Universidade de São Paulo Faculdade de Medicina de ...livros01.livrosgratis.com.br/cp075965.pdf · Luciana Carvalho, Silvia de Paula, ... pela grande e inesquecível amizade, na

Universidade de São Paulo

Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto

Departamento de Bioquímica e Imunologia

PAPEL DAS CATECOLAMINAS E DO AMP CÍCLICO NO METABOLISMO DE PROTEÍNAS EM MÚSCULO

ESQUELÉTICO DE RATOS DIABÉTICOS

Amanda Martins Baviera

Tese apresentada ao Departamento de

Bioquímica e Imunologia da Faculdade de

Medicina de Ribeirão Preto - USP para

obtenção do grau de Doutor em Ciências -

Área de concentração: Bioquímica

Ribeirão Preto

2007

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FICHA CATALOGRÁFICA

Baviera, Amanda Martins Papel das catecolaminas e do AMP cíclico no metabolismo de proteínas em músculo esquelético de ratos diabéticos. Ribeirão Preto, 2007. 183p. 30cm Tese de Doutorado apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/USP - Departamento de Bioquímica e Imunologia - Área de concentração: Bioquímica Orientadora: Kettelhut, Isis do Carmo Data da defesa: 09/03/2007

DEDICO ESTA TESE

A Deus, pela força dada, pelas oportunidades, pela vida, A minha mãe Zeni, por ser o exemplo máximo de verdadeiro amor, não

medindo esforços ao tentar me compreender e oferecer seu apoio em todas as minhas decisões; pela paciência nos momentos de ausência; por nunca dizer não em lutar ao meu lado pelos meus sonhos; pelo exemplo de força e amor incondicionais; enfim, por tudo,

A minha irmã Valéria, pelo amor, apoio e compreensão em tantos

momentos de ausência; por ser tão sensata ao me aconselhar durante os períodos de esmorecimento; ao meu cunhado Gino, pelo apoio e exemplo de máxima dedicação na realização de seu trabalho,

A minha sobrinha Mariana, pelo grande amor, por ser minha grande

companheirinha e meu verdadeiro orgulho, por fazer renascer em mim um sentimento que há muito tempo eu tinha abandonado, a vontade de ser uma eterna criança,

A meu pai Antonio Augusto (in memorian) pelo extremo amor e por me

dar mais de uma vez a chance de viver e seguir meu caminho, e a minha avó Benedita (in memorian), pelo amor e pelo exemplo de vontade de viver e fazer o bem ao próximo. Mesmo longe sei que vocês me acompanham sempre...

AGRADECIMENTOS ESPECIAIS

A Profa. Isis do Carmo Kettelhut, por ter oferecido a oportunidade única de aprender tantas coisas, de âmbito profissional e pessoal. Agradeço por me receber e me aceitar em seu laboratório nestes 5 anos, permitindo o aprimoramento de minha formação cientifica, e por me ensinar a compreender a importância do estudo do Controle do Metabolismo. Agradeço por oferecer um misto entre a paciência em me ensinar e a liberdade dada na realização da tese; pelo carinho, amizade e respeito pela individualidade dos alunos que é sua marca registrada. E agradeço especialmente pelo exemplo de garra pela vida, dedicação e amor por aquilo que faz, que nos serve de eterna lição,

Ao Prof. Renato Hélios Migliorini, por ser tão incansável na sua

tentativa de despertar em seus alunos a vontade de aprender e aprender bem; “Toda a arte de ensinar é apenas a arte de acordar a curiosidade

natural nas mentes jovens, com o propósito de serem satisfeitas mais tarde.” (Anatole France)

Pelo seu amor à pesquisa e pelos inesquecíveis momentos de apoio, A Profa. Maria Teresa Pepato, pela amizade e pela paciência durante

minha passagem em seu Laboratório onde, sob sua orientação, construí os melhores alicerces para a minha posterior formação aqui em Ribeirão Preto; por ser meu grande exemplo de empenho para realização do melhor trabalho, e de sinceridade em todos os momentos; pelo apoio tão especial que permitiu com que eu realizasse o sonho de fazer meu Doutorado junto à equipe da Profa. Isis, e por ter me dado a chance inicial de perceber que a pesquisa científica era o meu caminho,

Ao Prof. Luiz Carlos Carvalho Navegantes, pela amizade e pelo exemplo deixado no Laboratório de extrema dedicação e empenho naquilo que faz e pelo brilhante trabalho realizado, que hoje serve de referência para quem aqui quer trilhar sua carreira científica em Metabolismo. Pelas valiosas sugestões dadas em tantos momentos, especialmente durante a escrita do projeto de Pós-doutoramento e para a finalização desta tese.

AGRADECIMENTOS

A Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, por servir de berço para a realização deste meu grande sonho e por oferecer a mais bela visão do amanhecer,

Ao Laboratório de Controle do Metabolismo, que me recebeu de portas

abertas e permitiu que eu adquirisse ensinamentos científicos e crescimento pessoal para o resto da vida,

A Neusa Maria Zanon, pela amizade e pelo apoio técnico de extrema

qualidade; por me indicar a maneira mais coerente de conduzir as práticas científicas; pela paciência em me ensinar a mesma coisa mais de uma vez; pela energia e força de vontade contagiantes; sem seu apoio com certeza este trabalho não teria chegado até aqui,

A Elza Aparecida Filippin (Pila), pela especial amizade, agradáveis e

divertidas conversas, pelo valioso auxílio nos experimentos, por sua sinceridade e pelas caronas; a Maria Antonieta Garófalo, pela amizade, agradável convivência e apoio técnico; a Andreza Bonifácio e Adriano Duran, pela agradável convivência,

Aos especiais amigos que ganhei durante os 5 anos de convivência

neste Laboratório: ao irmão proteolítico Walter Dias Junior e irmã gliceroneogênica Valéria Ernestânia Chaves, pela grande amizade; por momentos tão divertidos no Laboratório, em minha casa ou nos eventos festivos; pelas conversas, pelo apoio, trocas de idéias e principalmente por me escutarem e me levantarem em momentos de esmorecimento; enfim, meus eternos e verdadeiros irmãos,

Aos amigos do Laboratório de Controle do Metabolismo, pela

convivência tão agradável e harmoniosa; por muitas vezes transformarem os momentos de tensão em situações de alegria; por criarem um ambiente verdadeiramente familiar, inesquecível: Danúbia Frasson e seu humor contagiante, Maria Emília S. Santos, Lidiany Góis e Renata Boschini. E aos amigos mais recentes: Eduardo C. Lira, Dawit A. Gonçalves, Julia Bueno, Luciana Carvalho, Silvia de Paula, Alexandre Machado e Marcos de Jesus,

Aos ex-alunos do Laboratório de Controle do Metabolismo que tive a

feliz oportunidade de conhecer: Prof. Elísio Evangelista e Profa. Nair Kawashita, por serem pessoas realmente especiais; Profa. Analúcia Xavier; Prof. Célio Machado; Profa. Eliana Pinheiro, pelo carinhoso auxílio no período de minha mudança de nível; Maria Ida Ravanelli, pela amizade e momentos divertidos,

Aos amigos do Departamento de Bioquímica, que tornaram a passagem

pela pós-graduação um momento especialmente único: Gyselle Baccan, Fernanda Cabral, Carlos Ono, Olavo Pereira Junior, William Borges e a todos os demais não citados aqui, mas que com certeza contribuíram para tornar esta passagem agradável. A Letícia Maragno por sua carinhosa amizade e pela realização dos experimentos de PCR. Aos “meninos do Porão”, pela especial amizade: Renê Beleboni, pelo exemplo de dedicação e inteligência e pelo

empenho em ajudar os colegas; Ricardo Mendonça (Pancinha), por ser o melhor e único companheiro de disciplinas, por sua amizade e por me ensinar uma maneira tão tranqüila de conduzir os problemas; e Ruither Carolino, pela amizade, apoio e oportunidade na realização de experimentos,

Aos amigos especiais que ganhei neste período: Victor Diaz Galban,

pela grande e inesquecível amizade, na verdade vinda desde minha passagem por Araraquara, onde tivemos longas conversas “informáticas” via telefone; pelas conversas divertidas, auxílios incansáveis e muitos ensinamentos. Ao Prof. Ithamar Vugman, pela tão delicada amizade e por me fazer enxergar um lado tão bonito do mundo que até então eu não percebia. Ao Seu Duda (Zezão), por me acompanhar tantas vezes ao ponto de ônibus altas horas da noite, me divertindo ao contar suas aventuras pelo Nordeste, e pelos deliciosos sorvetes,

Aos amigos de longa data, cujo apoio constante foi essencial para a

concretização de minha vida profissional: Marília Micelli, Carlos E. Micelli, Paulo R. Testa, Idelfonso Baviera, Carlos Laurato, Eunice Marques, Marlei Manfrin, Luiz César Manetti e Luiz Felício Colombini (Batatais); Dona Helena Paschoa e Angelina Morales (Araraquara). Obrigada por acreditarem em mim e por me acolherem em tantos momentos,

Aos professores do Departamento de Bioquímica e Imunologia, em

especial ao Prof. Dr. Marcelo Damário Gomes pelo uso de seu laboratório e pela realização dos experimentos de PCR e aos professores Dr. Vanderlei Rodrigues, Dr. Wilson Lodi e Dr. Cláudio Costa Neto pelo uso de equipamentos de seus laboratórios; ao Dr. Fernando Cunha (Farmacologia) e Dr. José Antunes Rodrigues (Fisiologia) pelos experimentos realizados em seus laboratórios,

Aos funcionários do Departamento de Bioquímica e Imunologia, em

especial Ivone, Lúcia, Téia e Ronaldo, Aos ratos, que há tanto tempo têm tornado possível a realização de meu

trabalho, A todos aqueles que contribuíram que alguma forma para minha

formação acadêmica, Ao apoio financeiro de CNPq e FAPESP.

Índice

Resumo ..................................................................................................................... i

Summary................................................................................................................. iii

1. Introdução............................................................................................................ 1

2. Objetivos ............................................................................................................ 15

3. Materiais e Métodos 3.1. Animais ....................................................................................................... 17 3.2. Indução do diabetes: administração de estreptozotocina (STZ) ................. 17 3.3. Coleta de sangue para determinação de glicemia ...................................... 18 3.4. Estudo do papel do sistema nervoso simpático no metabolismo de

proteínas em músculo esquelético de ratos diabéticos 3.4.1. Modelo Experimental: simpatectomia química através da

administração de guanetidina ......................................................... 18 3.4.2. Grupos experimentais ....................................................................... 19 3.4.3. Determinação das catecolaminas no plasma e nos músculos

esqueléticos soleus e EDL .............................................................. 20 3.4.4. Velocidade de renovação de noradrenalina nos músculos

esqueléticos soleus e EDL .............................................................. 21 3.4.5. Procedimento experimental para o estudo da proteólise em

músculos esqueléticos de ratos em diferentes períodos de diabetes e simpatectomia ................................................................ 22

3.4.6. Avaliação da atividade proteolítica.................................................... 23 3.4.7. Procedimentos experimentais para a avaliação das vias

proteolíticas ..................................................................................... 24 a. Via Lisossomal .............................................................................. 24 b. Via Dependente de Cálcio............................................................. 26 c. Via Dependente de ubiquitina-proteassoma e Via Residual.......... 27

3.4.8. Procedimento experimental para a avaliação da síntese total de proteínas ........................................................................................... 29

3.5. Estudo do papel da pentoxifilina no metabolismo de proteínas em músculo esquelético de ratos diabéticos

3.5.1. Modelo experimental: tratamento in vivo com pentoxifilina ............... 32

3.5.2. Efeito direto in vitro da pentoxifilina................................................... 32 a. Efeito da insulina in vitro................................................................ 33 b. Efeito do H89 in vitro ..................................................................... 33

3.5.3. Avaliação da ação da pentoxifilina in vivo e in vitro nas concentrações intracelulares de AMP cíclico (AMPc) em músculo esquelético de ratos normais e diabéticos....................................... 33

3.5.4. Medida dos níveis plasmáticos de TNF-α (Fator de Necrose Tumoral α) após tratamento com pentoxifilina ................................ 34

3.5.5. Quantificação da m-calpaína e da calpastatina em músculos de ratos após tratamento com pentoxifilina............................................ 35 a. Eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS

(SDS-PAGE).................................................................................. 35 b. Western blot para detecção de m-calpaína e calpastatina ............ 36

3.5.6. Trancrição reversa acoplada a PCR (RT-PCR) para determinação da expressão do RNAm da atrogin-1 (ou MAFbx)............................. 37 a. Extração de RNA........................................................................... 37 b. Quantificação da amostra de RNA ................................................ 38 c. Produção de cDNA - Transcrição Reversa (RT)............................ 38 d. PCR semi-quantitativa................................................................... 39 e. Densitometria ................................................................................ 39 f. PCR quantitativa............................................................................. 40

3.5.7. Avaliação da ação da pentoxifilina in vivo e in situ no metabolismo de proteínas em músculo esquelético de ratos adultos normais e diabéticos com a utilização da técnica de microdiálise ..................... 41

3.6. Análise estatística ....................................................................................... 42 3.7. Reagentes................................................................................................... 42

4. Resultados Estudo do papel do sistema nervoso simpático no metabolismo de proteínas em músculo esquelético de ratos diabéticos

4.1. Modelo Experimental: simpatectomia química através da administração de guanetidina ....................................................................................................... 43 4.1.1. Efeito da simpatectomia química no peso corporal........................... 44 4.1.2. Efeito da simpatectomia química na concentração plasmática de

glicose .............................................................................................. 45 4.1.3. Efeito da simpatectomia química na concentração das

catecolaminas plasmáticas e musculares ...................................... 50 4.1.4. Efeito do diabetes na velocidade de renovação de noradrenalina

muscular............................................................................................ 58

4.1.5. Efeito da simpatectomia química na proteólise total e na participação das vias proteolíticas de soleus e EDL de ratos em diferentes períodos de diabetes...................................................... 62

a. Proteólise total em soleus e EDL de ratos diabéticos simpatectomizados ..................................................................... 62

b. Participação das vias proteolíticas em soleus e EDL de ratos diabéticos simpatectomizados....................................................... 64 - Via Lisossomal ........................................................................... 66 - Via Dependente de Cálcio.......................................................... 72 - Via Dependente de ubiquitina-proteassoma e Via Residual....... 78

4.1.6. Velocidade da síntese de proteínas em soleus de ratos diabéticos simpatectomizados na ausência ou presença de adrenalina in vitro..... 87

Estudo do papel da pentoxifilina no metabolismo de proteínas em músculo esquelético de ratos diabéticos

4.2. Modelo Experimental: Estudo das ações in vivo da pentoxifilina em músculo esquelético de ratos normais e diabéticos ................................... 91 4.2.1. Níveis intracelulares de AMPc .......................................................... 91 4.2.2. Proteólise total .................................................................................. 91 4.2.3. Participação das vias proteolíticas .................................................... 94

- Via Lisossomal ................................................................................ 94 - Via Dependente de Cálcio............................................................... 94 - Via Dependente de ubiquitina-proteassoma e Via Residual ........... 99

4.2.4. Detecção das proteínas m-calpaína e calpastatina......................... 103 4.2.5. Expressão do RNAm da atrogin-1................................................... 105

4.2.6. Níveis plasmáticos de TNF-α .......................................................... 107 4.2.7. Efeito de uma única injeção de pentoxifilina na degradação de

proteínas em músculo esquelético de ratos diabéticos ................... 107 4.3. Estudo das ações in vitro da pentoxifilina em músculo esquelético de

ratos normais e diabéticos ........................................................................ 112 4.3.1. Níveis intracelulares de AMPc......................................................... 112 4.3.2. Proteólise total................................................................................. 114 4.3.3. Participação das vias proteolíticas .................................................. 114

- Via Lisossomal .............................................................................. 114 - Via Dependente de Cálcio............................................................. 118 - Via Dependente de ubiquitina-proteassoma e Via Residual ......... 118

4.3.4. Efeito da insulina in vitro na ação anti-proteolítica da pentoxifilina em músculo esquelético de ratos normais e diabéticos .................. 123

4.3.5. Efeito do H89 in vitro na ação anti-proteolítica da pentoxifilina em músculo esquelético de ratos normais e diabéticos ........................ 127

4.4. Estudo das ações in vivo da pentoxifilina na síntese protéica em músculo esquelético de ratos normais e diabéticos................................................ 132

4.5. Estudo das ações in vivo e in situ da pentoxifilina em músculo esquelético de ratos normais e diabéticos adultos .................................. 132

5. Discussão ........................................................................................................ 138 5.1. Concentração de noradrenalina muscular em animais submetidos ao

diabetes experimental............................................................................... 138 5.2. Papel das catecolaminas no metabolismo de proteínas em músculos

esqueléticos de animais diabéticos .......................................................... 140 a. Proteólise total e vias proteolíticas em músculos de animais

diabéticos simpatectomizados - 1 dia de diabetes ...................... 140 b. Proteólise total e vias proteolíticas em músculos de animais

diabéticos simpatectomizados - 3 dias de diabetes..................... 146 c. Proteólise total e vias proteolíticas em músculos de animais

diabéticos simpatectomizados - 5 dias de diabetes..................... 149 d. Síntese protéica em soleus de animais diabéticos

simpatectomizados...................................................................... 150 5.3. Papel da pentoxifilina no metabolismo de proteínas em músculos

esqueléticos de animais diabéticos........................................................... 152

6. Referências Bibliográficas ............................................................................. 163 Anexo

Resumo

Resumo i

Resumo

Estudos prévios de nosso laboratório demonstraram que o sistema nervoso

simpático (SNS) exerce ações anabólicas no metabolismo de proteínas na

musculatura esquelética de ratos normais, estimulando a síntese protéica e inibindo a

proteólise total em músculos de animais normais. No entanto, a importância do SNS

no controle do metabolismo protéico em uma situação de catabolismo permanece

desconhecida. Assim, a primeira parte do presente trabalho teve como objetivo

investigar o papel das catecolaminas no controle dos processos de degradação e

síntese de proteínas em músculos esqueléticos de animais diabéticos.

Para isso, foram estudadas as alterações ocorridas na proteólise total e a

participação das vias proteolíticas em músculos soleus e extensor digitorum longus -

EDL de ratos diabéticos simpatectomizados (administração de guanetidina). Foram

estudados animais jovens com 1, 3 e 5 dias de diabetes (indução por estreptozotocina

- STZ) tratados ou não com guanetidina durante 1 ou 2 dias.

A instalação do diabetes promoveu um aumento progressivo no conteúdo de

noradrenalina (NOR) em soleus e EDL de animais, provavelmente por conseqüência

de uma queda na velocidade de degradação da catecolamina nestes animais. Estes

animais também apresentam uma menor atividade simpática neste tecido. A

simpatectomia química foi capaz de promover uma redução eficiente no conteúdo da

NOR muscular nestes animais diabéticos.

Os resultados do presente trabalho mostraram que a simpatectomia química foi

capaz de promover um aumento adicional nos valores de proteólise total em soleus de

animais após 1 e 3 dias de diabetes (33% e 15%, respectivamente) e em EDL de

animais 1 dia pós-STZ (17% em relação ao grupo diabético controle). Estas respostas

são decorrentes do surpreendente aumento nas atividades da via proteolítica

lisossomal (soleus), da via dependente de cálcio (EDL) e da via dependente de

ubiquitina-proteassoma (soleus e EDL). A simpatectomia química não promoveu

alterações na degradação protéica muscular no 5o dia de deficiência insulínica. Assim,

parece que as catecolaminas têm efeito na atividade dos processos de degradação

protéica em músculo esquelético de ratos nas fases iniciais do diabetes (1 e 3 dias

pós-STZ); em períodos mais prolongados de deficiência insulínica, a presença ou

ausência das catecolaminas parece não interferir com as respostas observadas na

proteólise muscular.

Resumo ii

Em trabalhos anteriores do laboratório ficou demonstrado que as

catecolaminas são capazes de inibir a proteólise muscular através da ligação a

receptores adrenérgicos dos subtipos β2 e β3 e conseqüente aumento de AMPc

intracelular na musculatura esquelética de ratos normais. A pentoxifilina (PTX) é uma

droga com comprovada ação anti-proteolítica em situações de atrofia muscular, sendo

este efeito atribuído à redução nos níveis plasmáticos de TNF-α. No entanto, tornou-se

interessante a investigação da possibilidade da PTX exercer diretamente seu efeito

anti-proteolítico muscular, através de aumento nas concentrações de AMPc, uma vez

que ela é capaz de inibir a fosfodiesterase do AMPc (enzima responsável pela

degradação do nucleotídeo). Assim, o segundo objetivo deste trabalho foi investigar o

efeito in vivo e in vitro da PTX nos processos de degradação de proteínas na

musculatura esquelética de animais normais e diabéticos.

Os resultados do presente trabalho mostraram uma redução na proteólise total

e na atividade das vias proteolíticas dependentes de cálcio e de ubiquitina-

proteassoma em EDL de animais diabéticos (3 dias pós-STZ) tratados in vivo durante

4 dias com PTX em comparação aos animais não tratados. Este efeito foi atribuído ao

aumento nas concentrações de AMPc. Nestes mesmos animais foi observada redução

nos níveis protéicos de m-calpaína (protease do sistema proteolítico dependente de

cálcio) e na expressão do RNAm da atrogin-1 (componente do sistema proteolítico

dependente de ubiquitina-proteassoma). Músculos de ratos normais e diabéticos

incubados na presença de PTX apresentaram aumento no conteúdo de AMPc e

redução na proteólise total e na participação das vias proteolíticas citadas

anteriormente. Assim, ficou demonstrado que a PTX é capaz de promover diretamente

redução na proteólise total em músculos de animais normais (in vitro) e diabéticos (in

vivo e in vitro), e que este efeito pode ser mediado por um mecanismo ligado ao

aumento de AMPc intracelular, semelhante ao efeito anti-proteolítico muscular

atribuído às catecolaminas. Ainda vale a pena salientar que o mesmo efeito da PTX foi

observado em ratos diabéticos adultos com a utilização da técnica de microdiálise.

Summary

Summary

iii

Summary

Studies from our laboratory have previously shown that sympathetic nervous

system (SNS) exerts anabolic effects on skeletal muscle protein metabolism from

normal rats, through stimulation of protein synthesis and inhibition of proteolysis.

However, the importance of SNS in the control of protein metabolism in a catabolic

situation remains unknown. Thus the present work was performed to elucidate the role

of catecholamines in the control of the protein degradation and synthesis on the

skeletal muscles from diabetic rats.

The alterations in the overall proteolysis and participation of proteolytic systems

were investigated in soleus and extensor digitorum longus - EDL muscles from diabetic

rats after chemical sympathectomy (guanethidine administration). Male young rats

were used after 1, 3 and 5 days of diabetes (induced by streptozotocin - STZ injection)

and treated or not with guanethidine during 1 or 2 days.

A progressive increase in the norepinephrine content in soleus and EDL

muscles after diabetes induction is probably due to a reduction in the rate of

catecholamine degradation in these animals and a lower sympathetic activity. The

guanethidine administration resulted in a marked decrease in the norepinephrine

content of muscles from these diabetic rats.

The data from the present work showed that the chemical sympathectomy

promoted an additional increase in the rate of total protein degradation in soleus from

rats after 1 and 3 days of diabetes (33% and 15%, respectively) and in EDL muscles 1

day after STZ administration (17% in comparison to diabetic control group). These

responses were consequence of the surprising increase in the participation of the

lysosomal (soleus), the Ca2+-dependent (EDL) and the ubiquitin-proteasome-

dependent proteolytic pathways (soleus and EDL).

The chemical sympathectomy induced changes in the muscle protein

degradation of rats after 1 and 3 days of diabetes, without any effect in the 5th day of

insulin deficiency. These findings suggest that catecholamines control the activity of the

proteolytic systems in skeletal muscle from animals in the early stage of diabetes (1

and 3 days after STZ); in prolonged periods of insulin deficiency, catecholamines seem

not interfere in muscle proteolysis.

Summary

iv

Previous studies from our laboratory demonstrated that catecholamines inhibit

muscle proteolysis in normal rats by binding to β2 and β3-adrenoceptors and promoting

increase in the cAMP intracellular levels.

The pentoxifylline (PTX, a xanthine derivative compound) has an antiproteolytic

action in situations of skeletal muscle wasting attributed to the inhibition of TNF-α

synthesis. Nevertheless, an alternative hypothesis is that PTX reduces muscle protein

catabolism directly by increasing cAMP intracellular levels in skeletal muscle, because

this drug is a cAMP-phosphodiesterase inhibitor (enzyme that degrades the

nucleotide). So, the second goal of the present work was to investigate the effect of

PTX in vivo and in vitro on protein degradation in skeletal muscle from normal and

acutely diabetic rats.

In vivo four days PTX treatment induced a decrease in the rate of overall

proteolysis and in the activities of Ca2+-dependent and ubiquitin-proteasome-dependent

proteolytic systems in EDL muscles from diabetic rats (3 days after STZ). This effect

was attributed to an increase in cAMP content in these muscles. The increased protein

levels of m-calpain (Ca2+-dependent protease) and mRNA of atrogin-1 (ubiquitin-

proteasome-dependent component) in muscles from diabetic rats were reduced after

PTX in vivo treatment. The addition of PTX to the incubation medium induced an

increase in the cAMP levels and reduced the rate of overall proteolysis and the

activities of Ca2+-dependent and ubiquitin-proteasome-dependent degradative systems

in EDL muscles from normal and diabetic rats.

These results showed that PTX exerts a direct inhibitory effect on protein

degradation in muscles from normal (in vitro) and diabetic (in vivo and in vitro) rats, by

increasing cAMP intracellular levels, similar to the antiproteolytic effect of

catecholamines in skeletal muscle. Similar results were also found in adult diabetic rats

using a microdialysis technique with PTX treatment and perfusion.

Introdução

Introdução 1

1) Introdução

A manutenção da massa muscular esquelética é resultado do balanço

dinâmico existente entre os processos de síntese e de degradação de

proteínas. Embora a contínua degradação de proteínas celulares pareça ser

uma condição de gasto desnecessário de energia, este processo exerce uma

série de funções importantes para a manutenção da homeostase celular:

- Rápida remoção de proteínas regulatórias (por exemplo, fatores

transcricionais, enzimas, fatores inibitórios) essenciais para o controle do

metabolismo e crescimento celular. Diferente da maioria dos mecanismos de

regulação, a degradação de proteínas é um processo irreversível. A destruição

de um componente protéico pode levar à finalização rápida e completa de

processos celulares e conseqüente mudança na composição celular;

- Eliminação seletiva de proteínas anormais conseqüentes de

mutações, erros biossintéticos, ação de radicais livres ou desnaturação

(especialmente a altas temperaturas), consistindo em um mecanismo de

controle essencial para a sobrevivência celular;

- Funcionamento adequado do sistema imune, onde a fração de

pequenos peptídeos gerada durante a degradação protéica é dirigida ao

retículo endoplasmático e transportada para a superfície celular por moléculas

do complexo de histocompatibilidade maior. Tais peptídeos são reconhecidos

por linfócitos que monitoram as superfícies celulares, promovendo assim

destruição da célula;

- Em situações de ingestão calórica inadequada ou doenças catabólicas

(como diabetes, câncer, SIDA, sepse entre outras), a degradação total de

proteínas celulares, especialmente no tecido muscular esquelético,

disponibilizam aminoácidos essenciais para a neoglicogênese, síntese de

novas proteínas e geração de energia.

Introdução 2

Portanto, o estudo do controle dos processos de síntese e degradação

de proteínas fornece informações importantes para o entendimento dos

mecanismos envolvidos na regulação da massa muscular esquelética. O

metabolismo de proteínas neste tecido é regulado por numerosos fatores

nutricionais, hormonais e neurais, que promovem ajustes metabólicos frente às

mais diversas situações fisiológicas ou patológicas. Qualquer desequilíbrio

entre estes dois distintos processos poderá promover atrofia ou hipertrofia do

tecido muscular. Assim, a atrofia muscular pode ser conseqüência de uma

redução na síntese protéica, ou de uma ativação da degradação de proteínas,

ou ainda uma associação de ambos os processos.

A perda de massa corporal, que é característica freqüente de vários

estados patológicos, resulta principalmente da perda de proteínas do tecido

muscular, que em um adulto normal representa aproximadamente metade das

proteínas totais do corpo. A persistência de um estímulo catabólico afeta

significativamente a homeostase do tecido muscular esquelético, resultando em

perda de massa e fraqueza, com conseqüente atraso ou prejuízo da

reabilitação, piorando a qualidade de vida do paciente.

A atrofia muscular origina-se principalmente de um aumento da

velocidade de degradação de proteínas, sendo os mecanismos e os fatores

envolvidos para a geração da resposta hipercatabólica (e, portanto, ativadores

dos sistemas de degradação protéica muscular) alvos de intenso estudo

atualmente. Além disso, a contribuição relativa dos diferentes sistemas de

degradação de proteínas para o aumento da velocidade de proteólise é ainda

um campo para elucidação. Tem sido aceito que as diferentes vias de

degradação de proteínas atuam coordenadamente para a promoção do

catabolismo protéico.

A regulação da degradação de proteínas reflete a integração de

diferentes fatores, tais como redução na disponibilidade de nutrientes, níveis

elevados de citocinas pró-inflamatórias, alterações na homeostase hormonal,

interferência na sinalização intracelular e/ou na junção neuromuscular, falta de

exercício, etc. Experimentalmente, manipulações hormonais (por exemplo,

hipercorticosteronemia ou hipoinsulinemia), redução da atividade contrátil (por

Introdução 3

exemplo, desnervação ou desuso) ou aumento artificial das citocinas

circulantes resultam em um aumento na velocidade de degradação de

proteínas, isto é, uma resposta hipercatabólica na musculatura esquelética. O

aparecimento de atrofia muscular é resultado da persistência do

hipercatabolismo, e a manutenção deste quadro torna-se uma condição

extremamente prejudicial, uma vez que o organismo pode apresentar perdas

na habilidade de se recuperar dos danos conseqüentes de estresse e/ou

patologias. Assim, situações de contínua perda de massa muscular resultam

em aumento de morbidade e mortalidade, quando importantes músculos (por

exemplo, aqueles associados com processos respiratórios) tornam-se

atrofiados. Consequentemente, um grande número de pacientes em situações

de caquexia promovida por câncer, sepse, queimaduras ou traumas morrem

quando a perda de massa protéica muscular excede 70% (que corresponde a

uma perda de peso corporal de aproximadamente 30%). Portanto, o

entendimento da ativação diferencial das vias proteolíticas e a compreensão

dos fatores que controlam sua atividade oferecem informações úteis que

auxiliam na identificação de novos alvos terapêuticos para o desenvolvimento

de compostos anti-atróficos.

Durante a década passada muitos estudos foram realizados na tentativa

de elucidar a relativa contribuição dos diferentes sistemas de degradação de

proteínas para o desenvolvimento da atrofia muscular, além dos mecanismos

responsáveis por sua ativação. Todas as células possuem os seguintes

sistemas responsáveis pela degradação das proteínas intracelulares:

lisossomal, dependente de cálcio (Ca2+), dependente de ubiquitina (Ub)-

proteassoma e residual (ou independente de ATP).

