GIOVANA VECHI

ESTUDOS QUMICOS E BIOLGICOS in vitro E in vivo DE

DIFERENTES PARTES DE Eugenia mattosii

Itaja (SC)

2018

UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJA

PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM CINCIAS

FARMACUTICAS

REA DE CONCENTRAO EM PRODUTOS NATURAIS E

SUBSTNCIAS SINTTICAS BIOATIVAS

GIOVANA VECHI

ESTUDOS QUMICOS E BIOLGICOS in vitro E in vivo DE

DIFERENTES PARTES DE Eugenia mattosii

Tese submetida Universidade do Vale do

Itaja como parte dos requisitos para a

obteno do grau de Doutor em Cincias

Farmacuticas.

Orientador: Prof. Dr. Valdir Cechinel Filho

Itaja (SC)

Maro, 2018

Ficha Catalogrfica

V494e Vechi, Giovana, 1987-

Estudos qumicos e biolgicos in vitro e in vivo de diferentes partes de Eugenia mattosii [Manuscrito] / Giovana Vechi. - Itaja, SC. 2018.

194 f. ; il. ; tab. ; graf. ; fig.

Bibliografias f. 173-194 (Cpia de computador (Printout(s)).

Tese submetida Universidade do Vale do Itaja como parte dos requisitos

para a obteno do grau de Doutor em Cincias Farmacuticas.

Orientador: Prof. Dr. Valdir Cechinel Filho.

1. Eugenia (Planta). 2. Plantas medicinais. 3. Farmacologia.

I. Universidade do Vale do Itaja. II. Ttulo.

CDU: 615.32

Bibliotecria Eugenia Berlim Buzzi CRB - 14/963

Dedico essa conquista aos meus familiares, que nunca mediram esforos para que meus

sonhos se tornassem realidade.

Obrigada por estarem sempre presentes!

AGRADECIMENTOS

Ao Professor Valdir Cechinel Filho, por me acompanhar nessa

trajetria como professor e amigo, e confiar em mim em todos os

momentos.

Aos meus pais Jane e Juca, por sempre me apoiarem e

incentivarem meus estudos, me deram amor e carinho e me ajudaram a

me tornar a pessoa que sou.

toda minha famlia e amigos pelo apoio, carinho e amor em

tantos momentos importantes.

Aos membros da banca, Prof. Dr. Rivaldo Niero, ProfaDr Priscila

de Souza, Prof. Dr. Caio Maurcio Mendes de Crdova e Profa Dr. Maria

de Lourdes Leite de Moraes.

Aos meus colegas do laboratrio, s minhas amigas Cechinets

(Adriana, Adrielli, Camila, Fabile e Lusa) e todas as amizades que esse

caminho me proporcionou.

Aos colaboradores e coordenao do Programa de Ps-

Graduao em Cincias Farmacuticas, Prof. Dr. Clvis Antonio

Rodrigues, Juliano dos Santos e Helenise Heyse Moreria.

todas as pessoas que enriqueceram este trabalho com sua

disponibilidade na realizao dos testes biolgicos in vivo e in vitro.

os professores (Prof. Dr Srgio Faloni de Andrade, Lusa Motta

da Silva e Priscila de Souza), Ps-doutoranda Rita de Cssia M. V de

A. F da Silva, e aos alunos do laboratrio de farmacologia.

Ao prof. Dr. Luiz Carlos Klein Jr. e a Profa. Dra. Ftima de

Campos-Buzzi e seus respectivos alunos.

s instituies parceiras que auxiliaram nas avaliaes do

potencial antiproliferativo (Universidade de So Paulo USP),

antimicoplasmtico (Universidade Regional de Blumenau) e

antiparasitria (Universidad Mayor de San Andrs, La Paz, Bolvia)

Ao Prof. Thodoro Marcel Wagner, Pedro Pablo Perez Netto e

Prof. Rogrio Corra pela ajuda nas tcnicas de CLAE, RMN e CG/EM,

e ao prof. Dr. Franco Delle Monache (Roma/Itlia) pela inestimvel ajuda

na elucidao estrutural de algumas molculas.

s pessoas que me acompanharam e auxiliaram nos quatro

meses de doutora-sanduche no CIPRONA (San Jos Costa Rica), em

especial aos que acompanharam e auxiliaram meu trabalho, Lorena

Hernandez-Gmez, Alice L. Prez, Rosaura Romero, Victor Vsquez e

Godofredo Solano.

s agncias de fomento: CAPES, pela concesso da minha

bolsa e CNPq e FAPESC pelo auxlio financeiro ao laboratrio.

Talvez no tenha conseguido fazer o melhor, mas lutei para

que o melhor fosse feito. No sou o que deveria ser, mas graas a

Deus, no sou o que era antes

(Marthin Luther King)

ESTUDOS QUMICOS E BIOLGICOS in vitro E in vivo DE

DIFERENTES PARTES DE Eugenia mattosii Giovana Vechi

Maro/2018

Orientador: Prof. Dr. Valdir Cechinel Filho

rea de Concentrao: Produtos naturais e substncias sintticas bioativas

Nmero de Pginas: 194

As plantas medicinais produzem compostos bioativos com grande potencial

farmacolgico e teraputico sendo amplamente utilizadas na medicina

tradicional para tratar diversas enfermidades. O gnero Eugenia apresenta

metablitos importantes associados diversas atividades biolgicas. Tendo em

vista os escassos dados na literatura sobre a Eugenia mattosii, conhecida como

cambu, o objetivo deste trabalho foi avaliar a sua composio qumica, variao

sazonal e potencial biolgico/farmacolgico. Folhas e caules passaram por

extrao e partio com solventes de diferentes polaridades, e as respectivas

fraes acetato de etila e clorofrmio passaram por processos cromatogrficos,

levando ao isolamento de seis substncias: pinostrobin, cryptostrobin, fitol, cido

urslico, avicularin e (-)-catequina. Os extratos, fraes e substncias isoladas

foram avaliadas em relao ao seu potencial biolgico in vivo (atividade

antinociceptiva, gastroprotetora e vasorelaxante) e in vitro (antiproliferativa,

anticolinestersica, antiparasitria e antimicoplasmtica). O pinostrobin e

algumas fraes de E. mattosii apresentaram promissora atividade

antimicoplasmtica. Ambos extratos brutos e as fraes apresentaram potencial

antinociceptivo, assim como as substncias isoladas, especialmente o avicularin.

A avaliao da atividade gastroprotetora no apresentou resultados promissores.

O extrato e a frao clorofrmio das folhas apresentam atividade antiproliferativa

significativa, sendo esta influenciada pela presena de pinostrobin e

cryptostrobin. Atividade anticolinestersica foi observada para ambos extratos e

fraes acetato de etila. Resultados significativos foram evidenciados para os

extratos, fraes das folhas, (-)-catequina e cryptostrobin com relao ao efeito

vasorelaxante em animais normotensos e espontaneamente hipertensos.

Atividade antiparasitria para leishmaniose foi demonstrada pela frao

clorofrmio e para giardase pelo pinostrobin. Concluindo, pode-se afirmar que

a planta avaliada tem grande potencial biolgico e mais estudos podem ser

realizados a fim de descobrir novas atividades para folhas e caules de E. Mattosii,

bem como a presena de outros princpios ativos produzidos em menores

propores.

Palavras-chave: Eugenia mattosii, fitoqumica, flavonoides, potencial

antimicoplasmtico, atividade antinociceptiva, gastroproteo, efeito

vasorelaxante, anticncer, ao antiparasitria, atividade anticolinestersica.

CHEMICAL AND BIOLOGICAL in vitro AND in vivo STUDIES

OF DIFFERENT PARTS OF Eugenia mattosii

Giovana Vechi

March/2018

Advisor: Valdir Cechinel Filho, Doctor

Area of Concentration: Natural products and synthetic bioactive compounds

Number of Pages: 194

Medicinal plants produce bioactive compounds with good pharmacological and

therapeutic potential, and for this reason they are used in traditional medicine to

treat various diseases. The Eugenia genus presents important metabolites

associated with several biological activities. Considering the scarce data in the

literature on Eugenia mattosii, known as Cambui, the aim of this study was to

evaluate its chemical composition, seasonal variation and pharmacological

potential. Leaves and stems were extracted and partitioned with solvents of

different polarities, and the respective ethyl acetate and chloroform fractions

submitted to chromatographic processes, leading to the isolation of six

compounds: pinostrobin, cryptostrobin, phytol, ursolic acid, avicularin and (-)-

catechin. The extracts, fractions and isolated substances were evaluated for their

biological potential in vivo (antinociceptive, gastroprotective and vasorelaxant

activity) and in vitro (antiproliferative, anticholinesterase, antiparasitic and

antimycoplasmic). Pinostrobin and some fractions of E. mattosii showed

promising antimycoplasmic activity. Both extracts and fractions presented

antinociceptive potential, as did the isolated substance avicularin. The evaluation

of gastroprotective activity did not present promising results. The extract and

chloroform fraction of the leaves presented significant antiproliferative activity,

being influenced by the presence of pinostrobin and cryptostrobin.

Anticholinesterasic activity was observed for both extracts and ethyl acetate

fractions. Significant results were evidenced for the extracts, leaf fractions, (-)-

catechin and cryptostrobin in relation to its vasorrelaxant effect in normotensive

and spontaneously hypertensive animals. Antiparasitic activity for leishmaniosis

was demonstrated for the chloroform fraction and for giardiasis by pinostrobin.

In conclusion, it can be stated that the evaluated plant has good biological

potential, and further studies are needed to discover new activities for the leaves

and stems of E. Mattosii, as well as the presence of other active principles

produced in smaller proportions.

Keywords: E. mattosii, phytochemistry, flavonoids, antimycoplasmic potential,

antinociceptive activity, gastroprotection, vasorelaxant effect, anticancer,

antiparasitic action, antycholinesterasic activity.

