u QUARTO INTERLÚDIO – FILOCTETES É TRATADO POR MACÁON 114

Reprodução de um espelho de bronzeetrusco, Bolonha, Museu Cívico. 450 a.C.Filoctetes (barbado, com o himácio sobreos ombros) segura um bastão com a suamão direita e o seu arco com a esquerdae levanta para trás o seu pé feridoesquerdo para que Macáon ponha umcurativo. Ao pé de Filoctetes, há umaserpente. Fonte: LIMC (1994); MÜLLER,(1994).

Copa de prata romana, Copenhague, Museu Nacional.I século a.C. Filoctetes está sentado, apoiado em umrapaz, enquanto outro lava a sua ferida. Há ainda umterceiro rapaz que segura uma bacia. Fonte: LIMC(1994).

Camafeu etrusco de cornalina,Londres, Museu Britânico. Cerca450 a.C. Filoctetes, imberbe, nu,segurando um bastão, levanta o seupé esquerdo para Macáon, sentado,que lhe aplica uma atadura. Fonte:LIMC (1994).

u DISCUSSÃO 115

5. Discussão Haja vista a conspicuidade dos sangramentos nos envenenamentos humanos por serpentes Bothrops

jararaca, nesta investigação se analisaram alguns aspectos relativos às plaquetas – dando-se especial

relevância ao estudo das alterações cinéticas, da secreção, da expressão de receptores da membrana

plasmática e da função plaquetárias – e o seu envolvimento na gênese dos distúrbios hemorrágicos

característicos deste envenenamento. Para tanto, o coelho foi utilizado como modelo experimental e o

estudo das alterações plaquetárias foi conduzido até 144 h após o envenenamento.

A desestabilização da hemostasia por componentes dos venenos ofídicos é a origem dos distúrbios

hemorrágicos que ocorrem em pacientes e modelos experimentais de envenenamento. No modelo

apresentado aqui, os coelhos que receberam o veneno de B. jararaca apresentaram consumo de

plaquetas e fibrinogênio e, deste modo, reproduziram o quadro laboratorial de distúrbio hemostático do

envenenamento botrópico (CARDOSO et alii, 1993; KAMIGUTI et alii, 1986; SANO-MARTINS et alii,

1995; SANTORO et alii, 1994). Todavia, os coelhos não apresentaram os sinais clínicos de distúrbio

hemostático que caracterizam o envenenamento botrópico no homem, tais como o aparecimento

petéquias, equimoses e gengivorragia (CARDOSO et alii, 1993). Tampouco houve diferenças

significativas entre os valores do eritrograma do grupo experimental e controle ao longo do tempo, que

sugerisse a perda subclínica ou oculta de sangue nos animais envenenados. Ao se administrar doses

maiores deste veneno, pela via subcutânea ou intramuscular, os coelhos também não apresentam sinais

clínicos que evidenciem distúrbios hemostáticos e morrem antes deles surgirem (AMORIM et alii, 1951;

BRAZIL & PESTANA, 1909). De fato, a escolha da via intravenosa para a administração do veneno aos

coelhos – em oposição à via subcutânea ou intramuscular, mais habitualmente utilizadas pelas

serpentes para a inoculação do veneno no homem – foi baseada em dados preliminares em que altas

doses de veneno injetadas subcutaneamente promoviam a morte dos animais, sem haver, contudo, o

estabelecimento de um quadro laboratorial de distúrbio hemostático. Ademais, pela via intravenosa, a

ação do veneno na desestabilização da hemostasia é instantânea e o quadro laboratorial é reproduzível,

permitindo, outrossim, que um menor número de animais seja utilizado.

Os coelhos são considerados animais resistentes ao veneno da B. jararaca, quando este é inoculado

pela via intramuscular (ARAUJO & BELLUOMINI, 1960-62), fato que explica o porquê do coelho receber

doses altas de veneno por esta via e não apresentar distúrbios hemostáticos. Possivelmente, a presença

de inibidores próprios do tecido subcutâneo explique tal resistência. Inversamente, tomando-se a dose

necessária para causar hipofibrinogenemia aos animais, o coelho é bastante sensível à administração

intravenosa do veneno de B. jararaca, quando comparado ao cão: a dose máxima que pode ser

administrada ao coelho é de 70 µg/kg, enquanto que o cão consegue receber doses de até 100 µg/kg

(SANO-MARTINS et alii, 1995; SANTORO et alii, 1994).

u DISCUSSÃO 116

A hipofibrinogenemia ou a afibrinogenemia é observada amiúde em envenenamentos ofídicos,

inclusive nos botrópicos, que se traduz pelo prolongamento no tempo de coagulação dos pacientes

(BAUAB et alii, 1994; CARDOSO et alii, 1993; HAAD, 1981; JORGE et alii, 1995; KOUYOUNDJIAN &

POLIZELLI, 1988, 1989; KOUYOUNDJIAN et alii, 1986; MARUYAMA et alii, 1990; MILANI et alii, 1997;

OTERO et alii, 1996; RIBEIRO & JORGE, 1997). A hipofibrinogenemia observada nos coelhos do grupo

experimental se normalizou somente em 24 h. Semelhantemente, em cães que receberam uma dose de

veneno de B. jararaca suficiente para causar afibrinogenemia, a recuperação dos níveis de fibrinogênio

ocorria ao redor de 24 h após a administração do soro antibotrópico (ROSENFELD et alii, 1958). Nos

coelhos envenenados, não houve a administração de antiveneno, porém os níveis plasmáticos do

fibrinogênio se recuperaram no mesmo intervalo de tempo do que os cães que receberam antiveneno; a

dose administrada do veneno de B. jararaca aos coelhos produziu apenas hipofibrinogenemia,

diversamente dos cães que apresentaram afibrinogenemia, o que explica a rápida recuperação dos

níveis de fibrinogênio no coelho. Por outro lado, em cães que receberam uma dose de veneno de B.

jararaca capaz de induzir afibrinogenemia (100 µg/kg), mas que não receberam soro antibotrópico, os

níveis de fibrinogênio alcançaram os valores dos cães controles somente 72 h após a administração do

veneno (SANO-MARTINS et alii, 1995), confirmando que a rápida recuperação dos níveis de

fibrinogênio no coelho se deveu ao fato da hipofibrinogenemia não haver sido tão acentuada. Em um

modelo experimental de envenenamento, semelhante ao apresentado aqui, demonstrou-se que

concomitante à diminuição do fibrinogênio há um aumento dos PDF na circulação (SANTORO et alii,

1994). CRABTREE & KANT (1982) observaram que após 12 a 16 h da desfibrinogenação de ratos com

“ancrod” – uma enzima trombina-símile purificada do veneno de Calloselasma rhodostoma – ocorria

um aumento relativo ao redor de 12 vezes na concentração dos mRNA de todas as cadeias do

fibrinogênio no fígado, devido à possível estimulação dos hepatócitos pelos PDF circulantes; esta

evidência explica a rápida síntese do fibrinogênio nos coelhos envenenados e a célere recuperação dos

níveis circulantes do fibrinogênio.

A enzima trombina-símile do veneno de B. jararaca apresenta uma baixa atividade coagulante sobre

o fibrinogênio de coelho, tanto in vitro como in vivo (SANTORO & SANO-MARTINS, 1993; STOCKER,

1978). Dados in vitro mostraram, contudo, que a atividade coagulante do veneno de B. jararaca era

cerca de 4 vezes maior no plasma de coelho do que no plasma humano. Quando os plasmas eram

tratados com heparina, os valores da atividade coagulante se invertiam, de modo que este veneno perdia

a atividade coagulante sobre o plasma de coelho, mas ainda mantinha cerca de 60% da sua atividade

original no plasma humano (SANTORO & SANO-MARTINS, 1993). Tais resultados evidenciavam que os

componentes trombina-símiles do veneno da B. jararaca tinham pouca atividade coagulante no plasma

u DISCUSSÃO 117

de coelho e que os componentes pró-coagulantes (ativadores de fator II e X) eram os responsáveis

exclusivos pela coagulação deste plasma (SANTORO & SANO-MARTINS, 1993).

Sob a ação das enzimas trombina-símiles do veneno da B. jararaca, a cadeia Aα do fibrinogênio é

hidrolisada entre a Arg16 e a Gly17 e libera-se o fibrinopeptídeo A (BLOMBÄCK, 1958; BLOMBÄCK et

alii, 1957; NISHIDA et alii, 1994; SERRANO et alii, 1998, 2000). Com a liberação do fibrinopeptídeo A

do fibrinogênio, forma-se o monômero I da fibrina, que posteriormente se associa linearmente para

formar uma rede de fibrina altamente permeável e muito susceptível à ação da plasmina (STOCKER &

MEIER, 1988). KLÖCKING et alii (1987) observaram que a enzima trombina-símile do veneno de B.

atrox (batroxobina) também liberava tPA do endotélio vascular de suínos, porém estes resultados não

foram confirmados ao se utilizarem células endoteliais humanas (KIRSCHBAUM et alii, 1988). Da

mesma forma, KAMIGUTI et alii (1991a) não observaram uma variação acentuada nos níveis de tPA e

PAI-1 circulantes em pacientes envenenados por serpentes do gênero Bothrops; estes resultados eram

semelhantes aos observados no envenenamento pela Daboia russelli, em que a rápida degradação da

fibrina pela plasmina não é causada pela liberação de ativadores fibrinolíticos da parede vascular

(WOODHAMS et alii, 1989). Corroborando estas observações, pacientes que receberam infusão

intravenosa ou subcutânea de “ancrod” não apresentaram um aumento da concentração plasmática do

ativador do plasminogênio do tipo uroquinase ou do tPA, evidenciando que a rápida fibrinólise que

ocorria era mediada pela própria interação entre o plasminogênio e os ativadores de plasminogênio

ligados à fibrina solúvel (DEMPFLE et alii, 2000, 2001; PRENTICE et alii, 1993).

Distintamente, sob a ação da trombina, tanto a cadeia Aα como a cadeia Bβ do fibrinogênio são

hidrolisadas – liberando, respectivamente, os fibrinopeptídeos A e B – e forma-se o monômero de

fibrina II. A trombina também hidrolisa o fator XIII, que na sua forma ativada estabiliza os monômeros

II por meio de ligações covalentes (STOCKER & MEIER, 1988). A fibrina formada sob a ação da

trombina é mais compacta e mais lentamente degradada pela plasmina (STOCKER, 1978; ZAJDEL et alii,

1975).

Em muitos envenenamentos ofídicos, esta ativação secundária do sistema fibrinolítico, com a

formação de plasmina circulante, foi comprovada indiretamente pelo consumo da α2-antiplasmina

plasmática, o inibidor natural específico da plasmina (CARDOSO et alii, 1993; MARUYAMA et alii, 1990;

PHILLIPS et alii, 1988; SANO-MARTINS et alii, 2001; THAN-THAN et alii, 1988; YAMASHITA et alii,

1996). A ativação instantânea do sistema fibrinolítico não permite que a fibrina circulante se deposite

no leito vascular e cause tromboses e isquemias em órgãos. Realmente, EGBERG & LJUNGQUIST (1973)

observaram que após 30 min da administração de batroxobina a cães não havia o depósito de fibrina no

pulmão, rim ou fígado dos animais, mostrando a eficiência do sistema fibrinolítico na degradação da

fibrina instável. Corroborando esta observação, em estudos experimentais de desfibrinogenação de cães

u DISCUSSÃO 118

com a enzima trombina-símile do veneno da B. jararaca, havia a morte dos animais se a plasmina era

inibida pela administração de aprotinina, demonstrando que o sistema fibrinolítico desempenha um

papel fundamental no impedimento da formação de depósitos de fibrina em leitos vasculares e na

prevenção da morte dos animais (KELEN et alii, 1978).

Como citado anteriormente, o consumo do fibrinogênio nos envenenamentos humanos pela B.

jararaca é devido em grande parte aos componentes trombina-símiles (SANTORO & SANO-MARTINS,

1993). Contudo, no coelho, é a geração de trombina intravascular que causa o consumo do fibrinogênio

e a formação de fibrina estável na circulação, diversamente da formação de fibrina não estável induzida

pela ação da enzima trombina-símile em humanos (SANTORO et alii, 1994). Malgrado o consumo de

fibrinogênio ser devido indiretamente aos componentes pró-coagulantes do veneno de B. jararaca

(SANTORO & SANO-MARTINS, 1993), a geração de trombina intravascular nos coelhos foi branda, pois

não houve consumo acentuado de ATIII, o inibidor plasmático natural da trombina. Todavia, a

quantidade de trombina gerada foi capaz de causar a hipofibrinogenemia. Para a determinação dos

níveis plasmáticos da ATIII nos coelhos do grupo controle e experimental, empregou-se um ensaio

imunoenzimático (ELISA), baseado na detecção antigênica com anticorpos policlonais obtidos de

caprinos imunizados com ATIII humana. Os níveis plasmáticos em seres humanos de ATIII (2,4 µM) e

protrombina (1,4 µM) são muito próximos (BUTENAS et alii, 1999; MURANO et alii, 1980). Como a

ATIII forma complexos estequiométricos de 1:1 com a trombina (ROSENBERG & DAMUS, 1973) e não

houve consumo de ATIII no grupo experimental, pode-se inferir que a geração de trombina não foi

intensa o suficiente para diminuir os níveis plasmáticos de ATIII. Durante muitos envenenamentos

ofídicos, inclusive naqueles causados por serpentes em cujos venenos estão presentes componentes pró-

coagulantes, os níveis de protrombina e ATIII não decrescem ou diminuem brandamente (ARONSON,

1988; DEMPFLE et alii, 1990; EDGAR et alii, 1980; MARUYAMA et alii, 1990; MBA & ONYEMELUKWE,

1989; MCNALLY et alii, 1993; PHILLIPS et alii, 1988; RAPAPORT et alii, 1997; SANTORO et alii, 1994;

THAN-THAN et alii, 1988). ARONSON (1988) e RAPAPORT et alii (1997) observaram que a infusão do

ativador de fator X do veneno de D. russelli (RVV-X) em coelhos causava um consumo acentuado dos

níveis plasmáticos do fator X, porém um consumo pouco intenso dos níveis da protrombina e do

fibrinogênio plasmáticos. De modo diverso do que ocorre na ativação da cascata da coagulação em uma

superfície celular, em que os fatores dependentes da vitamina K estão ligados à superfície fosfolipídica

e mais protegidos da ação dos inibidores plasmáticos, na ativação do fator X pelo RVV-X em fase

líquida (plasma) a ATIII prontamente inibe o fator Xa e não há consumo da protrombina e do

fibrinogênio (RAPAPORT et alii, 1997). Em coelhos em que se fazia a imunodepleção da ATIII,

anteriormente à infusão de RVV-X, ocorria a diminuição dos níveis plasmáticos de fibrinogênio e

protrombina, além do surgimento de trombocitopenia (RAPAPORT et alii, 1997). Todos estes resultados

u DISCUSSÃO 119

apontam em direção a uma diferença entre a ativação fisiológica da cascata da coagulação, e.g. em uma

lesão tecidual, e a ativação induzida pelos ativadores de fator X e II dos venenos na fase líquida

plasmática. Isto explicaria a ausência de consumo de ATIII, no presente estudo, e da protrombina

(SANTORO et alii, 1994) após a administração do veneno da B. jararaca a coelhos. Apesar de não ter

ocorrido o consumo de ATIII nos coelhos do grupo experimental, a trombina intravascular foi

engendrada, porquanto houve consumo do fibrinogênio plasmático nestes animais.

Os níveis do complexo trombina-ATIII (TAT) e dímeros D estão aumentados em pacientes

envenenados pelas serpentes B. jararaca (KAMIGUTI et alii, 1992; MARUYAMA et alii, 1990),

mostrando que mesmo em seres humanos os ativadores do fator II e X desempenham um papel

importante na geração de trombina intravascular, em parte responsável pelo consumo do fibrinogênio

observado neste envenenamento. No coelho, como visto anteriormente, somente estes ativadores

seriam os responsáveis pelo consumo do fibrinogênio (SANTORO & SANO-MARTINS, 1993; SANTORO et

alii, 1994) e pela geração de fibrina estável. A delonga na degradação das redes de fibrina estáveis

favoreceria o aparecimento de trombos, como observado, no presente trabalho, no pulmão e rim dos

coelhos envenenados. A análise histopatológica dos coelhos do grupo experimental revelou alterações

semelhantes àquelas descritas por AMORIM et alii (1951) para o envenenamento botrópico: os coelhos

apresentaram depósitos de trombos de fibrina e plaquetas no pulmão e depósitos de fibrina no rim; a

natureza dos depósitos foi evidenciada nos cortes histológicos quer pela utilização de técnicas especiais

de coloração de fibrina, quer pela utilização de anticorpos específicos para o fibrinogênio e GPIIb-IIIa

(plaquetas). Há também a ocorrência de depósitos de fibrina e plaquetas no rim e no pulmão em outros

envenenamentos ofídicos, sejam experimentais, sejam humanos (AMORIM et alii, 1951; MILANI et alii,

1997; MYINT-LWIN et alii, 1985; RECHNIC et alii, 1962; SCHAEFFER et alii, 1984; THAN-THAN et alii,

1989); é interessante observar que todas as serpentes que causam tais depósitos durante os

envenenamentos apresentam componentes pró-coagulantes em seus venenos, capazes de ativar o fator

X ou o fator II, e que, outrossim, engendram trombina intravascular. De fato, quando AMORIM et alii

(1951) administraram o veneno de Crotalus durissus terrificus a coelhos, não havia a presença de

trombos pulmonares, diferentemente do que era observado após a administração do veneno de B.

jararaca. AMORIM et alii (1951) propõem, inclusive, que a presença de depósitos de fibrina no pulmão

serviria para o diagnóstico diferencial entre o envenenamento botrópico e crotálico, porquanto este

último não apresenta tais alterações histopatológicas no pulmão. Tanto o veneno de B. jararaca como o

veneno de Crotalus durissus terrificus apresentam enzimas trombina-símiles, porém somente o

primeiro apresenta componentes ativadores de fator II e X, que são os responsáveis pela geração de

trombina intravascular e pelo consumo de fibrinogênio no coelho (NAHAS et alii, 1979; SANTORO &

SANO-MARTINS, 1993; SANTORO et alii, 1994). Dessarte, somente os venenos que possuem

u DISCUSSÃO 120

componentes pró-coagulantes são capazes de causar o depósito de plaquetas e fibrina no pulmão e rins.

Em um estudo da distribuição de trombos em autópsias de pacientes humanos que apresentaram

síndrome de coagulação intravascular disseminada, observou-se que 100% dos casos apresentavam

microtrombos no pulmão e 76% no rim (SHIMAMURA et alii, 1983). Esta observação confirma a

presença freqüente de trombos no pulmão e rim de pacientes em diversas situações patológicas que

causam a geração de trombina intravascular. Ao tentar desvendar a razão do pulmão ser um órgão em

que há amiúde a deposição de plaquetas em situações de ativação plaquetária, valendo-se de plaquetas

e fibrinogênio marcados radioativamente, BERGENTZ et alii (1972) observaram que a infusão

intravenosa de trombina (pela veia cava) em cães causava um maior depósito de plaquetas marcadas no

pulmão do que no rim; inversamente, quando a trombina era administrada pela via intraarterial (no arco

aórtico), as plaquetas se acumulavam mais no rim do que no pulmão. A fibrina se acumulava

primariamente no rim e, se fosse administrada pela via intravenosa, também no pulmão. Tais resultados

mostravam que a razão da maior acumulação de plaquetas no pulmão é tanto a situação do pulmão

como o primeiro leito vascular a ser alcançado pelo sangue venoso, como também uma alta afinidade

das plaquetas pelo pulmão. De acordo com os achados histopatológicos do presente estudo, BERGENTZ

et alii (1972) também não observaram depósitos de plaquetas e fibrina no baço e no fígado.

Dos elementos figurados sangüíneos, as plaquetas foram as células que sofreram alterações

quantitativas e qualitativas mais marcantes no envenenamento, quando comparados os coelhos

envenenados e controles. Houve um declínio acentuado, de cerca de 50%, na contagem plaquetária dos

coelhos envenenados, com relação ao grupo controle, que perdurou por 24 h após a administração do

veneno. Posteriormente, o número de plaquetas circulantes se restabeleceu, alcançando os níveis do

grupo controle em 120 h. Em um estudo anterior, observou-se que a contagem plaquetária de coelhos

injetados intravenosamente com veneno de B. jararaca diminuía na mesma intensidade que o presente

estudo, embora a diferença entre a contagem plaquetária do grupo experimental e controle existisse

somente até 3 h após o envenenamento (SANTORO et alii, 1994). Aparentemente, o protocolo de

marcação das plaquetas de coelho com biotina intensificou a duração da trombocitopenia nos animais

envenenados. Todavia, a explicação para tal fenômeno não é aparente. A trombocitopenia moderada é

um achado comum em vários envenenamentos ofídicos, mas não é infreqüente ocorrerem

trombocitopenias mais graves (CARDOSO et alii, 1993; KAMIGUTI et alii, 1986; MARUYAMA et alii,

1990; MCNALLY et alii, 1993; MILANI et alii, 1997; MYINT-LWIN et alii, 1985; NAHAS et alii, 1975;

PHILLIPS et alii, 1988; RECHNIC et alii, 1962; SANO-MARTINS et alii, 1995, 1997; SANTORO et alii,

1994; SCHAEFFER et alii, 1986; THAN-THAN et alii, 1988; WANG et alii, 1994).

A causa da trombocitopenia é provavelmente múltipla no envenenamento pela B. jararaca

(SANTORO et alii, 1994). A primeira causa seria a trombina intravascular, gerada pelos componentes

u DISCUSSÃO 121

pró-coagulantes existentes no veneno da B. jararaca (KAMIGUTI et alii, 1991a; MARUYAMA et alii,

1990; NAHAS et alii, 1975), que ativaria as plaquetas e as retiraria da circulação. A trombina é o mais

potente dos agonistas plaquetários conhecidos. A administração intravenosa da trombina causa

trombocitopenia, hipofibrinogenima e o acúmulo de plaquetas e fibrina no pulmão e rins (ALLEN et alii,

1964; BERGENTZ et alii, 1972; CHIU et alii, 1997; KONSTAM et alii, 1989; LUTERMAN et alii, 1977;

MORIAU et alii, 1974; MUSTARD et alii, 1966). É interessante observar que se a quantidade de trombina

administrada a animais é suficiente unicamente para induzir um declínio brando ou moderado da

contagem plaquetária, há o retorno total das plaquetas à circulação em cerca de meia hora (ADELSON et

alii, 1960; CHIU et alii, 1997; KONSTAM et alii, 1989; MUSTARD et alii, 1966; TOH et alii, 1993).

Dentre os demais motivos que poderiam causar a trombocitopenia no envenenamento, poderia-se

citar a presença de componentes com atividade pró-agregante plaquetária no veneno da B. jararaca

(PA-BJ, botrocetina e trombolectina). Alguns autores chegaram mesmo a citar que a trombocitopenia

observada em envenenamentos por vários gêneros de serpente, mesmo aquelas que contêm ativadores

de protrombina, era devida à ação dos componentes com atividade pró-agregante plaquetária e não à

formação de trombina intravascular, porquanto a neutralização da atividade da trombina com PPACK

ou heparina não obstava a trombocitopenia (OUYANG & TENG, 1978; RECHNIC et alii, 1962;

SCHAEFFER et alii, 1986). No entanto, a trombocitopenia induzida pela Pseudonaja textilis, cujo veneno

contém um ativador de protrombina, era totalmente coibida pela administração prévia de heparina

(TIBBALLS et alii, 1992). Da mesma forma, NAHAS et alii (1975) observaram que a administração

prévia de heparina a cães injetados intravenosamente com o veneno de B. jararaca conseguia inibir

totalmente o desenvolvimento de trombocitopenia, embora ainda houvesse o consumo do fibrinogênio.

Dessarte, os componentes pró-coagulantes do veneno da B. jararaca desempenham uma ação

incontestável na indução de trombocitopenia durante o envenenamento.

A participação in vivo da trombolectina e da PA-BJ no consumo plaquetário durante o

envenenamento pela B. jararaca ainda não foi descrita, porém é bem conhecido que a administração de

botrocetina a cães, ratos e suínos é capaz de causar trombocitopenia, acompanhada de diminuição dos

níveis circulantes de vWF (BRINKHOUS et alii, 1981; SANDERS et alii, 1988, 1995). No presente estudo,

pôde-se avaliar a contribuição da botrocetina na indução da trombocitopenia no envenenamento pela B.

jararaca em coelhos. Os níveis de vWF plasmático não se reduziram após o envenenamento, sequer

nas três primeiras horas, quando a contagem plaquetária já atingira o seu nadir. Esta evidência

demonstra claramente que a botrocetina não causou a trombocitopenia observada nos coelhos do grupo

experimental. Ademais, KAMIGUTI et alii (1991a) observaram que os níveis plasmáticos do vWF em

pacientes envenenados pela B. jararaca estavam aumentados, consolidando as observações do presente

estudo de que durante o envenenamento botrópico não há consumo de vWF. Estes mesmos autores

u DISCUSSÃO 122

também investigaram a distribuição dos multímeros de vWF destes pacientes e observaram que não

havia diferença com a distribuição de indivíduos normais. Por outro lado, o veneno de B. jararaca

quando incubado com o plasma humano é capaz de degradar os multímeros do vWF, de maneira

análoga à clivagem causada pela ADAMTS13, a metaloproteinase responsável pela degradação

fisiológica dos multímeros de alta massa molecular do vWF (de estrutura molecular semelhante às

ADAMs dos venenos ofídicos) (FOSANG & SMITH, 2001; FUJIKAWA et alii, 2001; GERRITSEN et alii,

2001; JIA et alii, 1996; KAMIGUTI et alii, 1991a; LEVY et alii, 2001; ZHENG et alii, 2001). A causa do

aumento dos níveis plasmáticos do vWF não parece ser a lesão endotelial causada por proteases ou

hemorraginas do veneno de B. jararaca, uma vez que ratos que receberam o veneno total ou a

jararragina purificada não apresentaram variação dos níveis de vWF (KAMIGUTI et alii, 1991b). O

estresse induzido em pacientes humanos pela picada da B. jararaca foi considerado a causa do aumento

do vWF plasmático (KAMIGUTI et alii, 1991b), porém nossos dados não suportam tal conclusão, pois os

coelhos dos dois grupos receberam o mesmo tratamento e, no entanto, os coelhos do grupo controle não

apresentaram um aumento dos níveis plasmáticos do vWF nas três primeiras horas após a

administração da solução salina. O aumento dos níveis plasmáticos de vWF parece ter como causa a

secreção do vWF pelas células endoteliais estimulada pela trombina engendrada no grupo

experimental. Como observado por TOH et alii (1993), a geração de grandes quantidades de trombina

intravascular, causada pela administração concomitante de fator Xa e fosfolipídios, promove a secreção

dos corpúsculos de WEIBEL-PALADE das células endoteliais e o aumento dos níveis plasmáticos de

vWF. Deste modo, a geração de trombina intravascular induzida pelo veneno de B. jararaca é a causa

provável do aumento dos níveis circulantes de vWF em coelhos.

A lesão endotelial causada pelas hemorraginas também seria outro mecanismo que levaria ao

consumo plaquetário, como observado por QUEIROZ & SANTO NETO (1986). KAMIGUTI et alii (1991b)

demonstraram que ratos administrados com a jararragina, uma hemorragina do veneno de B. jararaca,

apresentavam trombocitopenia dose-dependente. Porém, a dose de veneno utilizada nos coelhos, no

presente estudo, foi capaz de causar trombocitopenia, sem a observação de manifestações hemorrágicas

macroscópicas, sugerindo que as lesões endoteliais são pouco importantes na indução da

trombocitopenia. Conclusões semelhantes foram obtidas por JOSHUA et alii (1964), utilizando doses de

veneno de Echis coloratus capazes de induzir trombocitopenia em cobaias, sem causar manifestações

hemorrágicas. GROTTO et alii (1969), do mesmo modo, observaram que após a administração da fração

hemorrágica do veneno de Vipera palestinae a cobaias, não ocorria trombocitopenia, apesar da

hemorragia generalizada. Por outro lado, MCKAY et alii (1970) descreveram alterações ultra-estruturais

de endotélio vascular após a administração da mesma fração hemorrágica de V. palestinae, em que

ocorriam adesão e agregação plaquetárias, sugerindo que esta seria uma das causas da trombocitopenia

u DISCUSSÃO 123

observada neste envenenamento. Torna-se evidente pelos dados destes autores que a lesão endotelial,

conquanto possa coexistir com a trombocitopenia, não é condição sine qua non para o desenvolvimento

da queda da contagem plaquetária observada nos envenenamentos ofídicos. No modelo experimental

apresentado aqui, não se investigou a presença de lesões endoteliais, contudo a ausência de dados

clínicos e laboratoriais que indicassem uma perda adicional de sangue no grupo experimental,

evidencia que a lesão endotelial, caso tenha ocorrido, foi de pouca monta na indução da

trombocitopenia observada.

Após a trombocitopenia ter se estabelecido no grupo experimental, as plaquetas que foram

consumidas não retornaram à circulação, como evidenciado pelo gráfico de sobrevivência plaquetária

em valores relativos e absolutos (Figura 36), mostrando que a ativação plaquetária induzida pelo

veneno de B. jararaca foi intensa o suficiente para causar o seqüestro definitivo das plaquetas, como

evidenciado por ADELSON et alii (1960). A análise das curvas de sobrevivência, expressas em números

absolutos de plaquetas circulantes, evidenciou que, após um consumo inicial na primeira hora de

envenenamento, a sobrevivência das plaquetas que ainda se mantinham na circulação estava

praticamente inalterada (Figura 36). Desta forma, o consumo de 50% das plaquetas circulantes foi igual

quer para as plaquetas marcadas com NHS-biotina quer para as não marcadas.

Habitualmente, as técnicas para a determinação da sobrevivência plaquetária utilizam isótopos

radioativos, e.g. o cromo-51 (51Cr), o índio-111 (111In), o gálio-67 (67Ga), o tecnécio-99 (99Tc), o

diisopropilfluorofosfato marcado com trício (3H-DFP) e a serotonina marcada com 14C (EBBE et alii,

1965; MAZOYER et alii, 1988a; REIMERS et alii, 1973a; SCHEFFEL et alii, 1977; WANLESS, 1984;

WISTOW et alii, 1978). Devido aos inconvenientes da manipulação de radioisótopos, outras técnicas

foram desenvolvidas para a análise da sobrevivência plaquetária, tais como a inibição irreversível da

ciclooxigenase ou da monoaminooxidase plaquetárias (CHAMBERLAIN et alii, 1989; STUART et alii,

1975). À medida que o citômetro de fluxo teve sua sensibilidade e especificidade apuradas, a utilização

de sondas fluorescentes foi empregada para a análise da sobrevivência plaquetária. Por exemplo, as

sondas PKH2, PKH26 e PKH67 se intercalam na bicamada lipídica e, desta forma, servem como

marcadores celulares estáveis (MICHELSON et alii, 1996; RAND et alii, 2002); outra sonda fluorescente é

o diacetato de 5-clorometilfluoresceína (CFMDA), que atravessa livremente as membranas celulares e

se transforma em um produto altamente fluorescente (BAKER et alii, 1997). Outra técnica que utiliza

indiretamente sondas fluorescentes para a mensuração da sobrevivência plaquetária e eritrocitária é a

marcação celular com a N-hidróxi-succinimida-biotina (NHS-biotina) e a reação ulterior com a avidina

ou a estreptoavidina ligadas a um fluorocromo. Esta é uma técnica relativamente nova (DALE &

NORENBERG, 1990; HEILMANN et alii, 1993), mas o número de trabalhos que a utilizam cresce

progressivamente devido à sua facilidade (AULT & KNOWLES, 1995; BAKER et alii, 1998; BERGER et

u DISCUSSÃO 124

alii, 1998; DALE et alii, 1995, 1996; FRANCO et alii, 1994; MANNING et alii, 1996; PENG et alii, 1994;

PIGUET et alii, 2001; RAND et alii, 2002; ROBINSON et alii, 2000; STOHLAWETZ et alii, 1999b).

Malgrado a marcação plaquetária com biotina ter sido relatada como uma causa de disfunção

plaquetária (MAGNUSSON et alii, 1998), os dados no presente estudo não demonstram tal observação,

como o demonstra a Figura 37. As plaquetas marcadas com NHS-biotina e estimuladas com trombina

ou colágeno agregaram normalmente (dados não mostrados) e expressaram os marcadores de ativação

plaquetária em sua superfície celular de maneira análoga às plaquetas incubadas com DMSO;

resultados semelhantes foram obtidos por RAND et alii (2002) ao marcarem plaquetas de coelhos com

NHS-biotina. Houve, contudo, após a reinfusão das plaquetas marcadas com NHS-biotina, uma queda

moderada do número de leucócitos circulantes, tanto nos animais do grupo controle como nos do grupo

experimental, que progressivamente foi aumentando, atingindo o seu zênite em 24 h. A normalização

da contagem de leucócitos somente ocorreu em 72 h. Com relação aos valores do eritrograma, os

valores da série eritrocitária do hemograma em 0 h, do grupo controle e experimental, estavam dentro

da faixa de valores de referência descritos para o coelho (KABATA et alii, 1991; RILEY et alii, 1992) e

aparentemente a infusão das plaquetas marcadas com NHS-biotina não alterou estes valores, como o

fez com a contagem de leucócitos. Houve uma diminuição progressiva da contagem de eritrócitos,

hematócrito e hemoglobina, até o intervalo de 48 h, de mesma intensidade e duração para os animais do

grupo controle e experimental, que se explica pela coleta sucessiva de amostras de sangue até 24 h.

Obtiveram-se resultados similares em um modelo experimental de envenenamento em cães pela B.

jararaca, no qual um declínio paralelo dos valores do eritrograma foi observado nos cães do grupo

controle e experimental (SANO-MARTINS et alii, 1995). A infusão de plaquetas marcadas com NHS-

biotina como causa de leucopenia não encontra relato na literatura.

Os valores médios de sobrevivência plaquetária no grupo controle e experimental foram,

respectivamente, de 71,6 ± 7,0 h e 72,7 ± 2,7 h (média ± e.p.m.), que não foram estatisticamente

diferentes entre si. Estes valores estão de acordo com a maior parte dos valores de sobrevivência

plaquetária relatados na literatura para o coelho2. Dentre os diversos valores relatados, aqueles obtidos

2 Os valores para a sobrevivência plaquetária de coelhos estão apresentados a seguir como média ± e.p.m.: ARNOTT et

alii (1987) (68,0 ± 6,0 h, n = 15, marcação com 111In), CASTLE et alii (1988) (60,0 ± 3,9 h, n = 27, marcação com 111In), CATTANEO et alii (1983) (71,6 ± 3,8 h, n = 13, marcação com 51Cr), CATTANEO et alii (1985) (56,9 ± 8,0 h, n = 5, marcação com 51Cr), FRANCO et alii (1994) (64,3 ± 6,8 h, n = 5, marcação com NHS-biotina), GOLDBLUM et alii (1985) (65,3 ± 9,9 h, n=7, marcação com 51Cr), GREENBERG et alii (1979b) (77,2 ± 4,2 h, n = 12, marcação com 51Cr), GROVES et alii (1979) (76,2 ± 3,8 h, marcação com 51Cr), GROVES et alii (1982) (57,2 ± 8,4 h, n = 6, marcação com 51Cr), HILL-ZOBEL et alii (1983) (61,2 ± 8,2 h, n = 5, marcação com 51Cr; 68,6 ± 4,6 h, n = 14, marcação com 111In), MAZOYER et alii (1988a) (91,2 ± 12,0 h, n = 4, marcação com 51Cr; 81,6 ± 4,8 h, n = 23, marcação com 67Ga), MAZOYER et alii (1988b) (62,4 ± 12 h, n = 5, marcação com 51Cr), RAND et alii (1983) (59,6 ± 14,6 h, n = 4, marcação com 51Cr; 59,7 ± 14,5 h, n = 4, marcação com 111In), RAND et alii (2002) (85,2 ± 7,3 h, n = 6, marcação com NHS-biotina; 62,4 ± 5,1 h, n = 6, marcação com PKH26; 61,9 ± 4,6 h, n = 6, marcação com PKH67), REIMERS et alii (1973a) (88,9 ± 1,3 h, n = 8, marcação com 3H-DFP), REIMERS et

u DISCUSSÃO 125

pela marcação das plaquetas com 3H-DFP (REIMERS et alii, 1973a,b) são os que mais se distanciam dos

valores ora obtidos pela marcação das plaquetas com a NHS-biotina.

A sobrevivência plaquetária está diminuída em vários estados patológicos humanos, como na

púrpura trombocitopênica auto-imune, trombocitopenia induzida por drogas, diabetes, aterosclerose

coronariana, síndrome de deficiência imunológica adquirida, coagulação intravascular disseminada,

púrpura trombocitopênica trombótica, descompressão causada por altitudes elevadas, hipertensão e

doenças vasculares (BERBERICH et alii, 1974; DALE, 1997; FUSTER et alii, 1983; GRAY et alii, 1975;

NEAME et alii, 1980; PAULUS et alii, 1971). Em coelhos, sob condições experimentais, relata-se a

diminuição da sobrevivência plaquetária após o tratamento das plaquetas ex vivo com plasmina,

neuraminidase, quimiotripsina e tripsina (GREENBERG et alii, 1975, 1979b), com o uso de cateteres

residentes (CATTANEO et alii, 1983, 1985; SOMERS et alii, 1990), na septicemia por Pneumococcus sp.

