UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE CIÊNCIAS ... · resposta o coeficiente de partição (K) 33 Figura 2.3: Diagrama para interpretação geométrica dos efeitos da concentração

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

Programa de Pós-Graduação em Tecnologia Bioquímico-Farmacêutica

Área de Tecnologia Químico-Farmacêutica Extração da ascorbato oxidase de Cucurbita maxima por processo descontínuo e contínuo em coluna de discos rotativos perfurados

utilizando sistemas de duas fases aquosas

Tatiana Souza Porto

Tese para obtenção do grau de DOUTOR

Orientador: Prof. Dr. Adalberto Pessoa Junior

São Paulo 2008

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS Programa de Pós-Graduação em Tecnologia Bioquímico-

Farmacêutica Área de Tecnologia Químico-Farmacêutica

Extração da ascorbato oxidase de Cucurbita maxima por processo descontínuo e contínuo em coluna de discos rotativos perfurados


Tatiana Souza Porto

Tese para obtenção do grau de DOUTOR

Orientador: Prof. Dr. Adalberto Pessoa Junior

São Paulo 2008

Ficha Catalográfica Elaborada pela Divisão de Bibliotecas e

Documentação do Conjunto das Químicas da USP.

Porto, Tatiana Souza P853e Extração da ascorbato oxidase de Cucurbita maxima por

processo descontínuo e contínuo em coluna de discos rotativos perfurados utilizando sistemas de duas fases aquosas / Tatiana Souza Porto. – São Paulo, 2008.

123p. Tese (doutorado) – Faculdade de Ciências Farmacêuticas

da Universidade de São Paulo. Departamento de Tecnologia Bioquímico-Farmacêutica.

Orientador: Pessoa Junior, Adalberto 1. Enzima: Biotecnologia 2. Engenharia bioquímica

3. Engenharia de Alimentos I. T. II. Pessoa Junior, Adalberto, orientador.

620.8 CDD

Tatiana Souza Porto Extração da ascorbato oxidase de Cucurbita maxima por processo descontínuo e contínuo em coluna de discos rotativos perfurados


Comissão Julgadora da

Tese para obtenção do grau de Doutor

Prof. Titular Adalberto Pessoa Junior

orientador/presidente

____________________________ 1o. examinador

____________________________ 2o. examinador

____________________________ 3o. examinador

____________________________ 4o. examinador

São Paulo, Maio de 2008.

Dedico esta tese à minha família, principalmente a minha Mãe, Graça, que sempre esteve ao meu lado e ao meu namorado Fábio, por todo o amor e apoio.

“A alegria está na luta,, na tentativa,, no sofrimento envolvido. Não na vitória propriamente dita”.

Mahatma Gandhi

AGRADECIMENTOS

Ao Prof. Dr. Adalberto Pessoa Junior pela excelente orientação, apoio e

incentivo dados durante os quase seis anos em que trabalhamos juntos.

Declaro aqui a minha enorme admiração e agradeço pela confiança depositada

em mim, pois fazer a pós-graduação na USP possibilitou a realização de um

sonho.

À Profa Dra Ana Lúcia Figueiredo Porto, pela oportunidade e incentivo

dados para o ingresso na pesquisa científica e pelas orientações durante toda

a minha vida científica. Obrigada pelo carinho, amizade e dedicação, que tanto

colaboraram para a realização deste trabalho.

Ao Prof. Attilio Converti que me recebeu de braços abertos em seu

laboratório em Genova e me orientou da melhor forma possível durante o

período que fiquei na Itália. Não posso deixar de agradecer também sua família

que sempre foi muito simpática. Agradeço pela a orientação, mas

principalmente pela amizade que surgiu durante este tempo.

Ao Prof. Dr. Benício Barros Neto, pela enorme colaboração, sempre com

bom humor, para ajudar na análise estatística dos dados deste trabalho.

Obrigada pelos ensinamentos, que tanto me ajudam neste mundo da pesquisa.

Os meus mais sinceros agradecimentos.

Ao Prof. Dr. José Luiz de Lima Filho, Diretor do Laboratório de

Imunopatologia Keizo Asami – LIKA por sempre estar disposto a colaborar com

o trabalho nos mais diferentes aspectos, além de ter disponibilizado a infra-

estrutura deste grande laboratório para a realização dos experimentos.

À Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

pelos recursos financeiros e pela bolsa concedida durante toda a minha pós-

graduação.

Agradeço à CAPES (Coordenadoria de Aperfeiçoamento de Pessoal de

Nível Superior), pela concessão da bolsa de Estágio de Doutorado no Exterior,

sem a qual eu não poderia ter vivenciado um período tão especial na minha

vida profissional e pessoal.

À Doutora Maria Taciana Cavalcanti, que sempre ajuda na realização e

na coordenação dos experimentos, trabalhamos muito juntas em função das

nossas teses. Obrigada por ter me apoiado no momento tão difícil no início do

meu mestrado e também por todos esses anos de trabalho em conjunto.

Agradeço especialmente à minha irmã e colaboradora científica Camila

Souza Porto, por todo o apoio, incentivo e ajuda nos momento que mais

necessitei durante o meu mestrado e doutorado. Obrigada por todos os

experimentos realizados e coordenados durante todo este período,

principalmente durante a minha viagem ao exterior.

Às amigas, em especial à Ana Carolina, Ana Cecília, Catarina, Juliana,

Mariana, Michaelle, Veruska, pela força, carinho e amizade dados durante esta

fase.

Aos amigos da USP, Ângelo Samir, Carlota Yagui, Francislene

Hashmann, André Moreni, Daniela Gurpilhares, Daniele Maia, Alziana Pedrosa,

Alexandre Ferreira, Raquel Bezerra e Marcelo Matsudo. Obrigada pelo

acolhimento e pela força dados durante o tempo que permaneci em São Paulo.

Aos funcionários da FCF Elza, Mirian, Juarez, Elaine e Jorge, que sempre

foram muito atenciosos comigo e me ajudaram no que foi preciso.

Aos amigos do LIKA, Keila, Daniela, Carol, Petrus, Germana, Pedro,

Roberto, Márcia, e Edgar. Obrigada pelo carinho e amizade.

Ringrazio a tutti amici del Dipartimento di Ingegneria Chimica e di

Processo “G. B. Bonino” - DICHEP, Bahar, Davide, Alberto, Chiara, Eliseo,

Eugenia, Andréa, Marco, Danilo, Carla, per tutti momenti belli che abbiamo

avuto in quel periodo che sono stata a Genova. I miei saluti, voi mi mancati

tantissimo.

Agradeço por tudo e a todos que me ajudaram de alguma forma neste

trabalho.

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS........................................................................................... I

LISTA DE TABELAS .........................................................................................V

LISTA DE SÍMBOLOS......................................................................................VI

RESUMO..........................................................................................................VII

ABSTRACT.....................................................................................................VIII

OBJETIVOS...................................................................................................... IX OBJETIVO GERAL ..............................................................................................IX OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...................................................................................IX

INTRODUÇÃO................................................................................................... 1

CAPITULO I ....................................................................................................... 3

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA.............................................................................. 3 1.1. ASCORBATO OXIDASE ................................................................................ 3 1.2. PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS....................................................................... 7 1.3. SISTEMA DE DUAS FASES AQUOSAS (SDFA) .............................................. 8 1.4. POLIETILENO GLICOL ................................................................................ 10 1.5. FATORES QUE INFLUENCIAM O SISTEMA DE DUAS FASES AQUOSAS. ............. 11

1.5.1. Massa molar e concentração do polímero ...................................... 11 1.5.2. pH.................................................................................................... 12 1.5.3. Adição de sais ................................................................................. 14 1.5.4. Temperatura.................................................................................... 15

1.6. SISTEMAS DE DUAS FASES AQUOSAS (SDFA) ............................................ 15 1.7. EQUIPAMENTOS PARA EXTRAÇÃO UTILIZANDO SISTEMAS DE DUAS FASES AQUOSAS ....................................................................................................... 16

1.7.1. Coluna de discos perfurados rotativos (PRDC)............................... 18 1.8. APLICAÇÃO DE PLANEJAMENTOS EXPERIMENTAIS EM SDFA ....................... 20

CAPITULO II .................................................................................................... 22

SISTEMAS DE DUAS FASES AQUOSAS PEG/CITRATO: ESTUDO DAS VARIÁVEIS QUE INFLUENCIAM A PARTIÇÃO E PURIFICAÇÃO DA ASCORBATO OXIDASE DE CUCURBITA MAXIMA ..................................... 22

2.1. INTRODUÇÃO ...................................................................................... 23 2.2. MATERIAL E MÉTODOS...................................................................... 24

2.2.1. Ascorbato oxidase........................................................................... 24 2.2.2. Preparo do Extrato Enzimático........................................................ 24 2.2.3. Preparo dos sistemas de duas fases aquosas para os estudos de partição da ascorbato oxidase em PEG/Citrato. ....................................... 25 2.2.4. Planejamento fatorial fracionário para a extração da ascorbato oxidase...................................................................................................... 25

2.2.5. Planejamento fatorial completo para a extração da ascorbato oxidase...................................................................................................... 26 2.2.6. Determinação da atividade ascorbato oxidase................................ 28 2.2.7. Determinação do conteúdo protéico................................................ 28

2.3. DEFINIÇÃO DOS PARÂMETROS DE ANÁLISE DO PROCESSO...... 28 2.3.1. Atividade Específica ........................................................................ 28 2.3.2. Aumento de Pureza (AP) ................................................................ 29 2.3.3. Recuperação da ascorbato oxidase (Y) .......................................... 29 2.3.4. Coeficiente de Partição da ascorbato oxidase (K) .......................... 29

2.4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................ 30 2.4.1. Planejamento fatorial fracionário para a extração da ascorbato oxidase...................................................................................................... 30 2.4.2. Primeiro planejamento fatorial completo para a extração da ascorbato oxidase ..................................................................................... 41 2.4.3. Segundo planejamento fatorial completo para extração da ascorbato oxidase em SDFA. .................................................................................... 47

2.5. CONCLUSÃO........................................................................................ 51 CAPITULO III ................................................................................................... 52

EFEITO DO PH E DA TEMPERATURA NA ATIVIDADE E ESTABILIDADE DA ASCORBATO OXIDASE NO EXTRATO BRUTO E NO PRÉ-PURIFICADO POR SDFA....................................................................................................... 52


3.2.1. Preparo do Extrato Enzimático........................................................ 54 3.2.2. Efeito do pH e da temperatura na atividade e estabilidade da ascorbato oxidase no extrato enzimático .................................................. 54 3.2.3. Efeito do pH e da temperatura na atividade e estabilidade da AO após pré-purificação em SDFA. ................................................................ 55 3.2.4. Determinações analíticas ................................................................ 56

3.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................ 57 3.3.1. Obtenção do extrato enzimático de Cucurbita maxima contendo a ascorbato oxidase ..................................................................................... 57 3.3.2. Efeito do pH na atividade e estabilidade da ascorbato oxidase no extrato enzimático ..................................................................................... 57 3.3.3. Efeito da temperatura na atividade e estabilidade da ascorbato oxidase no extrato enzimático................................................................... 60 3.3.4. Efeito do pH e da temperatura na atividade e estabilidade da AO após pré-purificação em SDFA. ................................................................ 62

3.4. CONCLUSÃO........................................................................................ 65 CAPITULO IV................................................................................................... 66

INVESTIGAÇÃO CINÉTICA E TERMODINÂMICA NA ATIVIDADE DA ASCORBATO OXIDASE E ESTABILIDADE DO EXTRATO DE CUCURBITA MAXIMA........................................................................................................... 66

4.1 INTRODUÇÃO ....................................................................................... 67 4.2. MATERIAL E MÉTODOS...................................................................... 68

4.2.1. Preparo do Extrato Enzimático........................................................ 68

4.2.2. Determinação dos Parâmetros Cinéticos e Termodinâmicos da AO.................................................................................................................. 68 4.2.3. Determinação da atividade ascorbato oxidase................................ 69

4.3. TEORIA ................................................................................................. 69 4.3.1. Cinética da Atividade Enzimática. ................................................... 69 4.3.2. Termodinâmica da Reação Enzimática........................................... 70 4.3.3. Inativação Térmica da Enzima. ....................................................... 70 4.3.4.Tempo de Meia-Vida da Enzima. ..................................................... 71 4.4.5. Atividade Integral da Enzima........................................................... 71

4.4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................ 72 4.4.1. Caracterização Cinética da Atividade da AO. ................................. 72 4.4.2. Termodinâmica da Reação Enzimática........................................... 73 4.4.3. Termodinâmica da Inativação Térmica da AO. ............................... 76 4.4.4. Atividade Integral............................................................................. 80

4.5. CONCLUSÃO........................................................................................ 81 CAPITULO V.................................................................................................... 83

EXTRAÇÃO CONTÍNUA DA ASCORBATO OXIDASE EM SISTEMAS DE DUAS FASES AQUOSAS PEG/CITRATO, UTILIZANDO A COLUNA DE DISCOS PERFURADOS ROTATIVOS............................................................ 83


5.2.1. Ascorbato oxidase........................................................................... 85 5.2.2. Preparo do Extrato Enzimático........................................................ 86 5.2.3. Coluna de discos perfurados rotativos ............................................ 86 5.2.4. Extração contínua em sistema de duas fases aquosas .................. 87 5.2.5. Planejamento utilizando a extração contínua com a coluna de discos perfurados rotativos .................................................................................. 88 5.2.6. Determinações analíticas ................................................................ 89

5.3. DEFINIÇÃO DOS PARÂMETROS DO PROCESSO DE EXTRAÇÃO CONTÍNUA................................................................................................... 90 5.4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................ 91

5.4.1. Planejamento utilizando a extração contínua com a coluna de discos perfurados rotativos .................................................................................. 91 5.4.2. Planejamento utilizando a extração contínua com a coluna de discos perfurados rotativos para avaliação dos parâmetros operacionais ........... 99

5.5. CONCLUSÃO...................................................................................... 107 CONCLUSÕES.............................................................................................. 108

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................. 109

ANEXOS ........................................................................................................ 124 ANEXO 1 – NORMAS PARA A DEFESA DA TESE ............................................... 125 ANEXO 2 – ARTIGO PUBLICADO..................................................................... 126

i

LISTA DE FIGURAS

Figura 1.1: Reação catalisada pela enzima ascorbato oxidase. 3 Figura 1.2: Estrutura da enzima ascorbato oxidase (Protein Data Bank

/PDB: 1AOZ). 5 Figura 1.3 : Coluna de discos perfurados rotativos em operação (A), e

em (B) vista frontal da coluna com mais detalhes, onde se pode observar o eixo com os discos e as bombas de alimentação, a alimentação da fase leve e drenagem da fase pesada será realizada pela parte inferior da coluna, e pelo topo da coluna ocorreu a alimentação da fase pesada e drenagem da fase leve. 19

Figura 2.1: Gráfico de Pareto dos efeitos principais, tendo como

variável-resposta o coeficiente de partição (K) da ascorbato oxidase. Os significados dos símbolos na ordenada da figura são: (1)MMPEG-massa molar do PEG, (2)CPEG-concentração do PEG, (3)Citrato-concentração de citrato, (4)pH-valor de pH, (5)MTS-massa total do sistema, (6)FD-fator de diluição do extrato enzimático e (7)NaCl-concentração de NaCl. 32

Figura 2.2: Diagrama para interpretação geométrica dos efeitos do

fator de diluição e massa molar do PEG, tendo como variável-resposta o coeficiente de partição (K) 33

Figura 2.3: Diagrama para interpretação geométrica dos efeitos da

concentração de citrato e massa molar do PEG, tendo como variável-resposta o coeficiente de partição (K). 35


variável-resposta a recuperação da ascorbato oxidase. Os significados dos símbolos na ordenada da figura são: (1)MMPEG-massa molar do PEG, (2)CPEG-concentração do PEG, (3)Citrato-concentração de citrato, (4)pH-valor de pH, (5)MTS-massa total do sistema, (6)FD-Fator de diluição do extrato enzimático e (7)NaCl-concentração de NaCl. 36

Figura 2.5: Gráfico cúbico das variáveis (massa molar do PEG,

concentração de PEG e concentração de citrato), tendo como variável-resposta a recuperação da ascorbato oxidase. 37


variável-resposta o aumento de pureza (AP) da ascorbato oxidase. Os significados dos símbolos na ordenada da figura são: (1)MMPEG-massa molar do PEG, (2)CPEG-concentração do PEG, (3)Citrato-concentração de citrato, (4)pH-valor de pH,

ii

(5)MTS-massa total do sistema, (6)FD-Fator de diluição do extrato enzimático e (7)NaCl-concentração de NaCl. 38

Figura 2.7: Valores de recuperação da enzima e aumento de pureza

na fase superior dos sistemas de duas fases aquosas PEG/Citrato. 40


variável-resposta a recuperação da ascorbato oxidase na fase superior do sistema de duas fases aquosas. Os significados dos símbolos na ordenada da figura são: (1)CPEG-concentração do PEG, (2)Citrato-concentração de citrato. 43

Figura 2.9: Diagrama para interpretação geométrica dos efeitos, tendo

como variável-resposta a recuperação (Y) para analisar a concentração de citrato em função da concentração do PEG no SDFA. 44


variável-resposta o aumento de pureza (AP) da ascorbato oxidase na fase superior do sistema de duas fases aquosas. Os significados dos símbolos na ordenada da figura são: (1)CPEG-concentração do PEG, (2)Citrato-concentração de citrato. 45

Figura 2.11: Superfície de resposta do planejamento experimental

para o aumento de pureza da ascorbato oxidase na fase superior do sistema de duas fases aquosas (PEG/citrato). 46


variável-resposta o coeficiente de partição (K) da ascorbato oxidase na fase superior do sistema de duas fases aquosas. Os significados dos símbolos na ordenada da figura são: (1) CPEG-concentração do PEG, (2) Citrato-concentração de citrato. 49


variável-resposta a recuperação da ascorbato oxidase na fase superior do sistema de duas fases aquosas. Os significados dos símbolos na ordenada da figura são: (1) CPEG-concentração do PEG, (2) Citrato-concentração de citrato. 50

Figura 3.1: Efeito do pH na atividade da ascorbato oxidase a 25°C.

Tampão citrato-fosfato 0,1M pH 3,0 a 6,0 ( ), tampão fosfato 0,1M pH 7,0 ( ) e tampão Tris-HCl 0,1M pH 8,0 e 9,0( ). 58

Figura 3.2: Efeito do pH na estabilidade da ascorbato oxidase contida

no extrato de Cucurbita máxima, durante 20 horas a 5°C. Tampão citrato-fosfato 0,1M pH 3,0 a 6,0, tampão fosfato 0,1M pH 7,0 e tampão Tris-HCl 0,1M pH 8,0 e 9,0. 59

iii

Figura 3.3: Efeito da temperatura na atividade da ascorbato oxidase a pH 6,0. 60

Figura 3.4: Efeito da temperatura na estabilidade da ascorbato

oxidase durante 60 min. Tampão citrato-fosfato 0,1M pH 6,0. 61 Figura 3.5: Efeito do pH na atividade da ascorbato oxidase pré-

purificada em SDFA a 25°C. Tampão citrato-fosfato 0,1M pH 3,0 a 6,0 ( ) e tampão fosfato 0,1M pH 7,0 e 8,0 ( ). 62

Figura 3.6: Efeito do pH na estabilidade da ascorbato oxidase pré-

purificada em SDFA durante 20 horas a 25°C. Tampão citrato-fosfato 0,1M pH 3,0 a 6,0 e tampão fosfato 0,1M pH 7,0 e 8,0. 63

Figura 3.7: Efeito da temperatura na atividade da AO pré-purificada

em SDFA a pH 6,0. 64 Figura 3.8: Efeito da temperatura na estabilidade da AO pré-purificada

em SDFA durante 60 min. Tampão citrato-fosfato 0,1M pH 6,0. 64 Figura 4.1: Curva de Lineweaver-Burk. Inverso da velocidade inicial

de oxidação do AA em função do inverso da concentração inicial de substrato (R2 =0,98). 73

Figura 4.2: Gráfico semi-logarítimico de Eyring para a determinação

dos parâmetros termodinâmicos da reação enzimática. 74 Figura 4.3: Gráficos semi-logarítimos de Eyring com correlação entre

o tempo e o coeficiente de atividade residual da AO (ψ ) do extrato bruto de C. maxima. 77

Figura 4.4: Gráfico semi-logarítimo de Eyring para a estimativa dos

parâmetros termodinâmicos da inativação térmica irreversível da AO. 79

Figura 4.5: Atividade Integral de AO (P, μm) em função do tempo (t,

min) no extrato bruto de C. maxima a diferentes temperaturas. 81 Figura 5.1: Desenho esquemático da extração contínua em coluna de

discos rotativos perfurados. Os números significam: 1=eixo rotativo central, 2=entrada da fase pesada (sal), 3=saída da fase pesada ou contínua (rafinado), 4=entrada da fase leve ou dispersa (PEG), 5=saída da fase leve (extrativa), 6=entrada de água d refrigeração e 7=saída da água de refrigeração. 86

Figura 5.2: Comportamento de extração da ascorbato oxidase em

PRDC. Proteína total residual na fase sal (rafinado) (-♦-), Proteína total na fase PEG (- -), Atividade total residual na fase sal ( ), Atividade total na fase PEG ( ), após extração com

iv

sistemas PEG 20000/citrato (20% e 15% m/m) e pH 6,0, 23°C±2°C. 92

Figura 5.3: Gráfico de Pareto dos efeitos principais, tendo como variável-resposta o coeficiente de partição da ascorbato oxidase na fase dispersa. Os significados dos símbolos na ordenada da figura são: (1)MMPEG–massa molar do PEG, (2)CPEG-concentração do PEG, (3)citrato-concentração de citrato. 94


concentração de PEG e concentração de citrato) de um planejamento 23, tendo como variável-resposta o coeficiente de partição (K) da ascorbato oxidase. 95


variável-resposta o coeficiente de transferência. Os significados dos símbolos na ordenada da figura são: (1)MMPEG–massa molar do PEG, (2)CPEG-concentração do PEG, (3)citrato-concentração de citrato. 96


concentração de PEG e concentração de citrato) de um planejamento 23, tendo como variável-resposta o coeficiente de transferência de massa (kda) para a extração contínua em PRDC. 97


variável-resposta a eficiência de separação. Os significados dos símbolos na ordenada da figura são: (1)MMPEG–massa molar do PEG, (2)CPEG-concentração do PEG, (3)citrato-concentração de citrato. 98

Figura 5.8: Comportamento de extração da ascorbato oxidase em

PRDC em função do tempo. Proteína total residual na fase sal ou contínua (rafinado) (-♦-), Proteína total na fase PEG ou dispersa (- -), Atividade total residual na fase sal ( ), Atividade total na fase PEG ( ). Extração conduzida com sistemas PEG 20000/citrato (20% e 15% m/m) e ph 6,0, 23°C±2°C. 100


variável-resposta o coeficiente de partição da ascorbato oxidase na fase dispersa do sistema de duas fases aquosas. 102


variável-resposta a recuperação da ascorbato oxidase na fase dispersa do sistema de duas fases aquosas. 105

v

LISTA DE TABELAS

Tabela 2.1 - Níveis das variáveis do planejamento fatorial fracionário (27-2),

utilizadas na extração em SDFA (PEG/Citrato) da ascorbato oxidase. 26 Tabela 2.2 - Níveis das variáveis do primeiro planejamento fatorial completo (22),

utilizados na extração SDFA (PEG/Citrato) da ascorbato oxidase. 27 Tabela 2.3 - Níveis das variáveis do segundo planejamento fatorial completo

(22), utilizados na extração SDFA (PEG/Citrato) da ascorbato oxidase. 27 Tabela 2.4 - Resultados do planejamento fatorial fracionário (27-2) da extração da

ascorbato oxidase na fase superior do sistema PEG/citrato. 31 Tabela 2.5 - Resultados do primeiro planejamento fatorial completo (22) para

extração da ascorbato oxidase no sistema PEG/citrato. 42 Tabela 2.6 - Resultados confirmatórios do sistema selecionado (ensaio 2) de

extração descontínua da ascorbato oxidase em SDFA. 47 Tabela 2.7 - Resultados do segundo planejamento fatorial completo (22) para a

extração da ascorbato oxidase no sistema PEG/Citrato. 48 Tabela 4.1 - Parâmetros Termodinâmicos da reação enzimática e Inativação

Térmica do extrato bruto de C. maxima 75 Tabela 4.2 - Velocidade Específica de Desnaturação da AO (kd), Meia-Vida (t1/2)

e Atividade Integral até t1/2 (P1/2) e Tempo Infinito (P∞) estimados para o extrato bruto de C. maxima a diferentes temperaturas 78

Tabela 5.1 - Planejamento fatorial completo (23) para a extração continua da

ascorbato oxidase em sistema de duas fases aquosas, utilizando PRDC. 88 Tabela 5.2 - Planejamento fatorial completo (22) para a extração continua da

ascorbato oxidase em sistema de duas fases aquosas, utilizando PRDC. 89 Tabela 5.3 - Resultados do planejamento fatorial completo (23) da extração

contínua da ascorbato oxidase em PRDC utilizando PEG/Citrato. 93 Tabela 5.4 - Resultados do planejamento fatorial completo (22) da extração

contínua da ascorbato oxidase em PRDC utilizando PEG/Citrato. 101

vi

LISTA DE SÍMBOLOS A atividade da AO, (mM min-1) Ao atividade inicial da AO, (mM min-1) Ao,max atividade inicial máxima da AO, (mM min-1) CE2A concentração do dímero ativo de AO, (μM) CE2Ao inicial concentração do dímero ativo de AO, (μM) h constante de Planck, (J min) kB constante de Boltzmann, (J K-1) Km constante de Michaelis, (μM) kv velocidade de reação específica, (min-1) kd velocidade específica de desnaturação irreversível da AO, (min-1) P atividade integral da AO, (mM) P1/2 atividade integral da AO até t1/2, (mM) P∞ atividade integral da AO até tempo infinito, (mM) R constante universal do gás ideal, (J mol-1 K-1) r2 coeficiente de determinação, adimensional So concentração inicial de AA, (μM) t tempo de reação, (min) T temperatura, (°C ou K) t1/2 tempo de meia-vida da AO, (min) K coeficiente de Partição, adimensional Pt concentração de proteínas totais na fase superior “top”, (mg/mL) Pb concentração de proteínas totais na fase inferior “bottom”, (mg/mL) At atividade da ascorbato oxidase na fase superior, “top”, (U/mL) Ab atividade da ascorbato oxidase na fase inferior, “bottom”, (U/mL) AA ácido ascórbico AO ascorbato oxidase SDFA sistema de duas fases aquosas PRDC coluna de discos rotativos perfurados E2A dímero ativo da AO E1I monômero inativo da AO PEG polietileno glicol MMPEG massa molar do PEG (g/mol) CPEG concentração de PEG (%) CIT concentração de citrato de sódio (%) AP aumento de pureza, adimensional Y recuperação da enzima na fase PEG (%) KDa coeficiente de transferência de massa (min-1) Es Eficiência de separação (%) H Hold up, adimensional ΔG* energia livre de ativação da reação enzimática, (kJ mol-1) ΔG*D energia livre de ativação da inativação da AO, (kJ mol-1) ΔH* entalpia de ativação da reação enzimática, (kJ mol-1) ΔH*D entalpia de ativação da inativação da AO, (kJ mol-1) ΔS* entropia de ativação da reação enzimática, (J mol-1 K-1) ΔS*D entropia de ativação da inativação da AO, (J mol-1 K-1) ψ coeficiente de atividade residual, adimensional

vii

RESUMO

PORTO, T.S. Extração da ascorbato oxidase de Cucurbita maxima por processo descontínuo e contínuo em coluna de discos rotativos perfurados utilizando sistemas de duas fases aquosas. 2008. 126f. Tese (Doutorado) – Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo, São Paulo. 2008. A partição e purificação de ascorbato oxidase de abóbora (Cucurbita maxima) por extração líquido-líquido em sistema de duas fases aquosas (SDFA), pelos processos descontínuos e contínuos, utilizando coluna de discos rotativos perfurados (PRDC), foram estudadas. Foram utilizados planejamentos estatísticos para selecionar as variáveis significativas no processo descontínuo de purificação, e as variáveis estudadas foram massa molar e concentração do polietileno glicol (PEG), concentração de citrato, pH, concentração de NaCl, fator de diluição e massa total do sistema. Os melhores resultados (coeficiente de partição 1,72, recuperação 90,8% e aumento de pureza 3,12) foram obtidos nas seguintes condições: massa molar do PEG 20000 (g/mol), pH 6,0, concentração de PEG 25% (m/m) e concentração de citrato 10% (m/m). No valor de pH 6,0 e temperatura 35°C a ascorbato oxidase apresentou seus maiores valores de atividade, e manteve a estabilidade na faixa de pH 5,0 a 9,0 durante 36 horas e a temperaturas de até 40°C durante 1 hora. Experimentos também foram realizados para estimar as principais propriedades cinéticas e termodinâmicas da atividade e estabilidade da ascorbato oxidase, e esse estudo revelou que a enzima foi estável nas condições testadas. A PRDC mostrou um bom desempenho para extração da ascorbato oxidase em modo contínuo utilizando SDFA. A melhor condição operacional selecionada neste estudo foi selecionada com o auxílio de planejamentos estatísticos, sendo selecionadas as seguintes condições: massa molar do PEG 20000 (g/mol), concentração de PEG 20% (m/m), concentração de citrato 10% (m/m), velocidade de rotação dos discos de 80 rpm e velocidade da fase dispersa de 2 mL/min. Os melhores resultados em valores médios foram: coeficiente de partição 3,36, recuperação 152%, aumento de pureza 2,31, coeficiente de transferência de massa 0,045, eficiência de separação 43,7% e hold up 0,33. Os dados experimentais demonstram o potencial da aplicação do sistema de duas fases aquosas PEG/citrato para purificar a ascorbato oxidase utilizando coluna de discos rotativos perfurados.