Sistema proteolítico lisossomal A proteólise lisossomal foi o primeiro sistema proteolítico descrito, sendo

o mais conhecido. O lisossomo corresponde a uma importante organela

envolvida em processos degradativos nas células de mamíferos, contendo

altas concentrações de diferentes hidrolases ácidas e normalmente possuindo

Introdução 4

um lúmen acídico (pH 4-5). Catepsinas B, D, H e L são as principais proteases

lisossomais, determinando a capacidade proteolítica dos lisossomos. O

principal papel funcional das catepsinas está associado à degradação de

proteínas exógenas endocitadas, proteínas de membranas e glicoproteínas

(Rechsteiner, 1987; Lecker et al., 1999a), em diferentes tecidos como fígado,

coração, músculo esquelético, dentre outros.

Inicialmente, acreditava-se que a degradação protéica que ocorre no

interior dos lisossomos era inespecífica e isenta de regulação; porém, na

continuidade dos estudos ficou comprovado que a proteólise lisossomal

apresenta especificidade, onde proteínas que possuem uma seqüência de

aminoácidos KFERQ (Lys-Phe-Glu-Arg-Gln) se ligam a uma proteína da família

HSP70 (proteínas de choque térmico) de 73KDa presente na membrana dos

lisossomos, conhecida por HSC73. O complexo formado entre o substrato e a

HSC73 é importante para promover o transporte da proteína para o interior da

organela, ocorrendo assim sua degradação (Dice, 1990; Cuervo et al., 1995).

O aumento na velocidade de degradação de proteínas pelos lisossomos

pode ser observado em determinados tecidos e em alguns estados patológicos,

sendo as proteínas solúveis ou citoplasmáticas os principais substratos. No

jejum, por exemplo, ocorre um aumento na degradação de proteínas pelos

lisossomos em tecidos como fígado e coração, porém não em músculos

esqueléticos (Wing et al., 1991).

Em alguns modelos de atrofia muscular pode ser observada uma

estimulação coordenada do processo proteolítico lisossomal com os sistemas

dependentes de Ca2+ e de Ub-proteassoma. No entanto, dentre as

endopeptidases lisossomais envolvidas na proteólise intracelular, as catepsinas

B e L têm sido consideradas como as principais proteases ativadas em

situações de atrofia muscular.

A importância do processo proteolítico lisossomal para o

desenvolvimento de atrofia muscular tem sido pouco avaliada; parece que seu

papel restringe-se aparentemente na degradação de proteínas não-

miofibrilares (Blommaart et al., 1997). No entanto, trabalhos têm demonstrado

um aumento na expressão de proteases lisossomais em situações

Introdução 5

características de hipercatabolismo muscular. Foi observado aumento na

expressão do RNAm da catepsina L em músculos obtidos de animais

submetidos a modelos de atrofia como desuso (Taillandier et al., 1996), câncer

(Deval et al., 2001; Combaret et al., 2002), uremia (Lecker et al., 2004) e sepse

(Jagoe et al., 2002). Aumento na atividade da catepsina B tem sido

demonstrado em músculos de camundongos distróficos (Sanada et al., 1978;

Sano et al., 1988) e em pacientes com distrofia muscular de Duchenne

(Katunuma et al., 1978). Atrofia muscular induzida por administração de

glicocorticóide (Dardevet et al., 1995) e pelo desuso (Taillandier et al., 1996)

também está associada com níveis aumentados de RNAm das catepsinas B e

D.

Em animais hipofisectomizados (Kettelhut et al., 1988) ou submetidos a

uma dieta deficiente em proteínas (Tawa et al., 1992), nas quais há uma

diminuição da proteólise muscular total, ocorre uma concomitante redução na

atividade do sistema proteolítico lisossomal, que parece ser devido à queda

dos hormônios tireoidianos.

Sistema proteolítico dependente de Ca2+ O sistema proteolítico dependente de Ca2+ envolve a atividade de

cisteína-proteases denominadas de calpaínas (Ono et al., 1999), que se

dividem em duas principais isoformas: a microcalpaína (µ-calpaína ou calpaína

I), que apresenta metade da atividade máxima em concentrações de 5 a 50 µM

de Ca2+ (Inomata et al., 1983), e a milicalpaína (m-calpaína ou calpaína II),

ativada com concentrações de Ca2+ compreendida entre 200 a 1000 µM (Tsuji

& Imahori, 1981; Inomata et al., 1983). As células que contêm calpaínas

também possuem um inibidor endógeno específico para esta protease, a

calpastatina, já tendo sido isolada de diversos tecidos (Waxman & Krebs, 1978;

Murachi, 1983; Otsuka & Goll, 1987), inclusive da musculatura esquelética

(Nakamura et al., 1984).

Alguns trabalhos correlacionam um aumento na atividade do sistema

proteolítico dependente de Ca2+ na musculatura esquelética com alterações na

homeostase intracelular dos íons Ca2+. Situações de perda de massa em

Introdução 6

distrofias musculares, queimaduras e sepse normalmente estão associadas

com aumento nos níveis intracelulares de Ca2+ (Tidball et al., 2000;

Christensen et al., 2004). O aumento na proteólise observado em modelos de

atrofia muscular (como sepse e imobilização) foi revertido após tratamento dos

animais com drogas (nifedipina, por exemplo) que restauram as concentrações

intracelulares de Ca2+ a valores normais (Williams et al., 1999; Wagatsuma et

al., 2002). No entanto, situações de perda de massa muscular também têm

sido correlacionadas com alterações na expressão dos componentes deste

sistema proteolítico. Foi observado um aumento na expressão de m-calpaína

em músculos esqueléticos de ratos portadores de sarcoma de Yoshida

(Temparis et al., 1994).

A participação da via proteolítica dependente de Ca2+ em músculos

esqueléticos também tem importância em situações, como por exemplo, atrofia

muscular por desnervação (Furuno et al., 1990) e no diabetes (Pepato et al.,

1996). Alguns hormônios parecem ter efeito na atividade desta via; as

catecolaminas (Navegantes et al., 1999, 2001) e a testosterona (Galo, 1995)

exercem ação anti-proteolítica na musculatura esquelética através de inibição

da via dependente de Ca2+.

Sistema proteolítico dependente de Ub-proteassoma O sistema proteolítico dependente de Ub-proteassoma é a principal

maquinaria intracelular responsável pela degradação de proteínas contráteis da

musculatura esquelética, desempenhando importante papel no

desenvolvimento de atrofia muscular. A via dependente de Ub-proteassoma

compreende dois passos sucessivos. Inicialmente, as proteínas destinadas à

degradação são “marcadas” por um processo de poliubiquitinação que envolve

a ação seqüencial da enzima ativadora de ubiquitina (E1), enzimas

conjugadoras de ubiquitina (E2) e enzimas ligadoras de ubiquitina (E3)

(Hershko et al., 1979; Ciechanover et al., 1980). Após a identificação e

marcação da proteína a ser degradada, ocorre participação do complexo

enzimático de natureza citosólica, formado pelo proteassoma 20S (Orlowski,

1990), o qual constitui o centro catalítico de uma protease maior, o

Introdução 7

proteassoma 26S (Rechsteiner, 1987), que degrada o substrato em pequenos

peptídeos. Ao contrário dos demais componentes proteolíticos, esse sistema é

ativado na presença de ATP (Goldberg & St. John, 1976; Hershko &

Ciechanover, 1982). Esta maquinaria proteolítica está envolvida na degradação

de proteínas anormais oriundas de erros pós-sintéticos, mutações, oxidações,

desnaturações (Jagoe & Goldberg, 2001) além da degradação de produtos de

oncogenes viral e celular (Ciechanover et al., 1994; Stancovski et al., 1995) e

de proteínas reguladoras de meia vida curta, como fatores de transcrição

(Jentsch et al., 1990) e enzimas chaves de vias metabólicas.

Trabalhos têm demonstrado ativação da via dependente de Ub-

proteassoma em várias situações fisiológicas e patológicas: jejum (Wing &

Goldberg, 1993; Medina et al., 1995), ausência de gravidade (Taillandier et al.,

1996), diabetes (Dice, 1987; Pepato et al., 1996; Galban et al., 2001),

desnervação muscular (Furuno et al., 1990; Tawa et al., 1997), após tratamento

com hormônios tireoidianos e glicocorticóides (Dardevet et al., 1995),

septicemia (Tiao et al., 1996; Voisin et al., 1996), câncer (Temparis et al., 1994;

Attaix et al., 1998) e acidose metabólica (Mitch et al., 1994).

Recentemente, avanços têm sido obtidos na elucidação dos detalhes da

participação do sistema proteolítico dependente de Ub-proteassoma no

desenvolvimento da atrofia muscular em várias situações, além do controle da

atividade dos componentes desta via por diferentes fatores hormonais. Dentre

estes componentes, tem recebido um grande destaque a investigação da

contribuição de uma proteína da família das ubiquitina ligases (E3), cuja

expressão é específica para o tecido muscular, denominada atrogin-1 (ou

MAFbx). Alterações na expressão gênica da atrogin-1 foram inicialmente

estudadas por Gomes et al. (2001), sendo demonstrado um aumento no RNAm

desta enzima na musculatura esquelética de camundongos submetidos a

diversas situações que apresentavam atrofia muscular, como jejum, diabetes,

câncer e falência renal. Assim, foi proposto que este componente parece ser

um elemento essencial para o processo de ubiquitinação dos substratos

protéicos a serem degradados, levando ao desenvolvimento de atrofia

muscular nestas diferentes condições estudadas.

Introdução 8

Em músculos depletados de ATP permanece ainda uma atividade

proteolítica chamada de via residual ou independente de ATP. Não se

conhecem as enzimas envolvidas neste processo proteolítico, nem os

substratos preferenciais ou sua regulação (Kettelhut et al., 1988). Apenas

alguns trabalhos realizados em nosso laboratório mostraram que esta via

também pode ser regulada, tendo sido encontrada redução em sua atividade

em músculos soleus de ratos diabéticos, após 10 dias da administração de

estreptozotocina (Pepato et al., 1996) e após 4 dias de simpatectomia química

induzida pelo tratamento com guanetidina (Navegantes et al., 1999), mas o

significado fisiológico de tais alterações permanece ainda para ser esclarecido.

Dentre as proteases que podem estar contribuindo com a atividade do

processo proteolítico residual na musculatura esquelética, as caspases, as

aminopeptidases e as endopeptidases (como as thimet oligopeptidases - TOP)

parecem exercer um papel importante na degradação de proteínas ou

peptídeos no interior da célula em colaboração com outros processos

proteolíticos. As caspases parecem ter envolvimento na degradação das

miofibrilas e dos complexos de actomiosina, liberando unidades monoméricas

de actina e miosina para a subseqüente degradação pela via dependente de

Ub-proteassoma (Du et al., 2004; Lee et al., 2004). Já as aminopeptidases e as

TOP degradam os oligopeptídeos de 3 a 24 aminoácidos gerados pelo

proteassoma em aminoácidos livres (Saric et al., 2004).

Trabalhos realizados em nosso laboratório mostraram a importância de

diferentes fatores hormonais e neurais no controle do metabolismo de

proteínas na musculatura esquelética de ratos. Vale a pena destacar os

estudos que verificaram o papel da insulina e do sistema nervoso simpático

(SNS, representado pelas catecolaminas) no controle da degradação protéica

em músculos de ratos.

A deficiência de insulina está geralmente associada com atrofia

muscular esquelética. Trabalhos anteriores do nosso laboratório (Pepato et al.,

1996) mostraram que, após a indução do diabetes com estreptozotocina (STZ),

Introdução 9

ocorrem variações temporais na atividade das diferentes vias proteolíticas no

músculo, sendo observado um aumento na proteólise muscular na fase aguda

e uma redução em períodos mais prolongados de deficiência insulínica. Assim,

foi demonstrado que a deficiência aguda de insulina (1 e 3 dias após a

instalação do diabetes) é capaz de promover um aumento na proteólise total

em músculos soleus e EDL de ratos, conseqüência da elevação na atividade

dos sistemas proteolíticos dependente de Ca2+ (soleus e EDL, 1 dia de

diabetes; soleus, 3 dias de diabetes) e dependente de Ub-proteassoma (EDL, 3

dias de diabetes). Na deficiência crônica de insulina (5 e 10 dias após a

indução do diabetes) foi observada queda na atividade de ambas as vias

proteolíticas, tanto em soleus quanto em EDL (Pepato et al., 1996), alcançando

valores até menores que as taxas de proteólise observadas em soleus de ratos

controles. Esses dados sugerem que a ativação destas vias proteolíticas na

fase inicial do diabetes é responsável, pelo menos em parte, pela perda de

massa na deficiência de insulina, considerando ainda a queda da velocidade de

síntese de proteínas, que ocorre desde o primeiro dia de ausência insulínica.

Desta maneira, ficou demonstrado que as alterações ocorridas nas atividades

dos diferentes sistemas proteolíticos dependem tanto da duração do diabetes

quanto do tipo de fibra que prevalece no tecido muscular (soleus - fibras

predominantemente oxidativas do tipo I; EDL - fibras predominantemente

glicolíticas do tipo II).

A maioria dos trabalhos que investigam a participação dos sistemas

proteolíticos no desenvolvimento da atrofia muscular na deficiência de insulina

prioriza o estudo da participação da via proteolítica dependente de Ub-

proteassoma, sem a preocupação em observar a alteração em outros sistemas

envolvidos na degradação de proteínas. Assim, o aumento na atividade da via

dependente de Ub-proteassoma observado em músculos de animais diabéticos

tem sido atribuído à elevação na expressão do RNAm de diferentes

componentes deste sistema, tal como ubiquitina, E214k, E3α e subunidades do

proteassoma (Price et al., 1996; Lecker et al., 1999b; Liu et al., 2000; Combaret

et al., 2004).

Introdução 10

Além disso, trabalhos de Mitch e colaboradores têm relatado a

contribuição de uma protease apoptótica, a caspase-3, na degradação de

proteínas em músculo esquelético de animais diabéticos. A elevação na

atividade desta protease em músculos gastrocnemius de ratos diabéticos foi

demonstrada através do aumento na geração de fragmentos de actina de

14KDa, produto característico da atividade da caspase (Du et al., 2004; Lee et

al., 2004). De acordo com estes estudos, a atividade da caspase-3 parece ser

um passo inicial importante para a perda de proteínas musculares no estado

diabético, uma vez que esta caspase estaria gerando produtos que seriam

rapidamente removidos pela proteólise dependente de Ub-proteassoma. Como

esta ação da caspase-3 parece semelhante àquela atribuída as calpaínas para

o processo de degradação de proteínas na musculatura esquelética, e devido

aos resultados anteriores do laboratório que mostraram a importância da via

dependente de Ca2+ em diversas situações, o presente trabalho se propôs a

continuar o estudo para investigar a contribuição da via dependente de Ca2+ na

degradação de proteínas musculares.

Além da insulina, as catecolaminas também exercem um papel

anabólico no controle do metabolismo de proteínas na musculatura esquelética.

Trabalhos na literatura demonstraram que a administração de agonistas β2-

adrenérgicos é capaz de estimular hipertrofia muscular esquelética (Yang &

McElligott, 1989; Mersmann, 1998) e reduzir a atrofia de músculos

desnervados (Zeman et al., 1987). Trabalho de Navegantes et al. (1999)

demonstrou que o bloqueio adrenérgico agudo resulta em aumento na

proteólise total em músculos soleus, devido a uma elevação da atividade da via

proteolítica dependente de Ca2+. A incubação de músculos de ratos

previamente simpatectomizados com isoproterenol (agonista β adrenérgico)

reduziu a proteólise total, sugerindo que o SNS exerce ações anti-proteolíticas

na musculatura esquelética. Na investigação dos mecanismos intracelulares

envolvidos neste efeito anabólico do SNS, foi demonstrado que a incubação de

músculos na presença de adrenalina, clembuterol (agonista β2 seletivo) ou CL

316,243 (agonista β3 seletivo) é capaz de diminuir os valores de proteólise total

Introdução 11

em cerca 20% em comparação aos controles (Navegantes et al., 2000, 2006).

Dibutiril AMPc e isobutilmetilxantina (inibidor da fosfodiesterase de AMPc,

enzima responsável pela degradação deste nucleotídeo) reduzem a proteólise

em soleus e EDL (Navegantes et al, 2000). Estas ações são mediadas através

da inibição do sistema proteolítico dependente de Ca2+ (Navegantes et al.,

2001). Assim, ficou demonstrado que as catecolaminas exercem um controle

inibitório na proteólise muscular esquelética, efeito este mediado por receptores

adrenérgicos dos subtipos β2 e β3, com a participação de vias intracelulares

dependentes de AMPc. Além disso, foi confirmado que o efeito anabólico das

catecolaminas ocorre pelo controle da proteólise dependente de Ca2+,

possivelmente através de fosforilação direta e inibição das calpaínas, ou

fosforilação e ativação da calpastatina, ou mesmo através de controle direto da

expressão gênica destes componentes (Navegantes et al., 2001, 2002). Não

pode ainda ser afastada a possibilidade das catecolaminas interferirem também

na concentração intracelular de íons Ca2+.

Tendo em vista a importância do sistema nervoso simpático no controle

do metabolismo de proteínas na musculatura esquelética de ratos em uma

situação basal, promovendo inibição da proteólise principalmente por

diminuição da atividade da via dependente de Ca2+, o objetivo deste trabalho

foi estudar o papel das catecolaminas no metabolismo protéico muscular de

animais submetidos a uma situação de catabolismo. Assim, foi avaliado no

presente trabalho a influência do SNS no metabolismo de proteínas em

músculos soleus e EDL de ratos diabéticos. A alta atividade proteolítica

observada em animais com diabetes agudo pode ser ainda maior na ausência

de catecolaminas? Para isso, foram estudados os processos de degradação e

síntese de proteínas de animais em diferentes tempos de diabetes e

submetidos à simpatectomia química induzida pela administração de

guanetidina, um inibidor pré-sináptico da liberação de noradrenalina.

O estudo do metabolismo protéico em uma situação experimental que se

caracteriza pela ausência tanto da insulina quanto das catecolaminas pode

trazer esclarecimentos importantes relacionados ao cross-talk entre as

Introdução 12

cascatas de sinalização de ambos os hormônios. As ações desempenhadas

isoladamente por estes hormônios têm sido bastante estudadas, no entanto,

pouco se sabe sobre as interações existentes entre eles e seu significado no

controle de processos fisiológicos. Atualmente, tem sido demonstrado o cross-

talk existente entre as cascatas de sinalização da insulina e das catecolaminas

(principalmente do sinal que envolve ativação de receptores β2-adrenérgicos e

aumento de AMPc intracelular). No entanto, merece destaque o papel

desempenhado pela proteína quinase B (PKB ou AKT), um intermediário da

sinalização da insulina que está envolvido no mecanismo inibitório da proteólise

muscular exercido pela insulina e IGF-1 (Glass, 2003; Guttridge, 2004; Latres

et al., 2005; Nader, 2005). Trabalhos recentes na literatura têm comprovado a

ativação da AKT por intermediários da sinalização que envolve o AMPc em

vários tecidos (Klein et al., 1999; Misra & Pizzo, 2005; Machida et al., 2005).

Trabalhos de Brennesvik et al. (2005) e Jensen et al. (2005) demonstraram um

aumento na fosforilação e na atividade da AKT em músculo esquelético

incubado na presença de adrenalina, e esta ativação ocorre através de uma

sinalização dependente de AMPc. Assim, a AKT pode ser um intermediário

comum no controle do metabolismo protéico muscular pela insulina e pelas

catecolaminas, sendo esse um campo muito interessante que necessita de

maiores investigações. Portanto, o estudo do metabolismo de proteínas em

animais diabéticos simpatectomizados pode trazer importantes informações

sobre as inter-relações entre os mecanismos de ação intracelulares da insulina

e das catecolaminas no controle do metabolismo de proteínas musculares.

É sabido que os derivados de xantinas são compostos que promovem

inibição da fosfodiesterase do AMPc e aumento nas concentrações

intracelulares deste nucleotídeo. Nesta classe de drogas, merece destaque a

pentoxifilina (PTX), a qual tem sido bastante utilizada em seres humanos, pois

além de ser bem tolerada, apresenta propriedades terapêuticas por seus

efeitos vasculares, aumentando o fluxo sanguíneo pulmonar, diminuindo a

viscosidade sanguínea (Berman et al., 1994; Kamphuis et al, 1994; Skjeldal et

al., 1994), além de exercer ações no sistema imune, com efeitos benéficos em

Introdução 13

transplantes de órgãos, SIDA e diabetes (Balazs & Kiss, 1994; Liang et al.,

1998; Stosic-Grujicic, 2001). Além disso, existem relatos na literatura

demonstrando a capacidade da PTX na redução da degradação de proteínas

da musculatura esquelética em algumas situações caracterizadas por atrofia

muscular, tal como sepse (Breuillé et al., 1993; Vary et al., 1999) e câncer

(Combaret et al., 1999). Tais estudos têm sugerido que este papel da PTX seja

decorrente do seu efeito na inibição da síntese e secreção do TNF-α (Fator de

Necrose Tumoral-α), citocina que parece estar relacionada com o aumento de

degradação protéica (Breuillé et al., 1993; Vary et al., 1999). A maioria destes

trabalhos demonstrou que a PTX é capaz de promover uma redução da

proteólise muscular pela inibição da via proteolítica dependente de Ub-

proteassoma em músculos de ratos sépticos ou portadores de tumor. Costelli et

al. (2002) também comprovaram a ação anti-proteolítica muscular da PTX

através de redução na atividade do proteassoma e da calpaína em músculos

gastrocnemius de ratos portadores de sarcoma de Yoshida AH-130.

Recentemente, o efeito anti-atrófico da PTX in vivo foi também

observado em músculos de animais desnervados e imobilizados, modelos

experimentais nos quais não ocorrem alterações nos níveis circulantes de

citocinas (Hinkle et al., 2005). Considerando trabalhos anteriores de nosso

laboratório que demonstraram que outro derivado de xantina e inibidor da

fosfodiesterase de AMPc, a isobutilmetilxantina, é capaz de promover inibição

da proteólise total em músculos incubados na presença da droga (Navegantes

et al., 2000), tornou-se interessante investigar a possibilidade de uma ação

anti-proteolítica muscular direta da PTX, diferente de seu efeito clássico de

redução da síntese de TNF-α. De acordo com esta hipótese, a droga estaria

inibindo a velocidade de degradação de proteínas por um mecanismo

semelhante ao proposto anteriormente por Navegantes et al. (1999-2002) para

explicar a ação anabólica do SNS no metabolismo protéico da musculatura

esquelética, isto é, através da ativação de proteína G e adenilato ciclase, e

conseqüente aumento nos níveis de AMPc.

Introdução 14

Portanto, o presente trabalho também teve como objetivo investigar o

papel anti-proteolítico direto da PTX, tanto in vivo quanto in vitro, no

metabolismo de proteínas em músculo esquelético de ratos normais e ratos

submetidos a uma situação de catabolismo, o diabetes.

Objetivos

Objetivos 15

2) Objetivos Gerais 2.1) Considerando que as catecolaminas exercem um efeito anti-proteolítico, o

objetivo deste trabalho foi investigar o papel destes hormônios na resposta

proteolítica de músculos de ratos diabéticos. Para isto foram estudados ratos

diabéticos submetidos ao modelo de simpatectomia química pela administração

de guanetidina, droga que promove bloqueio simpático seletivo através da

inibição da liberação dos grânulos secretórios e da depleção das reservas de

noradrenalina nos neurônios pré-sinápticos.

Os objetivos específicos foram investigar o efeito da simpatectomia

química:

a) na proteólise total em músculos soleus (de fibras predominantemente

oxidativas do tipo I) e EDL (de fibras predominantemente glicolíticas do tipo II)

de ratos após 1, 3 e 5 dias de diabetes;

b) nos diferentes sistemas proteolíticos (lisossomal, dependente de Ca2+,

dependente de Ub-proteassoma e residual) em soleus e EDL de ratos após 1,

3 e 5 dias de diabetes;

c) na velocidade de síntese de proteínas em soleus de ratos após 1 e 3 dias de

diabetes, assim como o papel da adrenalina in vitro nesta via metabólica.

2.2) Considerando que o aumento nos níveis intracelulares de AMPc parecem

ser responsáveis pelo controle da proteólise dependente de Ca2+ na

musculatura esquelética de ratos normais, o objetivo geral foi verificar o efeito

da pentoxifilina (droga que inibe a fosfodiesterase do AMPc) no metabolismo

de proteínas tanto em ratos normais como em animais submetidos à situação

de atrofia muscular, o diabetes mellitus.

Objetivos específicos:

Objetivos 16

a) Investigar o efeito in vivo e in vitro da pentoxifilina nas concentrações

intracelulares de AMPc em EDL de ratos normais e diabéticos (3 dias após a

administração de STZ);

b) Investigar o efeito in vivo e in vitro da pentoxifilina na proteólise total em EDL

de ratos normais e diabéticos (3 dias após a administração de STZ);

c) Investigar o efeito in vivo e in vitro da pentoxifilina nos diferentes sistemas

proteolíticos (lisossomal, dependente de Ca2+, dependente de Ub-proteassoma

e residual) em EDL de ratos normais e diabéticos (3 dias após a administração

de STZ);

d) Uma vez encontradas alterações na participação dos sistemas proteolíticos

em músculos de animais tratados com pentoxifilina, investigar o efeito in vivo

da droga na quantidade das proteínas m-calpaína e calpastatina e do RNAm da

atrogin-1, componentes dos sistemas proteolíticos dependentes de Ca2+ e de

Ub-proteassoma, respectivamente, em músculos EDL de animais normais e

diabéticos;

e) Investigar o efeito in vivo da pentoxifilina na velocidade de síntese de

proteínas em EDL de ratos normais e diabéticos (3 dias após a administração

de STZ);

f) Investigar o efeito in vivo da pentoxifilina nas concentrações plasmáticas de

TNF-α de ratos normais e diabéticos (3 dias após a administração de STZ);

g) Investigar o efeito in vivo e in situ da pentoxifilina na concentração intersticial

de tirosina de músculos tibialis anterior de ratos normais e diabéticos adultos (3

dias após a administração de aloxana).

Materiais e Métodos

Materiais e Métodos 17

3) Materiais e Métodos 3.1) Animais

Foram utilizados ratos machos da linhagem Wistar, pesando entre 70 e

80g, provenientes do Biotério Central da Faculdade de Medicina de Ribeirão

Preto (FMRP) - USP. Os animais foram mantidos no Biotério do Departamento

de Bioquímica, recebendo dieta balanceada (NUVLAB CR1 - NUVITAL) para

roedores e água ad libitum em ambiente com ciclos luz-escuro de 12 horas

(luzes acesas às 7:00 horas e apagadas às 19:00 horas) e temperatura

controlada de 25oC. Todos os animais permaneceram nestas condições

ambientais por pelo menos 24 horas antes de qualquer procedimento

experimental.

Os animais utilizados para a indução do diabetes permaneceram por

pelo menos dois dias no biotério antes da administração de STZ, recebendo

água e alimento ad libitum. Precedendo o dia da indução do diabetes, os

mesmos animais foram colocados em jejum de 14 a 16 horas, sendo mantidos

somente com água.

Todos os experimentos foram realizados pela manhã, entre 8:00 e

11:00 horas. O sacrifício dos animais foi realizado por deslocamento cervical ou

decapitação (quando necessária coleta de sangue). Os músculos soleus e EDL

foram imediatamente removidos e pesados em balança digital (ACATEC BEM

0100).

3.2) Indução do diabetes: administração de estreptozotocina (STZ)

A droga foi dissolvida em tampão citrato 0,01M (pH 4,5), sendo

protegida da luz. Após jejum de 14 a 16 horas e anestesia dos animais com

éter etílico, a STZ foi injetada na veia jugular em até 5 minutos após sua

dissolução. Foram administrados 135mg STZ/kg de peso corporal em volume

de 0,2mL por 80g de peso do animal (Pepato et al., 1996), que neste dia

apresentavam peso corporal de cerca de 70g. Após 90 minutos da

administração de STZ, os animais voltaram a receber alimento ad libitum.


Os experimentos para determinação da proteólise nos músculos

esqueléticos foram conduzidos em animais com 1, 3 ou 5 dias de diabetes, de

acordo com Pepato et al. (1996). A indução do diabetes foi comprovada pela

determinação da glicemia dos animais. Foram utilizados apenas animais que

apresentaram valores de glicemia iguais ou superiores a 400mg/dL.

3.3) Coleta de sangue para determinação de glicemia O sangue foi coletado em tubos heparinizados, após decapitação dos

animais ou obtido pela cauda (realização de corte cerca de 2mm de sua

extremidade distal), 30 minutos antes do experimento. Após a coleta, o sangue

foi centrifugado para obtenção do plasma e a determinação das concentrações

de glicose foi realizada pelo método enzimático da glicose-oxidase (Bergmeyer

& Bernt, 1974) através do Glucose Analyser Beckman Instruments Inc. ou pelo

Kit glicose-oxidase da Labtest, através do espectrofotômetro U-200I HITACHI

em comprimento de onda de 505nm.

3.4) Estudo do papel do sistema nervoso simpático no metabolismo de proteínas em músculo esquelético de ratos diabéticos 3.4.1) Modelo Experimental: simpatectomia química através da administração de guanetidina

Para a indução da simpatectomia química, foi preparada solução de

sulfato de guanetidina (1-[2-guanidinoetil]-octahidroazocina) dissolvida em

salina 0,9% na concentração de 4mg/mL e pH ajustado para 7,4. A droga foi

administrada na região dorso-cervical, via subcutânea (s.c.), aos animais

diabéticos durante 1 ou 2 dias sucessivos (Navegantes et al., 1999), na dose

de 100 mg/Kg de peso corporal ao dia, entre 8:00 e 9:00 horas da manhã. O

grupo experimental, desta maneira, foi composto de animais diabéticos que

receberam injeções diárias de guanetidina (grupo DG). Os grupos controle

foram constituídos de ratos normais (grupo N) e diabéticos (grupo D) que

receberam injeções de salina pela mesma via. Os animais foram sacrificados


por deslocamento cervical ou decapitação 24 horas após a última injeção. A

indução da simpatectomia química foi comprovada através das determinações

das concentrações das catecolaminas no plasma, na medular adrenal e nos

músculos soleus e EDL.

3.4.2) Grupos experimentais Todos os experimentos de determinação da concentração das

catecolaminas teciduais e de investigação da proteólise total e participação das

vias proteolíticas em músculos soleus e EDL foram conduzidos em três grupos

de animais:

a) grupo normal controle: ratos não injetados com estreptozotocina (STZ) e

portanto utilizados como controle dos demais grupos diabéticos. Além disso,

esse grupo recebeu injeção(ões) diária(s) de solução de NaCl 0,9% via s.c., a

fim de simular a situação experimental dos animais que passaram pela

simpatectomia química;

b) grupo diabético salina: ratos que receberam injeção única de STZ (135

mg/kg peso, i.v.) para a instalação do diabetes. Os experimentos foram

realizados nos períodos de 1, 3 e 5 dias após a administração da droga

diabetogênica. Tal grupo também era submetido à administração s.c. de salina

0,9%, configurando desta maneira o grupo controle do procedimento de

simpatectomia;

c) grupo diabético guanetidina: ratos cujo quadro diabético foi instalado pela

administração de STZ e utilizados nos experimentos após 1, 3 e 5 dias da

injeção desta droga. Nos experimentos realizados 1 dia pós-STZ, os animais

receberam uma única dose da solução de guanetidina (100 mg/kg peso, s.c.)

no mesmo dia da indução do diabetes, porém no período da tarde, por volta

das 18:00 horas. Nos demais tempos de diabetes (3 e 5 dias pós-STZ) os

grupos foram tratados com guanetidina por 2 dias, sendo estes imediatamente

precedentes ao dia do experimento.

