Embed Size (px)
Citation preview
UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
GIOVANA VECHI
POTENCIAL BIOLÓGICO E COMPOSIÇÃO QUÍMICA DAS FOLHAS DE Eugenia involucrata DC. (cerejinha do mato)
Itajaí
2015
UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E
SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS
GIOVANA VECHI
POTENCIAL BIOLÓGICO E COMPOSIÇÃO QUÍMICA DAS FOLHAS DE Eugenia involucrata DC. (cerejinha do mato)
Dissertação submetida à Universidade do Vale do Itajaí como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas. Orientador: Prof. Dr. Valdir Cechinel Filho
Itajaí, julho de 2015
FICHA CATALOGRÁFICA
V494p
Vechi, Giovana, 1984-
Potencial biológico e composição química das folhas de Eugenia
involucrata DC. (cerejinha do mato) / Giovana Vechi, 2015.
80f. ; il., tab. ; fig.
Cópia de computador (Printout(s)).
Dissertação (Mestrado) Universidade do Vale do Itajaí, Mestrado em
Ciências Farmacêuticas.
“Orientador : Prof . Dr Valdir Cechinel Filho ”
Bibliografia : p. 70-80
1. Plantas medicinais. 2. Catequina. 3. Eugenia involucrata.
4. Triterpenos. 5. Fitoterapia. I. Título.
CDU: 615.32
CDU: 612.78
Josete de Almeida Burg – CRB 14.ª 293
Dedico essa conquista à toda minha família,
em especial aos meus pais Juca e Jane,
que nunca mediram esforços para que meus
sonhos se tornassem realidade.
Obrigada de todo o meu coração!
AGRADECIMENTOS
A Deus, primeiramente, que é a origem e o princípio de tudo, por me
proporcionar sabedoria, tranquilidade e paz!
Ao Professor Valdir Cechinel Filho, por acreditar no meu potencial e aceitar
me orientar nesses dois anos de caminhada. Por sua paciência e calma diante dos
obstáculos dessa trajetória.
Aos meus pais Jane e Juca, por me ajudarem e apoiarem nessa etapa da
minha vida em especial, mas também, por toda a educação que me deram e me
fazem ser a pessoa que sou hoje.
À toda minha família e ao meu namorado, pelo apoio, carinho, amor e
paciência dedicados à mim durante esses dois anos de mestrado.
Aos membros da banca, Professora Dra. Angela Malheiros, Professora Dra.
Tânia Bellé Bresolin e Professor Dr. Walter Antônio Roman Jr, pelas contribuições
para conclusão deste trabalho.
À minha grande amiga, desde os primeiros dias da faculdade, Adriana
Campos, que me incentivou à essa busca pelo título de mestre, e além disso, se
disponibilizou a me ajudar em todo o aprendizado dentro do laboratório, e em todas
as etapas dessa caminhada para a finalização desse trabalho. Obrigada sem fim!
Aos meus colegas do laboratório de Fitoquímica, que sempre se
disponibilizaram a tirar minhas dúvidas e me auxiliar no que fosse preciso. Obrigada
em especial à Luísa Nathália Bolda Mariano, que esteve presente mais de perto em
toda minha caminhada, mas também ao Tiago Bonomini e Marcel Petreanu.
Aos colaboradores e à coordenação do Programa de Pós-Graduação em
Ciências Farmacêuticas, Prof. Dr. Clóvis Antonio Rodrigues, Prof. Dra. Tania Mari
Bellé Bresolin, Juliano dos Santos e Helenise Heyse Moreria.
À todas as pessoas que enriqueceram este trabalho com sua disponibilidade
e realização dos testes biológicos: Marcélly dos Santos Boera, Prof. Dr. Alexandre
Bella Cruz, Roseane Leandra da Rosa, Prof. Dr. Sérgio Faloni de Andrade, Karla
Capistrano e Profa. Dra. Fátima de Campos Buzzi.
Ao Prof. Theo, Tailyn Zerminani, Pedro Pablo Perez Netto e Prof. Rogério
Corrêa pela ajuda nas técnicas de CLAE, RMN e CG/EM.
Ao Prof. Dr. Arturo San Feliciano, da Universidade de Salamanca, pela
grande ajuda nas avaliação das análises de RMN para determinação estrutural de
uma substância inédita.
Às agências de fomento: CAPES, pela concessão da minha bolsa e CNPQ e
FAPESC pelo auxílio financeiro ao laboratório.
“Deus não sabe o que fazer com o nosso saber e com as
nossas obras se nelas não estiver o nosso coração”.
(Pe. Dehon)
POTENCIAL BIOLÓGICO E COMPOSIÇÃO QUÍMICA DAS FOLHAS DE Eugenia involucrata DC. (cerejinha do mato)
Giovana Vechi
Julho/2015 Orientador: Valdir Cechinel Filho, Prof. Doutor. Área de Concentração: Produtos Naturais e Substâncias Sintéticas Bioativas Número de Páginas: 80 O uso de plantas medicinais para tratar doenças é tão antigo quanto a humanidade. A descoberta de novas substâncias através das plantas é uma promissora alternativa para a busca de novos medicamentos. O gênero Eugenia tem apresentado relevantes resultados terapêuticos, mas pouco se conhece sobre o potencial da Eugenia involucrata DC. O presente trabalho teve como objetivo conhecer a composição química das folhas da E. involucrata e avaliar o seu potencial antimicrobiano, gastroprotetor e antinociceptivo. A coleta da planta se deu em três momentos, janeiro, julho e dezembro de 2014. Em todas as coletas, as folhas foram inicialmente maceradas em metanol, resultando em Extratos Metanólico Brutos, EMB-jan, EMB-jul e EMB-dez. Os extratos foram submetidos à partição, gerando a Fração Clorofórmio (FCL) e Acetato de Etila (FAE). A análise fitoquímica foi realizada por meio de técnicas cromatográficas convencionais e as substâncias isoladas analisadas por técnicas espectrométricas usuais. Essa análise permitiu o isolamento da (-)-catequina (substância majoritária), e de outras duas substâncias da FAE-jan. Da FCL-jan foram isoladas outras três substâncias, o fitol e as substâncias 7-9 e 3-6, inéditas, denominadas 24,25-epoxi-28-hidroxicicloartan-3-ona e 24,25-epoxi-28-hidroxicicloartan-3-ona acetilado. A comparação entre os EMB de inverno e verão por CLAE mostrou algumas diferenças importantes e maior quantidade de catequina no inverno. O extrato e frações de janeiro foram avaliados quanto sua atividade antimicrobiana frente as cepas de B. subtilis, S. aureus, S. saprophyticus, E. coli e C. albicans pela técnica de microdiluição em caldo, que permitiu a determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM). O EMB-jul foi avaliado quanto ao seu potencial gastroprotetor, pelo modelo de úlcera induzida por etanol, e antinociceptivo, pelo modelo de contorções induzidas pelo ácido acético, que avaliou também a FCL-jul, FAE-jul, uma substância isolada. O EMB-jan apresentou CIM de 125 µg/ml para S. aureus e C. albicans e 500 µg/ml para E. coli. A FAE-jan foi inativa para todas as cepas e a FCL-jan apresentou CIM de 500 µg/ml para as bactérias Gram-positivas, sendo inativa para as demais. O EMB-jul reduziu a área total lesada e a área relativa de lesão para os tratamentos com as doses de 125 e 250 mg/kg de maneira significativa. Na avaliação da atividade antinociceptiva tanto o extrato quanto as frações apresentaram redução da nocicepção (26,5 a 64,4% na dose de 10 mg/kg), mas a FCL-jul foi mais eficaz, apresentando DI50 de 2,33 mg/kg. A substância 7-9 inédita, também foi testada e apresentou redução do número de contorções abdominais em 50% na dose de 1 mg/kg. Os resultados permitiram concluir que a E. involucrata é uma promissora espécie vegetal com potencial terapêutico, particularmente contra processos dolorosos, embora seja necessário confirmação em outros modelos de dor. Palavras-chave: Eugenia involucrata; catequina; novos triterpenos, efeito antimicrobiano; gastroproteção; atividade antinociceptiva.
BIOLOGICAL POTENTIAL AND CHEMICAL COMPOSITION OF Eugenia involucrata DC. LEAVES
Giovana Vechi
July/2015 Supervisor: Valdir Cechinel Filho Area of Concentration: Natural Products and Synthetic Bioactive Substances Number of pages: 80 The use of medicinal plants to treat diseases is as old as humanity. The discovery of new compounds from these plants is a promising alternative in the search of new medicine drugs. The genus Eugenia has shown relevant therapeutic results, but the potential of E. involucrata is still unknown. This study investigates the chemical composition of E. involucrata leaves and evaluates its antimicrobial, gastroprotective and antinociceptive potential. The leaves were collected at three separate times: in January, July and December 2014. In each case, the leaves were first macerated in methanol, resulting in Crude Methanol Extracts (EMB), denominated EMB-Jan, EMB-Jul and EMB-Dez. The extracts were partitioned to give Chloroform (FCL) and Ethyl Acetate (FAE) Fractions. Phytochemical analysis was performed by conventional chromatographic techniques, and the isolated substances were analyzed by the usual spectroscopic techniques. This analysis allowed the isolation of (-)- catechin (main substance), and two other substances from FAE-Jan. FCL-Jan allowed the isolation of three other substances: phytol, compounds 7-9 and 3-6, two novel substances denominated 24,25-epoxy-28-hydroxycicloartan-3-ona and 24,25-epoxy-28-hydroxycicloartan-3-ona acetyl respectively. The comparison between winter and summer EMB by HPLC showed some significant differences, and higher amounts of catechin in the winter. The extract and fractions collected in January were evaluated for their antimicrobial activity against strains of B. subtilis, S. aureus, S. saprophyticus, E. coli and C. albicans by determining the Minimum Inhibitory Concentration using the broth microdilution technique. EMB-Jul was evaluated for its gastroprotective activity by the ethanol-induced ulcer model. The same extract, and also FCL-Jul, FAE-Jul and an isolated substance, were evaluated for their antinociceptive activity using the model of writhing induced by acetic acid. The antimicrobial analysis of EMB showed an MIC of 125 µg/ml for S. aureus and C. albicans and 500 µg/ml for E. coli. FAE did not showed any activity, and FCL showed an MIC of 500 µg/ml for Gram-positive bacteria and was inactive for the others. In the gastroprotective evaluation, the extract significantly reduced the total damaged area and the area of injury, compared to the treatments with doses of 125 and 250 mg/kg. In the evaluation of antinociceptive activity both extract and fractions reduced nociception (26.5 to 64.4% at 10 mg/kg), but the FCL-Jul was the most effective, with DI50 of 2.33 mg/kg. The novel compound 7-9 was also tested, and decreased the number of writhes by 50% at a dose of 1 mg/kg. The results showed that E. involucrata is a promising species with therapeutic potential, particularly against pain process, although, other models of pain should be further used to confirm such potential.
Keywords: Eugenia involucrata; catechin; new triterpenes; antimicrobial effect; gastroprotection; antinociceptive activity.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Exemplos de estruturas químicas encontradas no gênero Eugenia.....
22
Figura 2 Ocorrência natural da espécie Eugenia involucrata no Brasil..............
23
Figura 3 Árvore da Eugenia involucrata..............................................................
24
Figura 4 Folhas e flor da Eugenia involucrata..................................................... 25
Figura 5 Frutos da Eugenia involucrata..............................................................
25
Figura 6 Figura 7
Processo de obtenção do extrato e das frações das folhas de Eugenia involucrata da coleta de janeiro de 2014................................ Processo de obtenção de substâncias isoladas a partir da FCL-jan das folhas de Eugenia involucrata da coleta de janeiro de 2014......................................................................................................
34 35
Figura 8 Processo de obtenção de substâncias isoladas a partir da FAE-jan das folhas de Eugenia involucrata da coleta de janeiro de 2014......................................................................................................
36
Figura 9 CCD comparativa das frações clorofórmio e acetato de etila nas três diferentes coletas, janeiro, julho e dezembro, respectivamente...........
42
Figura 10 Estrutura química da (-)-catequina (substância 11-14).........................
43
Figura 11 Figura 12
Espectro de RMN 1H da substância 11-14, isolada da fração acetato de etila das folhas de Eugenia involucrata........................................... Espectro de RMN 1H aproximado da substância 11-14, isolada da fração acetato de etila das folhas de Eugenia involucrata....................
44 44
Figura 13 Figura 14
Espectro de RMN 13C da substância 11-14, isolada da fração acetato de etila das folhas de Eugenia involucrata........................................... Estrutura química numerada da (-)-catequina......................................
45 45
Figura 15 Estrutura química do fitol (substância 13).............................................
46
Figura 16 Espectro de massas da substância 13, obtido por CG/EM..................
47
Figura 17 Espectro de infravermelho da substância 7-9, isolada da fração clorofórmio das folhas de Eugenia involucrata.....................................
48
Figura 18 Espectro de RMN 1H da substância 7-9, isolada da fração clorofórmio das folhas de Eugenia involucrata.....................................
49
Figura 19 Figura 20
Espectro ampliado de RMN 13C da substância 7-9, isolada da fração clorofórmio das folhas de Eugenia involucrata..................................... Espectro de RMN 13C (A) e modo DEPT (B) da substância 7-9, isolada da fração clorofórmio das folhas de Eugenia involucrata.........
50 51
Figura 21 Estrutura do composto 4 (3-ceto-28-hidroxicicloartano) isolado da Amoora cucullata..................................................................................
52
Figura 22 Estrutura do composto 4 isolado do própolis........................................ 52
Figura 23 Estruturas químicas dos compostos 1, 3a e 3b isolados da Borrichia frutescens.............................................................................................
53
Figura 24 Estrutura química da substância 24,25-epoxi-28-hidroxicycloartan-3-ona, isolado da fração clorofórmio das folhas de Eugenia involucrata.
54
Figura 25 Análise por CLAE do EMB-jan das folhas de Eugenia involucrata a 280 nm...............................................................................................
55
Figura 26 Análise por CLAE do EMB-jul das folhas de Eugenia involucrata a 280 nm..................................................................................................
56
Figura 27 Análise por CLAE da sobreposição do EMB-jan, EMB-jul e (-)-catequina das folhas de Eugenia involucrata a 280nm....................
56
Figura 28 Percentual de inibição de contorções abdominais do EBM-jul, FCL-
jul e FAE-jul das folhas de Eugenia involucrata, na dose de 10 mg/kg, via i.p. pelo modelo de dor induzida pelo ácido acético em camundongos (n = 6)............................................................................
60
Figura 29 Percentual de inibição de contorções abdominais da Fração Clorofórmio (FCL-jul) das folhas de Eugenia involucrata, nas doses de 1, 3 e 10 mg/kg, via i.p. pelo modelo de dor induzida pelo ácido acético em camundongos (n = 6)..........................................................
61
Figura 30 Percentual de inibição de contorções abdominais da substância 7-9, isolado da Fração Clorofórmio das folhas de Eugenia involucrata, nas doses de 1 e 3mg/kg, via i.p. pelo modelo de dor induzida pelo ácido acético em camundongos (n = 6)................................................
62
Figura 31 Imagens dos estômagos após a indução de úlcera por etanol.............
65
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Eluição utilizada na análise por CLAE do EMB-jan e o EMB-jul........... 38
Tabela 2 Tabela 3
Dados de RMN de 1H e 13C da (-)-catequina em comparação com dados da literatura*............................................................................... Análise da atividade antimicrobiana do EMB-jan, FAE-jan e FCL-jan das Folhas de Eugenia involucatra.......................................................
46
57
Tabela 4 Efeito da administração oral de cimetidina (100 mg/kg) e das diferentes doses do EMB-jul da Eugenia involucrata (50, 125 e 250 mg/kg) em úlcera gástrica aguda induzida por etanol em camundongos (n = 6)............................................................................
65
LISTA DE ABREVIATURAS
AE – acetato de etila
AINE – anti-inflamatório não-esteroidal
ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária
CC – coluna cromatográfica
CCD – cromatografia em camada delgada
CIM – concentração Inibitória Mínima
CGMS – cromatografia Gasosa acoplada à Espectro de Massas
CLAE – cromatografia líquida de alta eficiência
EARP – software de análise de imagens
EMB – extrato metanólico bruto
i.p. – via intraperitonial
IV – infravermelho
NIQFAR – Núcleo de Investigações Químico-Farmacêuticas
OMS – Organização Mundial da Saúde
PPGCF – Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
RMN-¹H – ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio
RMN-¹³C – ressonância Magnética Nuclear de Carbono
v.o. – via oral
UV – ultravioleta
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 14
2 OBJETIVOS ........................................................................................................... 16
2.1 Objetivo Geral .......................................................................................... 16
2.2 Objetivos Específicos ............................................................................. 16
3 REVISÃO DA LITERATURA ................................................................................. 17
3.1 A família Myrtaceae ................................................................................. 20
3.2 O gênero Eugenia .................................................................................... 21
3.3 A espécie Eugenia involucrata DC ........................................................ 23
3.4 Potencial farmacológico de produtos naturais .................................... 26
3.4.1 Aspectos relacionados ao potencial antimicrobiano .................................. 26
3.4.2 Aspectos relacionados aos processos dolorosos ...................................... 28
3.4.3 Aspectos relacionados à gastroproteção .................................................... 30
4 MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................... 33
4.1 Material Vegetal ....................................................................................... 33
4.2 Análise Fitoquímica ................................................................................. 33
4.2.1 Obtenção de extratos e frações e isolamento de substâncias .................. 33
4.2.3 Elucidação estrutural ..................................................................................... 37
4.2.4 Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) .......................................... 38
4.3 Análise Farmacológica/Biológica .......................................................... 39
4.3.1 Avaliação da Atividade Antimicrobiana ....................................................... 39
4.3.2 Avaliação da Atividade Antinociceptiva ....................................................... 40
4.3.3 Avaliação da Atividade Gastroprotetora ...................................................... 40
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................. 42
5.1 Análise Fitoquímica ................................................................................. 42
5.1.1 Isolamento e identificação dos princípios ativos ........................................ 42
5.1.2 Cromatografia Líquida Alta Eficiência .......................................................... 55
5.2 Análise Farmacológica/Biológica .......................................................... 57
5.2.1 Atividade Antimicrobiana .............................................................................. 57
5.2.2 Atividade Antinociceptiva .............................................................................. 60
5.2.3 Atividade Gastroprotetora ............................................................................. 64
6 CONCLUSÕES ...................................................................................................... 69
REFERÊNCIAS…………………………………………………………………………….70
14
1 INTRODUÇÃO
O uso de plantas para tratamento de doenças é tão antigo quanto a
humanidade. Durante muito tempo ele foi o único recurso disponível para tratar
enfermidades (ALVES, 2013). Atualmente, a química medicinal moderna vem
utilizando novas tecnologias que permitem a comprovação científica da utilização e
eficácia do uso de diversas plantas medicinais, seus derivados e substâncias
isoladas, no tratamento de muitas patologias (CECHINEL FILHO; YUNES, 2012).
