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UNIVERSIDADE DE FRANCA
ESTUDO FITOQUÍMICO E AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES ESQUISTOSSOMICIDA, ANTIMICROBIANA E
ACETILCOLINESTERÁSICA DE Roupala montana Aubl. (Proteaceae).
Herbert Cristian de Souza
FRANCA 2012
HERBERT CRISTIAN DE SOUZA
ESTUDO FITOQUÍMICO E AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES ESQUISTOSSOMICIDA, ANTIMICROBIANA E
ACETILCOLINESTERÁSICA DE Roupala montana Aubl. (Proteaceae).
Dissertação apresentada à Universidade de Franca, como exigência parcial para a obtenção do título de Mestre em Ciências, área de concentração: Química – Biológica. Orientadora: Drª Ana Helena Januário
FRANCA 2012
HERBERT CRISTIAN DE SOUZA
ESTUDO FITOQUÍMICO E AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES ESQUISTOSSOMICIDA, ANTIMICROBIANA E
ACETILCOLINESTERÁSICA DE Roupala montana Aubl. (Proteaceae).
COMISSÃO JULGADORA DO PROGRAMA DE MESTRADO EM CIÊNCIAS
PRESIDENTE: __________________________________________________ NOME: PROFa. DRa. ANA HELENA JANUÁRIO INSTITUIÇÃO: Universidade de Franca (UNIFRAN) TITULAR 1: ____________________________________________________ NOME: PROFa. DRa. Lizandra Guidi Magalhães INSTITUIÇÃO: Universidade de Franca (UNIFRAN) TITULAR 2: ____________________________________________________ NOME: PROFa. DRa. Rosemeire Cristina Linhari Rodrigues Pietro INSTITUIÇÃO: Universidade estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho"
Franca, _____/_____/_____
Trabalho realizado nos Laboratórios de Pesquisa em Microbiologia Aplicada (LaPeMA), Química de Produtos Naturais da Universidade de Franca (GPNUF) e Pesquisa em Parasitologia (Lappa) da UNIFRAN.
AGRADECIMENTOS
A Deus, pela minha vida, pelas oportunidades dadas, pela sabedoria e força para
aproveitá-las e por me conceder mais uma vitória.
À minha orientadora, Profa. Drª. Ana Helena Januário, por todo o ensinamento,
confiança, paciência, disposição, amizade, sugestões e encorajamento contínuo
durante este trabalho. Faço um agradecimento especial à Profa. Drª. Lizandra Guidi
Magalhães pelos ensinamentos e dedicação em seu laboratório, e aos alunos de
Iniciação Científica que dedicaram muito para a realização deste trabalho.
À minha esposa Caroline pela paciência de ter suportado os dias de ausência,
ficando sozinha em casa, pela compreensão, pelo companheirismo feito em viagens
difíceis e pelo amor durante em todo este período.
À minha irmã Cristiane, por ter feito companhia em todos os momentos durante
estes dois anos.
Aos meus pais, Jesus e Selma. A vocês um texto em uma página não descreveria o
quanto são importantes para mim, vocês foram meu alicerce, minha fonte de força,
meus incentivadores, e a cada viagem, me apoiaram incondicionalmente de todas as
formas possíveis e acreditaram neste sonho e o sonharam junto a mim. Obrigado
por me amarem tanto.
SUMÁRIO
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS ........................................................................... I
LISTA DE FIGURAS ............................................................................................................. II
RESUMO ............................................................................................................................... V
ABSTRACT .......................................................................................................................... VI
1. INTRODUÇÃO .............................................................................................................. 14
1.1 O GÊNERO ROUPALA E A ESPÉCIE MONTANA .................................................................. 17
1.2 ESQUISTOSSOMOSE ...................................................................................................... 20
1.3 ANTIMICROBIANOS ........................................................................................................ 23
1.4 A DOENÇA DE ALZHEIMER ............................................................................................. 25
1.4.1 A ACETILCOLINA E OS INIBIDORES DA ACETILCOLINESTERASE ....................................... 26
2. OBJETIVOS .................................................................................................................. 30
2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................................... 30
3. PARTE EXPERIMENTAL ............................................................................................. 31
3.1 OBTENÇÃO DO MATERIAL VEGETAL ................................................................................ 31
3.2 PREPARAÇÃO DO EXTRATO BRUTO E PARTIÇÃO LÍQUIDO-LÍQUIDO ................................... 31
3.3 FRACIONAMENTO DO EXTRATO BRUTO ........................................................................... 32
3.4 ANÁLISES CROMATOGRÁFICAS ...................................................................................... 33
3.4.1 ANÁLISES CROMATOGRÁFICAS POR CLAE ................................................................... 34
3.5 ENSAIO DA ATIVIDADE ESQUISTOSSOMICIDA................................................................... 36
3.6 ENSAIO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA ........................................................................ 39
3.6.1 MICRO-ORGANISMOS UTILIZADOS NOS ENSAIOS ........................................................... 39
3.6.2 ENSAIO DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA (CIM) ................................................. 40
3.6.3 PREPARO DA SUSPENSÃO BACTERIANA E PADRONIZAÇÃO DA DENSIDADE DO INOCULO. .. 43
3.6.4 DILUIÇÃO DAS AMOSTRAS ........................................................................................... 44
3.6.5 PREPARO DO FÁRMACO PADRÃO ................................................................................. 45
3.6.6 TÉCNICA DE DETERMINAÇÃO DA CIM .......................................................................... 46
3.7 ENSAIOS DE INIBIÇÃO DA ACHE POR BIO-AUTOGRAFIA EM CCD ..................................... 48
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES .................................................................................. 51
4.1 ANÁLISE CROMATOGRÁFICA DA FRAÇÃO RP1 ................................................................ 51
4.2 ATIVIDADE BIOLÓGICA ................................................................................................... 59
4.2.1 ATIVIDADE ESQUISTOSSOMICIDA PARA EXTRATOS E FRAÇÕES DE R. MONTANA............... 59
4.2.2 ATIVIDADE ANTIBACTERIANA PARA EXTRATOS E FRAÇÕES DE R. MONTANA ..................... 60
4.2.3 ATIVIDADE INIBITÓRIA DA ACETILCOLINESTERASE ......................................................... 62
5. CONCLUSÕES ............................................................................................................. 64
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................. 66
I
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
ACh Acetilcolina AChE Acetilcolinesterase AcOEt Acetato de etila APP Proteína Precursora Amiloide Aß Proteína Beta Amilóide ATCC American Type Culure Collection BHI Caldo Cérebro Coração (Brain Heart Infusion) CCD Cromatografia em camada delgada CG-EM Cromatografia a gás acoplada à espectrometria de massas CIM Concentração inibitória mínima CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência CYP 450 Citocromo enzimático P450 DA Doença de Alzheimer DD Difusão em Disco DMSO Dimetilsulfóxido EM Espectrometria de massas ESBL Beta Lactamase de Espectro Extendido (Extended-spectrum beta-lactamase) HEPES Agente Tampão (4-(2-hidroxietil)-1-piperazinoetanossulfónico) IAChE Inibidores da acetilcolinesterase n-BuOH n-butanol OMS Organização Mundial da Saúde Rf Fator de retenção RPMI Meio de cultura de tecido animal desidratado (Roswell Park Memorial Institute) RR Retenção relativa UFC Unidade formadora de colônia
II
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Mapa de vegetação do Brasil, mostrando a área central do bioma Cerrado (Brasil, 2004). ...................................................................................................................... 15
Figura 2 – Imagem da árvore de Roupala montana (à esquerda), e seus frutos e flores (à direita) (Savanna, 2011) ......................................................................................... 18
Figura 3 – Imagem da folha de Roupala montana (Carvalho, 2009). ................................... 19
Figura 4 – Distribuição da esquistossomose, de acordo com a faixa de prevalência, por município (Brasil, 2011b). .............................................................................................. 21
Figura 5 – Formação excessiva da proteína beta-amilóide (Aß), derivadas da proteína APP (Sayeg, 2011). ............................................................................................................. 27
Figura 6 – Efeitos prejudiciais da proteína beta-amilóide (Aß) na fenda sináptica (Querfurth; Laferla, 2010) .................................................................................................... 28
Figura 7 – Preparação do extrato bruto de Roupala montana. ............................................. 32
Figura 8 – Fluxograma da partição líquido-líquido do extrato de Roupala montana. ............ 33
Figura 9 – Inoculação das cercárias por via subcutânea em camundongos. ........................ 36
Figura 10 – Avaliação da atividade esquistossomicida in vitro, os vermes adultos de Schistosoma mansoni. ......................................................................................................... 38
Figura 11 – Reação química de redução da resazurina para resorufina, com mudança de cor .................................................................................................................................. 41
Figura 12 – Microplaca exemplificando a mudança de cor dos poços pelam presença da Resazurina (Rosa – crescimento bacteriano / Azul – ausência de crescimento bacteriano). Imagem: Laboratório de Microbiologia UNIFRAN. ............................................ 42
Figura 13 - Preparo da suspensão bacteriana e Padronização da densidade do inoculo. ................................................................................................................................ 44
Figura 14 – Preparo da Solução mãe. ................................................................................. 45
Figura 15 – Preparo dos Fármacos Padrões. ...................................................................... 46
Figura 16 – Distribuição das amostras, controles e solventes na microplaca para a determinação da CIM. .......................................................................................................... 47
Figura 17 – Etapas finais para o teste de determinação da CIM. ......................................... 48
Figura 18 – Reação de detecção de atividade anticolinesterásica de substâncias naturais pelo método de Marston e Hosttetamenn (Marston et al., 2002). ........................... 49
Figura 19 – Etapas do ensaio de inibição da AChE por Bioautografia em CCD. .................. 50
