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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
ANA PAULA DE OLIVEIRA
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE GASTROPROTETORA DO
EXTRATO METANÓLICO E DESENVOLVIMENTO
TECNOLÓGICO DE PREPARAÇÕES EXTRATIVAS DAS
PARTES AÉREAS DE Marrubium vulgare L. (Lamiaceae)
Itajaí – 2011
1
UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ PROGRAMA DE MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E
SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS
ANA PAULA DE OLIVEIRA
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE GASTROPROTETORA DO
EXTRATO METANÓLICO E DESENVOLVIMENTO
TECNOLÓGICO DE PREPARAÇÕES EXTRATIVAS DAS
PARTES AÉREAS DE Marrubium vulgare L. (Lamiaceae)
Dissertação submetida ao Programa de Mestrado Acadêmico em Ciências Farmacêuticas, da Universidade do Vale do Itajaí, como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
Orientadora: Prof.ª. Dra. Angélica Garcia Couto Co-orientador: Prof. Dr. Valdir Cechinel Filho
Itajaí, maio de 2011.
2
O3a
Oliveira, Ana Paula de, 1981- Avaliação da atividade gastroprotetora do extrato metanólico e desenvolvimento tecnológico de preparações extrativas das partes aéreas de Marrubium vulgare L. (Lamiaceae) [manuscrito] / Ana Paula de Oliveira. – 2011. 118 f. : il. ; 30 cm
Cópia de computador (Printout(s)). Dissertação (mestrado) – Universidade do Vale do Itajaí, Pró-reitoria de Pesquisa. Pós-graduação, Extensão e Cultura, 2011. “Orientador: Profª. Dra. Angélica Garcia Couto ”. Bibliografia: f. 104-117.
1. Produtos naturais. 2. Plantas medicinais. 3. Farmacognosia. 4. Química vegetal. I. Universidade do Vale do Itajaí. II. Título.
CDU: 615.32
Cristina M. V. Porciúncula – CRB 14/966
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AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE GASTROPROTETORA DO EXTRATO METANÓLICO E DESENVOLVIMENTO
TECNOLÓGICO DE PREPARAÇÕES EXTRATIVAS DAS PARTES AÉREAS DE Marrubium vulgare L. (Lamiaceae)
ANA PAULA DE OLIVEIRA
‘Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em
Ciências Farmacêuticas, Área de Concentração Produtos Naturais e substâncias Bioativas e, aprovada em sua forma final pelo Programa de Mestrado em Ciências Farmacêuticas da Universidade do Vale do Itajaí.’
____________________________________ Angélica Garcia Couto, Doutora
Orientadora
__________________________________________________________
Tânia Mari Bellé Bresolin, Doutora Coordenador do Programa Mestrado em Ciências Farmacêuticas
Apresentado perante a Banca Examinadora composta pelos Professores:
______________________________________ Dra. Angélica Garcia Couto (UNIVALI)
Presidente
______________________________________
Dr. Valdir Cechinel Filho (UNIVALI) Co-orientador
______________________________________
Dr. Sérgio Faloni de Andrade (UNIVALI) Membro
______________________________________
Dr. Andreas Sebastian Loureiro Mendez (UNIPAMPA/Uruguaiana-RS) Membro
Itajaí (SC), 31, maio de 2011.
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Aos meus pais...
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AGRADECIMENTOS
A Deus pela proteção e por tornar isso tudo isso possível e por ter permitido
esta transformação em minha vida...
À minha família, meu porto seguro... especialmente minha mãe e meu pai,
pessoas maravilhosas que sempre me incentivaram a buscar o melhor, pelas
palavras incentivadoras e reconfortantes, pela preocupação a cada viagem,
pelo apoio financeiro, pelos conselhos, pelo exemplo de garra que são em
minha vida, pela educação que me deram, enfim... por tudo que fez ser quem
eu sou e me fez chegar até aqui e buscar ir muito mais além...
A meu irmão pelo incentivo e demonstração de interesse...
A meu amor, Cristiano, por incansáveis discursos de apoio, pela paciência, por
ser meu amigo, companheiro, parceiro, conselheiro, me dar força e não me
deixar desistir, pelo abraço acolhedor, pelo carinho, cuidado, dedicação e
amor...
À Profª. Dr. Angélica Garcia Couto pela orientação...
Ao Prof. Dr. Valdir Cechinel Filho pela co-orientação...
Aos professores do Programa de Mestrado em Ciências Farmacêuticas que
colaboraram com seus conhecimentos para a realização deste trabalho...
A Profa. Dr. Christiane Meyre pelo interesse a pesquisa...
Prof. MSc. Rene Arthur pela análise botânica...
Ao Prof. Theodoro Marcel Wagner pela ajuda e apoio nas análises em CG...
Ao Prof. Dr. Sérgio pela excelente ajuda e orientação, na realização dos
experimentos farmacológicos...
Aos técnicos de todos os laboratórios pelos quais passei...
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Ao Juliano dos Santos e a Helenize Heyse Moreira...
Aos meus queridos colegas de mestrado por toda a ajuda que me deram...
A José Roberto Santin e a Marivane Lemos, colegas e amigos do mestrado,
pela importante ajuda nos experimentos farmacológicos...
As minhas amigas, parceiras, Juliana, Jaqueline, Isabel, Marivane e Isabela...
pessoas extremamente especiais, que tornaram minha vida mais alegre e
divertida...
A todas as pessoas que de alguma forma tenham colaborado para a realização
deste trabalho, direta ou indiretamente e que sempre serão lembradas...
Muito obrigada!
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AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE GASTROPROTETORA DO EXTRATO
METANÓLICO E DESENVOLVIMENTO TECNOLÓGICO DE PREPARAÇÕES EXTRATIVAS DAS PARTES AÉREAS DA Marrubium vulgare L.
(Lamiaceae)
ANA PAULA DE OLIVEIRA
Maio de 2011
Orientadora: Profª. Dra. Angélica Garcia Couto Co- Orientador: Prof. Dr. Valdir Cechinel Filho Área de Concentração: Produtos naturais e substâncias sintéticas bioativas. Número de páginas: 119
Resumo:
Marrubium vulgare L. (Lamiaceae) é uma planta de origem européia, popularmente conhecida no Brasil por marroio, maromba, ou erva de sapo, entre outros, cujo chá tem sido usado no tratamento de inflamações, dispesias e desordens gastrointestinais. O presente trabalho teve como objetivos avaliar o potencial gastroprotetor do extrato metanólico (EMMV) e do seu diterpeno majoritário, a marrubiína (Mb), contribuindo para o desenvolvimento tecnológico de fitoterápicos a base desta planta. A atividade gastroprotetora foi avaliada utilizando-se o modelo de úlceras agudas induzidas por etanol/HCl e AINE/simpaticomimético, a atividade sobre a secreção gástrica, através da ligadura de piloro e doseamento de muco e os possíveis mecanismos da gastroproteção, estudando-se a participação do sistema do óxido nítrico e dos grupamentos sulfidrilas, pelos modelos L-NAME e NEM, respectivamente. Para a caracterização física e química da droga vegetal, foram realizadas duas coletas em Bom Retiro/SC, sendo uma no verão de 2009 e outra no inverno de 2010. As partes aéreas foram secas, moídas e caracterizadas quanto à perda por secagem (PS), granulometria média (Gm), cromatografia em camada delgada (CCD) para terpenóides, teor de extrativos solúveis em água quente (TE), teor de flavonóides equivalentes em quercetina (EQ) e fenólicos totais equivalentes em ácido gálico (EAG). Após coleta, tratamento e caracterização da droga vegetal, foi avaliado o efeito da extração com água, por decocção e infusão, e com as misturas hidroalcoólicas, por maceração estática, sobre o teor de fenólicos totais e presença de Mb nas CCDs. Após a seleção do solvente e método de extração, foram desenvolvidas nove soluções extrativas, seguindo planejamento fatorial 32, no qual se variou o tempo de extração (5, 10 e 15 dias) e relação planta: solvente (5, 7,5 e 10%, m/V), estudando-se o efeito destas variáveis sobre o resíduo seco (RS), teor de Mb (TM), por cromatografia gasosa (CG), e EAG. Os resultados demonstraram que tanto o EMMV, como a Mb reduziram o índice de lesões induzidas por etanol, quando comparados ao grupo controle, sendo que nos grupos tratados com EMMV 25, 50 e 100 mg/kg houve redução de 18,20 ± 2,57, 14,60 ± 3,07 e 7,40 ± 2,01, respectivamente, demonstrando efeito superior ao tratamento com Mb (25 mg/kg), que causou um índice de redução de 11,00 ± 2,38. Tanto o EMMV, como a cimetidina (CM) (controle positivo), inibiram significativamente as lesões induzidas por indometacina, quando comparados ao grupo controle, sendo que, nos grupos tratados com EMMV 25, 50 e 100 mg/kg houve inibição de 50,32 ± 5,60, 66,24
8
± 4,30 e 83,17 ± 4,09%, respectivamente, equiparáveis ao tratamento com CM (100 mg/kg), que causou inibição de 67,52 ± 4:38%. Todas as doses de EMMV e Mb causaram alterações significativas de pH, volume e acidez total, quando comparados ao grupo controle e aumento significativo (p<0,01) do muco. Os resultados demonstram que a gastroproteção induzida pelo EMMV e Mb estão altamente relacionados com a atividade do óxido nítrico, segundo o modelo L-NAME, e ligeiramente relacionada às sulfidrilas, segundo modelo NEM. A PS das partes aéreas frescas foi em média 83% (m/m). A presença de Mb foi confirmada por CCD em todos os EMMV. Não houve diferença significativa entre as coletas realizadas no inverno e verão quanto aos parâmetros de EAG, EQ e TE, que foram em média 7,64 mg/g, 2,79 mg/g e 32,71%, respectivamente. Para o estudo de otimização foi selecionado o método de maceração com álcool 70%, utilizando-se as partes aéreas (61% de folhas e 39% de caules), secas e moídas, classificadas como pós-grossos (Gm = 2,86 mm). O TM variou de 1,53 mg/mL (5%; 10 dias) a 6,46 mg/mL (7,5%, 5 dias); o EAG variou de 0,603 mg/mL (5%; 15 dias) a 1,13 mg/mL (10%; 10 dias) e o RS de 0,805% (5%; 15 dias) a 1,592% (10%; 5 dias). Apenas o EAG e o RS sofreram influência significativa (p<0,01) da relação planta: solvente. Pode-se sugerir que a atividade gastroprotetora esteja ligada a fatores antioxidantes. Recomenda-se o tempo de 10 dias e relação planta: solvente de 5,7% e 10% para a extração otimizada de marrubiína. Palavras-chave: Marrubium vulgare. Soluções extrativas. Gastroproteção.
Marrubiína.
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EVALUATION OF GASTROPROTECTIVE ACTIVITY OF METHANOL EXTRACT PREPARATIONS AND TECHNOLOGICAL DEVELOPMENT OF
EXTRACT FROM AERIAL PARTS OF Marrubium vulgare L. (LAMIACEAE)
ANA PAULA DE OLIVEIRA
May, 2011
Supervisor: Angélica Garcia Couto, Doctor. Co-supervisor: Valdir Cechinel Filho, Doctor. Area of Concentration: Natural products and synthetic bioactive substances Number of Pages: 119
Abstract
Marrubium vulgare L. (Lamiaceae) is a European plant, popularly known as marrubio, cowshed or grass frog, among other names, that is used in the form of a tea to treat inflammation, dyspepsia and gastrointestinal disorders. This study evaluates the gastroprotective activity potential of methanol extract (MEMV) and its major diterpene, marrubiin (Mb), contributing to the technological development of herbal medicines from aerial parts of M. vulgare. The gastroprotective activity was evaluated through the model of acute ulcer induced by ethanol/ HCl and NSAIDs/ sympathomimetic. This work also studied the activity on gastric secretion by pylorus ligation, mucus levels, and the possible mechanisms of antiulcer action, taking into account the system involvement of nitric oxide and sulfhydryl groups by the L-NAME and NEM models, respectively. For physical and chemical characterization, the herbal raw material was harvested, one in summer 2010 and one in winter 2009, both in Bom Retiro (Santa Catarina, Brazil). The aerial parts were dried, milled and characterized in relation to loss on drying (LD), mean particle size (MS), thin layer chromatography (TLC) for terpenoids, water extractable matter (WEM), total phenol content as gallic acid equivalent (GAE) and total flavonoid content as quercetin equivalent (QE). After harvesting, pre-treatment and herbal drug characterization, the extraction effect with water, through decoction and infusion, and with hydroethanol mixtures, through static maceration, on the GAE and TLC for terpenoid, were evaluated. After solvent and method selection, 9 extract solutions were developed, using a 32 factorial design and varying the extraction time (5, 10 and 15 days) and plant:solvent ratio (5, 7.5 and 10%, w/v), in order to study the effect of those variables on the dry residue (DR), Mb content by gas chromatography and GAE. The results showed that both MEMV and Mb reduced the ethanol induced lesion index, compared with the control group. MEMV 25, 50 and 100 mg/kg caused a reduction in the lesion indexes of 18.20 ± 2.57, 14.60 ± 3.07 and 7.40 ± 2.01, respectively, demonstrating a superior effect to the treatment with Mb 25 mg/kg, which caused a reduction of 11.00 ± 2.38. Both MEMV and cimetidine (CM) (positive control) significantly inhibited the indomethacin induced lesions, compared with the control group. Likewise, the MEMV 25, 50 and 100 mg/kg treatments inhibited 50.32 ± 5.60, 66.24 ± 4.30 and 83.17 ± 4.09%, similar to the CM 100 mg/kg treatment, which showed 67.52 ± 4.38% inhibition. All treatments caused significant (p<0.01) alterations in pH, volume and total acidity, and an increase in mucus, compared with the control group. The results also showed that the gastroprotection is probably related to nitric oxide activity, and slightly related to sulphydryls, according the L-NAME and NEM models, respectively. The herbal quality
10
control results showed a loss on drying of 83% (m/m) from fresh aerial parts, and no statistical differences was observed between the summer and winter harvests for GAE, QE and WEM, which were around 7.64 mg/g, 2.79 mg/g and 32,71%, respectively. TLC confirmed the presence of Mb in all of MEMV samples. For the optimization study for extraction, maceration with ethanol 70% was selected, using a mixture of 61% leaves and 39% stems as herbal raw materials, dried, milled and classified as coarse powder (MS = 2.86 mm). The Mb content varied from 1.53 mg/mL (5%; 10 days) to 6.46 mg/mL (7.5%, 5 days); the GAE from 0.603 mg/mL (5%; 15 days) to 1.13 mg/mL (10%; 10 days) and the DR from 0.805% (5%; 15 days) to 1,592% (10%; 5 days). Only GAE and DR were significantly influenced (p<0.01) by the plant: solvent ratio. This work suggests that gastroprotection is related to antioxidant factors. For the development of M. vulgare solutions by maceration with ethanol 70%, the results recommend 10 days of extraction and a plant: solvent ratio of 7.5% or 10% as the optimal conditions for marrubiin extraction. Key words: Marrubium vulgare. Extract solution. Gastroprotection. Marrubiin.
11
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Fotografia obtida da parte superior das folhas da Marrubium vulgare L....................................................................................
23
Figura 2. Partes aéreas e flores da Marrubium vulgare L. ....................... 23 Figura 3. Medicamentos a base da Marrubium vulgare comercializados
em diferentes países..................................................................
25 Figura 4. Estrutura química da pré-marrubiína e do seu derivado,
marrubiína.................................................................................
26 Figura 5. Secção longitudinal, face ventral do estômago......................... 30 Figura 6. Índice de cura obtido pelo efeito da administração oral de
omeprazol (30 mg/kg) e das diferentes doses do extrato metanólico das partes aéreas da Marrubium vulgare (nas doses de 25, 50 e 100 mg/kg) em úlceras gástricas agudas induzidas por etanol/HCl em camundongos..............................
63 Figura 7. Índice de cura obtido pelo efeito da administração oral de
omeprazol (30 mg/kg) e do diterpeno marrubiína obtido do extrato das partes aéreas da M. vulgare (na dose de 25 mg/kg) em úlceras gástricas induzidas por etanol/HCl em camundongos............................................................................
65 Figura 8. Índice de cura obtido pelo efeito da administração oral de
cimetidina (100 mg/kg) e das diferentes doses do extrato metanólico das partes aéreas da M. vulgare (EMMV) (nas doses de 25, 50 e 100 mg/kg) em úlceras gástricas agudas induzidas por indometacina/betanecol em camundongos...........................................................................
67 Figura 9. Efeitos do extrato da M. vulgare (100 mg/kg), marrubiina (25
mg/kg) e carbenoxolona (200 mg/kg) nas lesões induzidas por etanol em ratos pré-tratados com L-NAME (70 mg/kg, ip)..............................................................................................
72 Figura 10. Efeitos do extrato da M. vulgare (100 mg/kg), marrubiína (25
mg/kg) e carbenoxolona (200 mg/kg) nas lesões induzidas por etanol em ratos pré-tratados com NEM (10 mg/kg, ip).....
73 Figura 11. Cromatoplaca em camada delgada dos extratos metanólicos
dos lotes 1. BR06; 2. BR07/09; 3. BR02/10; AU. Padrão de
ácido ursólico..........................................................................
77 Figura 12. Cromatoplaca em camada delgada dos extratos metanólicos
dos lotes; 1. BR06; 2. BR07/09; 3. BR02/10; . Padrão de beta-sitosterol...........................................................................
77
Figura 13. Cromatoplaca em camada delgada dos extratos metanólicos dos lotes 1. EMBR06 2. BR07/09; 3. BR02/10; M. Padrão de
marrubiína.................................................................................
78 Figura 14. Cromatograma obtido por cromatografia gasosa. A = Padrão
marrubiína isolada da M. vulgare; B = Extrato metanólico EMBR06.....................................................................................
79
12
Figura 15. Cromatograma obtido por cromatografia gasosa dos extratos metanólicos. C = lote BR02/10 e D = lote BR07/09...................
80
Figura 16. Distribuição granulométrica das partes aéreas secas e trituradas da M. vulgare.............................................................
82
Figura 17. Análise granulométrica das partes aéreas secas e trituradas da M. vulgare.............................................................................
82
Figura 18. Curva analítica de ácido gálico em 750 nm............................... 84 Figura 19. Curva analítica de quercetina em solução hidroalcoólica
(70%) em 415 nm.....................................................................
85
Figura 20. Esquema de desenvolvimento dos extratos da M. vulgare utilizados para seleção do solvente e método de extração........
88
Figura 21. Cromatoplacas em camada delgada dos extratos hidroalcoólicos 90, 70 e 50% (1, 2 e 3 respectivamente), aquosos obtidos pela decoção (4) e infusão (5), metanólico (6) e o padrão marrubiína (M); confeccionados com a M. vulgare dos diferentes lotes de coleta (BR07/09 e BR02/10)....
89 Figura 22. Curva analítica de ácido gálico em 750 nm............................... 91 Figura 23. Distribuição granulométrica das partes aéreas secas e
moídas do lote BR07/09............................................................
93
Figura 24. Aspectos visuais da distribuição granulométrica da droga vegetal. (A) Folhas trituradas. (B) Mistura de folhas e caules após a moagem adicional em moinho de martelos...................
95 Figura 25. Esquema de otimização e desenvolvimento dos extratos da
M. vulgare..................................................................................
96 Figura 26. Superfície de respostas para o Resíduo seco das soluções
extrativas da M. vulgare por maceração...................................
98 Figura 27. Superfície de respostas para o Teor de Marrubiína das
soluções extrativas da M. vulgare obtidas por maceração.......
98 Figura 28. Superfície de respostas para o Teor de fenólicos totais
equivalentes a ácido gálico (EAG), das soluções extrativas da M. vulgare obtidas por maceração............................................
100
13
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Lotes de droga vegetal classificados pelo local e época de coleta.............................................................................................
51
Tabela 2. Sistema de cromatoplacas em camada delgada para a análise de terpenóides em extratos com as partes aéreas da M. vulgare
56
Tabela 3. Planejamento fatorial 32 para a otimização das condições extrativas do processo de maceração com álcool 70 % (V/V)......
58
Tabela 4. Diluição das soluções extrativas para a determinação do teor de fenólicos totais...............................................................................
59
Tabela 5. Efeitos da administração oral de omeprazol (30 mg/kg) e das diferentes doses do extrato metanólico das partes aéreas da M. vulgare (25, 50 e 100 mg/kg) em úlceras gástricas agudas induzidas por etanol/HCl em camundongos..................................
63 Tabela 6. Efeitos da administração oral de omeprazol (30 mg/kg) e do
diterpeno marrubiína isolado das partes aéreas da M. vulgare (25 mg/kg) em úlceras gástricas agudas induzidas por etanol/HCl em camundongos........................................................
64 Tabela 7. Efeitos da administração oral de cimetidina (100 mg/kg) e das
diferentes doses do extrato metanólico das partes aéreas da M. vulgare (25, 50 e 100 mg/kg) em úlceras gástricas agudas induzidas por AINE/betanecol em camundongos..........................
66 Tabela 8. Efeitos da administração intraduodenal de cimetidina (100
mg/kg) e das diferentes doses do extrato metanólico das partes aéreas da Marrubium vulgare (20, 50 e 100 mg/kg) nos parâmetros bioquímicos de camundongos submetidos à ligadura de piloro para avaliação da secreção ácida....................
69 Tabela 9. Efeitos da administração intraduodenal de carbenoxolona (200
mg/kg) e indometacina (100 mg/kg) e das diferentes doses do extrato metanólico das folhas da Marrubium vulgare (20, 50 e 100 mg/kg) nos parâmetros bioquímicos de camundongos submetidos à ligadura de piloro para avaliação da quantidade de muco ligada ao tecido...............................................................
70 Tabela 10. Rendimentos do material vegetal (fresco e seco) obtido nas
diferentes coletas e perda por secagem (PPS)............................
74 Tabela 11. Rendimento seco das partes vegetais da M. vulgare coletadas
em Bom Retiro/SC nas diferentes épocas....................................
