UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO INSTITUTO DE FÍSICA DE ... - …...ROMANELLO, L. Studies of adenosine kinase isoform 1, hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase isoforms 1, 2 and

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO INSTITUTO DE FÍSICA DE SÃO CARLOS

LARISSA ROMANELLO

Estudos das enzimas adenosina kinase isoforma 1, hipoxantina-guanina

fosforibosiltransferase isoformas 1, 2 e 3, adenilsuccinato liase,

adenilsuccinato sintetase de Schistosoma mansoni

São Carlos 2016

LARISSA ROMANELLO

Estudos das enzimas adenosina kinase isoforma 1, hipoxantina-guanina

fosforibosiltransferase isoformas 1, 2 e 3, adenilsuccinato liase,

adenilsuccinato sintetase de Schistosoma mansoni

Versão Original

São Carlos 2016

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Física do Instituto de Física de São Carlos da Universidade de São Paulo, para a obtenção do título de Doutora em Ciências. Área de concentração: Física Aplicada Opção: Física Biomolecular Orientador: Prof. Dr. Humberto D´Muniz Pereira

AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTETRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO PARAFINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.

Ficha catalográfica revisada pelo Serviço de Biblioteca e Informação do IFSC, com os dados fornecidos pelo(a) autor(a)

Romanello, Larissa Estudos das enzimas adenosina kinase isoforma 1,hipoxantina-guanina fosforibosiltransferaseisoformas 1, 2 e 3, adenilsuccinato liase,adenilsuccinato sintetase de Schistosoma mansoni. /Larissa Romanello; orientador Humberto D`MunizPereira -- São Carlos, 2016. 160 p.

Tese (Doutorado - Programa de Pós-Graduação emFísica Biomolecular) -- Instituto de Física de SãoCarlos, Universidade de São Paulo, 2016.

1. Schistosoma mansoni. 2. Via de salvação depurinas. 3. Hipoxantina-Guanina. 4.Fosforibosiltransferase. 5. Adenilsuccinato Liase.I. Pereira, Humberto D`Muniz, orient. II. Título.

FOLHA DE APROVAÇÃO

Larissa Romanello

Tese apresentada ao Instituto de Física de São Carlos da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Doutora em Ciências. Área de Concentração: Física Aplicada - Opção: Física Biomolecular.

Aprovado(a) em: 03/06/2016

Comissão Julgadora Dr(a). Humberto D'Muniz Pereira

Instituição: (IFSC/USP)

Dr(a). Andrea Soares da Costa Fuentes

Instituição: (UFSCar/São Carlos)

Dr(a). Carlos Henrique Inacio Ramos

Instituição: (UNICAMP/Campinas)

Dr(a). Ariel Mariano Silber

Instituição: (ICB/USP)

Dr(a). Richard John Ward

Instituição: (FFCLRP/USP)

Dedicado à minha mãe Vera Aparecida Horvatte, meu maior

exemplo de vida, de força, de espiritualidade e de amor.

AGRADECIMENTOS

Ao meu orientador Humberto pelos anos de convivência e aprendizado constante. Que na

ausência do meu pai, ao longo desses anos foi minha referência como tal. Gratidão por me

dizer “sim” em 2008 e sempre acreditar no meu trabalho. Todo o crescimento pessoal e

profissional nesse período, assim como as conquistas materiais são frutos dessa confiança e

companheirismo. Você é e sempre será pra mim uma grande referência como profissional e

orientador.

À Deus pela presença constante em meu viver. Por me proporcionar experiências e pessoas

grandiosas ao longo dessa jornada.

À minha amada mãe Vera e minhas queridas irmãs Karen e Vanessa pelo suporte familiar e

apoio incondicional.

Ao meu companheiro Rafa (Bonito) por me ensinar sobre o amor na mais pura essência. Por

todo suporte emocional e por tornar a minha vida mais completa e feliz todos os dias. Eu não

teria conseguido sem você.

Aos queridos irmãos que a generosidade da vida me proporcionou Tati, Renan, Tiago e

Serginho.

Às tchubis Aline, Fá e Josi por sempre me lembrarem como é maravilhoso ser rodeada de

pessoas tão iluminadas.

Às negas Daia e Lívia por tão especial amizade desde meu primeiro dia na USP.

Aos meus amigos da Bio 05, que muito além de amigos, são uma grande família.

Ao amigo Alexandre Cassago por toda paciência e ensinamentos na minha iniciação na

ciência.

Aos colaboradores do projeto José Brandão-Neto, Louise Bird, Joanne Nettleship, Ray

Owens, Yamini Reddivari, Dr. Ricardo De Marco, Vitor Hugo Balasco Serrão e Ana Elisa

Zeraik.

Aos professores do LBest Dr. Richard Charles Garratt, Dr. Otávio Henrique Thiemann e Dr.

Eduardo Horjales.

Aos amigos do LBest: Bianca, Michel, Taty, Túlio, Gabi, Fer, Paola, Alan, Matheus, Naty,

Tomás, Diego, Juliana, Marília, Ivan e Suzana e todos os outros que tive a oportunidade de

conviver ao longo desses anos.

Aos queridos amigos que passaram pelo lab Maycou, Malu, Bachega, Ivani e Gustavo pelos

maravilhosos dias de convivência e tão valiosa amizade.

Ao amigo Angelo Fragelli, que como proprietário da Orion Bartenders me deu grande suporte

no início no doutorado sem bolsa.

Aos amigos do centro espírita Murilo, Nicole, Alex, Bianca, Diogo, Victor e Erik.

À todos que de alguma forma contribuíram para a realização desse sonho.

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) e ao Conselho

Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo suporte financeiro.

“Que eu jamais me esqueça que Deus me ama infinitamente, que um pequeno

grão de alegria e esperança dentro de cada um é capaz de mudar e transformar

qualquer coisa, pois...

A vida é construída nos sonhos e concretizada no amor.”

CHICO XAVIER

RESUMO

ROMANELLO, L. Estudos das enzimas adenosina kinase isoforma 1, hipoxantina-

guanina fosforibosiltransferase isoformas 1, 2 e 3, adenilsuccinato liase, adenilsuccinato

sintetase de Schistosoma mansoni. 2016. 160 p. Tese (Doutorado em Ciências) - Instituto de

Física de São Carlos, Universidade de São Paulo, São Carlos, 2016.

O Schistosoma mansoni, parasita responsável pela esquistossomose (barriga d’água), doença

que afeta cerca de 300 milhões de pessoas em todo mundo, não possui a via de síntese de

purinas, dependendo integralmente da via de salvação de purinas para seu suprimento dessas

bases. Uma vez que a terapia se resume a administração de um único fármaco, o praziquantel,

diversos casos de resistência do parasita a esse medicamento foram reportadas, sendo assim

esta via tem sido citada como alvo potencial para o desenvolvimento de novos fármacos

contra a doença. As enzimas adenosina kinase (AK), hipoxantina-guanina

fosforibosiltransferase (HGPRT), adenilsuccinato liase (ADSL) e adenilsuccinato sintetase

(ADSS) são enzimas chave desta via. Este trabalho faz parte de um projeto maior que visa a

obtenção de todas as estruturas das enzimas envolvidas na via de salvação de purinas de

Schistosoma mansoni. O cDNA correspondente às enzimas foi amplificado e clonado no vetor

de expressão pOPIN; as enzimas AK isoforma 1, HGPRT isoforma 1 e ADSL foram

expressas em E. coli Lemo21(DE3) e HGPRT isoforma 3 em E. coli B834(DE3); purificadas

em coluna de cobalto agarose por afinidade, concentradas e cristalizadas no kit de

cristalização Morpheus (Molecular Dimensions) no Oxford Protein Production Facility

(OPPF) em Harwell – UK. As coletas de dados por difração de raio-X foram realizadas no

Síncrotron Diamond Light Source (DLS) - UK. Foram coletadas duas estruturas de ADSL, a

2.36Ǻ de resolução em complexo com AMP e 2.14Ǻ na forma Apo. A análise das estruturas

revelou uma estrutura tetramérica bastante conservada entre as ADSLs, sendo este estado de

oligomerização requerido, uma vez que resíduos de três das quatro subunidades compõem o

sítio ativo. Apesar do sítio ativo ser altamente conservado entre SmADSL e ADSL humana, a

interface dimérica dessas enzimas tem se apresentado suficientemente distintas, o que pode

representar um potencial alvo para o desenvolvimento de um inibidor. O ensaio de atividade

enzimática de ADSL revelou uma reação endotérmica, indicando que a contribuição da

entropia relacionada a grande quantidade de moléculas de água presentes no sítio ativo é

importante para a reação cinética. Após diversos experimentos de otimização dos cristais de

HGPRT1 e aproximadamente 200 cristais testados, foi obtida uma estrutura em complexo

com IMP a 2.8Ǻ de resolução. A análise da estrutura revelou uma estrutura tetramérica.

Apesar das subunidades não compartilharem o sítio ativo, este estado de oligomerização é

requerido, uma vez que resíduos que compõem o sítio ativo também estão envolvidos em

interações na interface dimérica, orientando o resíduo invariável Arg206 na direção do sítio

ativo. Foram identificadas quatro mutações na região do sítio ativo entre SmHGPRT e

HGPRT humana: Ile149Met, Pro176Arg, Val189Ile e Arg192Lys. Desta forma, a obtenção

das estruturas contribui para o entendimento bioquímico desta via essencial para o parasita e

de como este pode ser seletivamente privado de recursos.

Palavras-chave: Schistosoma mansoni. Via de salvação de purinas. Hipoxantina-Guanina.

Fosforibosiltransferase. Adenilsuccinato Liase.

ABSTRACT

ROMANELLO, L. Studies of adenosine kinase isoform 1, hypoxanthine-guanine

phosphoribosyltransferase isoforms 1, 2 and 3, adenylosuccinate lyase, adenylosuccinate

synthetase enzymes from Schistosoma mansoni. 2016. 160 p. Tese (Doutorado em

Ciências) - Instituto de Física de São Carlos, Universidade de São Paulo, São Carlos, 2016.

Schistosoma mansoni is the parasite responsible for schistosomiasis, disease that affects about

300 million people worldwide, and does not have the purine “de novo” pathway, depending

entirely on the purine salvage pathway to supply its demands on purines. Currently, both

direct treatment and most disease control initiatives, rely on chemotherapy using a single

drug, praziquantel. Concerns over the possibility of resistance developing to praziquantel, has

stimulated efforts to develop new drugs for the treatment of schistosomiasis. The purine

salvage pathway has been reported as a potential target for developing new drugs against

schistosomiasis. Adenosine kinase (AK), hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase

(HGPRT), adenylosuccinate lyase (ADSL), adenylosuccinate synthetase (ADSS) are key

enzymes in this pathway. This work is part of a larger project aimed at obtaining all the

structures of enzymes involved in purine salvage pathway of Schistosoma mansoni. The

cDNA corresponding to the enzymes was amplified and cloned in vector pOPIN, AK isoform

1, HGPRT isoform 1 and ADSL were expressed in E. coli Lemo 21 (DE3) and HGPRT

isoform 3 in E. coli B834(DE3); purified in cobalt agarose column, concentrated and

crystallized in several conditions of the Morpheus (Molecular Dimensions) crystallization kit

at the Oxford Protein Production Facility (OPPF) in Harwell – UK. The data collection by x-

ray diffraction were performed at Diamond Light Source – UK. Two ADSL structures were

obtained, ADSL in complex with AMP at 2.36Ǻ resolution and ADSL Apo form at 2.14Ǻ.

The analysis revealed a tetrameric structure highly conserved between ADSLs, and this

oligomerization state is required since residues three of the four subunits comprise the active

site. Despite the active site being highly conserved between human ADSL and SmADSL, the

dimeric interface of these enzymes it has been shown sufficiently distinct, which may

represent a potential target for the development of an inhibitor. The ADSL enzymatic activity

assay showed an endothermic reaction, indicating the contribution of the entropy related to

the large quantity of water molecules present in the active site is important for the reaction

kinetics. After several optimization experiments of HGPRT1 crystals and about 200 crystals

tested was obtained a structure in complex with IMP at 2.8Ǻ resolution. The structure analysis

revealed a tetrameric structure. Despite the subunits do not share the active site, this

oligomerization state is required, since residues that make up the active site are also involved

in interactions in dimeric interface, guiding the invariable residue Arg206 toward the active

site. Four mutations were identified in the region of the active site between SmHGPRT and

human HGPRT: Ile149Met, Pro176Arg, Val189Ile e Arg192Lys. These structures increase

the important structural information available about the Schistosoma mansoni purine salvage

pathway and how it can be selectively private resources.

Keywords: Schistosoma mansoni. Purine salvage pathway. Hypoxanthine-guanine

phosphoribosyltransferase. Adenylosuccinate lyase.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Levantamento dos países endêmicos para esquistossomose em 2014................... 32

Figura 2 - Ciclo de vida do Schistosoma. Ovos são eliminados nas fezes ou urina, em

condições ideais há eclosão dos ovos e liberação de miracídios, que nadam

e penetram em hospedeiros intermediários específicos (moluscos). Os

estágios no caramujo incluem duas gerações de esporocistos e a produção

de cercárias. Após liberadas do caramujo, as cercárias infectantes nadam e

penetram na pele do hospedeiro humano, perdem sua cauda, passando a ser

esquistossômulo. (, ) Os esquistossômulos migram através de diversos

tecidos para se instalarem as veias. Os vermes adultos nos seres humanos

residem nas vênulas mesentéricas em várias localizações, que parecem ser

específicas para cada espécie. As fêmeas (com tamanho de 7 a 20 mm,

macho um pouco menor) depositam ovos em pequenas vênulas do sistema

portal e perivesical. Os ovos são movidos progressivamente para o lúmen do

intestino (S. mansoni e S. japonicum) e da bexiga e ureteres (S.

haematobium), e são eliminados com as fezes ou urina, respectivamente. ........... 33

Figura 3 - Origem dos átomos do anel de purinas (via de novo). .......................................... 35

Figura 4 - Esquema das vias de conversão de adenosina em nucleotídeos em S.

mansoni. ADA - adenosina desaminase, PNP - purina nucleosídeo

fosforilase, HGPRT - hipoxantina guanina fosforibosiltransferase, APRT -

adenina fosforibosiltransferase, AK - adenosina kinase, ADK - adenilato

kinase, NDPK - nucleosídeo difosfato kinase, MTAP - metiltioadenosina

fosforilase, ADSL - adenilosuccinato liase, ADSS - adenilosuccinato

sintase, IMPDH - inosina-5'-fosfato desidrogenase, GMPS - guanilato

sintase, GK - guanilato kinase. Em destaque com contorno vermelho as

enzimas alvo de estudo deste projeto, e as estruturas das enzimas já

resolvidas por nosso grupo de pesquisa. ................................................................ 36

Figura 5 - Estrutura cristalográfica da enzima adenosina kinase de Schistosoma

mansoni em modelo de fitas. Pode ser observada a ligação de uma molécula

de adenosina e uma de AMP na estrutura. ............................................................. 40

Figura 6 - Análise do nível de expressão de RNAms da via de salvação de purinas por

PCR em tempo real. O número de cópias dos genes foi normalizado para a

tubulina pela divisão do número de cópia de cada gene pelo número de

cópias de tubulina em cada reação de cDNA. Um nível de expressão de um

indica que o nível de expressão é equivalente à tubulina. Adenilosuccinato

liase – barra branca; adenina fosforibosiltransferase – barra preta;

hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase – barra cinza. ................................... 43

Figura 7 - Segundo passo do procedimento de purificação do produto de amplificação

de cDNA por PCR utilizando o sistema de purificação por interação

magnética. .............................................................................................................. 48

Figura 8 - Esquema da construção dos vetores pOPIN, cedidos pelo grupo OPPF................ 49

Figura 9 - Análise da expressão-teste das enzimas em E.coli Lemo21(DE3) no meio de

cultura Power BrothTM

em gel SDS-PAGE. Padrão de preso molecular.

ADSS – pOPIN S3C, TRX, E, F e M (A1. B1, C1, D1 e E1

respectivamente). IMPDH – pOPIN S3C, TRX, E, F e M (F1, G1, H1, A2 e

B2 respectivamente). ADSL - pOPIN S3C, TRX, E, F e M (C2, D2, E2, F2

e G2 respectivamente). HGPRT short -pOPIN S3C, TRX, E, F (H2, A3, B3

e C3). HGPRT 148820 -pOPIN S3C, TRX, E, F (D3, E3, F3 e G3). HGPRT

168500-pOPIN S3C, TRX, E, F (H3, A4, B4, C4). PNP2 - pOPIN S3C, M

eTRX (D4, E4 e F4). NDPK -pOPIN S3C, TRX, E e F (G4, H4, A5, B5).

AK1 - pOPINF e S3C (C5 e D5). GMPS- pOPIN S3C, TRX, E, F e M (H5,

A6, B6, C6, D6). GK - pOPIN S3C, TRX, E e F (E6, F6, G6 e H6). .................... 52

Figura 10 - Análise da expressão-teste em gel SDS-PAGE, do lado esquerdo, expressão

em E.coli Lemo21(DE3) e indução com IPTG; do lado direito, expressão

em E.coli Lemo21 (DE3) em meio de auto indução ONEX. Padrão de preso

molecular. ADA – pOPINE, F, S3C, TRX, e M (C7, D7, E7, F7, G7).

NDPK short– pOPINE, F, S3C, TRX, e M (H7, A8, B8, C8, D8). NDPK

large– pOPINE, F, S3C, TRX, e M (E8, F8, G8, H8, A9). IMPDH short–

pOPINE, F, S3C, TRX, e M (B9, C9, D9, E9, F9). IMPDH large– pOPINE,

F, S3C, TRX, e M (G9, H9, A10, B10, C10). ADSS– pOPINE, F, S3C,

TRX, e M (D10, E10, F10, G10, H10). Esta sequência se repete no teste de

expressão utilizando o meio de auto indução ONEX. ............................................ 54

Figura 11 - Análise da purificação das enzimas AK1 e HGPRT1 em gel de

poliacrilamida 15%. Poço 1: Marcador de peso molecular. Poço 2 - 7.

Enzima AK1 (42KDa). Poço 9 - 17: Enzima HGPRT1 (24 kDa). ........................ 56

Figura 12 - Análise da purificação da enzima HGPRT3 em gel de poliacrilamida 15%.

Poço 1: Marcador de peso molecular. Poço 6 - 18. Enzima HGPRT3 (24

kDa). ....................................................................................................................... 56

Figura 13 - Análise da purificação da enzima ADSL em gel de poliacrilamida 15%.

Poço 1: Marcador de peso molecular. Poço 2, 3 e 4: Lavado. Poço 5 - 8.

Enzima ADSL (54.5 kDa). ..................................................................................... 57

Figura 14 - Cristais de HGPRT1 à 2,5mg/mL de proteína incubada com IMP à 18ºC na

condição A4 do kit Morpheus. ............................................................................... 62

Figura 15 - Análise da purificação da enzima HGPRT1SeMet em gel de poliacrilamida

15%. Poço 1: Marcador de peso molecular. Poço 2. Expressão da enzima.

Poço 3: Eluato. Poço 4: Lavado. Poço 5 e 6: Eluição da enzima (24kDa). ........... 64

Figura 16 - Cristais de HGPRT1 com selenometionina na condição de cristalização B3

do Bloco 1. ............................................................................................................. 68

Figura 17 - Cristal de ADSL da condição E12 do kit de cristalização Morpheus (30mM

de etilenos glicóis, 120mM de Tris base/bicina pH8.5, 12.5% de MPD,

PEG1000 e PEG3350). .......................................................................................... 69

Figura 18 - Mapa de densidade eletrônica (Fo-Fc) para o AMP no sítio ativo da ASDL

de S.mansoni. O sítio ativo é formado pela participação de três das quatro

subunidades da enzima. ......................................................................................... 72

Figura 19 - Diagrama de Ramachandran com a distribuição dos ângulos diedros para a

estrutura ADSL-AMP. A região representada em vermelho corresponde à

região mais favorável para os valores dos ângulos, a região amarelo escuro é

a adicionalmente permitida, amarelo claro é a generosamente permitida e a

região em branco é a região não permitida. As glicinas são representadas por

triângulos. .............................................................................................................. 74


estrutura ADSL-Apo. A região representada em vermelho corresponde à




triângulos. .............................................................................................................. 75

Figura 21 - Estrutura de ADSL de S. mansoni (monômero) é composta por 3 domínios:

domínio I (vermelho), domínio II (azul) e domínio III (amarelo). ........................ 76

Figura 22 - Estrutura secundária de SmADSL em complexo com AMP em função da

sequência de aminoácidos. As fitas β são representadas por setas rosas, as α-

hélices por espirais roxas com a respectiva numeração em cima (H1,

H2...H25), as 2 folhas β são classificadas como A e B, sendo essas letras

colocadas acima das fitas identificando a qual folha pertencem. Os

símbolos: β - beta turn, γ - gamma turn e - beta hairpin. .................................. 77

Figura 23 - Topologia de ADSL-AMP. As fitas β são representadas por setas rosa, as α-

hélices em tubos vermelhos e os loops em azul. O N-terminal é indicado

pela letra N e o C-terminal pela letra C. ................................................................ 78

Figura 24 - Alinhamento de ADSL humana e de Schistosoma mansoni. A primeira linha

corresponde à estrutura secundária formada, a segunda linha a sequência de

aminoácidos de ADSL de S. mansoni e a terceira linha de ADSL humana.

Os resíduos brancos grifados em vermelho são conservados nas duas

estruturas, os em vermelho grifados em branco são os resíduos não

conservados, porém similares. ............................................................................... 80

Figura 25 - Análise das regiões conservadas à partir do alinhamento da sequência de

aminoácidos de ADSL de S. mansoni e ADSL humana. A. Regiões

conservadas destacadas em vermelho. B. Resíduos idênticos entre ambas

destacados em pink. ............................................................................................... 81


aminoácidos de ADSL de S. mansoni com todas as ADSLs depositadas no

PDB. Regiões conservadas destacadas em degradê de vermelho a branco,

da mais conservada a não conservada respectivamente. Resíduos idênticos

entre as estruturas destacados em pink. .................................................................. 82

Figura 27 - Estrutura dimérica de SmADSL em complexo com AMP (preto)

(subunidade A: verde, subunidade B: vermelho). .................................................. 83

Figura 28 - Estrutura tetramérica de SmADSL em complexo com AMP (preto)

(subunidade A: verde, B: vermelho, C: amarelo, D: azul). .................................... 84

Figura 29 - Sobreposição do monômero da ADSL-AMP (vermelho) com os monômeros

da ADSL-APO (azul). A maior diferença é observado no domino III, que

possui orientação diferente em A e é parcialmente desordenado em B. ................ 85

Figura 30 - Sobreposição dos tetrâmeros da S. mansoni em complexo com AMP

(vermelho) e APO (azul) o RMSd é de 1.14Å. ...................................................... 86

Figura 31 - Sobreposição das estruturas de ADSL de S.mansoni (monômero) em

vermelho e ADSL humana em amarelo. AMP em preto. RMSd = 0,589Å. .......... 87

Figura 32 - Sobreposição das ADSL de S. mansoni (ADSL-AMP vermelho), (APO-

azul) contra a ADSL humana em complexo com AMP (amarelo). ....................... 88

Figura 33 - Participação de três das quatro subunidades da enzima SmADSL em

complexo com AMP na formação do sítio ativo. ................................................... 89

Figura 34 - Ligações de hidrogênio (pontilhado amarelo) do ligante AMP no sítio ativo

de SmADSL. ........................................................................................................... 90

Figura 35 - Modelo esquemático para a ligação da AMP no sítio ativo da ADSL de S.

mansoni. ................................................................................................................. 91

Figura 36 - Loop correspondente a sequência de aminoácidos de 281 à 293 na

SmADSL-AMP correspondente à região conservada considerada a

assinatura das enzimas da superfamília de β-eliminação na região do sítio

ativo. ....................................................................................................................... 92

Figura 37 - Loop correspondente a sequência de aminoácidos de 281 à 293 na

SmADSL-Apo correspondente à região conservada considerada a assinatura

das enzimas da superfamília de β-eliminação na região do sítio ativo. ................. 93

Figura 38 - Sobreposição dos loops de ADSL-AMP (amarelo) e ADSL-Apo (verde)

onde a conformação da Arg291 e Lys290 difere entre ambos. .............................. 94

Figura 39 - Sobreposição dos sítios de ligação ao AMP nas ADSLs de S mansoni

(Branco-AMP e amarelo-APO) e humana (magenta). .......................................... 95

Figura 40 - ADSL catalisa a clivagem de adenilsuccinato (ADS) em AMP e Fumarato......... 96

Figura 41 - Esquema geral mostrando a clivagem de adesnilosuccinato (SAMP) pela

enzima ADSL. Os 5 passos envolvidos são: (1) Abstração de um próton pela

base catalítica (B) do átomo CB do grupo succínico; (2) estabilização do

carbânion intermediário formado; (3) protonação de N1 ou N6 da porção do

AMP pelo ácido catalítico; (4) clivagem da ligação de Cα-N entre AMP e o

grupo succínico; e (5) liberação dos produtos AMP e fumarato. .......................... 97

Figura 42 - Posicionamento estrutural em SmADSL dos resíduos identificados cujas

mutações implicam na deficiência severa de ADSL em humanos e

consequentemente retardo mental em pacientes. ................................................. 100

Figura 43 - Posicionamento do resíduo Lys241 em SmADSL na interface dimérica A-B. ... 101

Figura 44 - Ligações de hidrogênio (pontilhado amarelo) entre os resíduos Lys241A

com Thr256B, Asp176B e Asn252B em SmADSL. ............................................ 102

Figura 45 - Posicionamento do resíduo Arg298 em SmADSL na interface B-C. .................. 103

Figura 46 - Ligações de hidrogênio (pontilhado amarelo) entre os resíduos Arg298B,

Ile480B, Glu75C, Arg14B e uma molécula de água como mediadora em

SmADSL. ............................................................................................................. 104

Figura 47 - Determinação da entalpia molar aparente (ΔHapp) de ADS. ................................ 106

Figura 48 - Determinação da entalpia molar aparente (ΔHapp) de SAICAR. ......................... 106

Figura 49 - Moléculas de água (esferas vermelhas) presentes em um dos quatro sítios

ativos da estrutura SmADSL-Apo. ...................................................................... 107

Figura 50 - Determinação da entalpia molar aparente (ΔHapp) de AICAR. ........................... 108

Figura 51 - Determinação da entalpia molar aparente (ΔHapp) de fumarato/AICAR. ΔH

~0 – sem reação. .................................................................................................. 108

Figura 52 - Determinação da entalpia molar aparente (ΔHapp) de AMP. ............................... 109

Figura 53 - Determinação da entalpia molar aparente (ΔHapp) de Fumarato. ΔH ~0 –

sem reação. .......................................................................................................... 109

Figura 54 - Cinética enzimática de SmADSL para ADS. ....................................................... 110

Figura 55 - Cinética enzimática de SmADSL para SAICAR. ................................................. 111

Figura 56 - Esquerda: Cristais de HGPRT1 à 2,5mg/mL de proteína incubada a 18ºC na

condição A4 do kit Morpheus. Direita: Cristal em loop, coletado à 2,8Å de

resolução por difração de raio-X. ......................................................................... 114

Figura 57 - Mapa de densidade eletrônica fo-fc na região do sítio ativo das quatro

subunidades (A, B, C e D) da enzima HGPRT1 de S. mansoni. É possível

observar a densidade correspondente ao ligante IMP. ......................................... 116


estrutura HGPRT-IMP. A região representada em vermelho corresponde à




triângulos. ............................................................................................................. 118

Figura 59 - Estrutura de HGPRT de S. mansoni (monômero) é composta por 2

domínios: domínio Hood (vermelho), domínio Core (azul). ............................... 119

Figura 60 - Estrutura secundária de SmHGPRT em complexo com IMP em função da

sequência de aminoácidos. As fitas β são representadas por setas rosas, as α-

hélices por espirais roxas com a respectiva numeração em cima (H1,

H2...H25), as 2 folhas β são classificadas como A e B, sendo essas letras

colocadas acima das fitas identificando a qual folha pertecem. Os símbolos:

β - beta turn, γ - gamma turn e - beta hairpin. ................................................. 120

Figura 61 - Topologia de SmHGPRT-IMP gerada pelo PDB sum. As fitas β são

representadas por setas rosa, as α-hélices em tubos vermelhos e os loops em

azul. O N-terminal é indicado pela letra N e o C-terminal pela letra C. .............. 121

