Universidade de São Paulo - USP · A Deus meu eterno guia e protetor. A minha instituição, Universidade Centroccidental “Lisandro Alvarado” por ter confiado em minha capacidade

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Universidade de São Paulo

Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”

Caracterização morfológica e genética de Fusarium spp. isolados de sementes e

associados à podridão do colmo de milho (Zea mays L.)

Pastora Josefina Querales

Tese apresentada para obtenção do titulo de Doutor em

Ciências. Área de concentração: Fitopatologia

Piracicaba

2010

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Pastora Josefina Querales

Engenheiro Agrônomo

Caracterização morfológica e genética de Fusarium spp. isolados de sementes e associados à

podridão do colmo de milho (Zea mays L.)

Orientador:

Prof. Dr. LUIS EDUARDO ARANHA CAMARGO

Tese apresentada para obtenção do título de Doutor em

Ciências. Área de concentração: Fitopatologia

Piracicaba

2010

3

A meu pai Felix, e meus sobrinhos José Rafael e Rafael Alfonso (in memorian), apesar de não ter

vivido com vocês os últimos momentos de suas vidas, meu consolo é: pai, a certeza de ter sido

orgulho para você e exemplo para vocês meus queridos sobrinhos que continuam torcendo por

meus sucessos no abrigo do nosso senhor.

Dedico

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AGRADECIMENTOS

A Deus meu eterno guia e protetor.

A minha instituição, Universidade Centroccidental “Lisandro Alvarado” por ter confiado em minha

capacidade e pelo apoio financeiro.

A ESALQ-USP por abrir-me as portas e oferecer uma imensidão de conhecimento muito valioso para

minha evolução profissional.

A meu orientador, professor Dr. Luis Eduardo Aranha Camargo pelo oportuno apoio, por disponibilizar

parte de seu tempo para me orientar e pela oportunidade para aprimorar um conhecimento numa área quase

nova para mim.

A os professores dos departamentos de Fitopatologia e Nematologia, Tecnologia de sementes e Ciências

Exatas que me deram a valiosa oportunidade de aproveitar seus conhecimentos para enriquecer os meus.

Meu agradecimento muito especial à Dra. Maria Heloisa de Moraes, prof. Dr. Jose Octavio M. Menten,

prof. Dr. Sergio Pascholati, prof. Dr. Julio Marco Filho e profa. Dr. Ana Novembro porque alem de suas

orientações acadêmicas me permitiram conhecer seu lado humano.

A meus pais Josefa, Felix (in memoriam) e Dília por seu amor e entender que as minhas decisões são

necessidades de crescimento profissional.

A meu esposo e meu filho com seu amor, apoio e compreensão impediram a minha fraqueza e desistir de

alcançar as metas propostas.

A minha família irmãos, sobrinhos, cunhadas, e amigos pelas palavras de estimulo durante estes quatro

anos mostrando seu orgulho por meus triunfos e por esperar pacientemente a minha volta.

Às empresas Dow AgroSciences, GueraSementes, Aprossul e Pionner pelo fornecimento das sementes

utilizadas nos ensaios.

A meus amigos da turma de estrangeiros; Hector, Landy, Freddy, Altagracia, Alba, Pepe, Alejandro, Pedro

e Rosa todos juntos com suas famílias nos ajudaram a viver momentos inesquecíveis e cheios de

recordações.

A meu amigo e irmão, Carlos com sua contagiante alegria fez de nossa passagem pelo Brasil um passeio de

laser.

Ao anjo protetor da família encarnado em nossa amiga Fátima. Não existem palavras nem fatos com que

possa dar de volta todo quanto ela fez por nós desde nossa chegada ao Brasil.

A todos os funcionários com quem compartilhei especialmente Fernanda, Rodolfo, e a Helena pelo apoio,

orientações no trabalho do dia a dia e pela amizade.

Ao senhor Pedro Arthuso pelo apoio no trabalho de campo, respeito profissional e amizade.

6

Aos meus colegas dos laboratórios de Patologia de Sementes e Genética Molecular, Heloazinha, Annelise,

Thais, Vanessa, Raphaelle, Bruno, Thayne, Carol Fazza, Lara, Fernanda, Fernandinha, Leandro, Giselle e

Gerônimo, com eles compartilhei conhecimentos, experiências profissionais, momentos de alegrias e

também de tristeza, mas, sempre com a feliz expressão brasileira que nunca esquecerei “no fim, todo vai

dar certo”.

A meus amigos de coração; meus filhos Bruno e Thayne, Raphaelle, Greysi, Leandro, Tatiane, Mauro,

Gerônimo, Fernando, Barbara, Julio e a Liliane. Abriram seu coração e permitiram-me sentir seu carinho.

Obrigada pelo apoio e pelo carinho.

A meus amigos Diogo, Laura, Luana, Tathiana e Julia, foram embora, na procura de seu progresso

profissional, mas ficarão por sempre em meu coração.

Às senhoras Carmen e Sirlene sempre alegres divertidas e dispostas a dar uma força para os alunos.

Aos alunos estagiários Annelise, Heloazinha, Lara e a Mariana porque suas funções nos laboratórios são

indispensáveis para o desenvolvimento bem sucedido de nossas pesquisas. Obrigada pelo apoio.

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SUMÁRIO

RESUMO ..........................................................................................................................................9

ABSTRACT ....................................................................................................................................11

LISTA DE FIGURAS .....................................................................................................................13

LISTA DE TABELAS ....................................................................................................................15

1 INTRODUÇÃO............................................................................................................................17

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .....................................................................................................21

2.1 Classificação taxonômica de Fusarium ...................................................................................21

2.2 Conceitos de espécie utilizados na classificação de Fusarium ................................................21

2.3 Caracterização morfológica .....................................................................................................22

2.3.1 Principais caracteres morfológicos ..................................................................................22

2.4 Caracterização molecular ........................................................................................................24

2.5 O patossistema Fusarium-milho ..............................................................................................25

2.6 Condições ambientais e aspectos nutricionais da planta que favorecem a patogenicidade de

Fusarium spp.. .................................................................................................................................26

3 MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................................................29

3.1 Amostras de sementes de milho ..............................................................................................29

3.2 Incidência de Fusarium spp. em sementes de milho ...............................................................29

3.3 Obtenção de isolados de Fusarium spp. ...................................................................................29

3.3.1 Isolamento de Fusarium spp. de sementes ......................................................................29

3.3.2 Obtenção de culturas monospóricas ................................................................................30

3.4 Caracterização e identificação morfológica .............................................................................30

3.4.2 Caracterização morfológica .............................................................................................31

3.4.3 Identificação morfológica ................................................................................................32

3.5 Caracterização molecular ................................................................................................32

3.5.1 Extração e quantificação de DNA de Fusarium spp. ......................................................32

3.5.2 Identificação da espécie utilizando reação da polimerase em cadeia (PCR) ...................33

3.7 Estudo da diversidade genética dos isolados de Fusarium com marcadores AFLP ................34

3.8 Patogenicidade e agressividade de isolados de Fusarium spp.. ...............................................36

3.8.1 Determinação da agressividade dos isolados selecionados em três cultivares com

diferentes níveis de resistência ........................................................................................................37

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4 RESULTADOS E DISCUSÃO ............................................................................................... 41

4.1 Incidência de Fusarium spp. em sementes de milho ............................................................... 41

4.2 Isolamento de Fusarium spp. da semente ................................................................................ 44

4.3 Caracterização cultural e morfológica dos isolados de Fusarium spp. .................................... 46

4.3.1 Caracterização cultural .................................................................................................... 46

4.3.2 Caracterização e identificação morfológica dos isolados de Fusarium spp. .................. 47

4.4 Identificação molecular de Fusarium spp. ............................................................................... 58

4.5 Estudo da diversidade genética dos isolados de Fusarium com marcadores AFLP ................ 60

4.6 Seleção de isolados patogênicos para testes de agressividade. ................................................ 65

4.7 Agressividade de isolados de F. verticillioides avaliada em colmos de milho. ....................... 66

5 CONCLUSÕES ...................................................................................................................... 75

REFERENCIAS ............................................................................................................................. 77

9

RESUMO

Caracterização morfológica e genética de Fusarium spp. isolados de sementes e associados à

podridão do colmo de milho (Zea mays L.)

O gênero Fusarium é um grupo de fungos de importância mundial, não só por causar

patologias em plantas, mas também porque abriga espécies toxigênicas. Dentre estas, Fusarium

verticillioides, Fusarium proliferatum e Fusarium subglutinans, cujos teleomorfos se agrupam no

complexo Gibberella fujikuroi, estão associadas a patologias em milho. O presente estudo

caracterizou uma coleção de 100 isolados de Fusarium spp. tanto do ponto de vista morfológico

como molecular com vistas a identificá-los em nível de espécie. Para isto, foram usados como

marcadores morfológicos a presença/ausência de clamidósporos, o tipo de célula conidiogênica e

a disposição dos microconídios sobre a célula conidiogênica. Os isolados foram também

identificados em espécie baseado em informações disponíveis na literatura acerca de marcadores

moleculares desenvolvidos a partir da reação de PCR e primers espécie-específicos. A ausência de

clamidósporo permitiu alocar a totalidade dos isolados no complexo G. fujikuroi. Os demais

critérios morfológicos permitiram identificar 77 isolados como F. verticillioides, 20 como F.

proliferatum, 2 como F. subglutinans. Apenas 1 isolado não foi possível identificar em espécie.

Análises moleculares concordaram em 100% dos casos em que os isolados foram identificados

como F. verticillioides e F. subglutinans. Porem, no caso dos 20 isolados identificados

morfologicamente como F. proliferatum apenas 4 foram confirmados na análise molecular; os

demais foram identificados como F. verticillioides. A diversidade genética estudada por AFLP

ratificou a separação das espécies F. verticillioides e F. proliferatum, com um índice de

similaridade de 0,40. Marcadores AFLP também evidenciaram alta diversidade genética de F.

verticillioides. Todos os isolados causaram podridão do colmo em três híbridos comerciais de

milho e não variaram em agressividade, independente do nível de resistência dos híbridos.

Palavras-chave: Diversidade genética; Complexo G. fujikuroi; Zea mays L.; Podridão do colmo

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ABSTRACT

Morphological and genetic characterization of Fusarium spp. isolated from seed and

associated to stalk rot corn (Zea mays L.)

The genus Fusarium is an important group of fungi worldwide, not only for its capability

to cause disease but because it also contains species which produce toxins. Among these,

Fusarium verticillioides, Fusarium proliferatum and Fusarium subglutinans, which teleomorphs

are grouped in the Gibberella fujikuroi group are associated with diseases in maize. This study

characterized a collection of 100 isolates of Fusarium spp. under morphological and molecular

criteria to identify them at the species level. For this purpose, morphological markers such as

presence/absence of chlamydospores, conidiogenou cell type and microconidia arrangement on

conidiogenou cell were assessed. The isolates were also identified at the species level based upon

available information about molecular markers developed from the PCR reaction using species-

specific primers. The absence of chlamydospores in all of the isolates placed them within the G.

fujikuroi complex, and based on the other morphological criteria, 77 isolates were identified as F.

verticillioides, 20 as F. proliferatum, 2 as F. subglutinans and one isolate remained unidentified at

the species level. The molecular analyses agreed with the morphological identification of all F.

verticillioides and F. subglutinans. However, in the case of 20 isolates identified morphologically

as F. proliferatum only 4 were confirmed, the rest being identified as F. verticillioides. The

genetic diversity based on AFLP confirmed the separation of F. verticillioides and F. proliferatum

in two groups, with a similarity index of 0.40. AFLP markers also showed high genetic diversity

within F. verticillioides. All isolates were caused stalk rot on three commercial hybrids and did

not vary in aggressiveness regardless of the resistance level of the hybrids.

Keywords: Genetic diversity; G. fujikuroi complex; Zea mays L.; Stalk rot

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13

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Características das colônias de isolados de Fusarium spp. crescendo em meio de

cultura BDA. a1, a2, a3. F. verticillioides; b1, b2, b3. F. proliferatum. c1, c2. F.

subglutinans. c3. Fusarium sp...................................................................................

46

Figura 2 - Estruturas morfológicas de isolados de Fusarium spp. (40x). a. microconídios em

cadeia e falsa cabeça sobre monofiálide. b. Célula conidiogênica tipo polifiálide

c. célula conidiogênica semelhante à polifiálide. d. Esporodóquio laranja,

escleródio sobre folha de craveiro. e. Macroconídio formado em esporodóquio. f.

Asco com ascósporos. g. Engrossamento de hifas....................................................

48

Figura 3 - Produtos da reação polimerase em cadeias (PCR) com primers específicos para F.

verticillioides isolados de sementes de milho...........................................................

58

Figura 4 - Padrão de AFLP gerado a partir de 5 combinações de primers (E_AT+M_CA,

E_AA+M_AG, E_AG+M_AA, E_AA+M_CC, E_CC+M_CC) na analise de 100

isolados de Fusarium spp. (complexo G. fujikuroi)................................................

61

Figura 5 - Dendrograma UPGMA para isolados de Fusarium spp.. do complexo G. fujikuroi

(Correlação cofenética 0,97) pelo coeficiente de similaridade (Dice).......................

62

Figura 6 - Gráfico da Analise de Coordenadas Principais para 100 isolados de Fusarium spp.

(G. fujikuroi)..............................................................................................................

64

Figura 7 - Efeito de interação isolado x ano no desenvolvimento da lesão necrótica no colmo

do milho.....................................................................................................................

67

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Dados sobre a procedência das amostras de sementes analisadas neste estudo.......... 42

Tabela 2 - Incidência de Fusarium spp. em sementes de milho produzidas no Brasil

submetidas ou não à assepsia superficial.................................................................... 43

Tabela 3 - Identificação e origem de isolados monospóricos de Fusarium spp. oriundos de

sementes de milho híbrido.......................................................................................... 44

Tabela 4 - Marcadores morfológicos para a identificação de Fusarium spp. do complexo G.

fujikuroi....................................................................................................................... 50

Tabela 5 - Comparação da identificação morfológica e molecular de isolados de Fusarium

spp. associados ás sementes de milhos produzidas no Brasil.................................... 56

Tabela 6 - Dimensões dos microconídios e macroconídios de Fusarium spp............................. 56

Tabela 7 - Porcentagem de isolados com características morfológicas semelhantes.................. 57

Tabela 8 - Lista de combinações primers usados para determinar por AFLP a diversidade

genética de Fusarium spp. (G. fujikuroi) presentes em sementes.............................. 61

Tabela 9 - Comprimento da lesão necrótica causada por isolados de F. verticillioides

inoculados em três híbridos comerciais com diferentes níveis de resistência............ 69

Tabela 10 - Severidade da podridão do colmo do milho causada por isolados de F.

verticillioides inoculados em três híbridos comerciais de milho com diferentes

níveis de resistência.................................................................................................... 70

Tabela 11 - Incidência do Tombamento de plantas devido ao dano causado por isolados de F.

verticillioides inoculados no colmo de três híbridos de milho com diferentes níveis

de resistência.............................................................................................................. 72

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1 INTRODUÇÃO

O gênero Fusarium, segundo a classificação taxonômica, constitui um estado anamorfo da

ordem Hypocreales do Filo Ascomycota (SEIFERT, 1996). Dentro deste grupo encontram-se as

espécies Fusarium verticillioides ((Saccardo) Nirenberg), Fusarium proliferatum ((Matsushima)

Nirenberg) e Fusarium subglutinans ((Wollenweber & Reinking) Nelson, Toussoun & Marasas),

que representam os anamorfos das espécies Gibberella moniliformis (Wineland), Gibberella

intermedia ((Kuhlman) Samuels, Nirenberg & Seifert) e G. subglutinans (Nelson, Toussoun &

Marasas) respectivamente. Atualmente essas três espécies participam de um grupo de

aproximadamente vinte espécies que compõem o complexo Gibberella fujikuroi, antigamente

seção Liseola (LESLIE; SUMMERELL, 2006) e estão associadas a patologias de várias culturas

de importância econômica, tais como milho, trigo e cana-de-açúcar, além de serem produtoras de

micotoxinas.