(GOLDBLUM et alii, 1985), na hipercolesterolemia (MAZOYER et alii, 1988b; WANLESS, 1984) e na

trombocitopenia induzida por anticorpos antiplaquetários (ARNOTT et alii, 1987). O tratamento das

plaquetas com proteases que degradam suas glicoproteínas de membrana ou com a neuraminidase, que

retira o ácido siálico das mesmas, encurta a sobrevivência plaquetária (GREENBERG et alii, 1975,

1979b). Assim, uma hipótese para a trombocitopenia no envenenamento pela B. jararaca seria a

degradação das glicoproteínas da membrana plaquetária diretamente pelas diversas proteases presentes

no veneno desta serpente ou indiretamente pela plasmina gerada após à formação de fibrina na

circulação (SANTORO et alii, 1994). Contudo, visto que as curvas de sobrevivência plaquetária em

valores relativos, do grupo experimental e controle, foram idênticas, esta hipótese parece ser falsa, uma

vez que, após a administração do veneno, as plaquetas continuaram circulando e tiveram o mesmo

tempo de sobrevivência das plaquetas do grupo controle. Por outro lado, a administração de trombina

i.v., em doses que causavam o retorno das plaquetas ativadas à circulação, não diminuía a

sobrevivência plaquetária nem alterava a inclinação da curva de sobrevivência (MUSTARD et alii,

1966). Da mesma forma, plaquetas de coelho ativadas ex vivo com altas doses de trombina

apresentavam, após a reinfusão, curva e tempo de sobrevivência iguais às plaquetas não ativadas

(MICHELSON et alii, 1996; REIMERS et alii, 1973b, 1976). Os dados dos coelhos envenenados são

compatíveis com as observações sobre a ação da trombina na sobrevivência plaquetária. Dessarte, em

seguida à administração do veneno, ocorreria uma intensa ativação plaquetária, de tal modo que as

plaquetas muito ativadas fossem seqüestradas da circulação e se alojassem no pulmão. A primeira

amostra de sangue coletada para a quantificação da porcentagem de plaquetas circulantes marcadas

alii (1973b) (82,9 ± 2,0 h, marcação com 3H-DFP), SCHEFFEL et alii (1977) (63,1 ± 9,2 h, n = 8, marcação com 51Cr; 86,1 ± 6,7 h, n = 8, marcação com 111In), SIMON & GRACE (1981) (72,7 ± 7,0 h, n = 15, marcação com 51Cr) e SOMERS et alii (1990) (61,1 ± 3,0 h, n = 12, marcação com 51Cr).

u DISCUSSÃO 126

com NHS-biotina foi obtida 1 h após a administração do veneno. Como descrito anteriormente, após a

infusão de trombina, as plaquetas que retornavam à circulação o faziam dentro de um período de 30

min. Outrossim, as plaquetas ativadas marcadas que permaneceram na circulação, subseqüentemente a

1 h após o envenenamento, proviriam da recirculação das plaquetas previamente ativadas ou seriam

plaquetas cuja ativação não foi intensa o suficiente para causar o seu seqüestro. Independentemente do

que tenha ocorrido, a trombocitopenia observada evidencia que as plaquetas que ainda permaneciam

circulando apresentavam tempo de sobrevivência igual a plaquetas quiescentes, mesmo após o

consumo inicial, sugerindo que a geração de trombina, como descrito acima, desempenha um papel

proeminente nas alterações plaquetárias induzidas neste modelo experimental de envenenamento.

Dados que fortalecem a evidência de que a trombina desempenha um papel importante na indução

da trombocitopenia por venenos de serpentes que contenham componentes pró-coagulantes foram

apresentados por KORNALÍK et alii (1972). Em um estudo da sobrevivência de plaquetas marcadas com 51Cr, em ratos injetados intravenosamente com a fração ativadora de protrombina do veneno de Echis

carinatus, observou-se uma queda na contagem plaquetária de 55%, semelhante àquela observada nos

coelhos envenenados pela B. jararaca, que se recuperava a partir de 24 h; ocorria também

afibrinogenemia, porém esta se recuperava somente em 4 dias. Após o envenenamento, tanto as

plaquetas marcadas, como as não marcadas, eram seqüestradas da circulação, fazendo com que

existisse trombocitopenia e a radioatividade total das amostras de sangue diminuísse. Contudo, não

havia uma grande diferença entre o tempo de sobrevivência das plaquetas dos animais envenenados e

dos controles, como também a inclinação das curvas dos dois grupos era quase paralela. Isto indicava

que as plaquetas marcadas dos animais envenenados, que ainda sobreviviam na corrente sangüínea,

apresentavam um tempo de sobrevivência semelhante ao do grupo controle (KORNALÍK et alii, 1972).

Estes dados são idênticos aos nossos e demonstram definitivamente que a trombina, naquele caso

engendrada pelo ativador de protrombina da E. carinatus, tem importância capital no consumo

plaquetário e na manutenção da sobrevivência das plaquetas que ainda permanecem na circulação.

Estes autores também estudaram o fígado e o baço como órgãos de seqüestro plaquetário e observaram

que um aumento mais evidente da radioatividade ocorria somente após 4 h, especialmente no fígado

(KORNALÍK et alii, 1972). A deposição no baço e no fígado de plaquetas marcadas, no período que

antecedia 4 h, foi idêntica entre os dois grupos, a despeito da trombocitopenia já ter sido observada em

20 min nos animais envenenados; estes dados sugerem que talvez o pulmão pudesse ter sido um local

de seqüestro plaquetário, porém não foram apresentados os dados de acúmulo de radioatividade para

este órgão.

SIMON & GRACE (1981) estudaram a interferência da administração intramuscular do veneno de

Crotalus atrox sobre a sobrevivência plaquetária em coelhos. Seus resultados indicavam um consumo

u DISCUSSÃO 127

plaquetário no local da inoculação do veneno e a diminuição do tempo de sobrevivência plaquetária,

inversamente proporcional à dose administrada de veneno. Talvez a discrepância entre os dados

apresentados aqui e as observações de SIMON & GRACE (1981) se deva à via diferente de inoculação do

veneno, de tal forma que a lesão local assuma um papel preponderante sobre o pulmão, como local para

o seqüestro plaquetário. A própria lesão tecidual seria, assim, uma causa e um agravante na

trombocitopenia que surge no envenenamento pela C. atrox. Contudo, a mensuração da radioatividade

não foi descrita em outros órgãos senão nos músculos próximos à inoculação do veneno, o que não

rejeita a hipótese de que o seqüestro plaquetário também tenha ocorrido no pulmão.

No coelho, como já visto, as enzimas trombina-símiles do veneno de B. jararaca não contribuem

expressivamente para a hipofibrinogenemia, mas este não é o caso de envenenamentos humanos, em

que elas contribuem para a hipofibrinogemia. Em um estudo da participação da batroxobina na

sobrevivência plaquetária, LATALLO & LOPACIUK (1973) observaram que pacientes humanos com

trombose venosa profunda apresentavam o seqüestro das plaquetas circulantes (marcadas com 51Cr) por

um curto período de tempo após o tratamento com batroxobina e estreptoquinase; no entanto, estas logo

retornavam à corrente sangüínea e mantinham o tempo de sobrevivência dentro da variação de

normalidade, apesar da afibrinogenemia durar 7 dias (LATALLO & LOPACIUK, 1973). Isto demonstra

claramente que os componentes trombina-símiles dos venenos pouco interferem na sobrevivência

plaquetária.

Desconhece-se o motivo pelo qual algumas plaquetas ativadas são retiradas da circulação, enquanto

outras se mantêm circulando ativadas, como o demonstra a alta expressão de P-selectina nas plaquetas

circulantes dos coelhos envenenados. Ainda não são claros quais são os mecanismos para o

reconhecimento e eliminação das plaquetas ativadas da circulação, embora alguns já tenham sido

arrolados, como a proteólise dos receptores de membrana, a perda de ácido siálico e a expressão de

fosfatidilserina na superfície plaquetária (GREENBERG et alii, 1975, 1979b; PEREIRA et alii, 1999; RAND

et alii, 2001). A P-selectina – por promover a ligação das plaquetas com monócitos e neutrófilos e ser

expressa na superfície de plaquetas ativadas – foi inicialmente considerada como uma proteína que

estivesse diretamente relacionada à eliminação de plaquetas ativadas da corrente sangüínea. Todavia,

estudos recentes mostram que a expressão da P-selectina em plaquetas ativadas não causa o seqüestro

definitivo das mesmas, mas apenas um seqüestro temporário. Desta maneira, ao contato com monócitos

e neutrófilos, a P-selectina da superfície plaquetária seria hidrolisada, o fragmento clivado alcançaria a

circulação, e as plaquetas retornariam rapidamente à corrente sangüínea (MICHELSON et alii, 1996,

2001). Reforçando estas observações, camundongos deficientes de P-selectina têm tempo de

sobrevivência plaquetária igual ao de camundongos normais (BERGER et alii, 1998), demonstrando que

esta proteína não interfere com o seqüestro plaquetário.

u DISCUSSÃO 128

Com relação à produção de plaquetas pelos megacariócitos, o grau de trombocitopenia dos coelhos

envenenados não foi tão intenso para que se promovesse um aumento substancial na produção de

plaquetas, uma vez que o número relativo de plaquetas reticuladas foi semelhante entre os coelhos

envenenados e controles. As plaquetas reticuladas possuem um copioso conteúdo de ácido nucléico

(RNA mensageiro) residual dos megacariócitos (ROTH et alii, 1989) e, assim, reagem intensamente

com o tiazol orange, uma sonda fluorescente específica para ácidos nucléicos. Semelhantemente aos

reticulócitos, as plaquetas reticuladas perdem aos poucos o seu conteúdo de ácido nucléico ao longo do

tempo (que dura em média 24 h no citoplasma plaquetário), devido provavelmente à ação de

ribonucleases (AULT & KNOWLES, 1995; BALDUINI et alii, 1999; DALE et alii, 1995; NADANO et alii,

1995; REDDI, 1977). As plaquetas reticuladas são, portanto, células recém-liberadas da medula óssea e

refletem o grau de atividade da trombopoese. A avaliação da intensidade da trombopoese, por meio da

determinação do número de plaquetas reticuladas, vem crescendo paulatinamente, devido à rapidez e

facilidade de obtenção de resultados e, de forma mais importante, por dispensar as punções da medula

óssea. Ademais, a quantificação das plaquetas reticuladas, associada à determinação dos níveis

circulantes de trombopoetina, permite diferenciar as trombocitopenias hipoplásicas das hiperdestrutivas

(KURATA et alii, 2001). O aumento das plaquetas reticuladas na circulação foi descrito em pacientes

com púrpura trombocitopênica auto-imune, hipertensão na gravidez, síndrome urêmica hemolítica,

púrpura trombocitopênica trombótica, hiperesplenismo, síndrome de coagulação intravascular

disseminada, trombocitose reativa, anemias falciformes, talassemia e em pacientes submetidos à

plaquetoferese (AULT et alii, 1992; BALDUINI et alii, 1999; CHAVDA et alii, 1996; GYONGYOSSY-ISSA

et alii, 2001; KIENAST & SCHMITZ, 1990; KURATA et alii, 2001; RICHARDS & BAGLIN, 1995; SAXON et

alii, 1998; STOHLAWETZ et alii, 1998).

Os dados obtidos nos coelhos envenenados sugerem que a remissão da trombocitopenia ocorre pela

produção de plaquetas recém-liberadas da medula óssea, apesar da contagem de plaquetas reticuladas

ser praticamente idêntica entre o grupo experimental e controle. Efetivamente, a recuperação da

contagem plaquetária dos coelhos envenenados se iniciou após 48 h da administração do veneno,

simultaneamente ao aumento da porcentagem de plaquetas reticuladas, conquanto este valor não fosse

estatisticamente diferente do controle; a partir de 96 h, nos grupos controle e experimental, ocorreu

trombocitose reativa, como demonstrado pelo aumento das contagens plaquetárias acima dos valores

respectivos de 0 h. Os intervalos de tempo para a recuperação da contagem plaquetária dos coelhos

envenenados são idênticos àqueles observados por KUTER & ROSENBERG (1994) para o recobro da

trombocitopenia aguda induzida por anticorpos antiplaquetários em coelhos.

Se a contagem plaquetária do sangue total reflete o equilíbrio entre as plaquetas circulantes, as

plaquetas contidas em órgãos de estoque plaquetário (como o baço), as plaquetas que são produzidas

u DISCUSSÃO 129

pela medula óssea (trombopoese) e as plaquetas que são retiradas da circulação, pode-se afirmar que as

plaquetas acumuladas no baço pouco contribuíram para o restabelecimento da trombocitopenia nas

primeiras 24 h após o envenenamento. O reservatório esplênico de plaquetas no coelho corresponde a

35% do total das plaquetas circulantes, valor equivalente ao do homem (30 a 40%) (FREEDMAN &

KARPATKIN, 1975). Em condições de consumo de plaquetas circulantes ou em condições de estresse, o

baço se contrai e ocorre a liberação das plaquetas do reservatório esplênico para a circulação e, assim, a

contagem plaquetária aumenta (FREEDMAN & KARPATKIN, 1975). Nas 24 h iniciais, aparentemente, não

houve qualquer indício de que o baço houvesse liberado plaquetas de seus estoques, pois a contagem

plaquetária se manteve sucessivamente baixa ao longo deste período. Todavia, o aumento do número

de plaquetas provindas do baço talvez tenha ocorrido minutos após a administração do veneno e as

plaquetas recém-liberadas tenham sido também consumidas como as demais, desta forma ocultando a

liberação de plaquetas pelo reservatório esplênico.

Como observado por AULT et alii (1992) e RICHARDS et alii (1995), em patologias de consumo

plaquetário a porcentagem de plaquetas reticuladas somente ultrapassava o limite superior dos valores

de referência quando a contagem plaquetária era menor que 80×109/L. Do mesmo modo, a

trombocitopenia observada no coelhos do grupo experimental não foi suficientemente intensa para

provocar aumentos drásticos na produção de plaquetas reticuladas pela medula óssea e a normalização

da contagem plaquetária se fez mais lentamente. Em condições de consumo plaquetário em seres

humanos, o aumento da porcentagem de plaquetas reticuladas geralmente antecipa a recuperação da

contagem plaquetária (AULT et alii, 1992; CONSOLINI et alii, 2001; GYONGYOSSY-ISSA et alii, 2001;

STOHLAWETZ et alii, 1998), porém nos coelhos envenenados o aumento das plaquetas reticuladas foi

concomitante à elevação da contagem plaquetária em 48 h. No coelho, o aumento do volume

plaquetário médio (VPM) precedeu ao restabelecimento da contagem plaquetária no grupo

experimental. De fato, os valores do VPM e da dispersão dianteira foram significativamente maiores

(em torno de 25%) que os valores dos coelhos controles exclusivamente no intervalo de 24 h. O

aumento do VPM anterior à elevação da contagem plaquetária, em modelos de trombocitopenia

induzida por anticorpos antiplaquetários ou pela injeção de trombopoetina, também já havia sido

observado (CORASH et alii, 1987; ULICH et alii, 1996). O aumento do VPM também precedeu ao

aumento das plaquetas reticuladas, indicando que não havia uma relação entre ambos, corroborando os

resultados de outrem (GYONGYOSSY-ISSA et alii, 2001; RICHARDS & BAGLIN, 1995; STOHLAWETZ et

alii, 1998). Em doenças humanas, o aumento do VPM é relatado especialmente na hipercolesterolemia,

diabetes melito, infarto agudo do miocárdio, acidente vascular cerebral agudo, pré-eclampsia, púrpura

trombocitopênica idiopática e estenose de artéria renal (BATH & BUTTERWORTH, 1996). MARTIN &

TROWBRIDGE (1983) demonstraram que as plaquetas jovens liberadas após uma trombocitopenia

u DISCUSSÃO 130

intensa, como após a administração de soro antiplaquetário, são maiores porque são produzidas por

megacariócitos com ploidia e volume citoplasmático maiores do que os normais. O aumento da

produção de plaquetas reticuladas e do VPM evidenciam, dessarte, que a medula óssea sofreu um

estímulo para aumentar a trombopoese após o envenenamento. Ainda que nos coelhos envenenados

tenha ocorrido um aumento moderado das plaquetas reticuladas circulantes, os coelhos do grupo

controle também apresentaram um aumento no número absoluto de plaquetas reticuladas em 48 h,

indicando que a coleta sucessiva de amostras também foi um estímulo para a medula óssea aumentar a

taxa de trombopoese, sem que no entanto a contagem plaquetária tivesse reduzido abruptamente; estes

dados confirmam as observações de GYONGYOSSY-ISSA et alii (2001) de que a coleta de sangue per se,

a despeito de não causar grandes variações na contagem das plaquetas circulantes, é um estímulo para a

trombopoese. Uma plêiade de fatores de crescimento e citocinas estimulam a trombopoese e, dentre

eles, se destacam a trombopoetina, a interleucina 6 e a eritropoetina (CAEN et alii, 1999). O mais

potente deles é a trombopoetina, que promove a geração, endomitose e maturação citoplasmática de

megacariócitos (COHEN-SOLAL et alii, 1997; HARKER et alii, 2000). A transcrição de trombopoetina

parece não se modificar em condições de trombocitopenia ou trombocitose e o nível de trombopoetina

circulante é controlado tanto pelo número total de plaquetas na circulação, quanto pelo número de

megacariócitos, cujos receptores de superfície (c-mpl) são capazes de internalizar a trombopoetina e

controlar o seu nível plasmático (NAGATA et alii, 1997). A trombopoetina e a interleucina 6, em seres

humanos e animais, são capazes de aumentar a contagem plaquetária e o número de plaquetas

reticuladas, normalmente a partir de 3 dias após a indução de trombocitopenia ou da administração de

trombopoetina ou interleucina 6 (HARKER et alii, 2000; KUTER et alii, 1994; PENG et alii, 1996;

STOHLAWETZ et alii, 1999a). Contudo, a formação de proplaquetas e a liberação de plaquetas pelos

megacariócitos não são estimuladas pela trombopoetina, mas pela interleucina 6 (ITO et alii, 1996). A

recuperação da trombocitopenia induzida pelo veneno de B. jararaca ocorreu a partir de 48 h,

provavelmente devido ao sinergismo de várias citocinas que abreviou a recuperação da contagem

plaquetária. De fato, em envenenamentos experimentais e humanos por serpentes do gênero Bothrops,

várias citocinas têm seu nível circulante aumentado, especialmente a interleucina 6 (BARRAVIERA et

alii, 1995; BARROS et alii, 1998; LOMONTE et alii, 1993; PETRICEVICH et alii, 2000), o que poderia

contribuir para o célere restabelecimento da contagem plaquetária. Além disso, o aumento da contagem

plaquetária acima dos valores de 0 h, a partir de 96 h, quer no grupo controle, quer no experimental,

favorece a idéia de que a contagem plaquetária foi recobrada pelo estímulo de fatores de crescimento e

citocinas (HARKER et alii, 2000; KUTER & ROSENBERG, 1994; NAGATA et alii, 1997; PENG et alii,

1996; WEISBACH et alii, 1999). Para esta estimulação da trombopoese talvez a eritropoetina tenha

contribuído significativamente, pois tanto no grupo controle, em que não ocorreu trombocitopenia,

u DISCUSSÃO 131

como no grupo experimental, houve trombocitose reativa. A contagem eritrocitária diminuiu

gradativamente em ambos os grupos e isto pode ter servido de estímulo para a produção de

eritropoetina pelo rim; a eritropoetina tem ação sinérgica com a trombopoetina na estimulação de

unidades formadoras de colônia de megacariócitos e no aumento da ploidia megacariocítica

(BIRKMANN et alii, 1997; BROUDY et alii, 1995). Doadores humanos de plaquetoferese apresentam

também aumentos dos níveis plasmáticos de eritropoetina, que pode ter um efeito sinérgico com a

trombopoetina na recuperação da contagem plaquetária após este procedimento (WEISBACH et alii,

1999).

Se o VPM apresentou um aumento significativo somente em 24 h, o PDW se apresentou elevado de

1 a 3 h após o envenenamento. Embora o aumento da anisocitose plaquetária seja responsável pela

elevação do PDW, um excesso de plaquetas com menor volume ou de microvesículas parece ter sido a

causa do aumento do PDW. Quando se analisaram os gráficos de dispersão dianteira das plaquetas no

citômetro de fluxo (dados não apresentados), entre 1 e 3 h, não se observaram plaquetas com volumes

maiores nem a presença de agregados plaquetários, sugerindo que a presença de microvesículas seria a

causa do aumento do PDW. No entanto, a presença de microvesículas não pôde ser demonstrada pelo

citômetro de fluxo, visto que o limite inferior da dispersão dianteira (“threshold”) foi ajustado para que

fragmentos celulares fossem excluídos e não interferissem na análise das plaquetas. Portanto, diante do

aumento do PDW entre 1 e 3 h no grupo experimental e a ausência de plaquetas com volumes muito

grandes que pudessem interferir na distribuição plaquetária, a hipótese mais provável para a explicação

de tal elevação é o aumento do número de microvesículas plaquetárias circulantes. O PDW é utilizado

especialmente para o diagnóstico diferencial entre as trombocitoses reativas e as causadas por doenças

mieloproliferativas, pois seu valor é significativamente menor naquelas do que nestas (OSSELAER et

alii, 1997; SEHAYEK et alii, 1988; SMALL & BETTIGOLE, 1981). Em conformidade com esta

observação, no período de trombocitose reativa (após 96 h), os valores de PDW dos grupos controle e

experimental se mantiveram baixos, inclusive inferiores aos respectivos valores de 0 h. A

microvesiculação, i.e. o desprendimento de vesículas das plaquetas, é uma das respostas que ocorrem

após as plaquetas serem ativadas por certos estímulos químicos – como pela trombina, colágeno, cálcio

ionóforo A23187, proteínas do complemento C5b-9, mas não pelo ADP e adrenalina – e físicos (fluxos

com alta força de cisalhamento) (MIYAZAKI et alii, 1996; SAKARIASSEN et alii, 1998; SIMS et alii,

1989). As microvesículas possuem um diâmetro de 0,1 a 1,0 µm e brotam de pseudópodes ou de outras

regiões da membrana citoplasmática após a ativação plaquetária; expressam em suas membranas fator

Va e fosfatidilserina, tendo, portanto, uma alta atividade pró-coagulante (HEIJNEN et alii, 1999;

HUGHES et alii, 2000; SIMS et alii, 1989). O aumento do número de microvesículas circulantes já foi

evidenciado em condições como a trombocitopenia induzida pela heparina, a circulação extracorporal,

u DISCUSSÃO 132

o diabetes melito, a coagulação intravascular disseminada, a púrpura trombocitopênica idiopática, as

isquemias transitórias, os acidentes vasculares cerebrais trombóticos e a arteriosclerose obliterante

(ABRAMS et alii, 1990; HOLME et alii, 1994; HUGHES et alii, 2000; JY et alii, 1992; LEE et alii, 1993;

NOMURA et alii, 2000; SUZUKI et alii, 1996). No envenenamento botrópico, em que houve a obstrução

parcial do fluxo sangüíneo, causada pelo depósito de fibrina nos vasos do pulmão e do rim,

possivelmente tanto a maior força de cisalhamento encontrada pelas plaquetas para atravessá-los, como

a geração de trombina intravascular induzida pelo veneno, tenham favorecido que a ativação e a

microvesiculação plaquetárias ocorressem, como descrito nos quadros de arteriosclerose obliterante,

acidentes vasculares cerebrais trombóticos e tromboses arteriais agudas de membros inferiores (LEE et

alii, 1993; NOMURA et alii, 2000; SILJANDER et alii, 1996).

Nesse panorama de ativação plaquetária que ocorre no envenenamento botrópico, no qual a

trombina desempenha uma função singular, esperava-se inicialmente encontrar na circulação plaquetas

com conteúdo decrescido de serotonina e concentrações elevadas de PF4 circulante. Como já

mencionado, a trombina é o agonista plaquetário mais potente, sendo capaz de induzir a secreção de

grânulos α, corpos densos e lisossomos (HOLMSEN & DANGELMAIER, 1989b; SIMS et alii, 1989; WITTE

et alii, 1978). Todavia, não foram estes os resultados observados no estudo atual; a concentração de

serotonina intraplaquetária e os níveis de 5-HI e PF4 plasmáticos nunca foram estatisticamente

diferentes dos respectivos valores do grupo controle ao longo do tempo.

Dentre as condições patológicas que induzem diminuição da serotonina intraplaquetária, podem ser

citadas a hipertensão essencial, a síndrome de coagulação intravascular disseminada, a insuficiência

renal crônica, o diabetes melito, a hipercolesterolemia e a doença vascular periférica (BARRADAS et alii,

1988; GUICHENEY et alii, 1988; KAMAL et alii, 1984; MEZZANO et alii, 1996; OGAWA et alii, 2000;

PARETI et alii, 1976, 1980). Note-se que nestas patologias a estimulação plaquetária é constante e

crônica, que as diferenciam da situação de ativação plaquetária aguda e efêmera induzida pela injeção

intravenosa do veneno de B. jararaca. A captura de serotonina pelas plaquetas é um processo bastante

rápido (em torno de 15 min) e já foi demonstrado que as plaquetas de coelhos ativadas e degranuladas

ex vivo pela ação da trombina são ainda capazes de readquiri-la do meio extracelular (REIMERS et alii,

1975; SHUTTLEWORTH & O'BRIEN, 1981). A serotonina tem uma meia-vida curta na circulação, em

torno de 1 a 2 min, sendo capturada primariamente pelos pulmões e plaquetas (THOMAS & VANE,

1967). A acelerada recaptura da serotonina plasmática pelas plaquetas circulantes poderia explicar,

destarte, a invariabilidade observada do conteúdo de serotonina intraplaquetária, ao presumir-se que em

1 h após o envenenamento as plaquetas já teriam recapturado toda a serotonina livre no plasma. Esta

hipótese é fortalecida pelos resultados obtidos por WANG et alii (1994) para coelhos que foram

injetados intravenosamente com o veneno de Agkistrodon acutus. Nesse estudo, a contagem plaquetária

u DISCUSSÃO 133

estava diminuída ainda em 6 h após o envenenamento, mas os níveis intraplaquetários de serotonina

alcançavam seu nadir em 20 min e iniciavam a sua recuperação em 50 min; inversamente, os níveis

plasmáticos de serotonina atingiam o seu zênite em 20 min e diminuíam a partir de 50 min. Esses

resultados mostram quão célere é a recuperação da serotonina intraplaquetária e explicam a aparente

constância dos valores obtidos neste estudo, a partir de 1 h, do grupo experimental em relação ao grupo

controle. Em um estudo prévio, relatou-se que o número de corpos densos plaquetários, determinados

por meio da análise morfométrica das plaquetas sangüíneas, estava diminuído significativamente em

relação ao grupo controle até 24 h após o envenenamento (SANTORO et alii, 1994); os novos resultados

apresentados aqui mostram que a variação do conteúdo de serotonina intraplaquetária, a partir de 1 h

após o envenenamento, é semelhante entre os dois grupos e apontam para a hipótese de que durante o

envenenamento experimental a concentração de serotonina dos corpos densos das plaquetas

remanescentes na circulação seja maior que a concentração das plaquetas em condições de repouso,

compensando o número reduzido de corpos densos. Esta hipótese não parece ser espúria, pois há

transtornos, como o infarto agudo do miocárdio, que induzem o aumento da captura da serotonina

plasmática e, conseqüentemente, a elevação da concentração da serotonina intraplaquetária (CHANDRA

et alii, 1993; PURI et alii, 1990; VIKENES et alii, 1999).

As concentrações de serotonina intraplaquetária de coelho obtidas no presente estudo são bastante

semelhantes as de outros estudos (OGAWA et alii, 2000; PACKHAM et alii, 1992). Um fato a ser notado é

a diminuição da concentração de serotonina intraplaquetária, em ambos os grupos, conforme o início da

trombocitose reativa. Esta observação corrobora o relato de FETKOVSKA et alii (1988) de que existe

uma relação inversa entre a contagem plaquetária e o conteúdo de serotonina intraplaquetária.

Os níveis de 5-HI plasmáticos são presumivelmente influenciados pela taxa de síntese e degradação

da serotonina, nos vários órgãos em que ela existe, e pela taxa de excreção dos 5-HI. Os níveis de 5-HI

plasmáticos mostrados aqui não apresentaram uma relação inversa com os níveis intraplaquetários de

serotonina, indicando que o metabolismo da 5-HI foi alterado não somente nas plaquetas, mas também

em outros órgãos. Para comprovar esta hipótese estudos ulteriores serão necessários.

Ainda em relação à secreção plaquetária, os valores do PF4 plasmático do grupo experimental

também não foram estatisticamente diferentes daqueles do grupo controle. Para a dosagem do PF4

plasmático do coelho, foi mister purificar o PF4 de coelho e obter anticorpos que o reconhecessem em

ensaios imunoenzimáticos, uma vez que não existem testes comerciais para esta proteína das plaquetas

do coelho.

O PF4 de coelho purificado na presente investigação apresentou atividade anti-heparina, seqüência

aminoterminal e massa molecular muito semelhante ao PF4 de coelho purificado anteriormente por

outrem (ADELMAN et alii, 1981; GINSBERG et alii, 1979; MCMANUS et alii, 1979). A massa molecular

u DISCUSSÃO 134

do PF4 obtida aqui, em gel de tricina, foi diferente na presença ou ausência do 2-mercaptoetanol. A

proteína não reduzida apresentou uma massa molecular aproximada de 8200 Da, um valor praticamente

idêntico àquele obtido por GINSBERG et alii (1979) a partir da composição de aminoácidos (8900 Da).

Possivelmente, a presença das duas pontes de dissulfeto, conservadas em muitas espécies (Figuras 4 e

21) tenha causado o dobramento da proteína e a diminuição da massa molecular do PF4 na ausência de

agentes redutores. Do mesmo modo do que o observado aqui, outros autores (GINSBERG et alii, 1979;

RUCINSKI et alii, 1979) também notaram que o PF4 humano e de coelho, na ausência de agentes

redutores, formavam bandas protéicas fracamente coradas nos géis de poliacrilamida com massas

moleculares acima de 20 kDa, que desapareciam na presença de agentes redutores; segundo GINSBERG

et alii (1979), o aparecimento dessas bandas sugeria que na presença de SDS o PF4 se polimerizava

com a troca de pontes de dissulfetos entre as unidades de 8900 Da. Na presença de agentes redutores,

houve a formação de duas bandas protéicas, uma com 8966 Da e a outra com 8302 Da, que poderia ser

explicada pela presença de isoformas de PF4 ou pela presença de diferentes graus de glicosilação desta

proteína. A presença de isoformas pode ser inferida devido ao aparecimento na seqüência

aminoterminal do PF4 de coelho de resíduos que não puderam ser diferenciados pelo seqüenciador (20°

e 25° resíduos). De fato, a presença de isoformas já havia sido observada por EISMAN et alii (1990)

para o PF4 humano. Da mesma forma, a presença concomitante de formas glicosiladas e não

glicosiladas já foi descrita para o PF4 de rato (RAVANAT et alii, 1994), enquanto que em bovinos e

suínos o PF4 é sempre glicosilado (PROUDFOOT et alii, 1995; ST. CHARLES et alii, 1989).

A homologia entre os 27 resíduos incontestes do PF4 de coelho e as seqüências aminoterminais do

PF4 humano, de camundongo, de rato, de bovino, de ovino e de suíno foi de 67%, 61%, 54%, 46%,

50% e 50%, respectivamente, valores relativamente altos para uma região do PF4 não tão conservada,

porquanto a maior homologia entre as diferentes espécies está nas regiões carboxiterminais do PF4

(ZUCKER & KATZ, 1991). Isso demonstra o alto grau de similaridade do PF4 entre os mamíferos, que se

torna um obstáculo para a produção de anticorpos nos animais de laboratório comumente utilizados.

Inicialmente, a cobaia foi utilizada para a imunização com o PF4 de coelho; contudo, a obtenção de

anticorpos policlonais nessa espécie se mostrou infrutífera, pois os títulos foram muito baixos (dados

não apresentados). Pensou-se, assim, que a diferença antigênica entre o PF4 do coelho e da cobaia era

tão pequena que dificultava a obtenção de anticorpos com título alto. De fato, dificuldades semelhantes

foram encontradas por CAZZOLA et alii (1992) e CIAGLOWSKI et alii (1986) ao tentarem obter

anticorpos específicos para o PF4 em mamíferos. Baseado no trabalho de RAVANAT et alii (1993),

utilizou-se a galinha para a obtenção de anticorpos policlonais contra o PF4 de coelho. De fato, a

galinha se mostrou um excelente animal para a obtenção de anticorpos policlonais específicos, não

u DISCUSSÃO 135

somente para o PF4, mas igualmente para a GPIIb-IIIa de coelho3. Os anticorpos IgY da galinha

imunizada com PF4 reconheceram proteínas com massas moleculares ao redor de 8 kDa no soro e no

lisado plaquetário (Figura 23), que equivale à massa molecular do PF4. Porém, outras proteínas com

massas moleculares maiores também foram reconhecidas no lisado plaquetário tanto pela IgY antiPF4,

como pela IgY total controle (Figura 23), demonstrando a presença de IgY naturais na galinha que

apresentavam reação cruzada com outras proteínas da plaqueta de coelho. No soro, esta reação cruzada

não existiu para a IgY antiPF4, o que proporcionou um ensaio imunoenzimático específico para o PF4

de coelho. Ademais, a purificação da IgY total antiPF4 em coluna de afinidade de PF4-Sepharose

permitiu um aumento de 8 vezes na sensibilidade de detecção do PF4 no ensaio imunoenzimático. De

fato, a metodologia proposta para a quantificação do PF4 em amostras de plasma permitiu que se

obtivesse um ELISA bastante específico e sensível, que detectava concentrações de PF4 tão baixas

quanto 0,6 ng/mL. Sensibilidades equivalentes ou menores para a detecção do PF4 em amostras de

plasma foram descritas ao utilizar-se o radioimunoensaio ou o ELISA (CAZZOLA et alii, 1992; FILES et

alii, 1981; GINSBERG et alii, 1979; KAPLAN & OWEN, 1982).

Como citado anteriormente, os níveis plasmáticos de PF4 do grupo experimental não foram

significativamente diferentes do grupo controle ao longo do tempo. O aumento na concentração

plasmática do PF4 ocorre em condições de ativação plaquetária in vivo que as induzam a secretar o

conteúdo dos grânulos α, tais como a circulação extracorpórea, a síndrome de coagulação intravascular

disseminada e a administração experimental de PAF ou trombina a animais (ANGLE et alii, 1987; FILES

et alii, 1981; KAPLAN & OWEN, 1982; MCMANUS et alii, 1979, 1980; MORIAU et alii, 1974). É mister

ressaltar que em todas estas condições a elevação dos níveis plasmáticos de PF4 é efêmera, existindo

unicamente enquanto perdura o estímulo plaquetário. Isto ocorre devido à célere meia-vida do PF4 na

circulação, cuja depuração se faz em duas fases: na primeira a meia-vida do PF4 é de 1 a 2 min e na

segunda de 20 a 140 min (PROSDOCIMI et alii, 1984; RUCINSKI et alii, 1986, 1990b). Na primeira fase

3A distância filogenética entre os mamíferos e as aves faz da galinha um excelente animal para a produção de anticorpos

para as proteínas altamente conservadas de mamíferos (BURGER et alii, 1985; CARROLL & STOLLAR, 1983; GASSMANN et alii, 1990; LEMAMY et alii, 1999; MURATA et alii, 1996). Além disso, devido à diferença filogenética entre essas duas classes taxonômicas, os anticorpos da galinha reagem com mais epítopos do antígeno do mamífero e, dessarte, ocorre uma amplificação do sinal nas reações imunológicas (OLOVSSON & LARSSON, 1993). A galinha produz três classes de anticorpos: a IgM, a IgG (também denominada IgY) e a IgA (SHARMA, 1999; ZHAO et alii, 2000). O acrônimo IgY advém da propriedade desta imunoglobulina de ser transferida e estocada na gema do ovo (“Yolk”), com a finalidade de proteger os embriões (LÖSCH et alii, 1986; MURATA et alii, 1996). É grande a quantidade de anticorpos estocados diariamente nos ovos. As galinhas poedeiras imunizadas com PF4 ou GPIIb-IIIa de coelho produziram diariamente cerca de 150 mg de anticorpo por ovo. Ademais, todos os reforços de imunização nas galinhas poedeiras, conduzidos para o aumento do título de anticorpos específicos, podem ser feitos com adjuvantes completos, como o de FREUND, sem que haja a formação de qualquer lesão local (GASSMANN et alii, 1990). Porém, a maior vantagem da utilização da galinha é não se precisar sangrar os animais para a obtenção dos anticorpos.

u DISCUSSÃO 136

de depuração, o PF4 se liga ao sulfato de heparana presente na superfície das células endoteliais,

especialmente nas do fígado; na segunda, a depuração ocorre por conta do catabolismo e da excreção

do PF4 pelo rim (RUCINSKI et alii, 1986). Cinco min após a injeção intravenosa de quantidades

elevadas de PF4 marcado com radioisótopo em coelhos, apenas cerca de 25% da radioatividade total

injetada estava ainda presente na circulação. A depuração da βTG também se faz em duas fases, porém

devido à sua menor afinidade por glicosaminaglicanos, na primeira fase a meia-vida da βTG dura 5 a 7

min e na segunda 60 a 90 min (RUCINSKI et alii, 1986). Desta forma, a imperturbabilidade dos valores

do PF4 no grupo experimental ao longo do tempo, em comparação ao grupo controle, se deveu

possivelmente ao fato das amostras de sangue terem sido coletadas somente 1 h após a administração

do veneno, quando os níveis do PF4 já haviam retornado à normalidade. Alguns estudos demonstraram

que ao injetar-se intravenosamente o PAF no coelho, o zênite dos níveis plasmáticos de PF4 ocorria 30

segundos após a administração, diminuindo a seguir progressivamente até que em 50 min os níveis já

estivessem normais (ANGLE et alii, 1987; MCMANUS et alii, 1980). Um padrão semelhante de cinética

de elevação dos níveis plasmáticos de PF4 ocorria após a administração do veneno de A. acutus a

coelhos (WANG et alii, 1994); o apogeu dos níveis plasmáticos de PF4 se dava 20 min após a

administração do veneno, simultaneamente ao nadir da concentração de serotonina intraplaquetária, e

depois ambos rapidamente se recuperavam. O mesmo fenômeno pode ter ocorrido após a administração

do veneno de B. jararaca ao coelho, de modo que a ativação plaquetária tenha induzido a secreção

imediata do conteúdo dos grânulos α e dos corpos densos, que se recuperaram já em 1 h após o

envenenamento. Isso demonstra a efemeridade do processo de ativação plaquetária induzida pelo

veneno de B. jararaca no modelo experimental utilizado. Contudo, em um estudo de THAN-THAN et

alii (1988), dez pacientes humanos picados por serpentes D. russelli tiveram determinados os seus

níveis plasmáticos de PF4 e βTG e os níveis intraplaquetários dos nucleotídeos. Em todos os pacientes,

os níveis plasmáticos de PF4 e βTG estavam aumentados, não importando as suas contagens

plaquetárias ou os seus níveis plasmáticos de fibrinogênio, porém os nucleotídeos plaquetários totais

estavam diminuídos somente em três pacientes (THAN-THAN et alii, 1988). Esses dados demonstram

que as quantidades maiores de veneno, injetadas durante o acidente ofídico humano, causam uma

ativação plaquetária mais prolongada e, assim, níveis elevados de PF4 podem ser detectados mais

facilmente.