Figura 62 - Alinhamento de HGPRT humana (1HMP) e de Schistosoma mansoni em

função da estrutura secundária. Os resíduos brancos grifados em vermelho

são conservados nas duas estruturas, os em vermelho grifados em branco

são os resíduos não conservados, porém similares. A quarta linha

corresponde a exposição dos resíduos ao solvente, em azul escuro os mais

expostos, azul claro podem estar expostos e branco hidrofóbicos. ...................... 122


aminoácidos de HGPRT de S. mansoni e HGPRT humana. A. Regiões

conservadas destacadas em vermelho. B. Resíduos idênticos entre ambas

destacados em pink. ............................................................................................. 123


aminoácidos de HGPRT de S. mansoni com todas as HGPRTs depositadas

no PDB. Regiões conservadas destacadas em degradê de vermelho a

branco, da mais conservada a não conservada respectivamente. Resíduos

idênticos entre as estruturas destacados em pink. ................................................ 124

Figura 65 - Estrutura tetramérica de SmAHGPRT em complexo com IMP (preto)

(subunidade A: amarelo, B: magenta, C: azul, D: verde). ................................... 126

Figura 66 - Sobreposição das quatro subunidades da estrutura tetramérica de HGPRT. A

– vermelho, B – amarelo, C- azul e D verde. ...................................................... 127

Figura 67 - Sobreposição das estruturas de HGPRT de S.mansoni (monômero) em

vermelho e ADSL humana em amarelo. RMSd = 1,154 Å. ................................ 128

Figura 68 - Localização do sítio ativo na interface dos domínios “core” (azul) e “hood”

(vermelho) e compreende 4 loops, I – IV. ........................................................... 129

Figura 69 - Loop I correspondente aos resíduos de 73 à 78 (VLKGGF) localizados entre

a fita β2 e a hélice α4 do domínio core. ............................................................... 130

Figura 70 - Loop II correspondente aos resíduos 107 à 134 entre as fitas β3 e β4 do

domínio core. ....................................................................................................... 131

Figura 71 - Loop III correspondente aos resíduos de 141 à 146 (DIIDTG) entre as fitas

β4 e hélice α5 no domínio core. ........................................................................... 132

Figura 72 - Loop IV correspondente aos resíduos de 190 à 211 no domínio hood. ............... 132

Figura 73 - Ligações de hidrogênio (pontilhado amarelo) do ligante IMP no sítio ativo

de SmHGPRT....................................................................................................... 133

Figura 74 - Modelo esquemático para a ligação da IMP no sítio ativo da SmHGPRT. ......... 134

Figura 75 - Sobreposição dos sítios de ligação do IMP na HGPRT de S. mansoni (verde)

e humana (branco). .............................................................................................. 135

Figura 76 - Posicionamento e conformação dos resíduos Lys75 e Pro176 em SmHGPRT

(verde) e seus correspondentes Lys68 e Arg169 em HGPRT humana

(branco). ............................................................................................................... 136

Figura 77 - Esquema da reação catalisada pela enzima HGPRT. .......................................... 136

Figura 78 - Mecanismo de reação enzimática da HGPRT. 1- Apoenzima com PRPP

entrando no sítio ativo. Os loops II, III e III´ na conformação aberta. 2-

Complexo PRPP-Mg ligado e Lys79 adota a conformação cis peptídeo. As

interações do PPi do PRPP, loop I e loop IV aproximam o domínio hood do

domínio core. Loop III ordenado ao redor do 5´fosfato e guanina entra no

sítio ativo. 3- Bolsão de ligação à guanina é fechado e ordenado ao redor da

base. Loop III fechado permite que o loop III´ se feche colocando Arg182

entre Asp150 e Asp197 completando a ligação dos domínios hood e core. 4-

Loop II se fecha colocando o resíduo Tyr118 em posição de ligação de

hidrogênio com o fosfato 5´ permitindo a transferência fosforibosil. 5- Loop

I e IV são abertos e PPi sai do sítio ativo. Lys79 do loop I retorna a

conFiguração trans e o loop II é aberto. 6- Loop III´ e III se abrem e liberam

GMP e HGPRT retoma a forma apoenzima. ....................................................... 140

Figura 79 - Ligação do resíduo Lys75B do loop I com Val103A em SmHGPRT. ................. 142

Figura 80 - Interação entre os resíduos Lys75B do loop I com Val103A, Asp207B com

três moléculas de água e Glu89A, este com Lys79B em SmHGPRT. ................. 143

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Identidade sequencial entre homólogos da HGPRT. ............................................. 40

Tabela 2 - Construções realizadas na primeira etapa. ............................................................. 49

Tabela 3 - Construção realizada na segunda etapa. ................................................................ 49

Tabela 4 - Resultado sumarizado dos testes de expressão das enzimas. ................................ 53

Tabela 5 - Resultado sumarizado do segundo teste de expressão da enzima ADSS. ............. 54

Tabela 6 - Enzimas e suas respetivas construções, meio de cultura, método de indução

e volume escolhidos para expressão em larga escala. ........................................... 54

Tabela 7 - Ligantes e kits de cristalização utilizados para testes de cristalização das

enzimas. ................................................................................................................. 59

Tabela 8 - Cristais obtidos para as enzimas do projeto. .......................................................... 60

Tabela 9 - Condições de cristalização do kit Morpheus utilizadas para “screening” ............. 65

Tabela 10 - Estatísticas da coleta de dados e refinamento para os cristais de ADSL. ............. 70

Tabela 11 - Análise da geometria de ADSL gerada pelo programa MOLPROBITY. (78) ..... 73

Tabela 12 - Comparação dos resíduos entre a ADSL humana nativa, ADSL humana

mutada e SmADSL que foram identificados cujas mutações implicam na

deficiência severa de ADSL em humanos e consequentemente retardo

mental em pacientes. .............................................................................................. 99

Tabela 13 - Valores dos parâmetros da cinética enzimática de SmADSL para ADS. ............ 110

Tabela 14 - Valores dos parâmetros da cinética enzimática de SmADSL para SAICAR. ..... 111

Tabela 15 - Estatísticas da coleta de dados e refinamento para os cristais de HGPRT1. ....... 114

Tabela 16 - Análise da geometria de HGPRT gerada pelo programa MOLPROBITY.

(78) ....................................................................................................................... 117

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ADA- adenosina desaminase

ADK - adenilato kinase

ADSL - adenilosuccinato liase

ADSS - adenilosuccinato sintase

AICAR - aminoimidazol carboxamida ribosídeo

AK - adenosina kinase

AMP – adenosina monofosfato

AMPc – adenosina monofosfato cíclico

AP - adenosina fosforilase

APRT- adenina fosforibosiltransferase

ATP – adenosina trifosfato

BRENDA – BRaunschweig ENzyme DAtabase

cDNA – ácido desoxirribonucleico codificante

DLS - Diamond Light Source

DNA – ácido desoxirribonucleico

DO – densidade óptica

EST – expressed sequence tag

FAD – Flavina adenina dinucleotídeo

FMR – fumarato

GDP - Guanosina difosfato

GK - guanilato kinase

GMP - Guanosina monofosfato

GMPc – Guanosina trifosfato cíclico

GMPS - guanilato sintase

GTP – Guanosina trifosfato

HGPRT- hipoxantina guanina fosforibosiltransferase

HGXPRT - hipoxantina guanina xantina fosforibosiltransferase

IFSC – Instituto de Física de São Carlos

IMP – inosina monofosfato

IMPDH - inosina-5'-fosfato desidrogenase

IPTG – isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside

ITC - calorimetria de titulação isotérmica

kDa – kilodaltons

MBP - maltose

mg – miligrama

mM – milimolar

MPD – 2-Methyl-2,4-pentanediol

MTAP - metiltioadenosina fosforilase

NAD – nicotinamida adenina dinucleotídeo

NDPK - nucleosídeo difosfato kinase

nL – nanolitro

OMS – Organização Mundial da Saúde

OPPF - Oxford Protein Production Facility

PCR – Reação em cadeia da polimerase

PDB – Protein data bank

PEG – polietilenoglicol

PNP- purina nucleosídeo fosforilase

PRPP - 5-fosforribosil-1-pirofosfato

PZQ – Praziquantel

RMSd – root-mean-square deviation

RNA – ácido ribonucléico

RNAi - ácido ribonucleico de interferência

RNAm – ácido ribonucleico mensageiro

RPKM - reads per kilobase per million

rpm – rotação por minuto

S-Ado - succiniladenosina

SAICAR - succinilaminoimidazol carboxamida ribosídeo

SDS-PAGE - sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis

TRX - Tiorredoxina

UDP – uridina difosfato

μg – micrograma

μL – microlitro

μM – micromolar

SUMÁRIO

CAPÍTULO 1 ........................................................................................................................... 31

1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 31

1.1 Esquistossomose .............................................................................................................................. 31

1.1.1 Ciclo de vida do Schistosoma mansoni ........................................................................................ 32

1.1.2 Tratamento ................................................................................................................................... 33

1.2 Metabolismo de nucleotídeos ......................................................................................................... 34

1.2.1 Metabolismo de Purinas em Schistosoma mansoni ...................................................................... 35

1.3 Enzimas alvos do estudo ................................................................................................................ 38

1.3.1 Adenosina Kinase (AK) ............................................................................................................... 39

1.3.2 Hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase (HGPRT) ............................................................... 40

1.3.3 Adenilsuccinato Sintetase (ADSS) ............................................................................................... 42

1.3.4 Adenilsuccinato Liase (ADSL) .................................................................................................... 42

CAPÍTULO 2 ........................................................................................................................... 45

2 OBJETIVOS ........................................................................................................................ 45

2.1 Geral ................................................................................................................................................. 45

2.2 Específicos ....................................................................................................................................... 45

CAPÍTULO 3 ........................................................................................................................... 47

3 PRODUÇÃO DAS ENZIMAS RECOMBINANTES .......................................................... 47

3.1 Amplificação dos genes de interesse ................................................................................................ 47

3.2 Purificação do produto de PCR ........................................................................................................ 47

3.3 Ligação do produto de PCR em vetores pOPIN e transformação de células de propagação ........... 48

3.4 Escolha das colônias e transformação de células de expressão ........................................................ 50

3.5 Teste de expressão e purificação das enzimas .................................................................................. 51

3.6 Expressão e purificação das proteínas em larga escala .................................................................... 55

CAPÍTULO 4 ........................................................................................................................... 59

4 ENSAIOS DE CRISTALIZAÇÃO E OTIMIZAÇÃO DOS CRISTAIS .............................. 59

4.1 Ensaios de Cristalização ................................................................................................................... 59

4.2 Coleta de dados e otimização dos cristais ........................................................................................ 61

4.2.1 Variação de concentração da enzima e temperatura..................................................................... 62

4.2.2 Expressão e purificação de HGPRT com selenometionina .......................................................... 63

CAPÍTULO 5 ........................................................................................................................... 69

5 ESTRUTURA CRISTALOGRÁFICA E CINÉTICA ENZIMÁTICA DE ADSL de

Schistosoma mansoni .......................................................................................................... 69

5.1 Coleta de dados, processamento, resolução e refinamento de dados de difração de raios-X .......... 69

5.2 Validação das estruturas .................................................................................................................. 72

5.3 Análise das estruturas tridimensionais obtidas de ADSL de Schistosoma mansoni ........................ 76

5.3.1 Estrutura secundária, topologia e regiões conservadas ................................................................. 76

5.3.2 Enovelamento ............................................................................................................................... 82

5.3.3 O sítio ativo .................................................................................................................................. 88

5.3.4 Mecanismo catalítico .................................................................................................................... 95

5.4 Determinação de parâmetros cinéticos da enzima ADSL de Schistosoma mansoni através de

calorimetria de titulação isotérmica (ITC) ................................................................................... 105

CAPÍTULO 6 ......................................................................................................................... 113

6 ESTRUTURA CRISTALOGRÁFICA DE HGPRT isoforma 1 de Schistosoma mansoni 113

6.1 Coleta de dados, processamento, resolução e refinamento de dados de difração de raios-X ........ 113

6.2 Validação da estrutura ................................................................................................................... 116

6.3 Análise da estrutura tridimensional obtida de HGPRT de Schistosoma mansoni ......................... 119

6.3.1 Estrutura secundária, topologia e regiões conservadas ............................................................... 119

6.3.2 Enovelamento ............................................................................................................................. 124

6.3.3 O sítio ativo ................................................................................................................................ 129

6.3.4 Mecanismo catalítico .................................................................................................................. 136

CAPÍTULO 7 ......................................................................................................................... 145

7 CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS FUTURAS .............................................................. 145

7.1 Conclusões ..................................................................................................................................... 145

7.2 Perspectivas Futuras ...................................................................................................................... 146

REFERÊNCIAS ..................................................................................................................... 149

31

CAPÍTULO 1

1 INTRODUÇÃO

1.1 Esquistossomose

A esquistossomose, popularmente conhecida como barriga d’água, é uma doença

parasitária crônica, debilitante e, em alguns casos fatal. Afeta indivíduos principalmente em

áreas rurais, sendo endêmica em países tropicais e subtropicais. Nestes países ela constitui um

dos principais problemas de saúde pública e está associada diretamente às condições

socioeconômicas da população, uma vez que a transmissão da doença ocorre pela utilização

de água contaminada com a forma infectante do parasita. (1)

É uma das doenças mais negligenciadas do mundo, a segunda em importância mundial

atrás da Malária (2), sendo esquistossomose o nome coletivo para a infecção causada por uma

das cinco espécies do platelminto trematodo do gênero Schistosoma, na qual o Schistosoma

mansoni é o único predominante na América e um dos mais predominantes na África. (3)

Atualmente a Organização Mundial da Saúde (OMS) estima que cerca de 700 milhões

de pessoas em todo o mundo estão em áreas de risco para a esquistossomose. O índice de

mortalidade atinge mais de 200.000 pessoas por ano e inclui hepatomegalia, esplenomegalia,

fibrose hepática e ascite. (1,3-4) A doença é associada com uma morbidade crônica e

debilitante que manifesta suas consequências num déficit cognitivo, cansaço e redução do

crescimento. (5-6)

Dos 78 países considerados endêmicos para esquistossomose (Figura 1), apenas 52

países recebem quimioterapia preventiva. O número total de pessoas infectadas que

necessitavam de quimioterapia a nível global em 2014 foi de 258,9 milhões, dos quais 123,3

milhões eram crianças em idade escolar. Os dados reportados em 2014 mostram que pouco

mais de 61 milhões de pessoas receberam quimioterapia preventiva para a esquistossomose, o

que é equivalente a uma cobertura global de apenas 20,8%. (1)

32

Figura 1 - Levantamento dos países endêmicos para esquistossomose em 2014.

Fonte: WHO ...(1)

1.1.1 Ciclo de vida do Schistosoma mansoni

O S. mansoni possui um ciclo de vida heteroxênico (Figura 2), que se alterna entre

dois hospedeiros distintos: hospedeiro intermediário representado principalmente pelo

caramujo do gênero Biomphalaria (B. glabrata no Brasil), onde ocorre a reprodução

assexuada e o hospedeiro definitivo vertebrado, representado pelo homem, onde ocorre a fase

sexuada da reprodução. (7)

A infecção tem início quando o indivíduo se expõe à água contaminada com a forma

larval (cercária) liberada pelo caramujo. As cercárias penetram ativamente na pele, perdem a

cauda e se transformam em vermes imaturos (esquistossômulos). Esses vermes migram para o

sistema sanguíneo ou linfático e chegam aos pulmões onde passam para o sistema porta intra-

hepático e atingem a maturidade sexual. Os machos e fêmeas vivem acasalados e migram até

as veias mesentéricas inferiores onde ocorre a oviposição. Os ovos eliminados nas fezes

eclodem em contato com a água liberando o miracídio, que penetra o caramujo se

transformando em esporocistos que dão origem às cercárias, reiniciando o ciclo. Uma parte

dos ovos liberados pelos vermes adultos se aloja na mucosa intestinal e posteriormente nos

capilares do sistema porta levando a formação de granulomas ou provocam hemorragias e

ulcerações durante a sua passagem para a luz intestinal. (7)

33

Figura 2 - Ciclo de vida do Schistosoma. Ovos são eliminados nas fezes ou urina, em condições ideais há

eclosão dos ovos e liberação de miracídios, que nadam e penetram em hospedeiros intermediários

específicos (moluscos). Os estágios no caramujo incluem duas gerações de esporocistos e a

produção de cercárias. Após liberadas do caramujo, as cercárias infectantes nadam e penetram na

pele do hospedeiro humano, perdem sua cauda, passando a ser esquistossômulo. ( , ) Os

esquistossômulos migram através de diversos tecidos para se instalarem as veias. Os vermes

adultos nos seres humanos residem nas vênulas mesentéricas em várias localizações, que parecem ser

específicas para cada espécie. As fêmeas (com tamanho de 7 a 20 mm, macho um pouco menor)

depositam ovos em pequenas vênulas do sistema portal e perivesical. Os ovos são movidos

progressivamente para o lúmen do intestino (S. mansoni e S. japonicum) e da bexiga e ureteres (S.

haematobium), e são eliminados com as fezes ou urina, respectivamente.

Fonte: CDC...(131)

1.1.2 Tratamento

Na ausência de uma vacina, de um eficiente controle do vetor e de saneamento básico,

o tratamento e controle da esquistossomose residem em um único fármaco, o praziquantel

(PZQ). O principal problema com o PZQ é que é praticamente inativo contra

esquistossômulos imaturos, nos quais a atividade só é alcançada cerca de 6 a 8 semanas após a

34

infecção. (3) Além disto, o extensivo uso do PZQ por mais de 30 anos, especialmente em

programas de administração de medicamentos em massa, levanta sérias preocupações sobre o

desenvolvimento de resistência ao medicamento. Essa preocupação levou a um renovado

interesse científico na investigação de novos medicamentos, incluindo a identificação de

potenciais alvos moleculares. (8)

Várias comunicações com indicativos da falha no tratamento com PZQ têm sido

ultimamente reportadas. (6,8-15) A detecção de falha de um tratamento é frequentemente o

primeiro indicativo do fim da vida efetiva de um fármaco. Além de que não é

estrategicamente eficaz depender deste único agente para o controle sustentado da

esquistossomose. Idealmente, uma gama de opções de tratamento e controle deveria ser

disponível, de preferência incluindo o uso de diferentes classes de fármacos a fim de evitar o

desenvolvimento de resistência, e que atuassem em todos os estágios de vida do parasita para

um tratamento efetivo. (16) Dentro desse contexto surge a necessidade da busca de novos

alvos para o desenvolvimento de fármacos contra a esquistossomose.

1.2 Metabolismo de nucleotídeos

Os nucleotídeos são moléculas constituídas por uma base nitrogenada púrica (A ou G)

ou pirimídica (C, T, ou U), uma ribose e um grupamento fosfato, as quais desempenham uma

variedade de importantes papéis em todas as células de todos os organismos vivos. São

precursores de DNA e RNA, sendo inclusive carregadores essenciais da energia química -

função especialmente atribuída ao ATP e, em uma menor extensão, ao GTP. Além disso, são

componentes dos cofatores NAD, FAD, S-adenosilmetionina e coenzima A, bem como de

intermediários biosintéticos ativados, tais como UDP-glicose. Também são precursores de

moléculas sinalizadoras na célula, tais como AMPc e GMPc. (17)

Os conjuntos (pools) de nucleotídeos são geralmente pequenos nas células, perfazendo

aproximadamente 1% ou menos das quantidades requeridas para síntese do DNA. Portanto, a

síntese de nucleotídeos precisa ocorrer paralelamente à síntese de ácidos nucléicos, podendo

inclusive ser um fator limitante dos processos celulares de replicação e transcrição. (17)

Considerando a importância desses processos para as células em divisão, agentes que

inibem a síntese de nucleotídeos têm se tornado de grande importância para a medicina atual.

Dois tipos de vias levam à síntese de nucleotídeos nos seres vivos: via de síntese de

novo e via de salvação. A via de novo para biossíntese de purinas e pirimidinas são idênticas

35

em praticamente todos os organismos vivos e têm como precursores metabólicos

aminoácidos, ribose 5-fosfato, CO2 e NH3. As bases livres não são intermediários utilizados

pela via de síntese de novo, pois as bases não são sintetizadas previamente ao seu

acoplamento à ribose, mas sim, acopladas ao grupo 5-fosfo-ribosil do nucleotídeo (Figura 3).

A via de salvação, no entanto, utiliza as bases livres e nucleosídeos liberados da quebra de

ácidos nucléicos. Ambos os tipos de via são importantes para o metabolismo celular. (17)

Figura 3 - Origem dos átomos do anel de purinas (via de novo).

Fonte: LEHNINGER; NELSON; COX. (17)

1.2.1 Metabolismo de Purinas em Schistosoma mansoni

A produção de ovos é o aspecto mais significante do parasitismo e a maior causa da

patologia da esquistossomose. A estimativa da produção de ovos fertilizados pelo parasita é

de centenas de ovos por dia. Acredita-se que esta fecundidade persista por anos,

representando um exemplo notável de capacidade biosintética altamente especializada, que

obviamente requer um ativo metabolismo de nucleotídeos de purina, tanto como fonte de

energia (ATP) como para o suprimento de bases de purina nas sínteses de DNA e RNA. (18)

Em uma série de artigos entre os anos de 1972 a 1983, Senft e colaboradores (19-25)

elucidaram a via de salvação de purinas em S. mansoni. Inicialmente foi demonstrada uma

rápida incorporação de adenina em nucleotídeos e a não incorporação de 14

C-glicina e 14

C-

glicose no anel púrico. (25) Evidenciando uma grande dependência de um suprimento externo

de bases pré-formadas para a síntese de nucleotídeos, bem como provando a perda da via de

novo de síntese de purinas. Estes resultados foram confirmados em esquistossômulos por

Dovey e colaboradores. (26) Deste modo, o S. mansoni ao contrário do seu hospedeiro

humano, não possui a via biosintética de purinas de novo e depende integralmente da via de

36

salvação para seu requerimento dessas bases. (21-22) Sendo assim, esta via tem sido citada

como um potencial alvo para o desenvolvimento de novos fármacos.

Na Figura 4 observa-se o esquema da via de salvação de adenosina do parasita, onde as

enzimas AK2, ADK, PNP, AP (MTAP) são representadas também pelas respectivas

estruturas tridimensionais, todas estas determinadas em nosso grupo de pesquisa. As enzimas

alvo deste trabalho: AK1, HGPRTs, ADSS e ADSL são destacadas por contorno em

vermelho.

Figura 4 - Esquema das vias de conversão de adenosina em nucleotídeos em S. mansoni. ADA - adenosina

desaminase, PNP - purina nucleosídeo fosforilase, HGPRT - hipoxantina guanina

fosforibosiltransferase, APRT - adenina fosforibosiltransferase, AK - adenosina kinase, ADK -

adenilato kinase, NDPK - nucleosídeo difosfato kinase, MTAP - metiltioadenosina fosforilase, ADSL

- adenilosuccinato liase, ADSS - adenilosuccinato sintase, IMPDH - inosina-5'-fosfato desidrogenase,

GMPS - guanilato sintase, GK - guanilato kinase. Em destaque com contorno vermelho as enzimas

alvo de estudo deste projeto, e as estruturas das enzimas já resolvidas por nosso grupo de pesquisa.

Fonte: Elaborada pela autora.

Senft e colaboradores (22) estudando a deposição de adenosina em S. mansoni,

sugeriram que a via preferencial utilizada para o anabolismo de S. mansoni seria utilizando as

enzimas adenosina fosforilase (AP) e adenina fosforibosiltransferase (APRT). Os mesmos

autores (22-23) identificaram várias enzimas da via de salvação em extratos de S. mansoni,

entre elas fosforibosiltransferases, quinases, difosfoquinase, desaminases, e uma fosforilase.

Stegman e colaboradores (24) demonstraram que a adenosina pode ser processada por

dois mecanismos, uma via direta utilizando a enzima adenosina kinase que produz

37

diretamente AMP, e a via indireta: adenosina -> inosina -> hipoxantina -> IMP -> AMP,

sendo que a via indireta é muito mais ativa que a via direta utilizando a kinase.

Extratos de S. mansoni convertem mais da metade da adenosina utilizada como

substrato, convertendo-a para inosina e hipoxantina in vitro, utilizando as enzimas adenosina

desaminase (ADA) e purina nucleosídeo fosforilase (PNP), hipoxantina guanina

fosforibosiltransferase (HGPRT), adenilosuccinato sintase (ADSS) e adenilosuccinato liase

(ADSL). (19-20)

Quando vermes intactos de S. mansoni são incubados com hipoxantina -8-14

C,

quantidades substanciais de AMP e GMP são sintetizados, indicando a presença das enzimas

ADSS, ADSL, IMPDH e GMPS. (22)

Uma parte da adenosina é clivada em adenina via adenosina fosforilase (a enzima

responsável por esta atividade é a metiltioadenosina fosforilase - MTAP - Pereira e

colaboradores, dados ainda não publicados), quando PRPP (5-fosforribosil-1-pirofosfato) está

presente, com posterior formação de AMP pela fosforibosilação da adenina pela enzima

APRT. (19) Miech e colaboradores (27) reportaram que extratos e o vômito de S. mansoni

possuem uma atividade enzimática que catalisa a fosforólise de adenosina produzindo adenina

e ribose-1-fosfato, e que esta atividade é devido à enzima adenosina fosforilase. Esta atividade

é inteiramente separada da enzima purina nucleosídeo fosforilase, fato confirmado por nossos

experimentos. (28-29)

Uma das vantagens da via de salvação é o fato de que a via de novo requer grande

quantidade de energia para síntese de bases púricas. Com relação à via de salvação de purinas

vale ressaltar que ao contrário da biossíntese de purinas, que é idêntica em todas as células, a

via de salvação é diversa em características e distribuição.

Buscas no Genoma Paulista do S. mansoni (30), baseado em ESTs, e mais

recentemente nos estudos de genoma e transcriptoma do parasita realizados por Protasio e

colaboradores (31) confirmaram a presença de RNAm das enzimas relatadas por Senft;

Crabtree. (20) Recentemente foi sequenciado o genoma do S. mansoni pelo Sanger Center na

Inglaterra (32), onde foram encontrados os genes correspondentes a todas as enzimas da via,

sendo que algumas possuem mais de uma isoforma (duas para AK, três pra HGPRT, duas

para PNP), confirmando os trabalhos de identificação das enzimas da via de salvação

realizados por Senft e colaboradores. (19,25,27)

Durante a identificação das enzimas da via de salvação de purinas em extratos livre

nas células (22) foi observado que a degradação de adenosina continuava presente no meio,

mesmo após a remoção dos vermes, sugerindo que durante a incubação os vermes liberam

38

enzimas ativas do catabolismo de adenosina, e que algumas enzimas relacionadas com o

metabolismo de purinas são frouxamente ligadas às superfícies interna ou externa do parasita.

Estes autores predisseram que enzimas do metabolismo de purina podem gerar respostas do

sistema imune do hospedeiro e que estas enzimas podem ser úteis como sondas de

imunodiagnóstico para a detecção de vermes vivos no paciente. (21)

Desde os experimentos de Senft e colaboradores, escassa literatura é encontrada sobre

as enzimas da via de salvação de purinas. Com relação à estrutura destas enzimas apenas

artigos produzidos em nosso grupo sobre PNP (28-29,33-34), ADK (35) e AK (36) estão

disponíveis.

Um artigo que chama atenção é um artigo que apresenta as análises da estrutura do

gene e expressão do RNAm da ADSL (37), no qual foi realizado o estudo por PCR em tempo

real da expressão das enzimas HGPRT, APRT e ADSL em cercária, esquistossômulos,

vermes adultos machos e fêmeas. Foi observado que a fêmea possui o dobro do nível de

expressão da ADSL em comparação ao macho, indicando uma possível função fêmea

específica (38). Hoffmann relata que outras enzimas da via de salvação de purinas devem ser

estudadas para a avaliação da ligação a sexo específico. (38)

1.3 Enzimas alvos do estudo

Este projeto faz parte de um projeto mais abrangente que visa à obtenção da

estrutura tridimensional de todas as enzimas da via de salvação de purinas e síntese de

pirimidinas do parasita Schistosoma mansoni. Apesar da importância global que a

esquistossomose tem, existem poucos estudos sobre as vias metabólicas do parasita. O

entendimento bioquímico deste é de vital importância para a identificação de novos alvos para

o desenvolvimento racional de fármacos. Por este motivo, são estudadas todas as enzimas da

via, uma vez que estas são expressas de forma distinta no parasita ao longo do seu ciclo de

vida. No site GeneDB (http://www.genedb.org/Homepage) é possível encontrar os valores de

RPKM (reads per kilobase per million) (39) que quantifica a expressão de genes em cercárias,

esquistossômulos e vermes adultos. Permitindo a identificação de possíveis alvos terapeuticos

em diferentes estágios de vida do parasita.

http://www.genedb.org/Homepage

39

1.3.1 Adenosina Kinase (AK)

Uma das enzimas centrais da via de salvação é a adenosina kinase (E.C. 2.7.1.20), que

catalisa a fosforilação de adenosina para adenosina monofosfato (AMP) utilizando ATP ou

GTP como doadores de fosfato. (40)

No genoma do Schistosoma mansoni foram identificadas duas isoformas da enzima

adenosina kinase. As duas sequências Smp_008360 (AK2) e Smp_008400 (AK1) contendo

352 aminoácidos possuem 79% de identidade sequencial.