A identificação de espécies de Fusarium é realizada, tradicionalmente, com base em

aspectos morfológicos o que, além de constituir uma tarefa muito complexa pelo requerimento da

experiência do avaliador, também pode gerar controvérsias devido à variabilidade dos caracteres

fenotípicos analisados. É por isto que de forma reiterada se assinala que a classificação

taxonômica atual do gênero requer uma revisão, já que características fenotípicas não são

concordantes com os agrupamentos obtidos por caracterização molecular (KASSAWARA, 2005).

Em geral, a taxonomia de fungo está sofrendo mudanças devido à aceitação de diferentes

critérios para definir o conceito de espécie. O que antigamente era mais subjetivo, baseado só em

aspectos morfológicos, no novo paradigma abrange, além de critérios biológicos, critérios

filogenéticos baseado em informações moleculares (SEIFERT, 2006; SUMMERELL et al., 2003).

Diversas técnicas moleculares têm sido usadas no auxilio da classificação de Fusarium.

As relações filogenéticas, por exemplo, dentro do complexo de espécies Gibberella fujikuroi se

ampliaram para novas estirpes descobertas através de informação obtida mediante

seqüenciamento de nucleotídeos de DNA amplificado pela reação da polimerase em cadeia (PCR)

a partir de genes específicos, tais como β-tubulina, calmodulina e o fator de elongação

(O`DONNELL et al., 2000).

Também na identificação de espécies patogênicas de Fusarium, a reação da polimerase

em cadeia (PCR) tem sido um grande auxilio, por exemplo, na identificação de espécies do

18

complexo Gibberella em cereais de inverno (ANGELOTTI et al., 2006; SCHILLING et al., 1996)

e na identificação de fungos toxigênicos associados a grãos (MULÉ et al., 2004).

Muitas espécies filogenéticas reconhecidas em Fusarium ocupam distintos nichos

ecológicos, usualmente em plantas hospedeiras específicas (SEIFERT, 2006). Este gênero tem uma

alta heterogeneidade de espécies quanto à caracterização morfológica, molecular, diversidade

genética e no papel que cumprem na natureza, entre os quais se atribui a capacidade de promover o

crescimento vegetal e interagir tanto com outras espécies patogênicas do mesmo gênero quanto

com outras espécies de fungos (CARROL 1988; DIAZ et al., 2005). Isto representa uma

dificuldade para assumir um critério só como regra de identificação.

A correta identificação de Fusarium spp. associadas às sementes de milho é

indispensável para a condução de estratégias desde sua produção até o beneficiamento, levando em

conta que as sementes constituem um dos principais veículos de disseminação de patógenos em

campo. Também existem inúmeros relatos sobre a presença concomitante de espécies patogênicas

e não patogênicas na semente. Estas últimas, consideradas endófitas que em alguns casos

promovem benefícios para o desenvolvimento da planta, mas que também podem produzir toxinas

nocivas ao homem e outros animais (DANIELSEN; JENSEN, 1998; MUNKVOLD;

DESJARDINS, 1997a).

Do ponto de vista de sanidade de plantas, as espécies agrupadas no complexo G. fujikuroi

são importantes por estarem associadas a várias doenças na cultura do milho (Zea mays L), sendo a

podridão do colmo a de maior interesse em programas de melhoramento. Do gênero Fusarium, até

agora foram relatadas F. verticillioides, F. proliferatum e F. subglutinans agrupadas nesse

complexo, além de F. graminearum como agentes causais da podridão da espiga, do colmo e da

raiz.

Na evolução econômica mundial, a produção do milho tem sido destaque com o Brasil

ocupando o lugar de terceiro maior produtor, superado apenas por Estados Unidos seguido da

China. No Brasil, este cereal é usado principalmente para alimentação animal. Nos Estados

Unidos, cerca de 50% da produção é destinada a esse fim, enquanto que no Brasil varia de 60 a

80%, dependendo da fonte da estimativa e de ano para ano. Na Região Nordeste, o milho constitui

alimento básico na alimentação humana, sendo fonte de energia para muitas pessoas que vivem no

semi-árido. Pela sua versatilidade de uso, é um dos mais importantes produtos do setor agrícola no

Brasil (CASTRO et al., 2009).

19

No intuito de gerar informação sobre a composição do complexo Gibberella fujikuroi

(Sawada) Wollenw no Brasil; o presente trabalho objetivou aplicar técnicas morfológicas e

moleculares para identificar e determinar a variabilidade genética de isolados presentes em

sementes coletadas em diferentes regiões produtoras do Brasil. Também se objetivou avaliar

alguns isolados como agentes de podridão do colmo frente a três híbridos comerciais com

diferentes níveis de resistência.

20

21

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 Classificação taxonômica de Fusarium

A taxonomia de fungos baseada em critérios morfológicos está sofrendo mudanças

apoiadas em resultados da aplicação de técnicas moleculares a estes estudos. O gênero Fusarium é

um exemplo que ilustra o crescente número de espécies ainda em descoberta ou sendo

reconhecidas por taxonomistas de fungos. A maioria dos patologistas de plantas está familiarizado

com as controvérsias taxonômicas neste gênero e com os diferentes conceitos subjetivos de

espécie, que explicam em parte a disparidade em número de espécies admitida no período de

1935-1983. Três grupos dentro de gêneros são os exemplos mais específicos dessas mudanças,

nomeados como o complexo Gibberella fujikuroi (Sawada) Wollenw (com o nome genérico

referindo-se aos teleomorfo), o complexo Fusarium solani (Mart.) Sacc. e o complexo F.

graminearum (SEIFERT, 2006).

2.2 Conceitos de espécie utilizados na classificação de Fusarium

A identificação de Fusarium envolve três conceitos de espécie: o da espécie morfológica,

baseada na similaridade dos caracteres morfológicos observáveis, denominados de marcadores

morfológicos; o da espécie biológica, baseado na compatibilidade sexual entre membros da

mesma espécie; e o conceito de espécie filogenética, baseado na análise de seqüências gênicas

(O`DONNELL et al., 2000; SUMMERELL et al., 2003). A adoção de novos modelos de

classificação afeta a taxonomia do gênero já que por décadas foi baseada simplesmente em

caracteres morfológicos. Por outro lado também cria controvérsias, pois muitos patologistas de

plantas acreditam que tais modelos só acrescentam dificuldades para uma identificação prática na

diagnose de agentes causais de doenças em plantas e que, portanto, tais modelos estão mais

adaptados para os estudos realizados por micologistas. Não obstante, estas mudanças são

pertinentes, dado que dentro deste gênero existem espécies muito próximas, fato que pode levar a

uma diagnose errada com importantes conseqüências práticas.

A espécie F. moniliforme é um exemplo dos problemas mencionados acima. Antes de

1996, a espécie englobava espécimes referidos a vários anamorfos hoje conhecidos como F.

proliferatum, F. subglutinans, F. verticillioides e outras espécies recentemente descritas sob o

conceito de espécies biológica e/ou filogenética. Neste ponto, o critério biológico foi de muita

utilidade, pois foi confirmado que esse grupo de espécies pertence aos grupos de compatibilidade

22

A ao H do complexo Gibberella fujikuroi, também conhecido como secção Liseola (SEIFERT et

al., 2003).

Estudos de cruzamentos férteis em condições de laboratório para reproduzir o teleomorfo,

é uma técnica que garante uma correta identificação de uma espécie biológica do gênero Fusarium,

mas requer tempo e condições climáticas bem controladas. O procedimento mais usado consiste

em cruzar uma linhagem conhecida como macho com uma linhagem teste como fêmea

(SUMMERELL et al., 2003). Este procedimento tem permitido avaliar em campo a possibilidade

da ocorrência de cruzamentos entre isolados inoculados de forma natural. Segundo Huang et al.

(1997), acredita-se que infecções múltiplas podem ter um importante impacto sobre a evolução dos

fungos, devido a recombinações sexuais ou parassexuais.

2.3 Caracterização morfológica

Os atuais sistemas de classificação de Fusarium baseados em caracteres morfológicos

são controversos devido à instabilidade morfológica do fungo. Segundo Whalley (2003), estudos

moleculares mostraram que a separação de alguns gêneros baseada na morfologia de ascósporos,

por exemplo, foi variável mesmo quando feitas em condições controladas. Também Kwas´na;

Bateman (2005) apontam que a conidiogênese de Fusarium pode ser facilmente afetada por

mudanças ambientais, principalmente pela composição do meio de cultura. Por fim, Dufault et al.

(2006) encontraram que valores de temperatura e umidade diferentes do ótimo para o crescimento

e taxa de produção de peritécios respectivamente, são limitantes para a caracterização morfológica

destas espécies e mais ainda, podem resultar em uma variação biológica entre isolados.

Para maior complicação na identificação, existem espécies que, embora tenham fase

teleomórfica desconhecida, partilham características suficientes para serem agrupadas dentro de

complexos do gênero. Exemplo disso é Fusarium chlamydosporu que, conforme relatado por

Morales et al. (2007) possui caracteres morfológicos próprios que permitem classificá-lo como

uma espécie agrupada na seção Dlanimia, mas que, segundo análises das seqüências baseadas na

região ITS agrupa-se no complexo Gibberella, fato inexplicável já que se desconhece a fase

teleomórfica desta espécie.

2.3.1 Principais caracteres morfológicos

O conceito de espécie morfológica tem muita importância para uma classificação inicial

de biodiversidade. Caracteres estruturais e fisiológicos têm sido usados como marcadores

23

morfológicos para diferenciar espécies do gênero Fusarium, mas o problema é que a quantidade

de caracteres detectados é pouca se considerar o número de espécies a comparar (LESLIE;

SUMMERELL, 2006).

Para Fusarium, os principais caracteres taxonômicos de classificação estão agrupados nas

chaves sinótica de Nelson et al. (1983) para o agrupamento em nível de seções, e em Nirenberg;

O`Donnell (1998), para classificação em nível de espécies dentro do complexo Gibberella

fujikuroi (PFENNING; LIMA, 2008).

Segundo Nelson et al. (1983) as características usadas para a identificação de espécies de

Fusarium avaliadas em condições controladas referem-se às estruturas reprodutivas tais como tipo

de esporo assexuado e hifa reprodutiva, além da formação de clamidósporo num lapso de 10 – 14

dias de crescimento da cultura. Para Nirenberg; O`Donnell (1998) a identificação de espécies

dentro do complexo G. fujikuroi, no caso específico das espécies associadas ao milho, as

principais características são ausência de clamidósporo e a disposição dos microconídios sobre a

célula conidiogênica que pode ser de tipo mono ou polifiálide.

De acordo com Agrios (2005), o clamidósporo é um esporo de origem assexuada de

parede fina formada pela modificação de uma ou mais células de uma hifa do fungo. O gênero

Fusarium é caracterizado pela formação deste esporo, porém, no caso de espécies do complexo G.

fujikuroi uma das principais características é justamente sua ausência. Outras características do

gênero Fusarium, tais como o tipo de esporodóquio e tipo de macroconídio são avaliadas quando

se faz caracterização de um espécime, mas não têm um valor taxonômico para espécie dentro do

complexo G. fujikuroi.

Em resumo, as características com valor taxonômico usadas para separar espécies dentro

do complexo G. fujikuroi são o tipo de célula conidiogênica que suporta o microconídio e a

disposição destes esporos sobre as mesmas (LESLIE; SUMMERELL, 2006), baseado na chave

sinóptica de Nirenberg; O`Donnell (1998) citadas anteriormente. Assim, F. subglutinans

apresenta os microconídio dispostos sobre a célula conidiogênica exclusivamente em falsa cabeça,

porem F. verticillioides e F. proliferatum apresentam-nas em cadeias e falsa cabeça. A diferença

entre estas reside no tipo de célula conidiogênica, do tipo monofiálide em F. verticillioides e dos

tipos mono e polifiálide em F. proliferatum.

24

2.4 Caracterização molecular

2.4.1 Técnicas moleculares úteis para o estudo genético de Fusarium spp.

A introdução da análise de DNA por PCR facilitou a caracterização, identificação e

diagnose rápida dos patógenos, assim como estudos sobre sua epidemiologia (WEISING et al.,

1995). No caso de Fusarium, a discriminação de espécies, formae especiales e raças por métodos

tradicionais são usualmente dificultosas pelos motivos expostos acima. Este fato foi relatado por

Kassawara (2005), que demonstrou uma ampla variabilidade genética entre isolados patogênicos e

não patogênicos de Fusarium spp., a qual não esteve correlacionada com as características

taxonômicas. Em muitas pesquisas com este gênero, seqüências gênicas são usadas para auxiliar a

classificação de espécies. Alguns dos mais comumente utilizados são os genes que codificam para

a beta-tubulina, calmodulina e o fator de elongação (MULÉ et al., 2004; O`DONNELL et al.,

2000; SUMMERELL et al., 2003). Parece inevitável que a descrição de espécies baseada só no

seqüenciamento será uma realidade, e será interessante ver se estes nomes serão designados como

nomes temporários, análogos ao anamorfo ou se serão um fator determinante na eliminação da

nomenclatura dual na sistemática micológica (SEIFERT, 2006).

Além de seqüencias gênicas, outros marcadores moleculares também podem ser usados

não só para auxiliar na classificação de Fusarium, mas, principalmente para avaliar o grau de

diversidade entre e dentro de populações. Este é o caso dos marcadores AFLP (amplified fragment

length polymorphism). O trabalho combinado de duas enzimas, uma de corte raro e outra de corte

freqüente em uma etapa de digestão, permite obter diversidade de fragmentos do DNA que depois

são amplificados seletivamente através de reações de PCR com primers específicos e finalmente

separados em gel de alta resolução (FERREIRA; GRATTAPAGLIA, 1998).

