
Sbjct 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
Query 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
71
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
Query 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
Query 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
72
Query 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
Query 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
Query 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
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|||||||
73
Sbjct 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
Query 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
Query 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
Query 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
74
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
Query 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
Query 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
75
Query 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
Query 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
||||
Sbjct 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
LOCUS AF297554 1377 bp
DNA linear BCT 26-MAR-2001
DEFINITION Klebsiella pneumoniae carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
gene complete cds
ACCESSION AF297554
VERSION AF2975541 GI10121874
76
KEYWORDS
SOURCE Klebsiella pneumoniae
ORGANISM Klebsiella pneumoniae
Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Enterobacteriaceae Klebsiella
REFERENCE 1 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH QueenanAM
AndersonGJ Domenech-SanchezA
BiddleJW StewardCD
AlbertiS BushK and TenoverFC
TITLE Novel carbapenem-hydrolyzing beta-
lactamase KPC-1 from a
carbapenem-resistant strain of
Klebsiella pneumoniae
JOURNAL Antimicrob Agents Chemother 45 (4)
1151-1161 (2001)
PUBMED 11257029
REFERENCE 2 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH AndersonGJ and
TenoverFC
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (19-AUG-2000) Nosocomial
Pathogens Laboratory Branch
Centers for Disease Control and
Prevention 1600 Clifton Rd MS
G08 Atlanta GA 30333 USA
FEATURES LocationQualifiers
77
source 11377
organism=Klebsiella
pneumoniae
mol_type=genomic DNA
db_xref=taxon573
-35_signal 5560
-10_signal 7883
mRNA 921012
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
RBS 117122
CDS 1311012
note=blaKPC-1
codon_start=1
transl_table=11
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
protein_id=AAG134101
db_xref=GI10121875
translation=MSLYRRLVLLSCLSWPLAGFSATALTNLVAEPFAKLEQD
FGGSI
GVYAMDTGSGATVSYRAEERFPLCSSFKGFLAAAVLARSQQQAGLLDTPIRYG
KNALV
PWSPISEKYLTTGMTVAELSAAAVQYSDNAAANLLLKELGGPAGLTAFMRSIG
DTTFR
78
LDRWELELNSAIPSDARDTSSPRAVTESLQKLTLGSALAAPQRQQFVDWLKGN
TTGNH
RIRAAVPADWAVGDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTRAPNKDDK
HSEAV
IAAAARLALEGLGVNGQ
ORIGIN
1 cggggcagtt acagccgtta cagcctctgg
agagggagcg gcttgccgct cggtgataat
61 cccagctgta gcggcctgat tacatccggc
cgctacacct agctccacct tcaaacaagg
121 aatatcgttg atgtcactgt atcgccgtct
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181 ggctggcttt tctgccaccg cgctgaccaa
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241 acaggacttt ggcggctcca tcggtgtgta
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79
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1321 gcaccttgtc caggcccctc atgctgaact
gacgcaatcc catcaccgcc ttgatca
80
53
6 DISCUSSAtildeO
Nos uacuteltimos anos houve um aumento na incidecircncia de bacteacuterias
multirresistentes aos antimicrobianos no ambiente hospitalar tornando isto um
problema mundial de sauacutede puacuteblica (HULSCHER et al 2010) Quando se trata
principalmente de bacilos Gram negativos a frequumlecircncia destas bacteacuterias eacute ainda
maior em paiacuteses da Ameacuterica Latina quando comparada a paiacuteses desenvolvidos
(GALES etal 2012)
De acordo com dados do ldquoMeropenem Yearly Susceptibility Test Information
Collectionrdquo (MYSTIC) ocorreu nos Estados Unidos um aumento na susceptibilidade
de K pneumoniae nos uacuteltimos anos graccedilas a praacuteticas de controle de disseminaccedilatildeo
de amostras resistentes(RHOMBERG P R et al 2009) O aumento crescente da
prevalecircncia destes microrganismos foi proporcional ao aumento da dependecircncia do
uso de antibioacuteticos carbapenecircmicos considerados como a opccedilatildeo terapecircutica para o
tratamento de infecccedilotildees por bacilos Gram negativos multi-resistentes (LIVERMORE
2012) Isto afeta diretamente as opccedilotildees de tratamento sobrando poucas alternativas
para a terapecircutica que incluem colistina (polimixina E) e tigeciclina que apresentam
respectivamente problemas em termos de toxicidade e eficaacutecia (LIVERMORE et
al 2011) Um dos efeitos adversos mais importantes das poliminas B e E por
exemplo satildeo a neurotoxicidade e nefrotoxicidade (MENDES C A C et al2009 )
Devido agrave resistecircncia ser usualmente de natureza plasmidial e portanto de
maior disseminaccedilatildeo especialmente quando carreadas por K pneumoniae
microrganismo com uma notoacuteria capacidade para acumular e transferir plasmiacutedeos
com determinantes para resistecircncia o nuacutemero de casos detectados pelo
fenoacutetipogenoacutetipo blaKPC eacute bastante preocupante (MONTEIRO et al 2009)
Comparada com outras bacteacuterias hospitalares a transmissatildeo de clones
multirresistentes de K pneumoniae eacute maior e podem natildeo ser controladas pelos
meacutetodos de controle de infecccedilatildeo hospitalar (PAAUW et al 2007) A forma
plasmidial para transferecircncia da resistecircncia adicionada a este grande potencial para
disseminaccedilatildeo de clones resistentes eacute preocupante visto que apoacutes surtos muitas
vezes pode se tornar endecircmica Jaacute eacute uma realidade a disseminaccedilatildeo desta bacteacuteria
54
entre pacientes hospitais paiacuteses e ateacute mesmo continentes (WOODFORF et al
2010 ROGERS et al 2011)
As chances de surtos satildeo maiores em paiacuteses com poucos recursos devido agrave
maior carecircncia de praacuteticas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees hospitalares e o
uso irracional de antimicrobianos de forma empiacuterica e inadequada (KUMARASAMY
et al 2010) Ateacute o momento os mecanismos de resistecircncia aos cabapenecircmicos
geralmente encontrado eram a produccedilatildeo de ESBL (CTX-M) somada aacute perda de
porina (CARVALHAES et al 2010) Foi notado a partir do ano de 2008 um
aumento no nuacutemero de K pneumoniae produtoras de KPC-2 apresentando outra
forma de resistecircncia (GALES 2012)
Um estudo mostrou que o perfil do paciente colonizado ou infectado por KPC
foi de um paciente entre os 33 e os 82 anos de idade internado haacute mais de 1
semana no hospital A mortalidade geral nos uacuteltimos anos ficou em torno de 7
sendo que dos 77 pacientes estudados 32 (415) pacientes evoluiacuteram para oacutebito
evidenciando a alta morbi-mortalidade associada (ALVES A P et al 2013)
Em estudo com 2316 pacientes avaliados a populaccedilatildeo de sexo masculino foi
de 526 idade meacutedia global de 53 anos (mediana de 55 anos) permanecircncia meacutedia
de 58 dias (mediana de 3 dias) (OLIVEIRA A C et al 2010) Outros trabalhos
apresentaram ausecircncia de significacircncia entre sexoidade e o desenvolvimento de
infecccedilotildees por microrganismos resistentes (PERES-BOTA D et al 2003 COLPAN
A et al 2005 COELLO R et al 1997)
Outro estudo utilizou um total de 30 amostras sendo elas isoladas de urina
escarro secreccedilatildeo pleural ponta de cateter aspirado traqueal e hemocultura A mais
prevalente foi em urina (40) Entre as 30 cepas analisadas a maior porcentagem
foi da cepa Klebsiella pneumoniae (70) Enterobacter sp (133) Klebsiella
ozaenae (10) Escherichia coli (333) e Klebsiella oxytoca (333)
(DIENSTMANN R et al 2010) Nos Estados Unidos a enzima KPC jaacute se tornou
endecircmica Foi realizada uma pesquisa em dois hospitais de Nova York onde
testaram 602 amostras e 45 apresentaram algum mecanismo de resistecircncia
sendo apenas 33 confirmadas por biologia molecular como KPC-2 (BRATU et
al 2005)
55
Estudo sobre os tipos de ESBL feito no Japatildeo apresentou o tipo Toho-1 como
o mais prevalente nessa pesquisa Ateacute o ano de 2000 ano em que foi publicado tal
estudo este era o primeiro relatoacuterio no Japatildeo para identificar derivados de ESBLs
como tipo de SHV e TEM entre E coli e K pneumoniae Em especial o tipo SHV- 12
foi identificado com uma maior frequumlecircncia Estes resultados indicam que tipos
distintos de ESBLs que satildeo diferentes em sua especificidade de substrato e origem
geneacutetica coexistem no Japatildeo Isto mostra a importacircncia de caracterizar genoacutetipos
distintos de ESBLs e de estar em alerta continuamente para as tendecircncias de
ESBLs no Japatildeo aleacutem da necessidade de uma interpretaccedilatildeo uniforme utilizando as
diretrizes do CSLI para relatar cepas produtoras de ESBL Aleacutem da detecccedilatildeo de
ESBLs satildeo necessaacuterias mais informaccedilotildees tais como o perfil de sensibilidade
especiacutefica para diversas β-lactacircmicos e o local da infecccedilatildeo Esses fatores satildeo
essenciais para a escolha adequada de antibioacuteticos (YAGI T et al 2000)
No ano de 2004 uma pesquisa avaliou a produccedilatildeo de uma enzima de
hidroacutelise de carbapenecircmicos atraveacutes da teacutecnica de sequumlenciamento foi revelado
um novo membro da famiacutelia KPC designado KPC- 3 Pesquisadores encontraram
em um mutante de K pneumoniae uma substituiccedilatildeo de um gene associado com
resistecircncia a Imipenem mas essa substituiccedilatildeo foi considerada improvaacutevel na
contribuiccedilatildeo da resistecircncia aos carbapenecircmicos da espeacutecie estudada Aleacutem da
resistecircncia aos carbapenecircmicos estes isolados eram em sua maioria resistentes agraves
cefalosporinas penicilinas e aminoglicosiacutedeos Usando estudos de transformaccedilatildeo
conjugaccedilatildeo e hibridaccedilatildeo localizaram o alelo blaKPC em plasmiacutedeo aleacutem disso
mostraram que esse alelo tambeacutem carregava uma resistecircncia aos aminoglicosiacutedeos
A transferecircncia das enzimas KPCs foi demonstrada in vitro tanto neste como em
outros estudos pode ser que os plasmiacutedeos que fazem esta transferecircncia estavam
comeccedilando a se espalhar no ambiente cliacutenico resultando na multiresistecircncia dessas
estirpes (WOODFORD et al 2004)
O presente estudo apresentou um vieacutes quanto aos resultados dos testes de
susceptibilidade microbiana Observou-se que natildeo foi encontrado resultado deste
teste em algumas amostras o que natildeo cooperou para um estudo mais preciso
futuros estudos quanto agraves amostras e um melhor acompanhamento deste tipo de
patologia Poreacutem mesmo sem algumas amostras com este resultado disponiacutevel foi
56
confirmada a presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos
carbapenecircmicos por meio dos genes de resistecircncia blaKPC e 16S rRNA que as
amostras apresentaram em sua maioria serem portadoras Quanto aos resultados
estatiacutesticos nenhuma das variaacuteveis apresentou significacircncia estatiacutestica (p gt 005)
mostrando assim que estas variaacuteveis isoladas natildeo foram o fator determinante para
o desfecho cliacutenico de alta ou oacutebito
57
7 CONCLUSAtildeO
Os genes blaKPC e 16S rRNA foram caracterizados confirmando a a
presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos carbapenecircmicos
Houve uma maior prevalecircncia da cepa K pneumoniae e isto confirma outros
estudos que apresentam a maior prevalecircncia desta cepa em amostras com KPC
Aleacutem disso isso justifica a forma popular da K pneumoniae ser chamada de KPC
enquanto que na verdade KPC eacute uma enzima podendo estar presente em outras
cepas como Enterobacter clocae tambeacutem apresentada no presente estudo O
desfecho cliacutenico de oacutebitos maior que 50 eacute um possiacutevel indicador sobre a
necessidade de se realizar um teste raacutepido para identificaccedilatildeo de KPC visando
iniciar o mais raacutepido possiacutevel o tratamento afim de diminuir a mortalidade por esta
infecccedilatildeo
Nenhuma das variaacuteveis isoladamente estaacute relacionada ao desfecho cliacutenico
oacutebito ou alta pois natildeo apresentaram relevacircncia estatiacutestica O presente estudo
mostrou que haacute presenccedila da bacteacuteria nas amostras de pacientes do hospital
estudado podendo entatildeo afirmar que este tipo de bacteacuteria se encontra tambeacutem
presente em ambiente hospitalar O uso irracional de antimicrobiano eacute demonstrado
de forma indireta quando foi apresentado atraveacutes do Teste de Hodge Modificado
uma resistecircncia de 100 aos antibioacuteticos carbapenecircmicos Isto tambeacutem reflete na
terapecircutica sendo que pacientes portadores de bacteacuterias resistentes aos
antibioacuteticos carabepecircmicos tem uma escassa opccedilatildeo de tratamento e as opccedilotildees
apresentam problemas quanto agrave toxicidade e eficaacutecia
58
REFEREcircNCIAS
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Mecanismos
de resistecircncia bacteriana aos antimicrobianos Disponiacutevel em
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controleopas_
webmodulo3mec_sitiohtmgt Acesso em 25 de abril de 2014
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Nota teacutecnica nordm
012013 medidas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees por enterobacteacuterias
multiresistentes Acesso em 17 de abril de 2013
ALBA J et al Kinetics study of KPC-3 a plasmid-encoded class A
carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase Antimicrob Agents Chemother
Nov49(11)4760-2 2005
ALVES A P et al Nosocomial infections by KPC-producing enterobacteria in
a tertiary hospital in Southern Brazil Revista da AMRIGS Porto Alegre 57 (3) 213-
218 jul-set 2013
ALVES A et al Tipagem Geneacutetica de Microrganismos Lab De Diversidade
Microbiana Centro de Biologia Celular Dep de Biologia U de Aveiro 3810-193
Aveiro- 2003
BELL J M et Al Prevalence and significance of a negative extended-
spectrum beta-lactamase (ESBL) confirmation test result after a positive ESBL
screening test result for isolates of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae
results from the SENTRY Asia-Pacific Surveillance Program J Clin Microbiol
May45(5)1478-82 2007
BRATU S et al Detection of KPC carbapenem-hydrolyzing enzymes in
Enterobacter spp from Brooklyn New York Antimicrob Agents Chemother v 49 n
2 p 776-8 2005
59
BRATU S et al Emergence of KPC-possessing Klebsiella pneumoniae in
Brooklyn New York epidemiology and recommendations for detection Antimicrob
Agents Chemother v 49 n 7 p 3018-20 2005
BRATU S et al Rapid spread of carbapenem-resistant Klebsiella
pneumoniae in New York City Arch Intern Med v 165 p 1430-5 2005
CAMARGO C F et al Aplicaccedilatildeo das teacutecnicas de pcr e suas teacutecnicas
derivadas em diagnoacutestico molecular Disponiacutevel em
ltfileDUnB10C2BA20semestreArtigosPCR-
20CLEYTON20FLORENCIO20DE20CAMARGO20E20PAULO20ROB
ERTO20QUEIROZpdfgtgt Acesso em 08 de abril de 2014
CARVALHES C G et al Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting
carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive
results Journal of Antimicrobial Chemotherapy v 65 n2 p 249-251 2010
CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION- CDC Modified
Hodge Test for Carbapenemase Detection in Enterobacteriaceae 2004
CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE Methods for
dilutionantimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically Approved
standard M7ndashA7 7th ed CLSI Wayne PA 2011
COELLO R et al Risk factors for developing clinical infection with methicillin-
resistant Staphylococcus aureus (MRSA) amongst hospital patients initially only
colonized with MRSA J Hosp Infect 19973739-46
COLPAN A et al Evaluation of risk factors for mortality in intensive care
units A prospective study from a referral hospital in Turkey Am J Infect Control
200533(1)42-7
60
CORNAGLIA G et al Living with ESBLs Introduction Clinical Microbiology
and Infection 14 Suppl 1 1-2 2008
COTRIM E R et al Klebsiella pneumoniae carbapenemase ndash KPC em
Enterobacteriaceae o desafio das bacteacuterias multirresistentes Poacutes em revista do
centro universitaacuterio Newton Paiva 12012 - ediccedilatildeo 5 - issn 2176 7785
DESHPANDE L M et al Occurrence and characterization of
carbapenemase-producing Enterobacteacuteriaceae report from the SENTRY
Antimicrobial Surveillance Program (2000-2004) Microb Drug Resist 12(4)223-30
2006
DIAS D J A Estudos dos principais mecanismos de resistecircncia aos
antibioacuteticos β-lactacircmicos em bacteacuterias patogecircnicas gram negativas 2009 100 f
Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Geneacutetica Molecular e Biomedicina) ndash Faculdade de
Ciecircncias e Tecnologia Universidade de Nova Lisboa Lisboa
DIENSTMANN R et al Avaliaccedilatildeo fenotiacutepica da enzima Klebsiella
pneumoniae carbapenemase (KPC) em Enterobacteriaceae de ambiente hospitalar
J Bras Patol Med Lab v 46 n 1 p 23-27 fevereiro 2010
ENDIMIAMI A et al Emergence of blaKPC-containing Klebsiella
pneumoniae in a long-term acute care hospital a new challenge to our healthcare J
Antimicrob Chemother 64 1102-1110 Nov 2009
FALAGAS M E et al Extended-spectrum beta-lactamase producing
organisms The Journal of Hospital Infection 73 (4) pp 345-54 2009
FONTANA C et al Emergence of KPC-producing Klebsiella pneumoniae in
Italy BMC Rev Notes 3 40 2010
61
GALES A C et al Antimicrobial resistance among Gram-negative bacilli
isolated from Latin America results from Sentry Antimicrobial Surveillance Program
(Latin America 2008-2010) Diagnostic Microbiology and Infectious Disease v 3 n
4 p 354 -360 2012
GUPTA N et al Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Epidemiology
and Prevention HEALTHCARE EPIDEMIOLOGY Clinical Infectious Diseases
201153(1)60ndash67 Published by Oxford University Press on behalf of the Infectious
Diseases Society of America 2011
HARBOTTLE H et al Genetics of antimicrobial resistance Anim Biotechnol
n17 p111-124 2006
HENRIQUE W N et al RESISTEcircNCIA BACTERIANA Uniatildeo das
Faculdades Alfredo NasserInstituto de Ciecircncias da Sauacutede Disponiacutevel em lt
httpwwwfaculdadealfredonasseredubrfilespesquisaposter20HENRIQUE20
Wilker20Natividade20SANTIAGO20Silvania20CAVALCANTI20DSP
20ResistC3AAncia20Bacterianapdfgt Acesso em 17 marccedilo 2014
HULSCHER M E J I et al Antibiotic prescribing in hospital a social and
behavioral scientific approach The Lancet Infectious Diaseases v 10 n 3 p 167-
165 2010
KIDWAI M SAPRA P BHUSHAN KR Synthetic strategies and medicinal
properties of beta-lactams Curr Med Chem 1999 695-215
KUMARASAMY K K et al Emergence of a new antibiotic resistance
mechanism in India Pakistan and the UK a molecular biological and
epidemiological stuy The Lancet Infectious Diseases v10 n 9 p 597- 602 2010
LINCOPAN N et al Enterobacteacuteria producing extended-spectrum β-
lacatamases and IMP-1 Metalo-β-lactamases isolated from Brazilian hospitals J Med
62
Microbiol 7 1-3 2006
LINCOPAN N et al First Isolation of Metalo-β-Lacatamase-Producing
Multiresistant Klebsiella pneumoniae from a patient in Brazil J Clin Microbiol 43(1)
516-519 2005
LIVERMORE D M et al What remains against carbapenem- resistant
Enterobacteriaceae Evaluation of choramphenicol ciprofloxacin colistina
fosfomycin minocycline nitrofurantoin temocilin and tigecycline International
Journal of Antimicrobial Agents v 37 n 5 p 415- 459 2011
LIVERMORE D M Fourten years in resistance International Journal of
Antimicrobial Agents v 39 283- 294 2012
LIVERMORE D M Bacterial resistance to carbapenems Adv Exp Med Biol
1995 39025-47
LIVERMORE D M Bacterial resistance origins epidemiology and impact
Clin Infect Dis 36S11-S23 2003
LIVERMORE D M et al Carbapenemases a problem in waiting Curr
Opin Microbiol 2000 3489-95
LU et al Universal pcr for common bacterial pathogens J CLIN
MICROBIOL VOL 38 2000
LU et al Use of PCR with Universal Primers and Restriction Endonuclease
Digestions for Detection and Identification of Common Bacterial Pathogens in
Cerebrospinal Fluid Journal of Clinical Microbiology June 2000 p 2076ndash2080
MARSCHALL J Met al Presence of the KPC Carbapenemase Gene in
Enterobacteriaceae Causing Bacteremia and Its Correlation with In Vitro
Carbapenem Susceptibility J Clin Microbiol 47 239-241 Jan 2009
63
MARTINS WMBS et al Prevalecircncia do gene blaKPC em isolados cliacutenicos
de Enterobacteriaceae e natildeo fermentadores encontrados em amostras clinicas em
um hospital universitaacuterio do Recife X Jornada de ensino pesquisa e extensatildeo ndash
JEPEX 2010 ndash UFRPE Recife 18 a 22 de outubro
MENDES C A C et al Polimixinas Revisatildeo com ecircnfase na sua
nefrotoxicidade Rev Assoc Med Bras 2009 55(6) 752-9
MOHR J F 3rd Update on the efficacy and tolerability of meropenem in the
treatment of serious bacteacuterial infections Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S41-51
2008
MONTEIRO J et al First report of KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae
strains in Brazil Antimicrob Agents Chemother Jan53(1)333-4 2009
MOREIRA V C et al Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia a antibioacuteticos
Disponiacutevel em
lthttpwwwcpglsucgbr6mostraartigosSAUDEVANESSA20CARVALHO20M
OREIRApdfgt Acesso em 21 marccedilo 2014
NETIKUL T et al Emergence of novel blaKPC-12 and blaKPC-13 variants in
carbapenem non-susceptible Enterobacter cloacae a first report of blaKPC gene in
Thailand European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases May
S372 2011
NETO V A et al Antibioacuteticos na praacutetica Meacutedica 6ordf Ediccedilatildeo Editorial
SarverSP Brasil 2007
NICOLAU D P Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of
meropenem Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S32-40 2008
64
OLIVEIRA A C et al Resistecircncia bacteriana e mortalidade em um centro de
terapia intensiva Rev Latino-Am Enfermagem nov-dez 2010
PAAUW A et al Failure to control an outbreak of qnrA 1-positive multidrug-
resistant Enterobacter clocae despite adequate implementation of recommended
infection control measures Journal of Clinical Microbiology v 45 n 5 p 1420-1425
2007
PATERSON D L et al Extended-Spectrum Beta-Lactamases a Clinical
Update Clinical Microbiology Reviews v 18 p 657-686 2005
PEIRANO G et al Carbapenem-hydrolysing beta-lactamase KPC-2 in
Klebsiella pneumonia isolated in Rio de Janeiro Brazil J Antimicrob Chemother Nov
20 2009
PERES-BOTA D et al Are infections due to resistant pathogens associated
with worse outcome in critically ill patients J Infect 200347(4)307-16
PIDDOCK L J V Clinically relevant chromosomally encoded multidrug
resistance effl ux pumps in bacterial Clin Microbiol Rev n19 p382-402 2006
PITOUT J D D et al Emergence of Enterobacteriaceae producing
extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) in the community J Antimicrob
Chemother May 56 2005
POSSEBON M I et al Resistecircncia bacteriana aos carbapenecircmicos
Bacterial resitence to carbapenems RBM rev bras med60(6)378380-378-382
jun 2003
QUEENAN A M et al Carbapenemases the versatile beta-lactamases
Clin Microbiol Rev Jul20(3)440-58 2007
65
RHOMBERG P R et al Summary trends for the meropenem yearly
susceptibility test information collection program a 10- year experience in the United
States (1999-2008) Diagnostic Microbiology and Infectiois Disease v 65 n4 p
414-426 2009
ROBLEDO I E et al Detection of KPC in Acinetobacter spp in Puerto Rico
J Antimicrob Agents Chemother 54 1354-1357 Mar 2010
ROGERS B A et al Country-to-country transfer os patients and the risk of
multi-resistant bacterial infection Clinical Infectious Disease v53 n1 p49- 56
2011
SHAH A A et al Characteristics epidemiology and clinicalimportance of
emerging strains of Gram-negative bacilli producing extended-spectrum
betalactamases Research in Microbiology v 155 p 409-421 2004
TURNER P J Extended- Spectrum Beta-Lactamases Clinical Infectious
Diseases v 41 p 273-275 2005
WOLTER D J et al Phenotypic and Enzymatic Comparative Analysis
between the Novel KPC variant KPC-5 and Its Evolutionary Variants KPC-2 and
KPC-4 Antimicrob Agents Chemother Nov 17 2008
WOODFORD N et al Carbapenemases of Chryseobacterium
(Flavobacterium) meningosepticum distribution of blaB and characterization of a
novel Metalo-beta-lactamase gene blaB3 in the type strain NCTC 10016
Antimicrob Agents Chemother Jun44(6)1448-52 2000
WOODFORF N Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in
India Pakistan and the UK a molecular biological and epidemiological study The
Lancet Infectious Diseases v 10 n 9 p 597-602 2010
66
WOODFORD et al Outbreak of Klebsiella pneumoniae Producing a New
Carbapenem- Hydrolyzing Class A β-Lactamase KPC-3 in a New York Medical
Center Antimicrobial agents and chemotherapy Dec 2004 p 4793ndash4799 Vol 48
No 12
YAGI T et al A preliminary survey of extended-spectrum β-lactamases
(ESBLs) in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Japan
FEMS Microbiology Letters 184 (2000) 53-56
YIGIT H et al Novel carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase KPC-1 from
a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumonia J Antimicrob Agents
Chemother 45 (4) 1151-1161 (2001)
ZAVASCKI A P et al KPC-2- producing Enterobacter cloacae in two cities
from Southern Brazil Int J Antimicrob Agents Apr 28 2009
ZHANEL G G et al Comparative review of the carbapenecircmicos Drugs
67(7)1027-52 2007
67
ANEXOS
Sequumlecircncia do oligo blaKPC
Query 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
Query 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
Query 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
68
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
Query 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
Query 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
69
Query 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
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Sbjct 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
Query 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
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Sbjct 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
Query 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
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70
Sbjct 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
Query 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
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Sbjct 481
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ATTTGTT 540
Query 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
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Sbjct 541
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GCGATAC 600
Query 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
71
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Sbjct 601
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ATGCGCG 660
Query 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
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Sbjct 661
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GCTCTGC 720
Query 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
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Sbjct 721
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CCGGCAA 780
72
Query 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
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Sbjct 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
Query 841
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CACCTAT 900
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Sbjct 841
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CACCTAT 900
Query 901
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73
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CCGTCAT 960
Query 961
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GCTCTGA 1020
Query 1021
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Sbjct 1021
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Query 1081
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74
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Sbjct 1141
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AATCTTG 1200
Query 1201
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Sbjct 1201
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CTTCGCC 1260
75
Query 1261
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TCGGCTT 1320
Query 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
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Sbjct 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
LOCUS AF297554 1377 bp
DNA linear BCT 26-MAR-2001
DEFINITION Klebsiella pneumoniae carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
gene complete cds
ACCESSION AF297554
VERSION AF2975541 GI10121874
76
KEYWORDS
SOURCE Klebsiella pneumoniae
ORGANISM Klebsiella pneumoniae
Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Enterobacteriaceae Klebsiella
REFERENCE 1 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH QueenanAM
AndersonGJ Domenech-SanchezA
BiddleJW StewardCD
AlbertiS BushK and TenoverFC
TITLE Novel carbapenem-hydrolyzing beta-
lactamase KPC-1 from a
carbapenem-resistant strain of
Klebsiella pneumoniae
JOURNAL Antimicrob Agents Chemother 45 (4)
1151-1161 (2001)
PUBMED 11257029
REFERENCE 2 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH AndersonGJ and
TenoverFC
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (19-AUG-2000) Nosocomial
Pathogens Laboratory Branch
Centers for Disease Control and
Prevention 1600 Clifton Rd MS
G08 Atlanta GA 30333 USA
FEATURES LocationQualifiers
77
source 11377
organism=Klebsiella
pneumoniae
mol_type=genomic DNA
db_xref=taxon573
-35_signal 5560
-10_signal 7883
mRNA 921012
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
RBS 117122
CDS 1311012
note=blaKPC-1
codon_start=1
transl_table=11
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
protein_id=AAG134101
db_xref=GI10121875
translation=MSLYRRLVLLSCLSWPLAGFSATALTNLVAEPFAKLEQD
FGGSI
GVYAMDTGSGATVSYRAEERFPLCSSFKGFLAAAVLARSQQQAGLLDTPIRYG
KNALV
PWSPISEKYLTTGMTVAELSAAAVQYSDNAAANLLLKELGGPAGLTAFMRSIG
DTTFR
78
LDRWELELNSAIPSDARDTSSPRAVTESLQKLTLGSALAAPQRQQFVDWLKGN
TTGNH
RIRAAVPADWAVGDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTRAPNKDDK
HSEAV
IAAAARLALEGLGVNGQ
ORIGIN
1 cggggcagtt acagccgtta cagcctctgg
agagggagcg gcttgccgct cggtgataat
61 cccagctgta gcggcctgat tacatccggc
cgctacacct agctccacct tcaaacaagg
121 aatatcgttg atgtcactgt atcgccgtct
agttctgctg tcttgtctct catggccgct
181 ggctggcttt tctgccaccg cgctgaccaa
cctcgtcgcg gaaccattcg ctaaactcga
241 acaggacttt ggcggctcca tcggtgtgta
cgcgatggat accggctcag gcgcaactgt
301 aagttaccgc gctgaggagc gcttcccact
gtgcagctca ttcaagggct ttcttgctgc
361 cgctgtgctg gctcgcagcc agcagcaggc
cggcttgctg gacacaccca tccgttacgg
421 caaaaatgcg ctggttccgt ggtcacccat
ctcggaaaaa tatctgacaa caggcatgac
481 ggtggcggag ctgtccgcgg ccgccgtgca
atacagtgat aacgccgccg ccaatttgtt
541 gctgaaggag ttgggcggcc cggccgggct
gacggccttc atgcgctcta tcggcgatac
79
601 cacgttccgt ctggaccgct gggagctgga
gctgaactcc gccatcccaa gcgatgcgcg
661 cgatacctca tcgccgcgcg ccgtgacgga
aagcttacaa aaactgacac tgggctctgc
721 actggctgcg ccgcagcggc agcagtttgt
tgattggcta aagggaaaca cgaccggcaa
781 ccaccgcatc cgcgcggcgg tgccggcaga
ctgggcagtc ggagacaaaa ccggaacctg
841 cggagtgtat ggcacggcaa atgactatgc
cgtcgtctgg cccactgggc gcgcacctat
901 tgtgttggcc gtctacaccc gggcgcctaa
caaggatgac aagcacagcg aggccgtcat
961 cgccgctgcg gctagactcg cgctcgaggg
attgggcgtc aacgggcagt aaggctctga
1021 aaatcatcta ttggcccacc accgccgccc
ttgcgggcgg catggattac caaccactgt
1081 cacatttagg ctaggagtct gcgcggcaga
gccgtgtgac cggttttctg tagagcactg
1141 acgatggcgg cggcgctctc tgcaattggc
aaggcgtcgg cgccaaggat accaatcttg
1201 cggcgcgcgg cgtgttatga cgactggggt
gcatttgagc cgccccattt aaccttcgcc
1261 ctcacagata cgccattcgc ctcaaattta
gcgccatgca gacgagcttc cactcggctt
1321 gcaccttgtc caggcccctc atgctgaact
gacgcaatcc catcaccgcc ttgatca
80
54
entre pacientes hospitais paiacuteses e ateacute mesmo continentes (WOODFORF et al
2010 ROGERS et al 2011)
As chances de surtos satildeo maiores em paiacuteses com poucos recursos devido agrave
maior carecircncia de praacuteticas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees hospitalares e o
uso irracional de antimicrobianos de forma empiacuterica e inadequada (KUMARASAMY
et al 2010) Ateacute o momento os mecanismos de resistecircncia aos cabapenecircmicos