Quando alinhadas individualmente as sequências da AK com seu homólogo humano a

identidade sequencial é de 34 e 33% respectivamente.

Senft; Crabtree (21); relatam que os análogos de nucleotídeos 2-floroadenosina e 7-

deazaadenosina são rapidamente incorporados no pool de nucleotídeos do S. mansoni.

Nenhum destes análogos são substratos das enzimas adenosina desaminase e purina

nucleosídeo fosforilase. Desta forma a conversão destes análogos as suas correspondentes

bases, seguida da fosforibosilação gerando seus nucleotídeos não é realizada. Portanto a

fosforilação direta mediada pela adenosina kinase é a rota do anabolismo de 2-floroadenosina

e 7-deazaadenosina. Estes autores foram os primeiros a identificar a presença da enzima AK

no parasita. Dovey e colaboradores (26) identificaram baixos níveis de atividade para enzima

AK, ambos autores acima citados realizaram seus estudos com extratos de S. mansoni.

Durante o desenvolvimento do meu mestrado, a enzima recombinante AK2 foi

amplificada, clonada, expressa, purificada e cristalizada. Foram obtidas e analisadas cinco

estruturas tridimensionais com os diferentes ligantes: AMP, adenosina, 7-deazaadenosina

(tubercidina) e 2-fluoroadenosina, cujos PDBs correspondentes são: 3VAS, 3VAQ, 3UQ9,

3UQ6 e 4DC3. (36)

Nesse trabalho, através da análise estrutural da enzima foi possível explicar a

incorporação seletiva de análogos de adenosina de AK de Schistosoma em comparação com a

AK humana observada por El Kouni e Cha na década de 80.

El Kouni e Cha (18) testaram a incorporação de nove análogos de adenosina: 5'-deoxi-

5'-iodo-2-fluoroadenosina, tubercidina, nebularina, toiocamicina, sangivamicina, 3'-

deoxisangivamicina, 9-deazaadenosina, 7,9-dideaza-7-tiaadenosina e 1-metiformicina, no

verme adulto intacto e demonstraram que o S. mansoni poderia incorporar seis desses

compostos no pool de nucleotídeos, exceto: sangivamicina, 3'-deoxisangivamicina e 1-

metiformicina, em contraste com os outros análogos de adenosina testados. Fato esse que em

nosso trabalho pôde ser atribuído ao tamanho do grupo inserido na posição 7 no lugar do

40

nitrogênio da base nitrogenada. Por ser muito volumoso este grupo provavelmente se chocaria

com o resíduo Thr136 que está ligado ao N7 da molécula de adenosina com distância de

2.82Å.

Figura 5 - Estrutura cristalográfica da enzima adenosina kinase de Schistosoma mansoni em modelo de fitas.

Pode ser observada a ligação de uma molécula de adenosina e uma de AMP na estrutura.


1.3.2 Hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase (HGPRT)

A HGPRT (E.C 2.4.2.8) é codificada por um gene essencial do parasita. Catalisa a

fosforibosilação reversível de hipoxantina e guanina para IMP ou GMP respectivamente. No

genoma de S. mansoni foram encontrados três genes homólogos para a HGPRT (Smp_148820

– 227 aminoácidos, Smp_168500 – 228 aminoácidos, Smp_103560 – 249 aminoácidos). A

tabela 1 mostra a identidade sequencial entre elas.

Tabela 1 - Identidade sequencial entre homólogos da HGPRT.

HGPRT Identidade Sequêncial

Smp_148820 Smp_168500 – 46%

Smp_168500 Smp_103560 – 46%

Smp_103560 Smp_148820 – 39%

Fonte: Elaborada pela autora

Quando alinhadas as 3 sequências com seu correspondente humano (PDB 2JBH) essa

identidade é de 32% para Smp_148820, 38% para Smp_168500 e de 45% para Smp_103560.

41

Em humanos a completa ou quase completa deficiência da enzima HGPRT resulta em

uma doença chamada Síndrome de Lesch-Nyhan (42), caracterizada pela superprodução e

acúmulo de ácido úrico, chamada hiperuricemia. Os sintomas são graves e consistem

basicamente em retardos psicomotores (43). Os devastadores efeitos dessa síndrome ilustram

a importância da via de salvação. O cérebro é especialmente dependente dessa via, o que pode

explicar os danos ao sistema nervoso central em crianças portadoras da síndrome.

Já quando a deficiência da HGPRT é parcial, a doença por manifestar sintomas mais

leves, como formação e depósito de cristais nas articulações e no rim, é chamada de gota ou

Síndrome de Kelley-Seegmille. (44-45)

Hipoxantina e guanina surgem constantemente da quebra de ácidos nucléicos. Na

ausência de HGPRT, os níveis de PRPP aumentam e purinas são, portanto mais produzidas

pela via de novo, resultando no acúmulo de ácido úrico devido à redução do resgate de

hipoxantina e guanina para produção de IMP e GMP. (46)

Diferentemente das outras enzimas da via de salvação de purinas, vários estudos já

foram realizados utilizando a HGPRT de S. mansoni. (47-49) Esta proteína já foi expressa em

E. coli anteriormente por outros pesquisadores na década passada. (50)

Em 2008 estudos utilizando a técnica de RNAi reforçaram a importância desta enzima

para a sobrevivência do parasita. Pequenos RNAs interferentes (RNAis) foram produzidos

contra HGPRT, injetados em camundongos infectados, cujo número de vermes foi contado

seis dias após a injeção. O número total de parasitas foi reduzido em aproximadamente 27%

após o tratamento. (51)

Apesar da existência de vários estudos com a HGPRT, até o presente momento não se

conhecia sua estrutura tridimensional, a qual era buscada por pesquisadores há mais de 20

anos.

Durante o desenvolvimento do meu mestrado foi possível amplificar, clonar, expressar

e purificar a enzima recombinante HGPRT Smp_103560. Bem como realizar ensaios de

cristalização, sem sucesso. Novos estudos computacionais foram realizados pelo Prof. Dr.

Ricardo de Marco analisando a sequência codificadora da enzima e identificou-se que a

sequência do banco de dados, que foi previamente utilizada, possuía um éxon de 18

aminoácidos a mais no N-terminal. Novos primers foram desenhados para reinício dos

estudos com essa enzima, aqui apresentados.

42

1.3.3 Adenilsuccinato Sintetase (ADSS)

Adenilsuccinato sintetase (IMP: aspartato ligase (GMP) E.C. 3.3.4.4) é a responsável pelo

primeiro dos dois passos da conversão de IMP em AMP (52), catalisa a seguinte reação:

Mg2+

IMP + GTP + aspartato adenilsuccinato + GDP + Pi

Somente uma isoforma foi identificada no genoma do parasita que codifica uma

proteína com 433 aminoácidos, esta quando alinhada com sua correspondente humana (PDB

2V40) de 459 aminoácidos possui 54% de identidade.

Existem diversas estruturas dessa enzima depositadas no PDB, inclusive de E. coli

com o inibidor hadacidina (N-formylhydroxyamino-acetic acid), análogo estrutural do ácido

aspártico, além de estudos e descrição dos efeitos inibitórios de derivados deste. (53-62).

1.3.4 Adenilsuccinato Liase (ADSL)

Adenilsuccinato liase (ADSL, E.C. 4.3.2.2) é uma enzima que atua em duas vias de

metabolismo de purinas. Na via de síntese catalisa a conversão de succinilaminoimidazol

carboxamida ribosídeo (SAICAR) em aminoimidazol carboxamida ribosídeo (AICAR). (63)

Já na via de salvação de purinas, que é o alvo de nosso estudo, esta enzima é responsável pelo

segundo dos dois passos de conversão de IMP em AMP. (64) Responsável pela seguinte

reação:

Adenilsuccinato Fumarato + AMP (65).

No parasita essa enzima possui 480 aminoácidos (54.5 kDa), o alinhamento com a

enzima humana (PDB 2J91) que possui 503 aminoácidos demonstra que estas possuem 55%

de identidade sequencial.

Diversos estudos foram realizados com a enzima humana pelo fato de sua deficiência

estar relacionada a retardo mental e autismo (63,65-68) devido ao acúmulo das succinil-

purinas; succinilaminoimidazol carboxamida (SAICA-ribosídeo) e succiniladenosina (S-

Ado), no fluido cérebro-espinhal e urina. Dados sugerem que a lesão genética da ADSL

determina a proporção de sua atividade com S-AMP e com SAICAR, que por sua vez

determina a proporção S-Ado/SAICa-ribosídeo e o estado mental do paciente. (68)

43

Foulk e colaboradores estudaram a estrutura do gene de ADSL de S.mansoni, os

níveis de expressão de RNAm, a predição da estrutura tridimensional e o potencial terapêutico

da enzima. Estes pesquisadores demonstraram que os níveis de RNAms expressos de ADSL e

HGPRT são mais baixos em esquistossômulos e cercárias do que em vermes adultos.

Sugerindo que o nível de expressão desses genes é regulado e fornece evidências mais

contundentes a trabalhos anteriores, onde Dovey e colaboradores (26) concluíram que

esquistossômulos obtém a maior parte de AMP via APRT através da via de salvação de

purinas e Senft e colaboradores (25) demonstraram que vermes adultos de S. mansoni

incorporaram uma quantidade significativa de adenosina marcada em AMP por meio de IMP.

O que implicaria em algum grau de regulação da expressão gênica na via de salvação de

purinas.

Além de ser regulada positivamente em adultos, foi demonstrado que os níveis de

expressão de RNAm de ADSL são mais elevados em fêmeas do que em machos. Também foi

demonstrado um aumento de 2,5 vezes na atividade enzimática nas fêmeas em comparação

com vermes machos. (37) Sendo assim, ADSL parece estar regulada positivamente nas

fêmeas quanto em comparação com as outras fases do ciclo de vida examinada.

Figura 6 - Análise do nível de expressão de RNAms da via de salvação de purinas por PCR em tempo real. O

número de cópias dos genes foi normalizado para a tubulina pela divisão do número de cópia de cada

gene pelo número de cópias de tubulina em cada reação de cDNA. Um nível de expressão de um

indica que o nível de expressão é equivalente à tubulina. Adenilosuccinato liase – barra branca;

adenina fosforibosiltransferase – barra preta; hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase – barra

cinza.

Fonte: FOULK et al. (37)

44

Duas explicações são possíveis para esta regulação positiva da expressão de RNAm

e atividade de adenilossuccinato liase: (1) fêmeas necessitam de um maior número de

nucleótidos para a síntese de DNA associados com a produção de ovos e (2) as fêmeas são

mais dependentes da via de salvação mediada adenilosuccinato liase- AMP que os machos.

(37)

No entanto, a falta de um aumento correspondente nos níveis de RNAms de HGPRT

e APRT em fêmeas indica que ADSL tem uma regulação específica, em vez de ser parte de

uma supra regulação de RNAm geral na síntese de nucleotídeos ou mesmo na regulação

positiva das outras enzimas da via de salvação de purinas na produção de AMP mediada por

ADSL. Uma explicação alternativa para o aumento da produção de RNAm de ADSL é que

esta está sendo usado para fins além da produção de AMP. (37)

45

CAPÍTULO 2

2 OBJETIVOS

2.1 Geral

Realizar a clonagem, expressão, purificação, caracterização bioquímica, teste de atividade e

determinar a estrutura tridimensional das enzimas adenosina kinase 1 (AK), hipoxantina-

guanina fosforibosiltransferase 1, 2 e 3 (HGPRT), adenilsuccinato sintetase (ADSS) e

adenilsuccinato liase (ADSL) de Schistosoma mansoni.

2.2 Específicos

1. Amplificação, clonagem, expressão heteróloga em E. coli e purificação das enzimas

recombinantes.

2. Testes de cristalização das enzimas com diferentes substratos e/ou inibidores.

3. Experimentos de difração de raios-X com os cristais obtidos.

4. Resolução e refinamento das estruturas.

5. Teste de atividade enzimática e determinação das constantes catalíticas das enzimas com

estrutura tridimensional obtida.

6. Publicação dos resultados.

46

]

47

CAPÍTULO 3

3 PRODUÇÃO DAS ENZIMAS RECOMBINANTES

3.1 Amplificação dos genes de interesse

Os experimentos de amplificação, clonagem, transformação em bactérias, testes de

expressão e cristalização das enzimas AK1, HGPRT 1 (Smp_103560) ou HGPRT_short,

HGPRT 2 (Smp_148820) e HGPRT 3 (Smp_168500), ADSL e ADSS foram realizados nas

instalações do laboratório da Oxford Protein Production Facility (OPPF) em Harwell -

Inglaterra. A utilização do OPPF é uma colaboração do Dr. Humberto Pereira com o

pesquisador do síncrotron inglês Diamond Light Source (DLS), José Brandão-Neto.

Junto à equipe do OPPF os genes sintéticos foram amplificados por PCR, utilizando-

se a enzima PhusionTM

Flash High-Fidelity. A reação foi feita em termociclador, sendo o

anelamento a 60oC por 5 minutos e a extensão, a 72

oC por 1 minuto (1 minuto/kbp). Após a

reação completa, confirmou-se a amplificação das 6 enzimas por eletroforese em gel de

agarose 1,25% corado com SYBR®

Safe DNA Stain (Invitrogen).

3.2 Purificação do produto de PCR

Uma vez verificada a qualidade do produto da reação e PCR em gel de agarose, fez-se

a purificação do produto em 2 etapas:

1- Incubando o produto do PCR a 37ºC por 1 hora com a enzima DpnI que cliva DNA

metilado.

2- Sistema de purificação por interação magnética “Agencourt AMPure XP (Beckman

Coulter)” seguindo as instruções do fabricante. 90 uL desta solução são adicionados a solução

de cada poço da placa, tornando-a marrom bem escura. Então a placa é inserida sobre uma

placa contendo ímãs. As moléculas de cDNA que interagiram com as partículas magnéticas se

acoplam próximo ao ímã tornando a solução transparente novamente. Esta solução é retirada

do poço e este é lavado com etanol 70% por 2 vezes (Figura 7). Para eluição do cDNA, 30 uL

de água são adicionados aos poços ressuspendendo o produto acoplado ao ímã. Novamente a

placa é inserida na placa magnética e a solução transparente é coletada.

48

Figura 7 - Segundo passo do procedimento de purificação do produto de amplificação de cDNA por PCR

utilizando o sistema de purificação por interação magnética.


3.3 Ligação do produto de PCR em vetores pOPIN e transformação de células de

propagação

Após confirmada através de análise em gel de agarose a purificação do produto de

amplificação, os insertos foram ligados aos vetores. O OPPF emprega uma família de vetores

chamados pOPIN que são derivados do vetor pTriEx2, que permite a expressão em múltiplos

hospedeiros (E. coli, células de mamíferos e de insetos) e a ligação direta de produtos de PCR

(69). Todos os vetores possuem um sítio para clivagem da proteína de interesse da sua fusão

com a protease 3C (Figura 8). Os vetores escolhidos foram: pOPINS3C que produz uma

proteína em fusão com Histag-SUMO, pOPINTRX- Histag-thioredoxina., pOPINE - histag

no C-terminal, pOPINF- N-histag e pOPINM N-his-MBP.

49

Figura 8 - Esquema da construção dos vetores pOPIN, cedidos pelo grupo OPPF.


A construção dos vetores para expressão das proteínas foi feita em duas etapas. Na

primeira etapa, foram feitas as construções listadas na Tabela 2 e na segunda etapa, foi feita a

construção listada na Tabela 3.

Tabela 2 - Construções realizadas na primeira etapa.

Gene aa_N aa_C Vetores

AK1 2 345 pOPINF e pOPINS3C

HGPRT1 2 227 pOINTRX, pOPINF,pOPINE e pOPINS3C



ADSS 2 433 pOINTRX, pOPINF, pOPINE, pOPINS3C e pOPINM

ADSL 2 480 pOINTRX, pOPINF, pOPINE, pOPINS3C e pOPINM Fonte: Elaborada pela autora

Tabela 3 - Construção realizada na segunda etapa.

Gene aa_N aa_C Vetores

ADSS 21 433 pOINTRX, pOPINF, pOPINE, pOPINS3C e pOPINM


50

Os insertos foram inseridos nos vetores através da enzima In-Fusion. Em uma placa de

PCR foi adicionado 100 ng do vetor linearizado, acrescentou-se de 10 a 250 ng de produto de

PCR purificado e ajustou-se o volume com água. 10 μl dessa solução foram transferidos para

o kit In-Fusion®

HD Cloning Kits (Clontech) contendo a enzima In-Fusion liofilizada. A

placa foi mantida a 42oC por 30 minutos.

Após a ligação do inserto, os vetores foram utilizados para transformar bactérias de

propagação competentes E.coli OmniMax® II (Invitrogen). As células foram mantidas por 30

minutos no gelo na presença do vetor ligado ao inserto, posteriormente foram submetidas a

um choque térmico (30 segundos a 42oC e retornadas imediatamente ao gelo). Após o choque

térmico foi adicionado 300 μL de meio SOC-Invitrogen (sem antibiótico), e então as células

foram incubadas a 37oC por uma hora a 125 rpm.

Terminado o período de incubação, as bactérias foram plaqueadas em LB ágar

contendo 50 mg/mL de carbenicilina, 20% de X-Gal e 0,5 mM de IPTG. Este processo foi

realizado em duplicata, onde uma das placas recebeu 25 µL do meio contendo as bactérias e a

outra 5 µL. As placas foram incubadas a 37ºC “overnight”.

3.4 Escolha das colônias e transformação de células de expressão

Observou-se nas placas o crescimento de colônias isoladas brancas e azuis. Colônias

azuis são derivadas de bactérias não recombinantes e por isso foram escolhidas duas colônias

brancas para cada construção. Essas colônias foram transferidas para blocos (ABgene AB-

0932) que continham 1,2 mL de meio Power BrothTM

suplementado com 50 mg/mL de

carbenicilina. Os blocos foram vedados com adesivo poroso (ABgene AB-0718) e mantidos a

37ºC “overnight” sob agitação.

No dia seguinte, a cultura dos blocos foi centrifugada e submetida à extração de DNA

plasmidial usando o sistema robotizado The Onyx. Para confirmar a presença do inserto no

vetor, foi realizado um PCR com a enzima PhusionTM

Flash High-Fidelity usando primers

específicos para os vetores pOPIN. A reação foi feita em termociclador, sendo que a

temperatura de anelamento foi 60ºC por 30 segundos e a temperatura de extensão foi 68ºC por

2 minutos (2 minutos por kbp).

O produto da reação foi analisado em gel de agarose 1,5% corado com SYBR®Safe

DNA Stain (Invitrogen). Após confirmação do inserto nos vetores, esse produto de ligação foi

utilizado para transformar bactérias de expressão competentes: E.coli B834(DE3) e E.coli

Lemo21(DE3), utilizando o mesmo processo descrito anteriormente. Terminado o período de

51

incubação, as bactérias foram plaqueadas em LB ágar contendo 50 mg/mL de carbenicilina,

35 mg/mL de clorafenicol, 20% de X-Gal e 0,5 mM de IPTG. Este processo também foi

realizado em duplicata. As placas foram incubadas a 37ºC “overnight”.

3.5 Teste de expressão e purificação das enzimas

Observou-se novamente o crescimento de colônias isoladas brancas e azuis. Uma

colônia branca por construção foi escolhida a fim de se fazer um pré-inóculo, visando à

expressão das enzimas. Os testes de expressão foram realizados em pequena escala e por isso

as colônias escolhidas foram transferidas para blocos (ABgene AB-0932) que continham 0,7

mL de meio Power BrothTM

suplementado com 50 mg/mL de carbenicilina e 35 mg/mL de

clorafenicol. Os blocos foram vedados com adesivo poroso (ABgene AB-0718) e mantidos a

37ºC “overnight” sob agitação de 240 rpm.

No dia seguinte, 250 μL da cultura foram utilizados para produção de um estoque

glicerinado que foi armazenado a -80ºC, outros 250 μL foram transferidos para blocos

similares que continham 3 mL de meio de cultura Power BrothTM

suplementado com os

antibióticos apropriados citados anteriormente. Os blocos foram novamente vedados com

adesivo poroso e mantidos sob agitação de 240 rpm a 37ºC de 3 a 5 horas, tempo necessário

para que a densidade óptica (D.O.) a 595 nm fosse de aproximadamente 0,5. Neste ponto a

temperatura das culturas foi reduzida a 20ºC e então foi feita a indução da expressão com 1

mM de IPTG. As culturas foram mantidas “overnight” (~18 horas) sob agitação de 225 rpm a

20ºC.

Foram realizados também testes de expressão para as enzimas utilizando o meio de

autoindução Overnight ExpressTM

(ONEX) Instant TB medium (Novagen®

). O processo

utilizado foi o mesmo descrito para o meio de cultura Power BrothTM

excetuando-se apenas a

etapa de indução.

Após a expressão-teste os blocos foram centrifugados a 6000g por 10 minutos. O

sobrenadante foi descartado e o precipitado, ressuspendido em 210 μL de tampão de lise (50

mM Tris, 500mM NaCl, 30mM imidazol e 0,2% Tween com pH ajustado para 8,0)

suplementado com uma alíquota (~1 mg/mL) de inibidores de protease e uma alíquota de

DNAse tipo I (~400 U/mL). A solução foi homogeneizada e mantida sob agitação a 1000 rpm

por 30 minutos. Os blocos foram novamente centrifugados a 5000g por 30 minutos a 4ºC. O

sobrenadante foi aplicado no Biorobotic 8000 (Qiagem), que realiza a purificação das

52

proteínas em placas de forma automatizada. A purificação da expressão teste foi analisada em

SDS-PAGE.

Analisando o resultado dos testes de expressão das enzimas após protocolo de

purificação foi constatado que a melhor cepa de bactéria para a expressão da maioria das

enzimas foi a E. coli Lemo21(DE3) em meio de cultura Power BrothTM com expressão

induzida por IPTG, portanto, este sistema foi utilizado para a expressão das enzimas em larga

escala. Somente para a enzima HGPRT3 foi utilizada a cepa E. coli B834(DE3). Na Figura 9

pode-se observar o resultado do teste de expressão em SDS-PAGE da primeira rodada de

construções (juntamente com o teste de expressão de outras enzimas do projeto mais

abrangente ao qual este faz parte).

Figura 9 - Análise da expressão-teste das enzimas em E.coli Lemo21(DE3) no meio de cultura Power BrothTM

em gel SDS-PAGE. Padrão de preso molecular. ADSS – pOPIN S3C, TRX, E, F e M (A1. B1, C1, D1

e E1 respectivamente). IMPDH – pOPIN S3C, TRX, E, F e M (F1, G1, H1, A2 e B2

respectivamente). ADSL - pOPIN S3C, TRX, E, F e M (C2, D2, E2, F2 e G2 respectivamente).

HGPRT short -pOPIN S3C, TRX, E, F (H2, A3, B3 e C3). HGPRT 148820 -pOPIN S3C, TRX, E, F

(D3, E3, F3 e G3). HGPRT 168500-pOPIN S3C, TRX, E, F (H3, A4, B4, C4). PNP2 - pOPIN S3C,

M eTRX (D4, E4 e F4). NDPK -pOPIN S3C, TRX, E e F (G4, H4, A5, B5). AK1 - pOPINF e S3C

(C5 e D5). GMPS- pOPIN S3C, TRX, E, F e M (H5, A6, B6, C6, D6). GK - pOPIN S3C, TRX, E e F

(E6, F6, G6 e H6).


A tabela 4 apresenta o resultado sumarizado da análise do padrão de expressão,

apresentado no gel, para todas as construções que foram realizadas. Para a análise dos testes

de expressão, adotando a seguinte simbologia: + corresponde a um rendimento de 0,1 a 1

mg/litro de cultura; ++ Rendimento de 1 a 5 mg/litro de cultura; +++ > 5 mg/litro de cultura, (

) usado para delimitar baixos limites. Ex. +(+) espera-se rendimento mais próximo de 1 do

que 5; MBP - Apenas a proteína de ligação de maltose foi expressa; SUMO - Apenas a

proteína Sumo foi expressa, TRX - Apenas a proteína Tiorredoxina foi expressa.

53

Tabela 4 - Resultado sumarizado dos testes de expressão das enzimas.

PCR199 Expressão

Poço Nome do Gene aa_N aa_C OPPF

N°. Vetor

Verificação do PCR

B_IPTG L_IPTG B_ONEX L_ONEX

A01 ADSS 2 433 11273 S3C

B01 ADSS 2 433 11274 TRX

C01 ADSS 2 433 11270 E

D01 ADSS 2 433 11271 F (+)

E01 ADSS 2 433 11272 M (+)

C02 ADSL 2 480 11283 S3C +(+) +++

D02 ADSL 2 480 11284 TRX +++

E02 ADSL 2 480 11280 E ++ +++

F02 ADSL 2 480 11281 F +(+) +++

G02 ADSL 2 480 11282 M ++ +(+) +(+) +

H02 HGPRT1 2 227 11287 S3C +++ + +(+)

A03 HGPRT1 2 227 11288 TRX (+) +

B03 HGPRT1 2 227 11285 E ++ +(+)

C03 HGPRT1 2 227 11286 F +++ +++ (+)

D03 HGPRT2 2 227 11291 S3C + (+) (+)?

E03 HGPRT2 2 227 11292 TRX + +

F03 HGPRT2 2 227 11289 E

G03 HGPRT2 2 227 11290 F

H03 HGPRT3 2 228 11295 S3C ++ (+) (+) +(+)

A04 HGPRT3 2 228 11296 TRX + (+)

B04 HGPRT3 2 228 11293 E +

C04 HGPRT3 2 228 11294 F (+)

C05 AK1 2 345 11304 F + ++

D05 AK1 2 345 11305 S3C +


O resultado do teste de expressão foi satisfatório (++ ou +++) para as enzimas ADSL,

HGPRT1 e HGPRT3. As enzimas AK1 e HGPRT2 apresentaram baixa expressão (somente

+) e ADSS não apresentou expressão satisfatória.

Portanto, na segunda etapa foi realizado um novo teste de expressão utilizando a

construção de ADSS compreendendo os resíduos 21-433.

Na segunda rodada foi utilizada a linhagem de E. coli Lemo 21(DE3) em meio de

cultura Power BrothTM com indução por IPTG e o meio de cultura auto indutor ONEX. Como

pode ser observado na Figura 10 (juntamente com análise do teste de expressão de outras

enzimas do projeto) e na Tabela 5 com o sumário da expressão.

54

Figura 10 - Análise da expressão-teste em gel SDS-PAGE, do lado esquerdo, expressão em E.coli Lemo21(DE3)

e indução com IPTG; do lado direito, expressão em E.coli Lemo21 (DE3) em meio de auto indução

ONEX. Padrão de preso molecular. ADA – pOPINE, F, S3C, TRX, e M (C7, D7, E7, F7, G7).

NDPK short– pOPINE, F, S3C, TRX, e M (H7, A8, B8, C8, D8). NDPK large– pOPINE, F, S3C,

TRX, e M (E8, F8, G8, H8, A9). IMPDH short– pOPINE, F, S3C, TRX, e M (B9, C9, D9, E9, F9).

IMPDH large– pOPINE, F, S3C, TRX, e M (G9, H9, A10, B10, C10). ADSS– pOPINE, F, S3C,

TRX, e M (D10, E10, F10, G10, H10). Esta sequência se repete no teste de expressão utilizando o

meio de auto indução ONEX.


Tabela 5 - Resultado sumarizado do segundo teste de expressão da enzima ADSS.

Poço

Nome do gene aa_N aa_C Vetor OPPF No. Verificação

do PCR L21_IPTG L21_ONEX

D10 ADSS 21 433 E 13546

E10 ADSS 21 433 F 13547

F10 ADSS 21 433 S3C 13548

SUMO

G10 ADSS 21 433 TRX 13550

TRX

H10 ADSS 21 433 M 13549

MBP (+)? MBP


Conforme observado na análise do gel e tabela não houve expressão solúvel para

ADSS.

