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UNIVERSIDADE DE PASSO FUNDOFACULDADE DE AGRONOMIA E MEDICINA VETERINÁRIA
CURSO DE MEDICINA VETERINÁRIA
Marina Ragagnin de Lima
RELATÓRIO DO ESTÁGIO CURRICULAR SUPERVISIONADO EM MEDICINA VETERINÁRIA NA WASHINGTON STATE UNIVERSITY,
DEPARTAMENTO DE ANIMAL SCIENCES: Estudo da proteína miostatina e dos genes que a codificam
Passo Fundo2007
Marina Ragagnin de Lima
RELATÓRIO DO ESTÁGIO CURRICULAR SUPERVISIONADO EM MEDICINA VETERINÁRIA NA WASHINGTON STATE UNIVERSITY,
DEPARTAMENTO DE ANIMAL SCIENCES: Estudo da proteína miostatina e dos genes que a codificam
Relatório do Estágio Curricular Supervisionado apresentado ao Curso de Medicina Veterinária, da Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, da Universidade de Passo Fundo, como requisito parcial para a obtenção do grau de Médico Veterinário, sob orientação do Dr. Dan Rodgers e co-orientação do Dr. Eraldo L. Zanella.
Passo Fundo2007
2
Dedico este trabalho aos animais que me ajudaram a perceber o dom para Medicina Veterinária, com coragem e equilíbrio para prosseguir nos meus objetivos, e também à minha família que, com amor, força e paciência, sempre me amparou durante toda a formação pessoal e profissional.
3
AGRADECIMENTOS
A eterna gratidão a todos os que de alguma forma contribuíram para minha evolução
durante toda esta jornada, ensinando-me o valor de coisas simples, mas que me deram
coragem, força, equilíbrio e esperança para lutar e conquistar, talvez, o maior sonho da minha
vida até agora, que é obter o grau de médica veterinária. Peço desculpas se, ao citar o nome de
cada um, a memória falhar.
Obrigada Deus, Jesus e Anjo da Guarda pelas oportunidades que tive e por me
guiarem sempre pelo melhor caminho.
À minha família, sou grata, ensinando-me a importância de ter equilíbrio e, ao mesmo
tempo, dando-me liberdade e audácia para buscar meus ideais, sempre será o porto seguro em
minha vida.
Aos meus pais: Mãe, pela dedicação, amor, paciência e carinho (... um dia gatinha
manhosa...), dando-me firmeza e apoio nas horas mais difíceis (se for preciso pegamos um
tigre à unha), sempre um exemplo pessoal e profissional para mim. Pai, pelos ensinamentos
de organização, decisão e responsabilidade, contigo aprendi que devemos enxergar o que os
olhos não estão vendo. Obrigada por estarem presentes na minha vida, pela educação e por
acreditarem nas palavras da guriazinha que vestiu a camisa branca e pegou a maletinha preta
dizendo que seria “dotora vitirinária”. Vocês são os maiores incentivadores para que eu faça
dessas palavras uma conquista.
Aos meus incansáveis avós: Vô Romeu, com os passeios de carreta e carroça, os
remates, os leões do circo e tantas vezes que me puxou campo a fora montada na Xispa. Vó
Eline, sempre fazendo minhas vontades, o doce de figos, os almoços de família ao som da “la
bela polenta” ou dos boleros nos domingos, uma verdadeira guerreira que me dá muito
incentivo (coraggio, mulher). Vô Elci, presente na minha vida através dos seus sábios
ensinamentos. Vó Alci, com os causos de família e os quentinhos blusões de lã.
Aos meus zelosos tios, em especial à tia Kátia e ao tio Néco, pelas tantas vezes que me
cuidaram quando criança.
Aos meus primos, pelo carinho dos olhos brilhantes e a sinceridade da prece para o
anjo da guarda.
4
Aos animais que me inspiram e ensinam uma nova lição a cada dia, o meu eterno
reconhecimento. Em especial Xispa, Titica, Palomita, Guri, Dana, Cuca, Caetana, Marana,
Mouro, Rosilho e Cigano com quem simplesmente aprendi a sentir... o aroma da carqueja
molhada no trotar das campereadas, o embalo do galope e o vento que corta, a força de
vontade na perna que espicha para montar e a submissão no toque da rédea ou de um assovio,
a gratidão no olhar por uma porção de comida, a sintonia e a confiança na hora dos nossos
desafios.
E quando saí da querência em busca do sonho, tive tantas pessoas que me ajudaram.
Jamais as esquecerei.
Muito obrigada...
... à Família Mello Matte pelo carinho e apoio, proporcionando-me muitas alegrias e
aprendizados.
... aos professores e funcionários do curso de Medicina Veterinária da Universidade de
Passo Fundo, pelas oportunidades, especialmente aos Professores Leonardo Alves, Leonardo
Barcellos, Eraldo Zanella, meus orientadores. À professora Maria Isabel Vieira, mestra e
amiga, pelo apoio e incentivo. Aos professores Édison Nunes, Elci Dickel, Carlos Bondan.
... aos meus colegas e amigos: Marília, minha amiga de fé, por me ensinar a
importância de uma amizade sólida e recíproca (saudade, minha irmã).
... à Washington State University, Departamento de Animal Sciences, onde realizei o
estágio curricular: Dr. Jerry Reeves, Dr. Dan Rodgers e seu grupo que sempre me auxiliaram.
... ao meu namorado e futuro colega, Ricardo Zanella, pela atenção, paciência,
dedicação, amor e carinho, não medindo esforços em me ensinar, orientar e ajudar durante
toda a graduação. Para mim, um exemplo de pessoa e profissional médico veterinário. A ti,
minha eterna gratidão.
5
RESUMO
O presente relatório descreve as atividades desenvolvidas durante o Estágio Curricular Supervisionado em Medicina Veterinária, realizado na Washington State University, Departament of Animal Sciences, localizado na cidade de Pullman, no estado de Washington, Estados Unidos da América. As atividades acompanhadas ou realizadas abrangeram a participação em projetos de pesquisa, desenvolvimento de técnicas laboratoriais, participação em seminários ministrados por professores e estudantes de graduação da Washington State University, bem como algumas atividades complementares. O estágio foi realizado no período de julho a novembro de 2007, com carga horária total de X horas, sob a orientação do Prof. Dr. Dan Rodgers. O relatório refere-se às atividades desenvolvidas durante o período de Estágio Curricular Supervisionado em Biologia Molecular (Tabela 1).
Tabela 1 – Atividades realizadas no laboratório durante o estágio e o número de procedimentos realizados
Procedimento Número de procedimentos
Número total de amostras
PCRs 57 348Transformações 9 21Seqüenciamentos 8 28Purificação de DNA a partir de transformação 9 14Extração de DNA a partir de agarose gel 3 3Ampicilina estoque 1000 x 1 10mlKanamycin estoque 1000 x 1 10mlMeio LB estoque 1 2LMeio LB acrescido de ampicilina (50 µg/l) 1 1LPlacas para cultivo bacteriano 1 40 placas
6
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Comparação dos membros da superfamília dos fatores de crescimento e
diferenciação (GDF-β). ............................................................................................................16
Figura 2 – Seres com disfunção da miostatina ativa apresentando dupla-musculatura. (A)
bovino da raça Belgian Blue; (B) ratos modificados geneticamente; (C) menino de 7 meses de
idade com alterações no gene da miostatina.............................................................................19
Figura 3 – Avaliação da carcaça de um bovino wagyu através do método ribeye...................44
7
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Atividades realizadas no laboratório durante o estágio e o número de
procedimentos realizados............................................................................................................6
Tabela 2 – Ingredientes e quantidade para a realização da técnica PCR..................................28
8
LISTA DE ABREVIATURAS
ANS - Animal Science Department
ALK - Activin receptor–like kinase
BMP-1 - Vertebrate bone morphogenetic protein-1
C - Celsius (centígrado)
cDNA - DNA complementar
Ddntp - Didesoxinucleotídeos Trifosfatados
dL - Decilitro
DNA - Ácido deoxirribonucléico
Dr - Doutor
E. coli - Escheriquia Coli
EUA - Estados Unidos da América
F - Fahrenheit
g - Grama
GDF-8 - Miostatina ou Growth Differentiation Factor 8
GDF-11 - Growth Differentiation Factor 11
GDF-β - Fatores de Crescimento ou Growth Differentiations Factors
Kg - Quilograma
Kb - Kilo base pairs
L - Litro
M - Molar
mEq - Miliequivalente
mg - Miligrama
ml - Mililitro
mm - Milímetro
mRNA - Ácido ribonucléico mensageiro
mstn - miostatina
Pb - Pares de bases
9
PCR - Reação de Cadeia da Polymerase
pH - Concentração do íon hidrogênio
RNA - Ácido ribonucléico
rRNA - Ácido ribonucléico ribossômico
rpm - Rotações por minuto
tRNA - Ácido ribonucléico transportador
WSU - Washington State University
WA - Washington State
° - Grau
α - Alfa
β - Beta
γ - Gama
mg - Micrograma
ml - Miliitro
µ - Micro
µl - Microlitro
/ - Por
% - Porcentagem
= - Igual
< - Menor
> - Maior
10
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ..................................................................................................................... 13
2 DESCRIÇÃO DO LOCAL .................................................................................................... 14
3 ATIVIDADES DESENVOLVIDAS ..................................................................................... 15
4 REVISÃO DE LITERATURA .............................................................................................. 16
4.1 Miostatina ........................................................................................................................... 16
4.1.1 Síntese e ativação da miostatina ...................................................................................... 19
4.1.2 Receptores para miostatina .............................................................................................. 20
4.1.3 Eventos que podem interferir na função da miostatina .................................................... 22
4.2 Ácido Deoxirribonucléico (DNA) ...................................................................................... 22
4.3 Ácido Ribonucléico (RNA) ................................................................................................ 23
4.4 Síntese protéica ................................................................................................................... 24
4.5 Exons e Introns ................................................................................................................... 25
5 ATIVIDADES DESENVOLVIDAS ..................................................................................... 26
5.1 Técnicas laboratoriais ......................................................................................................... 26
5.1.1 Reação em cadeia da polimerase (PCR) .......................................................................... 26
5.1.2 Clonagem de genes .......................................................................................................... 29
5.1.3 Sequenciamento de DNA ................................................................................................. 33
5.1.4 Construção de mapas dos genes e da proteína miostatina ............................................... 34
5.1.5 Descongelamento, cultivo e congelamento de células cardíacas (C9H12) ...................... 34
6 PARTICIPAÇÃO EM PROJETO DE PESQUISA ............................................................... 37
6.1 Molecular Phylogenetic Analysis Of The Myostatin Gene Family: A Model For
Understanding Functional Divergence. ................................................................................... 37
6.1.1 Introdução ........................................................................................................................ 37
6.1.2 Material e métodos ........................................................................................................... 37
6.1.3 Resultados preliminares ................................................................................................... 38
6.1.4 Conclusão ......................................................................................................................... 38
7 APRESENTAÇÃO DE SEMINÁRIO .................................................................................. 39
11
7.1 Myostatin (Mstn) Gene Duplications In Atlantic Salmon (Salmo Salar): Evidence For
Different Selective Pressure On Teleost Mstn-1 And -2 .......................................................... 39
7.1.1 Introdução ........................................................................................................................ 39
7.1.2 Materiais e métodos ......................................................................................................... 40
7.1.3 Resultados ........................................................................................................................ 40
7.1.4 Conclusão ......................................................................................................................... 41
8 ATIVIDADES COMPLEMENTARES ................................................................................. 43
8.1 Atividades relacionadas com bovinos Wagyu ................................................................... 43
9 CONCLUSÃO ....................................................................................................................... 45
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................................... 46
ANEXOS .................................................................................................................................. 49
ANEXO 1 – PRIMERS UTILIZADOS NAS REAÇÕES DE PCR ......................................... 50
ANEXO 2 – CÁLCULO PARA TEMPERATURAS DE ANELAMENTO DOS PRIMERS 51
ANEXO 3 – GEL DE AGAROSE 1% ..................................................................................... 52
ANEXO 4 – AMPICILINA ESTOQUE 1000 X ...................................................................... 53
ANEXO 5 – KANAMYCIN ESTOQUE 1000 X ..................................................................... 54
ANEXO 6 – MEIO LB ESTOQUE .......................................................................................... 55
ANEXO 7 – MEIO LB ACRESCIDO DE AMPICILINA (50 µG/L) ..................................... 56
ANEXO 8 – PLACAS PARA CULTIVO BACTERIANO ..................................................... 57
ANEXO 9 – PURIFICAÇÃO DE DNA A PARTIR DE TRANSFORMAÇÃO. .................... 58
ANEXO 10 – EXTRAÇÃO DE DNA A PARTIR DE AGAROSE GEL ................................ 60
ANEXO 11 – MAPA DO VETOR UTILIZADO NA CLONAGEM DE GENES .................. 62
ANEXO 12 – MAPA COMPARATIVO DOS GENES DE MIOSTATINA EM
SALMONÍDEOS ...................................................................................................................... 63
ANEXO 13 – ALINHAMENTO DAS SEQÜÊNCIAS DOS EXONS DE MSTN-2 .............. 64
12
1 INTRODUÇÃO
Durante o estágio curricular, realizado no Departament of Animal Sciences, no
período de 18 de julho a 15 de novembro totalizando X horas, sob a orientação do Prof. Dr.