O Brasil é um dos países mais megabiodiversos do mundo, com seis biomas
terrestres bem distintos, o que favorece a busca por novas plantas com potencial
terapêutico. Além disso, o país tem tradição na linha de pesquisa em fitoquímica, e
vem despontando mundialmente nessa área. Estas características favorecem a
parceria com indústrias farmacêuticas para o desenvolvimento de novos
medicamentos fitoterápicos (BOLZANI; FLAUSINO JUNIOR; VALLI, 2012).
Apesar dos avanços contínuos da ciência, ainda existe muito trabalho a ser
realizado com plantas medicinais. Muitas espécies ainda são utilizadas
empiricamente, sem respaldo científico quanto à sua eficácia e segurança. O alto
custo para a pesquisa é um fator limitante para os avanços nessa área de estudos
(NEWMAN; CRAGG, 2012).
Atualmente muitas pesquisas interdisciplinares tem sido feitas com o esforço
de encontrar não somente novas substâncias, mas também no intuito de redescobrir
novas aplicações para muitas já utilizados na prática. Dessa forma pode-se tentar
reduzir os custos com pesquisas iniciais (CRAGG; GROTHAUS; NEWMAN, 2014).
Aproximadamente 64% de todos os medicamentos disponíveis no mercado
foram desenvolvidos com o uso, de alguma forma, de produtos naturais. Esse
desenvolvimento pode se dar por meio de substâncias isoladas das próprias plantas
medicinais, mas também por meio de modificações estruturais feitas a partir de sua
estrutura química ou ainda, via síntese de análogos (NEWMAN; CRAGG, 2012).
Medicamentos utilizados para tratar problemas comuns na sociedade
moderna muitas vezes causam efeitos adversos indesejáveis, como, por exemplo, a
resistência microbiana aos antibióticos convencionais (AGUIAR et al., 2012;
GOLDSTEIN et al., 2012), a baixa eficácia e os efeitos adversos causados pelos
medicamentos disponíveis no mercado para tratar a dor (SILVA et al., 2013) e as
15
recidivas, efeitos colaterais e interações medicamentosas causadas pelos fármacos
usados no tratamento da úlcera (LAKSHMI et al., 2010). Por todas essas
adversidades, a busca por novos medicamentos baseada em plantas medicinais se
faz pertinente.
Muitos estudos vem sendo realizados para avaliar o potencial biológico de
drogas vegetais utilizadas na medicina popular, através de diferentes modelos
farmacológicos. Alguns desses trabalhos já obtiveram resultados expressivos na
busca por substâncias ou drogas vegetais provenientes de plantas com poder
antimicrobiano, antinociceptivo e gastroprotetor (BAHMANI et al., 2014; CHAVASCO
et al., 2014; SRINIVAS et al., 2013).
A Família Myrtaceae é conhecida por abrigar grande variedade de plantas
medicinais, bem como o gênero Eugenia, que conta com espécies de alto potencial
farmacológico. Algumas espécies já estudadas são: Eugenia uniflora, Eugenia
dysenterica, Eugenia pyriformis, Eugenia jambolana, Eugenia punicifolia, Eugenia
fruticosa e Eugenia umbeliflora (BAG et al., 2012; BASTING et al, 2014;
CHATUVERDI et al., 2007; MAGINA et al., 2010; SHAMS-UD-DOHA et al, 2012).
Os metabólitos secundários apresentados por estas plantas incluem:
terpenos, flavonoides e taninos. O uso medicinal e popular dessas espécies é
extenso e por essa razão, tem-se estudado o seu potencial biológico em diversos
modelos farmacológicos como atividade antioxidante, diurética, antimicrobiana,
gastroprotetora, antiproliferativa, antinociceptiva, anti-inflamatória, anti-hipertensiva,
antidiarreica, antidepressiva e hipoglicemiante (BAG et al., 2012, CHATUVERDI et
al., 2007; COLLA et al., 2012; MAGINA et al., 2010; SANTOS et al., 2011).
A planta Eugenia involucrata DC., conhecida popularmente como cerejinha do
mato, araçazeiro ou cereja-do-rio-grande, é ainda pouco estudada, porém muito
utilizada popularmente no tratamento de diarreia, má-digestão, infecções e
hemorragia (LORENZI, 2002; SAUSEN et al., 2009). Visando contribuir para a
caracterização química e biológica da espécie em estudo, este trabalho pretende
avaliar a composição química das folhas, comparar os extratos do verão e inverno e
testar em modelos biológicos experimentais a atividade antimicrobiana,
antinociceptiva e gastroprotetora dos extratos, frações e substâncias isoladas,
quando possível.
16
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Avaliar a composição química e o potencial biológico das folhas de Eugenia
involucrata DC.
2.2 Objetivos Específicos
1. Preparar extratos e frações das folhas de E. involucrata em diferentes
épocas do ano e testar em distintos modelos biológicos.
2. Selecionar as frações mais ativas para isolamento via métodos de
cromatografia convencionais;
3. Identificar os princípios ativos obtidos por técnicas espectrométricas;
4. Avaliar o perfil cromatográfico dos extratos de verão e inverno por
cromatografia em camada delgada (CCD) e cromatografia líquida de alta eficiência
(CLAE);
5. Avaliar a atividade antimicrobiana dos extratos e frações pelo método de
diluição em ágar (CIM);
6. Avaliar o potencial gastroprotetor pelo modelo de úlcera induzida por etanol
em camundongos;
7. Avaliar a atividade antinociceptiva do extrato, frações e substância isolada
pelo modelo de dor induzido pelo ácido acético em camundongos.
17
3 REVISÃO DA LITERATURA
As plantas medicinais vêm sendo utilizadas como terapia desde muito tempo
em todas as partes do mundo e relatos dessa utilização foram descritos por diversas
civilizações antigas como: China, Índia, Egito e Grécia (ALVES, 2013).
Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), no final da década de 80
cerca de 65% da população mundial utilizava plantas medicinais ou medicamentos
derivados de plantas como fonte primária de atenção básica à saúde (CRAGG;
NEWMANN, 2013). No Brasil, os números se assemelham, já que 66% da
população não tem acesso à medicamentos convencionais, e recorrem à medicina
tradicional para tratamento de suas enfermidades. O fácil acesso, o baixo custo e a
empatia por este tipo de tratamento, são os principais fatores que justificam esta
prática (MAZZARI; PRIETO, 2014).
O uso plantas medicinais é relatado no Brasil desde a época dos índios. Mais
tarde também foram inseridos conhecimentos dos negros e europeus
(principalmente portugueses) na medicina popular brasileira. Naquela época, nas
áreas rurais do país, o uso da fitoterapia era imprescindível, já que os médicos se
limitavam às áreas urbanas. O conhecimento tradicional dessas culturas fornece
importantes informações para o início de pesquisas com plantas medicinais (ALVES,
2013; FIRENZUOLI; GORI; NERI, 2005; NEWMANN; CRAGG, 2012).
As plantas têm sido importantes fontes de componentes ativos para a
fabricação de novos medicamentos, e as pesquisas envolvendo fitofármacos podem
contribuir muito para o desenvolvimento tecnológico nacional. O Brasil ainda possui
muitos biomas inexplorados, com plantas de grande interesse farmacológico para
serem estudadas (BARREIRO, 2009).
O apelo pelo uso de produtos naturais vem crescendo com a ajuda da ciência,
que tem comprovado a eficácia do uso tradicional de muitas plantas e estruturado
sua utilização de forma segura e eficaz. A indústria, percebendo essa demanda, vem
inserindo no mercado novos produtos de origem vegetal a cada ano que passa
(BOORHEM; LAGE, 2009; CRAGG; NEWMANN, 2014).
Em 2011, o mercado mundial de medicamentos fitoterápicos movimentou
cerca de 26 bilhões de dólares, sendo que o maior mercado desses produtos
encontra-se na Europa (50% somente na Alemanha). Fato interessante é que a
América Latina, com sete países considerados megabiodiversos (Brasil, Colômbia,
18
Costa Rica, Equador, México, Panamá e Peru) representam apenas 5% desse
mercado. Neste mesmo período o mercado brasileiro de fitoterápicos movimentou
cerca de R$ 1,1 bilhão, comercializando 43 milhões de unidades desse tipo de
medicamento, um aumento representativo de 13% em relação ao ano de 2010
(ALVES, 2013).
A Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) (BRASIL, 2014) define
que medicamentos fitoterápicos são aqueles obtidos com matérias-primas
exclusivamente vegetais, provenientes de plantas medicinais e fabricados com
emprego exclusivo da planta, da droga vegetal ou de derivados de droga vegetal
como por exemplo: extrato, tintura, óleo, cera, exsudato, suco, e outros.
No ano de 2014 uma nova Resolução (RDC Nº 26, de 13 de maio de 2014)
sobre fitoterápicos foi publicada pela ANVISA e definiu dois tipos de medicamentos
fitoterápicos: O “medicamento fitoterápico”, cuja segurança e eficácia sejam
baseadas em evidências clínicas e que sejam caracterizados pela constância de sua
qualidade e o “medicamento tradicional fitoterápico”, que se caracteriza por ser
também seguro e efetivo, mas baseando-se em dados publicados na literatura
técnico-científica e que sejam concebidos para serem utilizados sem a vigilância de
um médico para fins de diagnóstico, de prescrição ou de monitorização. Estes
últimos não devem então, ser utilizados para tratamento de doenças graves
(BRASIL, 2014).
A ANVISA não considera medicamento fitoterápico ou produto tradicional
fitoterápico aquele que inclua na sua composição substâncias ativas isoladas ou
altamente purificadas, sejam elas sintéticas, semissintéticas ou naturais e nem as
associações dessas com outros extratos, sejam eles vegetais ou de outras fontes,
como a animal (BRASIL, 2014).
Além disso, as plantas medicinais e suas partes após processos de coleta,
estabilização e secagem, podendo ser íntegra, rasurada, triturada ou pulverizada,
passaram a ser denominadas chás medicinais pela nova Resolução. Elas podem ser
utilizadas por meio de infusão, decocção e maceração em água pelo consumidor
(BRASIL, 2014).
A qualidade das matérias-primas ativas vegetais deve ser controlada em
todas as etapas do processo, desde o produto até a sua comercialização. Sua
eficácia e segurança devem ser validadas por meio de levantamentos
19
etnofarmacológicos, documentações tecnocientíficas ou evidências clínicas
(BRASIL, 2014).
No ano de 2006 foi criada no Brasil a Política Nacional de Plantas Medicinais
e Fitoterápicos, que estava associada à Política Nacional de Práticas Integrativas e
Complementares do Sistema único de Saúde (SUS). A partir dessas políticas foram
criados programas para ampliar as opções terapêuticas ofertadas aos usuários,
garantindo o acesso à plantas medicinais e serviços relacionados à fitoterapia, com
segurança, eficácia e qualidade. Depois de quase 10 anos de existência observa-se
que, apesar de o governo federal ter desenvolvido diversas ações, a implementação
da política pouco avançou em função das dificuldades para seu uso no SUS, como o
pouco conhecimento que os profissionais de saúde têm sobre a fitoterapia, o
entendimento deturpado sobre a eficácia e a segurança deste tratamento por parte
de usuários e profissionais de saúde, a dificuldade do acesso à planta medicinal e
ao fitoterápico, além da estruturação dos serviços nos moldes que favorecem o uso
do medicamento sintético (FIGUEIREDO; GURGEL; GURGEL JR., 2014).
O Brasil, dotado de toda sua rica biodiversidade, é uma grande fonte de
plantas medicinais. Os esforços empregados na pesquisa básica de análise
fitoquimica e farmacológica podem ajudar na descoberta de novos medicamentos
fitoterápicos, capazes de tratar diferentes patologias de forma mais eficaz e sem
efeitos adversos. Portanto, o estudo da flora brasileira, especialmente a nativa, é
relevante e está alinhado à Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos
(FIGUEIREDO; GURGEL; GURGEL JR., 2014).
A pesquisa inicial para avaliação de plantas medicinais começa com uma
análise fitoquímica, que tem por objetivo conhecer os constituintes químicos de
espécies vegetais ou avaliar a presença de algum componente específico. O
segundo passo é a pesquisa farmacológica, que objetiva testar os extratos, frações
e substâncias puras provenientes da análise fitoquímica em diferentes modelos
experimentais, com a utilização de animais ou testes in vitro (MALHEIROS et al.,
2010).
Estudos interdisciplinares são de grande relevância para a área de produtos
naturais, que vem crescendo e se fortalecendo a cada dia, com o surgimento de
novas ferramentas e métodos analíticos, além do desenvolvimento da biologia
molecular. Todas essas mudanças vem agregando valor e gerando grandes
oportunidades para o estudo dos produtos naturais (OLIVEIRA; PUPO; VIEIRA,
20
2013). Da interação multidisciplinar entre diferentes áreas como a botânica,
fitoquímica, síntese, farmacologia, microbiologia, tecnologia farmacêutica, entre
outras, podem surgir possibilidades para o desenvolvimento de novos medicamentos
ou a validação de uso popular de alguma droga vegetal (MALHEIROS et al., 2010).
Quando se trata de plantas é imprescindível levar em conta as variações
temporais e espaciais do conteúdo total de metabólitos secundários produzidos por
elas nas diferentes horas do dia, épocas do ano ou níveis de maturação. As plantas
continuam sendo as mesmas geneticamente mas a expressão gênica pode sofrer
modificações resultantes da interação de processos bioquímicos, fisiológicos,
ecológicos e evolutivos. São relatadas variações sazonais no conteúdo de
praticamente todas as classes de metabólitos secundários (GOBBO-NETO; LOPES,
2007).
Diante das informações expostas, a família Myrtaceae é considerada uma
grande fonte de plantas medicinais, abrigando espécies que já obtiveram
importantes descobertas na área da fitoquimica e farmacologia. Essas
características justificam o interesse de pesquisadores em trabalhar com espécies
desta família, sendo ela, eleita para ser avaliada na presente pesquisa.
3.1 A família Myrtaceae
A família Myrtaceae é considerada uma das mais importantes da
biodiversidade brasileira. Ela compreende cerca de 100 gêneros e 3.500 espécies de
árvores e arbustos que se distribuem por todos os continentes, com predominância
nas regiões tropicais e subtropicais. No Brasil ela é encontrada predominantemente
no sul e se constitui de um grande número de plantas, desde matas rasteiras a
grandes árvores (GRESSLER; PIZO; MORELLATO, 2006).
A classificação proposta por Wilson et al. (2005) reconhece duas subfamílias
(Myrtoideae e Psiloxyloideae) e 17 tribos. Todas as espécies brasileiras são da Tribo
Myrteae. Destacam-se os gêneros Eugenia, Myrcia e Calyptranthes (com mais de
100 espécies) enquanto outros gêneros possuem menos de 60 espécies brasileiras.
As mirtáceas brasileiras geralmente não produzem madeiras valiosas, mas
abrigam numerosas espécies medicinais e frutíferas, algumas exploradas
comercialmente, como a Psidium guajava L (goiabeira), a Myrciaria cauliflora Berg
(jabuticabeira) e a Eugenia uniflora L. (pitangueira). Essas espécies representam
21
apenas uma pequena fração do grande potencial econômico da família, tendo em
vista o grande número de frutos comestíveis produzidos por espécies não comerciais
(GRESSLER; PIZO; MORELLATO, 2006).
3.2 O gênero Eugenia
O gênero Eugenia é um dos mais importantes da sua família, possuindo 350
espécies nativas no Brasil, muito utilizadas na medicina tradicional para tratar
inúmeras enfermidades. O seu potencial biológico vem sendo muito estudado e as
pesquisas têm mostrado um grande número de resultados positivos (MAGINA et al.,
2009).
A espécie Eugenia uniflora, conhecida popularmente como pitangueira, é a
planta mais estudada, e tem aplicação diurética, antifúngica, antimicrobiana,
antidiabética, antirreumática e gastroprotetora (ALMEIDA; FARIA; SILVA, 2012;
SANTOS et al., 2011). A Eugenia dysenterica, conhecida como cagaita, é muito
utilizada no tratamento de diarreia (DUARTE et al., 2010), e a Eugenia pyriformis,
popular uvaia, tem propriedades antimicrobianas (CHAVASCO et al., 2014;
STIEVEN; MOREIRA; SILVA, 2009). Eugenia jambolana, nome científico do jamelão
ou joão-bolão, é uma planta com potencial gastroprotetor, antidiabético e
antimicrobiano (CHATUVERDI et al., 2007; BAG et al., 2012), já a Eugenia
brasiliensis, grumixama como é chamada tradicionalmente, é utilizada como agente
antimicrobiano e também no tratamento de diarreia e reumatismo (COLLA et al.,
2012; MAGINA et al., 2009; MAGINA et al., 2010). A Eugenia umbeliflora (baguaçu)
também é utilizada e reconhecida como agente antimicrobiano e gastroprotetor em
estudos experimentais (MACHADO, 2005; MAGINA et al., 2009; MEYRE-SILVA et
al., 2009).
As espécies desse gênero são ricas em flavonoides, com grande capacidade
antioxidante e em sua maioria apresentam grandes quantidades de catequinas,
sendo que triterpenos e taninos também fazem parte de composição química
(MAGINA et al., 2010; NEERGHEEN et al., 2006). Além disso, são ricas em óleos
essenciais (compostos principalmente por monoterpenos e sesquiterpenos)
(CARVALHO JUNIOR et al., 2014; COLE; HABER; SETZER, 2007; ROMAGNOLO;
SOUSA, 2006).