Figura 20 – Cromatogramas obtidos por CLAE do Extrato Bruto (RP) e das frações (RP1, RP2, RP3 e RP4) de R. montana............................................................................... 52
III
Figura 21 – Cromatograma obtido via CG-EM da fração RP1. ............................................. 53
Figura 22 – Propostas de estruturas químicas para a Fração Hexânica (RP1) de R. montana: Éster etílico do ácido Palmítico (1), Fitol (2), δ-tocoferol (3), γ-tocoferol (4) e Neofitadieno (5). .................................................................................................................. 54
Figura 23 – Espectro de Massas (EM) obtido via CG-EM da fração RP1 para a substância com tR= 29,935min., e comparado com o EM contido na biblioteca de padrões................................................................................................................................ 55
Figura 24 – Espectro de Massas obtido via CG-EM da fração RP1 para a substância com tR= 33,653min., e comparado com o EM contido na biblioteca de padrões. ................. 55
Figura 25 – Espectro de Massas obtido via CG-EM da fração RP1 para a substância com tR= 52,799min., e comparado com o EM contido na biblioteca de padrões. ................. 56
Figura 26 – Espectro de Massas obtido via CG-EM da fração RP1 para a substância com tR= 58,395min., e comparado com o EM contido na biblioteca de padrões. ................. 56
Figura 27 – Espectro de Massas obtido via CG-EM da fração RP1 para a substância com tR= 60,342min., e comparado com o EM contido na biblioteca de padrões. ................. 57
Figura 28 – Cromatograma obtido via CG-EM da fração RP1 + Padrão interno 5-α-Colestano (tR= 53,881). ........................................................................................................ 57
Figura 29 – Estruturas químicas dos triterpenos: β-amirina (1), α-amirina (2) e Lupeol (3) detectados na Fração Hexânica (RP1) de R. Montana por CG-EM com injeção de padrão interno (5-α-Colestano) ............................................................................................ 58
Figura 30 – Placa de bioensaio para acetilcolinesterase: Padrão Galantamina (1); Extrato Bruto (2); Fração RP1 (3); Fração RP2 (4); Fração RP3 (5); Fração RP4 (6). Eluente: CHCl3/MeOH/H2O (43:37:20), Revelador: Acetilcolinesterase. ............................... 62
IV
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Características das Bactérias utilizadas nos ensaios na atividade antibacteriana (ATCC, 2011). .............................................................................................. 39
Tabela 2 – Bactérias utilizadas na atividade antibacteriana ................................................. 42
Tabela 3 – Composição química da fração hexânica de Roupala montana (RP1). .............. 53
Tabela 4 – Composição química da fração hexânica com injeção do padrão interno (5-α-Colestano) de Roupala montana (RP1). ....................................................................... 58
Tabela 5 – Potencial esquistossomicida de Roupala montana e suas frações. .................... 60
Tabela 6 – Resultado dos ensaios antibacteriano para o extrato bruto (RP) e frações (RP1, RP2, RP3 e RP4) de Roupala montana. .................................................................... 61
V
RESUMO
Roupala montana Aubl. é uma espécie da família Proteaceae com pouquíssimos ou quase nenhum relato sobre o seu perfil fitoquímico e/ou estudos biológicos, o que torna esta pesquisa inédita. Assim, este trabalho enfoca o preparo de um extrato bruto das partes aéreas de Roupala montana, seguido de um fracionamento com diferentes solventes de polaridades crescentes, obtendo-se as frações Hexânica (RP1), Acetato de etila (RP2), n-butanólica (RP3) e Hidrometanólica (RP4), e os seus respectivos ensaios biológicos (esquistossomicida, antimicrobiana e acetilcolinesterásica). A partir do fracionamento, houve o monitoramento das frações (RP1, RP2, RP3 e RP4) através de ensaios cromatográficos por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE), o qual se selecionou a fração RP1 para procedimentos cromatográficos por CG-EM objetivando traçar seu perfil fitoquímico. Através do estudo fitoquímico da fração RP1 por CG-EM, permitiu-se a identificação de 2 (dois) diterpenos (Fitol e Neofitadieno), 3 (três) triterpenos (β-amirina, α-amirina e Lupeol), 2 (dois) carotenóis (δ-tocoferol e γ-tocoferol) e 1 (um) éster de ácido graxo (Éster etílico do ácido Palmítico), como constituintes majoritários. O potencial esquistossomicida do extrato bruto (RP) e das frações provenientes da partição líquido-líquido foi avaliado in vitro frente aos vermes adultos de Schistosoma mansoni. Os resultados indicam que a fração RP2 foi a mais ativa dentre as amostras testadas, sendo que esta promoveu a morte de 100% dos parasitas na dose de 50 µg/mL no quinto dia de tratamento. Adicionalmente, os resultados obtidos frente à atividade antimicrobiana do extrato bruto e das frações de Roupala montana demonstraram valores de CIM intermediários, sendo que apenas a fração RP2 inibiu fracamente o crescimento de Streptococcus pneumoniae, com CIM de 200 µg/mL, o que se poderia sugerir seu uso como auxiliar no controle e redução dos microrganismos patogênicos. Paralelamente, a ação acetilcolinesterásica de Roupala montana revelou que as frações RP1, RP2 e RP3 apontaram ligeiro potencial de inibição frente à esta enzima, sendo que apresentou uma mancha branca no mesmo Fator de Retenção (Rf).
Palavras chave: Proteaceae, Roupala montana, Estudo fitoquímico, atividade Esquistossomicida, antimicrobiana e acetilcolinesterásica.
VI
ABSTRACT
Roupala montana is a species of the family Proteaceae with very few or almost no reports on the phytochemical profile and / or biological studies, which makes this original research. This work focuses on the preparation of a crude extract of aerial parts of Roupala montana, followed by fractionation with different solvents of increasing polarity, yielding hexane fractions (RP1), Ethyl acetate (RP2), n-butanol ( RP3) and hydromethanol (P4), and their respective biological assays (schistosomicidal, antimicrobial and acetilcolinesterásica). The fractionation, the fractions were monitored (RP1, RP2, RP3 and RP4) by chromatographic assays by High Performance Liquid Chromatography (HPLC), which was selected for chromatographic procedures RP1 fraction by GC-MS trace its objective phytochemical profile. Through the phytochemical study of RP1 fraction by GC-MS allowed the identification of two (2) diterpenes (Phytol and Neofitadieno), 3 (three) triterpenes (β-amyrin, α-amyrin and lupeol), two (2) carotenóis (γ-tocopherol and δ-tocopherol) and 1 (a) ester of fatty acid (palmitic acid ethyl ester), as major constituents. The potential schistosomicidal crude extract (RP) and the fractions from the liquid-liquid partition was evaluated in vitro against the adult worms of Schistosoma mansoni. The results indicate that the P2 fraction was the most active among the samples tested, this being promoted 100% death of the parasites on the dose of 50 mg / mL in the fifth day of treatment. Additionally, the results obtained against the antimicrobial activity of crude extract and fractions Roupala montana showed MIC values intermediate, and only a fraction RP2 weakly inhibited the growth of Streptococcus pneumoniae, with MIC of 200 mg / mL, which could suggest its use as an aid in the control and reduction of pathogenic microorganisms. In addition, the action acetilcolinesterasica of Roupala montana fractions revealed that RP1, RP2 and RP3 had a slight potential to inhibit this enzyme front, and had a white spot at the same retention factor (Rf). Keywords: Proteaceae, Roupala montana, Phytochemical study, acetilcolinesterasica activity, antimicrobial and antischistosomal.
14
1. INTRODUÇÃO
O conhecimento histórico do uso de plantas medicinais nos mostra ao longo
da história da humanidade que, pela própria necessidade humana, as plantas foram
os primeiros recursos terapêuticos utilizados (Corrêa, 2000). E
ainda hoje, grande parte da população, principalmente a de baixa renda, utiliza-se
dessa técnica milenar como principal recurso para a manutenção e alívio de seus
males (DI Stasi, 1996).
Nesta conjuntura, a Etnofarmacologia tem sido uma ferramenta muito útil na
busca destas substâncias de origem natural e que são empregadas em
medicamentos (Simões et. al., 2004), uma vez que o conhecimento da diversidade
molecular do reino vegetal, apesar dos avanços científicos, ainda é considerado
limitado (Nodari et. al., 2004).
O Brasil é um dos países de maior biodiversidade no mundo, com
aproximadamente 10% de toda a biota terrestre (Mittermeier et. al., 1997 apud
Machado, et. al., 2004), sendo que o cerrado representa o segundo bioma em
extensão do país, ocupando cerca de 24% (Figura 1) do território nacional. O
Cerrado é a savana mais diversificada do mundo, pois 44% de toda a sua flora são
endêmicas (Klink & Machado, 2005). Além disso, sua diversidade taxonômica, em
níveis superiores, é muito maior que a da Floresta Amazônica, e representa um
enorme patrimônio genético, elevando o potencial dos compostos bioativos
produzidos por suas espécies vegetais e a importância da pesquisa com plantas
medicinais nesse bioma (Calixto, 2003; Guarim-Neto & Morais, 2003; Lapa, et. al.,
2003).
15
Figura 1 – Mapa de vegetação do Brasil, mostrando a área central do bioma Cerrado (Brasil, 2004).
A razão desta afirmação é facilmente comprovada quando se analisa o
número de fármacos obtidos direta e indiretamente a partir de produtos naturais:
aproximadamente 25% dos medicamentos mais vendidos no mundo foram
desenvolvidos a partir de plantas medicinais utilizadas na medicina popular para os
mais diversos fins, sendo que 11% são considerados essenciais pela Organização
Mundial de Saúde (OMS) (Elisabetsky, 2003; Foglio et. al., 2006).
O estudo fitoquímico de plantas medicinais constitui alternativamente uma
estratégia na procura de novos agentes terapêuticos, sendo que os levantamentos
bibliográficos associado ao conhecimento popular servem de bases para a
identificação da atividade farmacológica de plantas medicinais. A busca de plantas
úteis para a saúde humana nos conhecimentos populares é de grande importância
para a ciência, uma vez que essas informações podem indicar quais as plantas
podem atuar sobre determinadas doenças (Mendes, 2007).
16
Nas últimas décadas, a maneira de se pesquisarem novos compostos
biologicamente ativos sofreu grandes mudanças, principalmente devido aos avanços
tecnológicos. Um dos mais importantes fatores para o sucesso no descobrimento de
um fármaco novo é a diversidade química dos compostos, essencialmente os
produtos naturais, os quais são considerados como uma das maiores fontes de
diversidade química (Trevisan; Macedo, 2003).
Portanto, a pesquisa fitoquímica tem por objetivo conhecer os constituintes
químicos de espécies vegetais e/ou avaliarem sua presença. Quando não se dispõe
de estudos químicos sobre as espécies de interesse, a análise fitoquímica preliminar
pode indicar o grupo de metabólitos secundário relevante da mesma espécie ou
família (Foglio et. al., 2006).
