UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE FILOSOFIA CIÊNCIAS E LETRAS DE RIBEIRÃO PRETO

DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA

“Expressão da proteína prM e da parte solúvel da proteína E do vírus de sorotipo 4 da dengue em células de inseto para produção de vacinas e diagnóstico”

Flávia Masson de Moraes

Monografia apresentada ao Departamento de Biologia da

Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto da

Universidade de São Paulo, como parte das exigências para a obtenção

do título de Bacharel em Ciências Biológicas.

RIBEIRÃO PRETO – SP

2013

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE FILOSOFIA CIÊNCIAS E LETRAS DE RIBEIRÃO PRETO

DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA

“Expressão da proteína prM e da parte solúvel da proteína E do vírus de sorotipo 4 da dengue em células de inseto para produção de vacinas e diagnóstico”

Flávia Masson de Moraes

Monografia apresentada ao Departamento de Biologia da

Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto da

Universidade de São Paulo, como parte das exigências para a obtenção

do título de Bacharel em Ciências Biológicas.

Benedito Antônio Lopes da Fonseca Emiliana Pereira Abrão

RIBEIRÃO PRETO – SP

2013

“Por vezes sentimos que aquilo que fazemos não é senão uma gota de água no mar.

Mas o mar seria menor se lhe faltasse uma gota.”

Madre Teresa de Calcutá

AGRADECIMENTOS

Gostaria de agradecer, primeiramente, a essa Força Maior que tem me guiado e iluminado

todos os meus caminhos. Agradeço ao orientador Prof. Dr. Benedito Antônio Lopes da Fonseca, por ter

aberto as portas de seu laboratório e me dado a oportunidade de realizar um grande sonho. Ao amigo e

co-orientador Danillo Lucas Alves Espósito, pelo grande apoio dedicado a mim durante todo o tempo,

sem o qual esse trabalho não teria sido possível. À querida amiga e co-orientadora Emiliana Pereira

Abrão, cuja calma e paciência me ajudaram durante os momentos difíceis. Ao Prof. Dr. Luiz Tadeu

Moraes Figueiredo e Prof. Dr. Eurico de Arruda Neto, por terem concedido o espaço de seus

laboratórios em diversos momentos. Agradeço, ainda, aos companheiros de trabalho Ana Luísa, Aline,

Fernanda, Letícia, Taline, Mariana, Luíza, Flávio e João, pela convivência e pelas grandes risadas que

sempre tornaram o ambiente de trabalho um lugar prazeroso. Agradeço à dona Leila por manter o

laboratório limpo e organizado. Agradeço ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e

Tecnológico (CNPq) pela concessão da bolsa de Iniciação Científica

Esse trabalho não teria acontecido sem meus pais Eliana e Gilberto, e meus irmãos Bruna e

Alexandre, cujo amor e apoio foram meus alicerces durante todo o tempo. Agradeço também aos meus

avós e tios queridos que sempre acreditaram em mim. Ao meu amigo e namorado Rodrigo, cujo

carinho foi essencial para que eu conseguisse percorrer esse caminho.

Aos membros da banca por terem encontrado um tempo para dedicar na avaliação desse

trabalho. Às queridas amigas e companheiras de faculdade Letícia, Natália e Vitória, pelas conversas e

risadas diárias. Agradeço a todos por essa oportunidade de crescimento não só profissional, mas

também pessoal, tão importante para os meus dias daqui para frente.

RESUMO

A dengue é uma arbovirose causada por um vírus do gênero Flavivirus, transmitida pelo vetor

Aedes aegypti e ocorre principalmente nos países tropicais. São conhecidos quatro sorotipos (DENV-1

a DENV-4) que apresentam características antigênicas diferentes. O genoma do vírus da dengue é

constituído por um RNA de senso positivo contendo 10.644 nucleotídeos, que codificam uma única

poliproteína, a qual, após ser processada, origina sete proteínas não-estruturais e três proteínas

estruturais, como a do capsídeo (C), que circunda o genoma do vírus, e as que se encontram na

bicamada lipídica do envelope viral, a precursora da membrana (prM) e a proteína do envelope (E).

Tendo em vista que as proteínas prM e E são os principais alvos do ataque de anticorpos numa

infecção, elas são de grande importância para a confecção de vacinas. Porém, a elaboração de uma

vacina contra os vírus da dengue ainda é um desafio, uma vez que a infecção com um dos sorotipos

não provoca a imunidade contra os outros tipos, induzindo, apenas, a imunidade homóloga e podendo

até aumentar a gravidade da doença. A linhagem de células Schneider 2 (S2) de Drosophila

melanogaster pode ser utilizada como hospedeira para a produção de proteínas recombinantes, graças

às diversas vantagens a elas atribuídas, visando ao desenvolvimento de vacinas para a dengue e à

criação de um método diagnóstico prático e seguro. Elas apresentam a característica de expressar de

maneira estável diversas proteínas recombinantes, utilizando como vetores plasmídeos desenhados

especificamente para tal expressão. Para verificar a expressão das proteínas, as células foram

induzidas com sulfato de cobre e a análise do Western Blotting mostrou a presença da proteína

recombinante prM-TEV-sE dentro das células. Já a análise do gel de poliacrilamida corado com azul de

Comassie mostrou que a proteína havia sido expressa e secretada para o sobrenadante da cultura,

além de também ter se mostrado presente no interior das células. Uma vez purificadas, as proteínas

desse trabalho podem ser utilizadas para uso em diagnóstico e futuros trabalhos de desenvolvimento

de vacina. Esse trabalho buscou expressar e purificar as proteínas prM e E do vírus dengue-4 na

linhagem de células S2, testar o soro de pacientes infectados para a presença de anticorpos IgM e IgG

contra esse sorotipo, aprender e fixar o conhecimento nas técnicas de expressão e purificação de

proteínas, além de possibilitar o contato com a metodologia científica.

Palavras chave: dengue, células S2, proteínas recombinantes, vacina e diagnóstico.

SUMÁRIO

1. Introdução ............................................................................................................................. 08

2. Objetivos ............................................................................................................................... 14 2.1. Objetivo geral ................................................................................................................. 14 2.2. Objetivos específicos ..................................................................................................... 14

3. Material e métodos ................................................................................................................ 16

3.1. Obtenção do fragmento prM – TEV – sE ....................................................................... 16 3.2. Digestão e ligação do plasmídeo pMT/BiP/V5-His B com o amplicon de 1600 pb ......... 17 3.3. Clonagem em bactérias competentes dh5α ................................................................... 17 3.4. Purificação do plasmídeo ............................................................................................... 18 3.5. Digestão com a enzima de restrição BamH I ................................................................. 18 3.6. Sequenciamento do plasmídeo ...................................................................................... 18 3.7. Detecção de anticorpos IgM e IgG por meio da técnica de ELISA ................................. 19 3.8. Cultura das células S2 ................................................................................................... 19 3.9. Plaqueamento das células S2 ........................................................................................ 19 3.10. Transfecção nas células S2 ......................................................................................... 20 3.11. Centrifugação das células S2 ....................................................................................... 20 3.12. Expressão transiente e indução das células S2 com sulfato de cobre ......................... 21 3.13. Coleta do sobrenadante da cultura de células de DENV-4 .......................................... 21 3.14. Eletroforese em gel de poliacrilamida .......................................................................... 21 3.15. Western Blotting da proteína de DENV-4 ..................................................................... 22 3.16. Purificação da proteína de DENV-4 pelo sistema FPLC .............................................. 23 3.17. Descongelamento das células S2 previamente transfectadas ..................................... 23 3.18. Indução das células S2 com sulfato de cobre .............................................................. 24 3.19. Coleta do sobrenadante da cultura de células de DENV-1 a DENV-3 ......................... 24 3.20. Eletroforese em gel de poliacrilamida .......................................................................... 24 3.21. Western Blotting da proteína de DENV-1 a DENV-3 .................................................... 24 3.22. Purificação da proteína pelo sistema FPLC ................................................................. 24

