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UNIVERSIDADE DE LISBOA
FACULDADE DE MEDICINA DE LISBOA
Farmacogenética em Toxicologia Forense:
Estudo do gene CYP2D6 em amostras post mortem com tramadol
Suzana de Morais Valente Martins da Fonseca Orientador: Mestre Mário João Dias Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses, I.P.
Co-Orientador: Prof. Doutor Jorge Costa Santos Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa
Dissertação especialmente elaborada para obtenção do grau de Mestre em Medicina Legal e Ciências Forenses
Lisboa, 2016
Todas as afirmações contidas neste trabalho são da exclusiva responsabilidade do seu
autor, não cabendo à Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa qualquer
responsabilidade pelos conteúdos apresentados.
A impressão desta dissertação foi aprovada pelo Conselho Científico
da Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa em reunião de
19 de janeiro de 2016.
Divulgação Científica
Os resultados obtidos com este trabalho foram submetidos para publicação sob a forma
de artigo científico com o título “Sequencing CYP2D6 for the detection of poor-
metabolizers in post-mortem blood samples with tramadol” na revista Forensic Science
International, estando à data em fase de revisão.
O trabalho desenvolvido foi também alvo de divulgação na comunidade científica
através de comunicações orais e comunicações em painel (“poster”), em encontros
nacionais e internacionais.
Comunicações orais:
Sequencing CYP2D6 in post-mortem blood samples with high concentration of
tramadol for the detection of *3, *4, *6, *8, *10 and *12 alleles, 53rd TIAFT
Meeting, 31 - 4 agosto, 2015, Florença, Itália.
Farmacogenética em toxicologia forense aplicação a amostras post mortem para
interpretação de resultados em casos de tramadol; II Jornadas Ibéricas de
Toxicologia, 13-15 de Novembro de 2014, Covilhã, Portugal.
Patologia molecular: aplicação da farmacogenética na interpretação de
resultados toxicológicos de amostras post mortem; I Conferência do Instituto
Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses, 30 a 31 de Outubro de 2014,
Coimbra, Portugal.
Comunicações em painel:
Pharmacogenetics application to forensic toxicology: Sequencing CYP2D6 in
post-mortem blood samples with high concentration of tramadol for the
detection of *3, *4, *6, *8, *10 and *12 alleles; 9th ISABS Conference on
Forensic and Anthropologic Genetics, June 22-26, 2015, Republic of Croatia
Pharmacogenetics application to forensic toxicology: Sequencing CYP2D6 in
post mortem blood samples with high concentration of tramadol; SPGH 18th
annual reunion, 19 – 21 November, 2014, Lisbon, Portugal.
Agradecimentos
Ao meu orientador, Mestre Mário João Dias, o meu profundo reconhecimento
por me ter dado esta oportunidade, pela inspiração quer na escolha do tema quer na
pessoa que é, pelos conselhos e críticas que me permitiram fazer mais e melhor, e acima
de tudo por acreditar em mim.
Aos meus orientadores Mestre António Amorim e Mestre Heloísa Afonso Costa
pela disponibilidade, incentivo, confiança e por todos os conhecimentos científicos que
me transmitiram, guiando os meus passos na descoberta desse “mundo novo” da
Genética Forense.
Ao meu orientador Professor Jorge Costa Santos por toda a disponibilidade,
aconselhamento e apoio prestado.
À Mestre Maria João Porto, na qualidade de Diretora do Serviço de Genética e
Biologia Forenses, e também à Dra. Teresa Ribeiro, na qualidade de Coordenadora da
Unidade Funcional da delegação Sul, por me permitirem a realização do projeto nas
instalações deste Serviço e disponibilização dos meios necessários à sua concretização.
Também um sincero agradecimento a toda a equipa do laboratório de Genética, bem
como colegas de estágio e mestrandas, pelas ajudas técnicas, apoio e boa disposição.
Ao Mestre João Miguel Franco, na qualidade de Director do Serviço de Química
e Toxicologia Forenses, mas também na qualidade de colega e amigo, com quem muito
aprendi desde que entrei no, então, IMLL.
Aos meus colegas e amigos do SQTF, companheiros de venturas e desventuras
deste e de outros projetos: Carla Mustra, Mário Barroso, Suzel Costa, Nuno Gonçalves,
Francisco Vale, Susana Simões, António Castañera, Elsa Rodrigues, Luísa Almeida e
Paula Rodrigues. Também à Catarina Mourato, à Rita Garção, ao David Pereira e à
Alexandra Gonçalves pelo incentivo e pela troca de ideias.
Aos Amores da minha vida: Gabriel Morais Gonçalves, Joana Morais Gonçalves,
Miguel Costa, Célia Figueira, Tiago Martins da Fonseca e José Martins da Fonseca, que
são o meu suporte, a minha força e estão sempre a meu lado.
À restante família e amigos e a todos os que de uma forma ou de outra estiveram
presentes e me ajudaram neste percurso.
O meu muito grande OBRIGADA!
Desloquei-me para tudo ver de um outro lado:
Levei o meu olhar, o desejo de um princípio infinitamente retomado.
Ganhei sonoridade nas vozes que me habitavam silenciosamente.
Entre mar e terra eu preferia ser espuma, ter raiz e poente entre oceano e continente.
Raiz de orvalho, Mia Couto
Suzana Fonseca Página 1
Índice
Índice ................................................................................................................................. 1
Índice de Anexos ............................................................................................................... 4
Índice de tabelas ................................................................................................................ 5
Índice de figuras ................................................................................................................ 7
Abreviaturas e Siglas ......................................................................................................... 9
2 Resumo .................................................................................................................... 13
Abstract ........................................................................................................................... 15
3 Introdução ................................................................................................................ 17
3.1 A Medicina Legal em Portugal ......................................................................... 17
3.2 Interpretação de resultados post mortem .......................................................... 20
3.3 Farmacocinética ................................................................................................ 24
3.4 Farmacogenética ............................................................................................... 28
3.4.1 Resumo histórico ....................................................................................... 28
3.4.2 Aplicação da farmacogenética .................................................................. 30
3.4.3 Genótipo e Fenótipo .................................................................................. 31
3.4.4 Farmacogenética em contexto forense ...................................................... 33
3.5 CYP2D6 ........................................................................................................... 35
3.5.1 Enzima CYP2D6 ....................................................................................... 39
3.5.2 Gene CYP2D6 ........................................................................................... 41
3.5.3 Variantes genéticas .................................................................................... 42
3.5.4 Diferenças populacionais .......................................................................... 43
3.5.5 Casos publicados ....................................................................................... 45
3.6 Tramadol ........................................................................................................... 46
3.7 Técnicas e métodos de genotipagem ................................................................ 52
4 Objetivos .................................................................................................................. 55
5 Materiais e Métodos ................................................................................................. 57
5.1 Amostragem ..................................................................................................... 57
5.2 Metodologia de análise genética ...................................................................... 58
5.2.1 Preparação das amostras ........................................................................... 59
Suzana Fonseca Página 2
5.2.2 Extração de ADN ...................................................................................... 59
5.2.3 Quantificação ............................................................................................ 60
5.2.4 Seleção dos alelos ..................................................................................... 60
5.2.5 Amplificação por PCR .............................................................................. 61
5.2.6 Purificação dos produtos amplificados ..................................................... 64
5.2.7 Verificação em gel de poliacrilamida ....................................................... 64
5.2.8 Sequenciação ............................................................................................. 64
5.2.9 Detecção por eletroforese capilar .............................................................. 66
5.2.10 Análise dos resultados ............................................................................... 67
5.3 Validação do método de análise genética ......................................................... 67
5.3.1 Especificidade e Exatidão ......................................................................... 68
5.3.2 Limiares analíticos .................................................................................... 70
5.3.3 Precisão do método: repetibilidade e reprodutibilidade ............................ 70
5.3.4 Qualidade média dos resultados. ............................................................... 71
5.4 Metodologia de quantificação de tramadol e metabolitos ................................ 71
5.4.1 Preparação das amostras ........................................................................... 72
5.4.2 Extração em fase sólida ............................................................................. 72
5.4.3 Análise por GC/MS ................................................................................... 73
5.4.4 Avaliação dos resultados ........................................................................... 73
5.5 Validação do método de quantificação de tramadol e metabolitos .................. 74
5.5.1 Especificidade/seletividade, capacidade de identificação e avaliação de
interferentes ............................................................................................................. 75
5.5.2 Eficiência da extração ............................................................................... 76
5.5.3 Limiares analíticos: Limite de Detecção e Limite de Quantificação ........ 76
5.5.4 Linearidade e Modelo de Calibração ........................................................ 76
5.5.5 Precisão Intermédia, Repetibilidade e Exatidão. Arrastamento entre
análises consecutivas. .............................................................................................. 77
5.5.6 Robustez .................................................................................................... 78
5.6 Metodologia para a análise estatística da correlação entre os resultados da
análise genética e toxicológica .................................................................................... 78
6 Resultados ................................................................................................................ 79
6.1 Validação do método de análise genética ......................................................... 80
6.1.1 Especificidade e exatidão .......................................................................... 81
6.1.2 Limite de detecção .................................................................................... 84
Suzana Fonseca Página 3
6.1.3 Precisão do método: repetibilidade e reprodutibilidade ............................ 85
6.1.4 Qualidade média dos resultados. ............................................................... 86
6.2 Validação do método de quantificação do tramadol e metabolitos .................. 89
6.2.1 Especificidade/Seletividade, Capacidade de Identificação e Avaliação de
interferentes ............................................................................................................. 89
6.2.2 Eficiência da extração ............................................................................... 89
6.2.3 Limiares analíticos: Limite de Detecção e Limite de Quantificação ........ 90
6.2.4 Linearidade e Modelo de Calibração ........................................................ 90
6.2.5 Precisão Intermédia e Repetibilidade ........................................................ 92
6.2.6 Exatidão ..................................................................................................... 92
6.3 Resultados de amostras ..................................................................................... 94
6.4 Estudo de casos ............................................................................................... 104
7 Discussão ............................................................................................................... 107
7.1 Metodologia de análise genética .................................................................... 107
7.2 Metodologia de análise toxicológica .............................................................. 113
7.3 Resultados do estudo das amostras ................................................................. 114
8 Perspetivas futuras ................................................................................................. 117
9 Conclusões ............................................................................................................. 119
10 Bibliografia ............................................................................................................ 121
Suzana Fonseca Página 4
Índice de Anexos
Anexo I – Certificados dos Materiais de Referência usados na Validação do Método
de Análise Genética ................................................................................................... A3
Anexo I.1. Certificado do material de referência MR1 (CYP2D6*4) .................. A3
Anexo I.2. Certificado do material de referência MR2 (CYP2D6*3) .................. A4
Anexo I.3. Certificado do material de referência MR3 (CYP2D6*6) .................. A5
Anexo II – Resultados de Validação do Método de Análise Genética...................... A6
Anexo II.1. Sequências analisadas no software Sequencing analysis .................. A6
Anexo II.2. Variantes genéticas identificadas com o SeqScape nas amostras. ..... A8
Anexo III – Fórmulas de Cálculo Utilizadas na Validação do Método de
Quantificação de Tramadol e Metabolitos ................................................................ A9
Anexo III.1. Recuperação ..................................................................................... A9
Anexo III.2. Teste da Homogeneidade de Variâncias (Teste F) ........................... A9
Anexo III.3. Modelo de Calibração .................................................................... A10
Anexo III.4. Precisão Intermédia, Repetibilidade e Limite de Repetibilidade ... A11
Anexo III.5. Exatidão e Cálculo da Incerteza ..................................................... A12
Anexo IV – Resultados de Validação do Método de Quantificação de Tramadol e
Metabolitos .............................................................................................................. A14
Anexo IV.1. Linearidade .................................................................................... A14
Anexo IV.2. Precisão intermédia e repetibilidade .............................................. A18
Anexo IV.3. Exatidão e Incerteza do método ..................................................... A23
Anexo IV.4. Espectros de massa do Tramadol, N-desmetil-tramadol e O-
desmetil-tramadol ............................................................................................... A27
Suzana Fonseca Página 5
Índice de tabelas
Tabela 1. Classificação dos genótipos CYP2D6 em função do fenótipo esperado...... 32
Tabela 2. Distribuição populacional da prevalência dos alelos mais estudados e a
correspondente atividade enzimática. .......................................................... 44
Tabela 3. Prevalência dos fenótipos da enzima CYP2D6 na população caucasiana ... 44
Tabela 4. Sequências dos primers e localização dos fragmentos. ................................ 63
Tabela 5. Condições dos ciclos de temperatura da reação de PCR. ............................. 63
Tabela 6. Condições dos ciclos de temperatura da reação de sequenciação. ............... 65
Tabela 7. Extração em fase sólida com colunas Waters Oasis HLB®. ....................... 72
Tabela 8. Descrição dos parâmetros de análise instrumental por GC/MS. .................. 73
Tabela 9. Tolerância máxima para as áreas relativas dos iões diagnóstico. ................ 74
Tabela 10. Códigos das amostras utilizadas nos ensaios de validação do método. ..... 81
Tabela 11. Resultados da pesquisa das sequências obtidas para 3 amostras com o
BLAST. ........................................................................................................ 82
Tabela 12. Perfil genético dos Materiais de Referência. .............................................. 84
Tabela 13. Resultados obtidos no ensaio do limite de detecção. ................................. 84
Tabela 14. Resultados obtidos no ensaio de reprodutibilidade para 15 amostras. ....... 85
Tabela 15. Resultados obtidos no ensaio de repetibilidade. ......................................... 85
Tabela 16. Valores médios de sinal e de sinal/ruído obtidos no ensaio de validação da
qualidade média dos resultados. .................................................................. 87
Tabela 17. Valor de sample score obtidos no ensaio de validação .............................. 87
Tabela 18. Critérios de aceitação usados no ensaio de validação da qualidade média
dos resultados .............................................................................................. 88
Tabela 19. Resultados de recuperação ......................................................................... 90
Suzana Fonseca Página 6
Tabela 20. Somatório dos desvios dos calibradores em 5 curvas de calibração, bem
como o fator de correlação médio, para cada fator de ponderação ............. 91
Tabela 21. Coeficientes de variação do estudo da precisão intermédia. ...................... 92
Tabela 22. Recuperações médias obtidas nas três gamas de concentrações. ............... 92
Tabela 23. Incerteza obtida durante a avaliação do parâmetro da exatidão. ................ 93
Tabela 24. Resumo dos resultados de validação do método de quantificação. ............ 93
Tabela 25. Resumo dos resultados de genotipagem e de quantificação de tramadol... 96
Tabela 26. Frequências alélicas obtidas nas amostras post mortem. ............................ 98
Tabela 27. Frequência de genótipo e fenótipo previsto para as amostras post mortem.
..................................................................................................................... 98
Tabela 28. Estatística descritiva das concentrações de tramadol (TMD), N-
desmetiltramadol (NDT) e O-desmetiltramadol (ODT) obtidas nas 100
amostras post mortem analisadas. ................................................................ 99
Tabela 29. Resultados de p-value por aplicação dos testes de Mann-Whitney e de
Jonckheere-Terpstra (JT) para comparação entre grupos. ......................... 103
Tabela 30. Resumo da informação fornecida ao SQTF e dos resultados obtidos na
análise toxicológica e genética dos casos de metabolizadores lentos. ...... 105
Suzana Fonseca Página 7
Índice de figuras
Figura 1. Regras de nomenclatura das enzimas e dos genes do Citocromo P450 ....... 36
Figura 2. Representação esquemática do funcionamento das CYP ............................. 37
Figura 3. Distribuição das enzimas CYP de acordo com o número de medicamentos
que metabolizam e fatores que podem influenciar a sua variabilidade. ...... 38
Figura 4. Representação da estrutura química dos enanteómeros do tramadol ........... 47
Figura 5. Representação esquemática do metabolismo do tramadol. .......................... 49
Figura 6. Fluxograma do método de análise genética. ................................................. 58
Figura 7. Variantes do gene CYP2D6 estudadas neste trabalho. ................................. 61
Figura 8. Demonstração esquemática da sequenciação com BigDye Terminator v. 3,1.
..................................................................................................................... 66
Figura 9. Pesquisa da sequência FH da amostra CYP016 no BLAST ......................... 82
Figura 10. Sequências obtidas para cada fragmento e comparação com as sequências
dos pseudogenes, segundo a entrada M33387.1 do Genebank. ................... 83
Figura 11. Eletroferogramas dos polimorfismos identificados nos materiais de
referência: .................................................................................................... 83
Figura 12. Alinhamento das sequências obtidas durante o ensaio de repetibilidade na
amostra CYP025. ......................................................................................... 86
Figura 13. Sobreposição das sequências obtidas com a de referência utilizando o
SeqScape. ..................................................................................................... 86
Figura 14. Fenótipo previsto com base nas variantes alélicas encontradas nas amostras.
..................................................................................................................... 94
Suzana Fonseca Página 8
Figura 15. Correlação entre a razão logarítmica de concentração TMD/ODT e
TMD/NDT com o fenótipo previsto, sendo que: EM corresponde à ausência
de variantes; IM ao genótipo *10/*10 ou *4/*10; PM ao genótipo *3/*4 e
*4/*4. ........................................................................................................... 99
Figura 16. Correlação entre a razão logarítmica de concentração NDT/ODT com o
fenótipo previsto, sendo que: EM corresponde à ausência de variantes; IM
ao genótipo *10/*10 ou *4/*10; PM ao genótipo 3/*4 e *4/*4. ................ 100
Figura 17. Correlação entre a razão logarítmica de concentração NDT/TMD e o
genótipo do indivíduo, sendo que: EM corresponde à ausência de variantes;
EM1 a um alelo *10; EM2 a um alelo *4 ou *6; IM a *10/*10 ou *4/*10 e
PM a *4/*4 ou *3/*4. ................................................................................ 101
Figura 18. Correlação entre a razão de concentrações TMD/ODT, TMD/NDT e
NDT/TMD e o fenótipo previsto do indivíduo, onde INIB é o grupo dos
casos com inibidores enzimáticos. ............................................................. 102
Suzana Fonseca Página 9
Abreviaturas e Siglas
ºC graus Celcius
µL / µg / µM microlitro / micrograma / micromolar
A Adenina
AB Applied Biossystems
ADME Fase da Farmacocinética: Absorção, Distribuição, Metabolização e
Excreção
ADN / DNA Ácido desoxirribonucleico (do inglês deoxyribonucleic acid)
ADR Reações adversas (do inglês adverse reactions)
BLAST Ferramenta de pesquisa em bases de dados genéticas disponibilizada
online pela NCBI (do inglês Basic Local Alignment Search Tool)
C Citosina
CNV Variação do número de cópias do gene
(do inglês Copy Number Variation)
CV Coeficiente de variação percentual
CYP450 Citocromo P450
CYP2D6 Proteína da família CYP450, família 2, subfamília D, isoforma 6
Gene que codifica a síntese da proteína CYP2D6
Cypallele Human Cytochrome P450 Allele Nomenclature Database
(disponível em http://www.cypalleles.ki.se)
dNTPs Desoxinucleótidos trifosfatados
(do inglês deoxy-nucleotide triphosphate)
ddNTPs Di-desoxinucleótidos trifosfatados
(do inglês di-deoxy-nucleotide triphosphate)
Suzana Fonseca Página 10
EI Ionização Electrónica (do inglês, Electronic Ionization)
EM Metabolizador extensivo/normal (do inglês Extensive Metabolizer)
EMR Erro médio relativo
ER% Erro relativo percentual
eV electrão volt
Fcrit Valor tabelado da distribuição F para (N-1;N-1;\)
FDA Food and Drug Admistration
G Guanina
GC-MS Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de Massa
(do inglês Gas Chromatography-Mass Spectrometry)
ID Índice de Degradação
IM Metabolizador intermédio (do inglês Intermediate Metabolizer)
INMLCF Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses, I. P.
(Instituto Público)
ISO International Organization for Standardization
IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry
LC-MS Cromatografia Líquida acoplada à Espectrometria de Massa
(do inglês Liquid Chromatography-Mass Sprectrometry)
LOD Limite de detecção (do inglês Limit of Detection)
LOQ Limite de quantificação (do inglês Limit of Quantification)
m/z Razão massa/carga
MeOH Metanol
min minuto
NCBI National Center for Biotechnology Information
NDT N-desmetil-tramadol
Suzana Fonseca Página 11
ODT O-desmetil-tramadol
OMS Organização Mundial de Saúde
OPRM1 Gene que codifica o receptor opióide µ.
pb / kb Pares de bases / 1000 pares de bases
PCR Reação de polimerase em cadeia
(do inglês Polymerase Chain Reaction)
PharmGKB PharmGKB Knowledge Base (disponível em www.pharmgkb.org)
PI Padrão interno
pka Constante de ionização
PM Metabolizador lento (do inglês Poor Metabolizer)
r2 Coeficiente de correlação
rpm Rotações por minuto
Sy/x Desvio-padrão residual, erro-padrão
SIM Monitorização seletiva de iões (do inglês Selective Ion Monitoring)
SNC Sistema Nervoso Central
SNP Polimorfismo de nucleótido único
(do inglês Single Nucleotide Polimorphism)
SGBF Serviço de Genética e Biologia Forenses
SPE Extração em Fase Sólida (do inglês Solid Phase Extraction)
SQTF Serviço de Química e Toxicologia Forenses
S/R Razão sinal/ruído (do inglês signal-to-noise)
SSRIs Inibidores Seletivos da Recaptação de Serotonina
(do inglês Selective serotonin reuptake inhibitor)
SWGDAM Scientific Working Group for DNA Analysis Methods
T Timina
Suzana Fonseca Página 12
TMD Tramadol
tr Tempo de retenção
trr Tempo de retenção relativo
UM Metabolizador ultra-rápido (do inglês Ultrarapid Metabolizer)
WADA World Anti-Doping Agency
Wi Fator de ponderação (do inglês weighing)
WT Sequência genética de referência (do inglês Wild Type)
Suzana Fonseca Página 13
1 Resumo
A variabilidade genética tem impacto na resposta individual aos fármacos, com
repercussões nas concentrações e nos efeitos observados. Os exames de toxicologia
forense são importantes para conhecer a contribuição dos xenobióticos na causa de
morte e as circunstâncias em que esta ocorreu. A aplicação das metodologias de
farmacogenética a casos post mortem é ainda pouco frequente, dependendo sobretudo
das características do gene a estudar e da existência de metodologias adequadas à
análise de amostras da rotina pericial. Por outro lado, para que os resultados possam
ser utilizados como prova em tribunal, é essencial dispor de fundamentação científica
para a sua interpretação, que pode ser obtida através de estudos de correlação entre os
resultados da genética e da toxicologia.
O tramadol é bioactivado por metabolização em O-desmetiltramadol, por acção da
enzima CYP2D6. Algumas variantes genéticas são responsáveis por alterações na
expressão enzimática e, portanto, na resposta analgésica e nas concentrações
encontradas nas amostras post mortem, para o tramadol e para os seus metabolitos.
Nos casos post mortem com tramadol, a identificação dos metabolizadores lentos pela
pesquisa de variantes genéticas descritas como não-funcionais pode ser útil para
explicar algumas circunstâncias relacionadas com a morte.
O objetivo deste trabalho foi o desenvolvimento de uma metodologia de sequenciação
parcial do gene CYP2D6 para a detecção de variantes genéticas responsáveis pela
inativação da atividade enzimática, tendo em vista a identificação de metabolizadores
lentos. A metodologia foi aplicada a casos post mortem positivos para tramadol.
Foram selecionadas e analisadas 100 amostras de sangue post mortem com tramadol.
O ADN foi extraído pelo método de Chelex 100® e quantificado por Real-time PCR
Suzana Fonseca Página 14
usando Quantifiler Trio da Applied Biosystems (AB). A amplificação dos fragmentos
de interesse do gene CYP2D6 foi efetuada por PCR com MasterMix da Qiagen. Os
fragmentos amplificados foram sequenciados com Big Dye v.3.1 cycle sequence e
detetados por eletroforese capilar num Genetic Analyser 3130 (AB). As sequências
obtidas foram comparadas com a de referência usando o programa informático
SeqScape v3. O método foi validado de acordo com recomendações internacionais. Foi
também validado o método de confirmação quantitativa de tramadol e dos seus
metabolitos N-desmetil-tramadol e O-desmetil-tramadol.
Os métodos foram aplicados com sucesso às amostras de sangue post mortem. As
distribuições de alelos e de genótipos das amostras analisadas estão de acordo com o
esperado para a população portuguesa e europeia. O metabolismo do tramadol,
expresso pela razão de concentrações entre os seus metabolitos (N-desmetil-
tramadol/O-desmetil-tramadol), demonstrou estar correlacionado com os fenótipos
previstos na análise genética, em particular no caso dos metabolizadores lentos. Foi
demonstrada também a importância da pesquisa de substâncias inibidoras da atividade
enzimática, nos casos de tramadol. De acordo com o nosso conhecimento, este é o
primeiro estudo em que a metodologia de sequenciação do gene CYP2D6 foi validada
e aplicada com sucesso a amostras post mortem, em Portugal. As metodologias
desenvolvidas permitem a recolha sistemática de resultados em casos post mortem,
constituindo ferramentas essenciais para fundamentar a utilidade da farmacogenética
na interpretação de casos de tramadol, numa avaliação conjunta entre a patologia, a
toxicologia e a genética forenses.
Palavras-chave: farmacogenética; CYP2D6; tramadol; post mortem; toxicologia
forense
Suzana Fonseca Página 15
Abstract
Genetic variation is related to individual drug response, with influence in the
concentration and effects observed. Forensic toxicology is important to know the
contribution of drugs to the cause of death and its circumstances. Forensic
pharmacogenetics is a relatively new and growing area of research and to be used in
the court decisions it is essential to have reliable methodologies that can be applied to
routine analysis. On the other hand, the interpretation of the results depends on the
knowledge based on scientific research with statistical coverage that can be obtained
by correlation studies between genetic and toxicology results.
Tramadol is bioactivated by metabolization to O-demethyl-tramadol, by CYP2D6
enzyme. Some genetic polymorphisms are responsible for the variability in the
expression of this enzyme, changing the individual drug response and also the post-
mortem concentrations of tramadol and its metabolites. The poor-metabolizers
identification by detection of allelic variants described as non-functional can be useful
to explain some circumstances of death in the study of post-mortem cases with
tramadol.
The aim of this work was the development of a Sanger sequencing methodology for
CYP2D6 gene to identify genetic variants that cause absence of enzyme activity and
its application to post-mortem cases with tramadol.
100 post-mortem blood samples were selected and analyzed. DNA was extracted by
Chelex 100® method and quantitated with Applied Biosystems (AB) Quantifiler Trio
Kit ® by Real-time PCR. Genetic fragments amplification was done by PCR using
Qiagen MasterMix. Sanger sequencing was performed with Big Dye v.3.1 cycle
sequence and detected in a Genetic Analyser 3130 (AB). Allelic variants were found
Suzana Fonseca Página 16
comparing the results with a reference sequence using SeqScape v3 software. The
sequencing method was validated following international guidelines as well as the
method used for tramadol and main metabolites quantification.
The methods were successfully applied to post mortem blood samples. Alleles and
genotype frequencies were in accordance with the expected for European population.
Tramadol metabolism, expressed as its metabolites concentration ratio (N-
desmethyltramadol/O-desmethyltramadol), has been shown to be correlated with the
predicted phenotypes based on genetic characterization. It was also demonstrated the
importance of enzyme inhibitors identification in the toxicology analysis. According
to our knowledge, this is the first time that a CYP2D6 sequencing methodology is
validated and applied to post-mortem samples, in Portugal. The developed
methodology allows the data collection of post-mortem cases, which is of primordial
importance to enhance the use of these pharmacogenetic tools to explain some
circumstances of death in the study of tramadol positive cases and demonstrate the
importance of this pharmacogenetics tools to forensic toxicology and pathology.
Keywords: pharmacogenetics, CYP2D6, tramadol, post-mortem, forensic toxicology
Suzana Fonseca Página 17
2 Introdução
A Medicina Legal e o mundo das Ciências Forenses vivem em progressiva fusão de
conhecimentos, no sentido de conseguir as melhores soluções na aplicação da Lei para
a realização da Justiça, contribuindo ainda para a melhoria da saúde pública e para o
desenvolvimento científico. O crescimento conjunto desta diversidade disciplinar vai
esbatendo as suas fronteiras, no ressurgir de um conhecimento abrangente e com
grande potencial de crescimento.
2.1 A Medicina Legal em Portugal
O Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses, I. P. (INMLCF), é um
instituto público dotado de autonomia administrativa e financeira e de património
próprio, sob a superintendência e a tutela do membro do governo responsável pela área
da justiça. Tem a natureza de laboratório do Estado com jurisdição sobre todo o
território nacional e é considerado “instituição nacional de referência” na área da
Medicina Legal e Ciências Forenses. (DL n.º 166/2012, de 31 de Julho)
Em 1899, com a Carta-Lei de 17 de Agosto, foram criadas as morgues de Lisboa,
Coimbra e Porto destinadas a efetuar exames médico-forenses e vocacionadas para o
ensino da Medicina Legal. Em Lisboa, a morgue estava localizada nas proximidades
do “Campo de Sant’Ana”, onde se encontrava sediada a Faculdade de Medicina. Os
exames químicos e toxicológicos foram realizados no Laboratório Químico da Escola
Politécnica até 1 de Abril de 1912, data em que, sob a direção do Prof. Dr. Azevedo
Neves, começou a funcionar o Laboratório de Química da morgue de Lisboa (Reys,
1985).
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Durante a 1ª República, em 1918, com a presidência de Sidónio Pais, foram
construídos e criados os Institutos de Medicina Legal de Lisboa, Coimbra e Porto, cuja
direção era reservada a docentes das Faculdades de Medicina. O decreto-lei 5:023
publicado a 3 de Dezembro de 1918, regulamenta a organização dos serviços periciais
medico-forenses, definindo as circunscrições territoriais de cada Instituto. Este
decreto-lei estabeleceu ainda que, para o seu funcionamento, os Institutos deveriam
estar equipados com um laboratório químico, destinado a análises toxicológicas e
outras de química forense, além de outros laboratórios (de medicina-legal, de
antropologia, de psicologia experimental e de fotografia) e ainda um museu, um
arquivo e uma biblioteca.
No final do século XX a evolução tecnológica foi fundamental para a renovação dos
serviços técnicos, com a introdução de novas técnicas e tecnologias, quer de análise
toxicológica (como a aquisição de equipamentos de GC/MS e HPLC), quer de
genética e biologia molecular (com o desenvolvimento de técnicas de PCR e de
eletroforese).
Em 2001 foi criado o Instituto Nacional de Medicina Legal, de âmbito nacional,
sediado em Coimbra e com 3 delegações sem autonomia administrativa nem
financeira, na dependência das quais funcionam os Gabinetes Médico-Legais da sua
área de atuação: a delegação do Norte no Porto, a delegação do Centro em Coimbra e
a delegação do Sul em Lisboa.
Em 2012, a nova Lei Orgânica estabelece que o Instituto passa a designar-se Instituto
Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses, I. P. (INMLCF), com novas
competências funcionais na área das ciências forenses. Os Serviços de Genética e
Biologia Forenses e de Química e Toxicologia Forenses passam a ser unidades
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orgânicas de carácter nacional, estando sediados em Coimbra e Lisboa, respetivamente,
dispondo de extensões funcionais nas outras delegações.
A atividade pericial do INMLCF está enquadrada pela Lei nº 45/2004 de 19 de
Agosto, que estabelece o regime jurídico das perícias médico-legais e forenses; pela
Lei Orgânica, constante do DR no Decreto-Lei n.º 166/2012 de 31 de Julho; e pelos
Estatutos, constantes da Portaria n.º 19/2013 de 21 de Janeiro. Os serviços técnicos do
INMLCF são o Serviço de Clínica e Patologia Forenses; o Serviço de Genética e
Biologia Forenses e o Serviço de Química e Toxicologia Forenses.
