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UNIVERSIDADE CRUZEIRO DO SUL
PROGRAMA DE PÓS- GRADUAÇÃO
DOUTORADO EM ODONTOLOGIA
AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA DAS ENZIMAS COX-1,
COX-2 NO MODELO DE TUMOR DE WALKER 256 EM PATA DE
RATO APÓS AVALIAÇÃO COM LASER DE BAIXA INTENSIDADE
JOSÉ EDUARDO BACCI
Orientador: Prof. Dr. Lúcio Frigo
Tese apresentada ao Doutorado em Odontologia da Universidade
Cruzeiro do Sul, como parte dos requisitos para obtenção do título de
Doutor em Odontologia
São Paulo
2015
2
UNIVERSIDADE CRUZEIRO DO SUL
PROGRAMA DE PÓS- GRADUAÇÃO
DOUTORADO EM ODONTOLOGIA
AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA DAS ENZIMAS COX-1,
COX-2 NO MODELO DE TUMOR DE WALKER 256 EM PATA DE
RATO APÓS AVALIAÇÃO COM LASER DE BAIXA INTENSIDADE
JOSÉ EDUARDO BACCI
Dissertação de Doutorado defendida e aprovada pela
banca examinadora em _____/____/2015.
BANCA EXAMINADORA:
__________________________________________
Prof. Dr. Lúcio Frigo
Universidade Cruzeiro do Sul (UNICSUL)
_________________________________________
Prof. Dr. Pedro Antonio Fernades
Universidade Cruzeiro do Sul (UNICSUL)
___________________________________________
Prof. Dr. Maurício Teixeira Duarte
Universidade Cruzeiro do Sul (UNICSUL)
___________________________________________
Prof. Dr. José Raul Girondi
___________________________________________ Prof. Dr. Artur Cerri Associação Paulista de Cirurgião Dentista
3
Dedicatória:
Para meus pais, José e Mathilde e minhas irmãs, Regina e Rosângela, por tudo
que significam pra mim.
4
Agradecimentos:
Á Deus, por estar sempre comigo.
Ao meus amigos Pedro Antônio Fernades e Maurício Teixeira Duarte, pois muito
do que sou hoje foi graças á ajuda e amizade de vocês.
Ao Prof. Dr. Lucio Frigo, muito obrigado pela ajuda, paciência e compreensão.
Ao meus amigo e irmão Luis Fernando Ferrari Bellasalma (Fernandinho),
Priscila dos Santos Alves e Amauri Frederico Patriota, por existirem na minha
vida.
Ao meu amigo Fernado Martins Baerder, pela grande força e pela coragem de
dizer coisas que somente amigos dizem.
À Universidade Cruzeiro do Sul, minha casa, que me deu apoio para a realização
deste trabalho.
5
Avaliação da expressão gênica das enzimas Cox-i, Cox-2 no modelo de tumor de Walker 256 emmpata de rato após irradiação com laser de baixa intensidade [tese]. São Paulo: Universidade Cruzeiro do Sul; 2015.
RESUMO
A dor e inflamação são experimentadas por pacientes com câncer em diferentes períodos de doença, podendo ser intensa em seu inicio e crônica em seu estágio mais avançado. A liberação das ciclooxigenases (COX) que ocorre como resposta tecidual frente a um tumor, leva á indução das ciclooxigenases COX-1, e COX-2, que também participam do processo inflamatório. Neste estudo foi realizada a indução de tumor de Walker 256 no dorso da pata do rato, levando ao desenvolvimento de massa tumoral causando dor e inflamação. Neste trabalho, foram avaliados a expressão gênica de enzimas COX-1,CO2 e IL-10 em trinta ratos wistar inoculados com células tumor de walker 256 obtidas pelo fuido ascético colhido de cavidade peritoneal. Um grupo foi irradiados (LBI; infravermelho, 810-nm). E outro grupo submetido a tratamento com AINES (nimesulida). Os resultados deste trabalho permitiram concluir que grupos tratados com nimesulida a 6J de potência apresentam aumento de expressão gênica de COX1 (p<0,005). Grupos tratados com laser a 1J mostraram diminbuição significativa nas expresses gênicas de COX2 (p<0,005). Os grupos tratados com laser apresentaram menores níveis de IL-10, não interferindo nos processos imunológicos quando comparados com nimesulida. Palavras chave: laser de baixa intensidade, biomodulação, mediadores inflamatórios.
6
ABSTRACT
Pain and inflammation are experienced by cancer patients at different stages
of disease and can be intense in its beginning and chronic in its most advanced stage. The release of the cyclooxygenase (COX) which occurs as a tissue response to a tumor, leading to induction of cyclooxygenase COX-1 and COX-2, also involved in the inflammatory process. This study was performed to induce Walker 256 tumor on the dorsum of the rat paw, leading to tumor development causing pain and inflammation. In this work, we evaluated the gene expression of COX1 enzymes, CO2 and IL-10 in thirty Wistar rats inoculated with Walker tumor cells 256 obtained by ascetic fuid harvested from the peritoneal cavity. One group was irradiated (LBI, infrared, 810-nm). And another group undergoing treatment with NSAIDs (nimesulide). The results of this study indicate that groups treated with nimesulide 6J power have increased gene expression of COX1 (p <0.005). Treated groups showed significant 1J laser diminbuição the COX2 gene expressions (p <0.005). The laser treated groups showed lower levels of IL-10, not interfering in immunological processes compared to nimesulide.
Key Words: low-intensity laser, biomodulation, inflammatory mediators.
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Lista de Abreviaturas e Símbolos
%: Porcentagem.
um: Micrômetro.
Al: Alumínio.
ATP: Adenosina-Trifosfato.
C: Carbono.
Ca2+ : Cálcio
cm: Centímetro.
cm2 : Centímetro quadrado.
λ: Comprimento de onda
DE: Densidade de Energia.
DNA: Sigla em inglês para ácido desoxirribonucléico.
et al.: et alli, e outros.
Fe: Ferro.
Fig.: Figura.
g: Grama.
GaAs: Arsenieto de Gálio.
GaAIAs: Arsenieto de Gálio e Alumínio.
H: Hidrogénio.
h: Hora
He-Ne: Hélio-Neônio.
Hz: Hertz
8
InGaAIP: Fosfeto de índio Gálio e Alumínio.
J: Joules.
K+ : Potássio
Kg: Kilograma.
Laser: Sigla em inglês para luz amplificada por emissão estimulada de
radiação.
LBI -: Laser de Baixa Intensidade
LLLT: sigla em inglês para low-level laser therapy.
mg: miligrama
m2 : metro quadrado
min.: Minuto.
mm: Milímetro.
mW: Miliwatts.
N: Nitrogênio.
n: Número
Na+ : Sódio
nm: nanometro.
O: Oxigénio.
P: Potência.
PBS: Fosfato tamponado salino
pH: Potencial hirogênico.
RNA: Sigla em inglês para ácido ribonucléico.
s: Segundo.
9
Y: Ítrio
W: Watts.
10
Lista de Gráficos
Gráfico 1: Análise quantitativa de COX-1 por PCR-RT............................................47
Gráfico 2: Análise quantitativa de COX-2 por PCR-RT...............................48
Gráfico 3: Análise quantitativa de COX-1 por PCR-RT...........................................49
11
SUMÁRIO
1.INTRODUÇÃO........................................................................................................12
2. REVISÃO DA LITERATURA.................................................................................15
2.1. Laser de Baixa Intensidade................................................................................15 2.1.1. Efeitos primários diretos..................................................................................18 2.1.1.1. Efeitos bioquímicos......................................................................................18 2.1.1.2. Efeitos bioelétrico.........................................................................................19 2.1.1.3. Efeitos bioenergético....................................................................................19 2.1.2. Efeitos secundários ou indiretos......................................................................20 2.1.2.1. Estímulo ao trofismo celular.........................................................................20 2.1.2.2. Estímulo á microcirculação...........................................................................21 2.1.3. Laser da baixa intensidade: biomodulação tecidual........................................23 2.2. Tumor de Walker 256.........................................................................................29 2.3. Processo Inflamatório.........................................................................................31 2.3.1. Ciclioxogenase (COX).....................................................................................32 2.3.1.1. Inibidores da COX-2 e efeitos teciduais.......................................................34
3. PROPOSIÇÃO.......................................................................................................42
4. MATERIAIS E MÉTODOS.....................................................................................43
4.1. Animais...............................................................................................................43 4.2. lnoculação das células do Tumor de Walker 256...............................................43 4.3. Análise ...............................................................................................................44 4.4. Divisão de tratamento.........................................................................................44 4.5. Análise por RT-PCR...........................................................................................45
5. RESULTADOS.......................................................................................................47 5.1. Análise quantitativa de COX-1 por PCR-RT.......................................................47 5.2. Análise quantitativa de COX-2 por PCR-RT.......................................................48 5.3. Análise quantitativa de COX-1 por PCR-RT.......................................................49
6. DISCUSSÃO..........................................................................................................50
7.CONCLUSÃO.........................................................................................................57 REFERÊNCIAS..........................................................................................................58
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1. Introdução
A laserterapia tornou-se uma realidade em muitos países. Seu emprego, por
profissionais da área odontológica e médica, tem crescido constantemente. (Mester,
1985). A palavra LASER é um acrônimo de "Light Amplification by Stimulated
Emission of Radiation", ou seja, "Luz Amplificada por Emissão Estimulada de
Radiação". Uma das mais significantes descobertas da ciência no século passado, o
laser envolve novas e incalculáveis perspectivas no campo das pesquisas biológicas
e aplicações nos mais diversos campos da saúde. O princípio da emissão
estimulada foi proposto primeiramente, sob forma teórica, por Einstein, em 1917: a
emissão estimulada de radiação é causada pela presença de um fóton indutor de
energia interagindo com um átomo em seu estado excitado, resultando na liberação
de dois fótons induzidos (GUTKNETCHT & EDUARDO, 2004).Um dos pioneiros na
pesquisa da aplicação do laser nas áreas biomédicas foi Endre Mester, onde,
utilizando um laser de rubi, demonstrou os efeitos não térmicos do laser na
cicatrização de feridas em pele de ratos.