Todavia, se a estimulação plaquetária aparentemente foi efêmera, como o comprovam os dados de

PF4 plasmático e serotonina intraplaquetária, os efeitos de tal estimulação sobre a agregação

plaquetária foram duradouros. Mesmo 24 h após o envenenamento, as plaquetas ainda apresentavam

diminuição da agregação induzida pelo colágeno e pela botrocetina, além de apresentarem uma redução

acentuada na secreção de ATP induzida pelo colágeno. Estes dados confirmam as observações

u DISCUSSÃO 137

anteriores de SANTORO (1993), que, ao injetar intravenosamente o veneno de B. jararaca em coelhos,

observaram no PRP uma acentuada hipoagregação plaquetária induzida pelo colágeno, ADP e PAF,

porém agregação normal ao cálcio ionóforo A23187. Ao serem lavadas e estimuladas por estes mesmos

agonistas, na ausência dos componentes plasmáticos, as plaquetas dos coelhos envenenados não

apresentavam mais hipoagregação e demonstravam perfis de agregação plaquetária idênticos aos dos

coelhos controles.

Neste estudo, estendeu-se a investigação da função plaquetária em coelhos envenenados

experimentalmente pela B. jararaca, ao analisar-se a secreção de ATP e a agregação plaquetária

induzidas pelo colágeno em sangue total. Teoricamente, o sangue total é um meio mais fisiológico para

a realização dos testes de função plaquetária, pois eritrócitos e leucócitos participam deste fenômeno

biológico, fomentando ou obstando-o (ABBATE et alii, 1985; LEHMAN et alii, 1985; MÜLLER et alii,

1995). Se por um lado a agregação plaquetária em sangue total é menos sensível para a detecção de

estados de inibição plaquetária (INGERMAN-WOJENSKI et alii, 1982, 1983; INGERMAN-WOJENSKI &

SILVER, 1984), por outro lado a agregação plaquetária induzida pelo colágeno é mais intensa no sangue

total do que PRP (ABBATE et alii, 1985; CARDINAL & FLOWER, 1980; KURATA et alii, 1995). Estes

dados se traduzem na observação de que no envenenamento de coelhos pela B. jararaca a agregação

plaquetária induzida pelo colágeno inexiste no PRP (SANTORO, 1993) e está diminuída parcialmente no

sangue total (resultados ora apresentados). A agregação plaquetária induzida pelo colágeno no sangue

total dos coelhos envenenados se recuperava parcialmente em 24 h, apesar da contagem plaquetária

neste intervalo de tempo não ter se elevado significativamente em relação a 3 h. Estes dados

corroboram a evidência de que a hipoagregação plaquetária no sangue total de pacientes humanos

envenenados pela B. jararaca não se vincula necessariamente à trombocitopenia (SANO-MARTINS et

alii, 1997). De fato, outros autores já observaram que não havia uma relação direta entre a contagem

plaquetária e a intensidade de agregação plaquetária no sangue total (KURATA et alii, 1995; SOLOVIEV

et alii, 1999).

A despeito dos níveis intraplaquetários de serotonina não terem sido diferentes dos controles ao

longo do tempo, a secreção de ATP permaneceu reduzida em 3 e 24 h após o envenenamento. Um

primeiro motivo que poderia ser arrolado para a baixa secreção de ATP seria a baixa contagem

plaquetária nas amostras de sangue total dos coelhos envenenados. Porém, como para a agregação em

sangue total, algumas investigações também já demonstraram que não há uma relação direta entre a

secreção de ATP e a contagem plaquetária das amostras (INGERMAN-WOJENSKI & SILVER, 1982, 1984;

KNÖFLER et alii, 1996; SWEENEY et alii, 1987), evidenciando que a contagem plaquetária não foi o

único motivo para a redução da secreção de ATP no sangue total dos coelhos envenenados. De acordo

com CARR et alii (1997), a secreção defeituosa de corpos densos pode ser causada pelo seu decréscimo

u DISCUSSÃO 138

numérico, pela diminuição do seu conteúdo intragranular, por um processo anormal da sua secreção ou

por uma combinação destes mecanismos. No caso em particular dos coelhos envenenados, o número de

corpos densos plaquetários parece estar reduzido, como o demonstra o estudo de SANTORO et alii

(1994). Como discutido acima, apesar do número de corpos densos estar diminuído e o conteúdo de

serotonina intraplaquetária estar normal, denotando uma recaptura rápida da serotonina previamente

secretada, aparentemente o conteúdo de ATP não foi readquirido. Diversamente do que ocorre com a

serotonina, os nucleotídeos existentes nos corpos densos plaquetários são sintetizados pelos

megacariócitos e uma vez secretados não são recapturados do meio extracelular pelas plaquetas, nem

capturados dos reservatórios metabólicos do citoplasma pelos corpos densos (WOJENSKI & SCHICK,

1993). Dessarte, a redução da secreção de ATP se deveu provavelmente ao decréscimo do conteúdo de

ATP dos corpos densos plaquetários. Todavia, haja vista que as plaquetas dos coelhos envenenados se

apresentavam hipoagregantes ao colágeno e a outros agonistas plaquetários, no sangue total e no PRP

(SANTORO, 1993), um defeito no mecanismo de transdução de sinal dos diversos receptores da

superfície plaquetária para a geração de segundos mensageiros no citoplasma pode ser também uma

causa da diminuição da secreção do ATP e da agregação. A secreção é um mecanismo dependente do

aumento da concentração de cálcio intracelular e da ativação da proteína quinase C, eventos mediados,

respectivamente, pela geração de IP3 e DAG (REED et alii, 2000). Este defeito na geração de segundos

mensageiros é demonstrado pela correção da hipoagregação plaquetária, induzida por agonistas

fisiológicos, pelo cálcio ionóforo A23187, que aumenta os níveis intracitoplasmáticos de Ca+2 e

restaura a agregação plaquetária aos seus níveis normais. O mesmo fenômeno ocorre em pacientes com

defeitos plaquetários de transdução de sinais que apresentam agregação normal após terem suas

plaquetas estimuladas pelo A23187 (YANG et alii, 1997).

Existe uma reciprocidade dos mecanismos de secreção e agregação plaquetárias. Por um lado, os

processos de secreção de corpos densos e geração de TxA2 dependem da ativação de fora para dentro

da GPIIb-IIIa (BALDUINI et alii, 1988; PHILLIPS et alii, 2001) e, outrossim, a inibição da agregação no

envenenamento botrópico promoveria igualmente a inibição daqueles eventos. Por outro lado, a

agregação plaquetária induzida pelo colágeno em plaquetas humanas ou de coelhos está

intrinsecamente vinculada à secreção do conteúdo dos corpos densos e da formação de TxA2

(PACKHAM et alii, 1992). Dentre os componentes secretados pelos corpos densos, o ADP possui uma

importância preponderante para as plaquetas humanas, enquanto que a secreção de serotonina é de

maior relevância para o coelho (LATTA et alii, 1994; PACHKAM et alii, 1991; TAKANO, 1995). Contudo,

o conteúdo de serotonina intracitoplasmático das plaquetas dos coelhos envenenados não difere dos

valores do controle e, portanto, este não parece ser o motivo da redução da agregação plaquetária

induzida pelo colágeno. Ademais, estudos em pacientes ou animais com deficiências congênitas ou

u DISCUSSÃO 139

adquiridas no conteúdo dos corpos densos plaquetários revelaram que todos eles apresentavam

prolongamento no tempo de sangramento, mas não apresentavam necessariamente uma diminuição da

intensidade da agregação plaquetária induzida por diversos agonistas, entre eles o colágeno (COLGAN et

alii, 1989; ISRAELIS et alii, 1990; NIEUWENHUIS et alii, 1987). Esta observação demonstra que apesar

da secreção dos corpos densos fomentar a agregação plaquetária, ela não é um evento imprescindível

para que a agregação, especialmente no sangue total, ocorra (INGERMAN-WOJENSKI & SILVER, 1984).

Pelos resultados obtidos neste estudo, considera-se que a trombina desempenhou um papel

preponderante na ativação plaquetária observada in vivo. Já se demonstrou que as plaquetas de coelhos

previamente estimuladas pela trombina não agregam a uma estimulação subseqüente pela trombina;

contudo, o colágeno é ainda capaz de estimulá-las a agregar parcialmente e secretar o conteúdo

remanescente dos seus corpos densos (REIMERS et alii, 1976). No entanto, as plaquetas previamente

estimuladas pelo colágeno ou pela convulxina não são ativadas novamente pelo colágeno (HALLAM et

alii, 1982; VARGAFTIG et alii, 1983). Este fenômeno, denominado dessensibilização, pode ter

cooperado para causar a hipoagregação plaquetária observada no sangue total após a administração do

veneno botrópico aos coelhos, visto que as plaquetas podem ter sido expostas à trombina intravascular

e ter se tornado, portanto, parcialmente refratárias a uma nova estimulação pelo colágeno. Conquanto

este fenômeno possa explicar aparentemente o mecanismo de hipoagregação plaquetária no sangue

total, ele não explica a observação de SANTORO (1993) de que há a restauração da agregação

plaquetária à sua intensidade normal quando as plaquetas são lavadas e retiradas do contato com o meio

plasmático.

A botrocetina é verdadeiramente um indutor de aglutinação plaquetária, embora haja relatos de que

ela cause a ativação de proteína quinases (especialmente a Syk) (ASAZUMA et alii, 1997; OZAKI et alii,

1995). A aglutinação plaquetária induzida pela botrocetina é mediada pela sua ligação a três regiões

descontínuas do domínio A1 do vWF (Asp539-Val553, Lys569-Gln583 e Arg629-Lys643), às quais a heparina

e o colágeno também se ligam fisiologicamente (SUGIMOTO et alii, 1991). Desta forma, o vWF na

presença da botrocetina sofre uma mudança estrutural que lhe permite ligar-se ao complexo GPIb-IX-V

da membrana plaquetária e induzir a aglutinação plaquetária (READ et alii, 1989; SUGIMOTO et alii,

1991). A atividade aglutinante da botrocetina ocorre tanto na presença de plaquetas fixadas como na

presença de plaquetas metabolicamente ativas, porém é necessário que haja vWF no meio extracelular.

A sua atividade independe da secreção de corpos densos, da produção de TxA2, do metabolismo

plaquetário e de íons bivalentes extracelulares (CLEMMONS et alii, 1984; USAMI et alii, 1993). Os

coelhos envenenados apresentaram uma diminuição da intensidade da aglutinação plaquetária induzida

pela botrocetina até 24 h após o envenenamento, porém não houve, como já observado, uma

diminuição dos níveis plasmáticos de vWF. Dessarte, a diminuição da intensidade de aglutinação

u DISCUSSÃO 140

plaquetária poderia ser devida à diminuição dos receptores para o vWF na membrana plasmática das

plaquetas do coelho ou à presença de alguma proteína presente no plasma que inibisse a aglutinação

plaquetária. A porção citoplasmática da GPIb é extremamente sensível à degradação proteolítica,

especialmente pela elastase, plasmina, calpaína, catepsina G, tripsina e pela mocarragina, uma

metaloproteinase do veneno de Naja mocambique mocambique (AZIZ et alii, 1995; BEER et alii, 1994;

WARD et alii, 1996). A plasmina pode ter contribuído para a digestão da GPIb, porquanto durante a

ativação secundária do sistema fibrinolítico após o envenenamento, como observado supra, há a

geração de grandes quantidades de plasmina intravascular, demonstrada pela acentuada redução dos

níveis plasmáticos da α2-antiplasmina (CARDOSO et alii, 1993; MARUYAMA et alii, 1990). Também

deve ser considerado, para a inibição da atividade da GPIb, a presença no veneno da B. jararaca de

uma proteína que se liga à GPIb humana e impede a aglutinação plaquetária induzida pela botrocetina e

pela ristocetina (FUJIMURA et alii, 1995); porém, ainda deve ser esclarecido se esta proteína se liga à

GPIb do coelho. Todavia, a hipótese mais provável para a redução da aglutinação induzida pela

botrocetina parece ser a redistribuição da GPIb na superfície plaquetária, induzida pela geração da

trombina intravascular. Como já relatado na literatura, a ativação plaquetária pela trombina causa uma

diminuição da expressão da GPIb na sua superfície e, por conseguinte, uma diminuição da intensidade

de aglutinação plaquetária induzida pela ristocetina (GEORGE & TORRES, 1988; MICHELSON &

BARNARD, 1987). Para que se verificasse se a GPIb apresentava alguma diminuição da GPIb na

superfície plaquetária dos coelhos, vários anticorpos monoclonais específicos para a GPIb humana

foram testados com a finalidade de quantificá-la, porém os resultados foram infrutíferos, uma vez que

nenhum anticorpo reconheceu a GPIb do coelho. A digestão enzimática da GPIb causa o seqüestro

imediato e definitivo das plaquetas de coelhos (GREENBERG et alii, 1979b); contudo, não se pôde

demonstrar se houve a digestão da GPIb durante o envenenamento. As plaquetas que permaneceram

circulando após o envenenamento, embora estivessem hipoagregantes ex vivo ao colágeno e à

botrocetina, mantiveram sua função hemostática in vivo, uma vez que os coelhos envenenados não

sofreram sangramentos ao longo do tempo. Para isto teve importância provavelmente os níveis normais

ou elevados de vWF circulante durante o envenenamento, que, apesar da trombocitopenia, foram

capazes de manter a hemostasia primária. Estes resultados estão de acordo com a observação clínica de

que pacientes, envenenados pela B. jararaca, com tempo de coagulação do sangue total normal ou

incoagulável, não apresentavam qualquer alteração do tempo de sangramento, um estimador da função

da hemostasia primária (ROSENFELD et alii, 1958).

A diminuição da agregação plaquetária em PRP já foi observada igualmente em outros

envenenamentos ofídicos, como pela E. coloratus (BIRAN et alii, 1972, 1973). Estes autores

observaram que a agregação plaquetária induzida pelo ADP e colágeno no PRP só retornava à

u DISCUSSÃO 141

normalidade no nono dia após o envenenamento. As plaquetas lavadas também não agregavam

normalmente, indicando uma ação direta deste veneno sobre as plaquetas. Da mesma forma, coelhos

que receberam uma injeção intravenosa de veneno de Trimeresurus flavoviridis apresentaram uma

redução da agregação plaquetária induzida pelo ADP e colágeno no PRP (KOSUGI et alii, 1989). No

envenenamento pela D. russelli também ocorria uma diminuição da resposta plaquetária ao estímulo

pelo ADP, adrenalina, colágeno e ristocetina; além disso, ocorria uma ativação plaquetária demonstrada

pela diminuição na concentração de nucleotídeos plaquetários e pelo aumento na concentração

plasmática de PF4 e β-TG (THAN-THAN et alii, 1988). No entanto, HUTTON et alii (1990) obtiveram

tênues evidências de ativação plaquetária em três pacientes envenenados pela Trimeresurus albolabris

uma vez que o número de agregados plaquetários circulantes, a concentração dos nucleotídeos

plaquetários e os níveis plasmáticos de PF4 se apresentavam dentro dos valores de referência. Todos os

três pacientes apresentaram elevação do nível plasmático de β-TG e somente dois desses pacientes

apresentaram uma diminuição da resposta de agregação a um dos quatro agonistas testados (ADP,

colágeno, adrenalina ou ristocetina). THOMAZINI et alii (1991) observaram que pacientes picados pela

Crotalus durissus terrificus brasileira apresentavam agregação reduzida no PRP ao ADP 1 µM, que

persistia até 48 h após o envenenamento, contudo apresentavam agregação normal à adrenalina, ao

colágeno e ao ADP 3 µM. Resultados semelhantes aos anteriores foram descritos para pacientes

humanos picados pela B. jararaca: a agregação plaquetária em PRP estava reduzida para o colágeno,

adrenalina e ADP na admissão hospitalar, porém retornava à normalidade em 24 h após o acidente,

com exceção da agregação induzida pelo ADP 1 µM (IUAN et alii, 1995).

Em um estudo da função plaquetária em sangue total de indivíduos picados pela B. jararaca, SANO-

MARTINS et alii (1997) relataram que, à chegada ao hospital, estes pacientes apresentavam

hipoagregação plaquetária ao ADP e à ristocetina, porém agregação normal ao colágeno; após 24 h do

tratamento com o soro antibotrópico, os valores da agregação induzida pela ristocetina e pelo colágeno

se apresentavam acima dos valores de referência, porém a agregação induzida pelo ADP ainda se

mantinha reduzida em comparação aos valores de referência (SANO-MARTINS et alii, 1997). Uma vez

que a agregação de plaquetas humanas pelo ADP depende da presença de fibrinogênio no meio

extracelular e como alguns pacientes apresentavam hipofibrinogenemia, fez-se a adição de fibrinogênio

às amostras de agregação, porém não houve a correção da hipoagregação plaquetária induzida pelo

ADP. Tampouco houve uma relação entre os níveis plasmáticos dos PDF com a agregação plaquetária

induzida pelo ADP, de modo a indicar que estas proteínas estivessem interferindo nesta reação. Como

já relatado na literatura, os PDF inibem a ligação do fibrinogênio aos receptores de plaquetas ativadas e

desse modo interferem na agregação plaquetária (KOWALSKI et alii, 1964; NIEWIAROWSKI et alii,

1977a; PASQUA & PIZZO, 1983). Similarmente, a persistente hipoagregação plaquetária no PRP de

u DISCUSSÃO 142

coelhos envenenados não apresentou qualquer relação entre a recuperação dos níveis plasmáticos do

fibrinogênio e a redução dos PDF (SANTORO, 1993).

Quando as plaquetas lavadas de indivíduos normais eram incubadas com plasma de pacientes

envenenados pela Bothrops jararaca, havia uma redução da agregação em comparação com plaquetas

incubadas com plasma normal (SANO-MARTINS et alii, 1997). Inversamente, as plaquetas lavadas de

coelhos envenenados pela B. jararaca, retiradas do contato com as proteínas plasmáticas, agregavam

do mesmo modo que as plaquetas obtidas de coelhos normais (SANTORO, 1993).

Os resultados de SANTORO (1993), SANO-MARTINS et alii (1997) e os dados obtidos no presente

estudo indicam a presença de alguma substância plasmática que interfere tanto na agregação

plaquetária como na transdução de sinais extracelulares nas plaquetas humanas e de coelhos durante o

envenenamento botrópico. Como observado anteriormente, a estimulação plaquetária no PRP pelo

cálcio ionóforo A23187 provocava respostas idênticas nos coelhos envenenados e controles (SANTORO,

1993). Este agonista é capaz de promover um aumento direto na concentração do cálcio

intracitoplasmático a partir dos estoques intraplaquetários e do meio extracelular e não prescinde da

geração de IP3 e DAG para causar agregação plaquetária (YANG et alii, 1997). Assim, a razão da

diminuição da resposta plaquetária ao colágeno no sangue total ou no PRP (SANTORO, 1993) parece

também advir da presença de inibidores plasmáticos que alterem os receptores plaquetários ou os

mecanismos de transdução dos estímulos fisiológicos externos. A natureza química deste(s)

inibidor(es) é ainda desconhecida no momento e será o objeto de futura investigação. Contudo, pode-se

citar alguns mecanismos prováveis desta inibição, tais como proteínas que alterem a atividade das

proteínas G, semelhantemente à ação da toxina pertússica (BRASS et alii, 1997) e/ou a presença de

proteínas que se liguem à GPIIb-IIIa e impeçam a sinalização de fora para dentro (PHILLIPS et alii,

2001). Ao estudarem a agregação e secreção plaquetárias após a administração da enzima trombina-

símile “ancrod” a coelhos, CHANG & HUANG (1995) chegaram a conclusões semelhantes acerca da

presença de uma substância plasmática inibitória da função plaquetária. De acordo com estes autores, o

consumo do fibrinogênio e o aumento dos níveis plasmáticos dos PDF eram fatores importantes para a

hipoagregação e a diminuição da secreção de ATP observadas nos coelhos administrados com o

“ancrod”. No entanto, estes eventos não eram a causa única dos distúrbios da função plaquetária, à

medida que outras proteínas plasmáticas pareciam estar envolvidas em tal fenômeno. Os níveis

plasmáticos da PGI2 liberada pelas células endoteliais aumentaram somente após 6 h da administração

do “ancrod”, evidenciando que a prostaciclina também não estava envolvida diretamente com a

inibição da agregação e secreção plaquetárias observadas anteriormente a este intervalo de tempo

(CHANG & HUANG, 1995). É motivo de especulação se a prostaciclina está envolvida na redução da

secreção e da agregação plaquetárias neste modelo de envenenamento botrópico, uma vez que já foi

u DISCUSSÃO 143

relatado na literatura que as infusões prolongadas e em altas doses de PGI2 no coelho fazem com que as

plaquetas se tornem refratárias à inibição da PGI2 após algumas horas (BERTELÉ et alii, 1985;

VANDERWEL & HASLAM, 1985).

Os inibidores da agregação plaquetária presentes no veneno da B. jararaca poderiam também

contribuir para a hipoagregabilidade plaquetária observada no sangue total. Dentre estes inibidores, as

disintegrinas jararacina e jarastatina (COELHO et alii, 1999; SCARBOROUGH et alii, 1993) poderiam ser

em parte responsáveis por esta inibição, visto que outras disintegrinas ao serem administradas a animais

de laboratório ou a cães são capazes de inibir a agregação plaquetária ex vivo em PRP ou impedir

eventos tromboembólicos (BEVIGLIA et alii, 1993; DENNIS et alii, 1989; SHEBUSKI et alii, 1989,

1990ab; SHEU & HUANG, 1994). Contudo, várias evidências sugerem que as disintegrinas não possuem

uma importância marcante durante o envenenamento botrópico, particularmente no modelo de

envenenamento ora descrito. Considerando-se a quantidade de jararacina presente no veneno de B.

jararaca e a sua massa molecular (7556 Da), de acordo com SCARBOROUGH et alii (1993), e o volume

total de plasma no coelho (40 mL/kg, ALVING et alii, 1977), a concentração máxima teórica de

jararacina que poderia ser atingida na circulação dos coelhos administrados com 60 µg/kg de veneno de

B. jararaca seria aproximadamente 3 nM. Esta concentração de jararacina circulante não é efetiva para

reduzir a agregação plaquetária dos coelhos perante a alta concentração de colágeno utilizada aqui

(SCARBOROUGH et alii, 1993). Ademais, muitos estudos experimentais já demonstraram que as

plaquetas de coelhos são muito mais resistentes, em relação às plaquetas humanas, à inibição da

agregação plaquetária pelas disintegrinas (CHEN et alii, 1995; COELHO et alii, 1999; DENNIS et alii,

1989; GAN et alii, 1988; SHEU & HUANG, 1994; TRIKHA et alii, 1994; VERHALLEN & BARTH, 1991).

Resultados semelhantes também foram obtidos com o peptídeo RGDS, cuja atividade inibitória foi

menor nas plaquetas de coelhos do que nas humanas (HARFENIST et alii, 1988; RAND et alii, 1999;

VERHALLEN & BARTH, 1991). Após 30 min da administração, em dose única, das disintegrinas

quistrina ou triflavina a coelhos (3,4 µM, concentração máxima no plasma de coelho), a resposta da

agregação no PRP, induzida pelo colágeno 10 µg/mL ou pelo ADP 20 µM, já se igualava à resposta de

coelhos controles (DENNIS et alii, 1989; SHEU & HUANG, 1994); isto se deve provavelmente à célere

depuração das disintegrinas na circulação, visto que suas baixas massas moleculares fazem com que

sejam filtradas rapidamente pelos rins e eliminadas na urina (BEVIGLIA et alii, 1993; MARQUES et alii,

2001). Todas estas evidências sugerem que as disintegrinas tenham apenas uma ação efêmera durante a

fase inicial do envenenamento botrópico.

Como os resultados de SANTORO (1993) sugeriam uma hipoagregação generalizada em resposta a

todos os agonistas fisiológicos no PRP, investigou-se no presente estudo a expressão e a ativação da

GPIIb-IIIa na superfície das plaquetas circulantes, por meio da técnica de citometria de fluxo. A GPIIb-

u DISCUSSÃO 144

IIIa é o receptor fisiológico para o fibrinogênio e faz-se mister a sua ativação para que ocorra a

agregação plaquetária induzida por qualquer agonista. Do mesmo modo, a expressão da P-selectina,

uma glicoproteína cuja expressão aumenta na superfície de plaquetas ativadas, e do fibrinogênio (ou

dos PDF) foram igualmente avaliadas.

Inicialmente, para a caracterização da expressão dos epítopos estudados na superfície de plaquetas

quiescentes e ativadas, empregou-se a trombina bovina para a ativação in vitro das plaquetas lavadas de

coelho. Para que se averiguasse a atuação direta do veneno de B. jararaca sobre a expressão desses

epítopos, as plaquetas foram tratadas da mesma forma com este veneno (Figura 37).

Como não existem anticorpos policlonais comerciais específicos para a GPIIb-IIIa do coelho, a

purificação deste complexo glicoprotéico se fez necessária para a obtenção de anticorpos específicos

para esta espécie. O complexo GPIIb-IIIa purificado do coelho apresentou massas moleculares

calculadas aproximadas para a GPIIb de 134,7 kDa e para a GPIIIa de 98,3 kDa (Figura 19), valores

correspondentes àqueles obtidos por AZRIN et alii (1994) (135 kDa e 104 kDa, respectivamente) e

RAND et alii (1999) (135 kDa e 95 kDa, respectivamente). A IgY total antiGPIIb-IIIa de coelho

conjugada com a fluoresceína reconheceu especificamente, no Western blotting, duas bandas com

massas moleculares de 130,4 kDa e 101,5 kDa, correspondentes aos valores das massas moleculares

calculadas, respectivamente, da GPIIb e da GPIIIa de coelho (Figura 25). Pela citometria de fluxo, este

anticorpo reconheceu as plaquetas não ativadas e mais intensamente as plaquetas ativadas pela

trombina (Figura 37). Da mesma maneira, este anticorpo reconheceu especificamente as plaquetas

fixadas, em lâminas de esfregaço sangüíneo, pela imunofluorescência direta (Figura 26). Todos estes

resultados demonstram a pureza da GPIIb-IIIa purificada das plaquetas de coelho e a especificidade do

anticorpo policlonal utilizado para detectá-las.

A ligação deste anticorpo policlonal à superfície das plaquetas ativadas in vitro pela trombina

aumentou cerca de duas vezes em comparação às plaquetas quiescentes. No entanto, o veneno de B.

jararaca não induziu qualquer alteração da expressão da GPIIb-IIIa na superfície plaquetária. Os dados

ora apresentados demonstram que as plaquetas de coelhos revelam um aumento da expressão da GPIIb-

IIIa em resposta à estimulação in vitro pela trombina, como acontece para as plaquetas humanas

(GEORGE et alii, 1986). As plaquetas humanas apresentam um reservatório interno de GPIIb-IIIa

presente na superfície interna dos grânulos α, o qual é deslocado para a superfície durante a ativação e

secreção plaquetárias (MICHELSON & BARNARD, 1987; WENCEL-DRAKE et alii, 1986). Este reservatório

de GPIIb-IIIa é móvel e uma vez que as GPIIb-IIIa ativadas se liguem ao fibrinogênio, por um processo

de endocitose, as plaquetas são capazes de internalizar este receptor ligado ao seu ligante e, dessarte, as

plaquetas podem voltar ao seu estado quiescente (WENCEL-DRAKE et alii, 1996). Entretanto este

modelo de recirculação de glicoproteínas da membrana plaquetária não é universal, uma vez que, como

u DISCUSSÃO 145

explicitado acima, as plaquetas ativadas pela trombina internalizam as moléculas de GPIb no interior

do sistema de canais abertos, onde não podem mais alcançar os seus ligantes naturais. Este mecanismo

ocorre graças ao rearranjo do citoesqueleto durante a mudança de forma plaquetária, cujo resultado é a

redução da expressão da GPIb na superfície plaquetária (GEORGE et alii, 1986; HOURDILLÉ et alii,

1990; MICHELSON & BARNARD, 1987; MICHELSON et alii, 1991; RAO et alii, 1997; WENCEL-DRAKE,

1990).

No modelo de envenenamento experimental pela B. jararaca no coelho, não ocorreu um aumento da

expressão da GPIIb-IIIa, avaliada pela IgY policlonal antiGPIIb-IIIa, ao longo do tempo nos dois

grupos de estudo, evidenciando que as plaquetas não perderam GPIIb-IIIa. Devido à presença de

inúmeras proteases no veneno de B. jararaca, havia a hipótese de que a diminuição da resposta da

agregação plaquetária a diversos agonistas plaquetários poderia ser causada pela degradação deste

complexo glicoprotéico pelas mesmas (SANTORO, 1993; SANTORO et alii, 1994). Todavia, isto não foi

observado, como o demonstram os dados apresentados aqui (Figura 39). As plaquetas dos coelhos

envenenados apresentaram índices de ativação plaquetária que não diferiram estatisticamente ao longo

do tempo, com valores similares ao das plaquetas dos coelhos controles, demonstrando que as

plaquetas circulantes, ativadas durante o envenenamento, apresentavam o mesmo número de receptores

do que as plaquetas quiescentes. Se houve um aumento da expressão da GPIIb-IIIa nas plaquetas dos

coelhos envenenados, isto ocorreu em intervalo de tempo anterior a 1 h. De fato, já se demonstrou que

as plaquetas não agregadas são capazes de internalizar em cerca de 30 min a GPIIb-IIIa em repouso ou

a GPIIb-IIIa ativada ligada ao fibrinogênio (WENCEL-DRAKE, 1990; WENCEL-DRAKE et alii, 1996).

Dessarte, as plaquetas dos coelhos envenenados provavelmente apresentaram um aumento da expressão

da GPIIb-IIIa durante os minutos iniciais do envenenamento, que contudo retornou aos níveis basais

rapidamente devido à mobilidade da GPIIb-IIIa.

Com relação à expressão do fibrinogênio, a incubação das plaquetas de coelho com a trombina

induziu um aumento de cerca de cem vezes na expressão do fibrinogênio na superfície da membrana

plaquetária, evidenciando que o anticorpo policlonal antifibrinogênio de coelho, utilizado no presente

estudo, pôde diferenciar estados de repouso e ativação plaquetária pela citometria de fluxo. Durante o

processo de ativação plaquetária, não somente o número de GPIIb-IIIa aumenta na superfície

plaquetária, mas também a capacidade de ligação da GPIIb-IIIa ao fibrinogênio. Isto ocorre devido a

uma mudança estrutural da GPIIb-IIIa, promovida pelo processo de sinalização de dentro para fora, que

induz a formação de um sítio de alta afinidade para o fibrinogênio na GPIIb-IIIa ativada (CALVETE,

1999). Este processo de ativação da GPIIb-IIIa pode ser detectado in vivo pela citometria de fluxo com

a utilização de anticorpos que reconheçam o fibrinogênio ligado à superfície da membrana plaquetária

ou com anticorpos que reconheçam a mudança estrutural da GPIIb-IIIa (ABRAMS & SHATTIL, 1991;

u DISCUSSÃO 146

FARADAY et alii, 1994; MICHELSON & FURMAN, 1999; SCHMITZ et alii, 1998). Durante o processo de

ativação plaquetária, a ativação da GPIIb-IIIa e a ligação do fibrinogênio ocorrem anteriormente à

secreção e à expressão da P-selectina (HOLMES et alii, 1999; RUF & PATSCHEKE, 1995). Outrossim, a

detecção do fibrinogênio na superfície plaquetária seria um indicador mais sensível da ativação

plaquetária, não fosse a capacidade das plaquetas de internalizá-lo, o que torna a sua detecção

reversível (RUF & PATSCHEKE, 1995; WENCEL-DRAKE et alii, 1996). Como observado por YAMAZAKI

et alii (2001), é difícil encontrar plaquetas circulantes ligadas ao fibrinogênio, da mesma forma que

encontrar uma correlação entre a ligação do fibrinogênio e a expressão da P-selectina em pacientes com

patologias que causam a ativação plaquetária in vivo. Isso se traduz pelo pequeno número de relatos

que conseguiram detectar o aumento da expressão do fibrinogênio na superfície plaquetária em

pacientes com plaquetas ativadas circulantes (SREEDHARA et alii, 1996; YAMAZAKI et alii, 2001). Com

relação à expressão do fibrinogênio nas plaquetas tratadas com o veneno de B. jararaca, não se

observou qualquer alteração do índice de ativação plaquetária após este tratamento.

Como observado na Figura 38, durante as primeiras horas iniciais após a administração do veneno

ou salina, ambos os grupos apresentaram um aumento discreto da expressão do fibrinogênio na

superfície plaquetária. Com exceção do intervalo de 24h, não houve um aumento significativo do

fibrinogênio no grupo experimental que demonstrasse uma ocupação da GPIIb-IIIa ativada pelo

fibrinogênio. Como o anticorpo utilizado neste estudo é policlonal e não distingue o fibrinogênio dos

PDF ligados à superfície plaquetária, pode-se afirmar que a superfície plaquetária não apresentou

igualmente um aumento destes durante o envenenamento. Não obstante, ainda deve ser investigado se

as plaquetas são capazes de fazer a endocitose dos PDF da mesma maneira que fazem com o

fibrinogênio ligado à GPIIb-IIIa ativada. Os resultados da expressão das proteínas reconhecidas pelo

anticorpo antifibrinogênio na superfície das plaquetas dos coelhos envenenados evidenciam, todavia,

que a razão da inibição da agregação plaquetária durante o envenenamento não é a presença de PDF

ligados à GPIIb-IIIa ativada. Confirmando conclusões prévias, os dados ora apresentados sugerem que

os PDF não são os únicos responsáveis pela inibição da agregação plaquetária durante o

envenenamento botrópico.

O P2 é um anticorpo específico para o complexo GPIIb-IIIa e, assim, não reconhece

individualmente as glicoproteínas IIb e IIIa isoladas (MCGREGOR et alii, 1986). Da mesma forma, o P2

reconheceu o complexo intacto de GPIIb-IIIa das plaquetas de coelho pela citometria de fluxo, mas não

reconheceu cada uma das unidades deste complexo pelo Western blotting (Figura 25). O P2 se liga quer

à GPIIb-IIIa inativa quer a GPIIb-IIIa ativa e é capaz de inibir a agregação e secreção plaquetárias

induzidas pela trombina, ADP e colágeno. Tanto a ligação do fibrinogênio como a da fibronectina às

plaquetas ativadas é inibida parcialmente pelo P2, sugerindo que o determinante antigênico

u DISCUSSÃO 147

reconhecido por este anticorpo esteja próximo ao sítio de ligação do fibrinogênio à GPIIb-IIIa ativada

(MCGREGOR et alii, 1983, 1986; PETER et alii, 1998). Diferentemente de outros anticorpos monoclonais

que reconhecem a GPIIb-IIIa e são capazes de ativá-la, o P2 não possui tal atividade (PETER et alii,

1998). Nos experimentos de ativação plaquetária in vitro, a expressão do P2 aumentou cerca de duas

vezes nas plaquetas ativadas pela trombina, porém o veneno de B. jararaca não foi capaz de alterar a

sua expressão (Figura 37). O aumento da expressão do P2 em plaquetas estimuladas já fora relatado

anteriormente na literatura (FARADAY et alii, 1997; MOLINO et alii, 1993). Nos resultados ora

apresentados houve uma redução estatisticamente significativa da expressão do epítopo reconhecido

pelo P2 nas plaquetas dos coelhos envenenados no intervalo de tempo de 1 e 2 h. Como o demonstram

os dados obtidos pela IgY policlonal, não ocorreu alteração quantitativa da GPIIb-IIIa na superfície

plaquetária a partir de 1 h após a administração do veneno ou salina. Assim, a diminuição da expressão

do epítopo reconhecido pelo P2 provavelmente reflete a ocupação deste sítio por alguma substância que

impediria a ligação da GPIIb-IIIa ao P2. A hipótese mais arrazoada seria a ligação do fibrinogênio ou

dos PDF às plaquetas, que interferiria na ligação do P2 à GPIIb-IIIa; contudo, a expressão dessas

proteínas não se alterou nas plaquetas dos coelhos envenenados em relação aos coelhos controles em 1

e 2 h. Desta forma, algum outro ligante, que não seja o fibrinogênio e seus derivados, parece interferir

na ligação do P2 à GPIIb-IIIa, o que corrobora a hipótese de que alguma substância presente no plasma

dos coelhos envenenados interfere na ocupação da GPIIb-IIIa e reduz a intensidade da agregação

plaquetária. Alguns ensaios clínicos já relataram a diminuição da expressão do determinante antigênico

reconhecido pelo P2 (RINDER et alii, 1991; SREEDHARA et alii, 1996; ZURBANO et alii, 1999), inclusive

sem o aumento da ligação do fibrinogênio às plaquetas (RINDER et alii, 1991). No estudo empreendido

por SREEDHARA et alii (1996), em pacientes com síndrome urêmica, aventou-se a hipótese de que

fragmentos do vWF se ligariam à GPIIb-IIIa e poderiam ser a causa da redução da expressão dos

epítopos reconhecidos pelo P2. De fato, naquele estudo havia um aumento da ligação do vWF à

superfície plaquetária dos pacientes urêmicos. É motivo de especulação se no modelo experimental de

envenenamento ora apresentado o vWF ou os seus fragmentos interferem na ligação do P2 à GPIIb-

IIIa; contudo, é relevante ressaltar que nas 3 primeiras horas, os níveis plasmáticos de vWF do grupo

experimental se elevaram devido provavelmente à liberação dos multímeros de alta massa molecular do

vWF pelas células endoteliais, cujo potencial trombogênico é sabidamente elevado (MARTIN et alii,

1981), o que pode ter interferido na exposição do sítio da GPIIb-IIIa reconhecido pelo P2.

