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UM SISTEMA PARA ACONTAGEM SEMI-AUTOMÁTICADE MICROORGANISMOS

ADRIANA C. LUCARINI; LEANDRO A. DA SILVA; REINALDO A.C. BIANCHI

Palavras-Chave: Automação Inteligente de

Processos, Processamento de Imagens,

Microbiologia, Contagem Automática de Células,

Microscopia Automática Inteligente.

Keywords: Intelligent Process Automation, Image

Processing, Microbiology, Cell Concentration,

Automatic Intelligent Microscopy.

ADRIANA C. LUCARINI é professora doutora e chefe do Departamentode Engenharia Química do Centro Universitário da FEILEANDRO A. DA SILVA é Engenheiro Elétrico formado pelo CentroUniversitário da FEIREINALDO A.C. BIANCHI é professor doutor do Departamento deEngenharia Elétrica do Centro Universitário da FEI

Esta matéria descreve o projeto e a implementação de

um sistema semi-automático de contagem de microor-

ganismos utilizando técnicas de Processamento de

Imagens. A metodologia se baseia na técnica

tradicionalmente utilizada em microbiologia da

contagem de células em hemacitômetro (Câmera de

Neubauer). Para tanto, foi implementado um sistema

que captura imagens de um microscópio óptico por meio

de uma câmera de vídeo e envia a imagem para um

computador. Neste, a imagem é digitalizada,

limiarizada e a quantidade de microorganismos

existentes em uma amostra é calculada usando um

algoritmo de rotulação de áreas conectadas. O sistema

foi testado na contagem de leveduras e os resultados

mostram-se promissores.

This article describes the design and

implementation of a semi-automatic system for

microorganism counting that makes use of

Image Processing techniques. The methodology

is based on a traditional technique used in

microbiology, which uses the Hemacytometer

(or Neubauer Chamber) for the cell counting. The

implemented system captures images of an optic

microscope thought of a video camera and sends

the image to a computer. In it, the image is

digitalized, limiarized and the amount of

microorganisms in a sample is calculated using

a labeling algorithm. The system was tested

counting yeast cells and the results are

promising.

UM SISTEMA PARA A CONTAGEM SEMI-AUTOMÁTICA DE MICROORGANISMOS

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Introdução

O presente trabalho tem comoobjetivo colocar à disposição dos alunosde Engenharia Química de nosso centrouniversitário uma nova metodologia decontagem de microorganismos para asaulas de Biotecnologia Industrial, a fimde se obter resultados de concentraçãocelular de maneira simples, rápida eprecisa.

O sistema implementado utilizaum microscópio óptico com umacâmara de vídeo acoplada e ummicrocomputador dotado de uma placade aquisição de imagens. Umailustração do sistema implementadopode ser vista na Figura 1.

Figura 1 – Foto do sistema implementado.

O sistema possui três módulosprincipais: o de aquisição das imagens,que captura as imagens provenientes dacâmera de vídeo; o de pré-processa-mento, que remove o fundo da imageme a binariza, utilizando um algoritmode limiarização; e o que realiza a con-tagem dos microorganismos, utilizandoalgoritmos de processamento deimagens para a segmentação dasimagens.

Neste trabalho foram utilizadaspara a aquisição das imagens dos micro-organismos, lâminas previamentepreparadas com suspensões de leve-duras, segundo método microscópicomanual tradicional utilizado em técni-cas de microbiologia (CARVALHO, 2001).

Realizações similares estãoocorrendo em diversas áreas: na análiseclínica, para contagens de célulassangüíneas (células vermelhas emKOYA, 2001 e células brancas em CSEKE,1992), de células de córneas “in vitro”(RIBEIRO et. al, 1996 e CAETANO et. al,1997); na análise ambiental, para amedida de massas de fitoplânctons emamostras de água, (GUADAGNIN et. al,1999, CAVALCANTI, 1999 e NAUFFAL

2000), entre outras. Existe também ummercado crescente para a MicroscopiaAutomática Inteligente nas áreas deanálises clínicas e patológicas (MEVIS,2002 e IRIS, 2002).