PALAVRAS-CHAVE: Sistemas de duas fases aquosas, Ascorbato oxidase, coluna de discos perfurados rotativos e PEG/citrato.

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ABSTRACT PORTO, T.S. Extraction of ascorbate oxidase from Cucurbita maxima by discontinuous and continuous process in perforated rotating disc contactor using aqueous two-phase systems. 2008. 126f. Thesis (Ph.D) – College of Pharmaceutical Sciences, University of São Paulo, São Paulo. 2008.

The partition and purification of ascorbate oxidase from pumpkin (Cucurbita maxima) by liquid-liquid extraction in aqueous two-phase system (ATPS) by discontinuous and continuous process, using perforated rotating disc contactor (PRDC) was studied. Experimental designs were used to choose the significant variables for discontinuous process, and polyethylene glycol (PEG) molar mass and concentration, citrate concentration, pH, NaCl concentration, dilution factor and total mass of the system, were the variables studied. The better results (partition coefficient 1.72, recovery 90.8% and purification factor 3.12) were obtained with following conditions: PEG molar mass of 20000 g/mol, pH 6.0, PEG concentration of 25% (w/w) and citrate concentration of 10% (w/w). In the pH 6.0 and temperature of 35°C the ascorbate oxidase showed their high activity values and the enzyme was stable in the pH range of 5.0 to 9.0 during 36 hours and temperatures up to 40°C for 1 hour. Experiments were also conducted to estimate the main kinetic and thermodynamic properties of ascorbate oxidase activity and stability, and this study revealed the interesting stability of this enzyme. The PRDC showed a good performance for extracting in continuous mode using aqueous two-phase systems. The best operating condition was selected in this study for the extraction of ascorbate oxidase in the PRDC, and it was obtained with PEG molar mass of 20000 g/mol, PEG concentration of 20% (w/w) and citrate concentration of 10% (w/w), the disc rotational speed of 80 rpm and dispersed phase flowrate of 2 mL/min. The results in mean values were: partition coefficient 3.36, recovery 152%, purification factor 2.31, mass transfer coefficient 0.045, separation efficiency 43.7% and Hold up 0.33. The experimental data showed the potential application of aqueous two-phase systems PEG/citrate to purification ascorbate oxidase using perforated rotating disc contactor. KEY-WORDS: Aqueous two-phase systems, Ascorbate oxidase, perforated rotating disc contactor, PEG/citrate

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OBJETIVOS Objetivo geral

Purificar a enzima ascorbato oxidase (E.C.1.10.3.3.) obtida de

Cucurbita maxima, pelo processo de extração líquido-líquido em sistema de

duas fases aquosas PEG/Citrato, de modo descontínuo e contínuo utilizando

coluna de discos perfurados rotativos.

Objetivos específicos

• Selecionar as variáveis que influenciam a purificação e determinar as

melhores condições do sistema de duas fases aquosas para a extração

descontínua da ascorbato oxidase em sistemas PEG/Citrato. Analisar as

variáveis (massa molar e concentração do polietileno glicol (PEG),

concentração de citrato, pH, concentração de NaCl, fator de diluição e

massa total do sistema) para selecionar o melhor resultado da combinação

das variáveis respostas (recuperação, aumento de pureza e coeficiente de

partição da enzima).

• Avaliar as propriedades físico-químicas da ascorbato oxidase, no extrato

enzimático e no pré-purificado por SDFA, em relação ao pH ótimo,

temperatura ótima, estabilidade ao pH e à temperatura.

• Analisar a cinética e a termodinâmica da ascorbato oxidase, bem como

estimar os seus parâmetros termodinâmicos e a inativação térmica da

enzima.

• Extrair a ascorbato oxidase em coluna de discos rotativos perfurados

(PRDC) utilizando SDFA em processo contínuo. Avaliar a melhor

composição do sistema e os parâmetros operacionais da coluna no

processo de purificação da ascorbato oxidase.

1

INTRODUÇÃO

Os avanços na biotecnologia têm aberto numerosas possibilidades para

a produção em larga escala de diversas biomoléculas que são importantes

para as pesquisas, fármacos e aplicações industriais. O desenvolvimento de

técnicas e métodos para a separação e purificação de proteínas e outras

biomoléculas tem sido parâmetro importante para vários destes avanços na

indústria biotecnológica. Métodos tradicionais para purificar biomoléculas

envolvem muitos passos, tais como diálise, cromatografias de troca iônica e de

afinidade, entre outros. Todavia, a extração líquido-líquido é uma alternativa

interessante de purificação, desde que diversas etapas dos passos iniciais de

processamento possam ser combinadas em uma única operação (MAZZOLA et

al., 2008).

A extração líquido-líquido tem sido extensivamente estudada para

concentração e purificação de biomoléculas principalmente por causa das suas

vantagens intrínsecas, tais como eficiência, versatilidade e baixo custo

(PESSOA-JR; KILIKIAN, 2005, CAVALCANTI et al., 2007; PORTO et al.,

2008). Sistemas de duas fases aquosas (SDFA) podem ser facilmente

aumentados de escala sem significativas mudanças na natureza ou eficiência

do processo. Além disso, a partição de biomoléculas e de moléculas do

polímero entre as fases é rápida, devido à ausência de uma fase sólida.

Poucos segundos são necessários para levar a maioria dos sistemas de duas

fases aquosas para o equilíbrio. Outro benefício é que as fases são

compatíveis com quase todas as proteínas conhecidas, mas a seletividade da

partição das proteínas ainda necessita ser melhor compreendida. Um maior

conhecimento sobre o comportamento das proteínas no sistema de duas fases

aquosas propiciará também a capacidade de estimar a partição da proteína

alvo, freqüentemente encontradas em uma mistura de proteínas heterogêneas

e complexas (SILVA; FRANCO, 2000).

O sistema de duas fases aquosas é formado pela mistura de dois ou

mais polímeros imiscíveis em ambiente aquoso. A separação das fases ocorre

acima de certas concentrações dos componentes das fases. Alternativamente,

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polímeros e sais podem ser usados para a formação dos sistemas de duas

fases aquosas (MAYERHOFF et al., 2004; PORTO et al., 2008). Os sistemas

PEG/sais tem sido introduzidos para a aplicação prática de separação de

proteínas em larga-escala, por causa da maior diferença na densidade entre as

fases, baixa viscosidade e menor custo, levando a uma maior rapidez na

separação quando comparada com os sistemas PEG/dextrana (MARCOS et

al., 2002). A aplicação industrial dos sistemas PEG/sais foi aumentada pela

viabilidade de separadores comerciais, os quais permitiram rápida separação

de proteínas de modo contínuo (SILVA; FRANCO, 2000).

O expressivo número de pesquisas relacionadas com a extração líquido-

líquido nos últimos 20 anos, impulsionou estudos mais aprofundados, de

caráter fenomenológico, relativos a equipamentos de extração. Após décadas

de trabalho para maior detalhamento dos fundamentos da extração líquido-

líquido, foi verificado crescimento considerável da aplicação dessa operação

unitária nas áreas da indústria petroquímica, metalúrgica e de processos

bioquímicos. Em seguida houve uma concentração de esforços para esclarecer

o comportamento de sistemas em equipamentos de extração. Entretanto o

comportamento da interface e o das gotas no interior do extrator ainda não é

bem compreendido (PESSOA-JR; KILIKIAN, 2005).

Dada a importância do sistema de duas fases aquosas e dos

equipamentos de extração por contato diferencial utilizando SDFA, este

trabalho se concentrou no estudo da composição do sistema e das

características operacionais do equipamento para a purificação da ascorbato

oxidase.

O presente trabalho encontra-se dividido em capítulos redigidos sob a

forma de artigos, com exceção do Capítulo I que consiste em uma revisão

bibliográfica do tema abordado nesta tese.

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CAPITULO I REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

1.1. Ascorbato oxidase

O ácido ascórbico ou vitamina C foi inicialmente, isolado e purificado de

páprica, possivelmente devido à alta concentração deste ácido. O conteúdo de

ácido L-ascórbico alto é característico de tecidos vegetais, e o ascorbato é

reconhecido como uma das moléculas antioxidantes mais importantes, tanto no

metabolismo normal de plantas como no metabolismo de células animais

(GARCÍA-PINEDA et al., 2004).

A determinação e/ou monitoramento da vitamina C (ácido ascórbico),

em produtos comercializados e fármacos em geral, é de extrema importância.

O ácido ascórbico, presente em sucos de frutas naturais, oxida-se

rapidamente, e em sucos comercializados a oxidação desse ácido depende da

concentração e tipo de antioxidante utilizado, bem como das características da

embalagem e condições de armazenamento dos produtos (FATIBELLO-FILHO;

VIEIRA, 2002).

A ascorbato oxidase (AO) catalisa a oxidação reversível do ácido

ascórbico para ácido dehidroascórbico com a concomitante redução de quatro

elétrons do oxigênio para água. Esta reação está representada na Figura 1.1.

Figura 1.1: Reação catalisada pela enzima ascorbato oxidase.

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A reação enzimática pode ser facilmente detectada pela diminuição do

coeficiente de extinção do ácido L-ascórbico a 268nm (λ máx. na qual os

produtos da reação não absorvem) ou pelo consumo do oxigênio,

polarograficamente. Pequenas quantidades de peróxido de hidrogênio podem

ser produzidas como subproduto da reação, causando desnaturação

enzimática. Este fenômeno é denominado de reação de inativação

(CARVALHO et al., 1981).

A enzima ascorbato oxidase (EC 1.10.3.3) tem sido extraída de

diversos vegetais, tais como: melão, abóbora, pepino, uva, laranja, pimenta,

tomate, pimentão e carambola. Estudos de purificação, caracterização e

expressão gênica foram realizados, porém, sua função biológica ainda é pouco

conhecida. Sabe-se que extrações, feridas e outras condições de tensão ou

estresse da planta estão relacionados com a modificação dos níveis de ácido

ascórbico (GARCÍA-PINEDA et al., 2004).

Kato e Esaka (2000) propuseram que a AO pode ter um papel

importante no crescimento da planta, na divisão celular e na regulação da

expansão celular, talvez pelo controle dos processos de transporte através da

membrana. Também, a enzima pode ter uma função durante respostas de

estresse modificando os níveis de ácido ascórbico.

A ascorbato oxidase é uma enzima dimérica, contém cobre como

cofator e catalisa a redução de quatro elétrons de dois oxigênios para água,

usando preferivelmente a molécula do ácido ascórbico como substrato. Esta

enzima pertence à família das oxidases azuis multicobres que incluem lacases

(E.C.1.10.3.2) em plantas e microrganismos, e ceruloplasminas (E.C.1.16.3.1)

em animais (SANTAGOSTINI et al., 2004).

As oxidases azuis multicobres formam um subgrupo de cupro-

proteínas, que são classificadas de acordo com suas propriedades

espectroscópicas dos seus íons metálicos (Cu), dividindo-as em três grupos,

cobre tipo 1 ou T1, tipo 2 ou T2 e tipo 3 ou T3 (SAID; PIETRO, 2004). O cobre

T1 é responsável pela intensa coloração azul da AO, enquanto o cobre T2 pela

transferência de elétrons para o O2 (GUPTA et al., 2004). Dois íons de cobre

T3 são ligados através de uma ponte OH e acredita-se de atuar como

receptores de elétrons (MESSERSCHMIDT et al., 1992). Este último pode

ainda formar o arranjo trinuclear T2/T3 (SAID; PIETRO, 2004). AO de plantas

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são homodímeros com cada subunidade contendo um cobre Tipo T1 e um

T2/T3 arranjo trinuclear (MESSERSCHMIDT et al., 1992).

Figura 1.2: Estrutura da enzima ascorbato oxidase (Protein Data Bank /PDB: 1AOZ).

Ascorbato oxidase, isolada de plantas pertencentes à família

Cucurbitaceae, foi caracterizada quanto às propriedades físico-químicas, como

massa molar, ponto isoelétrico, pH ótimo e temperatura ótima para cada

espécie vegetal. Baseado em análise cristalográfica da ascorbato oxidase de

abobrinha (Cucurbita pepo medulosa), foi observado que todos os resíduos de

aminoácidos envolvidos na ligação com o cobre estão situados em quatro

regiões ricas em histidina, a qual exibe uma seqüência de notável homologia

com as oxidases multicobres (SUGINO et al., 2002).

A estrutura da ascorbato oxidase consiste de duas subunidades

idênticas com 552 resíduos de aminoácidos e formadas por três domínios,

predominantemente em estado β-conformacional e foram encontradas poucas

formas helicoidais (MESSERSCHMIDT et al., 1990). A enzima apresenta uma

molécula espectroscopicamente muito complexa porque cada monômero

contém 23 resíduos de tirosina e 14 resíduos de triptofano (DI VENERE et al.,

1998)

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A enzima AO extraída da Cucurbita maxima e da Cucurbita pepo

condensa possuem massa molar de 150 kDa (AMON; MARKAKIS, 1973; LEE;

DAWSON , 1979 ; CARVALHO et al., 1981) e a extraída da Cucurbita pepo

medulosa tem massa molar de 140 kDa (MARITANO et al., 1996). AO é

constituída de duas subunidades idênticas ligadas por duas pontes dissulfeto,

cada subunidade tem uma massa molar de 70 kDa (CASELLA et al., 1999;

SUGINO et al., 2002).

A atividade da AO de Cucurbita maxima demonstrou seguir a lei de

Michaelis-Menten, que depende da ligação com o ácido ascórbico e com o

oxigênio (CARVALHO et al., 1981). AO de C. maxima é considerada

relativamente resistente ao calor, pois sua atividade permaneceu quase

inalterada quando foi incubada a 0-40° C por 30 min, mas a atividade foi

completamente perdida após 1 min a 100°C (CARVALHO et al., 1981). A

ascorbato oxidase dimérica, extraída de pepino, demonstrou ser a forma mais

resistente à inativação térmica (AMON; MARKAKIS, 1973). Todavia, não foram

realizados até agora estudos termodinâmicos sistemáticos, com este sistema

enzimático.

Em virtude da alta seletividade e poder catalítico, as enzimas têm sido

muito empregadas em química analítica, bem como na medicina, agricultura,

tecnologia de alimentos e estudos ambientais. O emprego de enzimas

purificadas foi encontrado em diversos trabalhos, no entanto, há uma carência

de trabalhos que utilizem tecidos e/ou extratos vegetais. Embora o uso de

extratos brutos seja extremamente econômico e possua tempo de vida superior

às enzimas purificadas, estes apresentam certa desvantagem quanto ao seu

uso nos métodos analíticos devido a sua baixa seletividade (FATIBELLO-

FILHO; VIEIRA, 2002).

O Brasil tem uma grande variedade de vegetais que podem constituir

fontes inesgotáveis de enzimas para serem aplicadas nas mais diversas áreas

de conhecimento. Há uma tendência recente de utilização de tecidos vegetais

e/ou extratos brutos, como fonte de enzimas, para confecção de biossensores

e nos procedimentos enzimáticos de análise (JAWAHEER et al., 2003;

CAMPANELLA et al., 2004). AO tem sido usada na composição de

biossensores bem como nas análises clinicas e alimentares do ácido ascórbico

(SHLEEV et al., 2005).

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1.2. Purificação de proteínas

A purificação de produtos biotecnológicos, produzidos por células

microbianas, animais ou vegetais, constitui a etapa complexa do processo,

dada as variadas características dos meios e das biomoléculas de interesse,

como as proteínas, aminoácidos, antibióticos, polissacarídeos e hormônios. Em

resultado à variedade de características, as etapas de purificação são tão ou

mais desafiantes que o estudo de produção, pois não há processos de

purificação de aplicação geral. No entanto, a purificação pode ser dividida em

quatro etapas genéricas: separação de células; concentração e/ou purificação

de baixa resolução; purificação de alta resolução; e operações para

acondicionamento final do produto (PESSOA-JR; KILIKIAN, 2005).

O impulso nas pesquisas de desenvolvimento, na área de

biosseparação, tem sido limitado pela dificuldade e complexidade dos

processos aplicados aos produtos farmacêuticos e biológicos. Cerca de 50 a

90% do custo de produção para um produto biológico reside na estratégia de

purificação. Existe a necessidade de se obter técnicas de biosseparação em

larga escala que sejam: eficientes, econômicas, que atinjam altos graus de

recuperação e pureza, mantendo a atividade biológica da molécula. Uma

promissora técnica de extração e purificação, que se enquadra nestes critérios,

e já vem sendo utilizada industrialmente, envolve a partição de biomoléculas

entre duas ou mais fases imiscíveis nos sistemas aquosos (DIAMOND; HSU,

1992, DYR; SUTTNAR, 1997).

A recuperação de produtos biotecnológicos é essencial em muitos

processos industriais, e a dificuldade nos processos de recuperação depende

significativamente da natureza do produto. Com isso, sob o ponto de vista

econômico, o desenvolvimento e otimização de processos de recuperação e

purificação de proteínas passaram a ser de vital importância na produção

industrial dessas biomoléculas (SEADER; HENLEY, 1998).

A definição de processo de purificação depende da aplicação final da

molécula-alvo, suas características físico-químicas, bem como aquelas das

impurezas. Há produtos (enzimas industriais) cuja aplicação não requer

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elevado grau de pureza, de modo que operações cromatográficas não são

necessárias e, por vezes, a simples concentração do meio é suficiente para a

comercialização e o uso. Produtos farmacêuticos (diagnósticos e terapêuticos)

são os que requerem maior grau de pureza e, portanto, a complexidade do

processo de purificação é elevada (PESSOA-JR; KILIKIAN, 2005).

1.3. Sistema de Duas Fases Aquosas (SDFA)

Os sistemas de duas fases aquosas foram inicialmente descritos na

literatura por Beijerick (1896), quando ele descobriu que ao se misturar

gelatina, ágar e água, em certas concentrações formava um sistema de duas

fases, sendo a fase superior rica em gelatina e a fase inferior rica em ágar.

Posteriormente, nos anos 50, Per-Aka Albertsson descobriu que o polietileno

glicol (PEG), fosfato de potássio e água, assim como PEG, dextrana e água

formavam sistemas de duas fases. Os sistemas PEG/dextrana/água e

PEG/sal/água têm sido, desde então, os mais freqüentemente investigados e

utilizados para purificação de um grande número de biomoléculas (DIAMOND;

HSU, 1992; COSTA et al., 1998; COSTA et al., 2000; OLIVEIRA et al., 2001).

Os sistemas de duas fases aquosas são geralmente formados por uma

solução aquosa de dois polímeros hidrófilos, ou de um polímero com

determinados sais. Acima da concentração crítica destes componentes ocorre

espontaneamente a separação de fases, predominando um ou outro

componente em cada uma das duas fases resultantes (TUBIO; NERLI; PICÒ,

2004).

Uma das características importantes dos sistemas de duas fases

aquosas é sua composição de cerca de 85-99% do seu conteúdo em água, o

que permite a partição de biomoléculas e de partículas celulares em condições

não desnaturantes. As propriedades físicas dos sistemas bifásicos aquosos

podem ser alteradas por manipulação de sua concentração e composição dos

polímeros e sais. Deste modo, a partição de moléculas e de partículas

biológicas pode ser explorada para obtenção de separações, que de outro

modo seriam difíceis ou mesmo impossíveis de serem realizadas (GAVASANE;

GAIKAR, 2003).

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Os sistemas bifásicos aquosos têm um grande potencial para a

eficiente separação e baixo custo das proteínas que podem ser difíceis de

separar em grande escala. Estes sistemas têm vantagens importantes em sua

habilidade de extrair pequenos materiais particulados (extração direta do meio

fermentado) e de obter grandes volumes em uma modalidade contínua com

tempo de contato curto. Entretanto, os recentes avanços em obter elevados

fatores de purificação para a separação da proteína alvo de seus

contaminantes usando SDFAs, foram bem sucedidos na escala de laboratório e

em operações industriais. Isto é, em parte, devido ao conhecimento da

engenharia básica e do entendimento dos sistemas (MERCHUK et al., 1998).

As ótimas condições para a recuperação e altos fatores de purificação

têm sido obtidas para várias proteínas que foram estudadas. Isto é comumente

feito seguindo um procedimento semi-empírico que inclui estudos

experimentais dos efeitos das variáveis que influenciam o sistema. Como um

exemplo típico tem-se a separação e purificação da proteína taumatina, que foi

purificada em 20 vezes e recuperação de 90-95% alcançados em um único

passo usando SDFA (CASCONE et al., 1991). Isto também foi realizado para

anticorpos monoclonais (NIELSEN; ASENJO, 1991).

A técnica de separação em sistemas de duas fases aquosas é

aconselhável para purificação de proteínas em larga escala (“scale-up”) porque

possibilita separação seletiva, uma baixa tensão superficial, biocompatibilidade,

bem como boa relação custo-benefício. Quando comparada com outras

técnicas de recuperação, o SDFA apresenta diversas vantagens, como:

operação rápida e contínua, altos rendimentos, baixo custo dos materiais,

reciclagem dos polímeros e minimização da desnaturação de proteínas

(CASCONE et al., 1991).

O desenvolvimento de extrações líquido-líquido utilizando sistema

bifásico aquoso em grande escala está muito limitado aos sistemas de

PEG/dextrana e PEG/sal. Estes possuem propriedades físicas favoráveis,

especialmente no que se refere à viscosidade e à diferença de densidade entre

as fases. Esta escolha é bastante influenciada por questões a que os

processos de produção têm que obedecer, tanto o PEG como a dextrana são

substâncias atóxicas e não causam distúrbios ao ambiente (SARMENTO et al.,

1994).

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Nos últimos anos, o interesse pela extração em sistema de duas fases

aquosas tem aumentado devido a sua aplicação na separação e purificação de

proteínas e enzimas tais como: purificação de ricina B (ZHANG et al., 2005),

xilose redutase (MAYERHOFF et al., 2004), fosfolipase D (TEOTIA; GUPTA,

2004); purificação de corantes: ficoeritrina B (BENAVIDES; RITO-

PALOMARES, 2004), luteína (CISNEROS et al., 2004), policetideos

(ESMANHOTO; KILIKIAN, 2004) e toxina alfa de Clostridium perfringens

(CAVALCANTI et al., 2007). Todavia, apesar da importância das técnicas de

sistemas de duas fases aquosas para o futuro das tecnologias de

biosseparação, pouco é conhecido sobre as interações básicas moleculares da

partição protéica (LIN et al., 2003, TUBIO; NERLI; PICÒ, 2004).

Outro aspecto importante é que para produtos que exigem elevado grau

de pureza, a extração em SDFA não é suficiente e, nesses casos, será

sucedida por uma ou mais etapas cromatográficas. Assim o sistema de duas

fases aquosas é considerado uma etapa de purificação parcial ou de baixa

resolução (PESSOA-JR; KILIKIAN, 2005).

1.4. Polietileno glicol O polietileno glicol (PEG) é um composto de grande importância para as

áreas biomédicas e de biomateriais. É produzido mundialmente em grandes

quantidades e com massas molares variando de poucas centenas a milhares

de Daltons. A designação PEG é usada para compostos de baixa massa molar

(abaixo 20.000g/mol) e a designação PEO poli (óxido de etileno) é restrito para

compostos de altas massas molares (maiores que 20.000g/mol). Os PEGs com

massas molares menores que 1.000g/mol são fornecidos na forma de soluções

incolores estáveis ou pastas. Os polímeros de massas molares elevadas,

acima de 1.000g/mol, são encontrados na forma de pó ou flocos brancos. Pode

ser estocado à temperatura ambiente, embora a 4°C, a ocorrência de oxidação

em soluções seja retardada (HARRIS, 1992).

A utilização do PEG é de grande interesse na biotecnologia

principalmente por excluir, em ambiente aquoso, outros polímeros de sua

vizinhança, não se solubilizando com eles. Por serem compostos

biodegradáveis e atóxicos, o descarte de PEG não é problemático para o meio

ambiente. O PEG possui uma variedade de propriedades pertinentes para

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aplicações biomédicas, são elas: insolubilidade em água a elevadas

temperaturas, forma complexos com cátions metálicos, alta mobilidade com

grande poder de volume excluído em água, agente precipitante de proteínas e

ácidos nucléicos. Vale ressaltar que o PEG foi aprovado para consumo interno

pelo FDA (Food and Drug Administration) (LI; KAO, 2003).

1.5. Fatores que influenciam o sistema de duas fases aquosas.

A aplicação biotecnológica do SDFA é influenciada pela habilidade de

desenvolver modelos e correlações que permitam compreender como ocorre a

interação entre as propriedades físico-químicas das proteínas e das fases do

polímero e do sal na partição nestes sistemas (OLIVEIRA–NAPPA et al., 2004).