Para a expressão em larga escala das enzimas ADSL, AK1, HGPRT1, HGPRT2 e

HGPRT3 foram escolhidas as construções destacadas em vermelho na tabela 4 apresentadas

na Tabela 6. O volume do meio de cultura foi ajustado de acordo com a efetividade

apresentada no teste de expressão.

Tabela 6 - Enzimas e suas respetivas construções, meio de cultura, método de indução e volume escolhidos para

expressão em larga escala.

Enzima Nº OPPF Cepa de E.coli Vetor Meio/Indução Volume

ADSL 11281 Lemo 21(DE3) F Power Broth+IPTG 1 L

HGPRT1 11286 Lemo 21(DE3) F Power Broth+IPTG 1 L

HGPRT2 11291 Lemo 21(DE3) S3C Power Broth+IPTG 4 L

HGPRT3 11295 B834(DE3) S3C Power Broth+IPTG 4 L

AK1 11304 Lemo 21(DE3) F Power Broth+IPTG 4 L


55

Na expressão em larga escala ADSL, HGPRT1, HGPRT3 e AK1 foram expressas e

purificadas satisfatoriamente. Não sendo observada expressão para a enzima HGPRT2.

3.6 Expressão e purificação das proteínas em larga escala

Na expressão em larga escala, para o crescimento dos pré-inóculos foi utilizado o

glicerinado de bactérias previamente estocado em -80ºC. Foram crescidos 20 mL de pré-

inóculo para cada 1L de expressão, em meio Power BrothTM

. Os meios foram suplementados

com os antibióticos carbenicilina e clorafenicol, mantidos “overnight” sob agitação a 37ºC.

Posteriormente realizou-se os experimentos de expressão das enzimas em volumes que

variaram de 1 a 4L ajustados de acordo com o rendimento obtido nos testes. A expressão

aconteceu sempre sob agitação a 20ºC “overnight”.

Para a purificação as células foram centrifugadas e ressuspendidas em tampão de lise

(30 mL para cada 10 gramas de pellet) e imediatamente aplicadas no ÄktaXpress, um sistema

automatizado de purificação e análise de proteínas recombinantes em larga escala que realiza

a purificação baseado na técnica de cromatografia. A purificação foi feita primeiramente em

coluna de níquel (Tampão lavagem: 50 mM Tris, 500mM NaCl, 50mM imidazol e 0,2%

Tween com pH ajustado para 8,0 e Tampão de eluição: 50 mM Tris, 500mM NaCl, 200mM

imidazol e 0,2% Tween com pH ajustado para 8,0) e automaticamente aplicada em uma

coluna de gel filtração (coluna His-Gel Filtration S200). As frações foram coletadas para

posterior análise em gel SDS-PAGE.

Em seguida as proteínas foram concentradas em concentrador MWCO e submetidas à

clivagem com 0,5 mg/mL da protease 3C (Humanrhinovirus 3C protease – GE) para a

retirada da cauda de histidinas. Após a clivagem, as proteínas foram submetidas à uma

segunda purificação, que se deu manualmente em coluna His-Trap, a fração coletada foi

novamente aplicada em gel SDS-PAGE e analisada.

Analisados os resultados e determinado o protocolo de expressão e purificação das

enzimas, este foi reproduzido nas dependências do laboratório de Cristalografia no IFSC/USP

com algumas adaptações sem comprometer a qualidade da amostra obtida. No protocolo de

expressão, o antibiótico carbenicilina foi substituído por ampicilina em mesma concentração.

Para o procedimento de purificação os tampões foram modificados visando estabilizar as

enzimas purificadas, uma vez que estas precipitaram durante o processo de concentração com

os tampões originais utilizados no OPPF. Inicialmente as bactérias foram lisadas em tampão

de lise (50mM Tris, 500mM NaCl, 30mM imidazol, 5mM β-mercaptoetanol e 10% de

56

glicerol com pH ajustado para 7,4) através de sonicação e a purificação da enzima foi

realizada em um único passo utilizando coluna de afinidade de Cobalto Agarose (tampão

lavagem: 50 mM Tris, 500mM NaCl, 50mM imidazol, 5 mM β-mercaptoetanol e 10% de

glicerol com pH ajustado para 7,4 e Tampão de eluição: 50 mM Tris, 500mM NaCl, 200mM

imidazol, 5 mM β-mercaptoetanol e 10% de glicerol com pH ajustado para 7,4).

O resultado da análise de purificação de AK1 e HGPRT1 é possível ser observado na

Figura 11, HGPRT3 na Figura 12 e ADSL na Figura 13.

Figura 11 - Análise da purificação das enzimas AK1 e HGPRT1 em gel de poliacrilamida 15%. Poço 1:

Marcador de peso molecular. Poço 2 - 7. Enzima AK1 (42KDa). Poço 9 - 17: Enzima HGPRT1

(24 kDa).


Figura 12 - Análise da purificação da enzima HGPRT3 em gel de poliacrilamida 15%. Poço 1: Marcador de peso

molecular. Poço 6 - 18. Enzima HGPRT3 (24 kDa).


57

Figura 13 - Análise da purificação da enzima ADSL em gel de poliacrilamida 15%. Poço 1: Marcador de peso

molecular. Poço 2, 3 e 4: Lavado. Poço 5 - 8. Enzima ADSL (54.5 kDa).


Puras e concentradas as enzimas foram submetidas a ensaios de cristalização.

58

59

CAPÍTULO 4

4 ENSAIOS DE CRISTALIZAÇÃO E OTIMIZAÇÃO DOS CRISTAIS

4.1 Ensaios de Cristalização

Os experimentos de cristalização e co-cristalização foram realizados em placas greiner

de 96 poços utilizando 100nL de solução de proteína por poço (9.6µL por placa) para o

screening de condições de cristalização utilizando o sistema Cartesian Microsys.

Para experimentos de co-cristalização foram selecionados ligantes naturais das

enzimas, bem como possíveis inibidores, como, por exemplo, análogos de ATP para a enzima

AK1. A proteína e os ligantes foram incubados em gelo por no mínimo 30 minutos. Foram

realizados os seguintes screenings para cada proteína, conforme apresentado na tabela 7.

Tabela 7 - Ligantes e kits de cristalização utilizados para testes de cristalização das enzimas.

Enzima Ligante (mM) Kits de Cristalização

ADSL Apo, AMP (5), Ácido Fumárico (2) Adenilsuccinato

(2)

Morpheus, JCSG+,

Index e Wizzard I e II

HGPRT 1

e 3

Apo, Hipoxantina (5), Guanina (5), PRPP (5), IMP

(5), GMP (5)

Morpheus, JCSG+ e

Index

AK1 Apo, Adenosina (5), AMP (5), ATP (2), AMP-

PNP*(2), ATPα5* (2), ApCpp*(2), AppCp*(2),

AppNHp*(2)

Morpheus e JCSG+

*análogos de ATP não hidrolisáveis Fonte: Elaborada pela autora

Os cristais resultantes destes ensaios podem ser observados na Tabela 8. Foram

obtidos cristais para as enzimas ADSL, AK1 e HGPRTs em diversas condições do kit de

cristalização Morpheus (70) que apresentou excelentes resultados com as enzimas testadas.

Centenas de cristais foram congelados para a coleta de dados no DLS.

60

Tabela 8 - Cristais obtidos para as enzimas do projeto.

Proteína Ensaio Kits de

Cristalização

Cristais obtidos

ADSL

AMP Morpheus

APO Morpheus

AK1

ADO Morpheus

APO Morpheus

ApCpp Morpheus

AppNHp Morpheus

continua

61

continuação

ATP Morpheus

ATPS Morpheus

HGPRT

GMP Morpheus

IMP Morpheus


4.2 Coleta de dados e otimização dos cristais

A primeira coleta de dados foi realizada testando os cristais obtidos e congelados no

OPPF. Os cristais das HGPRTs e AK1 difrataram pobremente, sendo difícil obter um

conjunto abaixo de 3.2Å. No caso dos cristais de HGPRT, estes possuem ~30m em sua

maior dimensão o que tornou esta coleta de dados muito desafiadora, os cristais sofreram um

severo dano por radiação durante a coleta. Portanto, a utilização das linhas do DLS foi de

fundamental importância para a obtenção dos resultados aqui apresentados.

Cristais da ADSL foram testados, na sua grande maioria em forma de placas. Estas

placas difrataram pobremente, em torno de 6-7 angstroms de resolução. Um cristal em forma

de agulha obtida na condição E12 do kit de cristalização Morpheus (30mM de etileno glicóis,

120mM de Tris base/bicina pH8.5 12.5% de MPD, PEG1000 e P3350), crescido na presença

de 2mM de AMP difratou a 2,36Å de resolução.

62

Nas duas coletas posteriores, os cristais de ADSL e HGPRT1 obtidos no Brasil foram

congelados e enviados para a coleta de dados via FEDEX. Já os cristais de AK1 e HGPRT3

não foram reproduzidos nas instalações do nosso laboratório.

Na segunda coleta de dados, foram obtidos diversos conjuntos de HGPRT1 na região

de 3Ǻ de resolução, mas nenhum cristal com resolução adequada para resolução da estrutura.

Sendo assim, para a terceira coleta de dados, houve um grande esforço na tentativa de

otimizar os cristais visando a obtenção de uma estrutura com resolução mais alta em relação

às obtidas. A otimização dos cristais incluiu experimentos de (1) variação de concentração da

enzima incubada em diferentes temperaturas, (2) expressão e purificação de HGPRT com

selenometionina e (3) “screening” das condições de cristalização incubadas em diferentes

temperaturas.

4.2.1 Variação de concentração da enzima e temperatura

Foram testadas 3 diferentes concentrações de enzima: 2,5 mg/mL, 3 mg/ml e 5 mg/mL

incubadas em três temperaturas: 4ºC, 10ºC e 18ºC. Os experimentos foram realizados com a

enzima Apo e incubada com os ligantes: hipoxantina, guanina, PRPP, GMP e IMP, entretanto,

somente na presença do ligante IMP foi possível observar o crescimento dos cristais.

Figura 14 - Cristais de HGPRT1 à 2,5mg/mL de proteína incubada com IMP à 18ºC na condição A4 do kit

Morpheus.


63

4.2.2 Expressão e purificação de HGPRT com selenometionina

A enzima foi expressa em M9 meio mínimo suplementado com selenometionina

seguindo o seguinte protocolo:

Solução de sais M9 – 5x

Em 800 ml de água foi adicionado:

- 34,07gr Na2HPO4

- 15g KH2PO4

- 2,5g NaCl

- 5g NH4Cl

A solução foi agitada até completa dissolução dos sais e o pH ajustado para 7.4.

O volume foi completado para 1000ml com água destilada e a solução esterilizada em

autoclave.

M9 Meio Mínimo

Foram autoclavados 780 ml de água deionizada em 4 frascos utilizados para expressão

de proteínas. Após frios, foram adicionados em cada frasco:

- 200 ml da Solução de sais M9 – 5x

- 20 ml de glucose 20% (esterilizada através de filtragem)

- 2 ml de 1M MgSO4 (esterilizada através de filtragem)

- 100 μl de 1M CaCl2 (esterilizada através de filtragem)

Os meios de cultura foram suplementados com antibiótico ampicilina e clorafenicol.

Foram retirados 200 ml de cada frasco para a preparação dos pré-inóculos em frascos

previamente esterilizados em autoclave. Os 4 pré-inóculos cresceram sob agitação à 37ºC

“overnight”.

Após crescidos, os pré-inóculos foram inoculados nos frascos contendo meio mínimo,

estes permaneceram sob agitação de 150 rpm à 37ºC até que a densidade óptica (DO) fosse

igual ou superior a 0,6. Diferente do protocolo original, cuja DO era atingida após 4 horas de

crescimento celular, nesse caso levou-se 6 horas.

64

Nesse momento foi adicionado um mix de aminoácidos para inibir a síntese de

metionina e suplementar selenometionina.

Mix de aminoácidos:

- 100mg Lisina (K), Fenilalanina (F) e Treonina (T)

- 50mg Isoleucina (I), Leucina (L) e Valina (V)

- 60mg SelenoMetionina (SeMet)

Por litro.

Os meios permaneceram sob agitação por 15 minutos para homogeneização dos

aminoácidos. Posteriormente, a temperatura do agitador foi ajustada para 20ºC e a expressão

induzida com 1mM de IPTG. Esta seguiu o protocolo original cuja enzima é expressa

“overnight”.

O protocolo de purificação também foi mantido conforme o original, utilizando coluna

de Cobalto Agarose para purificação por afinidade.

O resultado da purificação foi analisado em gel de poliacrilamida 15%, conforme

Figura 15.

Figura 15 - Análise da purificação da enzima HGPRT1SeMet em gel de poliacrilamida 15%. Poço 1: Marcador

de peso molecular. Poço 2. Expressão da enzima. Poço 3: Eluato. Poço 4: Lavado. Poço 5 e 6:

Eluição da enzima (24kDa).


65

4.3 “Screening” das condições de cristalização em diferentes temperaturas

A HGPRT1SeMet e HGPRT1 nativa puras foram submetidas à testes de cristalização

utilizando o kit a qual a enzima nativa cristaliza, o kit de cristalização Morpheus.

Identificadas as melhores condições de cristalização da enzima (Tabela 9), estas tiveram o

valor de pH e concentração de precipitantes variados, visando melhorar os cristais da enzima

que são bastante pequenos (~30μm na sua maior dimensão) portanto de difícil manuseio e

difração.

Tabela 9 - Condições de cristalização do kit Morpheus utilizadas para “screening”

Poço Mix de precipitantes Mix de aditivos Tampão

A1 10% PEG 20.000, 20% PEG MME

550

0,03M cátions

divalentes

0,1M MES/imidazol

pH 6,5

A4 12.5% PEG 1000, 12.5% PEG 3350,

12.5% MPD

0,03M cátions

divalentes

0,1M MES/imidazol

pH 6,5

A5 10% PEG 20.000, 20% PEG MME

550

0,03M cátions

divalentes

0,1M MOPS/HEPES

pH 7,5

A8 12.5% PEG 1000, 12.5% PEG 3350,

12.5% MPD

0,03M cátions

divalentes

0,1M MOPS/HEPES

pH 7,5

A9 10% PEG 20.000, 20% PEG MME

550

0,03M cátions

divalentes

0,1M Bis/Tris base

pH 8,5

A12 12.5% PEG 1000, 12.5% PEG 3350,

12.5% MPD

0,03M cátions

divalentes

0,1M Bis/Tris base

pH 8,5 Fonte: Elaborada pela autora

Para as otimizações foram utilizados 4 blocos de soluções contendo 96 poços cada.

Cada bloco de soluções foi utilizado para teste de cristalização através de gotas sentadas

também em placas de 96 poços utilizando robô de cristalização.

Dois blocos foram utilizados para o grupo de precipitantes 10% PEG 20.000 e 20%

PEG MME 550, cuja variação foi:

- PEG MME 550: 20%, 18%, 16% e 14%,

- PEG 20.000: 10%, 8%, 6% e 4%.

- MES/imidazol: pH 6.3, 6.5, 6.7 e 6.9,

- MOPS/HEPES: pH 7.3, 7.5, 7.7 e 7.9,

- Bis/Tris base: pH 8.3, 8.5, 8.7 e 8.9

66

As combinações foram as seguintes:

- Bloco 1:

Colunas (1 – 12): Variação de tampão e pH

Linhas (A – H): Concentração de precipitante (%)

1

6.3

2

6.5

3

6.7

4

6.9

5

7.3

6

7.5

7

7.7

8

7.9

9

8.3

10

8.5

11

8.7

12

8.9

A 20 x 10

B 20 x 8

C 20 x 6

D 20 x 4

E 18 x 10

F 18 x 8

G 18 x 6

H 18 x 4

- Bloco 2:



1

6.3

2

6.5

3

6.7

4

6.9

5

7.3

6

7.5

7

7.7

8

7.9

9

8.3

10

8.5

11

8.7

12

8.9

A 16 x 10

B 16 x 8

C 16 x 6

D 16 x 4

E 14 x 10

F 14 x 8

G 14 x 6

H 14 x 4

67

Os outros 2 blocos foram utilizados para o grupo de precipitantes: 12.5% PEG 1000,

12.5% PEG 3350 e 12.5% MPD. A variação do pH foi a mesma dos blocos anteriores e a dos

precipitantes:

- PEG 1000: 12.5%, 10% e 7.5%,

- PEG 3350: 12,5% ,10% e 7,5%,

- MPD: 12,5%, 10% e 7,5%.

- Bloco 3:



1

6.3

2

6.5

3

6.7

4

6.9

5

7.3

6

7.5

7

7.7

8

7.9

9

8.3

10

8.5

11

8.7

12

8.9

A 12.5 x 12.5 x 12.5

B 12.5 x 12.5 x 10

C 12.5 x 10 x 12.5

D 10 x 12.5 x 12.5

E 10 x 10 x 10

F 10 x 10 x 12.5

G 10 x 12.5 x 10

H 12.5 x 10 x 10

- Bloco 4:



1

6.3

2

6.5

3

6.7

4

6.9

5

7.3

6

7.5

7

7.7

8

7.9

9

8.3

10

8.5

11

8.7

12

8.9

A 12.5 x 12.5 x 12.5

B 12.5 x 12.5 x 7.5

C 12.5 x 7.5 x 12.5

D 7.5 x 12.5 x 12.5

E 7.5 x 7.5 x 7.5

68

F 7.5 x 7.5 x 12.5

G 7.5 x 12.5 x 7.5

H 12.5 x 7.5 x 7.5

Os cristais, ainda muito pequenos, aparecem em cerca de 3 dias (Figura 16).

Figura 16 - Cristais de HGPRT1 com selenometionina na condição de cristalização B3 do Bloco 1.


Após vários experimentos de otimização dos cristais, a análise das gotas revelou que

estes ainda possuíam ~30μm na sua maior dimensão. Sendo assim, entre 150 e 200 cristais de

HGPRT1 foram testados e na terceira coleta de dados foi possível obter uma estrutura inédita

de HGPRT1 abaixo de 3Ǻ, esta contém 2,5mg/mL de proteína incubada a 18ºC na condição

A4 do kit Morpheus.

Nessa mesma coleta de dados foi possível obter outra estrutura de ADSL na forma

Apo com resolução de 2,14Ǻ.

De todos os cristais testados nas três coletas de dados, foram obtidos 30 conjuntos de

dados de HGPRT1 entre 5.24Ǻ e 2.8Ǻ; 4 conjuntos de dados de AK1 (provenientes somente

da primeira coleta de dados, uma vez que os cristais obtidos nas instalações do OPPF ainda

não foram reproduzidos) entre 4.49Ǻ e 3.44Ǻ; 12 conjuntos de dados de ADSL entre 3.64Ǻ e

2.14Ǻ.

69

CAPÍTULO 5

5 ESTRUTURA CRISTALOGRÁFICA E CINÉTICA ENZIMÁTICA DE

ADSL de Schistosoma mansoni

5.1 Coleta de dados, processamento, resolução e refinamento de dados de difração de

raios-X

Foram obtidos dois conjuntos de dados de ADSL, o primeiro complexo binário

ADSL-AMP à 2.36Å de resolução coletado na linha de luz I02 no DLS crescido na condição

E12 do kit de cristalização Morpheus (30mM de etilenos glicóis, 120mM de Tris base/bicina

pH8.5, 12.5% de MPD, PEG1000 e PEG3350). O segundo conjunto de dados coletado na

linha I04-01, ADSL na forma Apo à 2.14Å de resolução crescido na condição F2 (0,12M de

monossacarídeos, 0,1M de MES/imidazol pH6.5, 30% de etileno glicol e PEG8000).

Figura 17 - Cristal de ADSL da condição E12 do kit de cristalização Morpheus (30mM de etilenos glicóis,

120mM de Tris base/bicina pH8.5, 12.5% de MPD, PEG1000 e PEG3350).


Os parâmetros da coleta de dados e refinamento das duas estruturas podem ser

visualizados na Tabela 10.

70

Tabela 10 - Estatísticas da coleta de dados e refinamento para os cristais de ADSL.

Coleta de Dados ADSL - AMP ADSL - APO

Grupo Espacial I222 P21212

Dimensão da célula (Å) a, b, c. 70.50, 73.06, 180.35 76.16, 82.63, 163.78

Ângulos da célula (º) α = β = γ = 90 α = β = γ = 90

Detector PILATUS 6M PILATUS 2M

Fonte de Raio-X DLS I02 DLS I04-1

Comprimento de onda (Å) 0.9795 0.9200

Resolução (Å) 35.23 - 2.36 (2.49 - 2.36)* 58.16 - 2.14 (2.20 - 2.14)*

Redundância 5.4 (5.6)* 7.2 (7.1)*

Rpim (%)** 6.2 (29.7)* 5.2 (29.8)*

CC (1/2) 0.987 (0.730)* 0.996 (0.701)*

Completeza (%) 99.8 (98.2)* 99.8 (99.9)*

Reflexões totais 105164 (15589)* 414384 (29958)*

Reflexões únicas 19416 (2774)* 57766 (4219)*

I / σ(I) 8.5 (2.6)* 10.4 (2.6)*

Parâmetros Refinamento

Reflexões usadas refinamento 19399 57730

R (%)*** 19.16 22.24

RFree(%)*** 23.12 25.57

No. átomos proteína 3735 6871

No. átomos ligante 23 -

Erro coordenada (ML baseado) (Å) 0.27 0.28

Erro de fase (o) 23.58 24.85

Clashscore 5.83 5.24

RMSD da geometria ideal****

r.m.s. distância ligações (Å) 0.002 0.002

r.m.s. ângulos de ligação (°) 0.544 0.493

PDB ID 5EYT 5EYV


*Valores entre parênteses referem-se aos valores da mais alta resolução.

**Rpim = ∑hkl[1/(N(hkl) - 1)]1/2 ∑i|Ii (hkl) – (I(hkl))|/∑hkl∑iIi (hkl)

***R = ∑ ||Fo| - |Fc|| / ∑ |Fo| onde |Fc| é a amplitude do fator de estrutura calculado do modelo e |Fo| é a amplitude do fator de estrutura

obervado do modelo. Rfree é calculado com base em 5% do conjunto de reflexões que não é utilizado durante o refinamento (71).

****RMSD "root mean square deviation", desvio quadrático médio do conjunto de parâmetros de estereoquímica ideal (72).

71

A primeira estrutura foi resolvida por substituição molecular utilizando o programa

Phaser (73) tendo ADSL humana em complexo com AMP (PDB 2J91) como modelo de

busca, a identidade sequencial entre a ADSL humana e de S. mansoni é de 57%. Conforme

observado na tabela, o cristal pertence ao grupo espacial I222 e possui apenas uma molécula

por unidade assimétrica.

Após a resolução da estrutura, o modelo resultante foi submetido a um ciclo

automático de construção do modelo utilizando o programa wARP/ARP (74). Após o ciclo

automático de refinamento vários ciclos de construção manual do modelo e refinamento

foram realizados utilizando o programa Coot (75) e Phenix. (76)

Analisando os mapas de densidade eletrônica da primeira estrutura coletada, nota-se a

presença de ligante na região do sítio ativo da molécula de ADSL presente na unidade

assimétrica, este foi identificado como sendo uma molécula de AMP (Figura 18).

72

Figura 18 - Mapa de densidade eletrônica (Fo-Fc) para o AMP no sítio ativo da ASDL de S.mansoni. O sítio

ativo é formado pela participação de três das quatro subunidades da enzima.


O AMP foi adicionado manualmente e as águas com o auxílio do programa Phenix.

A estrutura da forma APO também foi resolvida pelo mesmo processo de substituição

molecular e teve como modelo de busca a estrutura da ADSL com AMP previamente

refinada. A estrutura da ADSL APO possui dois monômeros na unidade assimétrica do grupo

espacial P21212.

5.2 Validação das estruturas

Os modelos tridimensionais de ADSL obtidos após o completo refinamento foram

73

validados de três formas: primeiro avaliando-se o valor do Rwork e Rfree obtidos ao final do

refinamento, que correspondem a Rwork = 0.1916 e Rfree = 0.2312 para ADSL-AMP e a Rwork =

0.2224 e Rfree = 0.2557 para ADSL Apo. Valores considerados coerentes e adequados em

relação ao valor da resolução obtida (77).

A segunda, foi a avaliação da geometria da proteína através do programa

MOLPROBITY (78). O resultado pode ser visualizado na tabela 11.

Tabela 11 - Análise da geometria de ADSL gerada pelo programa MOLPROBITY. (78)

Parâmetro analisado ADSL-AMP ADSL-Apo Parâmetros

referenciais (ideal)

Rotâmeros ruins 2.46% 2.46% <0.3%

Desvio Cβ >0.25Å 0 0 0

Resíduos com ligações

ruins

0% 0% 0%

Resíduos com ângulos

ruins

0% 0.02% <0.1%


Apesar da estrutura de ADSL Apo apresentar uma resolução melhor que o complexo

ADSL-AMP, o refinamento manual exigiu maior empenho devido a falta de densidade

eletrônica clara em diversas regiões. Ambas estruturas apresentam o número de “rotâmeros

ruins” acima do padrão de referência considerado ideal. ADSL-Apo apresentou uma

porcentagem de resíduos com “ângulos ruins” maior que ADSL-AMP. Entretanto, esta,

apesar de não ideal em alguns parâmetros analisados, é a melhor geometria alcançada após o

refinamento das estruturas. Estando em um padrão aceitável.

A terceira forma de validação utilizada foi a avaliação dos ângulos diédricos Φ (phi)

versus Ψ (psi) dos aminoácidos da estrutura no diagrama de Ramachandran gerado pelo

programa Procheck. (79) O resultado do gráfico de Ramachandran gerado pode ser

visualizado na Figura 19 para a estrutura de ADSL-AMP e Figura 20 para a estrutura de

ADSL-Apo.

74

Figura 19 - Diagrama de Ramachandran com a distribuição dos ângulos diedros para a estrutura ADSL-AMP. A

região representada em vermelho corresponde à região mais favorável para os valores dos ângulos, a

região amarelo escuro é a adicionalmente permitida, amarelo claro é a generosamente permitida e a

região em branco é a região não permitida. As glicinas são representadas por triângulos.


Na estrutura de ADSL-AMP é possível observar que os resíduos em regiões mais

favoráveis (vermelho) correspondem a 92.8%, adicionalmente permitida (amarelo escuro) a

6.9%, generosamente permitida (amarelo claro) a 0,2% não permitida a 0%.

75

Figura 20 - Diagrama de Ramachandran com a distribuição dos ângulos diedros para a estrutura ADSL-Apo. A





Na estrutura de ADSL-Apo os resíduos em regiões mais favoráveis (vermelho)

correspondem a 91%, adicionalmente permitida (amarelo escuro) a 8.5%, generosamente

permitida (amarelo claro) 0.5% e não permitida a 0%.

Baseado na análise de 118 estruturas com resolução em torno de 2Å e R-factor

próximo de 20%, é de esperar que um modelo de boa qualidade tenha mais de 90% de

resíduos nas regiões mais favorecidas. (79)

A partir dos métodos utilizados para a validação do modelo podemos considerá-los

confiáveis para a análise da estrutura tridimensional da enzima ADSL de Schistosoma

mansoni.

76

5.3 Análise das estruturas tridimensionais obtidas de ADSL de Schistosoma mansoni

5.3.1 Estrutura secundária, topologia e regiões conservadas

A subunidade de ADSL é quase completamente composta por α-hélices. Pode ser

dividida em três domínios (Figura 21) que se combinam para formar uma estrutura alongada.

Os domínios I e III são encontrados nas extremidades do feixe helicoidal longo formado pelo

domínio II. O domínio I ou N-terminal compreende os resíduos de 1 – 101, o qual é formado

por 7 hélices (α1 – α7).

O domínio II ou central, consistindo dos resíduos 102 – 358 que formam um feixe

helicoidal alongado montado por α8 até α15, bem como uma curta folha beta formada por 2

fitas antiparalelas (β1 , β2) posicionadas entre α8 e α9. O domínio III ou C-terminal

compreende 9 hélices (α16 – α 25) construídas dos resíduos 359 – 480.

Figura 21 - Estrutura de ADSL de S. mansoni (monômero) é composta por 3 domínios: domínio I (vermelho),

domínio II (azul) e domínio III (amarelo).


Domínio III

C-terminal

Domínio II

Central

Domínio I

N-terminal

AMP

77

A estrutura secundária em função da sequencia de aminoácidos da ADSL em

complexo com AMP e a topologia da estrutura podem ser visualizadas nas Figuras 22 e 23.

Figura 22 - Estrutura secundária de SmADSL em complexo com AMP em função da sequência de aminoácidos.

