UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA

FACULDADE DE AGRONOMIA E MEDICINA VETERINÁRIA

DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE PAINÉIS DE SNPs PARA TESTES DE PATERNIDADE EM OVINOS

CAROLINA CELSO MELO PINHEIRO DE VASCONCELOS

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO EM CIÊNCIAS ANIMAIS

BRASÍLIA/DF JUNHO DE 2012

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UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA

FACULDADE DE AGRONOMIA E MEDICINA VETERINÁRIA

DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE PAINÉIS DE SNPs PARA TESTES DE PATERNIDADE EM OVINOS

ALUNA: Carolina Celso Melo Pinheiro de Vasconcelos

ORIENTADOR: Samuel Rezende Paiva

CO-ORIENTADOR: Alexandre Rodrigues Caetano

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO EM CIÊNCIAS ANIMAIS

PUBLICAÇÃO: 74/2012

BRASÍLIA/DF JUNHO DE 2012

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VASCONCELOS, Carolina Celso Melo Pinheiro de. Desenvolvimento

e validação de painéis de SNPs para testes de paternidade em ovinos. Brasília: Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Universidade de Brasília, 2012, 58. Dissertação (Mestrado em Ciências Animais) – Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária da Universidade de Brasília, 2012.

1. Marcadores moleculares. 2. Pedigree. 3. Crioula Lanada. 4. Manejo de Rebanhos.

CDD ou CDU

Agris / FAO

REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA E CATALOGAÇÃO VASCONCELOS, C. C. M. P. DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE PAINÉIS DE SNPs PARA TESTES DE PATERNIDADE EM OVINOS. Brasília: Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Universidade de Brasília, 2012, 58. Dissertação de Mestrado.

Documento formal, autorizando reprodução desta dissertação de mestrado para empréstimo ou comercialização, exclusivamente para fins acadêmicos, foi passado pelo autor à Universidade de Brasília e acha-se arquivado na Secretaria do Programa. O autor e o seu orientador reservam para si os outros direitos autorais, de publicação. Nenhuma parte desta dissertação de mestrado pode ser reproduzida sem a autorização por escrito do autor ou do seu orientador. Citações são estimuladas, desde que citada a fonte.

FICHA CATALOGRÁFICA

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UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA FACULDADE DE AGRONOMIA E MEDICINA VETERINÁRIA

DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE PAINÉIS DE SNPs PARA TESTES DE PATERNIDADE EM OVINOS

CAROLINA CELSO MELO PINHEIRO DE VASCONCELOS

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO SUBMETIDA À FACULDADE DE AGRONOMIA E MEDICINA VETERINÁRIA DA UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA, COMO PARTE DOS REQUISITOS NECESSÁRIOS À OBTENÇÃO DO GRAU DE MESTRE EM CIÊNCIAS ANIMAIS.

APROVADA POR: __________________________________________ SAMUEL REZENDE PAIVA, DSc (Embrapa) e-mail: samuel.paiva@embrapa.br __________________________________________ CONCEPTA MARGARET McMANUS PIMENTEL, PhD (UFRGS) e-mail: concepta.mcmanus@ufrgs.br __________________________________________ DANIELLE ASSIS DE FARIA, DSc (Embrapa) e-mail: danyafp@gmail.com

BRASÍLIA/DF, 29 de JUNHO DE 2012

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Dedicatória...

À Teresa Marly Teles de Carvalho Melo

e Fabio Barros Britto

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AGRADECIMENTOS

Primeiramente, agradeço à Deus, por me dar força e confiança para seguir em

frente pois sem ele nada seria possível;

À UnB, por me dar condições de cumprir esta etapa da minha vida profissional e em especial ao programa de Pós-Graduação em Ciências Animais;

À CAPES pela concessão da bolsa de estudos; À Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnolgia, por abrir as portas para a

realização de meu trabalho e subsidiar minha pesquisa, com bolsa de estudos e espaço físico em seus laboratórios;

Ao Dr. Samuel pela orientação, paciência e por sua ajuda constante, seus ensinamentos e seus incentivos;

À Dra. Connie por me receber a inicialmente como sua orientanda; Ao Dr. Alexandre Caetano, por compartilhar sua experiência profissional e

ensinamentos; Aos meus professores de pós-graduação por ensinar não só disciplinas, mas por

seus conselhos que me auxiliaram profissionalmente; À Embrapa Pecuária Sul, nas pessoas dos pesquisadores Carlos José Hoff de

Souza e José Carlos Ferrugem Moraes por fornecer parte do material genético que possibilitou o desenvolvimento desta pesquisa;

Ao Dr. Alexandre Floriani Ramos por fornecer amostras biológicas do BBGA, fundamentais para a realização de meu estudo;

À Dra. Danielle Assis de Faria, por sua paciência e atenção com os dados finais de meu trabalho e ajuda com as genotipagens;

À Dra. Patricia Ianella, por me receber de braços abertos quando cheguei; À MSc. e doutoranda Thaísa por toda a atenção, ajuda, apoio e ensinamento na

manipulação dos SNPs na BeadXpress; Aos MSc. e doutorandos Elizabete e Ronyere, amigos conquistados, pelo

apoio, ensinamentos, atenção, acompanhamento em genotipagens, manhãs rodando programas, sábados de trabalho na embrapa, força, companheirismo, desabafos e descontração, pelos muitos momentos que ri com vocês;

Aos colegas de laboratório e aos colegas de pós graduação pela descontração nos intervalos das aulas, no laboratório e apoio nas bancadas;

Ao Marcio da Silva Costa por me mostrar possibilidades, quando se pensa que tudo esta perdido, e mostrar que amigo verdadeiro está presente em todas as horas;

Aos amigos Misa, Luana, Joasy, Francisca, Gledson, Bruno, Ocimara, Raphael, Sergio, Alex, Hélio, Ellida, Jackelliny, Iassudara, Aecio entre outros por pela amizade, apoio e por não desistirem de mim mesmo estando distante;

Ao meu Marido Fabio e à minha filha Sophia, pelo companheirismo, paciência, compreensão em horas exaustivas de trabalho e noites perdidas e descontração em momentos de desespero;

vii

À minha mãe Teresa Marly pelas vezes me mostrar querer até mais do que eu e que tudo é possível com garra e perseverança ao meu irmão Joao Victor pelos dias alegres e a minhas irmãs Gabriela, Juliana e Isadora pela companhia, amizade e desejos sinceros de retorno para casa, meu padrasto Ildemar, minha tia Carminha minha segunda mãe e a todos os meus familiares pelo apoio;

À minha avó Maria Dolores por me mostrar que nunca é tarde para buscar e alcançar seus objetivos.

Muito obrigada a todos!

viii

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CAPÍTULO I!"""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""!#!1. INTRODUÇÃO!"""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""!$!1.1. OBJETIVOS!"""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""!%!!"!"!"!Objetivo Geral!""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""!%!!"!"#"$Objetivos Específicos!""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""!%!1.2. REVISÃO DA LITERATURA!"""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""!&!1.2.1. Origem e principais características das raças brasileiras$""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""$%$1.2.2. Conservação dos recursos genéticos ovinos no cenário nacional$"""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""$&$1.2.3. Marcadores moleculares e a caracterização dos recursos genéticos ovinos$"""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""$'$1.2.4. Determinação de paternidade no melhoramento genético animal$"""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""$!!$1.2.5. Tecnologias para a genotipagem de SNPs$"""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""$!#$1.3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS!"""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""!#'! CAPÍTULO II!""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""!$#!2.1. RESUMO!"""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""!$$!2.2. ABSTRACT!"""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""!$(!2.3. INTRODUÇÃO!""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""!$%!2.4. MATERIAL E MÉTODOS!"""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""!$'!#"("!"$Material Biológico$"""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""$#)$2.4.2. Extraçã de DNA$""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""$#)$#"("*"$Identificação/seleção inicial dos SNPs$""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""$#)$#"("("$Genotipagem$""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""$#&$#"("%"$Análises dos Dados e Composição do Painel de SNPs$"""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""$#&$()*)'Resultados e Discussão!""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""!$)!2.5.1. Resultados$"""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""$#+$2.5.1.1. Avaliação locos genotipados para montagem do painel$""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""$#+$2.5.1.2. Análise de Paternidade$""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""$(,$2.5.2. Discussão$""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""$%,$2.6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS!"""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""!&(! CAPÍTULO III!"""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""!&&!4.1. CONSIDERAÇÕES FINAIS!""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""!&'!

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RESUMO

DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE PAINÉIS DE SNPs PARA TESTES DE PATERNIDADE EM OVINOS

Carolina Celso Melo Pinheiro de Vasconcelos1 Samuel Rezende Paiva2

1 – Mestranda da UnB, Brasília – DF 2 – Pesquisador da EMBRAPA Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília – DF A conservação dos recursos genéticos locais de ovinos é estratégica para contribuir na segurança alimentar da população de um país, seja na forma do fornecimento de produtos especializados com indicações de origem e/ou procedência geográfica seja na contribuição de combinações alélicas alternativas que poderão auxiliar programas de melhoramento e produção desenvolvidos para grupos genéticos especializados. Para isto, as informações sobre a genealogia dos rebanhos são críticas para se explorar o melhor potencial de cada raça e evitar problemas como aumento da endogamia e a erosão genética. Porém, como nem sempre essas informações estão disponíveis em parte do rebanho nacional, as ferramentas baseadas em marcadores moleculares podem ter papel fundamental para gerenciar programas de melhoramento ou conservação onde os registros genealógicos são escassos. Assim, o objetivo do presente trabalho foi desenvolver e testar um conjunto de marcadores de Base Única (Single Nucleotide Polymorphism – SNPs) para realizar testes de paternidade em ovelhas. Amostras de animais de três raças brasileiras de ovinos localmente adaptadas foram genotipadas com o chip contendo aproximadamente 50.000 marcadores SNP (SheepSNP50 Bead Chip, Illumina Inc., San Diego, CA) e, deste banco de dados, um painel de baixa densidade contendo 123 SNPs foi selecionado. Deste painel, 71 SNPs foram validados em uma amostra composta por 71 animais do Núcleo de Conservação da raça Crioula da Embrapa Pecuária Sul. Foi observado que 53 SNPs tiveram sucesso nas genotipagens e demonstraram níveis significativos de polimorfismo de forma que as probabilidades de exclusão combinadas obtidas apresentaram valores entre 88,8% a 99,9%. A partir do conjunto de SNPs genotipados, quatro sub-painéis foram definidos e testados e o sucesso na atribuição de paternidade, de acordo com informações de genealogia dos animais, variou entre 76 - 79%. Apesar do claro potencial dos marcadores selecionados, notou-se a necessidade de se aumentar o número de marcadores deste painel para elevar o poder de resolução nas análises.

Palavras-chave: Ovis aries, manejo de rebanhos, recursos genéticos animais, marcadores

moleculares, genética da conservação.

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ABSTRACT

DEVELOPMENT AND VALIDATION OF LOW DENSITY SNP PANEL FOR PARENTAGE IN BRAZILIAN SHEEP

The conservation of local sheep genetic resources is strategic to ensure food security through the offer of specialized products with geographic indication or certificate of origin as well as maintenance of alternatives for allelic combinations in relation to specialized genetic groups. Thus, information about the genealogy of the flocks is critical to exploit the potential of each breed and avoid problems such as inbreeding and genetic erosion. However, as the genealogical records are not always available, tools based on molecular markers can play a fundamental role in management of breeding programs. The objective of this study was to test a set of SNP markers (Single Nucleotide Polymorphism) to conduct paternity tests on sheep. Samples from three locally adapted Brazilian sheep breeds were genotyped ith a chip containing approximately 50.000 SNP markers (SheepSNP50 Bead Chip, Illumina Inc., San Diego, CA) and from this data bank a low density panel containing 123 SNPs was selected. Of these, 71 were validated on 71 Crioula sheep from the Conservation Nucleus, and 53 were successfully genotyped and showed significant levels of polymorphism. The combined probability of exclusion obtained showed values between 88.8% and 99.9% for paternity exclusion. From the set of SNPs genotyped, four sub-panels were defined based on analyzes of linkage disequilibrium (LD) and deviations from Hardy-Weinberg equilibrium. According to genealogy information, the success in paternity assignments by SNP ranged between 76 and 79% according to the panel used. Despite the potential, there was noted the need for increasing the number of selected markers, thus elevating the power of the analysis. Keywords: Ovis aries, livestock management, genetic diversity, animal genetic resources, molecular markers, conservation genetics.

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LISTA DE ILUSTRAÇÕES

CAPÍTULO I Figura 1. Etapa de hibridização de oligonucleotídeos alelo-específicos (ASO1 e ASO2) e loco-específico (LSO) ao DNA contendo o SNP com base T (timina). Todos os oligonucleotídeos contém sequências de primers universais em suas extremidades (ASO1 – P1 laranja; ASO2 – P2 amarelo; LSO – P3 verde) utilizados em amplificações realizadas em etapas futuras. Além disto, LSO contem também uma sequencia alvo (em azul) para posterior ligação com microesferas VeraCode e leitura em BeadXpress. Note que apenas ASO1 se anela perfeitamente ao loco do SNP. (fonte: Technical Note: Illumina® SNP Genotyping, http://www.illumina.com)........................................................................................................ 14 Figura 2. Fragmento amplificado com primer P1, marcado com fluorescência vermelha (específica do alelo ASO1), e P3. Os produtos desta PCR serão posteriormente ligados às microesferas pela sequencia alvo (azul), para leitura em BeadXpress. (fonte: Technical Note: Illumina® SNP Genotyping, http://www.illumina.com). ....................................................... 15 CAPÍTULO II Figura 1. Quantidade mínima de marcadores para a atribuir a paternidade em casos onde é possível obter o genótipo da mãe (P1 ! 99% com 31 marcadores) e quando se conhece somente o genótipo do provável pai e da progênie (P2 ! 98% com todos os 46 marcadores). .................................................................................................................................................. 45

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LISTA DE TABELAS

CAPÍTULO II

Tabela 1. Triagem de 123 marcadores selecionados a partir de três raças brasileiras (Crioula, Morada Nova e Santa Inês) genotipadas com 50.000 SNPs (http://www.sheephapmap.org). Foram considerados valores de MAF (Minor Allele Frequency) > 0,4 e desvios no Equilíbrio de Hardy Weinberg (EHW) significativos (P < 0,01) nas três raças. ........................................................................................................... 30 ''Tabela 2. Segunda triagem, realizada a partir de 71 marcadores selecionados de acordo com os critérios estabelecidos na Tabela 1. Foram considerados três painéis de acordo com o número de locos ligados nas estimativas de desequilíbrio de ligação (DL): marcadores com até 9 locos ligados (~12,5% de locos ligados/loco), 7 locos ligados (~10%) e 5 locos ligados (~7,5%). ....................................................................................36 Tabela 3. Terceira triagem, realizada a partir de 63 marcadores selecionados de acordo com os critérios estabelecidos na Tabela 2. Foram considerados três painéis de acordo com o número de locos ligados nas estimativas de desequilíbrio de ligação (DL = 12,5, 10 e 7,5%) e com o sucesso das genotipagens acima de 90% para cada loco........................ 38 Tabela 4. Estimativas de diversidade independentes para 46 locos selecionados para os testes de paternidade para todo o conjunto de animais testados (n=71).(A, número de alelos observado; HObs, heterozigosidade observada; HExp, heterozigosidade esperada; PIC, conteúdo de informação polimórfica; NE-1P, probabilidade média de não-exclusão para um pai candidato; NE-2P, probabilidade média de não-exclusão para um pai candidato dado o genótipo de um pai conhecido do sexo oposto; NE-I, probabilidade média de não-exclusão para a identidade de dois indivíduos não relacionados; NE-SI, probabilidade média de não-exclusão para a identidade de dois irmãos; significância para o desvio no equilíbrio de Hardy-Weinberg: *significante ao nível de 0.05; **significante ao nível de 0.01; ***significante ao nível de 0.001%; NR, não realizado; F(null) probabilidade de ocorrência de alelos nulos).....................................................................42

Tabela 5. Estimativas de probabilidades combinadas para quatro painéis de SNPs. (P1 – Probabilidade de Exclusão para apenas um progenitor; P2 – Probabilidade de exclusão sendo dado o genótipo de um dos progenitores; PI – probabilidade de identidade; DL – desequilíbrio de ligação; HWE – desvio no equilíbrio de Hardy-Weinberg). Foi ainda calculada a taxa esparada de insucesso (IS) nas atribuições de paternidade dos dados fornecidos, realizada nas simulações de uma prole com N = 100 mil indivíduos..............45 +,-./,' 0)! *+,-+! .+! /0-+123.0.+! /010! 3.+2-34350678! .8,! /03,! 502.3.0-8,! 903,!/18:;:+3,! /010! 0! /18<+! .+! 023903,! 20,53.8,! +9! $=#=! >-8-0<! .+! '$! /18.?-8,@!?-3<3A02.8!B?0-18!.34+1+2-+,! /032C3,D!ED! %'!90150.81+,! .+4323.8,! 0/F,! +G5<?,78!.+!

xiii

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CAPÍTULO I

2

1. INTRODUÇÃO

Diversas raças de animais domésticos criadas Brasil foram trazidas no período

do descobrimento, há aproximadamente 500 anos. Gradualmente, estas raças se adaptaram às

condições locais e, hoje, elas são comumente denominadas de crioulas, localmente adaptadas

ou naturalizadas (MARIANTE et al., 2003). Devido às características adaptativas alcançadas

por estes animais, eles podem ser considerados como um estoque genético diferenciado,

possuindo genótipos com potencial para desenvolvimento de programas de melhoramento

participativos ou mesmo industriais. No entanto, parte destes grupos genéticos encontram-se

ameaçados de extinção em razão de cruzamentos absorventes com animais de raças exóticas

especializadas, que passaram a ser importados no final do século XIX e inicio do século XX

(MORAIS, 2001). Este processo tem levado animais como ovinos a uma rápida erosão

genética, aumentando a vulnerabilidade dos mesmos às adversidades ambientais (SCHERF,

2000).

