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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
Faculdade de Odontologia de Piracicaba
Lesões endo-periodontais combinadas: caracterização
microbiológica e endotóxica
Piracicaba
2017
RAFAELA CASADEI CHAPOLA
Lesões endo-periodontais combinadas: caracterização
microbiológica e endotóxica
Dissertação apresentada à Faculdade de Odontologia
de Piracicaba, da Universidade Estadual de
Campinas, como parte dos requisitos para obtenção
do título de Mestra em Clínica Odontológica – Área de
Endodontia
Orientadora: Profa.Dra.Brenda Paula Figueiredo de Almeida Gomes
Este exemplar corresponde à versão final da dissertação defendida pela aluna Rafaela Casadei
Chapola e orientada pela Profa. Dra. Brenda Paula Figueiredo de Almeida Gomes.
Piracicaba
2017
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho...
Àqueles que tiveram fé que tudo isso aconteceria.
AGRADECIMENTOS
À Faculdade de Odontologia de Piracicaba, da Universidade Estadual de
Campinas, nas pessoas do diretor Prof. Dr. Guilherme Elias Pessanha Henriques e
do diretor associado Prof. Dr. Francisco Haiter Neto.
À Profa. Dra. Cínthia Pereira Machado Tabchoury, coordenadora geral
dos cursos de Pós-Graduação e à Profa. Dra. Karina Gonzales Silvério Ruiz,
coordenadora do curso de Pós-Graduação em Clínica Odontológica.
À minha orientadora Profa.Dra.Brenda Paula Figueiredo de Almeida
Gomes, pela oportunidade e anos de aprendizado. Meus sinceros agradecimentos.
A todos os professores da Área de Endodontia, nas pessoas do Prof. Dr.
Alexandre Augusto Zaia, Profa. Dra. Brenda Paula Figueiredo de Almeida, Prof.Dr.
Prof. Dr. Caio Cezar Randi Ferraz, Prof. Dr. José Flávio Affonso de Almeida, e
Profa.Dra. Adriana de Jesus Soares pelos sólidos ensinamentos transmitidos.
A todos os colegas e funcionários da área de Endodontia.
À área de Periodontia, nas pessoas do Prof. Dr. Antonio Wilson Sallum,
Prof. Dr. Enilson Antonio Sallum, Prof. Dr. Francisco Humberto Nociti Júnior, Profa.
Dra. Karina Gonzalez Silvério Ruiz, Prof. Dr. Márcio Zaffalon Casati. Em especial,
Prof. Dr. Renato Corrêa Viana Casarin, pela direta e positiva contribuição na
realização desse trabalho. Estendo os agradecimentos aos alunos de
PósGraduação da Área, pelos momentos de parceria e harmoniosa convivência,
durante as atividades clínicas. Muito obrigada!
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)
pela concessão da bolsa de estudo para parte do mestrado (Processo
2014/273651).
Agradeço a todos àqueles com quem eu firmei fortes e sinceros laços de
amizade, durante esses anos de FOP-UNICAMP. Vocês são especiais.
Enfim, agradeço àquelas pessoas que me fazem sentir mais perto de
Deus... Gratidão profunda.
RESUMO
A polpa dentária e o periodonto são duas estruturas anatomicamente
distintas, porém inter-relacionadas funcionalmente, visto que ambas as estruturas
têm origem embriológica e formação concomitante. Apesar de existir uma extensa
literatura quanto à microbiota associada a lesões periodontais, e a lesões
endodônticas separadamente, poucos estudos se dedicaram a investigação dos
microrganismos e de seus fatores de virulência, como por exemplo, as endotoxinas
(LPS) em lesões endo-periodontais (LEP) combinadas. O LPS é um componente
estrutural da membrana externa de bactérias Gram-negativas. A patogenicidade
dessas bactérias em processos inflamatórios pulpares e periapicais parece estar
relacionada com a presença e diversidade de LPS. Dessa forma, o objetivo deste
estudo foi investigar a presença de microrganismos periodontopatogênicos, em
canais radiculares (CR) e bolsas periodontais (BP), de dentes com lesões endo-
periodontais (LEP) combinadas; avaliar a suscetibilidade destes microrganismos ao
preparo químico-mecânico (PQM) e à medicação intracanal (MIC) em ambos os
sitios, através de dois métodos de identificação: cultura microbiológica (contagem de
unidade formadora de colônias, UFC) e Nested-PCR; e quantificar os níveis
endotóxicos nos CR e nas BP, antes e após as várias fases do tratamento
endodôntico. Foram selecionados 14 dentes com necrose pulpar e bolsa periodontal
associada. Após o PQM, os dentes foram divididos em dois grupos: G1- sessão
única (n=7); GII – sessão múltipla, com Ca(OH)2 associado à clorexidina gel 2%
como MIC (n=7). Amostras foram coletadas em três diferentes momentos da terapia
endodôntica: inicial, após PQM e após o uso da MIC por 30 dias, através de cones
de papéis apirogênicos/estéreis. A suscetibilidade destes microrganismos ao PQM e
ao uso da MIC por 30 dias foi realizada, através da contagem das UFC´s. Os
microrganismos foram identificados através do Nested-PCR, utilizando-se primers
espécies-específicos para Treponema denticola, Treponema socranskii, Gemella
morbillorum, Tannerella forsythia, Aggregatibacter actinomycetemcomitans,
Porphyromonas endodontalis, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia,
Prevotella tannerae, Prevotella nigrescens, Fusobacterium nucleatum, Filifactor
alocis, Parvimonas micra. Para quantificação das endotoxinas foi realizado o teste
Lisado de Amebócito Limulus (LAL). Os resultados mostraram que as unidades
formadoras de colônias (UFC/mL) iniciais médias foram maiores nas BP em
comparação aos CR, em todas as fases do tratamento endodôntico. Houve redução
estatisticamente significativa, comparando-se as coletas iniciais e as realizadas após
o PQM e comparando-se as coletas após o PQM e após 30 dias de MIC, em ambos
os sítios (p<0,05). Os microrganimos mais encontrados nos CR foram Prevotella
tannerae em 71,42% (10/14) antes do PQM; Após o PQM, Tannerella forsythia,
Prevotella Tannerae, Prevotella nigrescens e Fusobacterium nucleatum em 42,8%
(6/14); e Treponema denticola, Aggregatibacter actinomycetemcomitans,
Porphyromonas endodontalis, Prevotella nigrescens e Fusobacterium nucleatum em
57,1% (4/7) após a MIC. Os microrganimos mais encontrados nas BP foram
Treponema denticola e Parvimonas micra 92,8% (13/14) nas coletas iniciais;
Fusobacterium nucleatum 78,57% (11/14) após o PQM; e Tannerella forsythia e
Porphyromonas gingivalis em 100% (7/7) das coletas após a MIC. Nenhuma relação
estatisticamente significante foi encontrada entre a presença de microrganismos nas
diferentes fases do tratamento endodôntico, nas BP e nos CR (p<0,05). Associações
estatisticamente positivas foram observadas entre a presença de sinais e sintomas
de origem endodôntica e periodontal e algumas espécies bacterianas, e também
entre as espécies. A concentração de endotoxinas nas coletas iniciais nas BP foi alta
(648,11 EU/mL), porém após o PQM (109,65 EU/mL) e uso da MIC (36,5 EU/mL)
houve reduções estatisticamente significantes (p<0,05). Nos CR, a concentração
endotóxica inicial foi de 15,6 EU/mL; após o PQM 0,19 EU/mL; e após a MIC 0,06
EU/mL, sendo essas reduções estatisticamente significantes (p<0,05). Nenhuma
associação estatisticamente significante foi observada entre a presença de LPS e
aspectos clínicos, nos canais radiculares e bolsas periodontais. Conclui-se que os
CR e as BP dos dentes com necrose pulpar e bolsas periodontais associadas
apresentaram-se contaminados por potentes periodontopatógenos. PQM e o uso
MIC por 30 dias foram altamente eficazes em reduzir os níveis endotóxicos nos CR e
nas BP associadas. Embora a redução microbiana nas BP, após o uso da MIC não
tenha sido tão significativa, seu uso se mostrou bastante eficaz em reduzir os níveis
endotóxicos.
Palavras chave: Microrganismos, canal radicular, bolsa periodontal,
endotoxinas, hidróxido de cálcio.
ABSTRACT The dental pulp and the periodontium are two anatomically distinct but
functionally interrelated structures, since both structures have an embryological origin
and concomitant formation. Although there is an extensive literature on the
microbiota associated with periodontal lesions and on endodontic lesions separately,
few studies have focused on the investigation of microorganisms and their virulence
factors, such as endotoxins (LPS) of combined endo-periodontal lesions (EPL). LPS,
also known as endotoxin, is a structural component of the outer membrane of Gram-
negative bacteria responsible for bacterial organization and stability. The
pathogenicity of these bacteria in pulpal and periapical inflammatory processes
seems to be related to the presence and diversity of LPS. Thus, the objective of this
study was to investigate the presence of periodontopathogenic microorganisms in
root canals (RC) and periodontal pockets (PP) of teeth with combined endo-
periodontal lesions (EPL´s); to evaluate the susceptibility of these microorganisms to
CMP and to the use of intracanal medication (ICM) at both sites, through two
identification methods: microbiological culture (counts of colony forming units, CFU)
and Nested-PCR; and to quantify the endotoxic levels in RC and PP before and after
the various phases of endodontic treatment. Forteen teeth with pulp necrosis and
associated periodontal pocket were selected. After CMP, the teeth were divided into
two groups: GI-single session (n = 7); GII- multiple section, using the association of
Ca(OH)2 + CHX-gel 2% as ICM (n = 7). Samples were taken at three different
moments of endodontic therapy: initial, after CMP and after the use of MIC for 30
days, through pyrogenic/sterile paper points. The susceptibility of these
microorganisms to CMP and MIC for 30 days was performed through the count of
CFU. The microorganisms were identified using the molecular technique of Nested-
PCR, with the use of species-specific primers to Treponema denticola, Treponema
socranskii, Gemella morbillorum, Tannerella forsythia, Aggregatibacter
actinomycetemcomitans, Porphyromonas endodontalis, Porphyromonas gingivalis,
Prevotella intermedia, Prevotella tannerae, Prevotella nigrescens, Fusobacterium
nucleatum, Filifactor alocis, Parvimonas micra. The Limilus Amebocyte Lysate (LAL)
test was performed for endotoxin quantification. The results showed that the CFU
were higher in PP compared to RC, in all phases of endodontic treatment. There was
a statistically significant reduction, comparing the initial and post CMP samples, and
comparing the samples after CMP and after 30 days of MIC, in both sites (p <0.05).
The most commonly detected microorganisms in the RC were Prevotella tannerae in
71.42% (10/14) before CMP; after CMP, Tannerella forsythia, Prevotella Tannerae,
Prevotella nigrescens and Fusobacterium nucleatum in 42.8% (6/14); after MIC
Treponema denticola, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Porphyromonas
endodontalis, Prevotella nigrescens and Fusobacterium nucleatum in 57.1% (4/7.
The microorganisms most frequently found in the PP were Treponema denticola and
Parvimonas micra 92.8% (13/14) in the initial samples; Fusobacterium nucleatum
78.57% (11/14) after PQM; and Tannerella forsythia and Porphyromonas gingivalis in
100% (7/7) in the samples after MIC. No statistically significant relationship was
found between the presence of microorganisms in the different phases of the
endodontic treatment, in the PP and RC (p <0.05). Statistically positive associations
were detected between the presence of endodontic and periodontal signs and
symptoms and some bacterial species, as well as between species. The
concentration of endotoxins in the initial samples in the PP was high (648,11 EU /
mL), but after the CMP (109.65 EU / mL) and intracanal dressing use (36.5 EU / mL)
there were statistically significant reductions (P <0.05). In RC, the initial endotoxic
concentration was 15.6 EU / mL; after CMP 0.19 EU / mL; and after intracanal
dressing 0.06 EU / mL, these reductions were statistically significant (p <0.05). No
statistically significant association was detected between the presence of LPS and
clinical aspects, in the RC and PP. It was concluded that in the RC and PP of the
teeth with pulp necrosis and associated periodontal pockets were contaminated by
potent periodontopathogens. The CMP and MIC for 30 days were highly effective in
reducing endotoxic levels in the RC and associated PP. Although microbial reduction
in PP after the use of MIC was not significant, its use was very effective in reducing
endotoxic levels.
Key words: Microorganisms, root canal, periodontal pocket, endotoxins,
calcium hydroxide.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
LPS - Lipopolissacarídeos
PQM – Preparo químico-mecânico
Ca(OH)2 – Hidróxido de Cálcio
CHX - Clorexidina
SS – Solução Salina
MIC – Medicação Intracanal
LAL - Lisado de Amebócito Limulus
PCR – Reação em Cadeia da Polimerase
EDTA – ácido diaminotetracético
TNF α – Fator de necrose tumoral alfa
LTA – Ácido Lipoteicóico
CR – Canal radicular
BP – Bolsa periodontal
LEP – Lesão endo-periodontal
PS - Profundidade de sondagem
RMG - Recessão da margem gengival
NCI - Nível clínico de inserção
SS – Sangramento à sondagem
SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO .................................................................................... 15 2. REVISÃO DA LITERATURA .............................................................. 19
2.1 Interação endodonto-periodonto .................................................... 19
2.2 Patogênese .................................................................................... 26
2.3 Classificação das lesões endo-periodontais .................................. 32
2.4 Microbiologia das lesões endodônticas e periodontais .................. 37
2.5 Microbiota das lesões endo-periodontais ....................................... 41
2.6 Preparo químico-mecânico ............................................................ 46
2.7 Preparo químico-mecânico com SQA ............................................ 52
2.8 Medicações intracanais .................................................................. 56
2.9 Redução bacteriana após preparo químico-mecânico e após o uso
de medicação intracanal, em dentes com lesão endo-periodontal
combinada verdadeira .......................................................................... 62
3. PROPOSIÇÃO ..................................................................................... 65 4. MATERIAL E MÉTODOS .................................................................... 66
4.1 Comitê de Ética em Pesquisa ........................................................ 66
4.2 Seleção da Amostra ....................................................................... 66
4.3 Aspectos clínicos e radiográficos ................................................... 67
4.4 Procedimentos clínicos e coletas das amostras ............................. 68
4.5 Processamento microbiológico ...................................................... 74
5. RESULTADOS ..................................................................................... 85 5.1 Características clínicas .................................................................. 85
5.2 Método clássico de cultura ............................................................. 86
5.3 Nested-PCR ................................................................................... 89
5.4 Quantificação de endotoxinas ........................................................ 92
5.5 Associação entre os microrganismos ............................................. 95
5.6 Associações entre as espécies/LPS e sinais e sintomas ............... 104 6. DISCUSSÃO ........................................................................................ 106
6.1 Características clínicas das lesões endo-perio .............................. 107
6.2 Metodologias Utilizadas ................................................................. 108
6.3 Microbiologia das lesões endo-periodontais .................................. 109
6.4 Efeitos do preparo químico-mecânico e medicações intracanais sobre
os microrganismos do canal radicular e bolsa periodontal ................... 112
6.5 Quantificação de endotoxinas dos canais radiculares e bolsas
periodontais .......................................................................................... 115
6.6 Associações entre os microrganismos, entre as espécies e níveis de LPS
com sinais e sintomas .......................................................................... 118
7.CONCLUSÃO ....................................................................................... 119 REFERÊNCIAS ........................................................................................ 120 APÊNDICES APÊNDICE 1 – Fichas clínicas .............................................................. 153 APÊNDICE 2 – Caracteriísticas clínicas iniciais das bolsas
periodontais ........................................................................................ 158 APÊNDICE 3 – Protocolo extração de DNA .......................................... 159 APÊNDICE 4 – Espécies bacterianas encontradas nas coletas dos
canais radiculares e bolsas periodontais ........................................ 163 APÊNDICE 5 – Protocolo quantificação de Endotoxinas .................... 169 APÊNDICE 6 – Valores da concentração de endotoxinas dos pacientes
em todas as coletas ........................................................................... 172 ANEXOS ANEXO 1 – Comitê de Ética ................................................................... 173 ANEXO 2 – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido específico
para a pesquisa .................................................................................. 174
15
1. INTRODUÇÃO
A proximidade entre a polpa e o periodonto é justificada pela inter-relação
anatômica, embriológica e funcional entre essas estruturas (Chacker, 1974; Christie
& Holthuis, 1990). Essa intimidade é tamanha, que alguns autores sugerem, até
mesmo, que ambos os tecidos deveriam ser considerados como uma única estrutura
biológica (Sunitha et al., 2008).
Durante o desenvolvimento embriológico dos dentes, são formadas três
principais vias de comunicação anatômica entre o espaço pulpar e o periodonto:
túbulos dentinários, canais laterais/acessórios/secundários e forame apical (Gomes
et al., 1996a; Chacker, 1974; Christie & Holthuis, 1990; Rotstein & Simon, 2004),
sendo que esse último permite a passagem de vasos e nervos mais calibrosos da
região perirradicular para o interior dos canais radiculares, viabilizando a
manutenção do tecido pulpar e neoformação dentinária. Assim, o forame apical é a
maior e mais importante via de acesso com o periodonto (Sunitha et al., 2008).
Essas vias de comunicação podem funcionar, como caminhos potenciais para a
reciprocidade inflamatória e infecciosa entre polpa e periodonto e explicam a
influência que um tecido tem sobre o outro.
Existem fortes evidências na literatura que infecções cruzadas podem
ocorrer entre polpas infectadas e bolsas periodontais profundas (Kipioti et al., 1984;
Kobayashi et al.,1990; Rupf et al., 2000; Djais et al., 2006; Pereira et al., 2011; Li et
al., 2014; Gomes et al., 2015).
Quando a polpa é infectada, uma resposta inflamatória do ligamento
periodontal ocorre. Subprodutos inflamatórios e infecciosos de origem pulpar podem
infiltrar-se pelas vias de comunicação e iniciar a resposta inflamatória vascular no
periodonto. Esta, pode variar de um processo inflamatório mínimo, confinado ao
ligamento periodontal, até sua destruição extensa envolvendo alvéolo dentário e
osso adjacente (Seltzer et al., 1967).
As lesões endo-perio combinadas verdadeiras são caracterizadas pela
progressão de ambas as patologias, pulpares e periodontais, no mesmo elemento
dental, sendo então originadas, por dois processos diferentes e independentes
(Seltzer, 1963; Simon et al., 1972; Gomes et al., 2015), que podem se unir em algum
momento (Sharma et al., 2014).
16
Ainda que outros fatores sejam co-responsáveis pela instalação de lesões
endodônticas ou periodontais, os microrganismos e seus fatores de virulencia
representam um importante papel no seu estabelecimento e progressão. (Toledo &
Rosetti, 2005).
Entretanto, a microbiota das lesões endo-periodontais ainda não está bem
definida na literatura, existindo poucos trabalhos que confirmem a similaridade entre
estes dois sítios. Autores como Kipioti et al., (1984), Kurihara et al., (1995)
demonstraram que a microbiota de canais radiculares infectados era similar àquela
encontrada na adjacência das bolsas periodontais. Rupf et al., (2000) e Dahlén
(2002) também observaram similaridade na microbiota das lesões endodônticas e
periodontais, exceto no grupo da periodontite progressiva do adulto (Dahlén 2002).
Pereira et al., (2011) observaram que clones de P. intermedia e P. gingivalis com
uma alta similaridade genótipo intraespecífica foram encontrados colonizando os
mesmos sítios anatômicos em infecções endodônticas-periodontais. Didilescu et al.,
(2012) observaram que F.nucleatum, P.micra e C.sputigena podem desempenhar
um papel importante na patogênese das lesões endo-periodontais. Gomes et al.,
(2015), utilizando o Next Generation Sequencing para a identificação de bactérias
presentes nos canais radiculares e bolsas periodontais de dentes com lesoes endo-
perio, reportaram que a comunidade microbiana presente nestas lesões é complexa
e mais diversificada do que anteriormente relatada. A semelhança entre a microbiota
de ambos os locais sugere que pode haver uma via de infecção entre polpa e
periodonto.
Entre os fatores de virulência bacteriana encontram-se os componentes
estruturais e os produtos do metabolismo bacteriano. Os segundos são
responsáveis pelo dano direto ao tecido pulpar, enquanto que os componentes
estruturais da célula bacteriana, como por exemplo, lipopolissacarídeos (LPS) e
ácido lipoteicóico (LTA), podem injuriar o tecido indiretamente pela ativação de uma
resposta imune (Fouad, 2009; Gomes et al., 2013). O LPS, também conhecido como
endotoxina, é um componente estrutural da membrana externa de bactérias Gram-
negativas, os quais são responsáveis pela organização e estabilidade bacteriana
(Vaara & Nikaido, 1984; Martinho & Gomes, 2008; Martinho et al., 2011, 2012). A
patogenicidade dessas bactérias em processos inflamatórios pulpares e periapicais
parece estar relacionada com a presença e diversidade de LPS. Bactérias
anaeróbias Gram-negativas como Porphyromonas gingivalis, Aggregatibacter
17
actinomycetemcomitans e Tannerella forsythia, entre outras, tem sido relacionadas
com doença periodontal, sendo interessante verificar sua presença, também, nos
canais radiculares associados às bolsas periodontais.
Sabendo-se, então, que os microrganismos e seus fatores de virulência
exercem papel fundamental no desenvolvimento e manutenção das doenças
pulpares, perirradiculares e periodontais, torna-se fundamental a remoção/redução
de seus níveis nestes sítios, ou quando isso é impossível, como é o caso dos
tecidos periodontais, a mudança para uma comunidade mais relacionada com a
saúde periodontal.
A ação mecânica dos instrumentos endodônticos é incapaz de promover
a completa desinfecção de determinadas áreas, devido às complexidades
anatômicas do canal radicular (Byström et al., 1985; Gomes et al., 1996a). Desta
forma, a máxima redução de microrganismos e de seus subprodutos é conseguida
pelo emprego de substâncias químicas auxiliares e soluções irrigadoras, durante a
execução do preparo químico-mecânico (PQM). Além disso, o processo de
desinfecção é complementado pela ação da medicação intracanal (MIC), quando
necessária (Sundqvist, 1992; Gomes et al., 1996b; Gomes et al., 2004).