4. Resultados e discussão......................................................................................................... 26 4.1. Eletroforese em gel de agarose das PCRs convencionais ............................................. 26 4.2. Eletroforese em gel de agarose da digestão do plasmídeo pMT/BiP/V5-His B e do

amplicon de 1600 pb ..................................................................................................... 27 4.3. Liberação do fragmento de interesse utilizando a enzima de restrição BamH I ............. 28 4.4. Sequenciamento dos plasmídeos com inserto ............................................................... 28 4.5. Detecção de anticorpos IgM e IgG por meio da técnica de ELISA ................................. 30 4.6. Transfecção do plasmídeo nas células S2 ..................................................................... 32 4.7. Western Blotting da cultura de células submetidas à expressão transiente e à

expressão para gerar uma linhagem de células estável ................................................ 33 4.8. Eletroforese em gel de poliacrilamida da cultura de células dos sorotipos 1, 2 e 3........ 35 4.9. Purificação da proteína dos 4 sorotipos pelo sistema FPLC .......................................... 36

5. Referências bibliográficas ..................................................................................................... 44

1. INTRODUÇÃO

8

1. Introdução

Atualmente, a dengue é a arbovirose mais importante que afeta o ser humano, sendo um sério

problema de saúde pública que vem aumentando suas proporções e sua extensão geográfica no

mundo, desde meados do século XX (Guia de Vigilância Epidemiológica, 2005; Halstead, 1997). Essa

doença é causada por um vírus de RNA do gênero Flavivirus, pertencente à família Flaviviridae, e

ocorre, principalmente, nos países tropicais, uma vez que o meio ambiente dessas regiões favorece o

desenvolvimento e a proliferação do seu principal vetor, o mosquito Aedes aegypti (Guia de Vigilância

Epidemiológica, 2005). São conhecidos quatro sorotipos que apresentam características antigênicas

diferentes: DENV-1, DENV-2, DENV-3 e DENV-4 (Tauil, 2001). Tais sorotipos distinguem-se por

anticorpos neutralizantes produzidos pelo organismo em resposta à infecção (Stephenson, 2005). A

Secretaria de Vigilância em Saúde do Ministério da Saúde registrou, de 1º de janeiro até 16 de

fevereiro de 2013, 204.650 casos de dengue no país, com o sorotipo 4 como o responsável por cerca

de 52% desses casos (Ministério da Saúde, 2013).

O genoma do vírus da dengue (figura 1.A) é constituído por 10.644 nucleotídeos, que codificam

uma única poliproteína de 3.386 aminoácidos (Zhang et al, 1988), a qual, após ser processada, origina

sete proteínas não estruturais (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5) e três proteínas

estruturais: a do capsídeo (C), que circunda o genoma do vírus, a precursora da membrana (prM) e a

glicoproteína do envelope (E), sendo que as duas últimas encontram-se na bicamada lipídica do

envelope viral (Kelly et al, 2000; Halstead, 2008) (figura 1.B).

9

Figura 1. A. Organização genômica dos vírus pertencentes ao gênero Flavivirus. (Adaptado de Barros,

2007). B. Proteínas do vírus da dengue através da membrana do retículo endoplasmático. As setas

indicam vários locais de clivagem por proteases (Adaptado de Li et al, 2008).

O diagnóstico da doença pode ser feito de duas formas: pela detecção de anticorpos no soro

de pacientes bem como pela detecção de antígenos virais e do seu genoma, (Halstead, 2008). Dentre

os principais testes utilizados, merece destaque o imunoensaio ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent

Assay), por meio do qual é possível diferenciar a infecção primária da infecção secundária, detectando-

se diferentes níveis de anticorpos IgM e IgG, respectivamente. Existem, também, testes rápidos e de

menor custo que detectam a presença de anticorpos no soro de pacientes. Tais anticorpos, quando

presentes, reagem com um antígeno (como a proteína não estrutural NS1) comum a todos os

sorotipos, presente em uma coluna fornecida pelo kit diagnóstico, mostrando resultado positivo em um

pequeno intervalo de tempo (Cardosa et al, 1988). Além disso, dentre os métodos moleculares para

detecção do genoma viral, temos a reação em cadeia da polimerase (PCR) que também pode ser

utilizada no diagnóstico da dengue, assim como a PCR em tempo real (Timerman et al, 2012). Porém,

as técnicas moleculares ainda são pouco utilizadas para investigação de casos suspeitos fora dos

centros de pesquisa e universidades devido ao alto custo para o uso rotineiro nos serviços de saúde.

10

Sabe-se que a resposta imune contra a infecção por esse flavivírus atua, principalmente, contra

as proteínas prM e E. Porém, muitos estudos mostram que a resposta imune nas infecções primárias e

secundárias é predominantemente contra a proteína E (Rodenhuis-Zybert et al, 2011). Essa proteína é

de grande importância, pois além de induzir a resposta imune do hospedeiro, ela medeia a entrada do

vírus na célula. Vários candidatos têm sidos sugeridos como receptores primários para o vírus, como

as moléculas DC-SIGN, heparan sulfato e o receptor de manose (Chen et al. 1999; Chen et al. 1997;

Miller et al. 2008; Tassaneetrithep et al. 2003).

Após sua ligação à superfície celular, o vírus é endocitado e entregue a endossomos, cujo

baixo pH gera uma mudança conformacional na glicoproteína E, o que permite a fusão do vírus com a

membrana celular do endossomo e a liberação dos componentes virais no citoplasma celular (Henchal

& Putnak, 1990; Rey, 2003). Já a proteína prM é clivada em proteína de Membrana (M) por uma furino-

protease, o que a torna madura e permite que as porções da proteína E que se projetam do vírus

fiquem evidenciadas (figura 2), ocorrendo a saída do vírus por exocitose (Modis et al, 2003). Tal

clivagem da prM é de grande importância para a infectividade do vírus, pois partículas imaturas não se

fusionam com as membranas celulares, não havendo a liberação dos componentes virais (Henchal &

Putnak, 1990).

Figura 2. Esquema da partícula viral imatura (A) e madura (B) do vírus do dengue. Adaptado de

Barros, 2007.

11

Tendo em vista que as proteínas prM e E são os principais alvos de anticorpos numa infecção,

elas são de grande importância para a confecção de vacinas (Rodenhuis-Zybert et al, 2011). O

desenvolvimento das mesmas tem recebido grande destaque para o combate de algumas doenças

transmitidas por flavivírus como a febre amarela, a encefalite japonesa e a encefalite transmitida por

carrapato. Entretanto, a elaboração de uma vacina contra a dengue ainda é um desafio (Stephenson,

2005). Isso se deve ao fato de a infecção com um dos sorotipos não provocar a imunidade contra os

outros tipos, induzindo, apenas, a imunidade homóloga (Calvert et al, 2005). Assim sendo, é necessário

que as possíveis vacinas contra a dengue sejam polivalentes, o que dificulta o seu desenvolvimento.

Outro desafio está relacionado à ausência de modelos animais para se testar a efetividade das vacinas,

uma vez que a doença não se manifesta de maneira semelhante em animais e em seres humanos.

(Bricks, 2004).

Além disso, outro grande problema enfrentado no desenvolvimento de vacinas contra dengue é

a ocorrência de um fenômeno denominado amplificação dependente de anticorpos (ADE - Antibody

Dependent Enhancement). Neste fenômeno, os vírus, utilizando-se de anticorpos pré-existentes e sub-

neutralizantes produzidos por uma infecção anterior, ligam-se às células alvo portadoras de receptores

Fc, aumentando a sua capacidade de infecção por meio de rota natural receptor-ligante. Dessa

maneira, a quantidade de vírus torna-se exacerbada, assim como a gravidade da doença (Rodenhuis-

Zybert et al, 2011; Tirado & Yoon, 2003).