Dan Rodgers, tive a oportunidade de trabalhar com o desenvolvimento de técnicas
laboratoriais, pesquisas, participação em seminários, bem como em atividades
complementares.
Com relação às técnicas laboratoriais, realizou-se o aprendizado e desenvolvimento
das técnicas utilizadas nos projetos de pesquisa, tais como Reação em Cadeia da Polimerase
(PCR), Clonagem de genes, Purificação de DNA, Análise de seqüenciamentos de DNA,
Descongelamento, cultivo e congelamento de células musculares cardíacas, entre outras
técnicas.
Na área de pesquisa, houve a participação em projetos científicos relacionados com a
proteína miostatina, que tem como principal função a inibição do desenvolvimento e
diferenciação de células musculares.
As participações em seminários , defesas de teses junto ao departamento de Animal
Sciences, palestras realizadas pelos alunos de graduação, professores da WSU e outras
universidades, bem como nas reuniões do grupo do laboratório, onde eram apresentados
trabalhos científicos e realizavam-se estudos e discussões a respeito dos mesmos.
Nas atividades complementares, houve oportunidade de participação em alguns
eventos como a Reunião e Leilão Anual de Bovinos da Raça Wagyu (um dos maiores eventos
realizados pela Associação Americana de Wagyus), curso de aprimoramentos em ministrar
aulas, participações em feiras de animais e também em algumas atividades práticas como
vacinações, desmame, diagnóstico de gestação em vacas e avaliação de carcaça de bovino da
raça wagyu.
13
2 DESCRIÇÃO DO LOCAL
O estágio curricular em Medicina Veterinária foi realizado na Washington State
University (WSU), uma instituição de ensino localizada na cidade de Pullman, no noroeste do
estado de Washington, mais precisamente na região chamada Palouse, nos Estados Unidos da
América.
A WSU foi fundada em março de 1890 com o nome de Washington Agricultural
College and School of Science, modificando seu nome para State College of Washington em
1905 e, finalmente em 1959, para Washington State University.
A universidade possui quatro campus em distintas cidades, três destes localizados nos
EUA e um, no Canadá, sendo que o campus de Pullman é o maior, com uma área de 620 acres
(2.5 km²) aproximadamente; 200 cursos, num total de 20 mil acadêmicos e aproximadamente
3.500 pós-graduandos; destes, 1.200 são alunos internacionais, provenientes de 87 diferentes
países.
O Departamento do Animal Sciences, localizado no campus, possui dois prédios com
dois andares cada um, distribuindo-se ali as salas de professores e pós-graduandos, banheiros
e laboratórios.
O Laboratório de Molecular Endocrinology, Animal Genomic and Muscular Biology,
onde realizei o estágio, é subdividido em três ambientes, coordenado pelo professor Dan
Rodgers, e acolhe um grupo de quatro estudantes, sendo um doutorando, um mestrando e dois
graduandos. O principal enfoque do grupo no momento é investigar a proteína miostatina,
origem, síntese e ação nos diferentes tecidos musculares de diversas espécies.
14
3 ATIVIDADES DESENVOLVIDAS
Durante o estágio curricular supervisionado em Medicina Veterinária, as atividades
foram desenvolvidas no laboratório de Molecular Endocrinology, Animal Genomic and
Muscular Biology na WSU.
No primeiro período, foram feitas revisões bibliográficas relacionadas aos trabalhos
desenvolvidos pelo grupo do laboratório, bem como acompanhamento das técnicas
laboratoriais utilizadas pelos pós-graduandos no desenvolvimento dos mesmos. Além disso,
houve a participação como espectadora em defesas de mestrado e doutorado realizadas no
departamento e também em seminários apresentados por professores e pesquisadores da WSU
e de outras instituições.
Depois de um prévio conhecimento das técnicas desenvolvidas no laboratório, iniciou-
se a participação nos projetos de pesquisa com a prática das atividades laboratoriais de
descongelamento, cultivo e congelamento de células musculares cardíacas, PCR, clonagem
gênica, purificação de DNA, seqüenciamento de fragmentos de DNA clonados e
seqüenciamento da miostatina codificada pelos diferentes genes existentes em peixes.
Na segunda metade do estágio, além das atividades laboratoriais, iniciaram-se as reuniões e
seminários do laboratório de Molecular Endocrinology, incluindo-se a participação com o
trabalho, “Myostatin (MSTN) gene duplications in Atlantic salmon (Salmo salar): Evidence
for different selective pressure on teleost MSTN-1 and -2”.
Durante o estágio também foram realizadas algumas atividades complementares, como
presença na reunião e leilão anual de bovinos da raça Wagyu, curso para ministrar aulas, e
algumas participações em atividades práticas de manejo, como vacinações e desmame de
bezerros em uma fazenda, avaliação de carcaça de bovino pertencente à raça Wagyu no (meat
lab) laboratório de carnes da WSU.
15
4 REVISÃO DE LITERATURA
4.1 Miostatina
A miostatina, conhecida também como GDF-8, é uma proteína pertencente à
superfamília dos fatores de crescimento e diferenciação (GDF-β). Sua descoberta e os genes
que determinam sua síntese, expressão e função foram identificados em 1997 pelos
geneticistas Alexandra McPherron e Se-Jin Lee.
Figura 1 – Comparação dos membros da superfamília dos fatores de crescimento e diferenciação (GDF-β). refeRÊNCIAS
Pesquisas desenvolvidas com ratos mostraram que a miostatina começa a se expressar
no embrião aos nove dias, no miótomo, perpetuando-se durante o desenvolvimento do mesmo
16
ao longo da embriogênese. Esta proteína interfere negativamente no desenvolvimento e
diferenciação do tecido muscular esquelético. No tecido dos mamíferos adultos, geralmente, a
miostatina é expressa quase que exclusivamente no tecido muscular esquelético
(McPHERRON; LAWLER and LEE, 1997; RODGERS BD et al., 2001), embora sejam
detectados níveis de mRNA em outros tecidos como o tecido adiposo (McPHERRON et al.,
1997), glândulas mamárias (JI et al., 1998) e mais recentemente no tecido muscular cardíaco
(cardiomiócitos) (BRAND and SCHNEIDER, 1995). Nos peixes, o mRNA foi detectado em
músculos esqueléticos, olhos, filamentos branquiais, fígado, ovários, intestinos, cérebro e em
menos quantidade nos testículos (RODGERS et al., 2001; MACCATROZZO et al., 2001).
Através de mapeamento genético, estudos demonstraram que nos mamíferos existe
apenas 1 (um) gene determinando a síntese da miostatina (CHARLIER et al., 1995;
DUNNER et al., 1997; CASAS et al., 1998), porém em alguns peixes, como no caso da truta
arco-íris, foram descobertos até 2 (dois) genes que determinam a codificação desta proteína
(GARIKIPATI et al., 2007).
A superfamília dos fatores de crescimento e diferenciação (GDF-β) compreende um
grande número de proteínas reguladoras da proliferação e diferenciação celular, tendo como
função principal a regulação do desenvolvimento embrionário e manutenção dos tecidos em
animais adultos; geralmente necessitam ser contrabalanceadas por outros membros que
controlem este crescimento, sendo o caso da miostatina.
A principal função da miostatina, como inibidora do desenvolvimento e diferenciação
do tecido muscular esquelético, ficou bem elucidada através de um experimento em ratos, os
quais possuíam uma porção dos genes deletada; este local determina a codificação do C-
terminal na miostatina, onde esta, ativada, liga-se aos receptores nas fibras musculares. Do
cruzamento destes animais, resultou um descendente homozigoto para o gene alterado que era
2 (duas) a 3 (três) vezes mais musculoso que seus irmãos heterozigotos, e estes apresentavam
25% mais massa muscular que os ratos normais (homozigotos para o gene normal), sugerindo
assim que o efeito da miostatina seria dose dependente.
Os ratos que demonstraram aumento significativo na massa muscular esquelética
apresentaram aumento tanto no número (hiperplasia) quanto no tamanho (hipertrofia) das
fibras musculares, quando comparados com ratos normais (McPHERRON et al. 1997). Os
aumentos na massa muscular destes ratos foram observados em uma idade precoce e se
mantiveram ao longo da vida (McPHERRON & LEE, 2002).
Kambadur et al (1997); McPherron and Lee (1997); Grobet et al (1997) demonstraram
que as raças de bovinos Belgian Blue e Piedmontese, caracterizados pela dupla musculatura,
17
possuem mutações genéticas para miostatina. Na raça Belgian Blue existe uma deleção de 11
(onze) pares de base na região do exon 3 (três), seqüência que determina a codificação do C-
terminal da proteína; já, na raça Piedmontese, há substituições de Guanina por Adenina,
resultando em alterações de cisteínas por tirosinas nesta mesma região (McPHERRON &
LEE, 1997; KAMBADUR et al., 2006). Mais tarde, outras raças de bovinos, tais como Blond
d’aquitaine, Limousin, Parthenaise, Asturiana de los valles, Rubea, Galega e South devon
foram investigadas e também apresentaram mutações genéticas para miostatina (DUNNER et
al., 1997; KARIM et al, 2000).
Schuelke et al (2004) identificou alterações no primeiro intron do gene para a
miostatina em um menino alemão com 7 (sete) meses de idade.
Nas aves, a expressão da miostatina foi detectada inicialmente em embriões no estágio
de blastômero, sugerindo que a proteína também tem função na embriogênese e
desenvolvimento esquelético dos embriões (KOCAMIS et al, 1999). Estudos em aves de corte
e aves de postura demonstram uma significativa diferença entre as duas aptidões, com as taxas
de miostatina bem maiores em aves de postura maiores de 21 (vinte e um) dias de idade.