Na atualidade a técnica de AFLP é muito útil na avaliação de variações genéticas dentro

de populações de espécies de Fusarium, principalmente para F. verticillioides e F. graminearum

nas quais facilitou a geração dos mapas genéticos (LESLIE; SUMMERELL, 2006). Apesar do alto

custo, riscos de contaminação e a necessidade de experiência na condução desta técnica, seu uso

permite uma diferenciação genética mais detalhada entre indivíduos.

A diversidade genética de F. verticillioides foi estudada combinando as técnicas AFLP e

grupos de compatibilidade vegetativa (VCG) por Reynoso et al. (2009) na Argentina,

determinando que três populações em estudo foram genotipicamente diversas mas geneticamente

similares, com potencial acasalamento ao acaso e intercâmbio de genes entre as três, devido à

25

reprodução sexuada do fungo ser comum e a dispersão de isolados eficiente na principal região

produtora de milho nesse pais. No Brasil, Lima et al., (2009) usou as mesmas técnicas para

estudar a diversidade genética dos agentes causais da malformação em manga, determinado que

F. subglutinans é genética e geograficamente diversa e provavelmente sua reprodução seja por

clones de uma estirpe indígena.

Para o complexo F. graminearum, no qual diferenças morfológicas não são encontradas,

a aplicação da técnica possibilita a análise de um número elevado de marcadores em um também

elevado número de isolados por vez (SUGA et al., 2008). Em estudos do DNA de F. proliferatum,

a técnica permitiu identificar e diferenciar genes que regulam a produção de micotoxinas daqueles

que não, nas diferentes etapas de crescimento do fungo, alem de gerar fragmentos adequados para

marcadores de genes regulados pelo meio ambientes que participam de forma seletiva em eventos

chaves do ciclo de vida do fungo (JENEY et al., 2004).

2.5 O patossistema Fusarium-milho

Fusarium verticillioides e F. proliferatum são agentes causais de doenças em plântulas,

raiz, colmo, espiga e em grãos de milho. Os principais danos ocorrem em espigas e colmos. As

duas espécies apresentam muitas semelhanças morfológicas, conforme discutido acima, e podem

ser isoladas de tecidos sintomáticos e assintomáticos, incluindo sementes (MUNKVOLD;

DESJARDINS, 1997) o que dificulta determinar se a doença é causada por uma ou outra espécie.

F. verticillioides e F. subglutinans afetam as raízes, colo e primeiros internódios do

colmo. A podridão do colmo geralmente inicia-se pouco depois da polinização e se torna mais

severa à medida que a planta amadurece. A doença causada pelos dois patógenos apresenta os

mesmos sintomas, que compreendem alteração na cor da medula passando por várias mudanças

de descoloração esbranquiçada, rosa claro a salmão até tornar-se marrom. Em estádios mais

avançados acontece perda da integridade do colmo formando-se cavidades no interior da medula,

podendo ocorrer amadurecimento prematuro e quebra do colmo da planta (PEREIRA et al., 2005;

SHURTLEFF, 1980). As perdas na produção estão intimamente ligadas com a interrupção

precoce da translocação de fotoassimilados do colmo para o enchimento de grãos, devido à

destruição dos tecidos internos do colmo e pela quebra e acamamento de plantas antes da colheita

(NAZARENO, 1989).

26

2.6 Condições ambientais e aspectos nutricionais da planta que favorecem a patogenicidade

de Fusarium spp.

O comportamento de plantas atacadas e perdas relativas à podridão do colmo do milho

vão depender das condições ambientais, a exemplo das demais doenças vegetais. Além disso, a

variabilidade dos patógenos com relação à virulência, a heterogeneidade de distribuição dos

patógenos no solo, a uniformidade genética das cultivares e a disponibilidade de nutrientes nos

campos, entre outros, também são fatores condicionantes (NAZARENO, 1989).

Segundo Denti e Reis (2003), a dominância das espécies de fungos causadores da

podridão do colmo é diferente entre safras: a ocorrência de C. graminicola pode ser maior em

safras com maior precipitação, a de Diplodia maydis em períodos com estiagem mais prolongada e

de D. macrospora quando as condições de umidade são inferiores a 50. No caso de Fusarium,

acredita-se que sua incidência seja desfavorecida em safra de excessiva precipitação, já que isto

pode diminuir sua dispersão pelo ar. Em adição a isto, os autores verificaram que na safra de

menor precipitação a incidência de ferimentos causados por insetos pode ser maior, o qual favorece

a penetração de todos estes patógenos. Estudos combinando diferentes épocas de inoculação e

diferentes épocas de avaliação são necessários para esclarecer o comportamento de F. moniliforme

na colonização do colmo e o efeito na produção de grão, pois acima dos 30 dias após emergência

(DAE) não determinaram influências significativas na severidade da podridão do colmo no final do

ciclo da cultura (BORGES et al., 2001).

A fertilidade também é um fator envolvido na predisposição a podridão do colmo, pois

menores incidências desta doença foram observadas em tratamentos onde a quantidade de

nitrogênio e potássio aplicada foi maior (DENTI; REIS, 2003). O equilíbrio entre estes dois

nutrientes determina a quantidade de aminoácidos e açúcares solúveis acumuladas no colmo de

milho, os quais são nutrientes e fonte de energia para os fungos. Por outro lado, uma deficiência

pode causar o atraso no processo de cicatrização das lesões da planta, favorecendo a entrada dos

fungos (YAMADA, 1995).

A influência da temperatura tem sido estudada para F. moniliforme e F. proliferatum,

determinando-se que apesar de F. moniliforme (F. verticillioides) estar adaptado a uma ampla

faixa de temperatura, estas espécies estão relacionadas e chegam a ser confundidas porque as duas

são encontradas em culturas de milho de clima temperado e produzem fumonisinas. Além disso,

podem ser isoladas de tecidos sintomáticos e assintomáticos, incluindo sementes, e têm um ciclo

27

da doença muito semelhante (MUNKVOLD et al., 1997b). Mas, segundo Wilke et al. (2007), F.

verticillioides causa infecções sistêmicas assintomáticas em plantas de milho numa ampla faixa de

temperatura. Fusarium subglutinans como agente causal da podridão do colmo, tem sido

associado a esta doença em regiões úmidas e frias em países do norte da America (LESLIE;

SUMMERELL, 2006). Castellá et al. (1999) encontraram que a taxa de crescimento deste fungo

foi mais alta numa faixa de 20 -25 ºC tendo o milho como substrato, entanto, crescendo sobre

arroz foi maior a taxa de crescimento a temperatura de 15ºC, mas, produziu maior quantidade de

fusaproliferin em milho a 20ºC. As condições de temperatura para F. subglutinans incitar a

fusariose em folhas de abacaxizeiro tem sido determinadas numa faixa de temperatura de 10 a

30°C e mais favoráveis entre 15 e 25 °C, variando apenas o grau de evolução do tamanho das

lesões (MARTELLETO et al., 1998).

28

29

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Amostras de sementes de milho

Dezoito amostras (1 kg por amostra) de sementes de milho híbrido foram coletadas nas

principais regiões produtoras do Brasil e processadas para o isolamento de Fusarium spp. As

amostras foram provenientes de campos de produção das empresas Dow AgroSciences (SP, MG e

BA) , GuerraSementes (PA); Aprossul e Pioneer (RS) e Aprossul (MS) das safras dos anos 2001 a

2006. As sementes foram preservadas em ambiente controlado de 20ºC e umidade relativa entre

45 e 50% durante o período de processamento.

3.2 Incidência de Fusarium spp. em sementes de milho

A avaliação da incidência de Fusarium spp. nas sementes foi realizada em uma amostra

de 200 sementes que recebeu tratamento de assepsia superficial. A assepsia superficial consistiu

na imersão das sementes em uma solução de hipoclorito de sódio a uma concentração de 1%

durante 3 minutos.

A incidência do fungo foi avaliada utilizando-se o método de papel de filtro modificado

(CASA et al., 2005; MARTHUR; KONGSDAL, 2003; NEERGAARD, 1979). Para isto, foram

colocadas 3 folhas de papel filtro úmidas em placas de petri de plástico de 9 cm de diâmetro sobre

as quais foram distribuídas 10 sementes num total de 5 placas por repetição e 4 repetições por

amostra.

As sementes foram incubadas a temperatura de 20±2°C sob luz branca e regime de

fotoperiodo de 12 horas de luz/12 horas de escuro. Em seguida, foram acondicionadas a -20°C por

24 horas. Posteriormente, as sementes foram incubadas nas condições de temperatura e luz

anteriormente relatadas durante 6 dias (MARTHUR; KONGSDAL, 2003).

Após o período de incubação, a incidência de Fusarium spp. nas sementes foi

determinada através da visualização em estereomicroscópio, observando-se a presença ou

ausência de estruturas reprodutivas características do gênero. Quando necessário foram

preparadas lâminas para observação das estruturas do fungo em microscópio óptico.

3.3 Obtenção de isolados de Fusarium spp.

3.3.1 Isolamento de Fusarium spp. de sementes

Para o isolamento estruturas reprodutivas e micélio característicos do gênero foram

transferidas para placas de petri contendo meio de cultura ágar-água (AA) em condições

30

assépticas com o auxílio de agulha histológica e esteremicroscópio. As placas foram incubadas em

câmara climática com temperatura controlada a 20±2°C e luz próxima a ultravioleta (NUV) com

fotoperíodo de 12 horas luz / 12 horas escuro durante 7 dias. Após a incubação e sob visualização

em microscópio estereoscópico, os isolados que apresentaram estruturas características de

Fusarium spp. foram transferidos para placas contendo meio de cultura batata dextrose ágar

(BDA) para obtenção de cultura pura. As condições de temperatura, fotoperíodo e período de

incubação neste caso foram as mesmas descritas anteriormente.

3.3.2 Obtenção de culturas monospóricas

Com o auxílio de uma agulha histológica, microconídios foram transferidos para tubos de

ensaio contendo 1 ml de água destilada estéril e submetidos a agitação. Esta suspensão foi diluída

em um novo tubo com a mesma quantidade de água destilada estéril. Após agitação, 20 µL da

suspensão foram plaqueados com auxílio de alça de drigalski em placas de petri contendo meio

ágar-água (AA). As placas foram incubadas em câmara climática com temperatura controlada a

20±2°C e luz branca com fotoperíodo de 12 horas luz / 12 escuro durante 24 horas.

Após a incubação, sob microscópio estereoscópico e em condição asséptica foi

selecionado de cada isolado um microconídio com desenvolvimento do tubo germinativo de

comprimento maior que o comprimento do conídio, transferido para placa contendo meio BDA e

incubado em câmara climática sob condições controladas de temperatura 20±2°C e luz NUV com

fotoperíodo de 12 horas luz/12 escuro durante 10 dias. Após o desenvolvimento das colônias, 15

discos de meio de cultura de 5 mm de diâmetro contendo as estruturas fúngicas de cada isolado

foram preservados pelo método de Castellani (BARRETO, 1967).

3.4 Caracterização e identificação morfológica

3.4.1 Caracterização cultural

O índice de crescimento da colônia foi avaliado como base em mensurações dos

diâmetros perpendiculares da colônia com auxilio de uma régua milimetrada durante 8 dias em

intervalos de dois dias (FRENCH; HERBERT, 1980). Finalizada a avaliação do índice de

crescimento, as culturas foram mantidas nas mesmas condições para avaliar o aspecto e a cor da

colônia aos 10 dias de incubação. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado com

3 repetições. As avaliações foram feitas em intervalos de 2 dias durante um período máximo de 8

dias, totalizando 4 avaliações. O ensaio foi mantido sob condições experimentais controladas de

31

temperatura 20±2°C e luz NUV com fotoperíodo de 12 horas luz/12 escuro. Os dados foram

analisados utilizando metodologia descrita por Oliveira “apud” Machado et al. (2001) e com o

auxilio do programa estatístico Statistix 8.0.

3.4.2 Caracterização morfológica

A caracterização morfológica dos isolados foi feita baseada nos caracteres morfológicos

estudados para a maioria das espécies do gênero Fusarium associadas ao milho (NELSON et al.,

1983, NIRENBERG; O΄DONNELL, 1998; LESLIE; SUMMERELL, 2006), tais como ausência

de clamidósporo, tipo de célula conidiogênica (monofiálide ou polifiálide), tipo de células

reprodutivas (macroconídio e microconídio), dimensões das estruturas reprodutivas, disposição

dos microconídio sobre a célula conidiogênica (em cadeia ou em “falsa cabeça”) e estrutura de

formação dos macroconídios (esporodóquio ou micélio aéreo).

Em culturas monospóricas crescendo sobre meio ágar folha de craveiro (CLA) foram

avaliadas a formação de esporodóquio e características do macroconídio (medidas de

comprimento por largura, número de septos e forma das células pé e apical); e em meio SNA

(synthetic nutrient-poor ágar) foi avaliado o tipo de célula conidiogênica, disposição dos

microconídios, comprimento por largura dos microconídios e confirmou-se a presença/ausência

de clamidósporo, seguindo estudos feitos por Booth (1971), Leslie; Summerell, (2006); Nelson et

al. (1983), Singh et al. (1991), Summerell et al. (2003). Todas as culturas foram incubadas sob

condições controladas de temperatura 20±2°C e luz NUV com fotoperíodo de 12 horas luz/12

escuro durante 10 a 20 dias com algumas exceções.

A avaliação das características dos microconídios foi realizada em microculturas, que

consistiu em acondicionar cubos de 1x1cm aproximadamente de meio SNA colonizados pelo

fungo sobre lâminas de vidro. Para isto, micélio de cultura monospórica de cada isolado crescendo

em BDA foi retirado com auxilio de uma agulha histológica e colocado pelas bordas do ágar e

cobertos com uma lamínula (GONÇALVES; COUTO, 2007). As lâminas de microculturas foram

incubada em câmara úmida sob luz branca com fotoperíodo de 12 horas luz/12 horas em escuro

durante 3 dias. Após o período de incubação foi realizada a mensuração do comprimento e largura

dos microconídio.

Baseado na metodologia aplicada por Caldari (1998); Tozze (2007), as dimensões dos

esporos de cada isolado foram avaliadas em 30 microconídios selecionados ao acaso em cinco

campos diferentes sob aumento de 400X, sendo necessária precaução para não desmanchar a

32

disposição dos conídios sobre a fiálide. Com auxílio de um sistema de vídeo-câmara acoplado ao

microscópio, a mensuração foi realizada de forma indireta na imagem projetada na tela do

monitor televisivo (Color Vídeo Monitor Panasonic CT - 2084 Y). Para isto, foi utilizado um

sistema digital de câmara de vídeo (Digital Color Câmera CCD 1/3” SDC – 320 Samsung)

acoplado ao microscópio óptico. Os valores correspondentes às imagens projetadas (cm) foram

convertidos para a escala real dos conídios (µm). Para a conversão foi utilizada uma lâmina

micrografada (Carl Zeiss) e sua imagem no aumento 400X foi projetada no monitor e mensurada

com uma régua milimetrada, sendo que cada 50 µm na lâmina correspondiam a 15,7 cm na

imagem no monitor.

