Transcritoma e proteoma do fungo Paracoccidioides · Ao Prof. Dr. Robert A. Cramer e seus alunos Dawoon, Arsa, Kristin e Kelly por me darem suporte no laboratório durante o doutorado

UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA

FACULDADE DE MEDICINA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM

PATOLOGIA MOLECULAR

Transcritoma e proteoma do fungo Paracoccidioides

em condições de privação de glicose ou hipóxia

Tese apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Patologia Molecular da

Faculdade de Medicina, Universidade de

Brasília, como requisito para obtenção do

grau de Doutor em Patologia Molecular.

Candidata: Patrícia de Sousa Lima

Orientadora: Dra. Célia Maria de Almeida Soares

Brasília- DF, 2013

Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca Central da Universidade de Brasília. Acervo 1013385.

L ima , Pa t r í c i a de Sousa .

L732 t Transc r i t oma e pro t eoma do f ungo Paracocc i d i o i des

em cond i ções de pr i vação de g l i cose ou h i póx i a / Pa t r í c i a

de Sousa L ima . - - 2013 .

x i x , 218 f . : i l . ; 30 cm.

Tese (dou t orado) - Un i vers i dade de Bras í l i a , Facu l dade

de Med i c i na , Programa de Pós -Graduação em Pa to l og i a

Mo l ecu l a r , 2013 .

I nc l u i b i b l i ogra f i a .

1 . Paracocc i d i o i des bras i l i ens i s . 2 . Gl i cose . 3 . Pa t o l og i a

mo l ecu l a r . I . Soares , Cé l i a Mar i a de Alme i da . I I .

T í t u l o .

CDU 616 . 993 . 192 .1

II

TRABALHO REALIZADO NO LABORATÓRIO DE BIOLOGIA

MOLECULAR, DO DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E

BIOLOGIA MOLECULAR, NO INSTITUTO DE CIÊNCIAS

BIOLÓGICAS, UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS.

APOIO FINANCEIRO: CAPES/ CNPq/ FAPEG/ PRONEX.

III

BANCA EXAMINADORA

TITULARES:

Profa. Dra. Célia Maria de Almeida Soares

Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Goiás, UFG.

Profa. Dra. Rosely Maria Zancopé Oliveira

Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas, Fundação Oswaldo Cruz,

FIOCRUZ.

Profa. Dra. Izabela Marques Dourado Bastos

Instituto de Ciências Biológicas, Universidade de Brasília, UnB.

Prof. Dr. Carlos André O. Ricart


Prof. Dr. Sébastien Olivier Charneau


SUPLENTE:

Prof. Dr. Sinji Borges Ferreira Tauhata

Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Goiás, UFG.

IV

Feliz o homem que acha a sabedoria e

adquire o conhecimento porque são mais

preciosos do que pérolas e melhores do

que ouro mais fino. Tudo o que desejares

não se compara a tais bens!

Provérbios 3: 13-15

V

Dedido este trabalho aos meus queridos familiares que são reflexo do

cuidado de Deus na minha vida!

... Ao meu pai José Marcos que nunca mediu esforços para minha

formação no âmbito intelectual e pessoal. É meu grande exemplo. Amo

você!

... À minha mãe Sandra, que sempre me preparou para as adversidades

da vida e me ensina as verdadeiras dádivas de Deus. Tem um coração

imenso. Também te amo!

... À minha irmã Débora que sempre me mostrou força, competência e

fé, em tudo que faz! Você me anima a seguir em frente sem medo!

Agradeço pelo companheirismo em todas as fases da minha vida! Amo

pra sempre!

... Ao meu querido esposo Rodrigo que nunca me impediu de crescer.

Sempre quer meu bem e está disposto a viver comigo por mais uns 80

anos. Sinto orgulho de conviver com alguém tão inteligente, alegre e que

nunca me desampara!Obrigada pelo apoio... Te amo muito!

... Ao meu cunhado Gustavo, que apesar de novo integrante da família já

tem meu reconhecimento de pessoa corajosa e muito sábia. Deus tem

grandes planos para você!

Tudo que sou e tenho sou grata à vocês! Recebo amor, carinho,

atenção, paciência e zelo todos os dias da minha vida. Deus me deu

vocês para que as preciosidades Dele possam ser impressas em mim!

Muito obrigada!

VI

AGRADECIMENTOS

Agradeço de forma especial à Profa. Dra. Célia Soares pela oportunidade em

me orientar e suprir meios para que este trabalho fosse desenvolvido. Admiro a

extrema competência e sabedoria em tudo que a senhora faz resultando em um trabalho

científico brilhante que serve de exemplo a todos que querem seguir a mesma carreira.

Mesmo com toda adversidade, a senhora construiu um ambiente de trabalho de

excelência, superior a muitos lugares dentro e fora do nosso país. Contribuiu para que

eu conhecesse outros países, outros laboratórios e fizesse cursos que foram

extremamente importantes para minha formação. Sou eternamente grata à você!

Ao Prof. Dr. Alexandre Bailão por toda contribuição que me foi dada, científica

e pessoal. Além de proporcionar suporte científico, se revelou um verdadeiro amigo,

uma pessoa dedicada a fazer todos ao seu redor se sentirem bem e felizes! Admiro seu

trabalho, dedicação, inteligência e otimismo!

Aos Professores. Dr. Clayton Borges e Dra. Juliana Rocha que sempre

estiveram dispostos em me auxiliar. Obrigada pelo apoio e por desempenharem um

papel fundamental na formação de todos dentro do laboratório!

Às Professoras Maristela e Sílvia pela gentileza na qual sempre fui tratada.

Obrigada pela colaboração!

Ao Prof. Dr. Robert A. Cramer e seus alunos Dawoon, Arsa, Kristin e Kelly por

me darem suporte no laboratório durante o doutorado sanduíche. Aos demais

colaboradores, Profa. Dra. Ana Tereza Vasconcelos e Prof. Dr. Gabriel da Rocha

Fernandes, por suas valiosas contribuições e sugestões.

Aos professores Carlos André Ricart, Sebastién Charneau, Rosely Oliveira,

Izabela Bastos e Sinji Tauhata por aceitaram participar da banca e contribuir para

nosso trabalho.

VII

Às alunas de pós-doutorado Luciana Casaletti, Lilian e Ana Flávia, meu muito

obrigada! À Lú nem se fala! Trabalhar com você sempre foi uma felicidade pra mim.

Você é uma pessoa extremamente competente e que tem um futuro brilhante pela frente.

Pra mim, você é uma verdadeira amiga que completa nosso “clube da Luluzinha”.

Surpreendo-me a cada dia o quanto você é bondosa e paciente com todos, como se

fosse uma mãe mesmo... é a nossa Lú! Você sempre me deu muitos conselhos e vou

levá-los por toda vida! Obrigada por me auxiliar sempre que necessário, inclusive

quando estive fora do país! Você e o Sinji são muito especiais pra mim.

À Lilian, que mesmo recente no laboratório me conquistou com sua competência

e disposição em ajudar! Você faz diferença onde está e isso é dom de Deus. Adoro ouvir

suas histórias doidas e isso acaba tornando meu dia mais feliz. Você nos trouxe mais

confiança e alegria de que tudo vai dar certo! Te peço pra não sair pra comprar

cigarro...(risos).

À Ana Flávia que sempre se mostrou uma pessoa forte e objetiva! Agradeço por

ajudar na implantação da proteômica no nosso laboratório e estar sempre pronta a

ajudar à todos!

Às minha queridas amigas Mirelle e Elisa Flávia... A nossa amizade é muito

valiosa pra mim! Durante a iniciação científica, mestrado e doutorado passamos

momentos muito felizes e também difíceis! Dividimos alegrias e aflições tanto pessoais

quanto profissionais! Depositamos umas nas outras a fé de que tudo iria terminar bem

e sempre funcionou. Agradeço toda ajuda, companheirismo e peço à Deus que as

ilumine muito! Amo vocês...

À Mariana Tomazetti, minha amiga de longa data. Você é um exemplo pra mim

de objetividade, força, luta pela vida. Admiro sua sinceridade, dedicação em tudo que

faz e disposição em ajudar. É muito bom saber que tenho mais uma pessoa em quem

posso confiar e dividir experiências. Torço muito pra que tudo se encaminhe bem na

sua vida. Obrigada por ser essa pessoa maravilhosa!

Aos alunos de mestrado e iniciação científica Lucas Nojosa e Rafaela Borges no

qual tento auxiliar. Vocês me trouxeram alegria e são verdadeiros pequenos cientistas.

VIII

Fico surpresa com o compromisso, inteligência e esperteza que têm e isso é reflexo do

caráter e formação intelectual de cada um. Plantem para que colham frutos dignos e

agradáveis! Não parem com os obstáculos que virão pois serão degraus para o

sucesso!

À Marielle e Jú de Curcio por serem pessoas agradáveis e simpáticas em todo

tempo. Obrigada por toda ajuda!

À Laurine por ser um exemplo de superação e dedicação em tudo que faz.

Sucesso ...

À Sheyla, Lucas Oliveira e Leandro Nascimento pela companhia na sala de

estudo e sentimentos sinceros em relação à mim ... sorte na caminhada de vocês!

Ao Neto, Renata e Pati Zambuzzi por tantos momentos legais que passamos

juntos...

Aos alunos que iniciam carreira no LBM: Fabiana, LeLeandro, Luís Paulo,

André, Gabriel, Dani, Alessandro, Amanda, Alex, Hanna, Paulo Henrique, Edilânia,

Vanessa, Igor, Rebecca, Thaty, Paula, Zairo, Diandra, Felipe, Karla, Carla, Lívia e

Joyce. Acredito que vocês podem fazer diferença como pesquisadores, caso queiram!

Aos alunos que fizeram parte do meu convívio no laboratório, mas que não

trabalham mais conosco como a Day, Pri, Simone Weber, Dacie, Kelly, Luciane, Fabi,

Tereza Cristina, Ronney, Rod e Wesley Brito. Vocês foram excelentes companhias...

Aos professores de Brasília que contribuíram no meu trabalho ou participaram

da minha avaliação em algum momento do doutorado tais como Sônia Báo, Jaime

Santana, Sebátien Charneau, Izabela Bastos e Edivaldo Filho. Ao professor Bergmann

Ribeiro que, no posto de coordenador da Pós-Graduação, esteve disposto a me ajudar

sempre que precisei. Ao atual coordenador Carlos André Ricart pelo compromisso em

fazer um ótimo trabalho. Ao pessoal da secretaria, Jaqueline, Alessandro, Daniela e

atualmente o Dênis que sempre me ajudaram. Só tenho a agradecer!

IX

À minha cunhada Lariza e concunhado Péricles que sempre estiveram de braços

abertos a me receber em Brasília durante meu mestrado e doutorado. Vocês fazem

parte da minha formação e agradeço pela ajuda na minha carreira. Amo vocês...

Às minhas amigas Fernanda, Theyssa e Janaína que sempre me deram apoio

pra continuar. Nunca me deixaram sozinha e nossos bate-papos me ajudaram a lidar

com a solidão em momentos difíceis. Obrigada Thê pela estadia em Brasília em muitos

momentos das minhas idas e vindas de lá durante disciplinas e experimentos. Muito

obrigada meninas...

Enfim, à todos que de alguma forma contribuíram para o desenvolvimento deste

trabalho!

Meu muito obrigada!

X

PRODUÇÃO CIENTÍFICA DURANTE O

DOUTORAMENTO

Artigo completo publicado em periódico

1- Lima, PS; Bailão, EFLC; Silva, MG; Castro, NS; Báo, SN; Orlandi, I; Vai, M;

Soares, CMA. Characterization of the Paracoccidioides beta-1,3-glucanosyltransferase

family. FEMS Yeast Research. 12: 685–702, 2012.

Artigo submetido para publicação

1- Lima, PS; Casaletti, L; Bailão, AM; Vasconcelos, ATR; Fernandes, G; Soares,

CMA. Transcriptional and proteomic responses to glucose deprivation in

Paracoccidioides. PLOS Neglected Tropical Diseases. (submetido), 2013.

Manuscritos em preparação

1- Lima, PS; Chung, D; Bailão, AM, Cramer, RA; Soares, CMA. Characterization of

Paracoccidioides responses to hypoxia stress.

2- Casaletti, L; Lima, PS; Bailão, AM; Báo, SN; Soares, CMA. Proteomic analysis of

mitochondria enriched fraction of Paracoccidioides under glucose deprivation.

3- Oliveira, LN; Lima, PS; Casaletti, L; Bailão, AM; Borges, CL; Soares, CMA.

Proteomic analysis of the Paracoccidioides nucleus.

Trabalhos apresentados em eventos internacionais

Lima, PS; Casaletti, L; Bailão, AM; Cerdeira, L;Vasconcelos, ATR; Soares, CMA.

Transcriptional and proteomic analysis of Paracoccidioides in response to glucose

starvation. In: 18th Congress of International Society for Human and Animal Mycology,

Berlim, Germany, 2012. Apresentação oral.

XI

Lima, PS; Bailão, AM; Parente, AFA; Borges, CL; Soares, CMA. Proteomic analysis

of the response of Paracoccidioides to hypoxia. In: 18th Congress of International

Society for Human and Animal Mycology, Berlim, Germany, 2012. Pôster.

Lima, PS; Bailão, AM; Parente, AFA; Borges, CL; Soares, CMA. Proteomic analysis

of Paracoccidioides brasiliensis during hypoxic condition. In: XI International Meeting

on Paracoccidioidomycosis, Taubaté-SP-Brazil, 2011. Pôster.

Trabalhos apresentados em eventos nacionais

Oliveira, LN; Lima, PS; Casaletti, L, Bailão, AM; Borges, CL; Soares, CMA.

Proteomic analysis of the Paracoccidioides nucleus. 27o Congresso Nacional de

Microbiologia, 2013. Pôster.

Casaletti, L; Lima, PS; Bailão, AM; Soares, CMA. Analysis of the mitochondrial

response of Paracoccidioides to glucose starvation: a proteomic approach. In: 28a

Reunião de Genética de Microrganismos (REGEM) Foz do Iguaçu-PR, 2012. Pôster.

Lima, PS; Casaletti, L; Bailão, AM; Soares, CMA. Paracoccidioides brasiliensis

response to glucose starvation stress. In: 26o Congresso Brasileiro de Microbiologia,

2011, Foz do Iguaçu-PR-Brasil. Revista Microbiologia in foco, 2011. v. 16a Ed. Pôster.

Lima, PS; Parente, AFA; Borges, CL; Bailão, AM; Soares, CMA. Proteomic view of

Paracoccidioides brasiliensis under hypoxic stress. In: 26o Congresso Brasileiro de

Microbiologia, Foz do Iguaçu-PR-Brasil. Revista Microbiologia in foco, 2011. v. 16a

Ed. Apresentação oral.

XII

SUMÁRIO

Páginas

LISTA DE ABREVIATURAS …………………………………………................... XV

RESUMO …………………………………………………………………................. XVIII

ABSTRACT …………………………………………………………......................... XIX

CAPÍTULO 1

Introdução

1- Aspectos Gerais

1.1 - O fungo Paracoccidioides ........................................................................ 21

1.2 - Aspectos morfológicos de Paracoccidioides ........................................... 25

1.3 - Paracoccidioidomicose (PCM) …………………………………………. 28

1.4 - Condições de estresse enfrentadas por patógenos durante a infecção

1.4.1 - Privação de glicose ............................................................................ 32

1.4.2 – Hipóxia ............................................................................................. 36

2- Justificativa ………………………………………………………………… 41

3- Objetivos ......................................................................................................... 42

CAPÍTULO 2

Transcritoma e proteoma do fungo Paracoccidioides em privação de glicose

1- Manuscrito …………………………………………………………............... 44

2- Conclusões …………………………………………………………............... 102

CAPÍTULO 3

Respostas de Paracoccidioides à condição de hipóxia

1- Introdução ....................................................................................................... 105

1.1- Regulador hipóxico em mamíferos ........................................................... 109

1.2- Principais reguladores hipóxicos em fungos: SREBPs e Upc2 ................ 111

1.3- Outros reguladores hipóxicos em fungos .................................................. 116

1.4- Hipóxia e patogênese ................................................................................. 119

2- Materiais e métodos

2.1- Condições de cultivo de Paracoccidioides (Pb01) e A. fumigatus ........... 121

XIII

2.2- Análises in silico de proteínas da família SREBP..................................... 121

2.3- Análise de PCR quantitativa em tempo real em Paracoccidioides (Pb01)

e em A. fumigatus ..................................................................................... 122

2.4- Ensaio de complementação gênica de PbsrbA em células de A.

fumigatus ................................................................................................... 123

2.5- Condições de crescimento de linhagens de A. fumigatus em normóxia e

hipóxia ....................................................................................................... 124

2.6- Análise por western blot em Paracoccidioides (Pb01) e A. fumigatus..... 125

2.7- Susceptibilidade de A. fumigatus à antifúngicos ....................................... 126

2.8- Produção de biomassa por linhagens de A. fumigatus em condições de

privação do metal ferro.............................................................................. 126

2.9- Análises do crescimento, viabilidade e dosagem de glicose em

Paracoccidioides (Pb01) sob condições de hipóxia (CoCl2) .................... 127

2.10- Análises do crescimento, viabilidade e dosagem de glicose em

Paracoccidioides (Pb01) sob condições de hipóxia (CoCl2) ...................... 127

3- Resultados

3.1- Condições de cultivo de Paracoccidioides (Pb01) e A. fumigatus ........ 129

3.2- PbsrbA é funcional na linhagem mutante nulo para srbA (∆srbA) de A.

fumigatus ..................................................................................... 132

3.3- Inserções de PbsrbA e pyrG no genoma de A. fumigatus e restauração

do crescimento radial da linhagem ∆srbA por PbsrbA..................................... 135

3.4- Linhagem de A. fumigatus complementada com PbsrbA expressa

transcrito e proteína .......................................................................................... 138

3.5- Linhagem de A. fumigatus complementada com PbsrbA mostra

resistência à drogas antifúngicas ...................................................................... 140

3.6 - Linhagem de A. fumigatus complementada com PbsrbA restaura a

produção de biomassa em condição de privação de ferro ................................ 140

3.7- Paracoccidioides, Pb01, responde à condição de hipóxia ........................ 143

3.8- Respostas proteômicas de Paracoccidioides, Pb01, às condições de

hipóxia .............................................................................................................. 145

3.9- Paracoccidioides, Pb01, consome menos glicose em condições de

hipóxia .............................................................................................................. 148

4- Discussão .......................................................................................................... 149

5- Conclusões ....................................................................................................... 152

6- Tabelas ............................................................................................................. 154

XIV

CAPÍTULO 4

Artigo completo publicado em periódico

1- Artigo ......................................................................................................... 165

2- Figuras Suplementares ............................................................................ 185

PERSPECTIVAS ........................................................................................................ 192

CONSIDERAÇÕES FINAIS...................................................................................... 194

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Capítulo 1 ........................................................................................................ 197

Capítulo 2 ........................................................................................................ 206

Capítulo 3 ........................................................................................................ 211

XV

LISTA DE ABREVIATURAS

∆srbA mutante para o gene srbA

2DE Eletroforese bidimensional

ANOVA análise de variância

API aspergilose pulmonar invasiva

ATP adenosina trifosfato

BCIP 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato

BHI infusão de coração e cérebro

bHLH duas α-hélices com resíduos de aminoácidos básicos conectadas por um laço

cDNA DNA complementar

CEA10 linhagem selvagem de Aspergillus fumigatus

CFEM comuns em membranas celulares fúngicas

CFUs unidades formadoras de colônia

CHAPS 3-[(3-Colamidopropil)dimetilamônio]-1 propanosulfonato

CoA Coenzima A

DAPI 4,6-diamidino-2-phenylindole

DNA ácido desoxirribonucléico

DTT ditiotreitol

EBP proteína de ligação ao estradiol

FBS soro fetal bovino

Fe+2

íon ferro reduzido

Fe+3

íon ferro oxidado

- Fe depleção de ferro

+ Fe repleto de ferro

g força centrífuga

GABA shunt rota aminobutirato

GCPSR reconhecimento de espécies filogenéticas por concordância genealógica

GMM meio mínimo com glicose

GPI glicosilfosfatidilinositol

HIF-1 fator de transcrição 1 induzível por hipóxia

HIV vírus da imunodeficiência humana

IDs identidades

IDV valores de densidade integrada

IFN-gamma intérferon gama

INSIG gene induzido por insulina

ITS sequência espaçadora interna

J774 A.1 linhagem celular de macrófagos

kDa kilodálton

Log 2 logaritmo na base 2

XVI

mmHg milímetros de mercúrio

MALDI Matrix-Assisted Laser Desorption/ Ionization

Mb mega bases

MMcM meio mínimo Mc Veigh Morton

MS espectrometria de massas

NAD+ nicotinamida adenina dinucleotídeo oxidado

NADH nicotinamida adenina dinucleotídeo reduzido

NanoUPLC-

MSE

cromatografia líquida de ultra performance acoplada à espectrometria de

massas com método de aquisição alternativo (entre duas energias de colisão)

NBT nitroazul tetrazólio

NCBI National Center for Biotechnology Information

NH4HCO3 tampão bicarbonato de amônio

PAGE eletroforese em gel de poliacrilamida

PAMPs padrões moleculares associados aos patógenos

Pb01 isolado 01 de Paracoccidioides lutzii

Pb03 isolado 03 de Paracoccidioides brasiliensis

Pb18 isolado 18 de Paracoccidioides brasiliensis

PBS solução de tampão fosfato

PbSrbA proteína SrbA de Paracoccidioides

PbsrbA gene srbA de Paracoccidioides

PCM paracoccidioidomicose

PCR reação em cadeia da polimerase

PEG polietilenoglicol

PFAM banco de dados de famílias de proteínas

pH potencial hidrogeniônico

PHB proteína fosforilase B

PMSF fenilmetilsulfonilfluoreto

pO2 pressão parcial de oxigênio

ppm partes por milhão

PS2 espécie filogenética 2

PS3 espécie filogenética 3

pyrG gene orotidina-5′-fosfato descarboxilase

RNA ácido ribonucléico

RNA-seq sequenciamento de RNA em larga escala

ROS espécies reativas de oxigênio

S1 espécie 1

SCAP proteína de ativação da clivagem de SREBP

SDS dodecil sulfato de sódio

SP1 protease sítio-1

SP2 protease sítio-2

srbAKO mutante nulo para o gene srbA de A. fumigatus

XVII

.

SRE região promotora de genes regulados pelas SREBPs

SREBP proteína de ligação ao elemento responsivo esterol

TBS-T solução salina tamponada com TRIS

TCA ciclo do ácido tricarboxílico

TNF-α fator de necrose tumoral alfa

TRIS tris(hidroximetil) aminometano

UV ultravioleta

wt tipo selvagem

RESUMO

____________________________________________________________

XVIII

Paracoccidioides spp. causa a paracoccidioidomicose, uma das micoses mais

frequentes na América Latina. O fungo cresce como micélio no meio ambiente, e como

levedura, no hospedeiro. A fim de sobreviver no corpo humano, patógenos devem se

adaptar nos microambientes os quais são frequentemente caracterizados por baixas

disponibilidades de nutrientes e oxigênio. Uma das primeiras linhas de defesa deste

fungo durante invasão no hospedeiro são os macrófagos residentes nos pulmões,

considerados pobres em aminoácidos e nutrientes. Durante a doença sistêmica, o fungo

também pode atingir órgãos e tecidos onde o patógeno é exposto a variações nas

concentrações de oxigênio. Neste estudo, as respostas de Paracoccidioides, Pb01, sob

condições de privação de glicose e de oxigênio foram obtidas a partir de abordagens

transcricionais (RNAseq), proteômicas (NanoUPLC-MSE

e 2D-PAGE) e ensaio de

complementação gênica. Os resultados revelaram que Pb01 muda seu metabolismo em

resposta à privação de glicose. O fluxo de carbono é centrado na produção de etanol e

gliconeogênese pela modulação de outras vias tais como β-oxidação e ciclos do

glioxilato e ácido tricarboxílico. Mais ainda, as células privadas de glicose foram mais

susceptíveis à morte por macrófagos indicando que a glicose proporciona vantagem na

sobrevivência do fungo dentro dos macrófagos. Em relação à hipóxia, as respostas do

Pb01 possivelmente são mediadas pelo fator de transcrição SrbA, uma proteína da

família de ligação ao elemento regulatório esterol (SREBP). A PbsrbA é funcional no

mutante nulo para o gene srbA, de A. fumigatus (∆srbA), e também restaura ambos, a

susceptibilidade do ∆srbA à classe de azóis de drogas antifúngicas e a produção de

biomassa em resposta à condições de privação de ferro. Além disso, os níveis de

transcritos e proteínas de células leveduriformes do Pb01 mostraram que, em hipóxia, o

fungo aumenta a expressão de transcritos associados com a glicólise e biossínteses de

ergosterol e ácidos graxos. Um aumento na abundância de proteínas envolvidas com o

metabolismo de aminoácidos, carboidratos, lipídios/ ácidos graxos, produção de etanol e

destino protéico foi detectado por análises em gel bi-dimensional além da redução

daquelas relacionadas a processos oxidativos (de aminoácidos, ácidos graxos e

acetaldeído), TCA e transporte de elétrons. Desde que estudos têm mostrado a

importância do metabolismo de carbono e adaptação à hipóxia nos fungos, concluímos

que a caracterização das respostas de Pb01 às condições de privação de glicose e de

oxigênio é importante para elucidação de importantes moléculas e processos relevantes

para o entendimento do estabelecimento fúngico no hospedeiro.

ABSTRACT

____________________________________________________________

XIX

Paracoccidioides spp. represent the causative agent of paracoccidioidomycosis,

one of the most frequent systemic mycoses in Latin America. The fungus grows as

mycelium in the environmental, and as yeast form, in the host tissue. To survive in the

human body, pathogens must adapt to microenvironments which are often characterized

by low nutrient and oxygen availability. One of the first lines of defense during

Paracoccidioides spp. host invasion are the lung resident macrophages, considered a

glucose- and amino acid-poor environment. During the systemic disease, it also can

reach organs and tissues where the pathogen is exposed to variations in oxygen

concentrations. In this study, a comprehensive response of Paracoccidioides, isolate

Pb01, under glucose and oxygen deprivation was accessed by transcriptional (RNAseq),

proteomic (NanoUPLC-MSE

and 2D-PAGE) and genetic complementation approaches.

The results revealed that Pb01 changes its metabolism to responds to glucose

deprivation. The carbon flow is focused in gluconeogenesis and ethanol production

through β-oxidation, glyoxylate and tricarboxylic acid cycles modulations. Moreover,

the glucose deprived cells are more susceptible to macrophages killing indicating that

the glucose provides a survival advantage to Pb01 inside macrophages. Regarding

hypoxia, the responses of Pb01 showed that it is possibly mediated by a highly

conserved transcription factor, SrbA, a protein of the sterol regulatory element binding

protein family. Our results showed that the PbsrbA is functional in a null mutant of srbA

of A. fumigatus (∆srbA) and also restore both, the susceptibility of ∆srbA to the azole

class of antifungal drugs and the biomass production in response to low iron conditions.

Furthermore, the transcripts and proteins levels of the Pb01 yeast cells under hypoxia

showed that Pb01increases the expression of transcripts associated with glycolysis and

ergosterol/ fatty acid biosynthesis. In addition, as detected by 2D-PAGE, the fungus

also increases the abundance of proteins involved in amino acid, carbohydrate and

lipid/fatty acids metabolism, ethanol production and protein fate and reduce of those

related to oxidative processes (amino acids, fatty acid and acetaldehyde), TCA and

electron transport. Because studies have highlighted the importance of carbon

metabolism and hypoxia adaptation in fungi, we conclude that the characterization of

glucose and oxygen deprivation responses in Pb01 is important to elucidate molecules

and processes relevant in the understanding of the fungal establishment in the host.

Transcritoma e proteoma do fungo Paracoccidioides em condições de privação de glicose ou hipóxia

Patrícia de Sousa Lima

21

1) Aspectos gerais

1.1. O fungo Paracoccidioides spp.

O fungo patogênico humano do gênero Paracoccidioides foi primeiramente

observado pelo pesquisador brasileiro Adolpho Lutz em 1908 quando estudava novos

casos de coccidioidomicose, tendo observado um caso diferente de blastomicose

(LUTZ, 1908). O pesquisador descreveu o observado como “uma nova enfermidade

pseudococcídica”, caracterizada como sul-americana e diferente da norte-americana,

bem estabelecida até aquele momento. Depois, estudos detectaram lesões na mucosa e

culturas celulares com as mesmas características descritas anteriormente por Lutz

(1908) e, em 1912, o nome Zymonema brasiliensis foi proposto para designá-lo

(SPLENDORE, 1912). Porém, muitos casos foram relatados por pesquisadores

brasileiros ao longo dos anos e o fungo foi erroneamente confundido com Coccidioides

immitis. Em 1930, Floriano de Almeida observou características que distinguiam o

fungo observado por Lutz (1908) de C. immitis e criou o gênero Paracoccidioides,

entretanto mantendo o termo brasiliensis de Splendore (2012) para a espécie

(ALMEIDA, 1930).

Paracoccidioides spp. pertence ao filo Ascomycota, família Ajellomycetaceae,

ordem Onygenales, nos quais incluem fungos tais como Blastomyces dermatitidis,

Histoplasma capsulatum, Emmonsia parva, Emmonsia crescens e Lacazia loboi. Estes

organismos se desenvolveram em associação com hospedeiros vertebrados apresentando

um fase saprobiótica no solo e/ou fezes e outra parasítica nos tecidos do hospedeiro.

Análises filogenéticas agruparam Paracoccidioides spp. e L. loboi como irmãs quando

considerado o gênero Coccidioides como um grupo externo (TEIXEIRA et al, 2009;

UNTEREINER et al, 2004). Paracoccidioides spp. tem sido recuperado de amostras

clínicas de humanos, porém já foi detectada em espécies de tamanduás tais como os da

espécie Dasypus novemcinctus e ocasionalmente de Cabassus centralis (BAGAGLI et

al, 2003; CORREDOR et al, 2005). Além disso, o fungo já foi detectado em isolados

provenientes de cachorros no qual a doença paracoccidioidomicose (PCM) foi

diagnosticada pelas técnicas de imunohistoquímica e nested PCR, ambos relacionados

com anticorpo e amplificação gênica da gp43, respectivamente (RICCI et al, 2004) e



22

ainda em bichos preguiça e em fezes de morcego (GROSE & TAMSITT, 1965;

TREJO-CHÁVEZ et al, 2011).

O fungo P. brasiliensis era considerado uma única espécie até o ano de 2006

quando estudos sugeriram uma nova espécie, Paracoccidioides lutzii (CARRERO et al,

2008; MATUTE et al, 2006; TEIXEIRA et al, 2009). Matute e colaboradores (2006),

em estudos de polimorfismo genético, descreveram a existência de três diferentes

espécies filogenéticas de Paracoccidioides spp.: espécies filogenética 1 (S1), 2 (PS2) e

3 (PS3). A espécie filogenética 1 (S1) está distribuída no Brasil, Argentina, Paraguai,

Peru e Venezuela enquanto que alguns isolados da S2 foram encontrados somente no

Brasil, nos estados de São Paulo e Minas Gerais, e na Venezuela. Por outro lado, a

espécie filogenética 3 (PS3) é geograficamente restrita à Colômbia (Figura 1). Carrero e

colaboradores (2008), em continuidade aos estudos filogenéticos envolvendo o gênero

Paracoccidioides, realizaram análises comparando sequências codantes, não codantes e

ITS (internally transcribed sequence) de isolados de Paracoccidioides spp. pelo método

GCPSR (genealogical concordance phylogenetic species recognition). As análises

revelaram que algumas linhagens, por exemplo, a Pb01, apresentaram-se distantes das

outras três espécies filogenéticas descritas anteriormente (CARRERO et al, 2008). Na

tentativa de intensificar os estudos sobre a taxonomia do isolado Pb01, Teixeira e

colaboradores (2009) usaram o método de GCPSR para investigar as particularidades

dessa linhagem. Um total de 122 isolados foi analisado e o Pb01 exibiu divergência em

relação aos três grupos (S1, S2 e PS3), inclusive morfológicas (Figura 2). Assim, foi

sugerido que esta espécie juntamente com outras do mesmo grupo fosse denominada

como uma nova espécie, Paracoccidioides lutzii, em homenagem ao pesquisador

Adolpho Lutz, o primeiro a descrever o fungo, em 1908 (TEIXEIRA et al, 2009). A

localização da espécie também tem sido caracterizada indicando que P. lutzii é

encontrado nas regiões central, oeste e noroeste do Brasil assim como no Equador

(Figura 1) (MARQUES-DA-SILVA et al, 2012; RICHINI-PEREIRA et al, 2009;

TEIXEIRA et al, 2009; THEODORO et al, 2012).

Dificuldades em produzir conídeos em laboratórios e as exclusividades

morfológicas entre as espécies são motivos da escolha comum entre os micologistas em

utilizar diagnósticos moleculares na identificação de espécies de Paracoccidioides spp.

Vários marcadores moleculares já foram aplicados em estudos de populações do gênero,

porém os loci gp43 e hsp70 tem se mostrado os melhores para o delineamento das

espécies devido as altas freqüências de sítios polimórficos divididos entre as espécies



23

(MATUTE et al, 2006; TEIXEIRA et al, 2009; THEODORO et al, 2012).

Recentemente, análises baseadas em sequências parciais do gene gp43 foram realizadas

e revelaram mais um grupo filogenético, o PS4, no qual parece ser uma população

monofilética de isolados clínicos recuperados da Venezuela (BOCCA et al, 2013;

SALGADO-SALAZAR et al, 2010). Além disso, uma análise comparativa do proteoma

de membros das quatro linhagens filogenéticas de Paracoccidioides spp. mostrou

aspectos metabólicos diferenciais entre as linhagens. Este foi o primeiro estudo em nível

protéico que investigou diferenças bioquímicas entre os membros do gênero (PIGOSSO

et al, 2013).

Mesmo com todos estes estudos, a história evolutiva de Paracoccidioides spp.

não tem sido facilmente construída devido a constante migração de hospedeiros

humanos, período longo de latência da doença, a falta de informação sobre a história

clínica dos pacientes e pelo fato de que os isolados são pouco amostrados, dificultando a

informação da localização exata dos fungos (MATUTE et al, 2006).

Figura 1. Distribuição geográfica atual do gênero Paracoccidioides e L. loboi. As espécies

de Paracoccidioides S1, PS2, PS3 and P.lutzii, e sua espécie irmã L. loboi são mostradas na

América do Sul (THEODORO et al, 2012).



24

Figura 2. Filograma baseado na metodologia de inferência bayesiana mostrando a relação

entre as três espécies filogenéticas S1, PS2, PS3 e os isolados do grupo “Pb01-like”. (A) Um

total de 8 loci foram concatenados, correspondendo à 3565 nucleotídeos, do banco de dados 1

(fks-éxon2, fks-éxon 3, chs2-éxon 1, chs2-éxon 2-4, gp43-promoter-éxon 1, gp43-éxon2, arf e

a-tubulin). (B) Um total de 5 loci foram concatenados, correspondendo à 1662 nucleotídeos, do

banco de dados 2 (hidrofobina-3’UTR, hidrofobina-5’UTR, hsp70-5’UTR and íntron 1, íntron 1

kex e ITS 1/2 + 5.8S). Ambas as analyses mostram a distância do grupo “Pb01-like” das

espécies filogenéticas de P. brasiliensis (TEIXEIRA et al, 2009).

A organização genômica também tem sido investigada em espécies do gênero

Paracoccidiodes. Os genomas estruturais dos isolados Pb01, Pb03 e Pb18,

representantes das diferentes espécies filogenéticas foram depositados

(http://www.broad.mit.edu/science/projects/msc/data-release-summary). Os resultados

confirmaram a presença de 5 cromossomos em cada isolado. O genoma do isolado Pb01

é composto de 32,94 Mb, com um total de 9.132 genes. Este isolado apresenta o

genoma maior tanto em número de bases quanto em quantidade de genes comparado

aos outros dois isolados analisados, que apresentaram genomas do tamanho de 29,06 e

29,95 Mb, com número de genes de 7.875 e 8.741 (dados dos isolados Pb03 e Pb18,

respectivamente). Essas informações, além de auxiliar a elucidar as diferenças

existentes entre os isolados, são importantes na caracterização de genes e regiões

http://www.broad.mit.edu/science/projects/msc/data-release-summary



25

promotoras e, conseqüentemente, na melhor caracterização da biologia de

Paracoccidioides (DESJARDINS et al, 2011).

1.2. Aspectos morfológicos de Paracoccidioides spp.

Paracoccidioides spp. é um fungo dimórfico que cresce em temperaturas

próximas a 25°C no meio ambiente ou a 36°C no hospedeiro humano. À 25°C no meio

ambiente ou em condições que simulam esta temperatura in vitro, o fungo apresenta

aspecto algodonoso e estruturas celulares características de micélio, com formação de

hifas septadas, multinucleadas, com filamentos finos e artroconídios intercalares

(BRUMMER et al, 1993; SAN-BLAS, 1993) (Figura 3). O habitat do fungo sempre foi

motivo de investigação (RESTREPO et al, 2001). Acredita-se que este seja saprobiótico

no meio ambiente onde, por conseqüência, vive no solo obtendo energia da matéria

orgânica em decomposição (SILVA-VERGARA et al, 1998; TERÇARIOLI et al, 2007;

THEODORO et al, 2005). Terçarioli e colaboradores (2007) realizaram o cultivo de

vários isolados de Paracoccidioides spp. em diferentes tipos de solo e observaram que

este fungo apresenta a capacidade de crescimento em solos arenosos e argilosos, com

alta umidade. Neste caso, a produção de conídios, esporos assexuais dos fungos, e que

são importantes na disseminação destes organismos na natureza, foi observada em

alguns isolados (TERÇARIOLI et al, 2007). Apesar da ausência do estágio telemórfico,

dados morfológicos e moleculares revelaram a possibilidade do ciclo sexual no gênero

Paracoccidioides (TEIXEIRA et al, 2013).

À temperatura de 36°C no hospedeiro ou em condições in vitro, o fungo transita

para forma leveduriforme apresentando forma globular e brotamentos múltiplos (Figura

3) com característica de uma membrana birrefringente e cromatina evidente quando

observado no microscópio óptico. As células têm tamanhos heterogêneos

caracterizando-se por células-mãe ovais ou arredondadas circundadas por brotamentos

heterogêneos múltiplos também arredondados ou ovais (ALMEIDA et al, 2009; SAN-

BLAS, 1993).

Em relação às espécies filogenéticas P. lutzii e P. brasiliensis, características

morfológicas particulares em relação aos conídios e células leveduriformes são

observadas. Os conídios da espécie P. lutzii são mais alongados do que os da espécie P.

brasiliensis. As células leveduriformes de ambas as espécies não mostram variação

significante no tamanho e forma, com exceção do isolado Pb01 de P. lutzii, no qual



26

exibem células maiores, e espécies PS2 de P. brasiliensis nas quais comumente

apresentam células alongadas similares à pseudohifas (TEIXEIRA et al, 2009;

THEODORO et al, 2012).

Figura 3. Aspectos morfológicos de Paracoccidioides spp.. As fases miceliana, à direita, e

leveduriforme, à esquerda, de Paracoccidioides spp. são mostradas. (A) Visão macroscópica do

fungo na forma miceliana e leveduriforme cultivado in vitro em temperaturas próximas à 25 e

36oC, respectivamente. (B) Visão microscópica do fungo na forma miceliana e leveduriforme.

h: hifas; c: formação do conídio; m: célula-mãe e b: brotos. Figura construída a partir de dados do

Laboratório de Biologia Molecular, Universidade Federal de Goiás – UFG e do banco de dados genômico de Paracoccidioides spp.

- http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/paracoccidioides_brasiliensis/MultiHome.html.

A conversão morfológica de Paracoccidioides spp. constitui uma etapa inicial

para o estabelecimento da doença e invasão dos tecidos tornando-se um mecanismo de

defesa importante para a adaptação dos fungos ao ambiente hostil encontrado nos

tecidos do hospedeiro. A variação de temperatura parece ser o principal fator

responsável pela diferenciação celular de Paracoccidioides spp., porém o hormônio

feminino 17-β-estradiol também influencia nesta característica (NEMECEK et al, 2006;

RAPPLEYE & GOLDMAN, 2006; SAN-BLAS et al, 2002).

Estudos prévios mostraram que o hormônio feminino 17-β-estradiol inibe a

transição de micélio para levedura de maneira dose-dependente, in vitro (RESTREPO,

1985) e in vivo (SANO et al, 1999). A inibição não ocorre somente devido a presença

do hormônio e sim pela sua interação com a proteína fúngica denominada EBP

(Estradiol Binding Protein ou E2-Binding Protein) na qual atrasa e bloqueia a transição

http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/paracoccidioides_brasiliensis/MultiHome.html



27

da fase infectiva para a patogênica de Paracoccidioides spp. (SHANKAR et al, 2011).

Além disso, a proteção da doença também é relacionada ao tipo de resposta imunológica

desencadeada por cada gênero sexual. Camundongos machos e fêmeas infectados com

células de Paracoccidioides spp. mostraram diferença no desenvolvimento da doença,

fato este, atribuído em parte, aos hormônios sexuais. Estes, por sua vez, modulam a

resposta imune via estimulação da paracoccina, uma lectina presente na superfície do

fungo que se liga à laminina da superfície dos macrófagos. Esta ligação induz a

produção de altos níveis de TNF-α (fator de necrose tumoral alfa) e óxido nítrico pelos

macrófagos, os quais estão envolvidos na atividade fungicida destas células. Desse

modo, as fêmeas se mostraram mais resistentes à infecção pelo fungo (PINZAN et al,

2010).

Análises transcricionais e proteômicas têm ajudado na compreensão do

dimorfismo em Paracoccidioides spp. por elucidarem mapas metabólicos regulados

pelo fungo durante a transição. Bibliotecas de cDNA das fases de levedura e micélio

foram construídas e os resultados mostraram que de 6022 genes expressos, 38% dos

transcritos foram mais induzidos na levedura do que no micélio. O estudo elucidou

moléculas envolvidas no processo de transição dimórfica e imunopatogenicidade do

fungo além de algumas com grande potencial para alvos antifúngicos por não possuírem

nenhum homólogo no genoma humano como, por exemplo, quitina deacetilase,

isocitrato liase e α-1,3-glicana sintase (FELIPE et al, 2005). Outra análise transcricional

durante a transição da fase miceliana para leveduriforme de Paracoccidioides, Pb01,

revelou que vários transcritos potencialmente relacionados com a síntese de membrana

e parede celulares mostraram-se aumentados durante a diferenciação celular de micélio

para a forma leveduriforme durante a transição, sugerindo que o fungo favorece o

remodelamento da membrana e da parede celulares nos estágios iniciais da

morfogênese. A detecção de genes envolvidos em vias metabólicas como a do glioxilato

e transdução de sinal mostraram a importância de tais processos na adaptação do fungo

ao ambiente hostil do hospedeiro durante este processo dimórfico (BASTOS et al,

2007). Em nível protéico, mapas metabólicos dos três estágios de Paracoccidioides,

Pb01, foram construídos baseados nos níveis de expressão diferencial das proteínas das

fases miceliana, transição e leveduriforme. Os resultados mostraram que o metabolismo

da fase miceliana é mais aeróbico do que a leveduriforme e que os metabolismos de

carboidrato, aminoácidos, nitrogênio e a via do glioxilato foram modulados durante a

transição. O estudo enfatizou as mudanças metabólicas do processo de dimorfismo no



28

Pb01, proporcionando mais informações a respeito deste processo importante para o

estabelecimento da paracoccidioidomicose (REZENDE et al, 2011).

1.3. Paracoccidioidomicose

A paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica granulomatosa

causada por fungos do gênero Paracoccidioides e caracteriza uma enfermidade de alta

prevalência e morbidade, limitadas a alguns países da América central e sul do México

à Argentina. Países como o Brasil, Colômbia, Venezuela e Argentina a doença é

altamente prevalente (BOCCA et al, 2013; BRUMMER et al, 1993; MARQUES, 2012).

O fungo infecta hospedeiros, inclusive humanos, a partir da inalação de propágulos do

micélio e artroconídeos no qual caracteriza o início da patogênese pelas vias

respiratórias (BAGAGLI et al, 2006). Principalmente sob estímulo da temperatura,

ocorre a transição dimórfica do fungo para a fase leveduriforme iniciando o processo

infeccioso. Nos alvéolos pulmonares e a partir dos pulmões, o fungo pode disseminar-se

pelas vias hematogênica ou linfática acometendo outros órgãos e sistemas como fígado,

baço, ossos e sistema nervoso central (CAMARGO & FRANCO, 2000; SAN-BLAS,

1993; VALERA et al, 2008).