Apesar das dificuldades, diversas estratégias têm sido empregadas na tentativa de elaboração

da vacina contra a dengue, como: as clássicas (vírus vivos atenuados em cultura de tecidos; partículas

virais inativadas e vacinas de subunidades de proteínas ou peptídeos); as de tecnologia do DNA

recombinante (vacinas quiméricas caracterizadas pela inserção de genes de um ou mais sorotipos do

vírus da dengue no genoma de outros flavivírus ou em um sorotipo atenuado do vírus e uso de vetores

capazes de expressar proteínas ou peptídeos), as vacinas de DNA e as mistas (associação de vírus

vivos com proteínas ou partes do genoma viral) (Bricks, 2004). Dentre as técnicas existentes, a

produção de vacinas que se utilizam de proteínas recombinantes mostra-se muito vantajosa, uma vez

que o patógeno é excluído da vacina, o que elimina o risco de reversão ao genótipo virulento ou de

inativação incompleta do organismo (Liljeqvist & Stahl, 1999).

Muitos são os organismos que podem ser utilizados para a confecção de proteínas

recombinantes, sendo um dos mais utilizados a bactéria Escherichia coli (E. coli). Entretanto, tal

organismo não apresenta as modificações pós-traducionais características de seres eucariontes, como

a formação das pontes dissulfeto existentes em algumas proteínas, além de não haver um mecanismo

de secreção que permita uma liberação abundante da proteína no meio de cultura. Tais fatores acabam

12

tornando a E. coli um hospedeiro inviável para a expressão de glicoproteínas (Makrides, 1996). Por

isso, outros organismos têm sido utilizados graças às diversas vantagens a eles atribuídas, por

exemplo a linhagem de células Schneider 2 (S2) de Drosophila melanogaster (Schetz & Shankar,

2004), que foi o sistema de escolha para a realização do presente trabalho.

A cultura de células de Drosophila, até o início de 1970, era feita até o estágio inicial dos

embriões (6-8 horas) (Schetz & Shankar, 2004). Porém, utilizando-se de um estágio mais tardio (20-22

horas), Schneider criou três novas linhagens, dentre as quais a segunda linhagem é referida como S2

(Schneider, 1972). Tais células caracterizam-se pela expressão estável de diversas proteínas

recombinantes utilizando como vetores, plasmídeos desenhados especificamente para a expressão de

proteínas em células de Drosophila. Além disso, elas podem ser transfectadas com inúmeras cópias do

plasmídeo, o qual se integra aos cromossomos das células, resultando em cerca de 500 cópias de

plasmídeo por célula (Johansen et al, 1989). Ainda, seu cultivo requer manutenção mínima e poucos

equipamentos, o que contribui para a produção de uma grande quantidade de proteína em curto

espaço de tempo (Schetz & Shankar, 2004).

O vetor pMT/BiP/V5-His é um plasmídeo especialmente confeccionado para a expressão nesse

tipo celular. Ele apresenta inúmeras características que o tornam uma excelente opção para a

realização de experimentos com células de Drosophila, dentre as quais merece destaque a presença

de um promotor induzível por metal (“Drosophila metallothionein - MT - promoter”), o que permite altos

níveis de expressão do gene de interesse (pMT/BiP/V5-His A, B, and C – Invitrogen Handbook); a

presença de uma sequência sinal (“Binding Protein – BiP”) necessária para o transporte da proteína de

interesse para o retículo plasmático das células S2 (Kirkpatrick and Shatzman, 1997); sítios múltiplos

de clonagem; presença de um gene resistente à ampicilina para a seleção de transformantes em E. coli

e presença de uma cauda de polihistidina (6xHis) para a detecção e purificação por afinidade da

proteína de interesse (pMT/BiP/V5-His A, B, and C – Invitrogen Handbook).

2. OBJETIVOS

14

2. Objetivos 2.1. Objetivo geral

Esse trabalho tem como objetivo geral expressar as proteínas prM e a parte solúvel da proteína

E do sorotipo 4 do vírus da dengue na linhagem de células Schneider 2 de Drosophila melanogaster,

para uso em diagnóstico e futuros trabalhos de desenvolvimento de vacina.

2.2. Objetivos específicos

Expressar as proteínas prM e E ativas, em células de Drosophila melanogaster (S2), para o

sorotipo 4 do vírus da dengue;

Purificar as proteínas produzidas por coluna de níquel;

Testar em amostras (soro) de pacientes infectados a presença de anticorpos IgM e IgG contra

o sorotipo 4 da dengue;

Aprender as técnicas de expressão e purificação de proteínas, além de possibilitar o contato

com a metodologia científica.

3. MATERIAL E MÉTODOS

16

3. Material e Métodos 3.1. Obtenção do fragmento prM – TEV – sE

Inicialmente, para a obtenção do fragmento prM – TEV – sE foram desenhados dois pares de

primers para a realização de PCRs convencionais, as quais foram feitas utilizando-se o kit da QIAGEN

One Step RT-PCR. O primeiro par foi desenhado para a obtenção da proteína prM, cuja sequência foi

obtida no site “National Center for Biotechnology Information – NCBI” (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).

Este par de primers possui na sua região 3’ um sítio de clivagem para a enzima Bgl II, seguido da

sequência da prM e um conector TEV na região 5’, o qual é responsável pela ligação entre a prM e a

sE, podendo ser, eventualmente, clivado para a separação dessas proteínas com o intuito de utilizá-las

futuramente em outros trabalhos. A amostra utilizada nessa PCR foi o RNA viral (DENV-4) extraído de

uma amostra de paciente infectado.

Já o segundo par de primers foi desenhado para a obtenção de um amplicon contendo o

mesmo conector TEV na região 3’ e a sequência da parte solúvel da proteína E, também obtida no site

do NCBI, seguido de um sítio de clivagem para a enzima de restrição Age I na região 5’. A amostra

utilizada nesse caso foi, também, o RNA viral (DENV-4).

Por fim, para a junção dos amplicons e construção final do fragmento alvo deste trabalho, foi

realizada uma nova PCR utilizando apenas os primers externos das PCRs anteriores (primers da

região 3’ para a prM e da região 5’ para a E) contendo os sítios de restrição das enzimas Bgl II e Age I,

utilizando-se como amostra os amplicons das duas PCRs realizadas inicialmente, sendo que a região

de sobreposição contendo o conector TEV serviu de ligação entre os fragmentos. Entretanto, essa

última PCR teve algumas particularidades, pois foi realizada em duas etapas: inicialmente, foram

adicionados todos os constituintes da PCR convencional, com exceção dos primers, e esse mix foi

submetido a uma desnaturação inicial de 3 minutos a 94º C, a uma desnaturação de 30 segundos

nessa mesma temperatura, ao pareamento dos primers a 60º C durante 3 minutos e a uma extensão

final de 1 minuto a 72º C, com 4 ciclos de amplificação. Em seguida, os primers foram adicionados e a

PCR foi realizada conforme o protocolo do fabricante.

Dessa forma, o produto final de 1600 pb foi: SR (Bgl II) – prM – TEV – sE – SR (Age I), sendo

“SR” o mesmo que “sítio de restrição”. Após a eletroforese em gel de agarose (1%), a banda

correspondente ao amplicon de 1600 pb foi purificada com o kit Wizard SV Gel and PCR Clean-up

System (Promega). As sequências de todos os primers utilizados são mostradas na tabela 1.

17

Tabela 1. Sequências dos primers forward e reverse utilizados na PCR convencional.

3.2. Digestão e ligação do plasmídeo pMT/BiP/V5-His B com o amplicon de 1600 pb

A digestão, tanto do plasmídeo utilizado quanto do fragmento obtido com a PCR, foi necessária

para que houvesse, posteriormente, a inserção do amplicon nesse vetor. Para isso, em um tubo foram

adicionados o plasmídeo (1 µg de plasmídeo para 1 µl de reação), BSA, a enzima Bgl II (New England

Biolabs - NEB), o buffer da enzima e água, obtendo-se um volume final de 50 µl. Em outro tubo foram

adicionados os mesmos constituintes, com exceção do plasmídeo, colocando-se, em vez disso, o

fragmento de 1600 pb. Ambos os tubos ficaram submetidos a uma temperatura de 37º C em “banho

maria” durante 1 hora.

