UFPE · de Pós-Graduação em Saúde do Adulto e do Idoso do Centro de Ciências da Saúde da Universidade ... proliferativa basal do epitélio escamoso esofágico (A-100X; B-400X)

UFPE

GLUCIO NBREGA DE SOUZA

BIOMARCADORES MOLECULARES NO ESFAGO DE

BARRETT

Anlise comparativa da imunoexpresso tecidual do p53, c-erbB-2,

E-caderina, COX-2 e Ki-67, na esofagite por refluxo, no esfago de

Barrett e no adenocarcinoma associado ao esfago de Barrett

Recife2006

GLUCIO NBREGA DE SOUZA

BIOMARCADORES MOLECULARES NO ESFAGO

DE BARRETT

Anlise comparativa da imunoexpresso tecidual do p53, c-erbB-2,

E-caderina, COX-2 e Ki-67, na esofagite por refluxo, no esfago de

Barrett e no adenocarcinoma associado ao esfago de Barrett.

Dissertao apresentada ao colegiado do Programa

de Ps-Graduao em Sade do Adulto e do Idoso

do Centro de Cincias da Sade da Universidade

Federal de Pernambuco, como parte do requisito

para obteno do Ttulo de Mestre.

ORIENTADORESProf. Dr. Fernando Tarcsio de Miranda Cordeiro

Prof. Dr. Maria Salete Trigueiro de Arajo.

Recife2006

Souza, Glucio Nbrega de Biomarcadores moleculares no esfago de

Barrett: Anlise comparativa da imunoexpresso tecidual do p53, c-erbB-2, E-caderina, COX-2 e Ki-67, na esofagite por refluxo, no esfago de Barrett e no adenocarcinoma associado ao esfago de Barrett/ Glucio Nbrega de Souza. Recife : O Autor, 2006.

148 folhas : il., fig., tab.

Dissertao (mestrado) Universidade Federal de Pernambuco. CCS. Mestrado em Medicina Interna, 2006.

Inclui bibliografia e anexos.

1. Biomarcadores moleculares no esfago de Barrett. 2. Adenocarcinoma. 3. Esofagite por refluxo. I. Ttulo.

616.002.771 CDU (2.ed.) UFPE616.127 CDD (22.ed.) BC2006-062

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

REITORProf. Amaro Henrique Pessoa Lins

VICE-REITORProf. Gilson Edmar Gonalves e Silva

PR-REITOR PARA ASSUNTOS DE PESQUISA E PS-GRADUAOProf. Celso Pinto de Melo

CENTRO DE CINCIAS DA SADEDIRETOR

Prof. Jos Thadeu Pinheiro

HOSPITAL DAS CLNICASDIRETORA SUPERINTENDENTE

Prof a. Helosa Mendona de Morais

DEPARTAMENTO DE MEDICINA CLNICAProf a. Jocelene Madruga

PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM MEDICINA INTERNA

COORDENADORProf. Edmundo Pessoa de Almeida Lopes Neto

VICE-COORDENADORAProfa. Ana Lcia Coutinho Domingues

CORPO DOCENTEProfa. Ana Lcia Coutinho Domingues

Profa. ngela Luiza Pinto DuarteProf. Antnio Roberto Leite Campelo

Prof. Brivaldo Markman FilhoProf. Edgar Guimares Victor

Prof. Edmundo Pessoa de Almeida Lopes NetoProf. nio Torreo Soares Castellar

Prof. Fernando Tarcsio Miranda CordeiroProfa. Helosa Ramos Lacerda de Melo

Prof. Hilton de Castro Chaves Jr.Prof. Jos Ricardo Barros PernambucoProf. Lurildo Cleano Ribeiro Saraiva

Profa. Maria de Ftima Pessoa Milito de Albuquerque

De tudo, ficaram trs coisas :

a certeza de que ele estava sempre comeando,

a certeza de que era preciso continuar e

a certeza de que seria interrompido antes de

terminar.

Fazer da interrupo um caminho novo.

Fazer da queda um passo de dana, do medo

uma escada, do sono uma ponte, da procura um

encontro.

FERNANDO SABINO

O Encontro Marcado 1956

DEDICATRIA

Aos meus pais, Olavo e Glaura, princpio e fundamento de tudo na minha vida.

minha esposa, Fabiana, e aos nossos filhos, Joanna e Lucas, pelo amor, pelo

companheirismo, pelo apoio, pelo estmulo e pela compreenso nas minhas ausncias dos

momentos de famlia.

Ao amigo Pierre Landolt, grande incentivador e apoiador da minha vida profissional.

AGRADECIMENTOS

A DEUS, sempre presente em mim e ao meu lado, o qual me permitiu, mais uma

vez, concretizar um projeto cientfico-profissional.

Ao Prof. Dr. Fernando Tarcsio de Miranda Cordeiro, que como orientador, desde

o incio abraou o projeto e me permitiu a execuo, com observaes e orientaes

pertinentes e precisas.

Prof Dr. Maria Salete Trigueiro de Arajo, orientadora, que, de uma forma

incansvel e profissional, perseguiu, juntamente conosco, os objetivos deste trabalho.

Ao Governo do Estado da Paraba, na pessoa do Exm Sr. Governador, Dr. Cssio

Cunha Lima, por acreditar, incentivar e apoiar este projeto cientfico.

Ao laboratrio farmacutico NOVARTIS, na pessoa do seu presidente, o Dr. Patrice

Zagam, pelo apoio financeiro e pelos kits de imunoistoqumica, fundamentais na

viabilizao e execuo do nosso trabalho.

Dra. Norma Juc e ao Dr. Guilherme Costa Guedes Pereira, patologistas, pela

disponibilidade em fornecer material e informaes anatomoclnicas dos pacientes.

Aos Drs. Carlos Alberto Fernandes Ramos e lvaro Ferreira Lima Jnior,

patologistas, pela disponibilidade em nos ajudar profissionalmente no nosso projeto.

Aos Professores das Disciplinas do Mestrado em Medicina Interna, da

Universidade Federal de Pernambuco, os quais contriburam com o ensino e com as

orientaes valiosas para a concluso deste trabalho.

Aos colegas Clnicos e Cirurgies de Joo Pessoa e Recife, pela ateno,

prestimosidade e disponibilidade em fornecer as informaes clnico-cirrgicas de alguns

pacientes.

Aos Professores Dr. Jos Luiz Simes Maroja e Eurpedes Sebastio Mendona

de Souza, os quais viabilizaram e nos auxiliaram no estgio de docncia na Universidade

Federal da Paraba (UFPB).

Ao presidente da Fundao e Hospital do Cncer Napoleo Laureano, Dr. Antnio

Carneiro Arnaud, que, de uma forma profissional, cientfica e socialmente responsvel,

permitiu o acesso s informaes anatomoclnicas dos pacientes do hospital.

Aos Colegas de Mestrado, com os quais tive a honra e a oportunidade de

compartilhar as atividades dirias do aprendizado da ps-graduao.

Ao Professor Jos Natal Figueiroa pelo trabalho de toda a estatstica desta

dissertao de mestrado.

Ao Professor Laerte Pereira da Silva pela reviso de portugus do presente

trabalho.

Ao Professor John Philip Medcraft pelos preciosos ensinamentos na lngua inglesa

e pela reviso do abstract.

s secretrias do mestrado em Medicina Interna da UFPE, Esmeralda, Andra e

Karita, as quais me auxiliaram com as atividades administrativas para a execuo e concluso

do nosso projeto.

Aos Pacientes e Familiares, que, com uma atitude altrusta, contriburam para a

busca de novos conhecimentos na Medicina.

SUMRIO

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS................................................................ xiiiLISTA DE TABELAS................................................................................................ xvLISTA DE GRFICOS............................................................................................. xviiLISTA DE FIGURAS................................................................................................ xixRESUMO.................................................................................................................... xxiABSTRACT................................................................................................................ xxiii

1. INTRODUO...................................................................................................... 011.1 Objetivos............................................................................................................ 12

2. CASUSTICA E MTODOS................................................................................ 132.1 Local do estudo.................................................................................................. 142.2 Desenho do estudo............................................................................................. 142.3 Definio de critrios......................................................................................... 15

2.3.1 Critrios endoscpicos.............................................................................. 152.3.2 Critrios anatomopatolgicos.................................................................... 192.3.3 Critrios de incluso.................................................................................. 212.3.4 Critrios de excluso................................................................................. 21

2.4 Caracterizao da amostra.................................................................................. 212.5 Procedimentos e tcnicas.................................................................................... 22

2.5.1 Dados clnicos........................................................................................... 222.5.2 Procedimento endoscpico........................................................................ 222.5.3 Procedimento anatomopatolgico.............................................................. 242.5.4 Tcnica imunoistoqumica......................................................................... 242.5..5 Metodologia da descrio dos resultados.................................................. 28

2.6 Limitaes metodolgicas do estudo.................................................................. 322.7 Aspectos ticos do estudo................................................................................. 332.8 Anlise estatstica............................................................................................... 33

3. RESULTADOS...................................................................................................... 343.1 Dados clnicos................................................................................................... 353.2 Dados endoscpicos.......................................................................................... 40

3.3 Dados imunoistoqumicos.................................................................................... 44

4. DISCUSSO............................................................................................................. 66

5. CONCLUSES........................................................................................................ 82

REFERNCIAS.......................................................................................................... 84

ANEXOS...................................................................................................................... 110

ABREVIATURAS E SIGLAS

AGA American Gastroenterology Association.

cm centmetros.

COXs Ciclooxigenases.

DAB Diaminobenzidina.

DNA cido desoxirribonucleico.

DRGE Doena do refluxo gastroesofgico.

EB esfago de Barrett.

EGF Fator de crescimento epidrmico.

EGFR Receptor do fator de crescimento epidrmico.

EUA Estados Unidos da Amrica do Norte.

C grau Celsius

HE Hematoxilina-Eosina.

H. pylori Helicobacter pylori.

IMC ndice de massa corprea.

M Mol.

mM Milimol.

mRNA cido ribonuclico mensageiro.

N Nmero.

OMS Organizao Mundial da Sade.

OR Odds ratio.

PCNA Antgeno nuclear de proliferao celular.

SOBED Sociedade Brasileira de Endoscopia Digestiva.

SBP Sociedade Brasileira de Patologia.

TEG Transio esfago-gstrica.

TGF-alfa Fator de transformao do crescimento-alfa.

vs Versus.