O Serviço de Clínica e Patologia Forenses compreende duas unidades funcionais: a de
Clínica Forense e a de Patologia Forense. À unidade funcional de Clínica Forense
compete a realização de exames e perícias em pessoas: para a descrição e avaliação
dos danos provocados na integridade psicofísica relevantes para os diversos domínios
do Direito, bem como os exames de natureza psiquiátrica e psicológica ou outros atos
neste domínio. A unidade funcional de Patologia Forense assegura a realização das
autópsias médico-legais; dos exames de anatomia patológica forense; da identificação
de cadáveres e de outros restos humanos; do embalsamamento e do estudo de peças
anatómicas. Entre 2010 e 2014, foram realizadas em média 6200 autópsias por ano
( http://www.inml.mj.pt/).
O Serviço de Química e Toxicologia Forenses assegura a realização de perícias e
exames laboratoriais químicos e toxicológicos, para a determinação, confirmação e
quantificação de substâncias químicas, nomeadamente: drogas de abuso;
medicamentos; pesticidas; etanol e outros voláteis; monóxido de carbono; cianeto ou
alguns metais. As pesquisas são efetuadas em diversas matrizes, principalmente
biológicas, nos seguintes âmbitos: perícias médico-legais efetuadas no vivo ou post
mortem; fiscalização da condução sob a influência de substâncias psicotrópicas ou de
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estupefacientes; controlo de consumo de substâncias psicoativas em meio laboral;
avaliação dos estados de influência como causa de perigosidade ou de
inimputabilidade; caracterização do estado de toxicodependência, entre outras. Como
exame complementar de autópsia, a perícia toxicológica é requerida sempre que o
perito médico considere necessário avaliar a presença de substâncias que possam
explicar a causa da morte ou das circunstâncias em que a mesma ocorreu. São
requisitados exames toxicológicos em cerca de 84% das autópsias realizadas no
INMLCF. As principais substâncias pesquisadas são o etanol, os medicamentos e as
drogas de abuso tendo uma prevalência de casos positivos de 38%, 47% e 12%,
respetivamente (J. M. Franco, 2015).
O Serviço de Genética e Biologia Forenses (SGBF) assegura a realização de perícias e
exames de identificação genética de indivíduos vivos, cadáveres ou restos cadavéricos,
perícias de investigação de parentesco biológico e perícias de criminalística biológica.
As perícias são realizadas em diversos vestígios biológicos, tais como: sangue, sémen,
saliva, cabelos, ossos, dentes ou outros tecidos. Como exame complementar de
autópsia, uma das principais finalidades da investigação genética é a identificação de
desconhecidos.
2.2 Interpretação de resultados post mortem
A autópsia médico-legal é efetuada sempre que haja suspeita de morte violenta ou de
causa desconhecida, sendo também relevante em mortes aparentemente não violentas
mas inexplicadas. Os principais objetivos são:
a. A identificação do indivíduo;
b. Determinar a causa e circunstâncias da morte;
c. Determinar a data e a hora da morte,
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d. Estabelecer a etiologia médico-legal.
O recurso a exames complementares de autópsia é frequente e é habitualmente
efetuado por requisição aos laboratórios de toxicologia, de genética ou de anatomia
patológica do INMLCF. O relatório de autópsia deverá reunir toda a informação do
processo e a sua interpretação integrada, numa perspetiva multidisciplinar. A
interpretação dos resultados do exame complementar de toxicologia deve ser sempre
enquadrada pela informação prévia (v. g. a informação recolhida pela investigação
policial e os dados clínicos), pelos achados autópticos e também pelos resultados de
outros exames complementares (Mozayani & Raymon, 2004).
Os resultados toxicológicos podem ser qualitativos ou quantitativos. Nos resultados
qualitativos faz-se a confirmação da presença ou da ausência de substâncias exógenas,
em particular as passíveis de ter um efeito tóxico ou de promoverem um estado de
influência. Quando a presença de uma substância é confirmada, pode ser fundamental
a determinação da sua concentração, em particular nas amostras de sangue (Schulz,
Iwersen-bergmann, Andresen, & Schmoldt, 2012). Para a interpretação dos resultados
quantitativos, é frequentemente necessário comparar as concentrações obtidas em cada
caso com os valores de referência publicados na literatura, onde se estabelecem os
intervalos considerados terapêuticos, tóxicos ou letais (F Musshoff, Padosch,
Steinborn, & Madea, 2004; Repetto & Repetto, 2015; Schulz et al., 2012). Contudo a
comparação com os valores das tabelas deve ser feita de uma forma crítica e prudente.
Por um lado, nestas tabelas de concentração, os limites tóxicos ou letais são
suportados por casos clínicos ou post mortem já publicados, muitas vezes com pouca
expressão estatística e influenciados por fatores circunstanciais, nomeadamente pela
presença de outras substâncias. Por outro lado, as tabelas geralmente não têm valores
de referência para as concentrações dos metabolitos nem a sua relação com as
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concentrações da substância primária. Estes valores são muito importantes nas
avaliações de resultados post mortem, quando se desconhecem os hábitos de consumo,
fenómenos de tolerância ou as características de cada indivíduo (Verrecas, Knaepen,
Gilissen, Cassiman, & Decorte, 2004).
Na avaliação de resultados quantitativos é ainda preciso considerar a possibilidade de
existência de variabilidade individual nas concentrações, mesmo com administração
de doses equivalentes e padronizadas. Os fatores de variabilidade individual podem ser
de natureza diversa (Frank Musshoff, Stamer, & Madea, 2010b), tais como:
a. Fisiológicos – a idade, o género ou o peso;
b. Patológicos – as patologias renais ou hepáticas, diabetes;
c. Ambientais/culturais – os hábitos alimentares ou de consumo; a exposição
continuada a substâncias tóxicas;
d. Circunstanciais – co-medicação; o stress emocional, intelectual ou físico;
e. Genéticos – as alterações genéticas que afetam a atividade enzimática ou
proteica.
As diferenças genéticas podem, portanto, ser responsáveis pela variabilidade na
resposta dos organismos à exposição a substâncias exógenas, alterando a sua
concentração e o tempo de permanência no organismo (farmacocinética), e também o
grau e o tipo de acção (farmacodinâmica). A variabilidade das concentrações reflete-se
nos efeitos observados, alterando a eficácia e a segurança da utilização dos fármacos,
podendo ocorrer reações adversas com impacto na saúde ou no comportamento do
indivíduo, podendo até conduzir à morte (Madadi et al., 2008; Frank Musshoff et al.,
2010b; Silva, Soares, & Martins, 2012). A elevada frequência de reações adversas
repercute-se também na gestão dos cuidados de saúde e nos custos associados.
Segundo Johansson et al, as reações adversas (ADR) correspondem à 5ª causa de
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morte nos Estados Unidos da América e são responsáveis por mais de 7% das
hospitalizações, prevalência que ultrapassa os 30% na população com mais de 70 anos
de idade (Johansson & Ingelman-Sundberg, 2011; Lazarou, Pomeranz, & Corey,
1998). As reações adversas mais graves estão geralmente relacionadas com
cardiotoxicidade e hepatotoxicidade (Buscemi & Tagliabracci, 2011; Chan, Jin, Loh,
& Brunham, 2015; Johansson & Ingelman-Sundberg, 2011).
Considerando a existência de variantes genéticas responsáveis pela alteração da
resposta farmacológica, as metodologias adequadas à sua detecção em amostras post
mortem podem constituir ferramentas de particular relevância para a interpretação das
concentrações observadas em cada caso (Pelotti & Bini, 2011). Holmgren et al, tal
como descrito por Musshoff et al, (Frank Musshoff et al., 2010b) propõe critérios para
a seleção dos casos em que seria adequado recorrer ao estudo de variantes genéticas, a
saber:
Quando as concentrações relativas entre o composto administrado e os seus
metabolitos não são as esperadas;
Quando existem reações adversas relacionadas com a alteração da
biodisponibilidade da substância;
Quando a administração foi efetuada de forma controlada e as concentrações
não são correspondentes;
Quando estão presentes outras substâncias que podem ter funcionado como
inibidores enzimáticos.
As variantes genéticas mais estudadas em farmacogenética são as que têm influência
na farmacocinética da substância, em particular as que alteram a capacidade funcional
das enzimas de metabolização.
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2.3 Farmacocinética
O efeito das substâncias depende da concentração disponível no seu local de acção. A
farmacocinética procura descrever a sua distribuição e transformação no organismo,
com o objetivo de conhecer a concentração disponível no órgão em que vão exercer o
efeito e qual a duração dessa disponibilidade. Para conhecer a farmacocinética das
substâncias são estudados todos os fatores que afetam a capacidade de absorção, a
distribuição, o metabolismo e a excreção, habitualmente designados por ADME (Y. O.
Franco & Franco, 2003).
A absorção consiste na passagem das substâncias do local de exposição para a corrente
sanguínea e depende muito da via de administração. A administração dos xenobióticos
pode ser oral, rectal, dérmica, por inalação ou parentérica (v.g. intramuscular,
intravenosa), entre outras. Na administração intravenosa, a substância entra
diretamente na corrente sanguínea e neste caso não há uma fase de absorção. A
administração oral é a mais frequente nos medicamentos e a absorção faz-se ao longo
de todo o trato gastrointestinal, desde o estôm go ao reto, mas com maior incidência na
parte inicial do intestino delgado (Meyer & Maurer, 2014). A absorção pode ser feita
por transporte ativo ou por difusão passiva, dependendo das características de cada
substância. A difusão passiva é mais frequente, particularmente para substâncias de
pequena dimensão molecular e lipofílicas (Asic & Of, 2008). Em algumas situações as
substâncias administradas podem não ser absorvidas, seja porque são degradadas pelo
ácido gástrico, pelas enzimas intestinais ou devido às suas características físico-
químicas (Jickells & Negrusz, 2008).
A distribuição descreve a transferência reversível da substância entre o sangue e os
tecidos e a sua extensão pode ser traduzida por um parâmetro quantitativo: o Volume
de Distribuição. A distribuição depende do fluxo sanguíneo nos tecidos e ainda de
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diversos fatores associados à substância – tais como o tamanho da molécula, o grau de
ionização ao pH do sangue, a afinidade para a ligação às proteínas plasmáticas ou aos
tecidos adiposos; e associados ao indivíduo - tais como o género, a idade ou a
existência de patologias. Numa fase inicial, a distribuição faz-se pelos órgãos mais
irrigados, como o fígado, o coração, os rins e o cérebro. Com o tempo, pode haver
distribuição para os órgãos periféricos, tecidos musculares ou adiposos. O Volume de
Distribuição será elevado para as substâncias com maior afinidade para o tecido
adiposo ou a outras estruturas celulares, onde podem ficar armazenadas prolongando a
sua permanência no organismo. A distribuição das substâncias entre o plasma e os
tecidos depende também da via e frequência de administração (Jickells & Negrusz,
2008; Meyer & Maurer, 2014).
O metabolismo e a excreção são frequentemente referidos como a eliminação porque
em conjunto promovem a remoção das substâncias do organismo. A eliminação
compreende principalmente 2 vias: a via renal, por excreção dos compostos polares e
hidrofílicos na urina; e a via hepática, quer por metabolização, quer por excreção biliar.
Alguns compostos podem ser eliminados por outras vias, como é o caso do etanol que
é excretado pelo ar expirado, ou em menor quantidade por outros fluidos corporais tais
como o leite materno, o suor ou as lágrimas.
As substâncias mais hidrofóbicas são geralmente eliminadas por excreção biliar, em
particular alguns metabolitos glucoronidos e sulfatos. Quando a bílis é excretada e
libertada nos intestinos, as enzimas produzidas por algumas bactérias podem hidrolisar
estes grupos conjugados, deixando a substância livre para a reabsorção. Este fenómeno
é designado por recirculação enterohepática e, em algumas substâncias como a
morfina, tem um impacto grande no tempo de permanência no organismo (Asic & Of,
2008). Nestes casos, a presença das substâncias no conteúdo gástrico não se deve
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necessariamente à administração por via oral mas sim a fenómenos de refluxo ou à
difusão passiva a partir da mucosa gástrica, em particular nos compostos alcalinos.
(Meyer & Maurer, 2014).
A absorção das substâncias exógenas por difusão passiva no epitélio intestinal é
efetuada através da bicamada fosfolipídica das membranas. Por essa razão, as
substâncias lipofílicas e com estrutura molecular pequena são mais facilmente
absorvidas de acordo com o gradiente de concentração. Em contrapartida, a sua
excreção na urina é mais difícil devido à baixa solubilidade em água e, sendo de
pequena dimensão, podem ser reabsorvidas a nível renal.
A metabolização é um mecanismo de defesa do organismo que consiste na
biotransformação dos compostos exógenos lipofílicos em substâncias hidrofílicas, para
facilitar a excreção por via renal. Os produtos de reação são os metabolitos que podem
ser substâncias activas também. Por essa razão, a metabolização altera a intensidade e
a duração da resposta farmacológica. As reações de metabolização são catalisadas
enzimaticamente, ocorrendo no local ou órgão com maior expressão da enzima
específica para cada reação, mais frequentemente no fígado.
O processo de biotransformação pode dividir-se em duas fases: numa primeira fase o
organismo procura aumentar a solubilidade em meio aquoso (metabolização de fase I)
e na fase seguinte evitar a reabsorção renal (metabolização de fase II).
O metabolismo de fase I visa transformar as substâncias lipofílicas em substâncias
mais polares, com a introdução ou exposição de grupos funcionais (–OH, –NH2, –SH
ou –COOH) através de reações de oxidação, redução, hidrólise ou desalquilação. As
reações são mediadas por enzimas, em particular pelas enzimas microssomais do
Citocromo P450 (CYP), que se localizam essencialmente no retículo endoplasmático
no fígado, mas podem também encontrar-se noutros órgãos como intestino delgado,
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rins, pulmões, cérebro e pele. As substâncias lipofílicas e hidrofóbicas penetram bem
na bicamada lipídica do retículo endoplasmático dos hepatócitos, onde estão situadas
as enzimas responsáveis pela metabolização. Deste tipo de reações resultam
metabolitos polares que podem ser também ativos, e que podem diferir muito do
composto administrado no tipo, no grau e na duração dos efeitos (Asic & Of, 2008).
O metabolismo de fase II envolve reações de conjugação, formando compostos muito
polares e de maior massa molecular. Os metabolitos são conjugados por
glucuronização, sulfatação, acetilação ou metilação (Asic & Of, 2008). As enzimas
envolvidas no metabolismo de conjugação são transferases, tais como, metiltransferase
(MT), N-acetiltransferase (NAT) ou UDP-glucuroniltransferase (UGT) e os
metabolitos resultantes são geralmente inativos.
Quando uma substância é administrada por via oral, após a absorção no epitélio
intestinal, há uma primeira passagem no fígado antes da distribuição. Tanto nas células
do epitélio como nos hepatócitos existem enzimas de metabolização. Dependendo da
extensão desta primeira metabolização, o impacto nas concentrações sujeitas a
distribuição e disponíveis para exercer o efeito no órgão alvo pode ser elevado. Este
fenómeno é designado por eliminação pré-sistémica e pode alterar muito a
biodisponibilidade da substância.
A caracterização da ADME faz-se com recurso a parâmetros calculados com base em
valores observados da concentração plasmática ao longo do tempo. Os parâmetros
principais (primários) são a biodisponibilidade, o volume de distribuição e a depuração
(clearance). Os parâmetros secundários são dependentes do tempo e são o tempo de
semi-vida de eliminação (t1/2), a área da curva de concentração plasmática em função
do tempo (AUC) e a concentração máxima no plasma (Cmax) (Asic & Of, 2008; Meyer
& Maurer, 2014).A metabolização é catalisada por enzimas e a sua expressão depende
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dos genes que as codificam. As variantes genéticas podem interferir na
farmacocinética da substância, alterando a biodisponibilidade e a capacidade de
eliminação. A análise dos genes responsáveis pela expressão das enzimas que
catalisam a metabolização de fase I e de fase II pode facilitar a interpretação da
distribuição das substâncias no organismo (Gaedigk, 2013; Frank Musshoff, Stamer,
& Madea, 2010a; Sajantila, Palo, Ojanperä, Davis, & Budowle, 2010).
2.4 Farmacogenética
A farmacogenética é a disciplina que estuda a relação existente entre as características
genéticas de cada indivíduo e a sua resposta às substâncias administradas. As
diferenças nos efeitos das substâncias podem dever-se à existência de polimorfismos
nos genes que codificam as enzimas que metabolizam essas substâncias, os
transportadores e os receptores no órgão alvo, entre outros.
2.4.1 Resumo histórico
Os aspetos históricos da farmacogenética remontam ao ano 510 AC, quando Pitágoras
relacionou o surgimento de anemia hemolítica com a ingestão de favas apenas em
alguns indivíduos, atribuindo o fenómeno observado às características individuais.
Surgiu como disciplina nos anos 50 do século XX com a descoberta do mesmo tipo de
anemia hemolítica subsequente à administração de primaquina (anti-malárico) e que se
verificou ser devida a um défice enzimático de glucose-6-fosfato hidrogenase (G6PD).
A deficiência enzimática tinha uma prevalência significativa maior entre afro-
americanos que entre caucasianos, concluindo-se que se deveria a um fator genético.
Outros estudos foram desenvolvidos nos anos 50 relacionados com as diferenças
genéticas e variabilidade individual da resposta aos fármacos, tais como o
metabolismo de acetilação da isoniazida pela enzima N-acetil-transferase (NAT2) e da
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hidrólise da succinilcolina pela enzima butirilcolinesterase (BCHE). O termo
farmacogenética foi introduzido por Vogel em 1959 para designar esta nova área de
estudo.
Nos anos 70 dois grupos de investigação independentes (Eichelbaum em 1979 e
Mahgoub em 1977) observaram reações adversas (ADR) inesperadas após a
administração da esparteína e da debrisoquina, respetivamente. As ADR observadas
seriam devidas a diferenças de metabolização por uma enzima que é responsável pela
oxidação de ambas as substâncias, a que na altura se chamou debrisoquina ou
esparteína hidroxilase. Usando estudos farmacocinéticos para compreender os efeitos
observados, diferenciaram-se os indivíduos que teriam uma metabolização normal
(EM) dos de metabolização lenta (PM). A sequenciação do gene que codifica essa
enzima, que passou a designar-se por CYP2D6, foi conseguida pela primeira vez em
1988 por Gonzalez et al. Alguns estudos seguintes identificaram as primeiras variantes
genéticas e comprovaram a existência dos pseudogenes CYP2D7 e CYP2D8 (ver
2.5.2), com elevada homologia com o CYP2D6 (Kimura, Umeno, Skoda, Meyer, &
Gonzalez, 1989). Em 1993, Johansson et al identificaram pela primeira vez um
metabolizador ultrarrápido (UM) (Johansson & Ingelman-Sundberg, 2011).
O desenvolvimento das técnicas de biologia molecular, em particular a PCR, permitiu
aprofundar o estudo da influência genética na variabilidade de resposta aos fármacos e
distingui-la de outros fatores (v.g. idade, género, patologias, etc.). Os primeiros
estudos incidiram nos genes relacionados com a farmacocinética, em particular os que
codificam enzimas de metabolização, tendo sido estabelecido em 1996 o The Human
Cytochrome P450 (CYP) Allele Nomenclature Committee
(http://www.cypalleles.ki.se/cyp2d6.htm). O gene que codifica a enzima CYP2D6 foi
o primeiro a ser caracterizado e tem servido de modelo para outros estudos
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farmacogenéticos, não só a nível das enzimas de metabolização mas também nos
transportadores e receptores.
2.4.2 Aplicação da farmacogenética
O objetivo principal dos estudos farmacogenéticos é, atualmente, a individualização da
terapia com base em informação genética. O estudo genético dos indivíduos permite
adequar a farmacoterapia, facilitando a escolha dos fármacos e as dosagens para cada
indivíduo de modo a obter o efeito terapêutico desejado, reduzindo substancialmente a
probabilidade de existência de reações adversas, bem como os custos dos tratamentos
e a ocorrência de mortes acidentais (Abraham & Adithan, 2001; Gupta, 2013;
Saladores, Precht, Schroth, Brauch, & Schwab, 2013; Samer, Lorenzini, Rollason,
Daali, & Desmeules, 2013; Sorich & Coory, 2014). Existem já recomendações
internacionais para adequar a terapêutica tendo em conta o genótipo do indivíduo,
principalmente a nível dos genes que alteram a expressão das enzimas de
metabolização (guidelines em http://www.pharmgkb.org/ e Ehmann et al. 2015). A
FDA publicou uma lista dos biomarcadores genéticos com demonstrada relevância
clínica para as substâncias medicamentosas aprovadas nos EUA, onde, com maior
frequência, aparecem os genes que codificam as enzimas de metabolização, em
particular o CYP2D6 (http://www.fda.gov/Drugs/ScienceResearch/ResearchAreas/
Pharmacogenetics/ucm083378.htm).
Os anestésicos e analgésicos opióides são, a par com a terapia oncológica (Woods,
Veenstra, & Hawkins, 2011; Zafra-Ceres et al., 2013) e os antidepressivos (Hicks et al.,
2013; Prado, 2009), das substâncias medicamentosas mais estudadas em
farmacogenética, estando já publicados vários artigos de revisão (Book, Stamer,
Lehmann, & Stüber, 2013; Coller, Christrup, & Somogyi, 2009; M. Jin, Gock,
Jannetto, Jentzen, & Wong, 2005; Kleine-Brueggeney, Musshoff, Stuber, & Stamer,
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2010; Leppert, 2011; Palmer et al., 2005; Somogyi, Barratt, & Coller, 2007; Světlík &
Hronová, 2013; Zahari & Ismail, 2013).
A Farmacogenética tem sido também utilizada na área forense, embora com pouca
frequência. Quando as concentrações encontradas na pesquisa toxicológica post
mortem são diferentes do que seria de esperar, de acordo com a informação de cada
caso e com as tabelas de referência, a pesquisa de variantes genéticas que alterem a
capacidade de metabolização pode ser útil para a sua interpretação. A sua utilidade é
maior ainda quando as concentrações são tão elevadas que há suspeita de intoxicação,
servindo para diferenciar uma morte intencional (homicídio ou suicídio) de uma morte
acidental, devida ao desconhecimento das características genéticas do indivíduo, como
no caso apresentado, em 2000, por Sallee et al (Sallee, DeVane, & Ferrell, 2000).
2.4.3 Genótipo e Fenótipo
O Fenótipo é a expressão qualificável ou quantificável das características genéticas.
No caso dos genes que codificam as enzimas de metabolização traduz-se na
capacidade de metabolização, que é usualmente avaliada através da determinação do
índice metabólico fazendo a medição das concentrações das substâncias e dos seus
metabolitos após a administração de substâncias de teste, de forma controlada. O tipo
de metabolização observado é categorizado em quatro classes: metabolizadores
extensivos/normais, intermédios, lentos ou ultra-rápidos, (EM, IM, PM e UM - do
inglês extensive, intermediate, poor, ultrarapid metabolizers, respectivamente)
(Ingelman-Sundberg, Sim, Gomez, & Rodriguez-Antona, 2007). Os metabolizadores
extensivos/normais têm a atividade enzimática e a resposta ao medicamento de acordo
com o que é esperado. Nos metabolizadores intermédios observa-se uma redução da
velocidade de metabolização, podendo ter uma resposta aumentada ou, no caso de pro-
fármacos, diminuída. Os metabolizadores lentos são indivíduos com atividade
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enzimática residual, o que clinicamente se manifesta por uma grande deficiência na
formação de metabolitos e um aumento da biodisponibilidade da substância
administrada. A deficiência enzimática pode ser devida a alterações genéticas que
impeçam a codificação da enzima ou então que codifiquem enzimas não funcionais.
Os ultra-metabolizadores têm uma atividade enzimática muito superior à esperada
(Abraham & Adithan, 2001). Nestes dois perfis de metabolização, PM e UM,
observam-se alterações nas concentrações das substâncias e dos seus metabolitos que
se repercutem no tipo e duração da resposta, com uma maior probabilidade de
ocorrência de falha terapêutica, de reações adversas ou de intoxicação.
O perfil genético dos indivíduos (genótipo) pode ser então correlacionado com as
alterações no índice metabólico (fenótipo) e classificado de modo semelhante, tal
como é apresentado na Tabela 1.
Tabela 1. Classificação dos genótipos CYP2D6 em função do fenótipo esperado
Classe Genótipo observado Atividade enzimática prevista
EM N + N; N + R
Pelo menos um alelo funcional
Normal
IM N + 0; 0 + R; R + R
1 alelo nulo ou 2 de função reduzida
Reduzida
PM 0 + 0
homozigóticos para alelos nulos
Nula
UM N + nN
(múltiplas cópias do gene)
Aumentada
Onde, N corresponde a um alelo que codifica a enzima com atividade normal; R corresponde a um alelo com atividade enzimática reduzida; 0 corresponde a um alelo relacionado com inativação enzimática; n corresponde ao número de cópias do gene e é maior que 1.
O estudo das correlações entre os fenótipos e os genótipos tem como objectivo prever
a atividade enzimática com base nas variantes genéticas e já é possível para algumas
enzimas de metabolização (v.g. CYP2D6 conforme publicado em
http://www.cypalleles.ki.se/ cyp2d6.htm).
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Assim, o conhecimento das características genéticas individuais revela-se uma
ferramenta importante para aplicação à prática clínica, estando por isso a ser utilizado
no desenvolvimento e aprovação de novos medicamentos segundo as recomendações
da agência europeia do medicamento (European Medicines Agency, 2012).
As principais vantagens da pesquisa das variantes genéticas para a previsão dos
fenótipos relativamente a outros métodos, como o cálculo do índice metabólico, são:
Os resultados da análise genética não serem afetados pelas condições
fisiológicas, nem por outra medicação administrada simultaneamente;
Não ser necessário sujeitar indivíduos à administração de uma substância
de teste;
A amostra para análise genética poder ser colhida de forma não invasiva;
Uma só amostra fornecer informação sobre a capacidade de metabolização
de diversas substâncias e é válida para toda a vida do indivíduo (Sajantila
et al., 2010).
Contudo, indivíduos com o mesmo genótipo podem ter fenótipos diferentes,
explicados por outros fatores não genéticos tais como: a idade, o género, alterações
fisiológicas e de funcionamento dos órgãos (especialmente o fígado e rins), a
existência de vias metabólicas alternativas ou de patologias, o tipo de dieta e nutrição,
os hábitos de consumo (tabagismo, álcool, drogas de abuso) ou medicação, que
deverão ser tidas sempre em conta na altura da decisão terapêutica (Frank Musshoff et
al., 2010b).
2.4.4 Farmacogenética em contexto forense
Nos casos post mortem, o cálculo de um “índice metabólico” com base nas
concentrações relativas da substância e dos seus metabolitos não permite uma correta
aferição do fenótipo devido a diversos fatores que podem interferir nesta avaliação. A
Suzana Fonseca Página 34
colheita da amostra é efetuada durante a autópsia, não se sabendo qual a fase cinética
em que se encontrava a distribuição da substância no organismo, pois são geralmente
desconhecidos os factos relativos à administração, tais como a dose, o modo e o tempo
decorrido até ao momento da morte (Koski, 2005). A existência de concentração baixa
de um determinado metabolito relativamente à substância primária, pode ser indicativa
de duas situações: ou o tempo decorrido entre a administração e a morte foi tão curto
que não houve ainda tempo para a metabolização; ou o indivíduo estava com a
capacidade de metabolização diminuída. Estas situações podem gerar conclusões
médico-legais diferentes. Nestes casos, a caracterização do genótipo pode trazer
informação adicional e explicar as concentrações encontradas (Kupiec, Raj, & Vu,
2006; Sistonen, 2008; Zackrisson, 2009).
A primeira vez que se aplicaram ferramentas de genotipagem a amostras post mortem
foi em 1999 por Druid et al, com o estudo do gene CYP2D6, não tendo sido
identificados metabolizadores lentos (Druid, Holmgren, Carlsson, & Ahlner, 1999).
Posteriormente, foram já publicados vários estudos em amostras post mortem que
estabelecem a existência de correlação entre fenótipo e genótipo (em metabolizadores
lentos), nomeadamente em casos de tramadol (Levo, Koski, Ojanperä, Vuori, &
Sajantila, 2003), oxicodona (Jannetto et al., 2002), metadona (Wong et al., 2003),
fentanil (M. Jin et al., 2005) e amitriptilina (Koski et al., 2006; Sistonen, 2008). Além
destes, existem, atualmente, muitos trabalhos publicados que procuram evidenciar a
relevância da farmacogenética aplicada à Medicina Legal e às Ciências Forenses
(Buscemi & Tagliabracci, 2011; Koski, 2005; Kupiec et al., 2006; Langford, Bolton,
Carlin, & Palmer, 2015; Madea, Saukko, Oliva, & Musshoff, 2010; Frank Musshoff et
al., 2010b; Pelotti & Bini, 2011; Sajantila et al., 2010; Zackrisson, 2009).
Suzana Fonseca Página 35
A maior parte dos estudos post mortem foram efetuados com um número limitado de
amostras e apenas algumas variantes genéticas (consideradas as mais relevantes). A
falta de dados que correlacionem, de forma segura, as características genéticas
(genótipo) com os efeitos observados (fenótipo) são a principal limitação para a
aplicação destas ferramentas na área forense (Buscemi & Tagliabracci, 2011). Por esta
razão, o desenvolvimento de mais estudos em farmacogenética é da maior relevância
para a recolha de dados que permitam entender melhor a relação entre o genótipo e o
fenótipo, em particular nos casos de intoxicação ou de falha terapêutica, contribuindo
também para a aplicação à prática clínica e para a determinação dos limites de
segurança das substâncias. Sajantila et al. recomenda que os fatores genéticos da
metabolização sejam estudados de forma sistemática para aumentar a fiabilidade na
previsão do fenótipo, sendo para tal necessária a disponibilidade de metodologias
adequadas, seletivas, exatas e precisas (National Academy of Sciences, 2009; Sajantila
et al., 2010).
2.5 CYP2D6
O Citocromo P450 é uma família de enzimas cuja designação advém do facto de que
quando são reduzidas e ligadas ao monóxido de carbono, geram um composto rosado
(designando-se com um P, de pigmento), a que corresponde um pico de absorção
espectral a 450 nm (http://drnelson.uthsc.edu/talks/P450lect.2009.pdf).
As enzimas deste sistema identificam-se com as siglas CYP e dividem-se em 18
famílias (com mais de 40 % de semelhança entre si; designadas por um algarismo), 44
subfamílias (com mais de 55% de semelhança; designadas por uma letra) e cada
enzima designada por um número final (Zanger & Schwab, 2013). A nomenclatura
encontra-se esquematizada na Figura 1.
Suzana Fonseca
Figura 1. Regras de nomenclatura das enzimas e dos genes do Citocromo P450
Os genes que codificam as enzimas
são conhecidos 115 genes,
(CYP1A1/2, CYP1B1; CYP2A6/7/13, CYP2B6, CYP2C8/9/18/19, CYP2D6,
CYP2E1, CYP2F1, CYP2J2, CYP2R1, CYP2S1, CYP2U1, CYP2W1;
CYP3A4/5/7/43; CYP4A11/22, CYP4B1, CYP4F2/3/8/11/12/22, CYP4V2, CYP4X1,
CYP4Z1; CYP5A1; CYP7A1, CYP7B1; CYP8A1
CYP11B1/2/17/19/20; CYP21A2/24; CYP26A1, CYP26B1, CYP26C1; CYP2
CYP27B1, CYP27C1/39/46/51),
presentes noutras espécies animais e vegetais
coelho (http://drnelson.uthsc.edu.htm
As enzimas CYP localizam
hepatócitos. São proteínas hidrofóbicas
terminação N, o que facilita o acesso dos substratos lipofílico
bicamada lipídica. A atividade
Figura 2).