Observa-se, portanto, a importância dos estudos sobre conservação, que podem

trazer informações sobre os padrões genéticos dos ovinos naturalizados bem como orientar

programas de cruzamento e de melhoramento. Um dos principais desafios para a conservação

dos recursos genéticos é conhecer, entender e manter toda diversidade genética distribuída

pelo mundo (SILVA, 2010). Em diversas situações a manutenção da diversidade é dependente

de informações confiáveis sobre a genealogia dos rebanhos, para guiar programas de

melhoramento genético e evitar processos indesejados como o aumento da endogamia e a

fixação de alelos deletérios (LUIKART et al., 1999). No entanto, nem sempre estas

informações estão disponíveis nos principais locais de criação de ovinos no Brasil. Para

contornar esta condição, os marcadores moleculares baseados no DNA vêm sendo cada vez

mais usados em estudos com ovinos (p. ex., PAIVA, 2005; McManus et al., 2010). Além das

informações sobre a genealogia, com este tipo de ferramenta é possível ter acesso a dados

sobre evolução, filogenia, filogeografia e análise da estrutura e dinâmica populacionais

(AVISE, 1994). Diferente dos marcadores morfológicos, os marcadores de moleculares

permitem o acesso direto à informação genética na molécula de DNA, não sendo afetados por

variações ambientais (FERREIRA & GRATTAPAGLIA, 1998).

Atualmente, despontam neste cenário os Marcadores de Base Única, mais

conhecidos como SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) que podem ser utilizados como

uma poderosa ferramenta de análise (SCHLÖTTERER, 2004). A grande vantagem desse tipo

de marcador molecular é a possibilidade de automação da genotipagem de milhares de locos

3

em paralelo, além do fato de serem co-dominantes e apresentarem herança Mendeliana (LEE

et al., 2006). Dentre as várias consequências diretas desta tecnologia destaca-se o

desenvolvimento de mapas genéticos de alta densidade saturados com marcadores

moleculares bem como a possibilidade de efetiva implantação da seleção genômica nos

programas de melhoramento.

Para os ovinos, o International Sheep Genomics Consortium

(http://www.sheephapmap.org) teve atuação fundamental no desenvolvimento destas

ferramentas genéticas. Este se iniciou em 2002 e contou com a articipação de 20 países,

incluindo o Brasil (DALRYMPLE et al., 2007). Sua ação levou a criação de um painel de

marcadores de alta densidade e ampla cobertura do genoma da espécie. Assim, informações

de frequências alélicas em diferentes raças de ovinos podem ser obtidas utilizando para isso

dezenas de milhares de marcadores SNP já identificados. Esta ação possibilita a instalação de

protocolos de rastreabilidade, certificação, exclusão de paternidade, seleção de doadores de

germoplasma bem como caracterizar sêmen depositado em Bancos de germoplasma em raças

de ovinos utilizados na pecuária brasileira. O desenvolvimento e validação dessas tecnologias

tem como objetivo potencializar a cadeia produtiva ovina bem como programas de

conservação ex situ, provendo ferramentas de última geração, nos moldes do que está sendo

desenvolvido e aplicado nos centros mundiais de produção e consumo de produtos de origem

animal. Até o momento a seleção dos animais que compõe estes bancos no Brasil e, em

muitos países, é realizada por meio de critérios tradicionais tais como a avaliação de

características produtivas, reprodutivas e sanitárias (NOGUEIRA et al., 2011).

O impacto do desenvolvimento e validação de marcadores moleculares auxiliarão as

associações de criadores e órgãos legislativos relacionados, como a Associação Brasileira de

Criadores de Ovinos (ARCO) e o Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento

(MAPA). Estes terão à disposição, informações que poderão ser úteis na formulação de

políticas para avanço da ovinocultura no país. As soluções geradas poderão trazer, em futuro

próximo, não apenas avanços para organização da cadeia produtiva de ovinos, mas também

proporcionarão soluções para antever e contornar restrições não tarifárias sofridas pelos

nossos produtos de origem animal nos mercados internacionais.

4

1.1. OBJETIVOS

1.1.1. Objetivo Geral

• Avaliar o potencial de marcadores SNPs no teste de exclusão de paternidade em

ovinos no Brasil

1.1.2. Objetivos Específicos

• Desenvolver um painel de marcadores de polimorfismo de base única (SNP) para

exclusão de paternidade em ovinos no Brasil;

• Validar o painel desenvolvido utilizando animais do Núcleo de Conservação da

Ovelha Crioula no Sul do Brasil

5

1.2. REVISÃO DA LITERATURA

1.2.1. Origem e principais características das raças brasileiras

Evidências arqueozoológicas sugerem que os ovinos atuais foram

primeiramente domesticados a partir de animais selvagens que viveram há cerca de 8.000 a

9.000 anos (LEGGE, 1996). Em seguida, as necessidades humanas levaram à geração de

animais cada vez mais especializados na produção de lã, leite e/ou carne. Desde então os

ovinos tem estabelecido uma ampla distribuição geográfica devido sua alta adaptabilidade à

dietas pobres em nutrientes e sua tolerância à condições climáticas extremas, sendo hoje

descritos mais de 1400 fenótipos distintos organizados em diferentes raças distribuídas ao

longo do mundo (SCHERF, 2000).

As raças brasileiras de ovinos podem ser primeiramente divididas em raças

produtoras de lã (Crioula Lanada e Bergamácia Brasileira) ou deslanadas (Santa Inês, Morada

Nova, Somalis, Rabo Largo, Barriga Preta, Cariri), sendo as últimas conhecidas por

produzirem as melhores peles entre os ruminantes (juntamente com caprinos) e terem alta

demanda no mercado de roupas (JACINTO et al., 2004).

Apesar da rusticidade ser um fator comum à maioria das raças naturalizadas no

Brasil, outras características definem cada uma delas. A raça Crioula Lanada, cuja provável

origem se deu a partir da raça espanhola Churra, foi introduzida no Rio Grande do Sul durante

o século XVII. Possui a cara e as extremidades descobertas de lã e coloração variando de

branco ao preto, podendo apresentar tonalidades de marrom. Seu porte é médio, quando

comparado a outras raças naturalizadas, e são conhecidas pela precocidade, fertilidade e

resitência a endoparasitas. São utilizadas para produção de lã destinada ao artesanato e

tapeçaria industrial (MARIANTE et al., 2003).

A raça Bergamácia Brasileira é originária do norte da Itália, foi inicialmente

introduzida no Brasil no início do século XX. Os animais apresentam pelagem branca e são de

grande porte. Os machos adultos apresentam peso variando entre 100 a 120 Kg e fêmeas entre

70 a 80 Kg. É considerada mista, pois, além da lã, produz carne e leite. Porém, sua lã é

destinada principalmente para a fabricação de tecidos grosseiros (ARCO, 2012).

Entre as raças deslanadas, a Morada Nova teve origem incerta. Relatos indicam

que sua provável origem ocorreu por meio de animais da raça Bordaleiro, de Portugal, que

teriam capacidade de gerar tanto animais lanados, quanto deslanados. Porém, devido às

pressões da seleção natural impostas pelo ambiente árido do Nordeste brasileiro, estes animais

6

foram perdendo a característica lanada. Apresentam coloração vermelha, branca ou creme e

são considerados pequeno porte, com o peso adulto atingindo os 60 Kg nos machos e 50 Kg

nas fêmeas. Apesar disto, são considerados como importante fonte de proteína nas regiões de

clima adverso (ARCO, 2012).

A raça Somalis teve sua origem nas regiões da Somália e Etiópia, pertencente

ao grupo dos ovinos de garupa gorda, pela deposição de gordura na inserção caudal. Porém,

há evidências de que estes tenham sofrido a infusão de genes de raças sem esta característica

pela pequena deposição de gordura, quando comparado ao seu ancestral mais primitivo, o

Urial. Tem coloração característica branca com pescoço negro, apresentam porte médio e são

destinados, principalmente à produção de carne e pele (ARCO, 2012).

A raça Santa Inês é considerada de grande porte, com animais adultos machos

podendo alcançar 120 Kg, e fêmeas, 90 Kg. São originários do nordeste do Brasil, como

resultado do cruzamento entre as raças Bergamacia, Morada Nova, Somalis e outros ovinos

sem raça definida. Algumas características particulares confirmam esta hipótese como a

presença de vestígios de lã (oriundos da Bergamácia), condições de pelagem típicas da

Morada Nova e acúmulo de gordura na região da implantação caudal (Morada Nova),

principalemente em animais de grande peso. Sua coloração pode ser preta, avermelhada ou

branca, com diversas tonalidades intermediárias. Apresentam excelente qualidade de carne e

baixo teor de gordura, pele de altíssima qualidade e adaptável a qualquer sistema de criação e

pastagem (ARCO, 2012). Segundo dados de Mariante, et al. (2003), sua expansão se deu

principalemente devido ao seu porte superior ao apresentado pela raça Morada Nova.

A raça Rabo Largo é provavelmente constituída por ovelhas de origem do Sul-

Africana cruzadas com animais da raça Crioula (MARIANTE et al., 2003). Tem como

principal caracaterística a cauda com base larga, devido ao acúmulo de gordura, a qual serve

como reserva de energia para períodos de escasses de alimento. Além disto os animais

apresentam chifres bem desenvolvidos. São de médio porte e possuem pelagem variando de

branco a vermelho. Apresentam aptidão para produção de carne e pele, sendo considerados

férteis mesmo em condições adversas. Seu porte é médio e seu corpo é longo e medianamente

profundo (ACCOMIG, 2007).

Já a raça Cariri, assim como Santa Inês, originou-se no Nordeste brasileiro.

Ocorre principalmente na região semi-árida dos Cariris Paraibanos. Relatos de criadores

informam que esta se originou com o cruzamento entre animais Santa Inês, Morada Nova e

Black-Belle (provenientes de Barbados). São caracterizados pela presença de uma mutação

dominante que garante uma pelagem definida de coloração. O padrão apresenta-se preto com

7

ventre e parte interna dos membros brancos ou castanha clara. Machos cruzados com ovinos

de qualquer outra raça transmitem estas características de forma consistente (ARCO, 2012).

1.2.2. Conservação dos recursos genéticos ovinos no cenário nacional

Nos últimos anos o aumento populacional e a demanda por alimentos levou a

uma alteração nas práticas agrícolas que passou a considerar como seu principal foco a

produção (TABERLET et al., 2007). Este processo levou à padronização dos produtos e dos

sistema de produção, aumentando a produtividade. Em contrapartida, o mesmo levou a perda

de variedades tradicionais e aumentou a vulnerabilidade de diversos animais frente a

mudanças climáticas, epidemias e doenças (ESQUINAS-ALCÁZAR, 2005). Atualmente a

uniformização dos alimentos e das variedades tradicionais tem sido combatida em programas

de conservação (LOTTI, 2010).

Os programas de conservação priorizam raças ameaçadas ou aquelas onde o

nível de informação tecno-científica ainda é baixo. Deve-se ainda ressaltar que o termo

“recurso genético” leva em consideração toda informação genética de origem animal e vegetal

com potencial para uso em alimentação (FAO, 2007). Um dos principais desafios é entender e

conhecer como toda a diversidade está distribuída e organizada pelo mundo. Porém, a

escassez de estudos pode, muitas vezes, levar a falsas interpretações sobre a diversidade

genética de determinadas localidades. Segundo a FAO, baixos níveis de biodiversidade

animal doméstica são relatados na região Ibero-Americana. Porém, embora nem todas as

raças brasileiras sejam contempladas em projetos de conservação, estima-se que 65% das

raças criadas no Brasil já tiveram alguma característica de interesse estudada (MARIANTE et

al., 2003). Isto faz com que o Brasil se destaque quando comparado a outros países da

América Latina.

Mesmo nestas condições, de todas as raças de ovinos existentes no Brasil,

apenas 11 apresentam crescimento populacional efetivo em seus rebanhos (McMANUS et al.,

2007), mostrando que ainda há défcits de informação em alguns locais. Como exemplo,

variedades de ovinos potencialmente distintas são hoje definidas apenas como “Crioulas”

(DELGADO et al., 2005). Este fator, juntamente com as diferenças geográficas, preferências

reprodutivas e a seleção natural, podem dar origem a distintos ecótipos raciais ainda

desconhecidos (LANARI et al., 2003). Além disto, estudos genéticos vem demonstrando

vulnerabilidades nas definições fenotípicas de algumas raças. Em Santa Inês foram

8

observadas diferenças significativas entre rebanhos do alto nordeste versus rebanhos do baixo

nordeste e centro-oeste (PAIVA et al., 2005).

1.2.3. Marcadores moleculares e a caracterização dos recursos genéticos ovinos

Além da caracterização morfológica das raças, recentemente vem se

destacando a caracterização molecular (PAIVA et al., 2005; EGITO et al., 2009; PAIVA et

al., 2011; KIJAS et al., 2012). Assim, marcadores moleculares têm sido utilizados na

tentativa de se determinar padrões genéticos específicos de raças ou de seus produtos,

aumentando o nível técnico das informações.

Os marcadores moleculares são definidos como toda e qualquer informação

molecular, oriunda de um gene expresso ou de um segmento específico de DNA, que segue os

padrões Mendelianos de herança (FERREIRA & GRATTAPAGLIA, 1998). Diversas

técnicas vêm sendo desenvolvidas para detectar variabilidade genética nas seqüências de

DNA, mediante marcadores moleculares. Entre as principais utilizadas para o estudo em

ovinos podemos destacar os microssatélites (também conhecidos como STR – Short Tandem

Repeats) e SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms ou Marcadores de Base Única).

Os locos de microssatélites são altamente polimórficos e foram considerados a

principal ferramenta molecular usada em estudos de genética de populações e associação com

características quantitativas (SCHLÖTTERER, 2004). Em programas de conservação de

ovinos no Brasil, um estudo com microssatélites detectou que 11,76% da variação total (p <

0,001) ocorria devido às diferenças inter-raciais (PAIVA et al., 2006). Três diagramas obtidos

da diversidade de Nei e Neighbor-joining dividiram as raças em três grandes grupos: raças

naturalizadas brasileiras, raças exóticas produtoras de lã e raças africanas recentemente

introduzidas. Análises Bayesianas identificaram uma subestrutura significante na raça Santa

Inês e Morada Nova (PAIVA et al., 2005). Estes resultados, juntos com a variabilidade

interna das raças mostraram que, embora a Santa Inês possa ser considerada uma única raça,

ela apresenta alguns eventos de introgressão no seu passado recente, apresentando, portanto,

alta taxa de polimorfismo genético com uma pobre definição fenotípica (por exemplo,

presença de múltiplas cores). Este fato pode ter várias causas, como o padrão da raça ser

muito amplo, deixando margem para várias interpretações de definição de suas características

ou pelo cruzamento entre raças. Assim, estudos associados a marcadores moleculares que

incluem as ovelhas Santa Inês devem ser precedidos por testes detalhados de estrutura

9

genética, de modo que os resultados não sejam confundidos pelos ecótipos. A raça

Bergamacia (produtora de lã), por exemplo, apareceu situada dentro do grupo das ovelhas

deslanadas, indicando que a mesma pode ter sofrido cruzamentos com outras raças deslanadas

no passado (McMANUS et al., 2010).

Os microssatélites são, ainda hoje, o tipo de marcador mais usado para estudos

de exclusão de paternidade em várias espécies (inclusive espécie humana), com a

padronização de inúmeros painéis para esta finalidade homologados oficialmente, tanto no

âmbito nacional para espécies domésticas de produção (MAPA, 2004) bem como

internacional (www.isag.org.uk).

Entretanto, os microssatélites apresentam algumas características limitantes

para estudos de paternidade, origem, estruturação populacional, certificação e rastreabilidade

de determinadas raças (ex., ROHRER et al., 2007; EGITO et al., 2007; PAIVA, 2005;

HEATON et al., 2005; CANÕN et al., 2001). Avanços tecnológicos recentes criaram

condições para um cenário em que outro tipo de marcador molecular, os Polimorfismos de

Base Única ou SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms), passassem a auxiliar em estudos de

diversidade, confirmação de genealogias, certificação e rastreabilidade de produtos de origem

animal (veja, HEATON et al., 2005 e NEGRINI et al., 2008).

Os SNPs são as variações mais comuns no genoma, por se tratarem de

pequenas mutações pontuais, como transições e transversões. Ocorrem a uma frequência

aproximada de um SNP a cada Kilobase e seguem herança mendeliana (WANG et al, 1998).

Uma das vantagens dos SNPs quando comparados aos microssatélites é a baixa taxa de

mutação em populações (VIGNAL et al., 2002). Uma estimativa da taxa de mutação de um

loco de indicou valores de 10-9 mutações por sítio geração (SATTA et al., 1993), sendo este

valor inferior à taxa apresentada por marcadores microssatélites, que mostraram, em média,

10-2 a 10-5 mutações por sítio por geração (HEYER, 1993; TAUTZ et al., 1994).

