Embed Size (px)
Citation preview
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
Faculdade de Ciências Farmacêuticas
Programa de Pós-Graduação em Farmácia
Área de Análises Clínicas
Efeitos dos inibidores de IDO e TDO na proliferação, migração e invasão de
melanomas humanos e na atividade tumoricida de células mononucleares.
Maryana Stephany Ferreira Branquinho
Orientador: Prof. Tit. Ana Campa
São Paulo
2015
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
Faculdade de Ciências Farmacêuticas
Programa de Pós-Graduação em Farmácia
Área de Análises Clínicas
Efeitos dos inibidores de IDO e TDO na proliferação, migração e invasão de
melanomas humanos e na atividade tumoricida de células mononucleares.
Maryana Stephany Ferreira Branquinho
Versão corrigida da Dissertação conforme resolução CoPGr 6018.
O original encontra-se disponível no Serviço de Pós Graduação da FCF/USP.
Dissertação para obtenção do Título de Mestre
Orientador: Prof. Tit. Ana Campa
São Paulo
2015
Ficha Catalográfica Elaborada pela Divisão de Biblioteca e
Documentação do Conjunto das Químicas da USP.
Branquinho, Maryana Stephany Ferrei ra B821e Efei tos dos inibidores de IDO e TDO na proliferação, migração e invasão de melanomas humanos e na atividade tumoricida de células mononucleares / Maryana Stephany Ferreira Branquinho. -- São Paulo, 2015. 95p. Dissertação (mestrado) - Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo. Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas. Orientador: Campa, Ana 1 . Bioquímica cl ínica : Medicina 2. Câncer : Imunologia I. T. I I. Campa, Ana, orientador. 616.0756 CDD
Maryana Stephany Ferreira Branquinho
Efeitos dos inibidores de IDO e TDO na proliferação, migração e invasão de melanomas
humanos e na atividade tumoricida de células mononucleares.
Comissão Julgadora
da
Dissertação para obtenção do Título de Mestre.
_________________________________________________
Profa. Tit. Ana Campa
Orientadora/Presidente
_________________________________________________
1º. examinador
_________________________________________________
2º. examinador
São Paulo, ______ de _______________ de 2015.
Dedico este trabalho a Deus, fonte inesgotável
de força em todos os momentos desta
caminhada.
Aos meus pais, Sivaldo e Suelene. Obrigada por
acreditarem e incentivarem esta conquista.
À Ana Campa, orientadora, e definição melhor
não há. Obrigada por abrir os meus olhos para
a ciência.
“É preciso força pra sonhar e perceber que a estrada vai além do que se vê...”
Agradecimentos
Primeiramente agradeço a Deus! Obrigada por tornar possível esta vitória!
“Deus nos concede, a cada dia, uma página de vida no livro do tempo. Aquilo
que colocamos nela corre por nossa conta”.
Chico Xavier
Mãe e Pai: Obrigada! Não existem palavras que eu invente para escrever aqui
capazes de expressar a minha gratidão. Talvez a maneira na qual eu irei olhar pra vocês
no final da minha aula no dia da defesa, traduza este sentimento. Nada disso aconteceria
se vocês não tivessem dito “ok, pode deixar tudo aqui com a gente, pode ir para SP.”.
Obrigada por serem os melhores pais e os melhores amigos. Vocês são os melhores do
mundo! Guilherme, obrigada por sempre ter sido o meu maior parça e o melhor irmão
que alguém pode ter! Espero que você me ajude a fazer na comemoração da defesa,
metade do que fizemos na da qualificação. Só metade porque não há necessidade de
apelação dessa vez, hehehe. Madrinha, obrigada por estar sempre aqui com a gente, sem
a senhora a vida não teria o mesmo sentido. E obrigada também pela oncinha que eu
ganhava a cada ida à Alfenas, ela salvava todo final de mês (e vai continuar salvando no
doutorado). Vocês quatro são a melhor família para a qual Deus poderia ter me
mandado. EU AMO VCS!
Chefa, obrigada pela paciência, dedicação e confiança durante esses três anos.
Ahhh, e obrigada também pelo abraço com o qual você me recebeu quando vim
conhecer o Lab. Ele fez toda a diferença no momento de resolver se era isso mesmo que
eu queria.
Ao pessoal do Lab: Ale, Ari, Carol, Edson, Fran, Janis, Luzi, Mari, Maysa,
Michele, Nathi, Renan, Sika e Thais eu só tenho a agradecer por tudo o que eu aprendi
nesse tempo em que estive com vocês. Espero conseguir passar a diante todos os
ensinamentos que adquiri enquanto vocês todos ainda estavam por aqui. Grupo W,
obrigada por estarem sempre me ensinando e dando puxões de orelha. Este trabalho é
nosso, porque somos e sabemos o que é ser um GRUPO.
Luciene, Marcela e Juliana, vocês foram as pessoas certas no lugar certo.
Durante muito tempo eu ainda irei agradecer a Deus por ter colocado vocês na minha
vida. Vocês são minha segunda família.
Débora, Nayara, Paula, Samara e Cássia, obrigada pela amizade de alguns 20 e
poucos anos. Vocês estiveram e estarão presentes nos momentos mais importantes da
minha vida.
Maylla, Ana, Jacque (minhas três filhinhas), Simoninha e Tai obrigada pela
amizade, companhia, caronas, cervejas, conversas, conselhos. Obrigada por estarem
sempre presentes nos bons e nos maus momentos. Bora comemorar sajoçaaaaa...
Brendinha e Tili, obrigada pela presença e amizade em TODOS os momentos.
Obrigada por terem vindo à São Paulo 7628710191 vezes, enquanto eu tive o trabalho
de me deslocar 0 vezes até a casa de vocês em todo este tempo! Minha cara nem queima
mesmo!! Loviu!
Paulo, Deus não poderia ter te colocado na minha vida em outro momento.
Obrigada por me incentivar, acreditar e entender esse período estressante de fim de
mestrado.
Não posso me esquecer de agradecer também àqueles que mesmo de longe,
sempre ajudaram de alguma maneira, primos, tios, tias e avós. Obrigada pelo carinho...
Agradeço ainda à todos os professores colaboradores que tornaram possível a
realização deste trabalho. Especialmente o Prof. Ernani, pela disponibilidade do massas
e da Ari, Profª’s Silvya, Silvia e Dulcinéia pelo empréstimo de aparelhos e reagentes.
Aos colegas de departamento, amigos da Hemato, Pato e Bioquímica. Às meninas da
secretaria que sempre me salvaram nos momentos de desespero! À Claudinha e a Rose,
que nos mantém acordados com o bom cafezinho de todo dia. À Renatinha, pelos
inúmeros “socorros” que pedi e sempre fui atendida.
Agradeço também ao CNPq e a Capes pelo financiamento desta pesquisa.
“É preciso que eu suporte duas ou três larvas se quiser conhecer as borboletas.”
O Pequeno Príncipe
RESUMO
BRANQUINHO, M.S.F. Efeitos dos inibidores de IDO e TDO na proliferação,
migração e invasão de melanomas humanos e na atividade tumoricida de células
mononucleares. 2015. 95f. (Dissertação de Mestrado). Faculdade de Ciências
Farmacêuticas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2015.
No câncer, o aumento da expressão das enzimas indolamina 2,3-dioxigenase 1 (IDO1) e
triptofano 2,3-dioxigenase (TDO), que convertem o triptofano (Trp) em quinurenina
(QUIN), tem sido associado ao mecanismo de imuno escape tumoral e inibidores destas
enzimas têm sido considerados como imunoadjuvantes na terapia antitumoral. O mais
conhecido deles é o 1-metil-triptofano (1-MT), um inibidor competitivo da IDO e alvo
de estudos clínicos. O 1-MT é encontrado nas formas enantioméricas D- e L- e embora o
enantiômero 1-L-MT seja mais eficiente na inibição da IDO1 (a isoforma mais ativa em
tumores), é o 1-D-MT o enantiômero mais eficiente na redução experimental de
tumores. Esse dado sugere que o 1-MT pode ter ações adicionais à inibição da IDO.
Neste estudo avaliamos os efeitos diretos dos estereoisomeros, 1-D-MT, 1-L-MT, 1-DL-
MT, sobre melanomas humanos e também do composto 680C91 (um inibidor de TDO).
Proliferação, migração e invasão são os ensaios usuais in vitro para avaliar como um
determinado composto afetaria a progressão tumoral. Observamos que todos os
compostos testados possuem algum efeito direto sobre pelo menos um desses
parâmetros, sendo que esse efeito varia de acordo com a linhagem. Logo, todos eles
possuem ação direta sobre a célula tumoral que deve contribuir com a atividade
antineoplásica. Também analisamos os efeitos destes compostos sobre a ação
tumoricida de células mononucleares de sangue periférico humano (PBMC). Em co-
culturas, observamos que o 1-MT foi capaz de potencializar a atividade tumoricida de
PBMC’s e levou à diminuição da produção de IFN-γ e TNF-α e aumento de IL-10.
Essas alterações não cursam com a inibição da produção de QUIN, o que nos faz pensar
que esta ação de 1-MT sobre IFN-γ ocorre independente da enzima IDO e que parte dos
efeitos antitumorais da 1-MT seja consequência de sua ação sobre a liberação destas
citocinas. 1-MT também levou a modificações na concentração de outros metabólitos do
Trp. Por fim, a co-cultura por si só aumentou o consumo de ácido xanturênico (XA) e
aumentou a produção de ácido quinurênico (KA). Esse resultado parece significativo
para a imunologia de tumores dado os efeitos biológicos destes compostos.
Palavras-chave: câncer, indolamina-2,3-dioxigenase, 1-metil-triptofano, imune escape,
IFN-γ.
ABSTRACT
BRANQUINHO, M.S.F. Effects of IDO and TDO inhibitors in proliferation,
migration and invasion of human melanomas and on tumoricidal activity of
mononuclear cells. 2015. 95f. (Master's thesis). Faculty of Pharmaceutical Sciences,
University of São Paulo, São Paulo, 2015.
In cancer, the increased expression of the enzymes indolamine 2,3-dioxygenase 1
(IDO1) and tryptophan 2,3-dioxygenase (TDO), that convert tryptophan (Trp) to
kynurenine (KYN), has been associated with the mechanism of immune escape of
tumoral cells and inhibitors of these enzymes have been considered as immuno-
adjuvants in antitumor therapy. The most known is the 1-methyl-tryptophan (1-MT), a
competitive inhibitor of IDO and a target in clinical trials. 1-MT is found in the
enantiomeric forms D- and L- and although 1-L-MT is more efficient to inhibit IDO1
(the isoform more active in tumors), 1-D-MT is more efficient in experimental models.
This fact suggests that 1-MT may have additional actions beyond IDO inhibition. In this
study, we evaluated the direct effects of 1-D-MT, 1-L-MT and 1-DL-MT on human
melanomas. We also tested the effects of the compound 680C91 (an inhibitor of TDO).
Proliferation, migration and invasion are the usual in vitro tests to evaluate how a
specific compound affects tumor progression. We observed that all of the tested
compounds have some direct effect on at least one of these parameters depending on the
cell lineage. Therefore, direct effects on proliferation, migration and invasion must
compose the antineoplastic activity of these compounds. In co-cultures, we observed
that 1-MT was able to potentiate the tumoricidal activity of peripheral blood
mononuclear cells (PBMC) and led to a decreased production of IFN-γ and TNF-α, and
an increase in IL-10. These changes were not linked with the inhibition of KYN
production, and led us to consider that the effect of 1-MT on cytokine production occurs
independently of the enzyme IDO and is part of its antitumor effects. 1-MT also led to
changes in the concentration of other Trp metabolites. Finally, the co-culture by itself
led to an increased consumption of xanthurenic acid (XA) and increased production of
kynurenic acid (KA). This result seems significant to the immunology of tumors given
the biological effects of these compounds.
Keywords: cancer, indoleamine-2,3-dioxygenase, 1-methyl-tryptophan, immuno escape
IFN-γ.
SUMÁRIO
LISTA DE ABREVEATURAS........................................................................................16
LISTA DE FIGURAS........................................................................................................18
LISTA DE TABELAS.......................................................................................................20
1. INTRODUÇÃO..............................................................................................................21
1.1. Metabolismo do Triptofano...............................................................................21
1.2. Metabolismo do Triptofano e Câncer................................................................24
1.3. Câncer e Imunogenicidade................................................................................26
1.4. Enzimas IDO e TDO.........................................................................................28
1.5. Inibidores de IDO e TDO..................................................................................30
1.6. Efeitos de 1-MT independentes de sua ação inibitória sobre IDO...................32
2. OBJETIVOS..................................................................................................................35
2.1. OBJETIVO GERAL........................................................................................35
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS..........................................................................35
3. MATERIAIS E MÉTODOS........................................................................................36
3.1. Cultura de células.............................................................................................36
3.2. Quantificação de triptofano nas amostras de 1-MT.........................................37
3.3. Ensaio de viabilidade celular por MTT (24h)..................................................37
3.4. Ensaio Clonogênico.........................................................................................38
3.5. Teste da ferida.................................................................................................38
3.6. Invasão celular in vitro....................................................................................39
3.7. Co-cultura........................................................................................................40
3.7.1. Co-cultura em placas de 96 poços em formato de U........................40
3.7.2. Co-cultura em placas de 12 poços.....................................................41
3.7.3. Produção de IFN-γ............................................................................41
3.7.4. Produção de IL-10, IL-6, IL-1 β, IL-8, IL-12 e TNF-α.....................41
3.7.5. Quantificação dos metabólitos do Trp...............................................42
3.8. Análise do Ciclo Celular..................................................................................43
3.9. Análise estatística.............................................................................................43
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO..................................................................................44
CAP. 1: Efeitos diretos dos inibidores de IDO e TDO sobre a célula tumoral...................45
CAP. 2: Efeitos sobre a resposta imunológica, mediados ou não pela enzima IDO..........57
5. CONCLUSÕES.............................................................................................................78
6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................................79
7. ANEXOS........................................................................................................................89
16
LISTA DE ABREVEATURAS
1-D-MT: 1-D-metil-triptofano
1-DL-MT: 1-DL-metil-triptofano
1-L-MT: 1-L-metil-triptofano
1-MT: 1-metil-triptofano
5-HT: serotonina
5-OH-QUIM: 5-hidróxi-quinuramina
AA: ácido antranílico
ACS: 2-amino-3-carboximuconato semialdeído
AFMK: N1-acetil-N2-formil-5-metóxiquinuramina
AhR: receptor aril hidrocarboneto
AMK: N1-acetil-α5-metoxiquinuramina
ATB: antibiótico
CBA: Cytometric Bead Array
DMT: N-N-dimetiltriptamina
f-QUIN: N-formil-quinurenina
HAA: ácido 3-hidróxi-antranílico
HIAA: ácido 5-hidróxi-indol-acético
HIAA-D2: ácido 5-hidróxi-indol-acético deuterado 2
HK: 3–hidróxi–quinurenina
IAA: ácido indolacético
IDO1: indolamina 2,3-dioxigenase 1
IDO2: indolamina 2.3-dioxigenase 2
IFN-γ: interferon-gama
IL-1 β: interleucina 1 beta
17
IL-6: interleucina 6
IL-8: interleucina 8
IL-10: interleucina 10
IL-12: interleucina 12
KA: ácido quinurênico
MLT: melatonina
MLT-D7: melatonina deuterada 7
NA: ácido nicotínico
NAD+: nicotinamida adenina dinucleotídeo
NAM: nicotinamida
NrN: nicotinato D-ribonucleotídeo
PA: ácido picolínico
PBMC: células mononucleares do sangue periférico
QA: ácido quinolínico
QUIN: N-quinurenina
SFB: soro fetal bovino
TDO: triptofano-2,3-dioxigenase
TME: triptofano-metil-éster
TNF-α: fator de necrose tumoral alfa
Trp: triptofano
TRY: triptamina
Via QUIN: via das quinureninas
Via SER/MLT: via serotoninérgica/melotoninérgica
Via TRY: via das triptaminas
XA: ácido xanturênico
18
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Via das quinureninas do catabolismo do TRP................................................22
Figura 2: Via das triptaminas do catabolismo do TRP...................................................23
Figura 3: Via Serotoninérgica/Melatoninérgica do catabolismo de Trp........................24
Figura 4: Estrutura das enzimas IDO e TDO.................................................................29
Figura 5: Reação de oxidação do triptofano pelas enzimas IDO e TDO originando N-
formilquinurenina............................................................................................................29
Figura 6: Estrutura química dos enantiômeros de 1-MT................................................31
Figura 7: Estrutura química do composto 680C91.........................................................32
Figura 8: Porcentagem e concentração final de triptofano contaminante em todos os
lotes de 1-MT...................................................................................................................47
Figura 9: Triptofano existente em cada lote de 1-MT acrescida do triptofano contido
em DMEM.......................................................................................................................48
Figura 10: Viabilidade celular na presença de diferentes concentrações de triptofano
segundo o método de MTT..............................................................................................49
Figura 11: Proliferação da SK-Mel 19 na presença de 1-MT e 680C91........................50
Figura 12: Proliferação da SK-Mel 147 na presença de 1-MT e 680C91......................51
Figura 13: Migração da linhagem SK-Mel 19 na presença de 1-MT e 680C91............53
Figura 14: Migração da linhagem SK-Mel 147 na presença de 1-MT e 680C91..........54
19
Figura 15: Invasão da SK-Mel 19 e da SK-Mel 147 na presença de 1-MT e
680C91.............................................................................................................................55
Figura 16: Padronização das co-culturas com diferentes proporções de célula tumoral e
PBMC e diferentes concentrações de 1-DL-MT..............................................................58
Figura 17: Análise do ciclo celular segundo condições estipuladas na padronização...60
Figura 18: Grupos de condições com as quais trabalhamos nas co-culturas realizadas
em placas de 96 poços.....................................................................................................61
Figura 19: Viabilidade celular segundo contagem com Azul de Tripan, após incubação
de 72 horas em placa de 96 poços com fundo em U.......................................................62
Figura 20: Grupos de condições com as quais trabalhamos nas co-culturas realizadas
em placas de 12 poços.....................................................................................................64
Figura 21: Quantificação de citocinas inflamatórias, IFN- γ, TNF-α, IL-6, IL-1 β, IL-
12, IL-8 e IL-10...............................................................................................................65
Figura 22: Concentração de Trp e QUIN no sobrenadante dos ensaios de co-cultura...68
Figura 23: Concentração dos metabólitos da via QUIN (AA, KA, XA, QA, NA) no
sobrenadante dos ensaios de co-cultura...........................................................................72
Figura 24: Concentração de 5-HT e IAA no sobrenadante dos ensaios de co-cultura...76
20
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Mutações apresentadas pelas linhagens de melanomas SK-Mel 19 e SK-Mel
147...................................................................................................................................36
21
1. INTRODUÇÃO
1.1. Metabolismo do Triptofano
O triptofano (Trp) é um aminoácido essencial que é utilizado para síntese
proteica, mas também pode ser degradado por diferentes vias catabólicas e gerar
compostos com diversas atividades biológicas (1, 2), sendo a via das quinureninas (Via
QUIN) seu principal fluxo catabólico (Fig. 1). Nela, o Trp é oxidado a N-formil-
quinurenina (f-QUIN) com subsequente deformilação por arilformidases constitutivas,
gerando o metabólito quinurenina (QUIN), o produto mais estudado da via QUIN.