LISTA DE ABREVIATURAS

ABIFISA Associao brasileira de empresas do setor fitoterpico, suplemento

alimentar e de promoo da sade

ACh Acetilcolina

AChE Acetilcolinesterase

AINE anti-inflamatrio no-esteroidal

AM Azul de metileno

ANVISA - Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria

ATCC - American Type Culture Collection (Coleo de tipos de cultura

Americana)

BPI base peak intensity (intensidade do pico base)

CAT extrato de alcaloides padronizado de Galipea longiflora

CC coluna cromatogrfica

CCD cromatografia em camada delgada

CIM concentrao inibitria mnima

CG/EM cromatografia gasosa acoplada espectro de massas

cGMP - Guanosina monofosfato cclica

DA Doena de Alzheimer

DMEM - meio de cultura Dulbeccos modified Eagles

DMSO dimetilsulfxido

EARP software de anlise de imagens

EDTA - Ethylenediamine tetraacetic acid (cido etilenodiamino tetra-actico)

EMB extrato metanlico bruto

FAE frao acetato de etila

FCL frao clorofrmio

FE Fenilefrina

FURB Universidade Regional de Blumenau

IASP International Association for the Study of pain (Associao Internacional

para o Estudo da Dor)

INCA Instituto nacional do Cncer

i.p. via intraperitoneal

L-NAME - N()-nitro-L-arginina metil ester

MTT Metil-tiazolil-tetrazlio

NIQFAR Ncleo de Investigaes Qumico-Farmacuticas

NRT Ratos wistar normotensos

OMS Organizao Mundial da Sade

PPGCF Programa de Ps-Graduao em Cincias Farmacuticas

PBS Physiological buffered saline (Tampo salina fosfato)

PMS - Metossulfato de fenazina

PSS Physiological saline solution (Soluo salina fisiolgica)

RMN H ressonncia magntica nuclear de hidrognio

RMN C ressonncia magntica nuclear de carbono

RPMI - Meio de cultura Roswell Park Memorial Institute

SBF Soro bovino fetal

SHR Ratos wistar espontaneamente hipertensos

SNC Sistema nervoso central

SUS Sistema nico de sade

TYI-S-33 Meio de cultura para Giardia

UPLC - Ultra performance liquid chromatography (Cromatografia lquida de alta

performance)

UV ultravioleta

v.o. Via oral

XTT Tetrazolium Salt (Sal de tetrazlio)

SUMRIO

CAPTULO I ................................................................................................... 19

1 INTRODUO ............................................................................................. 21

2 OBJETIVOS .................................................................................................. 23

2.1 Objetivo Geral ............................................................................................ 23

2.2 Objetivos Especficos .................................................................................. 23

CAPTULO II ................................................................................................. 25

1 PLANTA MEDICINAIS E FITOTERAPIA ............................................................... 27

1.1 Aspectos gerais ........................................................................................... 27

1.2 Mercado ...................................................................................................... 30

2 ASPECTOS RELACIONADOS PLANTA EUGENIA MATTOSII ................................ 33

2.1 A famlia Myrtaceae ................................................................................... 33

2.2 O gnero Eugenia ....................................................................................... 33

2.3 A espcie Eugenia mattosii ......................................................................... 39

3 POTENCIAL BIOLGICO DE PLANTAS MEDICINAIS ............................................ 41

3.1 Ativiadade antibaceriana ............................................................................ 41

3.2 Atividade gastroprotetora ........................................................................... 43

3.3 Atividade antinociceptiva ........................................................................... 45

3.4 Atividade antiproliferativa .......................................................................... 48

3.5 Atividade anticolinestersica ...................................................................... 50

3.6 Atividade hipotensiva .................................................................................. 52

3.7 Atividade antiparasitria ............................................................................ 54

CAPTULO III ............................................................................................... 57

1 ANLISE FITOQUMICA .................................................................................... 59

2 IDENTIFICAO E QUANTIFICAO DE SUBSTNCIAS ISOLADAS POR UPLC-

PDA/ESI -QTOF ................................................................................................... 69

CAPTULO IV ................................................................................................ 71

COMPOSIO QUMICA E ATIVIDADE ANTIMICOPLASMTICA DE

EXTRATOS, FRAES E SUBSTNCIAS ISOLADAS DAS FOLHAS E

CAULES DE Eugenia mattosii ............................................................................

CAPTULO V ................................................................................................. 85

AVALIAO DA ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA E

GASTROPROTETORA DE EXTRATOS, FRAES E SUBSTNCIAS

ISOLADAS DAS FOLHAS E CAULES DE Eugenia mattosii ..

CAPTULO VI ............................................................................................. 101

ATIVIDADE ANTIPROLIFERATIVA in vitro DO EXTRATO

METANLICO, FRAES E COMPOSTOS ISOLADOS DAS FOLHAS DE

Eugenia mattosii ..................................................................................................

CAPTULO VII ............................................................................................ 113

ATIVIDADE ANTICOLINESTERSICA DO EXTRATO METANLICO,

FRAES E SUBSTNCIAS ISOLADAS DAS FOLHAS E CAULES DE

Eugenia mattosii ...................................................................................................

CAPTULO VIII .......................................................................................... 133

EFEITO VASORELAXANTE DOS EXTRATOS, FRAES E COMPOSTOS

ISOLADOS DAS FOLHAS E CAULES DE Eugenia mattosii...........................

CAPTULO IV ............................................................................................. 159

ATIVIDADE ANTIPARASITRIA in vitro DE EXTRATO, FRAES E

COMPOSTOS ISOLADOS DAS FOLHAS DE Eugenia mattosii.......................

CAPTULO X ................................................................................................169

CONSIDERAES FINAIS ....................................................................... ..169

REFERNCIAS ........................................................................................... ..173

19

CAPTULO I

Introduo e Objetivos

20

21

1 INTRODUO

O tratamento de enfermidades com o uso de plantas medicinais to

antigo quanto a prpria humanidade e as evidncias desta utilizao vo desde

documentos escritos at monumentos muito bem preservados. Este uso o

resultado de anos de luta contra diferentes doenas, onde o homem aprendeu a

buscar medicamentos em cascas, sementes, razes, frutos, folhas e flores de

diferentes plantas (ALVES; PONTES, 2017; PETROVSKA, 2012).

Alguns exemplos desta utilizao so o pio (Papaver somnniferum)

e a maconha (Cannabis sativa), utilizados h mais de 4.000 anos. O estudo dos

constituintes das plantas, no entanto, se iniciou apenas no sculo 19, quando

vrias substncias importantes comearam a ser isoladas e estudadas, incluindo

a morfina, codena, cafena, atropina, salicina, entre outros (CECHINEL FILHO;

YUNES, 2016).

Segundo Newman e Cragg (2016), a maior parte dos medicamentos

disponveis no mercado farmacutico atualmente foram desenvolvidos a partir

de produtos naturais. O percentual de medicamentos naturais ou derivados de

produtos naturais muito significativo, sendo que nas reas de agentes

neoplsicos e antimicrobianos, o percentual de 75% e 73%, respectivamente.

A qumica medicinal moderna vem identificando e validando a ao

de diversas plantas utilizadas em tratamentos tradicionais por meio da pesquisa

fitoqumica e farmacolgica, e inmeros medicamentos derivados de produtos

naturais j so utilizados na medicina convencional (CECHINEL FILHO;

YUNES, 2016; PETROVSKA, 2012).

O desenvolvimento destes medicamentos pode se dar por meio de

extratos, fraes, substncias isoladas, modificaes estruturais feitas a partir de

sua estrutura qumica ou tambm por sntese de anlogos. Os avanos da cincia

nesta rea so grandes, porm o alto custo com as pesquisas um fator limitante.

Por esta razo ainda existem muitas espcies que so utilizadas popularmente

22

sem respaldo cientfico quanto sua eficcia e segurana (NEWMAN; CRAGG,

2012).

O Brasil o pas detentor da maior biodiversidade vegetal do planeta,

alm de possuir um vasto conhecimento popular em relao ao uso de plantas

medicinais e ter tradio em pesquisa fitoqumica, rea em que os cientistas

brasileiros vem publicando muitos artigos. Por outro lado, falta apoio e interesse

de indstrias farmacuticas brasileiras em obter parcerias com universidades e

avanar nos estudos para o desenvolvimento de novos medicamentos de origem

vegetal (DUTRA et al., 2016; CECHINEL FILHO, 2017).

A famlia Myrtaceae uma das mais importantes da biodiversidade

brasileira, pois abriga grande variedade de plantas medicinais com importantes

metablitos secundrios, como terpenos, flavonoides e taninos. O gnero

Eugenia um dos mais importantes desta famlia e conta com espcies de alto

potencial farmacolgico, como a E. uniflora, E. dysenterica, E. jambolana, E.

brasiliensis, E. umbelliflora e E. fruticosa. Muitas destas espcies apresentam

propriedades biolgicas, tais como: atividade antioxidante, diurtica,

antimicrobiana, gastroprotetora, antiproliferativa, antinociceptiva, anti-

inflamatria, anti-hipertensiva, antidiarreica, antidepressiva e hipoglicemiante

(BAG et al., 2012; BASTING et al, 2014; MAGINA, 2008; PRADO et al., 2014;

SHAMS-UD-DOHA et al, 2012, TENFEN et al., 2017, CHAREPALLI et al.,

2016, MEYRE-SILVA et al., 2009).

Tendo em vista o potencial fitoquimico e farmacolgico do gnero

Eugenia, surge a hiptese de encontrar novas substncias bioativas na espcie

Eugenia mattosii, uma planta comum da regio sul do Brasil, popularmente

conhecida como cambu ou pitanguinha de mattos e que ainda no foi avaliada

quanto ao seu potencial biolgico (LEGRAND, 1969; SOBRAL et al., 2009).

Desta forma, o objetivo dopresente trabalho foi avaliar a composio

qumica e o potencial farmacolgico de diferentes partes de Eugenia mattossii.

23

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

Isolar e identificar princpios ativos de diferentes partes de Eugenia

mattosii, verificar a variao sazonal dos seus metablitos secundrios e avaliar

o seu potencial biolgico.

2.2 Objetivos Especficos

- Preparar extratos e fraes das diferentes partes de Eugenia mattosii

(caules e folhas) e avaliar em diferentes modelos experimentais in vivo e in vitro.

- Selecionar as fraes mais ativas para isolamento de princpios ativos

via mtodos de cromatografia convencionais (colunas cromatogrficas,

cromatografia em camada delgada);

- Identificar os princpios ativos obtidos por tcnicas espectroscpicas

usuais (CG/EM e RMN);

- Realizar estudos de controle de qualidade considerando a variao

sazonal dos extratos por UPLC-PDA/ESI+ - QTOF;

- Avaliar a atividade biolgica das substncias obtidas em diferentes

modelos experimentais in vitro como: atividade antiproliferativa, atividade

antibacteriana, antiparasitria e anticolinestersica;

- Avaliar a atividade biolgica das substncias obtidas em diferentes

modelos experimentais in vivo como: atividade antinociceptiva, efeito

gastroprotetor e efeito vasorrelaxante;

- Comparar o efeito biolgico dos princpios ativos obtidos com

medicamentos usados na clnica.

24

25

CAPTULO II

Reviso Bibliogrfica

26

27

1 PLANTAS MEDICINAIS E FITOTERAPIA

1.1 ASPECTOS GERAIS

As plantas medicinais vm sendo utilizadas como agentes teraputicos

em muitas culturas desde a antiguidade. Evidncias histricas e arqueolgicas

demostram a utilizao de produtos naturais na medicina tradicional de diversas

civilizaes antigas como: China, ndia, Egito e Grcia. Os relatos mais

consistentes so da medicina tradicional chinesa e da medicina ayurvdica, que

at os dias atuais guiam muitas pesquisas cientficas (ALVES; PONTES, 2017;

BRUSOTTI et al., 2014).