São diversos os fatores que influenciam o sistema de duas fases

aquosas e a seleção das condições adequadas para a extração da proteína de

interesse ainda é empírica. Os fatores se dividem em duas categorias, aqueles

inerentes ao próprio sistema (tipo e concentração do polímero, tipo e

concentração do sal, pH, etc.) e os fatores inerentes à biomolécula (massa

molar, hidrofobicidade, conformação e carga) (OLIVEIRA et al., 2001;

PESSOA-JR; KILIKIAN, 2005).

1.5.1. Massa molar e concentração do polímero

Em geral, o aumento da massa molar do polímero diminui a partição do

material biológico para a fase rica em polímero. Quanto maior a massa molar

do polímero, menor é o volume de solvente disponível, o que implicaria em

uma diminuição da solubilização das proteínas hidrofílicas na fase rica em

polímero (ALBERTSSON, 1986).

O efeito da massa molar dos polímeros por sua vez depende da massa

molar da biomolécula a ser separada. No caso das proteínas, aquelas com

massas molares maiores são mais influenciadas pelas mudanças na massa

molar dos polímeros que as proteínas com pequena massa molar. Segundo

Schmidt et al. (1994) o PEG é capaz de excluir as proteínas sem desnaturação

de acordo com o aumento da sua massa molar (“Efeito do volume excluído”).

Este fenômeno de volume excluído observado com freqüência em sistemas

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PEG/sal, tem sido visto também em sistemas polímero/polímero, nos quais o

PEG faz parte de uma das fases (TUBIO; NERLI; PICÓ, 2004).

Além desse efeito, a massa molar do PEG participa da interação hidrofóbica,

onde aumentando a massa molar há um aumento na capacidade de interação

com proteínas hidrofóbicas. Aparentemente, isto é Independente do volume

excluído, pois PEG com grande massa molar possui a capacidade de formar

ligações intramolecular, assim adquirindo uma conformação mais compacta

(TUBIO; NERLI; PICÓ, 2004; FARRUGIA; NERLI; PICÓ, 2003).

Com relação à concentração do polímero, tem sido demonstrado que o

aumento da concentração do PEG causa um decréscimo da partição das

proteínas, mas este comportamento não é regra geral, depende do tipo do

sistema (SCHIMIDT et al., 1994).

Próximo ao ponto crítico do sistema, que representa a concentração

mínima para a formação de sistemas de duas fases aquosas, moléculas como

proteínas particionam quase igualmente entre as fases. Se a concentração do

polímero é aumentada, ou seja, a composição das fases do sistema desvia

mais do ponto crítico, a partição da proteína terá preferência por uma das fases

dependendo das características da biomolécula (DIAMOND; HSU, 1992). A

concentração do polímero tem sido relatada como um dos fatores que

influenciam a partição de proteínas em sistemas de duas fases aquosas,

principalmente em sistemas PEG/sal (CASCONE et al., 1991). Por isto tem

sido usada como variável de estudo (ESMANHOTO; KILIKIAN, 2004;

CISNEIROS et al., 2004; BENAVIDES; RITO–PALOMARES, 2004).

A viscosidade das fases também aumenta com o aumento da

concentração do polímero e isto pode influenciar a partição da proteína alvo

(ASENJO, 1990; ZHI et al., 2005; SHIBUSAWA et al 2006). A concentração do

polímero a ser usada para a separação de fases depende da massa molar do

mesmo, tem sido observado que o aumento da massa molar do polímero leva

ao uso de baixas concentrações do polímero (DIAMOND; HSU, 1992).

1.5.2. pH

O pH influencia na participação de biomoléculas carregadas

eletricamente, como por exemplo, as proteínas em sistemas de duas fases

13

aquosas, pois a dissociação dos grupos ionizáveis dessas moléculas altera as

cargas de sua superfície e do seu coeficiente de partição (COSTA et al., 1998).

A separação de moléculas carregadas em sistemas de duas fases aquosas

contendo sais tamponantes depende da carga líquida do biomaterial, em

função do pH da solução.

Mudanças no pH podem também induzir mudanças conformacionais na

estrutura das proteínas, causando mudanças em seus comportamentos de

separação. As partições das proteínas e enzimas são dependentes dos seus

pontos isoelétricos (pIs). O ponto isoelétrico pI é o valor de pH no qual a

proteína tem igual número de cargas positivas e negativas. Para valores de pH

acima do ponto isoelétrico os resíduos de aminoácidos expostos na superfície

da proteína se carregam negativamente, tornando a proteína carregada

negativamente. Situação inversa ocorre quando o pH é abaixo do pI (GAUTAM;

SIMON, 2006). Como regra geral, as proteínas carregadas mais negativamente

(nos casos em que o pH é superior ao ponto isoelétrico) têm maior afinidade

pela fase superior que é rica em PEG (ENGEL et al., 2000). Além disso, um

aumento na concentração do íon mais carregado negativamente pode

aumentar a força de repulsão entre a fase inferior rica em sal e a proteína, Os

sais causam mudança na carga eletrostática do SDFA e influenciam na

distribuição de aminoácidos e proteínas carregadas (SHANG et al., 2004).

O aumento do coeficiente de partição relacionado com o aumento do pH

tem sido observado para várias proteínas e a manipulação do pH tem sido

explorada para obter uma separação diferencial de proteínas em uma

variedade de esquemas de purificação. A influência do pH na separação de

várias proteínas puras e de homogeneizados de leveduras tem sido estudada

por Huddleston et al. (1991).

A maioria das proteínas, com ponto isoelétrico na região ácida, são

carregadas negativamente na região de pH neutra, por isso se direcionam para

a fase superior e o coeficiente de partição aumenta ao redor do pH 7, aumento

assim a concentração do íon fosfato. Este fenômeno foi observado por Han e

Lee (1997), quando estudaram a partição de albumina de soro bovino em

SDFA PEG/fosfato, como modelo. Eles observaram também que a protease

neutra produzida por Bacillus subtilis, se direcionou para a fase sal nos

14

sistemas com alta concentração de fosfato por causa da sua carga positiva a

pH neutro (HAN; LEE, 1997).

1.5.3. Adição de sais

A adição de sais, mesmo que em concentrações milimolares, influencia

fortemente a partição de materiais eletricamente carregados. Embora os sais

se distribuam quase que igualmente entre as fases, existem pequenas

diferenças nos coeficientes de partição de diferentes sais, o que significa que

diferentes íons possuem diferentes afinidades pelas fases, criando uma

diferença de potencial elétrico entre as fases, que por sua vez direciona a

partição de materiais biológicos carregados (SARUBBO, 2000).

O deslocamento da curva binodal da origem foi observado com a

adição de NaCl. Todavia o aumento da concentração de NaCl não causa

grande diferença na forma da curva binodal (MARCOS et al., 1999). Diversos

autores (ASENJO, 1990; SCHIMIDT et al., 1994; GÜNDÜZ; KORKMAZ, 2000)

observaram que a adição de NaCl em sistemas PEG/sal aumenta a diferença

na hidrofobicidade das fases, promovendo a partição de proteínas hidrofóbicas

para a fase superior do sistema, aumentando assim a resolução do sistema.

Isto significa que a diferença no coeficiente de partição aumenta com a

concentração de NaCl (MARCOS et al., 2002).

Em sistemas PEG/sal, a adição de outros sais interfere no coeficiente de

partição, pois, existe uma partição desigual entre eles, formando uma diferença

de potencial elétrico. Além disso, íons mais hidrofóbicos se direcionam para a

fase PEG, carregando proteínas igualmente hidrofóbicas e cátions induzem a

transferência de proteínas para a fase PEG, como observado por Farrugia,

Nerli e Picò (2004). Os autores ressaltaram a importância da concentração de

sais no direcionamento de proteínas como albumina bovina sérica,

ovoalbumina, lisozima, tripsina para a fase PEG. Observaram também que um

aumento na concentração dos sais promove uma diminuição do efeito de

volume excluído, devido à perda de água ligada ao polímero. Vale salientar que

estes fenômenos foram visto em baixas concentrações de sais, pois existe o

efeito de saturação.

15

1.5.4. Temperatura

A influência da temperatura em sistemas de duas fases aquosas é

bastante complexa por causa de seu efeito na composição das fases em

equilíbrio, assim como na alteração da estrutura da biomolécula, com

possibilidade de desnaturação. Alguns trabalhos (FORCINITI et al., 1991;

DIAMOND; HSU, 1992; SARUBBO et al., 2004) relatam aumento do coeficiente

de partição com a temperatura e outros afirmam que não há relação entre

essas duas variáveis (JOHANSSON et al., 1973; TJERNELD et al., 1985).

Essas contradições apresentadas na literatura mostram a necessidade de

estudos mais aprofundados para se esclarecer o seu efeito na partição e a

determinação dos seus parâmetros termodinâmicos.

1.6. Sistemas de duas fases aquosas (SDFA)

Os sistemas de duas fases aquosas formados por PEG/sais de fosfato

têm sido amplamente utilizados para extração de proteínas diversas

(SRINIVAS et al., 1999; GÜNDÜZ; KORKMAZ, 2000; MAYERHOFF et al.,

2004; CAVALCANTI et al., 2007), mas outros sais estão sendo utilizados para

a composição dos sistemas, tais como, sulfato de amônio (TRINDADE et al.,

2005) e citrato de sódio (OLIVEIRA et al., 2001; MARCOS et al., 2002).

O trabalho realizado por Vernau e Kula (1990) utilizando PEG e citrato

para extração de R-Oxinitrilase apresentou resultados interessantes. A

utilização do citrato no trabalho foi justificada por apresentar vantagens em

relação ao uso de outros sais equivalentes, como o fosfato e o sulfato, por

apresentar alta seletividade e por razões econômicas e ambientais. Avaliando

os resultados obtidos por Vernau e Kula (1990) e por Oliveira et al. (2001)

pode-se concluir que o sistema de duas fases aquosas envolvendo um

polímero, o PEG, e um sal, como o citrato de sódio, pode ser aplicado para a

extração ou pré-purificação de proteínas. O citrato é um sal biodegradável e

pode ser reciclado ou pode ser descarregado em plantas de tratamento de

água com resíduos biológicos. Uma desvantagem que deve ser considerada é

16

a atividade quelante do citrato de sódio, que pode interferir em reações que

envolvam íons metálicos durante o processo extrativo.

O sistema de duas fases aquosas utilizando PEG/citrato vem sendo

utilizado como uma alternativa para a purificação de biomoléculas, que

possuem aplicação na indústria de medicamentos. Marcos et al. (1999 e 2002)

utilizaram o sistema PEG/citrato e purificaram a enzima Penicilina acilase,

produzida por Escherichia coli, que na indústria farmacêutica participa na

produção de antibióticos β-lactâmicos semi-sintéticos, tais como ampicilina e

amoxilina.

Vários sistemas são utilizados atualmete como PEG-sais e outros

compostos de dextrana, amido, e derivados celulósicos, devido à vantagem de

serem biodegradáveis. Sarubbo (2000) e Oliveira et al. (2002) estudaram um

novo sistema de duas fases aquosas formado por PEG e goma de cajueiro

(POLICAJU) a qual mostrou potencial utilização como polímero para formação

de sistemas aquosos. Os autores afirmam que a disponibilidade de um

polímero barato para a partição de fases favorece economicamente o uso

conjunto com PEG na separação de biomoléculas.

1.7. Equipamentos para extração utilizando sistemas de duas fases aquosas

Extratores e colunas de extração líquido-líquido têm basicamente duas

funções: i) estabelecer o contato entre as duas fases líquidas presentes no

sistema, em geral pela dispersão de uma fase na outra, com o objetivo de

possibilitar a transferência de massa; e ii) separar os dois líquidos depois da

extração. A mistura de dois líquidos consiste geralmente em um conjunto de

gotas de uma fase dispersa no contínuo da outra (PESSOA-JR; KILIKIAN,

2005).

A escolha de um extrator é função da natureza dos produtos e das

características físicas e químicas do sistema em estudo, além de ser função do

desempenho do equipamento, considerando-se as condições de extração.

Para o desenvolvimento de equipamentos de extração líquido-líquido, deve-se

avaliar além do sistema de trabalho, os dados de equilíbrio e de transferência

de massas nas temperaturas de interesse (RABELO, 1999).

17

A utilização de extratores verticais nos processos de extração líquido-

líquido é justificada pelo fato desses equipamentos ocuparem pequena área,

terem boa eficiência de separação e apresentarem facilidades de operação e

manutenção. Além disso, nesses equipamentos, os processos de transferência

de massa e separação das fases são mais rápidos, e o sistema pode atingir o

equilíbrio, ou aproxima-se dele, em um período de tempo menor do que em

outros tipos de equipamentos (PORTO et al., 2000).

Existem vários tipos de equipamento ou colunas descritos na literatura

sendo utilizados com o sistema de duas fases aquosas, tais como: coluna

spray (SRINIVAS et al., 2002), coluna graesser (GIRALDO-ZUNINGA et al,

2005 e 2006), coluna empacotada (IGARASHI et al., 2004), York-scheibel

(JAPARABAD et al.,1992), coluna PRDC (TAMBOURGI; PEREIRA, 1993;

PORTO et al., 2000; SARUBBO et al., 2003; CUNHA et al., 2003; PORTO et

al., 2004; SARUBBO et al., 2004).

Em todos eles é de fundamental importância o estudo da transferência

de massa, fenômeno definido como o transporte de um constituinte de uma

região de maior concentração para outra de menor concentração, até que o

sistema entre em equilíbrio (SARUBBO, 2000). O estudo da transferência de

massa visa avaliar o quanto o sistema se aproxima do equilíbrio. Com isso

podemos definir um limite ideal de operação para o extrator.

Para avaliar a transferência de massa é necessário compreender o

funcionamento das gotas, pois a mistura de dois líquidos consiste geralmente

em um conjunto de gotas, que por apresentarem pequeno diâmetro garantem

elevada área de contato entre as fases, podendo possibilitar boa transferência

de massa. Mas se o tamanho das gotas for muito pequeno podem ocorrer

dificuldades para posterior decantação e separação das duas fases (PESSOA-

JR; KILIKIAN, 2005).

Nos equipamentos de extração líquido-líquido, em sistema

contracorrente, a transferência de massa ocorre numa dispersão de gotas que

fluem pela gravidade através da fase líquida contínua, sendo a coluna de

discos rotativos um exemplo destes equipamentos (SARUBBO, 2000).

Num processo de extração, existem diversos fatores que influenciam o

desempenho do extrator, principalmente em escala industrial. Durante o

processo vários fenômenos acontecem no interior do extrator, alguns dos quais

18

prejudicam a transferência de massa. Os mais conhecidos estão definidos

abaixo:

• “Hold up”: é a fração retida da fase dispersa, que é a razão do volume

da fase dispersa pelo volume total do equipamento;

• Inundação: quando as condições de operação na coluna fazem com

que seja impossível o escoamento em contracorrente, e uma fase

se dispersa na outra. Nesta situação as correntes entram e saem

da coluna numa mesma extremidade;

• “Backmixing" (mistura axial): é o retorno axial da fase dispersa. A fase

dispersa escoa em sentido oposto ao esperado. Ele faz com que

o gradiente de concentração, que é a força motriz da

transferência de massa na coluna, diminua, prejudicando a taxa

de transferência de massa e a eficiência de separação;

• “Backflow”: é o retorno axial da fase contínua. Ocorre quando a fase

contínua é carregada na direção oposta à esperada.

1.7.1. Coluna de discos perfurados rotativos (PRDC)

Com a finalidade de melhorar a transferência de massa, aumentando a

área interfacial entre as fases e diminuindo o tamanho das gotas tem-se

recorrido a colunas mecanicamente agitadas. Entre esses tipos de coluna

estão as colunas de discos rotativos (RDC), que foram primeiro sugeridas por

Reman em 1951. A coluna de disco rotativo é um equipamento utilizado para

extração contínua em contracorrente.

Em 1971, Pope e Shah apresentaram a coluna de discos perfurados

rotativos (PRDC) que era similar à coluna de discos rotativos proposta

anteriormente por Reman, com a diferença nas perfurações nos discos. Esta

modificação promoveu um aumento nas taxas de transferência de massa e na

eficiência da coluna como foi relatado pelos autores. Desde então a PRDC

(Figura 1.3) tem sido usada na extração líquido-líquido.

19

Figura 1.3: coluna de discos perfurados rotativos em operação (a), e em (b)

vista frontal da coluna com mais detalhes, onde se pode observar o eixo com os discos e as bombas de alimentação, a alimentação da fase leve e drenagem da fase pesada será realizada pela parte inferior da coluna, e pelo topo da coluna ocorreu a alimentação da fase pesada e drenagem da fase leve.

Tambourgi e Pereira (1993), utilizando o sistema ácido acético-butanol-

água, relataram os resultados obtidos com uma coluna PRDC, variando os

espaçamentos e o número de discos, bem como a velocidade de rotação. Os

resultados obtidos demonstraram que o número de discos influencia a

eficiência de separação, tendo sido observado maior eficiência de separação

para 7 discos do que para 5 discos testados. Segundo os autores, este

fenômeno é devido ao fato de que elevado grau de agitação causa maior área

interfacial refletindo num maior valor de coeficiente de transferência de massa.

Resultados semelhantes foram obtidos por Carneiro-Da-Cunha et al. (1994),

que utilizaram uma coluna PRDC para extração de cutinase recombinante com

sistemas micelares, obtendo um rendimento de extração 78% em

proteína.Porto et al. (1997) utilizando uma coluna PRDC para extração do

citocromo b5 recombinante com sistema PEG-fosfato, obtiveram um

rendimento de 75% em proteína.

Coimbra et al. (1998) estudaram a fração retida da fase dispersa (“hold

up”) em uma coluna PRDC com sistema PEG-fosfato. Porto et al. (2000)

avaliaram o hold up para albumina de soro bovino em uma coluna PRDC com

sistema PEG-fosfato. Sarubbo et al. (2003) utilizaram um novo sistema de duas

(B)(A)

20

fases aquosas PEG-POLICAJU em uma coluna PRDC para extração de

albumina de soro bovino.

Porto et al. (2004) avaliaram a transferência de massa e eficiência de

separação para a enzima ascorbato oxidase em PRDC com sistema PEG-

fosfato. Sarubbo et al. (2004) estudaram a eficiência de separação da coluna

PRDC utilizando sistema de duas fases aquosas PEG-POLICAJU para

extração de albumina de soro bovino, e obtiveram uma eficiência de separação

de 96%.

1.8. Aplicação de planejamentos experimentais em SDFA

A separação das proteínas em duas fases depende da natureza do

polímero e da sua massa molar, concentração do polímero e do sal,

composição iônica e força, e pH do sistema, juntos com o tamanho, carga e

hidrofobicidade da molécula, que são as principais variáveis que interferem

com o coeficiente de partição. As variáveis e mecanismos que causam a

distribuição desigual de proteínas entre as fases são pouco conhecidos, mas

regras empíricas têm sido desenvolvidas. A utilização de planejamentos

experimentais é uma ótima ferramenta para se conhecer os principais fatores

relacionados com cada tipo de extração e tipo de proteína que se quer separar.

Costa et al. (2000) avaliaram a influência de 5 variáveis (pH, massa

molar do PEG e concentração de PEG, concentração de fosfato e de NaCl) na

partição do complexo xilanolítico em SDFA, usando um planejamento

experimental 25. A análise estatística dos resultados mostrou que as variáveis

massa molar do PEG, concentração de PEG e concentração de NaCl

exerceram um efeito significativo sobre o valor do coeficiente de partição.

Marcos et al. (2002) otimizaram a purificação da penicilina acilase

utilizando o sistema PEG/citrato de sódio com o auxílio de um planejamento

experimental fatorial 23 , onde as variáveis estudadas foram as concentrações

de PEG com massa molar 3350 (g/mol), citrato de sódio e NaCl.

Mayerhoff et al. (2004) utilizaram um planejamento experimental 24 para

avaliar a influência das variáveis massa molar do PEG, concentração do PEG,

concentração de fosfato e concentração de NaCl, na extração de xilose

redutase utilizando sistemas de duas fases aquosas.

21

A elaboração de planejamentos experimentais tem sido de fundamental

importância nestes estudos, pois reduziu o número de experimentos

necessários, selecionando as principais variáveis que interferem

significativamente no SDFA e ainda indicam os efeitos das variáveis e as

interações entre elas.

A utilização de um planejamento estatístico para avaliar a extração da

toxina alfa de Clostridium perfringens em uma coluna de disco perfurado

rotativo foi recentemente relatada na literatura (CAVALCANTI et al, 2007). Esta

ferramenta já provou ser eficiente em sistema descontínuo, e também auxiliou

no estudo da aplicação da PRDC para extração contínua de biomoléculas com

sistema de duas fases aquosas (PEG/sais).

22

CAPITULO II Sistemas de duas fases aquosas PEG/Citrato: Estudo das variáveis que influenciam a partição e purificação da ascorbato oxidase de Cucurbita maxima

Tatiana Souza Portoa,b, Camila Souza Portob, Maria Taciana Holanda

Cavalcantia,b, Benício de Barros Netoc, José Luiz Lima-Filhob, Ana Lúcia

Figueiredo Portob,d, Adalberto Pessoa-Jra*

aDepartamento de Tecnologia Bioquímico-Farmacêutica /FCF,

Universidade de São Paulo; bLaboratório de Imunopatologia Keizo Asami

(LIKA), UFPE; cDepartamento de Química Fundamental, UFPE; dDepartamento

de Morfologia e Fisiologia Animal, UFRPE.

Endereço do autor para correspondência: Adalberto Pessoa Júnior Av. Prof. Lineu Prestes, 580 – Bloco16 CEP: 05508-950, São Paulo, SP, Brasil. Tel: (11) 3091-3710 Fax: (11) 3094-3694 e-mail: [email protected]

Artigo a ser submetido para publicação no periódico Journal of

Chromatography B.

Parte dos resultados foram apresentados na forma de resumo na X

Semana Farmacêutica de Ciência e Tecnologia da USP

23

2.1. INTRODUÇÃO

A ascorbato oxidase é a enzima utilizada para determinar o conteúdo de

ácido ascórbico na indústria farmacêutica, na alimentícia (suco de frutas,

vinhos, etc.) e nas análises clínicas (FATIBELLO-FILHO; VIEIRA, 2002;

SHLEEV et al., 2005), sendo esta enzima isolada de plantas, principalmente as

pertencentes à família Cucurbitaceae (SUGINO et al., 2002).

As técnicas utilizadas atualmente para purificação dessa enzima fazem

com que o seu custo de produção seja elevado. Com isso, o desenvolvimento

de processos alternativos e com potencial para redução de custos é

interessante. A aplicação do sistema de duas fases aquosas (SDFA) é

proposta como alternativa para extração e purificação da ascorbato oxidase,

pois permite a separação e análise de biomoléculas. Esta técnica é

aconselhável para purificação em larga escala pela possibilidade de partição

seletiva com altas recuperações, além de apresentar uma boa relação custo-

benefício (SILVA; FRANCO, 2000; PESSOA-JR; KILIKIAN, 2005; MAZZOLA et

al., 2008).

Diferentes parâmetros influenciam o sistema de duas fases aquosas: (i)

a massa molar do PEG – a forma das moléculas de PEG que poderia ser

capaz de distribuir as biomoléculas, quanto maior for a massa molar do PEG,

maior a viscosidade e maior dificuldade para separação e equilíbrio das fases;

(ii) concentração de polímero e de sais – interferência no diagrama de fases;

(iii) pH – determina a hidrofobicidade e hidrofilicidade das biomoléculas,

mudando o seu comportamento de partição. Outros fatores também

influenciam os sistemas aquosos e o comportamento de partição das

biomoléculas, são eles os fenômenos de salt-in, salt-out, densidade, interações

bioespecíficas (afinidade ou repulsão), e temperatura (MAZZOLA et al., 2008).

Diversos autores estudaram as características de sistemas PEG/sais

para a extração de diferentes biomoléculas (MARCOS et al., 2002;

CAVALCANTI et al., 2006; PORTO et al., 2008). Costa et al. (1998)

investigaram a partição de xilanase, utilizando uma ferramenta estatística, com

o objetivo de identificar os fatores chave que governavam a partição da enzima.

Eles avaliaram cinco fatores ou variáveis (concentração e massa molar do

24

PEG, concentração de fosfato, pH e concentração de NaCl) e conseguiram

identificar quais as principais influências e seus efeitos.

A análise estatística dos experimentos é uma ferramenta

frequentemente utilizada para otimização e controle dos processos envolvendo

SDFA. É um método adequado para estudar o efeito das variáveis envolvidas

no processo de purificação, porque é capaz de estimar seus efeitos

significativos nas respostas de interesse, bem como as suas possíveis

interações (BALASUBRAMANIAM et al., 2003; PORTO et al., 2007).

O objetivo deste trabalho foi identificar as variáveis que influenciam a

partição e purificação da ascorbato oxidase, e utilizar estas variáveis para o

estudo de purificação da enzima em SDFA (PEG/citrato).

2.2. MATERIAL E MÉTODOS

2.2.1. Ascorbato oxidase

A ascorbato oxidase (E.C.1.10.3.3.) foi extraída da abóbora Cucurbita

maxima, conhecida regionalmente no nordeste, como jerimum, variedade

“jerimum caboclo”.

2.2.2. Preparo do Extrato Enzimático As abóboras foram descascadas a uma profundidade de

aproximadamente 3mm. Ao tecido foi adicionado tampão citrato/fosfato 0,1M,

pH 6,0, mantendo a relação de 1g de tecido por 1,5mL de tampão. Em seguida

foi realizada a homogeneização do extrato com o auxílio de um processador de

alimentos, por 5 min. Após a centrifugação do homogeneizado a 13.000xg por

10 min a 0-4°C, o precipitado foi desprezado, e o sobrenadante foi denominado

extrato bruto, que foi armazenado a -20°C. Com a finalidade de minimizar toda

a variação da quantidade de AO no extrato bruto, todos os experimentos foram

realizados usando sempre o mesmo grupo das frutas colhidas imediatamente

antes do seu amadurecimento.

25

2.2.3. Preparo dos sistemas de duas fases aquosas para os estudos de partição da ascorbato oxidase em PEG/Citrato.

Os parâmetros de extração estudados foram: massa molar e

concentração do PEG, pH, concentração do citrato, massa total do sistema,

fator de diluição do extrato enzimático e adição de NaCl na extração da

ascorbato oxidase do extrato bruto obtidos de Cucurbita maxima. Os resultados

obtidos desse estudo foram utilizados para definir quais foram as variáveis

significativas no processo de purificação da ascorbato oxidase.

Para a extração da ascorbato oxidase, os sistemas foram preparados

inicialmente com PEG e sal citrato de sódio (Na3C6H6O7. 2H2O) acrescido de

ácido cítrico para o ajuste do pH. A variação na proporção entre o citrato de

sódio e o ácido cítrico foi o que definiu o valor do pH de extração.

Em tubos de centrífuga graduados (15mL), contendo as quantidades

desejadas de PEG e sal, foi adicionado o extrato enzimático contendo a

ascorbato oxidase, que corresponde a 20% da massa total do sistema. Em

seguida, a água deionizada foi adicionada para ajustar a concentração final

desejada dos componentes e, ainda, manter constante a massa final do

sistema.