Este estudo está organizado daseguinte maneira: seção 2: descreve ametodologia tradicionalmente usadapara a contagem de células; seção 3:apresenta o sistema de aquisição dasimagens; seção 4: descreve o processa-mento realizado nas imagens; seção 5:descreve a interface com o usuário; seção6: apresenta os resultados; seção 7:conclusões.

Contagem de células em Câmarade Neubauer

Quando se trabalha com microor-ganismos, na maioria das vezes deseja-se determinar a concentração de célulasda suspensão preparada. Uma dasformas mais comuns de se obter estaestimativa é através da contagem aomicroscópio, utilizando-se uma Câmarade Neubauer, também conhecida comoHemacitômetro ou Câmara de Conta-gem (VIEIRA, 2000).

Figura 2 – A Câmara de Neubauer.

A Câmara de Neubauer consiste deuma lâmina de microscopia, bem mais

alta do que uma lâmina normal, ondeexiste uma câmara gravada no vidro (asduas partes mais escuras no centro daFigura 2 – cada lâmina contémgeralmente duas câmaras). Ao lado dacâmara existem dois suportes (as duasbarras cinza-claro ao lado da câmara naFigura 2) que mantém uma lamínulaespecial de quartzo exatamente a 10-1

mm acima do chão da câmara (Figura3). Assim, quando se coloca umasolução na câmara e se cobre a mesmacom a lamínula, a profundidade dasolução é conhecida.

Figura 3 – A Câmara de Neubauer comlamínula (de Rouge, 2002).

Nesta câmara também são gravadasmarcações que a dividem em quadran-tes de dimensões conhecidas. Cadacâmara possue 9 quadrados de conta-gem, cada um com 1mm2 de área(Figura 4), resultando em uma áreatotal de 9 mm2.

Figura 4 – Área sob a lamínula.

Observando-se o gabarito de umaCâmara de Neubauer (Figura 5),percebe-se que existem três tiposdiferentes de quadrados de contagens,denominados A, B e C. Pode-se notarque as marcações destes quadrantes têmdimensões diferentes, permitindo quesejam realizadas contagens de célulasde tamanhos diferentes: células grandessão contadas no quadrante A, as detamanho intermediário no quadrante Be as células muito pequenas noquadrante C.

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Figura 5 – Gabarito de uma Câmara deNeubauer. (de VIEIRA, 2000)

Como a área de cada quadrado decontagem é conhecida e a profundidadeda solução também, pode-se determinaro volume de cada câmara formada entreas marcações, como mostrado na Tabela1. A Figura 6 mostra uma imagem demicroscópio da Câmara de Neubauer.

Para se realizar a estimativa daconcentração de células, são realizadascontagens da quantidade de célulasencontradas em cada quadrado menor,o que dividido pelo respectivo volumeresulta na concentração de células pormm3. Para se obter a média daconcentração de uma amostra, sãorealizadas diversas contagens em

quadrados diferentes, calculando-se amédia e o desvio padrão. A precisão dacontagem manual utilizando estemétodo depende basicamente:

➢ da mistura correta da amostra,para que a concentração estejahomogênea e que não se formembolhas;

➢ do número de câmaras contadas;➢ do número de células contadas,

onde a concentração viável é de200 a 500 por 0.1 mm3.

Nas próximas seções são descritosos elementos do sistema implementado.

A aquisição de imagens

A aquisição da imagem se realizaatravés de uma câmera de vídeo aco-plada ao microscópio óptico que, através

de um cabo coaxial, envia o sinal devídeo composto para um computadorequipado com uma placa de aquisiçãode imagens que utiliza o padrão VideoFor Windows. A interface deaquisição de imagens é baseada noprocessador de vídeo BT-848 e foiescolhida devido a seu reduzido custoe boa qualidade de imagem.