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Dados clnicos dos pacientes do grupo I (esofagite por refluxo)........... 37Tabela 2 Dados clnicos dos pacientes do grupo II (esfago de Barrett).............. 38Tabela 3 Dados clnicos dos pacientes do grupo III (adenocarcinoma

relacionado com o esfago de Barrett).................................................... 39Tabela 4 Dados endoscpicos dos pacientes com esofagite por refluxo (grupo

I).............................................................................................................. 41Tabela 5 Dados endoscpicos dos pacientes com esfago de Barrett (grupo II)... 42Tabela 6 Dados endoscpicos dos pacientes com adenocarcinoma esofgico

relacionado com o esfago de Barrett (grupo III).................................. 43Tabela 7 Imunoexpresso tecidual do p53 em todos os grupos analisados............ 45Tabela 8 Imunoexpresso tecidual da COX-2 em todos os grupos analisados...... 47Tabela 9 Imunoexpresso tecidual do c-erbB-2 em todos os grupos analisados.... 49Tabela 10 Escore final da imunoexpresso tecidual do p53 em todos os grupos

analisados................................................................................................ 53Tabela 11 Escore final da imunoexpresso tecidual da COX-2 em todos os grupos

do estudo................................................................................................. 55Tabela 12 Escore da imunoexpresso tecidual do c-erbB-2 nos trs grupos

analisados................................................................................................ 57Tabela 13 Escore final da imunoexpresso tecidual do Ki-67 nos trs grupos do

estudo...................................................................................................... 61Tabela 14 Escore final da imunoexpresso tecidual da E-caderina nos grupos do

estudo...................................................................................................... 63

LISTA DE GRFICOS

Grfico 1 Imunoexpresso tecidual do p53 em todos os grupos do

estudo....................................................................................................... 45Grfico 2 Imunoexpresso tecidual da COX-2 em todos os grupos analisados....... 47Grfico 3 Imunoexpresso tecidual do c-erbB-2 em todos os grupos estudados..... 49Grfico 4 Anlise agrupada da positividade tecidual dos biomarcadores p53, c-

erbB-2 e COX-2, nos trs grupos do estudo............................................. 51Grfico 5 Escore semiquantitativo do Ki-67 em todos os grupos de estudo............ 60Grfico 6 Anlise do escore semiquantitativo da E-caderina em todos os grupos

de estudo.................................................................................................. 64

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Imunoexpresso fraca e focal da protena p53 na esofagite por refluxo

(400X)..................................................................................................... 46Figura 2 Imunomarcao do p53 no esfago de Barrett (400X)........................... 46Figura 3 Forte imunoexpresso do oncgeno p53 no adenocarcinoma esofgico

(400X)..................................................................................................... 46Figura 4 Imunoexpresso da COX-2 na esofagite por refluxo (400X).................. 48Figura 5 COX-2 - imunoexpresso citoplasmtica no epitlio glandular do

esfago de Barrett: 100X(A) e 400X(B)................................................. 48Figura 6 Imunoexpresso acentuada da COX-2 no adenocarcinoma esofgico

(400X), e fraca marcao no controle interno (epitlio

escamoso)................................................................................................ 48Figura 7 c-erbB-2 - imunoexpresso citoplasmtica, sem forte marcao de

membrana epitelial, no esfago de Barrett - A(100X) e B(400X).......... 50Figura 8 Forte imunoexpresso (citoplasmtica e de membrana) da oncoprotena

c-erbB-2 no adenocarcinoma esofgico (400X)....................................... 50Figura 9 Ki-67 atividade proliferativa da camada basal do epitlio

malphigiano, na esofagite por refluxo (AB:400X)................................ 59Figura 10 Expresso nuclear do Ki-67 no esfago de Barrett e na atividade

proliferativa basal do epitlio escamoso esofgico (A-100X; B-400X).. 59Figura 11 Ki-67 - alto ndice proliferativo no adenocarcinoma esofgico (A

B:400X)................................................................................................... 59Figura 12 Forte expresso de membrana da E-caderina na esofagite por refluxo

(400X)..................................................................................................... 65Figura 13 Imunoexpresso da E-caderina no esfago de Barrett (400X)................ 65Figura 14 Imunomarcao inconstante da E-caderina no adenocarcinoma

associado com o esfago de Barrett (A-Bulbo duodenal amplo e sem

anormalidades.: 400X)............................................................................. 65

RESUMO

O esfago de Barrett, definido pela metaplasia colunar do esfago distal, com a presena de

clulas caliciformes, representa importante complicao da doena do refluxo gastroesofgico

(DRGE), e caracteriza-se como a principal leso precursora do adenocarcinoma esofgico.

Fatores clnicos e endoscpicos no apresentam a sensibilidade e especificidade necessrias

estratificao de risco para o cncer. Biomarcadores moleculares tm sido utilizados com esse

objetivo. Este trabalho incluiu trs grupos de pacientes, portadores de esofagite por refluxo

(grupo I; N=23), esfago de Barrett (grupo II; N=30) e adenocarcinoma esofgico associado

ao esfago de Barrett (grupo III; N=11), nos quais foram realizadas, respectivamente, anlises

comparativas da imunoexpresso tecidual dos seguintes biomarcadores: p53, c-erbB-2, E-

caderina, COX2 e Ki-67. As imunorreaes qualitativas com p53, COX-2 e c-erbB-2

revelaram maior expresso no grupo III, contrastando com a positividade menor e decrescente

dos grupos II e I (p

ABSTRACT

Barretts esophagus, defined by the presence of columnar metaplasia of distal esophagus, and

characterized by the presence of goblet cells, is an important complication of gastroesophageal

reflux disease (GERD), and represents the main premalignant lesion of esophageal

adenocarcinoma. Clinical and endoscopic factors do not have the sensibility and/or the

specificity needed to stratify the risk of the development of cancer. Molecular biomarkers

have been used with this purpose. This paper included three groups of patients, with reflux

esophagitis (group I; N=23), Barretts esophagus (group II; N=30) and Barrett associated

esophageal adenocarcinoma (group III; N=11), in which were proceeded comparative

analyses, respectively, of the tissues immunoexpressions of p53, c-erbB-2, E-cadherin, COX

2 and Ki-67. Qualitative immunoreactions with p53, c-erbB-2 and COX-2, revealed high

indexes of positivity in group III, contrasting with lower and decreasing levels in groups II and

I (p

INTRODUO

O esfago de Barrett (EB) definido como uma condio pr-maligna, em que se

assinala a substituio do epitlio escamoso do esfago distal por epitlio colunar, em

qualquer extenso, e caracteriza-se, histologicamente, pela presena de clulas mucparas

caliciformes1,2.

O EB representa uma importante complicao da doena mais prevalente do

aparelho digestrio, a doena do refluxo gastroesofgico (DRGE)3, sendo considerado, pela

comunidade cientfica internacional, como a principal leso precursora do adenocarcinoma

esofgico.

Historicamente, atribui-se a Normann Barrett, no ano de 1950, a descrio da

sndrome do esfago recoberto por mucosa colunar4. Allinson & Johnstone, por sua vez, em

1953, relacionaram a DRGE com o EB5, e Naef et al.6, na sua srie clssica em 1975, de uma

forma definitiva, correlacionaram a DRGE com o EB e com o adenocarcinoma esofgico.

De elevada e crescente prevalncia na populao ocidental7,8, estima-se que,

atualmente, a DRGE afete 40% dos adultos nos Estados Unidos da Amrica do Norte (EUA)9.

No Brasil, em amplo estudo envolvendo vinte e duas cidades, com 14.000 mil indivduos,

observou-se que 7,3% da populao sofrem da DRGE10. Por sua vez, supe-se que a

prevalncia do EB oscile entre 0,5% a 2% dos adultos no Ocidente11, podendo, no entanto, ser

este percentual bem maior, uma vez que, conforme dados de autpsia, foi encontrada uma

prevalncia vinte e uma vezes acima daqueles casos clinicamente diagnosticados12.

H, tambm, relatos na literatura que referem ser assintomtica a grande parte dos

pacientes portadores de EB, de forma que a maioria dos casos permanece, assim,

subdiagnosticada12-14. Esse fato poderia explicar o aumento nas taxas de incidncia do

adenocarcinoma do esfago e da crdia, nas ltimas trs dcadas, nos pases ocidentais15,16.

Dos portadores de esofagite por refluxo, estima-se que 10% evoluem para o esfago

de Barrett12,17. Uma vez diagnosticado o EB, observa-se a progresso para a displasia de alto

grau em 5% dos casos, em cinco anos, quando se considera, inicialmente, a presena do

epitlio de Barrett sem displasia e, em 25% dos pacientes, naqueles casos com a displasia,

princpio, de baixo grau18. Nas situaes de displasia de alto grau, relata-se a presena do

cncer invasivo em percentual de 38% a 50% dos espcimes de bipsias19.

A DRGE, o esfago de Barrett e o adenocarcinoma esofgico so doenas dos

tempos modernos.

Ao longo destas ltimas trs dcadas, desde os relatos iniciais de Naef et al.6, quando

o adenocarcinoma esofgico raramente era diagnosticado, tem-se observado que esta

neoplasia tem apresentado um aumento uniforme na incidncia, nos EUA e na Europa, em

propores epidmicas, com taxas que excedem as de quaisquer outras neoplasias20-24.

Atualmente, trs dentre cinco neoplasias malignas do esfago diagnosticadas so

adenocarcinomas25.

Com a definio da DRGE crnica e a sua principal seqela, o EB, como fatores de

risco primrios para o adenocarcinoma do esfago26, e considerando o EB como a nica leso

precursora desta neoplasia maligna, a American Gastroenterology Association (AGA) tem

recomendado o rastreamento endoscpico naqueles pacientes portadores de sintomas crnicos

de DRGE27. Indica tambm, em consonncia com outros autores, o seguimento peridico dos

pacientes reconhecidamente portadores do EB, com bipsias seriadas do epitlio metaplsico,

seguido do estudo histopatolgico27-29.

Objetiva-se, desse modo, detectar o cncer e as suas leses precursoras em estgios

precoces26, de forma que se oferea um melhor prognstico aos pacientes, com a perspectiva

de cura para uma patologia sabidamente letal30-32.

Entretanto, embora o adenocarcinoma esofgico encontre-se intimamente

relacionado com o EB, somente 5% dos pacientes portadores desta neoplasia tm um

diagnstico prvio do EB31,33,34.

Ademais, apesar do cncer do esfago ser uma das doenas mais letais do aparelho

digestrio, de pobre prognstico, com uma sobrevida mdia de cinco anos em torno de 10%

dos casos35, e mesmo j se conhecendo a sua leso precursora, a maioria desses cnceres ainda

continua sendo diagnosticada tardiamente, quando no podem mais ser curados36.