O anticorpo monoclonal antiLIBS1 reconheceu uma banda protéica no Western blotting com massa

molecular de 97 kDa, análoga àquela da GPIIIa de coelho (95 kDa) (Figura 25). De fato, RAND et alii

(1999) utilizaram este anticorpo para purificar a GPIIIa do coelho por meio de uma coluna de

imunoafinidade. O anticorpo antiLIBS1 reconhece um epítopo recôndito da GPIIIa que se torna

u DISCUSSÃO 148

exposto unicamente após a ligação da GPIIb-IIIa ao fibrinogênio, aos peptídeos que contenham a

seqüência RGD ou à seqüência do dodecapeptídeo carboxiterminal da cadeia de γ do fibrinogênio.

Portanto, como a união de algum ligante à GPIIb-IIIa se faz necessária para que haja a exposição do

sítio LIBS1 da GPIIIa, este anticorpo reconhece somente a mudança estrutural da GPIIb-IIIa, não

diferenciando os estados de ativação plaquetária, em que há a ligação do fibrinogênio à GPIIb-IIIa, dos

estados de repouso plaquetário que apresentem mudança estrutural da GPIIb-IIIa devido à ligação de

algum peptídeo (FRELINGER III et alii, 1990; GINSBERG et alii, 1990). O anticorpo antiLIBS1 não induz

a agregação ou secreção plaquetárias, todavia diminui a retração do coágulo (FRELINGER III et alii,

1990, 1991). Nos testes in vitro, este anticorpo reconheceu fracamente as plaquetas quiescentes, porém

evidenciou um aumento ao redor de 80 vezes na expressão do LIBS1 na superfície de plaquetas

ativadas pela trombina. Como para os demais anticorpos, a incubação das plaquetas com o veneno de

B. jararaca não induziu qualquer mudança na expressão do LIBS1. O aumento da expressão do LIBS1

já foi descrito em diversas condições patológicas que induzem ativação das plaquetas circulantes

(GAWAZ et alii, 1995a,b). Semelhantemente a estas observações, os coelhos envenenados apresentaram

um aumento significativo da expressão do LIBS1 até 24 h. Não obstante, como já observado

anteriormente, não ocorreu um aumento significativo da densidade do fibrinogênio ou dos PDF na

superfície plaquetária, nestes mesmos intervalos de tempo, que indicassem que o aumento da expressão

do LIBS1 fosse causado pela ligação destas proteínas a GPIIb-IIIa. Estes resultados sugerem que

alguma outra substância não identificada pelos anticorpos utilizados tenha se ligado à GPIIb-IIIa e

tenha promovido a sua mudança estrutural, de tal forma que expusesse o LIBS1 na superfície

plaquetária.

É interessante observar que os anticorpos policlonais e monoclonais utilizados como controles para

as reações de citometria de fluxo também apresentaram um aumento acentuado de suas expressões na

superfície plaquetária, tanto após a ativação plaquetária induzida in vitro pela incubação com a

trombina (Figura 37), como na ativação plaquetária induzida nos coelhos envenenados. Estes

anticorpos controles não reconheceram nenhuma banda plaquetária pelo Western blotting (Figura 25).

Assim, aparentemente, a maior ligação destes anticorpos às plaquetas ativadas não ocorreu por meio de

suas porções Fab. De fato, as plaquetas apresentam um receptor específico para a porção Fc da IgG – o

FcγRIIA (CD32) – na sua superfície, cuja expressão aumenta em plaquetas estimuladas pela trombina

(KARAS et alii, 1982; MCCRAE et alii, 1990). Este receptor, além da sua função imunológica de

reconhecimento da IgG, está fisicamente associado à GPIb-IX-V e é imprescindível para a transdução

de sinais e geração de mensageiros intracelulares (WU et alii, 2001). Outrossim, o aumento da

expressão dos receptores para a porção Fc da IgG na superfície plaquetária dos coelhos envenenados é

u DISCUSSÃO 149

apenas mais um dos eventos que ocorreram durante o processo de ativação plaquetária in vivo induzido

pelo veneno de B. jararaca.

A P-selectina é expressa em baixa densidade na superfície de plaquetas quiescentes, porém uma vez

que as plaquetas sejam ativadas e ocorra a exocitose dos grânulos α, a P-selectina acoplada à

membrana interna destas organelas é expressa na superfície plaquetária durante a coalescência de

membranas (REED et alii, 1998, 2000). O aumento de sua expressão na membrana plaquetária,

conseqüentemente, é um indicador bastante utilizado em estudos da ativação plaquetária in vivo e ex

vivo (GAWAZ et alii, 1996; GEORGE et alii, 1986; HOLMES et alii, 1999; MICHELSON & BARNARD,

1987; MICHELSON et alii, 1991, 2001; REED et alii, 1998; SCHMITZ et alii, 1998; WUN et alii, 1992;

YAMAZAKI et alii, 2001). Como o aumento da expressão da P-selectina depende da exocitose dos

grânulos plaquetários, este evento é ulterior ao aumento da expressão do fibrinogênio à GPIIb-IIIa e,

deste modo, é um indicador de uma ativação plaquetária mais intensa (RUF & PATSCHEKE, 1995).

Ademais, diferentemente da expressão temporária do fibrinogênio, a P-selectina não é reciclada pelas

plaquetas, permanecendo em sua superfície até que seja clivada por monócitos e neutrófilos

(MICHELSON et alii, 1994; RUF & PATSCHEKE, 1995). Como discutido acima, as plaquetas circulantes

com expressão incrementada de P-selectina rapidamente a perdem da sua superfície, porém continuam

a circular e funcionar (BERGER et alii, 1998; MICHELSON et alii, 1996, 2001). A P-selectina de coelho

apresenta uma massa molecular de 117 kDa, e sua expressão aumenta cerca de 30 vezes em plaquetas

estimuladas pela trombina (REED et alii, 1998). O anticorpo 12A7 (REED et alii, 1998) não foi capaz de

se ligar a nenhuma proteína do Western blotting, mas foi capaz de diferenciar especificamente as

plaquetas ativadas pela trombina das plaquetas quiescentes pela citometria de fluxo (Figuras 25 e 37);

estas observações indicam que o anticorpo 12A7 reconhece a P-selectina nativa e que a desnaturação da

sua estrutura pelo SDS torna o seu reconhecimento impraticável pelo Western blotting. As plaquetas

dos coelhos envenenados apresentaram uma aumento significativo da expressão da P-selectina nas

primeiras horas após o envenenamento, o que confirmou a hipótese inicial de que durante o

envenenamento botrópico as plaquetas são ativadas e assim permanecem por um determinado tempo

circulando. Como os testes in vitro de ativação plaquetária induzida pelo veneno de B. jararaca não

apresentaram qualquer aumento da expressão dos marcadores de ativação plaquetária (GPIIb-IIIa,

fibrinogênio e P-selectina), conclui-se que a ativação plaquetária que ocorre in vivo durante o

envenenamento pela Bothrops jararaca é basicamente devida à trombina engendrada

intravascularmente.

A análise dos resultados da citometria de fluxo demonstra que as plaquetas dos coelhos envenenados

apresentaram, especialmente nas três horas iniciais, um aumento da expressão da P-selectina, dos sítios

de ativação da GPIIIa (LIBS1) e dos receptores para Fc da IgG, além de uma diminuição acentuada do

u DISCUSSÃO 150

epítopo da GPIIb-IIIa reconhecido pelo anticorpo P2. Os aumentos observados na expressão da P-

selectina evidenciaram que as plaquetas foram realmente ativadas in vivo. Não ocorreu, contudo,

proteólise da GPIIb-IIIa, nem tampouco um aumento da expressão de proteínas que fossem

reconhecidas pelo anticorpo antifibrinogênio. Todavia, o aumento da expressão do LIBS1 evidenciou

que outras substâncias, que não eram reconhecidas pelo anticorpo antifibrinogênio, se ligaram à GPIIb-

IIIa e causaram a sua modificação estrutural. Paralelamente a esta observação, houve a ocupação dos

epítopos da GPIIb-IIIa próximos ao sítio de ligação ao fibrinogênio, reconhecidos pelo anticorpo P2.

Visto que a expressão do fibrinogênio ou dos PDF não estava aumentada nas plaquetas dos coelhos

envenenados, torna-se evidente que alguma proteína ou peptídeo se ligou próximo ou sobre o epítopo

da GPIIb-IIIa reconhecido pelo P2, aumentando a expressão do LIBS1 e possivelmente interferindo na

resposta de agregação e secreção plaquetárias que ocorreram durante o envenenamento.

Com todas as evidências ora apresentadas, a trombina gerada pela ação dos componentes pró-

coagulantes do veneno da B. jararaca parece ter desempenhado um papel primordial no

desencadeamento de todos os distúrbios hemostáticos observados. A trombocitopenia e o seqüestro

plaquetário no pulmão foram em grande medida causados pela ativação plaquetária. Ademais, a ação

da trombina sobre o fibrinogênio causou o depósito de fibrina estável nos pulmões e rins, o que

contribuiu decisivamente para a formação de microvesículas plaquetárias devido ao aumento da força

de cisalhamento em vasos obstruídos. Durante o processo de ativação pela trombina, as plaquetas

provavelmente secretaram o conteúdo de seus grânulos α e corpos densos, que não puderam, contudo,

ser evidenciados nos intervalos de tempo analisados devido provavelmente tanto à curta meia-vida do

PF4, como à célere recaptura da serotonina pelas plaquetas. A demonstração de que as plaquetas eram

realmente ativadas e continuavam na circulação proveio, respectivamente, da observação do aumento

da expressão da P-selectina na superfície das plaquetas dos coelhos do grupo experimental e da

determinação do tempo médio de sobrevivência plaquetária dos coelhos envenenados, que foi idêntico

ao dos coelhos controles. A recuperação da trombocitopenia se iniciou após 24 h da administração do

veneno e, aparentemente, não foi suficiente para aumentar acentuadamente a trombopoese, porquanto

os aumentos do volume plaquetário e do número de plaquetas reticuladas foram pouco significativos e

efêmeros. Houve, contudo, um distúrbio duradouro da função e da secreção plaquetárias, que perdurava

ainda 24 h após o envenenamento, quando os níveis de fibrinogênio plasmático já haviam se

normalizado. Este distúrbio da agregação e da secreção plaquetárias não foi causado pela degradação

proteolítica da GPIIb-IIIa, nem tampouco pela diminuição do conteúdo de serotonina intraplaquetária,

mas em grande medida pela ativação prévia das plaquetas circulantes pela trombina e pela ligação de

u DISCUSSÃO 151

algum composto, ainda desconhecido, que induzia tanto o aumento da expressão do LIBS1 da GPIIIa,

como a diminuição da expressão do epítopo reconhecido pelo anticorpo P2. Tais resultados evidenciam

a presença de uma ou mais substâncias plasmáticas inibitórias, ainda não identificadas, que alteram a

função da GPIIb-IIIa, a transdução de sinais e a geração de mediadores intracitoplasmáticos.

Reconhecer e purificar tal composto serão o escopo de uma investigação vindoura.

Contribuir para o conhecimento da fisiopatologia dos distúrbios hemostáticos é de certa forma

contribuir para que o sofrimento dos pacientes envenenados por serpentes seja dirimido, uma vez que

novas terapias podem advir de tais estudos. Como Filoctetes, que após ter sido tratado por Macáon,

retorna à guerra, fere com suas flechas o coração de Páris e viaja para a Itália, onde funda muitas

cidades, esperamos que os pacientes picados por serpentes peçonhentas tenham uma vida fecunda, sem

as mazelas causadas pelas seqüelas do envenenamento, a fim de que os seus destinos também sejam

cumpridos.

3 3 3

u CONCLUSÕES 152

6. Conclusões

1. Os coelhos injetados i.v. com veneno de B. jararaca reproduziram o quadro laboratorial do

envenenamento botrópico, caracterizado pela presença de hipofibrinogenemia e

trombocitopenia;

2. Os fatores pró-coagulantes do veneno da B. jararaca engendraram trombina intravascular, que

teve um papel destacado na patogênese dos distúrbios hemostáticos observados neste modelo;

3. O consumo de fibrinogênio nos coelhos envenenados se deveu à ação da trombina

intravascular, que converteu o fibrinogênio em fibrina estável. As redes de fibrina formadas

foram depositadas no leito vascular do rim e pulmão. No homem, no entanto, os componentes

trombina-símiles do veneno parecem ter uma maior importância na indução do consumo do

fibrinogênio. Estas enzimas formam fibrina solúvel, que não é depositada no leito vascular;

4. A formação de trombina intravascular foi branda no coelho, pois não houve consumo de

ATIII. Entretanto, a quantidade de trombina gerada foi suficiente para causar trombocitopenia

e hipofibrinogenemia moderadas;

5. O pulmão foi o principal local de depósito de plaquetas, presumivelmente pela sua alta

afinidade pelas plaquetas ativadas e também pela sua localização estratégica, que faz dele o

primeiro leito vascular a ser encontrado pelas plaquetas ativadas. Os capilares glomerulares

apresentaram depósitos de fibrina, porém não de plaquetas; o baço e o fígado não

apresentaram depósitos de fibrina nem de plaquetas;

6. A principal causa da trombocitopenia observada no envenenamento botrópico parece ser a

ativação das plaquetas circulantes pela trombina. A botrocetina não contribui para a indução

da trombocitopenia, assim como outros componentes com atividade pró-agregante plaquetária

presentes no veneno de B. jararaca;

7. A sobrevivência das plaquetas remanescentes na circulação após a administração do veneno

foi idêntica àquela dos animais controles, evidenciando que elas, a despeito de estarem

ativadas, ainda se mantinham circulando. Plaquetas previamente ativadas pela trombina

também apresentam o mesmo comportamento, evidenciando a importância que esta enzima

desempenha no destino das plaquetas circulantes durante o envenenamento botrópico;

8. O grau da trombocitopenia observada nos coelhos envenenados não foi capaz de aumentar

significativamente a produção de plaquetas reticuladas pela medula óssea. O restabelecimento

da contagem plaquetária, a partir de 48 h, se deveu, no entanto, à produção de novas plaquetas

pelos megacariócitos e não à recirculação das plaquetas depositadas nos órgãos. O estímulo de

u CONCLUSÕES 153

fatores de crescimento e citocinas parecem ter favorecido o aparecimento da trombocitose

reativa observada nos coelhos do grupo experimental e controle;

9. O aumento do PDW nas horas iniciais após a administração do veneno evidenciou o fenômeno

de microvesiculação plaquetária, induzido tanto pela ação direta da trombina sobre as

plaquetas circulantes, como pela alta força de cisalhamento encontrada pelas plaquetas ao

atravessarem os vasos obstruídos pelos depósitos de fibrina;

10. A despeito das plaquetas circulantes dos coelhos envenenados terem sido ativadas e secretado

o conteúdo de seus grânulos intraplaquetários, como o demonstra o aumento da expressão da

P-selectina na superfície plaquetária, não houve alteração dos valores de 5-HI e PF4

plasmáticos e da serotonina intraplaquetária nos tempos estudados. Estes dados evidenciam

que a secreção ocorreu logo após a administração do veneno e, devido à breve meia-vida do

PF4 na circulação e à acelerada recaptura da serotonina pelas plaquetas circulantes, estes

parâmetros não se apresentavam alterados já em 1 hora após a administração do veneno;

11. Os animais envenenados apresentaram um duradouro distúrbio da função plaquetária, avaliada

pela agregação e secreção de ATP no sangue total. Provavelmente, a ativação prévia pela

trombina contribuiu para a subseqüente dessensibilização das plaquetas circulantes ao

estímulo pelo colágeno. Uma vez que não houve decréscimo dos níveis plasmáticos do vWF, a

diminuição da GPIb-IX-V na superfície plaquetária – causada pela redistribuição deste

complexo, induzida pela trombina, ou pela proteólise da GPIb – parece ter contribuído para a

diminuição da resposta plaquetária à botrocetina;

12. As plaquetas dos coelhos envenenados não apresentaram um aumento da expressão do

fibrinogênio ou dos PDF, nem da GPIIb-IIIa, em sua superfície nos intervalos de tempo

estudados. Provavelmente, estas proteínas foram internalizadas pouco tempo após terem sido

estimuladas pela trombina. Ao ser incubado com as plaquetas de coelho in vitro, o veneno de

B. jararaca também não alterou a expressão da GPIIb-IIIa, do fibrinogênio ou da P-selectina

na superfície plaquetária;

13. Compostos, ainda não identificados, presentes no plasma dos coelhos envenenados parecem

ter se aderido à membrana plaquetária e interferido na expressão dos epítopos da GPIIb-IIIa

reconhecidos pelos anticorpos P2 e antiLIBS1. Da mesma forma, tais compostos parecem ter

interferido nas respostas de agregação e secreção plaquetárias no sangue total.

3 3 3

u QUINTO INTERLÚDIO – FILOCTETES DUELA COM PÁRIS 154

Urna, Volterra, MuseuGuarnacci. II século a.C. Após tersido tratado por Macáon,Filoctetes (barbado, usando umatúnica e tendo uma faixa enroladaem seu pé esquerdo) duela comParis. Fonte: LIMC (1994).

u RESUMO 155

7. Resumo SANTORO, M.L. Contribuição à investigação das alterações hemostáticas induzidas pelo veneno da serpente Bothrops jararaca em coelhos: estudo das glicoproteínas da membrana, função, secreção e sobrevivência plaquetárias. 2002. 194 p. Tese de doutorado – Departamento de Fisiologia, Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo, São Paulo.

Que o envenenamento pela serpente Bothrops jararaca causa distúrbios hemorrágicos sistêmicos, com alteração da coagulação e fibrinólise sangüíneas, é notório. Contudo, pouco se sabe sobre a ação in vivo desse veneno sobre as plaquetas. Em estudos recentes, demonstrou-se que esse veneno causa trombocitopenia, distúrbios da agregação e diminuição do número de corpos densos plaquetários, que, dessarte, sugeriam a ativação das plaquetas circulantes. Com o escopo de comprovar esta hipótese e melhor caracterizar as ações in vivo desse veneno sobre as plaquetas, serviu-se de um modelo experimental que empregava coelhos para o envenenamento pela B. jararaca. No grupo experimental, os animais foram injetados i.v. com o veneno da B. jararaca (60 µg/kg) e no grupo controle com salina. Previamente à administração de salina ou veneno, os coelhos tiveram suas plaquetas marcadas ex vivo com NHS-biotina. Para a avaliação das alterações plaquetárias, amostras de sangue foram coletadas seqüencialmente, em intervalos de tempo que variaram de 1 a 144 horas após a administração do veneno ou salina. Durante o envenenamento, houve trombocitopenia, hipofibrinogenemia, elevação dos níveis plasmáticos do fator de von Willebrand, diminuição da função plaquetária no sangue total induzida pela botrocetina e pelo colágeno e diminuição da secreção de ATP. Não obstante, os níveis plasmáticos de fator plaquetário 4, um marcador específico da ativação plaquetária in vivo, e os níveis intraplaquetários de serotonina se mantiveram constantes. Pela citometria de fluxo, observou-se um decréscimo significativo da expressão do epítopo da GPIIb-IIIa reconhecido pelo anticorpo monoclonal P2, porém isso não foi observado ao utilizar-se anticorpos policlonais. A expressão de fibrinogênio ou dos produtos de degradação do fibrinogênio/fibrina (PDF) na membrana plaquetária também não sofreu alteração significativa ao longo do tempo. Houve, todavia, elevações significativas da P-selectina plaquetária, um receptor cuja expressão é indicativa de ativação plaquetária, e do epítopo induzido por ligantes (LIBS1) da GPIIIa. A porcentagem de plaquetas reticuladas na circulação, assim como os tempos de sobrevivência plaquetária, não foram estatisticamente diferentes entre os dois grupos. As análises histológicas e imuno-histoquímicas dos órgãos dos coelhos mostraram que as plaquetas circulantes são retidas entre redes de fibrina nos capilares pulmonares. Os resultados obtidos sugerem que a trombina engendrada pelos componentes pró-coagulantes deste veneno desempenha uma função essencial na patogenia dos distúrbios da coagulação e plaquetários observados neste modelo de envenenamento. O aumento da expressão de P-selectina no grupo experimental comprovou a hipótese inicial de que as plaquetas dos coelhos envenenados são verdadeiramente ativadas na circulação. Os dados ora apresentados demonstram definitivamente que a diminuição do fibrinogênio ou o aumento dos PDF não são a causa fundamental da disfunção plaquetária observada no envenenamento botrópico e que outro(s) composto(s) parece(m) estar envolvido(s) com estes distúrbios plaquetários.

Palavras-chaves: Envenenamento, Bothrops jararaca, Serpentes, Venenos, Plaquetas, Coagulação, Agregação, Secreção, Citometria de fluxo, Sobrevivência Plaquetária, Plaquetas Reticuladas, P-selectina, Glicoproteína IIb-IIIa, Anticorpos, Galinha, Ovo, Fator plaquetário 4, Serotonina, Trifosfato de adenosina, Colágeno, Botrocetina, ELISA, Fibrinogênio, Fator de von Willebrand, Antitrombina III, Coelho

3 3 3

u ABSTRACT 156

8. Abstract SANTORO, M.L. Contribution to the investigation of hemostatic disturbances induced by Bothrops

jararaca snake venom in rabbits: study of platelet membrane glycoproteins, function, secretion and survival. 2002. 194 p. Doctorate Thesis - Departamento de Fisiologia, Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo, São Paulo, Brazil.

In spite of being well established that Bothrops jararaca snake venom causes blood coagulation and

fibrinolysis disturbances in patients, scant information about blood platelet disorders during envenomation is available. In recent investigations, thrombocytopenia, platelet aggregation disturbances and decreased numbers of platelet dense bodies were observed following venom administration, suggesting that circulating platelets had been activated. In order to prove this hypothesis and to gain a better characterization of the in vivo role of this venom on platelets, an experimental model of B. jararaca envenomation was utilized. Rabbits were injected i.v. either with B. jararaca venom (60 µg/kg) (experimental group) or saline (control group). Previously to saline or venom administration, rabbit platelets were labeled ex vivo with NHS-biotin. To evaluate platelet disturbances, blood samples were collected consecutively, at time intervals that varied from 1 to 144 hours after venom or saline administration. During envenomation, there were thrombocytopenia, hypofibrinogenemia, elevation of von Willebrand factor plasma levels, reduced botrocetin- and collagen-induced platelet aggregation in whole blood, and decreased ATP secretion. However, plasma levels of platelet factor 4, a specific marker of in vivo platelet activation, and intraplatelet serotonin levels remained constant. By flow cytometry, a significant decrease on the expression of GPIIb-IIIa epitope recognized by P2 monoclonal antibody was observed; however, this was not observed when polyclonal antibodies were employed. Fibrinogen or fibrin(ogen) degradation product (FDP) expression on platelet surface showed no significant alteration. Nonetheless, significant elevations of platelet P-selectin, a receptor whose expression is indicative of platelet activation, and of ligand-induced binding sites (LIBS1) of GPIIIa were noted. The percentage of circulating reticulated platelets, as well as platelet survival times, were not statistically different between the two groups. Histopathological and immunohistochemical analyses of rabbit organs demonstrated that circulating platelets were sequestered among fibrin deposits in pulmonary capillaries. These results suggest that thrombin generated by procoagulating components of B. jararaca venom has an essential role in the pathogenesis of platelet and coagulation disorders in this experimental model. Increased expression of P-selectin in the experimental group proves the initial hypothesis that platelets of envenomed rabbits are indeed activated in the circulation. The data presented herein demonstrate definitively that decreased fibrinogen or increased FDP levels are not the primary cause of the platelet dysfunction observed in bothropic envenomation, but other substances seem to be responsible for it.

Keywords: Envenomation, Bothrops jararaca, Snakes, Venoms, Platelets, Coagulation,

Aggregation, Secretion, Flow Cytometry, Platelet Survival, Reticulated platelet, P-selectin, Glycoprotein IIb-IIIa, Antibodies, Egg, Chicken, Platelet Factor 4, Serotonin, Adenosine Triphosphate, Collagen, Botrocetin, ELISA, Fibrinogen, von Willebrand Factor, Antitrombin III, Rabbit.

3 3 3

u REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

157

9. Referências bibliográficas4 ABBATE, R.; FAVILLA, S.; BODDI, M.; COSTANZO, G.; PRISCO, D. Factors influencing platelet aggregation in

whole blood. American Journal of Clinical Pathology, v. 86, p. 91-96, 1985. ABRAMS, C. & SHATTIL, S.J. Immunological detection of activated platelets in clinical disorders. Thrombosis

and Haemostasis, v. 65, p. 467-473, 1991. ABRAMS, C.S.; ELLISON, N.; BUDZYNSKI, A.Z.; SHATTIL, S.J. Direct detection of activated platelets and

platelet-derived microparticles in humans. Blood, v. 75, p. 128-138, 1990. ADELMAN, B.; STEMERMAN, M.B.; MENNELL, D.; HANDIN, R.I. The interaction of platelets with aortic

subendothelium: inhibition of adhesion and secretion by prostaglandin I2. Blood, v. 58, p. 198-205, 1981. ADELSON, E.; RHEINGOLD, J.J.; PARKER, O. Platelet and fibrinogen sequestration. Blood, v. 15, p. 596-605,

1960. AKITA, E.M. & NAKAI, S. Immunoglobulins from egg yolk: Isolation and purification. Journal of Food

Science, v. 57, p. 529-634, 1992. ALLEN, J.G.; GLOTZER, D.J.; CALIF, P.A. Acute disseminated intravascular coagulation and fibrinolysis.

Archives of Surgery, v. 88, p. 694-698, 1964. ALOOF, S.; KIRSCHMANN, C.; DE VRIES, A. Action of Near Eastern Viperidae venoms on human blood platelets

in vitro. Archives Internationales de Pharmacodynamie, v. 142, p. 216-227, 1962. ALVING, B.M.; EVATT, B.L.; BELL, W.R. Stimulation of fibrinogen synthesis by thrombin in rabbits with

ancrod-induced afibrinogenemia. American Journal of Physiology, v. 233, p. H562-H567, 1977. AMORIM, M.D.F.; DE MELLO, R.F.; SALIBA, F. Envenenamento botrópico e crotálico. Contribuição para o

estudo experimental comparado das lesões. Memórias do Instituto Butantan, v. 23, p. 63-108, 1951. ANCHIETA, JOSÉ DE. In: LEITE, SERAFIM. Cartas dos primeiros jesuítas do Brasil. Vol III. Coimbra: Atlântida,

1958. ANDREWS, R.K.; J.J., G.; BOOTH, W.J.; CORINO, G.L.; CASTALDI, P.A.; BERNDT, M.C. Cross-linking of a

monomeric 39/34-kDa dispase fragment of von Willebrand factor (Leu-480/ Val-481- Gly-718) to the terminal region of the alpha-chain of membrane glycoprotein Ib on intact platelets with bis(sulfosuccinimidyl) suberate. Biochemistry, v. 28, p. 8326-8336, 1989.

ANDREWS, R.K.; LÓPEZ, J.A.; BERNDT, M.C. Molecular mechanisms of platelet adhesion and activation. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, v. 29, p. 91-105, 1997.

ANDRIAO-ESCARSO, S.H.; SAMPAIO, S.V.; CUNHA, O.A.B.; MARANGONI, S.; OLIVEIRA, B.; GIGLIO, J.R. Isolation and characterization of a new clotting factor from Bothrops jararacussu (Jararacuçu) venom. Toxicon, v. 35, p. 1043-1052, 1997.

ANGLE, M.J.; PINCKARD, R.N.; SHOWELL, H.J.; MCMANUS, L.M. Ontogeny of the responsiveness to intravenous platelet-activating factor. Laboratory Investigation, v. 57, p. 321-328, 1987.

ARAUJO, P. & BELLUOMINI, H.E. Toxicidade de venenos ofídicos: I - sensibilidade específica de animais domésticos e de laboratório. Memórias do Instituto Butantan, v. 30, p. 133-142, 1960-62.

ARISTÓTELES. Meteorologica. Trad. Inglesa: LEE, H.D.P. London: Harvard University, 1952. ARNOTT, J.; HORSEWOOD, P.; KELTON, J.G. Measurement of platelet-associated IgG in animal models of

immune and nonimmune thrombocytopenia. Blood, v. 69, p. 1294-1299, 1987. AROCAS, V.; LEMAIRE, C.; BOUTON, M.C.; BEZEAUD, A.; BON, C.; GUILLIN, M.C.; JANDROT-PERRUS, M.

Inhibition of thrombin-catalyzed factor V activation by bothrojaracin. Thrombosis and Haemostasis, v. 79, p. 1157-1161, 1998.

AROCAS, V.; ZINGALI, R.B.; GUILLIN, M.C.; BON, C.; JANDROT-PERRUS, M. Bothrojaracin: A potent two-site-directed thrombin inhibitor. Biochemistry, v. 35, p. 9083-9089, 1996.

ARONSON, D.L. Effect of Russell's viper venom infusion on coagulation in the rabbit. In: Pirkle, H. & Markland, F.S., ed. Hemostasis and Animal Venoms. New York: Marcel Dekker, 1988, p. 481-490.

ASAZUMA, N.; OZAKI, Y.; SATOH, K.; YATOMI, Y.; HANDA, M.; FUJIMURA, Y.; MIURA, S.; KUME, S. Glycoprotein Ib-von Willebrand factor interactions activate tyrosine kinases in human platelets. Blood, v. 90, p. 4789-4798, 1997.

4

De acordo com a Norma Técnica da ABNT NBR 6023 – Informação e Documentação – Referências – Elaboração (ago./2000).

u REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

158

ASSAKURA, M.T.; REICHL, A.P.; MANDELBAUM, F.R. Comparison of immunological, biochemical and biophysical properties of three haemorrhagic factors isolated from the venom of Bothrops jararaca (jararaca). Toxicon, v. 24, p. 943-946, 1986.

ATKINSON, B.T.; STAFFORD, M.J.; PEARS, C.J.; WATSON, S.P. Signalling events underlying platelet aggregation induced by the glycoprotein VI agonist convulxin. European Journal of Biochemistry v. 268, p. 5242-5248, 2001.

AUCHAMPACH, J.A.; OLIVER, M.G.; ANDERSON, D.C.; MANNING, A.M. Cloning, sequence comparison and in vivo expression of the gene encoding rat P-selectin. Gene, v. 145, p. 251-255, 1994.

AULT, K.A. & KNOWLES, C. In vivo biotinylation demonstrates that reticulated platelets are the youngest platelets in circulation. Experimental Hematology, v. 23, p. 996-1001, 1995.

AULT, K.A. The clinical utility of flow cytometry in the study of platelets. Seminars in Hematology, v. 38, p. 160-168, 2001.

AULT, K.A.; RINDER, H.M.; MITCHELL, J.; CARMONY, M.B.; VARY, C.P.M.; HILLMAN, R.S. The significance of platelets with increased RNA content (reticulated platelets): a measure of the rate of thrombopoiesis. American Journal of Clinical Pathology, v. 98, p. 637-646, 1992.

AZIZ, K.A.; CAWLEY, J.C.; KAMIGUTI, A.S.; ZUZEL, M. Degradation of platelet glycoprotein Ib by elastase released from primed neutrophils. British Journal of Haematolgy, v. 91, p. 46-54, 1995.

AZRIN, M.A.; LING, F.S.; CHEN, Q.; PAWASHE, A.; MIGLIACCIO, F.; HOMER, R.; TODD, M.; EZEKOWITZ, M.D. Preparation, characterization, and evaluation of a monoclonal antibody against the rabbit platelet glycoprotein IIb/IIIa in an experimental angioplasty model. Circulation Research, v. 75, p. 268-277, 1994.

BAKER, G.R.; SULLAM, P.M.; LEVIN, J. A simple, fluorescent method to internally label platelets suitable for physiological measurements. American Journal of Hematology, v. 56, p. 17-25, 1997.

BAKER, L.C.; KAMENEVA, M.V.; WATACH, M.J.; LITWAK, P.; WAGNER, W.R. Assessment of bovine platelet life span with biotinylation and flow cytometry. Artificial Organs, v. 22, p. 799-803, 1998.

BALDUINI, C.L.; BERTOLINO, G.; NORIS, P.; SINIGAGLIA, F.; BISIO, A.; TORTI, M. Interrelation of platelet aggregation, release reaction and thromboxane A2 production. Biochemical and Biophysical Research Communications, v. 156, p. 823-829, 1988.

BALDUINI, C.L.; NORIS, P.; SPEDINI, P.; BELLETTI, S.; ZAMBELLI, A.; DA PRADA, G.A. Relationship between size and thiazole orange fluorescence of platelets in patients undergoing high-dose chemotherapy. British Journal of Haematology, v. 106, p. 202-207, 1999.

BARONE, A.D.; GHRAYEB, J.; HAMMERLING, U.; ZUCKER, M.B.; THORBECKE, G.J. The expression in Escherichia coli of recombinant human platelet factor 4, a protein with immunoregulatory activity. The Journal of Biological Chemistry, v. 263, p. 8710-8715, 1988.

BARRADAS, M.A.; GILL, D.S.; V.A., F.; MIKHAILIDIS, D.P.; DANDONA, P. Intraplatelet serotonin in patients with diabetes mellitus and peripheral vascular disease. European Journal of Clinical Investigation, v. 18, p. 399-404, 1988.

BARRAVIERA, B.; LOMONTE, B.; TARKOWSKI, A.; HANSON, L.A.; MEIRA, D.A. Acute-phase reactions including cytokines in patients bitten by Bothrops and Crotalus snakes in Brazil. The Journal of Venomous Animals and Toxins, v. 1, p. 11-22, 1995.

BARROS, S.F.; FRIEDLANSKAIA, I.; PETRICEVICH, V.L.; KIPNIS, T.L. Local inflammation, lethality and cytokine release in mice injected with Bothrops atrox venom. Mediators of Inflammation, v. 7, p. 339-346, 1998.

BASANI, R.B.; D'ANDREA, G.; MITRA, N.; VILAIRE, G.; RICHBERG, M.; KOWALSKA, M.A.; BENNETT, J.S.; PONCZ, M. RGD-containing peptides inhibit fibrinogen binding to platelet αIIbβ3 by inducing an allosteric change in the amino-terminal portion of αIIb. The Journal of Biological Chemistry, v. 276, p. 13975-13981, 2001.

BATH, P.M. & BUTTERWORTH, R.J. Platelet size: measurement, physiology and vascular disease. Blood Coagulation and Fibrinolysis, v. 7, p. 157-161, 1996.

BATH, P.M.W. The routine measurement of platelet size using sodium citrate alone as the anticoagulant. Thrombosis and Haemostasis, v. 70, p. 687-690, 1993.

BAUAB, F.A.; JUNQUEIRA, G.R.; CORRADINI, M.C.M.; SILVEIRA, P.V.P.; NISHIOKA, S.A. Clinical and epidemiological aspects of the 'urutu' lance-headed viper (Bothrops alternatus) bite in a Brazilian hospital. Tropical Medicine and Parasitology, v. 45, p. 243-245, 1994.

BECK, E.A. The discovery of fibrinogen and its conversion to fibrin. In: LAKI, K., ed. Fibrinogen. New York: Marcel Dekker, 1968. p. 25-37.

BEER, J.H.; BÜCHI, L.; STEINER, B. Glycocalicin: a new assay - the normal plasma levels and its potential usefulness in selected diseases. Blood, v. 83, p. 691-702, 1994.

u REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

159

BENNETT, J.S. Platelet-fibrinogen interactions. Annals of the New York Academy of Sciences, v. 936, p. 340-354, 2001.

BENTFELD-BARKER, M.E. & BAINTON, D.F. Identification of primary lysosomes un human megakaryocytes and platelets. Blood, v. 59, p. 472-481, 1982.

BERBERICH, F.R.; CUENE, S.A.; CHARD, R.L.J.; HARTMANN, J.R. Thrombotic thrombocytopenic purpura: three cases with platelet and fibrinogen survival studies. Journal of Pediatrics, v. 84, p. 503-509, 1974.

BERGENTZ, S.E.; LJUNGQVIST, U.; LEWIS, D.H. The distribution of platelets, fibrin, and erythrocytes in various organs following thrombin infusion: an experimental study in dogs with and without antifibrinolytic therapy. Surgery, v. 71, p. 190-195, 1972.

BERGER, G.; HARTWELL, D.W.; WAGNER, D.D. P-selectin and platelet clearance. Blood, v. 92, p. 4446-4452, 1998.

BERNDT, M.C.; SHEN, Y.; DOPHEIDE, S.M.; GARDINER, E.E.; ANDREWS, R.K. The vascular biology of the glycoprotein Ib-IX-V complex. Thrombosis and Haemostasis, v. 86, p. 178-188, 2001.

BERTELÉ, V.; STEMERMAN, M.; SCHAFER, A.; ADELMAN, B.; SMITH, M.; FUHRO, R.; SALZMAN, E. Refractoriness of platelets to prostaglandins after infusion in rabbits. Journal of Laboratory and Clinical Medicine, v. 106, p. 551-561, 1985.