A família Proteaceae representa, provavelmente, um dos mais antigos grupos
dentro das angiospermas. Entre as espécies desta família não existem formas
herbáceas, sendo apenas constituída por espécies lenhosas. Os seus hábitos de
crescimento são muito variáveis, podendo-se encontrar desde formas rastejantes,
com hastes trepadeiras, eretas, com caules subterrâneos, arbustos de crescimento
vertical e até mesmo árvores. Suas folhas são geralmente grandes, lenhificadas e de
aspecto coriáceo, podendo ser inteiras ou recortadas, formando lóbulos em forma de
agulha (Levin, 1999). O principal representante das Proteaceae no Cerrado
brasileiro é o gênero Roupala, devido à alta freqüência e biomassa que se
apresentam (Diniz, 2009).
Em recentes estudos (Januário, et. al., 2011; Ramos, et. al., 2011), foram
identificados importantes metabólitos secundários em Roupala montana Aubl, como
por exemplo: flavonóides, saponinas, heterosídeos cianogenéticos e ácidos
orgânicos.
17
Contudo, apesar de estes estudos apontarem para estes metabólitos, é
praticamente desconhecido o perfil químico-biológico de Roupala montana, fato este
que motivou o estudo aprofundado desta espécie tão populosa no Cerrado
brasileiro.
1.1 O gênero Roupala e a espécie montana
Roupala montana Aubl., é um representante da família Proteaceae,
popularmente conhecida por carne-de-vaca, caxuá ou farinha-seca (Júnior & Júnior,
2009; Neto, et al., 2010). Quanto à etimologia, o nome genérico Roupala é
comumente usado nas Guianas, e o termo específico montana vem das terras altas,
ou ainda ―planta rústica‖ (Carvalho, 2009).
Sua ocorrência é amplamente distribuída nos cerrados do Brasil (Ratter, et.
al., 2000 apud Bendicho-López, et. al., 2006), sendo uma espécie de grande
representatividade no cerrado sensu stricto (Ribeiro & Walter, 1998; Júnior & Júnior,
2009). Encontra-se distribuída no Amapá, Amazonas, Ceará, Distrito Federal,
Goiás, Maranhão, Pará, Tocantins, Mato Grosso e São Paulo (Miranda-Melo, 2004).
Além disso, a espécie é muito comum em inventários de Minas Gerais (Silva, et al.,
2003), e não aparece na lista oficial das espécies da flora brasileira ameaçadas de
extinção (Brasil, 2011a). Pesquisas feitas por Meirelles e colaboradores (2008),
indicam que o gênero Roupala também apresenta várias espécies típicas de áreas
de altitude.
Esta espécie é uma árvore de médio porte que atinge de 8 a 25 metros de
altura (Figura 2), com cerca de 40 a 70 cm de diâmetro, com crescimento lento
(Fournier, 2011). A inflorescência de Roupala montana é solitária axilar ou terminal,
formada por 10 a 100 flores medindo, cada uma, cerca de 5mm de comprimento
18
(Almeida et. al., 1998; Figueira & Barbosa, 2006). Suas hastes são finas e a casca é
cinzenta (Edwards & Prance, 2003; Fournier, 2011) e apresenta-se como uma
espécie bastante resistente às intempéries comuns ao cerrado, como fogo e
insolação excessiva.
Figura 2 – Imagem da árvore de Roupala montana (à esquerda), e seus frutos e flores (à direita) (Savanna, 2011)
Sua distribuição etária com predomínio nas classes mais jovens reflete a
funcionalidade das matrizes na ocupação da área, seja por propagação vegetativa,
seja por dispersão de sementes (Júnior & Júnior, 2009). Os frutos são do tipo
folículo com sementes de cor castanha (Borges, 2000; Figueira & Barbosa, 2006), e
floresce de dezembro a fevereiro e frutifica de fevereiro a abril (Almeida et. al., 1998;
Figueira & Barbosa, 2006).
As folhas de R. montana (Figura 3) são pecioladas, largo-elíptico a
lanceolado, com até 18 cm de comprimento, sendo que as folhas novas apresentam
indumento piloso em ambas as superfícies (Miranda-Melo, 2004; Figueira &
19
Barbosa, 2006; Fournier, 2011). Vários estudos indicam que as folhas de R.
montana são consumidas por lagartas da espécie lepidópteros folívoros,
principalmente consumindo folhas jovens (8%) e maduras (92%) (Morais et al. 1995;
Bendicho-López, 2006).
Figura 3 – Imagem da folha de Roupala montana (Carvalho, 2009).
A espécie R. montana tem na produção madeireira e na construção de casas
suas principais formas de exploração (Brandão, 1998; Botrel, 2006), apresentando
uma produção de madeira relativamente alta, similar à das árvores mais comuns do
cerrado brasileiro, mas com uma grande adaptação às condições adversas deste
ambiente, como fogo e insolação excessiva (Júnior & Júnior, 2009). Dentre as
utilidades desta espécie destaca-se também a aplicabilidade medicinal de sua
casca. Esta, sob a forma de infusão, é utilizada para limpeza de feridas e contra
ulcerações (Brandão, 1998). R. montana é uma planta melífera1 e também
considerada ornamental pelo formato e textura de suas folhas. Em artesanato, os
galhos secos, as folhas e os frutos compõem arranjos florais denominados ―flores do
planalto‖, comercializados em feiras (Miranda-Melo, 2004). Outra utilização comum é
1 Plantas preferidas pelas abelhas melíferas.
20
na recuperação ou reestruturação de paisagens degradadas pelo fogo (Júnior &
Júnior, 2009).
1.2 Esquistossomose
A esquistossomose é uma doença tropical negligenciada que afeta mais de
207 milhões de pessoas no mundo todo, sendo que aproximadamente 20 milhões
apresentam conseqüências graves da doença. Esta parasitose está distribuída em
74 países dos continentes africano, asiático e americano e, cerca de 779 milhões de
pessoas estão expostas ao risco de contrair uma das esquistossomoses,
principalmente através da água infectada nas atividades agrícolas, domésticas e no
lazer (Steinmamm, et. al., 2006; WHO, 2011a).
A área endêmica no Brasil abrange 19 estados com aproximadamente 42
milhões de habitantes expostos ao risco, e, cerca de 7 milhões de indivíduos
infectados pelo parasita (Figura 4). Para se ter uma idéia da gravidade, entre os
anos de 2000 e 2010, a esquistossomose provocou 505 óbitos no Brasil. Ademais,
as pessoas acometidas com esta parasitose apresentam graves deficiências
orgânicas, comprometendo o desenvolvimento de jovens e a produtividade de
adultos, fazendo desta doença um dos mais sérios problemas de saúde nos países
em desenvolvimento (Melo & Coelho, 2005; Lambertucci & Barravieira, 1994, WHO,
2011a; King, 2009; Brasil, 2011b).
21
Figura 4 – Distribuição da esquistossomose, de acordo com a faixa de prevalência, por município (Brasil, 2011b).
De acordo com Organização Mundial de Saúde (OMS) a esquistossomose
continua avançando em novas áreas, impulsionadas por fatores sociais,
econômicos, má organização nos projetos de irrigação e ocupação de terras nos
países em desenvolvimento (Chitsulo et. al., 2000). A estes, soma-se ainda o
esquema terapêutico e os elevados custos envolvidos no desenvolvimento de novos
medicamentos e respectivos testes de eficácia e segurança, o que vem afastando o
interesse das grandes companhias farmacêuticas a investirem nesta área.
Pela dificuldade de ser encontrados quimioterápicos que exibissem alta
eficácia e grande tolerabilidade, o tratamento medicamentoso da esquistossomose
sempre foi limitado (Novaes, et. al., 1999). Apesar de vários estudos com outras
classes de fármacos (Ribeiro-Dos-Santos, et. al., 2006), os dois fármacos
esquistossomicidas mais utilizados atualmente são a oxamniquina e o Praziquantel.
A oxamniquina apresenta efeitos colaterais no sistema nervoso central, com
possibilidade alucinações, convulsões e excitação. Este medicamento também leva
22
ao cansaço, principalmente no início do tratamento (Martínez, 1985).
Terapeuticamente é um fármaco usado como alternativa de segunda escolha ao
praziquantel (Goodman & Gilman, 2005). Ademais, a decisão da empresa
farmacêutica detentora do registro de produtos contendo oxamniquina de limitar a
produção de medicamentos com este fármaco, torna o praziquantel a única forma de
tratar esta parasitose (Mourão, 2001 apud Souza, 2010).
O praziquantel ainda é ainda é o fármaco utilizado no controle da
esquistossomose em todo o mundo (Bergquist, et al., 2002; Hagan, et al., 2004).
Este composto é efetivo contra todas as espécies de Schistosoma (Korolkovas,
1998; Doenhoff, et al., 2000; Fenwick, et al., 2003), no entanto apresenta efeitos
colaterais como desconforto abdominal, cefaléia, tontura e sonolência, febre e
mialgia. A administração em grávidas deve ser evitada, pois pode provocar abortos
(Parasitologia, 2011). Neste fármaco, interações medicamentosas importantes
acontecem com o uso concomitante de anticonvulsivantes, os quais induzem o
sistema enzimático do Citocromo P450 (CYP450) a diminuir a biodisponibilidade do
Praziquantel (Medicina, 2011).
Ademais, o Praziquantel não previne à re-infecção, necessitando de
tratamentos repetidos em áreas endêmicas, onde há relatos demonstrando o
crescente surgimento de linhagens resistentes a este medicamento (Fallon et. al.,
1998; Ismail et. al., 1999; Magnussen et. al., 2003). Frente a este quadro, o
desenvolvimento de novos fármacos podem ser tornar uma importante alternativa
para o tratamento da esquistossomose frente ao uso do Praziquantel.
23
1.3 Antimicrobianos
Nas últimas décadas o uso irracional de antimicrobianos contribuiu para o
surgimento de cepas de micro-organismos multi-rresistentes, impulsionando a
comunidade científica a pesquisas nas áreas de química, farmacologia e
microbiologia para a descoberta de novos fármacos que venham a ter atividade
antimicrobiana (Filho & Yunes, 1998; Souza et. al., 2003). Diversas pesquisas vêm
sendo produzidas baseadas nas propriedades anti-infecciosas e antiinflamatórias de
muitas plantas de uso consagrado na medicina popular (Holetz et. al., 2002).
Segundo a Organização Mundial de Saúde (2008), o Brasil está entre os 15
países de maior incidência de pneumonia, com 0,11 episódios/criança/ano em
menores de 5 anos, o que equivale a 1,8 milhões de casos/ano (Rudan, 2008).