Duas enzimas são responsáveis pela catálise do Trp à f-QUIN: a triptofano-2,3-
dioxigenase (TDO) e indolamina-2,3-dioxigenase (IDO). A QUIN pode ser substrato de
diferentes enzimas e gerar ácido antranílico (AA), 3–hidróxi–quinurenina (HK) e ácido
quinurênico (KA) (3).
HK pode ser hidrolisado e produzir ácido xanturênico (XA) (4) e ácido 3-
hidróxi-antranílico (HAA). HAA também pode ser sintetizado a partir da hidroxilação
de AA. HAA por sua vez é convertido em 2-amino-3-carboximuconato semialdeído
(ACS), que é rearranjado não enzimaticamente a ácido quinolínico (QA), que inicia o
metabolismo de nicotinamida (NAM). ACS pode também ser descarboxilado e gerar 2-
aminomuconato semialdeído que é rearranjado a ácido picolínico (PA) (1).
Os últimos passos da via QUIN são relacionados ao metabolismo de ácido
nicotínico (NA) e nicotinamida (NAM) que é responsável, dentre outras moléculas, pela
síntese de nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD+). Resumidamente, o ácido
quinolínico (QA) é substrato da síntese de nicotinato D-ribonucleotídeo (NrN). Entre
outras reações, NrN participa da síntese de vitamina B3, o ácido nicotínico (NA),
nicotinamida (NAM) e NAD+. Assim, todos esses metabólitos: QA, NA e NAM podem
ser usados por uma célula humana para sintetizar NAD+
(5, 6).
22
Figura 1: Via das quinureninas do catabolismo do TRP (Via QUIN).
Outra via de metabolização do Trp, é a via serotonérgica/melatoninérgica (via
SER/MLT) (Fig.2). Essa via se inicia a partir da hidroxilação do Trp, e formação de 5-
hidróxi-triptofano, com posterior descaboxilação gerando serotonina (5-HT) (7). Tanto
5-hidróxi-triptofano como a 5-HT podem sofrer ação da IDO e serem convertidos a 5-
hidróxi-quinurenina e 5-hidróxi-quinuramina (5-OH-QUIM), respectivamente, o que
demonstra que as vias QUIN e SER/MLT se intercomunicam entre si.
A 5-HT pode ser catalisada por monoamino oxidases e formar 5-hidróxi-indol-
acetalaldeído que gera o seu principal metabólito, o ácido 5-hidróxi-indol-acético
(HIAA) (8, 9). Como produto do 5-hidróxi-indol-acetaldeído tem-se também, 5-hidróxi-
triptofol, que é o metabólito de 5-HT encontrado em menor quantidade, representando
apenas 1% do turnover de 5-HT (10). A formação dos dois produtos metabólicos da 5-
HT, citados acima, são intimamente dependentes da relação NAD/NADH (11) já que as
enzimas envolvidas utilizam essas moléculas como co-fator. Algumas células são
capazes de utilizar 5-HT para a síntese de melatonina (MLT) através da rota
23
intermediada por N-acetilserotonina. A 5-HT é N-acetilada e metoxilada, gerando N-
acetil-5-metóxi-triptamina, a melatonina (12, 13).
A melatonina tem capacidade de capturar radicais de oxigênio e gerar diferentes
metabólitos (14). O metabólito N1-acetil-N2-formil-5-metóxiquinuramina (AFMK) é
considerado o principal metabólito da melatonina, sendo obtido por reações com
radicais hidroxila e oxigênio singlete, mas também pode ser produzido por catálise
enzimática por mieloperoxidase de neutrófilos (15). O AFMK obtido por oxidação da
MLT pode ser deformilado e dar origem a N1-acetil-α5-metoxiquinuramina (AMK)
(16). Juntos, AFMK e AMK são os principais metabólitos da melatonina.
Figura 2: Via Serotoninérgica/Melatoninérgica do catabolismo de Trp (Via SER/MTL).
NH2
NH
O
OH
Trp
1
5-OH-Trp
SERHIAA NAS
MLT
AMK AFMK
53
2
4
KYM
OH
NH
5-HTOL
ONH2
NH
O
NH
O
NH
O
OHN
O
O
NH
O
OH2N
O
2
6
7Enzimas
1 - EC 1.14.16.42 - EC 4.1.1.283 - EC 1.2.1.34 - EC 1.1.1.215 - EC 2.3.1.876 - EC 2.1.1.47 - EC 1.11.2.2
NH2
NH
O
HOHO
NH2
NH
HO
NH O
OH
HO
NH
NH
OH
O
NH2
HO
24
Apesar das vias QUIN e SER/MLT somadas serem responsáveis pela quase
totalidade do catabolismo de Trp, uma parte minoritária do Trp pode ser convertida em
dimetiltriptamina (DMT) pela via das Triptaminas (Via TRY) (Fig. 3). O DMT é
proveniente da metilação da triptamina (TRY), produzida a partir da descarboxilação do
triptofano. A TRY possui também como metabólito o ácido indolacético (IAA).
Figura 3: Via das triptaminas do catabolismo do TRP (via TRY).
1.2. Metabolismo do Triptofano e Câncer
O catabolismo elevado do triptofano no câncer foi descrito pela primeira vez na
década de 50 ao se analisar a urina de pacientes com neoplasia de bexiga.
Posteriormente, foi detectada grande quantidade de metabólitos do triptofano também
na urina de pacientes com câncer de mama, câncer de próstata, linfoma de Hodgkin e
leucemia (17). Atualmente, novos estudos mostraram a relevância de metabolitos das
três vias de catabolismo do triptofano, inclusive trabalhos desenvolvidos pelo nosso
grupo de pesquisa descrevem essa relação (18, 19).
O esgotamento do Trp pode ter um efeito negativo sobre a proliferação celular,
em especial a de células T, uma vez que a imunomodulação causada pela depleção do
Trp influência na tolerância de tumores, transplantes e até na implantação do feto (20).
Esta depleção de triptofano tem como fator determinante a atividade das enzimas
NH2NH
O
OH NH2
NH
1N
NHCO2 SAM SAM
NH
O
OH
2 2
3
Trp TRY DMT
IAA
Enzimas
1 - EC 4.1.1.282 - EC 2.1.1.493 - EC 1.4.3.4
25
indolamina-2,3-dioxigenase (IDO) e triptofano-2,3-dioxigenase (TDO), resultando em
produção de quinurenina (21). IDO está provavelmente relacionada à progressão do
câncer, atuando como marcador de mau prognóstico na doença (22). Isso ocorre, pois
QUIN tem efeitos tolerogênicos nas células dendríticas e suprime a atividade de células
T (23), causando um efeito pró-tumoral (24). Sugere-se também, que a expressão de
IDO pelo tumor pode inibir a ação das células NK e macrófagos (25).
TDO se encontra enzimaticamente ativa em vários tipos de câncer, sendo
expressa em carcinoma da bexiga, carcinoma hepatocelular e melanoma. Estudos sobre
sua atuação no câncer também vem ganhando atenção, uma vez que esta enzima pode
ativar o receptor aril hidrocarboneto (AhR), por meio de produção de QUIN, e este
receptor está diretamente relacionado ao crescimento e a motilidade celular (26, 27).
AhR é um fator de transcrição ativado por ligantes presentes em muitas células,
que pode ligar estímulos químicos ambientais com respostas adaptativas, tais como
desintoxicação, homeostase celular ou respostas imunes. Como exemplo disto, um
artigo publicado em 2012 mostra tumores cerebrais humanos que utilizam o AhR para
obter vantagens de crescimento (28). Outro trabalho do mesmo ano apresentou que a
expressão de TDO em tumores impediu sua rejeição em modelos pré-clínicos de ratos
imunizados, e, portanto, desenvolveram um inibidor de TDO que restaurou a capacidade
desses animais de rejeitarem os tumores. Os resultados deste trabalho descrevem um
mecanismo de resistência imunitária tumoral baseada na expressão de TDO e estabelece
um conceito para o uso de seus inibidores na terapia contra o câncer (29).
Considerando esses estudos, a relação do metabolismo do Trp com a progressão
e o desenvolvimento do câncer está intimamente envolvida com a supressão do sistema
imunológico no microambiente tumoral.
26
1.3. Câncer e Imunogenicidade
A compreensão da fisiopatologia do câncer depende dos mecanismos
imunológicos nela envolvidos. Recentemente, tem sido sugerido que o sistema imune
não responde ao não-próprio, mas sim a bruscas alterações nos padrões antigênicos com
os quais ele está em contato (30).
Posto isto, espera-se que o sistema imunológico possua habilidade protetora
contra o câncer, porém as células tumorais conseguem modificar o microambiente ao
seu redor, na tentativa de favorecer sua progressão. Esta disputa entre os dois tipos
celulares mostra que um sistema imunológico ativo pode erradicar o câncer, assim como
o câncer também pode escapar do sistema imunológico. Desta forma, o balanço entre
imunossupressão e imunoestimulação no microambiente tumoral tem profundas
implicações para a eliminação, equilíbrio e escape do tumor (31, 32).
A atuação do sistema imune envolve respostas do sistema imunológico inato e
adaptativo. Linfócitos T, células NK e macrófagos protegem o organismo quando ainda
não existem evidências clínicas da doença, e se as células tumorais forem extintas,
ocorreu então um processo de eliminação do tumor ainda em fase inicial. Vários estudos
têm mostrado a participação de cada uma dessas células em tumores específicos. Em
melanomas, as células T desempenham uma resposta eficiente por meio da ação efetora
de células T CD8+
e T CD4+ (33). Os linfócitos NK que também compõe o sistema
imune inato identificam e destroem células que perderam o complexo principal de
histocompatibilidade (MHC) I decorrente de uma transformação tumoral (34). Por este
motivo, essas células desempenham um importante papel na erradicação de tumores
durante a formação do tumor primário e também após o estabelecimento de metástases
(35). No microambiente tumoral ainda estão presentes os macrófagos que aparecem em
27
maior quantidade em lesões primárias e em menor, nas metastáticas. Essas células
podem tanto atuar no combate do tumor quanto sofrer uma ativação alternativa que
resulta na inibição do sistema imunológico e desta forma, favorecem a tolerância e a
progressão tumoral (34).
Se células tumorais não forem erradicadas pelo sistema imune nas fases iniciais,
numa etapa seguinte elas desenvolvem a capacidade de colonizar sítios em tecidos do
hospedeiro, porém o sistema imune ainda consegue contê-las, caracterizando um
equilíbrio imunológico. Entretanto existe também uma terceira possibilidade, que
acontece quando as células tumorais desenvolvem a capacidade de contornar e suprimir
o sistema imunológico do hospedeiro, tomando o controle da situação. Este processo é
chamado de imune escape e garante que a lesão tumoral progrida e a doença torne-se
aparente, dando inicio as limitações no tratamento do câncer (17). O imune escape das
células tumorais acontece porque a maioria dos tumores são formados por células do
próprio organismo, o que faz com que o sistema imune comece a trabalhar mais
tardiamente. Além disso, as células tumorais são capazes de desenvolver várias táticas
para evadir o sistema imune (33). Dentre os mecanismos moleculares envolvidos no
imune escape podemos citar, alteração da expressão de HLA clássico e não clássico,
diminuição de antígenos tumorais, perda de moléculas co-estimulatórias importantes na
resposta imunológica, produção de citocinas imunossupressoras, dentre outros (36).
No contexto do imune escape se sobressaem as enzimas IDO e TDO, que
produzirem QUIN, e por este motivo apresentam atividades imunossupressoras, atuando
assim no microambiente tumoral de forma a favorecer o escape imunológico das células
tumorais.
28
1.4. Enzimas IDO e TDO
Como dito anteriormente, indolamina 2,3-dioxigenase e triptofano 2,3-
dioxigenase são as enzimas responsáveis pelo passo inicial e limitante da velocidade na
via QUIN (20). IDO pode ser induzida por interferon-γ (IFN- γ) e é expressa na maioria
dos tecidos humanos. Outras citocinas ou lipopolissacáridos também são capazes de
induzir IDO, embora de forma menos efetiva (37). TDO pode ser induzida por
glicocorticoides, cortisol e estresse (38), e é expressa principalmente no fígado de seres
humanos, mas após estímulos pode ser detectada também em outros tecidos, incluindo a
placenta, útero gravídico, epidídimo, testículos e cérebro (27). Estas enzimas
apresentam características imunossupressoras e estão ligadas a uma variedade de
condições fisiológicas e fisiopatológicas imuno-relacionadas (37).
IDO é uma proteína monomérica que contém um domínio C-terminal, um N-
terminal e um grupo heme em sua estrutura. O domínio C-terminal é essencialmente
idêntico ao monómero de TDO, e as estruturas são facilmente sobreponíveis. A região
que liga os dois domínios é extensa e eles são unidos por um loop (39). A enzima TDO
possui estrutura tetramérica com um heme por monómero, sendo que os resíduos N-
terminais de cada monômero estão inseridos no local de ligação do substrato no
monômero adjacente. A região N-terminal encontra-se acima da face distal do heme,
formando parte da cavidade de ligação. A estrutura da enzima é completamente
helicoidal, e um loop flexível, envolvido na ligação do Trp, é observado na parte
exterior do grupo heme (Fig. 4) (39). Mesmo TDO sendo tetramérica e IDO
monomérica, elas apresentam grande semelhança estrutural entre si, que pode ser
explicada pela estrutura de alinhamento das sequências (39).
29
Figura 1: (A) Estrutura de IDO. O domínio N-terminal menor é mostrado em cinza e o
domínio C-terminal é mostrado em azul. (B) Estrutura de TDO. O triptofano é
representado pelas estruturas em vermelho e os monômeros diferentes são mostrados
em lilás, verde, cinza e azul (39).
A oxidação do Trp ocorre por meio da inserção de dois átomos de oxigênio no
seu anel pirrólico (Fig. 5). O mecanismo de clivagem do anel indólico envolve a
abstração de próton pelo O2 ligado ao ferro (que passa do seu estado férrico a ferroso),
seguindo de adição eletrofílica do oxigênio, atacando a dupla ligação entre os carbonos
C2 e C3 do anel indólico.
Figura 2: Reação de oxidação do triptofano pelas enzimas IDO e TDO originando N-
formil-quinurenina.