A definio dos fatores de risco que apontam essa possvel progresso neoplsica,

nos pacientes portadores do EB, reveste-se, portanto, de uma importncia fundamental. Isto

porque no s permite que se selecionem, realmente, aqueles pacientes que ingressaro em

programas eficazes de seguimento e vigilncia endoscpica, mas, tambm, possibilita que a

relao custobenefcio, do seguimento desses pacientes, seja, efetivamente, positiva, j que,

sabidamente, a maioria dos portadores dessa doena no evolui para o adenocarcinoma

esofgico30,37,38.

No obstante, fatores de risco convencionais, clnicos e endoscpicos (sexo, idade,

extenso do epitlio de Barrett, presena do refluxo duodeno-gastro-esofgico, cronicidade do

refluxo, raa, ndice de massa corprea (IMC), histria familiar de cncer, uso de

medicamentos com efeito sobre o esfncter inferior do esfago, infeco pelo Helicobacter

pylori, tabagismo e leses no epitlio de Barrett, relacionados ao desenvolvimento do cncer

no EB, no apresentam a sensibilidade e/ou a especificidade necessrias a estratificao de

risco dos pacientes para o surgimento do cncer13,27,39-48.

Atualmente, a presena da displasia epitelial, definida histopatologicamente, tem

sido o marcador tecidual mais utilizado na estratificao de risco do EB, para o

desenvolvimento do adenocarcinoma, determinando, inclusive, o perodo e o intervalo da

vigilncia endoscpica29. Contempla-se, nesta abordagem, a seqncia neoplsica descrita no

EB, de metaplasia, displasia de baixo grau, displasia de alto grau, carcinoma in situ e,

finalmente, cncer invasivo49-51.

Contudo, h vrias restries quando se considera a displasia como o nico fator

preditivo do adenocarcinoma relacionado com o EB.

Variaes intra e interobservadores no diagnstico e na graduao

anatomopatolgica da displasia52, incertezas a respeito da sua histria natural53,54, e

dificuldades na distino entre a displasia de baixo grau e atipia regenerativa, so alguns dos

fatores que tm limitado a sua aplicabilidade clnica.

Alm disso, a displasia epitelial tem sido considerada um marcador imperfeito para o

cncer no EB, uma vez que a neoplasia precoce j possvel de ser encontrada,

aproximadamente, em um tero dos pacientes portadores de displasia de alto grau, quando so

submetidos a cirurgia55. Contrariamente, pode, tambm, haver a regresso do epitlio

displsico, no seguimento dos pacientes portadores do EB56,57.

Observa-se, ademais, que nos portadores de displasia de alto grau no ocorrer

evoluo, invariavelmente, para o adenocarcinoma esofgico54,58,59, e que, pode ocorrer o

desenvolvimento do carcinoma do esfago sem o diagnstico prvio da displasia de alto

grau60,61. O significado clnico das displasias de baixo e alto grau permanece, portanto, ainda

controverso2,52,53,62-64.

Desta forma, mtodos de rastreamento alternativos e de deteco precoce so

necessrios para a identificao efetiva destes pacientes portadores do EB, com risco de

evolurem para o cncer esofgico.

Novas estratgias tm investigado reais fatores de risco adicionais, de forma que,

correlacionados com as alteraes histolgicas e com os dados clnico-endoscpicos, sejam

capazes de predizer e identificar esse subgrupo de pacientes com possibilidades concretas para

o desenvolvimento do cncer esofgico.

Uma melhor compreenso dos eventos celulares e de biologia molecular, que

ocorrem na evoluo neoplsica do EB, dentro da seqncia metaplasiadisplasia

adenocarcinoma descrita49-51, tem auxiliado e permitido a busca desta abordagem.

No adenocarcinoma esofgico relacionado com o EB, tem-se observado que as

clulas metaplsicas so predispostas a desenvolver todas as caractersticas do processo da

carcinognese em geral49, descritas por Hanahan e Weinberg65. Esses autores identificaram

vrios eventos biolgicos, de forma que as clulas necessitam, para uma evoluo neoplsica:

1) promover sinais de crescimento; 2) ignorar sinais inibitrios do crescimento; 3) evitar a

apoptose; 4) replicar sem limites; 5) sustentar a angiognese; 6) invadir e proliferar.

Nowell66, em 1976, por sua vez, props que o cncer desenvolve-se como resultado

de uma instabilidade gentica adquirida, predispondo, assim, a evoluo de um clone de

clulas com erros genticos acumulados. Estes clones adquirem, ento, vantagens

proliferativas seletivas, de forma que, eventualmente, um subclone poder progredir para o

cncer precoce.

H evidncias de que essa evoluo clonal, postulada por Nowell, ocorre na maioria

dos cnceres humanos, inclusive no adenocarcinoma esofgico relacionado com o EB67-70.

Vrios estudos tm demonstrado que nesta neoplasia ocorre este acmulo de alteraes

genticas descritas, desde as clulas normais s clulas neoplsicas invasoras51,71,72, alm das

anormalidades cromossmicas e mutaes especficas nos genes de supresso tumoral p53 e

p16. Distrbios no ciclo celular, como um aumento no nmero de clulas na fase S

(correspondente sntese do DNA) e na fase G2 (pr-mitose), tm, igualmente, sido

observados e relatados73.

A aneuploidia (contedo anormal de DNA) e uma frao maior da fase G2/M do

ciclo celular das clulas metaplsicas, tm sido, tambm, demonstradas na evoluo

neoplsica do epitlio esofgico normal para o epitlio de Barrett18,74,75. Segundo dados da

literatura, a aneuploidia encontrada em 79 a 100% dos adenocarcinomas esofgicos57,75-80.

Todo esse acmulo de alteraes genticas relatado, pode resultar na perda da funo

de genes que, normalmente, bloqueiam o crescimento da clula, nos pontos de checagem do

ciclo celular (genes de supresso tumoral), ou pode ativar genes dominantes que estimulam o

crescimento, a diferenciao e a proliferao celular (proto-oncogenes). A ativao desses

oncogenes pode ser observada pelo aumento de suas expresses proticas no tecido, as quais

so detectveis na anlise imunoistoqumica dos espcimes de bipsias.

Nesse contexto, o termo biomarcador tem sido introduzido e utilizado, aplicando-se

esta denominao a qualquer medida biolgica que possa evidenciar, no tecido, essa srie de

fatores imunoproticos, correspondentes s vrias alteraes genticas descritas, e, por

conseginte, permita predizer, com segurana, aqueles indivduos, portadores do EB, que

podero, ou no, evoluir para o adenocarcinoma esofgico.

A literatura sobre biomarcadores moleculares no esfago de Barrett bastante

ampla, envolvendo vrios estudos, desde a pesquisa bsica at estudos de base populacional.

Atualmente, j existe mais do que 60 biomarcadores descritos para o EB81,82.

O p53 um gene de supresso tumoral localizado no brao curto do cromossomo 17,

tendo um importante papel no crescimento e na proliferao celular. Influencia, de forma

supressora, a instabilidade genmica, promovendo a apoptose e modulando a diferenciao

celular. O produto de um gene p53 intacto impede a clula, com danos ao DNA, de entrar no

ciclo celular na fase S, no ponto de checagem G1, conduzindo a clula ao bloqueio na

progresso do ciclo, promovendo, posteriormente, reparo no DNA ou a apoptose da clula83.

Desse modo, a protena p53 considerada o guardio do genoma.

As mutaes e as delees do gene de supresso tumoral p53 so as leses genticas

mais comuns dos cnceres humanos. A meia-vida prolongada da protena p53 mutante (a

mutao estabiliza a protena), e o aumento na sua concentrao intracelular, permitem a

anlise imunoistoqumica.

No processo inflamatrio crnico observado na DRGE, h uma sobrecarga

intracelular de radicais de oxignio, que pode levar a mutaes de vrios genes relacionados

com o cncer, inclusive com o gene de supresso tumoral p5384. H evidncias de que estas

alteraes ocorram de uma forma freqente no adenocarcinoma esofgico, indicando, assim,

que este gene est associado degenerao maligna do epitlio de Barrett85-87.

Dados na literatura tambm tm demonstrado a importncia do p53 na manuteno

da estabilidade do genoma88. Anormalidades deste gene precedem o desenvolvimento da

aneuploidia no EB, podendo ser, desse modo, um importante marcador molecular na

determinao do risco para o adenocarcinoma no EB, sobretudo se for associado com a

deteco da aneuploidia89.

No desenvolvimento e surgimento do adenocarcinoma no epitlio de Barrett, a

proliferao celular , tambm, considerada como uma de suas etapas mais precoces.

Populaes normais de clulas em diviso mantm o equilbrio entre a proliferao celular e a

apoptose, conservando constante o nmero de clulas. Distrbios neste equilbrio podem

favorecer a formao e a progresso tumoral90. Do ponto de vista imunoistoqumico, a

proliferao celular pode, tambm, ser avaliada com o uso de anticorpos monoclonais, que

reconhecem os antgenos expressos no ncleo durante esse perodo.

Vrios estudos tm utilizado estes anticorpos relacionados com os antgenos Ki-67 e

PCNA (antgeno nuclear de proliferao celular), para se avaliar as propriedades proliferativas

do EB e do adenocarcinoma esofgico91-93.

O estudo imunoistoqumico, combinado, da expresso do p53 e do Ki-67 pode,

tambm, proporcionar um viso mais aprofundada da proliferao celular na metaplasia de

Barrett e na displasia associada, respectivamente, permitindo, assim, obter-se informaes

sobre o potencial neoplsico desse epitlio. Ademais, estas anlises objetivas e quantitativas

tm permitido a reprodutibilidade das avaliaes anatomopatolgicas e estabelecido

diferenas diagnsticas significativas, no obtidas, somente, com a avaliao microscpica,

qualitativa, habitual94.

A apoptose, considerada como um dos fatores protetores da clula, , de forma

semelhante, um dos mecanismos envolvidos na carcinognese esofgica. Na apoptose normal,

ocorre a remoo do DNA danificado e das clulas geneticamente alteradas, que podem

interferir na funo celular normal. Um aumento dos nveis de apoptose encontra-se associado

com um decrscimo no crescimento celular. Contrariamente, a inibio da apoptose (um dos

eventos precoces na seqncia evolutiva tumoral do epitlio de Barrett), promove um

incremento na sobrevida da clula, e est diretamente relacionada com a progresso

neoplsica. A anlise do mecanismo da apoptose tambm pode ser realizada pelo estudo

imunoistoqumico.

As ciclooxigenases (COXs) so enzimaschaves relacionadas com a produo das

prostaglandinas, a partir do cido araquidnico. Altos nveis de prostaglandinas tm potente

efeito imunomodulatrio, como a inibio de citocinas e a proliferao de linfcitos, que tm,

tambm, um importante papel na carcinognese.