Regras de nomenclatura das enzimas e dos genes do Citocromo P450
as enzimas têm a mesma denominação e na espécie humana
115 genes, entre os quais 57 conseguem codificar enzimas funcionais
(CYP1A1/2, CYP1B1; CYP2A6/7/13, CYP2B6, CYP2C8/9/18/19, CYP2D6,
CYP2E1, CYP2F1, CYP2J2, CYP2R1, CYP2S1, CYP2U1, CYP2W1;
CYP3A4/5/7/43; CYP4A11/22, CYP4B1, CYP4F2/3/8/11/12/22, CYP4V2, CYP4X1,
CYP4Z1; CYP5A1; CYP7A1, CYP7B1; CYP8A1, CYP8B1; CYP11A1,
CYP11B1/2/17/19/20; CYP21A2/24; CYP26A1, CYP26B1, CYP26C1; CYP2
CYP27B1, CYP27C1/39/46/51), e os restantes são pseudogenes. Os
presentes noutras espécies animais e vegetais, como por exemplo no rato, cão, boi ou
p://drnelson.uthsc.edu.htm).
enzimas CYP localizam-se principalmente no retículo endoplasmático liso dos
São proteínas hidrofóbicas ligadas à membrana por uma
facilita o acesso dos substratos lipofílicos, que se deslocam na
atividade catalítica dá-se na superfície endoplasmática (ver
Página 36
Regras de nomenclatura das enzimas e dos genes do Citocromo P450
têm a mesma denominação e na espécie humana
ificar enzimas funcionais
(CYP1A1/2, CYP1B1; CYP2A6/7/13, CYP2B6, CYP2C8/9/18/19, CYP2D6,
CYP2E1, CYP2F1, CYP2J2, CYP2R1, CYP2S1, CYP2U1, CYP2W1;
CYP3A4/5/7/43; CYP4A11/22, CYP4B1, CYP4F2/3/8/11/12/22, CYP4V2, CYP4X1,
, CYP8B1; CYP11A1,
CYP11B1/2/17/19/20; CYP21A2/24; CYP26A1, CYP26B1, CYP26C1; CYP27A1,
os restantes são pseudogenes. Os CYP estão
no rato, cão, boi ou
plasmático liso dos
por uma sequência com
s, que se deslocam na
se na superfície endoplasmática (ver
Suzana Fonseca
Figura 2. Representação esquemática do funcionamento das CYP(adaptado de http://www.pnas
No seu funcionamento dependem da presença de uma segunda enzima, a
P450 oxiredutase (NADPH:P450
o grupo heme da CYP consiga
molecular, gerando água, NADP reduzido e radicais livres de oxigénio que ficam
disponíveis para integrar o substrato.
reação de oxidação, mas a hidroxilação é a mais relevante na metabol
efetuada pela introdução de um átomo de oxigénio nos compostos orgânicos, por isso
se denominam monooxigenases.
Existem diversos fatores
indução ou inibição enzimática e modificam a expressão d
450 (ver Figura 3).
Representação esquemática do funcionamento das CYP(adaptado de http://www.pnas.org/content/101/31/11459/F8.large.jpg)
No seu funcionamento dependem da presença de uma segunda enzima, a
NADPH:P450) , responsável pela transferência de eletrões
o grupo heme da CYP consiga efetuar a clivagem da ligação dupla
molecular, gerando água, NADP reduzido e radicais livres de oxigénio que ficam
disponíveis para integrar o substrato. Estas enzimas podem catalisar vários tipos de
de oxidação, mas a hidroxilação é a mais relevante na metabol
pela introdução de um átomo de oxigénio nos compostos orgânicos, por isso
se denominam monooxigenases. (http://drnelson.uthsc.edu/talks/P450lect.2009.pdf
fatores, internos e externos ao organismo, que podem causar a
ndução ou inibição enzimática e modificam a expressão das enzimas
Página 37
Representação esquemática do funcionamento das CYP .org/content/101/31/11459/F8.large.jpg).
No seu funcionamento dependem da presença de uma segunda enzima, a citocromo
eletrões para que
gação dupla do oxigénio
molecular, gerando água, NADP reduzido e radicais livres de oxigénio que ficam
Estas enzimas podem catalisar vários tipos de
de oxidação, mas a hidroxilação é a mais relevante na metabolização e é
pela introdução de um átomo de oxigénio nos compostos orgânicos, por isso
http://drnelson.uthsc.edu/talks/P450lect.2009.pdf).
, internos e externos ao organismo, que podem causar a
do citocromo P-
Suzana Fonseca Página 38
Figura 3. Distribuição das enzimas CYP de acordo com o número de medicamentos que metabolizam e fatores que podem influenciar a sua variabilidade.
Gráfico retirado de (Zanger & Schwab, 2013).
As famílias CYP 1 a 3 são responsáveis pela catálise da metabolização de fase I de 70
a 80% das substâncias medicamentosas mais utilizadas e também das drogas de abuso,
enquanto as restantes famílias fazem a biossíntese e metabolismo de substâncias
endógenas (Ingelman-Sundberg et al., 2007; Zanger & Schwab, 2013). A família
CYP2 é a mais numerosa e conta com 13 subfamílias, 16 genes e 16 pseudogenes;
pode sofrer indução na presença de outras substâncias, mas a indução é seletiva a cada
uma das subfamílias (por exemplo a CYP2E sofre indução na presença de etanol e a
CYP2B na presença de fenobarbital). Desta família, as enzimas CYP2A6, CYP2B6,
CYP2C9, CYP2C19 e CYP2D6 são responsáveis pelo metabolismo da maior parte dos
medicamentos (exceto os de tratamento oncológico), são muito polimórficas e a
variabilidade genética repercute-se no perfil metabólico dos indivíduos (Johansson &
Ingelman-Sundberg, 2011). Yang et al. fizeram uma investigação sistemática da
Suzana Fonseca Página 39
funcionalidade, da interação e dos sistemas regulatórios entre as enzimas CYP no
fígado através do estudo das características genéticas com redes bayseanas (Yang et al.,
2010). Demonstrou que a correlação entre genótipo e a atividade enzimática é
particularmente elevada para a enzima CYP2D6.
2.5.1 Enzima CYP2D6
A enzima do citocromo P450 mais estudada é CYP2D6, responsável pela
metabolização de mais de 70 substâncias, muitas delas relevantes no contexto médico-
legal, tais como antidepressivos, antipsicóticos, analgésicos, antiarrítmicos e beta-
bloqueantes (Ingelman-Sundberg et al., 2007; Kleine-Brueggeney et al., 2010). O local
de ligação da enzima aos substratos está estruturalmente bem definido, junto ao grupo
heme, estabelecendo ligações fortes e seletivas com os seus substratos, que
tipicamente têm um átomo de azoto e um anel aromático. São substratos da enzima
CYP2D6 (https://www.pharmgkb.org/):
Analgésicos opióides: codeína, dihidrocodeína, fenacetina, fentanil, morfina,
oxicodona, petidina, propoxifeno ou tramadol;
Antidepressivos: amitriptilina, citalopram, clomipramina, desipramina,
doxepina, fluoxetina, fluvoxamina, imipramina,
maprotilina, mianserina, nortriptilina, paroxetina,
venlafaxina, trazodona
Antipsicóticos: cloropromazina, clozapina, haloperidol, perfenazina,
risperidona, tioridazina e zuclopentixol;
Antiarrítmicos: flecainida, mexiletina, propafenona;
Beta-bloqueantes: carvedilol, metoprolol, propranolol, timolol;
Medicamentos usados em oncologia: debrisoquina, esparteina, tamoxifeno
outros: dextrometorfano, anfetamina, clonidina, donepezil
Suzana Fonseca Página 40
A metabolização pela enzima CYP2D6 é a que apresenta maior variabilidade
individual entre as enzimas CYP, variação atribuída em grande parte a alterações
genéticas (Mathew, 2010). Outra característica relevante é o facto de não sofrer
indução e serem poucos os fatores que afetam a expressão enzimática além das
variantes genéticas e das patologias (ver a Figura 3).
As CYP2D6 correspondem a apenas 2% do conteúdo hepático em enzimas CYP
(Zanger & Schwab, 2013). A baixa expressão enzimática e a elevada afinidade para
muitos substratos podem levar à saturação e à competição pela enzima. Os substratos
com mais afinidade comportam-se como inibidores, diminuindo a metabolização de
outras substâncias por vezes com efeitos de relevância clínica (Abraham & Adithan,
2001; Bernard, Neville, Nguyen, & Flockhart, 2006; Mathew, 2010). Nestes casos, um
indivíduo de características metabólicas normais (EM) pode ter temporariamente, um
comportamento metabólico semelhante a um metabolizador lento (PM), fenómeno
habitualmente chamado phenocopying. Este fenómeno tem sido cada vez mais
estudado, principalmente no desenvolvimento de novos medicamentos, devido às
consequências clínicas das interações com inibidores enzimáticos (Abraham &
Adithan, 2001; European Medicines Agency, 2012; Samer et al., 2013). Os principais
inibidores da CYP2D6 são os inibidores seletivos da recaptação da serotonina (ISRR),
em particular a paroxetina e a fluoxetina (reduzem a capacidade de metabolização em
mais de 80%), mas também: Sertralina, Fluvoxamina, Venfalafaxina, Flufenazina;
Haloperidol, Perfenazina, Tioridazina e a Quinidina. A Metadona é também
considerada um forte inibidor da CYP2D6 (Coller et al., 2012; Y. Jin et al., 2005;
Saladores et al., 2013).
Suzana Fonseca Página 41
Autophenocopying é um fenómeno semelhante que pode ocorrer quando existe uma
administração continuada de um substrato do CYP2D6, em que a inibição é
desenvolvida pelo próprio substrato ao longo do tempo, quando a sua concentração se
aproxima do equilíbrio. Estes fenómenos podem justificar elevadas diferenças
observadas nas concentrações das substâncias e dos seus metabolitos nos casos com a
administração de uma dose única relativamente aos tratamentos prolongados
(https://www.pharmgkb.org/).
2.5.2 Gene CYP2D6
O gene que codifica a enzima CYP2D6 é designado pelo mesmo nome e está
localizado no braço longo do cromossoma 22, na região 1, banda 3 e sub-banda 1:
22q13.1. É constituído por 4378 pares de bases e por 9 exões, codificando uma
proteína com 497 aminoácidos. O gene pertence a um conjunto de 3 genes homólogos,
mas o CYP2D7 e o CYP2D8 não conseguem codificar a enzima funcional devido a
diversas alterações observadas na sequência genética.
A sequência de referência (wild-type ou WT) do gene CYP2D6 é designada por
CYP2D6*1 e corresponde à que foi inicialmente publicada por Kimura em 1989
(Kimura et al., 1989), sendo a entrada M33388.1 do Genbank (Gaedigk, 2013). Os
nucleótidos são numerados a partir da translação ATG do codão inicial. As variantes
encontradas foram sendo designadas por alelos, representados por um asterisco e o
número, conforme as regras do Human Cytochrome P450 Allele Nomenclature
Committee, e registadas numa base de dados disponível em
http://www.cypalleles.ki.se/cyp2d6.htm. O gene CYP2D6 tem uma grande
variabilidade individual e está presente em várias espécies além da humana, tais como,
nos chimpanzés, ratos, rãs e galinhas (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore
/NM_000106).
Suzana Fonseca Página 42
2.5.3 Variantes genéticas
O CYP2D6 caracteriza-se por ser muito polimórfico, estando já descritas mais de 100
variantes alélicas na população humana. Os polimorfismos são variações no código
genético que têm uma prevalência geralmente superior a 1% na população em estudo.
Quando a prevalência é inferior a 1% na população designam-se apenas por variantes
genéticas. As variantes deste gene compreendem: alterações de base única
(substituição - SNP, deleção ou inserção - indel); de uma cadeia curta de pares de
bases (repetição, inserção ou deleção de mini e microssatélites); variação do número
de cópias do gene inteiro (CNV) ou hibridação com os pseudogenes CYP2D7 e
CYP2D8 (Mathew, 2010). A identificação das variantes e da sua localização no gene
segue o mesmo sistema de nomenclatura recomendado por Human Cytochrome P450
Allele Nomenclature Committee.
Algumas variantes afetam a atividade enzimática, inibindo a sua expressão ou
produzindo proteínas deficientes, com repercussões na capacidade metabólica. No
caso do CYP2D6 mais de 20 alelos estão correlacionados com a inativação enzimática,
habitualmente designados por alelos nulos (http://www.cypalleles.ki.se/cyp2d6.htm).
Por outro lado, quando existem mais do que duas cópias de gene, a atividade
enzimática pode ficar muito aumentada. A amplificação da atividade genética por
duplicação do gene CYP2D6 foi a primeira a ser descrita em humanos. Johansson et al
encontrou 13 cópias activas num indivíduo, e também nos seus filhos, que
demonstraram um metabolismo da debrisoquina muito rápido (Johansson et al. 1993,
tal como descrito por (Sistonen, 2008)).
Os metabolizadores lentos (homozigóticos para alelos nulos) e ultrarrápidos (com mais
de 2 cópias de gene) têm uma maior probabilidade de sofrerem reações adversas, quer
Suzana Fonseca Página 43
por falha terapêutica quer por alteração das concentrações das substâncias em
circulação. Os alelos nulos mais estudados são os seguintes:
Alelo *3: 2549 delA (rs35742686);
Alelo *4: 1846 G>A (rs3892097);
Alelo *5: deleção total do gene
Alelo *6: 1707 delT (rs5030655).
Segundo Hersberger, a sua genotipagem pode prever 93 a 97,5% dos metabolizadores
lentos (Hersberger, Marti-jaun, Rentsch, & Hanseler, 2000).
De grande interesse é também o polimorfismo 100C>T (rs1065852: Pro34Ser) que
caracteriza o alelo *10, estando presente também no alelo *4 e em outros menos
prevalentes, a que corresponde uma diminuição significativa da atividade enzimática,
devida ao decréscimo da estabilidade da enzima que dificulta o reconhecimento do
substrato. Esta variante é substrato-dependente (Bagheri et al., 2015; Gan, Ismail, Wan
Adnan, & Zulmi, 2007; Leppert, 2011; Li et al., 2010).
A variabilidade genética do CYP2D6 verifica-se quer a nível individual, quer a nível
populacional.
2.5.4 Diferenças populacionais
Existem diferenças populacionais significativas nas variantes genéticas do CYP2D6
(Bernard et al., 2006; Chan et al., 2015; Sistonen et al., 2007). A tabela seguinte
apresenta a distribuição da prevalência dos alelos mais estudados em diferentes
populações (Tabela 2).
Suzana Fonseca Página 44
Tabela 2. Distribuição populacional da prevalência dos alelos mais estudados e a correspondente atividade enzimática.
(Adaptado de Gaedigk et al., PharmGKB CYP2D6 Allelic Variation Summary Table, conforme consultado a 08/01/2015 em http://www.cypalleles.ki.se/cyp2d6. htm)
População *1 *2 *3 *4 *5 *6 *9 *10 *17 *35 *41 *1N *2N *4N
Portugal* 75 - 1,4 13,3 2,8 1,9 - - - - - - - -
Espanha 63 27 0,9 16,9 2,4 0,6 2,5 1,8 0,9 3,9 4,9 1,4 1,1 0,2
Europa 54 27 1,3 18,5 2,7 1,0 2,1 3,2 0,3 5,8 8,6 0,8 1,3 0,2
África 41 14 0,3 6,2 6,1 0,2 0,5 4,2 18,2 0,8 9,4 0,4 1,6 2,1
América 64 24 0,7 11,3 1,9 0,4 1,3 3,4 3,0 4,8 5,9 0,7 2,4 0,6
Asia Oriental 34 13 0 0,4 5,6 0 0,1 42,3 0 0,2 2,0 0,3 0,4 0
Médio Oriente 58 22 0,1 7,8 2,3 0,7 0 3,5 1,6 2,0 20 3,1 3,9 0
Oceânia 70 1,2 0 1,1 5,0 0 0 1,6 0 0 0 11,8 0 0
Ásia Central 54 34 0 6,6 2,5 0 1,4 19,8 0,4 n/a 10 0,5 0,5 0
Atividade S S N N N N R R R S R A A N
Legenda (atividade enzimática) : S– normal; N – nula; R – reduzida; A – aumentada * (Correia, Santos, Coutinho, & Vicente, 2009)
Outro estudo mais recente efectuado na população do Sul de Portugal indica que a
prevalência da variante 100C>T de 14.2% (10.8%-17.5%; num intervalo de confiança
de 95%) (Gaio et al., 2015).
A distribuição populacional das variantes genéticas está de acordo com os estudos
fenotípicos, realizados com o cálculo do índice metabólico. A distribuição fenotípica
na população caucasiana encontra-se na Tabela 3.
Tabela 3. Prevalência dos fenótipos da enzima CYP2D6 na população caucasiana
(Zanger & Schwab, 2013)
Metabolizadores População caucasiana
Lentos (PM) 5-10%
Intermédios (IM) 10-17%
Extensivos/normais (EM) 70-80%
Ultra-rápidos (UM) 3-5%
Suzana Fonseca Página 45
2.5.5 Casos publicados
Existem já publicados alguns casos em que a caracterização do gene CYP2D6
permitiu estabelecer a correlação entre a dose administrada de alguns medicamentos e
as reações adversas observadas.
O 1º caso post mortem foi publicado por Sallee et al.em 2000. Este trabalho relata um
caso de intoxicação por fluoxetina, num indivíduo com 9 anos, metabolizador lento,
que era homozigótico para alelos nulos (Sallee et al., 2000).
Dois outros casos post mortem de intoxicação por morfina, subsequente à
administração de codeína em indivíduos com metabolização ultrarrápida foram
publicados por Koren et al em 2006 e por Gasche et al 2004 (Johansson & Ingelman-
Sundberg, 2011). O primeiro destes casos é particularmente interessante por se tratar
de um recém-nascido cuja intoxicação se deveu à excreção de morfina através do leite
materno. A elevada concentração de morfina foi resultante do facto da mãe ser
metabolizadora ultrarrápida de codeína. Este caso deu origem a uma recomendação da
FDA relativamente ao uso da codeína para controlo da dor post parto (Madadi et al.,
2008). Dalen et al (1997) e Voronov et al (2007), tal como foi descrito por (Johansson
& Ingelman-Sundberg, 2011), reportaram a ocorrência de reações adversas (dor
abdominal e apneia, respetivamente) relacionadas com o aumento de concentração de
morfina, por metabolização ultrarrápida da codeína.
Em 2004, Lee et al reportaram a ocorrência de reações adversas e concentrações
tóxicas de nortritpilina num metabolizador lento com genótipo CYP2D6 *5/*10B (S.-
Y. Lee, Ki, Hong, & Kim, 2004).
Já em Março de 2015 Orliaguet publicou um caso de uma depressão respiratória aguda
após a administração de tramadol em contexto post-cirúrgico. O indivíduo de 5 anos,
deu entrada no hospital em estado comatoso e recuperou totalmente com a
Suzana Fonseca Página 46
administração de um antagonista opióide (naloxona), ficando demonstrada a
intoxicação por um opiáceo. Após caracterização genética verificou-se que o indivíduo
é portador de 3 cópias activas do gene que codifica a enzima CYP2D6, e é, portanto,
um metabolizador ultrarrápido. O conhecimento do genótipo permitiu explicar o
quadro de intoxicação, que terá sido devido a um aumento da concentração do
metabolito ativo do tramadol (Orliaguet et al., 2015).
2.6 Tramadol
O Tramadol é um analgésico sintético, estruturalmente relacionado com a codeína,
muito utilizado no controlo de dor moderada ou intensa, aguda ou crónica, em
contexto cirúrgico, traumático ou em doenças oncológicas. Foi sintetizado em 1962,
começou a ser comercializado em 1977, na Alemanha Oriental, e mais tarde noutros
países da Europa, nos Estados Unidos da América e na Austrália.
A capacidade analgésica do tramadol é de aproximadamente 10% relativamente à
observada na morfina, sendo geralmente bem tolerado, com menos reações adversas
graves, principalmente a nível de depressão respiratória ou de dependência. As ADR
registadas com maior prevalência são a náusea, tonturas e cansaço, mas com
prevalências menores (<1%) pode ocorrer ainda: sonolência/sedação, hipotensão,
taquicardia, distúrbios gástricos, dor abdominal, diarreia e obstipação. Em casos mais
graves pode ocorrer a depressão respiratória e o coma (Orliaguet et al., 2015). Quando
administrado em contexto cirúrgico (não crónico), o tramadol não desenvolve
fenómenos de acumulação nem de tolerância, tem um baixo potencial de abuso, pelo
que não é uma substância controlada, e pode ser coadministrado com outros
analgésicos não opióides, como o paracetamol. Tem uma farmacocinética que não
depende da idade ou do género (Allegaert, Rochette, & Veyckemans, 2011), mas as
Suzana Fonseca
patologias renais ou hepáticas podem alterar a capacidade de eliminação, aumentando
o tempo de semivida, a
Grond & Sablotzki, 2004)
mas que podem ser revertidas com antagonistas
2011).
O Tramadol é geralmente administrado numa mistura racémica 1:1 e ambos os
enanteómeros contribuem para a
de forma complementar (ver
Figura 4. Representação((1RS, 2RS)-2-[(dimetilamino)metil]
O R(+)- tramadol inibe a recaptação da serotonina e o S
da norepinefrina, sendo estes efeitos
transmissão de dor a nível da coluna vertebral
A capacidade analgésica após a
à acção do seu metabolito (+)
nos receptores µ opióides.
isómeros (Grond & Sablotzki, 2004)
A administração de tramadol
tipos de formulações), por via rectal ou parentérica (intravenosa,
subcutânea). Quando administrado por v
patologias renais ou hepáticas podem alterar a capacidade de eliminação, aumentando
, a clearance e o volume de distribuição (Coller et al., 2012;
Grond & Sablotzki, 2004). Nestas patologias há maior prevalência de reações
que podem ser revertidas com antagonistas opióides, como a naloxona
geralmente administrado numa mistura racémica 1:1 e ambos os
enanteómeros contribuem para a atividade analgésica, com mecanismos diferentes mas
de forma complementar (ver Figura 4).
. Representação da estrutura química dos enanteómeros do tramadol [(dimetilamino)metil]-1-(3-metoxifenil)-ciclohexanol)
a recaptação da serotonina e o S(-)-tramadol inibe a recaptação
da norepinefrina, sendo estes efeitos inibitórios responsáveis pela diminuição da
transmissão de dor a nível da coluna vertebral (Pedersen, Damkier, & Brøsen, 2006)
após a sua administração de tramadol deve-se essencialmente
seu metabolito (+)-O-desmetil-tramadol (ODT), que atua como agonista
opióides. O (+)-TMD e o (+)-ODT são mais ativo
(Grond & Sablotzki, 2004).
tramadol pode ser feita por via oral (estando disponíveis
, por via rectal ou parentérica (intravenosa, intramuscular
subcutânea). Quando administrado por via oral é totalmente absorvido,
Página 47
patologias renais ou hepáticas podem alterar a capacidade de eliminação, aumentando
(Coller et al., 2012;
reações adversas
aloxona (Leppert,
geralmente administrado numa mistura racémica 1:1 e ambos os
analgésica, com mecanismos diferentes mas
da estrutura química dos enanteómeros do tramadol ciclohexanol)
inibe a recaptação
responsáveis pela diminuição da
(Pedersen, Damkier, & Brøsen, 2006).
se essencialmente
tua como agonista
ativos que os seus
estando disponíveis diversos
intramuscular ou
ia oral é totalmente absorvido, atingindo a
Suzana Fonseca Página 48
concentração máxima após 1-2 h, sendo a metabolização pré-sistémica a principal
responsável pela redução da biodisponibilidade a 70% (Grond & Sablotzki, 2004).
Nos tratamentos continuados, a biodisponibilidade aumenta até aos 100%,
provavelmente devido a um mecanismo de saturação da capacidade metabólica. É
rapidamente distribuído e tem aproximadamente 20% de ligação às proteínas
plasmáticas após uma dose única, mas que é inferior a 5% em caso de tratamento
continuado (García-Quetglas, Azanza, Sádaba, et al., 2007). O tramadol atravessa a
barreira placentar, sendo a concentração no feto cerca de 80% da verificada na mãe.
Aproximadamente 90% do tramadol é excretado por via renal (25-30% na forma
inalterada), sendo o restante por via fecal, biliar e salivar. Rapidamente a urina atinge
concentrações muito superiores às do plasma. Apenas 0,1% do TMD e do ODT podem
ser excretados no leite materno até 16h após a administração. O tempo de semivida de
eliminação do tramadol é de 5 a 6 h (Grond & Sablotzki, 2004).
As principais vias de metabolização de fase I, mediadas por enzimas CYP, dão origem
aos seus dois principais metabolitos: o O-desmetil-tramadol (ODT), cuja formação é
exclusivamente mediada pela enzima CYP2D6; e o N-desmetil-tramadol (NDT),
através da reação mediada pelas enzimas CYP2B6 e CYP3A4. A formação de um
terceiro metabolito, o N,O-didesmetil-tramadol (DDT), depende da catálise pelas 3
enzimas e, apesar de ter alguma atividade opióide, ela não é significativa. A
metabolização de fase II dá origem a vários metabolitos conjugados (glucuronidos e
sulfatos) e não são ativos (Grond & Sablotzki, 2004). São conhecidos mais de 30
metabolitos do tramadol (Grond & Sablotzki, 2004), resultantes da metabolização de
fase I e II (ver Figura 5).
Suzana Fonseca
Figura 5. Representação esquemática do metabolismo do tramadol.(retirado de https://www.pharmgkb.org/pathway/PA165946349
O metabolito NDT não tem
e 31% da concentração do tramadol
pico de concentração que nunca ultrapassa 18
tramadol e o tempo de semi
ODT é cerca de 700 vezes mais
. Representação esquemática do metabolismo do tramadol.https://www.pharmgkb.org/pathway/PA165946349
o tem atividade e a sua concentração máxima pode variar entre 4
e 31% da concentração do tramadol (Coller et al., 2012). O metabolito ODT tem um
concentração que nunca ultrapassa 18-26% da concentração máxima de
e o tempo de semi-vida é de aprox 7h (Grond & Sablotzki, 2004)
ODT é cerca de 700 vezes mais ativo nos receptores µ opióides do que a mistura
Página 49
. Representação esquemática do metabolismo do tramadol. https://www.pharmgkb.org/pathway/PA165946349)
e a sua concentração máxima pode variar entre 4
O metabolito ODT tem um
26% da concentração máxima de
(Grond & Sablotzki, 2004). O (+)-
opióides do que a mistura
Suzana Fonseca Página 50
racémica de tramadol. A metabolização é estereoseletiva, sendo o (-)-tramadol mais
rapidamente desmetilado em (+)-ODT (García-Quetglas, Azanza, Sádaba, et al., 2007).
Quando uma via metabólica está bloqueada, as vias alternativas são estimuladas.
Estudos in vitro revelam que quando a concentração de tramadol é baixa o metabolito
principal é o ODT. Quando a concentração de tramadol aumenta, a atividade
metabólica alternativa para NDT também aumenta, provavelmente devido à saturação
enzimática. Este fenómeno funciona também como um mecanismo de protecção do
organismo, porque o NDT é um metabolito inativo. Garcia-Quetglas et al. obteve
concentrações de (+)-NDT duas vezes superior nos metabolizadores CYP2D6 lentos
relativamente aos extensivos/normais, não se verificando o mesmo com o (-)-NDT
(García-Quetglas, Azanza, Sádaba, et al., 2007).
A grande variabilidade individual dos efeitos do tramadol pode ser parcialmente
explicada por fatores genéticos (Gan et al., 2007; Somogyi et al., 2007; Svetlik,
Hronová, Bakhouche, Matoušková, & Slanar, 2013), em particular os que estão
relacionados com a sua metabolização (Leppert, 2011). O gene que codifica a enzima
CYP2D6 é muito polimórfico e algumas variantes genéticas afetam a expressão
enzimática. Dependendo do genótipo de cada indivíduo, as concentrações plasmáticas
do TMD e do ODT podem variar, refletindo-se na resposta farmacológica. Foi já
demonstrada a correlação entre a ausência de alelos funcionais (metabolizadores lentos)
e o aumento do rácio metabólico TMD/ODT, bem como uma diminuição do efeito
analgésico (Gan et al., 2007; García-Quetglas, Azanza, Sádaba, et al., 2007; Pedersen,
Damkier, & Brosen, 2005; Pedersen et al., 2006). Koski em 2005 demonstrou que, nos
casos estudados, o fator genético foi o que mais influenciou as concentrações
observadas (Koski, 2005).
Suzana Fonseca Página 51
Garcia-Quetglas avaliou ainda a prevalência de efeitos adversos, verificando uma
maior prevalência nos metabolizadores extensivos/normais que nos PM e concluindo
que provavelmente se devem à acção opióide do (+)-ODT. Existe ainda um estudo que
demonstra haver diferenças de metabolização mesmo entre os metabolizadores
extensivos/normais, quando estão presentes 2 alelos funcionais ou apenas 1.
Comparando estas duas populações ficou demonstrado que a razão metabólica
TMD/ODT aumenta significativamente, e a de TMD/NDT diminui, no grupo que
apresenta um alelo funcional relativamente ao grupo com dois alelos funcionais
(García-Quetglas, Azanza, Sádaba, et al., 2007).
Os ultra-metabolizadores (UM) têm concentrações superiores de ODT, com maior
efeito analgésico, mas também maior risco de reações adversas, nomeadamente
depressão respiratória grave ou cardiotoxicidade (Elkalioubie et al., 2011; Stamer,
Stüber, Muders, & Musshoff, 2008). Foi recentemente publicado por Orliaguet et al
um caso de depressão respiratória aguda num indivíduo UM com 5 anos de idade após
a administração de tramadol (Orliaguet et al., 2015).
O Dutch Pharmacogenetics Working Group publicou em 2011 recomendações para a
prescrição e dosagem de tramadol, tendo em conta a caracterização do gene CYP2D6
(http://www.pharmgkb.org/guideline/PA166104959), sugerindo que nos casos dos
metabolizadores lentos seja alterada a prescrição para analgésicos com outra via
metabólica (não pode ser codeína nem oxicodona). Na página da PharmGKB foi
publicada uma nota clínica onde se referem expressamente as variantes genéticas que
têm elevado nível de correlação com as concentrações de tramadol (CYP2D6 *1, *10,
*1XN, *2, *2XN, *3, *4, *5, *6) (http://www.pharmgkb.org). Também a FDA emitiu
uma recomendação para a utilização de um medicamento com Tramadol e
Paracetamol (ULTRACET®) a qual adverte relativamente à sua utilização por
Suzana Fonseca Página 52
metabolizadores lentos e às interações com substâncias inibidoras da atividade da
enzima CYP2D6 (http://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2001
/21123lbl.pdf; Coller et al. 2012).
O estudo da caracterização genética e fenotípica contribui para que se consiga prever a
atividade enzimática a nível individual, permitindo a escolha da terapia adequada (em
casos clínicos) ou entender as reações adversas que possam ocorrer, bem como
justificar e entender as concentrações encontradas nas perícias em toxicologia forense
(Sistonen, 2008; Zackrisson, 2009).
A possibilidade de aplicação das metodologias de detecção das variantes genéticas em
amostras post mortem foi demonstrada por Levo et al, que analisou 33 casos de
autópsia tendo verificado a existência de correlação entre o genótipo dos indivíduos e
os resultados de quantificação do tramadol e dos seus metabolitos no sangue post
mortem(Levo et al., 2003).