22
Os triterpenos do tipo pentacíclicos, são os mais encontrados na literatura
para este gênero, em especial os com esqueleto do tipo lupano e oleanano, como a
betulina, ácido 29-hidroxi-oleanólico, α-amirina, β-amirina, isolados das folhas de E.
brasiliensis (MAGINA et al, 2012).
Alguns outros exemplos encontrados são: o ácido barbinérvico, isolado das
folhas da E. punicifolia (LEITE et al., 2014), o taraxerol, α-amirina, β-amirina,
betunlina e ácido betulínico, isolados das folhas da E. umbelliflora (MEYRE-SILVA et
al., 2009) e os ácidos triterpênicos isolados da E. moraviana, o ácido betulínico, 6α-
hidroxibetulínico e o ácido platânico (LUNARDI et al., 2001), entre outros.
Figura 1 – Exemplos de estruturas químicas encontradas no gênero Eugenia.
Legenda: 1 = Alfa-amirina; 2 = Beta-amirina; 3 = betulina; 4 = Ácido betulínico
23
3.3 A espécie Eugenia involucrata DC
O nome genérico Eugenia é dedicado a Francisco Eugenio de Saboya –
Carignan, chamado Príncipe de Saboya, generalíssimo imperial de notável talento
militar e protetor das artes. O epíteto específico involucrata é devido à coroa de
sépalas e restos de bractéolas na base do fruto, que parecem ser seu invólucro
(CARVALHO, 2008).
É uma espécie nativa, originária do Sul do Brasil e de grande importância
econômica, sendo amplamente encontrada nessa região e ainda em alguns locais
da região sudeste, como demonstra a Figura 2 (LATTUADA; SOUZA; GONZATTO,
2010).
Figura 2 - Ocorrência natural da espécie Eugenia involucrata no Brasil.
Fonte: (CARVALHO, 2008).
Esta espécie está inserida no gênero Eugenia, família Myrtaceae, ordem
Myrtales Juss, superordem Rosanae Takht, subclasse Magnoliidae Novák e classe
Equisetopsida C. Agardh, possuindo alguns sinonímios como: Phyllocalyx
involucratus (DC.) O. Berg, Phyllocalyx laevigatus O. Berg, Stenocalyx involucratus
24
(DC.) Kausel, Eugenia paraguayensis Barb. Rodr. e Eugenia aemilii Barb. Rodr.
(ANGELY, 1970).
A E. involucrata é conhecida popularmente por vários nomes como cerejeira-
do-mato e pitanga-preta (MG); cereja e cerejeira (PR); cereja, cereja-do-mato,
cereja-do-rio-grande, cerejeira, cerejeira-da-terra, cerejeira-do-mato e cerejeira-do-
rio-grande (RS); araçazeiro, cereja, cerejeira e cerejeira-do-mato (SC); e araçazeiro,
cereja, cereja-do-rio-grande e cerejeira-do-rio-grande (SP) (CARVALHO, 2008;
LORENZI, 2002).
Segundo Carvalho (2008), a E. involucrata é uma espécie arbustiva a
arbórea, de comportamento sempre-verde ou perenifólio de mudança foliar. As
árvores maiores atingem dimensões próximas a 15 m de altura e possuem uma copa
estreita e alongada. A casca externa é lisa, de coloração acinzentada-clara (FIGURA
3). Suas folhas tem coloração verde-escuras e as flores são hermafroditas, brancas
e vistosas, e desabrocham normalmente na primavera (FIGURA 4).
Figura 3- Árvore da Eugenia involucrata.
Fonte: o autor
25
Figura 4- Folhas e inflorescências da Eugenia involucrata.
Fonte: o autor
Os frutos desta planta são bagas piriformes, lisas, glabras, de coloração verde
quando imaturo, tornando-se vermelho e cor-de-vinho tinto quando maduro, medindo
de 1,3 cm a 2,3 cm de comprimento. Eles são próprios para consumo humano e
muito saborosos. De coloração esverdeada, a polpa desses frutos é suculenta e
agridoce. Os frutos pesam em média 5 g, sendo que no seu interior são encontradas
sementes de coloração cinéreo-amarelada com formato irregular (FIGURA 5)
(CARVALHO, 2008).
Figura 5- Frutos da Eugenia involucrata.
Fonte: o autor
26
Tradicionalmente suas folhas são empregadas em forma de chás no
tratamento da diarreia, má digestão, hemorragia e infecções. Os frutos são
consumidos in natura, na forma de doces, geleias e licores (LORENZI, 2002;
SAUSEN et al., 2009).
Uma recente pesquisa desenvolvida por Rosa (2013) demonstrou resultados
promissores com os extratos das sementes da E. involucrata em modelos
farmacológicos de atividade gastroprotetora e antiúlcera.
Outro estudo realizado com diferentes espécies de Eugenia, incluindo a E.
involucrata, revelou seu importante potencial antioxidante por diferentes métodos.
Além disso, foram identificados (mas não isolados) por meio de cromatografia líquida
de alta eficiência e espectrometria de massas (CLAE/EM), compostos fenólicos
importantes que podem estar relacionados à essa característica como a
(-)epicatequina e a (-)-catequina, substâncias majoritárias no extrato das folhas
(INFANTE, 2013).
Dametto (2014) observou alto teor de antocianidinas nos frutos da E.
involucrata e da E. brasiliensis, além de identificar 10 substâncias em infusões das
folhas dessas mesmas espécies por CLAE/EM: ácido gálico, ácido cafeico, ácido
quínico, [epi]catequina, [epi]galocatequina, ácido cafeoil-O-glicosídeo, quercetina-3-
O-ramnosídeo, [epi]afzelequina-[epi]catequina, [epi]galocatequina-[epi]catequina e
[epi]galocatequina-[epi]galocatequina.
3.4 Potencial farmacológico de produtos naturais
3.4.1 Aspectos relacionados ao potencial antimicrobiano
Atualmente pode-se perceber um aumento exacerbado no número de casos
de doenças infecciosas. Esse problema está diretamente ligado às mudanças que
permeiam a sociedade moderna e pode em alguns casos levar o indivíduo à morte.
Entre essas mudanças podemos citar as imigrações, alterações do ambiente,
aumento da população, sedentarismo e má-alimentação, além de um consumo
indiscriminado de agentes antimicrobianos. Todos esses fatores associados às
limitações dos medicamentos antibióticos disponíveis são relacionados ao aumento
da resistência antimicrobiana (GOLDSTEIN et al., 2012; AGUIAR et al., 2012)
As bactérias vem desenvolvendo mecanismos de resistência aos
medicamentos disponíveis no mercado, gerando um grave problema de saúde
27
pública no Brasil. Um problema tão importante que mobilizou a ANVISA à publicar
uma Resolução (RDC 20/2011) com o objetivo de racionalizar o consumo de
antimicrobianos, que passaram a ser vendidos somente sob prescrição médica
(BRASIL, 2011).
O fenômeno da resistência bacteriana é complexo e tem causas variadas,
pois, ao longo dos anos, as bactérias desenvolveram mecanismos capazes de
diminuir ou mesmo inativar a ação dos fármacos. As cepas podem adquirir
resistência por meio de mutações genéticas, produção de enzimas, alteração dos
sítios receptores impedindo a absorção do fármaco ou, ainda, podem sintetizar
proteínas que inibem a ação dos antibióticos. Na maioria das vezes, esta resistência
ocorre quando o tratamento não é seguido de forma adequada como, por exemplo,
no uso de subdoses, duração prolongada ou insuficiente dos medicamentos
(TANWAR et al., 2014).
Outro fator importante são as resistências microbianas indiretas, transmitidas
principalmente por alimentos de origem animal. O uso indiscriminado de antibióticos
para tratar doenças infecciosas de vacas leiteiras, bois, peixes, frangos e outros que
são abatidos para o consumo humano também produz bactérias resistentes e seus
genes podem ser transmitidos para o homem por contato direto com os animais ou
suas fezes ou na forma de alimento. Além disso, as fezes animais podem
contaminar a água dos rios e também transmitir genes resistentes (GASTALHO;
SILVA; RAMOS, 2014)
Entre os principais agentes etiológicos das infecções, encontra-se o
Staphylococcus aureus, uma bactéria que é encontrada normalmente no corpo
humano mas que pode desencadear infecções quando o hospedeiro encontra-se
fragilizado (BASSETTI; RIGHI, 2013).
A pneumonia causada por S. aureus é responsável por aproximadamente
18% das infecções hospitalares no Brasil e é a primeira em morbidade e
mortalidade, com taxas de mortalidade de 60%. Em UTIs, a taxa de mortalidade de
pacientes com pneumonia é de aproximadamente 50% (MARTINELLI et al., 2010).
Uma recente revisão estima que a maioria dos medicamentos utilizados no
controle de infecções é proveniente de insumos naturais. As plantas já fazem parte
dessa evolução e ainda representam uma estratégia atual de obtenção de novos
compostos que possam ter ação antimicrobiana (NEWMAN; CRAGG, 2012).
28
Muitas plantas vem sendo estudadas nesse sentido, e compostos como
cumarinas, flavonoides, taninos, alcaloides e terpenóides tem sido considerados
substâncias chaves para resultados positivos na atividade antimicrobiana. Há de se
levar em conta que a medicina tradicional deve ser bem acompanhada, pois existe
sinergismo e interações entre plantas e medicamentos tradicionais (SILVA;
FERNANDES JÚNIOR, 2010).
O gênero Eugenia vem apresentando resultados interessantes em diversos
estudos sobre a atividade antimicrobiana. Alguns autores atribuem os bons
resultados encontrados à presença de compostos mais polares como os flavonoides,
outros por sua vez acreditam nos compostos mais apolares como os terpenos.
Algumas espécies que apresentaram resultados expressivos de atividade
antimicrobiana foram a Eugenia pyriformis (CHAVASCO et al., 2014; STIEVEN;
MOREIRA; SILVA, 2009), Eugenia jambolana (BAG et al., 2012), Eugenia
umbelliflora (MACHADO, 2005; GILIOLI, 2010), Eugenia dysenterica (SILVA, 2013) e
Eugenia brejoensis (AZEVEDO et al., 2012).
3.4.2 Aspectos relacionados aos processos dolorosos
A dor, apesar de representar uma sensação desagradável, é um processo
fisiológico muito importante para o ser humano, porque ela permite que o indivíduo
tenha consciência de que sua integridade está sendo ameaçada ou que ocorre
alguma disfunção em seu organismo. A IASP (International Association for the Study
of Pain) descreve a dor como uma “experiência sensorial e emocional desagradável
que está associada com lesões reais ou potenciais”. Muitas vezes a dor representa o
único sintoma para o diagnóstico de várias doenças (NETO; COSTA; SIQUEIRA,
2009).
A dor é caracterizada por experiências sensoriais e emocionais, podendo ser
crônica (quando perdura por um longo tempo) ou aguda (quando finda em um curto
espaço de tempo). O conjunto das percepções de dor que somos capazes de
distinguir denomina-se nocicepção e pode ser induzida em um receptor de três
formas específicas: a indução de forma mecânica, capaz de excitar um
mecanorreceptor; a do tipo térmica, capaz de excitar um termorreceptor; e também a
indução do tipo química, que afeta quimioceptores. Este estímulo é então transmitido
até o sistema nervoso central e interpretado no córtex cerebral como dor
(KLAUMANN; WOUK; SILLAS, 2008; ROCHA et al., 2007)
29
A Organização Mundial da Saúde (OMS) recomenda que, para o tratamento
da dor, seja seguido um protocolo chamado Escada Analgésica. O primeiro degrau
recomenda o uso de medicamentos analgésicos simples e anti-inflamatórios para
dores fracas. O segundo degrau sugere opioides fracos, que podem ser associados
aos analgésicos simples ou anti-inflamatórios do primeiro degrau, para dores
moderadas. O terceiro degrau consta de opioides fortes, associados ou não aos
analgésicos simples ou anti-inflamatórios, para dores fortes. Os adjuvantes podem
ser usados nos três degraus da escada (WHO, 1996).
O problema do tratamento para a dor é que até os medicamentos do primeiro
degrau causam efeitos adversos indesejáveis aos pacientes com o uso contínuo,
como náuseas, dor de cabeça, vômitos, gastrites e úlceras. Já os opioides podem
levar aos sintomas descritos anteriormente, além de tolerância ao medicamento,
dependência ou crises de abstinência (POLSKI et al., 2014).
Muitas pessoas ao redor do mundo perdem diariamente sua qualidade de
vida por sofrerem de dor, crônica ou aguda. Por todos os efeitos adversos
apresentados pelos analgésicos convencionais, existe uma grande necessidade de
encontrar medicamentos mais eficazes e com menos efeitos colaterais. Nesse
sentido a busca por fármacos provenientes das plantas medicinais se faz justificável
e imprescindível para a saúde pública (BAHMANI et al., 2014).
Ao longo da história o homem tem usado diversas formas de terapia para o
alívio da dor, e muitas vezes acabam recorrendo às plantas medicinais. Um exemplo
é a Papaver somniferum, da qual a morfina foi isolada. A partir dela foi possível
sintetizar outros analgésicos opioides, mas não sem apresentar efeitos colaterais
consideráveis, tais como depressão respiratória, sonolência, diminuição da
motilidade gastrointestinal, náuseas e diversas alterações dos sistemas endócrino e
nervoso autônomo (ALMEIDA; NAVARRO; BARBOSA-FILHO, 2001).
Muitas outras plantas tem acompanhado a humanidade nessa busca pelo
tratamento da dor. Entre elas podemos citar a Cannabis sativa, conhecida
popularmente no Brasil como maconha, e amplamente utilizada para o tratamento da
dor até 1937, quando seu uso foi vetado pelo governo americano e passou-se a
considera-la uma droga em todo o mundo. A capsaicina, substância isolada de
várias espécies de Capsicum, as populares pimentas, também foi uma importante
descoberta comercial para o alivio da dor (CALIXTO et al., 2000).
30
No entanto, talvez nenhuma descoberta tenha sido tão documentada quanto a
da salicina, isolada de espécies de Salix e testada primeiramente no ano de 1763.
Após muitos anos de modificações estruturais e testes, em 1899 Dreser descobriu
que além de analgésico, o ácido acetilsalicílico abaixava a febre, e nomeou essa
nova substância de Aspirina®, amplamente consumida até os dias atuais (CALIXTO
et al., 2000).
Plantas do gênero Eugenia tem apresentado potencial antinociceptivo em
alguns estudos realizados como o de Basting e colaboradores (2014) e Shams-Ud-
Doha e colaboradores (2012), que estudaram as folhas da Eugenia punicifolia
Eugenia fruticosa e encontraram resultados bastante promissores. Os óleos
essenciais Eugenia uniflora (AMORIM, 2009) e Eugenia candolleana (GUIMARÃES,
2009) também apresentaram promissores resultados quanto ao seu potencial
antinociceptivo.
3.4.3 Aspectos relacionados à gastroproteção
A gastrite e a úlcera péptica não tem uma etiologia bem compreendida, a
principal suposição é o desequilíbrio entre os fatores de proteção da mucosa
gástrica (muco, fluxo sanguíneo, mecanismo antioxidante) e os fatores agressores
(ácido clorídrico, espécies reativas de oxigênio) gerando lesões, inflamações e
necroses na área atingida (BRZOZOWSKI, 2003; FLOCH, 2007).
Estas doenças podem estar associadas a diversos fatores internos como a
genética, patologias infecciosas e/ou patologias granulomatosas associadas a
doenças crônicas e a fatores externos como qualidade de vida, estresse, consumo
de álcool, cafeína, drogas e medicamentos como aspirina e anti-inflamatórios não
esteroidais e/ou a infecção pela bactéria Helicobacter pilory (MALFERTHEINER et
al., 2007; SOLL; GRAHAM, 2009).
O etanol é um dos grandes agentes lesivos da mucosa gástrica. Ele promove
distúrbios como, isquemia, aparecimento de radicais livres, degranulação de
mastócitos, inibição da produção de prostaglandinas e diminuição na produção do
muco gástrico (HIRUMA-LIMA et al., 2000).
Entre os mecanismos de defesa do estômago, podemos citar primeiramente a
reconstituição do epitélio a cada 2-4 dias, característica importante para a
integridade da mucosa. A produção de suco gástrico também é uma importante
defesa, pois previne o desenvolvimentos de bactérias (TULASSAY; HERSZENYI,
31
2010). Outro mecanismo indispensável, considerado a primeira linha de defesa da
mucosa, é a barreira de muco e bicarbonato, que tem uma função estrutural de reter
o bicarbonato secretado pelas células epiteliais, aproximando o pH do estômago à
neutralidade (ALQASOUMI et al., 2009).
Também, no epitélio ocorre a secreção de proteínas de choque térmico, com
função de manter a homeostase celular mediante o estresse oxidativo e aumento da
temperatura evitando a desnaturação das proteínas de proteção (TULASSAY;
HERSZENYI, 2010). Uma perfusão adequada de sangue no trato gastrintestinal
também evita danos epiteliais nas camadas mais profundas da mucosa, pois
mantém as células nutridas e com oxigênio, evitando agentes irritantes e
vasoconstritores (WALLACE; MILLER, 2000).
Outro fator relevante na proteção da mucosa são as prostaglandinas, que
atuam como agentes facilitadores da maioria dos outros mecanismos
gastroprotetores: inibe a liberação de ácido gástrico, aumenta o fluxo sanguíneo,
estimula a produção de muco e bicarbonato e acelera o processo de cicatrização
(TULASSAY; HERSZENYI, 2010).
Os sintomas descritos normalmente pelos acometidos desse problema são
dor epigástrica, sintomas dispépticos (plenitude), distensão abdominal, saciedade
precoce, náuseas e dispepsia (PRIMROSE, 2004).
As terapias mais utilizadas para tratamento de úlceras gástricas são os
fármacos inibidores ou neutralizadores da secreção de ácido gástrico: antiácidos que
neutralizam o ácido gástrico (hidróxido de magnésio, bicarbonato de sódio,
trissilicato de magnésio, gel de hidróxido de alumínio); antagonistas de receptores H2
da histamina (cimetidina, ranitidina, famotidina); inibidores da bomba de prótons
(omeprazol, pantoprazol, lansoprazol, esomeprasol, rabeprazol). Além desses
também existe a classe de fármacos que protegem a mucosa (quelato de bismuto,
sucralfato, misoprostol) (HUNT, 2005.; SCARPIGNATO, 2007).