Estudos tm demonstrado que, a injria contnua do refluxato gastroduodenal para o

esfago induz a sntese e a liberao de mediadores inflamatrios, inclusive as

prostaglandinas e as citocinas pr-inflamatrias, que podem causar danos mucosa esofgica,

com um papel definitivo, por conseginte, na progresso neoplsica do EB95-97.

Duas isoformas de COXs foram descritas: COX-1 e COX-2, sendo ambas reguladas

por diferentes mecanismos e tendo diferentes padres de expresso98. A COX-1

predominantemente constitutiva e a COX-2 est normalmente ausente na maioria dos tecidos,

no entanto, esta pode ser induzida por estmulos inflamatrios, citocinas, estmulos

mitognicos, fatores de crescimento e fatores promotores de tumores. Por outro lado, pode ser

suprimida pelos genes de supresso tumoral99-103.

A COX-2 encontra-se envolvida nos vrios processos necessrios ao

desenvolvimento das neoplasias, como a prpria apoptose, a adeso celular, a invaso, a

metstase e a angiognese104, relatando-se nveis aumentados em diversas neoplasias

malignas105,106. Pesquisas in vitro tm relatado que esta expresso aumentada, na seqncia

carcinogentica do EB, reduz a apoptose, estimula o poder de invaso das clulas malignas e

promove a angiognese, mediante efeitos parcrinos e autcrinos104,107-114.

Nveis elevados da COX-2 tm sido, efetivamente, relatados no esfago de Barrett e

no carcinoma epidermide do esfago, observando-se percentuais de expresso, no

adenocarcinoma esofgico, em torno de 70% a 80%96,115,116. A COX-2, com esses nveis de

expresso, tem sido definida como um fator prognstico independente na neoplasia esofgica

relacionada ao EB117.

A E-caderina, presente superfcie de todas as clulas epiteliais, est ligada ao

citoesqueleto por meio das cateninas, no citoplasma da clula, tendo uma importante funo

na adesividade e na interao das clulas. Quebras nessas pontes intercelulares tm, tambm,

um papel fundamental na patognese das neoplasia malignas118-125.

Nveis normais da E-caderina so observados no epitlio esofgico normal, contudo,

no epitlio de Barrett, medida que se evolui na seqncia neoplsica para o adenocarcinoma

esofgico, assinala-se uma reduo progressiva dos ndices de expresso destas molculas.

Nveis reduzidos nas imunoexpresses tm, tambm, sido evidenciados nos graus

progressivos das displasias, encontrando-se, da mesma forma, relacionados com os

mecanismos de invaso e metastatizao neoplsicos118,119,126-128.

Fatores de crescimento so igualmente importantes na regulao e na diferenciao

celular. Expresses anormais dos fatores de crescimento, como o EGF (fator de crescimento

epidrmico), o TGF-alfa (fator de transformao do crescimento-alfa) e o EGFR (receptor do

fator de crescimento epidrmico), esto associadas com a mitognese e com a carcinognese.

O c-erbB-2 um proto-oncogene que codifica uma glicoprotena altamente

homloga, porm distinta, ao EGFR e est relacionada com a diferenciao e com a

proliferao celular129. Apresenta-se superexpresso em vrios adenocarcinomas,

correlacionando-se com a sobrevida dos pacientes130. Expresso aumentada do c-erbB-2 foi

relatada em 11 a 73% dos carcinomas esofgicos invasivos, no entanto, foi ausente nas reas

displsicas, sugerindo ser, efetivamente, um evento tardio na seqncia neoplsica do esfago

de Barrett131.

Todos estes processos moleculares descritos previamente, com os seus respectivos

biomarcadores, antecedem as alteraes morfolgicas para o diagnstico da displasia, e seus

diferentes graus, no esfago de Barrett.

O emprego desses marcadores moleculares, em forma de painel, ou de um perfil

imunoistoqumico, no seguimento dos pacientes portadores do EB, tem-se apresentado como

ferramenta clnica importante e promissora, na identificao dos pacientes realmente de risco

para o desenvolvimento do adenocarcinoma esofgico. Alm disso, apresentam o potencial

para permitir, juntamente com os dados clnicos, endoscpicos e anatomopatolgicos, a

otimizao e a padronizao dos programas atuais de vigilncia.

A combinao desses biomarcadores, validados atravs de um painel

imunoistoqumico, tem demonstrado ser, tambm, um instrumento clnico-laboratorial com

potencial para ser empregado na monitorizao da eficcia dos tratamentos conservadores das

leses displsicas, associadas DRGE. Ademais, oferece a perspectiva de novas estratgias

teraputicas, a exemplo da quimioprofilaxia, em pacientes selecionados132.

1.1 Objetivos

Estabelecer e comparar, por meio de tcnica imunoistoqumica, o perfil da

imunoexpresso tecidual dos biomarcadores moleculares p53, c-erbB-2, E-caderina, COX-2 e

Ki-67, em trs fases distintas do espectro da doena do refluxo gastroesofgico,

respectivamente, na esofagite por refluxo, no esfago de Barrett e no adenocarcinoma

associado ao esfago de Barrett.

CASUSTICA E MTODOS

2.1 Local do estudo

O estudo foi desenvolvido na cidade de Joo Pessoa, na Paraba, no Endocentro

(clnica privada de gastroenterologia e endoscopia digestiva) e no Virchow (laboratrio

mdico de patologia celular). Os dados clnico-endoscpicos de oito pacientes foram obtidos

de outras instituies privadas de gastroenterologia, cirurgia do aparelho digestivo e

endoscopia digestiva: em Joo Pessoa (Clnica Cirrgica Dr. Gilson do Vale - 01 paciente;

Centro Mdico Dr. Luiz Antnio Cavalcante da Fonsca - 02 pacientes; Centro de Cirurgia do

Aparelho Digestivo-CECAD - 01 paciente; CEDIPA - Centro de Endoscopia Digestiva da

Paraba - 01 paciente; Clnica Cirrgica Dr. Cssio Virglio de Oliveira - 01paciente), e em

Recife (EndoSabin - 02 pacientes). Os dados anatomopatolgicos de 05 pacientes foram

obtidos em Joo Pessoa, no Histo (02 pacientes), e, em Recife, no SPAC (03 pacientes),

ambos laboratrios mdicos de patologia celular. Todos os demais pacientes pesquisados

foram provenientes do Endocentro e do Virchow. As anlises imunoistoqumicas foram

integralmente realizadas no laboratrio Virchow em Joo Pessoa.

2.2 Desenho do estudo

Estudo descritivo, ambidirecional, tipo srie de casos, no qual foram avaliados,

simultaneamente, em trs fases distintas, evolutivas, do espectro da doena do refluxo

gastroesofgico, os dados clnicos, endoscpicos, anatomopatolgicos e os respectivos painis

de imunoexpresso tecidual, de cinco biomarcadores moleculares selecionados.

2.3 Definio de critrios

2.3.1 Critrios endoscpicos

a) Esofagite por refluxo (grupo I)

Na definio endoscpica da esofagite por refluxo, foi utilizada a classificao de

Savary-Miller modificada (Quadro 1).

b) Esfago de Barrett (grupo II)

O critrio endoscpico utilizado para a definio do esfago de Barrett foi o

estabelecido e respaldado pelo I Consenso Brasileiro da Doena do Refluxo

Gastroesofgico133, pelo American College of Gastroenterology2 e pela Organizao Mundial

de Sade134, nos quais se denomina o esfago de Barrett como a substituio do epitlio

escamoso estratificado do esfago por epitlio colunar, contendo clulas intestinalizadas

(metaplasia intestinal), no estudo anatomopatolgico, em qualquer extenso do rgo.

Com o propsito de excluir metaplasia intestinal gstrica (da crdia), ou da transio

esfago-gstrica TEG (metaplasia intestinal da TEG), este estudo somente utilizou epitlios

de Barrett com, no mnimo, 1,0cm de extenso acima da TEG, definida, na endoscopia, como

o limite mximo, cranial, da prega gstrica.

A extenso do epitlio de Barrett, estabelecida endoscopicamente, correspondeu ao

segmento do esfago recoberto pelo epitlio colunar, existente entre o limite cranial da prega

gstrica e o incio da juno escamo-colunar, deslocada proximalmente.

c) Adenocarcinoma esofgico associado ao esfago de Barrett (grupo III).

A classificao macroscpica utilizada na definio endoscpica do adenocarcinoma

esofgico foi definida pela Associao Japonesa do Cncer Gstrico, tambm aplicada para o

carcinoma esofgico (Quadro 2).

Com o propsito de excluir tumores da juno esfago-gstrica, ou tumores gstricos

com invaso esofgica, este estudo somente incluiu os casos em que foi evidenciado epitlio

metaplsico tipo intestinal especializado, corados com a Hematoxilina-Eosina (HE), ao lado

do adenocarcinoma esofgico, independentemente da sua extenso.

Quadro 1. Classificao da esofagite por refluxo de Savary-Miller modificada.

Grau Aspecto endoscpicoI Uma ou mais eroses, lineares ou ovaladas, em uma

nica prega longitudinal.II Vrias eroses em mais de uma prega longitudinal,

confluentes ou no, mas que no ocupam toda a

circunferncia do rgo.III Eroses confluentes que ocupam toda a

circunferncia do rgo.IV Leses crnicas : lcera(s) e estenose(s), isoladas ou

associadas s leses dos graus I, II e III.V Epitlio colunar em continuidade com a linha Z:

circunferencial ou no, de extenso varivel,

associado ou no s leses dos graus I, II, III e IV.Fonte: Breyer & Maguilnik135

Quadro 2. Classificao endoscpica do adenocarcinoma esofgico, definida pela Associao

Japonesa do Cncer Gstrico, tambm aplicada para o carcinoma esofgico.

Tipo Aspecto endoscpico0 Superficial : polipide, elevado, plano, deprimido,

ulcerado.1 Avanado : polipide de base larga.2 Avanado : ulcerado de bordas elevadas e bem

delimitadas.3 Avanado : ulcerado, de bordas infiltrativas.4 Avanado : infiltrao difusa, sem ulcerao.5 Avanado : no-classificvel.

Fonte: Maluf, Moura & Sakai136

2.3.2 Critrios anatomopatolgicos

Os critrios anatomopatolgicos utilizados na definio dos distintos grupos do

presente estudo foram os descritos a seguir, aps colorao das lminas com HE e exame com

microscopia ptica.

a) Esofagite por refluxo (grupo I).