Em seguida, as duas reações foram purificadas com o kit Wizard SV Gel and PCR Clean-up

System (Promega) e a segunda digestão foi realizada da mesma maneira que a primeira, entretanto,

dessa vez a enzima utilizada foi a Age I (Invitrogen). Ao término desta, foi realizada novamente a

purificação das duas reações. Os passos de purificação são necessários para a eliminação de resíduos

de sal e das enzimas utilizadas.

A seguir, foi feita a reação de ligação do inserto no plasmídeo adicionando-se o inserto, o

plasmídeo, a enzima T4 ligase (New England Biolabs – NEB) e o buffer em um tubo de 1,5 ml,

obtendo-se um volume final de 20 µl. Foi feita, também, uma reação controle, na qual foi adicionada

água no lugar do inserto. A reação de ligação foi mantida overnight a 4º C.

3.3. Clonagem em bactérias competentes dh5α

A reação de ligação contendo o fragmento de 1600 pb e o plasmídeo foi adicionada em um

tubo contendo 200 µl de bactérias competentes dh5α e a reação controle foi adicionada em outro tubo,

ficando ambas cerca de 30 minutos no gelo. Ao término desse período, foi dado um choque térmico

durante 90 segundos a 42º C e, logo em seguida, os tubos foram imediatamente transferidos para o

gelo. As bactérias, agora com o plasmídeo nelas inserido, foram colocadas em meio SOC (Invitrogen) e

deixadas em uma estufa a 37º C durante 40 minutos, para a sua recuperação e início da expressão do

gene de resistência ao antibiótico ampicilina. Ao fim desse tempo, elas foram centrifugadas e

Primers Forward Primers Reverse

SR-prM 5’CCATGGAGATCTTTTCACTTGTCAAC

AAGA3’

prM-TEV 5’GCCCTGGAAGTACAGGTTCTCGCCGT

TTCTGAGTATCCAGCT3’

TEV-sE 5’GGCGAGAACCTGTACTTCCAGGGCA

TCCGATGCGTAGGAGTA3’

sE-SR 5’CTCGAGACCGGTGGGGCCAATGGAAC

TCCCTTT3’

18

concentradas, retirando parte do meio SOC no qual elas estavam imersas. Todo o restante foi aplicado

em placas de ágar contendo ampicilina: a solução contendo o inserto foi aplicada em uma placa

(positiva) e a solução controle (negativa) em outra. As duas placas foram deixadas overnight em uma

estufa a 37º C.

3.4. Purificação do plasmídeo

No dia seguinte, oito colônias crescidas na placa positiva foram colocadas separadamente para

crescer em oito tubos falcon contendo 5 ml de meio LB e 5 µl do antibiótico ampicilina. Esse

procedimento foi realizado numa capela de fluxo laminar e toda a manipulação foi feita próxima ao bico

de Bunsen. Todos os tubos foram mantidos em um agitador sob a temperatura de 37º C.

Após 16 horas, foram feitas oito purificações do plasmídeo, uma para cada tubo falcon,

utilizando o kit Gene JET Plasmid Miniprep (Thermo Scientific). Ao término desse procedimento, todas

as soluções extraídas foram transferidas para um único tubo de 1,5 ml, obtendo-se um volume final de

400 µl da solução de eluição contendo o plasmídeo de interesse. Essa amostra foi quantificada com o

espectrofotômetro NanoDrop 2000 (Thermo Scientific) e obteve-se uma quantidade de 559 ng/µl do

plasmídeo.

3.5. Digestão com a enzima de restrição BamH I

Para verificar quais colônias possuíam o fragmento desejado, foi realizada uma digestão com a

enzima BamH I, presente em duas regiões no plasmídeo completo e em apenas uma região no

plasmídeo em que o fragmento não foi inserido. A digestão foi realizada de acordo com protocolo do

fabricante: 10 unidades da enzima para 1µg de DNA, mantidos 1 hora a 37ºC.

3.6. Sequenciamento do plasmídeo

Para verificar se a sequência de nucleotídeos não apresentava mutações e se estava em frame

com o promotor do plasmídeo, este foi enviado para análise em sequenciamento (Applied Biosystems

3500), utilizando o kit BigDye Terminator 3.1 (Applied Biosystems) para metodologia de Sanger, de

acordo com o protocolo do fabricante.

Após o sequenciamento, foram introduzidas mutações em 3 aminoácidos diferentes na

proteína prM, mais especificamente no sítio de clivagem da Furina, uma protease do hospedeiro que

cliva a proteína prM em “pr” e em “proteína M”, causando a maturação viral. Para isso, foi utilizada a

técnica de mutação sítio dirigida, de acordo com protocolo descrito por Papworth et al (1996), sendo

necessária a confecção de um par de primers para a introdução da mutação e uma Taq DNA

19

Polimerase de alta fidelidade. A sequência final, com as mutações na região prM e sequência de

clivagem TEV, foi construída de acordo com modelo para cristalografia dessas proteínas para DENV-2,

sugerido por Li et al (2008).

3.7. Detecção de anticorpos IgM e IgG por meio da técnica de ELISA

Para verificar a presença de anticorpos IgM e IgG em soro de pacientes positivos para DENV-

4, a técnica de ELISA foi realizada utilizando 82 amostras obtidas pelo Serviço de Assistência Médica e

Social de Pessoal (SAMSP) de Ribeirão Preto. Foi utilizado o kit para detecção de anticorpos IgM da

SD Biomix e para a detecção de anticorpos IgG foi utilizado o kit de ELISA indireto da Panbio, de

acordo com os protocolos dos fabricantes. As placas foram lidas no equipamento “Labsystems –

Multiskan Ascent” (Uniscience).

3.8. Cultura das células S2

Para que a transfecção do plasmídeo contendo o fragmento de interesse pudesse ser

realizada, foi preciso, primeiramente, cultivar as células hospedeiras Schneider 2. As células estavam

devidamente acondicionadas em nitrogênio líquido e foram descongeladas em uma garrafa de cultura

celular de 25 cm² e foram colocados 5 ml de meio “Schneider’s Drosophila Medium” (Invitrogen) com

10% de soro bovino fetal. Após dois dias, foi feita a primeira passagem dessas células para uma

garrafa de 75 cm² e consecutivas passagens foram realizadas até as células atingirem crescimento

exponencial. Todos os procedimentos foram realizados numa capela de fluxo laminar e em cada um

deles foi adicionado o antibiótico penicilina-estreptomicina (1%). As garrafas de cultura foram mantidas

numa estufa a 28ºC.

3.9. Plaqueamento das células S2

As células foram contadas e semeadas em duas placas de seis poços, sendo uma delas o

controle. Em cada placa utilizou-se apenas um poço com cerca de 2 milhões de células cada. A

contagem foi realizada com o auxílio de uma câmara de Neubauer. Após semear a quantidade ideal de

células, completou-se cada poço para o volume de 2 ml de meio com 10% de soro bovino fetal e 1% de

penicilina-estreptomicina. Todos os procedimentos foram realizados numa capela de fluxo laminar e

ambas as placas foram mantidas na estufa a 28ºC.

20

3.10. Transfecção nas células S2

Decorridas 16 horas a partir do plaqueamento, foi realizada a transfecção do plasmídeo nas

células S2 por meio de tampão Fosfato de Cálcio. Para tal, foram feitas duas soluções utilizadas na

transfecção: a solução A (CaCl2 – 2 mol/L) e a solução B (Hepes – 5x10-2 mol/L; Na2HPO4 – 1,5x10-3

mol/L; NaCl – 2,8x10-1 mol/L), sendo que esta última teve seu pH ajustado para 7,1. Ambas as soluções

foram filtradas em filtros de 0,22 µm, utilizando-se seringas de 3 ml. Em um tubo de 1,5 ml foram

adicionados 36 µl da solução A, 19 µg do plasmídeo contendo o fragmento de interesse, 1 µg do

plasmídeo pCoHygro, necessário para a seleção de uma linhagem de células estável (Drosophila

Schneider 2 Cells, Invitrogen – Life Technologies) e 228,9 µl de água, completando 300 µl de solução.