IDO e TDO seguem mecanismos de ação semelhantes, porém diferenças sutis
distinguem as duas reações enzimáticas. IDO reage preferencialmente com superóxido,
30
podendo reagir também com oxigênio para catalisar Trp ou outras indolaminas,
enquanto TDO reage apenas com o oxigênio e é específico para Trp e alguns de seus
derivados substituídos na posição 5 e 6 (40).
Existem duas isoformas de IDO que apresentam 43% de similaridade entre si,
sendo elas IDO1 e IDO2. IDO2 foi descoberta em 2007, e o seu gene de codificação é
adjacente ao da IDO1 no cromossoma 8, sugerindo um produto de duplicação de genes.
As duas enzimas são capazes de oxidar Trp em f-QUIN, porém a IDO2 é menos
eficiente nesta função e apesar de ser expressa em células tumorais, ela parece não ser
ativa no microambiente tumoral (21, 41).
Com base nos mecanismos de tolerância induzida por IDO e TDO citados nos
itens anteriores, o bloqueio dessas enzimas pode ser clinicamente útil para impedir a
imunossupressão local. E o 1-metitriptofano (1-MT), tem sido o inibidor mais estudado
neste contexto.
1.5. Inibidores de IDO e TDO
Em 1991 estudos com intestino delgado de coelho mostraram que o 1-
metiltriptofano (1-MT) era um inibidor competitivo da IDO (42). Desde então, vários
grupos descrevem a inibição da atividade de IDO por 1-MT, em várias espécies, e um
dado que merece relevância nesses trabalhos é a diminuição da função imunoreguladora
da IDO na presença deste inibidor (18, 24, 43, 44). Esta diminuição pode ser ilustrada
pelo aumento da proliferação tanto de células mononucleares do sangue periférico (45)
quanto em culturas de linfócitos T CD4+ (46). Além disso, a administração in vivo de 1-
MT bloqueia o efeito imunossupressor da IDO (47, 48).
1-MT existe em duas formas (Fig. 6), o enantiômero levógiro (1-L-MT) e o
enantiômero dextrógiro (1-D-MT), sendo encontrado também na forma da mistura
31
racêmica (1-DL-MT), que possui em torno de 50% de cada um dos enantiômeros.
Embora a atividade da enzima IDO1 seja inibida mais eficientemente por 1-L-MT in
vitro, 1-D-MT é mais efetiva no aumento de respostas antitumorais in vivo (49, 50), e
por este motivo é esta a isoforma em análise nos clinical trials como um
imunoadjuvante na terapia do câncer (51).
Figura 3: Estrutura química dos enantiômeros de 1-MT, o inibidor de IDO.
Estudos de farmacodinâmica e farmacocinética do 1-MT são ainda insuficientes.
Um deles, publicado em 2007 mostra as características de biodisponibilidade e
segurança de 1-D-MT. O composto apresenta boa estabilidade e elevada
biodisponibilidade que podem variar entres diferentes espécies. No que diz respeito à
toxicidade, 1-D-MT não produz efeitos adversos significativos ou alterações
hematológicas e bioquímicas (52).
Quando comparado ao triptofano, o enantiômero dextrogiro de 1-MT, após
administração oral em ratos apresentou-se menos ligado a proteínas plasmáticas, o que
pode ser devido à adição do grupo metila e a maior concentração do composto foi
detectada no rim, seguido do fígado, músculo, coração, pulmão e baço respectivamente,
sendo que 35% da sua excreção se deu pela urina, restando apenas 15% nas fezes (52).
32
O composto 68OC91 (Fig. 7) é um potente inibidor de TDO, sendo seletivo para
este substrato quando comparado a uma série de outras enzimas e receptores que
modulam o metabolismo do triptofano. Eficaz não só para células isoladas, mas também
em sistemas mais complexos, este inibidor de TDO tem sido explorado quanto ao seu
papel na regulação do metabolismo de triptofano, relacionando-o ao microambiente
inflamatório e tumoral (53).
Figura 4: Estrutura química do inibidor de TDO, composto 680C91.
Um dado importante neste contexto é que 680C91 não apresenta capacidade
inibitória sobre a enzima IDO, assim como nenhuma das isoformas de 1-MT inibem
TDO (54).
1.6. Efeitos de 1-MT independentes de sua ação inibitória
sobre IDO.
Como mencionado anteriormente, vários estudos se dedicam a identificar novos
inibidores e decifrar mecanismos de ação destes compostos. Nosso interesse reside tanto
na ação destes compostos como inibidores de IDO e TDO, quanto na identificação de
efeitos não mediados pela IDO sobre a célula tumoral. Destacando que estes podem
contribuir como um dos fatores na terapia antineoplásica.
33
Conhecida a existência de duas formas enantioméricas do inibidor de IDO e da
atuação de IDO1 e IDO2 sobre o metabolismo do triptofano, é importante destacar que,
1-L-MT é mais eficiente na inibição da IDO1 e 1-D-MT é mais hábil na redução
experimental de tumores. Sendo IDO1 a isoforma mais ativa em tumores, esse dado
sugere que o 1-MT possa ter ações que independam de qualquer isoforma de IDO,
atuando diretamente contra ao câncer (21).
Uma publicação anterior do grupo descreveu que 1-DL-MT diminui a capacidade
clonogênica de melanomas e gliomas humanos. Este mesmo trabalho mostra que a
inibição de IDO por 1-MT, avaliada por meio da quantificação de QUIN nas mesmas
linhagens de melanomas usadas aqui (SK-Mel 19 e SK-Mel 147), só ocorre na presença
de IFN-γ, indicando que estas células não expressam IDO espontaneamente (18).
Um outro exemplo da ação de 1-MT independente de sua inibição sobre IDO foi
publicado em 2006 por Agaugué e colaboradores. Eles observaram que os efeitos do 1-
MT na maturação de células dendríticas não estão correlacionadas com a inibição da
atividade de IDO. Isto porque 1-MT possui efeitos distintos sobre a maturação
desencadeada por duas substâncias que induzem a mesma atividade sobre IDO. Além
disso, 1-MT modifica as propriedades funcionais das células dendríticas tratados com
peptídeos glicanos sem afetar a atividade de IDO dessas células (55).
Desta maneira sabemos que 1-MT pode ter várias funções além de inibir IDO
que podem contribuir para os efeitos in vivo e os enantiômeros podem atuar em
substratos distintos, e é neste âmbito que o nosso trabalho se insere. Inicialmente,
utilizando condições nas quais IDO não é expressa, ou seja células não ativadas por
IFN-γ, quisemos avaliar o efeitos diretos dos estereoisomeros, 1-D-MT, 1-L-MT, 1-DL-
MT, sobre melanomas humanos. Em uma segunda etapa do trabalho, analisamos os
34
efeitos destes compostos sobre a ação tumoricida de células do sistema imunológico,
sendo estes efeitos, modulados ou não pela enzima IDO. Com estes resultados
evidenciamos atividades adicionais que podem cooperar para a eficiência terapêutica
destes diferentes enantiômeros.
35
2. OBJETIVOS
2.1. OBJETIVO GERAL:
No presente trabalho avaliamos os efeitos diretos e os efeitos sobre o sistema
imunológico, mediado ou não pela enzima indoleamina-2,3-dioxigenase, dos compostos
1-D-MT, 1-L-MT, 1-DL-MT e 680C91.
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
Avaliar os efeitos diretos de 1-D-MT, 1-L-MT, 1-DL-MT e 680C91 na
proliferação, migração e invasão de melanomas humanos;
Avaliar a atuação destes inibidores na atividade antitumoral de células do
sistema imune, acompanhada em co-culturas de linhagens tumorais com
PBMC;
Identificar as possíveis ações do 1-MT sobre passos do metabolismo do Trp,
incluindo as três rotas conhecidas.
36
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Cultura de células
Os experimentos foram realizados com duas linhagens de melanomas humanos
metastáticos: SK-Mel-19 e SK-Mel-147. Optamos por este modelo experimental devido
a grande relevância deste tipo de câncer, além dos vários estudos envolvendo esse tipo
tumoral com respostas positivas que já se encontram em clinical trials (51). Em adição,
SK-Mel 19 e SK-Mel 147 são linhagens com as quais o grupo de pesquisa já possui
familiaridade e uma coleção de dados (18) que poderá sustentar as conclusões aqui
encontradas. Estas linhagens de melanomas possuem mutações especificas que estão
descritas na tabela 1.
As células foram mantidas e cultivadas em meio DMEM (Gibco) suplementado
com 10% de soro fetal bovino (SFB) e antibiótico (ATB; 100 U/mL penicilina e 100
μg/mL estreptomicina), sob 37º C em atmosfera úmida constituída de 5% de CO2.
Linhagens
estudadas BRAF NRAS p53 PTEN
SK-Mel 19 Mutante
(V600E) w w -
SK-Mel 147 w Q61R wR
+
Tabela 1: Mutações apresentadas pelas duas linhagens de células utilizadas neste
trabalho. wR: linhagem selvagem para o gene p 53 apresentando polimorfismo em
P72R. (56)
As células mononucleares do sangue periférico (PBMC) foram isoladas por
gradiente de densidade e mantidas durante os experimentos em RPMI (Gibco)
suplementado com 3% de soro fetal bovino (SFB) e antibiótico (ATB; 100 U/mL
penicilina e 100 μg/mL estreptomicina) sob 37º C em atmosfera úmida constituída de
5% de CO2.
37
3.2. Quantificação de triptofano nas amostras de 1-MT
A quantificação de triptofano nas amostras de 1-MT foi realizada por
espectrometria de massas, em colaboração com o Laboratório de Toxinas e Produtos
Naturais de Algas do Professor Dr. Ernani Pinto Júnior. A concentração deste analito foi
quantificada a partir de uma curva padrão de triptofano. Para todos os ensaios realizados
neste trabalho com os inibidores de IDO, foram utilizados lotes fixos de 1-MT. O ajuste
da porcentagem de triptofano nestes lotes foi feito através da sua adição nas soluções
todas as vezes em que elas foram preparadas, igualando desta forma as concentrações
nos diferentes enantiômeros.
3.3. Ensaio de viabilidade celular por MTT (24h)
Foram plaqueadas 7x103 células/poço para a SK-Mel 147 e 11x10
3 células/poço
para a SK-Mel 19 em 200 µl de suspensão celular. Posteriormente a placa foi incubada
sob 37º C em atmosfera úmida constituída de 5% de CO2 por 24 horas. Após este
período o meio de cultura foi retirado e as células foram tratadas com 200 µl das
soluções de triptofano nas concentrações testadas (100, 150 e 200 µM) e da solução
controle (apenas o Trp já contido no meio de cultura). A placa foi novamente incubada
nas mesmas condições anteriores e ao final das 24 horas o tratamento foi retirado e os
poços lavados duas vezes com 200 µl de PBS estéril a temperatura de 37ºC.
Foi feita uma solução de MTT 5mg/ml em PBS que então foi diluída 1:5 em
DMEM sem SFB. Em seguida foi adicionado 200 µl desta solução de MTT (0,5mg/mL)
em cada poço e então a placa foi incubada por 3 horas. Após a retirada da solução de
MTT da placa, foram adicionados a todos os poços 200µl de DMSO puro. Para a leitura
a 570 nM a placa foi agitada no próprio leitor de absorbância por 10 segundos.
38
3.4. Ensaio Clonogênico
A análise da proliferação das células foi realizada por meio do ensaio
clonogênico. Ensaio de formação de colônia ou ensaio clonogênico é um teste in vitro
que pondera a capacidade de uma única célula crescer e se multiplicar formando uma
colônia (48).
Para isso, as duas linhagens de melanomas estudados foram cultivadas em placas
de seis poços em uma densidade de 300 células por poço. Após três dias de incubação
sob 37º C em atmosfera úmida constituída de 5% de CO2, meio de cultura fresco,
condicionado ou não com diferentes tratamentos, foi adicionado aos poços. Este
procedimento foi realizado a cada dois dias, totalizando de 12 a 15 dias, dependendo da
quantidade de colônias formadas para cada linhagem celular. Após esta etapa, as células
foram lavadas com PBS gelado, fixadas e coradas em solução de glutaraldeído 25% e
cristal violeta 2% por três horas. Após sucessivas lavagens com água destilada para
retirar o excesso de cristal violeta, as placas foram deixadas à temperatura ambiente
para secarem. O tamanho e a quantidade das colônias foram calculados usando o
software de imagem CARESTREAM MOLECULAR da In-Vivo MS FX-PRO
(Carestream Health Inc., Woodbridge, CT, EUA).
3.5. Teste da ferida
A migração é definida como o movimento dirigido de células em um substrato,
tal como membranas basais ou placas de plástico. O teste da ferida ou scratch test é um
ensaio in vitro utilizado para medir a capacidade migratória das células sobre uma
superfície (57).
Foram plaqueadas em placas de 24 poços, 1x105 células/poço de SK-Mel 147 e
2x105 células/poço de SK-Mel 19. As duas linhagens de melanomas foram cultivadas
39
até confluência de 90%. Nesta condição, uma ferida foi feita no centro da monocamada
celular. Meio de cultura condicionado ou não com os tratamentos, foi adicionado ao
poço e imediatamente, imagens digitais foram obtidas e denominadas “tempo zero”.
Estas foram posteriormente utilizadas para o cálculo da área migrada. As células foram
então incubadas por 24 horas (SK-Mel 147) e por 36 horas (SK-Mel 19), o parâmetro
utilizado para a finalização do experimento foi o fechamento quase total da cicatriz na
célula controle. Neste momento, novas imagens digitais foram obtidas e a área migrada
foi quantificada pelo programa Axiovision®.
3.6. Invasão celular in vitro
A invasão requer capacidade migratória das células e o que difere esses
processos é a existência de uma barreira a ser transposta. A migração é um movimento
em 2D sobre uma superfície, enquanto a invasão envolve a transposição 3D das células
por uma camada de matrigel (58). O princípio deste ensaio é baseado em duas câmaras
separadas por uma membrana porosa, através do qual as células transmigram. Este é um
ensaio endpoint, ou seja, o tempo ótimo de análise deve ser determinado
individualmente para cada tipo de célula testada (59).
Neste estudo, a invasão foi realizada por testes em transwell ou câmaras de
Boyden. Para isso, as câmaras (8 μm, BD®) foram colocadas em placas de 24 poços.
Matrigel (BD®) foi diluído 1:10 em DMEM sem soro e adicionado sobre a membrana
da câmara. As células foram plaqueadas (1x105 células/mL) no compartimento interno
da câmara em uma suspensão de 200 μL de DMEM com SFB 3% na presença ou
ausência de tratamento. 400 μL de DMEM com SFB 3% foram adicionados no
compartimento externo à câmara de Boyden. O tempo de incubação foi de 48 horas para
as duas linhagens de melanomas. As células que invadiram através do matrigel foram
40
fixadas com glutaraldeído 5%, lavadas 3x com água destilada e então coradas com
solução de azul de toluidina 2%. Após nova lavagem com água destilada para retirada
do excesso de corante, o compartimento interno da câmara foi limpo com hastes de
algodão. Dez imagens de campos distintos foram capturas para cada poço da placa, e a
partir destas imagens as células que invadiram foram quantificadas.
3.7. Co-cultura
A co-cultura celular é uma metodologia onde dois ou mais tipos de células
diferentes são cultivados simultaneamente e no mesmo espaço. Neste trabalho, para
representar as células do sistema imune, utilizamos células mononucleares do sangue
periférico (PBMC), compostas principalmente por linfócitos e monócitos. Estas células
são cultivadas juntamente com células de melanoma, na presença ou não de inibidores.
Foram realizados dois desenhos experimentais distintos para as co-culturas, em
um primeiro momento visamos o contato das células por meio da utilização de placas de
96 poços em formato de U, porém este desenho não favorecia as quantificações no
sobrenadante dessas co-culturas. Desta forma, um novo desenho foi feito, onde
utilizamos placas de 12 poços, as quais não beneficiam o contato entre os dois tipos
celulares, mas possibilita a realização do experimento com uma quantidade maior de
meio de cultura, e assim foi possível usar o sobrenadante para ensaios de quantificação
de citocinas e metabólitos do Trp.
3.7.1. Co-cultura em placas de 96 poços em formato de U
Foram plaqueadas 5x103 células de SK-Mel 19 por poço e 2x10
3 células de SK-
Mel 147 em 200 µL de DMEM 10% SFB em placas de 96 poços em formato de U.
Após as 24 horas de incubação, sangue periférico de pessoas saudáveis foi coletado em
heparina e as células mononucleares do sangue periférico (PBMC) foram isoladas dos
41
outros componentes do sangue por gradiente de densidade com Histopaque®-1077.
Essas células de PBMC foram contabilizadas e colocadas em cultura na presença do
tratamento requerido e 200 µL de meio de cultura RPMI 3% SFB, juntamente com as
células tumorais plaqueadas no dia anterior. Após 72 horas de incubação, as células
tumorais foram quantificadas em câmara de Neubauer na presença de solução de
TRIPAN®.