Para avaliar as características dos macroconídios, estes foram coletados de esporodóquios

formados sobre folhas de craveiro em meio de cultura CLA e corados com lacto-glicerol. As

medidas dos esporos foram feitas seguindo a metodologia anteriormente descrita para avaliar os

microconídios. Para isto, foram preparadas lâminas de vidro contendo lacto-glicerol incolor e com

auxilio de agulha histológica adicionou-se esporodóquios formados sobre folhas de craveiro em

meio de cultura CLA.

3.4.3 Identificação morfológica

Para a identificação dos isolados segundo o critério morfológico foram considerados os

marcadores morfológicos de cada uma das espécies de interesse descritos por Nelson et al. (1983);

Leslie e Summerell, (2006). Para identificar cada espécie como membro do grupo chamado

complexo G. fujikuroi (seção Liseola) foi avaliado presença ou ausência de clamidósporos, e para

identificar cada espécie; foi considerada a presença de microconídios em cadeia sobre monofiálide

para Fusarium verticillioides, presença de microconídio em cadeias sobre polifiálide para F.

proliferatum e para F. subglutinans a presença de microconídio dispostos exclusivamente em

falsa cabeça sobre monofiálide e/ou polifiálide.

3.5 Caracterização molecular

3.5.1 Extração e quantificação de DNA de Fusarium spp.

A extração de DNA foi realizada a partir de micélio e estruturas reprodutivas formadas

em monoculturas dos isolados cultivados em meio BDA durante 7 a 10 dias, em câmara climática

de 20±2ºC e sob luz NUV com fotoperiodos de 12 horas. Com auxilio de agulha histológica o

micélio foi transferido a um tubo de 1,5 ml contendo 500 µL de tampão de extração (0,7M NaCl,

33

10%CTAB, 50mM Tris pH 8,0, 10mM EDTA) adicionado com 1,5 µL de beta-mercaptoetanol.

Estes tubos foram homogeneizados utilizando-se o vortex por 1 minuto e incubados 60 ºC durante

1 hora sendo agitados manualmente em intervalos de 15 minutos.

Utilizando-se a capela de exaustão, após o período de incubação foram adicionados 600

µL de solução de clorofórmio e álcool isoamílico na proporção de 24:1, e a emulsão resultante foi

agitada vagarosamente por 2 minutos. Os tubos foram centrifugados a 13.000 rpm a 25 ºC durante

10 minutos. O sobrenadante foi transferido em volume de 400 µL para novos tubos de 1,5 ml e

adicionado 600 µL de solução de clorofórmio e álcool isoamílico na proporção de 24:1. A solução

foi homogeneizada manualmente por inversão durante 2 minutos e os tubos foram centrifugados

sob as mesmas condições anteriormente descritas. O sobrenadante foi transferido para tubo de 1,5

ml e contendo 400 µL de 2-propanol a 15 ºC. Os tubos foram invertidos delicadamente por 4-6

vezes e incubados a -20 ºC durante 12 horas.

Posteriormente, os tubos foram centrifugados a 13.000 RPM a 25 ºC durante 8 minutos, e

o sobrenadante descartado. Ao precipitado foram adicionados 300 µL de etanol 70% a 15°C

seguido de centrifugação a 13.000 RPM e 25 ºC durante 5 minutos, o sobrenadante foi descartado.

Este procedimento foi repetido utilizando-se etanol 100%. Após as lavagens utilizando-se etanol e

descarte do sobrenadante, os peletes de DNA foram secos em estufa a 37 ºC durante 30 minutos.

Em seguida, o DNA foi ressuspendido em 30 l de solução TE (10mMTris e 1mM EDTA) e

foram adicionados 12,5µL de solução de Rnase (Invitrogen) na concentração de 10 g/ml. A

digestão de RNA ocorreu a 37°C por 30 minutos. As concentrações de DNA (ng/ µL) foram

determinadas em espectrofotômetro Nanodrop (Uniscience).

3.5.2 Identificação da espécie utilizando reação da polimerase em cadeia (PCR)

Para a identificação molecular foram utilizados iniciadores específicos desenvolvidos para

as espécies F. verticillioides, F. proliferatum e F. subglutinans baseados na seqüência parcial do

gene que codifica para calmodulina segundo o protocolo proposto por Mulé et al., (2004). Os

iniciadores utilizados foram VER1 5`-CTTCCTGCGATGTTTCTCC-3` e VER2 5`-

AATTGGCCATTGGTATTATATATCTA-3` (F. verticillioides); - PRO1 5`-

CTTTCCGCCAAGTTTCTTC-3` e PRO2- 5`-TG TCAGTAACTCGACGTTGTTG-3` (F.

proliferatum) e SUB1 5`-CTGTCGCTAACCTCTTTATCCA-3` e SUB2 5`-

CAGTATGGACGTTGGTATTATATCTAA-3` (F. subglutinans). As reações foram realizadas em

34

volume final de 15µL, contendo 1X tampão de PCR (Fermentas), 2,0 mM MgCl2 (Fermentas), 0,2

mM dNTPs (Fermentas), 0,3 M de cada iniciador, 1,25 unidade de Taq DNA Polymerase

(Fermentas) e aproximadamente 60 ng de DNA. As reações de PCR foram realizadas em

termociclador MJ Research, Inc.

O programa utilizado foi de desnaturação inicial a 95°C por 5 minutos, seguido de 35

ciclos de 94°C por 50 segundos, 55°C por 1 minuto e 72°C por 1 minuto; e extensão final de 72°C

por 7 minutos. Cada uma das espécies estudadas foi identificada devido a amplificação do

tamanho do fragmento amplificado esperado, sendo que para F. verticillioides foi de 578 pb, para

F. proliferatum de 585 pb e no caso de F. subglutinans de 631pb, descritos por Mulé et al. (2004).

3.6 Estudo da diversidade genética dos isolados de Fusarium com marcadores AFLP

A obtenção de marcadores AFLP foi feita baseado no protocolo adaptado de Vos et al.

(1995). A reação de digestão do DNA genômico foi realizada com duas enzimas; uma de corte

raro (EcoRI, New England-Biolabs) e a outra de corte freqüente (MseI, New England-Biolabs) em

reação composta de 1X de tampão OnePhorAll (OPA), 1X de Albumina bovina (BSA -10 µg/µL),

120 ng de DNA e 2,0 unidade de cada uma das enzimas completando com água milli-Q estéril em

volume final de 20 µL. As reações foram incubadas a 37ºC por 3 horas. A inativação das enzimas

de restrição foi ocasionada pela incubação a 70 ºC durante 15 min.

Após a digestão, procedeu-se a ligação de adaptadores em reação composta de 1X de

tampão da ligase, 0,5 M de cada um dos adaptadores e 0,4 unidades de T4 DNA ligase

(3unidades/ l – Fermentas) em volume final de 4 l acrescentado a cada tubo com DNA

previamente digerido. A incubação foi realizada a 23ºC por três horas.

A amplificação de fragmentos de DNA foi realizada em duas etapas, denominadas pré-

amplificação e amplificação seletiva. Para a reação de pré-amplificação foram utilizados 0,25 µM

de cada um dos iniciadores EcoRI adicionados de um nucleotídeo (E+A e E+C) combinados com

os 0,25 µM iniciadores MseI adicionados de um nucleotídeo (M+A e M+C), 0,2 mM de dNTPs,

1,0 X de tampão, 1,5mM de MgCl2, 1,5 unidades de Taq DNA polimerase (Fermentas) e 1,0 µL

de DNA digerido e ligado completando um volume final de 10 µL com água Milli-Q estéril. As

reações de pré-amplificação foram realizadas utilizando o programa de desnaturação inicial a

94°C por 2 minutos, seguido de 26 ciclos compostos de 94°C por 1 minuto, 56°C por 1 minuto e

72°C por 1 minuto, e no final um ciclo de extensão por 5 minutos a 72°C em termociclador MJ

Research Inc. Após a amplificação foram acrescentados 40 µL de água estéril em cada reação.

35

A amplificação seletiva usou iniciadores de dois nucleotídeos, sendo um adicional ao

usado na pré-amplificação. As combinações usadas foram EAA e MCC, EAA e MAG, EAT e

MCA, EAG e MAA, ECC e MCC. A reação foi composta de 0,25 µM do iniciador EcoRI , 0,30

uM do iniciador MseI , 0,2 mM de dNTPs , 1,2mM de MgCl2, 1,0 unidades de Taq DNA

polimerase (5 U/µL) e 2,0 µL de DNA pré-amplificado diluído com água Milli-Q estéril em

volume final de 20 µL. Para a amplificação de fragmentos foi utilizado um programa de

desnaturação inicial de 94 ºC por 2 minutos, seguido de 36 ciclos compostos de 94 ºC por 30

segundos, 65 ºC por 30 segundos, 72 ºC por 1 minuto, finalizando com um ciclo de extensão de

72 ºC por 1 minuto.

Os marcadores foram resolvidos em géis de acrilamida. Para tanto, as amostras foram

submetidas à eletroforese em gel de poliacrilamida 6% de 0.5 mm de espessura com utilização do

sistema “Sequi-gen GT” (BioRad) de 38 X 50 cm. Para preparo da solução matriz foram

utilizados 420 g de uréia, 3g de bisacrilamida e 60g de acrilamida, diluídos em TBE 1X em

volume de 1 litro.

Para o preparo do gel foram utilizados 160 ml da solução matriz, 160 l de TEMED

(Promega) e 1100 l de persulfato de amônio 10% (Promega). Após a polimerização, foi realizada

uma “pré-corrida”, à potência constante de 80 W por 1 hora, em cuba contendo TBE 1X na parte

superior e solução de acetato de sódio 0,5M preparada em TBE 1X na parte inferior. A

temperatura máxima foi de 50°C. O tempo de eletroforese foi de 4 horas. Previamente à aplicação

das amostras resultantes da amplificação seletiva, as mesmas foram adicionadas de 7 µL de

formamida e incubadas no termociclador por 5 minutos a 95 ºC para desnaturação e incubadas

imediatamente em gelo até o momento da aplicação.

A revelação dos géis foi feita segundo protocolo adaptado de Creste et. al., (2001). Os

géis foram fixados em 2 litros de solução 1% ácido acético glacial e 10% de álcool etílico por 10

minutos sob agitação constante. Após este período, procedeu-se lavagem por 1 minuto em 2 litros

de água destilada sob agitação. Em seguida, foi efetuada uma etapa de pré-tratamento por 2´40´´

em ácido nítrico 1,5% e outra lavagem com dois litros de água destilada. Posteriormente, os géis

foram tratados com solução de nitrato de prata 0,2%, sob agitação, por 20 minutos, e duas

lavagens em 2 litros de água de 30 segundos cada. A revelação foi feita em duplo tratamento

utilizando dois litros de solução gelada contendo 30g/l de carbonato de sódio adicionado de 600

l de formaldeído 37%. Esta fase foi feita em duas etapas, na primeira etapa foi utilizado 1 litro de

36

solução para revelação do gel até a visualização dos fragmentos, em seguida, a solução foi

descartada. Na segunda etapa o restante da solução foi utilizado para revelação até a boa

visualização dos fragmentos.

Depois de revelados, os géis foram submetidos a um tratamento de bloqueio (ácido

acético 5%) durante 5 minutos, finalizando com uma lavagem por 1 minuto com 2L de água

destilada. Terminado o processo os géis foram acondicionados na posição vertical para secar a

temperatura ambiente. A avaliação foi feita visualmente num trans-iluminador de luz branca.

Os fragmentos visualizados produziram uma tabela binária conforme a presença (1) ou

ausência (0) de fragmento para um determinado isolado. Foram considerados a totalidade de

fragmentos reproduzidos na faixa entre 500 e 100 pb de cada gel. Foi gerado um gel controle para

o qual foi selecionado ao acaso um conjunto de isolados e processados novamente sob iguais

condições junto a isolados de fungos não pertences ao gênero Fusarium a partir de uma nova

extração de DNA, reação de digestão, pré-amplificação e amplificação seletiva. Os dados foram

analisados utilizando-se o programa NTSYSpc (ROHLF, 2000). A matriz de similaridade foi

calculada com base no coeficiente de Dice (D(ij) = 2a/ (2a + b + c)), onde D(ij) é a medida de

similaridade entre isolados “i” e “j”, “a” o numero de bandas compartilhadas por “i” e “j”, “b” é o

numero de bandas presentes em “i” e ausentes em “j”, e “c” o numero de bandas presentes em “j”

e ausentes em “i”. Os dados obtidos foram utilizados na analise de agrupamento pelo método

UPGMA (ROHLF, 2000) para a construção do dendrograma e do gráfico de coordenadas

principais.

3.7 Patogenicidade e agressividade de isolados de Fusarium spp.

Os ensaios para determinar a patogenicidade e agressividade de isolados de Fusarium

spp. foram conduzidos no campus de Fitopatologia da ESALQ-USP, durante os períodos de maio

– agosto/2007, outubro/2007–fevereiro/2008 e outubro/ 2008 a fevereiro/ 2009.

A patogenicidade dos cem isolados como agentes da podridão do colmo foi testada em

um híbrido de milho suscetível (AG8060) com o fim de selecionar isolados patogênicos de

Fusarium spp. associados às sementes e com estes avaliar posteriormente sua agressividade para

causar a doença.

A seleção dos isolados foi realizada de acordo com a expressão dos sintomas típicos da

podridão do colmo relatados por Shurtleff (1980). Para isto, foi instalado um ensaio de campo, em

uma parcela de 10x12 m2 usando como planta testadora o milho híbrido comercial AG-8060

37

caracterizado como suscetível a Fusarium spp. As plantas foram inoculadas após atingiram o

estádio fenológico V (após florescimento e inicio da polinização) (FANCELLI; DOURADO,

2004) com 100 isolados de Fusarium spp. obtidos de sementes.

A inoculação consistiu em colocar no primeiro internódio do colmo do milho, 1 ml de

suspensão de esporos de concentração de 1x106 conidios/ml usando uma seringa descartável,

ajustando a concentração com o uso do hematocitômetro (FRENCH; HERBERT, 1980). Antes da

inoculação foi feito um ferimento com uma furadora manual atingindo a medula do colmo, para

facilitar a entrada do inóculo. O preparo do inóculo consistiu na lavagem com 10 ml de água

destilada estéril de 2 placas contendo culturas dos isolados de 7 -10 dias crescendo em meio de

cultura batata dextrose agar (BDA). A suspensão foi transferida para um erlenmeyer contendo 40

ml de água destilada estéril filtrando através gaze estéril para garantir na composição do inoculo

só de conídios.