O grande fator de risco para aquisição da infecção são as profissões ou

atividades relacionadas ao manejo do solo contaminado com o fungo, como por

exemplo, atividades agrícolas, terraplenagem, preparo de solo, práticas de jardinagens,

transporte de produtos vegetais, entre outros. Observa-se que a grande maioria dos

pacientes exerceu atividade agrícola nas duas primeiras décadas de vida, tendo nessa

época provavelmente adquirido a infecção, embora as manifestações clínicas tenham

surgido muitos anos depois. A maioria destes pacientes, quando procuram atenção

médica, já saiu da área endêmica, residindo em centros urbanos onde exercem outras

atividades, não ligadas ao trato do solo (SHIKANAI-YASUDA et al, 2006). Ao

contrário de outras micoses, como a criptococose, a histoplasmose disseminada e a

candidíase, a PCM não é usualmente relacionada a doenças imunodepressoras.

Entretanto, há casos desta micose associados à infecção pelo HIV, neoplasias e, mais

raramente, a transplantes de órgãos (SHIKANAI-YASUDA et al, 2008; ZAVASCKI et

al, 2004). Mais além, elevadas porcentagens de co-infecção com tuberculose (28,4%) e

HIV (4,9%) além da taxa de 14,7% de mortes entre a população estudada também já

foram descritas mostrando a severidade da PCM e a possibilidade de co-infecções que



29

interferem no tratamento e prognóstico da doença (LOTH et al, 2011). A transmissão da

PCM de pessoa para pessoa não tem sido relatada e a ingestão de álcool e o uso de

tabaco tem aumentado o risco da PCM (SANTOS et al, 2003).

A progressão da doença varia de assintomática à severa podendo ser fatal. As

formas clínicas da PCM foram estabelecidas em um encontro em Medellín, Colômbia,

em 1986 e são utilizadas até hoje. A doença pode ser dividida em forma subclínica

(infecção), detectada somente por teste positivo na pele, e nas formas clínicas onde

aparecem sinais e sintomas. A fase clínica se divide em aguda/ subaguda (tipo juvenil),

no qual pode ser classificada como moderada ou severa, e na forma crônica (tipo

adulto), que pode ser classificada baseada nas lesões uni ou multifocais e sequelas

(BOCCA et al, 2013; FRANCO, 1987).

Aproximadamente 5% dos casos de paracoccicioidomicose são classificados

como aguda. Esta fase tem como característica envolver do sistema mononuclear

fagocítico e afetar principalmente crianças, adolescentes, jovens adultos (até 35 anos de

idade) de forma semelhante entre homens e mulheres. Os sintomas incluem febre, perda

de peso e anemia moderada por 2 – 3 meses ou mais. Gânglios inguinais, axilares e

cervicais são os comumente aumentados. Quando gânglios linfáticos hepáticos são

afetados podem surgir sintomas e sinais de icterícia. Dos órgãos, o fígado e baço são

moderadamente aumentados e a medula óssea pode estar envolvida neste processo.

Múltiplas lesões na pele e mucosas podem ocorrer (BOCCA et al, 2013; MARQUES,

2012, 2013). No sangue, algumas alterações são observadas nos primeiros meses tais

como alta taxa de sedimentação de eritrócitos e marcadores inflamatórios. Após

tratamento estes parâmetros decresceram (SHIKANAI-YASUDA et al, 2006).

A fase crônica da doença responde por mais de 90% dos pacientes, e apresenta-

se principalmente em adultos entre os 30 e 60 anos, predominantemente, do sexo

masculino. A incidência da doença em homens foi de 13: 1 quando comparada a das

mulheres (PRADO et al, 2009). O trabalho com solo e plantações em área rural, citado

anteriormente, é fator ocupacional predisponente para a aquisição da PCM (FRANCO,

1987). Acredita-se, que provavelmente, a menor taxa de incidência entre as mulheres,

seja pela presença do hormônio β-estradiol que proporciona proteção para o sexo

feminino por inibir a transição dimórfica do fungo dificultando o estabelecimento da

doença (PINZAN et al, 2010; RESTREPO, 1985) e/ou pela ausência ou até mesmo

menor contato com as fontes de infecção (MARQUES et al, 1983). A doença nesta fase

crônica progride lentamente, de forma silenciosa, podendo levar anos até que seja



30

diagnosticada. As manifestações pulmonares estão presentes em 90% dos pacientes. Os

pulmões podem ser o único órgão afetado em até 25% dos casos. Geralmente, a doença

envolve mais de um órgão simultaneamente (apresentação multifocal e/ou disseminação

hematogênica da doença), sendo pulmões, mucosas e pele os sítios mais acometidos

pela infecção. Caso acometa um único órgão é chamada de apresentação unifocal

(SHIKANAI-YASUDA et al, 2006). Porém, gânglios linfáticos, glândulas adrenais e

outros órgãos ou tecidos podem estar envolvidos. Menos frequentemente, o intestino, o

sistema nervoso central (cérebro, cerebelo e meninges), ossos, baço, olhos, sistema

genital ou cardiovascular também podem ser acometidos (BOCCA et al, 2013;

SHIKANAI-YASUDA et al, 2006).

Considerando que a PCM é uma doença sistêmica cuja resposta do hospedeiro

ao agente infectante consiste de processo inflamatório granulomatoso crônico

resultando em fibrose, as sequelas da doença consistem no acúmulo de colágeno e

formação de fibroses que podem levar à alterações anatômicas e funcionais dos órgãos

acometidos durante a infecção, particularmente os pulmões. Fibrose pulmonar foi

descrita por imagem em cerca de 50% dos pacientes com infecção crônica deste órgão,

evoluindo em menor porcentagem com doença pulmonar obstrutiva crônica e suas

complicações. Além das sequelas relacionadas às lesões pulmonares, lesões adrenais e

do sistema nervoso central além de fibrose decorrente do acometimento das mucosas e

pele também podem acontecer. Nas mucosas e pele as sequelas podem causar alterações

crônicas de voz (disfonia por lesão de corda vocal), obstrução laríngea com necessidade

de traqueostomia, redução da rima bucal e sinéquia de nádegas. Na forma aguda da

doença, as sequelas mais comuns são obstrução de linfáticos abdominais com síndrome

de má absorção e perda de proteínas (linfangiectasia intestinal) além de quadros de

icterícia obstrutiva (SHIKANAI-YASUDA et al, 2006).

As micoses sistêmicas estão em décimo lugar entre as doenças parasitárias e

infecciosas que causam mais mortes no Brasil. Dados isolados mostraram que a

paracoccidioidomicose é a principal doença em causar mortes entre as micoses

sistêmicas seguida pela criptococose, candidíase e histoplasmose, representando um

importante problema de saúde pública. Os Estados da região Sudeste e Sul tiveram as

taxas de mortalidade mais altas, mais concentradas em São Paulo e Paraná (PRADO et

al, 2009). A paracoccidioidomicose foi fatal até o ano de 1940 quando sulfonamidas

(sulfadiazina, sulfadoxina, sulfametoxipiridazina, cotrimazina e trimetoprim-

sulfametoxazol) foram utilizadas no tratamento. O tratamento com anfotericina B



31

iniciou-se em 1958 e a primeira geração de azóis (cetoconazol, itraconazol, fluconazol,

voriconazol e posaconazol) foi usada na terapia com sucesso em 1980. A opção de

tratamento considera a severidade da doença (BOCCA et al, 2013; LACAZ, 1994). Para

as formas clínicas leve à moderada, o itraconazol é utilizado no tratamento da PCM em

menor período de tempo. Entretanto, considerando que o medicamento não está

disponível na rede pública na maioria dos Estados, a combinação sulfametoxazol-

trimetroprim é a alternativa mais utilizada na terapêutica ambulatorial dos pacientes

com PCM. Pacientes com formas graves, necessitando de internação hospitalar, devem

receber anfotericina B ou associação sulfametoxazol/ trimetoprim por via intravenosa.

Usualmente, o tratamento é de longa duração, para permitir o controle das

manifestações clínicas da micose e evitar as recaídas. Além dos azóis clássicos, aqueles

de segunda geração tal como o voriconazol, também tem sido utilizado no tratamento da

doença, principalmente para neuroPCM. O paciente deve permanecer em tratamento e

acompanhamento até a obtenção dos critérios de cura, com base nos parâmetros

clínicos, radiológicos e sorológicos. Além do tratamento antifúngico específico, o

paciente deverá receber assistência para as condições gerais como desnutrição,

tratamento odontológico, doença de Addison e co-morbidades (tuberculose, aids,

enteroparasitoses, infecções bacterianas pulmonares) (SHIKANAI-YASUDA et al,

2006).

Apesar do tratamento existente, muitos problemas ainda devem ser contornados

para que a doença seja totalmente controlada e deixe de ser de alta prevalência e

morbidade como tem se caracterizado. Muitos pacientes possuem a doença em sua

forma crônica, muitas vezes não diagnosticada. Quando a doença manifesta, problemas

com as formas severa da PCM podem resultar, por exemplo, em um tratamento não

eficiente e, mesmo se adequado, também gerar a chamada “reação paradoxical”

concernente principalmente à resposta imunológica do paciente devido a intensa reação

inflamatória (GRYSCHEK et al, 2010). Neste contexto, a PCM é ainda uma doença de

grande relevância principalmente pela variedade de manifestações clínicas, novos dados

epidemiológicos e constante evolução da etiopatogênese (MARQUES, 2013). Além

disso, há cada vez mais necessidade de estudos da biologia do fungo, pois a elucidação

de potenciais fatores de virulência, os que podem surgir através de análises das

respostas do fungo frente a estresses encontrados pelo mesmo nos nichos do hospedeiro,

pode resultar em futuras estratégias co-adjuvantes para o tratamento da doença



32

resultando em formas mais efetivas, com menor tempo e reação do hospedeiro na busca

por erradicação da doença.

1.4.Condições de estresse enfrentadas por patógenos durante a infecção

1.4.1. Privação de glicose

A interação patógeno-hospedeiro é um complexo de ação recíproca entre os

mecanismos de defesa do hospedeiro e a tentativa dos micro-organismos patogênicos

em driblar essas defesas. Em bactérias, por exemplo, no modelo de interação entre

Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis e o sistema imune bovino, as respostas

citotóxicas e proinflamatórias dos macrófagos no hospedeiro são essenciais para o

controle da infecção. A bactéria, por sua vez, expressa proteínas de membrana que

interagem com proteínas de células intestinais (células M) resultando em infecção do

animal (COUSSENS, 2004). Além das bactérias, as espécies fúngicas também parecem

apresentar vários mecanismos de invasão de células epiteliais os quais podem ser

considerados como um dos processos mais importantes durante o início da infecção

(FILLER & SHEPPARD, 2006). Uma vez que as condições do hospedeiro permitem o

início da infecção, os fungos enfrentam mudanças drásticas nas condições ambientais

(BROWN et al, 2007a). Os estresses enfrentados pelos patógenos incluem aqueles que

impedem o crescimento tais como temperatura, pH, anoxia e privação de nutrientes e

aqueles que são potencialmente tóxicos como espécies reativas de oxigênio, nitrogênio e

cloro (BROWN et al, 2007b).

Existem aproximadamente 1,5 milhões de espécies fúngicas (HAWKSWORTH,

2004), porém somente um pequeno número consegue causar doenças em humanos

possuindo mecanismos de adaptações particulares (ASKEW, 2008). Patógenos fúngicos

de diversos hospedeiros tais como plantas, insetos ou vertebrados têm no mínimo um

desafio em comum: nutrição durante a patogênese. A infecção no hospedeiro está

envolvida com o cruzamento da barreira epitelial, disseminação em diferentes locais no

hospedeiro, invasão de vários tecidos assim como a resistência ao ataque do sistema

imune do hospedeiro. Sem a habilidade em consumir nutrientes disponíveis em

respectivos locais no hospedeiro o fungo não tem sucesso como patógeno. O sucesso na

infecção, entretanto, requer uma adaptação rápida à diferentes condições

microambientais (BROCK, 2009).



33

A molécula de glicose pode muitas vezes servir como principal recurso de

carbono, mas proteínas e lipídeos provavelmente também servem de alimento à

patógenos durante a infecção (BROCK, 2009). Em fungos patogênicos, como a

Candida albicans, por exemplo, a disponibilidade de glicose durante a infecção tem

sido investigada. Seguindo invasão no hospedeiro, a glicose pode ser uma das principais

fontes de carbono para o patógeno desde que, na corrente sanguínea, a concentração de

glicose pode variar de 6 à 8 mM (EGI et al, 2008). Porém, células do sistema imune tais

como neutrófilos e macrófagos podem fagocitar as leveduras e a disponibilidade de

nutrientes torna-se consideravelmente diminuída resultando em privação de nutrientes.

A fim de escapar dos macrófagos, as células de C. albicans transitam para a forma de

hifa e por força mecânica destroem o fagócito. Genes envolvidos com o metabolismo de

lipídeos, ciclo do ciclo do glioxalato e da via gliconeogênica foram induzidos nesta

condição (LORENZ et al, 2004). Nos tecidos, a glicose pode novamente se tornar

escassa para C. albicans. Um estudo mostrou que diferentes populações de C. albicans

enfrentam microambientes distintos com diferentes níveis de açúcares durante a

infecção. A expressão do gene isocitrato liase (icl), representante do ciclo do glioxilato,

e de genes gliconeogênicos foi aumentada somente em uma das subpopulações

demonstrando que a assimilação de carbono pode ser diferente durante a infecção

(BARELLE et al, 2006).

Apesar da indução da icl durante várias fases da infecção, sua importância para

virulência de C. albicans vêm sendo investigada. Ao contrário de fungos patogênicos de

plantas tais como Magnaporthe grisea, Colleotrichium lagenarium e Leptosphaeria

maculans, nos quais dependem da icl para virulência fúngica porque utilizam os lipídios

como nutrientes durante a patogênese (ASAKURA et al, 2006; IDNURM &

HOWLETT, 2002; WANG et al, 2003), em C. albicans estudos demonstram que a icl

não é requerido exclusivamente para o metabolismo de fontes lipídicas. A deleção deste

gene alterou o crescimento do fungo em fontes alternativas de carbono tais como

acetato, etanol, ácidos graxos, glicerol e citrato (BROCK, 2009), assim como em A.

fumigatus (EBEL et al, 2006), mas também em fontes de lactato, piruvato e peptídeos/

aminoácidos (PIEKARSKA et al, 2008; RAMIREZ &LORENZ, 2007). Desse modo, a

icl não pode ser considerada um marcador para o metabolismo lipídico e sim para

utilização de recursos gliconeogênicos e durante condições de privação de carbono

(BROCK, 2009). Apesar da virulência atenuada do mutante para icl de C. albicans em

condições de infecção em camundongos (LORENZ & FINK, 2001) e da indução da icl



34

e de genes da β-oxidação por C. albicans após fagocitose por macrófagos (LORENZ et

al, 2004), os lipídeos não são utilizados como fonte preferencial de carbono durante a

infecção em C. albicans (BROCK, 2009). A fim de confirmar ainda mais esta hipótese,

um estudo recente com mutantes para genes da via de β-oxidação mostrou que os

mutantes não atenuaram a virulência de C. albicans enfatizando que os lipídeos não são

mesmo utilizados como fonte preferencial energética em C. albicans durante a

patogênese (OTZEN et al, 2013). A indução da icl e da β-oxidação durante infecção por

macrófagos pode então ser explicada pelas condições de estresse nutricional ou

limitação de glicose preferencialmente à utilização de ácidos graxos pelo fungo como

fonte energética (OTZEN et al, 2013). De fato, a atividade enzimática da icl aumentou

em C. albicans crescida em condições de privação de carbono, somente em acetato e em

fontes de aminoácidos (BROCK, 2009). Portanto, a indução diferencial do gene da icl e

de genes da via de degradação lipídica pode ser explicada devido às diferentes

condições de privação de nutrientes encontradas pelo fungo quando enfrenta diferentes

nichos no hospedeiro (BARELLE et al, 2006) preferencialmente à indução específica da

utilização de ácidos graxos (OTZEN et al, 2013). Existem diferenças entre a preferência

por assimilar fontes alternativas de carbono, por exemplo, entre Saccharomyces

cerevisiae e C. albicans o que reflete seus nichos contrastantes. S. cerevisiae evoluiu

explorando açúcares fermentáveis para posteriormente utilizar fontes alternativas de

carbono (JOHNSTON, 1999). C. albicans, como citado anteriormente, frequentemente

habita nichos que são limitados em glicose, porém ricos em fontes alternativas de

carbono. A robustez fisiológica deste patógeno in vivo provavelmente é aumentada por

sua habilidade em assimilar fontes alternativas de carbono preferencialmente à um uso

sequencial de fontes de carbono fermentáveis ou não (BROWN et al, 2007a).

A molécula de glicose é essencial como precursora de macromoléculas além de

fonte energética (LORENZ et al, 2004). A parede celular fúngica, por exemplo, é

composta por polissacarídeos tais como glicana e quitina assim como lipídeos e

proteínas (ENE et al, 2012b; KANETSUNA et al, 1969) e é afetada pela disponibilidade

de fontes de carbono. A parede celular é um dos principais pontos de contato com o

hospedeiro, moduladora ativa das defesas imune do organismo infectado além de alvo

de drogas antifúngicas. Estudos recentes demonstram que fontes alternativas de carbono

afetam esta estrutura em C. albicans remodelada em resposta à ambos, soro e fontes de

carbono (ENE et al, 2012b) . O crescimento de C. albicans em lactato afeta a arquitetura

das camadas de glicana e manana na parede celular e seu remodelamento resulta em



35

diferenças significativas na adaptação das células à estresses osmóticos, na parede

celular e drogas antifúngicas (ENE et al, 2012a) .

A adaptação a diferentes disponibilidades de nutrientes durante o processo

infeccioso também tem sido observada em outros fungos patogênicos humanos. Em

Cryptococcus neoformans, por exemplo, as células rapidamente se adaptam à privação

de glicose durante a patogênese e distúrbios nessa adaptação atenuam a sua virulência.

Durante a infecção, a glicose não está disponível em grande quantidade como fonte de

carbono sendo o etanol e o acetato, fontes preferenciais de carbono durante este

processo (HU et al, 2008). A habilidade de C. neoformans sensoriar glicose e, responder

remodelando vias metabólicas, pode ser crítica para o início da colonização no

hospedeiro (WILLIAMS & DEL POETA, 2011). A expressão da proteína antifagocítica

1 (App1) é dependente da disponibilidade de glicose. A expressão aumentada de App1

não é somente aumentada sob condições de baixos níveis de glicose, mas também no

lavado bronquialveolar, soro e sistema nervoso central. A proteína inibe a fagocitose por

macrófagos de maneira dose dependente contribuindo para a virulência de C.

neoformans (LUBERTO et al, 2003). Mutantes nulos para as enzimas glicolíticas

hexoquinases I e II e para piruvato quinase mostraram que a utilização de glicose foi

afetada e a virulência de C. neoformans foi atenuada em modelo murino de infecção

(PRICE et al, 2011). Além disso, a expressão aumentada de genes das vias glicolítica e

gliconeogênica durante interações de C. neoformans com células fagocíticas e de

tecidos do hospedeiro é similar ao já observado em C. albicans. O processo de

fagocitose e crescimento no hospedeiro resulta em aparente mudança de utilização de

carbono além da glicose e indução de transcritos para enzimas das vias do glioxilato, β-

oxidação e gliconeogênese (BARELLE et al, 2006; LORENZ et al, 2004;

PIEKARSKA et al, 2008; RAMIREZ & LORENZ, 2007). O mutante para o gene da

isocitrate liase (icl) não mostrou atenuação da virulência de C. neoformans após

modelos de infecção, mas a expressão deste mesmo gene aumentou após fagocitose do

fungo por macrófagos (RUDE et al, 2002). Isso indica respostas similares às obtidas

para C. albicans onde não há evidências de utilização de lipídeos durante a patogênese

(BROCK, 2009; OTZEN et al, 2013), apesar da indução de genes das vias do glioxilato

e defeitos na virulência do mutante para icl (LORENZ et al, 2004; LORENZ & FINK,

2001).

Recentemente, as respostas do protozoário Entamoeba hystolitica à privação de

glicose também foram caracterizadas. Os resultados mostraram que a virulência do



36

patógeno aumentou durante a baixa disponibilidade do nutriente resultando na

modulação de vias alternativas de obtenção de energia (TOVY et al, 2011). Em

protozoários, dados transcricionais e proteômicos em larga escala foram obtidos no

organismo modelo, Bacillus subtilis, sob privação de glicose. Diversas frações celulares

foram estudadas demonstrando que a bactéria alterna vias metabólicas de adaptação

para sua sobrevivência (OTTO et al, 2010).

A sobrevivência em ambientes hostis do hospedeiro tais como em tecidos

necróticos ou em fagossomos é um pré-requisito para o patógeno persistir no

hospedeiro. O conhecimento das vias metabólicas essenciais durante a patogênese pode

resultar na identificação de novos alvos de drogas ajudando a combater infecções

fúngicas. A maioria dos alvos antifúngicos tem como alvo a membrana e parede

celulares dos fungos, mas distúrbios no metabolismo podem fornecer alvos adequados.

Entretanto um dos maiores problemas na identificação de determinantes de

patogenicidade relacionados à nutrição é que as interações patógeno-hospedeiro são

processos dinâmicos e não estáticos. Porém, estudos são focados em alvos específicos

dos fungos e não das células do hospedeiro visto que vias metabólicas centrais são

comuns para ambos. A isocitrate liase, por exemplo, não é um marcador para o

metabolismo lipídico em C. albicans, mas preferencialmente para gliconeogênese e

privação. Estudos moleculares de outras enzimas que atuem como “marcadores

metabólicos” auxiliarão na construção de um mapa mais completo do metabolismo dos

patógenos, especificamente dos fungos, durante a infecção. Entretanto, apenas um

número limitado de estudos recentes tem focado no metabolismo primário durante a

infecção (BROCK, 2009).

1.4.2. Hipóxia

Outra condição enfrentada por patógenos e que é relevante para o

desenvolvimento das infecções são os baixos níveis de oxigênio encontrados no

hospedeiro. Geralmente, considera-se que a condição de hipóxia (redução dos níveis de

oxigênio comparada ao nível atmosférico) ocorre nos locais de infecção resultando em

significante estresse microambiental para a maioria das células dos patógenos

microbianos e do hospedeiro (CRAMER et al, 2003; NIZET & JOHNSON, 2009).

Estudos de monitoramento utilizando o fator de transcrição 1 induzível por hipóxia

(HIF-1) indicam que as respostas à baixos níveis de oxigênio, em células de mamíferos,



37

se iniciam em teores do gás de aproximadamente 6% (pO2, 40 mmHg) (RUPP et al,

2007). Em tecidos saudáveis no corpo humano, os níveis de oxigênio de 2,5 à 9% são

considerados normais enquanto que níveis < 1%, descrito em tumores e feridas, são

tipicamente considerados hipóxia (ARNOLD et al, 1987; DEWHIRST, 1998; SIMMEN

et al, 1994). Até mesmo nos pulmões, local de intensa troca gasosa e ponto de partida

para muitas infecções fúngicas, a pressão de oxigênio é considerada bem menor que a

atmosférica, em torno de 14% (pO2, 100 à 110 mmHg) (JAIN & SZNAJDER, 2005).

Os mecanismos de adaptação à hipóxia têm sido amplamente estudados em

células de mamíferos e micro-organismos não patogênicos, porém há pouca informação

na influência dessa condição na infectividade e virulência de patógenos (ERNST &

TIELKER, 2009). Quando micro-organismos invasores interagem com células

hospedeiras, lesões nos tecidos devido a processos inflamatórios, tromboses e necroses

resultam em diminuição das tensões de oxigênio pelo decréscimo da perfusão do gás

nos locais de infecção (ELTZSCHIG & CARMELIET, 2011; NIZET &J OHNSON,

2009). Consequentemente, os patógenos devem se adaptar à essa condição de estresse a

fim de estabelecerem a infecção (GRAHL et al, 2012).

Os mecanismos de adaptação à hipóxia são variáveis entre fungos patogênicos

humanos (BARKER et al, 2012; SHIMIZU et al, 2009; SYNNOTT et al, 2010) e são

considerados fatores chave na virulência destes patógenos (CHANG et al, 2007; CHUN

et al, 2007; ERNST & TIELKER, 2009; GRAHL & CRAMER, 2010; HALL &

DENNING, 1994; SETIADI et al, 2006; WEST, 1985; WILLGER et al, 2008). As

respostas frente às baixas tensões de oxigênio encontradas pelos micro-organismos se

baseiam no sensoriamento de oxigênio com a finalidade de ativar sistemas complexos

de respostas a essa condição. O sensoriamento de oxigênio nos fungos foi

primeiramente caracterizado na levedura de fissão Schizosaccharomyces pombe, sendo

recentemente caracterizada em outros fungos (CHANG et al, 2007; LANE et al, 2001;

WILLGER et al, 2008) como, por exemplo, C. neoformans e A. fumigatus. As células

de S. pombe respondem à baixa disponibilidade de oxigênio no ambiente controlando a

transcrição de genes envolvidos na síntese de esteróis das membranas celulares a partir

do fator de transcrição denominado Sre1, uma proteína homóloga às SREBPs (sterol

regulatory element binding protein) de mamíferos nas quais controlam a transcrição de

genes somente em resposta à depleção de esteróis nas células. Em C. neoformans e A.

fumigatus os homólogos da Sre1 de S. pombe também tem sido caracterizado sendo

denominados Sre1 e SrbA, respectivamente (BLATZER et al, 2011; CHANG et al,



38

2007; CHUN et al, 2007; WILLGER et al, 2008). As leveduras de fissão controlam as

respostas tanto à hipóxia quanto a depleção de esteróis da membrana pelo mesmo fator

de transcrição provavelmente pela incapacidade das células importarem esteróis do

meio extracelular, dependendo exclusivamente da via de biossíntese de ergosterol na

qual requer oxigênio (BIEN & ESPENSHADE, 2010; HUGHES et al, 2005). Assim,

Sre1 de S. pombe e seus homólogos em outros fungos parecem ser o principal regular

hipóxico nas células fúngicas. Apesar de regular dois terços de todos os genes

responsivos à hipóxia nas leveduras de fissão, o fator de transcrição Sre1 não controla

diretamente genes para as atividades glicolítica e respiratória. Somente 22% dos genes

regulados hipoxicamente dependem da regulação por Sre1 de forma direta (TODD et al,

2006).

A aplicação de abordagens transcricionais e proteômicas vem crescendo

gradativamente no estudo de fungos patogênicos humanos na tentativa de desvendar

ainda mais os mecanismos moleculares de adaptação destes fungos nos microambientes

do hospedeiro durante a patogênese. Por exemplo, cada vez mais têm sido descrito as

respostas dos fungos à limitação de oxigênio e sugerido mecanismos de adaptação à esta

condição. A importância desta adaptação para patogênese fúngica também tem sido

investigada pelos cientistas. Em C. neoformans, as respostas transcricionais à hipóxia

revelaram que o fungo aumenta a expressão de transcritos associados com a biossíntese

do grupo heme e de ergosterol, metabolismo de ácidos graxos, de respostas a estresse e

respiração celular. Por outro lado, o fungo diminuiu a expressão de transcritos

envolvidos com parede celular e biossíntese da cápsula (CHUN et al, 2007). Os

principais reguladores das respostas à hipóxia neste fungo são o fator de transcrição

Sre1, membro da família SREBPs, mas também a proteína Tco, membro da família das

histidina quinases específicas de fungo (CHUN et al, 2007). Como explicado

anteriormente, Sre1 tem sido caracterizado como o principal fator envolvido no

sensoriamento de oxigênio nos fungos, mas não o único. Em C. neoformans isto tem

sido demonstrado. Sre1 regula genes associados à biossíntese de ergosterol e captação

de metal em resposta à hipóxia e o mutante para este gene interfere no crescimento do

fungo nesta condição. Por outro lado, o mutante para o outro regulador, Tco, não afeta

os níveis de expressão de genes em resposta à hipóxia. Assim, os autores acreditam que

a proteína Tco atua pós-transcricionalmente para mediar os impactos no crescimento

hipóxico de C. neoformans (CHANG et al, 2007; CHUN et al, 2007).



39

No fungo A. fumigatus, respostas transcricionais e proteômicas em resposta à

hipóxia têm sido conduzidas (BARKER et al, 2012; VODISCH et al, 2011). Um dos

estudos focam nas respostas iniciais do fungo à hipóxia (BARKER et al, 2012)

enquanto o outro nas respostas mais tardias (VODISCH et al, 2011). O fungo,

inicialmente em resposta à hipóxia, induz a transcrição de genes envolvidos com a

glicólise, fermentação, biossíntese de ergosterol, captação do íon ferro e da rota

aminobutirato (GABA shunt). A rota aminobutirato tem sido descrita como envolvida

nas respostas à hipóxia somente em A. fumigatus, em relação aos fungos patogênicos

humanos. Esta rota contribui para a formação de glutamato e acredita-se estar envolvida

na prevenção do acúmulo de NADH devido a ausência de aceptores de elétrons terminal

tais como o oxigênio (FAIT et al, 2005). Isso indica que as espécies de Aspergillus não

somente fermentam para reabastecer recursos de NAD+ para o fluxo glicolítico

continuado, mas também parecem usar esta rota para prevenir a acumulação de NADH

(GRAHL et al, 2012). Por outro lado, o fungo reduz a expressão de transcritos do ciclo

do ácido cítrico e cadeia mitocondrial durante a resposta inicial à hipóxia (BARKER et

al, 2012). Ao contrário dos estudos iniciais à hipóxia, as respostas tardias de A.

fumigatus à hipóxia em níveis protéicos, revelaram que a abundância de proteínas

relacionadas à glicólise, ciclo do ácido cítrico e respiração, aumentou, enquanto que as

envolvidas com a fermentação, diminuiu, sugerindo que a fermentação pode ser

utilizada nas etapas iniciais do fungo em hipóxia enquanto que a respiração oxidativa

nas etapas mais tardias (VODISCH et al, 2011). Assim como em C. neoformans, A.

fumigatus apresenta o homólogo do fator de transcrição Sre1 de S. pombe, denominado

SrbA. A falta deste fator significativamente interfere no crescimento do fungo em

hipóxia e muitos transcritos foram encontrados ser dependentes desta SREBP tais como

aqueles envolvidos com a biossíntese de ergosterol e captação de metais (BLATZER et

al, 2011; WILLGER et al, 2008).

No fungo C. albicans, estudos transcricionais revelaram que a condição de

hipóxia eleva a expressão de genes envolvidos com metabolismo de ferro, biossíntese

do grupo heme, metabolismo de ácidos graxo, de ergosterol, glicólise e fermentação,

estruturas da parede e membrana celulares além de transcritos específicos da hifa. Ao

contrário, transcritos envolvidos com respiração oxidativa (síntese geral de ATP) foram

decrescidos em abundância (ASKEW et al, 2009; SETIADI et al, 2006; SYNNOTT et

al, 2010). Desse modo, semelhanças são detectadas entre as vias reguladas pelos três

fungos citados anteriormente assim como diferenças. Em C. neoformans, a respiração



40

foi aumentada em resposta à hipóxia e em C. albicans ocorreu o oposto, ambos em

níveis transcricionais. Em A. fumigatus esta via só foi detectada ativada, em níveis

protéicos, após longos períodos do fungo sob hipóxia. Por outro lado, C. albicans não

tem o homólogo da família das SREBPs presente em C. neoformans e A. fumigatus. O

homólogo do fator de transcrição de S. cerevisiae Upc2 foi encontrado para C. albicans

e parece regular os níveis de ergosterol em resposta à hipóxia (MACPHERSON et al,

2005; SILVER et al, 2004; SYNNOTT et al, 2010) assim como Sre1 em S. pombe, C.

neoformans e A. fumigatus (CHANG et al, 2007; HUGHES et al, 2005; WILLGER et

al, 2008). Outros reguladores também têm sido descritos em C. albicans em resposta à

hipóxia tais como a proteína Efg1, crítico para biossíntese de ácidos graxos em hipóxia

(SETIADI et al, 2006), os fatores de trancrição Tye7 e Gal4, envolvidos com a indução

de genes glicolíticos sob hipóxia (ASKEW et al, 2009) e o regulador transcricional

Ace2 requerido para a transcrição de genes envolvidos na separação celular sob

condições de hipóxia (MULHERN et al, 2006).

Além dos reguladores da resposta à hipóxia em fungos patogênicos citados

acima, outros mutantes nulos para genes regulados por hipóxia ou reguladores da

adaptação à hipóxia mostram que a virulência de vários fungos foi atenuada em

modelos murinos de infecção como revisto em Butler (2013). Muitas destas moléculas

requerem o oxigênio molecular para processos biossintéticos e consequentemente

participam do sensoriamento dos níveis deste gás. Em teoria, muitas das moléculas nas

quais a biossíntese é reduzida ou inibida em condição de hipóxia podem ser utilizadas

na invasão do fungo às células hospedeiras. Dessa forma, de forma indireta, tais

sensores dos teores de oxigênio estimulam mudanças no metabolismo geral das células

permitindo a adaptação à hipóxia (BUTLER, 2013) tornando extremamente relevante o

estudo deste estresse em fungos patogênicos humanos, pois o sucesso da infecção pode

ser influenciado por tal adaptação.



41

2) Justificativa

Estudos da interação do fungo Paracoccidioides spp. com seu hospedeiro

revelam que este patógeno possui estratégias de sobrevivência nos sítios de infecção e

se adapta às diferentes condições de estresse enfrentadas pelo patógeno, regulando a

expressão de genes e proteínas de forma nicho específica (BAILAO et al, 2006;

BAILAO et al, 2007; COSTA et al, 2007; DERENGOWSKI et al, 2008;

GROSSKLAUS et al, 2013; PARENTE et al, 2013; TAVARES et al, 2007). Nos

fagócitos ou mesmo em outros nichos ecológicos, os fungos patogênicos humanos

enfrentam estresses nutricional, térmico, nitrosativo, oxidativo além daqueles

decorrentes de alterações de pH, variações na tensão de oxigênio e exposição à agentes

tóxicos (BROWN et al, 2007b). Paracoccidioides spp. possivelmente se adapta às

condições de estresse nutricional e baixas tensões do gás oxigênio durante a sua

patogênese. O estudo dos aspectos metabólicos e a caracterização dos mecanismos

moleculares utilizados pelo fungo frente à estes estresses tornam-se relevantes no

contexto da interação e adaptação de Paracoccidioides spp. aos microambientes do

hospedeiro desde que são importantes durante o estabelecimento da doença e ainda não

foram elucidados.

A aplicação de abordagens transcricionais e proteômicas, ainda escassa em

fungos patogênicos humanos, vem crescendo gradativamente. A proteômica vem

acompanhada do desenvolvimento dos bancos de dados que, no gênero

Paracoccidioides, disponibilizou a anotação dos genomas das linhagens fúngicas Pb01,

Pb18 e Pb03 permitindo que genes e proteínas sejam rapidamente identificados.

Embora evidências de que Paracoccidioides spp. enfrenta condições de privação

de nutrientes durante interação com células fagocíticas do hospedeiro (TAVARES et al,

2007) e regula a expressão diferencial de genes durante a disseminação sistêmica do

fungo (BAILAO et al, 2007; COSTA et al, 2007), condições onde podem ser

encontradas condições de hipóxia, as respostas do fungo em condições de privação de

glicose e de baixas tensões de oxigênio não têm sido caracterizadas até o momento,

ainda mais por análises de sequenciamento em larga escala e cromatografia líquida bi-

dimensional acoplada à espectrometria de massas. Acreditamos que os dados obtidos

possam ser relevantes na elucidação de mecanismos moleculares e moléculas

importantes para o estabelecimento do fungo no hospedeiro, ainda bastante obscuros.



42

3) Objetivos

O objetivo do trabalho é caracterizar as respostas do fungo Paracoccidioides,

Pb01, frente às condições de privação de glicose ou hipóxia. Para tal, os objetivos

específicos são:

Avaliar as respostas do fungo em níveis transcricionais e proteômicos nas

condições de privação de glicose e controle, por meio de PCR em tempo

real, western blot, sequenciamento em larga escala (RNAseq) e

cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (NanoUPLC-

MSE);

Verificar a suceptibilidade de células do fungo previamente privadas ou não

de glicose à morte por macrófagos;

Caracterizar o homólogo do fator de transcrição da família das SREBPs,

responsivos à hipóxia no Pb01, PbsrbA, por análises in silico, PCR em

tempo real e ensaio de complementação gênica no mutante nulo para srbA de

A. fumigatus;

Verificar o crescimento, susceptibilidade à antifúngicos e privação do íon

ferro das linhagens mutante para srbA, geneticamente complementada com

PbsrbA e tipo selvagem de A. fumigatus;

Analisar o perfil de expressão diferencial de transcritos e proteínas do Pb01

em condições que mimetizam hipóxia e controle, por meio de PCR em

tempo real e western blot;

Caracterizar as respostas protéicas do Pb01 em condições que mimetizam

hipóxia por análise em gel bi-dimensional;

Propor possíveis estratégias moleculares e adaptativas enfrentadas pelo

fungo em resposta a ambos os estresses, privação de glicose e de oxigênio.

14/11/13 View Letter

www.editorialmanager.com/pntd/viewLetter.asp?id=255514&lsid={C6511542-43EE-4F45-AA56-6BA2B03F13D0} 1/1

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Date: Nov 7 2013 9:29PM

To: "Celia Maria de Almeida Soares" [email protected]

From: "PLOS Neglected Tropical Diseases" [email protected]

Subject: Your presubmission inquiry

Dear Dr. de Almeida Soares

Thank you very much for your presubmission inquiry to PLoS Neglected Tropical Diseases.

We are interested in your work, "Title - Transcriptional and Proteomic Responses of

Paracoccidioides Facing Glucose Deprivation Short Title - Glucose Deprivation in Paracoccidioides,"

and its relevance to neglected tropical diseases. The Editorial Board would like to invite you to

submit your manuscript for full consideration at:

http://www.editorialmanager.com/pntd

This decision reflects the Board's interest in the study you have described. However, please

understand that the editorial decision to send a paper out for peer-review can only be made after

we have the opportunity to evaluate the full-length manuscript.

When you do submit, please include mention of this presubmission inquiry and the manuscript

number (PNTD-D-13-01786) in the "Previous Interactions" section of the submission form.

We look forward to receiving your paper.

Sincerely,

Peter Hotez

Editor-in-Chief

Close

To the PloS Neglected Tropical Diseases Editorial Board

Goiânia, November 7th,, 2013.

It is our pleasure to submit our article entitled “Transcriptional and

proteomic responses to glucose deprivation in Paracoccidioides” to the PLoS

Neglected Tropical Diseases editorial board.

The genus Paracoccidioides comprises human thermal dimorphic fungi,

causing paracoccidioidomycosis (PCM), an important mycosis in Latin America.

This manuscript focuses in this dimorphic fungus, which causes a disease that

commonly presents a respiratory chronic manifestation and eventually

disseminated lesions. The disease is considered the most prevalent systemic

fungal infection in Brazil and is present in Latin American countries from Mexico to

Argentina.

Adaptation to environmental conditions is key to fungal survival during

infection of human hosts. Macrophages are a poor- glucose and amino acid

environment and it has been suggested that alternative carbon metabolism plays a

role in survival and virulence of Paracoccidioides spp. within the host cells.

Whereas the physiological and metabolic changes in Paracoccidioides spp.

following their exposure to oxidative stress, iron and zinc deprivation have been

investigated, the effects of glucose deprivation in this parasite is lacking.

For a complete understanding of physiological processes in an organism,

the integration of approaches addressing different levels of regulation should be

relevant. We analyzed differences in transcripts and proteins levels in control and

glucose-starved yeast cells, by quantitative large-scale transcriptome (RNAseq)

and proteome (NanoUPLC-MSE) analysis. A total of 2,437 transcripts and 421

proteins, were differentially regulated, providing a global view of metabolic

reprogramming during glucose deprivation. The main changes were those related

to cells shift to gluconeogenesis and ethanol production, supported by the

degradation of amino acids and fatty acids and by the modulation of the glyoxylate

and tricarboxylic cycles. This proposed carbon flow remodeling was reinforced by

gene and protein expression profiles accessed by qRT-PCR and western blot

analysis, respectively, as well as by enzymatic, cell dry weight and fungus-

macrophage interaction assays. The obtained data comprise the first

comprehensive profiling of changes of Paracoccidioides under glucose restriction

and allow in-depth analysis of major physiological processes.

This article is part of our work on identification and characterization of

molecules associated to the fungus host interaction as we had described in some

recent publications. We believe that this article represents a great contribution for

those involved in this area.