Segundo a OMS, cerca de 65-80% da populao mundial utiliza plantas

medicinais como primeiro recurso teraputico no tratamento de doenas. Essa

utilizao se d principalmente porque as plantas apresentam efeitos benficos

para o tratamento de diversas doenas e na maior parte das vezes possuem poucos

efeitos colaterais e baixo custo (MAZZARI; PRIETO, 2014; RAHMAN;

SINGHAL, 2002). No Brasil, a realidade semelhante, uma vez que 66% dos

brasileiros no tem acesso aos medicamentos tradicionais (TROJAN-

RODRIGUES et al., 2012).

No Brasil, o uso de plantas medicinais iniciou-se na poca dos ndios, e

logo em seguida houve a insero dos conhecimentos dos negros e europeus

(principalmente portugueses) na medicina popular brasileira. A fitoterapia se

fazia muito importante naquela poca porque nas reas rurais do pas, os mdicos

eram escassos. O conhecimento tradicional dessas culturas ainda hoje de grande

importncia para a etnofarmacologia, guiando os primeiros passos de muitas

pesquisas na rea das plantas medicinais (ALVES, 2013; NEWMANN;

CRAGG, 2012).

As plantas possuem uma vasta diversidade de molculas qumicas, uma

vez que produzem metablitos secundrios importantes para sua prpria

28

sobrevivncia. Estes metablitos possuem uma infinita diversidade de estruturas

qumicas e so os responsveis por grande parte das atividades biolgicas

descobertas e j descritas para as plantas medicinais. Estima-se que j foram

identificados aproximadamente 120 mil compostos naturais provenientes de

plantas de todo o mundo (CECHINEL FILHO; YUNES, 2016).

As plantas so capazes de desenvolver estratgias de proteo contra

diferentes fatores estressantes. Como mecanismos de defesa, desenvolvem

barreiras fsicas (produzem espinhos e pelos glandulares, por exemplo), e

barreiras qumicas, como os metabolitos secundrios. Estes compostos atuam na

defesa contra predadores e agentes patognicos, inibindo o crescimento e

desenvolvimento de insetos, aumentando a atrao de polinizadores, resistncia

a vrus, proteo contra a radiao e como agentes antioxidantes. Os metablitos

secundrios variam qualitativamente e quantitativamente entre diferentes pocas

do ano (MASA et al., 2016).

Estes compostos qumicos servem para o desenvolvimento de

medicamentos, pois assim como atuam na defesa das plantas, podem atuar na

defesa dos seres vivos. Atualmente 44% dos medicamentos disponveis no

mercado so provenientes de produtos naturais ou derivados dos mesmos, e este

nmero tende a crescer ainda mais. A cincia tm ajudado a comprovar a eficcia

do uso tradicional de muitas plantas e estruturado sua utilizao de forma segura

para a populao. Atenta a este fato, a indstria farmacutica mundial vem

percebendo essa demanda e inserindo no mercado novos medicamentos

derivados de produtos naturais (NEWMANN; CRAGG, 2016; CRAGG;

NEWMANN, 2013).

Na busca por novos fitoterpicos, a pesquisa etnofarmacolgica uma

pea fundamental, que visa conhecer o uso tradicional das plantas para guiar a

anlise fitoqumica e biolgica inicial. Seguindo esta primeira etapa, a anlise

fitoqumica busca conhecer os constituintes qumicos da espcie e isolar as

29

substncias presentes para o segundo passo, que a pesquisa farmacolgica.

Nesta etapa testam-se extratos, fraes e substncias puras em diferentes

modelos experimentais, com a utilizao de animais e/ou testes in vitro

(BRUSOTTI, 2014; MALHEIROS et al., 2010; CECHINEL FILHO, 2017).

Durante a pesquisa preciso tambm levar em considerao as

variaes temporais e espaciais do contedo total de metablitos secundrios

produzidos pelas plantas nas diferentes horas do dia, pocas do ano ou nveis de

maturao. Apesar de serem as mesmas geneticamente, a expresso gnica pode

sofrer modificaes resultantes da interao de processos bioqumicos,

fisiolgicos, ecolgicos e evolutivos (GOBBO-NETO; LOPES, 2007).

Alguns pases ao redor do mundo so classificados como

megabiodiversos, por apresentarem uma vasta diversidade de biomas e

consequentemente grandes possibilidades na busca por novos compostos

bioativos. O Brasil est na lista dos 15 pases com maior biodiversidade do

mundo, e esta lista tambm inclui: China, ndia, Costa Rica, Indonsia, Congo,

Equador, Madagascar, Panam, Peru, Colmbia, Equador, Malsia, Mxico e

Austrlia (ALVES; PONTES, 2017).

Vale ressaltar que das cerca de 250.000 espcies existentes no mundo,

apenas 5-15% j foram estudadas, e mesmo assim no em sua plenitude. Esse

nmero mostra a infinidade de metablitos secundrios e estruturas qumicas que

podem ajudar na descoberta de novos compostos com poucos ou nenhum efeito

colateral para o tratamento de muitas doenas que hoje em dia so denominadas

focos de estudo: cncer, doenas cardiovasculares, doenas do sistema nervoso

central, doenas anti-inflamatrias e infecciosas (WAGNER, 2016, JTTE et al.,

2017).

Dentre os biomas brasileiros a mata atlntica vem se destacando por ser

considerada um dos hotspots da biodiversidade mundial. Ela apresenta grande

riqueza de espcies vegetais, apesar de toda a devastao sofrida ao longo dos

30

anos por parte da humanidade (BOLZANI; FLAUSINO-JUNIOR; VALLI,

2016). Dentro deste bioma, a famlia Myrtaceae uma importante representante

de espcies com caractersticas qumicas promissoras e potencial biolgico j

comprovados. Esta famlia abriga o gnero Eugenia, objeto de estudo da presente

pesquisa.

1.2 MERCADO DOS FITOTERPICOS

Os medicamentos fitoterpicos representam uma poro significativa do

mercado mundial de medicamentos, com crescimento nas vendas de 15% ao ano

contra 4% do setor de frmacos sintticos (RODRIGUES, 2016). No Brasil, esse

mercado comeou a se expandir recentemente e movimenta cerca de 500 milhes

de dlares por ano, segundo estimativas da Associao Brasileira da Indstria de

Fitoterpicos (ABIFISA) (ABIFISA, 2017).

O mercado mundial de medicamentos fitoterpicos movimenta mais

dinheiro em pases desenvolvidos, principalmente os da Europa (50% somente

na Alemanha), fato interessante, pois estes pases detm pouca biodiversidade.

Em contrapartida, a Amrica Latina, com sete pases considerados

megabiodiversos (Brasil, Colmbia, Costa Rica, Equador, Mxico, Panam e

Peru) representam apenas 5% desse mercado (ALVES, 2013).

Alm da questo financeira, os pases desenvolvidos tambm

pesquisam mais na rea de fitoterpicos. Um estudo recente demonstra a forte

ligao entre publicaes na rea de produtos naturais com o ndice de

Desenvlvimento Humano (IDH). Dentre os pases com maior ndice, se destacam

tambm queles que mais publicam nesta rea, e so justamente os pases menos

megabiodiversos (pases europeus e da amrica do norte), com mais de 50% das

publicaes. Dentre os que possuem megabiodiversidade, o Brasil o terceiro

que mais publica artigos relacionados produtos naturais, depois de China e

ndia (ALVES; PONTES, 2017).

31

No Brasil, dos mais de 10.000 artigos sobre plantas medicinais

publicados por cientistas brasileiros entre 2011 e 2013 e da grande

biodiversidade brasileira (o pas detm 20-22% do total de espcies de plantas

medicinais existentes no mundo), apenas um medicamento fitoterpico

legitimamente brasileiro encontrado atualmente como um dos 20 fitoterpicos

mais vendidos nas farmcias brasileiras, o Acheflan, antiinflamatrio de uso

tpico (DUTRA et al., 2016).

Alm disto, o mercado brasileiro de fitoterpicos movimenta cerca de

261 milhes de dlares, o que representa 5% do mercado total de medicamentos.

Pode-se concluir que ainda h muito trabalho a ser desenvolvido entre academia

e as indstrias farmacuticas para que novos medicamentos fitoterpicos

cheguem ao mercado (DUTRA et al., 2016).

Segundo dados recentes, existem 332 medicamentos registrados a

base de produtos naturais e 27 combinados, totalizando 359 registros no Brasil.

Destes, 145 devem ser vendidos com prescrio mdica, um deles com reteno

da receita. Considerando a vasta biodiversidade brasileira e o potencial para

produo de fitoterpicos, poucos so os produtos disponveis no mercado

atualmente (CARVALHO et al, 2017).

No entanto, o sistema mdico no pas ainda prioriza o tratamento

convencional, apesar da grande fonte de recursos naturais disponveis na rica

biodiversidade brasileira. O governo brasileiro vem tentando ampliar as opes

teraputicas ofertadas pelo Sistema nico de sade (SUS), incluindo o tratamento

com plantas medicinais. Em 2006 foi ento criada a Poltica Nacional de Plantas

Medicinais e Fitoterpicos, em vigor at os dias de hoje (FIGUEIREDO;

GURGEL; GURGEL JR., 2014).

Entre 2013 e 2015, o Ministrio da Sade registrou um aumento de

161% na procura pelos medicamentos fitoterpicos no SUS. Talvez esta

expressiva mudana seja decorrente de outras aes governamentais que

32

impulsionaram a prescrio por parte dos profissionais da sade, como

lanamento do Memento Fitoterpico em 2016, importante documento que guia

a prescrio de espcies vegetais (CECHINEL FILHO, 2017).

Alm desta ao, em 2016 ainda foi lanada a Poltica e Programa

Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterpicos, que tem como objetivo garantir

o uso seguro, racional e sustentvel das plantas medicinais, alm de desenvolver

uma cadeia produtiva e a indstria nacional de fitoterpicos (CECHINEL

FILHO, 2017).

33

2. ASPECTOS RELACIONADOS PLANTA EM ESTUDO

2.2 A FAMLIA Myrtaceae

A famlia Myrtaceae uma das mais importantes da biodiversidade

brasileira, compreendendo cerca de 100 gneros e 3.500 espcies de rvores e

arbustos. Ela est distribuda por todos os continentes, nas regies tropicais e

subtropicais e no Brasil ela pode encontrada predominantemente no sul.

(GRESSLER; PIZO; MORELLATO, 2006).

Wilson e colaboradores (2005) classificaram esta famlia em duas

subfamlias, Myrtoideae e Psiloxyloideae e 17 tribos. No Brasil so encontradas

somente espcies da subfamlia Myrtoideae, de apenas uma tribo, Myrteae, que

por sua vez se divide em trs subtribos Eugeniinae, Myrciinae e Myrtinae. Os

gneros mais importantes (que possuem mais de 100 espcies), so Eugenia,

Myrcia e Calyptranthes.