A variável avaliada foi comprimento da lesão necrótica causada pelos fungos aos 30 dias

após a inoculação e consistiu em cortar os colmos de milho até o ponto de inserção da espiga em

sentido longitudinal com ajuda de uma serra elétrica e mensurar com uma fita graduada o

comprimento da lesão necrótica.

O delineamento experimental foi inteiramente casualizado com 4 repetições cada uma

representada por uma planta. O experimento compreendeu usado um total de 10 fileiras com 60

plantas cada uma, deixando 2 linhas de bordadura. Os tratamentos consistiram nos 100 isolados e

uma testemunha na qual foi aplicada uma injeção de 1 ml de água destilada estéril no internódio

inferior da planta. A análise estatística foi realizada com o auxilio do programa estatístico Statistix

8.0 para determinar a significância quanto as diferenças em agressividade inferida através da

severidade dos sintomas.

3.7.1 Determinação da agressividade dos isolados selecionados em três cultivares com

diferentes níveis de resistência

O ensaio foi instalado no mesmo local do ensaio anterior durante o período de novembro-

2007/Marςo-2008 e outubro- 2008 / fevereiro-2009. O delineamento experimental foi em parcelas

subdividas com 4 repetições e 10 plantas por repetição para cada tratamento. Em total foram 7

tratamentos que consistiram em 6 isolados selecionados no ensaio anterior e uma testemunha.

Foram utilizados 3 híbridos, identificados com os códigos 2B710, 2A525 e AG8060

catalogados como resistente, parcialmente resistente e suscetível a podridão do colmo

38

respectivamente. Os três são caracterizados como de tipo simples, de ciclo precoce, adaptados as

condições de plantio de safra, para serem semeados em uma densidade de semeadura de 55 a 60

mil, 60 a 70 mil e 65 a 75 mil plantas por ha respectivamente. Todos os híbridos usados nesta

pesquisa são resistentes ao acamamento e se adaptam a todas as regiões climáticas onde se cultiva

milho no Brasil, a exceção do híbrido AG8060 que não se adapta às condições do estado de Rio

Grande do Sul. Diferem no porte de planta e altura da espiga, sendo o de maior altura o 2A525

com 2.30m de altura de planta e 1.30m a altura da espiga, seguido de AG-8060 com uma altura de

planta de 2,15m e da espiga de 1,15m e o híbrido 2B710 de menor porte com 2.02m de altura de

planta e 1.10m de altura da espiga (CRUZ; PEREIRA FILHO, 2006).

A semeadura foi realizada utilizando um espaçamento de 0,80 x 0,20 m, para um total de

31 fileiras com 24 úteis, sendo 2 por cultivar e 6 por bloco com uma de bordadura entre blocos e 2

de bordadura da parcela.

O preparo do inoculo e a inoculação das plantas foi feita seguindo a mesma metodologia

explicitada para o ensaio anterior. A avaliação foi realizada aos 120 dias após a emergência de

plântulas (DAE). As variáveis avaliadas foram incidência do acamamento de plantas que consistiu

em aplicar força mecânica na base do colmo das plantas inoculadas. Seguidamente foi medida a

extensão da lesão necrótica estimada através do corte dos colmos em sentido longitudinal desde a

zona de inserção das raízes até o ponto de inserção da espiga com ajuda de uma serra elétrica e

mensuração do comprimento da lesão com uma fita graduada (Matiello, 2004).

Para determinar severidade da podridão do colmo, o comprimento da lesão foi

considerado a proporção de tecido do colmo afetado pelo fungo relativo à altura de inserção da

espiga, assumindo esta como a altura máxima que o fungo percorre em seu desenvolvimento

sistêmico.

Foram feitas análises de variância individuais e combinadas por ano, considerando cada

ano de avaliação como ambientes distintos. No combinado por ano se utilizou o seguinte modelo

linear aditivo:

ijkliklklikkijlilljliijklY )()()()()()(

donde Yijkl = refere-se ao valor observado no híbrido i, inoculado com a estirpe k, na

repetição j, dentro do ambiente l; é a média geral do caráter; i é o efeito fixo do híbrido i; l é

39

o efeito aleatório do lth ambiente de avaliação; )(ljé o efeito aleatório da jth repetição dentro do

lth ambiente; il)( é o efeito de interação entre o ith híbrido com o lth ambiente; ijl)( refere-

se ao efeito do erro associado à parcela principal (erro “a”); ké o efeito fixo do krh isolados;

ik)( é o efeito da interação entre o ith híbrido com o kth isolado; kl)( é o efeito da interação

entre o kth isolado com lth ambiente; ikl

é o efeito de interação de segundo ordem entre o ith

híbrido com o kth isolado no lth ambiente, e ijkl

é o erro associado à subparcela (erro “b”).

Na derivação das esperanças dos quadrados médios e para a realização dos testes F, os

híbridos e os isolados foram considerados efeitos fixos, entanto que os ambientes e repetições

foram considerados efeitos aleatórios. Em todos as análises foi utilizado o programa estadístico

SAS (versão 9.1- SAS INSTITUTE, 2003). Foi necessário transformar os dados de comprimento

da lesão necrótica e de severidade da podridão do colmo para a safra 2008 - 2009, de acordo a Y

= 2/1x . A análise da variância e o teste de contraste múltiplo (Tukey) permitiram inferências

sobre a agressividade dos isolados, e o conseqüente comportamento dos híbridos frente a cada

isolado.

40

41

4 RESULTADOS E DISCUSÃO

4.1 Incidência de Fusarium spp. em sementes de milho

Dezoito amostras de sementes provenientes de diferentes estados do país (Tabela 1)

foram submetidas a teste de sanidade para avaliação da incidência de Fusarium spp. após

tratamento de assepsia superficial. Os dados revelaram alta variabilidade em relação à incidência

(em porcentagem de sementes analisadas) de Fusarium spp. entre as amostras, a qual variou

significativamente (P<0,01) de 51,5 a 2%. A maior incidência de Fusarium spp. foi registrada na

amostra PR-7 procedente de Paraná, mas, que não diferiu de amostras dos outros estados, a

exceção das amostras de Minas Gerais cujas médias apresentaram menores valores de incidência

(Tabela 2). Destas, a amostra (MG-3) identificada como de semente bruta, o que para a indústria

sementeira define uma semente sem beneficiamento, apresentou 8,25 % de incidência de

Fusarium spp., diferindo daquelas com os valores mais altos de incidência, o qual sugere um

manejo adequado no campo de produção de origem desta amostra. De modo geral, as maiores

incidências de Fusarium spp. foram registradas em amostras do sul do país, representada pelos

estados Paraná (PR) e Rio grande do sul (RS). No entanto, o reduzido número de amostras por

região não possibilita nenhuma inferência sobre a ocorrência deste fungo em função da origem

geográfica das amostras (Tabela 2).

Com relação a ano de colheita e, por conseguinte, tempo de armazenamento, também

foram observadas diferenças entre amostras. Todas as amostras colhidas em 2001 e 2005

agruparam-se com uma incidência bastante baixa. Isto provavelmente se deve à perda de

viabilidade do fungo, pois segundo observações de Dias et al. (2005), esta é reduzida após 12

meses de armazenamento das sementes sob condição de ambiente não controlado. Porém,

Magalhães et al. (2009), observaram aumento da incidência de Fusarium spp. no decorrer do

tempo de armazenamento das sementes de milho em embalagem de plástico e em embalagem de

algodão sob ambiente não controlado.

O acondicionamento das sementes desde o campo de produção até o beneficiamento

reflete em sua qualidade sanitária. Neste estudo, a alta variabilidade na incidência de Fusarium

spp. entre as amostras avaliadas pode estar relacionada ao efeito de vários fatores como

ambientais, manejo da cultura nos campos de produção e as condições de beneficiamento

(DHINGRA, 2005).

42

Tabela 1 - Dados sobre a procedência das amostras de sementes analisadas neste estudo

Amostra Local de coleta Ano de coleta

Época de

plantio Identificação lote

SP-1 Guaira-SP 2007 Safra 2B710

MG-2 Janaúba-MG 2006 Safrinha SW-06

MG-3 Paracatú-MG 2006 Safrinha S Bruta

BA-4 Bahia 2006 Safra S Bruta

BA-5 Bahia 2006 Safrinha SW-06

PR-6 Pato Branco-PR 2007 Safra SG-6418

PR-7 Pato Branco-PR 2007 Safra SG-150

RS-8 Santa Cruz-RS 2001 Safra 30F44

RS-9 Santa Cruz-RS 2001 Safra 30F44

RS-10 Cruz Alta-RS 2007 Safra 30F53

RS-11 Santo Augusto-RS 2005 Safra 30F53

RS-12 Santo Augusto-RS 2007 Safra 30F53



MS-15 Bandeirantes-MS 2007 Safra Bus-Sol Amanhã

MS-16 Bandeirantes-MS 2007 Safra Al-Bandeirante

MS-17 Bandeirantes-MS 2007 Safra Br-106

MS-18 Rio Brilhante-MS 2007 Safra DG-504

43

Tabela 2 - Incidência de Fusarium spp.. em sementes de milho produzidas no Brasil submetidas a assepsia superficial

Amostra

de semente

Incidência Fusarium

spp..

(%)

Amostra

de semente

Incidência Fusarium

spp..

(%)

PR-7 51,50ª MS-15 12,50bcdefg

RS-13 46,00ab RS-11 8,50cdefg

RS-12 42,50ab MG-3 8,25cdefg

BA-5 42,25abc RS-9 7,50defg

PR-6 35,00abcd RS-10 6,50efg

MS-16 28,50abcde RS-8 5,75efg

MS-17 28,50abcde MS-18 5,50efg

BA-4 26,75abcde MG-2 3,00fg

SP-1 21,25abcdef RS-14 2,00g

CV(%) = 29,61

A incidência de patógenos veiculados pelas sementes é uma importante variável para o

estabelecimento de índices referenciais tais como o limite de tolerância, definido como a

incidência de um patógeno na semente acima da qual as perdas causadas pelo uso desse lote são

inaceitáveis (DHINGRA, 2005; MACHADO; POZZA, 2005) e o padrão sanitário de sementes

definido por Casa et al. (2005); Menten (1991), como o indicativo da relação entre a incidência do

patógeno nas sementes e a taxa de transmissão.

No caso de Fusarium spp. o padrão de sanidade de sementes também é um valor

referencial na tomada de decisão referente à adoção de medidas de controle adicionais como

acontece no milho quando são detectados fungos causadores da podridão do colmo (CASA et al.,

2005). Machado e Pozza (2005) apontam as possíveis conseqüências tanto no campo quanto na

pós-colheita da associação patógenos-semente, as quais justificam o estabelecimento de padrões

sanitários de sementes, mas, os autores não consideram a contaminação por espécies fúngicas

toxigênicas como é o caso de Fusarium spp. do complexo G. fujikuroi que, apesar de não serem

quarentenários, , são importantes pois são transmitidos de forma sistêmica até a espiga, lá

produzindo metabólitos secundários que contaminam o grão e causam problemas de saúde animal

e humano. Neste sentido, são necessários estudos que suportem o estabelecimento de padrões

sanitários de sementes para estas espécies toxigênicas e gerar evidências científicas sobre a

44

relevância de sua transmissão sistêmica à planta e o impacto no acumulo de toxinas no grão. Um

exemplo deste tipo de trabalho foi feito por Sartori et al. (2004) que, partindo de uma incidência

natural de F. moniliforme de 46%, encontraram uma transmissão de 34,9%, 23,6%, 7,2% e 14,6%

das sementes para raiz principal, entrenó subcoronal, coleóptilo e base da folha, respectivamente,

o qual indicou uma redução da associação do fungo com a planta no sentido da base ao ápice.

Os resultados das análises de sanidade de sementes do presente estudo revelam essa

necessidade, pois, sendo as amostras provenientes de campos de produção certificados, acredita-se

que tenham recebido tratamentos satisfatórios de beneficiamento e inspeção da qualidade. No

entanto, mesmo assim, os níveis de incidência de Fusarium spp. foram elevados e diferentes entre

lotes.

4.2 Isolamento de Fusarium spp. da semente

Cem isolados foram obtidos a partir da análise de sanidade das amostras de sementes

colhidas em diferentes zonas do Brasil (Tabela 3). O maior número de isolados foi obtido da

região sul, especificamente do Estado Rio Grande do Sul, pois esta região contribuiu com o maior

número de amostras.

Tabela 3 - Identificação e origem de isolados monospóricos de Fusarium spp. oriundos de sementes de milho

híbrido

Região Estado Amostra Isolado Região Estado Amostra Isolado

Sudeste São Paulo SP-1 Fv-1

Sul Rio Grande do Sul RS-8 Fv-51



Sudeste São Paulo SP-1 Fp-3









Sul Rio Grande do Sul RS-9 Fp-57





Sudeste Minas Gerais MG-2 Fv-10












(continua)

45

Tabela 3 - Identificação e origem de isolados monospóricos de Fusarium spp. oriundos de sementes de milho

híbrido

Região Estado Amostra Isolado Região Estado Amostra Isolado


Sul Rio Grande do Sul RS-11

Fv-66







Nordeste Bahia BA-4 Fv-20









Sul Rio Grande do Sul RS-13 Fs-74









Sul Paraná PA-6 Fv-29



Centro-Oeste Mato Grosso do Sul MS-15 Fv-80








Centro-Oeste Mato Grosso do Sul MS-16 Fp-84















Sul Paraná PA-7 Fp-42












Sul Paraná PA-7 Fs-48





Centro-Oeste Mato Grosso do Sul MS-18 Fsp-100

(continua) (conclusão)

46

4.3 Caracterização cultural e morfológica dos isolados de Fusarium spp.

4.3.1 Caracterização cultural

Neste estudo, os resultados do índice de crescimento não se ajustaram à normalidade,

sendo necessária a análise não paramétrica por Kruskal-Wallis. Os resultados indicaram que não

houve diferenças (P>0.05) em índices de crescimento entre isolados em meio BDA, não diferindo

dos resultados obtidos por Machado (2002) para F. moniliforme submetido a restrição hídrica em

meio BDA+Manitol. Segundo Seifert (1996), esta é uma característica mais adequada para

diferenciar espécies das seções Eupionnotes e Arachnites das espécies de outras seções por estas

apresentarem um crescimento lento.

A cor e aspecto do micélio foram muito variáveis entre isolados e ainda entre cultivos do

mesmo isolado feitos a partir de esporos provenientes da mesma colônia (Figura 1). Alguns

isolados apresentaram micélio abundante numa cultura e escasso em outra. A cor variou desde o

branco rosado, passando ao laranja salmão até o roxo, tanto no micélio quanto no fundo do meio

de cultura. Para Seifert (1996), a cor desenvolvida no verso da colônia em meio de cultura BDA

incubada a 25ºC entre 7-10 dias auxilia na identificação de espécies agrupadas na seção Liseola

(atual complexo G. fujikuroi) quando a pigmentação é roxa. Na atualidade, devido às constantes

variações apresentadas por estas espécies em meios artificiais esta característica não apresenta

importância para efeitos taxonômicos.