Nos experimentos após 5 dias de diabetes, os animais não receberam

o tratamento com guanetidina durante todo o período de instalação do quadro

diabético, devido à alta mortalidade causada por este procedimento; portanto,


tais animais forma submetidos à simpatectomia química 2 dias antes do

experimento (injeções no 3o e 4o dias pós-STZ).

Animais normais tratados somente com guanetidina foram estudados

em nosso laboratório, cujos resultados fizeram parte da dissertação de

Mestrado e tese de Doutorado do Dr. Luiz Carlos C. Navegantes e foram

publicados no American Journal of Physiology (1999, 2000, 2001) e no Current

Opinion in Clinical Nutrition and Metabolic Care (2002). Por esta razão não

foram repetidos aqui e alguns desses dados serão aqui apresentados, quando

necessários.

3.4.3) Determinação das catecolaminas no plasma e nos músculos esqueléticos soleus e EDL

Plasma: para a determinação das concentrações plasmáticas de

adrenalina e noradrenalina os animais foram sacrificados por decapitação e o

sangue coletado em tubos heparinizados. Após centrifugação sob refrigeração

a 4oC, alíquotas de 500 a 700µL de plasma foram transferidas para tubos de

plástico contendo 50mg de metabissulfito de sódio (antioxidante), tampão Tris-

HCl 2M (pH 8,9) com 0,5% de metabissulfito de sódio e 2,5% de EDTA e 50mg

de alumina previamente ativada em estufa a 100oC, por meia hora.

Diidroxibenzilamina foi utilizada como padrão interno. As amostras foram

agitadas durante 20 minutos, centrifugadas e após aspiração do sobrenadante

a alumina foi lavada repetidamente. As catecolaminas foram extraídas da

alumina pela adição de solução eluidora contendo ácido perclórico 0,1N, sob

agitação de 10 minutos (Krstulovic, 1982). Alíquotas de 50µL das amostras

assim obtidas foram analisadas através de cromatografia líquida de alta

performance (HPLC) em um cromatógrafo modelo LC-7A, equipado com uma

coluna de fase reversa Spherisorb ODS II (Sigma-Aldrich), acoplado a um

detector eletroquímico modelo L-ESD-6A e a um polígrafo modelo C-R5A,

todos da marca Shimadzu.

Músculos: para a determinação do conteúdo de noradrenalina nos

músculos soleus e EDL os animais foram sacrificados por deslocamento

cervical. Tais tecidos foram rapidamente retirados e imediatamente congelados


em nitrogênio líquido, mantidos sob refrigeração a -70oC, para posterior

análise.

Os tecidos foram homogeneizados em ácido perclórico 0,2N, contendo

metabissulfito de sódio 1% e EDTA 1mM. O homogeneizado foi centrifugado

sob refrigeração a 10000 rpm, durante 10 minutos. O sobrenadante foi então

processado e analisado como descrito anteriormente.

3.4.4) Velocidade de renovação de noradrenalina nos músculos esqueléticos soleus e EDL

A velocidade de renovação de noradrenalina foi avaliada nos músculos

soleus e EDL de ratos normais e diabéticos (1 e 3 dias pós-STZ) através da

medida da velocidade de queda da concentração de noradrenalina após 6 e 12

horas da administração intraperitonial de α-metil-éster-tirosina (300mg/Kg peso

corporal), um inibidor da síntese de noradrenalina, que bloqueia a atividade da

enzima tirosina hidroxilase. O grupo 12h recebeu uma segunda dose da droga

no intervalo de 6 horas. O grupo 0h não recebe o tratamento com α-metil-

tirosina.

Os animais foram sacrificados por deslocamento cervical. Os músculos

foram imediatamente removidos e processados para a extração de

noradrenalina, tal como descrito anteriormente (item 3.4.3). O conteúdo de

noradrenalina foi determinado através de HPLC.

A velocidade de renovação (VR) da noradrenalina é o produto da

concentração de noradrenalina no tempo 0 [NOR0] pela velocidade de

renovação fracional (k):

Após o bloqueio da síntese pela α-metil-tirosina, o declínio na

concentração de noradrenalina muscular é dado pela seguinte equação:

VR = k . [NOR0]

[NOR] = [NOR0] e –kt


O valor de k pode ser determinado pelo cálculo da regressão linear dos

logaritmos naturais da concentração de noradrenalina versus o tempo (Costa et

al., 1966).

O intervalo de confiança de 95% da velocidade de renovação (VR) da

noradrenalina foi determinado da seguinte maneira:

a) o intervalo de confiança do valor médio da velocidade de renovação

fracional (k) e da concentração de noradrenalina no tempo 0 [NOR0] foi

estabelecido utilizando o erro padrão da média de cada um dos fatores;

b) Os limites inferiores de k e de [NOR0] foram multiplicados para

determinação do limite inferior do intervalo de confiança de 95% da velocidade

de renovação (VR) da noradrenalina;

c) Os limites superiores de k e de [NOR0] foram multiplicados para

determinação do limite superior do intervalo de 95% de confiança da

velocidade de renovação (VR) da noradrenalina. (Taubin et al.; 1972).

O t ½, tempo em que a concentração de noradrenalina inicial cai à

metade, é calculado a partir da equação [NOR0] . 2 -1 = [NOR0] e –kt.

A diferença da velocidade de renovação fracional (k), da concentração

de noradrenalina [NOR0] e da velocidade de renovação (VR) da noradrenalina

entre os grupos foi analisada utilizando o test t de Student com P<0,05 para

nível de significância.

3.4.5) Procedimento experimental para o estudo da proteólise em músculos esqueléticos de ratos em diferentes períodos de diabetes e simpatectomia

A avaliação da degradação de proteínas em músculos esqueléticos de

ratos foi realizada em diferentes períodos de simpatectomia química e de

diabetes.

Na manhã do experimento, os animais diabéticos simpatectomizados e

os controles foram pesados e escolhidos aqueles com pesos próximos a 75g.

O sacrifício foi realizado por deslocamento cervical numa seqüência alternada

entre os grupos (a seqüência obedecida era um animal N, D e DG),

removendo-se rapidamente os músculos soleus e EDL, que foram pesados e


posteriormente incubados em tampão Krebs Ringer-bicarbonato (0,120M de

NaCl; 0,015M de NaHCO3; 4,828mM de KCl; 1,2mM de MgSO4; 1,212mM de

KH2PO4; 2,4mM de CaCl2 - pH 7,4) e aerados.

Para a medida da atividade proteolítica, os músculos íntegros foram

fixados por meio dos seus tendões a suportes de alumínio (soleus) ou de

acrílico (EDL), mantendo-os assim em seus comprimentos de repouso

(“stretch”). A manutenção dos músculos nestas condições possibilita a difusão

de oxigênio e nutrientes, evitando-se anóxia das fibras musculares centrais. A

maioria dos experimentos foram repetidos 2 vezes e o número de animais

utilizados em cada grupo foi de 7 a 9 animais.

3.4.6) Avaliação da atividade proteolítica A atividade proteolítica foi estimada por meio da liberação de tirosina

(Tyr) de proteínas de músculos incubados na presença de cicloheximida, que

impede a reutilização dos aminoácidos para a síntese de proteínas. A Tyr é

normalmente escolhida para a avaliação da proteólise, uma vez que não é um

aminoácido catabolizado e nem sintetizado "de novo" pelo músculo. Além

disso, a Tyr é facilmente dosada por meio de um método fluorimétrico simples

e de grande sensibilidade, descrito por Waalkes & Udenfriend (1957). Essa

liberação de Tyr deve refletir a velocidade de degradação de todas as classes

de proteínas celulares, uma vez que este aminoácido é distribuído em todas

proteínas celulares (Jefferson et al., 1977).

Para a determinação da degradação de proteínas, os músculos foram

incubados em meios adequados, aerados com carbogênio (95% de O2 e 5% de

CO2), permanecendo por 1 hora em banho sob agitação constante a 37oC, a

fim de estabelecer o equilíbrio da velocidade de liberação de Tyr para o meio

de incubação. Após esse período de pré-incubação, os meios foram renovados

e assim dada continuidade à incubação com o mesmo tipo de meio por mais 2

horas. No final deste período, 1mL do meio foi coletado e adicionado a 0,25mL

de ácido perclórico 1,5N para a determinação da Tyr liberada.


3.4.7) Procedimentos experimentais para a avaliação das vias proteolíticas

As seguintes vias proteolíticas foram estudadas em músculos

esqueléticos soleus e EDL: via lisossomal, via dependente de cálcio (Ca2+), via

dependente de Ub-proteassoma e via residual, seguindo os protocolos

metodológicos descritos a seguir.

a) via lisossomal

A quantificação da atividade proteolítica lisossomal foi feita através de

método que utiliza a inibição desta via, com a adição ao meio de incubação de

metilamina e aminoácidos de cadeia ramificada - BCAA (leucina, isoleucina e

valina) A metilamina é uma base fraca que se acumula nos lisossomos,

aumentando o pH intralisossomal para valores próximos à neutralidade,

inibindo assim a atividade das catepsinas e hidrolases ácidas lisossomais

(Mortimore, 1982; Kettelhut et al., 1988). Os BCAA atuam através de bloqueio

da formação de vacúolos autofágicos e também diminuindo a fragilidade

lisossomal nos músculos esquelético e cardíaco e, portanto, inibindo a

degradação protéica, sem alteração do conteúdo total de enzimas lisossomais

(Rannels et al., 1975; Jefferson et al., 1977; Kettelhut et al., 1988).

O esquema a seguir ilustra as condições de incubação dos músculos

soleus e EDL utilizados.


PROTOCOLO DA VIA LISOSSOMAL

MÚSCULOS (COM TENDÕES FIXOS A SUPORTES) RETIRADOS DAS 2 PATAS (1; 2)

COMPONENTES DO MEIO MÚSCULOS

1 2

Tampão Krebs Ringer Bicarbonato (pH 7,4) + +

Glicose (5mM) + +

Cicloheximida (0,5mM) + +

Metilamina (10mM) - +

BCAA* - +

* leucina: 0,5mM; isoleucina: 0,85mM; valina: 1,0mM

A diferença entre a proteólise observada com o músculo 1 e 2 reflete a

participação da via lisossomal. Vale a pena salientar que os valores de tirosina

liberada para o meio de incubação do músculo 1 representam a atividade

proteolítica “total” (embora haja uma relativa inibição da via dependente de

Ca2+ devido ao estiramento do músculo com manutenção do seu comprimento

de repouso e inibição da entrada do íon).

Os aminoácidos liberados na degradação das proteínas celulares

podem também ser utilizados na síntese protéica. Assim, para avaliar a

degradação protéica total, a síntese foi bloqueada pela adição de 0,5 mM de

cicloheximida, que bloqueia a síntese de proteínas por inibir a atividade peptidil

transferase da subunidade ribossomal 60S. Essa concentração do inibidor

acarreta em redução de 95% na incorporação de 14C-Tyr em proteína, sendo

linear por 3 horas, além de não afetar a atividade proteolítica (Fulks et

al.,1975). Por tal ação, a cicloheximida foi utilizada no estudo da determinação

da atividade de todas as vias de degradação de proteínas.


b) via dependente de cálcio O protocolo empregado para o estudo deste processo proteolítico foi a

incubação dos músculos soleus e EDL em tampão Krebs Ringer-bicarbonato

na presença de inibidores da via lisossomal. O músculo de uma pata foi

incubado de forma livre, ativando-se assim as calpaínas, proteases

pertencentes ao sistema dependente de Ca2+; o músculo da outra pata foi

incubado com seus tendões fixos aos suportes adequados, ocorrendo assim

inibição da via proteolítica estudada. A diferença de proteólise observada entre

os músculos das duas patas reflete a atividade do processo dependente de

Ca2+. O esquema a seguir ilustra as condições de incubação dos músculos

soleus e EDL.

PROTOCOLO DA VIA DEPENDENTE DE CÁLCIO



1 2


Glicose (5mM) + +


Metilamina (10mM) + +

BCAA* + +

“free” “stretch”


A diferença de proteólise observada entre os músculos 1 e 2 reflete a

atividade da via dependente de Ca2+.


c) via dependente de Ub-proteassoma e via residual O estudo da participação do sistema proteolítico dependente de Ub-

proteassoma foi realizado utilizando-se dois tipos de protocolos. No primeiro os

músculos foram incubados com seus tendões fixos a suportes em meio isento

de Ca2+, contendo E64 e leupeptina (bloqueio da via proteolítica dependente de

Ca2+) e metilamina e BCAA (acrescentados com a finalidade de bloquear a via

proteolítica lisossomal). E64 tem como função inibir as tiol proteases, inibindo,

além das calpaínas, as enzimas lisossomais. O músculo na presença de

dinitrofenol (0,5mM de DNP) e ausência de glicose apresenta 95% de depleção

do seu conteúdo de ATP tecidual por inibição da fosforilação oxidativa e

glicólise (Kettelhut et al., 1988). O músculo nestas condições apresenta uma

grande queda na degradação de proteínas (Goldberg & St. John, 1976;

Ciechanover, 1987). A ausência de Ca2+ no meio de incubação é fundamental

para a observação de tal achado, pois músculos depletados de ATP, se

incubados em meio contendo Ca2+, apresentam aumento do influxo e acúmulo

intracelular deste íon, que ativa as proteases dependentes de Ca2+ e aumento

da proteólise. Nestas condições, portanto, pode ser avaliada a participação da

via dependente de Ub-proteassoma.

O segundo tipo de protocolo utilizado neste estudo baseia-se na

inibição das vias proteolíticas lisossomal e Ca2+ tal como descrito

anteriormente, além de promover uma inibição direta da atividade proteolítica

do proteassoma com o uso do inibidor MG132 (N-carboxibenzoxi-Leu-Leu-

Leucinal). O MG132 é um peptídeo aldeído que inibe a atividade proteolítica do

proteassoma sem afetar as atividades ATPásicas ou isopeptidásicas. Com este

protocolo, também fica estimada a contribuição da atividade proteolítica

dependente de Ub-proteassoma.

Pela medida da diferença entre a proteólise observada no músculo da

pata 1 (que seria a proteólise não lisossomal e não dependente de Ca2+), a

qual chamamos de "basal" e a proteólise observada no músculo da pata 2, na

ausência de ATP (que seria a proteólise residual independente de energia) ou

com a atividade do proteassoma bloqueada, é possível quantificar com

reprodutibilidade o processo proteolítico dependente de Ub-proteassoma.


Nada ainda se conhece sobre o controle, quais são as enzimas

responsáveis e os substratos que fazem parte do processo proteolítico residual.

A proteólise residual é aquela que permanece quando as três outras vias estão

bloqueadas. Assim sendo, corresponde à proteólise encontrada na pata 2 dos

protocolos descritos adiante.

PROTOCOLO 1 DA VIA DEPENDENTE DE UB-PROTEASSOMA



1 2


Glicose (5mM) + -



BCAA* + +

E64 (25µM); Leupeptina (50µM) + +

Dinitrofenol (0,5mM) - +



PROTOCOLO 2 DA VIA DEPENDENTE DE UB-PROTEASSOMA



1 2


Glicose (5mM) + +



BCAA* + +

E64 (25µM); Leupeptina (50µM) + +

MG132 (20µM) - +


3.4.8) Procedimento experimental para a avaliação da síntese total de proteínas

A síntese protéica foi determinada nos músculos soleus de animais

normais, diabéticos controles e diabéticos submetidos à simpatectomia

química; foram utilizados os períodos de 1 e 3 dias de diabetes. Os músculos

foram incubados com seus tendões fixos a suportes apropriados para

manutenção dos seus comprimentos de repouso, em tampão Krebs Ringer-

bicarbonato, contendo glicose (5 mM) e todos os vintes aminoácidos, em

concentrações semelhantes às encontradas no plasma de ratos, conforme

apresentadas na Tabela I.


Tabela I - Aminoácidos adicionados no meio de incubação (Scharff & Wool,

1966) para avaliação da velocidade de síntese protéica total.

Aminoácido

Concentração (mM)

Aminoácido Concentração

(mM)

Ác. aspártico 0,035 Isoleucina 0,100

Àc. glutâmico 0,174 Leucina 0,170

Alanina 0,450 Lisina 0,400

Arginina 0,200 Metionina 0,070

Asparagina 0,061 Prolina 0,180

Cisteína 0,070 Serina 0,280

Fenilalanina 0,500 Tirosina 0,100

Glicina 0,400 Treonina 0,300

Glutamina 0,350 Triptofano 0,070

Histidina 0,080 Valina 0,200

Uma vez que a tirosina também foi adicionada ao meio de incubação,

não foi possível usar o mesmo músculo para a avaliação de síntese e

degradação protéica simultaneamente, pois a proteólise foi estimada pela

medida da tirosina liberada e o método não tem sensibilidade para detectar

estas diferenças.


Após 1 hora de pré-incubação, o meio era substituído a cada 2 horas

por outro idêntico, permanecendo os músculos incubados por um período final

de 6 horas. Nas últimas 2 horas, os músculos eram incubados na presença de

tirosina marcada no 14C ([U-14C]Tyr; 0,05µCi/mL). Nestes experimentos

também foi verificado o efeito de 10-5M de adrenalina em músculos de animais

normais, diabéticos e diabéticos simpatectomizados, e os músculos foram

incubados na presença do hormônio durante um período total de 6 horas.

Em seguida, os músculos foram removidos de seus suportes e lavados

com água destilada fria, secos em papel de filtro e colocados em 2mL de TCA

10%. Após homogeneização e centrifugação a 1800g por 10 minutos, 1mL do

sobrenadante foi utilizado para a avaliação da tirosina livre total no músculo e

uma alíquota de 100µL usada na medida da radioatividade, para determinação

da atividade específica da tirosina de cada músculo separadamente.

Posteriormente o precipitado foi lavado 3 vezes com 2mL de TCA 10%. A

dissolução do precipitado final foi obtida pela adição de 1mL de dodecil sulfato

de sódio (SDS) 10%, a temperatura ambiente por 12 horas ou em banho-maria

a 40°C por 2 horas. A seguir, foram adicionados 10mL de coquetel de cintilação

para contagem da radioatividade em espectrômetro de cintilação líquida (TRI-

CARB 2100TR, Packard BioScience Company).


3.5) Estudo do papel da pentoxifilina no metabolismo de proteínas em músculo esquelético de ratos diabéticos 3.5.1) Modelo experimental: tratamento in vivo com pentoxifilina A pentoxifilina (PTX) foi diluída em água destilada MilliQ e foram

administradas injeções intraperitoniais diárias na concentração de 100mg/kg de

peso corporal por dia. O início do tratamento ocorreu na véspera da indução do

diabetes, continuando nos demais dias após a administração de STZ.

Assim, para os experimentos foram utilizados ratos diabéticos (3 dias

pós-STZ) e controles tratados com PTX por 4 dias. Após este tempo de

tratamento os animais foram sacrificados, o sangue coletado para

determinação dos níveis plasmáticos de TNF-α, os músculos EDL foram

retirados, pesados e posteriormente incubados para quantificação da atividade

proteolítica total, participação das diferentes vias de degradação de proteínas e

determinação da síntese protéica, tal como descrito anteriormente.

Nestes experimentos de investigação da atividade proteolítica total, da

participação das vias proteolíticas e avaliação da síntese protéica em músculos

EDL de ratos tratados com pentoxifilina (PTX), foram conduzidos quatro grupos

de animais: normal controle (NS), tratado com salina via intraperitonial; normal

PTX (NPTX), que recebeu as injeções diárias de PTX; diabético controle (DS),

tratado diariamente com salina; e diabético PTX (DPTX), grupo que recebeu

tratamento diário de PTX.

3.5.2) Efeito direto in vitro da pentoxifilina Para verificação de possível efeito direto da droga no metabolismo

protéico em EDL de ratos normais e diabéticos, PTX (10mM) foi adicionada ao

meio de incubação. Os grupos experimentais foram os mesmos daqueles

utilizados para estudo do tratamento in vivo com a droga, isto é, ratos normais

e diabéticos (3 dias pós-STZ), onde os músculos destes animais foram

incubados ou não na presença de PTX. Foram analisadas alterações ocorridas

na atividade proteolítica total e na participação das diferentes vias de

degradação de proteínas em EDL, tal como anteriormente descrito.


a) Efeito da insulina in vitro Para verificar o efeito da insulina na atividade proteolítica de músculos

incubados in vitro na presença de PTX, foram realizados experimentos de

avaliação da liberação de tirosina em músculos EDL de ratos normais e

diabéticos incubados na presença de 10mM de PTX e na ausência ou

presença de insulina (0,1U/mL) in vitro. No entanto, pelo fato da insulina

adicionada ao meio de incubação ser capaz de promover inibição da

participação do sistema proteolítico lisossomal, os experimentos foram

realizados a partir da investigação dos valores de tirosina relacionados à

proteólise basal, isto é, os músculos foram incubados na presença dos

inibidores do sistema proteolítico lisossomal, metilamina e BCAA (como

descrito anteriormente).

b) Efeito do H89 in vitro

Foram realizados experimentos para investigação do possível

envolvimento da proteína quinase dependente de AMPc (PKA) na ação in vitro

da PTX na proteólise muscular. Para isso, foram realizados experimentos de

incubação de músculos de animais normais e diabéticos na presença de 10mM

de PTX e na ausência ou presença de N-(2-[p-bromocinamilamino]-etil)-5-

isoquinolinesulfonamida. 2 HCl, droga também conhecida como H89 (50µM),

inibidor especifico da atividade da PKA.

3.5.3) Avaliação da ação da pentoxifilina in vivo e in vitro nas concentrações intracelulares de AMP cíclico (AMPc) em músculo esquelético de ratos normais e diabéticos

Para a realização destes experimentos, foram utilizados os mesmos

grupos experimentais descritos anteriormente para a investigação da ação da

PTX no metabolismo de proteínas em músculo EDL de ratos.

Após o período de tratamento com PTX ou após o período de incubação

com a droga, os músculos foram imediatamente removidos, embalados em

papel alumínio e congelados a -70oC. O processamento dos músculos para

posterior realização dos testes foi feito da seguinte maneira: os músculos foram


homogeneizados em TCA 6%, na proporção 5% peso/volume. As amostras

foram centrifugadas a 10000 rpm durante 15 minutos a 4oC. O sobrenadante foi

recolhido, lavado 2 vezes com 4mL de éter dietílico para remoção de resíduos

lipídicos. A fração aquosa foi separada e liofilizada para a determinação dos

níveis de AMPc. O extrato seco foi ressuspendido em 1000µL do tampão de

ensaio do teste.

Para a determinação dos níveis de AMPc nas amostras foi utilizado um

método imunoenzimático comercial da Amersham Biosciences (cAMP Biotrak

Enzymeimmunoassay EIA System - RPN225). Este método baseia-se em um

princípio imunoenzimático competitivo, onde os poços da placa para o teste

são tratados com anticorpo de cabra anti-IgG de coelho; este anticorpo IgG de

coelho reconhece especificamente o AMPc. O ensaio é baseado na

competição entre o AMPc da amostra tecidual e uma quantidade fixa de AMPc

marcado com peroxidase (oferecido pelo próprio kit). Desta maneira, a

quantidade de AMPc marcado ligado ao anticorpo anti-AMPc foi oposta à

concentração de AMPc da amostra desconhecida.

O complexo anti-IgG/anti-AMPc/AMPc-peroxidase pode ser quantificado

após a adição do substrato para a peroxidase [3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina

(TMB) e peróxido de hidrogênio], ocorrendo a formação de produto colorido

que pode ser quantificado em comprimento de onda de 630nm (coloração azul)

ou 450nm (após a adição de 1M de ácido sulfúrico, coloração amarela), em

espectrofotômetro para microplaca (leitor de ELISA). A sensibilidade do método

é na faixa de detecção de 12,5 a 3200 fmol de AMPc por poço. Os resultados

foram expressos em fmol de AMPc/mg de músculo.

3.5.4) Medida dos níveis plasmáticos de TNF-α (Fator de Necrose Tumoral

α) após tratamento com pentoxifilina

A determinação dos níveis plasmáticos de TNF-α em animais normais e

diabéticos tratados ou não com PTX foi realizada utilizando-se a metodologia

ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) tipo duplo ligante. Tais

experimentos foram realizados no Laboratório de responsabilidade do Prof. Dr.

Fernando Q. Cunha, no Departamento de Farmacologia desta faculdade.


A placa de ELISA de 96 poços para microtestes foi tratada com

100µL/poço com anticorpo específico em diluição de 2 µg/mL em tampão

próprio e incubada overnight a 4oC. Posteriormente, a placa foi lavada e

bloqueada para ligações não-específicas com albumina bovina sérica a 1%,

durante 120 minutos a 37oC. As amostras e os padrões foram adicionados à

placa. Uma curva-padrão de TNF-α recombinante de roedor foi utilizada para

calcular a concentração da citocina. A placa foi lavada em seguida e

adicionado anticorpo anti-TNF-α biotinilado. Após 1 hora foi adicionado em

cada poço o complexo avidina-peroxidase (diluição 1:5000), sendo permitida

reação durante 15 minutos. Após lavagem da placa foi colocado o substrato

(4mg de o-fenilenediamina diidrocloreto e 0,4µL de H2O2 em 1mL de tampão) e

a reação foi bloqueada após a adição de 1M de ácido sulfúrico. A densidade

óptica foi medida em scanner de ELISA (Spectra Max 250 - Molecular Device)

a 490nm. Os resultados foram expressos em pg de TNF-α/mL de plasma, após

comparação entre as densidades ópticas das amostras com a curva padrão.

3.5.5) Quantificação da m-calpaína e da calpastatina em músculos de ratos após tratamento com pentoxifilina

O presente trabalho investigou as alterações ocorridas na quantidade

das proteínas m-calpaína e calpastatina, componentes do sistema proteolítico

dependente de Ca2+, em músculos EDL de animais normais e diabéticos

tratados com PTX.

a) Eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS (SDS-PAGE)

Os músculos EDL de ratos dos diferentes grupos experimentais foram

homogeneizados em Politrom, em volume de tampão A (20mM de Tris, 5mM

de EDTA, pH 7,5 ajustado com 1M de HCl) na proporção de 20% peso/volume.

O homogenado foi centrifugado a 10000 rpm, 4oC, durante 20 minutos. O

sobrenadante foi utilizado para a quantificação de proteína e posteriormente

para a identificação dos níveis de m-calpaína e calpastatina. A parte do

sobrenadante utilizada para quantificação da m-calpaína foi liofilizada e

ressupendida no tampão da amostra (solução de dodecil sulfato de sódio


(SDS) 4%, 125mM de Tris-HCl, glicerol 20%, 100mM de DTT, azul de

bromofenol 2% e pH 6,8 ajustado com 1M de HCl). O volume do sobrenadante

utilizado para a determinação da calpastatina foi inicialmente fervido durante 10

minutos (desnaturação das calpaínas). Em seguida, as amostras foram

novamente centrifugadas a 13000 rpm, 4oC, durante 15 minutos e o

sobrenadante finalmente liofilizado e diluído no tampão da amostra.

A eletroforese em gel de SDS-PAGE foi realizada de acordo com o

método descrito por Laemmli (1970). As amostras foram aquecidas a 100oC

por 5 minutos e aplicadas em sistema de gel largo (modelo Protean II Cell -

BioRad) de acrilamida:bisacrilamida com 1,0 mm de espessura, gel de

separação variando de 7,5% (para a calpastatina) a 8% (para a m-calpaína).

Na lateral do gel foi aplicado padrão de peso molecular da Santa Cruz

Biotechnology (10-250 kDa). As corridas eletroforéticas foram realizadas em

cubas de acrílico contendo tampão de corrida (25mM de Tris-HCl pH 8,3,

115mM de glicina, SDS 0,1%), sob voltagem de 120 Volts, durante 1 hora e 30

minutos.

b) Western blot para detecção de m-calpaína e calpastatina

Após a corrida eletroforética, o gel foi preparado para a transferência

(BioRad Trans-Blot, Hemel Hempstead, U.K.) de acordo com o método descrito

por Towbin et al., 1979. Inicialmente, o gel foi colocado na solução de

transferência (25mM de Tris-HCl, 0,192M de glicina, 20% etanol absoluto, pH

8,3%) por cerca de 20 minutos. Após a montagem do sistema de transferência,

as proteínas presentes no gel de poliacrilamida foram transferidas para uma

membrana de nitrocelulose (NC), sendo o processo de transferência realizado

durante 3 horas sob voltagem fixa de 100 Volts, à temperatura ambiente. Após

o término da transferência, a membrana de NC foi submetida à immunoblot.

Para isto foi incubada por 40 minutos, sob agitação, à temperatura ambiente

com leite desnatado em pó 5%, diluído em TBS-T (0,02M de Tris-HCl, 0,16M

de NaCl, 0,1% Tween 20). Após o bloqueio, a membrana foi incubada overnight

a 4oC com anticorpos primários para detecção de m-calpaína (anticorpo de

cabra anti-calpaína de rato - Santa Cruz Biotecnology, USA) ou calpastatina


(anticorpo de cabra anti-calpastatina de rato - Santa Cruz Biotecnology, USA).

As diluições dos anticorpos primários foram realizadas em solução de TBS-T

contendo 2,5% de albumina bovina sérica e 0,01% de azida sódica e utilizadas

as seguintes razões dos anticorpos: 1:500 ou 1:1000, para detecção de m-

calpaina e calpastatina, respectivamente. O anticorpo foi então retirado e a

membrana devidamente lavada com solução de TBS-T, posteriormente

incubada durante 1 hora à temperatura ambiente, com o anticorpo secundário

anti-IgG ligado à peroxidase (anti-IgG de cabra, diluição de 1:10000 em leite

em pó 5%/TBS-T). Após lavagem das membranas para remoção do excesso

de anticorpo secundário não ligado, a membrana foi revelada com filme

autoradiográfico (Hyperfilm ECL), na ausência de luz, 20 minutos após a adição

de partes iguais dos reagentes do Kit de Quimioluminescência Amplificada

(ECL, Amersham). As bandas reveladas foram quantificadas por densitometria.

3.5.6) Trancrição reversa acoplada a PCR (RT-PCR) para determinação da expressão do RNAm da atrogin-1 (ou MAFbx)

A expressão do RNAm da atrogin-1 foi investigada em músculos EDL de

animais normais e diabéticos tratados in vivo com PTX através da utilização da

metodologia de RT-PCR descrita com maiores detalhes a seguir. Tais

experimentos foram realizados no Laboratório do Prof. Dr. Marcelo Damário

Gomes, no Departamento de Bioquímica e Imunologia desta faculdade.

a) Extração de RNA Os músculos EDL de ambas as patas de animais normais e diabéticos

foram retirados e seguido protocolo de extração de RNA pelo método do

Trizol™ (Invitrogen Life Technologies). Os tecidos foram homogeneizados em

solução de Trizol™ na proporção de 100mg tecido para 1mL Trizol™, sendo as

amostras incubadas por 10 minutos à temperatura ambiente. Para a separação

de ácidos nucléicos foi adicionado 200µL de clorofórmio, e após 15 segundos

de agitação vigorosa as amostras foram centrifugadas por 15 minutos a 12000g

à 4ºC. A fase superior aquosa (contendo RNA), foi coletada e em seguida

precipitada com 500 µL de álcool isopropílico, incubada por 10 minutos à


temperatura ambiente, e novamente centrifugada. Ao final, os precipitados

foram lavados duas vezes com etanol 75% e solubilizados em 50µL de H2O

DEPC (água destilada tratada com dietil-pirocarbonato 0,01% e autoclavada).

b) Quantificação da amostra de RNA

As amostras foram quantificadas por densidade óptica (A) em

espectrofotômetro (260nm), e a qualidade da extração foi verificada pela

relação A260/A280. As amostras de RNA foram conservadas em freezer -80oC

para posterior utilização nas reações de transcrição reversa.

c) Produção de cDNA - Transcrição Reversa (RT)

As reações de transcrição reversa foram realizadas para obtenção de

cDNAs, utilizando 2µg de RNA total na presença de 50ng de primer oligo(dT) e

ImProm-IITM Reverse Transcriptase (Promega), seguindo as condições padrão

do fabricante. As condições usadas no termociclador modelo PTC 100 (MJ

Research) foram: 5 minutos à 70ºC, seguindo-se da adição da enzima

transcriptase reversa e 60 minutos à 42ºC e 15 minutos à 70ºC para inativação

da enzima.