We hope to hear from you soon

Sincerely,

Célia Maria de Almeida Soares, PhD Laboratório de Biologia Molecular Instituto de Ciências Biológicas Universidade Federal de Goiás,

74001-970, Goiânia, Goiás, Brazil. Tel/Fax:55-62-5211110

e-mail:<[email protected] >

1

Transcriptional and proteomic responses to glucose deprivation in 1

Paracoccidioides 2

3

Patrícia de Sousa Lima 1,2

, Luciana Casaletti 1, Alexandre Melo Bailão

1, Ana Tereza 4

Ribeiro de Vasconcelos 3, Gabriel da Rocha Fernandes

4, Célia Maria de Almeida 5

Soares 1,*

6

7

1 Laboratório de Biologia Molecular, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade 8

Federal de Goiás, Goiânia, Goiás, Brazil;2 Programa de Pós Graduação em Patologia 9

Molecular, Faculdade de Medicina, Universidade de Brasília, Brasília, Distrito Federal, 10

Brazil.3Laboratório Nacional de Computação Científica (LNCC), Petrópolis, Rio de 11

Janeiro, Brazil.4Laboratório de Bioinformática, Universidade Católica de Brasília, 12

Brasília, Distrito Federal, Brazil. 13

* e-mail: [email protected] 14

15

Abstract 16

17

Background 18

The genus Paracoccidioides comprises human thermal dimorphic fungi, which 19

cause paracoccidioidomycosis (PCM), an important mycosis in Latin America. 20

Adaptation to environmental conditions is key to fungal survival during human host 21

infection. The adaptability of carbon metabolism is a vital fitness attribute during 22

pathogenesis. 23

24

25

mailto:[email protected]

2

Methodology/ Principal Findings 26

The fungal pathogen Paracoccidioides spp. is exposed to numerous adverse 27

conditions, such as nutrient deprivation, in the human host. In this study, a 28

comprehensive response of Paracoccidioides, Pb01, under glucose deprivation was 29

investigated using high-resolution transcriptomic (RNAseq) and proteomic 30

(NanoUPLC-MSE) approaches. A total of 2,437 transcripts and 421 proteins, were 31

differentially regulated, providing a global view of metabolic reprogramming during 32

glucose deprivation. The main changes were those related to cells shifting to 33

gluconeogenesis and ethanol production, supported by the degradation of amino acids 34

and fatty acids and by the modulation of the glyoxylate and tricarboxylic cycles. This 35

proposed carbon flow hypothesis was supported by gene and protein expression profiles 36

assessed using qRT-PCR and western blot analysis, respectively, as well as using 37

enzymatic, cell dry weight and fungus-macrophage interaction assays. The glucose 38

provides a survival advantage to Paracoccidioides inside macrophages. 39

40

Conclusions/ Significance 41

For a complete understanding of the physiological processes in an organism, the 42

integration of approaches addressing different levels of regulation is important. To the 43

best of our knowledge, this report presents the first description of the responses of 44

Paracoccidioides spp., to host-like conditions using large-scale expression approaches. 45

The alternative metabolic pathways that could be adopted by the organism during 46

glucose deprivation can be important for a better understanding of the fungal adaptation 47

to the host, because systems for detecting and responding to carbon sources play a 48

major role in adaptation and persistence in the host niche. 49

50

3

Author Summary 51

The species of the Paracoccidioides genus, a neglected human pathogen, 52

represents the causative agents of paracoccidioidomycosis (PCM), one of the most 53

frequent systemic mycoses in Latin America. Despite being phagocytosed, the fungus 54

conidia differentiate into the parasitic yeast form that subverts the normally harsh 55

intraphagosomal environment and survives and replicates into murine and human 56

macrophages. It has been suggested that alternative carbon metabolism plays a role in 57

the survival and virulence of Paracoccidioides spp within host cells. We used large 58

scale transcriptome and proteome approaches to better characterize the responses of 59

Paracoccidioides, Pb01, yeast parasitic cells, to glucose deprivation. We aimed to 60

identify important molecules used by the fungus to adapt to these hostile conditions. 61

The shift to a starvation mode, including gluconeogenic and ethanol increases, 62

activation of fatty acids and amino acid degradation are the strategies used by the 63

pathogen to persist under this stress. Our study provides a detailed map of 64

Paracoccidioides spp. responses under glucose deprivation conditions and contributes 65

to further investigations of the importance of alternative carbon adaptation during 66

fungus pathogenesis. 67

68

Introduction 69

Metabolic adaptability and flexibility are important attributes for pathogens to 70

successfully colonize, infect, and cause disease in a wide range of hosts. Therefore, they 71

must be able to assimilate various carbon sources. Carbohydrates are the primary and 72

preferred source of metabolic carbon for most organisms and are used for generating 73

energy and producing biomolecules (ASKEW et al, 2009). 74

4

Studies have highlighted the importance of carbon metabolism in fungi (PRICE 75

et al, 2011; RAMIREZ & LORENZ, 2007). Pathogens such as Candida albicans 76

display sufficient metabolic flexibility to assimilate the available nutrients in diverse 77

niches such as the skin, mucous membranes, blood, and biofilms (CALDERONE, 2002; 78

ODDS, 1988). The mucosal surface of the lung may provide a more nutrient-limited 79

condition because it is not in direct contact with nutrients from food intake (TRAVIS et 80

al, 1999). Additionally, in the lungs, macrophages rapidly phagocytose inhaled 81

microorganisms supported by neutrophils and dendritic cells (IBRAHIM-GRANET et 82

al, 2010). Macrophages are considered a glucose- and amino acid-poor environment 83

(BARELLE et al, 2006; LORENZ et al, 2004) and may form extremely nutrient-limited 84

conditions causing severe starvation (FLECK et al, 2011). In C. albicans and 85

Cryptococcus neoformans, alternative carbon metabolism was detected after 86

internalization by macrophages playing a role in fungal survival in these host cells 87

(COONEY & KLEIN, 2008; FAN et al, 2005; LORENZ et al, 2004). In contrast, in the 88

case of systemic infections, pathogens can reach different internal organs such as the 89

liver, which is the main storage compartment of glucose in the form of glycogen. The 90

bloodstream, for example, is the major carrier of nutrients, glucose, proteins, amino 91

acids, and vitamins in larger quantities (FLECK et al, 2011). In this way, metabolic and 92

stress adaptation represent vital fitness attributes that have evolved alongside virulence 93

attributes in fungi (BARELLE et al, 2006; FLECK et al, 2011; FRADIN et al, 2005; 94

LORENZ et al, 2004). 95

Alternative carbon metabolism was also described to be important to protozoa 96

and bacteria (OTTO et al, 2010; TOVY et al, 2011). Entamoeba histolytica uses an 97

alternative source of energy when the microorganism is exposed to glucose starvation. 98

In the specific pyruvate-to-ethanol pathway in E. histolytica, acetyl-CoA is converted to 99

5

acetaldehyde, which is then reduced to ethanol (LO & REEVES, 1978). Reduced levels 100

of the long-chain fatty-acid-CoA ligase protein during glucose starvation conditions in 101

E. histolytica may explain a mechanism by which acetyl-CoA is shuttled from the fatty 102

acid metabolism into this pyruvate-to-ethanol pathway. In addition, the glucose 103

starvation modulates the protozoa virulence based on proteome analysis (TOVY et al, 104

2011). The transcriptome and large-scale proteome dynamics were also analyzed in 105

Bacillus subtilis from glucose-starved cells. A direct consequence of glucose depletion 106

on enzymes was the switch from glycolytic to gluconeogenic metabolism and elevated 107

abundance of proteins of the tricarboxylic cycle used for energy generation. Genes that 108

are involved in exponential growth, amino-acid biosynthesis, purine/ pyrimidine 109

synthesis and the translational machinery were down-regulated in the bacteria cells 110

under glucose starvation (OTTO et al, 2010). 111

The species of the Paracoccidioides genus represent the causative agents of 112

paracoccidioidomycosis (PCM), one of the most frequent systemic mycoses in Latin 113

America (RESTREPO & TOBON, 2005). The genus comprises four phylogenetic 114

lineages (S1, PS2, PS3, and Pb01-like). The phylogenetic analysis of many 115

Paracoccidioides isolates has resulted in the differentiation of the genus into two 116

species: P. brasiliensis, which represents a complex of three phylogenetic groups, and 117

P. lutzii, which represents the Pb01-like isolates (CARRERO et al, 2008; 118

DESJARDINS et al, 2011; MATUTE et al, 2006; TEIXEIRA et al, 2009). 119

Paracoccidioides spp. grows as a yeast form in the host tissue and in vitro at 36°C, 120

while it grows as mycelium under saprobic condition and in culture at room temperature 121

(18–23°C). As the dimorphism is dependent on temperature, when the mycelia/ conidia 122

are inhaled into the host lungs, the transition of the mycelia to the pathogenic yeast 123

phase occurs (SAN-BLAS et al, 2002). 124

6

One of the first lines of defense faced by Paracoccidioides spp. during host 125

invasion is the lung resident macrophages. Despite being phagocytosed, the fungus 126

conidia differentiate into the parasitic yeast form that subverts the normally harsh 127

intraphagosomal environment and survives and replicates into murine and human 128

macrophages (BRUMMER et al, 1989). It has been proposed for PCM and other 129

systemic mycoses that the fungal intracellular parasitism is a major event for disease 130

establishment and progression in susceptible hosts, by enabling fungal latency and/or 131

dissemination from the lungs to several organs such as observed in C. neoformans 132

(FELDMESSER et al, 2000; FRANCO, 1987). In this sense, Paracoccidioides spp. has 133

evolved defense mechanisms to survive under nutritionally poor environments. It has 134

been suggested that alternative carbon metabolism plays a role in the survival and 135

virulence of Paracoccidioides spp. within the host (DERENGOWSKI et al, 2008; 136

TAVARES et al, 2007), as occurs in C. albicans and C. neoformans (FAN et al, 2005; 137

LORENZ et al, 2004). The early transcriptome of Paracoccidioides spp. upon 138

internalization by macrophages showed that the fungus responds to the glucose-depleted 139

environment found in the macrophage phagosome. Genes involved in methionine 140

biosynthesis (cystathionine β-lyase), oxidative stress response (superoxide dismutase 141

and heat shock protein 60), and cytochrome electron transport system (cytochrome 142

oxidase c) were induced by the fungus. Moreover, Paracoccidioides spp. reduced the 143

expression of genes that are involved in the glycolysis pathway such as the key 144

regulatory phosphofructokinase (pfkA) and genes related to cell wall polysaccharides 145

such as β-glucan synthase (fks) (TAVARES et al, 2007). In addition, the transcriptome 146

profiling from yeast cells of Paracoccidioides spp. derived from mouse livers revealed 147

that the fungus most likely uses multiple carbon sources during liver infection. Genes 148

encoding enzymes, regulators, and transporters in carbohydrate and lipid metabolism 149

7

were significantly overexpressed. Ethanol production was also detected, indicating that 150

it may be particularly important during infection (COSTA et al, 2007). 151

Here, we described the response of Paracoccidioides facing glucose deprivation 152

using a high-throughput RNA sequencing (RNAseq) and quantitative proteome 153

NanoUPLC-MSE, a two-dimensional liquid chromatography-tandem mass spectrometry 154

approach. RNAseq is a developed approach to transcriptome profiling that uses deep-155

sequencing technologies and has already been applied to organisms such as 156

Saccharomyces cerevisiae, Arabidopsis thaliana, mouse, and human cells (CLOONAN 157

et al, 2008; LISTER et al, 2008; MORTAZAVI et al, 2008; NAGALAKSHMI et al, 158

2008; WANG et al, 2009b). With regard to proteomic analysis, our group has developed 159

detailed proteome maps of the process of the fungus dimorphism, the response to iron 160

deprivation, the fungus exoproteome, and the response to oxidative stress as well as 161

comparative proteome maps of members of Paracoccidioides phylogenetic species 162

(GROSSKLAUS et al, 2013; PARENTE et al, 2011; PIGOSSO et al, 2013; REZENDE 163

et al, 2011; WEBER et al, 2012). In this study, a comprehensive response of 164

Paracoccidioides, isolate Pb01, under glucose deprivation was performed by 165

transcriptional and proteomic approaches. To the best of our knowledge, this is the first 166

description of high-resolution transcriptomics and proteomics applied to study the 167

response of Paracoccidioides spp. to glucose deprivation. We believe that the obtained 168

data can be relevant in the understanding of the fungal establishment in the host. 169

170

171

172

173

174

8

Materials and Methods 175

176

Paracoccidioides maintenance 177

Paracoccidioides, Pb01 (ATCC MYA-826), was used in the experiments. The 178

yeast phase was cultivated for 7 days, at 36°C in BHI semisolid medium added to 4% 179

(w/v) glucose. When required, the cells were grown for 72 h at 36°C in liquid BHI, 180

washed with PBS, and incubated at 36°C in McVeigh/Morton medium (MMcM) 181

(RESTREPO & JIMENEZ, 1980). Because amino acids in MMcM could be 182

gluconeogenic precursors, we modified it to cultivate Paracoccidioides with [4% (w/v)] 183

or without glucose in medium without cysteine and asparagine amino acids. 184

185

Quantitative real time PCR (qRT-PCR) analysis 186

Following Paracoccidioides yeast cells growth in glucose deprivation, cells 187

were centrifuged at 1500 x g, frozen in liquid nitrogen, and disrupted by maceration as 188

described in (PARENTE et al, 2011). Briefly, cells were treated with TRIzol reagent 189

(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). The manufacturer’s protocol was followed to extract 190

total RNA. The RNA was reversibly transcribed using the high capacity RNA-to-cDNA 191

kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). We confirmed the specificity of each 192

primer pairs for the target cDNA by the visualization of a single PCR product following 193

agarose gel electrophoresis and melting curve analysis. The cDNA was quantified by 194

qRT-PCR using a SYBR green PCR master mix (Applied Biosystems Step One Plus 195

PCR System). qRT-PCR analysis was performed in triplicate for each cDNA sample as 196

previously described (PARENTE et al, 2011). The data were normalized using the 197

constitutive gene encoding the 60S ribosomal L34 gene as the endogenous control, 198

which was amplified in each set of qRT-PCR experiments and were presented as 199

9

relative expression in comparison to the experimental control cells value set at 1. Data 200

were expressed as the mean ± standard deviation of the triplicates of independent 201

experiments. Standard curves were generated by diluting the cDNA solution 1:5. 202

Relative expression levels of genes of interest were calculated using the standard curve 203

method for relative quantification (BOOKOUT et al, 2006). Statistical comparisons 204

were performed using the student’s t test and p-values <0.05 were considered 205

statistically significant. The specific primers, both sense and antisense, are described in 206

Table S5. 207

208

Western blot analysis 209

Proteins were fractionated by 12% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and 210

stained with Coomasie Blue R or transferred to HybondTM

ECLTM

membrane (GE 211

Healthcare). Membranes were blocked for 1 h at room temperature in a solution 212

containing 10% (w/v) skim milk powder and 0.1% Tween 20 in Tris-buffered saline 213

(TBS-T). The primary antibody (the rabbit polyclonal anti-isocitrate lyase) was diluted 214

in blocking solution and incubated with the membrane for 1 h at room temperature. 215

Membranes were washed in Tris-buffered saline and then incubated with alkaline 216

phosphatase conjugated secondary antibodies for another hour at room temperature. 217

Labeled bands were revealed with5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate/nitroblue 218

tetrazolium and negative controls were obtained with rabbit preimmune. Images from 219

western blots were acquired with ImageMasterTM

2D Platinum 6.0 (Geneva 220

Bioinformatics, GeneBio). Raw Tiff images were analyzed by Image J 1.45s (Wayne 221

Rasband). Pixel intensity for the analyzed bands was generated and expressed as 222

Integrated Density Values (IDV). Values were normalized considering 100% the 223

maximum IDV value for each experiment. 224

10

High-throughput mRNA sequencing (RNA-seq) 225

Following Paracoccidioides growth in glucose (control) or glucose deprivation 226

(treatment) for 6 h, cells were treated with TRIzol reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, 227

USA) to obtain RNA molecules. Aliquots from mRNA samples were used for 228

construction of the cDNA libraries. Total cDNAs sequencing from a pool of biological 229

triplicates was performed using the HiSeqTM

2000 Sequencing System from Illumina 230

(http://www.illumina.com/). As a result, approximately 40 million of reads of 100 bp 231

paired-end sequencing were obtained for each sample. The sequencing reads were 232

mapped to reference the Paracoccidioides genome (Pb01), 233

(http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/paracoccidioides_brasiliensis/MultiH234

ome.html), using the Bowtie 2 tool (LANGMEAD et al, 2009). Mapped reads data were 235

analyzed by the DEGseq package (WANG et al, 2009a). Briefly, each read was allowed 236

to alignment in just one site of the genome and the reads were counted. The fold change 237

selection method was used for differentially expressed genes selection using a Fisher 238

exact test, and a p-value of 0.001 was considered to select the genes. From the selected 239

genes, the 1.5-fold change cut-off was considered. Genes with log2 (fold change) higher 240

than 0.58 or less than -0.58 were selected and classified as up- and down-regulated 241

genes, respectively. Gene’s identifications and annotations were determined from the 242

Paracoccidioides genome database 243


ome.html). The biological processes were obtained using the Pedant on MIPS 245

(http://pedant.helmholtz-246

muenchen.de/pedant3htmlview/pedant3view?Method=analysis&Db=p3_r48325_Par_br247

asi_Pb01) which provides a tool to browse and search the Functional Categories 248

(FunCat) of proteins. All scripts can be obtained on request. 249

http://www.illumina.com/






http://pedant.helmholtz-muenchen.de/pedant3htmlview/pedant3view?Method=analysis&Db=p3_r48325_Par_brasi_Pb01



11

Sample preparation, data acquisition and processing and protein identification by 250

mass spectrometry analysis 251

Following Paracoccidioides cell growth in glucose depleted media for up to 48 252

h, the cells were centrifuged at 1500 x g, resuspended in a in homogenization buffer (2 253

mM CaCl2, 20 mM Tris–HCl, pH 8.8) containing a mixture of nuclease and protease 254

inhibitors (GE Healthcare, Uppsala, Sweden) and disrupted using glass beads and bead 255

beater apparatus (BioSpec, Oklahoma, USA) in 5 cycles of 30 sec, while on ice. The 256

cell lysate was centrifuged at 10000 x g for 15 min at 4 °C and the supernatant was 257

concentrated and subsequently washed three times using 50 mM ammonium 258

bicarbonate pH 8.5 solution via ultracentrifugation through a 10-kDa molecular weight 259

cut off in ultracel regenerated membrane (Amicon Ultra centrifugal filter, Millipore, 260

Bedford, MA, USA). Proteins were quantified using the Bradford reagent (Sigma-261

Aldrich) (BRADFORD, 1976). The samples were analyzed using nanoscale liquid 262

chromatography coupled with tandem mass spectrometry. Sample aliquots (50 μg) were 263

prepared for NanoUPLC-MSE

as previously described (MURAD & RECH, 2012; 264

MURAD et al, 2011). Briefly, 50 mM ammonium bicarbonate was added and was 265

followed by addition of 25 µL of RapiGESTTM

(0.2% v/v) (Waters Corp, Milford, MA). 266

The solution was vortexed and then incubated at 80°C for 15 min; 2.5 µL of a 100 mM 267

DTT solution was then added and incubated for 30 min at 60°C. The sample was then 268

cooled at room temperature, and 2.5 µL of 300 mM iodoacetamide was added followed 269

by sample incubation in a dark room for 30 min. A 10 µL aliquot of trypsin (Promega, 270

Madison, WI, USA) prepared with 50 mM ammonium bicarbonate to 50 ng/ uL, was 271

added. The sample was vortexed slightly and digested at 37°C overnight. Following the 272

digestion, 10 µL of 5% (v/v) trifluoroacetic acid was added to hydrolyze the 273

RapiGESTTM

, followed by incubation at 37°C for 90 min. The sample was centrifuged 274

12

at 18000 x g at 6°C for 30 min, and the supernatant was transferred to a Waters Total 275

Recovery vial (Waters Corp). A solution of one pmol ul-1

MassPREP Digestion Standard 276

[rabbit phosphorilase B (PHB)] (Waters Corp) was used to prepare the final 277

concentration of 150 fmol ul-1

of the PHB. The buffer solution of 20 mM ammonium 278

formate (AF) was used to increase the pH. The digested peptides were separated further 279

via NanoUPLC-MSE and analyzed using a nanoACQUITY

TM system (Waters 280

Corporation, Manchester, UK). Mass spectrometry data obtained from NanoUPLC-MSE 281

were processed and searched using ProteinLynx Global Server (PLGS) version 3.0 282

(Waters Corp). Protein identifications were obtained by searching against the 283

Paracoccidioides database 284


ome.html). Protein and peptides tables generated by PLGS were merged and the 286

dynamic range of the experiments, peptides detection type, and mass accuracy were 287

determined for each condition as described in (MURAD & RECH, 2012). In addition, a 288

constitutive protein detected in all replicates and with a low variance coefficient was 289

used to normalize the expression data and accurately compare the expression protein 290

level to control and glucose-deprived samples. 291

292

Paracoccidioides cell dry weight assay 293

Paracoccidioides yeast cells were grown for 72 h at 36°C in liquid BHI, washed 294

with PBS 1X, and filtered using a nylon mesh filter to yield small and non-aggregated 295

cells. A total of 5 x 107 cells/ 50 mL were inoculated in modified MMcM medium 296

(RESTREPO & JIMENEZ, 1980) with (4%) or without (0%) glucose and were 297

incubated at 36°C. In each time-point, 10 mL of culture were centrifuged at 1500 x g 298

and the supernatants were carefully removed. The cells were ressuspended in PBS1X up 299




13

to 500 µl and submitted to 95°C heating for 1 h. The cells were centrifuged, frozen in 300

liquid nitrogen and lyophilized for 24 h. Dry weight was determined. Data are expressed 301

as the mean ± standard deviation of the triplicates of independent experiments. 302

Statistical comparisons were performed using the Student’s t test, and p-values <0.05 303

were considered statistically significant. 304

305

Ethanol measurement assay 306

The concentration of ethanol was quantified by enzymatic detection kit 307

according to the manufacturer’s instruction (UV-test for ethanol, RBiopharm, 308

Darmstadt, Germany). Ethanol is oxidized to acetaldehyde by the enzyme alcohol 309

dehydrogenase, in the presence of nicotinamide-adenine dinucleotide (NAD). 310

Acetaldehyde is quantitatively oxidized to acetic acid in the presence of aldehyde 311

dehydrogenase, releasing NADH, which is determined by means of its absorbance at 312

340 nm. Paracoccidioides, Pb01 yeast cells, were submitted or not to glucose 313

deprivation and 108

cells were used to assay. Briefly, cells were counted, centrifuged, 314

and lysed using glass beads and bead beater apparatus (BioSpec, Oklahoma, USA) in 5 315

cycles of 30 sec, keeping the samples on ice. The cell lysate was centrifuged at 10000 x 316

g for 15 min at 4 °C and the supernatant was used for enzymatic assay according to the 317

manufacturer's instructions. The concentrations of ethanol were obtained in triplicate. 318

319

Macrophage infection assays 320

To evaluate whether glucose deprivation influenced the internalization and 321

survival of Paracoccidioides, the survival rate (viable fungi after co-cultivation) was 322

determined by quantifying the number of colony-forming units (CFUs) recovered from 323

macrophage infection. Macrophages, cell line J774 A.1 (Rio de Janeiro Cell Bank – 324

14

BCRJ/ UFRJ, accession number: 0121), maintained in RPMI medium (RPMI 1640, 325

Vitrocell, Brazil), with 10% FBS (fetal bovine serum, [v/v]) were used in assays. A total 326

of 106 macrophages were seeded into each well of a 24-well tissue culture plate and 100 327

U/ ml of IFN-gamma (murine IFN-γ, PeproTech, Rocky Hill, New Jersey, USA) was 328

used for 24 hours at 37°C with 5% CO2 for activation of macrophages (YOUSEFF et al, 329

2012). Prior to co-cultivation, Paracoccidioides yeast cells were grown in BHI liquid 330

medium (4% [w/v] glucose, 3.7% [w/v] brain hearth infusion, pH 7.2) for 72 h and 331

submitted to glucose deprivation in McVeigh/Morton medium (MMcM) for 48 h, with 332

(4% [w/v]) or without (0% [w/v]) of glucose at 36°C. The same ratio of 1:2.5 333

macrophage:yeast was used for infection of both the glucose-deprived and control yeast 334

cells. The cells were co-cultivated for 24 h with 5% CO2 at 37°C to allow fungal 335

internalization. Prior to macrophages lysis, dilutions of the supernatant (culture from co-336

cultivation) removed by aspiration, were plated in BHI medium supplemented with 5% 337

FBS (fetal bovine serum, [v/v]) incubated in 5% CO2 at 37 °C for 10 days. The number 338

of viable cells was determined based on the number of CFUs. Infected macrophages 339

were lysed with distilled water and dilutions of the lysates were plated in BHI medium 340

supplemented with 5% FBS (fetal bovine serum, [v/v]). Colony-forming units (CFU) 341

were determined after growth at 37°C, in 5% CO2, for 10 days. For both experiments, 342

the CFUs data were expressed as the mean value ± the standard deviation from 343

triplicates and the statistical analyses were performed using Student’s t test. 344

To analyze the kinetics of expression of genes from Paracoccidioides yeast cells 345

infecting macrophages, the same cell line described above was used. Paracoccidioides 346

yeast cells were cultivated in BHI liquid medium (4% [w/v] glucose, 3.7% [w/v] brain 347

hearth infusion, pH 7.2) for 72 h and incubated with macrophages for 24 h, followed by 348

15

washing with distilled water to promote macrophages lysis. RNAs and cDNAs were 349

obtained as previously described. Controls were obtained. 350

351

Results 352

353

Effect of glucose deprivation on transcripts and proteins of Paracoccidioides 354

We first sought to set up a time-point to analyze the fungus response to glucose 355

deprivation at transcriptional and proteomic levels. Hence, we analyzed gene and 356

protein expression of genes known to be regulated under glucose-limited 357

microenvironments in other fungi (FAN et al, 2005; LORENZ et al, 2004), by using 358

qRT-PCR and western blot assays, in Pb01 (Fig. 1A). Changes in the kinetics of 359

expression of genes encoding fructose-1,6-biphosphatase, isocitrate lyase, and 3-360

ketoacyl-CoA thiolase, which are representatives of gluconeogenesis, the glyoxylate 361

cycle, and β-oxidation, respectively, were analyzed in the Paracoccidioides, Pb01 yeast 362

cells, submitted under glucose deprivation. As depicted in Fig. 1A, glucose deprivation 363

promoted the increase of gene expression at 6 h and at 12 h for the treatments. At 364

protein level, the differential expression of isocitrate lyase suggested that 365

Paracoccidioides, Pb01, up-regulated the glyoxylate cycle after 48 h of glucose 366

deprivation (Fig. 1B). In this way, the 6 h and 48 h treatments were considered in 367

further transcriptional and proteomic analysis, using a high-throughput RNA Illumina 368

sequencing (RNAseq) and NanoUPLC-MSE, respectively. 369

370

Transcriptomic analysis 371

The transcriptome analysis was performed using next generation sequencing and 372

the Paracoccidioides, isolate Pb01, genome database was used as a reference genome 373

16

for mapping the reads. For the control and glucose deprivation after 6 h, 58.48 and 374

55.89% of reads were mapped against the Paracoccidioides genome database 375


ome.html), respectively, indicating satisfactory genome coverage for both. The mapped 377

reads data were analyzed by DEGseq package, and plotting graphs were performed for 378

global analysis of the data (Fig. S1). The scatter plot shows that the number of reads 379

mapped to each gene for both conditions was similar (Fig. S1A). This density of reads 380

for each gene can also be visualized in the MA-plot graph. This graph shows the 381

intensity of expression, density of mapped reads, and the significant expression ratio to 382

expressed genes. The fold change range (log2) in the majority of genes shown is 383

between 2 and - 2 (Fig. S1B). 384

A cut-off of 1.5-fold change was applied to determine the up- and down-385

regulated transcripts (Tables S1 and S2, respectively) totaling 2,437 differentially 386

expressed transcripts in Pb01 yeast cells under glucose deprivation. A biological 387

process classification was performed to gain a general understanding of the functional 388

categories affected by glucose deprivation. A total of 57% (1388 transcripts) were 389

represented by miscellaneous and unclassified categories, and the other 43% (1049 390

transcripts) were represented by classified biological categories. The functional 391

classifications and the percentage of up- and down-regulated transcripts in each 392

classified category are shown in Fig. S2. 393

The transcriptome analysis showed that transcripts associated with metabolism 394

were the most represented during 6 h of glucose deprivation in Pb01 (Fig. S2A). From 395

these, approximately 20% were represented by up-regulated and 12% by down-396

regulated transcripts (Fig. S2B). Subcategories of metabolism related to amino acid, 397

nitrogen/ sulfur, C-compound/ carbohydrate, lipid/ fatty acid, purines, secondary, and 398



17

phosphate metabolisms were regulated under glucose deprivation stress, and all of them 399

showed a higher number of up- than down-regulated transcripts (Tables S1 and S2). 400

Other categories were also regulated in Pb01 under glucose deprivation. The categories 401

associated with protein fate, cell cycle/ DNA processing, transcription, and cellular 402

transport were largely represented in the transcriptome (Fig. S2A). The number of 403

transcripts with increased or reduced expression was also investigated for these 404

categories and the results show that, in contrast to metabolism, the number of down-405

regulated transcripts was generally higher than that of up-regulated transcripts for each 406

category (Fig. S2B). Down-regulated transcripts associated with cell cycle, 407

transcription, cell growth morphogenesis, and signal transduction could reflect the 408

reduced growth of this fungus submitted to glucose deprivation, as demonstrated in Fig. 409

2. The cellular transport process was also representative in our transcriptome analysis. 410

The abundance of specific transporters was elevated such as those of copper, hexoses, 411

and monosaccharides (Table S1 and S2) indicating that carbohydrate, amino acid and 412

metal-uptake processes are required for Pb01 cells during glucose deprivation. 413

Thus, a large part of the transcription response to glucose deprivation in Pb01 is 414

involved in an increase of transcripts levels of genes associated with metabolism and 415

reduction of those involved with core cellular processes. 416

417

Proteomic analysis 418

The proteomic approach was performed using NanoUPLC-MSE

as previously 419

described (MURAD & RECH, 2012; MURAD et al, 2011). This method has been 420

shown to improve protein and proteome coverage compared to the conventional LC-421

MS/MS approach (MURAD et al, 2011). The resulting NanoUPLC-MSE

protein and 422

peptide data generated by PLGS process are shown in Fig. S3, S4, and S5. First, the 423

18

false positive rates of proteins from control and glucose deprivation data were 0.34 and 424

0.27%, respectively. The experiments resulted in 3,327 and 3,842 identified peptides, 425

where 45 and 57% of these were obtained from peptide match type data in the first pass, 426

and 19 and 14% from the second pass (LI et al, 2009) to control and glucose deprivation 427

conditions, respectively (Fig. S3). A total of 17 and 14% of total peptides were 428

identified by a missed trypsin cleavage in control and glucose deprivation conditions, 429

respectively, whereas an in-source fragmentation rate of the same 4% was obtained for 430

both (Fig. S3). Fig. S4 shows the peptide parts per million error (ppm) indicating that 431

the majority, 94.8 and 95.7%, from identified peptides were detected with an error of 432

less than 15 ppm for control and glucose deprivation conditions, respectively. Fig. S5 433

depicts the results obtained from dynamic range detection indicating that a 3-log range 434

concentration and a good detection distribution of high and low molecular weights were 435

obtained for the both conditions. 436

From the 603 identified proteins, 421 proteins were regulated in Pb01 yeast cells 437

under glucose deprivation. Exactly 20% of them (86 proteins) were represented by 438

miscellaneous and unclassified categories, and the remaining 80% (335 proteins) were 439

represented by classified biological categories. The biological processes and the 440

percentage of up- and down- regulated proteins in each classified category are shown in 441

Fig. S6. 442

The proteome analysis showed that proteins associated with metabolism were 443

also the most represented during 48 h of glucose deprivation in Pb01. (Fig. S6A). The 444

metabolism was represented by amino acid, nitrogen/ sulfur, C-compound/ 445

carbohydrate, lipid/ fatty acid, purines, secondary, and phosphate metabolisms. All of 446

these subcategories showed more up- than down-regulated proteins (Tables S3 and S4). 447

Interestingly, the nitrogen/ sulfur metabolism was detected as up-regulated only at 448

19

protein level (Table S3). Other categories presented a high number of regulated proteins 449

such as translation, protein fate and energy. On the other hand, processes involved with 450

transcription, cellular transport, cell growth/ morphogenesis, and signal transduction 451

presented a lower number of regulated proteins in which the majority was down-452

regulated (Fig. S6A and B). 453

454

An overview of the Paracoccidioides (Pb01) responses to glucose deprivation 455

The responses of the Paracoccidioides, Pb01, to glucose deprivation, as revealed 456

by transcriptome and proteomic analysis, are summarized in Fig. 3, which depicts the 457

metabolic and energy adaptation of the fungus to this stress. Pathways associated with 458

ethanol, acetyl-CoA, oxaloacetate, and consequently glucose production were induced. 459

Moreover, amino acid degradation supply precursors such as pyruvate, oxaloacetate, 460

succinate, and also acetyl-CoA for glucose production pathways (Fig. 3). 461

Specific enzymes related to ethanol production were up-regulated in the absence 462

of glucose. The ethanol molecule is supported by pyruvate that, in turn, is not involved 463

directly in oxaloacetate production because the pyruvate carboxylase (PYC) enzyme is 464

down-regulated (Fig. 3). Ethanol measurement was performed, and the results showed 465

that after up to 48 h under glucose deprivation, a significantly higher level of ethanol 466

was produced compared with control cells (Fig. 4). Regarding the acetyl-CoA molecule, 467

several enzymes associated with its production from pyruvate, via the acetaldehyde 468

precursor, and β-oxidation were also up-regulated. Once produced, acetyl-CoA may be 469

used by the glyoxylate shunt to generate glyoxylate and succinate molecules. This is 470

reinforced by fact that the TCA cycle enzyme isocitrate dehydrogenase is repressed, so 471

the acetyl-CoA pool should be consumed by the glyoxylate cycle. Additionally, 472

20

succinate can be converted in oxaloacetate by enzymes from the tricarboxylic acid cycle 473

(Fig. 3). 474

The oxaloacetate molecule is a key intermediate of gluconeogenesis. Once 475

produced, gluconeogenic enzymes convert it into glucose. We detected up-regulated 476

specific enzymes that support this suggestion in Pb01 under glucose deprivation, such 477

as phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK), fructose-1,6-biphosphatase (FBPase), 478

and phosphoglucomutase (PGM) (Fig. 3). 479

480

A comparative analysis of the transcriptome and proteome of Paracoccidioides 481

under glucose deprivation 482

To compare similar aspects between transcriptome and proteome data, we 483

sought the same transcripts and proteins detected by both analyses. The transcripts and 484

proteins identities (ID), from the Paracoccidioides, Pb01, database, were shown 485

including their levels of abundance (Tables 1, 2, 3, and 4). One hundred and ten 486

identities (IDs) were matched of which 57 and 32 of them presented the same 487

abundance profile, up- or down-regulated in both data, respectively (Fig. 5, Tables 1 488

and 2). In this way, approximately 80% of the matches showed the same pattern of 489

transcript and protein levels. On the other hand, the minority of IDs showed discrepancy 490

in their abundance. Several of the transcripts in these groups were decreased in 491

abundance, while the protein levels were increased and vice - versa (Fig. 5, Tables 3 and 492

4). 493

A comparative analysis including all transcripts and proteins for metabolism and 494

energy categories from RNAseq and NanoUPLC-MSE analysis was also performed 495

(Fig. 6). Metabolism, which was the most regulated category in our data and energy are 496

considered essential categories for understanding the carbon flow used by Pb01 during 497

21

glucose deprivation. The results show that the amino acid, carbohydrate/ C-compound, 498

and lipid metabolism were similarly regulated in both approaches, showing the 499

consistency with the suggested carbon flow in Paracoccidioides, Pb01, under glucose 500

deprivation (Figs. 3 and 6A). Amino acids and lipids are supposed to be intensively 501

degraded (Tables S1 and S3) suggesting the production of precursors during glucose 502

deprivation, which include acetyl-CoA, pyruvate, oxaloacetate and succinate. 503

Furthermore, the percentage of transcripts and proteins related to energy categories such 504

as glycolysis/ gluconeogenesis, electron transport/ membrane associated energy 505

conservation, and TCA cycle are also similar, in accordance with suggested responses 506

of Pb01 to glucose deprivation (Fig. 6B). Thus, the induction of gluconeogenesis, β-507

oxidation, part of TCA, and glyoxylate cycles was required to compensate for the 508

absence of glucose and depicts the rearrangement of pathways when a carbon source 509

condition is changed. 510

511

Fungus-macrophage interaction 512

We investigated the response to macrophages in Paracoccidioides, Pb01, under 513

glucose deprivation. We analyzed whether the fungus differentially expresses genes 514

involved in gluconeogenesis, glyoxylate cycle, and β-oxidation pathways after 515

internalization by the J744 A.1 macrophages. The relative expression analysis of 516

transcripts encoding fructose-1,6-biphosphatase, isocitrate lyase, and 3-ketoacyl CoA 517

thiolase was performed using qRT-PCR. Fig. 7A demonstrates that genes encoding 518

isocitrate lyase and 3-ketoacyl CoA thiolase were induced, suggesting a response of 519

Paracoccidioides to glucose deprivation in phagosomes. Furthermore, whether yeast 520

cells under glucose deprivation were more susceptible to macrophage killing than cells 521

growing in plentiful glucose was analyzed. Plating of recovered yeast cells by aspiration 522

22

of culture supernatant (non-internalized yeast cells) and from lysis of macrophages 523

(internalized yeast cells) was performed (Fig. 7B). The result showed that glucose 524

deprivation influenced in Paracoccidioides, Pb01, survival inside the macrophages, as 525

demonstrated in Fig. 7B. The number of cells recovered from culture supernatant was 526

not significantly different between control and glucose deprived cells. 527

528

Discussion 529

530

In the current study, the responses of Paracoccidioides, Pb01, to glucose 531

deprivation were described using both, high-throughput transcriptome and proteomic 532

analysis. Pb01 yeast cells were able to adapt to glucose deprivation conditions. We 533

show that the fungus regulates pathways that lead to glucose production to compensate 534

for the effect of stress. The fungus regulates transcripts and proteins that are mainly 535

associated with gluconeogenesis and ethanol production via precursors from β-536

oxidation, glyoxylate and tricarboxylic acid cycles. Our study presents a detailed 537

response of Paracoccidioides spp. facing glucose deprivation and contributes to 538

investigations of the importance of alternative carbon adaptation during fungus 539

pathogenesis. 540

Changes in the kinetics of expression of representatives of gluconeogenesis, the 541

glyoxylate cycle, and β-oxidation as well as the differential expression of isocitrate 542

lyase at the protein level could establish a better time-point for our transcriptional (6 h) 543

and proteomic (48 h) analysis, using RNAseq and NanoUPLC-MSE, respectively (Fig. 544

1). The transcriptome and proteomic analysis demonstrated that general metabolism and 545

energy was the most represented regulated categories. Transcripts/ proteins classified in 546

energy and cell rescue, defense, and virulence categories were also induced in both 547

23

approaches although less representative than metabolism (Fig. S2 and S6). Categories 548

involved in the cell cycle, transcription, cellular transport, growth/morphogenesis, and 549

signal transduction were predominantly down-regulated at transcription and protein 550

levels. Although Pb01 yeast cells displayed no significant difference in cell viability 551

until 72 h under glucose deprivation (data not shown), the yeast biomass was 552

significantly reduced in glucose deprivation (Fig. 2). In addition, the abundance of 553

specific transporters was elevated such as those related to copper, hexose, and 554

monosaccharide uptake, suggesting a nutrient limitation and a hostile environment as 555

detected in other fungi (HU et al, 2008). 556

Paracoccidioides, Pb01, presented a complex mechanism to respond to nutrient 557

deprivation. The fungus uses a carbon flow (Fig. 3) through classical biochemical 558

pathways such as glyoxylate cycle, β-oxidation, and gluconeogenesis which is in 559

accordance with previous data on other fungi facing nutrient deprivation (BARELLE et 560

al, 2006; FAN et al, 2005; LORENZ et al, 2004). Fungi such as C. albicans and C. 561

neoformans appear to experience a nutrient limited and stressful environment in the 562

context of interaction with host cells. The elevated expression of the glyoxylate pathway 563

and gluconeogenesis genes during Cryptococcus interactions with host tissue and 564

phagocytic cells is similar to the regulation observed in C. albicans. These pathogenic 565

fungi present a niche dependent metabolism, with activation of an alternative carbon 566

source consuming process and the up-regulation of transcripts for enzymes of the 567

glyoxylate cycle, β-oxidation, and gluconeogenesis, (FAN et al, 2005; LORENZ et al, 568

2004) which was also detected in Paracoccidioides, Pb01. Our data suggest that Pb01 569

yeast cells facing glucose deprivation use the oxaloacetate molecule as a key 570

intermediate of gluconeogenesis. It is supported by β-oxidation and, in part, by 571

glyoxylate and TCA cycles activation. The glyoxylate cycle can allow the fungus to 572

24

assimilate two-carbon compounds, a relevant aspect to the viability and growth inside 573

macrophages (LORENZ & FINK, 2001; OLIVAS et al, 2008). Studies involving the 574

isocitrate lyase gene, representative of glyoxylate cycle, displayed that this gene is 575

important as a marker for gluconeogenic carbon source utilization and starvation rather 576

than a marker for lipid metabolism (BROCK, 2009; OTZEN et al, 2013). Despite 577

induction of isocitrate lyase and genes required for fatty acid utilization especially after 578

phagocytosis by macrophages (LORENZ et al, 2004), this induction may derive from a 579

general stress response due to nutrient or glucose limitation rather than a specific 580

induction from fatty acid utilization (OTZEN et al, 2013). In fact, null mutants to 581

isocitrate lyase in C. albicans, A. fumigatus and C. neoformans and for β-oxidation 582

genes in C. albicans revealed no virulence defects, showing that fatty acids do not 583

provide an essential nutrient source during infection (OTZEN et al, 2013; PIEKARSKA 584

et al, 2008; RAMIREZ & LORENZ, 2007; RUDE et al, 2002; SCHOBEL et al, 2007). 585

In addition, isocitrate lyase activity increased when C. albicans was submitted to carbon 586

starvation or other carbon sources such as acetate, glutamate and peptone as solely 587

carbon source (BROCK, 2009) reinforcing its importance as a marker for gluconeogenic 588

carbon source utilization and starvation. Then, the global characterization of the 589

responses of Pb01 to glucose deprivation becomes relevant in this context especially by 590

flow of carbon used by the fungus during this stress. 591

The same transcripts and proteins detected by both analyses were identified 592

(Tables 1, 2, 3 and 4). Approximately 80% of the matches (a total of 110) showed the 593

same pattern of transcript and protein levels (Fig. 5). In this way, we believe that the 594

transcriptional and proteome time-points were enough to characterize the global 595

responses of the Paracoccidioides to glucose deprivation conditions. Similarly to 596

previous study in A. fumigatus, few times transcripts and proteins do not follow the 597

25

same trend of expression that could be explained, for example, by mRNA stabilization 598

process or by active post-transcriptional and translational regulatory mechanisms 599

(BARKER et al, 2012). In our data, in many metabolic aspects, transcripts and protein 600

levels were correlated. The identities to amino acid degradation, β-oxidation and ethanol 601

synthesis were increased in expression while those involved in pyruvate, fatty acid 602

synthesis and tricarboxylic acid cycles were down-regulated (Table 1 and 2). The results 603

corroborates our hypothesis of a well establish response to glucose poor environments 604

(Fig. 3). The pyruvate-acetyl-CoA conversion, for example, is diminished by repression 605

of pyruvate dehydrogenase enzyme. In addition, pyruvate carboxylase is repressed so 606

pyruvate is not been conversed in oxaloacetate. These observations strongly suggest that 607

the available pyruvate would end up in ethanol via acetaldehyde (Fig. 3). Moreover, the 608

isocitrate dehydrogenase enzyme was also down-regulated in both data (Table 2). The 609

activities of isocitrate dehydrogenase and isocitrate lyase enzymes, regulate the flow of 610

isocitrate into either the tricarboxylic acid cycle or the glyoxylate cycle (DEXTER & 611

GUNAWARDENA, 2013; GARNAK & REEVES, 1979). Here, while the isocitrate 612

dehydrogenase is down, the isocitrate lyase is up-regulated, in accordance with 613

suggested carbon flow in Pb01 through glyoxylate shunt. As the same importance, the 614

phosphoenolpyruvate carboxykinase expression confirms that gluconeogenesis process 615

is ongoing (Table 3). 616

In addition, comparison of regulated molecules in transcriptome and proteome 617

data with focus in metabolism and energy categories can support the use of alternative 618

carbon sources by Pb01 in glucose deprivation (Fig. 6). Metabolism of amino acids, 619

lipids, and carbohydrate/ C-compound was the most regulated in both used approaches 620

(Fig. 6A). The amino acids and lipids likely are been used as precursors to important 621

molecules involved in alternative carbon metabolism in Pb01 as depicted in Fig. 3. In 622

26

fact, Paracoccidioides spp. can use a relatively wide range of amino acids and peptides 623

rather than carbohydrates (DESJARDINS et al, 2011). In addition to the structural 624

importance of lipids, these molecules provide an energy-rich nutrient source. β-625

oxidation is a common pathway for the utilization of fatty acids (POIRIER et al, 2006) 626

in which of the 3-ketoacyl-CoA thiolases enzymes are important (OTZEN et al, 2013). 627

Recent studies have highlighted the relevance of the β-oxidation in response to nutrient 628

or glucose limitation rather than a specific induction from fatty acid utilization. In fact, 629

fatty acids do not provide an essential nutrient source during infection in C. albicans but 630

is important for coupling the glyoxylate cycle and fatty acid β-oxidation during host-631

pathogen interactions regulating responses related to carbon starvation (BROCK, 2009; 632

OTZEN et al, 2013). Here, the induction of β-oxidation pathway in Pb01 likely reflects 633

the requirement of this metabolic pathway for glucose deprivation adaptation, which is 634

consistent with previous data in C. albicans submitted to a poor-nutrition environment 635

(LORENZ et al, 2004). Regarding energy producing pathways, the gluconeogenesis, 636

tricarboxylic acid and glyoxylate cycles are well represented, which reinforces our 637

model of adaptation to glucose deprivation conditions (Fig. 6B). Moreover, the electron 638

transport and ethanol subcategories were also shown. Ethanol metabolism was 639

previously described in Pb01 showing evidence for a more anaerobic metabolism of this 640

fungus compared with other isolates of Paracoccidioides (FELIPE et al, 2005; 641

PIGOSSO et al, 2013; REZENDE et al, 2011), and this metabolite has also been 642

described as relevant to pathogenic fungi such as A. fumigatus (BARKER et al, 2012; 643

GRAHL et al, 2011; TEUTSCHBEIN et al, 2010). 644

The responses of Pb01 to macrophage infection shows that the fungus most 645

likely faces glucose starvation in macrophages, because a higher expression of genes 646

encoding fructose-1,6-biphosphatase, isocitrate lyase, and 3-ketoacyl-CoA thiolase was 647

27

detected. In fact, in terms of usable nutrients, the phagosome has been reported to not 648

have a rich environment evidenced by the unsubstantial quantities of glucose, other 649

sugars, and amino acids (COONEY & KLEIN, 2008; FAN et al, 2005; LORENZ et al, 650

2004; SILVA et al, 2008; TAVARES et al, 2007). Here, we showed that Pb01 yeast 651

cells were more susceptible to macrophage killing when were previously deprived of 652

glucose. In this context, the expression of the C. neoformans antiphagocytic protein 1, 653

App1, is dependent of glucose availability and a critical component of fungus virulence 654

(WILLIAMS & DEL POETA, 2011). 655

Taken together, our data suggest that Pb01 changes its metabolism under 656

glucose deprivation. This fungus reprograms several biological processes to facilitate its 657

maintenance under this condition; these programs are mainly related to 658

gluconeogenesis, β-oxidation, and the glyoxylate cycle to compensate for the poor 659

glucose environment. Considering a new perspective, the transcriptome and proteome 660

data could reinforce the responses of this fungus, which is able to survive in the hostile 661

environment during macrophage infection. This study may elucidate potential 662

molecules involved in host-fungus interactions, an important factor related to 663

pathogenic organisms. 664

665

Acknowledgments 666

This work at Universidade Federal de Goiás was supported by grants from 667

CNPq, Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, FAPEG, 668

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás, CAPES, Coordenação de 669

Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior and PRONEX, Programa de Apoio a 670

Núcleos de Excelência. PSL was supported by a fellowship from CAPES. 671

672

28

Competing interests 673

The authors have declared that no competing interests exist. 674

675

Author’s Contributions 676

Conceived and designed the experiments: CMAS. Performed the experiments: 677

PSL and LC. Analyzed the data: PSL, AMB, ATRV, GRF, CMAS. Contributed 678

reagents/materials/ analysis tools: CMAS. Wrote the paper: CMAS, PSL. 679

680

Tables 681

682

683

684

685

686

687

688

689

690

691

692

693

694

695

696

697

29

Table 1. Up-regulated proteins and transcripts of Paracoccidioides (Pb01) yeast cells under glucose deprivation detected by NanoUPLC-MSE and

RNAseq analysis.