Figura 1 - Características das colônias de isolados de Fusarium spp. crescendo

em meio de cultura BDA. a1, a2, a3. F. verticillioides; b1, b2, b3.

F. proliferatum. c1, c2. F. subglutinans. c3. Fusarium sp

a1 a2 a3

b1 b2 b3

c1 c2 c3

47

4.3.2 Caracterização e identificação morfológica dos isolados de Fusarium spp.

As condições de incubação das culturas não favoreceram o desenvolvimento da fase

teleomórfica. Porém, a avaliação das características anamórficas, segundo Nelson et al. (1983),

permitiu alocar todos os isolados na seção Liseola, na atualidade chamado complexo G. fujikuroi

(LESLIE; SUMMERELL, 2006; NIRENBERG; O`DONNELL, 1998).

A presença ou ausência de clamidósporo é a característica que determina a inclusão de uma

espécie no complexo G. fujikuroi. Esta é a estrutura típica do gênero Fusarium (NELSON et al.,

1983), mas, no entanto, espécies do complexo G. fujikuroi não a produzem. Por isto, esta foi a

primeira característica avaliada, mostrando que a totalidade dos isolados não formaram esta

estrutura e que, portanto, pertencem a espécies deste complexo.

A ausência de clamidósporo, aliada à produção de esporodóquios de coloração alaranjada

em folhas de craveiro com 10 a 20 dias de crescimento, alojando macroconídios com 3 – 5 septos

predominando 3, com paredes delgadas e curvatura dorso-ventral; e a presença de microconídios

abundantes dispostos em cadeias e/ou falsas cabeças são características consideradas nas chaves

sinópticas para identificação da sessão Liseola. Neste estudo, noventa isolados formaram

esporodóquios. Nos dez restantes, os macroconídios foram avaliados quando formados em

micélio aéreo, ainda que em baixa quantidade, e apresentaram formato semelhante aos de origem

esporodoquial, com predominância de 3 septos e disposição da célula basal em falso pé e a célula

apical ligeiramente curva (Figura 2e).

Todos os isolados apresentaram microconídios unicelulares, ovais e dispostos em falsa

cabeça. Além disto, a maioria (97%) produziu estes esporos na forma de cadeias, indicando se

tratar de F. verticillioides ou F. proliferatum, já que F. subglutinans não produz esporos em

cadeia.

Alguns isolados apresentaram microconídios bicelulares. Acredita-se que os esporos de

tipo microconídios que apresentam septo são na verdade ascósporos, mas, neste caso, para o 98%

dos isolados, não foi observado formação de peritécios no período de avaliação considerado e só

foi possível observar esta estrutura com os ascos carregando os ascósporos bicelulares nas

culturas dos isolados Fv-BA25 e Fv-MS80 em meio BDA e em folhas de craveiro repetidas vezes

aos 30 a 60 dias após inicio do desenvolvimento da colônia (Figura 2f).

A fim de distinguir isolados das espécies F. verticillioides e F. proliferatum, as células

conidiogênicas foram caracterizadas em tipo monofiálides e/ou polifiálides (Figura 2a, 2b). O tipo

48

de célula conidiogênica é uma estrutura chave para distinguir F. verticillioides de F. proliferatum,

pois polifiálides não são produzidas pela primeira espécie e o são pela segunda, além de F.

subglutinans (LESLIE; SUMMERELL, 2006). Os dois tipos de células conidiogênicas foram

observados sobre conidióforos simples e ramificados; monofiálides foram observados em setenta e

sete isolados e as polifiálides em vinte e dois. Destes, vinte desenvolveram microconídios em cadeia

confirmando a espécie F. proliferatum, e os outros dois foram identificados como F. subglutinans.

Esta espécie, apesar de não apresentar diferenças muito visíveis com F. verticillioides e F.

proliferatum já que pode formar tanto mono como polifiálides, apresenta uma característica

distintiva de fácil visualização que é a disposição dos microconídios sobre a fiálide, que ocorre

somente sobre falsas cabeças. Por fim, apenas um isolado (Fsp-MS100) não pôde ser identificado

em nível de espécie com base nos critérios aqui considerados.

Figura 2 - Estruturas morfológicas de isolados de Fusarium spp. (40x). a. microconídiomicroconídios em cadeia e

falsa cabeça sobre monofiálide. b. Célula conidiogênica tipo polifiálide c. célula conidiogênica semelhante

a polifiálide. d. Esporodóquio laranja, escleródio sobre folha de craveiro. e. Macroconidio formado em

esporodóquio. f. Asco com ascósporos. g. Engrossamento de hifas

a b c

d e f

g

49

Para F. subglutinans as dimensões dos microconídios variaram de 2,23 – 6,37 x 1,0– 1,59

µm e dos macroconídios de 10,83 – 28,03 x 1,27 – 1,91 µm, sendo em todos os casos inferiores aos

resultados obtidos por Morales et al. (2007) para esta espécie. Neste estudo, as dimensões dos

macronídios obtidas para F. subglutinans são coincidentes com as dimensões de estruturas nomeada

por Morales et al. (2007) como mesoconidio, termo não usado aqui porque a literatura empregada

para auxilio na identificação das espécies não usa. As dimensões dos microconídios de F.

verticillioides (1,91–4,46 x 1,00–1,59 µm; 4,46–5,73 x 1,59-3,18 µm) e de Fusarium proliferatum

(2,23–4,78 x 1,0–1,59 µm; 2,87 – 4,46 x 1,27 µm) foram muito próximas; já as dimensões dos

macroconídios foram discordantes entre estas espécies, sendo os produzidos por F. verticillioides

(28,66-54,14 x 1,27–2,55 µm) maiores que os de F. proliferatum (9,83–19,43 x 1,0–1,27 µm)

(Tabela 6). Como as chaves sinópticas utilizadas neste estudo não utilizam estas medidas como

critério classificatório, as discrepâncias entre os dois estudos não refletem alterações significativas

na identificação dos isolados. O intuito de analisá-las foi apenas o de comparar informações de

isolados brasileiros com isolados de outras localidades.

.

50

Tabela 4 - Marcadores morfológicos para a identificação de Fusarium spp.. do complexo G. fujikuroi

(continua)

Tipo de microconídio Disposição dos

microconídios

Célula conidiogênica

Isolado Unicelular Bicelular

Cadeia Falsa

cabeça

Monofiálide Polifiálide Espécie

morfológica Confirmação

PCRs

Fv-SP01 + +

+ +

+ - F. verticillioides F. verticillioides

Fv-SP02 + +

+ +


Fp-SP03 + -

+ +

+ + F. proliferatum F. proliferatum

Fv-SP04 + -

+ +


Fv-SP05 + +

+ +


Fv-SP06 + -

+ +


Fv-SP07 + +

+ +

+ + F. proliferatum F. verticillioides

Fv-SP08 + -

+ +

+ - F. verticillioides F. proliferatum

Fv-SP09 + -

+ +


Fv-MG10 + -

+ +


Fv-MG11 + -

+ +


Fv-MG12 + +

+ +


Fv-MG13 + -

+ +


Fv-MG14 + +

+ +


Fv-MG15 + +

+ +


Fv-MG16 + -

+ +


Fv-MG17 + -

+ +


51


(continua)


microconídios



Cadeia Falsa

cabeça



PCRs

Fv-MG18 + -

+ +


Fv-MG19 + -

+ +


Fv-BA20 + -

+ +


Fv-BA21 + -

+ +


Fv-BA22 + -

+ +


Fv-BA23 + -

+ +


Fv-BA24 + -

+ +


Fv-BA25 + -

+ +


Fv-BA26 + -

+ +


Fv-BA27 + -

+ +


Fv-BA28 + -

+ +


Fv-PR29 + -

+ +


Fv-PR30 + +

+ +


Fv-PR31 + -

+ +


Fv-PR32 + -

+ +


Fv-PR33 + -

+ +


Fv-pr34 + -

+ +


Continuação

Continuação

(continuação)

52


(continua)


microconídios



Cadeia Falsa

cabeça



PCRs

Fv-PR35 + -

+ +


Fv-PR36 + -

+ +


Fv-PR37 + -

+ +


Fv-PR38 + -

+ +

+ - F. proliferatum F. verticillioides

Fv-PR39 + -

+ +


Fv-PR40 + -

+ +


Fv-PR41 + -

+ +


Fp-PR42 + -

+ +


Fv-PR43 + -

+ +


Fv-PR44 + -

+ +


Fv-PR45 + -

+ +


Fv-PR46 + -

+ +


Fv-PR47 + -

+ +


Fv-PR48 + -

- +

+ + F. subglutinans F. subglutinans

Fv-RS49 + +

+ +


Fv-RS50 + -

+ +


Fv-RS51 + -

+ +


(continuação)

53


(continua)


microconídios



Cadeia Falsa

cabeça



PCRs

Fv-RS52 + -

+ +


Fv-RS53 + -

+ +


Fv-RS54 + -

+ +


Fv-RS55 + -

+ +


Fv-RS56 + -

+ +


Fp-RS57 + -

+ +


Fv-RS58 + -

+ +


Fv-RS59 + -

+ +


Fv-RS60 + -

+ +


Fv-RS61 + -

+ +


Fv-RS62 + -

+ +


Fv-RS63 + -

+ +


Fv-RS64 + -

+ +


Fv-RS65 + -

+ +


Fv-RS66 + -

+ +


Fv-RS67 + -

+ +


Fv-RS68 + -

+ +


(continuação)

(continuação)

54


(continua)


microconídios



Cadeia Falsa

cabeça



PCRs

Fv-RS69 + -

+ +

+ - F. verticillioides

F. verticillioides

Fv-RS70 + -

+ +


Fv-RS71 + -

+ +


Fv-RS72 + -

+ +


Fv-RS73 + -

+ +


Fs-RS74 + -

- +

+ + F. subligutinans F. subglutinans

Fv-RS75 + -

+ +


Fv-RS76 + -

+ +


Fv-RS77 + -

+ +


Fv-RS78 + -

+ +


Fv-RS79 + -

+ +


Fv-MS80 + +

+ +


Fv-MS81 + -

+ +


Fv-MS82 + -

+ +


Fv-MS83 + -

+ +


Fv-MS84 + -

+ +


Fv-MS85 + +

+ +


(continuação)

(continuação)

54

55


(continua)


microconídios



Cadeia Falsa

cabeça



PCRs

Fv-MS86 + -

+ +


Fv-MS87 + -

+ +


Fv-MS88 + -

+ +


Fv-MS89 + -

+ +


Fv-MS90 + -

+ +


Fv-MS91 + -

+ +


Fv-MS92 + -

+ +


Fv-MS93 + -

+ +


Fv-MS94 + -

+ +


Fv-MS95 + -

+ +


Fv-MS96 + -

+ +


Fv-MS97 + -

+ +


Fv-MS98 + -

+ +


Fv-MS99 + -

+ +

+ - F.verticillioides F. verticillioides

Fv-MS100 + -

+

+ - Fusarium sp Fusarium sp

(conclusão)

55

56

Tabela 5 - Comparação da identificação morfológica e molecular de isolados de Fusarium spp..

associados ás sementes de milhos produzidas no Brasil

Espécie Critério Morfológico Critério Molecular % verificado

F. verticillioides 77 77 100,00

F. proliferatum 20 4 20.00

F. subglutinans 2 2 100,00

Fusarium sp. 1 - -

Tabela 6 - Dimensões dos microconídios e macroconídios de Fusarium spp. avaliados neste estudo

Espécie Microconídio em

cadeia (C x L) (µm)

Microconídio em falsa

cabeça (C x L) (µm)

Macroconídio em

esporodóquio (C x L) (µm)

Nº de septos

em

macroconídio

F. verticillioides 3,5-12,1 x 0,6-1,6 3,8-12,7 x 0,6-1,9 18,45-34,3 x 8,9-1,0 3

F. proliferatum 2,2-8,6 x 0,6-1,6 2,2 -8,0 x 0,6-2,2 12,50-45,2 x 1-11,8 3

F. subglutinans - 1,6-6,4 x 2,2-1,0 17,43-28,0 x 1-10,8 3

Fusarium sp. - 4,14–1,46 x 0,96–1,59 16,00-20,7 x 1,6 4

Segundo Leslie et al. (2006) a formação de escleródios, embora não tenha importância

taxonômica, podem ser um indicativo de alto nível de fertilidade. Para estes autores, esta estrutura é

observada tanto em F. proliferatum quanto em F. verticillioides. Observações deste estudo são

coincidentes com as destes autores para oito isolados (10,39%) de F. verticillioides e dois isolados

(10,00%) de F. proliferatum (Tabela 7). Neste caso, foram observados, durante período de avaliação

de 7 a 15dias, aglomerados de hifas que não alcançam a formar o corpo de frutificação e tornam-se

uma estrutura esclerosada de cor escura, sem esporos em seu interior e desenvolvidos geralmente

acima dos esporodóquios característicos das espécies do complexo G. fujikuroi, (Figura 2d).

57

Tabela 7 - Porcentagem de isolados com características morfológicas semelhantes

Espécie

Isolados com esporodóquios de

cor laranja

(%)

Isolados formando

escleródios

(%)

Isolados com

microconídio bicelular

(%)

F. verticillioides 100 10.39 10,52

F. proliferatum 100 10,00 14,29

F. subglutinans 100 50 0

Fusarium sp. 100 0 0

A exemplo do relatado por Leslie et al. (2006), isolados aqui identificados como F.

proliferatum e F. verticillioides produziram engrossamentos na hifa semelhantes a clamidósporos

(Figura 2g). A ocorrência das espécies identificadas neste estudo já foi reportada no Brasil

associadas à cultura de milho, principalmente como agentes causais de grãos ardidos. Ottoni (2008)

reportou as espécies F. verticillioides e F. subglutinans associadas a grãos ardidos em incidências de

82% e 3%, respectivamente e não relatou a presença de F. proliferatum. Também, em estudo similar

realizado por Pinto et al. (2007), F. subglutinans foi relatada como única espécie associada a grãos

ardidos e produção de fumonisinas com uma incidência de 55% – 99% em grãos de 36 cultivares

testados. Estes resultados discordantes podem ser devido ao fato de que os autores não indicaram os

critérios utilizados para a identificação da espécie, o que pode ter levado a identificações errôneas.