As fitas β são representadas por setas rosas, as α-hélices por espirais roxas com a respectiva

numeração em cima (H1, H2...H25), as 2 folhas β são classificadas como A e B, sendo essas letras

colocadas acima das fitas identificando a qual folha pertencem. Os símbolos: β - beta turn, γ -

gamma turn e - beta hairpin.


78

A análise de estrutura secundária de ADSL-AMP gerada pelo programa PROMOTIF

mostrou que 17 resíduos de aminoácidos (3,6%) estão em fitas β, 289 (61,2%) em α-hélices,

18 (3,8%) em hélices 3-10, 148 (31,4%) em outros, totalizando 472 aminoácidos. A estrutura

possui: 2 folhas β antiparalelas, 2 beta hairpins, 1 beta bulge, 4 fitas β, 25 α-hélices, 44

interações hélice-hélice, 25 β-turns e 4 gama-turns.

Figura 23 - Topologia de ADSL-AMP. As fitas β são representadas por setas rosa, as α-hélices em tubos

vermelhos e os loops em azul. O N-terminal é indicado pela letra N e o C-terminal pela letra C.


A análise de estrutura secundária de ADSL-Apo gerada pelo programa PROMOTIF

79

mostrou que 17 resíduos de aminoácidos (3,6%) estão em fitas β, 296 (63,5%) em α-hélices,

17 (3,6%) em hélices 3-10, 136 (29,2%) em outros, totalizando 466 aminoácidos. A estrutura

possui: 2 folhas β antiparalelas, 2 beta hairpins, 1 beta bulge, 4 fitas β, 26 α-hélices, 62

interações hélice-hélice, 23 β-turns e 7 gama-turns.

O alinhamento da sequência de aminoácidos de ADSL de Schistosoma mansoni com a

correspondente humana pode ser visualizado na Figura 24.

80

Figura 24 - Alinhamento de ADSL humana e de Schistosoma mansoni. A primeira linha corresponde à estrutura

secundária formada, a segunda linha a sequência de aminoácidos de ADSL de S. mansoni e a

terceira linha de ADSL humana. Os resíduos brancos grifados em vermelho são conservados nas

duas estruturas, os em vermelho grifados em branco são os resíduos não conservados, porém

similares.


81

O alinhamento da sequência de aminoácidos de ADSL com sua correspondente

humana revelou longas regiões extremamente conservadas entre ambas. Na região dos

resíduos 281 – 293 é possível observar que a sequência assinatura Q*GSS*MP*K*NP

comum a todos os membros da superfamília de β-eliminação (64) é exatamente igual na

ADSL de S. mansoni e humana. As regiões conservadas podem ser observadas na estrutura

apresentada Figura 25. Em A. essas regiões estão destacadas em vermelho, em B é possível

observar os 261 resíduos idênticos entre ambas destacados em pink.

Figura 25 - Análise das regiões conservadas à partir do alinhamento da sequência de aminoácidos de ADSL de S.

mansoni e ADSL humana. A. Regiões conservadas destacadas em vermelho. B. Resíduos idênticos

entre ambas destacados em pink.


Já a análise do alinhamento da sequência de aminoácidos com todas as outras enzimas

depositadas no PDB revelou similaridade nos domínios I e II com outras espécies. Na Figura

26 é possível observar a análise dos resíduos conservados e idênticos entre ADSL de S.

mansoni (SmADSL) com todas as ADSLs depositadas no PDB. O degrade de vermelho a

branco, passando por tons de rosa indica o grau de conservação dessas regiões, sendo

vermelho mais conservado e branco não conservado. Destacados em pink estão os 5

aminoácidos que são idênticos em todas as ADSLs analisadas: Ala157, Gly198, Pro288,

Lys290 e Asn292.

A B

82

Figura 26 - Análise das regiões conservadas à partir do alinhamento da sequência de aminoácidos de ADSL de S.

mansoni com todas as ADSLs depositadas no PDB. Regiões conservadas destacadas em degradê de

vermelho a branco, da mais conservada a não conservada respectivamente. Resíduos idênticos entre

as estruturas destacados em pink.


5.3.2 Enovelamento

Atualmente (além das estruturas de S. mansoni aqui descritas) existem 23 estruturas de

ADSLs depositadas no banco de dados PDB que correspondem a 15 organismos diferentes:

Thermotoga maritima (2) (64), Pyrobaculum aerophilum (1) (81), Bacillus subtilis (1) (81),

Caenorhabditis elegans (1), Plasmodium Vivax (2) (82), Humano (4) (83), Bacillus anthracis

(1), Escherichia coli (4) (84), Legionella pneumophila (1), Staphylococcus aureus (1) (85),

Francisella tularensis (1), Trypanosoma Brucei (1), Mycobacterium smegmatis (1) (86),

Leishmania donovani (1), Salmonella typhimurium. (1)

Experimentos de “Dynamic light scattering” (DLS) indicaram que em amostras

frescas de ADSL concentradas a 1 mg/mL existem 2 espécies em solução, sendo de

aproximadamente 8% dímeros e 92% tetrâmeros. Em amostras congeladas há uma semana

essa relação era de 15% dímeros e 85% tetrâmeros na mesma concentração.

http://www.rcsb.org/pdb/search/smartSubquery.do?smartSearchSubtype=TreeEntityQuery&t=1&n=1423

83

Alterações no estado multimérico entre dímeros e tetrâmeros de ADSLs foram

previamente reportadas. A enzima de Bacillus subtilis é descrita como dimérica em sua

maioria quando a concentração da proteína é baixa (0.1 mg/ml). No entanto, quando a

concentração de proteína aumenta, as espécies tetraméricas tornam-se o mais abundantes. (87)

O dímero de ADSL pode ser visualizado na Figura 27 e o tetrâmero na Figura 28.

Figura 27 - Estrutura dimérica de SmADSL em complexo com AMP (preto) (subunidade A: verde, subunidade

B: vermelho).


http://www.rcsb.org/pdb/search/smartSubquery.do?smartSearchSubtype=TreeEntityQuery&t=1&n=1423

84

Figura 28 - Estrutura tetramérica de SmADSL em complexo com AMP (preto) (subunidade A: verde, B:

vermelho, C: amarelo, D: azul).


AMP

Vista Superior

Vista Frontal

85

É observado que estruturas cristalográficas de ortólogos também revelaram a formação

de tetrâmeros. Esta é descrita como a estrutura funcional da enzima, uma vez que o tetrâmero

contém 4 sítios ativos e cada um deles é formado por regiões de 3 diferentes subunidades.

(82,85-86)

Sobrepondo as estruturas ADSL em complexo com AMP (vermelho) contra a ADSL

APO (azul) obtêm-se o valor de RMSd de 1.3Å (quando sobreposto os monômeros A) e de

0.28Å (quando sobreposto o monômero B) (Figura 29). A diferença mais significativa é

observada no domino III, que possui orientação diferente em A e é parcialmente desordenado

em B.

Figura 29 - Sobreposição do monômero da ADSL-AMP (vermelho) com os monômeros da ADSL-APO (azul).

A maior diferença é observado no domino III, que possui orientação diferente em A e é parcialmente

desordenado em B.


Quando sobrepostos os tetrâmeros de ADSL-AMP e ADSL-APO o RMSd foi de

1.14Å (Figura 30).

A B

86

Figura 30 - Sobreposição dos tetrâmeros da S. mansoni em complexo com AMP (vermelho) e APO (azul) o

RMSd é de 1.14Å.


Sobrepondo a estrutura de SmADSL com a estrutura da ADSL humana (Figura 31) é

possível observar que seu enovelamento é bastante similar, apresentando somente uma

diferença na orientação do domínio III entre as duas estruturas. É reportado que a estrutura do

core, referente ao domínio II da enzima é altamente conservado entre os membros da

superfamília de β-eliminação, enquanto os domínios I e III podem mudar significativamente.

(64)

87

Figura 31 - Sobreposição das estruturas de ADSL de S.mansoni (monômero) em vermelho e ADSL humana em

amarelo. AMP em preto. RMSd = 0,589Å.


Quando comparados os tetrâmeros da SmADSL com a ADSL humana em complexo

com AMP o RMSd é de 1.43Å para o complexo com AMP e de 1.46Å para a estrutura APO.

(Figura 32).

Domínio III

88

Figura 32 - Sobreposição das ADSL de S. mansoni (ADSL-AMP vermelho), (APO- azul) contra a ADSL

humana em complexo com AMP (amarelo).


5.3.3 O sítio ativo

Conforme descrito anteriormente, o sítio ativo da ADSL, assim como das outras

ADSLs depositadas no banco de dados, é formado por resíduos provenientes de três das

quatro subunidades que compõe a estrutura catalítica da enzima (Figura 33).

89

Figura 33 - Participação de três das quatro subunidades da enzima SmADSL em complexo com AMP na

formação do sítio ativo.


Na estrutura de SmADSL em complexo com AMP, o fosfato do AMP faz ligação de

hidrogênio com Arg14C, Tyr15C, Arg298C, Ser329A, Arg333A e uma molécula de água.

90

O O2 da ribose faz ligação de hidrogênio com o grupo carbonila da Arg79A e O3 faz

ligação de hidrogênio com o grupo carbonila da Arg79A, com o grupo amina da Asp81A e

uma molécula de água.

O N1 da adenina faz ligação de hidrogênio com Ser106A e uma molécula de água. N6

da adenina com Gln236A.

Figura 34 - Ligações de hidrogênio (pontilhado amarelo) do ligante AMP no sítio ativo de SmADSL.


Um modelo esquemático da ligação do AMP no sitio ativo da SmADSL foi gerado

através do programa Ligplot + pode ser visualizado na Figura 35.

91

Figura 35 - Modelo esquemático para a ligação da AMP no sítio ativo da ADSL de S. mansoni.


O maior número de ligações de hidrogênio ocorre entre a ASDL e o grupo fosfato do

AMP.

A sequência de aminoácidos de 281 à 293 na SmADSL correspondente à região

conservada considerada a assinatura das enzimas da superfamília de β-eliminação, é uma

região de loop que circunda o sítio ativo.

92

Na estrutura SmADSL em complexo com AMP, esta região é uma região difusa, não

sendo observada densidade eletrônica clara para os resíduos 281QIGSSA286. Somente são

observados os resíduos 287MPYKRNP293 (Figura 36). Nesse loop encontram-se três, dos

cinco resíduos (Pro288, Lys290 e Asn292) invariáveis encontrados em todas as ADSLs

depositadas no PDB.

Figura 36 - Loop correspondente a sequência de aminoácidos de 281 à 293 na SmADSL-AMP correspondente à

região conservada considerada a assinatura das enzimas da superfamília de β-eliminação na região

do sítio ativo.


O resíduo Lys80 está representado na Figura como referência para ligação da

sequência da cadeia cuja densidade eletrônica não foi possível observar.

Fyfe e colaboradores (85) descrevem essa região da estrutura de ADSL de

Staphylococcus aureus como uma parte do sítio ativo formada por um loop móvel, uma vez

que a densidade eletrônica nessa região também se apresentou de forma difusa. Corroborando

com esses dados na ADSL de E.coli (EcADSL) esse loop é desordenado na estrutura Apo,

mas a presença de um ligante induz a reorganização parcial do loop para perto do sítio de

ligação. (84)

Assim como em EcADSL, na estrutura SmADSL Apo esta região é ainda mais difusa,

onde são observados somente os resíduos Lys290, Arg291, Asn292 e Pro293 (Figura 37).

Sugerindo que a presença do ligante gere certa estabilidade ao local.

93

Figura 37 - Loop correspondente a sequência de aminoácidos de 281 à 293 na SmADSL-Apo correspondente à

região conservada considerada a assinatura das enzimas da superfamília de β-eliminação na região

do sítio ativo.


É possível observar através da sobreposição dos loops (Figura 38), que conformação

da cadeia lateral do resíduo Arg291 difere entre ambos. Na estrutura em complexo com AMP,

Arg291 aponta para baixo e para fora do sítio ativo enquanto que na estrutura Apo a cadeia

lateral aponta para dentro do sítio ativo. A continuação do loop pela ligação da Lys290 mostra

que na ADSL-AMP, o loop se afasta mais do sítio ativo em relação à ADSL-Apo. Essa

diferença sugere que existe uma adaptação do loop ao volume do ligante presente no sítio

ativo.

94

Figura 38 - Sobreposição dos loops de ADSL-AMP (amarelo) e ADSL-Apo (verde) onde a conformação da

Arg291 e Lys290 difere entre ambos.


Através da comparação dos sítios ativos das estruturas da SmADSL e da ADSL

humana (Figura 39), é possível observar que estrutura de ligação de AMP no sítio ativo de S.

mansoni é bastante similar ao complexo de ADSL humana com AMP. Um alto grau de

conservação ao redor do sítio de ligação e ativo é observado em todas ADSLs, sugerindo que

o mecanismo enzimático é estritamente conservado.

O sítio de ligação ao AMP é totalmente conservado entre as ADSLs humana e de S.

mansoni. A conformação das cadeias laterais é bastante similar entre os complexos com

AMP, entretanto quando comparamos os complexos com AMP com a estrutura APO se

observa diferentes conformações para a cadeia lateral especialmente para os resíduos Arg79 e

His80.

95

Figura 39 - Sobreposição dos sítios de ligação ao AMP nas ADSLs de S mansoni (Branco-AMP e amarelo-APO)

e humana (magenta).


Além dos resíduos que fazem ligação de hidrogênio com a molécula de AMP, os

resíduos conservados da região do loop, outros resíduos que merecem atenção na descrição do

sítio ativo são os resíduos catalíticos.

A identificação da base catalítica de ADSLs tem sido um extenso debate. (81,84-

86,88) Os resíduos catalíticos seguem uma reação ácido-base geral, envolvendo dois grupos

separados para função de ácido e base catalíticos. (88)

5.3.4 Mecanismo catalítico

ADSL catalisa a clivagem de adenilsuccinato (ADS) através de um mecanismo ácido-

base geral envolvendo a β-eliminação de fumarato.

96

Figura 40 - ADSL catalisa a clivagem de adenilsuccinato (ADS) em AMP e Fumarato.

Fonte: FYFE et al. (85)

A base catalítica está envolvida na abstração de um próton (Figura 41, passo 1),

seguido da protonação do ácido catalítico (Figura 41 , passo 3).

A reação tem início com a abstração do próton do Cβ do substrato pela base geral,

resultando na formação de um carbânion intermediário. O intermediário é estabilizado por

formas de ressonância do acil-carboxilato, que transporta duas cargas negativas no seu grupo

δ-carboxílico (Figura 41, passo 2). Subseqüente doação de prótons pelo ácido catalítico para o

átomo N1 ou N6 do substrato resulta na clivagem da ligação de Cα-N (Figura 41, passo 4) e

liberação do produto (Figura 41, passo 5). A reação prossegue através de um mecanismo de

uni-bi com fumarato deixando o sítio ativo antes do AMP. (84)

Adenilosuccinato

ADSL

AMP Fumarato

97

Figura 41 - Esquema geral mostrando a clivagem de adesnilosuccinato (SAMP) pela enzima ADSL. Os 5 passos

envolvidos são: (1) Abstração de um próton pela base catalítica (B) do átomo CB do grupo

succínico; (2) estabilização do carbânion intermediário formado; (3) protonação de N1 ou N6 da

porção do AMP pelo ácido catalítico; (4) clivagem da ligação de Cα-N entre AMP e o grupo

succínico; e (5) liberação dos produtos AMP e fumarato.

Fonte: TSAI et al. (84)

A estereoquímica trans da reação sugere que dois grupos separados participam das

etapas de abstração e doação de prótons. (89) Conforme descrito anteriormente, ainda não

existe consenso de quais são os resíduos que atuam como ácido e base catalíticos no sítio

ativo de ADSLs.

Nos primeiros estudos realizados em 1999 (90), ensaios de atividade envolvendo a

enzima ADSL de B. subtilis sugeriram que os resíduos His68 e His141 são respectivamente

ácido e base geral nessa reação (His80 e His153 em SmADSL). Foulk e colaboradores no

estudo da estrutura do gene da enzima sugeriram que estes mesmos resíduos deveriam ser

também os resíduos catalíticos em SmADSL devido a conservação exata em sua sequência.

(37)

1. Abstração do próton 2. Estabilização do carbânion

intermediário por ressonância

3. Protonação dos átomos N1 ou N6

4. Clivagem ligação Cα-N

4. Liberação do produto

98

Posteriormente, estudos estruturais de ADSL de T. marítima complementaram esses

dados bioquímicos, permitindo a construção manual de um modelo para o substrato ligado,

evidenciando a participação de His68 e His141 na catálise e dos resíduos Gln212, Asn270 e

Glu275 na orientação do substrato. (81)

Mais tarde em 2007 (84), foi proposto que o resíduo His153 ou uma molécula de água

funcionariam como ácido e Ser284 como base (resíduos correspondentes em SmADSL). Estes

estudos propuseram que uma vez que a serina conservada está posicionada no loop móvel

perto do sítio ativo, esta pode abstrair o próton do substrato, ajudando a criar o carbânion

intermediário. A histidina seria o doador de próton de N6 para suportar a quebra da ligação C-

N. A colocação da adenina no sítio ativo em relação a histidina sugere que é improvável que a

protonação de N1 ocorre durante a catálise.

Em um estudo mais recente com ADSL de Staphylococcus aureus realizado em

2010 (85) foi proposto que o resíduo His153 e Lys290 (resíduos correspondentes em

SmADSL) são os resíduos ácido e base respectivamente.

Mutagênese da lisina equivalente em ADSL de B. subtilis diminuiu

significativamente a atividade da enzima. (91)

Ainda mais recentemente em 2014 (86), a primeira estrutura de ADSL apo com o loop

móvel, conservado na região do sítio ativo, ordenado foi reportada. Essa ADSL de

Mycobacterium smegmatis sugere que His153, Lys290 e Ser284 são os resíduos mais

prováveis para as funções de ácido e base catalíticos.

5.3.5 Interface dimérica, estabilidade estrutural e o potencial para desenvolvimento de

inibidores

Fyfe e colaboradores (85) em seus estudos da estrutura de ADSL de Staphylococcus

aureus em complexo com AMP, ficaram intrigados com duas observações. A primeira, que o

tetrâmero (ou dímero de dímeros) é requerido para a produção da enzima funcional, uma vez

que os resíduos de três subunidades são requeridos para a formação do sítio ativo. Em

segundo lugar, há menos conservação da sequência entre os resíduos de ADSLs envolvidas na

montagem da estrutura quaternária do que aqueles em torno dos sítios ativos que são

extremamente conservados. A partir dessas observações, decidiram considerar a interface do

dímero como um potencial alvo para desenvolvimento de novos fármacos baseados na

estrutura da enzima.

99

Este ponto de vista é bastante interessante e reforçado por pesquisas que

identificaram onze mutações pontuais que causam a deficiência de ADSL em humanos e

consequentemente retardo mental, sendo que algumas dessas mutações influenciam a

estabilidade do tetrâmero. (66)

Comparando os resíduos da ADSL humana nativa e a forma inativa, quando mutada,

com os resíduos correspondentes em SmADSL (tabela 12), foi mostrado que sete de onze

desses resíduos são exatamente conservados com respeito ao grupo funcional da cadeia lateral

em relação a enzima nativa. Sugerindo que esses resíduos também são importantes para

SmADSL. (37) O posicionamento dos onze resíduos na estrutura trimensional pode ser

observado na Figura 42.

Tabela 12 - Comparação dos resíduos entre a ADSL humana nativa, ADSL humana mutada e SmADSL que

foram identificados cujas mutações implicam na deficiência severa de ADSL em humanos e

consequentemente retardo mental em pacientes.

ADSL humana ADSL humana

mutante

ADSL Schistosoma

mansoni

M26 L26 M20

I72 V72 V66

P100 A100 P94

R141 W141 R135

R190 Q190 K184

K246 R246 K241

R303 C303 R298

S395 R395 A390

D422 Y422 S418

R426 H426 K422

S438 P438 S434

Fonte: FOULK et al. (37)

No entanto, o resíduo V66 é equivalente ao resíduo encontrado na enzima humana

mutada e os resíduos A390 e S418 não são conservadas em relação ao grupo funcional da sua

cadeia lateral. Isto sugere que esses resíduos podem ser menos importantes para a estrutura e

função de SmADSL ou que a estrutura da enzima humana e de S.mansoni alcançam sua

estrutura e estabilidade de uma forma diferente. (37)

100

Figura 42 - Posicionamento estrutural em SmADSL dos resíduos identificados cujas mutações implicam na

deficiência severa de ADSL em humanos e consequentemente retardo mental em pacientes.


A mutação de Lys246 (Lys241 em SmADSL – Figura 43) para ácido glutâmico na

enzima humana situa-se na interface dimérica A-B ou na interface C-D e resulta numa

proteína predominantemente monomérica com atividade enzimática insignificante. (92)

101

Figura 43 - Posicionamento do resíduo Lys241 em SmADSL na interface dimérica A-B.


Na estrutura SmADSL, o resíduo Lys241 da cadeia A faz uma ligação de hidrogênio

com o resíduo Thr256, duas ligações com Asp176 e duas com Asn252 da cadeia B (Figura

44).

102

Figura 44 - Ligações de hidrogênio (pontilhado amarelo) entre os resíduos Lys241A com Thr256B, Asp176B e

Asn252B em SmADSL.


A mutação de Arg303 (Arg298 em SmADSL – Figura 45) para cisteína na enzima

humana situa-se na interface B-C ou na interface A-D na formação do tetrâmero. A

importância do resíduo equivalente na estabilidade tetramérica e atividade da enzima, em

ADSL de Bacillus subtilis foi demonstrada através de experimentos de mutação sítio dirigida.

(93)

Posteriormente, Ray e colaboradores (83) realizaram estudos termodinâmicos e

enzimáticos dessa mutação na enzima humana e observaram a perda de cooperatividade por

causa da mutação R303C devido à remoção de ligações de hidrogênio com um dos três

monômeros que compreendem o sítio ativo. Curiosamente, perceberam que ao contrário de

outras mutações que conduzem a deficiência de ADSL, essa mutação afetaria mais

significativamente a capacidade da enzima para catalisar a conversão de ADS do que a de

SAICAR aos seus respectivos produtos.

103

Figura 45 - Posicionamento do resíduo Arg298 em SmADSL na interface B-C.


Na estrutura SmADSL, o resíduo Arg298 da cadeia B interage com a cadeia C

mediado por uma ligação de hidrogênio com o resíduo Ile480B ligado à uma molécula de

água que Glu75 da cadeia C também faz ligação. Glu75C faz uma ligação de hidrogênio com

o resíduo Arg14B que se liga na mesma molécula de água que Ile480B e Glu75C (Figura 46).

104

Figura 46 - Ligações de hidrogênio (pontilhado amarelo) entre os resíduos Arg298B, Ile480B, Glu75C, Arg14B

e uma molécula de água como mediadora em SmADSL.


Outras mutações dos resíduos que não se encontram na interface dimérica ou

tetramérica também foram relatadas como sendo importantes na estabilidade estrutural da

enzima. Polenchar e colaboradores (87,93) realizaram experimentos de mutação sítio dirigida

em ADSL de Bacillus subtilis correspondente à outras três mutações descritas (M26L,

R141W, S395R) para a severa deficiência de ADSL em humanos. Esses pesquisadores

demonstraram a importância desses resíduos na estabilidade da estrutura quaternária da

enzima.

Ter como alvo a forma transiente de interações proteína-proteína ou a interface de

conjuntos oligoméricos por métodos de busca baseados em estrutura para encontrar inibidores

apresenta um desafio significativo. Os fatores de complicação incluem o elevado grau de

especificidade e as grandes áreas de interacções envolvidas na formação do complexo. (94)

No entanto, ADSL existe em formas diméricas e tetraméricas, com a atividade da

enzima restrita à forma tetramérica. Por conseguinte, a prevenção da formação ou

desestabilização do tetrâmero proporciona uma via para a inibição da enzima.

É importante lembrar que a ADSL humana está envolvida em duas reações diferentes

na via de síntese de purinas: a eliminação de fumarato de 50-phosphoribosyl-4-

(Nsuccinocarboxamide)-5-aminoimidazole e de adenilsuccinato. Em contraste, em

Schistosoma, somente a via de salvação de purinas é ativa, portanto, a SmADSL está

105

envolvida somente na conversão de adenilsuccinato em AMP. Essas diferentes funções

bioquímicas podem ter resultado na evolução de diferenças estruturais entre parasita e

hospedeiro. Sendo assim, estas diferenças podem conduzir ao desenvolvimento de fármacos

anti-esquistossomose baseados na inibição seletivade SmADSL. (37)

5.4 Determinação de parâmetros cinéticos da enzima ADSL de Schistosoma mansoni

através de calorimetria de titulação isotérmica (ITC)

Os ensaios enzimáticos de ADSL foram realizados em colaboração com o aluno de

doutorado do nosso grupo, Vitor Hugo Balasco Serrão.

Experimentos de calorimetria de titulação isotérmica (ITC) foram implementados

conforme descrito por Todd e Gomez, (95) para investigar a cinética enzimática dos dois

substratos: ADS e SAICAR, bem como a classificação “liase” de SmADSL, ou seja,

investigar a formação de ADS através de AMP e fumarato e a formação de SAICAR a partir

de AICAR e fumarato. Os experimentos de titulação foram realizados utilizando um

calorímetro VP-ITC – Microcal. (96)

Inicialmente, uma injeção única, em concentração saturante de substrato, foi realizada

para determinar a entalpia molar aparente (ΔHapp). Neste experimento, 500 nM de ADSL,

preparada em tampão contendo 20mM NaH2PO4, 200mM NaCl e 1mM MgCl2, foi colocada

na cela do microcalorimetro (Microcal) a temperatura constante de 25° C. Na seringa, 300 µl

de ADS (1mM) foram carregados usando o mesmo tampão. Para proceder com a

determinação do ΔHapp, foi realizada uma única injeção de 20 µL de substrato e monitorada a

troca de calor por 1200 segundos. Após subtrair o calor de diluição de ADS, previamente

observado ao titular o mesmo volume de ADS em tampão, foi possível obter a entalpia molar

aparente (ΔHapp) (Figura 47). O mesmo procedimento foi utilizado para a reação com

SAICAR usando 11,2 µM em seringa (Figura 48).

106

ADS → AMP + Fumarato

0 200 400 600 800 1000 1200 1400

-0,2

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

HADS

= + 8991.34625 cal/mol

µca

l/se

c

Time (s)

DeltaH

ADS dilution

DeltaHnorm

Figura 47 - Determinação da entalpia molar aparente (ΔHapp) de ADS.


SAICAR → AICAR + Fumarato

0 500 1000 1500 2000

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

µca

l/se

c

Time (s)

HSAICAR

SAICAR dilution

H SAICAR

norm

HSAICAR

= 4711.8 cal/mol

Figura 48 - Determinação da entalpia molar aparente (ΔHapp) de SAICAR.


107

Como pode ser observado nas Figuras 44 e 45, a atividade enzimática de ADSL

revelou uma reação endotérmica com reação de troca de entalpia de ΔHADS = +8,9 kcal/mol e

ΔHSAICAR = +4.7 kcal/mol.

Como é necessário ΔG < 0 para que as reações biológicas sejam

termodinamicamente favoráveis, a observação de ΔH > 0 indica que um sistema endotérmico,

na qual a contribuição da entropia é fundamental para que a reação seja favorável. Essa

elevada contribuição entrópica pode estar relacionada com a grande quantidade de moléculas

de água (aproximadamente 40) presentes no sítio ativo (Figura 49).

Figura 49 - Moléculas de água (esferas vermelhas) presentes em um dos quatro sítios ativos da estrutura

SmADSL-Apo.


Este ensaio foi também utilizado para medir a troca de calor dos produtos (AICAR +

fumarato e AMP + fumarato, respectivamente) a fim de verificar se a enzima é ativa para a

formação de ADS e SAICAR. Foram utilizados 1 mM de cada combinação carregado na

seringa para a realização do experimentos de injeção única.

Uma única injeção também foi usada para determinar a classificação “liase” de

SmADSL, em outras palavras, a conversão de ADS ou SAICAR em AMP / Fumarato e

AICAR / fumarato, respectivamente, não é reversível pela SmADSL . Esta condição “liase”

108

foi demonstrada pela determinação de entalpia molar aparente, resultando em valores

próximos de valores de calor de diluição anteriores medidos nas mesmas condições

experimentais (ΔH ~ 0 kcal/mol), portanto, sem atividade enzimática mensurável nessas

condições experimentais.

AICAR + Fumarato → SAICAR

0 200 400 600 800 1000 1200 1400

-5,0x10-1

-4,0x10-1

-3,0x10-1

-2,0x10-1

-1,0x10-1

0,0

1,0x10-1

2,0x10-1

3,0x10-1

4,0x10-1

5,0x10-1

µcal/se

c

Time (s)

HAICAR

AICAR dilution

HAICAR norm

Figura 50 - Determinação da entalpia molar aparente (ΔHapp) de AICAR.