75 Tabela 12. Perda por dessecação das partes aéreas secas e trituradas da
M. vulgare coletadas em Bom Retiro nas diferentes épocas........
75
Tabela 13. Distribuição granulométrica (%) das partes aéreas secas e trituradas da M. vulgare e granulometria média (Gmédia)...............
81
Tabela 14. Teor de extrativos das partes aéreas secas e trituradas da M. vulgare...........................................................................................
83
Tabela 15. Teor de fenólicos totais da M. vulgare coletada em diferentes épocas e locais..............................................................................
84
14
Tabela 16. Resultados da caracterização da droga vegetal quanto ao teor de flavonóides totais.....................................................................
86
Tabela 17. Características de pH (média ± DP (DPR%) e resíduo seco (média ± DP (DPR%) das soluções extrativas das partes aéreas da M. vulgare.................................................................................
90 Tabela 18. Teor de fenólicos totais (mg/mL) nos diferentes extratos (2,5%,
m/V) produzidos a partir das amostras vegetais da M. vulgare coletadas em Bom Retiro nas diferentes épocas..........................
92 Tabela 19. Teor de marrubiína, resíduo seco e pH das soluções extrativas
obtidas segundo o planejamento fatorial 32 para a otimização das condições extrativas do processo de maceração das partes aéreas com álcool 70 % (V/V).........................................................................
97 Tabela 20. Teor de fenólicos totais equivalentes a ácido gálico (EAG) das
soluções extrativas obtidas segundo o planejamento fatorial 32 para a otimização das condições extrativas do processo de maceração das partes aéreas com álcool 70 % (V/V)..................
100
15
LISTA DE ABREVIATURAS
ABS Absorbância
AC Padrão de ácido cafêico
AINE Anti-inflamatório não-esteroidal
AU Padrão de ácido ursólico
Padrão de beta-sitosterol
CCD Cromatografia em camada delgada
CEP Comitê de ética em pesquisa
CG Cromatografia gasosa
DM Diterpeno marrubiína
DP Desvio padrão
DPR Desvio padrão relativo
EAD Extrato aquoso por decocção
EAG Equivalente em ácido gálico
EAI Extrato aquoso por infusão
EARP Software de análise de imagens
EH50 Extrato hidroalcoólico a 50%
EH70 Extrato hidroalcoólico a 70%
EH90 Extrato hidroalcoólico a 90%
EM Extrato metanólico
EMMV Extrato metanólico de Marrubium vulgare
FID Detector de ionização de chama
i.p. Via intraperitoneal
IC Índice de cura
L Padrão de luteolina
L-NAME N-nitro-L-arginina metil éster
M Padrão de marrubiína
MeOH Metanol
mEq Miliequivalente-grama
MOL Padrão de marrubenol
Nd Não determinado
NEM N-etilmaleimida
16
NO Óxido nítrico
NOS Óxido nítrico-sintase
RS Resíduo seco
SA Solução amostra
SC Solução comparativa
SHs Grupos sulfidrilas
TF Teor de fenólicos
TM Teor de marrubiína
ULI Índice de lesão ulcerativa
V Padrão de vitexina
v.o. Via oral
17
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ........................................................................ 19
2 OBJETIVOS ........................................................................... 21
2.1 Objetivo Geral ........................................................................................ 21 2.2 Objetivos Específicos ........................................................................... 21
3 REVISÃO DE LITERATURA .................................................. 22
3.1 Marrubium vulgare L. (Lamiaceae) ...................................................... 22
3.1.1 Características botânicas e agronômicas .......................................... 22 3.1.2 Etnofarmacologia .................................................................................. 24
3.1.3 Estudos tecnológicos e mercadológicos............................................ 24 3.1.4 Estudos fitoquímicos ........................................................................... 25
3.1.5 Estudos farmacológicos....................................................................... 27 3.2 Fisiopatologia da úlcera, secreção gástrica e terapia da úlcera....... 28 3.3 Úlcera ..................................................................................................... 31 3.3.1 Epidemiologia e conceito geral ........................................................... 31
3.3.2 Agentes agressores da mucosa.......................................................... 32 3.3.3 Agentes de defesa da mucosa ............................................................. 33
3.3.4 Tratamento de desordens gástricas ................................................... 35 3.4 Desenvolvimento de fitoterápicos........................................................ 36
4 MATERIAL E MÉTODOS ....................................................... 43
4.1 Matérias-primas de origem vegetal ..................................................... 43 4.2 Reagentes, soluções e outras matérias-primas ................................. 43 4.3 Equipamentos e outros materiais ....................................................... 44 4.4 Atividade Farmacológica ...................................................................... 45
4.4.1 Animais e ensaios farmacológicos ..................................................... 45 4.4.2 Avaliação da atividade gastroprotetora............................................... 46
4.4.2.1 Modelo de úlcera aguda induzida por etanol/HCl.................................... 46 4.4.2.2 Modelo de úlcera aguda induzida por antiinflamatório não-
esteroidalassociada à estimulação parassimpaticomimética...................
47
4.4.3. Avaliação da atividade sobre a secreção gástrica ............................ 48
4.4.3.1 Modelo da avaliação da secreção gástrica (ligadura de piloro)............... 48 4.4.3.2 Modelo de avaliação da secreção de muco em mucosa gátrica ............ 49
4.4.4 Mecanismos de ação antiúlcera .......................................................... 50 4.4.4.1 Participação do óxido nítrico endógeno envolvido na gastroproteção..... 50
4.4.4.2 Participação dos grupamentos sulfidrila endógenos envolvidos na gastroproteção.........................................................................................
50
4.5 Obtenção, tratamento e caracterização da droga vegetal ................ 51 4.5.1 Determinação da perda por dessecação ............................................ 52
4.5.2 Análise granulométrica ........................................................................ 52 4.5.3 Determinação do teor de fenólicos totais equivalentes a ácido
gálico (EAG) na droga vegetal .............................................................
53 4.5.4 Determinação do teor de flavonóides totais na droga vegetal ......... 54 4.6 Obtenção e caracterização preliminar das soluções extrativas ....... 55 4.6.1 Determinação do pH ............................................................................. 56
4.6.2 Determinação do resíduo seco ............................................................ 56 4.6.3 Análise cromatográfica em camada delgada (CCD) .......................... 56
4.6.4 Determinação do teor de fenólicos totais nas soluções extrativas.. 57
18
4.6.5 Análise cromatográfica por CG ........................................................... 57 4.7 Otimização das condições extrativas ................................................. 58 4.7.1 Caracterização das soluções extrativas ............................................. 59
4.7.1.1 Determinação do pH................................................................................ 59 4.7.1.2 Determinação do resíduo seco................................................................ 59
4.7.1.3 Determinação do teor de fenólicos totais................................................. 59 4.7.1.4 Determinação do teor de marrubiína....................................................... 59
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................. 61
5.1 Avaliação da atividade antiúlcera do extrato metanólico e da marrubiína...............................................................................................
61
5.1.1 Efeito do extrato metanólico da M. vulgare e do diterpeno marrubiina em úlceras agudas induzidas por etanol/HCl..................
61
5.1.2 Efeito do extrato metanólico da M. vulgare em úlceras agudas induzidas por AINE/parassimpaticomimético.....................................
65
5.1.3 Avaliação da atividade sobre a secreção gástrica............................. 67 5.1.3.1 Ligadura de piloro.................................................................................... 68
5.1.3.2 Secreção de muco em mucosa gástrica.................................................. 69 5.1.4 Mecanismo de ação antiúlcera in vivo................................................. 71
5.1.4.1 Papel do óxido nítrico e do extrato metanólico da Marrubium vulgare em úlceras agudas induzidas por etanol/HCl...........................................
71
5.2 Obtenção, tratamento e caracterização da droga vegetal ................ 74 5.2.1 Rendimento do material vegetal .......................................................... 74
5.2.2 Perda por dessecação........................................................................... 75 5.2.3 Caracterização química por cromatografia em camada delgada ..... 76
5.2.4 Análise cromatográfica por CG ........................................................... 78 5.2.5 Análise granulométrica ........................................................................ 81
5.2.6 Teor de extrativos solúveis em água .................................................. 83 5.2.7 Teor de fenólicos totais equivalentes a ácido gálico(EAG)............... 83
5.2.8 Teor de flavonóides totais na droga vegetal ...................................... 85 5.3 Desenvolvimento das soluções extrativas ......................................... 87
5.3.1 Caracterização química por cromatografia em camada delgada dos extratos metanólicos, hidroalcoólicos e aquosos......................
88
5.3.2 Determinação pH e resíduo seco nos extratos metanólicos, hidroalcoólicos e aquosos ...................................................................
89
5.3.3 Determinação de fenólicos totais nos extratos metanólicos, hidroalcoólicos e aquosos....................................................................
91
5.4 Otimização do Processo Extrativo ..................................................... 92
5 CONCLUSÕES ....................................................................... 102
REFERÊNCIAS ......................................................................................... 104
ANEXO A ................................................................................................... 118
19
1 INTRODUÇÃO
As plantas medicinais são importantes fontes de compostos bioativos,
constituem-se em importante matéria-prima para a produção de
fitomedicamentos. Dentre os fitomedicamentos, os fitoterápicos, preparações
contendo extratos padornizados de uma ou mais planta, tem sua utilização em
contínua expansão. Esta acelerada valorização das plantas acaba por gerar o
aumento na busca de comprovação das propriedades farmacêuticas,
qualidade, segurança e eficácia dos fitoterápicos, reforçando a importância de
estudos científicos que permitam o seu controle de qualidade e de suas
matérias-primas (CALIXTO, 2001; SIMÕES; SCHENKEL, 2002; MELLO et al.,
2004; ARNOUS; BEINNER; SANTOS, 2005; RIBEIRO et al., 2005; SOUZA;
LIONZO; PETROVICK, 2006).
Dentre as plantas medicinais, a Marrubium vulgare L. (Lamiaceae),
popularmente conhecida por marroio, marrubio, maromba, erva-virgem, bom-
homem, marroio-comum ou erva de sapo é uma planta melífera, de origem
européia, adaptada ao planalto catarinense do Brasil, muito usada na medicina
popular na forma de chás para o tratamento de diversas doenças, incluindo
inflamações, desordens gastrointestinais e doenças respiratórias.
A partir do uso na medicina popular, uma série de propriedades desta
planta vem sendo confirmada em estudos laboratoriais, que tiveram início pelos
pesquisadores no Núcleo de Investigações Químicas e Farmacêuticas desta
universidade (NIQFAR/UNIVALI), através do estudo das propriedades
analgésica, antiespasmódica, hipoglicemiante e hipolipidêmica (SCHLEMPER
et al., 1996; DE SOUZA et al., 1998; NOVAES et al., 2001; HERRERA-
ARELLANO et al., 2004; MEYRE-SILVA et al., 2005); atividade vasorelaxante e
anti-hipertensiva (EL-BARDAI et al., 2001, 2003a, b), bem como anti-
inflamatória (MOLINARI et al., 1997) e antioxidante (SCHINELLA et al., 2002).
O guia terapêutico de plantas medicinais alemães, o Comission E
Monographs, cita a M. vulgare como colerético, utilizado para a falta de apetite
e dispepsia (azia). Há também na literatura relatos sobre o uso popular em
tribos do México, das sementes da M. vulgare para dores de estômago e
parasitoses intestinais (MORENO-SALAZAR; ROBLES-ZEPEDA; JOHNSON;
2008).
20
Segundo Toso et al. (2007), o extrato hidroalcoólico das partes aéreas
da M. vulgare demonstrou atividade gastroprotetora e efeito inibitório da
motilidade gastrointestinal, sugerindo que o mecanismo de ação do extrato
esteja ligado a ação espasmolítica. No entanto, apesar destes achados,
existem poucos estudos bem desenhados nesta área, e há pouca informação
disponível sobre a eficácia da M. vulgare para este uso.
Junto ao amplo potencial terapêutico e a incipiente aceitabilidade no
mercado, vem necessidade de estabelecer condições para o controle de
qualidade e desenvolvimento de fitoterápicos em geral. Dada à importância
clínica e a ausência de medicamentos mais eficazes e com menos efeitos
indesejáveis, torna-se necessário a procura de novas terapias contra os
distúrbios gástricos, bem como a compreensão de todos os processos
envolvidos na fisiopatologia das úlceras e gastrites (LA VECCHIA; TAVANI,
2002; RAGHUNATH et al., 2005; SCHMEDA-HIRSCHAMANN; YESILADA,
2005).
Diante do exposto, este trabalho visa avaliar a atividade antiúlcera das
partes aéreas da M. vulgare, planta que apresenta relatos de efeitos curativos
para dispepsias e para o alívio de distúrbios gastrointestinais, através dos
modelos de úlceras agudas induzidas por etanol/HCl, AINE/simpaticomimético,
bem como a atividade sobre a secreção gástrica (ligadura de piloro,
doseamento de muco).
Tendo-se em vista a procura por novas terapias para os distúrbios
gástricos que sejam totalmente eficazes e estejam associados a menos efeitos
colaterais, buscou-se também, investigar e otimizar a preparação de soluções
extrativas da M. vulgare, que possam instigar estudos posteriores para a
produção futura de um fitoterápico. Buscou-se caracterizar a droga vegetal e
preparações extrativas, a fim de se estabelecer parâmetros de qualidade ou
conformidade ligados às diversas etapas do desenvolvimento de fitoterápicos
para que estes conhecimentos possam ser utilizados para a industrialização
nacional de medicamentos a base desta planta.
21
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivos Gerais
1. Avaliar o potencial gastroprotetor do extrato metanólico das partes
aéreas da Marrubium vulgare, e do diterpeno isolado, marrubiína;
2. Contribuir para o desenvolvimento tecnológico de fitoterápicos a
partir das partes aéreas da Marrubium vulgare.
2.2 Objetivos Específicos
1. Caracterizar a droga vegetal, quanto aos parâmetros físicos
(perda por secagem, rendimento, granulometria) e químicos (cromatografia em
camada delgada, teor de flavonóides e fenólicos totais);
2. Avaliar a atividade gastroprotetora e a atividade sobre a secreção
gástrica do extrato metanólico e da marrubiína, obtidos das partes aéreas da
Marrubium vulgare;
3. Investigar os possíveis mecanismos de ação antiúlcera, via
participação do sistema óxido nítrico e grupamentos sulfidrila;
4. Avaliar o efeito do método de extração (maceração, infusão e
decocção) e líquido extrator em diferentes graduações alcoólicas (90, 70 e
50%) sobre a extração de potenciais marcadores químicos;
5. Otimizar as condições extrativas do método selecionado, através
de planejamento fatorial, variando o tempo de extração, a relação
planta:solvente e a granulometria padronizada, visando o maior teor de resíduo
seco e marcadores químicos.
22
3 REVISÃO DA LITERARURA
3.1 Marrubium vulgare L. (Lamiaceae)
3.1.1 Características botânicas e agronômicas
Apesar de não ser uma planta muito comum, a M. vulgare L.
(Lamiaceae) (Fig. 1) pode ser encontrada nos campos não cultivados e nas
margens das estradas, preferindo zonas de calor mais intenso e clima seco.
Possui origem européia, entretanto pode ser encontrada nas regiões altas da
Armênia, Rússia, Afeganistão e Azerbaidjão. Foi introduzida no Brasil pelos
imigrantes europeus e apresentou melhor adaptação à região sul,
principalmente no planalto catarinense (DE SOUZA et al., 1998).
M. vulgare é uma planta herbácea perene, da família das Labiadas, cuja
altura não ultrapassa os 50 cm. Possui caule lenhoso quadrangular, ereto e
robusto, densamente albo-lanoso. Suas folhas são oval-arredondadas de 4,5
cm de comprimento, com base estreita e ápice obtuso, pecíolo de 1-2 cm de
comprimento e flores pseudo verticilos de 20 a 50 flores de cor clara (Fig. 2),
localizados nas axilas das folhas superiores. As substâncias encontradas são
amargo-adstringentes, tônicas e sudoríferas, com ação sobre a membrana
pituitária e os pulmões (CORRÊA, 1984; CIRILO, 1993; DE SOUZA et al.,
1998).
Possui um cálice tubuloso e estriado, com um número variável de dentes
(5-10), terminados em ponta. Toda a planta tem cor esbranquiçada por sua
abundante velosidade, e desprende um odor característico (QUER, 1992).
23
Figura 1. Fotografia obtida das folhas da Marrubium vulgare L.
Figura 2. Fotografia das partes aéreas (A) e das flores (B) da Marrubium vulgare L. (Fonte: CHARTERS, 2003; RIGNANESE, 2007).
A B
24
3.1.2 Etnofarmacologia
No Brasil, a M. vulgare é uma planta conhecida popularmente pelos
seguintes nomes: marroio, marroio-branco, marrubio, maromba, erva-virgem,
bom-homem, marroio-comum ou erva de sapo. Consiste em uma planta
melífera que é usada pela população na forma de chás e suas raízes são
indicadas como diuréticas e nas doenças hepáticas e renais (BALMÉ, 1982;
CORRÊA, 1984; CIRILO, 1993).
Esta planta medicinal é também usada para o tratamento de diversas
doenças, incluindo inflamações, desordens gastrointestinais e doenças
respiratórias (BALMÉ, 1982; NEWAL; ANDERSON; PHILIPSON, 1996),
neurosedativo e antiinflamatório (MASCOLO et al., 1987; SAHPAZ et al., 2002).
Segundo Wichtl e Anton (1999), as partes floridas aéreas e os extratos
aquosos e hidroalcoólicos são usados na medicina para o tratamento de tosses
e como colérico em transtornos digestivos e biliares (SAHPAZEVSER et al.,
2002).
A M. vulgare é também muito utilizada no meio rural como fonte
terapêutica para uso veterinário (CORRÊA, 1984; KORBES, 1989). Há
referências do seu uso para tratamento da febre tifóide, com a ação antitérmica
muito notável, caracterizada pela baixa na temperatura, melhora rápida no
estado geral e diminuição real da duração da enfermidade (QUER, 1992).
Já foi descrito que a M. vulgare pode alterar o ciclo menstrual e foi
verificada a atividade uterogênica e o efeito abortivo desta planta em animais
de experimentação (VANACLOCHA; FOLCARO, 2003).
3.1.3 Estudos tecnológicos e mercadológicos
Quanto a M. vulgare, em países onde seu uso é mais descrito, é
possível encontrar medicamentos a base desta planta, ou com a associação de
outras plantas medicinais. É o caso de países como a Espanha (Marroio
Branco® - Arkocápsulas), Venezuela (Marrubina® - Vitaplant) e Portugal
(Sambukid xarope infantil – Farmodiética®) (Fig. 3). Nestes casos, os usos mais
populares destes medicamentos são para uso em casos de tosse e bronquite.
No México (Control de Azúcar® – Herbs of México) (Fig. 3), entretanto, é
possível encontrar um medicamento a base da M. vulgare para controle de
diabetes. (HERBS OF MÉXICO, 2009).
25
O FDA (Food and Drug Administration) proibiu o uso dos comprimidos
da M. vulgare (popularmente horehound em inglês), para tosse em 1989 por
não haver evidências suficientes que comprovassem sua eficácia. Entretanto, a
M. vulgare é comumente usada na Europa e pode ser encontrados para tosse,
preparados por indústrias Européias e que são vendidos nos Estados Unidos,
como por exemplo, Ricola®.
Figura 3: Medicamentos a base da Marrubium vulgare comercializados em
diferentes países. (A) México (Herbs of Mexico®) (B) Espanha (Marroio Branco® - Arkocápsulas) (C) Inglaterra (Cough Elixir® – Welleda).
3.1.4 Estudos fitoquímicos
Estudos antigos indicaram nesta planta a presença de alcalóides,
esteróides, lactonas, terpenos, taninos, açúcares e vitamina C (POURRAT; LE
MEM, 1953; NICHOLAS, 19648; HENDERSON; McCRINDLE, 1969).
Portanto, já foram isolados diversos compostos, com grande
predominância de uma lactona diterpênica amarga de núcleo labdonofurânico,
a marrubiína, (Fig. 3B), um esterol da série do estigmasterol e um
sesquiterpeno (NICHOLAS, 1964; ABBONDANZA; BRECCIA; CRESPI, 1964;
VANACLOCHA; FOLCARO, 2003). Outros diterpenos presentes são:
marrubiol, peregrinol, vulgarol, (VANACLOCHA; FOLCARO, 2003).
Aliev e Aliev, em 1956, demonstraram os efeitos dos alcalóides
presentes nesta planta ao provocar a inibição das contrações provocadas em
coração isolado de sapos. Anos mais tarde, Paudler e Wagner (1963) isolaram
e caracterizaram os principais alcalóides turicina, betocina e estaquidrina.
A análise química desta planta revelou ainda, a presença de compostos
fenólicos (DE VICENZI; MAIALETTI, 1995), enquanto o extrato da cultura de
A C B
26
calos revelou a presença de fitosteróis (KNOSS; WILHELM; GLONBITZA
1993).
Estudos demonstraram a atividade biológica anti-esquistossomal dos
óleos voláteis da M. vulgare. (SALEH; GLOMBITZA, 1989; VANACLOCHA;
FOLCARO, 2003).
Além disto, verificou-se, nesta e em outras plantas da família das
Labiadas, a presença do ácido ursólico, composto este reconhecido como
sendo capaz de inibir a tumorigênese e inflamação induzida quimicamente na
pele de camundongos (BRIESKORN et al., 1952; HUANG et al., 1994).
Investigações fitoquímicas com a M. vulgare levaram à caracterização
de uma série de flavonóides, incluindo luteolina, apigenina, 7-glucosídeos, 7-
lactatos, vitexina (NAWWAR et al., 1989).
El Bardai et al. (2003a) identificaram e caracterizaram o marrubenol (1,4-
naptalenediol, 1-[2-(3-furanil)etil]decahidro-5-(hidroximetil)-2,5,8 atrimetil, [1R-
(1a, 2a, 4b, 4a, 5b, 8ab)], um diterpenóide sintetizado a partir da marrubiína e o
primeiro a ser isolado da Marrubium vulgare por Fulke, Henderson e McCrindle
(1968).