geralmente encontrado eram a produccedilatildeo de ESBL (CTX-M) somada aacute perda de
porina (CARVALHAES et al 2010) Foi notado a partir do ano de 2008 um
aumento no nuacutemero de K pneumoniae produtoras de KPC-2 apresentando outra
forma de resistecircncia (GALES 2012)
Um estudo mostrou que o perfil do paciente colonizado ou infectado por KPC
foi de um paciente entre os 33 e os 82 anos de idade internado haacute mais de 1
semana no hospital A mortalidade geral nos uacuteltimos anos ficou em torno de 7
sendo que dos 77 pacientes estudados 32 (415) pacientes evoluiacuteram para oacutebito
evidenciando a alta morbi-mortalidade associada (ALVES A P et al 2013)
Em estudo com 2316 pacientes avaliados a populaccedilatildeo de sexo masculino foi
de 526 idade meacutedia global de 53 anos (mediana de 55 anos) permanecircncia meacutedia
de 58 dias (mediana de 3 dias) (OLIVEIRA A C et al 2010) Outros trabalhos
apresentaram ausecircncia de significacircncia entre sexoidade e o desenvolvimento de
infecccedilotildees por microrganismos resistentes (PERES-BOTA D et al 2003 COLPAN
A et al 2005 COELLO R et al 1997)
Outro estudo utilizou um total de 30 amostras sendo elas isoladas de urina
escarro secreccedilatildeo pleural ponta de cateter aspirado traqueal e hemocultura A mais
prevalente foi em urina (40) Entre as 30 cepas analisadas a maior porcentagem
foi da cepa Klebsiella pneumoniae (70) Enterobacter sp (133) Klebsiella
ozaenae (10) Escherichia coli (333) e Klebsiella oxytoca (333)
(DIENSTMANN R et al 2010) Nos Estados Unidos a enzima KPC jaacute se tornou
endecircmica Foi realizada uma pesquisa em dois hospitais de Nova York onde
testaram 602 amostras e 45 apresentaram algum mecanismo de resistecircncia
sendo apenas 33 confirmadas por biologia molecular como KPC-2 (BRATU et
al 2005)
55
Estudo sobre os tipos de ESBL feito no Japatildeo apresentou o tipo Toho-1 como
o mais prevalente nessa pesquisa Ateacute o ano de 2000 ano em que foi publicado tal
estudo este era o primeiro relatoacuterio no Japatildeo para identificar derivados de ESBLs
como tipo de SHV e TEM entre E coli e K pneumoniae Em especial o tipo SHV- 12
foi identificado com uma maior frequumlecircncia Estes resultados indicam que tipos
distintos de ESBLs que satildeo diferentes em sua especificidade de substrato e origem
geneacutetica coexistem no Japatildeo Isto mostra a importacircncia de caracterizar genoacutetipos
distintos de ESBLs e de estar em alerta continuamente para as tendecircncias de
ESBLs no Japatildeo aleacutem da necessidade de uma interpretaccedilatildeo uniforme utilizando as
diretrizes do CSLI para relatar cepas produtoras de ESBL Aleacutem da detecccedilatildeo de
ESBLs satildeo necessaacuterias mais informaccedilotildees tais como o perfil de sensibilidade
especiacutefica para diversas β-lactacircmicos e o local da infecccedilatildeo Esses fatores satildeo
essenciais para a escolha adequada de antibioacuteticos (YAGI T et al 2000)
No ano de 2004 uma pesquisa avaliou a produccedilatildeo de uma enzima de
hidroacutelise de carbapenecircmicos atraveacutes da teacutecnica de sequumlenciamento foi revelado
um novo membro da famiacutelia KPC designado KPC- 3 Pesquisadores encontraram
em um mutante de K pneumoniae uma substituiccedilatildeo de um gene associado com
resistecircncia a Imipenem mas essa substituiccedilatildeo foi considerada improvaacutevel na
contribuiccedilatildeo da resistecircncia aos carbapenecircmicos da espeacutecie estudada Aleacutem da
resistecircncia aos carbapenecircmicos estes isolados eram em sua maioria resistentes agraves
cefalosporinas penicilinas e aminoglicosiacutedeos Usando estudos de transformaccedilatildeo
conjugaccedilatildeo e hibridaccedilatildeo localizaram o alelo blaKPC em plasmiacutedeo aleacutem disso
mostraram que esse alelo tambeacutem carregava uma resistecircncia aos aminoglicosiacutedeos
A transferecircncia das enzimas KPCs foi demonstrada in vitro tanto neste como em
outros estudos pode ser que os plasmiacutedeos que fazem esta transferecircncia estavam
comeccedilando a se espalhar no ambiente cliacutenico resultando na multiresistecircncia dessas
estirpes (WOODFORD et al 2004)
O presente estudo apresentou um vieacutes quanto aos resultados dos testes de
susceptibilidade microbiana Observou-se que natildeo foi encontrado resultado deste
teste em algumas amostras o que natildeo cooperou para um estudo mais preciso
futuros estudos quanto agraves amostras e um melhor acompanhamento deste tipo de
patologia Poreacutem mesmo sem algumas amostras com este resultado disponiacutevel foi
56
confirmada a presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos
carbapenecircmicos por meio dos genes de resistecircncia blaKPC e 16S rRNA que as
amostras apresentaram em sua maioria serem portadoras Quanto aos resultados
estatiacutesticos nenhuma das variaacuteveis apresentou significacircncia estatiacutestica (p gt 005)
mostrando assim que estas variaacuteveis isoladas natildeo foram o fator determinante para
o desfecho cliacutenico de alta ou oacutebito
57
7 CONCLUSAtildeO
Os genes blaKPC e 16S rRNA foram caracterizados confirmando a a
presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos carbapenecircmicos
Houve uma maior prevalecircncia da cepa K pneumoniae e isto confirma outros
estudos que apresentam a maior prevalecircncia desta cepa em amostras com KPC
Aleacutem disso isso justifica a forma popular da K pneumoniae ser chamada de KPC
enquanto que na verdade KPC eacute uma enzima podendo estar presente em outras
cepas como Enterobacter clocae tambeacutem apresentada no presente estudo O
desfecho cliacutenico de oacutebitos maior que 50 eacute um possiacutevel indicador sobre a
necessidade de se realizar um teste raacutepido para identificaccedilatildeo de KPC visando
iniciar o mais raacutepido possiacutevel o tratamento afim de diminuir a mortalidade por esta
infecccedilatildeo
Nenhuma das variaacuteveis isoladamente estaacute relacionada ao desfecho cliacutenico
oacutebito ou alta pois natildeo apresentaram relevacircncia estatiacutestica O presente estudo
mostrou que haacute presenccedila da bacteacuteria nas amostras de pacientes do hospital
estudado podendo entatildeo afirmar que este tipo de bacteacuteria se encontra tambeacutem
presente em ambiente hospitalar O uso irracional de antimicrobiano eacute demonstrado
de forma indireta quando foi apresentado atraveacutes do Teste de Hodge Modificado
uma resistecircncia de 100 aos antibioacuteticos carbapenecircmicos Isto tambeacutem reflete na
terapecircutica sendo que pacientes portadores de bacteacuterias resistentes aos
antibioacuteticos carabepecircmicos tem uma escassa opccedilatildeo de tratamento e as opccedilotildees
apresentam problemas quanto agrave toxicidade e eficaacutecia
58
REFEREcircNCIAS
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Mecanismos
de resistecircncia bacteriana aos antimicrobianos Disponiacutevel em
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controleopas_
webmodulo3mec_sitiohtmgt Acesso em 25 de abril de 2014
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Nota teacutecnica nordm
012013 medidas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees por enterobacteacuterias
multiresistentes Acesso em 17 de abril de 2013
ALBA J et al Kinetics study of KPC-3 a plasmid-encoded class A
carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase Antimicrob Agents Chemother
Nov49(11)4760-2 2005
ALVES A P et al Nosocomial infections by KPC-producing enterobacteria in
a tertiary hospital in Southern Brazil Revista da AMRIGS Porto Alegre 57 (3) 213-
218 jul-set 2013
ALVES A et al Tipagem Geneacutetica de Microrganismos Lab De Diversidade
Microbiana Centro de Biologia Celular Dep de Biologia U de Aveiro 3810-193
Aveiro- 2003
BELL J M et Al Prevalence and significance of a negative extended-
spectrum beta-lactamase (ESBL) confirmation test result after a positive ESBL
screening test result for isolates of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae
results from the SENTRY Asia-Pacific Surveillance Program J Clin Microbiol
May45(5)1478-82 2007
BRATU S et al Detection of KPC carbapenem-hydrolyzing enzymes in
Enterobacter spp from Brooklyn New York Antimicrob Agents Chemother v 49 n
2 p 776-8 2005
59
BRATU S et al Emergence of KPC-possessing Klebsiella pneumoniae in
Brooklyn New York epidemiology and recommendations for detection Antimicrob
Agents Chemother v 49 n 7 p 3018-20 2005
BRATU S et al Rapid spread of carbapenem-resistant Klebsiella
pneumoniae in New York City Arch Intern Med v 165 p 1430-5 2005
CAMARGO C F et al Aplicaccedilatildeo das teacutecnicas de pcr e suas teacutecnicas
derivadas em diagnoacutestico molecular Disponiacutevel em
ltfileDUnB10C2BA20semestreArtigosPCR-
20CLEYTON20FLORENCIO20DE20CAMARGO20E20PAULO20ROB
ERTO20QUEIROZpdfgtgt Acesso em 08 de abril de 2014
CARVALHES C G et al Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting
carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive
results Journal of Antimicrobial Chemotherapy v 65 n2 p 249-251 2010
CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION- CDC Modified
Hodge Test for Carbapenemase Detection in Enterobacteriaceae 2004
CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE Methods for
dilutionantimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically Approved
standard M7ndashA7 7th ed CLSI Wayne PA 2011
COELLO R et al Risk factors for developing clinical infection with methicillin-
resistant Staphylococcus aureus (MRSA) amongst hospital patients initially only
colonized with MRSA J Hosp Infect 19973739-46
COLPAN A et al Evaluation of risk factors for mortality in intensive care
units A prospective study from a referral hospital in Turkey Am J Infect Control
200533(1)42-7
60
CORNAGLIA G et al Living with ESBLs Introduction Clinical Microbiology
and Infection 14 Suppl 1 1-2 2008
COTRIM E R et al Klebsiella pneumoniae carbapenemase ndash KPC em
Enterobacteriaceae o desafio das bacteacuterias multirresistentes Poacutes em revista do
centro universitaacuterio Newton Paiva 12012 - ediccedilatildeo 5 - issn 2176 7785
DESHPANDE L M et al Occurrence and characterization of
carbapenemase-producing Enterobacteacuteriaceae report from the SENTRY
Antimicrobial Surveillance Program (2000-2004) Microb Drug Resist 12(4)223-30
2006
DIAS D J A Estudos dos principais mecanismos de resistecircncia aos
antibioacuteticos β-lactacircmicos em bacteacuterias patogecircnicas gram negativas 2009 100 f
Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Geneacutetica Molecular e Biomedicina) ndash Faculdade de
Ciecircncias e Tecnologia Universidade de Nova Lisboa Lisboa
DIENSTMANN R et al Avaliaccedilatildeo fenotiacutepica da enzima Klebsiella
pneumoniae carbapenemase (KPC) em Enterobacteriaceae de ambiente hospitalar
J Bras Patol Med Lab v 46 n 1 p 23-27 fevereiro 2010
ENDIMIAMI A et al Emergence of blaKPC-containing Klebsiella
pneumoniae in a long-term acute care hospital a new challenge to our healthcare J
Antimicrob Chemother 64 1102-1110 Nov 2009
FALAGAS M E et al Extended-spectrum beta-lactamase producing
organisms The Journal of Hospital Infection 73 (4) pp 345-54 2009
FONTANA C et al Emergence of KPC-producing Klebsiella pneumoniae in
Italy BMC Rev Notes 3 40 2010
61
GALES A C et al Antimicrobial resistance among Gram-negative bacilli
isolated from Latin America results from Sentry Antimicrobial Surveillance Program
(Latin America 2008-2010) Diagnostic Microbiology and Infectious Disease v 3 n
4 p 354 -360 2012
GUPTA N et al Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Epidemiology
and Prevention HEALTHCARE EPIDEMIOLOGY Clinical Infectious Diseases
201153(1)60ndash67 Published by Oxford University Press on behalf of the Infectious
Diseases Society of America 2011
HARBOTTLE H et al Genetics of antimicrobial resistance Anim Biotechnol
n17 p111-124 2006
HENRIQUE W N et al RESISTEcircNCIA BACTERIANA Uniatildeo das
Faculdades Alfredo NasserInstituto de Ciecircncias da Sauacutede Disponiacutevel em lt
httpwwwfaculdadealfredonasseredubrfilespesquisaposter20HENRIQUE20
Wilker20Natividade20SANTIAGO20Silvania20CAVALCANTI20DSP
20ResistC3AAncia20Bacterianapdfgt Acesso em 17 marccedilo 2014
HULSCHER M E J I et al Antibiotic prescribing in hospital a social and
behavioral scientific approach The Lancet Infectious Diaseases v 10 n 3 p 167-
165 2010
KIDWAI M SAPRA P BHUSHAN KR Synthetic strategies and medicinal
properties of beta-lactams Curr Med Chem 1999 695-215
KUMARASAMY K K et al Emergence of a new antibiotic resistance
mechanism in India Pakistan and the UK a molecular biological and
epidemiological stuy The Lancet Infectious Diseases v10 n 9 p 597- 602 2010
LINCOPAN N et al Enterobacteacuteria producing extended-spectrum β-
lacatamases and IMP-1 Metalo-β-lactamases isolated from Brazilian hospitals J Med
62
Microbiol 7 1-3 2006
LINCOPAN N et al First Isolation of Metalo-β-Lacatamase-Producing
Multiresistant Klebsiella pneumoniae from a patient in Brazil J Clin Microbiol 43(1)
516-519 2005
LIVERMORE D M et al What remains against carbapenem- resistant
Enterobacteriaceae Evaluation of choramphenicol ciprofloxacin colistina
fosfomycin minocycline nitrofurantoin temocilin and tigecycline International
Journal of Antimicrobial Agents v 37 n 5 p 415- 459 2011
LIVERMORE D M Fourten years in resistance International Journal of
Antimicrobial Agents v 39 283- 294 2012
LIVERMORE D M Bacterial resistance to carbapenems Adv Exp Med Biol
1995 39025-47
LIVERMORE D M Bacterial resistance origins epidemiology and impact
Clin Infect Dis 36S11-S23 2003
LIVERMORE D M et al Carbapenemases a problem in waiting Curr
Opin Microbiol 2000 3489-95
LU et al Universal pcr for common bacterial pathogens J CLIN
MICROBIOL VOL 38 2000
LU et al Use of PCR with Universal Primers and Restriction Endonuclease
Digestions for Detection and Identification of Common Bacterial Pathogens in
Cerebrospinal Fluid Journal of Clinical Microbiology June 2000 p 2076ndash2080
MARSCHALL J Met al Presence of the KPC Carbapenemase Gene in
Enterobacteriaceae Causing Bacteremia and Its Correlation with In Vitro
Carbapenem Susceptibility J Clin Microbiol 47 239-241 Jan 2009
63
MARTINS WMBS et al Prevalecircncia do gene blaKPC em isolados cliacutenicos
de Enterobacteriaceae e natildeo fermentadores encontrados em amostras clinicas em
um hospital universitaacuterio do Recife X Jornada de ensino pesquisa e extensatildeo ndash
JEPEX 2010 ndash UFRPE Recife 18 a 22 de outubro
MENDES C A C et al Polimixinas Revisatildeo com ecircnfase na sua
nefrotoxicidade Rev Assoc Med Bras 2009 55(6) 752-9
MOHR J F 3rd Update on the efficacy and tolerability of meropenem in the
treatment of serious bacteacuterial infections Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S41-51
2008
MONTEIRO J et al First report of KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae
strains in Brazil Antimicrob Agents Chemother Jan53(1)333-4 2009
MOREIRA V C et al Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia a antibioacuteticos
Disponiacutevel em
lthttpwwwcpglsucgbr6mostraartigosSAUDEVANESSA20CARVALHO20M
OREIRApdfgt Acesso em 21 marccedilo 2014
NETIKUL T et al Emergence of novel blaKPC-12 and blaKPC-13 variants in
carbapenem non-susceptible Enterobacter cloacae a first report of blaKPC gene in
Thailand European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases May
S372 2011
NETO V A et al Antibioacuteticos na praacutetica Meacutedica 6ordf Ediccedilatildeo Editorial
SarverSP Brasil 2007
NICOLAU D P Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of
meropenem Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S32-40 2008
64
OLIVEIRA A C et al Resistecircncia bacteriana e mortalidade em um centro de
terapia intensiva Rev Latino-Am Enfermagem nov-dez 2010
PAAUW A et al Failure to control an outbreak of qnrA 1-positive multidrug-
resistant Enterobacter clocae despite adequate implementation of recommended
infection control measures Journal of Clinical Microbiology v 45 n 5 p 1420-1425
2007
PATERSON D L et al Extended-Spectrum Beta-Lactamases a Clinical
Update Clinical Microbiology Reviews v 18 p 657-686 2005
PEIRANO G et al Carbapenem-hydrolysing beta-lactamase KPC-2 in
Klebsiella pneumonia isolated in Rio de Janeiro Brazil J Antimicrob Chemother Nov
20 2009
PERES-BOTA D et al Are infections due to resistant pathogens associated
with worse outcome in critically ill patients J Infect 200347(4)307-16
PIDDOCK L J V Clinically relevant chromosomally encoded multidrug
resistance effl ux pumps in bacterial Clin Microbiol Rev n19 p382-402 2006
PITOUT J D D et al Emergence of Enterobacteriaceae producing
extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) in the community J Antimicrob
Chemother May 56 2005
POSSEBON M I et al Resistecircncia bacteriana aos carbapenecircmicos
Bacterial resitence to carbapenems RBM rev bras med60(6)378380-378-382
jun 2003
QUEENAN A M et al Carbapenemases the versatile beta-lactamases
Clin Microbiol Rev Jul20(3)440-58 2007
65
RHOMBERG P R et al Summary trends for the meropenem yearly
susceptibility test information collection program a 10- year experience in the United
States (1999-2008) Diagnostic Microbiology and Infectiois Disease v 65 n4 p
414-426 2009
ROBLEDO I E et al Detection of KPC in Acinetobacter spp in Puerto Rico
J Antimicrob Agents Chemother 54 1354-1357 Mar 2010
ROGERS B A et al Country-to-country transfer os patients and the risk of
multi-resistant bacterial infection Clinical Infectious Disease v53 n1 p49- 56
2011
SHAH A A et al Characteristics epidemiology and clinicalimportance of
emerging strains of Gram-negative bacilli producing extended-spectrum
betalactamases Research in Microbiology v 155 p 409-421 2004
TURNER P J Extended- Spectrum Beta-Lactamases Clinical Infectious
Diseases v 41 p 273-275 2005
WOLTER D J et al Phenotypic and Enzymatic Comparative Analysis
between the Novel KPC variant KPC-5 and Its Evolutionary Variants KPC-2 and
KPC-4 Antimicrob Agents Chemother Nov 17 2008
WOODFORD N et al Carbapenemases of Chryseobacterium
(Flavobacterium) meningosepticum distribution of blaB and characterization of a
novel Metalo-beta-lactamase gene blaB3 in the type strain NCTC 10016
Antimicrob Agents Chemother Jun44(6)1448-52 2000
WOODFORF N Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in
India Pakistan and the UK a molecular biological and epidemiological study The
Lancet Infectious Diseases v 10 n 9 p 597-602 2010
66
WOODFORD et al Outbreak of Klebsiella pneumoniae Producing a New
Carbapenem- Hydrolyzing Class A β-Lactamase KPC-3 in a New York Medical
Center Antimicrobial agents and chemotherapy Dec 2004 p 4793ndash4799 Vol 48
No 12
YAGI T et al A preliminary survey of extended-spectrum β-lactamases
(ESBLs) in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Japan
FEMS Microbiology Letters 184 (2000) 53-56
YIGIT H et al Novel carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase KPC-1 from
a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumonia J Antimicrob Agents
Chemother 45 (4) 1151-1161 (2001)
ZAVASCKI A P et al KPC-2- producing Enterobacter cloacae in two cities
from Southern Brazil Int J Antimicrob Agents Apr 28 2009
ZHANEL G G et al Comparative review of the carbapenecircmicos Drugs
67(7)1027-52 2007
67
ANEXOS
Sequumlecircncia do oligo blaKPC
Query 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
Query 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
Query 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
68
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
Query 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
Query 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
69
Query 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
Query 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
Query 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
70
Sbjct 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
Query 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 481
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ATTTGTT 540
Query 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Sbjct 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
Query 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
71
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
Query 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
Query 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
72
Query 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
Query 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
Query 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
73
Sbjct 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
Query 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
Query 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
Query 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
74
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
Query 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
Query 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
75
Query 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
Query 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
||||
Sbjct 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
LOCUS AF297554 1377 bp
DNA linear BCT 26-MAR-2001
DEFINITION Klebsiella pneumoniae carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
gene complete cds
ACCESSION AF297554
VERSION AF2975541 GI10121874
76
KEYWORDS
SOURCE Klebsiella pneumoniae
ORGANISM Klebsiella pneumoniae
Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Enterobacteriaceae Klebsiella
REFERENCE 1 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH QueenanAM
AndersonGJ Domenech-SanchezA
BiddleJW StewardCD
AlbertiS BushK and TenoverFC
TITLE Novel carbapenem-hydrolyzing beta-
lactamase KPC-1 from a
carbapenem-resistant strain of
Klebsiella pneumoniae
JOURNAL Antimicrob Agents Chemother 45 (4)
1151-1161 (2001)
PUBMED 11257029
REFERENCE 2 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH AndersonGJ and
TenoverFC
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (19-AUG-2000) Nosocomial
Pathogens Laboratory Branch
Centers for Disease Control and
Prevention 1600 Clifton Rd MS
G08 Atlanta GA 30333 USA
FEATURES LocationQualifiers
77
source 11377
organism=Klebsiella
pneumoniae
mol_type=genomic DNA
db_xref=taxon573
-35_signal 5560
-10_signal 7883
mRNA 921012
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
RBS 117122
CDS 1311012
note=blaKPC-1
codon_start=1
transl_table=11
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
protein_id=AAG134101
db_xref=GI10121875
translation=MSLYRRLVLLSCLSWPLAGFSATALTNLVAEPFAKLEQD
FGGSI
GVYAMDTGSGATVSYRAEERFPLCSSFKGFLAAAVLARSQQQAGLLDTPIRYG
KNALV
PWSPISEKYLTTGMTVAELSAAAVQYSDNAAANLLLKELGGPAGLTAFMRSIG
DTTFR
78
LDRWELELNSAIPSDARDTSSPRAVTESLQKLTLGSALAAPQRQQFVDWLKGN
TTGNH
RIRAAVPADWAVGDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTRAPNKDDK
HSEAV
IAAAARLALEGLGVNGQ
ORIGIN
1 cggggcagtt acagccgtta cagcctctgg
agagggagcg gcttgccgct cggtgataat
61 cccagctgta gcggcctgat tacatccggc
cgctacacct agctccacct tcaaacaagg
121 aatatcgttg atgtcactgt atcgccgtct
agttctgctg tcttgtctct catggccgct
181 ggctggcttt tctgccaccg cgctgaccaa
cctcgtcgcg gaaccattcg ctaaactcga
241 acaggacttt ggcggctcca tcggtgtgta
cgcgatggat accggctcag gcgcaactgt
301 aagttaccgc gctgaggagc gcttcccact
gtgcagctca ttcaagggct ttcttgctgc
361 cgctgtgctg gctcgcagcc agcagcaggc
cggcttgctg gacacaccca tccgttacgg
421 caaaaatgcg ctggttccgt ggtcacccat
ctcggaaaaa tatctgacaa caggcatgac
481 ggtggcggag ctgtccgcgg ccgccgtgca
atacagtgat aacgccgccg ccaatttgtt
541 gctgaaggag ttgggcggcc cggccgggct
gacggccttc atgcgctcta tcggcgatac
79
601 cacgttccgt ctggaccgct gggagctgga
gctgaactcc gccatcccaa gcgatgcgcg
661 cgatacctca tcgccgcgcg ccgtgacgga
aagcttacaa aaactgacac tgggctctgc
721 actggctgcg ccgcagcggc agcagtttgt
tgattggcta aagggaaaca cgaccggcaa
781 ccaccgcatc cgcgcggcgg tgccggcaga
ctgggcagtc ggagacaaaa ccggaacctg
841 cggagtgtat ggcacggcaa atgactatgc
cgtcgtctgg cccactgggc gcgcacctat
901 tgtgttggcc gtctacaccc gggcgcctaa
caaggatgac aagcacagcg aggccgtcat
961 cgccgctgcg gctagactcg cgctcgaggg
attgggcgtc aacgggcagt aaggctctga
1021 aaatcatcta ttggcccacc accgccgccc
ttgcgggcgg catggattac caaccactgt
1081 cacatttagg ctaggagtct gcgcggcaga
gccgtgtgac cggttttctg tagagcactg
1141 acgatggcgg cggcgctctc tgcaattggc
aaggcgtcgg cgccaaggat accaatcttg
1201 cggcgcgcgg cgtgttatga cgactggggt
gcatttgagc cgccccattt aaccttcgcc
1261 ctcacagata cgccattcgc ctcaaattta
gcgccatgca gacgagcttc cactcggctt
1321 gcaccttgtc caggcccctc atgctgaact
gacgcaatcc catcaccgcc ttgatca
80
55
Estudo sobre os tipos de ESBL feito no Japatildeo apresentou o tipo Toho-1 como
o mais prevalente nessa pesquisa Ateacute o ano de 2000 ano em que foi publicado tal
estudo este era o primeiro relatoacuterio no Japatildeo para identificar derivados de ESBLs
como tipo de SHV e TEM entre E coli e K pneumoniae Em especial o tipo SHV- 12
foi identificado com uma maior frequumlecircncia Estes resultados indicam que tipos
distintos de ESBLs que satildeo diferentes em sua especificidade de substrato e origem
geneacutetica coexistem no Japatildeo Isto mostra a importacircncia de caracterizar genoacutetipos
distintos de ESBLs e de estar em alerta continuamente para as tendecircncias de
ESBLs no Japatildeo aleacutem da necessidade de uma interpretaccedilatildeo uniforme utilizando as
diretrizes do CSLI para relatar cepas produtoras de ESBL Aleacutem da detecccedilatildeo de
ESBLs satildeo necessaacuterias mais informaccedilotildees tais como o perfil de sensibilidade
especiacutefica para diversas β-lactacircmicos e o local da infecccedilatildeo Esses fatores satildeo
essenciais para a escolha adequada de antibioacuteticos (YAGI T et al 2000)
No ano de 2004 uma pesquisa avaliou a produccedilatildeo de uma enzima de
hidroacutelise de carbapenecircmicos atraveacutes da teacutecnica de sequumlenciamento foi revelado
um novo membro da famiacutelia KPC designado KPC- 3 Pesquisadores encontraram
em um mutante de K pneumoniae uma substituiccedilatildeo de um gene associado com
resistecircncia a Imipenem mas essa substituiccedilatildeo foi considerada improvaacutevel na
contribuiccedilatildeo da resistecircncia aos carbapenecircmicos da espeacutecie estudada Aleacutem da
resistecircncia aos carbapenecircmicos estes isolados eram em sua maioria resistentes agraves
cefalosporinas penicilinas e aminoglicosiacutedeos Usando estudos de transformaccedilatildeo
conjugaccedilatildeo e hibridaccedilatildeo localizaram o alelo blaKPC em plasmiacutedeo aleacutem disso
mostraram que esse alelo tambeacutem carregava uma resistecircncia aos aminoglicosiacutedeos
A transferecircncia das enzimas KPCs foi demonstrada in vitro tanto neste como em
outros estudos pode ser que os plasmiacutedeos que fazem esta transferecircncia estavam
comeccedilando a se espalhar no ambiente cliacutenico resultando na multiresistecircncia dessas
estirpes (WOODFORD et al 2004)
O presente estudo apresentou um vieacutes quanto aos resultados dos testes de
susceptibilidade microbiana Observou-se que natildeo foi encontrado resultado deste
teste em algumas amostras o que natildeo cooperou para um estudo mais preciso
futuros estudos quanto agraves amostras e um melhor acompanhamento deste tipo de
patologia Poreacutem mesmo sem algumas amostras com este resultado disponiacutevel foi
56
confirmada a presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos
carbapenecircmicos por meio dos genes de resistecircncia blaKPC e 16S rRNA que as
amostras apresentaram em sua maioria serem portadoras Quanto aos resultados
estatiacutesticos nenhuma das variaacuteveis apresentou significacircncia estatiacutestica (p gt 005)
mostrando assim que estas variaacuteveis isoladas natildeo foram o fator determinante para
o desfecho cliacutenico de alta ou oacutebito
57
7 CONCLUSAtildeO
Os genes blaKPC e 16S rRNA foram caracterizados confirmando a a
presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos carbapenecircmicos
Houve uma maior prevalecircncia da cepa K pneumoniae e isto confirma outros
estudos que apresentam a maior prevalecircncia desta cepa em amostras com KPC
Aleacutem disso isso justifica a forma popular da K pneumoniae ser chamada de KPC
enquanto que na verdade KPC eacute uma enzima podendo estar presente em outras
cepas como Enterobacter clocae tambeacutem apresentada no presente estudo O
desfecho cliacutenico de oacutebitos maior que 50 eacute um possiacutevel indicador sobre a
necessidade de se realizar um teste raacutepido para identificaccedilatildeo de KPC visando
iniciar o mais raacutepido possiacutevel o tratamento afim de diminuir a mortalidade por esta
infecccedilatildeo
Nenhuma das variaacuteveis isoladamente estaacute relacionada ao desfecho cliacutenico
oacutebito ou alta pois natildeo apresentaram relevacircncia estatiacutestica O presente estudo
mostrou que haacute presenccedila da bacteacuteria nas amostras de pacientes do hospital
estudado podendo entatildeo afirmar que este tipo de bacteacuteria se encontra tambeacutem
presente em ambiente hospitalar O uso irracional de antimicrobiano eacute demonstrado
de forma indireta quando foi apresentado atraveacutes do Teste de Hodge Modificado
uma resistecircncia de 100 aos antibioacuteticos carbapenecircmicos Isto tambeacutem reflete na
terapecircutica sendo que pacientes portadores de bacteacuterias resistentes aos
antibioacuteticos carabepecircmicos tem uma escassa opccedilatildeo de tratamento e as opccedilotildees
apresentam problemas quanto agrave toxicidade e eficaacutecia
58
REFEREcircNCIAS
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Mecanismos
de resistecircncia bacteriana aos antimicrobianos Disponiacutevel em
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controleopas_
webmodulo3mec_sitiohtmgt Acesso em 25 de abril de 2014
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Nota teacutecnica nordm
012013 medidas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees por enterobacteacuterias
multiresistentes Acesso em 17 de abril de 2013
ALBA J et al Kinetics study of KPC-3 a plasmid-encoded class A
carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase Antimicrob Agents Chemother
Nov49(11)4760-2 2005
ALVES A P et al Nosocomial infections by KPC-producing enterobacteria in
a tertiary hospital in Southern Brazil Revista da AMRIGS Porto Alegre 57 (3) 213-
218 jul-set 2013
ALVES A et al Tipagem Geneacutetica de Microrganismos Lab De Diversidade
Microbiana Centro de Biologia Celular Dep de Biologia U de Aveiro 3810-193
Aveiro- 2003
BELL J M et Al Prevalence and significance of a negative extended-
spectrum beta-lactamase (ESBL) confirmation test result after a positive ESBL
screening test result for isolates of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae
results from the SENTRY Asia-Pacific Surveillance Program J Clin Microbiol
May45(5)1478-82 2007
BRATU S et al Detection of KPC carbapenem-hydrolyzing enzymes in
Enterobacter spp from Brooklyn New York Antimicrob Agents Chemother v 49 n
2 p 776-8 2005
59
BRATU S et al Emergence of KPC-possessing Klebsiella pneumoniae in
Brooklyn New York epidemiology and recommendations for detection Antimicrob
Agents Chemother v 49 n 7 p 3018-20 2005
BRATU S et al Rapid spread of carbapenem-resistant Klebsiella
pneumoniae in New York City Arch Intern Med v 165 p 1430-5 2005
CAMARGO C F et al Aplicaccedilatildeo das teacutecnicas de pcr e suas teacutecnicas
derivadas em diagnoacutestico molecular Disponiacutevel em
ltfileDUnB10C2BA20semestreArtigosPCR-
20CLEYTON20FLORENCIO20DE20CAMARGO20E20PAULO20ROB
ERTO20QUEIROZpdfgtgt Acesso em 08 de abril de 2014
CARVALHES C G et al Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting
carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive
results Journal of Antimicrobial Chemotherapy v 65 n2 p 249-251 2010
CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION- CDC Modified
Hodge Test for Carbapenemase Detection in Enterobacteriaceae 2004
CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE Methods for
dilutionantimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically Approved
standard M7ndashA7 7th ed CLSI Wayne PA 2011
COELLO R et al Risk factors for developing clinical infection with methicillin-
resistant Staphylococcus aureus (MRSA) amongst hospital patients initially only
colonized with MRSA J Hosp Infect 19973739-46
COLPAN A et al Evaluation of risk factors for mortality in intensive care
units A prospective study from a referral hospital in Turkey Am J Infect Control
200533(1)42-7
60
