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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
Fabiana Gomes Nascimento
Avaliação qualitativa e quantitativa por CLAE de iridóides na Allamanda schottii
ITAJAÍ – 2008
UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E
SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS
Fabiana Gomes Nascimento
Avaliação qualitativa e quantitativa por CLAE de iridóides na Allamanda schottii
Dissertação submetida à Universidade do Vale do Itajaí como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
Orientadora:Profª. Dra. Ângela Malheiros
Co-Orientadora: Profª.Dra. Marina da S.Machado
Itajaí, novembro de 2008
N17a
Nascimento, Fabiana Gomes, 1985- Avaliação qualitativa e quantitativa por CLAE de iridóides na Allamanda schottii [manuscrito] / Fabiana Gomes Nascimento. – 2008. 89 f. : il. ; 30 cm Cópia de computador (Printout(s)). Dissertação (mestrado) – Universidade do Vale do Itajaí, Pró-reitoria de Pesquisa. Pós-graduação, Extensão e Cultura, 2011. “Orientador: Profª. Dra. Ângela Malheiros ”. Bibliografia: f. 80-89.
1. Produtos naturais. 2. Plantas medicinais. 3. Farmacognosia. 4. Química vegetal. I. Universidade do Vale do Itajaí. II. Título. CDU: 615.32
Cristina M. V. Porciúncula – CRB 14/966
AGRADECIMENTOS
Muitos seriam as pessoas que deveria agradecer, muitos passaram pelo
caminho nesta trajetória. Tenho um agradecimento especial a minhas irmãs
Fernanda e Flávia e ao meu pai, Jorge, que sempre estiveram ao meu lado e me
apoiaram, mesmo que de longe em todas as situações.
Agradeço aos amigos que construí pela força que sempre me deram, em
especial a três destas pessoas, a Carol e a Folvi, que junto comigo desenvolveram
este trabalho, e a Roseni, minha tão querida colega, que a distância separa mas
tenho um imenso carinho.
Não posso deixar de dizer o meu muito obrigada a Marina, minha co-
orientadora, que me ensinou o que sei sobre HPLC e que por muitas vezes me
ajudou e aconselhou, não só sobre o trabalho mas nos mais diversos assuntos.
Obrigada.
Seriam muitos agradecimentos ainda, ao meu namorado Alexandro, que
sempre me deu forças, aos amigos do laboratório Pedro e Tiago, a coordenadora do
curso Profª Tânia, e as secretarias do mestrado Vânia e Roselia. Aos professores
Niero, Maique e Cechinel que auxiliaram nas correções deste trabalho com idéias e
sugestões.
Enfim, muitos agradecimentos devo ter esquecido, porém tenho que
lembrar de Deus, que me deu saúde para chegar ao final desta jornada e concluir
com êxito este trabalho. E duas pessoas que foram muito importantes neste
caminho: Ângela, minha orientadora e amiga, agradeço muito a ti pelo carinho,
compreensão, auxilio, ajuda e principalmente paciência que dedicou a mim neste
período; e a Minha Mãe, minha principal fonte, quem me da toda força e inspiração,
pessoa pela qual este trabalho chega ao fim. A vocês duas um agradecimento do
fundo do coração e é a vocês que dedico este trabalho.
EPIGRAFE
Quantas vezes nós pensamos em desistir,
deixar de lado, o ideal e os sonhos;
Quantas vezes sentimos o peso da responsabilidade, sem ter com quem dividir;
Quantas vezes sentimos solidão, mesmo cercados de pessoas;
Quantas vezes voltamos para casa com a sensação de derrota;
Quantas vezes aquela lágrima, teima em cair, justamente na hora que precisamos parecer
fortes;
Quantas vezes pedimos a Deus um pouco de força, um pouco de luz;
E a resposta vem, seja lá como for, um sorriso, um olhar cúmplice, um cartãozinho, um
bilhete,
E a gente insiste,
Insiste em prosseguir, em acreditar, em transformar, em dividir, em estar, em ser;
E Deus insiste em nos abençoar,
Em nos mostrar o caminho:
Aquele mais difícil,
mais complicado, mais bonito.
E a gente insiste em seguir,
por que tem uma missão...
SER FELIZ!
Avaliação qualitativa e quantitativa por CLAE de iridóides na Allamanda schottii
Fabiana Gomes Nascimento
Orientadora: Angela Malheiros, Doutora. Co-Orientadora: Marina da Silva Machado, Doutora Área de Concentração em Produtos Naturais e Substâncias Sintéticas Bioativas Número de Páginas: 91 O gênero Allamanda é conhecido pela sua capacidade de produzir alguns iridóides, flavonóides, cumarinas e triterpenóides que tem apresentado expressiva atividade biológica. O iridóide plumierídeo, isolado neste gênero, tem demostrado atividade antiinflamatória e antitumoral, e a plumericina atividade antineoplásica, antiflogística e antimicrobiana. A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) é uma alternativa para avaliar qualitativa e quantitativamente extratos de plantas e determinar a concentração de um biomarcador. O presente estudo teve como objetivo avaliar qualitativamente a influência da sazonalidade na produção de metabólitos secundários em especial dos iridóides nas diferentes partes (raiz, caule e folhas) da Allamanda schottii, e quantitativamente a plumericina e o plumierídeo nas frações diclorometano e acetato de etila. As diferentes partes coletadas de A.schottii foram submetidas a extração usando etanol e depois particionadas com hexano, diclorometano e acetato de etila, obtendo-se as respectivas frações. A análise das frações de diclorometano e acetato de etila por CLAE foi realizada utilizando um cromatógrafo Watters 2996, detector UV, coluna Phenomenex C-18 (3,9 mm X 150 mm X 5µm) e fase móvel metanol-acetonitrila-água (10:10:80 v/v, 70/10/20), fluxo constante de 0,8 mL/min e detecção em 230 nm. A sazonalidade interferiu na produção dos metabólitos secundários, as diferenças foram observadas principalmente nas massas de todas as partes das respectivas frações. Nas frações de diclorometano e acetato de etila foram observadas diferenças nas alturas dos picos, além das diferenças nas concentrações destes metabólitos. Cinco iridóides foram detectados em quase todas as amostras analisadas porém com diferentes concentrações. Isto indica que as mudanças climáticas não interferem significativamente na produção destas substâncias, mas sim na sua concentração. A analise demonstra maior concentração do plumierídeo nos caules de outono (362,74 µg/mL) e primavera (351,65 µg/mL) e maiores concentrações da plumericina nas raízes das quatro estações, sendo mais significativa nas raízes de verão (320,42 µg/mL). Correlacionando o rendimento obtido partindo-se de 100 g de planta seca a melhor concentração para o plumierídeo foi obtida nos caules de primavera e outono 201,79 µg/mL e 47,63 µg/mL, respectivamente, e para a plumericina os rendimentos foram similares entre as raízes de primavera (94 µg/mL) e folhas de outono (92,81 µg/mL). A produção destes metabólitos está relacionada aos mecanismos de defesa da planta, isto pode explicar as diferenças obtidas nas concentrações em relação a parte da planta avaliada e época de coleta. Palavras – chave: Allamanda schottii, iridóides, CLAE
Qualitative and quantitative assessment by CLAE of iridoids in Allamanda schottii
Fabiana Gomes Nascimento
Supervisor: Angela Malheiros Co-supervisor: Marina da Silva Machado Area of Concentration on Natural Products and Synthetic Bioactive Substances Number of pages: 91
The Allamanda genus is known for its ability to produce some iridoids, flavonoids, coumarins and triterpenoids that have shown significant biological activity. The iridoid plumieride, isolated from this genus, has demonstrated antiinflammatory and antitumoral activities, while plumericin has shown antineoplasic, antiflogystic and antimicrobial action. High performance liquid chromatography (HPLC) is an alternative for the qualitative and quantitative evaluation of plant extracts, and determines the concentration of a biomarker. The aim of this study was to qualitatively evaluate the influence of seasonality on the production of secondary metabolites, particularly iridoids, in the different parts (root, steam and leaves) of A. schottii and to quantitatively evaluate the iridoids plumieride and plumericin, present in dichloromethane and ethyl acetate fractions. The different parts of A. schottii were submitted to extraction using ethanol, then partitioned with hexane, dichloromethane and ethyl acetate, to obtain the respective fractions. HPLC analysis of the dichloromethane and ethyl acetate fractions was performed using a Waters 2996 chromatograph, UV detector, phenomenex C-18 (3.9 mm x 150 mm x 5 µm) column and methanol-acetonitrile-water (10:10:80 V/V, 70/10/20) as mobile phase, with 0.8 mL/min, for 70 mins, at a detection wavelength of 230 nm. It was found that seasonality influences secondary metabolite production, with differences being observed mainly in the masses of all parts of the respective fractions. In the dichloromethane and ethyl acetate fractions, differences in peak heights were observed, as well as differences in concentrations of these metabolites. Five iridoids were detected by UV profile in almost all the samples analyzed, but with different concentrations. This indicates that climatic changes do not significantly influence the production of these substances, but do influence the concentration. HPLC analysis showed a higher concentration of plumieride in the stems in Fall (362.74 µg/mL) and Spring (351.65 µg/mL) and higher concentrations of plumericin in the roots in all four seasons of the year, particularly in the Summer roots (320.42 µg/mL). Correlating the yield obtained from 100 g of dried plant, the best concentrations for plumieride were obtained in the stems in Spring and Fall, with 201.79 and 47.63 µg/mL, respectively. For plumericin, the yields were similar for the Spring roots (94.00 µg/mL) and Fall leaves (92.81 µg/mL). The production of these metabolites is related to the defense mechanisms of the plant, which may explain the differences observed in the concentration of these markers, in relation to the part of the plant evaluated, and the season.
Key words: Allamanda schottii, iridoids, HPLC
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Biossíntese de terpenóides................................................................ 27 Figura 2 Biossíntese de iridóides...................................................................... 28 Figura 3 Allamanda schottii............................................................................... 37 Figura 4 Esquema geral dos procedimentos de extração e fracionamento
das coletas de raiz, caule e folhas da Allamanda schottii.................. 43
Figura 5 Perfil dos iridóides plumierídeo (a) e plumericina (b). Condições cromatográficas: eluição de gradiente metanol:acetonitrila:água, na proporção 10:10:80 a 20:10:70 a 10 minutos, 35:10:55 a 20 minutos, 50:10:40 a 35 minutos, 70:10:20 a 50 minutos, 50:10:40 a 60 minutos e por fim a 65 minutos 10:10:80, fluxo 0,8 mL/min. λ=230 nm............................................................................................
52
Figura 6 Perfis cromatográficos da mesma parte coletada de Allamanda schottii em diferentes estações do ano. a) raiz; b) caule; c) folha. Condições cromatográficas: eluição de gradiente A:B:C, na proporção 10:10:80 a 20:10:70 a 10 minutos, 35:10:55 a 20 minutos, 50:10:40 a 35 minutos, 70:10:20 a 50 minutos, 50:10:40 a 60 minutos e por fim a 65 minutos 10:10:80, fluxo 0,8 mL/min. 230 nm, fração diclorometano...................................................................
54
Figura 7 Perfis cromatográficos da mesma parte coletada de Allamanda schottii em diferentes estações do ano. a) raiz; b) caule; c) folha. Condições cromatográficas: eluição de gradiente A:B:C, na proporção 10:10:80 a 20:10:70 a 10 minutos, 35:10:55 a 20 minutos, 50:10:40 a 35 minutos, 70:10:20 a 50 minutos, 50:10:40 a 60 minutos e por fim a 65 minutos 10:10:80, fluxo 0,8 mL/min., 230 nm, fração acetato de etila.................................................................
55
Figura 8 Perfis cromatográficos de iridóides da mesma parte coletada de Allamanda schottii em diferentes estações do ano. a) outono, b) inverno. Condições cromatográficas: eluição de gradiente A:B:C, na proporção 10:10:80 a 20:10:70 a 10 minutos, 35:10:55 a 20 minutos, 50:10:40 a 35 minutos, 70:10:20 a 50 minutos, 50:10:40 a 60 minutos e por fim a 65 minutos 10:10:80, fluxo 0,8 mL/min., 230 nm, fração diclorometano...................................................................
58
Figura 9 Perfis cromatográficos de iridóides da mesma parte coletada de Allamanda schottii em diferentes estações do ano. a) primavera, b) verão. Condições cromatográficas: eluição de gradiente A:B:C, na proporção 10:10:80 a 20:10:70 a 10 minutos, 35:10:55 a 20 minutos, 50:10:40 a 35 minutos, 70:10:20 a 50 minutos, 50:10:40 a 60 minutos e por fim a 65 minutos 10:10:80, fluxo 0,8 mL/min., 230 nm, fração diclorometano. .................................................................
59
Figura 10 Concentrações médias (µg/mL) de plumierídeo na fração diclorometano das diferentes partes da A. schottii (�) raiz, (�) caule e (�)folha coletada nas diferentes estações do ano................
65
Figura 11 Concentrações médias (µg/mL) de plumierídeo na fração acetato das diferentes partes da A. schottii (�) raiz, (�) caule e (�)folha coletada nas diferentes estações do ano...........................................
66
Figura 12 Concentrações médias (µg/mL) de plumericina na fração diclorometano das diferentes partes da A. schottii (�) raiz, (�) caule e (�) folha coletada nas diferentes estações do ano...............
67
Figura 13 Concentrações médias (µg/mL) de plumericina na fração acetato das diferentes partes da A. schottii (�) raiz, (�) caule e (�) folha coletada nas diferentes estações do ano...........................................
68
Figura 14 Concentrações médias em mg de plumierídeo em 100g de parte de planta seca na fração diclorometano das diferentes partes da A. schottii (�- Raiz; �-Caule; �-Folha) e coletadas nas diferentes estações do ano.................................................................................
73
Figura 15 Concentrações médias em mg de plumierídeo em 100g de parte de planta seca na fração acetato de etila das diferentes partes da A. schottii (�- Raiz; �-Caule; �-Folha) e coletadas nas diferentes estações do ano.................................................................................
74
Figura 16 Concentrações médias em mg de plumericina em 100g de parte de planta seca na fração diclorometano das diferentes partes da A. schottii (�- Raiz; �-Caule; �-Folha) e coletadas nas diferentes estações do ano.................................................................................
75
Figura 17 Concentrações médias em mg de plumericina em 100g de parte de planta seca na fração acetato de etila das diferentes partes da A. schottii (�- Raiz; �-Caule; �-Folha) e coletadas nas diferentes estações do ano.................................................................................
76
LISTA DE TABELAS Tabela 1 Rendimento de massa do extrato bruto obtido de diferentes
partes de A. schottii nas diferentes estações de coleta, partindo de 100g de planta............................................................................
47
Tabela 2 Rendimento de massa das frações obtidas das diferentes partes de A. schottii em diferentes estações do ano de coleta partindo de 2g de extrato bruto......................................................................
49
Tabela 3 Concentração média do plumierídeo na fração diclorometano nas diferentes partes da A. schottii, coletada em diferentes estações...
60
Tabela 4 Concentração média do plumierídeo na fração acetato de etila nas diferentes partes da A. schottii, coletada em diferentes estações...........................................................................................
61
Tabela 5 Concentração média da plumericina na fração diclorometano nas diferentes partes da A. schottii.........................................................
62
Tabela 6 Concentração média da plumericina na fração acetato de etila nas diferentes partes da A. schottii..................................................
63
Tabela 7 Concentração média de plumierídeo na fração diclorometano nas diferentes partes e coletas em mg/ 100 g de parte de planta seca.
69
Tabela 8 Concentração média de plumierídeo na fração acetato de etila nas diferentes partes e coletas em mg/ 100 g de parte de planta seca.................................................................................................
70
Tabela 9 Concentração média de plumericina na fração diclorometano nas diferentes partes e coletas em mg/ 100 g de parte de planta seca.
71
Tabela 10 Concentração média de plumericina na fração acetato nas diferentes partes e coletas em mg/ 100 g de parte de planta seca.