Em ovinos, nos estágios de feto com 90 (noventa) dias de idade e em animais adultos,
além da função da miostatina no tecido muscular esquelético, também foi comprovada a
expressão da mesma no tecido muscular cardíaco, mais especificamente nos cardiomiócitos,
através da técnica de reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). Níveis
elevados de miostatina foram detectados em tecido muscular cardíaco após infarto,
especialmente nas áreas peri-infartadas, iniciando-se a elevação em 12 (doze) horas, atingindo
o ápice em 30 (trinta) horas e retornando aos níveis iniciais 48 (quarenta e oito) horas após o
início do infarto (MRIDULA et al, 1999).
Podemos notar que o gene da miostatina bem como o seqüenciamento e a função desta
proteína são largamente estudados em diversas espécies. Estas características parecem se
manter bem conservadas ao longo das gerações e nas diversas espécies (McPHERRON &
LEE, 1997), porém as seqüências de miostatina identificadas em diferentes espécies de peixes
(McPHERRON & LEE, 1997; MACCATROZZO et al, 2001; OSTBYE et al, 2001;
RESCAN et al, 2001; ROBERT & GOETZ, 2001; RODGERS & WEBER, 2001; RODGERS
et al, 2001; KOCABAS et al, 2002) divergem significativamente dos outros vertebrados,
sendo bem próximas de uma outra proteína da superfamília dos GDF- β, GDF-11 (Growth
Differentiation Factor 11), o que leva a crer que a miostatina nos peixes divergiu do GDF-11
após a origem dos mesmos, existindo assim a suspeita de que há um ancestral precursor
original (OSTBYE et al, 2001).
18
Além dos peixes apresentarem diferença nos genes, na seqüência da proteína e
também na localização em diversos órgãos, não se sabe exatamente se a principal função da
miostatina está restrita em regular somente o desenvolvimento e a diferenciação do tecido
muscular esquelético, em virtude destas diferenças.
Figura 2 – Seres com disfunção da miostatina ativa apresentando dupla-musculatura. (A) bovino da raça Belgian Blue; (B) ratos modificados geneticamente; (C) menino de 7 meses de idade com alterações no gene da miostatina.
4.1.1 Síntese e ativação da miostatina
A miostatina, assim como os demais componentes da superfamília dos GDF-β, é
sintetizada como uma proteína precursora e posteriormente passa por dois processos
proteolíticos. Na primeira quebra são removidos 24 (vinte e quatro) aminoácidos, usados
como alvo. A segunda quebra ocorre no local conhecido como RSRR (Argenina-Serotonina-
Argenina-Argenina), mais precisamente nos aminoácidos 240-243 (numerados do primeiro
aminoácido depois da seqüência do sinal). Esta quebra gera 2 (dois) fragmentos, o N-terminal
e o C-terminal, tornando a molécula biologicamente ativa. O C-terminal da miostatina, uma
vez ativado, caracteriza-se por possuir 9 (nove) resíduos de cisteína separados por espaços
característicos, que resulta em pontes disulfides intra e intermoleculares chamadas CKS
(Cysteine Knot structure). Através do C-terminal, a miostatina é capaz de se ligar aos seus
receptores e ativar o sinal de transcrição em cascata nas células-alvo. A ativação da miostatina
latente pode ocorrer pela clivagem provocada por membros da família das metalloproteinases,
mas não se sabe precisamente qual das proteinases é responsável por essa clivagem in vivo.
Sabe-se que as proteinases (BMP)-1/tolloid da família das metalloproteinases,
presentes no osso, são capazes de clivar o pró-peptideo da miostatina no aspartato 76 (setenta
19
A B C
e seis), logo após o N- terminal. A importância destas proteinases regulando a latência da
miostatina in vivo é demonstrada por estudos, onde se utilizou uma forma mutante do pró-
peptideo, em que o aspartato 76 (setenta e seis) foi alterado para alanina; desta mutação
resultou o pró-peptideo resistente à proteólise pelas BMP-1/tolloid proteinases in vitro. Este
pró-peptideo alterado, quando injetado durante quatro semanas seguidas em ratos, resultou em
aumentos de aproximadamente 25% no crescimento muscular em comparação quando se usou
o não-alterado.
Esse experimento nos mostra que o pró-peptideo, quando alterado, é capaz de manter a
forma latente da miostatina, sendo esta resistente à clivagem por proteinases na família de
BMP-1/tolloid e conseqüentemente à ativação.
Estudos com TLL-2, membro da família das BMP-1/tolloid proteinases, estão sendo
desenvolvidos. Acredita-se que ele pode ser expresso especificamente no músculo
esquelético durante a embriogênese (SCOTT et al, 1999), levantando a possibilidade de que
TLL-2 pode ser a proteinase que ativa a miostatina durante o desenvolvimento do músculo
esquelético no embrião.
4.1.2 Receptores para miostatina
A miostatina, depois de ativada, assim como os demais membros da família das GDF-
β, necessita se ligar através do complexo C-terminal aos seus receptores para que o sinal de
transcrição em cascata nas células-alvo também seja ativado. A maioria dos membros da
superfamília dos TGF-β acredita-se sinalizarem, através dos complexos heteroméricos do tipo
I e tipo II, serina/treonina/kinase receptores (MASSAGUÉ, 1998).
Primeiramente, a miostatina une-se com o receptor do tipo II e esta ligação então
recruta os receptores do tipo I, formando o complexo de receptores I e II; o receptor I passa
por um processo de fosforilação tornando-se ativado e, por sua vez, fosforila o receptor Smad
(R-Smad) que, no caso da miostatina, associa-se às proteínas Smad-2 ou Smad-3. Estas
proteínas se ligam com a Smad-4 (Co-Smad, common-partner Smads) formando um
complexo que se move até o núcleo, faz associação com outro receptor e finalmente se liga
aos genes alvos ativando a transcrição na célula-alvo.
Em contrapartida, a proteína Smad-7 (I-Smads, Inibitiry Smads) realiza a regulação
deste mecanismo ao se ligar no receptor do tipo I ativado (bloqueando a ligação do R-Smad)
e/ou nas proteínas Smad-2 e 3 (impedindo a ligação com Smad-4). A transcrição desta
20
proteína é ativada por TGF- β e ativina, comprovando desta a existência de um mecanismo de
feedback.
Estudos usando miostatina purificada recombinante demonstraram que, in vitro, ela é
capaz de se ligar aos receptores de ativina do tipo II, ActRIIA e ActRIIB (LEE &
McPHERRON, 2001; REBBAPRAGADA et al, 2003).
Assim como acontece com a miostatina, GDF-11, uma outra proteína pertencente à
superfamília das GDF- β, também tem a capacidade de se ligar aos receptores ActRIIA e
ActRIIB, levando-nos a pensar como funciona o mecanismo de sinalização para que ocorra a
ligação especificamente da miostatina nestes receptores. Uma possível hipótese é de que as
BMP-1/tolloid proteinases, responsáveis pela clivagem do pró-peptideo da miostatina,
somente realizem esta ativação nos locais e nas horas em que a supressão do crescimento
muscular seja desejada. Mas, para que seja totalmente entendido esse mecanismo, é
necessário um estudo mais detalhado de como acontece a ativação dos pró-peptídeos de
miostatina em diferentes condições fisiológicas.
Determinados membros da família de TGF-β requerem correceptores a fim de se
acoplarem aos receptores do tipo II. Uma alternativa para conseguir a especificidade da
miostatina é a utilização seletiva de correceptores, porém ainda não se sabe quais são os
correceptores especificamente requeridos pela miostatina para que esta se ligue aos receptores
ActRIIA e ActRIIB.
Outro possível mecanismo para ligação específica da miostatina é a restrita expressão
de um receptor tipo I apropriado, sendo possível a ativação somente se a célula-alvo expressar
os receptores tipo II, e o receptor tipo I traduzir o sinal da miostatina (ATTISANO et al,
1993).
Estudos com células co-transfectadas com ActRIIB e receptores do tipo I mostraram
que a miostatina pode se ligar a dois receptores do tipo I, ALK-4 e ALK-5
(REBBAPRAGADA et al, 2003).
O tratamento de células em cultura com miostatina purificada mostra que há um
aumento nos níveis de proteínas Smad-2 e Smad-3 ativadas, e estas por sua vez irão atuar no
gene alvo no núcleo das células.
4.1.3 Eventos que podem interferir na função da miostatina
Conforme foi mencionado anteriormente, são muitos os eventos que podem interferir
na função e/ou ação da miostatina, tais como: a ativação da miostatina realizada pelas
21
metaloproteinases através das clivagens do pró-peptideo, tornando a proteína ativa com o C-
terminal funcional; as ligações da miostatina nas células-alvo através do C-terminal, dos
receptores tipo II (ActRIIA e ActRIIB) e dos receptores tipo I (ALK-4 e ALK-5), bem como
os processos de fosforilação e ativação das proteínas Smad (Smad-2 e Smad-3).
Além desses eventos, ainda existem algumas proteínas que podem interferir também,
como é o caso da folistatina, capaz de bloquear os receptores de ligação para a miostatina
(ActRIIA e ActRIIB) nas células-alvo, impedindo assim a ligação da miostatina. Estudos
comprovam que, quando há uma expressão elevada de folistatina no tecido muscular, pode
ocorrer grande crescimento deste tecido (LEE & McPHERRON, 2001; ZIMMERS et al,
2002). Amthor et al (1996 e 2002) realizou estudos com embriões e constatou a presença de
folistatina nas células miotomais dos mesmos.
Em adição à folistatina, ainda existem as proteínas FLRG e GASP-1, que têm o
potencial de se ligar à molécula de miostatina ativada, bloqueando o C-terminal dimer e
impedindo assim a ligação da miostatina nas células-alvo (HILL et al, 2002, 2003).
4.2 Ácido Deoxirribonucléico (DNA)
O ácido deoxirribonucléico é uma molécula orgânica responsável por carregar as
informações genéticas codificadas, que coordenam o desenvolvimento e funcionamento de
todos os organismos vivos através da síntese de proteínas e RNAs. Estas informações
genéticas são transmitidas de gerações a gerações através dos genes, constituídos por DNA e
contidos nos cromossomos localizados no núcleo das células.
A molécula de DNA é formada por nucleotídeos, estas estruturas possuem um
grupamento fosfato, uma pentose (desoxirribose) e uma base nitrogenada.
O DNA apresenta estrutura de dupla hélice com duas cadeias simples,
complementares, antiparalelas (com sentidos opostos, designando-se uma no sentido 3’-5’ e a
outra para 5’-3’), ligadas entre si.
Cada fita simples contém inúmeros nucleotídeos unidos por ligações fosfodiéster entre
o carbono 3’ do nucleotídeo anterior e o carbono 5’ do nucleotídeo posterior; dessa forma, a
cadeia de DNA apresenta as extremidades livres, a 3’com um grupamento hidroxila e outra
5’com o grupamento fosfato.
22
As moléculas de desoxirribose, juntamente com os grupos fosfato, formam o esqueleto
do ácido nucléico. Este conjunto está localizado na parte externa da molécula de DNA e
apresenta uma carga exterior negativa.
Existem quatro bases nitrogenadas ou azotas que podem constituir o DNA, sendo duas
bases púricas, adenina (A) e timina (T), e duas bases pirimídicas, guanina (G) e citosina (C).
