Bioquímica

TRADUÇÃO DE PROTEÍNAS

PROCESSAMENTO PÓS-

TRADUCIONALCÓDIGO

GENÉTICO

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Maria Carolina F. da S. Sousa

Universidade Federal do MaranhãoCentro de Ciências Biológicas e da SaúdeDepartamento de Ciências Fisiológicas Disciplina de BioquímicaCurso de Medicina, primeiro períodoAluna: Maria Carolina Ferreira da Silva SousaCódigo: ME02127-03Professor José Raimundo Lindoso

Tradução de Proteínas,

Processamento Pós – Traducional e

Código Genético

Maria Carolina Ferreira da Silva Sousa ME02127-03

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São Luís2002

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Universidade Federal do MaranhãoCentro de Ciências Biológicas e da SaúdeDepartamento de Ciências FisiológicasDisciplina de BioquímicaCurso de Medicina, primeiro períodoAluna: Maria Carolina Ferreira da Silva SousaCódigo: ME02127-03Professor José Raimundo Lindoso

Tradução de Proteínas,

Processamento Pós – Traducional e

Código Genético

Maria Carolina Ferreira da Silva Sousa ME02127-03

Trabalho apresentado junto à disciplina de Bioquímica, ministrada pelo professor Raimundo Lindoso como pré-requisito para obtenção da terceira nota.

São Luís

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2002

Aos meus pais, cujo contínuo encorajamento tornou possível a conclusão deste trabalho.

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“Não há emoção no fácil velejar quando os céus estão claros e azuis.Não há alegria em, meramente, fazer coisas que qualquer um pode fazer.Mas existe satisfação, que é muito doce, quando você aporta num destino onde você pensou que não chegaria”

Spirella

Agradecimentos

Se este texto tiver algum sucesso, muitas pessoas o tornaram possível.

Gostaria de expressar meu reconhecimento ao professor Raimundo Lindoso por todo conteúdo de informações transmitido durante o período.

Agradeço aos meus colegas cujo aconselhamento contribuiu de forma significativa para a elaboração desta obra.

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E aos meus pais que, como sempre fazem, me apoiaram e incentivaram de forma a proporcionar condições ótimas durante a conclusão desse belíssimo trabalho.

Apresentação

Este trabalho trata dos processos envolvidos na tradução protéica tanto procarionte como eucarionte. Esclarece de forma objetiva todas as etapas compreendidas no processo e fornece informações sofre como se chegou a tais conclusões, descreve experiências e trabalhos científicos que possam trazer alguma contribuição para o entendimento.

Foi acrescentado ao trabalho o destino das proteínas, seu endereçamento, processamento pós-tradução, etapas envolvidas e agentes inibidores da síntese.

Cada passo descrito foi detalhado de forma a proporcionar alto nível de entendimento, todos os processos aqui tratados apresentam figuras ilustrativas para atingir esse mesmo objetivo.

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Sumário

BIOSSÍNTESE DE PROTEÍNAS 9

CÓDIGO GENÉTICO 12Porque uma trinca de nucleotídeos? 13O significado dos códons 14Seqüência de nucleotídeos 14Códon de início 16Códons de Término 16Características do Código Genético 16Mutações 18Universalidade do Código 20Evolução do Código de Aminoácidos 20Pareamento Códon-Anticódon 21

COMPONENTES DA SÍNTESE PROTÉICA 22tRNA 22Aminoacil-tRNA-Sintetase 25rRNA 26Polissomo 27mRNA 27Aminoácido 28

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Fatores Protéicos 29Energia 29

MECANISMO DE TRADUÇÃO 30Direção da síntese protéica 30Etapas Sucessivas da Síntese Protéica 30Ativação 32Iniciação 34Elongação 37Término 40Inibidores 41

PROCESSAMENTO PÓS-TRADUCIONAL 42Endereçamento 42Translocação 43Enovelamento 43Glicosilação do Cerne 44Glicosilação Terminal 45Degradação 45

BIBLIOGRAFIA 46

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Biossíntese de Proteínas

As proteínas são codificadas pela seqüência de aminoácidos do RNA mensageiro, que carrega a informação contida nas bases do DNA, em outras palavras, a seqüência de desoxirribonucleotídeos do DNA é transcrita para uma seqüência análoga de nucleotídeos no RNA mensageiro que vai trazer essa informação de dentro do núcleo para o citoplasma celular onde vai se dar a tradução em proteínas.

É bem fácil entender porque esse processo é chamado tradução, a informação genética é expressa

predominantemente na forma de proteínas, a informação que indica toda a composição das proteínas está guardada nos ácidos nucléicos numa seqüência linear formada por um alfabeto de quatro caracteres: os quatro tipos de nucleotídeos. Os aminoácidos, constituintes das proteínas, representam um outro alfabeto constituído de vinte caracteres e a informação genética deve fluir do primeiro para o segundo, esse processo também é chamado biossíntese de proteínas.

Agora surge uma importante questão: como a informação genética contida na seqüência de nucleotídeos do RNA mensageiro é traduzida para a estrutura protéica? Trataremos dos mecanismos pelos quais a cadeia polipeptídica é construída e através dos quais os ribossomos tornam possível a transferência da informação genética para a seqüência apropriada dos aminoácidos na cadeia polipeptídica.

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O estudo do mecanismo da biossíntese de proteínas já elucidou muitas dúvidas a respeito de doenças genéticas, aumentando a qualidade de vida de portadores e abrindo possibilidades para a prevenção. Além dessas doenças, está se tornando possível o combate a alguns vírus e bactérias.

Este sempre foi um campo que atraiu a curiosidade de muitos pesquisadores. Um ponto de vista inicial foi de que as peptidases e as enzimas proteolíticas funcionam não somente na degradação, mas também na síntese de proteínas. Contudo, com a descoberta do papel fundamental do ATP nas reações biossintéticas, assim como o estabelecimento do conceito de que reações biossintéticas e catabólicas possuem vias diferentes, a reversão da atividade hidrolítica pareceu um mecanismo improvável para a biossíntese protéica.

Os avanços nessa área foram significativos quando surgiram experimentos que aplicavam a técnica de isótopos marcados. Aminoácidos radioativos eram incorporados a células de animais intactas e assim era possível acompanhar a biossíntese das proteínas.

A partir dessas experiências surgiu uma noção primária da síntese protéica, foi comprovado que as proteínas dos tecidos animais sofrem alteração metabólica, que a síntese de proteína necessita uma fonte de energia metabólica e que os aminoácidos e não os peptídeos simples são os precursores imediatos da proteína.

A era moderna de pesquisa sobre o mecanismo da biossíntese de proteínas começou na década de 50, com as investigacões de P. C. Zamecnik e seus colegas, em Boston, que através da pesquisa em sistemas livres de células, foram os primeiros a identificar partículas ribonucleoproteicas, os ribossomos, como o sítio da biossíntese de proteína e o RNA transportador.

Este complexo mecanismo exige um número muito grande de macromoléculas e enzimas. Sendo que cada componente vai realizar uma função específica. Todos os aminoácidos devem estar presentes para ocorrer a síntese, se houver carência de um aminoácido, a tradução será interrompida num códon que o codifique. A fita de RNA mensageiro a ser traduzida, os RNAs transportadores, os ribossomos funcionais, as fontes de energia, as enzimas e os fatores protéicos necessários à iniciação, ao alongamento e à terminação da cadeia polipeptídica.