As plantas medicinais apresentam muitos metabólitos secundários capazes
de proteger o estômago e até de tratar lesões já instaladas. Diversas substâncias
das classes dos flavonóides, terpenos, polisacarídeos, alcalóides, e alguns outros
em menor escala, já foram pesquisadas e algumas delas obtiveram comprovação
científica de seu potencial gastroprotetor, sendo levadas à outras fases de estudos
(KLEIN-JÚNIOR et al., 2012).
32
Os medicamentos mais utilizados para o tratamento da úlcera apresentam
recidivas, efeitos colaterais e interações medicamentosas. Por essa razão, justifica-
se a busca de substâncias novas provenientes de plantas medicinais, que pssam
oferecer opções de tratamento melhores e com menos adversidades (KLEIN-
JÚNIOR et al., 2012; LAKSHMI et al., 2010).
A grande quantidade de flavonoides, considerados potentes antioxidantes,
presentes nas plantas do gênero Eugenia é um dos principais motivadores da
pesquisa gastroprotetora e antiúlcera de espécies deste gênero (CRUZ; KAPLAN,
2004; MAGINA et al., 2010). Algumas delas já foram estudadas quanto ao seu
potencial gastroprotetor.
Trabalhos realizados com as folhas da Eugenia jambolana (DONATINI et al.,
2009), Eugenia umbeliflora (MEYRE-SILVA, 2009), Eugenia punicifolia (BASTING et
al., 2014) demostraram resultados promissores. Além disso, outra espécie do
mesmo gênero, já bastante conhecida e descrita na literatura apresenta um grande
potencial gastroprotetor, a Eugenia caryophyllata, popularmente conhecida como
cravo-da-índia (SRINIVAS et al., 2013).
33
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Material Vegetal
A planta foi coletada no município de Itajaí-SC, segundo as coordenadas
geográficas 26°54'17.7"S e 48°40'17.0"W. Ela foi identificada pelo Prof. Oscar Iza,
da Universidade do Vale do Itajaí – UNIVALI. Uma excicata foi depositada no
Herbário Barbosa Rodrigues (Itajaí) sob o código n˚55283.
As coletas foram realizadas em três diferentes momentos, em janeiro (210 g),
em julho (240 g) e em dezembro (234 g) de 2014. As folhas frescas foram picadas
em pedaços pequenos para a obtenção dos extratos e posterior análise fitoquímica.
4.2 Análise Fitoquímica
4.2.1 Obtenção de extratos e frações e isolamento de substâncias
Em todas as coletas, as folhas foram submetidas ao processo de maceração
estática com metanol (foi utilizada em média 1 L), em temperatura ambiente, por um
período de sete dias. Posteriormente, o solvente foi removido por destilação em
evaporador rotatório sob pressão reduzida, para obtenção do extrato metanólico
bruto (EMB). Eles foram designados respectivamente, EMB-jan, EMB-jul e EMB-dez.
O EMB-jan foi utilizado para realizar a análise fitoquímica convencional, sendo
submetido à partição com solventes de polaridade crescente (clorofórmio e acetato
de etila), conforme metodologia anteriormente descrita (CECHINEL FILHO; YUNES,
1998, 2001; MALHEIROS et al., 2010; NIERO et al., 2003). Dessa partição foram
geradas duas frações, designadas FCL-jan (Fração Clorofórmio), com uma massa
de 2,5419 g e FAE-jan (Fração Acetato de Etila), com uma massa de 8,839 g,
conforme o fluxograma apresentado (FIGURA 6).
As frações foram então submetidas à uma série de Colunas Cromatográficas
(CC) e Cromatografias em camada delgada (CCD) para isolamento de substâncias,
de acordo com as Figuras 7 e 8 (CECHINEL FILHO; YUNES, 1998; 2001;
MALHEIROS et al., 2010; NIERO et al., 2003; VILEGAS; CARDOSO, QUEVEDO,
2012).
34
A coleta de julho e dezembro seguiu o mesmo padrão de partição e análises
por CC e CCD’s da coleta de janeiro, no entanto, o extrato e as frações destas
coletas foram utilizados principalmente para os ensaios farmacológicos e para
comparação com a coleta de janeiro.
Figura 6. Processo de obtenção do extrato e das frações das folhas de Eugenia involucrata da coleta de janeiro de 2014.
35
Figura 7. Processo de obtenção de substâncias isoladas a partir da FAE-jan das folhas de Eugenia involucrata da coleta de janeiro de 2014.
Legenda: FE = fase estacionária; FM = fase móvel; H = hexano; A = acetona
36
Figura 8. Processo de obtenção de substâncias isoladas a partir da FAE-jan das folhas de Eugenia involucrata da coleta de janeiro de 2014.
Legenda: FE = fase estacionária; FM = fase móvel; C = clorofórmio; M = metanol
37
4.2.3 Elucidação estrutural
Para elucidar e caracterizar quimicamente as substâncias purificadas foram
utilizadas técnicas espectrométricos usuais como Infra-vermelho (IV), Ressonância
Magnética Nuclear de hidrogênio (RMN-¹H) e carbono 13 (RMN-¹³C) e
Espectrometria de Massa (EM), todos disponíveis no Curso de Farmácia e PPGCF
da UNIVALI.
Os espectros de RMN foram realizados por Pedro Pablo Perez Netto no
espectrômetro BRUKER AC-300F 300 MHz, tendo como referência interna o
tetrametilsilano (TMS) ou o próprio solvente. Os deslocamentos químicos foram
registrados em valores adimencionais ᵟ (ppm).
A avaliação dos espectros obtidos das substâncias isoladas foram
acompanhadas com o auxílio de tabelas que indicam deslocamentos químicos para
hidrogênios e carbonos em comparação com trabalhos encontrados na literatura.
A análise espectrométrica por IV foi realizada pelo Prof. Rogério Corrêa em
espectômetro interfotométrico Fourier Transform Infrared IR Prestige 21
(SHIMADZU), pelo método de reflectância difusa – DRIFTS. Os espectros foram
obtidos registrando transmitância versus número de onda (cm-1) e foram corrigidos
pelo algoritmo Kubelka Munk.
Para fazer o espectro de massa foi utilizado o cromatógrafo gasoso acoplado
ao detector de massas da marca Shimadzu modelo GCMS - QP2010S,
apresentando interface acoplada a um computador para controle e aquisição de
dados com sistema de amostragem automatizada. A coluna utilizada foi da marca
Marca DB-1 (USA): 0,25 mm (d.i.) x 30 m (comprimento), espessura do filme 0,25
μm de 100% de dimetil polisiloxano, com volume de injeção: 1,0 μL (injetor modo
Splitless (razão do split 40,0:1) a 300˚C). O eluente foi o gás hélio (0,79 mL/min) e a
temperatura inicial foi 80 ˚C e permaneceu desta maneira por 1 min, quando foi
elevada até 200 ˚C a uma velocidade de 25 ˚C /min, logo após a 10 ˚C /min até 230
˚C, em seguida 20 ˚C /min até 310 ficando por 10 min. O detector MS – razão m/z
com scan 40 a 450 D foi utilizado e as análises dos espectros de massas foram
feitos por comparação aos espectros encontrados na biblioteca NIST 8.0. Estas
análises foram realizadas pelo Prof. Theodoro Marcel Wagner.
38
4.2.4 Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)
A análise por CLAE foi realizada visando comparar as substâncias
encontradas no EMB-jan (verão) e no EMB-jul (inverno) e identificar as classes de
compostos presentes nos extratos. Esta técnica foi realizada pela mestranda Tailyn
Zermiani.
Para fazer a análise do EMB das folhas de E. involucatra foi utilizado o
cromatógrafo líquido da marca Shimadzu® LC 20-AT, equipado com uma bomba
quaternária, detector de varredura de espectro no ultravioleta por arranjo de
fotodiodos (diodo array) e injetor automático SIL-20A. O software LC Solution® foi
utilizado para registrar os cromatogramas e medir as áreas dos picos. A detecção
por varredura de espectro foi realizada na faixa de comprimentos de onda entre 190
nm até 400 nm. A separação dos fitoconstituintes das folhas de E. involucatra foi
executada com uma coluna de fase reversa C18 (250 X 4,6 mm X 5 µm) da marca
Phenomenex. Os solventes utilizados foram grau HPLC, filtrados a vácuo com
membrana de celulose regenerada 47 mm de diâmetro e 0,45 μm de porosidade
(RC-L 58 Schleicher e Schuell) e degaseificados em ultrassom (UltraSonic Cleaner
Unique® USC 1400) por sonicação sob vácuo (Bomba de Vácuo Tecnal TE® – 058).
Como marcador químico foi utilizada a catequina. A eluição foi realizada com fluxo
de 1,0 mL/min, utilizando como fases móveis acetonitrila:água (acidificada com
H3PO4 pH 2,53), em modo gradiente, conforme apresentado na Tabela 1.
Tabela 1. Eluição utilizada na análise por CLAE do EMB-jan e o EMB-jul.
Tempo Acetonitrila (%) Água* (%)
0 15 85 25 35 65 30 80 20 32 15 85 35 15 85
*Acidificada com ácido fosfórico pH 2,53.
39
4.3 Análise Farmacológica/Biológica
Os experimentos de análise da atividade antimicrobiana, gastroprotetora e
antinociceptiva foram realizados por acadêmicos orientados por professores
vinculados ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas e ao Núcleo
de Investigações Químico-Farmacêuticas da Univali - NIQFAR/CCS/UNIVALI.
4.3.1 Avaliação da Atividade Antimicrobiana
A avaliação da atividade antimicrobiana foi realizada pela acadêmica Marcélly
dos Santos Boera sob orientação do Prof. Alexandre Bella Cruz.
A avaliação do EMB-jan, FCL-jan e FAE-jan quanto ao seu potencial
antimicrobiano foi realizada pela metodologia da diluição em ágar, e os resultados
permitiram a determinação da concentração inibitória mínima (CIM) em µg/mL. As
cepas utilizadas nos experimentos foram as das bactérias gram-positivas Bacillus
subtilis (ATCC 23858), Staphylococcus aureus (ATCC 25923) e Staphylococcus
saprophyticus (ATCC 35552), da bactéria gram-negativa Escherichia coli (ATCC
25922) e da levedura Candida albicans (ATCC 10231) (BELLA CRUZ et al., 2010).
Os valores da CIM foram determinados pela diluição dos componentes
obtidos da planta em ágar empregando a metodologia descrita por CLSI (2009) para
as bactérias e Espinel-Ingroff e Pfaller (1995) para a levedura, com pequenas
modificações. Os extratos e frações foram dissolvidos em solução de dimetilsulfóxido
(DMSO) e água destilada (4:6), foram adicionados em séries de 10 frascos com
capacidade para 5 mL em diferentes concentrações (1000 a 2 μg/mL). Em seguida,
a cada frasco foi adicionado 1 mL de meio agar Mueller-Hinton para as bactérias e 1
mL de ágar Sabouraud dextrosado para a levedura, seguido de imediata
homogeneização da mistura. Após a solidificação dos respectivos meios de cultura,
os micro-organismos, previamente ativados, foram inoculados nas séries
correspondentes, sendo então incubados a 35 ºC por 18 a 24 horas para as
bactérias, 30 ºC por 24 a 48 horas para o fungo leveduriforme.
Após esse período de incubação, foram realizadas leituras da CIM através da
verificação visual do crescimento microbiano. Para a interpretação dos resultados foi
considerada CIM a inibição total do crescimento microbiano.
Durante os testes foram utilizados controles, como os meios de cultura e
solvente utilizado na solubilização do extrato e das frações, a fim de verificar seu
40
efeito sobre o micro-organismo. A concentração final de DMSO nos ensaios não
excedeu 2%. A leitura dos resultados foi considerada válida somente quando houve
crescimento microbiano nos controles. Foram utilizados como controles,
antimicrobianos empregados na clínica e os ensaios foram feitos em triplicata.
4.3.2 Avaliação da Atividade Antinociceptiva
A avaliação da atividade antinociceptiva foi realizada pela acadêmica Karla
Capistrano sob orientação da Profª. Fátima de Campos Buzzi.
Os animais utilizados neste estudo foram mantidos segundo as normas e
cuidados com animais de laboratório, bem estar e biossegurança na
experimentação, conforme descritas na Lei n. 11.794, de 8 de outubro de 2008, e de
acordo com as diretrizes da Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de
Laboratório. Os experimentos foram submetidos ao Comitê de Ética na Utilização de
Animais da Universidade do Vale do Itajaí, sendo aprovado sob protocolo n° 599-07.
Para esta avaliação foram utilizados camundongos Swiss machos pesando
entre 25 a 35 gramas, aclimatados a temperatura de 22 ± 2 °C com ciclo
claro/escuro de 12 horas mantidos no biotério central da UNIVALI, tratados com
água e ração “ad libitum”. Os animais foram levados ao ambiente do teste 1 h antes
da realização do experimento para se adaptarem, e 30 minutos antes do mesmo,
receberam uma injeção via i. p., do EMB-jul, FCL-jul e FAE-jul nas doses de 10
mg/kg. A FCL-jul também foi avaliada nas doses de 6 e 3 mg/kg e a substância
isolada 7-9 na dose de 3 mg/kg e 1 mg/kg. Os animais do grupo controle receberam
somente veículo.
O modelo utilizado foi o de contorções abdominais induzidas pelo ácido
acético, que consistiu na aplicação por via i. p., depois do tratamento, do ácido
acético (0.6 %), dissolvido em NaCl 0.9% previamente tamponado em pH 7.4 numa
dose de 0,15 mL/10 g de peso (SOUZA et al., 2003). As contorções foram
quantificadas acumulativamente durante 20 minutos e o indicativo de antinocicepção
foi a redução da resposta nociceptiva à contorção, em relação ao grupo controle.
4.3.3 Avaliação da Atividade Gastroprotetora
A avaliação da atividade gastroprotetora foi realizada pela doutoranda
Roseane Leandra da Rosa sob orientação do Prof. Sérgio Faloni de Andrade.
41
Os animais utilizados neste estudo foram mantidos segundo as normas e
cuidados com animais de laboratório, bem estar e biossegurança na
experimentação, conforme descritas na Lei n. 11.794, de 8 de outubro de 2008, e de
acordo com as diretrizes da Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de
Laboratório. Os experimentos foram submetidos ao Comitê de Ética na Utilização de
Animais da Universidade do Vale do Itajaí, sendo aprovado pelo protocolo n° 019/13.
Neste ensaio foram utilizados 30 camundongos fêmeas Swiss, pesando entre
25–50 g, provenientes do Biotério Central da Universidade do Vale do Itajaí –
UNIVALI. Os animais foram mantidos em caixas de polipropileno, em sala com
temperatura média de 22 ºC e ciclo controlados (claro/escuro 12 horas cada), tendo
ração e água ad libitum. Nas doze horas anteriores aos experimentos, os animais
foram mantidos em jejum e com livre acesso à água, sendo adicionada a caixa uma
grade para inibir a coprofagia.
No estudo farmacológico de plantas utilizam-se normalmente concentrações
crescentes, correlacionadas para possível observação da relação dose-resposta.
Neste estudo, avaliou-se efeito do extrato (EMB-jul) utilizando as concentrações de
50 mg/kg, 125 mg/kg e 250 mg/kg.
A metodologia utilizada no experimento foi descrita por Mizui e Doteuchi
(1983), com algumas modificações. Os camundongos foram divididos em diferentes
grupos (n = 6), pré-tratados por via oral com cimetidina (controle positivo – 100
mg/kg), veículo (controle negativo – água destilada) e o EMB-jul nas doses de 50,
125 e 250 mg/kg.
Após uma hora do tratamento, foram administrados por via oral nos animais,
0,1 mL/10 g (peso animal) de etanol (agente lesivo). Uma hora após a administração
do agente lesivo, os animais foram sacrificados por deslocamento cervical. Os
estômagos foram retirados e abertos ao longo da curvatura maior e esticados em
placas de parafina. As imagens foram digitalizadas e analisadas por programa de
computador de análise de imagens EARP, a fim de determinar o número de lesões e
o seu tamanho, para determinação da área total de lesão (mm2) e da área relativa
lesada (%).
Os resultados foram apresentados como média ± erro padrão da média. A
análise estatística dos resultados foi realizada por meio de análise de variância
seguida pelo teste de múltipla comparação utilizando-se o método de Dunnett.
Valores de p<0,05 ou menos foram considerados como indicativos de significância.
42
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Análise Fitoquímica
Os extratos obtidos com as folhas da Eugenia involucrata nas coletas de
janeiro, julho e dezembro apresentaram rendimentos diferentes, não somente devido
à produção dos metabólitos pela planta nas distintas épocas do ano, mas
possivelmente também devido a variações na quantidade de material coletado e
possivelmente na quantidade de solvente utilizada na maceração. O EMB-jan obteve
o maior rendimento, 5,63%, seguido pelo EMB-jul (rendimento de 3,75%) e EMB-dez
(rendimento de 3,19%).
5.1.1 Isolamento e identificação dos princípios ativos
A análise comparativa entre as frações das diferentes coletas, feita por CCD
está descrita na Figura 9, onde pode-se observar similaridade entre os extratos,
tanto para os compostos polares, como os compostos fenólicos (FAE eluída em
Clorofórmio:Metanol na proporção de 8:2 e revelada com Cloreto Férrico) quanto
para os mais apolares, como os terpenos e esteróides (FCL eluída em
Hexano:Acetona na proporção de 7:3 e revelada com Anisaldeído).
Figura 9. CCD comparativa das frações Clorofórmio e Acetato de Etila nas três diferentes coletas, janeiro, julho e dezembro, respectivamente.
A - Fase móvel utilizada: Hexano:Acetona (7:3) e revelador anisaldeído B – Fase móvel: Clorofórmio:Metanol (8:2) e revelador cloreto férrico
A B
43
As análises cromatográficas permitiram o isolamento de três substâncias da
fração acetato de etila das folhas da E. involucrata (coleta de janeiro), uma delas, a
subfração 11-14 foi identificada como a (-)-catequina (FIGURA 10). As outras duas
substâncias isoladas (3-5 e 6-8) que estão em fase de elucidação estrutural.