Essas bases nitrogenadas são complementares na estrutura de dupla hélice e se unem entre si
por pontes de hidrogênio (as ligações A-T possuem duas e as C-G três pontes de hidrogênio),
estando localizadas internamente na molécula de DNA e se unindo às pentoses pela ligação
entre a hidroxila e o carbono 1’ da pentose.
A capacidade de autoduplicação do DNA chama-se replicação. Esse processo ocorre
nas células geralmente quando há divisões celulares, como no caso da mitose, onde as células
filhas têm as mesmas informações genéticas da célula que lhes deu origem. Podemos dizer
que o processo de replicação é semiconservativo, pois consiste na abertura de uma molécula
de DNA parental e, a partir dessa, na subseqüente formação de duas moléculas filhas que
possuem 50% do DNA da molécula parental. A replicação nos indivíduos eucariotos deve
ocorrer antes da divisão celular, mais precisamente na fase S da interfase, enquanto que nos
procariotos a replicação ocorre entre as divisões celulares.
4.3 Ácido Ribonucléico (RNA)
O RNA tem a importante função de intermediar informações entre as seqüências
existentes no DNA até a completa síntese protéica. Possui quase que a mesma estrutura do
DNA, porém com algumas diferenças: é constituído apenas de uma fita simples, a pentose do
seu esqueleto é a ribose e em vez de Timina (T), a base nitrogenada é a Uracila (U).
Os principais tipos de RNA são os RNAs mensageiros (mRNAs), os transportadores
(tRNAs) e os ribossomais (rRNAs).
Os RNAs mensageiros (mRNAs) são responsáveis por copiar as seqüências do DNA
nos genes, formando dos códons que carregam as sequências até os ribossomos para que
ocorra a decodificação e conseqüentemente a síntese das proteínas.
Os RNAs transportadores (tRNAs) formam os anticódons que transportam os
aminoácidos específicos para complementar a seqüência de nucleotídeos do mRNA (códons)
nos ribossomos.
23
Os RNAs ribossomais (rRNAs) fazem parte da estrutura do ribossomo junto com
diversas proteínas e são eles que permitem a ligação entre os aminoácidos para formar as
proteínas.
4.4 Síntese protéica
A síntese protéica é constituída de vários eventos, sendo os principais a transcrição e a
tradução.
O fenômeno da transcrição caracteriza-se pela síntese de mRNA a partir das moléculas
de DNA que servem como moldes, sendo a molécula de mRNA formada, complementar ao
trecho do DNA transcrito.
A enzima RNA polimerase age sobre as duplas hélices de DNA, promovendo o
desnovelamento e a abertura da fita dupla. Esta enzima então reconhece os sítios promotores
na molécula de DNA e a partir destes inicia a adição de nucleotídeos complementares às bases
do DNA, sintetizando assim a molécula de RNA mensageiro; esta deposição ocorre até que
sejam encontrados os códigos de parada. Desta forma, a molécula de mRNA transcrita se
destina até os ribossomos onde será decodificada, ocorrendo assim a síntese da proteína a ser
expressa.
Cada conjunto de três bases nitrogenadas presentes no mRNA denomina-se códon e
um códon codifica apenas um determinado aminoácido, porém pode existir mais de um códon
para um mesmo aminoácido.
A tradução nada mais é do que a decodificação do mRNA que ocorre nos ribossomos.
Este fenômeno corresponde à tradução das informações contidas nos genes do código
genético para que haja a síntese das proteínas.
Durante a síntese de proteínas, os ribossomos deslocam-se ao longo do mRNAs,
possibilitando um pareamento entre ele e os tRNAs que carregam os diferentes aminoácidos e
irão compor as proteínas. Cada tRNA contém em sua composição um anticódon
complementar ao códon do mRNA específico para cada aminoácido.
Os ribossomos possuem duas subunidades, as quais são separadas por uma proteína
chamada de fator de iniciação (FI).
A subunidade maior é composta por dois sítios denominados A e P, e é nestes locais
que o tRNA chegará com o aminoácido para fazer a ligação com o mRNA.
A subunidade menor contém somente um sítio e é neste local que o mRNA se liga.
24
Como o primeiro códon do mRNA é sempre metionina (AUG), o primeiro anticódon
será tRNA, que carrega o aminoácido metionina (UAC), iniciando a síntese protéica ao se
ligar ao sítio P do aminoácido. Começando a síntese das proteínas, concomitantemente o
segundo anticódon tRNA se liga ao correspondente códon no sítio A. O ribossomo então vai
deslizando sobre o mRNA, fazendo com que o primeiro tRNA seja liberado. A metionina
permanece ligada ao tRNA seguinte, fazendo com que ocorra a ligação peptídica entre a
metionina e o segundo aminoácido sintetizado, e assim por diante até que ocorra a
decodificação de toda a molécula de mRNA com a conseqüente síntese da cadeia
polipeptídica.
4.5 Exons e Introns
O estudo dos exons e introns iniciou quando se percebeu que o tamanho da molécula
de DNA que codificava a proteína da globina era bem maior que o mRNA transcrito da
mesma. Dessa forma, identificaram os introns como as regiões do DNA que não estão
contidas no mRNA de alguma proteína; já, os exons são as regiões do DNA que estão
presentes no mRNA de alguma proteína.
A proteína miostatina caracteriza-se por possuir na sua molécula 3 (três) exons e 2
(dois) introns, podendo variar suas posições de acordo com as espécies e genes que a
codificam.
Explica oq é.
25
5 ATIVIDADES DESENVOLVIDAS
5.1 Técnicas laboratoriais
5.1.1 Reação em cadeia da polimerase (PCR)
A técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR) foi publicada e patenteada no ano
de 1985 por Kary Mullis, que oito anos mais tarde recebeu o Nobel Prize, in Chemistry.
Pode-se dizer seguramente que esta técnica causou uma verdadeira revolução na
biologia molecular, pois tem sido um excelente recurso, tanto na pesquisa visando ao
entendimento de processos biológicos fundamentais, bem como na parte de diagnósticos,
perícia forense, arqueologia, testes de paternidade, melhoramentos genéticos em plantas e
animais domésticos, entre outros.
Através do PCR é possível obter-se cópias de um segmento específico de material
genético, pois esta técnica baseia-se na amplificação de seqüências específicas de DNA, mas
para tal é preciso ter um conhecimento prévio da seqüência de nucleotídeos contidos na
amostra de DNA que se deseja amplificar.
Para realizar o PCR são necessários os seguintes componentes:
DNA - A amostra precisa ser previamente purificada, ou seja, livre das proteínas que
geralmente estão acopladas ao DNA nos tecidos;
Primers – São pequenas seqüências de nucleotídeos iniciadores que reconhecem,
complementam e dão a partida ao processo de síntese da seqüência alvo. Estes primers são
escolhidos a partir da seqüência de nucleotídeos do local específico de DNA que se deseja
amplificar. Para que ocorra esta amplificação é necessário o forward primer, que tem como
função sintetizar a seqüência alvo no sentido 5’- 3’, e o reverse primer que atua no sentido
3’-5.’;
26
Deoxinucleosídeos trifosfatados (dNTP) – composto que fornece os quatro tipos de
nucleotídeos necessários para a formação das novas fitas de DNA: dATP (desoxiadenosina
Trifosfatada), dCTP (desoxicitidina Trifosfatada), dGTP (desoxiguanosina Trifosfatada) e
dTTP (desoxitimidina Trifosfatada);
Taq polimerase – enzima que logo após o reconhecimento dos primers realiza a
elongação dos mesmos, sintetizando uma cópia complementar à fita de DNA;
MgCl2 – O magnésio, fornecido na forma de MgCl2, tem a função de co-fator para a
enzima Taq Polimerase, geralmente com a concentração de 50 mM;
Buffer 10x – tem a função de tampão, ou seja, manter a mistura de reação no pH e
condições iônicas ideais;
Água – a água utilizada deve ser livre de nuclease, pois esta enzima tem a capacidade
de clivar as ligações fosfodiester entre os nucleotídeos da molécula de DNA.
Neste momento as amostras são colocadas no termociclador. Esta máquina realiza
basicamente a função de manter as amostras em determinadas temperaturas por determinados
períodos de tempo, conforme cada etapa do ciclo a ser cumprida (desnaturação, anelação e
extensão), as características dos primers utilizados e da molécula a ser ampliada.
A primeira etapa é a desnaturação, onde acontece o aquecimento a aproximadamente
90 a 960 C das amostras de PCR, ocorrendo então a separação das fitas de DNA a serem
copiadas pelo rompimento das pontes de hidrogênio que ligam a estrutura de dupla hélice.
Na etapa seguinte, a de anelamento, ocorre o reconhecimento das fitas de DNA pelos
primers e a conseqüente ligação dos mesmos nas seqüências complementares. A temperatura
do termociclador é rapidamente reduzida para aproximadamente 57 a 61ºC, dependendo do
tamanho e seqüência dos primers utilizados (esta temperatura deve ser calculada para cada
primer).
A elongação é a etapa em que ocorre a síntese de uma nova cadeia de DNA pela taq
polimerase a partir do anelamento dos primers. Nesta etapa geralmente a temperatura é de 72º
C e o tempo depende do tamanho da fita de DNA amplificada (1 minuto para cada 1000 pares
de bases).
Se pensarmos que a cada ciclo a quantidade de DNA da seqüência alvo dobra, no final
de 20 (vinte) ciclos teremos uma quantidade de mais de um milhão de vezes a quantidade
inicial de seqüência alvo.
As reações de PCR efetuadas durante o estágio tiveram como objetivo realizar a
amplificação de seqüências de DNA que codificam a proteína miostatina em salmonídeos.
Para tal utilizou-se DNA genômico dos salmonídeos Rainbow trout, Coho salmon,, Chum
27
salmon, Chinook salmon, Atlantic salmon, Socheye, Cutthroat, Book trout, Grayling.
Utilizaram-se diversas combinações de forward e reverse primers durante as reações, porém
um reverse e um forward primer por reação. Previamente era feita uma análise dos primers,
onde se estudavam as combinações entre forward e reverse primer, a compatibilidade para
ampliar seqüências de miostatina, tamanho da seqüência de DNA a ser amplificada,
características da seqüência de pares de base e tamanho do primer (Anexo 1). Em seguida
eram realizados os cálculos para a temperatura de anelamento dos primers durante a reação
(Anexo 2).
Após a escolha dos primers e cálculo das temperaturas, procedia-se ao
descongelamento e às pipetagens dos componentes do PCR, em gelo, pois a maioria destes
reagentes são termoestáveis e devem ser estocados a -20ºC.
Tabela 2 – Ingredientes e quantidade para a realização da técnica PCRComponentes Para 50µl
de reaçãoPara 25µl de reação
Para 15µl de reação
Nuclease free water 38,3 µl 18,65 µl 10,72 µlDntp mix 10mM (invitrogen) 2,5 µl 0,5 µl 0,3 µl10X buffer (invitrogen) 1,0 µl 2,5 µl 1,5 µlMgCl2 50mM (invitrogen) 1,0 µl 1,25 µl 0,8 µlTaq DNA polymerase (invitrogen) 0,2 µl 0,1 µl 0,08 µlForward primer 50 mm/ml (invitrogen) 1,0 µl 0,5 µl 0,3 µlReverse primer 50mm/ml (invitrogen) 1,0 µl 0,5 µl 0,3 µlDNA (genômico) 5,0 µl 1,0 µl 1,0 µl
Pipetadas, as amostras eram colocadas no termociclador. O termociclador então era
regulado conforme as temperaturas e tempo desejado para cada fase dos ciclos e número de
ciclos igualmente desejados. Inicialmente a estabilização do termociclador e das amostras era
de 94ºC durante 3 minutos; para a desnaturação, 941ºC durante 1 minuto; no anelamento dos
primers as temperaturas eram variáveis, conforme os primers utilizados (anexo 1), por 30
segundos; na elongação da nova cadeia de DNA, 72ºC por 3 minutos e, para finalizar, as
amostras eram resfriadas à 4ºC. Geralmente utilizaram-se 35 ciclos de PCR. Depois de
finalizada esta etapa, eram realizadas as análises das seqüências ampliadas; para tal, era
necessário correr o PCR em gel de agarose 1% (anexo 3) através de eletroforese.