A medicação intracanal (MIC) a base de hidróxido de cálcio e clorexidina
gel2% tem o objetivo de aumentar as propriedades antimicrobianas do hidróxido de
cálcio, mantendo suas propriedades biológicas e mecânicas, atuando como barreira
física. Dessa forma, impede a reinfecção e interrompe o suprimento de nutrientes
para os microrganismos remanescentes ao preparo químico-mecânico. A clorexidina
fornece substantividade a esta, devido à capacidade de adsorção e de liberação
lenta de moléculas ativas pelos tecidos dentais. Desta maneira, a clorexidina é
capaz de manter níveis reduzidos de microrganismos mesmo após ter sido removida
dos canais. (Gomes et al., 2006).
O canal radicular pode funcionar como um compartimento de liberação
lenta para difusão de medicações em direção à superfície radicular externa. Estas
poderiam, assim, exercer ação na dentina radicular contaminada por
microrganismos alojados no interior dos túbulos e, consequentemente, resultar em
um efeito antimicrobiano complementar à terapêutica periodontal (Gomes et al.,
2009). Recentemente, Raheja et al., (2014) reportaram ganhos significativos nos
parâmetros periodontais, quando a clorexidina 2% foi usada como curativo
intracanal, antes da cirurgia periodontal, em lesões endo-periodontais combinadas
18
sem comunicações. Estes autores não investigaram, entretanto, a parte
microbiológica destas lesões.
Por outro lado, o tratamento periodontal também consiste na remoção
física do biofilme através das raspagens e aplicação de agentes antimicrobianos
locais como a clorexidina gel (Paquette et al., 2008).
Para a identificação bacteriana dispomos de técnicas tradicionais, como a
cultura, e técnicas moleculares, como por exemplo, o PCR, Next Generation
Sequencing (NGS), o Checkerboard, entre outras. A grande vantagem dos métodos
moleculares é a detecção e identificação de bactérias anaeróbias de difícil cultivo
(Willis et al., 1999; Gomes & Montagner, 2010). O Nested-PCR é um método muito
sensível (Kawada et al., 2004; Gomes et al, 2005) e muito usado para detecção de
espécies observadas em infecções endo-periodontais (Gomes et al, 2015; Takeuchi
et al., 2015). Em contrapartida, a técnica clássica de contagem das unidades
formadoras de colônias (UFC´s) é um método que permite identificar um grande
número de microrganismos viáveis, além de possibilitar sua quantificação (Shah e
Gharbia, 1993; Dahlén, 2002).
Dessa forma, o objetivo deste estudo foi investigar a presença de
microrganismos periodontopatogênicos, em canais radiculares e bolsas periodontais,
de dentes com lesões endo-periodontais combinadas; avaliar a suscetibilidade
destes microrganismos ao preparo químico-mecânico e ao uso de medicação
intracanal, em ambos os sitios: endodonto e periodonto, pelos métodos Nested-PCR
e contagem das unidades formadoras de colônias (UFC´s) (por dois métodos de
identificação: cultura microbiológica (contagem de UFC) e Nested-PCR); e
quantificar os níveis endotóxicos nos canais radiculares e bolsas periodontais antes
e após as várias fases do tratamento endodôntico.
19
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Interação endodonto-periodonto O desenvolvimento dos tecidos pulpares e periodontais começa no início
da fase embrionária, quando as células da crista neural (ou do tubo neural do
embrião) migram para o primeiro arco branquial. Nessa posição, as células da crista
neural formam uma faixa de ectomesênquima abaixo do epitélio do estomodeo
(cavidade oral primitiva). Após as células da crista neural terem atingido sua
localização no espaço correspondente à boca, o epitélio do estomodeo libera
fatores, que iniciam uma interação do epitélio com o ectomesênquima. Uma vez que
essas interações tenham ocorrido, o ectomesênquima assume um papel domimante
no decorrer do desenvolvimento. Após a formação da lâmina dental, inicia-se uma
série de processos (estágio de botão, estágio de capuz, estágio de campânula e o
desenvolvimento da raiz), que resultam na formação de um dente e seus tecidos
periodontais, incluindo osso alveolar. Durante o estágio de capuz, células
ectomesenquimais condensam-se em relação ao epitélio oral, formando a papila
dentária, que dá origem à dentina e à polpa, e o folículo dentário, que origina os
tecidos periodontais de suporte. O papel decisivo representado pelo
ectomesênquima nesse processo é posteriormente estabelecido pelo fato de que o
tecido da papila dentária, aparentemente, também participa da formação dos dentes
e determina sua forma (Kattchburian & Arana, 2012).
A confluência contínua desses tecidos na região apical permanece após o
completo desenvolvimento dental. Sendo assim, é natural que, estruturalmente, o
tecido pulpar próximo ao ápice se assemelhe mais ao tecido do ligamento
periodontal, naquela área, do que propriamente ao tecido conjuntivo pulpar (Stallard,
1972; Osborn & Ten Cate, 1988).
À medida que o órgão dental se desenvolve embriologicamente são
estabelecidas vias anatômicas, que podem funcionar como caminhos potenciais
para a reciprocidade inflamatória e infecciosa entre o tecido pulpar e periodontal e
explicam a influência que um tecido tem sobre o outro (Seltzer et al., 1963). O
forame apical (principal via de comunicação), canais laterais, secundários e
acessórios e áreas permeáveis da dentina e do cemento radicular explicam, então,
possíveis semelhanças microbiológicas existentes em um dente com uma polpa
20
infectada, comprometido periodontalmente (Gomes et al., 2015), uma vez que o
trânsito de microrganismos e seus subprodutos entre uma estrutura e outra é
facilitado por essas vias.
No processo de formação da região da raiz dental, a projeção apical da
bainha epitelial de Hertwig pode ser interrompida por vasos sanguíneos ou nervos,
passando através dos tecidos mesodérmicos. A indução do desenvolvimento
odontoblástico e subseqüente deposição de dentina e cemento pode não ser
continua em áreas onde onde o tecido indutor, que é a bainha epitelial radicular, é
penetrada por vasos ou nervos. Portanto, um vaso sanguíneo, nervo, ou outro tecido
passando através da bainha radicular resulta no desenvolvimento de um canal,
através do cemento e da dentina, promovendo uma comunicação direta entre o
ligamento periodontal e a polpa. O suprimento sanguíneo do aparato de inserção
periodontal ganha acesso ao tecido pulpar através de algumas comunicações:
canais acessórios, canais laterais, canais da furca, e uma variedade de foraminas
apicais (Chacker, 1974; Osborn & Ten Cate, 1994; Walton & Torabinejad, 1997;
Aguiar, 1999).
Dessa forma, essas vias de acesso entre polpa e periodonto possuem
extrema relevância clínica, devido ao fato de justificarem a inter-relação entre a
Periodontia e a Endodontia, quando se referem à etiopatogenia das lesões endo-
periodontais (Pilatti & Toledo, 2000; Toledo & Rosetti, 2005).
A verdadeira relação entre as patologias pulpares e periodontais foi
primeiramente descrita em 1964, por Simring e Goldberg. Desde então, o termo
“lesão endo-periodontal” vem sendo utilizado para descrever lesões decorrentes de
produtos inflamatórios, encontrados em diferentes graus, em ambos os tecidos:
pulpar e periodontal.
2.1.1. Comunicações fisiológicas
A principal causa das doenças periodontais é a presença do biofilme
subgengival, formado por microrganismos aeróbios e anaeróbios (Haapasalo et al.,
1986; Dahle et al., 1996; Trope et al., 1988; Jansson et al., 1995). As exposições
pulpares, a periodontite e a cárie dentária têm importância significativa no
desenvolvimento de lesões endo-periodontais. Se tais lesões não forem bem
tratadas e os canais radiculares desinfectados em toda sua extensão, com posterior
obturação hermética até o limite apical adequado, haverá resíduos de restos
21
necróticos bacterianos, que podem explicar a progressão das lesões (Madison &
Wilcox, 1988; Saunders & Saunders, 1990; Ray & Trope, 1995). Outra forma de
inter-relação endodôntica - periodontal é através das perfurações iatrogênicas,
provocadas pelos instrumentos rotatórios ou pela manipulação inadequada dos
instrumentos endodônticos (Jew et al., 1982).
2.1.1.1 Túbulos dentinários
No dente, o complexo dentina-polpa é protegido pela camada de esmalte,
um tecido mineralizado relativamente pouco permeável, pelo cemento e pela fração
mineralizada da dentina. Embora a porção mineralizada da dentina represente uma
barreira física à ação de agentes agressores, ela possui uma estrutura tubular,
dando permeabilidade ao tecido e permitindo com que alguns irritantes, oriundos de
bolsas periodontais, sejam capazes de se difundir e afetar a polpa em distintas
situações clínicas. Semelhantemente, o conteúdo infeccioso de uma polpa
comprometida pode atingir os tecidos periodontais, uma vez que a presença desses
túbulos patentes facilita o trânsito de microrganismos e seus subprodutos entre a
polpa e o periodonto (Walton & Torabinejad, 1997). Entretanto, parece haver uma
variação regional na extensão da dentina invadida. O terço cervical é invadido mais
extensamente que o terço médio e este, mais que o apical (Mjor & Nordahl, 1996).
Qualquer método utilizado para desinfecção do canal radicular deve ser capaz de
acessar e eliminar o máximo de microrganismos possíveis, de todas as partes do
sistema de canais radiculares (Coldero et al., 2002).
Os túbulos dentinários percorrem toda a extensão da dentina e ocupam
de 20 a 30% do volume total. Apresentam uma conformação cônica, com diâmetro
maior próximo a polpa (2,5 µm), diminuindo à medida que se aproximam das regiões
amelodentinária ou cemento-dentinária (em média 0,9 µm) (Garberoglio &
Brannström, 1976).
Na junção dentino-pulpar a concentração de túbulos dentinários é de
aproximadamente 45000 unidades/mm², correspondendo a 22% da área superficial
total. No entanto, à medida que se aproxima da periferia, a sua concentração se
reduz a 15000 unidades/mm², ocupando uma área de 1% do total (Lopes & Siqueira
Jr, 1999). O número médio de túbulos dentinários por unidade de área em dentina
radicular é de 44.243 túbulos/mm² na região cervical, 42.360 túbulos/mm² no terço
médio e 8.190 túbulos/mm² na região apical (Carrigan et al., 1984). Seltzer, em
22
1988, descreve que essa diferença de densidade seja explicada devido ao fato da
dentina produzida pelos odontoblastos na região apical ser amorfa e irregular, não
seguindo os padrões verificados na dentina dos terços radiculares cervical e médio.
Essas características reduziriam sua permeabilidade, dificultando o acesso de
microrganismos ou outros irritantes ao interior dos túbulos dentinários.
A presença de uma superfície cementária intacta é extremamente
importante para proteger a polpa dos agentes patogênicos, oriundos do biofilme
subgengival. Porém, uma vez que a continuidade dessa camada de cemento é
rompida, através mesmo de procedimentos da terapia periodontal, como a raspagem
e alisamento radicular, haverá a exposição de túbulos dentinários, permitindo a
invasão bacteriana através desses túbulos patentes. Isso aumentaria a
probabilidade de danos cumulativos à polpa (Grudianov et al., 2013).
Nagaoka et al., 1995 relataram que os túbulos dentinários, associados a
uma polpa vital, dificultam a entrada bacteriana, retardando essa invasão. A
presença de prolongamento odontoblástico, fluido dentinário e fibras colágenas
também são possíveis fatores que influenciam nessa progressão. Já, nos dentes
com polpa necrótica, ou nos tratados endodonticamente, a invasão é facilitada. Dez
anos mais tarde, Puapichartdumrong et al., 2005 demonstraram que a presença de
componentes pulpares retardou a difusão de substâncias químicas em discos de
dentina, reforçando a ideia de que a presença do prolongamento odontoblástico,
ocupando um espaço considerável na luz do túbulo dentinário, representa uma
barreira física importante e capaz de dificultar a invasão bacteriana em dentes com
polpa vital.
Portanto, a permeabilidade da dentina é determinada, principalmente,
pela anatomia dos túbulos dentinários (densidade, diâmetro e profundidade dos
túbulos) e pelas características da substância a se difundir (tamanho da molécula e
carga) (Pashley, 1990), à exemplo da difusão de medicamentos intracanais à base
de hidróxido cálcio, uma vez que a ação antimicrobiana do íon hidroxila pode ser
afetada pela capacidade tampão, pela adsorção e pela carga da dentina.
23
2.1.1.2 Forame apical O forame apical é a principal via de comunicação entre a polpa e o
periodonto. Subprodutos infecciosos e inflamatórios de uma polpa lesionada podem
infiltrar-se pelo forame apical e resultar em uma lesão perirradicular. O forame apical
pode ser também uma porta de entrada de elementos inflamatórios das bolsas
periodontais profundas para a polpa. A inflamação pulpar, ou necrose, se estendem
para os tecidos periapicais, causando uma resposta inflamatória local, acompanhada
de reabsorção óssea e radicular. A importância da terapia endodôntica, nesse
contexto, é a máxima eliminação dos fatores etiológicos do sistema de canais
radiculares, a fim de facilitar a cicatrização e reparo dos tecidos de suporte (Rotstein
& Simon, 2004; Walton & Torabinejad, 1997).
Adriaens et al., em 1988, afirmaram que a progressão da doença
periodontal em direção apical pode resultar na contaminação de outras ramificações
ao longo da superfície radicular, como canais acessórios, laterais, secundários, ou
mesmo os túbulos dentinários. Portanto, a microbiota do biofilme subgengival pode
ultrapassar essas vias de contaminação, comprometendo o estado de saúde pulpar.
Embora tenha sido cada vez mais demonstrado que a doença periodontal
possui um efeito prejudicial cumulativo sobre o tecido pulpar, a total desintegração
da polpa só ocorrerá se o biofilme subgengival se estender até a região mais apical
da superfície radicular, envolvendo o forame apical. Dessa forma, isso
comprometerá o suprimento vascular nessa região (Singh, 2011).
2.1.1.3 Canais laterais, acessórios e secundários
Anatomicamente, os canais laterais e secundários saem do canal
radicular principal para a superfície externa da raiz. No entanto, eles são
encontrados nos terços coronário e apical, respectivamente. Os canais acessórios
saem dos canais secundários em direção a superfície externa da raiz. Eles se
diferem apenas na localização da superfície dentária (Rubach & Mitchell, 1965;
Kirkham, 1975).
De Deus (1992) realizou um estudo com 1.140 dentes humanos
extraídos, por meio da técnica de diafanização com infiltração de tinta nanquim. O
objetivo foi verificar a localização e direção dos canais acessórios, secundários e
laterais em diferentes níveis radiculares. Os resultados demonstraram que 27,4%
dos dentes apresentaram algum tipo de ramificação, sendo localizados, em maior
24
frequência, na região apical (17%) e na região de bifurcação e trifurcação de pré-
molares e molares. O terço apical apresentou uma frequência de 8,8% de canais
secundários e o terço coronário de 1,6% de canais laterais. O autor afirma que as
ramificações podem ser encontradas em qualquer parte ao longo do comprimento da
raiz, mas ocorrem mais frequentemente na porção apical e em dentes posteriores.
Ruccuci e Siqueira, 2010, analisaram o estado histopatológico e
histobacteriológico dos tecidos presentes em canais laterais e ramificações apicais,
em diversas condições clínicas, bem como em resposta ao tratamento endodôntico.
Os resultados mostraram que em dentes não tratados, as condições do tecido
dentro dos canais laterais e ramificações apicais refletem as condições da polpa do
canal principal. Em relação aos dentes tratados, observaram que o tecido no interior
das ramificações permanece relativamente pouco afetado por instrumentos e
irrigantes após o preparo químico-mecânico, independentemente das condições
pulpares iniciais. Materiais obturadores que foram forçados em canais laterais, em
casos de polpa vital, apresentaram danos aos tecidos e inflamação. Mesmo que,
radiograficamente o material obturador apareça nos canais laterais e ramificações
apicais, isso não indica que a ramificação foi selada ou desinfectada. Concluíram
que como bactérias localizadas em grandes ramificações podem causar ou manter
uma doença, outras estratégias devem ser avaliadas com o objetivo de desinfectar
essas regiões e melhorar o prognóstico do tratamento. Assim, canais laterais e
ramificações apicais compreendem possíveis caminhos, através dos quais
microrganismos e/ou seus produtos podem transitar do canal radicular para bolsas
periodontais e vice versa. Eles são, indiscutivelmente, de difícil acesso, limpeza e
desinfecção durante o tratamento endodôntico. Seu possível significado clínico há
muito tempo chamou a atenção de clínicos e pesquisadores a respeito de como
essas ramificações devem ser tratadas e qual o destino do tecido presente nelas
após o tratamento.
Sob condições clínicas rotineiras, a identificação de canais laterais,
secundários e acessórios, com base na interpretação de radiografias, pode ser
alcançada apenas em um número pequeno de casos. Entretanto, alguns cuidados
clínicos podem ser úteis para sua identificação, como: presença de uma imagem
radiográfica de uma lesão periapical lateral associada à uma polpa necrótica,
identificação radiográfica de uma imagem na superfície lateral radicular, sugerindo a
25
presença de um orifício e imagem de extravasamento de material obturador para o
interior das ramificações (Walton & Torabinejad, 1997).
O canal cavo inter-radicular é encontrado no assoalho da câmara pulpar,
saindo desta e percorrendo a dentina interradicular, até alcançar o ligamento
periodontal, em nível de furca, podendo servir como uma avenida de contaminação
entre polpa e periodonto. Dessa forma, a existência do canal-cavo inter-radicular
justificaria manifestações clínico-patológicas, como rarefações ósseas, envolvendo
estruturas periodontais na região de furca de dentes multirradiculares (Seltzer et al.,
1967).
Shambarger et al., 2015 investigaram se há um aumento da
contaminação bacteriana no interior do tecido pulpar, após o tratamento periodontal,
em dentes molares, na região de furca. Observaram que a comunicação entre a
polpa e os tecidos periodontais, após a terapia periodontal ocorreu em,
aproximadamente, 95% dos 65 dentes analisados. Concluíram que a instrumentação
periodontal, na região de furca, aumenta o risco de contaminação bacteriana do
espaço pulpar em até 39%.
2.1.1.4 Sulco palato-radicular O sulco palato-radicular é uma anomalia de desenvolvimento encontrada
nos incisivos superiores, dos quais os incisivos laterais são mais frequentemente
afetados. Esse sulco normalmente começa na fossa central, atravessa o cíngulo e
se estende apicalmente. Os sulcos podem favorecer o acúmulo de biofilme
bacteriano e resultar na destruição do epitélio sulcular e, até mesmo, de partes mais
profundas do aparato de inserção dental (Hou & Tsai, 1993). O acúmulo de
microrganismos nessa região também pode provocar danos ao tecido pulpar. O envolvimento periodontal, decorrente do acúmulo de biofilme nos
sulcos palato radiculares, na maioria das situações clínicas, é de difícil diagnóstico
(Rotstein & Simon, 2004).
2.1.2. Comunicações não-fisiológicas
Perfurações radiculares criam uma comunicação entre o sistema de
canais e o ligamento periodontal. Isso pode ocorrer como resultado de uma
instrumentação mecânica excessiva durante os procedimentos endodônticos,
reabsorções externas e/ou internas ou cáries invadindo o assoalho de câmaras
26
pulpares. Quanto mais próxima a perfuração está do sulco gengival ou bolsa
periodontal, particularmente no terço cervical da raiz ou região de furca, maior é a
probabilidade de um problema endo-periodontal (Meng, 1999).
As fraturas verticais, que ocorrem ocasionalmente, também podem
funcionar como avenidas de contaminação entre os tecidos pulpares e periodontais.
Além das bactérias e seus subprodutos, as fraturas funcionam também como vias de
acesso para fungos e vírus, além de corpos estranhos, colesterol, corpúsculo de
Russel, corpúsculos hialinos de Rushton e cristais de Charcot-Leyden (Rotstein &
Simon, 2004).
2.2. Patogênese
2.2.1. Biofilme bacteriano
A maioria dos processos patológicos endodônticos e periodontais se
desenvolve à partir de estímulos nocivos, advindos das bactérias organizadas em
biofilme (Nair, 1987; Belibasakis et al.,2015; Gomes et al., 2013). Define-se biofilme
como uma comunidade de microrganismos, aderidos à uma superfície sólida. Além
disso, é a forma padrão de crescimento de procariotas em seu ambiente natural. O
crescimento bacteriano na forma planctônica ocorre somente em bactérias
adaptadas a viver em ambientes com concentrações extremamente baixas de
nutrientes. Outra importante propriedade que essa forma de organização microbiana
confere é a resistência a forças físicas, que removeriam com facilidade células
apenas aderidas a uma superfície.
Propriedades gerais de um biofilme (Fejerskov & Kidd, 2011):
Proteção contra a defesa do hospedeiro;
Proteção contra ressecamento;
Alta resistência ou tolerância a agentes antimicrobianos;
Novas expressões gênicas e fenotípicas;
Persistência e retenção dos microrganismos em sistema de fluxo;
Heterogeneidade espacial e ambiental que cria um mosaico de
microambientes;
Aumento da diversidade microbiana;
27
Organização espacial entre os microrganismos, que facilita as
interações metabólicas entre eles;
Alta concentração de nutrientes na interface líquido-superfície.
2.2.2. Infecção endodôntica e lesão periodontal Quando a polpa é infectada, uma resposta inflamatória do ligamento
periodontal ocorre pela comunicação com o forame apical ou ramificações
adjacentes de canais laterais e acessórios (Seltzer et al., 1967). Subprodutos
inflamatórios de origem pulpar podem infiltrar-se pelo forame apical, canais
acessórios, laterais e túbulos dentinários para iniciar a resposta inflamatória vascular
no periodonto. Os resultados da inflamação da polpa podem variar, em extensão,
desde um processo inflamatório mínimo, confinado ao ligamento periodontal, até sua
destruição extensa, assim como do alvéolo dentário e do osso adjacente. Tal lesão
pode resultar em edema localizado ou difuso, que ocasionalmente pode envolver a
gengiva inserida. Uma lesão relacionada à necrose pulpar pode resultar também em
uma fístula, que drena através da mucosa alveolar ou da gengiva inserida. Essa
última pode drenar, ocasionalmente, pelo sulco gengival do dente envolvido ou pelo
sulco gengival de um dente adjacente. Após o tratamento endodôntico adequado, as
lesões resultantes da necrose pulpar irão regredir sem intercorrências, na maioria
dos casos. Subsequentemente, a integridade dos tecidos periodontais será
restabelecida (Walton & Torabinejad, 1997).