CORNAGLIA G et al Living with ESBLs Introduction Clinical Microbiology
and Infection 14 Suppl 1 1-2 2008
COTRIM E R et al Klebsiella pneumoniae carbapenemase ndash KPC em
Enterobacteriaceae o desafio das bacteacuterias multirresistentes Poacutes em revista do
centro universitaacuterio Newton Paiva 12012 - ediccedilatildeo 5 - issn 2176 7785
DESHPANDE L M et al Occurrence and characterization of
carbapenemase-producing Enterobacteacuteriaceae report from the SENTRY
Antimicrobial Surveillance Program (2000-2004) Microb Drug Resist 12(4)223-30
2006
DIAS D J A Estudos dos principais mecanismos de resistecircncia aos
antibioacuteticos β-lactacircmicos em bacteacuterias patogecircnicas gram negativas 2009 100 f
Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Geneacutetica Molecular e Biomedicina) ndash Faculdade de
Ciecircncias e Tecnologia Universidade de Nova Lisboa Lisboa
DIENSTMANN R et al Avaliaccedilatildeo fenotiacutepica da enzima Klebsiella
pneumoniae carbapenemase (KPC) em Enterobacteriaceae de ambiente hospitalar
J Bras Patol Med Lab v 46 n 1 p 23-27 fevereiro 2010
ENDIMIAMI A et al Emergence of blaKPC-containing Klebsiella
pneumoniae in a long-term acute care hospital a new challenge to our healthcare J
Antimicrob Chemother 64 1102-1110 Nov 2009
FALAGAS M E et al Extended-spectrum beta-lactamase producing
organisms The Journal of Hospital Infection 73 (4) pp 345-54 2009
FONTANA C et al Emergence of KPC-producing Klebsiella pneumoniae in
Italy BMC Rev Notes 3 40 2010
61
GALES A C et al Antimicrobial resistance among Gram-negative bacilli
isolated from Latin America results from Sentry Antimicrobial Surveillance Program
(Latin America 2008-2010) Diagnostic Microbiology and Infectious Disease v 3 n
4 p 354 -360 2012
GUPTA N et al Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Epidemiology
and Prevention HEALTHCARE EPIDEMIOLOGY Clinical Infectious Diseases
201153(1)60ndash67 Published by Oxford University Press on behalf of the Infectious
Diseases Society of America 2011
HARBOTTLE H et al Genetics of antimicrobial resistance Anim Biotechnol
n17 p111-124 2006
HENRIQUE W N et al RESISTEcircNCIA BACTERIANA Uniatildeo das
Faculdades Alfredo NasserInstituto de Ciecircncias da Sauacutede Disponiacutevel em lt
httpwwwfaculdadealfredonasseredubrfilespesquisaposter20HENRIQUE20
Wilker20Natividade20SANTIAGO20Silvania20CAVALCANTI20DSP
20ResistC3AAncia20Bacterianapdfgt Acesso em 17 marccedilo 2014
HULSCHER M E J I et al Antibiotic prescribing in hospital a social and
behavioral scientific approach The Lancet Infectious Diaseases v 10 n 3 p 167-
165 2010
KIDWAI M SAPRA P BHUSHAN KR Synthetic strategies and medicinal
properties of beta-lactams Curr Med Chem 1999 695-215
KUMARASAMY K K et al Emergence of a new antibiotic resistance
mechanism in India Pakistan and the UK a molecular biological and
epidemiological stuy The Lancet Infectious Diseases v10 n 9 p 597- 602 2010
LINCOPAN N et al Enterobacteacuteria producing extended-spectrum β-
lacatamases and IMP-1 Metalo-β-lactamases isolated from Brazilian hospitals J Med
62
Microbiol 7 1-3 2006
LINCOPAN N et al First Isolation of Metalo-β-Lacatamase-Producing
Multiresistant Klebsiella pneumoniae from a patient in Brazil J Clin Microbiol 43(1)
516-519 2005
LIVERMORE D M et al What remains against carbapenem- resistant
Enterobacteriaceae Evaluation of choramphenicol ciprofloxacin colistina
fosfomycin minocycline nitrofurantoin temocilin and tigecycline International
Journal of Antimicrobial Agents v 37 n 5 p 415- 459 2011
LIVERMORE D M Fourten years in resistance International Journal of
Antimicrobial Agents v 39 283- 294 2012
LIVERMORE D M Bacterial resistance to carbapenems Adv Exp Med Biol
1995 39025-47
LIVERMORE D M Bacterial resistance origins epidemiology and impact
Clin Infect Dis 36S11-S23 2003
LIVERMORE D M et al Carbapenemases a problem in waiting Curr
Opin Microbiol 2000 3489-95
LU et al Universal pcr for common bacterial pathogens J CLIN
MICROBIOL VOL 38 2000
LU et al Use of PCR with Universal Primers and Restriction Endonuclease
Digestions for Detection and Identification of Common Bacterial Pathogens in
Cerebrospinal Fluid Journal of Clinical Microbiology June 2000 p 2076ndash2080
MARSCHALL J Met al Presence of the KPC Carbapenemase Gene in
Enterobacteriaceae Causing Bacteremia and Its Correlation with In Vitro
Carbapenem Susceptibility J Clin Microbiol 47 239-241 Jan 2009
63
MARTINS WMBS et al Prevalecircncia do gene blaKPC em isolados cliacutenicos
de Enterobacteriaceae e natildeo fermentadores encontrados em amostras clinicas em
um hospital universitaacuterio do Recife X Jornada de ensino pesquisa e extensatildeo ndash
JEPEX 2010 ndash UFRPE Recife 18 a 22 de outubro
MENDES C A C et al Polimixinas Revisatildeo com ecircnfase na sua
nefrotoxicidade Rev Assoc Med Bras 2009 55(6) 752-9
MOHR J F 3rd Update on the efficacy and tolerability of meropenem in the
treatment of serious bacteacuterial infections Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S41-51
2008
MONTEIRO J et al First report of KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae
strains in Brazil Antimicrob Agents Chemother Jan53(1)333-4 2009
MOREIRA V C et al Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia a antibioacuteticos
Disponiacutevel em
lthttpwwwcpglsucgbr6mostraartigosSAUDEVANESSA20CARVALHO20M
OREIRApdfgt Acesso em 21 marccedilo 2014
NETIKUL T et al Emergence of novel blaKPC-12 and blaKPC-13 variants in
carbapenem non-susceptible Enterobacter cloacae a first report of blaKPC gene in
Thailand European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases May
S372 2011
NETO V A et al Antibioacuteticos na praacutetica Meacutedica 6ordf Ediccedilatildeo Editorial
SarverSP Brasil 2007
NICOLAU D P Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of
meropenem Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S32-40 2008
64
OLIVEIRA A C et al Resistecircncia bacteriana e mortalidade em um centro de
terapia intensiva Rev Latino-Am Enfermagem nov-dez 2010
PAAUW A et al Failure to control an outbreak of qnrA 1-positive multidrug-
resistant Enterobacter clocae despite adequate implementation of recommended
infection control measures Journal of Clinical Microbiology v 45 n 5 p 1420-1425
2007
PATERSON D L et al Extended-Spectrum Beta-Lactamases a Clinical
Update Clinical Microbiology Reviews v 18 p 657-686 2005
PEIRANO G et al Carbapenem-hydrolysing beta-lactamase KPC-2 in
Klebsiella pneumonia isolated in Rio de Janeiro Brazil J Antimicrob Chemother Nov
20 2009
PERES-BOTA D et al Are infections due to resistant pathogens associated
with worse outcome in critically ill patients J Infect 200347(4)307-16
PIDDOCK L J V Clinically relevant chromosomally encoded multidrug
resistance effl ux pumps in bacterial Clin Microbiol Rev n19 p382-402 2006
PITOUT J D D et al Emergence of Enterobacteriaceae producing
extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) in the community J Antimicrob
Chemother May 56 2005
POSSEBON M I et al Resistecircncia bacteriana aos carbapenecircmicos
Bacterial resitence to carbapenems RBM rev bras med60(6)378380-378-382
jun 2003
QUEENAN A M et al Carbapenemases the versatile beta-lactamases
Clin Microbiol Rev Jul20(3)440-58 2007
65
RHOMBERG P R et al Summary trends for the meropenem yearly
susceptibility test information collection program a 10- year experience in the United
States (1999-2008) Diagnostic Microbiology and Infectiois Disease v 65 n4 p
414-426 2009
ROBLEDO I E et al Detection of KPC in Acinetobacter spp in Puerto Rico
J Antimicrob Agents Chemother 54 1354-1357 Mar 2010
ROGERS B A et al Country-to-country transfer os patients and the risk of
multi-resistant bacterial infection Clinical Infectious Disease v53 n1 p49- 56
2011
SHAH A A et al Characteristics epidemiology and clinicalimportance of
emerging strains of Gram-negative bacilli producing extended-spectrum
betalactamases Research in Microbiology v 155 p 409-421 2004
TURNER P J Extended- Spectrum Beta-Lactamases Clinical Infectious
Diseases v 41 p 273-275 2005
WOLTER D J et al Phenotypic and Enzymatic Comparative Analysis
between the Novel KPC variant KPC-5 and Its Evolutionary Variants KPC-2 and
KPC-4 Antimicrob Agents Chemother Nov 17 2008
WOODFORD N et al Carbapenemases of Chryseobacterium
(Flavobacterium) meningosepticum distribution of blaB and characterization of a
novel Metalo-beta-lactamase gene blaB3 in the type strain NCTC 10016
Antimicrob Agents Chemother Jun44(6)1448-52 2000
WOODFORF N Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in
India Pakistan and the UK a molecular biological and epidemiological study The
Lancet Infectious Diseases v 10 n 9 p 597-602 2010
66
WOODFORD et al Outbreak of Klebsiella pneumoniae Producing a New
Carbapenem- Hydrolyzing Class A β-Lactamase KPC-3 in a New York Medical
Center Antimicrobial agents and chemotherapy Dec 2004 p 4793ndash4799 Vol 48
No 12
YAGI T et al A preliminary survey of extended-spectrum β-lactamases
(ESBLs) in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Japan
FEMS Microbiology Letters 184 (2000) 53-56
YIGIT H et al Novel carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase KPC-1 from
a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumonia J Antimicrob Agents
Chemother 45 (4) 1151-1161 (2001)
ZAVASCKI A P et al KPC-2- producing Enterobacter cloacae in two cities
from Southern Brazil Int J Antimicrob Agents Apr 28 2009
ZHANEL G G et al Comparative review of the carbapenecircmicos Drugs
67(7)1027-52 2007
67
ANEXOS
Sequumlecircncia do oligo blaKPC
Query 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
Query 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
Query 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
68
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
Query 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
Query 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
69
Query 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
Query 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
Query 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
70
Sbjct 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
Query 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
Query 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
Query 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
71
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
Query 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
Query 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
72
Query 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
Query 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
Query 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
73
Sbjct 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
Query 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
Query 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
Query 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
74
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
Query 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
Query 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Sbjct 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
75
Query 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
Query 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
||||
Sbjct 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
LOCUS AF297554 1377 bp
DNA linear BCT 26-MAR-2001
DEFINITION Klebsiella pneumoniae carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
gene complete cds
ACCESSION AF297554
VERSION AF2975541 GI10121874
76
KEYWORDS
SOURCE Klebsiella pneumoniae
ORGANISM Klebsiella pneumoniae
Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Enterobacteriaceae Klebsiella
REFERENCE 1 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH QueenanAM
AndersonGJ Domenech-SanchezA
BiddleJW StewardCD
AlbertiS BushK and TenoverFC
TITLE Novel carbapenem-hydrolyzing beta-
lactamase KPC-1 from a
carbapenem-resistant strain of
Klebsiella pneumoniae
JOURNAL Antimicrob Agents Chemother 45 (4)
1151-1161 (2001)
PUBMED 11257029
REFERENCE 2 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH AndersonGJ and
TenoverFC
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (19-AUG-2000) Nosocomial
Pathogens Laboratory Branch
Centers for Disease Control and
Prevention 1600 Clifton Rd MS
G08 Atlanta GA 30333 USA
FEATURES LocationQualifiers
77
source 11377
organism=Klebsiella
pneumoniae
mol_type=genomic DNA
db_xref=taxon573
-35_signal 5560
-10_signal 7883
mRNA 921012
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
RBS 117122
CDS 1311012
note=blaKPC-1
codon_start=1
transl_table=11
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
protein_id=AAG134101
db_xref=GI10121875
translation=MSLYRRLVLLSCLSWPLAGFSATALTNLVAEPFAKLEQD
FGGSI
GVYAMDTGSGATVSYRAEERFPLCSSFKGFLAAAVLARSQQQAGLLDTPIRYG
KNALV
PWSPISEKYLTTGMTVAELSAAAVQYSDNAAANLLLKELGGPAGLTAFMRSIG
DTTFR
78
LDRWELELNSAIPSDARDTSSPRAVTESLQKLTLGSALAAPQRQQFVDWLKGN
TTGNH
RIRAAVPADWAVGDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTRAPNKDDK
HSEAV
IAAAARLALEGLGVNGQ
ORIGIN
1 cggggcagtt acagccgtta cagcctctgg
agagggagcg gcttgccgct cggtgataat
61 cccagctgta gcggcctgat tacatccggc
cgctacacct agctccacct tcaaacaagg
121 aatatcgttg atgtcactgt atcgccgtct
agttctgctg tcttgtctct catggccgct
181 ggctggcttt tctgccaccg cgctgaccaa
cctcgtcgcg gaaccattcg ctaaactcga
241 acaggacttt ggcggctcca tcggtgtgta
cgcgatggat accggctcag gcgcaactgt
301 aagttaccgc gctgaggagc gcttcccact
gtgcagctca ttcaagggct ttcttgctgc
361 cgctgtgctg gctcgcagcc agcagcaggc
cggcttgctg gacacaccca tccgttacgg
421 caaaaatgcg ctggttccgt ggtcacccat
ctcggaaaaa tatctgacaa caggcatgac
481 ggtggcggag ctgtccgcgg ccgccgtgca
atacagtgat aacgccgccg ccaatttgtt
541 gctgaaggag ttgggcggcc cggccgggct
gacggccttc atgcgctcta tcggcgatac
79
601 cacgttccgt ctggaccgct gggagctgga
gctgaactcc gccatcccaa gcgatgcgcg
661 cgatacctca tcgccgcgcg ccgtgacgga
aagcttacaa aaactgacac tgggctctgc
721 actggctgcg ccgcagcggc agcagtttgt
tgattggcta aagggaaaca cgaccggcaa
781 ccaccgcatc cgcgcggcgg tgccggcaga
ctgggcagtc ggagacaaaa ccggaacctg
841 cggagtgtat ggcacggcaa atgactatgc
cgtcgtctgg cccactgggc gcgcacctat
901 tgtgttggcc gtctacaccc gggcgcctaa
caaggatgac aagcacagcg aggccgtcat
961 cgccgctgcg gctagactcg cgctcgaggg
attgggcgtc aacgggcagt aaggctctga
1021 aaatcatcta ttggcccacc accgccgccc
ttgcgggcgg catggattac caaccactgt
1081 cacatttagg ctaggagtct gcgcggcaga
gccgtgtgac cggttttctg tagagcactg
1141 acgatggcgg cggcgctctc tgcaattggc
aaggcgtcgg cgccaaggat accaatcttg
1201 cggcgcgcgg cgtgttatga cgactggggt
gcatttgagc cgccccattt aaccttcgcc
1261 ctcacagata cgccattcgc ctcaaattta
gcgccatgca gacgagcttc cactcggctt
1321 gcaccttgtc caggcccctc atgctgaact
gacgcaatcc catcaccgcc ttgatca
80
56
confirmada a presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos
carbapenecircmicos por meio dos genes de resistecircncia blaKPC e 16S rRNA que as
amostras apresentaram em sua maioria serem portadoras Quanto aos resultados
estatiacutesticos nenhuma das variaacuteveis apresentou significacircncia estatiacutestica (p gt 005)
mostrando assim que estas variaacuteveis isoladas natildeo foram o fator determinante para
o desfecho cliacutenico de alta ou oacutebito
57
7 CONCLUSAtildeO
Os genes blaKPC e 16S rRNA foram caracterizados confirmando a a
presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos carbapenecircmicos
Houve uma maior prevalecircncia da cepa K pneumoniae e isto confirma outros
estudos que apresentam a maior prevalecircncia desta cepa em amostras com KPC
Aleacutem disso isso justifica a forma popular da K pneumoniae ser chamada de KPC
enquanto que na verdade KPC eacute uma enzima podendo estar presente em outras
cepas como Enterobacter clocae tambeacutem apresentada no presente estudo O
desfecho cliacutenico de oacutebitos maior que 50 eacute um possiacutevel indicador sobre a
necessidade de se realizar um teste raacutepido para identificaccedilatildeo de KPC visando
iniciar o mais raacutepido possiacutevel o tratamento afim de diminuir a mortalidade por esta
infecccedilatildeo
Nenhuma das variaacuteveis isoladamente estaacute relacionada ao desfecho cliacutenico
oacutebito ou alta pois natildeo apresentaram relevacircncia estatiacutestica O presente estudo
mostrou que haacute presenccedila da bacteacuteria nas amostras de pacientes do hospital
estudado podendo entatildeo afirmar que este tipo de bacteacuteria se encontra tambeacutem
presente em ambiente hospitalar O uso irracional de antimicrobiano eacute demonstrado
de forma indireta quando foi apresentado atraveacutes do Teste de Hodge Modificado
uma resistecircncia de 100 aos antibioacuteticos carbapenecircmicos Isto tambeacutem reflete na
terapecircutica sendo que pacientes portadores de bacteacuterias resistentes aos
antibioacuteticos carabepecircmicos tem uma escassa opccedilatildeo de tratamento e as opccedilotildees
apresentam problemas quanto agrave toxicidade e eficaacutecia
58
REFEREcircNCIAS
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Mecanismos
de resistecircncia bacteriana aos antimicrobianos Disponiacutevel em
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controleopas_
webmodulo3mec_sitiohtmgt Acesso em 25 de abril de 2014
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Nota teacutecnica nordm
012013 medidas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees por enterobacteacuterias
multiresistentes Acesso em 17 de abril de 2013
ALBA J et al Kinetics study of KPC-3 a plasmid-encoded class A
carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase Antimicrob Agents Chemother
Nov49(11)4760-2 2005
ALVES A P et al Nosocomial infections by KPC-producing enterobacteria in
a tertiary hospital in Southern Brazil Revista da AMRIGS Porto Alegre 57 (3) 213-
218 jul-set 2013
ALVES A et al Tipagem Geneacutetica de Microrganismos Lab De Diversidade
Microbiana Centro de Biologia Celular Dep de Biologia U de Aveiro 3810-193
Aveiro- 2003
BELL J M et Al Prevalence and significance of a negative extended-
spectrum beta-lactamase (ESBL) confirmation test result after a positive ESBL
screening test result for isolates of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae
results from the SENTRY Asia-Pacific Surveillance Program J Clin Microbiol
May45(5)1478-82 2007
BRATU S et al Detection of KPC carbapenem-hydrolyzing enzymes in
Enterobacter spp from Brooklyn New York Antimicrob Agents Chemother v 49 n
2 p 776-8 2005
59
BRATU S et al Emergence of KPC-possessing Klebsiella pneumoniae in
Brooklyn New York epidemiology and recommendations for detection Antimicrob
Agents Chemother v 49 n 7 p 3018-20 2005
BRATU S et al Rapid spread of carbapenem-resistant Klebsiella
pneumoniae in New York City Arch Intern Med v 165 p 1430-5 2005
CAMARGO C F et al Aplicaccedilatildeo das teacutecnicas de pcr e suas teacutecnicas
derivadas em diagnoacutestico molecular Disponiacutevel em
ltfileDUnB10C2BA20semestreArtigosPCR-
20CLEYTON20FLORENCIO20DE20CAMARGO20E20PAULO20ROB
ERTO20QUEIROZpdfgtgt Acesso em 08 de abril de 2014
CARVALHES C G et al Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting
carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive
results Journal of Antimicrobial Chemotherapy v 65 n2 p 249-251 2010
CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION- CDC Modified
Hodge Test for Carbapenemase Detection in Enterobacteriaceae 2004
CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE Methods for
dilutionantimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically Approved
standard M7ndashA7 7th ed CLSI Wayne PA 2011
COELLO R et al Risk factors for developing clinical infection with methicillin-
resistant Staphylococcus aureus (MRSA) amongst hospital patients initially only
colonized with MRSA J Hosp Infect 19973739-46
COLPAN A et al Evaluation of risk factors for mortality in intensive care
units A prospective study from a referral hospital in Turkey Am J Infect Control
200533(1)42-7
60
CORNAGLIA G et al Living with ESBLs Introduction Clinical Microbiology
and Infection 14 Suppl 1 1-2 2008
COTRIM E R et al Klebsiella pneumoniae carbapenemase ndash KPC em
Enterobacteriaceae o desafio das bacteacuterias multirresistentes Poacutes em revista do
centro universitaacuterio Newton Paiva 12012 - ediccedilatildeo 5 - issn 2176 7785
DESHPANDE L M et al Occurrence and characterization of
carbapenemase-producing Enterobacteacuteriaceae report from the SENTRY
Antimicrobial Surveillance Program (2000-2004) Microb Drug Resist 12(4)223-30
2006
DIAS D J A Estudos dos principais mecanismos de resistecircncia aos
antibioacuteticos β-lactacircmicos em bacteacuterias patogecircnicas gram negativas 2009 100 f
Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Geneacutetica Molecular e Biomedicina) ndash Faculdade de
Ciecircncias e Tecnologia Universidade de Nova Lisboa Lisboa
DIENSTMANN R et al Avaliaccedilatildeo fenotiacutepica da enzima Klebsiella
pneumoniae carbapenemase (KPC) em Enterobacteriaceae de ambiente hospitalar
J Bras Patol Med Lab v 46 n 1 p 23-27 fevereiro 2010
ENDIMIAMI A et al Emergence of blaKPC-containing Klebsiella
pneumoniae in a long-term acute care hospital a new challenge to our healthcare J
Antimicrob Chemother 64 1102-1110 Nov 2009
FALAGAS M E et al Extended-spectrum beta-lactamase producing
organisms The Journal of Hospital Infection 73 (4) pp 345-54 2009
FONTANA C et al Emergence of KPC-producing Klebsiella pneumoniae in
Italy BMC Rev Notes 3 40 2010
61
GALES A C et al Antimicrobial resistance among Gram-negative bacilli
isolated from Latin America results from Sentry Antimicrobial Surveillance Program
(Latin America 2008-2010) Diagnostic Microbiology and Infectious Disease v 3 n
4 p 354 -360 2012
GUPTA N et al Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Epidemiology
and Prevention HEALTHCARE EPIDEMIOLOGY Clinical Infectious Diseases
201153(1)60ndash67 Published by Oxford University Press on behalf of the Infectious
Diseases Society of America 2011
HARBOTTLE H et al Genetics of antimicrobial resistance Anim Biotechnol
n17 p111-124 2006
HENRIQUE W N et al RESISTEcircNCIA BACTERIANA Uniatildeo das
Faculdades Alfredo NasserInstituto de Ciecircncias da Sauacutede Disponiacutevel em lt
httpwwwfaculdadealfredonasseredubrfilespesquisaposter20HENRIQUE20
Wilker20Natividade20SANTIAGO20Silvania20CAVALCANTI20DSP
20ResistC3AAncia20Bacterianapdfgt Acesso em 17 marccedilo 2014
HULSCHER M E J I et al Antibiotic prescribing in hospital a social and
behavioral scientific approach The Lancet Infectious Diaseases v 10 n 3 p 167-
165 2010
KIDWAI M SAPRA P BHUSHAN KR Synthetic strategies and medicinal
properties of beta-lactams Curr Med Chem 1999 695-215
KUMARASAMY K K et al Emergence of a new antibiotic resistance
mechanism in India Pakistan and the UK a molecular biological and
epidemiological stuy The Lancet Infectious Diseases v10 n 9 p 597- 602 2010
LINCOPAN N et al Enterobacteacuteria producing extended-spectrum β-
lacatamases and IMP-1 Metalo-β-lactamases isolated from Brazilian hospitals J Med
62
Microbiol 7 1-3 2006
LINCOPAN N et al First Isolation of Metalo-β-Lacatamase-Producing
Multiresistant Klebsiella pneumoniae from a patient in Brazil J Clin Microbiol 43(1)
516-519 2005
LIVERMORE D M et al What remains against carbapenem- resistant
Enterobacteriaceae Evaluation of choramphenicol ciprofloxacin colistina
fosfomycin minocycline nitrofurantoin temocilin and tigecycline International
Journal of Antimicrobial Agents v 37 n 5 p 415- 459 2011
LIVERMORE D M Fourten years in resistance International Journal of
Antimicrobial Agents v 39 283- 294 2012
LIVERMORE D M Bacterial resistance to carbapenems Adv Exp Med Biol
1995 39025-47
LIVERMORE D M Bacterial resistance origins epidemiology and impact
Clin Infect Dis 36S11-S23 2003
LIVERMORE D M et al Carbapenemases a problem in waiting Curr
Opin Microbiol 2000 3489-95
LU et al Universal pcr for common bacterial pathogens J CLIN
MICROBIOL VOL 38 2000
LU et al Use of PCR with Universal Primers and Restriction Endonuclease
Digestions for Detection and Identification of Common Bacterial Pathogens in
Cerebrospinal Fluid Journal of Clinical Microbiology June 2000 p 2076ndash2080
MARSCHALL J Met al Presence of the KPC Carbapenemase Gene in
Enterobacteriaceae Causing Bacteremia and Its Correlation with In Vitro
Carbapenem Susceptibility J Clin Microbiol 47 239-241 Jan 2009
63
MARTINS WMBS et al Prevalecircncia do gene blaKPC em isolados cliacutenicos
de Enterobacteriaceae e natildeo fermentadores encontrados em amostras clinicas em
um hospital universitaacuterio do Recife X Jornada de ensino pesquisa e extensatildeo ndash
JEPEX 2010 ndash UFRPE Recife 18 a 22 de outubro
MENDES C A C et al Polimixinas Revisatildeo com ecircnfase na sua
nefrotoxicidade Rev Assoc Med Bras 2009 55(6) 752-9
MOHR J F 3rd Update on the efficacy and tolerability of meropenem in the
treatment of serious bacteacuterial infections Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S41-51
2008
MONTEIRO J et al First report of KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae
strains in Brazil Antimicrob Agents Chemother Jan53(1)333-4 2009
MOREIRA V C et al Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia a antibioacuteticos
Disponiacutevel em
lthttpwwwcpglsucgbr6mostraartigosSAUDEVANESSA20CARVALHO20M
OREIRApdfgt Acesso em 21 marccedilo 2014
NETIKUL T et al Emergence of novel blaKPC-12 and blaKPC-13 variants in
carbapenem non-susceptible Enterobacter cloacae a first report of blaKPC gene in
Thailand European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases May
S372 2011
NETO V A et al Antibioacuteticos na praacutetica Meacutedica 6ordf Ediccedilatildeo Editorial
SarverSP Brasil 2007
NICOLAU D P Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of
meropenem Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S32-40 2008
64
OLIVEIRA A C et al Resistecircncia bacteriana e mortalidade em um centro de
terapia intensiva Rev Latino-Am Enfermagem nov-dez 2010
PAAUW A et al Failure to control an outbreak of qnrA 1-positive multidrug-
resistant Enterobacter clocae despite adequate implementation of recommended
infection control measures Journal of Clinical Microbiology v 45 n 5 p 1420-1425
2007
PATERSON D L et al Extended-Spectrum Beta-Lactamases a Clinical
Update Clinical Microbiology Reviews v 18 p 657-686 2005
PEIRANO G et al Carbapenem-hydrolysing beta-lactamase KPC-2 in
Klebsiella pneumonia isolated in Rio de Janeiro Brazil J Antimicrob Chemother Nov
20 2009
PERES-BOTA D et al Are infections due to resistant pathogens associated
with worse outcome in critically ill patients J Infect 200347(4)307-16
PIDDOCK L J V Clinically relevant chromosomally encoded multidrug
resistance effl ux pumps in bacterial Clin Microbiol Rev n19 p382-402 2006
PITOUT J D D et al Emergence of Enterobacteriaceae producing
extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) in the community J Antimicrob
Chemother May 56 2005
POSSEBON M I et al Resistecircncia bacteriana aos carbapenecircmicos
Bacterial resitence to carbapenems RBM rev bras med60(6)378380-378-382
jun 2003
QUEENAN A M et al Carbapenemases the versatile beta-lactamases
Clin Microbiol Rev Jul20(3)440-58 2007
65
RHOMBERG P R et al Summary trends for the meropenem yearly
susceptibility test information collection program a 10- year experience in the United
States (1999-2008) Diagnostic Microbiology and Infectiois Disease v 65 n4 p
414-426 2009
ROBLEDO I E et al Detection of KPC in Acinetobacter spp in Puerto Rico
J Antimicrob Agents Chemother 54 1354-1357 Mar 2010
ROGERS B A et al Country-to-country transfer os patients and the risk of
multi-resistant bacterial infection Clinical Infectious Disease v53 n1 p49- 56
2011
SHAH A A et al Characteristics epidemiology and clinicalimportance of
emerging strains of Gram-negative bacilli producing extended-spectrum
betalactamases Research in Microbiology v 155 p 409-421 2004
TURNER P J Extended- Spectrum Beta-Lactamases Clinical Infectious
Diseases v 41 p 273-275 2005
WOLTER D J et al Phenotypic and Enzymatic Comparative Analysis
between the Novel KPC variant KPC-5 and Its Evolutionary Variants KPC-2 and
KPC-4 Antimicrob Agents Chemother Nov 17 2008
WOODFORD N et al Carbapenemases of Chryseobacterium
(Flavobacterium) meningosepticum distribution of blaB and characterization of a
novel Metalo-beta-lactamase gene blaB3 in the type strain NCTC 10016
Antimicrob Agents Chemother Jun44(6)1448-52 2000
WOODFORF N Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in
India Pakistan and the UK a molecular biological and epidemiological study The
Lancet Infectious Diseases v 10 n 9 p 597-602 2010
66
WOODFORD et al Outbreak of Klebsiella pneumoniae Producing a New
Carbapenem- Hydrolyzing Class A β-Lactamase KPC-3 in a New York Medical
Center Antimicrobial agents and chemotherapy Dec 2004 p 4793ndash4799 Vol 48
No 12
YAGI T et al A preliminary survey of extended-spectrum β-lactamases
(ESBLs) in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Japan
FEMS Microbiology Letters 184 (2000) 53-56
YIGIT H et al Novel carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase KPC-1 from
a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumonia J Antimicrob Agents
Chemother 45 (4) 1151-1161 (2001)
ZAVASCKI A P et al KPC-2- producing Enterobacter cloacae in two cities
from Southern Brazil Int J Antimicrob Agents Apr 28 2009
ZHANEL G G et al Comparative review of the carbapenecircmicos Drugs
67(7)1027-52 2007
67
ANEXOS
Sequumlecircncia do oligo blaKPC
Query 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
Query 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
Query 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
68
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
Query 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
Query 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
69
Query 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
Query 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
Query 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
70
Sbjct 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
Query 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
Query 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
Query 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
71
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
Query 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
Query 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
72
Query 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
Query 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
Query 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
73
Sbjct 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
Query 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
Query 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
Query 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
74
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
Query 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
Query 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
75
Query 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Sbjct 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
Query 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
||||
Sbjct 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
LOCUS AF297554 1377 bp
DNA linear BCT 26-MAR-2001
DEFINITION Klebsiella pneumoniae carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
gene complete cds
ACCESSION AF297554
VERSION AF2975541 GI10121874
76
KEYWORDS
SOURCE Klebsiella pneumoniae
ORGANISM Klebsiella pneumoniae
Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Enterobacteriaceae Klebsiella
REFERENCE 1 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH QueenanAM
AndersonGJ Domenech-SanchezA
BiddleJW StewardCD
AlbertiS BushK and TenoverFC
TITLE Novel carbapenem-hydrolyzing beta-
lactamase KPC-1 from a
carbapenem-resistant strain of
Klebsiella pneumoniae
JOURNAL Antimicrob Agents Chemother 45 (4)
1151-1161 (2001)
PUBMED 11257029
REFERENCE 2 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH AndersonGJ and
TenoverFC
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (19-AUG-2000) Nosocomial
Pathogens Laboratory Branch
Centers for Disease Control and
Prevention 1600 Clifton Rd MS
G08 Atlanta GA 30333 USA
FEATURES LocationQualifiers
77
source 11377
organism=Klebsiella
pneumoniae
mol_type=genomic DNA
db_xref=taxon573
-35_signal 5560
-10_signal 7883
mRNA 921012
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
RBS 117122
CDS 1311012
note=blaKPC-1
codon_start=1
transl_table=11
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
protein_id=AAG134101