2.7 Técnicas e métodos de genotipagem
A genotipagem consiste na caracterização genética de um indivíduo, ou de uma
amostra de ADN, com um determinado painel de marcadores que são selecionados de
acordo com a aplicação que se pretende. No caso da farmacogenética, a genotipagem
tem como objectivo identificar as variantes genéticas que tenham influência na
resposta aos fármacos e pode incluir genes de enzimas de metabolização, de proteínas
de transporte ou de receptores (Frank Musshoff et al., 2010a).Na pesquisa
bibliográfica verificou-se a existência de várias metodologias já testadas e
implementadas em diversos laboratórios, muitas delas desenhadas de acordo com os
objetivos de cada trabalho, havendo também sistemas comerciais (Hicks et al., 2013;
Koch, 2004; H. K. Lee et al., 2007; Lyon et al., 2012). Segundo um estudo publicado
Suzana Fonseca Página 53
em 2011 por Fleeman et al, o custo cobrado por laboratórios subcontratados para a
genotipagem variava, à data, entre 30£ e 500£/amostra, havendo também grandes
diferenças na tecnologia utilizada por cada laboratório e no número de alelos
pesquisado (Fleeman et al., 2011).
Entre as metodologias mais utilizadas, destacam-se as que utilizam enzimas de
restrição (Restriction Fragment Length Polymorphism analysis - RFLP) com maior
número de publicações (Bagheri et al., 2015; Barreto, 2011; Dorado et al., 2005; Levo
et al., 2003; Sachse, Brockmöller, Bauer, & Roots, 1997). Esta metodologia requer um
elevado número de reações de amplificação (além da amplificação de gene inteiro,
requer pelo menos uma PCR para cada variante), é muito seletiva mas pouco
abrangente, pois não deteta outras variantes além das que foram incluídas no seu
desenvolvimento. Esta característica também se verifica nas tecnologias específicas
para a detecção de SNPs.
Os kits comerciais são tecnologias desenvolvidas para aplicar em laboratórios de
ensaio clínico, caracterizando os indivíduos relativamente a um grande número de
polimorfismos em vários genes (Almoguera et al., 2010; Chou et al., 2003; Galan,
Guivier, Caraux, Charbonnel, & Cosson, 2010; Kramer et al., 2009; H. K. Lee et al.,
2007). Pratt et al. fizeram a comparação entre seis metodologias de detecção de
variantes em genes CYP, utilizando para tal 107 materiais de referência do Coriell
Cell Repositories (Pratt et al., 2010). As plataformas comerciais mais utilizadas são
Amplichip CYP450 Test da Roche e xTAG CYP2D6 Kit da Luminex. No entanto, são
onerosas, apenas rentáveis quando se destinam a um grande volume de amostras. Estas
tecnologias não existem no SGBF da delegação Sul do INMLCF.
Suzana Fonseca Página 54
A sequenciação de Sanger usa tecnologia atualizada para obter sequências de ADN
com elevada qualidade até 1000 pb, em 1 a 2 dias, e com custos operacionais e de
consumíveis relativamente baixos, dependendo do tipo de aplicação (v.g. o fluxo de
amostras, que em casos forenses será baixo). É a tecnologia de referência para
validação de todos os outros métodos, tendo apenas a limitação de não ser possível a
detecção do número de cópias de gene (CNV).
A metodologia de sequenciação demonstra-se, assim, adequada ao objetivo forense,
conseguindo identificar as variantes com maior relevância clínica, com especificidade,
abrangência (pois pode detetar outras variantes além das selecionadas), rapidez e baixo
custo (Riccardi et al., 2013). Além disso, permite incluir na pesquisa qualquer novo
polimorfismo relevante, logo que seja identificado, desde que esteja nos fragmentos
amplificados. A metodologia de sequenciação de Sanger é já utilizada no SGBF em
ADN mitocondrial, sendo possível implementar o método de sequenciação do
CYP2D6 utilizando os consumíveis e equipamentos existentes.
Suzana Fonseca Página 55
3 Objetivos
O objetivo geral deste trabalho foi desenvolver uma metodologia de caracterização do
gene CYP2D6 em amostras de sangue post mortem, tendo em vista a identificação de
metabolizadores lentos em casos positivos para tramadol.
Do objetivo global derivam objetivos parcelares, a saber:
1. Desenvolvimento e validação de uma metodologia de sequenciação parcial do
gene CYP2D6 para a detecção de variantes nulas em amostras de sangue post
mortem;
2. Validação da metodologia de quantificação de tramadol e dos seus metabolitos
em amostras de sangue post mortem;
3. Aplicação das metodologias desenvolvidas a amostras de sangue post mortem
positivas para tramadol;
4. Avaliação da existência de correlação entre os resultados obtidos pelas duas
metodologias.
Suzana Fonseca Página 56
Suzana Fonseca Página 57
4 Materiais e Métodos
4.1 Amostragem
Neste trabalho foram analisadas amostras colhidas no âmbito das perícias realizadas
no INMLCF, ao abrigo do artigo 31º da Deliberação nº 849/2010, de 07 de maio
(Regulamento Interno do INMLCF), que prevê a utilização de amostras da rotina
pericial para fins de investigação científica, pelo que não suscita questões de natureza
ética ou legal.
Foram selecionadas 100 amostras de sangue post mortem dos casos que deram entrada
no SQTF entre janeiro de 2012 e junho de 2015 e com resultado positivo para
tramadol. A seleção de casos positivos para tramadol como objeto de estudo neste
trabalho, tem os seguintes fundamentos:
a. A elevada prevalência na casuística do SQTF;
b. O metabolismo do tramadol ser bem conhecido e a atividade opióide depender
quase só da enzima CYP2D6 (Grond & Sablotzki, 2004);
c. A correlação entre fenótipo e genótipo já ter sido demonstrada em amostras
post mortem (Levo et al., 2003) e o tramadol ser considerado como substância
de teste para a obtenção de rácios metabólicos em alguns ensaios clínicos
(Pedersen et al., 2005);
d. A disponibilidade de método analítico no SQTF com sensibilidade para a
quantificação do tramadol e também dos metabolitos principais (NDT e ODT);
e. As dificuldades de interpretação de alguns casos registados nos últimos anos
em Portugal, casos esses com concentração de tramadol superior ao intervalo
terapêutico, sem que haja quaisquer indício ou suspeita de intoxicação
voluntária ou acidental.
Suzana Fonseca
1. Preparação das amostras
2. Extracção do ADN
3. Quantificação de ADN
Foram ainda selecionadas, para a validação do método de quantificação de tramadol e
metabolitos, 40 amostras de sangue periférico e de sangue colhido na cavidade
cardíaca negativas para medicamentos.
As amostras de sangue periférico foram colhidas durante a autópsia para tubos de 10
mL com fluoreto de sódio, usado como conservante, e foram armazenadas a
Nos 5 casos em que o sangue periférico tinha volume insuficiente, foram usadas
amostras de sangue colhido na cavidade cardíaca.
4.2 Metodologia de
A caracterização do gene
amplificados, onde se localizam os polimorfismos com maior relevância na expressão
enzimática. Para tal, após a extraçã
por PCR, que depois foram analisados pelo método de sequenciação de
Figura 6).
Figura
Durante o desenvolvimento do método revelou
a amostras degradadas e a necessidade de aumentar a sensibilidade para a a
de ADN fragmentado.
4. Reacção de Amplificção por PCR
5. Purificação com ExoSAPiT
6. Verificação em gel de poliacrilamida
7. Reacção de sequenciação
8. Detecção por Electroforese Capilar
9. Análise dos resultados
Foram ainda selecionadas, para a validação do método de quantificação de tramadol e
metabolitos, 40 amostras de sangue periférico e de sangue colhido na cavidade
cardíaca negativas para medicamentos.
tras de sangue periférico foram colhidas durante a autópsia para tubos de 10
mL com fluoreto de sódio, usado como conservante, e foram armazenadas a
casos em que o sangue periférico tinha volume insuficiente, foram usadas
lhido na cavidade cardíaca.
Metodologia de análise genética
caracterização do gene CYP2D6 foi efetuada por sequenciação de fragmentos
amplificados, onde se localizam os polimorfismos com maior relevância na expressão
Para tal, após a extração do ADN, fez-se a amplificação dos fragmentos
por PCR, que depois foram analisados pelo método de sequenciação de
Figura 6. Fluxograma do método de análise genética.
envolvimento do método revelou-se importante o fator de aplicabilidade
a amostras degradadas e a necessidade de aumentar a sensibilidade para a a
Página 58
7. Reacção de sequenciação
8. Detecção por Electroforese Capilar
9. Análise dos resultados
Foram ainda selecionadas, para a validação do método de quantificação de tramadol e
metabolitos, 40 amostras de sangue periférico e de sangue colhido na cavidade
tras de sangue periférico foram colhidas durante a autópsia para tubos de 10
mL com fluoreto de sódio, usado como conservante, e foram armazenadas a -10ºC.
casos em que o sangue periférico tinha volume insuficiente, foram usadas
por sequenciação de fragmentos
amplificados, onde se localizam os polimorfismos com maior relevância na expressão
se a amplificação dos fragmentos
por PCR, que depois foram analisados pelo método de sequenciação de Sanger (ver
de aplicabilidade
a amostras degradadas e a necessidade de aumentar a sensibilidade para a amplificação
Suzana Fonseca Página 59
4.2.1 Preparação das amostras
As manchas de sangue foram preparadas em papel Whatman®
FTA, com o
procedimento habitualmente utilizado no SGBF. Este é um bom meio de conservação
da amostra, que permite um longo período de armazenamento (Healthcare 2009 -
Whatman FTA™ data file 51750), tendo já sido demonstrada a sua aplicabilidade a
metodologias de farmacogenética (Mas, Crescenti, Gassó, Vidal-Taboada, & Lafuente,
2007).
As manchas de sangue foram codificadas de modo a garantir a confidencialidade e
também a rastreabilidade. O código único para cada mancha consiste nas 3 letras
“CYP” seguidas de 3 algarismos sequenciais a partir do 001 e pela ordem de
preparação da mancha (exemplo: CYP001).
4.2.2 Extração de ADN
A extração de ADN das manchas de sangue foi realizada pelo método de Chelex®
100
da BioRad a 5% (m/v), segundo o método de Walsh (Walsh, Metzger, & Higuchi,
1991) e conforme procedimento recomendado pela Whatman (GE Healthcare 2010 -
Application note 28-9822-22 AA).
O Chelex100® é uma resina de troca iónica quelante (copolímero de divinilbenzeno)
que através de um processo simples e a temperatura elevada promove a lise
membranar, precipita a hemoglobina e retém iões metálicos, proteínas desnaturadas e
outros inibidores de PCR. Este processo de captura dos iões metálicos, com maior
afinidade para o cobre, chumbo e ferro, promove também a inativação da enzima
responsável pela quebra das ligações entre os nucleótidos, protegendo a integridade do
ADN (Barea, Pardini, & Gushiken, 2004; Bio-Rad Laboratories, 2000).
No final do processo de extração, e após a centrifugação, o ADN extraído encontra-se
no sobrenadante (aproximadamente 150µL), existindo um depósito formado com o
Suzana Fonseca Página 60
Chelex e todas as substâncias a desprezar. As amostras assim extraídas foram
armazenadas a -20ºC.
4.2.3 Quantificação
A determinação da concentração e da pureza do ADN genómico extraído foi efetuada
com um kit Quantifiler®
Trio DNA Quantification da Applied Biosystems (AB),
seguindo as recomendações do fabricante (Applied Biosystems, 2014).
O Quantifiler Trio faz a amplificação e a quantificação de vários loci em simultâneo
(para aumentar a sensibilidade) e em zonas com menor variabilidade individual e
populacional (para aumentar a precisão), com 3 objetivos: amplificar pequenos
fragmentos autossómicos (80 pb), amplificar grandes fragmentos autossómicos (214pb)
e determinar o género (75 pb no cromossoma Y).
O Quantifiler Trio permite efetuar uma análise quantitativa por sondas TaqMan® num
sistema RealTime PCR 7500, e assim obter além da concentração, também a qualidade
do ADN humano de cada amostra através de um índice de degradação (Vernarecci et
al., 2015). A concentração de ADN amplificável é útil para ajustar o volume de
amostra a utilizar na preparação da reação de amplificação. O índice de degradação e
de inibição permite aferir a possibilidade de amplificar fragmentos com mais de 200pb.
4.2.4 Seleção dos alelos
Os polimorfismos alvo da metodologia foram selecionados utilizando como critério a
sua correlação com a atividade enzimática e a frequência populacional, segundo
revisão da literatura. De acordo com o exposto no ponto 2.5.3. e tendo em conta a
limitação desta metodologia relativamente à detecção da variação do número de cópias
do gene (ver ponto 2.7), as variantes alélicas do gene CYP2D6 selecionadas para o
estudo são:
Suzana Fonseca
CYP2D6 *3 (rs4986774)
CYP2D6 *4 (rs3892097
CYP2D6 *6 (rs5030655)
Dada a abrangência do método, foi possível
localizadas nos fragmentos sequenciados,
(1758G>T), *10 (100C>T)
ainda *40 (1863_1864ins TTTCGCCCCx2)
(73C>T), *49 (1611T>A)
Figura 7. Variantes do gene CYP2D6 estudadas
4.2.5 Amplificação por PCR
A amplificação do ADN é um processo de replicação de um fragmento
aumentando a sua concentração
A Polymerase Chain Reaction
seguido pela replicação natural
espaço de tempo, a frequência n
delimitado pelos iniciadores d
3 fases, que se repetem ciclicamente:
(rs4986774) – 2549delA;
(rs3892097) – 100C>T e 1846G>A;
(rs5030655) – 1707delT.
ada a abrangência do método, foi possível pesquisar outras variantes genéti
nos fragmentos sequenciados, em particular as seguintes:
(100C>T), *12 (124G>A), *14 (1758G>A), *15 (137_138insT)
(1863_1864ins TTTCGCCCCx2), *43 (77G>A), *44
(1611T>A), *50 (1720A>C), entre outros (ver Figura 7).
Variantes do gene CYP2D6 estudadas neste trabalho.
Amplificação por PCR
A amplificação do ADN é um processo de replicação de um fragmento
concentração na amostra, de forma a possibilitar a análise.
Polymerase Chain Reaction (PCR) é uma reação em cadeia baseada no princípio
seguido pela replicação natural que aumenta, de forma exponencial e num curto
espaço de tempo, a frequência na amostra de um determinado fragmento de ADN
iniciadores da reação, denominados primers. Para tal são necessárias
3 fases, que se repetem ciclicamente:
Página 61
pesquisar outras variantes genéticas
em particular as seguintes: CYP2D6*8
(137_138insT), e
4 (82C>T), *47
).
neste trabalho.
A amplificação do ADN é um processo de replicação de um fragmento de ADN,
de forma a possibilitar a análise.
baseada no princípio
aumenta, de forma exponencial e num curto
fragmento de ADN
. Para tal são necessárias
Suzana Fonseca Página 62
1. Desnaturação: separação das cadeias complementares do ADN a T> 90ºC;
2. Hibridização ou Annealing: ligação dos primers às cadeias simples de ADN a
temperatura mais baixa (entre 50 e 65ºC). A seleção da temperatura de
annealing é dependente dos primers e do meio e é um fator crítico no
desenvolvimento do método.
3. Extensão: ligação dos dNTP (desoxinucleótidos trifosfatados) às duas cadeias
simples de ADN sempre a partir do extremo 3’ de cada primer, criando duas
cadeias duplas. A extensão é catalisada pela enzima Taq polimerase a 72ºC,
exclusivamente na direção 5’ para 3’do ADN.
A repetição dos ciclos, com um controlo rigoroso de temperaturas e tempos, usando
para tal um termociclador, permite um aumento exponencial do número de fragmentos.
Para que as reações em cadeia se possam realizar é necessária, além da amostra, a
presença de uma enzima catalítica (HotStarTaq®
DNA Polymerase), do controlo de
meio por utilização de um tampão com cloreto de magnésio (QIAGEN Multiplex PCR
Buffer com 6 mM MgCl2), de dNTPs (desoxinucleótidos trifosfatados: adenina,
citosina, guanina e timina) e dos primers específicos para o fragmento alvo.
Neste trabalho, a amplificação por PCR foi efetuada com a química Multiplex PCR
Master Mix da Qiagen, segundo as recomendações do fabricante (Qiagen, 2010).
Os iniciadores ou primers são sequências de nucleótidos sintetizadas quimicamente
com 20 a 25 pb, complementares ao ADN das extremidades do fragmento alvo. A
escolha dos primers é o fator fundamental para a especificidade do método e para cada
fragmento de ADN que se pretende amplificar. São necessários dois primers que se
ligam a cada uma das extremidades 3' das cadeias de ADN simples já desnaturadas.
Os primers utilizados neste trabalho encontram-se descritos na Tabela 4.
Suzana Fonseca Página 63
Tabela 4. Sequências dos primers e localização dos fragmentos.
primer Sequência pb Localização Referência
F1 CAGTCAACACAGCAGGTTCA 437 1446 a 1883 Levo et al. 2003
R1 CCTGTGGTTTCACCCACCAT (-173 a 264)
FH TCCCAGCTGGAATCCGGTGTCG 736 2918 a 3653 Hersberger 2000
R2 GAGACTCCTCGGTCTCTCG (1300 a 2034) Levo et al. 2003
F3 GCTGGGGCCTGAGACTT 200 3988 a 4188 Levo et al. 2003
R3 GGCTGGGTCCCAGGTCATAC (2369 a 2569)
A reação de PCR preparou-se para um volume final de 25 µL, com: 12,5 µL de
Multiplex PCR Master Mix 2x; DMSO a 5%; 200 nM de cada primer e
aproximadamente 200 nM de ADN, perfazendo o volume final com água.
O termociclador foi programado para uma desnaturação inicial de 15 minutos a 95ºC,
os ciclos específicos para cada par de primers e uma extensão final de 7 minutos a
72ºC, conforme se descreve na Tabela 5.
Tabela 5. Condições dos ciclos de temperatura da reação de PCR.
F1+R1 FH+R2 F3+R3
Desnaturação inicial 95ºC/15 min 95ºC/15 min 95ºC/15 min
Nº ciclos 40 40 35
desnaturação 94ºC/30s 94ºC/30s 94ºC/30s
hibridação 55ºC/30s 55ºC/30s 57ºC/30s
extensão 72ºC/30s 72ºC/30s 72ºC/30s
Extensão final 72ºC/7 min 72ºC/7 min 72ºC/7 min
Na amplificação de cada grupo de amostras juntou-se um controlo de reagentes de
amplificação e, sempre que possível, um controlo de amostra.
Suzana Fonseca Página 64
4.2.6 Purificação dos produtos amplificados
Os produtos de amplificação foram purificados com ExoSAP-IT® da Affymetrix. Este
reagente de purificação é constituído por duas enzimas hidrolíticas: a Exonuclease 1
remove primers residuais e outros resíduos de ADN; a fosfatase alcalina de camarão
(Shrimp Alkaline Phosphatase: SAP) remove dNTPs residuais. A reação de
purificação foi efetuada num termociclador, conforme as recomendações do fabricante
[ExoSAP-IT®
protocol], mantendo a temperatura a 37ºC durante 15 minutos, seguido
de uma inativação dos resíduos e das enzimas a 80ºC durante 15 minutos.
4.2.7 Verificação em gel de poliacrilamida
O rendimento da reação de amplificação foi verificado por eletroforese em gel de
poliacrilamida (SDS-PAGE: Sodium Dodecyl Sulfate - PolyAcrylamide Gel
Electrophoresis (Amersham Biosciences, 1998)) seguida de revelação de coloração de
prata (Silver Staining), com um equipamento Phastsystem da GE Healthcare.
A eletroforese foi efetuada com o gel PHASTGEL gradient 10-15 e o tampão em gel
PHASTGEL buffer strips. Para a coloração foi utilizado o PhastGel DNA Silver
Staining Kit, seguindo as recomendações do fabricante.
Pela observação do gel foi possível avaliar a existência de produtos amplificados, o
tamanho relativo dos fragmentos e a negatividade do controlo de reagentes de
amplificação.
4.2.8 Sequenciação
A sequenciação de Sanger é um método que foi desenvolvido por este autor em 1977 e
que permite conhecer a localização e ordem dos nucleótidos de um fragmento de ADN
(Sanger, Nicklen, & Coulson, 1977). O método é semelhante ao PCR, utilizando-se
apenas um primer de cada par, DNA polimerase, nucleótidos (dNTPs) e
dideoxinucleótidos (ddNTPs). Durante a extensão, além de serem incorporados os
Suzana Fonseca Página 65
dNTPs, vão sendo incluídos também os ddNTPs, que se caracterizam por não ter o
grupo hidroxilo que permite ligar ao nucleótido seguinte, terminando a extensão. São
então formados produtos de dimensões diferentes com um ddNTP na extremidade 3’.
Cada ddNTP tem um marcador fluorescente de acordo com a base a que corresponde,
marcando o nucleótido final. Os fragmentos de ADN de tamanho diferente são então
separados por eletroforese capilar e o último nucleótido é identificado pelo detetor de
fluorescência induzida por LASER (Applied Biosystems, 2009).
A sequenciação foi efetuada com a química BigDye Terminator v. 3,1 Cycle
Sequencing Kit da Applied Biosystems (AB), segundo as recomendações do fabricante
(Applied Biosystems, 2002). Para controlo do meio utilizou-se Better Buffer e os
primers descritos anteriormente para as reações de amplificação por PCR.
A reação de sequenciação foi preparada para um volume final de 10 µL, com: 2 µL de
BigDye Terminator v. 3,1; 4 µL de Better Buffer; DMSO a 5%; 500nM de um dos
primers do fragmento amplificado e 1µL de produto amplificado, perfazendo o
volume final com água. As reações de sequenciação foram efetuadas em placa de 96
poços e a cada grupo de amostras juntou-se um controlo de reagentes de sequenciação
e, quando possível, um controlo de amostra.
O termociclador foi programado conforme as condições de tempos e temperaturas
apresentadas na Tabela 6.
Tabela 6. Condições dos ciclos de temperatura da reação de sequenciação.
F1+R1 FH+R2 F3+R3
Desnaturação inicial 95ºC/3 min 95ºC/3 min 95ºC/3 min
Nº ciclos 35 35 35
desnaturação 95ºC/20s 95ºC/20s 95ºC/20s
hibridação 55ºC/20s 55ºC/20s 57ºC/20s
extensão 60ºC/6 min 60ºC/6 min 60ºC/6 min
Suzana Fonseca
Os produtos de sequenciação foram purificados com
kit da Applied Biosystems
dos produtos, seguindo as indicações do fabricante
4.2.9 Detecção por eletroforese
Os produtos de sequenciação foram separados de acordo com o seu
por eletroforese capilar: os fragmentos de ADN com carga negativa deslocam
o cátodo a uma velocidade inversamente proporcional ao seu peso molecular.
dos capilares está colocado um
Figura 8). Este processo consegue diferenciar os produtos de extensão com a resolução
de 1 base (Applied Biosystems, 2009)
Figura 8. Demonstração esquemática da sequenciação com
A análise por eletroforese
sequenciador automático
equipado com 4 capilares de 36 cm.
capilares o polímero POP
utilizados neste método
simultâneo, sendo que cada corrida demora cerc
Obtém-se assim um eletroferograma
sequência de sinais de fluorescência
Os produtos de sequenciação foram purificados com BigDye Xterminator Purification
Applied Biosystems para a remoção dos resíduos de sequenciação e estabilização
tos, seguindo as indicações do fabricante (Applied Biosystems, 2007)
eletroforese capilar
Os produtos de sequenciação foram separados de acordo com o seu
: os fragmentos de ADN com carga negativa deslocam
o cátodo a uma velocidade inversamente proporcional ao seu peso molecular.
dos capilares está colocado um detetor de fluorescência por indução com LA
Este processo consegue diferenciar os produtos de extensão com a resolução
(Applied Biosystems, 2009).
. Demonstração esquemática da sequenciação com BigDye Terminator v. 3,1
eletroforese capilar dos produtos sequenciados foi
sequenciador automático Genetic Analyser 3130 da Applied Biosystems (AB)
lares de 36 cm. Utilizou-se como matriz de separação nos
POP-6 da AB, que é adequado para o tamanho dos
utilizados neste método. O equipamento permite a análise de 4 amostras em
simultâneo, sendo que cada corrida demora cerca de 1:30h.
eletroferograma, que corresponde à representação gráfica da
sinais de fluorescência correspondentes ao ddNTP terminal de cada
Página 66
BigDye Xterminator Purification
para a remoção dos resíduos de sequenciação e estabilização
(Applied Biosystems, 2007).
Os produtos de sequenciação foram separados de acordo com o seu peso molecular
: os fragmentos de ADN com carga negativa deslocam-se para
o cátodo a uma velocidade inversamente proporcional ao seu peso molecular. No final
por indução com LASER (ver
Este processo consegue diferenciar os produtos de extensão com a resolução
BigDye Terminator v. 3,1.
s produtos sequenciados foi efetuada num
Applied Biosystems (AB),
se como matriz de separação nos
o tamanho dos fragmentos
O equipamento permite a análise de 4 amostras em
representação gráfica da
correspondentes ao ddNTP terminal de cada
Suzana Fonseca Página 67
fragmento em função do tempo de migração na matriz do capilar. Tendo em conta que
para cada amostra foram analisados 3 fragmentos delimitados por 2 primers cada um,
obtiveram-se 6 eletroferogramas por amostra.
4.2.10 Análise dos resultados
A qualidade dos eletroferogramas obtidos foi avaliada usando o programa informático
Sequencing Analysis versão 5.2 da AB (Applied Biosystems, 2009). Verificou-se a
resolução dos sinais detetados e a sua altura (que será proporcional à concentração
final), o número de bases detetadas em cada sequência, bem como a existência de
interferências.
A comparação com a sequência de referência (CYP2D6*1,entrada M33388.1 no
GenBank) e a classificação das variantes de cada amostra foi efetuada com recurso ao
programa informático SeqScape versão 3, da AB (Applied Biosystems, 2012b). Este
programa faz automaticamente o alinhamento das sequências obtidas com a de
referência, de acordo com os parâmetros de análise definidos no método.
O SeqScape permite de uma forma expedita, verificar as diferenças relativamente à
sequência de referência e, após uma avaliação cuidada de cada base, identificar as
variantes genéticas da amostra.
4.3 Validação do método de análise genética
A validação dos métodos permite conhecer os seus limites e demonstrar a
adequabilidade ao uso que se pretende, através do estudo de parâmetros objetivos e
cientificamente aceites. É importante, em particular, a demonstração da possibilidade
de utilização na rotina pericial e a sua exatidão.
Para a seleção dos parâmetros a avaliar na validação do método de análise genética,
consideraram-se:
Suzana Fonseca Página 68
os objetivos específicos do método e as suas características;
o tipo de amostras em que será aplicado – sangue post mortem;
as recomendações da SWGDAM para validação de métodos (Scientific
Working Group on & Methods, 2012);
as recomendações da ENFSI para validação de métodos (ENFSI DNA
WORKING GROUP, 2010);
o Procedimento Geral de Validação de Ensaios em vigor no SGBF;
a revisão bibliográfica sobre validação de métodos de sequenciação
(Branicki, Kupiec, & Pawlowski, 2003; Budowle et al., 2014; Holland
& Parsons, 1999; Pont-kingdon et al., 2012; Wilson, DiZinno,
Polanskey, Replogle, & Budowle, 1995).
Os parâmetros avaliados são:
1. Especificidade e exatidão;
2. Limite de detecção;
3. Precisão do método: repetibilidade e reprodutibilidade;
4. Qualidade média dos resultados.
4.3.1 Especificidade e Exatidão
A metodologia de sequenciação de Sanger é, por natureza, muito específica dado que
se analisam sequências com mais de 200 pb e todos são comparados com a sequência
de referência (Sanger et al., 1977). Para tal é essencial escolher uma sequência de
referência credível e utilizar primers seletivos. A sequência de referência foi
selecionada tendo em conta a utilizada pelo Human Cytochrome P450 Allele
Nomenclature Committee: a entrada do Genbank m33388.1
(http://www.cypalleles.ki.se/cyp2d6.htm).
Suzana Fonseca Página 69
A avaliação da especificidade deve garantir que os primers são suficientemente
seletivos para que os produtos de sequenciação obtidos sejam efetivamente os
pretendidos, neste caso, fragmentos do gene CYP2D6. A ferramenta de pesquisa
BLAST disponibilizada pela NCBI em http://blast.ncbi.nlm. nih.gov/Blast.cgi, pode
ser utilizada para verificar a especificidade, quer dos primers utilizados (no Primer
BLAST), quer das sequências obtidas (Branicki et al., 2003; Morgulis et al., 2008;
Pont-kingdon et al., 2012). Os 6 primers utilizados e os produtos de sequenciação de 3
amostras com variantes genéticas diferentes foram assim verificados (6 sequências por
amostra). Dada a elevada homologia dos pseudogenes CYP2D7 e CYP2D8 com o
gene CYP2D6, procuraram-se ainda as diferenças entre as sequências obtidas apara as
amostras e a de referência dos 2 pseudogenes (entrada no Genbank m33387.1).
A exatidão consiste na concordância entre os resultados obtidos pela metodologia
desenvolvida e os reais, isto é, se as variantes detetadas são as que efetivamente estão
presentes (Pont-kingdon et al., 2012; Scientific Working Group on & Methods, 2012).
A exatidão pode aferida por comparação com os resultados de outro laboratório, outro
método ou outros primers e usando sempre controlos negativos, mas deve ser sempre
confirmada com recurso a materiais de referência como os que são disponibilizados
pelo Coriell Cell Repositories ou então com ensaios de aptidão interlaboratoriais (Pratt
et al., 2010). Neste trabalho, utilizaram-se materiais de referência do Coriell Cell
Repositories com as variantes dos 3 alelos mais prevalentes e que contêm todas as
variantes que foram detetadas nas amostras post mortem analisadas:
a. MR1: CYP2D6 *4/*4 ref Coriell - NA17226
b. MR2: CYP2D6 *3/*2 ref Coriell - NA17280
c. MR3: CYP2D6 *6/*1 ref Coriell – NA17300
Suzana Fonseca Página 70
Aplicou-se o procedimento de ensaio completo (excluindo extração) e identificaram-
se as variantes nas sequências obtidas, comparando-as depois com os certificados, que
se encontram no Anexo I.
4.3.2 Limiares analíticos
O método desenvolvido é um método qualitativo, pelo que dos limiares analíticos
apenas o limite de detecção tem relevância (ENFSI DNA WORKING GROUP, 2010;
Scientific Working Group on & Methods, 2012).
Selecionaram-se duas amostras controlo com concentração conhecida: controlo THP
(10 ng/uL) e controlo 007 (0.1 ng/uL) (Applied Biosystems, 2012a, 2014). Fizeram-se
diluições de cada amostra em água de forma a obter 6 amostras com as concentrações:
10 ng/uL; 1 ng/uL; 0.5 ng/uL; 0.1 ng/uL; 0.05 ng/uL e 0.01 ng/uL. Aplicou-se o
procedimento de amplificação e sequenciação completo. Avaliou-se a capacidade de
resposta da sequenciação através dos seguintes parâmetros: sinal; S/R; identificação do
genótipo.
4.3.3 Precisão do método: repetibilidade e reprodutibilidade
A precisão é uma forma de medir a variabilidade dos erros aleatórios, através da
dispersão observada nos resultados de ensaios independentes da mesma amostra.
4.3.3.1 Repetibilidade
Fizeram-se triplicados de 5 amostras de genótipo diferente, em simultâneo e mantendo
todas as condições de análise, excepto a localização no termociclador e na placa do
sequenciador (ENFSI DNA WORKING GROUP, 2010; Scientific Working Group on
& Methods, 2012).