3.7.2. Co-cultura em placas de 12 poços
Foram plaqueadas 1x105 células de SK-Mel 19 por poço e 3x10
4 células de SK-
Mel 147 em 1000 µL de DMEM 10% SFB em placas de 12 poços. Após as 24 horas de
incubação, as PBMC’s foram isoladas e quantificadas como citados no item anterior e
posteriormente elas foram colocadas em cultura juntamente com as células tumorais.
Após 48 horas de incubação, o sobrenadante foi recolhido para quantificação de
citocinas e metabólitos do Trp.
3.7.3. Produção de IFN-γ
A produção de IFN-γ pelas células em co-cultura foi avaliada pela técnica de
ELISA (Enzyme-Linked Immunsorbent Assay) a partir do kit Human Interferon-γ
ELISA kit (Life Technologies). Para a análise utilizamos 100 µL do sobrenadante das
co-culturas e as amostras não foram diluídas.
3.7.4. Produção de IL-10, IL-6, IL-1 β, IL-8, IL-12 e TNF-α
A produção dessas citocinas foi analisada simultaneamente por citometria de
fluxo (FACS Calibur; Becton-Dickinson) pela técnica de Cytometric Bead Array (CBA)
da BD™. Para a análise utilizamos 25 µL do sobrenadante das co-culturas.
42
3.7.5. Quantificação dos metabólitos do Trp
A quantificação dos metabólitos do triptofano foi realizada por cromatografia
líquida acoplada à espectrometria de massas do tipo triplo quadrupolo LC-MS/MS
(QqQ). O equipamento utilizado é composto por Bombas LC 1250 Bin Pump VL, auto-
injetora 1260 HiP ALS acoplados ao espectrômetro de massas 6460 (todos da Agilent
Technologies), a partir de uma colaboração com o Prof. Dr. Ernani Pinto, professor do
Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas da Faculdade de Ciências
Farmacêuticas da USP. As análises foram realizadas a partir do software MassHunter e
os dados serão coletados a partir do modo MRM (Multiple Reaction Monitoring).
Para o preparo das amostras, o sobrenadante das co-culturas (500 µL) foi
adicionado a um microtubo de 2 mL contendo 1,5 mL de metanol gelado. Após adição
das amostras, 10 µL de um mix de padrões internos (MLT-D7 417,9 nM, TME 5 µL e
HIAA-D2 5 µL) para os analitos estudos, foi adicionado ao microtubo. Posteriormente,
homogeneizamos em vortex por 1 min e então armazenamos essas soluções por 1 hora a
-20ºC para precipitação das proteínas do meio de cultura. Após a 1 hora de incubação,
os microtubos foram submetidos a centrifugação a 14.000 x g por 10 min a 4 ºC. O
sobrenadante dos microtubos foi filtrado em coluna, em placa Phree Phospolipid
Removal (Phenomenex, EUA) para remoção de proteínas e fosfolipídios da amostra. Em
seguida, as amostras foram transferidas para tubos de vidro e secas sob atmosfera de gás
nitrogênio. Ao final da secagem, as amostras foram reconstituídas em 100 µL de uma
mistura de água:metanol (9:1) contendo 0,1 % de ácido fórmico e filtradas em tubos do
tipo Spin-X® ( Costar ®- em membrana de nylon, 0,22 µm) para então serem
analisadas por cromatografia líquida.
43
3.8. Análise do Ciclo Celular
As células foram plaqueadas (1x105 células de SK-Mel 19 por poço e 5x10
4
células de SK-Mel 147 por poço) em 2 mL de RPMI 3% SFB em placas de 6 wells.
Após 24 horas de incubação em estufa sob 37º C e atmosfera úmida constituída de 5%
de CO2, foi adicionado meio de cultura acrescido dos tratamentos. Após 72 de
incubação, o sobrenadante de cada poço foi recolhido e centrifugado. Após a
tripsinização, as células foram recolhidas nos mesmos tubos com o pellet da
centrifugação anterior e centrifugadas novamente. Então as células foram lavadas com
PBS e ressuspendidas em solução contendo 2 mg/mL de Iodeto de Propídio, 0,1% de
citrato de sódio e 0,1 % de Triton X-100. As células foram incubadas sob abrigo de luz
por 30 minutos e posteriormente a proporção de células em cada fase do ciclo celular foi
determinada citometria de fluxo (FACS Calibur; Becton-Dickinson) e os dados
analisados pelo software FlowJo.
3.9. Análise estatística
Os experimentos foram realizados em um n de no mínimo três valores
independentes. A análise estatística foi realizada por Test t de Student quando o
desejado era a comparação do controle com um único tratamento; e por ONE Way
ANOVA seguido do pós teste de Tukey quando desejamos comparar todos os
tratamentos entre si e também com controle. Foram considerados significativos os
valores de ρ < 0,05.
44
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Visando o maior entendimento dos resultados obtidos durante a realização deste
projeto, a presente seção será divida em dois capítulos. No capítulo 1 serão apresentados
os resultados referentes à quantificação de triptofano nos lotes de 1-MT e aos efeitos
diretos dos inibidores de IDO e TDO sobre a célula tumoral. No capítulo 2 serão
apresentados os resultados obtidos com o ensaio de co-cultura, englobando os efeitos
sobre a resposta imunológica, mediados ou não pela enzima IDO.
45
CAPÍTULO 1: Efeitos diretos dos inibidores de IDO e TDO
sobre a célula tumoral.
46
Em 2012 foi publicado um artigo mostrando a existência de contaminação com
Trp em amostras de 1-MT (60). Sabendo-se disso, todos os estudos realizados com este
inibidor da indolamina-2,3-dioxigenase até esta data perderam a confiabilidade, uma
vez que a presença de altas concentrações de Trp nestes compostos e a variação destas
concentrações de enantiômero para enantiômero e também entre diferentes lotes, pode
causar resultados falsos.
Desta forma, para utilização dos dois enantiômeros e da mistura racêmica de 1-
MT e para a comparação entre eles neste trabalho, viu-se a necessidade de dosar e
posteriormente nivelar a concentração de Trp em todos os lotes de 1-MT utilizados.
Para isto, o primeiro resultado apresentado nesta seção foi realizado em colaboração
com o Prof. Dr. Ernani Pinto e sua aluna de doutorado Ariane Rivellis Júlio e mostra a
concentração de Trp em todos os lotes de 1-MT existentes no laboratório.
Como previsto, os sete lotes de 1-MT analisados apresentaram alguma
quantidade de Trp, sendo que a porcentagem do aminoácido variou de 1,93 a 8,4 (Fig.
8. A). A purificação do contaminante é bastante trabalhosa e demorada. Assim, nossa
estratégia foi normalizar a quantidade de Trp através da sua adição, estipulando uma
concentração fixa do aminoácido. Em todos os experimentos nos quais 1-MT foi
adicionado tomamos o cuidado de adicionar quantidades de Trp para que as soluções
apresentassem a mesma concentração final (150 µM). Após essas dosagens de Trp
contaminante trabalhamos com um mesmo lote de cada composto para todos os
experimentos. Esse mesmo cuidado foi tomado quando 1-MT foi adicionado a culturas
de células, e observamos que houve aumento nas concentrações de Trp, o que pode ser
explicado por esta contaminação. Vemos na figura 8.B. que as variações da
concentração final de Trp se mantiveram similares para 1-DL-MT, 1-D-MT e 1-L-MT.
Para ilustrar essa condição mostramos abaixo a concentração de Trp com os
47
enantiômeros e a mistura racêmica nas células mononucleares do sangue periférico
(PBMC’s) e na linhagem de melanoma SK-Mel 19.
(A)
0
10
20
30
40
50
SK-Mel 19 PBMC
1-DL-MT 1-D-MT 1-L-MTControle 1-DL-MT 1-D-MT 1-L-MTControle
***
*
Trp
[
M]
(B)
Figura 8: (A) Contaminação de triptofano existente em todos os lotes de 1-DL-MT, 1-
D-MT e 1-L-MT. (B) Concentração final de triptofano em culturas celulares (SK-Mel 19
e PBMC) nas quais foram adicionados 1-DL-MT, 1-D-MT e 1-L-MT. As barras
representam a média ± desvio padrão de uma duplicata. O teste estatístico utilizado foi
ONE Way ANOVA seguido de Tukey. *ρ<0,05 e ***ρ<0,001.
Como o meio de cultura utilizado (DMEM) possui aproximadamente 50 μM de
triptofano e a adição de 1mM de 1-MT elevaria esta concentração em até 100 μM, nós
normalizamos a concentração de Trp para 150 μM em todos os ensaios (Fig. 9).
0
2
4
6
8
10
1-DL-MT
1 4 5 6 2 3 7
1-L-MT 1-D-MT
Lote
MKBJ4016V (1)
MKBD5067V (2)
MKBG9576V (3)
03111CJ (4)
03111CJ (5)
MKBC7435V (6)
MKBF1251V (7)
% T
rip
tofa
no
48
Figura 9: Triptofano existente em cada lote de 1-DL-MT, 1-D-MT e 1-L-MT acrescida
do triptofano contido no meio de cultura (DMEM).
Considerando que estávamos elevando significativamente a concentração de Trp
no meio de cultura, foi necessária a pesquisa da viabilidade celular. Com esta finalidade
fizemos ensaios de MTT e da capacidade clonogênica com as duas linhagens de células
utilizadas como modelo neste trabalho. Trp na concentração de 150 μM, ou até superior
(200 μM e 250 μM) não causou nenhuma alteração na viabilidade e clonogenicidade
destas células. O ensaio de MTT é realizado em tempos curtos (24 h) enquanto que o
ensaio clonogênico permite avaliar efeitos tóxicos ou proliferativos a longo prazo (15
dias) (Fig. 10).
0
50
100
150TRP no meio
TRP no 1-MT
1 4 5 6 2 3 7
1-DL-MT 1-D-MT1-L-MT
Trp
[
M]
49
(A) (B)
(C)
Figura 10: Viabilidade celular na presença de diferentes concentrações de triptofano
segundo o método de MTT para as linhagens (A) SK-Mel 19 e (B) SK-Mel 147. (C)
Imagens digitalizadas representativos do ensaio clonogênico em diferentes
concentrações de triptofano com as linhagens SK-Mel 147 e SK-Mel 19. As barras
representam a média ± desvio padrão de dois experimentos independentes realizados em
duplicatas.
Nenhuma das concentrações de Trp testadas alterou a viabilidade dessas
linhagens de melanomas, garantindo assim a segurança de trabalharmos nessas
condições. Nos ensaios de proliferação, migração e invasão destas células utilizamos 1
mM de 1-MT, lembrando que em todas as vezes que foram preparadas estas soluções
para realização dos experimentos, foi adicionada quantidade de Trp suficiente para
igualar a concentração do aminoácido nos dois enantiômeros e na mistura racêmica.
SK-Mel 19
0
50
100
150
Controle 150 M 200 M 250 M
Célu
las v
iáveis
(%
)
SK-Mel 147
0
50
100
150
Controle 150 M 200 M 250 M
Célu
las v
iáveis
(%
)
50
Nos experimentos a seguir também mostramos o efeito do composto 680C91 (20 µM)
que é um inibidor da TDO, entretanto devido a baixa solubilidade e alta toxicidade não
avançamos muito com esse inibidor e no capítulo 2 nos concentramos apenas com as
isoformas de 1-MT.
Para avaliarmos os efeitos diretos de 1-MT e 680C91 sobre a célula tumoral o
primeiro ensaio realizado foi o teste clonogênico.
(A)
(B)
(C)
SK-Mel 19
0
5000
10000
15000
Controle 680C91 1-DL-MT 1-D-MT 1-L-MT
Inte
ns
ida
de
da
s c
olô
nia
s (
pix
els
)
(D)
Figura 11: (A) Imagens representativas digitalizadas por MS FX-PRO dos ensaios
clonogênicos da célula SK-Mel 19. (B) Número, (C) área e (D) intensidade da
coloração das colônias de acordo com o tratamento. As barras representam a média ±
desvio padrão de três experimentos independentes. O teste estatístico utilizado foi ONE
Way ANOVA seguido de Tukey. ** ρ<0,01 em relação do controle.
SK-Mel 19
0
50
100
150
200
**
Controle 680C91 1-DL-MT 1-D-MT 1-L-MT
Nú
mero
de c
olô
nia
s
SK-Mel 19
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
Controle 680C91 1-DL-MT 1-D-MT 1-L-MT
Áre
a d
as c
olô
nia
s (
mm
2)
51
No ensaio de proliferação realizado para a linhagem SK-Mel 19, o número de
colônias aumentou na presença de 1-D-MT durante 15 dias (Fig. 11). Por outro lado a
área e a intensidade de coloração das colônias não tiveram alteração significante na
presença de nenhum dos tratamentos.
(A)
(B)
(C)
SK-Mel 147
0
5000
10000
15000
Controle 680C91 1-DL-MT 1-D-MT 1-L-MT
Inte
ns
ida
de
da
s c
olô
nia
s (
pix
els
)
(D)
Figura 12: (A) Imagens representativas digitalizadas por MS FX-PRO dos ensaios
clonogênicos da célula SK-Mel 147. (B) Número, (C) área e (D) intensidade da
coloração das colônias de acordo com o tratamento. As barras representam a média ±
desvio padrão de três experimentos independente. O teste estatístico utilizado foi ONE
Way ANOVA seguido de Tukey. * ρ<0,05, ** ρ<0,01, *** ρ<0,001, todos em relação
ao controle.
SK-Mel 147
0
20
40
60
80
Controle 680C91 1-DL-MT 1-D-MT 1-L-MT
Nú
mero
de c
olô
nia
s
SK-Mel 147
0
1
2
3
***
***
*
**
Controle 680C91 1-DL-MT 1-D-MT 1-L-MT
Áre
a d
as c
olô
nia
s (
mm
2)
52
Os enantiômeros e a mistura racêmica do 1-MT, assim como o composto
680C91 diminuíram a área das colônias de células SK-Mel 147 segundo o ensaio
clonogênico de 12 dias (Fig. 12). O maior efeito de 680C91 desta linhagem de
melanoma pode ser resultado da sua toxicidade. Não foi observada diferença
significativa entre as formas de 1-MT neste experimento.
De uma forma geral, observamos que os compostos 680C91 e 1-MT podem
afetar a clonogênicidade dependendo da linhagem de células. A SK-Mel 19 foi bem
menos responsiva que a SK-Mel 147 e apresentou aumento do número de colônias na
presença de 1-D-MT. Para a SK-Mel 147 predominou uma resposta inibitória.
O ensaio clonogênico é uma ferramenta clássica muito utilizada para avaliação
do efeito de diferentes compostos sobre a capacidade proliferativa de células tumorais.
Este ensaio monitora uma das muitas etapas envolvidas e necessárias à expansão
tumoral. Ao observarmos os resultados referentes ao efeito de 1-D-MT sobre a SK-Mel
19 vemos um efeito “pró-tumoral” em uma das etapas da progressão tumoral. Apesar de
isoladamente o ensaio clonogênico não poder confirmar a ação de uma substância, o
resultado encontrado merece atenção e pode servir como um alerta à utilização de 1-D-
MT. Para avaliar a eficiência da utilização de 1-MT talvez fosse válida uma análise
individualizada da resposta das células de cada paciente antes da sua utilização clínica.
O efeito de 680C91 e 1-MT também foi avaliado sobre a capacidade migratória
das linhagens de melanoma e analisada por meio do teste de cicatriz, também conhecido
por scratch teste, nas mesmas concentrações em que realizamos o ensaio clonogênico.
O tempo de incubação das células dependeu do tempo de dobramento de cada linhagem.
O ensaio com a linhagem SK-Mel 19 foi incubado por 36 horas e não foi observada
nenhuma alteração na migração com 1-MT e 680C91 (Fig. 13).
53
(A)
(B)
Figura 13: (A) Imagem representativa digitalizada da migração da linhagem SK-Mel
19 na presença de 680C91 e 1-MT. (B) Porcentagem de migração das células das
linhagens SK-Mel 19 de acordo com os tratamentos utilizados. As barras representam a
média ± desvio padrão de três experimentos independentes realizados em duplicata.
A linhagem SK-Mel 147 foi incubada por 24 horas, e assim como na linhagem
SK-Mel 19, se manteve sem alterações na porcentagem de migração quanto tratadas
com estes compostos (Fig. 14).
SK-Mel 19
0
40
80
120
*
Controle 680C91 1-DL-MT 1-D-MT 1-L-MT
% m
igra
ção
54
(A)
(B)
Figura 14: (A) Imagem representativa digitalizada da migração da linhagem SK-Mel
147. (B) Porcentagem de migração das células das linhagens SK-Mel 147 de acordo
com os tratamentos utilizados. As barras representam a média ± desvio padrão de três
experimentos independentes realizados em duplicata.