Das amostras de PCR utilizavam-se 10µl de cada amostra que, adicionada a 3 µl de
loadding buffer, era depositada em um orifício do gel, e assim por diante até todas as amostras
serem pipetadas. E, para a mensuração das bandas amplificadas, era usado como marcador o
28
1kb plus DNA ladder (invitrogen). Colocava-se o gel em eletroforese a uma voltagem de 130
watts por aproximadamente 15 a 20 minutos.
A visualização do gel de agarose com as respectivas bandas (segmentos de DNA
amplificados) era realizada através de luz ultravioleta, na câmara de visualização acoplada a
um computador, onde apareciam as imagens que posteriormente eram salvas no computador e
impressas para serem anexadas ao livro de procedimentos do laboratório. Durante o estágio
foi realizado um total de 56 reações de PCR.
5.1.2 Clonagem de genes
A clonagem de genes tem como objetivo promover a multiplicação de uma
determinada porção de DNA. Este processo consiste em inserir um fragmento de DNA
contendo o gene a ser clonado em um elemento genético auto-replicante, chamado vetor, que
geralmente é vírus ou plasmídeo. O vetor funciona como um veículo que transporta o gene
para o interior da célula hospedeira, normalmente utilizam-se bactérias, embora outras células
vivas possam ser usadas. Dentro da célula hospedeira o vetor multiplica-se, produzindo
numerosas cópias idênticas e também do gene que transporta. Quando a célula hospedeira se
divide, a sua descendência recebe cópias das moléculas de DNA recombinante, continuando
depois a replicação dos vetores. Após um grande número de divisões celulares, é produzido o
clone de células hospedeiras idênticas.
Para realizar tal processo, necessita-se uma série de procedimentos, tais como
obtenção da cadeia de DNA que se deseja clonar, inserção desta cadeia nos vetores e estes,
por sua vez, nas células hospedeiras, multiplicação das células hospedeiras e extração das
seqüências de DNA clonadas.
Para a obtenção da cadeia de DNA pode-se usar a técnica de PCR (descrita
anteriormente) ou a técnica de restrição enzimática.
A técnica de restrição enzimática consta na aplicação de enzimas de restrição ou
endonucleases sob o DNA que se deseja isolar, que atuam fazendo o reconhecimento de
seqüências específicas de bases nitrogenadas e o corte da cadeia de DNA em determinado
ponto. Esta técnica também pode ser usada para fazer a “abertura” dos vetores de clonagem
onde se pretende introduzir o fragmento de DNA de interesse.
As endonucleases de restrição são divididas em três tipos: os tipos I e III reconhecem
uma determinada seqüência do DNA e realizam o corte fora do sítio de reconhecimento; as
29
enzimas do tipo II (as mais importantes na Tecnologia do DNA Recombinante) são proteínas
monoméricas ou diméricas que clivam o DNA no mesmo sítio de reconhecimento, gerando
fragmentos específicos.
O sítio de reconhecimento deste tipo de enzima é normalmente uma seqüência
palindrômica. Tem um eixo de simetria e a seqüência de bases de uma fita é a mesma da fita
complementar, quando lida na direção oposta. Estas enzimas reconhecem seqüências
específicas de 4 (quatro) a 8 (oito) pares de base (pb) na molécula de DNA e fazem dois
cortes, um em cada fita.
Os cortes, em geral, podem ser de duas maneiras diferentes. Em um deles ocorrem
dois cortes no eixo de simetria da seqüência específica, gerando extremidades abruptas ou
blunt ends; no outro tipo, os cortes são feitos simetricamente, porém fora do eixo de simetria,
gerando extremidades coesivas ou stick ends.
Os vetores de clonagem têm um papel fundamental na clonagem de genes, podem ser
utilizados como vetores os plasmídeos, vírus, M13 e até lipossomos. A grande parte utilizada
na clonagem de genes são os plasmídeos, pois ocorrem naturalmente em muitas espécies
bacterianas, facilitando assim a expressão de genes nestas células hospedeiras pelo fato de
serem capazes de se replicar de forma independente do cromossoma desta célula, transmitindo
assim a nova informação genética às gerações seguintes. No entanto, estes plasmídeos
naturais, a serem usados em clonagem, necessitam possuir características que permitam
modificá-los geneticamente.
Uma das características cruciais é que o vetor possua a região de origem de replicação
(ORI, Origin of Replication), para que ocorra a sua replicação e assim a transmissão às células
bacterianas descendentes. Cabe-se ressaltar que é muito importante não haver alterações nesta
região durante o processo de clonagem.
Outra região importante dos vectores de clonagem é o local múltiplo de clonagem
(MCS, Multiple Cloning Site), onde se localizam seqüências de nucleotídeos, reconhecidas
por diversas enzimas de restrição que realizam os cortes e a abertura nos vetores para
introdução das seqüências de DNA in vitro.
Deverão estar presentes, ainda, as regiões responsáveis pelas chamadas marcas
genéticas de seleção , as quais permitem aos vetores evidenciar certas características,
possibilitando a seleção e identificação das células que os contenham.
As marcas genéticas de seleção podem ser genes que codifiquem proteínas, como no
caso da enzima β-galactisidase que cliva a galactosidase, e esta, por sua vez, quando oxidada,
expressa a cor azulada nas colônias de bactérias. Quando as bactérias são transformadas, ou
30
seja, geneticamente modificadas, a expressão destes genes é alterada, não havendo a produção
de galactosidase, produzindo assim colônias brancas ou transparentes. Outra marca de seleção
pode ser seqüências de DNA que garantam às células hospedeiras (bactérias) certa resistência
a um dado antibiótico. Nesse caso, somente irão se desenvolver na presença desse antibiótico
as colônias que possuírem o vetor de clonagem resistente.
Após a obtenção das porções de DNA que se deseja clonar e também dos vetores onde
será introduzido este DNA, é necessário realizar a etapa de ligação entre eles, através do
restabelecimento das pontes de hidrogênio e as ligações covalentes (fosfodiéster) com a
utilização da enzima DNA ligase.
Quando a clonagem é realizada com seqüências de DNA amplificadas por PCR, é
necessário que se utilizem vetores TA. Nas reações de PCR, algumas das polimerases
utilizadas (como Taq polimerase), além de promoverem a elongação das cadeias de DNA,
também exercem a função de transferase, adicionando uma adenosina (A) na posição 3’, ao
final de cada cadeia amplificada, permitindo ao vetor de clonagem TA (comercialmente, pré-
processado), que é linear e possui uma timina na posição 3’, realizar a ligação com esta cadeia
de DNA.
O processo de inserção das moléculas de DNA recombinado, ou seja, do vetor com o
DNA exógeno clonado num hospedeiro adequado, que transmita esse material genético às
gerações celulares seguintes, chama-se transformação. Este processo tem como objetivo
tornar as células competentes para viabilizar a introdução do DNA recombinado e pode ser
realizado através de diversas formas, tais como: transformação química (ou clássica), quando
as células (principalmente de E. coli) são incubadas em solução fria de cloreto de cálcio e, em
seguida, submetidas a um choque térmico de curta duração; electroporação, quando as células
são expostas a um pulso elétrico de elevada intensidade e curta duração, conjugação, processo
natural de transferência de material genético entre bactérias através do contacto físico entre
elas; transdução, que pode ser simplesmente explicada por uma infecção viral em bactérias.
A próxima atitude a ser tomada após a transformação das células hospedeiras é aplicá-
las a um meio de cultura e incubá-las para que ocorra a multiplicação das mesmas. Após a
incubação é realizada a seleção das colônias transformadas com base nas marcas genéticas de
seleção dos vetores.
Os processos de clonagem de genes realizados durante o estágio tiveram como
objetivo multiplicar seqüências de DNA que codificam miostatina para, posteriormente,
realizar seqüenciamento dos mesmos.
31
As seqüências de DNA utilizadas nas clonagens de genes eram obtidas a partir da
técnica de PCR (descrita anteriormente). Em algumas vezes aconteceu de aparecer no gel de
agarose (na análise do PCR) mais de uma banda correspondente à miostatina e desejava-se
clonar somente uma delas. Procedia-se, então, à extração desta banda direto do gel de agarose
(Anexo 3).
Obtidas estas seqüências de DNA, realizava-se então a inserção destas no vetor (PCR
4-topo vetor, invitrogen) para em seguida serem transformadas nas células hospedeiras, neste
caso Escherichia coli (One Shot TOP10 Chemically Competent E.coli, invitrogen).
Os processos de inserção das seqüências de DNA nos vetores e a transformação das
células hospedeiras eram feitos da seguinte forma: descongelamento dos componentes e
pipetagem em gelo (termoestabilidade).
Descongelados, eram pipetados para um eppendorf 4.5 µl da amostra de PCR, 1.0 µl
de solução salina e 0.5 µl de PCR topo vector (TOPO TA cloning kit for sequencing,
invitrogen). Após a incubação dessas amostras por 5 minutos, em temperatura ambiente,
realizava-se a adição das mesmas nos tubos, contendo as amostras bacterianas que, por sua
vez, eram submetidas à incubação em gelo por 20 minutos. O choque térmico (para promover
a transformação) era aplicado logo depois, quando se imergiam as amostras em banho-maria à
42ºC, por 30 segundos. Para finalizar a etapa de transformação, adicionavam-se 250 µl de
meio SOC às amostras que, posteriormente, eram incubadas à 37ºC, sob movimentos
rotatórios de 225 rpm, durante 1 hora.
As placas de cultivo contendo ampicilina (descritas no anexo X) eram preparadas com
40µl de X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) e 4µl de IPTG
(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) por placa. Tais componentes eram pipetados para as
placas e espalhados com o auxílio de alça de Drigalsky, próximo ao bico de bunsen (ambiente
esteril). As placas eram incubadas em estufa de cultivo à 370C, aproximadamente 15 minutos,
antes das amostras transformadas serem pipetadas e espalhadas, com o intuito de equilibrar a
temperatura e evitar choque térmico. Ao término da incubação das amostras transformadas,
eram pipetadas e espalhadas nas placas (da mesma forma que o X-gal e IPTG) para incubação
à 37ºC, por aproximadamente 24 horas. Transcorridas 24 horas, realizava-se a visualização e
a seleção das colônias transformadas.
Nas transformações, além da seleção, através da utilização de ampicilina, também se
utilizava X-gal e IPTG nas placas de cultivo, permitindo-nos assim a visualização das
colônias transformadas, ou não. Julgava-se não-transformadas as colônias que tivessem a cor
32
azul (em virtude da presença da enzima β–galactosidase nas bactérias não modificadas
geneticamente).