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translation=MSLYRRLVLLSCLSWPLAGFSATALTNLVAEPFAKLEQD
FGGSI
GVYAMDTGSGATVSYRAEERFPLCSSFKGFLAAAVLARSQQQAGLLDTPIRYG
KNALV
PWSPISEKYLTTGMTVAELSAAAVQYSDNAAANLLLKELGGPAGLTAFMRSIG
DTTFR
78
LDRWELELNSAIPSDARDTSSPRAVTESLQKLTLGSALAAPQRQQFVDWLKGN
TTGNH
RIRAAVPADWAVGDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTRAPNKDDK
HSEAV
IAAAARLALEGLGVNGQ
ORIGIN
1 cggggcagtt acagccgtta cagcctctgg
agagggagcg gcttgccgct cggtgataat
61 cccagctgta gcggcctgat tacatccggc
cgctacacct agctccacct tcaaacaagg
121 aatatcgttg atgtcactgt atcgccgtct
agttctgctg tcttgtctct catggccgct
181 ggctggcttt tctgccaccg cgctgaccaa
cctcgtcgcg gaaccattcg ctaaactcga
241 acaggacttt ggcggctcca tcggtgtgta
cgcgatggat accggctcag gcgcaactgt
301 aagttaccgc gctgaggagc gcttcccact
gtgcagctca ttcaagggct ttcttgctgc
361 cgctgtgctg gctcgcagcc agcagcaggc
cggcttgctg gacacaccca tccgttacgg
421 caaaaatgcg ctggttccgt ggtcacccat
ctcggaaaaa tatctgacaa caggcatgac
481 ggtggcggag ctgtccgcgg ccgccgtgca
atacagtgat aacgccgccg ccaatttgtt
541 gctgaaggag ttgggcggcc cggccgggct
gacggccttc atgcgctcta tcggcgatac
79
601 cacgttccgt ctggaccgct gggagctgga
gctgaactcc gccatcccaa gcgatgcgcg
661 cgatacctca tcgccgcgcg ccgtgacgga
aagcttacaa aaactgacac tgggctctgc
721 actggctgcg ccgcagcggc agcagtttgt
tgattggcta aagggaaaca cgaccggcaa
781 ccaccgcatc cgcgcggcgg tgccggcaga
ctgggcagtc ggagacaaaa ccggaacctg
841 cggagtgtat ggcacggcaa atgactatgc
cgtcgtctgg cccactgggc gcgcacctat
901 tgtgttggcc gtctacaccc gggcgcctaa
caaggatgac aagcacagcg aggccgtcat
961 cgccgctgcg gctagactcg cgctcgaggg
attgggcgtc aacgggcagt aaggctctga
1021 aaatcatcta ttggcccacc accgccgccc
ttgcgggcgg catggattac caaccactgt
1081 cacatttagg ctaggagtct gcgcggcaga
gccgtgtgac cggttttctg tagagcactg
1141 acgatggcgg cggcgctctc tgcaattggc
aaggcgtcgg cgccaaggat accaatcttg
1201 cggcgcgcgg cgtgttatga cgactggggt
gcatttgagc cgccccattt aaccttcgcc
1261 ctcacagata cgccattcgc ctcaaattta
gcgccatgca gacgagcttc cactcggctt
1321 gcaccttgtc caggcccctc atgctgaact
gacgcaatcc catcaccgcc ttgatca
80
57
7 CONCLUSAtildeO
Os genes blaKPC e 16S rRNA foram caracterizados confirmando a a
presenccedila da cepa Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia aos carbapenecircmicos
Houve uma maior prevalecircncia da cepa K pneumoniae e isto confirma outros
estudos que apresentam a maior prevalecircncia desta cepa em amostras com KPC
Aleacutem disso isso justifica a forma popular da K pneumoniae ser chamada de KPC
enquanto que na verdade KPC eacute uma enzima podendo estar presente em outras
cepas como Enterobacter clocae tambeacutem apresentada no presente estudo O
desfecho cliacutenico de oacutebitos maior que 50 eacute um possiacutevel indicador sobre a
necessidade de se realizar um teste raacutepido para identificaccedilatildeo de KPC visando
iniciar o mais raacutepido possiacutevel o tratamento afim de diminuir a mortalidade por esta
infecccedilatildeo
Nenhuma das variaacuteveis isoladamente estaacute relacionada ao desfecho cliacutenico
oacutebito ou alta pois natildeo apresentaram relevacircncia estatiacutestica O presente estudo
mostrou que haacute presenccedila da bacteacuteria nas amostras de pacientes do hospital
estudado podendo entatildeo afirmar que este tipo de bacteacuteria se encontra tambeacutem
presente em ambiente hospitalar O uso irracional de antimicrobiano eacute demonstrado
de forma indireta quando foi apresentado atraveacutes do Teste de Hodge Modificado
uma resistecircncia de 100 aos antibioacuteticos carbapenecircmicos Isto tambeacutem reflete na
terapecircutica sendo que pacientes portadores de bacteacuterias resistentes aos
antibioacuteticos carabepecircmicos tem uma escassa opccedilatildeo de tratamento e as opccedilotildees
apresentam problemas quanto agrave toxicidade e eficaacutecia
58
REFEREcircNCIAS
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Mecanismos
de resistecircncia bacteriana aos antimicrobianos Disponiacutevel em
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controleopas_
webmodulo3mec_sitiohtmgt Acesso em 25 de abril de 2014
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Nota teacutecnica nordm
012013 medidas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees por enterobacteacuterias
multiresistentes Acesso em 17 de abril de 2013
ALBA J et al Kinetics study of KPC-3 a plasmid-encoded class A
carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase Antimicrob Agents Chemother
Nov49(11)4760-2 2005
ALVES A P et al Nosocomial infections by KPC-producing enterobacteria in
a tertiary hospital in Southern Brazil Revista da AMRIGS Porto Alegre 57 (3) 213-
218 jul-set 2013
ALVES A et al Tipagem Geneacutetica de Microrganismos Lab De Diversidade
Microbiana Centro de Biologia Celular Dep de Biologia U de Aveiro 3810-193
Aveiro- 2003
BELL J M et Al Prevalence and significance of a negative extended-
spectrum beta-lactamase (ESBL) confirmation test result after a positive ESBL
screening test result for isolates of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae
results from the SENTRY Asia-Pacific Surveillance Program J Clin Microbiol
May45(5)1478-82 2007
BRATU S et al Detection of KPC carbapenem-hydrolyzing enzymes in
Enterobacter spp from Brooklyn New York Antimicrob Agents Chemother v 49 n
2 p 776-8 2005
59
BRATU S et al Emergence of KPC-possessing Klebsiella pneumoniae in
Brooklyn New York epidemiology and recommendations for detection Antimicrob
Agents Chemother v 49 n 7 p 3018-20 2005
BRATU S et al Rapid spread of carbapenem-resistant Klebsiella
pneumoniae in New York City Arch Intern Med v 165 p 1430-5 2005
CAMARGO C F et al Aplicaccedilatildeo das teacutecnicas de pcr e suas teacutecnicas
derivadas em diagnoacutestico molecular Disponiacutevel em
ltfileDUnB10C2BA20semestreArtigosPCR-
20CLEYTON20FLORENCIO20DE20CAMARGO20E20PAULO20ROB
ERTO20QUEIROZpdfgtgt Acesso em 08 de abril de 2014
CARVALHES C G et al Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting
carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive
results Journal of Antimicrobial Chemotherapy v 65 n2 p 249-251 2010
CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION- CDC Modified
Hodge Test for Carbapenemase Detection in Enterobacteriaceae 2004
CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE Methods for
dilutionantimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically Approved
standard M7ndashA7 7th ed CLSI Wayne PA 2011
COELLO R et al Risk factors for developing clinical infection with methicillin-
resistant Staphylococcus aureus (MRSA) amongst hospital patients initially only
colonized with MRSA J Hosp Infect 19973739-46
COLPAN A et al Evaluation of risk factors for mortality in intensive care
units A prospective study from a referral hospital in Turkey Am J Infect Control
200533(1)42-7
60
CORNAGLIA G et al Living with ESBLs Introduction Clinical Microbiology
and Infection 14 Suppl 1 1-2 2008
COTRIM E R et al Klebsiella pneumoniae carbapenemase ndash KPC em
Enterobacteriaceae o desafio das bacteacuterias multirresistentes Poacutes em revista do
centro universitaacuterio Newton Paiva 12012 - ediccedilatildeo 5 - issn 2176 7785
DESHPANDE L M et al Occurrence and characterization of
carbapenemase-producing Enterobacteacuteriaceae report from the SENTRY
Antimicrobial Surveillance Program (2000-2004) Microb Drug Resist 12(4)223-30
2006
DIAS D J A Estudos dos principais mecanismos de resistecircncia aos
antibioacuteticos β-lactacircmicos em bacteacuterias patogecircnicas gram negativas 2009 100 f
Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Geneacutetica Molecular e Biomedicina) ndash Faculdade de
Ciecircncias e Tecnologia Universidade de Nova Lisboa Lisboa
DIENSTMANN R et al Avaliaccedilatildeo fenotiacutepica da enzima Klebsiella
pneumoniae carbapenemase (KPC) em Enterobacteriaceae de ambiente hospitalar
J Bras Patol Med Lab v 46 n 1 p 23-27 fevereiro 2010
ENDIMIAMI A et al Emergence of blaKPC-containing Klebsiella
pneumoniae in a long-term acute care hospital a new challenge to our healthcare J
Antimicrob Chemother 64 1102-1110 Nov 2009
FALAGAS M E et al Extended-spectrum beta-lactamase producing
organisms The Journal of Hospital Infection 73 (4) pp 345-54 2009
FONTANA C et al Emergence of KPC-producing Klebsiella pneumoniae in
Italy BMC Rev Notes 3 40 2010
61
GALES A C et al Antimicrobial resistance among Gram-negative bacilli
isolated from Latin America results from Sentry Antimicrobial Surveillance Program
(Latin America 2008-2010) Diagnostic Microbiology and Infectious Disease v 3 n
4 p 354 -360 2012
GUPTA N et al Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Epidemiology
and Prevention HEALTHCARE EPIDEMIOLOGY Clinical Infectious Diseases
201153(1)60ndash67 Published by Oxford University Press on behalf of the Infectious
Diseases Society of America 2011
HARBOTTLE H et al Genetics of antimicrobial resistance Anim Biotechnol
n17 p111-124 2006
HENRIQUE W N et al RESISTEcircNCIA BACTERIANA Uniatildeo das
Faculdades Alfredo NasserInstituto de Ciecircncias da Sauacutede Disponiacutevel em lt
httpwwwfaculdadealfredonasseredubrfilespesquisaposter20HENRIQUE20
Wilker20Natividade20SANTIAGO20Silvania20CAVALCANTI20DSP
20ResistC3AAncia20Bacterianapdfgt Acesso em 17 marccedilo 2014
HULSCHER M E J I et al Antibiotic prescribing in hospital a social and
behavioral scientific approach The Lancet Infectious Diaseases v 10 n 3 p 167-
165 2010
KIDWAI M SAPRA P BHUSHAN KR Synthetic strategies and medicinal
properties of beta-lactams Curr Med Chem 1999 695-215
KUMARASAMY K K et al Emergence of a new antibiotic resistance
mechanism in India Pakistan and the UK a molecular biological and
epidemiological stuy The Lancet Infectious Diseases v10 n 9 p 597- 602 2010
LINCOPAN N et al Enterobacteacuteria producing extended-spectrum β-
lacatamases and IMP-1 Metalo-β-lactamases isolated from Brazilian hospitals J Med
62
Microbiol 7 1-3 2006
LINCOPAN N et al First Isolation of Metalo-β-Lacatamase-Producing
Multiresistant Klebsiella pneumoniae from a patient in Brazil J Clin Microbiol 43(1)
516-519 2005
LIVERMORE D M et al What remains against carbapenem- resistant
Enterobacteriaceae Evaluation of choramphenicol ciprofloxacin colistina
fosfomycin minocycline nitrofurantoin temocilin and tigecycline International
Journal of Antimicrobial Agents v 37 n 5 p 415- 459 2011
LIVERMORE D M Fourten years in resistance International Journal of
Antimicrobial Agents v 39 283- 294 2012
LIVERMORE D M Bacterial resistance to carbapenems Adv Exp Med Biol
1995 39025-47
LIVERMORE D M Bacterial resistance origins epidemiology and impact
Clin Infect Dis 36S11-S23 2003
LIVERMORE D M et al Carbapenemases a problem in waiting Curr
Opin Microbiol 2000 3489-95
LU et al Universal pcr for common bacterial pathogens J CLIN
MICROBIOL VOL 38 2000
LU et al Use of PCR with Universal Primers and Restriction Endonuclease
Digestions for Detection and Identification of Common Bacterial Pathogens in
Cerebrospinal Fluid Journal of Clinical Microbiology June 2000 p 2076ndash2080
MARSCHALL J Met al Presence of the KPC Carbapenemase Gene in
Enterobacteriaceae Causing Bacteremia and Its Correlation with In Vitro
Carbapenem Susceptibility J Clin Microbiol 47 239-241 Jan 2009
63
MARTINS WMBS et al Prevalecircncia do gene blaKPC em isolados cliacutenicos
de Enterobacteriaceae e natildeo fermentadores encontrados em amostras clinicas em
um hospital universitaacuterio do Recife X Jornada de ensino pesquisa e extensatildeo ndash
JEPEX 2010 ndash UFRPE Recife 18 a 22 de outubro
MENDES C A C et al Polimixinas Revisatildeo com ecircnfase na sua
nefrotoxicidade Rev Assoc Med Bras 2009 55(6) 752-9
MOHR J F 3rd Update on the efficacy and tolerability of meropenem in the
treatment of serious bacteacuterial infections Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S41-51
2008
MONTEIRO J et al First report of KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae
strains in Brazil Antimicrob Agents Chemother Jan53(1)333-4 2009
MOREIRA V C et al Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia a antibioacuteticos
Disponiacutevel em
lthttpwwwcpglsucgbr6mostraartigosSAUDEVANESSA20CARVALHO20M
OREIRApdfgt Acesso em 21 marccedilo 2014
NETIKUL T et al Emergence of novel blaKPC-12 and blaKPC-13 variants in
carbapenem non-susceptible Enterobacter cloacae a first report of blaKPC gene in
Thailand European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases May
S372 2011
NETO V A et al Antibioacuteticos na praacutetica Meacutedica 6ordf Ediccedilatildeo Editorial
SarverSP Brasil 2007
NICOLAU D P Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of
meropenem Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S32-40 2008
64
OLIVEIRA A C et al Resistecircncia bacteriana e mortalidade em um centro de
terapia intensiva Rev Latino-Am Enfermagem nov-dez 2010
PAAUW A et al Failure to control an outbreak of qnrA 1-positive multidrug-
resistant Enterobacter clocae despite adequate implementation of recommended
infection control measures Journal of Clinical Microbiology v 45 n 5 p 1420-1425
2007
PATERSON D L et al Extended-Spectrum Beta-Lactamases a Clinical
Update Clinical Microbiology Reviews v 18 p 657-686 2005
PEIRANO G et al Carbapenem-hydrolysing beta-lactamase KPC-2 in
Klebsiella pneumonia isolated in Rio de Janeiro Brazil J Antimicrob Chemother Nov
20 2009
PERES-BOTA D et al Are infections due to resistant pathogens associated
with worse outcome in critically ill patients J Infect 200347(4)307-16
PIDDOCK L J V Clinically relevant chromosomally encoded multidrug
resistance effl ux pumps in bacterial Clin Microbiol Rev n19 p382-402 2006
PITOUT J D D et al Emergence of Enterobacteriaceae producing
extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) in the community J Antimicrob
Chemother May 56 2005
POSSEBON M I et al Resistecircncia bacteriana aos carbapenecircmicos
Bacterial resitence to carbapenems RBM rev bras med60(6)378380-378-382
jun 2003
QUEENAN A M et al Carbapenemases the versatile beta-lactamases
Clin Microbiol Rev Jul20(3)440-58 2007
65
RHOMBERG P R et al Summary trends for the meropenem yearly
susceptibility test information collection program a 10- year experience in the United
States (1999-2008) Diagnostic Microbiology and Infectiois Disease v 65 n4 p
414-426 2009
ROBLEDO I E et al Detection of KPC in Acinetobacter spp in Puerto Rico
J Antimicrob Agents Chemother 54 1354-1357 Mar 2010
ROGERS B A et al Country-to-country transfer os patients and the risk of
multi-resistant bacterial infection Clinical Infectious Disease v53 n1 p49- 56
2011
SHAH A A et al Characteristics epidemiology and clinicalimportance of
emerging strains of Gram-negative bacilli producing extended-spectrum
betalactamases Research in Microbiology v 155 p 409-421 2004
TURNER P J Extended- Spectrum Beta-Lactamases Clinical Infectious
Diseases v 41 p 273-275 2005
WOLTER D J et al Phenotypic and Enzymatic Comparative Analysis
between the Novel KPC variant KPC-5 and Its Evolutionary Variants KPC-2 and
KPC-4 Antimicrob Agents Chemother Nov 17 2008
WOODFORD N et al Carbapenemases of Chryseobacterium
(Flavobacterium) meningosepticum distribution of blaB and characterization of a
novel Metalo-beta-lactamase gene blaB3 in the type strain NCTC 10016
Antimicrob Agents Chemother Jun44(6)1448-52 2000
WOODFORF N Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in
India Pakistan and the UK a molecular biological and epidemiological study The
Lancet Infectious Diseases v 10 n 9 p 597-602 2010
66
WOODFORD et al Outbreak of Klebsiella pneumoniae Producing a New
Carbapenem- Hydrolyzing Class A β-Lactamase KPC-3 in a New York Medical
Center Antimicrobial agents and chemotherapy Dec 2004 p 4793ndash4799 Vol 48
No 12
YAGI T et al A preliminary survey of extended-spectrum β-lactamases
(ESBLs) in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Japan
FEMS Microbiology Letters 184 (2000) 53-56
YIGIT H et al Novel carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase KPC-1 from
a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumonia J Antimicrob Agents
Chemother 45 (4) 1151-1161 (2001)
ZAVASCKI A P et al KPC-2- producing Enterobacter cloacae in two cities
from Southern Brazil Int J Antimicrob Agents Apr 28 2009
ZHANEL G G et al Comparative review of the carbapenecircmicos Drugs
67(7)1027-52 2007
67
ANEXOS
Sequumlecircncia do oligo blaKPC
Query 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
Query 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
Query 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
68
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
Query 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
Query 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
69
Query 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
Query 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
Query 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
70
Sbjct 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
Query 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
Query 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Sbjct 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
Query 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
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71
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
Query 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
Query 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
72
Query 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
Query 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
Query 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
73
Sbjct 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
Query 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
Query 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
Query 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
74
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
Query 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
Query 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
75
Query 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
Query 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
||||
Sbjct 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
LOCUS AF297554 1377 bp
DNA linear BCT 26-MAR-2001
DEFINITION Klebsiella pneumoniae carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
gene complete cds
ACCESSION AF297554
VERSION AF2975541 GI10121874
76
KEYWORDS
SOURCE Klebsiella pneumoniae
ORGANISM Klebsiella pneumoniae
Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Enterobacteriaceae Klebsiella
REFERENCE 1 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH QueenanAM
AndersonGJ Domenech-SanchezA
BiddleJW StewardCD
AlbertiS BushK and TenoverFC
TITLE Novel carbapenem-hydrolyzing beta-
lactamase KPC-1 from a
carbapenem-resistant strain of
Klebsiella pneumoniae
JOURNAL Antimicrob Agents Chemother 45 (4)
1151-1161 (2001)
PUBMED 11257029
REFERENCE 2 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH AndersonGJ and
TenoverFC
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (19-AUG-2000) Nosocomial
Pathogens Laboratory Branch
Centers for Disease Control and
Prevention 1600 Clifton Rd MS
G08 Atlanta GA 30333 USA
FEATURES LocationQualifiers
77
source 11377
organism=Klebsiella
pneumoniae
mol_type=genomic DNA
db_xref=taxon573
-35_signal 5560
-10_signal 7883
mRNA 921012
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
RBS 117122
CDS 1311012
note=blaKPC-1
codon_start=1
transl_table=11
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
protein_id=AAG134101
db_xref=GI10121875
translation=MSLYRRLVLLSCLSWPLAGFSATALTNLVAEPFAKLEQD
FGGSI
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KNALV
PWSPISEKYLTTGMTVAELSAAAVQYSDNAAANLLLKELGGPAGLTAFMRSIG
DTTFR
78
LDRWELELNSAIPSDARDTSSPRAVTESLQKLTLGSALAAPQRQQFVDWLKGN
TTGNH
RIRAAVPADWAVGDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTRAPNKDDK
HSEAV
IAAAARLALEGLGVNGQ
ORIGIN
1 cggggcagtt acagccgtta cagcctctgg
agagggagcg gcttgccgct cggtgataat
61 cccagctgta gcggcctgat tacatccggc
cgctacacct agctccacct tcaaacaagg
121 aatatcgttg atgtcactgt atcgccgtct
agttctgctg tcttgtctct catggccgct
181 ggctggcttt tctgccaccg cgctgaccaa
cctcgtcgcg gaaccattcg ctaaactcga
241 acaggacttt ggcggctcca tcggtgtgta
cgcgatggat accggctcag gcgcaactgt
301 aagttaccgc gctgaggagc gcttcccact
gtgcagctca ttcaagggct ttcttgctgc
361 cgctgtgctg gctcgcagcc agcagcaggc
cggcttgctg gacacaccca tccgttacgg
421 caaaaatgcg ctggttccgt ggtcacccat
ctcggaaaaa tatctgacaa caggcatgac
481 ggtggcggag ctgtccgcgg ccgccgtgca
atacagtgat aacgccgccg ccaatttgtt
541 gctgaaggag ttgggcggcc cggccgggct
gacggccttc atgcgctcta tcggcgatac
79
601 cacgttccgt ctggaccgct gggagctgga
gctgaactcc gccatcccaa gcgatgcgcg
661 cgatacctca tcgccgcgcg ccgtgacgga
aagcttacaa aaactgacac tgggctctgc
721 actggctgcg ccgcagcggc agcagtttgt
tgattggcta aagggaaaca cgaccggcaa
781 ccaccgcatc cgcgcggcgg tgccggcaga
ctgggcagtc ggagacaaaa ccggaacctg
841 cggagtgtat ggcacggcaa atgactatgc
cgtcgtctgg cccactgggc gcgcacctat
901 tgtgttggcc gtctacaccc gggcgcctaa
caaggatgac aagcacagcg aggccgtcat
961 cgccgctgcg gctagactcg cgctcgaggg
attgggcgtc aacgggcagt aaggctctga
1021 aaatcatcta ttggcccacc accgccgccc
ttgcgggcgg catggattac caaccactgt
1081 cacatttagg ctaggagtct gcgcggcaga
gccgtgtgac cggttttctg tagagcactg
1141 acgatggcgg cggcgctctc tgcaattggc
aaggcgtcgg cgccaaggat accaatcttg
1201 cggcgcgcgg cgtgttatga cgactggggt
gcatttgagc cgccccattt aaccttcgcc
1261 ctcacagata cgccattcgc ctcaaattta
gcgccatgca gacgagcttc cactcggctt
1321 gcaccttgtc caggcccctc atgctgaact
gacgcaatcc catcaccgcc ttgatca
80
58
REFEREcircNCIAS
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Mecanismos
de resistecircncia bacteriana aos antimicrobianos Disponiacutevel em
lthttpwwwanvisagovbrservicosaudecontrolerede_rmcursosrm_controleopas_
webmodulo3mec_sitiohtmgt Acesso em 25 de abril de 2014
AGEcircNCIA NACIONAL DE VIGILAcircNCIA SANITAacuteRIA- ANVISA Nota teacutecnica nordm
012013 medidas de prevenccedilatildeo e controle de infecccedilotildees por enterobacteacuterias
multiresistentes Acesso em 17 de abril de 2013
ALBA J et al Kinetics study of KPC-3 a plasmid-encoded class A
carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase Antimicrob Agents Chemother
Nov49(11)4760-2 2005
ALVES A P et al Nosocomial infections by KPC-producing enterobacteria in
a tertiary hospital in Southern Brazil Revista da AMRIGS Porto Alegre 57 (3) 213-
218 jul-set 2013
ALVES A et al Tipagem Geneacutetica de Microrganismos Lab De Diversidade
Microbiana Centro de Biologia Celular Dep de Biologia U de Aveiro 3810-193
Aveiro- 2003
BELL J M et Al Prevalence and significance of a negative extended-
spectrum beta-lactamase (ESBL) confirmation test result after a positive ESBL
screening test result for isolates of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae
results from the SENTRY Asia-Pacific Surveillance Program J Clin Microbiol
May45(5)1478-82 2007
BRATU S et al Detection of KPC carbapenem-hydrolyzing enzymes in
Enterobacter spp from Brooklyn New York Antimicrob Agents Chemother v 49 n
2 p 776-8 2005
59
BRATU S et al Emergence of KPC-possessing Klebsiella pneumoniae in
Brooklyn New York epidemiology and recommendations for detection Antimicrob
Agents Chemother v 49 n 7 p 3018-20 2005
BRATU S et al Rapid spread of carbapenem-resistant Klebsiella
pneumoniae in New York City Arch Intern Med v 165 p 1430-5 2005
CAMARGO C F et al Aplicaccedilatildeo das teacutecnicas de pcr e suas teacutecnicas
derivadas em diagnoacutestico molecular Disponiacutevel em
ltfileDUnB10C2BA20semestreArtigosPCR-
20CLEYTON20FLORENCIO20DE20CAMARGO20E20PAULO20ROB
ERTO20QUEIROZpdfgtgt Acesso em 08 de abril de 2014
CARVALHES C G et al Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting
carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive
results Journal of Antimicrobial Chemotherapy v 65 n2 p 249-251 2010
CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION- CDC Modified
Hodge Test for Carbapenemase Detection in Enterobacteriaceae 2004
CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE Methods for
dilutionantimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically Approved
standard M7ndashA7 7th ed CLSI Wayne PA 2011
COELLO R et al Risk factors for developing clinical infection with methicillin-
resistant Staphylococcus aureus (MRSA) amongst hospital patients initially only
colonized with MRSA J Hosp Infect 19973739-46
COLPAN A et al Evaluation of risk factors for mortality in intensive care
units A prospective study from a referral hospital in Turkey Am J Infect Control
200533(1)42-7
60
CORNAGLIA G et al Living with ESBLs Introduction Clinical Microbiology
and Infection 14 Suppl 1 1-2 2008
COTRIM E R et al Klebsiella pneumoniae carbapenemase ndash KPC em
Enterobacteriaceae o desafio das bacteacuterias multirresistentes Poacutes em revista do
centro universitaacuterio Newton Paiva 12012 - ediccedilatildeo 5 - issn 2176 7785
DESHPANDE L M et al Occurrence and characterization of
carbapenemase-producing Enterobacteacuteriaceae report from the SENTRY
Antimicrobial Surveillance Program (2000-2004) Microb Drug Resist 12(4)223-30
2006
DIAS D J A Estudos dos principais mecanismos de resistecircncia aos
antibioacuteticos β-lactacircmicos em bacteacuterias patogecircnicas gram negativas 2009 100 f
Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Geneacutetica Molecular e Biomedicina) ndash Faculdade de
Ciecircncias e Tecnologia Universidade de Nova Lisboa Lisboa
DIENSTMANN R et al Avaliaccedilatildeo fenotiacutepica da enzima Klebsiella
pneumoniae carbapenemase (KPC) em Enterobacteriaceae de ambiente hospitalar
J Bras Patol Med Lab v 46 n 1 p 23-27 fevereiro 2010
ENDIMIAMI A et al Emergence of blaKPC-containing Klebsiella
pneumoniae in a long-term acute care hospital a new challenge to our healthcare J
Antimicrob Chemother 64 1102-1110 Nov 2009
FALAGAS M E et al Extended-spectrum beta-lactamase producing
organisms The Journal of Hospital Infection 73 (4) pp 345-54 2009
FONTANA C et al Emergence of KPC-producing Klebsiella pneumoniae in
Italy BMC Rev Notes 3 40 2010
61
GALES A C et al Antimicrobial resistance among Gram-negative bacilli
isolated from Latin America results from Sentry Antimicrobial Surveillance Program
(Latin America 2008-2010) Diagnostic Microbiology and Infectious Disease v 3 n
4 p 354 -360 2012
GUPTA N et al Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Epidemiology
and Prevention HEALTHCARE EPIDEMIOLOGY Clinical Infectious Diseases
201153(1)60ndash67 Published by Oxford University Press on behalf of the Infectious
Diseases Society of America 2011
HARBOTTLE H et al Genetics of antimicrobial resistance Anim Biotechnol
n17 p111-124 2006
HENRIQUE W N et al RESISTEcircNCIA BACTERIANA Uniatildeo das
Faculdades Alfredo NasserInstituto de Ciecircncias da Sauacutede Disponiacutevel em lt
httpwwwfaculdadealfredonasseredubrfilespesquisaposter20HENRIQUE20
Wilker20Natividade20SANTIAGO20Silvania20CAVALCANTI20DSP
20ResistC3AAncia20Bacterianapdfgt Acesso em 17 marccedilo 2014
HULSCHER M E J I et al Antibiotic prescribing in hospital a social and
behavioral scientific approach The Lancet Infectious Diaseases v 10 n 3 p 167-
165 2010
KIDWAI M SAPRA P BHUSHAN KR Synthetic strategies and medicinal
properties of beta-lactams Curr Med Chem 1999 695-215
KUMARASAMY K K et al Emergence of a new antibiotic resistance
mechanism in India Pakistan and the UK a molecular biological and
epidemiological stuy The Lancet Infectious Diseases v10 n 9 p 597- 602 2010
LINCOPAN N et al Enterobacteacuteria producing extended-spectrum β-
lacatamases and IMP-1 Metalo-β-lactamases isolated from Brazilian hospitals J Med
62
Microbiol 7 1-3 2006
LINCOPAN N et al First Isolation of Metalo-β-Lacatamase-Producing
Multiresistant Klebsiella pneumoniae from a patient in Brazil J Clin Microbiol 43(1)
516-519 2005
LIVERMORE D M et al What remains against carbapenem- resistant
Enterobacteriaceae Evaluation of choramphenicol ciprofloxacin colistina
fosfomycin minocycline nitrofurantoin temocilin and tigecycline International
Journal of Antimicrobial Agents v 37 n 5 p 415- 459 2011
LIVERMORE D M Fourten years in resistance International Journal of
Antimicrobial Agents v 39 283- 294 2012
LIVERMORE D M Bacterial resistance to carbapenems Adv Exp Med Biol
1995 39025-47
LIVERMORE D M Bacterial resistance origins epidemiology and impact
Clin Infect Dis 36S11-S23 2003
LIVERMORE D M et al Carbapenemases a problem in waiting Curr
Opin Microbiol 2000 3489-95
LU et al Universal pcr for common bacterial pathogens J CLIN
MICROBIOL VOL 38 2000
LU et al Use of PCR with Universal Primers and Restriction Endonuclease
Digestions for Detection and Identification of Common Bacterial Pathogens in
Cerebrospinal Fluid Journal of Clinical Microbiology June 2000 p 2076ndash2080
MARSCHALL J Met al Presence of the KPC Carbapenemase Gene in
Enterobacteriaceae Causing Bacteremia and Its Correlation with In Vitro
Carbapenem Susceptibility J Clin Microbiol 47 239-241 Jan 2009
63
MARTINS WMBS et al Prevalecircncia do gene blaKPC em isolados cliacutenicos
de Enterobacteriaceae e natildeo fermentadores encontrados em amostras clinicas em
um hospital universitaacuterio do Recife X Jornada de ensino pesquisa e extensatildeo ndash
JEPEX 2010 ndash UFRPE Recife 18 a 22 de outubro
MENDES C A C et al Polimixinas Revisatildeo com ecircnfase na sua
nefrotoxicidade Rev Assoc Med Bras 2009 55(6) 752-9
MOHR J F 3rd Update on the efficacy and tolerability of meropenem in the
treatment of serious bacteacuterial infections Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S41-51
2008
MONTEIRO J et al First report of KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae
strains in Brazil Antimicrob Agents Chemother Jan53(1)333-4 2009
MOREIRA V C et al Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia a antibioacuteticos
Disponiacutevel em
lthttpwwwcpglsucgbr6mostraartigosSAUDEVANESSA20CARVALHO20M
OREIRApdfgt Acesso em 21 marccedilo 2014
NETIKUL T et al Emergence of novel blaKPC-12 and blaKPC-13 variants in
carbapenem non-susceptible Enterobacter cloacae a first report of blaKPC gene in
Thailand European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases May
S372 2011
NETO V A et al Antibioacuteticos na praacutetica Meacutedica 6ordf Ediccedilatildeo Editorial
SarverSP Brasil 2007
NICOLAU D P Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of
meropenem Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S32-40 2008
64
OLIVEIRA A C et al Resistecircncia bacteriana e mortalidade em um centro de
terapia intensiva Rev Latino-Am Enfermagem nov-dez 2010
PAAUW A et al Failure to control an outbreak of qnrA 1-positive multidrug-
resistant Enterobacter clocae despite adequate implementation of recommended
infection control measures Journal of Clinical Microbiology v 45 n 5 p 1420-1425
2007
PATERSON D L et al Extended-Spectrum Beta-Lactamases a Clinical
Update Clinical Microbiology Reviews v 18 p 657-686 2005
PEIRANO G et al Carbapenem-hydrolysing beta-lactamase KPC-2 in
Klebsiella pneumonia isolated in Rio de Janeiro Brazil J Antimicrob Chemother Nov
20 2009
PERES-BOTA D et al Are infections due to resistant pathogens associated
with worse outcome in critically ill patients J Infect 200347(4)307-16
PIDDOCK L J V Clinically relevant chromosomally encoded multidrug
resistance effl ux pumps in bacterial Clin Microbiol Rev n19 p382-402 2006
PITOUT J D D et al Emergence of Enterobacteriaceae producing
extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) in the community J Antimicrob
Chemother May 56 2005
POSSEBON M I et al Resistecircncia bacteriana aos carbapenecircmicos
Bacterial resitence to carbapenems RBM rev bras med60(6)378380-378-382
jun 2003
QUEENAN A M et al Carbapenemases the versatile beta-lactamases
Clin Microbiol Rev Jul20(3)440-58 2007
65
RHOMBERG P R et al Summary trends for the meropenem yearly
susceptibility test information collection program a 10- year experience in the United
States (1999-2008) Diagnostic Microbiology and Infectiois Disease v 65 n4 p
414-426 2009
ROBLEDO I E et al Detection of KPC in Acinetobacter spp in Puerto Rico
J Antimicrob Agents Chemother 54 1354-1357 Mar 2010
ROGERS B A et al Country-to-country transfer os patients and the risk of
multi-resistant bacterial infection Clinical Infectious Disease v53 n1 p49- 56
2011
SHAH A A et al Characteristics epidemiology and clinicalimportance of
emerging strains of Gram-negative bacilli producing extended-spectrum
betalactamases Research in Microbiology v 155 p 409-421 2004
TURNER P J Extended- Spectrum Beta-Lactamases Clinical Infectious
Diseases v 41 p 273-275 2005