As caractersticas histolgicas da esofagite por refluxo encontradas nas bipsias

endoscpicas, esto demonstradas no quadro 3.

b) Esfago de Barrett (grupo II)

Para a definio histolgica do esfago de Barrett, considerou-se fundamental e

necessria a presena do epitlio colunar metaplsico, definido pela presena das clulas

caliciformes no epitlio colunar, substituindo o epitlio escamoso estratificado do esfago, em

qualquer extenso do rgo, e sendo, indubitavelmente, positivas a colorao padro com HE.

Epitlios colunares com clulas pseudocaliciformes no foram includos no estudo.

c) Adenocarcinoma esofgico associado ao esfago de Barrett (grupo III)

As alteraes citolgicas e arquiteturais definidas na microscopia ptica, aps

colorao com HE, foram, para o adenocarcinoma esofgico, estabelecidas pela classificao

de tumores da Organizao Mundial da Sade (OMS)134.

Quadro 3. Caractersticas histolgicas das bipsias endoscpicas nos portadores de DRGE.

lceras, eroso, tecido de granulao.

Dilatao e congesto de vasos papilares.

Exocitose de clulas inflamatrias no epitlio escamoso:

Neutrfilos.

Eosinfilos.

Linfcitos.

Alteraes epiteliais escamosas:

Hiperplasia de clulas basais.

Alongamento de cones interpapilares.

Fonte : DeNardi & Riddel137

2.3.3 Critrios de incluso

Foram selecionadas e includas no estudo as amostras das lminas dos pacientes com

os seguintes diagnsticos endoscpicos e anatomopatolgicos: esofagite por refluxo (grupo I),

esfago de Barrett (grupoII) e adenocarcinoma associado ao esfago de Barrett (grupo III), de

ambos os sexos, conforme os critrios estabelecidos nos itens 2.3.1 e 2.3.2.

2.3.4 Critrios de excluso

Foram excludos do estudo aqueles pacientes que se recusaram a participar, aqueles

em uso de antiinflamatrios ou de inibidores da bomba de prtons, em tratamento

quimioterpico ou radioterpico, e os que no se enquadraram nos critrios endoscpicos e

anatomopatolgicos definidos nos itens 2.3.1 e 2.3.2.

2.4 Caracterizao da amostra

Os casos do presente estudo foram do Estado da Paraba e de Pernambuco (trs casos

do grupo III), sendo a maioria residente na cidade de Joo Pessoa. Foram selecionados, entre

julho de 1994 e setembro de 2005. Ao final das avaliaes dos pronturios, verificou-se que

64 pacientes satisfaziam os critrios de incluso e excluso definidos previamente, sendo

ento distribudos, segundo os objetivos do estudo, em trs grupos:

Grupo I: esofagite por refluxo: 23 pacientes;

Grupo II: esfago de Barrett sem displasia: 30 pacientes;

Grupo III: adenocarcinoma esofgico associado com o esfago de Barrett:

11 pacientes.

As anlises anatomopatolgicas foram inicialmente realizadas nos Laboratrios

Mdicos de Patologia Celular, Virchow e Histo (02 casos) em Joo Pessoa, e SPAC (03casos)

em Recife, no mesmo perodo previamente descrito. Os estudos imunoistoqumicos foram

todos procedidos posteriormente no Laboratrio Virchow, no perodo de outubro de 2005 a

janeiro de 2006.

2.5 Procedimentos e tcnicas

2.5.1 Dados clnicos

Dados referentes idade, sexo, queixa principal e tempo da sintomatologia foram

coletados a partir das informaes dos pronturios em arquivo e registrados em protocolo

prprio (Anexo 1), sendo ento cruzados entre si.

2.5.2 Procedimento endoscpico

As endoscopias digestivas foram, na maioria, realizadas pelo autor deste trabalho -

GNS, segundo as normas e padres tcnicos da Sociedade Brasileira de Endoscopia Digestiva

(SOBED), com videoendoscpio padro Pentax-EG2901 e processadora Pentax-EPM

3000, exceto em sete casos do grupo III, que foram realizados por endoscopistas do aparelho

digestrio, de outras clnicas privadas de Joo Pessoa e Recife, respectivamente.

O exame foi procedido aps jejum prvio de oito horas, com o paciente em decbito

lateral esquerdo, sob sedao venosa leve (quando assim indicada). A realizao das bipsias

foi efetuada com a pina padro da Pentax (7mm de tamanho e fenestrada).

No grupo I (esofagite por refluxo) e no grupo III (adenocarcinoma relacionado com o

esfago de Barrett), as bipsias foram procedidas diretamente sobre a leso. No grupo II

(esfago de Barrett), as bipsias foram realizadas cranialmente, em pontos eqidistantes,

iniciando s doze, trs, seis e nove horas, progressivamente a cada 1,0cm, no epitlio de

Barrett circunferencial, ou, diretamente, sobre a projeo parcial da mucosa tipo gstrica

acima do limite cranial da prega gstrica, no epitlio de Barrett parcial, tambm no sentido

cranial, at a neojuno escamo-colunar, em ambas as situaes.

As medidas da extenso do epitlio de Barrett, e dos locais para a realizao das

bipsias, foram realizadas considerando-se, indiretamente, a distncia do endoscpio

observada na topografia dos dentes incisivos centrais.

Os espcimens de bipsias, colhidos durante o procedimento endoscpico, foram

imediatamente imersos em soluo tamponada de formaldedo a 10%, sendo ento

devidamente identificados e encaminhados para estudo histopatolgico.

2.5.3 Procedimento anatomopatolgico

O estudo anatomopatolgico de todos os pacientes, previamente ao estudo

imunoistoqumico, foi realizado pela orientadora desse trabalho, MSTA, em microscopia

ptica, abrangendo tcnicas histolgicas convencionais. Outro patologista, AFLJ, foi

convocado para uma segunda anlise, de forma que os resultados finais do estudo histolgico

fornecessem um diagnstico consensual.

Os espcimens de bipsias endoscpicas foram recebidos para exame, devidamente

identificados e imersos em soluo tamponada de formaldedo a 10%. O processamento

histotcnico incluiu etapas sucessivas de desidratao e diafanizao das amostras teciduais,

antecedendo o emblocamento em parafina. Cortes histolgicos foram efetuados no micrtomo

rotativo manual, com a espessura de 3 a 4 micrmetros, perpendiculares superfcie da

mucosa, e, posteriormente, submetidos a colorao por soluo de HE e montagem de

lamnulas em Entellan (Merck 1,07961).

2.5.4 Tcnica imunoistoqumica

O estudo imunoistoqumico foi realizado pela mesma equipe de profissionais,

precedentemente enunciada, que emitiu, individualmente, sua interpretao para cada

imunorreao efetuada. Os casos de discordncia foram reavaliados conjuntamente pelos dois

patologistas, de modo a se obter pareceres consensuais, nos escores aplicados aos resultados

finais.

A tcnica imunoistoqumica empregada seguiu protocolo da SBP, adaptada s

condies laboratorias locais. Efetuaram-se cortes histolgicos com espessura varivel de 3 a

4 micrmetros, dispostos em lminas previamente revestidas com soluo a 4% de

dimetiletoxisilano (Sigma A3648) e acetona. A desparafinizao ocorreu em estufa a 60C,

por 24 horas, com posterior submisso do material a banhos sucessivos de imerso em xilol,

lcool e gua corrente. Procedida a inibio das peroxidases endgenas, em soluo de

perxido de hidrognio a 3% em metanol durante 10 minutos, todos os cortes histolgicos

foram submetidos ao processo de recuperao antignica, em soluo de citrato 10mM / pH

6,0, atravs da exposio das amostras ao calor mido, utilizando-se banho-maria especfico

para esse tipo de procedimento, a uma temperatura de 96C. Aps esfriamento e lavagens em

PBS (soluo salina tamponada com fostato 0,01M / pH 7,4), realizou-se incubao em

cmara mida, com o anticorpo secundrio, durante 20 minutos, a uma temperatura ambiente.

Subseqentemente, procedeu-se incubao das amostras com os anticorpos monoclonais

selecionados para o presente estudo, diludos em soluo PBS, conforme discriminados no

quadro 4. A incubao foi realizada tambm em cmara mida, overnight, a 4C. No processo

de revelao utilizou-se o Complexo Estreptavidina-biotina-peroxidase (Kit StrepABC-

Vectastain) e soluo reveladora substrato-cromgeno DAB plus (diaminobenzidina).

Controles positivos e negativos, internos e externos, atestaram a fidelidade da reao. Ao

final, as lminas foram contracoradas por hematoxilina de Harris e montadas com lamnulas

em Entellan (Merck 1,07961), para leitura em microscopia ptica comum.

Os resultados foram considerados positivos quando apareceram coloraes ou

granulaes castanho-douradas, nos citoplasmas ou ncleos celulares.

Os anticorpos utilizados, as diluies e o fabricante encontram-se sumarizados no

quadro 4.

Em todas as amostras definidas para os trs grupos, foi realizado, individualmente, o

painel dos seguintes biomarcadores moleculares: p53, c-erbB-2, a E-caderina, o COX-2 e o

Ki-67.

Quadro 4. Anticorpos monoclonais utilizados na tcnica imunoistoqumica.

Anticorpo Clone Diluio Origemp53 PAb240 1:200 Dako

Ki-67 MIB 1 1:200 Dakoc-erbB-2 Produto de oncogene 1:400 Dako

E-caderina NCH-38 1:200 DakoCOX-2 CX-294 1:100 Dako

2.5.5 Metodologia da descrio dos resultados

a) Dados clnicos e endoscpicos

Foram obtidos e tabulados para cada grupo conforme o preenchimento do modelo de

ficha tipo A (Anexo 1).

b) Anlise anatomopatolgica

A anlise histolgica dos fragmentos das bipsias endoscpicas, juntamente com as

informaes dos laudos da endoscopia digestiva, definiram e classificaram os pacientes dentro

dos trs grupos de estudo, para posterior anlise imunoistoqumica, conforme o modelo de

ficha tipo B (Anexo 1).

c) Anlise imunoistoqumica

Na anlise imunoistoqumica de todos os imunomarcadores teciduais (antgeno de

proliferao celular Ki-67, gene de supresso tumoral p53, E-caderina, COX2 e o proto-

-oncogene c-erbB-2), foram obedecidos a metodologia de interpretao descrita a seguir, e

preenchidos conforme o modelo de ficha tipo B (Anexo 1), com base nos critrios descritos

em 2001, por Morris et al.138.