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Todos esses componentes vão se reunir, vão apresentar afinidades uns pelos outros e vão reagir de maneira específica, com gasto energético, para formar as proteínas.

A tradução acontece em células eucariontes tanto no citosol como nas mitocôndrias, sendo que o mecanismo nas mitocôndrias está mais parecido com o que ocorre nos procariontes. Na verdade, o processo nos eucariontes se apresenta mais complexo e contém maior número de enzimas e fatores protéicos, mas tem uma base em comum com o processo procarionte.

Código Genético

Antes de entender a tradução de proteínas, se faz necessário o conhecimento do código genético que consiste na relação existente entre a seqüência de bases do RNA mensageiro

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Esquema geral da síntese protéica

e a seqüência de nucleotídeos da proteína por ele formada.Consideraremos agora como a linguagem de quatro letras

dos ácidos nucléicos é traduzida na linguagem de vinte letras das proteínas. Por convenção, seqüências de ácidos nucléicos são escritas na direção 5’ 3’ e a seqüência de proteínas, amino – terminal carboxi – terminal. Essas direções no RNA mensageiro e na proteína correspondem a seus sentidos de leitura e biossíntese.

Tabela do Código Genético

1a posição 2a posição 3a posição

U C A G

U

UUUPhe(F)

UCU

Ser(S)

UAUTyr(Y)

UGUCys(C)

U

UUC UCC UAC UGC C

UUALeu(L)

UCA UAATERM

UGA TERM A

UUG UCG UAG UGG Trp(W) G

C

CUU

Leu(L)

CCU

Pro(P)

CAUHis(H)

CGU

Arg(R)

U

CUC CCC CAC CGC C

CUA CCA CAAGln(Q)

CGA A

CUG CCG CAG CGG G

A

AUU

Ile(I)

ACU

Thr(T)

AAUAsn(N)

AGUSer(S)

U

AUC ACC AAC AGC C

AUA ACA AAALys(K)

AGAArg(R)

A

AUG Met(M) ACG AAG AGG G

G

GUU

Val(V)

GCU

Ala(A)

GAUAsp(D)

GGU

Gly(G)

U

GUC GCC GAC GGC C

GUA GCA GAAGlu(E)

GGA A

GUG GCG GAG GGG G

PORQUE UMA TRINCA DE NUCLEOTÍDEOS?

A partir de considerações puramente matemáticas é razoável afirmar que mais de um nucleotídeo é necessário para codificar cada aminoácido, uma vez que há apenas quatro bases diferentes no DNA e vinte aminoácidos nas proteínas. Outrossim, uma vez que as quatro letras do código do DNA (A, G, C e T), arranjadas em grupos de duas, podem originar somente 42 = 16 pares diferentes, as palavras do código para os aminoácidos devem conter mais de duas letras. As quatro bases, tomadas três de cada vez, teoricamente especificam 43 = 64 aminoácidos. Um código tríplice é portanto, o menor necessário para a codificação de aminoácidos.

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Estudos gênicos em mutantes com mudança de estrutura de bacteriófagos T4, dos quais um, dois ou três resíduos de nucleotídeos são retirados (ou inseridos) comprovaram essa idéia inicial de trinca. Deleções unitárias ou duplas resultam na síntese de proteínas de envoltório defeituosas, com muitos aminoácidos errados, mas deleções triplas (ou inserções triplas) originam proteína de envoltório, nas quais somente um resíduo de aminoácido era perdido ou ganho, sendo todos os outros normais. Além desses, outros tipos de experimentos gênicos também apoiaram um código triplo sem vírgulas.

Essa ilustração mostra que dependendo do ponto escolhido para começar a leitura do RNAm, podem existir 3 quadros de leitura. Por isso que é importante um sinal de início que vai direcionar a leitura correta.

O SIGNIFICADO DOS CÓDONS

Importantes experimentos foram realizados para desvendar o código genético. M. Nirenberg e H. Matthaei incubaram polímeros de RNA com composição de bases conhecidas, preparados sinteticamente pela ação da polinucleotídeo – fosforilase em misturas apropriadas de substratos de nucleotídeos – 5’ - difosfatos, numa série de tubos contendo ribossomos de E. coli sem mensageiro, suplementados com os ingredientes usuais necessários para realizar síntese de polipeptídeo, incluindo todos os aminoácidos. Em cada tubo, era marcado um aminoácido (radioativo) diferente. A análise da fração polipeptídica insolúvel em ácido, recuperada dos tubos no final da incubação, mostrou que esses polímeros serviriam como RNA mensageiro, sua proporção de bases era conhecida, mas não a seqüência de nucleotídeos, sendo assim, através de

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cálculos de probabilidade era possível delinear a provável composição em bases de alguns aminoácidos. Através de tais experiências, os laboratórios de Nirenberg e Ochoa conseguiram rapidamente identificar a composição em nucleotídeos de cerca de 50 palavras do código para os vários aminoácidos.

SEQÜÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS

Embora a abordagem experimental descrita tenha dado a composição em nucleotídeos das palavras do código, ela forneceu muito pouca informação sobre a seqüência de nucleotídeos nas trincas. Nirenbeg e P. Leder descobriram que ribossomos de E. coli isolados, incubados em MgCl2 0,02 M, na ausência de GTP, ligam preparações de RNA mensageiro sintético, tal como poli U (filamento de RNA formado só de uridinas). Eles também ligaram uma molécula do aminoacil-tRNA que é especificado pelo mensageiro. Não há formação de ligações peptídicas em tais sistemas porque o GTP está ausente. Esse teste é chamado de ensaio de ligação. Descobriu-se que trinucletídeos simples funcionam como mensageiros de ligação; assim, o trinucleotídeo UUU é suficiente como mensageiro para realizar a ligação de fenilalanil-tRNAPhe. Igualmente, a adição de AAA aos ribossomos promovia a ligação de lisil-tRNALys, mas não outro aminoacil-tRNA.

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Alguns polinucleotídeos usados para decodificar as trincas dos RNAs mensageiros.Quando é atingido um códon de terminação, nenhum nucleotídeo se liga e a síntese para. Como não existe sinal de início, a síntese começa em qualquer ponto.

0 ensaio de ligação foi usado para determinar a seqüência de bases nas palavras do código. Isso se tornou possível porque muitos trinucleotídeos de seqüência de bases conhecida podiam ser fabricados, quer enzimaticamente, quer por métodos sintéticos. Por determinação de qual aminoacil-tRNA estava especificamente ligado pelos ribossomos, na presença de um dado trinucleotídeo de seqüência conhecida, Nirenberg e Leder rapidamente estabeleceram a soletração das palavras do código para muitos dos aminoácidos.

As palavras do código para aminoácidos têm sido extensivamente confirmadas por outros tipos de observações feitas sobre a correspondência entre a seqüência de nucleotídeos de RNAs mensageiros naturais e a seqüência de aminoácidos de proteínas formadas biologicamente.

CÓDONS DE INÍCIO

Embora não seja requerida pontuação entre palavras separadas do código de aminoácidos, são necessários sinais específicos para iniciar a cadeia polipeptídica no ponto exato, de forma que a conexão correta da estrutura de leitura seja estabelecida, N-formilmetionina é o aminoácido de iniciação em procariontes e a metionina em eucariontes; GUG é um códon de iniciação alternativo para a metionina, em procariontes. Entretanto, há dois RNAs de transferência para metionina, mas somente um deles é comumente usado como o tRNA de iniciação.