WOLTER D J et al Phenotypic and Enzymatic Comparative Analysis
between the Novel KPC variant KPC-5 and Its Evolutionary Variants KPC-2 and
KPC-4 Antimicrob Agents Chemother Nov 17 2008
WOODFORD N et al Carbapenemases of Chryseobacterium
(Flavobacterium) meningosepticum distribution of blaB and characterization of a
novel Metalo-beta-lactamase gene blaB3 in the type strain NCTC 10016
Antimicrob Agents Chemother Jun44(6)1448-52 2000
WOODFORF N Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in
India Pakistan and the UK a molecular biological and epidemiological study The
Lancet Infectious Diseases v 10 n 9 p 597-602 2010
66
WOODFORD et al Outbreak of Klebsiella pneumoniae Producing a New
Carbapenem- Hydrolyzing Class A β-Lactamase KPC-3 in a New York Medical
Center Antimicrobial agents and chemotherapy Dec 2004 p 4793ndash4799 Vol 48
No 12
YAGI T et al A preliminary survey of extended-spectrum β-lactamases
(ESBLs) in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Japan
FEMS Microbiology Letters 184 (2000) 53-56
YIGIT H et al Novel carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase KPC-1 from
a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumonia J Antimicrob Agents
Chemother 45 (4) 1151-1161 (2001)
ZAVASCKI A P et al KPC-2- producing Enterobacter cloacae in two cities
from Southern Brazil Int J Antimicrob Agents Apr 28 2009
ZHANEL G G et al Comparative review of the carbapenecircmicos Drugs
67(7)1027-52 2007
67
ANEXOS
Sequumlecircncia do oligo blaKPC
Query 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
Query 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
Query 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
68
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
Query 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
Query 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
69
Query 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
Query 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
Query 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
70
Sbjct 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
Query 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
Query 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
Query 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
71
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
Query 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
Query 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
72
Query 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
Query 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
Query 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
73
Sbjct 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
Query 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
Query 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
Query 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
74
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
Query 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
Query 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
75
Query 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
Query 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
||||
Sbjct 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
LOCUS AF297554 1377 bp
DNA linear BCT 26-MAR-2001
DEFINITION Klebsiella pneumoniae carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
gene complete cds
ACCESSION AF297554
VERSION AF2975541 GI10121874
76
KEYWORDS
SOURCE Klebsiella pneumoniae
ORGANISM Klebsiella pneumoniae
Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Enterobacteriaceae Klebsiella
REFERENCE 1 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH QueenanAM
AndersonGJ Domenech-SanchezA
BiddleJW StewardCD
AlbertiS BushK and TenoverFC
TITLE Novel carbapenem-hydrolyzing beta-
lactamase KPC-1 from a
carbapenem-resistant strain of
Klebsiella pneumoniae
JOURNAL Antimicrob Agents Chemother 45 (4)
1151-1161 (2001)
PUBMED 11257029
REFERENCE 2 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH AndersonGJ and
TenoverFC
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (19-AUG-2000) Nosocomial
Pathogens Laboratory Branch
Centers for Disease Control and
Prevention 1600 Clifton Rd MS
G08 Atlanta GA 30333 USA
FEATURES LocationQualifiers
77
source 11377
organism=Klebsiella
pneumoniae
mol_type=genomic DNA
db_xref=taxon573
-35_signal 5560
-10_signal 7883
mRNA 921012
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
RBS 117122
CDS 1311012
note=blaKPC-1
codon_start=1
transl_table=11
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
protein_id=AAG134101
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translation=MSLYRRLVLLSCLSWPLAGFSATALTNLVAEPFAKLEQD
FGGSI
GVYAMDTGSGATVSYRAEERFPLCSSFKGFLAAAVLARSQQQAGLLDTPIRYG
KNALV
PWSPISEKYLTTGMTVAELSAAAVQYSDNAAANLLLKELGGPAGLTAFMRSIG
DTTFR
78
LDRWELELNSAIPSDARDTSSPRAVTESLQKLTLGSALAAPQRQQFVDWLKGN
TTGNH
RIRAAVPADWAVGDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTRAPNKDDK
HSEAV
IAAAARLALEGLGVNGQ
ORIGIN
1 cggggcagtt acagccgtta cagcctctgg
agagggagcg gcttgccgct cggtgataat
61 cccagctgta gcggcctgat tacatccggc
cgctacacct agctccacct tcaaacaagg
121 aatatcgttg atgtcactgt atcgccgtct
agttctgctg tcttgtctct catggccgct
181 ggctggcttt tctgccaccg cgctgaccaa
cctcgtcgcg gaaccattcg ctaaactcga
241 acaggacttt ggcggctcca tcggtgtgta
cgcgatggat accggctcag gcgcaactgt
301 aagttaccgc gctgaggagc gcttcccact
gtgcagctca ttcaagggct ttcttgctgc
361 cgctgtgctg gctcgcagcc agcagcaggc
cggcttgctg gacacaccca tccgttacgg
421 caaaaatgcg ctggttccgt ggtcacccat
ctcggaaaaa tatctgacaa caggcatgac
481 ggtggcggag ctgtccgcgg ccgccgtgca
atacagtgat aacgccgccg ccaatttgtt
541 gctgaaggag ttgggcggcc cggccgggct
gacggccttc atgcgctcta tcggcgatac
79
601 cacgttccgt ctggaccgct gggagctgga
gctgaactcc gccatcccaa gcgatgcgcg
661 cgatacctca tcgccgcgcg ccgtgacgga
aagcttacaa aaactgacac tgggctctgc
721 actggctgcg ccgcagcggc agcagtttgt
tgattggcta aagggaaaca cgaccggcaa
781 ccaccgcatc cgcgcggcgg tgccggcaga
ctgggcagtc ggagacaaaa ccggaacctg
841 cggagtgtat ggcacggcaa atgactatgc
cgtcgtctgg cccactgggc gcgcacctat
901 tgtgttggcc gtctacaccc gggcgcctaa
caaggatgac aagcacagcg aggccgtcat
961 cgccgctgcg gctagactcg cgctcgaggg
attgggcgtc aacgggcagt aaggctctga
1021 aaatcatcta ttggcccacc accgccgccc
ttgcgggcgg catggattac caaccactgt
1081 cacatttagg ctaggagtct gcgcggcaga
gccgtgtgac cggttttctg tagagcactg
1141 acgatggcgg cggcgctctc tgcaattggc
aaggcgtcgg cgccaaggat accaatcttg
1201 cggcgcgcgg cgtgttatga cgactggggt
gcatttgagc cgccccattt aaccttcgcc
1261 ctcacagata cgccattcgc ctcaaattta
gcgccatgca gacgagcttc cactcggctt
1321 gcaccttgtc caggcccctc atgctgaact
gacgcaatcc catcaccgcc ttgatca
80
59
BRATU S et al Emergence of KPC-possessing Klebsiella pneumoniae in
Brooklyn New York epidemiology and recommendations for detection Antimicrob
Agents Chemother v 49 n 7 p 3018-20 2005
BRATU S et al Rapid spread of carbapenem-resistant Klebsiella
pneumoniae in New York City Arch Intern Med v 165 p 1430-5 2005
CAMARGO C F et al Aplicaccedilatildeo das teacutecnicas de pcr e suas teacutecnicas
derivadas em diagnoacutestico molecular Disponiacutevel em
ltfileDUnB10C2BA20semestreArtigosPCR-
20CLEYTON20FLORENCIO20DE20CAMARGO20E20PAULO20ROB
ERTO20QUEIROZpdfgtgt Acesso em 08 de abril de 2014
CARVALHES C G et al Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting
carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive
results Journal of Antimicrobial Chemotherapy v 65 n2 p 249-251 2010
CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION- CDC Modified
Hodge Test for Carbapenemase Detection in Enterobacteriaceae 2004
CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE Methods for
dilutionantimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically Approved
standard M7ndashA7 7th ed CLSI Wayne PA 2011
COELLO R et al Risk factors for developing clinical infection with methicillin-
resistant Staphylococcus aureus (MRSA) amongst hospital patients initially only
colonized with MRSA J Hosp Infect 19973739-46
COLPAN A et al Evaluation of risk factors for mortality in intensive care
units A prospective study from a referral hospital in Turkey Am J Infect Control
200533(1)42-7
60
CORNAGLIA G et al Living with ESBLs Introduction Clinical Microbiology
and Infection 14 Suppl 1 1-2 2008
COTRIM E R et al Klebsiella pneumoniae carbapenemase ndash KPC em
Enterobacteriaceae o desafio das bacteacuterias multirresistentes Poacutes em revista do
centro universitaacuterio Newton Paiva 12012 - ediccedilatildeo 5 - issn 2176 7785
DESHPANDE L M et al Occurrence and characterization of
carbapenemase-producing Enterobacteacuteriaceae report from the SENTRY
Antimicrobial Surveillance Program (2000-2004) Microb Drug Resist 12(4)223-30
2006
DIAS D J A Estudos dos principais mecanismos de resistecircncia aos
antibioacuteticos β-lactacircmicos em bacteacuterias patogecircnicas gram negativas 2009 100 f
Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Geneacutetica Molecular e Biomedicina) ndash Faculdade de
Ciecircncias e Tecnologia Universidade de Nova Lisboa Lisboa
DIENSTMANN R et al Avaliaccedilatildeo fenotiacutepica da enzima Klebsiella
pneumoniae carbapenemase (KPC) em Enterobacteriaceae de ambiente hospitalar
J Bras Patol Med Lab v 46 n 1 p 23-27 fevereiro 2010
ENDIMIAMI A et al Emergence of blaKPC-containing Klebsiella
pneumoniae in a long-term acute care hospital a new challenge to our healthcare J
Antimicrob Chemother 64 1102-1110 Nov 2009
FALAGAS M E et al Extended-spectrum beta-lactamase producing
organisms The Journal of Hospital Infection 73 (4) pp 345-54 2009
FONTANA C et al Emergence of KPC-producing Klebsiella pneumoniae in
Italy BMC Rev Notes 3 40 2010
61
GALES A C et al Antimicrobial resistance among Gram-negative bacilli
isolated from Latin America results from Sentry Antimicrobial Surveillance Program
(Latin America 2008-2010) Diagnostic Microbiology and Infectious Disease v 3 n
4 p 354 -360 2012
GUPTA N et al Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Epidemiology
and Prevention HEALTHCARE EPIDEMIOLOGY Clinical Infectious Diseases
201153(1)60ndash67 Published by Oxford University Press on behalf of the Infectious
Diseases Society of America 2011
HARBOTTLE H et al Genetics of antimicrobial resistance Anim Biotechnol
n17 p111-124 2006
HENRIQUE W N et al RESISTEcircNCIA BACTERIANA Uniatildeo das
Faculdades Alfredo NasserInstituto de Ciecircncias da Sauacutede Disponiacutevel em lt
httpwwwfaculdadealfredonasseredubrfilespesquisaposter20HENRIQUE20
Wilker20Natividade20SANTIAGO20Silvania20CAVALCANTI20DSP
20ResistC3AAncia20Bacterianapdfgt Acesso em 17 marccedilo 2014
HULSCHER M E J I et al Antibiotic prescribing in hospital a social and
behavioral scientific approach The Lancet Infectious Diaseases v 10 n 3 p 167-
165 2010
KIDWAI M SAPRA P BHUSHAN KR Synthetic strategies and medicinal
properties of beta-lactams Curr Med Chem 1999 695-215
KUMARASAMY K K et al Emergence of a new antibiotic resistance
mechanism in India Pakistan and the UK a molecular biological and
epidemiological stuy The Lancet Infectious Diseases v10 n 9 p 597- 602 2010
LINCOPAN N et al Enterobacteacuteria producing extended-spectrum β-
lacatamases and IMP-1 Metalo-β-lactamases isolated from Brazilian hospitals J Med
62
Microbiol 7 1-3 2006
LINCOPAN N et al First Isolation of Metalo-β-Lacatamase-Producing
Multiresistant Klebsiella pneumoniae from a patient in Brazil J Clin Microbiol 43(1)
516-519 2005
LIVERMORE D M et al What remains against carbapenem- resistant
Enterobacteriaceae Evaluation of choramphenicol ciprofloxacin colistina
fosfomycin minocycline nitrofurantoin temocilin and tigecycline International
Journal of Antimicrobial Agents v 37 n 5 p 415- 459 2011
LIVERMORE D M Fourten years in resistance International Journal of
Antimicrobial Agents v 39 283- 294 2012
LIVERMORE D M Bacterial resistance to carbapenems Adv Exp Med Biol
1995 39025-47
LIVERMORE D M Bacterial resistance origins epidemiology and impact
Clin Infect Dis 36S11-S23 2003
LIVERMORE D M et al Carbapenemases a problem in waiting Curr
Opin Microbiol 2000 3489-95
LU et al Universal pcr for common bacterial pathogens J CLIN
MICROBIOL VOL 38 2000
LU et al Use of PCR with Universal Primers and Restriction Endonuclease
Digestions for Detection and Identification of Common Bacterial Pathogens in
Cerebrospinal Fluid Journal of Clinical Microbiology June 2000 p 2076ndash2080
MARSCHALL J Met al Presence of the KPC Carbapenemase Gene in
Enterobacteriaceae Causing Bacteremia and Its Correlation with In Vitro
Carbapenem Susceptibility J Clin Microbiol 47 239-241 Jan 2009
63
MARTINS WMBS et al Prevalecircncia do gene blaKPC em isolados cliacutenicos
de Enterobacteriaceae e natildeo fermentadores encontrados em amostras clinicas em
um hospital universitaacuterio do Recife X Jornada de ensino pesquisa e extensatildeo ndash
JEPEX 2010 ndash UFRPE Recife 18 a 22 de outubro
MENDES C A C et al Polimixinas Revisatildeo com ecircnfase na sua
nefrotoxicidade Rev Assoc Med Bras 2009 55(6) 752-9
MOHR J F 3rd Update on the efficacy and tolerability of meropenem in the
treatment of serious bacteacuterial infections Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S41-51
2008
MONTEIRO J et al First report of KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae
strains in Brazil Antimicrob Agents Chemother Jan53(1)333-4 2009
MOREIRA V C et al Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia a antibioacuteticos
Disponiacutevel em
lthttpwwwcpglsucgbr6mostraartigosSAUDEVANESSA20CARVALHO20M
OREIRApdfgt Acesso em 21 marccedilo 2014
NETIKUL T et al Emergence of novel blaKPC-12 and blaKPC-13 variants in
carbapenem non-susceptible Enterobacter cloacae a first report of blaKPC gene in
Thailand European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases May
S372 2011
NETO V A et al Antibioacuteticos na praacutetica Meacutedica 6ordf Ediccedilatildeo Editorial
SarverSP Brasil 2007
NICOLAU D P Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of
meropenem Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S32-40 2008
64
OLIVEIRA A C et al Resistecircncia bacteriana e mortalidade em um centro de
terapia intensiva Rev Latino-Am Enfermagem nov-dez 2010
PAAUW A et al Failure to control an outbreak of qnrA 1-positive multidrug-
resistant Enterobacter clocae despite adequate implementation of recommended
infection control measures Journal of Clinical Microbiology v 45 n 5 p 1420-1425
2007
PATERSON D L et al Extended-Spectrum Beta-Lactamases a Clinical
Update Clinical Microbiology Reviews v 18 p 657-686 2005
PEIRANO G et al Carbapenem-hydrolysing beta-lactamase KPC-2 in
Klebsiella pneumonia isolated in Rio de Janeiro Brazil J Antimicrob Chemother Nov
20 2009
PERES-BOTA D et al Are infections due to resistant pathogens associated
with worse outcome in critically ill patients J Infect 200347(4)307-16
PIDDOCK L J V Clinically relevant chromosomally encoded multidrug
resistance effl ux pumps in bacterial Clin Microbiol Rev n19 p382-402 2006
PITOUT J D D et al Emergence of Enterobacteriaceae producing
extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) in the community J Antimicrob
Chemother May 56 2005
POSSEBON M I et al Resistecircncia bacteriana aos carbapenecircmicos
Bacterial resitence to carbapenems RBM rev bras med60(6)378380-378-382
jun 2003
QUEENAN A M et al Carbapenemases the versatile beta-lactamases
Clin Microbiol Rev Jul20(3)440-58 2007
65
RHOMBERG P R et al Summary trends for the meropenem yearly
susceptibility test information collection program a 10- year experience in the United
States (1999-2008) Diagnostic Microbiology and Infectiois Disease v 65 n4 p
414-426 2009
ROBLEDO I E et al Detection of KPC in Acinetobacter spp in Puerto Rico
J Antimicrob Agents Chemother 54 1354-1357 Mar 2010
ROGERS B A et al Country-to-country transfer os patients and the risk of
multi-resistant bacterial infection Clinical Infectious Disease v53 n1 p49- 56
2011
SHAH A A et al Characteristics epidemiology and clinicalimportance of
emerging strains of Gram-negative bacilli producing extended-spectrum
betalactamases Research in Microbiology v 155 p 409-421 2004
TURNER P J Extended- Spectrum Beta-Lactamases Clinical Infectious
Diseases v 41 p 273-275 2005
WOLTER D J et al Phenotypic and Enzymatic Comparative Analysis
between the Novel KPC variant KPC-5 and Its Evolutionary Variants KPC-2 and
KPC-4 Antimicrob Agents Chemother Nov 17 2008
WOODFORD N et al Carbapenemases of Chryseobacterium
(Flavobacterium) meningosepticum distribution of blaB and characterization of a
novel Metalo-beta-lactamase gene blaB3 in the type strain NCTC 10016
Antimicrob Agents Chemother Jun44(6)1448-52 2000
WOODFORF N Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in
India Pakistan and the UK a molecular biological and epidemiological study The
Lancet Infectious Diseases v 10 n 9 p 597-602 2010
66
WOODFORD et al Outbreak of Klebsiella pneumoniae Producing a New
Carbapenem- Hydrolyzing Class A β-Lactamase KPC-3 in a New York Medical
Center Antimicrobial agents and chemotherapy Dec 2004 p 4793ndash4799 Vol 48
No 12
YAGI T et al A preliminary survey of extended-spectrum β-lactamases
(ESBLs) in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Japan
FEMS Microbiology Letters 184 (2000) 53-56
YIGIT H et al Novel carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase KPC-1 from
a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumonia J Antimicrob Agents
Chemother 45 (4) 1151-1161 (2001)
ZAVASCKI A P et al KPC-2- producing Enterobacter cloacae in two cities
from Southern Brazil Int J Antimicrob Agents Apr 28 2009
ZHANEL G G et al Comparative review of the carbapenecircmicos Drugs
67(7)1027-52 2007
67
ANEXOS
Sequumlecircncia do oligo blaKPC
Query 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
Query 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
Query 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
68
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
Query 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
Query 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
69
Query 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
Query 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
Query 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
70
Sbjct 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
Query 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
Query 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
Query 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
71
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
Query 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
Query 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
72
Query 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
Query 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
Query 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
73
Sbjct 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
Query 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
Query 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
Query 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
74
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
Query 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
Query 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
75
Query 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
Query 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
||||
Sbjct 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
LOCUS AF297554 1377 bp
DNA linear BCT 26-MAR-2001
DEFINITION Klebsiella pneumoniae carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
gene complete cds
ACCESSION AF297554
VERSION AF2975541 GI10121874
76
KEYWORDS
SOURCE Klebsiella pneumoniae
ORGANISM Klebsiella pneumoniae
Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Enterobacteriaceae Klebsiella
REFERENCE 1 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH QueenanAM
AndersonGJ Domenech-SanchezA
BiddleJW StewardCD
AlbertiS BushK and TenoverFC
TITLE Novel carbapenem-hydrolyzing beta-
lactamase KPC-1 from a
carbapenem-resistant strain of
Klebsiella pneumoniae
JOURNAL Antimicrob Agents Chemother 45 (4)
1151-1161 (2001)
PUBMED 11257029
REFERENCE 2 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH AndersonGJ and
TenoverFC
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (19-AUG-2000) Nosocomial
Pathogens Laboratory Branch
Centers for Disease Control and
Prevention 1600 Clifton Rd MS
G08 Atlanta GA 30333 USA
FEATURES LocationQualifiers
77
source 11377
organism=Klebsiella
pneumoniae
mol_type=genomic DNA
db_xref=taxon573
-35_signal 5560
-10_signal 7883
mRNA 921012
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
RBS 117122
CDS 1311012
note=blaKPC-1
codon_start=1
transl_table=11
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
protein_id=AAG134101
db_xref=GI10121875
translation=MSLYRRLVLLSCLSWPLAGFSATALTNLVAEPFAKLEQD
FGGSI
GVYAMDTGSGATVSYRAEERFPLCSSFKGFLAAAVLARSQQQAGLLDTPIRYG
KNALV
PWSPISEKYLTTGMTVAELSAAAVQYSDNAAANLLLKELGGPAGLTAFMRSIG
DTTFR
78
LDRWELELNSAIPSDARDTSSPRAVTESLQKLTLGSALAAPQRQQFVDWLKGN
TTGNH
RIRAAVPADWAVGDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTRAPNKDDK
HSEAV
IAAAARLALEGLGVNGQ
ORIGIN
1 cggggcagtt acagccgtta cagcctctgg
agagggagcg gcttgccgct cggtgataat
61 cccagctgta gcggcctgat tacatccggc
cgctacacct agctccacct tcaaacaagg
121 aatatcgttg atgtcactgt atcgccgtct
agttctgctg tcttgtctct catggccgct
181 ggctggcttt tctgccaccg cgctgaccaa
cctcgtcgcg gaaccattcg ctaaactcga
241 acaggacttt ggcggctcca tcggtgtgta
cgcgatggat accggctcag gcgcaactgt
301 aagttaccgc gctgaggagc gcttcccact
gtgcagctca ttcaagggct ttcttgctgc
361 cgctgtgctg gctcgcagcc agcagcaggc
cggcttgctg gacacaccca tccgttacgg
421 caaaaatgcg ctggttccgt ggtcacccat
ctcggaaaaa tatctgacaa caggcatgac
481 ggtggcggag ctgtccgcgg ccgccgtgca
atacagtgat aacgccgccg ccaatttgtt
541 gctgaaggag ttgggcggcc cggccgggct
gacggccttc atgcgctcta tcggcgatac
79
601 cacgttccgt ctggaccgct gggagctgga
gctgaactcc gccatcccaa gcgatgcgcg
661 cgatacctca tcgccgcgcg ccgtgacgga
aagcttacaa aaactgacac tgggctctgc
721 actggctgcg ccgcagcggc agcagtttgt
tgattggcta aagggaaaca cgaccggcaa
781 ccaccgcatc cgcgcggcgg tgccggcaga
ctgggcagtc ggagacaaaa ccggaacctg
841 cggagtgtat ggcacggcaa atgactatgc
cgtcgtctgg cccactgggc gcgcacctat
901 tgtgttggcc gtctacaccc gggcgcctaa
caaggatgac aagcacagcg aggccgtcat
961 cgccgctgcg gctagactcg cgctcgaggg
attgggcgtc aacgggcagt aaggctctga
1021 aaatcatcta ttggcccacc accgccgccc
ttgcgggcgg catggattac caaccactgt
1081 cacatttagg ctaggagtct gcgcggcaga
gccgtgtgac cggttttctg tagagcactg
1141 acgatggcgg cggcgctctc tgcaattggc
aaggcgtcgg cgccaaggat accaatcttg
1201 cggcgcgcgg cgtgttatga cgactggggt
gcatttgagc cgccccattt aaccttcgcc
1261 ctcacagata cgccattcgc ctcaaattta
gcgccatgca gacgagcttc cactcggctt
1321 gcaccttgtc caggcccctc atgctgaact
gacgcaatcc catcaccgcc ttgatca
80
60
CORNAGLIA G et al Living with ESBLs Introduction Clinical Microbiology
and Infection 14 Suppl 1 1-2 2008
COTRIM E R et al Klebsiella pneumoniae carbapenemase ndash KPC em
Enterobacteriaceae o desafio das bacteacuterias multirresistentes Poacutes em revista do
centro universitaacuterio Newton Paiva 12012 - ediccedilatildeo 5 - issn 2176 7785
DESHPANDE L M et al Occurrence and characterization of
carbapenemase-producing Enterobacteacuteriaceae report from the SENTRY
Antimicrobial Surveillance Program (2000-2004) Microb Drug Resist 12(4)223-30
2006
DIAS D J A Estudos dos principais mecanismos de resistecircncia aos
antibioacuteticos β-lactacircmicos em bacteacuterias patogecircnicas gram negativas 2009 100 f
Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Geneacutetica Molecular e Biomedicina) ndash Faculdade de
Ciecircncias e Tecnologia Universidade de Nova Lisboa Lisboa
DIENSTMANN R et al Avaliaccedilatildeo fenotiacutepica da enzima Klebsiella
pneumoniae carbapenemase (KPC) em Enterobacteriaceae de ambiente hospitalar
J Bras Patol Med Lab v 46 n 1 p 23-27 fevereiro 2010
ENDIMIAMI A et al Emergence of blaKPC-containing Klebsiella
pneumoniae in a long-term acute care hospital a new challenge to our healthcare J
Antimicrob Chemother 64 1102-1110 Nov 2009
FALAGAS M E et al Extended-spectrum beta-lactamase producing
organisms The Journal of Hospital Infection 73 (4) pp 345-54 2009
FONTANA C et al Emergence of KPC-producing Klebsiella pneumoniae in
Italy BMC Rev Notes 3 40 2010
61
GALES A C et al Antimicrobial resistance among Gram-negative bacilli
isolated from Latin America results from Sentry Antimicrobial Surveillance Program
(Latin America 2008-2010) Diagnostic Microbiology and Infectious Disease v 3 n
4 p 354 -360 2012
GUPTA N et al Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Epidemiology
and Prevention HEALTHCARE EPIDEMIOLOGY Clinical Infectious Diseases
201153(1)60ndash67 Published by Oxford University Press on behalf of the Infectious
Diseases Society of America 2011
HARBOTTLE H et al Genetics of antimicrobial resistance Anim Biotechnol
n17 p111-124 2006
HENRIQUE W N et al RESISTEcircNCIA BACTERIANA Uniatildeo das
Faculdades Alfredo NasserInstituto de Ciecircncias da Sauacutede Disponiacutevel em lt
httpwwwfaculdadealfredonasseredubrfilespesquisaposter20HENRIQUE20
Wilker20Natividade20SANTIAGO20Silvania20CAVALCANTI20DSP
20ResistC3AAncia20Bacterianapdfgt Acesso em 17 marccedilo 2014
HULSCHER M E J I et al Antibiotic prescribing in hospital a social and
behavioral scientific approach The Lancet Infectious Diaseases v 10 n 3 p 167-
165 2010
KIDWAI M SAPRA P BHUSHAN KR Synthetic strategies and medicinal
properties of beta-lactams Curr Med Chem 1999 695-215
KUMARASAMY K K et al Emergence of a new antibiotic resistance
mechanism in India Pakistan and the UK a molecular biological and
epidemiological stuy The Lancet Infectious Diseases v10 n 9 p 597- 602 2010
LINCOPAN N et al Enterobacteacuteria producing extended-spectrum β-
lacatamases and IMP-1 Metalo-β-lactamases isolated from Brazilian hospitals J Med
62
Microbiol 7 1-3 2006
LINCOPAN N et al First Isolation of Metalo-β-Lacatamase-Producing
Multiresistant Klebsiella pneumoniae from a patient in Brazil J Clin Microbiol 43(1)
516-519 2005
LIVERMORE D M et al What remains against carbapenem- resistant
Enterobacteriaceae Evaluation of choramphenicol ciprofloxacin colistina
fosfomycin minocycline nitrofurantoin temocilin and tigecycline International
Journal of Antimicrobial Agents v 37 n 5 p 415- 459 2011
LIVERMORE D M Fourten years in resistance International Journal of
Antimicrobial Agents v 39 283- 294 2012
LIVERMORE D M Bacterial resistance to carbapenems Adv Exp Med Biol
1995 39025-47
LIVERMORE D M Bacterial resistance origins epidemiology and impact
Clin Infect Dis 36S11-S23 2003
LIVERMORE D M et al Carbapenemases a problem in waiting Curr
Opin Microbiol 2000 3489-95
LU et al Universal pcr for common bacterial pathogens J CLIN
MICROBIOL VOL 38 2000
LU et al Use of PCR with Universal Primers and Restriction Endonuclease
Digestions for Detection and Identification of Common Bacterial Pathogens in
Cerebrospinal Fluid Journal of Clinical Microbiology June 2000 p 2076ndash2080
MARSCHALL J Met al Presence of the KPC Carbapenemase Gene in
Enterobacteriaceae Causing Bacteremia and Its Correlation with In Vitro
Carbapenem Susceptibility J Clin Microbiol 47 239-241 Jan 2009
63
MARTINS WMBS et al Prevalecircncia do gene blaKPC em isolados cliacutenicos
de Enterobacteriaceae e natildeo fermentadores encontrados em amostras clinicas em
um hospital universitaacuterio do Recife X Jornada de ensino pesquisa e extensatildeo ndash
JEPEX 2010 ndash UFRPE Recife 18 a 22 de outubro
MENDES C A C et al Polimixinas Revisatildeo com ecircnfase na sua
nefrotoxicidade Rev Assoc Med Bras 2009 55(6) 752-9
MOHR J F 3rd Update on the efficacy and tolerability of meropenem in the
treatment of serious bacteacuterial infections Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S41-51
2008
MONTEIRO J et al First report of KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae
strains in Brazil Antimicrob Agents Chemother Jan53(1)333-4 2009
MOREIRA V C et al Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia a antibioacuteticos
Disponiacutevel em
lthttpwwwcpglsucgbr6mostraartigosSAUDEVANESSA20CARVALHO20M
OREIRApdfgt Acesso em 21 marccedilo 2014
NETIKUL T et al Emergence of novel blaKPC-12 and blaKPC-13 variants in
carbapenem non-susceptible Enterobacter cloacae a first report of blaKPC gene in
Thailand European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases May
S372 2011
NETO V A et al Antibioacuteticos na praacutetica Meacutedica 6ordf Ediccedilatildeo Editorial
SarverSP Brasil 2007
NICOLAU D P Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of
meropenem Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S32-40 2008
64
OLIVEIRA A C et al Resistecircncia bacteriana e mortalidade em um centro de
terapia intensiva Rev Latino-Am Enfermagem nov-dez 2010
PAAUW A et al Failure to control an outbreak of qnrA 1-positive multidrug-
resistant Enterobacter clocae despite adequate implementation of recommended
infection control measures Journal of Clinical Microbiology v 45 n 5 p 1420-1425
2007
PATERSON D L et al Extended-Spectrum Beta-Lactamases a Clinical
Update Clinical Microbiology Reviews v 18 p 657-686 2005
PEIRANO G et al Carbapenem-hydrolysing beta-lactamase KPC-2 in
Klebsiella pneumonia isolated in Rio de Janeiro Brazil J Antimicrob Chemother Nov
20 2009
PERES-BOTA D et al Are infections due to resistant pathogens associated
with worse outcome in critically ill patients J Infect 200347(4)307-16
PIDDOCK L J V Clinically relevant chromosomally encoded multidrug
resistance effl ux pumps in bacterial Clin Microbiol Rev n19 p382-402 2006
PITOUT J D D et al Emergence of Enterobacteriaceae producing
extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) in the community J Antimicrob
Chemother May 56 2005
POSSEBON M I et al Resistecircncia bacteriana aos carbapenecircmicos
Bacterial resitence to carbapenems RBM rev bras med60(6)378380-378-382
jun 2003
QUEENAN A M et al Carbapenemases the versatile beta-lactamases
Clin Microbiol Rev Jul20(3)440-58 2007
65
RHOMBERG P R et al Summary trends for the meropenem yearly
susceptibility test information collection program a 10- year experience in the United
States (1999-2008) Diagnostic Microbiology and Infectiois Disease v 65 n4 p
414-426 2009
ROBLEDO I E et al Detection of KPC in Acinetobacter spp in Puerto Rico
J Antimicrob Agents Chemother 54 1354-1357 Mar 2010
ROGERS B A et al Country-to-country transfer os patients and the risk of
multi-resistant bacterial infection Clinical Infectious Disease v53 n1 p49- 56
2011
SHAH A A et al Characteristics epidemiology and clinicalimportance of
emerging strains of Gram-negative bacilli producing extended-spectrum
betalactamases Research in Microbiology v 155 p 409-421 2004
TURNER P J Extended- Spectrum Beta-Lactamases Clinical Infectious
Diseases v 41 p 273-275 2005
WOLTER D J et al Phenotypic and Enzymatic Comparative Analysis
between the Novel KPC variant KPC-5 and Its Evolutionary Variants KPC-2 and
KPC-4 Antimicrob Agents Chemother Nov 17 2008
WOODFORD N et al Carbapenemases of Chryseobacterium
(Flavobacterium) meningosepticum distribution of blaB and characterization of a
novel Metalo-beta-lactamase gene blaB3 in the type strain NCTC 10016
Antimicrob Agents Chemother Jun44(6)1448-52 2000
WOODFORF N Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in
India Pakistan and the UK a molecular biological and epidemiological study The
Lancet Infectious Diseases v 10 n 9 p 597-602 2010
66
WOODFORD et al Outbreak of Klebsiella pneumoniae Producing a New
Carbapenem- Hydrolyzing Class A β-Lactamase KPC-3 in a New York Medical
Center Antimicrobial agents and chemotherapy Dec 2004 p 4793ndash4799 Vol 48
No 12
YAGI T et al A preliminary survey of extended-spectrum β-lactamases
(ESBLs) in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Japan
FEMS Microbiology Letters 184 (2000) 53-56
YIGIT H et al Novel carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase KPC-1 from
a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumonia J Antimicrob Agents
Chemother 45 (4) 1151-1161 (2001)
ZAVASCKI A P et al KPC-2- producing Enterobacter cloacae in two cities
from Southern Brazil Int J Antimicrob Agents Apr 28 2009
ZHANEL G G et al Comparative review of the carbapenecircmicos Drugs
67(7)1027-52 2007
67
ANEXOS
Sequumlecircncia do oligo blaKPC
Query 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
Query 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
Query 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
68
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