1) Biomarcadores teciduais nucleares: p-53 e Ki-67

Os resultados da imunorreao em cada grupo foram definidos separadamente,

mediante uma escala com nvel de mensurao ordinal, baseada na intensidade da

imunomarcao nuclear, com escore varivel de 0+ a 4+, avaliada de forma semiquantitativa,

pela qualidade da expresso antignica em clulas glandulares, conforme o que est descrito a

seguir:

0+ = Marcao negativa ou ausncia de expresso;

1+ = Marcao positiva focal;

2+= Marcao positiva multifocal;

3+= Marcao positiva: moderada e difusa;

4+= Marcao positiva intensa.

O padro de expresso tambm foi definido, de forma semiquantitativa, por meio da

mdia de uma anlise percentual dos ncleos imunomarcados, sobre uma total de cem clulas,

em quatro campos de grande aumento por lmina, categorizados em escore varivel de 1 a 4,

conforme o que est descrito a seguir:

1= 50-75% de ncleos imunomarcados;

4= > 75% de ncleos imunomarcados.

2) Biomarcadores teciduais citoplasmticos : COX-2 e E-caderina.

Os resultados da imunorreao em cada grupo foram definidos separadamente,

mediante uma escala com nvel de mensurao ordinal, baseada na intensidade da

imunomarcao citoplasmtica, com escore varivel de 0+ a 4+, avaliada de forma

semiquantitativa, pela qualidade da expresso antignica em clulas glandulares.

0+ = Marcao negativa ou ausncia de expresso;

1+ = Marcao positiva focal;

2+= Marcao positiva multifocal;

3+= Marcao positiva: moderada e difusa;

4+= Marcao positiva intensa.

O padro de expresso tambm foi definido, de forma semiquantitativa, por meio da

mdia de uma anlise percentual de clulas com expresso antignica citoplasmtica, sobre

uma total de cem clulas, em quatro campos de grande aumento, por lmina, categorizadas em

escore varivel de 1 a 4, conforme o que est descrito a seguir:

1= 50-75% clulas com marcao citoplasmtica;

4= > 75% clulas com marcao citoplasmtica.

A qualidade da imunomarcao (escore 0, 1, 2, 3, 4) e o escore percentual

supradescrito, correspondente a 1, 2, 3 e 4, foram multiplicados entre si, de forma que se

obteve um escore semiquantitativo final para os imunomarcadores descritos acima, cujos

resultados devero variar, no mnimo de zero a, no mximo, dezesseis, obtendo-se ento um

escore final para cada biomarcador, com a seguinte pontuao:

Marcao Ausente - 0 ponto;

Marcao Fraca - 1, 2 e 3 pontos;

Marcao Moderada - 4, 6 e 8 pontos;

Marcao Forte - 9 , 12 e 16 pontos.

Para a validao do escore de cada lmina, os procedimentos descritos foram

efetuados por dois patologistas, objetivando identificar possveis variaes entre os

observadores. Para tanto, os dados resultantes da anlise histolgica foram omitidos para o

segundo observador, de forma que no influssem nos resultados. Nos casos de discrepncia,

os resultados foram tambm reavaliados conjuntamente pelos dois patologistas, para que

houvesse um escore consensual final.

3) Biomarcador tecidual: c-erbB-2

Os resultados da imunorreao, em cada grupo, foram definidos separadamente, por

meio de uma escala com nvel de mensurao ordinal, baseada na intensidade da

imunomarcao de membrana citoplasmtica de clulas glandulares, com escores variveis de

0+ a 4+, conforme o que est descrito a seguir:

0+= Ausncia de marcao de membrana celular ou marcao apenas

citoplasmtica;

1+= Marcao focal ou fracamente perceptvel, em membranas celulares. Este

padro , imunoistoquimicamente, reportado como negativo;

2+= Marcao moderada de membrana, na maioria das clulas;

3+= Forte marcao de membrana celular (superexpresso).

2.6 Limitaes metodolgicas do estudo

a) Como os dados foram obtidos a partir dos pronturios mdicos, algumas

informaes no estavam disponveis por completo;

b) Possveis fontes de vieses:

Vis de seleo: heterogeneidade da amostra em relao ao sexo, idade,

tempo de durao dos sintomas, queixas clnicas e extenso do epitlio de

Barrett;

Vis de classificao: pacientes no grupo de esofagite por refluxo com

diferentes graus de severidade de esofagite (graus: I, II, III e IV);

Vis de aferio e interpretao:

Pelo endoscopista na extenso do epitlio de Barrett;

Pelo anatomopatologista na anlise semiquantitativa da imunorreao;

c) No foram identificados fatores de confuso no presente estudo.

2.7 Aspectos ticos do estudo

O presente estudo foi realizado aps a aprovao e autorizao do Comit de tica

em Pesquisa, do Centro de Cincias da Sade da Universidade Federal da Paraba, com a

certido sob o nmero de protocolo 111/05, aprovado no dia 25 de maio de 2005 (Anexo 2).

As anlises dos dados clnicos nos pronturios mdicos e os exames laboratoriais,

anatomopatolgicos e imunoistoqumicos, s foram procedidos aps os pacientes e/ou

responsveis assinarem o termo de consentimento livre e esclarecido (Anexo 3).

2.8 Anlise estatstica

Todos os dados dos pacientes foram preenchidos e tabulados conforme os modelos

de ficha anexos (fichaspadro, tipo A e B ) - (Anexo 1).

Os resultados da imunorreao dos biomarcadores teciduais, em cada grupo, foram

definidos, separadamente, mediante uma escala com nvel de mensurao ordinal. A anlise

comparativa entre os grupos foi realizada atravs do teste exato de Fisher (distribuio do

sexo), do Score test de tendncia (positividade dos biomarcadores teciduais), da anlise de

varincia (comparao da idade) e do teste de KruskalWallis (comparao do tempo de

queixas e dos escores finais de imunoexpresso tecidual dos biomarcadores). As comparaes

pareadas foram realizadas com o teste de Marascuillo, teste de Dunn e o teste de Tukey. O

teste binomial foi utilizado para verificar se entre os pacientes com adenocarcinoma

esofgico, acima de 50% deles apresentavam neoplasia avanada. Igualmente, este mesmo

teste foi utilizado para verificar se, no grupo III, mais de 50% dos pacientes eram do sexo

masculino. Em todos os testes foi adotado o nvel de significncia de 5%.

RESULTADOS

3.1 Dados clnicos

Neste estudo foram includos 64 pacientes: 39 (60,9%) do sexo masculino e 25

(39,1%) do feminino, com a mdia de idade de 52,3 anos, variando de 13 a 87 anos. Foram

distribudos em 03 grupos, sendo 23 no grupo I, 30 no grupo II, e 11 no grupo III. Os dados

referentes distribuio por sexo, idade, queixas clnicas e durao da queixa principal, em

cada grupo, encontram-se discriminados, respectivamente, nas tabelas 1, 2 e 3. No foi

possvel recuperar as informaes clnicas de um paciente do grupo III.

O resultado da anlise da varincia mostra que as mdias das idades dos pacientes

apresentaram diferenas estatisticamente significantes (p=0,011). O resultado do teste de

comparaes mltiplas de Tukey indica que s a mdia de idade do grupo III apresentou

diferena significante em relao s mdias do grupo I (p=0,021) e do grupo II (p=0,012),

respectivamente. Entre os grupos I e II no houve diferena estatstica significante (p>0,05).

Em relao anlise comparativa entre os grupos, para distribuio do sexo, atravs

do teste exato de Fisher, observa-se que no houve homogeneidade nas amostras (p=0,048). O

teste de Marascuillo mostra que a proporo de homens foi significativamente maior no grupo

III, em comparao com o grupo I (p=0,030). Em relao aos outros pares de grupos, as

diferenas no foram significantes (grupo I vs grupo II: p=0,997; grupo II vs

grupo III: p=0,090). O resultado do teste binomial indica que, no grupo III, a proporo de

pacientes do sexo masculino foi significativamente maior do que 50,0% (p = 0,012).

Na anlise estatstica da durao das queixas, o resultado do teste de KruskalWallis

indica que houve diferenas significantes entre os trs grupos de pacientes (p=0,004). As

comparaes pareadas, realizadas pelo teste de comparaes mltiplas de Dunn, mostraram

que o grupo III apresentou uma distribuio de tempo de queixas significativamente diferente

daquelas observadas nos grupos I e II (grupo III vs grupo I: p=0,026; grupo III vs grupo II:

p

Tabela 1. Dados clnicos dos pacientes do grupo I (esofagite por refluxo).

Dados clnicos n %Pacientes 23Sexo

Masculino 13Feminino 10

Idade em anos (mdia) 13-86 (49,9)Queixa principal

Pirose 17 73,9Epigastralgia 11 47,8Regurgitao 8 34,8Vmitos 4 17,4Sensao de entalo 4 17,4Odinofagia 2 8,7Dor torcica de origem

no-cardaca (DTNC)

2 8,7

Dor abdominal 2 8,7Outros* 4 17,4

Tempo de histria clnicaDias (< 30) 5 21,7Meses (01-12) 7 30,4Anos (> 01) 11 47,8

*Outros: nuseas, empachamento, faringite e emagrecimento.Fonte: fichas clnicas dos pacientes (arquivo privado).

Tabela 2. Dados clnicos dos pacientes do grupo II (esfago de Barrett).




Pirose 21 70,0Epigastralgia 13 43,3Regurgitao 6 20,0Plenitude gstrica 3 10,0Tosse seca 3 10,0Pigarro 2 6,7Disfagia 1 3,3Odinofagia 1 3,3Dor torcica de origem

no-cardaca (DTNC)

1 3,3

Globo farngeo 1 3,3Tempo de histria clnica

Dias (< 30) 2 6,7Meses (01-12) 9 30,0Anos (> 01) 19 63,3

Fonte: fichas clnicas dos pacientes (arquivo privado).

Tabela 3. Dados clnicos dos pacientes do grupo III (adenocarcinoma relacionado com o

esfago de Barrett).




Disfagia 8 72,7Emagrecimento 5 45,5Epigastralgia 2 18,2Vmitos 1 9,09Hemorragia digestiva alta 1 9,09Pirose/Regurgitao 1 9,09No disponvel 1 9,09

Tempo de histria clnicaDias (< 30) 5 45,45Meses (01-12) 4 36,36Anos (> 01) 1 9,09


3.2 Dados endoscpicos

Os dados referentes aos resultados das endoscopias digestivas altas, realizadas nos

trs grupos do presente estudo, encontram-se discriminados nas tabelas 4, 5 e 6,

respectivamente. Entre os 11 pacientes do grupo III, portadores de adenocarcinoma esofgico,

8 (72,7%) apresentaram aspecto endoscpico de leso avanada e 3 (27,3%) de leso

superficial. O resultado do teste binomial indica que a proporo de adenocarcinoma

esofgico avanado no foi significativamente maior do que 50,0% (p=0,227). A mdia da

extenso do epitlio de Barrett, no grupo II, entre os 30 pacientes estudados, foi igual a

2,53cm, variando de 1 a 11cm.