Assim como o clonogênico, o scratch teste é um ensaio clássico que
isoladamente não estabelece uma atividade pró ou antitumoral para substância em
análise, mas compõe os testes que a indicam. Alterações na migração celular não
parecem ser o alvo de 680C91 e 1-MT pelo menos para as duas linhagens analisadas.
A seguir, na análise da invasão celular in vitro utilizamos câmaras de Boyden.
Todas as formas de 1-MT, mas não 680C91, diminuíram a invasão das células da
SK-Mel 147
0
50
100
150
***
Controle 680C91 1-DL-MT 1-D-MT 1-L-MT
% m
igra
ção
55
linhagem SK-Mel 19. Em contraste, a linhagem SK-Mel 147 não exibiu alteração com
nenhum dos tratamentos.
(A)
(B) (C)
Figura 15: (A) Imagens de campos representativos das duas linhagens estudadas após
invasão in vitro na presença de 1-MT e 680C91. Porcentagem de invasão das células
das linhagens (B) SK-Mel 19 e (C) SK-Mel 147. As barras representam a média ±
desvio padrão de três experimentos independentes realizados em duplicata. O teste
estatístico utilizado foi ONE Way ANOVA seguido de Tukey. **ρ<0,01 em relação ao
controle.
Proliferação, migração e invasão são alguns dos parâmetros utilizados
experimentalmente para monitorar o crescimento e habilidade metastática de células
tumorais. A diminuição desses três parâmetros, por meio do tratamento com
determinadas substâncias, sugerem que elas possam conter propriedades antitumorais,
podendo atuar na minimização de metástases (57, 58). Os resultados apresentados neste
SK-Mel 19
0
40
80
120
******
Controle 680C91 1-DL-MT 1-D-MT 1-L-MT
% i
nvasão
SK-Mel 147
0
40
80
120
Controle 680C91 1-DL-MT 1-D-MT 1-L-MT
% i
nvasão
56
capítulo sugerem que todos os compostos testados possuem algum efeito direto sobre
pelo menos um dos parâmetros testados em duas linhagens de melanoma, sendo claro
que esse efeito varia de acordo com a linhagem. Com exceção da clonogenicidade da
SK-Mel 19, não observamos nenhuma diferença significativa entre o efeito dos
enantiômeros dextrógiro e levógiro, e concluímos que todos eles possuem ação direta
sobre a célula tumoral que deve compor a sua atividade antineoplásica. Assim, o fator
que faz o 1-D-MT alvo de estudo em clinical trials ainda não está claro. Aparentemente,
este fator não envolve nenhum efeito direto sobre a proliferação, migração ou invasão
tumorias, como visto neste estudo. A utilização do 1-D-MT poderia estar envolvida com
sua farmacocinética, biodisponibilidade e segurança (61). Além disso, a atividade
antitumoral deste composto pode abranger sua ação sobre células do sistema
imunológico. Sabe-se que D-aminoácidos são usualmente tóxicos e que bactérias usam
estes compostos como fonte de nitrogênio (62), além de recentemente ter sido sugerido
um papel regulatório de D-aminoácidos em bactérias (63). Assim, esta isoforma do
aminoácido poderia ser uma das maneiras de sinalização necessária para que o sistema
imunológico reconheça bactérias e se ative. Tendo em vista esta hipótese, a segunda
parte do nosso trabalho visa a avaliação da atividade tumoricida de células do sistema
imunológico na presença do enantiômeros de 1-MT.
57
CAPÍTULO 2: Efeitos sobre a resposta imunológica, mediados
ou não pela enzima IDO.
58
Sabendo-se da importante função que as células do sistema imune presentes no
microambiente tumoral têm no desenvolvimento da doença, demos prosseguimento a
estudos que permitissem avaliar esta atuação. Buscando atender a esta necessidade, co-
culturas de células tumorais com células mononucleares do sangue periférico (PBMC’s)
foram realizadas. Por meio deste ensaio analisamos a resultante do contato das células
tumorais com as células do sistema imune na presença de 1-MT.
Para realização destas co-culturas, inicialmente foi necessária a padronização da
proporção entre os dois tipos celulares que possibilitaria a visualização de algum efeito,
bem como a concentração do tratamento. Neste ensaio usamos exclusivamente a mistura
racêmica de 1-MT.
(A)
SK-Mel 19
C 1:10 1:15 1:20 1:30 1:50 500 100 50
0
50
100
150
*******
***
1-DL-MT (M)Proporção (SK-Mel 19:PBMC)
*
Célu
las v
iáveis
(%
)
59
(B)
Figura 16: Porcentagem de células tumorais viáveis na presença de diferentes
proporções de célula tumoral e PBMC (1:10, 1:15, 1:20, 1:30, 1:50) e diferentes
concentrações de 1-DL-MT (50, 100 e 500 µM) para SK-Mel 19 (A) e SK-Mel 147 (B).
As barras representam a média ± desvio padrão de dois experimentos independentes
realizados em duplicatas. O teste estatístico utilizado foi Test T Student. * ρ<0,05, **
ρ<0,01, ***ρ<0,001 em relação ao controle (C), que possui apenas célula tumoral.
Com os resultados da padronização determinamos a melhor proporção entre as
células. Buscávamos uma relação em que PBMC’s sozinhas conseguissem matar as
células tumorais, porcentagem observada na condição 1:50 (Melanoma:PBMC). Desse
modo, as co-culturas seguintes foram realizadas com 50 células do sangue para cada
célula tumoral.
Além disso, com esta padronização foi estabelecido que a concentração ideal
para realizarmos as co-culturas seria 50 µM de 1-MT, sendo que este valor é válido para
as três formas estudadas do composto. Esta concentração foi escolhida, pois,
procurávamos um valor onde as células tumorais, na ausência das PBMC, não
morressem, já que a finalidade do ensaio de co-cultura é analisar a capacidade
tumoricida de PBMC’s frente ao tratamento.
SK-Mel 147
C 1:10 1:15 1:20 1:30 1:50 500 100 500
50
100
150
**
***
**
1-DL-MT (M)Proporção (SK-Mel 147:PBMC)
Célu
las v
iáveis
(%
)
60
Para confirmarmos a viabilidade das células tumorais nesta concentração,
fizemos uma análise do ciclo celular das duas linhagens de melanomas. Incubamos estas
células pelo mesmo tempo no qual as células iriam ficar em co-cultura (72 h), porém
não adicionamos as PBMC’s (Fig. 17).
(A)
(B)
Figura 17: Análise do ciclo celular da SK-Mel 19 (A) e SK-Mel 147 (B), na presença
de 50 µM de 1-DL-MT, 1-D-MT e 1-L-MT em meio RPMI 3% SFB por 72 horas. As
barras representam a média ± desvio padrão de dois experimentos independentes
realizados em duplicatas.
Não houve alteração em nenhuma das fases do ciclo celular para estas linhagens
nas condições estudadas, portanto, vimo-nos aptos a prosseguir com os experimentos. A
61
padronização das co-culturas e o primeiro ensaio de viabilidade apresentado aqui
(contagem de células com Azul de Tripan) foram realizados em placas de 96 poços de
fundo em U, pois estas favorecem o contato entre as células. Porém, a quantidade de
meio de cultura utilizada nessas placas não é suficiente para a quantificação de
metabólitos do Trp e de citocinas inflamatórias. Desta forma, os resultados referentes a
análise do sobrenadante das co-culturas, foram originários de co-culturas em placas de
12 poços de fundo chato.
No primeiro ensaio, foram analisadas quatro grupos de condições, sendo elas:
(1) controle, onde só haviam células tumorais; (2) célula tumoral mais 1-MT (1-DL-MT,
1-D-MT, 1-L-MT); (3) célula tumoral mais PBMC; (4) célula tumoral mais PBMC e 1-
MT (1-DL-MT, 1-D-MT, 1-L-MT) (Fig. 18).
(1) (2)
(3) (4)
Figura 18: Esquema dos grupos de condições com as quais trabalhamos nas co-culturas
realizadas em placas de 96 poços. (1) Tumor, (2) Tumor + 1-MT, (3) Tumor + PBMC,
(4) Tumor + PBMC + 1-MT.
62
As condições 1 e 2 (Fig.19. A; Fig.19. B) são controles que asseguram a
viabilidade das células nessas concentrações, confirmando a padronização em cada
experimento realizado. As condições 3 e 4 são as co-culturas propriamente ditas, sendo
que a condição 3 é o controle e a 4 são co-culturas na presença das 3 isoformas de 1-
MT (Fig.19. C; Fig.19. D).
(A) (B)
(C) (D)
Figura 19: Células viáveis (contagem com Azul de Tripan) após incubação de 72 horas
na ausência (A e B) ou presença (C e D) de PBMC em placa de 96 poços com fundo em
U. Os tratamentos (1-DL-MT, 1-D-MT, 1-L-MT) foram utilizados à 50 µM. As barras
representam a média ± desvio padrão de dois experimentos independentes realizados em
duplicatas. O teste estatístico utilizado foi ONE Way ANOVA seguido de Tukey. #
ρ<0,05 e ### ρ<0,001 em relação à células tumorais; ** ρ<0,01 e * ρ<0,05 em relação à
co-cultura sem 1-MT.
0
2
4
6SK-Mel 19
SK-Mel 19
1-DL-MT
1-D-MT
1-L-MT
+ + + +
- + - -
- + -
- - +
-
-
Nú
mero
de c
élu
las (
x10
4)
0
1
2
3
4SK-Mel 147
SK-Mel 147
1-DL-MT
1-D-MT
1-L-MT
+ + + +
- + - -
- + -
- - +
-
-
Nú
mero
de c
élu
las (
x10
4)
0
1
2
3
4
5
PBMC
SK-Mel 19
###
***
*
SK-Mel 19
1-DL-MT
1-D-MT
1-L-MT
+ + + +
- + - -
- + -
- - +
-
-
-
-
-
+
+ + ++-
Nú
mero
de c
élu
las (
x10
4)
0
1
2
3
4SK-Mel 147
#
*
PBMC
SK-Mel 147
1-DL-MT
1-D-MT
1-L-MT
+ + + +
- + - -
- + -
- - +
-
-
-
-
-
+
+ + ++-
Nú
mero
de c
élu
las (
x10
4)
63
Para a co-cultura da linhagem SK-Mel 19, a adição de PBMC matou de cerca de
40% das células tumorais, e todas as isoformas de 1-MT acentuaram esta morte (Fig.19.
C). Na linhagem SK-Mel 147, as células do sistema imunológico mataram em média
30% dos melanomas, sendo que apenas a mistura racêmica do 1-MT foi capaz de
intensificar esta morte. Para as duas linhagens foi observado um efeito mais acentuado
na presença de 1-DL-MT, e este efeito pode ser resultado de uma ação conjunta de 1-D-
MT e 1-L-MT. O 1-L-MT como inibidor da enzima e o1-D-MT como sinal de alerta ao
sistema imune (62, 63).
Este resultado é importante na análise das co-culturas, pois ele representa melhor
o contato célula-a-célula no microambiente tumoral, por isso consideramos relevante
realizar esta análise. Por outro lado, como explicado anteriormente, devido a
inviabilidade de análise do sobrenadante nestas condições, a partir daqui apresentamos
os resultados das co-culturas em placas de 12 poços de fundo chato.
Nesse novo desenho, utilizamos apenas a SK-Mel 19, por ter sido esta linhagem
a mais responsiva nas placas de 96 poços. A incubação foi de 48 horas, devido ao maior
número de células utilizadas nestas placas. Além disso, aqui, consideramos quatro
grupos de condições: PBMC (Fig. 20. A), SK-Mel 19 (Fig. 20. B), SK-Mel 19 + IFN-γ
(Fig. 20. C), SK-Mel 19 + PBMC (Fig. 20. D), sendo que foram feitos controles para
todos os grupos de condições.
64
(A) (B)
(C) (D)
Figura 20: Esquema dos grupos de condições com as quais trabalhamos nas co-culturas
realizadas em placas de 12 poços. (A) PBMC, (B) SK-Mel 19, (C) SK-Mel 19 + IFN-γ,
(D) SK-Mel 19 + PBMC, todos nas condições controle e presença dos três isômeros de
1-MT.
Para analisar a produção das citocinas inflamatórias, não consideramos a
condição SK-Mel 19 + IFN-γ. O interferon-gama (IFN-γ) foi produzido
constitutivamente pelas células tumorais e também em co-cultura, e a adição de das três
formas de 1-MT fez com ela caísse significativamente nas duas condições (Fig. 21.A.).
O fator de necrose tumoral (TNF-α) foi produzido apenas na co-cultura, sendo que nesta
condição 1-MT consegue diminuir os níveis da citocina (Fig. 21.B.). A Interleucina-8
(IL-8) apresentou concentrações detectáveis tanto para as PBMC’s em monocultura
quanto para a co-cultura. Estas concentrações foram maiores para as PBMC’s, e em co-
cultura 1-MT foi capaz de diminui-las. Porém para as células imunes isoladamente a
produção desta citocina foi aumenta tanto na presença de 1-DL-MT quanto de 1-D-MT
(Fig. 21.C.). A Interleucina-12 (IL-12) não manteve um padrão de concentração nestas
condições (Fig. 21.D.). Interleucina-1 beta (IL-1 β) teve uma produção baixa pelas
células imunológicas isoladas, porém em co-cultura a concentração desta citocina
65
aumentou e nenhuma das formas de 1-MT alterou-a (Fig. 21.E.). A Interleucina-6 (IL-
6) foi produzida pelas PBMC’s isoladamente e quando adicionamos 1-DL-MT e 1-D-MT
a concentração da citocina diminuiu. Em co-cultura, a produção de IL-6 foi maior,
porém não houve alteração na presença de nenhuma das formas de 1-MT (Fig. 21.F.). A
Interleucina-10 (IL-10) apresentou uma baixa produção nas condições de monocultura
(SK-Mel 19 e PBMC), porém em co-cultura sua concentração foi maior, sendo que na
presença de 1-MT esta produção se elevou ainda mais (Fig. 21.G.).
(A)
(B)
0.00
0.050.1
1.1
2.1
3.1
SK-Mel 19
PBMC
1-DL-MT
1-D-MT
1-L-MT
** ***
**
*****
****
+ +-
-
---
---
---
+
+--
-+-
--+
+ + ++
- --
+
+--
-+-
--+
+ +
+++
+--
-+-
--+
---
+ + +
IL-8
(p
g/m
L)
(C) (D)
0
100
200
300
400
SK-Mel 19
PBMC
1-DL-MT
1-D-MT
1-L-MT
+ +-
-
---
---
---
+
+--
-+-
--+
+ + ++
- --
+
+--
-+-
--+
+ +
+++
+--
-+-
--+
---
+ + +
*** *** ***
IFN
- (
pg
/mL
)
0
2000
4000
6000
8000
SK-Mel 19
PBMC
1-DL-MT
1-D-MT
1-L-MT
**
**
+ +-
-
---
---
---
+
+--
-+-
--+
+ + ++
- --
+
+--
-+-
--+
+ +
+++
+--
-+-
--+
---
+ + +
TN
F-
(p
g/m
L)
0
2
4
6
8
10
SK-Mel 19
PBMC
1-DL-MT
1-D-MT
1-L-MT
+ +-
-
---
---
---
+
+--
-+-
--+
+ + ++
- --
+
+--
-+-
--+
+ +
+++
+--
-+-
--+
---
+ + +
IL-1
2 (
pg
/mL
)
66
0
500
100010000
15000
20000
SK-Mel 19
PBMC
1-DL-MT
1-D-MT
1-L-MT
*
+ +-
-
---
---
---
+
+--
-+-
--+
+ + ++
- --
+
+--
-+-
--+
+ +
+++
+--
-+-
--+
---
+ + +
IL-1
(pg
/mL
)
(E)
0
2001000
15000
29000
SK-Mel 19
PBMC
1-DL-MT
1-D-MT
1-L-MT
**
+ +-
-
---
---
---
+
+--
-+-
--+
+ + ++
- --
+
+--
-+-
--+
+ +
+++
+--
-+-
--+
---
+ + +
IL-6
(p
g/m
L)
(F)
0
100
2004000
6000
8000
SK-Mel 19
PBMC
1-DL-MT
1-D-MT
1-L-MT
****
*
+ +-
-
---
---
---
+
+--
-+-
--+
+ + ++
- --
+
+--
-+-
--+
+ +
+++
+--
-+-
--+
---
+ + +
**
IL-1
0 (
pg
/mL
)
(G)
Figura 21: Quantificação de citocinas pro-inflamatórias, IFN- γ (A), TNF-α (B), IL-6
(C), IL-1 β (D), IL-12 (E), IL-8 (F) e da citocina anti-inflamatória, IL-10 (G) no
sobrenadante da co-cultura, da célula tumoral e do PBMC isoladamente na presença de
1-MT. As barras representam a média ± desvio padrão de uma triplicata. O teste
estatístico utilizado foi ONE Way ANOVA seguido de Tukey. * ρ<0,05, ** ρ<0,01 e
***ρ<0,001 em relação ao controle de cada condição.
Nossa discussão será restrita aos resultados de IFN-γ, TNF-α e IL-10, uma vez
que para estas citocinas tivemos efeitos mais consistentes da adição de 1-MT, além de
estas serem citocinas muito importantes no processo tumoral. Os resultados dos efeitos
de 1-MT inibindo a produção de IFN- γ e de TNF-α e estimulando IL-10 pareceram-nos
surpreendente. Do nosso conhecimento esta informação é nova e não há relato anterior
desta ação.