ID

a Annotation

b Fold change (proteome)

c Fold change

(transcriptome)d

Biological processe

METABOLISM

Amino acid metabolism

PAAG_08164 homogentisate 1.2-dioxygenase 1.00 0.60 tyrosine degradation

PAAG_05253 delta-1-pyrroline-5-carboxylate

dehydrogenase

0.87 1.26 glutamate degradation

PAAG_00966 L-threonine 3-dehydrogenase 0.74 1.20 threonine degradation

PAAG_08162 maleylacetoacetate isomerase # 1.35 phenylalanine degradation

PAAG_08649 cysteine dioxygenase # 1.15 cysteine degradation

PAAG_06416 alanine racemase family protein # 0.69 D- alanine biosynthethic process

PAAG_01969 arginase # 0.95 glutamate biosynthesis

PAAG_01365 choline dehydrogenase # 1.64 glycine biosynthesis

PAAG_07317 PENR2 protein # 0.97 methionine biosynthesis

Nitrogen and sulfur metabolism

PAAG_03333 formamidase 2.05 4.39 nitrogen metabolism

C-compound and carbohydrate metabolism

PAAG_06953 short chain dehydrogenase/reductase

family

2.96 0.60 Carbohydrate metabolism_sugar

epimerase family

PAAG_02162 lactam utilization protein LamB # 2.54 C-compound and carbohydrate

metabolism

PAAG_02653 acetyl-coenzyme A synthetase # 1.67 C-compound and carbohydrate

metabolism

PAAG_03765 NADP-dependent glycerol

dehydrogenase

# 2.53 sugar. glucoside. polyol and

carboxylate catabolism

30

PAAG_05416 NADP-dependent leukotriene B4 12-

hydroxydehydrogenase

# 2.43 C-compound and carbohydrate

metabolism

Lipid, fatty acid and isoprenoid metabolism

PAAG_02664 3-ketoacyl-CoA thiolase 1.15 1.77 lipid and fatty acid metabolism_beta

oxidation

PAAG_05249 aldehyde dehydrogenase 2.45 2.42 lipid and fatty acid

metabolism_oxidation

PAAG_02163 acetyl-/propionyl-coenzyme A

carboxylase alpha chain

3.03 2.09 lipid metabolism

PAAG_04142 NAD-dependent 15-

hydroxyprostaglandin dehydrogenase

# 0.61 lipid metabolism

PAAG_01928 peroxisomal dehydratase # 1.93 lipid. fatty acid and isoprenoid

metabolism

Purin nucleotide/ nucleoside/ nucleobase metabolism

PAAG_02633 ribose-phosphate pyrophosphokinase # 0.63 nucleotide biosynthesis

PAAG_04974 adenylosuccinate lyase # 0.92 purine biosynthesis

PAAG_09072 mitochondrial nuclease # 0.60 polynucleotide degradation

Secundary metabolism

PAAG_02336 nudix hydrolase 1.27 1.07 metabolism of vitamins. cofactors.

and prosthetic groups

PAAG_08856 nicotinate-nucleotide

pyrophosphorylase

# 1.20 biosynthesis of vitamins. cofactors.

and prosthetic groups

PAAG_00851 6.7-dimethyl-8-ribityllumazine

synthase

# 0.72 biosynthesis of riboflavin

ENERGY

Glycolysis and gluconeogenesis

PAAG_01995 fructose-bisphosphate aldolase 1.30 1.28 glycolysis and gluconeogenesis

Tricarboxylic-acid pathway

PAAG_04597 malate dehydrogenase # 0.66 TCA cycle

31

Electron transport and membrane-associated energy conservation

PAAG_03599 formate dehydrogenase # 0.89 electron transport

Ethanol production

PAAG_00403 alcohol dehydrogenase 1.83 3.92 alcohol fermentation

PAAG_02050 pyruvate decarboxylase 1.30 0.79 alcohol fermentation

PAAG_04541 alcohol dehydrogenase 0.97 2.77 alcohol fermentation

PAAG_02512 pyruvate decarboxylase # 1.33 alcohol fermentation

PAAG_08248 alcohol dehydrogenase # 0.98 alcohol fermentation

CELL CYCLE AND DNA PROCESSING

PAAG_00126 histone H4.2 # 0.87 DNA processing

TRANSCRIPTION

PAAG_06250 nuclear cap-binding protein # 0.67 mRNA processing

PAAG_02255 mRNA decapping hydrolase # 0.59 mRNA processing

BINDING

PAAG_07038 APAF1-interacting protein # 1.24 metal binding

SIGNAL TRANSDUCTION

PAAG_02377 rho GDP-dissociation inhibitor # 0.92 regulator of G-protein signalling

CELL RESCUE, DEFENSE AND VIRULENCE

PAAG_02926 superoxide dismutase # 2.49 detoxification

PAAG_08277 nitroreductase family protein # 1.30 detoxification

PAAG_03502 cytochrome c peroxidase # 3.03 oxidative stress response

32

PAAG_02548 hydroxyacylglutathione hydrolase # 1.03 glutathione biosynthetic process/

stress response

PROTEIN FATE

PAAG_02155 peroxisomal targeting signal 2

receptor (PTS2)

# 0.67 protein fate

PAAG_00768 peptidase family protein # 0.97 proteolysis

CELL GROWTH/ MORPHOGENESIS

PAAG_03624 Arp2/3 complex subunit Arc16 # 2.46 cell growth/morphogenesis

MISCELLANEOUS

PAAG_06955 thiol methyltransferase # 0.94 thiol methyltransferase activity

UNCLASSIFIED

PAAG_00340 conserved hypothetical protein 1.96 0.96 -

PAAG_06083 dienelactone hydrolase family protein 1.40 3.34 -

PAAG_00297 conserved hypothetical protein 1.37 1.19 -

PAAG_01075 conserved hypothetical protein # 0.79 -

PAAG_01254 predicted protein # 1.24 -

PAAG_01399 NAD dependent

epimerase/dehydratase family protein

# 1.21 -

PAAG_01455 hypothetical protein # 3.07 -



PAAG_05856 conserved hypothetical protein # 1.21 -

a Identification of the same proteins and transcripts which were regulated in both analysis, proteome and transcriptome from Paracoccidioides genome database

(http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/paracoccidioides_brasiliensis/MultiHome.html);


33

b Proteins and transcripts annotations from Paracoccidioides genome database or by homology in NCBI database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/); c Protein expression profiles in log2 (fold change) obtained from ProteinLynx Global Server (PLGS) analysis normalized with internal standard. #: identified only

in control condition. d Transcript expression profiles in log2 (fold change) obtained from fold change selection method for differentially expressed transcripts using a Fisher exact

test with a p-value of 0.001. e Biological process of differentially expressed transcripts and proteins from MIPS

(http://pedant.helmholtz-muenchen.de/pedant3htmlview/pedant3view?Method=analysis&Db=p3_r48325_Par_brasi_Pb01 ) and Uniprot database

(http://www.uniprot.org/).


http://www.uniprot.org/

34

Table 2. Down-regulated proteins and transcripts of Paracoccidioides (Pb01) yeast cells under glucose deprivation detected by NanoUPLC-MSE and

RNAseq analysis.

IDa Annotation

b Fold change

(proteome)c

Fold change

(transcriptome)d

Biological processe

METABOLISM


PAAG_02603 aspartate aminotransferase -0.88 -0.89 aspartate biosynthesis

PAAG_07102 pentafunctional AROM polypeptide * -1.83 aromatic group biosynthesis

PAAG_05929 sulfate adenylyltransferase * -2.74 cysteine and methionine biosynthesis

PAAG_07813 cysteine synthase * -1.34 cysteine biosynthesis

PAAG_05328 3-isopropylmalate dehydrogenase A * -1.54 leucine biosynthesis

PAAG_03043 adenylyl-sulfate kinase * -0.89 methionine biosynthesis

C-compound and carbohydrate metabolism

PAAG_00545 glycogen phosphorylase -1.47 -1.68 carbohydrate metabolism

PAAG_02769 pyruvate dehydrogenase protein X

component

* -0.94 carbohydrate metabolism


PAAG_01524 fatty acid synthase subunit beta

dehydratase

* -0.88 lipid and fatty acid biosynthesis

Purin nucleotide/ nucleoside/ nucleobase metabolism

PAAG_06906 adenine phosphoribosyltransferase * -1.24 purin nucleotide/nucleoside/nucleobase

metabolism

ENERGY


PAAG_00726 pyruvate carboxylase -0.81 -1.63 pyruvate metabolism

35

Tricarboxylic-acid pathway

PAAG_01463 succinyl-CoA ligase subunit beta -1.92 -0.69 TCA cycle

PAAG_00856 isocitrate dehydrogenase subunit 1 -0.95 -0.75 TCA cycle

PAAG_07729 isocitrate dehydrogenase subunit 2 -1.00 -0.61 TCA cycle

Electron transport and membrane-associated energy conservation

PAAG_00953 NADH-cytochrome b5 reductase -0.59 -1.06 electron transport

Pentose Phosphate pathway

PAAG_00633 glucose-6-phosphate 1-

dehydrogenase

* -0.60 pentose-phosphate pathway


PAAG_00106 histone acetyltransferase type B

catalytic subunit

* -0.72 DNA repair

TRANSCRIPTION

PAAG_07957 pre-mRNA-splicing factor srp1 -1.50 -0.59 splicing

TRANSLATION and RIBOSSOME BIOGENESIS

PAAG_00815 eukaryotic translation initiation

factor 3 subunit A

* -0.68 translation

CELL RESCUE, DEFENSE AND VIRULENCE

PAAG_03216 mitochondrial peroxiredoxin PRX1 * -3.50 oxidative stress response

PAAG_01465 carbonic anhydrase * -3.66 stress oxidative response/ carbon utilization

PROTEIN FATE

PAAG_04327 ubiquitin carboxyl-terminal

hydrolase

* -0.95 protein deubiquitination

PAAG_03834 vacuolar sorting-associated protein * -0.68 protein sorting in cell division

TRANSPORT

36

PAAG_04904 ATP-binding cassette sub-family F

member 2

* -0.78 ABC transport

UNCLASSIFIED

PAAG_03152 CobW domain-containing protein -1.31 -1.55 -

PAAG_07772 conserved hypothetical protein -0.69 -1.70 -

PAAG_08103 EF hand domain-containing protein * -1.00 -

PAAG_00251 hypothetical protein * -2.70 -

PAAG_04793 LEA domain-containing protein * -1.76 -

PAAG_05037 HHE domain-containing protein * -6.18 -

PAAG_05181 conserved leucine-rich repeat protein * -1.70 -

PAAG_06914 conserved hypothetical protein * -0.77 -


(http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/paracoccidioides_brasiliensis/MultiHome.html); b Proteins and transcripts annotations from Paracoccidioides genome database or by homology in NCBI database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/); c Protein expression profiles in log2 (fold change) obtained from ProteinLynx Global Server (PLGS) analysis normalized with internal standard. *: identified only








37

Table 3. Up- and down-regulated proteins and transcripts, respectively, of Paracoccidioides (Pb01) yeast cells under glucose deprivation detected by

NanoUPLC-MSE and RNAseq analysis.

ID

a Annotation

b Fold change

(proteome)c

Fold change

(transcriptome)d

Biological processe

METABOLISM


PAAG_01568 glycine dehydrogenase 0.59 -0.70 glycine biosynthesis

PAAG_07998 glutamate synthase small chain # -1.54 glutamate biosynthesis

PAAG_02693 saccharopine dehydrogenase # -0.72 lysine biosynthesis

PAAG_02901 S-adenosylmethionine synthetase # -1.38 L-methionine biosynthesis

ENERGY


PAAG_08203 phosphoenolpyruvate carboxykinase 1.30 -0.63 gluconeogenesis


PAAG_07608 DNA helicase # -0.77 DNA repair

TRANSCRIPTION

PAAG_05609 C2H2 type zinc finger domain-

containing protein

# -0.79 transcriptional control

PAAG_05397 DNA-directed RNA polymerase II

subunit RPB1

# -0.83 rRNA synthesis

PROTEIN FATE

PAAG_05583 cysteine protease PalB # -0.61 proteolysis

PAAG_04555 sarcosine oxidase # -1.20 protein modification

TRANSPORT

38

PAAG_03577 ABC drug exporter AtrF # -1.89 drug/ toxin transport

MISCELLANEOUS

PAAG_03233 oxidoreductase # -1.15 oxidation-reduction process

UNCLASSIFIED

PAAG_04812 predicted protein # -0.71 -

PAAG_02242 hypothetical protein # -1.77 -

PAAG_07989 conserved hypothetical protein # -0.65 -




(http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/paracoccidioides_brasiliensis/MultiHome.html); b Proteins and transcripts annotations from Paracoccidioides genome database or by homology in NCBI database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/); c Protein expression profiles in log2 (fold change) obtained from ProteinLynx Global Server (PLGS) analysis normalized with internal standard. #: identified only








39

Table 4. Down- and up-regulated proteins and transcripts, respectively, of Paracoccidioides (Pb01) yeast cells under glucose deprivation detected by

NanoUPLC-MSE and RNAseq analysis.

ID

a Annotation

b Fold change

(proteome)c

Fold change

(transcriptome)d

Biological processe

METABOLISM


PAAG_07013 enoyl-CoA hydratase/carnithine

racemase

* 0.91 lipid. fatty acid and isoprenoid

metabolism

TRANSCRIPTION

PAAG_08234 transcription factor RfeF * 0.76 transcription control

UNCLASSIFIED

PAAG_00503 HAD-superfamily hydrolase -0.78 1.41 -

PAAG_06624 predicted protein * 1.41 -


(http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/paracoccidioides_brasiliensis/MultiHome.html); b Proteins and transcripts annotations from Paracoccidioides genome database or by homology in NCBI database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/); c Protein expression profiles in log2 (fold change) obtained from ProteinLynx Global Server (PLGS) analysis normalized with internal standard. *: identified only








40

Figures

Figure 1. Effect of glucose deprivation in transcripts and protein expression in

Paracoccidioides yeast cells. (A) The kinetics of fructose-1,6-biphosphatase, isocitrate

lyase and 3-ketoacyl-CoA thiolase gene expression in Pb01 yeast cells grown in MMcM

medium with 4% (control) or without glucose (0%) were analyzed. The cells were

incubated at 36oC for several time intervals. The data were normalized using the

constitutive gene encoding the 60S ribosomal L34 gene as the endogenous control and

41

are presented as relative expression in comparison to the experimental control cells

value set at 1. Data are expressed as mean +standard deviation of the triplicates of

independent experiments. *, significantly different from the control, at a P value of <

0.05. (B) Proteins (50µg) of Pb01 yeast cells were incubated at 36oC using (4%) or

(0%) glucose and the abundance of PbIcl was analyzed by western blotting. The

proteins were fractionated by one-dimensional gel electrophoresis. The proteins were

blotted onto a nitrocellulose membrane and the 63kDa protein species was detected by

using the rabbit polyclonal antibody anti-PbIcl. Densitometric analysis of imunoblotting

bands was performed using the software AphaEaseFC.

Figure 2. Growth of Paracoccidioides under glucose deprivation. A total of 5.107

Paracoccidioides yeast cells were incubated in minimal medium (MVM) with (4%) and

without (0%) glucose up to 72 h. At time points 0, 24, 48 and 72 h cells were collected,

killed by heat, and lyophilized to determine the cell dry weight. Data are expressed as

mean + standard deviation of the triplicates of independent experiments.*, significantly

different from the control, at a P value of< 0.05.

42

Figure 3. Overview of metabolic responses of Paracoccidioides to glucose deprivation. The figure summarizes the data from transcriptome

and proteomic analyses and suggests the mechanism and the first flow of carbon used by this fungus to overcome the nutrient deprivation stress.

GPH: glycogen phosphorylase; PGM: phosphoglucomutase; GPI: glucose-6-phosphate isomerase; HXK: hexokinase; FBPase: fructose-1,6-

biphosphatase; ALD: fructose-bisphosphate aldolase; TPI: triosephosphate isomerase; GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase;

PGK: phosphoglycerate kinase; PGAM: phosphoglyceratemutase; ENO: enolase; PEPCK: phosphoenolpyruvate carboxykinase; PYC: pyruvate

43

carboxylase; PK: pyruvate kinase; ICL: isocitrate lyase; MLS: malate synthase; IDH: isocitrate dehydrogenase; SUCLA: succinyl-CoA ligase;

SDHA: succinate dehydrogenase; FUM: fumarate hydratase (fumarase); MDH: malate dehydrogenase; OGDC: 2-oxoglutarate dehydrogenase

E1; PDC: pyruvate decarboxylase; ADH: alcohol dehydrogenase; ALDH: aldehyde dehydrogenase; ACD: acyl-CoA dehydrogenase; ECH:

enoyl-CoA hydratase; THIO: 3-ketoacyl-CoA thiolase and PDH: pyruvate dehydrogenase. Enzymes were colored according to their differences

in expression and and labelled to indicate if the data were obtained from transcriptome or proteomics. Italic, bold, and underlined labels indicate

that the data were obtained from transcriptome, proteome, or both, respectively. Green or red colors indicate up- or down-regulated proteins,

respectively. Blue color indicates down-regulated transcript and up-regulated protein. The numbers 1, 2, 3, and 4 indicate some up-regulated

pathways for amino acids detected from transcriptome (italic), proteome (bold) or in both (underlined), indicated below, which can be involved

in the production of the pyruvate, oxaloacetate, succinate, and acetyl-CoA, respectively. 1) pyruvate production: tryptophan, alanine, cysteine

and glycine. 2) oxaloacetate production: phenylalanine, glutamate and tyrosine. 3) succinate production: threonine. 4) acetyl-CoA production:

threonine, tryptophan, tyrosine and leucine. OXA: oxaloacetate; e -: released electrons from enzymatic reaction.

44

Figure 4. Ethanol detection in Paracoccidioides Pb01 yeast cells under glucose

deprivation. The concentration of ethanol (g/L) in Paracoccidioides yeast cells under

or not (control) glucose deprivation was determined. A total of 108

cells was used for

each sample and the ethanol compound was quantified using the enzymatic detection kit

(UV-test for ethanol, RBiopharm, Darmstadt, Germany). Data are expressed as mean +

standard deviation of the biological triplicates of independent experiments. Test t

student was used.*, significantly different from the control, at a P value of < 0.05.

45

Figure 5. Number of proteins and transcripts in common from RNAseq and

NanoUPLC-MSE

analysis. The number of the same proteins and transcripts matched

from RNAseq and NanoUPLC-MSE

analysis is shown by IDs (identity from

Paracoccidioides, Pb01, genome database). A total of 57 and 32 proteins and transcripts

were up- and down-regulated in both analyses. The number of 17 IDs were up-regulated

in proteome and down in transcriptome while a total of 4 IDs were down-regulated in

proteome and up in transcriptome.

46

Figure 6. Number of transcripts and proteins related to metabolism and energy

subcategories regulated in Paracoccidioides, Pb01, under glucose deprivation. The

number of transcripts and proteins, in percentage (%), regulated in Paracoccidioides,

Pb01, under glucose deprivation was calculated based on number of transcripts/

proteins in each category shown in Figures S2 and S6, panels A. (A) Metabolism. The

subcategories were represented by amino acid, nitrogen/ sulfur, C- compound and

carbohydrates, lipid/ fatty acid, and isoprenoid, purin nucleotide/ nucleoside/

nucleobase, secondary and phosphate metabolisms. (B) Energy. The subcategories were

represented by glycolysis/ gluconeogenesis, TCA cycle, electron transport and

membrane associated energy, ethanol production, pentose phosphate pathway and

glyoxylate cycle. Black and gray bars indicate genes and proteins, respectively.

47

Figure 7. Kinetics of Paracoccidioides fbp, icl and thio expression and susceptibility of yeast cells to macrophages killing during infection.

(A) Pb01 yeast cells were grown without (yeast cells) and with macrophages (yeast cells-macrophages) for 24 h in RPMI medium, and the

48

relative expression of genes fbp (fructose-1,6-biphosphatase), icl (isocitratelyase), and thio (3-ketoacyl-CoA thiolase) was determined. The data

were normalized using the constitutive gene encoding the 60S ribosomal L34 gene as the endogenous control and are presented as relative

expression in comparison to the experimental control cells value set at 1. (B) Pb01 yeast cells were previously grown in MMcM medium with

(4%), as control, or without (0%) of glucose up to 48 h and then were incubated with macrophages at a 1:2.5 macrophages: yeast ratio, for both

conditions. As demonstrated, the number of viable cells was determined by quantifying the number of colony forming units/ mL (CFUs/ mL)

during infection from culture supernatant (non internalized cells removed by aspiration prior to macrophages lysis) and after internalization. Data

are expressed as mean + standard deviation of the biological triplicates of independent experiments. Test t student was used. *, significantly

different from the control, at a P value of < 0.05.

49

Figure S1. Global analysis of RNAseq data. Mapped reads data were analyzed by DEGseq package and plotting graphs were obtained. The

transcripts are represented by dots. (A) Scatter plot shows the number of reads (log2) counts for each transcript in GD (glucose deprivation) and

control conditions. (B) MA-plot of GD versus control conditions shows the intensity of expression of identified transcripts (log2 of fold change)

in the y axe [M] and the density of reads (log2) in the x axe [A] mapped for each transcript. In addition, the graph shows the number of

differentially expressed transcripts obtained from FET (Fisher Exact Test) using a P-value of 0.001 in red color.

50

Figure S2. Functional classification and abundance levels of transcripts regulated

in Paracoccidiodes under glucose deprivation obtained by RNAseq. (A) Biological

processes of differentially expressed transcripts in Paracoccidioides, Pb01, under

glucose deprivation are shown. The biological processes were obtained using the Pedant

on MIPS (http://pedant.helmholtz-

muenchen.de/pedant3htmlview/pedant3view?Method=analysis&Db=p3_r48325_Par_

brasi_Pb01) and Uniprot database (http://www.uniprot.org/). A total of 1049

transcripts are shown represented by the percentage (%) of regulated classified

transcripts for each category. (B) The number of up and down-regulated transcripts in





51

Paracoccidioides, Pb01, under glucose deprivation stress is shown for each category depicted in (A). A total of 506 and 543 transcripts were up-

and down-regulated and are depicted by light and dark gray colors bars, respectively. The percentages (%) show the number of up and down

regulated transcripts for each category based on a total of them.

Figure S3. Peptide detection type to control and glucose deprivation samples. The pie graph show the percentage of peptides matched

against the Paracoccidioides (Pb01) database by PLGS (PepFrag 1 and PepFrag 2), variables modifications (VarMod), fragmentation that

occurred on ionization source (InSource), missed cleavage performed by trypsin (Missed Cleavage) and Neutral loss H2O and NH3correspondent

to water and ammonia precursor losses to control (A) and glucose deprivation (B) conditions. The SpotFire Decision Site 8.0 v program was

used. The PepFrag parameters should be predominant, in contrast to insource and missed cleavage which should not reach 20%.

52

Figure S4. Peptide mass accuracy analyses. Peptides data were used to make the bar graph showing the accuracy of mass for peptides in

control and glucose deprivation samples. A total of 94.9 and 95.7% of identified peptides were detected in a 15 ppm error range in both samples,

control (A) and glucose deprivation (B), respectively.

53

Figure S5. Detection of dynamic range of proteomic analysis. The dynamic range of proteomic experiment for each condition was performed.

Graphs for control (A) and glucose deprivation (B) are shown. Regular, reverse, and standard proteins were indicated by gray/ square, blue/ circle

and yellow/ triangle colors/ shape, respectively. The regular and reverse proteins indicate identified proteins using regular and reverse genomic

database from Paracoccidioides, Pb01, respectively. The standard protein was used to normalize the expression data and compare the control and

glucose deprivation proteins. Our data showed an acceptable quantification to standard protein between the both conditions.

54

Figure S6. Functional classification and abundance levels of proteins regulated in

Paracoccidiodes under glucose deprivation obtained by NanoUPLC-MSE data. (A)

Biological processes of differentially expressed proteins in Paracoccidioides, Pb01,

under glucose deprivation are shown. The biological processes were obtained using the

Pedant on MIPS (http://pedant.helmholtz-

muenchen.de/pedant3htmlview/pedant3view?Method=analysis&Db=p3_r48325_Par_

brasi_Pb01) and Uniprot databases (http://www.uniprot.org/). Three hundreds and

thirty-five proteins are represented by the percentage (%) in each category. (B) The

number of up- and down-regulated proteins in Paracoccidioides, Pb01, under glucose

deprivation is shown for each category depicted in (A). Two hundreds and three

proteins were up- regulated (dark gray) and one hundred and thirty-two proteins were

down-regulated and are depicted by the light gray color bar.







102

2) Conclusões

A fim de sobreviver no corpo humano, patógenos devem se adaptar nos

microambientes os quais são frequentemente caracterizados por baixas disponibilidades

de nutrientes. Em Paracoccidioides spp. uma das primeiras linhas de defesa durante

invasão no hospedeiro são os macrófagos residentes nos pulmões, considerados pobres

em aminoácidos e nutrientes tais como a glicose. Neste estudo, as respostas de

Paracoccidioides, isolado Pb01, sob condições de privação de glicose foram obtidas a

partir de abordagens transcricional e proteômica em larga escala além de ensaio

enzimático, peso seco celular e ensaios de interação macrófago-fungo. As análises

revelaram que:

Pb01 muda seu metabolismo em resposta à privação de glicose,

detectado por análises trancricionais e proteômicas em larga escala;

O fluxo de carbono é centrado na produção de etanol e gliconeogênese

pela modulação de vias tais como a beta-oxidação e ciclos do glioxilato e

ácido tricarboxílico que, juntamente com a degradação de aminoácidos,

geram precursores que alimentam tal fluxo;

O aumento da quantidade de etanol em 24 e 48 h de privação de glicose

comparada à condição controle corroboram o fluxo de carbono sugerido;

A detecção da menor taxa de crescimento das células em privação de

glicose estão de acordo com dados prévios em outros organismos e têm

associação com a menor abundância de transcritos e proteínas associadas

com a regulação do ciclo celular, transcrição, crescimento celular/

morfogênese e transdução de sinal;

As células que foram previamente privadas de glicose mostraram ser

mais susceptíveis à morte por macrófagos indicando que a glicose

proporciona uma vantagem de sobrevivência de Paracoccidioides dentro

dos macrófagos;



103

Neste estudo, vias metabólicas alternativas adotadas pelo fungo Pb01

durante a privação de glicose foram elucidadas resultando no melhor

entendimento da adaptação e persistência fúngica no ambiente hostil do

hospedeiro. Desse modo, o estudo contribuiu nas investigações em

relação à adaptação do fungo à privação da fonte preferencial de

carbono, condição encontrada no hospedeiro e que se torna relevante

para o estabelecimento da infecção.



105

1) Introdução

Os níveis de oxigênio na atmosfera eram baixos até a evolução de organismos

fotossintéticos (cianobactérias) a aproximadamente 2,5 – 3 bilhões de anos atrás e este

cenário começou a mudar (SEMENZA, 2007). As concentrações de oxigênio

aumentaram significativamente a cerca de 1,5 bilhão de anos atrás o que coincidiu com

o aparecimento dos primeiros eucariotos aeróbios. Estes organismos puderam gerar

energia por fosforilação oxidativa em organelas internas, as mitocôndrias (HEDGES et

al, 2004), essenciais como aceptora de elétrons durante a respiração. Os primeiros

fungos provavelmente surgiram neste período. Os níveis de oxigênio continuaram a

oscilar particularmente durante a expansão dos metazoários (a 500 milhões de anos

atrás). O oxigênio é uma molécula tóxica e não é surpreendente que os organismos

desenvolveram mecanismos sofisticados para responderem a níveis alterados desta

molécula (TAYLOR & MCELWAIN, 2010).

O oxigênio é uma molécula crítica para biossíntese de esteróis, ácidos graxos

mono e poliinsaturado, NAD (dinocleotídeo de nicotinamida e adenina), porfirina para

algumas vias metabólicas e biossintéticas (RAYMOND & SEGRE, 2006; SUMMONS

et al, 2006). Assim, a disponibilidade de oxigênio é um fator crítico no metabolismo

geral das células de aeróbios obrigatórios e facultativos. Alguns eucariotos fúngicos,

tais como representantes do filo Neocallimastigales são anaeróbios obrigatórios e foram

primeiramente isolados do rúmen de ovelhas (TRINCI et al, 1994) não utilizando o

oxigênio nos processos de produção de ATP nas mitocôndrias. Por outro lado, as

organelas denominadas hidrogenossomas produzem quantidades equimolares de CO2,

H2 e acetato a partir do piruvato. Neste processo o ATP é formado sem a presença de

oxigênio tendo esta organela, portanto, uma função também de respiração aeróbia

(BENCHIMOL et al, 1997).

As diferentes tensões de oxigênio são descritas como anóxia ou anaeróbia

(depletada ou ausência completa de oxigênio); hipóxia (condição em que há redução nos

níveis de oxigênio) e normóxia (níveis de oxigênio atmosférico de aproximadamente

21% de O2 ou uma pressão parcial de oxigênio [pO2] de 159 mmHg no nível do mar)

(GRAHL et al, 2012b). Como citado anteriormente, os organismos possuem

mecanismos sofisticados para responderem a níveis alterados de oxigênio. Até mesmo

os aeróbios obrigatórios e facultativos podem ser expostos à longos períodos ou



106

transientes condições de hipóxia. Muitos fungos crescem no solo onde teores de

oxigênio são baixos e outros, tais como Aspergillus fumigatus, colonizam pilhas de

compostagem onde as concentrações de oxigênio são próximas a 1,5% (WANG et al,

2007). Mais ainda, em relação aos patógenos humanos nos quais são em sua maioria

considerados aeróbios obrigatórios, esta disponibilidade é essencial para o

desenvolvimento da infecção visto que a adaptação à ambientes normóxicos, no meio

ambiente, e hipóxicos, no corpo humano, é um desafio para tais organismos (ERNST &

TIELKER, 2009; GRAHL et al, 2012b) com consequente produção de estresse

ambiental na maioria das células dos patógenos e do hospedeiro (COONEY & KLEIN,

2008; PEYSSONAUX & JOHNSON, 2004).

O desafio de se adaptar às condições de hipóxia no hospedeiro é descrito até

mesmo para patógenos dependentes do hospedeiro mamífero como o fungo patogênico

humano Candida albicans. Este fungo enfrenta diversas tensões de oxigênio durante o

processo infectivo tais como níveis atmosféricos (21% ou 160 mmHg), quando infecta

cavidades orais e mucosas, e níveis mais baixos do gás quando penetra em órgãos,

células e tecidos internos. De fato, no intestino, residência de muitos micro-organismos

patógenos e comensais, os teores de oxigênio variam de 0 à 70 mmHg com picos em

torno de 20 mmHg no duodeno. Concentrações similares são encontradas no fígado,

pâncreas e cérebro. Nos rins, as concentrações são um pouco maiores, em torno de 70

mmHg (ERNST & TIELKER, 2009). O gradiente de oxigênio em tais órgãos depende

da proximidade da corrente sanguínea, na qual transporta oxigênio nas veias, ou ainda

pela atividade das células, tanto do hospedeiro quanto dos micro-organismos que

colonizam os nichos no hospedeiro, resultando no consumo desta molécula (ERNST &

TIELKER, 2009). Além disso, a produção de CO2 está diretamente acoplada ao

consumo de O2 nas células eucarióticas. Os sítios de hipóxia in vivo também contêm

níveis elevados de gás carbônico no qual o sensoriamento tem sido relacionado à

virulência fúngica (KLENGEL et al, 2005).

A ideia de que patógenos fúngicos enfrentam níveis baixos de oxigênio durante

a patogênese, tem sido confirmada in vivo em modelos murinos de aspergilose

pulmonar invasiva (API). Estudos utilizando uma linhagem de A. fumigatus que produz

luciferase mostraram que a luminescência produzida pela enzima, in vivo, decrescia

durante a infecção, apesar de um aumento na carga fúngica. A hipótese foi de que,

durante a infecção, a lesão severa nos tecidos causou um decréscimo na disponibilidade

de oxigênio o qual afetou a reação que produz luz pela luciferase, dependente de



107

oxigênio (BROCK et al, 2008; IBRAHIM-GRANET et al, 2010). Além disso, a

confirmação adicional de hipóxia nos sítios de infecção foi ainda mais evidente em um

estudo que utilizou três modelos murinos de API imunologicamente distintos usando o

agente de detecção de hipóxia hidrocloreto pimonidazol (Hypoxyprobe – 1) (GRAHL et

al, 2011). Os resultados do estudo mostraram que o influxo e a atividade das células do

sistema imune do hospedeiro contribuem muito para o desenvolvimento da condição de

hipóxia durante a infecção fúngica pulmonar invasiva. Os modelos murinos de infecção

onde as respostas inflamatórias foram maiores, a condição de hipóxia também foi mais

detectada (Figura 1A e C). No primeiro modelo (Figura 1A), os camundongos foram

quimioterapeuticamente imunossuprimidos com depleção de neutrófilos e outras células

efetoras do sistema imune. Apesar de se detectar hipóxia neste modelo, esta condição

foi menor do que nos outros dois modelos e a principal conseqüência foi o processo

inflamatório mínimo mesmo com o crescimento fúngico intenso. Na Figura 1B, os

camundongos foram tratados com altas doses de corticosteróides. Este tratamento

resulta em uma maior susceptibilidade à infecções por micro-organismos devido à

supressão, e não depleção, como nos quimioterapeuticamente tratados, da atividade das

células efetoras do sistema imune do hospedeiro. Desse modo, há, mesmo que mínimo,

um processo inflamatório nos tecidos pulmonares, acompanhado do crescimento

fúngico e ao aparecimento mais intenso da condição de hipóxia.

No terceiro caso, demonstrado na Figura 1C, camundongos transgênicos

deficientes da subunidade gp91 phox

da enzima NADP oxidase foram observados durante

a infecção por A. fumigatus. Este modelo murino simulou uma condição de doença

granulomatosa crônica desordenada, o que torna os pacientes altamente susceptíveis à

infecções por micro-organismos. Houve um forte aumento da resposta inflamatória do

hospedeiro acompanhado do crescimento fúngico reduzido. A condição de hipóxia foi

maior tanto no centro das lesões quanto ao redor do tecido pulmonar, dependendo dos

dias pós-infecção. Concluiu-se que, partes significantes do pulmão, tiveram contato com

a condição de hipóxia durante a infecção por A. fumigatus. Juntos, os dados

demonstraram que A. fumigatus encontra microambientes hipóxicos e diferentes

disponibilidades de oxigênio durante o processo infectivo e sugeriram que a resposta

inflamatória inicia um importante, mas não exclusivo, papel na geração de

microambientes hipóxicos no hospedeiro (GRAHL et al, 2011; GRAHL et al, 2012b).



108

Figura 1. Ocorrência de hipóxia em modelos murinos de API (aspergilose pulmonar invasiva). O

agente de detecção de hipóxia, hidrocloreto pimonidazol (Hypoxyprobe-1), foi usado para monitorar a

condição de hipóxia in vivo em três modelos murinos distintos de aspergilose invasiva. Verde: A.

fumigatus; Azul: 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) corando células do hospedeiro; Vermelho:

hipóxia detectada pelo Hypoxyprobe-1. Todas as imagens são do dia 4 pós-inoculação do fungo e

representam as imagens sobrepostas como previamente descrito em Grahl et al. (2011). (A) Modelo

murino quimioterapêutico representando camundongos imunossuprimidos com ciclofosfamida e

triamcinolon e inoculados com conídios de A. fumigatus. (B) Modelo murino corticosteróide

representando camundongos imunossuprimidos com dose única de triamcinolona e inoculados com

conídios de A. fumigatus. (C) Modelo murino de doença granulomatosa crônica representando

camundongos deficientes da subunidade da enzima NADPH oxidase e inoculados com conídios de A.

fumigatus. Os dados foram retirados dos experimentos descritos em Grahl et al. (2011). Adaptação da

figura: Grahl et al. (2012).

Os mecanismos de adaptação à hipóxia têm sido amplamente explorados em

micro-organismos não patogênicos e células de mamíferos/ humanas, porém poucos

estudos mostram a influência da hipóxia na infectividade e virulência de patógenos

(ERNST & TIELKER, 2009). Muitos organismos conseguem sensoriar as

concentrações de oxigênio e respondem rapidamente à esta condição. Respostas

transcricionais de muitas espécies fúngicas, patogênicas ou não, mostram a adaptação

destes micro-organismos durante estágios iniciais de hipóxia (BARKER et al, 2012;

BECERRA et al, 2002; ERNST & TIELKER, 2009; GUIDA et al, 2011; HUGHES et

al, 2005; KWAST et al, 2002; SETIADI et al, 2006; SYNNOTT et al, 2010). Em níveis

transcricionais, as respostas centrais entre a maioria deles envolvem aumento da

expressão de genes que codificam enzimas de vias dependentes de oxigênio tais como

síntese de esteróis, lipídios e heme (BIEN & ESPENSHADE, 2010; BUTLER, 2013).

Outras mudanças vistas em algumas, mas não em todas as espécies, incluem um

aumento de genes relacionados com a via glicolítica e diminuição daqueles envolvidos



109

com a respiração assim como mudanças na expressão de genes da parede celular das

células fúngicas como ocorrem em C. albicans, C. parapsilosis e S. cerevisiae

(ASKEW et al, 2009; GUIDA et al, 2011; KWAST et al, 1998; KWAST et al, 2002;

SYNNOTT et al, 2010). Em Cryptococcus neoformans, as respostas transcricionais à

hipóxia revelaram que o fungo aumenta a expressão de transcritos associados com a

biossíntese do grupo heme e de ergosterol, metabolismo de ácidos graxos, de respostas a

estresse e respiração celular, mas diminuiu a expressão de transcritos envolvidos com

parede celular e biossíntese da cápsula. No fungo A. fumigatus, respostas transcricionais

e proteômicas em resposta à hipóxia também têm sido conduzidas (BARKER et al,

2012; VODISCH et al, 2011) mostrando semelhanças e diferenças entre as respostas à

hipóxia dos organismos anteriormente citados. Depois desta visão geral, para que

entendamos os mecanismos que estão por trás destas respostas nas células fúngicas e em

outros eucariotos, é importante que saibamos primeiramente como as respostas ocorrem

nas células de mamíferos e em fungos não-patogênicos, melhor caracterizadas. Assim,

podemos pontuar tanto semelhanças quanto diferenças destes para com os fungos

patogênicos e entendamos a importância do estudo de tais fatores no estabelecimento da

patogênese fúngica.

1.1 - Regulador hipóxico em mamíferos

O fator induzível por hipóxia (HIF) é o melhor regulador da resposta à hipóxia

estudado em mamíferos (GREER et al, 2012). Este fator é bem conservado nos

Metazoários (mamíferos, artrópodos e cnidários, por exemplo) inclusive em sua função,

como previamente detectado em vermes e moscas (ARQUIER et al, 2006; EPSTEIN et

al, 2001). O HIF é um fator de transcrição dimérico consistindo de uma subunidade

reguladora e outra constitutivamente expressa, HIF-α e HIF-β, respectivamente. Quando

os níveis de oxigênio estão altos a subunidade HIF-α é modificada por prolil-

hidroxilases, dependentes de oxigênio, e subsequentemente degradada via proteassoma

sinalizada por ubiquitina. Quando ocorre o oposto, a atividade hidrolase das prolil-

hidroxilases é inibida, devido a quantidade menor de oxigênio. Consequentemente, a

HIF-α, livre, entra no núcleo, dimeriza com HIF-β e regula a expressão de centenas de

genes em resposta à hipóxia (Figura 2). A expressão de transportadores de glicose,

enzimas glicolíticas e lactato desidrogenase A é induzida no qual aumenta a glicólise

(TAYLOR, 2008). A eficiência da respiração mitocondrial é aumentada (SEMENZA,



111

1.2 - Principais reguladores hipóxicos em fungos: SREBPs (sterol regulatory

element binding proteins) e Upc2

A biossíntese de esteróis é um processo dependente de oxigênio e, em algumas

espécies, as respostas à hipóxia se dá pelo sensoriamento dos níveis de esteróis nas

membranas fúngicas. As SREBPs são as proteínas mais bem estudadas e entendidas

envolvidas com o mecanismo hipóxico em sistemas fúngicos (BIEN & ESPENSHADE,

2010; ESPENSHADE & HUGHES, 2007; OSBORNE & ESPENSHADE, 2009).

Mamíferos têm dois genes que codificam para SREBPs, SREBP-1 e SREBP-2. Estes

genes regulam a expressão de genes para síntese e captação de ácidos graxos e

colesterol e, portanto, não estão envolvidos com a resposta à hipóxia (HORTON et al,

2002). Como ocorre em HIF (hipoxia inducible factor), fator de transcrição responsivo

à hipóxia em mamíferos, as SREBPs têm um domínio de ligação ao DNA denominado

bHLH (basic helix loop helix), porém o resíduo único de tirosina no lugar de uma

arginina só ocorre nas SREBPs e é conservado entre as espécies (KIM et al, 1995). Nos

fungos ascomicetos Schizosaccharomyces pombe e A. fumigatus, assim como no

basidiomiceto C. neoformans, existem ortólogos SREBPs envolvidos na expressão de

genes relacionados à biossíntese de lipídios, ergosterol e heme (CHANG et al, 2007;

CHUN et al, 2007; TODD et al, 2006; WILLGER et al, 2012).

Em mamíferos e em alguns fungos, as proteínas da família SREBP são

sintetizadas como precursores inativos inseridas na membrana do retículo

endoplasmático das células (Figura 3). A presença de dois domínios transmembrana

garante que ambas as porções, N- e C-terminal, estejam no citoplasma celular. As

SREBPs estão associadas com a proteína SCAP (SREBP cleavage activating protein),

onde o homólogo nos fungos é denominado Scp1, no retículo endoplasmático. A

proteína SCAP se liga à esteróis, mantendo-se na conformação inativa e retendo as

SREBPs na membrana. Em condições de depleção de esteróis, a região N-terminal das

SREBPs, na qual contém o domínio de ligação ao DNA, é clivada e entra no núcleo

atuando como fator de transcrição, ativando a expressão de genes alvo (BUTLER,

2013).

Apesar deste mecanismo básico de ativação das SREBPs ser conservado entre

mamíferos e fungos, há também diferenças substanciais. Primeiramente, a proteína

INSIG (insulin-induced gene), bem caracterizada no mecanismo de ativação das

SREBPs em mamíferos, está envolvida com a regulação do transporte do complexo



110

2007) e genes associados com eritropoiese, angiogênese e vasodilatação são também

regulados (GUILLEMIN & KRASNOW, 1997). Entretanto, não há evidência da

presença de ortólogos HIF além dos Metazoários (LOENARZ et al, 2011), inclusive em

fungos onde não têm sido descrito ortólogos HIF até o momento (BUTLER, 2013).

Figura 2. HIF-1α regula várias funções importantes em leucócitos polimorfonucleares

durante mecanismos de defesa do hospedeiro em condições de normóxia e hipóxia. (A) Durante

normóxia, as prolina hidroxilases, dependetes de oxigênio, modificam a subunidade alfa do fator de

transcrição HIF-1 nos resíduos de prolina 402 e 564. A asparagina 803 é, então, hidroxilada pela proteína

FIH o qual decresce a interação do fator com coativadores transcricionais p300/CBP. As prolinas

hidroxiladas são reconhecidas por vHL, um componente do complexo ubiquitina ligase, que ubiquitina

(Ub) HIF-1α e o direciona para degradação via proteassoma. (B) Durante hipóxia e/ou infecção

bacteriana, as prolina hidroxilases não são ativadas. Consequentemente, o HIF-1α se liga à HIF-1β e

p300/CBP e regula a expressão de genes responsivos por hipóxia, envolvidos em angiogênese,

metabolismo e transporte de glicose, eritropoiese, inflamação, apoptose e estresse celular. EPO,

eritropoietina. Adaptação: Zarember & Malech, 2005.



112

SCAP-SREBP (Figura 3). Em condições repletas de esteróis (colesterol), estes se ligam

à proteína SCAP induzindo uma conformação que permite a ligação da SCAP à proteína

INSIG (ADAMS et al, 2004). Quando os níveis de esteróis caem, a interação entre

SCAP e INSIG é rompida e o complexo SCAP-SREBP é transportando para o

Complexo de Golgi via vesículas COP II (LEE et al, 2004) SREBP é, então, clivada no

Golgi e a porção N-terminal liberada para entrar no núcleo (ESPENSHADE &

HUGHES, 2007), como explicado anteriormente. Além deste papel, a proteína INSIG

também regula a proteólise de HMG-CoA redutases (5-hidroxi-3-metilglutaril-

Coenzima A) requerida para a produção de mevalonato, um passo na biossíntese do

colesterol, em mamíferos (SEVER et al, 2003). A proteína INSIG é bem conservada no

reino dos fungos exceto em C. neoformans (BIEN & ESPENSHADE, 2010).