As partes aéreas da M. vulgare contém 2% da lactona diterpênica, a
marrubiína, que se encontra na forma de pré-marrubiína (Fig. 3A), assim como
alcoóis diterpênicos: marrubiol, vulgarol e peregrinol (BUSBY et al., 1983).
A otimização na obtenção do diterpeno marrubiína tem sido relatada
com a utilização de quitina, um biopolímero natural que é capaz de promover a
obtenção da marrubiína com alto rendimento de maneira eficaz e de baixo
custo (RODRIGUES et al., 1998).
A B
Figura 4. Estrutura química da pré-marrubiína (A); e do seu derivado,
marrubiína (B) (KNOSS; REUTER; ZAPP, 1997).
Considerando que existem muitos terpenos com atividade
27
gastroprotetora (KLOPELL et al., 2007; ANDRADE et al., 2008; ANDRADE et
al., 2006), foi avaliado o potencial antiúlcera do extrato metanólico, bem como
da marrubiína, obtidos da M. vulgare, em diferentes modelos experimentais de
úlcera.
3.1.5 Estudos farmacológicos
Além de exibir significante atividade analgésica, pelo antagonismo da
dor aguda induzida quimicamente, o extrato hidroalcoólico de partes aéreas e
raízes da M. vulgare exerceu efeito antiespasmódico em músculo liso in vitro
com a inibição de alguns neurotransmissores como a acetilcolina, bradicinina,
prostaglandina E e ocitocina (SCHLEMPER et al., 1996). Em estudos
preliminares, o extrato hidroalcoólico da M. vulgare também apresentou a
atividade broncodilatadora não específica in vitro (MOLINARI et al., 1997).
O extrato hidroalcoólico das partes aéreas demonstrou efeito inibitório
sobre o extravasamento de plasma induzido por agonistas inflamatórios em
orelhas de camundongos. O efeito apresentado parece estar ligado a
interferência sobre o sistema histaminérgico e sobre a cascata de cininas
(CAVALLI;, MOLINARI, 1997).
O decocto da M. vulgare quando administrado oralmente, apresentou
uma diminuição de glicemia semelhante a apresentada pela tolbutamida, uma
sulfoniluréia utilizada para o tratamento do diabetes (RAMOS et al., 1992).
Além disso, o extrato hidroalcoólico do M. vulgare, quando administrado
oralmente em ratos diabéticos na dose de 300 mgkg, diminui a hiperglicemia
tornando os animais normoglicêmicos (NOVAES; ROSSI, 1998). Arellano et al.
(2004) demonstraram que esta planta é capaz de reduzir os níveis de glicose
sanguíneo e lipídio em pacientes portadores do diabetes tipo 2.
Outros efeitos medicinais reportados para a M. vulgare são: antioxidante
(VANDERJAGT et al., 2002), hipotensivo (EL BARDAI et al., 2001) e
propriedades inseticidas (PAVELA, 2004).
Meyre-Silva et al. (2005), demonstraram que alguns derivados presentes
na M. vulgare, ácido marrubinico e marrubiína, apresentam efeito analgésico, o
que poderia contribuir para o uso como modelo para obtenção de novos e mais
efetivos agentes analgésicos.
28
O resultado do estudo de Stulzer et al. (2006), demonstrou pela primeira
vez que a marrubiína exibe significante inibição na reação microvascular
induzida por agonistas pró-inflamatórios, além de significante propriedades
inibitórias no edema alérgico. Os resultados sugeriram ainda, que a marrubiína
interfere com alguns mecanismos comuns de agentes flogísticos usados.
Verificou-se que a marrubiína apresenta propriedade antiinflamatória não
seletiva.
Outro estudo revelou ainda que a M. vulgare possui atividade
antimicrobiana contra gram positivos, especialmente Staphylococcus aureus
(AL-BARKI; AFIFI, 2007).
Recentemente foi publicada por Meyre-Silva e Cechinel (2010), uma
ampla revisão abordando as propriedades para as espécies do gênero
Marrubium.
Segundo Toso et al. (2007), o extrato hidroalcoólico das partes aéreas
apresentou atividade gastroprotetora, utilizando-se o extrato na concentração
de 2 g/mL, por via oral. Além disso, A Commission E guia terapêutico alemão
com monografias de ervas medicinais, aprovou o uso da M. vulgare para falta
de apetite, dispepsia e agente colérico (WHITE HOREHOUND, 2008).
Com base nestes optou-se pela avaliação da atividade farmacológica do
extrato metanólico feito a partir das partes aéreas da M. vulgare, coletada em
fevereiro de 2006 (verão) na cidade de Bom Retiro/SC.
3.2 Fisiopatologia da úlcera
A humanidade convive com úlceras pépticas desde tempos mais remotos.
A primeira descrição de úlceras pépticas data do século IV a.C., inscrita nos
pilares do templo de Esculápido, em Epidaurus (Grécia), descrevendo de forma
mitológica a origem da doença. Outro fato histórico foi a morte de Marco
Aurélio, ilustre imperador romano, cujo médico, Galeano, concluiu ser por
perfuração de úlcera péptica. A terapia mais antiga contra a úlcera gástrica
data do século IX, cuja uma mistura de solos ricos em sais e leite era
responsável pela neutralização do ácido (BRUNTON; LAZO;, PARKER, 2006).
As úlceras gástricas e duodenais afetam pessoas em todo o mundo. O
estilo de vida moderno (estresse, fumo, uso de drogas, má alimentação),
29
colabora para o aumento da incidência de úlceras pépticas (BELAICHE et al.,
2002; BRUNTON;, LAZO;, PARKER, 2006). Cerca de 10% da população dos
países industrializados é afetada, sendo que só no continente americano mais
de dois milhões de adultos sofrem deste mal em alguma fase da vida. Este
distúrbio afeta aproximadamente de 11 a 20% dos homens e 8 a 11% das
mulheres (FERREIRA, 2005). As úlceras gástricas costumam ser
freqüentemente uma doença crônica, a qual pode persistir por até 20 anos,
caracterizada por episódios repetidos de cura e re-exacerbação (NAIK et al.,
2007).
O estômago é um reservatório em forma de “J”, no qual o alimento é
embebido pelo suco gástrico, que contém enzimas e ácido clorídrico. Este suco
gástrico desdobra os alimentos em substâncias químicas mais simples, que
podem ser absorvidas pela mucosa intestinal (KUTCHAI, 1996; FLOCH et al.,
2007).
O estômago é um reservatório composto por uma túnica mucosa, de cor
cizento-avermelhado, composta de uma única camada superficial de células
epiteliais que começa na região da cárdia e se estende até a região do piloro. A
capacidade do estômago é de aproximadamente 1200 mililitros (FLOCH et al.,
2007). É um órgão revestido por várias camadas de músculo liso e que possui
um revestimento de muco. Anatomicamente este órgão é dividido em três
regiões topográficas (fundo, corpo e antro) (Fig. 5) e duas áreas funcionais
(glândulas parietais e piloricas) (CARVALHO, 2006; SCHUBERT; PEURA,
2008).
O corpo principal do estômago apresenta várias pregas longitudinais. A
mucosa gástrica apresenta glândulas secretoras (células parietais). Estas
glândulas estão localizadas no fundo e no corpo e são as responsáveis pela
secreção do muco e dos íons HCO3-, que são os responsáveis pela proteção
do lúmen estomacal contra a ação ácida promovida pelo estímulo de agonistas
endógenos sobre as células parietais (CARVALHO, 2006).
30
Figura 5. Secção longitudinal, face ventral do estômago. (Fonte: Enciclopédia multimídia do corpo humano, 2000)
Segundo Crawford (2000), o estômago está dividido em quatro regiões
anatômicas:
a) Cárdia: representa a região próxima à junção esofagogástrica;
b) Fundo: é a região bulbosa subdiafragmática do estômago,
localizado à esquerda do esôfago, em direção cefálica à entrada do esôfago
para o estômago;
c) Corpo: é a maior região anatômica interposta entre o fundo e o
antro mais caudal. O início do antro é demarcado por uma linha vertical traçada
através da incisura angular da pequena curvatura do estômago;
d) Antro ou porção pilórica: se estende desde o corpo do estômago
até o esfíncter pilórico.
Segundo Carvalho (2006), a liberação do ácido na luz do estômago
pelas células parietais é desencadeada por três diferentes vias:
a) Parácrina: estimula a secreção de histamina, que e liberada por
células enterocromafins (ECL), semelhantes aos mastócitos existentes no
estômago e dispostas em intimo contato com as células parietais, atuando em
31
receptores H2, promove o aumento da secreção ácida gástrica por elevar os
níveis intracelulares de AMPc;
b) Endócrina: estimula a liberação de gastrina a qual incita
receptores da célula parietal, provocando aumento dos níveis intracelulares de
Ca2+, levando desta forma a uma excreção aumentada de ácido gástrico;
c) Neuronal: estimula a liberação de acetilcolina a qual atua em
receptores muscarínicos, estimulando a secreção ácida por elevar os níveis
intracelulares de Ca2+. Esta excitabilidade está associada a estímulos olfativos,
visão, paladar e mastigação e por neurônios locais da parede gástrica os quais
são estimulados pela distenção das paredes do estômago;
O estômago a fim de manter sua função primordial de efetuar a digestão,
apresenta barreiras que evitam a lesão das células pelo ácido gástrico, sendo a
camada de muco a principal barreira (TULASSAY; HERSZENYI, 2010).
3.3 Úlcera
3.3.1 Epidemiologia e conceito geral
O surgimento de úlceras pépticas e desordens gástricas é um processo
que não é totalmente compreendido. Acredita-se que quando este sistema de
gastroproteção se torna deficiente, a mucosa e o epitélio ficam expostos aos
fatores agressivos (secreção do suco gástrico), que geram lesões, inflamação e
necrose. Ocorre um desequíbrio entre os fatores agressivos e os mecanismos
protetores da mucosa (BRZOZOWSKI, 2003; TULASSAY;, HERSZE’NYI,
2010).
Segundo o National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney
Diseases (2004), a úlcera péptica é definida como uma ferida no revestimento
do estômago ou do duodeno.
Segundo Toledo Dias et al. (2009), a úlcera gástrica corresponde a uma
perda circunscrita de tecido da mucosa, ocorrendo nas regiões do trato
digestivo que entram em contato com o suco gástrico secretado no estômago.
Esta lesão, pode se estender da camada mucosa até a camada
muscular, porém, geralmente são lesões crônicas e solitárias. As desordens
gástricas também envolvem dispepsias e gastrites, que podem ser tanto
32
agudas quanto crônicas. A dispepsia é um grupo de sintomas do trato
digestório, geralmente associado a causas orgânicas, mas em geral é
caracterizada pelo aumento da secreção ácida. Já a gastrite é caracterizada
como a inflamação do revestimento do estômago, podendo ser aguda ou
crônica, podendo também evoluir para um quadro ulcerativo (LIPOF;,
SHAPIRO;, KOZOL, 2006; MAHADEVA; GOH, 2006).
Quando a mucosa perde a capacidade de proteger-se através das
secreções de bicarbonato e muco, ocorrem lesões, que são desencadeadas
devido a um desequilíbrio entre os agentes ofensivos (secreção de ácido e
pepsina) e defensivos (secreção de bicarbonato, muco e produção de
prostaglandinas) acarretando no surgimento de úlceras (ANDRADE et al.,
2006).
3.3.2 Agentes agressores da mucosa
A úlcera gástrica pode ser provocada, por diversos fatores, muitos estão
relacionados com maus hábitos alimentares, estresse, tabagismo, uso abusivo
de AINEs e bebidas alcoólicas (BARROS et al., 2008; KLEIN-JR et al., 2010).
As desordens gástricas, gastrites e úlceras podem estar associadas a
fatores endógenos, tais como predisposição genética, ácido, pepsina, secreção
biliar, e fatores endógenos, relacionados com as condições de vida, tais como
estresse, fumos, álcool, uso de drogas e medicamentos, uso de alimentos
nocivos ou infecção por Helicobacter pylori (HIRSCHOWITZ et al., 1995;
WOLFE; SANCHS, 2000; BRUNTON; LAZO; PARKER, 2006).
A mucosa gástrica é continuamente exposta a agentes potencialmente
irritantes, tais como ácidos, pepsina, ingredientes alimentares, bactérias e
drogas. Estes implicam na patogênese da úlcera, incluindo aumento da
secreção gástrica, diminuição do fluxo sangüíneo gástrica, supressão de
produção de prostaglandinas endógenas, inibição da proliferação de células da
mucosa e alteração da motilidade gástrica (KONTUREK et al., 1998;
KWIECIÉN; BRZOZOWSKI; KONTUREK, 2002; TULASSAY; HERSZE’NYI,
2010).
33
A seguir estão descritos os principais agentes agressores:
Etanol: É considerado um dos agentes que induz mais intensamente a
úlcera gástrica, ele promove sérios distúrbios na mucosa gástrica como,
isquemia e aparecimento de radicais livres, degranulação de mastócitos,
inibição da produção de prostaglandinas e diminuição na produção do muco
gástrico (HIRUMA-LIMA et al., 2009).
AINEs: O uso abusivo de AINEs é um dos maiores causadores de
úlceras, estes medicamentos inibem a produção de prostaglandinas, com
consequente aumento na liberação de ácido gástrico e diminuição na produção
do muco citoprotetor, acarretando assim no surgimento de lesões (HIRUMA-
LIMA et al., 2009).
Estresse: As úlceras provocadas por estresse são ocasionadas por um
aumento na peroxidação lipídica, a principal consequência deste aumento, é a
formação de espécies reativas de oxigênio, levando assim a formação de
lesões no lúmen gástrico (RODRIGUES et al., 2008).
Infecção por Helicobacter pylori: É fato conhecido que a úlcera pode ser
ocasionada por uma elevação na liberação de ácido clorídrico e pepsina,
porém ocorrem casos em que o paciente apresenta úlcera sem ter esta
liberação aumentada de fatores ofensivos. Nestes casos, o provável agente
etiológico é o H. pylori, uma bactéria gram-negativa, que é considerada o
agente de infecção crônica mais comum em seres humanos, tendo como
habitat específico a mucosa gástrica e em função disto, acredita-se que
contribua para a destruição das células gástricas (SIQUEIRA et al., 2007;
FALCÃO et al., 2008). A bactéria é o principal agente etiológico da úlcera
péptica em humanos, apresenta uma alta taxa de prevalência a nível mundial,
em países desenvolvidos chega a 40% e em países em desenvolvimento a
taxa é maior de 80% (SOUZA et al., 2006).
3.3.3 Agentes de defesa da mucosa
Os mecanismos de defesa da mucosa gástrica permitem que esta
mucosa suporte a exposição frequente de agentes agressores. Os mecanismos
de defesa podem agir localmente bem como a partir de mecanismos neuro-
hormonais. A defesa da mucosa gástrica é um processo dinâmico.
34
A primeira linha de defesa da mucosa gástrica constitui-se na barreira de
muco e bicarbonato, sendo esta a única barreira entre o epitélio e a luz. Esta
barreira é composta por um gel de muco, bicarbonato e fosfolipídios
surfactantes, possuindo característica elástica, viscosa e aderente
(ALQASOUMI et al., 2009).
O muco é secretado por células secretoras encontradas entre as células
superficiais, por toda a mucosa gástrica. No muco estão presentes íons
bicarbonato, que geram um gradiente de pH 6-7 na mucosa gástrica,
protegendo-a do pH 1-2 presente na luz estomacal, formando uma camada
inerte, como se fosse um gel, protegendo a mucosa do suco gástrico. Acredita-
se que os distúrbios nas funções secretórias descritas acima estejam
envolvidos na patologia da úlcera. As células parietais são estimuladas pela
histamina que provém de mastócitos (ou células semelhantes), e esta, atua em
receptores H2, ocorrendo um aumento da ação da gastrina e da acetilcolina
(TULASSAY; HERSZE’NYI, 2010).
Uma perfusão sanguínea adequada evita danos epiteliais às camadas
mais profundas da mucosa. A principal função da micro-circulação da mucosa
é abastecer as células com nutrientes e com oxigênio. O fluxo sanguíneo
protege a mucosa gástrica por fornecer oxigênio, bicarbonato e nutrientes,
além de remover o dióxido de carbono, íons hidrogênio e difundir toxinas do
lúmen gástrico (BECKMAN; KOPPENOL, 1996; REPETTO; LLESUY, 2002).
Quando a mucosa gástrica é exposta a agentes irritantes, as células
endoteliais produzem potentes vasodilatadores, como óxido nítrico (NO) e
prostaciclina I2 (PGI2), que agem protegendo a mucosa de lesões causadas
por substâncias vasoconstritoras como leucotrienos, tromboxanos e endotelina.
O NO age ainda inibindo a secreção de ácido gástrico pelas células parietais
(WALLACE; MILLER, 2000).
Além do muco e do fluxo sanguíneo, o ácido gástrico também constitui
uma defesa da mucosa, pois reduz a possibilidade de colonização por
bactérias. O epitélio, que se encontra logo após a camada de muco é uma
barreira protetora capaz de se reparar rapidamente, possuindo células de
rápida proliferação. Existem ainda a linha de defesa do sistema imune, como
mastócitos, macrófagos e imunoglobulinas que reconhecem a entrada de
35
invasores na mucosa e produzem uma resposta inflamatória (WALLACE;
GRANGER, 1996; WALLACE, 2001).
Outro fator de proteção da mucosa é a renovação celular. O epitélio
gástrico é reconstruído a cada 2-4 dias. Esta contínua renovação das células
progenitoras da mucosa, é uma característica muito importante, que colabora
na manutenção da integridade estrutural da mucosa, acarretando em maior
resistência na formação de lesões (TULASSAY; HERSZENYI, 2010).
As prostaglandinas também estão envolvidas na proteção da mucosa.
Elas facilitam e estimulam a maioria dos mecanismos de gastroproteção da
mucosa. Responsável pela geração contínua de PGI2 e principalmente de
PGE2, que são essenciais na manutenção da integridade gástrica e na
proteção contra agentes necrotizantes e ulcerosos. As PGs inibem a liberação
de ácido gástrico, aumentam o fluxo sanguíneo da mucosa, estimulam a
produção de muco e bicarbonato, aceleram o reparo e a cicatrização tecidual
(BRZOZOWSKI, 2003; TULASSAY; HERSZENYI, 2010).
3.3.4 Tratamento de desordens gástricas
O tratamento das desordens gástricas, gastrites e úlceras, por muitos
anos, foram baseados na supressão da secreção ácida. Porém, pesquisas
recentes revelam que os fatores envolvidos na defesa participam do controle
da acidez, sendo que atualmente há um grande interesse pelos mecanismos
reguladores e cicatrizantes envolvidos na resolução do quadro ulcerativo
(DAJANI; KLAMUT, 2000; WALLACE, 2005).
A terapia para cura de úlceras tem por objetivo a redução da dor,
promover a cicatrização e prevenir prováveis úlceras reincidentes. A terapia
farmacológica baseia-se em reestabelecer o equilíbrio entre os fatores
ofensivos e defensivos, ou seja, proteger a mucosa da ação do suco gástrico
(AIHARA et al., 2003)
Durante muitos séculos o tratamento das úlceras gástricas era realizado,
utilizando-se antiácidos para neutralizar a secreção gástrica, restrições
alimentares eram utilizadas e os procedimentos cirúrgicos eram corriqueiros
(YUHONG et al., 2006).
36
Assim, fármacos utilizados no tratamento da úlcera gástrica agem por
um dos seguintes mecanismos:
Drogas que inibem ou neutralizam a secreção de ácido gástrico
(terapia anti-secretória). Nesta classe estão agrupados:
a) antagonistas de receptores H2 da histamina (cimetidina, ranitidina):
agem diretamente sobre as células parietais provocando uma
diminuição na liberação de secreção gástrica (YUHONG et al., 2006)
b) inibidores da bomba de prótons, (H+-K+)-ATPase (omeprazol,
pantoprazol): atua inibindo a secreção de ácido gástrico através da
inativação da bomba, a partir da formação de ligações dissulfeto entre
as moléculas reagentes do omeprazol com a estrutura da bomba de
prótons;
c) antiácidos que neutralizam o ácido gástrico (hidróxido de magnésio,
trissilicato de magnésio, bicarbonato de sódio).
Drogas que protegem a mucosa (quelato de bismuto, sucralfato)
(RANG; DALE; RITTER, 2001; BRUNTON; LAZO; PARKER, 2006).
Atualmente, recomenda-se a associação de uma droga que atue inibindo
a secreção ácido e/ou protegendo a mucosa e associações de antibióticos,
para o tratamento desta patologia (RANG; DALE; RITTER, 2001), porém, ainda
não há um fármaco que produza 100% de cura das úlceras gástricas e devido
ao fato da úlcera gástrica ser considerada agravo a saúde, a pesquisa de
novos fármacos e o desenvolvimento de terapias alternativas é de extrema
importância. Neste aspecto os extratos vegetais estão entre os mais
promissores no tratamento de úlceras gástricas (SANNOMIYA et al., 2005;
BONACORSI et al., 2009; DONATINI et al., 2009).
3.4 Desenvolvimento de fitoterápicos
A produção de fitomedicamentos a partir de plantas cultivadas torna-se
ainda mais atrativo, tendo em vista a produção de biomassa associada à
produção do(s) princípio(s) ativo(s) de interesse. O aumento da procura por
drogas vegetais reflete os índices de crescimento do setor. Neste aspecto, o
Brasil já abarca US$ 550 milhões desse segmento, com previsão de ter
dobrado esse valor em 2010. Além disso, o mercado sofre um crescimento
37
anual de cerca de 10% (ABIFISA, 2010).
Este crescimento, que também é observado em outros países, pode
gerar divisas para o Brasil desde que a produção de fitomedicamentos atenda
a características de qualidade, eficácia e segurança. Estrategicamente,
políticas claras que proporcionem ações e fomento do governo na área de
fitoterápicos são entraves antigos; porém são necessárias, não só para o
desenvolvimento do setor, como também para o desenvolvimento social e
econômico do país (HEINZMANN; BARROS, 2007).