67
Apesar de ser conhecido que células do sistema imunológico desencadeiam seus
efeitos citotóxicos também através da produção de citocinas, principalmente pela ação
das citocinas tumoricidas IFN-γ e TNF-α (64), sabe-se que estas mesmas citocinas
levam a efeitos que podem ser pró-tumorais. Ou seja, IFN-γ e TNF-α possuem efeitos
duais (65). Além da ação de IFN-γ como indutora de IDO, que possui atividade
imunossupressora, foi descrito que TNF-α diminui a capacidade de reconhecimento das
células tumorais pelas células T (66). Posto isto, nossos resultados, mostram que 1-MT
pode alterar a concentração destas citocinas, e esta alteração deve ter impacto sobre o
crescimento tumoral. Apesar de não sabermos de forma definitiva qual será a resposta
do tumor frente a estas alterações das citocinas, é possível que parte dos efeitos
antitumorais da 1-MT seja consequência de sua ação sobre elas.
IL-10 é caracterizada como uma citocina anti-inflamatória que inibe a resposta
imune (67). Porém existem relatos conflitantes a respeito desta citocina. Um trabalho
publicado em 2004 mostra que IL-10 aumenta a expressão de genes relacionados à
citotoxicidade e a ativação de células NK (68). Outro trabalho, publicado em janeiro
deste ano, mostrou que IL-10 não afeta a capacidade funcional de células do sistema
imune, e células dendríticas maduras co-cultivadas com células de melanoma
produziram um aumento de IL-10 e induziram a proliferação de células T (69). Posto
isso, além da função imunossupressora, IL-10 pode contribuir para a resposta imune
inata. Nossos resultados mostraram um aumento de IL-10 com a adição de 1-MT em co-
cultura e é possível, como discutido no parágrafo acima para IFN-γ e TNF-α, que esta
alteração possa ter impacto sobre o crescimento tumoral.
A seguir, a quantificação dos metabólitos de Trp foi realizada nas quatro
condições esquematizadas na Figura 17. Triptofano foi consumido do meio de cultura
pelas células tumorais (ρ<0,001) e pelas PBMC’s (ρ<0,05) em monocultura, e como
68
esperado a adição de 1-MT inibiu este consumo (ρ>0,05). A co-cultura propriamente
dita (SK-Mel 19 + PBMC) mimetizou o que acontece quando adicionamos IFN-γ (SK-
Mel 19 + IFN-γ), sendo que todo o Trp foi consumido nos controles e este consumo foi
levemente inibido após adição de 1-MT. Com exceção do 1-DL-MT em co-cultura, que
foi menos eficaz na inibição do consumo do Trp (Fig. 22. A).
A produção de QUIN foi bem discreta para a célula SK-Mel 19 em monocultura,
sendo que a adição de 1-MT nesta condição não causou alterações. Nas PBMC’s, apesar
da produção deste metabólito não ter sido muito elevada, a adição de todas as isoformas
de 1-MT foi capaz de inibi-la. Assim como observado para o Trp, as co-culturas
propriamente ditas mimetizaram o que acontece com IFN- γ, sendo que 1-MT não inibiu
a produção de quinurenina em nenhuma das duas condições (Fig. 22. B).
(A)
0
10
20
30
40
50
SK-Mel 19
PBMC
1-DL-MT
1-D-MT
1-L-MT
+-
---
---
+
+--
-+-
--+
+ + ++
- --
+
+--
-+-
--+
+ +
+++
IFN- ---- ----
----
+ +++
--
--
+-
-+
- - --+
+ +++
+
-
---
+--
-+-
--+
---
+ + +
----
*** *** ***
*** *** ******
* ***
Trp
[
M]
69
(B)
Figura 22: Concentração de Trp (A) e QUIN (B) no sobrenadante da co-cultura e
também da célula tumoral isolada e na presença de IFN- γ, e do PBMC isoladamente
após incubação de 48 horas na presença de 1-MT. As barras representam a média ±
desvio padrão de uma triplicata. A linha em vermelho representa a concentração do
analito no meio de cultura. O teste estatístico utilizado foi ONE Way ANOVA seguido
de Tukey. * ρ<0,05, ** ρ<0,01 e ***ρ<0,001 em relação ao controle de cada condição.
Como podemos observar, houve consumo do triptofano do meio de cultura pelas
células tumorais isoladamente, porém este consumo não foi eficiente para ser refletido
na produção de QUIN (Fig. 22). Trp, além de produzir QUIN, é utilizado para síntese
protéica. Apesar de termos visto que SK-Mel 19 apresenta uma produção basal de IFN-
γ (400 pg/mL; Fig. 21. A.), esta concentração é muito menor do que a necessária para a
indução de IDO (70). Por outro lado PBMC produz QUIN e fica clara a inibição de IDO
pelos diferentes enantiômeros do 1-MT. De qualquer forma na co-cultura a produção de
QUIN é muito superior e os inibidores não foram capazes de modificar sua
concentração.
0.00
1.25
2.5010
20
30
40
SK-Mel 19
PBMC
1-DL-MT
1-D-MT
1-L-MT
IFN-
+-
---
---
+
+--
-+-
--+
+ + ++
- --
+
+--
-+-
--+
+ +
+++
---- ----
----
+ +++
--
--
+-
-+
- - --+
+ +++
+
-
---
+--
-+-
--+
---
+ + +
----
***
*****
**
QU
IN [
M]
70
A seguir serão apresentados os resultados dos efeitos de 1-MT sobre os
metabólitos que dão sequencia a via das quinureninas em co-culturas. Os analitos
passíveis de serem quantificados foram ácido antranílico (AA), ácido quinurênico (KA),
ácido xanturênico (XA), ácido quinolínico (QA), ácido nicotínico (NA). Os compostos:
nicotinamida (NAM), 3-hidróxi-antranílico (HAA), ácido picolínico (PA), 2-amino-3-
carboximuconato semialdeído (ACS) e 3–hidróxi–quinurenina (HK) não estavam
presentes em quantidades mensuráveis.
SK-Mel 19 isolada não produz ácido antranílico (AA), tanto na condição
controle, quanto na presença de 1-MT. AA foi produzido pelo PBMC, mas após adição
de 1-MT essa produção foi inibida. SK-Mel 19 na presença de IFN-γ mostra uma
produção similar a do PBMC, que é aumentada apenas por 1-D-MT, e inibida pela
mistura racêmica e por 1-L-MT. Em co-cultura, vimos uma produção irregular de AA,
sendo que esta não sofreu alteração na presença de 1-MT. Para este metabólito, todas as
condições seguiram o padrão de sequência da rota esperado (Fig. 23. A).
SK-Mel 19 não modificou significativamente a concentração de ácido
quinurênico (KA) do meio de cultura em nenhuma das condições (ρ>0,05), porém
quando comparado ao controle, esta concentração é levemente menor na presença de 1-
D-MT e 1-L-MT. PBMC também manteve a concentração de KA do meio de cultura.
Após adição de IFN-γ, SK-Mel 19 aumentou sua produção deste metabólito, sendo que
esta foi mais significativa na presença de 1-DL-MT. Em co-cultura, foi observada o
aumento da produção de KA quando comparado a todas as outras condições controle
(ρ<0,01). Esta concentração se manteve na presença de todas isoformas de 1-MT (Fig.
23. B).
71
Ácido xanturênico (XA) foi consumido pela célula tumoral isolada, porém 1-MT
inibiu este consumo (ρ<0,05). PBMC, tanto na presença de 1-MT quanto no controle
manteve as concentrações de XA do meio de cultura. Na presença apenas de IFN-γ, SK-
Mel 19 foi capaz de esgotar o XA do meio de cultura, porém 1-MT inibiu discretamente
este consumo. Em co-cultura, 1-MT não teve efeito sobre o consumo deste metabólito e
suas concentrações se mantiveram semelhantes aos da condição SK-Mel 19 + IFN-γ na
presença de 1-MT (Fig. 23. C).
SK-Mel 19 em monocultura e também na presença de IFN-γ mantiveram a
concentração de ácido quinolínico (QA) do meio de cultura, 1-MT não alterou estas
condições. PBMC em monocultura e a co-cultura produziram QA em todas as
condições (ρ>0,05) e 1-MT não modificou esta produção (Fig. 23. D).
Ácido nicotínico (NA) foi produzido pela SK-Mel 19 apenas na presença de 1-
DL-MT (ρ<0,001). O PBMC no controle e com 1-MT consumiu este metabólito em
igual proporção. Na presença de IFN-γ, controle e células tratadas com 1-MT
mantiveram suas concentrações próximas à concentração do meio de cultura, sendo que
1-MT induziu o consumo quando comparado ao controle. Em co-cultura, todas as
condições geraram consumo de NA (ρ<0,05) (Fig. 23. E).
72
(A)
(B)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
SK-Mel 19
PBMC
1-DL-MT
1-D-MT
1-L-MT
IFN-
+-
---
---
+
+--
-+-
--+
+ + ++
- --
+
+--
-+-
--+
+ +
+++
---- ----
----
+ +++
--
--
+-
-+
- - --+
+ +++
+
-
---
+--
-+-
--+
---
+ + +
----
***
*** *** *** *** ***
AA
[
M]
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
SK-Mel 19
PBMC
1-DL-MT
1-D-MT
1-L-MT
IFN-
+-
---
---
+
+--
-+-
--+
+ + ++
- --
+
+--
-+-
--+
+ +
+++
---- ----
----
+ +++
--
--
+-
-+
- - --+
+ +++
+
-
---
+--
-+-
--+
---
+ + +
----
*
* *
KA
[
M]
73
(C)
(D)
0.0
0.1
0.2
0.3
SK-Mel 19
PBMC
1-DL-MT
1-D-MT
1-L-MT
IFN-
+-
---
---
+
+--
-+-
--+
+ + ++
- --
+
+--
-+-
--+
+ +
+++
---- ----
----
+ +++
--
--
+-
-+
- - --+
+ +++
+
-
---
+--
-+-
--+
---
+ + +
----
*** *** ***
*** ******
XA
[
M]
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
SK-Mel 19
PBMC
1-DL-MT
1-D-MT
1-L-MT
IFN-
+-
---
---
+
+--
-+-
--+
+ + ++
- --
+
+--
-+-
--+
+ +
+++
---- ----
----
+ +++
--
--
+-
-+
- - --+
+ +++
+
-
---
+--
-+-
--+
---
+ + +
----
QA
[
M]
74
(E)
Figura 23: Concentração dos metabólitos da via QUIN (AA (A), KA (B), XA (C), QA
(D), NA (E)) no sobrenadante da co-cultura, da célula tumoral isolada e na presença de
IFN- γ, e do PBMC isoladamente após incubação de 48 horas na presença de 1-MT. As
barras representam a média ± desvio padrão de uma triplicata. A linha em vermelho
representa a concentração da analito no meio de cultura. * ρ<0,05, ** ρ<0,01,
***ρ<0,001.
Alguns analitos mesmo mensuráveis estão em concentrações próximas ao limite
de detecção e quantificação, como é o caso do KA. Segundo o método de quantificação
validado pela aluna de Doutorado Ariane Rivellis Júlio, o KA possui limite de detecção
igual a 0,005 µM valor muito próximo à concentração encontrada nas condições onde
SK-Mel 19 e PBMC estão isoladas. Outros metabólitos que possuem limites de
detecção próximos as concentrações encontradas nestes resultados são 5-HT (0,002 µM)
e IAA (0,02 µM). Apesar destes valores baixos, os metabólitos em questão seguem um
padrão em relação a concentração de QUIN.
Como AA não foi produzido pela célula tumoral isolada e tendo aparecido tanto
na presença de IFN-γ quanto no PBMC, é tentador sugerir que a produção deste
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
SK-Mel 19
PBMC
1-DL-MT
1-D-MT
1-L-MT
IFN-
+-
---
---
+
+--
-+-
--+
+ + ++
- --
+
+--
-+-
--+
+ +
+++
---- ----
----
+ +++
--
--
+-
-+
- - --+
+ +++
+
-
---
+--
-+-
--+
---
+ + +
----
*** **
*
NA
[
M]
75
metabólito seja induzida por IFN-γ, já que foi mostrado que o contato entre célula
tumoral e célula imune induz a produção desta citocina (Fig. 19.A). Porém, vale
ressaltar que ainda não foi identificado o papel de AA no processo tumoral. Além disso,
nossos resultados mostram que 1-MT inibe a síntese de AA e que esta inibição
apresenta estereoespecificidade, uma vez que somente o 1-L-MT teve efeito (Fig 23.B).
É interessante notar que a co-cultura por si só leva a modificações alguns
metabólitos da via das quinureninas. Sendo que nesta condição tem-se um aumento no
consumo de XA e uma diminuição na produção de KA. Esse resultado parece
significativo para a imunologia de tumores, pois o XA tem ação anti-inflamatória (71) e
KA também é um metabólito imunossupressor (72).
O consumo de NA e a produção de QA pela co-cultura possivelmente deve-se a
metabolização destes compostos pelas PBMC’s, uma vez que não houveram diferenças
estatísticas entre estas condições. NA é precursor de NAD+
(5, 6), portanto as células
imunológicas podem ter usado este metabólito para produção de energia, e devido ao
número de PBMC’s ser 50 vezes maior que o número de células tumorais, não foi
possível observar este consumo para a SK-Mel 19. Já foi reportada a síntese de QA por
macrófago (73) e por células da micróglia (74). Os resultados apresentados neste
trabalho sugerem que células mononucleares, podem também sintetizar este metabólito
da via QUIN.
Quanto aos metabólitos de Trp oriundos de outras vias, nossas condições
permitiram quantificar apenas serotonina (5-HT) (via SER/MLT) e ácido indolacético
(IAA) (via das TRY). A serotonina foi consumida pelo PBMC e pela co-cultura, porém
SK-Mel 19 foi capaz de produzi-la tanto na ausência quanto na presença de IFN-γ. A
mistura racêmica e o enantiômero levógiro de 1-MT foram capazes de inibir a produção
76
de 5-HT na presença de IFN-γ (Fig 24. A). IAA foi consumido do meio de cultura em
todas as condições estudadas, sendo que este consumo levou ao esgotamento do
metabólito na SK-Mel 19 isolada e com IFN-γ. Apenas 1-L-MT modificou este
consumo quando comparado ao controle na condição PBMC em monocultura (Fig. 24.
B).
(A)
(B)
Figura 24: Concentração dos metabólitos da via Ser/MLT (5-HT (A)) e via Try (IAA
(B)) no sobrenadante da co-cultura, da célula tumoral isolada e na presença de IFN- γ, e
do PBMC isoladamente após incubação de 48 horas na presença de 1-MT. As barras
representam a média ± desvio padrão de uma triplicata. A linha em vermelho representa
a concentração da analito no meio de cultura. * ρ<0,05, ** ρ<0,01, ***ρ<0,001.
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
SK-Mel 19
PBMC
1-DL-MT
1-D-MT
1-L-MT
IFN-
+-
---
---
+
+--
-+-
--+
+ + ++
- --
+
+--
-+-
--+
+ +
+++
---- ----
----
+ +++
--
--
+-
-+
- - --+
+ +++
+
-
---
+--
-+-
--+
---
+ + +
----
* *
5-H
T [
M]
0.00
0.15
0.30
0.45
SK-Mel 19
PBMC
1-DL-MT
1-D-MT
1-L-MT
IFN-
+-
---
---
+
+--
-+-
--+
+ + ++
- --
+
+--
-+-
--+
+ +
+++
---- ----
----
+ +++
--
--
+-
-+
- - --+
+ +++
+
-
---
+--
-+-
--+
---
+ + +
----
**
IAA
[
M]
77
É sabido que IAA é bem tolerado em humanos e que apenas seus produtos de
oxidação apresentariam toxicidade tumor (75). Pelos nossos resultados não observamos
nenhuma situação que evidenciasse alguma ação tóxica do IAA ou de seus possíveis
produtos de oxidação. Serotonina possui vários efeitos na modulação do sistema imune,
tais como indução de inflamação, fagocitose, migração de células T e produção de
citocinas (76-78). Nos nossos ensaios vimos um aumento do consumo deste metabólito
na co-cultura, que pode ser resultado da utilização pelas PBMC’s, pois a célula tumoral
não consumiu 5-HT em nenhuma outra condição aqui estudada, pelo contrário, ela
aumenta esta produção. Assim, sugerimos que a 5-HT consumida pelas PBMC’s pode
ser usada na imunomodulação.