Outro fator que torna os SNPs mais vantajosos entre os marcadores

moleculares é seu potencial para automação e padronização da técnica entre laboratórios. Em

estudo recente, Kijas et al. (2012) avaliaram a diversidade genética de raças de ovinos de todo

o mundo. A padronização da técnica de genotipagem dos marcadores moleculares permitiu a

realização desse tipo de estudo em larga escala, de forma que dados originados de

laboratórios situados em diferentes continentes pudessem ser gerados independentemente e,

posteriormente, comparados utilizando os mesmos parâmetros estatísticos. Diversos

laboratórios do mundo participaram desta iniciativa, incluindo o Brasil, com atuação direta da

Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia. Os resultados mostraram a existência de

10

estruturação genética entre as principais raças de ovinos que corresponde aos eventos

históricos ocorridos ao longo do tempo de dispersão das mesmas.

Existem desafios para o emprego efetivo de marcadores moleculares do tipo

SNP na caracterização, paternidade, certificação e rastreabilidade de espécies de animais

domésticos Como são considerados bialélicos (ao contrário dos microssatélites que são

multialélicos) é necessário um número maior de SNPs para um poder similar de

discriminação (VAN EANENNAAM et al., 2007). Porém esta limitação vem sendo

contornada com o aumento de informação sobre as principais espécies de interesse

econômico. Utilizando a espécie humana como exemplo, mais de quatro milhões de SNPs

foram genotipados durante a segunda fase do projeto HapMap (INTERNATIONAL

HAPMAP CONSORTIUM et al., 2007). Em se tratando de espécies animais, uma ampla

gama de SNPs também foram descritos para galinhas (INTERNATIONAL CHICKEN

POLYMORPHISM MAP CONSORTIUM, 2004), cães (LINDBLAD-TOH et al., 2005),

ratos (FRAZER et al., 2007) e bovinos (VAN TASSELL et al., 2008). Em humanos, estes

marcadores tem sido associados a uma série de doenças complexas (VAN TASSELL et al.,

2008) e, em animais domésticos, os SNPs tem sido mapeados para rastrear Locus de

Características Quantitativas (QTLs) (KARLSSON et al., 2007; CHARLIER et al., 2008;

MANOLIO et al., 2008).

O Consórcio Internacional do Genoma Ovino (International Sheep Genomics

Consortium, ISGC, 2006) validou um painel de 60.000 marcadores SNP em

aproximadamente 3.000 animais provenientes de mais de 50 raças de ovinos. Entre essas

raças, a Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia enviou amostras de DNA permitindo

assim que raças brasileiras participassem da validação da ferramenta desenvolvimenta.

Tecnologias para genotipagem de marcadores SNP de alta densidade (de dezenas de milhares

até 1 milhão de SNPs em um único ensaio), assim como média (centenas) e baixa densidade

(dezenas) estão disponíveis. Muitas dessas tecnologias estão disponíveis na forma de serviços

ofertados por empresas comerciais. Estas novidades estão revolucionando a capacidade de

trabalho e os objetivos almejáveis em projetos de prospecção de genes de interesse

econômico.

Assim, os marcadores moleculares podem ser usados na caracterização como

uma estratégia de monitorar cruzamentos entre raças nos registros genealógicos. Os

cruzamentos entre raças podem reduzir a frequência de importantes características na

população e causar a introgressão de características não desejadas (McMANUS et al., 2010).

Assim, a seleção de características desejáveis contará com o auxílio das informações obtidas

11

com o uso de seleção assistida por marcadores moleculares (SAMM). Neste caso, os melhores

marcadores seriam aqueles derivados de mutações casuais, porém, quando os mesmos não

estão disponíveis, uma haplótipo que está em forte desequilíbrio de ligação poderia ser

utilizado (McMANUS et al., 2010). Alguns exemplos já foram citados em ovinos como no

caso do marcador Inverdale para identificar padrões de prolificidade em ovelhas

(GALLOWAY et al., 2000) e o haplótipo GDF8 para identificar uma variedade de ovelhas

com uma musculatura mais desenvolvida (JOHNSON et al., 2005).

1.2.4. Determinação de paternidade no melhoramento genético animal

Além da caracterização genética das raças, os programas de melhoramento

requerem informações acuradas sobre o pedigree para controlar o aumento da endogamia nos

rebanhos. Ron et al. (1996) estimou aumento de mais de US$ 2 milhões em 20 anos, apenas

aumentando a eficiência das informações de pedigree de raças de bovinos.

Como um exemplo em raças de ovinos, os programas de seleção para o

aumento de fertilidade em ovinos são baseados na escolha de machos candidatos com

referência na fertilidade de suas mães e, posteriormente, avaliando a fertilidade das suas

filhas. Os melhores machos são escolhidos como reprodutores, aumentando o “valor”

genético da população. Quando os erros de determinação de paternidade são altos, o sucesso

de um projeto de melhoramento pode ser comprometido (ARRUGA et al., 2001).

Neste sentido, os marcadores moleculares podem ser considerados uma

ferramenta poderosa nos casos onde as informações genealógicas não estão disponíveis ou

podem conter erros principalmente no que diz respeito ao provável pai da prole em questão

As informações de frequências alélicas destes marcadores podem ser utilizadas para a

determinação dos possíveis pais de um rebanho por meio das estimativas de exclusão de

paternidade.. O principal requisito para a utilização dos marcadores em análise de paternidade

é a obtenção de um painel com marcadores que tenha poder estatístico suficiente para

identificar com acurácia os progenitores dentro de populações onde a informação genealógica

é escassa (HEATON et al., 2002). O emprego de ferramentas como essa possibilita a

formulação de estratégias de conservação, determinação do número populacional efetivo e,

por fim, abre possibilidades para o gerenciamento adequado de cruzamentos (McMANUS et

al., 2010).

12

A estimativa de exclusão de paternidade pode ser definida como a

probabilidade de se excluir um indivíduo aleatoriamente como suposto pai frente a outro

indivíduo amostrado aleatoriamente na população. Este tipo de análise pode ser definida em

casos onde um dos pais é conhecido, ou nos casos onde nenhum dos pais estão confirmado

(JAMIESON & TAYLOR, 1997). A probabilidade de identidade também pode ser utilizada e

indica a chance de selecionar, aleatoriamente, dois indivíduos idênticos geneticamente

(PEATKAU et al., 1998).

Diversos estudos citam a importância dos marcadores moleculares neste

sentido. Como exemplo, Arruga et al. (2001) utilizaram apenas quatro microssatélites para

estimar a paternidade de raças de ovelha Rasa Aragonesa. Porém, estas estimativas de

exclusão de paternidade mostram que há uma taxa de erro relacionada com a quantidade de

marcadores utilizados nas análises. Em trabalhos onde foram utilizados seis marcadores

microssatélites, foi observado uma taxa de erro de 10% quando os genótipos das mães foram

informados e 18% quando os mesmos não foram informados. Considerando marcadores com

frequências alélicas uniformemente distribuídas, ao se comparar os resultados de

microssatélites com os de SNPs, estimou-se que seriam necessários 30 SNPs para se obter a

mesma taxa de erro quando a informação dos genótipos maternos está disponível e 70 quando

não disponível (VIGNAL et al., 2002). Isso mostra a necessidade de se acessar uma maior

quantidade de locos quando os marcadores SNPs são utilizados.

1.2.5. Tecnologias para a genotipagem de SNPs

Como citado anteriormente, um fator que conta positivamente a favor dos SNPs é o

seu potencial para automação e a possibilidade de padronização da técnica entre laboratórios.

Assim, diversas técnicas de genotipagem deste marcador vem sendo descritas, sendo que

critérios como número de amostras e quantidade de locos analisados são os principais pontos

a se considerar na escolha da melhor metodologia.

A metodologia que requer menor investimento em infra-estrutura para genotipagem de

SNPs é a genotipagem por Clivagem por Endonuclease. Nesta metodologia, diferentes alelos

de SNPs presentes em um determinado loco podem fornecer um sítio de clivagem ou não para

uma enzima de restrição. Deste modos, fragmentos RFLP podem ser gerados onde um dos

alelos conserva a sequencia do fragemento original, enquanto o outro é clivado pela enzima

de restrição. Esta é uma das técnicas mais antigas utilizadas para a genotipagem de SNPs,

13

porém, apresenta a limitação de não poder ser realizada em análises em larga escala e a

dependência de se encontrar um ponto de corte específico de restrição para cada loco

estudado (TWYMAN, 2005).

Outra metodologia de genotipagem a ser citada é a genotipagem por Hibridização

Alelo-Específica (TWYMAN & PRIMROSE, 2003), que consiste na criação de sondas

complementares ao loco contendo o SNP (allele-specific oligonucleotide probes ou ASO

probes), sendo criadas tantas sondas distintas quanto forem o número de alelos. Cada sonda é

criada criada com nucleotídeos exatamente complementares ao alelos disponíveis e estas

recebem marcação específica (p. ex., fluorocromos). As condições de estringência na

hibridização entre DNA ! sonda definem o anelamento ou não entre ambos. Assim, é

esperado que apenas a sonda totalmente complementar seja hibridizada. Consequentemente, a

leitura da sonda hibridizada definirá qual alelo está presente na amostra. Ensaios mais

sofisticados com esta técnica (TaqMan) usam a hibridização alelo específica como critério de

discriminação inicial, porém, acrescentam passos enzimáticos adicionais para detectar o sinal

do alelo correto.

Outra metodologia com princípio semelhante ao último e que pode ser empregada na

análise de SNPs é a genotipagem por PCR Alelo-Específica (GAUDET et al., 2009). Neste

processo, as reações de PCR são dirigidas com a utilização de iniciadores que apresentam

nucleotídeos específicos para cada alelo de SNP disponível. Cada um destes iniciadores

recebem marcações fluorescentes distintas para que possam ser detectados os alelos da

amostra. É uma metodologia simples, porém, conta com a desvantagem de necessitar de

sequenciadores automáticos para a leitura e de apresentar alta taxa de erro nas genotipagens,

já que as otimizições das reações devem ser rigorosamente calculadas. Além disto, a análise

também é limitada pelo número de fluorescências que podem ser detectadas pelos

sequenciadores (TWYMAN, 2005).

Como metodologia alternativa, pode-se citar ainda a Extensão de Base Única, também

conhecida como Mini-Sequenciamento (SYVANEN, 1999). Nesta técnica, são desenhados

iniciadores que se anelam a extamente um nucleotídeo antes da posição do SNP. Assim, uma

reação de sequenciamento é conduzida, porém esta contém apenas os dideoxinucleotídeos.

Desta forma, apenas uma base será incorporada pela Polimerease na cadeia de DNA em

crescimento e esta, por sua vez, corresponderá ao próprio SNP. O alelo correspondende pode,

então, ser detectado uma vez que dependendo da base adicionada, uma marcação diferente

poderá ser adotada. Esta metodologia é a base de alguns kits comerciais de genotipagem de

14

média a larga escala como SnaPshot™ (Applied Biosystems), GenFlex™ (Affymetrix) e

SNuPETM™ (Amersham).

Outra metodologia que vem sendo explorada utiliza a combinação do processo de

genotipagem GoldenGate® em conjunto com a tecnologia VeraCode® (LIN et al., 2009).

Genotipagens de média e alta densidade podem ser realizadas e a metodologia conta com a

utilização de dois oligonucleotídeos alelo-específicos (ASO) que se posicionam exatamente

antes do local do SNP e um terceiro oligonucleotídeo loco-específico (LSO), que se posiciona

algumas bases depois da posição do SNP. Dependendo do alelo presente no DNA alvo,

apenas um ou outro ASO irá se ligar (Figura 1).

Figura1. Etapa de hibridização de oligonucleotídeos alelo-específicos (ASO1 e ASO2) e loco-específico (LSO) ao DNA contendo o SNP com base T (timina). Todos os oligonucleotídeos contém sequências de primers universais em suas extremidades (ASO1 – P1 laranja; ASO2 – P2 amarelo; LSO – P3 verde) utilizados em amplificações realizadas em etapas futuras. Além disto, LSO contem também uma sequencia alvo (em azul) para posterior ligação com microesferas VeraCode e leitura em BeadXpress. Note que apenas ASO1 se anela perfeitamente ao loco do SNP. (fonte: Technical Note: Illumina® SNP Genotyping, http://www.illumina.com).

Após a hibridização dos oligonucleotídios, a extremidade 3’ do ASO é extendida pela

enzima DNA-polimerase até alcançar a extremidade 5’ do LSO. Em seguida, ambas as

extremidades são ligadas pela enzima DNA-ligase, formando um fragmento único (ver Figura

2, fragmento inferior). A molécula resultante (ASO + loco extendido + LSO) servirá como

molde para uma PCR onde os primers específicos de cada alelo (P1 ou P2) estão

distintamente marcados. Após a PCR, os fragmentos gerados serão ligados às microesferas

para posterior leitura em BeadXpress, utilizando a tecnologia VeraCode.

15

Figura 2. Fragmento amplificado com primer P1, marcado com fluorescência vermelha (específica do alelo ASO1), e P3. Os produtos desta PCR serão posteriormente ligados às microesferas pela sequencia alvo (azul), para leitura em BeadXpress. (fonte: Technical Note: Illumina® SNP Genotyping, http://www.illumina.com).

16

1.3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ACCOMIG, Associação dos Criadores de Caprinos e Ovinos de Minas Gerais. Disponível em: <http://www.caprileite.com.br> Acessado em: 10/12/2007.

ARCO, Assistência ao Rebanhos Criadores de Ovinos; Associação Brasileira de Criadores de Ovinos. Disponível em: http://www.arcoovinos.com.br Acessado em: 15/08/2012.

ARRUGA, M.V.; MONTEAGUDO, L.V.; TEJEDOR, M.T.; BARRAO, R.; PONZ, R. Analysis of microsatellites and paternity testing in Rasa Aragonesa sheep. Research in Veterinary Science, 70, 271-273, 2001.

AVISE, J.C.; HAMRICK, J.L. 1994. Conservation genetics: case histories from nature. New York: Chapman e Hall. 556p.

CAÑON J., ALEXANDRINO P., BESSA I., CARLEOS C., CARRETERO Y., DENNER S., FERRAN N., GARCIA D., JORDANA J., LALOE D., PEREIRA A., SANCHEZ A., MOAZAMI-GOUDARZI K. Genetic diversity measures of local European beef cattle breeds for conservation purposes. Genet. Sel. Evol. v. 33, p.311-332, 2001.

CHARLIER C, COPPIETERS W, ROLLIN F, DESMECHT D, AGERHOLM JS, et al. Highly effective SNP-based association mapping and management of recessive defects in livestock. Nature Genetics, p. 449–454, 2008.

DALRYMPLE, B.P.; KIRKNESS, E.F.; NEFEDOV, M.; McWILLLIAM, S.; RATNAKUMAR, A.; BARRIS, W.; ZHAO, S.; SHETTY, J.; MADDOX, J.F.; O’GRADY, M.; NICHOLAS, F.; CRAWFORD, A.M.; SMITH, T.; JONG, P.J.; McEWAN, J.; ODDY, H.; COCKETT, N.E. and the INTERNATIONAL SHEEP GENOMICS CONSORTIUM. Using comparative genomics to reorder the human genome sequence into a virtual sheep genome. Genome Biology, v. 8, p. R152, 2007.

DELGADO, J.V.; MARTÍNEZ, R.; REVIDATTI, M.A.; VACA, J.L.; STEMMER, A.; SERENO, J.R.B.; BENÍTEZ, D.; MARIANTE, A.S.; RIBEIRO, M.N.; RIBAMAR, J.; ANZOLA, H.; VELAZQUES, F.; ZAMBRANO, D.; CAMACHO, M.E.; SIERRA, A.; HERNANDEZ, J.S.; PERREZGROVAS, R.; MEDRANO, A.; ALUJA, A.; URVIOLA, N.G.; MATOS, C.; CARCAMO, F.; FERNÁNDEZ, G.; PARIACOTE, F.; TOLEDO, P.M. Balance de siete años em pro de La conservación de razas ibero-americanas: Red cyted- XII-H. Archivos de Zootecnia, Córdoba, v.54, p. 129-134, 2005.

EGITO, A.A.; PAIVA, S.R.; ALBUQUERQUE, M.S.M.; MARIANTE, A.S.; ALMEIDA, L.D.; CASTRO, S.R. AND GRATTAPAGLIA D. Microsatellite based genetic diversity and relationships among ten Creole and commercial cattle breeds raised in Brazil. BMC Genetics, v. 8, p. 83, 2007.

ESQUINAS-ALCÁZAR, J. Protecting crop genetic diversity for food security: political, ethical and technical challenges. Natural Reviews Genetics, v. 6, p. 946-953, 2005.

FAO (Food and Agriculture Organization of the United Nations) The state of the world’s animal genetic resource for food and agriculture (Eds. B. RISCHKOWSKY e D. PILLING). Roma, Italy, 2007, 512p.

17

FERREIRA, M.E.; GRATTAPAGLIA, D. Introdução ao uso de marcadores moleculares em análise genética. 3ª ed. Brasília: Embrapa/CENARGEN, 1998.

FRAZER, K.A. et al. A sequence-based variation map of 8.27 million SNPs in inbred mouse strains. Nature, n. 448, p. 1050–1053, 2007.

GAUDET, M; FARA, AG; BERITOGNOLO, I; SABATTI, M. Allele-Specific PCR in SNP Genotyping. In: WALKER, JM. (ed.). Mehods in Molecular Biology, Humana Press, Clifton, NJ, 415-424, 2009.