CÓDONS DE TÉRMINO

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Aqui está representada a experiência onde o RNAt ligado ao trinucleotídeo (através do seu anticódon), não vai passar pelo filtro e poderá ser identificado. Experiências desse tipo ajudaram a desvendar o código genético.

Quando a síntese de proteínas é codificada por um RNA mensageiro natural, a cadeia polipeptídica completa é liberada na forma livre, depois de sua remoção hidrolítica do terminal carboxílico do tRNA. Entretanto, quando a síntese de polipeptídeo é codificada por mensageiros sintéticos, tais como poli U, a cadeia recém-formada permanece ligada aos ribosomos, como polifenilalanil-tRNAPhe, presumivelmente porque poli U não contem sinal de terminação.

Durante a pesquisa sobre a atribuição das palavras do código para os diferentes aminoácidos, descobriu-se que três códons, UAG, UAA e UGA, não especificavam para qualquer dos vinte aminoácidos. Estabeleceu-se que eles eram sinais de terminação.

Os três códons de terminação não são, provavelmente, usados com igual freqüência; na realidade, pesquisas recentes sugerem que UAA é o sinal de terminação mais comum.

CARACTERÍSTICAS DO CÓDIGO GENÉTICO

Há quatro características particularmente notáveis do código genético. Primeiro é que não é necessária qualquer pontuação ou sinal para indicar o final de um códon e o começo do próximo, o código é "sem vírgulas". A estrutura de leitura deve ser, portanto, corretamente estabelecida no início da leitura de uma molécula de mRNA e, então, dirigida seqüencialmente de uma trinca à próxima, ou então todos os códons ficarão fora de registro, resultando na formação de uma proteína com seqüência de aminoácidos deturpada. Esse fato enfatiza a necessidade de alguma forma de sinal único, no mRNA, para indicar o ponto correto no qual a leitura pelo ribosoma deve começar; esses sinais de iniciação serão discutidos mais tarde.

A segunda característica importante é que o código de aminoácidos é degenerado, isto é, há mais de uma palavra do código para a maioria dos aminoácidos. Degenerado não significa imperfeito, pois não há palavra do código que especifique mais de um aminoácido.

A degenerescência do código genético é uma característica que dá sua contribuição para a sobrevivência. Se houvesse somente uma palavra do código para cada aminoácido, somente 20 dos 64 códons possíveis seriam usados, e a maioria das mutações pontuais das trincas de codificação resultaria em trincas que não codificam para qualquer aminoácido. Por outro lado, devido à degenerescência do código, uma mutação, na maior parte dos casos, resulta na formação de uma trinca-

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sinônimo ou substituição de um aminoácido por outro, geralmente produzindo uma mutação silenciosa, isto é, um produto gênico com função inalterada. A degenerescência do código, assim, permite formação de uma proteína mutante, que é freqüentemente ainda funcional e, na realidade, poderia mesmo ser uma proteína melhor que a do organismo do tipo selvagem. A degenerescência do código pode então levar a um "melhoramento" gradual do genoma e de seus produtos gênicos; ela permite que ocorra uma variedade de substituições de aminoácidos por mutação, a partir das quais a substituição com um melhor valor de sobrevivência pode ser selecionada. Uma vez que as mutações mais freqüentes envolvem mudanças A-G ou C-T, que usualmente não tem efeito no aminoácido codificado, quando elas ocorrem na terceira posição, a degenerescência do código pode também ser considerada como tendo um valor protetor, estabilizando o genoma contra mutações.

Uma terceira importante característica é que a terceira base nos códons é menos específica que as duas primeiras. Note-se que a degeneração do código envolve somente a terceira base no códon, na maioria dos casos (exceções são arginina, leucina e serina). A terceira posição, isto é o nucleotídeo na extremidade 3'-hidroxílica do códon é de menor importância e não se encaixa perfeitamente; em outras palavras, é frouxo e tende a “oscilar”.

Pareamentos permitidos na 3a posição

Base 5' - anticódon Base 3' - códon

C G

A U

U A ou G

G U ou C

I U, C ou A

Uma explicação plausível ao fato de o pareamento de bases entre códon e anticódon ser frouxo ou oscilante na posição 3 do códon surgiu de considerações cinéticas.

M. Eigen estabeleceu que o anticódon não deve fixar-se muito fortemente ao códon, pois a velocidade de dissociação das pontes de hidrogênio que mantêm unido o complexo códon-anticódon pode, então, ser muito lenta para ser compatível com a conhecida alta velocidade da síntese de proteínas. As pontes de hidrogênio envolvidas no pareamento de bases de somente

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um ou dois nucleotídeos seriam relativamente frouxas e, assim, teriam baixa especificidade, enquanto que as pontes de hidrogênio formadas quando muitos resíduos de nucleotídeos sucessivos, pareados pelas bases com uma seqüência complementar, teriam alta especificidade, mas se dissociariam muito lentamente para ser útil na codificação da síntese de proteínas. Aparentemente, uma trinca de nucleotídeos torna ótimas tanto a especificidade da ligação de hidrogênio coma a velocidade de formação e dissociação da interação códon-anticódon.

Uma quarta característica do código é que três das 64 trincas não codificam para qualquer aminoácido. UAG, UAA e UGA. Como já foi citado, essas trincas são sinais para a terminação das cadeias polipeptídicas.

MUTAÇÕES

Uma alteração em um único nucleotídeo, que pode ser uma deleção, substituição ou mesma adição, é chamada de mutação pontual.

Se o nucleotídeo alterado (substituído) acabar por especificar o mesmo aminoácido que o códon normal, essa será uma mutação silenciosa. Se codificar outro aminoácido, será dita missense e se tornar-se um códon de encerramento, nonsense (sem sentido).

Uma adição ou deleção vai alterar o quadro de leitura e todos os aminoácidos seguintes vão ser alterados até que um códon de término seja alcançado.

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No primeiro esquema temos um RNA mensageiro normal. Logo abaixo ele sofre adição de um nucleotídeo (C) que altera o quadro de leitura, no último esquema, o quadro é recuperado por uma deleção.

UNIVERSALIDADE DO CÓDIGO

As palavras do código genético consideradas biologicamente universais. A questão foi testada de várias maneiras, foram realizados testes cruzados de tRNAs de uma espécie versus códons de outra em todas as espécies testadas até a presente data, as palavras do código são idênticas. Entretanto a freqüência de uso das diferentes palavras do código para um dado aminoácido pode variar de uma espécie para outra. Esse fato sugeriu que a multiplicidade das palavras do código para a maioria dos aminoácidos está relacionada com desenvolvimento evolutivo e diferenciação.

Apesar da universalidade do código genético, a proporção das quatro bases no DNA varia grandemente com a espécie. Assim, o DNA, em várias espécies de bactérias, contem sempre de 30 a 70% de par G-C. As bactérias que têm um alto conteúdo de G-C podem, portanto, usar mais freqüentemente os códons nos quais a terceira posição é G ou C, em comparação com uma bactéria com baixo conteúdo de G-C. A razão para essas variações surpreendentes não é clara, embora DNA com alto conteúdo de G-C seja mais resistente à mutação por luz ultravioleta.