Tabela 4. Dados endoscpicos dos pacientes com esofagite por refluxo (grupo I).

Esofagite por refluxo n %Pacientes 23

Grau I 12 52,2Grau II 4 17,4Grau III 3 13,0Grau IV 4 17,4Grau V 0 0

Fonte: fichas clnicas dos pacientes (arquivo privado); classificao de esofagite por refluxo de Savary-Miller modificada: Breyer & Maguilnik135

Tabela 5. Dados endoscpicos dos pacientes com esfago de Barrett (grupo II).

Esfago de Barrett n %Pacientes 30Extenso do epitlio de Barrett (cm)

01 a 03cm 25 83,3> 03cm 5 16,7


Tabela 6. Dados endoscpicos dos pacientes com adenocarcinoma esofgico relacionado com o esfago de Barrett (grupo III).

Adenocarcinoma esofgico relacionado com o esfago

de Barrett

n %

Pacientes 11Classificao endoscpica*Tipo 0 Superficial

(polipide, elevado, plano, deprimido, ulcerado )

3 27,3

Tipo 1 Avanado

(polipide de base larga )

1 9,1

Tipo 3 Avanado

(ulcerado, de bordas infiltrativas)

7 63,6

Fonte: fichas clnicas dos pacientes (arquivo privado); classificao endoscpica da Associao Japonesa do Cncer Gstrico tambm aplicada para o Carcinoma Esofgico146.

3.3 Dados imunoistoqumicos

O resultado da positividade e da negatividade da imunoexpresso tecidual dos

seguintes biomarcadores: p53, COX-2 e c-erbB-2, em todos os grupos de estudo do presente

trabalho, encontra-se discriminado, em uma anlise isolada, nas tabelas 7, 8 e 9 e nos grficos

1, 2 e 3 e, de uma forma agrupada, no grfico 4, respectivamente. Exemplos das

imunorreaes destes trs biomarcadores analisados, nos trs grupos do presente estudo,

encontram-se ilustrados, respectivamente nas figuras 1, 2 e 3 (p53); 4, 5 e 6 (COX-2) e 7 e 8

(c-erbB-2).

Observa-se que houve uma significativa tendncia monotnica de crescimento na

positividade, de todos os biomarcadores, do grupo I para o grupo II e, finalmente para o grupo

III [Score test: p

Tabela 7. Imunoexpresso tecidual do p53 em todos os grupos analisados.

Grupo n p53 positivo p53 negativon % n %

Esofagite por refluxo I 23 5 21,74 18 78,26Esfago de Barrett II 30 19 63,33 11 36,66Adenocarcinoma associado ao esfago de Barrett - III

11 11 100,0 0 0

0

20

40

60

80

100

Esofagite porrefluxo

Esfago deBarrett

Adenocarcinomaesofgico

p53

Grfico 1. Imunoexpresso tecidual do p53 em todos os grupos do estudo.

%

Figura 1. Imunoexpresso fraca e focal da protena p53 na esofagite por refluxo (400X).

Figura 2. Imunomarcao do p53 no esfago de Barrett (400X).

Figura 3. Forte imunoexpresso do oncgeno p53 no adenocarcinoma esofgico (400X).

Tabela 8. Imunoexpresso tecidual da COX-2 em todos os grupos analisados.

Grupo n COX-2 positivo COX-2 negativon % n %


11 11 100,0 0 0

0

20

40

60

80

100


Esfago deBarrett


COX-2

Grfico 2. Imunoexpresso tecidual da COX-2 em todos os grupos analisados.

%

Figura 4. Imunoexpresso da COX-2, na esofagite por refluxo (400X).

Figura 5. COX-2 - imunoexpresso citoplasmtica, no epitlio glandular do esfago de Barrett: 100X(A) e 400X(B).

Figura 6. Imunoexpresso acentuada da COX-2, no adenocarcinoma esofgico(400X), e fraca marcao no controle interno (epitlio escamoso).

A B

A

B

Tabela 9. Imunoexpresso tecidual do c-erbB-2, em todos os grupos analisados.

Grupo n c-erbB-2 positivo c-erbB-2 negativon % n %


11 11 100,0 0 0

0

20

40

60

80

100


Esfago deBarrett


c-erb-B2

Grfico 3. Imunoexpresso tecidual do c-erbB-2, em todos os grupos estudados.

%

Figura 7. c-erbB-2 - imunoexpresso citoplasmtica, sem forte marcao de membrana epitelial, no esfago de Barrett - A(100X) e B(400X).

Figura 8. Forte imunoexpresso (citoplasmtica e de membrana) da oncoprotena c-erbB-2, no adenocarcinoma esofgico (400X).

A B

0102030405060708090

100


Esfago deBarrett


p53c-erbB-2COX-2

Grfico 4. Anlise agrupada da positividade tecidual dos biomarcadores p53, c-erbB-2 e COX-2, nos trs grupos do estudo.

%

O padro de expresso do p53 tambm foi analisado de uma forma estratificada e

semiquantitativa (escore final), nos trs grupos estudados, quanto intensidade da

imunomarcao nuclear, com os resultados demonstrados na tabela 10.

O resultado do teste de KruskalWallis indica que houve diferenas significantes

entre os trs grupos de pacientes em relao ao escore final (p

Tabela 10. Escore final da imunoexpresso tecidual do p53 em todos os grupos analisados.

Grupo n Escore final

ausente

(0)

fraco

(1-2-3)

moderado

(4-6-8)

forte

(9-12-16)n % n % n % n %

Esofagite por refluxo - I 23 18 78,3 5 21,7 0 0 0 0

Esfago de Barrett - II 30 11 36,7 19 63,3 0 0 0 0

Adenocarcinoma associado ao

esfago de Barrett - III 11 0 0 1 9,1 3 27,3 7 63,3

Na tabela 11, observa-se o escore final da COX-2 nos trs grupos estudados, quanto

intensidade da imunomarcao citoplasmtica.

O resultado do teste de KruskalWallis indica que houve diferenas significativas

entre os trs grupos de pacientes (p

Tabela 11. Escore final da imunoexpresso tecidual da COX-2 em todos os grupos do estudo.

Grupo n Escore final ausente

(0)

fraco

(1-2-3)

moderado

(4-6-8)

forte

(9-12-16)n % n % n % n %

Esofagite por refluxo I 23 12 52,2 7 30,4 4 17,4 0 0

Esfago de Barrett II 30 9 30,0 15 50,0 5 16,7 1 3,3

Adenocarcinoma associado

ao esfago de Barrett - III 11 0 0 0 0 5 45,5 6 54,5

O imunomarcador c-erbB-2 apresentou um perfil de marcao mais tardio, de forma

que somente 1 paciente no grupo I, de um total de 23 (4,35%), foi fracamente positivo. No

grupo II a positividade foi a de 63,33% e, no grupo III, todos os pacientes (100%)

apresentaram imunoexpresso (tabela 12 e grfico 3).


entre os trs grupos de pacientes em relao ao escore final (p

Tabela 12. Escore da imunoexpresso tecidual do c-erbB-2 nos trs grupos analisados.

Grupo n Escore ausente

+

fraco

++

moderado

+++

forte

++++n % n % n % n %

Esofagite por refluxo - I 23 22 95,7 1 4,3 0 0 0 0

Esfago de Barrett - II 30 11 36,7 13 43,3 4 13,3 2 6,7


ao esfago de Barrett - III 11 0 0 1 9,1 2 18,2 8 72,7

Na anlise da imunoexpresso tecidual do Ki-67, qualitativa e semiquantitativa,

observou-se que o biomarcador foi positivo nos trs grupos analisados, no havendo

imunoexpresso negativa. Nas figuras 9, 10 e 11, observam-se exemplos da imunomarcao

do Ki-67, e, no grfico 5, assinala-se o escore semiquantitativo deste biomarcador, em todos

os grupos de estudo, respectivamente.


entre os trs grupos de pacientes, em relao ao escore final (p

Figura 9. Ki-67 atividade proliferativa da camada basal do epitlio malphigiano, na esofagite por refluxo (AB:400X).

Figura 10. Expresso nuclear do Ki-67, no esfago de Barrett e na atividade proliferativa basal do epitlio escamoso esofgico (A - 100X; B - 400X).

Figura 11. Ki-67 - alto ndice proliferativo no adenocarcinoma esofgico (400X).

A B

A B

A B

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Ausente Fraco Moderado Forte

Ki-67 Escore final

Per

cent

agem

G1 G2 G3

Grfico 5. Escore semiquantitativo do Ki-67, em todos os grupos de estudo.

Tabela 13. Escore final da imunoexpresso tecidual do Ki-67 nos trs grupos do estudo.


(0)

fraco

(1-2-3)

moderado

(4-6-8)

forte

(9-12-16)n % N % n % n %

Esofagite por refluxo - I 23 0 0 21 91,3 2 8,7 0 0

Esfago de Barrett - II 30 0 0 24 80,0 6 20,0 0 0



Na anlise qualitativa e semiquantitativa da imunoexpresso tecidual da E-caderina,

observou-se que o biomarcador foi positivo em todos os grupos estudo, entretanto o resultado

do teste de KruskalWallis indica que houve diferenas significantes entre os trs grupos de

pacientes, em relao ao escore final (p

Tabela 14. Escore final da imunoexpresso tecidual da E-caderina nos grupos do estudo.


(0)

fraco

(1-2-3)

moderado

(4-6-8)

forte

(9-12-16)n % N % n % n %

Esofagite por refluxo - I 23 0 0 0 0 7 30,4 16 69,6

Esfago de Barrett - II 30 0 0 0 0 19 63,3 11 36,6



0

10

20

30

40

50

60

70

80

Ausente Fraco Moderado Forte

Escore final da E-caderina

Perc

enta

gem

G1 G2 G3

Grfico 6. Anlise do escore semiquantitativo da E-caderina, em todos os grupos de estudo.

Figura 12. Forte expresso de membrana da E-caderina, na esofagite por refluxo (400X).

Figura 13. Imunoexpresso da E-caderina, no esfago de Barrett (400X).

Figura 14. Imunomarcao inconstante da E-caderina no adenocarcinoma associado com o esfago de Barrett (A-B: 400X).

A B

DISCUSSO

O EB representa a conseqncia mais sria da DRGE crnica, ocorrendo entre 5 a

10% dos pacientes12,17.