72
LISTA DE ABREVIATURAS λ - comprimento de onda AAS – ácido acetil salicílico
ACN – acetonitrila
AS – ácido salicílico
C10 – 10 unidades de carbono
CLAE – cromatografia liquida de alta eficiência
CV – coeficiente de variação EPM – erro padrão de média EtOAc – acetato de etila
LD – limite de detecção
LQ – limite de quantificação
MeOH – metanol
min – minutos
PTFE – politetrafluoretileno
RSD – desvio padrão relativo
s – desvio padrão SAR – resistência sistêmica adquirida
Tr – tempo de retenção
UV – ultra violeta
UV-Vis – ultra violeta – visível
v/v – volume/volume
SUMÁRIO
1 Introdução.............................................................................................. 15
2 Objetivos................................................................................................ 17
2.1 Objetivo Geral..................................................................................... 17
2.2 Objetivos Específicos.......................................................................... 17
3 Revisão bibliográfica.............................................................................. 18
3.1 Plantas Medicinais como fonte de Medicamentos.............................. 18
3.2 O Estudo de Plantas medicinais no Brasil.......................................... 20
3.3 Fisiologia vegetal............................................................................... 21
3.3.1 Raiz.................................................................................................. 22
3.3.2 Caule................................................................................................ 22
3.3.3 Folha................................................................................................ 23
3.4 Metabolismo secundário..................................................................... 24
3.4.1 Iridóides: metabólitos secundários alvos deste trabalho................ 26
3.5 Fatores que influenciam o conteúdo de metabólitos secundários...... 30
3.5.1 Sazonalidade................................................................................... 30
3.5.2 Luminosidade................................................................................... 31
3.5.3 Disponibilidade hídrica..................................................................... 32
3.5.4 Temperatura.................................................................................... 33
3.5.5 Nutrientes do solo............................................................................ 34
3.6 Considerações sobre a família APOCYNACEAE A.L. de Jussieu..... 35
3.6.1 Considerações sobre o Gênero Allamanda..................................... 36
3.7 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) na análise de
metabólitos secundários...........................................................................
38
4 Parte experimental................................................................................. 41
4.1 Material............................................................................................... 41
4.1.1 Reagentes........................................................................................ 41
4.1.2 Padrões............................................................................................ 41
4.1.3 Equipamentos.................................................................................. 41
4.2 Material vegetal................................................................................... 42
4.3 Preparação dos extratos..................................................................... 42
4.4 Analises cromatográficas através de CLAE........................................ 44
4.4.1 Preparo das soluções...................................................................... 44
4.4.2 Quantificação dos metabólitos secundários.................................... 45
4.5 Análise estatística............................................................................... 46
5 Resultados e discussões....................................................................... 47
5.1 Rendimento dos extratos.................................................................... 47
5.1.1 Rendimento das frações.................................................................. 48
5.2 Análise qualitativa por CLAE de metabólitos secundários nas
frações de diclorometano e acetato de etila obtidas das raízes, caules e
folhas da A.schottii coletadas nas quatro estações.................................
51
5.3 Análise quantitativa dos iridóides plumierideo e plumericina na
Allamanda schottii.....................................................................................
60
5.4 Análise quantitativa do rendimento dos iridóides partindo de 100
gramas de planta seca..............................................................................
68
6 Conclusões............................................................................................ 78
7 Referências Bibliográficas..................................................................... 80
15
1 INTRODUÇÃO
Os produtos naturais são utilizados pela humanidade desde tempos
imemoriais. A busca incessante pela compreensão das leis naturais e o desafio de
transpor barreiras à sua sobrevivência, como o clima e as doenças, levaram o
homem ao atual estágio de desenvolvimento científico (VIEGAS Jr.; BOLZANI;
BARREIRO, 2006). As plantas representam uma extraordinária fonte de novos
compostos com atividade terapêutica. Elas são responsáveis pela síntese de
diversas substâncias, entre estas se destacam os metabólitos secundários, sendo
estes fonte de interesse no estudo de plantas medicinais (GURIB-FAKIM, 2006).
Durante muito tempo, acreditou-se que os metabólitos secundários fossem
produzidos sem uma função específica, simplesmente como produtos finais das
reações, chegaram a ser considerados até como anomalias. Essa visão mudou
radicalmente e a cada dia descobre-se um pouco mais sobre a função dessas
substâncias (JENKE-KODAMA; MÜLLER, DITTMANN, 2008; SMETANSKA, 2008).
Os metabólitos secundários têm importantes funções no ecossistema seja
como substâncias de sinal, reconhecimento, defesa e inibição, ou ainda como
substâncias venenosas. Sua produção nas plantas está relacionada a processos
adaptativos frente às adversidades como predadores, mudanças climáticas ou
situações de estresse, como falta de água ou baixa luminosidade. A quantidade ou a
natureza destas substâncias não é constante durante o ano. Já foram relatadas
variações sazonais no conteúdo de praticamente todas as classes de metabólitos
secundários (TAMURA; NISHIBE, 2002; LARCHER, 2006; GOBBO-NETO; LOPES,
2007; CHAUDHURI et al., 2008).
Atualmente, é muito expressivo o número de fármacos disponíveis na
terapêutica desenvolvidos a partir de metabólitos secundários provenientes de
plantas medicinais. Entre os exemplos de pode-se citar a escopolamina (sedativo),
quinina (antimalárico), eugenol (analgésico tópico), cafeína (estimulante do sistema
nervoso central), azadiraquitina (fagorepelente) (PINTO et al, 2002; NIERO et al.,
2003), reserpina (tranquilizante) e o taxol (antitumoral) (GURIB-FAKIM, 2006).
Tornando-se esta uma área de interesse na busca de novas moléculas que possam
somar ao arsenal terapêutico existente.
Entre as técnicas usadas para avaliar a composição química das plantas,
destaca-se a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). Esta técnica é utilizada
16
tanto em análises qualitativas como quantitativas. Os perfis cromatográficos obtidos
podem ser úteis para o isolamento direcionado dos metabólitos de interesse.
O curso de farmácia através do NIQFAR/CCS, vem consolidando a
importância das plantas medicinais, e é por meio deste núcleo de pesquisa que este
trabalho visa contribuir através da caracterização do perfil químico de frações
obtidas de diferentes partes da Allamanda schottii, bem como estabelecer a melhor
época de coleta visando a obtenção de metabólitos secundários de interesse
farmacológico através da avaliação por CLAE.
17
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Avaliar qualitativamente a influência da sazonalidade na produção de
metabólitos secundários, entre os quais os iridóides nas diferentes partes (raiz,
caule e folhas) da Allamanda schottii, assim como quantitativamente a produção dos
iridóides plumericina e plumierídeo, presentes nas frações diclorometano e acetato
de etila através da técnica de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE).
2.2 Objetivos específicos
Coletar raiz, caule e folhas da Allamanda schottii no final de cada estação do ano,
obter os respectivos extratos etanólicos e submete-los a processo de partição
líquido-líquido com hexano, diclorometano e acetato de etila;
Avaliar o rendimento de massa dos extratos e frações obtidas nas diferentes coletas;
Avaliar qualitativamente por cromatografia líquida de alta eficiência a influência da
sazonalidade na produção de metabólitos secundários presentes nas frações
diclorometano e acetato de etila obtidas das diferentes partes da Allamanda schottii.
Quantificar os iridóides plumericina e plumierídeo nas frações de diclorometano e
acetato de etila obtidas das diferentes partes da planta nas diferentes épocas de
coleta.
18
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 Plantas medicinais como fonte de medicamentos
Uma planta medicinal pode ser definida como qualquer vegetal que
produza, em quantidade considerável, substâncias biologicamente ativas utilizadas
direta ou indiretamente como medicamentos (CASTRO et al., 2001; BARREIRO;
BOLZANI; VIEGAS, 2006). Outros autores também definem como sendo uma planta
que contenha um ou mais principio(s) ativo(s) que possa lhe conferir atividade
terapêutica (MARTINS et al., 2000; NIERO et al., 2003; CALIXTO, 2005). As plantas
e microrganismos cultiváveis são as principais fontes de moléculas biologicamente
ativas e terapeuticamente úteis, embora as triagens contínuas destas fontes
frequentemente levem a altos índices de reisolamento de substâncias já
caracterizadas (PUPO et al, 2007).
A utilização de plantas para fins medicinais é, provavelmente, tão antiga
quanto a humanidade (DAVID, 2004). Se acompanharmos a evolução através dos
tempos, analisaremos que as civilizações primitivas logo cedo perceberam ao lado
das plantas comestíveis, a existência de outras plantas dotadas de maior ou menor
toxicidade que, quando experimentadas no combate à doença, revelaram, embora
empiricamente, o seu potencial curativo (CUNHA, 2003; BARREIRO; BOLZANI;
VIEGAS, 2006).
O homem primitivo sempre buscou na natureza as soluções para os males
que o assolava, fossem esses de ordem espiritual ou física (ALVIM et al., 2006).
Alguns estudiosos afirmam que existe uma correlação entre homem e planta,
baseando-se nas pinturas rupestres que mostram desenhos de vegetais ao lado de
órgãos humanos (HENRIQUES, 2006). O conhecimento de plantas alucinógenas
pelos amerídios, que as empregavam em seus ritos pagãos, bem como das
propriedades afrodisíacas de diversas porções preparadas a partir de distintas
espécies vegetais, acompanha o homem há milênios (BARREIRO; FRAGA, 2001).
Aos feiticeiros, considerados intermediário entre homens e deuses cabiam a tarefa
de curar os doentes, unindo-se, deste modo, magia e religião ao saber empírico das
práticas de saúde, a exemplo do emprego de plantas medicinais (ALVIM et al.,
2006).
19
história relata o uso da beladona, ópio, ginseng, acônito, quina, alho, sene,
cânfora, dentre outras, como sendo as primeiras descrições sobre plantas
medicinais feitas pelo homem que remontam às sagradas escrituras e ao papiro de
Ebers (GURIB-FAKIM, 2006).
Ao longo dos anos diversas plantas vem contribuindo para o arsenal
terapêutico, destacando-se a Papaver somniferun, cujo uso tem sido como
anestésico e analgésico; Digitalis purpúrea, empregada em afecções
cardiovasculares, ou como regulador cardíaco; Digitalis lanata, que atua em
disritmias cardíacas e como cardiotônica; beladona, Atropa belladona, que tem
atividade antiespasmódica, sedativa, antihipertensiva e atuam nos problemas
oculares; Hypericum perforatum, com atividade antidepressiva e inibidor da
monoamina oxidase, entre outras (NIERO et al., 2003; GURIB-FAKIM, 2006;
NEWMAN; CRAGG, 2007).
Estudos demonstram que a partir do século XXI houve um interesse
crescente pelos fitoterápicos devido à aceitação da visão holística de tratamento,
que atribui o surgimento de muitas doenças complexas como diabetes, doenças do
coração, câncer e desordens psiquiátricas, a uma combinação de fatores genéticos,
ambientais e comportamentais. Além disso, o aparecimento de resistência no uso
contínuo de antibióticos também pode ser considerado um fator que tem levado a
um maior interesse por estes medicamentos (RASKIN et al., 2002).
O desenvolvimento de medicamentos oriundos de plantas medicinais
(fitoterápicos) é geralmente mais rápido e envolve custos menores se comparados
com os sintéticos. Algumas plantas têm suas propriedades medicinais conhecidas
na medicina popular e muitas delas são comercializadas de maneira informal, sendo,
muitas vezes, o uso popular a principal fonte de informação para o desenvolvimento
de um fitoterápico (CALIXTO, 1996; BUTLER, 2005).
A idéia do uso de fitoterápicos não substitui medicamentos registrados e já
comercializados, mas sim aumenta a opção terapêutica dos profissionais de saúde
ofertando medicamentos equivalentes, também registrados, talvez mais baratos,
com espectros de ação mais adequados e, quiçá, com indicações terapêuticas
complementares às medicações existentes (NIERO et al.,2003).
A indústria de fitoterápicos comercializou bilhões em todo o mundo, tendo
como principais mercados, o americano e o europeu. Entre os medicamentos
fitoterápicos mais vendidos na Europa destacam-se o Ginkgo biloba, Hypericum
20
perforatum, Valeriana officinalis e o Panax ginseng (MARTINS, 2003; CRAGG,
NEWMAN, 2007).
Os produtos encontrados na natureza revelam uma imensa diversidade
em termos de estrutura e de propriedades físico-químicas e biológicas. Apesar dos
intensos estudos nesta área, os dados disponíveis revelam que apenas 15 a 17%
das espécies vegetais existentes foram estudadas quanto ao seu potencial
medicinal, tornando esta uma área de pesquisa muito importante para o
desenvolvimento de novos fármacos (NIERO et al., 2003).
3.2 O estudo de plantas medicinais no Brasil
A pesquisa em produtos naturais é uma das áreas mais tradicionais da
Química no Brasil, devido aos fatores históricos amplamente discutidos e à grande
biodiversidade do país (PINTO et al., 2002). O Brasil tem em sua biodiversidade um
grande potencial de moléculas inovadoras. As florestas tropicais são frequentemente
consideradas as de maior biodiversidade vegetal, atraindo olhares e atenção de
pesquisadores de todo o mundo. O país tem como vantagem competitiva
aproximadamente 55.000 espécies vegetais catalogadas que, se tiverem
comprovação do seu valor medicinal, poderão ser utilizadas pela indústria
farmacêutica como matéria-prima para o desenvolvimento de fitoterápicos e como
fonte para fitofármacos (PUPO et al., 2007).
Muitas das espécies medicinais utilizadas pela população brasileira são
exóticas, originárias da Europa, com técnicas de cultivo apropriadas daquela região,
mas que ainda não foram adaptadas às condições climáticas brasileiras (SABINO,
2004). Atualmente no Brasil, plantas medicinais e drogas vegetais são
comercializadas em farmácias e lojas de produtos naturais, em geral sem possuírem
um certificado de qualidade expedido pelos órgãos competentes. Esta ausência de
controle de qualidade pode contribuir para a ocorrência de adulterações, trocas de
matérias vegetais, uma vez que não são identificadas adequadamente, e até mesmo
interações com medicamentos alopáticos, problemas de superdosagem e reações
alérgicas podem ocorrer (VEIGA Jr.; PINTO; MACIEL, 2005).
Das plantas brasileiras estudadas fitoquimicamente e farmacologicamente
vale citar a Croton cajucara, conhecida popularmente como sacaca, da qual foram
21
isolados diterpenos como a desidrocrotonina e cajucarina B. Esta classe de
compostos apresentou atividade antibiótica e antitumoral (ALVIANO et al.,2005).
Dentre os ativos mais importantes isolados de plantas brasileiras podemos citar os
diterpenos caurânicos como o ácido caurenóico, isolado de plantas como a Wedelia
paludosa e Xylopia frutescens, apresentando atividade tripanossomicida,
antibacteriana e antifúngica (SARTORI et al., 2003; CECHINEL FILHO et al., 2004).
Assim como o lapachol, uma naftoquinona isolada do gênero Tabebuia, que
apresentou atividade antitumoral, antimalárica, tripanossomicida e antimicrobiana
(OLIVEIRA; BRAGA, 2003). Outra espécie é a Drimys brasiliensis, que possui
grande concentração de sesquiterpenos drimanos, entre eles o poligodial e o
drimanial que possuem atividade analgésica (MALHEIROS, 2001). Estes e outros
resultados fazem do Brasil um país competitivo nesta área.
3.3 Fisiologia vegetal
A diversidade de organismos vegetais criou no homem a necessidade de
classificação, com o fim de poder acumular conhecimentos sobre eles.
Instintivamente, o homem começou a classificar as plantas, dividindo o mundo
vegetal em grupos menores e mais fáceis de entender, para que isso ocorresse,
Darwin começou a organizar os vegetais em grupos, baseados no aspecto estrutural
das partes que o compõe: raízes, caules, folhas, frutos e sementes (OLIVEIRA;
AKISUE; AKISUE, 1991; RAVEN; EVERT; EICHHARN, 1998).
Nos últimos 20 anos, grandes questões foram levantadas e atualmente se
apresentam como fundamentais no estudo de plantas. No Brasil, um país com um
enorme índice de biodiversidade e com uma produção agrícola que se coloca entre
as maiores e mais importantes do mundo, questões relacionadas à biotecnologia e
ao meio ambiente são centrais e de grande importância para a sociedade. Neste
contexto, a Fisiologia Vegetal, que visa compreender como as plantas funcionam, é
hoje um dos pilares da ciência moderna (FERRI, 1990; LARCHER, 2006).
22
3.3.1 Raiz
A raiz faz parte do eixo de fixação da planta, e em geral, é subterrânea
exercendo funções de fixação da planta ao substrato e de absorção de sais
minerais. Há casos de raízes que não vivem subterraneamente, mas na água ou
expostas ou ar (GARCIA; MARTINEZ-LABORDA, 1994). Grande parte das raízes
são órgãos de armazenamento, mas de uma maneira geral pode-se relaciona-las a
fixação, absorção, reserva e condução (LACHER, 2006).