HEATON, M.P.; HARHAY, G.P.; BENNETT, G.L. et al. Selection and use of SNP markers for animal identification and paternity analysis in U.S. beef cattle. Mammalian Genome, v.13, n.5, p.272-81, 2002.

HEATON, M.P. ; KEEN, J.E. ; CLAWSON, M.L. ; HARHAY, G.P. ; BAUER, N. ; SCHULTZ, C. ; GREEN, B.T. ; DURSO, L.M. ; CHITKO-MCKOWN, C.G. ; LAEGREID, W.W. Use of bovine single nucleotide polymorphism markers to verify sample tracking in beef processing. Journal of the American Veterinary Medical Association, v. 226, n. 8, p. 1311-1314, 2005.

HEYER, E., PUYMIRAT, J., DIELTJES, P., BAKKER, E., DE KNIJFF, P., Estimating Y chromosome specific microsatellite mutation frequencies using deep rooting pedigrees, Hum Mol Genet v. 6, p. 799–803, 1997.

INTERNATIONAL CHICKEN POLYMORPHISM MAP CONSORTIUM. A genetic variation map for chicken with 2.8 million single-nucleotide polymorphisms. Nature 432: 717–722, 2004

INTERNATIONAL HAPMAP CONSORTIUM, et al. A second generation human haplotype map of over 3.1 million SNPs. Nature 449: 851–861, 2007.

JACINTO, M.A.C.; SOBRINHO, A.G.S.; COSTA, R.G. Características anátomo-estruturais da pele de ovinos (Ovis aries L.) lanados e deslanados, relacionadas com o aspecto físicomecânico do couro. Revista Brasileira de Zootecnia, v.33, n.4, p.1001-1008, 2004.

JAMIESON, A.; TAYLOR, St.C.S. Comparisons of three probability formulae for parentage exclusiion. Animal Genetics, 28, 397-400, 1997.

KARLSSON EK, BARANOWSKA I, WADE CM, SALMON HILLBERTZ NH, ZODY MC. Efficient mapping of mendelian traits in dogs through genome-wide association. Nature Genetics, v. 39, p.1321–1328, 2007.

KIJAS, J.W.; TOWNLEY D, DALRYMPLE BP, HEATON MP, MADDOX JF, et al. A genome wide survey of SNP variation reveals the genetic structure of sheep breeds. PLoS Biology: v. 10, p. e1001258, 2012.

LANARI, M.R.; TADDO, H.; DOMINGO, E.; PEREZ-CENTERO, M.; GALLO, L. Phenotypic differentiation of exterior traits in local Criollo Goat Population in Patgonia (Argentina). Archives Animal Breeding, Dummerstorf, v. 46, p. 347-356, 2003.

18

LEE MA, KEANE OM, GLASS BC, MANLEY TR, CULLEN NG, DODDS KG, MCCULLOCH AF, MORRIS CA. Establishment of a pipeline to analyse non-synonymous SNPs in Bos taurus. BMC Genomics, v. 7, p. 298, 2006.

LEGGE T (1996) The beginnings of caprine domestication, in HARRIS DR, ed. The Origins and Spread of Agriculture and Pastoralism in Eurasia. New York: Smithsonian Institution Press. pp 238–262.

L_XN! R"T"N! `YEaLY`! N! b"c"N! cRKEX_YL! *aN! dTYX! e"! >$==)@! c+.3?9V! -8! T3JfV*f18?Jf/?-!dXg!h+28-U/32J!i,32J!j+10R8.+!c3518I+0.,"!1.23456'14/'784/"!:"!%)'N!/"#$)V#%$N!!$==)"!

!LINDBLAD-TOH K, WADE CM, MIKKELSEN TS, KARLSSON EK, JAFFE DB, et al. (2005) Genome sequence, comparative analysis and haplotype structure of the domestic dog. Nature 438: 803–819

LOTTI, A. The commodization of products and taste: slow food and the conservation of agrobiodiversity. Agriculture and Human Values, v. 27, n. 1, p. 71-83, 2010.

LUIKARTE, G.; BIJU-DUVAL, M.P.; ERTUGRUL, O.; ZAGDSUREN, Y.; MAUDET, C.; TABERLET, P. Power of 22 microsatellite markers in fluorescente multiplexes for parentage testing in goats (Capra hircus) Animal Genetics, v. 30, p. 431-438, 1999.

MANOLIO TA, BROOKS LD, COLLINS FS. A HapMap harvest of insights into the genetics of common disease. Journal of Clinical Investigation. v. 118, p.1590–1605, 2008.

MARIANTE, A.S.; McMANUS, C. ; MENDONÇA, J.F. Country report on the state of animal genetic resources. (S. L.) : Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento e Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária, 2003, p. 97 (Research Division Report).

McMANUS, C. ; PAIVA, S.R. ; LANDIM, A.V. ;LOUVADINI, H. Melhoramento genético de ovinos. In: ZOOTEC 2007, Londrina. A Zootecnia frente a novos desafios. Londrina : Anais... UEL, 2007, p. 501-530.

McMANUS, C. ; PAIVA, S.R. ; ARAUJO, R.O. Genetics and breeding of sheep in Brazil. Revista Brasileira de Zootecnia, v. 39, p. 236-246, 2010.

MINISTÉRIO DA AGRICULTURA, PECUÁRIA E ABASTECIMENTO – MAPA. Instrução Normativa No. 74 de 20 de Outubro de 2004. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, Brasília: 2004.

MORAIS, O.R. O Melhoramento genético dos ovinos no Brasil. In: Melhoramento Genético Aplicado à Podução Animal (ed. PEREIRA, J.C.C.). 3ed. Belo Horizonte, FEPMUZ, 555p., 2001.

NEGRINI, R. ; NICOLOSO, L. ; CREPALDI, P. ; MILANESI, E. ; MARINO, R. ; PERINI, D. ; PARISET, L. ; DUNNER, S. ; LEVEZIEL, H. ; WILLIAMS, J.L. ; AJMONE- MARSAN, P. Traceability of four European Protected Geographic Indication (PGI) beef products using Single Nucleotide Polymorphisms (SNP) and Bayesian statistics. Meat Science, v. 80, n. 4, p. 1212-1217, 2008.HEGGEBØ et al., 2002

19

NOGUEIRA, D.M.; ELOY, A.M.X. ; SÁ, C.O. ; LOPES-JÚNIOR, E. S. ; SALLES, HÉVILA OLIVEIRA ; SÁ, J.L. ; SOUZA, PEDRO HUMBERTO FELIX DE . Manejo Reprodutivo. In: Tadeu Vinhas Voltolini. (Org.). Produção de Caprinos e Ovinos no Semiárido. Produção de Caprinos e Ovinos no Semiárido. 1ed.Petrolina: Embrapa Semiárido, 2011, v. 1, p. 385-420.

PAIVA, S.R. Caracterização da diversidade genética de ovinos no Brasil com quatro técnicas moleculares. 2005. 108f. Tese (Doutorado em Genética e Melhoramento) - Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, MG.

PAIVA, S.R.; SILVÉRIO, V.C.; EGITO, A.A.; MCMANUS, C.; FARIA, D.A.; MARIANTE, A.S.; CASTRO, S.R.; ALBUQUERQUE, M.S.M.; DERGAM, J.A. Genetic variability of the Brazilian hair sheep breeds. Revista Agropecuária Brasileira, v. 40, n.9, p. 887-893, 2005.

PAIVA, S.R.; FARIA, D.A.; DERGAM, J. et al. Genetic structure of hair sheep breeds in Brazil by microsatellites markers. In: INTERNATIONAL CONFERENCE ON ANIMAL GENETICS, 30., 2006, Porto Seguro. Proceedings... Porto Seguro, 2006.

PAIVA, S.R.; FACÓ, O.; FARIA, D.A. ; LACERDA, T. ; BARRETTO, G.B. ; CARNEIRO, P.L.S. ; LOBO, R.N.B. ; McMANUS, C. Molecular and pedigree analysis applied to conservation of animal genetic resources: the case of Brazilian Somali hair sheep. Tropical Animal Health and Production, v. 43, p. 1-8, 2011

PEATKAU, D. ; WAITS, L. ; CLARKSON, P.L. et al. Variation in genetic diversity across the range of North American brown bears. Conservation Biology, 12, 418-429, 1998.

ROHRER, G. A.; FREKING, B. A.; NONNEMAN, D. Single nucleotide polymorphisms for pig identification and parentage exclusion. Animal genetics, v. 38, p. 253-258, 2007.

RON, M.; BLANC, Y.; BAND, M.; EZRA, E.; WELLER, J.I. Misidentification rate in the Israeli dairy cattle population and its implication for genetic improvment. Journal of Dariry Science, v.79, p. 676-681.

SATTA, Y., OHUIGIN, C., TAKAHATA, N., KLEIN, J., The synonymous substitution rate of the major histocompatibility complex loci in primates. Proc Natl Acad Sci USA, v. 90, p. 7480–7484, 1993.

SCHERF DB, ed (2000) World Watch List for Domestic Animal Diversity, Ed. 3. Rome: Food and Agriculture Organization of the United Nations.

SCHLÖTTERER, C. The evolution of molecular markers — just a matter of fashion? Nature Reviews Genetics, v. 5, p. 63–69, 2004.

SILVA, M.C. Estudo Morfométrico de Ovinos da Raça Crioula Lanada no Sul do Brasil: um subsídio para a conservação in situ. 2010. 71F. Dissertação (Mestrado em Ciência Animal) – Universiade Federal de Goiás, Goiás, GO.

SOUZA, C.A.; PAIVA, S.R.; FARIA, D.A. et al. Allele frequency of 23 STRs loci among five populations of Santa Inês hair sheep breed in Brazil. In: 30th INTERNATIONAL

20

CONFERENCE ON ANIMAL GENETICS - ISAG, 30., 2006, Porto Seguro. Anais… Porto Seguro, 2006.

SYVANEN, A.C. From gels to chips: ‘‘Minisequencing’’ primer extension for analysis of point mutations and single S nucleotide polymorphisms. Human Mutat. 1999, 13 (1), 16.

TABERLET, P.; VALENTINI, A.; REZAEI, H.R.; NADERI, S.; POMPANON, F.; NEGRINI, R.; AJMONE-MARSAN, P. Are cattle, sheep, and goats endangered species? Molecular Ecology, v. 17, p. 275-284, 2007.

TAUTZ D, SCHLOTTERER C. Simple sequences. Curr. Opin. Genet. Dev. v. 4, p. 832–37, 1994.

TWYMAN, R.M.; PRIMROSE, S.B. Techniques patents for SNP genotyping. Pharmacogenomics, v. 4, n. 1, p. 67–79, 2003.!TWYMAN, R.M.! d32J<+!X?5<+8-3.+!g8<U981/f3,9! >dXg@!h+28-U/32J!*+5f23B?+,kE2!l:+1:3+m"!Encyclopedia of Diagnostic Genomics and Proteomics, p. 1202-1207, 2005.

TORRES, A.P.; JARDIM, W.R.; JARDIM, L.F. Raças que interessam ao Brasil. Ed. Agronômica Ceres, 2a ed., 303p. 1975.

VAN EENENNAAM, A.L.; WEABER, R.L; DRAKE, D.J.; PENEDO, M.C.T.; QUAAS, R.L.; GARRICK, D.J., POLLAK, E.J. DNA-based paternity analysis and genetic evaluation in a large, commercial cattle ranch setting. Journal of Animal Sciences, v. 85, p. 3159-3169, 2007.

VAN TASSELL CP, SMITH TP, MATUKUMALLI LK, TAYLOR JF, SCHNABEL RD, et al. (2008) SNP discovery and allele frequency estimation by deep sequencing of reduced representation libraries. Nature Methods 5: 247–252.

VIGNAL, A.; MILAN, D.; SANCRISTOLBAL, M.; EGGEN, A. A review on SNP and other types of molecular markers and their use in animal genetics. Genetics Selection Evolution, v. 34, p. 275-305, 2002.

WANG, D.G., FAN, J.B., SIAO, C.J., BERNO, A., YOUNG, P., SAPOLSKY, R., GHANDOUR, G., PERKINS, N., WINCHESTER, E., SPENCER., J., KRUGLYAK, L., STEIN, L., HSIE, L., TOPALOGLOU, T., HUBBELL, E., ROBINSON, E., MITTMANN, M, MORRIS, M. S., SHEN, N., KILBURN, D., RIOUX, J, NUSBAUM, C., ROZEN, S., HUDSON, T.J., LIPSHUTZ, R., CHEE, M.S., LANDER, E.S. Large-scale identification, mapping, and genotyping of single-nucleotide polymorphisms in the human genome, Science 280, p. 1077-1082, 1998.

21

CAPÍTULO II

22

CAPÍTULO II

Análise de Paternidade com Marcadores SNP (Single Nucleotide Polymorphism) em

Ovinos da raça Crioula Lanada

Vasconcelos, Carolina; Caetano, A.R.; Yamagishi, Michel E.B.; Lacerda, Thaísa; McManus,

Concepta M.; Silva, M.V.G.B.; Carneiro, Paulo L.S.; Azevedo, Hymerson C.; Facó, Olivardo;

Souza, Carlos J.H.; Moraes, José C.F.; Araújo, Adriana M.; Martins, Vera M.V.; Paiva,

Samuel R.

2.1. RESUMO

A conservação dos recursos genéticos locais de ovinos é estratégica para contribuir na

segurança alimentar da população de um país, seja na forma do fornecimento de produtos

especializados com indicações de origem e/ou procedência geográfica seja na contribuição de

combinações alélicas alternativas que poderão auxiliar programas de melhoramento e

produção desenvolvidos para grupos genéticos especializados. Para isto, as informações sobre

a genealogia dos rebanhos são críticas para se explorar o melhor potencial de cada raça e

evitar problemas como aumento da endogamia e a erosão genética. Porém, como nem sempre

essas informações estão disponíveis em parte do rebanho nacional, as ferramentas baseadas

em marcadores moleculares podem ter papel fundamental para gerenciar programas de

melhoramento ou conservação onde os registros genealógicos são escassos. Assim, o objetivo

do presente trabalho foi desenvolver e testar um conjunto de marcadores de Base Única

(Single Nucleotide Polymorphism – SNPs) para realizar testes de paternidade em ovelhas.

Amostras de animais de três raças brasileiras de ovinos localmente adaptadas foram

genotipadas com o chip contendo aproximadamente 50.000 marcadores SNP (SheepSNP50

Bead Chip, Illumina Inc., San Diego, CA) e, deste banco de dados, um painel de baixa

densidade contendo 123 SNPs foi selecionado. Deste painel, 71 SNPs foram validados em

uma amostra composta por 71 animais do Núcleo de Conservação da raça Crioula da

Embrapa Pecuária Sul. Foi observado que 53 SNPs tiveram sucesso nas genotipagens e

demonstraram níveis significativos de polimorfismo de forma que as probabilidades de

exclusão combinadas obtidas apresentaram valores entre 88,8% a 99,9%. A partir do conjunto

de SNPs genotipados, quatro sub-painéis foram definidos e testados e o sucesso na atribuição

de paternidade, de acordo com informações de genealogia dos animais, variou entre 76 - 79%.

Apesar do claro potencial dos marcadores selecionados, notou-se a necessidade de se

aumentar o número de marcadores deste painel para elevar o poder de resolução nas análises.

Palavras-chave: pedigree, marcadores moleculares, Ovis aries

23

Parentage testing using SNP Markers for Brazilian Creole Sheep

Vasconcelos, Carolina; Caetano, A.R.; Yamagishi, Michel E.B.; Lacerda, Thaísa; McManus,

Concepta M.; Silva, M.V.G.B.; Carneiro, Paulo L.S.; Azevedo, Hymerson C.; Facó, Olivardo;

Souza, Carlos J.H.; Moraes, José C.F.; Araújo, Adriana M.; Martins, Vera M.V.; Paiva,

Samuel R.

2.2. ABSTRACT

The conservation of local sheep genetic resources is strategic to ensure food security through

the offer of specialized products with geographic indication or certificate of origin as well as

maintenance of alternatives for allelic combinations in relation to specialized genetic groups.

Thus, information about the genealogy of the flocks is critical to exploit the potential of each

breed and avoid problems such as inbreeding and genetic erosion. However, as the

genealogical records are not always available, tools based on molecular markers can play a

fundamental role in management of breeding programs. The objective of this study was to test

a set of SNP markers (Single Nucleotide Polymorphism) to conduct paternity tests on sheep.

Samples from three locally adapted Brazilian sheep breeds were genotyped ith a chip

containing approximately 50.000 SNP markers (SheepSNP50 Bead Chip, Illumina Inc., San

Diego, CA) and from this data bank a low density panel containing 123 SNPs was selected.

Of these, 71 were validated on 71 Crioula sheep from the Conservation Nucleus, and 53 were

successfully genotyped and showed significant levels of polymorphism. The combined

probability of exclusion obtained showed values between 88.8% and 99.9% for paternity

exclusion. From the set of SNPs genotyped, four sub-panels were defined based on analyzes

of linkage disequilibrium (LD) and deviations from Hardy-Weinberg equilibrium. According

to genealogy information, the success in paternity assignments by SNP ranged between 76

and 79% according to the panel used. Despite the potential, there was noted the need for

increasing the number of selected markers, thus elevating the power of the analysis.