Em relação à sensibilidade dos pneumococos à penicilina, os pontos de corte
de Concentração Inibitória Mínima (CIM) para penicilina foram estabelecidos no final
dos anos 1970 e surgiram da necessidade de se assegurar sucesso no tratamento
da meningite pneumocócica. Nas últimas três décadas, evidenciou-se uma CIM
crescente dos pneumococos à penicilina, com aumento da porcentagem de cepas
com sensibilidade intermediária e resistentes à penicilina (Yoshioka, 2011).
Um dos patógenos de maior prevalência em infecções hospitalares é o
Staphylococcus aureus. Além disso, grande parte dessas infecções é causada por
amostras resistentes a oxacilina (Kaiser et. al., 2010). Resultados de um estudo
conduzido pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (Brasil, 2008) envolvendo
75 hospitais brasileiros (julho/2006 até junho/2008) mostraram os Staphylococcus
como os micro-organismos mais freqüentes (47%), entre 5.406 amostras bacterianas
isoladas de infecções primárias, da corrente sanguínea. Além disso, apenas 39%
das amostras de S. aureus foram classificadas como sensíveis a oxacilina.
24
Este mesmo estudo identificou que 53% das amostras testadas frente à
Pseudomonas aeruginosa foram classificadas como resistente à Levofloxacina e
Gentamicina. Já para a Klebsiella pneumoniae e Escherichia coli, 61% e 35%
respectivamente, das cepas testadas são resistentes a Ceftriaxona (Brasil, 2008).
Taxas elevadas de isolamento de estafilococos resistentes a oxacilina fazem
com que ocorra o uso em grande escala de antimicrobianos mais caros ou tóxicos
como a Vancomicina (Kaiser et. al., 2010).
Levando em consideração que grande parte dos microrganismos tende a
desenvolver resistência aos antibióticos rotineiramente utilizados na clínica,
atualmente é crescente o interesse por compostos antibacterianos que sejam mais
eficientes e com menos reações adversas (Meng et. al., 2000; Ho et. al., 2001;
Michelin et. al., 2005; Kaiser et. al., 2010).
Atualmente é crescente o interesse por compostos antimicrobianos de origem
natural, uma vez que, grande parte dos microrganismos tende a desenvolver
resistência aos antibióticos rotineiramente utilizados na clínica, por uso excessivo ou
até inadequado (Kaiser et. al., 2010).
Pesquisas indicam que as partes aéreas de Roupala montana tem forte
atividade frente a várias cepas de bactérias, incluindo S. aureus, E. coli, B. cereus,
e P. aeruginosa (Alves et. al., 2000). Estas indicações favorecem a prospecção e
investigação de tais atividades frente a outras formas de bactérias.
25
1.4 A Doença de Alzheimer
A doença de Alzheimer (DA), caracterizada pelo neuropatologista alemão
Alois Alzheimer em 1907, é uma afecção neurodegenerativa progressiva e
irreversível caracterizada pelo declínio progressivo de funções cognitivas como
memória, pensamento, compreensão, cálculo, linguagem, capacidade de
aprendizagem e julgamento (WHO, 2011b). Ao realizar uma autópsia, o Dr. Alois
Alzheimer, descobriu no cérebro de uma paciente que os neurônios encontravam-se
atrofiados por zonas e formavam um tipo de placas de morfologia diferente do
normal, estando às fibras nervosas ―enroscadas‖ e ―retorcidas‖ umas nas outras. A
esta característica histopatológica de neurodegenereção deu-se o nome de placas
senis, característica fundamental da Doença de Alzheimer (Luzardo, 2006).
Nas últimas décadas do século XX, descobriu-se que a doença de Alzheimer
está fortemente relacionada ao processo de envelhecimento. É o tipo de demência
com maior chance de se desenvolver nas idades mais avançadas (> 60 anos),
sendo que o envelhecimento constitui o principal fator de risco para o
desenvolvimento da doença (Harman, 2000; Smith, 2011), uma vez que ambos,
envelhecimento e demência, compartilham qualitativamente das mesmas alterações
neuropatológicas. No entanto, na DA essas alterações ocorrem em intensidade
muito maior (Pittella apud Luzardo, 2006) e não possui uma causa antecedente, tais
como acidente vascular, trauma craniano ou álcool (Rang & Dale, 2007).
Após os 65 anos, a incidência da doença praticamente dobra a cada 5 anos,
com diagnósticos de 1275 novos casos por ano para cada 100.000 pessoas acima
de 65 anos (Querfurth; Laferla, 2010). Para o ano 2050, a prevalência mundial da
doença de Alzheimer aumentará para 106,8 milhões de casos (Small & Bullock,
2010). A incidência da doença é alta e afeta 0,9% de pessoas com idade de 65
26
anos, 4,2% com 75 anos e 14,7% dos que possuem 85 anos ou mais (Brookmeyer,
et. al., 2007).
Estima-se que aproximadamente 4 milhões de americanos tenham a Doença
de Alzheimer e mais de 1 milhão de pessoas são afetadas pela doença no Brasil.
Esta patologia afeta cerca de 15 milhões de pessoas em todo o mundo, aumentando
sua incidência de acordo com a idade, e proporcionalmente se comparado com
outras doenças (Heinrich, 2004; Forlenza, 2005; Tatsch, et. al., 2006; Filho, et. al.,
2006).
A DA caracteriza-se por distúrbio progressivo da memória e outras funções
cognitivas, afetando o funcionamento ocupacional e social. O transtorno da memória
afeta os processos de aprendizado e evocação, levando a um déficit na linguagem,
depressão, problemas de comportamento, inclusive agitação, alterações de humor e
psicose. Na DA ocorre à diminuição na aquisição de novas informações, com piora
progressiva até que não haja mais nenhum aprendizado novo. Embora haja certa
preservação da memória remota, em estágios iniciais, a perda de memória é global
na evolução da DA (Forlenza, 2005; Filho et. al., 2006).
1.4.1 A Acetilcolina e os Inibidores da Acetilcolinesterase
Pacientes com DA apresentam uma diminuição nos níveis de acetilcolina no
processo sináptico, diminuindo a neurotransmissão colinérgica cortical (Adsersen et.
al., 2006). Observa-se que muitos relatos de déficits cerebrais ligados a doença
estão associados ao sistema colinérgico, ou seja, as disfunções cognitivas,
funcionais e comportamentais associadas com a doença de Alzheimer podem ser
causadas por uma incapacidade de transmitir impulsos neurológicos em toda
sinapse colinérgica (Orhan et, al., 2004).
27
As alterações bioquímicas decorrentes da doença de Alzheimer afetam as
regiões cerebrais associadas às funções mentais, particularmente o córtex frontal e
o hipocampo (Reichman, 2003; Viegas et al., 2005 apud Seidl, 2010). As
características neurodegenerativas mais evidentes da doença são as formações de
agregados de placas da proteína β-amilóide (Aß) e os emaranhados neurofibrilares
(Mukherjee, et. al., 2007) (Figura 5), resultantes do clivagem anormal da proteína
APP, que é precursora da β-amilóide (Forlenza, 2005; Smith, 2011).
Figura 5 – Formação excessiva da proteína beta-amilóide (Aß), derivadas da proteína APP (Sayeg, 2011).
Num estudo publicado no Journal of Neuroscience, pesquisadores
conseguiram demonstrar que a proteína β-amilóide (Aß), presente nestas placas dos
pacientes com Alzheimer, bloqueia o contato entre o neurotransmissor acetilcolina
em seus receptores nicotínicos neuronais (Figura 6), interferindo assim nos
mecanismos de transmissão de sinais neuronais envolvidos na aprendizagem e na
memória (Jerrel et. al., 2001), levando a perda das conexões entre os neurônios e a
morte celular.
Como a morte dos neurônios acontece em todo o cérebro, as regiões
afetadas começam a diminuir em um processo denominado atrofia cerebral. Na fase
final da doença o dano é generalizado e o tecido cerebral se encontra
significativamente diminuído (Selkoe, 2004; Kim, et. al., 2010). Todo este processo
resulta em perda da função neuronal e dano sináptico, com subseqüente
28
comprometimento da memória, da coordenação motora e do raciocínio, além de
perda da capacidade cognitiva e demência (Viegas et. al., 2004).
Figura 6 – Efeitos prejudiciais da proteína beta-amilóide (Aß) na fenda sináptica (Querfurth; Laferla, 2010)
i
Inúmeras abordagens farmacológicas vêm sendo exploradas para restaurar a
função central colinérgica, como por exemplo, o uso de agentes liberadores de
Acetilcolina (ACh), a estimulação da captação de acetilcolina, a ativação de
receptores colinérgicos (pós-sinápticos) e a diminuição da degradação metabólica
de acetilcolina pela inibição da acetilcolinesterase (AChE) (Gomes; Koszuoski, 2005)
Os inibidores da acetilcolinesterase (I-AChE) são as principais drogas para o
tratamento específico da DA. Seu uso baseia-se no pressuposto déficit colinérgico
que ocorre na doença, e visa o aumento da disponibilidade sináptica de acetilcolina,
através da inibição da sua principal enzima catalítica, a acetilcolinesterase (Forlenza,
2005; Gomes; Koszuoski, 2005), de modo que a menor quantidade de acetilcolina
disponível seja utilizada de modo mais eficiente (Vale et. al., 2011), promovendo
29
assim a melhora dos sintomas cognitivos, comportamentais e funcionais
relacionados com a DA.
A primeira droga a ser aprovada nos Estados Unidos para o tratamento da DA
através da inibição da AChE foi a Tacrina. No entanto, seus efeitos colaterais graves
como hepatotoxicidade e desconforto gastrointestinal, representam uma importante
desvantagem (Alcala et. al., 2005). Existem outros fármacos utilizados como
inibidores da AChE, como a Galantamina, Donezepil e Rivastigmina sendo
considerados mais eficazes no tratamento da DA (Rhee et. al., 2001). Entretanto, há
relatos de problemas de biodisponibilidade e efeitos colaterais (Racchi et. al., 2004).
Em diversos estudos, há relatos de muitas plantas como fontes interessantes
frente à inibição da AChE, demonstrando um potencial terapêutico para o tratamento
de doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer (Feitosa et. al.,
2011). Abordagens etnofarmacológicas e estudos fitoquímicos fornecem caminhos
para a identificação de plantas e compostos isolados como inibidores de AChE, e
conseqüentemente levam à descoberta de drogas relevantes para o tratamento da
doença de Alzheimer (Mukherjee et. al., 2007).