Query 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
Query 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
69
Query 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
Query 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
Query 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
70
Sbjct 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
Query 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
Query 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
Query 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
71
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
Query 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
Query 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
72
Query 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
Query 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
Query 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
73
Sbjct 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
Query 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
Query 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
Query 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
74
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
Query 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
Query 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
75
Query 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
Query 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
||||
Sbjct 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
LOCUS AF297554 1377 bp
DNA linear BCT 26-MAR-2001
DEFINITION Klebsiella pneumoniae carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
gene complete cds
ACCESSION AF297554
VERSION AF2975541 GI10121874
76
KEYWORDS
SOURCE Klebsiella pneumoniae
ORGANISM Klebsiella pneumoniae
Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Enterobacteriaceae Klebsiella
REFERENCE 1 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH QueenanAM
AndersonGJ Domenech-SanchezA
BiddleJW StewardCD
AlbertiS BushK and TenoverFC
TITLE Novel carbapenem-hydrolyzing beta-
lactamase KPC-1 from a
carbapenem-resistant strain of
Klebsiella pneumoniae
JOURNAL Antimicrob Agents Chemother 45 (4)
1151-1161 (2001)
PUBMED 11257029
REFERENCE 2 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH AndersonGJ and
TenoverFC
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (19-AUG-2000) Nosocomial
Pathogens Laboratory Branch
Centers for Disease Control and
Prevention 1600 Clifton Rd MS
G08 Atlanta GA 30333 USA
FEATURES LocationQualifiers
77
source 11377
organism=Klebsiella
pneumoniae
mol_type=genomic DNA
db_xref=taxon573
-35_signal 5560
-10_signal 7883
mRNA 921012
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
RBS 117122
CDS 1311012
note=blaKPC-1
codon_start=1
transl_table=11
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
protein_id=AAG134101
db_xref=GI10121875
translation=MSLYRRLVLLSCLSWPLAGFSATALTNLVAEPFAKLEQD
FGGSI
GVYAMDTGSGATVSYRAEERFPLCSSFKGFLAAAVLARSQQQAGLLDTPIRYG
KNALV
PWSPISEKYLTTGMTVAELSAAAVQYSDNAAANLLLKELGGPAGLTAFMRSIG
DTTFR
78
LDRWELELNSAIPSDARDTSSPRAVTESLQKLTLGSALAAPQRQQFVDWLKGN
TTGNH
RIRAAVPADWAVGDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTRAPNKDDK
HSEAV
IAAAARLALEGLGVNGQ
ORIGIN
1 cggggcagtt acagccgtta cagcctctgg
agagggagcg gcttgccgct cggtgataat
61 cccagctgta gcggcctgat tacatccggc
cgctacacct agctccacct tcaaacaagg
121 aatatcgttg atgtcactgt atcgccgtct
agttctgctg tcttgtctct catggccgct
181 ggctggcttt tctgccaccg cgctgaccaa
cctcgtcgcg gaaccattcg ctaaactcga
241 acaggacttt ggcggctcca tcggtgtgta
cgcgatggat accggctcag gcgcaactgt
301 aagttaccgc gctgaggagc gcttcccact
gtgcagctca ttcaagggct ttcttgctgc
361 cgctgtgctg gctcgcagcc agcagcaggc
cggcttgctg gacacaccca tccgttacgg
421 caaaaatgcg ctggttccgt ggtcacccat
ctcggaaaaa tatctgacaa caggcatgac
481 ggtggcggag ctgtccgcgg ccgccgtgca
atacagtgat aacgccgccg ccaatttgtt
541 gctgaaggag ttgggcggcc cggccgggct
gacggccttc atgcgctcta tcggcgatac
79
601 cacgttccgt ctggaccgct gggagctgga
gctgaactcc gccatcccaa gcgatgcgcg
661 cgatacctca tcgccgcgcg ccgtgacgga
aagcttacaa aaactgacac tgggctctgc
721 actggctgcg ccgcagcggc agcagtttgt
tgattggcta aagggaaaca cgaccggcaa
781 ccaccgcatc cgcgcggcgg tgccggcaga
ctgggcagtc ggagacaaaa ccggaacctg
841 cggagtgtat ggcacggcaa atgactatgc
cgtcgtctgg cccactgggc gcgcacctat
901 tgtgttggcc gtctacaccc gggcgcctaa
caaggatgac aagcacagcg aggccgtcat
961 cgccgctgcg gctagactcg cgctcgaggg
attgggcgtc aacgggcagt aaggctctga
1021 aaatcatcta ttggcccacc accgccgccc
ttgcgggcgg catggattac caaccactgt
1081 cacatttagg ctaggagtct gcgcggcaga
gccgtgtgac cggttttctg tagagcactg
1141 acgatggcgg cggcgctctc tgcaattggc
aaggcgtcgg cgccaaggat accaatcttg
1201 cggcgcgcgg cgtgttatga cgactggggt
gcatttgagc cgccccattt aaccttcgcc
1261 ctcacagata cgccattcgc ctcaaattta
gcgccatgca gacgagcttc cactcggctt
1321 gcaccttgtc caggcccctc atgctgaact
gacgcaatcc catcaccgcc ttgatca
80
61
GALES A C et al Antimicrobial resistance among Gram-negative bacilli
isolated from Latin America results from Sentry Antimicrobial Surveillance Program
(Latin America 2008-2010) Diagnostic Microbiology and Infectious Disease v 3 n
4 p 354 -360 2012
GUPTA N et al Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae Epidemiology
and Prevention HEALTHCARE EPIDEMIOLOGY Clinical Infectious Diseases
201153(1)60ndash67 Published by Oxford University Press on behalf of the Infectious
Diseases Society of America 2011
HARBOTTLE H et al Genetics of antimicrobial resistance Anim Biotechnol
n17 p111-124 2006
HENRIQUE W N et al RESISTEcircNCIA BACTERIANA Uniatildeo das
Faculdades Alfredo NasserInstituto de Ciecircncias da Sauacutede Disponiacutevel em lt
httpwwwfaculdadealfredonasseredubrfilespesquisaposter20HENRIQUE20
Wilker20Natividade20SANTIAGO20Silvania20CAVALCANTI20DSP
20ResistC3AAncia20Bacterianapdfgt Acesso em 17 marccedilo 2014
HULSCHER M E J I et al Antibiotic prescribing in hospital a social and
behavioral scientific approach The Lancet Infectious Diaseases v 10 n 3 p 167-
165 2010
KIDWAI M SAPRA P BHUSHAN KR Synthetic strategies and medicinal
properties of beta-lactams Curr Med Chem 1999 695-215
KUMARASAMY K K et al Emergence of a new antibiotic resistance
mechanism in India Pakistan and the UK a molecular biological and
epidemiological stuy The Lancet Infectious Diseases v10 n 9 p 597- 602 2010
LINCOPAN N et al Enterobacteacuteria producing extended-spectrum β-
lacatamases and IMP-1 Metalo-β-lactamases isolated from Brazilian hospitals J Med
62
Microbiol 7 1-3 2006
LINCOPAN N et al First Isolation of Metalo-β-Lacatamase-Producing
Multiresistant Klebsiella pneumoniae from a patient in Brazil J Clin Microbiol 43(1)
516-519 2005
LIVERMORE D M et al What remains against carbapenem- resistant
Enterobacteriaceae Evaluation of choramphenicol ciprofloxacin colistina
fosfomycin minocycline nitrofurantoin temocilin and tigecycline International
Journal of Antimicrobial Agents v 37 n 5 p 415- 459 2011
LIVERMORE D M Fourten years in resistance International Journal of
Antimicrobial Agents v 39 283- 294 2012
LIVERMORE D M Bacterial resistance to carbapenems Adv Exp Med Biol
1995 39025-47
LIVERMORE D M Bacterial resistance origins epidemiology and impact
Clin Infect Dis 36S11-S23 2003
LIVERMORE D M et al Carbapenemases a problem in waiting Curr
Opin Microbiol 2000 3489-95
LU et al Universal pcr for common bacterial pathogens J CLIN
MICROBIOL VOL 38 2000
LU et al Use of PCR with Universal Primers and Restriction Endonuclease
Digestions for Detection and Identification of Common Bacterial Pathogens in
Cerebrospinal Fluid Journal of Clinical Microbiology June 2000 p 2076ndash2080
MARSCHALL J Met al Presence of the KPC Carbapenemase Gene in
Enterobacteriaceae Causing Bacteremia and Its Correlation with In Vitro
Carbapenem Susceptibility J Clin Microbiol 47 239-241 Jan 2009
63
MARTINS WMBS et al Prevalecircncia do gene blaKPC em isolados cliacutenicos
de Enterobacteriaceae e natildeo fermentadores encontrados em amostras clinicas em
um hospital universitaacuterio do Recife X Jornada de ensino pesquisa e extensatildeo ndash
JEPEX 2010 ndash UFRPE Recife 18 a 22 de outubro
MENDES C A C et al Polimixinas Revisatildeo com ecircnfase na sua
nefrotoxicidade Rev Assoc Med Bras 2009 55(6) 752-9
MOHR J F 3rd Update on the efficacy and tolerability of meropenem in the
treatment of serious bacteacuterial infections Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S41-51
2008
MONTEIRO J et al First report of KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae
strains in Brazil Antimicrob Agents Chemother Jan53(1)333-4 2009
MOREIRA V C et al Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia a antibioacuteticos
Disponiacutevel em
lthttpwwwcpglsucgbr6mostraartigosSAUDEVANESSA20CARVALHO20M
OREIRApdfgt Acesso em 21 marccedilo 2014
NETIKUL T et al Emergence of novel blaKPC-12 and blaKPC-13 variants in
carbapenem non-susceptible Enterobacter cloacae a first report of blaKPC gene in
Thailand European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases May
S372 2011
NETO V A et al Antibioacuteticos na praacutetica Meacutedica 6ordf Ediccedilatildeo Editorial
SarverSP Brasil 2007
NICOLAU D P Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of
meropenem Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S32-40 2008
64
OLIVEIRA A C et al Resistecircncia bacteriana e mortalidade em um centro de
terapia intensiva Rev Latino-Am Enfermagem nov-dez 2010
PAAUW A et al Failure to control an outbreak of qnrA 1-positive multidrug-
resistant Enterobacter clocae despite adequate implementation of recommended
infection control measures Journal of Clinical Microbiology v 45 n 5 p 1420-1425
2007
PATERSON D L et al Extended-Spectrum Beta-Lactamases a Clinical
Update Clinical Microbiology Reviews v 18 p 657-686 2005
PEIRANO G et al Carbapenem-hydrolysing beta-lactamase KPC-2 in
Klebsiella pneumonia isolated in Rio de Janeiro Brazil J Antimicrob Chemother Nov
20 2009
PERES-BOTA D et al Are infections due to resistant pathogens associated
with worse outcome in critically ill patients J Infect 200347(4)307-16
PIDDOCK L J V Clinically relevant chromosomally encoded multidrug
resistance effl ux pumps in bacterial Clin Microbiol Rev n19 p382-402 2006
PITOUT J D D et al Emergence of Enterobacteriaceae producing
extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) in the community J Antimicrob
Chemother May 56 2005
POSSEBON M I et al Resistecircncia bacteriana aos carbapenecircmicos
Bacterial resitence to carbapenems RBM rev bras med60(6)378380-378-382
jun 2003
QUEENAN A M et al Carbapenemases the versatile beta-lactamases
Clin Microbiol Rev Jul20(3)440-58 2007
65
RHOMBERG P R et al Summary trends for the meropenem yearly
susceptibility test information collection program a 10- year experience in the United
States (1999-2008) Diagnostic Microbiology and Infectiois Disease v 65 n4 p
414-426 2009
ROBLEDO I E et al Detection of KPC in Acinetobacter spp in Puerto Rico
J Antimicrob Agents Chemother 54 1354-1357 Mar 2010
ROGERS B A et al Country-to-country transfer os patients and the risk of
multi-resistant bacterial infection Clinical Infectious Disease v53 n1 p49- 56
2011
SHAH A A et al Characteristics epidemiology and clinicalimportance of
emerging strains of Gram-negative bacilli producing extended-spectrum
betalactamases Research in Microbiology v 155 p 409-421 2004
TURNER P J Extended- Spectrum Beta-Lactamases Clinical Infectious
Diseases v 41 p 273-275 2005
WOLTER D J et al Phenotypic and Enzymatic Comparative Analysis
between the Novel KPC variant KPC-5 and Its Evolutionary Variants KPC-2 and
KPC-4 Antimicrob Agents Chemother Nov 17 2008
WOODFORD N et al Carbapenemases of Chryseobacterium
(Flavobacterium) meningosepticum distribution of blaB and characterization of a
novel Metalo-beta-lactamase gene blaB3 in the type strain NCTC 10016
Antimicrob Agents Chemother Jun44(6)1448-52 2000
WOODFORF N Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in
India Pakistan and the UK a molecular biological and epidemiological study The
Lancet Infectious Diseases v 10 n 9 p 597-602 2010
66
WOODFORD et al Outbreak of Klebsiella pneumoniae Producing a New
Carbapenem- Hydrolyzing Class A β-Lactamase KPC-3 in a New York Medical
Center Antimicrobial agents and chemotherapy Dec 2004 p 4793ndash4799 Vol 48
No 12
YAGI T et al A preliminary survey of extended-spectrum β-lactamases
(ESBLs) in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Japan
FEMS Microbiology Letters 184 (2000) 53-56
YIGIT H et al Novel carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase KPC-1 from
a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumonia J Antimicrob Agents
Chemother 45 (4) 1151-1161 (2001)
ZAVASCKI A P et al KPC-2- producing Enterobacter cloacae in two cities
from Southern Brazil Int J Antimicrob Agents Apr 28 2009
ZHANEL G G et al Comparative review of the carbapenecircmicos Drugs
67(7)1027-52 2007
67
ANEXOS
Sequumlecircncia do oligo blaKPC
Query 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
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Sbjct 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
Query 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
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Sbjct 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
Query 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
68
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Sbjct 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
Query 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
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Sbjct 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
Query 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
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Sbjct 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
69
Query 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
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|||||||
Sbjct 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
Query 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Sbjct 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
Query 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
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|||||||
70
Sbjct 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
Query 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
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|||||||
Sbjct 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
Query 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
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Sbjct 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
Query 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
71
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Sbjct 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
Query 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
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|||||||
Sbjct 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
Query 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
72
Query 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
Query 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
Query 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
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|||||||
73
Sbjct 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
Query 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
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Sbjct 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
Query 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
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Sbjct 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
Query 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
74
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Sbjct 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
Query 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
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|||||||
Sbjct 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
Query 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
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Sbjct 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
75
Query 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
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Sbjct 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
Query 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
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Sbjct 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
LOCUS AF297554 1377 bp
DNA linear BCT 26-MAR-2001
DEFINITION Klebsiella pneumoniae carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
gene complete cds
ACCESSION AF297554
VERSION AF2975541 GI10121874
76
KEYWORDS
SOURCE Klebsiella pneumoniae
ORGANISM Klebsiella pneumoniae
Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Enterobacteriaceae Klebsiella
REFERENCE 1 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH QueenanAM
AndersonGJ Domenech-SanchezA
BiddleJW StewardCD
AlbertiS BushK and TenoverFC
TITLE Novel carbapenem-hydrolyzing beta-
lactamase KPC-1 from a
carbapenem-resistant strain of
Klebsiella pneumoniae
JOURNAL Antimicrob Agents Chemother 45 (4)
1151-1161 (2001)
PUBMED 11257029
REFERENCE 2 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH AndersonGJ and
TenoverFC
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (19-AUG-2000) Nosocomial
Pathogens Laboratory Branch
Centers for Disease Control and
Prevention 1600 Clifton Rd MS
G08 Atlanta GA 30333 USA
FEATURES LocationQualifiers
77
source 11377
organism=Klebsiella
pneumoniae
mol_type=genomic DNA
db_xref=taxon573
-35_signal 5560
-10_signal 7883
mRNA 921012
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
RBS 117122
CDS 1311012
note=blaKPC-1
codon_start=1
transl_table=11
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
protein_id=AAG134101
db_xref=GI10121875
translation=MSLYRRLVLLSCLSWPLAGFSATALTNLVAEPFAKLEQD
FGGSI
GVYAMDTGSGATVSYRAEERFPLCSSFKGFLAAAVLARSQQQAGLLDTPIRYG
KNALV
PWSPISEKYLTTGMTVAELSAAAVQYSDNAAANLLLKELGGPAGLTAFMRSIG
DTTFR
78
LDRWELELNSAIPSDARDTSSPRAVTESLQKLTLGSALAAPQRQQFVDWLKGN
TTGNH
RIRAAVPADWAVGDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTRAPNKDDK
HSEAV
IAAAARLALEGLGVNGQ
ORIGIN
1 cggggcagtt acagccgtta cagcctctgg
agagggagcg gcttgccgct cggtgataat
61 cccagctgta gcggcctgat tacatccggc
cgctacacct agctccacct tcaaacaagg
121 aatatcgttg atgtcactgt atcgccgtct
agttctgctg tcttgtctct catggccgct
181 ggctggcttt tctgccaccg cgctgaccaa
cctcgtcgcg gaaccattcg ctaaactcga
241 acaggacttt ggcggctcca tcggtgtgta
cgcgatggat accggctcag gcgcaactgt
301 aagttaccgc gctgaggagc gcttcccact
gtgcagctca ttcaagggct ttcttgctgc
361 cgctgtgctg gctcgcagcc agcagcaggc
cggcttgctg gacacaccca tccgttacgg
421 caaaaatgcg ctggttccgt ggtcacccat
ctcggaaaaa tatctgacaa caggcatgac
481 ggtggcggag ctgtccgcgg ccgccgtgca
atacagtgat aacgccgccg ccaatttgtt
541 gctgaaggag ttgggcggcc cggccgggct
gacggccttc atgcgctcta tcggcgatac
79
601 cacgttccgt ctggaccgct gggagctgga
gctgaactcc gccatcccaa gcgatgcgcg
661 cgatacctca tcgccgcgcg ccgtgacgga
aagcttacaa aaactgacac tgggctctgc
721 actggctgcg ccgcagcggc agcagtttgt
tgattggcta aagggaaaca cgaccggcaa
781 ccaccgcatc cgcgcggcgg tgccggcaga
ctgggcagtc ggagacaaaa ccggaacctg
841 cggagtgtat ggcacggcaa atgactatgc
cgtcgtctgg cccactgggc gcgcacctat
901 tgtgttggcc gtctacaccc gggcgcctaa
caaggatgac aagcacagcg aggccgtcat
961 cgccgctgcg gctagactcg cgctcgaggg
attgggcgtc aacgggcagt aaggctctga
1021 aaatcatcta ttggcccacc accgccgccc
ttgcgggcgg catggattac caaccactgt
1081 cacatttagg ctaggagtct gcgcggcaga
gccgtgtgac cggttttctg tagagcactg
1141 acgatggcgg cggcgctctc tgcaattggc
aaggcgtcgg cgccaaggat accaatcttg
1201 cggcgcgcgg cgtgttatga cgactggggt
gcatttgagc cgccccattt aaccttcgcc
1261 ctcacagata cgccattcgc ctcaaattta
gcgccatgca gacgagcttc cactcggctt
1321 gcaccttgtc caggcccctc atgctgaact
gacgcaatcc catcaccgcc ttgatca
80
62
Microbiol 7 1-3 2006
LINCOPAN N et al First Isolation of Metalo-β-Lacatamase-Producing
Multiresistant Klebsiella pneumoniae from a patient in Brazil J Clin Microbiol 43(1)
516-519 2005
LIVERMORE D M et al What remains against carbapenem- resistant
Enterobacteriaceae Evaluation of choramphenicol ciprofloxacin colistina
fosfomycin minocycline nitrofurantoin temocilin and tigecycline International
Journal of Antimicrobial Agents v 37 n 5 p 415- 459 2011
LIVERMORE D M Fourten years in resistance International Journal of
Antimicrobial Agents v 39 283- 294 2012
LIVERMORE D M Bacterial resistance to carbapenems Adv Exp Med Biol
1995 39025-47
LIVERMORE D M Bacterial resistance origins epidemiology and impact
Clin Infect Dis 36S11-S23 2003
LIVERMORE D M et al Carbapenemases a problem in waiting Curr
Opin Microbiol 2000 3489-95
LU et al Universal pcr for common bacterial pathogens J CLIN
MICROBIOL VOL 38 2000
LU et al Use of PCR with Universal Primers and Restriction Endonuclease
Digestions for Detection and Identification of Common Bacterial Pathogens in
Cerebrospinal Fluid Journal of Clinical Microbiology June 2000 p 2076ndash2080
MARSCHALL J Met al Presence of the KPC Carbapenemase Gene in
Enterobacteriaceae Causing Bacteremia and Its Correlation with In Vitro
Carbapenem Susceptibility J Clin Microbiol 47 239-241 Jan 2009
63
MARTINS WMBS et al Prevalecircncia do gene blaKPC em isolados cliacutenicos
de Enterobacteriaceae e natildeo fermentadores encontrados em amostras clinicas em
um hospital universitaacuterio do Recife X Jornada de ensino pesquisa e extensatildeo ndash
JEPEX 2010 ndash UFRPE Recife 18 a 22 de outubro
MENDES C A C et al Polimixinas Revisatildeo com ecircnfase na sua
nefrotoxicidade Rev Assoc Med Bras 2009 55(6) 752-9
MOHR J F 3rd Update on the efficacy and tolerability of meropenem in the
treatment of serious bacteacuterial infections Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S41-51
2008
MONTEIRO J et al First report of KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae
strains in Brazil Antimicrob Agents Chemother Jan53(1)333-4 2009
MOREIRA V C et al Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia a antibioacuteticos
Disponiacutevel em
lthttpwwwcpglsucgbr6mostraartigosSAUDEVANESSA20CARVALHO20M
OREIRApdfgt Acesso em 21 marccedilo 2014
NETIKUL T et al Emergence of novel blaKPC-12 and blaKPC-13 variants in
carbapenem non-susceptible Enterobacter cloacae a first report of blaKPC gene in
Thailand European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases May
S372 2011
NETO V A et al Antibioacuteticos na praacutetica Meacutedica 6ordf Ediccedilatildeo Editorial
SarverSP Brasil 2007
NICOLAU D P Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of
meropenem Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S32-40 2008
64
OLIVEIRA A C et al Resistecircncia bacteriana e mortalidade em um centro de
terapia intensiva Rev Latino-Am Enfermagem nov-dez 2010
PAAUW A et al Failure to control an outbreak of qnrA 1-positive multidrug-
resistant Enterobacter clocae despite adequate implementation of recommended
infection control measures Journal of Clinical Microbiology v 45 n 5 p 1420-1425
2007
PATERSON D L et al Extended-Spectrum Beta-Lactamases a Clinical
Update Clinical Microbiology Reviews v 18 p 657-686 2005
PEIRANO G et al Carbapenem-hydrolysing beta-lactamase KPC-2 in
Klebsiella pneumonia isolated in Rio de Janeiro Brazil J Antimicrob Chemother Nov
20 2009
PERES-BOTA D et al Are infections due to resistant pathogens associated
with worse outcome in critically ill patients J Infect 200347(4)307-16
PIDDOCK L J V Clinically relevant chromosomally encoded multidrug
resistance effl ux pumps in bacterial Clin Microbiol Rev n19 p382-402 2006
PITOUT J D D et al Emergence of Enterobacteriaceae producing
extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) in the community J Antimicrob
Chemother May 56 2005
POSSEBON M I et al Resistecircncia bacteriana aos carbapenecircmicos
Bacterial resitence to carbapenems RBM rev bras med60(6)378380-378-382
jun 2003
QUEENAN A M et al Carbapenemases the versatile beta-lactamases
Clin Microbiol Rev Jul20(3)440-58 2007
65
RHOMBERG P R et al Summary trends for the meropenem yearly
susceptibility test information collection program a 10- year experience in the United
States (1999-2008) Diagnostic Microbiology and Infectiois Disease v 65 n4 p
414-426 2009
ROBLEDO I E et al Detection of KPC in Acinetobacter spp in Puerto Rico
J Antimicrob Agents Chemother 54 1354-1357 Mar 2010
ROGERS B A et al Country-to-country transfer os patients and the risk of
multi-resistant bacterial infection Clinical Infectious Disease v53 n1 p49- 56
2011
SHAH A A et al Characteristics epidemiology and clinicalimportance of
emerging strains of Gram-negative bacilli producing extended-spectrum
betalactamases Research in Microbiology v 155 p 409-421 2004
TURNER P J Extended- Spectrum Beta-Lactamases Clinical Infectious
Diseases v 41 p 273-275 2005
WOLTER D J et al Phenotypic and Enzymatic Comparative Analysis
between the Novel KPC variant KPC-5 and Its Evolutionary Variants KPC-2 and
KPC-4 Antimicrob Agents Chemother Nov 17 2008
WOODFORD N et al Carbapenemases of Chryseobacterium
(Flavobacterium) meningosepticum distribution of blaB and characterization of a
novel Metalo-beta-lactamase gene blaB3 in the type strain NCTC 10016
Antimicrob Agents Chemother Jun44(6)1448-52 2000
WOODFORF N Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in
India Pakistan and the UK a molecular biological and epidemiological study The
Lancet Infectious Diseases v 10 n 9 p 597-602 2010
66
WOODFORD et al Outbreak of Klebsiella pneumoniae Producing a New
Carbapenem- Hydrolyzing Class A β-Lactamase KPC-3 in a New York Medical
Center Antimicrobial agents and chemotherapy Dec 2004 p 4793ndash4799 Vol 48
No 12
YAGI T et al A preliminary survey of extended-spectrum β-lactamases
(ESBLs) in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Japan
FEMS Microbiology Letters 184 (2000) 53-56
YIGIT H et al Novel carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase KPC-1 from
a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumonia J Antimicrob Agents
Chemother 45 (4) 1151-1161 (2001)
ZAVASCKI A P et al KPC-2- producing Enterobacter cloacae in two cities
from Southern Brazil Int J Antimicrob Agents Apr 28 2009
ZHANEL G G et al Comparative review of the carbapenecircmicos Drugs
67(7)1027-52 2007
67
ANEXOS
Sequumlecircncia do oligo blaKPC
Query 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
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Sbjct 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
Query 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
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Sbjct 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
Query 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
68
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Sbjct 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
Query 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
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Sbjct 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
Query 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
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Sbjct 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
69
Query 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
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Sbjct 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
Query 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
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Sbjct 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
Query 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
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Sbjct 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
Query 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
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Sbjct 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
Query 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
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Sbjct 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
Query 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
71
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Sbjct 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
Query 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
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Sbjct 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
Query 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
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Sbjct 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
72
Query 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
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Sbjct 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
Query 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
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Sbjct 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
Query 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
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73
Sbjct 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
Query 961
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Sbjct 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
Query 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
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Sbjct 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
Query 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
74
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Sbjct 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
Query 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
Query 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
75
Query 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
Query 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
||||
Sbjct 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
LOCUS AF297554 1377 bp
DNA linear BCT 26-MAR-2001
DEFINITION Klebsiella pneumoniae carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
gene complete cds
ACCESSION AF297554
VERSION AF2975541 GI10121874
76
KEYWORDS
SOURCE Klebsiella pneumoniae
ORGANISM Klebsiella pneumoniae
Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Enterobacteriaceae Klebsiella
REFERENCE 1 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH QueenanAM
AndersonGJ Domenech-SanchezA
BiddleJW StewardCD
AlbertiS BushK and TenoverFC
TITLE Novel carbapenem-hydrolyzing beta-
lactamase KPC-1 from a
carbapenem-resistant strain of
Klebsiella pneumoniae
JOURNAL Antimicrob Agents Chemother 45 (4)
1151-1161 (2001)
PUBMED 11257029
REFERENCE 2 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH AndersonGJ and
TenoverFC
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (19-AUG-2000) Nosocomial
Pathogens Laboratory Branch
Centers for Disease Control and
Prevention 1600 Clifton Rd MS
G08 Atlanta GA 30333 USA
FEATURES LocationQualifiers
77
source 11377
organism=Klebsiella
pneumoniae
mol_type=genomic DNA
db_xref=taxon573
-35_signal 5560
-10_signal 7883
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hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
RBS 117122
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product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
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db_xref=GI10121875
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KNALV
PWSPISEKYLTTGMTVAELSAAAVQYSDNAAANLLLKELGGPAGLTAFMRSIG
DTTFR
78
LDRWELELNSAIPSDARDTSSPRAVTESLQKLTLGSALAAPQRQQFVDWLKGN
TTGNH
RIRAAVPADWAVGDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTRAPNKDDK
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IAAAARLALEGLGVNGQ
ORIGIN
1 cggggcagtt acagccgtta cagcctctgg
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atacagtgat aacgccgccg ccaatttgtt
541 gctgaaggag ttgggcggcc cggccgggct
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79
601 cacgttccgt ctggaccgct gggagctgga
gctgaactcc gccatcccaa gcgatgcgcg
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attgggcgtc aacgggcagt aaggctctga
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ttgcgggcgg catggattac caaccactgt
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gccgtgtgac cggttttctg tagagcactg
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aaggcgtcgg cgccaaggat accaatcttg
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gcatttgagc cgccccattt aaccttcgcc
1261 ctcacagata cgccattcgc ctcaaattta
gcgccatgca gacgagcttc cactcggctt
1321 gcaccttgtc caggcccctc atgctgaact
gacgcaatcc catcaccgcc ttgatca
80
63