Desde então, vários trabalhos tem sido publicados e confirmados por mais de
1000 estudos sobre o mecanismo primário e o efeito cascata secundário que
contribuem para alcançar os efeitos do tecido local e sistêmicos.
A primeira lei da fotobiologia afirma que para a luz de baixa potencia visível
ter qualquer efeito em um sistema biológico vivo, os fótons devem ser absorvidos por
bandas de absorção eletrônica pertencentes a alguns fotorreceptores moleculares
ou cromóforos (Sutherland, 2002). Um cromóforo é uma molécula (ou parte de uma
molécula) que confere alguma cor definida do composto dos quais é um ingrediente.
13
A fototerapia é caracterizada em induzir um processo fotobiológico em
células. São necessárias a exata ação do espectro para a determinação dos
fotorreceptores bem como para outras investigações do mecanismo celular para a
fototerapia. O espectro de ação mostra em qual específico comprimento de onda da
luz é mais efetivamente usado em uma específica reação química (Karu e Koltakov,
2005). O fato de que a ação do espectro pode ser utilizada para várias respostas
celulares confirma a primeira lei da fotobiologia (absorção da luz por um cromóforo
molecular específico).
O espectro de absorção obtido para citocromo c oxidase (COX) em diferentes
estados de oxidação foram registrados e verificou-se ser muito semelhante ao do
espectro de ação para respostas biológicas a luz, (karu and Kolyakov 2005). Por isso
foi proposto que a COX é o receptor primário para a gama vermelho –infravermelho
em células de mamíferos (karu and Kolyakov 2005). O óxido nítrico produzidos pelas
mitocôndrias inibem a respiração por ligação a Cox e deslocando competitivamente
o oxigênio, especialmente em células estressadas ou hipóxicas. O aumento do óxido
nítrico pode as vezes ser medido em cultura celular ou em animais após após LBI
devido a sua liberação pela mitocôndria e cox. Tem sido proposto que o LBI pode
trabalhar na fotodissociação do óxido nítrico do cox, revertendo assim a inibição da
respiração mitocondrial devido a ligação excessiva de NO (Lane, 2006).
Neste estudo a indução do tumor de walker 256 no dorso da pata do rato, que
leva ao desenvolvimento da massa tumoral e causa dor e inflamação, podem ser
melhoradas com o uso de laserterapia.
O objetivo deste estudo foi avaliar a expressão gênica das enzimas cox-1, cox2- no
modelo de tumor de walker 256.
14
2. Revisão de literatura
15
2.1- Laser de baixa intensidade
Em 1960 Teodore Maiman desenvolveu o primeiro aparelho de laser,
utilizando um cristal de rubi como meio ativo e operado em alta intensidade. O laser
é uma forma de radiação eletromagnética que possui propriedades únicas que a
diferenciam de outras fontes luminosas, que ao contato com diferentes tecidos
promove, de acordo com a potência e o comprimento de onda, efeitos fototérmicos e
fotoquímicos. É uma luz monocromática, onde a radiação é formada pela emissão
de fótons, todos da mesma cor e com o mesmo comprimento de onda. Possui
coerência no tempo e no espaço, onde as energias dos fótons se somam e estes,
viajam na mesma direção. Outra característica é a colimação, que confere à luz laser
um feixe paralelo ou com pequena divergência, que pode ser concentrado com o
uso de um sistema de lentes (GENOVESE, 2007).
A existência da fotoestimulação pelos lasers de baixa intensidade, tópico tão
controverso e pouco entendido antes de 1980, tem sido objeto de intenso estudo
científico. A aplicação clínica demonstra a evidência factual então obtida onde
extensivas discussões da ação (com possíveis mecanismos) da luz visível
monocromática nos fotorreceptores primários de células e organismos têm
encantado tanto os profissionais clínicos quanto os pesquisadores. Para que o laser
possa funcionar, devem ser satisfeitas, simultaneamente, três condições
fundamentais. Em primeiro lugar, é necessário dispor de um meio ativo, ou seja, de
uma coleção de átomos, moléculas ou íons, que emitam radiação na parte óptica do
espectro. Em segundo lugar, deve ser satisfeita uma condição conhecida sob o
nome de inversão de população. Esta condição, geralmente não preenchida em
nosso ambiente natural, é gerada por um processo de excitação denominado
16
bombeamento: ela transforma o meio ativo em meio amplificador de radiação.
Finalmente, é indispensável dispor de uma reação óptica para que o sistema
composto por essa reação óptica e pelo meio ativo, sejam a sede de uma oscilação
laser (ALMEIDA LOPES et al., 2001).
O Laser operando em baixa intensidade foi considerado um bioestimulador,
pois notou-se seus efeitos de estimular e acelerar os processos de cicatrização,
mas, a partir de estudos clínicos e laboratoriais, ficou evidente que essa terapia não
somente acelerava determinados processos, mas também retardava outros, e que
essa era uma função biomoduladora do laser (MESTER et al, 1971).
Os Lasers em baixa intensidade mais utilizados em odontologia são os de
Hélio-neônio, argônio e o arsenieto de gálio-alumínio. O bombardeamento desses
lasers pode ser realizado de várias maneiras, porém a forma mais usual é a
utilização do semicondutor na forma de diodo, com excitação produzida por uma
corrente elétrica. Ele apresenta potência pico de alguns mW, e comprimento de onda
na faixa do infravermelho, por volta de 830nm. Esse Laser apresenta uma grande
profundidade de penetração nos tecidos, pois a água e a hemoglobina apresentam
um baixo coeficiente de absorção para esse tipo de radiação (ZEZELL et al., 2004).
Os lasers são classificados de acordo com muitos critérios. A mais ampla
classificação é aquela que divide os lasers em dois grandes grupos, de acordo com
a sua ação terapêutica em lasers cirúrgicos e os lasers clínicos. Os lasers podem ser
também classificados de acordo com seu funcionamento, em contínuo ou pulsátil, e
ainda com a natureza do seu meio ativo em sólidos, gasosos, ou semicondutores.
Como exemplo de meio ativo sólido cita-se o laser rubi; de meio gasoso, o CO2 e o
17
He-Ne; meio líquido (laser com corante ou dye laser), o rodamina e o cumarina;
semi-sólidos, o YAG e os de neodímio. Os lasers semicondutores são os de
arseneto de gálio (AsGa), arseneto de gálio-alumínio (AsGaAl) e fosfeto arseneto de
gálio-índio (InGaAsP). Os lasers mais comuns são variações do gálio: arseneto de
gálio-alumínio ou alumínio-arsênio (AsGaAl), que emite um espectro na faixa do
infravermelho, ou o fosfeto arseneto de gálio-índio (InGaAsP), que emite espectro
visível de luz vermelha (λ=600-680 nm) com potência entre 10 e 50 mW.
(GENOVESE, 2000; WALSH, 1997).
Também é utilizada a seguinte classificação: os lasers cirúrgicos ou HILT
(High-Intensity Laser Therapy), os lasers não-cirúrgicos, terapêuticos, LILT (Low-
Intensity Laser Therapy), ou ainda, laser de baixa potência, em inglês LLLT (Low-
Level Laser Therapy), e os SLAT (Selective Laser Treatment). (PINHEIRO &
FRAME, 1992).
Os primeiros sistemas LILT (Low Intensity Laser Therapy) tinham como meio
ativo uma mistura gasosa de gás hélio e neônio (lasers de HeNe) que emitiam no
vermelho (632,8 nm), mas que apresentam também outra linha de emissão no
verde. Atualmente os sistemas laser LILT são, na sua grande maioria, constituídos
de um cristal confeccionado em laboratório de diodo semicondutor de arseneto de
gálio (GaAs) podendo estar dopado por diversos outros elementos, dependendo do
comprimento de onda desejado (p. ex., In-índio dopa o cristal para emitir no
vermelho) (GUTKNECHT & EDUARDO, 2004).
Os parâmetros fundamentais do protocolo de irradiação laser essêncial, para
comparação dos dados são os seguintes: comprimento de onda, freqüência,
potência de saída, diâmetro do spot, tempo de irradiação, intensidade, dose, e
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intervalos de tratamento. O tamanho do spot e o tempo de exposição são de
importância significante porque eles determinam a intensidade e a dose e,
portanto,as respostas celulares para a incidência da luz. A termicidade e reações
fotoquímicas são a base do laser de baixa potência, ocorrendo com densidades de
potência entre 10-2 e 100 W/cm2 e densidades de energia entre 10-2 e 102 J/cm2.
(SCHINDL et al., 2000).
O comprimento de onda depende do meio ativo que também determina a
afinidade ou não do laser com o tecido-alvo (BRUGNERA JR. et al., 2003). A
escolha do comprimento de onda determina a profundidade de penetração do laser
nos diferentes tecidos (KNAPPE et al., 2004).
2.1.1. Efeitos Primários ou Diretos
2.1.1.1. Efeito Bioquímico
Karu et al., (1995) demonstraram que a radiação laser exerce estímulo na
produção de ATP no interior das células, originando e provocando a aceleração da
mitose, fato que se produz quando há um aumento desta enzima das mitocôndrias.
O efeito bioquímico, como certos fármacos não-opiáceos, interfere na produção de
prostaglandinas, pela interferência na atividade da ciclooxigenase que intermedia a
produção desta substância pelo ácido araquidônico (CAMPANA et al., 1998).