Em outro tubo de 1,5 ml, foram adicionados 300 µl da solução B e nesta gotejou-se, com o auxílio de

uma pipeta, toda a solução feita primeiramente.

Após 40 minutos de repouso, houve a formação de um precipitado branco necessário para a

transfecção e toda a solução foi gotejada cuidadosamente no poço da placa positiva, sendo que a

placa controle não foi alterada. Para a homogeneização, foram feitos leves movimentos circulares.

Ambas as placas foram mantidas por 24 horas na estufa a 28ºC. Transcorrido esse tempo, o meio com

a solução de transfecção foi removido com uma pipeta e as células aderidas no poço da placa positiva

e da placa controle foram lavadas cuidadosamente, evitando o descolamento das células aderidas à

placa, com 2 ml de meio de cultivo com 10% de soro bovino fetal e 1% do antibiótico penicilina-

estreptomicina; essa lavagem foi realizada duas vezes. Por fim, 2 ml da mesma solução de lavagem

foram adicionados nas placas e estas foram mantidas durante 48 horas na estufa a 28ºC. Todos os

procedimentos foram realizados numa capela de fluxo laminar e de acordo com protoloco previamente

estabelecido.

3.11. Centrifugação das células S2

Após 2 dias de cultivo das células transfectadas, com o auxílio de uma pipeta, o meio de cultivo

presente nos poços de ambas as placas foi pipetado para cima e para baixo, cuidadosamente, para

que as células aderidas se soltassem. Toda a solução foi transferida para um tubo de 15 ml e foi

centrifugada à temperatura ambiente durante 5 minutos a 500 g. O sobrenadante foi descartado e as

células foram ressuspendidas com 1 ml de meio de cultivo com 10% de soro bovino fetal e 1% de

penicilina-estreptomicina e transferidas para uma garrafa de 25 cm², onde foram adicionados mais 4 ml

do mesmo meio. Nessa etapa, foi necessário adicionar o antibiótico higromicina (300ug/ml de

higromicina), pois este seleciona aquelas células que foram transfectadas com o plasmídeo de

interesse e com o plasmídeo pCoHygro, o qual é resistente à higromicina (The Drosophila expression

21

system, Invitrogen). Todos os procedimentos foram realizados com a placa positiva e com a placa

controle e todas as etapas que envolviam a manipulação direta das células foram realizadas numa

capela de fluxo laminar. As garrafas foram mantidas numa estufa a 28ºC durante 72 horas.

3.12. Expressão transiente e indução das células S2 com sulfato de cobre

Os passos 3.8, 3.9 e 3.10 foram repetidos, entretanto, nesse último não houve a adição do

plasmídeo de seleção pCoHygro. Além disso, nesse tipo de expressão o procedimento de

centrifugação realizado no passo 3.11 não é necessário. A solução de transfecção foi removida no dia

pós-transfecção e as células foram transferidas para uma garrafa de 25 cm² com novo meio de cultura

completo. O plasmídeo utilizado na transfecção (pMT/BiP/V5-His B) apresenta um metalo-promotor, ou

seja, um promotor induzível por metal, no caso, o cobre. Por isso, foi feita uma solução 1 mol/L de

sulfato de cobre, a qual foi devidamente filtrada com filtro de 0,22 µm numa capela de fluxo laminar, e

adicionada na garrafa de cultura, de tal forma que se obtivesse uma solução 500 µM de sulfato de

cobre. A indução teve duração de 4 dias e as garrafas foram mantidas numa estufa a 28ºC durante

todo o tempo.

3.13. Coleta do sobrenadante da cultura de células de DENV-4

Os 5 ml de sobrenadante da garrafa induzida foram coletados e transferidos para um tubo

falcon de 50 ml. Foi realizada uma centrifugação durante 5 minutos a 500xg. O sobrenadante foi

separado do precipitado de células que se formou com a centrifugação e tais células foram

ressuspendidas com 5 ml de PBS 1X. Nessa etapa, não há necessidade de se realizar o experimento

numa capela de fluxo laminar.

3.14. Eletroforese em gel de poliacrilamida

Foi feito um gel de poliacrilamida (15%) e cada amostra foi fervida durante 10 minutos na

presença do tampão de amostra, para a desnaturação da proteína. As amostras utilizadas foram as

seguintes: sobrenadante das células S2 não transfectadas, células S2 transfectadas e induzidas e

sobrenadante das células S2 transfectadas e induzidas. A corrida teve duração de 90 minutos a 100 V.

As tabelas 2 e 3 mostram a concentração de cada um dos componentes utilizados para preparar o

tampão de amostra e para fazer o gel stacking (no qual as amostras são aplicadas) e o gel resolving

(no qual as amostras são resolvidas), respectivamente.

22

Tabela 2. Concentração dos componentes utilizados no tampão de amostra.

Glicerol 10%

β-mercaptoetanol 5%

SDS 2,3%

Tris-HCl (pH 6,8) 0,0625 M

Tabela 3. Concentração dos componentes utilizados no preparo dos géis stacking (5%) e resolving

(15%).

Stacking Resolving

30% Acrilamida/Bis 1,66 ml 5 ml

Buffer Tris 0,5 M (pH 6,8) – 2,5 ml 1,5 M (pH 8,8) – 2,5 ml

10 % SDS 0,1 ml 0,1 ml

10% Persulfato de amônio 50 ul 100 ul

TEMED 10 ul 10 ul

H2O 5,74 ml 2,4 ml

3.15. Western Blotting da proteína de DENV-4

As bandas do gel de poliacrilamida foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose. O

gel foi posicionado abaixo da membrana e acima desta e do gel foi colocado um papel filtro e uma

esponja, materiais apropriados para tal experimento. A transferência foi feita durante 60 minutos a 300

mA. Em seguida, a membrana foi bloqueada com 20 ml de uma solução 5% de leite em pó e PBS

Tween-20 (PBS-T) durante 1 hora à temperatura ambiente, para impedir ligações inespecíficas do

anticorpo na membrana. Passado esse tempo, 3 µl do anticorpo primário “anti-HIS Tag” (GE

Healthcare Life Sciences) foram adicionados nessa mesma solução de leite, com a função de se ligar à

proteína de interesse. A incubação foi feita por 1 hora à temperatura ambiente. Ao término da

incubação com o primeiro anticorpo, foram realizadas três lavagens da membrana com PBS-T, tendo

duração de 10 minutos cada uma.

A seguir, 1,5 µl do anticorpo secundário “anti-mouse” conjugado com a enzima “Horseradish”

peroxidase - HRP (GE Healthcare Life Sciences) foram adicionados em 20 ml da solução 5% de leite

em pó e PBS-T e a incubação teve duração de 1 hora sob temperatura ambiente. Tal anticorpo liga-se

23

ao anticorpo primário e funciona como um sinalizador molecular, permitindo a visualização da proteína

após a adição de um reagente de detecção (luminol peróxido), havendo emissão de luz

(quimioluminescência) durante a revelação da membrana (Hanbook GE Healthcare Life Sciences,

Western Blotting: Principles and Methods). Por fim, mais três lavagens com PBS-T foram realizadas e 1

ml da solução de ECL (Enhanced Chemiluminescence), responsável por aumentar a sensibilidade da

reação realizada pela enzima peroxidase (Hanbook GE Healthcare Life Sciences, Western Blotting:

Principles and Methods), foi adicionado em cima da membrana. Sob temperatura ambiente, foi feita

uma incubação de 3 minutos e logo em seguida a membrana foi revelada utilizando o equipamento

ImageQuant LAS 500 (GE Healthcare Life Sciences). Todos os procedimentos com a membrana de

nitrocelulose foram realizados sob moderada agitação.

3.16. Purificação da proteína de DENV-4 pelo sistema FPLC

O processo de purificação teve início com o preparo de uma coluna de níquel (HisTrapHP GE

Healthcare) de 1 ml para a ligação da proteína de interesse por afinidade à coluna de níquel.