Key-words: pedigree, molecular markers, Ovis aries

24

2.3. INTRODUÇÃO

Atualmente, das raças de ovinos presentes no Brasil, apenas 11 apresentam

crescimento populacional efetivo em seus rebanhos, sendo os cruzamentos indiscriminados

um dos principais fatores para o aumento da endogamia e, consequentemente, da diminuição

da variabilidade genética (McMANUS et al., 2010). Para reverter este quadro, um dos

maiores pontos a ser explorado para o melhoramento genético é justamente o conhecimento

sobre a origem e o pedigree de cada animal. Porém, esta é uma situação desafiadora visto que

grande parte dos rebanhos não apresentam estas informações ou as possuem de forma

incompleta. A utilização de múltiplos reprodutores também pode deixar estas informações

imprecisas (ARRUGA et al., 2001).

O uso de técnicas modernas baseadas em informações diretas do DNA vem

auxiliando na identificação de paternidade e levando a informações sobre a genealogia

(CUNNINGHAM & MEGHEN, 2001). Além disto, o emprego destas ferramentas possibilita

a formulação de estratégias de conservação, determinação do número populacional efetivo e,

por fim, abre possibilidades para o gerenciamento adequado de cruzamentos (McMANUS et

al., 2010). De acordo com Pariset et al. (2006) estas técnicas visam atingir três metas

principais: (a) informações de pedigree mais confiáveis; (b) seleção de pool genético visando

a conservação e a determinação de reprodutores e matrizes e (c) a oportunidade de utilizar as

informações para a seleção de genes candidatos e QTLs.

Os pedigrees baseados em informações moleculares baseaim-se no simples

conceito de que os pais passaram para seus filhos apenas um dos dois alelos que possuem para

cada loco. No entanto, apesar da simplicidade, a seleção de locos que possam ser utilizados

para se aplicar esta técnica pode não ser uma tarefa tão direta. Em alguns casos a quantidade

de informação genética pode ser limitada ou, então, a taxa de erro de genotipagem pode

induzir a falhas que comprometem os resultados, levando à idenficação de progenitores falso-

positivos ou à exclusão dos verdadeiros. Assim, diversas ferramentas estatísticas que utilizam

metodologias de probabilidade com simulações de Monte Carlo ou técnicas Bayesianas foram

formuladas e levam em consideração as possíveis fontes de erros (JONES et al., 2010).

Dentre os marcadores moleculares utilizados para este fim, destacam-se os

microssatélites, que são altamente polimórficos e tem demonstrado resultados confiáveis

(FISHER et al., 2009; HARA et al., 2010). Entretanto, com o avanço da tecnologia e com o

aumento da informação gerada em diversos projetos genoma, vem se destacando para este fim

os marcadores SNP (Single Nucleotyde Polymorphisms). A recente preferência por este tipo

25

de marcador em diversos projetos científicos vem sendo justificada pela capacidade de

genotipagem de alta densidade, baixa taxa de mutação e, principalmente, pela

transferibilidade da técnica entre laboratórios (ANDERSON & GARZA, 2006). No caso dos

microssatélites, nem sempre é possível comparar dados gerados em diferentes laboratórios

devido a inconsistência das medidas de comprimento dos alelos e das variações relacionadas

com as próprias reações de PCR, sendo este um fator favorável ao uso dos SNPs (VIGNAL,

2002). Etrentanto, o principal fator limitante dos últimos é o fato dos mesmos serem

geralmente bialélicos. Assim, é necessário um grande número de SNPs para se alcançar o

mesmo poder de exclusão dos microssatélites em testes de paternidade (JONES et al., 2010).

Assim, o presente estudo teve como objetivo avaliar o potencial de um

conjunto de marcadores SNP para teste de paternidade em ovinos. Os marcadores foram

testados na raça Crioula Lanada visando gerar uma ferramenta auxiliar para gerar informações

de pedigree para os Núcleos de Conservação da raça.

26

2.4. MATERIAL E MÉTODOS

2.4.1. Material Biológico

Para etapa de seleção foram usados 88 amostras de raças brasileiras (Crioula,

Morada Nova e Santa Inês) genotipadas com 50.000 SNPs (Kijas et al., 2012). Para a etapa de

validação do painel de baixa densidade de SNPs, foram utilizados ovinos da raça Crioula

Lanada mantidos no Núcleo de Conservação da raça localizado na Embrapa Pecuária Sul

(CPPSUL), Bagé, RS. Foram considerados para identificação de paternidade uma prole de 62

produtos nascidos no ano de 2010, com 9 pais candidatos. Informações da genealogia de

todos os produtos foram fornecidas pela CPPSUL. Todos os animais tiveram amostras de

sangue coletadas e depositadas no Banco Brasileiro de Germoplasma Animal (BBGA) da

Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia.

2.4.2. Extração do DNA

Todo material biológico foi submetido ao protocolo de extração de DNA descrito por

Sambrook et al. (1989). Após as extrações as amostras de DNA foram quantificadas por

espectrofotômetro NanoDrop®, utilizando-se 1,0 !L do DNA diluído em TE + 1,0 !L de

reagente Pico-Green. A concentração de todas as amostras foi ajustada para concentração

final de 40 ng/!L de DNA, sendo estas destinadas à genotipagem.

2.4.3. Identificação/seleção inicial dos SNPs

Um conjunto inicial de 123 marcadores SNPs (ver Tabela 1, Resultados) foi

selecionado a partir de critérios qualitativos e quantitativos estimados a partir da genotipagem

das 88 amostras de raças brasileiras para aproximadamente 50.000 SNPs. Para mais

informações acesse sobre este chip acessar: http://www.sheephapmap.org.

O primeiro critério de seleção adotado para a montagem do painel de

paternidade levou em consideração: (1) Alelo de menor frequência (Minor Allele Frequency -

MAF >0,4; critério eliminatório; (2) posição no genoma definida; e (3) desvios no Equilíbrio

de Hardy-Weinberg (p<0,01) ocorrendo nas três raças genotipadas no Hapmap (critério

eliminatório); (4) Realização de Teste de Desequilíbrio de Ligação entre cada par de

marcadores SNP selecionado. A partir deste último critério foi realizada uma subdivisão

adicional dos marcadores selecionados em que consistiu retirar, progressivamente, os locos

que apresentaram maior número de combinações par a par com desequilíbrio de ligação (DL)

significativo. Assim, foram montados três painéis considerando limites: (A) DL 7,5%:

27

eliminação dos locos que apresentaram 6 ou mais combinações par a par significativas; (B)

DL 10%: eliminação dos locos que apresentaram 8 ou mais combinações par a par

significativas; (C) DL 12,5%: eliminação dos locos que apresentaram 9 ou mais combinações

par a par significativas. As estimativas de Equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW) e

desequilíbrio de ligação (DL) foram estimadas no programa ARLEQUIN 3.5 (EXCOFFIER &

LISCHER, 2010).

2.4.4. Genotipagem

As amostras de DNA foram submetidas à genotipagem utilizando a tecnologia

GoldenGate/Veracode, onde o DNA genômico de cada animal foi hibridizado com os

oligonucleotíodeos alelo-específicos para posterior leitura no BeadXpress (Illumina®),

conforme especificações do fabricante (http://www.illumina.com).

2.4.5. Análises dos Dados e Composição do Painel de SNPs

Os dados gerados no BeadXpress foram analisados com o software

GenomeStudio (Illumina®) para identificação dos alelos dos produtos e dos pais candidatos

da raça Crioula Lanada.

A avaliação dos marcadores genotipados levou em consideração a taxa de

sucesso na definição dos alelos de cada amostra. Foram considerados os locos que

apresentaram no mínimo 90% de alelos definidos (terceira seleção). Marcadores que não

atingiram esta meta foram excluídos das análises.

Após estes procedimentos, os dados dos marcadores selecionados foram

submetidos à análise no programa CERVUS 3.0 (MARSHALL et al. 1998), onde foram

determinadas as estimativas de Heterozigosidade observada (Ho) e esperada (He), desvios no

Equilíbrio de Hardy-Weinberg (HWE) e probabilidade de ocorrência de alelos nulos. O

mesmo software foi, ainda, utilizado para realização de testes de inclusão/exclusão de

paternidade, considerando-se toda a prole (N = 62) juntamente com os pais candidatos (N =

9). Na simulação de paternidade, o parâmetro “proporção de locos genotipados” foi fixada em

0,94, com taxa de erro de genotipagem de 0,01/indivíduo. Os valores críticos de Delta foram

ajustados para 95% (confidência estrita) e 80% (confidência relaxada), baseados em 100.000

simulações. Após estas análises, os dados foram utilizados para se estimar a paternidade da

progênie utilizando o parâmetro Paternity.

28

Comparações para determinar o número mínimo de marcadores SNPs

necessários para exclusão de paternidade foram realizadas utilizando o software GENALEX 6

(PEAKALL & SMOUSE, 2006).

29

2.5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

2.5.1. Resultados

2.5.1.1 Avaliação locos genotipados para montagem do painel

Dos 123 marcadores inicialmente utilizados, 71 foram selecionados após

análise dos valores de MAF e desvios significativos no equilíbrio de Hardy-Weinberg (Tabela

1). Após a triagem inicial, o novo painel gerado passou pela análise de desequilíbrio de

ligação (DL) para a detecção do número de locos ligados a cada um deles. Dentro do conjunto

de 71 marcadores, foram considerados três possibilidades para os testes de paternidade.

Marcadores com até 9 locos ligados (~12,5% de locos ligados/loco), 7 locos ligados (~10%) e

5 locos ligados (~7,5%). Após estas análises três novos painéis foram gerados apresentando

63, 51 e 34 marcadores, aos níveis tolerância de DL de 12,5%, 10% e 7,5% respectivamente

(Tabela 2).

Assim, o terceiro critério de seleção para a validação dos painéis de

marcadores ocorreu de acordo com os sucessos obtidos nas genotipagens. As amostras de

ovelha Crioula Lanada fornecidas pelo CPPSUL (62 produtos e 9 pais candidatos) foram

genotipadas e apenas 46 marcadores mostraram definição precisa dos alelos de cada animal

(Tabela 3).

Cada painel gerado com os diferentes níveis de tolerância de DL (12,5% -

Painel A; 10% - Painel B; 7,5% - Painel C) foi testado no programa Cervus para avaliação das

frequências alélicas e níveis de polimorfismos. Foram observados valores médios de

heterozigosidade observada (Ho) de 0,388 (±0,141) e esperada (He) de 0,423 (± 0,106). Os

valores de He variaram de 0,058 a 0,502, porém, apesar da ampla variação, apenas três dos

locos apresentaram valores inferiores a 0,20 (Tabela 4). O polimorfismo dos mesmos também

foi observado com os valores de PIC, que obteve média de 0,327 (± 0,072) por loco analisado.

Mesmo com os testes preliminares mostrando ausência de locos com desvios

no Equilíbrio de Hardy-Weinberg, foi constatado desvio significativo nas análises com os

animais testados. Na Tabela 4, podem ser observados que, do total de 46 marcadores, 12

tiveram desvios significativos (26%). Outros sete marcadores apresentarem ausência de

polimorfismos (15%), restando, portanto, 27 marcadores deste total. Assim, estes marcadores

também foram testados como um painel independente (Painel D) para se avaliar seu potencial.

30

Tabela 1. Triagem de 123 marcadores selecionados a partir de três raças brasileiras (Crioula, Morada Nova e Santa Inês) genotipadas com

50.000 SNPs (http://www.sheephapmap.org). Foram considerados valores de MAF (Minor Allele Frequency) > 0,4 e desvios no Equilíbrio de

Hardy Weinberg (EHW) significativos (P < 0,01) nas três raças.

Desvios no EHW No. Loco Cromossomo MAF Crioula Morada Nova Santa Inês 1a. Seleção 1 OAR1_23734999 1 0,460 ok 2 OAR1_32906689 1 <0,4 (eliminado)

3 OAR1_36080883 1 <0,4 (eliminado) 4 OAR1_61493280 1 0,460 ok

5 OAR1_73027197 1 <0,4 (eliminado) 6 OAR1_88092654 1 0,500 ok

7 OAR1_91326800 1 <0,4 (eliminado) 8 OAR1_98453311 1 <0,4 (eliminado) 9 OAR1_148726685 1 0,443 ok

10 OAR1_157363688 1 <0,4 (eliminado) 11 OAR1_170034165 1 0,483 ok

12 OAR1_197916874 1 <0,4 (eliminado) 13 OAR1_241598383 1 0,454 ok

14 OAR1_263131531 1 0,500 ok 15 OAR1_278980576 1 <0,4 (eliminado)

16 OAR1_287365859 1 <0,4 (eliminado) 17 OAR1_296820284 1 <0,4 (eliminado) 18 OAR2_3512138 2 <0,4 (eliminado) 19 s46561 2 <0,4 (eliminado) 20 s16234 2 0,500 ok

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31

Tabela 1. Triagem de 123 marcadores selecionados a partir de três raças brasileiras (Crioula, Morada Nova e Santa Inês) genotipadas com

50.000 SNPs (http://www.sheephapmap.org). Foram considerados valores de MAF (Minor Allele Frequency) > 0,4 e desvios no Equilíbrio de

Hardy Weinberg (EHW) significativos (P < 0,01) nas três raças (continuação).

Desvios no EHW No. Loco Cromossomo MAF Crioula Morada Nova Santa Inês 1a. Seleção 21 OAR2_43599765 2 <0,4 (eliminado)

22 OAR2_58394462 2 <0,4 (eliminado) 23 OAR2_116945286 2 0,477 ok

24 s71929 2 0,460 ok 25 OAR2_142085758 2 <0,4 (eliminado)

26 OAR2_165344428 2 0,489 ok 27 OAR2_179267347 2 <0,4 (eliminado)

28 OAR2_206338195 2 0,454 ok 29 s15714 2 0,477 ok 30 s69717 3 0,477 ok 31 s69310 3 0,483 ok 32 s57698 3 <0,4 (eliminado)

33 OAR3_54271173 3 <0,4 (eliminado) 34 OAR3_58366737 3 <0,4 (eliminado) 35 s25032 3 <0,4 (eliminado) 36 OAR3_84188031 3 0,454 ok

37 s60452 3 <0,4 (eliminado) 38 OAR3_132066295 3 0,477 ok

39 OAR3_149119745 3 <0,4 (eliminado) 40 OAR3_157444522 3 <0,4 (eliminado) )#$%&$'(!

! !

32

!!

Tabela 1. Triagem de 123 marcadores selecionados a partir de três raças brasileiras (Crioula, Morada Nova e Santa Inês) genotipadas com

50.000 SNPs (http://www.sheephapmap.org). Foram considerados valores de MAF (Minor Allele Frequency) > 0,4 e desvios no Equilíbrio de

Hardy Weinberg (EHW) significativos (P < 0,01) nas três raças (continuação).

! Desvios no EHW

No. Loco Cromossomo MAF Crioula Morada Nova Santa Inês 1a. Seleção 41 OAR3_179063841 3 0,489 ok 42 s62475 3 <0,4 (eliminado)

43 OAR4_11240022 4 0,454 ok 44 s00373 4 0,460 ok 45 OAR4_91739253 4 0,448 ok 46 OAR4_94766796 4 <0,4 (eliminado)

47 s37700 4 0,466 ok 48 OAR5_26459986 5 0,466 ok 49 OAR5_29893442 5 <0,4 (eliminado)

50 OAR5_36153266 5 <0,4 (eliminado) 51 s03876 5 0,460 ok

52 OAR5_82642729 5 <0,4 (eliminado) 53 OAR5_111606992 5 0,477 ok

54 OAR6_48792023 6 0,448 ok 55 OAR6_68532683 6 0,460 ok 56 OAR6_72352340 6 <0,4 (eliminado)

57 OAR6_83896483 6 <0,4 (eliminado) 58 OAR6_95930760 6 0,489 ok

59 OAR6_101507836 6 <0,4 (eliminado) 60 s71297 6 0,454 P < 0,01

ok

)#$%&$'(! !

33

Tabela 1. Triagem de 123 marcadores selecionados a partir de três raças brasileiras (Crioula, Morada Nova e Santa Inês) genotipadas com

50.000 SNPs (http://www.sheephapmap.org). Foram considerados valores de MAF (Minor Allele Frequency) > 0,4 e desvios no Equilíbrio de

Hardy Weinberg (EHW) significativos (P < 0,01) nas três raças (continuação).

! Desvios no EHW

No. Loco Cromossomo MAF Crioula Morada Nova Santa Inês 1a. Seleção 61 OAR7_1224949 7 0,500

ok

62 OAR7_5350977 7 <0,4 (eliminado) 63 s60649 7 0,489 ok

64 OAR8_4035646 8 0,460 ok 65 OAR8_32459191 8 0,500 ok 66 s08950 8 <0,4 (eliminado)

67 OAR9_48204690 9 0,494 ok 68 OAR9_56055528 9 <0,4 (eliminado)

69 OAR9_59297091 9 <0,4 (eliminado) 70 OAR9_67226699 9 <0,4 (eliminado) 71 OAR9_80918118 9 0,454 ok

72 OAR9_93048703 9 0,489 ok 73 OAR10_38586588 10 0,448 ok 74 OAR10_45286350 10 <0,4 (eliminado)

75 OAR10_68005037 10 0,477 ok 76 OAR10_71498684 10 <0,4 (eliminado)

77 OAR10_88932679 10 0,448 ok 78 OAR11_13817708 11 0,477 ok 79 OAR12_70188998 12 0,489 ok 80 OAR12_75421182 12 <0,4 (eliminado)

!)#$%&$'(! !