Entretanto, estes homólogos não têm papel aparente na regulação do transporte do

complexo SREBP-SCAP. Em S. pombe, o homológo INSIG, Ins1, regula a síntese de

esteróis, mas somente pela inibição da atividade das HMG-CoA redutases (BURG et al,

2008). Em S. cerevisiae, o homólogo INSIG, Ngs1, controla as HMG-CoA redutases

estabilizando a atividade e regulando os níveis protéicos de sua isoforma, Hmg2

(BURG et al, 2008; FLURY et al, 2005). As INSIG dos outros fungos não têm suas

funções ainda descritas.

Outra particularidade do mecanismo de ativação das SREBPs está relacionada

ao processo de clivagem destas proteínas por proteases no complexo de Golgi. A

SREBP de mamíferos é clivada por duas proteases sítio-dirigidas (Figura 3). A primeira

(SP1 ou protease sítio-1) cliva dentro do loop no lúmen do Golgi e a segunda (SP2 ou

protease sítio-2) cliva dentro do domínio transmembrana (DUNCAN et al, 1997;

DUNCAN et al, 1998). As SP-1 são bem conservadas entre os fungos e têm muitas

funções (SEIDAH et al, 1994) e as SP-2 são conservadas em muitos basidiomicetos,

inclusive em C. neoformans mas parece ter sido perdida nos ascomicetos (BIEN et al,

2009; BIEN & ESPENSHADE, 2010; CHANG et al, 2009). Em C. neoformans, a

deleção do ortólogo SP-2, stp1, resulta em aumento da sensibilidade à hipóxia (CHANG

et al, 2009; CHUN et al, 2007) sendo requerida para o processamento de Sre1p, a

SREBP de C. neoformans, em condições de baixos níveis de esteróis (BIEN et al,

2009).

O processamento das SREBPs é muito diferente nos ascomicetos quando

comparado ao dos basidiomicetos, por exemplo, C. neoformans. A. fumigatus e espécies

relacionadas não têm homólogo para a proteína SCAP, por exemplo (Figura 3) e S.



113

pombe, têm dois homólogos SREBPs, Sre1 e Sre2. Sre2 é muito menor que Sre1, não se

liga à SCAP e é constitutivamente clivada independentemente dos níveis de esteróis

(HUGHES et al, 2005). Um estudo mostrou que proteínas do complexo Dsc E3 ligase,

no qual transferem ubiquitina de uma enzima E2 conjugada à ubiquitina para um alvo, é

requerida para o processamento de Sre1 e Sre2 em S. pombe (Figura 3) (STEWART et

al, 2012; STEWART et al, 2011). A clivagem de Sre1 também requer a enxima Ubc4

conjugada à E2 e componentes do proteassoma. Stewart et. al. (2012; 2011) sugere que

Scp1 transporta SREBPs do complexo de Golgi, onde estas proteínas são ubiquitinadas

por Ubc4-Dsc e direcionadas para clivagem no proteassoma. Este mecanismo pode ser

uma resposta comum à hipóxia em muitos ascomicetos, compensada pela perda da

protease SP2, e suportada pela recente demonstração de que este complexo também é

requerido para a clivagem de SrbA, a SREBP de A. fumigatus (WILLGER et al, 2012).

Ainda em S. pombe, outra proteína envolvida nos mecanismos de resposta à hipóxia, é a

proteína 2-oxoglutarato Fe (II) dioxigenase, Ofd1 (Figura 3). Ofd1 está envolvida na

regulação de Sre1 independente dos níveis de esteróis. Esta proteína é membro da

família das prolil-hidroxilases nas quais, em mamíferos, regulam a degradação do fator

de transcrição induzível por hipóxia, HIF-α. Quando os níveis de oxigênio são altos, a

proteína Ofd1 acelera a degradação da porção N-terminal de Sre1 via proteassoma.

Entretanto, o fator de transcrição é estabilizado em baixos níveis de oxigênio (HUGHES

& ESPENSHADE, 2008). Ofd1 atua como um sensor de oxigênio via dois domínios

distintos: um domínio dioxigenase na extremidade N-terminal, na qual sensoria

oxigênio, e um domínio C-terminal, no qual acelera a degradação. Estudos mostraram

que a parte C-terminal de Ofd1 interage com a proteína Nro1, de localização nuclear.

Quando os níveis de oxigênio estão baixos, Nro1 se liga à Ofd1, ajudando a estabilizar

Sre1 na qual não é degradada e regula a transcrição de genes hipóxicos (Figura 3) (LEE

et al, 2011; YEH et al, 2011). Ofd1 é geralmente bem conservada entre as espécies

fúngicas (BIEN & ESPENSHADE, 2010) e é possível ser recrutada para regulação

hipóxica em muitas espécies fúngicas, mas atua através de diferentes mecanismos

(BUTLER, 2013).



114

Figura 3. A via das SREBPs em mamíferos e fungos. O complexo SREBP/SCAP, em mamíferos, é

mantido pela interação com a proteína INSIG, no retículo endoplasmático. Baixos níveis de esteróis

causam mudança na conformação de SCAP, liberação da INSIG e transporte para o complexo de Golgi.

A região N-terminal é liberada por duas proteases específicas, entra no núcleo e ativa a expressão de



115

genes alvo. As vias de transporte nos fungos e o papel do complexo de Golgi não são completamente

entendidos. A SREBP Sre1 é ligada à membrana por um complexo com SCAP, Scp1, em C. neoformans

e S. pombe porém, não há SCAP em A. fumigatus e o mecanismo de retenção não é conhecido. A

clivagem da porção N-terminal das SREBPs (pela protease PS-1 em C. neoformans e pelo proteassoma

em S. pombe e A. fumigatus) é inibida por níveis de esteróis e oxigênio. O fator de transcrição N-terminal

se liga à elementos regulatórios esteróis no promotor dos genes (SRE) e ativa a expressão de genes

envolvidos no metabolismo de esteróis e outros. Em S. pombe, quando os níveis de oxigênio são altos, a

proteína Ofd1 se liga à Sre1-N-terminal, inibindo sua ligação ao DNA e direcionando o fator para

degradação ao proteassoma. Quando os níveis estão baixos, Ofd1 é seqüestrada pelo transportador nuclear

Nro1. O papel de Ofd1 na regulação à hipóxia em outros fungos não é conhecido. Na figura, alguns

passos putativos ou não caracterizados ainda são indicados com pontos de interrogação. Abreviações:

INSIG: insuline-induced gene; SCAP: SREBP cleavage activating protein; SREBP: sterol regulatory

element-binding protein. Adaptação: Butler (2013).

Muito interessante, em algumas espécies de ascomicetos (as Saccharomycotina)

há diferenças peculiares em relação às SREBPs. Nestas espécies, o papel central da

regulação à hipóxia feito pelas proteínas da família SREBP foi evolutivamente

substituído pelo fator de transcrição Upc2 (Figura 4). Upc2 não tem similaridade de

sequência com as proteínas da família SREBP e contém um domínio de ligação ao

DNA tipo Gal4. Upc2 regula a expressão de genes hipóxicos e síntese de esteróis em S.

cerevisiae, C. albicans e Candida parapsilosis (BUTLER, 2013; GUIDA et al, 2011;

HOOT et al, 2008; VIK & RINE, 2001). Os homólogos mais prováveis das SREBPs

nos Saccharomycotina são representados por Cph2 (C. albicans) e Hms1 (S. cerevisiae).

Ambos têm o domínio bHLH com o resíduo conservado de tirosina (BIEN &

ESPENSHADE, 2010) entretanto os domínios transmembrana associados com a função

das SREBPs são pouco conservados e as proteínas são menores. Além disso, Cph2

regula o crescimento da hifa (LANE et al, 2001) e Hms1 foi demonstrado ser regulador

do crescimento da pseudohifa (LORENZ & HEITMAN, 1998). A hipótese de que Upc2

substituiu a função da SREBP como regulador hipóxico da via de esteróis nas espécies

Saccharomycotina é de que um ancestral fúngico tinha uma SREBP com papel duplo,

regulação à hipóxia e determinação da morfologia. Esta é uma forte evidência já que

estudos demonstram que em A. fumigatus, SrbA (SREBP) é requerida para ambos,

regulação à hipóxia e ramificação da hifa (WILLGER et al, 2008).



116

Figura 4. Resposta à hipóxia em fungos baseada nas SREBPs: diferenças entre reguladores. As

SREBPs dos diferentes fungos indicados demonstram que, em espécies de Saccharomycotina, as

proteínas envolvidas no mesmo processo não têm homologia com as SREBPs de mamíferos. Estas

proteínas, Upc2, regulam a expressão de genes envolvidos com a síntese de esteróis e outros genes

hipóxicos em resposta à este estresse porém não contêm regiões que as caracterizam como uma SREBP.

A hipótese é de que possivelmente um ancestral fúngico tinha uma SREBP com papel duplo, regulação à

hipóxia e determinação da morfologia, e que posteriormente Upc2 substituiu a função da SREBP. De

fato, em A. fumigatus, SrbA (SREBP) é requerida para ambos, regulação à hipóxia e ramificação da hifa.

1.3 - Outros reguladores hipóxicos em fungos

Esteróis e lipídios são essenciais para fluidez de membrana e seus níveis são

cuidadosamente controlados pelas células. A indução da expressão de genes envolvidos

com a síntese de esteróis é uma das respostas mais conservadas à hipóxia em fungos e

tem sido relatada em várias espécies, visto ser uma via dependente de oxigênio

(BUTLER, 2013). Porém, o estresse hipóxico resulta na expressão de outros genes,

compensando os efeitos do estresse por outras vias metabólicas. O grupo heme, por

exemplo, no qual possui uma molécula de ferro que se liga ao oxigênio, pode atuar

como um regular secundário da condição de hipóxia e os mecanismos têm sido bem

caracterizados no fungo Saccharomyces cerevisiae. Níveis reduzidos do grupo heme são



117

utilizados pelo fungo para monitorar os níveis de oxigênio pelo fator de transcrição

Hap1 e, em alguns casos, Upc2 (DAVIES & RINE, 2006).

Evidências sugerem que a mitocôndria e a cadeia respiratória também são

importantes durante as respostas à hipóxia nos micro-organismos eucariotos. Cerca de

70% dos genes diferencialmente expressos em hipóxia requerem uma mitocôndria

funcional (POYTON et al, 2009b). A mitocôndria das leveduras produz óxido nítrico

(NO- nitric oxide) do nitrato em condições de hipóxia através da enzima citocromo-c-

oxidase (CASTELLO et al, 2006). Em mamíferos, a citocromo-c-oxidase é requerida

para estabilização do fator de transcrição induzível por hipóxia, o HIF-α, em condições

de hipóxia (MANSFIELD et al, 2005). Porém, o papel da mitocôndria pode não ser o

mesmo nos fungos visto que neste filo não há homólogo do HIF. Entretanto, é provável

que o óxido nítrico regule a estabilização ou atividade de outras proteínas requeridas

para a resposta à hipóxia. Observações em A. fumigatus mostraram que a deleção do

gene que codifica para citocromo-c-oxidase significativamente atenuou o crescimento

do fungo em condições de hipóxia sugerindo que a cadeia transportadora de elétrons

também é importante para as respostas à hipóxia nas espécies fúngicas (GRAHL et al,

2012a). Além disso, em C. neoformans, mutantes que se mostraram sensíveis ao CoCl2

(cloreto de cobalto) e à condição de hipóxia foram defectivos em funções mitocondriais.

Alguns dos mutantes mitocondriais produziram níveis elevados de ROS (reactive

oxigen species) reforçando a hipótese de que as ROS podem ser usadas como um

mecanismo de sensoriamento de oxigênio em muitos fungos (INGAVALE et al, 2008).

O CoCl2 é comumente usado como agente mimetizador de hipóxia em células de

mamíferos (HAN et al, 2006) pois este estabiliza o fator induzível por hipóxia, HIF,

através da regulação da atividade das prolil-hidroxilases (enzimas que evitam a

degradação do fator em condições de hipóxia). Ao contrário do íon ferro (Fe), o cobalto

(Co) e o níquel (Ni) têm baixa afinidade pelo oxigênio e se incorporam em proteínas

que se ligam ao oxigênio. Desse modo, o CoCl2 mimetiza a condição de hipóxia mesmo

na presença do oxigênio molecular (LEE et al, 2007). Como a atividade das prolil-

hidroxilases é dependente de oxigênio, estas enzimas tornam-se inativas e evitam que o

fator de transcrição seja degradado via proteassoma. Estudos no fungo C. neoformans

tem estabelecido uma correlação entre a síntese de ergosterol, sensoriamento de

oxigênio e a sensibilidade ao CoCl2 (BIEN et al, 2009; LEE et al, 2007).

É possível que o ferro seja utilizado também como um sensor de oxigênio de

forma distinta ao seu papel nas proteínas que contêm o grupo heme, porém isto deve ser



118

ainda mais caracterizado (CAMILO & GOMES, 2010). O que se sabe é que as

respostas à hipóxia se sobrepõem às respostas a baixos níveis do metal ferro. Muitos

genes envolvidos na biossíntese do grupo heme e/ou aquisição de ferro têm expressão

aumentada em ambas as condições (BARKER et al, 2012; BLATZER et al, 2011;

CHANG et al, 2009; CHUN et al, 2007; SETIADI et al, 2006; SYNNOTT et al, 2010;

TODD et al, 2006). Em A. fumigatus, genes associados com a aquisição de ferro são

provavelmente regulados diretamente pela SREBP SrbA (BLATZER et al, 2011).

Contudo, devido o sistema de transporte redutivo do ferro em espécies tais como C.

albicans requerer a oxidação do Fe+2

, é difícil separar o efeito direto dos baixos níveis

de oxigênio daqueles dos baixos níveis de ferro (ALMEIDA et al, 2009b).

A via glicolítica também está relacionada com as respostas à hipóxia descritas

até o momento. Em eucariotos multicelulares (incluindo células de mamíferos), a

expressão de enzimas glicolíticas é forte e coordenadamente induzida em condições de

hipóxia. Contudo, os mecanismos não são conservados. Nas células de mamíferos a

expressão dos genes glicolíticos em hipóxia é regulada pelo fator induzível por hipóxia,

HIF, e em fungos, não é claro ainda se há um mecanismo central em comum. As

respostas caracterizadas mostram ser diferentes entre representantes fúngicos

(WEBSTER, 2003). A indução de genes glicolíticos é bem caracterizada no fungo S.

cerevisiae (KWAST et al, 2002) e mudanças similares são observadas em fungos tais

como C. albicans, C. parapsilosis e S. pombe (ASKEW et al, 2009; GUIDA et al, 2011;

SYNNOTT et al, 2010; TODD et al, 2006). Em A. fumigatus, a expressão aumentada

dos genes glicolíticos em hipóxia só foi descrita em nível protéico (BARKER et al,

2012) e entre espécies aeróbias obrigatórias tais como Trichoderma reesei e C.

neoformans há diminuição da expressão de representantes glicolíticos em hipóxia, no

primeiro fungo (BONACCORSI et al, 2006), e indução da expressão de genes

respiratórios quando os níveis de oxigênio são baixos, no segundo micro-organismo

(CHUN et al, 2007).

O crescimento em hipóxia tem ainda efeitos dramáticos na parede celular

fúngica. Em S. cerevisiae a expressão de manoproteínas da família DAN/TIR é

altamente induzida em condições de hipóxia e anóxia e requer o fator de transcrição

Upc2 (ABRAMOVA et al, 2001; COHEN et al, 2001). Em C. albicans, a condição de

hipóxia afeta níveis de transcritos e proteínas de representantes das proteínas GPI-

ancoradas e membros da família CFEM (comuns em membranas celulares fúngicas). O

uso de azóis mimetizou baixos níveis de esteróis e, após requerimento de Upc2 e de



119

outro fator de transcrição denominado Bcr1, a indução de genes da parede celular foi

detectada (SOSINSKA et al, 2008; SYNNOTT et al, 2010). Em A. fumigatus, o

aumento da expressão de genes que codificam proteínas da parede celular também foi

observado durante crescimento em hipóxia (BARKER et al, 2012). Desse modo,

mudanças nos níveis de oxigênio provavelmente alteram a estrutura da parede celular

fúngica demonstrando um grande campo de investigação ainda amplamente inexplorado

e importante, por exemplo, para patogênese em espécies fúngicas causadoras de

doenças.

1.4 - Hipóxia e patogênese

Mutantes nulos para os principais genes regulados por hipóxia ou para

reguladores desta condição nos fungos geralmente mostram virulência atenuada em

modelos murinos de infecção fúngica. Muitos destes genes estão envolvidos com a

regulação do metabolismo celular básico. Desse modo, as deleções resultam em

atenuado crescimento fúngico em hipóxia mostrando a importância do controle do

metabolismo para adaptação e sobrevivência dos micro-organismos em condições de

depleção de oxigênio, principalmente em relação à biossíntese de esteróis, ácidos

graxos, heme e homeostase de ferro (GRAHL et al, 2012b).

Um aspecto comum das respostas fúngicas à hipóxia, que parece ter grande

relevância para a virulência destes micro-organismos, é o sensoriamente e regulação dos

níveis de esteróis, como explicado anteriormente. Em C. albicans, por exemplo, o

mutante para o fator de transcrição Upc2, no qual tem sua expressão ativada em

condições de hipóxia e baixos níveis de esteróis, reduz o crescimento do fungo e

interfere de forma significativa na formação de filamentos mais longos

(MACPHERSON et al, 2005; SYNNOTT et al, 2010). Entretanto, a ligação mais direta

da adaptação fúngica à hipóxia e a habilidade destes organismos causarem doenças

letais vêm dos estudos com as SREBPs. Mutantes nulos para representantes gênicos

desta família de proteínas em A. fumigatus e C. neoformans, SrbA e Sre1,

respectivamente, mostram que há uma forte atenuação da virulência dos fungos em

modelos murinos de criptococose e aspergilose invasiva pulmonar (CHANG et al, 2007;

CHUN et al, 2007; WILLGER et al, 2008). Além disso, uma outra via relacionada às

respostas à proteínas não enoveladas e que está envolvida com a homeostase de esteróis

de forma independente das proteínas da família SREBP, tem se mostrado ser crítica para



120

a adaptação à hipóxia e virulência de A. fumigatus. O mutante nulo para o sensor de

estresse do retículo endoplasmático IreA mostrou ser avirulento em modelos murinos de

aspergilose invasiva em condições de hipóxia (FENG et al, 2011). Então, perturbações

na biossíntese de esteróis são um aspecto comum de alguns mutantes fúngicos nulos

com defeitos de crescimento em hipóxia (GRAHL et al, 2012b).

Outro grupo de moléculas que podem ser críticas para as respostas à hipóxia nos

fungos são aquelas envolvidas com a formação de espécies reativas e oxigênio e

nitrogênio (GRAHL et al, 2012a; GUZY et al, 2007; POYTON et al, 2009a; POYTON

et al, 2009b) e com a estrutura da parede celular (SOSINSKA et al, 2008). A produção

de espécies reativas de nitrogênio e homeostase de espécies reativas de oxigênio pelo

complexo IV da cadeia transportadora de elétrons podem interferir na habilidade de A.

fumigatus se adaptar à hipóxia e microambientes pulmonares (GRAHL et al, 2012a). O

papel exato da cadeia respiratória na sinalização à hipóxia em patógenos fúngicos é

ainda indefinido e, portanto uma área promissora para mais investigações.

Considerando mudanças na parede celular fúngica, condições de hipóxia alteraram a

expressão de transcritos relacionados à biossíntese da parede celular tanto em C.

albicans quanto em A. fumigatus. Estas alterações foram acompanhadas de mudanças

no padrão de expressão e exposição das PAMPs (pathogen-associated molecular

patterns) o que torna relevante a procura por tais moléculas importantes para adaptação

fúngica durante estresse hipóxico (GRAHL et al, 2012b; SHEPARDSON & CRAMER,

2013; SHEPARDSON et al, 2012).

O fungo Paracoccidioides apresenta uma fase saprobiótica no solo e/ou fezes e

outra parasítica nos tecidos do hospedeiro (ALMEIDA et al, 2009a; TERÇARIOLI et

al, 2007). Estas características indicam que o fungo, provavelmente, possui mecanismos

de adaptação à hipóxia visto que organismos que habitam tais ambientes têm mostrado

estes mecanismos (GRAHL et al, 2012b). Além disso, o solo por si só torna-se hipóxico

após fortes chuvas e devido o aumento dos níveis de gás carbônico, CO2. Assim,

organismos que habitam solos desenvolveram mecanismos para tolerar mudanças nos

níveis baixos de oxigênio rapidamente (DAT et al, 2004; MACEK et al, 2011). O

estudo das adaptações à hipóxia tem sido pouco investigado em muitos fungos

dimórficos patógenos humanos e clinicamente relevantes tais como Coccidioides

immitis, Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermatitidis e inclusive nas espécies de

Paracoccidioides. Em hipóxia, há ativação primordial da via das SREBPs, na qual tem

sido proposta como excelente alvo para drogas antifúngicas, devido o seu requerimento



121

para virulência de fungos como A. fumigatus e C. neoformans (BIEN &

ESPENSHADE, 2010). Assim, as diferenças substanciais entre os mecanismos entre os

ortólogos das SREBPs de fungos e humanos indicam a possibilidade destas proteínas

serem alvos específicos em potencial para drogas terapêuticas. Levando em conta todas

estas observações e o fato de que nada sobre hipóxia tem sido descrito para as espécies

de Paracoccidioides até o momento, o objetivo do nosso trabalho é caracterizar as

respostas do fungo Paracoccidioides à condição de hipóxia, tanto pela regulação da

proteína da família SREBP, SrbA, quanto por análises proteômicas em condições que

mimetizam ou não a condição de hipóxia. A elucidação de tais respostas será relevante

no contexto das relações patógeno-hospedeiro, pois poderá elucidar moléculas

importantes para a adaptação do fungo durante o processo de patogênese.

2) Materiais e métodos

2.1- Condições de cultivo de Paracoccidioides (Pb01) e A. fumigatus

Células leveduriformes de Paracoccidioides, Pb01, (ATCC MYA – 826) foram

mantidas in vitro à 36oC em meio Fava-Netto por 7 dias (FAVA NETTO et al, 1969).

Quando necessário, as células foram cultivadas em meio Fava-Netto líquido por 72 h e

posteriormente transferidas para meio mínimo MMcM (RESTREPO & JIMENEZ,

1980) acrescentado com o reagente cloreto de cobalto, CoCl2 (Sigma-Aldrich) na

quantidade de 300 μM, à 36oC.

Células selvagens (WILLGER et al, 2008), mutante nulo para o gene srbA

(∆srbA) (WILLGER et al, 2008) e as complementadas com o homólogo do gene srbA

de Paracoccidioides, Pb01 (neste estudo), de A. fumigatus, foram cultivadas em meio

mínimo com glicose (GMM – glucose minimal medium) à 37oC com suplementos

apropriados como previamente descrito (SHIMIZU & KELLER, 2001). Para o preparo

de meios sólidos, 1,5% de Agar foi adicionado antes do procedimento de esterilização.

2.2 - Análises in silico de proteínas da família SREBP

As sequências deduzidas de aminoácidos das proteínas da família SREBP foram

obtidas pelo banco de dados do NCBI – GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) por

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/



122

homologia com a sequência protéica de Sre1p, de S. pombe. A procura por domínios

conservados e segmentos transmembrana foram realizados a partir do banco de dados

PFAM (http://pfam.sanger.ac.uk/) e do software Phobius (http://phobius.sbc.su.se/),

respectivamente. A montagem da figura foi feita em proporção exata aos tamanhos das

proteínas e local/ quantidade dos domínios e segmentos transmembrana.

2.3 - Análise de PCR quantitativa em tempo real em Paracoccidioides (Pb01)

e em A. fumigatus

A análise de expressão diferencial dos transcritos regulados pela condição de

hipóxia utilizando cloreto de cobalto (CoCl2) em células leveduriformes de

Paracoccidioides, Pb01, foi realizada para os genes srbA (PbsrbA), enolase (eno),

lanosterol 14-alfa-demetilase (erg11), C-5 esterol desaturase (erg3), C-22 esterol

desaturase (erg5) e acetil-CoA carboxilase (acc). Os RNAs foram extraídos utilizando o

reagente Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) e os cDNAs foram obtidos usando o

kit High Capacity RNA-to-cDNA (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).

Ocleotídeos utilizados foram sintetizados com base na sequência de éxons e íntrons

(íntron-spanning) para amplificação somente de produtos do DNA complementar e não

genômico. Quando não foi possível utilizar esta estratégia, os RNAs foram tratados com

DNAse I (Invitrogen) antes da síntese de cDNA. A especificidade de cada par de

oligonucleotídeos foi anteriormente confirmada pela visualização de um único produto

de PCR em gel de agarose 1,2% e pela curva de dissociação dos produtos amplificados.

Os cDNAs foram submetidos à análises por qRT-PCR em tempo real das condições

controle e experimental. Os cDNAs foram diluídos 1:5 em água e o qRT-PCR foi

realizado utilizando-se mistura SYBR green qPCR mix (Applied Biosystems, Foster City,

CA) no sistema Step One Plus real-time PCR system (Applied Biosystems Inc.). As

reações foram realizadas em triplicata para cada amostra de cDNA e os dados

normalizados com o gene constitutivo que codifica para alfa tubulina como controle

endógeno. Os níveis de expressão relativa dos genes de interesse foram calculados

utilizando-se o método de curva padrão para quantificação relativa dos genes

(BOOKOUT et al, 2006). Os resultados foram validados pelo teste t-Student’s, sendo

consideradas diferenças significativas as amostras que apresentaram P < 0,05.

Em A. fumigatus, as linhagens selvagem (CEA10), mutante para o gene srbA

(∆srbA) e a linhagem complementada geneticamente com PbsrbA, foram cultivadas em

http://pfam.sanger.ac.uk/

http://phobius.sbc.su.se/



123

meio mínimo com glicose (GMM) por 18 h. Após coleta por filtração à vácuo, as

células foram liofilizadas por 24 h e submetidas a lise com pérolas de vidro para

posterior extração de RNAs e PCR quantitativa em tempo real como descrito

previamente (WILLGER et al, 2012). Moléculas de RNA foram extraídas usando

TRIsure reagent (Bioline) de acordo com protocolo do fabricante e subsequentemente

purificadas (Qiagen-RNeasy plant minikit). A contaminação com DNA genômico foi

removida com tratamento utilizando Turbo DNase I (Ambion). Um total de 500 µg de

RNA tratado com DNAse foi utilizado para síntese de cDNA pelo kit transcriptase

reversa Quantitec (Qiagen). A PCR em tempo real foi realizada com um controle sem

DNA em cada análise. Cada amostra foi testada em triplicata e os dados normalizados

com o gene referência actina. Os dados são apresentados relativos à normalização da

expressão dos genes no controle. Os oligonucleotídeos utilizados neste estudo estão na

Tabela S1.

2.4 - Ensaio de complementação gênica de PbsrbA em células de A.

fumigatus: linhagens, processo de transformação e ensaios confirmatórios

A sequência de nucleotídeos do gene homólogo srbA de A. fumigatus em

Paracoccidioides, Pb01, foi obtida por análise de homologia no banco de dados do

NCBI – GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) e posterior busca da sequência no

banco de dados genômico de Paracoccidioides

(http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/paracoccidioides_brasiliensis/MultiH

ome.html). Oligonucleotídeos foram construídos para amplificação da sequência

codificante do gene srbA do Pb01, com sua região terminadora, e para a região

promotora do gene que codifica para gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase de

Aspergillus nidulans (AngpdA). Os fragmentos foram ligados um ao outro por PCR de

fusão (YU et al, 2004). Subsequentes passos de purificação e concentração deste

produto, utilizando kits de purificação de DNA (Qiagen), resultaram em quantidade

suficiente de material para transformação de A. fumigatus Além disso,

oligonucleotídeos específicos para o gene que codifica para oritidina-5-fosfato

descarboxilase de A. parasiticus (pyrG) foram utilizados para amplificação da sequência

gênica que, após purificação, foram utilizadas nos procedimentos de co-transformação

de A. fumigatus e posterior seleção dos clones transformados com AngpdA+PbsrbA.






124

A geração de protoplastos e transformação da linhagem mutante nula para srbA

de A. fumigatus com AngpdA+PbsrbA, foi mediada por polietilenoglicol (PEG) e

realizada conforme descrito anteriormente em Willger et al. (2012). Esporos do fungo

foram germinados por 10 h à 23oC. Após digestão enzimática com a enzima liticase por

6 h, os protoplastos foram obtidos. Um total de 10 µg de cada produto de PCR

purificada, AngpdA+PbsrbA e pyrG, foram co-transformados em 1 x 107 protoplastos

de A. fumigatus em um volume final de 100 µL. Os transformantes foram plaqueados

em meio seletivo onde somente as células transformadas com pyrG cresceram (seleção

auxotrófica para uridina). Posteriormente, várias colônias foram rastreadas por PCR

convencional para identificação de potenciais transformantes positivos para

AngpdA+PbsrbA, utilizando oligonucleotídeos que amplificam a região promotora de

AngpdA. Além disso, o número de inserções de PbsrbA e do gene pyrG foi confirmada

pela técnica de southern blot com sistema de marcação por digoxigenina (Roche

Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany) como previamente descrito (CRAMER

& LAWRENCE, 2003). A fim de eliminação de heterocárions, cada transformante foi

coletado e um único esporo isolado no mínimo duas vezes (técnica de single spore). Os

oligonucleotídeos utilizados neste estudo estão na Tabela S1.

2.5 - Condições de crescimento de linhagens de A. fumigatus em normóxia e

hipóxia

Colônias positivas foram submetidas à condição de normóxia e hipóxia.

Condições de normóxia foram consideradas níveis atmosféricos de oxigênio (~21% O2).

Condições de hipóxia foram adquiridas em câmara de oxigênio (Invivo2 400, Ruskinn).

A câmara foi mantida à 37oC e à 1% do nível de O2 utilizando uma mistura de gás

contendo 1% O2, 5% CO2 e 94% N2.

O crescimento das colônias foi quantificado como previamente descrito

(WILLGER et al, 2008). Brevemente, alíquotas de 5 µL contendo 106

conídeos de A.

fumigatus, de cada linhagem estudada, foram colhidas de placas GMM (meio mínimo

com glicose) e pingadas no centro de placas com meio mínimo com glicose sólido

(GMM sólido). Os conídios foram coletados com 20 mL de uma solução de 0,01%

Tween 80 estéril e filtrados com, também estéreis, filtros de duas camadas do tipo

miracloth (EMD Biosciences, La Jolla, CA). Depois, os esporos foram quantificados.

As placas foram cultivadas sob condições de normóxia e hipóxia à 37 oC. O diâmetro



125

das linhagens selvagem (CEA10), mutante nulo para srbA (∆srbA) e linhagens

transformadas com PbsrbA [5 (1.2) e 7 (1.1)] foram medidos a cada 24 h por até 96 h (4

dias). A média do diâmetro a cada 24 h foi calculado por 3 culturas independentes. Os

resultados foram validados pelo teste t-Student’s, sendo consideradas diferenças

significativas as amostras que apresentaram P < 0,05 (*).

2.6 - Análise por western blot em Paracoccidioides (Pb01) e A. fumigatus

Um total de 30 μg de proteínas totais da fase leveduriforme de Paracoccidioides

(Pb01) foram utilizadas nas análises por western blot. Células com 2, 6, 12 e 24h sob

tratamento em hipóxia com o agente químico CoCl2 foram colhidas e as proteínas

extraídas em uma solução contendo 20 mM de Tris-HCl, pH 8.8, 2 mM CaCl2

(FONSECA et al, 2001) suplementado com inibidores de proteases (Protease Inhibitor,

GE Healthcare, Uppsala, Sweden). As concentrações protéicas foram determinadas

usando o reagente Bradford (Sigma-Aldrich) e albumina de soro bovina foi utilizada

como padrão (BRADFORD, 1976). Depois de separadas por SDS-PAGE (12%) e

transferidas para membrana de nitrocelulose, as proteínas foram coradas com vermelho

de Ponceau. As membranas foram bloqueadas em tampão de bloqueio (PBS1X –

tampão fosfato-salino, 5% (p/v) de leite desnatado e 0,1% (v/v) de Tween 20) e

incubadas com o anticorpo primário por 2h. O anticorpo contra a proteína Erg6 (esterol

C-24 metiltransferase) (PEREIRA et al, 2010)., 2010) foi reagido com anticorpo

secundário anti-coelho acoplado à fosfatase alcalina (Sigma-Aldrich) e revelados com

5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate/nitrobluetetrazolium (BCIP/NBT). Após análises

de densitometria das bandas, utilizando o software AphaEaseFC (Alpha Innotech

Corporation), a intensidade de pixels (%) de cada banda foi detectada e um gráfico foi

gerado. O tempo de 12 h foi o único no qual houve diferença de expressão da proteína

Erg6 em condição de hipóxia (CoCl2) comparada à condição controle e, então, foi

escolhido para a análises proteômica em gel bi-dimensional.

Em A. fumigatus, conídios de cada linhagem foram cultivados sob condições de

normóxia em meio mínimo com glicose líquido (GMM líquido) por 18 h. A partir deste

ponto, as culturas foram cultivadas em normóxia e hipóxia por mais 1 h. Após filtração

das células usando papel de filtro Whatman número 54 em funis com sucção leve, a

massa fúngica foi lavada com solução salina 0,96% contendo PMSF

(phenylmethylsulfonylfluoride) (MP Biomedicals) à 1%. A massa celular foi congelada



126

e liofilizada por 8 h. Após maceração em nitrogênio líquido, em torno de 60 à 80 mg de

massa fúngica foi ressuspendido em um tampão contendo uréia e detergente

(OSHEROV & MAY, 1998) com adicional 100 mM de PMSF, 10 µL/ mL de inibidor

de protease HALT (Thermo Scientific) e outro detergente na concentração final de

0,1%, o Igepal. A amostra foi centrifugada por 5 min à 16000 x g e o sobrenadante

quantificado utilizando o ensaio protéico Pierce (660 nm), com albumina de soro bovina

(BSA) como padrão. Após separação de 40 µg de proteínas por SDS-PAGE (10%)

(Bio-Rad), as proteínas foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose

(Hybond-C Extra; Amersham Biosciences). O anticorpo anti-SrbA, que reconhece a

porção N-terminal da proteína SrbA de A. fumigatus (dos aminoácidos 1 à 275), foi

utilizado na titulação de 1: 27000 como anticorpo primário e o anticorpo secundário

anti-coelho acoplado à fosfatase alcalina (Abcam), à uma diluição de 1: 5000. A

quimioluminescência foi medida seguindo incubação da membrana com substrato

Tropix CPD Star (Applied Biosystems) com Immun-star enhancer (Bio-Rad) e a

imagem captada com sistema de fotocumentação FluorChem FC2 (Alpha Innotech).

2.7 - Susceptibilidade de A. fumigatus à antifúngicos

A susceptibilidade das linhagens selvagem (CEA10), mutante nulo para srbA e

transformadas com PbsrbA de A. fumigatus foram submetidas a um teste de

sensibilidade às drogas antifúngicas fluconazol e voriconazol. A estratégia utilizada foi

plaquear um total de 105 conídios em 20 mL de meio de cultura sólido RPMI-1640

(Sigma-Aldrich) e fazer um orifício no centro das placas com a parte oposta de

ponteiras estéreis onde foi possível pipetar, até o volume de 20 µL, diferentes

concentrações das duas drogas, fluconazol e voriconazol. As placas foram incubadas à

37oC e o crescimento foi monitorado por 24 e 48 h por observação direta do halo em

volta do local onde as drogas foram depositadas. Nenhuma diferença nos resultados foi

observada entre 24 e 48 h. O experimento foi realizado em triplicata para cada condição.

2.8 – Produção de biomassa por linhagens de A. fumigatus em condições de

privação do metal ferro

A produção de biomassa (peso celular seco) das linhagens selvagem (CEA10),

mutante nulo para o gene srbA e transformada com PbsrbA de A. fumigatus foi



127

analisada conforme descrito previamente (BLATZER et al, 2011). Um total de 108

esporos de cada linhagem foi inoculada em 200 mL de meio mínimo líquido com

glicose (GMM líquido) em condições de privação (- Fe) ou não (+Fe, 30 µM) do metal

ferro. Após 24 h de incubação à 37oC e agitação de 200 rpm, as células foram coletadas

por filtração usando papel de filtro Whatman número 54 em funis com sucção leve. A

massa fúngica de cada linhagem foi congelada e liofilizada por 24 h. O peso seco foi

determinado. Os valores são a média de 3 experimentos independentes. A condição de

privação de ferro foi obtida por privar esse metal do meio de cultura além de tratar todas

as vidrarias e materiais utilizados com HCl 2N para remoção de traços do metal

(GAUTHIER et al, 2010). Depois de quarenta minutos em contato com o ácido, as

vidrarias foram lavadas exaustivamente até o pH retornar à neutralidade.

2.9 - Análises do crescimento, viabilidade e dosagem de glicose em

Paracoccidioides (Pb01) sob condições de hipóxia (CoCl2)

A viabilidade e crescimento das células leveduriformes de Paracoccidioides

(Pb01) foram determinados usando azul de Tripan em triplicata biológica. As células

foram incubadas em meio mínimo MMcM à 36 oC acrescentado ou não com o reagente

cloreto de cobalto (300 µM) por 72 h. A viabilidade e o crescimento foram

determinados nos pontos 0, 6, 12, 24, 36, 48 e 72 h. As barras de erro representam os

desvios padrões das réplicas biológicas. Para análise estatística, o teste t de Student foi

realizado e o valor de p<0.05 foi considerado como a probabilidade do resultado ser

estatisticamente significativo indicado pelo asterisco (*). Além disso, a concentração de

glicose no sobrenadante de cultura em hipóxia foi determinada por atividade enzimática

(Doles – produtos laboratoriais, Goiânia-GO-Brasil).

2.10 -Análise proteômica em gel bi-dimensional de Paracoccidioides (Pb01)

sob condição de hipóxia (CoCl2)

Seguindo as condições de crescimento das células de Pb01 em hipóxia usando o

CoCl2 (300 μM), as células foram colhidas nos pontos de 12 h e as proteínas extraídas

conforme metodologia descrita anteriormente. Para cada amostra, 350 μg de proteínas,

foram submetidas à corrida eletroforética. Para remoção de contaminantes não protéicos

como detergentes, sais, lipídios e ácidos nucléicos foi utilizado o sistema comercial 2-D



128

Clean-Up kit (GE Healhtcare, Uppsala, Sweeden) de acordo com o fabricante. As

amostras protéicas foram tratadas com 250 μL de tampão contendo 7 M de uréia, 2M de

tiouréia, CHAPS 2%, 65 mM DTT, anfólitos pH 3-11 e azul de bromofenol.

Os géis bidimensionais (2D) foram realizados de acordo com o método de

Rabilloud (1988) com pequenas modificações. Amostras contendo as diferentes frações

protéicas foram solubilizadas em tampão de lise contendo uréia 7 M, tiouréia 2 M,

CHAPS 2%, 65 mM DTT, anfólitos pH 3-11 e azul de bromofenol. As amostras foram

aplicadas em fitas immobiline (13 cm de comprimento, GE Healthcare Biosciences),

pH 3-11. A focalização isoelétrica foi realizada em sistema de eletroforese Multiphor-II

(GE Healthcare). Seguindo a focalização isoelétrica, as fitas foram reduzidas com 1%

de DTT e alquiladas em 2,5 % de iodoacetamina em tampão de equilíbrio (uréia 6 M,

pH 6.8; 30 % de glicerol e 2 % de SDS) (HERBERT et al, 2001). A segunda dimensão

foi realizada em gel de poliacrilamida segundo Laemmli (1970) Os géis de

poliacrilamida foram corados por azul de Coomassie (PlusOne Comassie Tablets

PhastGel Blue R-350, GE Healthcare), segundo metodologia padrão. As imagens dos

géis 2D, em triplicata, foram obtidas e processadas em sistema de fotodocumentação

Image Scanner III (GE Healthcare). A detecção, quantificação volumétrica, edição de

massas moleculares e pontos isoelétricos das proteínas identificadas nos géis foram

obtidos utilizando o Image Master Platinum (GE Healthcare).

O teste ANOVA foi aplicado para comparar as diferenças entre as condições

testadas. Comparações com um valor de p<0.05 foram consideradas significantes. As

proteínas selecionadas foram removidas dos géis para digestão peptídica.

Primeiramente, as proteínas foram tratadas com acetonitrila 100% e posteriormente

lavadas duas vezes com acetonitrila 50 % e 25 mM de NH4HCO3 (tampão bicarbonato

de amônio). O processo de redução das amostras foi realizado pelo uso de DTT (10

mM) em NH4HCO3 (25 mM) por 30 min e alquilação com iodoacetaminada (55 mM)

em NH4HCO3 (25 mM). A digestão enzimática foi realizada utilizando 25 mM de

NH4HCO3 contendo tripsina (12.5 ng/μL) (Roche, Molecular Biochemicals). Os

peptídeos digeridos foram extraídos dos géis em 50% de acetonitrila, 1% de ácido

trifluoracético e posteriormente em acetonitrila 100%. Os peptídeos trípticos foram

purificados por cromatografia de fase reversa (ZipTips® C18 PipetteTips, Milipore,

Bedford, MA, USA) e submetidos à análise em espectrômetro de massas, MALDI-Q-

TOF MS (Synapt, Waters, Manchester, UK) que geraram espectros para análise por MS

e MS/MS. Todos os espectros foram processados usando NE ProteinLynx Global



129

Server software (Waters-Micromass, Manchester, UK). A busca no banco de dados para

identificação de cada proteína foi realizada submetendo-se a massa monoisotópica dos

peptídeos ao programa MASCOT (MASCOT 2.1.03, Matrix Science, UK)

(http://www.matrixscience.com), usando o banco de dados não redundante do National

Center for Biotechnology Information, NCBI. As proteínas identificadas foram

agrupadas em categorias funcionais e são mostradas nas Tabelas 1 e 2.

3) Resultados

3.1 – Paracoccidioides possui homólogo da proteína SREBP

O sensoriamento de oxigênio nos fungos foi primeiramente caracterizado na

levedura de fissão S. pombe sendo recentemente caracterizada em outros fungos. As

proteínas da família SREBP são as principais reguladoras deste estresse reguladas pelos

níveis de oxigênio e esteróis nas células fúngicas. Nossos resultados demonstram que

Paracoccidioides contém homólogos da proteína SREBP apresentando domínios

característicos das mesmas (Figura 1). A análise in silico revelou que a proteína SREBP

de Paracoccidioides, denominada SrbA, contém um domínio de ligação ao DNA

altamente conservado em dupla hélice formando um “loop” em sua porção N-terminal,

com o resíduo único de tirosina, presente no domínio de ligação ao DNA característico

destas proteínas, também conservado. Além disso, PbSrbA contém um domínio

transmembrana ao longo da cadeia peptídica que, provavelmente, está envolvido na

manutenção da proteína no retículo endoplasmático.

Com intuito de entender melhor como Paracoccidioides responde à hipóxia e se

o mecanismo é similar às respostas de outros fungos, a análise da expressão relativa do

gene srbA de Paracoccidioides, Pb01, foi realizada por PCR em tempo real. Vários

tempos de incubação do fungo em condições controle e utilizando o agente químico que

mimetiza hipóxia, o CoCl2, foram analisados (Figura 2) . Os resultados demonstram

que a expressão gênica de PbsrbA é aumentada em condições de hipóxia em relação ao

controle, em torno de 1h / 1 h 30 min indicando que em Paracoccidioides, esta proteína

pode estar envolvida nas respostas do fungo à condição de estresse hipóxico.