Um fator limitante para uma maior utilização de plantas como matéria-
prima pelas indústrias é que sua maioria não possui descrição em códigos
oficiais (formulários e farmacopeias) não havendo inclusive estudos científicos
adequados sobre muitas delas. Dentro deste restrito número, pode-se citar que
324 estão descritas na Farmacopéia Alemã, 60 na Cooperativa Europeia
Científica de Fitoterapia, 13 na Farmacopéia Americana, 60 na Organização
Mundial da Saúde e apenas 24 na Farmacopéia Brasileira (TOLEDO et al.,
2003).
O decreto nº 5.813, de 22 de junho de 2006, que aprova a Política
Nacional de Plantas Medicinal e Fitoterápico, fortalece e amplia as ações
políticas voltadas ao setor, constituindo-se num marco regulatório histórico.
Como objetivo geral, esta política visa à promoção do uso sustentável da
biodiversidade, o desenvolvimento da cadeia produtiva e da indústria nacional.
O impacto esperado com essas medidas é a diminuição da dependência
externa e o aumento da competitividade do setor farmacêutico nacional
(BRASIL, 2006).
A legislação brasileira, segundo o que consta na redação da Resolução
RDC n° 14, de 31 de março de 2010 (BRASIL, 2010) define como
medicamento fitoterápico:
“medicamento obtido com emprego exclusivo de matérias-primas ativas vegetais, e cuja eficácia e segurança são validadas por meio de levantamentos etnofarmacológicos, de utilização, documentações tecnocientíficas ou evidências clínicas, caracterizados pelo conhecimento da eficácia e dos riscos de seu uso, assim como pela reprodutibilidade e constância de sua qualidade, não considerando medicamento fitoterápico aquele que inclui na sua composição substâncias ativas isoladas, sintéticas ou naturais, nem as associações dessas com extratos vegetais.”
Antes que um medicamento seja registrado e prescrito pela classe
38
médica, são necessários estudos científicos que comprovem sua segurança e
eficácia clínica. Tais quais os critérios utilizados para o desenvolvimento de
medicamentos sintéticos, estudos farmacológicos pré-clínicos, estudos
toxicológicos em animais, e estudos clínicos (Fases I, II e III) devem ser
realizados seguindo protocolos rígidos e critérios aceitos internacionalmente
(YUNES; CALIXTO, 2001).
Os estudos de um novo medicamento fitoterápico seguem importantes
etapas sequenciais, conforme descrito a seguir (SONAGLIO et al., 2004):
a) Etapa botânica e agronômica: identificação da planta, relativo à
obtenção do material, manejo e coleta. Pontos críticos desta fase: se
a planta que se deseja estudar é selvagem ou cultivada,
disponibilidade crescente ou decrescente, com ou sem a
manipulação agronômica, variação no fornecimento, a melhora
genética, controle de qualidade e manuseio pós-colheita.
b) Etapa fitoquímica: isolamento, elucidação estrutural, identificação
dos constituintes do vegetal, ausência de contaminantes e
padronização de marcadores químicos.
c) Desenvolvimento de metodologias analíticas: avaliação do teor
de substâncias ativas ou grupo de substâncias ativas e do perfil
qualitativo dos constituintes químicos de interesse, bem como a
avaliação das características físicas e físico-químicas dos produtos
tecnologicamente transformados.
d) Etapa farmacêutica: preparo das formas farmacêuticas para a
administração, garantindo a qualidade e uniformidade da amostra e
sua estabilidade durante os testes pré-clínicos e clínicos.
e) Ensaios biológicos pré-clínicos: ensaios farmacodinâmicos,
farmacocinéticos e toxicológicos em animais de laboratório.
f) Etapa clínica: estudos farmacológicos pré-clínicos, estudos
toxicológicos em animais, estudos clínico (Fase I, II e III).
A transformação tecnológica do material vegetal em um produto
tecnicamente elaborado, intermediário ou acabado, faz uso de técnicas de
operação de transformação tecnológica. Estas operações de transformação
pedem ser classificadas, de forma geral, em: operações preliminares (divisão e
classificação), extração, concentração e secagem (SONAGLIO et al., 2004).
39
O termo extração refere-se a uma forma mais seletiva e completa de
retirada de substancias ou frações ativas que estão contidas na droga vegetal.
Para isto utiliza-se um líquido ou uma mistura de líquidos apropriados para tal
extração e que garanta segurança tecnológica em seu uso. Como produto
resultante desta extração sólido-líquido obtém-se a chamada solução extrativa
(SONAGLIO et al., 2004).
Antes de se iniciar um processo de extração deve-se definir a
seletividade do solvente a ser empregado no processo. Esta escolha irá
determinar a constituição do extrato: maior parte de constituintes químicos da
planta ou apenas constituintes químicos com uma determinada característica.
Portanto, a escolha do solvente de extração assim como a constância da
composição química da matéria-prima vegetal, representam duas etapas
importantes no processo de fabricação de produtos fitofarmacêuticos
(SHARAPIN et al., 2000).
Apesar da variedade de substâncias líquidas conhecidas, as que são
utilizadas na extração de drogas vegetais são poucas e esta limitação é
justificada por três aspectos (SONAGLIO et al., 2004):
Propriedades extrativas: eficiência e seletividade com que o líquido
extrator dissolve, à temperatura ambiente, uma substância. Depende
dos parâmetros de solubilidade do solvente e do soluto.
Adequação tecnológica: diz respeito à facilidade de eliminação de
sua eliminação da solução extrativa ou do produto final. Depende do
ponto de ebulição, ocorrências de misturas azeotrópicas, risco de
explosão, corrosão e formação de peróxidos.
Inocuidade fisiológica: toxicidade do líquido extrator para o ser
humano.
Os solventes mais utilizados como líquidos extratores no caso de
fitofármacos é a água, o álcool etílico, a glicerina, o propilenoglicol e as
misturas destes líquidos (SANTOS, 2000).
As variáveis que interferem no processo de extração, independente da
escala de produção ou do tipo de produto final que se deseja são (SANTOS,
2000):
a) Estado de divisão da droga: a utilização de pós moderadamente
grossos é recomendada para a grande maioria das drogas para
40
partículas muito pequenas podem resultar na que se evite a
compactação e formação de canais que dificultam os processos de
percolação ou passam para o extrato, nos processos de maceração.
b) Natureza do solvente: dependendo da finalidade desejada, o líquido
extrator utilizado extrai determinada classe de compostos,
seletivamente ou não.
c) Temperatura: o aumento da temperatura de extração facilita a
dissolução das substâncias extratíveis e, consequentemente, o
aumento a eficiência do processo. Entretanto, deve-se cuidar para
que o aumento da temperatura do processo não destrua princípios
ativos termolábeis ou cause a perda de substâncias voláteis.
d) Agitação: permite que uma nova quantidade do líquido extrator entre
em contato com o sólido e seja alcançado, desta forma, um novo
ponto de equilíbrio de saturação, o que, por sua vez, determinará a
eficiência do processo extrativo. Para o aumento na eficiência do
processo pode-se fazer uso de bombas de recirculação do solvente
ou agitadores mecânicos.
e) pH: influencia a solubilidade de diversos compostos pela
possibilidade de formação de sais.
f) Tempo de extração: é determinado em função do solvente e do
equipamento selecionado e deve corresponder ao tempo suficiente
para retirar os componentes de interesse.
Os processos de extração variam de acordo com três características:
escala de produção, qualidade da matéria-prima e natureza do solvente. Os
processos extrativos usualmente estudados no desenvolvimento de extratos
vegetais, incluem a maceração, a percolação, a turbo-extração, extração em
contra-corrente e fluido-supercrítico.
Dentre eles, a maceração é um dos processos mais economicamente
viáveis, por ser um processo que pode ser realizado em temperatura ambiente
e de forma predominantemente estática. É realizada em recipiente fechado,
podendo-se variar a temperatura, durante um período de tempo prolongado,
sob agitação ocasional e sem remoção do líquido extrator. Esta operação
possui variações, entre elas: digestão, que consiste no processo de maceração
que ocorre em sistema aquecido a 40-60 °C; maceração dinâmica, feita sob
41
agitação mecânica constante; e a remaceração, que consiste na repetição do
processo com o mesmo material vegetal, porém com a remoção do solvente
(SONAGLIO et al., 2004).
Os extratores para maceração estática possuem maior tamanho e são
fechados. A droga fica em contato com o solvente durante o tempo necessário.
Em escala industrial, são mais usados os extratores com agitação (SANTOS,
2000).
Não se recomenda o uso de água ou de misturas hidroalcoólicas com
concentrações etanólicas inferiores a 20%, pois favorecem a proliferação
microbiana (SONAGLIO et al., 2004).
Geralmente, a otimização de variáveis experimentais é realizada por
meio de procedimentos que avaliam o efeito de uma variável por vez
(univariado), apresentando desvantagens tais como o tempo gasto para
otimização e a falta de avaliação acerca das interações entre as variáveis que
afetam o processo em estudo. De acordo com BRASIL et al. (2007), estas
desvantagens resultam numa otimização ineficiente, impedindo o rápido
estabelecimento de ótimos verdadeiros, os quais são atingidos pelo emprego
de sistemas multivariados.
O planejamento fatorial é o mais indicado quando se deseja estudar os
efeitos de duas ou mais variáveis de influência, sendo que em cada tentativa
ou réplica, todas as combinações possíveis dos níveis de cada variável são
investigadas (BARROS NETO et al., 2001).
Dentre as diversas vantagens da utilização do planejamento fatorial,
destacam-se as seguintes (BUTTON, 2005):
• Redução do número de ensaios sem prejuízo da qualidade da
informação;
• Estudo simultâneo de diversas variáveis, separando seus efeitos;
• Determinação da confiabilidade dos resultados;
• Realização da pesquisa em etapas, num processo interativo de
acréscimo de novos ensaios;
• Seleção das variáveis que influenciam um processo com número
reduzido de ensaios;
O planejamento fatorial determina que fatores tenham efeitos relevantes
na resposta e, também, como o efeito de um fator varia com os níveis dos
42
outros fatores. Além disso, permite estabelecer e quantificar as correlações
entre os diferentes fatores. Diante do exposto, verifica-se que sem o uso de
planejamentos fatoriais de experimentos, importantes interações entre fatores
podem não ser detectadas e a otimização máxima do sistema pode levar mais
tempo para ser alcançada (CUNICO et al., 2008).
43
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Matérias-primas de origem vegetal
As partes aéreas da M. vulgare utilizadas para produção do extrato
metanólico utilizado nos testes farmacológicos foram coletadas no município de
Bom Retiro, estado de Santa Catarina, Brasil, em fevereiro de 2006, pela
equipe de estudo da profa. Dr. Christiane Meyre.
O composto, marrubiína, foi isolado pela profa. Dra. Christiane Meyre, a
partir do extrato das partes aéreas da M. vulgare coletas em Bom Retiro/SC, no
mês de fevereiro de 2006.
Para caracterizar a droga vegetal segundo parâmetros farmacopeicos e
de compêndios oficias (WHO, 1998) foram utilizadas as partes aéreas da M.
vulgare coletada em Bom Retiro/SC, em julho de 2009 (inverno) e em fevereiro
de 2010 (verão).
4.2 Reagentes, soluções e outras matérias-primas
Todos os reagentes são de grau de pureza pró-análise, ou grau CLAE,
exceto os diferentemente especificados.
Acetato de Etila (Tedia®);
Acetona (Tedia®);
Ácido Gálico (Vetec®, lote 0904283, validade 07/2013);
Ácido gálico (Sigma Aldrich®);
Água purificada (Tipo I obtido por filtração em aparato Mili® Q);
Álcool 95% (Nuclear®);
Álcool Etílico PA (Dinâmica®, lote 31285, validade 10/2012);
Carbonato de Sódio (Labysinth®);
Cimetidina Sigma-Aldrich® (St. Louis, MD, USA);
Clorofórmio (Tedia®);
Hexano (Tedia®);
Indometacina Sigma-Aldrich® (St. Louis, MD, USA);
Metanol (Tedia® - grau HPLC);
44
Omeprazol Sigma-Aldrich® (St. Louis, MD, USA);
Quercetina (Sigma Aldrich®);
Reativo de Folin-Ciocalteau (Dinâmica®, lote 35164, validade 08/2011);
Solução de carbonato de sódio 10%.
4.3 Equipamentos e outros materiais
Balança analítica (Marte®);
Balança analítica (Celtac® FA- 2104N);
Balança de secagem IV (Mettler Toledo® HB13);
Balança semi-analítica (Marte®);
Câmara reveladora de UV (Dist® GRC-03) dotada de lâmpadas GE® de
254/365 nm;
Chapa de aquecimento (Quimis®);
Cromatógrafo gasoso CG Agilent Technologies 5975C inert MSD, com
detector de massas da Agilent, modelo 7890C e injetor de amostra
(amostrador automático) modelo 7683B, usando coluna HP-5;
Cromatoplacas de gel de sílica (Merck® GF254);
Cromatógrafo gasoso marca Shimadzu modelo QP 2010S;
Cromatoplacas Merck GF254;
Espectrofotômetro (Spectrovision® DB 1880 S) com software U.V. Win 5;
Estufa (Fanem® 315 SE);
Estufa (Fanem® 502 C);
Estufa com renovação e circulação de ar (Marconi® MA 037);
Geladeira (Consul®);
Manta aquecedora (Ética®);
Manta aquecedora (Fisatom® 752A);
Microscópio óptico binocular (Leica® 1349522X);
Moinho de facas (Cremar®);
Moinho de martelos (Marconi® 600);
pHmetro (Digimed®/DM 20);
Processador de alimentos (Walita®);
Refrigerador (Bosch® Frost Free KDN 43);
45
Refrigerador (Consul® 280);
Rota-evaporador (Quimios®);
Rota-evaporador (Tecnal® TE 2 II);
Tamisador (Bertel®);
Tamises (2360, 1700, 1180, 600, 250, 150 m);
Tecidos Sontara®;
Ultrassom (Unique® UltraCleaner 800A com aquecimento).
4.4 Atividade Farmacológica
Como há pouca informação disponível sobre a eficácia da M. vulgare
para uso na gastroproteção, foram avaliados o extrato metanólico proveniente
das partes aéreas da M. vulgare coletadas em Bom Retiro/SC em fevereiro de
2006 (verão) e a marrubiína, utilizando os modelos descritos a seguir.
4.4.1 Animais e ensaios farmacológicos
As doses estabelecidas nos experimentos foram baseadas em dados da
literatura e em estudos preliminares realizados em nosso Laboratório.
No estudo farmacológico de plantas utilizam-se normalmente doses
crescentes correlacionadas para possível observação da relação dose-
resposta. Neste estudo foram avaliados os efeitos do extrato metanólico da M.
vulgare utilizando-se doses de 25 mg/kg, 50 mg/kg e 100 mg/kg e do padrão
Marrubiína, usado pela prof. Cristiane Meyre em nossos laboratórios, na
concentração de 25 mg/kg
Seguindo a Lei 11.794, de 8 de outubro de 2008, e de acordo com as
diretrizes da Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório, os
animais foram mantidos segundo normas e cuidados com animais de
laboratório, bem-estar e biosegurança na experimentação (BRASIL, 2008;
SBCAL/COBEA, 1991).
Os experimentos foram autorizados e aprovados pelo Comitê de Ética
em Pesquisa (CEP) da Universidade do Vale do Itajaí, tendo sido aprovados
através do parecer nº 015/2010 (Anexo A).
46
Nos ensaios biológicos foram utilizados camundongos machos e fêmeas
Swiss, pesando entre 25-50 g provenientes do Biotério Central da Universidade
do Vale do Itajaí – UNIVALI. Os animais foram mantidos em caixas de
polipropileno, em sala com temperatura (25 ºC) e ciclo controlados
(claro/escuro 12 horas cada), tendo ração e água ad libitum. Doze horas
anteriores aos experimentos, os animais foram mantidos em jejum, sendo
adicionada a caixa uma grade para inibir a coprofagia e tiveram livre acesso à
água.
4.4.2 Avaliação da atividade gastroprotetora
Na avaliação da atividade gastroprotetora, foram utilizados experimentos
que procuram mimetizar os distúrbios gástricos em humanos, baseados em
fatores etiológicos da doença no homem, como por exemplo, o aumento do
suco gástrico, o uso de drogas anti-inflamatórias não esteroidais e uso abusivo
de bebidas alcoólicas. Cada experimento apresenta seus respectivos controles
positivos (omeprazol, cimetidina ou carbenoxolona) e negativos (veículo ou
indometacina), dependendo da necessidade de cada modelo. Para avaliar a
atividade gastroprotetora do extrato metanólico da Marrubium vulgare L., foram
utilizados diferentes modelos experimentais, conforme descritos a seguir.
4.4.2.1 Modelo de úlcera aguda induzida por etanol/HCl
A metodologia que foi utilizada neste experimento foi a descrita por Mizui
e Doteuchi (1983), com algumas modificações. Os camundongos foram
submetidos inicialmente a jejum de doze horas e, após esse período, divididos
em diferentes grupos (n=5) que foram pré-tratados por via oral com omeprazol
na dose de 30 mg/kg (controle positivo), veículo (controle negativo- água
destilada), extrato metanólico da M. vulgare nas concentrações de 25, 50 e 100
mg/kg e o diterpeno isolado, Marrubiína, na concentração de 25 mg/kg.
Após uma hora e meia, foram administrados aos animais 0,5 mL de
solução EtOH/HCl (60% / 0,3 M) (agente lesivo) por via oral, e uma hora e meia
após a administração do agente lesivo, os mesmos foram sacrificados por
deslocamento cervical; em seguida, os estômagos foram retirados e abertos ao
47
longo da curvatura maior, sendo esticados em placas de parafina, e através de
Scanner, as imagens foram captadas e analisadas por software de análise de
imagens EARP, a fim de determinar-se o número de lesões e o tamanho
destas.
Posteriormente foi realizada a determinação da área total de lesão
(mm2), área relativa lesada (%) e índice de úlceras (ULI) calculado através da
severidade das lesões da mucosa gástrica, classificadas como:
a) tipo 1 (T1): área da úlcera 1 mm2;
b) tipo 2 (T2): área da úlcera de 1-3 mm2; e
c) tipo 3 (T3): área da úlcera 3 mm2.
O índice lesão ulcerativa (ULI) será determinado como:
ULI = (1 x T1) – (2 x T2) – (3 x T3)
O índice de cura (%) será determinado como:
IC = 100 – (ULITratado x 100/ULIControle)
Os resultados foram expressos em quantidade total de área lesada
(mm2), quantidade relativa de área lesada (%), índice de lesão ulcerativa (ULI)
e índice de cura (%).
4.4.2.2 Modelo de úlcera aguda induzida por antiinflamatório não-esteroidal
associada à estimulação parassimpaticomimética
A metodologia que foi utilizada foi descrita por Rainsford (1980), com
algumas modificações.
Após doze horas de jejum, os animais foram divididos em diferentes
grupos (n=5) que foram pré-tratados por via oral com cimetidina na dose de
100 mg/kg (controle positivo), veículo (controle negativo), extrato metanólico da
M. vulgare nas doses de 25, 50 e 100 mg/kg, e marrubiína, nas mesmas doses.
Após uma hora e meia da administração dos diferentes tratamentos, os
animais receberam 100 mg/kg de indometacina (v.o.), associada com a
administração via intraperitonial (i.p.) de betanecol, um estimulante
parassimpaticomimético, na dose de 5 mg/kg, preparada em solução fisiológica
48
antes do uso.
Passadas cinco horas após a administração de indometacina os animais
foram sacrificados por deslocamento cervical e os estômagos retirados e
abertos ao longo da grande curvatura; esticados e através de Scanner, as
imagens foram captadas e analisadas por software de análise de imagens
EARP, a fim de determinar-se o número de lesões e o tamanho destas.
Posteriormente foi realizada a determinação da quantidade total de área
lesada (mm2), quantidade relativa de área lesada (%), índice de lesão
ulcerativa (ULI) e índice de cura (%), conforme descrito anteriormente.
4.4.3 Avaliação da atividade sobre a secreção gástrica
4.4.3.1 Modelo de avaliação da secreção gástrica (ligadura de piloro)
Este experimento foi realizado de acordo com o método descrito por
Shay et al. (1945), com algumas modificações.
Os animais foram submetidos a jejum por doze horas com livre acesso a
água, e divididos em diferentes grupos (n=5). Em seguida foram anestesiados
(com os anestésicos cetamina 10% e xilazina 5% em solução de salina, 0,1
mL/10g de peso do animal) e submetidos a uma incisão longitudinal abaixo ao
processo apófise xifóide, para amarração do piloro e a administração por via
intraduodenal dos diferentes tratamentos: cimetidina na dose de 100 mg/kg
(controle positivo), veículo (controle negativo), extrato metanólico da M. vulgare
nas doses de 25, 50 e 100 mg/kg e Marrubiína na dose de 25 mg/kg.
Após os tratamentos, as incisões foram suturadas e quatro horas após a
cirurgia os animais foram sacrificados por deslocamento cervical. As incisões
foram reabertas e após pinçamento da válvula cárdia, evitando-se a perda do
conteúdo gástrico, o estômago foi retirado.
O conteúdo estomacal foi coletado e foram analisados os parâmetros de
volume, pH e concentração de íons hidrogênio. Após a determinação do
volume, adicionou-se 5 mL de água destilada à amostra e esta passou pelo
processo de centrifugação por 10 min a 3000 rpm. No sobrenadante
determinou-se o pH, titulando-se com solução de hidróxido de sódio a 0,01 N,
49
utilizando-se fenolftaleína como indicador.
Os resultados foram expressos em g (volume), pH e mEq/L/4h
(concentração de íons hidrogênio).
4.4.3.2 Modelo de avaliação da secreção de muco em mucosa gástrica
O modelo utilizado neste experimento é o descrito por Sun, Matsumoto e
Yamada (1991), com algumas modificações.