Jansson e colaboradores, em 1993, investigaram possíveis relações entre
o estado clínico periodontal, em dentes periodontalmente envolvidos, com e sem
infecção endodôntica, sendo analisada a correlação entre a condição periapical, dos
dentes endodonticamente envolvidos, e seu estado periodontal. Demonstraram que
a patologia periapical foi significativamente correlacionada com um aumento da
profundidade de sondagem da bolsa periodontal. Eles concluíram, então, que a
necrose pulpar radiograficamente detectada pela presença de uma radioluscência
periapical pode agravar a doença periodontal, sendo, portanto considerada como
fator de risco para a progressão de periodontite.
Sabendo-se que a possível interdependência das lesões endo-
periodontais pode ser justificada devido às conexões vasculares e anatômicas entre
28
os tecidos pulpar e periodontal, Jivoinovici et al., 2014 afirmaram que uma lesão
endodôntica primária com envolvimento periodontal secundário requer,
primeiramente, uma abordagem endodôntica, ou seja, uma adequada desinfecção e
obturação do canal radicular. Sugerem que procedimentos periodontais invasivos
devem ser evitados, nesses casos, levando-se em consideração que prognóstico
desse tipo de lesão é normalmente bom.
2.2.3. Doença periodontal e infecção endodôntica O biofilme polimicrobiano é o principal fator etiológico das periodontites
crônicas, formados por complexas comunidades microbianas. Acredita-se que a
doença seja iniciada após mudanças na microbiota que compõe esse biofilme
subgengival. A adesão entre as espécies de microrganismos que compõe esse
biofilme envolve moléculas associadas à superfície bacteriana, e as interações entre
as espécies bacterianas são essenciais no desenvolvimento espacial de um biofilme
polimicrobiano. Além disso, essas interações intensificam a progressão da doença
periodontal (Ng et al., 2016). As bactérias do Complexo Vermelho (Porphyromonas
gingivalis, Treponema denticola, Tannerella forsythia) são frequentemente
encontradas em bolsas periodontais profundas (Suzuki et al., 2013; Gomes et al.,
2015), sendo essas espécies ainda mais virulentas quando em interação sinérgica
entre si (Ng et al., 2016).
O efeito da inflamação periodontal sobre a polpa é controverso. Sugere-
se que a doença periodontal não tenha maiores efeitos sobre a polpa, a não ser que
a região apical seja envolvida. No entanto, vários estudos propõem que o efeito da
doença periodontal na polpa é degenerativo por natureza, causando aumento de
calcificações, fibrose, reabsorção de colágeno e sequelas inflamatórias diretas. A
polpa parece não ser severamente afetada pela doença periodontal até que o defeito
exponha um canal lateral ou acessório ao meio bucal. Nesse estágio, os patógenos
da cavidade bucal, que penetram na polpa por meio do canal acessório, podem
causar uma reação inflamatória, seguida pela necrose pulpar. Entretanto, se a
microvascularização do forame apical permanecer intacta, a polpa pode responder
positivamente aos testes de sensibilidade (Seltzer et al., 1963; Bender & Seltzer,
1985; Czarnecki & Schilder, 1979; Torabinejad & Kiger, 1985; Adriaens et al., 1988a,
Adriaens et al., 1988b).
29
Uma vez que a placa e o cálculo subgengival são os principais
precursores das lesões periodontais, os mediadores inflamatórios, liberados como
resposta a estímulos nocivos da microbiota que compõe esse biofilme, podem
causar a destruição de todo aparato de inserção do dente, dentre as quais:
alterações na superfície radicular, pela perda da camada externa de cementoblastos
e reabsorção cementária. Além disso, as endotoxinas (LPS), presentes na
membrana externa das bactérias Gram-negativas, também tem um efeito irritativo
nos tecidos periodontais, comprometendo seu reparo (Llango et al., 2016).
A presença de uma superfície cementária intacta é extremamente
importante para proteger a polpa dos agentes patogênicos, oriundos do biofilme
subgengival. Porém, uma vez que a continuidade dessa camada de cemento é
rompida, através mesmo de procedimentos da terapia periodontal, como a raspagem
e alisamento radicular, haverá a exposição de túbulos dentinários. Isso aumentaria a
probabilidade de danos cumulativos à polpa (Bergenholtz & Lindhe, 1978; Adriaens
et al., 1988).
Rubach e Mitchell, em 1965, sugeriram que a doença periodontal seja
capaz de afetar a saúde da polpa, quando ocorre a exposição de um canal
acessório, permitindo que as bactérias periodontopatógenas provoquem reações
inflamatórias, seguidas de necrose pulpar.
Lindhe, em 1999, também afirmou que os infiltrados bacterianos
periodontais podem atingir a polpa, quando há exposição de canais acessórios,
inclusive os situados na região de furca em dentes molares. Adriaens et al., 1988,
demonstraram que as bactérias, provenientes das bolsas periodontais, têm a
capacidade de atingir os canais radiculares em direção à polpa, sugerindo que os
túbulos dentinários representem potentes reservatórios para esses microrganismos.
Devido a esse fato, é possível que ocorra, até mesmo, uma recolonização da
superfície da raiz tratada.
Andreasen et al., 2002 afirmaram que as fraturas e rachaduras verticais
da raiz podem servir como uma potentes vias de contaminação do periodonto para o
espaço pulpar, pois se o tecido periodontal tiver uma inflamação prévia, esse
processo inflamatório poderá de disseminar até a polpa e resultar em necrose.
Khalid & Fouzan, 2014 acreditam que procedimentos periodontais, como
a raspagem e alisamento radicular, podem resultar na ruptura e destruição dos
vasos sanguíneos e feixes neurovasculares dos canais laterais, provocando uma
30
redução do suprimento sanguíneo e, conseqüentemente, levando a alterações
pulpares.
2.2.4. Endotoxinas A microbiota da cavidade oral é composta por bactérias Gram-positivas e
Gram-negativas. No entanto, especial atenção é dada às bactérias Gram-negativas,
porque elas apresentam como principal constituinte da membrana externa de sua
parede celular os lipopolissacarídeos (Gomes et al., 2009).
Devido ao elevado peso molecular, o LPS é sem dúvida um dos maiores
produtos liberados pelas bactérias (Nissan et al, 1995). Os LPS, quando liberados
da célula Gram-negativa (e exclusivamente por ela) por lise ou durante o processo
de divisão celular (na forma de vesículas), são conhecidos como endotoxinas, sendo
o lipídio A a porção da molécula principal, responsável por seus efeitos biológicos
(Rietschel et al., 1994). O nome endotoxina deve-se aos efeitos biológicos da
molécula, sendo consideradas, mesmo em baixas concentrações, potentes
estimuladores da resposta inata do sistema de defesa do hospedeiro (Beutler, 2004),
induzindo assim, uma série de eventos biológicos que levam a uma reação
inflamatória (Khabbaz et al., 2001) e reabsorção dos tecidos mineralizados (Mattison
et al.,1987; Stashenko et al., 1991).
LPS tem a habilidade de atravessar a dentina, e atingir uma profundidade
quatro vezes maior, no interior dos túbulos dentinários, do que a própria bactéria
(Berkiten et al., 2000; Gomes et al., 2009). Isto sugere que todos os produtos
bacterianos são potencialmente capazes de alcançar a polpa (Nissan et al., 1995).
Quimicamente LPS são constituídos de uma porção “Lípideo A", Core
oligossacarídeo (polissacarídeos) e Antígeno O. A porção “Lípideo A" exerce a maior
parte das atividades endotóxicas, a qual é referida como princípio endotóxico do
LPS (Dixon & Darveau, 2005). A estrutura química do lipídeo A é composta por
ácidos gráxos com 15 a 17 átomos de carbono, ligados a duas moléculas de amino-
açúcares (glicosaminas), à qual ligam-se dois radicais fosfatos, e a estes liga-se um
resíduo de proteína. As posições dos radicais fosfato, assim como o número, tipo e
sítio de ligações parecem determinar o potencial inflamatório dos diferentes
lipopolissacarídeos (Rietshel & Brade, 1992).
31
O organismo está apto a detectar pequenas quantidades de LPS
circulante. O reconhecimento do LPS se dá por meio do lipideo A, que por sua vez,
ativa diferentes vias de sinalização intracelular através de sua ligação a receptores
próprios. Os principais estão localizados na membrana celular de monócitos,
denominados receptores Toll-like 4 (TLR4) (Wilson et al., 1996; Beutler & Poltorak,
2000). Desde sua descoberta, no final da década de 1990, os receptores do tipo
Toll-like têm sido identificados como sensores primários de infecções bacterianas e
permitido avanços significativos na compreensão dos mecanismos envolvidos na
imunidade inata e adquirida (Coats et al., 2009; Marinho, 2016).
Estudos clínicos demonstraram a presença de LPS bacteriano em 100%
dos canais radiculares de dentes com infecção endodôntica primária e presença de
lesão periapical (Jacinto et al., 2005; Vianna et al., 2007; Martinho & Gomes, 2008;
Gomes et al., 2009; Martinho et al., 2010; 2011), e também em dente com insucesso
do tratamento endodôntico (Gomes et al., 2012), sugerindo sua participação na
patogênese de lesões periapicais.
Endotoxinas são capazes de estimular a liberação de citocinas pró-
inflamatórias, tais como IL1-, IL-6, TNF- e PGE2, por diferentes linhagens
celulares (Wilson et al., 1996; Martinho et al., 2010; 2011b; 2012). A rede de
citocinas produzidas revela sua complexa atividade antigênica e o padrão de
resposta imune/inflamatória pulpar e perirradicular gerado será determinado pelo
potencial inflamatório do conteúdo infeccioso (Homji et al., 2012).
Segundo Minabe et al., 1994, na doença periodontal, a maioria dos
LPS fica aderida superficialmente na porção radicular e pode ser removida através
do polimento radicular. As endotoxinas residuais, que ficam na superfície radicular,
podem ser toleradas ou neutralizadas pelos mecanismos de defesa do hospedeiro.
Em seu trabalho, eles observaram que a endotoxina pode ser removida, atingindo
taxas de até 99,2%. No entanto, o polimento por si só pode ser insuficiente, sendo
necessário a utilização de alguma substância química para eliminação total do LPS.
Estudos mostraram que a endotoxina se adere fracamente à superfície
radicular e não penetra profundamente no cemento. Além disso, alisamento radicular
excessivo pode levar a remoção completa de cemento e parece ser desnecessária,
uma vez que evita a sensibilidade pulpar (Nakib et al., 1982; Nyman et al., 1988;
Lowenguth & Greenstein, 1995; Duque, 2016).
32
Liu et al., 2002 mostraram que partículas de cemento, coletadas de
dentes comprometidos com doença periodontal, apresentaram quantidades
significativas de endotoxinas. Dessa forma, o LPS atuaria como um potente
estimulador de células inflamatórias tendo como consequência a destruição óssea
periodontal (Duque, 2016).
Jacob et al., 2012, avaliaram níveis de endotoxina na circulação
sangüínea de pacientes com periodontite crônica, através do ensaio semi
quantitativo LAL, imediatamente após processos de raspagem e alisamento
radicular. Eles observaram um aumento significativo nos níveis sangüíneos de
endotoxina 15 minutos após a terapia periodontal (Duque, 2016).
Touyz, 2013 demonstrou que periodontites com bolsas ativas de 7 mm,
ou mais, permite o ingresso de endotoxinas para a circulação sanguínea derivada,
contribuindo para o aparecimento de choque séptico (Duque, 2016).
2.3. Classificação das lesões endo-periodontais
As lesões endo-periodontais podem ser definidas como alterações
patológicas que acometem ambos os tecidos pulpares e periodontais, no mesmo
dente (Gomes al., 2015). Isto dificulta o diagnóstico, porque uma única lesão pode
apresentar sinais de comprometimento endodôntico e periodontal (Khalid & Fouzan,
2014). Existe um consenso geral hoje em dia de que a grande maioria das lesões
pulpares e periodontais é resultado de infecção bacteriana. Sugere-se que uma
doença pode ser o resultado, ou a causa da outra; ou até mesmo, originada de dois
processos diferentes e independentes, associados ao seu desenvolvimento
(Czarnecki & Schilder, 1979).
As lesões endo-perio totalmente desenvolvidas podem apresentar um
quadro radiográfico similar, tornando o diagnóstico diferencial um desafio (Peeran et
al., 2013). Porém, entendendo a patogênese, o clínico pode oferecer o tratamento
adequado e fazer uma estimativa do prognóstico (Khalid & Fouzan, 2014).
Existem diferentes classificações para as lesões endodônticas-
periodontais, dentre as quais se destaca a classificação de Simon e colaboradores,
proposta em 1972. Essa classificação é fundamentada em como essas lesões são
formadas, ou seja, de acordo com a causa primária da doença. Portanto, baseando-
33
se na etiologia, diagnóstico, prognóstico e tratamento, a classificação de Simon et
al., 1972 separa as lesões nos seguintes grupos (Walton & Torabinejad, 1997):
1) Lesões endodônticas primárias: nesse tipo de lesão a necrose
pulpar drena através do ligamento periodontal, na região do sulco gengival. Pode
drenar, também, através do forame apical, canais laterais e acessórios, na região de
furca. A bolsa periodontal que se forma é estreita e tem pouca, ou nenhuma relação
com fatores locais, ou seja, com formação de biofilme subgengival. Radiografias
com cones de guta percha são as ideais para detectar a origem da lesão. O
tratamento endodôntico é o de escolha, levando à resolução completa e rápida da
lesão periapical. Sendo assim, estas lesões possuem um excelente prognóstico.
2) Lesões periodontais primárias: as lesões periodontais são causadas,
primariamente, por patógenos periodontais. Nesse processo, a inflamação
periodontal marginal crônica progride apicalmente ao longo da superfície radicular. O
acúmulo de placa é frequentemente observado, e as bolsas são mais amplas.
Lesões ósseas com perda óssea angular são comumente encontradas e estendem-
se da região cervical até o ápice. As lesões podem não ser limitadas apenas a um
dente e frequentemente envolvem os dentes adjacentes. Ao contrário das lesões
endodônticas primárias, a ausência de crista óssea vestibular, lingual, ou ambas
pode mostrar claramente a raiz e o canal ao nível da perda óssea. O clínico também
deve estar atento ao aspecto radiográfico da doença periodontal associada à
presença das anomalias radiculares de desenvolvimento. Na maioria dos casos, os
testes de sensibilidade indicam clinicamente uma resposta pulpar normal. Esse é um
teste importante para fazer distinção entre as condições da doença endodôntica
primária e da lesão periodontal primária. A sondagem periodontal vai revelar bolsas
mais amplas, que não se estendem necessariamente até o ápice. O prognóstico
depende do estágio da doença periodontal e da eficácia do tratamento periodontal.
3) Lesões endodônticas primárias com envolvimento periodontal secundário: se uma doença endodôntica primária, com a presença de pus,
permanecer sem tratamento por determinado período de tempo, pode ser tornar
responsável, secundariamente, pelo rompimento do periodonto marginal. A placa é
34
encontrada na margem gengival de uma fístula isolada, que leva à inflamação
periodontal marginal. Quando a placa ou cálculo estão presentes, o tratamento e
prognóstico são diferentes daqueles do dente afetado apenas pela doença
endodôntica primária. Os dentes adjacentes não são necessariamente acometidos.
Um espessamento evidente do espaço do ligamento periodontal do dente afetado
pode ser observado, da região apical à cervical. Os testes de sensibilidade
normalmente revelam resposta negativa. Uma bolsa isolada, porém ampla, é
normalmente encontrada, estendendo-se até o ápice. O dente afetado necessita
tanto de tratamento endodôntico, quanto periodontal. Se o tratamento endodôntico
for adequado, o prognóstico depende da gravidade da lesão marginal periodontal e
da eficácia do tratamento. Com o tratamento endodôntico isolado, apenas a parte da
lesão que é de etiologia endodôntica irá cicatrizar até o nível da lesão periodontal
secundária. Um quadro similar pode ocorrer também como resultado de uma
perfuração radicular, durante o tratamento endodôntico, ou por pinos e núcleos
intrarradiculares mal posicionados, durante a restauração da coroa. Algumas vezes
os sintomas podem ser agudos, incluindo formação de abscessos periodontais
associados à dor, edema, exsudato purulento, formação de bolsas periodontais e
mobilidade dentária. Pode ocorrer também uma resposta crônica sem a presença de
dor, envolvendo o aparecimento rápido de uma bolsa periodontal, apresentando
sangramento à sondagem ou exsudato purulento. As fraturas radiculares também
podem simular o aspecto da lesão endodôntica primária com envolvimento
periodontal secundário. Isso ocorre, principalmente, em dentes tratados
endodonticamente com núcleos intrarradiculares e coroas protéticas. Os sinais
podem variar desde a presença de uma bolsa periodontal localizada até a formação
de abscessos periodontais mais agudos.
4) Lesões periodontais primárias com envolvimento endodôntico secundário: a progressão de uma bolsa periodontal pode continuar até os tecidos
apicais serem envolvidos. Nesse caso, a polpa pode se tornar necrótica, como
resultado da infecção pela penetração bacteriana via canais laterais ou forame
apical. As bactérias, oriundas da bolsa periodontal, podem ser a fonte da infecção do
canal. Uma forte correlação entre a presença de microrganismos nos canais
radiculares e sua presença em bolsas periodontais, em sítios com periodontite
avançada, tem sido demonstrada, indicando que patógenos similares podem estar
35
envolvidos em ambas as doenças. Enquanto o suprimento neurovascular da polpa
permanecer intacto, as perspectivas de sobrevida são boas. Se esse suprimento for
perdido pela doença periodontal, a necrose provavelmente irá ocorrer. As lesões
ósseas, associadas à perda óssea angular, são geralmente encontradas e
estendem-se da região cervical até o ápice. A periodontite generalizada ou o
envolvimento periodontal dos dentes adjacentes é comum. Sintomas associados à
dor, oriunda de uma polpa inflamada, são comuns nos estágios iniciais da doença.
Com a evolução da doença, é esperado que a polpa perca sua vitalidade. As
complicações do tratamento podem levar também ao envolvimento endodôntico
secundário. Canais laterais e túbulos dentinários podem estar abertos ao ambiente
bucal devido à curetagem, raspagem, ou procedimentos cirúrgicos peridontais. É
possível que um vaso sanguíneo do canal lateral seja lesionado, durante os
procedimentos periodontais, e que facilite a entrada de microrganismos para o
interior do canal radicular, resultando, assim, em inflamação e necrose pulpar. Os
testes de sensibilidade vão revelar uma resposta anormal ou completamente
ausente. A sondagem mostra uma bolsa profunda que se estende apicalmente, não
se estendendo necessariamente até o ápice. Enquanto o suprimento neurovascular
da polpa permanecer intacto, as perspectivas de sobrevida são boas. Se esse
suprimento for perdido pela doença periodontal, a necrose provavelmente irá
ocorrer. Em dentes unirradiculares o prognóstico geralmente é sombrio. Nos
molares, o prognóstico pode ser melhor, desde que todas as raízes não sofram a
mesma perda de tecidos de suporte. Em tais casos, a ressecção radicular pode ser
considerada como uma alternativa de tratamento.
5) Lesões endo-perio combinadas verdadeiras: ocorrem em dentes
acometidos por uma patologia endodôntica, que progride coronariamente e que
possuem uma bolsa periodontal infectada, que progride apicalmente. O grau da
perda de suporte nesse tipo de lesão é alto. Áreas de radiolucidez óssea extensa,
de origem endodôntica e periodontal, podem ser encontradas associadas ao dente
afetado. Isso se deve à natureza de longa duração dessa condição. Dependendo do
estágio da doença, a lesão pode ou não se comunicar. A apresentação radiográfica
pode ser semelhante à de um dente com fratura vertical. A elaboração do
diagnóstico diferencial correto é essencial. Os testes de sensibilidade vão revelar
ausência completa de resposta, e sondagem mostrará uma bolsa profunda e cônica,
36
característica da doença periodontal. O prognóstico é frequentemente desfavorável.
Isso é particularmente verdadeiro para dentes unirradiculares. Em molares, a
ressecção radicular pode ser considerada como alternativa para o tratamento, se
apenas algumas das raízes forem severamente envolvidas. Na maioria dos casos, a
cicatrização periapical pode ser antecipada após o tratamento endodôntico
adequado. Os tecidos periodontais, entretanto, podem não responder bem a esse
tratamento, e os resultados dependem da gravidade da condição.
Em 1996, Trope & Torabinejad propuseram uma outra classificação para
as lesões endo-periodontais, baseada no tratamento das mesmas:
1) Lesões de origem endodôntica;
2) Lesões de origem periodontal;
3) Lesões endo-perio combinadas;
4) Lesões que apresentam comunicações;
5) Lesões com ausência de comunicações.
Armitage, em 1999, separou as lesões endodônticas-periodontais em três
grupos:
1) Lesões endodônticas-periodontais;
2) Lesões periodontais-endodônticas;
3) Lesões combinadas.
Alguns autores afirmam que no primeiro item da classificação proposta
por Simon e colaboradores em 1972: “lesões endodônticas primárias”, não existe
nenhum tipo de relação com a doença periodontal. Dessa forma, foi sugerida uma
nova classificação de inter-relações endodôntico-periodontais, baseada na doença
primária com seu efeito secundário (Khalid & Fouzan, 2014):
1) Doença periodontal retrógrada:
a) Lesão endodôntica primária, que drena através do ligamento
periodontal;
b) Lesão endodôntica primária, com envolvimento periodontal secundário.
37
2) Lesão periodontal primária;
3) Lesão periodontal primária, com envolvimento endodôntico secundário;
4) Lesão endo-periodontal combinada;
5) Lesão periodontal iatrogênica.
2.4. Microbiologia envolvida nas lesões endodônticas-periodontais
2.4.1. Doença periodontal Diversos trabalhos tem evidenciado que a placa bacteriana é o principal
agente etiológico das várias formas de doença periodontal, e que a natureza exata
da microbiota associada à saúde e à doença periodontal é de extrema relevância
aos clínicos e pesquisadores. Teorias iniciais mostravam o papel da placa
bacteriana, sugerindo que ela era composta por uma massa microbiana complexa e
homogênea, que provocava doença nos locais onde fosse permitido seu
crescimento (Burnett & Scherp, 1968; Burnett, 1970). A literatura tem sido cada vez
mais concisa em demonstrar que a composição bacteriana da placa associada à
áreas sadias é diferente daquela da placa associada à doença. Importante tem sido
também a observação de que microbiotas características podem estar associadas a
enfermidades periodontais clinicamente diferentes (Garant, 1976; Gibbons and
Macdonald, 1961).