EVOLUÇÃO DO CÓDIGO DE AMINOÁCIDOS

Uma série de idéias interessantes relacionadas com a origem e evolução do código genético emergiu. Primeiro, a

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Já nessa figura, o mesmo RNA mensageiro sofre a adição com alteração no quadro de leitura.Logo após, sofre mais adições sucessivas que vão recuperar o quadro.

universalidade do código sugere que ele surgiu apenas uma vez no curso da evolução biológica. Uma vez que evidências fósseis indicam que procariontes semelhantes às bactérias atuais existiram há 3,3 milhões de anos, parece possível que o código genético atual possa ter sido funcional naquele tempo. 0 fato de as duas primeiras letras das palavras do código possuírem a maior parte da especificidade foi interpretado como significando que as palavras do código poderiam uma vez ter sido duplas, codificando para um grupo de 16 aminoácidos "primordiais" ou 15 aminoácidos mais um códon de terminação. Um código duplo deve ter empregado todo terceiro nucleotídeo como uma vírgula. Parece possível que um grupo de "novos" aminoácidos tenha surgido mais tarde, possivelmente incluindo asparagina, glutamina, metionina, tirosina e triptofano que, assim, requerem trincas para a sua codificação. 0 terceiro nucleotídeo para as novas trincas deve ter derivado dos símbolos usados para vírgulas no código duplo original.

PAREAMENTO CÓDON-ANTICÓDON

Muitos anticódons foram identificados pela análise da seqüência de tRNAs e concluiu-se que códons e seus anticódons correspondentes pareiam na direção antiparalela. Códons e anticódons são escritos na direção 5’ 3', tal como todos os polinucleotídeos.

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Componentes da Síntese Protéica

tRNA

As moléculas de tRNA têm de 73 a 93 nucleotídeos e uma conformação tridimensional específica. Muitas de suas bases está pareada (cerca de 60 a 70% de sua estrutura forma dupla hélice), essa conformação é importante para manter a funcionalidade da molécula, uma vez que o tRNA desdobrado não é capaz de agir como aceptor de aminoácidos. Outra observação curiosa é que apesar da enorme diferença na constituição de bases de diferentes tRNAs, todos eles podem ser obtidos bidimensionalmente no mesmo arranjo de trevo de quatro folhas se as cadeias estão arranjadas de maneira a produzir o máximo pareamento de bases intracadeia.

Os quatro “braços” que são grupos não pareados na estrutura, têm características próprias que se repetem em todos os tipos de tRNA:

Braço do aminoácido: seqüência terminal na extremidade 3’ que corresponde a uma purina seguida de C-C-A. O aminoácido vai se ligar à adenina nessa extremidade da molécula. Quando o tRNA possui um aminoácido covalentemente ligado, é dito carregado e o aminoácido, ativado; quando não está ligado a aminoácidos é descrito como descarregado.

Braço do anticódon: contém uma trinca de nucleotídeos que vai indicar o aminoácido ao qual o tRNA vai se ligar, é essa trinca que se liga ao códon no mRNA através de interações de pontes de hidrogênio. Dessa maneira, o aminoácido necessário é selecionado e posicionado também corretamente na transferência para a cadeia polipeptídica em crescimento. Uma das bases do anticódon é a base oscilante que é menos específica na interação com sua base correspondente do códon do que as outras duas bases do anticódon. Um resíduo de uracila é encontrado próximo do terminal 5' do anticódon, e uma purina ou um derivado da purina é encontrado junto ao terminal 3'.

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Essas bases características servem aparentemente como bloqueadores para delimitar o anticódon.

Braço T ψ C (ribotimina-pseudo-uridina-citidina): é caracterizado pela presença dessa base incomum, a pseudo-uridina (ψ). Esta região é responsável pela ligação do aminoacil-tRNA ao ribossomo no sítio A

Braço DHU (várias diidrouracilas): também é caracterizado pela presença de uma base incomum. Está relacionado com o reconhecimento do tRNA pela amnoacil-tRNA-sintetase.

O tRNA pode apresentar ainda uma alça variável que é mais uma região sem pareamento de bases. Essas regiões que não se pareiam são importantes pois permitem outros pareamentos na estrutura. Essas bases não complementares formam outros tipos de interações, pontes de hidrogênio em interações terciárias e interações hidrofóbicas. Todos os tRNAs têm que seguir uma estrutura comum para interagir de modo semelhante, reconhecendo a enzima especifica e o códon do mRNA.

A molécula de tRNA é em forma de “L” formada por dois segmentos de dupla hélice perpendiculares. Na conformação tridimensional do tRNA, os braços TψC e DHU formam a quina do “L” e o terminal CCA-OH 3’ e o anticódon, as duas extremidades. Isso contribui para que o aminoácido fique bem longe do anticódon não interferindo nas interações com o códon.

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As moléculas de tRNA devem conter pelo menos dois sítios específicos, o sítio de reconhecimento da enzima, no qual o tRNA é ligado à enzima de ativação correspondente, e o sítio de ligação ao ribosoma. Os vários resíduos nucleotídeos dos tRNAs diferem não somente no aminoácido que codificam, mas variam também entre os órgãos ou entre as espécies.

Uma característica notável da estrutura molecular dos tRNA é a presença de várias bases raras, além das bases normalmente encontradas A, U, G e C. Pelo menos 40 nucleosídeos raros diferentes foram descobertos nos tRNAs, sendo a maioria deles formas metiladas dos nucleosídeos comuns. As bases raras podem possivelmente apresentar várias funções. Elas podem impedir o pareamento de bases intracadeia em determinados pontos, para produzir a estrutura ramificada característica, impedir o pareamento de uma base inadequada com o RNA mensageiro e, ainda tornar o tRNA menos suscetível ao ataque hidrolítico de nucleases.

A esterificação do aminoácido a seu tRNA correspondente não contribui para a especificidade do aminoacil-tRNA, uma vez que o grupo aminoacílico não é reconhecido como tal, nem pelo ribosoma nem pelo mRNA-molde. Isso foi comprovado de maneira conclusiva através de experimentos nos quais o resíduo de aminoácido de um aminoacil-tRNA era modificado quimicamente. Esse experimento forneceu evidências para a hipótese de que o tRNA é um "adaptador" molecular, no qual o

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aminoácido é inserido de tal forma que ele possa ser adaptado à linguagem da trinca nucleotídica do código genético.

AMINOACIL-tRNA-SINTETASE

As enzimas ativadoras devem ter especificidade extremamente elevada, tanto para seus aminoácidos quanto para seus tRNAs, pois qualquer erro que surja durante a reação de ativação não poderá ser corrigido durante a formação da cadeia polipeptídica.

Existe mais de um tRNA-específico para cada aminoácido. Todavia uma aminoacil-tRNA-sintetase determinada não é igualmente reativa com todos os tRNA homólogos. Além disso, em algumas células, existe mais de uma aminoacil-tRNA-sintetase para certos aminoácidos, as quais podem diferir em sua especificidade relativa para os tRNAs homólogos, uma aminoacil-sintetase para um determinado aminoácido tem maior atividade quando os tRNAs correspondentes são da mesma espécie.

RNA RIBOSSÔMICO

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Esse esquema demonstra os sítios da aminoacil-tRNA-sintetase: um para a ligação com o aminoacil-adenilato, outro para ligar ATP e outro para tRNA. No final ocorre a acilação do tRNA.