O conteúdo de RNAm da proteína β-actina de camundongo foi utilizado

como controle para verificação da quantificação dos RNAs purificados. Os

primers foram gentilmente cedidos pelo Prof. Dr. Cláudio M. da Costa-Neto, do

Departamento de Bioquímica e Imunologia desta faculdade.

Como controle da pureza do RNA extraído, foi feito um controle

negativo, em que não foi adicionada a enzima transcriptase reversa, com o

objetivo de identificarmos a presença de DNA genômico na amostra. Nenhuma

banda foi observada nesta amostra nas PCRs para os três genes analisados.


d) PCR semi-quantitativa

- primers utilizados

A seqüência dos primers foi obtida a partir da seqüência gênica

depositada no GenBank para atrogin-1 e β-actina (Tabela II).

TABELA II - Seqüências dos primers utilizados para as reações de RT-PCR.

Gene Seqüência Produto

atrogin-1 Sense: TGAAGACCGGCTACTGTGGAAGAGAC

Antisense: TTGGGGTGAAAGTGAGACGGAGCAG 486 bp

β-actina Sense: CTAAGGCCAACCGTGAAAAGA

Antisense: ATTGCCGATAGTGATGACCTG 422 bp

- amplificação do cDNA gerado por transcrição reversa Reações de PCR com volume final de 25µL foram realizadas utilizando

uma concentração final de 0,1µM de cada primer (Sense e Antisense), 1,5mM

MgCl2, 1X tampão NH4+, 200µM de cada dNTP, 10% DMSO, 2 unidades de Taq

Polimerase Pht (Promega) e 1-2 µL de cDNA, o volume final foi completado

com ddH2O. O programa utilizado no termociclador PTC100 (MJ Research) foi

de 94ºC por 5 minutos, seguido de 25 ciclos de 94ºC por 30 segundos, 47ºC

por 1 minuto e 72ºC por 1,5 minutos, finalizando com uma etapa de 10 minutos

a 72ºC. Metade do volume do produto final das reações foi aplicado em gel de

agarose (1.5%), corado com brometo de etídio e visualizado em transluminador

UV, após eletroforese em tampão TBE 1X e voltagem de 100V.

e) Densitometria

Os géis foram foto-documentados e o arquivo “.jpg” foi aberto no

software Image J (http://rsb.info.nih.gov/ij/) para análise de densitometria. A

partir dos valores das áreas de cada banda, foi calculada a razão entre a


expressão de atrogin-1 e de β-actina. Os resultados foram expressos de acordo

com os níveis de expressão diferencial de atrogin-1 nas diferentes amostras. f) PCR quantitativa

A expressão do RNAm da atrogin-1 também foi analisada em amostras

de EDL de ratos normais e diabéticos tratados in vivo com PTX através da

metodologia de RT-PCR quantitativa, sendo os procedimentos descritos a

seguir.

Após a extração e quantificação do RNA das amostras tal como descrito

anteriormente, foi adicionado a 2µg de RNA total o primer de oligo(dT)12-18

(20pmols, Invitrogen Life Technologies) em volume total de 5µL e a mistura foi

preparada em água DEPC.

O RNA e o primer foram aquecidos a 70oC durante 5 minutos e

posteriormente colocados em gelo. Os seguintes reagentes foram então

adicionados: 4µL de 5X tampão de reação (Promega), 1µL de mistura de

deoxinucleosídeo trifosfato (dNTP, 10mM de cada), 6,6µL de água DEPC,

2,4µL de MgCl2 e 1µL de recombinante ImProm-IITM Reverse T. A mistura foi

incubada a 25oC durante 5 minutos para anelamento e depois a 42oC para

polimerização. A síntese do cDNA foi interrompida por aquecimento da mistura

de reação a 70oC por 15 minutos.

Os cDNAs foram posteriormente submetidos ao real-time PCR

utilizando-se Platinum® SYBR® Green qPCR Supermix UDG (Invitrogen) com

as seguintes seqüências de primers:

ciclofilina B sense - 5'-AAGGACTTCATGATCCAGGG-3'

ciclofilina B antisense - 5'-TGACATCCTTCAGTGGCTTG-3'

atrogin-1 sense - 5'- TGAAGACCGGCTACTGTGGAAGAGAC-3'

atrogin-1 antisense - 5'- TTGGGGTGAAAGTGAGACGGAGCAG-3'

Os resultados foram coletados em sistema de detecção Perkin-Elmer

ABI Prism 7000 com os seguintes parâmetros: 50oC (2 minutos), 95oC (2

minutos), 40 ciclos de 95oC (15 segundos), 57oC (30 segundos), 60oC (30

segundos), seguido pelo ciclo de dissociação para verificação de um produto

através de análise pela curva melting.


Para a análise do RNAm, o nível relativo da expressão do gene foi calculado

em referência à expressão da ciclofilina B na amostra, utilizando-se o método

do ciclo threshold (Ct). Nenhuma amplificação foi observada quando o real-time

PCR foi realizado sem o passo da transcriptase reversa, demonstrando que os

produtos atrogin-1/ciclofilina B não são resultantes de contaminação por DNA.

3.5.7) Utilização da técnica de microdiálise para avaliação da ação da pentoxifilina in vivo e in situ no metabolismo de proteínas em músculo esquelético de ratos adultos normais e diabéticos

Foram utilizados cateteres de microdiálise do tipo linear, manualmente

confeccionados: uma membrana de diálise semi-permeável (Cuprophane,

18mm de comprimento por 0,3mm de diâmetro, 3kDa de limite de

permeabilidade) foi colada em ambas as extremidades a tubos de polietileno

PE-10 (comprimento padrão de 50mm).

No dia do experimento, os animais foram anestesiados com tiopental

sódico (50mg/kg peso corporal, i.p.), traqueostomizados com cateter de

polietileno PE-240 (Becton Dickinson, Nova Jersey, EUA) e mantidos em

mesas cirúrgicas aquecedoras (Insight®) sob temperatura constante de 37oC. O

cateter de microdiálise foi inserido longitudinalmente no músculo tibialis anterior

e perfundido a um fluxo constante de 1µL/min com a solução de perfusão

(solução de NaCl 0,9% contendo 50µM de tirosina, albumina bovina 0,5% e

0,05mmol/L de 14C-tirosina ≈ 2500 DPM). Os primeiros 30 minutos de perfusão

ficaram estabelecidos como período de equilíbrio e os 90 minutos posteriores

foram considerados para a coleta das amostras de dialisado.

Após este período, a cavidade abdominal dos animais foi aberta e a

aorta exposta para coleta de sangue arterial. O sangue foi imediatamente

centrifugado, sendo o plasma separado e desproteinizado com ácido perclórico

(PCA) 1N. O plasma desproteinizado era utilizado para a determinação da

concentração de tirosina e do fator de recuperação do cateter.

O dialisado foi coletado diretamente em Eppendorfs estéreis. Após o

período de 90 minutos de coleta, o dialisado era devidamente mantido à -20oC

em solução de ácido tricloroacético (TCA) 5%. As concentrações de tirosina no


dialisado (50µL), na solução de perfusão (50µL) e no plasma (100µL) foram

determinadas de acordo com método fluorimétrico de Waalkes & Udenfriend

(1957).

Para a realização destes experimentos, foram utilizados ratos adultos de

peso entre 220 e 250g. O mesmo procedimento descrito para os experimentos

de indução de diabetes em animais jovens foi aqui utilizado para a obtenção

dos grupos normais e diabéticos. No entanto, a droga utilizada para a

instalação do diabetes foi a aloxana (ALX), na dose de 45mg/kg peso corporal.

Os experimentos foram realizados 3 dias após a administração de ALX. Foram

verificados os efeitos: a) do tratamento de ratos normais e diabéticos durante 4

dias com PTX (100mg/kg peso, i.p.), sendo o tratamento iniciado no dia anterior

à instalação do quadro diabético. Assim, foi estudado o efeito do tratamento in

vivo da PTX no metabolismo de proteínas na musculatura esquelética de ratos

adultos; b) da adição de 10mM de PTX no meio de perfusão, sendo o

experimento realizado com animais normais e diabéticos perfundidos ou não

com a droga, para verificação de seu efeito direto in situ no metabolismo

protéico muscular.

3.6) Análise estatística Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média

(EPM) ou como médias percentuais ± EPM dos grupos diabéticos em relação

ao normal controle (considerado como 100%). Para a análise estatística dos

resultados entre os grupos foi empregado o teste t de Student e níveis de

significância de 0,05 (5%) e 0,01 (1%).

3.7) Reagentes Os reagentes utilizados nos diferentes experimentos foram obtidos dos

laboratórios Sigma Chemicals, Calbiochem EMD Biosciences, Amershan

Biosciences, Santa Cruz Biotechnology, Roche, Merck, New England Nuclear,

Pierce Co, Peptides International, Alexis Biochemicals, Promega e Invitrogen

Life Technologies.

Resultados

Resultados 43

4) Resultados Estudo do papel do sistema nervoso simpático no metabolismo de proteínas em músculo esquelético de ratos diabéticos 4.1) Modelo Experimental: simpatectomia química através da administração de guanetidina

Após os primeiros minutos da primeira administração de guanetidina

em ratos diabéticos, ocorriam algumas mudanças comportamentais nos

animais, tais como imobilidade na caixa e aumento da freqüência cardíaca.

Além disso, depois de alguns minutos, estes animais apresentavam uma

ingestão líquida adicional àquela observada no quadro diabético e diminuição

da ingestão alimentar neste dia. O aumento transitório da ingestão hídrica não

foi observado nos animais ao receberem a segunda injeção da droga; a

ingestão alimentar também era normalizada após o segundo dia de tratamento.

Além disso, algumas horas após a administração de guanetidina, os animais

apresentavam ptose bilateral, característica esta mantida até o final do

experimento. Estas alterações eram semelhantes às observadas nos animais

normais que recebiam 1 ou 2 injeções de guanetidina (Navegantes et al.,

1999).

A diminuição da ingestão alimentar após a primeira injeção de

guanetidina não comprometeu os experimentos realizados com animais no

tempo de 1 dia pós-STZ, uma vez que eles se alimentaram durante todo o

período da tarde, após a administração da droga diabetogênica (no período da

manhã), e recebiam a única dose de guanetidina no final do dia. Além disso,

antes da remoção dos tecidos, era realizada prévia confirmação da presença

de alimento no estômago dos animais pertencentes ao grupo diabético

guanetidina. Assim, qualquer resultado obtido nos experimentos com animais

após 1 dia de diabetes seria conseqüência da simpatectomia e não de uma

possível diminuição da ingestão alimentar.

Resultados 44

4.1.1) Efeito da simpatectomia química no peso corporal Os resultados de peso corporal (g) dos grupos normal, diabético salina

e diabético guanetidina após 1, 3 e 5 dias de diabetes estão apresentados,

respectivamente, nas Figuras 1, 2 e 3.

Como pode ser analisado nestas figuras, os grupos iniciam o

tratamento com valores de peso corporal diferentes entre si, para que

alcancem no dia do sacrifício um peso aproximado de 70g. Isto pode ser

justificado pelos diferentes perfis de crescimento corporal observado nos

grupos. Os animais pertencentes aos grupos diabéticos apresentam uma

tendência à manutenção do peso corporal quando da administração de STZ, ou

então pequeno ganho ponderal em relação a este dia. Para o tratamento com

guanetidina, no entanto, eram selecionados os ratos maiores, uma vez que

estes animais diabéticos tinham uma queda significativa do peso corporal após

a primeira injeção da droga simpatolítica, sendo este peso mantido até o dia do

experimento. Assim, ambos os grupos de ratos diabéticos (salina e

guanetidina) apresentavam valores de peso corporal semelhantes no dia do

sacrifício. Já os animais normais, embora iniciassem o tratamento com valores

de peso inferiores em relação aos grupos diabéticos, apresentavam um ganho

ponderal diário de aproximadamente 7g, atingindo no dia do experimento

valores de peso corporal próximos aos animais diabéticos.

Na Figura 1 encontram-se os valores de peso corporal obtidos em

típico experimento realizado após 1 dia de diabetes. Todos os grupos

apresentaram um ganho ponderal de aproximadamente 7g no período da tarde,

em relação à manhã do mesmo dia; isto se deve ao fato dos animais terem

sido submetidos a um período de jejum de cerca de 14 horas antes do

momento da indução do diabetes, permitindo-se livre acesso à comida após 1

hora aproximadamente à administração da droga. Porém, no dia seguinte (1

dia pós-STZ), era observado nos animais diabéticos uma perda de peso

corporal, tendendo aos valores ponderais da manhã da indução do diabetes. Já

os animais normais continuavam com ganho de peso corporal. Mesmo sendo

selecionados os maiores animais para o tratamento com guanetidina, o grupo

diabético simpatectomizado apresentou uma perda de peso ainda maior em

Resultados 45

relação ao grupo diabético salina (queda de 10g no grupo tratado em

comparação a 4g no grupo não tratado).

Nos experimentos realizados após 3 e 5 dias de diabetes (Figuras 2 e

3, respectivamente), os animais normais apresentaram um constante ganho

ponderal. Já no grupo diabético salina pode ser observado manutenção ou

discreto aumento de peso corporal em relação ao peso no dia da administração

de STZ. Foi observada perda de peso (7 a 9g) nos animais diabéticos

simpatectomizados após a primeira injeção de guanetidina, com tendência à

manutenção deste peso até o dia do experimento.

4.1.2) Efeito da simpatectomia química na concentração plasmática de glicose

Na Figura 4 estão apresentados os valores médios de glicemia

(mg/dL) dos animais pertencentes aos grupos normal, diabético salina e

diabético guanetidina, obtidos após 1, 3 e 5 dias de deficiência insulínica.

Houve um aumento significativo nos valores glicêmicos dos animais

tratados com STZ, em relação aos animais normais, confirmando-se assim a

instalação do diabetes. Não ocorreram flutuações nos valores de glicemia

durante os diferentes tempos de diabetes utilizados. A simpatectomia química

não acarretou em alterações adicionais nos valores glicêmicos, em qualquer

período estudado. Também a administração de guanetidina não altera a

glicemia de animais normais (Navegantes et al., 1999).

Resultados 46

FIGURA 1: Peso corporal (g) de ratos diabéticos tratados com guanetidina (100

mg/kg.dia, s.c.), um dia após a administração de estreptozotocina (STZ). Os

resultados são expressos como média ± EPM de 7 a 9 animais por grupo.

65

70

75

80

85

90

induçãodiabetes(manhã)

guanetidinaou salina

(tarde)

dia doexperimento

(1 dia pós-STZ)

normal diabético salina diabético guanetidina

peso

cor

pora

l(g

)

Resultados 47


mg/kg.dia, s.c.), três dias após a administração de estreptozotocina (STZ). Os

resultados são expressos como média ± EPM de 7 a 9 animais por grupo.

60

65

70

75

80

85

90

dia doexperimento

(3 dias pós-STZ)

guanetidinaou

salina(2 dias pós-STZ)

guanetidinaou

salina(1 dia pós-STZ)

induçãodiabetes


peso

cor

pora

l(g

)

Resultados 48


mg/kg.dia, s.c.), cinco dias após a administração de estreptozotocina (STZ).

Os resultados são expressos como média ± EPM de 7 a 9 animais por grupo.

As linhas pontilhadas e a quebra no eixo x significam o período inicial de

diabetes onde os animais não receberam tratamento com guanetidina ou

salina.

55

60

65

70

75

80

85

90

dia doexperimento

(5 dias pós-STZ)

guanetidinaou


guanetidinaou


induçãodiabetes


peso

cor

pora

l(g

)

Resultados 49

FIGURA 4: Glicemia (mg/dL) de ratos diabéticos tratados com guanetidina (100

mg/kg.dia, s.c.), 1, 3 e 5 dias após a administração de STZ. Os resultados são

expressos como média ± EPM de 7 a 9 animais por grupo. ∗∗ p<0,01 D x N;

## p<0,01 DG x N.

0 1 2 3 4 5 60

100

200

300

400

500

600

###### ******

glic

emia

(mg/

dL)

dias pós-STZ


Resultados 50

4.1.3) Efeito da simpatectomia química na concentração das catecolaminas plasmáticas e musculares

A comprovação da simpatectomia foi feita através da quantificação das

catecolaminas plasmáticas e musculares nos três grupos de animais, N, D e

DG.

Na Figura 5 e Tabela 1 encontram-se os valores de adrenalina

plasmática (ng/mL) após a administração de guanetidina, nos diferentes

tempos de diabetes estudados. Não foram encontradas diferenças nas

concentrações de adrenalina no plasma de animais diabéticos em relação aos

animais normais, em qualquer período de diabetes estudado. Ocorreu uma

redução significativa na concentração de adrenalina no plasma de animais

diabéticos tratados com guanetidina (queda de 51 a 70% em relação aos

animais do grupo diabético salina). A administração de guanetidina em ratos

normais leva à idêntica redução dos níveis plasmáticos de adrenalina

observada nos animais diabéticos, de cerca de 50 a 70% (Navegantes et al.,

1999).

Resultados 51

FIGURA 5: Concentrações plasmáticas de adrenalina (ng/mL) de ratos

diabéticos e diabéticos tratados com guanetidina (100 mg/kg.dia, s.c.), 1, 3 e 5

dias após a administração de STZ. Os resultados são expressos como média ±

EPM de 7 a 9 animais por grupo. ## p<0,01 DG x N; φφ p<0,01 DG x D.

0 1 2 3 4 5 60

2

4

6

8

10

12

14

16

18

##φφ##

φφ

##φφ

adre

nalin

a pl

asm

átic

a(n

g/m

L)

dias pós-STZ


52R

esultados

TABELA 1: Concentração plasmática de adrenalina em ratos normais controles, diabéticos

controles e diabéticos tratados com guanetidina (100 mg/kg.dia, s.c.) em diferentes períodos de

diabetes.

Adrenalina plasmática

(ng/mL)

normal controle (N)

diabético salina (D)

diabético guanetidina (DG)

Dias pós-STZ

Diferença (%)

D x N DG x D

1

13,18 ± 1,03 (12)

14,56 ± 1,13

(13)

6,32 ± 0,89

(7) ns - 57 **

3

13,60 ± 0,95 (14)

13,04 ± 0,82

(14)

3,91 ± 0,31

(8) ns - 70 **

5

10,83 ± 0,51 (11)

9,34 ± 0,51

(16)

4,54 ± 0,63

(7) ns - 51 **

Os valores representam a média ± EPM. O valor entre parênteses expressa o número de animais utilizados. ns: não significativo; ** p< 0,01 na comparação entre os grupos.

Resultados

53

Os valores de noradrenalina em músculos soleus (ng/g) estão

apresentados na Tabela 2 e Figura 6, após 1, 3 e 5 dias de indução do quadro

diabético e tratamento com guanetidina. Como pode ser observado, houve um

aumento significativo nas concentrações de noradrenalina em músculos soleus

de animais diabéticos em relação aos normais. Um dia após a instalação do

quadro diabético ocorreu elevação de 26% nas concentrações da catecolamina

em soleus de ratos diabéticos em comparação aos controles. Esta elevação

tende a ser progressiva, atingindo um aumento de 83% quando a mesma

comparação é feita após 5 dias de diabetes. O tratamento com guanetidina foi

eficaz em promover a simpatectomia química nos animais diabéticos, levando à

queda de 97, 83 e 91% nos valores de noradrenalina em soleus, 1, 3 e 5 dias

após a administração de STZ, respectivamente.

A Tabela 3 e Figura 7 apresentam os valores de noradrenalina em

músculos EDL de ratos após a simpatectomia química nos diferentes tempos

de diabetes estudados. O mesmo perfil de resposta foi observado para ambos

os músculos: houve um aumento progressivo nas concentrações de

noradrenalina em EDL de animais diabéticos em relação aos normais (de 21 a

97% de elevação), sendo o tratamento com guanetidina efetivo na redução

destes valores, após 1, 3 e 5 dias de diabetes (queda de 97, 87 e 78%,

respectivamente).

A administração de guanetidina em ratos normais reduz drasticamente

(quase 100%) a concentração muscular de noradrenalina, tanto em soleus

quanto em EDL. Desta maneira foi comprovada a eficácia na indução da

simpatectomia.

Resultados

54

soleus

FIGURA 6: Concentração de noradrenalina (ng/g) em músculos soleus de ratos



EPM de 7 a 9 músculos por grupo. ∗ p<0,05 D x N; ∗∗ p<0,01 D x N;

## p<0,01 DG x N; φφ p<0,01 DG x D.

0 1 2 3 4 5 60

30

60

90

120

150

180

210 **

##φφ

##φφ

***

##φφ

nora

dren

alin

a so

leus

(ng/

g)

dias pós-STZ


55R

esultados

TABELA 2: Concentração de noradrenalina em músculos soleus de ratos normais controles,

diabéticos controles e diabéticos tratados com guanetidina (100 mg/kg.dia, s.c.) em diferentes

períodos de diabetes.

Noradrenalina muscular (soleus)

(ng/g)

normal controle (N)



Dias pós-STZ

Diferença (%)

D x N DG x D

1

102,0 ± 6,26 (6)

129,0 ± 8,43

(5)

4,00 ± 2,01

(8) + 26 * - 97 **

3

110,9 ± 7,16 (12)

141,7 ± 5,47

(13)

24,19 ± 1,76

(6) + 28 ** - 83 **

5

108,0 ± 5,79 (12)

197,9 ± 10,83

(17)

17,45 ± 6,61

(7) + 83 ** - 91 **

Os valores representam a média ± EPM. O valor entre parênteses expressa o número de animais utilizados. ns: não significativo; * p<0,05 e ** p< 0,01 na comparação entre os grupos.

Resultados

56

EDL

FIGURA 7: Concentração de noradrenalina (ng/g) em músculos EDL de ratos



EPM de 7 a 9 músculos por grupo. ∗ p<0,05 D x N; ∗∗ p<0,01 D x N;

## p<0,01 DG x N; φφ p<0,01 DG x D.

0 1 2 3 4 5 60

50

100

150

200

250

*

****

##φφ##

φφ##φφ

nora

dren

alin

a ED

L(n

g/g)

dias pós-STZ


57R

esultados

TABELA 3: Concentração de noradrenalina em músculos EDL de ratos normais controles,

diabéticos controles e diabéticos tratados com guanetidina (100 mg/kg.dia, s.c.) em diferentes

períodos de diabetes.

Noradrenalina muscular (EDL)

(ng/g)

normal controle (N)



Dias pós-STZ

Diferença (%)

D x N DG x D

1

124,8 ± 5,34 (6)

151,0 ± 9,50

(6)

5,10 ± 1,33

(8) + 21 * - 97 **

3

132,7 ± 6,51 (12)

196,3 ± 10,06

(13)

25,64 ± 4,62

(6) + 48 ** - 87 **

5

115,6 ± 4,07 (13)

227,5 ± 13,05

(18)

49,02 ± 4,16

(8) + 97 ** - 78 **

Os valores representam a média ± EPM. O valor entre parênteses expressa o número de animais utilizados. ns: não significativo; * p<0,05 e ** p< 0,01 na comparação entre os grupos.

Resultados

58

4.1.4) Efeito do diabetes na velocidade de renovação de noradrenalina muscular

Uma vez que foi encontrado um aumento progressivo no conteúdo de

noradrenalina em músculos soleus e EDL de animais após a instalação do

diabetes em comparação aos animais normais controles, tornou-se

interessante investigar a atividade do sistema nervoso simpático para estes

tecidos, através da medida da velocidade de renovação de noradrenalina após

administração de um inibidor de sua síntese.

O declínio na concentração de noradrenalina (NOR) nos músculos

soleus e EDL de ratos normais e diabéticos (1 e 3 dias pós-STZ) estão

apresentados nas Figuras 8 e 9, respectivamente. O declínio da concentração

de NOR apresentou-se reduzido em músculos soleus e EDL de animais

diabéticos em comparação aos controles, nos dois períodos de diabetes

estudados.

A Tabela 4 apresenta os valores da concentração de NOR no tempo 0,

da velocidade de renovação fracional (k), da velocidade de renovação de NOR

(VR) e do t1/2 em soleus e EDL de animais normais e diabéticos após

administração de α-metil-tirosina. Como descrito anteriormente, o conteúdo de

NOR no tempo 0 foi significativamente maior em ambos os músculos de

animais com 1 e 3 dias de diabetes em comparação aos controles. Os valores

de k e de VR em soleus e EDL de animais diabéticos apresentaram-se

significativamente menores em relação aos mesmos valores em animais

normais, indicando ocorrer uma menor atividade simpática em músculos de

animais com deficiência insulínica. A instalação do diabetes promoveu uma

elevação nos valores de t1/2 em ambos os músculos dos ratos.

Resultados

59

soleus

FIGURA 8: Concentração de noradrenalina em músculos soleus de animais

normais e diabéticos (1 e 3 dias pós-STZ) após a administração de α-metil-

tirosina. Cada ponto representa a média e o erro padrão de 6-8 animais.

0 6 12

37

46

5555

78

102

125

148148

nora

dren

alin

a so

leus

(ng/

g) t1/2 = 18,33h

1 DIA PÓS-STZ

horas após α-MT

diabético

t1/2 = 9,09h

normal

0 6 12

46

5555

78

102

125

148148

t1/2 = 18,33h

horas após α-MT

nora

dren

alin

a so

leus

(ng/

g)

3 DIAS PÓS-STZ

diabético

t1/2 = 10,21h

normal

Resultados

60

EDL

FIGURA 9: Concentração de noradrenalina em músculos EDL de animais

normais e diabéticos (1 e 3 dias pós-STZ) após a administração de α-metil-

tirosina. Cada ponto representa a média e o erro padrão de 6-8 animais.

t1/2 = 7,83h

normal

0 6 12

37

46

5555

78

102

125

148148

t1/2 = 20,32h

1 DIA PÓS-STZ

horas após α-MT

nora

dren

alin

a E

DL

(ng/

g) diabético

0 6 12

46

5555

78

102

125

148148

212

horas após α-MT

t1/2 = 17,72h

3 DIAS PÓS-STZ

diabético

nora

dren

alin

a E

DL

(ng/

g)

t1/2 = 8,09h

normal

Resultados

61

TABELA 4: Conteúdo de Noradrenalina (NOR), velocidade de renovação fracional (k)

e velocidade de renovação de noradrenalina (VR) em músculos soleus e EDL de

ratos normais e diabéticos (1 e 3 dias pós-STZ).

1 dia pós-STZ

3 dias pós-STZ

NOR (ng/g) k (%/h) VR (ng/g.h) t1/2

soleus

normal 102,0 ± 6,26 7,62 ± 0,36 7,77 (6,95-8,64) 9,09

diabético 129,0 ± 8,43 3,78 ± 0,29 4,88 (4,21-5,59) 18,33

EDL

normal 124,8 ± 5,34 8,85 ± 0,11 11,04 (10,44-11,65) 7,83

diabético 151,0 ± 9,5 3,41 ± 0,32 5,15 (4,37-5,99) 20,32

NOR (ng/g) k (%/h) VR (ng/g.h) t1/2

soleus

normal 110,9 ± 7,16 6,79 ± 0,23 7,53 (6,81-8,29) 10,21

diabético 141,7 ± 5,47 3,78 ± 1,33 5,36 (3,34-7,52) 18,33

EDL

normal 132,7 ± 6,51 8,57 ± 0,46 11,37 (10,23-12,57) 8,09

diabético 196,3 ± 10,06 3,91 ± 0,77 7,67 (5,85-9,66) 17,72

Resultados

62

4.1.5) Efeito da simpatectomia química na proteólise total e na participação das vias proteolíticas de soleus e EDL de ratos em diferentes períodos de diabetes

Sabendo-se que as catecolaminas exercem um papel anti-proteolítico

no metabolismo de proteínas da musculatura esquelética de ratos normais, o

presente trabalho investigou o papel do sistema nervoso simpático no

metabolismo protéico muscular frente a uma situação catabólica, caracterizada

pelo diabetes. Estes estudos avaliaram assim o efeito da simpatectomia

química na proteólise total de músculos soleus e EDL de ratos após 1, 3 e 5

dias de diabetes; além disso, foram estudadas as alterações ocorridas nas

atividades das vias proteolíticas lisossomal, dependente de cálcio, dependente

de Ub-proteassoma e residual nestas mesmas condições.

a) Proteólise total em soleus e EDL de ratos diabéticos simpatectomizados

Na Figura 10 estão apresentados os valores de proteólise total

(expressos como percentuais médios em relação aos animais controles

normais, considerados como 100%) de soleus de animais diabéticos controles

e simpatectomizados, nos diferentes períodos de diabetes estudados.

Podemos verificar que o perfil de resposta da proteólise total de soleus de

ratos diabéticos reproduziu resultados anteriormente obtidos no laboratório

(Pepato et al, 1996): houve um aumento de aproximadamente 14% na

degradação de proteínas neste músculo após 1 dia de diabetes; no entanto,

estes valores aproximaram-se daqueles obtidos no grupo normal quando os

animais encontravam-se no 3o dia de deficiência insulínica. Já os valores de

proteólise total em soleus de ratos após 5 dias de diabetes apresentaram-se

significativamente menores que os normais (queda de 24%).

O tratamento com guanetidina acarretou em aumento de 33% e 15%

na degradação de proteínas de soleus de animais após 1 e 3 dias de diabetes,

respectivamente, em comparação aos animais diabéticos controles. Já os

valores de proteólise total de animais com 5 dias de deficiência insulínica e

Resultados

63

soleus

FIGURA 10: Efeito da simpatectomia química na proteólise total em músculos

soleus de ratos diabéticos tratados com salina ou guanetidina (100 mg/kg.dia,

s.c.), 1, 3 e 5 dias após a administração de STZ. Os resultados são expressos

como médias percentuais ± EPM dos grupos diabéticos em relação ao grupo

normal controle (considerado como 100%). Os valores foram obtidos de 7 a 9

músculos por grupo e representam um experimento típico, que foi repetido pelo

menos 2 vezes, tendo sido obtidos resultados semelhantes. ∗ p<0,05 D x N;

∗∗ p<0,01 D x N; # p<0,05 DG x N; ## p<0,01 DG x N; φ p<0,05 DG x D;

φφ p<0,01 DG x D.

1 2 3 4 570

80

90

100

110

120

130

140

150

160

*

**

##

# φ

##φφ

prot

eólis

e to

tal

(% d

os c

ontro

les)

dias pós-STZ

diabético salina diabético guanetidina

Resultados

64

tratados com guanetidina foram semelhantes aos observados em músculos de

ratos só diabéticos, embora ambos menores que os valores controles. A falta

das catecolaminas neste período de diabetes não interferiu na resposta

proteolítica como foi observado nos períodos mais agudos de deficiência

insulínica.