As doenças periodontais são muito comuns, afetando até 90% da
população global. A inflamação nos tecidos periodontais mais profundos é causada
pela microbiota patogênica do biofilme subgengival. O processo inflamatório varia
em grau e intensidade, e pode ter como consequência o aparecimento de
mobilidade dentária, dor ocasional, ou até mesmo, eventual perda dos dentes
afetados. Várias bactérias Gram-negativas, incluindo Porphyromonas gingivalis,
Treponema denticola e Tannerella forsythia, são freqüentemente isoladas em
biofilmes subgengivais de pacientes portadores de periodontite crônica e são
consideradas potentes patógenos periodontais (Tsai et al., 2016).
Também já foi relatada uma forte correlação entre várias bactérias
cultiváveis, como Prevotella intermedia, Fusobacterium nucleatum, Aggregatibacter
actinomycetemcomitans e doença periodontal (Slots, 1986; Kolenbrander et al.,
1989). Embora as bactérias subgengivais sejam as principais causadoras das
doenças periodontais (Socransky et al., 1998), grande parte das espécies ou filotipos
38
não é facilmente cultivável (Paster et al., 2006), o que aparenta ser um obstáculo
para entender completamente as relações causais entre as bactérias subgengivais e
a periodontite.
Para superar as dificuldades e limitações associadas às técnicas de
cultivo microbiológico, foram desenvolvidos métodos independentes da cultura,
baseados na amplificação e sequenciamento de metagenomas bacterianos, com a
finalidade de identificar milhares de bactérias diferentes numa única amostra.
Utilizando a técnica de amplificação do gene bacteriano 16S rRNA, Wang
et al., 2013 investigaram a estrutura da comunidade microbiana, associada à uma
condição de saúde periodontal e à periodontite, e encontrou uma forte correlação
entre a complexidade estrutural da comunidade microbiana e o desenvolvimento da
doença periodontal. Além disso, ao analisarem a variação metabólica entre as
espécies bacterianas, em ambas as condições (saúde e doença), observaram que
alguns genes funcionais e vias metabólicas, incluindo os relacionados com a
quimiotaxia bacteriana e a biossíntese de glicanos, estavam sobre-representados
nos microbiomas da doença periodontal.
Liu et al., 2012 e Chen et al., 2015, investigaram a diversidade bacteriana,
encontrada em dentes que apresentavam parâmetros periodontais saudáveis e em
dentes comprometidos periodontalmente, utilizando o seqüenciamento do gene 16S
rRNA. Eles mostraram que há uma mudança na composição da microbiota
subgenvival, em amostras coletadas de dentes periodontalmente saudáveis e
naqueles com doença periodontal. Nas amostras saudáveis, a comunidade
bacteriana era predominantemente Gram-positiva, já nos dentes com doença
periodontal, foi observada uma microbiota com maior número de espécies Gram-
negativas. Os achados desses estudos demonstram que os gêneros Gram-
negativos: Selenomonas (Faveri et al., 2008; Kumar et al., 2005), Prevotella (Darby
and Curtis, 2001), Treponema (Mineoka et al., 2008), Tannerella (Mineoka et al.,
2008), Haemophilus (Slots, 1979), e Catonella (Siqueira & Rôças, 2006) são
significativamente mais encontrados na doença periodontal. Os gêneros Gram-
positivos, Streptococcus, Actinomyces e Granulicatella são mais frequentemente
detectados em amostras de tecidos periodontais saudáveis.
39
2.4.2. Infecção endodôntica
A cavidade oral é uma região do organismo que abriga,
aproximadamente, 1010 bactérias (Figdor & Sundqvist, 2007). No dente, o complexo
dentina-polpa é protegido da invasão bacteriana pela camada de esmalte, um tecido
mineralizado relativamente pouco permeável, pelo cemento e pela fração
mineralizada da dentina.
O rompimento da continuidade desses tecidos expõe os microrganismos
e seus subprodutos ao tecido conjuntivo adjacente. Portanto, a cárie dentária, lesões
traumáticas, ou mesmo rachaduras e trincas podem criar diferentes caminhos, para
que esses microrganismos e seus subprodutos atinjam o sistema de canais
radiculares (Figdor & Sundqvist, 2003).
Entretanto, os microrganismos envolvidos em infecções endodônticas
pertencem a um grupo mais restrito de espécies (Sundqvist & Figdor, 2003;
Sundqvist & Figdor, 2007; Sundqvist, 1994; Siqueira & Rôças, 2009; Munson et al.,
2002; Siqueira et al., 2005), sendo predominantemente anaeróbios estritos. Os
anaeróbios facultativos situam-se na porção mais coronária do canal radicular.
Diferentemente dos anaeróbios estritos, encontrados em maiores quantidades no
terço apical (Baumgartner & Falkler, 1991; Fabricius et al., 1982).
Os principais fatores ecológicos que afetam a sobrevivência das espécies
no ambiente endodôntico são: disponibilidade de nutrientes, nível de oxigênio e pH
(Sundqvist & Figdor, 2003; Sundqvist, 1994; Fabricius et al., 1982). Nos estágios
iniciais da infecção endodôntica, a microbiota é composta por uma maior proporção
de microrganismos anaeróbios facultativos, que exercem suas atividades
metabólicas a partir de carboidratos disponíveis no meio. No decorrer do tempo
(Sundqvist, 1994) e com o avanço do processo infeccioso em direção apical, a
disponibilidade de oxigênio e carboidratos diminuem (Fabricius et al., 1982). Dessa
forma, a microbiota, que era composta predominantemente por espécies anaeróbias
facultativas, passa a ter uma maior proporção de anaeróbios estritos, que exercem
suas atividades metabólicas à partir de proteínas e glicoproteínas, oriundas do
tecido pulpar infectado em desintegração (Figdor & Sundqvist, 2007; Sundqvist &
Figdor, 2003).
Relações de interdependência entre as espécies microbianas
proporcionam mudanças consideráveis na microbiota endodôntica. Estas
associações são provavelmente baseadas em demandas de relações nutricionais
40
(Sundqvist, 1992). Outras interações podem ocorrer entre o hospedeiro e bactéria,
entre uma ou várias bactérias específicas e aspectos clínicos (Gomes et al., 1994;
Jacinto et al. 2003, Gomes et al. 2004; Montagner et al., 2010).
Os estudos microbiológicos, tradicionalmente realizados, são baseados
em métodos cultura dependentes. No entanto, o advento das técnicas moleculares,
que envolvem o estudo do gene 16S rRNA em células bacterianas, permitiu a
identificação de novas espécies (Figdor & Sundqvist, 2007; Figdor & Sundqvist,
2003; Siqueira & Rôças, 2005) e a expansão do conhecimento da microbiota
endodôntica. Assim, os métodos moleculares foram descobertos para superar as
limitações encontradas nas metodologias cultura-dependentes, tais como (Figdor &
Sundqvist, 2007; Siqueira & Rôças, 2005):
a. Baixa sensibilidade, especialmente em bactérias anaeróbias
fastidiosas;
b. Dificuldade de cultivar determinadas espécies;
c. Possíveis características fenotípicas diferentes, presentes em espécies
de mesma linhagem genética, levando muitas vezes a uma identificação errônea.
Os métodos moleculares, entretanto, também apresentam suas
limitações, tais como:
a. O risco de inclusão de contaminantes nas amostras, resultando em
amplificação de espécies não-prevalentes;
b. A falta de discriminação entre células mortas e viáveis, uma vez que a
identificação de células mortas valorizará seu papel na patogênese das doenças
pulpares (Siqueira & Rôças, 2005; Figdor & Sundqvist, 2007).
Porém, apesar das limitações inerentes aos métodos cultura-dependentes
e moleculares, os resultados obtidos através de ambas as metodologias são
extremamente necessários para expandir cada vez mais o conhecimento da
microbiota envolvida nas patologias pulpares e perirradiculares. A prevalência de
determinadas espécies microbianas, nos diferentes tipos de infecções endodônticas,
depende dos métodos utilizados no estudo e da população da amostra. De fato,
espécies como Tannerella forsythia, Treponema spp., Dialister spp., Filifactor alocis
e Olsella spp., foram detectados através do uso de técnicas moleculares. Um
41
assunto ainda controverso é que alguns microrganismos podem ser comumente
encontrados em infecções endodônticas, porém, em pequeno número, o que poderia
significar que seu potencial patogênico é menor (Siqueira & Rôças, 2009).
Dentre os microrganismos mais detectados no terços apicais de canais
radiculares infectados estão: Pseudoramibacter alactolyticus, Treponema denticola,
Fusobacterium nucleatum, Porphyromonas endodontalis, Filifactor alocis, Dialister
pneumosintes, Porphyromonas gingivalis e Tannerella forsythia (Siqueira & Rôças,
2009).
A grande maioria dos microrganismos, que colonizam o sistema de canais
radiculares, organizam-se na forma de biofilme (Jhajharia et al., 2015). Essa forma
de organização espacial é caracterizada como uma comunidade microbiana séssil,
na qual as espécies estão embebidas em uma matriz extracelular polimérica e
firmemente aderidas às paredes dentinárias do canal radicular (De Paz, 2010).
Várias vantagens são proporcionadas às espécies microbianas
organizadas em biofilme, como:
a. Criação de nichos, que permitem a sobrevivência de diferentes
microrganismos;
b. Maior eficiência metabólica;
c. Maior resistência frente aos mecanismos de defesa do hospedeiro;
d. Maior resistência aos agentes antimicrobianos;
e. Melhor comunicação entre as células que compõe o biofilme, sob a
forma de “quorum sensing”, além de permitir a troca de materiais genéticos;
f. Retenção de água para hidratação das espécies (De Paz, 2010;
Jhajharia et al., 2015; De Kievit & Iglewski, 2000).
2.5. Microbiota das lesões endo-periodontais Kipioti et al., 1984, analisando a microbiota periodontal e endodôntica de
6 dentes necrosados, com coroas intactas, sem lesões periapicais e com bolsas
periodontais profundas, observaram que a microbiota encontrada nos canais e nas
bolsas periodontas adjacentes era similar. Também demonstraram que os
microrganismos mais predominantemente encontrados, em ambos os sítios, foram
Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Peptostreptococcus spp,
Capnocytophaga spp, Actinomyces spp e Streptococcus spp. Os autores sugeriram
que a bolsa periodontal era a possível fonte de infecção dos canais radiculares.
42
Kurihara et al., 1995, estudaram a microbiota presente no interior de
canais radiculares e em bolsas periodontais de cinco dentes necrosados, sem cárie
aparente, e com bolsas periodontais profundas. Os autores encontraram mais
microrganismos nas bolsas periodontais que nos canais radiculares, sendo que a
microbiota das bolsas periodontais consistia principalmente de bacilos e cocos.
Espiroquetas foram encontradas apenas nas bolsas periodontais. As espécies
bacterianas mais encontradas nos canais radiculares foram as dos gêneros
Peptostreptococcus spp., e Streptococcus spp., (cocos Gram-positivos),
Actinomyces spp., e Rothia spp., (bacilos Gram-positivos). As bactérias mais
encontradas nas bolsas periodontais foram os bacilos anaeróbios facultativos e
obrigatórios (Gram-negativos e positivos), Campylobacter spp., Fusobacterium spp.,
Peptostreptococcus productus e Peptostreptococcus spp, Porphyromonas gingivalis,
Streptococcus mutans e spp.
Rupf et al., 2000 investigaram a presença de patógenos periodontais
Actinobacillus actinomycetemcomitans, Tannerella forsythia, Eikenella corrodens,
Fusobacterium nucleatum, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia e
Treponema denticola em canais radiculares e bolsas peridontais de dentes com
comprometimento endodôntico-periodontal, através da Reação em Cadeia da
Polimerase (PCR). Coletas clínicas foram realizadas em 31 dentes intactos que
apresentavam, simulteaneamente, ambas as patologias: pulpar e periodontal. As
amostras eram coletadas das bolsas periodontais e dos canais radiculares,
utilizando-se cones de papel absorventes estéreis. Os patógenos periodontais,
analisados nesse estudos também foram encontrados nas amostras endodônticas
dos dentes com comprometimento endo-periodontal, sustentando a ideia de que as
inter-relações endodônticas-periodontais justificam as etiopatogenias endo-
periodontais.
A pesquisa de Berber (2009) teve como objetivos: identificar a microbiota
dos canais radiculares (CR) e bolsas periodontais (BP) de dentes com polpas
necrosadas, lesões periapicais, sangramento gengival e bolsas periodontais, pelos
métodos de cultura microbiológica e PCR; verificar a capacidade do preparo
químico-mecânico (PQM) e do uso de medicação intracanal por 7 (clorexidina gel
2%) e 14 dias (hidróxido de cálcio e associação entre hidróxido de cálcio e
clorexidina gel 2%) em reduzir a contagem de unidades formadoras de colônias
(UFC/mL) no canal radicular e na bolsa periodontal associada; e investigar possíveis
43
associações entre as espécies bacterianas detectadas e entre microrganismos e
sinais e sintomas clínicos. Amostras foram coletadas de CR (E1) e BP (P1) antes e
após o PQM (E2, P2) e após o uso de medicação (E3, P3). Foram utilizados meios
de transporte, cultura e incubação adequados, e os microrganismos identificados
através dos testes bioquímicos. O DNA bacteriano das amostras foi extraído e
“primers” específicos para Treponema denticola (Td), Treponema socranskii (Ts),
Gemella morbillorum (Gm), Tannerella forsythia (Tf), Aggregatibacter
actinomycetemcomitans (Aa), Porphyromonas endodontalis (Pe), Porphyromonas
gingivalis (Pg), Prevotella intermedia (Pi), Prevotella tannerae (Pt), Prevotella
nigrescens (Pn), Fusobacterium nucleatum (Fn), Filifactor alocis (Fa), Parvimonas
micra (Pm) foram utilizados para detecção destas espécies por PCR. Os resultados
mostraram que as UFC/mL iniciais médias foram 17,33 x 106 nos CR e 17,93 x 108
nas BP, após o PQM foram 15,25 x 104 nos CR e 8,53 x 108 nas BP e após o uso
das medicações intracanais 7,6 x 104 nos CR e de 3,88 x 108 nas BP. Pela cultura,
os microrganismos mais encontrados nos CR foram Pi/Pn/Pt e Fn em 45% de E1,
Pi/Pn/Pt (5%), P.propionicum (5%), S.salivarius (5%), M.varians (5%) em E2, A.
naeslundii e P.propionicum em 36,6% de E3. Nas BP, os mais encontrados foram Pg
e Gm em 50% dos casos de P1, Pm em 62,5% de P2 e Fn em 73,3% de P3. Por
PCR, nos CR e nas BP, em todos os momentos da terapia endodôntica, Pm foi o
microrganismo mais frequente. Verificou-se que Pm, Td e Tf foram encontrados em
maior número em P2 que em E2 e que Pe e Fn estavam mais presentes em P3 que
em E3. Nas primeiras coletas não houveram diferenças estatisticamente
significantes. Concluiu-se que os canais radiculares e as bolsas periodontais, de
dentes com comprometimento pulpar e bolsa periodontal, apresentaram-se
infectados por uma combinação de espécies de microrganismos formada,
principalmente, por bactérias anaeróbias estritas e facultativas, Gram-positivas; o
PQM foi o grande responsável pela redução dos microrganismos dos CR;
correlações estatísticas positivas foram observadas entre a presença de sinais e
sintomas de origem endodôntica e periodontal e algumas espécies bacterianas, e
também entre as espécies; quaisquer das medicações intracanais testadas não
foram capazes de alterar ou reduzir a microbiota da bolsa periodontal associada, no
período de 7 ou 14 dias; não houveram diferenças de eficiência antimicrobiana entre
as medicações intracanais utilizadas tanto no canal radicular como na bolsa
periodontal, no período estudado.
44
Pereira e colaboradores, em 2011, detectaram microrganismos
anaeróbios estritos em lesões endodôntico-peridontais, através da Reação em
Cadeia da Polimerase. As amostras clínicas foram coletadas de 27 dentes, no
interior dos canais radiculares e nas bolsas periodontais associadas. A espécie
bacteriana mais frequentemente encontrada, em amostras das bolsas periodontais,
foi Prevotella intermedia, enquanto nos canais radiculares as espécies detectadas
com maior frequência foram Porphyromonas gingivalis e Prevotella intermedia. A
presença simultânea de Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia e
Porphyromonas endodontalis, em ambos os sítios, ocorreu em 18% dos casos.
O estudo de Duque (2013), avaliou a influência do tratamento
endodôntico em pacientes com doença periodontal crônica e polpa vital, através da
análise microbiológica por PCR e quantificação de endotoxinas, em bolsas
periodontais e canais radiculares, de 15 dentes com envolvimento periodontal
crônico e sensibilidade pulpar positiva. Os dentes foram divididos em três grupos: no
Grupo I o tratamento endodôntico foi realizado em uma única sessão. Os dentes do
Grupo II e III receberam medicação intracal por 30 dias. Porém, no Grupo II ela era
composta por hidróxido de cálcio e clorexidina gel 2%, enquanto no Grupo III, pela
combinação de hidróxido de cálcio e solução salina. As amostras foram coletadas
em três diferentes momentos da terapia endodôntica: inicial, após preparo químico-
mecânico e após medicação intracanal por 30 dias, através de cones de papel
absorventes apirogênicos/estéreis. Os microrganismos foram identificados pela
técnica molecular do PCR simples, com o uso de primers específicos para
Fusobacterium nucleatum, Prevotella intermedia, Porphyromonas gingivalis,
Tannerella forsythia, Treponema denticola, Gemella morbillorum e Parvimonas
micra, e para quantificação de endotoxina foi realizado o teste Lisado de Amebócito
Limulus (LAL). Os resultados mostraram que após o preparo químico-mecânico e o
uso de medicação intracal por 30 dias houve redução do conteúdo microbiano em
ambos os sítios, e que a concentração de endotoxinas nas amostras das bolsas
periodontais iniciais foi maior do que nas encontradas após o preparo químico-
mecânico. Os canais radiculares apresentaram concentrações de endotoxinas quase
nulas, em todos os momentos das coletas. Das medicações intracanais testadas
nesse estudo, a que apresentou maiores reduções dos níveis endotóxicos nas
bolsas periodontais foi a composta pela associação de hidróxido de cálcio e solução
45
salina. Esse trabalho concluiu, então, que a presença de uma medicação intracanal
diminui a concentração do LPS nos canais radiculares e bolsas periodontais.
Li et al., 2014, conduziram um estudo que analisaram a comunidade
microbiana presente em canais radiculares e bolsas periodontais de dentes com
lesões endo-periodontais combinadas. Para tal, foram realizadas coletas clínicas em
molares de 20 pacientes. O DNA das amostras dos canais radiculares e bolsas
periodontais foi extraído para posterior amplificação, clonagem e sequenciamento
genético. A análise genética foi realizada por eletroforese em gel de gradiente de
desnaturação. Como resultados, o PCR-DGGE revelou um maior número de bandas
em amostras das bolsas periodontais, o sequenciamento genético identificou, no
geral, 60 gêneros bacterianos, dos quais 43 foram comuns em amostras de ambos
os sítios: pulpar e periodontal. As espécies bacterianas mais prevalentes nas
amostras de canais radiculares e bolsas periodontais foram Filifactor alocis,
Parvimonas micra, Porphyromonas gingivalis e Tannerella forsythia. Eles concluíram
que a alta similaridade entre a microbiota encontrada em amostras de ambos os
sítios sugere que a bolsa periodontal pode ser a possível fonte de infecção do canal
radicular, e que a comunidade microbiana presente em dentes com lesões endo-
periodontais combinadas é diversa e complexa.
Gomes et al., 2015, avaliaram os microbiomas de lesões endo-
periodontais (LEP) antes e após o preparo químico-mecânico (PQM). Foram
coletadas amostras clínicas de 15 canais radiculares (CR) com polpa necrótica e
bolsas periodontais associadas (BP), antes e após PQM. Para identificação de
microrganismos humanos orais foi usado o protocolo do Next Generation
Sequencing (NGS) e cultura viável, para análises das amostras dos CR´s e BP´s. O
teste de Mann-Whitney e de Benjamini-Hochberg foram realizados para
correlacionar os achados clínicos e radiográficos com achados microbianos (p
<0,05). As bactérias foram detectadas em 100% das amostras em ambos os sítios
(15/15), utilizando NGS. Firmicutes foi o filo mais frequentemente detectado em
ambos os sítios, através dos dois métodos de identificação microbiológica. As
espécies mais predominantes no CR, antes e após PQM, por NGS foram:
Enterococcus faecalis, Parvimonas micra, Mogibacterium timidum, Filifactor alocis e
Fretibacterium fastidiosum. As espécies mais prevalentes na BP´s, antes e após o
PQM, através do método NGS foram P. micra, E. faecalis, Streptococcus
constellatus, Eubacterium brachy, Tannerella forsythia e F. alocis. Foram
46
encontradas associações entre lesões periapicais ≤ 2 mm e Desulfobulbus sp. Oral
taxon 041; e entre bolsas periodontais ≥ 6mm e Dialister invisius e
Peptostreptococcus stomatis (todos p <0,05, encontrados no CR antes do PQM).
Concluiu-se que a comunidade microbiana presente nas lesões endo-periodontais
combinadas é complexa e mais diversa do que a relatada anteriormente. É
importante notar que bactérias sobrevivem em alguns canais radiculares após o
preparo químico-mecânico. Finalmente, a similaridade entre a microbiota de ambos
os sítios, antes e após o preparo químico-mecânico, sugere que pode haver uma via
de infecção entre a polpa e o periodonto.
2.6. Preparo Quimico-Mecânico 2.6.1. Substâncias Quimicas Auxiliares O principal propósito do tratamento endodôntico é a eliminação das
bactérias e de seus fatores de virulência (LPS, LTA, etc) do sistema de canais
radiculares, através da ação mecânica dos instrumentos e da ação química de uma
ampla variedade de agentes antimicrobianos (Safavi & Nichols, 1993).
Durante o preparo utilizando como agente irrigante a solução salina, a
quantidade de bactérias presentes é reduzida significantemente, mostrando a
eficiência da instrumentação mecânica (Byström & Sundqvist 1981).