O ribossomo é uma estrutura constituída por RNAr associado a mais de cinqüenta tipos de proteína. Sua função é percorrer a molécula de RNAm e promover a união dos aminoácidos transportados pelos RNAt.

As proteínas desempenham função importante na estrutura e na função do ribossomo, assim como nas interações deste com outros componentes do sistema de tradução. O ribossomo eucariótico tem maior quantidade de proteínas e coeficiente de sedimentação mais alto que os procarióticos.

Cada ribossomo ativo na síntese de proteína se compõe de duas subunidades, a subunidade maior é a que fica aderida ao RER nos polissomos e a menor apresenta o sítio decodificador onde mRNA e tRNA interagem. O ribossomo possui dois sítios, um aminoacil e o outro peptidil (A e P) que serão efetivamente utilizados no processo de tradução. É nesses dois sítios que ocorre a interação do tRNA com o mRNA.

A subunidade 16S do RNA ribossômico de procariontes tem uma seqüência de pirimidinas que se pareia com a seqüência de Shine-Dalgarno (purinas) do RNA mensageiro, interação necessária para o início da síntese em procariontes.

POLISSOMOS

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Subunidades maior e menor do ribossomos, primeiramente dissociadas e depois juntas.

Nas células eucarióticas há tanto ribossomos livres no citoplasma como ribossomos presos às membranas do retículo endoplasmático. Ribossomos livres sintetizam proteínas que atuam no líquido citoplasmático ou no interior do núcleo e das mitocôndrias. Ribossomos presos ao retículo produzem tanto as proteínas que compõem as estruturas celulares membranosas (membrana plasmática, aparelho de Golgi, lisossomos, vacúolos etc.) como as proteínas secretadas pela célula.

A única diferença entre um ribossomo livre e um aderido ao retículo é o tipo de proteína que ele está sintetizando. Se a proteína tiver, em seu início, uma determinada seqüência de aminoácidos, conhecida como seqüência sinal, ela é reconhecida por um complexo protéico que faz o ribossomo aderir à membrana do retículo. À medida que a cadeia polipeptídica vai sendo sintetizada, ela penetra no interior da bolsa do retículo. Quando a síntese termina, a proteína é liberada na cavidade do retículo e o ribossomo desgruda da membrana, dissociando-se em suas duas subunidades.

Se a proteína não tiver a seqüência sinal, o ribossomo que a sintetiza permanece livre no citoplasma.

RNA MENSAGEIRO

Muitas informações significativas estão surgindo com relação às seqüências de codificação em moléculas de mRNA naturais, os sítios de ligação do ribosoma, onde as cadeias polipeptídicas são iniciadas, foram determinados fazendo-se ribosomas ligarem-se ao RNA e, então, submetendo o complexo ribosoma-RNA a ação de ribonuclease, que digere todo o RNA, exceto aquele dos segmentos de 25 a 30 resíduos que estavam ligados aos ribosomas.

Desses e de outros experimentos é possível deduzir que a localização dos sítios de ligação do ribosoma é interna. 0 primeiro cístron do RNA mensageiro sempre começa a uma distância de algumas centenas de nucleotídeos da extremidade 5’, onde o primeiro códon de iniciação (AUG) está localizado. Além disso, a extremidade 3’ tem um longo trecho em seguida do último cístron. Nenhuma dessas longas extremidades do RNA é traduzida por ribosomas de E. coli totalmente suplementados com todos os cofatores necessários; as extremidades, portanto, parecem ter outras funções além da codificação das proteínas.

Todos os cístrons começam com o códon de iniciação AUG, seguido de trincas que codificam para as seqüências

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aminoterminais das proteínas. A busca de códons de terminação revela que podem aparecer mais de um códon de terminação sucessivos, sugerindo um arranjo à prova de falhas, no caso do primeiro códon de terminação ser ultrapassado ou não-reconhecido pelo ribosoma.

Muito pouca informação sobre mensageiros não virais é disponível, tanto para organismos procarióticos como para eucarióticos, uma vez que eles são muito difíceis de isolar em forma pura. Entretanto, os RNAs mensageiros para as cadeias de hemoglobinas α e β foram isolados em forma altamente purificada. Cada um com longas seqüências de resíduos de nucleotídeos não traduzidas em ambas extremidades da molécula.

AMINOÁCIDOS

Todos os aminoácidos que posteriormente surgem na proteína acabada devem estar presentes no momento da síntese protéica.

Se um aminoácido está ausente, por exemplo, se a dieta não contem um aminoácido essencial, a tradução cessa no códon especificando aquele aminoácido. Isto demonstra a importância de ter todos os aminoácidos essenciais e semi-essenciais em quantidades suficientes na dieta para assegurar a continuação da síntese de proteínas.

Dez dos vinte aminoácidos necessários para a síntese são essenciais, isto é, eles não podem ser sintetizados pelo corpo em uma velocidade adequada. Destes dez, oito são essenciais em qualquer situação, enquanto dois (arginina e histidina) são requeridos somente durante períodos de crescimento rápido dos tecidos, característico da infância e da recuperação de uma doença.

FATORES PROTÉICOS

Os fatores protéicos de iniciação, alongamento e de terminação são necessários para a síntese de peptídeos. Alguns destes fatores protéicos realizam uma função catalítica, enquanto outros parecem estabilizar a maquinaria sintética.

ENERGIA

A clivagem de quatro ligações de alta energia é necessária para a adição de um aminoácido à cadeia polipeptídica em

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crescimento: duas do ATP na reação da aminoacil-tRNA-sintetase e duas do GTP, uma para a ligação do aminoacil-tRNA no sítio A e outra para a etapa de deslocamento. Além disso, moléculas adicionais de ATP e GTP são requeridas para a iniciação e terminação da síntese da cadeia polipeptídica.

Mecanismo de Tradução

DIREÇÃO DA SÍNTESE PROTÉICA

Para determinar a direção de crescimento da cadeia polipeptídica, foi realizada uma experiência onde leucina marcada com trítio foi adicionada a suspensões de reticulócitos, sintetizando ativamente as cadeias α e β de hemoglobina, que contêm muitos resíduos de leucina e cujas seqüências de aminoácidos eram conhecidas. A incubação era mantida a baixa temperatura para diminuir a velocidade da síntese protéica. Eram então tomadas amostras dos reticulócitos a diferentes intervalos, entre 4 e 60 min. A hemoglobina marcada formada pelos reticulócitos era isolada, as cadeias α e β separadas e clivadas em fragmentos peptídicos com tripsina, e os fragmentos resultantes separados por eletroforese em papel. Obviamente as cadeias da hemoglobina que se tomaram isotopicamente marcadas no intervalo de 4 min estavam quase completas no momento em que foi adicionado o isótopo da leucina. Portanto somente alguns resíduos de leucina marcada poderiam ter sido acrescentados ao terminal de tais cadeias antes que elas fossem completadas e desconectadas do ribosoma. Reciprocamente, nas cadeias que haviam sido iniciadas quando o isótopo da leucina foi adicionado, todos os peptídeos que continham leucina eram

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marcados, exceto aquele da extremidade amino-terminal. Concluiu-se, portanto, que as cadeias polipeptídicas são construídas começando com o aminoácido amino-terminal, cujo grupo carboxílico se combina com o aminogrupo do aminoácido subseqüente.