Suzana Fonseca Página 71
4.3.3.2 Reprodutibilidade
Aplicou-se o método desenvolvido a 15 amostras com genótipo diferente, em 3 dias
diferentes, tendo sido contempladas as fontes de variabilidade que simulam o normal
funcionamento do laboratório (data, reagentes, condições ambientais, termocicladores,
pipetas, etc.) (ENFSI DNA WORKING GROUP, 2010; Scientific Working Group on
& Methods, 2012).
4.3.4 Qualidade média dos resultados.
A qualidade média dos resultados pode ser aferida utilizando parâmetros fornecidos
pelo programa de análise das sequências (SeqSCAPE) durante o estudo da
reprodutibilidade (Pont-kingdon et al., 2012). Calculou-se a média e o coeficiente de
variação para 5 amostras:
a. Intensidade de sinal;
b. Sinal / ruído das bases;
c. Sample score.
A utilização de controlos de reagentes e de amostra permite aferir se os reagentes,
primers, consumíveis e equipamentos utilizados em cada conjunto de amostras, bem
como as condições ambientais em cada dia de análise, estão aptos a gerar resultados
que cumpram critérios de qualidade.
4.4 Metodologia de quantificação de tramadol e metabolitos
A quantificação de tramadol e dos metabolitos ODT e NDT foi efetuada por
cromatografia gasosa com detetor de espectrometria de massas (GC/MS), após
extração em fase sólida (SPE).
Suzana Fonseca Página 72
4.4.1 Preparação das amostras
As amostras de sangue total post mortem foram homogeneizadas agitando suavemente
durante pelo menos 10 minutos, até atingirem uma temperatura próxima da ambiente.
Para tubos de 10 mL adicionaram-se 5 mL de tampão fosfato pH 7.00 da Merck; 25
µL de uma solução de padrão interno (solução a 1 ug/mL de fentanil) e a toma de
ensaio de sangue total (500µL). Após homogeneização por rotação/inversão durante
cerca de 5 minutos, centrifugaram-se a 3500 rpm durante 15 minutos.
Paralelamente às amostras em duplicado, prepararam-se 7 calibradores na gama de
trabalho (50 ng/mL a 1000 ng/mL), controlos em 3 níveis de concentração (150 ng/mL,
500 ng/ml e 850 ng/mL) e os controlos negativos: de reagentes e do sangue branco
usado como matriz para os calibradores e restantes controlos. Os calibradores e os
controlos foram preparados por fortificação com soluções de padrões primários
Cerilliant de tramadol, O-desmetil-tramadol, N-desmetil-tramadol e fentanil, com as
concentrações de 1 ug/mL e 10 ug/mL..
4.4.2 Extração em fase sólida
Usando colunas de extração em fase sólida Waters Oasis HLB® de 3cc e 60 mg, fez-se
a extração das substâncias de interesse com o procedimento descrito na Tabela 7.
Tabela 7. Extração em fase sólida com colunas Waters Oasis HLB®.
Ativação Acondicionamento
2 mL de metanol p.a.
2 mL de água ultra-pura
Aplicação da amostra Amostra
Lavagem 2 mL de metanol a 5%
Secagem das colunas Secar as colunas sob vácuo cerca de 30 min
Eluição para tubos de vidro 2 mL de metanol p.a.
Levou-se o extrato à secura sob corrente de azoto a 35 ºC (cerca de 30 minutos) e
redissolveu-se em 75 µL de metanol. Transferiu-se o extrato para um vial adequando
ao injector automático.
Suzana Fonseca Página 73
4.4.3 Análise por GC/MS
A análise das amostras foi efetuada num cromatógrafo gasoso Agilent 6890 acoplado a
um detetor de massa Agilent 5973, com as condições do método que se encontram
descritas na Tabela 8.
Tabela 8. Descrição dos parâmetros de análise instrumental por GC/MS.
Parâmetro Descrição
Modo e volume de injeção 2 µL, split 1:10
Fluxo inicial 1 mL/min
Temperatura e tempo inicial 150 °C, 1 min
Gradiente 5 °C/min
Temperatura e tempo final 290 °C, 8 min
Modo de ionização Impacto Eletrónico
Modo de aquisição SIM, SCAN
Iões adquiridos e tempos de retenção: Iões / TR
tramadol 58, 263, 135 / 12,2 min
N-desmetil-tramadol 188, 249, 135 / 12,6 min
O-desmetil-tramadol 58, 249, 121 / 13,5 min
fentanil 245 / 25 min
4.4.4 Avaliação dos resultados
Após integração dos sinais cromatográficos obtidos para cada ião ao tempo de
retenção de cada composto, para todas as amostras, calibradores e controlos, foram
efetuados os cálculos de confirmação qualitativa e quantitativa em Microsoft®
Excel.
A identificação das substâncias presentes nas amostras é efetuada por comparação das
áreas dos sinais cromatográficos obtidos com os de um controlo fortificado preparado
em simultâneo e em condições idênticas, por cumprimento dos seguintes critérios
(documentados no Procedimento Operacional de Avaliação e cálculo de resultados,
em vigor no SQTF):
Suzana Fonseca Página 74
a. a razão sinal/ruído (S/R) deve ser superior a 3 para todos os sinais;
b. o tempo de retenção relativo (TRR) de cada substância não deve diferir
mais que 1% do obtido para o controlo;
c. as relações iónicas dos três iões característicos e no tempo de retenção de
cada composto não devem diferir mais do que o limite admitido de acordo
com a Tabela 9, tendo como referência as obtidas para o controlo.
Tabela 9. Tolerância máxima para as áreas relativas dos iões diagnóstico.
Áreas relativas (% do pico base, no controlo)
Tolerância Máxima (na amostra)
> 50% 10% (absoluto)
25%> Ar> 50% 20% (relativo)
5%> Ar> 25% 5% (absoluto)
< 5% 50% (relativo)
A quantificação das substâncias presentes nas amostras é efetuada pelo método do
padrão interno, com uma curva de calibração obtida por ajuste de regressão linear aos
calibradores, que deverá cumprir os seguintes critérios de aceitação:
a. Curva de calibração com pelo menos 5 calibradores;
b. Coeficiente de correlação linear (r2) superior a 0,99;
c. Controlos com desvio inferior a 20%, relativamente à concentração
teórica.
4.5 Validação do método de quantificação de tramadol e metabolitos
A validação do método de análise quantitativa de tramadol e dos seus metabolitos
ODT e NDT foi efetuada segundo os critérios em vigor no SQTF, tendo sido avaliados
os seguintes parâmetros:
Suzana Fonseca Página 75
1. especificidade/seletividade, capacidade de identificação e avaliação de
interferentes;
2. eficácia de extração;
3. limiares analíticos: limites de detecção e de quantificação;
4. linearidade e modelo de calibração;
5. precisão intermédia e repetibilidade;
6. exatidão;
7. arrastamento entre análises consecutivas;
8. robustez.
4.5.1 Especificidade/seletividade, capacidade de identificação e avaliação de
interferentes
Quarenta amostras brancas foram agrupadas em dez pools de sangue total: oito
constituídas de sangue periférico e duas de sangue cardíaco. A partir de cada uma das
pools foram preparadas duas alíquotas de 500uL: uma das alíquotas foi fortificada com
as substâncias em estudo a 100 ng/mL. Aplicou-se o procedimento de ensaio e
compararam-se os resultados obtidos nas alíquotas fortificadas com os resultados
obtidos nas alíquotas da mesma matriz que não foram fortificadas, aplicando-se os
critérios de identificação.
Para a avaliação de interferentes foram selecionadas aleatoriamente três pools e de
cada uma delas foram utilizadas três alíquotas (500uL): uma foi fortificada com 100
ng/mL dos compostos em estudo e sem padrão interno; outra apenas com padrão
interno; e a terceira foi fortificada com 500 ng/mL de compostos passíveis de serem
encontrados em casos de rotina no STF, nomeadamente, cocaína e metabolitos,
opiáceos, anfetaminas e benzodiazepinas.
Suzana Fonseca Página 76
4.5.2 Eficiência da extração
O estudo da eficiência da extração foi efetuado com três níveis de concentração (150,
500 e 850 ng/mL) e foram preparados dois conjuntos de triplicados para cada nível.
Um destes conjuntos foi fortificado no início do procedimento de preparação das
amostras, enquanto o outro logo após a extração (antes da evaporação do extrato). O
padrão interno foi adicionado a todas as alíquotas antes da etapa de evaporação.
4.5.3 Limiares analíticos: Limite de Detecção e Limite de Quantificação
Para a avaliação do limite de detecção foram preparados 5 conjuntos de 3 alíquotas de
sangue branco, com diferentes níveis de concentração: 10, 12.5, 15, 25 e 50 ng/mL.
Aplicou-se o procedimento de ensaio e, utilizando a primeira alíquota de 50 ng/mL
como referência, selecionou-se como limite de detecção a concentração mais baixa
para a qual foram cumpridos os critérios de identificação.
O limite de quantificação de 50 ng/mL foi estabelecido com base na sensibilidade do
método e nos limites inferiores do intervalo terapêutico estabelecido para o tramadol,
de acordo com a tabela de referência (Repetto & Repetto, 2015). Simultaneamente a
uma curva de calibração, prepararam-se seis replicados a 50 ng/mL, que foi definido
como primeiro calibrador. Aplicou-se o procedimento de ensaio e calculou-se o
coeficiente de variação para as concentrações obtidas nos seis replicados para cada um
dos compostos.
4.5.4 Linearidade e Modelo de Calibração
O estudo da linearidade e modelo de calibração permite, num determinado intervalo de
concentrações avaliar se o sinal analítico é proporcional à concentração e, se existir
heterocedasticidade, selecionar a ponderação a utilizar na curva de calibração de cada
substância (Almeida, Castel-Branco, & Falcao, 2002).
Suzana Fonseca Página 77
Para avaliar os parâmetros de linearidade e modelo de calibração prepararam-se cinco
curvas de calibração, mediante fortificação de alíquotas de 500 µL de uma amostra de
sangue branco, num total de sete calibradores (50, 100, 200, 400, 600, 800 e 1000
ng/mL). Prepararam-se ainda 6 replicados do primeiro e do último calibrador e
aplicou-se o procedimento de ensaio.
4.5.5 Precisão Intermédia, Repetibilidade e Exatidão. Arrastamento entre análises
consecutivas.
A precisão intermédia, a repetibilidade e o limite de repetibilidade foram estudados
através da preparação de cinco curvas de calibração e controlos em triplicado aos 3
níveis de concentração, em 5 dias diferentes. Foram ainda preparados seis replicados
dos controlos aos três níveis de concentração. Aplicou-se o procedimento de ensaio,
tendo sido contempladas as fontes de variabilidade que simulam o normal
funcionamento do laboratório (tempo, reagentes, curva de calibração, temperatura
ambiente e equipamentos diferentes).
A exatidão do método é a razão entre o valor observado e o valor real, para verificar a
existência de erros sistemáticos e quando relevante estimar a incerteza associada.
Utilizaram-se os resultados obtidos durante o estudo da precisão intermédia,
calcularam-se as recuperações médias em três sub-gamas de trabalho (baixa, média e
alta), verificou-se se são estatisticamente diferentes de 100% e estimou-se a incerteza
do método conforme se refere no Anexo III.5..
A contaminação entre amostras sucessivas por arrastamento, só se pode verificar na
análise instrumental, dado que todo o processo extrativo é efetuado de forma
independente. Para avaliar a possibilidade de arrastamento injetou-se metanol entre
cada calibrador durante um dos ensaios de precisão intermédia.
Suzana Fonseca Página 78
4.5.6 Robustez
Durante todo o procedimento de validação foram introduzidas naturalmente pequenas
variações no decurso do normal funcionamento do laboratório que permitiram avaliar
a robustez do método, nomeadamente: lotes de reagentes, equipamentos de medição
de volumétrica (material de vidro e micro-pipetas), condições ambientais, desgaste de
colunas analíticas, manutenção do equipamento, entre outros. Não se verificaram
efeitos que afetassem significativamente os parâmetros de validação, nomeadamente a
precisão, a exatidão e a capacidade de identificação do método.
4.6 Metodologia para a análise estatística da correlação entre os
resultados da análise genética e toxicológica
Aplicou-se o teste de normalidade Kolmogorov-Smirnova para testar se as razões de
concentração de tramadol e metabolitos têm uma distribuição normal. Utilizando
testes não paramétricos, fez-se a comparação de medianas pelo teste de Mann-Whitney
e de Jonckheere-Terpstra. São testes robustos e adequados à análise de modelos
genéticos (Câmara, 2001; Yang et al., 2010). Foram ainda visualizados gráficos de
medianas e quartis, usando como escala o logaritmo decimal das razões de
concentração dos compostos detetados. Todos os dados obtidos foram tratados e
analisados com o programa de cálculo estatístico SPSS Statistics, versão 17.0, com um
nível de significância de 0,05.
Suzana Fonseca Página 79
5 Resultados
O desenvolvimento de um método para a análise genética do CYP2D6 em amostras
post mortem envolve dificuldades acrescidas que se prendem com dois aspetos
principais:
a. a especificidade de amplificação, devido à elevada semelhança entre o gene e
os pseudogenes CYP2D7 e CYP2D8 (Gaedigk, 2013);
b. a necessidade de amplificação de ADN fragmentado e degradado (Riccardi et
al., 2013).
Para ultrapassar estas dificuldades optou-se por utilizar primers previamente
desenvolvidos e validados por autores diferentes e publicados em artigos científicos
(Gaedigk, 2013; Hersberger et al., 2000; Levo et al., 2003). Estes primers têm um
conteúdo em guanina-citosina superior a 60% e, portanto, uma elevada temperatura de
fusão, o que faz subir a temperatura necessária à hibridação. As temperaturas de
annealing muito altas têm geralmente baixas recuperações de amplificaçãoPor outro
lado, as amostras degradadas têm também baixo rendimento de amplificação e ruído
devido à fragmentação do ADN. Para aumentar a recuperação da reação de
amplificação verificou-se, durante o desenvolvimento do método, ser necessário
utilizar dimetilsulfóxido (DMSO). O DMSO liga-se às citosinas, alterando a sua
conformação e tornando-as mais lábeis, isto é, baixando a sua temperatura de fusão
(Montgomery & Wittwer, 2014).As condições de PCR, de purificação e de
sequenciação foram então otimizadas, de forma a obter a melhor sensibilidade e
especificidade, por ajuste dos seguintes parâmetros:
a. volume de amostra;
b. volume total de reação;
Suzana Fonseca Página 80
c. volumes e concentrações de reagentes;
d. utilização de DMSO a 5%;
e. temperaturas e tempos de annealing;
f. tempos de extensão;
g. número de ciclos.
De notar que o fragmento 3 tem condições de amplificação e de sequenciação
diferentes, tendo sido mais difícil de otimizar. As sequências deste fragmento alinham
com a sequência de referência mas, mesmo após os ensaios de otimização, não há
sobreposição total entre as sequências obtidas com os primers complementares. A
variante 2549delA foi sempre detetada apenas com o fragmento sense (forward).
Todas as amostras que apresentaram uma variante nula, foram confirmadas por
repetição do ensaio correspondente.
5.1 Validação do método de análise genética
O método demonstrou um desempenho conforme os requisitos aplicáveis para a
detecção das variantes genéticas correspondentes aos alelos CYP2D6 *3, *4, *6 e *10.
Os códigos das amostras que foram utilizadas nos ensaios de validação são
apresentados na Tabela 10. As amostras a analisar por este método são de origem
conhecida e colhidas durante a autópsia, não existindo a possibilidade de uma amostra
ser de mais que um indivíduo. Por outro lado, a sequenciação deteta bases que tenham
mais do que 10% da base mais abundante em cada posição. Desta forma a
contaminação cruzada teria que ser superior a 10%, facto que seria facilmente
identificado pelo operador. Por estas razões não se considerou relevante efetuar o
ensaio de contaminação cruzada conforme recomendado pela SWGDAM (Scientific
Working Group on & Methods, 2012). A avaliação da contaminação por reagentes é
feita através da inclusão de controlos negativos em todas as séries.
Suzana Fonseca Página 81
Tabela 10. Códigos das amostras utilizadas nos ensaios de validação do método.
Especificidade Reprodutibilidade
Fragmento 1 Fragmento 2 Fragmento 3 Fragmento 1 Fragmento 2 Fragmento 3
CYP015 CYP015 CYP015 CYP002 CYP002 CYP002
CYP016 CYP016 CYP016 CYP015 CYP015 CYP015
CYP018 CYP018 CYP018 CYP016 CYP016 CYP016
CYP017 CYP017 CYP017
Limite de detecção CYP018 CYP018 CYP018
Controlo THP - 10 ng/uL CYP019 CYP019 CYP019
Controlo 007 - 0,1 ng/uL CYP021 CYP021 CYP021
CYP024 CYP024 CYP024
Repetibilidade CYP025 CYP025 CYP025
Fragmento 1 Fragmento 2 Fragmento 3 CYP026 CYP026 CYP026
CYP024 CYP024 CYP002 CYP027 CYP027 CYP027
CYP025 CYP025 CYP025 CYP028 CYP028 CYP028
CYP026 CYP026 CYP026 CYP029 CYP029 CYP031
CYP028 CYP027 CYP027 CYP032 CYP071 CYP032
CYP032 CYP028 CYP028 CYP071 CYP078 CYP038
5.1.1 Especificidade e exatidão
O método cumpre os critérios de especificidade e de exatidão.
A avaliação da especificidade do método foi efetuada por pesquisa das 6 sequências
obtidas (F1, R1, FH, F2, F3 e R3) para cada uma das 3 amostras selecionadas
(CYP015, CYP016 e CYP018) em bases de dados genéticos com a ferramenta BLAST
do NCBI. Para tal, utilizou-se o Standard Nucleotide BLAST, na base de dados de
nucleótidos nucleotide collection nr/nt; human (taxid:9606) procurando sequências
com um elevado grau de semelhança (megablast) (Morgulis et al., 2008). As 18
sequências verificadas têm 99-100% de correspondência (dependendo das variantes
presentes) com a entrada “Homo sapiens CYP2D6 (CYP2D6) gene, complete cds,
Sequence ID: gb|JF307778.1|Length: 6587”, como se pode observar no resumo dos
resultados que estão na Tabela 11.
Suzana Fonseca Página 82
Tabela 11. Resultados da pesquisa das sequências obtidas para 3 amostras com o BLAST.
CYP015 (*4/*10) CYP016 (wt) CYP018 (*4/*10)
Seq. n/N match n/N match n/N match
F1 329 / 330 99% 356 / 356 100% 361 / 362 99%
R1 369 / 370 99% 373 / 373 100% 313 / 314 99%
FH 593 / 595 99% 522 / 522 100% 346 / 348 99%
R2 429 / 431 99% 499 / 499 100% 581 / 583 99%
F3 148 / 149 99% 152 / 153 100% 156 / 157 99%
R3 125 / 125 100% 154 / 154 100% 140 / 140 100%
Quando pesquisadas na base de dados NCBI Genomes (chromosome), apenas há
correspondência com o cromossoma 22, onde está situado o gene CYP2D6, como se
pode observar no exemplo apresentado na Figura 9.
Figura 9. Pesquisa da sequência FH da amostra CYP016 no BLAST (NCBI Genomes)
As sequências destas amostras foram também procuradas diretamente na sequência do
CYP2D7 e do CYP2D8 (M33387.1 do Genbank). Na Figura 10 são apresentadas
partes dos fragmentos sequenciados, estando assinaladas as bases que os diferenciam
das sequências dos pseudogenes. Pode assim verificar-se que as sequências obtidas são
específicas para o CYP2D6.
Suzana Fonseca
Figura 10. Sequências obtidas para cada fragmento e comparação com as sequências dospseudogenes,
A exatidão do método foi verificada pela análise do material de referência adquirido
ao banco de células do Coriell Cell Repositories
*4/*4; MR2 – CYP2D6 *2/*3 e MR3
para os materiais de referência são apresentados
Tabela 12.
Figura 11. EletroferogramaMR1 – CYP2D6 *4/*4;
obtidas para cada fragmento e comparação com as sequências dospseudogenes, segundo a entrada M33387.1 do Genebank.
do método foi verificada pela análise do material de referência adquirido
Coriell Cell Repositories, com os genótipos: MR1
CYP2D6 *2/*3 e MR3 – CYP2D6 *6/*1. Os eletroferograma
para os materiais de referência são apresentados na Figura 11 e o perfil genético na
Eletroferogramas dos polimorfismos identificados nos materiais de referência: CYP2D6 *4/*4; MR2 CYP2D6 *2/*3; MR3 – CYP2D6 *2/*6
Página 83
obtidas para cada fragmento e comparação com as sequências dos
do método foi verificada pela análise do material de referência adquirido
, com os genótipos: MR1 – CYP2D6
eletroferogramas obtidos
e o perfil genético na
fismos identificados nos materiais de referência: CYP2D6 *2/*6
Suzana Fonseca Página 84
Tabela 12. Perfil genético dos Materiais de Referência.
Variante 100C>T 124G>A 137insT 1661G>C 1707delT 1758G>T 1846G>A 2549delA
MR1 TT GG - CC TT GG AA na
MR2 CC GG - GG TT GG GG A/del A
MR3 CC GG - CG T/del T GG GG na
na – não analisado.
Foram identificados corretamente os alelos CYP2D6 *4, *3 e *6. A identificação da
variante 100 C>T ficou também validada.
5.1.2 Limite de detecção
A concentração definida como limite de detecção foi a mais baixa para a qual se
cumpriram os critérios de identificação de todas as variantes nos 3 fragmentos. O
genótipo foi consistente em todas as sequências obtidas. As diluições com
concentrações mais baixas (0.05 ng/uL e 0.01 ng/uL) foram analisadas utilizando o
volume máximo de amostra em cada reação, mas sem qualquer alteração nas restantes
condições do método (v.g. número de ciclos de amplificação). Os resultados são
apresentados na Tabela 13.
Tabela 13. Resultados obtidos no ensaio do limite de detecção. Conc
(ng/uL) 100C>T 124G>A 137insT 1661G>C 1707delT 1758G>T 1846G>A 2549delA
10 TT GG - CC TT GG GG A
1,0 TT GG - CC TT GG GG A
0,5 TT GG - CC TT GG GG A
0,1 TT GG - CC TT GG GG A
0,05 TT GG - nd nd GG nd A
0,01 nd GG - nd nd GG nd A
nd – não detectado.
O perfil genético foi corretamente identificado ao limite de detecção de 0,1 ng/µL. Os
fragmentos menores permitem limites de detecção menores (0,05 ng/µLpara o
fragmento 1 e 0,01ng/µL para o fragmento 3). Entre as 100 amostras post mortem
estudadas com o método foi ainda possível sequenciar com sucesso os 3 fragmentos de
uma amostra com 0.06ng/µL.
Suzana Fonseca Página 85
5.1.3 Precisão do método: repetibilidade e reprodutibilidade
O estudo da reprodutibilidade foi efetuado com 15 amostras em 3 dias diferentes,
fazendo variar os reagentes, consumíveis, equipamentos (como termocicladores e
micropipetas), contemplando ainda as flutuações normais do estado do equipamento
de eletroforese capilar (tais como o desgaste dos capilares, o estado e nível do tampão,
o lote do polímero POP6, bem como as condições ambientais. Para cada
fragmento/variante obtiveram-se, portanto, 90 replicados (15 amostras x 3 dias x 2
sequências). O resumo dos resultados é apresentado na Tabela 14.
Tabela 14. Resultados obtidos no ensaio de reprodutibilidade para 15 amostras.
Alelo *4, *10 *12 *15 *6 *8 *4 *3
Variante 100C>T 124G>A 137insT 1707delT 1758G>T 1846G>A 2549delA
Dia 1 15/15 15/15 15/15 15/15 15/15 14/152 15/15
Dia 2 15/15 15/15 15/15 14/151 14/151 14/151 15/15
Dia 3 15/15 15/15 15/15 15/15 15/15 15/15 15/15
1 – fragmento não amplificado; 2 – variante não sequenciada.
As amostras com erro de amplificação (CYP032) e de sequenciação (CYP002) são
amostras com elevado índice de degradação: 1,6 e 1,3 respectivamente.
O estudo da repetibilidade foi efetuado com 5 amostras em triplicado no mesmo dia,
fazendo apenas variar a localização dos replicados no termociclador e na placa do
sequenciador. Para cada fragmento/variante obtiveram-se, portanto, 30 replicados (5
amostras x 3 réplicas x 2 sequências). O resumo dos resultados e o alinhamento das
sequências obtidas para os 3 fragmentos são apresentados na Tabela 15 e na Figura 12.
Tabela 15. Resultados obtidos no ensaio de repetibilidade.
Alelo *4, *10 *12 *15 *6 *8 *4 *3
Variante 100C>T 124G>A 137insT 1707delT 1758G>T 1846G>A 2549delA
Réplica 1 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5
Réplica 2 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5
Réplica 3 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5
Suzana Fonseca
Figura 12. Alinhamento das sequê
5.1.4 Qualidade média dos resultados.
As sequências de primers
ao programa informático
boa sobreposição com a sequ
variantes.
Figura 13. Sobreposição das
O fragmento 3 não demonstra
especificidade e a exatidão
Selecionando 5 amostras das analisadas no decorrer do estudo da reprodutibilidade
retiraram-se os valores médios de sinal e da razão sinal/ruído (S/R),
Sample Score (parâmetro de avaliação da qualidade da sequência), que são
apresentados na Tabela 16
Alinhamento das sequências obtidas durante o ensaio de repetibilidadeCYP025.
Qualidade média dos resultados.
primers complementares foram alinhadas corretamente
SeqScape (ver Figura 13). Os fragmentos 1, 2 e 3 têm uma
boa sobreposição com a sequência de referência, sendo detetadas as principais
Sobreposição das sequências obtidas com a de referência utilizando o SeqScape.
O fragmento 3 não demonstra a sobreposição das sequências complementares, mas a
exatidão não são comprometidas.
ndo 5 amostras das analisadas no decorrer do estudo da reprodutibilidade
se os valores médios de sinal e da razão sinal/ruído (S/R),
(parâmetro de avaliação da qualidade da sequência), que são
16 e na Tabela 17.
Página 86
ante o ensaio de repetibilidade na amostra
corretamente com recurso
s 1, 2 e 3 têm uma
tadas as principais
ncia utilizando o SeqScape.
a sobreposição das sequências complementares, mas a
ndo 5 amostras das analisadas no decorrer do estudo da reprodutibilidade
se os valores médios de sinal e da razão sinal/ruído (S/R), bem como o
(parâmetro de avaliação da qualidade da sequência), que são
Suzana Fonseca Página 87
Tabela 16. Valores médios de sinal e de sinal/ruído obtidos no ensaio de validação da qualidade média dos resultados.
Fragmento 1 F1 Sinal S/R R1 Sinal S/R CYP025 385 156 956 293 CYP026 2122 795 2099 718 CYP028 692 229 999 216 CYP032 1758 646 2400 661 CYP025r 937 232 1098 383
Fragmento 2 FH Sinal S/R R2 Sinal S/R
CYP015 1743 593 1545 531 CYP016 1333 302 1713 496 CYP018 1696 580 2025 688 CYP019 1341 490 1709 578 CYP020 1302 306 2000 558
Fragmento 3 F3 Sinal S/R R3 Sinal S/R CYP024 763 302 487 228 CYP025 594 268 296 136 CYP026 707 316 348 131 CYP027 2130 793 337 115 CYP028 1291 545 278 121
Tabela 17. Valor de sample score obtidos no ensaio de validação da qualidade média dos resultados.
Fragmento 1 F1 R1
CYP025 51 45 CYP026 28 39 CYP027 41 51 CYP028 39 48 CYP032 23 44
Fragmento 2 FH R2
CYP015 36 26 CYP016 34 25 CYP018 41 26 CYP019 35 23 CYP020 34 28
Fragmento 3 F3 R3
CYP024 24 25 CYP025 47 28 CYP026 39 26 CYP027 28 32 CYP028 44 45
Suzana Fonseca Página 88
Os critérios de qualidade de sequenciação recomendados pela Applied Biosystems
(Applied Biosystems, 2009) são apresentados na Tabela 18 e foram genericamente
cumpridos.
Tabela 18. Critérios de aceitação usados no ensaio de validação da qualidade média dos resultados (Applied Biosystems, 2009).
Variável Critério
Sinal Maior que 50
S/R Maior que 25
Sample score Entre 20 e 50
Suzana Fonseca Página 89
5.2 Validação do método de quantificação do tramadol e metabolitos
O método demonstrou um desempenho conforme os requisitos aplicáveis para a
confirmação quantitativa de tramadol, O-desmetil-tramadol e N-desmetil-tramadol.
As fórmulas de cálculo utilizadas na validação do método encontram-se no Anexo III.
Os resultados da validação encontram-se no Anexo IV, apresentando-se aqui apenas o
resumo dos parâmetros mais importantes.
5.2.1 Especificidade/Seletividade, Capacidade de Identificação e Avaliação de
interferentes
O método cumpre os critérios de especificidade e de seletividade.
As alíquotas de sangue não fortificadas deram resultado negativo. Nas alíquotas
fortificadas, as substâncias foram detetados e cumpriram os critérios de identificação
de S/R> 3, de TRR e das relações iónicas. Não existiram falsos negativos, nem falsos
positivos.
O ensaio de avaliação de interferentes permite concluir que os analitos não sofrem
interferência do padrão interno, nem dos restantes compostos que podem estar
presentes nas amostras de rotina. Foram detetadas interferências de matriz no
fragmento iónico de m/z 135 do tramadol, que contudo não afetam a capacidade de
detecção, dado que só se verificam para um dos fragmentos iónicos e as áreas dos
sinais são muito menores do que as que se verificam quando o composto está presente.
5.2.2 Eficiência da extração
As áreas relativas obtidas com e sem processo extrativo foram comparadas. A
eficiência de extração é superior a 80% nos 3 níveis de concentração (Tabela 19).
Suzana Fonseca Página 90
Tabela 19. Resultados de recuperação
Recuperação 150 ng/mL 500 ng/mL 850 ng/mL Média
N-desmetil-tramadol 82% 97% 86% 88%
O-desmetil-tramadol 90% 100% 95% 95%
Tramadol 90% 100% 88% 93%
5.2.3 Limiares analíticos: Limite de Detecção e Limite de Quantificação
A concentração definida como limite de detecção foi a mais baixa entre as testadas
para a qual se cumpriram todos os critérios de identificação (S/R, TRR e relações
iónicas), nas cinco alíquotas de sangue fortificadas e nos equipamentos validados. O
limite de detecção obtido para o tramadol e para o N-desmetil-tramadol foi de 10
ng/mL e para o O-desmetil-tramadol foi de 12,5 ng/mL.
Verificou-se que o coeficiente de variação dos seis replicados ao limite de
quantificação de 50 ng/mL é inferior a 20% para todos os compostos, nos
equipamentos utilizados.
5.2.4 Linearidade e Modelo de Calibração
O modelo clássico de regressão linear pressupõe que exista uma dispersão aleatória e
uniforme dos desvios dos calibradores na gama de trabalho, ou seja,
homocedasticidade. A homocedasticidade deve ser testada aplicando um teste de
homogeneidade de variâncias. Para tal calcularam-se as variâncias das áreas relativas
dos seis replicados no limite inferior da curva de calibração (calibrador 1) e dos seis
replicados no limite superior (calibrador 7). Aplicando o teste de homogeneidade de
variâncias ANOVA obtém-se um p-value inferior a 0,05 para todas as substâncias,
concluindo-se que o teste de homocedasticidade é falso nas gamas de trabalho
utilizadas. Os desvios ao nível do calibrador 1 são significativamente superiores aos
do nível de concentração superior.