As mirtceas, como so chamadas no Brasil, abrigam numerosas

espcies medicinais e frutferas bastante conhecidas e comercializadas, como a

Psidium guajava L (goiabeira), a Myrciaria cauliflora Berg (jabuticabeira) e a

Eugenia uniflora L. (pitangueira), e por essa razo elas so economicamente

muito importantes. O gnero mais importante das mirtceas o gnero Eugenia,

com 1.200-1800 espcies (tambm conhecido como gnero Syzygium)

(BRIGGS; JOHNSON, 1979; MCVAUGH, 1968; GRESSLER; PIZO;

MORELLATO, 2006).

2.3 O GNERO Eugenia

O gnero Eugenia um dos mais importantes da sua famlia, possuindo

350 a 400 espcies nativas no Brasil, muito utilizadas na medicina tradicional

para tratar inmeras enfermidades. O seu potencial biolgico vem sendo muito

34

estudado e as pesquisas tm mostrado um grande nmero de resultados positivos

(MAGINA et al., 2009; QUEIROZ et al, 2015).

As plantas do gnero Eugenia apresentam rvores ou arbustos verdes

durante o ano todo. Seu fruto esfrico e geralmente comestvel, constitudo de

uma baga de at 3 centmetros de dimetro, coroado pelo clice e achatado nas

extremidades (AURICCHIO; BACCHI, 2003).

As espcies deste gnero so amplamente estudadas por apresentarem

grande potencial farmacolgico e importantes metablitos secundrios. A

espcie E. uniflora, conhecida popularmente como pitangueira, a planta mais

estudada, e tem aplicao diurtica, antifngica, antimicrobiana, antidiabtica,

antirreumtica, gastroprotetora, entre outros (ALMEIDA; FARIA; SANTOS et

al., 2011).

Alm da pitanga, podem ser citadas muitas outras como a Eugenia

dysenterica (Cagaita), utilizada no tratamento de diarreia e lcera (DUARTE et

al., 2010; PRADO et al., 2014); Eugenia pyriformis (Uvaia), com propriedades

antimicrobianas (CHAVASCO et al., 2014; STIEVEN; MOREIRA; SILVA,

2009); Eugenia jambolana (Jamelo ou Joo-bolo), com potencial

gastroprotetor, antiproliferativo, antidiabtico e antimicrobiano

(CHATUVERDI et al., 2007; BAG et al., 2012; CHAREPALLI et al., 2016);

Eugenia brasiliensis (Grumixama), utilizada como agente antimicrobiano e

antiproliferativo, alm de ser usada tratamento de diarreia e reumatismo

(COLLA et al., 2012; MAGINA et al., 2009; MAGINA et al., 2012; TEIXEIRA

et al., 2017), a Eugenia umbelliflora (Baguau), com propriedade

gastroprotetora, antimicrobiana, antileishmanicida (CECHINEL et al., 2013;

FAQUETTI et al., 2015; MAGINA et al., 2009; MEYRE-SILVA et al., 2009) e

a Eugenia euosma, (conhecida como Guamirim ou Murta), com potencial de

inibio da adipognese, sendo um aliado para o tratamento da obesidade

(OIKAWA et al., 2016).

35

2.3.1 Composio qumica

Dados sobre o perfil qumico das espcies de Eugenia demonstram uma

composio qumica bastante ampla, que varia de acordo com o estgio de

desenvolvimento e principalmente em funo das variaes climticas

(QUEIROZ et al., 2015).

Muitos compostos j foram isolados de espcies de Eugenia, dentre

eles: compostos fenlicos (olivetol), flavonoides (keampferol, quercetina,

isoquercetina, quercitrina, rutina, myricitrina, myricitina, catequina,

epicatequina) antocianinas, taninos (cido elgico, acido glico, metill gallato,

casuarinina), triterpenos (cido betulnico, betulina, -amirina, -amirina, cido

urslico, cido oleanlico, nilocitina, cido maslnico) e esterides (-sitosterol,

stigmasterol) (TENFEN et al., 2018).

As classes de compostos mais importantes do gnero Eugenia so os

terpenoides e os flavonoides. Os flavonoides so compostos facilmente

encontrados em diversas espcies de Eugenia, sendo os mais conhecidos a

quercetina, mirecetina, canferol e as catequinas (QUEIROZ et al., 2015).

Os metablitos fenlicos so vastos na natureza, sendo abundantes em

frutas, vegetais e algumas plantas medicinais. A ingesto de algumas classes

especficas destas substncias na dieta (flavonis, antocianinas,

proantocianidinas, flavonas, flavanonas e catequinas) est fortemente

relacionada preveno de doenas cardiovasculares, que atualmente so a

principal causa de morte nos pases desenvolvidos (WANG et al., 2014).

Os mecanismos pelos quais este compostos atuam como

cardioprotetores esto relacionados ao seu efeito antioxidante, vasodilatador e

atividade anti-inflamatria. Estas atividades relatadas tambm so relacionadas

preveno de doenas neurodegenerativas e cncer, pois ambas doenas tem

suas respectivas patogneses ligadas ao estresse oxidativo (MUSCHIETTI,

MARTINO, 2016; WANG et al., 2014).

36

Os flavonoides so produtos de origem biossinttica mista, sintetizados

atravs da via do cido chiqumico (ou chiquimato) e tambm do acetato (acetil

coenzima A). A via do cido chiqumico origina o cido cinmico e seus

derivados (cidos cafeico, ferlico, sinpico, etc.). A via do acetato origina um

tricetdeo, que pode ser condensado com algum derivado de cido cinmico,

gerando uma chalcona com 15 tomos de carbono, que o precursor inicial de

toda a classe dos flavonoides (DEWIK, 2002).

Os terpenides so considerados a maior classe de metablitos

secundrios, com 30.000 compostos j descritos. A classe dos triterpenos a

mais importante deste grupo de substncias, e apresenta grande atividade

biolgica, principalmente anti-inflamatria, antitumoral e analgsica (NIERO,

MALHEIROS, 2016; SULTANA, 2017).

Os triterpenos do tipo pentacclico so os mais encontrados na literatura

para este gnero, em especial os com esqueleto do tipo lupano e oleanano, como

a betulina, -amirina e -amirina (MAGINA et al, 2012). Alguns exemplos de

triterpenos encontrados em espcies j estudadas so: cido barbinrvico, isolado

das folhas da E. punicifolia (LEITE et al., 2014), o taraxerol, -amirina, -

amirina, betulina e cido betulnico, isolados das folhas da E. umbelliflora

(MEYRE-SILVA et al., 2009) e os cidos triterpnicos isolados da E. moraviana,

o cido betulnico, -hidroxibetulnico e o cido platnico (LUNARDI et al.,

2001).

Em um trabalho de reviso sobre o gnero Eugenia, Tenfen e

colaboradores (2018) descrevem algumas estruturas qumicas j isoladas de

espcies deste gnero. As figuras a seguir demonstram exemplos de compostos

fenlicos (Figura 1) e terpenoides j descritos na literatura para este gnero

(Figura 2).

https://pt.wikipedia.org/wiki/%C3%81cido_xiqu%C3%ADmicohttps://pt.wikipedia.org/wiki/Xiquimatohttps://pt.wikipedia.org/wiki/Acetatohttps://pt.wikipedia.org/wiki/Acetil_coenzima_Ahttps://pt.wikipedia.org/wiki/Acetil_coenzima_Ahttps://pt.wikipedia.org/wiki/%C3%81cido_cin%C3%A2mico

37

Figura 1. Compostos fenlicos isolados de espcies de Eugenia.

38

Figura 2. Terpenoides isolados de espcies de Eugenia

39

Novos compostos isolados do gnero Eugenia tem sido descritos

constantemente na literatura, como os eugenial C, isolado da E. umbelliflora

(FAQUETTI et al., 2015) e o triterpeno indito 24,25-epoxi-28-

hidroxicicloartan-3-ona, isolado da E. involucrata (VECHI, 2015).

2.4 A ESPCIE Eugenia mattosii

A espcie E. mattosii D. Legrand (Figura 3) foi descoberta perto da

dcada de 1950 pelo engenheiro agrnomo Joo Rodrigues de Mattos, nos

arredores de Blumenau (SC), e por essa razo foi classificada pelo botnico

uruguaio Diego Legrand com este nome, em homenagem Mattos. conhecida

popularmente como Cambu ou Pitanguinha de mattos e encontra-se em risco de

extino (LEGRAND, 1969; SOBRAL et al., 2009)

Os frutos de E. mattosii, j foram estudados previamente por nosso

grupo de pesquisa, tendo sido demonstrado por CCD a presena de compostos

fenlicos, terpenos e esteroides. Avaliou-se tambm o potencial antinociceptivo

e gastroprotetor do extrato metanlico bruto do fruto inteiro. No teste de dor

induzida por cido actico em camundongos (dose de 10 mg/kg de peso), o

extrato apresentou um percentual mdio de 43% de inibio das contores

abdominais, demonstrando efeito antinociceptivo. Na avaliao do potencial

gastroprotetor, houve diminuio da rea lesada do estmago de camundongos

submetidos aos modelos de lcera por etanol e indometacina na dose de 250

mg/kg de peso (NESELLO, 2015; DOS SANTOS et al., 2018).

Quanto ao aspecto fitoquimico, Apel e colaboradores (2005),

verificaram por meio de cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de

massas (CG/EM) a presena de 21 compostos no leo voltil das folhas de E.

mattosii, identificados atravs do espectro de massas como sesquiterpenos

oxigenados (17,6%) e hidrocarbonetos sesquiterpenos (78,8%), representando

96,4% da composio do leo.

40

Figura 3. Foto ilustrativa das partes areas de E. mattosii (A) e no local de coleta

da planta (B).

Fonte: o autor

A

A

B

41

3 POTENCIAL BIOLGICO DE PLANTAS MEDICINAIS

As plantas medicinais representam uma inesgotvel fonte de

substncias qumicas para a pesquisa e descoberta de novos compostos com

potencial farmacolgico para a preveno e tratamento de diversas doenas

(CECHINEL FILHO, 2017; CRAGG; NEWMANN, 2013).

De acordo com estas informaes, imprescindvel que se realize um

estudo qumico e farmacolgico abrangente quando se inicia um trabalho com

uma planta potencialmente medicinal que ainda no foi estudada em relao s

suas caractersticas qumicas. Desta forma, neste trabalho, objetivamos realizar

uma triagembiolgica amplo para conhecer melhor o potencial farmacolgico da

planta em questo.

Foram selecionadas algumas atividades biolgicas especficas in vitro

e in vivo para avaliar a planta escolhida, E. mattosii. Sobres estas respectivas

atividades, uma breve descrio foi preparada, conforme descrito abaixo:

3.1 Atividade antibacteriana

As mudanas que a globalizao trouxe para a sociedade atual tm

aumentado o nmero de casos de doenas infecciosas na populao. Entre essas

mudanas podemos citar as imigraes, alteraes do ambiente, aumento da

populao, sedentarismo e m-alimentao, alm do consumo indiscriminado de

agentes antimicrobianos. Estes fatores somados falta de novos antibiticos

disponveis no mercado vem gerando um grave problema de sade pblica: a

resistncia antimicrobiana (GOLDSTEIN et al., 2012; AGUIAR et al., 2012).