Os valores de proteólise total obtidos em músculos EDL de ratos

diabéticos simpatectomizados encontram-se na Figura 11. Foi observado um

aumento nos valores de proteólise total em EDL de animais 1 e 3 dias pós-STZ

(elevação de 27% e 51%, respectivamente), quando comparados com o grupo

normal. Os níveis de degradação de proteínas em EDL de ratos com 5 dias de

diabetes foram próximos daqueles obtidos com os animais normais. Estes

resultados foram semelhantes aos já observados no laboratório por Pepato e

colaboradores (1996).

Em animais diabéticos simpatectomizados, houve uma elevação

adicional (17% em relação ao grupo diabético salina) na degradação protéica

no músculo EDL após 1 dia de diabetes. Nos demais tempos a simpatectomia

química não acarretou em alterações significativas nos valores de proteólise

total de músculos EDL além daquelas já observadas nos ratos diabéticos.

b) Participação das vias proteolíticas em soleus e EDL de ratos diabéticos simpatectomizados

Com a demonstração das alterações ocorridas na proteólise total em

músculos soleus e EDL de ratos diabéticos submetidos à simpatectomia

química, o presente trabalho passou a investigar qual(is) via(s) proteolítica(s)

estaria(m) contribuindo para estas respostas. Assim, foram estudadas as

participações das vias proteolíticas lisossomal, dependente de cálcio,

dependente de Ub-proteassoma e residual em soleus e EDL de animais com 1,

3 e 5 dias de diabetes submetidos à simpatectomia pelo tratamento com

guanetidina.

Resultados

65

EDL

FIGURA 11: Efeito da simpatectomia química na proteólise total em músculos

EDL de ratos diabéticos tratados com salina ou guanetidina (100 mg/kg.dia,

s.c.), 1, 3 e 5 dias após a administração de STZ. Os resultados são expressos

como médias percentuais ± EPM dos grupos diabéticos em relação ao grupo

normal controle (considerado como 100%). Os valores foram obtidos de 7 a 9


menos 2 vezes, tendo sido obtidos resultados semelhantes. ∗∗ p<0,01 D x N;

## p<0,01 DG x N; φ p<0,05 DG x D.

1 2 3 4 5

80

90

100

110

120

130

140

150

160

170

180

**

**##

##φ

prot

eólis

e to

tal

(% d

os c

ontro

les)

dias pós-STZ


Resultados

66

- Via Lisossomal A Figura 12 mostra os valores médios percentuais em relação ao

grupo normal da participação da via lisossomal em soleus de animais

diabéticos controle e tratados com guanetidina, 1, 3 e 5 dias após a

administração de STZ. A instalação do quadro diabético não promoveu

alterações na contribuição desta via neste músculo, em comparação aos

animais normais, assim como o obtido em trabalhos anteriores do laboratório

(Pepato et al., 1996). Porém, o tratamento de animais diabéticos com

guanetidina levou a uma mudança na participação da via lisossomal em soleus:

houve aumento de 48% e 96% nos valores desta via em ratos com 1 e 3 dias

de diabetes, respectivamente, após a simpatectomia. O tratamento com

guanetidina não acarretou em alterações nesta via em soleus de animais com 5

dias de deficiência insulínica.

A participação da via lisossomal em EDL de ratos diabéticos

submetidos à simpatectomia química encontra-se na Figura 13. As respostas

obtidas em músculos ricos em fibras do tipo II foram diferentes daquelas

obtidas em músculos de fibras do tipo I: tanto a instalação do quadro diabético

quanto o tratamento dos animais com guanetidina não levaram a alterações na

participação da via lisossomal em EDL, em nenhum período de diabetes

estudado, em relação aos animais controles.

Nas Tabelas 5, 6 e 7 estão sumarizados os valores médios da

contribuição da via lisossomal nos grupos normal, diabético salina e diabético

guanetidina 1, 3 e 5 dias pós-STZ, respectivamente. Os valores médios da

proteólise total em soleus e EDL podem ser avaliados pelos resultados obtidos

com a ausência de inibidores da via, representados na tabelas pelo sinal (-).

Resultados

67

soleus

FIGURA 12: Participação da via lisossomal em músculos soleus de ratos

diabéticos tratados com salina ou guanetidina (100 mg/kg.dia, s.c.), 1, 3 e 5

dias após a administração de STZ. Os resultados são expressos como médias

percentuais ± EPM da participação da via nos grupos diabéticos em relação ao

grupo normal controle (considerado como 100%). Os valores foram obtidos de

7 a 9 músculos por grupo e representam um experimento típico, que foi

repetido pelo menos 2 vezes, tendo sido obtidos resultados semelhantes.

## p<0,01 DG x N; φ p<0,05 DG x D; φφ p<0,01 DG x D.

0 1 2 3 4 5 6

0

25

50

75

100

125

150

175

200 ##φ

##φφ

via

lisos

som

al(%

dos

con

trole

s)

dias pós-STZ


Resultados

68

EDL FIGURA 13: Participação da via lisossomal em músculos EDL de ratos

diabéticos tratados com salina ou guanetidina (100 mg/kg.dia, s.c.), 1, 3 e 5

dias após a administração de STZ. Os resultados são expressos como médias

percentuais ± EPM da participação da via nos grupos diabéticos em relação ao

grupo normal controle (considerado como 100%). Os valores foram obtidos de

7 a 9 músculos por grupo e representam um experimento típico, que foi

repetido pelo menos 2 vezes, tendo sido obtidos resultados semelhantes.

0 1 2 3 4 5 60

25

50

75

100

125

150

via

lisos

som

al(%

dos

con

trole

s)

dias pós-STZ


69R

esultados TABELA 5: Tirosina liberada no meio (nmol/mg.2h) pelos músculos soleus e EDL de ratos normais controles, diabéticos

controles e diabéticos tratados, 1 dia pós-STZ e 10 horas após a administração de guanetidina (100 mg/kg.dia, s.c.).

Avaliação da proteólise total e da participação da via proteolítica lisossomal.

Adição Tirosina liberada (nmol/mg.2h)

BCAA e metilamina normal controle (N)



Diferença (%)

soleus

D x N DG x D

(-) 0,302 ± 0,012 0,345 ± 0,011 0,457 ± 0,012 + 14 * + 33 ** (+) 0,227 ± 0,010 0,259 ± 0,009 0,330 ± 0,011 + 14 * + 27 **

componente lisossomal 0,075 ± 0,011 # 0,086 ± 0,013 # 0,127 ± 0,008 # ns + 48 *

EDL

D x N DG x D

(-) 0,192 ± 0,010 0,244 ± 0,010 0,286 ± 0,010 + 27 ** + 17 * (+) 0,113 ± 0,004 0,157 ± 0,009 0,205 ± 0,005 + 39 ** + 31 **

componente lisossomal 0,079 ± 0,007 # 0,087 ± 0,006 # 0,081 ± 0,008 # ns ns

Os valores representam a média ± EPM de 7 a 9 músculos. ns: não significativo; * p< 0,05 e ** p< 0,01 na comparação entre os grupos. # p< 0,05 em relação à ausência dos inibidores da via.

70R

esultados

TABELA 6: Tirosina liberada no meio (nmol/mg.2h) pelos músculos soleus e EDL de ratos normais controles, diabéticos

controles e diabéticos tratados, 3 dias pós-STZ e 2 dias após a administração de guanetidina (100 mg/kg.dia, s.c.).

Avaliação da proteólise total e da participação da via proteolítica lisossomal.





Diferença (%)

soleus

D x N DG x D

(-) 0,364 ± 0,016 0,358 ± 0,015 0,411 ± 0,014 ns + 15 * (+) 0,307 ± 0,012 0,307 ± 0,010 0,311 ± 0,010 ns ns

componente lisossomal 0,057 ± 0,009 # 0,051 ± 0,005 # 0,100 ± 0,007 # ns + 96 **

EDL

D x N DG x D

(-) 0,203 ± 0,012 0,306 ± 0,019 0,282 ± 0,012 + 51 ** ns (+) 0,133 ± 0,009 0,221 ± 0,007 0,203 ± 0,006 + 66 ** ns



71R

esultados

TABELA 7: Tirosina liberada no meio (nmol/mg.2h) pelos músculos soleus e EDL de ratos normais controles,

diabéticos controles e diabéticos tratados, 5 dias pós-STZ e 2 dias após a administração de guanetidina (100

mg/kg.dia, s.c.). Avaliação da proteólise total e da participação da via proteolítica lisossomal.




diabético guanetidina(DG)

Diferença (%)

soleus

D x N DG x D

(-) 0,344 ± 0,009 0,260 ± 0,009 0,290 ± 0,012 - 24 ** ns (+) 0,270 ± 0,010 0,182 ± 0,006 0,196 ± 0,007 - 33 ** ns


EDL

D x N DG x D

(-) 0,253 ± 0,009 0,235 ± 0,006 0,264 ± 0,013 ns ns (+) 0,184 ± 0,007 0,152 ± 0,005 0,179 ± 0,007 ns ns


Os valores representam a média ± EPM de 7 a 9 músculos. ns: não significativo; ** p< 0,01 na comparação entre os grupos. # p< 0,05 em relação à ausência dos inibidores da via.

Resultados

72

- Via Dependente de Cálcio Na Figura 14 encontram-se os valores médios percentuais (em relação

ao grupo normal) da contribuição da via dependente de cálcio em soleus obtidos

de ratos pertencentes aos grupos diabéticos salina e guanetidina. Os resultados

mostram aumento na participação desta via em soleus de animais com 1 dia de

diabetes (elevação de aproximadamente 81% em relação ao grupo normal); após

3 dias da indução do diabetes, a participação da via dependente de cálcio foi da

mesma magnitude da observada no grupo normal. Já com 5 dias de diabetes

houve queda (48%) na contribuição do processo dependente de cálcio em soleus,

em relação aos animais normais. Estes resultados corroboram dados

anteriormente obtidos em nosso laboratório por Pepato et al. (1996).

A simpatectomia química realizada em animais diabéticos (com a

redução das catecolaminas musculares e plasmáticas) promoveu alteração na

participação do processo dependente de cálcio em soleus de ratos apenas com

3 dias de diabetes: foi observada uma queda surpreendente de 72% nos

valores desta via quando os grupos diabético salina e diabético guanetidina

foram comparados. Nos demais tempos estudados o tratamento com

guanetidina não acarretou em modificações neste processo proteolítico.

São apresentados na Figura 15 os valores da participação da via

dependente de cálcio em músculos EDL de ratos diabéticos submetidos à

simpatectomia, 1, 3 e 5 dias pós-STZ. Tal como era esperado, a contribuição

desta via em EDL de ratos diabéticos estava aumentada nos tempos de 1 e 3

dias de diabetes, em comparação aos ratos normais (66% e 93%,

respectivamente), sem diferenças entre os mesmos grupos após 5 dias de

deficiência insulínica.

O tratamento com guanetidina levou a uma resposta bifásica na

participação da via dependente de cálcio em EDL de animais diabéticos: a

simpatectomia promoveu aumento de 49% nos valores desta via em EDL de

animais com 1 dia de diabetes e, posteriormente, levou a uma queda 3 dias

pós-STZ (41%, aproximadamente). Não foram encontradas diferenças na

contribuição do processo proteolítico dependente de cálcio quando os grupos

Resultados

73

soleus FIGURA 14: Participação da via dependente de cálcio em músculos soleus

de ratos diabéticos tratados com salina ou guanetidina (100 mg/kg.dia, s.c.), 1,

3 e 5 dias após a administração de STZ. Os resultados são expressos como

médias percentuais ± EPM da participação da via nos grupos diabéticos em

relação ao grupo normal controle (considerado como 100%). Os valores foram

obtidos de 7 a 9 músculos por grupo e representam um experimento típico, que

foi repetido pelo menos 2 vezes, tendo sido obtidos resultados semelhantes.

∗∗ p<0,01 D x N; # p<0,05 DG x N; ## p<0,01 DG x N; φφ p<0,01 DG x D.

0 1 2 3 4 5 60

50

100

150

200

250

**

**#

####φφ

via

depe

nden

te d

e cá

lcio

(% d

os c

ontro

les)

dias pós-STZ


Resultados

74

EDL

FIGURA 15: Participação da via dependente de cálcio em músculos EDL de

ratos diabéticos tratados com salina ou guanetidina (100 mg/kg.dia, s.c.), 1, 3 e

5 dias após a administração de STZ. Os resultados são expressos como

médias percentuais ± EPM da participação da via nos grupos diabéticos em

relação ao grupo normal controle (considerado como 100%). Os valores foram


foi repetido pelo menos 2 vezes, tendo sido obtidos resultados semelhantes.

∗ p<0,05 D x N; ∗∗ p<0,01 D x N; ## p<0,01 DG x N; φ p<0,05 DG x D;

φφ p<0,01 DG x D.

0 1 2 3 4 5 60

50

100

150

200

250

*

**

φ

##φφ

via

depe

nden

te d

e cá

lcio

(% d

os c

ontro

les)

dias pós-STZ


75R

esultados


diabéticos controles e diabéticos tratados, 1 dia pós-STZ e 10 horas após a administração de guanetidina (100

mg/kg.dia, s.c.). Avaliação da participação da via proteolítica dependente de Ca2+.

Tirosina liberada (nmol/mg.2h)

manutenção do comprimento de repouso

normal controle (N)



Diferença (%)

soleus

D x N DG x D

(-) 0,265 ± 0,009 0,310 ± 0,008 0,373 ± 0,015 + 17 ** + 20 ** (+) 0,239 ± 0,008 0,263 ± 0,008 0,324 ± 0,010 + 11 * + 23 **

componente dep. cálcio 0,026 ± 0,002 # 0,047 ± 0,005 # 0,049 ± 0,008 # + 81 ** ns

EDL

D x N DG x D

(-) 0,212 ± 0,005 0,295 ± 0,015 0,400 ± 0,016 + 39 ** + 36 ** (+) 0,139 ± 0,004 0,174 ± 0,007 0,220 ± 0,008 + 25 ** + 26 **

componente dep. cálcio 0,073 ± 0,009 # 0,121 ± 0,011 # 0,180 ± 0,007 # + 66 * +49 **

Os valores representam a média ± EPM de 7 a 9 músculos. ns: não significativo; * p< 0,05 e ** p< 0,01 na comparação entre os grupos. # p< 0,05 em relação à manutenção do comprimento de repouso.

76R

esultados


controles e diabéticos tratados, 3 dias pós-STZ e 2 dias após a administração de guanetidina (100 mg/kg.dia, s.c.).

Avaliação da participação da via proteolítica dependente de Ca2+.



normal controle (N)



Diferença (%)

soleus

D x N DG x D

(-) 0,392 ± 0,033 0,352 ± 0,030 0,323 ± 0,011 ns ns (+) 0,294 ± 0,012 0,256 ± 0,012 0,296 ± 0,009 ns + 16 *

componente dep. cálcio 0,098 ± 0,013 # 0,096 ± 0,012 # 0,027 ± 0,010 # ns - 72 **

EDL

D x N DG x D

(-) 0,249 ± 0,007 0,352 ± 0,018 0,338 ± 0,010 + 41 ** ns (+) 0,173 ± 0,010 0,205 ± 0,008 0,252 ± 0,011 + 18 * + 23 *

componente dep. cálcio 0,076 ± 0,009 # 0,147 ± 0,016 # 0,086 ± 0,016 # + 93 ** - 41 *


77R

esultados


diabéticos controles e diabéticos tratados, 5 dias pós-STZ e 2 dias após a administração de guanetidina (100

mg/kg.dia, s.c.). Avaliação da participação da via proteolítica dependente de Ca2+.



normal controle (N)



Diferença (%)

soleus

D x N DG x D

(-) 0,325 ± 0,010 0,270 ± 0,010 0,263 ± 0,010 - 17 ** ns (+) 0,271 ± 0,010 0,242 ± 0,009 0,233 ± 0,008 - 11 * ns

componente dep. cálcio 0,054 ± 0,005 # 0,028 ± 0,003 # 0,030 ± 0,003 # - 48 * ns

EDL

D x N DG x D

(-) 0,264 ± 0,016 0,283 ± 0,024 0,273 ± 0,013 ns ns (+) 0,195 ± 0,008 0,219 ± 0,012 0,214 ± 0,009 ns ns

componente dep. cálcio 0,069 ± 0,009 # 0,064 ± 0,016 # 0,059 ± 0,009 # ns ns


Resultados

78

diabético salina e diabético guanetidina foram comparados após 5 dias da

injeção da droga diabetogênica.

Os valores médios da participação da via dependente de cálcio nos

grupos normal, diabético salina e diabético guanetidina 1, 3 e 5 dias pós-STZ

estão apresentados, respectivamente, nas Tabelas 8, 9 e 10, com as

diferenças percentuais observadas na contribuição desta via em soleus e EDL

entre os referidos grupos.

- Via Dependente de Ub-proteassoma e Via Residual

Na Figura 16 estão apresentados os valores da participação da via

dependente de Ub-proteassoma expressos como percentuais médios em

relação aos animais normais (considerados como 100%) de soleus de animais

diabéticos controles e simpatectomizados, 1, 3 e 5 dias após a administração

de STZ. Como era esperado, não ocorreu alteração na contribuição desta via

em soleus de ratos após 1 e 3 dias de diabetes, quando comparados aos

resultados obtidos com o grupo normal. Após 5 dias de deficiência insulínica,

no entanto, pôde ser observada uma queda de aproximadamente 24% nos

valores da via dependente de Ub-proteassoma em relação aos controles,

corroborando dados de Pepato et al. (1996).

A simpatectomia química acarretou em um aumento de cerca de 27%

na participação da via dependente de Ub-proteassoma em músculos soleus de

animais após 1 dia de diabetes, quando comparados ao grupo diabético tratado

com salina e ao grupo normal. Nos demais tempos estudados o tratamento

com guanetidina não acarretou em modificações neste processo proteolítico,

além daqueles já observados no quadro diabético.

A Figura 17 apresenta os valores da participação da via dependente

de Ub-proteassoma em músculos EDL de ratos com 1, 3 e 5 dias de diabetes e

submetidos à simpatectomia. Não existem alterações na participação desta via

em EDL de ratos com 1 dia de diabetes em comparação aos normais. Após 3

dias de deficiência insulínica houve aumento (48%) na contribuição da via

dependente de Ub-proteassoma neste músculo, não existindo diferenças

Resultados

79

soleus

FIGURA 16: Participação da via dependente de Ub-proteassoma em

músculos soleus de ratos diabéticos tratados com salina ou guanetidina (100


expressos como médias percentuais ± EPM da participação da via nos grupos

diabéticos em relação ao grupo normal controle (considerado como 100%). Os

valores foram obtidos de 7 a 9 músculos por grupo e representam um

experimento típico, que foi repetido pelo menos 2 vezes, tendo sido obtidos

resultados semelhantes. ∗∗ p<0,01 D x N; # p<0,05 DG x N; ## p<0,01 DG x N;

φφ p<0,01 DG x D.

0 1 2 3 4 5 60

20

40

60

80

100

120

140

160

** ##

##φφ

via

depe

nden

te d

e Ub

-pro

teas

som

a(%

dos

con

trole

s)

dias pós-STZ


Resultados

80

EDL

FIGURA 17: Participação da via dependente de Ub-proteassoma em

músculos EDL de ratos diabéticos tratados com salina ou guanetidina (100


expressos como médias percentuais ± EPM da participação da via nos grupos

diabéticos em relação ao grupo normal controle (considerado como 100%). Os



resultados semelhantes. ∗ p<0,05 D x N; ## p<0,01 DG x N; φφ p<0,01 DG x D.

0 1 2 3 4 5 60

25

50

75

100

125

150

175

200

* ##

##φφ

via

depe

nden

te d

e Ub

-pro

teas

som

a(%

dos

con

trole

s)

dias pós-STZ


Resultados

81

entre os mesmos grupos quando a via foi analisada em EDL de ratos com 5

dias de diabetes. Estes resultados foram semelhantes aos de Pepato et al.

(1996).

O tratamento com guanetidina levou ao mesmo perfil de resposta

observado em soleus. Com a diminuição das catecolaminas (muscular e

plasmática), ocorreu aumento de 53% na contribuição da via dependente de

Ub-proteassoma em EDL de animais com 1 dia de diabetes. Entretanto

nenhuma diferença foi observada quando os grupos diabético salina e diabético

guanetidina foram comparados 3 e 5 dias após a administração de STZ.

Nas Tabelas 11, 12 e 13 estão apresentados os valores médios da

contribuição das vias dependente de Ub-proteassoma e residual nos grupos

normal, diabético salina e diabético guanetidina 1, 3 e 5 dias pós-STZ,

respectivamente. O tratamento com guanetidina não promoveu alterações na

participação da via residual, tanto em soleus quanto em EDL dos animais nos

diferentes tempos de diabetes estudados.

Em seguida apresentamos nas Figuras 18 (soleus) e 19 (EDL) um

resumo da participação das 3 principais vias proteolíticas em músculos de ratos

diabéticos controles e simpatectomizados. Acrescentamos também para

comparação dados obtidos de ratos que foram tratados apenas com

guanetidina (durante 1 e 2 dias) antes do sacrifício (Navegantes et al., 1999).

82R

esultados


controles e diabéticos tratados, 1 dia pós-STZ e 10 horas após a administração de guanetidina (100 mg/kg.dia, s.c.).

Avaliação da participação da via proteolítica dependente de Ub-proteassoma e da via residual.


DNP glicose normal controle (N)



Diferença (%)

soleus

D x N DG x D

(-) (+) 0,191 ± 0,008 0,200 ± 0,006 0,237 ± 0,007 ns + 19 ** (+) (-) 0,088 ± 0,009 0,079 ± 0,004 0,083 ± 0,002 ns ns

componente dep. Ub-proteassoma 0,103 ± 0,008 # 0,121 ± 0,006 # 0,154 ± 0,007 # ns + 27 **

EDL

D x N DG x D

(-) (+) 0,100 ± 0,005 0,110 ± 0,003 0,148 ± 0,004 ns + 34 ** (+) (-) 0,046 ± 0,004 0,050 ± 0,002 0,056 ± 0,003 ns ns

componente dep. Ub-proteassoma 0,054 ± 0,005 # 0,060 ± 0,002 # 0,092 ± 0,003 # ns + 53 **

Os valores representam a média ± EPM de 7 a 9 músculos. ns: não significativo; ** p< 0,01 na comparação entre os grupos. # p< 0,05 em relação ao basal.

83R

esultados


controles e diabéticos tratados, 3 dias pós-STZ e 2 dias após a administração de guanetidina (100 mg/kg.dia, s.c.). Avaliação

da participação da via proteolítica dependente de Ub-proteassoma e da via residual.





Diferença (%)

soleus

D x N DG x D

(-) (+) 0,209 ± 0,006 0,224 ± 0,012 0,228 ± 0,010 ns ns (+) (-) 0,079 ± 0,004 0,081 ± 0,003 0,082 ± 0,003 ns ns

componente dep. Ub-proteassoma 0,130 ± 0,007 # 0,143 ± 0,012 # 0,146 ± 0,011 # ns ns

EDL

D x N DG x D

(-) (+) 0,129 ± 0,007 0,166 ± 0,010 0,170 ± 0,013 + 29 ** ns (+) (-) 0,071 ± 0,004 0,080 ± 0,005 0,083 ± 0,006 ns ns

componente dep. Ub-proteassoma 0,058 ± 0,004 # 0,086 ± 0,008 # 0,087 ± 0,007 # + 48 * ns

Os valores representam a média ± EPM de 7 a 9 músculos. ns: não significativo; * p< 0,05 e ** p< 0,01 na comparação entre os grupos. # p< 0,05 em relação ao basal.

84R

esultados


controles e diabéticos tratados, 5 dias pós-STZ e 2 dias após a administração de guanetidina (100 mg/kg.dia, s.c.). Avaliação

da participação da via proteolítica dependente de Ub-proteassoma e da via residual.





Diferença (%)

soleus

D x N DG x D

(-) (+) 0,224 ± 0,009 0,176 ± 0,007 0,177 ± 0,010 - 21 ** ns (+) (-) 0,098 ± 0,005 0,080 ± 0,006 0,081 ± 0,005 - 18 ** ns

componente dep. Ub-proteassoma 0,126 ± 0,005 # 0,096 ± 0,003 # 0,096 ± 0,005 # - 24 * ns

EDL

D x N DG x D

(-) (+) 0,146 ± 0,004 0,153 ± 0,020 0,160 ± 0,006 ns ns (+) (-) 0,081 ± 0,006 0,085 ± 0,010 0,088 ± 0,007 ns ns

componente dep. Ub-proteassoma 0,065 ± 0,007 # 0,068 ± 0,009 # 0,072 ± 0,003 # ns ns

Os valores representam a média ± EPM de 7 a 9 músculos. ns: não significativo; * p< 0,05 e ** p< 0,01 na comparação entre os grupos. # p< 0,05 em relação ao basal.

Resultados

85

FIGURA 18: Vias proteolíticas lisossomal (A), dependente de cálcio (B) e dependente de Ub-

proteassoma (C) em músculos soleus de ratos diabéticos e diabéticos tratados com

guanetidina (100 mg/kg.dia, s.c.), 1, 3 e 5 dias após a administração de STZ. Os resultados são

expressos como médias percentuais ± EPM dos grupos relação ao grupo normal controle

(considerado como 100%). Os valores foram obtidos de 7 a 9 músculos por grupo e

representam um experimento típico, que foi repetido pelo menos 2 vezes, tendo sido obtidos

resultados semelhantes. γ p<0,05 NG x N; γ γ p<0,01 NG x N; * p<0,05 D x N; ** p<0,01 D x N;

# p<0,05 DG x N; ## p<0,01 DG x N; φ p<0,05 DG x D; φφ p<0,01 DG x D.

soleus

0

50

100

150

1 3 5 dias pós-STZ

##**

##φφ

γ

via

dep.

Ub-

prot

eass

oma

(% d

os c

ontr

oles

)

50

100

150

200

250

γγγ

##**##φφ

#

**

via

dep.

cál

cio

(% d

os c

ontro

les)

50

100

150

200##φφ##

φ

via

lisos

som

al(%

dos

con

trole

s)

normal guanetidina diabético salina diabético guanetidina

A

B

C

Resultados

86


proteassoma (C) em músculos EDL de ratos diabéticos e diabéticos tratados com guanetidina

(100 mg/kg.dia, s.c.), 1, 3 e 5 dias após a administração de STZ. Os resultados são expressos

como médias percentuais ± EPM dos grupos em relação ao grupo normal controle

(considerado como 100%). Os valores foram obtidos de 7 a 9 músculos por grupo e

representam um experimento típico, que foi repetido pelo menos 2 vezes, tendo sido obtidos

resultados semelhantes. . g p<0,05 NG x N; g g p<0,01 NG x N; * p<0,05 D x N; ** p<0,01 D x

N; # p<0,05 DG x N; ## p<0,01 DG x N; φ p<0,05 DG x D; φφ p<0,01 DG x D.

EDL

0

50

100

150

200

1 3 5 dias pós-STZ

##*

##φφ

γγ

via

dep.

Ub-

prot

eass

oma

(% d

os c

ontro

les)

50

100

150

200

250

φ

**

##φφ

*

via

dep.

cál

cio

(% d

os c

ontro

les)

50

100

150

via

lisos

som

al(%

dos

con

trole

s)

normal guanetidina diabético salina diabético guanetidina

A

B

C

Resultados

87

4.1.6) Velocidade da síntese de proteínas em soleus de ratos diabéticos simpatectomizados na ausência ou presença de adrenalina in vitro

Após a verificação do papel das catecolaminas na proteólise total e na

atividade das vias proteolíticas em músculos soleus e EDL de ratos diabéticos,

o presente trabalho passou a investigar as alterações ocorridas na velocidade

de síntese protéica em soleus de animais diabéticos (1 e 3 dias pós-STZ)

simpatectomizados. Também foi verificado o efeito da adição de 10-5M de

adrenalina in vitro na síntese de proteínas destes mesmos músculos.

Os valores da velocidade de síntese protéica em soleus de animais

normais, diabéticos controles e diabéticos simpatectomizados (1 dia pós-STZ)

incubados na ausência ou na presença de adrenalina encontram-se na Figura

20. Tal como era esperado, ocorreu uma redução de aproximadamente 31% na

velocidade de síntese protéica em soleus de animais com 1 dia de diabetes em

comparação aos valores obtidos com o grupo normal. A simpatectomia

promoveu uma redução adicional nos valores de síntese protéica em soleus de

animais diabéticos (15% em comparação ao grupo diabético controle). A adição

de adrenalina ao meio de incubação não causou modificações na síntese de

proteínas nos músculos de ratos normais, sendo este resultado já observado

anteriormente (Navegantes et al., 2004). A presença de adrenalina também

não promoveu alterações adicionais na velocidade de síntese protéica em

soleus de animais diabéticos controles ou diabéticos simpatectomizados, 1 dia

após a administração de STZ.

A Figura 21 apresenta os valores de síntese protéica obtidos em soleus

de animais normais, diabéticos controles e diabéticos simpatectomizados,

incubados na ausência ou presença de adrenalina, 3 dias após a indução de

diabetes. A instalação do diabetes promoveu uma queda na velocidade de

síntese protéica em soleus em relação aos valores obtidos no grupo normal

(redução de aproximadamente 36%). Não ocorreram alterações adicionais na

síntese protéica em músculos de animais diabéticos simpatectomizados em

comparação aos diabéticos controles. A presença de adrenalina no meio de

incubação não causou modificações na velocidade de síntese de proteínas em

Resultados

88

soleus de animais normais e diabéticos; no entanto, foi observado um aumento

de 22% na velocidade de síntese protéica em músculos de animais diabéticos

(3 dias pós-STZ) simpatectomizados incubados na presença de adrenalina em

comparação aos mesmos músculos incubados na ausência do hormônio.

Resultados

89

FIGURA 20: Efeito da simpatectomia química e da adrenalina (10-5M) na

síntese protéica em músculos soleus de ratos diabéticos e diabéticos tratados

com guanetidina (100 mg/kg.dia, s.c.), 1 dia após a administração de STZ. Os

resultados são expressos como médias ± EPM dos grupos experimentais. Os



resultados semelhantes. ∗∗ p<0,01 D x N ou Dadr x N; φ p<0,05 DG x D ou

DGadr x D.

0,00

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

**φ

****φ

**

sínt

ese

prot

éica

(nm

ol T

yr/m

g.2h

)

normal normal + ADR diabético diabético + ADR diabético guanetidina diabético guanetidina + ADR

Resultados

90

FIGURA 21: Efeito da simpatectomia química e da adrenalina (10-5M) na

síntese protéica em músculos soleus de ratos diabéticos e diabéticos tratados

com guanetidina (100 mg/kg.dia, s.c.), 3 dias após a administração de STZ. Os




resultados semelhantes. ∗∗ p<0,01 D x N ou Dadr x N; ω p<0,05 DGadr x DG.