ESTÁGIOS SUCESSIVOS DA SÍNTESE PROTÉICA

A síntese de cadeias polipeptídicas ocorre em quatro estágios principais e enzimas específicas e cofatores são necessários em cada estágio. No primeiro estágio, chamado de passo de ativação e que tem lugar inteiramente no citoplasma solúvel, aminoácidos são esterificados enzimaticamente a seus tRNAs correspondentes, às custas de energia do ATP. No segundo estágio, denominado iniciação o RNA mensageiro, que carreia a mensagem genética especificando a seqüência de aminoácidos, e o primeiro aminoacil-tRNA, ou iniciador, são ligados à menor subunidade do ribosoma, um processo que requer três proteínas específicas, chamadas fatores de iniciação (FI-1, FI-2, FI-3), assim como GTP e Mg

2+. A grande subunidade ribosomal então se une, para formar um ribosoma funcional, pronto para a etapa seguinte.

No terceiro estágio, chamado alongamento, a cadeia polipeptidica é aumentada em seu comprimento, pela adição seqüencial de novos resíduos aminoacílicos, transferidos enzimaticamente dos ésteres aminoacil-tRNA, cada um dos quais ligado ao ribosoma em resposta a um códon específico, ou trinca básica no mRNA. Para aumentar o comprimento da cadeia, são necessários dois fatores de alongamento, 0 FA-T e 0 FA-G, que também são proteínas. Após a formação de cada nova ligação peptídica, o ribosoma se move ao longo do mRNA para trazer o códon seguinte à posição para alinhamento do próximo ami-noacil-tRNA, um processo que sequer energia armazenada na forma de GTP.

No último estágio da síntese protéica, a terminação, a cadeia polipeptídica é completada quando são atingidas marcas apropriadas de terminação no mRNA; o produto é então liberado do ribosoma, um processo que necessita de proteínas específicas chamadas fatores de liberação.

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ATIVAÇÃO

No primeiro estágio da síntese de proteínas, que ocorre no citossol, os vinte diferentes aminoácidos que funcionam como blocos construtivos de proteínas são esterificados com seus tRNAs correspondentes, pela ação de uma classe de enzimas conhecida como de ativação de aminoácido, ou mais especificamente, aminoacil-tRNA-sintetase, sendo cada enzima altamente específica para um aminoácido e para seu tRNA correspondente. A reação catalisada é:

Mg2+

aminoácido + tRNA + ATP aminoacil-tRNA + AMP + PPi

As aminoacil-tRNA-sintetases têm necessidade absoluta de Mg2+ e contêm um ou mais grupamentos de sulfidrila que são essenciais para que elas apresentem atividade.

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Na reação de ativação, ocorre a clivagem do pirofosfato do ATP produzindo AMP e pirofosfato. A transferência de um aminoácido para seu tRNA ocorre em duas etapas distintas, no sítio catalítico da enzima. Na primeira etapa, o ATP reage com o aminoácido, com um deslocamento de pirofosfato, para formar um intermediário ligado à enzima, um ácido aminoaciladenílico. Nesse intermediário, o grupamento carboxílico do aminoácido é inserido por uma ligação de anidrido com o grupamento 5'-fosfato do AMP; a ligação de anidrido de alta energia ativa o grupo carboxílico do aminoácido. Na segunda etapa, 0 grupo aminoacílico é transferido do AMP ao terminal 3' de seu tRNA, o que é seguido pela liberação dos produtos, um aminoacil-tRNA e ácido adenílico. As duas etapas são:

ATP + aminoácido [ácido aminoaciladenílico] + pirofosfato

[ácido aminoaciladenílico] + tRNA aminoacil-tRNA + ácido adenílico

O grupo aminoacílico torna-se esterificado pelas carboxilas ativadas com o grupamento livre 2'-hidroxílico do resíduo AMP-terminal na extremidade 3' da molécula de tRNA, aquela que suporta a seqüência C-C-A-terminal.

Observe que a reação de ativação global ocorre com uma diminuição relativamente pequena na energia livre-padrão. A nova ligação de éster entre o aminoácido e o tRNA, formada às custas da hidrólise da ligação de alta energia do ATP, é portanto, uma ligação de alta energia. Uma vez que o pirofosfato inorgânico formado na reação de ativação sofre subseqüente hidrólise a ortofosfato, pela pirofosfatase, duas ligações de fosfato de alta energia podem, em última análise, ser rompidas para cada molécula de aminoácido ativado. A reação global para a ativação do aminoácido na célula é portanto, essencialmente irreversível.

As aminoacil-tRNA-sintetases são altamente específicas para ambos, o aminoácido e o tRNA correspondente. Esse é um assunto de extrema importância, já que, uma vez formado o aminoacil-tRNA, ele é reconhecido somente pela trinca anticódon de seu tRNA, e não pelo resíduo de aminoácido. Assim, as aminoacil-tRNA-sintetases têm de possuir dois sítios de ligação muito específicos, um para o substrato aminoácido e o outro para o tRNA correspondente; existe também um terceiro sítio para ligar ATP.

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Para aumentar a fidelidade dessa reação, o intermediário de aminoácido ligado à proteína passa por uma etapa de verificação ou edição onde aminoácidos incorretamente ligados são hidrolisados.

INICIAÇÃO

A síntese de uma proteína começa com o reconhecimento de uma região específica do RNAm pela subunidade menor do ribossomo. Um grupo de proteínas, os fatores de iniciação, auxilia esse reconhecimento e a colocação da subunidade menor sobre a primeira seqüência AUG encontrada no RNAm. Essa seqüência é chamada códon de início e marca o começo da tradução da mensagem genética. Uma vez que o códon AUG corresponde à metionina, esse é o primeiro aminoácido de qualquer cadeia polipeptídica.

O códon AUG pode ser reconhecido por dois diferentes tipos de RNAt, ambos portadores do anticódon CAU e que transportam o aminoácido metionina. Um desses RNAt, entretanto, atua apenas na iniciação da síntese de proteínas, colocando o primeiro aminoácido na cadeia polipeptídica.

Já o outro tipo de RNAt da metionina atua durante a etapa de elongação, adicionando as demais metioninas que a proteína possua.

Na E. coli e em todos os outros procariotes, a síntese de todas as proteínas começa com o resíduo de metionina iniciador que não entra como metionil-tRNA, mas como N-formilmetionil-tRNA (fMet-tRNA). 0 produto de uma transformilação enzimática na qual um grupo de formila é transferido do N10-formiltetraidrofolato ao aminogrupo do metionil-tRNA. Existem duas espécies de metionil-tRNAMet; somente uma delas, designada metionil-tRNAF, é capaz de aceitar o grupo de N-formil. A reação é:

N10-formiltetraidrofolato + Met-tRNAF tetraidrofolato + fMet-tRNAF

A enzima que catalisa essa reação não formila a metionina livre ou um resíduo de metionina ligado a outras espécies de tRNAMet. Provavelmente o fMet-tRNAF inicia a síntese da cadeia peptídica não somente na bactéria, mas também na mitocôndria de células eucarióticas. Verificou-se que o resíduo iniciador na síntese de proteínas citoplasmáticas de células eucarióticas é um resíduo de metionina não acilado, esterificado a um tRNAMet

específico, o tRNA iniciador.