Os animais foram submetidos a jejum por doze horas com livre acesso a
água, e divididos em diferentes grupos (n=5). Em seguida foram anestesiados
(com os anestésicos cetamina 10% e xilazina 5% em solução de salina, 0,1
mL/10g de peso do animal) e submetidos a uma incisão longitudinal abaixo ao
processo apófise xifóide, para amarração do piloro e a administração por via
intraduodenal dos diferentes tratamentos: carbenoxolona na dose de 200
mg/kg (controle positivo), veículo (controle normal), indometacina na dose de
30 mg/kg (controle negativo) e extrato metanólico da M. vulgare nas doses de
25, 50 e 100 mg/kg.
Após os tratamentos, as incisões foram suturadas e quatro horas após a
cirurgia os animais forão sacrificados por deslocamento cervical. As incisões
foram reabertas e após pinçamento da válvula cárdia (evitando-se a perda do
conteúdo gástrico) o estômago foi retirado, sua face exterior lavada
cuidadosamente em salina e pesado em balança analítica. O conteúdo
gástrico, bem como a mucosa, foi acondicionada em 10 mL de solução de
Alcian Blue (Alcian Blue 0,02%, sacarose 0,16 M, acetato de sódio 0,05 M; pH
5,8 a 20 ºC) por 24 horas.
Após este período, o tecido estomacal foi retirado e o líquido foi
centrifugado a 3000 rpm por 10 minutos. A leitura do sobrenadante foi realizada
através de leitor de microplaca em Asys Expert Plus UV (no comprimento de
onda a 620 nm), em triplicata. Os resultados foram expressos em quantidade
de corante aderido ao muco (mg) por grama de tecido (g).
50
4.4.4 Mecanismos de ação antiúlcera
4.4.4.1 Participação do óxido nítrico endógeno envolvido na gastroproteção
O método empregado neste experimento foi descrito primeiramente por
Arrieta et al. (2003), com algumas modificações. Os ratos foram separados em
dez grupos (n=6), onde cinco grupos receberam pré-tratamento com L-NAME
(N-nitro-L-Arginina metil éster), um inibidor da enzima óxido nítrico sintase, na
dose de 70 mg/kg, i.p. e os cinco grupos restantes foram pré-tratados com
salina, i.p. Após 30 minutos dos pré-tratamentos, aplicou-se o teste de indução
de úlcera por etanol, utilizando como tratamento extrato metanólico da M.
vulagre, na concentração de 100 mg/kg, o composto isolado, marrubiína, na
concentração de 25 mg/kg, controle positivo (carbenoxolona 200 mg/kg) e
controle negativo (veículo). Passado o tempo do teste, os animais foram
sacrificados e os estômagos retirados e abertos ao longo da grande curvatura,
esticados e através de Scanner, as imagens foram captadas e analisadas por
software de análise de imagens EARP, a fim de determinar-se a % de área
lesada.
4.4.4.2 Participação dos grupamentos sulfidrila endógenos envolvidos na
gastroproteção
Para a avaliação dos grupamentos sulfidrila na gastroproteção foi
adotado o modelo de Matsuda e Yoshikawa (1999). Os ratos foram separados
em dez grupos (n=6), onde cinco grupos receberam o pré-tratamento com NEM
(N-etilmaleimida), um quelante de grupamentos sulfidrila, na dose de 10 mg/kg,
i.p. e os cinco grupos restante foram pré-tratados com salina, i.p. Após 30
minutos dos pré-tratamentos, aplicou-se o teste de indução de úlcera por
etanol, utilizando como tratamento o extrato metanólico da M. vulgare na dose
de 100 mg/kg, marrubiína na dose de 25 mg/kg, controle positivo
(carbenoxolona 200 mg/kg) e controle negativo (veículo). Passado o tempo do
teste, os animais foram sacrificados e os estômagos retirados e abertos ao
longo da grande curvatura, esticados e através de Scanner, as imagens foram
51
captadas e analisadas por software de análise de imagens EARP, a fim de
determinar-se a % de área lesada.
4.5 Obtenção, tratamento e caracterização da droga vegetal
As partes aéreas da espécie Marrubium vulgare foram coletadas nos
municípios de Bom Retiro (SC) (Tab.1). Uma excicata encontra-se depositada
no Herbarium Flor sob número 4725, em Florianópolis – SC.
Tabela 1. Lotes de droga vegetal classificados pelo local e época de coleta.
Local Mês Ano Lote
Bom Retiro/SC Julho 2009 BR07/09 (inverno)
Bom Retiro/SC Fevereiro 2010 BR02/10 (verão)
BR refere-se ao local de coleta; os dois primeiros dígitos reportam-se ao mês da coleta e os dois últimos ao ano da coleta.
Após a colheita, o material vegetal foi tratado manualmente por meio da
seleção das partes aéreas, em folhas, caules e flores, e eliminação do material
estranho. O material vegetal foi então, submetido à estabilização através da
secagem em estufa a 35 ºC, com circulação de ar até que apresentassem
consistência friável, referente a teor de umidade inferior a 10% e após, foi
acondicionado em embalagens plásticas de polietileno recobertas por papel
pardo.
As partes aéreas foram pesadas, separadamente, antes e após a
secagem, para determinação do rendimento de massa fresca e seca,
respectivamente, para as folhas, caules e flores, correspondentes a cada lote.
As partes aéreas secas foram inicialmente submetida ao processo de
moagem grosseira em moinho de facas Cemar® com abertura de malha de 3
mm e o tamanho de suas partículas foi padronizado entre 1,0 e 2,0 mm, para
caracterização preliminar.
Para o estudo posterior de otimização das condições extrativas, as
partes aéreas secas pré-moídas, lote BR02/10, foram novamente submetidas à
moagem em moinho de martelos Marconi® 600, com abertura de malha de 3
mm, e padronizadas entre 0,150 e 2,36 mm.
52
4.5.1 Determinação da perda por dessecação
O teor de umidade foi determinado por método gravimétrico
(FARMACOPEIA BRASILEIRA, 2010), em balança de secagem por radiação
infravermelha (Mettler Toledo® HB13), com o uso de aproximadamente 1,0 g do
material vegetal, correspondente às folhas, caules e flores, quando existentes.
O teor de umidade foi obtido a 105 ºC, em triplicata.
4.5.2 Análise granulométrica
A granulometria dos pós foi determinada após cada procedimento de
moagem. Para a determinação da granulometria dos pós, foi utilizado o método
da tamisação, em tamises com aberturas de malha de 1,0 e 2,0 mm
empilhados sobre o coletor em ordem crescente.
Após a segunda moagem, em moinho de martelos, foram selecionados
os tamises com abertura de malha de 2,36; 1,70; 1,18; 0,6; 0,25 e 0,15 mm.
Uma amostra de 50 g da droga vegetal (representada pelas folhas,
caules ou flores secas e moídas; ou ainda, pela misturadas partes aéreas) foi
submetida à passagem pelos tamises, previamente tarados, com aberturas de
malhas de diferentes tamanhos. A tamisação foi realizada a 60 vibrações por
segundo, durante 15 minutos em tamisador (Bertel®). Em seguida, as frações
retidas nos tamises e no coletor foram pesadas. Para a análise dos dados foi
empregado o cálculo do diâmetro médio de distribuição granulométrica
(ALLEN; POPOVICH; ANSEL, 2007), conforme equação 1. O ensaio foi
realizado em triplicata.
1 Eq.
%100
%
FrAMdmédio
onde dmédio = diâmetro médio aritmético (mm); AM = abertura média de malha
(mm) e a Fr% = fração retida percentual em cada tamis.
53
4.5.3 Determinação do teor de fenólicos totais equivalentes a ácido gálico (EAG) na droga vegetal (SINGLETON; ORTHOFER; LAMUELA-RAVENTOS, 1999)
Inicialmente foi obtida uma curva padrão de absorbância do ácido gálico
no ultravioleta, em 750 nm. A partir da solução de 1 mg/mL foram feitas
diluições que resultaram nas concentrações de 0,005; 0,05; 0,1; 0,2; 0,4 e 0,6
mg/mL. De cada diluição foram retiradas alíquotas de 25 µL, transferindo-se
para tubo de ensaio, onde se adicionou 125 µL de reagente de Folin-Ciocalteau
e 1,5 mL de água, seguido de homogeneização. Adicionou-se a solução de
carbonato de sódio 15%. Após 30 segundos, completou-se o volume com água
q.sp. 2,5 mL. Paralelamente, foi preparada uma solução comparativa (branco)
do mesmo, substituindo-se a adição da solução de ácido gálico por etanol.
Para a determinação do teor de fenólicos na droga vegetal, cerca de 500
mg (partes aéreas secas e moídas), exatamente pesados, foram transferidos
para um balão volumétrico de 100 mL, completando-se o volume do mesmo
com álcool etílico. Após sonicação por 10 minutos, filtrou-se a solução extrativa
em papel filtro desprezando-se os primeiros 10 mL do filtrado. Uma alíquota de
0,1 mL deste filtrado foi transferido para um balão volumétrico de 25 mL, onde
se adicionou 0,5 mL de reativo de Folin-Ciocalteau, 10 mL solução de
carbonato de sódio 10% e água purificada até completar o volume do balão.
Esta foi considerada a solução amostra (SA).
Paralelamente, uma alíquota de 0,5 mL de reativo de Folin-Ciocalteau foi
transferida para o balão de fundo redondo de 25 mL, onde se adicionou 10 mL
de solução de carbonato de sódio a 10% e água purificada até completar o
volume do balão, constituindo-se a solução comparativa (SC).
Após 60 minutos, foi realizada a leitura da absorbância da SA
comparando-se a leitura com o SC no espectrofotômetro em 750 nm.
O teor de fenólicos totais foi calculado como equivalente em ácido gálico
(EAG), pela média de três determinações, conforme a equação 2:
100
)/(
mppdm
FCmLgCEAG
Eq. 2
onde EAG = equivalente em ácido gálico (mg/g), C = concentração de ácido
gálico, na solução amostra (µg/mL), calculada pela equação da reta da curva
54
analítica do ácido gálico; FC = fator de correção (25); m = massa da droga
vegetal (g); ppd = perda por dessecação da droga vegetal (%).
4.5.4 Determinação do teor de flavonóides totais na droga vegetal (Chang
et al., 2002 com modificações)
Inicialmente foi obtida uma curva padrão de absorbância no ultravioleta,
em 420 nm, a partir de cinco diluições da solução de quercetina a 1 mg/mL,
resultando nas concentrações de 10,0; 5,0; 2,5; 1,25; 0,5 g/mL.
Paralelamente, uma alíquota de 0,5 mL de cada concentração da solução
padrão de quercetina foi transferida para outro tubo de ensaio, no qual foram
acrescentados 1,5 mL de etanol 96%, 1,5 mL de acetato de potássio 0,1 M e
1,5 mL de água destilada, a fim de se obter a solução comparativa (SC).
Para a determinação do teor de flavonóides na droga vegetal (partes
aéreas secas e moídas dos lotes BR07/09 e BR02/10), cerca de 500 mg das
partes aéreas secas e moídas, foram transferidos para um balão volumétrico
de 100 mL, completando-se o volume do mesmo com etanol 70% (v/v).
Após sonicação por 10 minutos, a solução extrativa foi filtrada em papel
filtro, desprezando-se os primeiros 10 mL do filtrado. Uma alíquota de 0,5 mL
do filtrado foi transferida para um tubo de ensaio e foram adicionados 1,5 mL
de etanol 96%, 1,5 mL de solução de cloreto de alumínio 10%, 1,5 mL de
acetato de potássio 0,1 M e 1,5 mL de água purificada, a fim de se obter a
solução amostra (SA).
Uma alíquota de 0,5 mL da solução padrão de quercetina (1 mg/mL) foi
transferida para outro tubo de ensaio, onde acrescentou-se 1,5 mL de etanol
96%, 1,5 mL de acetato de potássio 0,1 M e 1,5 mL de água destilada,
constituindo-se a solução comparativa (SC).
Após 30 minutos, realizou-se a leitura da absorbância de SA e SC no
espectrofotômetro em 420 nm.
Os resultados foram expressos em porcentual ponderal calculado como
quercetina pela média de três determinações, segundo a equação 3.
100
)/(
mppd
FDmLmgCTF
-m
Eq. 3
55
onde TF = Teor de flavonóides totais equivalentes a quercetina (mg/g), C =
concentração de quercetina, na solução amostra (µg/mL), calculada pela
equação da reta da curva analítica da quercetina; FD = fator de diuição (1000);
m = massa da droga vegetal (g); ppd = perda por dessecação da droga vegetal
(%).
4.6 Obtenção e caracterização preliminar das soluções extrativas
A droga vegetal (partes aéreas secas e moídas dos lotes BR07/09 e
BR02/10) foi submetida a uma análise preliminar para identificação dos
possíveis marcadores químicos, escolha do solvente e método de extração; e
avaliação do efeito da época de coleta sobre os parâmetros determinados.
Para tanto, as partes aéreas secas e pré-moídas foram extraídas com
diferentes solventes e métodos, conforme descrito a seguir.
Soluções extrativas metanólicas obtidas por maceração: cerca de 5,0 g
da droga vegetal, lotes BR07/09 e BR02/10, foram macerados com 200 mL de
metanol, durante 7 dias.
Soluções extrativas hidroetanólicas obtidas por maceração: cerca de 5,0
g da droga vegetal, lotes BR07/09 e BR02/10, foram macerados com 200 mL
das diferentes misturas de etanol: água (V/V) (90:10; 70:30 e 50:50), durante 7
dias.
Solução extrativa aquosa obtida por infusão: cerca de 5,0 g da droga
vegetal foi mantida em repouso por 15 minutos com 200 mL de água fervente.
Solução extrativa aquosa obtida por decocção: cerca de 5,0 g da droga
vegetal foi mantida em contínuo aquecimento sob refluxo com 200 mL de água.
Após a extração, as soluções foram filtradas utilizando-se prensagem
manual em duplo tecido Sontara® sobre papel de filtro, em funil de büchner,
com auxílio de vácuo. A seguir, as soluções foram caracterizadas quanto ao pH
e determinação de resíduo seco. Uma parte das soluções foi concentrada em
aparelho de rota-evaporador Quimios® a 50 ºC até consistência mole, e
retomada em metanol para aplicação em cromatoplacas de gel de sílica GF254.
Para a avaliação conjunta do efeito da época de coleta, foram usados os
lotes de plantas coletadas em Bom Retiro (SC) (Tab.1).
56
4.6.1 Determinação do pH
A determinação do pH nos extratos líquidos hidroalcoólicos e aquosos
foi realizada em potenciômetro calibrado (pHmetro Digimed®/DM20).
4.6.2 Determinação do resíduo seco
Foram transferidos 5,0 mL de cada extrato para as cápsulas de
porcelana, previamente taradas e dessecadas, as quais foram levadas a chapa
de aquecimento (chapa de aquecimento - Quimis®) até evaporação do solvente.
Os cadinhos contendo os resíduos secos foram então levados à estufa a 100 ±
5 ºC e, depois, resfriados em dessecador, imediatamente após sua retirada da
estufa. A secagem e resfriamento foram repetidos até peso constante. Os
resultados foram expressos utilizando-se da média de três determinações.
4.6.3 Análise cromatográfica em camada delgada (CCD)
Os cromatogramas foram desenvolvidos de forma ascendente, em
cubas saturadas, a altura de até 10 cm. As amostras foram aplicadas (10 L)
com capilar volumétrico na forma de manchas circulares sequencialmente, à
distância não inferior a 0,5 cm das bordas laterais e inferior. Após a secagem, à
temperatura ambiente, as placas foram observadas sob luz UV em 365 nm e,
novamente, após a revelação química com revelador específico e adequado
para grupo de marcadores, conforme tabela 2.
Tabela 2. Sistema de cromatografia em camada delgada para a análise de
terpenóides em extratos obtidos com as partes aéreas da M. vulgare.
Grupo fitoquímico Sistema eluente Sistema revelador SQR
Terpenóides Clorofórmio: Metanol
Anisaldeído Sulfurico
Marrubiína, -sitosterol, ácido ursólico
SQR: Substâncias químicas de referência obtidas por isolamento no laboratório de Fitoquímica do NIQFAR
57
4.6.4 Determinação do teor de fenólicos totais nas soluções extrativas (SINGLETON; ORTHOFER; LAMUELA-RAVENTOS, 1999)
Previamente foi feita a seleção do comprimento de onda e do tempo de
leitura. Para isso, um extrato escolhido aleatoriamente foi submetido ao
processo de preparo de amostra e esta teve suas medidas de absorbância
realizadas a cada 15 minutos, avaliando-se o comportamento da amostra frente
ao tempo de leitura.
Para o preparo das amostras, a uma alíquota de 25 L da solução
amostra, adicionaram-se 125 L do reativo de Folin-Ciocalteau e 1,5 mL de
água destilada. Após agitação e repouso de 1 minuto, uma alíquota de 0,5 mL
da solução recém preparada de carbonato de sódio a 15% foi adicionada a
mistura inicial. Submeteu-se esta mistura à agitação por 30 segundos e após
completou-se o volume para 2,5 mL com água destilada. Após 30 minutos fez-
se a medida de sua absorbância a 784 nm contra um branco contendo os
reagentes e etanol no lugar da amostra.
Construiu-se curva de calibração com seis concentrações (0,005; 0,05;
0,1; 0,2; 0,4; 0,6 g/mL) de ácido gálico, em triplicata.
4.6.5 Análise cromatográfica por CG1
As análises cromatográficas dos fitoconstituintes foram realizadas em
cromatógrafo gasoso CG Agilent Technologies 5975C inert MSD, com detector
de massas da Agilent, modelo 7890C e injetor de amostra (amostrador
automático) modelo 7683B, usando coluna HP-5 (5% fenil dimetilpolisiloxano)
de 30 m de comprimento, com 0,25 mm de diâmetro interno e 0,25 μm de
espessura do filme. Foi utilizado etanol grau de pureza pró-análise.
As condições de operação da análise cromatográfica foram as
seguintes: temperatura inicial do forno igual a 50 °C por 2 min, logo em seguida
a velocidade de aquecimento foi de 20 °C/min até 220 °C, em seguida 5 °C/min
até 250 °C. Após 10 °C/min até 290 °C, permanecendo por 3 min e logo em
seguida 20 °C/min até 300 °C e continuando por 2 min; temperatura do injetor:
1 Realizada na Universidade de Joinville/SC (UNIVILLE), pelo Prof. MSc. Theodoro Marcel
Wagner.
58
280 ºC; gás de arraste: hélio, com fluxo de 1,0 mL/min, modo de injeção na
forma de divisão de fluxo pulsado (pulsed split), com condições do pulso de 22
psi x 30 seg. A corrida com detetor de massa foi feita no modo scan M/Z igual
30 a 400 m, com tempo de aquisição de 3,85 scan/seg; analisador do tipo
quadrupolo.
Foram submetidas a esta análise os extratos metanólicos produzidos
com as partes aéreas dos lotes das plantas coletadas em Bom Retiro no
verão/2006, inverno/2009 e verão/2010, utilizando-se como referência o padrão
de marrubiína.
4.7 Otimização das condições extrativas
Esta etapa teve por objetivo otimizar as condições extrativas do processo
de maceração, avaliando a influência da relação planta:solvente e tempo de
extração, sobre as características das soluções extrativas, como o rendimento
(volume líquido), pH, resíduo seco, fenólicos totais, e teor de marrubiína. Este
estudo foi realizado seguindo um modelo fatorial 32, tendo a relação
planta:solvente e tempo de extração como variáveis independentes e o resíduo
seco e teor dos fitoconstituintes (fenólicos totais e marrubiína) como variáveis
dependentes.
Foram preparadas 9 soluções extrativas conforme tabela 3.
Tabela 3. Planejamento fatorial 32 para a otimização das condições extrativas
do processo de maceração com álcool 70 % (V/V)
Experimento Relação planta:solvente (m/V, %) Tempo de extração
(dias) 01 5,0 (-1) 5 (-1) 02 5,0 (-1) 10 (0) 03 5,0 (-1) 15 (+1) 04 7,5 (0) 5 (-1) 05 7,5 (0) 10 (0) 06 7,5 (0) 15 (+1) 07 10,0 (+1) 5 (-1) 08 10,0 (+1) 10 (0) 09 10,0 (+1) 15 (+1) -1: nível inferior; 0: nível intermediário; +1: nível superior
Os resultados foram submetidos à análise de regressão múltipla
59
(COCHRAN; COX, 198378; MONTGOMERY, 1991) e curvas de superfície de
respostas construídas a partir das equações ajustadas pela regressão, com o
auxílio do software Statgraphics Plus®.
4.7.1 Caracterização das soluções extrativas
4.7.1.1 Determinação do pH
Conforme descrito no item 4.6.1.
4.7.1.2 Determinação do resíduo seco
Conforme descrito no item 4.6.2.
4.7.1.3 Determinação do teor de fenólicos totais
Conforme descrito no item 4.6.4.
Para a análise do teor, as soluções extrativas foram submetidas à
diluição 1:1 e 1:2, conforme a tabela 4.
Tabela 4. Diluição das soluções extrativas para a determinação do teor de
fenólicos totais. Diluição Volume da amostra Volume de etanol 1:1 1 mL 1 mL 1:2 1 mL 2 mL
4.7.1.4 Determinação do teor de marrubiína
As análises por CG/MS foram feitas com o uso de um cromatógrafo
gasoso da marca Shimadzu modelo QP 2010S com detector de ionização de
chama (FID) e injetor de amostra (amostrador automático) modelo AOC-20i.
Foi utilizada uma coluna RTX-1 (100% dimetilpolisiloxano) de 30 m de
comprimento, com 0,25 mm de diâmetro interno e 0,25 μm de espessura do
filme.
As condições de operação da análise cromatográfica foram as
seguintes: temperatura inicial do forno igual a 80°C por 1 min, logo em seguida
a velocidade de aquecimento foi de 20°C/min até 300°C por 2 min. Após
10°C/min até 310°C, permanecendo por 5 min. Temperatura do injetor: 300 ºC;
gás de arraste: hélio, com fluxo de 0,8 mL/min, modo de injeção na forma de
60
divisão de fluxo (split 40:1), com condições de fluxo total de 35,8 mL/min. A
temperatura do detetor foi de 310oC e o volume de injeção da amostra foi de
1µL.