Numa raiz pode-se encontrar a estrutura primária e a secundária. Em uma
estrutura primária verifica-se a existência de duas regiões demarcadas: uma região
mais desenvolvida e situada exteriormente, a casca, formada por várias camadas,
sendo a externa a epiderme seguida pelo parênquima, e outra, de menor
desenvolvimento e situada no interior, denominada cilindro central, a endoderme. O
crescimento das raízes se dá em um processo contínuo que cessa somente em
condições adversas como épocas de secas e baixas temperaturas (ESAU, 1985;
GARCIA; MARTINEZ-LABORDA, 1994).
3.3.2 Caule
O caule é a parte área do eixo da planta, e sua formação se inicia
geralmente durante o período embrionário, no processo de germinação da semente.
Este órgão fornece o suporte mecânico para as folhas, flores e frutos e quando visto
externamente, mostra com maior ou menor nitidez os nós entre os quais ficam os
entrenós. Nos nós se originam ramos caulinares em axilas de folhas (GARCIA;
MARTINEZ-LABORDA, 1994).
Quanto ao desenvolvimento dos caules pode-se classifica-los em ervas
(pouco desenvolvidas e com ausência de crescimento secundário), subarbustos
(plantas que chegam a aproximadamente 1,5 m, cujos ramos são sublenhosos),
arbustos (plantas com altura média inferior a 5 m, resistentes, com ramos lenhosos
mas sem um tronco predominante), árvores (plantas de altura superior a 5 m,
geralmente com tronco nítido), arvoreta (árvore de pequeno porte com tronco muito
curto) e trepadeiras (caule tipo cipó, trepador, sarmentoso, lenhoso) (FERRI, 1990;).
23
As duas principais funções associadas aos caules são condução e
suporte. As substâncias produzidas nas folhas são transportadas através dos
caules, via floema, para os locais de consumo, incluindo caule e raízes em
crescimento, assim como flores, semente e frutos em desenvolvimento. Grande
parte do material nutritivo é armazenado em células do parênquima das raízes,
semente e fruto, mas o caule também constitui importante órgão de reserva, além
disso é responsável pela condução da água, via xilema, indo das raízes para as
folhas. Sua função de suporte está diretamente relacionada as folhas, principais
órgãos fotossintetizantes da planta, pois as colocam em posições favoráveis para a
exposição à luz (LACHER, 2006).
3.3.3 Folha
A folha é o principal órgão lateral da planta, nascido sobre o caule, e
juntamente com este formam os ramos. Geralmente são clorofiladas e apresentam
crescimento limitado. A folha quando completa, é constituída de peça laminar
denominada limbo, de parte estreita geralmente subcilíndrica, denominada pecíolo e
de parte basal que pode ser provida de estípulas e bainhas. Sua principal função
está relacionada a fotossíntese (OLIVEIRA; AKISUE; AKISUE, 1991).
A variação na estrutura das folhas está relacionada, em grande parte, com
o habitat e a disponibilidade de água do local onde a planta está situada, ambos os
fatores afetam o formato e a estrutura das folhas (LACHER, 2006) .
Com base em sua necessidade de água, as folhas são classificadas como
mesófitas (plantas que requerem solo com água em abundância e uma atmosfera
relativamente úmida), hidrófitas (plantas que dependem de um suprimento
abundante de umidade ou crescem parcial ou completamente submersas na água) e
xerófitas (plantas adaptadas a habitats áridos) (RAVEN; EVERT; EICHHARN, 1998).
A epiderme evita a perda de água, por isso que em ambientes onde as
folhas estão sob forte iluminação não apresentam cloroplastos (células responsáveis
pela fotossíntese), sendo que estes ficam dispostos em camadas mais profundas.
Em ambiente mais secos e de maior luminosidade as folhas são, geralmente, mais
espessas devido maior desenvolvimento do parênquima paliçádico (GARCIA;
MARTINEZ, 1994; LACHER, 2006).
24
3.4 Metabolismo secundário
As plantas produzem dois tipos distintos de metabólitos, os primários que
são encontrados em todos os sistemas vivos e são essenciais ao crescimento e os
secundários, que são produtos de metabolismo específico e são resultantes de
processos adaptativos a vida da própria planta (BRUNETON, 1995; BASILE et al.,
2000; LIMA, 2001; NIERO et al., 2003). Um extrato vegetal bruto constitui uma
matriz bem complexa contendo centenas ou milhares de metabólitos, que diferem
consideravelmente em seus parâmetros físico-químicos e espectroscópicos
(RODRIGUES et al., 2006).
A maioria dos compostos presentes nas plantas faz parte do metabolismo
primário. Estes são polissacarídeos, açúcares, proteínas e graxas, substâncias
essenciais à sua sobrevivência e desenvolvimento (VERPOORTE; MEMELINK,
2002).
Já os metabólitos secundários não são necessariamente essenciais ao
organismo produtor, porém têm um papel importante na sobrevivência em seu
ecossistema (SANTOS, 2004). A produção de determinados metabólitos
secundários, pode ser restrita de certas plantas e são caracterizados por uma
enorme diversidade química. Hoje, sabe-se que as referidas substâncias, são de
importância relevante nos mecanismos de defesa contra seus predadores (LIMA,
2001; NIERO et al., 2003; HARTMANN, 2007).
Embora os metabólitos secundários encontrem-se presentes em
concentrações bem menores, a maioria deles, tais como alcalóides, terpenóides,
antocianinas, esteróides, flavonóides, quinonas e lignanas, têm encontrado
aplicações comerciais como fármacos, corantes, aromas, inseticidas etc. Estes
compostos apresentam uma ampla diversidade em estruturas e tamanhos, sendo
encontrados e distribuídos por todo o reino vegetal (BRAZ – FILHO, 1999;
VERPOORTE et al., 2000; COLLIN, 2001).
Como estes compostos são utilizados em grandes quantidades, a
produção pelas plantas nem sempre é satisfatória. Estas substâncias
frequentemente estão restritas a uma espécie ou gênero. Muitas vezes podem ser
produzidas somente durante uma determinada fase do crescimento ou um estágio
do desenvolvimento vegetal, ou ainda em estações específicas do ano, sob
25
condições de estresse ou de disponibilidade de nutrientes (VERPOORTE;
MEMELINK, 2002; HARTMANN, 2007).
Os metabólitos secundários vêm sendo estudados quanto a sua
biossíntese, isolamento, determinação estrutural e investigação de suas
propriedades biológicas. Muitas “curas” de patologias são atribuídas aos metabólitos
secundários e nos dias atuais o interesse científico por essas substâncias tem
aumentado devido a busca por novos medicamentos oriundos de plantas (BASILE et
al., 2000).
Alguns estudos descobriram o envolvimento do ácido salicílico (AS) e de
seu derivado acetilado (AAS) nas reações de defesa contra patógenos, o ácido
salicílico foi umas das primeiras substâncias isoladas a partir de produtos naturais.
Ele é acumulado no tecido vegetal após a infecção, provocando uma resposta
imune, chamada de resistência sistêmica adquirida (SAR). O ácido salicílico foi
descrito como a molécula sinalizadora no desenvolvimento da SAR no fumo e no
pepino. No fumo, o nível de AS aumentou em mais de 40 vezes nas imediações da
lesão por onde penetrou o patógeno (PINTO et al., 2002).
Nos últimos anos, técnicas como cultivo de células vegetais e utilização de
estimuladores biológicos vêm ganhando destaque na produção de metabólitos
secundários de interesse (VERPOORTE; MEMELINK, 2002). Pode-se citar como
exemplo, a transformação genética usando o sistema de vetor natural mediado pelo
Agrobacterium rhizogenes ou A. tumefaciens, causadores do fenótipo hairy roots
(raízes em cabeleira) em plantas. Estas raízes oferecem um sistema promissor para
a produção de metabólitos secundários, uma vez que elas possuem crescimento
rápido assim como estabilidades genética e biossintética. Assim essas raízes podem
ser usadas como uma fonte contínua para a produção de metabólitos secundários
(GIRI; NARASU, 2000).
3.4.1 Iridóides: metabólitos secundários alvos dest e trabalho
Os iridóides são um grupo amplo de princípios amargos dentro da
subclasse dos monoterpenos bicíclicos (C10). O esqueleto iridano (núcleo
fundamental) possui um anel ciclopentano que usualmente está fundido com um
segundo heterociclo oxigenado de seis membros (BIANCO, 1994). Estes
26
denominam-se iridóides, por se considerarem derivados do iridodial, isolado das
formigas da Austrália Iridomyrmex spp., que produz estes compostos como defesa
(COSTA, 1994; HEIDELBERG, 2007).
Os iridóides são derivados biossiteticamente do monoterpeno geraniol por
meio de uma ciclização alternativa do geranil difosfato (Figura 1) (DUBEY et al.,
2003; NIERO, MALHEIROS, 2007). O núcleo iridóide é formado pela ciclização do
iridodial (Figura 2), que é produzido por uma serie de reações de oxidação e
hidroxilação no geraniol. A oxidação é assistida por enzima e se forma através de
uma base de Schiff intermediária. O iridodial está em equilíbrio com a sua forma
hemiacetal bicíclica (SAMPAIO–SANTOS; KAPLAN, 2001; SIMÕES et al, 2004).
27
GPP sintase
OPP OPP
H
DMAPP IPP
(GPP, C10)
(FPP, C15)
C30
Monoterpenos
DiterpenosCarotenóidesClorofila
Sesquiterpenos
Triterpenos
IPP
GGPP sintase + IPP
Hemiterpenos
Geranil difosfato
FPP sintase +
Farnesil difosfato
Óleos essenciais
Geranilgeranil difosfato (GGPP, C20)
(+IPP)n
Politerpenos
Esqualenodimerização
Saponinas
Fitoesteróis
Figura 1- Biossíntese de terpenóides (adaptado de DUBEY et al., 2003)
Esta classe de metabólitos secundários pode ser encontrada em uma
grande variedade de plantas e alguns animais, sendo produzidos principalmente por
plantas como defesa contra herbívoros ou infecções por microorganismos (DIDNA;
DEBNATH; HARIGAYA, 2007). Já se encontram descritos cerca de 2500 iridóides
na natureza, sendo diferenciados em sua maioria somente no grau e no tipo de
substituição no sistema básico do anel ciclopentano (BREITMAER, 1999;
HEIDELBERG, 2007).
28
O HC H O
O
H
geraniol
via hidroxilação e oxidação
C H O
N H +
e nz im a
O
C H O
C H O
N H
enz im a
H O
OO
iridodial(forma ceto)
iridodial(forma enol)
iridodial(forma hemiacetal)
+
H -
(NADPH)
H +
H +
Figura 2- Biossíntese de iridóides (SAMPAIO–SANTOS; KAPLAN, 2001)
Estes compostos podem ser encontrados em estruturas abertas
(secoiridóides) ou fechadas (iridóides), geralmente na forma heterosídica e na
maioria das vezes como glicosídeos. Os principais iridóides glicosídeos encontrados
são: plumerídeo (1), verbenalina (2) e aucubina (3). Entre os não glicosilados
destacam-se o iridodial (4), plumericina (5), allamandina (6) e a fulvoplumierina (7).
Entre os iridóides isolados do gênero Allamanda vale salientar a
fulvoplumierina, ativa contra o vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV–1)
(TAN et al., 1991; STEPHENS et al., 2007), leucemia P–388 e vários tipos de células
de câncer humano (mama, colon, pulmão, melanoma) (KARDONO et al., 1990).
Entre as atividades farmacológicas dos iridóides, destacam-se alguns de
seus representantes por possuem potencial antiinflamatório, analgésico,
antibacteriano, antifúngico, antitumoral, além de apresentar atividade sedativa,
tranqüilizante, indutora do sono e hepatoprotetora (KABAZINKI et al., 1999;
MILKOWSKA; BORKOWSKI; ROZANSKI, 1999; DEWICK, 2002; AFIFI et al., 2006;
CHIBA et al., 2006; SIMÃO DA SILVA, 2007).
29
O
O O
O
O H
H O OH
HO OH
OH
(1)(2)
(3)
O
O O
O
O
H
OH
H
O
H
OHH O
O O
O
O
H
OH
H
O OH
HO OH
OH
O
O O
O
O
O
OH
H
H
O
O
HO
HO
H
H O OH
HO OH
OH
(4)
(5)
(6)O
O O
H
OH
(7)
O iridóide plumierídeo (1) vem se destacando por apresentar potencial
antifungico (AFIFI et al., 2006), além do potencial inibitório sobre o crescimento de
plantas (TIWARI et al., 2002). Ele também possui ação antitumoral em células de
fibrosarcoma. Algumas modificações na sua estrutura, como esterificação da
unidade glicosídica, hidrólise de éster e amidação, promoveram a formação de
derivados que obtiveram aumento da citotoxicidade (DOBHAL et al., 2004).
Recentemente foi constatado que o plumierídeo inibe processos
inflamatórios e nociceptivos. Os resultados indicam que o efeito possa decorrer de
sua interferência com mecanismos de sinalização celular mediadas por bradicinina,
bem como de inibição sobre mecanismos de migração de leucócitos.Estudos ainda
estão sendo realizados no intuito de desenvolver uma nova alternativa terapêutica
30
para o tratamento de inflamação e dor, principais alvos de estudos relacionados os
iridóide até o momento. (SIMÃO DA SILVA, 2007).
A plumericina (4) foi reportada por apresentar bioatividade frente a cultura
de tecidos KB (KUPCHAN et al., 1974), células 9KB e células 3PS (ANDERSON;
CHANG; McLAUGHLIN, 1988). Este iridóide também apresenta atividade
antimicrobiana (LITTLE; JOHNSTONE, 1951; HAMBURGUER; CORDELL;
RUANGRUNGSI, 1991), antifúngica, além de ter ação antineoplásica, antiflogística
(BOLZANI et al., 1999; LI, 2006) e potente atividade antileishmaniose (CASTILHO et
al., 2007).
3.5 Fatores que influenciam o conteúdo de metabólit os secundários
O teor dos constituintes presentes em uma espécie vegetal varia
consideravelmente em função de fatores externos, incluindo: temperatura, umidade,
luminosidade, nutrientes do solo, método de coleta, transporte e secagem, parte
planta usada. Cada um desses fatores pode afetar diretamente a qualidade da
matéria-prima vegetal, e conseqüentemente, o extrato bruto final obtido das plantas
podem ser atingidos quanto ao teor de metabólitos presentes (ENGEL, 2006;
GOBBO-NETO; LOPES, 2007).
3.5.1 Sazonalidade
A época em que uma planta é coletada é um dos fatores de maior
importância, visto que a quantidade e, às vezes, até mesmo a natureza dos
constituintes ativos não é constante durante o ano. Há estudos que demonstram que
a composição de metabólitos secundários de uma planta pode variar até durante o
ciclo dia/ noite ( GOBBO – NETO; LOPES, 2007).
Estes compostos podem ter sua concentração diferente em poucos dias
ou dentro de poucas horas devido a influência de estresse que modificam a
quantidade e a composição dos metabólitos que a planta tende a produzir. O clima e
31
o tempo estão continuamente mudando e os metabólitos secundários acabam
sofrendo fortes interações (LARCHER, 2006).
Os fatores ambientais afetam a produção de matéria seca por meio de
suas influências sobre as trocas gasosas de CO2 e sobre o balanço de carbono.
Para exemplificar pode-se analisar que no verão há um aumento do rendimento da
produção de matéria seca devido a alta intensidade de radiação e maior duração do
dia (GOBBO-NETO; LOPES, 2007).
Com base nisto a escolha da época do ano em que uma planta será
coletada, assim como o dia e o horário de sua coleta são fatores que devem ser
levados em consideração no início de um trabalho que utilizará plantas medicinais,
tendo em vista o desenvolvimento sustentável da espécie que se está estudando.
3.5.2 Luminosidade
A luz é a fonte de energia da qual as plantas e, consequentemente, todos
os seres vivos dependem. Nas plantas além da fotossíntese, a luz pode
desempenhar um importante papel no controle do crescimento do vegetal. As
diferentes espécies de plantas estão adaptadas a uma enorme variação na
intensidade e quantidade de incidência luminosa (WATERMAN; MOLE, 1989).
Pela luminosidade há o controle de processos como a germinação das
sementes, desenvolvimento da planta e floração devido a luz ser tida como fonte de
energia. Plantas que possuem maior irradiação tendem a ter suas partes mais leves,
principalmente folhas, que as mantidas em sombreamento, estas tendem a ser mais
altas e apresentam uma área foliar maior. A radiação interfere também no ciclo
vegetativo e desenvolvimento do fruto (WHATHEY; WHATHEY, 1982; PEREIRA,
2007).