No presente estudo, a distribuição das espécies resultou em 77% F. verticillioides, 20% F.

proliferatum, 2% F. subglutinans e 1% Fusarium sp. (Tabela 5), evidenciando, mais uma vez, a alta

freqüência da associação F. verticillioides–milho, sendo coincidentes com resultados de estudos

anteriores, como é o caso de Rahjoo et al. (2008) em plantios de milho para sementes no Irã, que

determinaram, através da análise de caracteres morfológicos, que de um total de 191 isolados

avaliados, 140 foram identificados como F. verticillioides, 47 como F. proliferatum, e o resto não

foi identificado. Os resultados deste estudo também concordam com levantamentos recentes

realizados no país e no México, nos quais F. verticillioides foi predominante (MORALES, 2007;

OTTONI, 2008).

58

4.4 Identificação molecular de Fusarium spp.

O DNA dos 100 isolados foi usado em reações de PCR com o intuito de confirmar os

resultados da identificação morfológica mediante o uso de marcadores moleculares específicos

para cada espécie sob estudo. Os setenta e sete isolados classificados morfologicamente como F.

verticillioides amplificaram um produto de 578pb com o primer específico desenvolvido para esta

espécie (Figura 3). Além destes, outros 16 isolados identificados morfologicamente como F

proliferatum (de um total de vinte), também amplificaram com este primer, totalizando noventa e

três isolados como pertences á espécie F. verticillioides (Tabela 5). Os quatros isolados restantes

de F. proliferatum apresentaram fragmentos amplificados com primers específicos para esta

espécie, confirmando sua classificação morfológica.

A provável causa da discrepância entre as análises morfológicas e a molecular no caso de

F. proliferatum pode estar na dificuldade de avaliação da característica que distingue estas duas

espécies (produção de esporos em polifiálides). Um exemplo disto é a estrutura ilustrada na figura

2c, a qual foi observada no isolado Fv-SP-07, identificado como F. proliferatum pela semelhança

desta com a polifiálide, mas, que resultou F. verticillioides na confirmação com a identificação

molecular.

Figura 3 - Produtos da reação polimerase em cadeias (PCR)

com primers específicos para F. verticillioides

isolados de sementes de milho

1 K

b

Fv

-SP

02

Fv

-MG

17

Fv

-BA

25

Fv

-PR

40

Fv

-RS

56

Fv

-MS

93

Ág

ua

578 pb

59

Por outro lado, a discrepância pode ser resultado da inespecificidade dos primers para os

isolados de F. proliferatum do Brasil, uma vez que foram desenvolvidos com base em seqüências

parciais do gene calmodulina de isolados europeus (Itália) (MULÉ et al., 2004). Em estudos com

isolados do Irã, Rahjoo et al. (2008) também relataram discordâncias entre a identificação

morfológica e molecular de F. verticillioides e F. proliferatum e concluíram que estes resultados

eram esperados, pois os primers usados correspondem a seqüência parciais de genes de isolados

oriundos da Europa e Estados Unidos, e os isolados do Irã podem apresentar maior diversidade

genética, fato comprovado neste mesmo já que alguns isolados que não amplificaram com primers

específicos para F. proliferatum e F. verticillioides foram confirmados como sendo destas

espécies através do seqüenciamento do gene que codifica para o fator de elongação (TEF).

Da totalidade dos isolados analisados, apenas dois isolados amplificaram um produto de

631pb com primers específicos para F. subglutinans, que coincidiu com a identificação

morfológica (Tabela 4).

Curiosamente, um isolado não amplificou para nenhum dos primers usados e também não

apresentou marcadores morfológicos das três espécies identificadas, nem de outras espécies do

complexo G. fujikuroi, a pesar de não ter formado clamidósporos, característica que o aponta como

espécie deste grupo (Tabela 4).

Neste estudo foi uma vez mais, esclarecida a importância da combinação de diferentes

critérios para a identificação das espécies do gênero Fusarium, principalmente dentro do complexo

G. fujikuroi. Por isto, a identificação molecular é um critério que se tornou indispensável para a

identificação de espécies de fungos que apresentam alta variabilidade dentro da espécie, sempre

que esta analise seja suficientemente precisa. Para o uso da PCR como técnica de diagnose, é

necessário o desenvolvimento e validação de primers a partir de seqüência gênicas de espécimes

em desenvolvimento na mesma geografia ocupada pelos espécimes sob estudo porque o uso de

marcadores obtidos em condições climáticas diferentes do âmbito de estudo, provavelmente seja

em alguns casos o motivo das discrepâncias. Estudos posteriores sobre identificação baseada em

outras seqüência gênicas, como caso do gene TEF, provavelmente ajudariam a esclarecer possíveis

discrepâncias entre as classificações morfológicas e moleculares de espécies deste gênero.

60

4.5 Estudo da diversidade genética dos isolados de Fusarium com marcadores AFLP

O DNA dos 100 isolados de Fusarium spp. foram analisados por AFLP usando 5

combinações de primers (E_AT+M_CA, E_AA+M_AG, E_AG+M_AA, E_AA+M_CC,

E_CC+M_CC) que geraram um total de 367 bandas entre 100 e 500 pb (Figura 4). Neste estudo,

foram identificados 276 (75,20% do total) fragmentos polimórficos, assumindo como fragmento

polimórfico o estado mais comum entre os isolados que compõem o grupo estudado (presente ou

ausente) e que estiver presente em menos de 95% dos espécimes (LAURENTIN, 2009). A

combinação E_AA+M_AG amplificou o maior número de fragmentos, mas revelou o menor

número de fragmentos polimórficos. A combinação E_AT+M_CA detectou o maior número de

fragmentos polimórficos (98,46%). Em geral, as combinações de primers usados neste estudo

revelaram um alto polimorfismo entre a população sob análise (Tabela 8).

O dendrograma resultante do agrupamento dos dados obtidos dos haplótipos AFLP de

cada isolado se apresenta na figura 5. A análise de agrupamentos mostrou uma similaridade

genética entre pares de isolados que variou de 0,13 a 0,94. Considerando um índice de

similaridade superior de 0,40, foram observados dois grandes grupos: o maior (I) agrupando os

isolados pertences as espécies F. verticillioides, F. subglutinans e Fusarium sp. e outro grupo (II)

com isolados da espécie F. proliferatum. Espécies de outros gêneros de fungos (Cercospora

maydis, Curvularia sp. e Monilinia sp) foram incluídas na analise simplesmente para enraizar a

árvore. A correlação cofenética resultante foi de 0,97, indicando que houve pouco desvio entre os

dados originais da matriz de similaridade e os dados utilizados para construção do dendrograma, o

que significa que esta explica adequadamente os dados biológicos.

61

Figura 4 - Padrão de AFLP gerado a partir de 5 combinações de primers (E_AT+M_CA, E_AA+M_AG,

E_AG+M_AA, E_AA+M_CC, E_CC+M_CC) na analise de 100 isolados de Fusarium spp.. (complexo

G. fujikuroi)

Tabela 8 - Lista de combinações de primers usados para determinar por AFLP a diversidade genética de

Fusarium spp. (G. fijikuroi) presentes em sementes

Combinação de

Primers Total

Bandas/Primer Bandas

polimórficas Porcentagem de polimorfismo

E_AA+M_CC 43 37 86,05

E_AA+M_AG 111 53 47,75

E_AT+M_CA 65 64 98,46

E_AG+M_AA 84 65 77,38

E_CC+M_CC 64 57 89,06

Total bandas 367

62

Dice coefficient

0.13 0.33 0.53 0.74 0.94

Fv-SP01 Fv-SP04 Fv-SP06 Fv-SP08 Fv-SP02 Fv-MG10 Fv-MG12 Fv-BA23 Fv-BA24 Fv-MG13 Fv-MG16 Fv-MG18 Fv-BA20 Fv-MG19 Fv-BA21 Fv;BA25 Fv-BA26 Fv-BA28 Fv-BA27 Fv-PR34 Fv-PR31 Fv-PR30 Fv-PR29 Fv-PR35 Fv-PR36 Fv-PR32 Fv-PR33

Fv-PR37 Fv-PR38 Fv-BA22 Fv-MG14 Fv-MG15 Fv-MG17 Fv-PR39 Fv-PR40 Fv-PR43 Fv-RS53 Fv-PR45 Fv-PR47 Fv-RS51 Fv-RS52 Fv-RS50 Fv-PR46 Fv-RS49 Fv-RS54 Fv-RS55 Fv-RS58 Fv-RS56 Fv-RS60 Fv-RS65 Fv-RS63 Fv-RS64 Fv-RS70 Fv-RS59 Fv-RS61 Fv-RS62 Fv-RS66 Fv-RS69 Fv-RS71 Fv-RS75 Fv-RS76 Fv-RS77 Fv-MS80 Fv-RS68 Fv-RS78 Fv-RS79 Fv-MS81 Fv-RS72 Fv-MS82 Fv-MS87 Fv-MS92 Fv-MS91 Fv-MS95 FvMS96 Fv-MS88 Fv-MS89 Fv-MS93 Fv-MS98 Fv-MS99 Fv-MS94 Fv-MS97 Fv-MS83 Fv-MS85 Fv-MS86 Fv-MS90 Fv-RS67 Fv-MG11 Fv-RS73 Fv-PR44 Fv-PR41 Fv-SP05 Fv-SP07 Fv-SP09 Fs-PR48 Fsp-MS100 Fs-RS74 Fp-SP03 Fp-PR42 Fp-RS57 Fp-MS84 Cercospora maydis Monilinia sp. Curvularia sp.

Figura 5 - Dendrograma UPGMA para isolados de Fusarium spp. do complexo G. fujikuroi

(Correlação cofenética 0,97) pelo coeficiente de similaridade Dice)

I

II

IA

IB

IC

ID

IE

63

O grupo I pode ser dividido em cinco sub-grupos. O isolado Fs-RS74, identificado

previamente como F. subglutinans foi diferenciado do resto do grupo, enquanto que isolados de

F. verticillioides foram agrupados com um índice de similaridade superior a 0,70 em cinco sub-

grupos. Dos cinco sub-grupos, o sub-grupo IC foi o mais heterogêneo em termos de origem, pois

agrupou isolados de Minas Gerais (MG), Bahia(BA) e Paraná(PR). Os outros grupos foram

compostos por isolados provenientes de um mesmo estado. Assim, por exemplo, o sub-grupo IA

agrupou os isolados oriundos de São Paulo (SP), o ID agrupou isolados em sua maioria de origem

Rio Grande do Sul (RS) com alguns de PR e Mato Grosso do Sul (MS), e o sub-grupo IE, o mais

homogêneo, foi composto pela maioria dos isolados de MS e apenas um de RS. Os sub-grupos IA

e IB agruparam o menor número de isolados de F. verticillioides.

Os resultados indicam, portanto, que isolados de uma mesma região foram geneticamente

mais próximos entre si do que entre isolados de outras regiões. No entanto, este resultado deve ser

tomado com muita cautela, pois o número reduzido de amostras de cada local não permite inferir

que as diferenças observadas entre clusters se devam às variações locais, mas, por outro lado,

permitem antever a existência de grande variabilidade genética entre espécies do complexo G.

fujikuroi associadas ao milho no país.

Os resultados da análise bi-direcional por coordenadas principais foram consistentes com

os resultados do dendrograma, coincidindo principalmente com a separação em grupos para as

espécies de Fusarium, especialmente F. verticillioides e F. proliferatum, o qual foi o resultado

mais robusto da analise neste estudo (Figura 6). Também permitiram verificar a aproximação dos

isolados Fs-PR48 e Fs-RS74 identificados como F. subglutinans, os quais, segundo o

dendrograma, apresentam uma similaridade genética com F. verticillioides próxima de 50%. No

entanto, os isolados Fp-SP03, Fp-PR42, Fp-RS57 e Fp-MS84, previamente identificados como F.

proliferatum foram agrupados em clusters diferentes, com uma similaridade genética de 40%

(Figura 5).

64

Segundo Silva et al. (2006), a conservação de locos em F. verticillioides e F.

subglutinans mostra duas espécies intimamente relacionadas, apresentando o mesmo haplotipo e

conformando um mesmo clado. No presente estudo, isolados desta espécie encontram-se no

dendrograma a uma distância genética menor de F. verticillioides se comparar com a distância de

F. proliferatum, o qual se pode associar com a antiga classificação da espécie F. moniliforme

subsp. subglutinans, inferindo uma maior proximidade genética entre estas, pois F. verticillioides

é a antigamente F. moniliforme quando associado ao milho.

Comparando a similaridade genética detectada entre isolados de cada espécie, pode-se

evidenciar que a similaridade média entre isolados de F. verticillioidesI foi de 0,70, ao passo que

entre isolados de F. proliferatum foi de 0,60. Neste caso, provavelmente o pequeno número de

isolados não foi representativo de uma população com alta diversidade genética (RAHJOO et al.,

2008).

Dim-1 -0.16 0.07 0.30 0.53 0.76

Dim-2

-0.29

-0.14

0.01

0.16

0.32

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15 16

17

18

19 20 21

22

23 24

25 26 27

28

29 30 31 32

33 34 35 36

37

38

39

40

41

42

43

44

45

46

47

48

49

50

51 52

53

54

55

56

57

58

59 60

61 62 63 64

65

66

67

68

69 70

71

72

73

74

75

76 77

78

79

80

81

82

83

84

85

86

87 88 89

90

91

92 93 94 95

96

97

98 99

100

F. proliferatum

F. subglutinans

Fusarium sp.

F. verticillioides

Figura 6 - Gráfico da Análise de Coordenadas Principais para 100

isolados de Fusarium spp.. (G. fujikuroi)

65

4.6 Seleção de isolados patogênicos para testes de agressividade.

Estudos prévios sustentam a hipótese da existência de uma relação endófita de alguns

isolados pertences às espécies de fungos agrupadas no complexo G. fujikuroi, principalmente de

F. verticillioides. Estes estabeleceriam uma associação específica com o hospedeiro, alojando-se

nas sementes e outras partes da planta em qualquer estádio fenológico resultando numa infecção

assintomática (CARROL, 1988, DESJARDINS, 2003, MUNKVOLD; McGEE; CARLTON,

1997). Estes relatos despertaram o interesse de avaliar a capacidade patogênica da coleção de

isolados de Fusarium spp. provenientes de sementes produzidas em diferentes regiões do Brasil.

Neste estudo, os resultados mostraram que 100% dos isolados testados induziram sintomas de

podridão do colmo em milho. Não obstante, os resultados mostraram diferenças significativas

(P<0,05) entre isolados, sendo Fv-BA22 e Fv-BA25 os de maior agressividade avaliada pelo

comprimento necrótico da lesão no colmo do híbrido AG8060 (resultados não apresentados). No

entanto, os outros isolados não mostraram diferenças significativas com estes nem com a

testemunha. Os isolados Fv-SP01, Fv-MS94 e Fsp-MS100, produziram lesões menores de 2,75

cm, as quais estatisticamente não diferiram da testemunha.