Inicialmente, com uma seringa foram aplicados 10 ml de água destilada em cada uma das colunas para

a lavagem delas, pois estas são armazenadas com álcool em seu interior e esse passo é necessário na

primeira utilização. Em seguida, 10 ml do buffer A (HEPES – 50 mM; ajustar pH para 7,5; NaCl – 500

mM) foram injetados com a seringa, para estabilizar a coluna. Feito isso, 5 ml do sobrenadante das

células S2 do sorotipo 4 foram aplicados. Por fim, uma lavagem foi realizada com 10 ml do buffer A

mais 20 mM de imidazol, para a remoção de ligações inespecíficas à coluna. Vale dizer que todas as

aplicações à coluna são feitas a uma velocidade de 1 ml/min, para que a pressão da injeção não

danifique o material.

Com a coluna em mãos, foi feita a purificação da proteína pelo sistema FPLC (“Fast Protein

Liquid Chromatography”) utilizando o equipamento AKTAprimeTM Plus (GE Healthcare), de acordo com

o protocolo do fabricante.

3.17. Descongelamento das células S2 previamente transfectadas

Cada criotubo foi descongelado e todo o conteúdo das células S2 anteriormente transfectadas

com plasmídeo expressando prM-sE de DENV-1, DENV-2 e DENV-3 foi transferido para uma garrafa

de cultura de 75 cm², com 15 ml de meio “Schneider’s Drosophila Medium” contendo 10% de soro

bovino fetal e 30 µl do antibiótico higromicina para cada 5 ml de cultura. Após 5 dias, as células de

cada uma das três garrafas foram passadas para duas garrafas de 75 cm², contendo 15 ml do mesmo

meio suplementado e 5 ml da cultura anterior, totalizando 6 garrafas de cultura (duas para cada

24

sorotipo). Passados dois dias, cada garrafa foi passada para outra de 75 cm², contendo 15 ml do

mesmo meio suplementado e 5 ml da cultura anterior, como dito acima. As garrafas foram mantidas

numa estufa a 28º C durante 48 horas.

3.18. Indução das células S2 com sulfato de cobre

A indução foi realizada como explicado no passo 3.12. Porém, a concentração final de sulfato

de cobre nas três garrafas de cultura foi de 700 µM.

3.19. Coleta do sobrenadante da cultura de células de DENV-1 a DENV-3

Os 20 ml de sobrenadante das três garrafas induzidas foram coletados e transferidos para

tubos falcon de 50 ml. Foi realizada uma centrifugação durante 5 minutos a 500xg para remoção de

células e debris celulares. O sobrenadante de cada tubo foi separado do precipitado de células que se

formou com a centrifugação e tais células foram ressuspendidas com 20 ml de PBS 1X.

3.20. Eletroforese em gel de poliacrilamida

Foi feito um gel de poliacrilamida (15%) e cada amostra foi fervida durante 10 minutos, como

no passo 3.14. As amostras utilizadas foram as seguintes: sobrenadante das células S2 dos sorotipos

DENV-1, DENV-2 e DENV-3 induzidas e células S2 de cada um desses sorotipos ressuspendidas com

PBS 1x, após a centrifugação. A corrida teve duração de 90 minutos a 150 V. Foi feito, ainda, outro gel,

no qual foram aplicadas as soluções resultantes da lavagem da coluna de níquel utilizada para a

purificação das proteínas de cada sorotipo com a solução A mais 20 mM de imidazol, mostrado no

passo 3.22. Após a corrida, o gel foi corado com uma solução de Azul de Comassie (25% Isopropanol,

10% Ácido Acético e 0.025% de Azul de Comassie) durante 1 hora e, em seguida, descorado com

ácido acético 10x até que fosse possível visualizar as bandas.

3.21. Western Blotting da proteína de DENV-1 a DENV-3

O Western Blotting foi realizado de acordo com o passo 3.15.

3.22. Purificação da proteína de DENV-1 a DENV-3 pelo sistema FPLC

O processo de purificação foi realizado com três colunas de níquel (HisTrapHP GE Healthcare)

de 1 ml, de acordo com o passo 3.16. Porém, uma quantidade maior de sobrenadante (10 ml) das

células S2 dos sorotipos DENV-1, DENV-2 e DENV-3 foram aplicados, cada um em uma coluna

diferente. Por fim, uma lavagem foi realizada com 10 ml do buffer A mais 20 mM de imidazol e toda a

25

solução que passou foi recolhida em tubos falcon para posterior verificação em gel de poliacrilamida da

quantidade de proteína que é perdida nesse passo, por meio da coloração com Azul de Comassie.

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

26

4. Resultados e discussão

4.1. Eletroforese em gel de agarose das PCRs convencionais

Os produtos da primeira e da segunda PCR convencional (figura 3, banda 1 e 2

respectivamente) foram aplicados em um gel de agarose (2%) e como resultado foi possível observar

duas bandas: uma referente ao fragmento que codifica a proteína prM (400 pb) e outra referente ao

fragmento que codifica a parte solúvel da E (1200 pb).

Figura 3. Revelação do gel de agarose referente aos produtos da primeira e da segunda PCR

convencional. Na ordem: marcador de 100 pb, banda referente ao fragmento que codifica a proteína

prM, controle negativo da primeira PCR, banda referente ao fragmento que codifica a sE, controle

negativo da segunda PCR e marcador de 1 kb.

O produto da terceira PCR foi, da mesma forma, aplicado em um gel de agarose (2%) e o

resultado obtido é mostrado na figura 4. A banda marcada com o asterisco é referente ao fragmento

completo (1600 pb), contendo as porções codificantes da prM e da sE, bem como o conector TEV. O

marcador utilizado é de 1 kb.

27

Figura 4. Revelação do gel de agarose referente ao produto da terceira PCR convencional. O asterisco

indica a banda que apresenta o fragmento completo, de 1600 pb (as primeiras bandas, à direita do

marcador, referem-se a uma tentativa anterior de produzir o amplicon de 1600 pb por meio de uma

PCR convencional).

4.2. Eletroforese em gel de agarose da digestão do plasmídeo pMT/BiP/V5-His B e do amplicon de 1600 pb Foram aplicadas em um gel de agarose (1%) pequenas amostras dos plasmídeos digeridos e

não digeridos pelas enzimas Bgl II e Age I e dos fragmentos digeridos com apenas uma ou com ambas

as enzimas. O resultado é mostrado na figura 5. O marcador utilizado é de 1 kb.

Figura 5. Revelação do gel de agarose referente às digestões do plasmídeo pMT/BiP/V5-His B e do

amplicon de 1600 pb. Na ordem: marcador de 1 kb, pMT/BiP/V5-His B sem digestão, pMT/BiP/V5-His B

digerido com a enzima Bgl II, fragmento digerido com Bgl II (não foi possível visualizar na revelação),

28

pMT/BiP/V5-His B digerido com Bgl II e com Age I, fragmento digerido com Bgl II e com Age I (não foi

possível visualizar na revelação) e pMT/BiP/V5-His B digerido somente com a enzima Age I.

4.3. Liberação do fragmento de interesse utilizando a enzima de restrição BamH I

Para confirmar a presença do inserto no vetor foi realizada uma digestão com a enzima BamH

I. É possível observar que o plasmídeo, na presença da enzima, libera dois fragmentos: um de 1875 pb

(inserto) e outro de 3335 pb (figura 6).

Figura 6. Digestão do plasmídeo pMT/BiP/V5-His B com a enzima BamH I. Na ordem: marcador de 1

kb, pMT/BiP/V5-His B sem inserto e sem digestão, pMT/BiP/V5-His B sem inserto e com digestão,

pMT/BiP/V5-His B com inserto e sem digestão e pMT/BiP/V5-His B com inserto e com digestão.

A revelação dos géis de agarose mostra que tanto os procedimentos de PCR como de digestão

foram bem sucedidos, uma vez que as bandas obtidas com a eletroforese tinham o tamanho esperado.

Além disso, a digestão do plasmídeo com as enzimas Bgl II, Age I e BamH I provou o funcionamento

destas, uma vez que os plasmídeos fechados foram linearizados e houve a liberação do inserto após o

tratamento com a enzima BamH I.