78
5. CONCLUSÕES
Esse trabalho contribui para mostrar alguns dos efeitos de 1-MT que devem
acontecer in vivo compondo parte de sua atividade antitumoral. Alterações na
proliferação e invasão de duas linhagens de melanomas foram mostradas, sugerindo que
todos os compostos testados possuem pelo menos algum efeito direto sobre estes
parâmetros, sendo claro que esse efeito pode variar de acordo com a linhagem.
Além disso, nossos resultados chamam atenção para o efeito de 1-MT sobre a
produção de citocinas como IFN-γ, TNF-α e IL-10, sendo possível que parte dos efeitos
antitumorais dessa substância seja consequência de sua ação sobre elas. Alterações em
compostos das três vias de metabolização do Trp também merecem destaque neste
trabalho, mostrando que não só o eixo Trp-QUIN tem atuação no microambiente
tumoral. Ainda devemos ressaltar que a co-cultura por si só leva a modificações em
alguns metabólitos da via QUIN, indicando que estes merecem ser mais explorados em
estudos da imunologia do câncer.
79
6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Peters JC. TRYPTOPHAN NUTRITION AND METABOLISM - AN
OVERVIEW. Kynurenine and Serotonin Pathways : Progress in Tryptophan Research.
1991;294:345-58.
2. King NJC, Thomas SR. Molecules in focus: Indoleamine 2,3-dioxygenase.
International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 2007;39(12):2167-72.
3. Opitz C, Wick W, Steinman L, Platten M. Tryptophan degradation in
autoimmune diseases. Cell Mol Life Sci. 2007;64(19-20):2542-63.
4. Gobaille S, Kemmel V, Brumaru D, Dugave C, Aunis D, Maitre M. Xanthurenic
acid distribution, transport, accumulation and release in the rat brain. J Neurochem.
2008;105(3):982-93.
5. Moffett JR, Namboodiri MA. Tryptophan and the immune response.
Immunology and Cell Biology. 2003;81(4):247-65.
6. Keszthelyi D, Troost FJ, Masclee AAM. Understanding the role of tryptophan
and serotonin metabolism in gastrointestinal function. Neurogastroenterology and
Motility. 2009;21(12):1239-49.
7. Nordlind K, Azmitia E, Slominski A. The skin as a mirror of the soul: exploring
the possible roles of serotonin. Exp Dermatol. 2008;17(4):301-11.
8. Xiang Z, Hrabetova S, Moskowitz S, Casaccia-Bonnefil P, Young S, Nimmrich
V, et al. Long-term maintenance of mature hippocampal slices in vitro. J Neurosci
Methods. 2000;98(2):145-54.
9. Squires L, Jakubowski J, Stuart J, Rubakhin S, Hatcher N, Kim W, et al.
Serotonin catabolism and the formation and fate of 5-hydroxyindole thiazolidine
carboxylic acid. J Biol Chem. 2006;281(19):13463-70.
80
10. Keszthelyi D, Troost F, Masclee A. Understanding the role of tryptophan and
serotonin metabolism in gastrointestinal function. Neurogastroenterol Motil.
2009;21(12):1239-49.
11. Tekes K. HPLC determination of serotonin and its metabolites from human
platelet-rich plasma; shift to 5-hydroxytryptophol formation following alcohol
consumption. J Chromatogr Sci. 2008;46(2):169-73.
12. LERNER A, CASE J, MORI W, WRIGHT M. Melatonin in peripheral nerve.
Nature. 1959;183:1821.
13. Sugden D. Melatonin biosynthesis in the mammalian pineal gland. Experientia.
1989;45(10):922-32.
14. Tan D, Hardeland R, Manchester L, Poeggeler B, Lopez-Burillo S, Mayo J, et al.
Mechanistic and comparative studies of melatonin and classic antioxidants in terms of
their interactions with the ABTS cation radical. J Pineal Res. 2003;34(4):249-59.
15. Silva S, Ximenes V, Livramento J, Catalani L, Campa A. High concentrations of
the melatonin metabolite, N1-acetyl-N2-formyl-5-methoxykynuramine, in cerebrospinal
fluid of patients with meningitis: a possible immunomodulatory mechanism. J Pineal
Res. 2005;39(3):302-6.
16. Hirata F, Hayaishi O, Tokuyama T, Seno S. In vitro and in vivo formation of
two new metabolites of melatonin. J Biol Chem. 1974;249(4):1311-3.
17. Katz JB, Muller AJ, Prendergast GC. Indoleamine 2,3-dioxygenase in T-cell
tolerance and tumoral immune escape. Immunological Reviews. 2008;222:206-21.
18. Moreno ACR, Clara RO, Coimbra JB, Julio AR, Albuquerque RC, Oliveira EM,
et al. The expanding roles of 1-methyl-tryptophan (1-MT): in addition to inhibiting
kynurenine production, 1-MT activates the synthesis of melatonin in skin cells. Febs
Journal. 2013;280(19):4782-92.
81
19. Tourino MC, de Oliveira EM, Belle LP, Knebel FH, Albuquerque RC, Doerr
FA, et al. Tryptamine and dimethyltryptamine inhibit indoleamine 2,3 dioxygenase and
increase the tumor-reactive effect of peripheral blood mononuclear cells. Cell
Biochemistry and Function. 2013;31(5):361-4.
20. Fatokun AA, Hunt NH, Ball HJ. Indoleamine 2,3-dioxygenase 2 (IDO2) and the
kynurenine pathway: characteristics and potential roles in health and disease. Amino
Acids. 2013;45(6):1319-29.
21. Loeb S, Koenigsrainer A, Zieker D, Bruecher BLDM, Rammensee H-G, Opelz
G, et al. IDO1 and IDO2 are expressed in human tumors: levo- but not dextro-1-methyl
tryptophan inhibits tryptophan catabolism. Cancer Immunology Immunotherapy.
2009;58(1):153-7.
22. Zamanakou M, Germenis AE, Karanikas V. Tumor immune escape mediated by
indoleamine 2,3-dioxygenase. Immunology Letters. 2007;111(2):69-75.
23. Prendergast GC, Metz R, Muller AJ. IDO recruits Tregs in melanoma. Cell
Cycle. 2009;8(12):1818-9.
24. Munn DH, Mellor AL. Indoleamine 2,3-dioxygenase and tumor-induced
tolerance. Journal of Clinical Investigation. 2007;117(5):1147-54.
25. Munn DH, Sharma MD, Lee JR, Jhaver KG, Johnson TS, Keskin DB, et al.
Potential regulatory function of human dendritic cells expressing indoleamine 2,3-
dioxygenase. Science. 2002;297(5588):1867-70.
26. Opitz CA, Litzenburger UM, Sahm F, Ott M, Tritschler I, Trump S, et al. An
endogenous tumour-promoting ligand of the human aryl hydrocarbon receptor. Nature.
2011;478(7368):197-203.
82
27. Pantouris G, Mowat CG. Antitumour agents as inhibitors of tryptophan 2,3-
dioxygenase. Biochemical and Biophysical Research Communications. 2014;443(1):28-
31.
28. Esser C. Biology and function of the aryl hydrocarbon receptor: report of an
international and interdisciplinary conference. Archives of Toxicology.
2012;86(8):1323-9.
29. Pilotte L, Larrieu P, Stroobant V, Colau D, Dolusic E, Frederick R, et al.
Reversal of tumoral immune resistance by inhibition of tryptophan 2,3-dioxygenase.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.
2012;109(7):2497-502.
30. Langman RE, Cohn M. A minimal model for the self-nonself discrimination: a
return to the basics. Seminars in Immunology. 2000;12(3):189-95.
31. Vesely MD, Schreiber RD. Cancer immunoediting: antigens, mechanisms, and
implications to cancer immunotherapy. Renaissance of Cancer Immunotherapy.
2013;1284:1-5.
32. Prendergast GC. CANCER Why tumours eat tryptophan. Nature.
2011;478(7368):192-4.
33. Mukherji B. Immunology of melanoma. Clinics in Dermatology.
2013;31(2):156-65.
34. Shimanovsky A, Jethava A, Dasanu CA. Immune alterations in malignant
melanoma and current immunotherapy concepts. Expert Opinion on Biological
Therapy. 2013;13(10):1413-27.
35. Terme M, Chaput N, Combadiere B, Ma A, Ohteki T, Zitvogel L. Regulatory T
cells control dendritic cell/NK cell cross-talk in lymph nodes at the steady state by
inhibiting CD4(+) self-reactive T cells. Journal of Immunology. 2008;180(7):4679-86.
83
36. Poggi A, Musso A, Dapino I, Zocchi MR. Mechanisms of tumor escape from
immune system: Role of mesenchymal stromal cells. Immunology Letters. 2014;159(1-
2):55-72.
37. Capece L, Lewis-Ballester A, Yeh SR, Estrin DA, Marti MA. Complete
Reaction Mechanism of Indoleamine 2,3-Dioxygenase as Revealed by QM/MM
Simulations. Journal of Physical Chemistry B. 2012;116(4):1401-13.
38. Tatsumi K, Higuchi T, Fujiwara H, Nakayama T, Egawa H, Itoh K, et al.
Induction of tryptophan 2,3-dioxygenase in the mouse endometrium during
implantation. Biochemical and Biophysical Research Communications.
2000;274(1):166-70.
39. Thackray SJ, Mowat CG, Chapman SK. Exploring the mechanism of tryptophan
2,3-dioxygenase. Biochemical Society Transactions. 2008;36:1120-3.
40. Dang YH, Dale WE, Brown OR. Comparative effects of oxygen on indoleamine
2,3-dioxygenase and tryptophan 2,3-dioxygenase of the kynurenine pathway. Free
Radical Biology and Medicine. 2000;28(4):615-24.
41. Yuasa HJ, Ball HJ, Austin CJD, Hunt NH. 1-L-methyltryptophan is a more
effective inhibitor of vertebrate IDO2 enzymes than 1-D-methyltryptophan.
Comparative Biochemistry and Physiology B-Biochemistry & Molecular Biology.
2010;157(1):10-5.
42. Cady SG, Sono M. 1-METHYL-DL-TRYPTOPHAN, BETA-(3-
BENZOFURANYL)-DL-ALANINE (THE OXYGEN ANALOG OF TRYPTOPHAN),
AND BETA- 3-BENZO(B)THIENYL -DL-ALANINE (THE SULFUR ANALOG OF
TRYPTOPHAN) ARE COMPETITIVE INHIBITORS FOR INDOLEAMINE 2,3-
DIOXYGENASE. Archives of Biochemistry and Biophysics. 1991;291(2):326-33.
84
43. Loeb S, Koenigsrainer A. Is IDO a key enzyme bridging the gap between tumor
escape and tolerance induction? Langenbecks Archives of Surgery. 2008;393(6):995-
1003.
44. Opitz CA, Litzenburger UM, Opitz U, Sahm F, Ochs K, Lutz C, et al. The
Indoleamine-2,3-Dioxygenase (IDO) Inhibitor 1-Methyl-D-tryptophan Upregulates
IDO1 in Human Cancer Cells. Plos One. 2011;6(5):11.
45. Sarkhosh K, Tredget EE, Uludag H, Kilani RT, Karami A, Li YY, et al.
Temperature-sensitive polymer-conjugated IFN-gamma induces the expression of IDO
mRNA and activity by fibroblasts populated in collagen gel (FPCG). Journal of Cellular
Physiology. 2004;201(1):146-54.
46. Rutella S, Bonanno G, Procoli A, Mariott A, de Ritis DG, Curti A, et al.
Hepatocyte growth factor favors monocyte differentiation into regulatory interleukin
(IL)-10++IL-12(low/neg) accessory cells with dendritic-cell features. Blood.
2006;108(1):218-27.
47. Mellor AL, Munn DH. IDO expression by dendritic cells: Tolerance and
tryptophan catabolism. Nature Reviews Immunology. 2004;4(10):762-74.
48. Uyttenhove C, Pilotte L, Theate I, Stroobant V, Colau D, Parmentier N, et al.
Evidence for a tumoral immune resistance mechanism based on tryptophan degradation
by indoleamine 2,3-dioxygenase. Nature Medicine. 2003;9(10):1269-74.
49. Hou D-Y, Muller AJ, Sharma MD, DuHadaway J, Banerjee T, Johnson M, et al.
Inhibition of indoleamine 2,3-dioxygenase in dendritic cells by stereoisomers of 1-
methyl-tryptophan correlates with antitumor responses. Cancer Research.
2007;67(2):792-801.
50. Metz R, DuHadaway JB, Kamasani U, Laury-Kleintop L, Muller AJ,
Prendergast GC. Novel tryptophan catabolic enzyme IDO2 is the preferred biochemical
85
target of the antitumor indoleamine 2,3-dioxygenase inhibitory compound D-1-methyl-
tryptophan. Cancer Research. 2007;67(15):7082-7.
51. Munn D, Mellor A, inventors; MEDICAL COLLEGE GEORGIA RES INST
(MEDI-Non-standard) GEORGIA REGENTS RES INST INC (GEOR-Non-standard),
assignee. Use of indoleamine-2,3-dioxygenase inhibitors (e.g. 1-methyl-tryptophan) and
at least one additional therapeutic agent (e.g. cyclophosphamide) for treatment of
cancers or viral, bacterial or parasite infections patent US2004234623-A1; US7598287-
B2; US8580844-B2. US2004234623-A1 25 Nov 2004 A61N-005/00 200482 Pages: 42
English US7598287-B2 06 Oct 2009 A61K-031/40 200966 English US8580844-B2 12
Nov 2013 A61K-031/40 201375 English.
52. Jia L, Schweikart K, Tomaszewski J, Page JG, Noker PE, Buhrow SA, et al.
Toxicology and pharmacokinetics of 1-methyl-D-tryptophan: Absence of toxicity due to
saturating absorption. Food and Chemical Toxicology. 2008;46(1):203-11.
53. Salter M, Hazelwood R, Pogson CI, Iyer R, Madge DJ. THE EFFECTS OF A
NOVEL AND SELECTIVE INHIBITOR OF TRYPTOPHAN 2,3-DIOXYGENASE
ON TRYPTOPHAN AND SEROTONIN METABOLISM IN THE RAT. Biochemical
Pharmacology. 1995;49(10):1435-42.
54. Sedlmayr P. The role of placental tryptophan catabolism. American Journal of
Reproductive Immunology. 2013;70:12-.
55. Agaugue S, Perrin-Cocon L, Coutant F, Andre P, Lotteau V. 1-methyl-
tryptophan can interfere with TLR signaling in dendritic cells independently of IDO
activity. Journal of Immunology. 2006;177(4):2061-71.
56. Tormo D, Checinska A, Alonso-Curbelo D, Perez-Guijarro E, Canon E, Riveiro-
Falkenbach E, et al. Targeted Activation of Innate Immunity for Therapeutic Induction
of Autophagy and Apoptosis in Melanoma Cells. Cancer Cell. 2009;16(2):103-14.
86
57. Kramer N, Walzl A, Unger C, Rosner M, Krupitza G, Hengstschlaeger M, et al.
In vitro cell migration and invasion assays. Mutation Research-Reviews in Mutation
Research. 2013;752(1):10-24.
58. Decaestecker C, Debeir O, Van Ham P, Kiss R. Can anti-migratory drugs be
screened in vitro? A review of 2D and 3D assays for the quantitative analysis of cell
migration. Medicinal Research Reviews. 2007;27(2):149-76.
59. Liu Y, Wu H-W, Sheard MA, Sposto R, Somanchi SS, Cooper LJN, et al.
Growth and Activation of Natural Killer Cells Ex Vivo from Children with
Neuroblastoma for Adoptive Cell Therapy. Clinical Cancer Research. 2013;19(8):2132-
43.
60. Schmidt SK, Siepmann S, Kuhlmann K, Meyer HE, Metzger S, Pudelko S, et al.
Influence of Tryptophan Contained in 1-Methyl-Tryptophan on Antimicrobial and
Immunoregulatory Functions of Indoleamine 2,3-Dioxygenase. Plos One. 2012;7(9).
61. Sainio EL, Pulkki K, Young SN. L-tryptophan: Biochemical, nutritional and
pharmacological aspects. Amino Acids. 1996;10(1):21-47.
62. Zhang G, Sun HJ. Racemization in Reverse: Evidence that D-Amino Acid
Toxicity on Earth Is Controlled by Bacteria with Racemases. Plos One. 2014;9(3).
63. Cava F, Lam H, de Pedro MA, Waldor MK. Emerging knowledge of regulatory
roles of d-amino acids in bacteria. Cellular and Molecular Life Sciences.
2011;68(5):817-31.
64. Braumueller H, Wieder T, Brenner E, Assmann S, Hahn M, Alkhaled M, et al.
T-helper-1-cell cytokines drive cancer into senescence. Nature. 2013;494(7437):361-5.