34

Tabela 1. Triagem de 123 marcadores selecionados a partir de três raças brasileiras (Crioula, Morada Nova e Santa Inês) genotipadas com

50.000 SNPs (http://www.sheephapmap.org). Foram considerados valores de MAF (Minor Allele Frequency) > 0,4 e desvios no Equilíbrio de

Hardy Weinberg (EHW) significativos (P < 0,01) nas três raças (continuação).

! Desvios no EHW

No. Loco Cromossomo MAF Crioula Morada Nova Santa Inês 1a. Seleção 81 s07776 13 0,489 ok 82 OAR13_48889355 13 0,494 ok 83 OAR13_81471049 13 0,460 ok 84 s02515 14 0,466 ok 85 OAR14_27308027 14 <0,4 (eliminado)

86 OAR14_38256049 14 <0,4 (eliminado) 87 OAR14_44836628 14 <0,4 (eliminado) 88 s42929 14 0,500 ok

89 s33503 15 0,483 ok 90 OAR15_58590296 15 0,477 ok 91 OAR16_35656302 16 0,483 ok 92 OAR16_51697426 16 <0,4 (eliminado)

93 OAR16_62197518 16 0,443 ok 94 s46434 16 <0,4 (eliminado)

95 OAR17_2443477 17 0,454 ok 96 OAR17_37705408 17 0,477 ok 97 OAR17_42330622 17 <0,4 (eliminado)

98 s23373 18 0,500 ok 99 OAR18_25765614 18 <0,4 (eliminado)

100 DU396708_413 18 0,489 ok 101 s25497 19 0,455 ok 102 OAR19_31723606 19 <0,4 (eliminado)

)#$%&$'(! !

35

Tabela 1. Triagem de 123 marcadores selecionados a partir de três raças brasileiras (Crioula, Morada Nova e Santa Inês) genotipadas com

50.000 SNPs (http://www.sheephapmap.org). Foram considerados valores de MAF (Minor Allele Frequency) > 0,4 e desvios no Equilíbrio de

Hardy Weinberg (EHW) significativos (P < 0,01) nas três raças (conclusão).

Desvios no EHW No. Loco Cromossomo MAF Crioula Morada Nova Santa Inês 1a. Seleção 103 s72304 19 0,460 ok 104 OAR20_37979703 20 0,494 ok 105 OAR20_49840203 20 <0,4 (eliminado)

106 s53672 20 0,454 ok 107 OAR21_28570553 21 0,477 ok 108 s56586 21 <0,4 (eliminado)

109 OAR21_37069978 21 <0,4 (eliminado) 110 s66083 21 0,471 ok

111 OAR22_24300913 22 0,471 ok 112 s19752 22 0,494 ok 113 OAR23_24059095 23 0,443 ok 114 s35293 23 <0,4 (eliminado)

115 s25094 24 0,437 ok 116 s37634 24 0,460 ok 117 DU512685_259 25 0,477 ok 118 OAR25_34706036 25 0,466 ok 119 OAR26_21211648 26 0,477 ok 120 OAR26_40381225 26 0,500 ok 121 s12967 26 <0,4 (eliminado)

122 s75780 27 0,443 ok 123 s05229 27 0,455 P < 0,01

ok

TOTAL SELECIONADO 71

36

Tabela 2. Segunda triagem, realizada a partir de 71 marcadores selecionados de acordo com os critérios estabelecidos na Tabela 1. Foram considerados três painéis de acordo com o número de locos ligados nas estimativas de desequilíbrio de ligação (DL): marcadores com até 9 locos ligados (~12,5% de locos ligados/loco), 7 locos ligados (~10%) e 5 locos ligados (~7,5%).

2a. Seleção (% locos ligados/loco)

No. Loco Cromossomo DL < 12,5% DL < 10% DL < 7,5% 1 OAR1_23734999.1 1 ok

2 OAR1_61493280.1 1 3 OAR1_88092654.1 1 ok ok

4 OAR1_148726685.1 1 ok 5 OAR1_170034165.1 1 ok ok ok

6 OAR1_241598383.1 1 ok ok ok 7 OAR1_263131531.1 1 ok

8 s16234.1 2 ok ok ok 9 OAR2_116945286.1 2 ok ok

10 s71929.1 2 11 OAR2_165344428.1 2 ok ok ok

12 OAR2_206338195.1 2 ok ok 13 s15714.1 2 ok ok ok

14 s69717.1 3 ok ok ok 15 s69310.1 3

16 OAR3_84188031.1 3 ok ok 17 OAR3_132066295.1 3 ok ok 18 OAR3_179063841.1 3 ok ok 19 OAR4_11240022.1 4

20 s00373.1 4 21 OAR4_91739253.1 4 ok ok ok

22 s37700.1 4 ok ok ok 23 OAR5_26459986.1 5 ok ok ok 24 s03876.1 5 ok

25 OAR5_111606992.1 5 ok ok ok 26 OAR6_48792023.1 6 ok ok

27 OAR6_68532683.1 6 ok 28 OAR6_95930760.1 6 ok ok

29 s71297.1 6 ok ok 30 OAR7_1224949.1 7 ok ok 31 s60649.1 7 ok ok ok

32 OAR8_4035646.1 8 ok 33 OAR8_32459191.1 8 ok ok ok

34 OAR9_48204690.1 9 ok ok ok 35 OAR9_80918118.1 9 ok ok ok

!"#$%#&'( (

37

Tabela 2. Segunda triagem, realizada a partir de 71 marcadores selecionados de acordo com os critérios estabelecidos na Tabela 1. Foram considerados três painéis de acordo com o número de locos ligados nas estimativas de desequilíbrio de ligação (DL): marcadores com até 9 locos ligados (~12,5% de locos ligados/loco), 7 locos ligados (~10%) e 5 locos ligados (~7,5%) (conclusão).

( 2a. Seleção (% locos ligados/loco)

No. Loco Cromossomo DL < 12,5% DL < 10% DL < 7,5% 36 OAR9_93048703.1 9 ok ok

37 OAR10_38586588.1 10 ok ok 38 OAR10_68005037.1 10 ok ok 39 OAR10_88932679.1 10 ok ok ok

40 OAR11_13817708.1 11 ok ok ok 41 OAR12_70188998.1 12 ok

42 s07776.1 13 43 OAR13_48889355.1 13 ok ok ok

44 OAR13_81471049.1 13 ok ok 45 s02515.1 14 ok ok ok

46 s42929.1 14 ok 47 s33503.1 15 ok 48 OAR15_58590296.1 15 ok ok ok

49 OAR16_35656302.1 16 ok ok ok 50 OAR16_62197518.1 16 ok ok ok 51 OAR17_2443477.1 17 ok ok ok 52 OAR17_37705408.1 17 ok ok ok 53 s23373.1 18 ok ok ok 54 DU396708_413.1 18

55 s25497.1 19 ok ok ok 56 s72304.1 19

57 OAR20_37979703.1 20 ok ok ok 58 s53672.1 20 ok ok ok 59 OAR21_28570553.1 21 ok ok ok 60 s66083.1 21 ok ok

61 OAR22_24300913.1 22 ok ok 62 s19752.1 22 ok

63 OAR23_24059095.1 23 ok ok ok 64 s25094.1 24 ok

65 s37634.1 24 ok 66 DU512685_259.1 25 ok ok ok

67 OAR25_34706036.1 25 ok ok 68 OAR26_21211648.1 26 ok ok ok

69 OAR26_40381225.1 26 ok ok ok 70 s75780.1 27 ok ok ok 71 s05229.1 27 ok ok ok

TOTAL SELECIONADO 63 51 34

38

Tabela 3. Terceira triagem, realizada a partir de 63 marcadores selecionados de acordo com os critérios estabelecidos na Tabela 2. Foram considerados três painéis de acordo com o número de locos ligados nas estimativas de desequilíbrio de ligação (DL = 12,5, 10 e 7,5%) e com o sucesso das genotipagens acima de 90% para cada loco.

3a. Seleção (Genotipagem definida > 90%) No. Locus_Name Cromossomo Painel A Painel B Painel C 1 OAR1_23734999.1 1 ok

2 OAR1_88092654.1 1 ok ok 3 OAR1_148726685.1 1 ok

4 OAR1_170034165.1 1 ok ok ok 5 OAR1_241598383.1 1 ok ok ok 6 OAR1_263131531.1 1 ok

7 s16234.1 2 ok ok ok 8 OAR2_116945286.1 2 ok ok

9 OAR2_165344428.1 2 ok ok ok 10 OAR2_206338195.1 2

11 s15714.1 2 12 s69717.1 3 ok ok ok

13 OAR3_84188031.1 3 14 OAR3_132066295.1 3 ok ok

15 OAR3_179063841.1 3 ok ok 16 OAR4_91739253.1 4 ok ok ok

17 s37700.1 4 18 OAR5_26459986.1 5 ok ok ok

19 s03876.1 5 ok 20 OAR5_111606992.1 5

21 OAR6_48792023.1 6 ok ok 22 OAR6_68532683.1 6 ok

23 OAR6_95930760.1 6 24 s71297.1 6 25 OAR7_1224949.1 7 26 s60649.1 7 ok ok ok

27 OAR8_4035646.1 8 ok 28 OAR8_32459191.1 8 ok ok ok

29 OAR9_48204690.1 9 ok ok ok 30 OAR9_80918118.1 9 ok ok ok 31 OAR9_93048703.1 9 ok ok

32 OAR10_38586588.1 10 ok ok 33 OAR10_68005037.1 10 ok ok 34 OAR10_88932679.1 10 ok ok ok

35 OAR11_13817708.1 11 !"#$%#&'( (

39

Tabela 3. Terceira triagem, realizada a partir de 63 marcadores selecionados de acordo com os critérios estabelecidos na Tabela 2. Foram considerados três painéis de acordo com o número de locos ligados nas estimativas de desequilíbrio de ligação (DL = 12,5, 10 e 7,5%) e com o sucesso das genotipagens acima de 90% para cada loco (conclusão).

( 3a. Seleção (Genotipagem definida > 90%)

No. Locus_Name Cromossomo Painel A Painel B Painel C 36 OAR12_70188998.1 12

37 OAR13_48889355.1 13 38 OAR13_81471049.1 13 ok ok

39 s02515.1 14 40 s42929.1 14 ok

41 s33503.1 15 ok 42 OAR15_58590296.1 15 ok ok ok

43 OAR16_35656302.1 16 ok ok ok 44 OAR16_62197518.1 16 ok ok ok 45 OAR17_2443477.1 17 ok ok ok 46 OAR17_37705408.1 17

47 s23373.1 18 ok ok ok 48 s25497.1 19 ok ok ok 49 OAR20_37979703.1 20 ok ok ok 50 s53672.1 20

51 OAR21_28570553.1 21 ok ok ok 52 s66083.1 21 ok ok

53 OAR22_24300913.1 22 ok ok 54 s19752.1 22 ok

55 OAR23_24059095.1 23 ok ok ok 56 s25094.1 24 ok

57 s37634.1 24 58 DU512685_259.1 25 ok ok ok

59 OAR25_34706036.1 25 ok ok 60 OAR26_21211648.1 26

61 OAR26_40381225.1 26 ok ok ok 62 s75780.1 27

63 s05229.1 27 ok ok ok TOTAL SELECIONADOS 46 36 24

40

Os marcadores incluídos no teste de paternidade mostraram valores distintos de

probabilidades de exclusão e identidade de acordo com o tamanho do painel considerado. As

probabilidades combinadas de exclusão e identidade de todos os marcadores foram calculadas

para os quatro painéis distintos sugeridos de acorco com os critérios de desequilíbrio de

ligação e desvios no equilíbrio de Hardy-Weinberg (Tabela 5). Probabiliaddes combinadas

acima de 99% para P1 ()*"+'+%,%-'-.( -.( /0!,&12"( 3'*'( '3.#'1( &4( 3*"5.#%$"*) e P2

()*"+'+%,%-'-.( -.( .0!,&12"( 1.#-"( -'-"( "( 5.#6$%3"( -.( &4( -"1( 3*"5.#%$"*.1) foram

obtidas apenas nas análises do painel de 46 SNPs (Painel A). O painel de 36 SNPs (Painel B)

apresentou probabilidade de exclusão acima de 99% apenas para P2, bem como o painel de 27

marcadores. O painel definido com 24 marcadores (Painel C) mostrou valores abaixo dos

99% para ambas as estimativas. O Painel D mostrou-se melhor que o Painel C, em todas as

estimativas (Tabela 5).

No programa GENALEX todos os 46 marcadores foram testados para a

determinação da quantidade mínima de marcadores para se atingir poder de exclusão superior

a 99%. Os resultados indicaram que 29 SNPs são necessários para resolver a paternidade em

casos onde é possível obter o genótipo da mãe, da progênie e do provável pai (probabilidade

de 99%). Quando se conhece somente o genótipo do provável pai e da progênie, são

necessários mais do que os 46 marcadores desse mesmo painel para atingir a probabilidade de

99% de exclusão de paternidade (Figura 1). Porém, o painel completo com 46 marcadores

atingiu a probabilidade de 98%.

2.5.1.2 Análise de Paternidade

Os testes de paternidade realizados aferiram um suposto pai à maioria dos

produtos, porém em alguns casos a paternidade não foi resolvida pelos marcadores SNPs. Os

melhores resultados foram obtidos pelo Painel A, que apresentou maior número de

marcadores (n = 46), juntamente com o painel Painel D (Tabela 6). Ambos tiveram sucesso

na atribuição de 79% dos pais (49 casos), de acordo com as informações fornecidas pelo

CPPSUL (ver final da Tabela 6). Porém, no Painel A observou-se nove casos não resolvidos e

quatro atribuições diferentes daquelas informadas pelo CPPSUL, enquanto o painel B

apresentou seis casos não resolvidos e sete atribuições diferentes das informadas.

Ainda nesses painéis, foram observados 9,6% de casos sem paternidade

atribuída e 11,4% de casos de atribuições diferentes daquelas informadas pelo CPPSUL.

41

Resultados ligeiramente inferiores foram obtidos com o painel DL < 10% (painel B), com

77% de identificações positivas (48 casos), e DL < 7,5% (painel C), com 76% (47 casos)

(Tabela 6). O painel C destacou-se pelo menor número de casos não identificados (apenas

três), mas mostrou o maior índice de atribuições diferentes das informadas nos registros

genealógicos (12 casos).

Apesar dos critérios de seleção de marcadores adotados terem reduzidos

demasiadamente o tamanho dos painéis testados, nota-se a importância desta avaliação para

se evitar problemas como a presença de locos em desacordo (mismatching loci) entre

progenitor e progênie. Todos os testes realizados mostraram ausência de locos nestas

condições (Tabela 6).

As valores médios de LOD score obtidos foram superiores para o painel A,

porém todos os outros painéis mostraram valores médios dentro da mesma magnitude (104)

(Tabela 6). Observa-se também que nos casos onde a paternidade foi identificada, os níveis de

confidência mostraram-se superiores a 95% na maioria dos casos (Tabela 6). Assim, embora

em pequeno número, nota-se que os marcadores selecionados apresentam qualidade de

informação.

42

Tabela 4. Estimativas de diversidade independentes para 46 locos selecionados para os testes de paternidade para todo o conjunto de animais testados (n=71).(A, número de alelos observado; HObs, heterozigosidade observada; HExp, heterozigosidade esperada; PIC, conteúdo de informação polimórfica; NE-1P, probabilidade média de não-exclusão para um pai candidato; NE-2P, probabilidade média de não-exclusão para um pai candidato dado o genótipo de um pai conhecido do sexo oposto; NE-I, probabilidade média de não-exclusão para a identidade de dois indivíduos não relacionados; NE-SI, probabilidade média de não-exclusão para a identidade de dois irmãos; significância para o desvio no equilíbrio de Hardy-Weinberg: *significante ao nível de 0.05; **significante ao nível de 0.01; ***significante ao nível de 0.001%; NR, não realizado; F(null) probabilidade de ocorrência de alelos nulos).