Suzana Fonseca Página 91
Na presença de heterocedasticidade é necessário estudar os fatores de ponderação a
utilizar na curva de calibração de forma a minimizar as variâncias entre os desvios dos
calibradores ao longo da gama de concentrações. Os fatores de ponderação testados
foram 1/x, 1/x2, 1/y, 1/y2, 1/x1/2 e 1/y1/2 (Almeida et al., 2002). Por observação da
representação gráfica dos resíduos verificou-se se a distribuição é aleatória. O fator de
ponderação foi determinado pelo somatório dos erros relativos, desde que com fator de
correlação médio superior a 0,99 (Tabela 20).
Tabela 20. Somatório dos desvios dos calibradores em 5 curvas de calibração, bem como o
fator de correlação médio, para cada fator de ponderação em dois equipamentos.
Ponderação GCMSD004 GCMSD005 Ponderação Selecionada
R2 (média) %ER R2 (média) %ER
N-desmetil-tramadol
1/x 0,998 151,7 0,996 106,7 1/ x2
1/x2 0,995 141,9 0,994 100,3
1/y 0,998 150,3 0,995 103,6
1/y2 0,993 143,4 0,993 103,7
1/x1/2 0,998 163,9 0,996 131,3
1/y1/2 0,993 161,1 0,996 126,4
O-desmetil-tramadol
1/x 0,999 106,8 0,998 80,5 1/ x2
1/x2 0,997 104,6 0,998 72,1
1/y 0,999 106,5 0,998 79,6
1/y2 0,997 106,4 0,998 71,3
1/x1/2 0,999 111,4 0,998 86,5
1/y1/2 0,999 111,2 0,998 85,3
Tramadol 1/x 0,999 94,8 0,998 70,6 1/x2
1/x2 0,998 87,8 0,998 64,5
1/y 0,999 95,1 0,998 69,3
1/y2 0,998 88,7 0,998 65,9
1/x1/2 0,999 109,0 0,997 85,0
1/y1/2 0,999 108,9 0,997 83,7
Demonstrou-se a existência de heterocedasticidade das curvas de calibração das três
substâncias, e o fator de ponderação com menor somatório de desvios foi 1/x2.
Suzana Fonseca Página 92
5.2.5 Precisão Intermédia e Repetibilidade
Os resultados de concentração obtidos para os controlos durante o estudo da precisão
intermédia foram tratados por aplicação da ferramenta estatística ANOVA de fator
único para a avaliação da homogeneidade de variâncias. Foram então calculados os
coeficientes de variação da precisão intermédia para as 3 gamas de concentração dos
controlos (Tabela 21).
Tabela 21. Coeficientes de variação do estudo da precisão intermédia.
% CV 150 ng/mL 500 ng/mL 850 ng/mL ponderado
N-desmetil-tramadol 12,4 6,51 6,47 10,7
O-desmetil-tramadol 4,19 5,81 5,57 5,24
Tramadol 7,49 5,71 6,39 6,57
Os resultados cumprem os critérios estabelecidos para todos os compostos analisados,
isto é, o CV é inferior a 20% para a gama baixa e inferior a 10% para as gamas média
e alta.
Para verificar a repetibilidade do método foram calculados os coeficientes de variância
das concentrações obtidas para 6 replicados de cada um dos controlos analisados em
simultâneo e verificou-se que são inferiores a 10% (ver Anexo IV).
5.2.6 Exatidão
As recuperações médias (calculadas conforme se indica no anexo III) aos 3 níveis de
concentração dos controlos analisados durante o estudo da precisão intermédia são
apresentadas na Tabela 22.
Tabela 22. Recuperações médias obtidas nas três gamas de concentrações.
Substância % Recuperação média
150 ng/mL 500 ng/mL 850 ng/mL
N-desmetil-tramadol 95,0 96,2 104,9
O-desmetil-tramadol 98,5 96,5 102,0
Tramadol 100,6 99,3 98,1
Suzana Fonseca Página 93
O método é considerado exato uma vez que as recuperações médias estão todas
incluídas no intervalo 90 – 110 %. Na Tabela 23 pode verificar-se que a recuperação
média do O-desmetil-tramadol a 500 ng/mL é estatisticamente diferente de 100%, mas
a exatidão é elevada e o nível de incerteza calculado é baixo.
Tabela 23. Incerteza obtida durante a avaliação do parâmetro da exatidão.
Substância 150 ng/mL 500 ng/mL 850 ng/mL
T exp* Incerteza (%)
T exp* Incerteza (%)
T exp* Incerteza (%)
N-desmetil-tramadol 1,34 4,44 0,29 2,43 -0,15 1,76
O-desmetil-tramadol 1,15 1,34 3,48 2,12 -0,85 2,29
Tramadol -0,31 1,88 0,40 1,91 0,72 2,75
* Sabendo que o T crítico para 5 graus de liberdade e 95% de intervalo de confiança é 2,57.
Não se observou a existência de arrastamento entre análises consecutivas na gama de
trabalho das três substâncias e o método demonstrou ser robusto.
A Tabela 24 apresenta os resultados dos parâmetros mais relevantes da validação.
Tabela 24. Resumo dos resultados de validação do método de quantificação.
Substância Recuperação LOD (ng/mL)
LOQ (ng/mL)
Fator de Ponderação CV
N-desmetil-tramadol 88% 10 50 1/x2 11%
O-desmetil-tramadol 95% 12.5 50 1/x2 5,2%
Tramadol 93% 10 50 1/x2 6,6%
Suzana Fonseca
5.3 Resultados de am
As metodologias desenvolvidas, para a genotipagem e para a quantificação do
tramadol e dos seus metabolitos principais, foram aplicadas a 100 amostras
mortem, não tendo sido possível obter o perfil genético
Dadas as dificuldades inerentes à análise de ADN em amostras degradadas,
considerou-se como uma sequenciação satisfatória sempre que as duas sequências de
cada fragmento se encontraram alinhadas com a de referência na localização das
variantes pesquisadas (segundo os crité
correspondentes às variantes seja inequívoca.
A cada genótipo foi associado um fenótipo previsto tal como se apresenta na
14 .
Figura 14. Fenótipo previst
O resumo dos resultados obtidos na análise toxicológica e na análise genética das
amostras é apresentado na
a. A concentração de tramadol e dos meta
b. A concentração de ADN e respetivo índice de degradação;
c. As variantes genéticas mais relevantes
(alelos *3, *4, *6, *8, *10, *12, *14, *15);
d. O genótipo correspondente às variantes;
e. O fenótipo previsto com base no genótipo;
f. Indicação da presença de inibidores enzimáticos confirmados.
Resultados de amostras
As metodologias desenvolvidas, para a genotipagem e para a quantificação do
tramadol e dos seus metabolitos principais, foram aplicadas a 100 amostras
, não tendo sido possível obter o perfil genético em apenas 3 casos
ades inerentes à análise de ADN em amostras degradadas,
se como uma sequenciação satisfatória sempre que as duas sequências de
cada fragmento se encontraram alinhadas com a de referência na localização das
variantes pesquisadas (segundo os critérios do SeqSCAPE) e cuja leitura das bases
correspondentes às variantes seja inequívoca.
A cada genótipo foi associado um fenótipo previsto tal como se apresenta na
Fenótipo previsto com base nas variantes alélicas encontradas nas amostras
O resumo dos resultados obtidos na análise toxicológica e na análise genética das
na Tabela 25, que contém:
A concentração de tramadol e dos metabolitos ODT e NDT;
A concentração de ADN e respetivo índice de degradação;
As variantes genéticas mais relevantes
(alelos *3, *4, *6, *8, *10, *12, *14, *15);
O genótipo correspondente às variantes;
O fenótipo previsto com base no genótipo;
resença de inibidores enzimáticos confirmados.
Página 94
As metodologias desenvolvidas, para a genotipagem e para a quantificação do
tramadol e dos seus metabolitos principais, foram aplicadas a 100 amostras post
casos.
ades inerentes à análise de ADN em amostras degradadas,
se como uma sequenciação satisfatória sempre que as duas sequências de
cada fragmento se encontraram alinhadas com a de referência na localização das
rios do SeqSCAPE) e cuja leitura das bases
A cada genótipo foi associado um fenótipo previsto tal como se apresenta na Figura
o com base nas variantes alélicas encontradas nas amostras.
O resumo dos resultados obtidos na análise toxicológica e na análise genética das
Suzana Fonseca Página 95
Tendo em conta que a prevalência dos alelos nulos que não foram pesquisados é muito
baixa e para facilitar o tratamento dos resultados, considerou-se que a ausência de
variantes nos fragmentos analisados corresponde à sequência de referência (WT, do
inglês wild type) e a um fenótipo de metabolizador extensivo/normal (EM). A
caracterização de género e de idade dos indivíduos não é apresentada porque estes
fatores não são responsáveis por alterações à função enzimática da CYP2D6 (Zanger
& Schwab 2013).
Suzana Fonseca Página 96
Tabela 25. Resumo dos resultados de genotipagem e de quantificação de tramadol e metabolitos (ODT e NDT) para 100 amostras de sangue post mortem.
nd: não detetada; na: não analisada; I – c/ inibidor; S – c/ substrato
amostra TMD NDT ODT fen gen ADN ID 100 124 137_138 1661 1707 1758 1846 2549
CYP2D6*1 EM *1 C G - G T G G A
CYP001 1392 90 344 EM WT 1,82 0,63 C G - T G G A
CYP002 I 1137 1479 161 PM *4/*3 0,25 1,281 CT G - GC T G GA del A
CYP003 - - - - - 0,001 12,1 - - - - - - - A
CYP004 1307 49 78 EM WT 3,26 0,46 C G - G T G G A
CYP005 1986 54 56 EM WT 1,51 0,55 C G - C T G G A
CYP006 874 56 245 EM WT 4,56 0,57 C G - G T G G A
CYP007 1682 40 538 EM WT 0,61 0,61 C G - GC T G G A
CYP008 1455 57 76 IM *4/*10 1,21 0,56 TT G - C T G GA A
CYP009 1941 303 251 EM WT 3,10 0,51 C G - G T G G A
CYP010 1742 36 252 EM WT 0,80 0,41 C G - G T G G A
CYP011 I 1835 881 315 IM *4/*10 0,10 0,55 TT G - C T G GA A
CYP012 I 18000 1479 325 EM WT 0,24 0,50 C G - G T G G A
CYP013 863 nd 49 EM *4/WT 1,29 0,52 CT G - GC T G GA A
CYP014 1651 362 176 EM *4/WT 5,47 0,50 CT G - GC T G GA A
CYP015 I 1279 137 78 IM *4/*10 2,58 0,57 TT G - C T G GA A
CYP016 1186 nd nd EM WT 2,00 0,59 C G - G T G G A
CYP017 1427 nd nd EM WT 1,68 0,58 C G - GC T G G A
CYP018 I 2290 87 535 IM *4/*10 1,29 0,50 TT G - C T G GA A
CYP019 I 2288 nd 551 EM WT 3,94 0,67 C G - GC T G G A
CYP020 821 134 242 EM *4/WT 2,15 0,61 CT G - GC T G GA A
CYP021 2045 59 352 EM WT 4,24 0,74 C G - GC T G G A
CYP022 287 44 nd EM WT 1,09 0,73 CT G - C T G G A
CYP023 1014 32 158 EM WT 1,84 0,59 C G - G T G G A
CYP024 866 1809 16 IM *4/*10 1,01 0,80 CT G - GC T G GA A
CYP025 1839 123 168 EM WT 9,16 0,62 C G - G T G G A
CYP026 1400 61 nd EM *4/WT 0,54 0,91 CT G - GC T G GA A
CYP027 994 191 208 EM WT 4,69 0,52 C G - G T G G A
CYP028 12000 1820 3127 EM WT 0,30 0,87 C G - G T G G A
CYP029 5600 1338 167 PM *4/*4 1,18 0,62 TT G - C T G AA A
CYP030 3175 196 732 EM *10/WT 0,24 1,015 CT G - C T G G A
CYP031 I 611 464 69 EM *10/WT 1,30 0,67 CT G - GC T G G A
CYP032 2130 1502 50 PM *4/*4 0,45 1,629 TT G - C T G AA A
CYP033 3739 99 nd EM *4/WT 0,94 0,98 CT G - GC T G GA A
CYP034 1696 73 136 - - 0,004 6,479 CT G - ? - - - A
CYP035 1502 66 nd - - 0,004 4,157 CT G - ? - - - A
CYP036 620 30 29 EM WT 0,70 0,54 C G - G T G G A
CYP037 I 366 28 18 EM *10/WT 0,25 0,36 CT G - GC T G G A
CYP038 528 221 30 PM *4/*4 5,65 0,47 TT G - C T G AA A
CYP039 I 618 23 65 EM WT 0,44 0,45 C G - G T G G A
CYP040 686 nd 77 EM *10/WT 0,063 0,87 CT G - GC T G G A
CYP041 1514 169 559 EM WT 0,45 0,59 C G - G T G G A
CYP042 2570 167 169 EM *4/WT 2,10 0,84 CT G - GC T G GA A
CYP043 34000 154 nd IM *4/*10 0,51 0,43 TT G - C T G GA A
CYP044 S 1116 1436 414 EM WT 2,66 0,32 C G - C T G G A
CYP045 1142 119 222 EM WT 0,54 0,56 C G - G T G G A
CYP046 7106 1003 1345 EM WT 4,96 0,55 C G - C T G G A
CYP047 I 4205 3863 212 EM *4/WT 5,75 0,47 CT G - CG T T GA A
CYP048 2682 246 487 EM *10/WT 4,30 0,42 CT G - C T T G A
CYP049 S 1416 186 22 EM WT 1,99 0,52 C G - CG T G G A
CYP050 I 863 26 18 EM *10/WT 2,88 0,51 CT G - C T G G A
(concentração: ng/mL)
Suzana Fonseca Página 97
Tabela 25. (continuação) Resumo dos resultados de genotipagem e de quantificação de tramadol e metabolitos (ODT e NDT) para 100 amostras de sangue post mortem.
nd: não detetada; na: não analisada; I – c/ inibidor; S – c/ substrato
A reanálise de algumas amostras foi necessária quando a amplificação não foi bem-
sucedida ou quando as sequências obtidas não foram satisfatórias. Todas as amostras
que apresentaram variantes genéticas foram confirmadas por repetição da
sequenciação do fragmento correspondente ao polimorfismo detetado.
CYP051 648 63 254 EM *10/WT 2,11 0,36 CT G - C T G G A
CYP052 S 463 96 24 IM *4/*10 2,30 0,64 TT G - C T G GA A
CYP053 369 5889 357 IM *4/*10 1,29 0,47 TT G - C T G GA A
CYP054 I 782 28 16 EM *10/WT 3,53 0,41 CT G - C T G G A
CYP055 226 nd 33 EM WT 1,72 0,45 C G - G T G G A
CYP056 222 nd 53 EM *10/WT 8,34 0,43 CT G - C T G G A
CYP057 I 94 89 nd EM *10/WT 1,76 0,54 CT G - C T G G A
CYP058 205 103 13 PM *4/*4 2,51 0,38 TT G - C T G AA A
CYP059 342 36 258 EM WT 1,33 0,37 CT? G - G T G G A
CYP060 172 102 277 EM WT 1,46 0,43 C G - G T G G A
CYP061 759 65 47 EM *10/WT 0,21 0,70 CT G - CG T G G A
CYP063 116 nd 70 EM WT 0,27 0,45 C G - CG T G G A
CYP065 330 65 45 IM *4/*10 4,09 0,58 TT G - C T G GA A
CYP066 789 nd 72 EM WT 0,80 0,57 C G - G T G G A
CYP067 528 126 111 EM *4/WT 1,19 0,44 CT G - CG T G GA A
CYP068 219 nd 105 EM *4/WT 1,99 0,39 CT G - CG T G GA A
CYP069 245 70 85 EM *4/WT 0,92 0,44 CT G - CG T G GA A
CYP070 292 68 99 EM WT 4,62 0,48 C G - CG T G G A
CYP071 I 147 262 15 PM *4/*4 2,51 0,41 TT G - C T G AA A
CYP072 770 35 43 IM *4/*10 2,87 0,47 TT G - C T G GA A
CYP073 246 nd 49 EM WT 0,71 0,59 C G - CG T G G A
CYP074 421 150 242 EM WT 2,58 0,55 C G - CG T G G A
CYP075 I 714 250 101 EM *4/WT 0,78 0,55 CT G - CG T G GA A
CYP076 644 454 262 EM WT 1,56 0,56 C G - G T G G A
CYP077 561 67 136 EM *4/WT 3,40 0,66 CT G - CG T G GA A
CYP078 335 67 122 EM *6/WT 2,67 0,79 C G - G T/del G G A
CYP079 198 nd nd EM WT 3,86 0,50 C G - C T G G A
CYP080 I 598 nd nd EM WT 1,48 0,51 C G - G T G G A
CYP081 I 674 nd nd EM WT 1,56 0,73 C G - G T G G A
CYP082 621 136 145 EM *10/WT 0,86 0,53 CT G - G T G G A
CYP083 257 37 83 IM *4/*10 3,24 0,52 TT G - C T G GA A
CYP084 480 nd nd EM WT 1,26 0,43 C G - CG T G G A
CYP085 459 59 62 EM WT 1,06 0,53 C G - G T G G A
CYP086 557 326 62 IM *4/*10 1,82 0,66 TT G - C T G GA A
CYP087 159 36 53 EM *10/WT 0,80 0,55 CT G - CG T G G A
CYP088 373 51 107 EM *10/WT 1,34 0,61 CT G - CG T G G A
CYP089 227 37 39 EM WT 1,99 0,56 C G - G T G G A
CYP090 188 nd 482 EM WT 4,77 0,69 C G - CG T G G A
CYP091 709 83 44 IM *4/*10 1,13 0,49 TT G - C T G GA A
CYP092 813 199 496 IM *10/*10 0,79 1,37 TT G - C T G G A
CYP093 669 nd nd EM *10/WT 1,89 0,63 CT G - C T G G A
CYP094 285 nd 126 EM WT 3,84 0,75 C G - CG T G G A
CYP095 2971 232 531 EM WT 1,81 0,80 C G - G T G G A
CYP096 1162 865 206 EM WT na na C G - G T G G A
CYP097 732 nd nd IM *4/*10 na na TT G - C T G GA A
CYP098 1030 20 102 EM WT na na C G - CG T G G A
CYP099 1503 474 643 EM WT na na C G - C T G G A
CYP100 258 14 61 EM WT na na C G - G T G G A
CYP101 988 112 98 IM *4/*10 na na TT G - C T G GA A
CYP102 563 12 67 EM WT na na C G - CG T G G A
Suzana Fonseca Página 98
As frequências alélicas e de genótipo são apresentadas na Tabela 26 e na Tabela 27.
Tabela 26. Frequências alélicas obtidas nas amostras post mortem.
Alelo n Prevalência
CYP2D6 *3 1 0,5%
CYP2D6 *4 38 19,6%
CYP2D6 *6 1 0,5%
CYP2D6 *10 32 16,5%
Tabela 27. Frequência de genótipo e fenótipo previsto para as amostras post mortem.
Genótipo Fenótipo n Prevalência
*4/*4 PM 5 5,2%
*3/*4 PM 1 1,0%
*4/*10 IM 15 15,5%
*10/*10 IM 1 1,0%
*4/WT EM 12 12,4%
*6/WT EM 1 1,0%
*10/WT EM 15 15,5%
WT EM 47 48,4%
Nas 100 amostras analisadas, 50 apresentavam uma concentração de tramadol inferior
a 800 ng/mL, ou seja no intervalo considerado terapêutico de acordo com os níveis de
referência (Repetto & Repetto, 2015; Schulz et al., 2012). Em 27 casos não foi
possível detetar pelo menos um dos metabolitos por estar ausente ou em concentração
inferior ao limite de detecção do método analítico. A estatística descritiva dos
resultados da análise de tramadol e dos seus dois metabolitos principais (NDT e ODT)
é apresentada na Tabela 28.
Suzana Fonseca
Tabela 28. Estatística descritiva das concentrações de tramadol (TMD), N(NDT) e O-desmetiltramadol (ODT) obtidas nas
TMD < 800ng/mL
TMD
média 439
mediana 421
máximo 789
mínimo 94
* os valores < 50 ng/mL e > 5000 ng/mL
Os fenótipos previstos foram comparados com as razões de concentração TMD/ODT e
TMD/NDT (Koski, 2005; Levo et al., 2003)
casos em que não foi possível a genotipagem e também todos os que não foi possível
quantificar algum dos metabolitos. Após exclusões, fez
estatística num total de 73 casos. A análise da distribuição avaliou
de medianas e quartis com escala logarítmica (
Figura 15. Correlação entre a razão logarítmica de concentração TMD/o fenótipo previsto, sendo que: EM corresponde à ausência de variantes;
*10/*10 ou *4/*10
Ao contrário do esperado, e apesar de se observar uma tendência, os grupos não
demonstraram uma separação clara entre si. A razão de concentração entre metabolitos
Estatística descritiva das concentrações de tramadol (TMD), N-desmetiltramadol desmetiltramadol (ODT) obtidas nas 100 amostras post mortem
NDT ODT TMD>
800ng/mL TMD
312 114 média 3070
77 75 mediana 1514
464 482 máximo 34000*
12 29 mínimo 813
> 5000 ng/mL foram obtidos por extrapolação das curvas de calibração.
Os fenótipos previstos foram comparados com as razões de concentração TMD/ODT e
(Koski, 2005; Levo et al., 2003). Para tal foi necessário excluir os três
casos em que não foi possível a genotipagem e também todos os que não foi possível
quantificar algum dos metabolitos. Após exclusões, fez-se a avaliação gráfica e
num total de 73 casos. A análise da distribuição avaliou-se usando gráficos
de medianas e quartis com escala logarítmica (Figura 15).
Correlação entre a razão logarítmica de concentração TMD/ODT e TMD/NDT com
o fenótipo previsto, sendo que: EM corresponde à ausência de variantes; IM *10/*10 ou *4/*10; PM ao genótipo *3/*4 e *4/*4.
Ao contrário do esperado, e apesar de se observar uma tendência, os grupos não
ação clara entre si. A razão de concentração entre metabolitos
Página 99
desmetiltramadol post mortem analisadas.
NDT ODT
497 363
161 222
3863 3127
20 18
obtidos por extrapolação das curvas de calibração.
Os fenótipos previstos foram comparados com as razões de concentração TMD/ODT e
. Para tal foi necessário excluir os três
casos em que não foi possível a genotipagem e também todos os que não foi possível
se a avaliação gráfica e
se usando gráficos
ODT e TMD/NDT com IM ao genótipo
Ao contrário do esperado, e apesar de se observar uma tendência, os grupos não
ação clara entre si. A razão de concentração entre metabolitos
Suzana Fonseca
(NDT/ODT) parece apresentar uma melhor relação
se pode observar na Figura
Figura 16. Correlação entre a rprevisto, sendo que: EM corresponde à ausência de variantes;
Neste caso, as amostras consideradas
extensivos/normais são também positivas para substâncias que induzem inibição
enzimática. Os casos positivos para inibidores da enzima CYP2D6, t
fluoxetina, paroxetina, sertraline, citalopram, metadona e ticlopidina
Saladores et al., 2013), foram então separados num grupo: INIB. Além disso,
subdividiram-se os metabolizadores
os diferentes genótipos
diferenças significativas entre os diferentes genótipos dos metabolizadores
extensivos/normais. Por outro lado, nos casos em que está presente
as concentrações entre metabolitos formam um grupo distinto dos restantes genótipos,
aproximando-se das observadas nos metabolizadores lentos.
parece apresentar uma melhor relação com os fenótipos previstos
Figura 16.
Correlação entre a razão logarítmica de concentração NDT/ODT com o fenótipo previsto, sendo que: EM corresponde à ausência de variantes; IM ao genótipo
*4/*10; PM ao genótipo 3/*4 e *4/*4.
Neste caso, as amostras consideradas outliers do grupo de metabolizadores
são também positivas para substâncias que induzem inibição
enzimática. Os casos positivos para inibidores da enzima CYP2D6, t
sertraline, citalopram, metadona e ticlopidina (Flockhart, 2007;
, foram então separados num grupo: INIB. Além disso,
se os metabolizadores extensivos/normais em subgrupos, de a
os diferentes genótipos encontrados (ver Figura 17). Verificou-se que não há
diferenças significativas entre os diferentes genótipos dos metabolizadores
. Por outro lado, nos casos em que está presente um inibidor forte
as concentrações entre metabolitos formam um grupo distinto dos restantes genótipos,
se das observadas nos metabolizadores lentos.
Página 100
com os fenótipos previstos como
azão logarítmica de concentração NDT/ODT com o fenótipo ao genótipo *10/*10 ou
do grupo de metabolizadores
são também positivas para substâncias que induzem inibição
enzimática. Os casos positivos para inibidores da enzima CYP2D6, tais como
(Flockhart, 2007;
, foram então separados num grupo: INIB. Além disso,
em subgrupos, de acordo com
se que não há
diferenças significativas entre os diferentes genótipos dos metabolizadores
um inibidor forte
as concentrações entre metabolitos formam um grupo distinto dos restantes genótipos,
Suzana Fonseca Página 101
Figura 17. Correlação entre a razão logarítmica de concentração NDT/TMD e o genótipo do indivíduo, sendo que: EM corresponde à ausência de variantes; EM1 a um alelo *10; EM2 a
um alelo *4 ou *6; IM a *10/*10 ou *4/*10 e PM a *4/*4 ou *3/*4.
Voltando a agrupar os metabolizadores extensivos/normais, fez-se por fim a
representação gráfica das concentrações relativas em função dos grupos com
distribuições de medianas e quartis aparentemente diferentes: EM; IM; INIB -
positivos para inibidores; PM (Figura 18).
Para avaliar o tipo de distribuição das concentrações relativas utilizou-se o teste de
normalidade Kolmogorov-Smirnova no SPSS, usando um nível de significância de
0.05. A hipótese nula foi rejeitada para as 3 variáveis de concentração relativa
(NDT/ODT, TMD/ODT e TMD/NDT), portanto a sua distribuição não é normal.
Como não se conhece a distribuição de frequências dos grupos e o número de
observações é relativamente pequeno, recorreu-se a testes não paramétricos para
comparação entre as medianas das concentrações relativas dos 4 grupos (EM, IM,
INIB e PM) por aplicação dos testes de Mann-Whitney (comparação entre grupos 2 a
2) e de Jonckheere-Terpstra (comparação dos 4 grupos). Os resultados da aplicação
dos testes são apresentados na Tabela 29. Verifica-se que os metabolizadores lentos
têm concentrações relativas estatisticamente diferentes dos extensivos/normais e dos
Suzana Fonseca
intermédios. Os casos em que se confirmou a presença de substâncias que inibem a
enzima CYP2D6 apenas se conseguem distinguir dos metabolizadores le
razão das concentrações dos metabolitos (NDT/ODT). Usando esta variável fez
ainda a comparação estatística dos diferentes genótipos de metabolizadores
extensivos/normais e não há diferenciação estatística entre o genótipo wt e os
heterozigóticos (*4/wt, *6/wt e *10/wt), apenas se conseguindo verificar diferença
estatística relativamente aos metabolizadores intermédios com genótipo *4/*10 (ver
Tabela 29).
Figura 18. Correlação entre a razão fenótipo previsto do indivíduo, onde INIB é o grupo
intermédios. Os casos em que se confirmou a presença de substâncias que inibem a
enzima CYP2D6 apenas se conseguem distinguir dos metabolizadores le
razão das concentrações dos metabolitos (NDT/ODT). Usando esta variável fez
ainda a comparação estatística dos diferentes genótipos de metabolizadores
extensivos/normais e não há diferenciação estatística entre o genótipo wt e os
óticos (*4/wt, *6/wt e *10/wt), apenas se conseguindo verificar diferença
estatística relativamente aos metabolizadores intermédios com genótipo *4/*10 (ver
. Correlação entre a razão de concentrações TMD/ODT, TMD/NDT e NDT/TMD e o fenótipo previsto do indivíduo, onde INIB é o grupo dos casos com inibidores enzimáticos.
Página 102
intermédios. Os casos em que se confirmou a presença de substâncias que inibem a
enzima CYP2D6 apenas se conseguem distinguir dos metabolizadores lentos usando a
razão das concentrações dos metabolitos (NDT/ODT). Usando esta variável fez-se
ainda a comparação estatística dos diferentes genótipos de metabolizadores
extensivos/normais e não há diferenciação estatística entre o genótipo wt e os
óticos (*4/wt, *6/wt e *10/wt), apenas se conseguindo verificar diferença
estatística relativamente aos metabolizadores intermédios com genótipo *4/*10 (ver
o de concentrações TMD/ODT, TMD/NDT e NDT/TMD e com inibidores enzimáticos.
Suzana Fonseca Página 103
Tabela 29. Resultados de p-value por aplicação dos testes de Mann-Whitney e de Jonckheere-Terpstra (JT) para comparação entre grupos.
TMD/ODT n EM IM INIB PM Teste JT
EM 43 - - - -
IM 11 0.367 - - - p-value:
INIB 13 < 0,001 0,030 - - < 0,001
PM 6 < 0,001 0,048 0,980 -
TMD/NDT Teste JT
EM 43 - - - -
IM 11 0,307 - - - p-value:
INIB 13 0,054 0,569 - - 0.001
PM 6 < 0,001 0,020 0,036 -
NDT/ODT
Teste JT
EM 43 - - - -
IM 11 0,053 - - - p-value:
INIB 13 < 0,001 0,006 - - < 0.001
PM 6 < 0,001 0,002 0,005 -
NDT/ODT n wt *10/wt *4/wt *4/*10 Teste JT
wt 30 - - - - *10/wt 8 0,923 - - - p-value:
*4/wt 5 0,151 0.222 - - 0.019
*4/*10 10 0,026 0,101 0,572 -
Suzana Fonseca Página 104
5.4 Estudo de casos
A avaliação de casos post mortem com tramadol deve ter em conta toda a informação
disponível: exame do local, dados clínicos, investigação circunstancial policial,
achados da autópsia, relatórios de outros exames complementares como os de
anatomia patológica, tentando também excluir outras causas possíveis (Mozayani &
Raymon, 2004). A informação disponível relativamente aos casos analisados não é
suficiente para que as conclusões sejam tidas como prova forense. Procurou-se apenas
enquadrar circunstancialmente os resultados da análise genética (presença de alelos
nulos para a CYP2D6) e de análise toxicológica (concentração do tramadol e dos seus
metabolitos e a presença de inibidores enzimáticos).
As informações fornecidas ao SQTF quando foram requisitados os exames
toxicológicos nos casos de indivíduos que se verificou serem metabolizadores lentos,
todos eles do género masculino, estão sumarizadas na Tabela 30, assim como os
resultados obtidos por aplicação das metodologias desenvolvidas.
Os primeiros 3 casos têm concentração de tramadol superior ao intervalo terapêutico,
de acordo com as tabelas de referência (Repetto & Repetto, 2015; Schulz et al., 2012),
mas as concentrações de ODT são aceitáveis, tendo em conta os resultados publicados
por Grod et al (Grond & Sablotzki, 2004). Em particular, o caso 3 tem uma
concentração de ODT no intervalo terapêutico apesar da elevada concentração de
tramadol. O conhecimento do seu genótipo permitiu concluir que é um metabolizador
lento, explicando as concentrações encontradas no sangue periférico, sendo a do ODT
comparável às obtidas por metabolizadores extensivos/normais nos estudos
farmacocinéticos (García-Quetglas, Azanza, Cardenas, Sábada, & Campanero, 2007;
Grond & Sablotzki, 2004). A concentração elevada do tramadol pode ser devida à
acumulação pela deficiente metabolização ou então a um aumento de dosagem, que
Suzana Fonseca Página 105
pode estar relacionado com o baixo efeito analgésico de origem opióide. Contudo,
sendo o caso de um doente oncológico não se pode excluir a possibilidade de
desenvolvimento de tolerância em tratamento prolongado. Apenas foi encontrado um
comprimido no conteúdo gástrico e a causa de morte foi determinada como natural.