0,00

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

ω

****

sínt

ese

prot

éica

(nm

ol T

yr/m

g.2h

)

normal normal + ADR diabético diabético + ADR diabético guanetidina diabético guanetidina + ADR

Resultados

91

Estudo do papel da pentoxifilina no metabolismo de proteínas em músculo esquelético de ratos diabéticos 4.2) Modelo experimental: Estudo das ações in vivo da pentoxifilina em músculo esquelético de ratos normais e diabéticos 4.2.1) Níveis intracelulares de AMPc

Os valores intracelulares de AMPc em músculos de animais normais e

diabéticos tratados ou não com PTX encontram-se na Figura 22. Como pode ser

observado, não existem diferenças nas concentrações intracelulares de AMPc

entre músculos de animais normais e diabéticos controles, isto é, na ausência do

tratamento com PTX. Não ocorreram diferenças nos valores deste nucleotídeo

cíclico em músculos de ratos normais tratados durante 4 dias com PTX quando

comparados ao grupo não tratado. No entanto, ocorreu um aumento de 22% nos

níveis de AMPc em músculos de animais diabéticos tratados com PTX em

relação ao grupo diabético não tratado.

4.2.2) Proteólise total

Na Figura 23 e Tabela 14 estão apresentados os valores médios da

proteólise total de músculos EDL de animais normais e diabéticos, controles e

tratados durante 4 dias com PTX. O perfil de resposta da proteólise total de

EDL de ratos diabéticos reproduziu resultados previamente obtidos no

laboratório: ocorreu um aumento de aproximadamente 60% na degradação de

proteínas neste músculo após 3 dias de diabetes. O tratamento com PTX

promoveu uma queda significativa de 17% nos valores de proteólise total em

EDL de animais no 3o dia de deficiência insulínica.

Na Tabela 14 encontram-se os valores médios da proteólise total em

EDL, que correspondem aos resultados obtidos na ausência de inibidores da

via (BCAA e metilamina), representados na tabela pelo sinal (-).

Resultados

92

FIGURA 22: Efeito do tratamento com pentoxifilina (100 mg/kg.dia, i.p.) nas

concentrações intracelulares de AMPc em músculos EDL de ratos normais e

diabéticos. Os resultados são expressos como médias ± EPM dos grupos

experimentais. Os valores foram obtidos de 7 a 9 músculos por grupo e

representam um experimento típico, que foi repetido pelo menos 2 vezes, tendo

sido obtidos resultados semelhantes. # p<0,05 DPTX x D.

300

400

500

600

700 #

cont

eúdo

de

AMPc

(fmol

/mg

mús

culo

)

normal normal + PTX (in vivo) diabético diabético + PTX (in vivo)

Resultados

93

FIGURA 23: Efeito do tratamento com pentoxifilina (100 mg/kg.dia, i.p.) na

proteólise total em músculos EDL de ratos normais e diabéticos. Os




resultados semelhantes. ∗∗ p<0,01 D x N; # p<0,05 DPTX x D.

0.00

0.08

0.16

0.24

0.32

0.40

0.48

**

#

tiros

ina

liber

ada

(nm

ol T

yr/m

g.2h

)

Proteólise total


Resultados

94

4.2.3) Participação das vias proteolíticas Como o tratamento com PTX levou a alterações na proteólise total em

músculos EDL de ratos diabéticos, o presente trabalho passou a investigar

qual(is) via(s) proteolítica(s) estaria(m) contribuindo para estas respostas.

Assim, foram estudadas as participações das vias proteolíticas lisossomal,

dependente de cálcio, dependente de Ub-proteassoma e residual nos músculos

destes animais.

- Via Lisossomal

A Figura 24 e a Tabela 14 apresentam os valores médios da

participação da via lisossomal em EDL de animais normais e diabéticos

controles e tratados com PTX. Como pode ser observado, o quadro diabético

não promoveu alterações significativas na atividade desta via neste músculo,

em comparação aos animais normais. O tratamento destes animais durante 4

dias com PTX também não promoveu modificações na participação desta via

proteolítica em nenhum dos grupos estudados.

- Via Dependente de Cálcio

São apresentados na Figura 25 e na Tabela 15 os valores de tirosina

liberada de músculos EDL de ratos normais e diabéticos submetidos ao

tratamento com PTX. Tais medidas permitem a avaliação da participação da

via proteolítica dependente de cálcio. Tal como era esperado, a contribuição

deste processo proteolítico em EDL de ratos diabéticos está aumentada

(aproximadamente 175%) após 3 dias de diabetes, em comparação aos ratos

normais. A administração de PTX durante 4 dias aos animais normais não

promoveu alterações na atividade da via dependente de cálcio em EDL quando

comparados aos controles tratados com salina; contudo, o tratamento com PTX

acarretou uma queda de cerca de 47% na participação desta via em EDL de

ratos diabéticos em relação aos animais diabéticos controles.

Resultados

95

FIGURA 24: Efeito do tratamento com pentoxifilina (100 mg/kg.dia, i.p.) na via lisossomal em músculos EDL de ratos normais e diabéticos. Os resultados

são expressos como médias ± EPM dos grupos experimentais. Os valores

foram obtidos de 7 a 9 músculos por grupo e representam um experimento

típico, que foi repetido pelo menos 2 vezes, tendo sido obtidos resultados

semelhantes.

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

Via lisossomal

tiros

ina

liber

ada

(nm

ol T

yr/m

g.2h

)


96R

esultados

TABELA 14: Proteólise total e participação da via proteolítica lisossomal em músculos EDL de

ratos normais e diabéticos controles e tratados com pentoxifilina.


BCAA e metilamina

normal salina (NS)

normal PTX

(NPTX)

diabético salina (DS)

diabético PTX

(DPTX)

Diferença (%)

EDL

DS x NS DPTX x DS

(-) 0,245 ± 0,013 0,241 ± 0,011 0,391 ± 0,016 0,326 ± 0,018 + 60 ** - 17 *

(+) 0,184 ± 0,010 0,172 ± 0,013 0,306 ± 0,009 0,240 ± 0,011 + 66 ** - 21 *

componente lisossomal

0,061 ± 0,014 # 0,069 ± 0,013 # 0,085 ± 0,020 # 0,086 ± 0,008 # ns ns


Resultados

97

FIGURA 25: Efeito do tratamento com pentoxifilina (100 mg/kg.dia, i.p.) na via dependente de cálcio em músculos EDL de ratos normais e diabéticos. Os




resultados semelhantes. ∗∗ p<0,01 D x N; ## p<0,01 DPTX x D.

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

0.14

0.16

Via dependente de cálcio


tiros

ina

liber

ada

(nm

ol T

yr/m

g.2h

)

**

##

98R

esultados

TABELA 15: Participação da via proteolítica dependente de Ca2+ em músculos EDL de ratos

normais e diabéticos controles e tratados com pentoxifilina.


manutenção comprimento de repouso

normal salina (NS)

normal PTX

(NPTX)


diabético PTX

(DPTX)

Diferença (%)

EDL

DS x NS DPTX x DS

(-) 0,224 ± 0,007 0,226 ± 0,021 0,342 ± 0,011 0,305 ± 0,010 + 53 ** - 11 *

(+) 0,175 ± 0,008 0,183 ± 0,010 0,207 ± 0,008 0,233 ± 0,020 + 18 * ns

componente dep. cálcio

0,049 ± 0,003 # 0,043 ± 0,011 # 0,135 ± 0,008 # 0,072 ± 0,007 # + 175 ** - 47 **


Resultados

99

- Via Dependente de Ub-Proteassoma e Via Residual Os valores da participação da via proteolítica dependente de Ub-

proteassoma em músculos EDL de ratos diabéticos e tratados com PTX

encontram-se na Figura 26 e Tabela 16. Após 3 dias da injeção de STZ,

ocorreu aumento de 97% na atividade da via dependente de Ub-proteassoma

neste músculo, sendo este resultado semelhante ao encontrado por Pepato et

al. (1996). O tratamento com PTX não levou a alterações na participação desta

via em EDL de animais normais, mas acarretou em queda de 23% na atividade

da via dependente de Ub-proteassoma neste mesmo músculo de ratos

diabéticos, quando comparada aos valores obtidos no grupo diabético controle.

Na Tabela 16 estão apresentados os valores médios da contribuição

da via residual nos grupos normal e diabético, tratados ou não com PTX, os

quais correspondem aos valores de tirosina liberada na presença de MG132

(inibidor do proteassoma). A administração de PTX não promoveu alterações

na participação da via residual em EDL dos animais nos diferentes grupos

estudados.

Está apresentado na Figura 27 um resumo da participação das 3

principais vias proteolíticas em músculo EDL de ratos normais e diabéticos

controles e tratados com PTX durante 4 dias.

Resultados

100

FIGURA 26: Efeito do de tratamento com pentoxifilina (100 mg/kg.dia, i.p.) na

via dependente de Ub-proteassoma em músculos EDL de ratos normais e

diabéticos. Os resultados são expressos como médias ± EPM dos grupos



sido obtidos resultados semelhantes. ∗∗ p<0,01 D x N; # p<0,05 DPTX x D.

0.00

0.03

0.06

0.09

0.12

0.15

Via dependente de Ub-proteassoma


tiros

ina

liber

ada

(nm

ol T

yr/m

g.2h

)

**

#

101R

esultados

TABELA 16: Participação da via proteolítica dependente de Ub-proteassoma e da via residual em

músculos EDL de ratos normais e diabéticos controles e tratados com pentoxifilina.


MG132 normal salina (NS)

normal PTX

(NPTX)


diabético PTX

(DPTX)

Diferença (%)

EDL

DS x NS DPTX x DS

(-) 0,146 ± 0,008 0,160 ± 0,009 0,209 ± 0,011 0,178 ± 0,007 + 43 * - 15 **

(+) (via residual)

0,085 ± 0,004 0,084 ± 0,007 0,089 ± 0,009 0,085 ± 0,010 ns ns

componente dep. Ub-proteassoma

0,061 ± 0,006 # 0,076 ± 0,008 # 0,120 ± 0,008 # 0,093 ± 0,011 # + 97 ** - 23 *

Os valores representam a média ± EPM de 7 a 9 músculos. ns: não significativo; * p< 0,05 e ** p< 0,01 na comparação entre os grupos. # p< 0,05 em relação à ausência do inibidor da via.

Resultados

102


proteassoma (C) em músculos EDL de ratos normais e diabéticos tratados com pentoxifilina.

Os resultados são expressos como médias ± EPM dos grupos experimentais. Os valores foram

obtidos de 7 a 9 músculos por grupo e representam um experimento típico, que foi repetido

pelo menos 2 vezes, tendo sido obtidos resultados semelhantes. ∗∗ p<0,01 D x N;

# p<0,05 DPTX x D; ## p<0,01 DPTX x D.

C

B

A

0.00

0.04

0.08

0.12

via

depe

nden

te d

e Ub

-pro

teas

som

a(n

mol

Tyr

/mg.

2h)

**

#

0.04

0.08

0.12

0.16

via

depe

nden

te d

e C

a2+

(nm

ol T

yr/m

g.2h

)

**

##

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

via

lisos

som

al(n

mol

Tyr

/mg.

2h)


Resultados

103

4.2.4) Determinação do conteúdo das proteínas m-calpaína e calpastatina Uma vez que foi observada uma redução na participação da via

proteolítica dependente de cálcio, em músculos EDL de ratos diabéticos

tratados com PTX, o presente trabalho passou a investigar as alterações que

estariam ocorrendo nos componentes deste sistema de degradação de

proteínas. Desta maneira, foi analisado o conteúdo protéico da m-calpaína,

protease do sistema, e da calpastatina, inibidor fisiológico endógeno desta

protease, sendo os resultados deste estudo apresentados nas Figuras 28A e

28B, respectivamente.

Foi observado um aumento de 115% no conteúdo protéico da m-

calpaína em músculos de animais diabéticos quando comparados aos

músculos de animais do grupo controle (Figura 28A). Já o conteúdo protéico da

calpastatina apresentou-se reduzido (31%) nos músculos após 3 dias de

instalação do diabetes (Figura 28B), em relação aos animais normais.

O tratamento com PTX promoveu uma redução de 70% nos níveis

protéicos da m-calpaína em músculos de ratos diabéticos, mas nenhuma

alteração foi observada neste mesmo parâmetro no grupo normal (Figura 28A);

o menor conteúdo de calpastatina presente em músculos de animais diabéticos

não foi afetado pelo tratamento com PTX (Figura 28B).

104R

esultados

FIGURA 28: Níveis protéicos de m-calpaína (A) e calpastatina (B) em músculos EDL de animais normais e diabéticos

tratados ou não com PTX. Os resultados são expressos como médias percentuais em relação ao grupo normal. Os

valores foram obtidos de 5 a 7 pares de músculos por grupo e representam um experimento típico, que foi repetido

pelo menos 2 vezes, tendo sido obtidos resultados semelhantes. ∗ p<0,05 D x N; # p<0,05 DPTX x D.

0

50

100

150

200

250

M-CALPAÍNA

A

#

*

níve

is p

roté

icos

(% d

o gr

upo

norm

al)

0

25

50

75

100

125

CALPASTATINA

B

**

ní

veis

pro

téic

os(%

do

grup

o no

rmal

)

normal diabético normal PTX diabético PTX

80KDa 120KDa

Resultados

105

4.2.5) Expressão do RNAm da atrogin-1 A atrogin-1 é uma enzima E3 ligase pertencente ao sistema

proteolítico dependente de Ub-proteassoma e alterações na sua expressão

podem ser observadas após a instalação de situações que promovam atrofia

muscular. Tendo em vista a redução da atividade da via dependente de Ub-

proteassoma encontrada em músculos de animais diabéticos tratados com

PTX, foi verificado se a expressão do RNAm da atrogin-1 também estava

alterada nestas condições.

A Figura 29 apresenta os resultados da expressão do RNAm da atrogin-

1 em músculos de animais normais e diabéticos tratados ou não com PTX,

tanto pela utilização de PCR semi-quantitativa quanto por PCR quantitativa.

Como pode ser observado, a instalação do diabetes promoveu uma elevação

significativa na expressão do RNAm da atrogin-1 em EDL de rato. Quando

animais normais foram tratados com PTX, não foram encontradas alterações

na expressão da atrogin-1 em comparação ao grupo normal controle (Figura

29). A PCR semi-quantitativa detectou uma queda de 27% na expressão da

atrogin-1 em músculos de animais diabéticos tratados com PTX em

comparação ao grupo diabético não tratado. Com a utilização da metodologia

de PCR quantitativa, esta diferença apresentou-se mais significativa, sendo

observada uma diminuição de 65% na expressão do RNAm da atrogin-1 em

músculos de animais diabéticos tratados com a droga.

106R

esultados

FIGURA 29: Expressão do RNAm da atrogin-1 em músculos EDL de animais normais e diabéticos tratados ou não com PTX.

Determinação realizada através de PCR semi-quantitativa (A) e PCR quantitativa (B). Os valores foram obtidos de 5 a 7 pares

de músculos por grupo e representam um experimento típico, que foi repetido pelo menos 2 vezes, tendo sido obtidos

resultados semelhantes. ** p<0,01 D x N; # p<0,05 DPTX x D.

0

20

40

60

80

100

120

#

##

**

RN

Am d

a at

rogi

n-1

(% d

o gr

upo

diab

étic

o)

normal normal + PTX diabético diabético + PTX

atrogin-1 β-actina

0

20

40

60

80

100

120

140

160

#

##

**

RN

Am d

a at

rogi

n-1

(atr

ogin

-1/c

iclo

fB)

normal normal + PTX diabético diabético + PTXA B

Resultados

107

4.2.6) Níveis plasmáticos de TNF-α

Na Figura 30 encontram-se os valores dos níveis plasmáticos de TNF-α

de animais normais e diabéticos tratados ou não com PTX in vivo. Como pode

ser observado, ocorreu um aumento significativo (63%) nas concentrações

plasmáticas de TNF-α em animais diabéticos quando comparados aos animais

normais. O tratamento com PTX promoveu uma queda de 68% nos níveis de

TNF-α no plasma de animais diabéticos, no entanto, não provocou alterações

nas concentrações plasmáticas desta citocina no grupo normal.

4.2.7) Efeito de uma única injeção de pentoxifilina na degradação de proteínas em músculo esquelético de ratos diabéticos

Sabendo-se que o tratamento de animais diabéticos com PTX durante

4 dias acarretou em redução nos valores de proteólise total em músculos EDL,

um próximo passo do presente trabalho foi investigar a possibilidade da PTX

exercer seus efeitos em uma situação mais aguda.

Para isso, os animais foram divididos em dois grupos: normais e

diabéticos (3 dias pós-STZ). Na véspera da data onde os animais completariam

3 dias de diabetes, ratos de ambos os grupos receberam injeção única de PTX

(100 mg/kg, i.p.). Quatorze horas após esta única administração de PTX os

músculos EDL de animais normais e diabéticos tratados e não-tratados foram

removidos para a avaliação das concentrações intracelulares de AMPc (Figura

31) e para o estudo dos valores de proteólise total (Figura 32).

A Figura 31 apresenta os resultados do conteúdo de AMPc em

músculos de animais normais e diabéticos após a administração de uma única

injeção de PTX. O tratamento agudo com PTX reproduziu o mesmo perfil de

resposta encontrado com o tratamento crônico, isto é, as concentrações de

AMPc são semelhantes em músculos de animais normais e diabéticos e o

tratamento com PTX foi capaz de promover um aumento de 17% nos níveis

deste nucleotídeo cíclico apenas em músculos de animais pertencentes ao

grupo diabético.

Posteriormente, foram avaliados os valores de proteólise total nos

músculos nesta mesma condição. Como pode ser observado na Figura 32,

Resultados

108

uma única administração de PTX já foi capaz de promover uma redução (15%)

nos valores de proteólise total em EDL de ratos diabéticos. Da mesma maneira

que observado com o tratamento durante 4 dias, animais normais que

receberam uma única injeção de PTX não demonstraram alterações na

degradação de proteínas em músculos EDL.

Resultados

109

FIGURA 30: Efeito do tratamento com pentoxifilina (100 mg/kg.dia, i.p.) nos

níveis plasmáticos de TNF-α de ratos normais e diabéticos. Os resultados


foram obtidos de 7 a 9 animais por grupo e representam um experimento típico,

que foi repetido pelo menos 2 vezes, tendo sido obtidos resultados

semelhantes. ∗ p<0,05 D x N; ## p<0,01 DPTX x D.

0

20

40

60

80

##

*

TNF-

α(p

g/m

L de

pla

sma)


Resultados

110

FIGURA 31: Efeito do tratamento agudo (14 horas antes do experimento) com

pentoxifilina (100 mg/kg, i.p.) nas concentrações intracelulares de AMPc em

músculos EDL de ratos normais e diabéticos, 3 dias após a administração de

STZ. Os resultados são expressos como médias ± EPM dos grupos



sido obtidos resultados semelhantes. # p<0,05 DPTX x D.

0

300

400

500

600

700#

cont

eúdo

de

AMPc

(fmol

/mg

mús

culo

)


Resultados

111

FIGURA 32: Efeito do tratamento agudo (14 horas antes do experimento) com

pentoxifilina (100 mg/kg, i.p.) na proteólise total em músculos EDL de ratos

normais e diabéticos, 3 dias após a administração de STZ. Os resultados são

expressos como médias ± EPM dos grupos experimentais. Os valores foram


foi repetido pelo menos 2 vezes, tendo sido obtidos resultados semelhantes. ∗∗

p<0,01 D x N; # p<0,05 DPTX x D.

0.00

0.10

0.20

0.30

0.40

0.50**

#

tiros

ina

liber

ada

(nm

ol T

yr/m

g.2h

)

Proteólise total


Resultados

112

4.3) Estudo das ações in vitro da pentoxifilina em músculo esquelético de ratos normais e diabéticos

Uma vez que a PTX administrada in vivo promoveu alterações

significativas no metabolismo de proteínas na musculatura esquelética de ratos

diabéticos, foi investigado um possível efeito direto da droga em músculos EDL

de ratos normais e diabéticos, 3 dias pós-STZ. Para isso, os músculos foram

incubados na ausência e na presença de 10mM de PTX. Foi avaliado o efeito

da PTX in vitro no conteúdo intracelular de AMPc, na proteólise total de

músculos EDL de ratos normais e diabéticos, assim como nas atividades das

vias proteolíticas lisossomal, dependente de cálcio, dependente de Ub-

proteassoma e residual nestes mesmos músculos incubados in vitro com a

droga. 4.3.1) Níveis intracelulares de AMPc

Na Figura 33 podem ser observados os resultados das concentrações

de AMPc em EDL de ratos normais e diabéticos incubados na presença ou não

de PTX. Não foram observadas diferenças nas concentrações intracelulares de

AMPc entre músculos de animais normais e diabéticos controles. No entanto,

diferente dos resultados observados com o tratamento in vivo com PTX, a

adição da droga no meio de incubação foi capaz de promover aumento nos

níveis intracelulares de AMPc tanto em músculos de animais normais (22%)

quanto em músculos de animais diabéticos (51%), em comparação aos

músculos incubados na ausência da droga.

Resultados

113

FIGURA 33: Efeito da pentoxifilina in vitro (10mM) nas concentrações intracelulares de AMPc em músculos EDL de ratos normais e diabéticos. Os

resultados são expressos como médias ± EPM. Os valores foram obtidos de 7

a 9 músculos por grupo e representam um experimento típico, que foi repetido

pelo menos 2 vezes, tendo sido obtidos resultados semelhantes. # p<0,05

NPTX x N ou DPTX x D.

0

400

600

800

1000

#

#

cont

eúdo

de

AMPc

(fmol

/mg

mús

culo

)

normal normal + PTX (in vitro) diabético diabético + PTX (in vitro)

Resultados

114

4.3.2) Proteólise total Os resultados do efeito da PTX in vitro na proteólise total em EDL de

ratos normais e diabéticos são mostrados na Figura 34 e Tabela 17 (valores

médios obtidos na ausência de inibidores da via lisossomal, BCAA e

metilamina). Como esperado, o diabetes promoveu um aumento (44%) na

degradação total de proteínas em músculos EDL. A incubação destes

músculos na presença de PTX promoveu uma resposta diferente em relação

ao tratamento in vivo com a droga; além de ser observada uma significativa

redução de aproximadamente 17% nos valores de proteólise total em EDL de

animais diabéticos incubados com PTX in vitro, a adição da droga ao meio de

incubação também levou à diminuição na degradação total de proteínas em

músculos de animais normais (25%).

4.3.3) Participação das vias proteolíticas

Após a observação da redução nos valores de proteólise total em EDL

de animais normais e diabéticos incubados na presença de PTX, o próximo

passo deste trabalho foi analisar o(s) sistema(s) proteolítico(s) afetado(s)

nestas condições. Músculos EDL de animais normais ou após 3 dias de

diabetes foram incubados in vitro com PTX e posteriormente investigadas as

participações das vias proteolíticas lisossomal, dependente de cálcio,

dependente de Ub-proteassoma e residual.

- Via Lisossomal Os valores médios da participação do sistema proteolítico lisossomal

em EDL de animais normais e diabéticos incubados ou não com PTX in vitro

encontram-se na Figura 35 e na Tabela 17. De acordo com resultados obtidos

anteriormente em nosso laboratório (Pepato et al., 1996), não são observadas

alterações significativas na participação da via lisossomal em EDL de animais

após 3 dias de diabetes, em comparação aos animais normais. Da mesma

Resultados

115

FIGURA 34: Efeito da pentoxifilina in vitro (10mM) na proteólise total em

músculos EDL de ratos normais e diabéticos. Os resultados são expressos

como médias ± EPM. Os valores foram obtidos de 7 a 9 músculos por grupo e


sido obtidos resultados semelhantes. ∗∗ p<0,01 D x N; # p<0,05 DPTX x D ou

NPTX x N.

0,00

0,16

0,24

0,32

0,40

0,48

0,56

tiros

ina

liber

ada

(nm

ol T

yr/m

g.2h

) #

**

#

Proteólise total


Resultados

116

FIGURA 35: Efeito da pentoxifilina in vitro (10mM) na via lisossomal em

músculos EDL de ratos normais e diabéticos. Os resultados são expressos

como médias ± EPM. Os valores foram obtidos de 7 a 9 músculos por grupo e


sido obtidos resultados semelhantes.

0,00

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

Via lisossomal

tiros

ina

liber

ada

(nm

ol T

yr/m

g.2h

)


117R

esultados

TABELA 17: Proteólise total e participação da via proteolítica lisossomal em músculos EDL de ratos

normais e diabéticos incubados na ausência ou na presença de pentoxifilina (10mM).


BCAA e metilamina

normal controle

(N)

normal PTX

in vitro

diabético controle

(D)

diabético PTX

in vitro

Diferença (%)

EDL

NPTX in vitro x N

DPTX in vitro x D

(-) 0,312 ± 0,010 0,234 ± 0,010 0,448 ± 0,021 0,374 ± 0,025 - 25 ** - 17 *

(+) 0,238 ± 0,011 0,170 ± 0,010 0,364 ± 0,016 0,295 ± 0,014 - 28 ** - 19 **

componente lisossomal

0,074 ± 0,010 # 0,064 ± 0,004 # 0,085 ± 0,010 # 0,079 ± 0,012 # ns ns


Resultados

118

maneira, a adição de 10mM de PTX ao meio de incubação não acarretou em

modificações na participação desta via em músculos desses mesmos animais.

- Via Dependente de Cálcio Na Figura 36 encontram-se os valores referentes à contribuição do

sistema proteolítico dependente de cálcio em músculos de ratos normais e

diabéticos incubados na presença de PTX. A participação deste processo

proteolítico encontra-se elevada (cerca de 14%) em EDL de ratos diabéticos

quando comparado aos animais normais. A adição de PTX ao meio de

incubação promoveu em redução na atividade desta via em músculos tanto de

animais normais (11%) quanto de animais diabéticos (14%), em comparação

aos músculos incubados na ausência da droga.

- Via Dependente de Ub-Proteassoma e Via Residual

Os valores da participação da via proteolítica dependente de Ub-

proteassoma em músculos EDL de ratos normais e diabéticos incubados na

presença de PTX encontram-se na Figura 37 e Tabela 18. Houve um aumento

de cerca de 25% na participação do sistema proteolítico dependente de Ub-

proteassoma em músculos de ratos diabéticos, dado este semelhante ao

encontrado por Pepato et al. (1996). Quando músculos de ratos normais e

diabéticos foram incubados na presença de PTX, ocorreu uma diminuição

significativa na participação da via proteolítica dependente de Ub-proteassoma,

em ambos os músculos (13% e 20% em EDL de ratos normais e diabéticos,

respectivamente).

Os valores médios da participação da via proteolítica residual em

músculos desses mesmos animais estão apresentados na Tabela 18, e

correspondem aos valores de tirosina liberada na presença de inibidores dos

sistemas proteolíticos lisossomal, dependente de cálcio e de MG132 (inibidor

do proteassoma). Não ocorreram alterações na contribuição da via residual em

qualquer das situações estudadas.

Resultados

119

FIGURA 36: Efeito da pentoxifilina in vitro (10mM) na via dependente de cálcio em músculos EDL de ratos normais e diabéticos. Os experimentos

foram realizados na presença de inibidores da via lisossomal (metilamina e

BCAA) e da via dependente de Ub-proteassoma (MG132). Os resultados são

expressos como médias ± EPM. Os valores foram obtidos de 7 a 9 músculos

por grupo e representam um experimento típico, que foi repetido pelo menos 2

vezes, tendo sido obtidos resultados semelhantes. ∗ p<0,05 D x N; # p<0,05

DPTX x D ou NPTX x N.

0,00

0,09

0,12

0,15

0,18

Via dependente de cálcio

#

tir

osin

a lib

erad

a(n

mol

Tyr

/mg.

2h)


*

#

Resultados

120

FIGURA 37: Efeito da pentoxifilina in vitro (10mM) na via dependente de Ub-proteassoma em músculos EDL de ratos normais e diabéticos. Os resultados

são expressos como médias ± EPM. Os valores foram obtidos de 7 a 9


menos 2 vezes, tendo sido obtidos resultados semelhantes. ∗∗ p<0,01 D x N; #

p<0,05 DPTX x D ou NPTX x N.

0.00

0.15

0.18

0.21

0.24

0.27

Via dependente de Ub-proteassoma

#

tiros

ina

liber

ada

(nm

ol T

yr/m

g.2h

)


**

#

121R

esultados

TABELA 18: Participação da via proteolítica dependente de Ub-proteassoma e da via residual em músculos EDL

de ratos normais e diabéticos incubados na ausência ou na presença de pentoxifilina (10mM).


MG132 normal

controle (N)

normal PTX

in vitro

diabético controle

(D)

diabético PTX

in vitro

Diferença (%)

EDL

NPTX in vitro x N

DPTX in vitro x D

(-) 0,280 ± 0,011 0,241 ± 0,009 0,330 ± 0,013 0,278 ± 0,019 - 14 * - 16 *

(+) (via residual)

0,090 ± 0,008 0,079 ± 0,009 0,092 ± 0,012 0,088 ± 0,011 ns ns

componente dep. Ub-proteassoma

0,188 ± 0,005 # 0,163 ± 0,005 # 0,234 ± 0,013 # 0,188 ± 0,014 # - 13 ** - 20 *

Os valores representam a média ± EPM de 7 a 9 músculos. ns: não significativo; * p< 0,05 e ** p< 0,01 na comparação entre os grupos. # p< 0,05 em relação à ausência do inibidor da via.

Resultados

122


proteassoma (C) em músculos EDL de ratos normais e diabéticos na presença de pentoxifilina in vitro

(10 mM). Os resultados são expressos como médias ± EPM. Os valores foram obtidos de 7 a 9 músculos

por grupo e representam um experimento típico, que foi repetido pelo menos 2 vezes, tendo sido obtidos

resultados semelhantes. ∗ p<0,05 D x N; ∗∗ p<0,01 D x N; # p<0,05 DPTX x D ou NPTX x N.

C

B

A

0.00

0.16

0.20

0.24

#

via

depe

nden

te d

e Ub

-pro

teas

som

a(n

mol

Tyr

/mg.

2h)

**

#

0.09

0.12

0.15 #

vi

a de

pend

ente

de

Ca2+

(nm

ol T

yr/m

g.2h

)

*

#

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

via

lisos

som

al(n

mol

Tyr

/mg.

2h)


Resultados

123

A Figura 38 apresenta um resumo da participação dos 3 sistemas de

degradação de proteínas em músculo EDL de ratos normais e diabéticos

controles e incubados na presença de 10mM de PTX.

4.3.4) Efeito da insulina in vitro na ação anti-proteolítica da pentoxifilina em músculo esquelético de ratos normais e diabéticos

Os resultados do presente trabalho indicam que o tratamento in vivo

com PTX promove diminuição na degradação de proteínas na musculatura

esquelética de animais diabéticos, e esta ação anti-proteolítica da droga é

exercida através da redução na atividade das vias proteolíticas dependentes de

Ca2+ e de Ub-proteassoma. A ausência do efeito da PTX em músculos de

animais normais tratados em comparação aos diabéticos levantou a

possibilidade de uma possível ação da insulina existente nos animais normais.

Provavelmente os efeitos da insulina, ativando a fosfodiesterase do AMPc e

promovendo redução nos níveis deste nucleotídeo cíclico, poderiam estar

prevalecendo em relação aos efeitos da PTX na musculatura esquelética de

ratos normais. Esta hipótese pareceu ainda mais provável após a observação

da ação anti-proteolítica da PTX em EDL de animais normais incubados na

presença da droga in vitro, isto é, em uma situação onde a insulina não está

presente.

Para confirmar esta hipótese, foram realizados experimentos de

avaliação da liberação de tirosina em músculos EDL de ratos normais e

diabéticos incubados na presença de 10mM de PTX, na ausência ou na

presença de insulina in vitro (Figuras 39 e 40). Uma vez que a insulina

adicionada ao meio de incubação é capaz de promover uma redução na

participação do sistema proteolítico lisossomal, estes experimentos foram

realizados em uma condição de inibição prévia desta via, onde foram

adicionados metilamina e BCAA. Assim, o efeito anti-proteolítico observado

nestes experimentos são atribuídos somente à ação da PTX in vitro.