0 200 400 600 800 1000 1200 1400

-0,4

-0,2

0,0

0,2

0,4

µcal/se

c

Time (s)

HFumarate/AICAR

Fumarate dilution

HFumarate/AICAR norm

Figura 51 - Determinação da entalpia molar aparente (ΔHapp) de fumarato/AICAR. ΔH ~0 – sem reação.


109

AMP + Fumarato → ADS

0 200 400 600 800 1000 1200 1400

-0,7

-0,6

-0,5

-0,4

-0,3

-0,2

-0,1

0,0

0,1

µca

l/se

c

Time (s)

HAMP

HAMP norm

AMP dilution

Figura 52 - Determinação da entalpia molar aparente (ΔHapp) de AMP.


0 200 400 600 800 1000 1200

-5,0x10-1

-4,0x10-1

-3,0x10-1

-2,0x10-1

-1,0x10-1

0,0

1,0x10-1

2,0x10-1

3,0x10-1

4,0x10-1

5,0x10-1

µca

l/se

c

Time (s)

HFumarate

Fumarate dilution

HFumarate norm

Figura 53 - Determinação da entalpia molar aparente (ΔHapp) de Fumarato. ΔH ~0 – sem reação.


Para a determinação da cinética de ADS, a seringa foi carregada com 1mM de ADS e

a cela com 50 nM de SmADSL utilizando o mesmo tampão como descrito anteriormente. O

substrato foi titulada por 17 injeções de 4 µL. Para analisar o segundo substrato, 18 injeções

de 4 µL de SAICAR (11,2 µM) foram tituladas usando as mesmas condições previamente

110

estabelecidas. Estes experimentos foram realizados a temperatura constante (25° C) e uma

velocidade de agitação de 300 rpm. Os resultados foram processados utilizando o software

Origin 7.0 associada ao microcalorímetro, e a integral da curva obtida reflete a variação de

calor no sistema. Essa metodologia de múltiplas injeções foi utilizada para determinar a

cinética enzimática em função da quantidade de substrato, a qual é possível, ajustar através de

uma função de Michaelis-Menten.

0,0 1,0x10-2

2,0x10-2

3,0x10-2

4,0x10-2

5,0x10-2

0,0

5,0x10-6

1,0x10-5

1,5x10-5

2,0x10-5

2,5x10-5

0 1000 2000 3000 4000 5000

0.0

2.0x10-1

4.0x10-1

P(µ

ca

l/se

c)

Time (s)

Data: ADSkinetic_R

Model: M2 Substrate Only

Chi^2/DoF = 1.323E-12

KcatA

0.730 ±0.038

KmA

0.0172 ±0.0023

H 8991

Rate

(m

illim

ole

s/l/s

ec)

[S] (mM)

Figura 54 - Cinética enzimática de SmADSL para ADS.


Tabela 13 - Valores dos parâmetros da cinética enzimática de SmADSL para ADS.

ΔH (kcal/mol) KM (µM) kcat (s-1) Kcat/KM (µMs)-1

ADS +8991.2 ± 0.2 17.2 ± 2.3 0.73 ± 0.04 0,042 ± 0,006 Fonte: Elaborada pela autora

111

0,0 2,0x10-3

4,0x10-3

6,0x10-3

0

1x10-5

2x10-5

3x10-5

4x10-5

5x10-5

Data: SAICARKine_R

Model: M2 Substrate Only

Chi^2/DoF = 3.279E-12

KcatA

1.81 ±0.25

KmA

0.00527 ±0.0012

H -4712

Ra

te (

mill

imo

les/l/s

ec)

[S] (mM)

Figura 55 - Cinética enzimática de SmADSL para SAICAR.


Tabela 14 - Valores dos parâmetros da cinética enzimática de SmADSL para SAICAR.

ΔH (kcal/mol) KM (µM) kcat (s-1) Kcat/KM (µMs)-1

SAICAR 4712.8 ± 1.3 5.27 ± 1.2 1.8 ± 0.3 0,3 ± 0,1 Fonte: Elaborada pela autora

Conforme observado nas Figuras 51 e 52 e tabelas 13 e 14, estes experimentos

determinaram os valores de KM = (17.2 ± 2.3) µM e kcat = (0.73 ± 0.04) s-1

para o substrato

ADS e KM = (5.27 ± 1.2) µM e kcat = (1.8 ± 0.3) s-1

para o substrato SAICAR.

O banco de dados BRENDA não apresenta qualquer valor desta enzima para

Schistosoma sp.

Em comparação com a enzima humana (HsADSL), a SmADSL apresenta um valor de

KM 10 vezes maior (1.46 µM) para ADS e apresenta valores compatíveis com a enzima

mutada nos resíduos I62D e D69E de Bacillus subtilis (BsADSL), mutação a qual foi

responsável pela mudança nos valores de Km de 2.1 µM para 17.7 µM de ADS. I62 e D69

correspondem respectivamente à E74 e D81 em SmADSL. Ambos encontrados em região de

hélice α no domínio I.

112

O valor kcat é único, onde a correspondência mais próxima é com a enzima mutante

BsADSL S94A (1.14 s-1

). A única enzima de tipo selvagem, que apresenta valores de kcat é a

BsADSL (1.74 s-1

).

O valor do KM para SAICAR apresentado é de HsADSL (1.74 µM) e é próximo ao

valor de SmADSL para este substrato. Infelizmente, não existem outras referências usando

este substrato para comparação das propriedades enzimáticas.

O banco de dados BRENDA não contém valores de kcat para HsADSL,

consequentemente, não é possível estabelecer uma relação de kcat/KM.

113

CAPÍTULO 6

6 ESTRUTURA CRISTALOGRÁFICA DE HGPRT isoforma 1 de

Schistosoma mansoni

6.1 Coleta de dados, processamento, resolução e refinamento de dados de difração de

raios-X

A estrutura de HGPRT de S. mansoni foi buscada por mais de 20 anos por diversos

pesquisadores em diferentes grupos de pesquisa, dentre estes, durante 8 anos em nosso grupo.

A obtenção da estrutura dessa enzima representou um enorme desafio em diferentes etapas do

processo. À princípio os experimentos de amplificação, clonagem, expressão, purificação e

teste de cristalização foram realizados utilizando a sequência completa codificadora da

enzima depositada no banco de dados. Após extensas tentativas de cristalizá-la sem sucesso,

novos estudos de bioinformática identificaram que essa sequência do banco de dados possuía

um éxon de 18 aminoácidos a mais no N-terminal. A nova sequência foi amplificada, clonada,

expressa, purificada (Capítulo 3) e foi possível obter cristais dessa enzima (Capítulo 4).

Entretanto, os cristais obtidos são muito pequenos, frágeis e difícil manuseio, alcançando em

torno de 30μm em sua maior dimensão. Diversos experimentos de otimização dos cristais

foram realizados (Capítulo 4) e não foi possível obter cristais maiores.

Nos últimos 4 anos de pesquisa foram congelados aproximadamente 200 cristais que

foram submetidos à 4 coletas de dados no Síncrotron inglês Diamond Light Source (DLS). Na

terceira coleta de dados foi obtido um único conjunto de dados de HGPRT1 com resolução

abaixo de 3Å, o complexo binário HGPRT-IMP à 2.8Å de resolução coletado na linha de luz

I04-1 do DSL. O cristal contém 2,5 mg/mL de proteína incubada a 18ºC na condição A4 do

kit Morpheus (12.5% PEG 1000, 12.5% PEG 3350, 12.5% MPD 0.03M de cátions

divalentes, 0.1M MES/imidazol pH 6.5) (Figura 56).

114

Figura 56 - Esquerda: Cristais de HGPRT1 à 2,5mg/mL de proteína incubada a 18ºC na condição A4 do kit

Morpheus. Direita: Cristal em loop, coletado à 2,8Å de resolução por difração de raio-X.


Os parâmetros de coleta de dados e refinamento da estrutura pode ser visualizados na

Tabela 15.

Tabela 15 - Estatísticas da coleta de dados e refinamento para os cristais de HGPRT1.

Coleta de dados HGPRT - IMP

Grupo Espacial P212121

Dimensão da célula (Å) a, b, c. 59.95 117.96 139.37

Ângulos da célula (º) α = β = γ = 90

Detector PILATUS 2M

Fonte Raio-X DLS I04-1

Comprimento de onda (Å) 0.9200

Resolução (Å) 60.0 - 2.8 (2.95 - 2.8)*

Multiplicidade 3.8 (3.8)*

Rpim (%)** 6.3 (54.1)*

CC (1/2) 0.996 (0.605)*

Completeza (%) 98.0 (99.2)*

Reflexões Totais 92655 (13365)*

Reflexões únicas 24452 (3562)*

I / σ (I) 8.9 (1.4)*


Reflexões usadas refinamento 24416

R (%)*** 23.17

continua

115

Tabela 16 - Estatísticas da coleta de dados e refinamento para os cristais de HGPRT1.

continuação


RFree(%)*** 29.00

No. átomos proteína 5604

No. átomos ligante 92

B (Å2) 61.56

Erro coordenada (ML baseado) (Å) 0.50

Erro de fase (o) 30.56

Clashscore 7.09

RMSD geometria ideal****

r.m.s. distância ligações (Å) 0.002

r.m.s. ângulos de ligação (°) 0.544

PDB ID 5IPF


*Valores entre parênteses referem-se aos valores da mais alta resolução.

**Rpim = ∑hkl[1/(N(hkl) - 1)]1/2

∑i|Ii (hkl) – (I(hkl))|/∑hkl∑iIi (hkl)

***R = ∑ ||Fo| - |Fc|| / ∑ |Fo| onde |Fc| é a amplitude do fator de estrutura calculado do modelo e |Fo| é a

amplitude do fator de estrutura obervado do modelo. Rfree é calculado com base em 5% do conjunto de reflexões

que não é utilizado durante o refinamento (71).

****RMSD "root mean square deviation", desvio quadrático médio do conjunto de parâmetros de

estereoquímica ideal. (72)

A estrutura foi resolvida por substituição molecular utilizando o programa Phaser (73)

tendo HGPRT humana (PDB 1HMP) como modelo de busca, a identidade sequencial entre a

HGPRT humana e de S. mansoni é de 49%. Conforme observado na tabela, o cristal pertence

ao grupo espacial P212121 com 4 monômeros na unidade assimétrica.

Devido à baixa resolução da estrutura coletada, o refinamento foi bastante desafiador e

de difícil interpretação em diversas regiões do mapa de densidade eletrônica. Vários ciclos de

refinamento e construção manual do modelo foram realizados utilizando o programa Coot

(75) e Phenix. (76) Foram utilizados os parâmetros para construção manual do modelo: NCS

Ghosts Coordinates, NCS Maps e NCS Restraints; e para o refinamento: bulk solvent

correction, anisotropic scaling of the data, coordinate refinement, ADP refinement e

refinement of occupancies.

Analisando os mapas de densidade eletrônica da estrutura coletada é possível observar

116

a presença de ligante na região do sítio ativo da molécula de HGPRT presente na unidade

assimétrica, este foi identificado como sendo uma molécula de IMP (Figura 57), o qual a

enzima foi incubada para a cristalização, uma vez que durante nossos ensaios observamos que

esta só cristalizava na presença do ligante IMP.

Figura 57 - Mapa de densidade eletrônica fo-fc na região do sítio ativo das quatro subunidades (A, B, C e D) da

enzima HGPRT1 de S. mansoni. É possível observar a densidade correspondente ao ligante IMP.


O IMP foi adicionado manualmente e as águas com o auxílio dos programas Phenix e

Coot.

6.2 Validação da estrutura

Após completamente refinado, o modelo tridimensional de HGPRT1 foi validado de

três formas: primeiro avaliando-se o valor do Rwork e Rfree obtidos ao final do refinamento, que

correspondem a Rwork = 0.2317 e Rfree = 0.2900. Valores coerentes e considerados adequados

em relação ao valor da resolução obtida. (77)

A

D C

B

117

A segunda, foi a avaliação da geometria da proteína através do programa

MOLPROBITY (78). Cujo resultado pode ser visualizado na tabela 3.

Tabela 17 - Análise da geometria de HGPRT gerada pelo programa MOLPROBITY. (78)

Parâmetro analisado HGPRT-AMP Parâmetros

referenciais (ideal)

Rotâmeros ruins 2.62% < 0.3%

Desvio Cβ >0.25Å 0 0

Resíduos com ligações ruins 0% 0%

Resíduos com ângulos ruins 0.01% < 0.1%


É possível observar na tabela a porcentagem de “rotâmeros ruins” exceder o valor

considerado ideal. Entretanto, todos esses rotâmeros foram criteriosamente checados ao

longo do refinamento manual. Diversas regiões possuem densidade eletrônica difusa e nas

regiões com densidade eletrônica clara é possível observar que estes rotâmeros encontram-se

na conformação considerada menos adequada nas quatro cadeias. Apesar de não ideal nesse

parâmetro analisado, é a melhor geometria alcançada após o refinamento da estrutura.

Estando em um padrão aceitável.

A terceira forma de validação utilizada foi a avaliação dos ângulos diédricos Φ (phi)

versus Ψ (psi) dos aminoácidos da estrutura no diagrama de Ramachandran gerado pelo

programa Procheck. (79) O resultado do gráfico de Ramachandran gerado pode ser

visualizado na Figura 59 para a estrutura de HGPRT-IMP.

118

Figura 58 - Diagrama de Ramachandran com a distribuição dos ângulos diedros para a estrutura HGPRT-IMP. A





Os resíduos em regiões mais favoráveis (vermelho) correspondem a 88.9%,

adicionalmente permitida (amarelo escuro) a 10.9%, generosamente permitida (amarelo claro)

a 0,1% não permitida a 0,1%.

A partir dos métodos utilizados para a validação em função da resolução obtida do

modelo podemos considerá-lo confiáveis para a análise da estrutura tridimensional da enzima

HGPRT.

119

6.3 Análise da estrutura tridimensional obtida de HGPRT de Schistosoma mansoni

6.3.1 Estrutura secundária, topologia e regiões conservadas

A subunidade de HGPRT é composta por α-hélices e folhas β. Pode ser dividida em

dois domínios (Figura 60). O domínio altamente conservado entre as HGPRTs chamado de

“core” é composto por 4 fitas paralelas (β2, β3, β4 e β5) formando uma folha β flanqueada

por 3 α-hélices (α3, α4 e α5), o qual liga o substrato primário PRPP. (97) Compreende os

resíduos 41 – 173 formando uma estrutura chamada de “doubly wound α/β sheet” (98), com

hélices de ambos os lados da folha β. Esse domínio também compreende o loop II, o qual

apresenta uma região desornada sem densidade eletrônica para os resíduos de 108 – 122.

O segundo domínio, localizado acima do domínio “core” é chamado domínio

“hood”, este é composto por 4 pequenas fitas β (β1, β6, β7 e β8), divididas em 2 folhas, sendo

uma paralela e outra antiparalela, 3 pequenas α-hélices (α1, α2 e α6) e várias conexões de

longos loops. Compreende os resíduos 8 – 40 e 174 – 224.

Figura 59 - Estrutura de HGPRT de S. mansoni (monômero) é composta por 2 domínios: domínio Hood

(vermelho), domínio Core (azul).


A estrutura secundária em função da sequência de aminoácidos da HGPRT em

complexo com IMP e a topologia da estrutura podem ser visualizadas nas Figuras 61 e 62.

Loop II desordenado

IMP

Domínio “Core”

Domínio “Hood”

120

Figura 60 - Estrutura secundária de SmHGPRT em complexo com IMP em função da sequência de aminoácidos.

As fitas β são representadas por setas rosas, as α-hélices por espirais roxas com a respectiva

numeração em cima (H1, H2...H25), as 2 folhas β são classificadas como A e B, sendo essas letras

colocadas acima das fitas identificando a qual folha pertecem. Os símbolos: β - beta turn, γ -

gamma turn e - beta hairpin.


A análise de estrutura secundária gerada pelo programa PROMOTIF mostrou que 51

resíduos de aminoácidos (25,4%) estão em fitas β, 53 (26,4%) em α-hélices, 6 (3%) em

hélices 3-10, 91 (45,3%) em outros, totalizando 201 aminoácidos (201 nas cadeias A e B, 186

na C e 189 na D). A estrutura possui: 2 folhas β paralelas, 2 beta-alfa-beta, 1 beta hairpins, 4

beta bulges, 8 fitas β, 6 α-hélices, 7 interações hélice-hélice, 20 β-turns e 2 gama-turns.

121

Figura 61 - Topologia de SmHGPRT-IMP gerada pelo PDB sum. As fitas β são representadas por setas rosa, as

α-hélices em tubos vermelhos e os loops em azul. O N-terminal é indicado pela letra N e o C-

terminal pela letra C.


122

Figura 62 - Alinhamento de HGPRT humana (1HMP) e de Schistosoma mansoni em função da estrutura

secundária. Os resíduos brancos grifados em vermelho são conservados nas duas estruturas, os em

vermelho grifados em branco são os resíduos não conservados, porém similares. A quarta linha

corresponde a exposição dos resíduos ao solvente, em azul escuro os mais expostos, azul claro

podem estar expostos e branco hidrofóbicos.


O alinhamento da sequência de aminoácidos de SmHGPRT com sua correspondente

humana revelou longas regiões extremamente conservadas entre ambas. Principalmente nas

regiões entre β3 e α2, β5, β6, β7, β8 e β9. As regiões conservadas podem ser observadas na

estrutura apresentada na Figura 64. Em A. essas regiões estão destacadas em vermelho, em B

é possível observar os resíduos idênticos entre ambas destacados em pink.

123

Figura 63 - Análise das regiões conservadas à partir do alinhamento da sequência de aminoácidos de HGPRT de

S. mansoni e HGPRT humana. A. Regiões conservadas destacadas em vermelho. B. Resíduos

idênticos entre ambas destacados em pink.


Já a análise do alinhamento da sequência de aminoácidos com todas as outras enzimas

depositadas no PDB revelou alta similaridade com outras espécies. Na Figura 65 é possível

observar que diversas regiões, principalmente a que circunda o sítio ativo são bastante

conservadas. O degrade de vermelho a branco, passando por tons de rosa indica o grau de

conservação dessas regiões, sendo vermelho mais conservado e branco não conservado.

Destacados em pink estão os 10 aminoácidos que são idênticos em todas as HGPRTs

depositadas no PDB: Leu74, Gly76, Leu84, Glu140, Asp141, Thr148, Lys172, Gly196,

Asp200 e Arg206.

A B

124

Figura 64 - Análise das regiões conservadas à partir do alinhamento da sequência de aminoácidos de HGPRT de

S. mansoni com todas as HGPRTs depositadas no PDB. Regiões conservadas destacadas em

degradê de vermelho a branco, da mais conservada a não conservada respectivamente. Resíduos

idênticos entre as estruturas destacados em pink.


6.3.2 Enovelamento

Atualmente (além da estrutura de S. mansoni aqui descrita) existem 48 estruturas de

HGPRTs depositadas no banco de dados PDB que correspondem a 10 organismos diferentes:

Humano (18) (99-107), Trypanosoma Cruzi (9) (108-113), Mycobacterium tubrculosis (4)

(114), Toxoplasma gondii (3) (115), Escherichia coli (3) (116), Thermus thermophilus (3)

(117), Caldanaerobacter subterraneus (3) (97,118), Saccharomyces cerevisiae (3) (119),

Leishmania tarentolae (1) (120), Tritrichomonas foetus (1). (121)

Canyuk e colaboradores em 2003 (113) destacam que enzimas que salvam 6-

oxopurinas, incluindo as (HGPRTs), são potenciais alvos para o desenvolvimento de

fármacos no tratamento de doenças causadas por parasitas. Por esse motivo, um grande

número de estruturas cristalográficas de HGPRTs são reportadas.

Alterações no estado multimérico entre dímeros e tetrâmeros de HGPRTs foram

previamente reportadas. A estrutura de Thermus thermophilus, assim como de Toxoplasma

gondii é descrita como tetramérica (97). HGPRT humana existe como dímero e tetrâmero em

solução, dependendo do pH e da força iônica (122) e foi cristalizada como um tetrâmero,

125

como várias outras HGPRTs (99). A enzima de Trypanosoma Cruzi cristalizou como um

dímero (108), mas foi reportada como monômero em solução na forma apo e como um

dímero quando PRPP está ligado (123), essa estrutura assim como de T. foetus, a qual é

dimérica na estrutura cristalográfica, perderam regiões correspondentes à parte do N-terminal

em que na HGPRT humana essa sequência se mostrou importante na contribuição de

interações tetramérica (99).

A estrutura de SmHGPRT aqui descrita cristalizou como um tetrâmero e esse estado

oligomérico foi confirmado através de experimentos de gel filtração. O tetrâmero de

SmHGPRT pode ser visualizado na Figura 66.

126

Vista Frontal

Vista Superior

Figura 65 - Estrutura tetramérica de SmAHGPRT em complexo com IMP (preto) (subunidade A: amarelo, B:

magenta, C: azul, D: verde).


IMP

IMP

127

Sobrepondo as quatro subunidades da HGPRT obtêm-se os valores de RMSd de A-B

= 0.304Å, A-C = 0.448Å, A-D = 0.315Å, B-C = 0.336Å, B-D = 0.336Å e C-D = 0.387Å. A

diferença mais significativa é observada na região do loop II móvel, onde a cadeia A

(vermelho) apresenta uma densidade eletrônica clara para um maior número de resíduos em

relação às cadeias B (amarelo), C (azul) e D (verde).

Figura 66 - Sobreposição das quatro subunidades da estrutura tetramérica de HGPRT. A – vermelho, B –

amarelo, C- azul e D verde.


A sobreposição da estrutura de SmHGPRT com a estrutura da HGPRT humana (RMSd

é de 1.154Å) (Figura 67) revelou que o perfil do enovelamento, dividida em dois domínios, é

bastante similar. Entretanto, existem diversos pontos entre as estruturas que não se sobrepõem

completamente e apresentam grandes diferenças na orientação e composição da estrutura

secundária. Por exemplo, as fitas β são mais alongadas na estrutura humana e o loop II

apresenta-se completamente ordenado.

Loop II desordenado

128

Figura 67 - Sobreposição das estruturas de HGPRT de S.mansoni (monômero) em vermelho e ADSL humana em

amarelo. RMSd = 1,154 Å.


129

6.3.3 O sítio ativo

O sítio ativo de SmHGPRT, assim como de suas ortólogas, está localizado na interface

dos domínios “core” e “hood” e compreende 4 loops, I – IV (Figura 68).

Figura 68 - Localização do sítio ativo na interface dos domínios “core” (azul) e “hood” (vermelho) e compreende

4 loops, I – IV.


O loop I (Figura 69) corresponde aos resíduos de 73 à 78 (VLKGGF) localizados

entre a fita β2 e a hélice α4, que fazem parte do motivo α/β/α no domínio core. Nesse loop em

diversas estruturas foi verificada a ligação peptídica na conFiguração cis, para o resíduo

Leu74. (108,111,116,120-121) Tem-se atribuído um significado estrutural e funcional para

esta ligação. (111)

I

VI

I

I

III

II

Sítio Ativo

130

Figura 69 - Loop I correspondente aos resíduos de 73 à 78 (VLKGGF) localizados entre a fita β2 e a hélice α4 do

domínio core.


O loop II (Figura 70) corresponde aos resíduos 107 à 134 localizados entre as fitas

β3 e β4 do motivo α/β/α do domínio core. Este loop foi caracterizado como flexível

previamente em outras estruturas (99,108,121,124), não está completamente ordenado, por

ausência de densidade eletrônica para os resíduos de 108 à 124. Foi observado que o sítio

ativo nessas estruturas encontra-se aberto para a ligação de substrato ou liberação do produto.

Sendo assim, para explicar o fechamento do sítio ativo, uma conformação fechada desse loop

flexível foi levantada como hipótese para essa enzima. (99)

Devido à importância para o entendimento do mecanismo catalítico, a estrutura com

o sítio ativo fechado foi por muito tempo buscada. Posteriormente, essa hipótese foi

confirmada na estrutura de HGPRT de T. cruzi onde as duas subunidades diferem

principalmente na conformação do "loop flexível" (loop II) e revelaram duas novas

visualizações de sítio ativo da HGPRT no complexo ternário, uma aberta e exposta solvente e

a outra fechada para o solvente. (111) Na conformação fechada são observadas interações

entre o loop II com o PRPP e com íons metálicos (Mg2+

) hidratados.

Na estrutura de SmHGPRT o loop II apresentar-se de forma desordenada como

observado na maioria das estruturas que apresentam conformação aberta, podendo ser

atribuído ao fato da estrutura conter uma molécula do produto de reação (IMP) ligada no sítio

ativo.

131

Figura 70 - Loop II correspondente aos resíduos 107 à 134 entre as fitas β3 e β4 do domínio core.


O loop III (Figura 71) compreende os resíduos de 141 à 146 (DIIDTG) entre as fitas

β4 e hélice α5, também no domínio core. Na estrutura cristalográfica de SmHGPRT este loop

está bem definido.

Todas as estruturas de HGPRT apresentam no loop III um Asp141 invariável

(SmHGPRT). Estudos com mutante desse resíduo em T. cruzi confirmaram que esse resíduo

atua na catálise, mas não é requerido como base geral nessa posição, como era proposto

previamente para a HGPRT humana. (112)

132

Figura 71 - Loop III correspondente aos resíduos de 141 à 146 (DIIDTG) entre as fitas β4 e hélice α5 no domínio

core.


O loop IV (Figura 72) é o único dos 4 que pertence ao domínio hood, é o maior dos

quatro e compreende os resíduos de 190 à 211. Nesse loop é encontrado o resíduo aromático

Phe193 que participa do sítio ativo com interação “π-π stacking” com o anel aromático da

base purina. Em diversas estruturas este loop contém uma pequena fita β no interior. Esta fita

está envolvida na ligação da base purina no sítio ativo. (120)

Figura 72 - Loop IV correspondente aos resíduos de 190 à 211 no domínio hood.


133

Na estrutura de SmHGPRT em complexo com IMP, o fosfato do IMP faz ligação de

hidrogênio com Asp144, Thr145, Gly146 e Lys147 do loop III, Thr148 da hélice α5 e uma

molécula de água.

O O2 da ribose faz duas ligações de hidrogênio com Asp141 do loop III e com duas

moléculas de água. O3 faz ligação de hidrogênio com uma das moléculas de água que O2

liga.

A interação do Asp141 do loop III com o ligante pode ser observada nas estruturas de

T. cruzi, E. coli, humana e de T. gondii, onde a cadeira lateral aponta para o sítio ativo. No

entanto, a cadeia lateral do Asp141 aponta para fora do sítio ativo e não interage com o

ligante na estrutura de L. tarentolae, P. falciparum, T, foetus e humana em complexo com

GMP. (120)

O N1 da hipoxantina faz ligação de hidrogênio com Val194 do loop IV e o N6 da

hipoxantina com Val194 e Lys172.

É possível observar que o loop III é o maior responsável por ancorar o IMP no sítio

ativo através de ligações de hidrogênio. A maior parte dos contatos ocorre entre a SmHGPRT

e o grupo fosfato do IMP.

Figura 73 - Ligações de hidrogênio (pontilhado amarelo) do ligante IMP no sítio ativo de SmHGPRT.


Um modelo esquemático da ligação do IMP no sitio ativo da SmHGPRT foi gerado

através do programa Ligplot + pode ser visualizado na Figura 74.

134

Figura 74 - Modelo esquemático para a ligação da IMP no sítio ativo da SmHGPRT.


Em algumas estruturas de HGPRT foi relatada a presença do íon magnésio (Mg+2

) na

região do sítio ativo (101,102,108,125). Embora esse íon estivesse presente no tampão de

diálise da proteína e no kit de cristalização Morpheus, não foi observada a presença de Mg+2

no sítio ativo de SmHGPRT.

Quando sobrepostas as regiões correspondentes ao sítio ativo da SmHGPRT e humana

(Figura 75) um alto grau de conservação ao redor do sítio de ligação e ativo é observado.

Destacam-se quatro mutações entre ambas Ile149 (SmHGPRT) por Met142 (HGPRT

humana), Pro176 por Arg169, Val189 por Ile182 e Arg192 por Lys185.

135

Figura 75 - Sobreposição dos sítios de ligação do IMP na HGPRT de S. mansoni (verde) e humana (branco).