BEVIGLIA, L.; POGGI, A.; ROSSI, C.; MCLANE, M.A.; CALABRESE, R.; SCANZIANI, E.; COOK, J.J.; NIEWIAROWSKI, S. Mouse antithrombotic assay, inhibition of platelet thromboembolism by disintegrins. Thrombosis Research, v. 71, p. 301-315, 1993.

BIRAN, H.; DVILANSKY, A.; NATHAN, I.; LIVNE, A. Impairment of human platelet aggregation and serotonin release caused in vitro by Echis colorata venom. Thrombosis et Diathesis Haemorrhagica, v. 30, p. 191-198, 1973.

BIRAN, H.; STERN, J.; DVILANSKY, A. Impaired platelet aggregation after Echis colorata bite in man. Israel Journal of Medical Sciences, v. 8, p. 1757, 1972.

BIRKMANN, J.; OEZ, S.; SMETAK, M.; KAISER, G.; KAPPAUF, H.; GALLMEIER, W.M. Effects of recombinant human thrombopoietin alone and in combination with erythropoietin and early-acting cytokines on human mobilized purified CD34+ progenitor cells cultured in serum-depleted medium. Stem Cells, v. 15, p. 18-32, 1997.

BLAJCHMAN, M.A.; SENYI, A.F.; HIRSH, J.; GENTON, E.; GEORGE, J.N. Hemostatic function, survival, and membrane glycoprotein changes in young versus old rabbit platelets. Journal of Clinical Investigation, v. 68, p. 1289-1294, 1981.

BLOMBÄCK, B. & YAMASHINA, I. On the N-terminal amino acids in fibrinogen and fibrin. Arkiv för Kemi, v. 12, p. 299-319, 1958.

BLOMBÄCK, B. Studies on the action of thrombic enzymes on bovine fibrinogen as measured by N-terminal analysis. Arkiv för Kemi, v. 12, p. 321-335, 1958.

BLOMBÄCK, B.; BLOMBÄCK, M.; NILSSON, I.M. Coagulation studies on reptilase, an extract of the venom from Bothrops jararaca. Thrombosis et Diathesis Haemorrhagica, v. 1, p. 76-86, 1957.

BLUM, H.; BEIER, H.; GROSS, H.J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. Electrophoresis, v. 8, p. 93-99, 1987.

BORN, G.V.R. Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal. Nature, v. 194, p. 927-929, 1962.

BOUCHARD, B.A. & TRACY, P.B. Platelets, leukocytes, and coagulation. Current Opinion in Hematology, v. 8, p. 263-269, 2001.

BOUNAMEAUX, Y. Action de la thrombine et de la reptilase sur la métamorphose visqueuse des plaquettes de diverses espèces animales. Revue Française d'Études Cliniques et Biologiques, v. 4, p. 54-55, 1959.

BRANDT, E.; LUDWIG, A.; PETERSEN, F.; FLAD, H.D. Platelet-derived CXC chemokines: old players in new games. Immunological Reviews, v. 177, p. 204-216, 2000a.

BRANDT, E.; PETERSEN, F.; LUDWIG, A.; EHLERT, J.E.; BOCK, L.; FLAD, H.D. The β-thromboglobulins and platelet factor 4: blood platelet-derived CXC chemokines with divergent roles in early neutrophil regulation. Journal of Leukocyte Biology, v. 67, p. 471-478, 2000b.

BRASIL, MINISTÉRIO DA SAÚDE. Manual de diagnóstico e tratamento de acidentes por animais peçonhentos. Ministério da Saúde, Fundação Nacional de Saúde/Coordenação de Controle de Zoonoses e Animais Peçonhentos. Brasília, 1998.

BRASS, L.F. More pieces of the platelet activation puzzle slide into place. Journal of Clinical Investigation, v. 104, p. 1663-1665, 1999.

u REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

160

BRASS, L.F.; MANNING, D.R.; CICHOWSKI, K.; ABRAHMS, C.S. Signaling through G proteins in platelets: to the integrins and beyond. Thrombosis and Haemostasis, v. 78, p. 581-589, 1997.

BRAZIL, V. & PESTANA, B.R. Nova contribuição ao estudo do envenenamento ophidico. Collectanea de Trabalhos do Instituto Butantan, 1901-17, v. 1, p. 151-193, 1909.

BRETON-GORIUS, J. & GUICHARD, J. Two different types of granules in megakaryocytes and platelets as revealed by the diamiinobenzidine method. Journal de Microscopie et de Biologie Cellulaire, v. 23, p. 197-202, 1975.

BRETON-GORIUS, J. & GUICHARD, J. Ultrastructural localization of peroxidase activity in human platelets and megakaryocytes. American Journal of Pathology, v. 66, p. 277-286, 1972.

BRINKHOUS, K.M. & READ, M.S. Use of venom coagglutinin and lyophilized platelets in testing for platelet-aggregation von Willebrand factor. Blood, v. 55, p. 517-520, 1980.

BRINKHOUS, K.M.; READ, M.S.; REDDICK, R.L.; GRIGGS, T.R. Pathophysiology of platelet-aggregating von Willebrand factor: applications of the venom coagglutinin vWF assay. Annals of the New York Academy of Sciences, v. 370, p. 191-204, 1981.

BROUDY, V.C.; LIN, N.L.; KAUSHANSKY, K. Thrombopoietin (c-mpl ligand) acts synergistically with erythropoietin, stem cell factor, and interleukin-11 to enhace murine megakaryocyte colony growth and increases megakaryocyte ploidy in vitro. Blood, v. 85, p. 1719-1726, 1995.

BUCARETCHI, F.; HERRERA, S.R.F.; HYSLOP, S.; BARACAT, E.C.E.; VIEIRA, R.J. Snakebites by Bothrops spp in children in Campinas, São Paulo, Brazil. Revista do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo, v. 43, p. 329-333, 2001.

BURGER, D.; RAMUS, M.A.; SCHAPIRA, M. Antibodies to human plasma kallikrein from egg yolks of an immunized hen: preparation and characterization. Thrombosis Research, v. 40, p. 283-288, 1985.

BUTENAS, S.; VEER, C.V.T.; MANN, K.G. "Normal" thrombin generation. Blood, v. 94, p. 2169-2178, 1999. CAEN, J.P.; HAN, Z.C.; BELLUCCI, S.; ALEMANY, M. Regulation of megakaryocytopoiesis. Haemostasis, v. 29,

p. 27-40, 1999. CALVETE, J.J. Clues for understanding the structure and function of a prototypic human integrin: the platelet

glycoprotein IIb/IIIa complex. Thrombosis and Haemostasis, v. 72, p. 1-15, 1994. CALVETE, J.J. On the structure and function of platelet integrin αIIbβ3, the fibrinogen receptor. Proceedings of

the Society for Experimental Biology and Medicine, v. 208, p. 346-360, 1995. CALVETE, J.J. Platelet integrin GPIIb/IIIa: structure-function correlation. An update and lessons from other

integrins. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine, v. 222, p. 29-38, 1999. CARDINAL, D.C. & FLOWER, R.J. The eletronic aggregomenter: a novel device for assessing platelet behavior in

blood. Journal of Pharmacological Methods, v. 3, p. 135-158, 1980. CARDOSO, J.L.C.; FAN, H.W.; FRANÇA, F.O.S.; JORGE, M.T.; LEITE, R.P.; NISHIOKA, S.A.; AVILA, A.; SANO-

MARTINS, I.S.; TOMY, S.C.; SANTORO, M.L.; CHUDZINSKI, A.M.; CASTRO, S.C.B.; KAMIGUTI, A.S.; KELEN, E.M.A.; HIRATA, M.H.; MIRANDOLA, R.M.S.; THEAKSTON, R.D.G.; WARRELL, D.A. Randomized comparative trial of three antivenoms in the treatment of envenoming by lance-headed vipers (Bothrops jararaca) in São Paulo, Brazil. The Quarterly Journal of Medicine, v. 86, p. 315-325, 1993.

CARR, M.E.; HINES, S.; CARR, S.L.; TODD, W.M.; TAYLOR, T.L.; MOHANTY, L. Storage pool disease in chronic lymphocytic leukemia: abnormal aggregation and secretion without bleeding. The American Journal of the Medical Sciences, v. 313, p. 176-181, 1997.

CARROLL, S.B. & STOLLAR, B.D. Antibodies to calf thymus RNA polymerase II from egg yolks of immunized hens. The Journal of Biological Chemistry, v. 258, p. 24-26, 1983.

CASAL, MANUEL AIRES DE. Corografia brazílica. 1817. Tomo I. Rio de Janeiro: Imprensa Nacional, 1945. CASTLE, V.; COATES, G.; MITCHELL, L.G.; O'BRODOVICH, H.; ANDREW, M. The effect of hypoxia on platelet

survival and site of sequestration in the newborn rabbit. Thrombosis and Haemostasis, v. 59, p. 45-48, 1988.

CASTRO, H.C.; DUTRA, D.L.S.; OLIVEIRA-CARVALHO, A.L.; ZINGALI, R.B. Bothroalternin, a thrombin inhibitor from the venom of Bothrops alternatus. Toxicon, v. 36, p. 1903-1912, 1998.

CATTANEO, M.; CHARHIL, A.; SOMERS, D.; KINLOUGH-RATHBONE, R.L.; PACKHAM, M.A.; MUSTARD, J.F. Effects of aspirin and sodium salicylate on thrombosis, fibrinolysis, prothrombin time, and platelet survival in rabbits with indwelling aortic catheters. Blood, v. 61, p. 353-361, 1983.

CATTANEO, M.; WINOCOUR, P.D.; SOMERS, D.A.; GROVES, H.M.; KINLOUGH-RATHBONE, R.L.; PACKHAM, M.A.; MUSTARD, J.F. Effect of ticlopidine on platelet aggregation, adherence to damaged vessels, thrombus formation and platelet survival. Thrombosis Research, v. 37, p. 29-43, 1985.

u REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

161

CAVINATO, R.A.; REMOLD, H.; KIPNIS, T.L. Purification and variability in thrombin-like activity of Bothrops atrox venom from different geographic regions. Toxicon, v. 36, p. 257-267, 1998.

CAZZOLA, F.; SAGGIN, L.; CALLEGARO, L. Production of novel monoclonal antibodies against rabbit platelet factor four. Hybridoma, v. 11, p. 61-69, 1992.

CELSUS, AULUS CORNELIUS. De Medicina. 3 vol. Trad. inglesa SPENCER, W.G. Massachusetts: Harvard University. 1971.

CHAMBERLAIN, K.G.; TONG, M.; CHIU, E.; PENINGTON, D.G. The relationship of human platelet density to platelet age: platelet population labeling by monoamine oxidase inhibition. Blood, v. 73, p. 1218-1225, 1989.

CHANDRA, M.; CHANDRA, N.; GUPTA, S.; VARMA, M.; SAXENA, A.K.; KUMAR, A.; SHANKAR, K. Platelet serotonin kinetics in acute myocardial infarction before and after thrombolysis. Indian Journal of Experimental Biology, v. 1993, p. 999-1001, 1993.

CHANG, M.C. & HUANG, T.F. The antiplatelet activity of ancrod on administration to rabbits. Journal of Laboratory and Clinical Medicine, v. 125, p. 508-516, 1995.

CHAVDA, N.; MACKIE, I.J.; PORTER, J.B.; HARRISON, P.; PATTERSON, K.; MACHIN, S.J. Rapid flow cytometric quantitation of reticulated platelets in whole blood. Platelets, v. 7, p. 189-194, 1996.

CHEN, Y.L.; HUANG, T.F.; CHEN, S.W.; TSAI, I.H. Determination of the structure of two novel echistatin variants and comparison of the ability of echistatin variants to inhibit aggregation of platelet from different species. The Biochemical Journal, v. 305, p. 513-520, 1995.

CHIPPAUX, J.P. Snake-bites: appraisal of the global situation. Bulletin of the World Health Organization, v. 76, p. 515-524, 1998.

CHIU, P.J.S.; TETZLOFF, G.G.; FOSTER, C.; CHINTALA, M.; SYBERTZ, E.J. Characterization of in vitro and in vivo platelet responses to thrombin and thrombin receptor-activating peptides in guinea pigs. European Journal of Pharmacology, v. 321, p. 129-135, 1997.

CIAGLOWSKI, R.E.; MARTINEZ, J.; RYAN, T.J.; LEWANDOWSKI, L.J.; BARNHART, M.I.; WELLER, M.A.; CHEN, S.T.; WALZ, D.A. Monoclonal antibodies to bovine platelet factor 4: species interactions to platelets and megakaryocytres using indirect immunocytofluorescence. Thrombosis Research, v. 41, p. 855-865, 1986.

CIAGLOWSKI, R.E. & WALZ, D.A. Amino acid sequence homology between bovine and human platelet proteins. Comparative Biochemistry and Physiology, v. 82B, p. 715-719, 1985.

CIEUTAT, A.M.; ROSA, J.P.; LETOURNEUR, F.; PONCZ, M.; RIFAT, S. A comparative analysis of cDNA-derived sequences for rat and mouse β3 integrins (GPIIIa) with their human counterpart. Biochemical and Biophysical Research Communications, v. 193, p. 771-778, 1993.

CLEMETSON, K.J. & CLEMETSON, J.M. Platelet collagen receptors. Thrombosis and Haemostasis, v. 86, p. 189-197, 2001.

CLEMMONS, R.M.; DORSEY-LEE, M.R.; GORMAN, N.T.; MEYER, D.J. Comparison of coagglutinin-induced agglutination of fresh and fixed canine platelets. Thrombosis Research, v. 36, p. 271-276, 1984.

COELHO, A.L.J.; DE FREITAS, M.S.; OLIVEIRA-CARVALHO, A.L.; MOURA-NETO, V.; ZINGALI, R.B.; BARJA-FIDALGO, C. Effects of jarastatin, a novel snake venom disintegrin, on neutrophil migration and actin cytoskeleton dynamics. Experimental Cell Research, v. 251, p. 379-387, 1999.

COHEN-SOLAL, K.; DEBILI, N.; VAINCHENKER, W.; WENDLING, F. Thrombopoietin (Mpl-ligand) and the regulation of platelet production. Thrombosis and Haemostasis, v. 78, p. 37-41, 1997.

COLGAN, S.P.; THRALL, M.A.H.; GASPER, P.W. Platelet aggregation and ATP secretion in whole blood of normal cats and cats homogygous and heterozygous for Chediak-Higashi syndrome. Blood Cells, v. 15, p. 585-595, 1989.

CONNOLLY, T.M.; CONDRA, C.; FENG, D.M.; COOK, J.J.; STRANIERI, M.T.; REILLY, C.F.; NUTT, R.F.; GOULD, R.J. Species variability in platelet and other cellular responsiveness to thrombin receptor-derived peptides. Thrombosis and Haemostasis, v. 72, p. 627-633, 1994.

CONSOLINI, R.; CALLERI, A.; BENGALA, C.; LEGITIMO, A.; CONTE, P.F. Evaluation of thrombopoiesis kinetics by measurement of reticulated platelets and CD34+ cell subsets in patients with solid tumors following high dose chemotherapy and autologous peripheral blood progenitor cell support. Haematologica, v. 86, p. 959-964, 2001.

CONTANT, G.; GOUAULT-HEILMANN, M.; MARTINOLI, J.L. Heparin inactivation during blood storage: its prevention by blood collection in citric acid, theophylline, adenosine, dipyridamole - C.T.A.D. mixture. Thrombosis Research, v. 31, p. 365-374, 1983.

COOK, J.J.; NIEWIAROWSKI, S.; YAN, Z.; SCHAFFER, L.; LU, W.; STEWART, G.J.; MOSSER, D.M.; MYERS, J.A.; MAIONE, T.E. Platelet factor 4 efficiently reverses heparin anticoagulation in the rat without adverse effects of heparin-protamine complexes. Circulation, v. 85, p. 1102-1109, 1992.

u REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

162

COOK, N.S.; ZERWES, H.G.; TAPPARELLI, C.; POWLING, M.; SINGH, J.; METTERNICH, R.; HAGENBACH, A. Platelet aggregation and fibrinogen binding in human, rhesus monkey, guinea-pig, hamster and rat blood: activation by ADP and a thrombin receptor peptide and inhibition by glycoprotein IIb/IIIa antagonist. Thrombosis and Haemostasis, v. 70, p. 531-539, 1993.

CORASH, L.; CHEN, H.Y.; LEVIN, J.; BAKER, G.; LU, H.; MOK, Y. Regulation of thrombopoiesis: effects of the degree of thrombocytopenia on megakaryocyte ploidy and platelet volume. Blood, v. 70, p. 177-185, 1987.

COUGHLIN, S.R. Protease-activated receptors in vascular biology. Thrombosis and Haemostasis, v. 86, p. 298-307, 2001.

CRABTREE, G.R. & KANT, J.A. Coordinate accumulation of the mRNAs for the α, β and γ chains of rat fibrinogen following defibrination. The Journal of Biological Chemistry, v. 257, p. 7277-7279, 1982.

CRAWFORD, N.; AUTHI, K.S.; HACK, N. Isolation and characterization of platelet membranes prepared by free flow electrophoresis. Methods in Enzymology, v. 215, p. 5-20, 1992.

CUTLER, L.; RODAN, G.; FEINSTEIN, M.B. Cytochemical localization of adenylate cyclase and of calcium ion, magnesium ion-activated ATPases in the dense tubular system of human blood platelets. Biochimica et Biophysica Acta, v. 542, p. 357-371, 1978.

CZERVIONKE, R.L.; SMITH, J.B.; HOAK, J.C.; FRY, G.L.; HAYCRAFT, D.L. Use of radioimmunoassay to study thrombin-induced release of PGI2 from cultured endothelium. Thrombosis Research, v. 14, p. 781-786, 1979.

DACHARY-PRIGENT, J.; FREYSSINET, J.M.; PASQUET, J.M.; CARRON, J.C.; NURDEN, A.T. Annexin V as a probe of aminophospholipid exposure and platelet membrane vesiculation: A flow cytometry study showing a role for free sulfhydryl groups. Blood, v. 81, p. 2554-2565, 1993.

DACIE, J.V. & LEWIS, S.M. Reference ranges and normal values. In: ____. Practical haematology, 7.ed. New York: Churchill Livingstone, 1991. p. 9-17.

DAIMON, T. Freeze-substitution and X-ray microprobe analysis of amine-storage organelles of rat platelet after treatment with reserpine. Journal of Electron Microscopy., v. 41, p. 350-356, 1992.

DAIMON, T.; GOTOH, Y.; KAWAI, K.; UCHIDA, K. Ultrastructural distribution of peroxidase in thrombocytes of mammals and submammals. Histochemistry, v. 82, p. 345-350, 1985.

DALE, G.L. Platelet kinetics. Current Opinion in Hematology, v. 4, p. 330-334, 1997. DALE, G.L.; FRIESE, P.; HYNES, L.A.; BURSTEIN, S.A. Demonstration that thiazole-orange-positive platelets in

the dog are less than 24 hours old. Blood, v. 85, p. 1822-1825, 1995. DALE, G.L. & NORENBERG, S.L. Density fractionation of erythrocytes by Percoll/Hypaque results in only a

slight enrichment for aged cells. Biochimica et Biophysica Acta, v. 1036, p. 183-187, 1990. DALE, G.L.; WOLF, R.F.; HYNES, L.A.; FRIESE, P.; BURSTEIN, S.A. Quantitation of platelet life span in

splenectomized dogs. Experimental Hematolgy, v. 24, p. 518-523, 1996. DANGLEMAIER, C.A. & HOLMSEN. Platelet dense granule and lysosome content. In: HARKER, L.A. &

ZIMMERMAN, T.S. Measurements of platelet function. New York: Churchill Livingstone, 1983. p. 92-114. DAVEY, M.G. & LÜSCHER, E.F. Actions of some coagulant snake venoms on blood platelets. Nature, v. 207, p.

730-732, 1965a. DAVEY, M.G. & LÜSCHER, E.F. Effects of some coagulant snake venoms upon human platelets. In: Proceedings

of the 10th Congress of the European Society of Haematology. Strausbourg, 1965b, p. 1181-1123. DAVEY, M.G. & LÜSCHER, E.F. Actions of thrombin and other coagulant and proteolytic enzymes on blood

platelets. Nature, v. 216, p. 857-858, 1967. DE COURCELLES, D.C.; LEYSEN, J.E.; DE CLERCK, F.; VAN BELLE, H.; JANSSEN, P.A.J. Evidence that

phospholipid turnover is the signal transducing system coupled to serotonin-S2 receptor sites. The Journal of Biological Chemistry, v. 260, p. 7603-7608, 1985.

DE GAETANO, G. A new blood corpuscle: an impossible interview with Giulio Bizzozero. Thrombosis and Haemostasis, v. 86, p. 973-979, 2001.

DEMPFLE, C.E.; ALESCI, S.; KUCHER, K.; MÜLLER-PELTZER, H.; RÜBSAMEN, K.; BORGGREFE, M. Plasminogen Activation Without Changes in tPA and PAI-1 in Response to Subcutaneous Administration of Ancrod. Thrombosis Research, v. 104, p. 433-438, 2001.

DEMPFLE, C.E.; ARGIRIOU, S.; KUCHER, K.; MÜLLER-PELTZER, H.; RÜBSAMEN, K.; HEENE, D.L. Analysis of fibrin formation and proteolysis during intravenous administration of ancrod. Blood, v. 96, p. 2793-2802, 2000.

DEMPFLE, C.E.; KOHL, R.; HARENBERG, J.; KIRSCHSTEIN, W.; SCHLAUCH, D.; HEENE, D.L. Coagulopathy after snake bite by Bothrops neuwiedi: case report and results of in vitro experiments. Blut, v. 61, p. 369-374, 1990.

u REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

163

DENNIS, M.S.; HENZEL, W.J.; PITT, R.M.; LIPARI, M.T.; NAPIER, M.A.; DEISHER, T.A.; BUNTING, S.; LAZARUS, R.A. Platelet glycoprotein IIb-IIIa protein antagonists from snake venoms: evidence for a family of platelet-aggregation inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v. 87, p. 2471-2475, 1989.

DENSON, K.W.E. & ROUSSEAU, W.E. Separation of the coagulant components of Bothrops jararaca venom. Toxicon, v. 8, p. 15-19, 1970.

DERIAN, C.K.; SANTULLI, R.J.; TOMKO, K.A.; HAERTLEIN, B.J.; ANDRADE-GORDON, P. Species differences in platelet responses to thombin and SFLLRN receptor-mediated calcium moblilization and aggregation, and regulation by protein kinases. Thrombosis Research, v. 78, p. 505-519, 1995.

DOI, T.; GREENBERG, S.M.; ROSENBERG, M.D. Structure of the rat platelet factor 4 gene: a marker for megakaryocyte differentiation. Molecular and Cellular Biology, v. 7, p. 898-904, 1987.

DOOLITTLE, R.F. & BLOMBÄCK, B. Amino-acid sequence investigations of fibrinopeptides from various mammals: evolutionary implications. Nature, v. 202, p. 147-152, 1964.

EBBE, S.; BALDINI, M.; DONOVAN, J. Comparative studies of platelet survival by different methods in the rabbit. Blood, v. 25, p. 548-566, 1965.

EDGAR, W.; WARRELL, M.J.; WARRELL, D.A.; PRENTICE, C.R.M. The structure of soluble fibrin complexes and fibrin degradation products after Echis carinatus bite. British Journal of Haematology, v. 44, p. 471-481, 1980.

EGBERG, N. & LJUNGQUIST, A. On fibrin distribution in organs of dogs during defibrination with the thrombin-like enzyme from Bothrops atrox. Thrombosis Research, v. 3, p. 191-207, 1973.

EISMAN, R.; SURREY, S.; RAMACHANDRAN, B.; SCHWARTZ, E.; PONCZ, M. Structural and functional comparison of the genes for human platelet factor 4 and PF4alt. Blood, v. 76, p. 336-344, 1990.

FAN, H.W. & CARDOSO, J.L.C. Clinical toxicology of snakebites in South America. In: MEIER, J. & WHITE, J., eds. Handbook of clinical toxicology of animal venoms and poisons. Boca Raton: CRC, 1995. p. 667-688.

FARADAY, N.; GOLDSCHMIDT-CLERMONT, P.; DISE, K.; BRAY, P.F. Quantitation of soluble fibrinogen binding to platelets by fluorescence-activated flow cytometry. Journal of Laboratory and Clinical Medicine, v. 123, p. 728-740, 1994.

FARADAY, N.; GOLDSCHMIDT-CLERMONT, P.J.; BRAY, P.F. Gender differences in platelet GPIIb-IIIa activation. Thrombosis and Haemostasis, v. 77, p. 748-754, 1997.

FERRERAS, M.; GAVILANES, J.G.; GARCÍA-SEGURA, M. A permanent Zn2+ reverse staining method for the detection and quantification of proteins in polyacrylamide gels. Analytical Biochemistry, v. 213, p. 206-212, 1993.

FETKOVSKA, N.; AMSTEIN, R.; FERRACIN, F.; REGENASS, M.; BÜHLER, F.R.; PLETSCHER, A. 5HT- kinetics and sensitivity of human blood platelets: variations with age, gender and platelet number. Thrombosis and Haemostasis, v. 60, p. 486-490, 1988.

FILES, J.C.; MALPASS, T.W.; YEE, E.K.; RITCHIE, J.L.; HARKER, L.A. Studies of human platelet α-granule release in vivo. Blood, v. 58, p. 607-618, 1981.

FLESCH, B.; NTAMBI, E.; NEPPERT, J. Biotinylation: A nonradioactive method for the identification of cell surface antigens in immunoprecipitates. Electrophoresis, v. 16, p. 757-762, 1995.

FONTANNAZ, D. Philoctète à Lemnos dans la cerámique antique et italiote: une mise au point. Antike Kunst, v. 43, p. 52-69, 2000.

FOSANG, A.J. & SMITH, P.J. To clot or not. Nature, v. 413, p. 475-476, 2001. FRACHET, P.; UZAN, G.; THEVENON, D.; DENARIER, E.; PRANDINI, M.H.; MARGUERIE, G. GPIIb and GPIIIa

amino acid sequences deduced from human megakaryocyte cDNAs. Molecular Biology Reports, v. 14, p. 27-33, 1990.

FRANCIS, C.W. & MARDER, V.J. Physiologic regulation and pathologic disorders of fibrinolysis. In: COLMAN, R.W.; HIRSH, J.; MARDER, V.J.; SALZMAN, E.W., eds. Hemostasis and thrombosis: basic principles and clinical practice. 2. ed. Philadelphia: J.B. Lippincott, 1987. p. 358-379.

FRANCISCHETTI, I.M.B.; CASTRO, H.C.; ZINGALI, R.B.; CARLINI, C.R.; GUIMARÃES, J.A. Bothrops sp. snake venoms: Comparison of some biochemical and physicochemical properties and interference in platelet functions. Comparative Biochemistry and Physiology, v. 119C, p. 21-29, 1998.

FRANCO, R.S.; LEE, K.N.; BARKER-GEAR, R.; GATES, R.; MENITOVE, J.E. Use of bi-level biotinylation for concurrent measurement of in vivo recovery and survival in two rabbit platelet populations. Transfusion, v. 34, p. 784-789, 1994.

FREEDMAN, M.L. & KARPATKIN, S. Heterogeneity of rabbit platelets. V. Preferential splenic sequestration of megathrombocytes. British Journal of Haematology, v. 31, p. 255-262, 1975.

u REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

164

FRELINGER III, A.L.; COHEN, I.; PLOW, E.F.; SMITH, M.A.; ROBERTS, J.; LAM, S.C.T.; GINSBERG, M.H. Selective inhibition of integrin function by antibodies specific for ligand-occupied receptor conformers. The Journal of Biological Chemistry, v. 265, p. 6346-6352, 1990.

FRELINGER III, A.L.; DU, X.; PLOW, E.F.; GINSBERG, M.H. Monoclonal antibodies to ligand-occupied conformers of integrin αIIbβ3 (glycoprotein IIb-IIIa) alter receptor affinity, specificity, and function. The Journal of Biological Chemistry, v. 266, p. 17106-17111, 1991.

FROJMOVIC, M.M. & PANJWANI, R. Geometry of normal mammalian platelets by quantitative microscopic studies. Biophysical Journal, v. 16, p. 1071-1089, 1976.

FUJIKAWA, K.; SUZUKI, H.; MCMULLEN, B.; CHUNG, D. Purification of human von Willebrand factor-cleaving protease and its identification as a new member of the metalloproteinase family. Blood, v. 98, p. 1662-1666, 2001.

FUJIMURA, Y.; IKEDA, Y.; MIURA, S.; YOSHIDA, E.; SHIMA, H.; NISHIDA, S.; SUZUKI, M.; TITANI, K.; TANIUCHI, Y.; KAWASAKI, T. Isolation and characterization of jararaca GPIb-BP, a snake venom antagonist specific to platelet glycoprotein Ib. Thrombosis and Haemostasis, v. 74, p. 743-750, 1995.

FUJIMURA, Y.; TITANI, K.; USAMI, Y.; SUZUKI, M.; OYAMA, R.; MATSUI, T.; FUKUI, H.; SUGIMOTO, M.; RUGGERI, Z.M. Isolation and chemical characterization of two structurally and functionally distinct forms of botrocetin, the platelet coagglutinin isolated from the venom of Bothrops jararaca. Biochemistry, v. 30, p. 1957-1964, 1991.

FURIE, B.; FURIE, B.C.; FLAUMENHAFT, R. A journey with platelet P-selectin: the molecular basis of granule secretion, signalling and cell adhesion. Thrombosis and Haemostasis, v. 86, p. 214-221, 2001.

FURTADO, M.F.D.; MARUYAMA, M.; KAMIGUTI, A.S.; ANTONIO, L.C. Comparative study of nine Bothrops snake venoms from adult female snakes and their offspring. Toxicon, v. 29, p. 219-226, 1991.

FURUKAWA, Y. & HAYASHI, K. Factor X converting and thrombin-like activities of Bothrops jararaca snake venom. Toxicon, v. 15, p. 107-114, 1977.

FUSTER, V.; CHESEBRO, F.H.; BADIMON, L.; OFFORD, K.P.; WAHNER, H.W. Platelet survival. In: HARKER, L.A. & ZIMMERMAN, T.S., ed. Measurements of platelet function. London: Churchill Livingstone, 1983, p. 189-215.

GACHET, C. ADP receptors of platelets and their inhibition. Thrombosis and Haemostasis, v. 86, p. 222-232, 2001.

GALVEZ, A.; BADIMON, L.; BADIMON, J.J.; FUSTER, V. Electrical aggregometry in whole blood from hunam, pig and rabbit. Thrombosis and Haemostasis, v. 56, p. 128-132, 1986.

GAN, Z.R.; GOULD, R.J.; JACOBS, J.W.; FRIEDMAN, P.A.; POLOKOFF, M.A. Echistatin - a potent platelet aggregation inhibitor from the venom of the viper, Echis carinatus. The Journal of Biological Chemistry, v. 263, p. 19827-19832, 1988.

GÂNDAVO, PERO DE MAGALHÃES DE. Historia da prouincia sãcta cruz, a que vulgarme)te chamamos Brasil. Lisboa: Officina de Antonio Gonsaluez, 1576.

GARTNER, T.K. & OGILVIE, M.L. Isolation and characterization of three Ca+2-dependent β-galactoside-specific lectins from snake venoms. The Biochemical Journal, v. 224, p. 301-307, 1984.

GARTNER, T.K.; STOCKER, K.; WILLIAMS, D.C. Thrombolectin: a lectin isolated from Bothrops atrox venom. FEBS Letters, v. 117, p. 13-16, 1980.

GASSMANN, M.; THOMMES, P.; WEISER, T.; HUBSCHER, U. Efficient production of chicken egg yolk antibodies against a conserved mammalian protein. The FASEB Journal, v. 4, p. 2528-2532, 1990.

GATTER, K.C.; CORDELL, J.L.; TURLEY, H.; HERYET, A.; KIEFFER, N.; ANSTEE, D.J.; MASON, D.Y. The immunohistological detection of platelets, megakaryocytes and thrombi in routinely processed specimens. Histopathology, v. 13, p. 257-267, 1988.

GAWAZ, M.; FATEH-MOGHADAM, S.; PILZ, G.; GURLAND, H.J.; WERDAN, K. Platelet activation and interaction with leucocytes in patients with sepsis or multiple organ failure. European Journal of Clinical Investigation, v. 25, p. 843-851, 1995a.

GAWAZ, M.; FATEH-MOGHADAM, S.; PILZ, G.; GURLAND, H.J.; WERDAN, K. Severity of multiple organ failure (MOF) but not of sepsis correlates with irreversible platelet degranulation. Infection, v. 23, p. 16-23, 1995b.

GAWAZ, M.; NEUMANN, F.J.; OTT, I.; MAY, A.; SCHOMIG, A. Platelet activation and coronary stent implantation. Effect of antithrombotic therapy. Circulation, v. 94, p. 279-285, 1996.

GEORGE, J.N.; LEWIS, P.C.; SEARS, D.A. Studies on platelet plasma membrane. II. Characterization of surface proteins of rabbit platelets in vitro and during circulation in vivo using diazotized (125I)-diidosulfanilic acid as a label. Journal of Laboratory and Clinical Medicine, v. 88, p. 248-260, 1976.

u REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

165

GEORGE, J.N.; PICKETT, E.B.; SAUCERMAN, S.; MCEVER, R.P.; KUNICKI, T.J.; KIEFFER, N.; NEWMAN, P.J. Platelet surface glycoproteins. Studies on resting and activated platelets and platelet membrane microparticles in normal subjects, and observations in patients during adult respiratory distress syndrome and cardiac surgery. Journal of Clinical Investigation, v. 78, p. 340-348, 1986.

GEORGE, J.N. & TORRES, M.M. Thrombin decreases von Willebrand factor binding to platelet glycoprotein Ib. Blood, v. 71, p. 1253-1259, 1988.

GERRARD, J.M.; RAO, G.H.R.; WHITE, J.G. The influence of reserpine and ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) on serotonin storage organelles of blood platelets. American Journal of Pathology, v. 87, p. 633-646, 1977.

GERRARD, J.M.; WHITE, J.G.; RAO, G.H.R.; TOWNSEND, D. Localization of platelet prostaglandin production in the platelet dense tubular system. American Journal of Pathology, v. 83, p. 283-298, 1976.

GERRITSEN, H.E.; ROBLES, R.; LÄMMLE, B.; FURLAN, M. Partial amino acid sequence of purified von Willebrand factor-cleaving protease. Blood, v. 98, p. 1654-1661, 2001.

GINSBERG, M.H.; FRELINGER, A.L.; LAM, S.C.T.; FORSYTH, J.; MCMILLAN, R.; PLOW, E.F.; SHATTIL, S.J. Analysis of platelet aggregation disorders based on flow cytometric analysis of membrane glycoprotein IIb-IIIa with conformation-specific monoclonal antibodies. Blood, v. 76, p. 2017-2023, 1990.

GINSBERG, M.H.; HOSKINS, R.; SIGRISTI, P.; PAINTER, R.G. Purification of a heparin-neutralizing protein from rabbit platelets and its homology with human platelet factor 4. The Journal of Biological Chemistry, v. 254, p. 12365-12371, 1979.

GLUSA, E.; BRAUNS, H.; STOCKER, K. Endothelium-dependent relaxant effect of thrombocytin, a serine proteinase from Bothrops atrox snake venom, on isolated pig coronary arteries. Toxicon, v. 29, p. 725-732, 1991.

GODING, J.W. Conjugation of antibodies with fluorochromes: modifications to the standard methods. Journal of Immunological Methods, v. 13, p. 215-226, 1976.

GOLDBLUM, S.E.; SIMON, T.L.; THILSTED, J.P.; BABCOCK, T.L. Pneumococcus-induced thrombocytopenia in rabbits. Journal of Laboratory and Clinical Medicine, v. 106, p. 298-307, 1985.

GOULD, R.J.; POLOKOF, M.A.; FRIEDMAN, P.A.; HUANG, T.F.; HOLT, J.C.; COOK, J.J.; NIEWIAROWSKI, S. Disintegrins: a family of integrin inhibitory proteins from viper venoms. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine, v. 195, p. 168-171, 1990.

GOVERS-RIEMSLAG, J.W.P.; KNAPEN, M.J.H.; TANS, G.; ZWAAL, R.F.A.; ROSING, J. Structural and functional characterization of a prothrombin activator from the venom of Bothrops neuwiedi. Biochimica et Biophysica Acta, v. 916, p. 388-401, 1987.

GRAY, G.W.; BRYAN, A.C.; FREEDMAN, M.H.; HOUSTON, C.S.; LEWIS, W.F.; MCFADDEN, D.M.; NEWELL, G. Effect of altitude exposure on platelets. Journal of Applied Physiology, v. 39, p. 648-652, 1975.

GREENBERG, J.; PACKHAM, M.A.; CAZENAVE, J.P.; REIMERS, H.J.; MUSTARD, J.F. Effects on platelet function of removal of platelet sialic acid by neuraminidase. Laboratory Investigation, v. 32, p. 476-484, 1975.

GREENBERG, J.P.; PACKHAM, M.A.; GUCCIONE, M.A.; HARFENIST, E.J.; ORR, J.L.; KINLOUGH-RATHBONE, R.L.; PERRY, D.W.; MUSTARD, J.F. The effect of pretreatment of human or rabbit platelets with chymotrypsin on their responses to human fibrinogen and aggregating agents. Blood, v. 54, p. 753-765, 1979a.

GREENBERG, J.P.; PACKHAM, M.A.; GUCCIONE, M.A.; RAND, M.L.; REIMERS, H.J.; MUSTARD, J.F. Survival of rabbit platelets treated in vitro with chymotrypsin, plasmin, trypsin, or neuraminidase. Blood, v. 53, p. 916-927, 1979b.

GROTTO, L.; JERUSHALMY, Z.; DE VRIES, A. Effect of purified Vipera palestinae hemorrhagin on blood coagulation and platelet function. Thrombosis et Diathesis Haemorrhagica, v. 22, p. 482-495, 1969.