A imagem observada através daslentes do microscópio é, ao comando dousuário, capturada pela câmera de vídeoe armazenada em um buffer. Oaplicativo desenvolvido permite que ousuário salve a imagem em disco, parao caso de ele querer ilustrar um experi-mento, ou então realizar a contagem. Aoreceber um desses comandos a imagembufferizada será salva no disco dousuário e caso o comando tenha sidopara contar as células, o sistema iniciaráeste processamento, descrito na próximaseção.

Figura 7 – Exemplo de imagem capturada.

O processamento da imagem

Depois de capturada, o próximopasso para a contagem das células é alimiarização da imagem. A limiarizaçãoé realizada para separar as células quese deseja contar do fundo. Estalimiarização é feita usando como limiteos pontos de cruzamento das médiascrescente e decrescente do histogramade luminância das imagens, criandouma imagem binária (GONZALEZ eWOODS, 1992).

A Figura 8 mostra um exemplo deimagem limiarizada.

Para a identificação das células foiutilizado o algoritmo de rotulação de

Tabela 1 – Área e volume de cada quadrado de contagem.

Quadrante Área (mm2) Volume (mm3)

A (quadrados maiores) 0,0625 0,00625

B (retângulos) 0,0125 0,00125

C (quadrados menores) 0,0025 0,00025

Figura 6 – Vista da área de contagem da Câmara de Neubauer (de ROUGE, 2002).

Figura 8 – Imagens original e limiarizada.

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áreas conhecido como componentesconectados-de-4-p, que é descrito emGONZALEZ e WOODS (1992).

O algoritmo pode ser descrito daseguinte maneira: considere p=0 comosendo um pixel branco da imagem ep=1 um pixel preto da imagem. Varratoda a imagem e adote o seguinteprocedimento:

➢ Se p (valor do pixel) for zero,mova para o próximo pixel;

➢ Se p = 1, analise os vizinhossuperior e da esquerda:

➢ Se ambos os vizinhos foremzero, assinala-se um novo rótulopara p;

➢ Se um dos vizinhos for 1,assinala- se o rótulo deste vizinhopara p;

➢ Se ambos os vizinhos forem 1 eos dois possuírem o mesmorótulo, assinala-se este rótulopara p;

➢ Se ambos forem 1 e possuíremrótulos diferentes, substitui-setodos os rótulos iguais aos en-contrados pelo valor do menorrótulo, ou seja, pelo que foiatribuído antes.

Terminada a varredura da imagem,o número de células é igual ao númerode rótulos atribuídos para as áreas daimagem

O sistema foi implementado emum microcomputador padrão Pentium200MHz, com 64 Mbytes de memóriae usando o Sistema OperacionalMicrosoft Windows 2000. Comoplataforma de desenvolvimento foiutilizado o Microsoft Visual C++ 6.0(SDK e Vídeo for Windows).

Mesmo sendo uma plataforma debaixo poder de processamento, osistema foi eficiente, sendo que cadacontagem pode ser realizada em menosde um segundo (tempo muito menorque o levado pelo operador humano,manualmente).

Na próxima seção é descrita ainteração do sistema com os usuários.

A interação com o usuário

O usuário interage com o sistemaseguindo os seguintes passos:

1. Manualmente, através dos para-fusos posicionadores da lâmina,o usuário escolhe no microscópioa região onde deseja contar osmicroorganismos.

2. Em seguida, o aplicativo desen-volvido permite que o usuáriosalve a imagem em disco ourealize a contagem.

3. Se desejar contar os microorga-nismos, o usuário deve executaro comando para a contagem.Neste caso, a imagem que foicapturada é gravada tempora-riamente no computador eaberta em uma nova janela.

4. O usuário marca, utilizando omouse, a área da imagem emque deseja realizar a contagem(geralmente a imagem contémmais de um quadrado decontagem).