Este um problema bastante complexo e tem causas variadas, mas o

fato que ao longo dos anos, as bactrias desenvolveram mecanismos capazes

de diminuir ou mesmo inativar a ao dos frmacos. As cepas podem adquirir

resistncia por meio de mutaes genticas, produo de enzimas, alterao dos

42

stios receptores impedindo a absoro do frmaco ou, ainda, podem sintetizar

protenas que inibem a ao dos antibiticos. Na maioria das vezes, esta

resistncia ocorre quando o tratamento no seguido de forma adequada como,

por exemplo, no uso de subdoses, durao prolongada ou insuficiente dos

medicamentos (TANWAR et al., 2017).

Os antimicrobianos utilizados na prtica clnica mdica e veterinria

tambm representam um grande risco ambiental, se no forem utilizados com

precauo ou descartados de maneira correta. Vrias substncias existentes nos

frmacos so resistentes ao processo de tratamento, permanecendo no meio

ambiente por longos perodos, acarretando srios riscos socioeconmicos e

ambientais. Muitos antibiticos acabam por selecionar os microorganismos mais

resistentes, ocasionando uma futura resistncia este medicamento quando

utilizado por pessoas que foram expostas alimentos ou gua contaminada por

antibiticos, por exemplo (BALBINO; BALBINO, 2012).

Algumas bactrias, chamadas molicutes ou micoplasmas, no possuem

parede celular e por esta razo so mais propensos a no responder ao tratamento

com antibiticos convencionais, pois a maioria deles atua justamente sobre a

parede celular. Estas bactrias, consideradas os menores microrganismos

capazes de autorreplicao, so responsveis por diversas doenas em seres

humanos (algumas doenas sexualmente transmissveis), mas tambm em

animais e plantas. Em humanos j foram descritas cerca de 17 espcies, sendo

que cinco delas so patognicas (ZANETTI, 2015; BENFATTI et al., 2010).

Somando-se todos estes fatores, se faz necessria a busca por novas

terapias que possam servir de tratamento contra os molicutes. Levando em

considerao que a maioria dos medicamentos utilizados no controle de

infeces derivada de produtos naturais, a pesquisa com plantas medicinais

representa uma estratgia para a obteno de novos compostos que possam ter

ao antimolicute (NEWMAN; CRAGG, 2012).

43

Muitas plantas vem sendo estudadas nesse sentido, e compostos como

cumarinas, flavonoides, taninos, alcaloides e terpenides tem sido considerados

substncias chaves para resultados positivos na atividade antimicrobiana

(SILVA; FERNANDES JNIOR, 2010).

O gnero Eugenia foi recentemente estudado quanto sua atividade

antimolicute. As espcies E. beaurepaireana, E. brasiliensis, E. umbelliflora

foram avaliadas por Benfatti e colaboradores (2010), que observaram uma

atividade antimolicute interessante para a primeira espcie descrita. No caso da

E. platysema, cujas folhas so ricas em compostos fenlicos, o extrato

hidroalcolico e as fraes apresentaram resultados promissores, sendo o a

frao de diclorometano a mais ativa (125 g.mL-1) frente a algumas cepas

testadas (TENFEN et al., 2016). O leo essencial das folhas de E. hiemalis,

demonstrou bons resultados frente s cepas avaliadas por Zatelli e colaboradores

(2016).

3.2 Atividade gastroprotetora

A gastrite e a lcera pptica so ocasionadas por modificaes na funo

celular e estrutura tecidual, gerando um desequilbrio entre os fatores de proteo

da mucosa gstrica (muco, fluxo sanguneo, mecanismo antioxidante) e os

fatores agressores (cido clordrico, espcies reativas de oxignio), que podem

gerar leses na parede do estmago (PRABHU; SHIVANI, 2014; NAJIM, 2011).

Diversos fatores esto relacionados estas doenas, podendo ser

internos: gentica, patologias infecciosas e/ou patologias granulomatosas

associadas a doenas crnicas ou externos: qualidade de vida, estresse, consumo

de lcool, cafena, drogas e medicamentos comos anti-inflamatrios no

esteroidais e/ou a infeco pela bactria Helicobacter pylori

(MALFERTHEINER; CHAN; McCOLL, 2009; PRABHU; SHIVANI, 2014).

44

O tecido gstrico possui mecanismos de defesa prprios: a

reconstituio do epitlio, produo de suco gstrico, barreira de muco e

bicarbonato, secreo de protenas de choque trmico, alm da perfuso

adequada de sangue no trato gastrintestinal (NAJIM, 2011; TULASSAY;

HERSZENYI, 2010).

Os sintomas dos pacientes com lcera e gastrite so dor epigstrica,

sintomas disppticos (plenitude), distenso abdominal, saciedade precoce,

nuseas e dispepsia (HIRUMA-LIMA et al., 2009).

Os frmacos mais utilizados no tratamento da lcera gstrica atuam

inibindo a secreo cida gstrica, como a cimetidina e a ranitidina (que so

frmacos antagonisstas do receptor H2 da histamina), ou inibindo a bomba de

prtons (como o omeprazol e esomeprazol). Apesar de efetivos, estes

medicamentos apresentam baixa qualidade na cicatrizao da leso ulcerativa e

recidivas constantes da doena, com necessidade do prolongamento do

tratamento (ARAKAWA et al., 2012; KANGWAN et al., 2014).

O uso prolongado dos medicamentos anti-secretores tambm provoca

uma srie de efeitos adversos, como ginecomastia, cefaleia, dor abdominal,

diarria, vmito, fraturas osteoporticas (devido baixa calcificao ssea) e no

osteoportica (originada de trauma), alm de hipergastrinemia, que em casos

mais acentuados pode contribuir para o desenvolvimento de neoplasia gstrica

(MOULI; AHUJA, 2011).

Neste sentido, imprescindvel investigar alternativas farmacolgicas

capazes de promover a preveno e a cicatrizao de lceras, com ausncia ou

reduo de efeitos colaterais, e as plantas medicinais so uma alternativa

interessante. Alguns metablitos secundrios produzidos pelas plantas, como

alguns flavonoides, terpenos e alcalides, so capazes de proteger o estmago e

at de tratar leses j instaladas (KLEIN-JNIOR et al., 2012).

45

Muitas plantas medicinais estudadas por nosso grupo de pesquisa j

apresentaram potencial gastroprotetor: Achyrocline satureoides, Polygala

cyparissias, Rubus imperialis, Maytenus robusta, Brassica oleracea, Baccharis

dracunculifolia. No mercado farmacutico tambm existem fitoterpicos para o

tratamento da lcera gstrica, como o caso de cpsulas de Maytenus ilicifolia,

que comercializada por diversos laboratrios (SOMENSI, 2015).

Dentre os metablitos que mais se destacam por seu potencial

antioxidante, anti-inflamatrio e consequentemente gastroprotetor esto os

flavonoides, compostos bastante encontrados nas plantas do gnero Eugenia

(MAGINA et al., 2010). Algumas espcies j estudadas demostraram atividade

gastroprotetora: E. jambolana (DONATINI et al., 2009), E. umbelliflora

(MEYRE-SILVA et al., 2009), E. punicifolia (BASTING et al., 2014).

3.3 Atividade antinociceptiva

Nocicepo ou algesia o termo mdico para a recepo de estmulos

aversivos, transmisso, modulao e percepo de estmulos agressivos, que so

interpretados e transmitidos pelo sistema nervoso perifrico at o sistema

nervoso central onde interpretado como dor (KLAUMANN; WOUK; SILLAS,

2008; OMS, 2012).

A dor caracterizada por experincias sensoriais e emocionais, e pode

ser crnica, quando perdura por um longo tempo ou aguda, quando acaba em um

curto espao de tempo. O conjunto das percepes de dor que o ser humano

capaz de distinguir pode ser induzida em um receptor de trs formas especficas.

A primeira forma a mecnica (capaz de excitar um mecanorreceptor); a segunda

a do tipo trmica (capaz de excitar um termorreceptor) e a terceira a do tipo

qumica (que afeta quimioceptores) (KLAUMANN; WOUK; SILLAS, 2008).

Sentir dor, apesar de representar uma sensao desagradvel, um

processo fisiolgico muito importante para o ser humano. Esta sensao permite

46

que o indivduo tenha conscincia de que algo est ameaando o bom

funcionamento do seu organismo e muitas vezes ela o nico sintoma para o

diagnstico de vrias doenas. A IASP (International Association for the Study

of Pain) descreve a dor como uma experincia sensorial e emocional

desagradvel que est associada com leses reais ou potenciais (OMS, 2012).

Um estudo epidemiolgico realizado pela SBED (Sociedade Brasileira

para estudo da dor) com 919 pessoas das cinco regies do Brasil, demonstrou

que 42% relataram algum tipo de dor e 37% disseram conviver com dor h pelo

menos seis meses. A pesquisa revelou que a dor acomete mais mulheres que

homens e demonstrou algumas diferenas entre as regies. A maior incidncia

(42%) no Sul, seguido do Sudeste (38%) (SOUZA et al., 2016).

A dor crnica no um problema somente no Brasil, j que 20 a 40%

da populao mundial em algum momento da vida acometido por ela, que causa

sofrimento, inaptido ao trabalho, problemas psicossociais e prejuzos

econmicos (SBED, 2016).

A OMS recomenda que para o tratamento da dor, seja seguido um

protocolo chamado Escala Analgsica. O primeiro degrau recomenda o uso de

medicamentos analgsicos simples e anti-inflamatrios para dores fracas. O

segundo degrau sugere opioides fracos, que podem ser associados aos

analgsicos simples ou anti-inflamatrios do primeiro degrau, para dores

moderadas. O terceiro degrau consta de opioides fortes, associados ou no aos

analgsicos simples ou anti-inflamatrios, para dores fortes (OMS, 2012).

Todos os medicamentos descritos nesta escala, at mesmo os do

primeiro degrau podem causar efeitos adversos indesejveis aos pacientes com o

uso contnuo. Estes efeitos incluem nuseas, dor de cabea, vmitos, gastrites e

lceras. J os opioides podem tambm causar dependncia e crises de abstinncia

(POLSKI et al., 2014).

47

Considerando que a dor um problema de sade pblica e que o

tratamento convencional provoca muitos efeitos colaterais, se faz necessria a

busca por novos medicamentos, menos agressivos. Nesse sentido, a busca por

compostos derivados de plantas medicinais se faz justificvel e imprescindvel

para a sade mundial (BAHMANI et al., 2014).