Resultados

124

A Figura 39 apresenta os valores de tirosina liberada de músculos de

animais normais incubados na presença de PTX e de insulina. Como pode ser

observado, a adição de metilamina e BCAA ao meio de incubação promoveu

diminuição (cerca de 21%) nos valores de tirosina liberada, correspondendo

esta diferença à participação do sistema proteolítico lisossomal. A incubação

destes músculos na presença de PTX levou a uma inibição adicional (14%) na

liberação de tirosina em comparação aos músculos incubados somente na

presença dos inibidores da via lisossomal, comprovando que realmente esta

droga não exerce sua ação anti-proteolitica via inibição da atividade do sistema

lisossomal. No entanto, quando a insulina foi adicionada ao meio de incubação,

ocorreu praticamente um bloqueio da ação anti-proteolítica da PTX, sendo os

valores de tirosina liberada para o meio de incubação semelhantes àqueles

observados quando os músculos foram incubados na ausência da PTX.

Os valores de tirosina liberada pelos músculos EDL de animais

diabéticos incubados na presença de PTX e insulina encontram-se na Figura

40. A participação do sistema proteolítico lisossomal pôde ser observada

quando os músculos foram incubados na presença de metilamina e BCAA,

ocorrendo uma queda de 16% na liberação de tirosina destes músculos em

comparação aos valores obtidos com músculos incubados na ausência dos

inibidores. Foi observada inibição adicional da liberação de tirosina quando

músculos de animais diabéticos foram incubados na presença de PTX, sendo

estes valores cerca de 19% menores em relação aos músculos incubados na

presença somente dos inibidores da via lisossomal. Diferentemente dos

resultados obtidos com o grupo de ratos normais, a adição de insulina ao meio

de incubação de EDL de animais diabéticos não foi capaz de promover

alterações na ação anti-proteolítica da PTX, sendo os valores de tirosina

liberada semelhantes aos músculos incubados na presença da droga e

ausência do hormônio.

Resultados

125

FIGURA 39: Efeito da pentoxifilina e da insulina in vitro na proteólise basal em

músculos EDL de ratos normais. Os resultados são expressos como médias ±

EPM. Os valores foram obtidos de 7 a 9 músculos por grupo e representam um


resultados semelhantes. ∗∗ p<0,01 proteólise total x metilamina + BCAA; #

p<0,05 na presença de PTX; φ p< 0,05 na presença de insulina.

0,00

0,16

0,20

0,24

0,28

0,32

tiros

ina

liber

ada

(nm

ol T

yr/m

g.2h

)

φ

#

**

proteólise total metilamina + BCAA metilamina + BCAA + PTX metilamina + BCAA + PTX + insulina

EDL - ratos normais

Resultados

126

FIGURA 40: Efeito da pentoxifilina e da insulina in vitro na proteólise basal em

músculos EDL de ratos diabéticos. Os resultados são expressos como médias

± EPM. Os valores foram obtidos de 7 a 9 músculos por grupo e representam

um experimento típico, que foi repetido pelo menos 2 vezes, tendo sido obtidos

resultados semelhantes. ∗∗ p<0,01 proteólise total x metilamina + BCAA; #

p<0,05 e ## p<0,01 na presença de PTX.

0,00

0,24

0,30

0,36

0,42

0,48

#

tiros

ina

liber

ada

(nm

ol T

yr/m

g.2h

)

##

**

proteólise total metilamina + BCAA metilamina + BCAA + PTX metilamina + BCAA + PTX + insulina

EDL - ratos diabéticos

Resultados

127

4.3.5) Efeito do H89 in vitro na ação anti-proteolítica da pentoxifilina em músculo esquelético de ratos normais e diabéticos

Na tentativa de elucidar o mecanismo intracelular da ação anti-

proteolítica da PTX, o presente trabalho investigou o possível envolvimento da

proteína quinase A (PKA) na ação intracelular da droga, uma vez que a PTX

promoveu alterações nos níveis intracelulares de AMPc. Para isso, foram

realizados experimentos de incubação de músculos de animais normais e

diabéticos na presença de PTX e na ausência ou presença de H89, inibidor

específico da atividade da PKA.

Sabendo-se que as catecolaminas ativam a PKA em diversos tecidos, e

que estas aminas exercem ação anti-proteolítica na musculatura esquelética,

foram realizados experimentos para verificar se o H89, inibidor da PKA,

promovia alteração no efeito inibitório da adrenalina na proteólise em EDL de

ratos normais.

A Figura 41 mostra que a adição de adrenalina ao meio de incubação

reduziu em cerca de 20% os valores de liberação de tirosina em EDL, resultado

este similar ao obtido em trabalhos anteriores do laboratório (Navegantes et al.,

2000). Músculos de animais normais incubados na presença de H89 não

apresentam alteração na liberação de tirosina em comparação aos músculos

incubados na ausência do inibidor. No entanto, a adição de H89 foi capaz de

bloquear completamente a ação anti-proteolítica da adrenalina: os valores de

tirosina de músculos EDL incubados na presença de adrenalina e H89 foram

semelhantes àqueles obtidos com músculos incubados na ausência de ambos.

Tendo sido confirmado o envolvimento da PKA no efeito anti-proteolítico

da adrenalina, o passo seguinte foi verificar o envolvimento desta enzima no

efeito inibitório da proteólise exercido pela PTX. Como pode ser observado na

Figura 42, PTX in vitro foi capaz de promover uma redução de 14% nos valores

de proteólise total em músculos de animais normais. A incubação dos

músculos na presença somente de H89 não promoveu diferenças na liberação

de tirosina em comparação aos mesmos incubados na ausência da droga.

Entretanto, a adição do inibidor de PKA (H89) ao meio de incubação promoveu

um bloqueio total da ação anti-proteolítica da PTX; a proteólise total em

Resultados

128

músculos de animais normais incubados na presença de PTX e H89 foram

semelhantes aos valores obtidos em músculos incubados na ausência das

drogas.

A Figura 43 mostra que a PTX in vitro foi capaz de reduzir em 23% os

valores de tirosina liberada pelos músculos de ratos diabéticos em comparação

aos mesmos incubados na ausência da droga. Tal como observado nos

experimentos prévios, a adição de H89 ao meio de incubação não acarretou

em diferenças nos valores de proteólise total nestes músculos. Porém, a

redução da proteólise provocada pela PTX foi bloqueada quando H89 foi

adicionado no meio.

Resultados

129

FIGURA 41: Efeito do H89 (50µM) na ação anti-proteolítica in vitro da

adrenalina (10-5M) em músculos EDL de ratos normais. Os resultados são



vezes, tendo sido obtidos resultados semelhantes. φφ p<0,01 presença de ADR

x N; ψψ p<0,01 presença de H89 x ausência de H89.

0,00

0,20

0,25

0,30

0,35

tiros

ina

liber

ada

(nm

ol T

yr/m

g.2h

)

ψψ

φφ

normal normal + H89 normal + ADR normal + ADR + H89

Resultados

130


pentoxifilina (10mM) em músculos EDL de ratos normais. Os resultados são



vezes, tendo sido obtidos resultados semelhantes. φ p<0,05 presença de PTX x

N; ψ p<0,05 presença de H89 x ausência de H89.

0,00

0,20

0,25

0,30

0,35

Proteólise total

ψ

φ

tiros

ina

liber

ada

(nm

ol T

yr/m

g.2h

)

controle normal + H89 + PTX + PTX + H89

Resultados

131


pentoxifilina (10mM) em músculos EDL de ratos diabéticos. Os resultados são



vezes, tendo sido obtidos resultados semelhantes. φ p<0,05 presença de PTX x

N; ψ p<0,05 presença de H89 x ausência de H89.

0,00

0,25

0,30

0,35

0,40

0,45

controle diabético + H89 + PTX + PTX + H89

ψ

φ

tiros

ina

liber

ada

(nm

ol T

yr/m

g.2h

)

Proteólise total

Resultados

132

4.4) Estudo das ações in vivo da pentoxifilina na síntese protéica em músculo esquelético de ratos normais e diabéticos

Após a investigação dos efeitos in vivo e in vitro da PTX nos processos

de degradação de proteínas em músculos esqueléticos de animais normais e

diabéticos, foi estudado o papel da droga nos processos de síntese protéica em

músculos EDL de animais tratados com PTX.

Os valores da síntese protéica em músculos de animais normais e

diabéticos tratados com PTX estão apresentados na Figura 44. Tal como era

esperado, ocorreu uma queda significativa (cerca de 50%) na síntese protéica

em músculos de animais após 3 dias de instalação do diabetes. O tratamento

com PTX não foi capaz de promover alterações nos valores de síntese protéica

em músculos desses animais.

4.5) Estudo das ações in vivo e in situ da pentoxifilina em músculo esquelético de ratos normais e diabéticos adultos

Com o objetivo de estudar as alterações promovidas pela PTX no

metabolismo de proteínas em músculo esquelético de animais normais e

diabéticos adultos, foi utilizada a metodologia de microdiálise muscular. Assim,

foram realizados experimentos na tentativa de elucidar o papel deste derivado

de xantina em duas situações distintas: a) estudos in vivo, analisando animais

adultos normais e diabéticos (3 dias pós-ALX) tratados durante 4 dias com PTX

e b) estudos in situ, investigando o metabolismo de proteínas em animais

adultos normais e diabéticos (3 dias pós-ALX) perfundidos com solução

contendo 10mM de PTX.

Resultados

133


síntese protéica em músculos EDL de ratos normais e diabéticos. Os




resultados semelhantes. ∗∗ p<0,01 D x N ou DPTX x N.

0.00

0.08

0.16

0.24

0.32

0.40

**

sínt

ese

prot

éica

(nm

ol T

yr/m

g.2h

)

**


Resultados

134

Os resultados relacionados ao efeito in vivo da PTX estão apresentados

na Figura 45. O diabetes promoveu um aumento nas concentrações de tirosina

do interstício (I) (30%) e do plasma arterial (A) (33%). O índice I-A apresentou

uma elevação de 79% no grupo diabético em comparação ao grupo normal.

Não ocorreram alterações nos valores de tirosina intersticial e plasmática ou no

valor do índice I-A em animais normais tratados com PTX. No entanto, o

tratamento de ratos diabéticos durante 4 dias com PTX foi capaz de promover

uma queda de 20% nos valores de tirosina intersticial, quando comparados ao

grupo diabético não tratado; conseqüentemente, pode ser observada uma

redução de 54% nos valores da diferença I-A no grupo diabético tratado com a

droga em comparação ao mesmo grupo não tratado.

A Figura 46 apresenta os resultados obtidos em músculos de animais

normais e diabéticos perfundidos com solução contendo 10mM de PTX. Tal

como observado no resultado anterior (Figura 45), ocorreu um aumento nos

valores de tirosina intersticial e plasmática no grupo diabético em relação ao

normal, e conseqüente elevação no índice I-A. PTX in situ (na solução de

perfusão) não promoveu alterações nos valores de tirosina no interstício, no

plasma e no índice I-A em animais normais. No entanto, tal como nos

experimentos in vivo, a PTX adicionada ao meio de perfusão foi capaz de

reduzir os valores de tirosina intersticial nos animais diabéticos (cerca de 17%);

assim, a PTX in situ promoveu uma queda de 40% na diferença I-A no grupo

diabético em comparação ao grupo diabético controle.

Resultados

135


concentração intersticial (I), arterial (A) e na diferença I-A de tirosina em

músculos tibialis anterior de ratos adultos normais e diabéticos. Os resultados


foram obtidos de 7 a 9 músculos por grupo e representam um experimento

típico, que foi repetido pelo menos 2 vezes, tendo sido obtidos resultados

semelhantes. ∗ p<0,05 D x N; # p<0,05 DPTX x D.

0

20

40

60

80

100

120

140

160

#

#

*

**

*

(I) (A) interstício plasma I - A

tiros

ina

(nm

ol/m

L)

normal normal PTX (in vivo) diabético diabético PTX (in vivo)

Resultados

136

FIGURA 46: Efeito da pentoxifilina in situ (10mM) na concentração intersticial (I), arterial (A) e na diferença I-A de tirosina em músculos tibialis anterior de ratos adultos normais e diabéticos. Os resultados são expressos como

médias ± EPM dos grupos experimentais. Os valores foram obtidos de 7 a 9


menos 2 vezes, tendo sido obtidos resultados semelhantes. ∗ p<0,05 D x N; #

p<0,05 DPTX x D.

0

20

40

60

80

100

120

140

160

#

#

*

**

*

(I) (A) interstício plasma I - A

tiros

ina

(nm

ol/m

L)

normal normal PTX (in situ) diabético diabético PTX (in situ)

Resultados

137

Com estes resultados, pode-se comprovar que as respostas

encontradas em animais adultos após a instalação do diabetes e o tratamento

in vivo e in situ com PTX são semelhantes às respostas observadas em

animais jovens. Além disso, foi possível comprovar que a microdiálise muscular

é uma técnica adequada para o estudo do metabolismo de proteínas em

músculos de ratos adultos submetidos a diferentes situações fisiológicas ou

patológicas que promovam alterações na liberação de tirosina pelo tecido

muscular.

Discussão

Discussão 138

5) Discussão

A primeira parte deste trabalho teve como objetivo investigar as

alterações ocorridas na proteólise total e a participação das vias proteolíticas

em soleus e EDL de animais diabéticos submetidos à simpatectomia. Antes de

transcorrer sobre os principais achados relacionados ao metabolismo de

proteínas neste estudo, vale a pena ressaltar os interessantes resultados

obtidos em relação aos níveis de catecolaminas (neste caso, noradrenalina) em

ambos os músculos de animais diabéticos.

5.1) Concentração de noradrenalina muscular em animais submetidos ao diabetes experimental

Podemos observar, tanto em soleus quanto em EDL, um aumento

significativo e progressivo no conteúdo de noradrenalina nos períodos de 1, 3 e

5 dias pós-STZ (ver Figuras 6 e 7 e Tabelas 2 e 3 para soleus e EDL,

respectivamente). Este acréscimo nas concentrações musculares de

noradrenalina poderia explicar algumas das respostas obtidas por Pepato et al.

(1996) no que se refere às quedas nas participações das vias proteolíticas,

especialmente na via dependente de cálcio em soleus após 3 e 5 dias de

diabetes. Esta sugestão baseia-se em trabalhos de nosso laboratório

(Navegantes et al., 1999 - 2002) que mostraram ter as catecolaminas um papel

anti-proteolítico inibindo a atividade proteolítica da via dependente de cálcio. No

entanto, esta elevação das catecolaminas nos músculos soleus e EDL de ratos

diabéticos não interfere na interpretação dos resultados obtidos no presente

trabalho, uma vez que a administração de guanetidina nestes animais reduziu

os níveis de adrenalina e noradrenalina (plasmáticas e musculares) na mesma

magnitude da redução promovida pela droga em animais normoinsulinêmicos

(Navegantes et al, 1999). Ou seja, as alterações encontradas no presente

trabalho não poderão ser explicadas pelas alterações do conteúdo e/ou dos

níveis de catecolaminas nos músculos e plasma de ratos diabéticos

simpatectomizados, pois foram exatamente iguais aos dos ratos normais

simpatectomizados.

Discussão 139

Alguns trabalhos na literatura relatam aumento de conteúdo tecidual

das catecolaminas em animais submetidos ao diabetes. Adeghate et al. (2001)

encontraram elevação nas concentrações de noradrenalina em pâncreas de

ratos após 4 semanas de diabetes estreptozotocínico, sem aumento

significativo nas concentrações plasmáticas de adrenalina ou noradrenalina,

resposta semelhante encontrada neste trabalho (em relação à ausência de

alteração nos níveis de catecolaminas no plasma de animais diabéticos).

Também existem relatos de aumento no conteúdo de noradrenalina em tecido

cardíaco de ratos diabéticos (Paulson et al., 1981; Fushimi et al., 1982;

Ganguly et al., 1987). Este aumento nas concentrações musculares das

catecolaminas de animais diabéticos pode ser explicado, dentre outros fatores,

pela queda na atividade da enzima monoamino oxidase (MAO), que promove a

metabolização das catecolaminas em seus produtos finais inativos (como o

ácido vanililmandélico) que são excretados pelas vias urinárias. Alguns

trabalhos demonstram ocorrer redução significativa na atividade da MAO em

pâncreas, plaquetas e outros tecidos de indivíduos diabéticos (Mosnaim et al.,

1979; Quasah et al., 1981; Adeghate et al., 2004).

As alterações ocorridas na atividade do sistema nervoso simpático em

músculos soleus e EDL de animais diabéticos foram estudadas através da

realização da medida da queda na concentração tecidual de noradrenalina após

administração de um inibidor de sua síntese, permitindo-se desta maneira a

determinação da velocidade de renovação de noradrenalina nos tecidos citados.

Nestes experimentos, uma vez que a velocidade de queda das concentrações

de noradrenalina encontra-se reduzida em músculos de animais diabéticos

quando comparados aos controles, podemos sugerir que esta redução seja

realmente conseqüência de queda na velocidade de metabolização

(degradação) da catecolamina, uma vez que a síntese estava inibida pela

administração de metil-tirosina. Como pode ser observado nas Figuras 8 e 9, os

valores de t1/2 (isto é, o tempo gasto para que o conteúdo de noradrenalina atinja

metade do valor inicial) encontram-se aumentados em cerca de 50 a 60% em

músculos de animais diabéticos (1 e 3 dias pós-STZ). Estes dados nos permitem

sugerir que nestes tecidos haja uma menor atividade simpática.

Discussão 140

5.2) Papel das catecolaminas no metabolismo de proteínas em músculos esqueléticos de animais diabéticos

A seguir está apresentado um resumo dos principais achados

relacionados ao estudo do papel das catecolaminas na proteólise muscular de

ratos diabéticos:

- As catecolaminas parecem ter efeito na atividade das vias

proteolíticas de músculo esquelético de ratos nas fases iniciais do diabetes (1 e

3 dias após a administração de STZ);

- Em períodos mais prolongados de deficiência insulínica, a presença

ou ausência das catecolaminas parece não interferir com as respostas

observadas na proteólise muscular;

- O efeito das catecolaminas na atividade das vias proteolíticas de

músculo de ratos diabéticos depende do tipo de músculo, ou seja, se

predominam fibras do tipo I ou do tipo II.

a) Proteólise total e vias proteolíticas em músculos de animais diabéticos simpatectomizados - 1 dia de diabetes

Para facilitar a compreensão, vamos resumir primeiramente os

resultados obtidos em músculos soleus (rico em fibras oxidativas do tipo I) e

EDL (rico em fibras glicolíticas do tipo II) de ratos com 1 dia de diabetes e

simpatectomizados.

A ausência das catecolaminas musculares em animais com 1 dia de

diabetes foi capaz de promover um aumento ainda maior da proteólise total em

músculos soleus (a qual já era alta em ratos diabéticos em relação aos

controles - ver Figura 10). Este aumento adicional da proteólise total em soleus

de ratos diabéticos simpatectomizados foi decorrente da elevação na atividade

de dois sistemas proteolíticos, o lisossomal e o dependente de Ub-

proteassoma. Inicialmente será feita uma descrição do surpreendente aumento

na atividade da via proteolítica lisossomal após 1 e 3 dias de diabetes.

Discussão 141

A atividade do sistema proteolítico lisossomal na musculatura

esquelética não sofre qualquer alteração quando o diabetes ou a

simpatectomia são estudados isoladamente (Pepato et al., 1996; Navegantes

et al., 1999). Como foi observado no presente trabalho, nas fases agudas de

diabetes (1 e 3 dias após STZ), a simpatectomia promoveu uma ativação de

48% e 96%, respectivamente, do sistema proteolítico lisossomal. Este

resultado inesperado indica que as catecolaminas e a insulina exercem ações

comuns na regulação do metabolismo de proteínas, podendo um hormônio

compensar o efeito anti-proteolítico do outro em um quadro de deficiência

hormonal aguda de um deles.

Existem poucos trabalhos na literatura demonstrando o envolvimento do

sistema proteolítico lisossomal no desenvolvimento da perda de massa

muscular esquelética. Na maioria das vezes estes trabalhos demonstram que,

quando existe uma situação de perda de proteínas pelo tecido muscular com

ativação do sistema proteolítico lisossomal, o aumento na participação deste

processo degradativo não ocorre isoladamente. Normalmente, a elevação na

velocidade da via proteolítica lisossomal na musculatura esquelética acontece

concomitantemente ao aumento na participação de outros sistemas

proteolíticos, principalmente os dependentes de cálcio e de Ub-proteassoma.

No presente trabalho, foi observado um aumento concomitante na

atividade dos sistemas proteolíticos lisossomal e dependente de Ub-

proteassoma em soleus de animais diabéticos simpatectomizados. A ativação

conjunta de diferentes vias de degradação de proteínas na musculatura

esquelética permite que ocorra, inicialmente, a degradação específica de

proteínas contráteis ou proteínas de citoesqueleto, passo qualitativamente

importante para a proteólise subseqüente de componentes como actina e

miosina. Sabe-se que as catepsinas (proteases lisossomais) estão envolvidas

na degradação de proteínas endocitadas, e que as calpaínas são responsáveis

pela degradação de proteínas do citoesqueleto e pela proteólise limitada de

algumas proteínas específicas; portanto, as vias lisossomal e dependente de

cálcio não são responsáveis pela degradação completa de proteínas

miofibrilares, e a contribuição individual destes sistemas proteolíticos para o

Discussão 142

desenvolvimento de atrofia muscular não é significativa. Assim, um aumento na

participação destes dois processos pode ter um papel permissivo para a

degradação de proteínas miofibrilares pelo processo dependente de Ub-

proteassoma, principal sistema responsável pelo aparecimento de atrofia

muscular em situações catabólicas.

Trabalho de Taillandier et al. (1996) também demonstrou uma ativação

coordenada dos sistemas proteolíticos lisossomal, dependente de cálcio e

dependente de Ub-proteassoma em soleus de ratos submetidos à atrofia

muscular pelo modelo de suspensão das patas inferiores durante 9 dias. A

incubação de músculos soleus destes animais mostrou um aumento importante

na velocidade dos sistemas degradativos lisossomal e dependente de cálcio,

além de elevação na atividade proteolítica e na expressão do RNAm das

catepsinas B e L e da m-calpaína. Ao mesmo tempo, foi encontrado nestes

músculos uma elevação na expressão do RNAm da ubiquitina, E2 14KDa e

subunidades do proteassoma, componentes do sistema proteolítico

dependente de Ub-proteassoma.

Similarmente, Mansoor et al. (1996) observaram aumento na

participação de vários processos de degradação de proteínas (inclusive o

processo lisossomal) em músculo esquelético de pacientes hospitalizados por

traumatismo craniano. Estes pacientes apresentam um balanço nitrogenado

negativo, elevação na velocidade de degradação corporal de proteínas e

contínuo aumento na excreção urinária de 3-metil-histidina (um indicador da

degradação de proteínas miofibrilares). O estudo de diferentes proteases em

músculo vastus lateralis destes pacientes demonstrou um aumento no

conteúdo de RNAm de m-calpaína, ubiquitina, E2 14KDa, subunidades do

proteassoma e da catepsina D. De acordo com esse trabalho, uma ativação

coordenada dos diferentes sistemas proteolíticos seria importante para a

eliminação de diferentes classes de proteínas celulares (Furuno et al., 1990).

Estudo realizado por Jagoe et al. (2002) é exemplo de um dos poucos

relatos na literatura demonstrando elevação isolada na expressão do RNAm de

uma protease do sistema lisossomal em músculo esquelético, sem ativação de

componentes de outros sistemas proteolíticos. Neste trabalho, foi encontrado

Discussão 143

aumento nos níveis de RNAm de catepsina B em músculos latissimus dorsi de

pacientes com câncer pulmonar, sem qualquer alteração na expressão de

componentes do sistema dependente de Ub-proteassoma. No entanto, os

autores não descartam a possibilidade de serem encontradas alterações em

componentes de outros sistemas proteolíticos nas fases mais tardias do

câncer, e supõem que o aumento na expressão da catepsina B esteja

ocorrendo em um estágio inicial da doença, sendo assim importante para o

início do aparecimento da atrofia muscular nesta condição. O trabalho ainda

sugere que estas mudanças no perfil de expressão das proteases sejam

amplificadas, com conseqüente ativação do sistema dependente de Ub-

proteassoma na musculatura esquelética de pacientes em períodos mais

avançados do câncer.

Apesar de não encontrarmos em nosso laboratório alterações na

participação do sistema proteolítico lisossomal em músculos de animais

diabéticos (Pepato et al., 1996), recente trabalho de Skurk et al. (2005)

demonstrou que um importante intermediário da sinalização intracelular

desencadeada pela insulina, a proteína quinase B (PKB ou AKT) é capaz de

controlar a expressão gênica da catepsina L em cardiomiócitos. Neste trabalho

foram utilizados cardiomiócitos de camundongos transgênicos que expressam

uma forma constitutivamente ativa da AKT e camundongos que não expressam

a AKT (através de repressão gênica), sendo observado, respectivamente,

supressão e indução do gene da catepsina L nestes tecidos, ou seja, a AKT

teria um efeito inibitório na expressão gênica desta protease.

A catepsina L tem sido considerada, atualmente, a principal protease do

sistema lisossomal que é ativada em processos que culminam em atrofia

muscular, juntamente com o aumento na participação de outros processos

proteolíticos. Lecker et al. (2004), identificando o perfil transcricional obtido do

músculo gastrocnemius de ratos e camundongos em situações catabólicas

como jejum, diabetes, tumor e falência renal (uremia), encontraram um

aumento na expressão do RNAm de vários componentes envolvidos em

maquinaria de degradação de proteínas intracelulares, inclusive da catepsina L.

Discussão 144

Animais submetidos ao quadro de sepse também desenvolvem uma

significativa perda de massa muscular. A importância da catepsina L para o

desenvolvimento de atrofia nesta condição também tem sido identificada. Deval

et al. (2001) encontraram aumento na expressão do RNAm e nos níveis

protéicos da catepsina L no músculo gastrocnemius de ratos em diferentes

fases da sepse. Além da catepsina L, os autores encontraram também uma

elevação na expressão do RNAm de outras catepsinas (C, D e H) e de

componentes do sistema proteolítico dependente de Ub-proteassoma.

Recentemente, Fareed et al., 2006 demonstraram que a presença de

inibidor da catepsina L no meio de incubação de músculos EDL de ratos

sépticos foi capaz de reduzir o aumento na proteólise total destes músculos.

Porém, quando estes mesmos músculos foram incubados na presença de

inibidores da catepsina B, nenhuma diferença foi encontrada em relação aos

valores de proteólise total. Encontraram também nestes animais aumento na

atividade proteolítica da calpaína e na expressão do RNAm da atrogin-1,

demonstrando assim que o aumento na atividade da catepsina L, juntamente

com outros sistemas proteolíticos, contribuem para o desenvolvimento da

atrofia muscular em ratos sépticos.

Somente um único trabalho na literatura (Dwyer et al., 2004) havia

mostrado previamente que as catecolaminas seriam capazes de controlar a

atividade de uma protease do processo lisossomal. Em ratas tratadas durante

10 dias com guanetidina, ocorreu um aumento na expressão do RNAm da

catepsina K no ligamento colateral médio em comparação aos animais não

simpatectomizados. Neste tecido, a catepsina K está envolvida em processos

de remodelamento ósseo por promover a degradação do colágeno tipo I.

Não houve nenhuma alteração na atividade da via proteolítica

lisossomal em músculos EDL de animais diabéticos simpatectomizados.

Parece que a presença ou ausência de insulina e catecolaminas em músculo

com predominância de fibras glicolíticas (tipo II) não promove nenhuma

alteração na participação deste processo proteolítico.

Desta maneira, o presente trabalho demonstra, pela primeira vez, que o

sistema nervoso simpático é capaz de exercer agudamente um controle na

Discussão 145

atividade das proteases do sistema lisossomal na musculatura oxidativa de

animais. As catecolaminas parecem inibir a atividade deste processo

proteolítico em situações de deficiência insulínica.

As alterações observadas em músculos EDL de ratos com 1 dia de

diabetes indicam que a falta das catecolaminas promove uma elevação ainda

maior nos valores de proteólise total (ver Figura 11), que pode ser explicado

pelo aumento na atividade da via dependente de cálcio (a qual já estava alta

em EDL de ratos diabéticos controles). Esses achados parecem demonstrar

que em músculos EDL, na deficiência de insulina, as catecolaminas

apresentam um efeito inibidor da proteólise dependente de cálcio pois, quando

esses hormônios ficam ausentes, os valores de proteólise aumentam e ficam

ainda mais elevados que os verificados nos músculos de ratos só diabéticos.

A elevação nos valores de proteólise total em soleus e EDL de ratos

após 1 dia de diabetes e simpatectomizados é também conseqüência de um

surpreendente aumento na atividade da via dependente de Ub-proteassoma. A

ausência de ambos os hormônios promoveu estimulação deste processo

proteolítico. Vale a pena lembrar que a presença de pelo menos um destes

(insulina ou catecolaminas) é capaz que inibir a atividade da via dependente de

Ub-proteassoma, justificando a hipótese de que cada um desses hormônios

parece exercer o papel do outro em uma situação de ausência aguda de um

deles, promovendo assim inibição deste processo proteolítico. Apenas quando

os dois estão ausentes é que se observa elevação da proteólise dependente de

Ub-proteassoma. Este resultado, juntamente com as observações de aumento

na atividade do sistema proteolítico lisossomal em soleus (até então nunca

observado em animais somente diabéticos ou somente simpatectomizados) e

do sistema dependente de cálcio em EDL (1 dia de diabetes), nos leva a

concluir que exista um cross-talk positivo entre as cascatas de sinalização da

insulina e das catecolaminas na musculatura esquelética. Este cross-talk

parece ser importante na manutenção da inibição da atividade de diferentes

processos proteolíticos, uma vez que a ausência de um destes hormônios

anabólicos poderia levar a uma perda de massa muscular excessiva.

Discussão 146

Recentemente, alguns trabalhos na literatura já elucidaram os intermediários

da cascata de sinalização da insulina responsáveis pela inibição da proteólise

muscular. Além disso, já foi demonstrado que estes intermediários do sinal da

insulina também participam da sinalização desencadeada pelas catecolaminas,

especificamente aquela envolvida com a ativação dos receptores β2-

adrenérgicos e subseqüente aumento de AMPc intracelular. Uma vez que a

segunda parte deste trabalho demonstrou que a PTX parece exercer suas

ações anabólicas através de elevação nos níveis deste nucleotídeo, a

descrição detalhada deste possível cross-talk anabólico entre o sinal da

insulina e das catecolaminas será demonstrada na segunda parte desta

Discussão e elucidada na Figura 47.

b) Proteólise total e vias proteolíticas em músculos de animais diabéticos simpatectomizados - 3 dias de diabetes As principais alterações observadas em relação ao metabolismo de

proteínas em músculos de animais após 3 dias de diabetes e

simpatectomizados estão relacionadas ao aumento na atividade do processo

proteolítico lisossomal em soleus (já descrito com detalhes anteriormente) e

também à curiosa queda na participação do sistema proteolítico dependente de

cálcio, em ambos os músculos. Talvez seja esta a razão do aumento nos

valores de proteólise total em soleus de animais diabéticos simpatectomizados

não ter sido tão grande neste período de diabetes (ver Figuras 10 e 18), apesar

do considerável aumento na atividade da via lisossomal. Este também parece

ser o motivo da falta de alteração nos valores de proteólise total em EDL de

ratos com 3 dias de diabetes e simpatectomizados, apesar da alta atividade da

via dependente de Ub-proteassoma em EDL, neste período (ver Figuras 11 e

19).