GROVES, H.M.; KINLOUGH-RATHBONE, R.L.; RICHARDSON, M.; JORGENSEN, L.; MOORE, S.; MUSTARD, J.F. Thrombin generation and fibrin formation following injury to rabbit neointima. Studies of vessel wall reactivity and platelet survival. Laboratory Investigation, v. 46, p. 605-612, 1982.

GROVES, H.M.; KINLOUGH-RATHBONE, R.L.; RICHARDSON, M.; MOORE, S.; MUSTARD, J.F. Platelet interaction with damaged rabbit aorta. Laboratory Investigation, v. 40, p. 194-200, 1979.

GUCCIONE, M.A.; KINLOUGH-RATHBONE, R.L.; PACKHAM, M.A.; HARFENIST, E.J.; RAND, M.L.; GREENBERG, J.P.; PERRY, D.W.; MUSTARD, J.F. Effects of plasmin on rabbit platelets. Thrombosis and Haemostasis, v. 53, p. 8-14, 1985.

GUICHENEY, P.; DEVYNCK, M.A.; CLOIX, J.F.; PERNOLLET, M.G.; GRICHOIS, M.L.; MEYER, P. Platelet 5-HT content and uptake in essential hypertension: role of endogenous digitalis-like factors and plasma cholesterol. Journal of Hypertension, v. 6, p. 873-879, 1988.

u REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

166

GUILHERME P., FERNANDES I., BARBARO K.C Neutralization of dermonecrotic and lethal activities and differences among 32-35 kDa toxins of medically important Loxosceles spider venoms in Brazil revealed by monoclonal antibodies. Toxicon, v. 39, p. 1333-1342, 2001.

GUTIÉRREZ, J.M.; NÚÑEZ, J.; DÍAZ, C.; CINTRA, A.C.O.; HOMSI-BRANDEBURGO, M.I.; GIGLIO, J.R. Skeletal muscle degeneration and regeneration after injection of bothropstoxin-II, a phospholipase A2 isolated from the venom of the snake Bothrops jararacussu. Experimental and molecular pathology, v. 55, p. 217-229, 1991.

GYONGYOSSY-ISSA, M.I.C.; MIRANDA, J.; DEVINE, D.V. Generation of reticulated platelets in response to whole blood donation or plateletpheresis. Transfusion, v. 41, p. 1234-1240, 2001.

HAAD, J.S. Accidentes humanos por las serpientes de los gêneros Bothrops y Lachesis. Memórias do Instituto Butantan, v. 44/45, p. 403-423, 1981.

HALLAM, T.J.; RUGGLES, P.A.; SCRUTTON, M.C.; WALLIS, R.B. Desensitisation in human and rabbit blood platelets. Thrombosis and Haemostasis, v. 47, p. 278-284, 1982.

HANSEN, P.; SCOBLE, J.A.; HANSON, B.; HOOGENRAAD, N.J. Isolation and purification of immunoglobulins from chicken eggs using thiophilic interaction chromatography. Journal of Immunological Methods, v. 215, p. 1-7, 1998.

HARFENIST, E.J.; PACKHAM, M.A.; MUSTARD, J.F. Effects of the cell adhesion peptide, Arg-Gly-Asp-Ser, on responses of washed platelets from humans, rabbits and rats. Blood, v. 71, p. 132-136, 1988.

HARKER, L.A.; ROSKOS, L.K.; MARZEC, U.M.; CARTER, R.A.; CHERRY, J.K.; SUNDELL, B.; CHEUNG, E.N.; TERRY, D.; SHERIDAN, W. Effects of megakaryocyte growth and development factor on platelet production, platelet life span, and platelet function in healthy human volunteers. Blood, v. 95, p. 2514-2522, 2000.

HARLOW, E. & LANE, D. Antibodies: a laboratory manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. HARRISON, P.; SAVIDGE, G.F.; CRAMER, E.M. The origin and physiological relevance of α-granule adhesive

proteins. British Journal of Haematology, v. 74, p. 125-130, 1990. HAWIGER, J. Platelet secretory pathways: an overview. Methods in Enzymology, v. 169, p. 191-195, 1989. HE, X. & BAHLBÄCK, B. Rabbit plasma, unlike its human counterpart, contains no complex between protein S

and C4b-binding protein. Thrombosis and Haemostasis, v. 71, p. 446-451, 1994. HEIJNEN, H.F.G.; SCHIEL, A.E.; FIJNHEER, R.; GEUZE, H.J.; SIXMA, J.J. Activated platelets release two types of

membrane vesicles: microvesicles by surface shedding and exosomes derived from exocytocis of multivesicular bodies and α-granules. Blood, v. 94, p. 3791-3799, 1999.

HEILMANN, E.; FRIEZE, P.; ANDERSON, S.; GEORGE, J.N.; HANSON, S.R.; BURSTEIN, S.A.; DALE, G.L. Biotinylated platelets: a new approach to the measurement of platelet life span. British Journal of Haematology, v. 85, p. 729-735, 1993.

HENN, V.; SLUPSKY, J.R.; GRÄFE, M.; ANAGNOSTOPOULOS, I.; FÖRSTER, R.; MÜLLER-BERGHAUS, G.; KROCZEK, R.A. CD40 ligand on activated platelets triggers an inflammatory reaction of endothelial cells. Nature, v. 391, p. 591-594, 1998.

HENRIQUES, O.B.; FICHMAN, M.; HENRIQUES, S.B. Partial purification and some properties of the blood clotting factor from the venom of Bothrops jararaca. The Biochemical Journal, v. 75, p. 551-556, 1960.

HENRIQUES, O.B.; MANDELBAUM, F.R.; HENRIQUES, S.B. Blood-clotting activity of the venom of Bothrops jararaca. Nature, v. 183, p. 114-115, 1959.

HERS, I.; BERLANGA, O.; TIEKSTRA, M.J.; KAMIGUTI, A.S.; THEAKSTON, R.D.G.; WATSON, S.P. Evidence against a direct role of the integrin α2β1 in collagen-induced tyrosine phosphorylation in human platelets. European Journal of Biochemistry, v. 267, p. 2088-2097, 2000.

HILL-ZOBEL, R.L.; SCHEFFEL, U.; MCINTYRE, P.A.; TSAN, M.F. 111In-oxine-labeled rabbit platelets: in vivo distribution and sites of destruction. Blood, v. 61, p. 149-153, 1983.

HOFFMAN, M.; MONROE, D.M.; OLIVIER, J.A.; ROBERTS, H.R. Factors IXa and Xa play distinct roles in tissue factor-dependent initiation of coagulation. Blood, v. 86, p. 1794-1801, 1995.

HOFFMANN, P.; BERNAT, A.; SAVI, P.; HERBERT, J.M. Antiplatelet and antithrombotic efficacy of SR121787, a nonpeptide orally active GP IIb/IIIa antagonist, in rabbits: comparison with clopidogrel and aspirin. Journal of Cardiovascular Pharmacology, v. 30, p. 360-366, 1997.

HOFMANN, H. & BON, C. Blood coagulation induced by the venom of Bothrops atrox. 1. Identification, purification, and properties of a prothrombin activator. Biochemistry, v. 26, p. 772-780, 1987a.

HOFMANN, H. & BON, C. Blood coagulation induced by the venom of Bothrops atrox. 2. Identification, purification, and properties of two factor X activators. Biochemistry, v. 26, p. 780-787, 1987b.

HOFMANN, H.; DUMAREY, C.; BON, C. Blood coagulation induced by Bothrops atrox venom: identification and properties of a factor X activator. Biochimie, v. 65, p. 201-210, 1983.

u REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

167

HOLLEMAN, W.H. & WEISS, L.J. The thrombin-like enzyme from Bothrops atrox snake venom. Properties of the enzyme purified by affinity chromatography on p-aminobenzamidine-substituted agarose. The Journal of Biological Chemistry, v. 251, p. 1663-1669, 1976.

HOLME, P.A.; SOLUM, N.O.; BROSSTAD, F.; RØGER, M.; ABDELNOOR, M. Demonstration of platelet-derived microvesicles in blood from patients with activated coagulation and fibrinolysis using a filtration technique and Western blotting. Thrombosis and Haemostasis, v. 72, p. 666-671, 1994.

HOLMES, M.B.; SOBEL, B.E.; HOWARD, D.B.; SCHNEIDER, D.J. Differences between activation thresholds for platelet P-selectin and glycoprotein IIb-IIIa expression and their clinical implications. Thrombosis Research, v. 95, p. 75-82, 1999.

HOLMSEN, H. & DALGELMAIER, C.A. Measurement of secretion of lysosomal acid glycosidases. Methods in Enzymology, v. 169, p. 336-342, 1989a.

HOLMSEN, H. & DANGELMAIER, C.A. Measurement of secretion of serotonin. Methods in Enzymology, v. 169, p. 205-210, 1989b.

HOURDILLÉ, P.; GRALNICK, H.R.; HEILMANN, E.; DERLON, A.; FERRER, A.M.; VEZON, G.; NURDEN, A.T. Von Willebrand factor bound to glycoprotein Ib is cleared from the platelet surface after platelet activation by thrombin. Blood, v. 79, p. 2011-2021, 1992.

HOURDILLÉ, P.; HEILMAN, E.; COMBRIÉ, R.; WINCKLER, J.; CLEMETSON, K.J.; NURDEN, A.T. Thrombin induces a rapid distribution of glycoprotein Ib-IX complexes within the membrane systems of activated human platelets. Blood, v. 76, p. 1503-1513, 1990.

HUANG, T.F.; HOLT, J.C.; LUKASIEWICZ, H.; NIEWIAROWSKI, S. Trigramin - a low molecular weight peptide inhibiting fibrinogen interaction with platelet receptors expressed on glycoprotein IIb-IIIa complex. The Journal of Biological Chemistry, v. 262, p. 16157-16163, 1987.

HUGHES, M.; HAYARD, C.P.M.; WARKENTIN, T.E.; HORSEWOOD, P.; CHOMEYKO, K.A.; KELTON, J.G. Morphological analysis of microparticle generation in heparin-induced thrombocytopenia. Blood, v. 96, p. 188-194, 2000.

HUTTON, R.A.; LOOAREESUWAN, S.; SILAMUT, K.; CHANTHAWANICH, J.K.; SUPANARANOND, W.; VEJCHO, S.; VIRAVAN, C.; PHILLIPS, R.E.; WARRELL, D.A. Arboreal green pit vipers (genus Trimeresurus) of South-East Asia: bites by T. albolabris and T. macrops in Thailand and a review of the literature. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, v. 84, p. 866-874, 1990.

HWANG, D.H. Species variation in platelet aggregation. In: LONGENECKER, G.L., ed. The platelets: physiology and pharmacology. Orlando: Academic, 1985, p. 289-305.

ICSH (International Committee for Standardization in Hematology: BELCHER, E.H.; BERLIN, N.I.; EERNISSE, J.G.; GARBY, L.; GLASS, H.I.; HEIMPEL, H.; LEE, M.; LEWIS, S.M.; MCINTYRE, P.A.; MOLLISON, P.L.; MURPHY, E.A.; NAJEAN, Y.; PETTIT, J.E.; SZUR, L.) Recommended methods for radiosotope platelet survival studies. Blood, v. 50, p. 1137-1144, 1977.

INGERMAN-WOJENSKI, C.; BRYAN SMITH, J.; SILVER, M.J. Evaluation of electrical aggregometry: comparison with optical aggregometry, secretion of ATP, and accumulation of radiolabeled platelets. Journal of Laboratory and Clinical Medicine, v. 101, p. 44-52, 1983.

INGERMAN-WOJENSKI, C.M. & SILVER, M.J. A quick method for screening platelet dysfunctions using the whole blood lumi-agregometer. Thrombosis and Haemostasis, v. 51, p. 154-156, 1984.

INGERMAN-WOJENSKI, C.M.; SMITH, J.B.; SILVER, M.J. Difficulty in detecting inhibition of platelet aggregation by the impedance method. Thrombosis Research, v. 28, p. 427-432, 1982.

INGRAM, M & COOPERSMITH, A. Reticulated platelets following acute blood loss. British Journal of Haematology, v. 17, p. 225-229, 1969.

ISRAELIS, S.J.; MCNICOL, A.; ROBERTSON, C.; GERRARD, J.M. Platelet storage pool deficiency: diagnosis in patients with prolonged bleeding times and normal platelet aggregation. British Journal of Haematology, v. 75, p. 118-121, 1990.

ITO, T.; ISHIDA, Y.; KASHIWAGI, R.; KURIYA, S.I. Recombinant human c-Mpl is not a direct stimulator of proplatelet formation in mature human megakaryocytes. British Journal of Haematology, v. 94, p. 387-390, 1996.

IUAN, F.C.; THOMAZINI, I.A.; CARVALHO, I.; CARREIRA, D.M.G.; CASSINELLI, V.J.; PEREIRA, P.C.M.; BARRAVIERA, B. Evaluation of platelet number and function and fibrinogen level in patients bitten by snakes of the Bothrops genus. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, v. 28, p. 19-24, 1995.

JAKOBSEN, E. & KIERULF, P. A modified β-alanine precipitation procedure to prepare fibrinogen free of antithrombin-III and plasminogen. Thrombosis Research, v. 3, p. 145-159, 1973.

u REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

168

JÁNSZKY, B. The solubility of fibrin clots produced by thrombin and by snake venom. Science, v. 112, p. 173-174, 1950.

JENNINGS, L.K.; WHITE, M.M.; MANDRELL, T.D. Interspecies comparison of platele aggregation, LIBS expression and clot retraction: observed differences in GPIIb-IIIa functional activity. Thrombosis and Haemostasis, v. 74, p. 1551-1556, 1995.

JIA, L.G.; SHIMOKAWA, K.I.; BJARNASON, J.B.; FOX, J.W. Snake venom metalloproteinases: structure, function and relationship to the ADAMS family of proteins. Toxicon, v. 34, p. 1269-1276, 1996.

JIMENEZ-MARIN, A.M.; GARRIDO, J.J.; LLANES, D.; BARBANCHO, M.J. Characterization of the porcine CD61 (GPIIIa) gene. 2001. Disponível em <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/ query.fcgi?db=Protein>. Acesso: AAK69529.

JOHNSON, G.S. & DODDS, W.J. Species specificity in von Willebrand factor-supported platelet agglutination. Annals of the New York Academy of Sciences, v. 370, p. 227-235, 1981.

JOHNSTON, G.I.; COOK, R.G.; MCEVER, R.P. Cloning of GMP-140, a granule membrane protein of platelets and endothelium: sequence similarity to proteins involved in cell adhesion and inflammation. Cell, v. 56, p. 1033-1044, 1989.

JORGE, M.T. & RIBEIRO, L.A. Acidentes por serpentes peçonhentas no Brasil. Revista da Associação Médica Brasileira, v. 36, p. 66-77, 1990.

JORGE, M.T.; CARDOSO, J.L.C.; CASTRO, S.C.B.; RIBEIRO, L.; FRANÇA, F.O.S.; SBROGIO DE ALMEIDA, M.E.; KAMIGUTI, A.S.; SANO-MARTINS, I.S.; SANTORO, M.L.; MANCAU, J.E.C.; WARRELL, D.A.; THEAKSTON, R.D.G. A randomized 'blinded' comparison of two doses of antivenom in the treatment of Bothrops envenoming in São Paulo, Brazil. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, v. 89, p. 111-114, 1995.

JOSHUA, H.; DJALDETTI, M.; OZCAN, E.; BESSLER, H.; ROSEN, M.; DE VRIES, A. Mechanism of thrombocytopenia in the dog and the guinea pig following Echis colorata venom inoculation. Hémostase, v. 4, p. 333-339, 1964.

JY, W.; HORSTMAN, L.L.; ARCE, M.; AHN, Y.S. Clinical significance of platelet microparticles in autoimmune thrombocytopenia. Journal of Laboratory and Clinical Medicine, v. 119, p. 334-345, 1992.

KABATA, J.; GRATWOHL, A.; TICHELLI, A.; JOHN, L.; SPECK, B. Hematologic values of New Zealand white rabbits determined by automated flow cytometry. Laboratory Animal Science, v. 41, p. 613-619, 1991.

KAMAL, L.A.; QUAN-BUI, K.H.L.; MEYER, P. Decreased uptake of 3H-serotonin and endogenous content of serotonin in blood platelets in hypertensive patients. Hypertension, v. 6, p. 568-573, 1984.

KAMIGUTI, A.S.; ANTONIO, L.C.; MARIANO, M. Coagulant activity of the venom of mature and immature snakes (Bothrops jararaca) on the blood of some mammals. In: Gopalakrishnakone, P. & Tan, C.K., ed. Progress in Venom and Toxin Research. Singapore: National Taiwan University of Singapore, 1987, p. 296-304.

KAMIGUTI, A.S. & CARDOSO, J.L.C. Haemostatic changes caused by the venoms of South American snakes. Toxicon, v. 27, p. 955-963, 1989.

KAMIGUTI, A.S.; CARDOSO, J.L.C.; THEAKSTON, R.D.G.; SANO-MARTINS, I.S.; HUTTON, R.A.; RUGMAN, F.P.; WARRELL, D.A.; HAY, C.R.M. Coagulopathy and haemorrhage in human victims of Bothrops jararaca envenoming in Brazil. Toxicon, v. 29, p. 961-972, 1991a.

KAMIGUTI, A.S.; HAY, C.R.M.; THEAKSTON, R.D.G.; ZUZEL, M. Insights into the mechanism of haemorrhage caused by snake venom metalloproteinases. Toxicon, v. 34, p. 627-642, 1996a.

KAMIGUTI, A.S.; HAY, C.R.M.; ZUZEL, M. Inhibition of collagen-induced platelet aggregation as the result of cleavage of α2β1-integrin by the snake venom metalloproteinase jararhagin. The Biochemical Journal, v. 320, p. 635-641, 1996b.

KAMIGUTI, A.S.; MARKLAND, F.S.; ZHOU, Q.; LAING, G.D.; THEAKSTON, R.D.G.; ZUZEL, M. Proteolytic cleavage of the β1 subunit of platelet α2β1 integrin by the metalloproteinase jararhagin compromises collagen-stimulated phosphorylation of pp72syk. The Journal of Biological Chemistry, v. 272, p. 32599-32605, 1997a.

KAMIGUTI, A.S.; MATSUNAGA, S.; SPIR, M.; SANO-MARTINS, I.S.; NAHAS, L. Alterations of the blood coagulation system after accidental human inoculation by Bothrops jararaca venom. Brazilian Journal of Medical and Biological Research, v. 19, p. 199-204, 1986.

KAMIGUTI, A.S.; MOURA-DA-SILVA, A.M.; LAING, G.D.; KNAPP, T.; ZUZEL, M.; CRAMPTON, J.M.; THEAKSTON, R.D.G. Collagen-induced secretion-dependent phase of platelet aggregation is inhibited by the snake venom metalloproteinase jararhagin. Biochimica et Biophysica Acta, v. 1335, p. 209-217, 1997b.

u REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

169

KAMIGUTI, A.S.; RUGMAN, F.P.; THEAKSTON, R.D.G.; FRANÇA, F.O.S., ISHII, H.; HAY, C.R.M.; BIASG. The role of venom haemorrhagin in spontaneous bleeding in Bothrops jararaca envenoming. Thrombosis and Haemostasis, v. 67, p. 484-488, 1992.

KAMIGUTI, A.S.; SLUPSKY, J.R.; ZUZEL, M.; HAY, C.R.M. Properties of fibrinogen cleaved by jararhagin, a metalloproteinase from the venom of Bothrops jararaca. Thrombosis and Haemostasis, v. 72, p. 244-249, 1994.

KAMIGUTI, A.S.; SOUSA E SILVA, M.C.C.; MORENA, P.; NAHAS, L. The anticoagulant effect of Bothrops castelnaudi snake venom (Castelnaud's pit viper). Toxicon, v. 23, p. 383-391, 1985.

KAMIGUTI, A.S.; THEAKSTON, R.D.G.; DESMOND, H.; HUTTON, R.A. Systemic haemorrhage in rats induced by a haemorrhagic fraction from Bothrops jararaca venom. Toxicon, v. 29, p. 1097-1105, 1991b.

KAPLAN, K.L. & OWEN, J. Radioimmunoassay of platelet factor 4. Methods in Enzymology, v. 84, p. 83-92, 1982.

KAPLAN, K.L. & OWEN, J. Radioimmunoassay of β-thromboglobulin. Methods in Enzymology, v. 84, p. 93-102, 1976.

KARAS, S.P.; ROSSE, W.F.; KURLANDER, R.J. Characterization of the IgG-Fc receptor on human platelets. Blood, v. 60, p. 1277-1282, 1982.

KARGES, H.E.; FUNK, K.A.; RONNEBERGER, H. Activity of coagulation and fibrinolysis parameters in animals. Arzneimittel-Forschung, v. 44, p. 793-797, 1994.

KASE, F. & POSPISIL, J. 2 Comparison of the blood clotting mechanisms in man and some common laboratory animals. Acta Universitatis Carolinae, v. 119, p. 11-22, 1987.

KELEN, E.M.A.; ROSENFELD, G.; VAINZOF, M.; MACHADO, Z.C. Experimental defibrination with bothropase. A study on the fibrinolytic mechanism in vivo. Haemostasis, v. 7, p. 35-45, 1978.

KEMA, I.P.; DE VRIES, E.G.E.; MUSKIET, F.A.J. Clinical chemistry of serotonin and metabolites. Journal of Chromatography B, v. 747, p. 33-48, 2000.

KIENAST, J. & SCHMITZ, G. Flow cytometric analysis of thiazole orange uptake by platelets: a diagnostic aid in the evaluation of thrombocytopenic disorders. Blood, v. 75, p. 116-121, 1990.

KINLOUGH-RATHBONE, R.L.; RAND, M.L.; PACKHAM, M.A. Rabbit and rat platelets do not respond to thrombin receptor peptides that activate human platelets. Blood, v. 82, p. 103-106, 1993.

KIRBY, E.P.; NIEWIAROWSKI, S.; STOCKER, K.; KETTNER, C.; SHAW, E.; BRUDZYNSKI, T.M. Thrombocytin, a serine protease from Bothrops atrox venom. 1. Purification and characterization of the enzyme. Biochemistry, v. 18, p. 3564-3570, 1979.

KIRSCHBAUM, N.E.; RECZKOWSKI, R.S.; BUDZYNSKI, A.Z. Secretion of cellular plasminogen activators upon stimulation by Crotalinae snake venoms. In: PIRKLE, H. & MARKLAND, F.S., ed. Hemostasis and animal venoms. New York: Marcel Dekker, 1988, p. 191-202.

KISIEL, W. & CANFIELD, W.M. Snake venom proteases that activate blood-coagulation factor V. Methods in Enzymology, v. 80(C), p. 275-285, 1981.

KISKER, C.T. The animal models for hemorrhage and thrombosis in the neonate. Thrombosis and Haemostasis, v. 57, p. 118-122, 1987.

KLEINBAUM, D.G.; KUPPER, L.L.; MULLER, K.E.; NIZAM, A. Applied regression analysis and other multivariable methods. 3.ed. Pacific Grove: Duxbury, 1998. 798 p.

KLÖCKING, H.P.; HOFFMANN, A.; MARKWARDT, F. Release of plasminogen activator by batroxobin. Haemostasis, v. 17, p. 235-237, 1987.

KNÖFLER, R.; WEISSBACH, G.; KUHLISCH, E. Critical evaluation of the quantification of ATP release reaction in whole blood. Thrombosis Research, v. 84, p. 157-165, 1996.

KONSTAM, M.A.; BROCKWAY, B.A.; ARONOVITZ, M.J.; RAMBERG, K.; PALABRICA, T.M.; OTRAVEC, C.L.; COOPER, A.; HILL, N. Kinetics of pulmonary platelet deposition and clearance during thrombin-induced microembolism in rabbits. Experimental Lung Research, v. 15, p. 867-879, 1989.

KORNALÍK, F.; FORTÝNOVA, J.; TÁBORSKÁ, E.; TÁBORSKÁ, Z.; HLAVATÁ, O. Thrombocytopenia in defibrination syndrom induced by Echis carinatus venom coagulase. Acta Universitatis Carolinae, Medica, Monographia, v. 53, p. 433-439, 1972.

KOSUGI, T.; MYIAGI, T.; SHIMA, Y.; NAKAMURA, M. Changes of fibrinogen and platelet function in rabbits following administration fo Trimeresurus flavoviridis venom. The Snake, v. 21, p. 9-17, 1989.

KOUYOUMDJIAN, J.A.; POLIZELLI, C.; LOBO, S.M.A.; GUIMARÃES, S.M. Fatal extradural haematoma after snake bite (Bothrops moojeni). Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, vol. 85: p. 552, 1991.

u REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

170

KOUYOUNDJIAN, J.A. & POLIZELLI, C. Acidentes ofídicos causados por Bothrops moojeni: relato de 37 casos. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, v. 30, p. 424-432, 1988.

KOUYOUNDJIAN, J.A. & POLIZELLI, C. Acidentes ofídicos causados por Bothrops moojeni: correlaçao do quadro clínico com o tamanho da serpente. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, v. 31, p. 84-90, 1989.

KOUYOUNDJIAN, J.A.; ABDEHUR, C.P.; FARES, G.H.; FONSECA, M.G.; KOUYOUNDJIAN, N.C.D.V. Envenenamentos ofídicos na região de São José do Rio Preto. Estudos prospectivo de 49 casos. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, v. 19, Suppl., p. 27, 1986.

KOUYOUNDJIAN, J.A.; FONSECA, M.G.; POLIZELLI, C.; FARES, G.F.; ANANIAS, M.P.; KOUYOUNDJIAN, N.C.D.V. Acidentes ofídicos causados por Bothrops moojeni, na região de São José do Rio Preto: estudo de 27 casos. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, v. 20, Suppl., p. 53, 1987.

KOWALSKI, E.; BUDZYSNKI, A.Z.; KOPEC, M.; LATALLO, Z.S.; LIPINSKI, B.; WEGRZYNOWICZ, Z. Studies on the molecular pathology and pathogenesis of bleeding in severe fibrinolytic states in dogs. Thrombosis et Diathesis Haemorrhagica, v. 12, p. 69-86, 1964.

KUBISZ, P.; ARABI, A.; SEGHIER, F.; CRONBERG, S. Investigations on the effect of thrombocytin on platelets. Thrombosis Research, v. 33, p. 225-227, 1984.

KUCH, U.; MEBS, D.; GUTIÉRREZ, J.M.; FREIRE, A. Biochemical and biological characterization of ecuadorian pitviper venoms (genera Bothriechis, Bothriopsis, Bothrops and Lachesis). Toxicon, v. 34, p. 714-717, 1996.

KURATA, M.; ISHIZUKA, N.; MATSUZAWA, M.; HARUTA, K.; TAKEDA, K. A comparative study of whole-blood platelet aggregation in laboratory animals: its species differences and comparison with turbidimetric method. Comparative Biochemistry and Physiology, v. 112C, p. 359-365, 1995.

KURATA, Y.; HAYASHI, S.; KIYOI, T.; KOSUGI, S.; KASHIWAGI, H.; HONDA, S.; TOMIYAMA, Y. Diagnostic value of tests for reticulated platelets, plasma glycocalicin, and thrombopoietin levels for discriminating between hyperdestructive and hypoplastic thrombocytopenia. American Journal of Clinical Pathology, v. 115, p. 656-664, 2001.

KUTER, D.J. & ROSENBERG, R.D. Apperance of a megakaryocyte growth-promoting activity, megapoietin, during acute thrombocytopenia in the rabbit. Blood, v. 84, p. 1464-1472, 1994.

KUTER, D.J.; BEELER, D.L.; ROSENBERG, R.D. The purification of megapoietin: a physiological regulator of megakaryocyte growth and platelet production. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v. 91, p. 11104-11108, 1994.

LAEMMLI, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, v. 227, p. 680-685, 1970.

LATALLO, Z.S. & LOPACIUK, S. New approach to thrombolytic therapy. The use of defibrase in connection with streptokinase. Thrombosis et Diathesis Haemorrhagica, v. 56, Suppl., p. 253-264, 1973.

LATTA, E.K.; PACKHAM, M.A.; GROSS, P.L.; RAND, M.L. Enhanced collagen-induced responses of platelets from rabbits with diet-induced hypercholesterolemia are due to increased sensitivity to TxA2. Response inhibition by chronic ethanol administration in hypercholesterolemia is due to reduced TxA2 formation. Arteriosclerosis and thrombosis, v. 14, p. 1379-1385, 1994.

LAVERGNE, J.M.; PIAO, Y.C.; FERREIRA, V.; KERBIRIOU-NABIAS, D.; BAHNAK, B.R.; MEYER, D. Primary structure of the factor VIII binding domain of human, porcine and rabbit von Willebrand factor. Biochemical and Biophysical Research Communications, v. 194, p. 1019-1024, 1993.

LEE, Y.J.; JY, W.; HORSTMAN, L.L.; JANANIA, J.; REYES, Y.; KELLEY, R.E.; AHN, Y.S. Elevated platelet microparticles in transient ischemic attacks, lacunar infarcts, and multiinfarct dementias. Thrombosis Research, v. 72, p. 295-304, 1993.

LEHMAN, K.; GROSCURTH, P.; VOLLENWEIDER, I.; VON FELTEN, A.; RHYNER, K. Morphologic alterations of blood cells in the impedance aggregometer. Blood Cells, v. 11, p. 325-336, 1985.

LEMAMY, G.J.; ROGER, P.; MANI, J.C.; ROBERT, M.; ROCHEFORT, H.; BROUILLET, J.P. High-affinity antibodies from hen's-egg yolks against human mannose-6-phosphate/insulin-like growth factor II receptor (M6P/IGFII-R): characterization and potential use in clinical cancer studies. International Journal of Cancer, v. 80, p. 896-902, 1999.

LEVINE, S.P. & WOHL, H. Human platelet factor 4: purification and characterization by affinity chromatography. The Journal of Biological Chemistry, v. 251, p. 324-328, 1976.

LEVY, G.G.; NICHOLS, W.C.; LIAN, E.C.; FOROUD, T.; MCCLINTICK, J.N.; MCGEE, B.M.; YANG, A.Y.; SIEMIENIAK, D.R.; STARK, K.R.; GRUPPO, R.; SARODE, R.; SHURIN, S.B.; CHANDRASEKARAN, V.; STABLER, S.P.; SABIO, H.; BOUHASSIRA, E.E.; UPSHAW, J.D.J.; GINSBURG, D.; TSAI, H.M. Mutations in a member of the ADAMTS gene family cause thrombotic thrombocytopenic purpura. Nature, v. 413, p. 488-494, 2001.

u REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

171

LEYTIN, V.; MODY, M.; SEMPLE, J.W.; GARVEY, B.; FREEDMAN, J. Flow cytometric parameters for characterizating platelet activation by measuring P-selectin (CD62) expression: theoretical consideration and evaluation in thrombin-treated platelet populations. Biochemical and Biophysical Research Communications, v. 269, p. 85-90, 2000a.

LEYTIN, V.; MODY, M.; SEMPLE, J.W.; GARVEY, B.; FREEDMAN, J. Quantitation of platelet activation status by analyzing P-selectin expression. Biochemical and Biophysical Research Communications, v. 273, p. 565-570, 2000b.

LIMC (Lexicon Iconographicum Mythologiae Classicae), vol. VII, partes 1 e 2. Zürich und München: Artemis, 1994. Pranchas 321-326.

LIPSCOMB, D.L.; BOURNE, C.; BOUDREAUX, M.K. DNA sequence of the canine platelet β3 gene from cDNA: comparison of canine and mouse β3 to segments that encode alloantigenic sites and functional domains of β3 in human beings. Journal of Laboratory and Clinical Medicine, v. 134, p. 313-321, 1999.

LIPSCOMB, D.L.; BOURNE, C.; BOUDREAUX, M.K. Nucleotide sequence of the canine αIIb gene from platelet-derived cDNA. American Journal of Veterinary Science, v. 62, p. 1486-1492, 2001.

LOCHNIT, G. & GEYER, R. Carbohydrate structure analysis of batroxobin, a trombin-like serine protease from Bothrops moojeni venom. European Journal of Biochemistry v. 228, p. 805-816, 1995.

LOMONTE, B.; TARKOWSKI, A.; HANSON, L.A. Host response to Bothrops asper snake venom. Analysis of edema formation, inflammatory cells, and cytokine release in a mouse model. Inflammation, v. 17, p. 93-105, 1993.

LÖSCH, U.; SCHRANNER, I.; WANKE, R.; JÜRGENS, L. The chicken egg, an antibody source. Journal of Veterinary Medicine B, v. 33, p. 609-619, 1986.

LUNA, M.G. Manual of histologic staining methods of the Armed Forces Institute of Pathology. New York: Mc-Graw-Hill, 1968. p.81

LUTERMAN, A.; MANWARING, D.; CURRERI, P.W. The role of fibrinogen degradation products in the pathogenesis of the respiratory distress syndrome. Surgery, v. 82, p. 703-709, 1977.

MAGNUSSON, S.; HOU, M.; HALLBERG, E.C.; BREIMER, M.E.; WADENVIK, H. Biotinylated platelets have an impaired response to agonists as evidenced by in vitro platelet aggregation tests. Thrombosis Research, v. 89, p. 53-58, 1998.

MAICKEL, R.P. & MILLER, F.P. Fluorescent products formed by reaction of indole derivatives and o-phthalaldehyde. Analytical Chemistry, v. 38, p. 1937-1938, 1966.

MAIONE, T.E.; GRAY, G.S.; PETRO, J.; HUNT, A.J.; DONNER, A.L.; BAUER, S.I.; CARSON, H.F.; SHARPE, R.J. Inhibition of angiogenesis by recombinant human platelet factor-4 and related peptides. Science, v. 347, p. 77-79, 1990.

MANDELBAUM, F.R. & ASSAKURA, M.T. Antigenic relationship of hemorrhagic factors and proteases isolated from the venoms of three species of Bothrops snakes. Toxicon, v. 26, p. 379-385, 1988.

MANDELBAUM, F.R. Snake venom hemorrhagins. Memórias do Instituto Butantan, v. 52, Suppl., p. 35-36, 1990.

MANDELBAUM, F.R.; ASSAKURA, M.T.; REICHL, A.P. Characterization of two hemorrhagic factors isolated from the venom of Bothrops neuwiedi (jararaca pintada). Toxicon, v. 22, p. 193-206, 1984.

MANDELBAUM, F.R.; REICH, A.P.; ASSAKURA, M.T. Some physical and biochemical characteristics of HF2, one of the hemorrhagic factors in the venom of Bothrops jararaca. In: OHSAKA, A.; HAYASHI, K.; SAWAI, Y., ed. International symposium on animal, plant and microbial toxins. New York: Plenum Press, 1976, p. 111-121.

MANNING, K.L.; NOVINGER, S.; SULLIVAN, P.S.; MCDONALD, T.P. Successful determination of platelet lifespan in C3H mice by in vivo biotinylation. Laboratory Animal Science, v. 46, p. 545-548, 1996.

MARKWARDT, F.; BARTLEL, W.; GLUSA, E.; HOFFMANN, A. Über die freisetsung biogener amine aus hut plättchen durch tierische gifte. Naunyn-Schmiedebergs Archiv für experimentelle Pathologie und Pharmakologie, v. 252, p. 297-304, 1966.

MARQUES, J.A.; GEORGE, J.K.; SMITH, I.J.; BHAKTA, V.; SHEFFIELD, W.P. A barbourin-albumin fusion protein that is slowly cleared in vivo retains the ability to inhibit platelet aggregation in vitro. Thrombosis and Haemostasis, v. 86, p. 902-908, 2001.

MARRAKCHI, N.; BARBOUCHE, R.; GUERMAZI, S.; BON, C.; EL AYEB, M. Procoagulant and platelet-aggregating properties of cerastocytin from Cerastes cerastes venom. Toxicon, v. 35, p. 261-272, 1997a.

MARRAKCHI, N.; BARBOUCHE, R.; GUERMAZI, S.; KAROUI, H.; BON, C.; EL AYEB, M. Cerastotin, a serine protease from Cerastes cerastes venom, with platelet-aggregating and agglutinating properties. European Journal of Biochemistry v. 247, p. 121-128, 1997b.

u REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

172

MARTIN, J.F. & TROWBRIDGE, E.A. The biological significance of platelet volume: its relationship to bleeding time, platelet thromboxane B2 production and megakaryocyte nuclear DNA concentration. Thrombosis Research, v. 32, p. 443-460, 1983.

MARTIN, S.E.; MARDER, V.J.; FRANCIS, C.W.; BARLOW, G.H. Structural studies on the functional heterogeneity of von Willebrand protein polymers. Blood, v. 57, p. 313-323, 1981.

MARUYAMA, M.; KAMIGUTI, A.S.; CARDOSO, J.L.C.; SANO-MARTINS, I.S.; CHUDZINSKI, A.M.; SANTORO, M.L.; MORENA, P.; TOMY, S.C.; ANTONIO, L.C.; MIHARA, H.; KELEN, E.M.A. Studies on blood coagulation and fibrinolysis in patients bitten by Bothrops jararaca (jararaca). Thrombosis and Haemostasis, v. 63, p. 449-453, 1990.

MARUYAMA, M.; KAMIGUTI, A.S.; TOMY, S.C.; ANTONIO, L.C.; SUGIKI, M.; MIHARA, H. Prothrombin and factor X activating properties of Bothrops erythromelas venom. Annals of Tropical Medicine and Parasitology, v. 86, p. 549-556, 1992a.

MARUYAMA, M.; SUGIKI, M.; YOSHIDA, E.; MIHARA, H.; NAKAJIMA, N. Purification and characterization of two fibrinolytic enzymes from Bothrops jararaca (jararaca) venom. Toxicon, v. 30, p. 853-864, 1992b.