Além dos efeitos sobre o crescimento da planta, geralmente relacionados
aos caules, a luz pode afetar também o crescimento de outras partes da planta,
incluindo as que estão abaixo do solo. A capacidade de enraizar, a rapidez de
enraizamento e o número de raízes formadas, podem ser influenciados pela duração
do dia. As folhas, responsáveis pela percepção da luz, tem seu desenvolvimento e
relação de forma e tamanho relacionada a resposta do fotoperíodo que a planta
está, ou seja, a luminosidade presente. O tamanho e a espessura de uma folha
32
estão relacionados a duração e intensidade da luz, quanto maior a intensidade,
menor e mais grossa a folha será devido a disponibilidade de carboidratos
presentes, diminuída em baixos níveis de luminosidade (PEREIRA, 2007).
Com relação aos metabólitos secundários, há uma correlação positiva
entre a intensidade de radiação solar e a produção de compostos fenólicos, tais
como flavonóides, taninos e antocianinas. O aumento na produção de metabólitos
como flavonóides, tidos como “protetores solares” são controlados por enzimas da
rota biossintética dos fenilpropanóides , as quais podem ter sua expressão gênica
induzida pela luz. A exposição a luz de forma mais intensa também interfere no
aumento da produção de alcalóides e na formação de lactonas sesquiterpênicas
(GOBBO – NETO; LOPES, 2007).
3.5.3 Disponibilidade hídrica
A água é indispensável para o funcionamento de todo o metabolismo das
plantas. A maior parte da água absorvida por uma planta é perdida pela evaporação
das folhas, processo conhecido como transpiração. As plantas podem transpirar
mais de 98% do total de água que absorvem, do restante maior parte fica retida nos
tecidos e somente uma porção muito pequena, de aproximadamente 0,2%, é
utilizada na fotossíntese (TRENTO et al., 2006; SIVA, 2007; SOUZA; MÜLLER,
2008).
A perda de água pelas folhas no processo de transpiração é quem
determina a absorção de água pelas raízes (KUDREV, 1994). A absorção pela raiz
de água pode ocorrer por dois caminhos, um deles a água e os sais minerais
penetram pelos espaços inter-celulares e avançam sem penetrar nas células, o outro
caminho é por dentro das células, penetrando suas paredes e protoplastos. A água
se move pelas raízes através de tubos chamados de vasos de xilema, chega as
folhas e é eliminada pelos estômatos (CORREA, 2007; SOUZA; MÜLLER, 2008).
A participação da água em numerosas reações químicas, como hidrólise e
condensação, que ocorrem na planta é direta. Além de atuar como fonte de calor, o
que torna possível às plantas absorverem grande quantidade de radiação solar sem
elevação prejudicial da temperatura (SANTOS; CARLESSO, 1999; SILVA, 2007).
33
O estresse hídrico pode interferir em fatores como a fotossíntese, no
comportamento estomatal, na mobilização de reservas, na expansão foliar e no
crescimento, e consequentemente levar a alterações no metabolismo secundário
(SUTCLIFFE, 1980). Em alguns casos, como no Hypericum perforatum há um
aumento significativo na concentração de flavonóides, hipericinas e ácido
clorogênico nas flores sob condições de estresse hídrico, porém há uma diminuição
na concentração de hiperforinas. Geralmente o estresse hídrico leva a um aumento
na produção de vários metabólitos secundários, como glicosídeos cianogênicos,
glucosinolatos, alguns terpenóides, antocianinas e alcalóides (WATERMAN; MOLE,
1989; GOBBO – NETO; LOPES, 2007).
3.5.4 Temperatura
A temperatura do ar atua no processo de transpiração da planta, devido o
fato que a radiação solar absorvida pela atmosfera e o calor emitido pela superfície
elevam a temperatura do ar (PEREIRA, 2007). As variações de temperatura do solo
entre manhã e tarde, a chamada amplitude térmica estão diretamente relacionas a
produção de seus metabólitos. Variações anuais, mensais e diárias são um dos
fatores que exerce maior influencia no desenvolvimento da planta (GOBBO – NETO;
LOPES, 2007).
O ar aquecido próximo as plantas transfere energia na forma de fluxo de
calor, aumentando as taxas transpiratórias, além disso, interferindo na atividade
fotossintética das plantas, pois este fenômeno envolve reações bioquímicas, cujos
catalisadores, as enzimas, são dependentes da temperatura para expressar sua
atividade máxima. Valores baixos também são limitantes e quando próximos a 0ºC
por poucas horas promovem danos severos ou morte da planta (TORRES et al.,
2006; PEREIRA, 2007).
Em baixas temperaturas há redução na parte aérea, porém em alguns
casos, como nas folhas de tabaco, a diminuição da temperatura pode promover um
aumento de seus metabólitos secundários. Com o aumento da temperatura, a parte
aérea é mais favorecida, culminando em maior crescimento dos ramos e das folhas.
Neste caso pode-se citar a formação de óleos voláteis, que, em geral, parece
aumentar em temperaturas mais elevadas, apesar de dias muito quentes levarem a
34
uma perda excessiva destes metabólitos. A floração e a frutificação também são
afetadas pela temperatura (GOBBO–NETO; LOPES, 2007).
3.5.5 Nutrientes do solo
Uma planta pode estar bem iluminada, com bom nível de CO2, que não
crescerá se não possuir nutrientes necessários para si (DIOGO, 2007). Os nutrientes
não afetam somente o metabolismo primário, mas também influenciam na produção
de diferentes metabólitos secundários. Em solos pobres em nutrientes há menor
taxa de crescimento e, o que geralmente se verifica, maior taxa de produção de
metabólitos secundários. Particularmente se observa diferenças na composição de
derivados fenólicos. Porém na deficiência de nitrogênio e enxofre, a produção de
metabólitos fica diminuída. O aumento nos níveis de derivados do ácido chiquímico
como ácidos cinâmicos e taninos se dão em deficiências em nitrogênio, fósforo,
enxofre e potássio (GOBBO – NETO; LOPES, 2007).
Um dos principais nutrientes exigidos quantitativamente pela maioria das
plantas é o nitrogênio. Ele atua em todas as fases, dentre elas fotossíntese,
respiração, sínteses, crescimento, floração e frutificação. Assim como é constituinte
de todos os aminoácidos, amidas, ácidos nucléicos, nucleotídeos e poliamidas. Sua
carência aumenta o sistema radicular, palidez da planta, amarelecimento e queda
das folhas (SILVA et al., 2006; DIOGO,2007).
O fósforo é um elemento que tem papel chave na aquisição, estocagem e
utilização de energia, além de atuar na respiração e divisão celular. Ajuda na fixação
do nitrogênio, podendo ser encontrado nos açúcares, adenosinas, nucleotídeos e
ácidos nucléicos. A carência deste faz com que as folhas escureçam (SILVA et al.,
2006; DIOGO, 2007).
A formação das raízes, amadurecimento dos frutos, ativação de
numerosas enzimas e colaboração na abertura e fechamento dos estômatos é
mediada pelo potássio, que também transporta carboidratos e outros produtos, está
relacionado a fotossíntese, respiração, sínteses e fixação simbiótica do nitrogênio.
Seu papel principal é o de ativador das funções enzimáticas e de manutenção da
turgidez celular. Sua carência faz que com as folhas mais velhas apresentem
35
extremidades com manchas cloróticas, degenerando-se e tornando-se necróticas
(SILVA et al., 2006; DIOGO, 2007).
O cálcio contribui para o fortalecimento de todos os órgãos das plantas,
principalmente raízes e folhas. Também é importantíssimo na manutenção do
equilíbrio entre a alcalinidade e a acidez do meio e da seiva das plantas além de
participar da sinalização e regulação das atividades de muitas enzimas. A carência
deste promove lesões nas margens das folhas mais novas, fazendo com que as
mesmas morram (SILVA et al., 2006; DIOGO, 2007).
Por fim, o magnésio é parte integrante da molécula de clorofila e por isso
está diretamente ligado ao metabolismo energético das plantas. Ativa mais enzimas
que qualquer outro elemento, em especial pode-se destacar a ativação das enzimas
na transferência de fosfato. Sua carência faz com que apareçam manchas entre as
nervuras, espalhando-se das margens para o centro das folhas (DIOGO, 2007).
3.6 Considerações sobre a família APOCYNACEAE A.L. de JUSSIEU
Apocynaceae é uma família botânica da ordem Gentianales que inclui
4555 espécies, classificadas em 415 gêneros, importante entre os vegetais
superiores, sendo que pode ser encontrada na forma de árvores, arbustos, ervas,
cipós e trepadeiras (CRONQUIST, 1981; LORENZI; MOREIRA, 2001). A família
Apocynaceae encontra-se distribuída de maneira preponderante em regiões
tropicais e semitropicais, sendo poucas de zona temperada (SOUZA; LORENZI,
2005).
Muitas espécies desta família são cultivadas como ornamentais, com
destaque para alamanda (Allamanda sp.), vinca (Catharanthus roseus), espirradeira
(Nerium oleander), jasmim–manga (Plumeria rubra), flor–de-cera (Hoya spp.), flor–
estrela (Stapelia hirsuta) e o chapéu–de-napoleão (Thevetia peruviana) (SOUZA;
LORENZI, 2005).
Esta família é conhecida por fornecer, principalmente, alcalóides, alguns
deles com ampla utilização na medicina tradicional (PHILIPSON, 2001) e outros com
grande grau de toxicidade (ENDRESS; BRUYNS, 2000), além disto encontrarmos
também flavonóides, iridóides, grupos esteróidais, entre outros metabólitos
secundários (CRONQUIST, 1981).
36
Destaca-se nesta família o gênero Allamanda que tem contribuindo com
novas moléculas promissoras para o tratamento de diversas enfermidades como
imunodeficiência tipo I (HIV – I) e inibição de processos tumorais (KARDONO et al.,
1990; DOBHAL et al., 2004).
3.6.1 Considerações sobre o Gênero Allamanda
O gênero Allamanda é amplamente difundido nos países de clima tropical
(JOLY, 1975). Cultivada como ornamental, esta planta pode ser encontrada em
jardins domésticos e públicos (LORENZI; MATOS, 2002). Este gênero compreende
12 espécies distribuídas pela parte tropical da América, e outras 4 espécies são
cultivadas como plantas ornamentais na Índia. No Brasil, encontram-se 10 espécies
deste gênero, as mais comuns são a Allamanda cathartica, caracterizada por ter flor
grande e amarela, a Allamanda blanchetti, com flor grande rosa ou aroxeada, e a
Allamanda schottii, esta com flor pequena e amarelada (LORENZI; MOREIRA,
2001).
Algumas espécies do gênero Allamanda são usadas há muito tempo na
medicina popular como purgativas, contra tumores hepáticos, vermes intestinais,
afecções do baço além de ser utilizada no combate a pediculose e escabiose
(CORREA, 1984). Neste gênero já foram encontrados diversos grupos químicos de
expressiva atividade farmacológica, que foram isolados, identificados e testados
farmacologicamente, como iridóides, cumarinas, flavonóides e triterpenos
(SCHMIDT, 2005).
Poucos trabalhos foram encontrados com a Allamanda schottii (figura 3).
Pode-se citar o trabalho de Ganapaty e Rao (1988), que identificaram os seguintes
constituintes nas suas flores: plumierídeo, cumarato de plumierídeo, glicosil
cumarato de plumierídeo, kaempferol, quercetina, rutina, beta-sitosterol e beta-
amirina. Anderson, Chang e McLaughilin (1988), visavam substâncias com atividade
antitumoral e isolaram dos caules da Allamanda schottii os seguintes compostos:
plumericina, isoplumericina, allamandina, allancina, pinoresinol, escopoletina e
escoparona, estes compostos demonstraram atividade antitumor em células 9 KB
(carcinoma nasofaringeal humano).
37
Figura 3: Allamanda schottii (Fonte: Autor)
Três espécies pertencentes ao gênero Allamanda estão sendo
investigadas por este grupo com parcerias com outros centros de pesquisa. As
espécies selecionadas foram: A. cathartica, A. schottii e A. blanchettii. Um dos
projetos tem como enfoque o isolamento e a avaliação da atividade biológica das
espécies apresentadas acima. Entre as substâncias isoladas encontram-se os
iridóides, cumarinas, flavonóides e terpenóides (SCHAAB, 2005; SCHMIDT, 2005).
Os efeitos antiproliferativos das raízes, caules e folhas das espécies A.
schottii e A. blanchettii foram avaliados em células leucêmicas K562. Neste estudo
as raízes da A.schottii apresentaram resultados bastante promissores (SCHIMIDT et
al., 2006). A atividade antineoplásica em tumor de Erlish em camundongos foi
constatada para o extrato etanólico das partes aéreas da Allamanda cathartica
(BERRI; SCARIOT, 2004). Algumas substâncias purificadas destas espécies
merecem destaque, entre elas vale destacar a atividade antiinflamatória observada
pelo iridóide plumierídeo (1), isolado da fração polar (SIMÃO DA SILVA, 2007). O
ácido úrsólico, isolado da fração apolar vem sendo testado em modelos
experimentais e tem apresentado atividade sobre o sistema nervoso central e
atividade antitumoral (SOUZA et al., 2004).
Pode-se destacar a importância destes estudos na tentativa de se
estabelecer o perfil fitoquímico para os futuros projetos que venham a ser realizados
com este gênero.
38
3.7 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) na análise de metabólitos
secundários
A cromatografia pode ser definida como um processo molecular de fluxo
direcionado, no qual um substrato é forçado a percolar através de um leito
estacionário de grande superfície (CIENFUEGOS; VAITSMAN, 2000; COLLINS;
GUIMARÃES; JARDIM, 2006). A cromatografia líquida de alta eficiência é uma
técnica de separação que, em menos de trinta anos, passou a ser um dos métodos
analíticos mais utilizados para fins qualitativos e quantitativos. As razões para este
crescimento estão relacionadas a sua adaptabilidade para determinações
quantitativas com boa sensibilidade, e possibilidade de separar substâncias não
voláteis, bem como as suas aplicações em determinações ambientais e em muitos
outros campos da ciência, como o da medicina (MARASCHIN; VERPOORTE, 2001;
TONHI et al., 2002).
A CLAE geralmente é usada quando o objetivo é caracterizar, detectar e
separar os compostos presentes numa determinada matriz, portanto sendo utilizada
para identificação, separação e teste de pureza de determinado composto após
análise de sua estabilidade. Pode ser utilizada com fins preparativos, para separar
compostos presentes em concentrações muito pequenas com curto tempo de
análise, além de determinar e caracterizar substâncias em formulações complexas.
Isto é possível pelo fato da fase móvel e estacionária possuir um amplo espectro de
polaridade no qual a seletividade no processo de separação pode ser otimizado e
ajustado (CIENFUEGOS; VAITSMAN, 2000; COLLINS; GUIMARÃES; JARDIM,
2006)
Em um método cromatográfico há separação, detecção e quantificação de
substâncias presentes em uma matriz ou alguma formulação que esta sendo
estudada, e este deve ser simples, rápido e seletivo (SRINIVAS et al., 2007). Uma
detecção eficiente e rápida caracterização têm papel fundamental na pesquisa de
produtos naturais biologicamente ativos (RODRIGUES et al., 2006).
A CLAE pode fornecer um cromatograma pelo qual se pode determinar o
perfil fitoquímico da planta. Os perfis cromatográficos obtidos podem ser utilizados
no controle de qualidade das mesmas e preparações delas derivadas, através da
comparação com o perfil cromatográfico do padrão obtido sob as mesmas condições
39
experimentais (MATOS, 1994; ALAERTS et al., 2007). A utilização da CLAE
conjugada à técnica de detecção por varredura de espectro ao ultravioleta é uma
ferramenta muito útil na caracterização do perfil químico de plantas, permitindo
caracterizar simultaneamente as substâncias constituintes ou seus principais grupos
estruturais (PAIVA et al., 2002).
O perfil metabólico de extratos brutos de uma planta não é tarefa fácil de
ser realizada em razão da diversidade de estruturas químicas presentes. Porém, o
avanço tecnológico de técnicas analíticas proporcionou um papel importante na
elucidação de composições químicas complexas dos produtos de origem vegetal,
com níveis de sensibilidade e seletividade impensáveis até poucos anos atrás. Isso
possibilitou o estudo do extrato bruto vegetal, sem a necessidade do exaustivo
trabalho de isolamento que, muitas vezes, leva a compostos já conhecidos. Sendo
assim, estratégias de triagem tem sido desenvolvidas obtendo-se cromatogramas da
espécie que está sendo analisada (RODRIGUES et al., 2006; CHAUDHARY et al.,
2007).