Ao longo da histria o homem tem buscado as plantas medicinais para

o tratamento da dor. Alguns exemplos comuns so: a morfina, isolada da Papaver

somniferum; a Cannabis sativa, conhecida popularmente no Brasil como

maconha; a capsaicina, substncia isolada de vrias espcies de Capsicum, as

populares pimentas vermelhas, amplamente utilizadas na culinria (ALMEIDA;

NAVARRO; BARBOSA-FILHO, 2001; CALIXTO et al., 2000).

A descoberta mais importante neste sentido foi a da salicina, isolada de

espcies de Salix alba por Rafaele Piria em 1832. Aps muitas modificaes

estruturais foi sintetizado o cido acetilsaliclico, com propriedades analgsicas

e antipirticas, dando origem famosa Aspirina, lanamento que foi

acompanhado pelo surgimento de uma gigante indstria farmacutica na

Alemanha, a Bayer (DUTRA et al., 2016).

O Ncleo de investigaes Qumico-Farmacuticas da UNIVALI

(NIQFAR), trabalha h 20 anos com plantas medicinais, e j demosntrou

atividade antinociceptiva para diversas plantas da flora catarinense, como a

Aleurites moluccana (nogueira-da-ndia), Chrysophyllum cainito (abiu-roxo),

Cipura paludosa (alho do mato), Garcinia achaicharu (bacupari), Ipomoea pes-

capae (p-de-cabra), Lichi chinensis (lichia), Marrubium vulgare (maromba),

Phyllanthus niruri (quebra-pedra), Plinia glomerata (cabeludinha), Polygala

cyparissias (avenca da praia), Rubus imperialis (amora-branca), Wedelia

paludosa (vedlia), Eugenia involucrata (cerejinha do mato), Campomanesia

reitziana (gabiroba) e Myrcianthes pungens (guabiju) (CECHINEL FILHO,

2017).

48

Algumas espcies do gnero Eugenia que j foram estudadas quanto ao

seu potencial antinociceptivo como E. punicifolia (BASTING et al., 2014), E.

fruticosa (SHAMS-UD-DOHA et al., 2012) e E. involucrata (VECHI, 2015;

VECHI et al., 2017), apresentaram promissores resultados.

3.4 Atividade antiproliferativa

O cncer uma doena considerada multicausal e crnica, que afeta

milhares de pessoas ao redor do mundo, tanto em pases subdesenvolvidos

quanto em pases em desenvolvimento. uma doena na qual as clulas sofrem

alteraes genticas e crescem de forma anormal, invadindo outros tecidos e

perdendo sua funo original (MIRANDA et al., 2013; SAN FELICIANO;

CECHINEL FILHO, 2014).

A etiologia do cncer ainda no muito bem esclarecida, porm, as

neoplasias podem surgir devido s mutaes genticas espontneas ou induzidas

por agentes patognicos como metais, radiaes, radicais livres do oxignio,

inflamaes crnicas e exposio xenobiticos (tabaco, lcool, pesticidas, etc).

Este processo termina com a proliferao de clulas anormais (tumorais),

gerando os tumores (CAMPOS et al., 2014; FERNANDES; MAFRA, 2005).

O National Cancer Institute (NCI), afirma que os EUA gastam 125

bilhes por ano no tratamento de cncer e a projeo de novos casos de cncer

s tende a aumentar, com possibilidades de se tornar a doena que mais mata no

mundo, ultrapassando as doenas cardiovasculares. No Brasil, o INCA (Instituto

Nacional do Cncer) aponta a ocorrncia de aproximadamente 600 mil novos

casos de cncer entre 2016-2017 (INCA, 2017; MARIOTTO et al., 2011).

A utilizao de compostos bioativos para o tratamento do cncer

conhecida ao longo da histria da humanidade. Estudos populacionais sugerem

que um risco reduzido de cncer est associado ao alto consumo de vegetais e

49

frutas devido presena de fitoqumicos naturais com poder quimiopreventivo

(GULLET et al., 2010; GREENWELL; RAHMAN, 2015).

Os compostos de origem vegetal possuem um grande potencial na

preveno do cncer devido sua segurana, baixo custo e biodisponibilidade

oral. Atualmente, a maioria dos medicamentos para o tratamento de cncer do

mercado farmacutico so derivados de produtos naturais, chegando um

percetual de aproximadamente 75% (NEWMAN; CRAGG, 2016; CAMPOS et

al., 2014).

Estudos tm demonstrado que as principais vias de sinalizao

desreguladas no cncer so afetadas por nutrientes: metabolismo carcinognico,

reparo de DNA, proliferao celular/apoptose, diferenciao, inflamao,

desequilbrio na proteo antioxidante e angiognese. Entre os nutrientes com

ao preventiva podem ser elencados o clcio, zinco, selncio, cido flico,

cidos graxos essenciais, vitaminas (C, D e E). Alm dos nutrientes, muitos

compostos bioativos encontrados em plantas tem demonstrado proteo em

vrias fases do desenvolvimento do cncer, dentro os quais pode-se citar os

flavonoides (apigenina, kaempferol, quercetina), carotenoides (licopeno,

betacaroteno), terpenoides (taxol), vitaminas (A, C, D e E), sulforafano, alguns

polifenis (resveratrol) (VALENTE et al., 2014).

Alm destas substncias isoladas, alguns extratos de plantas

demonstram atividade como Viscum album, Hypericum perforatum, Withania

somnifera (Ashwagandha), Melaleuca alterniflia (melaleuca ou tee tree),

Zingiber officinale (gengibre), Curcuma longa (crcuma), Calendula officinalis

(margarida), Rosmarinus officinalis (alecrim) tambm podem ter ao anticncer

por diferentes mecanismos, principalmente induzindo a apoptose, apresentando

atividade antiproliferativa e anti-metasttica (CHINEMBIRI et al., 2014).

Espcies de Eugenia so geralmente ricas em flavonoides e terpenoides

e por essa razo podem ser promissoras na busca por novos agentes anticncer.

50

Recentemente algumas espcies vem demostrando potencial antiproliferativo,

como a E. jambolana e a E. brasiliensis (CHAREPALLI, 2016; TEIXEIRA et

al., 2017).

3.5 Atividade anticolinestersica

A atividade anticolinestersica est relacionada inibio da

acetilcolinesterase (AChE), uma enzima que degrada a acetilcolina em colina e

cido actico. A acetilcolina (ACh) por sua vez um neurotransmissor

importante nas fendas sinpticas e possui uma funo essencial para o organismo

e para o sistema nervoso central (SNC), pois decisivo no desempenho

cognitivo. Alguns elementos qumicos, classificados como neurotoxinas, podem

afetar a atividade desta enzima, provocando principalmente

espasmos musculares (FORTUNATO, 2016; OLAZARN; NAVARRO;

ROJO, 2013).

Apesar de ser uma enzima importante, inibir sua ao por meio de

agentes anticolinestersicos pode ser uma importante soluo para algumas

doenas como a miastenia gravis, glaucoma e a doena de Alzheimer (DA), alm

de serem utilizados como agentes analgsicos (FORTUNATO, 2016).

Atualmente, a maioria dos tratamentos teraputicos para a DA esto

relacionados inibio da enzima acetilcolinesterase para aumentar o nvel de

acetilcolina nas sinapses nervosas, melhorando os sinais de vrios distrbios

neurolgicos (SENOL et al., 2010; TAKIZAWA et al., 2015).

A DA umas das principais causas de demncia no mundo. Ela

uma das doenas neurodegenerativas relacionadas idade mais prevalente em

idosos, junto com as deficincias cognitivas. O aumento da prevalncia desta

doena em todo o mundo uma ameaa sade pblica, uma vez que cerca de 5

a 8% das pessoas com mais de 60 anos apresenta a DA (OMS, 2018; SAEEDI et

al., 2017).

https://pt.wikipedia.org/wiki/Neurotoxinahttps://pt.wikipedia.org/wiki/Espasmohttps://pt.wikipedia.org/wiki/Miastenia_gravishttps://pt.wikipedia.org/wiki/Glaucomahttps://pt.wikipedia.org/wiki/Mal_de_Alzheimer

51

Em todo o mundo, cerca de 47 milhes de pessoas tm demncia, e

se identifica quase 10 milhes de novos casos a cada ano. Sendo a DA a causa

mais comum de demncia (60-70% dos casos), possvel calcular que existam

cerca de 6 a 7 milhes de novos casos de DA anualmente. O nmero total de

pessoas com demncia projetado para cerca de 75 milhes em 2030 e em 2050

para 132 milhes (OMS, 2018).

Nos ltimos anos, investimentos considerveis foram dedicados ao

desenvolvimento de medicamentos para o tratamento desta enfermidade, que

est relacionada destruio e envelhecimento celular, responsveis pela

desordem neurolgica caracterstica da DA. Os sintomas incluem a perda de

memria, disfuno cognitiva, distrbios de comportamento e dificuldade na

realizao das atividades dirias (MAGINA et al., 2012; SIEBERT et al., 2015).

A DA considerada grave, incapacitante e at o momento sem cura.

Considerando o aumento da expectativa de vida da populao mundial e o

consequente aumento da incidncia de DA, a busca por novos agentes com

potencial anticolinestersico se faz imprescindvel (DIAS et al., 2015). Neste

sentido, as plantas medicinais podem ser aliadas, como o caso da galantamina,

isolada de plantas da famlia Amaryllidaceae (GIORDANI et al., 2008).

O gnero Eugenia apresenta algumas espcies j estudadas quanto ao

seu potencial anticolinesterasico, como a E. dysenterica e E. brasiliensis

(GASCA et al., 2017; SIEBERT et al., 2015). Muitas espcies tambm

apresentam potencial anti-inflamatrio, tendo relao desta forma com a

preveno e tratamento da DA (DZOYEM et al., 2017). Desta forma, se justifica

a busca por substncias bioativas com potencial anticolinestersico nas folhas e

caules de E. mattosii.

52

3.6 Atividade vasorrelaxante

A presso arterial (PA) elevada a condio mais prevalente na

ateno bsica sade e est relacionada a diversas patologias importantes como

as doenas relacionadas ao corao e a falncia renal (JAMES, 2013).

Segundo a OMS, a hipertenso e suas complicaes so responsveis

por 17,7 milhes de mortes a cada dia (cerca de 31% de toda mortalidade

mundial), tanto em pases em desenvolvimento quanto em pases de primeiro

mundo. Apesar dos esforos governamentais, a sua prevalncia continua a

aumentar (GALLARDOORTZ et al., 2015; OMS, 2017).

As doenas cardiovasculares (DCVs) so distrbios relacionados ao

funcionamento do corao e dos vasos sanguneos . Os indivduos com presso

arterial aumentada, alteraes de glicemia e lipdeos plasmticos e com

sobrepeso ou obesidade apresentam alto risco para o desenvolvimento destas

doenas, que so a causa nmero um de mortes em todo o mundo (OMS, 2017;

OMS, 2007, WANG et al., 2014).