4.4. Sequenciamento dos plasmídeos com inserto

Após a verificação da existência do inserto por digestão, os plasmídeos foram enviados para

sequenciamento. Dos 5 plasmídeos enviados, um apresentou a sequência exata e em frame com o

promotor. O cromatograma e a sequência de aminoácidos que seria gerada pelos plasmídeos foram

analisados por programas de bioinformática específicos (BioEdit e pDraw32). A figura 7 mostra uma

29

parte da sequência do cromatograma resultante dessa análise e a sequência de aminoácidos da

proteína de interesse.

A obtenção do clone para a expressão da proteína de interesse foi um processo muito

delicado, pois foi realizado a partir de estoques virais existentes no laboratório. A estratégia de

clonagem foi a mesma utilizada por Li et al. (2008), na qual a proteína prM encontra-se ligada à região

solúvel da proteína E por um conector TEV. Isso possibilita a clivagem desta região por protease e

separação das proteínas prM e sE para análises futuras. Ainda, de acordo com estes autores, foram

realizadas mutações nos sítios de clivagem da furina (localizados na região que codifica a proteína

prM), uma enzima presente no hospedeiro. Dessa forma, a proteína prM não é clivada e permanece

acoplada ao complexo prM-sE. Ainda, o sequenciamento foi necessário para verificar se existiam

mutações resultantes do processo de clonagem, da PCR ou da digestão dos fragmentos.

Figura 7. A. Parte do cromatograma analisado por BioEdit.

Figura 7. B. Sequência final de aminoácidos da proteína analisada por pDraw32. A região em vermelho

indica a sequência de exportação da proteína, em azul a sequência de prM, em laranja a região de

clivagem TEV e em verde a parte solúvel da proteína E de dengue 4.

30

4.5. Detecção de anticorpos IgM e IgG por meio da técnica de ELISA

Os resultados obtidos mostraram que das 82 amostras de soro de pacientes utilizadas no

experimento, 11 eram positivas para o anticorpo IgM (figura 8) e 57 eram positivas para IgG (figura 9).

Além disso, observou-se que 91% das amostras positivas para IgM também mostraram positividade

para IgG.

Uma amostra é considerada positiva quando o valor do “cut-off” (limiar entre amostra positiva e

negativa) é atingido ou ultrapassado. Cada kit apresenta uma forma de calcular esse valor. No caso do

kit utilizado para a detecção de IgM, o valor de “cut-off” é calculado da seguinte forma: média dos

valores obtidos pelos controles negativos (fornecidos pelo kit) somada ao valor 0,3 (estabelecido pelo

kit). Os resultados obtidos foram os seguintes:

Média dos controles negativos: 0,053

“Cut-off”: 0,053 + 0,3 = 0,353

Dessa maneira, qualquer amostra com valor superior ou igual a 0,353 é considerada positiva

para DENV-4.

Figura 8. Detecção de anticorpos IgM pela técnica de ELISA.

Já no caso do kit utilizado para a detecção de anticorpos IgG, o valor de “cut-off” é obtido pela

média dos valores dos calibradores (fornecidos pelo kit) multiplicada por 0,64 (estabelecido pelo kit). Os

resultados obtidos são mostrados a seguir:

31

Média dos calibradores: 0,7037

“Cut-off”: 0,7037 x 0,64 = 0,4504

Dessa maneira, qualquer amostra com valor maior ou igual a 0,4504 é considerada positiva

para DENV-4.

Figura 9. Detecção de anticorpos IgG pela técnica de ELISA indireto.

O grande número de amostras reativas para IgG representa um quadro de infecção

secundária, uma vez que tais anticorpos podem continuar presentes no sangue por muitos anos e são

responsáveis pela imunidade contra os diferentes sorotipos do vírus (Lupi et al, 2007). Todas as

amostras utilizadas no ensaio de ELISA foram previamente testadas por PCR para detecção do

sorotipo viral. Sendo assim, a presença de anticorpos IgG (anticorpos tardios) é resultante de infecções

anteriores, provavelmente por sorotipos diferentes, uma vez que o sorotipo 4 foi recentemente

reinserido no Brasil. Por esse motivo, muitos testes rápidos não diagnosticam corretamente um

paciente infectado com esse sorotipo. A produção da proteína recombinante de DENV-4 pode ser uma

alternativa eficaz para a melhoria de tais kits, utilizando-a como antígeno no teste rápido.

Observação: No passo 3.11 surgiram dificuldades para dar continuidade ao experimento, uma vez que

um surto de contaminação acabou impossibilitando o trabalho. Uma série de medidas foram tomadas

para tentar reverter o problema e o experimento foi repetido várias vezes, porém sem sucesso já que a

contaminação sempre retornava. Por isso, foi realizada uma expressão alternativa, denominada

expressão transiente. Nesta, a indução também é realizada pela adição de metal no meio de cultura,

porém não se tem um plasmídeo de seleção das células transfectadas, como o pCoHygro. Além disso,

32

foi tomada a decisão de prosseguir com os experimentos também com os outros sorotipos da dengue

(DENV-1, DENV-2 e DENV-3). Isso foi possível, pois havia três alíquotas de células S2 já transfectadas

e congeladas em nitrogênio líquido, sendo que uma alíquota estava transfectada com o plasmídeo que

apresentava o inserto referente à proteína prM e sE de DENV-1, a outra com o de DENV-2 e a última

com o de DENV-3.

4.6. Transfecção do plasmídeo nas células S2

Todos os procedimentos com as células S2 foram realizados conforme descrito nos tópicos 4.8

a 4.11. Porém, não foi possível dar continuidade aos experimentos devido a uma grande contaminação

envolvendo o material utilizado. Com o intuito de acabar com a fonte de contaminação, o meio de

cultivo e todas as soluções utilizadas foram devidamente filtradas com filtros de 0,22 µm e todos os

procedimentos foram repetidos. Mesmo assim, a contaminação continuou a ocorrer. A seguir, são

mostradas algumas imagens das células no decorrer dos experimentos.

Figura 10. Transfecção do plasmídeo de interesse nas células S2. À esquerda, encontram-se as

células transfectadas e à direita, o controle negativo, sem transfecção.

33

Figura 11. Células S2 48 horas após a retirada da solução de transfecção e lavagem das células. À

esquerda encontram-se as células transfectadas e à direita, o controle negativo, sem transfecção.

4.7. Western Blotting da cultura de células submetidas à expressão transiente e à expressão para gerar

uma linhagem de células estável

Para verificar a expressão transiente das proteínas, as células foram induzidas com 500 µM de

sulfato de cobre e incubadas a 28°C durante 4 dias. Após este período, foi realizado um Western

Blotting com anticorpo “anti-HIS Tag” para a ligação destes à cauda de histidina presente na proteína

recombinante. Tanto dentro das células quanto no sobrenadante foi encontrada a proteína prM-TEV-sE

(figura 12), demonstrando que esta estava sendo secretada e era solúvel.

Figura 12. Western Blotting. Cultura de células submetidas à expressão transiente. Na ordem:

marcador, sobrenadante da cultura de células não transfectadas, células transfectadas e induzidas e

sobrenadante das células transfectadas e induzidas.

34

Uma grande quantidade de proteína foi encontrada dentro da célula, e diversos fatores podem

ter contribuído para a não completa exportação dessas proteínas. Por ser um experimento de

transfecção transiente, as células não se apresentaram sadias após a remoção do agente

transfectante, o que pode ter atrasado o início de produção das proteínas ou até mesmo a exportação

da mesma. Em experimentos realizados anteriormente com modelos semelhantes a este em nosso

laboratório, a maior parte das proteínas expressas foi encontrada no sobrenadante, mas estas células

tiveram um período maior de recuperação após transfecção. Novos experimentos estão em andamento

para elucidar e otimizar a exportação do complexo proteico prM-sE de DENV-4.