2.1.1.2. Efeito Bioelétrico
19
Toda célula tem em seu interior mais cargas negativas do que positivas. No
meio extracelular, existem substâncias de cargas positivas, como o Na+ e K+. A
diferença de potencial deve-se a existência de diferentes concentrações de íons
positivos ou negativos dentro ou fora da célula, o que mantém a pressão osmótica
da membrana celular, determinando a sua permeabilidade e agindo no limiar da
condução da dor, impedindo que os estímulos dolorosos se transmitam aos centros
superiores (KARU et al., 1995; BORTOLETTO et al., 2004). Os íons de sódio são
abundantes no meio externo e pode penetrar com facilidade pela membrana.
Entretanto, a célula deve expulsá-los mediante um mecanismo denominado “bomba
de sódio e potássio” e que, logicamente, precisa de uma energia para seu
funcionamento. Essa energia é extraída da hidrólise da ATP. Em condições
patológicas, as células não podem manter seu potencial de membrana, isto é, o
gradiente iônico de ambos os lados dessa membrana se transforma, podendo
chegar à zero ou inclusive inverter-se. As ações terapêuticas da energia a laser se
manifestam das seguintes formas: De modo direto, atuando sobre a mobilidade
iônica; De modo indireto, aumentando a quantidade de ATP produzida pela célula. O
efeito bioelétrico da radiação laser ajuda a normalizar o potencial da membrana,
atuando como reequilibrante e normalizador da atividade funcional da célula (KARU
et al., 1995).
2.1.1.3. Efeito Bioenergético
Há cerca de 70 anos o efeito bioenergético foi estudado a partir de diversos
cultivos celulares independentes e, observou-se que, quando se iniciavam as
mitoses em um deles, notou-se o mesmo processo nos outros. No entanto se
repetisse a mesma experiência interpondo uma barreira de vidro entre esses
20
cultivos, a referida reação não chegava a ocorrer. Desse fato pode deduzir-se que as
células vivas emitem irradiações próprias. Fazendo-se uma análise espectral
observou-se que essas irradiações vão desde o ultravioleta ao infravermelho. Esses
resultados levaram alguns pesquisadores a citar essas experiências para explicar os
efeitos do laser como um fenômeno de indução biológica, uma vez que, irradiando
uma zona, as mais próximas seriam beneficiadas. Dessa forma, pode-se admitir que
as radiações laser proporcionam às células, tecidos e organismos, em conjunto, uma
energia válida e que estimula, em todos os níveis, o trofismo, normalizando as
deficiências e equilibrando as desigualdades.
2.1.2. Efeitos Secundários ou Indiretos
Após a ação do efeito primário há ocorrências secundárias tais como o
estímulo ao trofismo celular e a microcirculação.
2.1.2.1. Estímulo ao Trofismo Celular
Com o aumento da produção de ATP, causada pela aplicação da energia
laser de baixa intensidade, a velocidade de mitose é aumentada. Esse fato indica
que o laser de baixa intensidade pode aumentar os processos de reparação tecidual;
isto é, devido ao estímulo na capacidade de cicatrização do tecido conjuntivo. Esse
fator contribui para reparar perdas de substância, sobretudo úlceras de diversas
origens, como a ulceração aftosa recorrente e reparação de feridas cirúrgicas (NARA
et al., 1990; GUZZARDELLA et al.,2002).
2.1.2.2. Estímulo a microcirculação
21
No sistema circulatório, as artérias se dividem e diminuem progressivamente
de calibre até que, posteriormente às arteríolas, abre-se a rede capilar, com abertura
e fechamento comandados pela atuação de um músculo chamado esfíncter pré-
capilar. Em circunstâncias normais, funciona de forma periódica, ativando ou
cessando o funcionamento das diferentes regiões (JUNQUEIRA & CARNEIRO,
1999).
Parece que a radiação laser tem uma ação indireta sobre o esfíncter pré-
capilar, por meio de mediadores químicos, paralisando-o e produzindo sua abertura
constante e, portanto, um estímulo a microcirculação. Admite-se que um dos
intermediários, não o único, é a liberação de histamina. O fato é que a dilatação
produzida é persistente e pode manifestar a maior ou menor distância, segundo a
potência de radiação (BENEDICENTI et al., 1984).
O laser de baixa intensidade produz efeito acalórico. Portanto, se houver
aumento de temperatura no local de aplicação da energia laser, deve-se ao aumento
do metabolismo celular e da vasodilatação provocada na região (GUTKNECHT &
EDUARDO, 2004).
Foi demonstrado que o laser de baixa intensidade aumentava o grau de
vascularização do tecido neoformado, quando se irradiava feridas em processo de
cicatrização (PRETEL et al., 2002; NICOLAU et al., 2003). A bioestimulação com
laser de baixa potência começou na Hungria com Mester (1966) e a partir daí até a
década de 80, foram reportados vários experimentos in vivo que visavam à
estimulação do processo de cicatrização de feridas e estudos em modelos usando
feridas e queimaduras em pele e mucosa de animais (MESTER et al., 1985). Os
primeiros estudos foram feitos in vivo e concluíam que o laser de baixa potência
22
afetava o processo metabólico celular e aumentava o potencial regenerativo dos
tecidos biológicos. Muitos desses trabalhos demonstravam os efeitos do laser de
baixa potência e o reconheciam como terapêutico, entretanto, os autores ainda não
conseguiam explicar completamente sua ação, sobretudo quando lhe atribuíram uma
importante ação sistêmica (MESTER et al., 1985).
Havia a necessidade, todavia, de serem feitos experimentos onde se
trabalhassem com modelos mais específicos como células, ou grupo delas,
isoladamente dentro de um determinado processo complexo, como é a cicatrização,
por exemplo, e assim se pudesse chegar a resultados mais conclusivos. Foi quando
começaram a aparecer trabalhos in vitro, com modelos em cultura de células,
buscando dessa forma maior facilidade para fixação de parâmetros e limitação de
variáveis nesses experimentos (KARU et al., 1995; DORTBUDAK et al., 2000;
BORTOLETTO et al., 2004).
A partir do final da década de 80, muitos autores e suas equipes como Karu et
al., 1995, passaram a buscar exaustivamente explicações para a elucidação dos
mecanismos de ação do laser de baixa intensidade. Os lasers emitindo na região do
visível foram os mais utilizados na terapia de cicatrização de feridas, desde Mester
(1966), mas com o advento dos diodos lasers semicondutores os clínicos
começaram a trabalhar principalmente com comprimentos de onda emitidos no
infravermelho próximo, devido ao baixo custo desses equipamentos.
Karu em 1988 sugeriu um mecanismo de ação diferente para os
comprimentos de onda emitidos no visível e no infravermelho próximo, já que alguns
autores tinham observado in vitro diferenças significativas quando trabalharam com
23
ambos. Com o passar do tempo, essas diferenças de resultados foram confirmadas
in vitro por outros pesquisadores (ALMEIDA LOPES et al., 2001).
É claramente observado nos dados da literatura que os efeitos do laser foram
dose-dependente. Parâmetros de irradiação, como fluência e irradiância foram
altamente relevantes para a obtenção de bons resultados. Os efeitos do laser de
baixa potência dependeram da fluência, energia, potência e comprimento de onda in
vitro (KARU et al., 1995; DORTBUDAK et al., 2000) e in vivo (TAKEDA, 1988;
NICOLLI FILHO & OKAMOTO, 1994).
A fluência administrada, 2 J/cm2, para reparação e cicatrização de feridas em
pele e mucosa comprovou-se eficaz em diferentes trabalhos clínicos e laboratoriais
(MESTER et al., 1985; ALMEIDA LOPES et al., 2001; PRETEL et al, 2002). O
mecanismo de ação do laser no processo de reparação e cicatrização tecidual ainda
não está totalmente esclarecido, entretanto, não há dúvida que a radiação laser
aumenta o Ca2+ intracelular (KARU et al., 1995).
2.1.3 Laser de Baixa Intensidade: BiomodulaçãoTecidual
Belkin; Schwartz (1989) enfatizaram que embora o fenômeno associado ao
laser de baixa intensidade, os seus bioefeitos estão longe de ser esclarecidos,
apesar de existir. Por razões médicas, científicas e de segurança, e também para
evitar charlatanismo, esses bioefeitos deveriam ser investigados por equipes
multidisciplinares de físicos, biólogos e cirurgiões.
Os diferentes tipos de laser de baixa densidade de potência possuem um
efeito eminentemente analgésico, antiinflamatório e bioestimulante. A laserterapia,
24
com essa finalidade, provoca um aumento da microcirculação local e da velocidade
da cicatrização (ALMEIDA LOPES et al., 2001).
A terapia com laser de baixa intensidade envolve a irradiação de 1 a 4 J/cm2
no local de tratamento, com potência estabelecida entre 10 mW a 90 mW.
Felizmente, a irradiação laser e a óptica tecidual foram estudadas extensivamente.
As características da irradiação laser – coerência, colimação, e monocromaticidade
– foram examinadas em detalhes. Em particular, a coerência e colimação não foram
cruciais já que elas foram rapidamente degradadas pelo espalhamento como um raio
passa através do tecido. Apoiando sua relativa falta de importância está o fato que
tanto os diodos laser quanto a luz não-coerente podem alterar os processos
biológicos. Monocromaticidade, contudo, pareceu ser uma característica importante.
Estudos laboratoriais suportaram o conceito que a irradiação laser pode modificar os
processos celulares na dependência do comprimento de onda, de comportamento
não-térmico. Outra hipótese é que a intensidade suficiente para produzir esses
efeitos nas células poderia ser distribuída para as uniões superficiais e tecidos
tipicamente tratados com laserterapia.(BASFORD, 1995).
As funções terapêuticas no campo da biomodulação do processo inflamatório
são geralmente desenvolvidas no espectro vermelho e infravermelho da luz, de λ
600 nm a λ 900 nm, aproximadamente. (TUNÉR & CHRISTENSEN, 2002).