MARUYAMA, M.; SUGIKI, M.; YOSHIDA, E.; SHIMAYA, K.; MIHARA, H. Broad substrate specificity of snake venom fibrinolytic enzymes: possible role in haemorrhage. Toxicon, v. 30, p. 1387-1397, 1992c.

MARUYAMA, M.; TANIGAWA, M.; SUGIKI, M.; YOSHIDA, E.; MIHARA, H. Purification and characterization of low molecular weight fibrinolytic/hemorrhagic enzymes from snake (Bothrops jararaca) venom. Enzyme Protein, v. 47, p. 124-135, 1993.

MARVAL, E.; GARCÍA, L.; CANDELA, D.E.; AROCHA-PIÑANGO, C.L. Valores normales de hemoglobina, hematocrito, factores de coagulación y fibrinolisis en conejos Nueva Zelanda blancos. Sangre, v. 37, p. 355-361, 1992.

MAZOYER, E.; CARPENTER, D.; EBBE, S.; YANO, Y.; DALAL, K.; SINGH, M.; MAZOYER, B. Survival of rabbit platelets labeled with gallium 67. Journal of Laboratory and Clinical Medicine, v. 111, p. 218-223, 1988a.

MAZOYER, E.; EBBE, S.; DALAL, K.; LEVEN, R.; MAZOYER, B.; CARPENTER, D.; YEE, T.; BRENNAN, K. Morphological and kinetic abnormalities of platelets in hypercholesterolemic rabbits. Atherosclerosis, v. 74, p. 23-32, 1988b.

MBA, E.C. & ONYEMELUKWE, G.C. Antithrombin III in Echis carinatus envenomation in Nothern Nigeria. Acta Haematologica, v. 81, p. 98-100, 1989.

MCCRAE, K.R.; SHATTIL, S.J.; CINES, D.B. Platelet activation induces increased Fcγ receptor expression. Journal of Immunology v. 144, p. 3920-3927, 1990.

MCEVER, R.P. Adhesive interactions of leukocytes, platelets, and the vessel wall during hemostasis and inflammation. Thrombosis and Haemostasis, v. 86, p. 746-756, 2001.

MCGREGOR, J.L.; BROCHIER, J.; WILD, F.; FOLLEA, G.; TRZECIAK, M.C.; JAMES, E.; DECHAVANNE, M.; MCGREGOR, L.; CLEMETSON, K.J. Monoclonal antibodies against platelet membrane glycoproteins - characterization and effect on platelet function. European Journal of Biochemistry v. 131, p. 427-436, 1983.

MCGREGOR, J.L.; MCGREGOR, L.; BAUER, A.S.; CATIMEL, B.; BROCHIER, J.; DECHAVANNE, M.; CLEMETSON, K.J. Identification of two distinct regions within the binding sites for fibrinogen and fibronectin on the IIb-IIIa human platelet membrane glycoprotein complex by monoclonal antibodies P2 and P4. European Journal of Biochemistry v. 159, p. 443-449, 1986.

MCHUGH, K.P.; TEITELBAUM, S.L.; KITAZAWA, S.; ROSS, F.P. Mouse integrin β3 precursor (platelet membrane glycoprotein IIIa). 2001. Disponível em <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/ query.fcgi?db=Protein>. Acesso: O54890.

MCKAY, D.G.; MOROZ, C.; DE VRIES, A.; CSAVOSSY, I.; CRUSE, V. The action of hemorrhagin and phospholipase derived from Vipera palestinae venom on microcirculation. Laboratory Investigation, v. 22, p. 387-399, 1970.

MCKINNEY, M.M. & PARKINSON, A. A simple, non-chromatographic procedure to purify immunoglobulins from serum and ascites fluid. Journal of Immunological Methods, v. 96, p. 271-278, 1987.

MCMANUS, L.M.; HANAHAN, D.J.; DEMOPOULOS, C.A.; PINCKARD, R.N. Pathobiology of the intravenous infusion of acetyl glyceryl ether phosphorylcholine (AGEPC), a synthetic platelet-activating factor (PAF), in the rabbit. The Journal of Immunology, v. 124, p. 2919-2924, 1980.

MCMANUS, L.M.; MORLEY, C.A.; LEVINE, S.P.; PINCHARD, R.N. Platelet activating factor (PAF) induced release of platelet factor 4 (PF4) in vitro and during IgE anaphylaxis in the rabbit. The Journal of Immunology, v. 123, p. 2835-2841, 1979.

u REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

173

MCNALLY, T.; CONWAY, G.S.; JACKSON, L.; THEAKSTON, R.D.G.; MARSH, N.A.; WARRELL, D.A.; YOUNG, L.; MACKIE, I.J.; MACHIN, S.J. Accidental envenoming by a gaboon viper (Bitis gabonica): the haemostatic disturbances observed and investigation of in vitro haemostatic properties of whole venom. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, v. 87, p. 66-70, 1993.

MCNICOL, A. & ISRAELS, S.J. Platelet dense granules: structure, function and implications for haemostasis. Thrombosis Research, v. 95, p. 1-8, 1999.

MEDVED, L.; TSURUPA, G.; YAKOVLEV, S. Conformational changes upon conversion of fibrinogen into fibrin: the mechanisms of exposure of cryptic sites. Annals of the New York Academy of Sciences, v. 936, p. 185-204, 2001.

MENASHI, S.; DAWIS, C.; CRAWFORD, N. Calcium uptake associated with an intracellular membrane fraction prepared from human blood platelets by high-voltage, free-flow electrophoresis. FEBS Letters, v. 140, p. 298-302, 1982.

MEYERS, K.M.; HOLMSEN, H.; SEACHORD, C.L. Comparative study of platelet dense granule constituents. American Journal of Physiology, v. 243, p. R454-R461, 1982.

MEZZANO, D.; TAGLE, R.; PANES, O.; PÉREZ, M.; DOWNEY, P.; MUÑOZ, B.; ARANDA, E.; BARJA, P.; THAMBO, S.; GONZÁLEZ, F.; MEZZANO, S.; PEREIRA, J. Hemostatic disorder of uremia: the platelet defect, main determinant of the prolonged bleeding time, is correlated with indices of activation of coagulation and fibrinolysis. Thrombosis and Haemostasis, v. 76, p. 312-321, 1996.

MICHELSON, A.D. & BARNARD, M.R. Plasmin-induced redistribution of platelet glycoprotein Ib. Blood, v. 76, p. 2005-2010, 1990.

MICHELSON, A.D. & BARNARD, M.R. Thrombin-induced changes in platelet membrane glycoproteins Ib, IX, and IIb-IIIa complex. Blood, v. 70, p. 1673-1678, 1987.

MICHELSON, A.D. & FURMAN, M.I. Laboratory markers of platelet activation and their clinical significance. Current Opinion in Hematology, v. 6, p. 342-348, 1999.

MICHELSON, A.D. Flow cytometry: A clinical test of platelet function. Blood, v. 87, p. 4925-4936, 1996. MICHELSON, A.D.; BARNARD, M.R.; HECHTMAN, H.B.; MACGREGOR, H.; CONNOLLY, R.J.; LOSCALZO, J.;

VALERI, C.R. In vivo tracking of platelets: Circulating degranulated platelets rapidly lose surface P-selectin but continue to circulate and function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v. 93, p. 11877-11882, 1996.

MICHELSON, A.D.; BARNARD, M.R.; KRUEGER, L.A.; VALERI, C.R.; FURMAN, M.I. Circulating monocyte-platelet aggregates are a more sensitive marker of in vivo platelet activation than platelet surface P-selectin. Circulation, v. 104, p. 1533-1537, 2001.

MICHELSON, A.D.; BENOIT, S.E.; KROLL, M.H.; LI, J.M.; ROHRER, M.J.; KESTIN, A.S.; BARNARD, M.R. The activation-induced decrease in the platelet surface expression of hte glycoprotein Ib-X complex is reversible.I. Blood, v. 83, p. 3562-3573, 1994.

MICHELSON, A.D.; ELLIS, P.A.; BARNARD, M.R.; MATIC, G.B.; VILES, A.F.; KESTIN, A.S. Dowregulation of platelet surface glycoprotein Ib-IX complex in whole blood stimulated by thrombin, adenosine diphosphate, or an in vivo wound. Blood, v. 77, p. 770-779, 1991.

MILANI, R.; JORGE, M.T.; FERRAZ DE CAMPOS, F.P.; MARTINS, F.P.; BOUSSO, A.; CARDOSO, J.L.C.; RIBEIRO, L.A.; FAN, H.W.; FRANÇA, F.O.S.; SANO-MARTINS, I.S.; CARDOSO, D.; FERNANDEZ, I.C.O.F.; FERNANDES, J.C.; ALDRED, V.L.; SANDOVAL, M.P.; PUORTO, G.; THEAKSTON, R.D.G.; WARRELL, D.A. Snake bites by the jararacuçu (Bothrops jararacussu): clinicopathological studies of 29 proven cases in Sao Paulo State, Brazil. The Quarterly Journal of Medicine, v. 90, p. 323-334, 1997.

MIYAZAKI, Y.; NOMURA, S.; MIYAKE, T.; KAGAWA, H.; KITADA, C.; TANIGUCHI, H.; KOMIYAMA, Y.; FUJIMURA, Y.; IKEDA, Y.; FUKUHARA, S. High shear stress can initiate both platelet aggregation and shedding of procoagulant containing microparticles. Blood, v. 88, p. 3456-3464, 1996.

MOLINO, M.; DI LALLO, M.; MARTELLI, N.; DE GAETANO, G.; CERLETTI, C. Effects of leukocyte-derived cathepsin G on platelet membrane glycoprotein Ib-IX and IIb-IIIa complexes: a comparison with thrombin. Blood, v. 82, p. 2442-2451, 1993.

MONTEIRO, JÁCOME. Relação da província do Brasil, 1610. In: LEITE, SERAFIM. História da Companhia de Jesus no Brasil. Vol. 8. Lisboa-Rio de Janeiro: Instituto Nacional do Livro, 1949.

MONTEIRO, R.Q.; CARLINI, C.R.; GUIMARAES, J.A.; BON, C.; ZINGALI, R.B. Distinct bothrojaracin isoforms produced by individual jararaca (Bothrops jararaca) snakes. Toxicon, v. 35, p. 649-657, 1997.

MONTEIRO, R.Q.; YAMANOYE, N.; CARLINI, C.R.; GUIMARÃES, J.A.; BON, C.; ZINGALI, R.B. Variability of bothrojaracin isoforms and other venom principles in individual jararaca (Bothrops jararaca) snakes maintained under seasonally invariant conditions. Toxicon, v. 36, p. 153-163, 1998.

u REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

174

MOORE, D.M. Hematology of rabbits. In: FELDMAN, B.F.; ZINKL, J.G.; JAIN, N.C. Schalm’s Veterinary Hematology. 5. ed. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins, 2000. p. 1100-1106.

MORIAU, M.; RODHAIN, J.; NOEL, H.; DE BEYS-COL, C.; MASURE, R. Comparative effects of proteinase inhibitors, plasminogen antiactivators, heparin and acetylsalicylic acid on the experimental disseminated intravascular coagulation induced by thrombin. Thrombosis et Diathesis Haemorrhagica, v. 32, p. 171-188, 1974.

MOSESSON, M.W.; SIEBENLIST, K.R.; MEH, D.A. The structure and biological features of fibrinogen and fibrin. Annals of the New York Academy of Sciences, v. 936, p. 11-30, 2001.

MÜLLER, C.W. Das Bildprogramm der Silberbecher von Hoby. Zur Rezeption Frühgriechscher Literatur in der Römischen Bildkunst der Augusteichen Zeit. Jahrbuch des Deutschen Archaologischen Instituts, v. 109, p.321-352, 1994.

MÜLLER, M.R.; SALAT, A.; PULAKI, S.; STANGL, P.; ERGUN, E.; SCHREINER, W.; LOSERT, U.; WOLNER, E. Influence of hematocrit and platelet count on impedance and reactivity of whole blood for electrical aggregometry. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods, v. 34, p. 17-22, 1995.

MURANO, G.; WILLIAMS, L.; MILLER-ANDERSSON, M.; ARONSON, D.L.; KING, C. Some properties of antithrombin-III and its concentration in human plasma. Thrombosis Research, v. 18, p. 259-262, 1980.

MURATA, T.; SAITO, S.; SHIOZAKI, M.; LU, R.Z.; ETO, Y.; FUNABA, M.; TAKAHASHI, M.; TORII, K. Anti-activin A antibody (IgY) specifically neutralizes various activin A activities. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine, v. 211, p. 100-107, 1996.

MUSTARD, J.F.; ROWSELL, H.C.; MURPHY, E.A. Platelet economy (platelet survival and turnover). British Journal of Haematology, v. 12, p. 1-24, 1966.

MYINT-LWIN; WARRELL, D.A.; PHILLIPS, R.E.; TIN-NU-SWE; TUN-PE; MAUNG-MAUNG-LAY Bites by Russell's viper (Vipera russelli siamensis) in Burma: haemostatic, vascular, and renal disturbances and response to treatment. Lancet, v. 2, p. 1259-1264, 1985.

NADANO, D.; YASUDA, T.; TAKESHITA, H.; KISHI, K. Ribonuclease inhibitors in human blood: comparative studies on the inhibitors detected in erythrocytes, platelets, monoclunear leukocytes and granulocytes. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, v. 27, p. 971-979, 1995.

NAGATA, Y.; SHOZAKI, Y.; NAGAHISA, H.; NAGASAWA, T.; ABE, T.; TODOKORO, K. Serum thromboietin level is not regulated by transcription but by the total counts of both megakaryocytes and platelets during thrombocytopenia and thrombocytosis. Thrombosis and Haemostasis, v. 77, p. 808-814, 1997.

NAHAS, L.; DENSON, K.W.E.; MACFARLANE, R.G. A study of the coagulant action of right snake venoms. Thrombosis et Diathesis Haemorrhagica, v. 12, p. 355-367, 1964.

NAHAS, L.; KAMIGUTI, A.S.; BARROS, M.A.R. Thrombin-like and factor X-activator components of Bothrops snake venoms. Thrombosis and Haemostasis, v. 41, p. 314-328, 1979.

NAHAS, L.; KAMIGUTI, A.S.; RZEPPA, H.W.; SANO, I.S.; MATSUNAGA, S. Effects of heparin on the coagulant action of snake venoms. Toxicon, v. 13, p. 457-463, 1975.

NEAME, P.B.; KELTON, J.G.; WALKER, I.R.; STEWART, I.O.; NOSSEL, H.L.; HIRSH, J. Thrombocytopenia in septicemia: the role of disseminated intravascular coagulation. Blood, v. 56, p. 88-92, 1980.

NIEUWENHUIS, H.K.; AKKERMAN, J.W.N.; SIXMA, J.J. Patients with a prolonged bleeding time and normal aggregation tests may have storage pool deficiency: studies on one hundred six patients. Blood, v. 70, p. 620-623, 1987.

NIEWIAROWSKI, S.; BUDZYNSKI, A.Z.; LIPINSKI, B. Significance of the intact polypeptide chains of human fibrinogen in ADP-induced platelet aggregation. Blood, v. 49, p. 635-644, 1977a.

NIEWIAROWSKI, S.; KIRBY, E.P.; BRUDZYNSKI, T.M.; STOCKER, K. Thrombocytin, a serine protease from Bothrops atrox venom. 2. Interaction with platelets and plasma-clotting factors. Biochemistry, v. 18, p. 3570-3577, 1979.

NIEWIAROWSKI, S.; KIRBY, E.P.; STOCKER, K. Thrombocytin - a novel platelet activating enzyme from Bothrops atrox venom. Thrombosis Research, v. 10, p. 863-869, 1977b.

NISHIDA, S.; FUJIMURA, Y.; MIURA, S.; OZAKI, Y.; USAMI, Y.; SUZUKI, M.; TITANI, K.; YOSHIDA, E.; SUGIMOTO, M.; YOSHIOKA, A.; FUKUI, H. Purification and characterization of bothrombin, a fibrinogen-clotting serine protease from the venom of Bothrops jararaca. Biochemistry, v. 33, p. 1843-1849, 1994.

NISHIOKA, S.A. & SILVEIRA, P.V.P. A clinical and epidemiologic study of 292 cases of lance-headed viper bite in a Brazilian teaching hospital. American Journal of Tropical Medicine Hygiene, v. 47, p. 805-810, 1992.

NOMURA, S.; IMAMURA, A.; OKUNO, M.; KAMIYAMA, Y.; FUJIMURA, Y.; IKEDA, Y.; FUKUHARA, S. Platelet-derived microparticles in patients with arteriosclerosis obliterans: enhacement of high shear-induced microparticle generation by cytokines. Thrombosis Research, v. 98, p. 257-268, 2000.

u REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

175

NURDEN, A.T.; BUTCHER, P.D.; HAWKEY, C.M. Comparative studies on the glycoprotein composition of mammalian platelets. Comparative Biochemistry and Physiology, v. 56B, p. 407-413, 1977.

OGAWA, T.; SUGIDACHI, A.; ASAI, F.; KOIKE, H. Reduced platelet serotonin content in rabbits with dietary hypercholesterolemia. Blood Coagulation and Fibrinolysis, v. 11, p. 313-319, 2000.

OGILVIE, M.L. & GARTNER, T.K. Identification of lectins in snake venoms. Journal of Herpetology, v. 18, p. 285-290, 1984.

OGILVIE, M.L.; BYL, J.A.; GARTNER, T.K. Platelet aggregation is stimulated by lactose - inhibitable snake venoms lectins. Thrombosis and Haemostasis, v. 62, p. 704-707, 1989.

OLOVSSON, M. & LARSSON, A. Biotin labelling of chicken antibodies and their subsequent use in ELISA and immunohistochemistry. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases, v. 16, p. 145-152, 1993.

OSSELAER, J.C.; JAMART, J.; SCHEIFF, J.M. Platelet distribution width for differential diagnosis of thrombocytosis. Clinical Chemistry, v. 43, p. 1072-1076, 1997.

OTERO, R.; GUTIÉRREZ, J.M.; NÚÑEZ, V.; ROBLES, A.; ESTRADA, R.; SEGURA, E.; TORO, M.F.; GARCIA, M.E.; DIAZ, A.; RAMÍREZ, E.C.; GÓMEZ, G.; CASTAÑEDA, J.; MORENO, M.E.; REGATHER. A randomized double-blind clinical trial of two antivenoms in patients bitten by Bothrops atrox in Colombia. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, v. 90, p. 696-700, 1996.

OUYANG, C. & TENG, C.M. The effect of Trimeresurus mucrosquamatus snake venom on platelet aggregation. Toxicon, v. 16, p. 575-582, 1978.

OZAKI, Y.; SATOH, K.; YATOMI, Y.; MIURA, S.; FUJIMURA, Y.; KUME, S. Protein tyrosine phosphorylation in human platelets induced by interaction between glycoprotein Ib and von Willebrand factor. Biochimica et Biophysica Acta, v. 1243, p. 482-488, 1995.

PACHKAM, M.A.; RAND, M.L.; RUBEN, D.H.; KINLOUGH-RATHBONE, R.L. Effect of calcium concentration and inhibitors on the response of platelets stimulated with collagen: contrast between human and rabbit platelets. Comparative Biochemistry and Physiology, v. 99A, p. 551-557, 1991.

PACKHAM, M.A.; RAND, M.L.; KINLOUGH-RATHBONE, R.L. Similarities and differences between rabbit and human platelet characteristics and functions. Comparative Biochemistry and Physiology, v. 103A, p. 35-54, 1992.

PAINE, M.J.I.; DESMOND, H.P.; THEAKSTON, R.D.G.; CRAMPTON, J.M. Purification, cloning, and molecular characterization of a high molecular weight hemorrhagic metalloprotease, jararhagin, from Bothrops jararaca venom. The Journal of Biological Chemistry, v. 267, p. 22869-22876, 1992.

PARASKEVAS, F. CLINICAL FLOW CYTOMETRY. IN: LEE, G.R.; FOERSTER, J.; LUKENS, J.; PARASKEVAS, F.; GREER, J.P.; RODGERS, G.M., ed. Wintrobe's Clinical Hematology. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins, 1999, p. 56-71.

PARETI, F.I.; CAPITANIO, A.; MANNUCCI, L.; PONTICELLI, C.; MANNUCCI, P.M. Acquired dysfunction due to the circulation of "exhausted" platelets. The American Journal of Medicine v. 69, p. 235-240, 1980.

PARETI, F.I.; CAPITANIO, A.; MANNUCCI, P.M. Acquired storage pool disease in platelets during disseminated intravascular coagulation. Blood, v. 48, p. 511-515, 1976.

PASQUA, J.J. & PIZZO, S.V. The role of ligand-ligand interactions in competition by fibrinogen and fibrin degradation products for fibrinogen binding to human platelets. Biochimica et Biophysica Acta, v. 757, p. 282-287, 1983.

PAULUS, J.M.; ASTER, R.H.; BRENY, H. Platelet kinetics: radioisotopic, cytological, mathematical and clinical aspects. Amsterdam: North-Holland, 1971, 360 p.

PENG, J.; FRIESE, P.; HEILMANN, E.; GEORGE, J.N.; BURSTEIN, S.A.; DALE, G.L. Aged platelets have an impaired response to thrombin as quantitated by P-selectin expression. Blood, v. 83, p. 161-166, 1994.

PENG, J.; FRIESE, P.; WOLF, R.F.; HARRISON, P.; DOWNS, T.; LOK, S.; DALE, G.L.; BURSTEIN, S. Relative reactivity of platelets from thrombopoietin- and interleukin-6-treated dogs. Blood, v. 87, p. 4158-4163, 1996.

PEREIRA, J.; PALOMO, I.; OCQUETEAU, M.; SOTO, M.; ARANDA, E.; MEZZNO, D. Platelet aging in vivo is associated with loss of membrane phospholipid asymmetry. Thrombosis and Haemostasis, v. 82, p. 1318-1321, 1999.

PETER, K.; SCHWARZ, M.; YIÀNNE, J.; KOHLER, B.; MOSER, M.; NORDT, T.; SALBACH, P.; KÜBLER, W.; BODE, C. Induction of fibrinogen binding and platelet aggregation as a potential intrinsic property of various glycoprotein IIb/IIIa (αIIbβ3) inhibitors. Blood, v. 92, p. 3240-3249, 1998.

PETRICEVICH, V.L.; TEIXEIRA, C.F.P.; TAMBOURGI, D.V.; GUTIÉRREZ, J.M. Increments in serum cytokine and nitric oxide levels in mice injected with Bothrops asper and Bothrops jararaca snake venoms. Toxicon, v. 38, p. 1253-1266, 2000.

u REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

176

PHILLIPS, D.R. Surface labeling of platelet membrane glycoproteins. Methods in Enzymology, v. 215, p. 412-419, 1992.

PHILLIPS, D.R.; FITZGERALD, L.; PARISE, L.; STEINER, B. Platelet membrane glycoprotein IIb-IIIa complex: purification, characterizationm and reconstitution into phospholipid vesicles. Methods in Enzymology, v. 215, p. 244-263, 1992.

PHILLIPS, D.R.; NANNIZZI-ALAIMO, L.; PRASAD, K.S. β3 tyrosine phosphorylation in αIIbβ3 (platelet membrane GP IIb-IIIa) outside-in integrin signaling. Thrombosis and Haemostasis, v. 86, p. 246-258, 2001.

PHILLIPS, D.R.; THEAKSTON, R.D.G.; WARRELL, D.A.; GALIGEDARA, Y.; ABEYSEKERA, D.I.D.I.; DISSANAYAKA, P.; HUTTON, R.A.; ALOYSIUS, D.J. Paralysis, rhabdomyolysis and haemolysis caused by bites of Russell's viper (Vipera russelli pulchella) in Sri Lanka: failure of Indian (Haffkine) antivenom. The Quarterly Journal of Medicine, v. 68, p. 691-716, 1988.

PIGUET, P.F.; VESIN, C.; ROCHAT, A. β2 integrin modulates platelet caspase activation and life span in mice. European Journal of Cell Biology, v. 80, p. 171-177, 2001.

PLETSCHER, A. Metabolism, transfer, and storage of 5-hydroxytryptamine in blood platelets. British Journal of Pharmacology and Chemotherapy, v. 32, p. 1-16, 1968.

PLOW, E.F.; CIERNIEWSKI, C.S.; XIAO, Z.; HAAS, T.A.; BYZOVA, T.V. αIIbβ3 and its antagonism at the new millennium. Thrombosis and Haemostasis, v. 86, p. 34-40, 2001.

PODOLSAK, B. & BRUNSWING, D. Veränderungen der hochmolekularen Membranglykoproteine bei Thrombasthenie als Ursache der fehlender Plättchenausbreitung? Klinische Wochenschrift, v. 54, p. 613-617, 1976.

POLSON, A.; COETZER, T.; KRUGER, J.; VON MALTZAHN, E.; VAN DER MERWE, K.J. Improvements in the isolation of IgY from the yolks of eggs laid by immunized hens. Immunological Methods, v. 14, p. 323-327, 1985.

PONCZ, M. & NEWMAN, P.J. Analysis of rodent platelet glycoprotein IIb: evidence for evolutionarily conserved domains and alternative proteolytic processing. Blood, v. 75, p. 1282-1289, 1990.

PONCZ, M.; EISMAN, R.; HEIDENREICH, R.; SILVER, S.M.; VILAIRE, G.; SURREY, S.; SCHWARTZ, E.; BENNETT, J.S. Structure of the platelet membrane glycoprotein IIb. Homology to the α subunits of the vitronectin and fibronectin membrane receptors. The Journal of Biology Chemistry, v. 262, p. 8476-8482, 1987.

PONCZ, M.; Surrey, S.; LAROCCO, P.; WEISS, M.J.; RAPPAPORT, E.F.; CONWAY, T.M.; SCHWARTZ, E. Cloning and characterization of platelet factor 4 cDNA derived from a human erythroleukemic cell line. Blood, v. 69, p. 219-223, 1987.

PRENTICE, C.R.M.; HAMPTON, K.K.; GRANT, P.J.; NELSON, S.R.; NIEUWENHUIZEN, W.; GAFFNEY, P.J. The fibrinolytic response to ancrod therapy: characterization of fibrinogen and fibrin degradation products. British Journal of Haematology, v. 83, p. 276-281, 1993.

PROSDOCIMI, M.; SCATTOLO, N.; ZATTA, A.; FABRIS, F.; STEVANATO, F.; GIROLAMI, A.; CELLA, G. Clearance and in vivo release by heparin of human platelet factor 4 (PF4) in the rabbit. Thrombosis and Haemostasis, v. 52, p. 157-159, 1984.

PROUDFOOT, A.E.I.; MAGNENAT, E.; HALEY, T.M.; MAIONE, T.E.; WELLS, T.N.C. The complete primary structure of glycosylated porcine platelet factor 4. European Journal of Biochemistry v. 228, p. 658-664, 1995.

PUKAC, L.A.; CARTER, J.E.; MORRISON, K.S.; KARNOVSKY, M.J. Enhancement of diaminobenzidine colorimetric signal in immunoblotting. Biotechniques, v. 23, p. 385-388, 1997.

PURI, V.K.; VERMA, M.; SAXENA, A.K.; SHANKER, K. Platelet serotonergic mechanisms in ischaemic heart disease. Thrombosis Research, v. 57, p. 445-451, 1990.

QUEIROZ, L.S. & SANTO NETO, H. Alterações ultraestruturais em capilares causadas por veneno de jararaca. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, v. 19, Suppl., p. 29, 1986.

QUEIROZ, L.S.; SANTO NETO, H.; ASSAKURA, M.T.; REICHL, A.P. Pathological changes in muscle caused by haemorrhagic and proteolytic factors from Bothrops jararaca snake venom. Toxicon, v. 23, p. 341-345, 1985.

RAND, M.L.; PACKHAM, M.A.; MUSTARD, J.F. Survival of density subpopulations of rabbit platelets: use of 51Cr- or 111In-labeled platelets to measure survival of least dense and most dense platelets concurrently. Blood, v. 61, p. 362-367, 1983.

RAND, M.L.; PACKHAM, M.A.; TAYLOR, D.M.; YEO, E.L.; GEMMELL, C.H.; PATIL, S.; LAM, S.C.T. The fibrinogen γ chain dodecapeptide inhibits agonist-induced aggregation of rabbit platelets and fibrinogen binding to rabbit glycoprotein IIb-IIIa. Thrombosis Haemostasis, v. 82, p. 1680-1686, 1999.

u REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

177

RAND, M.L.; WANG, H.; MODY, M.; CHU, I.; TREUTIGER, I.; NGUYEN, A.; PACKHAM, M.A.; FREEDMAN, J. Concurrent measuremet of the survival of two populations of rabbit platelets labeled with either two PKH lipophilic dyes or two concentrations of biotin. Cytometry, v. 47, p. 111-117, 2002.

RAND, M.L.; WANG, H.; MODY, M.; POON, K.S.V.; BLANCHETTE, V.S.; FREEDMAN, J. Shortened survival and senescence of rabbit platelets are associated with exposure of procoagulant surface. In: XVIII Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis, 2001, Paris. Abstract P1197.

RAO, G.H.R.; PELLER, J.D.; WHITE, J.G. Influence of ionized calcium on thrombin-induced down regulation of GPIb/IX receptors on human platelets. Thrombosis Research, v. 85, p. 23-31, 1997.

RAO, L.V.M. & HOANG, A.D. Characterization of rabbit tissue factor. Thrombosis Research, v. 56, p. 109-118, 1989.

RAO, L.V.M. & HOANG, A.D. Purification and characterization of rabbit factor IX and its existence as a two-chain factor IX in circulating plasma. Thrombosis Research, v. 64, p. 57-68, 1991.

RAPAPORT, S.I.; HJORT, P.F.; PATCH, M.J. Rabbit factor V: different effects of thrombin and venom, a source of error in assay. American Journal of Physiology, v. 211, p. 1477-1485, 1966.

RAPAPORT, S.I.; TONEFF, T.; RIMON, A.; WARN-CRAMER, B.J. The effect of immunodepletion of antithrombin III on the response of rabbits to Russell's viper venom-induced activation of factor X. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology, v. 17, p. 409-416, 1997.

RATNOFF, O.D. & MENZIE, C. A new method for the determination of fibrinogen in small samples of plasma. Journal of Laboratory and Clinical Medicine, v. 37, p. 216-320, 1951.

RAVANAT, C.; FREUND, M.; SCHUHLER, S.; GRUNERT, P.; CAZENAVE, J.P. Development of a sensitive immunoassay for quantitation of PF4 in rat platelets and plasma in order to follow experimental thrombosis in rats. Thrombosis and Haemostasis, v. 69, p. 1025, 1993.

RAVANAT, C.; GACHET, C.; HERBERT, J.M.; SCHUHLER, S.; GUILEMOT, J.C.; UZABIAGA, F.; PICARD, C.; FERRERA, P.; FREUND, M.; CAZENAVE, J.P. Rat platelets contain glycosylated and non-glycosylated forms of platelet factor 4. Identification and characterization by mass spectrometry. European Journal of Biochemistry, v. 223, p. 203-210, 1994.

RAWALA, R.; SARASWATHI, S.; NIEWIAROWSKI, S.; COLMAN, R. Molecular changes during the activation of bovine factor V by snake venom proteases. Circulation, v. 58, p. II-209a, 1978.

READ, M.S.; POTTER, J.Y.; BRINKHOUS, K.M. Venom coagglutinin for detection of von Willebrand factor activity in animal plasmas. Journal of Laboratory and Clinical Medicine, v. 101, p. 74-82, 1983.

READ, M.S.; SHERMER, R.W.; BRINKHOUS, K.M. Venom coagglutinin: an activator of platelet aggregation dependent on von Willebrand factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v. 75, p. 4514-4518, 1978.

READ, M.S.; SMITH, S.Y.; LAMB, M.A.; BRINKHOUS, K.M. Role of botrocetin in platelet agglutination: formation of an activated complex of botrocetin and von Willebrand factor. Blood, v. 74, p. 1031-1035, 1989.

RECHNIC, J.; TRACHTENBERG, P.; CASPER, J.; MOROZ, C.; VRIES, A. Afibrinogenemia and thrombocytopenia in guinea pigs following injection of Echis colorata venom. Blood, v. 20, p. 735-749, 1962.

REDDI, K.K. Human platelet ribonuclease. Biochemical and Biophysical Research Communications, v. 79, p. 532-538, 1977.

REED, G.L.; FITZGERALD, M.L.; POLGÁR, J. Molecular mechanisms of platelet exocytocis: insights into the "secrete" life of thrombocytes. Blood, v. 96, p. 3334-3342, 2000.

REED, G.L.; HOUNG, A.K.; BIANCHI, C. Comparative biochemical and ultrastructural studies of P-selectin in rabbit platelets. Comparative Biochemistry and Physiology, v. 119B, p. 729-738, 1998.

REIMERS, H.J.; ALLEN, D.J.; FEURSKIN, I.A.; MUSTARD, J.F. Transport and storage of serotonin by thrombin-treated platelets. The Journal of Cell Biology, v. 65, p. 359-372, 1975.

REIMERS, H.J.; BUCHANAN, M.R.; MUSTARD, J.F. Survival of washed rabbit platelets in vivo. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine, v. 142, p. 1222-1225, 1973a.

REIMERS, H.-J.; KINLOUGH-RATHBONE, R.L.; CAZENAVE, J.P.; SENYL, A.F.; HIRSH, J.; PACKHAM, M.A.; Mustard, J.F. In vitro and in vivo functions of thrombin-treated platelets. Thrombosis and Haemostasis, v. 35, p. 151-166, 1976.

REIMERS, H.J.; PACKHAM, M.A.; KINLOUGH-RATHBONE, R.L.; MUSTARD, J.F. Effect of repeated treated of rabbit platelets with low concentrations of thrombin on their function, metabolism and survival. British Journal of Haematology, v. 25, p. 675-689, 1973b.

REIS, C.C.A.; NIGRO, D.; CARVALHO, M.H.C. Autacóides. In: ZANINI, A.C. & OGA, S. Famacologia aplicada. 2. ed. São Paulo: Atheneu, 1982. p. 475-487

u REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

178

RIBEIRO, L.A. & JORGE, M.T. Acidente por serpentes do gênero Bothrops: série de 3.139 casos. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, v. 30, p. 475-480, 1997.

RIBEIRO, L.A. & JORGE, M.T. Alteração do tempo de coagulaçao sangüínea em pacientes picados por serpente Bothrops jararaca adulta e filhote. Revista do Hospital das Clínicas da FMUSP, v. 44, p. 143-145, 1989.

RIBEIRO, L.A. & JORGE, M.T. Epidemiologia e quadro clínico dos acidentes por serpentes Bothrops jararaca adultas e filhotes. Revista do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo, v. 32, p. 436-442, 1990.

RICHARDS, E.M. & BAGLIN, T.P. Quantitation of reticulated platelets: methodology and clinical application. British Journal of Haematology, v. 91, p. 445-451, 1995.

RIEWALD, M. & RUF, W. Mechanistic coupling of protease signaling and initiation of coagulation by tissue factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v. 98, p. 7742-7747, 2001.

RILEY, J.H.; DAVIDOVICH, A.; LIPMAN, J.M.; ARCEO, R.; ANDERSON, T.D. Hematological effects of 2',3'-dideoxycytidine in rabbits. Toxicologic Pathology, v. 20, p. 367-375, 1992.

RINDER, C.S.; MATHEW, J.P.; RINDER, H.M.; BONAN, J.; AULT, K.A.; SMITH, B.R. Modulation of platelet surface adhesion receptors during cardioplulmonary bypass. Anesthesiology, v. 75, p. 563-570, 1991.

ROBERTS, G.T. & EL BADAWI, S.B. Red blood cell distribution width index in some hematologic diseases. American Journal of Clinical Pathology, v. 83, p. 222-226, 1985.

ROBINSON, M.; MACHIN, S.; MACKIE, I.; HARRISON, P. In vivo biotinylation studies: specificity of labelling of reticulated platelets by thiazole orange and mepacrine. British Journal of Haematology, v. 108, p. 859-864, 2000.

ROSENBERG, R.D. & DAMUS, P.S. The purification and mechanism of action of human antithrombin-heparin cofactor. The Journal of Biological Chemistry, v. 248, p. 6490-6505, 1973.

ROSENFELD, G. Symptomatology, pathology, and treatment of snake bites in South America. In: BÜCHERL, W. & BUCKLEY, E.E., eds. Venomous animals and their venoms. New York: Academic Press, 1971. v. 2, p. 345-384.

ROSENFELD, G.; HAMPES, O.G.; KELEN, E.M.A. Coagulant and fibrinolytic activity of animal venoms; determination of coagulant and fibrinolytic index of different species. Memórias do Instituto Butantan, v. 29, p. 143-163, 1959.

ROSENFELD, G.; KELEN, E.M.A.; NAHAS, L. Regeneration of fibrinogen after defibrination by bothropic venom in man and in dogs. Relationships with clotting and bleeding time. Revista Clínica de São Paulo, v. 34, p. 36-44, 1958.

ROTH, G.J.; HICKEY, M.J.; CHUNG, D.W.; HICKSTEIN, D.D. Circulating human blood platelets retain appreciable amounts of poly (A)+ RNA. Biochemical and Biophysical Research Communications, v. 160, p. 705-710, 1989.

RUCINSKI, B.; KNIGHT, L.C.; NIEWIAROWSKI, S. Clearance of human platelet factor 4 by liver and kidney: its alteration by heparin. American Journal of Physiology, v. 251, p. H800-H807, 1986.

RUCINSKI, B.; NIEWIAROWSKI, S.; HOLT, J.C.; SOSZKA, T.; KOWDSEN, K.A. Batroxostatin, an Arg-Gly-Asp-containing peptide from Bothrops atrox, is a potent inhibitor of platelet aggregation and cell interaction with fibronectin. Biochimica et Biophysica Acta, v. 1054, p. 257-262, 1990a.