30
2. OBJETIVOS
Este trabalho tem como objetivo realizar o Estudo Fitoquímico e Avaliação
das Atividades esquistossomicida, antimicrobiana e da inibição da enzima
acetilcolinesterase das partes aéreas de Roupala montana.
2.1 Objetivos específicos
a. Preparo de um extrato bruto seguido de fracionamento, com solventes de
polaridades crescentes, para o estudo fitoquímico das partes aéreas de
Roupala montana.
b. Realizar monitoramento das frações obtidas por partição utilizando CLAE.
c. Identificar os compostos presentes na fração hexânica (RP1) obtida por
partição a partir do extrato bruto, por CG-EM.
d. Avaliar a atividade esquistossomicida do extrato bruto (RP) e das frações
(RP1, RP2, RP3 e RP4) de Roupala montana.
e. Avaliar a atividade antimicrobiana do extrato bruto (RP) e das frações (RP1,
RP2, RP3 e RP4) de Roupala montana.
f. Avaliar a atividade de inibição da acetilcolinesterase do extrato bruto (RP) e
das frações (RP1, RP2, RP3 e RP4) de Roupala montana.
31
3. PARTE EXPERIMENTAL
3.1 Obtenção do material vegetal
Partes aéreas de Roupala montana foram coletadas na Estação Experimental
de Luiz Antônio (EELA) no Município de Luiz Antônio-SP, entre as coordenadas
21º33’ a 21º37’ de latitude sul e 47º45’ a 47º57’ de longitude oeste. Os materiais
vegetais foram identificados pelo botânico Dr. Milton Groppo Junior e uma exsicata
da espécie foi depositada no herbário da Faculdade de Filosofia e Letras de Ribeirão
Preto (SP), e catalogado sob o número SPFR12166.
Após coleta, o material vegetal foi estabilizado por secagem em estufa de
circulação de ar, marca Marconi, modelo MA 035.
3.2 Preparação do extrato bruto e partição líquido-líquido
Após o processo de estabilização e secagem, as partes aéreas do vegetal
foram moídas, obtendo-se 869,80 g de material e este, foi extraído em
CH2Cl2:MeOH na proporção 2:1 (v/v) a temperatura ambiente em um frasco de vidro
durante 1 (uma) semana, sendo o extrato filtrado em papel de filtro e concentrado à
vácuo de 3 em 3 dias (Figura 7). Após este processo foram obtidos 30,91 g do
extrato bruto.
32
Figura 7 – Preparação do extrato bruto de Roupala montana.
3.3 Fracionamento do extrato bruto
Depois de ser concentrado em evaporador rotativo, dos 30,91g do extrato
bruto, foram diluídos exatamente 20g para 500mL de uma solução de metanol/água
(2:8), a fim de serem submetidos a uma partição líquido-líquido, empregando-se
solventes de polaridades crescentes. Esta solução foi particionada com n-hexano,
Acetato de etila (AcOEt) e n-butanol (n-BuOH) e água (3 x 300 mL), cada solvente e
concentrada em rota-evaporador, como mostra o fluxograma abaixo (Figura 8).
Partes aéreas de Roupala montana
1) Secagem e estabilização 2) Moagem
Obtenção de 869,8 g de material
Resíduo
3) Extração com CH2Cl2/MeOH (2:1) por 3x 4) Filtração
Extrato Bruto
(RP) 30,91g
Desprezar Fracionamento
33
Figura 8 – Fluxograma da partição líquido-líquido do extrato de Roupala montana.
3.4 Análises cromatográficas
O extrato bruto e as frações provenientes da partição líquido-líquido foram
preliminarmente analisados por cromatografia em Camada Delgada Comparativa
(CDC) e posteriormente optou-se por fazer a análise através de CLAE para a
comparação do pefil químico das frações obtidas.
As análises de CDC foram realizadas em placas cromatográficas de sílica
gel 60 G (Sigma). Para tal, foram feitas suspensões de sílica em água destilada na
Extrato Bruto (RP) 20g
Ressuspensão com metanol/água (2:8)
500mL de Extrato Bruto (RP) ressuspendido (Fração Hidrometanólica)
Partição com n-Hexano
Fração Hexânica
(RP1) Fração
Hidrometanólica
Fração AcOEt (RP2)
Fração Hidrometanólica
Partição com AcOEt
Fração n-BuOH (RP3)
Fração Hidrometanólica
(RP4)
Partição com n-BuOH
34
proporção 0,4:1 (m/V). A suspensão foi aplicada sobre a placa de vidro através da
utilização de um espalhador apropriado. As espessuras das placas foram de 0,25
mm. Posteriormente, foram deixadas em repouso por um período de 24 horas à
temperatura ambiente e depois, ativadas à estufa a 100º C por 1 hora, havendo
assim a completa evaporação da água.
Como reveladores para a CDC foram empregados luz UV 254-366 nm
(Spectroline), solução de vanilina sulfúrica, seguida de aquecimento.
A solução de vanilina foi preparada pesando-se 0,3 g de vanilina que foi
dissolvida em 30 mL da seguinte solução: água (450 mL), ácido sulfúrico (100 mL) e
metanol (450 mL).
Os solventes orgânicos utilizados como eluentes nas análises e separações
cromatográficas foram de grau PA (Synth) ou grau HPLC (J.T. Baker), levando-se
em conta a polaridade das substâncias. As concentrações das amostras foram
efetuadas em evaporador rotativo MA120 Marconi sob pressão reduzida.
3.4.1 Análises cromatográficas por CLAE
O uso da CLAE se mostra uma ferramenta útil na identificação rápida de
compostos através de comparação com respectivos padrões já anteriormente
isolados na espécie vegetal. A CLAE tem a capacidade de realizar separações e
análises quantitativas de uma grande quantidade de compostos presentes em uma
amostra, em escala de tempo de poucos minutos, com alta resolução, eficiência e
sensibilidade (Collins et al., 1997).
Nas separações cromatográficas analíticas foram utilizados dois
cromatógrafos de sistema binário SHIMADZU Proeminence-LC-6AD equipados com
35
um injetor manual, com loop de 20 µL, cada um acoplado a um detector UV-Vis
modelo SPD-20A. O outro acoplado a um detector Diode Array. A aquisição de
dados foi realizada através de um microcomputador.
A coluna analítica usada foi da SHIMADZU, Shim-pack ODS, 250 x 4,6 mm, 5
µm, equipada com pré-coluna. As condições cromatográficas utilizadas no CLAE
incluíram: volume de injeção: 20 µL, fluxo: 1,0 mL/min e condição: CH3OH:H2O
(+0,1% HAc) 40%, gradiente linear, (40% 100%) em 30 minutos, 10 minutos em
100% de CH3OH e 10 minutos para retornar à condição inicial, λ 254 e 230 nm.
As análises por Cromatografia gasosa acoplado ao Espectrômetro de Massas
(CG-EM) foram realizadas em um equipamento da marca Shimadzu, Modelo QP-
2010 (baixa resolução), utilizando uma coluna capilar HP-1, gás de arraste He, fluxo
1,10 mL/min; temperatura do injetor a 250 C, temperatura inicial do forno de 100 C
e programação 3C/min até 290 C, permanecendo nesta temperatura por 20 min;
energia de ionização de 70 eV, split 1:30. O banco de dados utilizado foi o Wiley 7
Library, FFNSC 1.2 Library e NIST08s Library.
36
3.5 Ensaio da atividade Esquistossomicida
Os ovos de S. mansoni de linhagem Luiz Evangelista (LE) presentes nas
fezes de camundongos das linhagens Balb/c, previamente infectados com o
parasita, foram recolhidos pelo método de Hoffman e expostos por
aproximadamente 1 hora sob luz para a liberação dos miracídios, que foram
utilizados para infectar o hospedeiro intermediário (caramujo da espécie B. glabrata)
e, após 38 a 43 dias, liberaram a forma infectante (cercárias) do parasita. As
cercárias foram inoculadas nos camundongos pela via subcutânea (Figura 9).
Figura 9 – Inoculação das cercárias por via subcutânea em camundongos.
37
Após aproximadamente 50 dias, casais de vermes adultos foram recuperados
de camundongos por perfusão do sistema porta-hepático, em condições assépticas
(Smithers & Terry, 1965). Após a coleta, os parasitas foram mantidos em meio RPMI
(Roswell Park Memorial Institute) 1640 (Invitrogen) tamponado com HEPES 20 µM,
pH 7,5, suplementado com penicilina (100U/mL), estreptomicina (100 µg/mL) e 10%
de soro bovino fetal, sendo em seguida utilizado para os experimentos (Figura 10).
Para a avaliação da atividade esquistossomicida in vitro, os vermes adultos
de Schistosoma mansoni foram transferidos para placas de 24 poços contendo 2 mL
de meio por parasita, e incubados em atmosfera umidificante a 37ºC na presença de
5% CO2. Após 24 horas de incubação, o extrato RP e as Frações RP1, RP2, RP3 e
RP4, previamente dissolvidos em dimetilsulfóxido (DMSO) foram adicionados ao
meio RPMI 1640 nas concentrações de 10 – 200 µg/mL.
Após adição dos compostos, os parasitas foram incubados nas mesmas
condições descritas anteriormente por 120 horas e monitorado a cada 24 horas
usando um microscópio invertido para avaliar as condições gerais dos parasitas
como: atividade motora, alteração no tegumento e morte (Magalhães et. al., 2009).
A redução na atividade motora foi definida como diminuído caso houvesse a
redução no movimento dos parasitas quando comparado com os controles negativo,
e mínimo, caso houvesse movimentos ocasionais na cabeça, corpo e espasmos
esporádicos. A mortalidade dos parasitas foi definida como ausência de movimento
por mais de 2 minutos de observação (Manneck et al., 2010).
Como controle negativo foi utilizado vermes adultos mantidos em meio RPMI
com 1% de DMSO e como controle positivo foi utilizados vermes adultos incubados
com 12,5 µg/mL de praziquantel. Foram realizados dois experimentos
38
independentes sendo avaliados oito vermes adultos por concentração em cada
experimento.
Figura 10 – Avaliação da atividade esquistossomicida in vitro, os vermes adultos de Schistosoma mansoni.
Os ensaios esquistossomicida foram realizados no laboratório de
Parasitologia Aplicada da UNIFRAN, sob supervisão da professora Lizandra Guidi
Magalhães.