Figura 10. Estrutura química da (-)-catequina (substância 11-14).
A identificação da (-)-catequina foi realizada pela comparação dos espectros
de RMN de 1H e 13C (FIGURAS 11,12 e 13) com dados da literatura, como expressa
a Tabela 2 (AYRES et al., 2009).
A principal diferença observada nos sinais de deslocamentos químicos entre a
(+)-catequina e a (-)-catequina estão nos sinais dos hidrogênios e carbonos 2 e 3.
44
Figura 11. Espectro de RMN 1H da substância 11-14, identificada como (-)-catequina, isolada da fração acetato de etila das folhas de Eugenia involucrata.
Figura 12. Espectro de RMN 1H aproximado da substância 11-14, identificada
como (-)-catequina, isolada da fração acetato de etila das folhas de Eugenia involucrata.
45
Figura 13. Espectro de RMN 13C da substância 11-14, identificada como (-)-catequina, isolada da fração acetato de etila das folhas de Eugenia involucrata.
Figura 14. Estrutura química numerada da (-)-catequina
46
Tabela 2. Dados de RMN de 1H e 13C da (-)-catequina em comparação com dados da literatura.
(-)-catequina
(Substância 11-14)
(+)-catequina
(AYRES et al., 2009)
δH (m;J) δC δH (m;J) δC
2 4,87 (s) 79,46 4,59 (d; J=7,4 Hz) 82,6
3 4,20 (d; J=4,5 Hz) 67,01 4,01 (ddd; J=8; 7,4 e 5,4 Hz) 68,6
4a 2,72 (dd; J=16,5 e 3 Hz) 2,52 (dd; J=16,0 e 8,0 Hz
4b 2,85 (dd; J=16,5 e 4,5 Hz) 29,04 2,84 (dd; J=16 e 5,4 Hz) 28,2
5 157,63 157,3
6 6,01 (d; J=2,1 Hz) 96,26 5,96 (d; J=2,2 Hz) 96,4
7 157,68 157,4
8 5,91 (d; J=2,1 Hz) 95,73 5,89 (d; J=2,2Hz) 95,6
9 157,17 156,7
10 99,83 100,9
1ʹ 132,27 132,0
2ʹ 7,04 (d; J=1,5 Hz) 115,31 6,85 (d; J=1,8 Hz) 115,2
3ʹ 145,47 146,0
4ʹ 145,34 146,0
5ʹ 6,84 (d; J=8,1 Hz) 115,54 6,79 (d; J=8,1 Hz) 116,0
6ʹ 6,79 (dd; J=1,8 e 8,1 Hz) 119,38 6,72 (dd; J=1,8 e 8,1 Hz) 120,1
A partir da Fração Clorofórmio (FCL-jan) foram isoladas outras três
substâncias. A substância 13 foi identificada por CG/EM como Fitol (4mg) (FIGURA
15 e 16). A estrutura do fitol foi confirmada pela biblioteca NIST versão 6, com
similaridade próxima à 100%. Os dados de EM estão de acordo com a literatura para
a estrutura proposta (SOUZA et al, 2012).
Figura 15. Estrutura química do fitol (substância 13).
47
Figura 16. Espectro de massas da substância 13, obtido por CG/EM.
A determinação estrutural da substância 7-9 foi realizada mediante a análise
dos espectros de IV, RMN 1H e 13C. Ela apresentou ponto de fusão de 212 ˚C e foi
isolada uma quantidade de 8 mg.
O espectro de absorção no IV da substância 7-9 apresentou bandas de
absorção com intensidade máxima em 3450 cm-1 referente a estiramento de ligação
OH. Bandas de intensidade máxima entre 2960 a 2870 cm-1, referente à deformação
axial de Csp3H. O estiramento em 1700 cm-1 caracteriza C=O e bandas de
intensidade máxima entre 1200 a 1050 cm-1 caracterizam deformação axial de C-O.
A análise do espectro de IV da substância 7-9 permitiu evidenciar as funções álcool
e cetona, além da cadeia de hidrocarboneto alifático (FIGURA 17).
48
Figura 17. Espectro de infravermelho da substância 7-9, isolada da fração clorofórmio das folhas de Eugenia involucrata.
No espectro de RMN 1H (FIGURA 18) foi possível observar inicialmente sinais
que podem ser atribuídos a um triterpenóide pelos múltiplos sinais entre 1 e 3 ppm
(5 a 6 grupos metilas). Dois simpletos na região de 1,3 ppm indicam a existência de
grupamentos metila próximo a carbono oxigenado com diferença estérica para os
grupos metila. Dois dupletos entre 0,5-0,8 ppm são característicos de hidrogênios de
ciclopropano, que se orientam à esqueletos de cicloartanos ou phylanthanos ou
outros menos comuns.
O sistema AB em 3,4-3,8 ppm é característico de um metileno alcoólico
isolado, sobre um carbono quaternário, sem hidrogênios vizinhos. A ausência de
sinais acima de 4 ppm indica que não há insaturações na molécula.
49
Figura 18. Espectro de RMN 1H da substância 7-9, isolada da fração clorofórmio das folhas de Eugenia involucrata.
No espectro de RMN13C (FIGURA 19 e 20) se confirma a natureza triterpênica
da substância, no entanto só foi possível observar claramente 28 sinais de carbono.
Não se observa sinais na região posterior à 66 ppm, além do sinal referente à
carbonila em 218 ppm.
50
Figura 19. Espectro ampliado de RMN 13C da substância 7-9, isolada da fração clorofórmio das folhas de Eugenia involucrata.
51
Figura 20. Espectro de RMN 13C (A) e modo DEPT (B) da substância 7-9, isolada da fração clorofórmio das folhas de Eugenia involucrata.
Com a proposta de carbonila em C-3 e hidroximetil em C-4 foi realizada uma
busca em Scifinder e foram encontradas poucas substâncias contendo essa função,
mas distintos da substância previamente isolada da E. involucrata.
Uma das substâncias encontradas foi o composto 4 (3-ceto-28-
hidroxicicloartano) isolado da Amoora cucullata (FIGURA 21), cujos deslocamentos
de RMN¹³C nos espectros permitiram identificar a funcionalidade e o esqueleto de
cicloartano (sinonímia CAs: Ciclolanostano), sem outra funcionalidade da
mencionada para o 7-9 da E. involucrata em todo sistema polinuclear (AHMED et al.,
2010). Além da disposição alfa do grupo hidroximetil, foi possível afirmar todos os
sinais do sistema policíclico, do ciclopropano e dos grupos metil substituintes, pela
coincidência quase perfeita de sinais (0,1-0,3 ppm de diferencias máximas) com as
descritas no presente trabalho.
A
B
52
Esse composto contém 3 funções hidroxila na cadeia e se observa que
particularmente o grupamento com ponte de hidrogênio vizinho 24,25-dihidroxi induz
diferenças de deslocamentos das substanciais (FIGURA 21).
Figura 21. Estrutura do composto 4 (3-ceto-28-hidroxicicloartano) isolado da Amoora cucullata.
Esta mesma coincidência foi encontrada para outra substância, também
nomeada composto 4, mas esta, isolada do própolis por Li e colaboradores (2009)
(FIGURA 22).
Figura 22. Estrutura do composto 4 isolado do própolis.
OH
O
CH3H
CH3
CH3
CH3
CH3
O
OH
H
H
53
A funcionalidade na cadeia lateral foi deduzida das absorções dos grupos
metil diasterópicos diferenciados (sinais em 1,3 ppm do RMN-¹H) e geminais com
função oxigenada e pela presença de um sinal de metino oxigenado em 64,7 ppm no
RMN¹³C e de outro carbono protonado, de menor intensidade, em 58,4. Essas
características levariam à existência de um grupamento oxirânico nas posições
25,25 do triterpenóide. A presença de um epóxido seria também existente pelo
multipleto em 2,7 ppm presente no espectro de RMN-¹H, característico de
hidrogêncio metínico H-24.
Foi possível confirmar a constituição de uma cadeia lateral mediante a busca
bibliográfica das numerosas substâncias descritas com função 24,25-epoxi em uma
cadeia de triterpeno ou esterol colestánico isenta de outras funções. Foram
encontrados vários compostos com essa funcionalidade de cadeia e a comparação
dos espectros permitiu constatar a coincidência de sinais da substância 7-9 da E.
involucrata com as descritas na literatura para esse tipo de compostos (compostos 1,
3a e 3b isolados da Borrichia frutescens), como observado na Figura 23 (CANTRELL
et al., 1996).
Figura 23. Estruturas moleculares dos compostos compostos 1, 3a e 3b isolados da Borrichia frutescens.
54
A constituição molecular da substância 7-9 sugerida é 24,25-epoxi-28-
hidroxicicloartan-3-ona, representada na Figura 24. Essa substância não aparece no
Chem. Abstracts segundo as buscas realizadas no Scifinder (até 30 de junho de
2015) dessa forma, esta é primeira vez que essa substância é descrita.
Foi realizada uma busca bibliográfica em importantes bases de dados,
incluindo Scielo, PubMed, SciFinder e Science Direct e não foram encontrados
resultados relacionados à presença de triterpenos do tipo cicloartano no gênero
Eugenia, sendo esta uma das raras citações.
Para a identificação inequívoca falta realizar alguns experimentos adicionais
(bidimensionais), espectro de massas de alta resolução e determinação da rotação
ótica.
Figura 24. Estrutura química da substância 24,25-epoxi-28-hidroxicicloartan-3-ona, isolado da fração clorofórmio das folhas de Eugenia involucrata.
Para a identificação da substância 3-6, uma pequena quantidade da
substância 7-9 foi acetilada usando metodologia convencional (piridina e anidrido
acético sob aquecimento), cujo produto não foi isolado, mas por CCD comparativa o
Rf foi similar ao 3-6, sugerindo que a substância 3-6 consiste no 7-9 acetilado.
55
5.1.2 Cromatografia Líquida Alta Eficiência
Com o intuito de avaliar a diferença entre as épocas de coleta (verão e
inverno), considerando os aspectos sazonais que influenciam na produção de
metabólitos secundários (GOBBO-NETO; LOPEZ, 2007), foi realizada uma análise
qualitativa por CLAE dos extratos obtidos das coletas de janeiro e julho (EMB-jan e
EMB-jul) (FIGURAS 25 e 26).
Os perfis de absorção no UV foram detectados entre 200 a 400nm, sendo
observados máximos de absorbância em 280 nm e 300nm, um perfil característico
de compostos fenólicos (MAATTA; KAMAL-ELDIN; TORRONEN, 2003; ZHANG et
al., 2013).
Figura 25. Análise por CLAE do EMB-jan das folhas de Eugenia involucrata a 280nm.
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 min
0
5
10
15
20
25
30
35
40
mAUExtract-280nm4nm (1.00)
/8.6
37
/9.4
17
/10.1
57
/11.7
46
/14.3
43
/14.8
77
/15.1
83
/15.6
09
/17.0
58
/18.9
65
/22.5
47
A Figura 27 mostra a sobreposição do EMB-jul e EMB-jan usando a
(-)-catequina, isolada das folhas da E. involucrata como marcador químico.
56
Figura 26. Análise por CLAE do EMB-jul das folhas de Eugenia involucrata a 280nm.
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 min
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0
17.5
20.0
22.5
25.0
27.5
mAUExtract-280nm4nm (1.00)
/6.6
62
/7.0
86
/8.6
65
/9.4
84
/10.0
74
/11.7
99
/13.0
07
/13.7
48
/14.4
02
/15.6
56
/17.1
38
/17.4
47 /2
2.5
95
/34.2
88
Figura 27. Análise por CLAE da sobreposição do EMB-jan, EMB-jul e (-)-catequina das folhas de Eugenia involucrata a 280nm.
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 min
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
uV(x10,000)
Conforme demonstrado pelos perfis de CLAE, a catequina é a substância
majoritária dos extratos, e aparentemente está presente em maior quantidade no
inverno. Há similaridade em relação à coleta do verão e do inverno, mas existem
algumas diferenças importantes, destacando-se algumas substâncias, como as que
apresentam tempo de retenção de ~3, ~7, ~10, ~14,5 e ~35 minutos (UV=280 nm)
na coleta de inverno, que não aparecem na coleta do verão, ou aparecem em menor
quantidade.
EMB-jan
EMB-jul
(-)-Catequina Fr 11-14
57
5.2 Análise Farmacológica/Biológica
5.2.1 Atividade Antimicrobiana
A triagem inicial da atividade antimicrobiana foi realizada com o extrato bruto
e testada em três micro-organismos padrões, sendo uma bactéria gram-positiva
(Staphylococcus aureus), uma bactéria gram-negativa (Escherichia coli) e uma
levedura (Candida albicans). Os resultados relacionados à atividade antimicrobiana
obtidos para o EMB-jan e as frações obtidas a partir da mesma coleta estão
demostrados na tabela 3.
Os valores encontrados foram considerados da seguinte maneira, em relação
ao CIM: >1000 µg/mL inativo, entre 500 e 1000 µg/mL atividade fraca, entre 100 e
500 µg/mL atividade moderada e <100 µg/mL boa atividade antimicrobiana
(HOLETZ et al., 2002).
Tabela 3. Análise da atividade antimicrobiana do EMB-jan, FAE-jan e FCL-jan das folhas de Eugenia involucrata (µg/mL)
Material Testado
Staphylococcus aureus
Staphylococcus saprophyticus
Bacillus subtilis Escherichia coli
Candida albicans
EMB-jan 125 - - 500 125
FCL-jan 500 500 500 1000 > 1000
FAE-jan > 1000 > 1000 > 1000 > 1000 > 1000
EMB-jan = Extrato Metanólico Bruto de janeiro; FCL-jan = Fração Clorofórmio de janeiro; FAE-jan = Fração Acetato de Etila de janeiro.
Segundo a tabela 3, o EMB-jan apresentou CIM de 125 µg/mL para
Staphylococcus aureus e Candida albicans e CIM de 500 µg/mL para Escherichia
coli, sendo esses três resultados considerados como atividade antimicrobiana
moderada (entre 100 e 500 µg/mL).
Diante destes resultados iniciais, foi então avaliada a atividade das frações
acetato de etila e clorofórmio, acrescentando à avaliação duas outras bactérias
Gram-positivas (Staphylococcus saprophyticus e Bacillus subtilis), levando em
consideração que o resultado inicial para esse tipo de bactéria foi melhor do que
para as bactérias gram-negativas.
A FAE-jan apresentou CIM >1000 µg/mL para todas as cepas, não
demonstrando nenhuma atividade antimicrobiana. Dessa forma pode-se sugerir que
a atividade encontrada no extrato bruto não seja proveniente dos compostos mais
58
polares encontrados nas folhas e solubilizados nesta fração e provavelmente não
tem relação com a (-)-catequina.
A FCL-jan apresentou CIM de 500 µg/mL para Staphylococcus aureus,
Staphylococcus saprophyticus e Bacillus subtilis, resultado considerado fraco, 1000
µg/mL para Escherichia coli e >1000 µg/mL para Candida albicans, indicando
inatividade frente à estas duas cepas.
O fitol, diterpeno isolado desta fração, apresenta propriedade antimicrobiana,
segundo a literatura (SANTOS, 2013), e pode ser um dos responsáveis pela melhor
ação antimicrobiana encontrada para a FCL em relação à FAE. Os resultados
encontrados frente às cepas de bactérias Gram-positivas foram melhores que para
as outras cepas testadas, tanto no extrato quanto na fração clorofórmio.
O EMB-jul apresentou ação antibacteriana superior, quando comparada às
frações, em todas as cepas testadas. A explicação para estes resultados pode estar
na associação de duas ou mais substâncias ativas encontradas na planta ou no
sinergismo entre elas. Além da possibilidade de efeito aditivo ou sinergismo, embora
imperceptível na realização do experimento, a influência da solubilidade dos
constituintes pode também ser uma possibilidade que explica esses resultados.
Não foram encontrados outros estudos avaliando o potencial antimicrobiano
da E. involucrata, porém, outras espécies do mesmo gênero já foram avaliadas e
podem ser utilizadas para comparação dos resultados.
Chavasco e colaboradores (2014) observaram um potencial antimicrobiano do
extrato hidroalcoólico das folhas de Eugenia pyriformis para algumas cepas também
testadas na presente pesquisa. O extrato apresentou atividade moderada S. aureus
e B. subtilis, E. coli e C. albicans. Outras partes da planta como semente, fruto e
caule também apresentaram bons resultados.
Ferreira e colaboradores (2014) avaliaram a atividade antimicrobiana do
extrato e de frações das folhas de Eugenia calycina e não encontraram atividade
antimicrobiana frente nenhuma bactéria testada.
A Eugenia brejoensis, característica do cerrado brasileiro, apresentou
atividade antimicrobiana tanto para bactérias Gram-positivas quanto para as Gram-
negativas. O extrato metanólico, a fração acetato de etila e a fração ciclohexano
demonstraram atividade fraca para S. aureus e atividade moderada para E. coli e B.
subtilis (AZEVEDO et al., 2012).
59
As folhas da planta Eugenia dysenterica, conhecida popularmente como
cagaita, foram avaliadas por Silva (2013), que encontrou seu resultado mais
relevante frente à cepa de S. aureus, com CIM de 250 µ/mL tanto para o extrato
aquoso quanto para as frações acetônica, isopropanólica e metanólica. Neste
mesmo trabalho foi verificada a presença de catequina e epicatequina nas folhas da
E. dysenterica, mesma classe de substâncias encontradas na E. involucrata.
A Eugenia umbelliflora também possui atividade antimicrobiana, como
descrito em trabalho realizado por Machado e colaboradores (2005), que revelou
seu potencial contra bactérias Gram-positivas em concentrações de CIM que
variaram de 2 a 400 µg/mL (atividade considerada de boa a moderada). Assim como
no presente estudo, os resultados alcançados pela E. umbelliflora foram melhores na
fração mais apolar (diclorometano) e no extrato bruto.
Em outro estudo realizado com a mesma espécie, foi avaliado o potencial
antibacteriano do extrato bruto, das frações e de uma mistura de triterpenos isolados
contra quatro bactérias Gram-positivas e seis bactérias Gram-negativas. Os
melhores resultados foram obtidos para o extrato bruto, e para as frações hexano,
diclorometano e acetato de etila, que mostraram atividade que variou de moderada a
excelente contra todas as bactérias Gram-positivas testadas (GILIOLI, 2010).