A atuação do laser de baixa potência ocorre no campo da biomodulação,
descrita também como bioestimulação. Muitas vezes encontram-se as duas
terminologias na literatura desenvolvidas como sinônimos. Biomodulação seria a
nomenclatura mais apropriada, visto que, esta terapia poderia tanto estimular o
25
processo biológico, atrasar o processo de reparação, como suprimi-lo,
intencionalmente ou não, trabalhando na dependência do fenômeno biológico
desejado. (BASFORD, 1995; BELKIN & SCHWARTZ, 1989; SCHINDL et al., 2000;
TUNÉR & CHRISTENSEN, 2002).
A biomodulação atribui-se o aumento do alcance dos efeitos biológicos, desde
o crescimento epitelial e fibroblástico, estimulação da síntese de colágeno, aumento
da capacidade de fagocitose e de liberação de endorfina. (MESTER, 1985).
Densidades de energia diminutas poderiam não provocar efeitos observáveis,
enquanto que altas doses eventualmente acarretariam na diminuição das funções
celulares. Foi estabelecido, em relação ao uso “in vivo” do laser, que potências
menores que 4 mW não proporcionariam, nos tecidos, efeitos biológicos,
independentemente do tempo total de irradiação. Em relação à quantidade de
energia, observou-se que, para a promoção de efeitos biológicos, deveriam ser
privilegiadas doses de no mínimo 1.104 J/m2 e no máximo 4.104J/m2, pois
dosimetrias mais elevadas poderiam acarretar na inibição da resposta celular.
(SOMMER et al., 2001).
Os mecanismos básicos da interação tecido – irradiação do laser de baixa
intensidade, ainda não estão esclarecidos. Os mecanismos de ação da irradiação
ultravioleta foram investigados intensivamente, e serviram de parâmetro para várias
hipóteses bem estabelecidas na indução de efeitos fotobiológicos nas células pela
luz visível e luz infravermelha de baixa intensidade. Basicamente, dois tipos de
reações podem ser distinguidos em fotobiologia: primárias (induzidas pela luz) e
secundárias (não-esclarecidas). Pelo menos quatro diferentes explanações têm sido
propostas para responder a questão de como a irradiação do laser não-cirúrgico
26
pode interagir com células vivas. A teoria de Olson afirma que a absorção primária
da luz pelas enzimas mitocondriais resultam no aquecimento local ocasionado pelo
aumento da vibração molecular; a teoria de Karu explica que a luz laser induz efeitos
estimulantes e inibitórios, respectivamente, sendo o resultado da absorção laser
pelas flavinas e citocromos na cadeia respiratória mitocondrial, principalmente para
alterações de transferência de elétrons na oxi-redução aí existente; a teoria de
Lubart relata que a existência de oxigênio simples fotoinduzido pelas porfirinas
endógenas é outro caminho provável; a teoria de Smith, uma modificação da teoria
de Karu, mostra que próximo à radiação infravermelha em um caminho adicional
poderia ativar diretamente os canais de Ca2+ na membrana celular pelas
modificações fotofísicas, desta maneira induzindo o influxo de Ca2+ e a proliferação
celular. Provavelmente, dois ou mais destes caminhos podem ser influenciados
simultaneamente pela irradiação laser e contribuir para as respostas biológicas
observadas. A alteração do pH intracelular, que é relatado para a ativação das
ATPases e seguido pelas mudanças nos níveis de cálcio intracelular, é o caminho
comum para o sinal de transdução e amplificação de todas as reações primárias.
Uma mudança no estado de oxi-redução em direção a oxidação leva ao aumento do
Ca2+ intracelular e à estimulação do metabolismo celular, uma vez que a redução
leva ao esgotamento do Ca2+ intracelular e, assim, a inibição do metabolismo. Altos
níveis de Ca2+ intracelular são necessários para estimular vários processos
biológicos, como a síntese de DNA e RNA, mitose celular, e secreção proteica.
Ainda, altos níveis de Ca2+ podem levar a inibição do metabolismo celular.
(SCHINDL et al., 2000).
A estimulação mitocondrial foi proposta por Karu (1989). Fotorreceptores
podem fazer parte da cadeia respiratória mas a fotosensibilidade não é específica
27
para a luz laser. É possível que a luz monocromática possa modificar a proliferação
celular. A concentração de cAMP muda nas células após elas serem irradiadas em
638,8 e 760 nm. A autora propôs que a luz do laser de baixa potência, visível, pode
estimular as células para aumentarem sua proliferação. A fotorecepção, ocorrendo
em nível mitocondrial, pode intensificar o metabolismo respiratório e as propriedades
eletrofisiológicas da membrana, desta maneira, mudando a fisiologia celular. Afirmou
ainda que a biomodulação laser é um fenômeno fotobiológico e que não é
necessária a coerência da luz. Os fotoaceptores primários são componentes da
cadeia respiratória. Isto explica a universalidade dos efeitos do laser de baixa
potência. Os componentes da cadeia respiratória podem ser os fotoaceptores no
caso da estimulação do metabolismo celular, bem como inibidores dependendo da
dose de energia. Em baixas doses, a irradiação causa regulação da oxi-redução do
metabolismo celular; em altas doses o dano é prevalente. O quantum de luz é
somente um gatilho para a regulação do metabolismo celular. Isto explica as baixas
doses e intensidades necessárias. A magnitude do efeito de bioestimulação
depende do estado fisiológico da célula antes da irradiação. Isto explica por que o
efeito de bioestimulação não é sempre possível. Os efeitos terapêuticos do laser de
baixa potência podem ser explicados pelo aumento da proliferação do G0 e G1
celular ou pelas mudanças na atividade fisiológica das células ativadas. Foram
descritos alguns dos fenômenos que estão associados aos bioefeitos da laserterapia
de baixa intensidade:
a) Os efeitos requerem um limiar de exposição à irradiação. O limiar é
específico para qualquer combinação tecidual com o comprimento de onda;
b) Os efeitos apresentam estimulação ou inibição de atividades bioquímicas,
fisiológicas e proliferativas;
28
c) Altas energias, dentro de limites específicos para cada combinação laser-
tecido, ocasionam prejuízo;
d) Os efeitos são dose-dependentes. Esta relação não é simples, mas é
relatada para a maioria das irradiações e parâmetros teciduais;
e) Foi visto que a irradiação coerente não é requerida para obter esses efeitos
e uma pequena faixa de irradiação não-coerente apropriada é suficiente para
produzir a maioria ou todos eles;
f) A irradiação direta do tecido alvo não é sempre requerida. A irradiação
transcutânea penetra profundamente para produzir efeitos suficientes em muitos
casos;
g) A irradiação local pode ter efeitos sistêmicos.
Rochkind et al. (1989) estudaram o efeito sistêmico do laser de baixa
intensidade em ratos. Para tal fim utilizaram um laser de comprimento de onda de
632,8 nm com potência útil de 16 mW e diferentes densidades de energia por um
período de 21dias. Afirmaram que os efeitos sistêmicos encontrados são relevantes
nos termos de aplicação de irradiação do laser de baixa potência, tanto na clínica
quanto em pesquisas. Concluíram que a irradiação do laser de baixa intensidade
exerce pronunciados efeitos sistêmicos na pele e nos tecidos subjacentes, e que
esses efeitos persistem muito tempo depois de uma única aplicação.
29
2.2. Tumor de Walker 256
O carcinossarcoma 256 de Walker é muito utilizado em modelos
experimentais em ratos. Foi identificado pela primeira vez pelo Prof George Walker
em 1928 como um tumor de glandula mamária de crescimento espontâneo em uma
rata albina grávida (Rattus nor-vegicus). Ele observou que esta neoplasia regredia
totalmente durante a lactação, mas que aparecia novamente após esse periodo. Foi
inicialmente classificado histologicamente como carcinoma. MAis tarde testes de
transplantabilidade mostraram a capacidade de fragmentos do tumor original
crescerem em ratos receptores (Earle, 1935). Depois de transplantes ao longo de
muitos anos, várias subcepas morfologicamente diferentes deste tumor foram
identificados e classificados como carcinoma, sarcoma, e carcinossarcoma mista.
Várias vias de inoculação ja foram utilizadas para administração das células
tumorais de W256, como o tecido ósseo a via subcutânea, intraperitoneal
intramuscular, intrapleural e intracardíaca (Iwama et al., 1973).
Quando a via subcutânea (sc) é utilizada há o desenvolvimento de tumores
sólidos, inicialmente firmes a palpação, encapsulados e de forma arredondada, que
provocam infiltração da pele e da musculatura adjacente (Earle, 1935; Iwama, 1979).
Por outro lado, a inoculação destas células tumorais através da via intraperitoneal
(ip), ocasiona o desenvolvimento da forma ascítica do tumor de W256 (Iwama et al.,
1973).
Este tipo de tumor tem sido amplamente utilizados em estudos pré-clínicos de
novas formas de terapia antitumoral e que permite a avaliação dos efeitos individuais
e combinadas de fatores físico-químicos e biológicos em diferentes características
30
desses crescimentos.
Patricia Brigatte et al(2006) apresentou um trabalho no qual utilizou ratos
portadores de tumor de Walker na superfície plantar da pata traseira para o estudo
da dor e metástase do câncer. O crescimento e a metástase foram analisados
histopatologicamente. Para a caracterização dos sintomas de dor, hiperalgesia,
alodinia e dor espontânea foram avaliados de 5 a 8 dias após a injeção das células.