Uma possível explicação para esta queda na participação da via

dependente de cálcio em músculos de animais diabéticos (3 dias pós-STZ) na

falta das catecolaminas reside na possibilidade de um mecanismo contra-

regulatório que a insulina promove em relação ao sinal adrenérgico. Existem

vários trabalhos na literatura que demonstram a clara interação entre esses

Discussão 147

dois hormônios (Hadcock et al., 1992; Karoor & Malbon, 1998a; Doronin et al.,

2002a; Gavi et al., 2006), mostrando que o receptor β-adrenérgico é um

substrato-alvo do receptor enzimático da insulina e que, quando fosforilado em

determinados resíduos de tirosina (Tyr364 e especialmente Tyr350), ocorre a

internalização do adrenoceptor e perda do sinal adrenérgico (Baltensperger et

al. 1996; Karoor et al. 1998b). Assim, pode ser observado um desacoplamento

entre o receptor β2-adrenérgico e a proteína Gs, com subseqüente perda da

capacidade funcional de ativação da adenilato ciclase. Esta dessensibilização

do sinal adrenérgico ocorre porque as fosforilações dos resíduos de tirosina da

região C-ternimal do receptor β2-adrenérgico pelo receptor da insulina criam

sítios de interações com domínios SH2 de moléculas adaptadoras como Grb2,

dinamina e subunidade p85 da fosfatidilinositol 3-quinase (PI3-quinase). A

interação destas proteínas e o recrutamento de microfilamentos para a

formação de F-actina compõem a maquinaria responsável pela internalização

do receptor β-adrenérgico. Além disso, a própria ativação da proteína AKT pela

ação da insulina também tem um efeito importante na fosforilação de resíduos

de serina (Ser345 e Ser346) na região C-terminal do receptor adrenérgico, o que

parece favorecer a fosforilação dos resíduos de tirosina (Doronin et al., 2002b;

Shumai et al., 2003).

De acordo com estes trabalhos realizados por Malbon e colaboradores,

a internalização de receptores β2-adrenérgicos estimulada pela insulina pode

ser observada em diferentes tipos celulares, como células de musculatura lisa

DDT1MF-2, células de ovário de hamster CHO, adipócitos NIH3T3-L1 e células

de carcinoma humano A431. A característica comum entre estes tipos celulares

para o aparecimento do referido fenômeno reside na necessidade da

integridade do resíduo de Tyr350 do receptor β2-adrenérgico e ativação das

proteínas PI3-quinase e AKT.

Desta maneira, este mecanismo de contra-regulação poderia estar

ocorrendo, fisiologicamente, nos tecidos frente a situações de necessidade de

refinado controle dos mecanismos intracelulares onde um hormônio poderia,

desta maneira, compensar a ausência ou o excesso de outro. Neste sentido,

em nosso modelo experimental, devido à ausência de insulina promovida pela

Discussão 148

instalação do diabetes por um tempo um pouco mais prolongado, o processo

de internalização dos receptores β2-adrenérgicos nos tecidos, inclusive na

musculatura esquelética, ficaria comprometido; assim, haveria uma maior

exposição dos adrenoceptores tanto em soleus como em EDL destes animais

diabéticos simpatectomizados. Esta maior exposição de receptores β-

adrenérgicos na superfície celular fica ainda mais pronunciada pelos

mecanismos de up-regulation em decorrência da queda do conteúdo de

noradrenalina no tecido muscular após a administração de guanetidina;

provavelmente este fenômeno não aparece em tempos imediatos à

simpatectomia, sendo necessários períodos um pouco mais prolongados para

que o número de receptores realmente se altere. Isto poderia levar a uma

maior responsividade destes receptores às catecolaminas plasmáticas ainda

presentes nestes animais, uma vez que a simpatectomia química promovida

pela guanetidina não leva à completa depleção nos níveis de adrenalina

circulantes (ver Figura 5), apesar da redução drástica nas concentrações

musculares. Assim, através deste possível mecanismo compensatório utilizado

em uma situação “emergencial”, as catecolaminas (neste caso a adrenalina)

desencadeariam processos de sinalização via estimulação de proteína G,

geração de AMPc e ativação da PKA – proteína quinase dependente de AMPc

ou da Epac – Exchange protein directy activated by cAMP (proteína trocadora

diretamente ativada por AMPc), que levariam à inibição da via dependente de

cálcio. Esta inibição poderia ser através de fosforilação direta das calpaínas,

sendo assim inibidas, ou por ação no inibidor calpastatina (por fosforilação ou

aumento na formação do RNAm) (Navegantes et al., 2002). Esta seqüência de

eventos poderia, então, justificar a inesperada queda na participação da via

dependente de cálcio observada tanto em soleus quanto em EDL de animais

simpatectomizados após 3 dias de diabetes.

Este mecanismo contra-regulatório que a insulina pode exercer na

sinalização das catecolaminas em músculos de animais em situações especiais

também pode ser corroborado pela ação de outros hormônios e metabólitos, na

tentativa de promover um ajuste metabólico para a preservação da massa

muscular e sobrevivência do animal. Possíveis candidatos para este papel

Discussão 149

seriam os hormônios tireoidianos (Kettelhut et al., 1988), assim como ácidos

graxos e corpos cetônicos (Fagan et al., 1987; Saudek & Felig, 1976), assunto

que mereceria ser melhor estudado.

c) Proteólise total e vias proteolíticas em músculos de animais diabéticos simpatectomizados - 5 dias de diabetes

Após 5 dias de diabetes, a diminuição das catecolaminas induzida pela

administração da guanetidina não provocou nenhuma alteração nos valores de

proteólise total e na atividade das vias proteolíticas, tanto em soleus quanto em

EDL de ratos diabéticos, permanecendo iguais às observadas apenas nos

animais diabéticos controles (ver Figuras 18 e 19).

Desta maneira, parece que as catecolaminas influenciam a velocidade

dos processos de degradação de proteínas apenas nas fases agudas de

deficiência insulínica.

As diferenças encontradas nas respostas relacionadas ao metabolismo

protéico dos músculos soleus e EDL frente à ausência de insulina e

catecolaminas pode ser justificada pelo fato destes músculos apresentarem

diferenças quanto à responsividade a estes hormônios, diferença esta ligada ao

tipo de fibra predominante em cada um destes músculos.

Song et al. (1999) demonstraram que o músculo soleus, com

predominância de fibras oxidativas, apresenta maior responsividade à ação da

insulina, com níveis mais elevados de fosforilação do receptor da insulina (IR),

dos substratos do IR 1 e 2 (IRS-1 e IRS-2) e da proteína AKT, além de maior

atividade da enzima PI 3-quinase, em comparação às respostas encontradas

em músculos compostos principalmente de fibras glicolíticas (EDL e

epitrochlearis).

Estudando-se a densidade de receptores β-adrenérgicos na superfície

de células da musculatura esquelética com o ligante hidrofílico [3H]CGP 12177

(isto é, um composto que não atravessa a membrana plasmática, ligando-se

somente a receptores na superfície celular), Jensen et al. (2002) comprovaram

que a densidade de receptores do tipo β-adrenérgicos em músculos de fibras

Discussão 150

glicolíticas (como vastus lateralis branco e EDL) era de 30 a 35% menor em

comparação aos músculos soleus.

d) Síntese protéica em soleus de animais diabéticos simpatectomizados

O papel das catecolaminas na síntese protéica de animais diabéticos

foi verificado em músculos soleus de animais 1 e 3 dias após a injeção de STZ

e 1 e 2 dias após a administração de guanetidina. Além disso, foi estudado o

efeito da adição de 10-5M de adrenalina in vitro na síntese de proteínas destes

mesmos músculos.

A redução nos valores de síntese de proteínas em músculos de animais

diabéticos (1 e 3 dias pós-STZ) estão de acordo com dados prévios de nosso

laboratório (Pepato et al., 1996), bem como a ausência de efeito da adrenalina

in vitro na síntese protéica em músculos de animais normais (Navegantes et

al., 2004). No entanto, era de se esperar que a adrenalina adicionada ao meio

de incubação pudesse reverter ou reduzir a queda nos valores de síntese

protéica em soleus de ratos diabéticos, uma vez que dados anteriores do

laboratório comprovaram que adrenalina e clembuterol (agonista β2-

adrenérgico) in vitro eram capazes de aumentar a síntese protéica em soleus

de ratos jejuados, corroborando a hipótese de que as catecolaminas teriam um

efeito estimulatório na síntese de proteínas em situações de deficiência de

hormônios anabólicos (Navegantes et al., 2004).

No entanto, músculos soleus de animais diabéticos (1 e 3 dias pós-STZ)

não apresentaram alterações nos valores de síntese protéica (já reduzidos)

após a incubação na presença de adrenalina. Esta falta de responsividade dos

músculos de animais diabéticos poderia ser explicada pelas altas

concentrações de noradrenalina encontradas em soleus de animais após 1 ou

3 dias de deficiência insulínica. Os níveis elevados de catecolaminas

musculares em animais diabéticos poderiam ser responsáveis pelo efeito

clássico de down-regulation dos receptores β2-adrenérgicos neste tecido, o que

explicaria, portanto, a ausência de efeito da adrenalina in vitro. Como o tempo

de simpatectomia em animais com 1 dia de diabetes é consideravelmente

curto, pode-se supor que em soleus destes animais a exposição dos receptores

Discussão 151

adrenérgicos na membrana plasmática não tenha sido alterado, o que também

explicaria a ausência de resposta da catecolamina adicionada in vitro.

A simpatectomia foi capaz de promover uma redução adicional nos

valores de síntese protéica em músculos de animais com 1 dia de diabetes,

porém nenhuma alteração adicional foi observada em músculos de animais

simpatectomizados após 3 dias de diabetes.

No entanto, após 3 dias de diabetes e 2 dias de simpatectomia, as

concentrações musculares de catecolaminas que se encontram drasticamente

reduzidas pelo tratamento com guanetidina poderiam ser responsáveis, agora,

pelo aumento na densidade de receptores β2-adrenérgicos na membrana

plasmática neste tecido, levando a uma maior responsividade do músculo ao

sinal catecolaminérgico. Além disso, vale a pena ressaltar a possibilidade de

aumento ainda maior na exposição destes receptores corroborado pelo

mecanismo relacionado à falta de insulina, que portanto não estaria

promovendo internalização dos receptores β2-adrenérgicos (mecanismo

explicado anteriormente para justificar a queda na participação da via

dependente de cálcio em músculos de ratos diabéticos simpatectomizados no

3o dia de diabetes). Estas hipóteses poderiam, também neste caso, explicar o

aumento nos valores de síntese protéica promovido pela adrenalina in vitro em

soleus de animais com 3 dias de diabetes e simpatectomizados durante 2 dias.

Desta maneira, fica registrada a necessidade de investigar o número de

receptores β2-adrenérgicos na membrana plasmática de músculos de animais

diabéticos, nos diferentes tempos de simpatectomia.

Discussão 152

5.3) Papel da pentoxifilina no metabolismo de proteínas em músculos esqueléticos de animais diabéticos

A segunda parte deste trabalho se propôs a estudar o efeito da

pentoxifilina (inibidor da fosfodiesterase do AMPc) in vivo e in vitro no

metabolismo de proteínas em músculo esquelético de ratos jovens normais e

diabéticos. Além disso, foi investigado o papel in vivo e in situ da droga no

metabolismo protéico em músculo esquelético de ratos adultos submetidos às

mesmas condições.

A PTX previne o aumento da proteólise total, resposta característica do

diabetes, em músculo EDL 3 dias pós-STZ, através de sua ação em vias

proteolíticas específicas. É sabido que, neste tempo de diabetes, ocorre um

aumento nos valores de proteólise total em músculos EDL (Pepato et al.,

1996), promovido pela elevação nas participações dos sistemas proteolíticos

dependentes de cálcio e de Ub-proteassoma. Já o tratamento de animais

normais com PTX não levou a qualquer alteração nos valores de proteólise

total neste músculo. Vary et al. (1999) também não encontraram diferenças na

degradação protéica de músculos epitrochlearis obtidos de animais normais

tratados com PTX quando comparados aos controles não tratados. Porém,

estes mesmos autores verificaram que quando ocorre uma elevação na

proteólise total muscular em animais submetidos à situação de sepse induzida

por E. coli, pode ser observada uma nítida redução do catabolismo protéico

muscular após a administração de PTX.

A maioria dos trabalhos na literatura que comprovaram esta

capacidade da PTX na redução da proteólise não investigou qual(is) a(s) via(s)

proteolítica(s) eram afetada(s) pelo tratamento, analisando somente

parâmetros relacionados ao ganho de massa muscular ou à quantificação da

proteólise total em músculos incubados in vitro. Alguns outros estudos

demonstraram inibição na atividade e na expressão de componentes de

sistemas proteolíticos após o tratamento com PTX, mas estas alterações foram

encontradas somente em componentes dos processos proteolíticos lisossomal

e dependente de Ub-proteassoma. Assim, por exemplo, o aumento da

liberação de tirosina observado em músculos EDL de ratos portadores de

Discussão 153

sarcoma de Yoshida foi totalmente bloqueado após a administração de PTX

(Combaret et al., 1999). Este efeito foi atribuído à redução na atividade da via

dependente de Ub-proteassoma (aumentada em EDL de animais portadores do

câncer), uma vez que a PTX reduziu a expressão do RNAm da ubiquitina, da

enzima conjugadora E2 14KDa e da subunidade C2 do proteassoma 20S.

Deval et al. (2001) observaram que o aumento na expressão do RNAm

da catepsina L em músculos gastrocnemius e tibialis anterior de ratos em

situação de septicemia (indução por E. coli) foi parcialmente bloqueado após a

administração de PTX. No presente trabalho não foi encontrado qualquer efeito

da PTX na atividade da via lisossomal. Isto pode ser decorrente do fato desta

via não se encontrar alterada em EDL de ratos diabéticos e, portanto, a PTX

poderia não atuar em um sistema que se encontra em atividade basal.

Além de promover queda já esperada na atividade do sistema

proteolítico dependente de Ub-proteassoma, o tratamento in vivo com PTX, no

presente trabalho, promoveu inibição na participação da via dependente de

cálcio em EDL de ratos diabéticos. Trabalho de Costelli et al. (2002) também

comprovou esta ação anti-proteolítica muscular da PTX, mostrando ocorrer

queda na atividade proteolítica do proteassoma e da calpaína em músculos

gastrocnemius de ratos portadores de sarcoma de Yoshida AH-130 (situação

de comprovada atrofia muscular) após tratamento com PTX.

Esta ação anti-proteolítica da PTX tem sido atribuída ao seu papel

inibitório da síntese de TNF-α, citocina pró-inflamatória freqüentemente

associada a quadros de caquexia (Costelli et al., 1993; Goodman, 1991; Lin et

al., 2005). Desta maneira, parte da resposta anti-proteolítica promovida pela

PTX em ratos diabéticos poderia ser explicada pela redução nos níveis

plasmáticos da citocina, que estavam aumentados em comparação aos níveis

encontrados em animais normais (ver Figura 30). Não foi detectada nenhuma

alteração nas concentrações plasmáticas de TNF-α em ratos normais, tratados

ou não com PTX.

No entanto, a redução nas concentrações de TNF-α não seria capaz de

explicar o efeito anti-proteolítico da PTX encontrado em situações onde os

níveis plasmáticos da citocina permanecem inalterados. Recente trabalho de

Discussão 154

Hinkle et al. (2005) demonstrou que o tratamento de camundongos com

inibidores da fosfodiesterase do AMPc reduziram a perda de massa e função

muscular decorrente do desuso e da desnervação atrófica, situações onde não

são observadas alterações nas concentrações plasmáticas de TNF-α. Além

disso, foi demonstrado no presente trabalho que a PTX reduziu diretamente a

velocidade de degradação de proteínas, tanto em músculos de animais

normais quanto em músculos de animais diabéticos incubados in vitro na

presença da droga. Assim, uma outra hipótese provável para justificar esta

ação anti-proteolítica da PTX é o fato desta droga promover aumento nas

concentrações intracelulares de AMPc, uma vez que ela inibe diretamente a

enzima responsável pela degradação deste nucleotídeo cíclico, a

fosfodiesterase do AMPc. De fato, o presente trabalho encontrou elevação nas

concentrações intracelulares de AMPc em músculos de animais diabéticos

tratados in vivo com PTX (ver Figura 22) e em músculos de animais normais e

diabéticos incubados in vitro com a droga (ver Figura 33), em comparação aos

controles não tratados.

Uma vez que a PTX promove aumento nas concentrações de AMPc, o

efeito inibitório da degradação protéica pela xantina pode ser atribuído a um

mecanismo muito semelhante àquele estudado por Navegantes et al. (2002),

demonstrando a ação anti-proteolítica das catecolaminas. Com o aumento dos

níveis intracelulares de AMPc, poderia estar ocorrendo estimulação das vias de

sinalização ligadas à PKA e/ou à proteína Epac que conseqüentemente

estariam promovendo, através de mecanismos de modificação covalente direta

ou controle da expressão gênica, a inibição dos sistemas proteolíticos

responsáveis pela redução da proteólise muscular. Os dados apresentados no

presente trabalho comprovaram o envolvimento da PKA nas ações

desencadeadas pela PTX na musculatura esquelética. O efeito anti-proteolítico

in vitro da PTX foi completamente bloqueado após a incubação dos músculos

na presença de H89, um inibidor específico da PKA, efeito este observado em

EDL de animais normais e diabéticos. Este achado comprova a existência de

um mecanismo de ação direto da PTX, promovendo aumento nas

concentrações intracelulares de AMPc e estimulando a sinalização que envolve

Discussão 155

a PKA, que conseqüentemente estaria envolvida na prevenção da proteólise

muscular na musculatura esquelética.

Músculos de animais normais tratados com PTX não apresentaram

alterações nos valores de proteólise total quando comparados aos mesmos

animais não tratados. Em contraste, a adição de PTX ao meio de incubação

promoveu redução na proteólise total tanto em músculos de animais normais

quanto diabéticos. Uma possível explicação para esta resposta diferenciada em

músculos de animais normais pode estar ligada à insulina. Quando animais

normais são tratados in vivo com PTX, o aumento esperado nas concentrações

intracelulares de AMPc pode não ocorrer, devido ao mecanismo de ação

oposto da insulina, que estimula a atividade das fosfodiesterases do AMPc no

tecido muscular, que impede o aumento deste nucleotídeo, bloqueando a

redução da proteólise induzida pela PTX. Assim, pode ser sugerido que,

fisiologicamente, as ações do hormônio prevaleçam sobre as ações da droga

na musculatura esquelética. Esta hipótese foi corroborada pelo aumento nos

níveis de AMPc encontrados somente em músculos de animais diabéticos

tratados in vivo com PTX mas não em animais normais tratados com a droga.

Além disso, a adição de PTX ao meio de incubação, sem insulina, é

responsável pela elevação nas concentrações de AMPc e diminuição da

proteólise total nos músculos de animais normais (ver Figura 33). Finalmente,

esclarecendo o envolvimento da insulina no impedimento da ação da PTX, os

experimentos de adição do hormônio in vitro mostraram que a insulina é capaz

de bloquear totalmente o efeito anti-proteolítico da PTX, tanto em músculos de

animais normais quanto diabéticos (ver Figuras 33 e 34).

Em síntese, a PTX é capaz de promover uma redução nos valores de

proteólise total na musculatura esquelética através da inibição da atividade das

vias proteolíticas que se apresentam ativadas nos diabetes, as vias

dependente de cálcio e dependente de ATP-proteassoma, tanto em EDL de

animais diabéticos tratados in vivo quanto em EDL de animais normais e

diabéticos incubados in vitro com a droga. Corroborando estes dados, estudos

de Navegantes et al. (2001) demonstraram diminuição na atividade da via

proteolítica dependente de cálcio em músculos de animais normais incubados

Discussão 156

na presença de dibutiril AMPc (análogo de AMPc) ou isobutilmetilxantina

(inibidor não-específico da fosfodiesterase do AMPc). Assim, o aumento nas

concentrações musculares de AMPc podem explicar o efeito anti-proteolítico da

PTX, através de um mecanismo muito similar ao demonstrado por Navegantes

et al. (1999-2002, 2006), onde foi demonstrado que as catecolaminas, após

ligação aos receptores β2 e β3-adrenérgicos, ativam as vias intracelulares

dependentes de AMPc, que inibem a degradação protéica muscular pela

redução na atividade da via proteolítica dependente de cálcio.

O presente trabalho demonstrou que o conteúdo da proteína m-calpaína,

aumentado em EDL de animais diabéticos, foi reduzido após o tratamento

destes animais com PTX (ver Figura 28A), sugerindo que a diminuição na

participação da via proteolítica dependente de cálcio promovida pela droga seja

conseqüência de uma redução no conteúdo e/ou atividade das calpaínas. Além

da regulação da expressão das calpaínas, a redução na atividade desta

protease pela PTX também pode ser mediada por mecanismos de fosforilação

direta. Shiraha et al. (2002) demonstraram em fibroblastos que o fator de

crescimento epidermal ativa PKA e esta é capaz de fosforilar diretamente a m-

calpaína, inibindo sua atividade. Dados do presente trabalho mostram que o

aumento na atividade do sistema proteolítico dependente de cálcio observado

em músculos de animais diabéticos pode em parte ser explicado tanto pelo

aumento nos níveis de m-calpaína (ver Figura 28A) quanto pela redução nos

níveis de calpastatina, inibidor fisiológico das calpaínas (ver Figura 28B).

Embora os níveis de calpastatina não tenham sido alterados pelo tratamento

com PTX, não pode ser descartada a possibilidade de aumento na atividade

desta proteína em músculos de animais diabéticos tratados com PTX, através

de controle direto, via fosforilação. Pontremoli et al. (1992) demonstraram que a

calpastatina pode ser diretamente fosforilada in vitro pela PKA em músculo

esquelético, sendo aumentada sua atividade inibitória sobre as calpaínas.

Estas possibilidades merecem ser investigadas.

Discussão 157

Estudos anteriores relatam que o tratamento de ratos com derivados de

xantina promove redução na expressão de diferentes componentes do sistema

proteolítico dependente de ATP-proteassoma em animais com câncer

(Combaret et al., 1999) ou sepse (Combaret et al., 2002). Mais recentemente

foi demonstrado que o tratamento de ratos com clembuterol (agonista β2-

adrenérgico) atenua a atrofia muscular desencadeada pela falta de gravidade

(modelo de suspensão do animal pela cauda) através de redução na formação

dos conjugados poliubiquitinados em músculos fast plantaris e tibialis anterior

(Yimlamai et al. 2005). Assim, as ações da PTX podem ser atribuídas à

ativação da PKA, que conseqüentemente regularia a atividade do proteassoma

e/ou os processos de ubiquitinação de proteínas. A redução na alta expressão

do RNAm de atrogin-1 em músculos de animais diabéticos tratados com PTX

(ver Figura 29) corrobora esta hipótese. Da mesma maneira, Navegantes et al.

(2006, dados não publicados) encontraram inibição na atividade proteolítica

dependente de ATP-proteassoma e redução na expressão gênica de ubiquitina

ligases em músculos de ratos normais incubados in vitro na presença de

clembuterol ou isobutilmetilxantina.

Assim, a ação anti-proteolítica direta da PTX está ligada a um

mecanismo que envolve aumento nas concentrações intracelulares de AMPc e

ativação da PKA. No entanto, uma outra possibilidade é que a ação inibitória da

proteólise muscular ligada ao AMPc poderia ocorrer via ativação da AKT, um

intermediário da sinalização intracelular da insulina.

Trabalho de Mei et al. (2002) elucidou pela primeira vez a estimulação

da AKT por intermediários da cascata de sinalização do AMPc. Foi

demonstrado que o aumento dos níveis de AMPc promovido pela adição de

forskolina (ativador da adenilato ciclase) ou dibutitil AMPc, em cultura de

células HEK 293, ativa a Epac, sendo esta proteína capaz de aumentar os

níveis de fosforilação (e conseqüentemente ativação) da AKT. A integração

entre a sinalização que envolve AMPc e elevação nos níveis de fosforilação e

na atividade da AKT, por mecanismo independente de PKA, também já foi

observada em outros tipos celulares, como tecido adiposo marrom (Klein et al.

Discussão 158

1999), macrófagos (Misra & Pizzo, 2005), eosinófilos (Machida et al. 2005) e

musculatura esquelética (Brennesvik et al. 2005; Jensen et al., 2005).

Recentemente, uma série de trabalhos tem investigado a regulação

exercida pela insulina ou pelo IGF-1 no metabolismo protéico da musculatura

esquelética, especificamente na identificação das cascatas de sinalização

responsáveis pela regulação da massa muscular (revisões em: Glass, 2003;

Guttridge, 2004). Assim, foi demonstrado que a via PI3-quinase/AKT está

diretamente envolvida no controle exercido pela insulina na maquinaria de

degradação de proteínas em células musculares esqueléticas (Latres et al.,

2005; Nader, 2005). Neste contexto, uma das principais ações atribuídas à AKT

é a regulação inibitória de proteínas Foxo, fatores de transcrição que participam

no controle de processos biológicos relacionados ao metabolismo celular,

diferenciação e apoptose (Birkenkamp & Coffer, 2003; Tran et al. 2003; Barthel

et al., 2005). A AKT seria responsável em prevenir a atrofia muscular através

de fosforilação e inibição da atividade dos fatores de transcrição Foxo1 e

Foxo3a, que controlam a expressão de “atrogenes” que expressam enzimas do

tipo ubiquitina ligases (E3), componentes chave para o processo de

ubiquitinação das proteínas a serem degradadas pelo proteassoma (Sandri et

al, 2004; Stitt et al., 2004).

Baseado neste conjunto de dados que mostram que a AKT promove

inibição da degradação de proteínas e no fato de que a sinalização dependente

de AMPc pode ativar a AKT, outra hipótese para explicar os resultados do

presente trabalho seria que a AKT pudesse ser outro intermediário ligado às

ações anabólicas da PTX na musculatura esquelética. Além disso, vale aqui

ressaltar os resultados obtidos na primeira parte deste trabalho que

demonstraram um aumento surpreendente na participação das vias

proteolíticas dependentes de cálcio e de ATP-proteassoma em EDL de ratos

diabéticos submetidos a um quadro de simpatectomia aguda. Estas mesmas

vias, em contrapartida, foram inibidas em músculos EDL de ratos diabéticos

tratados in vivo e in vitro com PTX. Estas informações reforçam a possibilidade

da existência de intermediários comuns nas cascatas de sinalização do AMPc

e da insulina na regulação do metabolismo protéico (ver Figura 47). Assim, esta

Discussão 159

hipótese merece maiores estudos na tentativa de esclarecer quais os

intermediários envolvidos neste cross-talk.

O efeito anti-catabólico da PTX em músculo esquelético também foi

verificado em animais adultos, empregando-se para tal a metodologia da

microdiálise. As ações da in vivo e in situ da PTX foram estudadas em

músculos tibialis anterior de ratos normais e diabéticos (3 dias após a

administração de aloxana). O perfil de resposta observado nos animais foi

semelhante àquele encontrado no estudo realizado com músculos incubados in

vitro de animais jovens. Ocorreu um aumento nas concentrações de tirosina

intersticial muscular e plasmática de animais diabéticos adultos. Assim, o índice

I-A apresentou-se elevado em ratos diabéticos quando comparado aos

normais, indicando que o aumento da concentração intersticial de tirosina

resultante da deficiência insulínica foi decorrente de alterações metabólicas

locais, na musculatura (decorrente de aumento da degradação e/ou diminuição

da síntese de proteínas) e não de alterações no metabolismo protéico de

outros tecidos como fígado, intestino, etc. Em animais diabéticos tratados

durante 4 dias com PTX ocorreu uma redução nos valores de tirosina

intersticial, e conseqüentemente no índice I-A, em comparação aos ratos não

diabéticos tratados. Tal como encontrado nos animais jovens, ratos adultos

normais tratados com PTX não apresentaram alterações nos valores de tirosina

intersticial ou no índice I-A em comparação aos animais não tratados com a

droga.

A PTX adicionada ao meio de perfusão também foi capaz que promover

diminuição nos valores de tirosina intersticial em músculos de animais

diabéticos perfundidos, e o índice I-P apresentou-se menor nestes animais em

comparação aos ratos diabéticos não perfundidos com PTX. Nenhuma

alteração da PTX in situ foi observada em animais normais.

Apesar de não terem sido determinados os níveis plasmáticos de TNF-α

nos animais adultos utilizados nestes experimentos, pode-se sugerir que um

dos mecanismos de ação anti-proteolítica da PTX seja atribuído à redução nas

concentrações desta citocina no plasma de animais diabéticos tratados com a

Discussão 160

droga. Porém, não pode ser descartada a possibilidade de um efeito direto da

droga no metabolismo de proteínas na musculatura esquelética, considerando

a resposta anti-catabólica observada nos músculos de animais perfundidos

com a xantina. Esta última hipótese pode ser corroborada pelos estudos

recentes realizados em nosso laboratório por Lira e colaboradores (dados não

publicados), onde foi demonstrado um aumento local nos níveis de AMPc em

músculos tibialis anterior de ratos sépticos perfundidos in situ com

isobutilmetilxantina, um outro composto derivado de xantina que apresenta um

efeito anti-proteolítico in situ semelhante à PTX na musculatura esquelética.

Apesar de a PTX in vivo ser capaz de promover uma resposta anti-

proteolítica em músculos EDL de animais diabéticos, o tratamento durante 4

dias com esta droga não promoveu alterações na velocidade da síntese de

proteínas destes mesmos animais. Resultados similares também foram

encontrados por Combaret et al. (2002), que estudaram o efeito da torbafilina

(HWA 448), um derivado de xantina tal como a PTX, no metabolismo protéico

em EDL de animais portadores de sarcoma de Yoshida, tratados durante 9 dias

com a droga. Apesar da torbafilina promover redução na proteólise muscular,

também não foi encontrado efeito da droga na velocidade de síntese protéica

em músculos EDL de animais tratados.

Desta maneira, os resultados do presente trabalho demonstraram que a

PTX é capaz de promover redução na proteólise total e na participação das

vias proteolíticas dependente de cálcio e dependente de ATP-proteassoma em

músculos de animais diabéticos (efeito in vivo e in vitro) e normais (efeito in

vitro). Esta ação anti-proteolítica pode ser uma associação entre o efeito

indireto da PTX na redução das concentrações plasmáticas de TNF-α e um

efeito direto da droga promovendo aumento nos níveis intracelulares de AMPc.

Assim, este é o primeiro relato, tanto quanto saibamos, que a PTX é capaz de

inibir diretamente a proteólise muscular em uma situação clássica de atrofia

muscular, o diabetes. Estes achados apontam para a possibilidade de

Discussão 161

utilização da PTX ou seus derivados no tratamento de quadros agudos de

atrofia muscular em diferentes situações de perda de massa corporal.

A Figura 47 elucida as diferentes possibilidades de cross-talk entre os

intermediários da sinalização da insulina e das catecolaminas que poderiam

levar a uma inibição na expressão e/ou atividade de diferentes componentes

dos sistemas proteolíticos na musculatura esquelética.

Discussão 162

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