39
3.6 Ensaio da atividade Antimicrobiana
3.6.1 Micro-organismos utilizados nos ensaios
Para o ensaio da atividade antimicrobiana foi selecionado cepas de bactérias
que apresentam resistência múltipla a antimicrobianos. Todas as cepas utilizadas
são padronizadas da American Type Culture Collection (ATCC) (Tabela 1). Cepas
padronizadas são recomendadas para este tipo de avaliação por apresentarem uma
origem confiável, no qual o centro de referência realiza testes fenotípicos e
moleculares para confirmar sua identificação e perfil de sensibilidade (Sejas et al.,
2003; Brasil, 2006; ATCC, 2011).
Tabela 1 – Características das Bactérias utilizadas nos ensaios na atividade antibacteriana (ATCC, 2011).
Micro-organismos Gram Negativos
ATCC Testes indicados
Escherichia coli 25922
Qualidade da prova de DD (Difusão em disco) e CIM de enterobactérias
Qualidade da prova de DD e CIM de Pseudomonas, Acinetobacter, S. maltophilia e Burkholderia
Qualidade da prova de DD e CIM de Vibrio colerae
Testes de triagem e confirmatório de ESBL (Beta Lactamase de Espectro Extendido - Extended-spectrum beta-lactamase)
Qualidade da prova em testes automatizados de susceptibilidade em painéis de gram negativos
Klebsiella pneumoniae 10031 Qualidade da prova em testes automatizados de
identificação de bacilos gram-negativos
Pseudomonas aeruginosa 27853
Sensível aos agentes anti-pseudoma
Qualidade da prova em testes de diluição em caldo e diluição em ágar de P. aeruginosa e outros não-enterobacteriaceas
Testes automatizados para verificação da concentração de cátion e pH com aminoglicosídeos em painéis de gram-negativos
Micro-organismos
Gram Positivos ATCC Testes indicados
Staphylococcus aureus 25923
Cepa não produtora de ß-lactamase
Qualidade da prova em testes de DD para Staphylococcus spp, Enterococcus sp
Controle de qualidade de testes de sensibilidade a antimicrobianos (discos)
Streptococcus pyogenes 19615 Controle de qualidade de meios de cultura seletivos.
Streptococcus pneumoniae 6305 Controle de qualidade de meios de cultura seletivos.
Haemophilus influenzae 10211 Testes de suscetibilidade do disco
40
Os testes antimicrobianos foram realizados no Laboratório de Pesquisas em
Microbiologia da UNIFRAN, coordenado pelo Prof. Dr. Carlos Henrique G. Martins.
3.6.2 Ensaio da Concentração Inibitória Mínima (CIM)
A Concentração Inibitória Mínima (CIM) é a menor concentração de um
agente antibiótico que inibe o crescimento visível de um microrganismo após
incubação in vitro. A CIM pode ser utilizada como uma medida comparativa da
atividade antimicrobiana contra um patógeno específico. A determinação acurada da
CIM através dos testes de suscetibilidade antibiótica e a vigilância continuada são
estratégias imprescindíveis para avaliar e monitorar a suscetibilidade das cepas
isoladas em cada hospital, uma vez que evidenciam tendências de evolução
temporal da suscetibilidade de cada espécie (Ricardo, 2008).
O ensaio para a determinação da CIM é obtido através da microdiluição, que
consiste em preparar diluições sucessivas da amostra a ser testada, em meios de
cultura sólidos ou líquidos, semear a bactéria e após a incubação verificar a menor
concentração (maior diluição) do antimicrobiano que inibiu o crescimento do micro-
organismo
Os valores da CIM foram determinados através da microdiluição em caldo do
extrato bruto RP e das frações RP1, RP2, RP3 e RP4, frente aos diferentes
microrganismos, segundo a metodologia a metodologia preconizada pelo ―National
Committee for Clinical and Laboratory Standards‖ (NCCLS, 2003), atualmente
denominado Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), com adaptações,
empregando a resazurina como revelador do crescimento bacteriano.
41
O teste bioquímico de toxicidade é baseado na redução do corante resazurina
por meio da desidrogenase microbiana, sendo que o corante resazurina atua como
um aceptor de elétrons, mudando de cor na presença da enzima desidrogenase
ativa, proveniente de uma cultura de bactérias em crescimento. A conversão da
resazurina em seu produto reduzido, mediada pela desidrogenase, pode ser
representada pela reação química apresentada na Figura 11 (Liu, 1981; Brower,
1991 apud Martins 2008).
Figura 11 – Reação química de redução da resazurina para resorufina, com mudança de cor
Em microplacas foram depositados o caldo do meio de cultura adequado, com
os extratos ou frações nas concentrações de 0,195 a 400 µg/mL e os inoculos. Cada
poço conteve um volume final de 100µL.
As microplacas foram incubadas a 36º C em estufa bacteriológica e em
atmosfera adequada por 24 h. Após o tempo de incubação, foi adicionado em cada
poço 30 µL de resazurina na concentração de 0,02% preparado em solução aquosa.
Os resultados foram lidos visualmente. Uma mudança na cor da resazurina de azul
para rosa indica redução do indicador e, portanto, o crescimento bacteriano. A CIM
foi definida como a menor concentração da droga que impediu uma mudança
Resazurina (Azul 610nm) Resorufina (Rosa 580nm)
OOHO
N
O
OOHO
N
+NADH+H+
Enzima + NAD+ + H2O
42
completa de cor da resazurina de azul para rosa (Palomino et. al., 2002), como pode
ser visto na figura 12.
Figura 12 – Microplaca exemplificando a mudança de cor dos poços pelam presença da Resazurina (Rosa – crescimento bacteriano / Azul – ausência de crescimento bacteriano). Imagem: Laboratório de Microbiologia UNIFRAN.
Os meios de cultura utilizados para o crescimento bacteriano e o caldo
utilizado para a obtenção da CIM estão representados na Tabela 2. Os
antimicrobianos Cloranfenicol e Vancomicina serviram como controles positivos.
Para garantir a qualidade do ensaio, foram realizados os controles de esterilidade do
caldo, do extrato, frações e dos controles positivos e negativos.
Tabela 2 – Bactérias utilizadas na atividade antibacteriana
Micro-organismos ATCC Morfotipo Agar Caldo
Escherichia coli 25922 Bacilo Gram
Negativo Agar BHI Caldo BHI
Klebsiella pneumoniae 10031 Bacilo Gram
Negativo Agar BHI Caldo BHI
Pseudomonas aeruginosa 27853 Bacilo Gram
Negativo Agar BHI Caldo BHI
Staphylococcus aureus 25923 Coco Gram
Positivo Agar BHI Caldo BHI
Streptococcus pyogenes 19615 Coco Gram
Positivo Agar sangue Caldo BHI
Streptococcus pneumoniae 6305 Coco Gram
Positivo Agar sangue Caldo BHI
Haemophilus influenzae 10211 Bacilo Gram
Negativo Agar chocolate Caldo especial
43
3.6.3 Preparo da suspensão bacteriana e Padronização da densidade do inoculo.
Para a obtenção do inoculo, as cepas armazenadas em freezer a 20 ºC
negativos foram ressuspendidas em meio de cultura líquido do caldo BHI (Brain
Heart Infusion) e posteriormente incubados a 35ºC por 18 horas. Em seguida, com o
auxílio de uma alça de platina esterilizada, uma alíquota de cada cultura foi
transferida para a placa de Petri com Agar Mueller-Hinton e incubado a 37ºC por
aproximadamente 24 horas em estufa bacteriológica e em atmosfera apropriada.
Após o período de incubação, selecionou-se de 3 a 4 colônias, transferindo-as para
um tubo estéril contendo 5mL de solução salina (0,9%). Como a densidade do
inoculo influencia nos resultados dos experimentos, foi padronizada a quantidade do
mesmo a ser utilizada, a fim de assegurar a reprodutibilidade dos ensaios.
Inicialmente foi preparada a escala de 0,5 da escala de McFarland (1,5 x 108
UFC/mL), como o cloreto de bário a 1%, o qual foi adicionado 0,5 mL em 99,5 mL de
ácido sulfúrico a 1%, sendo este adicionado para a comparação da turbidez.
A turvação da suspensão celular foi medida em espectrofotômetro lendo-se
em comprimento de onda de 530nm. Uma solução salina foi empregada como
branco. Quando necessário, fez-se a diluição da suspensão bacteriana para obter a
concentração de 1,5 x 108 UFC/mL, compatível com a escala 0,5 de McFarland. Esta
solução foi então diluída para obter a concentração final de 5,0 x 105 UFC/mL
(Figura 13) (NCCLS, 2003; Brasil, 2008).
44
Figura 13 - Preparo da suspensão bacteriana e Padronização da densidade do inoculo.
3.6.4 Diluição das amostras
Exatamente 1mg das amostras (extrato bruto e frações) foram diluídas em
125 µL de dimetilsulfoxido (DMSO) com auxílio de um banho de ultrasom. Em
seguida, adicionou-se 1875 µL de caldo BHI, para todas as bactérias, com exceção
de Haemophilus influenzae, que utilizou o caldo específico. Com esse procedimento
45
originaram-se as soluções denominadas de soluções mãe, que foram utilizadas para
determinação da CIM (Figura 14).
Figura 14 – Preparo da Solução mãe.
3.6.5 Preparo do fármaco padrão
Os fármacos padrões usados para validação da técnica foram os antibióticos
Cloranfenicol para os microrganismos H. influenzae, E. coli, P. aeruginosa e K.
pneumoniae e Vancomicina para S. pneumoniae, S. pyogenes e S. aureus.
O uso do Cloranfenicol se justifica por ser ativo contra bactérias Gram-
positivas e Gram-negativas, as quais têm a capacidade de provocar doenças
complicadas como a meningite. Já a Vancomicina atua contra agentes Gram-
positivos e são utilizados principalmente em infecções estafilocócicas com cepas
multi-resistentes (Brasil, 2008).
46
O antibiótico Cloranfenicol foi preparado a uma concentração de 0,1mg/mL.
Em seguida, transferiu-se 1 mL dessa solução para um tubo contendo 4 mL de caldo
BHI, obtendo-se uma concentração de 0,02 mg/mL. Este preparo foi repetido com o
caldo específico para H. influenzae. O antibiótico Vancomicina foi preparado a uma
concentração de 10 mg/mL, sendo transferido 8µL desta solução para 3992µL de
caldo BHI para obter também uma concentração de 0,02 mg/mL (Figura 15).
Figura 15 – Preparo dos Fármacos Padrões.