Segundo as Diretrizes Brasleiras de Hipertenso Arterial, a PA a

fora que o sangue bombeado pelo corao exerce contra a parede distensvel

dos vasos sanguneos. O volume de sangue que sai do corao (dbito cardaco)

e a resistncia que ele encontra para circular na periferia (resistncia perifrica

vascular) que determinam essa presso. Em humanos, a presso arterial mdia

gira em torno de 120 mm Hg para a presso sistlica e 80 mm Hg para diastlica

(SBC, 2016).

A regulao da PA em curto prazo (reao em segundos)

desempenhada pelos barorreflexos, quimiorreflexos e SNC. O controle da PA em

longo prazo (horas ou dias) desempenhado pelos rins. Em mdio prazo

(minutos), a regulao ou modulao ocorre principalmente por ao dos

sistemas hormonais (GUYTON, 1991; SILVA, 2011).

53

O endotlio vascular capaz liberar substncias que relaxam a

musculatura lisa, controlando a presso arterial, como por exemplo o xido

ntrico. O endotlio est localizado na parede interna dos vasos sanguneos, que

so constitudos de trs camadas histolgicas: a camada externa que formada

por tecido conjuntivo; a camada mdia, formada por clulas musculares lisas e a

camada ntima, constituda por uma nica camada de clulas que reveste

internamente os vasos sanguneos. Em condies normais existe um equilbrio

entre a liberao desses fatores, mas em condies patolgicas como a de

hipertenso arterial, acontece um desequilbrio que est associado ao

desenvolvimento de complicaes relacionadas s DCVs (SILVA, 2011).

Os riscos causados por essa enfermidade fazem com que seja cada

vez mais necessria a busca por tratamentos alternativos para o controle da

hipertenso. No Brasil e no mundo, muito comum o uso de plantas medicinais

como fonte alternativa no tratamento desta complicao. As propriedades

calmantes e anti-hipertensivas de determinadas plantas tm sido alvo de novas

descobertas farmacolgicas (SILVA et al., 2015).

O atratamento farmacolgico da hipertenso inclui uma variedade de

drogas que atuam em diferentes vias, com o objetivo teraputico de reduzir a PA

sistlica e diastlica para valores mais aceitveis fisiologicamente. No entanto,

muitos pacientes no apresentam reduo eficiente da PA com uso de drogas

anti-hipertensivas convencionais (SBC, 2016; MANCIA et al., 2013).

Neste sentido, o desenvolvimento de novas ferramentas

farmacolgicas pode ajudar a melhorar o manejo clnico da hipertenso arterial.

Plantas medicinais podem ser grandes aliadas no controle da presso arterial,

muitas delas j so utilizadas na medicina tradicional: Cymbopogon citratus

(DC.) Stapf (capim-limo), Cynara scolymus L. (alcachofra), Rosmarinus

officinalis L. (alecrim), Allium sativum L. (alho), Coleus barbatus Benth (falso

boldo) (FARIAIS et al., 2016).

54

As espcies de Eugenia so geralmente ricas em flavonoides,

compostos j conhecidos por seu potencial cardioprotetor, antioxidante e anti-

inflamatrio (WANG et al., 2014). Por esta razo, justifica-se a busca por novas

substncias biotivas provenientes de plantas medicinais como a Eugenia

mattosii, que possam reduzir a presso arterial, uma vez que esta espcie faz parte

de um gnero to promissor quando se trata de doenas cardiovasculares.

3.7 Atividade antiparasitria

As parasitoses so muito comuns em todo o mundo, gerando graves

consequncias para a sade pblica. Cerca de 50% da populao mundial e 36%

da populao brasileira sofrem com algum tipo de doena relacionada parasitas

(OMS, 2016). Apesar deste tipo de doenas estar relacionado precrias

condies de vida (falta de higiene e saneamento bsico, desnutrio, gua

poluda), sendo mais prevalente em pases em desenvolvimento, os pases

desenvolvidos tambm so afetados pelas parasitores (MUKBELl et al., 2017).

Estas doenas so normalmente negligenciadas pelo setor mdico e

farmacutico, pois no representam um mercado lucrativo, alm de tambm

serem esquecidas por pesquisadores. Faltam avanos tecnolgicos para o

desenvolvimento de novas ferramentas de diagnstico, drogas ou vacinas que

possam combater estas parasitoses to comuns. A giardase e a leishmaniose,

provocadas por parasitas, so doenas normalmente negligenciadas e bastante

prevalentes em pases em desenvolvimento. (ARVALO-LOPZ et al., 2018).

A giardase provocada por espcies de Giardia, sendo a principal

delas a G. lamblia (ou G. intestinalis/duodenalis). Animais domsticos e crianas

so os mais afetados por esse parasita intestinal (THOMPSON, 2011). A

giardase causa diversos problemas intestinais, entre eles a infeco intestinal, a

diarreia e a m absoro de nutrientes, sendo que pode ocasionar danos mais

55

severos em casos graves. A principal via de transmisso a oral-fecal (BARRY

et al., 2013; MUKBELl et al., 2017).

Muitos medicamentos existem para o tratamento da giardase, no

entanto, eles provocam muitos efeitos colaterais. No mundo das plantas

medicinais, algumas alternativas j so descritas para combater a giardase. Uma

delas a curcumina, o principal metablito isolado da Curcuma longa, um

rizoma de cor alaranjada bastante utilizado na culinria indiana (GUTIERRZ-

GUTIRREZ et al., 2017).

No caso da leishmaniose, existem muitas espcies associadas

patologia, que costuma acometer humanos e animais. Costumava ser encontada

somente na rea rural, mas atualmente pode ser diagnosticada em ambientes

urbanos. A doena se manifesta de trs maneiras: leishmaniose cutnea (lceras

drmicas), mucocutnea (lceras na pele, boca, nariz) ou visceral (forma mais

grave, causa febre de longa durao, perda de peso, astenia, anemia e pode levar

bito (GOBBI et al., 2016; OMS, 2016).

Existem mais de 300.000 casos de leishmaniose visceral e mais de 1

milho de casos de leishmaniose cutnea. No Brasil, a maior parte das infeces

por Leishmania acontece em adultos e so do tipo cutnea (OMS; 2015).

Para o tratamento de leishmania se utiliza alguns medicamentos

especficos como o Antimoniato de Meglumina (desde 1946) e a anfotericina B

(desde 1957). Miltefosina a droga mais recente em utilizao, aprovada para

em 2008 nos Estados Unidos pela FDA (Food and Drug Administration). Todos

esses tratamentos so altamente txicos e mostram efeitos secundrios graves.

Portanto, importante desenvolver novas alternativas para o tratamento destas

doenas e os produtos naturais desempenham um papel crucial na descoberta de

novos medicamentos nesta linha (ARVALO-LOPZ et al., 2018).

A Bolvia o pas que mais apresenta casos de Leishmaniose no

mundo, e vem buscando alternativas dentro de sua prpria biodiversidade para o

56

tratamento desta doena. Recentemente foi publicado um estudo com vrias

plantas de uma comunidade boliviana, levando em considerao o uso popular

das mesmas. Cinco plantas apresentaram potencial leishmanicida: Jacaranda

glabra, Scoparia dulcis, Tessaria integriflia, Thalia geniculata e Ejije Bidu.

As plantas medicinais so grandes aliadas na busca de novas

substncias capazes de combater estes parasitas. Muitos metablitos secundrios

vem sendo estudados em relao atividade antileishmanicida e antigirdia. O

Brasil, sendo um grande foco de zoonoses e ter uma grande biodiversidade, pode

ser local de descoberta de plantas com potecial antiparasitrio.

57

CAPTULO III

Resultados e Diiscusso

58

59

1 AVALIAO FITOQUMICA

Neste item, ser exposto toda a parte fitoqumica que permeia a tese,

sendo a parte inicial da pesquisa e tambm servindo de auxlio durante as

avaliaes biolgicas que sero descritas nos artigos posteriores a este item. As

metodologias apresentadas foram a base do estudo com a planta.

1.1 Material vegetal

O material vegetal foi coletado entre agosto de 2015 a novembro de

2016, nos jardins da UNIVALI, na cidade de Itaja, SC, Brasil. Foram realizadas

quatro coletas, a cada trs meses, de acordo com as diferentes estaes do ano,

sempre no ltimo ms de cada estao. A planta foi identificada pelo Prof. Oscar

Benigno Iza (UNIVALI) e uma exsicata foi depositada no Herbrio Barbosa

Rodrigues (Itaja-SC) sob o nmero VCFilho 150.

1.2 Anlise fitoqumica

As folhas e os caules frescos de E. mattosii foram picados e extrados

separadamente por macerao com metanol durante 7 dias temperatura

ambiente. A relao planta-solvente variou entre 1:3 a 1:5 (para cada 100 g de

planta fresca foram utilizados de 300 a 500 ml de metanol), dependendo da parte

da planta. Os extratos foram filtrados e concentrados em um rotaevaporador sob

presso reduzida (50C) fornecendo os respectivos extratos metanlicos brutos

(EMB), que seguiram para o processo de isolamento de compostos atravs de

colunas cromatogrficas (CC), conforme demonstra a Figura 4.

A fim de comparar os rendimentos de cada estao do ano, todos os

extratos foram realizados seguindo o procedimento j descrito acima, sempre

60

utilizando as partes da planta in natura. Os rendimentos de cada extrato esto

descritos na Tabela 1.

Figura 4. Fluxograma do procedimento de extrao e partio das folhas secas

de E. mattosii.

Tabela 1. Dados de coleta e rendimentos de extratos sazonais de E. mattosii.

Amostras E. mattosii Data

coleta

Rendimento (%)

EMB-Folhas Primavera Nov 2016 8,96

EMB-Caules Primavera Nov 2016 2,91

EMB-Folhas Vero Fev 2016 7,73

EMB-Caules Vero Fev 2016 2,09

EMB-Folhas Outono Maio 2016 6,73

EMB-Caules Outono Maio 2016 2,29

EMB-Folhas Inverno Ago 2015 10,94

EMB-Caules Inverno Ago 2015 2,4

* EMB= extrato metanlico bruto

61

1.3 Isolamento e identificao de compostos

O processo de triagem inicial da planta foi realizado na primeira

coleta, em agosto de 2015 com o extrato das folhas frescas. Uma CC inicial foi

preparada com 15g de extrato metanlico bruto das folhas (EMB-inverno) em

coluna de vidro de 125ml com 62g de slica gel 60 da marca Macherey-Nagel

(0,04-0,063 mm / 230-400 mesh ASTM). Esta coluna de triagem foi

recromatografada algumas vezes e levou ao isolamento de pequenas quantidades

de fitol (1mg), lcool palmtico (32 mg) e cido urslico (11 mg), que foram

identificados por CG/EM. Nesta fase do trabalho pode-se observar o grande

potencial fitoqumico da planta atravs da cromatografia em camada delgada

(CCD), conforme demonstra a Figura 5.

Figura 5. Cromatografia em Camada Delgada (CCD) das subfraes obtidas da

primeira Coluna Cromatogrfica (CC) com o extrato bruto de E. mattosii.