Dentre as quatro mutações encontradas na região do sítio ativo, três delas I149M,

V189I e R192K encontram-se em regiões cuja cadeia principal é sopreponível. A mutação

P176R encontra-se em uma região de loop que apresenta grande diferença conformacional

entre a enzima humana e a de S. mansoni. Na HGPRT humana esse loop encontra-se em uma

conformação mais fechada em torno do sítio em relação à SmHGPRT e a cadeia lateral do

resíduo Arg 169 aponta para dentro do sítio ativo, enquanto seu correspondente Pro 176

encontra-se mais distal (Figura 76).

Dentre os resíduos conservados, são observadas diferenças na conformação da cadeia

lateral do resíduo Lys75 que aponta para fora do sítio ativo, enquanto a cadeia lateral do

resíduo Lys68 da HGPRT humana aponta para dentro do sítio (Figura 76). Esses resíduos

compõem o loop I.

136

Figura 76 - Posicionamento e conformação dos resíduos Lys75 e Pro176 em SmHGPRT (verde) e seus

correspondentes Lys68 e Arg169 em HGPRT humana (branco).


6.3.4 Mecanismo catalítico

A HGPRT catalisa a reação reversível de transferência do grupo 5-fosforribosil do a-

D-fosforribosil-1-pirofosfato (PRPP) para o N9 da base (hipoxantina ou guanina) para a

formação do nucleotídeo de inosina-5-monofosfato (IMP) ou guanosina-5-monofosfato

(GMP) (Figura 77).

Figura 77 - Esquema da reação catalisada pela enzima HGPRT.

Fonte: FOCIA et al. (108)

Yuan e colaboradores (48) em seus estudos cinéticos da SmHGPRT identificaram que

o mecanismo de reação é bi-bi ordenado, o qual os substratos se ligam à enzima e os produtos

são liberados em uma ordem definida. Primeiro ocorre a ligação de PRPP-Mg2+

seguido das

137

bases purina. Os produtos são liberados na sequência PPi-Mg, seguido de GMP-Mg ou IMP-

Mg.

Héroux e colaboradores (115) baseados em análises de estruturas de HGPRT de

diversos organismos construíram o mecanismo de reação enzimática (Figura 78). Foram

utilizadas estruturas em diferentes formas de cristalização, na forma apo (121,126), na

presença dos substratos PRPP, hipoxantina e guanina (102,108,127) e na presença dos

produtos IMP, GMP e PPi (99,101,115,121,125,128). A descrição desses autores é baseada na

estrutura da enzima HGPRT de Toxoplasma gondii. São propostos dez principais passos,

transcritos por Monzani. (129)

Passo 1: Na apoenzima os resíduos Glu146, Asp147 e Asp206 em T. gondii (Glu140,

Asp141 e Asp200 em S. mansoni) que se ligarão aos íons Mg2+

e coordenam as moléculas de

água estão em posição e orientação corretas para a ligação do complexo PRPP-Mg. É

proposto que o íon Mg2+

se ligue primeiro, antes do PRPP (111). Neste momento, Leu78 e

Lys79 (Leu74 e Lys75) adotam uma conformação cis, concomitantemente à ligação de PRPP.

O loop III e o N-terminal da hélice G ajustam sua conformação para a ligação ao fosfato 5´ do

PRPP. Para que a ligação da base purina aconteça, é necessário o deslocamento da cadeia

principal do resíduo Ile200 (Val194) e das cadeias laterais dos resíduos Ile148, Lys178 e

Trp199 (Ile142, Lys172 e Phe193) aproximando o domínio hood da base purina.

Passo 2: Após a ligação do PRPP são formadas ligações de hidrogênio e uma grande

rede de pontes salinas na parte inferior do sítio ativo. Nessa região, o loop I, do domínio core,

e o loop IV, do domínio hood, fecham juntos esssa região do sítio ativo. Os íons Mg

posicionam o PPi na geometria necessária para occorer a transferência do fosforibosil. Não

existe interação entre o PRPP e a parte superior do sítio ativo do domínio hood, nesse

momento, essa região ainda está aberta, os resíduos Lys178 e Trp199 (Lys172 e Phe193) e a

fita-β 9 adotam conformações encontradas na apoenzima.

Passo 3: A ligação do fosfato 5´do PRPP torna o loop III ordenado, com o resíduo

Ile148 (Ile142) posicionado no bolsão de ligação da purina. Com isso, o Asp150 (Asp144) é

direcionado ao Asp197 (Asn191), servindo dessa forma, como uma base no sítio ativo.

Passo 4: Com a ligação da purina, o domínio hood se fecha completamente sobre o

domínio core. Os resíduos Trp199 e Ile200 (Phe193 e Val194) assumem suas posições,

simultaneamente com a entrada da purina no bolsão de ligação, ou após o loop III´ estar

completamente ordenado com a cadeia lateral do resíduo Arg182 (Pro176) direcionado aos

resíduos Asp150 e Asp197 (Asp144 e Asn191), formando uma dupla ponte salina forte que

fecha o domínio hood sobre o domínio core.

138

Passo 5: O loop II se fecha sobre o anel da ribose e o fosfato 5´, fazendo interações

entre os resíduos conservados Ser117 e Tyr118 (Ser110 e Tyr111) e o grupo fosfato 5´

(101,111,127) O fechamento do loop II é o passo final que precede a transferência do

fosforibosil. Com o loop II na conformação fechada são realizadas ligações de hidrogênio

adicionais ao PPi do PRPP e esse movimento força os substratos se aproximarem um do outro

até que eles atravessem o estado de transição.

Passo 6: As interações que ocorrem entre HGPRT e o PPi diferem entre as estruturas

de HGPRT. A mudança na posição do fosfato 5´ da ribose e o PPi antes e depois da

transferência do fosforibosil altera e enfraquece as interações entre o loop II e os produtos da

reação, permitindo o retorno do loop II para a conformação aberta.

Passo 7: O PPi é expelido do sítio ativo, sendo ajudado, em parte, pela energética

favorável, acompanhando o retorno de peptídio na forma cis para trans.

Passo 8: Quando o PPi deixa o sítio ativo, ocorre a perda da rede de ligações de

hidrogênio que liga os domínios hood e core na parte inferior do sítio ativo, enfraquecendo o

vínculo da ligação entre os dois domínios. A perda do PPi também enfraquece as interações

do loop IV, especialmente Asp206 (Asp200) com a porção C2-N3 do anel da purina. O

domínio hood começa a perder contato com a base purina, puxando a fita β9 e o Trp199

(Phe193) para longe da base. Nessa etapa, o nucleotídeo ainda está fortemente ligado por

ligações de hidrogênio com a enzima, pois são encontrados valores baixos para o fator de

temperatura do anel purina e do grupo fosfato, o GMP apresenta alta constante de dissociação

e o loop III´ ainda está fechado. Eventualmente, as interações entre os resíduos Arg182 no

loop III´, Asp150 e Asp197 (Asp144 e Asp191) são quebradas, e o loop III´ retorna à sua

posição aberta.

Passo 9: Neste momento com o loop III´ aberto, o loop III está livre para ser

desordenado na saída do fosfato 5´. Após a saída do nucleotídeo, a enzima HGPRT retorna ao

estado conformacional de apoenzima. A exigência desses 3 passos sequenciais para a

liberação do nucleotídeo, isto é, a abertura do domínio hood, a abertura dos loops III´ e III,

explica por que esse passo é limitante no mecanismo de reação da HGPRT. Segundo (128), a

liberação do nucleotídeo (NMP) no complexo enzima-nucleotídeo é mais vagarosa que a

liberação do PPi.

Passo 10: O passo determinante da reação envolve vários passos elementares, como

mudanças conformacionais da enzima, no NMP e sua dissociação. As mudanças

conformacionais na enzima são especificamente movimentos dos loops do sítio ativo e a

alteração na conexão espacial entre os domínios hood e core. Na análise das estruturas em

139

complexo ternário, o loop II adquire conformação aberta para a liberação do NMP, podendo

ser o movimento do loop II o passo elementar mais vagaroso na reação da HGPRT. No

entanto, na estrutura da HGPRT-XMP-PPi-Mg de T. gondii o loop II é observado também na

conformação aberta, o que indica que o passo limitante da reação está em algum passo

subsequente à liberação do nucleotídeo do sítio ativo, podendo ser a abertura do domínio

hood, a abertura do loop III`, a abertura do loop III, a mudança conformacional do NMP, a

dissociação do NMP ou algumas combinações desses passos.

140

Figura 78 - Mecanismo de reação enzimática da HGPRT. 1- Apoenzima com PRPP entrando no sítio ativo. Os

loops II, III e III´ na conformação aberta. 2- Complexo PRPP-Mg ligado e Lys79 adota a

conformação cis peptídeo. As interações do PPi do PRPP, loop I e loop IV aproximam o domínio

hood do domínio core. Loop III ordenado ao redor do 5´fosfato e guanina entra no sítio ativo. 3-

Bolsão de ligação à guanina é fechado e ordenado ao redor da base. Loop III fechado permite que o

loop III´ se feche colocando Arg182 entre Asp150 e Asp197 completando a ligação dos domínios

hood e core. 4- Loop II se fecha colocando o resíduo Tyr118 em posição de ligação de hidrogênio

com o fosfato 5´ permitindo a transferência fosforibosil. 5- Loop I e IV são abertos e PPi sai do sítio

ativo. Lys79 do loop I retorna a conFiguração trans e o loop II é aberto. 6- Loop III´ e III se abrem e

liberam GMP e HGPRT retoma a forma apoenzima.

Fonte: HEROUX et al. (115)

141

6.3.5 Interface dimérica e influência na composição do sítio ativo de HGPRT

Na enzima ADSL previamente descrita, faz-se necessário a formação da estrutura

tetramérica para que ocorra a atividade catalítica, uma vez que três das quatro subunidades

compõem o sítio ativo. Entretanto, na enzima HGPRT não há uma razão explícita para o

requerimento de uma estrutura dimérica ou tetramérica cataliticamente ativa, uma vez que as

subunidades não compartilham os sítios ativos, pois estes se encontram bem separados da

interface do dímero e tetrâmero. (111)

Estudos da HGXPRT de Plasmodium falciparum mostraram que uma mutação na

interface da estrutura quaternária resulta em uma diminuição significativa da eficiência

catalítica. (130)

Outros estudos realizados com mutantes da enzima HGPRT de Trypanosoma cruzi

também indicaram que o loop I do sítio ativo, o qual participa da interface dimérica da enzima

tem profunda influência na eficiência enzimática. (113)

A cadeia lateral da Lys75 (S. mansoni) do loop I da cadeia B faz interação com a

cadeia principal da Val 103 da subunidade oposta A. Essa ligação de hidrogênio faz com que

o resíduo invariável Arg206 fique orientado no sítio ativo (Figura 79), na posição correta para

interação com o PRPP ou PPi. Essa conformação desses resíduos pode ser observada nas

estruturas de HGPRT de L. tarentolae, T. gondii, P. falciparum, E. coli, T. cruzi e humana.

(113,129)

142

Figura 79 - Ligação do resíduo Lys75B do loop I com Val103A em SmHGPRT.


O loop IV também apresenta diversos resíduos na interface dimérica em todas as

HGPRTs depositadas no banco de dados. O loop IV é um dos loops que compõem o sítio

ativo. Em SmHGPRT o resíduo Asp207B está envolvido com interações de hidrogênio nessa

interface com três moléculas de água e o resíduo Glu89A (Figura 80). O fato de vários

resíduos próximos ao sítio ativo do loop I e do loop IV participarem tanto da dimerização

quanto da composição do sítio ativo, pode justificar a atividade da enzima HGPRT na forma

dimérica e tetramérica. (113,129)

143

Figura 80 - Interação entre os resíduos Lys75B do loop I com Val103A, Asp207B com três moléculas de água e

Glu89A, este com Lys79B em SmHGPRT.


144

145

CAPÍTULO 7

7 CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS FUTURAS

7.1 Conclusões

O sistema de expressão utilizando os vetores pOPIN em células de E. coli Lemo21

(DE3) para AK1, ADSL, HGPRT 1 e células de E.coli B834(DE3) para HGPRT 3 em meio

de cultura Power Broth, proporcionou um grande rendimento na produção das proteínas

recombinantes.

O método de purificação por afinidade estabelecido em um único passo, utilizando

resina de cobalto agarose foi eficiente, sendo obtidas proteínas com alto grau de pureza.

Cristais das enzimas AK1, ADSL, HGPRT 1 e 3 foram obtidos em diversas condições

do kit de cristalização Morpheus. Entretanto, cristais de AK1 e HGPRT3 difrataram

pobremente e não foram reproduzidos nas dependências do LBest.

Foram obtidas duas estruturas de SmADSL, uma na forma Apo coletada à 2.14Å de

resolução e outra em complexo com AMP coletada à 2.36Å. A estrutura apresenta o

enovelamento e estado de oligomerização conservados em relação às enzimas ortólogas. O

estado tetramérico é requerido para a funcionalidade da enzima, uma vez que resíduos de três

das quatro subunidades participam da formação do sítio ativo.

O sítio ativo é altamente conservado entre as espécies, inclusive a região

correspondente a um loop flexível na região do sítio ativo. Esse alto grau de conservação do

sítio ativo dificulta a identificação de potentes inibidores espécie-específico no

desenvolvimento de novos agentes terapêuticos. Em contraste, a interface dimérica dessas

enzimas tem se apresentado suficientemente distinta em comparação à ortóloga humana, o

que pode representar um potencial alvo para o desenvolvimento de um inibidor. No entanto, é

reconhecido que existe uma grande dificuldade em adotar essa abordagem.

O ensaio de atividade enzimática de SmADSL revelou uma reação endotérmica, com

reação de troca de entalpia de ΔHADS = +8,9 kcal/mol e ΔHSAICAR = +4.7 kcal/mol obtidos em

condições de saturação. Esse ΔH > 0 indica que no sistema endotérmico a contribuição da

entropia é importante para a reação cinética. Essa elevada contribuição da entropia

possivelmente está relacionada com a grande quantidade de moléculas de água presentes no

146

sítio ativo. Os valores obtidos foram de KM = (17.2 ± 2.3) µM e kcat = (0.73 ± 0.04) s-1

para o

substrato ADS e KM = (5.27 ± 1.2) µM e kcat = (1.8 ± 0.3) s-1

para o substrato SAICAR.

Após experimentos de otimização e mais de 200 cristais testados, foi possível obter

uma estrutura de SmHGPRT em complexo com IMP, cujo cristal crescido na condição A4 do

kit Morpheus difratou à 2.8Å de resolução. A estrutura apresenta o enovelamento e estado de

oligomerização dimérico e tetramérico conservados em relação às enzimas ortólogas. Apesar

das subunidades não compartilharem o sítio ativo, este estado de oligomerização é requerido

para a funcionalidade da enzima, uma vez que resíduos do loop I e loop IV que compõem o

sítio ativo também estão envolvidos em interações na interface dimérica. A ligação de

Lys75B (loop I) com Val103A orienta o resíduo invariável entre HGPRTs Arg206B (loop IV)

na direção do sítio ativo para a ligação do PRPP.

O sítio ativo é conservado entre as espécies, situado na interface dos domínios hood e

core, composto por quatro loops (I, II, III e IV). Foram identificadas quatro mutações na

região do sítio entre SmHGPRT e HGPRT humana: Ile149Met, Pro176Arg, Val189Ile e

Arg192Lys. A mutação Pro176Arg encontra-se em uma região de loop em conformação mais

fechada na HGPRT humana em relação à SmHGPRT. A cadeia lateral do resíduo Arg169

aponta para dentro do sítio ativo, enquanto seu correspondente em SmHGPRT Pro176

encontra-se mais distal.

O loop II em SmHGPRT encontra-se desordenado, assim como em outras HGPRTs

depositadas no banco de dados, essa desordem é comumente observada uma vez que esse loop

é móvel. O movimento dos loops na região do sítio ativo é essencial para o mecanismo

catalítico descrito como bi-bi ordenado.

7.2 Perspectivas Futuras

- ADSS

Novas análises de bioinformática da sequência codificadora da enzima. Testes de

amplificação, clonagem, expressão, purificação e cristalização.

- HGPRT 2

Nova amplificação e clonagem em diferentes vetores de expressão. Testes de expressão,

purificação, cristalização e atividade.

147

- HGPRT3 e AK1

Ensaios de “Differential Scanning Fluorimetry (DSF)” para identificação de tampões e

aditivos que estabilizem as enzimas e não comprometam a reprodução dos cristais obtidos no

kit de cristalização Morpheus. Coleta de dados, resolução e análise das estruturas

tridimensionais tendo como modelo de busca as enzimas AK2 e HGPRT1 previamente

resolvidas em nosso grupo de pesquisa. Teste de atividade enzimática.

- ADSL

Experimentos de mutação sítio dirigida de resíduos pontuais da interface dimérica e

tetramérica da enzima, visando a identificação de resíduos essenciais para a manutenção do

estado de oligomerização requerido para a atividade enzimática.

- HGPRT1

Experimentos de mutação sítio dirigida de resíduos mutados em relação à enzima humana no

sítio ativo e na interface dimérica e tetramérica da enzima, visando a identificação de resíduos

essenciais para a manutenção do estado de oligomerização requerido e atividade enzimática.

148

149

REFERÊNCIAS

1

WHO. WORLD HEALTH ORGANIZATION. Report on Schistosomiasis. 2014.

Disponível em: <http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs115/en/>. Acesso em: 10 jan.

2015.

2 HOTEZ, P. J.; MOLYNEUX, D. H.; FENWICK, A.; OTTESEN, E.; EHRLICH SACHS,

S.; SACHS, J. D. Incorporating a rapid-impact package for neglected tropical diseases with

programs for HIV/AIDS, tuberculosis, and malaria. PLoS Medicine, v. 3, n. 5, p. e102, Jan.

2006.

3

VAN DER WERF, M. J.; DE VLAS, S. J.; BROOKER, S.; LOOMAN, C. W.;

NAGELKERKE, N. J.; HABBEMA, J. D.; ENGELS, D. Quantification of clinical morbidity

associated with schistosome infection in sub-Saharan Africa. Acta Tropica, v. 86, n. 2-3, p.

125-39, May. 2003.

4 ABDULLA, M. H.; LIM, K. C.; SAJID, M.; MCKERROW, J. H.; CAFFREY, C. R.

Schistosomiasis mansoni: novel chemotherapy using a cysteine protease inhibitor. PLoS

Medicine, v. 4, n. 1, p. e14, Jan. 2007.

5 CAFFREY, C. R. Chemotherapy of schistosomiasis: present and future. Current Opinion

in Chemical Biology, v. 11, n. 4, p. 433-9, Aug. 2007.

6 ABDULLA, M. H.; RUELAS, D. S.; WOLFF, B.; SNEDECOR, J.; LIM, K. C.; XU, F.;

RENSLO, A. R.; WILLIAMS, J.; MCKERROW, J. H.; CAFFREY, C. R. Drug discovery for

schistosomiasis: hit and lead compounds identified in a library of known drugs by medium-

throughput phenotypic screening. PLOS Neglected Tropical Diseases, v. 3, n. 7, p. e478,

2009.

7

PESSOA, S. B.; MARTINS, A. V. Parasitologia Médica. 10. ed. Rio de Janeiro:

Guanabara Koogan, 1977. 986 p.

8

FALLON, P. G.; DOENHOFF, M. J. Drug-resistant schistosomiasis: resistance to

praziquantel and oxamniquine induced in Schistosoma mansoni in mice is drug specific.

American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, v. 51, n. 1, p. 83-88, July 1994.

9 FENWICK, A.; WEBSTER, J. P. Schistosomiasis: challenges for control, treatment and

drug resistance. Current Opinion in Infectious Diseases, v. 19, n. 6, p. 577-582, Dec. 2006.

10 SILVA, I. M.; THIENGO, R.; CONCEICAO, M. J.; REY, L.; LENZI, H. L.; PEREIRA

FILHO, E.; RIBEIRO, P. C. Therapeutic failure of praziquantel in the treatment of

Schistosoma haematobium infection in Brazilians returning from Africa. Memórias do

Instituto Oswaldo Cruz, v. 100, n. 4, p. 445-449, July 2005.

11

WOLFE, M. S. Schistosoma mansoni infection: failure of standard treatment with

praziquantel in a returned traveller. Transactions of the Royal Society of Tropical

Medicine and Hygiene, v. 97, n. 6, p. 720; Nov-Dec. 2003.

150

12 DANSO-APPIAH, A.; DE VLAS, S. J. Interpreting low praziquantel cure rates of

Schistosoma mansoni infections in Senegal. Trends in Parasitology, v. 18, n. 3, p. 125-129,

Mar. 2002.

13 ISMAIL, M. M.; TAHA, S. A.; FARGHALY, A. M.; EL-AZONY, A. S. Laboratory

induced resistance to praziquantel in experimental schistosomiasis. Journal of the Egyptian

Society of Parasitology, v. 24, n. 3, p. 685-695, Dec. 1994.

14 DOENHOFF, M. J.; KUSEL, J. R.; COLES, G. C.; CIOLI, D. Resistance of Schistosoma

mansoni to praziquantel: is there a problem? Transactions of the Royal Society of Tropical

Medicine and Hygiene, v. 96, n. 5, p. 465-469, Sept-Oct. 2002.

15 COLES, G. C. Drug resistance or tolerance in schistosomes? Trends in Parasitology, v.

18, n. 7, p. 294, July 2002.

16 HAGAN, P.; APPLETON, C. C.; COLES, G. C.; KUSEL, J. R.; TCHUEM-TCHUENTE,

L. A. Schistosomiasis control: keep taking the tablets. Trends in Parasitology, v. 20, n. 2, p.

92-97, Feb. 2004.

17

LEHNINGER, A. L.; NELSON, D. L.; COX, M. M. Lehninger principles of

biochemistry. 5th. ed. New York: W.H. Freeman, 2008.

18 EL KOUNI, M. H.; CHA, S. Metabolism of adenosine analogues by Schistosoma mansoni

and the effect of nucleoside transport inhibitors. Biochemical Pharmacology, v. 36, n. 7, p.

1099-1106, Apr. 1987.

19 CRABTREE, G. W.; SENFT, A. W. Pathways of nucleotide metabolism in schistosoma

mansoni. V. Adenosine cleavage enzyme and effects of purine analogues on adenosine

metabolism in vitro. Biochemical Pharmacology, v. 23, n. 3, p. 649-660, Feb. 1974.

20 SENFT, A. W.; CRABTREE, G. W. Pathways of nucleotide metabolism in Schistosoma

mansoni--VII. Inhibition of adenine and guanine nucleotide synthesis by purine analogs in

intact worms. Biochemical Pharmacology, v. 26, n. 20, p. 1847-1855, Oct. 1977.

21 SENFT, A. W.; CRABTREE, G. W. Purine metabolism in the schistosomes: potential

targets for chemotherapy. Pharmacology & Therapeutics, v. 20, n. 3, p. 341-356, 1983.

22

SENFT, A. W.; CRABTREE, G. W.; AGARWAL, K. C.; SCHOLAR, E. M.;

AGARWAL, R. P.; PARKS JR, R. E. Pathways of nucleotide metabolism in Schistosoma

mansoni. 3. Identification of enzymes in cell-free extracts. Biochemical Pharmacology, v.

22, n. 4, p. 449-458, Feb. 1973.

23 SENFT, A. W.; SENFT, D. G.; MIECH, R. P. Pathways of nucleotide metabolism in

Schistosoma mansoni. II. Disposition of adenosine by whole worms. Biochemical

Pharmacology, v. 22, n. 4, p. 437-447, Feb. 1973.

24 STEGMAN, R. J.; SENFT, A. W.; BROWN, P. R.; PARKS JR, R. E. Pathways of

nucleotide metabolism in Schistosoma mansoni. IV. incorporation of adenosine analogs in

vitro. Biochemical Pharmacology, v. 22, n. 4, p. 459-468, Feb. 1973.

151

25 SENFT, A. W.; MIECH, R. P.; BROWN, P. R.; SENFT, D. G. Purine metabolism in

Schistosoma mansoni. International Journal for Parasitology, v. 2, n. 2, p. 249-260, June

1972.

26 DOVEY, H. F.; MCKERROW, J. H.; WANG, C. C. Purine salvage in Schistosoma

mansoni schistosomules. Molecular and Biochemical Parasitology, v. 11, p. 157-167, Apr.

1984.

27 MIECH, F. P.; SENFT, A. W.; SENFT, D. G. Pathways of nucleotide metabolism in

Schistosoma mansoni--VI adenosine phosphorylase. Biochemical Pharmacology, v. 24, n. 3,

p. 407-411, Feb. 1975.

28 PEREIRA, H. D.; FRANCO, G. R.; CLEASBY, A.; GARRATT, R. C. Structures for the

potential drug target purine nucleoside phosphorylase from Schistosoma mansoni causal agent

of schistosomiasis. Journal of Molecular Biology, v. 353, n. 3, p. 584-599, Oct. 2005.

29 PEREIRA, H. M.; REZENDE, M. M.; CASTILHO, M. S.; OLIVA, G.; GARRATT, R. C.

Adenosine binding to low-molecular-weight purine nucleoside phosphorylase: the structural

basis for recognition based on its complex with the enzyme from Schistosoma mansoni. Acta

Crystallographica D, v. 66, n. Pt 1, p. 73-79, Jan. 2010.

30 VERJOVSKI-ALMEIDA, S. et al. Transcriptome analysis of the acoelomate human

parasite Schistosoma mansoni. Nature Genetics, v. 35, n. 2, p. 148-157, Oct. 2003.

31

PROTASIO, A. V. et al. A systematically improved high quality genome and

transcriptome of the human blood fluke Schistosoma mansoni. PLOS Neglected Tropical

Diseases, v. 6, n. 1, p. e1455, Jan. 2012.

32 BERRIMAN, M. et al. The genome of the blood fluke Schistosoma mansoni. Nature, v.

460, n. 7253, p. 352-358, July 2009.

33 PEREIRA, H. M.; CLEASBY, A.; PENA, S. S.; FRANCO, G. G.; GARRATT, R. C.

Cloning, expression and preliminary crystallographic studies of the potential drug target

purine nucleoside phosphorylase from Schistosoma mansoni. Acta Crystallographica D, v.

59, n. Pt 6, p. 1096-1099, June 2003.

34 PEREIRA, H. M.; BERDINI, V.; FERRI, M. R.; CLEASBY, A.; GARRATT, R. C.

Crystal structure of Schistosoma purine nucleoside phosphorylase complexed with a novel

monocyclic inhibitor. Acta Tropica, v. 114, n. 2, p. 97-102, May 2010.

35 MARQUES IDE, A.; ROMANELLO, L.; DEMARCO, R.; PEREIRA, H. D. Structural

and kinetic studies of Schistosoma mansoni adenylate kinases. Molecular and Biochemical

Parasitology, v. 185, n. 2, p. 157-160, Oct. 2012.

36

ROMANELLO, L.; BACHEGA, J. F.; CASSAGO, A.; BRANDAO-NETO, J.;

DEMARCO, R.; GARRATT, R. C.; PEREIRA, H. D. Adenosine kinase from Schistosoma

mansoni: structural basis for the differential incorporation of nucleoside analogues. Acta


152

37

FOULK, B. W.; PAPPAS, G.; HIRAI, Y.; HIRAI, H.; WILLIAMS, D. L.

Adenylosuccinate lyase of Schistosoma mansoni: gene structure, mRNA expression, and

analysis of the predicted peptide structure of a potential chemotherapeutic target.

International Journal for Parasitology, v. 32, n. 12, p. 1487-1495, Nov. 2002.

38 HOFFMANN, K. F. An historical and genomic view of schistosome conjugal biology with

emphasis on sex-specific gene expression. Parasitology, v. 128, p. S11-S22, 2004.

Supplement 1.

39 WAGNER, G. P.; KIN, K.; LYNCH, V. J. Measurement of mRNA abundance using RNA-

seq data: RPKM measure is inconsistent among samples. Theory in Biosciences, v. 131, n. 4,

p. 281-285, Dec. 2012.

40 ZHANG, Y.; EL KOUNI, M. H.; EALICK, S. E. Structure of Toxoplasma gondii

adenosine kinase in complex with an ATP analog at 1.1 angstroms resolution. Acta

Crystallographica D, v. 62, n. Pt 2, p. 140-145, Feb. 2006.

41 BAUGH, E. H.; LYSKOV, S.; WEITZNER, B. D.; GRAY, J. J. Real-time PyMOL

visualization for Rosetta and PyRosetta. PLoS One, v. 6, n. 8, p. e21931, 2011.

42 LESCH, M.; NYHAN, W. L. A Familial disorder of uric acid metabolism and central

nervous system function. American Journal of Medicine, v. 36, n. 4, p. 561-570, Apr. 1964.