3.6.6 Técnica de Determinação da CIM
Em microplacas foi adicionado meio de cultura BHI, solução mãe do extrato,
frações e o fármaco padrão previamente preparadas. As suspensões (20µL) dos
microrganismos foram colocadas por último obtendo-se sempre um volume final de
100µL por poço. O extrato bruto e as frações foram avaliados na faixa de
concentração de 50 a 400µg/mL em triplicata. Os fármacos padrões (Cloranfenicol e
Vancomicina) foram avaliados nas concentrações de 0,01 a 5,9µg/mL (Figura 16).
47
Figura 16 – Distribuição das amostras, controles e solventes na microplaca para a determinação da CIM.
Para todas as bactérias testadas foi realizado o controle do solvente
dimetilsulfóxido (DMSO) nas concentrações de 1 a 5 % (concentração utilizada para
dissolver as amostras).
Em cada placa foram realizados o controle do crescimento da cultura, controle
de esterilidade do caldo, extrato e suas frações, fármacos e solvente. As placas
foram incubadas a 36ºC em estufa bacteriológica com atmosferas adequadas
(microaerófila/aerobiose) por 24 h. Após o período de incubação foi adicionado em
cada poço 30µL de solução aquosa de resazurina na concentração de 0,02%. A
leitura dos resultados foi observada pela mudança ou permanência de coloração da
mesma, por meio de uma reação oxi-redução, sendo azul (ausência de crescimento
microbiano) e rosa (presença de crescimento microbiano) (Figura 17).
48
Figura 17 – Etapas finais para o teste de determinação da CIM.
3.7 Ensaios de Inibição da AChE por Bio-autografia em CCD
O método de Cromatografia em Camada Delgada (CCD) ou TLC (Thin Layer
Chromatography) foi escolhido porque ele dá acesso rápido às informações relativas
à atividade em placa. Os componentes separados podem ser detectados
diretamente na placa (Marston et. al., 2002).
A inibição da Acetilcolinesterase foi avaliada através de um teste enzimático
que se baseia na clivagem do acetato de 1-naftila pela acetilcolinesterase para
formar o 1-naftol, que por sua vez, vai reagir com o sal ―fast blue B‖ dando como
resultado a coloração púrpura do diazônio (Figura 18) (Hostettman et. al., 2003).
49
Figura 18 – Reação de detecção de atividade anticolinesterásica de substâncias naturais pelo método de Marston e Hosttetamenn (Marston et al., 2002).
A placa de CCD ficou coberta com a coloração púrpura e a inibição da enzima
resultou em manchas incolores (halos brancos). Tal ensaio foi estabelecido por
Marston et. al. em 2002. Os compostos controles e as amostras foram dissolvidos
em metanol e aplicados às placas CCD em diferentes diluições (Hostettman et. al.,
2003).
As amostras foram preparadas dissolvendo-se 10 mg/mL de cada amostra em
metanol. Uma alíquota de 2,5 μL (2,5 mg/mL) da solução foi aplicada na placa
cromatográfica com o auxílio de uma pipeta automática.
Após a aplicação das amostras, as placas de CCD foram eluídas com
CHCl3:MeOH (9:1 v/v) e, posteriormente, secas. As placas foram então pulverizados
com a solução de Acetilcolinesterase (1000 U/mL) e soro albumina (150 mg)
50
dissolvida em 150 mL de uma solução tris-ácido hidroclórico 0,05 M, pH 7,8,
completamente seco e incubados a 37 ° C por 20 min (atmosfera úmida).
Após a incubação, a atividade enzimática foi detectada através da
pulverização com uma solução composta por 0,25% de acetato de 1-naftil em EtOH
(5 ml) mais 0,25% de solução aquosa de Fast Blue B sal (20 ml).
Após 1-2 min a placa de CCD apresentou uma coloração púrpura e as
substâncias inibidoras da Acetilcolinesterase se mostraram como zonas claras sobre
um fundo de cor púrpura (Marston et. al., 2002) (Figura 19). A substância
Galantamina da marca Sigma-Aldrich® foi empregada como controle positivo na
concentração de 1 μg/μL.
Figura 19 – Etapas do ensaio de inibição da AChE por Bioautografia em CCD.
51
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES
Para este projeto, foi selecionada, por ensaio biomonitorado, a fração
hexânica (RP1) para ser analisado o perfil químico-biológico, com o intuito de
identificar os compostos majoritários e a atividade biológica.
4.1 Análise cromatográfica da Fração RP1
Baseado nos perfis cromatográficos obtidos por CLAE foi possível avaliar a
eficiência do processo de partição, em que se separou o extrato bruto e as frações
por diferença de polaridade (Figura 20).
Para este estudo em questão, das quatro frações obtidas, foi selecionada a
fração hexânica RP1 para ser submetida a procedimentos cromatográficos por CG-
EM com o intuito de identificar os possíveis compostos majoritários e suas classes
de metabólitos, tendo em vista que as outras frações fazem parte de outros projetos
com esta mesma espécie de planta.
52
Figura 20 – Cromatogramas obtidos por CLAE do Extrato Bruto (RP) e das frações (RP1, RP2, RP3 e RP4) de R. montana.
0 10 20 30 40 min
-25
0
25
50
75
mAU254nm,4nm (1.00)
4.0
81 4
.92
25
.14
8
7.4
63 8
.51
6
10
.27
2
36
.07
6 36
.42
8
38
.22
5
47
.52
04
7.7
23
0 10 20 30 40 min
0
25
50
75
mAU254nm,4nm (1.00)
1.9
95
2.1
32
2.7
63
2.9
66
3.6
273
.88
64
.13
9
6.4
15
9.5
79
14
.16
0
16
.19
5
18
.33
3
28
.32
8
0 10 20 30 40 min
0
25
50
75
mAU254nm,4nm (1.00)
2.9
55
3.6
483
.90
24
.14
9
14
.07
0
16
.12
8
18
.30
1
28
.35
8
0 10 20 30 40 min
0
50
100
mAU254nm,4nm (1.00)
4.0
19
4.8
98
5.9
65
6.4
00
7.0
63
8.1
45
8.5
87
9.9
38
35
.80
0 36
.15
7
37
.98
0
0 10 20 30 40 min
0
50
100
150
mAU254nm,4nm (1.00)
35
.95
93
6.2
97
36
.50
8 38
.06
3
Fração RP (Extrato Bruto)
Fração RP1 (Hexano)
Fração RP2 (AcOEt)
Fração RP3 (n-BuOH)
Fração RP4 (Hidrometanólico)
53
A partir do CLAE, notou-se que a fração RP1 (Hexânica) é constituída de
compostos apolares ou de média polaridade, e esta, foi analisada por CG-EM
(Figura 21) com o intuito de identificar as substâncias majoritárias (com as maiores
áreas) e agrupá-las de acordo com o Índice de Similaridade (maior que 80%)
propostos na biblioteca de padrões do equipamento utilizado para as análises.
Figura 21 – Cromatograma obtido via CG-EM da fração RP1.
Através do cromatograma dos íons totais obtidos via CG-EM para a fração
RP1 (Figura 21) e os respectivos espectros de massas (Figuras 23- 27) permitiram a
identificação de 33 compostos, sendo que destes, 5 foram classificados como
compostos majoritários (com maior área), os quais estão descritos na tabela 3.
Tabela 3 – Composição química da fração hexânica de Roupala montana (RP1).
Composto Fórmula
Molecular M
+• tR (min) Área (%)
Éster etílico do ácido Palmítico C18 H36 O2 284 29,935 8,89 Fitol C20H40O 296 33,653 17,91 δ-tocoferol C27 H46 O2 402 52,799 4,18
γ-tocoferol C28 H48 O2 416 58,395 10,54
Neofitadieno C20 H38 278 60,342 11,71
54
As estruturas químicas (Figura 22) foram propostas com base nos espectros
de massa obtidos, e em comparação com os espectros de massas contidos na
biblioteca de padrões (Biblioteca Wiley) do equipamento CG-EM.
Figura 22 – Propostas de estruturas químicas para a Fração Hexânica (RP1) de R. montana: Éster etílico do ácido Palmítico (1), Fitol (2), δ-tocoferol (3), γ-tocoferol (4) e Neofitadieno (5).
2
4
5
3
1
55
Figura 23 – Espectro de Massas (EM) obtido via CG-EM da fração RP1 para a substância com tR= 29,935min., e comparado com o EM contido na biblioteca de padrões.
Figura 24 – Espectro de Massas obtido via CG-EM da fração RP1 para a substância com tR= 33,653min., e comparado com o EM contido na biblioteca de padrões.
56
Figura 25 – Espectro de Massas obtido via CG-EM da fração RP1 para a substância com tR= 52,799min., e comparado com o EM contido na biblioteca de padrões.
Figura 26 – Espectro de Massas obtido via CG-EM da fração RP1 para a substância com tR= 58,395min., e comparado com o EM contido na biblioteca de padrões.
57
Figura 27 – Espectro de Massas obtido via CG-EM da fração RP1 para a substância com tR= 60,342min., e comparado com o EM contido na biblioteca de padrões.
No caso dos triterpenos, realizou-se a co-injeção de um padrão interno (5-α-
colestano, tR= 53,881), obtendo-se o cromatograma da figura 28. Adicionalmente,
também se realizou e a injeção de alguns padrões de triterpenos: β-amirina, α-
amirina e lupeol, os quais são largamente distribuídos no reino vegetal. A retenção
relativa foi calculada, confirmando assim a identidade dos triterpenos detectados
(Tabela 4).
Figura 28 – Cromatograma obtido via CG-EM da fração RP1 + Padrão interno 5-α-Colestano (tR= 53,881).
58
Tabela 4 – Composição química da fração hexânica com injeção do padrão interno (5-α-Colestano) de Roupala montana (RP1).
Composto Fórmula
Molecular M+ tR (min) RR
Área (%)
β-amirina C30H50O 426 70,015 1,300 1,34 α-amirina C30H50O 426 72,230 1,340 0,76 Lupeol C30H50O 426 72,546 1,346 8,05
RR = retenção relativa relacionada ao padrão interno 5-α-Colestano (tR = 53,881 min.)
As estruturas químicas (Figura 29) foram propostas com base nos espectros
de massa obtidos, e em comparação com os espectros de massas contidos na
biblioteca de padrões (Biblioteca Wiley) do equipamento CG-EM (Figuras 18- 22).