Para análise quantitativa da marrubiína foi realizada uma curva analítica,
a partir das diluições da solução etanólica do padrão a 1 mg/mL, resultando
nas concentrações de 0,4; 0,2; 0,1; 0,05; 0,025 e 0,0125 mg/mL. Foram
injetadas as diluições preparadas em triplicata. A partir da equação da reta
foram calculadas as concentrações da marrubiína presente nas amostras
analisadas.
Foram submetidas à análise, as soluções extrativas hidroetanólicas,
obtidas a partir da droga vegetal coletada em Bom Retiro no ano de 2009. As
amostras foram diluídas na concentração de 2:8, com o mesmo solvente
utilizado para a extração.
61
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Avaliação da atividade antiúlcera do extrato metanólico e da
marrubiína
Considerando o uso popular da M. vulgare já relatado para o tratamento
de dispepsias (WHITE HOREHOUND, 2008), torna-se importante comprovar a
sua eficácia através de modelos farmacológicos específicos. Ressalta-se que
Toso et al. (2007) avaliou o efeito gastroprotetor do extrato hidroalcoólico das
partes aéreas da M. vulgare, utilizando o modelo de indução de úlceras agudas
por estresse por imobilização e frio. O presente trabalho visa elucidar os
mecanismos da atividade gastroprotetora, avaliando os modelos descritos na
metodologia descrita anteriormente, cujos resultados estão descritos a seguir.
5.1.1 Efeito do extrato metanólico da M. vulgare e do diterpeno marrubiina
em úlceras agudas induzidas por etanol/HCl
A atividade gastroprotetora do extrato metanólico da M. vulgare foi
inicialmente avaliada nos modelos de indução de úlceras agudas induzidas por
etanol, que é um agente necrosante, e por AINE, que inibe a proteção normal
do estômago (diminuição de síntese de prostaglandinas constitutivas). Apesar
de não representar integralmente a patologia humana, esses dois modelos são
clássicos no screening para o estudo de fármacos com atividade
gastroprotetora. Estes modelos fornecem importantes indicativos de possíveis
mecanismos de ação dos extratos, que podem estar associados a fatores
antioxidantes e/ou fatores anti-inflamatórios, ou ainda à diminuição da secreção
ácida. O uso de substâncias como álcool e AINES está entre as principais
causas envolvidas na etiologia de úlceras gástricas no homem (RAIHA et al.,
1998; SCHMASSMANN, 1998; LEVENSTEIN, 1998).
Quando a mucosa perde a capacidade de proteger-se através das
secreções de bicarbonato e muco, ocorrem lesões, que são desencadeadas
devido a um desequilíbrio entre os agentes agressivos e defensivos,
acarretando o surgimento de úlceras (LAM et al., 2007; KLEIN-JR et al., 2010).
O etanol é um potente agente ulcerogênico que age dissolvendo a
camada de muco da mucosa gástrica, resultando em aumento do fluxo de Na+
e H+ no lúmen, estimulando a secreção de pepsina, histamina e H+ (SANTIN et
62
al., 2010; HIRUMA-LIMA et al., 2009; SINGH et al., 2008). Além disso, o etanol
faz com que o tecido entre em um estado de êxtase de sangue levando a
graves lesões com características necróticas (MARROTTA et al., 1999).
No modelo de úlceras agudas induzidas por etanol, as lesões ulcerativas
são decorrentes da ação necrosante do etanol sobre a mucosa gástrica, com
menor participação da secreção ácida, sendo de etiologia bastante ampla e
complexa, envolvendo a depleção dos fatores protetores (muco e bicarbonato,
por exemplo) e aumentando os fatores agressores (ácido clorídrico, por
exemplo) (SIKIRIC et al., 1999; REPETTO; LLESUY, 2002; VAZQUEZ-
RAMIREZ et al., 2006).
Os efeitos do etanol sobre a mucosa gástrica podem estar associados
com a formação de espécies reativas de oxigênio (EROs), que causam um
desequilíbrio entre o processo antioxidante e oxidante celular. A administração
de etanol resulta em lesões no plexo vascular, ocasionando ruptura dos vasos,
favorecendo a hemorragia e necrose, retrodifusão de íons hidrogênio,
causando esfoliação nas células epiteliais, rompendo a barreira protetora da
mucosa e alterando a permeabilidade da membrana (LEWIS, HANSON, 1991;
SIKIRIC et al., 1999).
Neste modelo, observou-se que o tratamento com o extrato metanólico
da M. vulgare (EMMV 50 e 100 mg/kg) e omeprazol (30 mg/kg) reduziu
significativamente a área total da lesão, a porcentagem de área lesada e o
índice de lesões (ULI) em comparação ao grupo controle negativo (Tab. 5). O
índice de cura (IC) for de 36,81% para a dose de 25 mg/kg; 49,31 para a dose
de 50 mg/kg e 74,31 para a dose de 100 mg/kg (Fig. 6). A dose de 25 mg/kg do
extrato metanólico da M. vulgare não apresentou valores significativos de
diminuição da área total de lesão e porcentagem de área lesada.
63
Tabela 5. Efeitos da administração oral de omeprazol (30 mg/kg) e das diferentes doses do extrato metanólico das partes aéreas da M. vulgare (25, 50 e 100 mg/kg) em úlceras gástricas agudas induzidas por etanol/HCl em camundongos.
Tratamentos Dose (mg/kg) Área total de lesão (mm2)
Área relativa de lesão (%)
Índice de Lesão Ulcerativa (ILU)
Controle Veículo 33,39 ± 7,97 11,08 ± 2,94 28,80 ± 2,10
EMMV
25 21,35 ± 5,25 5,78 ± 1,20 18,20 ± 2,57*
50 11,90 ± 3,40* 4,14 ± 1,15* 14,60 ± 3,07**
100 3,20 ± 0,76** 1,41 ± 0,16** 7,40 ± 2,01**
Omeprazol 30 4,13 ± 1,67** 1,56 ± 0,56** 5,80 ± 1,06**
Diferença significativa em relação ao grupo controle (*p<0,05 e **p<0,01), ANOVA, teste a posteriori de Dunnet
EMMV 25 mg/kg EMMV 50 mg/kg EMMV 100 mg/kg Omeprazol 30 mg/kg0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
**
**
** **
Tratamentos
Índ
ice d
e c
ura
(IC
- %
)
Figura 6. Índice de cura obtido pelo efeito da administração oral de omeprazol
(30 mg/kg) e das diferentes doses do extrato metanólico das partes aéreas da Marrubium vulgare (nas doses de 25, 50 e 100 mg/kg) em úlceras gástricas agudas induzidas por etanol/HCl em camundongos. Diferença significativa em relação ao grupo controle (**p<0,01), ANOVA, teste a posteriori de Dunnett).
Buscando-se investigar o possível metábolito responsável pela atividade
gastroprotetora, foram avaliadas no modelo de úlceras agudas induzidas por
64
etanol/HCl, o composto diterpênico marrubiína (DM), isolado das partes aéreas
da M. vulgare.
Neste modelo, o DM (25 mg/kg) reduziu significativamente todos os
parâmetros, quando comparados ao grupo controle (p<0,01). A dose utilizada
reduziu a área total lesada e a área relativa lesada quando comparados com o
grupo controle negativo (Tab. 6).
Tabela 6. Efeitos da administração oral de omeprazol (30 mg/kg) e do
diterpeno marrubiína isolado das partes aéreas da M. vulgare (25 mg/kg) em úlceras gástricas agudas induzidas por etanol/HCl em camundongos.
Tratamentos Dose (mg/kg) Área total de
lesão (mm2)
Área relativa
de lesão (%)
Índice de Lesão
Ulcerativa (ILU)
Controle Veículo 32,18 ± 4,22 11,11 ± 1,13 19,80 ± 0,73
Marrubiína 25 3,32 ± 1,16** 1,42 ± 0,58** 11,00 ± 2,38**
Omeprazol 30 3,12 ± 0,90** 1,13 ± 0,13** 6,60 ± 1,69**
Diferença significativa em relação ao grupo controle (*p<0,05 e **p<0,01), ANOVA, teste a posteriori de Dunnet
Assim, o índice de cura calculado foi de 44,44% para a dose de 25
mg/kg de marrubiína e 66,67% para o omeprazol (30 mg/kg) (Fig. 7). De
acordo com os parâmetros avaliados, o DM na dose de 25 mg/kg apresentou-
se ativo contra o dano gástrico produzido pelo etanol/HCl. Estes resultados
indicam que o extrato apresenta uma possível atividade citoprotetora,
provavelmente correlacionado com o diterpeno marrubiína.
65
DM 25 mg/kg Omeprazol 30 mg/kg0
10
20
30
40
50
60
70
80
**
**
Tratamentos
Índ
ice d
e c
ura
(IC
- %
)
Figura 7. Índice de cura obtido pelo efeito da administração oral de omeprazol
(30 mg/kg) e do diterpeno marrubiína obtido do extrato das partes aéreas da M. vulgare (na dose de 25 mg/kg) em úlceras gástricas induzidas por etanol/HCl em camundongos. Diferença significativa em relação ao grupo controle (**p<0,01), ANOVA, teste a posteriori de Dunnett.
A gastroproteção pode estar relacionada com a manutenção da
integridade da mucosa gástrica, que depende da integridade da
microcirculação, secreção de muco e atividade de enzimas antioxidantes
(KWIECIÉN et al., 2004).
5.1.2 Efeito do extrato metanólico da M. vulgare em úlceras agudas
induzidas por AINE/parassimpaticomimético
Outro fator que leva ao desequilíbrio dos fatores protetores da mucosa
gástrica são os AINEs. A indometacina e outros AINEs atuam inibindo a síntese
das prostaglandinas através da inibição da enzima ciclooxigenase-1,
fornecendo forte evidencia de que o efeito ulcerogênico destes fármacos esta,
intimamente correlacionado com a supressão da síntese de prostaglandinas
(KUSHIMA et al., 2009).
Os anti-inflamatórios não esteroidais apresentam como efeito
indesejável a ulceração da mucosa gástrica, resultado principalmente da
66
diminuição da síntese de prostaglandinas, devido à inibição da enzima ciclo-
oxigenase. As prostaglandinas são responsáveis pela secreção de muco e
bicarbonato na mucosa gástrica. Sua diminuição acarreta em perda da
citoproteção e redução do fluxo sanguíneo local (CRYER, 2000).
No estômago, as prostaglandinas desempenham um importante papel
de proteção, estimulando a secreção de bicarbonato e muco, mantendo o fluxo
sanguíneo, sendo também responsável pela regulação da renovação das
células da mucosa (MALFERTHEINER; CHAN; Mc COLL, 2009). A inibição da
síntese das prostaglandinas enfraquece os fatores protetores da mucosa,
diminuindo a sua capacidade de resistir aos agentes agressores (KLEIN-JR et
al., 2010).
A atividade gastroprotetora do extrato metanólico da M. vulgare e do
composto isolado marrubiína, foi avaliada no modelo de úlcera induzida por
AINE/parassimpaticomimético (indometacina/betanecol). Neste modelo o
tratamento com o EMMV (25, 50 e 100 mg/kg) e o controle positivo cimetidina
(100 mg/kg) reduziram significativamente todos os parâmetros avaliados
quando comparado ao grupo controle (p <0,01).
Tabela 7. Efeitos da administração oral de cimetidina (100 mg/kg) e das
diferentes doses do extrato metanólico das partes aéreas da M. vulgare (25, 50 e 100 mg/kg) em úlceras gástricas agudas induzidas por AINE/betanecol em camundongos.
Tratamentos Dose (mg/kg) Área total de
lesão (mm2)
Área relativa
de lesão (%)
Índice de Lesão
Ulcerativa (ILU)
Controle Veículo 11,30±1,49 3,53±0,47 31,40±5,60
EMMV
25 3,67±1,14** 1,72±0,26** 15,60±1,03**
50 2,94±0,57** 1,14±0,28** 10,60±0,92**
100 2,68±0,91** 0,73±0,26** 5,60±1,63**
Cimetidina 30 3,99±0,59** 1,44±0,11** 10,20±0,80**
EMMV = Extrato Metanólico da M. vulgare. Diferença significativa em relação ao grupo controle (*p<0,05 e **p<0,01), ANOVA, teste a posteriori de Dunnett.
A porcentagem de inibição da úlcera foi de 50,32; 66,24; 83,17 e 67,52
para os grupos tratados com 25, 50 e 100 mg/kg do EMMV e controle positivo
(cimetidina), respectivamente (Fig. 8). A dose de 100 mg/kg revelou ser mais
efetiva que o fármaco de escolha cimetidina.
67
Os resultados nesses dois experimentos (úlceras agudas induzidas por
etanol/HCl e úlceras agudas induzidas por AINE/parassimpaticomimético)
sugerem que as substâncias presentes no EMMV promovem a participação
coordenada de mediadores na resposta gastroprotetora e que esta resposta
esteja fortemente ligada a marrubiína. Podem estar havendo influência da
PGE2 e NO, os quais podem modular a defesa da mucosa, estimulando a
secreção de muco e bicarbonato, elevando o fluxo sanguíneo, promovendo o
tamponamento da acidez ou inibindo a secreção ácida, e citoproteção,
favorecendo os mecanismos de reparo tecidual (WALLACE; MILLER, 2000).
EMMV 25 mg/kg EMMV 50 mg/kg EMMV 100 mg/kg Cimetidina 100 mg/kg0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
**
**
**
Tratamentos
Índ
ice d
e c
ura
(IC
- %
)
Figura 8. Índice de cura obtido pelo efeito da administração oral de cimetidina (100 mg/kg) e das diferentes doses do extrato metanólico das partes aéreas da M. vulgare (EMMV) (nas doses de 25, 50 e 100 mg/kg) em úlceras gástricas agudas induzidas por indometacina/betanecol em camundongos. Diferença significativa em relação ao grupo controle (**p<0,01), ANOVA, teste a posteriori de Dunnett.
5.1.3 Avaliação da atividade sobre a secreção gástrica
Considerando que os dados obtidos em testes de úlcera aguda sugerem
que o extrato metanólico da M. vulgare é capaz de proteger a mucosa gástrica
contra lesões induzidas por etanol e AINEs, passou-se a estudar se o extrato
da M. vulgare e o composto marrubiina seriam capazes de interferir nos
parâmetros da secreção gástrica, uma vez que os medicamentos atualmente
disponíveis atuam através desse mecanismo. Para isso, foi utilizado o teste de
68
ligadura do piloro, que fornece parâmetros importantes para avaliar o
envolvimento de compostos sobre a secreção gástrica, pois o estiramento da
mucosa causada pela obstrução pilórica leva ao aumento da liberação de
acetilcolina, que age diretamente sobre as células parietais, induzindo a
secreção de ácido clorídrico (SHAY et al., 1945; LEWIS, HANSON, 1991;
LAKSHMI et al., 2009).
5.1.3.1 Ligadura de piloro
No modelo de ligadura de piloro foi avaliada a atividade do extrato
metanólico da M. vulgare e do composto diterpênico isolado, a marrubiína,
sobre a secreção de ácido, uma das mais importantes funções do estômago.
Quando os mecanismos homeostáticos estão prejudicados, o volume e a
acidez gástrica podem aumentar desproporcionalmente, superando assim as
defesas da mucosa gástrica, levando a formação de úlceras gástricas (LAPA et
al., 2008).
Ao quantificar o muco livre no tecido gástrico, foi observado que o
extrato da M. vulgare e a marrubiína, nas doses testadas, diminuiram
significativamente a produção de muco, quando comparado com o controle (p
<0,01) (Tab. 8). Estes resultados sugerem que o extrato tem efeito anti-
secretor, provavelmente relacionado com a marrubiína.
A via de administração no modelo de ligadura de piloro é a via
intraduodenal, que permite investigar as ações do extrato por via sistêmica,
excluindo as interações do contato direto com a mucosa gástrica. Os
resultados obtidos através deste modelo sugerem que os compostos presentes
no extrato possam estar atuando sobre a secreção ácida gástrica e que esta
atuação esta fortemente ligada ao composto isolado, a marrubiína.
69
Tabela 8. Efeitos da administração intraduodenal de cimetidina (100 mg/kg) e
das diferentes doses do extrato metanólico das partes aéreas da Marrubium vulgare (20, 50 e 100 mg/kg) nos parâmetros bioquímicos de camundongos submetidos à ligadura de piloro para avaliação da secreção ácida.
Tratamentos Dose
(mg/kg) pH
Volume de
secreção (mL)
[H+]
(mEq.g-1/L)
Controle Veículo 3,62 ± 0,13 0,74 ± 0,05 155,21 ± 16,02
EMMV
25 3,91 ± 0,18 0,39 ± 0,06* 123,34 ± 13,40
50 4,80 ± 0,41** 0,36 ± 0,09* 83,05 ± 15,13**
100 5,01 ± 0,24** 0,33 ± 0,08** 48,36 ± 4,36**
Marrubiína 25 4,46 0,32** 0,37 0,10** 94,99 15,98**
Cimetidina 100 5,49 ± 0,17** 0,38 ± 0,02* 40,55 ± 1,23**
EMMV = Extrato Metanólico da M. vulgare. Diferença significativa em relação ao grupo controle (*p<0,05 e **p<0,01), ANOVA, teste a posteriori de Dunnett.
5.1.3.2 Secreção de muco em mucosa gástrica
O envolvimento do extrato com a secreção gástrica instigou a
investigação dos mecanismos protetores da mucosa gástrica, pois estes
mecanismos protegem a mucosa contra inúmeros agentes agressores. O
primeiro mecanismo protetor investigado foi a produção de muco gástrico.
Quando a barreira de muco é afetada, o epitélio gástrico torna-se mais
sensível ao ataque de ácido produzido pelo estômago e, consequentemente,
leva à formação de úlceras gástricas.
O muco é um dos fatores protetores da mucosa gástrica, criando uma
barreira física contra bactérias, ácidos, toxinas, além de agir como um
lubrificante, reduzindo o atrito e os efeitos abrasivos sobre a mucosa. O muco
tem a capacidade de sequestrar radicais livres, devido a sua composição
glicoprotéica (NAM et al., 2005; WALLACE, 2007).
Um fármaco disponível, capaz de promover a produção de muco, é o
misoprostol (Citotec®). Trata-se de um análogo sintético da prostaglandina E1
que atua inibindo a secreção gástrica e estimulando a produção de muco,
protegendo o epitélio gástrico de lesões, principalmente as causadas por
AINEs. Porém, este fármaco apresenta sérios efeitos adversos que limitam seu
uso, como por exemplo, promover severas contrações uterinas, o que levou ao
uso como abortivo, sendo usado indiscriminadamente pela população, e devido
70
a isto, foi retirado do mercado, sendo proibida sua comercialização
(ARONSSON et al., 2007).
A busca por um novo tratamento que tenha ação semelhante, porém,
com menores efeitos indesejáveis seria interessante farmacologicamente, uma
vez que, o muco aderido à superfície da mucosa gástrica protege o epitélio
subjacente contra o ácido, pepsina e agentes necrotizantes como etanol e
indometacina (ALQASOUMI et al., 2009).
Após o tratamento com o extrato metanólico da M. vulgare nas doses de
25 (6,10 ± 0,41), 50 (6,78 ± 0,70) e 100 (7,04 ± 0,25) mg/kg e o composto
marrubiína na dose de 25 (6,52 0,34) mg/kg, houve um aumento significativo
na produção de muco quando comparados ao grupo controle (5,16 ± 0,26)
(Tab. 9). A carbenoxolona (200 mg/kg) mostrou-se efetiva como controle
positivo, pois promoveu o aumento de muco. A indometacina (100 mg/kg)
também mostrou-se efetiva como controle negativo, pois diminuiu a quantidade
de muco presente na mucosa gástrica.
Tabela 9. Efeitos da administração intraduodenal de carbenoxolona (200
mg/kg) e indometacina (100 mg/kg) e das diferentes doses do extrato metanólico das folhas da Marrubium vulgare (20, 50 e 100 mg/kg) nos parâmetros bioquímicos de camundongos submetidos à ligadura de piloro para avaliação da quantidade de muco ligada ao tecido.
Tratamentos Dose (mg/kg) Quantidade de Alcian Blue
ligado (mg/g tecido)
Salina Veículo 5,16 ± 0,26
Indometacina 100 3,07 ± 0,24
EMMV
25 6,10 ± 0,41**
50 6,78 ± 0,70**
100 7,04 ± 0,25**
Marrubiína 25 6,52 0,34**
Carbenoxolona 200 7,09 ± 0,42**
EMMV = Extrato Metanólico da M. vulgare.Diferença significativa em relação ao grupo controle (*p<0,05 e **p<0,01), ANOVA, teste a posteriori de Dunnett. (ABS = 0,0035 + 0,0081 * Conc; R
2: 0,998)
Desta forma, sugere-se que os compostos presentes no extrato de
alguma forma estejam atuando de maneira similar ao efeito produzido pelo
fármaco misoprostol (SULEYMAN et al., 2009).
71
5.1.4 Mecanismo de ação antiúlcera in vivo 5.1.4.1 Papel do óxido nítrico e do extrato metanólico da Marrubium vulgare em
úlceras agudas induzidas por etanol/HCl
Os resultados obtidos neste modelo demonstram que além de diminuir a
secreção ácida gástrica, o extrato metanólico da M. vulgare e a marrubiína
estimulam a produção de muco gástrico, ou seja, favorecem o aparecimento
dos fatores defensivos da mucosa, que pode estar relacionado com o aumento
do potencial antioxidante do muco (HAMAISHI; KOJIMA; ITO, 2006).
Em busca de mecanismos de gastroproteção possíveis, envolvidos na
atividade antiúlcera do extrato da M. vulgare e marrubiína, experimentos foram
realizados para verificar o envolvimento do óxido nítrico (NO) e dos compostos
sulfidrílicos (SHs).
Visto que o extrato metanólico da M. vulgare e o diterpeno marrubiína
apresentam ação gastroprotetora, provavelmente por atuar aumentando os
mecanismos antioxidantes, deste modo, testes na tentativa de elucidação do
mecanismo de ação (L-NAME e NEM) foram realizados.