Tabela 30. Resumo da informação fornecida ao SQTF e dos resultados obtidos na análise toxicológica e genética dos casos de metabolizadores lentos.
Caso Idade (anos)
Causa provável de morte
TMD
NDT (ng/mL)
ODT
Outras substâncias
(ng/mL)
DNA (ng/µL)
DI GEN
1 66 Desconhecida 1137 1479 161
Petidina (12)
Sertralina (212)
Benzodiazepinas
(< C terapêutica)
0,25 1,28 *4/*3
2 64 Desconhecida 5600 1338 167
Ticlopidina(401)
Trazodona(156)
Bromazep.(54)
Flurazepam(291)
1,18 0,62 *4/*4
3 71 Natural
(Neoplasia) 2130 1502 50 Negativo 0,45 1,63 *4/*4
4 71 Acidente
(traumático) 528 221 30 Negativo 5,65 0,47 *4/*4
5 55 Desconhecida 205 103 < 25 Negativo 2,51 0,38 *4/*4
6 83 Suicídio
(enforcamento) 147 262 < 25
Paroxetina(160)
Alprazolam(6) 2,51 0,41 *4/*4
(onde: TMD, NDT e ODT são as concentrações do tramadol, N-desmetil-tramadol e O-desmetil-tramadol; DNA é a concentração de ADN; DI é o fator de degradação dado por
aplicação do Quantifiler trio kit e GEN é o genótipo).
Nos casos post mortem de tramadol, a determinação do genótipo de um indivíduo, em
particular se for metabolizador lento, permite já interpretar as concentrações
encontradas no sangue e clarificar as circunstâncias específicas em algumas situações.
No entanto, para que se possam usar estes resultados como prova em tribunal, é
fundamental o estudo aprofundado dos mecanismos de metabolização e do grau
Suzana Fonseca Página 106
interferência das variantes genéticas, de forma a melhor compreender a sua
repercussão no organismo. Por outro lado, a pesquisa e recolha de dados de casos de
rotina é também essencial para aplicar a farmacogenética a casos forenses, em
particular tratando-se de amostras post mortem. Os dados devem compreender, não
apenas os resultados obtidos nas análises laboratoriais de toxicologia e de genética
forenses, mas também toda a informação resultante da investigação policial, a
informação clínica e os restantes achados autópticos.
Suzana Fonseca Página 107
6 Discussão
As características genéticas de cada indivíduo podem ter influência nas concentrações
das substâncias presentes no sangue post mortem, pelo que o seu conhecimento
constitui mais uma ferramenta de apoio ao patologista para o estabelecimento da causa
de morte ou das circunstâncias em que ocorreu (Kupiec et al., 2006). A metodologia
de análise genética aqui desenvolvida permite a identificação dos polimorfismos do
gene CYP2D6 mais prevalentes na população caucasiana que estão relacionados com
o decréscimo da atividade metabólica. Em particular, nos casos com tramadol, o défice
metabólico conduz a um aumento do tempo de permanência desta substância no
organismo e, por vezes, ao aumento da sua concentração, sem que isso se reflita no
efeito opióide. Assim, a informação obtida pela genotipagem e o conhecimento da
concentração do metabolito ativo do tramadol (ODT) através da análise toxicológica,
podem ser contributos importantes para a exclusão do diagnóstico de intoxicação por
sobredosagem, que constituiria uma causa de morte violenta, exclusão esta que nem
sempre é possível recorrendo apenas aos resultados toxicológicos ou aos dados
clínicos.
6.1 Metodologia de análise genética
A farmacogenética no âmbito forense não tem como objetivo a caracterização genética
total do indivíduo, mas sim saber se naquele contexto e de acordo com as substâncias
detetadas nas amostras, existem variantes genéticas com repercussão nas
concentrações observadas. As plataformas comerciais de genotipagem, como
Amplichip CYP450 Test da Roche, detetam muitas variantes de muitos genes e a
informação obtida tem relevância clínica mas, para aplicar em casos forenses, torna-se
Suzana Fonseca Página 108
excessiva, pouco específica e dispendiosa(Almoguera et al., 2010). Além disso, os kits
são desenvolvidos para amostras colhidas para ensaios clínicos, armazenadas nas
melhores condições, podendo ser de difícil aplicação a amostras degradadas. Mesmo
que essas metodologias sejam validadas para amostras forenses, dependerá da
qualidade de ADN da amostra em questão. A utilização de metodologias seletivas para
o gene que se pretende caracterizar, mas com sensibilidade e flexibilidade para adaptar
às amostras disponíveis é vantajosa.
O método desenvolvido neste trabalho é eficaz para a detecção das variantes nulas
mais frequentes, em particular os alelos *3, *4 e *6 do gene CYP2D6. É aplicável à
rotina pericial usando os equipamentos e consumíveis existentes no SGBF do
INMLCF e com custos relativamente baixos. A sequenciação de Sanger é considerada
a metodologia de referência para a genotipagem pela sua exatidão e abrangência e
possibilita a análise de outras variantes genéticas presentes nos fragmentos
amplificados, variantes que frequentemente não são detetadas pelas plataformas
comerciais. O método pode ser complementado com a amplificação de outros
fragmentos do gene que se considerem relevantes, quando haja necessidade. A
sequenciação é uma metodologia rápida, podendo dar resposta de uma amostra em
menos de 24h.
A metodologia desenvolvida pretende discriminar claramente os metabolizadores
lentos, ou seja, com dois alelos nulos. Para facilitar o tratamento dos resultados e
tendo em conta que a prevalência das variantes nulas não pesquisadas é muito baixa,
considerou-se que a ausência de polimorfismos nos fragmentos analisados
corresponde a um fenótipo de metabolizador extensivo/normal (EM). No entanto, para
a interpretação de resultados forenses deverá ser sempre salvaguardada a possibilidade
do indivíduo ser portador de alelos não pesquisados, raros ou desconhecidos.
Suzana Fonseca Página 109
Uma limitação da metodologia desenvolvida é a incapacidade de identificar a variação
do número de cópias do gene (CNV), tal como a deleção total ou multiplicação. A
deleção total do gene em ambos os alelos de um indivíduo corresponde a um fenótipo
de metabolizador lento. Se a amostra tem uma quantidade e uma qualidade de ADN
satisfatória (o que pode ser verificado no passo de quantificação), a ausência de
produtos de sequenciação pode ser indicadora de que o indivíduo é homozigótico para
a variante CYP2D6*5 (deleção do gene). Nas amostras analisadas neste trabalho não
foi encontrada nenhuma nesta situação, o que pode ser justificado pela baixa
prevalência deste alelo (ver Tabela 2). No entanto, para a confirmação deste genótipo
seria adequado desenvolver e validar um método passível de aplicação a amostras
degradadas, como aquele que é proposto por Bodin et al (Bodin, Beaune, & Loriot,
2005). Por outro lado, a possibilidade de detetar a duplicação do gene CYP2D6 é
essencial para identificar os ultra-metabolizadores (UM), genótipo que frequentemente
está na origem de reações adversas e tem uma prevalência média de 2,3% (ver Tabela
2). No entanto, o objetivo do método é identificar os PM e, se for detetada pelo menos
uma cópia funcional do gene, considera-se que existe atividade metabólica e que o
indivíduo não é metabolizador lento.
As amostras em mancha e a metodologia de extração são as habitualmente utilizadas
no SGBF para diversas aplicações de rotina, tendo-se verificado adequadas à
generalidade das amostras estudadas. As manchas foram efetuadas entre 2 meses e 2
anos após a colheita de sangue no cadáver, que entretanto esteve armazenado a -10ºC.
Obtiveram-se resultados satisfatórios mesmo nas amostras mais antigas. Apenas 3
amostras não foram totalmente genotipadas devido ao elevado índice de degradação
(amostras com o código CYP003, CYP034 e CYP035). Nestes casos ou nas amostras
que revelaram mais ruído no eletroferograma, poderá ser importante testar outro
Suzana Fonseca Página 110
método de extração com maior rendimento e seletividade. As amostras de ADN
extraídas pelo método de Chelex foram armazenadas a -20ºC, tendo sido obtidos bons
resultados mais de um ano após a sua extração. Os produtos amplificados já
purificados, bem como os produtos de sequenciação, foram armazenados durante 1
semana a -20ºC e depois analisados com sucesso.
As amostras post mortem estão geralmente sujeitas a fatores de degradação, o que
pode inibir a amplificação e, portanto, a genotipagem (Neville et al., 2002; Sistonen,
2008). A qualidade do ADN é um fator limitante para a obtenção de resultados, em
particular para a amplificação do gene (5000pb) ou de fragmentos longos (736 pb).
Por essa razão utilizou-se o kit Quantifiler®
Trio que consegue discriminar as amostras
que se encontram mais degradadas e que permite avaliar a possibilidade de amplificar
fragmentos com mais de 200 pb. No entanto, os resultados obtidos na quantificação
não são diretamente relacionáveis com a capacidade de amplificação do gene inteiro,
como ficou demonstrado durante o desenvolvimento do método. A sensibilidade do
método é adequada à concentração de ADN nas amostras de sangue post mortem, com
um limite de detecção de 0,1 ng/uL. Durante o ensaio verificou-se que os fragmentos
mais pequenos têm limites de detecção inferiores de 0,01 ng/uL para a zona 3 (200 pb)
e 0,05ng/uL para a zona 1 (437 pb). Durante a análise das amostras de casos de rotina
foi possível verificar que estes limites são adequados, tendo em conta as concentrações
de ADN obtidas. Por outro lado, a quantidade de amostra não é também um fator
limitante porque os volumes habitualmente colhidos para análise toxicológica são
elevados, permitindo fazer várias manchas se tal for necessário.
A amplificação dos 3 fragmentos selecionados demonstrou ser específica, tendo a
vantagem de não ser necessário amplificar o gene inteiro. No entanto, deverá ter-se em
conta que poderão existir variantes ainda não reportadas que, se se localizarem nos
Suzana Fonseca Página 111
fragmentos de ligação dos primers, podem diminuir o rendimento de amplificação ou,
nos heterozigóticos, gerar produtos resultantes de apenas um dos cromossomas, sendo
nesse caso considerados homozigóticos. Tal também acontece no caso de o indivíduo
ser heterozigótico para o alelo CYP2D6*5.
A avaliação dos eletroferogramas foi efetuada com o programa informático
Sequencing analysis da AB, sendo a qualidade das sequências considerada satisfatória
na globalidade das amostras testadas. A degradação dos reagentes utilizados na
amplificação, na purificação, na sequenciação e na análise foi o fator que teve mais
influência no sinal e no ruído dos eletroferogramas, bem como no número de bases
identificadas em cada fragmento.
A identificação das variantes genéticas com o programa informático SeqSCAPE da
AB, é simples para substituições de bases mas pode constituir um desafio para detetar
deleções ou inserções em heterozigóticos. A seleção de primers que permitissem que o
alelo CYP2D6*6 ficasse localizado a meio do fragmento 2 (e não nas extremidades),
permitiu o alinhamento de ambas as sequências (sense e anti-sense), facilitando a
detecção da variante. Tal não foi possível para o alelo CYP2D6*3, porque a variante
está situada na extremidade final do fragmento, e foi sempre detetado apenas com a
sequência sense. A utilização de controlos negativos e positivos em todos os ensaios é,
particularmente nestes casos, essencial para o controlo da metodologia e a validação
dos resultados.
A interpretação dos resultados teve por base o princípio de que o gene CYP2D6 é um
bloco não recombinante no genoma. Portanto, a combinação das variantes detetadas de
acordo com os alelos do CYP Allele Nomenclature Comitee foi considerada como
pertencendo a um cromossoma, constituindo um haplótipo distinto. Por exemplo, a
existência das variantes 100C>T e 1846G>A numa amostra, foi considerada com
Suzana Fonseca Página 112
pertencendo a um só cromossoma, constituindo o alelo CYP2D6*4. O erro introduzido
por esta assunção não é relevante dada a baixa prevalência do alelo CYP2D6*4M, que
tem a variante 1846G>A mas não 100C>T. No entanto, se for este o alelo presente,
estaremos a atribuir o genótipo *4/wt (EM) em vez de *4/10 (IM). Também a presença
do polimorfismo 100C>T sem que esteja presente o 1846G>A foi considerada como
marcador do alelo *10, apesar de poder pertencer a outros alelos (*36, *37, *47, *49,
*52, *54, *56B, *57, *64, *65, *68, *69, *72, *100 ou *101), quase sempre
acompanhado pelo 1661 G>C. Para além da baixa frequência dos outros alelos, o
polimorfismo 100C>T é o responsável pela redução significativa da atividade
enzimática, estando também na origem da discriminação de alguns substratos. Por essa
razão, independentemente do alelo presente, a repercussão no metabolismo existe.
A exatidão do método ficou demonstrada pela identificação das variantes em materiais
de referência adquiridos ao repositório genético do Coriell Cell Repositories, pelo
correcto alinhamento dos fragmentos com a sequência de referência (m33388.1), pela
análise comparativa dos resultados de sequenciação de amplificações com primers
diferentes e pela pesquisa das sequências obtidas no BLAST. Apesar da detecção do
alelo CYP2D6*3 no fragmento 3 só ser possível com a sequência obtida para o primer
sense, a variante foi facilmente identificada no material de referência.
Qualquer metodologia deve ser validada antes da sua aplicação para que se conheçam
as suas vantagens e limitações, demonstrando a fiabilidade dos resultados. A validação
é particularmente importante na área forense, para que os resultados possam ser
utilizados como meio de prova. O método de análise genética foi validado segundo as
recomendações da SWGDAM (Scientific Working Group on & Methods, 2012),
adequando os ensaios à metodologia de sequenciação e complementando com o
procedimento de validação em vigor no SGBF e com informação recolhida na
Suzana Fonseca Página 113
pesquisa bibliográfica (ENFSI DNA WORKING GROUP, 2010; Pont-kingdon et al.,
2012; Zackrisson, 2009). O método revelou-se específico, exato, sensível, reprodutível,
robusto e adequado à aplicação em amostras post mortem, para o fim a que se destina.
6.2 Metodologia de análise toxicológica
A metodologia de confirmação quantitativa de tramadol (TMD), N-desmetil-tramadol
(NDT) e O-desmetil-tramadol (ODT) em amostras post mortem é importante para
avaliar a influência destas substâncias no organismo. O tramadol é um analgésico de
acção central, mas a acção opióide ocorre através da bioativação por metabolização
em ODT. O tramadol é um composto de elevada frequência na casuística do SQTF por
ser muito utilizado em contexto hospitalar e oncológico. Entre os casos positivos é
frequente a concentração de tramadol ser elevada, ultrapassando o intervalo
terapêutico. Em contexto oncológico tal poderia ser explicado pela tolerância
desenvolvida em tratamentos continuados e na necessidade do aumento da dosagem.
No entanto, em contexto hospitalar as dosagens são controladas e conhecidas, não
sendo fácil explicar os resultados encontrados. Nestes casos a comparação apenas com
as concentrações de referência não é adequada. O conhecimento da concentração dos
metabolitos, em particular do ODT por ser o principal responsável pela analgesia por
acção nos receptores µ, pode ser um indicador na capacidade metabólica do indivíduo.
Pode também ser importante na ausência de informação acerca da administração, dos
hábitos de consumo e da atividade enzimática. Caso as concentrações dos metabolitos
sejam diferentes das esperadas, será importante complementar os resultados
toxicológicos com a pesquisa de variantes genéticas com influência na expressão da
enzima de metabolização CYP2D6.
Suzana Fonseca Página 114
O método foi desenvolvido tendo em conta as características das amostras de sangue
post mortem, bem como os intervalos de concentrações de referência para as
concentrações do tramadol e dos seus metabolitos. Com base na experiência adquirida,
a metodologia de extração foi otimizada para uma melhor recuperação, de forma a
aumentar a sensibilidade do método e a diminuir o volume de amostra necessário,
fator muitas vezes limitante em toxicologia post mortem. A seletividade e
especificidade foram também otimizadas através da alteração das condições
cromatográficas e dos iões monitorizados. No decorrer deste trabalho verificou-se que
é importante a pesquisa de outras substâncias, em particular de inibidores enzimáticos.
O método foi também validado para a confirmação quantitativa dos inibidores da
CYP2D6 mais relevantes, tais como a fluoxetina, a paroxetina, a sertralina, o
citalopram, a metadona e a ticlopidina, entre outros (Flockhart, 2007).
A análise por GC/MS não permite a distinção de isómeros ópticos. Apesar de estar
comprovada a diferença de atividade entre os enanteómeros do TMD e também do
ODT, a sua análise diferenciada não será relevante na medida em que a administração
de TMD é efetuada em mistura racémica. A metodologia foi validada segundo as
recomendações da Agência Mundial de Anti-Dopagem (WADA), adequando e
complementando os ensaios de acordo com o procedimento de validação em vigor no
SQTF, bem como com publicações de referência [Almeida 2002]. O método
demonstrou ser seletivo, sensível, preciso, exato e robusto, adequado à utilização na
rotina pericial de toxicologia forense em amostras post mortem.
6.3 Resultados do estudo das amostras
Foram analisadas 100 amostras post mortem, sendo que em 3 não foi possível obter o
genótipo o que corresponde a uma taxa de sucesso de 97%, que é comparável à obtida
por outros autores (Koski, 2005). A degradação da amostra é provavelmente o fator
Suzana Fonseca Página 115
limitante para a dificuldade de amplificação, o que no caso da amostra com o código
CYP003 ficou evidenciado pelos resultados da quantificação Quantifiler Trio. Esta
amostra tem uma concentração de ADN inferior ao limite de detecção do método (0.1
ng/uL) e um coeficiente de degradação muito elevado (ID=12). No entanto, outras
explicações poderiam ser colocadas, tais como as amostras serem homozigóticas para
o alelo CYP2D6*5 ou então para um alelo híbrido que impedisse a amplificação. Em
qualquer destes casos, os alelos seriam nulos e a capacidade metabólica estaria
comprometida, o que não é evidenciado pela observação dos resultados toxicológicos,
como no caso da amostra CYP034 que tem uma concentração de ODT (136 ng/mL)
superior à de NDT (73 ng/mL).
As frequências alélicas encontradas para os alelos nulos são semelhantes às das
esperadas para a população europeia mas diferem das reportadas por Correia et al
(Correia et al., 2009), o único estudo da população portuguesa presente na tabela de
frequências alélicas de Gaedigk com hiperligação em
http://www.cypalleles.ki.se/cyp2d6.htm. Relativamente ao alelo *10 a prevalência é
muito elevada (16,5%) quando comparada com a média europeia de 3.2% (ver Tabela
3 e Tabela 26). A prevalência do genótipo *10/WT foi de 16%, o *4/*10 de 16% e o
*10/*10 de 1% (ver Tabela 27). Por observação do gráfico de medianas e quartis
apresentado na Figura 17, verifica-se que os heterozigóticos para o alelo *4 ou *6 têm
aparentemente uma mediana ligeiramente superior aos que não apresentam variantes.
Apesar das diferenças nestas medianas não serem estatisticamente comprovadas (ver
Tabela 29) pode observar-se que os genótipos *4/wt, *6/wt e *10/wt não se distinguem
dos EM, mas os metabolizadores intermédios sim (*4/*10 e *10/*10). Wang et al.
(2006) estudou o controlo da dor pós-operatória com tramadol e demonstrou que os
indivíduos saudáveis portadores de um alelo CYP2D6*10 (heterozigóticos) têm uma
Suzana Fonseca Página 116
semi-vida de tramadol no plasma significativamente maior que os portadores de 2
alelos funcionais, o que pode ser justificado pela diminuição da velocidade de
eliminação devida a uma deficiente metabolização (G. Wang, Zhang, He, & Fang,
2006). No estudo efetuado não foi possível distinguir este genótipo do dos
metabolizadores normais.
Nas amostras estudadas, os metabolizadores lentos têm razões de concentração de
tramadol em relação aos seus metabolitos diferentes dos metabolizadores intermédios
ou extensivos/normais. Verificou-se que a razão entre as concentrações dos
metabolitos principais NDT/ODT é um marcador do nível de metabolização mais
evidente do que os rácios metabólicos habitualmente utilizados - TMD/ODT e
TMD/NDT (Koski, 2005; Levo et al., 2003). Com o índice NDT/ODT foi possível
distinguir estatisticamente todos os genótipos com exceção dos IM relativamente aos
EM (ver Tabela 29). Mas ainda assim foi possível distinguir estatisticamente o
genótipo *4/*10 do WT (ver Tabela 29). Foram analisados 13 casos em que, além de
tramadol, foi confirmada a presença de substâncias conhecidas por serem inibidores
enzimáticos. Nesses casos, independentemente do genótipo, a interação exercida pelos
inibidores é um fator mais importante na metabolização, pelo que as razões de
concentração distinguem-se estatisticamente dos restantes genótipos, constituindo um
grupo com comportamento metabólico diferenciado e que se aproxima do observado
em metabolizadores lentos. Estes resultados estão de acordo com estudos já publicados
por outros autores (Y. Jin et al., 2005; Saladores et al., 2013; Sistonen, 2008; Stearns
et al., 2003). A avaliação da presença de substâncias inibidoras da enzima CYP2D6
nas amostras durante a análise toxicológica parece ser fundamental para a apreciação
de casos com tramadol ou com outras substâncias que tenham a mesma via metabólica.
Suzana Fonseca Página 117
7 Perspetivas futuras
O método escolhido para a extração de ADN das amostras de sangue total post mortem
demonstrou ser satisfatório, tendo sido possível obter concentrações aceitáveis na
generalidade das amostras. No entanto, algumas sequências apresentaram ruído que,
por comparação com as amostras de referência utilizadas no ensaio de exatidão e de
limite de detecção, devem-se à qualidade de ADN utilizado (Stephen, Lin, & Lai,
2015). Por essa razão, a extração poderá ser otimizada utilizando outras metodologias
com melhor recuperação e qualidade de resultados.
A sequenciação do fragmento 3, que permite a identificação do alelo CYP2D6*3,
deverá ser otimizada através da seleção de novos primers, em particular o anti-sense
(R3), de forma a permitir a amplificação de um fragmento específico e seletivo, com
um número razoável de pb, que permita obter 2 sequências (sense e anti-sense) de
todo o fragmento e em que a variante alvo (2549A>G) fique centrada, para facilitar a
sua identificação. O alelo CYP2D6*5, ou seja a deleção do gene inteiro, é um alelo
nulo com uma frequência significativa (2,7%) mas apenas os indivíduos
homozigóticos para este alelo têm alterações metabólicas. No entanto, seria importante
o desenvolvimento e validação de uma metodologia para a detecção da variação do
número de cópias (Bodin, Beaune, & Loriot, 2005). Tal permitiria também a
identificação dos metabolizadores ultra-rápidos que são um genótipo particularmente
sensível, no caso da administração de substâncias que necessitam da bioativação,
como o tramadol e a codeína, podendo estar na origem de intoxicações (Madadi et al.,
2008; Orliaguet et al., 2015; Sallee et al., 2000).
Suzana Fonseca Página 118
A evolução rápida das técnicas de biologia molecular como a sequenciação de nova
geração (NGS) (Rehm et al., 2013) que permitirá a sequenciação integral do gene
CYP2D6 e se necessário dos seus pseudogenes, associada a metodologias que
identifiquem CNV de forma mais fácil como real-time PCR (Bodin et al., 2005; Book
et al., 2013; Schaeffeler, Schwab, Eichelbaum, & Zanger, 2003), permitirá a
genotipagem completa com a identificação de outras variantes, a seleção de melhores
biomarcadores e estabelecer correlações melhores com os fenótipos observados. No
entanto, as características complexas associadas aos polimorfismos do gene CYP2D6,
nomeadamente a sua semelhança com os pseudogenes e a existência de hibridação,
constitui um grande desafio quer para os especialistas em análise genética quer para o
desenvolvimento e utilização de ferramentas informáticas adequadas (Gaedigk, 2013).
Na análise toxicológica, a utilização de uma metodologia mais sensível, que permita a
identificação e quantificação dos metabolitos e a distinção enanteomérica, por LC/MS,
poderá contribuir para aumentar a correlação com os genótipos A metodologia de
sequenciação pode ser complementada quando se considere necessário com novos
fragmentos para identificar outros polimorfismos. Poderá também ser aplicada a casos
positivos para outras substâncias que metabolizem pela mesma via (CYP2D6), tais
como antidepressivos (amitriptilina e nortriptilina (Hicks et al., 2013; Koski et al.,
2006), citalopram (Holmgren et al., 2004), fluoxetina (Z. Wang et al., 2014)),
antipsicóticos (haloperidol (Brockmöller et al., 2002)) ou outros analgésicos opióides
(codeína (Madadi et al., 2008; Yee, Atayee, Best, & Ma, 2014), metadona (Fonseca et
al., 2011; Shiran et al., 2009)).
Suzana Fonseca Página 119
8 Conclusões
As metodologias desenvolvidas e validadas para a identificação das variantes nulas
mais prevalentes do gene CYP2D6 e para a quantificação de tramadol e metabolitos
em amostras de sangue post mortem demonstraram ser sensíveis, seletivas, específicas,
exatas, precisas e robustas, sendo adequadas à rotina pericial e à análise de amostras
forenses até 3 anos após a colheita.
As 100 amostras de sangue post mortem, selecionadas da casuística do SQTF entre
2012 e 2015 e positivas para tramadol, foram analisadas pelas metodologias
desenvolvidas. Foi possível a análise toxicológica de todas as amostras selecionadas e
a genotipagem de 97. Os resultados obtidos pelas duas metodologias foram
comparados e verificou-se a existência de uma relação entre a razão de concentrações
dos metabolitos do tramadol (NDT/ODT) e os diferentes genótipos, em particular para
o perfil metabólico dos metabolizadores lentos que é estatisticamente diferente dos
metabolizadores extensivos/normais e intermédios. Este parâmetro pode ser uma
alternativa para a avaliação das características metabólicas especialmente em casos
post mortem.
A análise dos resultados destas metodologias e o cruzamento com informação
toxicológica adicional permitiu ainda concluir que a triagem e identificação de
substâncias responsáveis pela inibição enzimática da CYP2D6 que estejam presentes
nas amostras com tramadol é fundamental para a interpretação das concentrações
obtidas.
A utilização da farmacogenética post mortem só é possível se, tendo sempre em conta
os fatores externos e circunstanciais, houver uma correta articulação dos
conhecimentos da patologia, da toxicologia e da genética forenses.
Suzana Fonseca Página 120
Suzana Fonseca Página 121
9 Bibliografia
Abraham, B. K., & Adithan, C. (2001). Genetic Polymorphism of Cyp2D6. Indian
Journal of Pharmacology, 33(2), 147–169.
Allegaert, K., Rochette, A., & Veyckemans, F. (2011). Developmental pharmacology of tramadol during infancy: ontogeny, pharmacogenetics and elimination clearance. Paediatric Anaesthesia, 21(3), 266–73. doi:10.1111/j.1460-9592.2010.03389.x
Almeida, A. M., Castel-Branco, M. M., & Falcao, A. C. (2002). Linear regression for calibration lines revisited: weighting schemes for bioanalytical methods. Journal
of Chromatography B, 774, 215–222.
Almoguera, B., Riveiro-Alvarez, B., Gomez-Dominguez, Lopez-Rpdriguez, R., Dorado, P., Vaquero-Lorenzo, C., … Ayuso, C. (2010). Evaluating a newly developed pharmacogenetic array : screening in a Spanish population. Pharmacogenomics, 11(11), 1619–1625.
Amersham Biosciences. (1998). PCR Product Analysis a guide to using semidry
flatbed gel electrophoresis (80-6437-96/Rev. A) (Amersham B.).
Applied Biosystems. (2002). BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit
Protocol (4337035 Rev. A). Applied Biosystems. Retrieved from https://www3.appliedbiosystems.com/cms/groups/mcb_marketing/documents/generaldocuments/cms_081527.pdf
Applied Biosystems. (2007). Applied Biosystems BigDye XTerminator Purification Kit Protocol. doi:Part Number 4374408 Rev. C
Applied Biosystems. (2009). DNA Sequencing by Capillary Electrophoresis DNA Sequencing by Capillary Electrophoresis.
Applied Biosystems. (2012a). AmpF l STR ® NGM TM
PCR Amplification Kit - user
guide. Retrieved from https://www3.appliedbiosystems.com/cms/groups/applied_markets_support/documents/generaldocuments/cms_041477.pdf
Applied Biosystems. (2012b). SeqScape® Software 3 User Guide (4474242 Rev. A). Life Technologies Corporation. Retrieved from https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/4474242A.pdf
Applied Biosystems. (2014). Quantifiler ® HP and Trio DNA Quantification Kits User Guide (4485354, rev C).
Asic, H. E., & Of, C. (2008). C Asarett and D Oull ’ S Toxicology. Toxicology (Vol. 12). doi:10.1036/0071470514
Bagheri, A., Kamalidehghan, B., Haghshenas, M., Azadfar, P., Akbari, L., Hossein, M., … Houshmand. (2015). Prevalence of the CYP2D6*10 (C100T), *4 (G1846A), and *14 (G1758A) alleles among Iranians of different ethnicities. Drug Design, Development and Therapy, 9, 2627–2634.
Suzana Fonseca Página 122
Barea, J. A., Pardini, M. I., & Gushiken, T. (2004). Extração de DNA de materiais de arquivo e fontes escassas para utilização em reação de polimerização em cadeia ( PCR ). Rev. Bras. Hematol. Hemoter, 26(4), 274–281.
Barreto, T. (2011). Contribuição genética dos Citocromos P450 2C9 e 2D6 e da
Osteopontina na história natural da Hepatite C Crónica.
Bernard, S., Neville, K. a, Nguyen, A. T., & Flockhart, D. a. (2006). Interethnic differences in genetic polymorphisms of CYP2D6 in the U.S. population: clinical implications. The Oncologist, 11(2), 126–35. doi:10.1634/theoncologist.11-2-126
Bio-Rad Laboratories. (2000). Chelex® 100 and Chelex 20 Chelating Ion Exchange Resin - Instruction Manual.
Bodin, L., Beaune, P. H., & Loriot, M.-A. (2005). Determination of cytochrome P450 2D6 (CYP2D6) gene copy number by real-time quantitative PCR. Journal of
Biomedicine & Biotechnology, 2005(3), 248–253. doi:10.1155/JBB.2005.248
Book, M., Stamer, U. M., Lehmann, L. E., & Stüber, F. (2013). Genetic predisposition in anaesthesia and critical care, science fiction or reality? Trends in Anaesthesia
and Critical Care, 3(3), 171–175. doi:10.1016/j.tacc.2013.02.002
Branicki, W., Kupiec, T. C., & Pawlowski, R. (2003). Validation of Cytochrome b Sequence Analysis as a method of Species Identification. Journal of Forensic
Science, 48(1). Retrieved from www.astm.org
Brockmöller, J., Kirchheiner, J., Schmider, J., Walter, S., Sachse, C., Müller-Oerlinghausen, B., & Roots, I. (2002). The impact of the CYP2D6 polymorphism on haloperidol pharmacokinetics and on the outcome of haloperidol treatment. Clinical Pharmacology and Therapeutics, 72(4), 438–52. doi:10.1067/mcp.2002.127494
Budowle, B., Connell, N. D., Bielecka-oder, A., Colwell, R. R., Corbett, C. R., Fletcher, J., … Morse, S. A. (2014). Validation of high throughput sequencing and microbial forensics applications. Investigative Genetics, 5(9), 1–18. doi:10.1186/2041-2223-5-9
Buscemi, L., & Tagliabracci, A. (2011). Pharmacogenetics Role in Forensic Sciences. In Prof Duarte Nuno Vieira (Ed.), Forensic Medicine - From Old Problems to
New Challenges (Prof. Duar., pp. 251–267). INTECH. Retrieved from http://www.intechopen.com/books/forensic-medicine-from-old-problems-to-new-challenges/pharmacogenetics-role-in-forensic-sciences
Câmara, F. G. da. (2001). Estatística Não Paramétrica. Universidade dos Açores. http://www.amendes.uac.pt/monograf/monograf01estatNparamt.pdf
Chan, S. L., Jin, S., Loh, M., & Brunham, L. (2015). Progress in understanding the genomic basis for adverse drug reactions: a comprehensive review and focus on the role of ethnicity. Pharmacogenomicsics. Retrieved from http://www.futuremedicine.com/doi/abs/10.2217/pgs.15.54
Chou, W., Yan, F., Robbins-weilert, D. K., Ryder, T. B., Liu, W. W., Perbost, C., … Wedlund, P. J. (2003). Comparison of Two CYP2D6 Genotyping Methods and Assessment of Genotype-Phenotype Relationships. Clinical Chemistry, 49(4), 542–551.