Após o oitavo dia os ratos sacrificados o os resultados avaliados. O crescimento
tornou-se visível após o quinto dia e necrose e sangramento da pele foram
observados no sétimo dia. Fármacos opióides, como a morfina, são eficazes no
controlo dos sintomas de dor neste modelo de cancer Exame macroscópico, nos
dias 7 e 8 não revelou metástases nos pulmões, fígado e rins. Concluíram que este
modelo pode ser apropriado para o desenvolvimento de estudos para investigar
novas abordagens terapêuticas para o controle da dor do cancer.
Qi-Liang Mao-Ying et al (2006) descreveram um estudo em ratos sobre a dor
oncológica através da inoculação intra-tíbia de células cancerígenas de Tumor de
Walker 256 e constataram dor ambulatórial significativa, alodinia mecânica, e
redução na capacidade de peso, assim como o aumento da incidência de atividade
espontânea em fibras Ab no membro afetado. Alodinia mecânica, também foi
observada no membro contralateral, indicando o envolvimento de dor "imagem de
espelho" da dor do cancro ósseo. O presente estudo concluiu que o modelo de rato
é útil e pode contribuir para um estudo mais aprofundado dos mecanismos
subjacentes da dor oncológica.
31
2.3. Processo Inflamatório
O processor inflamatório se dá em resposta á uma lesão provocada por vários
agentes, como por exemplo infecções, traumas e ação de anticorpos. Basicamante
pode ser dividido em 3 fases: 1) Aguda, caracterizada por uma vasodilatação local e
uma permeabilidade capilar aumentada; 2) Sub-aguda caracterizada pela infiltração
de leucócitos e células fagocitárias; 3) E uma fase crônica proliferativa onde ocorre a
degeneração do tecido e fibrose.
Quando de uma lesão tissular periférica, a liberação de fosfolipidios na membrana
celular se tranformam, pela ação da enzima fosfolipaze A2 e forsfolipase C, em
Acido aracdônico. (TILLEY COFFMAN, KOLLER; 2001)
O ácido aracdônico apresenta um papel regulador chave na fisiologica cellular.
Consiste em um ácido graxo de 20 carbonos, liberado a partir de fosfolipidios de
membranas através da enzima fosfolipase A2, a qual pode ser ativada por diversos
estimilos(químico, inflamatório, traumático, mitogênico). É convertido pela
prostaglandina G/H sintase citosólica, também denominada ciclooxigenase (COX),
nos compostos intermediaries PGG2 e PGH2 (BROOKS et. Al., 1999),( TILLEY
COFFMAN, KOLLER; 2001)
A enzima prostaglandina G/H sintase, apresenta dois sítios catalíticos: o sítio
ciclooxigenase e o sítio peroxidase. O sítio ciclooxigenase converte o AA em
PGG2, que por sua vez é reduzida ao intermediário instável, PGH2 pelo sítio
peroxidase, o qual não é inibido pelos AINES (Brooks P et all, 1999).
A PGH2 é convertida pelas isomerases tissulares específicas em múltiplos
prostanóides (prostaglandinas e tromboxanos). As prostaglandinas podem agir de
32
forma parácrina ou autócrina através de duas classes de receptores: os receptores
de membrana ligados à proteína G, e os receptores nucleares PPAR (peroxisome
proliferator activated receptors) (Dubois R et al,1998).
Pela diversidade de receptores específicos e vários mecanismos reguladores,
explica-se a variedade clínica de atuação das prostaglandinas, como: papel central
na inflamação, coagulacão sangüínea, ovulação, parturição, metabolismo ósseo,
crescimento e desenvolvimento neuronal, cicatrização de feridas, função renal, tônus
vascular e respostas imunes.
2.3.1. Ciclooxigenase (COX)
O termo COX deve-se ao seu proposto mecanismo de ação consistir na formação de
peróxidos bicíclicos (endoperóxidos) a partir da oxigenação de ácidos graxos
polinsaturados (Marnett LJ, 1999). Nos últimos anos, tem se tornado claro que
existem duas isoformas homólogas da COX, sendo referidas como COX-1 e COX-2
(Jones R,2001). Em quase todos os tecidos normais foi detectada a presença
estrutural da COX-1(Dubois R et all,1998), e baixos a indetectáveis níveis da COX-2,
a qual pode ser expressa em maior quantidade mediante presença de citocinas,
fatores de crescimento e estimulantes tumorais (Fitzgerald GA, Patrono C,2001)
(Harris RC, Breyer MD,2001) sugerindo sua relevância no câncer e em processos
inflamatórios. Expressão aumentada de COX-2 também tem sido implicada na
Doença de Alzheimer, além de outras condições neurológicas. Desta forma, à COX-
1 foi dado o nome de constitutiva; à COX-2, indutiva. Embora aproximadamente 60%
homólogas, com peso molecular cerca de 70kD, e com similares mecanismos de
metabolização do AA (Schonbeck U, 1999), as isoformas COX-1 e 2 apresentam
algumas diferenças como:
33
a) Seqüência genética diferente para cada isoforma. Os genes são regulados por
dois sistemas independentes e diferentes, apesar da reação enzimática por eles
catalisada ser idêntica (Dubois R et all, 1998);
b) O sítio de ligação do agente inibidor na isoforma COX-2 é estruturalmente cerca
de 25% maior que o da COX-1 (Brooks P, 1999), apresentando também local de
ligação secundário, além do sítio catalítico. Isto tem permitido o desenvolvimento de
agentes que bloqueiam a atividade COX-2, especificamente em concentrações que
apresentam mínimos efeitos COX-1. O mesmo composto pode funcionar como um
inibidor COX-2 em baixas concentrações e inibidor competiivo da COX-1 quando em
altas dosagens. As bases moleculares para tais diferenças ainda não são
completamente entendidas (Marnett LJ, 1999);
c) A COX-1 é uma enzima presente na maioria dos tecidos. Diante de quadros
inflamatórios, a atividade desta isoforma não parece ser alterada ou apresenta um
aumento discreto de 2 a 4 vezes na sua expressão (Dubois R et all, 1998)
(Fitzgerald GA, Patrono C, 2001). Em menores quantidades, a COX-2 encontra-se
em determinados tecidos como cérebro, intestinos, rins, testículos, glândula tireóide,
pancreas (Beejay V, Wolfe MM, 1999); diante de quadro inflamatório, sua expressão
é aumentada cerca de 20 vezes ou mais;
d) Além do ácido aracdônico, a COX-2 também é capaz de agir no metabolismo de
outras substâncias como: ácido linolênico e ácido linolêico (Schonbeck U, 1999).
Recentemente foi proposta a existência de uma terceira isoforma desta família
enzimática, denominada COX-3, a qual, ao contrário da COX-1 e COX-2, não
produziria prostanóides pró-inflamatórios, mas sim substâncias antiinflamatórias
(Willoughby DA, 2000). Tal evidência poderia explicar os períodos de remissão visto
34
em casos de doenças inflamatórias crônicas, como a artrite reumatóide.
2.3.1.1 Inibidores da COX-2 e efeitos teciduais
Função Renal
Prostaglandinas são importantes moduladores fisiológicos do tônus vascular e
equilíbrio hídrico em rins de mamíferos, incluindo modulação da hemodinâmica
glomerular, reabsorção tubular de sódio e água e regulação da secreção de renina
(Dubois R, 1998).
Diante de hipovolemia, o sistema renina-angiotensina-aldosterona renal é ativado, o
que contribui para vasoconstrição sistêmica e maior reabsorção de sódio e água, na
tentativa de manter níveis tensionais adequados. Ao mesmo tempo, a angiotensina
provoca síntese de prostaglandinas renais vasodilatadoras, as quais são
sintetizadas às custas da COX-1 (Lipsky PE, 2000), a qual está presente no
endotélio, glomérulo e ductos coletores renais. Na presença de AINES, e
conseqüente inibição de prostaglandinas, este mecanismo protetor falha, podendo
ocasionar isquemia e dano renal irreversível.
Determinados pacientes encontram-se em maior dependência das prostaglandinas
renais vasodilatadoras para o adequado funcionamento deste órgão, por exemplo:
idosos, indivíduos com insuficiência cardíaca, doenças renais prévias, diabéticos,
cirróticos, hipovolêmicos.
O fato do avançar da idade ser associado com declínio progressivo da função renal
gera sérias implicações para a segurança do uso de antiinflamatórios em pacientes
idosos (Whelton A, 2000). Já em adultos jovens, sem história prévia de alterações
renais, os AINES não parecem interferir na função deste órgão podendo ser
35
indicados sempre que necessário (Harris CJ, Brater DC,2001).
A síntese de prostaglandinas em túbulos renais distais interfere com o metabolismo
de sódio e água, sendo produzidas principalmente por intermédio da COX-1. AINES
convencionais, conseqüentemente, podem ocasionar edema e retenção de sal, os
quais estão entre os mais comuns efeitos adversos AINES-associados envolvendo o
rim (Whelton A, 2001).
Entre outras complicações, existem: hipercalemia, hiponatremia, ou mesmo o
desenvolvimento de falência renal aguda, síndrome nefrótica, necrose papilar aguda
(Whelton A, 2001). Quase todas as classes de agentes anti-hipertensivos, com
exceção dos bloqueadores de canais de cálcio e antagonistas da angiotensina II,
necessitam de síntese normal de prostaglandinas vasodilatadoras para completa
atividade anti-hipertensiva. Assim, AINES impedem a completa efetividade
terapêutica de muitos compostos anti-hipertensivos e, inclusive, de drogas diuréticas
(Whelton A, 2001).
No entanto, estudos recentes têm mostrado a presença da COX-2 constitutivamente
na mácula densa e em células intersticiais da medula renal de animais (Dubois R,
1998). Em situações experimentais como: deprivação de sódio, estados de
hiperfiltração, inibição de enzima de conversão da angiotensina, administração de
diuréticos ou ainda hipertensão renovascular, foi detectada maior expressão da
COX-2 na região da mácula densa renal, o que aumenta a probabilidade de
prostanóides gerados por esta isoforma serem importantes mediadores da produção
de renina e do feedback tubulo- glomerular (Lipsky PE, 2000) (Harris CJ, Brater DC,
2001)(Wolf K,1999).