Para investigar a influência do NO endógeno no efeito gastroprotetor do
extrato da M. vulgare e da marubiína, os ratos foram pré-tratados com um
inibidor da enzima óxido nítrico sintase (ONS), éster metílico NG-Nitro-L-
arginina (L-NAME), um análogo da L-arginina, que é hidrolisado para produzir
L-nitro arginina, inibindo a atividade da ONS. Isso faz com que a úlcera
induzida por etanol seja aumentada (ZANATTA et al., 2009).
O NO é um importante transmissor endógeno liberado pelas células
endoteliais, quando a mucosa está exposta a agentes nocivos. Sua principal
função é proteger a mucosa gástrica de agentes vasopressores e inibem a
secreção de ácido gástrico de células parietais (TULASSAY; HERSZÉNYI,
2010).
O L-NAME é uma substância capaz de inibir a enzima NOS. Em
modelos de avaliação da atividade gastroprotetora ligada a fatores
antioxidantes, verifica-se a participação do NO através da pré-administração de
L-NAME. Neste modelo, quando administrado o L-NAME aos animais antes
dos tratamentos com EMMV (100 mg/kg) e DM (25 mg/kg) , verificou-se que
72
estes perderam sua atividade gastroprotetora, quando comparado com animais
tratados somente com EMMV e DM.
Os resultados obtidos neste experimento demonstraram que a atividade
gastroprotetora do extrato metanólico da M. vulgare e da marrubiína
apresentaram alta correlação com a atividade do NO, uma vez que, foi
observada uma perda estatisticamente significativa da proteção após a
administração do L-NAME (Fig. 9).
Figura 9. Efeitos do extrato da M. vulgare (100 mg / kg), marrubiina (25 mg / kg) e carbenoxolona (200 mg / kg) nas lesões induzidas por etanol em ratos pré-tratados com L-NAME (70 mg / kg, ip) ou com salina (grupo controle). Os resultados são média ± EPM de seis ratos. A comparação estatística foi realizada utilizando ANOVA e pós teste de Tukey. ** P <0,01 quando comparado com o grupo controle, # p <0,01 quando comparados ao grupo L-NAME. Δ mostra a diferença entre os grupos pré-tratados com L-NAME e pré-tratados com salina (p <0,01).
Para investigar o envolvimento de sulfidrilas endógenas no efeito
gastroprotetor do extrato da M. vulgare e da marubiina foi utilizado o NEM (N-
etilmaleimida), um bloqueador de tiol dos grupos sulfidrila (SHs). SHs são
importantes para a proteção da mucosa gástrica, especialmente quando as
espécies reativas de oxigênio estão envolvidas na lesão da mucosa
(BARBASTEFANO et al., 2007).
Carbenoxolona + L-NAME
Carbenoxolona
Extrato da M. vulgare + L-NAME
Extrato da M. vulgare
Marrubiína + L-NAME
Marrubiína
%
Á r e a
d e l e s ã o
L-NAME Controle
Tratamentos
73
O NEM, ao diminuir a concentração de SH na mucosa, potencializa os
danos gástricos induzidos pelo etanol, danos estes associados à diminuição
significativa nos níveis de grupos sulfidrílicos (DEVI et al., 2007).
Figura 10. Efeitos do extrato da M. vulgare (100 mg/kg), marrubiína (25 mg/kg)
e carbenoxolona (200 mg/kg) nas lesões induzidas por etanol em ratos pré-tratados com NEM (10 mg/kg, ip) ou com solução salina (grupo controle). Os resultados são médios ± EPM de seis ratos. A comparação estatística foi realizada utilizando ANOVA e pós-teste de Tukey. ** p <0,01 quando comparado com o grupo controle, # p <0,01 quando comparado ao grupo NEM. Δ mostra a diferença entre os grupos pré-tratados com NEM e pré-tratados com salina (p <0,05).
Os dados sugerem que o mecanismo farmacológico do extrato da M.
vulgare está ligeiramente relacionado aos grupos sulfidrilas (Fig. 10).
Entretanto, na avaliação da participação dos grupamentos sulfidrílas
(SHs) endógenos envolvidos na gastroproteção, utilizando NEM (quelante de
grupamentos SHs), foi possível verificar que a substância isolada, marrubiína,
não age por esta via de gastroproteção, uma vez que não foi observada a
perda da gastroproteção nos grupos pré-tratados com NEM (Fig. 10).
Carbenoxolona + NEM
Carbenoxolona
Extrato da M. vulgare + NEM
Extrato da M. vulgare
Marrubiína + NEM
Marrubiína
Tratamentos NEM Controle
NEM Controle
%
Á r e a
d e l e s ã o
74
5.2 Obtenção, tratamento e caracterização da droga vegetal
5.2.1 Rendimento do material vegetal
Para a realização deste trabalho a planta foi coletada no município de
Bom Retiro em julho de 2009 (lote BR07/09) e em fevereiro de 2010 (lote
BR02/10).
Para o cálculo dos rendimentos de material fresco e seco, e
consequentemente da perda por secagem (%), foram pesadas,
separadamente, antes e após a secagem, as partes aéreas dos lotes BR07/09
e BR02/10. Os resultados estão descritos na Tabela 5.
Tabela 10. Rendimentos do material vegetal (fresco e seco) obtido nas
diferentes coletas e perda por secagem (PPS)
Coleta Material Fresco (g) Material Seco (g) PPS (%)
BR 07/09 (inverno) 3400 745,00 78,08
BR 02/10 (verão) 1700 208,56 87,73
BR refere-se ao local de coleta; os dois primeiros dígitos reportam-se ao mês da coleta e os dois últimos ao ano da coleta. Nd =valores não determinados de coletas anteriores ao desenvolvimento deste trabalho.
O maior rendimento de planta seca, considerando todas as partes
aéreas, foi obtido da coleta realizada em Bom Retiro/SC no inverno de 2009
(Tab. 10), sendo 61% representado pelas folhas (Tab. 11). O menor
rendimento, obtido em Bom Retiro pode estar relacionado com as condições
climáticas menos favoráveis ao desenvolvimento da planta no período de julho
de 2009 a fevereiro de 2010.
75
Tabela 11. Rendimento seco das partes vegetais da M. vulgare coletadas em
Bom Retiro/SC nas diferentes épocas. Coletas Partes da planta (%)
Folhas Caules Flores
BR 07/09 (inverno) 61,07 38,93 0,00
BR 02/10 (verão) 42,57 51,96 5,47
BR refere-se ao local de coleta; os dois primeiros dígitos reportam-se ao mês da coleta e os dois últimos ao ano da coleta.
No inverno, houve maior desenvolvimento de folhas e ausência de
flores. Assim, o maior rendimento de material seco total (Tab. 10) está
relacionado à maior quantidade de folhas presentes nesta coleta (BR07/09), e
menor desenvolvimento de caules.
5.2.2 Perda por dessecação
O teor de umidade, determinado por método gravimétrico
(FARMACOPEIA BRASILEIRA, 2010), corresponde aos valores descritos na
Tabela 7.
Tabela 12. Perda por dessecação das partes aéreas secas e trituradas da M. vulgare coletadas em Bom Retiro nas diferentes épocas.
Amostra média(%) ± DP (DPR%)
Primeira secagem Segunda secagem
Caule 5,71 0,11 (1,86) 5,64 0,02 (0,35)
BR07/09 (inverno) Folhas 9,26 0,16 (1,68) 3,29 0,12 (3,67)
Flores Não existente Não existente
Caules 1,51 ± 0,05 (3,26) Nd
BR02/10 (verão) Folhas 4,11 ± 0,07 (1,75) Nd
Flores 2,90 ± 0,09 (3,20) Nd
BR refere-se ao local de coleta; os dois primeiros dígitos reportam-se ao mês da coleta e os dois últimos ao ano da coleta.
DP = desvio padrão; DPR = desvio padrão relativo. Nd = valores não determinados para o material vegetal procedente desta coleta.
O teor de umidade foi determinado de acordo com o método descrito na
Farmacopeia Brasileira (2010). Esse método baseia-se na perda por
dessecação em estufa e visa determinar a quantidade de substância(s)
volátil(eis) de qualquer natureza eliminada(s). Esta determinação é importante
76
para o controle de qualidade microbiológico, pois um excesso de água na
droga vegetal favorece o crescimento de fungos e bactérias, podendo também
levar à hidrólise de seus constituintes (SHARAPIN, 2000). Além de, sob o
ponto de vista tecnológico e de produção, é importante conhecer
quantitativamente, o conteúdo de água presente na matéria-prima, para que
este valor seja considerado nos cálculos de rendimento (PAULA, 1996).
Foi observado que os teores de umidade encontrados para todas as
amostras são inferiores ao limite máximo de 14% estabelecido pela
Farmacopeia Brasileira (2010). Por outro lado, em relação ao limite mínimo,
pôde-se observar que algumas amostras analisadas apresentaram valores
abaixo de 8%.
Como o protocolo adotado nesta etapa focou o benefício para a
operação de moagem, procedeu-se a secagem adicional a fim de tornar o
material vegetal mais friável. No caso da última coleta, realizada no verão de
2010, o teor de umidade foi extremamente reduzido, tornando-se
desnecessária operação adicional.
5.2.3 Caracterização química por cromatografia em camada delgada
Esta etapa teve por objetivo determinar os possíveis marcadores
químicos para o controle de qualidade da M. vulgare, bem como avaliar
comparativamente as diferentes amostras da droga vegetal. Como extrato de
referência foi utilizado o extrato metanólico, por representar uma matriz mais
complexa em termos de grupos de substâncias de interesse químico e
farmacológico. Para tanto, foram analisados os dois lotes de droga vegetal,
anteriormente citado (Tab. 10), incluindo um extrato metanólico procedente de
coleta realizada em Bom Retiro, no ano de 2006 (EMBR06).
Foram utilizados sistemas cromatográficos específicos para
investigação do diterpeno marrubiína isolado da M. vulgare, usado como
substância marcadora e que teve sua atividade gastroprotetora anteriormente
testada.
Os padrões de ácido ursólico e marrubiína b-sitosterol foram bem
evidenciados em todos os extratos analisados (Fig. 11 e 13).
77
Figura 11. Cromatoplaca em camada delgada dos extratos metanólicos dos lotes 1. BR06; 2. BR07/09; 3. BR02/10; AU. padrão de ácido
ursólico, eluídos em Clorofórmio : metanol (8,5:1,5) e revelados com anisaldeído sulfúrico.
Figura 12. Cromatoplaca em camada delgada dos extratos metanólicos dos
lotes 1. BR06; 2. BR07/09; 3. BR02/10; . Padrão de beta-
sitosterol, eluídos Hexano: Acetato de etila (7:3) e revelados com anisaldeído sulfúrico.
1 2 3 AU
1 2 3
78
Figura 13. Cromatoplaca em camada delgada dos extratos metanólicos dos lotes 1. EMBR06 2. BR07/09; 3. BR02/10; M. padrão de
marrubiína; eluídos em clorofórmio: metanol (9,8:0,2) e revelados com anisaldeído sulfúrico.
5.2.4 Análise cromatográfica por CG
Os extratos metanólicos produzidos com as plantas coletadas nos
diferentes anos (BR07/09, BR02/10), o extrato metanólico EMBR06, e o padrão
de marrubiína (Fig. 14A), foram submetidos à análise qualitativa. Todas as
análises realizadas apontaram para presença de marrubiína (Fig. 14 e 15).
1 2 3 M
79
Figura 14. Cromatograma obtido por cromatografia gasosa. A = padrão marrubiína isolada da M. vulgare; B = extrato metanólico
EMBR06.
Padrão marrubiína EMBR06 A B
80
Figura 15. Cromatograma obtido por cromatografia gasosa dos extratos metanólicos. C = lote BR02/10 e D = lote BR07/09.
BR02/10 BR07/09 C D
81
5.2.5 Análise granulométrica
Após as etapas de coleta, secagem e moagem grosseira, cada parte da
planta foi caracterizada quanto ao tamanho de partículas. A distribuição
granulométrica está representada na Tabela 8 e ilustrada no histograma da
frequência da massa retida (%) em função das classes granulométricas (Fig.
14) referentes a cada lote.
Tabela 13. Distribuição granulométrica (%) das partes aéreas secas e
trituradas da M. vulgare e granulometria média (Gmédia)
Classe granulométrica (mm) Gmédia
Amostra 0,0 -1,00
(<1,0) 1,00 - 2,00
2,00 – 5,00 (>2,0)
(mm)
BR07/09 (inverno)
Caule 17,85 44,13 38,02 2,08
Folha 35,96 31,71 32,33 1,79
Flor Nd Nd Nd Nd
BR02/10 (verão)
Caule 5,22 41,71 53,07 2,51
Folha 11,18 35,69 53,13 2,45
Flor 29,30 12,73 34,09 1,53 BR refere-se ao local de coleta; os dois primeiros dígitos reportam-se ao mês da coleta e os dois últimos ao ano da coleta. DP = desvio padrão; DPR = desvio padrão relativo. Nd = valores não determinados para o material vegetal procedente desta coleta.
Na Figura 16, pode-se verificar que a distribuição granulométrica não foi
uniforme, em se tratando de uma mesma parte do vegetal. Também não houve
correlação entre a perda por dessecação e a maior redução do tamanho de
partícula. Uma explicação plausível para esta variabilidade pode estar
relacionada com a formação de aglomerados de partículas ao serem trituradas.
Assim, quando submetidas à vibração, as partículas finas permanecem nos
tamises de maior abertura de malha, ao serem envolvidas pelas partículas mais
filamentosas, as quais provavelmente tenham origem na grande quantidade de
tricomas das folhas e caules. Ainda há que se considerar a própria
heterogeneidade do material vegetal analisado, uma vez o mesmo havia sido
submetido a apenas um corte grosseiro em moinho de facas.
82
Figura 16. Distribuição granulométrica das partes aéreas secas e trituradas da
M. vulgare.
Apesar de não haver uma reprodutibilidade entre os diferentes lotes de
folhas, caules e flores, foi possível identificar para uma mesma coleta, que os
caules apresentaram granulometria sempre maior que as folhas e flores.
Figura 17. Análise granulométrica das partes aéreas secas e trituradas da M.
vulgare.
(1,00 mm – 2,00 mm)
(>2,0 mm) (<1,0 mm)
83
5.2.6 Teor de extrativos solúveis em água
Segundo uma Organização Mundial de Saúde, este método determina a
quantidade de princípios ativos extraídos com solventes a partir de uma
determinada quantidade de plantas medicinais. É empregado para os materiais
para os quais ainda nenhum produto químico adequado ou ensaio biológico
existe (WHO, 1998).
Considerando-se o teor de extrativos obtido para as partes aéreas da M.
vulgare (Tab. 14), pôde-se verificar que não houve considerável variação na
concentração das substâncias extraíveis em água quente, e, portanto, não se
constatou diferenças importantes entre as épocas de coleta que possam estar
relacionadas a estação climática.
Tabela 14. Teor de extrativos das partes aéreas secas e trituradas da M.
vulgare. Amostra média (%) ± DP (DPR%)
BR07/09 (inverno) 31,95 2,32 (7,26)
BR02/10 (verão) 33,47 0,13 (0,39)
BR refere-se ao local de coleta; os dois primeiros dígitos reportam-se ao mês da coleta e os dois últimos ao ano da coleta. DP = desvio padrão; DPR = desvio padrão relativo. 5.2.7 Teor de fenólicos totais equivalentes a ácido gálico (EAG)
Para a determinação do teor de fenólicos totais na droga vegetal foi
construída a curva analítica, a partir da solução aquosa/etanólica de ácido
gálico a 5 mg/mL, nas concentrações de 0,05 a 6 µg/mL, com a qual se obteve
a equação da reta y= 0,0977x – 0,0002 com coeficiente de correlação r2=
0,9991 (Fig. 18).
84
Figura 18. Curva analítica de ácido gálico em 750 nm.
O teor de fenólicos totais equivalentes a ácido gálico (EAG) dos
diferentes lotes foi expresso em ácido gálico e estão descritos na Tabela 15.
Tabela 15. Teor de fenólicos totais no vegetal coletada em diferentes épocas e
locais.
Amostra média (mg/g) DP (DPR%)
BR07/09 (inverno) 7,09 1,44 (20,36)
BR02/10 (verão) 8,18 1,45 (17,72)
BR refere-se ao local de coleta; os dois primeiros dígitos reportam-se ao mês da coleta e os dois últimos ao ano da coleta. DP = desvio padrão; DPR = desvio padrão relativo.
O teor de fenólicos totais equivalente a ácido gálico (EAG) na droga
vegetal variou entre 7,09 e 8,18 mg/g. Os valores demonstram que dentre as
amostras coletadas em Bom Retiro/SC, o verão é a época mais propícias para
se obter a droga vegetal com maior teor de fenólicos. Entretanto os valores
obtidos não podem ser considerados conclusivos.
85
5.2.8 Teor de flavonóides totais na droga vegetal
Para a determinação dos flavonóides foi utilizada a da metodologia de
Chang et al. (2002) que utiliza o cloreto de alumínio (AlCl3) para avaliar a
presença de grupamentos químicos de flavonóides. O composto é empregado
como um reagente de deslocamento em espectrometria no UV-visível para a
determinação estrutural dos flavonóides. A leitura é feita em espectrofotômetro
a 420 nm. Nestas condições o complexo flavonóide-Al absorve mais
intensamente e em comprimento de onda maior do que o flavonóide sem a
presença do agente complexante. Os ácidos fenólicos, mesmo os que formam
complexos com o AlCl3, absorvem em comprimentos de onda inferiores,
evitando-se desta maneira interferências nas medidas da absorbância
(LIANDA, 2009).
Para a determinação do teor de flavonóides em quercetina, foi
construída a curva analítica, a partir de uma solução de quercetina a 1 mg/mL,
que deu origem às concentrações que variaram de 0,9 a 10,9 x 10-3 mg/mL,
resultando na equação da reta y= 12,355x – 0,0015, com coeficiente de
correlação r2= 0,9987 (Fig. 19).
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0 0,001 0,002 0,003 0,004 0,005 0,006 0,007 0,008 0,009 0,01 0,011 0,012
Concentração de quercetina (mg/mL)
Ab
so
rbâ
nc
ia (
U.A
.)
Figura 19. Curva analítica de quercetina em solução hidroalcoólica (70%) em
415 nm.
86
O teor de flavonóides totais, equivalente a quercetina (EQ), dos
diferentes lotes foi estão descritos na Tabela 16.
Tabela 16. Resultados da caracterização da droga vegetal quanto ao teor de
flavonóides totais.
Amostra média (mg/g) DP (DPR%)
BR07/09 (inverno) 3,05 0,74 (24,24)
BR02/10 (verão) 2,52 0,13 (5,21)
BR refere-se ao local de coleta; os dois primeiros dígitos reportam-se ao mês da coleta e os dois últimos ao ano da coleta. DP = desvio padrão; DPR = desvio padrão relativo.
Vários fatores ambientais influenciam a produção de flavonóides nas
plantas, como, por exemplo, temperatura, nutrição, injúria, metabolismo do
açúcar e do nitrogênio e qualidade de radiação (BLANK, 1947). A radiação
solar é um dos fatores que, via de regra, está relacionada à variação
quantitativa. Muitos trabalhos demonstraram que há um aumento quantitativo
de flavonóides em órgãos expostos à luz, em comparação com aqueles que
estão à sombra. Com relação a fatores edáficos, a maioria dos trabalhos com
flavonóides envolve a análise de pigmentos florais, havendo diferenças
qualitativas nos perfis flavonoídicos das plantas provenientes de diferentes
solos (SANTOS; BLATT, 1998).
No entanto, segundo os resultados do TFT apresentados na Tabela 15,
observa-se, pelo elevado desvio padrão relativo, que não foi possível identificar
diferença estatisticamente significativa entre amostras coletadas no inverno e
verão.
Os resultados encontrados para flavonóides totais para a M. vulgare são
equiparáveis a outras espécies. Yariwake et al. (2005) ao estudarem a
variabilidade química sazonal em Maytenus aquifolium encontraram 1,349 a
3,859 mg flavonóides/g folhas secas. No entanto, os trabalhos citados na
literatura para outras espécies, evidenciam maior teor de flavonóides na
primavera e verão, relacionando a maior expressão de compostos polifenólicos
com os fotoperíodos mais longos (HARBONE, 1994). No presente estudo,
porém, a estação climática não foi preponderante.
87
5.3 Desenvolvimento das soluções extrativas
Esta etapa foi realizada com o objetivo de selecionar o método e o
solvente para a extração das principais classes de compostos, utilizando-se da
cromatografia em camada delgada como técnica de triagem. Para tanto, foram
realizadas extrações com diferentes solventes e métodos de extração, levando-
se em conta a sua viabilidade no preparo de fitoterápicos. Nesse sentido optou-
se por trabalhar com misturas hidroetanólicas e água como solventes, e pela
decocção, infusão e maceração como métodos extrativos (Fig. 20).
As soluções extrativas foram obtidas a partir da droga vegetal,
representada pelas partes aéreas da M. vulgare, secas e trituradas,
respeitando-se as proporções de folhas, caules e flores provenientes de cada
coleta (Tab. 6). Nesta etapa do estudo, foi fixada a concentração de 2,5% (m/V)
como relação planta:solvente. Esta relação planta:solvente foi escolhida para
se evitar um eventual efeito de saturação de solvente.
As soluções extrativas obtidas de cada coleta, solvente e método, foram
caracterizadas quanto ao resíduo seco, CCDs qualitativas, pH e teor de
fenólicos.
As diferentes coletas foram utilizadas como amostras representativas de
diferentes locais e épocas do ano, a fim de se conhecer os efeitos destas
variáveis sobre as características químicas e físico-químicas, apresentadas a
seguir.
88
Figura 20. Esquema de desenvolvimento dos extratos da M. vulgare utilizados para seleção do solvente e método de extração.