5. Clicando no botão “Continue”,a contagem é iniciada e oresultado apresentado no vídeo.

6. Volta-se ao primeiro passoquantas vezes necessário para seobter uma boa média.

Uma imagem com a interface dosistema é apresentada na Fig.9.

Resultados e análises

O gráfico na Figura 10 apresenta oresultado do sistema para diversasmedidas. Ele mostra a contagemrealizada manualmente por umoperador e a contagem realizada pelosistema. A reta indica o que deveria sero resultado teórico, onde a contagemmanual deveria ser igual a do sistema.

A partir destes dados pode-sedeterminar o erro percentual médiopara todas as amostras, que é de 17,6± 18,0%.

Outro gráfico interessante é o quemostra que a distribuição do erroporcentual em relação a quantidade demicroorganismos medidos, apresentadona Figura 11. Este gráfico indica que oerro do sistema não depende daconcentração de células, mas de outrosfatores.

Análises qualitativas permitiramconcluir que o mais importante destesfatores é o agrupamento das células,que pode ocorrer em qualquer con-centração. A Figura 12 mostra a relaçãoentre o agrupamento percentual(definido como a quantidade de célulasagrupadas dividida pelo total decélulas). Pode-se ver que quanto maisagrupadas as células, maior o erropercentual.

A Figura 12 apresenta também (soba legenda Ampliação) erros causadosdevido a uma ampliação demasiadogrande. A ampliação exagerada faz comque as células fiquem com o centromuito claro, fazendo o sistema contarduas ou mais células onde só existe uma.A Figura 13 mostra um exemplo de

Figura 9 – A interface com o usuário.

Figura 10 – Resultados obtidos pelo sistema.

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Finalmente, o sistema está sendoutilizado pelos alunos de EngenhariaQuímica nas aulas de BiotecnologiaIndustrial, o que vem facilitando otrabalho do dia-a-dia no laboratório epermitindo a obtenção de resultados deconcentração celular de maneirasimples e rápida. ❑

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Figura 11 – Erro Percentual das medidasrealizadas.

Figura 12 – Agrupamento Percentual x ErroPercentual.

Figura 13 – Grande ampliação gera erros.

Figura 14 – Aglomeração sobre linhas e faltade foco.

ampliação exagerada. Finalmente,outros dois problemas que geram errosde contagem são a concentração decélulas sobre as linhas de marcação e afalta de foco, mostrados na Figura 14.Refazendo o cálculo do erro percentualmédio, levando em conta apenas asamostras que não apresentamproblemas de aglomeração nemampliação exagerada, chega-se a umresultado de 5,2 ± 8,8%. Vale lembrar queesta situação não é impossível de seatingir no laboratório, bastando apenaso controle por parte do usuário sobre aescolha das imagens a serem analisadas.

Conclusão

Este artigo apresentou um sistemaque permite a contagem de microor-ganismos de maneira semi-automática,utilizando uma Câmera de Neubauer.Testes realizados com a contagem deleveduras permitiram concluir que osistema é eficiente e preciso quando ascélulas analisadas se encontramseparadas. Trabalhos futuros incluem autilização de algoritmos mais poderosos,como Redes Neurais Artificiais,Morfologia Matemática ou outrastécnicas de Visão Computacional, paraa contagem de diferentes tipos demicroorganismos.

Desta maneira, o sistema que foidesenvolvido inicialmente para realizara contagem de leveduras, pode serestendido para qualquer imagem ondeexistam padrões repetidos, como emmedidas biológicas (células sangüíneas,bactérias, células de tecidos em geral),em metalurgia, na análise de desgastede motores através da análise das partí-culas existentes no óleo, entre outras.

O sistema descrito é dito semi-automático pois exige que o usuárioposicione a lâmina usando os parafusosde posicionamento. Um sistema com-pletamente automático deve controlar avarredura da lâmina, utilizando ummicroscópio com posicionadores servo-controlados.