A medula renal é o local da maior síntese de prostaglandinas e apresenta importante
36
expressão de COX-1 e também COX-2. A COX-1 predomina nos ductos coletores
medulares; e a COX-2, em células medulares intersticiais (Harris RC, Breyer MD,
2001). Desidratação e conseqüente hipertonicidade medular em coelhos resultou em
maior indução de COX-2 nesta região (Harris RC, Breyer MD, 2001) (Yang T, 1999).
Esta isoforma parece manter a viabilidade das células intersticiais medulares, pois
em situações experimentais de desidratação e posterior tratamento com inibidores
da COX-2, houve indução da apoptose (morte celular programada). Todavia, a
simples deprivação de água não interferiu na sua sobrevivência (Hao CM, Yull F,
Blackwell T et al, 2000). Estes dados podem ter importantes implicações no
entendimento da patogênese da lesão medular renal associada com AINES, além de
propor o possível papel da COX-2 como coadjuvante na preservação da função
renal. Prostaglandinas derivadas da COX-2 também podem ter papel critico na
manutenção do fluxo sangüíneo medular renal e excreção de sódio. A medula renal
interna parece apresentar importante papel na homeostase hidroeletrolítica (Cowley
A et all, 1995). Prostaglandinas medulares intersticiais podem modular reabsorção
de soluto e água também através de efeitos diretos na absorção de sódio pelo ramo
ascendente da alça de Henle e ducto coletor. A perda do efeito inibitório tônico da
PGE2 (derivada da COX-2) na reabsorção de sódio em tais segmentos pode
contribuir para a retenção deste íon e conseqüente resistência a terapêuticas anti-
hipertensivas, vistos com o uso de AINES (Brater DC, 1999). Juntas, estas
observações sugerem que a inibição da COX-2 na medula renal deve aumentar a
retenção de só- dio, comprometer o fluxo sangüíneo medular, piorando a lesão
hipóxica e prejudicando a viabilidade da célula intersticial medular.
Relatos de casos mostrando disgenesia renal em recém-nascidos de mulheres
usuárias de AINES convencionais durante a gestação, sugerem papel das
37
prostaglandinas no desenvolvimento renal e, conseqüentemente, da enzima COX.
Na tentativa de analisar o papel da COX-2, inibidores específicos desta isoforma
administrados a ratos previamente ao nascimento limitaram a nefrogênese e o
desenvolvimento glomerular (Komhoff M, 2000). Tais fatos levantam a hipótese da
participação da COX-2 no desenvolvimento renal normal.
Função Gastrointestinal
A COX-1 parece ter fundamental papel em manter a arquitetura glandular do
estômago. Constitui-se na única isoforma identificada na mucosa gástrica de animais
normais, incluindo humanos, estando intimamente envolvida na prevenção de
erosões e ulcerações (Lipsky PE, 2000).
Entretanto, diante de infecções ou úlceras gástricas já formadas, assim como
infecção pelo Helicobacter pylori (Fitzgerald GA, Patrono C, 2001), detecta-se maior
expressão de COX-2 nas células epiteliais do estômago, induzindo a formação de
prostaglandinas que contribuem para a cicatrização destas lesões (Dubois R, 1998)
(Emery P, 2001). Tais prostaglandinas, dentre elas a PGE2 com atividade
predominante, agem estimulando a secreção de fluidos e cloretos pela mucosa, o
que impede a invasão de bactérias na circulação sistêmica (Eckmann L, 1997).
Logo, tratamento com inibidores específicos da COX-2 podem retardar a cicatrização
de úlceras já formadas ou ainda reduzir a capacidade de defesa diante da presença
de microorganismos invasores, apesar de provavelmente não iniciarem o dano
gástrico como observado com AINES convencionais (Schnitzer TJ, 2001).
Sistema Cardiovascular e Função Plaquetária
A manutenção do fluxo sangüíneo normal e a apropriada resposta trombogênica à
38
lesão vascular necessitam de um adequado equilíbrio entre a atividade do
tromboxano A2 (TXA2) produzido pela plaqueta, e a ação da prostaciclina (PGI2)
derivada da célula endotelial.
As plaquetas, por serem anucleadas, apresentam apenas um suprimento da
isoforma COX-1, não sendo capazes de produzir enzimas em situações de ativação
(Dubois R, 1998) (Patrono C, 1994). O TXA2 é o principal eicosanóide originado pela
COX-1 nestas células, e sua biosíntese encontra-se aumentada em síndromes de
ativação plaquetária, como angina instável e doença oclusiva arterial periférica.
Apresenta potencial agregador plaquetário, vasoconstritor, além de estimular a
proliferação de músculo liso (Catella-Lawson F, Crofford LJ, 2001).
Contrabalançando o TXA2, a formação de eicosanóides em síndromes de ativação
plaquetária também parece prover maior expressão de COX-2 pelas células
endoteliais, resultando na produção de PGI2 , a qual possui ação vasodilatadora,
antiagregante e inibidora da proliferação de músculo liso vascular (Fitzgerald GA,
Patrono C, 2001) (Lipsky PE, 2001)(Catella-Lawson F, Crofford LJ, 2001). Maior
expressão tanto da COX-1 quanto da COX-2 tem sido detectada em artérias
ateroscleróticas (Schonbeck U, 1999) (Wijeyaratne SM, 2001).
Foi descrito que o estresse de cizalhamento endotelial (shear stress), o qual se
refere à força exercida pelo fluxo sangüíneo na parede do vaso, induz a expressão
da COX-2 nas células endoteliais e, também, que substanciais quantidades de
prostaglandinas endoteliais resultam da ação da COX-2 (Fitzgerald GA, Patrono C,
2001) (Lipsky PE, 2001).
39
Sistema Nervoso
As prostaglandinas são conhecidas por mediarem febre, reações inflamatórias no
tecido neural e mais recentemente, por influenciarem na função cerebral (Dubois R,
1998) (Lipsky PE, 2001). Também foi detectado o papel da COX-2 no
desenvolvimento do sistema nervoso e como importante modulador da resposta
neural durante a vida adulta. Níveis desta isoforma aumentam dramaticamente após
convulsões e atividades mediada pelo receptor NMDA (Dubois R, 1998). O papel da
COX-2 e de inibidores específicos desta isoforma na função cerebral humana ainda
é desconhecido.
Função Uterina e Ovariana
Além da clássica relação com o trabalho de parto, prostaglandinas e COX-2 têm sido
implicadas como agentes mediadores de outros estágios da gestação, incluindo
ovulação e implantação (Schnitzer TJ, 2001).
Câncer
Tumores coloretais, gástricos e esofágicos, tanto em animais de experimentação
como também em humanos, expressam altos níveis de COX-2, ao contrário da
mucosa intestinal normal, que apresenta baixos a indetectáveis níveis desta
isoforma (Dubois R, 1998). Tais achados levantam a hipótese do envolvimento da
COX-2 na progressão e disseminação do câncer nestes órgãos.
Nestes tumores, a COX-2 é responsável também pelos altos níveis de PGE2, a qual
parece promover o desenvolvimento tumoral inibindo a atividade supressora
neoplásica e estimulando a proliferação de células epiteliais (Sjodahl R, 2001).
40
Estudos com células em meio de cultura têm mostrado que a expressão da COX-2
contribui para o potencial tumorigênico da célula epitelial por aumentar sua adesão à
matriz extracelular, tornando-a resistente à apoptose, aumentando a viabilidade
tumoral. Tais alterações foram reversíveis com a associação de inibidores COX-2
(Dubois R, 1998).
Recentes evidências mostram relação da COX-2 com a regulação da angiogênese
associada a células tumorais neoplásicas. Tal fato já está bem estabelecido e
consiste em uma das formas através da qual a superprodução de PGE2 favorece a
progressão do câncer de prostata (Myers C, 2001).
Para o desenvolvimento do cancer, três termos chamados de “marcas do cancer”
devem acontecer: capacidade adquirida que represente violações ao mecanismo
regulatório normal, que controlam a sobrevivência da célula, proliferação migração,
invasão e as interações com as células vizinhas e estroma (Hanahan, D.; Weinberg,
R.A., 2000). Acredita-se que vários genes diferentes podem alterar-se durante o
desenvolvimento de um determinado tumor, e recentemente foi proposto que todos
os tumores surgem e são mantidos pela desregulação de um número relativamente
pequeno de vias de sinalização (Vogelstein,B. et al., 2004) (Wood,L.D. et al., 2007).
Acredita-se também que a grande expressão de COX-2 que ocorre na maioria dos
tumores representa um papel crusial durante seu desenvolvimento. A desregulação
da COX -2 leva a um crescimento abundante de seu principal produto metabólico,
prostaglandina E2, (PGE2), um efeito pleiotrópico que aparenta afetar a maioria, se
não todas, as características de tumor. Esta habilidade da via COX-2/ PGE2 de
afetar multiplos aspectos da fisiologia celular necessarias para o desenvolvimento e
manutenção do tumor, pode também oferecer uma explicação para a eficácia de
41
inibidores da Cox e fármacos anti-inflamatórios não-esteroidais para reduzir a
incidência e progressão de tumores interstinais em modelos animais e mais
importante ainda, em pacientes humanos (Brown, J.R. et al., 2005).
42
3. Proposição
Quantificar, por reação em cadeia da polimerase, em tempo real, a expressão gênica
das enzimas cox-1 e cox-2, após a irradiação com laser de baixa intensidade
(808nm) em tumor de Walker 256, injetado na pata de rato.