RUCINSKI, B.; NIEWIAROWSKI, S.; JAMES, P.; WALZ, D.A.; BUDZYNSKI, A.Z. Antiheparin proteins secreted by human platelets. purification, characterization, and radioimmunoassay. Blood, v. 53, p. 47-62, 1979.

RUCINSKI, B.; NIEWIAROWSKI, S.; STRZYZEWSKI, M.; HOLT, J.C.; MAYO, K.H. Human platelet factor 4 and its C-terminal peptides: heparin binding and clearance from the circulation. Thrombosis and Haemostasis, v. 63, p. 493-498, 1990b.

RUF, A. & PATSCHEKE, H. Flow cytometric detection of activated platelets: comparison of determining shape change, fibrinogen binding, and P-selectin expression. Seminars in Thrombosis and Hemostasis, v. 21, p. 146-151, 1995.

SAKARIASSEN, K.S.; HOLME, P.A.; ØRVIM, U.; BARSTAD, R.M.; SOLUM, N.O.; BROSSTAD, F.R. Shear-induced platelet activation and platelet microparticle formation in native human blood. Thrombosis Research, v. 92, Suppl., p. S33-S41, 1998.

SANDERS, W.E.; READ, M.S.; REDDICK, R.L.; GARRIS, J.B.; BRINKHOUS, K.M. Thrombotic thrombocytopenia with von Willegrand factor deficiency induced by botrocetin - an animal model. Laboratory Investigation, v. 59, p. 443-452, 1988.

SANDERS, W.E.; REDDICK, R.L.; NICHOLS, T.C.; BRINKHOUS, K.M.; READ, M.S. Thrombotic thrombocytopenia induced in dogs and pigs. The role of plasma and platelet vWF in animal models of thrombotic thrombocytopenic purpura. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology, v. 15, p. 793-800, 1995.

u REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

179

SANO-MARTINS, I.S.; SANTORO, M.L.; CASTRO, S.C.B.; FAN, H.W.; CARDOSO, J.L.C.; THEAKSTON, R.D.G. Platelet aggregation in patients bitten by the Brazilian snake Bothrops jararaca. Thrombosis Research, v. 87, p. 183-195, 1997.

SANO-MARTINS, I.S.; SANTORO, M.L.; MORENA, P.; SOUSA-E-SILVA, M.C.C.; TOMY, S.C.; ANTONIO, L.C.; NISHIKAWA, A.K.; GONÇALVES, I.L.C.; LARSSON, M.H.A.; HAGIWARA, M.K.; KAMIGUTI, A.S. Hematological changes induced by Bothrops jararaca venom in dogs. Brazilian Journal of Medical and Biological Research, v. 28, p. 303-312, 1995.

SANO-MARTINS, I.S.; TOMY, S.C.; CAMPOLINA, D.; DIAS, M.B.; CASTRO, S.C.B.; SOUSA-E-SILVA, M.C.C.; AMARAL, C.F.S.; REZENDE, N.A.; KAMIGUTI, A.S.; WARRELL, D.A.; THEAKSTON, R.D.G. Coagulopathy following lethal and non-lethal envenoming of humans by the South American rattlesnake (Crotalus durissus) in Brazil. The Quarterly Journal of Medicine, v. 94, p. 551-559, 2001.

SANTORO, M.L. & SANO-MARTINS, I.S. Different clotting mechanisms of Bothrops jararaca venom on human and rabbit plasmas. Toxicon, v. 31, p. 733-742, 1993.

SANTORO, M.L. Alterações morfofuncionais plaquetárias após envenenamento experimental por Bothrops jararaca em coelhos. 1993. 146 p. Dissertação de Mestrado - Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas, Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo, São Paulo.

SANTORO, M.L.; SANO-MARTINS, I.S.; CHAMONE, D.A.F. In vivo platelet activation induced by Bothrops jararaca venom in rabbits. Platelets, v. 5, p. 162-170, 1994.

SANTOS, B.F.; SERRANO, S.M.T.; KULIOPULOS, A.; NIEWIAROWSKI, S. Interaction of viper venom serine peptidases with thrombin receptors on human platelets. FEBS Letters, v. 477, p. 199-202, 2000.

SAVAGE, B.; CATTANEO, M.; RUGGERI, Z.M. Mechanisms of platelet aggregation. Current Opinion in Hematology, v. 8, p. 270-276, 2001.

SAXON, B.R.; MODY, M.; BLANCHETTE, V.S.; FREEDMAN, J. Reticulated platelet counts in the assessment of thrombocytopenic disorders. Acta Paediatrica, v. Suppl. 424, p. 65-70, 1998.

SAZIMA, I. Natural history of the jararaca pitviper, Bothrops jararaca, in Southeastern Brazil. In: CAMPBELL, J.A. & BRODIE JR, E.D., ed. Biology of the pitvipers. Tyler: Selva, 1992, p. 199-216.

SCARBOROUGH, R.M.; ROSE, J.W.; NAUGHTON, M.A.; PHILLIPS, D.R.; NANNIZZI, L.; ARFSTEN, A.; CAMPBELL, A.M.; CHARO, I.F. Characterization of the integrin-specificities of disintegrins isolated from American pit viper venoms. The Journal of Biological Chemistry, v. 268, p. 1058-1065, 1993.

SCHAEFFER, R.C.J.; BRISTON, C.; CHILTON, S.M.; CARLSON, R.W. Disseminated intravascular coagulation following Echis carinatus venom in dogs: effects of a synthetic thrombin inhibitor. Journal of Laboratory and Clinical Medicine, v. 107, p. 488-497, 1986.

SCHAEFFER, R.C.J.; CHILTON, S.M.; HADDEN, T.J.; CARLSON, R.W. Pulmonary fibrin microembolism with Echis carinatus venom in dogs: effects of a synthetic thrombin inhibitor. Journal of Applied Physiology, v. 57, p. 1824-1828, 1984.

SCHÄGGER, H. & VON JAGOW, G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Analytical Biochemistry, v. 166, p. 368-379, 1987.

SCHEFFEL, U.; MCINTYRE, P.A.; EVATT, B.; DVORNICKY JR., J.A.; NATARAJAN, T.K.; BOLLING, D.R.; MURPHY, E.A. Evaluation of Indium-111 as a new high photon yield gamma-emitting physiological platelet label. The Johns Hopkins Medical Journal, v. 140, p. 285-293, 1977.

SCHMITZ, G.; ROTHE, G.; RUF, A.; BARLAGE, S.; TSCHÖPE, D.; CLEMETSON, K.J.; GODALL, A.H.; MICHELSON, A.D.; NURDEN, A.T.; SHANKEY, T.V. European working group on clinical cell analysis: consensus protocol for the flow cytometric characterisation of platelet function. Thrombosis and Haemostasis, v. 79, p. 885-896, 1998.

SEHAYEK, E.; BEN-YOSEF, N.; MODAN, M.; CHETRIT, A.; MEYTES, D. Platelet parameters and aggregation in essential and reactive thrombocytosis. American Journal of Clinical Pathology, v. 90, p. 431-436, 1988.

SEKIYA, F.; ATODA, H.; MORITA, T. Isolation and characterization of an anticoagulant protein homologous to botrocetin from the venom of Bothrops jararaca. Biochemistry, v. 32, p. 6892-6897, 1993.

SELISTRE, H.S. & GIGLIO, J.R. Isolation and characterization of a thrombin-like enzyme from the venom of the snake Bothrops insularis (jararaca ilhoa). Toxicon, v. 25, p. 1135-1144, 1987.

SERRANO, S.M.T.; HAGIWARA, Y.; MURAYAMA, N.; HIGUCHI, S.; MENTELE, R.; SAMPAIO, C.A.M.; CAMARGO, A.C.M.; FINK, E. Purification and characterization of a kinin-releasing and fibrinogen-clotting serine proteinase (KN-BJ) from the venom of Bothrops jararaca, and molecular cloning and sequence analysis of its cDNA. European Journal of Biochemistry v. 251, p. 845-853, 1998.

u REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

180

SERRANO, S.M.T.; MENTELE, R.; SAMPAIO, C.A.M.; FINK, E. Purification, characterization, and amino acid sequence of a serine proteinase, PA-BJ, with platelet-aggregating activity from the venom of Bothrops jararaca. Biochemistry, v. 34, p. 7186-7192, 1995.

SERRANO, S.M.T.; REICHL, A.P.; MENTELE, R.; AUERSWALD, E.A.; SANTORO, M.L.; SAMPAIO, C.A.M.; CAMARGO, A.C.M.; ASSAKURA, M.T. A novel phospholipase A2, BJ-PLA2, from the venom of the snake Bothrops jararaca: purification, primary structure analysis, and its characterization as a platelet-aggregation-inhibiting factor. Archives of Biochemistry and Biophysics, v. 367, p. 26-32, 1999.

SERRANO, S.M.T.; SAMPAIO, C.A.M.; MENTELE, R.; CAMARGO, A.C.M.; FINK, E. A novel fibrinogen-clotting enzyme, TL-BJ, from the venom of the snake Bothrops jararaca: purification and characterization. Thrombosis and Haemostasis, v. 83, p. 438-444, 2000.

SHARMA, J.M. Introduction to poultry vaccines and immunity. Advances in Veterinary Science, v. 41, p. 481-493, 1999.

SHATTIL, S.J.; CUNNINGHAM, M.; HOXIE, J.A. Detection of activated platelets in whole blood using activation-dependent monoclonal antibodies and flow cytometry. Blood, v. 70, p. 307-315, 1987.

SHEBUSKI, R.J.; RAMJIT, D.R.; BENCEN, G.H.; PALOKOFF, M.A. Characterization and platelet inhibitory activity of bitistatin, a potent arginine-glycine-aspartic acid-containing peptide from the venom of the viper Bitis arietans. The Journal of Biological Chemistry, v. 264, p. 21550-21556, 1989.

SHEBUSKI, R.J.; RAMJIT, D.R.; SITKO, G.R.; LUMMA, P.K.; GARSKY, V.M. Prevention of canine coronary artery thrombosis with echistatin, a potent inhibitor of platelet aggregation from the venom of the viper, Echis carinatus. Thrombosis and Haemostasis, v. 64, p. 576-581, 1990a.

SHEBUSKI, R.J.; STABILITO, I.J.; SITKO, G.R.; POLOKOFF, M.H. Acceleration of recombinant tissue-type plasminogen activaton-induced thrombolysis and prevention of reocclusion by the combination of heparin and the Arg-Gly-Asp-containing peptide bitistatin in a canine model of coronary thrombosis. Circulation, v. 82, p. 169-177, 1990b.

SHEFFIELD, W.P.; BROTHERS, A.B.; WELLS, M.J.; HATTON, M.W.C.; CLARKE, B.J.; BLAJCHMAN, M.A. Molecular cloning and expression of rabbit antihrombin III. Blood, v. 79, p. 2330-2339, 1992.

SHEU, J.R. & HUANG, T.F. Ex-vivo and In-vivo antithrombotic effect of triflavin, an RGD-containing peptide. The Journal of Pharmacy and Pharmacology, v. 46, p. 58-62, 1994.

SHIGETA, O.; LU, W.; HOLT, J.C.; EDMUNDS, L.H.J.; NIEWIAROWSKI, S. Ovine platelet factor 4: purification, amino acid sequence, radioimmunoassay and comparison with platelet factor 4 of other species. Thrombosis Research, v. 1991, p. 509-520, 1991.

SHIMAMURA, K.; OKA, K.; NAKAZAWA, M.; KOJIMA, M. Distribution patterns of microthrombi in disseminated intravascular coagulation. Archives of Pathology & Laboratory Medicine, v. 107, p. 543-547, 1983.

SHUTTLEWORTH, R.D. & O'BRIEN, J.R. Intraplatelet serotonin and plasma 5-hydroxyindoles in health and disease. Blood, v. 57, p. 505-509, 1981.

SILJANDER, P.; CARPEN, O.; LASSILA, R. Platelet-derived microparticles associate with fibrin during thrombosis. Blood, v. 87, p. 4651-4663, 1996.

SIMON, T.L. & GRACE, T.G. Envenomation coagulopathy in wounds from pit vipers. The New England Journal of Medicine, v. 305, p. 443-447, 1981.

SIMS, P.J. & WIEDMER, T. Unraveling the mysteries of phospholipid scrambling. Thrombosis and Haemostasis, v. 86, p. 266-275, 2001.

SIMS, P.J.; WIEDMER, T.; ESMON, C.T.; WEISS, H.J.; SHATTIL, S.J. Assembly of the prothrombinase complex is linked to vesiculation of the platelet plasma membrane. Studies in Scott syndrome: an isolated defect in platelet procoagulant activity. The Journal of Biological Chemistry, v. 264, p. 17049-17057, 1989.

SLUNGAARD, A. & KEY, N.S. Platelet factor 4 stimulates thrombomodulin protein C-activating cofactor activity. The Journal of Biological Chemistry, v. 269, p. 25549-25556, 1994.

SMALL, B.M. & BETTIGOLE, R.E. Diagnosis of myeloproliferative disease by analysis of the platelet volume distribution. American Journal of Clinical Pathology, v. 76, p. 685-691, 1981.

SMITH, J.B.; DANGELMAIER, C.; SELAK, M. Identification of 50 kDa snake venom proteins which specifically inhibit platelet adhesion to collagen. FEBS Letters, v. 283, p. 307-310, 1991.

SMOLKA, M.B.; MARANGONI, S.; OLIVEIRA, B.; NOVELLO, J.C. Purification and partial characterization of a thrombin-like enzyme, balterobin, from the venom of Bothrops alternatus. Toxicon, v. 36, p. 1059-1063, 1998.

SOLOVIEV, M.V.; OKAZAKI, Y.; HARASAKI, H. Whole blood platelet aggregation in humans and animals: a comparative study. The Journal of Surgical Research, v. 82, p. 180-187, 1999.

u REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

181

SOMERS, D.; KINLOUGH-RATHBONE, R.L.; RICHARDSON, M.; MUSTARD, J.F. The relation among vessel injury, thrombus formation, and platelet survival in rabbits. Experimental and molecular pathology, v. 53, p. 239-254, 1990.

SOTTILE, J.; MOSHER, D.F.; FULLENSEIDER, J.; GEORGE, J.N. Human platelets contain mRNA transcripts for platelet factor 4 and actin. Thrombosis and Haemostasis, v. 62, p. 1100-1102, 1989.

SOUSA, GABRIEL SOARES DE. Notícia do Brasil, ca. 1587. Introdução, cometários e notas pelo Prof. Pirajá da Silva. São Paulo: Martins, 1945. Tomo II, cap. CXI.

SREEDHARA, R.; ITAGAKI, I.; HAKIM, R.M. Uremic patients have decreased shear-induced platelet aggregation mediated by decreased availability of glycoprotein IIb-IIIa receptors. American Journal of Kidney Diseases, v. 27, p. 335-364, 1996.

ST. CHARLES, R.; WALZ, D.A.; EDWARDS, B.F.P. The three-dimensional structure of bovine platelet factor 4 at 3.0-Å resolution. The Journal of Biological Chemistry, v. 264, p. 2092-2099, 1989.

STENBERG, P.E. & BAINTON, D.F. Storage organelles in platelets and megakaryocytes. In: PHILLIPS, D.R. & SHUMAN, M.A., ed. Biochemistry of platelets. Orlando: Academic Press, 1986, p. 257-294.

STOCKER, C.J.; SUGARS, K.L.; HARARI, O.A.; LANDIS, R.C.; MORLEY, B.J.; HASKARD, D.O. TNF-α, IL-4, and IFN-gamma regulate differential expression of P- and E-selectin expression by porcine aortic endothelial cells. The Journal of Immunology, v. 164, p. 3309-3315, 2000.

STOCKER, K. Defibrinogenation with thrombin-like snake venom enzymes. In: MARKWARDT, F., ed. Fibrinolytics and antifibrinolytics: handbook of experimental pharmacology. Berlin: Springer-Verlag, 1978, p. 451-484.

STOCKER, K. & BARLOW, G.H. The coagulant enzyme from Bothrops atrox venom (batroxobin). Methods in Enzymology, v. 45, p. 214-223, 1976.

STOCKER, K.; FISCHER, H.; MEIER, J.; BROGLI, M.; SVENDSEN, L. Protein C activators in snake venoms. Behring Institute Mitteilungen, v. 79, p. 37-47, 1986.

STOCKER, K. & MEIER, J. Thrombin-like snake venom enzymes. In: PIRKLE, H. & MARKLAND, F.S., ed. Hemostasis and animal venoms. New York: Marcel Dekker, 1988, p. 67-84.

STOHLAWETZ, P.; FOLMAN, C.C.; BORNE, A.E.G.K.; PERNERSTORFER, T.; EICHLER, H.G.; PANZER, S.; JILMA, B. Effects of endotoxemia on thrombopoiesis in men. Thrombosis and Haemostasis, v. 81, p. 613-617, 1999a.

STOHLAWETZ, P.; HORVATH, M.; PERNERSTORFER, T.; NGUYEN, H.; VONDROVEC, B.; ROBISCH, A.; EICHLER, H.G.; SPITZAUER, S.; JILMA, B. Effects of nitric oxide on platelet activation during plateletpheresis and in vivo tracking of biotinylated platelets in humans. Transfusion, v. 39, p. 506-514, 1999b.

STOHLAWETZ, P.; STIEGLER, G.; JILMA, B.; DETTKE, M.; HÖCKER, P.; PANZER, S. Measuremet of the levels of reticulated platelets after plateletpheresis to monitor activity on thrombopoiesis. Transfusion, v. 38, p. 454-458, 1998.

STUART, M.J.; MURPHY, S.; OSKI, F.A. A simple nonradioisotope technic for the determination of platelet life-span. The New England Journal of Medicine, v. 292, p. 1310-1313, 1975.

STUBBS, M.T. & BODE, W. A player of many parts: the spotlight falls on thrombin's structure. Thrombosis Research, v. 69, p. 1-58, 1993.

SUGIKI, M.; MARUYAMA, M.; YOSHIDA, E.; MIHARA, H.; KAMIGUTI, A.S.; THEAKSTON, R.D.G. Enhancement of plasma fibrinolysis in vitro by jararhagin, the main haemorrhagic metalloproteinase in Bothrops jararaca venom. Toxicon, v. 33, p. 1605-1617, 1995.

SUGIKI, M.; YOSHIDA, E.; ANAI, K.; MARUYAMA, M. Activation of single-chain urokinase-type plasminogen activator by a hemorrhagic metalloproteinase, jararafibrase I, in Bothrops jararaca venom. Toxicon, v. 36, p. 993-1000, 1998.

SUGIMOTO, M.; MOHR, H.; MCCLINTOCK, R.A.; RUGGERI, Z.M. Identification of discontinous von Willebrand factor sequences involved in complex formation with botrocetin. The Journal of Biological Chemistry, v. 266, p. 18192-18178, 1991.

SUZUKI, H.; KATAGIRI, Y.; TSUKITA, S.; TANOUE, K.; YAMAZAKI, H. Localization of adhesive proteins in two newly subdivided zones in electron-lucent matrix of human platelet α-granules. Histochemistry, v. 94, p. 337-344, 1990.

SUZUKI, M.; KAWAKATSU, T.; KIDO, H.; YAMAGUCHI, K.; KAGAWA, H.; YANABU, M.; NOMURA, S.; KUKUHARA, S. Immunological characteristics of platelets from experimental animals. American Journal of Hematology, v. 47, p. 142-151, 1994.

u REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

182

SUZUKI, M.; KAWAKATSU, T.; MIYAKE, T.; MIYAZAKI, Y.; KAGAWA, H.; YANABU, M.; NOMURA, S.; FUKUHARA, S. Platelet-derived microparticles in alloxan-induced diabetes in rabbits. Haemostasis, v. 26, p. 228-232, 1996.

SWEENEY, J.D.; LABUZETTA, J.W.; FITZPATRICK, J.E. The effect of the platelet count on the aggregation response and adenosine triphosphate release in an impedance lumi-aggregometer. American Journal of Clinical Pathology, v. 89, p. 655-659, 1987.

TAKANO, S. Role of 5-hydroxytryptamine in platelet thrombus formation and mechanisms of inhibition of thrombus formation by 5-hidroxytryptamine2A antagonists in rabbits. Archives Internationales de Pharmacodynamie et de Thérapie, v. 330, p. 297-308, 1995.

TAO, J. & PARRILLA, R. Molecular cloning of rabbit platelet GPIIIa cDNA. 1999a. Disponível em <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Protein>. Acesso: AAD51955.

TAO, J. & PARRILLA, R. Molecular cloning of rabbit platelet GPIIb cDNA. 1999b. Disponível em <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Protein>. Acesso: AAD51954.

TAO, J. & PARRILLA, R. Molecular cloning of pig platelet GPIIb cDNA. 1999c. Disponível em <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Protein>. Acesso: AAD51952.

TENG, C.M. & KO, F.N. Comparison of the platelet aggregation induced by three thrombin-like enzymes of snake venoms and thrombin. Thrombosis and Haemostasis, v. 59, p. 304-309, 1988.

THAN-THAN; FRANCIS, N.; TIN-NU-SWE; MYINT-LWIN; TUN-PE; SOE-SOE; MAUNG-MAUNG-OO; PHILLIPS, R.E.; WARRELL, D.A. Contribution of focal haemorrhage and microvascular fibrin deposition to fatla envenoming by Russell's viper (Vipera russelli siamensis) in Burma. Acta Tropica, v. 46, p. 23-38, 1989.

THAN-THAN; HUTTON, R.A.; MYINT-LUIN; KHIN-EI-HAN; SOE-SOE; TIN-NU-SWE; PHILLIPS, R.E.; WARRELL, D.A. Haemostatic disturbances in patients bitten by Russell's viper (Vipera russelli siamensis) in Burma. British Journal of Haematology, v. 69, p. 513-520, 1988.

THOMAS, D.P. & VANE, J.R. 5-hydroxytryptamine in the circulation of the dog. Nature, v. 216, p. 335-338, 1967.

THOMAS, K.B.; TUNE, E.P.; CHOONG, S.C. Parallel determination of von Willebrand factor - ristocetin and botrocetin cofactors. Thrombosis Research, v. 75, p. 401-408, 1994.

THOMAZINI, I.A.; IVAN, F.C.; CARVALHO, I.; HERNANDES, D.H.; AMARAL, I.F.; PEREIRA, P.C.M.; BARRAVIERA, B. Evaluation of platelet function and serum fibrinogen level in patients bitten by snakes of the genus Crotalus. Preliminary report. Revista do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo, v. 33, p. 219-220, 1991.

THORNTON, M.A. & PONCZ, M. Characterization of the murine platelet αIIb gene and encoded cDNA. Blood, v. 94, p. 3947-3950, 1999.

TIBBALLS, J.; SUTHERLAND, S.K.; RIVERA, R.A.; MASCI, P.P. The cardiovascular and haematological effects of purified prothrombin activator from the common brown snake (Pseudonaja textilis) and their antagonism with heparin. Anaesthesia and Intensive Care, v. 20, p. 28-32, 1992.

TOH, C.H.; HOOGENDOORN, H.; GILES, A.R. The generation of thrombin in vivo induces the selective loss of high molecular weight multimers of von Willebrand factor and the reversible sequestration of platelets. British Journal of Haematology, v. 85, p. 751-760, 1993.

TOOR, B.; MCGREGOR, J.L.; MCGREGOR, L.; CLEMETSON, K.J. Comparison of the major membrane glycoproteins and proteins of human, rabbit and rat blood platelets. Thrombosis Research, v. 26, p. 317-328, 1982.

TRIKHA, M.; ROTE, W.E.; MALEY, P.J.; LUCCHESI, B.R.; MARKLAND, F.S. Purification and characterization of platelet aggregation inhibitors from snake venoms. Thrombosis Research, v. 73, p. 39-52, 1994.

ULICH, T.R.; DEL CASTILLO, J.; SENALDI, G.; KINSTLER, O.; YIN, S.; KAUFMAN, S.; TARPLEY, J.; CHOI, E.; KIRLEY, T.; HUNT, P.; SHERIDAN, W.P. Systemic hematologic effects of PEG-rHuMGDF-induced megakaryocyte hyperplasia in mice. Blood, v. 87, p. 5006-5015, 1996.

USAMI, Y.; FUJIMURA, Y.; SUZUKI, M.; OZEKI, Y.; NISHIO, K.; FUKUI, H.; TITANI, K. Primary structure of two-chain botrocetin, a von Willebrand factor modulator purified from the venom of Bothrops jararaca. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v. 90, p. 928-932, 1993.

VAN OOST, B.A.; TIMMERMANS, A.P.M.; SIXMA, J.J. Evidence that platelet density depends on the X-granule content in platelets. Blood, v. 63, p. 482-485, 1984.

VAN OOST, B.A.; VAN HIEN-HAGG, I.H.; TIMMERMANS, A.P.M.; SIXMA, J.J. The effect of thrombin on the density distribution of blood platelets: detection of activated platelets in the circulation. Blood, v. 62, p. 433-438, 1983.

u REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

183

VANDERWEL, M. & HASLAM, R.J. Inhibition and subsequent enhancement of platelet responsiveness by prostacyclin in the rabbit. Relationship to platelet adenosine 3',5'-cyclic monophosphate. Journal of Clinical Investigation, v. 76, p. 233-240, 1985.

VARGAFTIG, B.B.; JOSEPH, D.; WALL, F.; MARLAS, G.; CHIGNARD, M.; CHEVANCE, L.G. Convulxin-induced activation of intact and of thrombin-degranulated rabbit platelets: specific crossed desensitisation with collagen. European Journal of Pharmacology, v. 92, p. 57-68, 1983.

VAZ, E. & MARTIRANI, I. O cloreto de cálcio na hemocoagulação pelo veneno de Bothrops jararaca. Anais do Instituto Pinheiros, v. 11, p. 1-16, 1948.

VERHALLEN, P.F.J. & BARTH, M. Species comparison of anti-aggregatory properties of three fibrinogen receptor-antagonists: RGDS, echistatin and the carboxiterminal duodecapeptide of the fibrinogen gamma-chain. Thrombosis and Haemostasis, v. 65, p. 1144, 1991.

VIKENES, K.; FARSTAD, M.; NORDREHAUG, J.E. Serotonin is associated with coronary artery disease and cardiac events. Circulation, v. 100, p. 483-489, 1999.

VIVIC, W.J. & WEISS, H.J. Evidence that platelet α-granules are a major determinant of platelet density: studies in storage poll deficiency. Thrombosis and Haemostasis, v. 50, p. 878-880, 1983.

VORA, D.K.; FANG, Z.; LIVA, S.M.; PARHAMI, F.; WATSON, A.D.; DRAKE, T.A.; TERRITO, M.C.; BERLINER, J.A. Induction of p-selectin by MM-LDL and its role in human atherosclerosis. 1995. Disponível em <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Protein>. Acesso: AAA81385.

WANG, C.; DENY, C.; LI, G. [Experimental study of Chinese Agkistrodon acutus venom in activation of rabbit platelets in vivo.] Artigo em chinês. Hua Hsi I Ko Ta Hsueh Pao, v. 25, p. 38-40, 1994.

WANLESS, I.R. The effect of dietary cholesterol on platelet survival in the rabbit - a study using 14C-serotonin and 51chromium double-labelled platelets. Thrombosis and Haemostasis, v. 52, p. 85-89, 1984.

WARD, C.M.; ANDREWS, R.K.; SMITH, A.I.; BERNDT, M.C. Mocarhagin, a novel cobra venom metalloproteinase, cleaves the platelet von Willebrand factor receptor glycoprotein Ibα. Identification of the sulfated tyrosine/anionic sequence Tyr-276-Glu-282 of glycoprotein Ibα as binding site for von Willebrand factor and α-thrombin. Biochemistry, v. 35, p. 4929-4938, 1996.

WATANABE, O.; TAMARI, M.; NATORI, K.; KUBO, S.; SHIOMOTO, Y.; NAKAMURA,Y. Isolation of the murine homologue of rat and human PF4 (platelet factor 4) cDNA from the spleen of NOA mouse that is a new atopic dermatitis model by a differential display method. 1998. Disponível em <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Protein>. Acesso: BAA75660.

WATSON, S.P. Collagen receptor signaling in platelets and megakaryocytes. Thrombosis and Haemostasis, v. 82, p. 365-376, 1999.

WATSON, S.P.; ASAZUMA, N.; ATKINSON, B.; BERLANGA, O.; BEST, D.; BOBE, R.; JARVIS, G.; MARSHALL, S.; SNELL, D.; STAFFORD, M.; TULASNE, D.; WILDE, J.; WONEROW, P.; FRAMPTON, J. The role of ITAM- and ITIM-coupled receptors in platelet activation by collagen. Thrombosis and Haemostasis, v. 86, p. 276-288, 2001.

WEINSTEIN, R.E. & WALKER, F.J. Species specificity of the fibrinolytic effects of activated protein C. Thrombosis Research, v. 63, p. 123-131, 1991.

WEINSTEIN, R.E.; RICKLES, F.R.; WALKER, F.J. Purification and preliminary characterization of rabbit vitamin K-dependent coagulation proteins. Thrombosis Research, v. 59, p. 759-772, 1990.

WEISBACH, V.; FRIEDLEIN, H.; GLASER, A.; ZINGSEM, J.; ZIMMERMANN, R.; ECKSTEIN, R. The influence of automated plateletpheresis on systemic levels of hematopoietic growth factors. Transfusion, v. 39, p. 889-894, 1999.

WEISEL, J.W.; NAGASWAMI, C.; VILAIRE, G.; BENNETT, J.S. Examination of the platelet membrane glycoprotein IIb-IIIa complex and Its interaction with fibrinogen and other ligands by electron microscopy. The Journal of Biological Chemistry, v. 267, p. 16637-16643, 1992.

WELLER, A.; ISENMANN, S.; VESTWEBER, D. Cloning of the mouse endothelial selectins. Expression of both E- and P-selectin is inducible by tumor necrosis factor alpha. The Journal of Biological Chemistry, v. 267, p. 15176-15183, 1992.

WENCEL-DRAKE, J.D. Plasma membrane GPIIb/IIIa. Evidence for a cycling receptor pool. American Journal of Pathology, v. 136, p. 61-70, 1990.

WENCEL-DRAKE, J.D.; BOUDIGNON-PROUDHON, C.; DIETER, M.G.; CRISS, A.B.; PARISE, L.V. Internalization of bound fibrinogen modulates platelet aggregation. Blood, v. 87, p. 602-612, 1996.

WENCEL-DRAKE, J.D.; PLOW, E.F.; KUNICKI, T.J.; WOODS, V.L.; KELLER, D.M.; GINSBERG, M.H. Localization of internal pools of membrane glycoproteins involved in platelet adhesive responses. American Journal of Pathology, v. 124, p. 324-334, 1986.

u REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

184

WHITE, J.G. Anatomy and structural organization of the platelet. In: COLMAN, R.W.; HIRSH, J.; MARDER, V.J.; SALZMAN, E.W., eds. Hemostasis and thrombosis: basic principles and clinical practice. 2. ed. Philadelphia: Lippincott, 1987. p. 537-554.

White, J.G. Interaction of membrane systems in blood platelets. American Journal of Pathology, v. 66, p. 295-312, 1972.

WHITE, J.G. The morphology of platelet function. In: HARKER, L.A. & ZIMMERMAN, T.S., eds. Measurements of platelet function. New York: Churchill Livingstone, 1983. p. 1-25.

WHITE, J.G. Ultrastructural analysis of platelet contractile apparatus. Methods in Enzymology, v. 215, p. 109-127, 1992.

WISTOW, B.W.; GROSSMAN, Z.D.; MCAFEE, J.G.; SUBRAMANIAN, G.; HENDERSON, R.W.; ROSKOPF, M.L. Labeling of platelets with oxine complexes of Tc-99m and In-111. Part 1. In vitro studies and survival in the rabbit. European Journal of Nuclear Medicine, v. 19, p. 483-487, 1978.

WITTE, L.D.; KAPLAN, K.L.; NOSSEL, H.L.; LAGES, B.A.; WEISS, H.J.; GOODMAN, D.W.S. Studies of the release from human platelets of the growth factor for cultured human arterial smooth muscle cells. Circulation Research, v. 42, p. 402-409, 1978.

WOJENSKI, C.M. & SCHICK, P.K. Development of storage granules during megakaryocyte maturation: accumulation of adenine nucleotides and capacity for serotonin sequestration. Journal of Laboratory and Clinical Medicine, v. 121, p. 479-485, 1993.

WOODHAMS, B.J.; THAN, T.; HUTTON, R.A. The action of Russell's viper venom on fibrin formation and fibrinolysis in vivo. British Journal of Haematology, v. 71, p. 107-111, 1989.

WOODS JR., V.L.; WOLFF, L.E.; KELLER, D.M. Resting platelets contain a substanctial centrally located pool of glycoprotein IIb-IIIa complex which may be accessible to some but not other extracellular proteins. The Journal of Biological Chemistry, v. 261, p. 15242-15251, 1986.

WU, Y.; SUZUKI-INOUE, K.; SATOH, K.; ASAZUMA, N.; YATOMI, Y.; BERNDT, M.C.; OZAKI, Y. Role of Fc receptor γ-chain in platelet glycoprotein Ib-mediated signaling. Blood, v. 97, p. 3836-3845, 2001.

WUN, T.; PAGLIERONI, T.; SAZAMA, K.; HOLLAND, P. Detection of plasmapheresis-induced platelet activation using monoclonal antibodies. Transfusion, v. 32, p. 534-540, 1992.

YAMADA, D.; SEKIYA, F.; MORITA, T. Prothrombin and factor X activator activities in the venoms of Viperidae snakes. Toxicon, v. 35, p. 1581-1589, 1997.

YAMASHITA, S.; NAKAMURA, M.; TOKESHI, Y.; MIYAGI, C.; SUNAGAWA, M.; KOSUGI, T. Effect of habu (Trimeresurus flavoviridis) antivenom on changes of hemostatic parameters following administration of crude venom from T. flavoviridis in rabbits. Toxicon, v. 34, p. 893-902, 1996.

YAMAZAKI, M.; UCHIYAMA, S.; IWATA, M. Measuremet of platelet fibrinogen binding and P-selectin expression by flow cytometry in patients with cerebral infarction. Thrombosis Research, v. 104, p. 197-205, 2001.

YANG, X.; SUN, L.; GABBETA, J.; RAO, A.K. Platelet activation with combination of ionophore A23187 and a direct protein kinase C activator induces normal secretion in patients with impaired receptor mediated secretiona and abnormal signal transduction. Thrombosis Research, v. 88, p. 317-328, 1997.

YOSHIMITSU, K.; WRIGHT, K.C.; WALLACE, S.; CHARNSANGAVEJ, C.; MAVLIGIT, G.M. Hepatic arterial infusion of recombinant platelet factor-4 suppresses metastases to the lungs from tumors implanted into livers of rabbits. Cancer, v. 75, p. 2435-2441, 1995.

ZAGANELLI, G.L.; ZAGANELLI, M.G.M.; MAGALHAES, A.; DINIZ, C.R.; LIMA, M.E.D. Purification and characterization of a fibrinogen-clotting enzyme from the venom of jararacuçu (Bothrops jararacussu). Toxicon, v. 34, p. 807-819, 1996.

ZAJDEL, M.; WEGRZYNOWICZ, Z.; SAWECKA, J.; KOPÉC, M. Subunits and susceptibility of fibrins formed from bovine fibrinogen by arvin, reptilase, thrombin and staphylothrombin. Thrombosis Research, v. 6, p. 337-344, 1975.

ZHAO, Y.; RABBANI, H.; SHIMIZU, A.; HAMMARSTRÖM, L. Mapping of the chicken immunoglobulin heavy-chain constant region gene locus reveals an inverted α gene upstream of a condensed υ gene. Immunology, v. 101, p. 348-353, 2000.

ZHENG, X.; CHUNG, D.; TAKAYAMA, T.K.; MAJERUS, E.M.; SADLER, J.E.; FUJIKAWA, K. Structure of von Willebrand factor-cleaving protease (ADAMTS13), a metalloprotease involved in thrombotic thrombocytopenic purpura. The Journal of Biological Chemistry, v. 276, p. 41059–41063, 2001.

ZINGALI, R.B.; BON, C.; GUILLIN, M.C.; JANDROT-PERRUS, M. Bothrops jararaca venom contains a specific, high affinity, inhibitor of human α-thrombin, with hirugen-like activity. Thrombosis and Haemostasis, v. 69, p. 1045, 1993a.

u REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

185

ZINGALI, R.B.; CARLINI, C., .R.; FRANCISCHETTI, I.M.; GUIMARÃES, J.A. Bothrops jararaca snake venom: effects on platelet aggregation. Thrombosis Research, v. 58, p. 303-316, 1990.

ZINGALI, R.B.; JANDROT-PERRUS, M.; GUILLIN, M.C.; BON, C. Bothrojaracin, a new thrombin inhibitor isolated from Bothrops jararaca venom: characterization and mechanism of thrombin inhibition. Biochemistry, v. 32, p. 10794-10802, 1993b.

ZIVELIN, A.; RAO, L.V.M.; RAPAPORT, S.I. Mechanism of the anticoagulant effect or warfarin as evaluated in rabbits by selective depression of individual procoagulant vitamin K-dependent clotting factors. Journal of Clinical Investigation, v. 92, p. 2131-2140, 1993.

ZUCKER, M.B. & KATZ, I.R. Platelet factor 4: production, structure, and physiologic and immunologic action. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine, v. 198, p. 693-702, 1991.

ZURBANO, M.J.; ANGUERA, I.; HERAS, M.; ROIG, E.; LOZANO, M.; SANZ, G.; ESCOLAR, G. Captopril administration reduces thrombus formation and surface expression of platelet glycoprotein IIb/IIIa in early postmyocardial infarction stage. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology, v. 19, p. 1791-1795, 1999.

3 3 3

u

186

Contato:

Marcelo Larami Santoro Instituto Butantan Laboratório de Fisiopatologia Av. Vital Brazil, 1500 05503-900 São Paulo, Brasil Tel.: (011) 3726-7222 R. 2163 ou 2165 e-mail: marcelosantoro@yahoo.com