5.3.1 Caracterização química por cromatografia em camada delgada dos
extratos metanólicos, hidroalcoólicos e aquosos
Os perfis cromatográficos dos extratos hidroalcoólicos, aquosos e
metanólicos dos lotes BR07/09 e BR02/10 da M. vulgare, apresentaram a
mancha referente à marrubiína entre seus compostos, independente da época
de coleta.
Todos os extratos hidroalcoólicos e aquosos apresentaram evidências
de marrubiína variando apenas a intensidade da mancha, o que pode estar a
relacionado à concentração em que esta substância encontra-se em
determinado extrato analisado. Entretanto, a maior intensidade das manchas
referentes a estas substâncias foi evidenciada no perfil cromatográfico dos
extratos aquosos obtidos por infusão (5) e decocção (4) do lote BR02/10 (Fig.
21). Este comportamento pode estar relacionado à maior solubilidade desta
classe de compostos em solventes orgânicos e do maior aporte de calor no
processo de extração aquosa por decocção.
89
Após a análise dos cromatograma para terpenóides (Figura 21)
confirmou-se a marrubiína como substância de referência para a análise de
controle de qualidade da M. vulgare, já que preenche os quesitos para um bom
marcador ideal, sendo específico para a droga vegetal em estudo, abundante e
farmacologicamente ativo.
Figura 21. Cromatoplacas em camada delgada dos extratos hidroalcoólicos 90, 70 e 50% (1, 2 e 3 respectivamente), aquosos obtidos pela decoção (4) e infusão (5), metanólico (6) e o padrão marrubiína (M); confeccionados com a M. vulgare dos diferentes lotes de coleta (BR07/09 e BR02/10); eluídos em clorofórmio:Metanol (9,8:0,2) e reveladas com anisaldeído sulfúrico.
5.3.2 Determinação pH e resíduo seco nos extratos metanólicos,
hidroalcoólicos e aquosos
O resultado do resíduo seco foi expresso em relação a 100 g do extrato,
pela média de três determinações, conforme descrito na Tabela 12.
Observou-se que, para o lote BR02/10, o resíduo seco foi diretamente
proporcional ao aumento da polaridade nos sistema solvente entre as misturas
hidroalcoólicas. Já o resíduo seco dos extratos aquosos sofreu maior influência
da época de coleta. No lote BR07/09 o resíduo seco do infuso foi discretamente
superior ao decocto. Não houve diferença significativa quanto ao resíduo seco
entre os extratos obtidos por decocção e infusão do lote BR02/10.
1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7
BR07/09 BR02/10
1 2 3 4 5 6 M
1 2 3 4 5 6 M 1 2 3 4 5 6 M
90
Por outro lado, o resíduo seco dos extratos hidroalcoólicos foi
inversamente relacionado à presença de marrubiína evidenciada na
cromatoplaca (Fig. 21), demonstrando que o resíduo seco deve ser associado
a outros parâmetros de qualidade como critério de decisão para a finalidade
que se pretende alcançar.
O pH é um parâmetro físico importante para avaliar a estabilidade e a
qualidade da preparação. As leituras de pH foram produzidas em triplicata e os
resultados estão apresentados a seguir, na tabela 17. Os diferentes métodos
(infusão e decocção) e solventes (água e misturas hidroalcoólicas) tiveram
fraca influência sobre o pH das soluções extrativas, que apresentaram valores
entre 5,88 e 6,10 (Tab. 17).
Tabela 17. Características de pH (média ± DP (DPR%) e resíduo seco (média
± DP (DPR%) das soluções extrativas das partes aéreas da M. vulgare.
Amostra Extratos pH Resíduo seco (mg/mL)
EAD 6,07 0,077 (1,28) 1,57 0,0474 (3,01)
EAI 6,04 0,055 (0,92) 1,87 0,0156 (0,83)
BR07/09 EM 5,99 0,040 (0,67) 1,42 0,0311 (2,19)
EH90 6,03 0,032 (0,53) 1,09 0,0202 (1,85)
EH70 6,02 0,047 (0,79) 1,65 0,0577 (3,48)
EH50 5,95 0,066 (1,12) 1,59 0,0352 (2,20)
EAD 6,01 0,040 (0,67) 0,71 0,0275 (2,09)
EAI 5,88 0,110 (1,88) 0,73 0,0222 (3,01)
BR02/10 EM 6,02 0,045 (0,76) 0,45 0,0091 (1,99)
EH90 5,91 0,116 (1,96) 0,43 0,0103 (2,38)
EH70 6,08 0,030 (0,50) 0,55 0,0116 (2,08)
EH50 6,10 0,081 (1,43) 0,67 0,0191 (2,81)
BR refere-se ao local de coleta; os dois primeiros dígitos reportam-se ao mês da coleta e os dois últimos ao ano da coleta. DP = desvio padrão; DPR = desvio padrão relativo. EAD = extrato aquoso por decocção; EAI = estrato aquoso por infusão; EM = extrato metanólico; EH90= extrato hidroalcoólico 90%; EH70= extrato hidroalcoólico 70%; EH50 = extrato hidroalcoólico 50%.
91
5.3.3 Determinação de fenólicos totais nos extratos metanólicos,
hidroalcoólicos e aquosos
Para a determinação do teor de fenólicos totais equivalentes a ácido
gálico (EAG) nos diferentes extratos foi construída a curva analítica do ácido
gálico (Fig. 22), nas concentrações de 0,5 a 10 µg/mL, com a qual se obteve a
equação da reta y= 0,1166x + 0,0330 com coeficiente de correlação r2= 0,9961.
Figura 22. Curva analítica de ácido gálico em 750 nm.
Os resultados foram expressos em mg/mL de fenólicos totais, calculados
com relação ao padrão de ácido gálico, pela média de duas determinações,
através da equação da reta e estão representados na tabela 18.
Analisando-se os resultados das amostras coletadas em Bom Retiro, os
maiores teores de fenólicos totais (TF) foram evidenciados nos extratos
hidroalcoólicos 70%. Dentre eles, o maior TF foi obtido da planta coletada no
verão, cujo extrato aquoso apresentou o maior valor (0,95 mg/mL).
Bom Retiro/2010
92
Tabela 18. Teor de fenólicos totais (mg/mL) nos diferentes extratos (2,5%, m/V)
produzidos a partir das amostras vegetais da M. vulgare coletadas em Bom Retiro nas diferentes épocas.
Amostra Extratos Teor de fenólicos (mg/mL)
EAD 0,35 0,025 (7,04)
EAI 0,55 0,033 (6,08)
BR07/09 (inverno) EM 0,38 0,046 (12,06)
EH90 0,29 0,116 (39,97)
EH70 0,93 0,004 (0,42)
EH50 0,62 0,077 (12,41)
EAD 0,40 0,026 (6,51)
EAI 0,59 0,023 (3,84)
BR02/10 (verão) EM 0,44 0,009 (2,16)
EH90 0,36 0,012 (3,27)
EH70 0,95 0,015 (1,53)
EH50 0,63 0,008 (1,23)
BR refere-se ao local de coleta; os dois primeiros dígitos reportam-se ao mês da coleta e os dois últimos ao ano da coleta. DP = desvio padrão; DPR = desvio padrão relativo. EAD = extrato aquoso por decocção; EAI = estrato aquoso por infusão; EM = extrato metanólico; EH90= extrato hidroalcoólico 90%; EH70= extrato hidroalcoólico 70%; EH50 = extrato hidroalcoólico 50%.
5.4 Otimização do Processo Extrativo
Os resultados das etapas de caracterização de diferentes extratos,
aliados à facilidade de transposição para a produção de um fitoterápico
apontaram para a escolha do álcool 70% como solvente e da maceração como
método extrativo. O estudo de otimização buscou identificar a influência das
variáveis tempo e relação planta:solvente, bem como identificar a melhor
condição, visando maximizar o teor de marrubiína. Como grupo de marcador
suplementar elegeu-se os fenólicos totais.
Como droga vegetal para a produção dos extratos, foi empregada o lote
BR07/09, considerando a maior quantidade de material disponível para os
estudos tecnológicos.
Foi planejado um delineamento fatorial 32, no qual foram estudados dois
fatores (A = tempo e B = relação planta:solvente) em três níveis (A = 5, 10 e 15
dias; B = 5, 7,5 e 10%, m/V). Os experimentos foram ordenados ao acaso e
93
sem reposição. Para caracterização dos extratos obtidos utilizou-se as técnicas
de CCD, resíduo seco (RS), teor de fenólicos (TF) por espectrofotometria no
UV e teor de marrubiína (TM) por cromatografia gasosa.
É importante que a matéria-prima vegetal esteja suficientemente
pulverizada para que se consiga um rendimento ótimo no processo de extração
dos constituintes químicos de interesse farmacêutico. O processo de
pulverização da matéria prima vegetal constitui uma etapa crítica na produção
de medicamentos fitoterápicos, uma vez que o produto pulverizado representa
na maioria das vezes o insumo indispensável para obtenção de preparações
intermediárias, desse modo, o controle da tenuidade de pós é uma etapa óbvia
no processo de produção (SILVA JR, 2006).
Portanto, nesta etapa de otimização do processo extrativo por
maceração, optou-se por realizar uma moagem adicional no material já
triturado, a fim de se obter uma granulometria mais uniforme do lote BR07/09,
visto que a granulometria da matéria-prima vegetal é o parâmetro que
determina a superfície de contato disponível para a interação com o solvente
utilizado.
Figura 23. Distribuição granulométrica das partes aéreas secas e moídas do
lote BR07/09
0
10
20
30
40
50
60
0-180 180-425 425-600 600-710 710-850 850-1000 1000-2000
classe granulométrica (um)
Fra
ção
reti
da (
%)
94
A determinação da distribuição granulométrica demonstrou
especificações equivalentes a um pó grosso, de acordo com a Farmacopéia
Brasileira (2010). A matéria-prima vegetal em análise representa a mistura de
folhas (61%) e caules (39%) após o processo de moagem adicional em moinho
de martelos. A distribuição granulométrica para esta amostra apresentou quase
50% de partículas entre 1,0 e 2,0 mm e menos que 30% das partículas passou
pelo tamis com abertura nominal de malha de 425 µm (Fig. 23). A
granulometria média foi 2,86 mm 0,463 (16,18). Embora seja possível notar a
diferença no aspecto visual das folhas e caules antes e após a moagem no
moinho de martelos (Fig. 24), verificou-se que mesmo após a moagem
adicional, não houve redução da Gmédia. Ao contrário, houve um deslocamento
para o aumento na % de partículas de maior tamanho. Este comportamento
pode ser devido à maior tendência de formação de aglomerados de partículas
fibrosas que englobam as partículas mais finas, especialmente quando a
amostra é composta de diferentes partes vegetais.
95
Figura 24. Aspectos visuais da distribuição granulométrica da droga vegetal. (A) Folhas trituradas. (B) Mistura de folhas e caules após a
moagem adicional em moinho de martelos.
Após realização do processo de padronização da granulometria das
partículas, realizou-se a produção dos extratos variando-se a quantidade de
planta e o tempo de extração de cada solução (Fig. 25).
A
B
96
Figura 25. Esquema de otimização do desenvolvimento dos extratos da M.
vulgare.
Os valores das determinações do pH, dos extratos obtidos por
maceração em meio hidroalcoólico estão descritos na tabela 19. Para cada
método de extração, as respostas estudadas (RS, TM e TFT) foram ajustadas
através de um modelo matemático de segunda ordem de acordo com a
equação: Y = β0 + β1*Conc + β2*T + β12 Conc*T + β11*Conc2+ β22*T2, onde
y = resposta estudada, β0... β22 = coeficientes, Conc = concentração de
fenólicos totais na solução extrativa, T = tempo de maceração.
Os valores de pH estão em conformidade com os resultados já descritos
anteriormente no item desenvolvimento de soluções extrativas. Naquela etapa,
o extrato EH70 a 2,5% (m/V) apresentou pH de 6,02 0,047, condizente com
os valores apresentados nos extratos preparados com o mesmo solvente na
presente etapa. Os resultados sugerem que o pH é proporcional à relação
planta:solvente, porém variam de levemente ácidos até muito próximos a
neutralidade.
97
Tabela 19. Teor de marrubiína, resíduo seco e pH das soluções extrativas
obtidas segundo o planejamento fatorial 32 para a otimização das condições extrativas do processo de maceração das partes aéreas com álcool 70 % (V/V)
Fator A Fator B pH* RS* % (m/m) TM* (mg/mL)
5,0 (-1) 5 (-1) 5,89 0,007 (1,25) 0,867 ± 0,010
(1,16) 3,44 ± 0,40 (11,63)
5,0 (-1) 10 (0) 5,95 0,021 (2,45) 0,914 ± 0,013
(1,38) 1,53 ± 0,01 (0,65)
5,0 (-1) 15 (+1) 6,13 0,022 (2,21) 0,805 ± 0,021
(2,56) 2,17 ± 0,54 (24,95)
7,5 (0) 5 (-1) 6,05 0,005 (1,33) 0,946 ± 0,019
(2,05) 6,46 ± 0,84 (13,08)
7,5 (0) 10 (0) 6,31 0,022 (1,55) 0,985 ± 0,024
(2,46) 4,38 ± 0,21 (4,72)
7,5 (0) 15 (+1) 6,36 0,084 (2,50) 1,016 ± 0,026
(2,55) 2,55 ± 0,09 (3,52)
10,0 (+1) 5 (-1) 6,33 0,007 (1,28) 1,592 ± 0,029
(1,80) 3,76 ± 0,60 (16,01)
10,0 (+1) 10 (0) 6,45 0,013 (1,98) 1,590 ± 0,021
(1,33) 5,08 ± 0,28 (5,61)
10,0 (+1) 15 (+1) 6,51 0,032 (2,01) 1,585 ± 0,009
(0,54) 3,83 ± 1,07 (28,00)
Fator A = relação planta solvente (%, m/V); Fator B = tempo de extração (dias). -1: nível inferior; 0: nível intermediário; +1: nível superior. TM = teor de marrubiína; RS = resíduo seco; *resultados expressos pela média ± desvio padrão (desvio padrão relativo).
Os dados experimentais do RS das soluções extrativas obtidas por
maceração foram ajustados através do modelo quadrático (RS = 1,0009 +
0,0003*T + 0,727*Conc – 0,0557*T2 + 0,0275*T*Conc + 0,4863*Conc2), sendo
que cerca de 99,33 % da variação experimental pode ser explicada pelo
modelo proposto. De acordo com a análise de variância, o coeficiente linear da
concentração, apresentou significância estatística (p = 0,0003). A significância
do coeficiente é refletida no gráfico de superfície de resposta (Fig. 26), onde
pode ser constatado que a concentração foi o fator a apresentar maior
influência, devido ao maior grau de significância, sobre o RS das soluções
extrativas. Além disso, a relação quadrática de planta:solvente também
apresentou significância estatística (p = 0,0047).
98
Figura 26. Superfície de respostas para o Resíduo seco das soluções
extrativas da M. vulgare obtidas por maceração.
Figura 27. Superfície de respostas para o Teor de Marrubiína das soluções extrativas da M. vulgare obtidas por maceração.
A extração do TM comporta-se de modo decrescente, quando se
analisado o tempo de extração, havendo uma obtenção de maiores
quantidades de marrubiína no nível intermediário de tempo, exceto no menor
nível de relação planta:solvente. Na tabela 19, observa-se que os maiores
teores de marrubiína (TM) foram obtidos no nível inferior (5 dias) e
intermediário de tempo (10 dias), para os níveis de relação planta:solvente de
7,5 e 10%, respectivamente. Para o nível de relação planta:solvente de 5%, o
maior TM foi obtido no nível inferior de 5 dias, seguido do nível superior de 15
dias.
99
Os dados experimentais de TM foram ajustados através do modelo
quadrático (TM = 4,4378 + 1,8433*Conc -1,70333 *T + 0,67 Conc*T - 2,32333
Conc2 + 0,0766667 *T2), porém este modelo proposto explica apenas 68,31%
da variação experimental. Nem o tempo de extração ou a relação
planta:solvente foram significativos sobre o teor de marrubiína (p = 0,2319 e p
= 0,2042, respectivamente).
Talvez este comportamento possa estar relacionado a outros fatores não
estudados neste delineamento, supostamente ligados à estabilidade da
marrubiína, pois em todos os níveis de concentração houve certo grau de
redução do TM ao longo do tempo, mas não foi possível identificar nenhuma
relação de proporcionalidade.
Para as soluções extrativas obtidas por maceração, os dados
experimentais de TFT foram ajustados através do modelo quadrático (TFT =
0,7751 + 0,0376*T + 0,4186*Conc – 0,0463*T2 + 0,0405*T*Conc +
0,1726*Conc2), sendo que cerca de 92,93% da variação experimental pode ser
explicada pelo modelo proposto.
Os resultados do teor de fenólicos totais equivalentes a ácido gálico
(EAG) estão descritos na Tabela 20. A fim de se avaliar um eventual efeito de
saturação na reação com Folin Ciocalteau, foram testadas duas diluições. Os
resultados apontam que a diluição 1:2 é a mais indicada, pois a diluição 1:1
não foi diretamente proporcional à concentração esperada, sugerindo o efeito
de saturação do reagente.
100
Tabela 20. Teor de fenólicos totais equivalentes a ácido gálico (EAG) das
soluções extrativas obtidas segundo o planejamento fatorial 32 para a otimização das condições extrativas do processo de maceração das partes aéreas com álcool 70 % (V/V)
Fator A Fator B TFT* (mg/mL)
Diluição 1:1 Diluição 1:2
5,0 (-1) 5 (-1) 0,769 ± 0,002 (0,307) 0,672 ± 0,021 (3,110)
5,0 (-1) 10 (0) 0,722 ± 0,002 (0,327) 0,635 ± 0,004 (0,558)
5,0 (-1) 15 (+1) 1,051 ± 0,003 (0,297) 0,603 ± 0,008 (1,281)
7,5 (0) 5 (-1) 0,771 ± 0, 033 (4,290) 0,688 ± 0,005 (0,773)
7,5 (0) 10 (0) 0,907 ± 0,016 (1,805) 0,733 ± 0,020 (2,724)
7,5 (0) 15 (+1) 1,104 ± 0,018 (1,669) 0,858 ± 0,006 (0,745)
10,0 (+1) 5 (-1) 0,772 ± 0,011 (1,403) 1,012 ± 0,025 (2,453)
10,0 (+1) 10 (0) 0,924 ± 0,001 (0,128) 1,130 ± 0,011 (0,979)
10,0 (+1) 15 (+1) 1,250 ± 0,008 (0,620) 1,024 ± 0,035 (3,462)
Fator A = relação planta solvente (%, m/V); Fator B = tempo de extração (dias). -1: nível inferior; 0: nível intermediário; +1: nível superior. TFT = teor de fenólicos totais equivalentes a ácido gálico (EAG); *resultados expressos pela média ± desvio padrão (desvio padrão relativo).
De acordo com a análise de variância, apenas o coeficiente de
concentração apresentou significância estatística (p = 0,0090). No gráfico de
superfície de resposta (Figura 28), visualiza-se que o maior tempo e maior
relação planta:solvente, levam a um maior TFT.
Figura 28. Superfície de respostas para o Teor de Fenólicos totais
equivalentes a ácido gálico (EAG), das soluções extrativas da M. vulgare obtidas por maceração.
101
Os resultados da otimização da extração indicam a necessidade de
investigação de estudos de estabilidade da marrubiína e outros fatores que
influenciam a extração, como a agitação, temperatura e polaridade do solvente.
102
5 CONCLUSÕES
1) O extrato metanólico da M. vulgare apresenta atividade gastroprotetora,
assim como seu composto isolado, o diterpeno marrubiína.
2) No modelo de úlceras induzidas por etanol/HCl, todas as concentrações
de extrato testadas apresentam atividade gastroprotetora, porém a substância
isolada marrubiína, é mais efetiva, demonstrando que a gastroproteção
observada no tratamento com a marrubiína isolada é mais efetiva do que a
observada nos tratamentos com omeprazol e cimetidina, nos modelos de
úlceras induzidas como por etanol/HCl e indometacina/betanecol.
3) Avaliando-se o papel do NO e dos compostos sulfidrilas, pode-se sugerir
que a atividade gastroprotetora esteja ligada a fatores antioxidantes.
4) Os compostos presentes no extrato podem estar atuando sobre a
secreção ácida gástrica e que esta atuação esta fortemente ligada ao
composto isolado, a marrubiína.
5) No teste de ligadura de piloro, os resultados obtidos sugerem que o
extrato e marrubiina interferiram com a secreção de ácido gástrico. Ao
quantificar o muco livre no tecido gástrico, observou-se que o extrato de M.
vulgare e marubiina, em doses de 100 e 25 mg/kg, aumentou
significativamente a produção de muco, quando comparado com o controle (p
<0,01)
6) Estudos posteriores in vitro e in vivo devem ser realizados para a
determinação das enzimas envolvidas nos processos antioxidantes e anti-
inflamatórios relacionados com a gastroproteção.
7) A presença de marrubiína foi identificada em todos os extratos
metanólicos, tanto por CCD, como por CG, sugerindo sua utilização como
marcador químico para M. vulgare.
103
8) Não houve diferenças significativas, entre as coletas realizadas no verão
e inverno, quanto ao teor de extrativos solúveis em água quente, fenólicos
totais e flavonóides totais.
9) Os flavonóides representam mais de 30% dos compostos fenólicos totais
das partes aéreas da M. vulgare.
10) Não foram identificadas diferenças significativas entre os TF das coletas
realizadas em Bom Retiro, no verão e inverno.
11) O maiores teores de marrubiína (TM) foram obtidos no nível inferior (5
dias) e intermediário de tempo (10 dias), para os níveis de relação
planta:solvente de 7,5 e 10%, respectivamente. Para o nível de relação
planta:solvente de 5%, o maior TM foi obtido no nível inferior de 5 dias, seguido
do nível superior de 15 dias.
12) O TFT sofreu forte influência da relação planta:solvente, e em menor
grau do tempo de extração.
13) O presente estudo aponta para o desenvolvimento de um fitoterápico,
empregando-se a marrubiína como marcador químico e farmacológico.
104
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ANEXO A