A partir da seleção das colônias transformadas, realizava-se a incubação de 10 (dez)
colônias (transformadas) de cada placa. Para este cultivo, utilizava-se 3ml de meio LB
acrescido de Ampicilina (50 µg/l) e uma colônia transformada por tubo, totalizando 10 ( dez )
tubos incubados durante a noite (aproximadamente 14 horas) para, na próxima manhã, serem
realizados PCRs (com os mesmos primers utilizados anteriormente) e a purificação de DNA
(protocolo no anexo) das amostras que apresentavam bandas (seqüências de DNA)
correspondentes com as anteriores (seqüências de DNA com que se realizou a clonagem).
5.1.3 Sequenciamento de DNA
O seqüenciamento de DNA tem como objetivo mapear a ordem em que as bases
nitrogenadas (Adenosina, Timina, Guanina e Citosina) estão dispostas numa dada molécula
de DNA.
Este processo pode ser realizado pelo método de Sanger, desenvolvido por Frederick
Sanger na década de 70 (mais utilizado), ou por piroseqüenciamento, desenvolvido pela
Roche Applied Sciences.
O método de Sanger consiste em um processo bem parecido com PCR, porém utiliza-
se um único primer (para formar fitas complementares somente em um sentido, 3’-5’ou 5’-3’)
e, além dos Desoxirribonucleotídeos Fosfatados dNTP's, também são acrescidos à solução
Didesoxinucleotídeos Trifosfatados ddntp, os quais não possuem o grupamento hidroxila na
posição 3’, marcado por fluorocromo. A reação ocorre normalmente com as etapas de
desnaturação das duplas hélices de DNA, anelamento do primer e elongação da nova cadeia
com a inclusão dos nucleotídeos “normais”, até que, por acaso, a DNA polimerase insere um
dideoxinucleotídeo, impossibilitando assim a ligação do nucleotídeo seguinte pela ausência da
ligação fosfodiéster. Ao final desse processo, observam-se fragmentos de tamanhos
diferentes.
Os produtos da reação de seqüenciamento, marcados com os fluorocromos, ao serem
submetidos à eletroforese passam por um feixe de laser, que promove a excitação dos
fluorocromos. A luz emitida pelos fluorocromos é detectada por um fotomultiplicador e a
informação é processada através de um computador, montando assim um tipo de mapa da
seqüência destes nucleotídeos.
33
Os seqüenciamentos de DNA eram realizados no laboratório da seguinte forma:
pipetava-se em gelo para um eppendorf 5µl de DNA (originário de transformação), 4 µl de
Big Dye (previamente preparado e fornecido pelo laboratório de seqüenciamentos) e 1 µl de
primer (utilizado no PCR para ampliar as seqüências de miostatina no DNA). Esta mistura,
como para o PCR, era levada ao termociclador, onde as temperaturas e tempos eram de 960C
por 1 minuto, 96ºC por 10 segundos, 50ºC por 15 segundos e 60ºC por 4 minutos, totalizando
25 (vinte e cinco) ciclos.
Terminada esta etapa, as amostras eram processadas (centrifugadas em gel filtration
cartridges e posteriormente sob vácuo) e enviadas ao laboratório de seqüenciamento de DNA
da WSU para que fossem realizadas as análises através do fotomultiplicador.
5.1.4 Construção de mapas dos genes e da proteína miostatina
Os mapas dos genes eram construídos através das técnicas de bioinformática, com o
auxílio de programas computacionais como conting express, anilix e outros. Obtendo-se a
posição dos exons e introns de cada gene (mapas em anexo), chegava-se ao cDNA e
finalmente à seqüência da proteína miostatina codificada por gene analisado.
5.1.5 Descongelamento, cultivo e congelamento de células cardíacas (C9H12)
Primeiramente era realizada a averiguação da localização de armazenamento das
células no botijão de nitrogênio para, posteriormente, efetuar a abertura do botijão e exposição
das raques, retirando os microtubos (eppendorfs) contendo as células.
Neste momento, procedia-se à abertura da tampa dos microtubos contendo as células,
pois em decorrência de troca muito brusca da temperatura havia a formação de pressão.
Em seguida, os eppendorfs eram fechados e o descongelamento ocorria em gelo, evitando
assim alterações bruscas de temperatura nas células e seguindo uma curva de
descongelamento.
Logo após o descongelamento, as células e o meio utilizado no cultivo das mesmas
eram depositados em banho-maria à temperatura de 37ºC por aproximadamente 15 (quinze)
minutos para ocorresse a estabilização da temperatura do meio, descongelamento completo e
reidratação das células.
34
Os próximos passos eram realizados na capela de fluxo laminar e para isso eram
necessários alguns cuidados, tais como: desligar a luz ultravioleta, ligar o fluxo 15 (quinze)
minutos antes de iniciar os procedimentos na capela, usar luvas e jaleco (não podendo ter
nenhuma parte dos braços exposta dentro da capela), borrifar etanol nas mãos e em qualquer
material antes de introduzir na capela, limpar o interior da capela com lenços de papel
embebidos em álcool 70%, antes e depois de trabalhar.
Antes de iniciar a manipulação das células, dentro da capela, eram organizados os
materiais necessários à realização dos procedimentos, tais como: tubo falcon de poliestireno
de 15ml, frascos de cultivo celular de 25cm2 e/ou 75cm2, pipetas de 5, 10 e 25 ml, pipetadores
e os meios utilizados, nesse caso, o meio fresh (Hyclone) com 10% de soro fetal bovino e 1%
de antibiótico.
No frasco de cultivo celular colocava-se 10ml de meio para umedecê-lo, evitando
assim o colabamento das células nas paredes do frasco.
No tubo falcon de poliestireno eram pipetados 9ml de meio fresh e 1ml das células
descongeladas, este conteúdo então era homogeneizado lentamente e posteriormente
centrifugado por 2 minutos a 1000rpm.
Em seguida, o meio sobrenadante era aspirado com pipeta de Pasteur estéril, adaptada
à bomba de vácuo; o pelet contendo as células era ressuspendido com 5ml de meio fresh e
novamente homogeneizado. Este conteúdo então era gentilmente pipetado e depositado
vagarosamente no fundo do frasco de cultivo celular que já continha 10ml de meio fresh.
Os cultivos foram incubados em estufa de cultivo celular (370C, 5% de CO2) e
observados diariamente sob estereoscopia.
O meio cultivo era substituído sempre que necessário, entre 2 (dois) a 3 (três) dias,
quando apresentava a coloração alterada (tendendo ao amarelo, quando a cor normal é rósea)
por conta das reações de oxiredução durante o metabolismo celular.
Para tal procedimento, era necessário aquecer previamente o meio fresh (estocado sob
refrigeração) em banho-maria, por 15 minutos, a 37ºC.
Na capela de fluxo laminar, realizava-se a aspiração do meio sobrenadante do cultivo
celular e em seguida a adição de 10ml do meio fresh pré-aquecido, retornando novamente
com o cultivo celular para a estufa.
Em aproximadamente 7 (sete) dias foi necessário fazer um remanejamento dos
cultivos, ou seja, a divisão da cultura em outras garrafas de cultivo.
Este foi um procedimento simples: feita a remoção do meio sobrenadante do frasco
contendo o cultivo celular, acrescentou-se 10ml do meio fresh médium (pré-aquecido a 37ºC).
35
Novamente ocorreu a retirada do meio sobrenadante do frasco e a adição de 2ml de
tripsina, deixando por 2 minutos (as células que estavam aderidas se desprenderam da parede
do frasco de cultivo).
Em seguida, o cultivo celular junto com tripsina foi depositado em um tubo falcon de
poliestireno (15ml) para a centrifugação por 2 minutos a 1000RPM.
O sobrenadante foi aspirado e o pelet contendo as células foi ressuspendido com 30ml
de meio fresh.
Os novos frascos de cultivo celular de 75cm2 eram umedecidos com 2ml de meio
fresh; em seguida, nestes frascos eram depositados 10ml de meio fresh contendo as células e
levados novamente para cultivo em estufa.
Após mais 7 (sete) dias de cultivo, foi feito o congelamento e armazenamento destas
células em nitrogênio líquido.
36
6 PARTICIPAÇÃO EM PROJETO DE PESQUISA
6.1 Molecular Phylogenetic Analysis Of The Myostatin Gene Family: A Model For
Understanding Functional Divergence.
6.1.1 Introdução
A miostatina, conforme foi citado anteriormente, tem uma grande importância no
desenvolvimento e diferenciação celular.
Apesar de a miostatina ser largamente estudada em diversas espécies de mamíferos,
em outras espécies, como nos peixes, sua organização genômica e bioatividade não é bem
clara.
Uma análise filogenética da família miostatina indicou que a duplicação dos primeiros
genes da miostatina em peixes ósseos resulta na produção de dois genes mstn-1 e mstn-2,
enquanto que nos salmonídeos existe a produção de quatro distintos genes para miostatina,
mstn-1a, 1b, 2a e 2b, dos quais apenas mstn-1 foi caracterizado.
O objetivo deste trabalho é identificar mstn-2 ortólogos em diferentes salmonídeos a
partir da clonagem dos genes de miostatina, comprovar uma robusta filogenia, o período em
que ocorreu a pseudogenização e o impacto das pressões de seleção.
6.1.2 Material e métodos
Para tal estudo, foram realizadas amplificações individuais dos genes para miostatina
através da técnica de PCR e clonagem de genes, utilizando-se específicos primers para
37
miostatina e DNA genômico de diferentes salmonídeos (procedimentos descritos
anteriormente em técnicas laboratoriais).
Os genes localizados foram estudados através dos programas computacionais
Neighbor-Joining, Maximum-Likelihood e Baysean analyses.
6.1.3 Resultados preliminares
Nas análises filogenéticas preliminares foram identificados ortólogos dos quatro
genes. Estes genes apresentaram a organização de três exons (conservando o padrão entre os
vertebrados), porém as seqüências dos introns só foram conservadas entre mstn-1 ou -2
paralógos (Anexo 12).
Todos os genes mstn-2b apresentaram porções deletadas quando comparados com
MSTN-2a (Anexo13), levando-nos a crer que existem alterações na transcrição (stop códons)
e, conseqüentemente, na síntese protéica destes genes. No entanto, a dimensão dessas
deleções e a posição dos stop códons não foram idênticas, mesmo entre os salmonídeos do
pacífico (Coho, chum, chinook e rainbow trout), sugerindo a pseudogenização recente e de
forma independente da mstn-2b nos salmonídeos.
6.1.4 Conclusão
A presença dessas modificações específicas pode ser indicativa de fortes pressões de
seleção que ocorreram de forma independente nos salmonídeos, sendo este, então, um bom
modelo para seguir o estudo e investigar os acontecimentos moleculares responsáveis pelas
divergências funcionais destes genes relacionados.
38
7 APRESENTAÇÃO DE SEMINÁRIO
7.1 Myostatin (Mstn) Gene Duplications In Atlantic Salmon (Salmo Salar): Evidence For
Different Selective Pressure On Teleost Mstn-1 And -2
Este artigo foi publicado na revista Gene, p. 159-169, em agosto de 2007, por Tone-
Kari K. Østbye, Ola F. Wetten, Ave Tooming-Klunderud, Kjetill S. Jakobsen, Anat Yafe,
Shulamit Etzioni, Thomas Moen, Øivind Andersen.
7.1.1 Introdução
Estudos têm demonstrado que a miostatina é um potente regulador negativo da
proliferação e diferenciação dos mioblastos pela inibição dos fatores de regulação da
miogênese (MRFs- Myogenic Regulator Factors) juntamente aos fatores de transcrição, que
regulam a expressão de múltiplos genes musculares através das ligação pelas E-boxes
(CANNTG).