A mistura foi agitada em vórtice por 1 min e colocada em repouso

durante 1 hora, para a total separação das fases. Após a leitura dos volumes

das fases, as mesmas foram separadas cuidadosamente com auxílio de

micropipetas. Amostras das fases foram retiradas para a realização das

análises de atividade enzimática e conteúdo protéico, que possibilitaram o

cálculo do aumento de pureza, do coeficiente de partição e da recuperação da

ascorbato oxidase.

2.2.4. Planejamento fatorial fracionário para a extração da ascorbato oxidase

Os estudos de extração foram feitos baseados em planejamentos

experimentais propostos por Barros-Neto (2002). Existem vários fatores que

interferiram no sistema de duas fases aquosas, e eles foram analisados e foi

determinado o nível de significância e a interação entre estes fatores sobre as

respostas: coeficiente de partição, aumento de pureza e recuperação da

ascorbato oxidase, com os respectivos erros experimentais. A melhor condição

26

final de extração foi definida como aquela que proporcionou a melhor

combinação entre as respostas.

Na Tabela 2.1 encontra-se a matriz contendo as condições iniciais de

extração. Como foram 7 variáveis avaliadas em dois níveis, foi realizado um

planejamento fatorial fracionário (27-2) com um total de 32 extrações e 4

repetições no ponto central. Essas extrações no ponto central foram realizadas

para possibilitar o cálculo do erro experimental. Após a realização dos

experimentos a análise estatística dos resultados foi realizada, com o auxílio do

software Statistica 6.1.

Tabela 2.1 - Níveis das variáveis do planejamento fatorial fracionário (27-2), utilizadas na extração em SDFA (PEG/Citrato) da ascorbato oxidase.

Níveis Variáveis Superior

(+1) Central

(0) Inferior

(-1)

Massa molar do PEG (g/mol) - MMPEG 20.000 10.000 1000

Concentração do PEG % (m/m) –CPEG 25 20 15

pH 8,0 7,0 6,0

Concentração de citrato % (m/m) - Citrato 20 15 10

Massa total do sistema (g) – MTS 10 8 6

Fator de diluição do extrato enzimático - FD

4 2 SD*

Adição de NaCl (%) – NaCl 1 0,5 0

* SD = Sem Diluição do extrato

O planejamento fracionário é utilizado quando existem muitas variáveis

e não se sabe quais apresentam efeitos significativos sobre o processo. Estes

planejamentos, com um número reduzido de experimentos avaliam os efeitos

de muitas variáveis para que seja possível fazer uma seleção ou triagem

destas variáveis para estudos subseqüentes, utilizando planejamentos fatoriais

completos.

2.2.5. Planejamento fatorial completo para a extração da ascorbato oxidase

Os estudos de extração foram realizados utilizando as variáveis

selecionadas pelo planejamento experimental fracionário anteriormente

27

descrito. Para análise estatística dos resultados foram utilizadas as mesmas 3

variáveis de respostas: coeficiente de partição, aumento de pureza e

recuperação. A melhor condição final de extração foi definida como aquela que

proporcionar a melhor combinação entre as respostas, mas priorizando o

aumento de pureza.

Nas Tabela 2.2 e 2.3 encontram-se as variáveis contendo os seus

níveis previamente selecionados para a extração. Como foram selecionadas

duas variáveis para avaliação em diferentes níveis, foi realizado um

planejamento fatorial completo (22) com um total de 8 extrações e 4 repetições

no ponto central, as quais possibilitaram o cálculo do erro experimental. Após a

realização dos experimentos a análise estatística dos resultados foi realizada

com o auxílio do software Statistica 6.1 (STATSOFT INC., 2004).

Tabela 2.2 - Níveis das variáveis do primeiro planejamento fatorial completo (22), utilizados na extração SDFA (PEG/Citrato) da ascorbato oxidase.


(+1) Central

(0) Inferior

(-1)

Concentração do PEG % (m/m) –

CPEG 25 20 15

Concentração de citrato % (m/m) –

Citrato 20 15 10

Tabela 2.3 - Níveis das variáveis do segundo planejamento fatorial completo (22), utilizados na extração SDFA (PEG/Citrato) da ascorbato oxidase.


(+1) Central

(0) Inferior

(-1)

Concentração do PEG % (m/m) –

CPEG 30 25 20

Concentração de citrato % (m/m) –

Citrato 15 10 05

28

As demais condições do sistema de duas fases aquosas para ambos os

planejamentos foram: massa molar do PEG 20.000 (g/mol), pH 6,0, o extrato

enzimático sem diluição, sem adição de NaCl e massa total do sistema de 10g.

2.2.6. Determinação da atividade ascorbato oxidase A atividade da ascorbato oxidase foi determinada segundo metodologia

descrita por Carvalho et al. (1981), a qual utiliza o ácido ascórbico 50μM em

tampão citrato-fosfato 0,1M pH 6,0 como substrato.

O sistema de reação foi constituído por 675μL do tampão contendo o

substrato e 25μL da solução contendo a enzima. O consumo do substrato foi

acompanhado por espectrofotometria durante 5 min, sendo a absorbância

determinada a 268nm, registrada a cada 1 min.

Uma unidade de atividade equivale à oxidação de 1,0μmol de L-

ascorbato em dehidroascorbato por minuto, no pH 6,0, à temperatura de 25°C,

sendo expressa em μmol de ácido ascórbico/min ou em U/mL. A atividade

específica foi calculada pela razão entre a atividade total e a quantidade de

proteínas contidas em 1mL de amostra (μmol/min.mg ou U/mg).

2.2.7. Determinação do conteúdo protéico A concentração de proteínas totais foi determinada de acordo com o

método de Bradford (1976). As amostras controle dos sistemas de duas fases

aquosas continham água em substituição ao extrato enzimático.

2.3. DEFINIÇÃO DOS PARÂMETROS DE ANÁLISE DO PROCESSO 2.3.1. Atividade Específica

A atividade específica da enzima foi obtida pela relação entre a

atividade da enzima e o teor de proteínas totais, presentes na mesma amostra.

Define-se atividade específica (Ae) em U/mg como:

PAAe =

em que: A = atividade da enzima na amostra expressa em (U/mL); P =

proteínas totais na amostra expressas em (mg/mL)

29

2.3.2. Aumento de Pureza (AP)

O aumento de pureza da ascorbato oxidase foi determinado pela razão

entre as atividades específicas na fase PEG e na amostra antes da extração.

ei

e

AA

AP 1=

em que: Ae1=atividade específica na fase extraída - PEG (U/mg); Aei=atividade

específica da amostra antes da extração (U/mg); AP = aumento de pureza

(adimensional)

2.3.3. Recuperação da ascorbato oxidase (Y)

A recuperação em relação à atividade da ascorbato oxidase foi

determinada pela razão entre a atividade volumétrica da fase superior (PEG) e

a atividade volumétrica no extrato bruto, ambas multiplicadas pelo seu volume.

100..

xVAVA

Yii

tt⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛=

em que: o At e Ai são as atividades enzimáticas em U/mL na fase superior

(“top”) e no extrato bruto (antes da partição), respectivamente; Vt e Vi são os

volumes da fase superior e do extrato bruto em mL, respectivamente.

2.3.4. Coeficiente de Partição da ascorbato oxidase (K)

A distribuição da enzima entre as fases do SDFA foi caracterizada pelo

coeficiente de partição, que foi calculado pela expressão:

b

t

AA

K =

em que: At e Ab são as atividades enzimáticas nas fases superior (“top”) e

inferior (“bottom”) (U/mL), respectivamente.

30

2.4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

2.4.1. Planejamento fatorial fracionário para a extração da ascorbato oxidase Inicialmente foi realizado um planejamento experimental, no qual as

variáveis, que influenciam o sistema de duas fases aquosas, foram estudadas

e avaliadas quanto aos seus efeitos sobre o coeficiente de partição,

recuperação e aumento de pureza da enzima. Foram escolhidas sete variáveis,

descritas como importantes para o SDFA, de acordo com a literatura. O

planejamento fatorial fracionário foi necessário devido ao elevado número de

ensaios (n = 128) determinados pelo planejamento fatorial completo. O

planejamento fatorial fracionário utilizado foi 27-2, que determinou a realização

de apenas 32 ensaios (Tabela 2.4).

O planejamento fracionário não apresenta apenas vantagens, também

existe a desvantagem de ter confundimento em seus efeitos. Na terminologia

estatística, o termo confundimento corresponde à estimativa da soma de dois

efeitos, ou seja, o efeito principal se confunde com o efeito das interações de

terceira ordem (BARROS-NETO et al., 2002). Porém, este padrão de

confundimento não é considerado um problema, pois os efeitos da interação de

terceira ordem são bem menos significativos que os de primeira ordem.

Após a realização dos ensaios foram realizadas análises estatísticas. A

estatística é uma importante ferramenta matemática para a interpretação dos

resultados, na qual os efeitos das variáveis sobre as respostas (coeficiente de

partição, recuperação e aumento de pureza da enzima) foram analisados. Vale

salientar que os valores apresentados nos gráficos correspondem aos valores

de efeitos calculados.

31

Tabela 2.4 - Resultados do planejamento fatorial fracionário (27-2) da extração da ascorbato oxidase na fase superior do sistema PEG/citrato. Ensaios MMPEG

(g/mol) CPEG

(%) Citrato

(%) pH MTS

(g) FD NaCl

(%) K Y

(%) AP

1 1000 15 10 6 6 4 1 0,00 0,00 0,00 2 20000 15 10 6 6 SD 0 0,04 8,06 1,95 3 1000 25 10 6 6 SD 0 0,03 18,35 0,31 4 20000 25 10 6 6 4 1 1,50 72,38 1,04 5 1000 15 20 6 6 SD 1 0,59 6,73 0,22 6 20000 15 20 6 6 4 0 7,42 78,06 0,64 7 1000 25 20 6 6 4 0 0,33 2,53 0,09 8 20000 25 20 6 6 SD 1 26,23 135,5 1,17 9 1000 15 10 8 6 SD 0 0,00 0,00 0,00

10 20000 15 10 8 6 4 1 0,09 8,04 0,27 11 1000 25 10 8 6 4 1 0,15 15,38 0,33 12 20000 25 10 8 6 SD 0 2,01 134,3 1,78 13 1000 15 20 8 6 4 0 0,74 13,40 0,24 14 20000 15 20 8 6 SD 1 19,52 145,0 1,58 15 1000 25 20 8 6 SD 1 0,95 7,84 0,15 16 20000 25 20 8 6 4 0 14,50 109,8 0,89 17 1000 15 10 6 10 4 0 0,00 0,00 0,00 18 20000 15 10 6 10 SD 1 0,04 6,33 1,85 19 1000 25 10 6 10 SD 1 0,04 10,92 0,22 20 20000 25 10 6 10 4 0 0,33 47,99 0,43 21 1000 15 20 6 10 SD 0 0,17 4,84 0,13 22 20000 15 20 6 10 4 1 6,16 49,09 1,30 23 1000 25 20 6 10 4 1 0,73 5,73 0,14 24 20000 25 20 6 10 SD 0 15,96 140,5 2,45 25 1000 15 10 8 10 SD 1 0,00 0,00 0,00 26 20000 15 10 8 10 4 0 0,08 7,87 1,24 27 1000 25 10 8 10 4 0 0,15 14,90 0,48 28 20000 25 10 8 10 SD 1 0,53 108,2 2,26 29 1000 15 20 8 10 4 1 4,67 8,08 0,23 30 20000 15 20 8 10 SD 0 11,34 99,91 1,47 31 1000 25 20 8 10 SD 0 1,36 6,06 0,18 32 20000 25 20 8 10 4 1 9,18 82,99 0,83 33 10000 20 15 7 8 2 0,5 1,49 44,70 1,99 34 10000 20 15 7 8 2 0,5 1,49 46,13 1,20 35 10000 20 15 7 8 2 0,5 2,44 46,20 0,89 36 10000 20 15 7 8 2 0,5 0,68 28,18 1,07

MMPEG-massa molar do PEG, CPEG-concentração de PEG, Citrato-concentração de citrato, MTS-massa total do sistema, FD- fator de diluição do extrato enzimático, NaCl-concentração de NaCl adicionado, K-coeficiente de partição, Y-recuperação da enzima na fase superior do sistema e AP-aumento de pureza na fase superior do sistema.

32

Os ensaios dos sistemas 1, 9, 17 e 25 não formaram duas fases, este

fenômeno foi justificado utilizando as curvas binodais, realizadas em estudos

prévios e publicadas recentemente (PORTO et al., 2007). O artigo apresenta a

curva binodal com a massa molar do PEG de 1000 (g/mol) e citrato de sódio,

na concentração de PEG 15% (m/m), nesta condição o sistema encontra-se na

região monofásica.

O gráfico de Pareto representa os efeitos estimados das variáveis (efeito

principal ou de primeira ordem) e das interações entre as variáveis (efeito de

segunda ordem) sobre a variável resposta (coeficiente de partição,

recuperação ou aumento de pureza) em ordem de magnitude. O comprimento

de cada barra é proporcional ao efeito padronizado da variável. A linha vertical

pode ser usada para julgar os efeitos estatisticamente significantes, pois as

barras que se estendem através desta linha correspondem aos efeitos

estatisticamente significantes com nível de confiança de 95%.

-0,200,510,670,891,40-1,47-1,50-1,52-1,60-1,621,77-1,891,92

-2,813,473,904,04-4,435,02

5,67-5,73

-6,546,86

-7,85-7,85-8,04

-9,41-9,82

23,6925,78

28,20

p=0,05Efeito Estimado (Valor Absoluto)

3*4*74*5

3*4*53*4

(4)pH2*3*7

4*72*3*5

1*42*71*72*6

1*3*72*52*3

(7)NaCl3*73*54*6

(2)CPEG(5)MTS

1*3*51*21*53*6

(6)FD2*41*61*3

(1)MMPEG(3)Citrato

Figura 2.1: Gráfico de Pareto dos efeitos principais, tendo como variável-

resposta o coeficiente de partição (K) da ascorbato oxidase. Os significados dos símbolos na ordenada da figura são: (1)MMPEG-massa molar do PEG, (2)CPEG-concentração do PEG, (3)Citrato-concentração de citrato, (4)pH-valor de pH, (5)MTS-massa total do sistema, (6)FD-fator de diluição do extrato enzimático e (7)NaCl-concentração de NaCl.

33

Observa-se na Figura 2.1 os efeitos significativos das sete variáveis

estudadas, assim como as interações entre elas. As variáveis e as interações

foram representadas por siglas e números no eixo vertical. Os efeitos principais

da massa molar do PEG, da concentração de citrato e do fator de diluição

foram os mais significativos para o coeficiente de partição.

As interações entre as variáveis, massa molar do PEG (1) e

concentração de citrato (3) e entre a massa molar do PEG (1) e o fator de

diluição (6) apresentaram efeitos significativos. Quando uma interação foi

significativa, significa que uma variável não atua sozinha sobre as respostas, o

seu efeito depende da outra variável. Este efeito de interação foi evidenciado

nos gráficos de interpretação geométrica (Figura 2.2 e 2.3)

0,12

0,58

9,19

4,64

1000 20000

MMPEG (g/mol)

SD

4

FD

Figura 2.2: Diagrama para interpretação geométrica dos efeitos do fator de

diluição e massa molar do PEG, tendo como variável-resposta o coeficiente de partição (K)

Os resultados dos efeitos das variáveis envolvidas na interação são

melhor interpretados utilizando o diagrama de interpretação geométrica A

Figura 2.2 mostra a interação existente entre as variáveis, fator de diluição do

extrato enzimático e a massa molar do PEG. Nota-se que ocorreu aumento no

coeficiente de partição (K) com o aumento da massa molar do PEG e

diminuição do fator de diluição, ou seja, a condição mais adequada para a

34

resposta coeficiente de partição foi obtida com a massa molar do PEG 20000 e

sem diluição do extrato enzimático.

Os resultados apresentados neste trabalho têm mostrado uma

preferência da ascorbato oxidase pela fase rica em PEG ou fase superior. Este

comportamento pode ser atribuído à inclusão desta molécula protéica no

volume disponível da fase rica em PEG. Todavia, com a massa molar do PEG

elevada (20000 g/mol), geralmente ocorre uma diminuição do coeficiente de

partição devido à teoria do volume excluído (MARCOS et al., 1999; RABELO et

al., 2004).

O fenômeno de volume excluído ocorre devido à elevada massa molar

do polímero aumentar a área de contato entre a biomolécula e os componentes

do sistema, de acordo com as características da molécula e com o tipo de

interação, mas de um modo geral o K diminui (PESSOA-JR; KILIKIAN, 2005).

Uma explicação para este fenômeno foi descrita quando se avaliou a interação

entre o polímero e a proteína nos sítios hidrofóbicos da molécula, este efeito foi

mais importante que o efeito do volume excluído. Este fenômeno foi observado

na partição de pepsina e quimosina em sistemas de duas fases aquosas

PEG/fosfato (SPELZINI et al. 2005).

Farrugia, Nerli e Picò (2003) reportaram estudos realizados com sonda

óptica para calcular a afinidade da albumina pelo PEG de forma indireta. Os

autores encontraram afinidade entre o PEG e a enzima, que aumentou com a

massa molar do PEG. Esta afinidade é menor quando comparada com outras

ligações que possuem interações específicas com proteínas, sugerindo que a

interação PEG/proteína seja de natureza não-específica para um grande

número de proteínas.

A interação entre a massa molar do PEG e a concentração de citrato

está representada na Figura 2.3. Observou-se que o maior valor do efeito foi

obtido com o PEG 20000 e concentração de citrato 20% (m/m). Nota-se ainda

que os efeitos foram positivos para ambas as variáveis e o efeito de interação

também, pois nos maiores níveis das duas variáveis foi obtido o maior valor do

coeficiente de partição (26,23). Este coeficiente foi obtido com PEG 20000,

citrato 20% (m/m) e sem diluição do extrato enzimático.

35

-0,21

0,92

0,31

13,52

1000 20000

MMPEG (g/mol)

10

20

Citr

ato

(% m

/m)

Figura 2.3: Diagrama para interpretação geométrica dos efeitos da

concentração de citrato e massa molar do PEG, tendo como variável-resposta o coeficiente de partição (K).

A partição de proteínas é um fenômeno complexo, guiado

principalmente pelas características da molécula estudada e dos componentes

das fases (HUNDDLESTON et al., 1991; BERGGREN et al., 2000). Os fatores

específicos relacionados à enzima incluem hidrofobicidade e cargas

superficiais, que podem ser utilizadas para aumentar o coeficiente de partição

(CAPEZIO et al., 2005).

Os resultados obtidos neste trabalho corroboram com os apresentados

na literatura. Alves et al. (2000) estudaram a partição de insulina em sistemas

PEG/citrato e obtiveram maior coeficiente de partição (K=22,4) quando a

massa molar do PEG foi aumentada. Este comportamento foi explicado pela

alta solubilidade da insulina quando a maior massa molar do PEG foi usada.

Oliveira et al. (2001) obtiveram os maiores valores de coeficiente de partição

(K=142) quando a concentração de citrato encontrava-se no nível mais alto

(20% m/m), mas a massa molar do PEG apresentou efeito contrário, ou seja,

quanto menor a massa molar maior foram os valores do coeficiente de partição.

36

Foram realizadas análises estatísticas dos efeitos, utilizando como

variável-resposta a recuperação (Y), considerando os resultados da

recuperação da ascorbato oxidase na fase superior do sistema.

0,05-0,070,08-0,27-0,42-0,48-0,65-0,83-0,92-0,94-1,00-1,27-1,50-1,55-1,681,69-2,082,36-2,712,85

-3,26-3,333,52

-6,16-6,37-6,58

7,678,939,10

9,6322,55

p=0,05

Efeito Estimado (Valor Absoluto)

4*73*72*51*7

1*3*7(7)NaCl

2*3*73*5

1*3*52*74*5

3*4*53*43*62*4

3*4*72*6

2*3*51*51*4

(5)MTS4*6

(4)pH2*3

(6)FD1*61*2

(3)Citrato1*3

(2)CPEG(1)MMPEG

Figura 2.4: Gráfico de Pareto dos efeitos principais, tendo como variável-resposta a recuperação da ascorbato oxidase. Os significados dos símbolos na ordenada da figura são: (1)MMPEG-massa molar do PEG, (2)CPEG-concentração do PEG, (3)Citrato-concentração de citrato, (4)pH-valor de pH, (5)MTS-massa total do sistema, (6)FD-Fator de diluição do extrato enzimático e (7)NaCl-concentração de NaCl.

Observando a Figura 2.4, o efeito da massa molar do PEG se destacou

como o mais significativo dos efeitos principais. O seu efeito positivo indicou

que quanto maior a massa molar do PEG maiores foram os valores da

recuperação da ascorbato oxidase. Este comportamento também pode ser

explicado da mesma forma que para o coeficiente de partição, ocorreu uma

possível interação entre o PEG e a ascorbato oxidase, a qual apresentou

preferência pela fase PEG. Por outro lado, as características hidrofílicas dos

contaminantes podem ter interagido melhor com a fase inferior rica em sal.

A concentração de PEG e de citrato e o fator de diluição foram as

variáveis principais que apresentaram efeitos significativos. Também se

verificou que as interações entre MMPEG(1) e Citrato(3), MMPEG(1) e

37

CPEG(2), e ainda entre MMPEG(1) e FD(6) apresentaram efeitos significativos.

Vale salientar que estes efeitos principais e suas interações também foram

significativos para o coeficiente de partição.

A Figura 2.5 apresenta um cubo, no qual estão as variáveis principais

que apresentaram interações significativas. Os efeitos das três variáveis foram

positivos, determinando que a melhor condição para a recuperação da

ascorbato oxidase foi obtida quando as variáveis estão nos seus maiores níveis

(massa molar do PEG 20000g/mol, concentração de PEG de 25% e

concentração citrato de 20%).

85,473

122,311

12,64

87,76

19,95

0,27

-5,26

13,33

Figura 2.5: Gráfico cúbico das variáveis (massa molar do PEG, concentração

de PEG e concentração de citrato), tendo como variável-resposta a recuperação da ascorbato oxidase.

Os melhores resultados para a recuperação da ascorbato oxidase

foram aproximadamente 140%. Valores de recuperação acima de 100% foram

encontrados para extração enzimática utilizando extração líquido-líquido

(CORTEZ et al., 2001; OLIVEIRA et al., 2002; MAYERHOFF et al., 2004).

Estes altos valores de recuperação foram explicados pela eliminação ou

diminuição dos inibidores enzimáticos durante o processo de purificação, ou

pela composição do sistema que favoreceu a atividade enzimática

38

(MAYERHOFF et al., 2004). A recuperação enzimática de 129% foi obtida para

tripsina em sistemas de duas fases aquosas PEG/POLICAJU (OLIVEIRA et al.,

2002). Para a ascorbato oxidase em sistemas PEG/fosfato Porto et al. (2004)

obtiveram recuperação da atividade enzimática de 236%, os autores

justificaram que o PEG promoveu maior estabilidade da enzima.

-0,00-0,03-0,09-0,090,12-0,14-0,16-0,19-0,19-0,20-0,25-0,330,34-0,36-0,370,40-0,41

-0,520,560,570,590,630,65

0,760,890,92

-1,48-1,62

-2,75-2,97

6,71

p=0,05


(4)pH2*52*73*74*51*7

(3)Citrato1*31*24*7

(7)NaCl1*3*7

3*51*42*6

1*3*53*42*3

3*4*73*6

(2)CPEG4*6

2*3*52*41*5

(5)MTS2*3*73*4*5(6)FD

1*6(1)MMPEG


resposta o aumento de pureza (AP) da ascorbato oxidase. Os significados dos símbolos na ordenada da figura são: (1)MMPEG-massa molar do PEG, (2)CPEG-concentração do PEG, (3)Citrato-concentração de citrato, (4)pH-valor de pH, (5)MTS-massa total do sistema, (6)FD-Fator de diluição do extrato enzimático e (7)NaCl-concentração de NaCl.

Apenas a variável massa molar do PEG apresentou efeito

estatisticamente significativo para o aumento de pureza (Figura 2.6). Este efeito

foi positivo, indicando que quanto maior for o valor da massa molar do PEG

melhor será o aumento de pureza, contudo o PEG 20000 já é a maior massa

molar disponível no mercado. Então podemos considerar que esta massa

molar do PEG foi a mais adequada para a purificação da ascorbato oxidase em

sistemas de duas fases aquosas PEG/citrato.

Estes resultados confirmaram a hipótese de um efeito de interação entre

a enzima e o PEG, pois a massa molar do PEG elevada (20000 g/mol)

39

apresentaria forte efeito de volume excluído. Spelzini et al. (2005) relataram

que vários resultados obtidos sugeriram que a interação PEG/proteína/sal

prevaleceu sobre o efeito do volume excluído. Isso nos permite explicar porque

o aumento da massa molar e da concentração do PEG favoreceu a partição, e

conseqüentemente a purificação, na fase superior do sistema ou fase PEG.

Vale salientar que o pH pode ter apresentado um papel importante para a

purificação, pois os valores de pH 6,0 e 8,0 estudados estavam acima do ponto

isoelétrico da ascorbato oxidase (pI=5,1), nestas condições a enzima

apresentou carga elétrica negativa. Em geral, as proteínas carregadas

negativamente apresentam preferência pela fase superior rica em PEG

(ALBERTSSON, 1986).

Os ensaios realizados com o PEG 20000 (g/mol) apresentaram valores

de aumento de pureza superiores aos com o PEG 1000 (g/mol), destacando-se

os ensaios que foram realizados com o extrato sem diluição (Tabela 2.4). Nas

condições de extração empregadas, ocorreu um aumento da atividade

específica da enzima, devido ao diferente comportamento de partição da

enzima desejada e das proteínas contaminantes para fases opostas.

O melhor resultado obtido neste estudo para o aumento de pureza foi

2,45, associado com o valor de recuperação 140%. Vale salientar que as

condições MMPEG de 20000 e FD sem diluição estavam presentes nos

melhores resultados, tanto para o coeficiente de partição quanto para o

aumento de pureza.

Estudos realizados por Mayerhoff et al. (2004) mostraram a purificação

da xilose redutase de Candida mogii, os autores obtiveram aumento de pureza

de 1,59 e recuperação de 105,8% utilizando sistemas PEG/fosfato. Resultados

semelhantes foram obtidos por Li e Peeples (2004) que purificaram a alfa

amilase recombinante obtendo aumento de pureza de 3,31 e 90% de

recuperação. Avaliando os resultados apresentados pela literatura em relação

ao aumento de pureza e recuperação, constatou-se que mesmo se tratando de

estudos preliminares de extração, os resultados obtidos neste estudo foram

similares aos descritos por outros autores.

40

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10 11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

28

29

30

31

32

33 (C)

34 (C)

35 (C)

36 (C)

-20 0 20 40 60 80 100 120 140 160

Recuperação (%)

-0,2

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

2,0

2,2

2,4

2,6

Aum

ento

de

Pur

eza

Figura 2.7: Valores de recuperação da enzima e aumento de pureza na fase

superior dos sistemas de duas fases aquosas PEG/Citrato.