Em 1958, Ingle & Zeldow demonstraram que imediatamente após a
instrumentação mecânica, utilizando solução salina estéril como irrigante, 80% dos
canais radiculares infectados apresentaram culturas positivas. Este número
aumentou para 95,4% após 48 horas.
Sundqvist & Bystrom, 1981, conduziram um estudo que mostrou a
importância do preparo químico-mecânico na redução microbiana. No trabalho, eles
instrumentaram 17 canais radiculares infectados com limas manuais de aço
inoxidável, utilizando apenas solução salina. Os resultados mostraram que a
redução bacteriana foi bastante considerável, mesmo sem o uso de agentes
antimicrobianos. Da mesma forma, Orstavik & Molven, 1991, mostraram que a ação
mecânica da instrumentação sem uso de substâncias antimicrobianas foi eficaz na
redução bacteriana no interior de canais radiculares. No entanto, a eliminação total
de bactérias não foi observada na maioria dos casos.
47
O estudo de Dalton et al., 1998 teve como objetivo comparar a redução
bacteriana no interior de canais radiculares infectados, através da instrumentação
com limas de NiTi e limas manuais de aço inoxidável, usando apenas solução salina.
Foram selecionados 48 dentes com periodontite e amostras microbiológicas foram
realizadas antes, durante e após a instrumentação. Essas amostras foram
incubadas anaerobicamente por 7 dias, e as UFC contadas. Os autores observaram
que a redução bacteriana foi similar, independentemente da técnica (p < 0,0001). Os
resultados deste estudo indicaram que ambas as limas não foram significativamente
diferentes na sua capacidade de reduzir as bactérias intracanais.
Siqueira et al., 1999, avaliaram, “in vitro”, a redução da população
bacteriana pela ação mecânica da instrumentação e irrigação. Os canais radiculares
foram inoculados com uma suspensão de Enterococcus faecalis e instrumentados
com limas manuais Nitiflex, limas Greater Taper (GT) e instrumentos rotatórios
Profile 0,06. A irrigação foi realizada com solução salina estéril. Amostras foram
coletadas antes e após a instrumentação. Todas as técnicas e instrumentos testados
foram capazes de reduzir significativamente o número de células bacterianas no
canal radicular. Os resultados deste estudo mostraram que a instrumentação
mecânica reduz 90% de bactérias presentes no interior dos canais radiculares.
Entretanto, a ação mecânica dos instrumentos endodônticos é incapaz de
promover completa desinfecção de algumas áreas, devido às complexidades
anatômicas dos canais radiculares, que apresentam regiões de istmos e
ramificações, não sendo alcançadas pela ação mecânica dos instrumentos.
Assim, o uso de substâncias químicas auxiliares (SQA) com ação
antimicrobiana, durante o preparo químico-mecânico, é indispensável e auxilia na
redução microbiana. É imperioso que tais substâncias possuam amplo espectro de
ação antimicrobiana, além da capacidade de dissolver tecidos e inativar
endotoxinas, ausência de citotoxicidade, auxiliar na lubrificação do canal radicular
durante a ação de corte dos instrumentos e na remoção de smear layer (Spangberg,
1982).
Dentre as SQA mais utilizadas na endodontia destacam-se o hipoclorito
de sódio (NaOCl), clorexidina (CLX) e ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA).
O hipoclorito de sódio (NaOCl) tem sido bastante utilizado como
substância química auxiliar, durante os procedimentos biomecânicos de desinfecção
dos canais radiculares. NaOCl tem uma atividade antibacteriana de amplo espectro,
48
pois exerce ação contra bactérias vegetativas, esporos bacterianos, fungos,
protozoários e vírus; além dissolver tecidos necróticos. Entretanto, é incapaz de
remover a smear layer. Ademais, é citotóxico e lesivo aos tecidos periapicais,
apresentando ainda, casos de alergia (Siqueira et al., 1998; Mc Donnel & Russel,
1999; Vianna et al., 2004; Okino et al., 2004).
CLX tem se destacado, devido ao seu amplo espectro de ação
antimicrobiana, substantividade, baixa citotoxicidade aos tecidos periapicais e
capacidade de lubrificação (Gomes et al., 2013). Segundo Ferraz et al., 2001, a
clorexidina na forma gel permite que partículas de detritos e restos de tecido fiquem
em suspensão. Essa propriedade, além de favorecer a capacidade lubrificante
durante a instrumentação, compensa a incapacidade da clorexidina de dissolver o
tecido, o que facilita a limpeza do canal radicular.
A clorexidina é uma bisbiguanida catiônica, praticamente insolúvel em
água. Essa substância, inodora e incolor, exerce atividade antimicrobiana de amplo
espectro. A clorexidina apresenta também substantividade, ou seja, ela se liga à
hidroxiapatita do esmalte ou dentina, e a grupos aniônicos de glicoproteínas, sendo
lentamente liberada à medida que sua concentração no meio decresce, permitindo
um tempo de atuação prolongado. Devido à tais propriedades, o uso da clorexidina
na terapia endodôntica tem sido preconizado tanto no preparo químico-mecânico,
como substância química auxiliar (Ferraz et al., 2001, 2007), quanto na forma de
medicação intracanal (Gomes et al., 2003a, 2009, 2013).
A instrumentação mecânica do sistema de canais radiculares produz uma
camada que cobre os túbulos dentinários, conhecida por smear layer. É uma
camada irregular amorfa, contendo detritos inorgânicos de dentina, orgânicos, como
tecido pulpar, processos odontoblásticos, restos necróticos, microrganismos e seus
subprodutos. A smear layer se adere às paredes do canal radicular e poder ocluir
parcialmente ou completamente os túbulos dentinário. Assim, bactérias podem ficar
confinadas no interior dos túbulos dentinários, podendo contribuir para o
desenvolvimento ou a persistência dos processos infecciosos e inflamatórios
(Torabinejad et al., 2002; Ballal et al., 2009; Mello et al., 2010). Essas partículas
também podem se tornar compactadas ao longo de toda a superfície das paredes
dos canais, reduzindo a adaptação da guta-percha durante a obturação (Bowman &
Baumgartner, 2002). Além disso, essa compactação pode se dar a nível apical,
criando um tampão apical que impede a completa limpeza e obturação desta região.
49
Assim, a remoção dessa camada se torna indispensável para o sucesso da terapia
endodôntica, sendo os agentes quelantes as substâncias mais eficazes para sua
remoção (Iqbal et al., 2003; Shahravan et al., 2007).
O EDTA é o agente quelante mais eficaz na remoção da smear layer, com
propriedades lubrificantes proeminentes e amplamente utilizados em endodontia
(Carvalho et al., 2008). O EDTA tem vários usos na endodontia, devido a uma série
de propriedades, tais como: remoção da smear layer (Herrera et al., 2013); atividade
antimicrobiana (Prado et al., 2015), atua na camada profunda de dentina (Martinho
et al., 2010, Marinho et al., 2014), ajuda a reduzir os níveis de LPS (Vianna et al.,
2007, Martinho & Gomes, 2008; Gomes et al., 2009), auxilia na remoção da MIC
(Abi-Rached et al., 2014), libera fatores de crescimento da dentina (Widbiller et al.,
2016), entre outros.
No entanto, para otimizar suas propriedades, o EDTA deve ser ativado
por via ultra-sônica, de modo que possa atingir áreas infectadas não acessíveis pela
instrumentação do canal radicular e irrigação convencional, questões muitas vezes
subestimadas em estudos in vitro (Herrera et al., 2016).
O uso do EDTA na prática clínica é bastante difundido, uma vez que
remove a camada de smear layer contaminada e os debris formados durante o
PQM, abrindo os túbulos dentinários para receber a MIC, ou os cimentos
endodônticos (Schmidt et al., 2015). O EDTA tem a capacidade de atuar sobre as
camadas profundas (≈130μm) de dentina contaminada, não atingida pelo PQM
(Martinho et al., 2010, Marinho et al., 2014), e pode aumentar a remoção de LPS das
amostras, devido ao seu potencial para se ligar ao cálcio presente na porção do
lipíde A das moléculas de endotoxina (Sousa et al., 2014, Gründling et al., 2015,
Herrera et al., 2016). Martinho et al., 2010 mostraram uma redução de 98,06% de
endotoxinas, após o PQM com NaOCl a 2,5% e irrigação passiva com EDTA 17%
(Gomes et al. In press).
A associação de EDTA 17% ao NaOCl melhora a limpeza do canal
radicular, devido à capacidade de remoção de matéria orgânica do NaOCl e à
capacidade do EDTA de remover a matéria inorgânica. Além disso, promove a
redução do conteúdo microbiano e endotóxico de canais radiculares infectados in
vivo (Martinho et al., 2010). A associação de EDTA com CHX também é
interessante, porque não causa alteração morfológica da estrutura dentinária e não
interfere com o colágeno presente na matriz orgânica da dentina radicular e na
50
adaptação do selante à dentina radicular. Portanto, mantém a qualidade do
substrato dentinário para posterior obturação ou restauração do dente com materiais
à base de resina (Gomes et al. in press).
Embora vários estudos tenham demonstrado níveis elevados de redução
da carga microbiana após PQM, independentemente do uso de NaOCl ou CHX
(Gomes et al., 2009b, Rôças et al., 2011, 2016), nenhuma dessas duas substâncias
químicas auxiliares tem a capacidade de eliminar os níveis endotóxicos do sistema
de canais radiculares de dentes com infecção endodôntica primária (Vianna et al.,
2007, Martinho & Gomes 2008, Gomes et al., 2009b, Martinho et al., 2010, Herrera
et al., 2016, Sousa et al., 2014), bem como daqueles com infecção secundária
(Gomes et al., 2012; Endo et al., 2013; Gomes et al. in press).
Dado que a instrumentação / irrigação / SQA com propriedades
antimicrobianas não são 100% eficazes na remoção de microrganismos / LPS/ LTA,
foram propostos procedimentos de desinfecção suplementares para promover uma
melhor desinfecção do canal radicular e remoção de detritos, melhorando o sucesso
do tratamento endodôntico (Plotino et al., 2016; Gomes et al. in press).
A ativação mecânica da SQA inclui a agitação manual com cones de
guta-percha, instrumentos endodônticos ou escovas especiais; sistemas vibratórios,
ativados por peças de mão em baixa velocidade ou por energia sônica ou subsônica;
uso de irrigação ultra-sônica passiva (PUI) ou energia a laser para ativar
mecanicamente os irrigantes; e sistemas de irrigação apical de pressão negativa
(PUI) (Caron et al., 2010, Plotino et al., 2016, Gomes et al., in press).
2.6.2. Técnicas de Instrumentação
Descobertas na área de microbiologia, tratamento da parede dentinária,
previamente à obturação do canal radicular, e o desenvolvimento de novos
instrumentos e técnicas para o aprimoramento do tratamento endodôntico, vêm
sendo fortemente estudados na Endodontia marcando, assim, sua evolução na
Odontologia (Berber, 2005).
Buscando o aprimoramento técnico e a simplificação da instrumentação
endodôntica, novos materiais para a confecção de limas ou instrumentos
endodônticos, novos instrumentos rotatórios de níquel titânio (NiTi) com conicidades
crescentes, novos sistemas de instrumentação rotatória vem sendo desenvolvidos
(Berber, 2005).
51
A introdução no mercado de sistemas rotatórios reciprocantes de NiTi,
baseados em uma única lima, criou novas perspectivas sobre o preparo mecânico
dos canais radiculares. A instrumentação reciprocante foi proposta para simplificar e
encurtar o procedimento de modelagem do canal radicular e reduzir a fadiga do
instrumento (Fidler, 2014). Além disso, a utilização do sistema reciprocante de lima
única foi tão eficaz quanto os sistemas rotatórios de múltiplas limas, para a remoção
de bactérias e endotoxinas de canais radiculares (Marinho et al., 2014). No entanto,
há uma preocupação de que este tipo de preparo, onde uma quantidade substancial
de dentina é removida, em um curto período de tempo, com uma única lima de corpo
robusto e cônico e de corte rápido, produza um debridamento mecânico menos
eficiente do que os sistemas que utilizam múltiplas limas e que produzem um
alargamento mais lento, mais suave e gradual do espaço do canal radicular (De
Deus et al., 2010, 2015; Gomes et al., in press).
Outro aspecto envolvido é o diâmetro do preparo apical. Um maior
preparo apical proporciona uma maior redução bacteriana e LPS, durante o
tratamento endodôntico (Fornari et al., 2010, Martinho et al., 2010, Silva et al., 2016).
Os preparos apicais maiores permitem uma melhor remoção da dentina infectada,
aumentam a ação de irrigação dos irrigantes no terço apical e reduzem
significativamente a carga bacteriana e os níveis de endotoxina no sistema de
canais (Marinho et al., 2012). As possíveis desvantagens de preparos apicais
maiores incluem o desvio da forma original do canal, formação de bordas e
perfurações (Card et al., 2002, Bartha et al., 2006). Estudos clínicos sugeriram que a
ampliação do forame apical resultaria em um aumento do processo de reparo apical
em dentes com polpas necróticas e lesões periapicais (Saini et al., 2012,
Aminoshariae & Kulild, 2015, Gomes et al. in press).
A tecnologia atual para a preparação mecânica falhou no debridamento
de canais ovais, deixando aletas ou reentrâncias não tocadas das extensões bucais
e / ou linguais. Estes recessos intocados podem abrigar biofilmes bacterianos
residuais não afetados e servir como uma causa potencial de infecção persistente,
podendo resultar no insucesso do tratamento (Siqueira et al., 2010, 2013).
Conseqüentemente, esses achados enfatizam o papel fundamental da irrigação e do
uso da MIC na tentativa de compensar o estado subóptimo do debridamento
mecânico em todas as áreas intocadas do canal (De Deus et al., 2015; Gomes et al.
in press).
52
2.7. Preparo Químico-Mecânico com Substâncias Químicas Auxiliares
Byström & Sundqvist, 1981 avaliaram a presença de bactérias em 15
canais radiculares de dentes unirradiculares, com presença de lesão periapical,
irrigados com solução salina fisiológica, durante a instrumentação. Colônias
bacterianas foram isoladas em 100% das amostras iniciais - média de 4,0 x 105
UFC/mL, variando de 102 a 107 UFC/mL. A instrumentação reduziu
consideravelmente o número de bactérias dos canais radiculares, cujos valores de
UFC/mL variaram entre 102 e 103; bactérias foram eliminadas em 8 dentes após o
tratamento. Sete canais radiculares apresentaram infecções persistentes, mesmo
após as 5 sessões de tratamento. Os dentes que apresentaram infecções
persistentes foram aqueles com maior número de bactérias na coleta inicial.
Byström & Sundqvist, 1983, avaliaram a ação antimicrobiana do
hipoclorito de sódio 0,5% (NaOCl) em 30 canais radiculares de dentes apresentando
coroa intacta, necrose pulpar e presença de lesão periapical. Todas as amostras
bacteriológicas iniciais coletadas dos canais radiculares evidenciaram crescimento
bacteriano, sendo isoladas 169 espécies bacterianas, com 80% de incidência de
anaeróbios estritos. Na maioria das amostras, mais de uma espécie foi identificada,
obtendo, em média, 4 espécies por canal radicular. Os gêneros mais
freqüentemente isolados foram Fusobacterium spp., Eubacterium spp.,
Peptostreptococcus spp. e Bacteroides spp. Foram realizados 4 preparos
biomecânicos, com intervalos de 2 a 4 dias, coletando amostras em cada um deles.
Após o tempo pré-estabelecido, testes bacteriológicos dos canais foram realizados.
Os resultados evidenciaram cultura negativa em 12 de 15 espécimes tratados com
NaOCl 0,5%, e 8 de 15 espécimes tratados com soro fisiológico. Os resultados
desse estudo sugeriram que a solução de NaOCl 0,5%, utilizado como irrigante
endodôntico, apresentou melhor efetividade, quando comparada ao soro fisiológico.
Byström & Sundqvist, 1987, avaliaram a ação antibacteriana do hipoclorito
de sódio 0,5%, após o preparo biomecânico, com o uso de ultra-som, em 31 dentes
unirradiculares com necrose pulpar e presença de lesão periapical visível
radiograficamente. Culturas bacteriológicas em anaerobiose foram realizadas no
decorrer de 7 dias da primeira e da segunda sessão, apresentando 29% e 22,5% de
culturas positivas respectivamente.
53
Sjögren & Sundqvist, 1987, avaliaram o efeito antimicrobiano do
hipoclorito de sódio 0,5%, comparando a instrumentação manual e ultra-sônica, em
canais radiculares infectados. Os resultados indicaram que a técnica de ultra-som foi
mais eficiente na eliminação de bactérias dos canais quando comparada à técnica
manual. Os autores concluíram que apesar do ultra-som, definitivamente, aumentar
a desinfecção dos canais radiculares, o uso de uma medicação intracanal entre as
sessões faz-se necessário, com o objetivo de diminuir ainda mais o número de
células bacterianas.
Gomes et al., 1996, avaliaram as variações na suscetibilidade da
microbiota endodôntica aos procedimentos biomecânicos. Os autores investigaram
42 canais radiculares, coletando amostras microbiológicas antes e após a
instrumentação. Nos 15 casos de infecção endodôntica primária, não foi observada
mudança na microbiota. Já nos 27 casos de infecção secundária, houve uma
redução no número de Peptostreptococcus spp. Ao avaliar os 42 casos,
conjuntamente, houve um declínio no número de anaeróbios após o procedimento
biomecânico, especialmente de espécies Gram-positivas como Peptostreptococcus
spp. Os autores concluíram que algumas espécies foram mais resistentes ao
preparo biomecânico.
Shupping et al., 2000, avaliaram a redução bacteriana nos canais
radiculares após o uso de limas rotatórias de níquel titânio e irrigação com NaOCl
1,25%, assim como a ação antimicrobiana do hidróxido de cálcio utilizado por 7 dias.
Quarenta e dois dentes com periodontite apical aguda foram examinados. As
amostras foram coletadas antes e após o uso da medicação. A coleta inicial mostrou
infecção em todos os canais avaliados; 61,9% e 92,5% dos casos apresentaram
cultura negativa após a instrumentação e após medicação durante 7 dias,
respectivamente. Os autores concluíram que a instrumentação rotatória com NaOCl
é um passo importante na redução da microbiota dos canais radiculares, entretanto,
não foi possível eliminar microrganismos por completo dos canais radiculares. Os
autores sugerem a utilização da medicação intracanal por 7 dias, a qual reduziu
ainda mais a microbiota dos canais radiculares.
Vianna et al., 2006, avaliaram, in vivo, a redução microbiana após o
preparo químico-mecânico em canais radiculares de dentes com polpas necrosadas
e lesões periapicais. Foram selecionados 32 dentes unirradiculares, os quais foram
instrumentados com auxílio da clorexidina gel (2%) ou NaOCl (2,5%). Os resultados
54
mostraram que tanto o grupo da clorexidina como o do hipoclorito de sódio foi capaz
de reduzir substancialmente a quantidade de microrganismos no interior dos canais
radiculares (acima de 96%). Entretanto, o grupo instrumentado com NaOCl
apresentou maior número de canais livres de microrganismos do que o grupo da
clorexidina. Os autores concluíram que o hipoclorito de sódio apresentou maior
capacidade de eliminar microrganismos presentes nos canais radiculares de dentes
com infecções primárias.
O trabalho de Martinho & Gomes, 2008, mostrou que o preparo químico-
mecânico, utilizando NaOCl 2,5% como substância química auxiliar, foi eficaz contra
bactérias, mas menos eficaz contra endotoxinas, no interior de canais radiculares
infectados. Nesse estudo, vinte e quatro canais radiculares foram selecionados e
amostras foram coletadas antes e depois do preparo químico-mecânico. Técnicas de
cultura foram utilizadas para determinar as Unidades Formadoras de Colônias
(UFC´s) e o teste Limulus Amebocyte Lysate (LAL) foi utilizado para quantificar
endotoxinas. LPS e bactérias foram detectadas em 100% das amostras iniciais, com
uma concentração média de 139 unidades de endotoxina/mL e 105 unidades
formadoras de colônias/mL, respectivamente. A média na redução de endotoxinas,
após o preparo químico-mecânco, foi de 59,99%, e a média na redução da carga
bacteriana foi de 99,78%.
Gomes et al., 2009, conduziram um estudo clínico, comparando a eficácia
do preparo químico-mecânico com hipoclorito de sódio 2,5% e clorexidina gel 2%, na
eliminação de lipopolissacarídeos (LPS) bacterianos em dentes com periodontite
apical crônica. As amostras foram obtidas de quarenta e quatro canais radiculares,
antes e após o preparo. Os dentes foram aleatoriamente divididos em dois grupos:
G1- NaOCl 2,5% (n=27) e G2- CLX gel 2% (n=27). O teste do Lisado de Amebócito
de Limulus (LAL) foi usado para quantificar as endotoxinas coletadas nas amostras.
Os resultados mostraram presença de endotoxinas em 100% das amostras
investigadas, com uma média de 272 EU/mL em G1 e de 152,46 EU/mL em G2.
Após o preparo houve uma redução para 86 EU/mL em G1 e 85 EU/mL em G2. Os
autores concluem que nenhuma das duas substâncias utilizadas no preparo
biomecânico foi efetiva na eliminação de endotoxinas.
Martinho et al., 2010(a) investigaram a capacidade do preparo químico-
mecânico (PQM) com NaOCl a 5,25% + EDTA a 17% em remover endotoxinas de
55
21 canais radiculares com periodontite apical crônica. Instrumentação rotatória foi
realizada no limite apical de instrumentação correspondente ao ponto zero do
localizador foraminal. Amostras do conteúdo endodôntico foram coletadas antes e
após o preparo químico-mecânico. O teste cinético turbidimétrico de LAL foi utilizado
para quantificação de endotoxinas. Os resultados demonstraram a presença de
endotoxinas em 100% dos casos (antes e após o PQM) e uma redução de
endotoxina (98,06%), estatisticamente significante, após o preparo.
Marinho et al., 2012 verificaram que a redução dos níveis de endotoxina
dos canais radiculares pode ser obtida pela ampliação apical, no entanto, o PQM do
canal radicular foi capaz de reduzir, mas não de eliminar endotoxina.