Em contraste ao que ocorre nos mamíferos, onde o gene da miostatina tem expressão
quase especificamente no tecido muscular, nos peixes teleósteos (diplóides) já foram
identificados pelo menos dois genes que se expressam em tecido muscular e não-muscular.
Nos salmonídeos, acredita-se que durante a evolução ocorreram mutações gênicas
tornando-os tetraplóides, que podem ter alterado os genes da miostatina (pseudogenização),
porém somente foram bem estudados os genes para mstn-1.
Os objetivos deste trabalho foram de isolar os genes mstn-2 em salmões e identificar
possíveis mutações no gene mstn-2b através da clonagem e expressão dos genes mstn-2a e 2b,
identificar possíveis diferenças na expressão dos outros genes da miostatina rastreando
39
regiões promotoras para as ligações dos fatores de transcrição, elucidar a origem dos genes
para miostatina por análises filogenéticas e analisar as forças de seleção sobre os peixes
teleósteos através da análise de substituições de códons e nucleotídeos.
7.1.2 Materiais e métodos
Todos os peixes utilizados nesta pesquisa eram provenientes da Noruega.
Para a obtenção de DNA e RNA coletou-se tecido muscular (em adultos e juvenis),
hepático, intestinal, cerebral, hepático e gônadas (em juvenis), ovos fertilizados e larvas
eclodidas.
O isolamento de DNA genômico foi realizado através do kit QiagenDNAeasy e
extração de RNA total por transcrição reversa com TaqMan Reverse Transcription Reagents.
Na análise dos genes MSTN-2a e MSTN-2b foram realizadas ampliações através de
PCR, para posteriormente clonar e seqüenciar estes genes.
Na clonagem das regiões promotoras foi realizado o isolamento das regiões
5’upstream dos genes mstn-1a e 1b, utilizando-se Universal Genome Walker™ Kit
(Clontech), seguido de PCR, clonagem e seqüenciamento.
Para o mapeamento dos genes de mstn-1a e -1b utilizou-se PCR, inserção de dois
microssatélites (Ss-mstn1a e Ss-mstn1b) e programas computacionais, tais como: 3730ABI
DNA analyzer para a genotipagem individual; Joinmap 3.0 para a construção dos mapas.
Na análise das regiões 5’upstream, seqüências promotoras, pressão de seleção e
construção da filogenia foram utilizados os programas computacionais ClustalW,
MatInspector, PAML v3.15, PhyML e MrBayes v3.1, respectivamente.
A habilidade da miostatina se ligar com homo- / hetero-dimeros de MyoD e E47 foi
avaliada pela técnica de EMSA (electrophoretic mobility shift assay).
7.1.3 Resultados
A análise das seqüências de miostatina em Atlantic salmon foi realizada através do
alinhamento com os genes ortólogos em outras espécies (Rainbow trout, Tiger pufferfish e
Gilthead seabream), permitindo observar que entre as seqüências de miostatina mstn-2a/ -2b,
em salmões, existe uma semelhança de 92% (mstn-2b tem a inserção de 4 (quatro) pares de
40
bases e a deleção de 1 (um) par de base); ao passo que, quando se compara mstn-1 e mstn-2, a
semelhança é de 69 a 72%.
A seqüência de mstn-2a nos salmonídeos tem uma semelhança de 97% quando
comparada com o ortólogo em rainbow trout, e 63 à 75% em peixes não-salmonídeos.
O gene mstn-2a no tecido muscular branco apresenta a codificação da proteína quase
completa, exceto no local dos terminais C e N. Porém foi identificada a presença do mRNA
de mstn-2a em todos os tecidos coletados de peixes juvenis (tecido muscular branco e
vermelho, cardíaco, intestinal, cerebral e gonadal), exceto no tecido hepático.
O gene mstn-2b transcreve uma proteína de apenas 63 (sessenta e três) aminoácidos,
sendo essa incompleta e, portanto, não funcional. Não foi encontrado mRNA de mstn-2b em
tecidos de embriões, larvas e tão pouco em peixes juvenis.
As seqüências genômicas de mstn-2a -2b e mstn-1a -1b apresentaram ter conservado a
organização dos genes com 3 (três) exons interrompidos por 2 (dois) introns.
A miostatina apresentou capacidade de estabelecer ligação com os fatores de
transcrição MyoD e/ou E47N, tanto pela E2 (E-box 2) isolada quanto pelas E3 e E4 (E-boxes
3 e 4) associadas.
Através da árvore filogenética observou-se que a miostatina nos teleósteos está
localizada em dois grandes grupos, mstn-1 e -2, exceto em zebrafish (somente mstn-2).
A disposição dos paralógos nos salmonídeos dá suporte para a origem tetraplóide dos
quatro genes de miostatina.
As seqüências de aminoácidos em mstn-1 tiveram uma taxa de substituição de 2 a 3%,
sugerindo uma forte pressão seletiva nestes peixes.
7.1.4 Conclusão
A origem tetraplóide dos quatro genes de miostatina elucida a ocorrência de mutações
genéticas nos salmonídeos durante a evolução. Sendo que desses quatro genes, somente três
demonstraram ser potencialmente ativos.
A estrutura bem conservada de 3 (três) exons e 2 (dois) introns, com uma baixa taxa
de substituição de aminoácidos na proteína, demonstra a ocorrência da positiva e alta pressão
de seleção (exceto no gene mstn-2b).
O mRNA de mstn-2a presente nos tecidos de salmões juvenis, principalmente tecido
cerebral, indica que a proteína pode ter uma precoce atuação no desenvolvimento e
41
diferenciação tanto dos tecidos musculares quanto não-musculares (neurogênese, miogênese)
nestes peixes. Esta função da miostatina parece prolongar-se ao longo da vida desses peixes,
interferindo na miogênese através das ligações com os fatores de transcrição que atuam na
miogênese (MyoD e/ou E47).
42
8 ATIVIDADES COMPLEMENTARES
8.1 Atividades relacionadas com bovinos Wagyu
A raça de bovinos Wagyu ou “kobe beef” tem um reconhecimento mundial por
apresentar elevado teor de marmoreio, o que garante à carne um sabor, textura e suculência
diferenciados da carne de outras raças e, conseqüentemente, um preço bem elevado no
mercado.
Esta raça é originária do Japão, onde foi introduzida com a finalidade de instrumento
de trabalho (animais de tração) nas lavouras de arroz.
Em virtude da dificuldade de deslocamento nas regiões onde foram introduzidos
(relevo acidentado), não houve grande migração destes bovinos, originando assim os distintos
rebanhos e linhagens de Waguys, tais como Kyushu, Kochi (de pelagem vermelha), Tottori,
Tajima, Shimane, e Okayama (de pelagem preta).
O rebanho bovino do Japão permaneceu fechado aproximadamente 200 anos, sendo
aberto à importação de novas raças somente em 1868, após a “Restauração Meiji”; em 1910,
mais uma vez, o rebanho nacional foi fechado para cruzamentos.
A primeira exportação de bovinos Wagyu foi de quatro touros (dois pretos e dois
vermelhos) para os Estados Unidos na década de 70; mas, por possuir a característica de
quartos traseiros pouco desenvolvidos e a necessidade de um tempo maior para acabamento
de carcaça, comparando com outras raças européias, o wagyu não foi reconhecido como uma
raça melhoradora nos bovinos de corte.
Mais recentemente, entre os anos de 1991 e 1999, foram realizadas novas importações
pelos Estados Unidos, sendo um importante difusor desta raça para outros países.
Os procedimentos de vacinação e desmame de bovinos foram realizados na fazenda do
professor Jon Jerry Reeves, localizada na região do Palouse
43
As vacinas CattleMaster® 4 contra Rinotraqueíte Infecciosa Bovina – IBR, Diarréia
Viral Bovina – BVD, Parainfluenza tipo 3 – PI3 e Vírus Sincicial Bovino – BRSV, na dose de
2 ml por animal, por via intramuscular, e a vacina Fortress* 8 (Bacterina Toxóide contra
Carbúnculo Sintomático, Gangrena Gasosa, Enterotoxemia e Hemoglobinúria Bacilar dos
Bovinos), na dosagem de 5 ml por via subcutânea, foram aplicadas em 30 (trinta) bezerros
(machos e fêmeas) com aproximadamente 7 meses de idade. Alguns destes animais foram
selecionados e posteriormente separados das vacas (suas mães) para serem levados a uma
outra localidade, onde seriam preparados como reprodutores e/ou animais para exposições
(realizando-se assim o desmame).
A avaliação da carcaça de um bovino wagyu durante o estágio foi realizada no meat
lab - WSU.
Na avaliação foi realizada apenas a mensuração da área do olho da costela através do
método ribeye (rib =costela, eye = olho). Para a aplicação de tal método, foi feito um corte
transversal entre a 12a e a 13a costelas a fim de mensurar a área do olho da costela através de
uma tabela padrão (Figura 3).
Além deste parâmetro, no julgamento das carcaças de bovinos wagyu é realizado o
exame visual do marmoreio (principal característica dos bovinos wagyu), firmeza e textura da
carne, gordura subcutânea, cor e brilho da carne.
Figura 3 – Avaliação da carcaça de um bovino wagyu através do método ribeye.
44
9 CONCLUSÃO
O estágio curricular do curso de Medicina Veterinária realizado com Biologia
Molecular no Departamento de Animal Sciences da WSU, além de ter sido uma grande
experiência de vida, proporcionou-me um excelente aprendizado nesta área da ciência.
Ao participar dos projetos de pesquisa desenvolvendo os trabalhos de laboratório,
sentia-me a cada dia mais encantada e motivada em aprender novas tecnologias, aprimorando
o conhecimento e progredindo diante dos resultados. Durante esse período, aprendi que é
preciso muita atenção aos detalhes de cada etapa, pois estes fazem uma grande diferença nos
resultados finais (de projetos científicos). É muito importante, também, maturidade para
interpretá-los, pois nem sempre são conforme esperamos.
O desafio de enfrentar o desconhecido, trabalhar numa área desconhecida até então,
melhorando o desempenho e os resultados da pesquisa, tudo isso me permitiu perceber que,
com persistência, dedicação, responsabilidade, determinação e, sobretudo, ética
(ensinamentos estes que aprendi ao longo do curso de Medicina Veterinária – UPF), somos
capazes de superar dificuldades e alcançar nossos objetivos com êxito.
Ao término desta etapa, sinto a imensa satisfação e alegria do dever cumprido e do
sonho concretizado. Fica na memória a trajetória de crescimento, das dificuldades superadas,
das amizades conquistadas e, principalmente, a experiência de um grande aprendizado. A
próxima meta é prosseguir na carreira de pesquisa, através do mestrado, para desenvolver
sempre mais a arte da medicina veterinária e contribuir para a evolução da ciência.
45
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48
ANEXOS
49
ANEXO 1 – PRIMERS UTILIZADOS NAS REAÇÕES DE PCR
Todos os primers utilizados nas reações de PCR eram fabricados por invitrogen life
technologies, e na tabela estão representados seus respectivos nomes, seqüências dos pares de
bases, número de pares de bases nitrogenadas (N0 pb), percentual de bases Guanina e Citosina
(% GC), forward (FP) ou reverse (RP) primer e temperatura de anelamento (Tm).