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Durante a síntese protéica há uma dissociação contínua de ribosomas 70S em subunidades as subunidades constantemente reassociam-se. 0 ribosoma 70S precisa primeiro dissociar-se em subunidades 50S e 30S antes que a síntese polipeptídica possa começar; o mRNA e o aminoacil-tRNA iniciante não podem ligar-se diretamente aos ribosomas 70S, mas são primeiramente ligados a subunidades 30S, que então se combinam com as subunidades 5OS. Entretanto é um processo complexo de várias etapas que requer a participação de três proteínas específicas, denominadas fatores de iniciação (FI-1, FI-2 e FI-3).

As etapas de formação de um ribosoma completo e funcional é a seguinte: a subunidade 30S forma primeiramente um complexo com FI-3, o qual liga então o mRNA; com esse complexo junta-se uma molécula de F-1. Então Met-tRNA e GTP ligam-se ao FI-2, e o complexo resultante combina-se com o complexo da subunidade 30S, FI-3, mRNA e FI-1, para produzir o que é chamado de complexo de iniciação. 0 complexo de iniciação combina-se então com a subunidade 50S para formar um ribosoma 70S completo e funcional. Para isso, o GTP ligado é hidrolisado a GDP e Pi e os três fatores de iniciação, FI-1, FI-2 e FI-3, dissociam-se do ribosoma formando o complexo de início 70S.

Nesse ponto, o anticódon do fMet-tRNA pareia-se com o códon iniciador AUG no RNAm e a seqüência rica em purinas do RNAm com a seqüência rica em pirimidinas no RNA 16S do

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A iniciação da síntese em procariontes envolve a interação de três fatores de iniciação (IF-1, IF-2 e IF-3) com a subunidade menor do ribossomo, mais tRNA iniciador acilado.Depois a subunidade maior se liga havendo hidrólise de GTP

ribossomo. Além disso, o tRNA está localizado no sítio peptidil do ribossomo. Essas interações determinam a matriz de leitura.

ELONGAÇÃO

Após a junção das subunidades ribossômicas, o sítio A, até então vazio, é ocupado por um aminoacil-RNAt correspondente ao segundo códon do RNAm. A metionina solta-se do RNAt iniciador e une-se ao aminoácido recém-chegado por uma ligação peptídica.

Enquanto a ligação peptídica se estabelece, o ribossomo move-se em relação ao RNAm, deslocando-se o equivalente a um códon. O RNAt iniciador sai do ribossomo, e o segundo RNAt, com dois aminoácidos presos a sua extremidade, passa a ocupar o sítio P. O sítio A fica vazio e pronto para receber um novo aminoacil-RNAt. O processo se repete até que todos os aminoácidos codificados pelo RNAm sejam adicionados à cadeia polipeptídica.

No alongamento da cadeia polipeptídica ocorrem três etapas.

1 - O aminoácido se liga ao sítio A do ribossomo:

Na primeira etapa, o aminoacil-tRNA que vai entrar é ligado ao sítio de aminoacil (sitio A) do complexo ribosoma 70S completo, num processo bastante elaborado.

O fator de alongamento (FA-T) posiciona o aminoacil-tRNA no ponto A, onde está o códon cognato do RNAm. 0 FA-T contém

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Seqüência de Shine-Dalgarno do RNAm pareada com a seqüência 3’ do RNAr.

duas subunidades, FA-Ts e FA-Tu. 0 FA-Tu contém GTP ligado que quando hidrolisado a GDP sofre alteração de sua afinidade e junta-se ao FA-Ts. 0 complexo FA-Tu-GTP liga-se ao aminoacil-tRNA. Esse complexo liga-se então ao ribosoma, simultaneamente, o GTP ligado é hidrolisado a GDP e P i; o GDP deixa o ribosoma na forma de um complexo FA-Ts-GDP. A energia fornecida pela hidrólise do GTP é necessária para pôr o aminoacil-tRNA na posição correta.

A ligação do FA-Tu com o aminoacil-tRNA recém sintetizado o protege da hidrólise e o leva para o local correto no ribossomo. É interessante observar que o FA-Tu-GDP só vai liberar o aminoacil-tRNA se o pareamento códon-anticódon for correto, caso contrário, vai ocorrer uma nova fosforilação do GDP e o tRNA é carregado para fora do ribossomo.

2 – Formação da ligação peptídica:

O ponto A do ribossomo está ocupado por um aminoacil-tRNA e o ponto P por um fMet-tRNA. O EF-Tu já saiu do ribossomo. A ligação peptídica consiste de um ataque nucleófilo do aminogrupo do aminoacil-tRNA ao carbono do éster do fMet-RNA. Essa reação é catalisada pela peptidil-transferase, que está presente na subunidade 50S do ribosoma.

0 produto é um dipeptidil-tRNA. Nem ATP nem GTP são necessários para a formação da nova ligação peptídica, que é feita presumivelmente às custas da energia de ligação de ésteres que existe entre a N-formilmetionina e seu tRNA. Ocorre uma mudança nas interações do tRNA com as subunidades do ribossomo, sendo que o tRNAF desacilado ocupa o ponto E na subunidade 50S e continua no ponto P na subunidade 30S. O dipeptidil-tRNA ocupa o ponto P na subunidade 50S e o ponto A na 30S.

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Embora essa descrição se refira à formação da primeira ligação peptídica de uma cadeia polipeptídica, ocorre um pro-cesso idêntico em todo o ciclo de alongamento.

3 - Translocação

Depois que é feita a ligação peptídica, o tRNA desacilado precisa deixar o ribossomo e o peptidil-tRNA deve desocupar o ponto A para permitir a chegada de outro aminoácido.

Para essa etapa necessita-se de um fator de alongamento (FA-G), que assim como o FA-Tu alterna-se entre as formas GTP e GDT. Algumas proteínas são também necessárias, esses fatores juntos acionam a translocação do tRNA desacilado do ponto P para o ponto E na subunidade 30S e do dipetidil-tRNA do ponto A para o ponto P, assim como do mRNA que se desloca 3 nucleotídeos.

0 GTP liga-se primeiro ao FA-G, e o complexo resultante liga-se ao ribosoma. 0 GTP sofre então hidrólise a GDP e Pi. A hidrólise do GTP fornece a energia para a alteração conformacional. Após a etapa de translocação, o FA-G dissocia-se do ribosoma.

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peptidiltransferase

Os eventos envolvidos no alongamento requerem uma topologia altamente específica dos sítios para ligar o peptidil-tRNA, o aminoacil-tRNA, o mRNA, os fatores de alongamento e o GTP. 0 ribosoma sofre provavelmente alterações complexas e específicas em sua forma durante cada ciclo para construção de ligações.

TÉRMINO DA TRADUÇÃO

A síntese da cadeia polipeptídica termina quando o sítio A do ribossomo encontra um dos códons de término (UAG, UAA ou UGA). Como não há RNAt correspondente a esses códons, o sítio A é ocupado por proteínas chamadas fatores de terminação. O fator de terminação faz com que a cadeia polipeptídica se solte do último RNAt e induz a dissociação das subunidades ribossômicas, com liberação do RNAm.