O estudo clínico de Herrera et al., 2016 investigou a influência da ativação
ultrassônica do EDTA, após o preparo químico-mecânico, em reduzir a concentração
de endotoxinas e o número de bactérias cultiváveis, em dentes com necrose pulpar
e periodontite apical. Amostras foram coletadas de vinte e quatro canais radiculares,
antes e após o preparo químico mecânico, e após irrigação com EDTA 17%, sendo
que nessa última coleta, os dentes foram divididos em dois grupos: grupo I –
ativação ultrassônica do EDTA; grupo II – sem ativação ultrassônica. Os dentes
foram instrumentados com a utilização de instrumentos rotatórios do sistema Mtwo.
A técnica de cultura microbiológica foi utilizada para se determinar o número das
Unidades Formadoras de Colônias. Limulus Amebocyte Lysate (LAL) foi utilizado
para se quantificar as endotoxinas. Os resultados desse trabalho detectaram a
presença de bactérias e endotoxinas em 100% dos canais radiculares necrosados,
antes de realizados os procedimentos biomecânicos. A ativação ultrassônica do
EDTA 17% resultou em redução significativa dos níveis endotóxicos, porém, não
houve diferença estatisticamente significante ao comparar a redução bacteriana nos
grupos analisados. À partir dos resultados, os autores afirmam que a ativação
ultrassônica do EDTA 17% é eficaz em reduzir a concentração de endotoxinas no
interior de canais radiculares de dentes com necrose pulpar.
56
2.8. Medicações intracanais (MIC)
2.8.1. Indicações
Embora as medicações intracanais não possam substituir o preparo
químico-mecânico, seu emprego como coadjuvante em situações clínicas
específicas é indicado (Siqueira & Lopes, 1999). Alguns autores consideram o uso
de uma medicação intracanal essencial para o tratamento endodôntico (Abbott &
Salgado 2009).
A utilização do uso da MIC tem por finalidade, principalmente, reduzir ou
eliminar ao máximo o conteúdo microbiano e endotóxico, resistentes ao PQM.
Entretanto, nenhuma MIC demonstra capacidade de eliminar completamente
microrganismos patogênicos, presentes no sistema de canais radiculares,
principalmente nos casos de difícil resolução, como aqueles de periodontite apical
persistente e flare-up (Bystrom et al., 1985; Ørstavik & Haapasalo, 1990; Lopes &
Siqueira, 2004).
Recomenda-se a utilização de MIC em casos específicos como em dentes
com ápice aberto, exsudato persistente, sintomatologia periapical (dor à
palpação/percussão), além de tempo insuficiente para finalização do procedimento e
fadiga do paciente ou do cirurgião-dentista durante o procedimento (Gomes et al.,
2009).
Os principais propósitos do uso das medicações intracanais na terapia
endodôntica são: promover a máxima eliminação de bactérias que sobreviveram ao
preparo químico-mecânico, atuar como barreira físico-química contra a infecção ou
reinfecção por microrganismos da saliva, reduzir a inflamação perirradicular,
solubilizar a matéria orgânica, neutralizar produtos tóxicos, controlar a exsudação
persistente, controlar reabsorção inflamatória externa e estimular a reparação por
tecido mineralizado (Leonardo, 1998).
As medicações intracanais mais utilizadas na prática clínica endodôntica
são a base de hidróxido de cálcio (Ca(OH)2). O Ca(OH)2 tem um papel
importantíssimo durante o tratamento endodôntico, sendo seu uso cada vez mais
difundido como medicamento intracanal. O grupo hidroxila é considerado o
componente mais importante do Ca(OH)2, pois promove a alcalinização do meio, o
que encoraja o reparo e a calcificação ativa. O pH alcalino não apenas neutraliza o
ácido lático dos osteoclastos, prevenindo, dessa maneira, a dissolução dos
57
componentes minerais da dentina, como também pode ativar a fosfatase alcalina,
que tem papel importante na formação de tecido duro. Foi provado que o coeficiente
de dissociação do Ca(OH)2 permite uma liberação lenta e controlada de ambos os
íons, cálcio e hidroxila, que podem se difundir através dos túbulos dentinários
(Carrote, 2004).
As propriedades do Ca(OH)2 derivam da sua dissociação em íons cálcio
e hidroxila, os quais exercem ação sobre os tecidos e bactérias. Seu efeito
antibacteriano estaria ligado à inativação de enzimas bacterianas. Já seu efeito
mineralizador, está relacionado à sua capacidade de ativar enzimas que tem papel
na formação de tecido duro (Estrela & Pesce, 1996; Tanomaru et al., 2003). Na
busca por uma medicação que reúna o maior número de vantagens, o Ca(OH)2 têm
sido extensivamente estudado, tanto associado a veículos inertes, como a
substâncias ativas.
Como o pH do Ca(OH)2 é cerca de 12, a maioria das bactérias, isoladas
de canais radiculares infectados, são sensíveis aos seus efeitos, sendo eliminadas
em curto período de tempo, quando em contato direto com essa substância. Porém,
algumas espécies, como o Enterococcus faecalis e Candida albicans, sobrevivem
nesse meio alcalino (Siqueira & Lopes, 1999; Gomes et al.,2002 a). Inclusive, há um
questionamento a respeito da sua eficácia em reduzir o número de bactérias,
mesmo após longos períodos entre sessões (Peters et al., 2002).
A baixa solubilidade e difusibilidade do Ca(OH)2 necessita de um longo
tempo de ação para que o medicamento exerça atividade antimicrobiana nos túbulos
dentinários infectados. Embora o tempo ideal necessário para ele descontaminar o
sistema de canais radiculares seja ainda desconhecido, sua ação antibacteriana
pode ser confirmada, clinicamente, pela presença de microrganismos resistentes ou
ausência de exsudatos no canal radicular (Siqueira & Lopes, 1999).
A clorexidina gel é eficaz como medicação intracanal, devido ao seu
amplo espectro antimicrobiano, baixa toxicidade e liberação gradual prolongada,
além de reduzir o processo de reabsorção inflamatória (Ferraz et al., 2001; Gomes
et al., 2006; Lindskog et al., 1998). Entretanto, não funciona como barreira física
dentro do canal, e sua difusão pelos túbulos dentinários resulta num espaço vazio,
propício a recontaminação. Quando associada ao Ca(OH)2, reduz sua atividade
antimicrobiana, mas tal ação ainda é superior ao Ca(OH)2 não associado. Dessa
58
forma, a associação dessas duas substâncias melhora as propriedades
antimicrobianas do Ca(OH)2 (Gomes et al., 2003).
Nerwich et al., 1993 avaliaram mudanças de pH por quatro semanas,
após colocação de medicação intracanal à base de Ca(OH)2, em dentes humanos
extraídos. Os resultados demonstraram que os íons hidroxila difundem-se em horas
pela dentina mais próxima à luz do canal, mas requer de 1 a 7 dias para alcançar a
dentina mais externa, próxima ao cemento. Os picos de pH foram atingidos entre 2 e
3 semanas, e a difusão ocorreu mais significativamente no terço cervical, do que no
terço médio. Os autores acreditam que capacidade tampão da dentina é um fator
que afeta a difusão de íons hidroxila, através dos túbulos dentinários.
Estrela & Pesce, 1996 analisaram a velocidade de difusão dos íons
hidroxila de pastas de Ca(OH)2, preparadas com diferentes veículos: solução salina
estéril, solução anestésica e polietilenoglicol, por períodos de 7, 30, 45 e 60 dias.
Observaram que as variações no pH da superfície radicular externa ocorreram após
30 dias, para os grupos com solução salina e anestésico, indo de pH 6-7 para pH 7-
8; enquanto que a mesma variação para o grupo de polietilenoglicol ocorreu após 45
dias. O pH dentro do canal radicular permaneceu constante, em torno de 12, durante
o período de 60 dias. Eles demonstraram que o veículo associado ao Ca(OH)2
influencia a velocidade de sua dissociação iônica e, conseqüentemente, sua ação
antimicrobiana e mineralizadora. Não houve diferença nas medidas com a presença
ou ausência de cemento.
Trope et al., 1999, compararam a reparação radiográfica de dentes com
periodontite apical, tratados em sessão única ou múltipla sessão, através da
colocação de uma medicação intracanal, à base de Ca(OH)2. Os pacientes foram
divididos em 3 grupos: grupo I - tratamento em sessão única; grupo 2 - os canais
foram deixados vazios por uma semana e depois obturados; e grupo 3 - foi utilizada
medicação à base de Ca(OH)2 por uma semana e, depois, os dentes foram
obturados. Todos os dentes foram avaliados por 52 semanas, e os resultados
mostraram que o de Ca(OH)2 proporcionou, nos grupos que receberam medicação
intracanal por uma semana, uma reparação mais rápida e mais efetiva em relação
aos demais grupos.
Gomes et al., 2003 (a) avaliaram a efetividade do digluconato de
clorexidina 2% gel e Ca(OH)2, como medicação intracanal, em diferentes períodos
de tempo (1, 2, 7, 15 e 30 dias). Canais radiculares de dentes bovinos foram
59
previamente infectados com Enterococcus faecalis. As medicações testadas foram:
clorexidina gel 2%; Ca(OH)2 + polietilenoglicol; clorexidina gel 2% + Ca(OH)2. Foi
observado que a clorexidina 2% gel inibiu o crescimento bacteriano nas amostras de
dentina infectada, em todos os períodos de tempo. A associação de Ca(OH)2 e
polietilenoglicol foram ineficientes na eliminação bacteriana, em todos os períodos
de teste. Observaram ausência de contaminação da dentina nos períodos de 1 e 2
dias, nas amostras onde a associação de clorexidina 2% gel e Ca(OH)2 foi
empregada. Nos períodos subseqüentes, de 7 e 15 dias, houve um decréscimo da
atividade antimicrobiana e, em 30 dias, todas as amostras desse grupo
apresentaram-se contaminadas. Os autores concluíram que a clorexidina 2% gel
apresentou ampla atividade antimicrobiana sobre o Enterococcus faecalis, e que
esta decresceu com o passar do tempo.
Evans et al., 2003, avaliaram a atividade antimicrobiana da associação
entre clorexidina 2% gel e Ca(OH)2, quando comparado ao efeito da associação
entre Ca(OH)2 e água destilada, em discos de dentina bovina, previamente
contaminada com Enterococcus faecalis. Após uma semana no interior dos canais
radiculares, nenhuma das associações foi capaz de eliminar completamente as
bactérias do interior dos túbulos dentinários. A associação entre clorexidina 2% gel e
Ca(OH)2 foi a que apresentou o maior efeito bactericida.
Basrani et al., 2004, avaliaram algumas propriedades físico-químicas (pH,
ângulo de contato, tempo de trabalho, radiopacidade e viscosidade) de medicações
intracanais à base de Ca(OH)2 e clorexidina na forma gel. As medicações testadas
foram clorexidina 0,2% e 2%, Ca(OH)2 associado à água na proporção de
40g/100ml, e associação entre Ca(OH)2 e clorexidina 0,2%. O pH inicial das
associações entre Ca(OH)2 + clorexidina, ou Ca(OH)2 + água foi igual à 12,4 e não
se alterou nas primeiras 24 horas. Dessa forma, a clorexidina não alterou o pH do
Ca(OH)2, mantendo, assim, a ação antimicrobiana associada à liberação de íons
hidroxila. A adição da clorexidina ao Ca(OH)2 reduziu o ângulo de contato dessa
associação e aumentou sua viscosidade. O uso da clorexidina, em diferentes
concentrações, e em combinação ao Ca(OH)2 apresentou propriedades físico-
químicas satisfatórias para ser utilizada como medicação intracanal.
O estudo de De Rossi et al., 2005 avaliou, in vivo, os efeitos da
instrumentação manual e rotatória e utilização ou não de medicação intracanal à
base de Ca(OH)2 e clorexidina 1%, no reparo de lesões periapicais crônicas em
60
cães, avaliadas após 30, 75 e 120 dias. Os dentes foram divididos em quatro
grupos. Os dois primeiros grupos não receberam medicação, sendo obturados em
sessão única, e os outros dois grupos receberam medicação intracanal, composta
pela combinação de Ca(OH)2 e clorexidina por 15 dias. Os resultados
demonstraram, através de análise radiográfica e histológica, que passados 120 dias
da obturação, apenas o grupo que recebeu medicação intracanal apresentou
redução significante no tamanho das lesões, independente da técnica de
instrumentação (manual ou rotatória).
O objetivo do estudo de Gomes et al., 2008 foi avaliar, in vitro, a
suscetibilidade de Enterococcus faecalis, Candida albicans, Actinomyces viscosus e
Porphyromonas gingivalis frente à ação antimicrobiana de diferentes medicações
intracanais (clorexidina 2% gel; clorexidina 2% gel + Ca(OH)2; clorexidina 2% gel +
Ca(OH)2 + óxido de zinco e soro fisiológico + Ca(OH)2) na superfície radicular
externa. Os resultados mostraram que o maior efeito antimicrobiano foi produzido
pela clorexidina 2% gel, seguido da associação entre clorexidina 2% gel + Ca(OH)2;
clorexidina 2% gel + Ca(OH)2 + óxido de zinco; e soro fisiológico + Ca(OH)2. O
microrganismo mais suscetível à ação dos medicamentos foi A. viscosus, seguido de
E. faecalis, C. albicans e P. gingivalis. Os autores concluíram que as medicações
intracanais, que apresentaram clorexidina em sua composição, foram capazes de se
difundir através da dentina, atingindo a superfície radicular externa, e que a
associação de Ca(OH)2 e soro fisiológico não mostrou nenhuma atividade
antimicrobiana na superfície radicular externa no período de 72 horas. Além disso,
concluíram que a clorexidina 2% gel e suas associações com Ca(OH)2 e óxido de
zinco demonstraram rápida capacidade de difusão na dentina radicular, ocasionando
inibição de crescimento bacteriano.
Abbott & Salgado, em 2009, afirmaram que a reparação do tecido duro,
induzida pelo hidróxido de cálcio, ocorre devido à sua elevada toxicidade, que causa
a necrose na superfície do tecido a ser reparado. Porém, esse efeito tóxico do
hidróxido de cálcio é indesejável em um tecido que já está sendo afetado pelo
processo inflamatório, já que a aplicação do mesmo pode resultar na exacerbação
da reabsorção radicular inflamatória externa se o cemento estiver ausente, ou se for
removido através de procedimentos da terapia periodontal. Os autores sugerem que
o hidróxido de cálcio deve ser usado com cautela em áreas com ausência de
cemento.
61
2.8.2. MIC na neutralização de endotoxinas
Buck et al., 2001 avaliaram se o hidróxido de cálcio possui a capacidade
de degradar LPS bacteriano. Este estudo não abordou a questão de quanto tempo
uma condição altamente alcalina pode permanecer, in vivo no canal radicular, mas
sim, se o Ca (OH)2 é capaz de exercer um maior efeito contra as endotoxinas
presentes no canal infectado. Os resultados mostraram que a porção biologicamente
ativa do LPS, que é o lipídeo A, pode ser hidrolisada por produtos químicos
altamente alcalinos, como o Ca(OH)2.
Silva et al., 2002, avaliaram, histologicamente, os efeitos da endotoxina
pura, ou associada ao Ca(OH)2, sobre os tecidos apicais e periapicais em cães.
Eles concluíram que a endotoxina bacteriana causa lesão periapical, e que o
Ca(OH)2 inativa LPS in vivo. O mesmo foi verificado por Nelson Filho (2002), que
acrescenta que o Ca(OH)2 deve ser o medicamento de eleição para curativos
intracanais, em dentes com necrose pulpar e lesão periapical.
Vianna et al., 2007 quantificaram as endotoxinas presentes e as bactérias
cultiváveis, em canais radiculares necrosados, antes, após o preparo químico-
mecânico (sendo esse último realizado, utilizando-se a clorexidina gel 2% como
substância química auxilar) e após 7 dias de medicação intracanal. Foram
selecionados 24 dentes, nos quais foi realizado o preparo químico-mecânico e
aplicadas as seguintes medicações intracanais: pasta de Ca(OH)2; clorexidina 2%
gel, e a associação entre o hidróxido de cálcio e clorexidina gel 2%. Um teste
cromogênico quantitativo de Lisado de Amebócito de Limulus mensurou as
endotoxinas presentes. Cultura microbiológica foi realizada para determinar a
redução bacteriana, através da contagem de UFC´s. Valores relativamente altos de
endotoxina ainda estavam presentes no canal radicular após o preparo químico-
mecânico, embora a maioria das bactérias tivesse sido eliminada. Além disso, o uso
de medicação intracanal, por uma semana, não provocou redução significativa dos
níveis endotóxicos nos canais radiculares.
Um dos objetivos do estudo de Signoretti, em 2009, foi analisar os efeitos
do hidróxido de cálcio, da clorexidina gel 2% e da associação de ambos sobre o LPS
bacteriano, quando utilizados como medicação intracanal. Para isso, foram utilizados
dentes humanos, previamente preparados, contaminados e preenchidos com as
medicações. Os dentes foram divididos em três grupos: grupo I - Ca(OH)2 + soro
62
fisiológico; grupo II - Ca(OH)2 + clorexidina gel 2%; grupo III – clorexidina gel 2%.
As mensurações dos níveis endotóxicos foram realizadas nos períodos
experimentais de 24 horas, 7, 15 e 30 dias. Os resultados do trabalho mostraram
que a maior redução de endotoxinas foi observada no grupo da clorexidina 2% gel
(91,63%), seguida de sua associação com o Ca(OH)2 (88,76%), e depois da
combinação do Ca(OH)2 + soro fisiológico (82,13%). Não houve diferença estatística
entre o grupo da clorexidina gel 2% com o grupo que recebeu a combinação do
hidróxido de cálcio + clorexidina gel 2%, quanto à redução da quantidade de
endotoxinas dentro do canal radicular. Concluiu-se que a clorexidina 2% gel
melhorou a capacidade do Ca(OH)2 em reduzir o conteúdo endotóxico dos canais
radiculares in vitro.
2.9. Redução bacteriana após preparo químico-mecânico e após o uso de medicação intracanal, em dentes com lesão endo-periodontal combinadas verdadeiras
As lesões endo-periodontais combinadas são tratadas, inicialmente, como
lesões endodônticas primárias, com comprometimento periodontal secundário. O
prognóstico de uma lesão endo-perio combinada é muitas vezes desfavorável e
sombrio, especialmente quando as lesões periodontais são crônicas, com perda
extensiva de suporte ósseo (Adriaens et al., 1988). A amputação, hemisecção ou
separação da raiz afetada são algumas das abordagens periodontais mais utilizadas
para esses tipos de lesões. O prognóstico de um dente afetado por uma lesão endo-
periodontal combinada também pode ser mais favorável e com maior previsibilidade
de sucesso, se algumas das alternativas de tratamento periodontal regenerativo,
como os enxertos ósseos e a regeneração tecidual guiada, resultarem em aumento
de suporte ósseo (Zubery & Kozlovsky, 1993; Tseng et al., 1996). Isso ocorre,
porque o determinante mais crítico da piora do prognóstico é a perda de suporte
periodontal. Os casos de doença combinada verdadeira geralmente têm um
prognóstico duvidoso, comparando-se com os outros tipos de problemas
endodôntico-periodontais. Assim, o prognóstico de doenças combinadas reside mais
fortemente na eficácia da terapia periodontal (Jew et al., 1982; Rotstein & Simon,
2000).
63
Após a abordagem endodôntica, em dentes com lesões endo-periodontais
combinadas, a inflamação periodontal sem tratamento resulta na progressão da
doença, tendo até mesmo como consequência a perda do elemento dental. Existem,
na literatura, evidências clínicas acumuladas, que suportam o uso de
antimicrobianos aplicados localmente nas superfícies radiculares (tetraciclina,
clorexidina, doxiciclina e minociclina), concomitantemente às terapias de raspagem
subgengival e alisamento radicular, resultando em reduções significativas na
profundidade de sondagem das bolsas periodontais e ganhos nos níveis de inserção
clínica. Ensaios recentes também demonstram que os antimicrobianos
administrados localmente podem potencializar os efeitos da terapia cirúrgica
periodontal. Em periodontites crônicas, a clorexidina gel é também utilizada como
agente antimicrobiano local, para tratamento de bolsas periodontais iguais ou
superiores a 5 mm (Paquette et al., 2008).
Berber, em 2009, estudou a capacidade do preparo químico-mecânico e
do uso de medicação intracanal por 7 (clorexidina gel 2%) e 14 dias (hidróxido de
cálcio e associação entre hidróxido de cálcio e clorexidina gel 2%), em reduzir a
microbiota presente em canais radiculares e bolsas periodontais de dentes com
lesões endo-periodontais combinadas, através da contagem das UFC´s e pelo
método molecular PCR. Esse estudo concluiu que o número de UFC´s nas bolsas
periodontais foi maior do que o encontrado nos canais radiculares envolvidos, em
todas as fases do tratamento endodôntico, e que o preparo químico-mecânico
reduziu esse número principalmente no canal radicular. Além disso, os resultados
desse estudo mostraram que quaisquer das medicações testadas não foram
capazes de alterar, ou reduzir, a microbiota da bolsa periodontal associada no
período de 7 ou 14 dias, porém, o preparo químico-mecânico foi o grande
responsável pela redução microbiológica do interior dos canais radiculares.
Gamal et al., 2011 realizaram um estudo em 20 pacientes não fumantes,
clinicamente diagnosticados com periodontite crônica. A clorexidina gel 2% foi
utilizada como coadjuvante na terapia periodontal, utilizada superficialmente sobre
as raízes, após 3 minutos de aplicação de EDTA 24%. Os resultados revelaram que
o condicionamento radicular prévio com EDTA 24% potencializa a ação
antimicrobiana da clorexidina sobre o biofilme subgengival.
O principal objetivo do trabalho de Gomes et al., 2015 foi investigar o
perfil microbiano de dentes com lesões endo-periodontais combinadas, no interior
64
dos canais radiculares e nas bolsas periodontais associadas, antes e após o preparo
químico-mecânico, através do sequenciamento genético do gente 16S rRNA. A
substância química auxiliar de escolha, nesse estudo, foi a clorexidina gel 2%, não
apenas pelas suas propriedades antimicrobianas e capacidade de adsorção às
superfícies dentárias, mas também, pela ação reológica e sua capacidade de
lubrificação, facilitando a instrumentação de canais mais atrésicos, característica
comumente encontrada em dentes com comprometimento endo-periodontal. Esse
trabalho revelou que a redução dos níveis microbianos, após o preparo químico-
mecânico, foi mais significativa no interior dos canais radiculares do que nas bolsas
periodontais. Ademais, sugerem que uma medicação intracanal à base de
clorexidina, que permaneça no interior dos canais radiculares por um maior período
de tempo, pode contribuir para uma maior redução da microbiota nas bolsas
periodontais, nos dentes com lesões endo-periodontal combinadas verdadeiras. Por
isso, mais trabalhos devem ser desenvolvidos para esse fim.