Um cromatograma indica através de picos as substâncias presentes em
uma determinada matriz e com base nele pode ser desenvolvido um fingerprint. Este
identifica as substâncias presentes em uma determinada amostra através de alguma
técnica, uma das mais utilizadas é a Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HAN
et al., 2008). A CLAE serve para qualificar diferentes amostras identificando
possíveis alterações ou adulterações que podem ter ocorrido com a planta. Por isso
para a realização do fingerprint é necessário que se analise a autenticidade dos
compostos (GALLO et al., 2008; HUANG et al., 2008). Um fingerpirnt pode ser
utilizado em um material biológico complexo através de métodos processados e
agrupados conforme a planta que esta sendo utilizada, ou seja, separa diferentes
grupos que tem a mesma origem promovendo sua caracterização. Em um fingerprint
os picos majoritários são analisados, sendo os de interesse identificados (CHEN et
al., 2007; NI; PENG; KOKOT, 2008).
Cada matriz tem características diferentes e por isso seus fingerprints
também são. Uma mesma espécie em diferentes períodos e diferentes estágios de
desenvolvimento, certamente apresenta diferenças em seu fingerprint. Esta
comprovação foi demonstrada por Fan, Wan, Ye e Chen (2007) em um estudo que
caracterizou o fingerprint por HPLC da espécie Selaginella. Para isso utilizaram-se
40
de dez plantas da mesma espécie e como resultado obtiveram diferenças com
relação aos picos encontrados nos exemplares analisados.
Um estudo foi desenvolvido com os extratos e frações de Hypericum
japonicum. Utilizou-se do fingerprint da espécie para indicar a fração que continha
maior número de compostos da classe dos flavonóides. Esta classe é responsável
pela ação hepatotóxica da planta. Comprovou-se que diferentes frações
manifestaram diferentes efeitos, indicando potenciais para novas drogas
hepatoprotetoras (WANG et al., 2008).
O desenvolvimento de um fingerprint por HPLC pode ocorrer pelo
desenvolvimento de uma nova metodologia ou através do aprimoramento de
técnicas já existentes. O método de fingerprint adotado deve ser preciso, estável e
ter repetibilidade, além do método proposto ser adequado, validado e aplicável
(CARVALHO et al., 2005; ALAERTS et al., 2007; LIU et al., 2007).
Um método deve, idealmente, ser exato para fornecer valor real, ser
preciso para fornecer em um menor número de ensaios desse valor real, ser
sensível ou capaz de determinar concentrações as menores possíveis e, enfim,
responder de forma proporcionalmente linear, ao longo da ampla faixa de
concentração. Para desenvolver um fingerprint é realizada uma análise qualitativa,
levando em consideração parâmetros como robustez e precisão intermediária do
método e fornece dados que permitem criar o perfil cromatográfico da amostra sob
as determinadas condições (DANTUS, 2006; GIL; BATISTA FILHO, 2007).
Para realizar-se a análise quantitativa da amostra é necessário que o
método seja então validado, garantindo uma metodologia analítica exata, específica,
reprodutível e robusta dentro de uma faixa de aplicação em que o analito é
analisado. A importância da validação em análise química tornou-se mais acentuada
a partir da enorme variabilidade de resultados obtidos em análises clínicas de
amostras submetidas a estudos interlaboratoriais. A análise da linearidade do
método, um dos fatores fundamentais para uma análise quantitativa, é a capacidade
do método em fornecer resultados diretamente proporcionais à concentração da
substância em análise, dentro de uma determinada faixa de aplicação. A faixa de
aplicação é o intervalo de variação entre o maior e o menor nível de analito que
demonstra ser determinado com precisão, exatidão e linearidade (CARVALHO et
al., 2005; PEREIRA et al., 2005; CHANDRAN; SINGH, 2007; VILEGAS; CARDOSO,
2007).
41
4 Parte experimental
4.1 Material
Os materiais empregados para a realização deste trabalho foram:
- Vidrarias: funil de separação, béquer, proveta e erlenmeyer
- Coluna analítica fase reversa Luna (Phenomenex®) 25 cm;
- Filtro de membrana 0,45 µm (Millipore®, Millex lcr®);
- Membrana de filtração celulose regenerada 0,45 µm (RC-L 58 Schleicher e
Schuell);
- Micropipetador com ponteiras descartáveis de volume 10-100 e 100-1000 µL;
- Seringa de vidro capacidade 1 mL e 5 mL.
4.1.1 Reagentes
Os reagentes mais utilizados:
- Acetonitrila (Tedia®- grau HPLC);
- Ácido Fosfórico (Merck®- PA);
- Água Purificada (Obtido por filtração em aparato Milli® Q);
- Metanol (Tedia®- grau HPLC).
4.1.2 Padrões
Os padrões utilizados na pesquisa foram os iridóides plumierídeo e
plumericina, isolados previamente de A. cathartica (MALHEIROS, 1995; SCHAAB,
2005)
4.1.3 Equipamentos
- Evaporador rotatório Tecnal modelo TE - 211
- Banho de ultra-som Unique®, modelo USC 1400;
42
- Bomba de Vácuo Tecnal TE® – 058;
- Balança analítica Schimadzu modelo AUW 220D;
- Cromatógrafo líquido de alta eficiência Waters® modelo 600, e injetor automático
717, gerenciado por software Empower versão Pro e detector por arranjo de
fotodiodo em UV-Vis (PDA 2996).
4.2 Material vegetal
As raízes, caules e folhas da A. schottii foram coletadas na cidade de
Blumenau – SC no verão, outono, inverno e primavera de 2006. O material foi
classificado pelo Prof. Oscar Benigno Iza (UNIVALI e HBR) e uma amostra da
espécie foi depositada no Herbário Barbosa Rodrigues (HBR, Itajaí) sob o número
HBR 52525.
Todos os quatro indivíduos foram plantados no mesmo dia e estavam
expostos em torno de um metro entre si. A coleta da planta, em cada estação,
realizou-se em dia ensolarado e a seguir cada parte (raiz, caule e folha) foi
desidratada separadamente a temperatura ambiente, em local arejado.
4.3 Preparação dos extratos
O material vegetal foi reduzido a pó grosseiro dos quais 100 gramas de
cada parte coletada foram submetidos separadamente ao processo extrativo pelo
método da maceração com etanol por 7 dias, ao abrigo da luz, calor e umidade.
O extrato bruto de cada parte foi obtido após evaporação do solvente sob
pressão reduzida em evaporador rotatório a uma temperatura inferior a 50ºC. Uma
alíquota de cada extrato bruto (2 g) foi separadamente solubilizado em MeOH:Água
(90:10) e submetido a partição líquido-líquido com solventes de polaridade
crescente, obtendo-se dessa forma as frações semipurificadas de Hexano,
Diclorometano, Acetato de Etila e o resíduo aquoso. Os procedimentos realizados
estão descritos na figura 4.
43
Figura 4: Esquema geral dos procedimentos de extração e fracionamento das
coletas de raiz, caule e folhas da Allamanda schottii
Coleta da A. schottii em Blumenau no ano de 2006 (raiz, caule e folhas)
Maceração com etanol por 7 dias (100 g de planta)
Extrato bruto (2g)
Planta reduzida a pó grosseiro
Abrigo de luz, calor e umidade
Suspensão em 100mL de Solução etanol: água (9:1) v/v
Partição extrato com três alíquotas de 50mL de hexano
Fração Hexano Fração etanol:agua
Evapora-se o etanol em Rota evaporador Adicionar 30mL de água
Partição com três alíquotas de 50mL de CH2Cl2
Fração CH2Cl2
Fase aquosa
Partição com três alíquotas de 50mL de EtOAc
Fração EtOAc
Fração Aquosa
44
Os extratos e frações foram concentrados em rotavapor a pressão
reduzida com controle de temperatura BUCH RE-120. Os extratos, frações e
compostos foram pesados em balança analítica SHIMADZU LIBROR-AEG-220 ou
SHIMADZU LIBROR EB-33OD.
4.4 Análises cromatográficas através de CLAE
As análises cromatográficas das frações de diclorometano e acetato de
etila foram realizadas em um cromatógrafo líquido Waters 2996, equipado com uma
bomba 600, detector de varredura de espectro ao ultravioleta por arranjo de
fotodiodos (Diodo Array) e injetor automático 717 com volume de injeção de 20µL. O
software Empower (versão-Pro) foi utilizado para registrar os cromatogramas e medir
as áreas dos picos. Todos os solventes utilizados foram de grau HPLC (Tedia),
filtrados á vácuo com membrana de celulose regenerada 47 mm de diâmetro e 0,45
µm de porosidade (RC-L 58 Schleicher e Schuell) e degaseificados em ultrasom
(UltraSonic Cleaner Unique USC 1400) por sonicação sob vácuo (Bomba de Vacuo
Tecnal TE – 058).
Utilizou-se CLAE em fase reversa com uma coluna Phenomenex Luna
com fase C18, (250 x 4,6 mm x5µm), trabalhando-se em 25°C, cujo fluxo e
composição de fase móvel ideal foram determinados pelo desenvolvimento analítico
do método conforme descrito por Wittkowski e Tomczak (2008). A detecção por
varredura de espectro na faixa de comprimentos de onda entre190 nm até 400 nm
com acompanhamento em 230 nm para análise dos iridóides (KABZINSKI et al.,
1999; CHEN et al., 2007; QIAN et al., 2007) assim como análise de suas absorções.
4.4.1. Preparo das soluções
Pesou-se 1mg de cada frações de diclorometano e acetato de etila e
dissolveu-se em fase móvel (70:10:20, MeOH: ACN: H2O (H3PO4 0,5% v/v), com a
finalidade da obtenção de uma solução homogênea. Essa solução solubilizada foi
ultrasonicada, para garantir a solubilidade total do extrato no solvente.
45
Posteriormente esta solução foi filtrada com membrana de PTFE modificada de 0,45
µm (Millipore, Millex LCR).
4.4.2 Quantificação dos metabólitos secundários
Para análise dos iridóides plumierídeo e plumericina nas raízes, caules e
folhas obtidos nas quatro estações utilizou-se o método da padronização externa
validado e descrito Wittkowski e Tomczak (2008). Todas as soluções foram injetadas
em triplicatas e trabalhou-se em modo gradiente com fluxo constante de 0,8
mL/minuto utilizando-se uma combinação de solventes metanol: acetonitrila: água
acidificada (H3PO4 0,5% v/v) na proporção 10:10:80 a 20:10:70 a 10 minutos,
35:10:55 a 20 minutos, 50:10:40 a 35 minutos, 70:10:20 a 50 minutos, 50:10:40 a 60
minutos e por fim a 65 minutos 10:10:80, retorno à condição inicial. Nesta condição
cromatográfica, o plumierídeo e a plumericina apresentaram tempos de retenção (Tr)
próximos a 16,7 ± 0,5 min e 42,0 ± 0,5 min, respectivamente. Para a determinação
da concentração dos iridóides utilizou-se as equações de reta de ambos
marcadores, cujas equações das retas podem ser representadas pelas equações: y
= 4,26 x 104 + 3,10 x 102 com o coeficiente de correlação r = 0,99997 para o
plumierídeo e y = 6,77 x 104 + 1,35 x 105 com coeficiente de correlação r= 0,998580
para a plumericina, respectivamente (WITTKOWSKI e TOMCZAK, 2008). A
reprodutibilidade média das triplicatas foram avaliadas pelo desvio padrão relativo
(RSD ou coeficiente de variação), cujos valores na ordem de 5% foram
considerados significativos.
O LD encontrado para o plumierídeo foi de 1 µg/mL, e para a plumericina
foi de 0,25 µg/mL. Em relação ao LQ, o resultado foi de uma concentração de 2
µg/mL para o plumierídeo e de 1 µg/mL para a plumericina.
Como foram utilizadas fração de diclorometano e acetato de etila da
A.schottii na busca por iridóides, foi injetado a cada três amostras um padrão de
rastreio, sendo este constante para ambas as frações, com isso era realizada
análise das áreas e tempos de retenção obtido em cada um dos picos, tendo assim
certeza da não variabilidade da análise mesmo frente a diferença de polaridade da
frações.
46
4.5 Análise estatística
Após a quantificação da plumericina e do plumierídeo, os dados foram
interpretados por meio de análise da variância (ANOVA), utilizando teste F ao nível
de 5 % de significância. As médias dos valores das concentrações dos iridóides de
cada extrato da A. schottii foram comparadas utilizando teste de Tukey e adotando o
nível de significância de 5 %. As análises estatísticas foram realizadas utilizando-se
o aplicativo statistica versão 6.0, Statsoft , Inc. STATISTICA.
47
5 Resultados e discussões
5.1 Rendimento dos extratos
As massas dos extratos obtidos a partir de 100 g das diferentes partes das
A.schottii coletados nas diferentes estações, estão apresentados na tabela 1. Todos
os extratos utilizados foram obtidos por maceração do material vegetal. Esta técnica
tem a vantagem de usar solvente a frio o que minimiza a decomposição dos
metabólitos secundários. Utilizou-se sempre o evaporador a pressão reduzida
controlando a temperatura para evitar decomposição ou a formação de artefatos,
que poderiam comprometer os resultados obtidos.
De acordo com os resultados obtidos verificou-se que, de maneira geral,
as influências de sazonalidade interferiram de forma diferente na massa extraída das
distintas partes. Por exemplo, as folhas coletadas na primavera, apresentaram um
grande acréscimo de massa em relação as demais estações. Já nos caules, a coleta
do verão teve praticamente a metade rendimento das outras estações. As raízes
apresentaram rendimentos similares entre si.
Tabela 1: Rendimento de massa do extrato bruto obtido de diferentes partes de A.
schottii nas diferentes estações de coleta, partindo de 100g de planta.
Parte da planta inverno (g) primavera (g) verão (g) Outono (g) Total (g)
Folha 7,85 13,07 9,30 9,39 39,61
Caule 5,13 4,24 2,15 3,88 15,40
Raiz 3,68 3,96 4,62 4,51 16,77
Total 16,66 21,27 16,07 17,78 -
Existiu similaridade nas massas obtidas somando-se os extratos das
raízes, caules e folhas no inverno e verão. Na coleta do outono ocorreu um pequeno
acréscimo, porém na coleta da primavera este acréscimo foi mais significativo, cerca
de 16%. As folhas apresentaram massa superior às demais partes analisadas,
sendo que na somatória dos extratos das folhas nas quatro estações, quando
comparada com raiz e caule foi superior a 50%.
48
Ao realizar análise da literatura sobre trabalhos com acompanhamento
sazonal de espécies vegetais, encontrou-se a pesquisa desenvolvida por Rosa et al.
(2007) com a espécie Epidendrum mosenii, nesta também há um maior rendimento
das folhas, com relação a caules e raízes analisados.
Um dos fatores que pode ser considerado para justificar as diferenças de
massa das folhas em relação aos caules e raiz é a rigidez dos tecidos que compõe
cada parte, facilitando ou não a penetração do solvente. Assim como a natureza das
substâncias que compõe cada parte. Os caules e raízes apresentam maior rigidez
por terem como função principal suporte e condução de nutrientes, já as folhas são
responsáveis pela fotossíntese, isso faz com que o solvente penetre de forma mais
efetiva nesta parte da planta e assim há maior massa extraída.
5.1.1 Rendimento das frações
Para a obtenção das frações, submeteram-se dois gramas de cada um
dos extratos a partição líquido-líquido com hexano, diclorometano e acetato de etila.
As massas das frações estão apresentadas na Tabela 2. Cabe ressaltar que a
somatória das massas das frações de uma coleta não ultrapassou 730 mg (caules
de primavera). Em alguns casos ficou inferior a 200 mg (caule de outono). Isso
significa que a maioria das substâncias existentes em todos os extratos é muito
polar. No caso do caule coletado na primavera, por exemplo, 63% de sua massa
permaneceram na fração aquosa, assim como nos caules de outono onde 90% da
massa inicial ficou na mesma. Nesta análise de massa levou-se em consideração
também que os caules e raízes são responsáveis pela condução da seiva para a
planta. Estes apresentam grande quantidade de sais minerais e substâncias polares.
Assim como o caule também conduz a água dentro da planta. Com base nestas
afirmações já se esperava que grande parte das massas destas partes ficasse na
fração aquosa, como realmente ocorreu.