O término da cadeia polipeptídica e seu desligamento do

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Esquema do processo de alongamento, aqui estão demonstradas as três fases (aminoácido entrando no sítio A do ribossomo, ligação peptídica e translocação).

ribosoma requerem passos especiais, a conclusão de cadeias polipeptídicas envolve o reconhecimento do códon de terminação por fatores de liberação (R1, R2, R3) que vão alterar a especificidade da enzima peptidil-transferase, de modo que é a água e não a amina o aceptor da fração peptidil ativada, ou seja, ela age como uma hidrolase e faz uma hidrólise na ligação entre o polipeptídio e o tRNA o ponto P.

Uma vez liberado o polipeptídio, o último tRNA e o mRNA o abandonam. 0 ribosoma 70S livre, então dissocia-se nas suas subunidades 5OS e 30S um processo que requer um dos fatores específicos de iniciação, e pode ser iniciada uma nova cadeia polipeptídica.

INIBIDORES DA BIOSSÍNTESE DE PROTEÍNAS

Essa tabela resume os principais inibidores da síntese de proteínas, suas ações, local e efeito.

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O término envolve vários componentes. Existem três fatores de terminação que vão reconhecer o códon e a peptidil-transferase vai hidrolisar a ligação do peptídeo com o último tRNA. No final todos os componentes são liberados.

Processamento pós-Traducional

Depois que um polipeptídeo é sintetizado por um ribossoma, ele precisa sofrer urna modificação cavalente para produzir sua forma biologicamente ativa.

O grupamento de N-formila do resíduo fMet não aparece na proteína já pronta dos procariontes; ele é removido pela ação de uma deformilase. Além disso, o resíduo iniciante metionílico de alguns polipeptídeos pode também ser removido por uma

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metionina-aminopeptidase. Algumas proteínas são acetiladas no α-aminogrupo NH2-terminal. Esses grupos de acetila são introduzidos depois de completada a síntese protéica; eles não estão relacionados com a iniciação da cadeia durante a biossíntese da proteína.

Depois que a cadeia polipeptídica foi construída, são formadas enzimaticamente pontes cruzadas intracadeia de dissulfeto. A informação necessária para o estabelecimento das ligações cruzadas corretas das proteínas já está inerente na seqüência de aminoácidos da cadeia polipeptídica.

Outras modificações covalentes que ocorrem após a tradução incluem as reações de fosforilação, metilação e hidroxilação, assim como reações que envolvem a união de coenzimas ou grupos prostéticos.

A informação que indica por qual desses processos a proteína vai passar para se tornar ativa está contida na seqüência de aminoácidos da sua própria estrutura. A princípio existem dois caminhos, ou a proteína permanece sendo sintetizada por polissomos livres no citosol, ou se tiver a seqüência sinal vai para dentro das cisternas do retículo endoplasmático.

ENDEREÇAMENTO DE PROTEÍNAS

As proteínas destinadas a sofrerem alguma modificação covalente tanto no RER como no aparelho de Golgi, devem possuir uma seqüência amino-terminal que serve de enderaçamento. Essa seqüência é composta de 13 a 36 aminoácidos, sendo muitos deles hidrófobos.

Assim que a síntese da proteína começa e que essa seqüência desponta do ribossomo sintetizador, uma partícula reconhecedora de sinal (PRS) que é uma ribonucleoproteína, e liga ao ribossomo com a seqüência sinalizadora. Essa ligação impede o alongamento e posterior enovelamento da proteína, o que dificultaria a sua passagem pelos canais condutores de proteínas.

O complexo PRS-ribossomo se aproxima da membrana do RER e a PRS se liga ao receptor de PRS (proteína de ancoragem) que é uma proteína integrante da membrana. Essa ligação dispara a troca de GDT por GTP ligado à proteína de ancoragem, a proteína na forma GTP se liga fortemente à PRS e o peptídeo de sinal é liberado e pode então ser capturado pela maquinaria de translocação. O GTP da proteína receptora é hidrolisado e a PRS é liberada.

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TRANSLOCAÇÃO

Os peptídeos de sinal na maquinaria de translocação (translócon), formada de várias subunidades de proteínas integrantes e periféricas da membrana, abrem os canais condutores de proteínas.

A translocação é regulada por seqüências de parada de transferência (ou de ancoragem na membrana) e seqüências de sinal numa cadeia que cruza a membrana mais de uma vez.

ENOVELAMENTO

Proteínas acompanhantes (chaperone) mantém as proteínas nascentes desdobradas até que estejam prontas para se dobrarem, impedindo as interações heterogêneas, intermoleculares impróprias. Pertencem à classe das proteínas heat-shock.

O complexo ADP-chaperone tem alta afinidade por cadeias polipeptídicas não enoveladas, quando ocorre essa ligação, o ADP do centro catalítico é trocado por ATP que libera a proteína, a hidrólise subseqüente do ATP ligado possibilita que a acompanhante se ligue novamente a um segmento não enovelado.

Existem outras proteínas que participam do enovelamento, assim com a dissulfeto isomerase que acelera o enovelamento catalisando o pareamento correto de dissulfetos e a peptidil prolil isomerase que também impulsiona o enovelamento.

GLICOSILAÇÃO DO CERNE

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Muitas proteínas que são destinadas a se tornar parte de uma membrana plasmática ou serem secretadas pela célula possuem cadeias de carboidratos ligados a grupos hidroxila da serina ou treonina (ligação O) ou asparagina (ligação N). A adição por etapas dos açúcares ocorre no RE e no complexo de Golgi.

A glicosilação do cerne ocorre no RE, os doadores ativados são derivados de UDP, GDP e dolicol pirofosfato. É necessário um carreador ativado: o dolicol fosfato que vai acrescentar resíduos de açúcares em seqüências internas da proteína, a transferase catalisa a transferência do oligosídeo para a seqüência Asn-X-Ser(Tre).

Vários ciclos de adição e corte de glicose ocorrem enquanto a proteína está no RE até que ela esteja

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completamente formada e montada. Enquanto estiver alguma glicose terminal presente no oligosídeo da proteína, ela será ancorada pela calnexina.

GLICOSILAÇÃO TERMINAL

No golgi os oligosídeos são processados dependendo da seqüência e conformação da proteína à qual estão ligados e da composição da glicosil transferase presente o aparelho de Golgi.

São acrescentados alguns resíduos de N-acetil-glicosamina e retirados outros, assim como são retiradas algumas manoses, acrescentadas fucose, galactose e ácido siálico para formar um oligosídeo complexo.

DEGRADAÇÃO DE PROTEÍNAS

Proteases digestivas hidrolisam proteínas da dieta e não desempenham nenhum papel de reciclagem intracelular de roteínas. A digestão intracelular de proteínas provenientes do ambiente extracelular ocorre dentro dos lisossomos, embora essa rota ocorra, não é a principal de reciclagem de proteínas.

A ubiquitina marca as proteínas para a degradação, a sua ligação ocorre entre ε-amino grupos de resíduos de lisina da proteína e o resíduo carboxi-terminal de glicina da ubiquitina.

Proteases dependentes de ATP então degradam a proteína alvo e liberam a ubiquitina para outros ciclos de degradação

A proteólise dependente de ubiquitina desempenha um papel importante na regulação de eventos celulares.

Bibliografia Consultada

DEVLIN, THOMAS M; Manual de bioquímica com correlações clínicas; São Paulo, Editora Edgard Blücher

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LEHNINGER, ALBERT L., Princípios de Bioquímica, São Paulo, Editora Sarvier, 1984

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