43
4. Materiais e métodos
4.1. Animais
Ratos Wistar machos, pesando entre 160n a 180b gramas, foram utilizados
neste estudo. OS ratos foram alojados em uma instalação de cuidados de animais e
levado à sala de testes dois dias antes do experimento. Água e comida foram
disponibilizados “ad libitum. Todos os testes comportamentais foram realizados entre
9:00h e 16:00h . Todos os experimentos foram conduzidos de acordo com as
diretrizes para o uso ético de animais conscientes na investigação da dor, publicados
pela associação internacional para o estudo da dor. Os procedimentos foram
aprovados perla comissão de cuidados com os animais institucional do instituto
butantã.
4.2. Inoculação das células do carcinoma de Walker 256
As células do tumor de Walker foram obtidas a partir do liquido acumulado do
abdomem da cavidade periotonial , cinco dias após a injeção intraperitoneal de 1X
107 células do carcinoma. Após a colheita das células, a porcentagem das células
viáveis foi determinada através do uso de solução de trypan azul a 1%, em uma
câmera de Neubauer. Uma concentração de células tumorais de 106 foram obtidas
através da diluição com fosfato tamponado salino ( PBS, pH 7.4). Benzilpenicilina
( 120.000 de unidades em 10 ml de suspenção celular; benzetacil , laboratório
Eurofarma Brasil) foram adicionados à suspenção celular para evitar a contaminação
microbiana. As células tumorais ( 100ml) foram então injetados subcutaneamente na
44
região plantar na pata traseira direita do rato. PBS (100ml) injetada na pata traseira
do lado esquerdo utilizada como grupo controle.
4.3. Análise histopatológica
Os animais foram sacrificados por deslocamento cervical em diferentes
períodos de tempo após a inoculação do tumor. A pata direita traseira e o linfonodo
ploplitídeo foram removidos e fixados em formalina 10%. As Amostras foram
embebidas em parafina, seccionadas em 5-m, e corado com hematoxilina e eosina
para observação microscópica.
4.4. Divisão dos tratamentos
Para avaliar a eficácia na diminuição da dor tumoral, os animais foram
divididos em grupos após a injeção de PBS ou células tumorais:
- hígido, os animais sofriam apenas a injeção de PBS;
- tumor, apenas injeção subcutânea de células tumorais;
- Nimesulida, após injeção de células tumorais, eles sofreram injeção
intramuscular de inibidor de ciclooxigenase-1 (NISULID) no 2 e 5 dia após a
injeção inicial
- 1J: recebiam injeção de células tumorais e tratamento no 2 e 5 dia de laser
com 1J de potencia a 100mW.
- 3J: recebiam injeção de células tumorais e tratamento no 2 e 5 dia de laser
com 3J de potencia a 100mW.
45
- 6J: recebiam injeção de células tumorais e tratamento no 2 e 5 dia de laser
com 6J de potencia a 100mW.
O laser utilizado é do tipo Theralaser© (DMC, São Carlos, Brasil).
4.5. Análise por RT- PCR
O RNA total foi extraído a partir de células de Walker 256, isolado com o RNA
Mini Kit (Qagen), de acordo com as instruções do fabricante. As espécies de cDNA
foram sintetizados com o super-Script II (Life Technologies) , a partir de 5 μg de RNA
total em um volume total de 20 μg usando tanto oligo (dT) e hexâmeros aleatórios de
acordo com as instruções do fabricante. Um microlitro da reação de RT misturado,
foi utilizado como molde para PCR, em um volume total de RT misturado. Foi
utilizado como molde para PCR em um volume total de 20 μg utilizando uma
concentração de 0,5 μg de cada iniciador começando abaixo de 0,5 unidades de Taq
DNA polimerase (Takara Bio Inc, Japao). A PCR foi realizada durante 35 ciclos e as
condições dos ciclos foram como se segue: 1 min a 95°C, 1 min a 94°C, 1 min a
60°C, 1 min a 72°C, e uma extensão final de 10 min a 72°C. Dez conjuntos de
iniciadores utilizados para verificação foram: Entpd1 (CD39), Entpd2 (Cd39L1),
Entpd3 (Cd39L3), Entpd5 (Cd39L4) Entpd6, (Cd39L2) RT-PCR foram descritos por
Vollmayer et al. (2001). Para rato ecto-5'- nucleotidase (CD73) e -actina RT-PCR
foram descritos por Wink et ai. (2003a), e para NTPDase 8 foram 5'-
AGGTGCCTTTGGTTGGATC-3 'e 5 GGTAGCTGTGAGTGTAGAC-3 '. Os
oligonucleotídeos foram obtidos da Infogen para rato ecto-5'- nucleotidase (CD73) e
46
-actina RT-PCR,descritos por Wink et ai. (2003a), para NTPDase 8 foram 5'-
AGGTGCCTTTGGTTGGATC-3 'e 5' - GGTAGCTGTGAGTGTAGAC-3 '.
Os controles negativos foram realizados com água como molde e os controlos
positivos foram plasmídeos com sequências de cDNA para rato Entpd1, rat Entpd2
(Kegel et al., 1997; Sevigny et al., 2002), e para ENTPD3 humana (Smith e Kirley,
1998), ENTPD5 (Mulero et al., 1999) e ENTPD6 (Yeung et al., 2000), ecto-5'
nucleotidase / CD73 e células de glioma de rato C6\ADNc-actina(Wink et al, 2003a).
5.Resultados
47
Método estatístico:
O banco de dados era composto por 36 ratos wistar. As comparações entre as
médias de variação contínua entre dois grupos foram realizadas comteste t-studant e
para comparação entre 3 grupos testaram-se as médias pelo teste f da amova para
um fator (Neter et al, 1996)
Os cálculos foram realizadoso com o auxilio do software estatístico R.3.0.2 (Rcore
Team, 2014) e os testes consideraram um nívelde significância de 5%. Os gráficos
foram gerados com o auxilio do pacote ggplot2 (Widckan, 2009). Os resultados são
apresentados em gráficos para descrever as variáveis categorias.
5.1. Análise quantitativa de COX-1 por PCR-RT
48
Figura 1 – Determinação dos níveis do gene de COX-1 por PCR-RT nos animais que sofreram
injeção ou não de células tumorais (Walker 256). Cada ponto representa a média +- EP de 5 a 7
ratos, valores considerados significativos quando comparados ao grupo Tumor (*p<0,05 e
***p<0,001).
A figura demonstra que os grupos tratados com Nimesulida e 6J apresentam
aumentos nos genes de COX-1 se comparados com o grupo Tumor, assim como
nos grupos tratados com 1J e 3J (#p<0,05, ###p<0,001).
5.2. Análise quantitativa de COX-2 por PCR-RT
Figura 2 - Determinação dos níveis do gene de COX-2 por PCR-RT nos animais que sofreram injeção
ou não de células tumorais (Walker 256). Cada ponto representa a média +- EP de 5 a 7 ratos,
valores considerados significativos quando comparados ao grupo Tumor (*p<0,05).
49
A figura demonstra que o grupo tratado com 1J apresentou queda significativa
(p<0,05) nos genes de COX-2 se comparado com o grupo Tumor e nimesulida, não
apresentando diferenças entre os outros grupos tratados.
5.3. Análise quantitativa de COX-1 por PCR-RT
Figura 3 - Determinação dos níveis do gene de interleucina-10 (IL-10) por PCR-RT nos animais que
sofreram injeção ou não de células tumorais (Walker 256). Cada ponto representa a média +- EP de 5
a 7 ratos, valores considerados significativos quando comparados ao grupo Tumor (*p<0,05).
Apenas o grupo Nimesulida apresentou aumento nos níveis de IL-10 se
comparado com os grupos tratados e grupo Tumor, não havendo diferença entre os
outros tratamentos.
50
6. Discussão
O presente estudo in vitro teve como objetivo Quantificar, por reação em
cadeia da polimerase, em tempo real, a expressão gênica das enzimas cox-1 e cox-
2, após a irradiação com laser de baixa intensidade (808nm) em tumor de Walker
256 injetado na pata de rato.
Os resultados deste estudo revelam que grupos tratados com laser (1J e 3J),
tiveram uma diminuição significativa na liberação de marcadores inflamatórios COX
1 quando comparados a nimesulida e potência de 6J os aumentos na experessão
gênica de COX1 foram significativamente superiores até mesmo com relação a
nimesulida. Assim nossos estudos mostram a eficácia do laser quando comparados
a antiinflamatórios não esteroidais como nimesulida.
A fototerapia com laser baseia-se na utilização de baixas irradiâncias de luz,
influenciando comportamento celular, onde ocorre a aplicação de uma luz (
geralmente laser de baixa potência) em uma patologia para promover regeneração
tecidual, redução de inflamação e alivio da dor. A luz é tipicamente de largura
espectral estreita no vermelho ou próximo ao espectro infravermelho ( 600 –
1000nm), com uma dose de densidade (irradiação) entre 1mw-5W/cm2 . ë
geralmente aplicada em uma injuria por um minuto ou mais, alguns dias da semana
por várias semanas. Ao contrário de outros laser medicinais, o laser da baixa
potencia não produz ablação ou mecanismo térmico mas sim um efeito fotoquímico.
O fenômeno foi primeiramente publicado por Endre Mester em 1967 poucos anos
depois que o primeiro trabalho sobre laser foi inventado. Assim os parâmetros
utilizados neste estudo seguiram os protocolos relacionados a doses ja
referenciadas na literatura.
51
Segundo Afanaséva et al. (1995), os lasers podem ser classificados
dependendo do seu comprimento de onda (λ) e potencia do aparelho, sendo Lasers
de Alta Intensidade (LAI), com emissão de radiação em alta potencia, com efeitos
térmicos e destrutivos, sendo muito utilizados em procedimentos curúrgicos e Lasers
de Baixa Intensidade (LBI), com emissão de radiação em baixa potência, sem efeitos
térmicos ou destrutivos, podendo regular reações químicas e fisiológicas
(fototerapia).