130

Figura 1. Domínios protéicos preditos da SREBP em Paracoccidioides (proteína SrbA) e em outros

organismos. Os dados das proteínas da família SREBP foram obtidos com as sequências do banco de

dados do NCBI – Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) para Paracoccidioides Pb01

(XP_002794199), Pb18 (EEH47197) e Pb03 (EEH18275), assim como para outros eucariotos como

Aspergillus fumigatus (EDP53790), Arthroderma otae (XP_002850076), Aspergillus dermatitides

(XP_002629502), Schizosaccharomyces pombe (NP_595694), Homo sapiens (NP_004590) e

Cryptococcus neoformans (XP_567526). O domínio de ligação ao DNA, bHLH (basic helix-loop- helix

leucine zipper DNA-binding domain) foi obtido pelo banco de dados PFAM (http://pfam.sanger.ac.uk/) e

os segmentos transmembrana (barra azul), usando o software Phobius (http://phobius.sbc.su.se/). O

comprimento de cada proteína, em aminoácidos, é mostrado à direita. *, resíduo único de tirosina presente

no domínio bHLH.


http://pfam.sanger.ac.uk/

http://phobius.sbc.su.se/



131

Figura 2. Cinética de expressão de srbA em células leveduriformes do Pb01 em hipóxia (CoCl2). As

células leveduriformes de Pb01foram incubadas de 5 min à 24 h em meio mínimo sem (controle) e com

300 µM de CoCl2 (hipóxia) e a expressão relativa do gene srbA foi analisada por qRT-PCR. Os dados

foram normalizados usando o gene constitutivo que codifica para alfa tubulina como controle endógeno e

são apresentados comparando-se com cada controle experimental fixado no valor 1. Teste t Student foi

usado para análise estatística e as barras de erro representam o desvio padrão das três réplicas biológicas.

* representa p<0.05. PbsrbA, gene homólogo da SREBP de S. pombe e A. fumigatus, sre1 e srbA,

respectivamente.



132

3.2 – PbsrbA é funcional na linhagem mutante nulo para srbA (∆srbA) de A.

fumigatus

A fim de avaliarmos a funcionalidade da proteína PbSrbA, um ensaio de

complementação gênica na linhagem ∆srbA de A. fumigatus, importante fungo

oportunista causador da aspergilose em imunocomprometidos, foi realizada. As colônias

de A. fumigatus transformadas com PbsrbA e a estratégia utilizada para transformação e

rastreamento das colônias são mostrados na Figura 3. O primeiro rastreamento foi

realizado a partir da técnica de PCR convencional e os resultados mostram que algumas

colônias possuíam a sequência de PbsrbA. O uso de oligonucleotídeos específicos para

sequência promotora da gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (AngpdA) e para a

sequência relativa à AngpdA+PbsrbA, confirmam que o produto fusionado foi

transformado com sucesso (Figura 3B). Um segundo rastreamento foi realizado (Figura

4). Colônias positivas do primeiro rastreamento foram submetidas às condições de

normóxia e hipóxia a fim de selecionarmos possíveis colônias com PbsrbA funcional.

Sabe-se que a linhagem ∆srbA de A. fumigatus não cresce em condições de hipóxia. Os

resultados mostram que diferentes colônias transformadas com PbsrbA restauraram

parcialmente o fenótipo da colônia selvagem indicando participação da PbsrbA nos

mecanismos de restauração do crescimento e viabilidade do fungo A. fumigatus em

condições de hipóxia (Figura 4).



133

A

Figura 3. Transformação da linhagem ∆srbA de A. fumigatus com srbA de Paracoccidioides. (A)

Algumas colônias crescidas em meio mínimo (GMM) após transformação da linhagem ∆srbA de A.

fumigatus com srbA de Paracoccidioides. Estas colônias seguiram para rastreamento utilizando estufa de

oxigênio em condição de hipóxia à 36 oC. (B) Estratégia utilizada para inserir e selecionar a sequência de

PbsrbA. O produto de clonagem foi composto pelas sequências do promotor do gene que codifica para

gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de A. nidulans (AngpdA), da sequência do gene que codifica para a

proteína da família SREBP, srbA, de Paracocdidioides (PbsrbA) e a região terminadora de PbsrbA. A

transformação foi realizada concomitantemente com o gene de seleção pyrG (oritidina-5’-fosfato

descarboxilase) de A. parasiticus, utilizado para rastrear as colônias transformadas em meio de cultura

específico (colônias auxotróficas para uridina). Mais abaixo, a figura mostra o gel das PCRs das colônias

rastreadas em estufa de oxigênio (hipóxia) com colônias positivas para a sequência promotora AngpdA

(1.5 kb) e para AngpdA+PbsrbA (4.8 Kb). Os oligonucleotídeos utilizados para a PCR são mostrados

acima de cada gel e na Tabela S1.



134

Figura 4. Rastreamento das colônias transformadas em condições de normóxia e hipóxia. Após

transformação das colônias ∆srbA de A. fumigatus com srbA de Paracoccidioides e confirmação da

inserção da sequência utilizando PCR convencional (Figura 3), um total de 12 colônias foram submetidas

a mais um rastreamento em condições de normóxia e hipóxia. O mesmo número de esporos (106) foi

inoculado em meio mínimo sem uridina (GMM) por 48 h à 37 oC. wt: tipo selvagem; ∆srbA: mutante nulo

para o gene srbA de A. fumigatus; números: diversas colônias ∆srbA de A. fumigatus transformadas com

srbA de Paracoccidioides. Cada número representa uma colônia diferente pré-selecionada por PCR

convencional e, entre parênteses, são as indicações dos isolamentos de um único esporo das respectivas

colônias (single spore). O mutante nulo para o gene srbA de A. fumigatus é incapaz de crescer em

condições de hipóxia e as colônias geneticamente complementadas com PbsrbA mostraram restauração

parcial do defeito no crescimento do mutante nulo para srbA de A. fumigatus em condições de hipóxia.



135

3.3 – Inserções de PbsrbA e pyrG no genoma de A. fumigatus e restauração

do crescimento radial da linhagem ∆srbA por PbsrbA

O número de cópias inseridas no genoma de A. fumigatus das linhagens

transformadas com PbsrbA foi analisado nas colônias positivas do segundo

rastreamento (Figura 5). Os resultados mostram que melhores resultados foram obtidos

para duas colônias, denominadas 5 (1.2) e 7 (1.1), nas quais apenas duas cópias da

inserção PbsrbA foram detectadas no genoma da linhagem 5 (1.2) e, três cópias de

pyrG, no genoma da linhagem 7 (1.1) (Figura 5). Desse modo, tais colônias foram

submetidas às condições de normóxia e hipóxia, à 37 oC, para que a taxa de crescimento

radial destas colônias, em cada condição, fosse analisada a cada 24 h (Figura 6). Os

resultados mostram que, após 96 h de crescimento, as linhagens 5 (1.2) e 7 (1.1)

restauraram o crescimento da linhagem selvagem e parcialmente o seu fenótipo (Figura

6A). Como esperado, a linhagem ∆srbA de A. fumigatus não cresceu em condições de

hipóxia e a análise do crescimento radial das linhagens selvagem, ∆srbA e

transformadas com PbsrbA de A. fumigatus a cada 24 h, confirmou que a restauração do

crescimento das linhagens transformadas com PbsrbA, em condições de hipóxia, foi

estatisticamente significativa (Figura 6B). Apesar de PbsrbA restaurar completamente o

crescimento do fungo, a coloração das colônias foi parcialmente ou nada restaurada em

condições de hipóxia indicando que a conidiação do fungo foi afetada (Figura 6A).



136

Figura 5. Integração e número de cópias de PbsrbA e do gene de seleção pyrG nas linhagens ∆srbA

de A. fumigatus co-transformadas com PbsrbA e pyrG. (A) Confirmação pela técnica de southern blot

de apenas duas inserções de PbsrbA no genoma de A. fumigatus para a colônia 5. Uma sonda que

reconhece o promotor fusionado à PbsrbA foi utilizada. (B) Confirmação pela técnica de southern blot de

apenas três inserções do gene de seleção pyrG no genoma de A. fumigatus para a colônia 7. Uma sonda

que reconhece o parte do gene pyrG foi utilizada. MW: marcador de peso molecular; CEA10: linhagem

selvagem; ∆srbA pyrG- : linhagem mutante para o gene srbA de A. fumigatus que tem o gene pyrG com

mutação funcional; 5 (1.2) e 7 (1.1): colônias ∆srbA de A. fumigatus transformadas com PbsrbA.



137

Figura 6. Crescimento radial das colônias selvagem, ∆srbA de A. fumigatus e linhagens

complementadas geneticamente com PbsrbA. (A) Um total de 106 esporos de cada linhagem foi

inoculado em placas com meio GMM sem uridina, por 96 h à 37 oC, em condições de normóxia e de

hipóxia, e o crescimento monitorado pelo diâmetro de cada colônia, a cada 24 h (B). Teste t Student foi

usado para análise estatística e as barras de erro representam o desvio padrão das três réplicas biológicas.

* representa p<0.05. CEA10: tipo selvagem de A. fumigatus; ∆srbA: mutante nulo para o gene srbA de A.

fumigatus; 5 (1.2) e 7 (1.1): colônias ∆srbA de A. fumigatus complementadas geneticamente com

PbsrbA. As colônias geneticamente complementadas com PbsrbA mostraram restauração do defeito no

crescimento do mutante nulo para srbA de A. fumigatus em condições de hipóxia.



138

3.4 – Linhagem de A. fumigatus complementada com PbsrbA expressa

transcrito e proteína

A colônia 5 (1.2) foi escolhida para teste de expressão do transcrito e proteína de

PbsrbA. Os resultados mostram que a colônia expressa tanto o transcrito quanto a

proteína de PbsrbA em condição de hipóxia (Figura 7). A análise de expressão do

transcrito, pela técnica de PCR em tempo real, mostra que, conforme esperado, PbsrbA

não foi detectada nas linhagens selvagem e ∆srbA de A. fumigatus. Além disso, a

expressão de PbsrbA aumenta conforme o tempo de exposição do fungo ao estresse

hipóxico (Figura 7A). Em nível protéico, a expressão da proteína PbSrbA também foi

detectada na linhagem 5 (1.2), após 1 h de exposição do fungo na condição de hipóxia

(Figura 7B). O anticorpo policlonal que reconhece a porção N-terminal de AfSrbA foi

utilizado. Os resultados mostram que, assim como na linhagem selvagem de A.

fumigatus, a linhagem 5 (1.2) possui, em condições de hipóxia, maior abundância da

proteína SrbA em sua forma clivada. O tamanho das porções íntegra e clivada foi

comparável às variações existentes entre a proteína predita e nativa da SrbA de A.

fumigatus mostrando que, também para PbSrbA, há uma pequena variação do tamanho

predito com o experimental seguindo as mesmas proporções encontradas para AfSrbA

(WILLGER et al, 2012).



139

horas em hipóxia

Expr e

ssã

o n

orm

aliz

ad

a

A B

CEA10

srbAKO5 (1.2)

Figura 7. Expressão do transcrito e proteína de PbsrbA na linhagem ∆srbA de A. fumigatus

transformada com PbsrbA [colônia 5 (1.2)] em condições de normóxia e hipóxia. (A) Análise da

expressão do transcrito de PbsrbA por PCR quantitativa em tempo real. Após crescimento das linhagens

em normóxia, por 18 h, as colônias foram incubadas por 0, 2 e 4 h em condição de hipóxia à 36 oC. A

análise foi verificada utilizando oligonucleotídeos que amplificam a sequência de PbsrbA. Os dados

foram normalizados usando o gene constitutivo que codifica para actina como controle endógeno e são

apresentados comparando-se com cada controle experimental (em normóxia) fixado no valor 1. Nenhuma

expressão foi obtida nas linhagens selvagem (CEA10) e mutante para srbA de A. fumigatus (srbAKO).

Teste t Student foi usado para análise estatística e as barras de erro representam o desvio padrão das três

réplicas biológicas. * representa p<0.05. (B) Análise da expressão da proteína de PbsrbA pela técnica de

western blot. Após crescimento das linhagens em normóxia, por 18 h, as colônias foram incubadas por 1

h em condições de normóxia e de hipóxia à 36 oC. O anticorpo policlonal que reconhece a porção N-

terminal de AfSrbA foi utilizado. A banda maior que 120 kDa corresponde à proteína de PbsrbA na qual

foi detectada em sua forma íntegra (*) e clivada (#), acima de 60 kDa.



140

3.5 – Linhagem de A. fumigatus complementada com PbsrbA mostra

resistência à drogas antifúngicas

Com base em dados prévios publicados para a proteína SrbA de A. fumigatus

(AfSrbA), a susceptibilidade à drogas antifúngicas das linhagens geneticamente

complementada com PbsrbA, selvagem e ∆srbA de A. fumigatus, foi analisada (Figura

8). AfSrbA medeia a resistência de A. fumigatus à classes de drogas antifúngicas que

têm como alvo o ergosterol da membrana plasmática fúngica. Os resultados

demonstram que, assim como para AfSrbA, PbSrbA está envolvida na resistência do

fungo aos efeitos deletérios das drogas visto que a falha no crescimento dos esporos de

A. fumigatus na presença de concentrações crescentes de voriconazol e fluconazol foram

restauradas na linhagem complementada com PbsrbA (Figura 8).

3.6 – Linhagem de A. fumigatus complementada com PbsrbA mostra

restaurar a produção de biomassa em condição de privação de ferro

Dados prévios indicam que além da proteína AfSrbA participar da regulação da

expressão de genes da via do ergosterol, como as enzimas desta via são também

dependentes do íon ferro, AfSrbA está adicionalmente envolvida na regulação positiva

da aquisição de ferro em A. fumigatus. A partir desta informação, com o objetivo de

testar se a linhagem complementada com PbsrbA também tinha essa função,

experimentos de produção de biomassa das linhagens selvagem, ∆srbA e 5 (1.2) de A.

fumigatus foram conduzidos em condições repletas e depletadas do íon ferro (Figura 9).

Os resultados demonstram que PbsrbA restaura a produção de biomassa da linhagem

mutante para srbA sendo o crescimento comparável ao da linhagem selvagem do fungo

(Figura 9).



141

Figura 8. Sensibilidade das linhagens selvagem, ∆srbA e complementada com PbsrbA [5 (1.2)] aos antifúngicos voriconazol e fluconazol. Três concentrações dos

antifúngicos voriconazol e fluconazol foram utilizadas baseadas em testes previamente publicados para AfsrbA (WILLGER et al., 2008). Um total de 105 esporos de cada

linhagem foi inoculado em meio RPMI/ MOPS em triplicata para cada dosagem e linhagem indicadas. As drogas foram depositadas no centro de cada placa, mantidas à 37 oC

por 24 h quando o crescimento foi monitorado pela formação do halo em volta do local onde as drogas foram depositadas. O experimento foi realizado em triplicata mas

somente uma placa representativa de cada condição é mostrada. A linhagem selvagem assim como a restaurada com PbsrbA mostrou resistência aos antifúngicos enquanto

que a linhagem ∆srbA foi sensível, em ambas as condições.



142

Figura 9. Produção de biomassa pelas linhagens selvagem, ∆srbA e 5 (1.2) de A. fumigatus à

condição de deprivação de ferro. Um total de 108 esporos das linhagens selvagem, ∆srbA e

complementada com PbsrbA [5 (1.2)] foram inoculados em 200 mL de meio mínimo GMM em condições

deprivação de ferro ou não, em triplicata. A verificação do crescimento foi realizada após 48 h de

incubação. As células foram coletadas (filtração à vácuo), liofilizadas por 24 h e a massa anotada. Teste t

Student foi usado para análise estatística e as barras de erro representam o desvio padrão das três réplicas

biológicas. * representa p<0.05.



143

3.7 – Paracoccidioides, Pb01, responde à condição de hipóxia

O fato de que Paracoccidioides possui um homólogo da proteína da família

SREBP e que, em A. fumigatus, esta proteína mostrou ser funcional restaurando o

crescimento, a sensibilidade à drogas antifúngicas e a produção de biomassa em

condições de depleção do íon ferro, as respostas de Paracoccidioides à condição de

hipóxia foram investigadas. Primeiramente, o crescimento e a viabilidade de células

leveduriformes do Pb01 crescidas em meio mínimo com e sem adição do agente

químico que mimetiza hipóxia, o CoCl2, foram determinados usando a coloração por

azul de Tripan (Figura 10). Os resultados demonstram que o crescimento das células foi

mais significativamente diferente a partir de 36 h de tratamento com o agente químico

(Figura 10A). Além disso, os dados não apresentaram diferença significativa na

viabilidade das células que se mantiveram vivas em uma taxa maior que 80% dentro de

72 h analisadas utilizando 300 µM de CoCl2 (Figura 10B).

Com base nestes dados, alguns pontos de incubação das células de

Paracoccidioides em condição de hipóxia foram selecionados para análise da expressão

de transcritos relacionados com vias descritas serem afetadas em condições de hipóxia e

da proteína Erg6, representante da via de biossíntese de ergosterol nos fungos (Figuras

11 e 12). A cinética de expressão relativa de representantes das vias metabólicas da

glicólise, biossíntese de ergosterol e de ácidos graxos, reguladas em outros fungos em

condições de hipóxia, foi realizada em Paracoccidioides, Pb01, pela técnica de PCR em

tempo real. Os resultados mostram que a condição que mimetiza hipóxia regula a

expressão dos genes eno (enolase), erg11 (lanosterol 14-alfa-demetilase), erg3 (C-5

esterol desaturase), erg5 (C-22 esterol desaturase) e acc (acetil-CoA carboxilase)

principalmente nos tempos de 2 e 6 h (Figura 11). Mais ainda, a expressão da proteína

Erg6, envolvida na biossíntese de ergosterol, foi verificada nos extratos de proteínas

totais das células controle e em hipóxia nos tempos de 2, 6, 12 e 24 h. Apenas em 12 h

houve diferença de expressão da proteína, indicada pela análise densitométrica da

intensidade da banda, de 55 kDa, expressa em pixels (Figura 12).



144

Figura 10. Crescimento e viabilidade de células leveduriformes do Pb01 sob condições controle e de

hipóxia. As células foram incubadas pelo tempo de 0 à 72 h em meio mínimo sem (controle) e com 300

µM de CoCl2 (hipóxia) para determinação do crescimento e viabilidade das células. (A) Crescimento

celular. (B) Viabilidade celular. Ambas foram determinadas por azul de Tripan. A barra de erros

representa os desvios padrão da triplicata biológica e a diferença significante (p< 0.05) é representada

pelo asterisco (*).

Figura 11. Cinética de expressão relativa dos genes Pbeno, Pberg11, Pberg3, Pberg5 e Pbacc nas

células leveduriformes de Pb01 em condições de hipóxia (CoCl2). As células leveduriformes foram

incubadas por 2, 6 e 24 h em meio mínimo sem (controle) e com 300 µM de CoCl2 (hipóxia) e a

expressão relativa dos genes eno (enolase), erg11 (lanosterol 14-alfa-demetilase), erg3 (C-5 esterol

desaturase), erg5 (C-22 esterol desaturase) e acc (acetil-CoA carboxilase) foi analisada. Os dados foram

normalizados usando o gene constitutivo que codifica para alfa tubulina como controle endógeno e são

apresentados como expressão relativa comparando com cada controle experimental fixado no valor 1.

Teste t Student foi usado para análise estatística e as barras de erro representam o desvio padrão das três

réplicas biológicas. * representa p<0.05.



145

Figura 12. Ánálise por western blot de PbErg6 sob condição de hipóxia. (A) Proteínas (30µg) de

células leveduriformes de Pb01 incubadas à 36 oC por 12 h sem tratamento (controle-linha 1) ou em

hipóxia (linha 2) foram separadas por eletroforese unidimensional e transferidas para uma membrana de

nitrocelulose. (B) As proteínas foram bloqueadas e a banda de 55 kDa foi detectada usando o anticorpo

anti-PbErg6 (PEREIRA et al, 2010). (C) Análise densitométrica das bandas do imunoblotting após

detecção dos pixels expressos em valor de densidade integrada (IDV - Integrated Density Values) usando

o programa AphaEaseFC.

3.8 – Respostas proteômicas de Paracoccidioides, Pb01, às condições de

hipóxia

Paracoccidioides, Pb01, mostrou regular níveis de transcritos e proteínas em

resposta ao tratamento com CoCl2. Levando em conta o tempo onde houve aumento da

expressão da proteína Erg6 além dos dados das curvas de crescimento e viabilidade, o

tempo de 12 h foi escolhido para a análise proteômica em gel bi-dimensional (Figura

13). Extratos protéicos das células do Pb01 sob condições controle e tratamento com

CoCl2 foram utilizados. A análise de imagem dos géis mostrou que um total de 568

proteínas foram pareadas entre o controle e o tratamento sendo que, após análise

estatística, 94 proteínas foram diferencialmente expressas, 11 proteínas visualizadas

somente na condição controle e 30 proteínas somente nos géis relativos à hipóxia.

Porém, deste total, 70, 7 e 23 proteínas foram identificadas com sucesso entre as

diferencialmente expressas, visualizadas somente na condição controle e somente em

hipóxia, respectivamente, totalizando 100 proteínas identificadas até o momento (Figura



146

13). Destas, um total de 14 foram representadas por mais de uma isoforma (diferentes

massas moleculares e pontos isoelétricos). Tais isoformas geralmente originam-se de

modificações pós-traducionais como fosforilação, glicosilação, acetilação, acilação,

ubiquitinação ou clivagem proteolítica (GORG et al, 2004).

As proteínas identificadas foram agrupadas em classes funcionais como

demonstrado nas Tabelas 1 e 2. O número de proteínas identificadas em cada classe

funcional conforme o nível de expressão detectado (aumentado ou diminuído em

condição de hipóxia) é mostrado na Fig. 14. O fungo Paracoccidioides, Pb01, aumenta

o nível de expressão de proteínas envolvidas com o metabolismo de aminoácidos,

carboidratos, ácidos graxos (biossíntese), etanol (biossíntese) e endereçamento protéico.

Por outro lado, o fungo diminui a expressão de proteínas envolvidas com processos de

obtenção de energia no geral tais como processos oxidativos (de ácidos graxos e etanol),

ciclo do ácido tricarboxílico e transporte de elétrons (Figura 14).



147

Figura 13. Gel representativo das proteínas de Paracoccidioides (Pb01) nas condições controle e hipóxia (CoCl2). As células leveduriformes de Pb01 foram incubadas

com 300 µM CoCl2 (hipóxia) e sem o agente químico (controle experimental), por 12 h em meio mínimo MMcM. (A) Controle experimental e (B) hipóxia, ambos

representantes de triplicatas biológicas. Um total de 300 µg de proteínas de cada condição foram submetidas à eletroforese em gel bidimensional usando fitas com gradientes

de pH imobilizados de pH 3 à pH 11 na primeira dimensão. Na segunda dimensão, géis SDS-PAGE de 12% foram usados e as proteínas foram visualizadas por coloração

com azul de Comassie. As proteínas reguladas diferencialmente foram identificadas pelo MALDI-Q-TOF MS. As proteínas identificadas são numeradas e listadas na Tabela 1

e 2. As numerações em vermelho indicam proteínas com expressão aumentada e as em branco, expressão reduzida durante hipóxia.



148

Figura 14. Frequência de proteínas do Pb01 observadas após hipóxia. As frequências foram

contabilizadas e agrupadas de acordo com a classificação funcional (Tabelas 1 e 2). Barras à esquerda e à

direita representam a freqüência em números de proteínas identificadas em cada classe funcional,

respectivamente, no qual números negativos significam redução no nível de expressão e positivos,

aumento no nível de expressão.

3.9 – Paracoccidioides, Pb01, consome menos glicose em condições de

hipóxia

O consumo de glicose em Paracoccidioides incubado ou não com o CoCl2 foi

determinado durante 72 h de crescimento fúngico (Figura 15). O objetivo desta análise

foi verificar se as respostas de Paracoccidioides eram similares às anteriormente

descritas para o fungo A. fumigatus onde o consumo de glicose foi detectado ser

reduzido em condições de hipóxia e a produção de compostos típicos da fermentação,

como o acetato, lactato e etanol, aumentada (BARKER et al, 2012). Os resultados

mostram que, de fato, o consumo de glicose foi intenso nas duas primeiras horas de

hipóxia e depois foi reduzido (Figura 15) condizente com a possível produção de

compostos da fermentação como o etanol, observada pelo aumento da expressão de

proteínas envolvidas com sua síntese (Tabela 1).



149

Figura 15. Análise do consumo de glicose em células leveduriformes do Pb01. As células foram

incubadas pelo tempo de 0 a 72 h em meio mínimo sem (controle) e com 300 µM de CoCl2 (hipóxia) para

determinação do consumo de glicose (g/L). A barra de erros representa os desvios padrão da triplicata

biológica e a diferença significante (p< 0.05) é representada pelo asterisco (*).

4) Discussão

O entendimento das condições encontradas pelos fungos patogênicos humanos

no microambiente in vivo é uma linha de investigação promissora para futuras

estratégias de combate a estes micro-organismos. A importância da hipóxia neste

contexto tem sido relevante desde que a adaptação a microambientes com baixos níveis

de oxigênio pode ser um atributo de virulência crítico de muitos fungos patógenos

humanos (BUTLER, 2013; CHANG et al, 2007; CHUN et al, 2007; GRAHL &

CRAMER, 2010; WILLGER et al, 2008). Neste estudo, apresentamos a primeira

caracterização das respostas à condição de hipóxia de Paracoccidioides, na linhagem

Pb01. O fungo demonstrou ter um homólogo funcional das SREBPs em A. fumigatus

que, em outros fungos é crucial para biossíntese de esteróis, viabilidade, crescimento e

virulência sob condições de hipóxia (CHANG et al, 2007; WILLGER et al, 2008).

Adicionalmente, Pb01 regulou a expressão de transcritos e proteínas em condições que

mimetizam hipóxia sugerindo que vias metabólicas específicas são alteradas na tentativa

de compensar os efeitos da hipóxia que, em parte, podem ser resultado dos mecanismos

de regulação da proteína SrbA de Paracoccidioides.



150

Análises in silico revelaram que homólogos das SREBPs foram encontrados em

três linhagens de Paracoccidioides, nas quais o banco de dados genômico é disponível

até o momento (Fig. 1). Após análise da expressão diferencial aumentada do transcrito

para PbsrbA em células de Pb01 sob condições de hipóxia (CoCl2) (Fig. 2), testes para

determinação funcional da SrbA, do isolado Pb01, mostraram que a proteína é funcional

em A. fumigatus restaurando o crescimento da linhagem mutante para srbA (Fig. 3, 4, 5,

6 e 7). Estudos em C. neoformans e A. fumigatus mostraram que os mutantes nulos para

SREBP de cada espécie é incapaz de crescer em hipóxia e causar doenças letais em

modelos murinos de infecção fúngica (BIEN et al, 2009; CHANG et al, 2007; CHUN et

al, 2007; WILLGER et al, 2008). Desse modo, a funcionalidade da proteína PbSrbA é

de extrema importância para o estudo da biologia e patogênese de Paracoccidioides, o

que torna nosso estudo mais atrativo.

As SREBPs são fatores de transcrição capazes de regular um número

significante de genes nos fungos. Em A. fumigatus, por exemplo, aproximadamente

12% dos genes são afetados pela atividade de SrbA no qual regula principalmente genes

das vias de biossíntese de ergosterol, aquisição de ferro, glicólise, biogênese ribossomal

e biossíntese de aminoácidos sugerindo ser um regulador transcricional que pode atuar

como positivo ou negativo da transcrição (BLATZER et al, 2011). Nos experimentos de

complementação gênica da linhagem mutante para srbA de A. fumigatus com PbsrbA,

nossos resultados mostram que além de funcional, a PbsrbA foi capaz de proporcionar

resistência do fungo às drogas voriconazol e fluconazol (Fig. 8). Drogas tais como o

voriconazol e fluconazol têm como alvo o ergosterol da membrana plasmática fúngica.

Dado um grande de genes associados com a biossíntese de ergosteróis regulados pela

SrbA de A. fumigatus (WILLGER et al, 2008), sugerimos que, também em

Paracoccidioides, SrbA provavelmente é requerida para a resistência às drogas

regulando a expressão de genes desta via. De fato, genes da via do ergosterol são

regulados em Paracoccidiodies, Pb01, em condições de hipóxia (CoCl2), detectados por

PCR quantitativa (Fig. 11) porém, não podemos afirmar ainda que esta regulação venha

diretamente da atividade da SrbA.

Adicionalmente, a proteína SREBP é a principal reguladora da homeostase de

ferro em A. fumigatus no que diz respeito à aquisição deste metal durante adaptação à

condições de hipóxia e microambientes depletados deste metal (BLATZER et al, 2011).

Também em C. neoformans, experimentos de perfis transcricionais com a linhagem

mutante nulo para SREBP também sugerem que esta proteína está envolvida em



151

processos de aquisição de ferro (CHANG et al, 2007; JUNG & KRONSTAD, 2008).

Aqui, a PbsrbA foi capaz de restaurar a produção de biomassa de A. fumigatus em

condições de depleção de ferro, comparáveis ao tipo selvagem (Fig. 9). Estes resultados

mostram que, muito provavelmente, a SrbA de Paracoccidioides também está

envolvida em processos de homeostase de ferro. Os mecanismos e com quais proteínas

a PbSrbA regula esta homeostase ainda precisam ser investigados.

Com intuito de investigar melhor quais vias metabólicas são afetadas em

Paracoccidioides durante hipóxia, uma análise proteômica em gel bi-dimensional foi

realizada com células leveduriformes do isolado Pb01 submetidas ou não ao tratamento

com CoCl2 (condição de hipóxia). Os resultados mostraram que o fungo regula vias

metabólicas importantes para sua adaptação à condição de estresse de forma semelhante

à previamente descrita para outros fungos. Aqui, Pb01 aumenta principalmente a

expressão de proteínas envolvidas com o metabolismo de aminoácidos, carboidratos,

ácidos graxos, endereçamento de proteínas, glicólise e produção de etanol (fermentação)

e diminui a expressão de proteínas envolvidas com processos de obtenção de energia

tais como oxidação de aminoácidos, ácidos graxos e acetaldeído, via do ciclo

tricarboxílico (TCA), gliconeogênese e transporte de elétrons. Em A. fumigatus, C.

albicans e C. neoformans estudos têm demonstrado que os fungos regulam

positivamente, em hipóxia, genes e proteínas envolvidos com glicólise, biossíntese de

ergosterol e metabolismo de ácidos graxos. Adicionalmente, em A. fumigatus e C.

albicans, a fermentação e o metabolismo de ferro são parte das respostas induzidas

pelos fungos durante condição de hipóxia. Contrariamente, A. fumigatus e C. albicans

reduzem a expressão de genes e proteínas envolvidas com o ciclo do ácido cítrico e

cadeia mitocondrial (síntese de ATP) (ASKEW et al, 2009; BARKER et al, 2012;

CHUN et al, 2007; SETIADI et al, 2006; SYNNOTT et al, 2010; VODISCH et al,

2011). Um detalhe interessante é que em A. fumigatus as respostas tardias à hipóxia em

nível protéico mostram que a respiração oxidativa volta a ser induzida (VODISCH et al,

2011). As respostas do Pb01 se assemelham à destes fungos indicando que o fungo

responde à condição de hipóxia e que esta caracterização pode levar a descoberta dos

mecanismos utilizados pelo fungo durante sua adaptação a tal estresse durante a

patogênese fúngica. As características se assemelham às respostas iniciais à hipóxia em

A. fumigatus, indicando mudanças na rota energética e de produção de compostos tais

como o etanol, a fim de compensar os efeitos dos baixos níveis de oxigênio. O

metabolismo de ácidos graxos está ativado o que pode estar envolvido à uma regulação



152

da biossíntese de ergosterol visto que um aumento na expressão dos transcritos de

representantes da via, tais como erg 3, erg 11 e erg 5 foi detectado em nossos dados por

PCR em tempo real (Fig. 11) além do aumento da expressão da proteína Erg6, também

representante desta via, nos resultados de western blot (Fig. 12).

Em relação ao consumo de glicose, em A. fumigatus este consumo foi detectado

como reduzido em condições de hipóxia e a produção de compostos típicos da

fermentação, como o acetato, lactato e etanol, aumentada (BARKER et al., 2012).

Nossos dados se assemelham a tal condição onde o consumo de glicose parece ser

intenso até certo momento e se mantém praticamente inalterado por um longo tempo

(Fig. 15). A produção de etanol pode ser inferida pelo aumento na expressão de

proteínas específicas desta via como detectado em nossos dados proteômicos (Tabela 1)

representando a produção de compostos da fermentação. Os resultados proteômicos

foram mostrados com 12 h de hipóxia e representam, desse modo, um panorama da

resposta fúngica neste momento. Não podemos afirmar que somente o etanol está sendo

produzido enquanto há uma estabilidade no consumo da glicose durante um período

maior. Outra evidência da falta do consumo direto da glicose a fins de obtenção de

energia pode ser a reflexo no crescimento lento das células do Pb01 em hipóxia quando

comparado às células controle (Fig. 10). Apesar de viáveis, as células estabilizam seu

crescimento refletindo uma condição de mudança metabólica e utilização de fontes de

carbono durante o estresse hipóxico.

5) Conclusões

O estudo das respostas hipóxicas em Paracoccidioides é descrito pela primeira

vez e sugere que neste fungo, assim como em outros fungos patogênicos humanos há

adaptação à esta condição observada pela:

Presença de um regulador principal da resposta à condição de hipóxia, a

proteína SrbA, funcional na linhagem mutante para o gene srbA de A.

fumigatus;

Complementação gênica utilizando a linhagem mutante para o gene

srbA de A. fumigatus;



153

Susceptibilidade à drogas antifúngicas e o crescimento em meio

depletado do íon ferro mostrando que a PbsrbA possivelmente está

envolvida na regulação de genes da via do ergosterol e homeostase de

ferro.

Mudança no metabolismo geral das células detectada por análises

proteômicas em gel bidimensional em condições que simulam hipóxia

confirmando que o fungo realmente responde à esta condição regulando

vias metabólicas importantes no processo de adaptação.

Dada a relevância da paracoccidioidomicose como uma enfermidade de alta

prevalência e morbidade, com grande incidência no Brasil, a caracterização dos efeitos

da hipóxia nas células de Paracoccidioides pode auxiliar nos estudos da patogênese

fúngica sendo um passo inicial na elucidação de potenciais fatores de virulência e

mecanismos de adaptação do fungo nos nichos do hospedeiro, onde possivelmente

enfrenta hipóxia.



154

6) Tabelas

Tabela 1 - Proteínas identificadas em células leveduriformes de Pb01 com expressão aumentada durante estresse hipóxico com CoCl2.

Categoria

funcional a

Proteína Número do

proteínab

Expressão

relativac

MS MS/MS Organismo/ Acesso

ao GenBankf

MM

Exp.g

(Teó.)h

pI

Exp.g

(Teó.)h

Valor de

pi Score

d

Cob. da

seq. (%)e

Score Peptídeos

Metabolismo

Metabolismo de aminoácidos e nitrogênio

Argininosuccinato sintase

1

1.74

99

60

146

6

Pb01/

gi|295660644

46.6

(46.7)

5.21

(5.18)

0,045180

Argininosuccinato sintase

2 1.50 112 47 _ _ Pb01/

gi|295660644

47.3

(46.7)

5.90

(5.18)

0,007298

Aminopeptidase sensível-puromicina 3 _ 106 67 _ _

Pb01/

gi|295657024

79.4

(100.7)

6.67

(5.65) *

Cetol-ácido redutoisomerase

4 4.10 214 54 312 8 Pb03/

gi|225678712

39.1

(44.8)

8.06

(9.12)

0,003010

Hidroxiacilglutationa hidrolase 5 _ 87 69 123 3

Pb01/

gi|295670589

28.5

(28.9)

7.39

(6.11) *

Cianeto hidratase

6 3.08 128 72 135 4 Pb01/

gi|295661763

15.8

(18.0)

5.84

(5.88)

0,012602

Imidazol Glicerol fosfato sintase hisHF

7 1.65 105 67 _ _ Pb01/

gi|295674401

53.5

(60.4)

6.29

(5.71)

0,029072

Gama glutamil-transpeptidase 8 _ 109 54 _ _

Pb01/

gi|295659988

41.1

(57.3)

7.14

(5.37) *

Metabolismo de carboidratos e componentes de carbono

ATP citrato liase

9

2.44

145

44 _ _

Pb01/

gi|295664927

48.3

(52.9)

7.00

(5.99)

0,002422

Hidrolase da superfamília-HAD

10

_

137

56

125

4

Pb01/

gi|295674837

28.3

(27.3)

6.20

(5.67)

*

Fosfomanomutase

11 1.15 183 63 160 5

Pb01/

gi|295672968

28.6

(30.5)

5.77

(5.60)

0,008918



155

Energia

Metabolismo de fosfato

Pirofosfatase inorgânica 12 _ 93 70 _ _

Pb01/

gi|295672504

25.1

(33.5)

5.04

(5.13) *

Metabolismo de ácidos graxos

Esterase D 13 _ 82 40 193 5

Pb01/

gi|295663705

31.8

(31.6)

7.33

(5.98) *

2-metilcitrato sintase 14 2.28 183 64 234 8

Pb01/

gi|295666179

45.5

(51.5)

9.57

(9.02)

0,038151

Acetil-CoA acetiltransferase 15 1.52 84 71 _ _

Pb01/

gi|295668707

39.6

(46.6)

8.28

(8.98)

0,046665

12-Oxofitodienoato redutase 16 _ 230 81 338 7

Pb01/

gi|295669073

42.1

(43.2)

8.27

(8.69) *

Metabolismo de álcool

Piruvato descarboxilase 17 1.89 72 60 248 8

Pb18/

gi|226288913

56.1

(63.8)

7.56

(6.33) 0,022531

Álcool desidrogenase 18 5.65 101 44 211 7

Pb01/

gi|295666161

35.8

(44.8)

8.17

(8.96)

0,000528

Álcool desidrogenase 19 _ 120 42 198 3

Pb01/

gi|295665123

32.8

(54.5)

6.97

(5.87) *

Oxidação de aminoácidos

4-hidroxifenilpiruvato dioxigenase 20 2.30 159 84 _ _

Pb01/

gi|295658704

41.8

(45.6)

6.38

(5.58)

0,000462

Oxidação de acetaldeído

Betaína aldeído desidrogenase

21 2.64 78 66 144 6

Pb01/

gi|295664222

53.0

(51.6)

6.87

(5.98) 0,003373

Aldeído desidrogenase 22 _ 127 51

192

5

Pb01/

gi|295665123

39.0

(54.5)

7.38

(5.87) *

Via do ácido tricarboxílico

Malato desidrogenase 23 3.73 82 59 116 3 Pb01/ 32.1 8.18 0,034201



156

gi|295673937 (36.0) (8.99)

Subunidade - 3-isopropilmalato

desidratase

24 6.39 200 49 149 3 Pb01/

gi|295664721

78.1

(79.1)

8.05

(6.49)

0,005872

Subunidade α - succinil CoA ligase

25 3.52 109 56 153 4

Pb01/

gi|295674665

37.1

(34.9)

8.01

(8.54)

0,003486

Glicólise

Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase

26 2.35 252 79 276 10 Pb01/

gi|295658119

33.6

(36.6)

9.40

(8.26)

0,050325

Frutose-bisfosfato aldolase 27 3.81 194 62 220 5

Pb01/

gi|295671120

36.8

(39.7)

7.39

(6.09) 0,006943

Fosfoglicerato mutase independente -

2,3-bifosfoglicerato

28 3.16 107 59 _ _ Pb01/

gi|295659988

53.5

(57.3)

5.83

(5.37)

0,005436

Fosfoglicerato mutase independente -

2,3-bifosfoglicerato 29 9.44 109 54 _ _

Pb01/

gi|295659988

56.8

(57.3)

5.57

(5.37)

0,000405

Fosfoglicerato quinase 30 2.85 _ _ 114 3

Pb03/

gi|225682817

43.8

(45.1)

7.91

(7.10)

0,000702

Piruvato desidrogenase E1-α 31 _ 86 76 76 3

Pb01/

gi|295658595

42.5

(45.3)

6.98

(8.62) *

Transporte de elétrons e conservação de energia associada à membrana

Subunidade β - ATP sintase 32 2.61 80 67 _ _

Pb01/

gi|295658821

45.8

(55.1)

7.72

(5.28)

0,004484

Síntese Protéica

Fator β-1 de elongação

33 1.45 72 45 47 3 Pb01/

gi|295667868

34.1

(25.9)

4.45

(4.78)

0,038183

Endereçamento de proteínas (enovelamento, modificação e destino)

Disulfeto isomerase Pdi1

34 _ 259 72 167 7

Pb01/

gi|295673162

61.5

(59.3)

4.52

(4.08) *

Componente do proteassoma PRE6 35 _ 83 70 _ _

Pb01/

gi|295659891

26.8

(29.4)

9.41

(8.24) *

Tiosulfato enxofre transferase 36 _ 77 62 _ _

Pb01/

gi|295657885

32.0

(38.5)

6.70

(6.48) *

http://www.matrixscience.com/cgi/protein_view.pl?file=../data/20120315/FtGtmGHSh.dat&hit=gi%7c225682817&db_idx=1&px=1&ave_thresh=45&_ignoreionsscorebelow=0&report=0&_sigthreshold=0.05&_msresflags=1025&_msresflags2=2&percolate=-1&percolate_rt=0



157

Co-chaperona GrpE mitocondrial 37 1.98 _ _ 84 1

Pb01/

gi|295662873

23.8

(28.5)

5.58

(8.89)

0,017698

Componente PUP2 do proteassoma 38 1.87 119 74 _ _

Pb01/

gi|295667089

27.6

(26.8)

4.29

(4.79)

0,022689

Componente PRE5 do proteassoma 39 3.54 111 63 121 4

Pb01/

gi|295668885

30.3

(29.0)

5.51

(5.35)

0,000204

Dipeptidil-peptidase 40 2.88 85 59 _ _

Pb01/

gi|295660102

69.5

(86.5)

7.42

(7.99)

0,017557

Peptidase β de processamento

mitocondrial 41 _ 97 67 46 2

Pb01/

gi|295664272

48.3

(53.0)

5.38

(5.84) *

Defesa e virulência celular

Proteína de choque térmico - Hsp70

42 _ 180 64 _ _ Pb01/

gi|295673716

72.1

(68.8)

3.99

(5.39) *

Proteína Y20 43 5.02 84 63 71 2

Pb/

gi|17980998

21.1

(21.6)

6.68

(6.09)

0,000734

Proteína SSC1- relacionada à Hsp70 44 1.37 183 68 156 3

Pb01/

gi|295671569

66.1

(73.8)

5.47

(5.92)

0,015932

Proteína de estresse DDR48 45 1.81 82 95 _ _

Ajellomyces capsulatus/

gi|240280489

21.5

(33.5)

8.29

(4.83) 0,016548

Biossíntese de vitaminas e co-fatores

Proteína PDX1 de biossíntese de

piridoxina 46 2.09 151 61 _ _

Pb01/

gi|295660455

36.5

(34.4)

6.67

(6.04)

0,048750

Cadeia alfa da riboflavina sintase

47

_

99

53

93

2

Pb01/

gi|295670998

27.8

(26.0)

6.10

(5.55)

*

Transcrição

Proteína de ligação-ácido nucléico

48 _ 91 47 133 3

Pb01/

gi|295665468

26.0

(30.4)

7.17

(9.40) *

Proteínas não-classificadas

Proteína hipotética conservada

49 _ _ _ 107 4 Pb01/

gi|295657565

29.3

(28.7)

7.20

(7.07) *

Proteína hipotética conservada 50 2.37 98 70 _ _

Pb01/

gi|295658821

39.3

(55.1)

7.72

(5.28)

0,004484

Proteína hipotética conservada 51 _ 90 47 _ _

Pb01/

gi|295669766

26.6

(26.1)

6.16

(5.80) *

Proteína hipotética conservada 52 _ 88 52 _ _ Aspergillus terreus/ 41.1 5.18 *

http://www.matrixscience.com/cgi/protein_view.pl?file=../data/20120311/FtGtrnaTE.dat&hit=gi%7c295662873&db_idx=1&px=1&ave_thresh=54&_ignoreionsscorebelow=0&report=0&_sigthreshold=0.05&_msresflags=1025&_msresflags2=2&percolate=-1&percolate_rt=0



158

gi|115397195 (66.5) (6.02)

Proteína hipotética conservada 53 _ 87 68 _ _

Pb01/

gi|295668004

42.0

(41.4)

5.03

(5.20) *

Proteína contendo domínio DUF866 54 _ _ _ 74 3

Pb01/

gi|295667495

21.6

(18.5)

4.53

(4.81) *

Proteína contendo domínio DUF833

55

2.28

135

78 _ _

Pb01/

gi|295662444

37.1

(35.5)

5.91

(5.50)

0,025116

Proteína com domínio VPS9

56 _

74

42 _ _

Aspergillus fumigatus/

gi|71001482

39.8

(80.3)

6.68

(6.29) *

* Proteínas visualizadas somente na condição de hipóxia. a Categoria funcional baseada no banco de dados MIPS (http://www.helmholtz-muenchen.de/en/ibis) e UniProt (http://www.uniprot.org/). b Número da proteína como descrito na Figura 13. c Expressão relativa em relação à condição de hipóxia. d Probabilidade obtida da busca pelo banco de digestão teórica Mascot. e Cobertura da sequência da proteína predita pelo pareamento dos peptídeos no Mascot. f Número de acesso e descrição da proteína identificada no banco de dados do Mascot. g Massas moleculares (kDa) e pontos isoelétricos estimados dos géis 2-DE. h Massas moleculares (kDa) e pontos isoelétricos baseados nas sequências de aminoácidos das proteínas identificadas. iANOVA – teste de significância estatística para comparar as diferenças na expressão das proteínas entre as condições analisadas. Os valores da ANOVA são indicados (p < 0,05).

http://www.helmholtz-muenchen.de/en/ibis




159

Tabela 2 - Proteínas identificadas em células leveduriformes de Pb01 com expressão reduzida durante estresse hipóxico com CoCl2.