Os resultados dificultaram a escolha dos isolados para o teste de agressividade, pois

somente através da avaliação do comprimento da lesão necrótica foi difícil determinar e

diferenciar o grau de patogenicidade dos fungos inoculados. Porém, segundo Schurtleff (1980) e

Pereira et al. (2005) existe um conjunto de sintomas característicos que aparecem de forma

progressiva à medida que a doença se desenvolve e estes foram observados neste estudo. Estes

sintomas vão desde a descoloração da medula, que se torna de esbranquiçada a amarela, passando

para cor salmão até marrom, perda da estrutura do colmo, abertura de cavidades, separação das

fibras, necrose de internódios superiores e, ao final, quando o colmo não suporta pressão ou peso

das espigas, ocorre o prostramento da planta (acamamento). Todos estes sintomas foram

observados aos 30 dias após inoculação em todos os isolados. Foi constatado também, que o

isolado Fsp-MS100 causou apenas uma lesão amarela, semelhante à descrita como inícios da

doença. Este isolado não foi identificado em espécie por critério morfológico nem molecular

(MULÉ et al., 2004). No entanto, como todos os isolados incluindo este espécime causaram

mudanças na medula do colmo do milho, conclui-se que, nas condições de avaliação deste estudo,

nenhum se comportou como endófito quando inoculado no híbrido suscetível AG8060.

66

Diante estes resultados, a seleção dos isolados para o teste de agressividade foi feita

baseada na observação do aparecimento do sintoma terminal da doença, representada pela perda

da estrutura do colmo por separação das fibras. Além disto, também foi priorizada a escolha de

isolados oriundos de regiões distintas.

4.7 Agressividade de isolados de F. verticillioides avaliada em colmos de milho.

A agressividade de 6 estirpes de Fusarium verticillioides foi avaliada em dois

experimentos (2007- 2008 / 2008 – 2009) através das variáveis severidade da podridão do colmo

(SPC), comprimento necrótico (CN) e a incidência de acamamento (IA) de plantas em três

híbridos comerciais de milho. Em termo geral, as temperaturas predominantes para os dois

períodos de avaliação neste estudo mantiveram-se entre 23 – 25 ºC durante o ciclo da cultura,

sendo favoráveis tanto para o desenvolvimento da planta quanto do fungo, igualmente, a umidade

em média atingiu durante os dois períodos entre 150 e 162 mm, o qual foi desfavorável para a

planta tornando-a vulnerável aos patógenos causadores da podridão do colmo. Estes resultados

são coincidentes com os de El-Meleigi et al. (1983), apontando a maior incidência da doença

quando a umidade no solo foi limitada.

Os resultados da ANOVA para a análise conjunta (dados não apresentados) indicaram

ausência de interação entre isolado x híbrido e híbrido x ano (P>0,05) tanto para CN como para

SPC. No caso da interação isolado x ano, esta foi significativa, o que sugere que o comportamento

dos isolados variou em função da época de condução do experimento (Figura 7). Desta forma os

resultados foram analisados individualmente por ano. Os resultados também indicaram alta

significância para efeito simples dos híbridos (P<0,01), o que indica que eles responderam de

forma diferente aos isolados inoculados, como esperado, já que possuem níveis contrastantes de

resistência.

Apesar de serem catalogados como resistente, parcialmente resistente e suscetível, os 3

foram suscetíveis a todos isolados, porem a ANOVA para a analise conjunta indicou diferenças

significativas entre eles (dados não apresentados), sendo o híbrido 2A525 o que apresentou o

maior CN (36,26 cm), que resultou significativamente (P≤0,05) superior aos outros dois

híbridos,os quais não se diferenciaram e tiveram valores de 31,49 (2B710) e 29,77 (AG8060)

(Tabela 9).

67

Foi observada uma alta variabilidade nas medidas do CN nos diferentes tratamentos. O

aparecimento de sintomas de doenças na testemunha pode ser produto do ferimento ocasionado

pela agulha o que possibilita a entrada de inoculo tanto de Fusarium como de outros agentes

colonizadores do colmo (BORGES et al., 2001), proveniente de outras possíveis fontes de

contaminação, tais como partículas de solo, respingos de água, tecidos senescentes adjacentes ás

plantas controle (MURILLO-WILLIAMS; MUNKVOLD, 2008) ou inoculo do ar (TRIMBOLI et

al., 2006). Como não houve interação isolado x híbrido para esta, os resultados apresentados na

tabela 9 correspondem aos efeitos independentes de cada fator, sendo que no sentido da coluna se

compara o comportamento dos híbridos em relação aos isolados. Nota-se que não houve diferença

de CN entre isolados em todos os híbridos e nos dois períodos avaliados, indicando uma

agressividade semelhante de todos os isolados causando podridão do colmo, independentemente

do híbrido testado neste estudo.

Os resultados obtidos para SPC na primeira safra foram semelhantes aos obtidos na

avaliação do CN (Tabela 10), ou seja, todos isolados induziram sintoma típico da doença e apenas

se diferenciaram (P<0,05) da testemunha. Na segunda safra, a severidade da podridão do colmo

68

também mostrou resultados semelhantes às médias de comprimento da lesão necrótica, não

havendo diferenças (P>0,05) na manifestação da doença em nenhuma das inoculações e nem com

a testemunha, a diferença da safra anterior.

69

Tabela 9 - Comprimento da lesão necrótica causada por isolados de F. verticillioides inoculados em três híbridos com diferentes níveis de resistência

Transformação de dados Safra 2008 – 2009: Y = 2/1x

Médias com letras minúsculas iguais no sentido das linhas não diferenciam estatisticamente o nível de resistência dos híbridos.

Médias com letras maiúsculas iguais no sentido das colunas não diferenciam estatisticamente a agressividade dos isolados de F. verticillioides.

Safra 2007 – 2008 Safra 2008 – 2009

Híbridos

Híbridos

Isolados 2B710 2A525 AG8060 2B710 2A525 AG8060

Fv-SP02 9.84±1,0828 a A 9.84±1,7703 a AB 10.14±4,4985 a A 9,80±1,8312 a A 10,60±2,8414 a A 6,80±4,6166 a AB

Fv-MG17 11,84±4,4025ab A 20.98±8,0917a A 9.38±1,6383b A 9,73±1,6523 a A 14,18±6,7992 a A 11,15±4,7948 a A

Fv-BA25 9.51±3,9651 a A 15,05±5,6526 a A 8,80±1,3385 a A 8,85±3,3478 a A 13,18±2,6235 a A 9,43±3,0869 a AB

Fv-PR40 12,01±2,0499 a A 16,10±7,1883 a A 9,84±1,3162 a A 10,10±1,0231 a A 14,43±5,3922 a A 8,83±2,0467 a AB

Fv-RS56 7,67±2,3741 a AB 11,50±2,4735 a AB 8,96±2,3393 a A 16,23±5,999 a A 12,40±4,1497 a A 11,33±2,3599 a A

Fv-MS93 9,46±1,6111 a A 12,75±3,9321 a AB 8,21±2,3271 a A 11,53±2,9136 a A 15,60±10,664 a A 13,23±6,1738 a A

T 4,09±2,3827a B 6.48±1,6292 a B 2,93±2,7318 a B 7,35±1,4821ab AB 11,58±4,1532 a A 4,88±1,3301b B

CV(%) 33,59 47,04

69

70

Tabela 10 - Severidade da podridão do colmo do milho causada por isolados de F. verticillioides inoculados em três híbridos de milho com diferentes níveis de resistência

Safra 2007 – 2008 Safra 2008 – 2009

Híbridos

Híbridos


Fv-SP02 8,95±0,9854aAB 7,57±1,3657aAB 8,81±3,9116aA 8,91±1,6661aA 8,15±2,1843aA 5,91±4,0147aA

Fv-MG17 10,76±4,0015aA 16,14±6,2261aA 8,15±1,4254aA 8,85±1,5036aA 10,90±5,2318aA 9,70±4,1690aA

Fv-BA25 8,65±3,6021aAB 11,58±4,3475aAB 7,65±1,1630aA 8,04±3,0442aA 10,14±2,0178aA 8,20±2,6868aA

Fv-PR40 10,92±1,8654aA 12,39±5,5264aAB 8,55±1,1476aA 9,18±0,9289aA 11,10±4,1464aA 7,67±1,7494aA

Fv-RS56 6,98±2,1572aAB 8,85±1,9038aAB 7,79±2,0352aA 14,75±4,5430aA 9,54±3,1948aA 9,85±2,0507aA

Fv-MS93 8,60±1,4679aAB 9,81±3,0277aAB 7,14±2,0248aAB 10,48±2,6486aA 11,99±8,2033aA 11,50±5,3680aA

T 3,72±2,1672aB 4,98±1,2537aB 2,55±2,3756aB 6,68±1,3463abA 8,91±3,1947aA 2,96±2,7400bA

CV(%) 32,83 47,47

Transformação de dados: Y = 2/1x

Médias com letras minúsculas iguais no sentido das linhas não diferenciam estatisticamente o nível de resistência dos híbridos.

Médias com letras maiúsculas iguais no sentido das colunas não diferenciam estatisticamente a agressividade dos isolados de F. verticillioides.

70

71

Respeito da incidência do acamamento de plantas aos 120 DAE também foram

observadas interações significativas (P<0,05) entre híbridos e isolados para os dois

experimentos (Tabela 11). No primeiro, as médias dos tratamentos se separaram em dois

grupos estatísticos diferentes em resposta à interação dos fatores híbrido e isolado; assim, os

tratamentos híbrido AG8060 (S) inoculado com o isolado Fv-MG17 e os híbridos 2B710 (R)

e 2A525 (PR) inoculados com o isolado Fv-BA25 apresentaram os maiores índices de

acamamento de plantas. No entanto, o tratamento híbrido AG8060 (S) inoculado com o

isolado Fv-PA40 apresentou o menor índice de acamamento de plantas sem diferenças com a

testemunha. O resto dos tratamentos não diferiu daqueles com os maiores índices de

acamamento (Tabela 11). Em termos gerais, na safra 2007-2008, o híbrido 2A525 obteve a

maior porcentagem de acamamento de plantas, seguido do híbrido AG8060.

No segundo experimento, os valores de IA foram maiores em relação ao primeiro. Os

tratamentos com as maiores médias de índice de acamamento foram os híbridos 2B710 (R)

inoculado com Fv-PR40, o híbrido 2A525 (PR) inoculado com Fv-SP02, Fv-MG17 e Fv-

RS56; e o hibrido AG8060 (S) inoculado com Fv-SP02 e Fv-RS56. Estes tratamentos foram

diferentes do resto dos tratamentos (Tabela 11). Na segunda safra, observou-se uma situação

similar ao ciclo anterior quanto à suscetibilidade dos híbridos ao acamamento.

72

Tabela 11 - Incidência do Tombamento de plantas devido ao dano causado por isolados de F. verticillioides inoculados no colmo de três híbridos de milho com diferentes

níveis de resistência

Safra 2007 – 2008 Safra 2008 – 2009

Híbridos

Híbridos


Fv-SP02 5,00±2,7735ab 12,50±5,000ab 12,50±5,000ab 22,50±5,000ab 37,50±5,000a 32,50±5,000a

Fv-MG17 10,00±0,000ab 15,00±5,7735ab 17,50±5,000a 12,50±5,000bcd 42,50±5,000a 30,00±0,000abc

Fv-BA25 12,50±5,000a 17,50±5,000a 12,50±5,000ab 7,50±5,000cd 32,50±5,000ab 32,50±5,000ab

Fv-PR40 7,50±5,000ab 12,50±5,000ab 2,50±1,000b 27,50±5,000a 22,50±5,000bc 27,50±5,000abc

Fv-RS56 7,50±5,000ab 7,50±5,000ab 7,50±5,000ab 20,00±0,000abc 37,50±5,000a 37,50±5,000a

Fv-MS93 7,50±5,000ab 5,00±2,7735ab 10,00±0,000ab 17,50±5,000abcd 32,50±5,000ab 22,50±5,000bc

T 0,00±0,000b 2,50±1,000b 7,50±5,000ab 5,00±2,7735d 17,50±5,000c 20,00±0,000c

CV(%) 29,95 9,84

Médias com letras minúsculas iguais não diferenciam estatisticamente a incidência de acamamento nos tratamentos isolado x híbrido.

72

73

Os resultados para a variável incidência do acamamento contrastaram com os resultados

para severidade da podridão do colmo, pois houve interação entre isolados e híbridos. Isto pode

ser atribuído ao fato do acamamento não ser causado simplesmente por um estresse biótico, como

também pela estruturação mecânica do colmo.

Neste estudo estirpes provenientes de sementes assintomáticas causaram sintomas típicos

da podridão do colmo, não resultando em nenhum dos casos plantas assintomáticas, porém

existam evidências de F. verticillioides alojado na semente não ter importância para a posterior

colonização de raízes e causar podridão do colmo (EL-MELEIGI et al., 1983; MUNKVOLD;

McGEE.; CARLTON, 1997) o que sugere possíveis condições climáticas favoráveis para o

desenvolvimento patogênico dos isolados, além de encontrar-se em altas populações.

Isolados presentes em sementes assintomáticas possivelmente não contribuem

diretamente na incidência de podridão do colmo, mas, em contato com os tecidos do colmo se

tornam patogênicos e potenciais inoculo para novos plantios. Estes resultados sustentam a

importância da semente como meio disseminador de patógenos aos campos de produção.

Para a podridão do colmo do milho o comprimento da lesão necrótica é uma medida de

avaliação adequada da severidade da doença, diferente do acamamento o qual resultou uma

variável pouco confiável para avaliação da severidade desta doença.

74

75

5 CONCLUSÕES

A alta incidência de Fusarium spp. em lotes de sementes de milho indicou a associação

concomitante da planta e o fungo, pois independente do controle sanitário da semente e as

condições de beneficiamento e armazenamento, níveis de 0% incidência não foram encontrados.

As análises morfológicas e moleculares de culturas monospóricas de Fusarium isoladas

de sementes assintomáticas de milho indicaram a prevalência de F. verticillioides em detrimento

das duas outras duas espécies do complexo fujikuroi patogênicas de milho.

Houve concordância entre as identificações morfológicas e moleculares na maioria dos

casos. As discrepâncias apresentadas para a espécie F. proliferatum, evidenciou a dificuldade para

a identificação desta espécie.

A análise de diversidade genética de isolados baseada na técnica AFLP evidenciou a

elevada diversidade genética entre isolados de F. verticillioides e corroborou a separação entre F.

verticillioides e F. proliferatum com um índice de similaridade de 0,40. Por outro lado, as

análises não deram suporte à distinção entre F. verticillioides e F. subglutinans.

Isolados de F. verticillioides provenientes de sementes assintomáticas causaram podridão

do colmo em milho e não apresentaram variação em agressividade frente a três híbridos

diferenciados na resistência à doença.

76

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Universidade de São Paulo - USP · A Deus meu eterno guia e protetor. A minha instituição, Universidade Centroccidental “Lisandro Alvarado” por ter confiado em minha capacidade