Suzana Fonseca Página 123
Coller, J. K., Christrup, L. L., & Somogyi, A. a. (2009). Role of active metabolites in the use of opioids. European Journal of Clinical Pharmacology, 65(2), 121–39. doi:10.1007/s00228-008-0570-y
Coller, J. K., Michalakas, J. R., James, H. M., Farquharson, A. L., Colvill, J., White, J. M., & Somogyi, A. A. (2012). Inhibition of CYP2D6-mediated tramadol O-demethylation in methadone but not buprenorphine maintenance patients. British
Journal of Clinical Pharmacology, 74(5), 835–41. doi:10.1111/j.1365-2125.2012.04256.x
Correia, C., Santos, P., Coutinho, A. M., & Vicente, A. M. (2009). Characterization of pharmacogenetically relevant CYP2D6 and ABCB1 gene polymorphisms in a Portuguese population sample. Cell Biochemistry and Function, 27(4), 251–255. doi:10.1002/cbf.1561
Dorado, P., Cáceres, M., Pozo-Guisado, E., Wong, M.-L., Licinio, J., & Llerena, A. (2005). Development of a PCR-based strategy for CYP2D6 genotyping including gene multiplication of worldwide potential use. BioTechniques, 39(10 Suppl), S571–4. doi:10.2144/000112044
Druid, H., Holmgren, P., Carlsson, B., & Ahlner, J. (1999). Cytochrome P450 2D6 (CYP2D6) genotyping on postmortem blood as a supplementary tool for interpretation of forensic toxicological results. Forensic Science International, 99(1), 25–34. doi:10.1016/S0379-0738(98)00169-8
Ehmann, F., Caneva, L., Prasad, K., Paulmichl, M., Maliepaard, M., Llerena, A., … Papaluca-Amati, M. (2015). Pharmacogenomic information in drug labels: European Medicines Agency perspective. Pharmacogenomics J, 15(3), 201–210. Retrieved from http://dx.doi.org/10.1038/tpj.2014.86
Elkalioubie, A., Allorge, D., Robriquet, L., Wiart, J. F., Garat, A., Broly, F., & Fourrier, F. (2011). Near-fatal tramadol cardiotoxicity in a CYP2D6 ultrarapid metabolizer. European Journal of Clinical Pharmacology, 67(8), 855–858. doi:10.1007/s00228-011-1080-x
ENFSI DNA WORKING GROUP. (2010). Recommended Minimum Criteria for the Validation of Various Aspects of the DNA Profiling Process. Retrieved from http://www.enfsi.eu/sites/default/files/documents/minimum_validation_guidelines_in_dna_profiling_-_v2010_0.pdf
European Medicines Agency. (2012). Guideline on the use of pharmacogenetic methodologies in the pharmacokinetic evaluation of medicinal products.
Fleeman, N., Dundar, Y., Dickson, R., Jorgensen, A., Pushpakom, S., McLeod, C., … Walley, T. (2011). Cytochrome P450 testing for prescribing antipsychotics in adults with schizophrenia: systematic review and meta-analyses. Pharmacogenomics J, 11(1), 1–14. Retrieved from http://dx.doi.org/10.1038/tpj.2010.73
Flockhart, D. (2007). Cytochrome P450 Drug Interaction Table. Indiana University
School of Medicine. Retrieved January 21, 2016, from http://medicine.iupui.edu/clinpharm/ddis/main-table
Suzana Fonseca Página 124
Fonseca, F., de la Torre, R., Díaz, L., Pastor, A., Cuyàs, E., Pizarro, N., … Torrens, M. (2011). Contribution of cytochrome P450 and ABCB1 genetic variability on methadone pharmacokinetics, dose requirements, and response. PloS One, 6(5), e19527. doi:10.1371/journal.pone.0019527
Franco, J. M. (2015). Relatório de Actividades de 2014 do Serviço de Química e
Toxicologia Forenses do INMLCF, I. P.
Franco, Y. O., & Franco, L. M. (2003). Biotransformação: importância e toxicidade. Saúde Em Revista.
Gaedigk, A. (2013). Complexities of CYP2D6 gene analysis and interpretation. International Review of Psychiatry (Abingdon, England), 25(5), 534–53. doi:10.3109/09540261.2013.825581
Gaio, V., Picanço, I., Nunes, B., Fernandes, A., Mendonça, F., Horta Correia, F., … Barreto da Silva, M. (2015). Pharmacogenetic Profile of a South Portuguese Population: Results from the Pilot Study of the European Health Examination Survey in Portugal. Public Health Genomics, 18, 139–150. doi:10.1159/000373920
Galan, M., Guivier, E., Caraux, G., Charbonnel, N., & Cosson, J. (2010). A 454 multiplex sequencing method for rapid and reliable genotyping of highly polymorphic genes in large-scale studies. BioMed Central Genomics, 11(296), 1–15. Retrieved from http://www.biomedcentral.com/1471-2164/11/296
Gan, S. H., Ismail, R., Wan Adnan, W. A., & Zulmi, W. (2007). Impact of CYP2D6 genetic polymorphism on tramadol pharmacokinetics and pharmacodynamics. Molecular Diagnosis & Therapy, 11(3), 171–181. doi:10.1007/BF03256239
García-Quetglas, E., Azanza, J. R., Cardenas, E., Sábada, B., & Campanero, M. A. (2007). Stereoselective Pharmacokinetic Analysis of Tramadol and its Main Phase I Metabolites in Healthy Subjects after Intravenous and Oral Administration of Racemic Tramadol. Biopharmaceutics & Drug Disposition, 28, 19–33. doi:10.1002/bdd
García-Quetglas, E., Azanza, J. R., Sádaba, B., Muñoz, M. J., Gil, I., & Campanero, M. A. (2007). Pharmacokinetics of tramadol enantiomers and their respective phase I metabolites in relation to CYP2D6 phenotype. Pharmacological Research : The
Official Journal of the Italian Pharmacological Society, 55(2), 122–30. doi:10.1016/j.phrs.2006.11.003
GE Healthcare. (2010). Reliable extraction of DNA from WhatmanTM FTATM cards ○(Application note 28-9822-22 AA). Retrieved July 23, 2015, from https://www.gelifesciences.com/gehcls_images/GELS/Related Content/Files/1392818611307/litdoc28982222_20140311044843.pdf
Grond, S., & Sablotzki, A. (2004). Clinical Pharmacology of Tramadol. Clinical
Pharmacokinetics, 43(13), 879–923.
Gupta, D. (2013). Pharmacogenomics in Drug Discovery and Development. Journal of
Developing Drugs, 02(02). doi:10.4172/2329-6631.1000e126
Suzana Fonseca Página 125
Healthcare, G. (2009). Whatman FTATM for the protection and storage of DNA (Data file 51750). https://promo.gelifesciences.com/na/K13080/misc/Protection_storage.pdf?extcm
p=K13080-GL-Brochures-SC_prot_stor_DF. Retrieved July 23, 2015, from https://promo.gelifesciences.com/na/K13080/misc/Protection_storage.pdf?extcmp=K13080-GL-Brochures-SC_prot_stor_DF
Hersberger, M., Marti-jaun, J., Rentsch, K., & Hanseler, E. (2000). CRapid Detection of the CYP2D6*3, CYP2D6*4, and CYP2D6*6 Alleles by Tetra-Primer PCR and of the CYP2D6*5 Allele by Multiplex Long PCR. Clinical Chemistry, 46(8), 1072–1077.
Hicks, J. K., Swen, J. J., Thorn, C. F., Sangkuhl, K., Kharasch, E. D., Ellingrod, V. L., … Stingl, J. C. (2013). Clinical Pharmacogenetics Implementation Consortium guideline for CYP2D6 and CYP2C19 genotypes and dosing of tricyclic antidepressants. Clinical Pharmacology and Therapeutics, 93(5), 402–8. doi:10.1038/clpt.2013.2
Holland, M. M., & Parsons, T. J. (1999). Mitochondrial DNA Sequence Analysis - Validation and Use for Forensic Casework. Forensic Science Rev, 11(1), 21–50.
Holmgren, P., Carlsson, B., Zackrisson, A.-L., Lindblom, B., Dahl, M.-L., Scordo, M. G., … Ahlner, J. (2004). Enantioselective analysis of citalopram and its metabolites in postmortem blood and genotyping for CYD2D6 and CYP2C19. Journal of Analytical Toxicology, 28(2), 94–104.
Ingelman-Sundberg, M., Sim, S. C., Gomez, A., & Rodriguez-Antona, C. (2007). Influence of cytochrome P450 polymorphisms on drug therapies: pharmacogenetic, pharmacoepigenetic and clinical aspects. Pharmacology &
Therapeutics, 116(3), 496–526. doi:10.1016/j.pharmthera.2007.09.004
INMLCF, I. P. (webpage). (n.d.). Retrieved from http://www.inml.mj.pt/
Jannetto, P. J., Wong, S. H., Gock, S. B., Laleli-Sahin, E., Schur, B. C., & Jentzen, J. M. (2002). Pharmacogenomics as molecular autopsy for postmortem forensic toxicology: genotyping cytochrome P450 2D6 for oxycodone cases. Journal of
Analytical Toxicology, 26(7), 438–447.
Jickells, S., & Negrusz, A. (Eds.). (2008). Clarke’s Analytical Forensic Toxicology. London.
Jin, M., Gock, S. B., Jannetto, P. J., Jentzen, J. M., & Wong, S. H. (2005). Pharmacogenomics as Molecular Autopsy for Forensic Toxicology: Genotyping Cytochrome P450 3A4*1B and 3A5*3 for 25 Fentanyl Cases. Journal of
Analytical Toxicology, 29(7), 590–598. doi:10.1093/jat/29.7.590
Jin, Y., Desta, Z., Stearns, V., Ward, B., Ho, H., Lee, K. H., … Flockhart, D. a. (2005). CYP2D6 genotype, antidepressant use, and tamoxifen metabolism during adjuvant breast cancer treatment. Journal of the National Cancer Institute, 97(1), 30–39. doi:10.1093/jnci/dji005
Johansson, I., & Ingelman-Sundberg, M. (2011). Genetic polymorphism and toxicology--with emphasis on cytochrome p450. Toxicological Sciences : An
Official Journal of the Society of Toxicology, 120(1), 1–13. doi:10.1093/toxsci/kfq374
Suzana Fonseca Página 126
Kimura, S., Umeno, M., Skoda, R. C., Meyer, U. a, & Gonzalez, F. J. (1989). The human debrisoquine 4-hydroxylase (CYP2D) locus: sequence and identification of the polymorphic CYP2D6 gene, a related gene, and a pseudogene. American
Journal of Human Genetics, 45(6), 889–904.
Kleine-Brueggeney, M., Musshoff, F., Stuber, F., & Stamer, U. M. (2010). Pharmacogenetics in palliative care. Forensic Science International, 203(1-3), 63–70. doi:10.1016/j.forsciint.2010.07.003
Koch, W. H. (2004). Technology platforms for pharmacogenomic diagnostic assays. Nat Rev Drug Discov, 3(9), 749–761. Retrieved from http://dx.doi.org/10.1038/nrd1496
Koski, A. (2005). INTERPRETATION OF POSTMORTEM TOXICOLOGY RESULTS
Pharmacogenetics and Drug-Alcohol Interaction. University of Helsinki, Finland. Retrieved from https://helda.helsinki.fi/handle/10138/20385
Koski, A., Sistonen, J., Ojanperä, I., Gergov, M., Vuori, E., & Sajantila, A. (2006). CYP2D6 and CYP2C19 genotypes and amitriptyline metabolite ratios in a series of medicolegal autopsies. Forensic Science International, 158(2-3), 177–83. doi:10.1016/j.forsciint.2005.05.032
Kramer, W. E., Walker, D. L., Kane, D. J. O., Mrazek, D. A., Pamela, K., Dukek, B. A., … Black, J. L. (2009). CYP2D6: novel genomic structures and alleles. Pharmacogenet, 19(10), 813–822. doi:10.1097/FPC.0b013e3283317b95.CYP2D6
Kupiec, T. C., Raj, V., & Vu, N. (2006). Pharmacogenomics for the Forensic Toxicologist. Journal of Analytical Toxicology, 30(2), 65–72. doi:10.1093/jat/30.2.65
Langford, A. M., Bolton, J. R., Carlin, M. G., & Palmer, R. (2015). Post-mortem toxicology : A pilot study to evaluate the use of a Bayesian network to assess the likelihood of fatality. Journal of Forensic and Legal Medicine, 33, 82–90. doi:10.1016/j.jflm.2015.04.013
Lazarou, J., Pomeranz, B. H., & Corey, P. N. (1998). Incidence of Adverse Drug Reactions in Hospitalized Patients : A Meta-analysis of Prospective Studies. JAMA, 279(15), 1200–1205. doi:10.1001/jama.279.15.1200.ABSTRACT
Lee, H. K., Lewis, L. D., Tsongalis, G. J., Schur, B. C., Jannetto, P. J., Wong, S. H., & Yeo, K. T. J. (2007). Validation of a CYP2D6 genotyping panel on the NanoChip Molecular Biology Workstation. Clinical Chemistry, 53(5), 823–828. doi:10.1373/clinchem.2006.081539
Lee, S.-Y., Ki, C.-S., Hong, K. S., & Kim, J. W. (2004). A Case Report of a Poor Metabolizer of CYP2D6 Presented with Unusual Responses to Nortriptyline Medication. Journal of Korean Medical Science, 19, 750–752.
Leppert, W. (2011). CYP2D6 in the metabolism of opioids for mild to moderate pain. Pharmacology, 87(5-6), 274–85. doi:10.1159/000326085
Levo, A., Koski, A., Ojanperä, I., Vuori, E., & Sajantila, A. (2003). Post-mortem SNP analysis of CYP2D6 gene reveals correlation between genotype and opioid drug (tramadol) metabolite ratios in blood. Forensic Science International, 135(1), 9–15. Retrieved from
Suzana Fonseca Página 127
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0379073803001592
Li, Q., Wang, R., Guo, Y., Wen, S., Xu, L., & Wang, S. (2010). Relationship of CYP2D6 genetic polymorphisms and the pharmacokinetics of tramadol in Chinese volunteers. Journal of Clinical Pharmacy and Therapeutics, 35(2), 239–47. doi:10.1111/j.1365-2710.2009.01102.x
Lyon, E., Gastier Foster, J., Palomaki, G. E., Pratt, V. M., Reynolds, K., Sábato, M. F., … Vitazka, P. (2012). Laboratory testing of CYP2D6 alleles in relation to tamoxifen therapy. Genetics in Medicine : Official Journal of the American
College of Medical Genetics, 14(12), 990–1000. doi:10.1038/gim.2012.108
Madadi, P., Ross, C. J. D., Carleton, B. C., Gaedigk, A., Leeder, J. S., & Koren, G. (2008). Pharmacogenetics of Neonatal Opioid Toxicity Following Maternal Use of Codeine During Breastfeeding : A Case – Control Study. Nature, (May), 1–5. doi:10.1038/clpt.2008.157
Madea, B., Saukko, P., Oliva, A., & Musshoff, F. (2010). Molecular pathology in forensic medicine--Introduction. Forensic Science International, 203(1-3), 3–14. doi:10.1016/j.forsciint.2010.07.017
Mas, S., Crescenti, A., Gassó, P., Vidal-Taboada, J. M., & Lafuente, A. (2007). DNA cards: Determinants of DNA yield and quality in collecting genetic samples for pharmacogenetic studies. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology, 101(2), 132–137. doi:10.1111/j.1742-7843.2007.00089.x
Mathew, S. (2010). An overview on the allelic variant of CYP2D6 genotype. African
Journal of Biotechnology, 9(54), 9096–9102.
Meyer, M. R., & Maurer, H. H. (2014). Toxicokinetics and Toxicogenetics. In B. Madea (Ed.), Handbook of Forensic Science (pp. 889–899).
Montgomery, J. L., & Wittwer, C. T. (2014). Influence of PCR reagents on DNA polymerase extension rates measured on real-time PCR instruments. Clinical
Chemistry, 60(2), 334–340. doi:10.1373/clinchem.2013.212829
Morgulis, A., Coulouris, G., Raytselis, Y., Madden, T. L., Agarwala, R., & Schäffer, A. a. (2008). Database indexing for production MegaBLAST searches. Bioinformatics, 24(16), 1757–1764. doi:10.1093/bioinformatics/btn322
Mozayani, A., & Raymon, L. P. (Eds.). (2004). Handbook of Drug Interactions A
Clinical and Forensic Guide. Handbook of Drug Interactions: A Clinical and
Forensic Guide. New Jersey. doi:10.1162/artl_r_00018
Musshoff, F., Padosch, S., Steinborn, S., & Madea, B. (2004). Fatal blood and tissue concentrations of more than 200 drugs. Forensic Science International, 142(2-3), 161–210. doi:10.1016/j.forsciint.2004.02.017
Musshoff, F., Stamer, U. M., & Madea, B. (2010a). Pharmacogenetics and forensic toxicology. Forensic Science International, 203(1), 53–62. Retrieved from http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S037907381000349X
Musshoff, F., Stamer, U. M., & Madea, B. (2010b). Pharmacogenetics and forensic toxicology. Forensic Science International, 203(1-3), 53–62. doi:10.1016/j.forsciint.2010.07.011
Suzana Fonseca Página 128
National Academy of Sciences. (2009). Strengthening Forensic Science in the United
States: A Path Forward. Retrieved from https://www.ncjrs.gov/pdffiles1/nij/grants/228091.pdf
Neville, M., Selzer, R., Aizenstein, B., Maguire, M., Hogan, K., Walton, R., … Arruda, M. De. (2002). Characterization of Cytochrome P450 2D6 Alleles Using the Invader System. BioTechniques, 32, 34–43.
Orliaguet, G., Hamza, J., Couloigner, V., Denoyelle, F., Loriot, M.-A., Broly, F., & Garabedian, E. N. (2015). A case of respiratory depression in a child with ultrarapid CYP2D6 metabolism after tramadol. Pediatrics, 135(3), e753–5. doi:10.1542/peds.2014-2673
Palmer, S., Giesecke, M., Body, S., Shernan, S., Fox, A., & Collard, C. (2005). Pharmacogenetics of Anesthetic and Analgesic Agents. Anesthesiology, 102, 663–671.
Pedersen, R. S., Damkier, P., & Brosen, K. (2005). Tramadol as a new probe for cytochrome P450 2D6 phenotyping: a population study. Clinical Pharmacology
and Therapeutics, 77(6), 458–67. doi:10.1016/j.clpt.2005.01.014
Pedersen, R. S., Damkier, P., & Brøsen, K. (2006). Enantioselective pharmacokinetics of tramadol in CYP2D6 extensive and poor metabolizers. European Journal of
Clinical Pharmacology, 62(7), 513–21. doi:10.1007/s00228-006-0135-x
Pelotti, S., & Bini, C. (2011). Forensic Pharmacogenetics. In D. N. Vieira (Ed.), Forensic Medicine - From Old Problems to New Challenges.
Pont-kingdon, G., Gedge, F., Wooderchak-Donahue, W., Schrijver, I., Weck, K., Kant, J., … Lyon, E. (2012). Design and Analytical Validation of Clinical DNA Sequencing Assays. Arch Pathol Lab Med, 136, 41–46. doi:10.5858/arpa.2010-0623-OA
Prado, C. M. do. (2009). Desenvolvimento de metodologia para a determinação dos
genótipos principais dos genes CYP2D6 , CYP2C19 e CYP2C9 : aplicação na
Farmacogenética. Universidade de São Paulo, Brasil. Retrieved from http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/87/87131/tde-30042010-093536/pt-br.php
Pratt, V. M., Zehnbauer, B., Wilson, J. A., Baak, R., Babic, N., Bettinotti, M., … Kalman, L. (2010). Characterization of 107 genomic DNA reference materials for CYP2D6, CYP2C19, CYP2C9, VKORC1, and UGT1A1: a GeT-RM and Association for Molecular Pathology collaborative project. The Journal of
Molecular Diagnostics : JMD, 12(6), 835–846. doi:10.2353/jmoldx.2010.100090
Qiagen. (2010). HotStarTaq® Plus PCR Handbook.
Rehm, H., Bale, S. J., Bayrak-Toydemir, P., Berg, J. S., Brown, K. K., Deignan, J. L., … Lyon, E. (2013). ACMG clinical laboratory standards for next-generation sequencing. Genetics in Medicine, 15(9), 733–747. doi:10.1038/gim.2013.92
Repetto, M. R., & Repetto, M. (2015). Tabla de Concentraciones de xenobioticos en
fluidos biologicos humanos como referencia para el diagnostico toxicologico. Sevilla. Retrieved from http://busca-tox.com
Suzana Fonseca Página 129
Reys, L. L. O. (1985). A MEDICINA LEGAL NO HOSPITAL. Acta Médica
Portuguesa, 6, 25–29.
Riccardi, L. N., Lanzellotto, R., Falconi, M., Ceccardi, S., Bini, C., & Pelotti, S. (2013). Development of a Tetraplex PCR Assay for CYP2D6 Genotyping in Degraded DNA Samples. Journal of Forensic Sciences, 8(21), 1–6. doi:10.1111/1556-4029.12358
Sachse, C., Brockmöller, J., Bauer, S., & Roots, I. (1997). Cytochrome P450 2D6 Variants in a Caucasian Population : Allele Frequencies and Phenotypic Consequences. American Journal of Human Genetics, 60, 284–295.
Sajantila, A., Palo, J. U., Ojanperä, I., Davis, C., & Budowle, B. (2010). Pharmacogenetics in medico-legal context. Forensic Science International, 203(1-3), 44–52. doi:10.1016/j.forsciint.2010.09.011
Saladores, P. H., Precht, J. C., Schroth, W., Brauch, H., & Schwab, M. (2013). Impact of Metabolizing Enzymes on Drug Response of Endocrine Therapy in Breast Cancer. Expert Rev Mol Diagnosis, 13(4), 349–65. Retrieved from http://www.medscape.com/viewarticle/804598
Sallee, F. R., DeVane, C. L., & Ferrell, R. E. (2000). Fluoxetine-related death in a child with cytochrome P-450 2D6 genetic deficiency. Journal of Child and
Adolescent Psychopharmacology, 10(1), 27–34.
Samer, C. F., Lorenzini, K. I., Rollason, V., Daali, Y., & Desmeules, J. a. (2013). Applications of CYP450 testing in the clinical setting. Molecular Diagnosis &
Therapy, 17(3), 165–84. doi:10.1007/s40291-013-0028-5
Sanger, F., Nicklen, S., & Coulson, A. R. (1977). DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the
United States of America, 74(12), 5463–5467.
Schaeffeler, E., Schwab, M., Eichelbaum, M., & Zanger, U. M. (2003). CYP2D6 genotyping strategy based on gene copy number determination by TaqMan real-time PCR. Human Mutation, 22(6), 476–85. doi:10.1002/humu.10280
Schulz, M., Iwersen-bergmann, S., Andresen, H., & Schmoldt, A. (2012). Therapeutic and toxic blood concentrations of nearly 1 , 000 drugs and other xenobiotics. Critical Care, 16(R136), 2–5. Retrieved from http://ccforum.com/content/16/4/R136
Scientific Working Group on, & Methods, D. A. (2012). SWGDAM Validation Guidelines for DNA Analysis Methods. Retrieved from http://www.swgdam.org
Shiran, M.-R., Lennard, M. S., Iqbal, M.-Z., Lagundoye, O., Seivewright, N., Tucker, G. T., & Rostami-Hodjegan, A. (2009). Contribution of the activities of CYP3A, CYP2D6, CYP1A2 and other potential covariates to the disposition of methadone in patients undergoing methadone maintenance treatment. British Journal of
Clinical Pharmacology, 67(1), 29–37. doi:10.1111/j.1365-2125.2008.03312.x
Silva, J. C. da, Soares, M. A., & Martins, S. de O. (2012). Reações Adversas a
Medicamentos Análise da base de dados do Sistema Nacional de
Farmacovigilância ( SVIG ). Lisboa.
Suzana Fonseca Página 130
Sistonen, J. (2008). PHARMACOGENETIC VARIATION AT CYP2D6 , CYP2C9 ,
AND CYP2C19 : Population Genetic and Forensic Aspects. University of Helsinki, Finland. Retrieved from https://helda.helsinki.fi/handle/10138/20340
Sistonen, J., Sajantila, A., Lao, O., Corander, J., Barbujani, G., & Fuselli, S. (2007). CYP2D6 worldwide genetic variation shows high frequency of altered activity variants and no continental structure. Pharmacogenetics and Genomics, 17(2), 93–101. doi:10.1097/01.fpc.0000239974.69464.f2
Somogyi, A. a, Barratt, D. T., & Coller, J. K. (2007). Pharmacogenetics of opioids. Clinical Pharmacology and Therapeutics, 81(3), 429–44. doi:10.1038/sj.clpt.6100095
Sorich, M. J., & Coory, M. (2014). Interpreting the clinical utility of a pharmacogenomic marker based on observational association studies. Pharmacogenomics J, 14(1), 1–5. Retrieved from http://dx.doi.org/10.1038/tpj.2013.35
Stamer, U. M., Stüber, F., Muders, T., & Musshoff, F. (2008). Respiratory depression with tramadol in a patient with renal impairment and CYP2D6 gene duplication. Anesthesia and Analgesia, 107(3), 926–929. doi:10.1213/ane.0b013e31817b796e
Stearns, V., Johnson, M. D., Rae, J. M., Morocho, A., Novielli, A., Bhargava, P., … Flockhart, D. a. (2003). Active tamoxifen metabolite plasma concentrations after coadministration of tamoxifen and the selective serotonin reuptake inhibitor paroxetine. Journal of the National Cancer Institute, 95(23), 1758–1764. doi:10.1093/jnci/djg108
Stephen, C. Y. I., Lin, S., & Lai, K. (2015). An evaluation of the performance of five extraction methods: Chelex® 100, QIAamp® DNA Blood Mini Kit, QIAamp® DNA Investigator Kit, QIAsymphony® DNA Investigator® Kit and DNA IQTM. Science & Justice, 55(3), 200–208. doi:10.1016/j.scijus.2015.01.005
Světlík, S., & Hronová, K. (2013). Pharmacogenetics of Chronic Pain and Its Treatment. Mediators of …, 2013. Retrieved from http://www.hindawi.com/journals/mi/2013/864319/abs/
Svetlik, S., Hronová, K., Bakhouche, H., Matoušková, O., & Slanar, O. (2013). Pharmacogenetics of Chronic Pain and Its Treatment. Hindawi, (864319), 1–23. Retrieved from http://dx.doi.org/10.1155/2013/864319
The Human Cytochrome P450 (CYP) Allele Nomenclature Database. (n.d.).
Vernarecci, S., Ottaviani, E., Agostino, A., Mei, E., Calandro, L., & Montagna, P. (2015). Genetics Quantifiler Trio Kit and forensic samples management : A matter of degradation. Forensic Science International: Genetics, 16, 77–85. doi:10.1016/j.fsigen.2014.12.005
Verrecas, M., Knaepen, K., Gilissen, a, Cassiman, J.-J., & Decorte, R. (2004). Forensic toxicology: development of an SNP-assay for genotyping CYP2D6 and CYP2C19 variants. International Congress Series, 1261, 583–585. doi:10.1016/S0531-5131(03)01775-8
Walsh, P. S., Metzger, D. A., & Higuchi, R. (1991). Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material. BioTechniques, 10(4), 506—513.
Suzana Fonseca Página 131
Retrieved from http://europepmc.org/abstract/MED/1867860
Wang, G., Zhang, H., He, F., & Fang, X. (2006). Effect of the CYP2D6*10 C188T polymorphism on postoperative tramadol analgesia in a Chinese population. European Journal of Clinical Pharmacology, 62(11), 927–931. doi:10.1007/s00228-006-0191-2
Wang, Z., Wang, S., Huang, M., Hu, H., Yu, L., Zeng, S. U., & Al, W. E. T. (2014). Characterizing the Effect of Cytochrome P450 ( CYP ) 2C8 , CYP2C9 , and CYP2D6 Genetic Polymorphisms on Stereoselective N-demethylation of Fluoxetine. Chirality, 450. doi:10.1002/chir
Wilson, M. R., DiZinno, J. A., Polanskey, D., Replogle, J., & Budowle, B. (1995). Validation of mitochondrial DNA sequencing for forensic casework analysis. International Journal of Legal Medicine, 108, 68–74.
Wong, S. H., Wagner, M. A., Jentzen, J. M., Schur, C., Bjerke, J., Gock, S. B., & Chang, C.-C. (2003). Pharmacogenomics as an aspect of molecular autopsy for forensic pathology/toxicology: does genotyping CYP 2D6 serve as an adjunct for certifying methadone toxicity? Journal of Forensic Sciences, 48(6), 1406–15. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14640293
Woods, B., Veenstra, D., & Hawkins, N. (2011). Prioritizing pharmacogenetic research: A value of information analysis of CYP2D6 testing to guide breast cancer treatment. Value in Health, 14(8), 989–1001. doi:10.1016/j.jval.2011.05.048
Yang, X., Zhang, B., Molony, C., Chudin, E., Hao, K., Zhu, J., … Lum, P. Y. (2010). Systematic genetic and genomic analysis of cytochrome P450 enzyme activities in human liver. Genome Research, 20(8), 1020–36. doi:10.1101/gr.103341.109
Yee, D. a, Atayee, R. S., Best, B. M., & Ma, J. D. (2014). Observations on the urine metabolic profile of codeine in pain patients. Journal of Analytical Toxicology, 38(2), 86–91. doi:10.1093/jat/bkt101
Zackrisson, A.-L. (2009). Pharmacogenetics from a Forensic Perspective – CYP2D6
and CYP2C19 genotype distributions in autopsy cases. Linköping University, Sweden. Retrieved from http://swepub.kb.se/bib/swepub:oai:DiVA.org:liu-17936
Zafra-Ceres, M., de Haro, T., Farez-Vidal, E., Blancas, I., Bandres, F., de Dueñas, E. M., … Gomez-Llorente, C. (2013). Influence of CYP2D6 polymorphisms on serum levels of tamoxifen metabolites in Spanish women with breast cancer. International Journal of Medical Sciences, 10(7), 932–7. doi:10.7150/ijms.5708
Zahari, Z., & Ismail, R. (2013). Influence of cytochrome P450, family 2, subfamily D, polypeptide 6 (CYP2D6) polymorphisms on pain sensitivity and clinical response to weak opioid analgesics. Drug Metabolism and Pharmacokinetics, 1–71. doi:10.2133/dmpk.DMPK-13-RV-032
Zanger, U. M., & Schwab, M. (2013). Cytochrome P450 enzymes in drug metabolism: regulation of gene expression, enzyme activities, and impact of genetic variation. Pharmacology & Therapeutics, 138(1), 103–41.
doi:10.1016/j.pharmthera.2012.12.007