Categoria

funcional a

Proteína Número do

proteínab

Expressão

relativac

MS MS/MS Organismo/ Acesso

ao GenBankf

MM

Exp.g

(Teó.)h

pI

Exp.g

(Teó.)h

Valor de

pi Score

d

Cob. da

seq. (%)e

Score Peptídeos

Metabolismo Metabolismo de aminoácidos e nitrogênio

Cetol-ácido redutoisomerase 57 - 2.43 178 80 229 7

Pb03/

gi|225678712

39.1

(44.8)

8.37

(9.12)

0,000314

Adenosilhomocisteinase

58 - 1.93 133 55 309 8 Pb01/

gi|295669670

43.3

(49.0)

6.86

(5.83)

0,047947

Aspartato aminotransferase 59 _ 82 44 134 4

Pb18/

gi|226289987

40.1

(47.2)

9.49

(9.15)

#

Família oxidorredutase 2-nitropropano

dioxigenase 60 - 1.47 86 63 _ _

Pb18/

gi|226288645

37.3

(37.8)

6.93

(6.01)

0,047825

Aminopeptidase sensível-puromicina

61 _

199

51

73

5

Pb18/

gi|226295047

93.8

(102.6)

5.96

(6.77)

#

Metabolismo de carboidratos e componentes de carbono

Manitol-1-fosfato 5-desidrogenase

62

- 2.27 111 57 _ _

Pb01/

gi|295662360

40.6

(43.1)

6.83

(5.66)

0,005309

Proteína SOU2 de utilização de Sorbitol 63 - 8.55 _ _ 82 3

Pb01/

gi|295666718

30.8

(31.4)

4.43

(7.05)

0,000070

Metabolismo de fosfato

Pirofosfatase inorgânica 64 - 1.50 92 50 149 6

Pb01/

gi|295672504

35.3

(33.5)

4.81

(5.13)

0,011490

Energia

Oxidação de ácidos graxos

3-cetoacil-CoA tiolase 65 _ 90 57 228 6

Pb01/

gi|295669280

43.1

(43.8)

9.04

(8.65)

#

Acil-CoA desidrogenase 66 - 2.25 105 55 82 2

Pb01/

gi|295664346

41.6

(47.7)

5.77

(8.19)

0,008951

Oxidação de aminoácidos



160

Aminopeptidase 67 _ 105 31 _ _

Pb18/

gi|226291623

92.1

(108.5)

5.82

(6.51)

#

Isovaleril-CoA desidrogenase 68 _ 114 44 _ _

Pb03/

gi|225683417

42.8

(47.3)

7.23

(8.35)

#

4-hidroxifenilpiruvato dioxigenase 69 -1.52 123 60 _ _

Pb01/

gi|295658704

42.1

(45.6)

6.49

(5.58)

0,005904

Via das pentoses fosfato

Transaldolase 70 -3.04 141 55 93 4

Pb03/

gi|225683456

35.3

(35.8)

6.89

(6.17) 0,008227

Oxidação de acetaldeído

Aldeído desidrogenase 71 - 2.89 101 57 122 3

Pb01/

gi|295665123

49.5

(54.5)

6.48

(5.87)

0,008479

Aldeído desidrogenase 72 - 1.74 106 54

256

9

Pb03/

gi|225680265

48.1

(54.6)

6.74

(5.92)

0,009495

Via do ácido tricarboxílico

Subunidade da flavoproteína succinato

desidrogenase 73 - 5.8 146 70 127 6

Pb18/

gi|226288251

61.0

(71.8)

6.71

(6.40)

0,002979

Malato desidrogenase

74

- 4.02

124

63

93

4

Pb01/

gi|295673937

32.6

(36.0)

5.10

(8.99)

0,001221

Malato desidrogenase

75 - 2.45 194 63 _ _ Pb01/

gi|295658218

32.8

(34.6)

7.93

(6.36)

0,018953

3-isopropilmalato desidrogenase 76 - 3.55 _ _ 61 1

Pb01/

gi|295664094

39.1

(38.5)

5.59

(5.60)

0,009998

Grande subunidade - 3-isopropilmalato

desidrogenase 77 _ 90 44 _ _

Pb01/

gi|295664721

78.8

(79.1)

8.34

(6.49)

#

Subunidade - flavoproteína succinato

desidrogenase

78

- 7.53

170

58

200

5

Pb01/

gi|295672341

24.1

(66.2)

6.50

(5.95)

0,007459

Glicólise e gliconeogênese

Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase 79 - 13.68 183 66 120 4

Pb01/

gi|295658119

34.6

(36.6)

8.62

(8.26) 0,000812

Enolase 80 - 2.26 95 64 363 6 Pb01/ 46.8 5.75 0,003727



161

gi|295672732 (43.8) (8.93)

Frutose-bisfosfato aldolase 81 - 2.15 112 54 189 5

Pb01/

gi|295671120

37.1

(39.7)

7.65

(6.09)

0,010360

Fosfoglicerato quinase 82 _ 127 55 261 11

Pb01/

gi|295669690

42.3

(45.3)

8.28

(6.48)

#

Glicoquinase 83 - 1.56 104 54 91 2

Pb18/

gi|226287617

50.5

(55.1)

5.03

(5.14)

0,008270

Frutose-1,6-bisfosfatase 84 - 2.36 125 37 _ _

Pb01/

gi|295669316

39.1

(38.9)

6.26

(5.80)

0,006159

Transporte de elétrons e conservação de energia associada à membrana

Subunidade α - ATPase 85 - 3.30 130 62 160 4

Pb18/

gi|226291035

52.2

(60.4)

5.11

(9.12)

0,007403

12-oxofitodienoato redutase 86 - 3.42 118 61 _ _

Pb03/

gi|225678587

42.1

(43.0)

9.20

(8.52)

0,002470

Síntese Protéica

Proteína ribossomal 40S – S0

87

- 1.79

110

33

77

1

Pb01/

gi|295671352

49.6

(32.0)

4.64

(4.84)

0,005900

Endereçamento de proteínas (enovelamento, modificação e destino)

Disulfeto isomerase Pdi1 88 _ 104 41 362 13

Pb01/

gi|295673162

57.1

(59.3)

4.48

(4.80)

#

Peptidil-prolil cis-trans isomerase D 89 - 1.83 97 51 _ _

Pb01/

gi|295668481

40.8

(41.3)

5.52

(5.36)

0,014547

Enzima conjugadora-ubiquitina 90 - 1.89 114 63 _ _

Pb01/

gi|295665642

31.3

(28.5)

4.70

(4.98)

0,000501

Peptidil-prolil cis-trans isomerase 91 - 3.73 _ _ 52 2

Pb03/

gi|225677985

19.1

(26.4)

6.76

(8.46)

0,012965

Defesa e virulência celular

Proteína de choque térmico - Hsp70 92

- 3.42

294 69 476 12

Pb01/

gi|295659116

68.1

(70.9)

4.47

(5.05) 0,006507

Catalse peroxissomal 93 - 3.29 112 60 91 4

Pb18/

gi|226288523

54.5

(57.6)

7.94

(6.53)

0,000481

Catalse peroxissomal 94 - 3.33 196 58 _ _

Pb18/

gi|226288523

54.3

(57.6)

8.08

(6.53)

0,005985

http://www.matrixscience.com/cgi/protein_view.pl?file=../data/20120315/FtGtmGewT.dat&hit=gi%7c225677985&db_idx=1&px=1&ave_thresh=45&_ignoreionsscorebelow=0&report=0&_sigthreshold=0.05&_msresflags=1025&_msresflags2=2&percolate=-1&percolate_rt=0

http://www.matrixscience.com/cgi/protein_view.pl?file=../data/20101207/FtttCxeOm.dat&hit=3



162

Superóxido dismutase 95 - 2.82 81 55 _ _

Pb03/

gi|225682872

23.5

(23.8)

8.39

(7.07)

0,020914

Proteína da família beta-lactamase 96 - 4.79 101 53 46 2

Pb18/

gi|226292076

41.1

(44.1)

4.69

(5.0)

0,003656

Proteína Y20 97 - 1.92 92 54 _ _

Pb01/

gi|17980998

21.3

(21.6)

7.27

(6.09)

0,007069

Biossíntese de vitaminas e co-fatores

Proteína ativadora de GTPase ran-

específica 98 - 2.21 95 64 _ _

Pb18/

gi|226294116

42.1

(29.3)

3.56

(4.80)

0,009471

Spermidina sintase 99 - 1.38 73 39 91 2

Pb03/

gi|226293104

31.5

(33.6)

5.35

(5.33)

0,003220

Organização celular

Tropomiosina-1

100 - 1.91 93 83 97 3 Pb01/

gi|295657091

19.9

(18.8)

4.63

(4.99)

0,039476

Transcrição

Proteína contendo um domínio de ligação

ao RNA 101 - 8.24 166 52 99 4

Pb18/

gi|226291029

25.3

(30.5)

6.28

(9.20)

0,000051

# Proteínas visualizadas somente na condição controle. a Categoria funcional baseada no banco de dados de categoria functional MIPS (http://mips.helmholtz-muenchen.de/genre/proj/yeast/listSearch.html?order=entry) e UniProt

(http://www.uniprot.org/). b Número do proteína como descrito na Figura 13. c Expressão relativa em relação à condição de hipóxia. d Probabilidade obtida da busca pelo banco de digestão teórica Mascot. e Cobertura da sequência da proteína predita pelo pareamento dos peptídeos no Mascot. f Número de acesso e descrição da proteína identificada no banco de dados do Mascot. g Massas moleculares (kDa) e pontos isoelétricos estimados dos géis 2-DE. h Massas moleculares (kDa) e pontos isoelétricos baseados nas sequências de aminoácidos das proteínas identificadas. iANOVA – teste de significância estatística para comparar as diferenças na expressão das proteínas entre as condições analisadas. Os valores da ANOVA são indicados (p < 0,05).

http://mips.helmholtz-muenchen.de/genre/proj/yeast/listSearch.html?order=entry




163

Tabela S1 – Oligonucleotídeos utilizados neste estudo.

qRT-PCR a

Gene 5’- 3’ (sense) 3’- 5’ (antissense)

PbsrbAb CGATACCGTGCCAATCTTAAC TGAGCTTGTTAGATGATGACAC

Pbeno GATTTGCAGGTTGTCGCCGA TGGCTGCCTGGATGGATTCA

Pberg11 CTGAGCTGTAGGGAAAAGTAC TCCTCAGCGCAAACGTCCTT

Pberg3 GGAGAATATGTATACCAGCCC ATCCAAGTGATGAGATACAGAG

Pberg5 GGTCCCATGTTCAAAATCCCT AAATTTGTGGAAAACCGAGACG

Pbacc CGTGGTGGTTCCTGGGTTG ATTTGTCGTTGAGTGCTTTTCG

PbsrbA c CGATACCGTGCCAATCTTAAC TGAGCTTGTTAGATGATGACAC

Complementação gênicad

AngpdA CCAACAGCTTTCTCAGCCAGGGC TGTGATGTCTGCTCAAGCGGGGT

PbsrbA GCTCCTTATTGAAGTCGGAGGAC CTATCATAGTGGTGTCTGCAGT

pyrG TGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGG CACAGGACGGGTGTGGTCGCCAT

Rastreamento por PCR convencionale

AngpdA+ PbsrbA GCACTATTGATCATCCGATAGC CTATCATAGTGGTGTCTGCAGT

AngpdA CCAACAGCTTTCTCAGCCAGGGC TGTGATGTCTGCTCAAGCGGGGT

Southern blot f

AngpdA GCCAACATGTCTTCCAAGTCGCAA ATGCATCCCATCCCTCTTTCTGGT

pyrG GCCAACATGTCTTCCAAGTCGCAA ATGCATCCCATCCCTCTTTCTGGT

a Oligonucleotídeos utilizados nas análises de expressão gênica por PCR em tempo real.

b Oligonucleotídeos que amplificam a sequência de PbsrbA utilizados para análise da expressão do gene em células

de Pb01 sob condições de hipóxia ou não, utilizando o agente químico CoCl2.

c Oligonucleotídeos que amplificam a sequência de PbsrbA utilizados para análise da expressão do gene em células

de A. fumigatus: tipo selvagem, mutante nulo para srbA e transformante cm PbsrbA, em condições de normóxia

(níveis de oxigênio atmosférico) e hipóxia (1% O2 e 5% CO2).

d Oligonucleotídeos utilizados para amplificar sequências dos genes gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de A.

nidulans (região promotora), PbsrbA e do gene pyrG (oritidina-5’-fosfato descarboxilase) de A. parasiticus.

A ideia foi realizar PCR de fusão para unir a região promotora do gene gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de

A. nidulans com a sequência de PbsrbA. Para o gene pyrG, a co-transformação proporcionou um método de

seleção dos transformantes em meio de cultura sem uridina.

e Oligonucleotídeos utilizados para confirmação do produto transformado tanto por amplificação da sequência

promotora quanto da sequência promotora fusionada à PbsrbA.

f Oligonucleotídeos utilizados na síntese das sondas: gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de A. nidulans: em

torno de 1,7 Kb; pyrG (oritidina-5’-fosfato descarboxilase): em torno de 1,0 Kb.

R E S EA RCH AR T I C L E

Characterization of the Paracoccidioides beta-1,3-glucanosyltransferase family

Patrıcia de Sousa Lima1, Elisa Flavia Luiz Cardoso Bailao1, Mirelle Garcia Silva1, Nadya da SilvaCastro1, Sonia Nair Bao2, Ivan Orlandi3, Marina Vai3 & Celia Maria de Almeida Soares1

1Laboratorio de Biologia Molecular, Instituto de Ciencias Biologicas, Universidade Federal de Goias, Goias, Brazil; 2Laboratorio de Microscopia

Eletronica, Universidade de Brasılia, Brasılia, Brazil; and 3Dipartimento di Biotecnologie e Bioscienze, Universita degli Studi di Milano-Bicocca,

Milan, Italy

Correspondence: Celia Maria de Almeida

Soares, Laboratorio de Biologia Molecular,

Instituto de Ciencias Biologicas II, Campus

Samambaia, Universidade Federal de Goias,

74690-900 Goiania, GO – Brazil. Tel./fax:

+55 62 3521 1110; e-mail:

[email protected]

Received 22 November 2011; revised 29 May

2012; accepted 6 June 2012.

DOI: 10.1111/j.1567-1364.2012.00819.x

Editor: Jose Ruiz-Herrera

Keywords

Paracoccidioides; beta-1,3-

glucanosyltransferases; cell wall integrity;

protein interaction.

Abstract

The cell wall of pathogenic microbes acts as an initial barrier that is in contact

with hostile environments. Several proteins are associated to the cell wall,

including the glucanosyltransferases, which are attached through glycosylphos-

phatidylinositol anchors to the wall. Here, we characterized the Paracoccidioides

beta-1,3-glucanosyltranferase (Gel) family of proteins that showed significant

homology to proteins belonging to the GH72 family. Immunoassays demon-

strated Gel1p associated with the cell wall and with the nucleus. For Gel2p,

immune labeling was associated with the cell wall and cytoplasm. Genetic com-

plementation studies in Saccharomyces cerevisiae demonstrated that Gel2p is

able to participate in the maintenance of fungal cell wall integrity, as it was

able to restore the lack of Gas1p activity in a gas1D mutant; Gel1p was not able

to do the same. On the other hand, Gel1p restores telomeric silencing in a

gas1D mutant, providing strong support that Gel1p can be involved in tran-

scriptional silencing in Paracoccidioides. Use of the in vivo yeast two-hybrid sys-

tem revealed proteins that interact with Paracoccidioides Gel proteins,

supporting new insights into the function of Gel family members and suggest-

ing that they could play other roles than those established at the fungal cell

wall.

Introduction

Paracoccidioides is a thermally dimorphic fungus that

causes paracoccidioidomycosis, which is the most preva-

lent systemic mycosis in Latin America. The Paracoccidio-

ides genus is composed of four distinct phylogenetic

lineages [PS2, PS3, S1 and Pb01-like, the latter recently

proposed as a new species, Paracoccidioides lutzii (Matute

et al., 2006; Carrero et al., 2008; Teixeira et al., 2009)].

Infection is established by inhalation of propagules that

are converted to the parasitic yeast form into the host

(Franco, 1987). Pathogenicity of dimorphic fungi is inti-

mately linked to morphological changes (Maresca &

Kobayashi, 2000), which are strongly associated with the

temperature shift encountered by Paracoccidioides in host

tissues (San-Blas et al., 2002).

In fungi, 80–90% of the cell wall is made of polysac-

charides, while the remainder is mostly proteins (Castillo

et al., 2008). The major structural polysaccharide of the

fungal cell wall is glucan, which represents approximately

50–60% of the cell wall dry weight (Kapteyn et al., 1999).

The glucan component is predominately beta-1,3-glucan,

long-linear chains of beta-1,3-linked glucose (Bowman &

Free, 2006). Beta-1,3-glucans are synthesized by a protein

complex on the plasma membrane. This complex uses

intracellular UDP-glucose as a substrate and extrudes lin-

ear beta-1,3-glucan chains through the membrane into

the cell wall space (Douglas, 2001). However, linear beta-

1,3-glucan chains remain unorganized until they are

branched, elongated, remodeled and cross-linked to other

cell wall components, like chitin and mannoproteins

(Mouyna et al., 2000).

In Paracoccidioides, as in other fungi, the cell wall com-

position comprises the polysaccharides glucan and chitin,

and lipids and proteins, both in the mycelium and in the

yeast cells. Both have similar contents of glucan (36–47%)

FEMS Yeast Res && (2012) 1–18 ª 2012 Federation of European Microbiological SocietiesPublished by Blackwell Publishing Ltd. All rights reserved

YEA

ST R

ESEA

RC

H

and lipids (5–10%). What differ are the types of glucan pre-

dominantly encountered in yeast (alpha-glucan) or in

mycelium (beta-glucan) cells. Chitin represents 37–48% of

the yeast cell wall content and 7–18% of the mycelium

(Kanetsuna et al., 1969).

Beta-1,3-glucan elongase activity was first identified in

a search for periplasmic transglycosidases responsible for

linking glucans to other cell wall molecules in Aspergillus

fumigatus (Hartland et al., 1996). This enzyme was

named glucan-elongating protein 1 (Gel1). Gel1p cata-

lyzes in vitro a two-step beta-1,3-glucanosyltransferase

reaction: First an internal glycosidic linkage of a donor

beta-1,3-glucan chain is cleaved, and then the reducing

portion is transferred to the nonreducing end of another

beta-1,3-glucan molecule. The generation of a new beta-

1,3-linkage between the acceptor, and the donor molecule

results in the elongation of the beta-1,3-glucan side chain

(Hartland et al., 1996). This beta-1,3-glucanosyltransfer-

ase activity was identified later in the homologs proteins

Gas1 of Saccharomyces cerevisiae and Phr1-2 of Candida

albicans (Mouyna et al., 2000).

Other proteins homologs to Gel1p are present in yeast

and fungal species, and all together form the glycoside

hydrolase 72 (GH72) family in the carbohydrate active

enzymes database (CAZy) of glycoside hydrolases (http://

www.cazy.org/GH72.html). Such GH72 enzymes constitute

a redundant family. In S. cerevisiae, five members are pres-

ent. The Gas1–Gas5 protein pair is active during vegetative

growth, whereas Gas2 and Gas4 are essential for spore wall

formation (Ragni et al., 2007a, b). The function of Gas3p

has also been investigated. In contrast to the other gas pro-

teins, Gas3p is dispensable for both vegetative growth and

sporulation of S. cerevisiae and seems to be an inactive pro-

tein (Rolli et al., 2010). All the five gas proteins are modi-

fied by a glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchor.

Candida albicans Gas protein homologs Phr1p and

Phr2p are regulated by extracellular pH (Saporito-Irwin

et al., 1995) and are predicted to be anchored to the

plasma membrane through a GPI anchor (Fonzi, 1999).

Three other Phr homologs are present: Phr3p, Pga4p

(putative GPI-anchored protein) and Pga5p. The genes

that encode the latter proteins appear to function in con-

ditions that differ from those of Phr1p and Phr2p, and

the single deletion of them does not show a relevant

impact on growth, dimorphism or virulence (Eckert

et al., 2007). Phr1p is a fundamental protein in the main-

tenance of morphology of C. albicans, and PHR1 inacti-

vation affects C. albicans potential to adhere and invade

human epithelia (Calderon et al., 2010). In A. fumigatus,

seven genes that encode orthologs of Gas1p (GEL1-GEL7)

are present. Among them, GEL1, GEL2 and GEL4 are

constitutively expressed during mycelium growth of

A. fumigatus (Gastebois et al., 2010).

Cell wall biogenesis and morphogenesis are tightly

linked processes, and the lack of activity of some GH72

proteins in S. cerevisiae and C. albicans affects cell shape,

causing the loss of the ellipsoidal shape, defects in cell

separation, bud maturation and filament elongation

(Popolo et al., 1993; Saporito-Irwin et al., 1995; Kang &

Jiang, 2005). A profound change in the cell wall composi-

tion and architecture occurs, which involves a hyper-

accumulation of chitin and increased cross-linking of

mannoproteins with chitin (Popolo et al., 1997; Ram

et al., 1998). These changes are secondary responses

aimed at counteracting the weakening of the cell wall and

preventing lysis (Popolo et al., 2001). Evidence indicates

that these changes are triggered by the constitutive activa-

tion of signaling pathways, which culminate in the up-

regulation of cell wall-related and stress-responsive genes

(Ram et al., 1998; Lagorce et al., 2003; Garcia et al.,

2004).

Paracoccidioides contains three genes encoding beta-1,3-

glucanosyltranferases, which are predicted GPI-anchored

proteins (Castro et al., 2005; Tomazett et al., 2005). The

Gel sequences were also identified in the genome of Para-

coccidioides (Broad Institute; http://www.broadinstitute.

org/annotation/genome/paracoccidioides_brasiliensis/Mul-

tiHome.html). To better understand the mechanisms

involved in cell wall building and remodeling, our group

has investigated the function of Gel3p. The deduced pro-

tein displays functional similarity to the GH72 family of

proteins (Gas/Phr/Gel). In fact, the protein, which is pre-

dominantly expressed in the mycelia phase, was able to

rescue the phenotype of the gas1D mutant of S. cerevisiae,

correcting morphological defects characteristic of the lack

of Gas1p. This indicates that Gel3p is a functional protein

and probably acts by elongating the chains of b-1,3-glu-can to mediate Paracoccidioides cell wall remodeling

(Castro et al., 2009).

In this study, using members of phylogenetic species of

Paracoccidioides, we characterized Gel1p and Gel2p, the

two other members of the glucanosyltransferase family. In

addition, we continued the study of Gel3p, enabling a

more complete analysis of this family of proteins. Our

results indicate that Gel1p and Gel2p are associated pre-

dominantly with the fungus cellular surface. Interestingly,

Gel1p is also found in the nuclear region of the cell.

Complementation studies in the S. cerevisiae gas1Dmutant demonstrated that Gel2p is able to participate in

the maintenance of fungal cell wall integrity by its ability

to restore Gas1p activity, unlike Gel1p. On the other

hand, Gel1p is able to restore the telomeric silencing in

the gas1D mutant; this was not observed for the other

Gel members. To better understand the biological role of

Paracoccidioides Gel members, we searched for potential

macromolecules that may interact with Gel1p, Gel2p and

ª 2012 Federation of European Microbiological Societies FEMS Yeast Res && (2012) 1–18Published by Blackwell Publishing Ltd. All rights reserved

2 P. de Sousa Lima et al.

Gel3p using the in vivo yeast two-hybrid system assay.

These data provide a new insight into the function of

each member of the Paracoccidioides beta-1,3-glucanosyl-

transferase family.

Material and methods

Fungal strains and growth conditions

We used the following strains of Paracoccidioides: P. lut-

zii, Pb01 (ATCC-MYA-826); and Pb18, phylogenetic spe-

cies 1 (PS1) that were cultivated in Fava Netto’s medium

[1% (w/v) peptone; 0.5% (w/v) yeast extract; 0.3% (w/v)

proteose peptone; 0.5% (w/v) beef extract; 0.5% (w/v)

NaCl; 4% (w/v) glucose; 1% (w/v) agar, pH 7.2]. They

were grown as mycelium or yeast at 22 and 36 °C,respectively.

The S. cerevisiae null mutant WB2d (gas1D:: LEU2), aderivative of W303-1B (MATa ade2-1 his3-11,15 leu2-

3,112 trp1-1 ura3-1 can1-100), was constructed in a previ-

ous study (Vai et al., 1996) and was the host strain for

complementation experiments. The sir2D (sir2D::URA3)strain has been described previously (Calzari et al., 2006).

Yeast cells were grown in batches at 30 °C in Difco yeast

nitrogen base medium without amino acids (YNB-aa,

6.7 g L�1) containing glucose or galactose at 2% (w/v)

and the required supplements. Buffered media were pre-

pared by adding 2-(N-morpholine)ethansulphonic acid

(MES, 10 g L�1) to YNB medium, followed by pH

adjustment to 6.5. During growth, the pH was monitored

and never varied by more than 0.1. Cell number was

determined on mildly sonicated and diluted samples

using a colter-counter particle count and size analyzer,

model Z2, as described previously (Vanoni et al., 1983).

Specific growth rates and duplication times (Td) were

obtained by fitting the cell number against time.

Sequence analysis of Paracoccidioides Gel

proteins and phylogenetic tree of the GH72

family

The amino acid sequences of Paracoccidioides Gel family

members were obtained at the Dimorphic Fungal Data-

base of the Broad Institute site at (http://www.broadinsti-

tute.org/annotation/genome/dimorph_collab//MultiHome.

html). These for Gel1, Gel2 and Gel3 sequences, respec-

tively, have been submitted to GenBank with the acces-

sion numbers XP_002794189, XP_002793109 and

XP_002792932 for Pb01 and EEH47188, EEH48997 and

EEH48839 for Pb18. InterProScan (http://www.ebi.ac.uk/

Tools/InterProScan/), SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/

services/SignalP/) and big-PI Fungal Predictor (http://

mendel.imp.ac.at/gpi/fungi_server.html) were used to

search for conserved domains, signal peptides and GPI

modification sites, respectively, in Paracoccidioides Gel

sequences. The amino acid sequences of beta-1,3-glucano-

syltransferase orthologs from A. fumigatus, C. albicans,

Candida maltosa, S. cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe,

Coccidioides posadasii, Neurospora crassa and Paracoccidio-

ides were aligned using CLUSTALX2 (Larkin et al., 2007).

TREEVIEW v.1.6.6 program (Page, 1996) was used for phy-

logenetic analysis, applying the neighbor-joining method,

and the tree architecture was inferred from 1000 boot-

straps. The Gas2p sequence of S. cerevisiae was used as an

outgroup.

Heterologous protein expression and

generation of polyclonal antibodies

The total cDNA encoding Gel1p from Pb01, and a partial

cDNA (amino acids 170–390 in the deduced protein;

GenBank accession number XP_002793109) coding for

Gel2p from Pb01, were obtained from a cDNA library

(https://www.biomol.unb.br/Pb), and both were subcl-

oned into the pGEX-4T-3 (GE Healthcare). Primer

sequences are available upon request. The obtained plas-

mids were used to transform Escherichia coli DH5a as

described in standard procedures (Sambrook & Russell,

1989). To express the Gel1p (rPbGel1p) and Gel2p

(rPbGel2p), the E. coli cells were induced with 1.0 or

0.4 mM IPTG, respectively. Polyacrylamide gels contain-

ing each rPbGelp were injected into rabbits to generate

specific rabbit polyclonal serum. Both rabbit preimmune

and immune serum were sampled and stored at �20 °C.

Protein extracts preparation and Western blot

analysis

A total cell homogenate of yeast of Paracoccidioides was

obtained as described by Fonseca et al. (2001) by the dis-

ruption of frozen cells using a pestle and mortar in the

presence of N a-p-tosyl-L-lysine chloromethyl ketone

(TLCK) (50 lg mL�1), 4-chloromercuribenzoic acid

(1 mM), leupeptin (20 mM), phenylmethylsulfonyl fluo-

ride (20 mM) and iodoacetamine (5 mM) in homogeni-

zation buffer (2 mM CaCl2, 20 mM Tris–HCl, pH 8.8).

The mixture was centrifuged at 12 000 g at 4 °C for

10 min, and the supernatant was stored at �80 °C.Paracoccidioides protein extract of yeast was probed

using Gel1p and Gel2p antibodies. Twenty micrograms

of protein samples were loaded onto a 12% SDS-PAGE

gel and separated by electrophoresis. Gels were run at

150 V for approximately 2 h. Protein bands were trans-

ferred from gels to nitrocellulose membrane at 30 V for

16 h in buffer containing 25 mM Tris–HCl pH 8.8,

190 mM glycine and 20% (v/v) methanol. Gels were


Beta-1,3-glucanosyltransferases of Paracoccidioides 3

stained with Ponceau red staining to confirm complete

protein transfer. Next, each membrane was submerged

in blocking buffer [phosphate-buffered saline solution

19 (PBS; 1.4 mM KH2PO4, 8 mM Na2HPO4, 140 mM

NaCl, 2.7 mM KCl; pH 7.3), 5% (w/v) nonfat dried

milk, 0.1% (v/v) Tween 20] for 2 h. Membranes were

washed with buffer [19 PBS, 0.1% (v/v) Tween 20] and

incubated with primary antibodies for 2 h at room tem-

perature. Primary antibodies were used at a 1/1000 (v/

v) ratio of antibody to buffer. This was followed by

three 15-min washes in washing buffer. Membranes

were incubated with the conjugated secondary antibody

[anti-rabbit immunoglobulin G coupled to alkaline

phosphatase (Sigma-Aldrich)] in a 1/5000 (v/v) ratio

and developed with 5-bromo-4-chloro-3-indolylphos-

phate–nitroblue tetrazolium (BCIP-NBT). Membranes

carrying nuclear extracts were incubated with horserad-

ish-peroxidase conjugated anti-rabbit IgG antibody in a

1/5000 (v/v) ratio, and blots were developed using the

enhanced chemioluminescence Western blotting detec-

tion (GE Healthcare).

Ultrastructure of Paracoccidioides yeast and

mycelium cells and immunocytochemistry of

Gel1p and Gel2p

For the ultrastructural and immunocytochemistry studies,

the protocols previously described in Barbosa et al.

(2006) were employed. Transmission electron microscopy

was performed using thin sections from yeast and myce-

lium fixed in 2% (v/v) glutaraldehyde, 2% (w/v) parafor-

maldehyde and 3% (w/v) sucrose in 0.1 M sodium

cacodylate buffer pH 7.2. The samples were postfixed in

solution containing 1% (w/v) osmium tetroxide, 0.8%

(w/v) potassium fericyanide and 5 mM CaCl2 in sodium

cacodylate buffer, pH 7.2. The material was embedded in

Spurr resin (Electron Microscopy Sciences, Washington,

PA). Ultrathin sections were stained with 3% (w/v) ura-

nyl acetate and lead citrate. For immunolabeling, yeast

and mycelium were fixed in a mixture containing 4% (w/

v) paraformaldehyde, 0.5% (v/v) glutaraldehyde and 0.2%

(w/v) picric acid in 0.1 M sodium cacodylate buffer at

pH 7.2 for 24 h at 4 °C. Free aldehyde groups were

quenched with 50 mM ammonium chloride for 1 h.

Block staining was performed in solution containing 2%

(w/v) uranyl acetate in 15% (v/v) acetone. After dehydra-

tion, samples were embedded in LR Gold resin (Electron

Microscopy Sciences, Washington, PA). For ultrastructur-

al immunocytochemistry studies, the ultrathin sections

were incubated for 1 h with the polyclonal antibody

raised against rGel1p (diluted 1 : 10) or rGel2p (diluted

1 : 100) and for 1 h at room temperature with the

labeled secondary antibody rabbit IgG, Au-conjugated

(10 nm average particle size; 1 : 20 dilution; Electron

Microscopy Sciences). The nickel grids were stained as

described above and observed with a Jeol 1011 transmis-

sion electron microscope (Jeol, Tokyo, Japan). Controls

were incubated with rabbit preimmune serum, diluted

1 : 10 for experiments with Gel1p or 1 : 100 for Gel2p

followed by incubation with the labeled secondary anti-

body.

Isolation of Paracoccidioides nuclei and

immunofluorescence assays

The isolation of nuclei of Paracoccidioides was performed

as described by Mosley et al. (2009). Spheroplasts were

prepared essentially as described by Brito et al. (2011).

Briefly, yeast cells were harvested, washed and converted

to spheroplasts by digestion with 400 U of lyticase

(Sigma-Aldrich) at 30 °C for 24 h. Spheroplasts were cen-

trifuged and resuspended in FB buffer [20 mM PIPES,

pH 6.5, 18% (w/v) Ficoll 400, 0.5 mM MgCl2]. Trypan

blue was used to assess the spheroplast viability. Spherop-

lasts were disrupted by homogenization with grinder

(Dounce homogenizer, tight pestle) to release the nuclei.

Production of spheroplasts and their disruption was

monitored by microscopy. Cells were centrifuged at

3000 g for 10 min, and the supernatant was layered over

GB buffer [20 mM PIPES, pH 6.5, 20% (v/v) glycerol,

0.5 mM MgCl2]. After centrifugation at 11 500 g for

30 min at 4 °C, nuclei were resuspended and washed

three times in FB buffer to remove cytoplasmic contami-

nants.

Immunofluorescence was performed on intact cells and

isolated nuclei. In the first case, yeast cells were washed

with 19 PBS, fixed for 30 min with cold methanol at

�80 °C and additionally for 20 min at �20 °C. Cells

were treated with 0.2% (v/v) Triton X-100 for 15 min.

Cells were incubated in blocking buffer for 1 h [5% (w/v)

BSA, 0.1% (v/v) Tween 20]. The antibody raised against

Gel1p (diluted 1 : 20) was used. Cells and nuclei were

incubated with anti-rabbit IgG coupled to fluorescein iso-

thiocyanate (FITC, 1/200 dilution) for 1 h, and after

washes, they were incubated with 50 lM 4′,6-diamidino-

2-phenylindole (DAPI) for nuclear staining. Cells and

nuclei were observed under an Axio Scope A1 fluores-

cence microscope. Digital images were acquired using the

software AxioVision (Carl Zeiss AG, Germany).

Complementation studies in S. cerevisiae and

reverse transcription (RT)-PCR

Complementation experiments were performed as

described in Castro et al. (2009). For ectopic expression

of Paracoccidioides Gel1p and Gel2p in S. cerevisiae, the



corresponding cDNA (GenBank accession numbers

XM_002794143 and XM_002793063) was cloned into the

yeast expression vector pYES2 (Invitrogen), which is a

plasmid that contains a GAL1-inducible promoter. The

resulting plasmids were used to transform the S. cerevisiae

WB2d strain (Vai et al., 1996). The transformed strains

are indicated throughout the text as YGEL1 and YGEL2.

Standard methods were used for DNA manipulation and

yeast transformation (Sambrook & Russell, 1989; Hill

et al., 1991).

To determine the sensitivity of the different strains to

sodium dodecyl sulfate (SDS) and calcofluor white

(CW), yeast cells exponentially growing in unbuffered

and buffered (pH 6.5) galactose medium were dropped

(5 lL from a concentrated suspension of 107 cell mL�1

and from serial 10-fold dilutions) onto galactose unbuf-

fered and buffered (pH 6.5) medium plates supple-

mented with 0.01% (w/v) SDS or 50 mg mL�1 of CW.

Plates were incubated at 30 °C for 3 days. Cells were

also dropped onto plates without SDS and CW to mon-

itor cell growth. S. cerevisiae cellular morphology was

examined by Nomarski phase-contrast microscopy.

Chitin was visualized after staining with CW as reported

(Cipollina et al., 2007) under a Nikon Eclipse E600 fluo-

rescence microscope equipped with a Leica DC 350F ccd

camera.

Total RNA extraction, RNA cleanup and DNase I

treatment were performed as previously reported

(Orlandi et al., 2004). The Access RT-PCR System (Pro-

mega) was used following the manufacturer’s instruc-

tions. To assess telomeric silencing, primers amplifying

an internal region of the telomeric YFR057W and

YER188W genes were used. ACT1 mRNA was used for

normalization. Primer sequences are available upon

request. Experiments were repeated at least twice with

different RNA preparations.

Screening of in vivo protein–protein

interactions through two-hybrid assays

For the in vivo interaction studies, we used a cDNA

library described previously by Borges et al. (2010). To

identify protein–protein interactions involving Paracoccid-

ioides Gel1p, Gel2p and Gel3p, the cDNAs encoding each

Gelp (accession numbers submitted in GenBank:

XM_002794143, XM_002793063 and XM_002792886)

was subcloned in frame with the GAL4 DNA binding

domain into the bait vector pGBKT7. A truncated form

of Gel1 was generated by PCR amplification of the gene

with the forward primer 5′-GAATTCCGGCAAGGCCAACAGTGTCAA-3′ and the reverse primer 5′-CTG-CAGTTAGACCACGATCAATGAAACG-3′. The forward

primer was complementary to nucleotides 61–80, relative

to the translational start codon, and incorporated an

EcoRI site (underlined) at the 5′end. The reverse primer

was complementary to nucleotides 1310–1333 of the cod-

ing region and incorporated a PstI site (underlined) at

the 3′end. A truncated form of Gel2 was generated by

PCR amplification of the gene with the forward primer

5′-CCCGGGGTTACCCCCATCAGCATCGAA-3′ and the

reverse primer 5′-CTGCAGTGTCGTCCTCTATACCATAAGC-3′. The forward primer was complementary to nu-

cleotides 128–148, relative to the translational start codon,

and incorporated a SmaI site (underlined) at the 5′ end.The reverse primer was complementary to nucleotides

1404–1425 of the coding region and incorporated a PstI

site (underlined) at the 5′end. A truncated form of Gel3

was generated by PCR amplification of the gene with the

forward primer 5′-GAATTCCGCTGACCTGGATCCTATTGTC-3′ and the reverse primer 5′-CTGCAGTTACAACAACAAAATACTCATC-3′. The forward primer was comple-

mentary to nucleotides 55–75, relative to the translational

start codon, and incorporated an EcoRI site (underlined)

at the 5′end. The reverse primer was complementary to

nucleotides 1569–1590 of the coding region and incorpo-

rated a PstI site (underlined) at the 3′end. All constructswere confirmed by DNA sequencing. The generation of

transformants was performed by introducing each bait

vector into S. cerevisiae yeast strain Y187 (MATa, trp1-

901), which allows selection in minimal medium without

tryptophan, and the prey vector into the S. cerevisiae

strain AH109 (MATa, leu2-3), allowing the selection in

minimal medium without leucine. The experimental pro-

tocol was performed according to the Matchmaker gal4

Two-Hybrid System 3 manual and the Yeast Protocol

Handbook (Clontech). Following cell mating, the S. cere-

visiae diploids containing the two vectors were selected

from plates containing minimal media without leucine

and tryptophan. The positive interactions activate the

transcription of ADE2, HIS3, MEL1 and lacZ reporter

genes. To exclude false-positive clones, the colonies were

replicated using high-stringency plates containing mini-

mal media without adenine, histidine, leucine and trypto-

phan. The screening of positive clones was accomplished by

detecting the blue/white color of the substrate 5-bromo-4-

chloro-3-indolyl-a-D-galactopyranoside (X-alpha-Gal), con-

firming the activation of the MEL1 reporter gene. A PCR

colony assay was performed using the AD-LD 5′ and AD-

LD 3′ supplied oligonucleotides for the pGADT7-Rec bait

plasmid. The PCR products of the identified transfor-

mants were subjected to DNA sequencing using a MegaB-

ACE 1000 sequencer (GE Healthcares®) for automated

sequence analysis. Sequence homologies to the genes of

interest were performed by searching the GenBank data-

base using the BLAST algorithm (http://www.ncbi.nlm.nih.

gov).



In vitro translation and coimmunoprecipitation

assays

The potential interactions detected for Gel1p, Gel2p and

Gel3p were confirmed using the in vitro translation system

TNT® T7 Coupled Reticulocyte Lysate Systems (Promega)

with S35 methionine and coimmunoprecipitation of the

translated proteins (MatchmakerTM Co-IP Kit, Clontech

Laboratories, Inc.). The PCR products of selected colonies

were used as a template for the in vitro transcription/trans-

lation. Briefly, the translated baits Gel1p, Gel2p and Gel3p,

fused to a c-myc epitope (c-myc), and the translated prey

proteins fused to a hemagglutinin epitope (HA) were mixed

at 25 °C for 1 h. The mixture was incubated with protein A

beads and with the monoclonal c-myc antibody in 19 PBS

at 25 °C for 1 h. After washing, the beads containing pro-

teins were resuspended in SDS-loading buffer [50 mM Tris

–HCl, pH 6.8; 100 mM dithiothreitol, 2% (w/v) SDS; 0.1%

(w/v) bromophenol blue; 10% (v/v) glycerol], followed by

boiling at 80 °C for 5 min. The proteins were separated on

a SDS-PAGE 4–12% linear gradient. The gel was fixed with

20% (v/v) ethanol and 10% (v/v) acetic acid for 30 min and

incubated in 20 mL of fluorographic reagent NAMP 100

(Amplify Fluorographic Reagent – GE Healthcare®). The

gels were dried at 80°C for 90 min under vacuum, and

autoradiography was obtained. Negative controls were

obtained using in vitro-translated preys that were immuno-

precipitated with the c-myc monoclonal antibody. Each

assay was repeated three times with a different batch of in

vitro-translated product to confirm the results.

Schematic drawing construction

To provide an illustration of the putative localizations of

partner proteins detected in the Paracoccidioides Gelsp

two-hybrid screening, a schematic drawing was con-

structed. Putative localizations of partner proteins were

based on literature data of proteins from fungi.

Results

In silico analysis of the Paracoccidioides beta-

1,3-glucanosyltransferases

The Gel-deduced amino acids sequences obtained from

the Paracoccidioides genome database (http://www.broad.

mit.edu/annotation/genome/paracoccidioides brasiliensis/

MultiHome.html) were aligned. The deduced proteins

Gel1p, Gel2p and Gel3p in both Pb01 and Pb18 sequences

present the same conserved motifs. The deduced proteins

contain a predicted signal sequence at the N-terminal end

followed by the conserved domain present in the GH72

family of proteins (Mouyna et al., 2000) and a region at

the C-terminus that is predicted to be GPI anchor (Sup-

porting information, Fig. S1a and b). Two glutamic resi-

dues, which are essential for the enzymatic activity

(Carotti et al., 2004), were conserved in the catalytic

domain of the three Paracoccidioides Gel sequences. Previ-

ous studies with Gel3p showed that it has significant

homology with proteins of the GH72 family. The

Paracoccidioides Gel3p also contains a domain named

Cys-Box, which contains six conserved cysteine residues

(Castro et al., 2009). This is an additional domain shared

by some members of the GH72 proteins that bears

sequence similarity with proteins of the carbohydrate-

binding module family 43 (CBM43) (Palomares et al.,

2003; Carotti et al., 2004; Barral et al., 2005) .

A phylogenetic analysis of GH72 proteins has shown that

they cluster into two subfamilies, GH72+ and GH72�,which differ in the presence or absence of the Cys-box.

Thus, from a phylogenetic tree constructed with the Para-

coccidioides Gel sequences and beta-1,3-glucanosyltransfe-

rases from other fungi sequences (Fig. S2), Gel1p and

Gel2p from Paracoccidioides were clustered into the sub-

family GH72� while Gel3p clustered with members of the

GH72+ subfamily, which is consistent with the protein

sequence alignment and the related clusters obtained by

Ragni et al. (2007b). The high identity of members of the

Gel family is demonstrated in this figure.

The deduced Gelsp presented high identity in Paracocc-

idoides, Pb01 and Pb18. By comparing the deduced pro-

teins, identity values of 82%, 98% and 97%, for Gel1p,

Gel2p and Gel3p, have been found, respectively (data not

shown). Owing to these high identity values among the

members of the Paracoccidioides Gelsp family, we utilized

the sequences of GEL1, GEL2 and GEL3 of Pb01 in fur-

ther experiments.