Alguns estudos também comprovam o potencial antimicrobiano de outras
partes de plantas do gênero Eugenia, como as sementes da Eugenia jambolana,
popular joão-bolão (BAG et al., 2012) e as flores da Eugenia caryophyllata, popular
cravo-da-índia (JOSHI et al., 2011). Os óleos essenciais desse gênero também são
amplamente estudados e com resultados expressivos na atividade antimicrobiana
(MAGINA et al., 2009; STIEVEN; MOREIRA; SILVA, 2009).
A busca por novas opções terapêuticas para infecções que afligem a
sociedade contemporânea é muito evidente. Dentre os agentes etiológicos de
processos infecciosos, S. aureus é considerado um dos mais importantes patógenos
oportunistas e está frequentemente associado a infecções comunitárias e
hospitalares (ANDERSON et al., 2012). Por essa razão, o potencial antimicrobiano
encontrado para esse micro-organismo específico é importante.
Os resultados encontrados demonstram ainda que a utilização popular das
folhas da cerejinha na forma de chás para tratar infecções tem fundamento, no
entanto, a diferença de solventes utilizados para a extração das substâncias pode
60
modificar os resultados apresentados. Por esta razão, outros experimentos
adicionais e pormenorizados precisam ser realizados para confirmar esta hipótese.
5.2.2 Atividade Antinociceptiva
A triagem da atividade antinociceptiva foi realizada com o extrato bruto e as
duas frações (Clorofórmio e Acetato de Etila), no modelo de dor induzida pelo ácido
acético, que é um modelo inicial para realizar esse tipo de teste, devido à
simplicidade, rapidez, reprodutibilidade e baixo custo (CECHINEL FILHO; YUNES,
1998).
O modelo supracitado tem sido empregado amplamente para análise da
atividade analgésica de diferentes tipos de compostos, pois mostra boa correlação
com a ação analgésica encontrada em outros modelos pré-clínicos e também em
estudos clínicos (CALIXTO et al., 2000; CAMPOS-BUZZI et al., 2006).
Os resultados dos primeiros testes realizados estão expressos na Figura 28.
Figura 28. Percentual de inibição de contorções abdominais do EBM-jul, FCL-
jul e FAE-jul das folhas de Eugenia involucrata, na dose de 10mg/kg, via i.p. pelo modelo de dor induzida pelo ácido acético em camundongos (n = 6) em comparação com o grupo controle.
Diferença significativa em relação ao grupo controle (**p<0,01), ANOVA, expressos como média ± EPM, teste a posteriori de Dunnett.
De acordo com os resultados apresentados na figura acima, pode-se observar
que tanto o extrato bruto quanto as frações inibiram significativamente as
contorções, no entanto, a FCL-jul foi a mais eficaz, com um percentual de 64,4%.
61
Os resultados sugerem que as substâncias menos polares, como os terpenos
evidenciados, são os principais compostos ativos do extrato. A título de comparação,
fármacos usados na clínica, como a aspirina e o paracetamol, apresentam inibição
de cerca de 35% nas mesmas condições (COSTA et al., 2007)
Tendo em vista esse importante resultado, foi realizado um segundo teste,
para calcular a DI50 (dose mínima capaz de inibir em 50% as contorções em relação
ao grupo controle) dessa fração (FIGURA 29).
Figura 29. Percentual de inibição de contorções abdominais da FCL-jul das folhas de Eugenia involucrata, nas doses de 1, 3 e 10 mg/kg, via i.p. pelo modelo de dor induzida pelo ácido acético em camundongos (n = 6).
Diferença significativa em relação ao grupo controle (**p<0,01), ANOVA, expressos como média ± EPM, teste a posteriori de Dunnett.
Como mostra a figura 28, todas as três doses testadas da FCL-jul
apresentaram redução significativa das contorções. A DI50 foi calculada e a dose de
2,33 mg/kg foi encontrada como a dose mínima para inibir 50% das contorções
abdominais nos camundongos. A DI50 da aspirina e paracetamol nestas mesmas
condições é de cerca de 25 mg/kg, sendo a FCL-jul cerca de 10 vezes mais potente
(SERAFIN et al., 2007).
O fitol foi uma das substâncias isoladas desta fração, sendo um diterpeno de
cadeia aberta amplamente encontrado na natureza e já se conhece seu potencial
analgésico (SANTOS, 2013). Esta substância pode ser uma das responsáveis pelo
efeito antinociceptivo da FCL-jul. No entanto, levando em consideração o isolamento
62
de uma substância inédita (7-9) a partir dessa mesma fração, foi decidido testá-la
para verificar se ela também poderia contribuir para a atividade encontrada. Os
resultados estão apresentados na Figura 30.
Figura 30. Percentual de inibição de contorções abdominais da substância
7-9, isolada das folhas de Eugenia involucrata, nas doses de 1 e 3mg/kg, via i.p. pelo modelo de dor induzida pelo ácido acético em camundongos (n = 6).
Diferença significativa em relação ao grupo controle (**p<0,01), ANOVA, expressos como média ± EPM, teste a posteriori de Dunnett.
Observando os resultados é possível perceber uma redução significativa do
número de contorções nas doses testadas (50% na dose de 1 mg/kg e 58,2% na
dose de 3 mg/kg), confirmando a suposição de que essa substância é um dos
principais responsáveis pela atividade antinociceptiva apresentada pela FCL-jul.
Devido à quantidade limitada da substância não foi possível calcular a DI50
exata, mas estima-se estar próxima à de 1 mg/kg, com potência cerca de 25 vezes
maior que os fármacos de referência.
Resultados encontrados em trabalho semelhante à este, realizado com o
extrato metanólico bruto das folhas da Eugenia fruticosa, no qual foi avaliando o
potencial antinociceptivo em camundongos por meio do mesmo modelo, mas com
administração via oral, mostram um percentual de inibição de 51,02% na dose de
200 mg/kg e 72,1% na dose de 400 mg/kg, comparados ao grupo controle. Ambos
resultados foram significativos estatisticamente, numa relação dose-dependente e
63
muito próximos ao percentual de inibição do fármaco de referência (Diclofenaco de
sódio, 65,31% de inibição) (SHAMS-UD-DOHA et al., 2012).
Basting e colaboradores (2014) avaliaram o potencial antinociceptivo do
extrato hidroalcóolico das folhas da Eugenia punicifolia em dois diferentes modelos
de dor, com doses administradas via oral. No modelo de dor induzida por formalina
foi observada inibição da nocicepção foi de 25% a 35%, além da redução da
inflamação de 41 a 63% quando comparados ao grupo controle.
O segundo modelo utilizado foi o da dor induzida por placa quente,
direcionado a investigar o efeito central de drogas analgésicas e determinar o seu
mecanismo de ação. Os resultados foram estatisticamente significantes para a dose
de 250 mg/kg e os autores sugeriram, mediante a outros testes realizados, que a
atividade antinociceptiva demostrada tem relação com a redução ou inibição da
síntese de óxido nítrico e envolve o sistema glutamatérgico, não demostrando
relação com o sistema opioide (BASTING et al., 2014)
Embora apresentem diferentes constituintes, os óleos essenciais de algumas
espécies do gênero Eugenia também apresentaram resultados significativos para a
redução de nocicepção em camundongos, como é o caso do óleo essencial extraído
das folhas da Eugenia candolleana, e da Eugenia uniflora (AMORIM et al., 2009;
GUIMARÃES et al., 2009).
A Eugenia jambolana é uma planta já bastante estudada e caracterizada na
literatura. Alguns estudos demostram atividade antiniciceptiva em diferentes modelos
e com diferente partes dessa planta. As cascas das raízes, por exemplo, foram
avaliados por Saha e colaboradores (2013) e foi encontrada uma significativa
atividade antinociceptiva, principalmente na fração éter de petróleo, a qual diminuiu
as contrações no modelo de ácido acético em 54,28% e em 73,77% no modelo de
formalina (dose de 400 mg/kg).
Das folhas desta mesma planta foi avaliado um substância isolada da fração
acetato de etila, um flavonóide chamado dicamferol ramnosídio. No modelo do ácido
acético essa substância inibiu as contrações nas doses de 10 e 30 mg/kg, não
mostrando significância na dose de 3 mg/kg (LINGARAJU et al., 2014).
Os terpenos constituem uma das maiores classes de metabólitos secundários
encontrados nas plantas, sendo o seu potencial analgésico bastante conhecido e
descrito na literatura. Eles atuam principalmente na inibição da agregação
plaquetária e interferem no meio intracelular de diferentes estágios do mecanismo de
64
tradução da dor (CALIXTO et al., 2000; GUIMARÃES; QUINTANS; QUINTANS,
2013).
Os sequiterpenos são em sua maioria encontrados nos óleos essenciais e
são responsáveis pela atividade antinociceptiva encontrada em muitas espécies
(PADUCHI et al., 2007).
Em uma busca bibliográfica por patentes de medicamentos para a dor que
continham em sua formulação terpenos (isolados ou não), Oliveira e colaboradores
(2014) encontraram 39 patentes que se encaixavam à busca. Destas, 54%
provinham de medicamentos compostos das classes de mono e sequiterpenos, 36%
de triterpenos, 8% de diterpenos e 2% de canabinóides (terpenofenólicos).
Muitos medicamentos comercializados nos dias atuais são compostos por
terpenóides isolados, como o mentol, um monoterpeno encontrado no medicamento
Salonpas®. Mais recentemente um exemplo de medicamento fitoterápico composto
de sesquiterpenos foi incluído no mercado farmacêutico do tratamento da dor, o
Acheflan® (OLIVEIRA et al., 2014).
Dado o importante valor dos terpenóides no tratamento da dor, sua presença
na fração clorofórmio pode explicar o potencial antinociceptivo encontrado neste
trabalho.
5.2.3 Atividade Gastroprotetora
A avaliação da atividade gastroprotetora foi realizada com um método de
triagem que procura se aproximar ao máximo da etiologia da doença no homem: o
uso abusivo de bebidas alcoólicas. Por isso foi selecionado o modelo de úlcera
induzida por etanol.
No presente estudo, o potencial gastroprotetor das folhas da E. involucrata foi
inicialmente evidenciado pela redução significativa da área lesada do estômago dos
camundongos induzidos a úlcera por etanol, um agente necrozante (LEMOS et al.,
2011; ROSA, 2013).
Apesar de não representar fielmente a patologia humana, esse modelo é
muito utilizado na triagem de estudos de fármacos com atividade gastroprotetora,
podendo inclusive evidenciar possíveis mecanismos de ação dos extratos, os quais
podem estar associados a fatores antioxidantes e/ou fatores anti-inflamatórios,
relacionados à manutenção ou aumento dos mecanismos de defesa da mucosa
gástrica (LEMOS et al., 2011; ROSA, 2013).
65
O EMB-jul das folhas da E. involucrata apresentou capacidade de defesa da
mucosa gástrica frente ao agente agressor etanol, reduzindo a área total lesada e a
área relativa de lesão para os tratamentos com as doses de 125 e 250 mg/kg de
maneira significativa quando comparados com o controle negativo, no entanto, a
dose de 125 mg/kg demostrou melhor resultado quando comparada a maior dose
testada, de 250 mg/kg.
A dose de 50 mg/kg apresentou redução das lesões também, mas não de
maneira significativa. Esse dado leva a crer na possibilidade de bons resultados para
uma dose menor, entre 50 e 125 mg/kg, que pode ser testada futuramente. A
cimetidina (controle positivo) também comprovou seu efeito gastroprotetor, validando
o experimento (Tabela 3).
Tabela 4. Efeito da administração oral de cimetidina (100 mg/kg) e das diferentes doses do EMB-jul da Eugenia involucrata (50, 125 e 250 mg/kg) em úlcera gástrica aguda induzida por etanol em camundongos (n = 6).
Tratamento Dose (mg/kg)
Área total de lesão (mm2)
Área relativa de lesão (%)
Controle Veículo 42,86 ± 10.60 10,57 ± 3,61
50 23,76 ± 5,63 6,31 ± 1,96
EBM-jul da E. involucrata
125 4,61 ± 2,03** 1,21 ± 0,56*
250 6,67 ± 1,81** 2,13 ± 0,54*
Cimetidina 100 1,98 ± 0,44** 0,75 ± 0,17**
Diferença significativa em relação ao grupo controle (**p<0,01 e *p<0,05), ANOVA, expressos como média ± EPM, teste a posteriori de Dunnett.
Figura 31. Imagens dos estômagos após a indução de úlcera por etanol.
Legenda: A - controle negativo (sem tratamento); B - EMB-jul 50mg/kg; C – EMB-jul 125mg/kg; D – EMB-jul 250mg/kg; E - controle positivo (cimetidina 100 mg/kg);
Como é possível observar na figura 31, o modelo de lesão gástrica induzida
por etanol danifica e necrosa a mucosa gástrica ocasionando extensas áreas
hemorrágicas, principalmente no grupo controle negativo (A), comprovando a
66
gastrotoxicidade desse agente, que promove alteração da homeostase celular
desencadeando danos teciduais resultantes de sua ação na mucosa e aumento na
geração de espécies reativas de oxigênio (EROs) (BASTING et al., 2014).
As plantas possuem alguns nutrientes que funcionam como agentes
antioxidantes, ou seja, combatem ou diminuem a geração de ERO’s. Os seres
humanos podem se beneficiar dessas substâncias por meio da alimentação,
principalmente das vitaminas e minerais como o α-tocoferol (vitamina E), -caroteno,
selênio e ácido ascórbico (vitamina C) (ROSA, 2013).
Além desses nutrientes, o seu sistema de defesa das plantas produz
metabólitos secundários, de acordo com sua necessidade. Muitos metabólitos
secundários possuem atividade antioxidante e são testados em modelos de
gastroproteção, dentre eles os flavonoides e terpenos, que foram os principais
metabólitos encontrados nas folhas da E. involucrata (KLEIN-JÚNIOR et al., 2012).
A atividade antioxidante é amplamente estudada no gênero Eugenia, e muitas
espécies tem essa capacidade já foi comprovada em estudos, como é o caso da
Eugenia dysenterica (PRADO et al., 2014), Eugenia bracteata (HEMALATHA;
SATYANARAYANA; ALEKHYANJALI, 2008) e a Eugenia copacabanensis
(CARVALHO JR. et al., 2014).
Essa capacidade pode ser atribuída a grande quantidade de compostos
fenólicos encontrados nesse gênero. Dentre os compostos fenólicos mais
encontrados nas espécies de Eugenia, podemos citar as catequinas, substância que
também foi isolada no presente estudo (MAGINA, 2008).
A presença de terpenos nesse gênero também é comum, e levando em conta
que esses compostos são potentes gastroprotetores, pesquisadores avaliaram a
atividade antiúlcera e gastroprotetora do extrato metanólico bruto das folhas Eugenia
umbelliflora e os resultados foram muito significativos. No modelo de úlcera induzida
por etanol o percentual de inibição variou de 64,8-82,8% nas doses de 50, 125 e 250
mg/kg administradas em camundongos por via oral. No modelo da indometacina foi
avaliada apenas a dose de 250 mg/kg e o percentual de inibição foi de 76,9%. No
modelo de úlcera induzida por stress o potencial antiúlcera na dose de 50mg/kg foi
de 61,7, na dose de 125 mg/kg foi de 91,3% e na dose de 250 mg foi observada
uma inibição de 94-6%. Os autores atribuíram a forte atividade gastroprotetora e
antiúlcera à grande quantidade de triterpenos presentes no extrato (MEYRE-SILVA
et al., 2009).
67
Em estudo recente, Basting e colaboradores (2014) avaliaram o potencial
gastroprotetor do extrato hidroalcólico das folhas de Eugenia punicifolia em
camundongos. As doses utilizadas foram de 125, 250 e 500 mg/kg em dois modelos
distintos, o de úlcera induzida por etanol e também por indometacina. No primeiro
modelo houve uma diminuição de 88,4 a 99,8% de lesões nos estômagos e no
segundo modelo foi observada uma diminuição de 53 a 72,3% de lesões. Os autores
analisaram também o mecanismo de ação do extrato e concluíram que o efeito
gastroprotetor ocorreu devido ao aumento da produção de muco, sem produzir
nenhum efeito antisecretor.
No modelo de indução com etanol, o extrato hidroetanólico da folha de
Eugenia jambolana, apresentou atividade gastroprotetora, sendo que a dose de 400
mg/kg apresentou em relação ao grupo controle resultados extremamente
significativos, demonstrando mais eficácia que o fármaco empregado como
referência (lansoprazol) (DONATINI et al., 2009).
Os autores sugeriram que a presença de flavonoides e taninos, verificados na
triagem fitoquímica da planta, pode ter sido responsáveis pela ação antiúlcera do
extrato, já que os taninos possuem a propriedade de formar complexos com
macromoléculas, como proteínas e polissacarídeos levado à formação de uma
camada protetora na mucosa do estômago, possibilitando mais resistência a
agressões químicas e/ou mecânicas (DONATINI et al., 2009).
O trabalho de Prado e colaboradores (2014) encontrou ótimos resultados de
gastroproteção para folhas de Eugenia dysenterica e os autores também
relacionaram a atividade gastroprotetora à presença de taninos condensados no
extrato aquoso testado. Além disso, também foi identificada a presença da catequina
no mesmo extrato.
Dessa maneira, levando em consideração a presença dos compostos
químicos encontrados na espécie estudada no presente trabalho e as atividades
biológicas documentadas, sugere-se que os compostos fenólicos (como a (-)-
catequina) e os terpenos presentes podem ser responsáveis por parte da atividade
gastroprotetora do EMB das folhas de E. involucrata na úlcera aguda induzida por
etanol.
Os mecanismos de ação pelo qual o extrato age precisam ser avaliados com
metodologia específica, no entanto, de acordo com a literatura relatada, pertinente à
68
plantas do mesmo gênero, sugere-se que o potencial gastroprotetor do extrato se dê
pela atividade antioxidante e aumento da produção de muco.
Os resultados encontrados no presente estudo corroboram com a utilização
das folhas da E. involucrata em forma de chás para o tratamento de má-digestão,
que acontece com frequência na medicina tradicional. Os solventes utilizados para a
extração no presente estudo são distintos daquele utilizado na medicina tradicional,
geralmente a água quente. Esta diferença pode modificar os resultados encontrados.