Revendo a literatura, podemos observar que apesar de lesões
endodônticas e periodontais terem etiologias bacterianas, e terem sido estudadas
em grande detalhe individualmente, pouco se sabe quanto à etiologia microbiana
das lesões endo-periodontais. Também pouca informação existe a respeito da inter-
relação polpa-periodonto em relação à carga microbiana e endotóxica presente
nestes dois sítios, antes e após as várias fases do tratamento endodôntico. Será que
os procedimentos endodônticos alteram a microbiota e o conteúdo endotóxico do
canal e da bolsa periodontal? Sabendo-se que a infecção atinge os dois tecidos é
necessário que os tratamentos adotados sejam capazes de reduzir os
microrganismos e seus fatores de virulência, de maneira a promover a cura dos
tecidos periapicais e substituir a microbiota presente nas bolsas periodontais por
uma mais relacionada com a saúde bucal. Neste sentido, pouca informação existe
sobre os efeitos do uso de uma medicação intracanal, composta pela combinação
do hidróxido de cálcio e clorexidina gel 2%, por um período de 30 dias, na redução
dos níveis microbiológicos e endotóxicos das bolsas periodontais e canais
radiculares, em dentes com comprometimento endo-periodontal combinado. Todos
estes fatos motivaram o desenvolvimento deste trabalho.
65
3. PROPOSIÇÃO
Os objetivos do presente trabalho foram:
Investigar a presença de microrganismos periodontopatogênicos
(Treponema denticola, Treponema socranskii, Gemella morbillorum,
Tannerella forsythia, Aggregatibacter actinomycetemcomitans,
Porphyromonas endodontalis, Porphyromonas gingivalis, Prevotella
intermedia, Prevotella tannerae, Prevotella nigrescens, Fusobacterium
nucleatum, Filifactor alocis, Parvimonas micra) em canais radiculares e bolsas
periodontais, de dentes com necrose pulpar e bolsas periodontais maiores
que 6 mm, antes e após o preparo químico-mecânico e após o uso de uma
medicação intracanal pelo método do Nested PCR;
Verificar a suscetibilidade destes microrganismos ao preparo
químico-mecânico e ao uso de medicação intracanal por 30 dias, através da
contagem de unidades formadoras de colônias (UFC);
Analisar o efeito do preparo químico-mecânico e da medicação
intracanal na redução dos níveis de endotoxinas do canal radicular e da bolsa
periodontal associada;
Investigar possíveis associações entre as espécies bacterianas
detectadas e endotoxinas com os sinais e sintomas clínicos.
66
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. Comitê de Ética em Pesquisa O projeto foi previamente aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa
(CEP), da Universidade Estadual de Campinas, da Faculdade de Odontologia de
Piracicaba (protocolo nº 119/2015– ANEXO I). Após a seleção dos pacientes, todos
receberam explicações sobre os objetivos e procedimentos da pesquisa e todos
assinaram um Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) elaborado
conforme as normas deste mesmo comitê (ANEXO II).
4.2. Seleção da amostra Compareceram à Faculdade de Odontologia de Piracicaba, na Clínica de
Especialização em Periodontia, no período de 2 anos, 566 pacientes com doença
periodontal avançada. Destes pacientes, 30 com bolsas periodontais profundas
foram avaliados. Para esse trabalho, 14 dentes foram selecionados. Os critérios de
inclusão foram:
Dentes indicados para a realização de tratamento endodôntico, devido
à necrose pulpar e lesão periapical;
Presença de sangramento gengival;
Presença de bolsa periodontal com profundidade de sondagem maior
ou igual a 6 mm, em mais de uma face.
Os critérios de exclusão do trabalho foram:
Pacientes que fizeram uso de antibióticos sistêmicos e/ou locais nos
últimos 3 meses antecedentes às coletas;
Pacientes submetidos ao tratamento periodontal no período de um ano
antecedente às coletas;
Pacientes que apresentavam dentes com grandes extensões de cárie,
com câmara pulpar exposta ao meio bucal, com trincas, calcificações, qualquer tipo
de reabsorção;
Pacientes portadores de doenças sistêmicas.
67
4.3. Aspectos clínicos (anamnese, exame físico, exame clínico) e radiográficos
Foram anotados dados pessoais dos pacientes tais como idade e gênero,
história médica e dentária. Durante o exame clínico foram registradas informações
sobre o dente e sua condição atual, em relação à qualidade e tipo da restauração ou
coroa protética, à presença de cáries, infiltrações coronárias e fraturas.
Quanto à sintomatologia, foi verificada a presença ou ausência de dor,
natureza da dor, história de dor prévia, dor à percussão (horizontal e vertical) e à
palpação. A condição pulpar foi verificada através do teste térmico à frio (Endo ice;
The Hygienic Corporation, Akron, OH, USA). Também foram anotados dados, tais
como: presença ou ausência de edema dos tecidos periapicais, fístulas, mobilidade
dental e bolsa periodontal.
A profundidade de sondagem (PS) e a recessão da margem gengival
(RMG) foram mensuradas milimétricamente, com uma sonda sensível à pressão
manual no local mais profundo do defeito interdental e realizada em todas as faces
do dente envolvido (mesial, distal, vestibular e palatina/lingual). Todas as medidas
foram realizadas com uma sonda periodontal manual sensível à pressão de 0,3 N da
Hu-Friedy (MGF Co. Inc., Chicago, Estados Unidos). O nível clínico de inserção
(NCI) foi calculado como a soma do PS e RMG (Tonetti et al., 1993).
A avaliação do grau de mobilidade dentária foi realizado de acordo com
Schluger et al., 1981 em: Grau 0 – Ausência de mobilidade; Grau I – Mobilidade
clínica de aproximadamente 1 mm na direção vestíbulo-lingual; Grau II - Mobilidade
clínica de aproximadamente 2 mm na direção vestíbulo-lingual e ausência de
mobilidade apical; e Grau III - Mobilidade clínica de aproximadamente 2 mm na
direção vestíbulo-lingual e mobilidade apical.
Todas essas características clínicas e radiográficas, referentes ao dente
investigado, foram anotadas na ficha clínica de cada paciente. Esses dados estão
descritos no APÊNDICE I.
68
Figura 1: Exemplo de radiografias iniciais dos pacientes selecionados
4.4. Procedimentos clínicos e coleta das amostras dos canais
radiculares e bolsas periodontais As metodologias relacionadas às coletas e análises das amostras,
utilizadas neste trabalho, foram baseadas em estudos prévios (Gomes, 1995;
Gomes et al., 1994a,b; 1996, 2004; 2015, Martinho & Gomes 2007).
As coletas foram realizadas nas bolsas periodontais (BP) e nos canais
radiculares (CR) dos dentes selecionados. As coletas nas BP foram denominadas
de coletas periodontais (CP) e as coletas nos CR foram denominadas de coletas
endodônticas (CE).
As coletas nas BP ocorreram nos seguintes momentos:
Coleta Periodontal Inicial (CP1);
Coleta Periodontal após PQM (CP2);
Coleta Periodontal após MIC (CP3).
As coletas nos CR ocorreram nos seguintes momentos:
Coleta Endodôntica Inicial (CE1);
Coleta Endodôntica após PQM (CE2);
Coleta Endodôntica após MIC (CE3).
Primeiramente, foram coletadas as amostras para quantificação das
endotoxinas e depois para a análise microbiológica, tanto nas amostras das BP,
como dos CR.
69
4.4.1. Detalhamento das coletas periodontais
Coleta periodontal Inicial (CP1)
Inicialmente, o paciente realizou bochecho com CLX 0,12% (Periogard®
Colgate-Palmolive Industrial Ltda, São Bernardo do Campo, SP). Alguns princípios
foram observados na coleta das amostras: utilização de técnicas assépticas e
promoção de um fácil acesso para a coleta das amostras, como a remoção de
cálculo supragengival. Esta foi realizada através de profilaxia prévia com pedra-
pomes e taça de borracha e utilização de curetas periodontais, em todas as faces,
evitando, dessa forma, uma contaminação proveniente do periodonto.
Um jato de ar foi aplicado, a fim de manter a superfície dental
completamente seca. Antes da coleta inicial, foi realizado o isolamento relativo do
dente, com o auxílio de roletes de algodão, para minimizar a contaminação por
saliva.
A coleta periodontal foi realizada na bolsa de maior profundidade de
sondagem, através de cones de papel absorventes estéreis/apirogênicos
(esterilizados através de calor seco, em estufa, por um período de tempo de 30 min
a 250°C) calibre FM (Dentsply - Petrópolis, RJ).
Inicialmente, um cone de papel absorvente estéril e apirogênico (i.e.
isento de endotoxinas) foi introduzido até o fundo da bolsa periodontal,
permanecendo por 1 minuto. Em seguida, esse cone era transferido para frascos de
vidro apirogênicos e armazenados em freezer -20 °C. Essa primeira coleta era
destinada para a análise de endotoxinas. Posteriormente, 3 cones de papel
absorventes, um de cada vez, eram introduzidos até o fundo da bolsa periodontal,
permanecendo por 1 minuto cada um. Esses cones eram transferidos para tubos do
tipo Eppendorfs, previamente esterilizados, contendo 1,0 mL do meio de transporte
pré-reduzido VMGA III – Viability Medium Goteberg Agar (Dahlén et al., 1993) e
transportados em jarros a vácuo para o Laboratório de Microbiologia da disciplina de
Endodontia da FOP-UNICAMP. Essa segunda coleta era destinada para a análise
microbiológica.
70
Coletas Periodontais Posteriores: Coleta Periodontal após PQM (CP2) e
Coleta Periodontal após MIC (CP3)
Com a remoção do isolamento absoluto, logo após finalização do preparo
químico-mecânico e selamento provisório do dente com resina fotopolimerizável Z
250 (3M Dental Products, St Paul, EUA), uma nova coleta da bolsa periodontal
(CP2) foi realizada como descrita na CP1.
Após 30 dias, os pacientes foram chamados e a medicação intracanal
removida. O canal foi então preenchido com soro fisiológico e novamente selado
com resina composta fotopolimerizada. Após 48 horas, os pacientes foram
novamente atendidos para finalização do tratamento endodôntico e novas coletas da
bolsa periodontal foram realizadas (CP3).
As características clínicas periodontais foram avaliadas novamente e
anotadas na ficha clínica.
4.4.2. Procedimentos clínicos endodônticos
As coletas foram realizadas na Clínica de Especialização em Endodontia
da FOP/UNICAMP, e as amostras processadas no Laboratório de Microbiologia
Endodôntica. O método utilizado neste estudo foi descrito por Gomes et al., (1994;
1996). Alguns princípios foram preconizados para realização das coletas clínicas,
como:
Durante toda terapia endodôntica, foram utilizadas técnicas assépticas
e instrumentos esterilizados e apirogênicos;
Remoção dos contaminantes coronários (cáries e restaurações
defeituosas) e descontaminação do campo operatório;
Realização do isolamento absoluto;
Remoção de possíveis interferências, a fim de que o instrumento
tivesse um acesso fácil no comprimento pré-estabelecido.
Antes da intervenção, foi realizada a descontaminação da face do
paciente com clorexidina gel 2% (Endogel TM, Itapetininga, SP, Brasil) e anestesia
local na região do dente envolvido. O dente recebeu um polimento coronário com
pedra pomes. Após, foi realizado o isolamento absoluto e o vedamento da interface
coroa-lençol, com auxílio do cianoacrilato (Super Bonder, Loctite, São Paulo, SP)
para evitar uma possível infiltração salivar. Em seguida, foi realizado a anti-sepsia do
campo operatório (superfície externa da coroa, grampo, lençol de borracha, arco e
71
cianoacrilato). Este procedimento foi realizado com swabs estéreis umedecidos,
primeiramente, em H2O2 a 30% (v/v) e depois em NaOCl 5,25% por 30 segundos
cada, sendo subseqüentemente neutralizados com solução estéril de tiossulfato de
sódio 5% (Möller 1981).
Para a fase de abertura coronária, a água proveniente do equipo foi
cessada, sendo a irrigação realizada manualmente com solução salina (SS) estéril e
apirogênica. Brocas de alta rotação diamantadas estéreis/apirogênicas esféricas
1012HL, 1014HL, 1016HL e tronco cônica de ponta inativa 3082 (K.G. Sorensen
Ltda, Barueri, SP, Brasil) foram utilizadas para a remoção de esmalte, dentina e
remoção total do teto da câmara pulpar. Ao adquirir a forma de contorno e
conveniência da abertura coronária, o campo operatório e a câmara pulpar foram
descontaminados novamente com as mesmas soluções e neutralizadores, citados
anteriormente.
Após a abertura coronária, uma lima K#15 (Maillefer/Dentsply, Ballaigues,
Suíça) era levada ao comprimento do canal radicular, determinado na radiografia
pré-operatória. Em seguida, o localizador apical era utilizado (Novapex, Forum
Technologies, Rishon le-zion, Israel) para confirmar a patência e obter o
comprimento real do canal radicular, equivalente a posição zero no localizador
apical.
Para as coletas destinadas à análise microbiológica e endotóxica dos
canais radiculares, cones de papel absorventes e limas endodônticas estéreis e
apirogênicos foram introduzidos no comprimento pré-determinado pelo localizador
foraminal, permanecendo nesta posição por 60 segundos. Os canais radiculares que
estavam secos foram umedecidos com soro fisiológico estéril e apirogênico, para
que fosse garantida uma cultura viável. Quatro cones de papel absorventes foram
sequencialmente introduzidos no comprimento total do canal, permanecendo cada
um por 1 minuto no interior do canal radicular. O primeiro cone foi transferido para
frascos de vidro apirogênicos, armazenados em freezer -20 °C, até o momento do
processamento das amostras. Os demais cones foram transferidos para tubos do
tipo Eppendorfs, previamente esterilizados, contendo 1,0 mL do meio de transporte
pré-reduzido VMGA III – Viability Medium Goteberg Agar (Dahlén et al., 1992) e
transportados em jarros a vácuo para o Laboratório de Microbiologia da disciplina de
Endodontia da FOP-UNICAMP. Esses eppendorfs foram congelados em freezer -
80°C. Essa segunda coleta foi destinada para a análise microbiológica.
72
4.4.2.1. Procedimentos clínicos
O preparo químico-mecânico foi realizado pelo sistema reciprocante
Reciproc (VDW, Munich, Germany). Os procedimentos de irrigação foram realizados
com o auxílio de seringa de 5mL (Becton Dickinson Indústrias Cirúrgicas Ltda, São
Paulo, SP) e agulha hipodérmica BD 20 x 5,5 (Becton Dickinson Indústrias
Cirúrgicas Ltda, São Paulo, SP) pré-curvada, introduzida até o terço médio do canal
radicular. A aspiração do conteúdo dos canais radiculares foi realizada por meio de
cânula aspiradora (Conjunto de aspiração – Colgran, São Paulo – SP).
Durante todo o preparo químico-mecânico, os canais foram preenchidos
com a substância química auxiliar de CLX gel 2% e irrigados com 5 mL de soro
fisiológico, após cada utilização da lima, seguido de aspiração. Além disso, lima K
#10 foi sempre utilizada para manter a patência do canal. Após a instrumentação, os
canais foram irrigados com 5,0 mL de solução de tween 80 + lecitina de soja 0,07%,
para neutralizar a ação da CLX (Siqueira et al., 1998), seguido de uma nova
irrigação com 5,0 mL de solução fisiológica.
Para remoção da smear layer, foi realizada irrigação com 1 mL de EDTA
17%, o qual permaneceu no interior dos canais radiculares por 3 min, sob agitação
constante com cones de guta percha, sendo renovado a cada minuto (Teixeira et al.,
2005). Em seguida, os canais foram irrigados com 5 mL de soro fisiológico
estéril/apirogênico para remoção do agente quelante. Após preparo químico-
mecânico, foram realizadas novas coletas endodônticas (CE2).
Em seguida, os dentes foram distribuídos, aleatoriamente por sorteio, em
2 grupos, a saber:
Grupo I: (n=7) - Sessão única, sem uso de medicação intracanal;
Grupo II: (n=7 MIC por 30 dias) - os canais deste grupo foram secos
com cones de papel e preenchidos com Ca(OH)2 + CLX-gel 2 % (2:1).
Nos pacientes do Grupo II, os canais foram preenchidos com a
medicação, composta da associação entre Ca(OH)2 + CHX gel 2% (2: 1). A pasta foi
inserida nos canais com o auxílio de broca Lentulo estéril (Dentsply-Maillefer,
73
Ballaigues, Suíça). Especial atenção foi dada para que o canal radicular fosse
completamente preenchido com a medicação. Um pellet de algodão estéril foi
utilizado para condensar a MIC ao nível da entrada do canal, e por fim uma
radiografia periapical foi realizada a fim de garantir total preenchimento do canal
radicular. Em seguida, o assoalho da câmara pulpar foi preenchido com uma
camada de aproximadamente 2 mm de coltosol. Posteriormente, foi realizada a
aplicação de ácido fosfórico 37% por 15 segundos e adesivo Single Bond 3M® (3M
Dental Products, St Paul, EUA), seguida da restauração do elemento dentário com
aproximadamente 3 mm de resina composta fotopolimerizável Z 250 (3M Dental
Products, St Paul, EUA). Passados 30 dias, os pacientes foram novamente
atendidos, e os canais assepticamente acessados, sob isolamento absoluto, de
acordo com o protocolo para a desinfecção, anteriormente descrito. A MIC foi
removida com o auxílio de uma lima K#40 contra as paredes laterais do canal
radicular e irrigados abundantemente com 10 mL de solução salina. À seguir, os
dentes foram novamente restaurados, de acordo com o protocolo acima listado. Dois
dias depois, os pacientes foram novamente atendidos, os canais assepticamente
acessados e irrigados com 10 mL de solução salina. Nessa mesma sessão de
atendimento, novas coletas clínicas foram realizadas.
Os canais foram, então, reinstrumentados e se estivessem secos,
obturados.
Previamente à obturação, tanto no Grupo I como no Grupo II, os canais
foram irrigados com 1 mL de EDTA 17% por 3 minutos, sob agitação constante com
cones de guta percha, trocando a solução a cada minuto, seguido de irrigação final
com 10 mL de soro fisiológico. A obturação do canal radicular foi realizada com
cones de guta-percha acessórios Fine Medium extra-longo e Medium (Konne
Indústria e Comércio de Materiais Odontológicos Ltda., Belo Horizonte, MG) e
cimento endodôntico Endométhasone (Specialités – Septodont, Saint-Maurdes,
Fossés Cedex, France), pela técnica do cone modelado apical, complementada com
condensação lateral. O procedimento restaurador de todos os dentes foi realizado,
através da colocação de 2 mm de Coltosol (Vigodent, Colténe, Rio de Janeiro, RJ)
na embocadura dos canais, aplicação de ácido fosfórico 37% por 15 segundos em
toda a cavidade, adesivo 3M Single Bond (3M Dental Products, St. Paul, MN, EUA) e
inserção de resina fotopolimerizável Z 250 (3M Dental Products, St. Paul, MN, USA)
pela técnica incremental. Ao final desse procedimento, foi realizada a radiografia
74
final do tratamento endodôntico. A análise das radiografias foi realizada com o
auxílio de um negatoscópio, primeiramente a olho nu, e depois, juntamente com uma
lupa estereoscópica (com aumento de 10X). Os pacientes foram, à seguir,
encaminhados à clínica da Faculdade de Odontologia de Piracicaba para tratamento
periodontal adequado.
Após um, 3, 6 e 12 meses, depois do término do tratamento endodôntico,
os pacientes foram/serão chamados para avaliação clínica e radiográfica. Dessa
forma, serão realizados todos os testes clínicos. As características referentes à dor,
sangramento, sensibilidade à palpação e percussão serão anotados na ficha clínica.
Será também realizada a radiografia do dente avaliado e esta comparada à
radiografia inicial do tratamento.
4.5. Processamento microbiológico
Cultura
Os frascos contendo VMGA foram agitados no interior da cabine de fluxo
laminar por 1 minuto, para facilitar a dispersão dos microrganismos. À seguir, foram
realizadas diluições seriadas (10-1, 10 -2, 10 -3, 10 -4), utilizando Fastidious Anaerobe
Broth (FAB-LabM, Bury, UK).
Cinquenta μL da amostra “mãe” (sem diluição) e 50 μL de cada diluição
foram inoculados em placas pré-reduzidas, contendo Fastidious Anaerobe Agar
(FAA-LabM, Bury, UK), acrescido de 5% de sangue de carneiro desfibrinado,
suplementados por hemina (5 mg/L), e vitamina K1 (1 mg/L). Essas placas foram
incubadas à 37°C, em atmosfera de 10% de H2, 10% de CO2, 80% de N2 por até 14
dias, para permitir a detecção de microrganismos anaeróbios estritos. Após a
incubação, as placas “mãe”, 10 -2, 10 -4 foram examinadas em lupa estereoscópica
em aumento de 3 vezes, para contagem das UFC´s.
75
Figura 2: Processamento das amostras pelo método de cultura, para contagem
das Unidades Formadoras de Colônias. A - Placa pré-reduzida contendo FAA; B – Cabine
de anaerobiose; C – Placa contendo microrganismos após 7 dias de incubação.
Técnicas moleculares
Extração de DNA Os tubos contendo VMGAIII com cones de papel absorventes (coletas
clínicas) foram descongelados e colocados no agitador de tubos (MA 162-
MARCONI, São-Paulo, SP, Brasil). À seguir, o DNA das amostras foi extraído com o
kit QIAamp DNA mini kit (QIAGEN, Chatsworth, CA, USA), de acordo com as
instruções do fabricante. Após extração, a presença de DNA e sua concentração,
em cada amostra, foi verificada por meio de um espectrofotômetro para ácidos
nucléicos (NanoDrop 2000, Thermo Scientific, Wilmington, DE, EUA). Após esse
procedimento, as amostras foram armazenadas a -80 ºC até seu uso posterior.