Detection of Gel1p and Gel2p by microscopy in

Paracoccidioides cells

As localization of Gel3p in yeast cells has been determined

(Castro et al., 2009), immunocytochemistry experiments

were performed to define the cellular localization of Gel1p

and Gel2p using the polyclonal antibodies anti-Gel1p and

anti-Gel2p, respectively. Western blot analysis demon-

strated the specificity of the polyclonal antibodies in cells of

the two lineages of Paracoccidioides. The antibody anti-

Gel1p recognized a single-protein species of 51 kDa in

yeast (Fig. S3a and b, lanes 1), and the anti-Gel2p antibody

recognized a single-protein species of 54 kDa (Fig. S3a and

b, lanes 3) in both, Pb01 and Pb18. No cross-reactivity was

observed with preimmune sera (Fig. S3a and b, lanes 2 and

4). In cells processed by the postembedding method, gold

particles revealed the localization of Gel1p and Gel2p in

Paracoccidioides Pb01 and Pb18 (Figs 1 and 2, Figs S4 and



S5). Interestingly, both in mycelium and in yeast cells, the

Gel1p was associated with the cell wall and with the nucleus

(Fig. 1a–d, Fig. S4a and b). Control samples were free of

label (Fig. 1e and f, Fig. S4c). For Gel2p, gold immune label

was predominantly associated with the cell wall (Fig. 2a–d,Fig. S5a and b). The control samples were free of label

when incubated with the rabbit preimmune serum (Fig. 2e

and f, Fig. S5c).

To confirm the nuclear association of Gel1p, Paracoc-

cidioides yeast cells and the nuclear fraction were incu-

bated with anti-Gel1p polyclonal antibody and with DAPI

and analyzed by fluorescence microscopy. After image

merging, it was observed that Gel1p co-localized with

DAPI staining either in intact cells (Fig. S6a) or in the

nuclear fraction (Fig. S6c). Control with preimmune sera

are presented in Fig. S6b and d. Western blot analysis of

the nuclear fraction with the anti-Gel1p polyclonal anti-

body is presented in Fig. S6e. A protein species of 51 kDa

was detected (Fig. S6e, lane 1). No cross-reaction was

obtained with the preimmune serum (Fig. S6e, lane 2).

Gel1p and Gel2p differently complement the

S. cerevisiae gas1 null mutant phenotype

In a previous study, we demonstrated that Gel3p, a mem-

ber of the beta-1,3-glucanosyltransferase family of Para-

coccidioides, completely rescued the phenotypic defects

resulting from GAS1 inactivation including slow growth,

abnormal morphology and hypersensitivity to CW and

SDS (Castro et al., 2009). The complementation was per-

formed in buffered growth medium similar to the condi-

tions for GAS4, a paralog of GAS1, which encodes a

protein that is functional at a pH value close to neutrality

(Ragni et al., 2007a).

Here, we tested whether the other glucanosyltransferase

family members were able to replace Gas1p function in

vivo. The GEL1 and GEL2 cDNAs of Pb01were placed

under the control of the GAL1 promoter in a gas1D back-

ground, and their expression was analyzed by RT-PCR. In

transformed cells (namely YGEL1 and YGEL2 strains)

grown in unbuffered or buffered (pH 6.5) galactose

media, a unique transcript was detected at a high level

(Fig. 3a). Then, we examined the phenotype YGEL1 and

YGEL2 strains. First, we analyzed cellular growth by

counting cell number over time during the exponential

phase. As shown in Table 1, in both growth conditions,

the YGEL1 strain had a slow growth similar to that of the

gas1D mutant, indicative of lack of complementation. In

agreement with this, YGEL1 cells showed hypersensitivity

to growth in the presence of SDS and CW (Fig. 3b).

In contrast, Gel2p completely suppressed the gas1Dphenotype in buffered growth conditions. In fact, the

(b) (a) (d) (c)

(e) (f)

Fig. 1. Localization of Gel1p in

Paracoccidioides, Pb01, mycelium and yeast

cells by immunoelectron microscopy. (a and b)

Gold particles are observed at the fungus cell

wall (w) (triple arrowheads) and in the nucleus

(n) (double arrowheads) mycelium. The nuclear

membranes are indicated by the arrows. (c

and d) Gold particles are observed in yeast

cells. The triple arrowheads indicate that

Gel1p is present in the cell wall, and the

double arrowheads indicate the presence of

Gel1p in the nucleus. The nuclear membranes

are indicated by the arrows. (e and f) Negative

controls were exposed to the rabbit

preimmune serum in mycelium and yeast cells,

respectively. v, vacuole.



YGEL2 strain showed a similar growth rate in galactose

medium (pH 6.5) (Table 1) and the same sensitivity to

SDS and CW (Fig. 3b) as wild-type cells. Under these

growth conditions, YGEL2 cells reassumed the ellipsoidal

shape, and cells carrying two or more buds that are dis-

tinctive of gas1D mutant were absent (Fig. 3c). Moreover,

upon CW staining, gas1D cells, showed increased and

delocalization of chitin as expected, while in YGEL2 cells,

chitin showed a clear localization in the bud scars and at

the mother–daughter junction (Fig. 3c). On the contrary,

in unbuffered growth conditions, the YGEL2 strain dis-

played the same phenotypic defects as the gas1D mutant

(Table 1 and Fig. 3b).

As shown in Fig. 1a–d (Figs S4a and S6a–c), Paracoc-cidioides Gel1p, similar to Gas1p, was also associated with

the nucleus. As the localization of Gas1p in S. cerevisiae

to the nuclear periphery correlates with a role of this pro-

tein in telomeric silencing (Koch & Pillus, 2009), we

decided to analyze whether Paracoccidioides Gel1p had

similar activity. Thus, in the YGEL1 strain grown on

galactose-buffered medium, we assessed gene expression

of two telomeric genes, YFR057W and YER188W, which

are localized on chromosomes VI-R and V-R, respec-

tively. In agreement with the changes observed by Koch

& Pillus (2009), the YFR057W transcript was up-regulated

in the gas1D and sir2D mutants used as control (Fig. 3d).

Sir2p is a NAD+-dependent deacetylase that has a key

role in the establishment and maintenance of silent chro-

matin: Its loss of function severely reduces telomeric

silencing (Blander & Guarente, 2004). Interestingly, in

YGEL1 cells, YFR057W expression was similar to that in

the wild-type strain, which is indicative of intact telomer-

ic silencing. On the other hand, in both YGEL2 and

YGEL3 strains, the YFR057W level was increased as in the

gas1D mutant (Fig. 3d). In gas1D cells transformed with a

plasmid carrying a wild-type copy of GAS1, silencing was

restored (data not shown). The gas1D silencing defect was

also observed on chromosome V-R (YER188W up-regula-

tion), in agreement with reporter assays (Koch & Pillus,

2009). In YGEL1 cells, the YER188W silencing was com-

pletely restored, while in both YGEL2 and YGEL3 strains

telomeric silencing was impaired as in the gas1D mutant

(Fig. 3d). The same results were obtained for cells grown

on galactose unbuffered medium (data not shown).

In vivo detection of proteins interacting with

Gel proteins of Paracoccidioides

A yeast two-hybrid assay was employed to identify pro-

teins that interact with Gel1p, Gel2p and Gel3p. For this,

a cDNA library was constructed of RNAs obtained from

Paracoccidioides yeast cells (Borges et al., 2010). The

(a) (b) (c)

(e) (f)

(d)

Fig. 2. Detection of Gel2p in

Paracoccidioides, Pb01, mycelium and yeast

cells by immunoelectron microscopy. (a and b)


wall (w) (triple arrowheads) and in the

cytoplasm (arrowheads) in mycelium. (c and d)


wall (w) (triple arrowheads) and in the

cytoplasm (arrowheads) in a yeast cell. (e and

f) Negative controls were exposed to the

rabbit preimmune serum in mycelium and

yeast cells, respectively. v, vacuole; m,

mitochondrion; n, nucleus.



positive mating clones growing on high-stringency mini-

mal medium were plated on medium containing X-alpha-

Gal (data not shown) and subjected to PCR. The PCR

products were subjected to DNA sequencing. The positive

cDNAs obtained from each Gelp interaction assay are

listed in Table 2. Some cDNAs were redundant in the

same two-hybrid assay, such as those encoding homologs

of heat shock protein (Hsp90), anthranilate synthase

component 2 and phosphatidylinositol-4-phosphate 5-

kinase (Its3). cDNAs encoding homologs of proteins that

participate in different pathways were detected. Some

pathways were found in more than one yeast two-hybrid

assay, such as amino acid biosynthesis, lipid metabolism

and cytokinesis. Some cDNAs encoded homologs that

interact with more than one Gel protein. Its3 protein

interacts with Gel2p and Gel3p. In addition, a predicted

protein with unknown function (accession number:

XP_002797017) was shown to interact with both Gel1p

and Gel3p. Figure 4 shows the confirmation of yeast two-

hybrid-identified interactions by coimmunoprecipitation

assays. Negative controls were performed to confirm the

specific Gel protein fusion to the c-myc epitope by the

recognition of the translated prey proteins with the com-

mercial c-myc antibody (Fig. 4, lanes marked with ‘). Fig-

ure 5 depicts interactions with Gel proteins. This

schematic drawing was constructed based on published

data regarding localization of the proteins in fungi. As

depicted in Fig. 5, several proteins interacting with Gel1p,

Gel2p and Gel3p are described to be present on the sur-

face of cells. The Gel2p was also detected in the cyto-

plasm of Paracoccidioides, and interacting proteins such as

SAMB and MAD2B have been also described to localize

(a)

(c)

(d)

(b)

Fig. 3. Analysis of the complementation of

the Saccharomyces cerevisiae gas1D mutant

phenotype by the expression of

Paracoccidioides, GEL1 and GEL2. (a) In the

indicated strains, transcript levels of GEL1 and

GEL2 were analyzed by RT-PCR. ACT1 was

used as a normalizing control. Only a

representative example of RT-PCR

amplification obtained in the gas1D mutant is

shown. (b) The indicated strains were grown

in an unbuffered and buffered medium

containing galactose at 30 °C. During

exponential growth, a concentrated

suspension of cells was prepared and

sensitivity to SDS and CW was tested as

described in Material and methods. Plates

were incubated at 30 °C, and growth was

analyzed after 3 days. wt, wild type. (c)

Cellular morphology, visualized by Nomarsky,

and CW staining of the indicated strains

exponentially growing in galactose medium,

pH 6.5. (d) In the indicated strains, transcript

levels of YFR057W and YER188W were

analyzed as in (a). Representative examples of

RT-PCR amplifications are shown (upper

panels). For each strain, signal intensities of

YFR057W and YER188W were normalized to

ACT1. Quantitative data are shown as fold

change estimated by dividing each normalized

value obtained for the different mutants to

the wt, which was arbitrarily set to 1 (lower

panels). Standard deviations are indicated.



to the cytoplasm. Gel1p was detected also in the Paracoc-

cidioides nucleus, and some described nuclear proteins

were identified as partner proteins by the two-hybrid

assays.

Discussion

The mechanisms involved in the Paracoccidioides cell wall

assembly and integrity maintenance are poorly known.

Previous transcriptional data allowed the identification of

several cell wall-related genes (Castro et al., 2005; Toma-

zett et al., 2005). Among them, Fks1p, a beta-1,3-glucan

synthase, and the Gel3p, a beta-1,3-glucanosyltransferase

family member, were characterized (Castro et al., 2009).

Functional analysis of Paracoccidoides Gel3p, showing its

capacity to rescue the S. cerevisiae gas1D mutant pheno-

type, indicates that this enzyme plays an active role in

biosynthesis and morphogenesis of the fungus cell wall

(Castro et al., 2009). Other genes encoding beta-1,3-glu-

canosyltransferases (Gel1p and Gel2p) in the genome of

Paracoccidioides warrant additional studies of the glucano-

syltransferase family in this fungus.

The high level of identity among members of the Gel

family in Paracoccidioides, as demonstrated in our in silico

analysis, validated the use of the genomic sequences of

GELs of strain Pb01 in analyzing the roles of the cognate

proteins in the biology of Paracoccidioides. Also, the high

conservation (from 82% to 98%) is strong evidence that

Gelsp of the both phylogenetic species, PS1- and Pb01-

like of Paracoccidioides, can play the same functions. The

potential roles of Gel1p and Gel2p in cell wall biosynthe-

sis and morphogenesis of Paracoccidioides were investi-

gated by analyzing their ability to rescue in vivo the

S. cerevisiae gas1D mutant phenotype. In S. cerevisiae, the

lack of Gas1 beta-1,3-glucanosyltransferase activity drasti-

cally affects the correct relative proportion and degree of

cross-linking of cell wall constituents (Popolo et al., 1997;

Ram et al., 1998). This leads to a detectable mutant phe-

notype characterized by reduced growth, round cell mor-

phologies, sensitivity to CW and defects in bud

maturation and cell separation besides increased cell wall

permeability and secretion (Popolo & Vai, 1999; Vai

et al., 2000). Interestingly, Gel2p was able to complement

the mutant phenotype of gas1D in buffered medium, sup-

pressing both the morphological defects and the compen-

satory responses induced by the lack of Gas1p.

Previously, similar results were found for Gel3p (Castro

et al., 2009) and for Gas2p and Gas4p of S. cerevisiae,

two redundant versions of Gas1p that are specialized to

function at pH values close to neutrality (Ragni et al.,

2007a), suggesting that Gel2p can be involved in fungal

cell wall biosynthesis and morphogenesis in Paracoccidio-

ides. In contrast, the ectopic expression of Gel1p did not

complement the morphological and growth defects of the

gas1D mutant in either unbuffered or buffered media.

Recently, it has also been reported that the ectopic

expression of Gas3p in S. cerevisiae did not complement

gas1D defects (Rolli et al., 2010).

Interestingly, the localization of Gel1p and Gel2p ana-

lyzed by immunoelectron microscopy in Paracoccidioides

showed that Gel1p is associated with the surface and with

the nucleus of the fungus while Gel2p was associated both

with the cell wall and with the cytoplasm. Immunofluo-

rescence and Western blot analysis add strength to the

hypothesis of the association of Gel1p with nuclei. An

unsuspected localization to the nuclear periphery has

been also described for Gas1p in S. cerevisiae (Koch &

Pillus, 2009; Mosley et al., 2009). This correlates with a

Gas1 role in locus-specific transcriptional silencing in a

manner that is independent from its established function

at the cell wall (Koch & Pillus, 2009). In accordance with

these data, we speculate that Gel1p might perform other

functions besides the building of the fungus cell wall. In

fact, although the ectopic expression of Gel1p did not

complement the morphological and growth defects of the

gas1D mutant, we found that it is able to restore loss of

silencing at telomeres because of GAS1 inactivation. This

feature is specific to Gel1p because Gel2p and Gel3p do

not complement the gas1D telomeric defects. Taken

together, these results indicate that Gel1p could partici-

pate in transcriptional silencing suggesting a nuclear role

for a putative carbohydrate modification enzyme in Para-

coccidioides, as reported for S. cerevisiae (Koch & Pillus,

2009).

The novel cellular localization and putative function of

glucanosyltransferases elicited our interest in studying the

protein interactions of the Paracoccidioides Gel proteins.

We identified proteins that interact with Gel1p, Gel2p

and Gel3p by an in vivo two-hybrid system. We showed

that Paracoccidioides Gel proteins interact with proteins

presumably located in different cellular compartments,

Table 1. Duplication times in unbuffered and buffered growth

conditions

Growth condition Strain Td (h)*

Galactose medium (unbuffered) W303-1B 1.78 ± 0.08

gas1Δ 3.03 ± 0.12

YGEL1 3.08 ± 0.09

YGEL2 2.93 ± 0.06

Galactose medium (pH 6.5) W303-1B 2.33 ± 0.05

gas1Δ 4.08 ± 0.09

YGEL1 3.96 ± 0.11

YGEL2 2.46 ± 0.07

*The duplication time (Td) was calculated as ln2/k, where k is the con-

stant rate of exponential growth. Data represent the average of three

independent experiments. Standard deviations are indicated.



Table

2.Gen

eproductsiden

tified

inParacoccidioides

Gel1p,Gel2p,an

dGel3ptw

o-hybridscreen

ing

Gen

eproducts

Protein

ID*

Organ

ism/accessionnumber

†

Evalue/

redundan

cyClassic

function‡

Cellularlocalization§

Referen

ces¶

Gel1

Alpha-glucosides

permease

MPH

2/3**

MPH

2Paracoccidioides,Pb

01/XP_002794175

2e�6

0/1

Tran

smem

branetran

sport

Cellularsurface

Day

etal.(2002)

Argininebiosynthesis

bifunctional

protein

argJ

–Paracoccidioides,Pb

01/XP_002790790

6e�6

1/2

Aminoacid

biosynthesis

Mitochondrion

Crabeelet

al.(1997)

Celldivisioncontrol

protein

(sep

tin)

SEPT

Paracoccidioides,Pb

01/XP_002797643

5e�2

9/1

Cytokinesis

Cellularsurface

Longtine&

Bi(2003)

Cellwall-an

choredprotein

–Ajellomyces

capsulatus/EG

C42237.1

3e�3

0/1

Unkn

own

ND

–

Eukaryotictran

slation

initiationfactor3subunitB

EIF3B

Paracoccidioides,Pb

01/XP_002791819

3e�105/1

Protein

synthesisregulation

Cellularsurface

Albuquerque

etal.(2008)

Farnesyltran

sferase,

alphasubunit**


18/EEH

48029

1e�7

8/1

Posttran

slational

modification

ND

–

GDSL

Lipase/Acylhydrolase

family

protein**


18/EEH

49274

4e�2

8/2

Lipid

metab

olism

ND

–

Glycinedeh

ydrogen

ase**

GLD

CParacoccidioides,Pb

01/XP_002796560

1e�8

2/3

Glycinecatabolism

Cellularsurface

Albuquerque

etal.(2008)

Heatshock

protein

(Hsp90)

HSP90

Paracoccidioides,Pb

01/XP_002792393

0.0/4

Chap

erone

Cellularsurface

Cab

ezonet

al.(2009)

Mitochondrial

ATPaseinhibitor


03an

d

Pb18/EEH

18729an

dEEH48355

1e�5

4/1

Enzymeinhibitoractivity

ND

–

Putative

acid

phosphatase**

PAP

Paracoccidioides,Pb

01/XP_002792481

9e�7

3/1

Hydrolase

Cellularsurface

Bernardet

al.(2002)

Pyruvate

deh

ydrogen

aseE1

componen

t,betasubunit**

PDHB

Paracoccidioides,Pb

01/XP_002796526

2e�105/2

Glycolysis,

conversionof

pyruvate

toacetyl-CoA

andCO2

Cellularsurface

Rodrigues

etal.(2008)

Pyruvate

kinase*

*PK

Paracoccidioides,Pb

01,Pb

03an

dPb

18/XP_002791641,EEH20554

andEEH45128

3e�8

0/1

Glycolysis,

conversionof

pyruvate

to

phosphoen

olpyruvate

Cellularsurface

Cab

ezonet

al.(2009)

RNA

interferen

cean

d

gen

e-silencingprotein

(Qde2

)**

QDE2

Paracoccidioides,Pb

01/XP_002794686

1e�3

6/3

Nucleicacid

binding

Nucleu

sMartien

ssen

etal.(2005)

RNA

polymeraseIItran

scription

factorBsubunit2

RPB

2Paracoccidioides,Pb

01,Pb

03an

d

Pb18/XP_002791593,EEH20511

andEEH45083

3e�2

6/1

Tran

scriptionregulation

Nucleu

sWan

get

al.(1995)

Sulfatasedomain–containing

protein


01/XP_002791669

5e�3

3/1

Metab

olism

(hydrolase

activity)

ND

–

Thym

inedioxygen

ase


03an

d

Pb18/EEH

17985an

dEEH46874

1e�5

8/3

Oxidoreductaseactivity

ND

–

Tran

scriptionelongation

factorSp

t6**

SPT6

Paracoccidioides,Pb

18/EEH

49900

9e�6

6/1

Tran

scriptionregulation

Nucleu

sBortvin&Winston

(1996)

Tran

scriptionfactorRfeF

–Ajellomyces

capsulatus/EG

C48019

6e�7

7/1

Tran

scriptionregulation

ND

–



Table

2.Continued

Gen

eproducts

Protein

ID*

Organ

ism/accessionnumber

†

Evalue/

redundan

cyClassic

function‡


Referen

ces¶

Tubulin

alpha-1chain

TUBA1

Paracoccidioides,Pb

01,Pb

03an

d

Pb18/XP_002796639,

EEH21480an

dEEH43839

2e�107/2

Cytoskeletoncomponen

t

(protein

polymerization)

Cellularsurface

Rodrigues

etal.(2008)

Conserved

hypothetical

protein


01/XP_002796245

4e�3

7/3

ND

ND

–

Conserved

hypothetical

protein


18/EEH

46259

4e�31/68

ND

ND

–

Conserved

hypothetical

protein


01/XP_002789109

4e�3

2/1

ND

ND

–

Conserved

hypothetical

protein


01/XP_002793787

4e�162/1

ND

ND

–

Conserved

hypothetical

protein


01/XP_002797737

7e�6

8/1

ND

ND

–

Conserved

hypothetical

protein


01/XP_002796469

2e�5

9/1

ND

ND

–

Pred

ictedprotein


01/XP_002797078

2e�3

7/1

ND

ND

–

Pred

ictedprotein

††


01/XP_002797017

0.0/1

ND

ND

–

Pred

ictedprotein


01/XP_002791637

3e�4

8/1

ND

ND

–

Pred

ictedprotein


01/XP_002789336

6e�5

0/1

ND

ND

–

Hypothetical

protein

‡‡

––

–/2

ND

ND

–

Hypothetical

protein

‡‡

––

–/3

ND

ND

–

Hypothetical

protein

‡‡

––

–/2

ND

ND

–

Hypothetical

protein

‡‡

––

–/1

ND

ND

–

Hypothetical

protein

‡‡

––

–/1

ND

ND

–

Hypothetical

protein

‡‡

––

–/1

ND

ND

–

Hypothetical

protein

‡‡

––

–/1

ND

ND

–

Hypothetical

protein

‡‡

––

–/1

ND

ND

–

Gel2

Anthranilate

synthase

componen

t2


01/XP_002789411

0.0/4

Aminoacid

biosynthesis

ND

–

Gprotein

complexbeta

subunitCpcB

CPC

BParacoccidioides,Pb

01an

dPb

03/

XP_002791085an

dEEH20774

6e�7

1/1

Cellmorphogen

esis

Cytoplasm

Valeriuset

al.(2007)

Mitoticspindle

checkp

ointprotein

(Mad

2B)**

MAD2B

Paracoccidioides,Pb

01/XP_002794342

5e�6

7/1

Celldivision

control(m

itosis)

Nuclearpore

complex

Iouket

al.(2002)

MYND

domainprotein

(Sam

B)**

SAMB

Paracoccidioides,Pb

01,Pb

03an

d

Pb18/XP_002795772,EEH49546

andEEH22754

9e�4

0/1

Cellmorphogen

esis

Cytoplasm

Kruger

&Fischer

(1998)

Phosphatidylinositol-4-phosphate

5-kinaseIts3

§§

ITS3

Paracoccidioides,Pb

01,Pb

03an

d

Pb18/XP_002792211,EEH23461

andEEH49920

2e�0

9/1

Cytokinesis

Cellularsurface

Van

curova

etal.(1999)

WD

repeatprotein


01/XP_002790747

2e�7

0/1

Cellmorphogen

esis

(protein

binding)

ND

–

Conserved

hypothetical

protein


01/XP_002797979

9e�5

8/1

ND

ND

–

Gel3

3-O

xoacyl

reductase


01/XP_002791870

2e�2

0/1

Lipid

metab

olism

Mitochondrion

Schneider

etal.(1997)

5′-3′exoribonuclease


01/XP_002789200

2e�102/1

Tran

scriptionregulation

Nucleu

sAmberget

al.(1992)



Table

2.Continued

Gen

eproducts

Protein

ID*

Organ

ism/accessionnumber

†

Evalue/

redundan

cyClassic

function‡


Referen

ces¶

ATP-dep

enden

tRNA

helicaseDbp5**


03/EEH

18264

4e�60/1

Protein

synthesis

regulation

Cytoplasm

Tsen

get

al.(1998)

Leptomycin

Bresistan

ce

protein

Pmd1

PMD1

Paracoccidioides,Pb

01/XP_002790798

5e�43/1

Tran

smem

brane

tran

sport

Cellularsurface

Nishiet

al.(1992)

Lipase/serineesterase**


01/XP_002796507

4e�75/1

Lipid

metab

olism

ND

–

Phosphatidylinositol-4-phosphate

5-kinaseIts3

§§

ITS3

Paracoccidioides,Pb

01,Pb

03,an

d

Pb18/XP_002792211,EEH23461

andEEH49920

9e�14/31

Cytokinesis

Cellularsurface

Van

curova

etal.(1999)

Protein

kinaseDsk1


01/XP_002796597

4e�38/1

Celldivisioncontrol

Cytoplasm

Takeuchi&

Yan

agida

(1993)

Tran

scriptionfactorCtf1B


01/XP_002797034

2e�97/2

Tran

scriptionregulation

ND

–

Conserved

hypothetical

protein


01/XP_002796037

4e�36/1

ND

ND

–

Conserved

hypothetical

protein


01/XP_002792818

3e�110/1

ND

ND

–

Conserved

hypothetical

protein


18/EEH

49628

2e�32/1

ND

ND

–

Pred

ictedprotein

††


01/XP_002797017

7e�13/1

ND

ND

–

*Protein

nam

eab

breviationsusedin

theschem

atic

drawing,Fig.5.

†Gen

Ban

kaccessionnumbers(http://w

ww.ncbil.nlm

.nih.gov).

‡Classical

functionsobtained

from

theUniProtdatab

ase(http://w

ww.uniprot.org/).

§Cellularlocalizationsbased

onfungal

literature

data.

¶ Referen

cesforcellularlocalizationsofhomologsproteinsin

fungi.

**Interactionsconfirm

edbycoim

munoprecipitation.

††Proteinsfoundto

interact

withboth

PbGel1an

dPb

Gel3.

‡‡Nohomologyfoundin

thedatab

ases

searched

.§§Proteinsfoundto

interact

withboth

PbGel2an

dPb

Gel3.

ND,notdetermined

.



including the cell wall, cytoplasm and nucleus. Some of

these interactions could be related to cell morphogenesis

and cytoskeleton organization. It is interesting to high-

light that cDNAs coding for Gelsp’ interaction partners

presented high identity to transcripts from different Para-

coccidioides cryptic species, reinforcing the notion that

those molecules likely play similar functions in this genus.

The phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinase Its3 par-

ticipates in the establishment of cell morphology and cell

division because of its localization peripheral to the

plasma membrane in S. pombe (Vancurova et al., 1999).

The protein CpcB, which is involved in the regulation of

transduction signal pathways, interacts with Gel2p; it is a

beta subunit of a G protein and homolog to Cpc2 of

S. cerevisiae (Hoffmann et al., 2000), which is related to

actin cytoskeleton organization during cell wall synthesis

(Won et al., 2001). The Gel2p-interactant partners SamB

and Mad2B are also involved in cell wall morphogenesis.

SamB participates preferentially in morphogenesis regula-

tion pathways in ascomycetes (Kruger & Fischer, 1998),

and its transcript is induced during morphological transi-

tion in Paracoccidioides (Bastos et al., 2007). The Mad2B

protein is involved in cell division control through a

mitotic spindle checkpoint (Li & Benezra, 1996). In addi-

tion, septin and tubulin interact with Gel1p. In fungi,

septins organize in budding points, which can serve as

support to proteins involved in functions related to cell

morphogenesis of the cell (Casamayor & Snyder, 2003;

Longtine & Bi, 2003; Cao et al., 2009). In this context,

Phr1p, a C. albicans homolog of Gel1p, localizes to the

apical growth sites during the induction of vegetative

growth (Ragni et al., 2011). These interactions may fur-

ther indicate that beta-glucanosyltransferases participate

in morphogenetic events in Paracoccidioides, as indicated

here for Gel2p and previously for Gel3p (Castro et al.,

2009).

Other interactions support a possible role of Gel1p in

chromatin organization, as suggested for ScGas1p (Koch

& Pillus, 2009). This is suggested by the interaction

between Gel1p and Qde2 argonaute and the transcription

elongation factor Spt6, which were confirmed by coim-

munoprecipitation. Qde2 argonaute contributes to gene

silencing (Fagard et al., 2000). Spt6 is involved in the

control of chromatin structure at the level of histone

modifications (Youdell et al., 2008). These interactions in

addition to the nuclear localization and the effects

(a)

(b) (c)

Fig. 4. Paracoccidioides Gel1p, Gel2p, and Gel3p interactions confirmed by coimmunoprecipitation assay. Proteins that were predicted to

interact with Gel proteins by the yeast two-hybrid assay were in vitro synthesized and labeled with 35S-methionine. The translated Gel1p (a),

Gel2p (b), and Gel3p (c) fused into the c-myc epitope and the translated partner proteins fused into the hemagglutinin epitope were mixed, and

the mixture was incubated with protein A-agarose beads and the monoclonal anti-c-myc. The proteins were separated by SDS-PAGE. The gels

were fixed and dried under vacuum, and autoradiographies were obtained. The numbers on the left of the autoradiographies correspond to the

molecular weight marker and the numbers on the right correspond to the molecular weight of the proteins obtained in this assay. (a) Gel1p,

45 kDa, and pyruvate dehydrogenase (lane 1), alpha-glucosides permease MPH2/3 (lane 2), putative acid phosphatase (lane 3), lipase/

acylhydrolase of the GDSL family (lane 4), farnesyltransferase (lane 5), glycine dehydrogenase (lane 6), RNA interference and gene-silencing

protein Qde2 (lane 7), pyruvate kinase (lane 8), transcription elongation factor Spt6 (lane 9). (b) Gel2p, 52 kDa, and MYND domain protein SamB

(lane 1), mitotic spindle checkpoint protein Mad2B (lane 2). (c) Gel3p, 55 kDa, and lipase/serine esterase of the GDSL family (lane 1), ATP-

dependent RNA helicase Dbp5 (lane 2). Negative controls were performed [a, b, and c: lanes marked with a quote (‘) corresponding to the

control of the reaction in the lane numbered without the quote].



observed on yeast telomeric silencing strongly support an

unexpected role of Gel1p in regulating transcriptional

silencing in Paracoccidioides.

In conclusion, in this work, the beta-1,3-glucanosyl-

transferase family of Paracoccidioides was characterized.

These proteins that are highly conserved in Paracoccidio-

ides are members of the GH72 family, and nuclear/cell

wall localization of Gel1p was detected as well as cell sur-

face and cytoplasmic localization of Gel2p. Functional

and interaction analyses indicate a possible involvement

of these proteins in pathways other than those well estab-

lished at the cell wall.

Acknowledgments

This work at Universidade Federal de Goias was sup-

ported by grants from Conselho Nacional de Desenvolvi-

mento Cientıfico e Tecnologico (CNPq, grant number

558405/2008-8), Coordenacao de Aperfeicoamento de

Ensino Superior (CAPES), Financiadora de Estudos e

Projetos (grants numbers 0106121200 and 0107055200)

and Fundacao de Apoio a Pesquisa do Estado de Goias

(CA 002/2007).

Authors’ contribution

P.S.L. and E.F.L.C.B. equally contributed to this study.

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Fig. 5. Schematic drawing of putative localizations of

Paracoccidioides Gel partner proteins. The localization model involving

Paracoccidioides Gel proteins and partner proteins was constructed

from two-hybrid results based on literature data. Proteins are

described by their abbreviated names, which are indicated in Table 2.

Interactions with Gel1p, Gel2p, and Gel3p are indicated in bold, italic,

and underlined, respectively. Numbers in parentheses indicate the

redundancy of partner proteins in the two-hybrid screening, and the

asterisk shows partners whose interaction with Paracoccidioides Gel

proteins was confirmed by coimmunoprecipitation assays. Predicted

localizations of Paracoccidioides Gel1p partner proteins: SEPT

(Longtine & Bi, 2003), TUBA1 (Rodrigues et al., 2008), HSP90

(Cabezon et al., 2009), PAP (Bernard et al., 2002), EIF3B

(Albuquerque et al., 2008), MPH2 (Day et al., 2002), PK (Cabezon

et al., 2009), GLDC (Albuquerque et al., 2008), PDHB (Rodrigues

et al., 2008), SPT6 (Bortvin & Winston, 1996), QDE2 (Martienssen

et al., 2005), and RPB2 (Wang et al., 1995). Predicted localizations of

Paracoccidioides Gel2p partner proteins: CPCB (Valerius et al., 2007),

ITS3 (Vancurova et al., 1999), MAD2B (Iouk et al., 2002), and SAMB

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Supporting Information

Additional Supporting Information may be found in the

online version of this article:

Fig. S1. Characterization of the Paracoccidioides beta-1,3-

glucanosyltransferase family.

Fig. S2. Phylogenetic analysis of proteins belonging to the

GH72 family by the Neighbor-Joining method.

Fig. S3. Western blot analysis.

Fig. S4. Localization of Gel1p in Paracoccidoides, Pb18

yeast cells by immunoelectron microscopy.

Fig. S5. Detection of Gel2p in Paracoccidioides, Pb18 yeast

cells by immunoelectron microscopy.

Fig. S6. Detection of Gel1p in Paracoccidioides yeast cells

and nuclei by immunofluorescence microscopy and wes-

tern blot analysis.

Please note: Wiley-Blackwell is not responsible for the

content or functionality of any supporting materials sup-

plied by the authors. Any queries (other than missing

material) should be directed to the corresponding author

for the article.



185

Supp. Fig. 1. Characterization of the Paracoccidioides beta-1,3-glucanosyltransferase family. Comparison of the deduced amino acid sequences of Gel1p, Gel2p and

Gel3p of Pb01 (A) and Pb18 (B). Asterisks indicate amino acid identity and dots represent conserved substitutions. The predicted signal sequences at the N-terminal

region are indicated by white letters in a black box. The bold letters are the GH72 domain [InterPro: IPR004886], while the catalytic regions [InterPro: IPR017853] are

underlined. Conserved catalytic motifs (CCM) are indicated above the amino acid sequences and this motif contains the conserved glutamate residues (E). The Cys-Box

domain [InterPro: IPR012946] of Paracoccidioides Gel3p is boxed (dotted lines). Predicted glycosylphosphatidylinositol anchor sites are boxed (solid lines).

186

Supp. Fig. 2. Phylogenetic analysis of proteins belonging to the GH72 family by the Neighbor-Joining

method. Paracoccidioides glucanosyltransferase proteins are indicated by the grey background. The bar

marker indicates the genetic distance, which is proportional to the number of amino acid substitutions. The

species are abbreviated using a two letter code and the sequences accession numbers

(http://www.ncbil.nlm.nih.gov) are in parentheses as follows: Pb01: Paracoccidioides, strain Pb01; (Gel1:

XP_002794189; Gel2 XP_002793109 and Gel3 XP_002792932:) ; Pb18 : Paracoccidioides ,strain Pb18

(Gel1: EEH47188; Gel2: EEH48997 and Gel3: EEH48839) Sc, Saccharomyces cerevisiae (Gas1: CAA39809;

Gas2: AAB67255; Gas3: AAP63931; Gas4: AAP63932; Gas5: AAP63933); Nc, Neurospora crassa (Gel1:

CAD21369; Gel2: CAD70378; Gel3: CAD70754; Gel4: CAD21216) ; Af, Aspergillus fumigatus (Gel1:

AAC35942 ; Gel2: AAF40139; Gel3: AAF40140; Gel4: XP_749664; Gel5: XP_746993; Gel6: XP_754302;

Gel7: XP_751119); Cp, Coccidioides posadasii (Gel1: AAL09458); Sp, Schizosaccharomyces pombe (Gas1:

CAC00550; Gas2: NP_596053; Gas4: CAB46773; Gas5: CAB11192); Ca, Candida albicans (Phr1:

AAA68196; Phr2: AAB80716; Phr3: AAF31451); Cm, Candida maltosa (Epd1: BAA21103; Epd2:

BAA32730). InterProScan (http://www.ebi.ac.uk/Tools/InterProScan/) was used to discriminate the subfamilies

GH72+ and GH72-.

http://www.ncbil.nlm.nih.gov/

http://www.ebi.ac.uk/Tools/InterProScan/

187

Supp. Fig. 3.Western blot analysis. A total of 20 µg of protein extracted from Paracoccidioides mycelia

was fractionated by SDS-PAGE (12%) and transferred to a nitrocellulose membrane. Protein extracts of

mycelia, Pb01 (A) and Pb18 (B) are shown after reaction with polyclonal antibodies against the proteins: 1-

Gel1p; 3- Gel2p. Lanes 2 and 4: reaction to the pre immune serum. The blots were reacted with the rabbit

polyclonal antibodies coupled to alkaline phosphatase and developed with 5-bromo-4-chloro-3-

indolylphosphate/nitrobluetetrazolium (BCIP/NBT).

188

Supp. Fig. 4. Localization of Gel1p in Paracoccidoides, Pb18 yeast cells by immunoelectron microscopy. (A and B) Gold particles are observed at the fungus

cell wall (w) (triple arrowheads) and in the nucleus (n) (double arrowheads). The nuclear membranes are indicated by the arrows. (C) Negative controls were exposed

to the rabbit preimmune serum in Pb18 yeast cells. v: vacuole.

189

Supp. Fig. 5. Detection of Gel2p in Paracoccidioides, Pb18 yeast cells by immunoelectron microscopy. (A and B) Gold particles are observed at the fungus

cell wall (w) (triple arrowheads). (C) Negative control was exposed to the rabbit preimmune serum in Pb18 yeast cells. v: vacuole.

190

Supp. Fig. 6. Detection of Gel1p in Paracoccidioides yeast cells and nuclei by immunofluorescence

microscopy and western blot analysis. Immunofluorescence analysis showing Gel1p of Paracoccidioides in

yeast cells using anti-Gel1p (A) and rabbit pre immune serum as a negative control (B). Immunofluorescence

analysis showing Gel1p of Paracoccidioides in nuclei using anti-PbGel1p (C) and rabbit pre immune serum as

a negative control (D). Cells and nuclei were incubated with anti-rabbit IgG coupled to fluorescein

isothiocyanate (FITC) and with 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) to nuclear staining. From left to right:

bright field; FITC; DAPI and image overlay. Nuclei protein extracts were fractionated by SDS-PAGE (12%)

and transferred to a nitrocellulose membrane (E). Gel1p of Paracoccidioides was detected after reaction with

polyclonal antibody against the protein Gel1p (lane-1) and using the pre immune serum as a negative control

(lane-2). The blots were developed with using the enhanced chemioluminescence western blotting detection and

revealed a single protein specie of 46 kDa (indicated by arrow).



192

PERSPECTIVAS

Privação de glicose

Realizar ensaios de atividade enzimática das proteínas isocitrato liase (Icl) e

malato sintase (Mls) em condições controle e privado de glicose;

Realizar análises in silico em Paracoccidioides para encontrar homólogos de

reguladores transcricionais de privação de glicose e de fontes não-fermentáveis

amplamente descritos para S. cerevisae;

Silenciar a expressão de algum destes alvos de Paracoccidioides pela técnica de

RNA-antisentido e caracterizar as respostas em meios de cultura privados de

glicose ou com outras fontes de carbono.

Hipóxia

Realizar análise proteômica de Paracoccidioides cultivado em condições de

normóxia (níveis atmosféricos) e hipóxia (1% de O2 e 5% CO2) por

cromatografia líquida bi-dimensional acoplada à espectrometria de massas

(NanoUPLC-MSE) nos tempos de 12 e 24 h;

Confirmar se há expressão diferencial de genes representantes da via do

ergosterol em condições de normóxia (níveis atmosféricos) e hipóxia (1% de O2

e 5% CO2) por PCR em tempo real;

Verificar se há expressão diferencial do transcrito e proteína PbSrbA em

condições privadas ou não do íon ferro por PCR em tempo real e western blot;

Silenciar a expressão da PbsrbA pela técnica de RNA-antisentido e caracterizar

as respostas dos transformantes em condições de hipóxia ou não;

Realizar análise proteômica da linhagem selvagem e silenciada para srbA de

Paracoccidioides por cromatografia líquida bi-dimensional acoplada à

espectrometria de massas (NanoUPLC-MSE) na tentativa de listar grupos de

proteínas reguladas por este fator de transcrição.

194

CONSIDERAÇÕES FINAIS

A doença causada pelo fungo patogênico humano Paracoccidioides, a

paracoccidioidomicose (PCM), caracteriza-se como uma enfermidade de alta

prevalência e morbidade, endêmica da América Latina, desde o sul do México e

América central até a Argentina. A infecção ocorre quando propágulos da forma

miceliana do fungo são inalados pelo hospedeiro e, ao atingirem os pulmões, devido

principalmente a mudança de temperatura, transitam para a forma parasitária do fungo,

a leveduriforme. Neste ambiente, uma das primeiras linhas de defesa do fungo são os

macrófagos residentes nos pulmões, considerados pobres em aminoácidos e nutrientes

tais como a glicose. Durante a infecção, o fungo também atingir a corrente sanguínea e

gânglios linfáticos, onde se dissemina pelo organismo do hospedeiro caracterizando a

patogênese como sistêmica. Órgãos tais como fígado, rins e baço podem ser

colonizados onde o fungo enfrenta diferentes tensões de oxigênio, menores quando

comparadas aos níveis atmosféricos, por exemplo. Neste contexto, a fim de estabelecer

a infecção o patógeno enfrenta diferentes estresses a serem vencidos para o sucesso da

patogênese. Apesar do tratamento existente, vários fatores ainda interferem na eficiência

deste processo o que ainda caracteriza a PCM como uma doença relevante, com alta

morbidade e necessidade de estudos que envolvam o patógeno na busca por estratégias

co-adjuvantes no tratamento para torná-lo mais eficiente, em menor período de tempo e

diminuída reação do hospedeiro, principalmente nas formas mais severa do doença. A

PCM, apesar de não ter sido associada à doenças imunossupressoras, tem sido descrita,

em elevada porcentagem, em co-infecção com tuberculose (28,4%) e HIV (4,9%)

mostrando uma alta taxa de mortes (14,7%) entre a população estudada. Estes aspectos

demonstram a severidade da PCM e a possibilidade de co-infecções que interferem no

tratamento e prognóstico da doença.

A caracterização das respostas de Paracoccidioides, isolado Pb01, sob

condições de privação de glicose e também dos efeitos da hipóxia nas células deste

mesmo organismo se tornam relevantes neste sentido. Estudos da biologia do fungo em

condições que simulam as encontradas pelo patógeno durante a infecção podem resultar

na elucidação de potenciais fatores de virulência que, em um futuro próximo,

contribuirão nas estratégias de erradicação do fungo durante a infecção desde que os

mecanismos de adaptação do patógeno no hospedeiro serão cada vez mais conhecidos.

195

Neste trabalho, as respostas de Paracoccidioides às condições de privação de

glicose e hipóxia foram estudadas auxiliando de forma significante no conhecimento da

biologia e estratégias de adaptação do fungo nos microambientes do hospedeiro. As

respostas do Pb01 sob condições de privação de glicose foram obtidas a partir de

abordagens em larga escala tanto transcricional quanto proteômica mostrando um mapa

detalhado das respostas do fungo frente à esta condição. O metabolismo do patógeno foi

alterado sendo que as principais mudanças detectadas se concentraram no fluxo de

carbono para produção de etanol e gliconeogênese modulando vias tais como a beta-

oxidação e ciclos do glioxilato e ácido tricarboxílico na tentativa de adaptação do

micro-organismo durante privação nutricional. Além disso, ensaios adicionais tais como

dosagem de etanol, peso seco celular e ensaios de interação macrófago-fungo

contribuíram ainda mais para o detalhamento das respostas do fungo à condição de

privação de glicose.

Outro aspecto tratado de forma ampla neste trabalho foram as respostas

hipóxicas de Paracoccidioides o que tornaram o estudo ainda mais relevante no

contexto da patogênese causada por este micro-organismo. Os resultados mostraram que

assim como em outros fungos patogênicos humanos, além da presença de um regulador

principal da resposta à condição de hipóxia, a proteína SrbA, há mudanças no

metabolismo geral das células frente à esta condição. Ensaios de complementação

gênica utilizando a linhagem mutante para o gene srbA de A. fumigatus mostraram que a

PbsrbA é funcional neste fungo. A susceptibilidade à drogas antifúngicas e o

crescimento em meio depletado do íon ferro mostraram que a PbsrbA possivelmente

está envolvida na regulação de genes da via do ergosterol e homeostase de ferro. Além

disso, análises proteômicas em gel bidimensional em condições que simulam hipóxia

confirmaram que o fungo realmente responde à esta condição regulando vias

metabólicas importantes no processo de adaptação. Contudo, a biologia de

Paracoccidioides pode ser ainda mais elucidada concernente a aspectos que até o

momento não tinham sido estudados de forma tão detalhada e que, com certeza,

contribuirão para futuras estratégias de combate ao patógeno.



197

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Transcritoma e proteoma do fungo Paracoccidioides · Ao Prof. Dr. Robert A. Cramer e seus alunos Dawoon, Arsa, Kristin e Kelly por me darem suporte no laboratório durante o doutorado