Por esta razão, é preciso realizar testes adicionais, com outro tipo de extração,
outras doses e em outros modelos experimentais para validar o uso popular.
69
6 CONCLUSÕES
O estudo fitoquímico das folhas da Eugenia involucrata possibilitou o
isolamento de três substâncias da Fração Clorofórmio, duas delas inéditas, a
substância 7-9 e a 3-6 (que foi confirmada como um acetilado da 7-9) e outra
identificada como fitol. Outras três substâncias foram isoladas da Fração Acetato de
Etila, uma delas já identificada como (-)-catequina e outras duas em fase de
elucidação estrutural.
Os extratos de verão e inverno comparados por CLAE se mostraram
semelhantes, mas com diferenças importantes em alguns tempos de retenção
específicos. Observou-se ainda, predominância da catequina no inverno, sendo ela
a substância majoritária em ambos os extratos.
A triagem dos extratos e frações realizada por diferentes testes biológicos
evidenciou resultados promissores. No ensaio microbiológico foi possível observar
uma moderada atividade antimicrobiana, principalmente no extrato bruto metanólico
para algumas bactérias Gram-positivas e a levedura Candida albicans.
Nos testes in vivo, evidenciou-se uma eficaz atividade antinociceptiva,
observada com maior potência na Fração Clorofórmio e na substância 7-9, isolada
desta mesma fração, com resultados superiores aos dos fármacos utilizados
convencionalmente. Observou-se também uma redução de lesões gástricas
induzidas por etanol no teste de atividade gastroprotetora.
Os resultados encontrados fundamentam, em parte, o uso popular da planta
para o tratamento de má-digestão e infecções, no entanto, a forma diferenciada de
extração realizada no estudo em comparação com os chás utilizadoss na medicina
tradicional precisam ser melhor avaliados para validar o uso popular desta planta.
70
REFERÊNCIAS
AGUIAR, J. S.; ARAÚJO, R. O.; DO DESTERRO RODRIGUES, M.; SENA, K. X.; BATISTA, A. M.; GUERRA, M. M.; OLIVEIRA, S. L.; TAVARES, J. F.; SILVA, M. S.; NASCIMENTO, S. C. Antimicrobial, antiproliferative and proapoptotic activities of extract, fractions and isolated compounds from the stem of erythroxylum caatingae plowman. International Journal of Molecular Sciences, v. 13, n. 4, p. 4124-4140, 2012. AHMED, F.; TOUME, K.; SADHU, S. K.; OHTSUKI, T.; ARAI, M. A.; ISHIBASHI, M. Constituents of Amoora cucullata with trail resistance-overcoming activity. Organic and Biomolecular Chemistry, v.8, p.3696–3703, 2010. ALMEIDA, D. J. de; FARIA, M. V.; SILVA, P. R. da. Biologia experimental em Pitangueira: uma revisão de cinco décadas de publicações científicas. Ambiência Guarapuava, v.8, n.1 p.177 - 193 Jan./Abr. 2012. ALMEIDA, R. N.; NAVARRO, D. S.; BARBOSA-FILHO, J. M. Plants with central analgesic activity. Phytomedicine, v.8, p.310-322, 2001. ALQASOUMI, S.; AL-SOHAIBANI, M.; AL-HWIRINY, T.; AL-YAHAYA, M.; RAFATULLAH, S. Rocket “Eruca sativa”. A salad herb with potential gastrict anti-ulcer activity. World Journal of Gastroenterology, v. 15, n. 16, p. 1958-1965, 2009. ALVES, L. F. Produção de Fitoterápicos no Brasil: história, problemas e perspectivas. Revista Virtual de Química, v.5, n.3, p.450-513, 2013. AMORIM, A. C. L.; LIMA, C. K. F.; HOVELL, A. M. C.; MIRANDA, A. L. P.; REZENDE, C. M. Antinociceptive and hypothermic evaluation of the leaf essential oil and isolated terpenoids from Eugenia uniflora L. (Brazilian Pitanga). Phytomedicine, v.16, p.923–928, 2009. ANDERSON, M. J.; LIN, Y.-C.; GILLMAN, A. N.; PARKS, P. J.; SCHLIEVERT, P. M.; PETERSON, M. L. Alpha-toxin promotes Staphylococcus aureus mucosal biofilm formation. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology, v. 2, n. 64, p. 1-10, 2012.
ANGELY, J. A. Myrtaceae. In: Fl. Anal. Fitogeográfica Estado São Paulo, v.3, p.548–610, 1970. AYRES, M. C. C.; CHAVES, M. H.; RINALDO, D.; VILEGAS, W.; VIEIRA JÚNIOR, G. M. Constituintes químicos e atividade antioxidante de extratos das folhas de Terminalia fagifolia Mart. et Zucc. Química Nova. v.32, n.6, p.1509-1512, 2009. AZEVEDO, P. R.; SILVA, L. C. N.; SILVA, A. G.; MACEDO, A. J.; ARAÚJO, J. M.; SILVA, M. V. Antimicrobial activity and phytochemical screening of branches, fruits and leaves of Eugenia brejoensis. Scientia Plena, v.8, n.5, 2012. BAG, A.; BHATTACHARYYA, S. K.; PAL, N. K.; CHATTOPADHYAY, R. R. In vitro antibacterial potential of Eugenia jambolana seed extracts against multidrug-
71
resistant human bacterial pathogens. Microbiological Research, v.167, n.6, p.352-357, jun. 2012. BAHMANI, M.; SHIRZAD, H.; MAJLESI, M.; SHAHINFARD, N.; RAFIEIAN-KOPAEI, M. A review study on analgesic applications of Iranian medicinal plants. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine, v.7, supl.1, p.43-53, 2014.
BASSETTI, M.; RIGHI, E. Multidrug-resistant bacteria: what is the threat? ASH Education Program Book, v. 2013, n. 1, p. 428-432, 2013. BASTING, R. T.; NISHIJIMA, C. M.; LOPES, J. A.; SANTOS, R. C.; PÉRICO, L. L.; LAUFER, S.; BAUER, S.; COSTA, M. F.; SANTOS, L. C.; ROCHA, L. R. M.; VILEGAS, W.; SANTOS, A. R. S.; SANTOS, C. DOS; HIRUMA-LIMA, C. A. Antinociceptive, anti-inflammatory and gastroprotective effects of ahydroalcoholic extract from the leaves of Eugenia punicifolia (Kunth) DC. in rodents. Journal of Ethnopharmacology, v.157, p.257–267, 2014. BARREIRO, E. J. Biodiversidade: fonte potencial para a descoberta de fármacos. Química Nova, v. 32, n. 3, p. 679-688, 2009.
BELLA CRUZ, A.; EGER, I.; BUENO, E. C.; FREITAS, R. A. Cap. VII. Métodos “in vitro” na avaliação da atividade biológica de produtos naturais e sintéticos. In: BRESOLIN, T. M. B.; CECHINEL FILHO, V. Fármacos e medicamentos: uma abordagem multidisciplinar. São Paulo: Ed. Santos, 2010, 417p. BOLZANI, V. da S.; FLAUSINO JUNIOR, O.; VALLI, M. In: YUNES, R. A.; CECHINEL FILHO, V. (Orgs.). Química de produtos naturais, novos fármacos e a moderna farmacognosia. Itajaí: UNIVALI, 2012. 383p. BOORHEM, R. L.; LAGE, E. B. Drogas e Extratos Vegetais Utilizados em Fitoterapia. Revista Fitos, v. 4, n. 1, p. 37-55, 2009. BRASIL. Ministério da Saúde. Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). Resolução – RDC nº 20 de 9 de maio de 2011. Dispõe sobre o controle de medicamentos à base de substâncias classificadas como antimicrobianos, de uso sob prescrição, isolados ou em associação. Disponível em: <
http://www.anvisa.gov.br/sngpc/Documentos2012/RDC%2020%202011.pdf?jornal=...(Acessadol> Acesso em 23 de agosto de 2014. BRASIL. Ministério da Saúde. Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). Resolução - RDC Nº 26, de 13 de maio de 2014. Dispõe sobre o registro de medicamentos fitoterápicos e o registro e a notificação de produtos tradicionais fitoterápicos. Disponível em: <http://www.brasilsus.com.br/legislacoes/rdc/103507-14.html> Acesso em 28 de julho de 2014. BRZOZOWSKI, T. Experimental production of peptic ulcer gastric damage and cancer models and their use in pathophysiological studies and pharmacological treatment. Journal of Physiology and Pharmacology, v. 54, n. 3, p. 99-126, 2003.
72
CAMPOS-BUZZI, F.; CAMPOS, J. P.; TONINI, P. P.; CORRÊA, R.; YUNES, R. A.; BOECK, P.; CECHINEL-FILHO, V. Antinociceptive effects of synthetic chalcones obtained from xanthoxyline. Archives of Pharmazie, v. 339, p. 361-365, 2006.
CANTRELL, C. L.; LU, T.; FRONCZEK, F. R.; FISCHER, N. H.; ADAMS, L. B.; FRANZBLAU, S. G. Antimycobacterial cycloartanes from Borrichia frutescens. Journal of Natural Products, v.59, p.1131-1136, 1996. CALIXTO, J. B.; BEIRITH, A.; FERREIRA, J.; SANTOS, A. R. S.; CECHINEL FILHO, V.; YUNES, R. A. Naturally occurring antinociceptive substances from plants. Phytotherapy Research, v.14, p.401–418, 2000. CARVALHO, P. E. R. Espécies arbóreas brasileiras. Brasília, DF: Embrapa: informação tecnológica; Colombo: Embrapa Florestas, v.3, 2008. CARVALHO JUNIOR, A. R. de; GOMES, G. A.; FERREIRA, R. O.; CARVALHO, M. G. de. Constituintes químicos e atividade antioxidante de folhas e galhos de Eugenia copacabanensis Kiaersk (Myrtaceae). Química Nova, v.37, n.3, p.477-482, 2014.
CECHINEL FILHO, V.; YUNES, R. A. Estratégias para a Obtenção de Compostos Farmacologicamente Ativos a partir de Plantas Medicinais. Conceitos sobre Modificação Estrutural para Otimização da Atividade. Química Nova, v. 21, n. 1, p. 99-105, 1998. CECHINEL FILHO, V.; YUNES, R. A. Estudo químico de plantas medicinais orientado para análise biológica. Obtenção, determinação e modificação estrutural de compostos bioativos. In: CALIXTO, J. B.; YUNES, R. A. (Eds.). Plantas medicinais sob a ótica da química medicinal moderna. Chapecó: Argos, 2001. 523p. CECHINEL FILHO, V.; YUNES, R. A. Novas perspectivas dos produtos naturais na química medicinal moderna. In: YUNES, R. A.; CECHINEL FILHO, V. (Orgs.). Química de produtos naturais, novos fármacos e a moderna farmacognosia. Itajaí: UNIVALI, 2012. 383p. CHATURVEDI, A.; KUMAR, M. M.; BHAWANI, G.; CHATURVEDI, H.; KUMAR, M.; GOEL, R. K. Effect of Ethanolic Extract of Eugenia Jambolana seeds on gastric ulceration and secretion in rats. Indian Journal of Physiology and Pharmacology. v.51, n.2, p.131-140, 2007. CHAVASCO, J. M.; PRADO E FELIPHE, B. H. M.; CERDEIRA, C. D.; LEANDRO, C. D.; COELHO, L. F. L; SILVA, J. J.; CHAVASCO, J. K.; DIAS, A. L. T. Evaluation of antimicrobial and cytotoxic activities of plant extracts from southern Minas Gerais cerrado. Revista do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo, v.56, n.1, p.13-20, Jan./Fev. 2014. CLSI - Clinical and Laboratory Standards Institute. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically, Approved Standard M07-A8. CLSI, Wayne, PA, 2009.
73
COLE, R. A.; HABER, W. A.; SETZER, W. N. Chemical composition of essential oils of seven species of Eugenia from Monteverde, Costa Rica. Biochemical Systematics and Ecology, v.35, p. 877-886, 2007. COLLA, A. R. S.; MACHADO, D. G.; BETTIO, L. E. B.; COLLA, G.; MAGINA, M. D. A.; BRIGHENTE, I. M. C.; RODRIGUES, A. S. Involvement of monoaminergic systems in the antidepressant-like effect of Eugenia brasiliensis Lam. (Myrtaceae) in the tail suspension test in mice. Journal of Ethnopharmacology, v.143, p.720–731, 2012. COSTA, B. B. C.; CORRÊA, R. SOUZA, M. M. de; PRETO, J. B.; ARDENGHI, J. V.; CAMPOS-BUZZI, F. de; CECHINEL FILHO, V. Antinociceptive effects of tetrahydrophtalamides and related compounds. Zeitschrift für Naturforschung, v.62, p. 201-206, 2007. CRAGG, G. M.; NEWMAN, D. J. Natural products: a continuing source of novel drug leads. Biochimica et Biophysica Acta n.1830, p.3670–3695, 2013. CRAGG, G. M.; GROTHAUS, P. G.; NEWMAN, D. J. New Horizons for Old Drugs and Drug Leads. Journal of Natural Products., v.77, n.3, p.703–723, 2014. CRUZ, A. V. M.; KAPLAN, M. A. C. Uso medicinal de espécies das famílias Myrtaceae e Melastomataceae no Brasil. Floresta e Ambiente, v.11, p.47-52, 2004. DAMETTO, A. C. Estudo químico e avaliação da atividade biológica de Eugenia brasiliensis e Eugenia involucrata (Myrtaceae). 169f. Tese (Doutorado) – Universidade Estadual Paulista, Instituto de Química, Araraquara, 2014. DONATINI, R. S.; ISHIKAWA, T.; BARROS, S. B. M.; BACCHI, E. M. Atividades antiúlcera e antioxidante do extrato de folhas de Syzygium jambos (L.) Alston (Myrtaceae). Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 19, n. 1A, p. 89-94, 2009. DUARTE, A. R.; NAVES, R. R.; SANTOS, S. C.; SERAPHINC, J. C.; FERRI, P. H. Genetic and environmental influence on essential oil composition of Eugenia dysenterica. Journal of Brazilian Chemical Society, v.21, n.8, p. 1459-1467, 2010. ESPINEL-INGROFF, A.; PFALLER, M. A. Antifungal agents and susceptibility testing. In: MURRAY, P. R.; BARON, E. J.; PFALLER, M. A.; TENOVER, F. C.; YOLKEN, R. H. Manual of Clinical Microbiology, 6 ed. Washington: ASM, 1995. FERREIRA, F. P. S.; MORAIS, S. R.; BARA, M. T. F.; CONCEICÃO, E. C.; PAULA, J. R.; CARVALHO, T. C.; VAZ, B. G.; COSTA, H. B.; ROMÃO, W.; REZENDE, M. W. Eugenia calycina Cambess extracts and their fractions: Their antimicrobial activity and the identification of major polar compounds using electrospray ionization FT-ICR mass spectrometry. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, v.99, p.89–96, 2014. FIGUEIREDO, C. A. de; GURGEL, I. G. D.; GURGEL JR, G. F. A Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos: construção, perspectivas e desafios. Physis, v.24, n.2, p.381-400, 2014.
74
FIRENZUOLI, F.; GORI, I.; NERI, D. Clinical phytotherapy: opportunities and problematics. Annali dell Instituto Superiore di Sanita, v. 41, n. 1, p. 27-33, 2005.
FLOCH, M. H. Gastrite. In: FLOCH, M. H.; MACG, M. D. Gatroenterologia de Netter. Porto Alegre: Artmed, 2007. p. 209-215. GASTALHO, S.; SILVA, G. J.; RAMOS, F. Uso de antibióticos em aquacultura e resistência bacteriana: Impacto em saúde pública. Acta Farmacêutica Portuguesa, v.3, n.1, p. 28-44, 2014. GILIOLI, A. Análise fitoquímica e atividade biológica de Eugenia umbelliflora. 2010. 103f. Dissertação (Mestrado) – Pós Graduação em Química, Universidade Federal de Santa Catarina – UFSC, Florianópolis, 2010.
GOBBO-NETO, L.; LOPES, N. P. Plantas medicinais: fatores de influência no conteúdo de metabólitos secundários. Química Nova, v.30, n.2, p.374-381, 2007. GOLDSTEIN, R. E. R.; MICALLEF, S. A.; GIBBS, S. G.; DAVIS, J. A.; HE, X.; GEORGE, A.; KLEINFELTER, L. M.; SCHREIBER, N. A.; MUKHERJEE, S.; SAPKOTA, A. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (mrsa) detected at four US wastewater treatment plants. Environmental Health Perspectives, v.120, n.11, p.1551-1558, 2012. GRESSLER, E.; PIZO, M. A.; MORELLATO L. P. C. Polinização e dispersão de sementes em Myrtaceae do Brasil. Revista Brasileira de Botânica, v.29, n.4, p.509-530, out./dez. 2006. GUIMARÃES, A. G.; QUINTANS, J. S. S.; QUINTANS, L. J., Jr. Monoterpenes with analgesic activity--a systematic review. Phytotherapy Research, v. 27, n. 1, p. 1–15, 2013. GUIMARÃES, A. G.; MELO, M. S.; BONFIM, R. R.; PASSOS, L. O.; MACHADO, S. M. F.; RIBEIRO, A. DE S.; SOBRAL, M.; THOMAZZI, S. M.; QUINTANS-JÚNIO, L. J. Antinociceptive and anti-inflammatory effects of the essential oil of Eugenia candolleana DC., Myrtaceae, on mice. Revista Brasileira de Farmacognosia. v.19, n.4, p.883-887, out./dez. 2009.
HEMALATHA, E.; SATYANARAYANA, T.; ALEKHYANJALI, G. In vitro antioxidant and free radical scavenging activity of Eugenia bracteata Roxb. International Journal of Chemical Sciences., v.6, n.2, p.1061-1066, 2008.
HIRUMA-LIMA, C. A.; GRACIOSA, J. S.; RODRIGUEZ, J. A.; HAUN, M.; NUNES, D. S.; BRITO, A. R. M. S. Gastroprotective effect of essencial oil from Croton cajucara Benth. (Euphobiaceae). Journal of Ethnopharmacology, v. 69, n. 3, p. 229-234, 2000.