62

Para isolamento de compostos, foi utilizado um extrato obtido das

folhas secas da primeira coleta, que aconteceu em agosto de 2015 (coleta de

inverno), pois esta coleta demonstrou um maior rendimento. Os procedimentos

de extrao e partio foram idnticos aos j mencionados anteriormente.

Aps a partio, ambas fraes foram submetidas colunas

cromatogrficas a fim de isolar os principais constituintes ativos. 15 g da frao

clorofrmio (FCL) foram submetidas a CC aberta em coluna de vidro de 200 ml

com 130 g de slica gel 60 eluda com gradiente de hexano:acetona, resultando

na coleta de 183 subfraes (10 ml cada) nesta coluna inicial.

As subfraes similares da primeira coluna foram combinadas com

base em seus perfis em CCD, utilizando-se de placas pr-revestidas Merck

Kieselgel 60 F254 (0,25 mm) eludas com gradiente hexano:acetona. As manchas

foram visualizadas por UV e reveladas com reagente anisaldedo. Algumas

subfraes foram recromatografadas seguindo o mesmo procedimento, conforme

Figura 6. As subfraes 75-85 (664 mg) e 86-89 (373 mg) forneceram o

isolamento de um total de 362 mg de um slido branco puro, identificado como

pinostrobin, enquanto as subfraes 153-165 (231 mg) e 166-177 (810 mg)

levaram ao isolamento de um total de 84 mg de outro slido branco puro,

indentificado como cryptostrobin.

Ambas substncias foram identificados com base nos dados espectrais

(FIGURA 7 a 10) e comparadas com dados da literatura (SOLLADI et al.,

1999; MASSARO et al., 2014).

63

Figura 6. Fluxograma do procedimento de isolamento de compostos da FCL-

folhas de E. mattosii.

64

Figura 7. RMN de H1 do flavonoide isolado pinostrobin.

Figura 8. RMN de C13 do flavonoide isolado pinostrobin.

65

Figura 9. RMN de H1 do flavonoide isolado cryptostrobin.

Figura 10. RMN de C13 do flavonoide isolado cryptostrobin

66

Em relao frao de acetato de etila (FAE), 12g foram submetidos

a procedimentos cromatogrficos em coluna de vidro de 200ml com 80 g de slica

gel 60 utilizando-se gradiente de clorofrmio:metanol. Conforme descrito na

Figura 11, 138 subfraes foram coletadas na primeira coluna e combinadas de

acordo com a similaridade. A subfrao 50-79 (450 mg) foi recromatografada

duas vezes e permitiu o isolamento de avicularin (15 mg) e (-)- catequina (6 mg),

identificadas com base nos dados espectrais de RMN (FIGURAS 12 a 15) e

comparadas com dados da literatura (LEE et al., 2014; AYRES et al., 2009). As

estruturas dos compostos isolados podem ser observadas na Figura 16.

A CCD tambm foi usada para monitorar a combinao das

subfraes e a pureza dos compostos. Neste caso elas foram eludas com

gradiente clorofrmio:metanol e reveladas com cloreto frrico (FeCl3).

Figura 11. Fluxograma do procedimento de isolamento de compostos da FAE-

folhas de E. mattosii.

67

Figura 12. RMN de H1 do flavonoide isolado (-)-catequina.

Figura 13. RMN de C13 do flavonoide isolado (-)-catequina.

68

Figura 14. RMN de H1 do flavonoide isolado avicularin.

Figura 15. RMN de C13 do flavonoide isolado avicularin.

69

Figura 16. Estruturas dos compostos isolados das folhas de E. mattosii. (A)

Pinostrobin, (B) Cryptostrobin, (C) (-)catequina e (D) Avicularin.

O

OH O

OCH3

O

CH3

OOH

OH

O

OH

OH

OH

OH

OH

(A) (B)

(C)

O

OH

OH

OH

OH

O

O

O

OH

OH

OH

(D)

2. Identificao e quantificao de substncias isoladas por UPLC-

PDA/ESI+ - QTOF

2.1 Equipamento

O equipamento utilizado foi um cromatgrafo lquido Acquity da

marca Waters, equipado com um detector de arranjo de fotodiodos (PDA)

acoplado a Quadrupole Time of Flight (Q-ToF) (Waters Synapt G1), (Waters

Corp., Milford, MA, USA). Os dados foram processados por software da Waters,

MassLynx V4.1.

2.2 Condio experimental

Todas as anlises foram realizadas em modo positivo e V ptico (ESI-

V +), e usando sistema de cromatografia de fase reversa. A coluna utilizada para

o mtodo UPLC foi um Acquity UPLC BEH C18 (1.7m 2.1 mm x 100 mm).

Os componentes da fase mvel foram A: gua com 0,1% de cido frmico e B:

acetonitrila. A coluna foi eluda no fluxo 0,2 ml.min-1. O gradiente comeou com

70

15% de B em A e manteve-se durante 5 minutos, aumentando para 35% em 10

minutos, para 55% em 20 minutos, para 70% em 22 minutos, para 80 % em 24

minutos, retornando s condies iniciais gradualmente em 35 minutos e mantido

durante 2 minutos para o equilbrio da coluna. O volume injetado foi de 1 l.

Os dados de espectrometria de massas foram adquiridos utilizando uma

fonte de eletrospray, faixa de varredura de massa de 70-1000 m / z, temperatura

da fonte 120 C, temperatura de dessolvatao 250 C, fluxo de gs de cone 10

Lh-1, gs de desolvatao 450 Lh-1 e tenso capilar de 3.0 kV.

Todas as amostras foram preparadas em 1ml de metanol grau LC-MS,

utilizando 10mg de extratos e 1mg de compostos puros (padres). Como

marcador qumico foram utilizados os compostos catequina, pinostrobin e

cryptostrobin.

2.3 Quantificao de compostos

As amostras foram comparadas pelos cromatogramas MS XIC,

utilizando a massa dos compostos para identificao dos mesmos. Para

identificar e quantificar o pinostrobin e o cryptostrobin no cromatograma,

utilizou-se a massa destas substncias para sua extrao, 271. No caso da (-)-

catequina, a sua respectiva massa, de 291, foi utilizada para extrao.

Para calcular a concentrao destes compostos nos extratos e fraes, a

rea total do cromatograma foi relacionada rea composta isolada

(cromatograma padro). A porcentagem em m / m foi transformada em

concentrao mg.g-1, assumindo linearidade.

71

CAPTULO IV

Composio qumica e atividade antimicoplasmatica de

extratos, fraes e substncias isoladas das folhas e caules de

Eugenia mattosii

Este artigo foi submetido ao peridico Qumica Nova, com fator de impacto

igual a 0.627. Submisso em 02-fevereiro-2018.

72

73

Composio qumica e atividade antimicoplasmtica de extratos, fraes e

substncias isoladas das folhas e caules de Eugenia mattosii

Giovana Vechi1, Adrielli Tenfen1, Ariela Mana Boeder2, Lorena Hernandez-

Gmez3, Caio Maurcio Mendes de Crdova2, Franco Delle Monache1, Valdir

Cechinel Filho1

1 Programa de Ps-Graduao em Cincias Farmacuticas, Universidade do

Vale do Itaja, CEP: 88302-901, Itaja, SC, Brasil 2 Departamento de Cincias Farmacuticas, Universidade Regional de

Blumenau, CEP: 89030-001 Blumenau, SC, Brasil 3 Centro de Investigacin em Productos Naturales - CIPRONA, Universidad de

Costa Rica, San Jos, Costa Rica

Resumo

A espcie Eugenia mattosii pertence a um gnero importante da famlia

Myrtaceae, conhecida pela diversidade de substncias bioativas, utilizadas na

medicina tradicional para curar diferentes tipos de doenas. Como no h muita

informao sobre esta espcie de Eugenia em literatura, o objetivo deste estudo

foi avaliar a composio qumica e a atividade antimicrobiana das folhas e caules

da E. mattosii. O extrato metanlico de folhas e caules e suas respectivas fraes

de clorofrmio (FCL) e acetato de etila (FAE), alm de trs substncias isoladas,

pinostrobin, cryptostrobin e (-)- catequina, foram avaliados em relao ao seu

potencial antimicrobiano, contra cepas de bactrias sem parede celular,

conhecidas como molicutes. Ambos extratos metanlicos demonstraram

atividade moderada (MIC = 250-500 g.mL-1). As fraes apresentaram

melhores resultados em comparao com o extrato metanlico bruto (MIC = 125-

1000 g.mL-1), especialmente as FAE das folhas, que mostraram atividade em

concentraes de 125-250 g.mL-1 para todas as cepas testadas. O pinostrobin e

o cryptostrobin apresentaram boa atividade antibacteriana contra M. pneumoniae

FH e M. Genitalium, sendo que o pinostrobin apresentou MIC de 12,5 g.mL-1

frente cepa de M. pneumoniae FH. A (-)-catequina no demonstrou atividade.

Em concluso, as fraes de E. mattosii e os compostos isolados (pinostrobin e

cryptostrobin) apresentaram uma promissora atividade antibacteriana.

Palavras-chave: Eugenia mattosii; atividade antimicoplasmatica; pinostrobin;

cryptostrobin, catequina.

74

1 Introduo

Molicutes so bactrias sem parede celular, responsveis por vrias

doenas humanas e animais, incluindo pneumonia, vaginite e pielonefrite.

Devido resistncia relatada esses microrganismos, essencial buscar novas

terapias antimicrobianas que sejam efetivas contra os molicutes, e o gnero

Mycoplasma considerado de grande importncia para esta classe de bactrias

(LOWE et al., 2014; TAYLOR-ROBINSON, 2017).

Estudos anteriores realizados em nossos laboratrios demonstraram

que algumas espcies do gnero Eugenia, como E. beaurepaireana, E.

brasiliensis, E. umbelliflora, E. hiemalis e E. platysema, apresentaram promissor

potencial antimolicute (BENFATTI et al., 2010; TENFEN et al., 2017;

ZATELLI et al., 2015).

A Eugenia mattosii, foco deste estudo, popularmente conhecida

como Cambui e ocorre no sul do Brasil, entretanto, pouco se conhece sobre sua

composio qumica e atividade biolgica.

Considerando as importantes atividades j descritas para este gnero

e as diversas infeces problemticas causadas por molicutes, este estudo tem

como objetivo avaliar o potencial antimicoplasmtico de extratos, fraes e

substncias isoladas das folhas e caules de E. mattosii, alm de quantificar os

principais compostos por Cromatografia lquida de ultra performance (UPLC).

75

2 Material e Mtodos

2.1 Anlise fitoqumica

A anlise fitoqumica est descrita no captulo II, item 4.

` Para avaliao do potencial antimicoplasmtico foram utilizados os

extratos e fraes das folhas e caules secos, provenientes da coleta de inverno,

alm das substncias isoladas destas amostras.

2.2 Ativid