MARTINS WMBS et al Prevalecircncia do gene blaKPC em isolados cliacutenicos
de Enterobacteriaceae e natildeo fermentadores encontrados em amostras clinicas em
um hospital universitaacuterio do Recife X Jornada de ensino pesquisa e extensatildeo ndash
JEPEX 2010 ndash UFRPE Recife 18 a 22 de outubro
MENDES C A C et al Polimixinas Revisatildeo com ecircnfase na sua
nefrotoxicidade Rev Assoc Med Bras 2009 55(6) 752-9
MOHR J F 3rd Update on the efficacy and tolerability of meropenem in the
treatment of serious bacteacuterial infections Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S41-51
2008
MONTEIRO J et al First report of KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae
strains in Brazil Antimicrob Agents Chemother Jan53(1)333-4 2009
MOREIRA V C et al Klebsiella pneumoniae e sua resistecircncia a antibioacuteticos
Disponiacutevel em
lthttpwwwcpglsucgbr6mostraartigosSAUDEVANESSA20CARVALHO20M
OREIRApdfgt Acesso em 21 marccedilo 2014
NETIKUL T et al Emergence of novel blaKPC-12 and blaKPC-13 variants in
carbapenem non-susceptible Enterobacter cloacae a first report of blaKPC gene in
Thailand European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases May
S372 2011
NETO V A et al Antibioacuteticos na praacutetica Meacutedica 6ordf Ediccedilatildeo Editorial
SarverSP Brasil 2007
NICOLAU D P Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of
meropenem Clin Infect Dis Sep 1547 Suppl 1S32-40 2008
64
OLIVEIRA A C et al Resistecircncia bacteriana e mortalidade em um centro de
terapia intensiva Rev Latino-Am Enfermagem nov-dez 2010
PAAUW A et al Failure to control an outbreak of qnrA 1-positive multidrug-
resistant Enterobacter clocae despite adequate implementation of recommended
infection control measures Journal of Clinical Microbiology v 45 n 5 p 1420-1425
2007
PATERSON D L et al Extended-Spectrum Beta-Lactamases a Clinical
Update Clinical Microbiology Reviews v 18 p 657-686 2005
PEIRANO G et al Carbapenem-hydrolysing beta-lactamase KPC-2 in
Klebsiella pneumonia isolated in Rio de Janeiro Brazil J Antimicrob Chemother Nov
20 2009
PERES-BOTA D et al Are infections due to resistant pathogens associated
with worse outcome in critically ill patients J Infect 200347(4)307-16
PIDDOCK L J V Clinically relevant chromosomally encoded multidrug
resistance effl ux pumps in bacterial Clin Microbiol Rev n19 p382-402 2006
PITOUT J D D et al Emergence of Enterobacteriaceae producing
extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) in the community J Antimicrob
Chemother May 56 2005
POSSEBON M I et al Resistecircncia bacteriana aos carbapenecircmicos
Bacterial resitence to carbapenems RBM rev bras med60(6)378380-378-382
jun 2003
QUEENAN A M et al Carbapenemases the versatile beta-lactamases
Clin Microbiol Rev Jul20(3)440-58 2007
65
RHOMBERG P R et al Summary trends for the meropenem yearly
susceptibility test information collection program a 10- year experience in the United
States (1999-2008) Diagnostic Microbiology and Infectiois Disease v 65 n4 p
414-426 2009
ROBLEDO I E et al Detection of KPC in Acinetobacter spp in Puerto Rico
J Antimicrob Agents Chemother 54 1354-1357 Mar 2010
ROGERS B A et al Country-to-country transfer os patients and the risk of
multi-resistant bacterial infection Clinical Infectious Disease v53 n1 p49- 56
2011
SHAH A A et al Characteristics epidemiology and clinicalimportance of
emerging strains of Gram-negative bacilli producing extended-spectrum
betalactamases Research in Microbiology v 155 p 409-421 2004
TURNER P J Extended- Spectrum Beta-Lactamases Clinical Infectious
Diseases v 41 p 273-275 2005
WOLTER D J et al Phenotypic and Enzymatic Comparative Analysis
between the Novel KPC variant KPC-5 and Its Evolutionary Variants KPC-2 and
KPC-4 Antimicrob Agents Chemother Nov 17 2008
WOODFORD N et al Carbapenemases of Chryseobacterium
(Flavobacterium) meningosepticum distribution of blaB and characterization of a
novel Metalo-beta-lactamase gene blaB3 in the type strain NCTC 10016
Antimicrob Agents Chemother Jun44(6)1448-52 2000
WOODFORF N Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in
India Pakistan and the UK a molecular biological and epidemiological study The
Lancet Infectious Diseases v 10 n 9 p 597-602 2010
66
WOODFORD et al Outbreak of Klebsiella pneumoniae Producing a New
Carbapenem- Hydrolyzing Class A β-Lactamase KPC-3 in a New York Medical
Center Antimicrobial agents and chemotherapy Dec 2004 p 4793ndash4799 Vol 48
No 12
YAGI T et al A preliminary survey of extended-spectrum β-lactamases
(ESBLs) in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Japan
FEMS Microbiology Letters 184 (2000) 53-56
YIGIT H et al Novel carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase KPC-1 from
a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumonia J Antimicrob Agents
Chemother 45 (4) 1151-1161 (2001)
ZAVASCKI A P et al KPC-2- producing Enterobacter cloacae in two cities
from Southern Brazil Int J Antimicrob Agents Apr 28 2009
ZHANEL G G et al Comparative review of the carbapenecircmicos Drugs
67(7)1027-52 2007
67
ANEXOS
Sequumlecircncia do oligo blaKPC
Query 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
Query 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
Query 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
68
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
Query 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
Query 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
69
Query 301
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|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
Query 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
Query 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
70
Sbjct 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
Query 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
Query 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
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|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 541
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GCGATAC 600
Query 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
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71
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
Query 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
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|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 661
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GCTCTGC 720
Query 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
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|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 721
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CCGGCAA 780
72
Query 781
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|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
Query 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
Query 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
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|||||||
73
Sbjct 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
Query 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
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|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
Query 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
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|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
Query 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
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74
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Sbjct 1081
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Query 1141
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AATCTTG 1200
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
Query 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
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|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Sbjct 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
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75
Query 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
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|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Sbjct 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
Query 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
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|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
||||
Sbjct 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
LOCUS AF297554 1377 bp
DNA linear BCT 26-MAR-2001
DEFINITION Klebsiella pneumoniae carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
gene complete cds
ACCESSION AF297554
VERSION AF2975541 GI10121874
76
KEYWORDS
SOURCE Klebsiella pneumoniae
ORGANISM Klebsiella pneumoniae
Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Enterobacteriaceae Klebsiella
REFERENCE 1 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH QueenanAM
AndersonGJ Domenech-SanchezA
BiddleJW StewardCD
AlbertiS BushK and TenoverFC
TITLE Novel carbapenem-hydrolyzing beta-
lactamase KPC-1 from a
carbapenem-resistant strain of
Klebsiella pneumoniae
JOURNAL Antimicrob Agents Chemother 45 (4)
1151-1161 (2001)
PUBMED 11257029
REFERENCE 2 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH AndersonGJ and
TenoverFC
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (19-AUG-2000) Nosocomial
Pathogens Laboratory Branch
Centers for Disease Control and
Prevention 1600 Clifton Rd MS
G08 Atlanta GA 30333 USA
FEATURES LocationQualifiers
77
source 11377
organism=Klebsiella
pneumoniae
mol_type=genomic DNA
db_xref=taxon573
-35_signal 5560
-10_signal 7883
mRNA 921012
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78
LDRWELELNSAIPSDARDTSSPRAVTESLQKLTLGSALAAPQRQQFVDWLKGN
TTGNH
RIRAAVPADWAVGDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTRAPNKDDK
HSEAV
IAAAARLALEGLGVNGQ
ORIGIN
1 cggggcagtt acagccgtta cagcctctgg
agagggagcg gcttgccgct cggtgataat
61 cccagctgta gcggcctgat tacatccggc
cgctacacct agctccacct tcaaacaagg
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gtgcagctca ttcaagggct ttcttgctgc
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cggcttgctg gacacaccca tccgttacgg
421 caaaaatgcg ctggttccgt ggtcacccat
ctcggaaaaa tatctgacaa caggcatgac
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atacagtgat aacgccgccg ccaatttgtt
541 gctgaaggag ttgggcggcc cggccgggct
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79
601 cacgttccgt ctggaccgct gggagctgga
gctgaactcc gccatcccaa gcgatgcgcg
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80
64
OLIVEIRA A C et al Resistecircncia bacteriana e mortalidade em um centro de
terapia intensiva Rev Latino-Am Enfermagem nov-dez 2010
PAAUW A et al Failure to control an outbreak of qnrA 1-positive multidrug-
resistant Enterobacter clocae despite adequate implementation of recommended
infection control measures Journal of Clinical Microbiology v 45 n 5 p 1420-1425
2007
PATERSON D L et al Extended-Spectrum Beta-Lactamases a Clinical
Update Clinical Microbiology Reviews v 18 p 657-686 2005
PEIRANO G et al Carbapenem-hydrolysing beta-lactamase KPC-2 in
Klebsiella pneumonia isolated in Rio de Janeiro Brazil J Antimicrob Chemother Nov
20 2009
PERES-BOTA D et al Are infections due to resistant pathogens associated
with worse outcome in critically ill patients J Infect 200347(4)307-16
PIDDOCK L J V Clinically relevant chromosomally encoded multidrug
resistance effl ux pumps in bacterial Clin Microbiol Rev n19 p382-402 2006
PITOUT J D D et al Emergence of Enterobacteriaceae producing
extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) in the community J Antimicrob
Chemother May 56 2005
POSSEBON M I et al Resistecircncia bacteriana aos carbapenecircmicos
Bacterial resitence to carbapenems RBM rev bras med60(6)378380-378-382
jun 2003
QUEENAN A M et al Carbapenemases the versatile beta-lactamases
Clin Microbiol Rev Jul20(3)440-58 2007
65
RHOMBERG P R et al Summary trends for the meropenem yearly
susceptibility test information collection program a 10- year experience in the United
States (1999-2008) Diagnostic Microbiology and Infectiois Disease v 65 n4 p
414-426 2009
ROBLEDO I E et al Detection of KPC in Acinetobacter spp in Puerto Rico
J Antimicrob Agents Chemother 54 1354-1357 Mar 2010
ROGERS B A et al Country-to-country transfer os patients and the risk of
multi-resistant bacterial infection Clinical Infectious Disease v53 n1 p49- 56
2011
SHAH A A et al Characteristics epidemiology and clinicalimportance of
emerging strains of Gram-negative bacilli producing extended-spectrum
betalactamases Research in Microbiology v 155 p 409-421 2004
TURNER P J Extended- Spectrum Beta-Lactamases Clinical Infectious
Diseases v 41 p 273-275 2005
WOLTER D J et al Phenotypic and Enzymatic Comparative Analysis
between the Novel KPC variant KPC-5 and Its Evolutionary Variants KPC-2 and
KPC-4 Antimicrob Agents Chemother Nov 17 2008
WOODFORD N et al Carbapenemases of Chryseobacterium
(Flavobacterium) meningosepticum distribution of blaB and characterization of a
novel Metalo-beta-lactamase gene blaB3 in the type strain NCTC 10016
Antimicrob Agents Chemother Jun44(6)1448-52 2000
WOODFORF N Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in
India Pakistan and the UK a molecular biological and epidemiological study The
Lancet Infectious Diseases v 10 n 9 p 597-602 2010
66
WOODFORD et al Outbreak of Klebsiella pneumoniae Producing a New
Carbapenem- Hydrolyzing Class A β-Lactamase KPC-3 in a New York Medical
Center Antimicrobial agents and chemotherapy Dec 2004 p 4793ndash4799 Vol 48
No 12
YAGI T et al A preliminary survey of extended-spectrum β-lactamases
(ESBLs) in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Japan
FEMS Microbiology Letters 184 (2000) 53-56
YIGIT H et al Novel carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase KPC-1 from
a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumonia J Antimicrob Agents
Chemother 45 (4) 1151-1161 (2001)
ZAVASCKI A P et al KPC-2- producing Enterobacter cloacae in two cities
from Southern Brazil Int J Antimicrob Agents Apr 28 2009
ZHANEL G G et al Comparative review of the carbapenecircmicos Drugs
67(7)1027-52 2007
67
ANEXOS
Sequumlecircncia do oligo blaKPC
Query 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
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|||||||
Sbjct 1
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TGATAAT 60
Query 61
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Sbjct 61
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Query 121
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68
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|||||||
Sbjct 121
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GGCCGCT 180
Query 181
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Sbjct 181
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Sbjct 241
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CAACTGT 300
69
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Sbjct 301
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Query 361
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Sbjct 361
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Query 421
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70
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Query 781
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Query 1081
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74
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Query 1201
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75
Query 1261
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TCGGCTT 1320
Query 1321
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||||
Sbjct 1321
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ATCA 1377
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DEFINITION Klebsiella pneumoniae carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
gene complete cds
ACCESSION AF297554
VERSION AF2975541 GI10121874
76
KEYWORDS
SOURCE Klebsiella pneumoniae
ORGANISM Klebsiella pneumoniae
Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Enterobacteriaceae Klebsiella
REFERENCE 1 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH QueenanAM
AndersonGJ Domenech-SanchezA
BiddleJW StewardCD
AlbertiS BushK and TenoverFC
TITLE Novel carbapenem-hydrolyzing beta-
lactamase KPC-1 from a
carbapenem-resistant strain of
Klebsiella pneumoniae
JOURNAL Antimicrob Agents Chemother 45 (4)
1151-1161 (2001)
PUBMED 11257029
REFERENCE 2 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH AndersonGJ and
TenoverFC
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (19-AUG-2000) Nosocomial
Pathogens Laboratory Branch
Centers for Disease Control and
Prevention 1600 Clifton Rd MS
G08 Atlanta GA 30333 USA
FEATURES LocationQualifiers
77
source 11377
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78
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TTGNH
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HSEAV
IAAAARLALEGLGVNGQ
ORIGIN
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79
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gacgcaatcc catcaccgcc ttgatca
80
65
RHOMBERG P R et al Summary trends for the meropenem yearly
susceptibility test information collection program a 10- year experience in the United
States (1999-2008) Diagnostic Microbiology and Infectiois Disease v 65 n4 p
414-426 2009
ROBLEDO I E et al Detection of KPC in Acinetobacter spp in Puerto Rico
J Antimicrob Agents Chemother 54 1354-1357 Mar 2010
ROGERS B A et al Country-to-country transfer os patients and the risk of
multi-resistant bacterial infection Clinical Infectious Disease v53 n1 p49- 56
2011
SHAH A A et al Characteristics epidemiology and clinicalimportance of
emerging strains of Gram-negative bacilli producing extended-spectrum
betalactamases Research in Microbiology v 155 p 409-421 2004
TURNER P J Extended- Spectrum Beta-Lactamases Clinical Infectious
Diseases v 41 p 273-275 2005
WOLTER D J et al Phenotypic and Enzymatic Comparative Analysis
between the Novel KPC variant KPC-5 and Its Evolutionary Variants KPC-2 and
KPC-4 Antimicrob Agents Chemother Nov 17 2008
WOODFORD N et al Carbapenemases of Chryseobacterium
(Flavobacterium) meningosepticum distribution of blaB and characterization of a
novel Metalo-beta-lactamase gene blaB3 in the type strain NCTC 10016
Antimicrob Agents Chemother Jun44(6)1448-52 2000
WOODFORF N Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in
India Pakistan and the UK a molecular biological and epidemiological study The
Lancet Infectious Diseases v 10 n 9 p 597-602 2010
66
WOODFORD et al Outbreak of Klebsiella pneumoniae Producing a New
Carbapenem- Hydrolyzing Class A β-Lactamase KPC-3 in a New York Medical
Center Antimicrobial agents and chemotherapy Dec 2004 p 4793ndash4799 Vol 48
No 12
YAGI T et al A preliminary survey of extended-spectrum β-lactamases
(ESBLs) in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Japan
FEMS Microbiology Letters 184 (2000) 53-56
YIGIT H et al Novel carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase KPC-1 from
a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumonia J Antimicrob Agents
Chemother 45 (4) 1151-1161 (2001)
ZAVASCKI A P et al KPC-2- producing Enterobacter cloacae in two cities
from Southern Brazil Int J Antimicrob Agents Apr 28 2009
ZHANEL G G et al Comparative review of the carbapenecircmicos Drugs
67(7)1027-52 2007
67
ANEXOS
Sequumlecircncia do oligo blaKPC
Query 1
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TGATAAT 60
Query 61
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AACAAGG 120
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Sbjct 61
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AACAAGG 120
Query 121
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GGCCGCT 180
68
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 121
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GGCCGCT 180
Query 181
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Sbjct 181
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AACTCGA 240
Query 241
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Sbjct 241
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CAACTGT 300
69
Query 301
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Sbjct 301
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Query 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
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Sbjct 361
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GTTACGG 420
Query 421
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GCATGAC 480
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70
Sbjct 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
Query 481
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|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Sbjct 481
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ATTTGTT 540
Query 541
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Sbjct 541
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Query 601
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71
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Sbjct 601
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Query 661
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Sbjct 661
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Query 721
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Sbjct 721
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Query 781
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Sbjct 781
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GAACCTG 840
Query 841
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Sbjct 841
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CACCTAT 900
Query 901
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73
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Query 961
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Sbjct 961
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Query 1021
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Sbjct 1021
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Query 1081
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74
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|||||||
Sbjct 1081
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Query 1141
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|||||||
Sbjct 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
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Query 1201
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Sbjct 1201
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75
Query 1261
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Sbjct 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
Query 1321
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Sbjct 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
LOCUS AF297554 1377 bp
DNA linear BCT 26-MAR-2001
DEFINITION Klebsiella pneumoniae carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
gene complete cds
ACCESSION AF297554
VERSION AF2975541 GI10121874
76
KEYWORDS
SOURCE Klebsiella pneumoniae
ORGANISM Klebsiella pneumoniae
Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Enterobacteriaceae Klebsiella
REFERENCE 1 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH QueenanAM
AndersonGJ Domenech-SanchezA
BiddleJW StewardCD
AlbertiS BushK and TenoverFC
TITLE Novel carbapenem-hydrolyzing beta-
lactamase KPC-1 from a
carbapenem-resistant strain of
Klebsiella pneumoniae
JOURNAL Antimicrob Agents Chemother 45 (4)
1151-1161 (2001)
PUBMED 11257029
REFERENCE 2 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH AndersonGJ and
TenoverFC
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (19-AUG-2000) Nosocomial
Pathogens Laboratory Branch
Centers for Disease Control and
Prevention 1600 Clifton Rd MS
G08 Atlanta GA 30333 USA
FEATURES LocationQualifiers
77
source 11377
organism=Klebsiella
pneumoniae
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-10_signal 7883
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hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
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product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
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FGGSI
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KNALV
PWSPISEKYLTTGMTVAELSAAAVQYSDNAAANLLLKELGGPAGLTAFMRSIG
DTTFR
78
LDRWELELNSAIPSDARDTSSPRAVTESLQKLTLGSALAAPQRQQFVDWLKGN
TTGNH
RIRAAVPADWAVGDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTRAPNKDDK
HSEAV
IAAAARLALEGLGVNGQ
ORIGIN
1 cggggcagtt acagccgtta cagcctctgg
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61 cccagctgta gcggcctgat tacatccggc
cgctacacct agctccacct tcaaacaagg
121 aatatcgttg atgtcactgt atcgccgtct
agttctgctg tcttgtctct catggccgct
181 ggctggcttt tctgccaccg cgctgaccaa
cctcgtcgcg gaaccattcg ctaaactcga
241 acaggacttt ggcggctcca tcggtgtgta
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gtgcagctca ttcaagggct ttcttgctgc
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cggcttgctg gacacaccca tccgttacgg
421 caaaaatgcg ctggttccgt ggtcacccat
ctcggaaaaa tatctgacaa caggcatgac
481 ggtggcggag ctgtccgcgg ccgccgtgca
atacagtgat aacgccgccg ccaatttgtt
541 gctgaaggag ttgggcggcc cggccgggct
gacggccttc atgcgctcta tcggcgatac
79
601 cacgttccgt ctggaccgct gggagctgga
gctgaactcc gccatcccaa gcgatgcgcg
661 cgatacctca tcgccgcgcg ccgtgacgga
aagcttacaa aaactgacac tgggctctgc
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tgattggcta aagggaaaca cgaccggcaa
781 ccaccgcatc cgcgcggcgg tgccggcaga
ctgggcagtc ggagacaaaa ccggaacctg
841 cggagtgtat ggcacggcaa atgactatgc
cgtcgtctgg cccactgggc gcgcacctat
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961 cgccgctgcg gctagactcg cgctcgaggg
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1021 aaatcatcta ttggcccacc accgccgccc
ttgcgggcgg catggattac caaccactgt
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aaggcgtcgg cgccaaggat accaatcttg
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gcatttgagc cgccccattt aaccttcgcc
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gcgccatgca gacgagcttc cactcggctt
1321 gcaccttgtc caggcccctc atgctgaact
gacgcaatcc catcaccgcc ttgatca
80
66
WOODFORD et al Outbreak of Klebsiella pneumoniae Producing a New
Carbapenem- Hydrolyzing Class A β-Lactamase KPC-3 in a New York Medical
Center Antimicrobial agents and chemotherapy Dec 2004 p 4793ndash4799 Vol 48
No 12
YAGI T et al A preliminary survey of extended-spectrum β-lactamases
(ESBLs) in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Japan
FEMS Microbiology Letters 184 (2000) 53-56
YIGIT H et al Novel carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase KPC-1 from
a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumonia J Antimicrob Agents
Chemother 45 (4) 1151-1161 (2001)
ZAVASCKI A P et al KPC-2- producing Enterobacter cloacae in two cities
from Southern Brazil Int J Antimicrob Agents Apr 28 2009
ZHANEL G G et al Comparative review of the carbapenecircmicos Drugs
67(7)1027-52 2007
67
ANEXOS
Sequumlecircncia do oligo blaKPC
Query 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
Query 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
Query 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
68
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
Query 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
Query 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
69
Query 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
Query 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
Query 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
70
Sbjct 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
Query 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
Query 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
Query 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
71
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
Query 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 661
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GCTCTGC 720
Query 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
72
Query 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
Query 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
Query 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
73
Sbjct 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
Query 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
Query 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
Query 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
74
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
Query 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
Query 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
75
Query 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
Query 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
||||
Sbjct 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
LOCUS AF297554 1377 bp
DNA linear BCT 26-MAR-2001
DEFINITION Klebsiella pneumoniae carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
gene complete cds
ACCESSION AF297554
VERSION AF2975541 GI10121874
76
KEYWORDS
SOURCE Klebsiella pneumoniae
ORGANISM Klebsiella pneumoniae
Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Enterobacteriaceae Klebsiella
REFERENCE 1 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH QueenanAM
AndersonGJ Domenech-SanchezA
BiddleJW StewardCD
AlbertiS BushK and TenoverFC
TITLE Novel carbapenem-hydrolyzing beta-
lactamase KPC-1 from a
carbapenem-resistant strain of
Klebsiella pneumoniae
JOURNAL Antimicrob Agents Chemother 45 (4)
1151-1161 (2001)
PUBMED 11257029
REFERENCE 2 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH AndersonGJ and
TenoverFC
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (19-AUG-2000) Nosocomial
Pathogens Laboratory Branch
Centers for Disease Control and
Prevention 1600 Clifton Rd MS
G08 Atlanta GA 30333 USA
FEATURES LocationQualifiers
77
source 11377
organism=Klebsiella
pneumoniae
mol_type=genomic DNA
db_xref=taxon573
-35_signal 5560
-10_signal 7883
mRNA 921012
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
RBS 117122
CDS 1311012
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codon_start=1
transl_table=11
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
protein_id=AAG134101
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FGGSI
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KNALV
PWSPISEKYLTTGMTVAELSAAAVQYSDNAAANLLLKELGGPAGLTAFMRSIG
DTTFR
78
LDRWELELNSAIPSDARDTSSPRAVTESLQKLTLGSALAAPQRQQFVDWLKGN
TTGNH
RIRAAVPADWAVGDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTRAPNKDDK
HSEAV
IAAAARLALEGLGVNGQ
ORIGIN
1 cggggcagtt acagccgtta cagcctctgg
agagggagcg gcttgccgct cggtgataat
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atacagtgat aacgccgccg ccaatttgtt
541 gctgaaggag ttgggcggcc cggccgggct
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79
601 cacgttccgt ctggaccgct gggagctgga
gctgaactcc gccatcccaa gcgatgcgcg
661 cgatacctca tcgccgcgcg ccgtgacgga
aagcttacaa aaactgacac tgggctctgc
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gcgccatgca gacgagcttc cactcggctt
1321 gcaccttgtc caggcccctc atgctgaact
gacgcaatcc catcaccgcc ttgatca
80
67
ANEXOS
Sequumlecircncia do oligo blaKPC
Query 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1
CGGGGCAGTTACAGCCGTTACAGCCTCTGGAGAGGGAGCGGCTTGCCGCTCGG
TGATAAT 60
Query 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 61
CCCAGCTGTAGCGGCCTGATTACATCCGGCCGCTACACCTAGCTCCACCTTCA
AACAAGG 120
Query 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
68
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
Query 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
Query 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
69
Query 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
Query 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
Query 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
70
Sbjct 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
Query 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
Query 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
Query 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
71
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
Query 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
Query 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
72
Query 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
Query 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
Query 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