Considerando-se a massa extraída pelos solventes utilizados (hexano,
diclorometano e acetato de etila), observou-se que, de maneira geral, as folhas e
caules apresentaram maior rendimento nas frações de hexano e diclorometano. Já
as raízes, exceto algumas frações, apresentaram rendimentos mais próximos com
os respectivos solventes.
49
Tabela 2: Rendimento de massa das frações obtidas das diferentes partes de A.
schottii em diferentes estações do ano de coleta partindo de 2g de extrato bruto.
Fração
hexano (mg)
Fração
diclorometano (mg)
Fração
acetato de etila (mg)
Total (mg)
folha inverno 159 208 29 396
folha primavera 185 50 67 302
folha verão 338 152 72 562
folha outono 373 327 15 715
caule inverno 155 33 17 205
caule primavera 32 476 221 729
caule verão 263 267 68 558
caule outono 69 35 82 186
raiz inverno 70 142 93 305
raiz primavera 15 28 123 166
raiz verão 165 127 101 385
raiz outono 157 80 186 423
Ao analisar-se separadamente uma parte da planta, observou-se que a
sazonalidade interferiu na produção dos metabólitos secundários extraídos pelos
solventes utilizados. Nas folhas (Tabela 2), somando as massas extraídas por cada
solvente, as coletas do verão (562 mg) e outono (715 mg) apresentaram quase o
dobro de massa das coletas do inverno (396 mg) e primavera (302 mg). Um dos
fatores que pode explicar esta diferença observada é a luminosidade, que interfere
na fotossíntese. As folhas coletadas no verão e outono estavam expostas a maior
período de luminosidade.
As folhas na sombra respiram com menos intensidade do que as folhas
no sol e, dessa forma, compensam consideravelmente a redução do ganho de
carbono nessa condição de fraca iluminação, ou seja, as folhas nas estações de
baixa luminosidade aproveitam melhor a radiação e com isso alcançam bem mais
rapidamente o ponto de saturação à radiação, poupando a clorofila no processo de
fotossíntese (HALL; RAO, 1980). Desta forma pode-se perceber que a planta está
gastando menos matéria seca. Como as plantas são constituídas em grande parte
por carboidratos, sendo estes cerca de 60% da matéria seca vegetal, pode-se
50
afirmar que na estação do frio a planta armazena material, tendo em vista a pouca
luminosidade, escassez de água e baixas temperaturas. Os dados apresentados
confirmam que diferenças climáticas interferem consideravelmente na produção de
metabólitos secundários.
Nas folhas, em quase todas as coletas, a fração de hexano apresentou os
melhores rendimentos. As substâncias apolares extraídas com o hexano, como os
esteróis e terpenos, encontrados na Allamanda, desempenham importantes papeis
de proteção contra os predadores (insetos e outras plantas), podendo ser este o
motivo de sua produção.
Nos caules os rendimentos obtidos nas coletas de primavera (729 mg) e
verão (558 mg) foram muito superiores a inverno (205 mg) e outono (186 mg). Isto
pode ser justificado pelo fato dos caules terem como função a sustentação das
folhas e o transporte de nutrientes. Cabe ressaltar que o caule de outono, de uma
maneira geral, foi o que apresenta menor massa. Fato este que pode ser confirmado
tendo em vista que nesta estação há diminuição significativa da quantidade de
absorção de sais minerais e de condução de água tendo em vista que grande parte
destes não estará presente na planta, ou seja, nesta estação as plantas perdem as
folhas e com isso necessitam de menos suprimentos. Destacam-se as massas das
frações de diclorometano (476 mg) e acetato de etila (221 mg) da primavera, muito
superior as demais frações. As substâncias de média e alta polaridade, extraídas
aqui, podem ser necessárias no processo de desenvolvimento do vegetal, que nesta
época esta acentuado, tendo em vista que flores e frutos começam a aparecer.
As raízes coletadas nas distintas estações (Tabela 2) apresentaram
massa total semelhantes nas coletas do verão (385 mg) e outono (423 mg), já na
primavera a massa obtida foi praticamente a metade (166 mg). Verificou-se nesta
parte, distribuição de massa mais uniforme entre as frações hexano, diclorometano e
acetato de etila, principalmente nas coletas do verão e outono. Na primavera há o
desenvolvimento de outras partes da planta, como as flores, contudo são
necessários mais água e nutrientes, por isso a quantidade de nutrientes depositados
nas raízes é muito inferior, o oposto do que ocorre no outono onde as mesmas
armazenam mais sais minerais e água (LARCHER, 2006).
Deve-se lembrar que a raiz é responsável pela absorção de nutrientes e o
seu crescimento é contínuo, porém diminui com temperaturas mais baixas. Outros
fatores que podem estar envolvidos são a disponibilidade hídrica e a luminosidade.
51
A capacidade de enraizar e a rapidez de enraizamento podem ser influenciados pela
duração do dia. Com relação as massas obtidas na fração de acetato de etila,
segundo Gobo-Neto e Lopes (2007) há uma correlação entre a intensidade de
radiação solar e a produção de compostos fenólicos, tais como flavonóides e
taninos.
5.2 Análise qualitativa por CLAE de metabólitos sec undários nas frações de
diclorometano e acetato de etila obtidas das raízes , caules e folhas da A.schottii
coletadas nas quatro estações
A análise do perfil cromatográfico das diferentes partes (raízes, caules e
folhas) de A.schottii obtidas das diferentes estações foi realizada em 230 nm.
Escolheu-se este comprimento de onda por detectar os iridóides, metabólitos
secundários alvo deste estudo (KABZINSKI et al., 1999; CHEN et al., 2007; QIAN et
al., 2007). Estes apresentam banda de absorção no UV entre 215 a 245 nm devido
as transições π π * de carboxilas α, β - insaturadas (SIMÕES et al., 2004).
Padrões dos iridóides plumierídeo e plumericina foram injetados nas
mesmas condições de análise das frações. O plumierídeo apresentou tR = 17,3 +
1,0 minutos e a plumericina tR = 42,2 + 1,0 minutos conforme apresentado na figura
5. Os picos referentes as duas substâncias foram identificados pelos números 1 e 8,
respectivamente, nos cromatogramas das frações avaliadas, com base no tempo de
retenção que cada uma das substâncias apresentou na análise.
52
AU
0,00
0,05
0,10
0,15
Minutes
10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00 40,00 45,00 50,00
18,3
22
OOH
OHOH
OH
O
O
O O
OOH
O
OO
OO
O O
H
H
H
Figura 5: Perfil dos iridóides plumierídeo (a) e plumericina (b). Condições cromatográficas: eluição de gradiente metanol:acetonitrila:água, na proporção 10:10:80 a 20:10:70 a 10 minutos, 35:10:55 a 20 minutos, 50:10:40 a 35 minutos, 70:10:20 a 50 minutos, 50:10:40 a 60 minutos e por fim a 65 minutos 10:10:80, fluxo 0,8 mL/min. λ=230 nm.
Os cromatogramas obtidos das frações de diclorometano e acetato de
etila das diferentes partes (raiz, caule e folha), nas diferentes estações, estão
apresentados nas figuras 6 e 7, respectivamente. Verificou-se similaridade no perfil
de cada uma das partes nas distintas estações nas duas frações analisadas.
Algumas diferenças foram observadas, principalmente na intensidade de
determinados picos.
Observou-se nas coletas dos caules de verão, outono e primavera, na
fração de diclorometano, um pico denominado 1, tR = 17,6 + 1,0 minutos (Figura 6b)
que não é observado nas outras coletas nesta fração. O tempo de retenção e o perfil
de absorção desta substância é semelhante ao do iridóide plumierídeo. Por ter uma
unidade glicosídica, este iridóide é melhor extraído na fração de acetato de etila,
como pode ser observado na figura 7. Nesta fração, nas raízes de verão e primavera
foram observadas picos muito pequenos.
Outros picos foram destacados e numerados de 2 a 10, alguns deles,
assim como o pico 1, são observados nas duas frações. Isto ocorre devido a
polaridade destas substâncias que se distribuem nas duas fases.
O pico 2, tR = 25,2 + 0,5 minutos foi encontrado nas raízes, caules e
folhas das quatro estações na fração de diclorometano. Já na fração de acetato de
etila foi encontrado nas folhas, caules, exceto outono, e raízes, porém não nas
raízes de verão, com intensidades diferentes dos picos. Por exemplo a intensidade
AU
0,00
0,10
0,20
0,30
Minutes10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00 40,00 45,00 50,00
42,9
85
AU
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
nm200,00 220,00 240,00 260,00 280,00 300,00 320,00 340,00 360,00 380,00
216,1
AU
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
0,18
nm200,00 220,00 240,00 260,00 280,00 300,00 320,00 340,00 360,00 380,00
212,6
377,2394,0
a)
b)
53
do pico da raiz de outono é bem inferior as demais estações.
O pico 3, tR = 28,7 + 0,5 minutos , esta presente também nas raízes,
caules e folhas, com exceção das folhas de verão na fração de diclorometano.
Observaram-se picos mais intensos nos caules. Este pico não foi detectado na
fração de acetato de etila.
O pico 4, tR = 31, 65 + 1,0 minutos, foi encontrado,na fração de
diclorometano, em todas as raízes, nos caules, exceto nos caules de outono e não
foi observado em nenhuma das folhas. Já na fração de acetato de etila foi
encontrado nas folhas.
Na fração diclorometano o pico 5, tR = 34,21 + 0,5 minutos, foi observado
em todas as raízes, nos caules, exceto primavera, e nas folhas de inverno e verão,
Ele é detectado também na fração de acetato de etila nas distintas partes,
principalmente no inverno.
Na análise denominou-se pico 6 o pico encontrado no tR = 35,83 + 0,5
minutos. Ele foi observado na fração de diclorometano em todas as raízes, porém
com picos menos resolvidos na inverno e verão, em todos os caules e folhas, exceto
folhas de verão. Já na fração de acetato de etila, o pico 6 pôde ser observado em
todas as partes nas quatro estações, com variabilidade somente nas intensidades
dos picos.
Os picos 7, 8 e 9, tR = 37,8 + 0,5; 38,4 + 1,0 e 39,1 + 0,5 minutos
respectivamente, apresentaram perfil de absorção no UV bastante semelhantes,
enquadrando-os dentro de uma mesma classe de metabólitos secundários. Eles
estão presentes na fração de diclorometano em todas as análises. Mas raízes e
caules (Figura 6 a, b) o pico 9 apresenta intensidade superior aos outros. Somente a
substância 7, entre as três, foi detectada em algumas frações nas amostras
extraídas com acetato de etila.
O pico 10, tR = 42,6 + 1,0 minutos, foi detectado em todas as raízes,
caules e folhas na fração de diclorometano. A intensidade dos picos foi superior nas
raízes e caules de inverno e verão. Na fração de acetato de etila ele foi detectado
somente nas folhas de outono e nos caules, exceto primavera. Este pico apresentou
tempo de retenção e perfil de absorção no UV semelhante ao iridóide
plumericina.
54
AU
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
1,40
1,60
Minutes0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00 40,00 45,00 50,00 55,00
a) raiz
b) caule
AU
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0,70
0,80
Minutes0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00 40,00 45,00 50,00 55,00
c) folha
AU
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0,70
0,80
Minutes0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00 40,00 45,00 50,00 55,00
Figura 6: Perfis cromatográficos da mesma parte coletada de Allamanda schottii em diferentes estações do ano. a) raiz; b) caule; c) folha. Condições cromatográficas: eluição de gradiente A:B:C, na proporção 10:10:80 a 20:10:70 a 10 minutos, 35:10:55 a 20 minutos, 50:10:40 a 35 minutos, 70:10:20 a 50 minutos, 50:10:40 a 60 minutos e por fim a 65 minutos 10:10:80, fluxo 0,8 mL/min. 230 nm, fração diclorometano.
inverno Outono verão primavera
1
2
3 4
5
9
6 7 8
10
11
10
6
10 110
2 3
4 5
9
12
9 6
5 3 2
11
12
inverno Outono verão primavera
AU
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
nm200,00 250,00 300,00 350,00
191,5216,1
332,0 374,8389,2
AU
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
nm200,00 220,00 240,00 260,00 280,00 300,00 320,00 340,00 360,00 380,00
205,6
227,9
310,6
AU
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
nm200,00 220,00 240,00 260,00 280,00 300,00 320,00 340,00 360,00 380,00
212,6
374,8
AU
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
nm200,00 220,00 240,00 260,00 280,00 300,00 320,00 340,00 360,00 380,00
204,4
229,0
294,0
344,0
AU
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
nm
200,00 250,00 300,00 350,00
216,1
345,2
AU
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
1,40
nm200,00 220,00 240,00 260,00 280,00 300,00 320,00 340,00 360,00 380,00
204,4
230,2
279,8
346,4
7 8
13
8
7
13
inverno Outono verão
primavera
AU
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
nm200,00 220,00 240,00 260,00 280,00 300,00 320,00 340,00 360,00 380,00
204,4
279,8
AU
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0,70
nm200,00 220,00 240,00 260,00 280,00 300,00 320,00 340,00 360,00 380,00
207,9
271,5
55
AU
0 ,0 0
0 ,2 0
0 ,4 0
0 ,6 0
0 ,8 0
1 ,0 0
1 ,2 0
1 ,4 0
1 ,6 0
1 ,8 0
2 ,0 0
2 ,2 0
Min u te s0 ,0 0 5 ,0 0 1 0 ,00 1 5 ,0 0 2 0 ,0 0 2 5 ,0 0 3 0 ,0 0 3 5 ,0 0 4 0 ,0 0 4 5 ,00 5 0 ,0 0 5 5 ,0 0
AU
0 ,00
0 ,20
0 ,40
0 ,60
0 ,80
1 ,00
1 ,20
1 ,40
1 ,60
1 ,80
2 ,00
2 ,20
Minutes0 ,00 5,00 10 ,00 15,00 20,00 25 ,00 30 ,00 35,00 40 ,00 4 5,00 50 ,00 55,00
AU
0 ,0 0
0 ,2 0
0 ,4 0
0 ,6 0
0 ,8 0
1 ,0 0
1 ,2 0
1 ,4 0
1 ,6 0
1 ,8 0
2 ,0 0
2 ,2 0
Min u te s0 ,0 0 5 ,0 0 1 0 ,00 1 5 ,0 0 2 0 ,0 0 2 5 ,0 0 3 0 ,0 0 3 5 ,0 0 4 0 ,0 0 4 5 ,00 5 0 ,0 0 5 5 ,0 0
AU
0,00
0,20
0,40
0,60
nm200,00 250,00 300,00 350,00
210,3 305,9
a) raiz
b) caule
c) folha
Figura 7: Perfis cromatográficos da mesma parte coletada de Allamanda schottii em diferentes estações do ano. a) raiz; b) caule; c) folha. Condições cromatográficas: eluição de gradiente A:B:C, na proporção 10:10:80 a 20:10:70 a 10 minutos, 35:10:55 a 20 minutos, 50:10:40 a 35 minutos, 70:10:20 a 50 minutos, 50:10:40 a 60 minutos e por fim a 65 minutos 10:10:80, fluxo 0,8 mL/min., 230 nm, fração acetato de etila.
11
1 2
12
5 6 13
1 2
3 4
5 6
12
1 2 3
5 6
10
12
inverno Outono verão primavera
inverno Outono verão primavera
inverno Outono verão primavera
7
7
7
AU
0,00
0,10
0,20
0,30
nm200,00 250,00 300,00 350,00
211,4 314,2
AU
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
nm200,00 220,00 240,00 260,00 280,00 300,00 320,00 340,00 360,00 380,00
215,0
345,2
AU
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
1,40
nm200,00 220,00 240,00 260,00 280,00 300,00 320,00 340,00 360,00 380,00
204,4
230,2
279,8
346,4
56
O pico 11, tR = 44,6 + 0,5 minutos, foi detectado somente na fração de
diclorometano. Porém nas folhas somente foi detectado no outono. A intensidade
deste pico é muito pequena em algumas frações.
Por fim, o pico 12, tR = 46,2 + 0,5 minutos, foi encontrado na fração de
diclorometano nas raízes, caules e folhas, exceto na coleta das folhas de verão.
Este pico foi encontrado na fração de acetato de etila das raízes com intensidade
muito superior as demais amostras. Porém nas raízes de verão não foi detectado.