Loco A HObs HExp PIC NE-1P NE-2P NE-PP NE-I NE-SI HW F(Null) OAR6_48792023 2 0,192 0,491 0,37 0,88 0,815 0,722 0,381 0,6 *** 0,4357 OAR16_35656302 2 0,341 0,43 0,337 0,908 0,832 0,742 0,418 0,64 NS 0,1142 s33503 2 0,373 0,493 0,37 0,879 0,815 0,722 0,38 0,599 NS 0,1364 s69717 2 0,541 0,498 0,373 0,877 0,813 0,72 0,377 0,596 NS -0,0431 OAR26_40381225 2 0,496 0,501 0,375 0,875 0,813 0,719 0,375 0,594 NS 0,0033 OAR9_80918118 2 0,415 0,33 0,275 0,946 0,863 0,78 0,505 0,712 NS -0,1145 OAR1_263131531 2 0,519 0,501 0,375 0,875 0,813 0,719 0,375 0,594 NS -0,0189 OAR1_170034165 2 0,489 0,5 0,374 0,876 0,813 0,719 0,376 0,595 NS 0,009 OAR1_148726685 2 0,096 0,092 0,087 0,996 0,956 0,918 0,829 0,911 NR -0,0155 OAR1_241598383 2 0,203 0,262 0,227 0,966 0,887 0,811 0,58 0,765 NR 0,1245 OAR6_68532683 2 0,244 0,237 0,209 0,972 0,896 0,823 0,611 0,784 NR -0,0165 OAR9_48204690 2 0,627 0,47 0,358 0,891 0,821 0,729 0,393 0,614 ** -0,1453 OAR10_38586588 2 0,328 0,38 0,307 0,928 0,847 0,76 0,458 0,675 NS 0,0712 OAR8_4035646 2 0,400 0,464 0,356 0,893 0,822 0,731 0,396 0,618 NS 0,0724 s60649 2 0,578 0,499 0,373 0,877 0,813 0,72 0,377 0,596 NS -0,0755 s42929 2 0,467 0,474 0,361 0,889 0,82 0,728 0,39 0,612 NS 0,0056 OAR10_88932679 2 0,289 0,289 0,246 0,959 0,877 0,798 0,549 0,743 NR -0,0023 OAR17_2443477 2 0,215 0,396 0,317 0,922 0,842 0,754 0,444 0,664 *** 0,2949 OAR8_32459191 2 0,570 0,453 0,35 0,898 0,825 0,734 0,403 0,625 NS -0,1162 OAR16_62197518 2 0,276 0,423 0,333 0,911 0,834 0,744 0,423 0,645 ** 0,2087

!"#$%#&'(

43

Tabela 4. Estimativas de diversidade independentes para 46 locos selecionados para os testes de paternidade para todo o conjunto de animais testados (n=71).(A, número de alelos observado; HObs, heterozigosidade observada; HExp, heterozigosidade esperada; PIC, conteúdo de informação polimórfica; NE-1P, probabilidade média de não-exclusão para um pai candidato; NE-2P, probabilidade média de não-exclusão para um pai candidato dado o genótipo de um pai conhecido do sexo oposto; NE-I, probabilidade média de não-exclusão para a identidade de dois indivíduos não relacionados; NE-SI, probabilidade média de não-exclusão para a identidade de dois irmãos; significância para o desvio no equilíbrio de Hardy-Weinberg: *significante ao nível de 0.05; **significante ao nível de 0.01; ***significante ao nível de 0.001%; NR, não realizado; F(null) probabilidade de ocorrência de alelos nulos) (continuação).

(Loco A HObs HExp PIC NE-1P NE-2P NE-PP NE-I NE-SI HW F(Null) s23373 2 0,333 0,367 0,299 0,933 0,851 0,765 0,469 0,685 0,0461 OAR1_88092654 2 0,504 0,479 0,363 0,886 0,818 0,726 0,387 0,608 -0,0273 s19752 2 0,652 0,482 0,365 0,885 0,818 0,725 0,386 0,606 ** -0,1518 OAR3_179063841 2 0,370 0,496 0,372 0,878 0,814 0,721 0,378 0,598 0,1429 s25497 2 0,059 0,058 0,056 0,998 0,972 0,946 0,89 0,944 NR -0,0068 OAR4_91739253 2 0,274 0,248 0,217 0,969 0,892 0,818 0,597 0,776 NR -0,0516 OAR13_81471049 2 0,511 0,499 0,374 0,876 0,813 0,72 0,376 0,595 -0,0137 OAR25_34706036 2 0,533 0,464 0,356 0,893 0,822 0,731 0,396 0,618 -0,0712 OAR20_37979703 2 0,291 0,497 0,373 0,877 0,814 0,72 0,377 0,597 *** 0,2597 OAR23_24059095 2 0,319 0,289 0,246 0,959 0,877 0,798 0,549 0,743 NR -0,0511 DU512685_259 2 0,341 0,482 0,365 0,885 0,818 0,725 0,386 0,606 * 0,1697 s16234 2 0,318 0,391 0,314 0,924 0,843 0,756 0,448 0,667 0,101 OAR3_132066295 2 0,407 0,483 0,366 0,884 0,817 0,725 0,385 0,605 0,0833 OAR22_24300913 2 0,341 0,501 0,375 0,875 0,813 0,719 0,375 0,594 * 0,1888 OAR2_165344428 2 0,541 0,501 0,375 0,875 0,813 0,719 0,375 0,594 -0,0396 OAR1_23734999 2 0,659 0,496 0,372 0,878 0,814 0,72 0,378 0,597 * -0,1427 OAR9_93048703 2 0,496 0,491 0,369 0,88 0,815 0,722 0,381 0,601 -0,0074 s25094 2 0,178 0,321 0,269 0,949 0,866 0,783 0,514 0,718 *** 0,2857 OAR21_28570553 2 0,358 0,488 0,368 0,882 0,816 0,723 0,382 0,602 0,1519

)"#$%#&'((

44

Tabela 4. Estimativas de diversidade independentes para 46 locos selecionados para os testes de paternidade para todo o conjunto de animais testados (n=71).(A, número de alelos observado; HObs, heterozigosidade observada; HExp, heterozigosidade esperada; PIC, conteúdo de informação polimórfica; NE-1P, probabilidade média de não-exclusão para um pai candidato; NE-2P, probabilidade média de não-exclusão para um pai candidato dado o genótipo de um pai conhecido do sexo oposto; NE-I, probabilidade média de não-exclusão para a identidade de dois indivíduos não relacionados; NE-SI, probabilidade média de não-exclusão para a identidade de dois irmãos; significância para o desvio no equilíbrio de Hardy-Weinberg: *significante ao nível de 0.05; **significante ao nível de 0.01; ***significante ao nível de 0.001%; NR, não realizado; F(null) probabilidade de ocorrência de alelos nulos) (conclusão).

((

Loco A HObs HExp PIC NE-1P NE-2P NE-PP NE-I NE-SI HW F(Null) OAR2_116945286 2 0,496 0,458 0,352 0,896 0,824 0,733 0,4 0,622 -0,0422 s66083 2 0,296 0,501 0,374 0,876 0,813 0,719 0,376 0,595 *** 0,2546 s03876 2 0,341 0,464 0,356 0,893 0,822 0,731 0,396 0,618 0,1515 OAR5_26459986 2 0,319 0,409 0,325 0,917 0,838 0,749 0,434 0,655 0,1228 s05229 2 0,348 0,396 0,317 0,922 0,842 0,754 0,444 0,664 0,0625 OAR15_58590296 2 0,348 0,502 0,375 0,875 0,813 0,719 0,375 0,594 * 0,179 OAR10_68005037 2 0,553 0,489 0,369 0,881 0,816 0,723 0,382 0,602 -0,0631 MÉDIA 2 0,388 0,423 0,327 0,906 0,837 0,750 0,441 0,650

45

Tabela 5. Estimativas de probabilidades combinadas para quatro painéis de SNPs. (P1 – Probabilidade de Exclusão para apenas um progenitor; P2 – Probabilidade de exclusão sendo dado o genótipo de um dos progenitores; PI – probabilidade de identidade; DL – desequilíbrio de ligação; HWE – desvio no equilíbrio de Hardy-Weinberg). Foi ainda calculada a taxa esparada de insucesso (IS) nas atribuições de paternidade dos dados fornecidos, realizada nas simulações de uma prole com N = 100 mil indivíduos.

Painel A

(46 SNPs) Painel B

(36 SNPs) Painel C

(24 SNPs) Painel D

(27 SNPs) DL < 12,5% DL < 10% DL < 7,5% HWE p>0,5 P1 0,99077 0,97627 0,88827 0,95149 P2 0,99978 0,99880 0,98404 0,99462 PI 6,09E-18 1,84E-14 3,71E-09 1,93E-11 IS 83 (0,08%) 120 (0,12%) 623 (0,62%) 220 (0,22%)

Figura 1. Quantidade mínima de marcadores para a atribuir a paternidade em casos onde é possível obter o genótipo da mãe (P1 ! 99% com 31 marcadores) e quando se conhece somente o genótipo do provável pai e da progênie (P2 ! 98% com todos os 46 marcadores). !

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46

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Produto/ Resultado suposto pai/painel Atribuições Corretas/painel Locos

Comparados Locos em desacordo LOD Score (Confidência)

Pai informado A B C D A B C D A B C D A B C D A B C D

3067/2809 2809 2809 2809 2809

OK OK OK OK

46 36 24 27

0 0 0 0

9,52E+14 * 7,85E+14 * 3,65E+14 + 4,54E+14 *

3068/2809 2809 2809 2809 2809

OK OK OK OK

46 36 24 27

0 0 0 0

9,20E+14 * 7,01E+14 * 1,73E+14 + 5,20E+14 *

3070/2896 N.E. N.E. N.E. N.E. 3075/2789 2789 2789 2789 2789

OK OK OK OK

46 36 24 27

0 0 0 0

4,03E+14 * 2,05E+14

1,24E+14

1,19E+14 3078/2896 2789 2789 2789 2789

46 36 24 27

0 0 0 0

6,47E+14 * 3,97E+14 * 1,54E+14 + 3,51E+14 *

3083/2809 2809 2809 2809 2809

OK OK OK OK

46 36 24 27

0 0 0 0

8,77E+14 * 7,59E+14 * 4,09E+14 * 5,28E+14 *

3084/2809 2809 2809 2809 2809

OK OK OK OK

46 36 24 27

0 0 0 0

1,00E+15 * 8,43E+14 * 4,24E+14 * 4,83E+14 *

3086/2809 2809 2809 2809 2809

OK OK OK OK

46 36 24 27

0 0 0 0

1,04E+15 * 7,51E+14 * 3,10E+14

6,20E+14 *

3088/2789 2789 2789 2789 2789

OK OK OK OK

46 36 24 27

0 0 0 0

9,25E+14 * 6,18E+14 * 3,14E+14 * 7,13E+14 *

3089/2809 N.E. N.E. 2721 2858

24 27

0 0

2,18E+14 + -6,29E+13 +

3092/2858 2858 2858 2646 2858

OK OK

OK

46 36 24 27

0 0 0 0

9,90E+14 * 6,38E+14 + 5,26E+14 + 5,96E+14 *

3093/2858 2858 2858 2858 2858

OK OK OK OK

46 36 24 27

0 0 0 0

7,76E+14 * 4,83E+14 * 2,49E+14 + 3,17E+14 +

3094/2789 N.E. N.E. N.E. N.E. 3095/2789 2789 2789 2789 2789

OK OK OK OK

46 36 24 27

0 0 0 0

6,43E+14 * 5,84E+14 * 3,80E+14 * 4,01E+14 *

3096/2858 2858 2858 2858 2858

OK OK OK OK

46 36 24 27

0 0 0 0

6,03E+14 * 5,39E+14 * 3,11E+14 * 3,38E+14 *

3098/2789 2789 2789 2789 2789

OK OK OK OK

46 36 24 27

0 0 0 0

7,11E+14 * 4,76E+14 * 2,51E+14

4,01E+14 *

3099/2789 2789 2789 2789 2789

OK OK OK OK

46 36 24 27

0 0 0 0

7,83E+14 * 6,02E+14 * 4,72E+14 * 6,39E+14 *

3101/2809 2809 2809 2809 2809

OK OK OK OK

46 36 24 27

0 0 0 0

5,93E+14 * 5,16E+14 * 2,36E+14

2,84E+14 *

3103/2809 N.E. N.E. 2863 N.E.

24

0

4,13E+14 * -0*%+*:(! !

47

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

Produto/ Resultado suposto pai/painel Atribuições Corretas/painel Locos

Comparados Locos em desacordo LOD Score (Confidência)

Pai informado A B C D A B C D A B C D A B C D A B C D

3104/2809 2809 2809 2809 2809

OK OK OK OK

46 36 24 27

0 0 0 0

7,63E+14 * 6,79E+14 * 4,29E+14 * 3,42E+14 *

3105/2789 2789 2721 2855 2721

OK

46 36 24 27

0 0 0 0

6,04E+13

1,62E+14 * 7,58E+13 + 1,43E+14 *

3107/2858 2858 2858 2858 2858

OK OK OK OK

46 36 23 27

0 0 0 0

6,93E+14 * 4,27E+14 * 3,62E+14 * 2,63E+14 *

3108/2809 N.E. N.E. 2809 2809

OK OK

23 25

0 0

3,65E+14 * 2,86E+14 *

3112/2858 2858 2858 2858 2858

OK OK OK OK

46 36 24 27

0 0 0 0

6,73E+14 * 4,97E+14 * 3,31E+14 + 4,55E+14 *

3113/2789 2789 2789 2789 2789

OK OK OK OK

46 36 24 27

0 0 0 0

3,81E+14 * 2,37E+14 * 2,04E+14 * 2,84E+14 *

3115/2789 2789 2789 2789 2789

OK OK OK OK

46 36 24 27

0 0 0 0

9,07E+14 * 6,73E+14 * 2,71E+14 * 7,60E+14 *

3116/2789 2789 2789 2789 2789

OK OK OK OK

46 36 24 27

0 0 0 0

6,11E+14 * 4,99E+14 * 3,09E+14 * 3,19E+14 *

3117/2858 2858 2858 2858 2858

OK OK OK OK

46 36 24 27

0 0 0 0

1,02E+15 * 6,15E+14

4,22E+14 + 5,79E+14 *

3118/2858 2858 2858 2858 2858

OK OK OK OK

46 36 24 27

0 0 0 0

9,13E+14 * 5,95E+14 * 3,09E+14 + 4,57E+14 *

3121/2858 2858 2858 2858 2858

OK OK OK OK

46 36 24 27

0 0 0 0

1,15E+15 * 9,02E+14 * 5,56E+14 * 6,51E+14 *

3122/2809 2809 2809 2809 2809

OK OK OK OK

46 36 24 27

0 0 0 0

1,03E+15 * 8,60E+14 * 4,19E+14 * 4,34E+14 *

3124/2845 2845 2845 2845 2845

OK OK OK OK

46 36 24 27

0 0 0 0

1,14E+15 * 8,33E+14 * 5,92E+14 * 7,71E+14 *

3125/2789 N.E. N.E. 2646 N.E.

24

0

3,84E+14 + 3126/2646 2646 2646 2646 2646

OK OK OK OK

46 36 24 27

0 0 0 0

9,96E+14 * 8,07E+14 * 4,50E+14 + 5,42E+14 *

3127/2845 2845 2845 2896 2845

OK OK

OK

46 36 24 27

0 0 0 0

6,18E+14 * 4,39E+14 * 6,36E+14 * 5,91E+14 *

3129/2855 2855 2855 2855 2855

OK OK OK OK

46 36 24 27

0 0 0 0

1,14E+15 * 8,34E+14 * 5,77E+14 * 5,48E+14 *

3130/2845 2845 2845 2845 2845

OK OK OK OK

46 36 24 27

0 0 0 0

8,77E+14 * 6,42E+14 * 3,95E+14 * 4,27E+14 *

3131/2845 2845 2845 2845 2845

OK OK OK OK

46 36 24 27

0 0 0 0

1,05E+15 * 7,10E+14 * 5,39E+14 * 5,84E+14 * -0*%+*:(!

48

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

Produto/ Resultado suposto pai/painel Atribuições Corretas/painel Locos

Comparados Locos em desacordo LOD Score (Confidência)

Pai informado A B C D A B C D A B C D A B C D A B C D

3132/2845 2845 2845 2845 2845

OK OK OK OK

46 36 24 27

0 0 0 0

7,79E+14 * 5,01E+14 * 2,87E+14 + 4,99E+14 *

3133/2721 2721 2721 2721 2721

OK OK OK OK

46 36 24 27

0 0 0 0

1,06E+15 * 1,05E+15 * 7,16E+14 * 6,13E+14 *

3135/2845 2845 2845 2845 2845

OK OK OK OK

46 36 24 27

0 0 0 0

6,34E+14 * 4,26E+14 + 1,63E+14 + 4,34E+14 *

3136/2646 2646 2646 2646 2646

OK OK OK OK

46 36 24 27

0 0 0 0

1,17E+15 * 8,86E+14 * 4,69E+14 * 7,14E+14 *

3137/2646 N.E. N.E. 2863 2863

24 27

0 0

2,13E+14 * 4,71E+14 *

3138/2845 N.E. N.E. 2863 N.E.

24

0

3,92E+14 * 3143/2896 2721 2721 2721 2721

46 36 24 27

0 0 0 0

9,77E+14 * 7,58E+14 * 5,46E+14 * 4,93E+14 *

3144/2855 2855 2855 2855 2855

OK OK OK OK

46 36 24 27

0 0 0 0

1,08E+15 * 7,60E+14 * 5,66E+14 * 6,15E+14 *

3146/2721 2721 2721 2721 2721

OK OK OK OK

46 36 24 27

0 0 0 0

1,02E+15 * 1,01E+15 * 7,03E+14 * 7,94E+14 *

3147/2721 2721 2721 2721 2721

OK OK OK OK

46 36 24 27

0 0 0 0

9,76E+14 * 7,88E+14 * 5,55E+14 * 4,79E+14 *

3148/2863 N.E. N.E. N.E. N.E. 3149/2863 2863 2863 2863 2863

OK OK OK OK

46 36 24 27

0 0 0 0

8,97E+14 * 6,59E+14 * 5,13E+14 * 4,14E+14 *

3151/2855 2855 2855 2855 2855

OK OK OK OK

46 36 24 27

0 0 0 0

9,95E+14 * 7,51E+14 * 3,49E+14 * 5,77E+14 *

3152/2896 2896 2896 2896 2896

OK OK OK OK

46 36 24 27

0 0 0 0

1,18E+15 * 1,05E+15 * 5,83E+14 * 7,48E+14 *

3153/2721 2721 2721 2721 2721

OK OK OK OK

46 36 24 27

0 0 0 0

2,10E+14

1,30E+14 * 1,04E+14

1,64E+14 *

3154/2855 2855 2855 2855 2855

OK OK OK OK

46 36 24 27

0 0 0 0

3,81E+14 * 4,49E+14 * 2,03E+14 * 1,86E+14 *

3155/2896 2858 2858 2858 2858

46 36 24 27

0 0 0 0

1,11E+14 * 1,44E+14 * 1,10E+14 + -5,26E+13 3157/2646 2646 2646 2646 2646

OK OK OK OK

46 36 24 27

0 0 0 0

8,53E+14 * 7,34E+14 * 4,51E+14 + 5,95E+14 *

-0*%+*:(!