Uma importante consideração deve ser feita sobre a propriedade optica do
tecido. Também chamada “janela optica” do tecido, onde a penetração do no tecido
é maximizada. Esta janela optica acontece aproximadamente entre 650nm a 1200
nm. A absorção e espalhamento da luz no tecido são ambas muito mais altas na
região azul do espectro do que na vermelha, porque o principal cromóforo tecidual (
hemoglobina e melanina) tem alta absorção na banda, em curto comprimento de
onda, o espalhamento da luz no tecido é mais alta em curto comprimento de onda, e
além disso, a água absorve fortemente a luz infravermelha em um comprimento de
onda maior que 1100nm. Portanto, o uso do LBP em animais e pacientes envolve
geralmente luz vermelha e luz proxima do infravermelho (600-1100nm) (Karu and
Afanaséva, 1995). Este trabalho utilizou laser no comprimento de onda de 808 nm
com melhor efetividade sobre os tecidos.
O mecanismo do LBI em nível celular pode ser atribuído á absorção da
radiação visível monocromática e infravermelha por componentes da cadeia
respiratória celular (Karu, 1989). Várias evidencias sugerem que as mitocôndrias são
responsáveis pela resposta celular á luz vermelha visível e á luz infravermelha. Os
efeitos do laser HeNe na mitocôndria isoladas de fígado de ratos, incluíram maior
52
potencial eletroquímico de prótons, mais síntese de ATP, aumento de RNA e síntese
de proteínas (Greco et al. 1989), aumento no consumo de oxigênio, do potencial de
membrana e aumento de síntese de NADH e ATP.
Este achado é semelhante a outro estudo que comparou o fator de necrose
tumoral (TNF) -α e expressão de IL-1 na inflamação induzida por LBI ( laser de baixa
intensidade) em ratos Os resultados mostraram que a LBI tem atividade anti-
inflamatória(Haupt JL el al.,2005). Similarmente, LBI reduziu a inflamação neste
estudo, o que indica que a LBI pode ser benéfico para superar a inflamação celular.
A relevância clínica deste estudo pode ser mais importante no que diz
respeito à utilização do laser aplicados com a densidade de energia correta para
obtermos os efeitos antiinflamatórios significativos e no controle de dor uma vez que
a inibição de prostaglandinas diminui ação nococeptiva.
A resposta tecidual do tumor leva á liberação das ciclooxigenases (COX),
sendo a COX-1 , também demoninada construtiva e expressa em células, tendo a
função de manter a integridade da mucosa gástrica e função renal, já a COX-2 é
induzida pelo oncogene, fatores de crescimento e citocinas, tendo como função
estimular proliferação celular, promover a angiogênese, aumentar a invasão e
adesão da matriz extracelular, inibir a vigilância imunológica e apoptose. Foi
demonstrado que a inibição de COX-2 diminui a evolução cancerígena, pois ela
estimula a carcinogênese pela inibição da apoptose, promoção da angiogênese,
invasão e imunossupressão em vários tipos de malignidade (Douris P, 2006; Leal Jr
et al., 2010; Servetto N et al., 2010)..
O LBI foi demonstrado ser eficaz na redução da resposta inflamatória, ser
53
capaz de promover a reparação de tecidos, atenuar a dor e reduzir a fadiga
muscular em vários estudos em modelos animais e em estudos clínicos (Douris P,
2006; Leal Jr et al., 2010; Servetto N et al., 2010). Embora a maioria dos estudos
demonstraram efeitos benéficos com esta terapia, pouco se sabe sobre como
exatamente a laserterapia é capaz de afetar os sistemas celulares e quais são os
mecanismos moleculares envolvidos nestes processos. Em particular, a questão de
saber se aumenta ou diminui LBI espécies reativas de oxigênio e estresse oxidativo
permanece sem resposta, pois há relatos de apoio ambos os lados da questão
(Servetto N et al., 2010; Chen AC et al., 2012). Nós usamos reação em cadeia da
polimerase, em tempo real, a expressão gênica das enzimas cox-1 e cox-2, após a
irradiação com laser de baixa intensidade (808nm) e observamos uma significativa
diferença no uso de laser quando comparado a nimesulida na expressão gênica de
enzimas cox 1 e cox 2.
Vários trabalhos mostram o efeito do LBI sobre o stress oxidativo e nitrativo.
Durante a inflamação, a presença de peroxidação lipídica, expressão de iNOS, NO,
e geração de nitrotirosina sugere que o stress oxidativo local pode amplificar a
gravidade da lesão e modificar, tanto estrutural como funcionalmente, proteínas e
lípidos de membranas celulares, promovem alterações nas vias de sinalização que
servem para aumentar a resposta inflamatória geral (Filippin LI et al., 2011; Shi X et
al., 2006). A peroxidação lipídica enzimática pode ocorrer, isto é, a ativação das
ciclooxigenases e as lipoxigenases e / ou não enzimaticamente, através da geração
de ROS exógeno, RNS, libertação de metais de transição, e produção de espécies
reativas (Droge W., 2002; Beckman JS, Koppenol WH, 1996). Nossos resultados
mostram que LBI provavelmente reduziu a peroxidação lipídica, mantendo-o perto
dos níveis basais. Embora o mecanismo desta redução é desconhecida, é uma
54
observação relevante que havia menos de COX-2 nos ratos que foram submetidos
a 1J de potência após a irradiação com LBI.
A resposta inflamatória envolve múltiplos mediadores e LBI poderia influenciar
a ativação de NF-kB global durante este processo. NF-kB é um fator de transcrição
rapidamente ativada em resposta ao estresse oxidativo e que participam na indução
de vários genes relacionados com inflamação, tais como COX-2, iNOS, e citoquinas
pró-inflamatórias [9,10]. Nossos resultados mostram a diminuição significativa de
COX2 quando submetidos ao LBI pode estar relacionada com a não ativação de
fator NF-KB. Outros trabalhos mostram-se necessários para verificação relacionada
a diminuição da expressão do gene de NF-kB, sugerindo que este efeito pode ser
responsável pela reduzida quantidade de mediadores pró-inflamatórios neste
modelo. Como discutido acima, a laserterapia mediada efeitos anti-inflamatórios
podem ser uma consequência da redução da NF-kB ou inativação (Pallotta RC et
al.,2012; Fillipin LI et al., 2005).
Em relação a tratamento com LBI resultados positivos tem sido publicados no
tratamento de diversas patologias como osteoartrite ( Bertolucci e Grey, 1995),
feridas (Caetano et al 2009), dores na nuca (Chow et al, 2006), fadiga muscular (
Leal Junior et al, 2008), porem com resultados nem sempre positivos. Essas falhas
podem ser atribuídas a divesos fatores, incluindo dosimetria (energia inadequada ou
muita liberada, irradiancia inadequada ou em excesso, irradiação insuficiente na
área patológica e medicação impropria do paciente (como antiinflamatórios
esteroidais e não esteroidais, os quais podem inibir a regeneração. (Aimbire et al,
2006). Nossos resultados mostram que doses maiores como 6J aumentaram
significativamente a expressão de cox 1 assim a dosimetria é um fator relevante que
deve ser considerado.
55
Oliveira et al.(2013) realizou um estudo experimental de hipersensibilidade
(DTH) reação do tipo retardado para a ovalbumina (OVA) foi utilizado para avaliar os
efeitos imunomoduladores da terapia a laser de baixa intensidade (LBI), que é
utilizado como uma terapia adjuvante em medicina, odontologia, e fisioterapia por
causa de seus efeitos anti-inflamatórios e analgésicos potenciais observada em
diversos estudos. Os efeitos da LBP de radiação em reação à ovalbumina em ratos
Balb / C foram examinados após a fase de indução da reacção de
hipersensibilidade. Os animais tratados com azatioprina (AZA) receberam veículo,
em vez de ovalbumina, e os que não foram imunizados serviram como controles (n =
6 para cada grupo). Medições de espessura da pata e hematoxilina-eosina exames
histopatológicos foram realizados. Ensaios de proliferação foram realizados também
(espontânea, em presença de concanavalina A e ovalbumina) para determinar a
produção em células mononucleares de culturas de necrose tumoral-alfa (TNF-α),
INF-γ, e IL-10. No grupo de animais irradiados com laser e no grupo tratado com
AZA, as medições da espessura da almofada da pata foram significativamente
reduzidos em comparação com o grupo de controlo (p <0,05). Esta redução foi
acompanhada por uma redução muito significativa na densidade do infiltrado
inflamatório e por uma redução significativa nos níveis de TNF-α, INF-γ, e IL-10.
Radiação laser foi mostrado para ter um efeito imunomodulador no DTH a OVA em
camundongos Balb / C. Nossos resultados mostram que apenas o grupo com
nimesulida apresentou aumento significativo ( p<0,05), nos níveis de IL-10, portanto
o uso de laser mostra sua efetividade não interferindo na imunidade, melhorando a
segurança quando comparado com a nimesulida.
56
Em resumo, os nossos resultados indicam que a (808 nm) com a dose
selecionada foi capaz de reduzir a COX-1, COX-2, e IL-10 na área da lesão, levando
a um efeito anti-inflamatório. Assim, estes dados experimentais podem contribuir
para melhor avaliar os efeitos benéficos da LBI sobre a inflamação.
57
7. Conclusão
Os resultados deste trabalho nos permitem concluir que:
Grupos tratados com nimesulida e laser a 6J de potência apresentam
aumento na expressão gênica de COX1.
Grupos tratados com laser a 1J de potência mostratam uma diminuição
significativa nas expressões gênicas de COX2.
Grupos tratados com laser apresentaram menores níveis de IL-!0, não
interferindo nos processos imunológicos quando comparados com nimesulida.
58
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