Além das raízes, este pico foi observado nos caules de verão e inverno e nas folhas
de inverno e primavera. E o pico 13 pode ser encontrado somente nos caules e
folhas de primavera da fração de diclorometano e somente nas raízes de inverno da
fração acetato de etila.
O pico 10 pode servir para ilustrar as diferentes necessidades de
metabólitos secundários nos órgãos vegetais, assim como a influência da
sazonalidade na na produção dos metabólitos.
Ao analisar-se as frações de diclorometano das diferentes partes na
mesma estação (Figuras 8 e 9), verificou-se, de modo geral, diferenças
principalmente na área dos picos de cada substância. Por exemplo, na coleta do
verão (Figura 9b) a área dos metabólitos das folhas é muito inferior as demais
partes, este fato pode estar relacionado também que na referida estação as plantas
perdem parte de suas folhas e as que permanecem podem ter menor quantidade de
clorofila ou cloroplastos pois são mais secas ou ressecadas, prontas para caírem da
planta na próxima estação.
As diferenças entre as partes da A.schottii (raízes, caules e folhas) fração
acetato de etila (Figura 7) podem ser bem visualizadas através dos cromatogramas
que comparam os perfis obtidos na análise realizada. Na análise do outono
encontrou-se a substância 12 predominante e observada somente nas raízes. Na
coleta de inverno há muita semelhança entre perfis de caules, folhas e raízes,
podendo ser verificado que o único pico diferente se trata da substância 10 que
somente é observado nos caules. A coleta realizada na primavera apresentou perfis
semelhantes mas com intensidades muito variáveis de picos. Observou-se a
substância 10 de forma acentuada nas raízes e a substância 1 nos caules da
referida estação, já a substância 2 é predominante nas folhas. Na análise da coleta
57
de verão os perfis encontrados são diferentes entre si, pode-se destacar a presença
da substância 6 que aparece com pico bem resolvido nos caules, das substâncias 2
e 4 somente encontradas nas folhas e da substância 10, predominante nas raízes
das demais estações, mas observada em concentração mínima na raiz de verão.
Nas figuras 8 e 9 pode-se verificar que além dos picos 1 e 8,
identificados como os iridóides plumierídeo e plumericina, respectivamente, os picos
3, 5 e 9 apresentaram perfil de absorção no UV característico de iridóides.
No outono (Figura 8a) o pico 1 foi encontrado somente nos caules, o pico
3 predominante nas raízes desta estação, mas encontramos nos caules e folhas
também. O pico 5 nas três partes, especialmente nos caules, já o pico 10 é
encontrado em grande quantidade nas três partes e o pico 11 especialmente nas
raízes. No inverno (Figura 8b) o pico 3 é observado somente nos caules e raízes, o
pico 5 nas três partes mas com baixas intensidades de pico, o pico 10
preferencialmente nas raízes e o pico 11 nos caules e raízes porém em poucas
quantidades.
Na primavera (Figura 9a) o pico 1 e 3 foram encontrados
preferencialmente nos caules, já os picos 10 e 11 nas raízes. No verão (Figura 9b) o
pico 1 é detectado nos caules, o 3 em caules e raízes assim como o pico 5, já os
picos 10 e 11 são encontrados em maior quantidade nas raízes.
Várias substâncias pertencentes a esta classe já foram relatadas no
gênero Allamanda, entre os quais a alancina e alamandina. Estes iridóides, exceto o
plumierídeo, possuem média polaridade, pois foram extraídos na fração de
diclorometano. Eles foram encontrados nas distintas partes analisadas, com
intensidades variáveis. Isto indica que as mudanças climáticas não interferem
significativamente na produção destas substâncias, mas sim na sua concentração.
Sabe-se que os iridóides são produzidos principalmente por plantas como defesa
contra herbívoros ou infecções por microorganismos (DIDNA; DEBNATH;
HARIGAYA, 2007) e pode ser este o motivo da sua produção neste gênero.
58
a) outono A
U
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
Minutes0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00 40,00 45,00 50,00 55,00
b) inverno
AU
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
Minutes0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00 40,00 45,00 50,00 55,00
Figura 8: Perfis cromatográficos de iridóides da mesma parte coletada de Allamanda schottii em diferentes estações do ano. a) outono, b) inverno. Condições cromatográficas: eluição de gradiente A:B:C, na proporção 10:10:80 a 20:10:70 a 10 minutos, 35:10:55 a 20 minutos, 50:10:40 a 35 minutos, 70:10:20 a 50 minutos, 50:10:40 a 60 minutos e por fim a 65 minutos 10:10:80, fluxo 0,8 mL/min., 230 nm, fração diclorometano.
folha caule raiz
folha caule raiz
1
AU
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
nm
200,00 220,00 240,00 260,00 280,00 300,00 320,00 340,00 360,00 380,00
212,6
374,8
3
5 11
10
2
3 5
10
11
AU
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
nm200,00 220,00 240,00 260,00 280,00 300,00 320,00 340,00 360,00 380,00
212,6
376,0
AU
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
nm200,00 250,00 300,00 350,00
216,1
345,2
59
a) primavera A
U
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
Minutes0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00 40,00 45,00 50,00 55,00
b) verão
AU
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
Minutes0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00 40,00 45,00 50,00 55,00
Figura 9: Perfis cromatográficos de iridóides da mesma parte coletada de Allamanda schottii em diferentes estações do ano. a) primavera, b) verão. Condições cromatográficas: eluição de gradiente A:B:C, na proporção 10:10:80 a 20:10:70 a 10 minutos, 35:10:55 a 20 minutos, 50:10:40 a 35 minutos, 70:10:20 a 50 minutos, 50:10:40 a 60 minutos e por fim a 65 minutos 10:10:80, fluxo 0,8 mL/min., 230 nm, fração diclorometano.
folha caule raiz
folha caule raiz
1
3
5
7
10
11
1
3 5
10
11
AU
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
nm200,00 220,00 240,00 260,00 280,00 300,00 320,00 340,00 360,00 380,00
215,0
345,2
AU
0,000
0,010
0,020
0,030
0,040
0,050
0,060
0,070
0,080
0,090
0,100
nm200,00 220,00 240,00 260,00 280,00 300,00 320,00 340,00 360,00 380,00
211,4
326,1 365,2379,6
60
5.3 Análise quantitativa dos iridóides plumierideo e plumericina na Allamanda
schottii
Nas Tabelas de 3 a 6 estão apresentados os valores de média das
concentração, o desvio padrão (s), o erro padrão de média e também o coeficiente
de variação para verificar a reprodutibilidade dos dados de concentração para o
plumierídeo e plumericina nas frações de diclorometano e acetato de etila nas
diferentes partes coletas da Allamanda schottii.
Tabela 3: Concentração média do plumierídeo na fração diclorometano nas
diferentes partes da A. schottii, coletada em diferentes estações.
Parte da planta
Época da coleta
Concentração (ug/mL) EPM
s CV (%)
Folha Verão 5,69 a 0,003 0,006 0,105 Folha Outono 7,66 a 0,012 0,021 0,274 Folha Inverno 6,28 a 0,027 0,047 0,748 Folha Primavera 0,76** b 0,001 0,002 0,263 Caule Verão 27,27 c 0,006 0,010 0,037 Caule Outono 110,45 d 0,058 0,100 0,090 Caule Inverno 3,15 b 0,002 0,004 0,127 Caule Primavera 68,51 e 0,101 0,175 0,255 Raiz Verão 0,80** b 0,001 0,002 0,250 Raiz Outono 2,58 b 0,003 0,005 0,194 Raiz Inverno 0,61** b 0,001 0,002 0,328 Raiz Primavera 0,62** b 0,001 0,002 0,322
EPM = Erro padrão de média; s = desvio padrão; CV = coeficiente de variação; **<LD plumierídeo = 1 µg/mL. Letras iguais não apresentam diferenças significativas, letras diferentes possuem diferenças significativas (p> 0,05).
61
Tabela 4: Concentração média do plumierídeo na fração acetato de etila nas
diferentes partes da A. schottii, coletada em diferentes estações.
Parte da planta
Época de coleta
Concentração (µµµµg/mL) EPM
s CV (%)
Folha Verão 80,73 a 0,018 0,031 0,038 Folha Outono ND b - - - Folha Inverno ND b - - - Folha Primavera ND b - - - Caule Verão 48,26 c 0,015 0,026 0,054 Caule Outono 252,29 d 0,101 0,175 0,069 Caule Inverno ND b - - - Caule Primavera 283,14 d 0,028 0,048 0,017 Raiz Verão 8,03 e 0,023 0,040 0,498 Raiz Outono 38,07 c 0,014 0,024 0,063 Raiz Inverno ND b - - - Raiz Primavera ND b - - -
EPM = Erro padrão de média; s = desvio padrão; CV = coeficiente de variação; ND = não detectado; LD plumierídeo = 1 µg/mL. Letras iguais não apresentam diferenças significativas, letras diferentes possuem diferenças significativas (p> 0,05).
62
Tabela 5: Concentração média da plumericina na fração diclorometano nas
diferentes partes da A. schottii.
Raiz Verão 320,42 g 0,062 0,107 0,033 Raiz Outono 120,05 h 0,015 0,026 0,022 Raiz Inverno 207,52 i 0,026 0,045 0,022 Raiz Primavera 105,61 j 0,083 0,143 0,135
EPM = Erro padrão de média; s = desvio padrão; CV = coeficiente de variação. Letras iguais não apresentam diferenças significativas, letras diferentes possuem diferenças significativas (p> 0,05).
Parte da planta
Época de coleta
Concentração (ug/mL) EPM s CV(%)
Folha Verão 2,36 a 0,014 0,024 1,017 Folha Outono 60,18 b 0,003 0,005 0,008 Folha Inverno 7,23 c 0,002 0,003 0,041 Folha Primavera 16,74 d 0,008 0,014 0,084 Caule Verão 96,72 e 0,016 0,028 0,029 Caule Outono 76,59 f 0,022 0,038 0,050 Caule Inverno 78,12 f 0,005 0,008 0,010 Caule Primavera 8,86 c 0,005 0,008 0,090
63
Tabela 6: Concentração média da plumericina na fração acetato de etila nas
diferentes partes da A. schottii.
Parte da planta
Época de coleta
Concentração (µµµµg/mL) EPM
s CV (%)
Folha Verão ND a - - - Folha Outono 5,88 b 0,004 0,006 0,102 Folha Inverno ND a - - - Folha Primavera ND a - - - Caule Verão 18,20 c 0,016 0,028 0,154 Caule Outono 6,23 b 0,026 0,045 0,722 Caule Inverno 71,32 d 0,051 0,088 0,123 Caule Primavera ND a - - - Raiz Verão ND a - - - Raiz Outono ND a - - - Raiz Inverno ND a - - - Raiz Primavera ND a - - -
EPM = Erro padrão de média; s = desvio padrão; CV = coeficiente de variação; ND = não detectado; LD = 0,25µg/mL. Letras iguais não apresentam diferenças significativas, letras diferentes possuem diferenças significativas (p> 0,05).
Através dos dados das Tabelas 3 a 6, observou-se que em todas as
análises os coeficientes de variação apresentaram-se abaixo de 2%, indicando baixa
dispersão e a significância das médias das concentrações tanto para o plumierídeo
como para a plumericina. Os valores do coeficiente de variação estão de acordo
com os critérios de aceitação descrita na literatura (RIBANI et al., 2004). Pela
análise dessas tabelas foi possível verificar que o método de extração utilizado,
partição líquido-líquido, foi eficaz na separação dos iridóides, tendo em vista as suas
polaridades. Verificou-se ainda predominância do plumierídeo na fração acetato de
etila e da plumericina na fração de diclorometano nas amostras analisadas.
Estes resultados podem ser melhor visualizados, fazendo-se o
somatório das concentrações médias de plumierídeo em todas as estações nas
frações diclorometano e acetato de etila (Tabelas 3 e 4), que resultou numa
concentração média de 78,12 µg/mL e 236,84 µg/mL, respectivamente. Uma
pequena concentração do plumierídeo se distribuiu na fração de diclorometano,
porém devido a sua polaridade a maior parte foi para a fração de acetato de etila.
Nas coletas onde havia pequena concentração desta substância, toda a massa
64
permaneceu na fração de diclorometano. Por exemplo, nas folhas coletadas no
outono havia 7,66 µg/mL na fração de diclorometano e o mesmo não foi encontrado
na fração de acetato de etila. Já nas coletas onde havia grande concentração do
plumierídeo, como nos caules de outono e primavera, ocorreu também um aumento
na sua concentração na fração de diclorometano.
Na comparação da concentração média total da plumericina entre as
duas frações, verificou-se que a fração de diclorometano apresentou concentração
média muito superior para este iridóide, quando comparada a fração de acetato de
etila, 366,81µg/mL e 33,876 µg/mL, respectivamente. Estes valores indicam
eficiência no processo de extração. A plumericina é um iridóide não glicosilado, de
média polaridade, por isso sua preferência na extração é permanecer na fração de
diclorometano. Pode-se verificar esta eficiência no processo de extração das raízes
onde toda a massa foi extraída na fração de diclorometano.
Após a quantificação da plumericina e do plumierídeo, os dados foram
interpretados por meio de análise da variância (ANOVA), utilizando teste F ao nível
de 5% de significância. As médias dos valores das concentrações do plumierídeo e
da plumericina de cada fração da Allamanda schottii foram comparadas utilizando
teste de Tukey e adotando o nível de significância de 5%.
Para melhor visualização das Tabelas 3 a 6 foram plotadas figuras que
apresentam as concentrações encontradas dos iridóides plumierídeo e plumericina.
Nas Figuras 10 a 13, estão representadas graficamente as concentrações do
plumierídeo e da plumericina em função das diferentes partes da A. schottii coletada
em diferentes épocas para as frações diclorometano e acetato de etila,
respectivamente (Tabelas 3 a 6).
Pela análise dos dados apresentados na Figura 10 (Tabela 3) não foi
observado diferença significativa entre as concentrações médias de plumierídeo
obtidas nas frações de diclorometano das raízes de verão, inverno, primavera e
folha coletada na primavera, cujos valores apresentaram-se abaixo do limite de
detecção do método (1µg/mL), e também para caule de inverno e raiz de outono
(3,15 e 2,58 µg/mL). Não foram encontradas diferenças significativas (p>0,05) entre
as folhas coletadas no verão, outono e inverno. Já para os caule foram encontradas
diferenças significativas com relação a época de coleta e às outras partes da A.
schottii, onde a maior concentração média do plumierídeo na fração de
diclorometano foi encontrada no caule de outono (110,45 µg/mL). Já às
65
concentrações médias de plumierídeo obtidas na fração acetato de etila ( Figura 11
e Tabela 4) apresentaram diferenças significativas nas amostras onde o mesmo foi
detectado, tendo em vista que em várias amostras este iridóide não foi encontrado.
Não houve diferença significativa somente entre as raízes de outono e caule de
verão.
Outono Inverno Primavera Verão
Época de coleta
0
20
40
60
80
100
120
Con
cent
raçã
o (u
g/m
L)
Figura 10: Concentrações médias (µg/mL) de plumierídeo na fração diclorometano das diferentes partes da A. schottii (�) raiz, (�) caule e (�)folha coletada nas diferentes estações do ano.
caule
folha raiz
Verão Outono Primavera Inverno
66
Outono Inverno Primavera Verão
Época de coleta
0
50
100
150
200
250
300
Con
cent
raçã
o (u
g/m
L)
Figura 11: Concentrações médias (µg/mL) de plumierídeo na fração acetato das diferentes partes da A. schottii (�) raiz, (�) caule e (�)folha coletada nas diferentes estações do ano.
Conforme resultados discutidos anteriormente, (Figura 11 e Tabela 4),
verificou-se que o iridóide plumierídeo somente foi detectado nas folhas, caules e
raízes coletados no verão, caules e raízes coletados no outono, e ainda caules
coletados na primavera. Os resultados de análise de variância interpretados pelo
teste de Tukey, indicaram que houve diferenças significativas nas concentrações
médias deste iridóide, havendo influência da parte da planta e da estação de coleta.
As maiores concentrações médias do plumierídeo foram encontradas nos caules de
inverno e primavera na fração acetato de etila 252,29 e 283,14 µg/mL,
respectivamente.
Na Figura 12 e 13 (Tabelas 5 e 6) estão mostrados as concentrações
médias de plumericina obtidas nas frações diclorometano e acetato de etila nas
diferentes partes e estações.