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|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
73
Sbjct 901
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CCGTCAT 960
Query 961
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|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 961
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GCTCTGA 1020
Query 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
Query 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
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74
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1081
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Query 1141
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|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1141
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AATCTTG 1200
Query 1201
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|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1201
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75
Query 1261
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TCGGCTT 1320
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
Query 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
||||
Sbjct 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
LOCUS AF297554 1377 bp
DNA linear BCT 26-MAR-2001
DEFINITION Klebsiella pneumoniae carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
gene complete cds
ACCESSION AF297554
VERSION AF2975541 GI10121874
76
KEYWORDS
SOURCE Klebsiella pneumoniae
ORGANISM Klebsiella pneumoniae
Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Enterobacteriaceae Klebsiella
REFERENCE 1 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH QueenanAM
AndersonGJ Domenech-SanchezA
BiddleJW StewardCD
AlbertiS BushK and TenoverFC
TITLE Novel carbapenem-hydrolyzing beta-
lactamase KPC-1 from a
carbapenem-resistant strain of
Klebsiella pneumoniae
JOURNAL Antimicrob Agents Chemother 45 (4)
1151-1161 (2001)
PUBMED 11257029
REFERENCE 2 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH AndersonGJ and
TenoverFC
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (19-AUG-2000) Nosocomial
Pathogens Laboratory Branch
Centers for Disease Control and
Prevention 1600 Clifton Rd MS
G08 Atlanta GA 30333 USA
FEATURES LocationQualifiers
77
source 11377
organism=Klebsiella
pneumoniae
mol_type=genomic DNA
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-35_signal 5560
-10_signal 7883
mRNA 921012
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hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
RBS 117122
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product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
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FGGSI
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KNALV
PWSPISEKYLTTGMTVAELSAAAVQYSDNAAANLLLKELGGPAGLTAFMRSIG
DTTFR
78
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TTGNH
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HSEAV
IAAAARLALEGLGVNGQ
ORIGIN
1 cggggcagtt acagccgtta cagcctctgg
agagggagcg gcttgccgct cggtgataat
61 cccagctgta gcggcctgat tacatccggc
cgctacacct agctccacct tcaaacaagg
121 aatatcgttg atgtcactgt atcgccgtct
agttctgctg tcttgtctct catggccgct
181 ggctggcttt tctgccaccg cgctgaccaa
cctcgtcgcg gaaccattcg ctaaactcga
241 acaggacttt ggcggctcca tcggtgtgta
cgcgatggat accggctcag gcgcaactgt
301 aagttaccgc gctgaggagc gcttcccact
gtgcagctca ttcaagggct ttcttgctgc
361 cgctgtgctg gctcgcagcc agcagcaggc
cggcttgctg gacacaccca tccgttacgg
421 caaaaatgcg ctggttccgt ggtcacccat
ctcggaaaaa tatctgacaa caggcatgac
481 ggtggcggag ctgtccgcgg ccgccgtgca
atacagtgat aacgccgccg ccaatttgtt
541 gctgaaggag ttgggcggcc cggccgggct
gacggccttc atgcgctcta tcggcgatac
79
601 cacgttccgt ctggaccgct gggagctgga
gctgaactcc gccatcccaa gcgatgcgcg
661 cgatacctca tcgccgcgcg ccgtgacgga
aagcttacaa aaactgacac tgggctctgc
721 actggctgcg ccgcagcggc agcagtttgt
tgattggcta aagggaaaca cgaccggcaa
781 ccaccgcatc cgcgcggcgg tgccggcaga
ctgggcagtc ggagacaaaa ccggaacctg
841 cggagtgtat ggcacggcaa atgactatgc
cgtcgtctgg cccactgggc gcgcacctat
901 tgtgttggcc gtctacaccc gggcgcctaa
caaggatgac aagcacagcg aggccgtcat
961 cgccgctgcg gctagactcg cgctcgaggg
attgggcgtc aacgggcagt aaggctctga
1021 aaatcatcta ttggcccacc accgccgccc
ttgcgggcgg catggattac caaccactgt
1081 cacatttagg ctaggagtct gcgcggcaga
gccgtgtgac cggttttctg tagagcactg
1141 acgatggcgg cggcgctctc tgcaattggc
aaggcgtcgg cgccaaggat accaatcttg
1201 cggcgcgcgg cgtgttatga cgactggggt
gcatttgagc cgccccattt aaccttcgcc
1261 ctcacagata cgccattcgc ctcaaattta
gcgccatgca gacgagcttc cactcggctt
1321 gcaccttgtc caggcccctc atgctgaact
gacgcaatcc catcaccgcc ttgatca
80
68
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 121
AATATCGTTGATGTCACTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT
GGCCGCT 180
Query 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 181
GGCTGGCTTTTCTGCCACCGCGCTGACCAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTA
AACTCGA 240
Query 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 241
ACAGGACTTTGGCGGCTCCATCGGTGTGTACGCGATGGATACCGGCTCAGGCG
CAACTGT 300
69
Query 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
Query 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
Query 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
70
Sbjct 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
Query 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
Query 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
Query 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
71
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
Query 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
Query 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
72
Query 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
Query 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
Query 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
73
Sbjct 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
Query 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
Query 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
Query 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
74
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
Query 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
Query 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
75
Query 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
Query 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
||||
Sbjct 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
LOCUS AF297554 1377 bp
DNA linear BCT 26-MAR-2001
DEFINITION Klebsiella pneumoniae carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
gene complete cds
ACCESSION AF297554
VERSION AF2975541 GI10121874
76
KEYWORDS
SOURCE Klebsiella pneumoniae
ORGANISM Klebsiella pneumoniae
Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Enterobacteriaceae Klebsiella
REFERENCE 1 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH QueenanAM
AndersonGJ Domenech-SanchezA
BiddleJW StewardCD
AlbertiS BushK and TenoverFC
TITLE Novel carbapenem-hydrolyzing beta-
lactamase KPC-1 from a
carbapenem-resistant strain of
Klebsiella pneumoniae
JOURNAL Antimicrob Agents Chemother 45 (4)
1151-1161 (2001)
PUBMED 11257029
REFERENCE 2 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH AndersonGJ and
TenoverFC
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (19-AUG-2000) Nosocomial
Pathogens Laboratory Branch
Centers for Disease Control and
Prevention 1600 Clifton Rd MS
G08 Atlanta GA 30333 USA
FEATURES LocationQualifiers
77
source 11377
organism=Klebsiella
pneumoniae
mol_type=genomic DNA
db_xref=taxon573
-35_signal 5560
-10_signal 7883
mRNA 921012
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hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
RBS 117122
CDS 1311012
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codon_start=1
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product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
protein_id=AAG134101
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FGGSI
GVYAMDTGSGATVSYRAEERFPLCSSFKGFLAAAVLARSQQQAGLLDTPIRYG
KNALV
PWSPISEKYLTTGMTVAELSAAAVQYSDNAAANLLLKELGGPAGLTAFMRSIG
DTTFR
78
LDRWELELNSAIPSDARDTSSPRAVTESLQKLTLGSALAAPQRQQFVDWLKGN
TTGNH
RIRAAVPADWAVGDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTRAPNKDDK
HSEAV
IAAAARLALEGLGVNGQ
ORIGIN
1 cggggcagtt acagccgtta cagcctctgg
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gccgtgtgac cggttttctg tagagcactg
1141 acgatggcgg cggcgctctc tgcaattggc
aaggcgtcgg cgccaaggat accaatcttg
1201 cggcgcgcgg cgtgttatga cgactggggt
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1261 ctcacagata cgccattcgc ctcaaattta
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gacgcaatcc catcaccgcc ttgatca
80
69
Query 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 301
AAGTTACCGCGCTGAGGAGCGCTTCCCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTC
TTGCTGC 360
Query 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 361
CGCTGTGCTGGCTCGCAGCCAGCAGCAGGCCGGCTTGCTGGACACACCCATCC
GTTACGG 420
Query 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
70
Sbjct 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
Query 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
Query 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
Query 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
71
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 601
CACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAAGCG
ATGCGCG 660
Query 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
Query 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
72
Query 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
Query 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
Query 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
73
Sbjct 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
Query 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
Query 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
Query 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
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74
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
Query 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
Query 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
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|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
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Query 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
Query 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
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|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
||||
Sbjct 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
LOCUS AF297554 1377 bp
DNA linear BCT 26-MAR-2001
DEFINITION Klebsiella pneumoniae carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
gene complete cds
ACCESSION AF297554
VERSION AF2975541 GI10121874
76
KEYWORDS
SOURCE Klebsiella pneumoniae
ORGANISM Klebsiella pneumoniae
Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Enterobacteriaceae Klebsiella
REFERENCE 1 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH QueenanAM
AndersonGJ Domenech-SanchezA
BiddleJW StewardCD
AlbertiS BushK and TenoverFC
TITLE Novel carbapenem-hydrolyzing beta-
lactamase KPC-1 from a
carbapenem-resistant strain of
Klebsiella pneumoniae
JOURNAL Antimicrob Agents Chemother 45 (4)
1151-1161 (2001)
PUBMED 11257029
REFERENCE 2 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH AndersonGJ and
TenoverFC
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (19-AUG-2000) Nosocomial
Pathogens Laboratory Branch
Centers for Disease Control and
Prevention 1600 Clifton Rd MS
G08 Atlanta GA 30333 USA
FEATURES LocationQualifiers
77
source 11377
organism=Klebsiella
pneumoniae
mol_type=genomic DNA
db_xref=taxon573
-35_signal 5560
-10_signal 7883
mRNA 921012
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hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
RBS 117122
CDS 1311012
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hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
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KNALV
PWSPISEKYLTTGMTVAELSAAAVQYSDNAAANLLLKELGGPAGLTAFMRSIG
DTTFR
78
LDRWELELNSAIPSDARDTSSPRAVTESLQKLTLGSALAAPQRQQFVDWLKGN
TTGNH
RIRAAVPADWAVGDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTRAPNKDDK
HSEAV
IAAAARLALEGLGVNGQ
ORIGIN
1 cggggcagtt acagccgtta cagcctctgg
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481 ggtggcggag ctgtccgcgg ccgccgtgca
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79
601 cacgttccgt ctggaccgct gggagctgga
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caaggatgac aagcacagcg aggccgtcat
961 cgccgctgcg gctagactcg cgctcgaggg
attgggcgtc aacgggcagt aaggctctga
1021 aaatcatcta ttggcccacc accgccgccc
ttgcgggcgg catggattac caaccactgt
1081 cacatttagg ctaggagtct gcgcggcaga
gccgtgtgac cggttttctg tagagcactg
1141 acgatggcgg cggcgctctc tgcaattggc
aaggcgtcgg cgccaaggat accaatcttg
1201 cggcgcgcgg cgtgttatga cgactggggt
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1261 ctcacagata cgccattcgc ctcaaattta
gcgccatgca gacgagcttc cactcggctt
1321 gcaccttgtc caggcccctc atgctgaact
gacgcaatcc catcaccgcc ttgatca
80
70
Sbjct 421
CAAAAATGCGCTGGTTCCGTGGTCACCCATCTCGGAAAAATATCTGACAACAG
GCATGAC 480
Query 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
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|||||||
Sbjct 481
GGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCA
ATTTGTT 540
Query 541
GCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCG
GCGATAC 600
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Sbjct 541
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GCGATAC 600
Query 601
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71
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Sbjct 601
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ATGCGCG 660
Query 661
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GCTCTGC 720
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Sbjct 661
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GCTCTGC 720
Query 721
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CCGGCAA 780
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|||||||
Sbjct 721
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CCGGCAA 780
72
Query 781
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GAACCTG 840
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Sbjct 781
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GAACCTG 840
Query 841
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Sbjct 841
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CACCTAT 900
Query 901
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CCGTCAT 960
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73
Sbjct 901
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CCGTCAT 960
Query 961
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GCTCTGA 1020
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Sbjct 961
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GCTCTGA 1020
Query 1021
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Sbjct 1021
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CCACTGT 1080
Query 1081
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74
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Sbjct 1081
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Query 1141
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AATCTTG 1200
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
Query 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Sbjct 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
75
Query 1261
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TCGGCTT 1320
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Sbjct 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
Query 1321
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Sbjct 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
LOCUS AF297554 1377 bp
DNA linear BCT 26-MAR-2001
DEFINITION Klebsiella pneumoniae carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
gene complete cds
ACCESSION AF297554
VERSION AF2975541 GI10121874
76
KEYWORDS
SOURCE Klebsiella pneumoniae
ORGANISM Klebsiella pneumoniae
Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Enterobacteriaceae Klebsiella
REFERENCE 1 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH QueenanAM
AndersonGJ Domenech-SanchezA
BiddleJW StewardCD
AlbertiS BushK and TenoverFC
TITLE Novel carbapenem-hydrolyzing beta-
lactamase KPC-1 from a
carbapenem-resistant strain of
Klebsiella pneumoniae
JOURNAL Antimicrob Agents Chemother 45 (4)
1151-1161 (2001)
PUBMED 11257029
REFERENCE 2 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH AndersonGJ and
TenoverFC
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (19-AUG-2000) Nosocomial
Pathogens Laboratory Branch
Centers for Disease Control and
Prevention 1600 Clifton Rd MS
G08 Atlanta GA 30333 USA
FEATURES LocationQualifiers
77
source 11377
organism=Klebsiella
pneumoniae
mol_type=genomic DNA
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-10_signal 7883
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hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
RBS 117122
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hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
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DTTFR
78
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IAAAARLALEGLGVNGQ
ORIGIN
1 cggggcagtt acagccgtta cagcctctgg
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541 gctgaaggag ttgggcggcc cggccgggct
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79
601 cacgttccgt ctggaccgct gggagctgga
gctgaactcc gccatcccaa gcgatgcgcg
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1201 cggcgcgcgg cgtgttatga cgactggggt
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1261 ctcacagata cgccattcgc ctcaaattta
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1321 gcaccttgtc caggcccctc atgctgaact
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80
71
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Sbjct 601
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Query 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 661
CGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGG
GCTCTGC 720
Query 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 721
ACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGA
CCGGCAA 780
72
Query 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
Query 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
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|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
Query 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
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|||||||
73
Sbjct 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
Query 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
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|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 961
CGCCGCTGCGGCTAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGCGTCAACGGGCAGTAAG
GCTCTGA 1020
Query 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
Query 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
74
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
Query 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
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Sbjct 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
Query 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Sbjct 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
75
Query 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
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Sbjct 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
Query 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
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Sbjct 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
LOCUS AF297554 1377 bp
DNA linear BCT 26-MAR-2001
DEFINITION Klebsiella pneumoniae carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
gene complete cds
ACCESSION AF297554
VERSION AF2975541 GI10121874
76
KEYWORDS
SOURCE Klebsiella pneumoniae
ORGANISM Klebsiella pneumoniae
Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Enterobacteriaceae Klebsiella
REFERENCE 1 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH QueenanAM
AndersonGJ Domenech-SanchezA
BiddleJW StewardCD
AlbertiS BushK and TenoverFC
TITLE Novel carbapenem-hydrolyzing beta-
lactamase KPC-1 from a
carbapenem-resistant strain of
Klebsiella pneumoniae
JOURNAL Antimicrob Agents Chemother 45 (4)
1151-1161 (2001)
PUBMED 11257029
REFERENCE 2 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH AndersonGJ and
TenoverFC
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (19-AUG-2000) Nosocomial
Pathogens Laboratory Branch
Centers for Disease Control and
Prevention 1600 Clifton Rd MS
G08 Atlanta GA 30333 USA
FEATURES LocationQualifiers
77
source 11377
organism=Klebsiella
pneumoniae
mol_type=genomic DNA
db_xref=taxon573
-35_signal 5560
-10_signal 7883
mRNA 921012
product=carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
RBS 117122
CDS 1311012
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hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
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GVYAMDTGSGATVSYRAEERFPLCSSFKGFLAAAVLARSQQQAGLLDTPIRYG
KNALV
PWSPISEKYLTTGMTVAELSAAAVQYSDNAAANLLLKELGGPAGLTAFMRSIG
DTTFR
78
LDRWELELNSAIPSDARDTSSPRAVTESLQKLTLGSALAAPQRQQFVDWLKGN
TTGNH
RIRAAVPADWAVGDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTRAPNKDDK
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IAAAARLALEGLGVNGQ
ORIGIN
1 cggggcagtt acagccgtta cagcctctgg
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72
Query 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
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|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 781
CCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCG
GAACCTG 840
Query 841
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|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 841
CGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGCG
CACCTAT 900
Query 901
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|||||||
73
Sbjct 901
TGTGTTGGCCGTCTACACCCGGGCGCCTAACAAGGATGACAAGCACAGCGAGG
CCGTCAT 960
Query 961
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|||||||
Sbjct 961
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GCTCTGA 1020
Query 1021
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Sbjct 1021
AAATCATCTATTGGCCCACCACCGCCGCCCTTGCGGGCGGCATGGATTACCAA
CCACTGT 1080
Query 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
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74
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Sbjct 1081
CACATTTAGGCTAGGAGTCTGCGCGGCAGAGCCGTGTGACCGGTTTTCTGTAG
AGCACTG 1140
Query 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
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Sbjct 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
Query 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
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Sbjct 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
75
Query 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|||||||
Sbjct 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
Query 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
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||||
Sbjct 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
LOCUS AF297554 1377 bp
DNA linear BCT 26-MAR-2001
DEFINITION Klebsiella pneumoniae carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
gene complete cds
ACCESSION AF297554
VERSION AF2975541 GI10121874
76
KEYWORDS
SOURCE Klebsiella pneumoniae
ORGANISM Klebsiella pneumoniae
Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Enterobacteriaceae Klebsiella
REFERENCE 1 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH QueenanAM
AndersonGJ Domenech-SanchezA
BiddleJW StewardCD
AlbertiS BushK and TenoverFC
TITLE Novel carbapenem-hydrolyzing beta-
lactamase KPC-1 from a
carbapenem-resistant strain of
Klebsiella pneumoniae
JOURNAL Antimicrob Agents Chemother 45 (4)
1151-1161 (2001)
PUBMED 11257029
REFERENCE 2 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH AndersonGJ and
TenoverFC
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (19-AUG-2000) Nosocomial
Pathogens Laboratory Branch
Centers for Disease Control and
Prevention 1600 Clifton Rd MS
G08 Atlanta GA 30333 USA
FEATURES LocationQualifiers
77
source 11377
organism=Klebsiella
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GVYAMDTGSGATVSYRAEERFPLCSSFKGFLAAAVLARSQQQAGLLDTPIRYG
KNALV
PWSPISEKYLTTGMTVAELSAAAVQYSDNAAANLLLKELGGPAGLTAFMRSIG
DTTFR
78
LDRWELELNSAIPSDARDTSSPRAVTESLQKLTLGSALAAPQRQQFVDWLKGN
TTGNH
RIRAAVPADWAVGDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTRAPNKDDK
HSEAV
IAAAARLALEGLGVNGQ
ORIGIN
1 cggggcagtt acagccgtta cagcctctgg
agagggagcg gcttgccgct cggtgataat
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79
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Sbjct 961
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Query 1021
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Query 1081
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Query 1141
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Sbjct 1141
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AATCTTG 1200
Query 1201
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Sbjct 1201
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CTTCGCC 1260
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Query 1261
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TCGGCTT 1320
Query 1321
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Sbjct 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
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DNA linear BCT 26-MAR-2001
DEFINITION Klebsiella pneumoniae carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
gene complete cds
ACCESSION AF297554
VERSION AF2975541 GI10121874
76
KEYWORDS
SOURCE Klebsiella pneumoniae
ORGANISM Klebsiella pneumoniae
Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Enterobacteriaceae Klebsiella
REFERENCE 1 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH QueenanAM
AndersonGJ Domenech-SanchezA
BiddleJW StewardCD
AlbertiS BushK and TenoverFC
TITLE Novel carbapenem-hydrolyzing beta-
lactamase KPC-1 from a
carbapenem-resistant strain of
Klebsiella pneumoniae
JOURNAL Antimicrob Agents Chemother 45 (4)
1151-1161 (2001)
PUBMED 11257029
REFERENCE 2 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH AndersonGJ and
TenoverFC
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (19-AUG-2000) Nosocomial
Pathogens Laboratory Branch
Centers for Disease Control and
Prevention 1600 Clifton Rd MS
G08 Atlanta GA 30333 USA
FEATURES LocationQualifiers
77
source 11377
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78
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Query 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
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Sbjct 1141
ACGATGGCGGCGGCGCTCTCTGCAATTGGCAAGGCGTCGGCGCCAAGGATACC
AATCTTG 1200
Query 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
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Sbjct 1201
CGGCGCGCGGCGTGTTATGACGACTGGGGTGCATTTGAGCCGCCCCATTTAAC
CTTCGCC 1260
75
Query 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
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Sbjct 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
Query 1321
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ATCA 1377
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Sbjct 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
LOCUS AF297554 1377 bp
DNA linear BCT 26-MAR-2001
DEFINITION Klebsiella pneumoniae carbepenem-
hydrolyzing beta-lactamase KPC-1
gene complete cds
ACCESSION AF297554
VERSION AF2975541 GI10121874
76
KEYWORDS
SOURCE Klebsiella pneumoniae
ORGANISM Klebsiella pneumoniae
Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Enterobacteriaceae Klebsiella
REFERENCE 1 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH QueenanAM
AndersonGJ Domenech-SanchezA
BiddleJW StewardCD
AlbertiS BushK and TenoverFC
TITLE Novel carbapenem-hydrolyzing beta-
lactamase KPC-1 from a
carbapenem-resistant strain of
Klebsiella pneumoniae
JOURNAL Antimicrob Agents Chemother 45 (4)
1151-1161 (2001)
PUBMED 11257029
REFERENCE 2 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH AndersonGJ and
TenoverFC
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (19-AUG-2000) Nosocomial
Pathogens Laboratory Branch
Centers for Disease Control and
Prevention 1600 Clifton Rd MS
G08 Atlanta GA 30333 USA
FEATURES LocationQualifiers
77
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GVYAMDTGSGATVSYRAEERFPLCSSFKGFLAAAVLARSQQQAGLLDTPIRYG
KNALV
PWSPISEKYLTTGMTVAELSAAAVQYSDNAAANLLLKELGGPAGLTAFMRSIG
DTTFR
78
LDRWELELNSAIPSDARDTSSPRAVTESLQKLTLGSALAAPQRQQFVDWLKGN
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IAAAARLALEGLGVNGQ
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CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
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Sbjct 1261
CTCACAGATACGCCATTCGCCTCAAATTTAGCGCCATGCAGACGAGCTTCCAC
TCGGCTT 1320
Query 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
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Sbjct 1321
GCACCTTGTCCAGGCCCCTCATGCTGAACTGACGCAATCCCATCACCGCCTTG
ATCA 1377
LOCUS AF297554 1377 bp
DNA linear BCT 26-MAR-2001
DEFINITION Klebsiella pneumoniae carbepenem-
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gene complete cds
ACCESSION AF297554
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KEYWORDS
SOURCE Klebsiella pneumoniae
ORGANISM Klebsiella pneumoniae
Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Enterobacteriaceae Klebsiella
REFERENCE 1 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH QueenanAM
AndersonGJ Domenech-SanchezA
BiddleJW StewardCD
AlbertiS BushK and TenoverFC
TITLE Novel carbapenem-hydrolyzing beta-
lactamase KPC-1 from a
carbapenem-resistant strain of
Klebsiella pneumoniae
JOURNAL Antimicrob Agents Chemother 45 (4)
1151-1161 (2001)
PUBMED 11257029
REFERENCE 2 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH AndersonGJ and
TenoverFC
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (19-AUG-2000) Nosocomial
Pathogens Laboratory Branch
Centers for Disease Control and
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G08 Atlanta GA 30333 USA
FEATURES LocationQualifiers
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PWSPISEKYLTTGMTVAELSAAAVQYSDNAAANLLLKELGGPAGLTAFMRSIG
DTTFR
78
LDRWELELNSAIPSDARDTSSPRAVTESLQKLTLGSALAAPQRQQFVDWLKGN
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RIRAAVPADWAVGDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTRAPNKDDK
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IAAAARLALEGLGVNGQ
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76
KEYWORDS
SOURCE Klebsiella pneumoniae
ORGANISM Klebsiella pneumoniae
Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria
Enterobacteriales
Enterobacteriaceae Klebsiella
REFERENCE 1 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH QueenanAM
AndersonGJ Domenech-SanchezA
BiddleJW StewardCD
AlbertiS BushK and TenoverFC
TITLE Novel carbapenem-hydrolyzing beta-
lactamase KPC-1 from a
carbapenem-resistant strain of
Klebsiella pneumoniae
JOURNAL Antimicrob Agents Chemother 45 (4)
1151-1161 (2001)
PUBMED 11257029
REFERENCE 2 (bases 1 to 1377)
AUTHORS YigitH AndersonGJ and
TenoverFC
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (19-AUG-2000) Nosocomial
Pathogens Laboratory Branch
Centers for Disease Control and
Prevention 1600 Clifton Rd MS
G08 Atlanta GA 30333 USA
FEATURES LocationQualifiers
77
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organism=Klebsiella
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PWSPISEKYLTTGMTVAELSAAAVQYSDNAAANLLLKELGGPAGLTAFMRSIG
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LDRWELELNSAIPSDARDTSSPRAVTESLQKLTLGSALAAPQRQQFVDWLKGN
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RIRAAVPADWAVGDKTGTCGVYGTANDYAVVWPTGRAPIVLAVYTRAPNKDDK
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IAAAARLALEGLGVNGQ
ORIGIN
1 cggggcagtt acagccgtta cagcctctgg
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121 aatatcgttg atgtcactgt atcgccgtct
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181 ggctggcttt tctgccaccg cgctgaccaa
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79
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