Os sistemas que apresentaram melhores resultados na extração da

ascorbato oxidase estão representados no quadrante superior direito do gráfico

(Figura 2.7). Este quadrante foi delimitado tendo como parâmetros valores de

recuperação acima de 100% e aumentos de pureza acima de 1,4. Foi

observado que os sistemas selecionados apresentavam em comum a massa

molar do PEG 20000, pH 6,0, massa total do sistema de 10g, extrato

enzimático sem diluição e sem adição de NaCl. Desta forma foram

selecionadas as variáveis significativas e seus respectivos níveis, que foram

capazes de purificar a ascorbato oxidase em SDFA.

Vale salientar que o pH, mesmo não apresentando efeito significativo

para o sistema de duas fases aquosas, desempenhou uma função importante

para a purificação, pois os valores de pH acima do ponto isoelétrico da enzima

favoreceram a partição para a fase PEG.

A adição de NaCl foi outra variável que não apresentou efeito

significante para a extração em SDFA. Este sal foi selecionado, pois tem sido

utilizado em diferentes estudos para favorecer a transferência de proteínas

para a fase superior (FORCINITI, 2002; CAPEZIO et al., 2005). A tendência

41

observada nos resultados deste estudo foi a diminuição da partição das

proteínas quando a concentração de NaCl aumenta. Esta tendência também foi

observada nos resultados encontrados para as proteínas estudadas por

Gündüz e Korkmaz (2000).

Neste estudo, verificamos que as três variáveis (pH, massa total do

sistema e a adição de NaCl) podem ser consideradas inertes, ou seja, não

apresentaram efeitos significativos para, no mínimo, duas respostas. Com isto,

podemos fixar os valores destas variáveis para estudos posteriores de

extração. O pH foi fixado no valor da melhor atividade (pH 6,0), a massa total

do sistema foi fixada em 10g e não houve adição de NaCl no sistema, o que

diminuiu a concentração de sais e o custo. Estas condições foram observadas

nos melhores ensaios de extração.

2.4.2. Primeiro planejamento fatorial completo para a extração da ascorbato oxidase

Após a seleção das variáveis (concentração de PEG e concentração de

citrato) que influenciaram significativamente a purificação da ascorbato

oxidase, utilizando o planejamento fracionário, estas variáveis foram estudadas

mais uma vez quanto aos seus efeitos sobre o coeficiente de partição,

recuperação e aumento de pureza da enzima. O planejamento fatorial completo

(22) foi utilizado, constituído por 8 ensaios, sendo 4 pontos centrais. Os

resultados obtidos estão apresentados na Tabela 2.5.

Foram realizadas as análises estatísticas e os efeitos das variáveis

sobre as respostas (coeficiente de partição, recuperação da enzima e aumento

de pureza da enzima) foram analisados.

42

Tabela 2.5 - Resultados do primeiro planejamento fatorial completo (22) para extração da ascorbato oxidase no sistema PEG/citrato.

Ensaios CPEG (%) Citrato (%) K Y (%) AP

1 15 10 0,05 7,52 0,62

2 25 10 1,74 87,86 3,70

3 15 20 4,52 53,02 2,19

4 25 20 5,47 38,47 1,28

5 (C) 20 15 9,05 103,75 1,71

6 (C) 20 15 11,31 106,76 2,60

7 (C) 20 15 13,20 111,47 1,35

8 (C) 20 15 11,17 113,16 1,97 CPEG-concentração de PEG, Citrato-concentração de citrato, K-coeficiente de

partição, Y-recuperação da enzima na fase superior do sistema e AP-aumento de

pureza na fase superior do sistema.

Na análise estatística verificou-se que nenhum dos efeitos principais foi

significativo para o coeficiente de partição, pois os valores dos efeitos

estimados foram menores que o nível de significância (p = 0,05).

A partição preferencial das proteínas para a fase PEG tem sido

explicada com base na hidrofobicidade protéica ou na teoria do volume

excluído. A teoria do volume excluído determina que massas molares do PEG

elevadas induzem a diminuição da quantidade de proteína solúvel na fase rica

em PEG. Esta teoria não pode explicar o aumento do valor de K (coeficiente de

partição) obtido neste estudo, nas condições investigadas. Relatos recentes

sobre a interação PEG/proteína (SPELZINI et al., 2005; CAPEZIO et al., 2005)

têm demonstrado a presença de leve interação ou afinidade entre eles. No

entanto, não foi possível definir os sítios específicos de ligação entre a

molécula de PEG e a superfície da proteína.

43

-0,45

7,62

-10,99

p=0,05

Efeitos Estimados (Valor Absoluto)

(2)CITRATO

(1)CPEG

1*2


resposta a recuperação da ascorbato oxidase na fase superior do sistema de duas fases aquosas. Os significados dos símbolos na ordenada da figura são: (1)CPEG-concentração do PEG, (2)Citrato-concentração de citrato.

Observa-se na Figura 2.8 o efeito significativo das duas variáveis

estudadas neste planejamento, assim como as interações entre elas. Para a

variável-resposta recuperação, o efeito da concentração do PEG se destacou

como o mais significativo dos efeitos principais. O efeito foi positivo, indicando

que quanto maior a concentração do PEG melhores foram os valores da

recuperação da ascorbato oxidase. Este comportamento pode ser explicado da

mesma forma que para o coeficiente de partição, ocorreu uma possível

interação entre o PEG e a ascorbato oxidase, a qual apresentou preferência

pela fase PEG ou as proteínas contaminantes se deslocaram

preferencialmente para a fase inferior rica em sal.

As interações entre as variáveis concentrações do PEG e de citrato

apresentaram efeitos significativos. Este efeito de interação foi evidenciado no

gráfico de interpretação geométrica (Figura 2.9).

44

38,5

84,0

118,8

69,5

15 25

CPEG

10

20C

ITR

ATO

Figura 2.9: Diagrama para interpretação geométrica dos efeitos, tendo como

variável-resposta a recuperação (Y) para analisar a concentração de citrato em função da concentração do PEG no SDFA.

A Figura 2.9 apresenta a interação observada entre as variáveis,

concentração de citrato e concentração do PEG para a recuperação da enzima.

O efeito da interação foi negativo, indicando que quando a concentração de

citrato esteve no seu menor nível (10% m/m) e a concentração de PEG no seu

maior nível (25% m/m), ocorreu o maior valor do efeito para esta resposta.

Nesta condição a recuperação em atividade enzimática da fase rica em PEG foi

87,86%. Os maiores valores para a recuperação da enzima foram obtidos nos

experimentos dos pontos centrais (ensaios 5 a 8), entretanto a escolha da

melhor condição de purificação da ascorbato oxidase depende também da

análise do aumento de pureza.

45

-0,80

2,04

-3,77

p=0,05


(2)CITRATO

(1)CPEG

1*2


resposta o aumento de pureza (AP) da ascorbato oxidase na fase superior do sistema de duas fases aquosas. Os significados dos símbolos na ordenada da figura são: (1)CPEG-concentração do PEG, (2)Citrato-concentração de citrato.

A interação entre a concentração do PEG e a concentração de citrato

apresentou efeito estatisticamente significativo para o aumento de pureza

(Figura 2.10). Este efeito foi negativo, indicando tendências opostas das

variáveis, ou seja, quanto maior o valor da concentração do PEG e menor a

concentração do citrato, maiores valores para o aumento de pureza foram

obtidos.

Observou-se que o ensaio realizado com a concentração de citrato 10%

(m/m) e a concentração de PEG 25% (m/m) apresentou o maior valor para o

aumento de pureza (3,7) (Tabela 2.5). Nestas condições de extração a

recuperação da atividade enzimática foi 87,86%.

Na análise de variância não foi observado falta de ajuste para a resposta

aumento de pureza, com isto foi possível ajustar um modelo matemático aos

dados experimentais obtendo uma indicação da região ótima para a resposta

estudada. Esta análise utilizou um modelo linear que descreveu a relação entre

o aumento de pureza (AP) e as variáveis, concentração de PEG e

46

concentração de citrato. O modelo foi descrito segundo a equação:

AP = 1,93 + 0,54 * CPEG – 0,21 * Citrato

2,5 2 1,5

Figura 2.11: Superfície de resposta do planejamento experimental para o

aumento de pureza da ascorbato oxidase na fase superior do sistema de duas fases aquosas (PEG/citrato).

A Figura 2.11 apresenta a superfície de resposta para o aumento de

pureza utilizando o modelo linear. A região da superfície que indica os

melhores valores do aumento de pureza corresponde à concentração de citrato

10% (m/m) e a concentração de PEG 25% (m/m).

Nestas condições foram obtidos 3,7 de aumento de pureza, associado

com 87,86% de recuperação e 1,74 de coeficiente de partição. Estes

resultados de aumento de pureza e recuperação corroboram com os

apresentados na literatura para a aplicação de SDFA no isolamento e

recuperação de enzimas de extratos brutos. Nos estudos de extração da

superóxido dismutase de extrato de fígado bovino, utilizando sistema PEG/sal,

a enzima foi purificada 4 vezes com uma recuperação de 83% (BOLAND et al.,

1991). O SDFA também foi utilizado para recuperar enzimas de tecidos

vegetais, tais como, folhas de Ipomoea palmetta, da qual foi purificada uma

47

peroxidase, utilizando o sistema PEG/sulfato de amônio, que apresentou

aumento de pureza de 2,18, e redução de volume de 57,5% (SRINIVAS et al.,

1999).

O sistema que apresentou melhor desempenho na extração da

ascorbato oxidase corresponde ao ensaio número 2 (Tabela 2.5). Este sistema

foi selecionado para realização da confirmação destes resultados. Então, foram

realizados experimentos, onde o sistema selecionado foi repetido 3 vezes para

conferir se realmente os resultados eram verdadeiros e apresentavam

reprodutibilidade. Estes resultados estão apresentados na Tabela 2.6.

Tabela 2.6 - Resultados confirmatórios do sistema selecionado (ensaio 2) de extração descontínua da ascorbato oxidase em SDFA.

ensaios K Y (%) AP

2 original 1,74 87,86 3,69

2 A 1,59 89,87 3,28

2 B 2,01 95,06 3,58

2 C 1,84 90,75 3,93

Média 1,79 90,88 3,62

K-Coeficiente de partição, Y-Recuperação em atividade enzimática e AP-

Aumento de pureza.

Estes resultados confirmaram que os valores obtidos anteriormente

eram verdadeiros e que o planejamento, mesmo sem repetição de todas as

extrações, garantiu segurança nos resultados com a análise do erro puro.

2.4.3. Segundo planejamento fatorial completo para extração da ascorbato oxidase em SDFA.

Após a confirmação dos resultados, foi realizado o segundo

planejamento fatorial completo para estudar a região que apresentou o melhor

resultado, ampliando os níveis das variáveis e seguindo a tendência descrita

pelo planejamento anterior. Para isto, foi realizado um segundo planejamento

completo 22 para avaliar se a região de estudo indicada aumentaria a

purificação e a recuperação da ascorbato oxidase (Tabela 2.7).

48

Tabela 2.7 - Resultados do segundo planejamento fatorial completo (22) para a extração da ascorbato oxidase no sistema PEG/Citrato. Ensaios CPEG (%) Citrato

(%) K Y (%) AP

1 20 5 - - - 2 30 5 0,06 30,08 1,49 3 20 15 9,59 94,77 2,26 4 30 15 10,24 123,64 2,78

5 (C) 25 10 1,45 82,95 2,09 6 (C) 25 10 2,07 113,58 3,06 7 (C) 25 10 1,25 75,47 3,18 8 (C) 25 10 1,86 100,78 2,21

CPEG-concentração de PEG, Citrato-concentração de citrato, K-coeficiente de

partição, Y-recuperação da enzima na fase superior do sistema e AP-aumento de

pureza na fase superior do sistema.

Inicialmente foi observado que no ensaio 1 não houve formação das

fases. Apesar de não possuirmos o diagrama de fases para o PEG 20000

(g/mol), foi determinado que a concentração de citrato utilizada neste estudo foi

muito baixa e por isso não obtivemos a formação das duas fases aquosas

quando a concentração de PEG foi 20%, pois a concentração total dos

componentes foi menor que a necessária para formação do SDFA.

Verifica-se ainda, que em todas as condições de extração foi obtida

purificação da ascorbato oxidase e os melhores valores encontram-se nos

experimentos realizados no ponto central. Os pontos centrais correspondem a

melhor condição encontrada no planejamento anterior, ou seja, esta condição

foi confirmada como a mais adequada para a extração e purificação da

ascorbato oxidase.

A análise estatística dos resultados foi realizada para verificar os efeitos

significativos de cada variável e auxiliou na compreensão de como a ascorbato

oxidase particionou no SDFA em diferentes concentrações dos componentes

do sistema.

49

0,78

0,94

26,48

p=0,05


1*2

(1)CPEG

(2)CITRATO


resposta o coeficiente de partição (K) da ascorbato oxidase na fase superior do sistema de duas fases aquosas. Os significados dos símbolos na ordenada da figura são: (1) CPEG-concentração do PEG, (2) Citrato-concentração de citrato.

A Figura 2.12 apresenta o efeito estatisticamente significativo da variável

concentração de citrato como 95% de confiança. O efeito positivo indicou que

aumentando a concentração de citrato (de 5% para 15%) maiores valores para

o coeficiente de partição seriam obtidos. Este fenômeno pode ser explicado

pela teoria do salting-out, pois quando a concentração salina da fase inferior

aumenta, as proteínas são forçadas a particionar para a fase superior (HEY et

al., 2005; TRINDADE et al., 2005; ZAFARANI-MOATTAR et al., 2005). Estes

resultados corroboram com os apresentados por Zhi et al. (2005), que

obtiveram os melhores resultados (coeficiente de partição 2,4, aumento de

pureza 2,0 e recuperação 90%) nas concentrações 14% e 15% de citrato.

Comportamento semelhante foi observado para a variável-resposta

recuperação, como pode ser observado na Figura 2.13, o aumento da

concentração de citrato favoreceu o aumento dos valores de recuperação,

apresentando como melhor valor 123% de recuperação da enzima. Este

50

comportamento similar possibilitou a determinação de condições de extração

considerando as duas respostas (coeficiente de partição e recuperação) ao

mesmo tempo, o que não seria possível se os comportamentos fossem

contrários.

-0,03

1,70

5,45

p=0,05


1*2

(1)CPEG

(2)CITRATO


resposta a recuperação da ascorbato oxidase na fase superior do sistema de duas fases aquosas. Os significados dos símbolos na ordenada da figura são: (1) CPEG-concentração do PEG, (2) Citrato-concentração de citrato.

Os resultados obtidos neste estudo diferiram dos apresentados por

Klomklao et al. (2005), que purificaram uma proteinase em SDFA. Os autores

descreveram uma diminuição da recuperação enzimática com o aumento da

concentração do sal (sulfato de magnésio) e justificaram que a perda na

atividade poderia ser devido à desnaturação das proteinases causadas pelo

efeito de salting-out, mas este efeito depende do tipo de sal e concentração

empregada.

Avaliando os resultados obtidos para o aumento de pureza, verificou-se

que nenhuma variável ou interação foi significativa com 95% de confiança. Isto

pode ter ocorrido devido aos valores do ponto central apresentarem valores de

51

aumento de pureza dispersos, ou seja, o valor do erro para essa resposta foi

maior e diminuiu os efeitos significativos.

Foi realizada uma análise comparativa do desempenho de extração em

relação ao aumento de pureza e a recuperação, verificou-se que os resultados

obtidos nos ensaios correspondentes aos pontos centrais estão entre os

maiores valores.

Como foram descritas anteriormente, as concentrações dos sistemas

nos pontos centrais corresponderam as melhores condições obtidas no

planejamento experimental. Então, os melhores resultados obtidos para a

extração da ascorbato oxidase de Cucurbita maxima foram calculados

utilizando a média de oito valores de sistemas realizados em diferentes

períodos, que resultou em coeficiente de partição de 1,72 ± 0,28, recuperação

de 91% ± 11% e aumento de pureza de 3,12 ± 0,67vezes.

2.5. CONCLUSÃO

O sistema PEG/citrato mostrou ser capaz de purificar ascorbato oxidase

de Cucurbita maxima em modo descontínuo. Os três planejamentos sucessivos

utilizados selecionaram as variáveis que influenciaram a extração, bem como

determinaram as melhores condições para a purificação da enzima,

demonstrando que o sistema de duas fases aquosas é uma alternativa para a

purificação de enzimas de interesse biotecnológico.

52

CAPITULO III Efeito do pH e da temperatura na atividade e estabilidade da ascorbato oxidase no extrato bruto e no pré-purificado por SDFA

Tatiana Souza Portoa,b, Petrus Pires Marquesb , Camila Souza Portob, José

Luiz Lima-Filhob, Attilio Convertic, Ana Lúcia Figueiredo Portob,d, Adalberto

Pessoa-Jra*

aDepartamento de Tecnologia Bioquímico-Farmacêutica/FCF,


(LIKA), UFPE; cDepartamento de Engenharia química de materiais e de

processos GB Bonino, UNIGE; dDepartamento de Morfologia e Fisiologia

Animal, UFRPE.


Artigo a ser submetido para publicação no periódico Enzyme Microbial

Technology.

Parte dos resultados foi apresentado na forma de resumos no XI

Semana Farmacêutica de Ciência e Tecnologia da USP (2006) e no I

Workshop Internacional de Biotecnologia (2008).

53

3.1. INTRODUÇÃO Ascorbato oxidase (AO - EC 1.10.3.3), isolada principalmente de plantas

pertencentes à família Cucurbitaceae, e para cada espécie vegetal, já foi

caracterizada em detalhes físico-químicos (massa molar, ponto isoelétrico, pH

e temperatura). Baseado em análise cristalográfica da ascorbato oxidase de

abobrinha (Cucurbita pepo), observou-se que todos os resíduos de

aminoácidos envolvidos na ligação com o cobre estão situados em quatro

regiões ricas em histidina, as quais exibem uma seqüência de notável

homologia com as oxidases multicobres (SUGINO et al., 2002).

A ascorbato oxidase extraída da Cucurbita maxima e da Cucurbita pepo

condensa possuem massa molar de 150 kDa (AMON e MARKAKIS, 1973; LEE

e DAWSON , 1979 ; CARVALHO et al., 1981) e a extraída da Cucurbita pepo

medulosa possui massa molar de 140 kDa (MARITANO et al., 1996). A enzima

existe predominantemente em estado β-conformacional e foram encontradas

poucas formas helicoidais. A ascorbato oxidase é constituída por duas

subunidades idênticas ligadas por duas pontes dissulfeto, cada subunidade tem

massa molar de 70 kDa (CASELLA et al., 1999; SUGINO et al., 2002).

As enzimas são proteínas globulares, e o seu poder catalítico depende

da conformação tridimensional da molécula, em particular do centro ativo,

existindo uma conformação ótima para a ligação do(s) substrato(s) e para a

catálise propriamente dita. Desta forma, são necessários estudos dos fatores

que influenciam a conformação da molécula, e consequentemente, a atividade

e estabilidade enzimática. Dentre estes fatores, destacam-se o pH e a

temperatura.

O pH influencia a ionização dos aminoácidos constituintes de uma

enzima, alterando sua conformação e, portanto, sua atividade. Valores de pH

extremos levam a desnaturação da proteína, com perda permanente da

atividade (LEHNINGER, 2005).

O efeito da temperatura sobre a atividade enzimática é positivo, pois o

aumento da temperatura acelera a velocidade das reações entre as moléculas,

mas este efeito é contrariado pela desnaturação das moléculas da enzima. O

aumento de temperatura acima de um dado valor provoca a destruição das

ligações que mantém a estrutura tridimensional da proteína, podendo levar a

uma destruição irreversível da atividade catalítica. A temperatura ótima para

54

cada enzima será uma conseqüência da interação entre estes dois fatores

(LEHNINGER, 2005).

Em virtude da alta seletividade e poder catalítico, as enzimas têm sido

muito empregadas em química analítica, bem como na medicina, agricultura,

tecnologia de alimentos e estudos ambientais. O emprego de enzimas

purificadas pode ser encontrado em diversos trabalhos, no entanto, há uma

carência de trabalhos que utilizem tecidos e/ou extratos vegetais. Embora o

uso de extratos brutos seja extremamente econômico e possua tempo de vida

superior às enzimas purificadas, estes apresentam certa desvantagem quanto

ao seu uso nos métodos analíticos devido a sua baixa seletividade

(FATIBELLO-FILHO; VIEIRA, 2002).

O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do pH e da temperatura na

atividade e estabilidade da ascorbato oxidase de Cucurbita maxima presente

no extrato enzimático e no pré-purificação por SDFA.


3.2.1. Preparo do Extrato Enzimático As abóboras, Cucurbita maxima var. jerimum caboclo, foram

descascadas a uma profundidade de aproximadamente 3mm. Ao tecido foi

adicionado tampão citrato/fosfato 0,1M, pH 6,0, mantendo a relação de 1g de

tecido por 1,5mL de tampão. Em seguida foi realizada a homogeneização do

extrato com o auxílio de um processador de alimentos, por 5 min. Após a

centrifugação do homogeneizado a 13.000xg por 10 min a 0-4°C, o precipitado

foi desprezado, e o sobrenadante foi denominado extrato bruto, que foi

armazenado a -20°C. Com a finalidade de minimizar toda a variação da

quantidade de AO no extrato bruto, todos os experimentos foram realizados

usando sempre o mesmo grupo das frutas colhidas imediatamente antes do

seu amadurecimento.

3.2.2. Efeito do pH e da temperatura na atividade e estabilidade da ascorbato oxidase no extrato enzimático

Para verificar o pH ótimo da atividade da ascorbato oxidase, a reação foi

realizada com soluções de substrato (ácido ascórbico) preparadas em tampão

55

0,1M com variação de pH (tampão citrato-fosfato pHs de 3,0 a 6,0; tampão

fosfato pHs 6,0 a 8,0 e tampão Tris-HCl pHs 8,0 e 9,0) a 25°C. Nos estudos de

estabilidade ao pH, 350μL do extrato contendo a ascorbato oxidase foram

adicionados a 34,65mL da solução tampão 0,1M nos valores de pH desejados

(tampão citrato-fosfato pHs de 3,0 a 6,0; tampão fosfato pHs 6,0 a 8,0 e

tampão Tris-HCl pHs 8,0 e 9,0) e incubados a 5°C. Alíquotas foram retiradas

nos tempos (0, 6, 10, 20h) de incubação. As amostras foram analisadas quanto

à atividade enzimática residual.

Para verificar o efeito da temperatura na atividade ótima da ascorbato

oxidase, a reação para a determinação da atividade da enzima foi realizada

nas diferentes temperaturas (25, 30, 32, 35, 40, 45 e 46°C). Para o estudo da

estabilidade à temperatura, o extrato enzimático foi colocado nas temperaturas

desejadas (10, 20, 30, 40, 50, 60 e 70°C). Alíquotas foram retiradas nos

tempos 0 min, 30 min e 60 min. As amostras foram analisadas quanto à

atividade enzimática residual.

3.2.3. Efeito do pH e da temperatura na atividade e estabilidade da AO após pré-purificação em SDFA.

As características bioquímicas da ascorbato oxidase após pré-

purificação em sistemas de duas fases aquosas foram avaliadas para verificar

se o processo de purificação alterou as propriedades da enzima. Para isto

foram realizadas as determinações do pH ótimo, temperatura ótima,

estabilidade ao pH e à temperatura da ascorbato oxidase pré-purificada em

presença de polietileno glicol.

Os sistemas de duas fases aquosas (massa molar do PEG 20.000

g/mol, concentração de PEG 25% (m/m), concentração de citrato 10% (m/m),

pH 6,0) foi selecionado para este estudo, pois apresentou o melhor

desempenho quanto à purificação da enzima (dados não mostrados, obtidos

em estudos prévios).

Para verificar o pH ótimo da atividade da ascorbato oxidase após a pré-

purificação, a reação foi realizada com a fase polimérica contendo a enzima e

soluções de substrato (ácido ascórbico) preparadas em tampão 0,1M em

diferentes valores de pH (tampão citrato-fosfato pHs de 3,0 a 6,0 e tampão

fosfato pHs 6,0 a 8,0) a 25°C. Para avaliar a estabilidade da enzima ao pH,

56

350μL do da fase polimérica contendo a ascorbato oxidase foram adicionados

a 3,65mL da solução tampão nos valores de pH desejados (tampão citrato-

fosfato pHs de 3,0 a 6,0 e tampão fosfato pHs 6,0 a 8,0) a 5°C. Alíquotas foram

retiradas nos tempos (0, 6, 10, 20h) de incubação. As amostras foram

analisadas quanto à atividade enzimática residual.

Para verificar o efeito da temperatura na atividade ótima da enzima pré-

purificada, a determinação da atividade enzimática foi realizada nas diferentes

temperaturas desejada (20, 23, 25, 27, 30, 32, 35, 37, 40, 43, 45 e 48°C). Para

o estudo da estabilidade à temperatura, a fase polimérica foi colocada nas

temperaturas desejadas (5, 25, 30, 40, 50, 60 e 70°C). Alíquotas foram

retiradas nos tempos 0 min, 30 min e 60 min. As amostras foram analisadas

quanto à atividade enzimática residual. Para o controle da interferência do

polímero, foi realizado um sistema branco, no qual não foi adicionado o extrato

enzimático.

3.2.4. Determinações analíticas A atividade da ascorbato oxidase foi determinada segundo metodologia






determinada a 268nm, registrada a cada 1 min.






Para a determinação do conteúdo protéico foi utilizado o método de

Bradford (1976). Todas as análises foram realizadas em triplicata e os desvios

padrões calculados estão representados nos gráficos dos resultados.

57


3.3.1. Obtenção do extrato enzimático de Cucurbita maxima contendo a ascorbato oxidase

Foram realizados vários processamentos da polpa do jerimum para a

obtenção do extrato enzimático, os quais forneceram aproximadamente 2,0L de

extrato enzimático quando 1,0kg de jerimum foi processado. O extrato

enzimático apresentou em média 300 μg/mL de proteína e 50 U/mL de

atividade enzimática, obtendo assim 166 U/mg de atividade específica.

Estes resultados estão compatíveis com os apresentados por Saari et

al.(1996), que descreveram uma intensa variação na atividade da ascorbato

oxidase em diferentes colheitas (14 a 1250 U/mg) e as frutas da família

Cucurbitacea apresentaram maior atividade quando comparadas com outras

frutas, tais como, laranjas, uvas, repolho e maçãs. A ascorbato oxidase de

carambola (Averrhoa carambola) apresentou atividade específica de 123,3

U/mg (SAARI et al., 1999).

3.3.2. Efeito do pH na atividade e estabilidade da ascorbato oxidase no extrato enzimático

O conhecimento das características físico-químicas da enzima é muito

importante, pois reduz a possibilidade de utilizar condições desnaturantes

durante o processo de extração em sistemas de duas fases aquosas. O pH

influencia diretamente a atividade e a estabilidade da enzima, em função disso,

foram realizados estudos sobre o efeito do pH na atividade e estabilidade da

ascorbato oxidase em função do tempo.

O valor de pH que apresentou maior atividade foi o pH 6,0 no tampão

citrato-fosfato, o qual apresentou aproximadamente 50 U/mL (Figura 3.1). Este

tampão é o recomendado pela literatura para ser utilizado na metodologia de

determinação da atividade da ascorbato oxidase.