43 TORRES, R. J.; PUIG, J. G. Hypoxanthine-guanine phosophoribosyltransferase (HPRT)

deficiency: Lesch-Nyhan syndrome. Orphanet Journal of Rare Diseases, v. 2, p. 48, Dec.

2007. doi: 10.1186/1750-1172-2-48.

44 SAIGAL, R.; CHAKRABORTY, A.; YADAV, R. N.; PRASHANT, R. K. Partial HPRT

deficiency (Kelley-Seegmiller syndrome). Journal of the Association of Physicians of

India, v. 54, p. 49-52, Jan. 2006. Disponível em: < http://www.japi.org/january2006/CR-

49.pdf>. Acesso em: 23 jan. 2015.

45 KELLEY, W. N.; ROSENBLOOM, F. M.; HENDERSON, J. F.; SEEGMILLER, J. E. A

specific enzyme defect in gout associated with overproduction of uric acid. Proceedings of

the National Academy of Sciences of the United States of America, v. 57, n. 6, p. 1735-

1739, June 1967.

46 PALELLA, T. D.; KELLEY, W. N. An approach to hyperuricemia and gout. Geriatrics, v.

39, n. 11, p. 89-92, 95-6, 101-2, Nov. 1984.

47 YUAN, L.; WU, C. S.; CRAIG, S. P., 3RD; LIU, A. F.; WANG, C. C. Comparing the

human and schistosomal hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferases by circular

dichroism. Biochimica et Biophysica Acta, v. 1162, n. 1-2, p. 10-16, Mar. 1993.

48 YUAN, L.; CRAIG, S. P., 3RD; MCKERROW, J. H.; WANG, C. C. Steady-state kinetics

of the schistosomal hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase. Biochemistry, v. 31, n.

3, p. 806-810, Jan. 1992.

153

49 CRAIG, S. P., 3RD; MCKERROW, J. H.; NEWPORT, G. R.; WANG, C. C. Analysis of

cDNA encoding the hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HGPRTase) of

Schistosoma mansoni; a putative target for chemotherapy. Nucleic Acids Research, v. 16, n.

14B, p. 7087-7101, July 1988.

50 DOVEY, H. F.; MCKERROW, J. H.; ALDRITT, S. M.; WANG, C. C. Purification and

characterization of hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase from Schistosoma

mansoni. A potential target for chemotherapy. Journal of Biological Chemistry, v. 261, n. 2,

p. 944-948, Jan. 1986.

51 PEREIRA, T. C.; PASCOAL, V. D.; MARCHESINI, R. B.; MAIA, I. G.; MAGALHAES,

L. A.; ZANOTTI-MAGALHAES, E. M.; LOPES-CENDES, I. Schistosoma mansoni:

evaluation of an RNAi-based treatment targeting HGPRTase gene. Experimental

Parasitology, v. 118, n. 4, p. 619-623, Apr. 2008.

52 VAN DER WEYDEN, M. B.; KELLY, W. N. Human adenylosuccinate synthetase. Partial

purification, kinetic and regulatory properties of the enzyme from placenta. Journal of

Biological Chemistry, v. 249, n. 22, p. 7282-7289, Nov. 1974.

53 POLAND, B. W.; LEE, S. F.; SUBRAMANIAN, M. V.; SIEHL, D. L.; ANDERSON, R.

J.; FROMM, H. J.; HONZATKO, R. B. Refined crystal structure of adenylosuccinate

synthetase from Escherichia coli complexed with hydantocidin 5'-phosphate, GDP, HPO4(2-),

Mg2+, and hadacidin. Biochemistry, v. 35, n. 49, p. 15753-15759, Dec. 1996.

54 SHIGEURA, H. T.; GORDON, C. N. Hadacidin, a new inhibitor of purine biosynthesis.

Journal of Biological Chemistry, v. 237, n. 6, p. 1932-1936, June 1962.

55 ROSSOMANDO, E. F.; MALDONADO, B.; CREAN, E. V. Effect of hadacidin on

growth and adenylosuccinate synthetase activity of Dictyostelium discoideum. Antimicrobial

Agents Chemotherapy, v. 14, n. 3, p. 476-482, Sept. 1978.

56 KACZKA, E. A.; GITTERMAN, C. O.; DULANEY, E. L.; FOLKERS, K. Hadacidin, a

new growth-inhibitory substance in human tumor systems. Biochemistry, v. 1, n. 2, p. 340-

343, Mar. 1962.

57 SHIGEURA, H. T.; GORDON, C. N. The mechanism of action of hadacidin. Journal of

Biological Chemistry, v. 237, n. 6, p. 1937-1940, June. 1962.

58

POLAND, B. W.; FROMM, H. J.; HONZATKO, R. B. Crystal structures of

adenylosuccinate synthetase from Escherichia coli complexed with GDP, IMP hadacidin,

NO3-, and Mg2+. Journal of Molecular Biology, v. 264, n. 5, p. 1013-1027, Dec. 1996.

59 MILLER-PATRICK, K.; VINCENT, D. L.; EARLY, R. J.; WEEMS, Y. S.; TANAKA,

Y.; ASHIMINE, D. T.; NUSSER, K. D.; LEE, C. N.; LEDGERWOOD, K. S.; WEEMS, C.

W. Effects of the purine biosynthesis pathway inhibitors azaserine, hadacidin, and

mycophenolic acid on the developing ovine corpus luteum. Chinese Journal Physiology, v.

36, n. 4, p. 245-252, 1993.

154

60

JAHNGEN, E. G.; ROSSOMANDO, E. F. Adenylosuccinate synthetase from

Dictyostelium discoideum: effects of hadacidin analogs and binding of [14C]hadacidin.

Archives of Biochemistry and Biophysics, v. 229, n. 1, p. 145-154, Feb. 1984.

61

GALE, G. R.; SMITH, A. B. Alanosine and hadacidin--comparison of effects on

adenylosuccinate synthetase. Biochemical Pharmacology, v. 17, n. 12, p. 2495-2498, Dec.

1968.

62 SHIGEURA, H. T. Structural Modifications of Hadacidin and Their Effects on the Activity

of Adenylosuccinate Synthetase. Journal of Biological Chemistry, v. 238, p. 3999-4001,

Dec. 1963.

63 CASTRO, M.; PEREZ-CERDA, C.; MERINERO, B.; GARCIA, M. J.; BERNAR, J.; GIL

NAGEL, A.; TORRES, J.; BERMUDEZ, M.; GARAVITO, P.; MARIE, S.; VINCENT, F.;

VAN DEN BERGHE, G.; UGARTE, M. Screening for adenylosuccinate lyase deficiency:

clinical, biochemical and molecular findings in four patients. Neuropediatrics, v. 33, n. 4, p.

186-189, Aug. 2002.

64 TOTH, E. A.; YEATES, T. O. The structure of adenylosuccinate lyase, an enzyme with

dual activity in the de novo purine biosynthetic pathway. Structure, v. 8, n. 2, p. 163-174,

Feb. 2000.

65

STONE, R. L.; ZALKIN, H.; DIXON, J. E. Expression, purification, and kinetic

characterization of recombinant human adenylosuccinate lyase. Journal of

Biological Chemistry, v. 268, n. 26, p. 19710-19716, Sept. 1993.

66 SPIEGEL, E. K.; COLMAN, R. F.; PATTERSON, D. Adenylosuccinate lyase deficiency.

Molecular Genetics and Metabolism, v. 89, n. 1-2, p. 19-31, Sept-Oct. 2006.

67 MARIE, S.; RACE, V.; VINCENT, M. F.; VAN DEN BERGHE, G. Adenylosuccinate

lyase deficiency: from the clinics to molecular biology. Advances in Experimental

Medicine and Biology, v. 486, n. 4, p. 79-82, 2000.

68 RACE, V.; MARIE, S.; VINCENT, M. F.; VAN DEN BERGHE, G. Clinical, biochemical

and molecular genetic correlations in adenylosuccinate lyase deficiency. Human Molecular

Genetics, v. 9, n. 14, p. 2159-2165, Sept. 2000.

69 BERROW, N. S.; ALDERTON, D.; SAINSBURY, S.; NETTLESHIP, J.; ASSENBERG,

R.; RAHMAN, N.; STUART, D. I.; OWENS, R. J. A versatile ligation-independent cloning

method suitable for high-throughput expression screening applications. Nucleic Acids

Research, v. 35, n. 6, p. e45, 2007.

70

GORREC, F. The MORPHEUS protein crystallization screen. Journal of Applied

Crystallography, v. 42, n. Pt 6, p. 1035-1042, Dec. 2009.

71 KUETTEL, S.; GREENWALD, J.; KOSTREWA, D.; AHMED, S.; SCAPOZZA, L.;

PEROZZO, R. Crystal Structures of T. b. rhodesiense Adenosine Kinase Complexed with

Inhibitor and Activator: Implications for Catalysis and Hyperactivation. PLoS Neglected

Tropical Diseases, v. 5, n. 5, p. e1164, May. 2011.

155

72 ENGH, R. A.; HUBER, R. Accurate bond and angle parameters for x-ray protein-structure

refinement. Acta Crystallographica A, v. 47, n. 6, p. 392-400, July. 1991.

73

MCCOY, A. J.; GROSSE-KUNSTLEVE, R. W.; ADAMS, P. D.; WINN, M. D.;

STORONI, L. C.; READ, R. J. Phaser crystallographic software. Journal of Applied

Crystallography, v. 40, n. Pt 4, p. 658-674, Aug. 2007.

74

LANGER, G.; COHEN, S. X.; LAMZIN, V. S.; PERRAKIS, A. Automated

macromolecular model building for X-ray crystallography using ARP/wARP version 7.

Nature Protocols, v. 3, n. 7, p. 1171-1179, 2008.

75 EMSLEY, P.; COWTAN, K. Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta

Crystallographica D, v. 60, Pt 12 Pt 1, p. 2126-2132, Dec. 2004.

76 ADAMS, P. D.; GROSSE-KUNSTLEVE, R. W.; HUNG, L. W.; IOERGER, T. R.;

MCCOY, A. J.; MORIARTY, N. W.; READ, R. J.; SACCHETTINI, J. C.; SAUTER, N. K.;

TERWILLIGER, T. C. PHENIX: building new software for automated crystallographic

structure determination. Acta Crystallographica D, v. 58, n. Pt 11, p. 1948-1954, Nov. 2002.

77 KLEYWEGT, G. J.; JONES, T. A. Homo crystallographicus--quo vadis? Structure, v. 10,

n. 4, p. 465-472, Apr. 2002.

78 CHEN, V. B.; ARENDALL, W. B., 3RD; HEADD, J. J.; KEEDY, D. A.; IMMORMINO,

R. M.; KAPRAL, G. J.; MURRAY, L. W.; RICHARDSON, J. S.; RICHARDSON, D. C.

MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta


79 LASKOWSKI, R. A.; RULLMANNN, J. A.; MACARTHUR, M. W.; KAPTEIN, R.;

THORNTON, J. M. AQUA and PROCHECK-NMR: programs for checking the quality of

protein structures solved by NMR. Journal of Biomolecular NMR, v. 8, n. 4, p. 477-486,

Dec. 1996.

80 ROBERT, X.; GOUET, P. Deciphering key features in protein structures with the new

ENDscript server. Nucleic Acids Research, v. 42, p. W320-W324, July 2014. doi:

10.1093/nar/gku316.

81 TOTH, E. A.; WORBY, C.; DIXON, J. E.; GOEDKEN, E. R.; MARQUSEE, S.;

YEATES, T. O. The crystal structure of adenylosuccinate lyase from Pyrobaculum

aerophilum reveals an intracellular protein with three disulfide bonds. Journal of Molecular

Biology, v. 301, n. 2, p. 433-450, Aug. 2000.

82 VEDADI, M. et al. Genome-scale protein expression and structural biology of Plasmodium

falciparum and related Apicomplexan organisms. Molecular and Biochemical Parasitology,

v. 151, n. 1, p. 100-110, Jan. 2007.

83 RAY, S. P.; DEATON, M. K.; CAPODAGLI, G. C.; CALKINS, L. A.; SAWLE, L.;

GHOSH, K.; PATTERSON, D.; PEGAN, S. D. Structural and biochemical characterization

of human adenylosuccinate lyase (ADSL) and the R303C ADSL deficiency-associated

mutation. Biochemistry, v. 51, n. 33, p. 6701-6713, Aug. 2012.

156

84 TSAI, M.; KOO, J.; YIP, P.; COLMAN, R. F.; SEGALL, M. L.; HOWELL, P. L.

Substrate and product complexes of Escherichia coli adenylosuccinate lyase provide new

insights into the enzymatic mechanism. Journal of Molecular Biology, v. 370, n. 3, p. 541-

554, July. 2007.

85 FYFE, P. K.; DAWSON, A.; HUTCHISON, M. T.; CAMERON, S.; HUNTER, W. N.

Structure of Staphylococcus aureus adenylosuccinate lyase (PurB) and assessment of its

potential as a target for structure-based inhibitor discovery. Acta Crystallographica D, v. 66,

n. Pt 8, p. 881-888, Aug. 2010.

86 BANERJEE, S.; AGRAWAL, M. J.; MISHRA, D.; SHARAN, S.; BALARAM, H.;

SAVITHRI, H. S.; MURTHY, M. R. Structural and kinetic studies on adenylosuccinate lyase

from Mycobacterium smegmatis and Mycobacterium tuberculosis provide new insights on the

catalytic residues of the enzyme. FEBS Journal, v. 281, n. 6, p. 1642-1658, Mar. 2014.

87 PALENCHAR, J. B.; COLMAN, R. F. Characterization of a mutant Bacillus subtilis

adenylosuccinate lyase equivalent to a mutant enzyme found in human adenylosuccinate lyase

deficiency: asparagine 276 plays an important structural role. Biochemistry, v. 42, n. 7, p.

1831-1841, Feb. 2003.

88 BULUSU, V.; SRINIVASAN, B.; BOPANNA, M. P.; BALARAM, H. Elucidation of the

substrate specificity, kinetic and catalytic mechanism of adenylosuccinate lyase from

Plasmodium falciparum. Biochimica et Biophysica Acta, v. 1794, n. 4, p. 642-654, Apr.

2009.

89 MILLER, R. W.; BUCHANAN, J. M. Biosynthesis of the purines. 28. mechanism of

action of adenylosuccinase. Journal of Biological Chemistry, v. 237, n. 6, p. 491-496, Feb.

1962.

90 LEE, T. T.; WORBY, C.; BAO, Z. Q.; DIXON, J. E.; COLMAN, R. F. His68 and His141

are critical contributors to the intersubunit catalytic site of adenylosuccinate lyase of Bacillus

subtilis. Biochemistry, v. 38, n. 1, p. 22-32, Jan. 1999.

91 BROSIUS, J. L.; COLMAN, R. F. Three subunits contribute amino acids to the active site

of tetrameric adenylosuccinate lyase: Lys268 and Glu275 are required. Biochemistry, v. 41,

n. 7, p. 2217-26, Feb. 2002.

92

ARIYANANDA LDE, Z.; LEE, P.; ANTONOPOULOS, C.; COLMAN, R. F.

Biochemical and biophysical analysis of five disease-associated human adenylosuccinate

lyase mutants. Biochemistry, v. 48, n. 23, p. 5291-5302, June 2009.

93 PALENCHAR, J. B.; CROCCO, J. M.; COLMAN, R. F. The characterization of mutant

Bacillus subtilis adenylosuccinate lyases corresponding to severe human adenylosuccinate

lyase deficiencies. Protein Science, v. 12, n. 8, p. 1694-1705, Aug. 2003.

94 YIN, H.; HAMILTON, A. D. Strategies for targeting protein-protein interactions with

synthetic agents. Angewandte Chemie Internacional Editon in English, v. 44, n. 27, p.

4130-4163, July. 2005.

157

95 TODD, M. J.; GOMEZ, J. Enzyme kinetics determined using calorimetry: a general assay

for enzyme activity? Analytical Biochemistry, v. 296, n. 2, p. 179-187, Sept. 2001.

96 WISEMAN, T.; WILLISTON, S.; BRANDTS, J. F.; LIN, L. N. Rapid measurement of

binding constants and heats of binding using a new titration calorimeter. Analytical

Biochemistry, v. 179, n. 1, p. 131-137, May. 1989.

97 CHEN, Q.; LIANG, Y.; SU, X.; GU, X.; ZHENG, X.; LUO, M. Alternative IMP binding

in feedback inhibition of hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase from

Thermoanaerobacter tengcongensis. Journal of Molecular Biology, v. 348, n. 5, p. 1199-

1210, May. 2005.

98 RICHARDSON, J. S. The anatomy and taxonomy of protein structure. Advances in

Protein Chemistry, v. 34, n. 2, p. 167-339, 1981.

99 EADS, J. C.; SCAPIN, G.; XU, Y.; GRUBMEYER, C.; SACCHETTINI, J. C. The crystal

structure of human hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase with bound GMP. Cell,

v. 78, n. 2, p. 325-34, July 1994.

100

GAYATHRI, P.; SUJAY SUBBAYYA, I. N.; ASHOK, C. S.; SELVI, T. S.;

BALARAM, H.; MURTHY, M. R. Crystal structure of a chimera of human and Plasmodium

falciparum hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferases provides insights into

oligomerization. Proteins, v. 73, n. 4, p. 1010-1020, Dec. 2008.

101

SHI, W.; LI, C. M.; TYLER, P. C.; FURNEAUX, R. H.; GRUBMEYER, C.;

SCHRAMM, V. L.; ALMO, S. C. The 2.0 A structure of human hypoxanthine-guanine

phosphoribosyltransferase in complex with a transition-state analog inhibitor. Nature

Structure Biology, v. 6, n. 6, p. 588-593, June. 1999.

102 BALENDIRAN, G. K.; MOLINA, J. A.; XU, Y.; TORRES-MARTINEZ, J.; STEVENS,

R.; FOCIA, P. J.; EAKIN, A. E.; SACCHETTINI, J. C.; CRAIG, S. P., 3RD. Ternary

complex structure of human HGPRTase, PRPP, Mg2+, and the inhibitor HPP reveals the

involvement of the flexible loop in substrate binding. Protein Science, v. 8, n. 5, p. 1023-

1031, May 1999.

103 KEOUGH, D. T.; BRERETON, I. M.; DE JERSEY, J.; GUDDAT, L. W. The crystal

structure of free human hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase reveals extensive

conformational plasticity throughout the catalytic cycle. Journal of Molecular Biology, v.

351, n. 1, p. 170-181, Aug. 2005.

104 KEOUGH, D. T.; HOCKOVA, D.; HOLY, A.; NAESENS, L. M.; SKINNER-ADAMS,

T. S.; JERSEY, J.; GUDDAT, L. W. Inhibition of hypoxanthine-guanine

phosphoribosyltransferase by acyclic nucleoside phosphonates: a new class of antimalarial

therapeutics. Journal of Medical Chemistry, v. 52, n. 14, p. 4391-4399, July. 2009.

158

105

KEOUGH, D. T.; SPACEK, P.; HOCKOVA, D.; TICHY, T.; VRBKOVA, S.;

SLAVETINSKA, L.; JANEBA, Z.; NAESENS, L.; EDSTEIN, M. D.; CHAVCHICH, M.;

WANG, T. H.; DE JERSEY, J.; GUDDAT, L. W. Acyclic nucleoside phosphonates

containing a second phosphonate group are potent inhibitors of 6-oxopurine

phosphoribosyltransferases and have antimalarial activity. Journal of Medical Chemistry, v.

56, n. 6, p. 2513-2526, Mar. 2013.

106 NAESENS, L.; GUDDAT, L. W.; KEOUGH, D. T.; VAN KUILENBURG, A. B.;

MEIJER, J.; VANDE VOORDE, J.; BALZARINI, J. Role of human hypoxanthine guanine

phosphoribosyltransferase in activation of the antiviral agent T-705 (favipiravir). Molecular

Pharmacology, v. 84, n. 4, p. 615-629, Oct. 2013.

107 KEOUGH, D. T.; HOCKOVA, D.; JANEBA, Z.; WANG, T. H.; NAESENS, L.;

EDSTEIN, M. D.; CHAVCHICH, M.; GUDDAT, L. W. Aza-acyclic nucleoside

phosphonates containing a second phosphonate group as inhibitors of the human, Plasmodium

falciparum and vivax 6-oxopurine phosphoribosyltransferases and their prodrugs as

antimalarial agents. Journal of Medical Chemistry, v. 58, n. 2, p. 827-846, Jan. 2015.

108

FOCIA, P. J.; CRAIG, S. P., 3RD; NIEVES-ALICEA, R.; FLETTERICK, R. J.;

EAKIN, A. E. A 1.4 A crystal structure for the hypoxanthine phosphoribosyltransferase of

Trypanosoma cruzi. Biochemistry, v. 37, n. 43, p. 15066-15075, Oct. 1998.

109

NIEVES-ALICEA, R.; FOCIA, P. J.; CRAIG, S. P., 3RD; EAKIN, A. E. Limited

proteolysis of a trypanosomal hypoxanthine phosphoribosyltransferase yields crystals that

diffract X-rays to near atomic resolution. Biochimica et Biophysica Acta, v. 1388, n. 2, p.

500-5, Nov. 1998.

110

FREYMANN, D. M.; WENCK, M. A.; ENGEL, J. C.; FENG, J.; FOCIA, P. J.;

EAKIN, A. E.; CRAIG, S. P. Efficient identification of inhibitors targeting the closed active

site conformation of the HPRT from Trypanosoma cruzi. Chemical Biology, v. 7, n. 12, p.

957-68, Dec. 2000.

111

FOCIA, P. J.; CRAIG, S. P., 3RD; EAKIN, A. E. Approaching the transition state in

the crystal structure of a phosphoribosyltransferase. Biochemistry, v. 37, n. 49, p. 17120-

17127, Dec. 1998.

112 CANYUK, B.; FOCIA, P. J.; EAKIN, A. E. The role for an invariant aspartic acid in

hypoxanthine phosphoribosyltransferases is examined using saturation mutagenesis,

functional analysis, and X-ray crystallography. Biochemistry, v. 40, n. 9, p. 2754-65, Mar.

2001.

113 CANYUK, B.; MEDRANO, F. J.; WENCK, M. A.; FOCIA, P. J.; EAKIN, A. E.;

CRAIG, S. P., 3RD. Interactions at the dimer interface influence the relative efficiencies for

purine nucleotide synthesis and pyrophosphorolysis in a phosphoribosyltransferase. Journal

of Molecular Biology, v. 335, n. 4, p. 905-921, Jan. 2004.

159

114 ENG, W. S.; HOCKOVA, D.; SPACEK, P.; JANEBA, Z.; WEST, N. P.; WOODS, K.;

NAESENS, L. M.; KEOUGH, D. T.; GUDDAT, L. W. First Crystal Structures of

mycobacterium tuberculosis 6-oxopurine phosphoribosyltransferase: complexes with GMP

and pyrophosphate and with acyclic nucleoside phosphonates whose prodrugs have

antituberculosis activity. Journal of Medicinal Chemistry, v. 58, n. 11, p. 4822-4838, June

2015.

115 HEROUX, A.; WHITE, E. L.; ROSS, L. J.; DAVIS, R. L.; BORHANI, D. W. Crystal

structure of Toxoplasma gondii hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase with XMP,

pyrophosphate, and two Mg(2+) ions bound: insights into the catalytic mechanism.

Biochemistry, v. 38, n. 44, p. 14495-506, Nov 2 1999.

116 GUDDAT, L. W.; VOS, S.; MARTIN, J. L.; KEOUGH, D. T.; DE JERSEY, J. Crystal

structures of free, IMP-, and GMP-bound Escherichia coli hypoxanthine

phosphoribosyltransferase. Protein Science, v. 11, n. 7, p. 1626-1638, July 2002.

117 KANAGAWA, M.; BABA, S.; EBIHARA, A.; SHINKAI, A.; HIROTSU, K.; MEGA,

R.; KIM, K.; KURAMITSU, S.; SAMPEI, G.; KAWAI, G. Structures of hypoxanthine-

guanine phosphoribosyltransferase (TTHA0220) from Thermus thermophilus HB8. Acta

Crystallographica F, v. 66, n. Pt 8, p. 893-898, Aug. 2010.

118 CHEN, Q.; YOU, D.; LIANG, Y.; SU, X.; GU, X.; LUO, M.; ZHENG, X. Crystal

structure of Thermoanaerobacter tengcongensis hypoxanthine-guanine phosphoribosyl

transferase L160I mutant--insights into inhibitor design. FEBS Journal, v. 274, n. 17, p.

4408-4415, Sept. 2007.

119 MOYNIE, L.; GIRAUD, M. F.; BRETON, A.; BOISSIER, F.; DAIGNAN-FORNIER,

B.; DAUTANT, A. Functional significance of four successive glycine residues in the

pyrophosphate binding loop of fungal 6-oxopurine phosphoribosyltransferases. Protein

Science, v. 21, n. 8, p. 1185-1196, Aug. 2012.

120 MONZANI, P. S.; TRAPANI, S.; THIEMANN, O. H.; OLIVA, G. Crystal structure of

Leishmania tarentolae hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase. BMC Structural

Biology, v. 7, n. 1, p. 59, Sept. 2007. doi: 10.1186/1472-6807-7-59

121SOMOZA, J. R.; CHIN, M. S.; FOCIA, P. J.; WANG, C. C.; FLETTERICK, R. J. Crystal

structure of the hypoxanthine-guanine-xanthine phosphoribosyltransferase from the protozoan

parasite Tritrichomonas foetus. Biochemistry, v. 35, n. 22, p. 7032-7040, June 1996.

122

JOHNSON, G. G.; EISENBERG, L. R.; MIGEON, B. R. Human and mouse

hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase: dimers and tetramers. Science, v. 203, n.

4376, p. 174-176, Jan. 1979.

123 ALLEN, T. E.; ULLMAN, B. Molecular characterization and overexpression of the

hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase gene from Trypanosoma cruzi. Molecular

and Biochemical Parasitology, v. 65, n. 2, p. 233-245, June 1994.

160

124 SCHUMACHER, M. A.; BASHOR, C. J.; SONG, M. H.; OTSU, K.; ZHU, S.; PARRY,

R. J.; ULLMAN, B.; BRENNAN, R. G. The structural mechanism of GTP stabilized

oligomerization and catalytic activation of the Toxoplasma gondii uracil

phosphoribosyltransferase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United

States of America, v. 99, n. 1, p. 78-83, Jan. 2002.

125 HEROUX, A.; WHITE, E. L.; ROSS, L. J.; BORHANI, D. W. Crystal structures of the

Toxoplasma gondii hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase-GMP and -IMP

complexes: comparison of purine binding interactions with the XMP complex. Biochemistry,

v. 38, n. 44, p. 14485-14494, Nov. 1999.

126 SCHUMACHER, M. A.; CARTER, D.; ROOS, D. S.; ULLMAN, B.; BRENNAN, R. G.

Crystal structures of Toxoplasma gondii HGXPRTase reveal the catalytic role of a long

flexible loop. Nature Structural Biology, v. 3, n. 10, p. 881-887, Oct. 1996.

127 HEROUX, A.; WHITE, E. L.; ROSS, L. J.; KUZIN, A. P.; BORHANI, D. W. Substrate

deformation in a hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase ternary complex: the

structural basis for catalysis. Structure, v. 8, n. 12, p. 1309-1318, Dec. 2000.

128 XU, Y.; EADS, J.; SACCHETTINI, J. C.; GRUBMEYER, C. Kinetic mechanism of

human hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase: rapid phosphoribosyl transfer

chemistry. Biochemistry, v. 36, n. 12, p. 3700-3712, Mar. 1997.

129

MONZANI, P. S. Estrutura Cristalográfica da enzima hipoxantina-guanina

fosforribosiltransferase (HGPRT) de Leishmania tarentolae complexada com GMP.

2003. 162 p. Tese (Doutorado em Ciências) - Instituto de Física de São Carlos, Universidade

de São Paulo, São Carlos, 2003.

130 SUBBAYYA, I. N.; BALARAM, H. A point mutation at the subunit interface of

hypoxanthine-guanine-xanthine phosphoribosyltransferase impairs activity: role of

oligomerization in catalysis. FEBS Letters, v. 521, n. 1-3, p. 72-76, June 2002.

131 CDC. CENTERS for disease control and Prevention. Schistosomiasis. Disponível em:

<http://www.dpd.cdc.gov/dpdx/HTML/Schistosomiasis.htm>. Acesso em: 10 fev. 2016.

http://www.dpd.cdc.gov/dpdx/HTML/Schistosomiasis.htm

Documents

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO INSTITUTO DE FÍSICA DE ... - …...ROMANELLO, L. Studies of adenosine kinase isoform 1, hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase isoforms 1, 2 and