65. Zaidi MR, Merlino G. The Two Faces of Interferon-gamma in Cancer. Clinical
Cancer Research. 2011;17(19):6118-24.
87
66. Landsberg J, Kohlmeyer J, Renn M, Bald T, Rogava M, Cron M, et al.
Melanomas resist T-cell therapy through inflammation-induced reversible
dedifferentiation. Nature. 2012;490(7420):412-+.
67. Striz I, Brabcova E, Kolesar L, Sekerkova A. Cytokine networking of innate
immunity cells: a potential target of therapy. Clinical Science. 2014;126(9-10):593-612.
68. Mocellin S, Panelli M, Wang E, Rossi CR, Pilati P, Nitti D, et al. IL-10
stimulatory effects on human NK cells explored by gene profile analysis. Genes and
Immunity. 2004;5(8):621-30.
69. Wiguna AP, Walden P. Role of IL-10 and TGF-beta in melanoma. Experimental
Dermatology. 2015;24(3):209-14.
70. Ozaki Y, Edelstein MP, Duch DS. INDUCTION OF INDOLEAMINE 2,3-
DIOXYGENASE - A MECHANISM OF THE ANTITUMOR-ACTIVITY OF
INTERFERON-GAMMA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the
United States of America. 1988;85(4):1242-6.
71. Nurcombe HL, Bucknall RC, Edwards SW. NEUTROPHILS ISOLATED
FROM THE SYNOVIAL-FLUID OF PATIENTS WITH RHEUMATOID-
ARTHRITIS - PRIMING AND ACTIVATION INVIVO. Annals of the Rheumatic
Diseases. 1991;50(3):147-53.
72. Sagan D, Kocki T, Kocki J, Szumilo J. Serum Kynurenic Acid: Possible
Association with Invasiveness of Non-small Cell Lung Cancer. Asian Pacific Journal of
Cancer Prevention. 2012;13(9):4241-4.
73. Heyes MP, Saito K, Markey SP. HUMAN MACROPHAGES CONVERT L-
TRYPTOPHAN INTO THE NEUROTOXIN QUINOLINIC ACID. Biochemical
Journal. 1992;283:633-5.
88
74. Heyes MP, Achim CL, Wiley CA, Major EO, Saito K, Markey SP. Human
microglia convert L-tryptophan into the neurotoxin quinolinic acid. Biochemical
Journal. 1996;320:595-7.
75. Folkes LK, Wardman P. Oxidative activation of indole-3-acetic acids to
cytotoxic species - a potential new role for plant auxins in cancer therapy. Biochemical
Pharmacology. 2001;61(2):129-36.
76. Laberge S, Cruikshank WW, Beer DJ, Center DM. Secretion of IL-16
(lymphocyte chemoattractant factor) from serotonin-stimulated CD8(+) T cells in vitro.
Journal of Immunology. 1996;156(1):310-5.
77. Cloez-Tayarani I, Petit-Bertron AF, Venters HD, Cavaillon JM. Differential
effect of serotonin on cytokine production in lipopolysaccharide-stimulated human
peripheral blood mononuclear cells: involvement of 5-hydroxytryptamine(2A)
receptors. International Immunology. 2003;15(2):233-40.
78. Nakamura K, Sato T, Ohashi A, Tsurui H, Hasegawa H. Role of a serotonin
precursor in development of gut microvilli. American Journal of Pathology.
2008;172(2):333-44.
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
Faculdade de Ciências Farmacêuticas Secretaria de Pós-Graduação
Av. Prof. Lineu Prestes, 580, Bloco 13 A - Cidade Universitária - CEP 05508-900 - São Paulo - SP Fone: (11) 3091 3621 - Fax (11) 3091 3141 – e-mail: [email protected]
Informações para os Membros de Bancas Julgadoras de Mestrado/Doutorado
1. O candidato fará uma apresentação oral do seu trabalho, com duração máxima de trinta minutos.
2. Os membros da banca farão a argüição oral. Cada examinador
disporá, no máximo, de trinta minutos para argüir o candidato, exclusivamente sobre o tema do trabalho apresentado, e o candidato disporá de trinta minutos para sua resposta.
2.1 Com a devida anuência das partes (examinador e candidato), é
facultada a argüição na forma de diálogo em até sessenta minutos por examinador. 3. A sessão de defesa será aberta ao público. 4. Terminada a argüição por todos os membros da banca, a mesma se
reunirá reservadamente e expressará na ata (relatório de defesa) a aprovação ou reprovação do candidato, baseando-se no trabalho escrito e na argüição.
4.1 Caso algum membro da banca reprove o candidato, a Comissão
Julgadora deverá emitir um parecer a ser escrito em campo exclusivamente indicado na ata.
4.2 Será considerado aprovado o aluno que obtiver aprovação por unanimidade ou pela maioria da banca.
5. Dúvidas poderão ser esclarecidas junto à Secretaria de Pós-
Graduação: [email protected], (11) 3091 3621.
São Paulo, 23 de maio de 2014.
Prof. Dr. Adalberto Pessoa Junior Presidente da CPG/FCF/USP
28/08/2015 Currículo do Sistema de Currículos Lattes (Maryana Stephany Ferreira Branquinho)
http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4970089Y9 1/4
2013 Mestrado em andamento em Farmácia (Análises Clínicas) (Conceito CAPES 7).Universidade de São Paulo, USP, Brasil. Título: Efeitos dos inibidores de IDO e TDO na proliferação, migração einvasão de melanomas humanos e na atividade tumoricida de célulasmononucleares.,Orientador: Ana Campa.Bolsista do(a): Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de NívelSuperior.
2007 2012 Graduação em Farmácia. Universidade Federal de Alfenas, UNIFAL/MG, Brasil. Título: Avaliação do efeito do extrato de partes aéreas de BaccharisDracunculifolia sobre a função renal em ratos diabéticos. Orientador: Fernanda Borges de Araújo Paula.
Vínculo institucional2013 Atual Vínculo: Bolsista, Enquadramento Funcional: Mestrando, Carga horária: 40,
Regime: Dedicação exclusiva.
Vínculo institucional2008 2008 Vínculo: , Enquadramento Funcional:
Vínculo institucional2012 2012 Vínculo: Voluntário, Enquadramento Funcional: Estagiária, Carga horária: 40
Nome Maryana Stephany Ferreira BranquinhoNome em citações bibliográficas BRANQUINHO, M. S. F.
Maryana Stephany Ferreira BranquinhoEndereço para acessar este CV: http://lattes.cnpq.br/2468990281614444Última atualização do currículo em 16/06/2015
Possui graduação em Farmácia pela Universidade Federal de Alfenas (2012). Atualmente émestranda em Farmácia (Área Análises Clínicas) na Faculdade de Ciências Farmacêuticas daUniversidade de São Paulo. (Texto informado pelo autor)
Identificação
Endereço
Formação acadêmica/titulação
Atuação Profissional
Universidade de São Paulo, USP, Brasil.
Universidade Federal de Alfenas, UNIFAL/MG, Brasil.
Laboratório Central de Análises Clínicas, LACEN, Brasil.
28/08/2015 Currículo do Sistema de Currículos Lattes (Maryana Stephany Ferreira Branquinho)
http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4970089Y9 2/4
Vínculo institucional2008 2008 Vínculo: Voluntário, Enquadramento Funcional: Estagiária, Carga horária: 20
Vínculo institucional2012 2013 Vínculo: Celetista, Enquadramento Funcional: Farmacêutica Responsável
Vínculo institucional2010 2010 Vínculo: Voluntário, Enquadramento Funcional: Estagiária, Carga horária: 4
Vínculo institucional2011 2011 Vínculo: Voluntário, Enquadramento Funcional: Estagiária, Carga horária: 40
Vínculo institucional2010 2010 Vínculo: Voluntário, Enquadramento Funcional: Estagiária, Carga horária: 30
2008 2008 Ler: uma eterna aventuraDescrição: Vinculado ao Programa "Atenção à Saúde da Criança eAdolescente", onde incentivávamos a leitura de crianças de creches eorfanatos da cidade de AlfenasMG.. Situação: Concluído; Natureza: Extensão. Alunos envolvidos: Graduação: (25) .
Integrantes: Maryana Stephany Ferreira Branquinho Integrante / Dênis daSilva Moreira Coordenador.
1. Grande área: Ciências da Saúde / Área: Farmácia.
Inglês Compreende Bem, Fala Bem, Lê Bem, Escreve Bem.Espanhol Compreende Razoavelmente, Fala Pouco, Lê Razoavelmente, Escreve Pouco.
2014 Melhor pôster de mestrado apresentado na XIX Semana Farmacêutica deCiência e Tecnologia da Faculdade de Ciências Farmacêutica da USP,Faculdade de Ciências Farmacêutica da USP.
Laboratório Municipal Dr. Alfredo Barbalho Cavalcante, L.M.A.B.C, Brasil.
CJL Drogarias LTDA, CJL, Brasil.
Município de Alfenas, ALFENAS, Brasil.
Pharmacêutica Manipulação, PHARMACÊTICA, Brasil.
Drogaria Rabelo e Peloso LTDA, DROG. RP, Brasil.
Projetos de extensão
Áreas de atuação
Idiomas
Prêmios e títulos
28/08/2015 Currículo do Sistema de Currículos Lattes (Maryana Stephany Ferreira Branquinho)
http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4970089Y9 3/4
1.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
1.
Bancas
Participação em bancas de comissões julgadoras
Outras participaçõesBRANQUINHO, M. S. F.. 22º Simpósio Internacional de Iniciação Científica e Tecnológica da USP SIICUSP.
2014. Universidade de São Paulo.
Eventos
Participação em eventos, congressos, exposições e feiras
XIX Semana Farmacêutica de Ciência e Tecnologia.Efeitos dos inibidores de IDO e TDO na proliferação, migraçãoe invasão de melanomas humanos e na atividade tumoricida de células mononucleares. 2014. (Seminário).
Hematologia: principais causas de erro do hemograma e automação..Hematologia: principais causas de erro dohemograma e automação.. 2011. (Outra).
Curso: Análise Forense.Análise Forense. 2011. (Outra).
Campanha pelo uso racional de medicamentos.Campanha pelo uso racional de medicamentos. 2010. (Oficina).
44ª Semana Farmacêutica da UNIFALMG.44ª Semana Farmacêutica da UNIFALMG. 2010. (Encontro).
"Prósaúde: Reformulando a Saúde Pública"."Ao povo o que é do povo... Prósaúde: Reformulando a SaúdePública". 2008. (Seminário).
Programa de Treinamento de Estagiários.Programa de Treinamento de Estagiários. 2008. (Outra).
Programa de Treinamento de Estagiários.Programa de Treinamento de Estagiários. 2008. (Outra).
Biossegurança: a importância da imunização para o trabalhador de saúde..Biossegurança: a importância daimunização para o trabalhador de saúde.. 2008. (Outra).
42ª Semana Farmacêutica da UNIFALMG.42ª Semana Farmacêutica da UNIFALMG. 2007. (Encontro).
Minicurso: Descarte de resíduos de serviço de saúde.Descarte de resíduos de serviço de saúde. 2007. (Outra).
Organização de eventos, congressos, exposições e feiras
BRANQUINHO, M. S. F. . 44ª Semana Farmacêutica da UNIFALMG. 2010. (Outro).
Outras informações relevantes
Monitorias durante a graduação: Monitoria da disciplina de Bioquímica Clínica, no curso deFarmácia, durante o primeiro semestre de 2012 totalizando 90 horas, Departamento deAnálises Clínicas ‐ UNIFAL MG, professor responsável Fernanda Borges de Araújo Paula.
28/08/2015 Currículo do Sistema de Currículos Lattes (Maryana Stephany Ferreira Branquinho)
http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4970089Y9 4/4
Monitoria da Disciplina de Controle Microbiológico de Alimentos, Cosméticos e Medicamentosno curso de Farmácia, durante o segundo semestre de 2011 totalizando 90 horas, Departamentode Alimentos e Medicamentos ‐ UNIFAL MG, professor responsável Sandra Maria Oliveira MoraisVeiga. Monitoria da Disciplina de Farmácia Hospitalar no curso de Farmácia, durante oprimeiro semestre de 2011 totalizando 90 horas, Faculdade de Ciências Farmacêuticas ‐UNIFAL MG, professor responsável Walneia Aparecida de Souza. Cursos de curta duração emesa‐redonda: Participação no minicurso: Farmácia, um estabelecimento de saúde. Com cargahorária de 2 horas, realizada no dia 03 de setembro de 2009. Participação na mesa‐redonda:Pós‐graduação. Com carga horária de 4 horas, realizada duranta a "44ª Semana Farmacêutica".
Página gerada pelo Sistema Currículo Lattes em 28/08/2015 às 13:34:38
Imprimir currículo
28/08/2015
about:blank 1/3
Sistema Administrativo da PósGraduação
Universidade de São PauloFaculdade de Ciências Farmacêuticas
Documento sem validade oficialFICHA DO ALUNO
9136 8442874/1 Maryana Stephany Ferreira BranquinhoEmail: [email protected] de Nascimento: 08/12/1988Cédula de Identidade: RG MG. 15.448.034 MGLocal de Nascimento: Estado de Minas GeraisNacionalidade: Brasileira
Graduação: Farmacêutica Universidade Federal de Alfenas Minas Gerais Brasil 2012
Curso: MestradoPrograma: Farmácia (Análises Clínicas)Área: Análises ClínicasData de Matrícula: 16/07/2013Início da Contagem de Prazo: 16/07/2013Data Limite para o Depósito: 18/01/2016
Orientador: Prof(a). Dr(a). Ana Campa 16/07/2013 até o presente. Email:[email protected]
Proficiência em Línguas: Inglês, Aprovado em 16/07/2013
Data de Aprovação no Exame deQualificação: Aprovado em 11/08/2014
Data do Depósito do Trabalho:Título do Trabalho:
Data Máxima para Aprovação daBanca:Data de Aprovação da Banca:
Data Máxima para Defesa:Data da Defesa:Resultado da Defesa:
Histórico de Ocorrências: Primeira Matrícula em 16/07/2013
Aluno matriculado no Regimento da PósGraduação USP (Resolução nº 5473 em vigor de 18/09/2008 até19/04/2013).Última ocorrência: Matrícula de Acompanhamento em 20/07/2015Impresso em: 28/08/2015 13:38:18
28/08/2015
about:blank 2/3
Sistema Administrativo da PósGraduação
Universidade de São PauloFaculdade de Ciências Farmacêuticas
Documento sem validade oficialFICHA DO ALUNO
9136 8442874/1 Maryana Stephany Ferreira Branquinho
Sigla Nome da Disciplina Início Término CargaHorária Cred.Freq.Conc.Exc.Situação
FBC57533/1 Processos de Invasão Celular 05/08/2013 15/09/2013 90 6 100 A N Concluída
FBC57574/2 Tópicos em Análises Clínicas II 06/08/2013 18/11/2013 15 1 87 A N Concluída
EDM57915/11
Metodologia do Ensino Superior(Faculdade de Educação Universidade de São Paulo)
13/08/2013 29/11/2013 120 0 NPré
matrículaindeferida
MCM58911/5
Estatística Instrumental (Faculdadede Medicina Universidade de SãoPaulo)
07/10/2013 03/11/2013 60 4 93 B N Concluída
FBC57802/2
Análise de Dados Aplicados àsPesquisas Biológicas 10/03/2014 20/04/2014 90 6 94 A N Concluída
FBC579312/1 Tópicos em Análises Clínicas I 11/03/2014 23/06/2014 15 1 80 A N Concluída
FBC57484/1
Trabalhos Científicos: da Elaboraçãoà Publicação 08/04/2014 19/05/2014 60 4 91 A N Concluída
FBA57283/10 Aprimoramento Didático 19/08/2014 15/09/2014 60 4 88 A N Concluída
Créditos mínimos exigidos Créditos obtidosPara exame dequalificação Para depósito da dissertação
Disciplinas: 0 25 26Estágios:Total: 0 25 26
Créditos Atribuídos à Dissertação: 71
Conceito a partir de 02/01/1997:A Excelente, com direito a crédito; B Bom, com direito a crédito; C Regular, com direito a crédito; R Reprovado; T Transferência.
Um(1) crédito equivale a 15 horas de atividade programada.
Última ocorrência: Matrícula de Acompanhamento em 20/07/2015Impresso em: 28/08/2015 13:38:19
28/08/2015
about:blank 3/3
Sistema Administrativo da PósGraduação
Universidade de São PauloFaculdade de Ciências Farmacêuticas
Documento sem validade oficialFICHA DO ALUNO
9136 8442874/1 Maryana Stephany Ferreira Branquinho
Comissão julgadora da dissertação de mestrado:NUSP Nome Vínculo Função
55700 Ana Campa FCF USP Presidente
Última ocorrência: Matrícula de Acompanhamento em 20/07/2015Impresso em: 28/08/2015 13:38:19