58

0

10

20

30

40

50

60

2 3 4 5 6 7 8 9 10

pH

Ativ

idad

e en

zim

átic

a (U

/mL)

Figura 3.1: Efeito do pH na atividade da ascorbato oxidase a 25°C. Tampão

citrato-fosfato 0,1M pH 3,0 a 6,0 ( ), tampão fosfato 0,1M pH 7,0 ( ) e tampão Tris-HCl 0,1M pH 8,0 e 9,0( ).

Estes resultados corroboram com os apresentados por Carvalho et al.

(1981), que obtiveram a faixa de pH 5,5 a 7,0 como ótima para a ascorbato

oxidase de Cucurbita maxima, entretanto os autores reportaram a ocorrência

de 25% de atividade enzimática a pH 3,0. A atividade da ascorbato oxidase

neste pH não foi verificada nos nossos estudos. Vale ressaltar que de acordo

com o descrito na literatura para enzima de outras fontes, a ascorbato oxidase

de jerimum não oxidou o ácido ascórbico quando o pH foi igual a 3,0 (STARK e

DAWSON, 1963).

Os resultados obtidos no presente trabalho também foram semelhantes

aos descritos para a ascorbato oxidase oriunda de outras fontes, tais como, a

AO de Cucurbita pepo medullosa apresentou atividade ótima a pH 6,0

(MACCARRONE et al., 1993) e a AO de Citrus unshi possui pH ótimo igual 5,5

(NAZAMID et al., 1994).

Mudanças no valor do pH alteram a distribuição de cargas da proteína.

Valores de pH acima do ponto isoelétrico tornam a proteína carregada

negativamente e abaixo carregada positivamente. As interações não-

covalentes, como as ligações de hidrogênio, ligações hidrofóbicas e interações

59

eletrostáticas, que mantém a estrutura tridimensional da proteína, são fracas e

podem ser desfeitas com valores extremos de pH, levando a uma

desnaturação (CAMPBEL, 2000).

A enzima apresentou estabilidade nos valores de pH 5,0 a 9,0, nos

quais as atividades residuais se mantiveram superiores a 90% durante 20

horas, como apresentado na Figura 3.2.

Maccarrone et al. (1993) determinaram a atividade da ascorbato

oxidase de Cucurbita pepo medullosa a diferentes valores de pH e verificaram

que a enzima foi estável após ser incubada em soluções com valores de pH na

faixa de 4 a 10, apresentando atividades residuais maiores que 90%.

0

20

40

60

80

100

120

2 3 4 5 6 7 8 9 10

pH

Ativ

idad

e re

sidu

al (%

)

Figura 3.2: Efeito do pH na estabilidade da ascorbato oxidase contida no

extrato de Cucurbita máxima, durante 20 horas a 5°C. Tampão citrato-fosfato 0,1M pH 3,0 a 6,0, tampão fosfato 0,1M pH 7,0 e tampão Tris-HCl 0,1M pH 8,0 e 9,0.

Sereikaite et al. (1993) estudaram a estabilidade da ascorbato oxidase

de Cucurbita sp. e reportaram que a enzima foi estável na faixa de pH 5,0 a

10,0. Entretanto, verificou-se perda da atividade enzimática em valores abaixo

de pH 4,0 e acima de pH 12,0, o que foi justificado pela desnaturação da

enzima em valores extremos de pH. Nazamid et al. (1994) relataram que a

ascorbato oxidase de Citrus unshi foi estável na faixa de pH 5,0 a 8,0.

60

3.3.3. Efeito da temperatura na atividade e estabilidade da ascorbato oxidase no extrato enzimático

O efeito da temperatura na atividade enzimática pode ser observado na

Figura 3.3. A temperatura que proporcionou maior valor de atividade da

ascorbato oxidase foi 35°C.

A temperatura ótima da ascorbato oxidase varia de acordo com a origem

da enzima, mas apresenta faixa de 30 a 45°C, por exemplo, Murao et al (1991)

relataram a temperatura ótima de 45°C para a ascorbato oxidase de

Acremonium sp. e a temperatura de 30°C para a ascorbato oxidase de

Cucumber. No entanto, Maccarrone et al (1993) relataram que a ascorbato

oxidase de Cucurbita pepo medullosa apresentou a temperatura ótima a 35°C.

Os resultados obtidos no presente trabalho corroboram com os relatados pela

literatura, principalmente com os artigos que utilizaram ascorbato oxidase de

fonte vegetal pertencente à mesma família (Cucurbitaceae).

0

10

20

30

40

50

60

20 25 30 35 40 45 50

Temperatura (°C)

Ativ

idad

e en

zim

átic

a (U

/mL)

Figura 3.3: Efeito da temperatura na atividade da ascorbato oxidase a pH 6,0.

As enzimas podem ser também desnaturadas em função da

temperatura, ou seja, o aumento da temperatura favorece a entropia no interior

da molécula e a energia destas vibrações pode tornar-se grande o suficiente

para desfazer a estrutura terciária da enzima (CAMPBEL, 2000).

61

A Figura 3.4 apresenta a estabilidade da ascorbato oxidase frente à

diferentes temperaturas durante 60 min de incubação. Verifica-se que a

ascorbato oxidase de Cucurbita maxima foi estável por 60 min na faixa de

temperatura de 10 a 40°C, mantendo em média aproximadamente 100% de

sua atividade. A 60°C a atividade residual foi maior que 50%.

0

20

40

60

80

100

120

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Temperatura (°C)

Ativ

idad

e re

sidu

al (%

)

Figura 3.4: Efeito da temperatura na estabilidade da ascorbato oxidase durante

60 min. Tampão citrato-fosfato 0,1M pH 6,0.

Estes resultados corroboram com os obtidos por Maccarrone et al

(1993), que obtiveram para a ascorbato oxidase de Cucurbita pepo medullosa,

uma estabilidade térmica na faixa de 5°C a 55°C, onde a atividade enzimática

residual não foi menor que 70%. No entanto, foi observada completa ausência

de atividade quando a enzima foi incubada a temperaturas acima de 65°C.

Sereikaite et al. (1993) obtiveram para a ascorbato oxidase de Cucurbita sp,

que apresentou estabilidade até 55°C após 30 min, entretanto, quando a

temperatura estudada foi de 60°C ocorreu diminuição na atividade residual de

45% e a 65°C esta diminuiu 70%, após 30 min.

Carvalho et al. (1981) obtiveram resultados de estabilidade a

temperatura semelhante aos apresentados neste trabalho, pois verificaram que

a ascorbato oxidase de Cucurbita maxima foi estável por 30 min até 40°C. Os

62

resultados obtidos neste trabalho mostram que a ascorbato oxidase de

Cucurbita maxima possui estabilidade térmica melhor que as enzimas de

outras fontes vegetais.

3.3.4. Efeito do pH e da temperatura na atividade e estabilidade da AO após pré-purificação em SDFA.

O estudo do pH e da temperatura na atividade e estabilidade da enzima

pré-purificada (EPP) foi importante para verificar se o processo de purificação

utilizando sistemas de duas fases aquosas alterou as características da

ascorbato oxidase.

O valor de pH que apresentou maior atividade foi o pH 6,0 no tampão

citrato-fosfato 0,1M, o qual apresentou aproximadamente 54 U/mL (Figura 3.5).

Este resultado foi muito semelhante ao determinado para a ascorbato oxidase

presente no extrato bruto (EB), apresentado anteriormente. Além disso, este

tampão e pH (citrato-fosfato 0,1M pH 6,0) são utilizados na metodologia

recomendada para a determinação da atividade da ascorbato oxidase.

0

10

20

30

40

50

60

2 3 4 5 6 7 8 9

pH

Ativ

idad

e en

zim

átic

a (U

/mL)

Figura 3.5: Efeito do pH na atividade da ascorbato oxidase pré-purificada em

SDFA a 25°C. Tampão citrato-fosfato 0,1M pH 3,0 a 6,0 ( ) e tampão fosfato 0,1M pH 7,0 e 8,0 ( ).

63

A Figura 3.6 apresenta o efeito do pH na estabilidade da ascorbato

oxidase. A enzima apresentou estabilidade ao pH na faixa de 5,0 a 8,0, as

atividades residuais se mantiveram acima de 85% durante 20 horas. Apenas

nos pHs 3,0 e 4,0 foi observada uma menor atividade residual, sendo 31% e

78%, respectivamente. Estes resultados foram muito semelhantes aos obtidos

com a ascorbato oxidase presente no extrato bruto, pois a enzima foi estável

na mesma faixa de pH. A enzima pré-purificada apresentou maior valor de

atividade residual nos pHs 3,0 e 4,0, que a enzima do extrato bruto.

0

20

40

60

80

100

120

2 3 4 5 6 7 8 9

pH

Ativ

idad

e re

sidu

al (%

)

Figura 3.6: Efeito do pH na estabilidade da ascorbato oxidase pré-purificada

em SDFA durante 20 horas a 25°C. Tampão citrato-fosfato 0,1M pH 3,0 a 6,0 e tampão fosfato 0,1M pH 7,0 e 8,0.

A temperatura que proporcionou maior atividade da ascorbato oxidase

pré-purificada foi 35°C (Figura 3.7). A temperatura ótima da ascorbato oxidase

no extrato bruto foi a mesma obtida para a ascorbato pré-purificada, indicando

que a purificação da enzima em sistemas de duas fases aquosas não alterou

as características da enzima.

64

0

10

20

30

40

50

60

70

80

14 18 22 26 30 34 38 42 46 50

Temperatura (°C)

Ativ

idad

e To

tal (

U/m

L)

Figura 3.7: Efeito da temperatura na atividade da AO pré-purificada em SDFA

a pH 6,0.

0

20

40

60

80

100

120

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Temperatura (°C)

Ativ

idad

e re

sidu

al (%

)

Figura 3.8: Efeito da temperatura na estabilidade da AO pré-purificada em

SDFA durante 60 min. Tampão citrato-fosfato 0,1M pH 6,0.

A Figura 3.8 apresenta o efeito da temperatura na estabilidade da

enzima pré-purificada. Verifica-se que a ascorbato oxidase de Cucurbita

65

maxima foi estável por 60 min de 10°C a 50°C, mantendo aproximadamente

100% de sua atividade. Nas temperaturas 60 e 70°C ocorreu perda total da

atividade. Comparando a atividade da enzima parcialmente purificada em

relação à do extrato bruto, esta última apresentou atividade residual a 60°C

(53%) e a 70°C (12%) após 60 min, deste modo a enzima pré-purificada foi

menos estável a temperaturas mais elevadas.

3.4. CONCLUSÃO

Os resultados demonstraram que o processo de pré-purificação em

sistemas de duas fases aquosas da ascorbato oxidase de Cucurbita maxima,

não modificou o pH e temperatura ótimos apresentados pela enzima no extrato

bruto. A estabilidade da enzima pré-purificada foi diminuída, embora esta

diminuição não foi significativa o bastante para comprometer o desempenho do

processo de purificação.

66

CAPITULO IV Investigação Cinética e Termodinâmica na atividade da ascorbato oxidase e estabilidade do extrato de Cucurbita

maxima

Tatiana Souza Portoa,b, Camila Souza Portob, Maria Taciana Holanda

Cavalcantia,b, José Luiz Lima-Filhob, Patrizia Peregoc, Ana Lúcia Figueiredo

Portob,d, Attilio Convertic , Adalberto Pessoa-Jra*

aDepartamento de Tecnologia Bioquímico-Farmacêutica/FCF,


(LIKA), UFPE; cDepartamento de Engenharia química de materiais e de

processos GB Bonino, UNIGE; dDepartamento de Morfologia e Fisiologia

Animal, UFRPE,.


Artigo foi publicado no periódico Biotechnology Progress. (ANEXO 2)

67

4.1 INTRODUÇÃO

Ascorbato oxidase (AO) (EC 1.10.3.3) é uma oxidase multicobre que

catalisa a oxidação de um elétron de ácido L-ascórbico, com concomitante

redução de quatro elétrons de oxigênio diatômico a duas moléculas de água.

AO é uma glicoproteína amplamente distribuída em plantas superiores e

microrganismos, a sua principal fonte são os membros da família

Cucurbitaceae (pepino, abobrinha, abóbora, melão, etc.) (DIALINAS et al.,

1997).

Recentemente, esta enzima tem sido usada na composição de

biossensores, bem como nas análises clinicas e alimentares do ácido ascórbico

(SHLEEV et al., 2005). AO de plantas são homodímeros com cada subunidade

contendo um cobre Tipo T1 e um arranjo T2/T3 trinuclear. O cobre T1 é

responsável pela intensa coloração azul da AO, enquanto o cobre T2 pela

transferência de elétrons para o O2 (GUPTA et al., 2004). Dois íons de cobre

T3 são ligados através de uma ponte OH (GUPTA et al., 2004) e acredita-se de

atuar como receptores de elétrons (MESSERSCHMIDT et al., 1992).

A função biológica da AO não é completamente conhecida. A atividade

da AO apresenta um significante aumento durante um período específico do

desenvolvimento do fruto, o qual sugere que ela deve atuar como um

componente importante durante o amadurecimento. A participação da AO na

expansão celular tem sido demonstrada, mas o mecanismo pelo qual ela afeta

o crescimento celular é ainda obscuro (AL-MADHOUN et al., 2003). Acredita-se

que a enzima protege o fruto contra danos oxidativos resultantes de alguma

injúria.

A atividade da AO de Cucurbita maxima demonstrou seguir a lei de

Michaelis-Menten, que depende da ligação com o ácido ascórbico e com o

oxigênio (CARVALHO et al., 1981). AO de C. maxima é considerada

relativamente resistente ao calor, sua atividade permanece quase inalterada

quando foi incubada a 0-40° C por 30 min e foi completamente perdida a 100°C

após 1 min (CARVALHO et al., 1981). Os dímeros de ascorbato oxidase de

pepino demonstraram ser as formas mais resistentes à inativação térmica

(AMON; MARKAKIS, 1973). Todavia, não foi realizado até agora estudos

68

termodinâmicos sistemáticos, com este sistema enzimático, para melhorar o

seu conhecimento.

O objetivo deste trabalho foi realizar uma caracterização cinética e

termodinâmica da atividade e estabilidade da AO de um extrato de C. maxima.

Estes estudos podem ser de crucial importância tanto para estabelecer

os possíveis efeitos das impurezas nas propriedades cinéticas e

termodinâmicas da enzima, como para concentrar e purificar parcialmente a

AO de C. maxima, por extração em sistemas de duas fases aquosas.

Esta tecnologia tem, de fato, um grande potencial principalmente para

separação industrial de enzimas, porque é um método barato e eficiente de

“downstream” e oferece várias vantagens, tais como, tempo de processo

reduzido, baixo consumo de energia e condições adequadas para a

biomolécula (ANTOV et al., 2006). A parte final deste estudo foi direcionada à

estimativa da atividade integral da enzima, simulando o funcionamento de um

biossensor, que pode ser útil para uma variedade de aplicações na indústria

alimentícia (SHLEEV et al., 2005).


4.2.1. Preparo do Extrato Enzimático Abóboras, Cucurbita maxima var. jerimum caboclo, foram descascadas a

uma profundidade de aproximadamente 3mm. Ao tecido foi adicionado tampão

citrato/fosfato 0,1M, pH 6,0, mantendo a relação de 1g de tecido por 1,5mL de

tampão. Em seguida foi realizada a homogeneização do extrato com o auxílio

de um processador de alimentos, por 5 min. Após a centrifugação do

homogeneizado a 13.000xg por 10 min a 0-4°C, o precipitado foi desprezado, e

o sobrenadante foi denominado extrato bruto, que foi armazenado a -20°C.

Com a finalidade de minimizar toda a variação da quantidade de AO no extrato

bruto, todos os experimentos foram realizados usando sempre o mesmo grupo

das frutas colhidas imediatamente antes do seu amadurecimento.

4.2.2. Determinação dos Parâmetros Cinéticos e Termodinâmicos da AO Os testes para a determinação dos parâmetros cinéticos da atividade da

AO foram realizados a 25°C e usando diferentes concentrações iniciais de

69

ácido ascórbico (50 ≤ So ≤ 750μM), enquanto aqueles para a estimativa dos

parâmetros termodinâmicos da reação enzimática foram feitos com So = 50μM

e diferentes temperaturas (25 ≤ T ≤ 48°C).

A atividade residual foi determinada utilizando a diluição de volumes

conhecidos de extrato descongelado em tampão citrato-fosfato, anteriormente

descrito, contidos em tubos de vidro de 10mL e expostos na faixa de

temperatura selecionada (10-70°C) a tempos variáveis. Alíquotas (25μL) foram

retiradas em diferentes períodos de tempo (1, 10, 30 e 60 min), imediatamente

resfriadas a 25°C, para garantir eficiente conformação das moléculas da

enzima, eventualmente inativadas reversivelmente, e posteriormente analisada

a atividade da AO.

4.2.3. Determinação da atividade ascorbato oxidase A atividade da AO no extrato (A) foi mensurado a 268nm através da

oxidação do ácido ascórbico (AA) durante 3 min a 25ºC por espectrofotometria,

uma célula de aquecimento foi utilizada para o controle da temperatura

(CARVALHO et al., 1981; AL-MADHOUN et al., 2003). Uma unidade de

atividade é definida a quantidade de enzima que catalisa a oxidação de

1,0μmol de AA por minuto a pH 6,0, sob as condições determinadas.

4.3. TEORIA

4.3.1. Cinética da Atividade Enzimática. A cinética da AO obedece à lei de Michaelis-Menten sendo, portanto,

dependente da concentração do substrato (CARVALHO et al., 1981; FARVER;

PECHT, 1992). Nas condições em que o substrato ácido ascórbico (AA) foi

limitante, usou-se uma equação tipo Michaelis-Menten para calcular a

regressão das atividades iniciais da oxidação do AA, Ao (mM min-1), a partir dos

dados experimentais. Um método não linear de mínimos quadrados foi utilizado, com um

software para minimização de erros (Table Curve Jandel para Windows),

estimando assim, com boa precisão, os valores máximos da atividade inicial,

Ao,max, e a constante de Michaelis, Km (μM), a partir dos dados experimentais

70

de Ao e concentração inicial de AA, So (μM).

4.3.2. Termodinâmica da Reação Enzimática. A termodinâmica da reação enzimática foi investigada utilizando os

experimentos realizados na faixa de temperatura de 25-48°C sob as condições

em que o substrato AA foi limitante. A velocidade da reação específica, kv (min-

1), foi definida como sendo proporcional à diminuição da densidade ótica sob as

condições selecionadas para a determinação da atividade inicial. Esta razão

aumenta com a temperatura em toda a faixa de temperatura investigada, de

acordo com a equação de Eyring (EYRING, 1935):

RS

RTH

Tkhk **ln

B

v Δ+

Δ−= (1)

em que kB é a constante de Boltzmann, h a constante de Planck, R a constante

ideal dos gases, ΔH* a entalpia de ativação e ΔS* a entropia de ativação.

Gráficos, semi-logarítimos de ln(kvh/kBT) em função de 1/T, foram utilizados

para estimar o valor de ΔH* utilizando a inclinação da reta e ΔS* pela

intersecção no eixo das ordenadas, respectivamente. Então, a energia livre de

ativação (ΔG*) foi calculada a uma temperatura de referência de 25°C de

acordo com a equação:

*** STHG Δ−Δ=Δ (2)

4.3.3. Inativação Térmica da Enzima. A inativação térmica da enzima é geralmente descrita, inicialmente pela

desnaturação reversível da sua forma nativa, seguida de uma conformação

intermediária menos estável, a qual está sujeita a desnaturação irreversível e

torna-se uma forma inativa (VOLKIN; KLIBANOV, 1989; MONTES et al., 1995;

RASHID; SIDDIQUI, 1998; BAPTISTA et al., 2000; CONVERTI et al., 2002).

Em relação às AOs de plantas, estas enzimas são homodímeros

estáveis (E2A) (SHLEEV et al., 2005), visto que sua forma monomérica (E1I) é

inativa (MURPHY et al., 1997); conseqüentemente, um mecanismo de reação

71

de primeira ordem pode ser proposto:

kd

E2A 2 E1I (3)

Em que kd (min-1) é a velocidade específica da inativação irreversível ou

desnaturação da AO.

Assim, a velocidade de inativação de E2A pode ser descrita pela equação:

tkψ d−=ln (4)

em que:

oAE

AE

CC ψ

2

2= (5)

Ψ é denominado coeficiente de atividade residual (adimensional) e CE2A e CE2Ao

são as concentrações atual e inicial de E2A, respectivamente.

De acordo com este modelo, já proposto para outros sistemas enzimáticos

(RASHID; SIDDIQUI, 1998; CONVERTI et al., 2002a; HASMANN et al., 2007),

os valores do kd foram estimados a temperaturas diferentes utilizando os

gráficos semi-logarítimos de lnψ em função do tempo. Do mesmo modo que os

parâmetros termodinâmicos da reação enzimática, aqueles de inativação da

enzima foram estimados por gráficos semi-logarítimos de Eyring, os quais

apresentam lnkd em função de 1/T.

4.3.4.Tempo de Meia-Vida da Enzima. O tempo de meia-vida da enzima (t1/2) é definido como o tempo que a

atividade enzimática foi reduzida à metade da atividade inicial e assim

calculado, de acordo com Rashid e Siddiqui (1998), a partir dos valores de kd

como:

t1/2 = ln2/kd (6)

4.4.5. Atividade Integral da Enzima.

Devido à desnaturação enzimática, a atividade da enzima torna-se uma

72

função do tempo de operação ou reação. A atividade integral, P (mM) pode ser

estimada para um processo, utilizando a integração do produto de Ao pelo

coeficiente de atividade (ROELS, 1983; CONVERTI et al., 2002b):

)]exp(1[)exp()( dd

d tkkAdttkAdtAtP o

oo −−=−== ∫ ∫ψ (7)

De acordo com o modelo acima descrito, este parâmetro obtém, até a meia-

vida da enzima (t1/2), o valor:

d1/2 2k

AP o= (8)

e duas vezes este valor determina o tempo infinito (P∞).


4.4.1. Caracterização Cinética da Atividade da AO.

A Figura 4.1 mostra o gráfico de Lineweaver-Burk da velocidade inicial da

AO em função da concentração inicial de substrato a 25°C. Entretanto, para

maior exatidão, os valores dos parâmetros cinéticos e bioquímicos (Ao,max =

1,57 ± 0,14mM min-1; Km = 126 ± 11μM) foram estimados utilizando um método

de mínimos quadrados não-linear (desvio-padrão médio de 0,03).

O valor estimado de Ao,max foi muito maior que os descritos pela literatura

para as ascorbato oxidases provenientes de extratos de Cucumis sativus

(0,15mM min-1) (FERNANDES et al., 1999), Cucurbita pepo var. condensa

(0,010mM min-1) (FRIEDEN; MAGGIOLO, 1957) e Cucumis anguria (0,012mM

min-1) (COSTA, 1985). Além disso, o valor de Km foi menor que os já descritos

para extratos brutos ou concentrados de C. maxima (Km=200μM) (CARVALHO

et al., 1981), Cucumis sativus (157μM) (FERNANDES et al., 1999) e

Acremonium sp. (290μM) (ITO et al., 1995). Estes resultados, de forma geral,

demonstram a especificidade da ascorbato oxidase contida no extrato bruto de

73

C. maxima nestas condições, considerando a presença simultânea de várias

outras proteínas no extrato.

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

0,000 0,005 0,010 0,015 0,020 0,025

1/S o (1/μM)

1/A

o (m

in/m

M)

Figura 4.1: Curva de Lineweaver-Burk. Inverso da velocidade inicial de

oxidação do AA em função do inverso da concentração inicial de substrato (R2 =0,98).

4.4.2. Termodinâmica da Reação Enzimática.

A Figura 4.2 apresenta o gráfico de Eyring com o semi-logaritmo da

velocidade específica de reação em função do recíproco da temperatura

absoluta, que tenta estimar, com boa correlação (R2=0,99), a entalpia de

ativação (ΔH*) e entropia (ΔS*) da reação de oxidação do AA pelo extrato bruto

de C. maxima. A faixa de temperatura investigada (25-48°C) foi selecionada

com base em artigos prévios da literatura, que apresentaram como temperatura

ótima para a atividade da AO (30-35°C) (MURAO et al., 1991; MACCARRONE

et al., 1993; FARVER et al., 1998; FERNANDES et al., 1999). Sabe-se que,

uma estimativa gráfica das entropias é de difícil realização, pois uma tentativa

rigorosa de determinação requer a utilização de aproximações matemáticas

complexas, as quais seriam quase impossíveis de se aplicar aos sistemas

biológicos, e estão fora do propósito deste estudo. Os valores estimados

74

destes parâmetros são apresentados na Tabela 4.1 juntamente com aqueles

do ΔG* calculado pela Eq. (2).

A velocidade da reação específica aumentou com temperatura, de acordo

com Eq. (1), dentro da faixa de temperatura selecionada para este estudo.

Contrário ao que tem sido observado para as preparações enzimáticas

similares (CONVERTI et al., 2002a; CONVERTI et al., 2002b; HASMANN et al.,

2007), nenhuma diminuição na atividade inicial em função da temperatura foi

detectada, o que confirmou a resistência térmica do extrato bruto de C. maxima

para a possível aplicação industrial. Este resultado sugere uma temperatura

ótima para a atividade enzimática maior que aquelas para AOs purificadas de

C. pepo medullosa (35°C) (MACCARRONE et al., 1993), Acremonium sp. HI-25

(45°C) e pepino (30°C) (MURAO et al., 1991).

-35,5

-35,3

-35,1

-34,9

-34,7

-34,5

3,10 3,15 3,20 3,25 3,30 3,35 3,40

1/T.103 (1/K)

ln(k

vh/k

BT

)

Figura 4.2: Gráfico semi-logarítimico de Eyring para a determinação dos

parâmetros termodinâmicos da reação enzimática.

75

Tabela 4.1 - Parâmetros Termodinâmicos da reação enzimática e Inativação Térmica do extrato bruto de C. maxima

ΔG*

(kJ mol-1)

ΔH*

(kJ mol-1)

ΔS*

(J mol-1 K-1)

R2

Atividade da AO a 87,2 10,3 -258 0,993

Inativação da AO b 103 51,7 -160 0,967 aTemperatura de referência: 25°C. bTemperatura de referência: 50°C.

É provável que o ambiente natural do extrato enzimático forneceu à

ascorbato oxidase uma proteção contra a inativação térmica, o que sugere a

investigação da estabilidade enzimática a longo do tempo com o auxílio de

testes de atividade residual.

A entalpia de ativação da reação enzimática (ΔH* = 10,3kJ mol-1) foi

muito baixa e está de acordo com a elevada eficiência na oxidação do AA pela

AO. Além disso, está próximo dos valores estimados para a atividade (10kJ

mol-1) (MACCARRONE et al., 1993) e para a transferência eletrônica interna no

Cu (II) de T1 a T3 da AO purificada de C. pepo medullosa (ΔH* = 6,8-9,1kJ mol-

1) (FARVER; PECHT, 1992). Este resultado não deveria ser inesperado,

considerando que tal transferência de elétrons poderia ter se transformado, sob

as condições selecionadas, na etapa determinante da atividade total da AO. O

valor de ΔH* acima descrito não diferiu muito daqueles estimados para a

atividade da AO da fração solúvel de folhas de repolho (Brassica oleracea)

(18,4kJ mol-1) e de abóbora (Cucurbita pepo) (14,6 – 16,7kJ mol-1), sobretudo

se compararmos com os valores de ΔH* das suas células (ΔH* = 50,2 e 28kJ

mol-1, respectivamente) (HALLAWAY et al., 1970), como também com o extrato

de abóbora (C. maxima) 30 vezes purificada (ΔH* = 36,8kJ mol-1) (CARVALHO

et al., 1981), que foram significativamente mais elevados. Os valores

relativamente baixos da entalpia de ativação são típicos da maioria das

oxidorredutases devido à transferência interna de elétrons. Por exemplo, Farver

et al. (1998) reportaram uma entalpia de ativação de 22,7 ± 3,4kJ mol-1 para a

nitrito redutase.