Nome do primer Seqüência do primer N0
pb%
GCFP/RP Tm
0C1a, 1b complete-2 TTT TTA TAG CAA ACT CCG CAC CTT AG 26 38,4 FP 52,57Ds mstn-1a, 1b-2 CAC CTG CAG AAG TAC CCC CAC ACC 24 62,5 FP 60,52Ds mstn-1a, 1b-1 GAC TGG ATT ATT GCC CCC AAG CGC 24 58,34 FP 58,90
Complete 1b GGC AAC TCT GTA GTC CGC CTT CAC GCA 27 59,25 FP 61,98Complete 1a GGC AAC TCT GTA GTC CGC CTT CAC ATA 27 51,85 FP 58,93
Exon-3, mstn-2, conserved-1
CCC ACC AAG ATG TCC CCC ATC AAC ATG 27 55,55 RP 60,46
Up mstn-1a, 1b-2 TTT GGC TGG GAC TGG ATT ATT GCC CCC AAG CGC TAC CGC TAC
42 57,14 RP 69,04
Exon-3, mstn-2, conserved-2
TGG GAC TGG ATT ATT GCC CCC AA 23 52,17 RP 55,22
Conserved all mstn 2-2
AAG ATG TCC CCC ATG AAC ATG CTC TAC TTC
30 46,7 RP 59,24
1a, 1b complete CCT GGA CTT TGG GAC AGA TCC ATC CA 26 53,84 RP 58,9Us mstn-2, exon-3 TGG GAC TGG ATT ATT GCC CCC AAG CG 26 57,7 RP 60,481a, 1b complete-2 GGA GAC CCT GCT GAG CCC CTC CC 23 73,91 RP 64,12
50
ANEXO 2 – CÁLCULO PARA TEMPERATURAS DE ANELAMENTO DOS PRIMERS
Tm = 81,5 0 C + 16,6(log10 [Na+]) + 0,41(fraction G+C) – 0,63(% formamide) – (600 / N0pb)
Onde:
[Na+] - concentração de sódio existente no primer
Fraction G+C - percentual de ácidos nucléicos Guanina e Citosina existente no primer
% formamide – percentual de formamide existente no primer
N0pb – número de pares de bases do primer
51
ANEXO 3 – GEL DE AGAROSE 1%
O preparo do gel de agarose a 1% consiste na mistura de 0,5g de agarose e 50 ml de
buffer TAE 1X. Depois de preparada, era aquecida em forno de microondas por 1,10 minutos.
Este aquecimento tem como objetivo promover uma melhor homogeneização da agarose. Em
seqüência, reservava-se a solução de agarose 1% até que ficasse morna para posteriormente
adicionar 4 µl de DNA gel stain. Logo após depositava-se a solução na placa molde para o gel
de PCR com os devidos pentes, para deixar as impressões dos orifícios onde seriam
depositadas as amostras no gel.
Quando o gel estava firme, os moldes eram retirados e, então, a placa de gel era imersa
no aparelho de eletroforese contendo buffer 1X TAE.
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ANEXO 4 – AMPICILINA ESTOQUE 1000 X
Para o preparo deste estoque utilizou-se 0,5g de Ampicilina invitrogen (950mcg/mg)
acrescidos a 10ml de água Millipore que, logo após a homogeneização, era aliqüotado em
eppendorfs e estocado sob refrigeração a aproximadamente 200C negativos.
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ANEXO 5 – KANAMYCIN ESTOQUE 1000 X
Para o preparo deste estoque utilizou-se 0,655g de Kanamycin sulfate invitrogen
(763mcg/mg), acrescidos a 10ml de água Millipore que, logo após a homogeneização, era
aliqüotado em eppendorfs e estocado sob refrigeração a aproximadamente 20ºC negativos.
54
ANEXO 6 – MEIO LB ESTOQUE
Este meio foi preparado com 20g de LB Broth Base invitrogen diluído em 1L de água
Millipore, depositado em garrafa de vidro com tampa e, em seguida, autoclavado a 121ºC
durante 15 minutos (conforme as recomendações do fabricante) para, posteriormente, ser
armazenado em temperatura ambiente.
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ANEXO 7 – MEIO LB ACRESCIDO DE AMPICILINA (50 µG/L)
Para este meio eram utilizados meio LB estoque e Ampicilina estoque 1000 X (numa
proporção de 1L de meio LB para 1ml de Ampicilina), armazenado em garrafa de vidro com
tampa em temperatura ambiente.
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ANEXO 8 – PLACAS PARA CULTIVO BACTERIANO
Para fazer 40 (quarenta) placas de cultivo, foram adicionados 400ml de água millipore,
8g de LB Broth Base e 7,2g de Bacto Agar. Esta mistura foi autoclavada a 121ºC por
aproximadamente 1hora. Depois de fria, acrescentou-se 400µl de ampicilina e depositou-se
aproximadamente 10ml deste meio de cultivo por placa (placas de petry 100x15mm, de
poliestireno) que, por sua vez, eram identificadas e armazenadas em refrigerador.
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ANEXO 9 – PURIFICAÇÃO DE DNA A PARTIR DE TRANSFORMAÇÃO.
BENCH PROTOCOL: QIAPREP SPIN MINIPREP KIT (QIAGEN)
This protocol is designed for the purification of to 20µg high-copy plasmid DNA from
1-5ml overnight E. coli culture in LB medium. New users and users wanting to purity low-
copy plasmids and cosmids, large plasmids (>10kb), and DNA prepared using other methods
should refer to the detailed protocols provided in the QIAprep Miniprep Handbook, 2nd ed.
Things to do before starting
• Add RNase A solution to Buffer P1.
• Optional: Add LyseBlue reagent to buffer P1.
• Add ethanol (96-100%) to buffer PE.
• Check buffers P2 and N3 for salt precipitation and dissolve at 370C if necessary.
Procedure
1. Resuspend the pellet bacterial cells in 250 µl Buffer P1 and transfer to a
icrocentrifuge tube.
2. Add 250 µl buffer P2 and mix thoroughly by inverting the tube 4-6 times (if use
LyseBlue reagent, solution turns blue).
3. Add 350µl N3 and mix immediately and thoroughly by inverting the tube 4-6 times (if
use LyseBlue reagent, solution turns colorless).
4. Centrifuge for 10 minutes at 13000rpm in a table-top centrifuge.
5. Apply the supernatant from step 4 to the QIAprep spin column by decanting or
pipetting.
6. Centrifuge for 30-60 seconds, discard the flow-througt.
7. Recommended: Wash the QIAprep spin column by adding 0.5ml buffer PB and
centrifuge for 30-60 seconds, discard the flow-througt (this step is only required when
using EndA or other bacteria strains with high nuclease activity or carbohydrate
content).
8. Wash QIAprep spin column by adding 0.75ml buffer PB and centrifuge for 30-60
seconds.
58
9. To elute DNA, place the QIAprep column in a clean 1,5ml microcentrifuge tube.
10. Add 50 µl buffer EB or water to the center of each QIAprep spin column, let stand for
1 minute, and centrifuge for 1 minute.
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ANEXO 10 – EXTRAÇÃO DE DNA A PARTIR DE AGAROSE GEL
QIAEX II AGAROSE GEL EXTRACTION PROTOCOL
This protocol is designed for the extraction of 40-bp to 50-kb DNA fragments from 0,3-2%
standard or low-melt agarose gels in TAE or TBE buffers.
Notes
• The yellow color of buffer QX1 indicates a pH ≤ 7,5.
• Add ethanol (96-100%) to buffer PE before use.
• A heating block or water bath at 500C is required.
• 3M sodium acetate, Ph 5,0, may be necessary.
• All centrigugation steps are at maximun speed (≥13000rpm) in a conventional, table
stop microcentrifuge.
• *For DNA fragments larger than 10kb, mix by gently flicking the tube to avoid
shearing the DNA. Do not vortex the tube.
Procedure
1. Excise the DNA band from the agarose gel with a clean, shsrp scalpel (minimize the size
of the gel slice by removing excess agarose, use a 1,5ml microcentrifuge tube for
processing up to 250mg agarose.
2. Weight the gel slice in a colorless tube. Add 3 volumes of buffer QX1 to 1 volume of gel
for DNA fragments 100 bp - 4 kb; otherwise, follow the table below.
60
DNA fragments < 100bp Add 6 volumes of buffer QX1
DNA fragments > 4kb Add 3 volumes of bufferQX1 and 2 volumes of water
>2% or Metaphor agarose gel Add 6 volumes of buffer QX1
3. Resuspend QIAEXII by overtaxing for 30sec. Add QIAEX II to the sample according to
the table below and mix.
4. Incubate at 50ºC for 10 min to solubilize the agarose and bind the DNA. Mix by
vortexing* every 2 min to keep QIAEX II in suspension. Check that color of the mixture
is yellow (if the color of the mixture is orange or purple, add 10µl 3M sodium acetate,
pH5.0 and mix).
5. Centrifuge the sample for 30 sec and carefully remove supernatant with a pipet.
6. Wash the pellet with 500µl of buffer QX1 (resuspend the pellet, centrifuge the sample for
30 sec and remove all traces of supernatant with a pipet).
7. Wash the pellet twice with 500µl of buffer PE (resuspend the pellet, centrifuge the sample
for 30 sec and remove all traces of supernatant with a pipet).
8. Air-dry the pellet for 10-15 min or until the pellet becomes white (if 30µl of QIAEX II
suspension is used, air-dry the pellet for approximately 30min).
9. To elute DNA, add 20µl of 10mM tris.Cl, pH8,5 or water and resuspend the pellet by
vortexing*. Incubate according to the table below.
10. Centrifuge for 30sec carefully pipet the supernatant into a clean tube.
11. Optional: repeat speat steps 9 and 10 and combine the eluates.
61
≤ 2µg DNA Add 10µl of QIAEX II
2-10µg DNA Add 30µl of QIAEX II
Each additional 10µg DNA Add additional 30µl of QIAEX II
DNA fragment ≤4kb Incubate at room temperature for 5 min
DNA fragment 4-10kb Incubate at 500C for 5 min
DNA fragment >10kb Incubate at 500C for 10 min
ANEXO 11 – MAPA DO VETOR UTILIZADO NA CLONAGEM DE GENES
Fonte:
https://catalog.invitrogen.com/index.cfm?fuseaction=viewCatalog.viewProductDetails&productDescription=761&
62
ANEXO 12 – MAPA COMPARATIVO DOS GENES DE MIOSTATINA EM
SALMONÍDEOS
63
O esquema representa o mapa dos exons (caixas) e introns (linhas) dos genes de miostatina
em diferentes espécies de salmonídeos.
Os genes MSTN-1a e -1b aparecem em cor azulada, enquanto que os genes MSTN-2a e -2b
estão em tons amarelados.
As linhas pontilhadas em vermelho representam regiões deletadas no primeiro e segundo
exons dos genes MSTN-2b.
Os asteriscos em vermelho significam os stop códons.
ANEXO 13 – ALINHAMENTO DAS SEQÜÊNCIAS DOS EXONS DE MSTN-2
64
Esta figura representa o alinhamento das seqüências do primeiro exon no gene mstns-2b
em cinco espécies diferentes de salmonídeos (rt, rainbow trout; co, Coho salmon; cm, Chum
salmon; ck, Chinook salmon; At, Atlantic salmon), que foram comparadas com a mesma região no
gene mstn-2a em rainbow trout. Para tal foram utilizados os programas de computador Clustal W
algorithm in Vector NTI Align X .
Cada seqüência começa com os respectivos iniciadores e termina no 3', no final de cada
exon.
Lacunas são indicadas por um traço no alinhamento (-), as posições conservadas aparecem
na cor amarela e as divergências entre as bases nitrogenadas em azul.