Na fração de diclorometano (Figura 12, Tabela 5), não foram encontradas
diferenças significativas nas concentrações médias da plumericina nas folhas de
inverno e caules de primavera (7,23 µg/mL e 8,86 µg/mL) e entre os caules de
caule
raiz
folha
Verão Outono Primavera Inverno
67
outono e inverno (76,59 e 78,12µg/mL), respectivamente. Para as demais partes da
A. schottii, foram observadas diferenças significativas nos valores das
concentrações médias da plumericina. Os maiores de valores de concentração deste
iridóide foram encontrados nas raízes da A. schottii, apresentando diferenças
significativas com relação a época de coleta desta parte da planta. Nas raízes de
verão foi encontrada a maior concentração (320,42 µg/mL), a menor concentração
deste iridóide foi observada nas folhas de verão (2,36 µg/mL) da fração de
diclorometano.
Para a fração acetato de etila (Figura 13, Tabela 6), nas raízes coletadas
nas quatro estações, nos caules de primavera e nas folhas de verão, inverno e
primavera este iridóide não foi detectado. As concentrações encontradas nas folhas
e caules coletados no outono foram semelhantes, não apresentando diferenças
significativas. A maior concentração de plumericina nesta fração foi encontrada nos
caules de inverno 71,31 µg/mL.
Outono Inverno Primavera Verão
Época de coleta
0
50
100
150
200
250
300
Con
cent
raçã
o (u
g/m
L)
Figura 12: Concentrações médias (µg/mL) de plumericina na fração diclorometano das diferentes partes da A. schottii (�) raiz, (�) caule e (�) folha coletada nas diferentes estações do ano.
caule
raiz
folha
Verão Outono Primavera Inverno
68
Outono Inverno Primavera Verão
Época de coleta
0
10
20
30
40
50
60
70
Con
cent
raçã
o (u
g/m
L)
Figura 13: Concentrações médias (µg/mL) de plumericina na fração acetato das diferentes partes da A. schottii (�) raiz, (�) caule e (�) folha coletada nas diferentes estações do ano.
5.4 Análise quantitativa do rendimento dos iridóide s partindo de 100 gramas de
planta seca
Para que se obtenha um extrato com bom rendimento, é importante que o
mesmo apresente de altas concentrações dos metabólitos com propriedades
bioativas. Para tanto, faz-se necessário correlacionar o rendimento de cada parte da
planta, a época de coleta e a concentração do metabólito encontrada.
Nas Tabelas de 7 a 10 estão apresentados os resultados de concentração
em miligramas de plumierídeo e plumericina por 100 gramas de parte de planta seca
(caule, folha, raiz) da A. schottii coletadas nas diferentes estações. Os dados de
concentração foram calculados correlacionando-se os dados das Tabelas 3 a 6, com
os dados de rendimento das frações de diclorometano e acetato de etila partindo-se
de 100 gramas de planta seca (raiz, caule e folha) (Tabela 2). Os resultados destas
tabelas foram representados graficamente para facilitar a visualização e estão
mostrados nas Figuras 14 a 17, mais adiante.
caule
raiz
folha
Verão Outono Primavera Inverno
69
Tabela 7: Concentração média de plumierídeo na fração diclorometano nas
diferentes partes e coletas em mg/ 100 g de parte de planta seca
Parte da planta
Época de coleta
Concentração (mg/mL) EPM s CV(%)
Folha Verão 4,02 a 0,00232 0,00401 0,09975 Folha Outono 11,76 b 0,01850 0,03200 0,27211 Folha Inverno 5,12 a 0,02219 0,03830 0,74805 Folha Primavera 0,03 c 0,00002 0,00003 0,10000 Caule Verão 7,83 d 0,00169 0,00292 0,03729 Caule Outono 7,50 d 0,00397 0,00686 0,09155 Caule Inverno 0,27 c 0,00011 0,00034 0,12592 Caule Primavera 69,13 e 0,10188 0,17626 0,25497 Raiz Verão 0,23 c 0,00031 0,00054 0,23478 Raiz Outono 0,47 c 0,00056 0,00097 0,20638 Raiz Inverno 0,16 c 0,00022 0,00037 0,23125 Raiz Primavera 0,03 c 0,00002 0,00003 0,10000
EPM = Erro padrão de média; s = desvio padrão; CV = coeficiente de variação. Letras iguais não apresentam diferenças significativas, letras diferentes possuem diferenças significativas (p> 0,05).
70
Tabela 8: Concentração média de plumierídeo na fração acetato de etila nas
diferentes partes e coletas em mg/ 100 g de parte de planta seca
Parte da
planta
Época de coleta
Concentração (mg/mL) EPM
s CV(%)
Folha Verão 27,03 a 0,006 0,010 0,037 Folha Outono ND b - - - Folha Inverno ND b - - - Folha Primavera ND b - - - Caule Verão 3,53 c 0,001 0,002 0,057 Caule Outono 40,13 d 0,016 0,028 0,070 Caule Inverno ND a - - - Caule Primavera 132,66 e 0,013 0,022 0,016 Raiz Verão 1,87 c 0,005 0,009 0,481 Raiz Outono 15,97 f 0,006 0,010 0,063 Raiz Inverno ND a - - - Raiz Primavera ND a - - -
EPM = Erro padrão de média; s = desvio padrão; CV = coeficiente de variação; ND = Não detectado. Letras iguais não apresentam diferenças significativas, letras diferentes possuem diferenças significativas (p> 0,05).
71
Tabela 9: Concentração média de plumericina na fração diclorometano nas
diferentes partes e coletas em mg/ 100 g de parte de planta seca
Parte da planta
Época de coleta
Concentração (mg/mL) EPM s CV(%)
Folha Verão 1,67 a 0,010 0,018 1,078 Folha Outono 92,40 b 0,005 0,008 0,009 Folha Inverno 5,90 c 0,002 0,003 0,051 Folha Primavera 5,86 c 0,005 0,008 0,136 Caule Verão 27,76 d 0,004 0,008 0,029 Caule Outono 5,20 c 0,002 0,003 0,058 Caule Inverno 6,61 c 0,001 0,001 0,015 Caule Primavera 8,94 e 0,005 0,009 0,101 Raiz Verão 94,00 b 0,018 0,031 0,033 Raiz Outono 21,66 f 0,003 0,005 0,023 Raiz Inverno 54,22 g 0,007 0,012 0,022 Raiz Primavera 5,86 c 0,005 0,008 0,136
EPM = Erro padrão de média; s = desvio padrão; CV = coeficiente de variação. Letras iguais não apresentam diferenças significativas, letras diferentes possuem diferenças significativas (p> 0,05).
72
Tabela 10: Concentração média de plumericina na fração acetato nas diferentes
partes e coletas em mg/ 100 g de parte de planta seca
Parte da planta
Época de coleta
Concentração (mg/mL) EPM S CV(%)
Folha Verão ND a - - - Folha Outono 0,41 a 0,0002 0,0004 0,0098 Folha Inverno ND a - - - Folha Primavera ND a - - - Caule Verão 1,33 a 0,0012 0,0021 0,1578 Caule Outono 0,99 a 0,0042 0,0072 0,7272 Caule Inverno 3,11 b 0,0022 0,0039 0,1254 Caule Primavera ND a - - - Raiz Verão ND a - - - Raiz Outono ND a - - - Raiz Inverno ND a - - - Raiz Primavera ND a - - -
EPM = Erro padrão de média; s = desvio padrão; CV = coeficiente de variação; ND = Não detectado. Letras iguais não apresentam diferenças significativas, letras diferentes possuem diferenças significativas (p> 0,05).
Na figura 14 (Tabela 7) mostrou-se os resultados de concentração média
do iridóide plumierideo na fração de diclorometano das diferentes partes da A.
schottii a partir de 100 g de parte planta seca. Observou-se maior concentração
deste iridóide no caule de primavera (69,13 mg/mL). Entre as folhas pode-se
considerar que folha de verão e de inverno não apresentam diferenças significativas
nesta fração e apresentam concentração de 4,02 e 5,12 mg/100g.
73
Outono Inverno Primavera Verão
Época de coleta
0
10
20
30
40
50
60
70
mg
plum
ierí
deo/
100
g de
par
te p
lant
a se
ca
Figura 14: Concentrações médias em mg de plumierídeo em 100g de parte de planta seca na fração diclorometano das diferentes partes da A. schottii (�- Raiz; �-Caule; �-Folha) e coletadas nas diferentes estações do ano.
Na figura 15 (Tabela 8) está apresentado a concentração média do
plumierídeo na fração acetato de etila, obtido por 100 g de cada parte da A. schottii.
Nesta fração observou-se a mesma tendência dos resultados cromatográficos
apresentados anteriormente. A principal diferença foi observada na concentração do
caule de outono devido a menor massa extraída nesta coleta.
raiz
raiz
caule
folha
Verão Outono Primavera Inverno
74
Outono Inverno Primavera Verão
Época de coleta
0
20
40
60
80
100
120
mg
plum
ierí
deo/
100
g de
par
te p
lant
a se
ca
Figura 15: Concentrações médias em mg de plumierídeo em 100g de parte de planta seca na fração acetato de etila das diferentes partes da A. schottii (�- Raiz; �-Caule; �-Folha) e coletadas nas diferentes estações do ano.
A análise estatística demonstrou que a melhor época para obtenção do
plumierídeo foi a primavera, sendo os caules que apresentam maior concentração
deste marcador. A coleta dos caules para a obtenção do plumierídeo apresenta a
vantagem de não interferir no ciclo de vida da planta, visto que raiz permanecerá
preservada.
Na figura 16 (Tabela 9) está apresentado a concentração média da
plumericina na fração de diclorometano em 100g de planta seca. Pode-se observar
que não há diferença significativa entre raízes de primavera, caules de outono e
inverno e folhas de inverno e primavera, onde a concentração fica em torno de 5,90
+ 0,7 mg/mL. Não há diferença significativa também para raízes de verão e folhas de
outono (94,03 mg/mL e 92,40 mg/mL, respectivamente), onde se encontra as
concentrações mais altas para este iridóide.
folha
raiz
caule
Verão Outono Primavera Inverno
75
Outono Inverno Primavera Verão
Época de coleta
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
mg
plum
eric
ina/
100
g d
e pa
rte
plan
ta s
eca
Figura 16: Concentrações médias em mg de plumericina em 100g de parte de planta seca na fração diclorometano das diferentes partes da A. schottii (�- Raiz; �-Caule; �-Folha) e coletadas nas diferentes estações do ano.
A época de coleta influenciou na concentração deste marcador nas raízes
e caules, ambos possuem sua concentração mais elevada na coleta de verão (94,00
mg/mL para raízes e 27,76 para caules), já as folhas nesta estação apresentou a
menor concentração deste iridóide.
As concentrações observadas a partir de 1 g de fração e avaliadas em
100 g de planta seca apresentaram a mesma tendência, exceto para folha de
outono, devido a maior quantidade de massa obtida nesta fração. Os caules de
verão e outono também apresentaram perfil diferente devido a menor quantidade de
massa extraída nestas estações.
Na figura 17 (Tabela 10) está apresentado a concentração média da
plumericina obtida na fração de acetato de etila. Verificou-se que somente no caule
da coleta de inverno a massa extraída foi superior a 3 mg por 100 g de planta. Estes
raiz
folha
caule
Verão Outono Primavera Inverno
76
dados confirmam a eficiência no processo de extração.
Outono Inverno Primavera Verão
Época de coleta
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
mg
plum
eric
ina/
100
g de
par
te p
lant
a se
ca
Figura 17: Concentrações médias em mg de plumericina em 100g de parte de planta seca na fração acetato de etila das diferentes partes da A. schottii (�- Raiz; �-Caule; �-Folha) e coletadas nas diferentes estações do ano.
A partir dos resultados obtidos pode-se verificar que a plumericina está
presente nas três partes analisadas, porém nas raízes observaram-se as maiores
concentrações deste marcador. As folhas também apresentaram concentrações
elevadas. Já os caules apresentaram concentrações bastante baixas.
Quando se avaliou a época de coleta em relação às partes avaliadas,
constatou-se para as folhas concentrações mais elevadas no outono. Os caules e
raízes apresentaram a maior concentração no verão.
Ao se levar em conta que a coleta de raízes faz com que aquele exemplar
da planta seja extinto, deve-se pensar em formas de plantio para que se evite a
extinção desta espécie.
Ainda não se conhece totalmente o mecanismo de produção de
metabólitos secundários de uma planta, principalmente por se tratar de uma matriz
caule
raiz folha
Verão Outono Primavera Inverno
77
biológica. A sua produção pode estar relacionada a vários fatores, entre os quais
como mediadores em interações ecológicas, como a defesa contra herbívoros e
microorganismos, proteção contra raios UV, atração de polinizadores ou animais
dispersores de sementes e interações alelopáticas. Como não se sabe exatamente
qual a função de cada um dos metabólitos produzidos pelas plantas, mas pode-se
afirmar que a necessidade de sua produção em determinado órgão ou estação está
relacionado coma sua função ecológica (SANTOS, 2004; GOBBO-NETO; LOPES,
2007).
Pode-se afirmar que, como os iridóides são produzidos como
mecanismos de defesa da planta contra herbívoros ou infecções por
microorganismos (DIDNA; DEBNATH; HARIGAYA, 2007; MEHRVARZ et al., 2008),
a relação da concentração dos iridóides nas diferentes estações pode estar aí
relacionada. O plumierídeo e a plumericina apresentam atividade inibitória do
crescimento de plantas (PAGE; MADRINAN; TOWERS, 1994). Altas concentrações
destas substâncias em determinadas estações e partes distintas do vegetal podem
estar relacionado a defesa contra algum tipo de invasor com o intuito de
sobrevivência da espécie. Porém o interesse na quantificação destes iridóides foi
devido aos efeitos farmacológicos, O plumierídeo devido ao seu grande potencial
antiinflamatório (SILVA, 2007) e antitumoral (DOBHAL et al., 2004) e a plumericina
pela ação antineoplásica, antiflogística e antimicrobiana (BOLZANI et al., 1999; LI et
al., 2006). As informações apresentadas neste trabalho têm grande importância no
sentido de planejamento de processos extrativos.
78
6 Conclusões
Avaliou-se no presente trabalho a influência da sazonalidade na obtenção
de metabólitos secundários presentes nas raízes, caules e folhas da Allamanda
schottii coletadas em Blumenau/SC no ano de 2006. As seguintes conclusões foram
possíveis:
- Observaram-se diferenças significativas nas massas obtidas no processo de
maceração nas distintas partes da A. schottii nas quatro coletas realizadas.
- Verificou-se nas frações obtidas por processo de partição líquido-líquido que a
maioria das substâncias presentes nos respectivos extratos apresentou polaridade
muito elevada, permanecendo acima de 60% da massa na fração aquosa.
- Na análise realizada por CLAE das frações de diclorometano e acetato de etila
observou-se similaridade na produção de metabólitos secundários em cada uma das
partes nas distintas coletas. Foi encontrado diferenças nas intensidades dos picos,
indicando diferenças nas concentrações destes metabólitos. Em alguns casos
observou-se a ausência de determinados picos nas distintas estações. Porém foram
observadas diferenças significativas quando se analisou as diferentes partes em
uma distinta estação.
- Cinco iridóides foram detectados pelo perfil de absorção obtido no ultravioleta.
Entre estes se encontra a plumericina e o plumierídeo. Estes iridóides, exceto o
plumierídeo, possuem média polaridade, pois foram extraídos na fração de
diclorometano. Eles foram encontrados nas distintas partes analisadas, com
intensidades variáveis. Isto indica que as mudanças climáticas não interferem
significativamente na produção destas substâncias, mas sim na sua concentração.
- Os iridóides plumierídeo e plumericina foram avaliados quantitativamente por
CLAE. Eles foram encontrados em todas as amostras avaliadas.. As maiores
concentrações do plumierídeo foram encontradas nos caules de outono e primavera.
Para a plumericina os melhores rendimentos foram observados nas raízes no verão.
- Os resultados obtidos de concentração média dos iridóides plumierídeo e
plumericina correlacionando o rendimento de cada parte da planta, a época de
coleta e a concentração do metabólito encontrado seguiram a mesma tendência
para o plumierídeo. As maiores concentrações foram observadas nos caules, mas
devido a maior quantidade de massa extraída na fração de acetato de etila dos
79
caules de primavera. Para a plumericina observou-se, agora, resultados similares
para a coleta das raízes de verão.
- A produção destes metabólitos está relacionada aos mecanismos de defesa da
planta, isto pode explicar as diferenças obtidas nas concentrações destes
marcadores em relação a parte da plnta avaliada e época de coleta.
80
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