49

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

Produto/ Resultado suposto pai/painel Atribuições Corretas/painel Locos

Comparados Locos em desacordo LOD Score (Confidência)

Pai informado A B C D A B C D A B C D A B C D A B C D

3158/2863 2863 2863 2863 2863

OK OK OK OK

46 36 24 27

0 0 0 0

8,01E+14 * 5,22E+14 * 4,14E+14 * 3,43E+14 *

3159/2721 2721 2721 2721 2721

OK OK OK OK

46 36 24 27

0 0 0 0

8,22E+14 * 7,41E+14 * 5,32E+14 + 5,59E+14 *

3160/2721 2721 2721 2721 2721

OK OK OK OK

46 36 24 27

0 0 0 0

5,52E+14 * 5,41E+14 * 4,39E+14 * 2,43E+14 3161/2721 2721 2721 2721 2721

OK OK OK OK

46 36 24 27

0 0 0 0

7,51E+14 * 6,70E+14 * 2,33E+14

5,11E+14 *

3162/2863 2721 2721 2721 2721

46 36 24 27

0 0 0 0

8,16E+14 * 6,73E+14 * 5,20E+14 * 4,82E+14 *

3163/2646 2646 2646 2646 2646

OK OK OK OK

46 36 24 27

0 0 0 0

8,91E+14 * 7,79E+14 * 4,79E+14 * 5,62E+14 *

Acertos 79% 77% 76% 79% Média 8,09E+14 6,29E+14 3,81E+14 4,57E+14 !

! !

50

2.5.2. Discussão

Um painel de SNPs adequado pode apresentar poder de resolução igual ou

superior a um painel de microssatélites. Hauser et al. (2011), compararam um painel de 80

SNPs com 11 marcadores microssatélites (contendo 192 alelos) para a identificação de

paternidade em salmão e evidenciaram maior acurácia nos SNPs. O principal requisito para a

utilização dos marcadores SNP em análise de paternidade é a obtenção de um painel com

marcadores que tenha poder suficiente para identificar com acurácia a progênie e seus

respectivos progenitores dentro de populações onde a informação genealógica é escassa

(HEATON et al., 2002). Dentre os painéis avaliados no presente estudo, apenas o painel A

(com 46 marcadores) conseguiu alcançar valores superiores aos 99% de probabilidade

combinada de exclusão de paternidade nas análises. Este parâmetro mostrou estar diretamente

relacionado com a quantidade de marcadores utilizados. Apesar das análises da quantidade

mínima de marcadores necessária para se atingir probabilidade de exclusão de 99% mostradas

no programa Genealex terem mostrado que 29 marcadores são suficientes, estes devem ser

selecionados com cautela. Dentro dos 46 marcadores utilizados, observou-se que apenas 27

mostraram-se sem problemas com relação à ocorrência de desvios no esequilíbrio de Hardy-

Weinberg. Estes desvios podem ser atribuídos não diretamente aos marcadores mas sim a

algum possível processo que esteja levando ao aumento da endogamia da população

amostrada, a alguma subdivisão da mesma ou, ainda, devido a processos de acasalamentos

não aleatórios em decorrência da escolha de reprodutores específicos (MENEZES et al.,

2006; SOUZA et al., 2012). Esta afirmação tem como base, o fato das 88 amostras

primeiramente utilizadas do banco de dados de SNPs Hapmap ovino (raças Crioula, Morada

Nova e Santa Inês) não terem mostrado esses desvios.

Os valores médios observados e esperados de heterozigosidade para os

marcadores foram considerados dentro das expectativas, visto que os SNPs são marcadores

bialélicos. Estes números foram comparados e mostraram-se semelhantes aos obtidos em

trabalhos recentes que também tem utilizados os mesmos marcadores para análises de

paternidade em animais de interesse econômico como bovinos (FISHER et al., 2009; HARA

et al., 2010) e suínos (BALLESTER et al., 2007). No entanto, aumentar o número de

marcadores também leva um outro desafio: a proporção de SNPs fortemente ligados pode ser

maior, gerando informações redundantes (SMOUSE, 2010). Assim, avaliar o desequilíbrio de

ligação (LD) tem sido indicado como o primeiro passo antes de iniciar uma estimativa de

parentesco (SANTURE et al., 2010; ROLF et al., 2010). Caso de desequilíbrio de ligação

51

foram observados em diferentes níveis ao longo do painel. Verificou-se, por exemplo, que

embroa o painel com menor número de marcadores tenha mostrado menor poder de

resolução, este também é o que leva ao menor número de identidicações falsas, já que o

mesmo contou com menor número de marcadores em desequiíbrio de ligação.

Os marcadores analisados no presente estudo mostraram-se níveis

consideráveis de polimorfismo. Valores de heterozigosidade esperada (He) para diversas

raças de ovinos distribuídas pelo mundo foram estimados com marcadores SNPs (KIJAS et

al., 2012). Os resultados mostraram que valores acima de 0,3 podem representar um bom

nível de polismorfismo para este tipo de marcador. Dos 46 marcadores utilizados no presente

trabalho, 41 mostraram valores de He superiores a 0,3. Além disto, muitos destes

evidenciaram valores que podem ser comparáveis até mesmo a aqueles obtidos por muitos

locos de microssatélites (por volta de 0,5).

Os SNPs vem ganhando espaço por apresentar algumas vantagens frente aos

microssatélites. Diversos trabalhos vem mostrando o poder de microssatélites altamente

polimórficos para testes de paternidade, observando-se resultados altamente significativos

(FISHER et al., 2009; HARA et al., 2010). Porém, um dos maiores desafios para a utilização

do último é o fato de que nem sempre é possível se comparar dados gerados em laboratórios

diferentes devido às inconsistências nos marcadores de comprimento de base (ladders). Além

disto pode-se ainda observar variação nos comprimentos dos fragmentos gerados em

decorrência da ação catalítica da enzima Taq polimerase, que pode adicionar bases extras na

extremidade 3’ dos fragmentos gerados. Esses tipos de erros não são encontrados quando as

análises são feitas com SNPs. Outro ponto que conta negativamente para este marcador são os

custos de genotipagem destes marcadores tem sido o maior fator limitante para aplica-los na

prática (VIGNAL, 2002).

A utilização do painel de SNPs selecionados mostrou algumas limitações por

por questões do número total de marcadores, porém, a grande maioria dos casos de

identificação se repetiram para qualquer um dos paneis testados, além do fato da maior parte

das atribuições de paternidade terem sido realizadas com níveis de confidência ! 95. Também

vale não descartar completamente a hipótese de erro humano durante o processo de anotação

do registro genealógico.

Seria necessário, portanto, que os mais testes fossem realizados, tentando,

inclusive, melhorar o sucesso das genotipagens, já que dos 71 marcadores inicialmente

selecionados, 18 foram eliminados por não apresentarem qualidade de genotipagem. Em todo

caso, outros fatores que podem levar a erros de atribuição de paternidade podem estar

52

relacionados com erros no próprio processo de genotipagem, devido a presença de mutações

ou, ainda, em decorrência da presença de alelos nulos. Estes tipos de erros podem levar a não

exclusão de uma falsa paternidade ou então, a rejeição de uma verdadeira (WELLER et al.,

2004).

A utilidade dos marcadores selecionados pôde também ser avaliada com os

valores de LOD score. De acordo com Marshal et al. (1998) LOD score indicaria que o

pai/mãe são candidatos fortes à paternidade. Hill et al. (2008) ainda estima que LOD scores

com valores maiores que 5 podem ser considerados como uma evidência de que a

paternidade foi identificada. Porém, vale ressaltar que o número reduzido de marcadores

também pode reduzir o poder de resolução das análises.

Embora muitos SNPs sejam necessários para se alcançar o mesmo nível de

precisão dos microssatélites para a identificação de paternidade, o desenvolvimento de novas

tecnologias de genotipagem em larga escala e a redução dos seus custos tem levado os SNPs a

se tornarem os principais marcadores moleculares da atualidade. Seu alto potencial de

automação tem possibilitado a realização do estudo em larga escala para que dados originados

de laboratórios situados em diferentes partes do mundo possam gerar dados

independentemente e, posteriormente, compará-los (KIJAS et al., 2012). Sua natureza

bialélica, que pode ser considerada uma desvantagem, pode transformar-se em uma de suas

principais vantagens em decorrência da redução da taxa de erro nas análises laboratoriais.

Assim, apesar de ainda estar em fase de aperfeiçoamento, este marcador vem sendo utilizado

para este tipo de análise (HEATON et al., 2002). Mesmo com os resultados do presente

estudo não identificando 100% dos progenitores, as informações obtidas fornecem recursos

para o planejamento de cruzamentos mais tecnificados, visando o melhoramento dos animais

em questão e evitando o aumento da endogamia e a perda de alelos dos mesmos.

53

2.6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ANDERSON, E.C.; GARZA, J.C. The Power of Single-Nucleotide Polymorphisms for Large-Scale Parentage Inference. Genetics v. 172, p. 2567–2582, 2006.

ARRUGA, M.V.; MONTEAGUDO, L.V.; TEJEDOR, M.T.; BARRAO, R.; PONZ, R. Analysis of microsatellites and paternity testing in Rasa Aragonesa sheep. Research in Veterinary Science, 70, 271-273, 2001.

BALLESTER, M; MERCADE, A.; VAN HAANDEL, B.; SANTAMARTINA, J; SANCHEZ, A. Individual identification and genetic traceability in the pig using the SNPlexTM genotyping system. Animal Genetics, v. 38, p. 662–666, 2007.

CUNNINGHAN, E.P.; MEGHEN, C.M. Biological Identification Systems: genetic markers. Rev Sci Tech Off Int Epiz, v. 20, n. 2, p. 491-499, 2001.

EXCOFFIER, L.; LISCHER, H.E.L. Arlequin suite ver 3.5: A new series of programs to perform population genetics analyses under Linux and Windows. Molecular Ecology Resources. v. 10, p. 564-567, 2010.

FISHER, P.J. ; MALTHUS, B. ; WALKER, M.C. ; CORBETT, G. ; SPELMAN, R.J. The number of single nucleotide polymorphisms and on-farm data required for whole-herd parentage testing in dairy cattle herds. Journal of Dairy Science, v. 92, p. 369-374, 2009.

HARA, K. ; WATANABE, S. ; MUKAI, H. ; MANNEN, H. Development of SNP markers for individual identification and parentage test in a Japanese Black cattle population. Jounal of animal Science, v. 81, p. 152-157, 2010.

HAUSER, L. ; BAIRD, M. ; HILBORN, R. ; SEEB, L.W. ; SEEB, J.E. An empirical comparison of SNPs and 1 microsatellites for 2 parentage and kinship assignment in a wild sockeye salmon 3 (Oncorhynchus nerka) population. Molecular Ecology Resources, in press. 2011.

HEATON, M.P. ; HARHAY G.P. ; BENNETT G.L. ; STONE R.T. ; GROSSE W.M. ; CASAS E. ; KEELE J.W. ; SMITH T.P.L. ; CHITKO-MCKOWN C.G. ; LAEGREID W.W. Selection and use of SNP markers for animal identification and paternity analysis in US beef cattle. Mammalian Genome, v. 13, p. 272–281, 2002.

HILL, W.G. ; SALISBURG, B.A. ; WEBB, J.A. Parentage identification using single nucleotide polymorphism genotypes : Application to product tracing. Jounral of Animal Science, v. 86, p. 2508-2517, 2008.

JONES, A.G., SMALL, C.M., PACZOLT, K.A., ANDRATTERMAN, N.L. Apractical guide to methods of parentage analysis. Molecular Ecology Resources. v. 10, p. 6–30, 2010

KIJAS, J.W.; TOWNLEY D, DALRYMPLE BP, HEATON MP, MADDOX JF, et al. A genome wide survey of SNP variation reveals the genetic structure of sheep breeds. PLoS Biology: v. 10, p. e1001258, 2012.

MARSHALL, T.C. ; SLATE, J. ; KRUUK, L.E.B. ; PEMBERTON, J.M. Statistical confidence for Likelihood-based paternity inference in natural populations. Molecular Ecology, v. 7, p. 639-655, 1998.

54

McMANUS, C. ; PAIVA, S.R. ; ARAUJO, R.O. Genetics and breeding of sheep in Brazil. Revista Brasileira de Zootecnia, v. 39, p. 236-246, 2010.

MENEZES, M.P.C.; MARTINEZ, A.M.; RIBEIRO, M.N.; PIMENTA-FILHO, E.C.; BERMEJO, J.V.D. Caracterização genética de raças caprinas nativas brasileiras utilizando-se 27 marcadores microssatélites. Revista Brasileira de Zootecnia, v. 35, n. 4, p. 1336-1341, 2006.

PARISET, L. ; CAPPUCCIO, I. ; AJMONE-MARSAN, P. ; BRUFORD, M. ; DUNNER, S. ; CORTES, O. ; ERHARDT, G. ; PRINZENBERG, E.M. ; GUTSCHER, K. ; JOOST, S. ; PINTO-JUMA, G. ; NIJMAN, I.J. ; LENSTRA, J.A. ; PEREZ, T. ; VALENTINI, A. and ECONOGENE CONSORTIUM. Characterization of 37 Breed-Specific Single-Nucleotide Polymorphisms in Sheep. Journal of Heredity, v. 97, n. 5, p. 531–534, 2006.

PEAKALL, R. ; SMOUSE, P.E. GENEALEX 6 : Genetic Analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research.

ROLF, M.M. ; TAYLR, J.F. ; SCHNABEL, R.D. ; McKAY, S.D. ; McCLURE, M.C. ; NORTHCUTT, S.L., KERLEY, M.S. ; WEABER, R.L. Impact of reduced marker set estimation of relationship matrices on genomic selection for feed efficiency in Angus cattle. BMC Genetics, v. 11, p. 24, 2010.

SAMBROOK, J., FRITSCH ,E.F. E MANIATIS, T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Lab. Press, New York.

SANTURE, A.W.; STAPLEY, J.; BALL, A.D.; BIRKHEAD, T.R.; BURKE, T.; SLATE, J. On the use of large marker panels to estimate inbreeding and relatedness: empirical and simulation studies of a pedigree zebra finch population typed at 771 SNPs. Molecular Ecology, v. 19, p. 1439-1451, 2010.

SMOUSE, P.E. !"#$%&'($)*+,$&-.$.'"/012$!"#$%&#'()*%"#"+,3$45$673$85$69:;<69::3$9=6=5$$

SOUZA, C.A.; PAIVA, S.R.; McMANUS, C.M.; AZEVEDO, H.C.; MARIANTE, A.S.; GRATTAPAGLIA, D. Genetic diversity and assessment of 23 microsatellite markers for parentage testing of Santa Inês hair sheep in Brazil. Genetics and Molecular Research, no prelo, 2012.

VIGNAL, A.; MILAN, D.; SANCRISTOLBAL, M.; EGGEN, A. A review on SNP and other types of molecular markers and their use in animal genetics. Genetics Selection Evolution, v. 34, p. 275-305, 2002.

WELLER, J.I.; FELDMESSER, E.; GOLIK, M. et al. Factors affecting incorrect paternity assignment in the Israeli Holstein population. Journal of Dairy Science, v.87, n.8, p.2627-2640, 2004.

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CAPÍTULO III

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3.1. CONSIDERAÇÕES FINAIS

O aumento da demanda por alimentos é um dos principais efeitos do

crescimento da população humana. Neste sentido, os setores produtivos vem cada vez mais se

tornando dependentes de tecnologias para atender a esta demanda e, entre os diversos

componentes do agronegócio, destaca-se o melhoramento genético como um dos que

demanda tecnologia de ponta para ser mais efetivo. Entretanto, a idealização de um panorama

onde apenas o incremento da produção se torna o objetivo, pode acarretar na acentuada erosão

genética de raças/ tipos localmente adaptados. Entre estes, destacam-se os ovinos

naturalizados no Brasil, que vem sendo progressivamente cruzados com raças especializadas

consideradas mais produtivas.

Após a chegada das novas tecnologias de sequenciamento e genotipagem de

grande escala, a utilização dos SNPs vem se mostrando uma alternativa viável para a

realização dos trabalhos de avaliação genética. Porém, um dos requisitos para a utilização

destes marcadores é que os mesmos tenham uma cobertura densa e um alto nível de

polimorfismo dentro das populações testadas.

Assim, o presente estudo mostrou que estes marcadores podem ser

considerados uma alternativa viável nestas análises frente a tecnologia tradicional de

microssatélites. Porém, observou-se a necessidade de se aumentar o número de marcadores no

painel utilizado para aumentar sua representatividade, visto que estes são bialélicos. Porém,

mesmo não identificando 100% dos progenitores testados, as informações obtidas fornecem

recursos para o planejamento de cruzamentos mais tecnificados e de menor custo, visando o

melhoramento dos animais em questão e evitando o aumento da endogamia e a perda de

alelos dos mesmos.