Foi realizada a expressão do mesmo complexo proteico, mas para sorotipos diferentes, em

linhagens de células anteriormente produzidas no laboratório, com a mesma metodologia que foi

empregada nesse trabalho. As células foram induzidas com 700 µM de sulfato de cobre e incubadas a

28°C durante 4 dias. O gel de poliacrilamida utilizado para a realização do Western Blotting foi feito

utilizando o sobrenadante das células S2 dos sorotipos DENV-1, DENV-2 e DENV-3 induzidas e as

células S2 de cada um desses sorotipos ressuspendidas com PBS 1x (figura 13). A figura 14 mostra a

cultura das células dos três sorotipos.

Figura 13. Western Blotting. Cultura de células submetidas à expressão para gerar uma linhagem de

células estável. Na ordem: marcador Full-range rainbow de 12 a 225 kDa (GE Healthcare Life

Sciences), sobrenadante das células S2 induzidas de DENV-1, células S2 induzidas de DENV-1

ressuspendidas com PBS 1x, sobrenadante das células S2 induzidas de DENV-2, células S2 induzidas

de DENV-2 ressuspendidas com PBS 1x, sobrenadante das células S2 induzidas de DENV-3, células

S2 induzidas de DENV-3 ressuspendidas com PBS 1x, controles positivos e marcador PageRuler

Prestained Protein Ladder de 70 a 170 kDa (Fermentas).

35

Pela figura 13 é possível observar que a proteína recombinante prM-TEV-sE mostrou-se

expressa apenas no interior das células S2 para os três sorotipos. As amostras do sobrenadante da

cultura celular, inclusive dos controles positivos, não mostraram a presença da proteína, a qual deveria

ter sido secretada da célula, mostrando apenas uma região amarelada causada pela proteína albumina

presente no soro bovino fetal (BSA), provavelmente pela grande quantidade desta no sobrenadante. A

presença em maior quantidade de proteínas dentro das células pode indicar a exportação incompleta

destas ou tempo insuficiente para que esse fenômeno pudesse ocorrer. Além disso, logo após a

transfecção a condição das células pode não ter sido a ideal para a expressão. Em trabalho similar,

Cuzzubbo e colaboradores (2001) produziram a proteína E recombinante e a expressaram em células

S2. Como resultado, foi observado que grande parte da proteína foi secretada da célula.

Realizando ensaios de ELISA com o vírus e com a proteína recombinante, eles verificaram a

ligação de anticorpos IgM e IgG à proteína recombinante, a qual mimetizou o vírus da dengue. Esse

resultado mostra que a utilização de tais proteínas pode ser uma alternativa prática, segura e mais

barata para o diagnóstico da dengue (Cuzzubbo et al, 2001). Existe, atualmente, o kit comercial

“PanBio Dengue Duo Rapid Strip Test“, que faz uso desse método e permite a diferenciação entre

infecções primárias e secundárias (Cuzzubbo et al, 2001).

4.8. Eletroforese em gel de poliacrilamida da cultura de células dos sorotipos 1, 2 e 3

Foi feito um gel de poliacrilamida (15%) com as soluções resultantes da lavagem da coluna de

níquel utilizada para a purificação das proteínas de cada sorotipo com a solução A mais 20 mM de

imidazol, para verificar o quanto da proteína era perdido nesse passo. O sobrenadante e as proteínas

eluídas também foram aplicados no gel (figura 15).

Figura 14. Células S2 de DENV-1, DENV-2 e DENV-3, respectivamente.

36

Figura 15. Gel de poliacrilamida corado com azul de Comassie. Na ordem: marcador Full-range-

rainbow de 12 a 225 kDa (GE Healthcare Life Sciences), sobrenadante da cultura de células de DENV-

1, solução resultante da lavagem da coluna de níquel utilizada para a purificação da proteína de DENV-

1 com solução A mais 20 mM de imidazol, proteína de DENV-1 eluída por FPLC, sobrenadante da

cultura de células de DENV-2, solução resultante da lavagem da coluna de níquel utilizada para a

purificação da proteína de DENV-2 com solução A mais 20 mM de imidazol, proteína de DENV-2 eluída

por FPLC, sobrenadante da cultura de células de DENV-3, solução resultante da lavagem da coluna de

níquel utilizada para a purificação da proteína de DENV-3 com solução A mais 20 mM de imidazol,

proteína de DENV-3 eluída por FPLC.

Observando a figura, nota-se que as amostras não purificadas formaram um número muito

grande de bandas inespecíficas. Além disso, existem bandas muito concentradas, o que indica,

provavelmente, uma alta concentração de BSA. Todavia, as amostras que foram submetidas à

purificação formaram uma menor quantidade de bandas no gel, o que reflete a pureza da proteína.

Devido a uma pequena quantidade da proteína expressa, novos experimentos estão em andamento

para otimizar o processo de purificação. Bandas remanescentes que se ligaram inespecificamente na

coluna de níquel podem ser removidas aumentando a quantidade de imidazol no buffer de lavagem ou

a quantidade de cloreto de sódio.

4.9. Purificação da proteína dos 4 sorotipos pelo sistema FPLC

O sistema FPLC foi utilizado para purificar a proteína de interesse de uma coluna por meio da

cromatografia de afinidade com metal imobilizado (do inglês, IMAC), que se baseia na interação de

metais, como níquel, zinco, cobalto ou cobre, com os aminoácidos histidina e cisteína (revisado por

37

Block et al, 2009). Nesse trabalho, foi utilizada a cauda de histidina na proteína recombinante, a qual

apresenta afinidade pelo níquel imobilizado na coluna HisTrapHP (GE Healthcare). Dessa forma, ao

passar o sobrenadante da cultura de células induzidas com sulfato de cobre pela coluna, toda a

proteína recombinante que foi expressa ficou retida.

A figura 16.A mostra o momento em que houve a eluição da proteína expressa para o sorotipo

1 da dengue da coluna de níquel, representado pelo pico no gráfico. O mesmo é mostrado para o

sorotipo 2 na figura 16.B, para o sorotipo 3 na figura 16.C e para o sorotipo 4 na figura 16.D. A amostra

eluída percorre a célula de UV onde está conectada a um detector e a um monitor de computador

(FPLC Standard Operating Procedure – AKTA prime plus system, Handbook), o que permite identificar

onde os picos de concentração de proteína ocorrem.

38

Figura 16. A. Gráfico de unidades de absorbância por minuto que representa o momento em que

houve a eluição da proteína do sorotipo 1 da coluna de níquel.

39

Figura 16. B. Gráfico de unidades de absorbância por minuto que representa o momento em que

houve a eluição da proteína do sorotipo 2 da coluna de níquel.

40

Figura 16. C. Gráfico de unidades de absorbância por minuto que representa o momento em que

houve a eluição da proteína do sorotipo 3 da coluna de níquel.

41

Figura 16. D. Gráfico de unidades de absorbância por ml que representa o momento em que houve a

eluição da proteína do sorotipo 4 da coluna de níquel (apesar de ser visualmente diferente, esse gráfico

representa o momento da eluição da proteína de DENV-4 da mesma forma que os gráficos anteriores;

porém, em vez de relacionar unidades de absorbância por minuto, relaciona por mililitros de buffer de

eluição).

Por se tratar de uma expressão transiente, uma pequena quantidade de proteína de interesse

foi purificada, possivelmente devido à baixa quantidade de células utilizadas para a expressão,

pequena escala de produção de proteínas ou mesmo baixa eficiência de transfecção. Estas células

continuam sendo cultivadas em laboratório para o estabelecimento de uma linhagem de expressão do

complexo prM-TEV-sE, com integração do DNA exógeno no genoma das células.

42

Mais experimentos são necessários para a finalização do trabalho e para o uso dessas

proteínas para diagnóstico ou como candidatas à vacina contra a dengue. De maneira geral, esse

trabalho possibilitou o aprofundamento em diversas metodologias de biologia molecular, fixando o

conhecimento anteriormente adquirido em sala de aula, além de permitir o contato com a metodologia

científica e com a construção de raciocínio crítico, necessários para a formação acadêmica.

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

44

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