Figura 29 – Estruturas químicas dos triterpenos: β-amirina (1), α-amirina (2) e Lupeol (3) detectados na Fração Hexânica (RP1) de R. Montana por CG-EM com injeção de padrão interno (5-α-Colestano)
(1) (2)
(3)
59
4.2 Atividade biológica
4.2.1 Atividade esquistossomicida para extratos e frações de R. montana
O potencial esquistossomicida do extrato bruto (RP) e das frações
provenientes da partição líquido-líquido foi avaliado in vitro frente aos vermes
adultos de Schistosoma mansoni. As amostras foram testadas nas concentrações de
10, 50, 100 e 200 µg/mL, utilizando-se o praziquantel como controle positivo.
Verificaram-se os seguintes índices de mortalidade (em %) nos seguintes
períodos de incubação, e como demonstrados na tabela 5: no primeiro dia de
incubação (24 horas), a fração RP2 promoveu a morte de 25% dos vermes adultos
na concentração de 100 µg/mL. Adicionalmente, no quinto dia de incubação (120
horas) o extrato bruto RP promoveu a morte de 100% dos vermes adultos na
concentração de 100 µg/mL; a fração RP1 promoveu a morte de 100% dos vermes
adultos na concentração de 100 µg/mL; a fração RP2 promoveu a morte de 100%
dos vermes adultos na concentração de 50 µg/mL; e a fração RP4 promoveu a
morte de 25% dos vermes adultos na concentração de 200 µg/mL.
60
Tabela 5 – Potencial esquistossomicida de Roupala montana e suas frações.
Amostras de Roupala montana
Período de incubação (h)
% de vermes mortos nas concentrações
10 µg/ml 50 µg/ml 100 µg/ml 200 µg/ml
RP 24 120
n. a. n. a.
n. a. n. a.
n. a. n. a.
n. a. 100
RP1 24 120
n. a. n. a.
n. a. n. a.
n. a. 100
n. a. 100
RP2 24 120
n. a. n. a.
n.a. 100
25 100
n.t. n.t.
RP3 24 120
n. a. n. a.
n. a. n. a.
n. a. n. a.
n. a. n. a.
RP4 24 120
n. a. n. a.
n. a. n. a.
n. a. n. a.
n. a. 25
PZQc 24
120 100 100
n. t. n. t.
n. t. n. t.
n. t. n. t.
RPMId 24
120 0 0
0 0
0 0
0 0
DMSO 1% 24
120 0 0
0 0
0 0
0 0
a n. a.= não ativo
b n. t.= não testado
c PZQ= Praziquantel (controle positivo)
d Meio RPMI 1640 = Controle negativo
4.2.2 Atividade antibacteriana para extratos e frações de R. montana
A concentração inibitória mínima (CIM) é considerada a menor concentração
capaz de inibir completamente o crescimento bacteriano. Os valores de CIM foram
determinados pela leitura visual após revelação com resazurina sendo considerada
como positiva para os poços que permaneceram com a coloração azul e negativa os
que obtiveram coloração vermelha (Salvat et al., 2001).
Atualmente diversos autores (Rios e Recio, 2005; Gibbons, 2008; Kuete,
2010) relatam que CIM’s inferiores a 100 µg/mL (para extratos) e inferiores a 10
µg/mL (para compostos) podem ser classificados como ativos frente a cepas de
bactérias.
De acordo com os resultados apresentados na tabela 6, as frações e o extrato
bruto de R. montana apresentaram fraca atividade antibacteriana frente à cepas de
bactérias testadas. Os melhores resultados foram apresentados pela fração RP2,
61
onde inibiu o crescimento de Streptococcus pneumoniae na concentração de 200
µg/mL.
Tabela 6 – Resultado dos ensaios antibacteriano para o extrato bruto (RP) e frações (RP1, RP2, RP3 e RP4) de Roupala montana.
Concentrações dos extratos/substancias testadas = 0,195 µg/mL a 400 µg/mL Concentrações do controle positivo testado = 0,0115 µg/mL a 5,9 µg/mL
No que tange ao aspecto cientifico, este trabalho acrescentou com resultados
inéditos e relevantes, possibilidades de desenvolvimento de agentes antimicrobianos
para utilização no tratamento e controle de patologias provocadas por bactérias.
Pelo fato das bactérias testadas terem apresentado valores de CIM´s
intermediários frente às frações RP1, RP2 e RP3, pode-se sugerir seu uso como
auxiliar no controle e redução dos microrganismos patogênicos. Porém, outros
estudos devem ser realizados para que realmente sejam utilizados na prevenção
das patologias associadas a estes agentes bacterianos.
Amostra
Resultados - µg/mL
Escherichia
coli
ATCC
25922
Klebsiella
pneumoniae
ATCC
10031
Pseudomonas
aeruginosa
ATCC
27853
Staphylococcus
aureus
ATCC
25923
Streptococcus
pyogenes
ATCC
19615
Streptococcus
pneumoniae
ATCC
6305
Haemophilus
influenzae
ATCC
10211
RP > 400 > 400 > 400 > 400 > 400 300 > 400
RP1 > 400 > 400 400 > 400 > 400 300 400
RP2 > 400 > 400 400 > 400 400 200 > 400
RP3 > 400 > 400 400 > 400 > 400 300 > 400
RP4 > 400 > 400 400 > 400 > 400 > 400 > 400
Cloranfenicol 0,1844 0,0461 0,7375 - - - 0,0461
Vancomicina - - - 1,475 0,3688 0,3688 -
62
4.2.3 Atividade inibitória da Acetilcolinesterase
O bioensaio por CCD descrito aqui é rápido e simples de usar. É fácil de
aplicar o teste em amostras e vários extratos de plantas podem ser rastreados ao
mesmo tempo (Ingkaninan et. al., 2000).
A placa cromatográfica foi revelada com a Acetilcolinesterase. Os resultados
obtidos até o momento (Figura 30) demonstram que para R. montana, as frações
RP1, RP2 e RP3 apresentaram uma mancha branca de inibição no mesmo fator de
retenção (Rf). Estes resultados preliminares apontam um potencial de inibição da
enzima AChE, destas amostras avaliadas, no entanto, devido a complexidade
química e coloração natural dos extratos e frações analisados, este procedimento
será repetido, empregando-se outras fases móveis e também com os compostos
puros isolados.
Figura 30 – Placa de bioensaio para acetilcolinesterase: Padrão Galantamina (1); Extrato Bruto (2); Fração RP1 (3); Fração RP2 (4); Fração RP3 (5); Fração RP4 (6). Eluente: CHCl3/MeOH/H2O (43:37:20), Revelador: Acetilcolinesterase.
a
Placa A - Acetilcolinesterase
1 2 3 4 5 6
63
Dentre os inibidores da enzima acetilcolinesterase isolados de plantas,
representantes das classes de alcalóides, compostos fenólicos, flavonóides e
terpenóides são relatados com atividade inibitória desta enzima (Silva, 2010).
Existem diversos relatos na literatura (Houghton et. al., 2006; Patočka, 2010)
que os terpenóides têm diversas propriedades medicinais, com grandes
potencialidades em atividades biológicas, entre as quais como fortes inibidores da
acetilcolinesterase, o que motiva a continuação desta pesquisa utilizando os
compostos isolados por CG-EM.
64
5. CONCLUSÕES
O presente trabalho constituiu a primeira investigação das atividades
esquistossomicida, antimicrobiana e da inibição da Acetilcolinesterase, e do perfil
fitoquímico do extrato bruto e frações das partes aéreas de Roupala montana.
Através do estudo fitoquímico da fração RP1 por CG-EM, permitiu-se a
identificação de 2 (dois) diterpenos (Fitol e Neofitadieno), 3 (três) triterpenos (β-
amirina, α-amirina e Lupeol), 2 (dois) carotenóis (δ-tocoferol e γ-tocoferol) e 1 (um)
éster de ácido graxo (Éster etílico do ácido Palmítico), como constituintes
majoritários.
Os resultados obtidos frente à atividade esquistossomicida de R. montana
indicam que a fração RP2 foi a mais ativa dentre as amostras testadas, sendo que
esta promoveu a morte de 100% dos parasitas na dose de 50 µg/mL no quinto dia
de tratamento.
Com relação à atividade antibacteriana, os resultados obtidos indicam valores
de CIM intermediários frente às frações RP1, RP2 e RP3, o que se poderia sugerir
seu uso como auxiliar no controle e redução dos microrganismos patogênicos.
Porém, outros estudos devem ser realizados para que realmente sejam utilizados na
prevenção das patologias associadas a estes agentes bacterianos.
Utilizando reveladores específicos frente à inibição da Acetilcolinesterase, os
resultados permitiram identificar que as frações RP1, RP2 e RP3 apontaram certo
potencial de inibição desta enzima, pois apresentou uma mancha branca no mesmo
Rf., indicando a inibição desta enzima neste ponto.
No que tange ao aspecto científico, este trabalho acrescentou com resultados
inéditos e relevantes, por comprovar a atividade do extrato e frações de Roupala
65
montana, frente aos ensaios propostos, considerando os dados estimulantes para o
desenvolvimento de novas pesquisas que levem ao isolamento e síntese de
substâncias como candidatos a novos fármacos.
66
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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i Explicação da Figura 6 (pág. 29): Perda sináptica melhor se correlaciona com o declínio cognitivo na doença de Alzheimer. A
sinapse controle é mostrada no topo da figura. Na parte inferior da figura, uma "sinapse típica da Doença de Alzheimer" que mostra os efeitos pleiotrópicos da proteína beta amilóide (Aß).
Anéis representam vesículas sinápticas. Aplicação experimental e expressão de (Aß), especialmente oligômeros, prejudicam a plasticidade sináptica, alterando o equilíbrio entre a potenciação de longa duração (LTP) e depressão em longo prazo (LTD) e redução do número de espinhas dendríticas.
Em altas concentrações, pode suprimir nos oligômeros basais a transmissão sináptica. A proteína beta amilóide (Aß) facilita a endocitose de receptores de N-metil-d-aspartato (NMDAR) e α-amino-3- hidroxi-5-metil-4-isoxazole ácido propiônico (AMPAr). A Aß também se liga aos receptores da neurotrofina p75 (p75NTr) e ao fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF o receptor, também conhecido como o receptor tirosina quinase B [trkBr]), exacerbando uma situação em que os níveis de BDNF e fator de crescimento neural (NGF) já estão reprimidos.
A proteína beta amilóide (Aß) prejudica os receptores nicotínicos de acetilcolina (ACh) (nAChR) de sinalização e ACh liberação do terminal pré-sináptico.
O número de sinapses do hipocampo diminui o comprometimento cognitivo leve na quais restantes perfis sinápticos mostrarem compensatório aumenta de tamanho.