76

O valor estimado de ΔH* neste trabalho foi aproximadamente 8 vezes

menor que a energia de ativação necessária para a reação catalisada pelo

CuSO4 (ΔH* = 92,1kJ mol-1) (CARVALHO et al., 1981).

O valor de ΔS* (-258J mol-1 K-1), alto e negativo, condiz com a formação

de um estado de transição, que é uma estrutura mais rígida com respeito à

separação dos reagentes (AO e AA) e está de acordo com aqueles reportados

para muitos outros sistemas enzimáticos (AIBA et al., 1973; CONVERTI et al.,

2002b; ALBERTY, 2003), particularmente, aqueles estimados para a AO

purificada de C. pepo medullosa (de -215 a -170J mol-1 K-1) (FARVER; PECHT,

1992; FARVER et al., 1998). Pelo fato da entropia de ativação incluir um fator

eletrônico (isto é, o coeficiente de transmissão), uma justificativa dos baixos

valores das constantes cinéticas, poderia ser uma combinação entre as

ligações fracas e as mudanças ocorridas nas estruturas dos respectivos sítios

receptores de elétrons. Em outras palavras, a desvantajosa contribuição da

entropia deveria ter sido quase que completamente contrabalançada a situação

de entalpia favorável. Como resultado, o sistema apresentou um valor

relativamente alto e positivo para a energia livre de ativação (ΔG* = 87,2kJ mol-

1). Este valor é maior que aqueles estimados utilizando os dados de literatura

para a AO purificada (ΔG* = 60-70kJ mol-1).

Comparando os parâmetros termodinâmicos estimados neste trabalho

com aqueles de AO pura, nota-se que a presença da AO no extrato natural de

C. maxima conferiu à enzima uma resistência ao stress do calor inicial, o qual

obviamente diminuiu esta atividade. Todavia, não ficou claro se as impurezas

contidas no extrato exerceram alguma influência sobre os parâmetros

termodinâmicos da reação enzimática, assim necessitando maiores

investigações usando um extrato parcialmente purificado ou mesmo a AO

purificada oriunda desta variedade.

4.4.3. Termodinâmica da Inativação Térmica da AO.

Esta parte do estudo foi direcionada para o efeito da temperatura na

termoestabilidade da AO em período mais longo, uma vez que foi observada

relativa insensibilidade à temperatura da atividade inicial da AO no extrato

enzimático a 25-48°C, como anteriormente descrito. Para este propósito, testes

77

de atividade residual foram realizados com uma larga faixa de temperatura (10-

70°C) cujos resultados, em termos de coeficiente de atividade residual da AO

(ψ), estão apresentados na Figura 4.3. A menor temperatura (10°C) foi

selecionada como a temperatura de referência na qual a inativação térmica da

enzima poderia ser considerada quase desprezível. Tendência linear similar,

relacionada à inativação irreversível pelo calor, também foi observada por

Macarrone et al. (1993) para a AO purificada de C. pepo medullosa.

-2,0

-1,6

-1,2

-0,8

-0,4

0,0

0 10 20 30 40 50 60 70

Tempo (min)

ln ψ

70°C

60°C

50°C

40°C30°C10-20°C

Figura 4.3: Gráficos semi-logarítimos de Eyring com correlação entre o tempo

e o coeficiente de atividade residual da AO (ψ ) do extrato bruto de C. maxima.

Dentro da faixa de temperatura estudada, a atividade da AO apresentou

típico decaimento de desnaturação, como verificado nas clássicas enzimas

com comportamento de primeira ordem e semelhante ao observado por

Moreno et al. (1997) para as enzimas lipases purificadas, nas formas nativas e

imobilizadas.

Os resultados cinéticos destes testes, resumidos na Tabela 4.2, mostram

que a velocidade específica de desnaturação da AO (kd) aumentou

progressivamente com a temperatura. Isto significa que a inativação enzimática

torna-se progressivamente mais significante, aparentemente devido à ruptura

78

das fortes interações eletrostáticas entre as subunidades de E2A e formação

de um monômero totalmente inativo (E1I).

Tabela 4.2 - Velocidade Específica de Desnaturação da AO (kd), Meia-Vida (t1/2) e Atividade Integral até t1/2 (P1/2) e Tempo Infinito (P∞) estimados para o extrato bruto de C. maxima a diferentes temperaturas

T (°C) 10 20 30 40 50 60 70

kd .103

(min-1) 0,662 0,822 1,80 3,40 6,00 16,7 32,7

t1/2 (min) 1047 844 385 204 115 41,5 21,2

P1/2 (mM) 205 166 78,6 34,2 21,3 6,89 0,535

P∞ (mM) 410 332 157 68,3 42,6 13,8 1,07

Deve ser evidenciado que os valores de kd foram particularmente baixos

(de 6,62.10-4min-1 a 10°C à 0,0327min-1 a 70°C) e os valores de t1/2

particularmente altos (1047min a 10°C e 21,2min a 70°C) se comparados com

aqueles de AO pura de C. pepo medullosa inativada termicamente

(kd=0,032min-1 e t1/2=21,5min a 55°C; perdeu completamente a atividade a T >

65°C) (MACARRONE et al., 1993). Estes resultados condizem tanto com a

termoestabilidade, durante longo prazo, da preparação enzimática, bem como

com a degradação mais lenta da AO à uma temperatura mais baixa.

Por outro lado, em T ≥ 40ºC, os valores de meia-vida foram muito

menores que aqueles à baixa temperatura. Isto é, a enzima foi desnaturada

rapidamente. Como conseqüência destes efeitos, a dependência do tempo

relativa à atividade total da AO foi mais influenciada pelo aumento da

temperatura, do que a atividade inicial foi favorecida. Do mesmo modo,

parâmetros de termoestabilidade melhores (t1/2 ≅ 128min a 60°C) puderam ser

calculados utilizando os dados descritos para a AO monomérica termoestável

de Acremonium sp. HI-25 clonada em Aspergillus nidulans (TAKEDA et al.,

1998).

A Figura 8 apresenta o gráfico semi-logarítimo de kd em função do

recíproco da temperatura absoluta, a qual possibilitou a estimativa dos

parâmetros termodinâmicos da inativação irreversível da AO (Tabela 4.2).

79

-43

-42

-41

-40

-39

-38

-37

-36

2,9 3,0 3,1 3,2 3,3 3,4 3,5 3,6

1/T .103 (1/K)

ln(k

dh/k

BT)

Figura 4.4: Gráfico semi-logarítimo de Eyring para a estimativa dos parâmetros

termodinâmicos da inativação térmica irreversível da AO.

A inativação enzimática foi caracterizada por uma entalpia de ativação

de 51,7kJ mol-1 e um valor negativo, relativamente alto, da entropia de ativação

(ΔS*D = -160J mol-1 K-1), resultando, particularmente, em alta energia livre de

ativação (ΔG*D = 103kJ mol-1), a qual foi consistente com a alta

termoestabilidade do extrato bruto. O valor estimado de ΔH*D foi comparável

com aqueles descritos pela literatura para vários sistemas biológicos.

Surpreendentemente, encontraram-se na faixa de valores reportados para

desnaturação térmica reversível (56-150kJ mol-1) (CONVERTI et al., 2002a e

2002b), e foi muito mais baixo que aqueles descritos para desnaturação

irreversível de diferentes enzimas (220-235kJ mol-1) (ROELS, 1983; ROSSI et

al., 2003).

Todavia, alguns estudos interessantes sobre a inativação da AO por

diferentes métodos, destacaram que este fenômeno ocorre irreversivelmente

(SAVINI et al., 1990). O valor negativo estimado para ΔS*D forneceu várias

informações sobre a possível tempo-dependência do mecanismo de inativação.

Inicialmente, a absorção de calor pelo extrato poderia inativar irreversivelmente

o dímero estável a monômeros desnaturados inativos. Em uma etapa

80

subseqüente, duas moléculas monoméricas poderiam ter se agregado dando

um estado de transição com estrutura mais rígida do que as moléculas

separadas.

A tendência, observada neste trabalho, para a termo-inativação da AO

foi qualitativamente diferente das múltiplas etapas descritas na literatura para

as bem conhecidas enzimas termoestáveis, tais como as lipases psicrotróficas

(OWUSU et al., 1992) e a glicose-6-fosfato desidrogenase (HASMANN et al.,

2007).

4.4.4. Atividade Integral Um aumento na termoestabilidade é freqüentemente acompanhado por

uma diminuição na atividade e vice-versa. Uma correlação, entre estas

tendências opostas, deveria então ser pesquisada para selecionar as melhores

condições para implementação em um processo industrial. Para esta

finalidade, a atividade integral até a meia-vida (P1/2) foi calculada pela Eq. (8)

(Tabela 4.2).

Considerando a possível utilização industrial da atividade de AO no

extrato, investigou-se o comportamento da atividade integral em função do

tempo, P (t), definida na Eq. (7), que representa a quantidade de ácido

ascórbico oxidado por 1g de biocatalizador sob condições contínuas de

alimentação (CONVERTI et al, 2002c). Este sistema pode simular uma coluna

oxidativa e funcionar como um biossensor em uma variedade de aplicações no

que diz respeito à indústria alimentícia (IIDA et al., 2003). A possibilidade de

uso com sucesso de extratos brutos para a preparação de biossensores, de

fato, tem sido demonstrada (FATIBELLO-FILHO; VIEIRA, 2002).

O modelo descrito pela Eq. (7) foi ilustrado na Figura 4.5, onde a

atividade integral estimada, na faixa de temperatura 10-70°C, foi traçada em

função do tempo em um gráfico bi-logarítimo. Todas as curvas cresceram

linearmente com quase a mesma velocidade inicial. Como conseqüência, a

desnaturação enzimática tornou-se significante só depois de um tempo

relativamente longo (2000min). Além disso, este tempo foi curto (70min) a

temperaturas elevadas, por causa dos altos valores de kd; conseqüentemente,

a atividade obteve valores progressivamente menores de P∞.

81

-4

-2

0

2

4

6

8

0 2 4 6 8 10 12

lnt

lnP

10°C20°C30°C40°C

60°C

70°C

50°C

Figura 4.5: Atividade Integral de AO (P, mM) em função do tempo (t, min) no

extrato bruto de C. maxima a diferentes temperaturas.

A única exceção desta tendência foi observada nos experimentos

realizados a 70°C, os quais exibiram uma notável perda da atividade inicial em

relação aos outros. Estes resultados estão de acordo com os observados por

Maccarrone et al. (1993), que sugeriram a ocorrência de um decréscimo na

atividade inicial com a temperatura, não evidenciado na faixa anteriormente

investigada (25-48°C) do nosso trabalho. Finalmente, a longa duração deste

aumento linear em todos os casos (≥ 50min) está de acordo com os valores

muito baixos de kd, isto é, com a termoestabilidade do extrato.

4.5. CONCLUSÃO

Os parâmetros cinéticos e termodinâmicos da atividade e estabilidade da

AO do extrato de Cucurbita maxima foram estimados neste trabalho. A

constante de Michaelis para o ácido ascórbico e a atividade máxima foram

126μM e 1,57mM min-1, respectivamente. Os testes de atividade inicial

realizados a 25-48°C foram utilizados para estimar os seguintes parâmetros

termodinâmicos da reação enzimática: ΔG* = 87.2 kJmol-1; ΔH* = 10.3kJ mol-1;

ΔS* = -258J mol-1 K-1. Testes de atividade residual foram realizados a 10-70°C

para estimar a longa meia-vida da enzima (t1/2 ≥ 204min a T ≤ 40°C), bem

82

como os parâmetros termodinâmicos da inativação irreversível da AO (ΔG*D =

103kJ mol-1; ΔH*D = 51.7kJ mol-1; ΔS*D = -160J mol-1 K-1). Os valores estimados

para a meia-vida da enzima revelaram a termoestabilidade desta preparação

enzimática para futuras aplicações. Com este propósito, a atividade integral da

enzima contida no extrato, foi também predita.

83

CAPITULO V Extração contínua da ascorbato oxidase em sistemas de duas fases aquosas PEG/citrato, utilizando a coluna de discos perfurados rotativos

Tatiana Souza Portoa,b, Petrus Pires Marquesb , Camila Souza Portob, Maria

Taciana Holanda Cavalcantia,b, Benício de Barros Netoc, José Luiz Lima-Filhob,

Attilio Convertie, Ana Lúcia Figueiredo Portob,d, Adalberto Pessoa-Jra*

aDepartamento de Tecnologia Bioquímico-Farmacêutica /FCF, Universidade de

São Paulo; bLaboratório de Imunopatologia Keizo Asami (LIKA), UFPE; cDepartamento de Química Fundamental, UFPE; dDepartamento de Morfologia

e Fisiologia Animal, UFRPE, eDepartamento de Engenharia química de

materiais e de processos GB Bonino, UNIGE.


Artigo a ser submetido para publicação no periódico Biochemical

Enginieering Journal.

Parte dos resultados será apresentada no XVII Congresso Brasileiro de

engenharia química em setembro de 2008.

84

5.1. INTRODUÇÃO A determinação e/ou monitoramento da vitamina C (ácido ascórbico) em

produtos comercializados e fármacos em geral é de extrema importância, pois

o ácido ascórbico presente em sucos de frutas naturais oxida-se rapidamente

e, em sucos comercializados, a oxidação desse ácido depende da

concentração e tipo de antioxidante utilizado, bem como das características da

embalagem e condições de armazenamento dos produtos (FATIBELLO-FILHO;

VIEIRA, 2002).

A enzima ascorbato oxidase (EC 1.10.3.3) tem sido extraída de diversos

vegetais, tais como: melão, abóbora, pepino, uva, laranja, pimenta, tomate,

pimentão e carambola (GARCÍA-PINEDA et al., 2004).

A ascorbato oxidase é uma enzima dimérica, contém cobre como cofator

e catalisa a redução de quatro elétrons de dois oxigênios para água, usando

preferivelmente a molécula de ácido ascórbico, como um substrato. A enzima

pertence à família das oxidases azuis multicobres que incluem lacases em

plantas e microrganismos, e ceruloplasminas em animais (SANTAGOSTINI et

al., 2004).

Em geral, a recuperação de proteínas de plantas inclui extração,

clarificação, recuperação da proteína, purificação e refinamento. O custo total

de produção é principalmente determinado pela eficiência da recuperação

inicial e dos passos de purificação (RITO-PALOMARES, 2004). Assim, o

estabelecimento de procedimentos de recuperação primária eficientes para as

biomoléculas é necessário. Neste contexto, sistemas de duas fases aquosas

(SDFA) é uma alternativa atrativa para facilitar a adorção de bioprocessos

básicos nas plantas de sistemas de produção (AGUILAR; RITO-PALOMARES,

2008).

As principais vantagens na purificação de biomoléculas pelo sistema de

duas fases aquosas são: a facilidade no aumento da escala; rápida

transferência de massa; equilíbrio alcançado com recursos a baixa energia na

forma de mistura mecânica; possibilidade de operação rápida e seletiva;

possibilidade de operação à temperatura ambiente e mais econômico que

outros processos de separação (ALBERTSSON, 1986).

Planejamento estatístico dos experimentos é frequentemente utilizado

para otimização e controle de processos com SDFA. Sendo um método

85

conveniente para estudar os efeitos das variáveis envolvidas na purificação,

porque ele é capaz de estimar seus efeitos significativos sobre as respostas

selecionadas, bem como suas possíveis interações (CAVALCANTI et al.,

2007).

Outra ferramenta que tem sido aplicada com sucesso para extração

líquido-líquido com sistemas de duas fases aquosas é a coluna de discos

rotativos perfurados (PRDC). Este tipo de equipamento para extração mostrou

grande eficiência e melhor flexibilidade operacional que os tipos de

equipamentos mais convencionais (PORTO et al., 2004).

Extratores e colunas de extração líquido-líquido têm basicamente duas

funções: i) estabelecer o contato entre as duas fases líquidas presentes no

sistema, em geral pela dispersão de uma fase na outra, com o objetivo de

possibilitar a transferência de massa; e ii) separar os dois líquidos depois da

extração. A mistura de dois líquidos consiste geralmente em um conjunto de

gotas de uma fase dispersa no contínuo da outra (PESSOA-JR; KILIKIAN,

2005).

Ainda é pequeno o número de sistemas de duas fases aquosas

PEG/sais, que têm sido estudados em coluna de discos rotativos perfurados

(SARUBBO et al., 2003), principalmente para o sistema PEG/citrato não foram

encontrados artigos utilizando a PRDC.

Este trabalho teve como finalidade obter condições de extrair e pré-

purificar a enzima ascorbato oxidase de Cucurbita maxima por extração em

sistemas de duas fases aquosas (PEG/citrato) de modo contínuo, utilizando

coluna de discos rotativos perfurados (PRDC).


5.2.1. Ascorbato oxidase

A ascorbato oxidase (E.C.1.10.3.3.) foi extraída da abóbora Cucurbita

maxima, conhecida regionalmente no nordeste, como jerimum, variedade

“jerimum caboclo”.

86

5.2.2. Preparo do Extrato Enzimático As abóboras foram descascadas a uma profundidade de

aproximadamente 3mm. Ao tecido foi adicionado tampão citrato/fosfato 0,1M,

pH 6,0, mantendo a relação de 1g de tecido por 1,5mL de tampão. Em seguida

foi realizada a homogeneização do extrato com o auxílio de um processador de

alimentos, por 5 min. Após a centrifugação do homogeneizado a 13.000xg por

10 min a 0-4°C, o precipitado foi desprezado, e o sobrenadante foi denominado

extrato bruto, que foi armazenado a -20°C. Com a finalidade de minimizar toda

a variação da quantidade de AO no extrato bruto, todos os experimentos foram

realizados usando sempre o mesmo grupo das frutas colhidas imediatamente

antes do seu amadurecimento.

5.2.3. Coluna de discos perfurados rotativos A coluna foi feita em Acrílico (Perspex) com 32mm de diâmetro interno e

170mm de altura. Seis discos perfurados rotativos com 30mm de diâmetro

cada, com 20 buracos com 2mm de diâmetro cada (área livre

aproximadamente 20%) foram montados em um eixo central e separados

igualmente. A coluna foi mantida a temperatura ambiente (25º C ±2º C).

Figura 5.1: Desenho esquemático da extração contínua em coluna de discos

rotativos perfurados. Os números significam: 1=eixo rotativo central, 2=entrada da fase pesada (sal), 3=saída da fase pesada ou contínua (rafinado), 4=entrada da fase leve ou dispersa (PEG), 5=saída da fase

87

leve (extrativa), 6=entrada de água d refrigeração e 7=saída da água de refrigeração.

5.2.4. Extração contínua em sistema de duas fases aquosas O sistema de duas fases aquosas (700g) foi preparado a partir de

soluções estoque de 30% (m/m) citrato/ácido cítrico a pH 6,0. A solução

estoque de citrato/ácido cítrico consistiu da mistura de citrato de sódio

trissódico anidro (Na3C6H6O7) e ácido cítrico monohidratado (C6H8O7. H2O). A

composição do sistema usada foi determinada em estudos em modo de

extração contínua, sendo de 10% (m/m) de PEG, 25% (m/m) de citrato a pH

6,0. O sistema foi agitado por 4h a temperatura ambiente de 25ºC, depois

incubado em um funil de decantação por um período de 12h a temperatura

ambiente. Decorrido este tempo, as fases foram separadas e serviram para

alimentar a coluna através de bombas peristálticas.

Na extração contínua, realizada com uma coluna de discos perfurados

rotativos, foram utilizadas as seguintes etapas de operação:

• A coluna foi inicialmente alimentada com 90mL da fase contínua (fase

pesada – solução com o sal citrato de sódio e o extrato enzimático). Após,

iniciou-se o bombeamento desta fase com auxílio de uma bomba

peristáltica, tanto para a entrada como para a drenagem da fase contínua.

Este processo foi realizado até o equilíbrio, ou seja, o volume não se

alterava.

• Em seguida, foi acionado o mecanismo de agitação dos discos, e depois de

ajustada a vazão de entrada com a de saída da fase contínua, foi iniciada

então a alimentação da fase dispersa (fase leve - PEG). Para estes

procedimentos foram utilizadas duas bombas peristálticas (cada uma com

dois canais), a fim de garantir a velocidade de fluxo requerida para cada

fase;

• As amostras da fase contínua e dispersa foram recolhidas em intervalos de

tempo de 10, 20, 30, 40, 50 e 60min de operação e em seguida submetidas

às determinações de proteína e atividade enzimática, conforme o caso.

• O processo de extração foi interrompido aos 65min e o conteúdo interno foi

mensurado e verificado o volume referente a cada fase do sistema.

88

5.2.5. Planejamento utilizando a extração contínua com a coluna de discos perfurados rotativos

Estudos iniciais com a coluna de discos rotativos perfurados (PRDC)

foram realizados para a investigação das melhores condições a serem

utilizadas na coluna de extração, pois não poderia ser utilizada a condição

encontrada para os sistemas PEG/citrato operados em modo descontínuos, já

que a condição determinada apresentou uma alta viscosidade e isso impediu a

sua utilização em sistemas contínuos, pois as bombas peristálticas não foram

capazes de impulsionar uma solução muito viscosa. Então foi necessário testar

diversas composições dos sistemas para saber qual seria a condição mais

adequada a ser utilizada na extração da ascorbato oxidase de Cucurbita

maxima.

Foi realizado um planejamento estatístico experimental 23 com 2 pontos

centrais (Tabela 5.1). As condições utilizadas foram: número de discos 6,

velocidade de rotação dos discos 80rpm, velocidade de fluxo da fase dispersa

2mL/min e velocidade de fluxo da fase contínua 1mL/min.

Tabela 5.1 - Planejamento fatorial completo (23) para a extração continua da ascorbato oxidase em sistema de duas fases aquosas, utilizando PRDC.

Níveis Variáveis

Inferior (-1) Central (0) Superior (+1)

MMPEG (g/mol) 3350 8000 20000

CPEG (%) 10 15 20

Citrato (%) 15 20 25

Para dar continuidade a investigação das melhores condições

operacionais da coluna de extração, utilizando as condições encontradas como

satisfatória para sistemas contínuos em PRDC no planejamento anteriormente

descrito. Foram estudadas velocidades de rotação dos discos e velocidade da

fase dispersa (PEG) para determinar a condição mais eficiente para extrair em

modo contínuo a ascorbato oxidase de Cucurbita maxima.

Foi realizado um planejamento fatorial completo (22) com 4 pontos

centrais. A composição e concentrações do sistema utilizadas foram: massa

molar do PEG 20.000 (g/mol), concentração de PEG 10%, concentração de

89

citrato 25% e pH 6,0. Os estudos de extração em processo contínuo em geral

não utilizavam planejamentos estatísticos, porém Cavalcanti et al., (2008)

utilizou planejamentos estatísticos como uma ferramenta de auxílio para o

estudo da extração em modo contínuo. Foi utilizado o planejamento fatorial

completo para determinar as condições operacionais mais adequadas da

PRDC, para extração da ascorbato oxidase em SDFA (PEG/citrato).

Tabela 5.2 - Planejamento fatorial completo (22) para a extração continua da ascorbato oxidase em sistema de duas fases aquosas, utilizando PRDC.

Níveis Variáveis

Inferior (-1) Central (0) Superior (+1)

Vel. de rotação dos

discos (rpm) 35 80 140

Vel. de fluxo da fase

dispersa (mL/min) 1 2 3

5.2.6. Determinações analíticas A atividade da ascorbato oxidase foi determinada segundo metodologia






determinada a 268nm, registrada a cada 1min.






A concentração de proteínas totais foi determinada de acordo com o

método de Bradford (1976). As amostras controle dos sistemas de duas fases

aquosas continham água em substituição ao extrato enzimático.

90

5.3. DEFINIÇÃO DOS PARÂMETROS DO PROCESSO DE EXTRAÇÃO CONTÍNUA

Considerando o estado de equilíbrio do processo, foram calculados os

seguintes parâmetros do processo de extração contínua:

O hold up (H) determina a quantidade de fase extratora, ou seja, a

capacidade de extração. Este parâmetro foi calculado pela razão do volume da

fase dispersa (VD) e o volume total do sistema no interior da coluna (VT).

TVVH D=

A eficiência de separação (ES) foi calculada utilizando a equação abaixo:

100C

CCE1

21s ∗⎟⎟

⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛ −=

C1 = concentração de proteína na entrada da fase contínua (mg/mL)

C2 = concentração de proteína na saída da fase contínua (mg/mL)

O coeficiente de transferência de massa (KDa) foi expresso como função

da concentração pelo seguinte balanço material descrito pela equação abaixo:

⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∗−∗−

∗=∴

⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∗−∗−

∗=

fcsai

fcent

fcsai

fcentD CKC

CKClnVQKda

CKCCKClnV

QaK

Q = velocidade de fluxo da fase dispersa; (mL/min)

Cent = concentração de proteína na entrada da fase contínua; (mg/mL)

Csai = concentração de proteína na saída da fase contínua; (mg/mL)

Cfc = valor médio entre a concentração final da fase dispersa e o valor

inicial na mesma fase; (mg/mL)

K = coeficiente de partição da proteína ou da enzima; (adimensional)

V = volume inicial da fase contínua (coluna) (mL).

O Aumento de pureza (AP) da ascorbato oxidase foi definido como a

razão entre a atividade específica da enzima após a extração em SDFA na

PRDC e a atividade específica da enzima antes da extração.

ei

e

AA

AP 1=

91

em que: Ae1=atividade específica na fase extraída (U/mg); Aei=atividade

específica da amostra antes da extração (U/mg); AP=aumento de pureza

(adimensional)

A recuperação em atividade da ascorbato oxidase foi determinada pela

razão entre a atividade volumétrica da fase e atividade volumétrica no extrato

bruto, ambas multiplicadas pelos seus volumes.

100. xAAY

iC

D⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛=

em que o AD e AC são as atividades enzimáticas em U/mL na saída da fase

dispersa e na entrada da fase contínua (antes da partição), respectivamente.

O coeficiente de partição da enzima entre as fases de um sistema de

duas fases aquosas foi calculado pela seguinte expressão:

C

D

AAK =

em que: AD e AC são as atividades enzimáticas nas fases dispersa e contínua

(U/mL), respectivamente.

5.4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 5.4.1. Planejamento utilizando a extração contínua com a coluna de discos perfurados rotativos

A Figura 5.2 apresenta os resultados obtidos da extração contínua da

ascorbato oxidase (ensaio 4 da Tabela 5.3). Pode-se verificar um aumento

crescente da quantidade de proteína transferida da fase rica em sal para fase

rica em PEG até o final da extração, e o mesmo comportamento ocorreu em

relação à atividade enzimática.