75
HOLETZ, F.B.; PESSINI, G. L.; SANCHES, N. R.; CORTEZ, D. A. G.; NAKAMURA, C. V.; DIAS FILHO, B. P. Screening of some plants used in the Brazilian folk medicine forthe treatment of infectious diseases, Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, v.97, n.7, p.1027–1031, 2002. HUNT, R.H. Review article: the unmet needs in delayed-release proton-pump inhibitor therapy in 2005. Pharmacology, v.3, p.10–19, 2005. INFANTE, J. Composição fenólica e atividade antioxidante de polpa, casca, semente e folha de espécies frutíferas nativas do Brasil. 2013. 113f. Dissertação (Mestrado) – Pós Graduação em Ciência e Tecnologia dos Alimentos, Universidade de São Paulo - USP, Piracicaba, 2013. JOSHI, B. SAH, G. P.; BASNET, B. B.; BHATT, M. R.; SHARMA, D.; SUBEDI, K.; PANDEY J.; MALLA, R. Phytochemical extraction and antimicrobial properties of different medicinal plants: Ocimum sanctum (Tulsi), Eugenia caryophyllata (Clove), Achyranthes bidentata (Datiwan) and Azadirachta indica (Neem). Journal of Microbiology and Antimicrobials, v.3, n.1, p.1-7, Jan. 2011. KLAUMANN, P.R.; WOUK, A.F.P.F.; SILLAS, T. Patofisiologia da dor. Archives of Veterinary Science, v.13, n.1, p.1-12, 2008. KLEIN-JÚNIOR, L. C.; SANTIN, J. R.; NIERO, R.; ANDRADE, S. F.; CECHINEL-FILHO, V. The therapeutic lead potential of metabolites obtained from natural sources for the treatment of peptic ulcer. Phytochemistry Reviews, v.11, n.4, p.567-616, 2012. LAKSHMI, V et al. Gedunin and Photogedunin of Xylocarpus granatum show significant anti-secretory effects and protect the gastric mucosa of peptic ulcer in rats. Phytomedicine, v.17, p. 569-574, 2010. LATTUADA, D. S.; SOUZA, P. V. D. de; GONZATTO, M. P. Enxertia herbácea em Myrtaceae nativas do Rio Grande do Sul. Revista Brasileira de Fruticultura, v.32, n.4, p.1285-1288, 2010. LEITE, P. E. C.; LIMA-ARAÚJO, K. G.; FRANÇA, G. R.; LAGROTA-CANDIDO, J.; SANTOS, W. C.; QUIRICO-SANTOS, T. Implant of polymer containing pentacyclic triterpenes from Eugenia punicifolia inhibits inflammation and activates skeletal muscle remodeling. Archives of Immunology and Experimental Therapy. v.62, p.483–491, 2014. LEMOS, M.; SANTIN, J. R.; KLEIN JUNIOR, L. C.; NIERO, R.; ANDRADE, S. F. Gastroprotective activity of hydroalcoholic extract obtained from the leaves of Brassica oleracea var. acephala DC in different animal models. Journal of Ethnopharmacology, v. 138, n.2, p. 503-507, 2011.
LI, F.; AWALE, S.; ZHANG, H.; TEZUKA, Y.; ESUMI, H.; KADOTA, S. Chemical constituents of propolis from myanmar and their preferential cytotoxicity against a human pancreatic cancer cell line. Journal of Natural Products, v.72, p.1283–1287, 2009.
76
LINGARAJU, M. C.; ANAND, S.; BALAGANUR, V.; KUMARI, R. R.; MORE, A. S.; KUMAR, D.; BHADORIA, B. K.; TANDAN, S. K. Analgesic activity of Eugenia jambolana leave constituent: A dikaempferol rhamnopyranoside from ethyl acetate soluble fraction. Pharmaceutical Biology, v.52, n.8, p.1069–1078, 2014. LORENZI, H. Árvores brasileiras: manual de identificação e cultivo de plantas arbóreas nativas do Brasil. 4. ed. Nova Odessa: Instituto Plantarum, 2002. 368p. LUNARDI, I; PEIXOTO, J. L. B.; SILVA, C. C. DA; SHUQUEL, I. T. A.; BASSO, E. A.; VIDOTTI, G. J. Triterpenic acids from Eugenia moraviana. Journal of the Brazilian Chemical Society. v.12, n.2, p.180-183, 2001. MACHADO, K. E.; CECHINEL FILHO, V.; TESSAROLO, M. L.; MALMANN, L.; MEYRE-SILVA, C.; BELLA CRUZ, A. Potent antibacterial activity of Eugenia umbelliflora. Pharmaceutical Biology. v.43, .n.7, p.636-639, 2005. MAGINA, M. D. A. Estudo fitoquímico e biológico de espécies do gênero Eugenia. 2008. 117f. Tese (Doutorado) – Curso de Pós Graduação em Química, Universidade Federal de Santa Catarina - UFSC, Florianópolis, 2008. MAGINA, M. D. A.; DALMARCO, E.; WISNIEWSKI JR, A.; SIMIONATTO, E.; DALMARCO, J.; PIZZOLATTI, M.; BRIGHENTE, I. Chemical composition and antibacterial activity of essential oils of Eugenia species. Journal of Natural Medicines, v.63, n.3, p.345-350, 2009. MAGINA, M. D. A.; DALMARCO, E. M.; DALMARCO, J. B.; COLLA, G.; PIZZOLATTI, M. G.; BRIGHENTE, I. M. C. Bioactive triterpenes and phenolics of leaves of Eugenia brasiliensis. Química Nova. v. 35, n.6, p.1184-1188, 2012. MAGINA, M. D. A.; GILIOLI, A.; MORESCO, H. H.; COLLA, G.; PIZZOLATTI, M. G.; BRIGHENTE, I. M. C. Atividade antioxidante de três espécies de Eugenia (Myrtaceae). Latin American Journal Pharmacy. v.29 n.3 p.376-82, 2010. MALFERTHEINER, P.; MEGRAUD, F.; O'MORAIN, C.; BAZZOLI, F.; EL‐OMAR, E.; GRAHAM, D.; HUNT, R.; ROKKAS, T.; VAKIL, N.; KUIPERS, E. J. Current concepts in the management of Helicobacter pylori infection: the Maastricht III Consensus Report. Gut; v.56, p. 772–81, 2007. MALHEIROS, A.; BITTENCOURT, C. M. S.; NIERO, R.; CECHINEL FILHO, V. Considerações gerais sobre aspectos químicos e biológicos de plantas medicinais. In: CECHINEL FILHO, V.; BRESOLIN, T. M. B. (Orgs). Fármacos e medicamentos, uma abordagem multidisciplinar. São Paulo: Santos, 2010. 416p. MARTINELLI, L. M. B.; BOAS, P. J. F. V.; QUELUZ, T. T.; YOO, H. H. B. Determinantes morfológicos de prognóstico em pneumonia nosocomial: um estudo em autópsias. Jornal Brasileiro de Pneumologia, v.36, n.1, p.51-58, 2010.
77
MAATTA, K.; KAMAL-ELDIN, A.; TORRONEN, R. High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) Analysis of Phenolic Compounds in Berries with Diode Array and Electrospray Ionization Mass Spectrometric (MS) Detection: Ribes Species. Journal of Agricultural and Food Chemistry. v.51, p.6736−6744, 2003. MAZZARI, A. L. D. A.; PRIETO, J. M. Herbal medicines in Brazil: pharmacokinetic profile and potential herb-drug interactions. Frontiers in Pharmacology, v.5, p.1-12, Jul. 2014. MEYRE-SILVA, C.; PETRY, C. M.; BERTÉ, T. E.; BECKER, R. G.; ZANATTA, F.; DELLE-MONACHE, F.; CECHINEL FILHO, V.; ANDRADE, S. F. Phytochemical analysis and gastroprotective effects of Eugenia umbelliflora (Myrtaceae) on experimental gastric ulcers. Natural Product Comunications, v.4, p.1-6, 2009.
MIZUI, T.; DOTEUCHI, M. Effect of polyamines on acidified ethanol-induced gastric lesion in rats. The Japanese Journal of Pharmacology, v. 33, n. 5, p. 939-945, 1983. NEWMAN, D. J.; CRAGG, G. M. Natural Products as Sources of New Drugs over the 30 Years from 1981 to 2010. Journal of Natural Products, v. 75, n. 3, p.311-335, 2012. NEERGHEEN, V. S.; SOOBRATTEE, M. A.; BAHORUN, T.; ARUOMA, O. I. Characterization of the phenolic constituents in Mauritian endemic plants as determinants of their antioxidant activities in vitro. Journal of Plant Physiology, v. 163, n. 8, p. 787-799, 2006.
NETO, O. A.; COSTA, C. M. de C.; SIQUEIRA, J. T. T. de. Dor princípios e prática. Porto Alegre: ArtMed, 2009. NIERO, R.; MALHEIROS, A.; BITTENCOURT, C. M. S.; BIAVATTI, M. W.; LEITE, S. N.; CECHINEL FILHO, V. Aspectos químicos e biológicos de plantas medicinais e considerações sobre fitoterápicos. In: CECHINEL FILHO, V.; BRESOLIN, T. M. B. (Orgs). Ciências Farmacêuticas: contribuição ao desenvolvimento de novos fármacos e medicamentos. Itajaí: UNIVALI, 2003. 239p. OLIVEIRA, L. G.; PUPO, M. T.; VIEIRA, P. C. Explorando produtos naturais microbianos nas fronteiras da química e da biologia. Química Nova, v. 36, n. 10, p. 1577-1586, 2013. OLIVEIRA, M. A.; BARRETO, A. A. O.; QUITANS JÚNIOR; L. J.; GUIMARÃES, A. G. Aplicação de terpenos como agentes analgésicos: uma prospecção tecnológica. International Symposium on technological innovation, Aracaju/SE, Brasil, v.2, n.1, p.33-39, set. 2014. PADUCH, R. et al. Terpenes: substances useful in human healthcare. Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis, v.55, n.5, p.315–327, 2007.
78
POLSKI, A.; KASPEREK, R.; SOBOTKA-POLSKA, K.; POLESZAK, E. Review on analgesic effect of co-administrated ibuprofen and caffeine. Current Issues in Pharmacy and Medical Sciences. v.27, n.1, p.10-13, 2014. PRADO, L. C. DA S.; SILVA, D. B.; OLIVEIRA-SILVA, G. L. DE; HIRAKI, K. R. N.; CANABRAVA, H. A. N.; BISPO-DA-SILVA, L. B. The Gastroprotective Effects of Eugenia dysenterica (Myrtaceae) Leaf Extract: The Possible Role of Condensed Tannins. Biological and Pharmaceutical Bulletin. v.37, n.5, p.722–730, 2014. PRIMROSE, J. N. Stomach and duodenum. In: RUSSELL, R. C. G, WILLIAMS, N. S, BULSTRODE, C. J. K. (eds). Bailey and Love’s short practice of surgery. London: Arnold, 2004. ROCHA, A. P. C.; KRAYCHETE, D. C.; LEMONICA, L.; CARVALHO, L. R de; BARROS, G. A. M. de; GARCIA, J. B. dos S.; SAKATA, R. K. Pain: current aspects on peripheral and central sensitization. Revista Brasileira de Anestesiologia. v.57, n.1, p.94-105, 2007. ROMAGNOLO, M. B.; SOUSA, M. C. O. Gênero Eugenia L. (Myrtaceae) na planície alagável do alto Rio Paraná, estados de Mato Grosso do Sul e Paraná, Brasil. Acta Botanica Brasilica, v. 20, n.3, 2006. ROSA, R. L. da. Avaliação do potencial gastroprotetor e antiúlcera das sementes da Eugenia involucrata DC. (cereja do mato) e Artocarpus heterophyllus Lam. (jaca) em roedores. 2013. 107f. Dissertação (Mestrado) – Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas, Universidade do Vale do Itajaí - UNIVALI, Itajaí, 2013. SAHA, S.; SUBRAHMANYAM, E. V. S., KODANGALA, C.; MANDAL, S. C.; SHASTRY, S. C. Evaluation of antinociceptive and anti-inflammatory activities of extract and fractions of Eugenia jambolana root bark and isolation of phytoconstituents. Revista Brasileira de Farmacognosia, v.23, n.4, Jul./Aug. 2013. SANTOS, C. C. DE M. P.; SALVADORI, M. S.; MOTA, V. G.; COSTA, L. M.; ALMEIDA, A. A. C. de; OLIVEIRA, G. A. L. de; COSTA, J. P.; SOUSA, D. P. de; FREITAS, R. M. de; ALMEIDA, R. N. de. Antinociceptive and antioxidant activities of phytol in vivo and in vitro models. Neuroscience Journal, v.2013, p.1-9, 2013. SANTOS, R.M.; OLIVEIRA, M.S.; FERRI, P.H.; SANTOS, S.C. Seasonal variation in the phenol content of Eugenia uniflora L. leaves. Revista Brasileira de Plantas Medicinais, v.13, n.1, p.85-89, 2011. SAUSEN, T. L.; LOWE, T. R.; FIGUEIREDO, L. S.; BUZATTO, C. R. Avaliação da atividade alelopática do extrato aquoso de folhas de Eugenia involucrata DC. e Acca sellowiana (O. Berg) Burret. Polibotánica [online]. n.27, p.145-158, 2009. SCARPIGNATO, C. New drugs to suppress acid secretion: current and future developments. Drug Discovery Today., v.4, n.3, P.155-163, 2007.
79
SERAFIN, C.; NART, V.; MALHEIROS, A.; SOUZA, M. M. de; FISCHER, L.; DELLE MONACHE, G.; DELLE MONACHE, F.; CECHINEL FILHO, V. Bioactive phenolic compounds from aerial parts of Plinia glomerata. Zeitschrift für Naturforschung, v.62, n.3-4, p.196—200, 2007. SHAMS-UD-DOHA, K. M.; AKTER, M.; AL MAHMUD, Z.; APU, A. S.; HOWLADER, M. A. Antinociceptive activity of the methanol extracts of leaves of Eugenia fruticosa (Roxb.) and Glycosmis pentaphylla (Retz.) in Swiss albino mice. Journal of Applied Pharmaceutical Science. v.2, n.4, p.99-102, 2012. SILVA, S. M. M. da. Avaliação da Atividade Antimicrobiana de Espécies Vegetais do Bioma Cerrado. Brasília, 2013. Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) - Faculdade de Ciências da Saúde, Universidade de Brasília, Brasília, 2013.
SILVA, N. C. C.; FERNANDES JÚNIOR, A. Biological properties of medicinal plants: a review on their antimicrobial activity. The Journal of Venomous Animals and Toxins including Tropical Diseases, v.16, n.3, p. 402-413, 2010. SILVA, J. C.; SARAIVA, S. R. G DE L.; OLIVEIRA JÚNIOR, R. G. de; ALMEIDA, J. R. G. da S. Modelos experimentais para avaliação da atividade antinociceptiva de produtos naturais: uma revisão. Revista Brasileira de Farmacognisia. v.94, n.1, p.18-23, 2013. SOLL, A. H.; GRAHAM, D. Y. Peptic ulcer disease. In: TADATAKA, Y. Textbook of Gastroenterology. v.2, 5.ed, Wiley: Blackwell Publishing, 2009. 3712p.
SOUZA, L. G. S.; ALMEIDA, M. C. S.; MONTE, F. J. Q.; SANTIAGO, G. M. P.; BRAZ-FILHO, R.; LEMOS, T. L. G.; GOMES, C. L.; NASCIMENTO, R. F. do. Constituintes químicos de Capraria biflora (Scrophulariaceae) e atividade larvicida de seu óleo essencial. Química Nova, v.35, n.11, p.1-8, 2012. SOUZA, M. M de. et al. Métodos de avaliação de atividade biológica de produtos naturais e sintéticos. In: BRESOLIN, T.M.B.; CECHINEL FILHO, V. (Org) Ciências Farmacêuticas: contribuição ao desenvolvimento de novos fármacos e medicamentos. Itajaí: UNIVALI, 2003. SRINIVAS, T. L.; LAKSHMI, S. M.; SHAMA, S. N.; REDDY, G. K.; PRASANNA, K. R. Medicinal plants as anti-ulcer agents. Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry, v.2, n.4, p.91-97, 2013. STIEVEN, C.; MOREIRA, J. J. S.; SILVA, C. F. Óleos essenciais de uvaia (Eugenia pyriformis Cambess): avaliação das atividades microbiana e antioxidante. Eclética Química, São Paulo, v.34, n.3, p.7-13, 2009. TANWAR, J.; DAS, S.; FATIMA, Z.; HAMEED, S. Multidrug Resistance: An Emerging Crisis. Interdisciplinary Perspectives on Infectious Diseases, v.1, 7 páginas, 2014. Disponível online: <http://dx.doi.org/10.1155/2014/541340>. Acesso em 26 de agosto de 2014.
80
TULASSAY, Z.; HERSZENYI, L. Gastric mucosal defense and cyto protection. Best Practice & Research Clinical Gastroenterology, v. 24, p. 99-108, 2010. VILEGAS, W.; CARDOSO, C. A. L.; QUEVEDO, A. E. P. Controle Químico de Qualidade de Fitoterápicos e Plantas Medicinais. In: YUNES, R. A.; CECHINEL FILHO, V. (Orgs.). Química de produtos naturais, novos fármacos e a moderna farmacognosia. Itajaí: UNIVALI, 2012. 383p. WALLACE, J. L.; MILLER, M. J. S. Nitric oxide in mucosal defense: A little goes along way. Gastroenterology, v. 119, n. 2, p. 512-520, 2000. WHO - World Health Organization. Cancer pain relief. Geneva, 1996. WILSON, P. G.; O’BRIEN, M. M., HESLEWOOD, M. M.; QUINN, C. J. Relationships within Myrtaceae sensu lato based on a matK phylogeny. Plant Systematics and Evolution, v.251, p.3-19, 2005. ZHANG A.; WAN, L.; WU, C.; ZHANG, Z.; WANG, H. Simultaneous Determination of 14 Phenolic Compounds in Grape Canes by HPLC-DAD-UV Using Wavelength Switching Detection. Molecules, v.18, p.14241-14257, 2013.