No espectro da DRGE, considera-se o EB como uma etapa intermediria no

desenvolvimento do adenocarcinoma esofgico49-51, a neoplasia que, nos ltimos 25 anos,

apresentou a maior incidncia dentre todos os cnceres, nos pases ocidentais e na Europa20,24.

Vrios autores ressaltam a importncia do seguimento endoscpico peridico dos

pacientes portadores do EB. Consideram a melhor sobrevida em cinco anos daqueles que

foram submetidos resseco do cncer esofgico e que participavam de programas de

seguimento e vigilncia endoscpica, com protocolos de bipsias, comparativamente queles

pacientes com cnceres diagnosticados na endoscopia, ou fora dos programas de vigilncia

54,139,140. No entanto, alguns pesquisadores afirmam no haver argumentos para se submeter a

totalidade desses indivduos a endoscopias e bipsias esofgicas seriadas, mas somente

aqueles com alto risco de degenerao maligna, considerando-se que a grande maioria dos

pacientes portadores do EB no evoluir para o adenocarcinoma esofgico37,141,142.

Realmente, no h, na literatura, dados concretos a respeito da histria natural do

EB, das suas taxas reais de progresso para o cncer, ou dos fatores de risco envolvidos,

efetivamente, na patognese e na degenerao maligna desta importante leso pr-neoplsica.

Os fatores considerados de risco, clnicos e endoscpicos, no apresentam, segundo alguns

autores, a sensibilidade e/ou a especificidade necessrias estratificao de risco dos

pacientes para o cncer13,29,39-48.

Adicionalmente, o rastreamento de pacientes portadores do EB no tem demonstrado

ser uma medida cientfica e epidemiologicamente capaz de reduzir o ndice de mortalidade do

adenocarcinoma esofgico. No demonstrou, tambm, diferenas significativas na sobrevida

dos pacientes, quando foram comparados com a populao.

Consideraes e questionamentos tm sido, efetivamente, levantados, a respeito da

relao custobenefcio deste rastreamento, uma vez que a incidncia estimada da displasia de

alto grau e do cncer esofgico, so baixas em geral (em torno de 0,5% ao ano), e as leses

neoplsicas precoces so difceis de identificar endoscopicamente143,144.

Nesse contexto, considerando no s estas limitaes dos programas de

rastreamento e vigilncia clnico-endoscpicos, associados ao estudo histopatolgico, mas

tambm que h caractersticas celulares e biomoleculares outras, na carcinognese esofgica

relacionada com o EB, as quais no so detectveis apenas com essas metodologias, que o

estudo e a definio de um painel imunoistoqumico de biomarcadores moleculares preditivos,

com o potencial de estratificar os pacientes realmente de risco para o cncer no EB, tm

assumido um papel fundamental na abordagem dessa importante entidade nosolgica.

O biomarcador preditivo deve ser capaz de identificar, precocemente, o clone de

clulas com a combinao necessria dos erros genticos descritos, com potencial evolutivo

para o cncer, dentro da seqncia neoplsica do EB.

Na deteco desses biomarcadores, a maior prevalncia deve ocorrer no

adenocarcinoma esofgico, e o seu desenvolvimento deve ser observado no epitlio pr-

maligno, antes do surgimento do tumor. Aqueles que surgirem tardiamente, ou seja, aps o

desenvolvimento do adenocarcinoma, no sero, portanto, teis nessa fase de deteco

precoce; no entanto, podem ter a sua aplicabilidade clnica como valor preditivo nas

metstases145,146.

O biomarcador preditivo deve ter, tambm, alta reprodutibilidade, sensibilidade e

especificidade, quando so comparados com a histopatologia25,147, atualmente o mtodo

padro-ouro para definio de risco do adenocarcinoma esofgico.

No presente estudo, considerando a seqncia neoplsica do epitlio de Barrett49-51,

foram estudados e correlacionados, alm dos aspectos clnicos e endoscpicos, o padro de

expresso de cinco biomarcadores moleculares: o antgeno de proliferao celular Ki-67, o

gene de supresso tumoral p53, a E-caderina, a COX2 e o proto-oncogene c-erbB-2, dentro

de trs fases do espectro evolutivo da DRGE: a esofagite por refluxo, o esfago de Barrett e o

adenocarcinoma esofgico relacionado com o esfago de Barrett.

Foi definido tambm, individualmente, o escore final para cada biomarcador, em

cada grupo de estudo, permitindo-se avaliar em conjunto, de uma forma semiquantitativa, a

qualidade da imunomarcao e a mdia do percentual de clulas que expressam o

biomarcador.

Foram consideradas, na seleo desses biomarcadores, todas as etapas descritas por

Hanahan e Weinberg, dentro do processo geral da carcinognese65, tambm aplicadas ao EB.

Na anlise dos resultados, observa-se que no houve homogeneidade dos grupos em

relao ao sexo. No grupo III, a proporo de homens foi significativamente maior, dados

estes em conformidade com os encontrados na literatura, onde a predominncia do

adenocarcinoma esofgico maior nos pacientes do sexo masculino14,42,148.

No que concerne aos dados relacionados, especificamente, com o sexo e com o EB,

assinala-se, na literatura, uma maior prevalncia do epitlio de Barrett nos pacientes do sexo

masculino, embora a razo seja desconhecida. Em estudo multicntrico italiano, o EB foi

encontrado em 1% dos homens e em 0,39% das mulheres, com uma proporo de 2,6 para

1149. Na clnica Mayo, observou-se uma predominncia de 0,97% em homens e de 0,49% nas

mulheres13. No nosso estudo no foram observadas estas propores, dentro do grupo de

pacientes portadores do esfago de Barrett.

Analisando-se os dados referentes sintomatologia, observou-se que a queixa clnica

predominante no grupo III foi a disfagia, em 8 de 11 pacientes (72%), comparativamente s

queixas de pirose e epigastralgia, que dominaram entre os pacientes dos grupos I e II (acima

de 80%). Contudo, h que se considerar o vis de seleo dos pacientes.

No que diz respeito durao das queixas, Winters et al.150, afirmam em seu trabalho

que, em relao ao EB e a esofagite por refluxo, no houve diferena estatisticamente

significativa na mdia de durao dos sintomas; entretanto, em ambos os casos, constatou-se

diferena maior do que a observada na DRGE no-erosiva.

Lieberman et al.151, por sua vez, comparando pacientes que foram submetidos

endoscopia por refluxo, afirmaram que a odds ratio (OR) para o EB, em pacientes com

durao da sintomatologia maior que 10 anos, era a de 6.4, comparativamente queles com

sintomas com durao de 1 a 5 anos, com OR de 3.0 ( p

No que concerne, especificamente, aos biomarcadores moleculares, em relao ao

gene de supresso tumoral p53, observam-se, na literatura, resultados conflitantes da

imunoexpresso no epitlio de Barrett, embora grande parte dos estudos apontem um perfil de

reatividade progressivamente maior na seqncia neoplsica evolutiva do EB19,83,152-159.

Alguns autores relatam que as alteraes do gene p53 so eventos precoces na

progresso neoplsica do EB, podendo, em alguns casos, ser detectadas antes da presena das

alteraes histolgicas ou das anormalidades no ciclo celular69,160,161.

Dolan et al.162, em estudo preliminar, na anlise de 30 pacientes submetidos

esofagectomia por adenocarcinoma associado, e de 48 portadores do EB, em programa de

vigilncia endoscpica, concluram que as mutaes no gene p53 podem ser detectadas antes

do desenvolvimento da displasia de alto grau ou do carcinoma, podendo ser, portanto, teis,

na estratificao de risco dos pacientes portadores do EB. No entanto, ressaltam que o

adenocarcinoma do esfago pode se desenvolver sem a expresso do gene p53 mutante, e que

a mutao pode ocorrer, tardiamente, no processo da carcinognese relativa ao EB. Afirmam,

tambm, que no est estabelecido, ainda, se todos os pacientes portadores de mutao no

gene p53 desenvolvero, ou no, o cncer esofgico.

Younes et al89, demonstraram, igualmente, expresso aumentada da protena p53 em

amostras de mucosa do EB, que ocorreram antes do desenvolvimento da displasia de alto grau

ou do carcinoma, em dois de trs pacientes.

Garewal163 identificou, na literatura, 16 trabalhos analisando a imunoexpresso do

p53 no EB. Os resultados demonstram, de forma semelhante, um acrscimo gradual na

freqncia das alteraes do p53, medida que o grau de displasia aumenta, com variao de

percentuais de 0% a 10% no epitlio sem displasia (mdia de 1,4%), 0% a 60% na displasia de

baixo grau (mdia de 30%), 50% a 100% na displasia de alto grau (mdia de 68%) e 53% a

100% no adenocarcinoma esofgico (mdia de 72%).

No entanto, outros pesquisadores tambm observaram resultados da imunoexpresso

do p53 mais tardios, dentro da seqncia neoplsica do EB, com baixos percentuais no

epitlio de Barrett19,154,156,164-166, ou positividade somente no adenocarcinoma esofgico, com

ausncia de expresso no epitlio metaplsico. Symmans et al.167 no encontraram

positividade do p53 em nenhum dos portadores do EB (n=7), e Roth168 encontrou mutao do

p53 em 5 de 12 pacientes com epitlio de Barrett adjacente ao adenocarcinoma esofgico, mas

no a encontrou em nenhum dos 10 pacientes com EB sem cncer.

Flejou et al.169 igualmente relataram imunoexpresso do p53 em 56 de 82 pacientes

com adenocarcinoma relacionado com o EB, com ausncia do p53 no epitlio metaplsico ou

com displasia de baixo grau, nas peas ressecadas. Reportaram, ainda, no haver correlao

entre o grau de disseminao do tumor e o status do p53, sugerindo ser a imunoexpresso

tecidual do p53 um evento, efetivamente, tardio170.

Feith et al.171, em anlise de 24 portadores de adenocarcinoma do esfago distal

ressecado, demonstraram, da mesma forma, no haver imunoexpresso do p53 no epitlio

esofgico normal ou na metaplasia colunar; entretanto, observaram positividade na

imunexpresso em 50% dos casos portadores de cncer. Concluram, tambm, na sua

pesquisa, ser o p53 uma marcador tardio na seqncia evolutiva neoplsica do EB.

H outros estudos na literatura, que tambm demonstram esta imunorreatividade

tardia do p53 na seqncia metaplasiadisplasiaadenocarcinoma do EB, com expresso

apenas demonstrvel, ma

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UFPE · de Pós-Graduação em Saúde do Adulto e do Idoso do Centro de Ciências da Saúde da Universidade ... proliferativa basal do epitélio escamoso esofágico (A-100X; B-400X)