92

0

2

4

6

8

10

12

14

16

0 10 20 30 40 50 60 700,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

0,18AT salAT PEGPT salPT PEG

Ativ

idad

e to

tal -

AT

(U/m

L)

Tempo (min)

Proteína total - PT (mg/m

L)

Figura 5.2: Comportamento de extração da ascorbato oxidase em PRDC.

Proteína total residual na fase sal (rafinado) (-♦-), Proteína total na fase PEG (- -), Atividade total residual na fase sal ( ), Atividade total na fase PEG ( ), após extração com sistemas PEG 20000/citrato (20% e 15% m/m) e pH 6,0, 23°C±2°C.

Os resultados obtidos do planejamento experimental com a coluna de

discos rotativos perfurados foram resumidamente apresentados na Tabela 5.3.

A eficiência na extração foi avaliada no tempo 30min, no qual o processo

estava no estado estacionário (“steady state”), ou seja, em equilíbrio.

93

Tabela 5.3 - Resultados do planejamento fatorial completo (23) da extração contínua da ascorbato oxidase em PRDC utilizando PEG/Citrato.

ensaios MMPEG (g/mol)

CPEG (%)

Citrato (%)

K AP Y (%) KDa Es (%)

H

1 3350 10 15 0,214 1,99 15,58 0,0041 16,86 0,619

2 20000 10 15 0,162 2,14 16,67 0,0025 10,65 0,552

3 3350 20 15 0,439 2,36 20,16 0,0063 24,57 0,642

4 20000 20 15 0,224 2,49 16,67 0,0163 51,60 0,527

5 3350 10 25 0,381 0,88 13,11 0,0172 53,31 0,561

6 20000 10 25 3,356 1,46 86,78 0,0586 54,98 0,400

7 3350 20 25 1,667 0,95 28,99 0,0143 46,61 0,605

8* 20000 20 25 - - - - - -

9 (C) 8000 15 20 0,364 0,51 14,04 0,0110 39,45 0,718

10 (C) 8000 15 20 0,265 0,18 18,57 0,0136 37,24 0,556

* Não formação de duas fases aquosas.

Observando a Tabela 5.3, nota-se que a enzima migrou para a fase

dispersa rica em PEG apenas em dois ensaios (6 e 7), o que significa que na

maioria das condições estudadas a ascorbato oxidase permaneceu na fase sal.

Este comportamento confirmou os dados apresentados por Porto et al. (2004)

que obteve maior concentração da enzima ascorbato oxidase na fase rica em

sais de fosfato, mesmo quando a enzima foi alimentada na coluna utilizando a

fase PEG. O ensaio de número 8 não pode ser realizado devido à não

solubilização dos componentes do sistema.

94

5,28

8,01

-9,06

-11,98

22,19

-22,77

-24,42

p=0,05

Efeito estimado (valor absoluto)

(1)MMPEG

1*3

(2)CPEG

2*3

(3)Citrato

1*2*3

1*2


resposta o coeficiente de partição da ascorbato oxidase na fase dispersa. Os significados dos símbolos na ordenada da figura são: (1)MMPEG–massa molar do PEG, (2)CPEG-concentração do PEG, (3)citrato-concentração de citrato.

Observa-se na Figura 5.3, que a interação entre (1)MMPEG e (2)CPEG,

a interação entre as três variáveis (1*2*3) e a concentração de citrato (3) foram

significativas com nível de confiança de 95%.

Observando as interações apresentadas na Figura 5.4, verificou-se que

a massa molar do PEG de 20000 (g/mol), concentração do PEG de 10% (m/m)

e concentração de citrato de 25% (m/m) foram as condições que melhor

favoreceram a partição da enzima para a fase dispersa, rica em PEG. Baixas

concentrações de PEG associadas com elevadas concentrações de citrato e

elevadas massas molares de PEG favoreceram preferencialmente a

transferência da enzima para a fase dispersa, aumentando o coeficiente de

partição.

Alguns autores têm proposto que quando o sistema apresentar elevada

massa molar do PEG, um forte efeito de volume de exclusão deveria ocorrer,

sugerindo então que não existia espaço suficiente para a enzima na Fase PEG

95

do sistema (MARCOS et al., 1999; RABELO et al., 2004; PESSOA-JR;

KILIKIAN, 2005). Todavia, este fenômeno não foi observado nos resultados

obtidos neste trabalho.

0,12

-0,09

0,06

3,25

0,34

1,56

0,11

0,28

Figura 5.4: Gráfico cúbico das variáveis (massa molar do PEG, concentração de PEG e concentração de citrato) de um planejamento 23, tendo como variável-resposta o coeficiente de partição (K) da ascorbato oxidase.

A análise estatística para o aumento de pureza foi realizada, mas

nenhuma variável independente apresentou efeito significativo. Observando a

Tabela 5.3 verificou-se que o sistema com PEG 20000 (g/mol), concentração

do PEG 20% (m/m) e concentração de citrato 15% (m/m) apresentou o maior

valor para o aumento de pureza (2,49), o que confirmou os resultados obtidos

na extração descontínua, apenas com uma diferença na concentração do PEG,

que mudou de 25% para 20%, pois na maior concentração a viscosidade da

fase foi elevada e não foi possível o impulso da fase dispersa para o interior da

coluna de extração pela bomba peristáltica.

Estes resultados foram semelhantes aos obtidos por Rabelo (1999), que

96

estudou a extração da ascorbato oxidase em coluna de campânula pulsada

(PEG 1500/fosfato), e obteve aumento de pureza de 1,34 vezes na fase rica

em sal com recuperação da enzima de 51,7%.

Avaliando a recuperação da enzima na fase PEG, os valores de

recuperação foram baixos, com exceção do ensaio 6, no qual a recuperação da

enzima foi de 86,78%, corroborando com a tendência apresentada pelos outros

parâmetros de resposta, como coeficiente de partição e coeficiente de

transferência de massa. A análise estatística indicou que nenhuma variável foi

significativa para a recuperação.

3,60

6,82

-8,50

-8,78

11,75

-12,96

-14,92

p=0,05

Efeito estimado (valor absoluto)

1*3

(1)MMPEG

1*2

(2)CPEG

(3)Citrato

1*2*3

2*3


resposta o coeficiente de transferência. Os significados dos símbolos na ordenada da figura são: (1)MMPEG–massa molar do PEG, (2)CPEG-concentração do PEG, (3)citrato-concentração de citrato.

A Figura 5.5 apresenta as variáveis significativas para o coeficiente de

transferência de massa, na qual se destacou a interação entre as

concentrações de PEG e de citrato, seguida pela interação entre os três

fatores. Para avaliar estas interações foi utilizado o gráfico cúbico que

apresentou a relação entre a massa molar do PEG, a concentração do PEG e a

concentração de citrato (Figura 5.6).

97

0,016

-0,001

0,002

0,058

0,006

0,014

0,004

0,017

Figura 5.6: Gráfico cúbico das variáveis (massa molar do PEG, concentração

de PEG e concentração de citrato) de um planejamento 23, tendo como variável-resposta o coeficiente de transferência de massa (KDa) para a extração contínua em PRDC.

A interação entre as variáveis indicou que o coeficiente de transferência

de massa aumentou quando o sistema foi constituído pela maior massa molar

do PEG 20000 (g/mol), menor concentração PEG de 10% (m/m) e maior

concentração de citrato de 25% (m/m). O maior valor obtido para o coeficiente

de transferência de massa foi 0,058 (min-1). Este resultado corrobora com os

obtidos por Porto et al. (2004) para ascorbato oxidase, em PRDC com sistema

PEG/fosfato, utilizando a mesma velocidade da fase dispersa (2mL/min).

Segundo Forciniti et al. (2002) a tensão interfacial aumenta com o

aumento da concentração do polímero, e o efeito total do aumento na

viscosidade das fases resulta na redução da difusibilidade da proteína, e um

aumento da espessura da camada limite entre fases, comprometendo a

transferência de massa. Como conseqüência deste fenômeno, o coeficiente de

98

transferência de massa foi menor, para concentrações de PEG maiores

(PORTO et al., 2004).

-2,94

-3,40

-5,45

11,58

-14,87

-18,44

-24,96

p=0,05


(2)CPEG

1*2

(1)MMPEG

(3)Citrato

1*3

1*2*3

2*3


resposta a eficiência de separação. Os significados dos símbolos na ordenada da figura são: (1)MMPEG–massa molar do PEG, (2)CPEG-concentração do PEG, (3)citrato-concentração de citrato.

Para a eficiência de separação a interação entre as concentrações de

PEG e de citrato foi o efeito mais significativo (Figura 5.7). Os melhores

resultados para o parâmetro eficiência de separação (54,9%) foram obtidos

quando se utilizou o sistema de massa molar do PEG 20000 (g/mol), a 10%

(m/m) e concentração de citrato de 25% (m/m). A eficiência de separação

apresentou o mesmo comportamento que o coeficiente de partição e o

coeficiente de transferência de massa. Estes resultados estão de acordo com

os apresentados por Porto et al. (2004).

O desempenho de uma unidade operacional de extração continua é

dependente da quantidade de solvente presente no extrator (SARUBBO et al.,

2003, PORTO et al., 2004, CAVALCANTI et al., 2007). Se o solvente está em

grandes quantidades, comparando a alimentação, o gradiente de concentração

99

do soluto é favorável à transferência de massa. O hold up representa a

quantidade de solvente disponível no extrator para extrair o soluto da

alimentação (GIRALDO-ZUNINGA et al., 2006).

Com o aumento da concentração dos componentes do sistema (massas

molares do PEG maiores, neste caso), valores menores foram observados para

a fração retida da fase dispersa para todos os sistemas estudados. Dados

similares foram observados por Venâncio et al. (1995) e Porto et al. (2000).

A análise estatística dos resultados para o hold up foi realizada, mas

nenhuma variável independente foi significativa. Verifica-se na Tabela 5.3, que

os ensaios realizados com maiores massas molares do polímero,

apresentaram menores valores para o parâmetro hold up.

Avaliando os resultados dos experimentos realizados neste estudo foi

possível selecionar uma composição do SDFA para dar continuidade aos

estudos de extração contínua da ascorbato oxidase em coluna de discos

rotativos perfurados.

5.4.2. Planejamento utilizando a extração contínua com a coluna de discos perfurados rotativos para avaliação dos parâmetros operacionais

Para melhor compreensão de como ocorre a influência dos parâmetros

operacionais da coluna de discos perfurados rotativos (PRDC) foi realizado um

planejamento fatorial completo (22) que avaliou a velocidade de rotação dos

discos e a velocidade de fluxo da fase dispersa (Tabela 5.2). Após a extração

foram avaliados o coeficiente de transferência de massa, a eficiência de

separação, a recuperação da atividade enzimática, o coeficiente de partição, o

fator de purificação e o “Hold up”.

A composição do sistema, selecionada nos estudos prévios das

extrações em fluxo contínuo, foi: massa molar do PEG 20.000 (g/mol),

concentração do PEG 10%, concentração de citrato 25%.

A Figura 5.8 apresenta os resultados obtidos da extração contínua da

ascorbato oxidase (ensaio 4 da Tabela 5.4). Pode-se verificar aumento

crescente (de 0,08 mg/mL para 0,15 mg/mL) da quantidade de proteína

transferida da fase rica em sal para fase rica em PEG até o final da extração. O

mesmo comportamento ocorreu em relação à atividade enzimática.

100

Inversamente, ocorre diminuição tanto da proteína como da atividade

enzimática na fase sal.

0

10

20

30

40

50

60

0 10 20 30 40 50 60 700,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

AT salAT pegPT salPT peg

Ativ

idad

e To

tal (

U/m

L)P

roteínas Totais (mg/m

L)

Tempo (min)

Figura 5.8: Comportamento de extração da ascorbato oxidase em PRDC em

função do tempo. Proteína total residual na fase sal ou contínua (rafinado) (-♦-), Proteína total na fase PEG ou dispersa (- -), Atividade total residual na fase sal ( ), Atividade total na fase PEG ( ). Extração conduzida com sistemas PEG 20000/citrato (20% e 15% m/m) e pH 6,0, 23°C±2°C.

Os resultados obtidos da segunda parte do planejamento experimental

com a coluna de discos rotativos perfurados foram resumidamente

apresentados na Tabela 5.4. A eficiência na extração foi avaliada no tempo 30

min, no qual o processo estava no estado estacionário ou equilíbrio.

101

Tabela 5.4 - Resultados do planejamento fatorial completo (22) da extração contínua da ascorbato oxidase em PRDC utilizando PEG/Citrato.

ensaios

V.

discos

(rpm)

V. fase

dispersa

(mL/min)

K Y (%) AP KDa

(min-1)

Es

(%) H

1 35 1 7,70 136,3 2,00 0,010 73,4 0,256

2 140 1 7,34 257,6 2,13 0,018 73,3 0,302

3 35 3 3,03 166,3 2,24 0,005 55,0 0,324

4 140 3 16,08 216,4 2,20 0,018 96,8 0,362

5 (C) 80 2 1,82 150,9 2,71 0,059 26,9 0,382

6 (C) 80 2 3,91 168,9 2,29 0,040 53,7 0,400

7 (C) 80 2 4,59 120,5 3,10 0,037 22,7 0,290

8 (C) 80 2 3,12 169,3 1,17 0,047 71,7 0,254

Observa-se na Tabela 5.4, que a enzima particionou para a fase

dispersa rica em PEG em todos os experimentos. Os estudos anteriormente

realizados indicaram que a composição do sistema selecionada apresentou

uma partição preferencial para a fase polimérica.

A análise estatística dos resultados foi realizada e proporcionou avaliar

cada variável resposta estudada separadamente, bem como a interação entre

elas.

Para o coeficiente de partição (K) foi observado que o efeito da

velocidade dos discos foi significativo, apresentando um valor positivo (Figura

5.9). Este efeito indicou que a maior velocidade dos discos proporcionou

maiores valores do coeficiente de partição da ascorbato oxidase. Também foi

verificado que a interação positiva entre a velocidade dos discos e a velocidade

da fase dispersa foi significativa com nível de confiança de 95%.

102

1,710

5,324

5,629

p=,05

Efeito estimado (valor Absoluto)

(2)Velocidade da f ase dispersa

(1)Velocidade dos discos

1*2


resposta o coeficiente de partição da ascorbato oxidase na fase dispersa do sistema de duas fases aquosas.

Esta interação significa que a maior velocidade de rotação dos discos

(140rpm) e a maior velocidade de fluxo da fase dispersa (3mL/min) foram as

condições que favoreceram a partição da enzima para a fase dispersa, rica em

PEG. Estas condições correspondem ao ensaio 4 (K=16,08), nos demais

experimentos a enzima também particionou preferencialmente para a fase

PEG.

Uma maior velocidade dos discos e velocidade da fase dispersa

favoreceram o aumento do coeficiente de partição principalmente devido a dois

fatores: o aumento da velocidade dos discos favoreceu uma maior partição das

moléculas para a fase polimérica, devido ao aumento da superfície de contato

entre as fases, provocada pela agitação. A maior velocidade de entrada da fase

dispersa favoreceu uma maior partição da enzima devido ao aumento da

quantidade de fase polimérica ou extratora dentro da coluna (SARUBBO et al.,

2003).

A análise estatística para o aumento de pureza (AP) foi realizada, mas

103

nenhuma variável independente apresentou efeito significativo. Observando a

Tabela 5.4 foi possível constatar que os melhores fatores de purificação

estavam presentes nos ensaios correspondentes aos pontos centrais

(AP=2,71; 2,29 e 3,10), com exceção do ensaio 8, que apresentou um

desempenho abaixo da média (1,17). As condições utilizadas nestes ensaios

foram velocidade dos discos 80rpm e velocidade de fase dispersa 2mL/min, o

que confirmou os resultados obtidos em estudos prévios da extração contínua,

apenas com um pequeno incremento nos valores do aumento de pureza.

Cavalcanti et al. (2007) observaram que o aumento da velocidade da

fase dispersa (VD) aumentou o fator de purificação da toxina alfa de Clostridium

perfringens, e o maior valor deste parâmetro (2,4) foi obtido a 3mL/min. Por

outro lado, Porto et al., (2004) estudaram a extração contínua da ascorbato

oxidase em PRDC usando SDFA PEG/fosfato, observaram que o aumento da

velocidade da fase dispersa diminuiu o aumento de pureza e que a

VD=1mL/min foi a melhor velocidade de fluxo para a purificação da enzima.

Além disso, obtiveram um elevado fator de purificação 34,3, que foi muito

superior ao obtido nos resultados deste trabalho. Esta grande variação

observada pode ser devido às diferentes características dos componentes do

sistema.

Os fenômenos que ocorrem durante a extração contínua foram

explicados avaliando a velocidade de rotação dos discos e a velocidade da

fase dispersa em separado, mas as justificativas, de cada variável, são muito

semelhantes para todos os parâmetros (“hold up”, coeficiente de transferência

de massa e eficiência de separação) estudados.

Quando duas fases imiscíveis estão em contato na extração contínua

em contra-corrente, o tamanho e a quantidade de gotas da fase dispersa

(PEG), que surgem na zona de contato, são governadas principalmente pela

velocidade de agitação dos discos. Uma baixa velocidade resulta em grandes

gotas, proporcionando pequenas áreas interfaciais e baixas transferências de

massa. Uma alta velocidade de rotação permite a formação de pequenas gotas

esféricas, levando altas taxas de transferência de massa devido ao aumento da

área interfacial, consequentemente aumentando a purificação na fase extratora

(SARUBBO, 2000; PORTO et al., 1997, 2000 e 2004; CAVALCANTI et al

2007).

104

Em sistema de extração líquido-líquido, o aumento da agitação,

inicialmente causa um aumento da área interfacial (pela diminuição no tamanho

das gotas) e assim, aumenta a taxa de transferência de massa. Porém, isso

não ocorre indefinidamente devido a três fenômenos: (1) existe um limite para o

aumento da área interfacial que pode ser obtida. (2) abaixo de certo tamanho

de gotas, estas começam a se comportar como esferas rígidas sem circulação

pelo lento processo de difusão molecular. (3) após certo ponto, o aumento na

agitação pode começar a suprimir a interação gota-gota, reduzindo a mistura

na fase dispersa e também a taxa de transferência de massa. Há, portanto, um

grau ótimo de agitação que fornece a taxa de transferência de massa máxima

(SARUBBO, 2000).

Os artigos da literatura relataram que o aumento na velocidade da fase

dispersa diminui o tamanho da gota, embora este aumento provoque o

aumento do número de gotas, resultando no aumento de diversos parâmetros

operacionais, como “hold up” (VENÂNCIO; TEIXIEIRA, 1995; PORTO et al.,

1999; GIRALDO-ZUNIGA et al., 2006; CAVALCANTI et al., 2007), coeficiente

de transferência de massa (SARUBBO, 2000).

A Figura 5.10 apresenta a recuperação da enzima na fase PEG, e foi

verificado que a velocidade dos discos apresentou efeito significativo com valor

positivo. Este comportamento foi semelhante ao descrito para o coeficiente de

partição, ou seja, quanto maior a velocidade dos discos, melhor recuperação

da enzima ocorreu na fase polimérica. O maior valor obtido para a recuperação

da ascorbato oxidase na fase PEG foi 257%. Valores de recuperação acima de

100% são explicados pelo fato de serem calculados baseados na atividade

enzimática, e esta foi influenciada pela presença de inibidores, como o

caroteno, presentes no extrato enzimático.

105

-0,245

-1,552

3,738

p=0,05


(2)Velocidade da f ase dispersa

1*2

(1)Velocidade dos discos

Figura 5.10: Gráfico de Pareto dos efeitos principais, tendo como variável-resposta a recuperação da ascorbato oxidase na fase dispersa do sistema de duas fases aquosas.

Foram realizadas análises estatísticas para o parâmetro “hold up”, mas

nenhuma variável apresentou efeito significativo porque não houve mudanças

significativas nos valores deste parâmetro. Observando a Tabela 5.4, nota-se

que os menores valores de “hold up” foram obtidos com as menores

velocidades rotacionais dos discos (35rpm). Estes resultados diferiram dos

obtidos por Cavalcanti et al. (2007). Os autores apresentaram resultados

sugerindo que uma menor velocidade rotacional dos discos favoreceu o

aumento do “hold up”, que por definição, representa a quantidade de fase

extratora capaz de retirar a biomolécula da fase contínua.

Maiores velocidades de fluxo da fase dispersa favoreceram o “hold up”,

isto foi devido à diminuição do tamanho das gotas e aumento do numero de

gotas. Este resultado está de acordo com os observados em PRDC usando

SDFA PEG/fosfato para extração contínua de toxina alfa (CAVALCANTI et al.,

2007), citocromo b5 (PORTO et al., 1997) e albumina bovina sérica (BSA)

106

(PORTO et al., 2004), bem como usando PEG-POLICAJU para extração

contínua de BSA (SARUBBO et al., 2004).

Nenhuma das variáveis foi significativa para o coeficiente de

transferência de massa e o melhor resultado obtido para este parâmetro foi

0,059 (min-1). Estes resultados corroboram com os obtidos por Porto et al.

(2004) para ascorbato oxidase, em PRDC com sistema PEG/fosfato, utilizando

a mesma velocidade da fase dispersa (2mL/min).

Estudos de purificação da toxina alfa em PRDC, mostraram que o

coeficiente de transferência de massa aumentou de forma progressiva com a

velocidade rotacional do disco e alcançou o valor máximo (KDa = 2.71.10-3 min -

1) a 140rpm (CAVALCANTI et al., 2007). Este resultado sugere que um

aumento na agitação pode ser necessário para ultrapassar a viscosidade da

fase extratora e aumentar a transferência de massa. Esta observação está de

acordo com os resultados obtidos por Porto et al. (1997), quando investigaram

a extração contínua do citocromo b5 em PRDC com SDFA PEG/fosfato.

O aumento do coeficiente de transferência de massa foi esperado a

partir da utilização de VD crescentes, como resultado da diminuição do

tamanho da gota por causa da alta velocidade usada e consequentemente

maior área de transferência de massa (CAVALCANTI et al., 2007). Entretanto,

como apresentado na Tabela 5.4, o KDa diminuiu com o aumento da VD,

apresentando melhores valores com a velocidade intermediária (2mL/min),

referentes aos experimentos do ponto central.

Para a eficiência de separação nenhuma variável apresentou efeito

significante e o melhor resultado obtido para este parâmetro (96,8%)

corresponde ao sistema com velocidade rotacional dos discos 140rpm e

velocidade da fase dispersa 3mL/min. A eficiência de separação apresentou o

mesmo perfil que o coeficiente de partição. De acordo com Porto et al., (2004),

este comportamento pode ser devido ao efeito contrário exercido por este

parâmetro com a diminuição do tamanho da gota e o aumento do número de

gotas, em conseqüência do aumento da taxa de fluxo da fase dispersa.

Após a análise dos resultados apresentados, verificamos que os

sistemas referentes ao ponto central foram aqueles que proporcionaram melhor

desempenho em extrair por processo contínuo PRDC, utilizando sistemas de

duas fases aquosas. Os resultados em valores médios foram: coeficiente de

107

partição de 3,36 ± 1,19, recuperação de 152% ± 23%, aumento de pureza de

2,31 ± 0,83, coeficiente de transferência de massa 0,045 ± 0,004, eficiência de

separação de 43,7% ± 12% e Hold up de 0,33 ± 0,07. A melhor condição

operacional selecionada neste estudo para a extração da ascorbato oxidase na

PRDC, foi obtida com a velocidade de rotação dos discos de 80rpm e

velocidade da fase dispersa de 2mL/min.

5.5. CONCLUSÃO

Os resultados apresentados e discutidos neste estudo demonstraram

que a extração contínua com PRDC pode ser utilizada como uma técnica

promissora para purificar ascorbato oxidase em sistema PEG/citrato. A

principal vantagem do método de extração em coluna é que as fases separam

facilmente e rapidamente, sem a necessidade de centrifugação. Além disso, o

processo é simples e fácil de operar em modo contínuo.

108

CONCLUSÕES

• O sistema PEG/Citrato provou ser capaz de purificar ascorbato oxidase de

Cucurbita maxima em modo descontínuo. Os planejamentos sucessivos

utilizados selecionaram as variáveis que influenciaram a purificação da

enzima. O melhor resultado foi coeficiente de partição 1,7, recuperação

91% e aumento de pureza 3,1 vezes

• Os valores dos parâmetros termodinâmicos foram estimados para a enzima

e revelaram a termoestabilidade desta preparação enzimática para futuras

aplicações.

• A enzima parcialmente purificada com SDFA apresenta características

semelhantes àquelas do extrato bruto, tendo pH e temperatura ótimos para

a atividade enzimática iguais, mas a enzima pré-purificada foi menos

estável.

• Os resultados mostraram que a velocidade de rotação dos discos

influenciou fortemente o desempenho da PRDC, e que o coeficiente de

partição e a recuperação aumentaram com este parâmetro. Estas respostas

estudadas apresentaram melhor desempenho com a maior velocidade

rotacional dos discos.

• A melhor condição operacional selecionada neste estudo para a extração

da ascorbato oxidase na PRDC, foi obtida com a velocidade de rotação dos

discos de 80rpm e velocidade da fase dispersa de 2mL/min.

• Os resultados apresentados demonstraram o potencial uso do sistema de

duas fases aquosas PEG/citrato utilizando PRDC para purificação contínua

da ascorbato oxidase de Cucurbita maxima.

109

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ANEXOS

125

Anexo 1 – Normas para a Defesa da Tese

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULOFaculdade de Ciências Farmacêuticas

Secretaria de Pós-Graduação

Informações para os Membros de Bancas Julgadoras de

Mestrado/Doutorado

1. O candidato fará uma apresentação oral do seu trabalho, com duração máxima de trinta minutos.

2. Os membros da banca farão a argüição oral. Cada examinador

disporá, no máximo, de trinta minutos para argüir o candidato, exclusivamente sobre o tema do trabalho apresentado, e o candidato disporá de trinta minutos para sua resposta.

2.1 Com a devida anuência das partes (examinador e candidato), é

facultada a argüição na forma de diálogo em até sessenta minutos por examinador.

3. A sessão de defesa será aberta ao público. 4. Terminada a argüição por todos os membros da banca, a mesma

se reunirá reservadamente e expressará na ata (relatório de defesa) a aprovação ou reprovação do candidato, baseando-se no trabalho escrito e na argüição.

4.1 Caso algum membro da banca reprove o candidato, a Comissão

Julgadora deverá emitir um parecer a ser escrito em campo exclusivamente indicado na ata.

4.2 Será considerado aprovado o aluno que obtiver aprovação por unanimidade ou pela maioria da banca.

5. Dúvidas poderão ser esclarecidas junto à Secretaria de Pós-

Graduação: [email protected], (11) 3091 3621.

São Paulo, 18 de março de 2005.

Profa. Dra. Bernadette D. G. M. Franco Presidente da CPG/FCF/USP

Av. Prof. Lineu Prestes, 580, Bloco 13 A - Cidade Universitária - CEP 05508-900 - São Paulo - SP

Fone: (11) 3091 3621 - Fax (11) 3091 3141 – e-mail: [email protected]

126

Anexo 2 – Artigo Publicado

Documents

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE CIÊNCIAS ... · resposta o coeficiente de partição (K) 33 Figura 2.3: Diagrama para interpretação geométrica dos efeitos da concentração