Nested-PCR 1. Reação de PCR universal O volume de DNA das reações foi ajustado de acordo com sua
concentração, para que cada reação fosse realizada com aproximadamente 50ng de
DNA. Água MiliQ estéril foi adicionada para complementar o volume de 37 μL, que
somado à 13 μL do mix de reagentes da PCR, resultava em um volume total de
reação de 50 μL. Para cada reação, o mix de reagentes era composto de 5μL de
Buffer 10X PCR; 1,5μL de Cloreto de Magnésio; 4μL de dNTP; 1 μL Primer Univ F
(25 pMol); 1 μL Primer Univ R (25 pMol); 0,5μL de Platinum Taq DNA Polymerase.
A B C
76
Os ciclos de variação de temperatura foram programados em um
aparelho termociclador convencional (MJ96G, Biocycler, termocicladores, Curitiba,
SC, Brasil), conforme os seguintes parâmetros:
Desnaturação inicial: 94ºC por 4 min.
30 ciclos:
Desnaturação: 94ºC por 45 seg;
Anelamento: 60ºC por 45 seg;
Extensão: 72ºC por 1,5 min;
Extensão final: 72ºC por 15 min.
A mistura de reagentes foi submetida à desnaturação inicial em 94°C por
4 min, seguido de 30 ciclos de desnaturação por 45s à 94°C, anelamento por 45s à
60°C, seguido de uma extensão final em 72°C por 1,5 min.
Os produtos amplificados foram analisados por eletroforese horizontal em
gel de agarose 1% (0,9 g de agarose ultrapura Invitrogen + 900 mL de TAE 1x),
corado com 0,5μL de brometo de etídio (10mg/ml), por aproximadamente 45 minutos
a 90V e sob temperatura ambiente, em um tampão TAE 1X. Para o controle positivo
da reação foi utilizado o DNA extraído de uma cepa bacteriana padrão (ATCC). Ao
controle negativo, que tem como objetivo evidenciar qualquer contaminação na
mistura de reagentes, não foi acrescentado DNA bacteriano. Produtos de
aproximadamente 1500bp, visualizados sob luz ultravioleta, foram considerados
positivos.
77
Tabela 1: Primers utilizados na reação de PCR universal
Primer Sequência Fragmento Referência
Univ. Foward 5’ AG AGT TTG ATY MTG
GCT CAG 3’
1,505 bp
Willis et al., 1999
Univ. Reverse 5’ ACG GCT ACC TTG
TTA CGA CTT 3’
2. Reação espécie-específica Verificado o sucesso da reação universal, uma alíquota do produto desta
reação foi utilizado como substrato para a realização de outra reação subseqüente
de PCR, agora utilizando primers espécie-específicos.
78
Espécie Sequência Ciclos Fragmento Referência
P.nigrescens F: 5’ ATG AAA CAA AGG
TTT TCC GGT AAG 3’
R: 5’ CCC ACG TCT CTG
TGG GCT GCG A 3’
Desnaturação inicial
95°C por 2 min e 36
ciclos: 94°C por 30s,
58°C por 1min, 72°C
por 2min e extensão
final 72°C por 10 min
804 bp Bogen & Slots,
1999
P. tannerae F: 5’ CTT AGC TTG CTA
AGT ATG CCG 3’
R: 5’ CAG CTG ACT TAT
ACT CCC G 3’
Desnaturação inicial
95°C por 2 min e 36
ciclos: 94°C por 30s,
55°C por 1min, 72°C
por 2min e extensão
final 72°C por 10 min
550 bp Xia et al., 2000
T. forsythia F: 5´ TGC TTC AGT GTC
AGT TAT ACC T 3´
R: 5´ AGA GTT TGA TCC
TGG CTC AG 3´
Desnaturação inicial
95°C por 2 min e 36
ciclos: 94°C por 30s,
56°C por 1min, 72°C
por 2min e extensão
final 72°C por 10 min
641 bp Slots et al.,
1995
Edwards et al.,
1989
T. denticola F: 5’ TAA TAC CGT ATG
TGC TCA TTT ACA T 3’
R: 5’TCA AAG AAG CAT
TCC CTC TTC TTC TTA 3’
Desnaturação inicial
95°C por 2 min e 36
ciclos: 94°C por 30s,
58°C por 1min, 72°C
por 2min e extensão
final 72°C por 10 min
316 bp Ashimoto et
al., 1996
T.socranskii F: 5’ GAT CAC TGT ATA
CGG AAG GTA GAC A 3’
Desnaturação inicial
95°C por 2 min e 36
ciclos: 94°C por 30s,
288 bp Siqueira et al.,
2003
79
Tabela 2: Reações e “primers” espécie – específicos
R: 5’ TAC ACT TAT TCC
TCG GAC AG 3’
56°C por 1min, 72°C
por 2min e extensão
final 72°C por 10 min
80
P. gingivalis F: 5’ CAA TAC TCG TAT
GCC CGT TAT TC 3’
R: 5’ AGA GTT TGA TCC
TGG CTC AG 3’
Desnaturação inicial
95°C por 2 min e 36
ciclos: 94°C por 30s,
58°C por 1min, 72°C
por 2min e extensão
final 72°C por 10 min
478 bp Conrads et
al.,1996
Edwards et al.,
1989
P. intermedia F: 5’ TTT GTT GGG GAG
TAA AGC GGG 3’
R: 5’ TCA ACA TCT CTG
TAT CCT GCG T 3’
Desnaturação inicial
95°C por 2 min e 36
ciclos: 94°C por 30s,
58°C por 1min, 72°C
por 2min e extensão
final 72°C por 10 min
575 bp Slots et al.,
1995
A.actinomycet
emcomitans
F: 5’ AAA CCC ATC TCT
GAG TTC TTC TTC 3’
R: 5’ ATG CCA ACT TGA
CGT TAA AT 3’
Desnaturação inicial
95°C por 2 min e 36
ciclos: 94°C por 30s,
50°C por 1min, 72°C
por 2min e extensão
final 72°C por 10 min
593 bp Ashimoto et
al., 1996
F. alocis F: 5’ CGT GGG TAA TCT
GCC TTT GTC 3’
R: 5’ CCT TGG TGG GCT
TTT ATC TCA 3’
Desnaturação inicial
95°C por 2 min e 36
ciclos: 94°C por 30s,
60°C por 1min, 72°C
por 2min e extensão
final 72°C por 10 min
594 bp Siqueira &
Rôças, 1997
F. nucleatum F: 5’ ATT GTG GCT AAA
AAT TAT AGT T 3’
Desnaturação inicial
95°C por 2 min e 36
ciclos: 94°C por 30s,
1000 bp Ávila-Campos
et al.,1999
81
R: 5’ ACC CTC ACT TTG
AGG ATT ATA G 3’
55°C por 1min, 72°C
por 2min e extensão
final 72°C por 10 min
G. morbillorum F: 5’ AGA GAC GGT ACC
TAA CCA GAA 3’
R: 5’ TAT GAG GTT GGC
TGA CTC TCG 3’
Desnaturação inicial
95°C por 2 min e 36
ciclos: 94°C por 30s,
52°C por 1min, 72°C
por 2min e extensão
final 72°C por 10 min
781 bp “Primer”
desenhado
pela autora a
partir do
seqüenciamen
to genético
L14327 do
Gen bank
P. micra F: 5’AGA GTT TGA ATC
CTG GCT CAG 3’
R: 5 ’ATA TCA TGC GAT
TCT GTG GTC TC 3’
Desnaturação inicial
95°C por 2 min e 36
ciclos: 94°C por 30s,
60°C por 1min, 72°C
por 2min e extensão
final 72°C por 10 min
207 bp Conrads et al.,
1997
P.
endodontalis
F: 5’ GCT GCA GCT CAA
CTG TAG TC 3’
R: 5’ CCG CTT CAT GTC
ACC ATG TC 3’
Desnaturação inicial
95°C por 2 min e 36
ciclos: 94°C por 30s,
58°C por 1min, 72°C
por 2min e extensão
final 72°C por 10 min
672 bp Siqueira et al.,
2001
82
Quantificação de Endotoxinas
Para quantificação de endotoxinas foi utilizado o método turbidimétrico
Pyrogent -5000® (Lonza, Walkersville, MD, EUA) de Limulus Amebocyte Lysate
(LAL). Por meio deste, um ensaio cinético quantitativo foi realizado, no qual a
amostra foi colocada em contato com o reagente LAL reconstituído, em seguida
incubada em um leitor de microplacas e monitorada automaticamente, através de
um software, até o surgimento de turvação. O tempo necessário, antes da
ocorrência da turvação (Tempo de reação), é inversamente proporcional à
quantidade de endotoxina presente na amostra.
O kit Pyrogent-5000® apresenta:
1. Pyrogent-5000® LAL Reagente;
2. Endotoxina de Escherichia coli 055:B5;
3. Tampão de reconstituição Pyrogent-5000.
Além dos substratos provenientes do kit, também foram utilizados:
1. Água Reagente LAL (Lonza, Walkersiville, MD, EUA);
2. Hidróxido de sódio 0.1 N ou Ácido clorídrico 0.1 N, dissolvidos em água
reagente LAL, para ajuste do pH da amostra;
3. Tubos de vidro descartáveis para diluição, isentos de endotoxina;
4. Ponteiras estéreis descartáveis de 10 μL, 200 μL e 1000 μL;
5. Microplacas estéreis descartáveis (Corning Costar, Cambridge, MA,
UK);
6. Multipipetador de 8 canais;
7. Reservatórios de reagentes (Lonza, Walkersiville, MD);
8. Leitor de microplacas (Ultramark, Bio-Rad Laboratories);
9. Software WinKQCL® (Lonza, Walkersiville, MD);
10. Cronômetro e agitador vortex.
Padronização da Curva Padrão
O estabelecimento da curva padrão, com concentrações conhecidas de
endotoxinas, é necessário para determinar a concentração de endotoxinas com
quantidades desconhecidas. A curva-padrão é necessária para determinar a menor
83
e a maior concentração de endotoxina presente na amostra, assim como os picos
obtidos dentro da curva. Como um parâmetro para o cálculo da quantidade de
endotoxinas, a curva padrão foi obtida à partir da reconstituição do liofilizado de
endotoxina oferecida pelo kit, numa concentração conhecida de 100EU/mL, onde
suas diluições alcançam as concentrações finais de: 0,01, 0,1, 1, 10, 100 EU/mL, de
acordo com as instruções do fabricante.
Diluições seriadas para obtenção das concentrações de endotoxina da
curva-padrão
1. Foi adicionado 0,1 ml de 100 EU/ml endotoxina estoque em 0,9 ml de
água para reagente LAL, resultando numa concentração de 10 EU/ml de
endotoxinas. Essa solução foi vigorosamente agitada em vortex, por pelo menos 1
minuto antes do procedimento;
2. Foi transferido 0,1 ml da solução de endotoxina 10 EU/ml em 0,9 ml de
água para reagente LAL para um recipiente adequado, resultando numa
concentração de 1 EU/ml. A solução foi vigorosamente agitada em Vortex, por pelo
menos 1 minuto antes do início do procedimento;
3. Foi transferido 0,1 ml da solução de endotoxina 1 EU/ml em 0,9 ml de
água para reagente LAL para um recipiente adequado, resultando numa
concentração de 0,10 EU/ml. Essa solução foi vigorosamente agitada em Vortex, por
pelo menos 1 minuto antes do procedimento;
4. Foi transferido 0,1 ml da solução de endotoxina 0,10 EU/ml em 0,9 ml
de água para reagente LAL para um recipiente adequado, resultando numa
concentração de 0,01 EU/ml. Essa solução foi vigorosamente agitada em Vortex, por
pelo menos 1 minuto antes do início do procedimento.
Padronização das diluições das amostras
Os frascos de vidro, contendo as amostras oriundas do canal radicular e
bolsa periodontal, foram colocados em banho-maria (37°C) por 30min. As amostras
foram reconstituídas em 1 mL de água de LAL e em seguida extraídas sob agitação
mecânica em vortex, por 60 segundos. O teste LAL pode ser influenciado por muitos
fatores. Fatores da inibição da detecção de endotoxinas devem ser evitados, para
isso foi realizada a adição de uma quantidade conhecida de endotoxina (0,1 EU/ml),
84
em cada amostra, procedimento que é denominado “Spike”. Em seguida, os testes
foram realizados em triplicata, sendo da mesma amostra: 3 poços contendo 100 μL
da amostra mãe ou suas diluições; e 3 poços contendo 100 μL amostra + 0.1 EU/mL
de endotoxina (Spike). O teste foi realizado como descrito à seguir. Para evitar que
houvesse qualquer tipo de interferência (inibição ou desenvolvimento) da amostra
com o reagente de LAL, a concentração de endotoxina recuperada dos poços
contaminados, calculada pelo software, permaneceu entre 50% - 200%, valor este
denominado controle positivo do produto (PPC).
Plate Layout
Para quantificação das endotoxinas presentes nas amostras foram
utilizadas placas de cultura de células (96 poços – 12 colunas e 8 fileiras) (Corning
Costar, Cambridge, MA) apirogênicas. Inicialmente, 100 μL do “blank” (água de LAL)
foram inoculados em triplicata na placa. Em seguida, 100 μL de cada ponto da curva
padrão, nas diferentes concentrações (100 EU/mL, 10 EU/mL, 1 EU/mL, 0,10 EU/mL
e 0,01 EU/mL), foram distribuídos em triplicata. Após, 100 μL das amostras e seus
respectivos controles (PPC) - ambos em triplicata - foram inoculados com reagente
de LAL. Para cada poço do controle positivo foi adicionado 10 μL de 0,1 EU/mL de
endotoxina de E. coli (spike). A placa foi posicionada no leitor de ELISA (Ultramark,
Bio-Rad Laboratories), com Software WinKQCL®, programado para - 340 nm, 37 º C
e 100 leituras - 100 μL do reagente de LAL foram adicionados em todos os poços. A
leitura das placas teve uma duração de aproximadamente 60 minutos.
Cálculo da concentração de endotoxinas
De forma contínua durante todo o ensaio, o leitor de microplacas/
software Kinetic-QCL foi monitorado na absorbância de 340nm de cada orifício da
microplaca. Usando a leitura de absorbância inicial de cada orifício como seu próprio
branco, o leitor determinou o tempo necessário para que a absorbância aumentasse
a 0.03 unidades. Este tempo foi denominado Tempo de Reação. O software
WinKQCL executou automaticamente uma correlação linear log/log do Tempo de
Reação de cada padrão com a concentração de endotoxinas correspondente.
85
5. RESULTADOS
5.1. CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS
Para esse estudo foram avaliados 13 pacientes, totalizando 14 dentes
que apresentavam necrose pulpar, lesão periapical e bolsas periodontais maiores,
ou iguais à 6 mm, em mais de uma face. Os elementos dentais avaliados pertenciam
ao grupo dos incisivos, caninos, pré-molares e molares. Clinicamente,
apresentaram-se com restaurações ou eram hígidos. Todos os 14 dentes avaliados
apresentaram-se com mobilidade dental, em todas as etapas do tratamento
endodôntico. As respostas aos testes de percussão vertical demonstraram-se
positivos em 71,42% dos casos iniciais, porém, nenhum paciente relatou
sensibilidade aos testes de palpação periapical, nem demostrou dor espontânea em
nenhuma das fases do tratamento endodôntico.
Os dados referentes a idade dos pacientes e alguns parâmetros clínicos e
periodontais estão apresentados na Tabela 3.
Tabela 3 - Características gerais dos 14 dentes que compuseram o
estudo
Parâmetro Dados amostrais
Idade (média ± desvio padrão) 52,5 (±10,5)
Gênero (Masculino/Feminino) 11/3
Estado da coroa Hígido/Restaurado 5/9
Uni/multirradicular 7/7
Profundidade de sondagem (mm) 8,8 (± 2)
Nível de Inserção clínico (mm) 8 (± 3,4)
Presença de mobilidade – n(%) 14 (100%)
86
A média de profundidade de sondagem nos pacientes do Grupo II,
inicialmente aos procedimentos biomecânicos foi 9,35 mm; após 30 dias de
medicação, foi de 9,57 mm. Porém, passado um mês da obturação do canal
radicular, a média foi de 7,4 mm. Nos pacientes do Grupo I, a média de
profundidade de sondagem foi 8,5 mm, antes dos procedimentos de desinfecção dos
canais radiculares; após 30 dias do término do tratamento endodôntico, foi de 7,35
mm.
5.2. MÉTODO CLÁSSICO DE CULTURA 5.2.1. Variação de Unidades Formadoras de Colônias após cada
intervenção
5.2.1.1. No canal radicular
Quanto a contagem das Unidades Formadoras de Colônias, inicialmente
ao preparo químico-mecânico, a mediana do número de microrganismos
encontrados nos canais radiculares foi de 1,3E+3 UFC/mL. Imediatamente após os
procedimentos endodônticos, obtivemos um valor de 0 UFC/mL.
Após 30 dias de medicação intracanal, composta por hidróxido de cálcio e
clorexidina gel 2%, a mediana foi de 0 UFC/mL. Estes dados estão na tabela 4.
Tabela 4: Mediana e média do número de microrganismos (UFC/mL)
encontrados nos canais radiculares antes e após intervenções.
Inicial (n=14)
GI (n=7)
GII (n=7)
E1
E2
E1
E2
E1
E2
E3
Mediana (mínimo e Máximo)
1,3E+3
(2,0E+1 -
3,2E+6) B
0,0E+0
(0,0E+0-
1,9E+3) A
1,3E+3
(2,0E+1-
1,8E+5) B
0,0E+0
(0,0E+0-
2,4E+2) A
1,7E+3
(1,9E+2-
3,2E+6) B
0,0E+0
(0,0E+0-
1,9E+3) A
0,0E+0
(0,0E+0-
6,4E+2) A
Média
2,4E+5
1,6E+2
2,7E+4
3,4E+1
4,6E+5
2,9E+2
1,0E+2
87
Nota: Letras diferentes indicam valores estatisticamente diferentes (Testes de Wilcoxon,
E1xE2, e Dunn, E1xE2xE3, p<0,05).
Houve redução estatisticamente significantes, comparando-se as coletas
iniciais e as realizadas após o PQM. Encontramos redução da média de UFC/mL ao
comparar as coletas após o PQM e após 30 dias de MIC. Esses dados estão
presentes na tabela 5.
Tabela 5: Redução de UFC (%) nos canais radiculares
Redução em % Canal radicular
Coleta pós preparo
Coleta pós medicação
UFC
Total 99,9* Sessão única 99,9*
Sessão múltipla 99,9* 65,7* Nota: Redução da média de UFC em relação à sessão anterior (s2 x s1) e (s3 x s2).
* redução significativa pelo teste Mann-Whitney (p<0,05)
5.2.1.2. Na bolsa periodontal
A mediana do número de microrganismos encontrados nas bolsas
periodontais iniciais foi de 6,3E+6 UFC/mL. Imediatamente após o preparo químico-
mecânico, obtivemos um valor de 1,0E+6 UFC/mL.
Após 30 dias de medicação intracanal, composta por hidróxido de cálcio e
clorexidina gel 2%, a mediana foi de 6,3E+5 UFC/mL. Estes dados estão na tabela 6.
88
Tabela 6: Mediana e média do número de microrganismos (UFC/mL)
encontrado nas bolsas periodontais antes e após intervenções.
Inicial (n=14)
GI (n=7)
GII (n=7)
P1
P2
P1
P2
P1
P2
P3
Mediana (mínimo e Máximo)
6,3E+6 (4,4E+5
- 4,8E+7) B
1,0E+6
(8,0E+3-
1,7E+7) A
6,4E+6
(6,7E+5-
3,6E+7) B
5,3E+5
(8,0E+3-
5,6E+6) A
2,8E+6
(4,4E+5-
4,8E+7) B
1,8E+6
(2,6E+5-
1,7E+7) A
6,3E+5
(3,0E+4-
1,0E+7) A
Média
1,1E+7
3,4E+6
1,2E+7
1,4E+6
1,1E+7
5,4E+6
2,7E+6
Nota: Letras diferentes indicam valores estatisticamente diferentes (Testes de Wilcoxon,
P1xP2, e Dunn, P1xP2xP3, p<0,05).
A estatística de ambas as tabelas foi feita linearmente comparando os
momentos 1, 2 e 3 em cada grupo. P1=coleta da bolsa periodontal antes das
instrumentações do canal radicular e da bolsa periodontal / P2= coleta da bolsa
periodontal logo após a instrumentação / P3=coleta da bolsa periodontal após 30
dias com canal preenchido com medicação (p<0,05). E1= coleta de canal após
abertura coronária / E2= coleta de canal logo após a instrumentação / E3= coleta de
canal após 30 dias de medicação (canal preenchido com medicação) p<0,05.
Houve redução estatisticamente significante, comparando-se as coletas
iniciais e as realizadas após o PQM. Encontramos redução da média de UFC/mL ao
comparar as coletas após o PQM e após 30 dias de MIC. Esses dados estão
presentes na tabela 7.
89
Tabela 7: Redução de UFC (%) nas bolsas periodontais
Redução em %
Bolsa periodontal
Coleta pós preparo
Coleta pós medicação
UFC
Total 70,2*
Sessão única 88,0*
Sessão múltipla 51,5* 49,4* Nota: Redução da média de UFC em relação à sessão anterior (s2 x s1) e (s3 x s2).
* redução significativa pelo teste Mann-Whitney (p<0,05)
5.3. NESTED-PCR
5.3.1. Canal Radicular
Os microrganismos mais frequentemente encontrados nos canais
radiculares na primeira coleta (antes do preparo químico-mecânico) foram:
Prevotella tannerae (71,42%,10/14), Treponema socranskii, Porphyromonas
endodontalis e Prevotella nigrescens (57%, 8/14), enquanto que imediatamente após
o preparo químico-mecânico Tannerella forsythia, Prevotella Tannerae, Prevotella
nigrescens e Fusobacterium nucleatum foram as mais prevalentes (42,8%, 6/14).
Passados os 30 dias de medicação intracanal, as espécies mais encontradas foram
Treponema denticola, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Porphyromonas
endodontalis, Prevotella nigrescens e Fusobacterium nucleatum (57,1%, 4/7). Esses
dados estão de acordo com a tabela 8.
Avaliando as etapas da terapia endodôntica, houve diferença estatística
quanto à frequência total de microrganismos nos canais radiculares, entre a primeira
coleta e a coleta pós preparo (teste de Wilcoxon, p=0,035), mas não houve diferença
na comparação com pós-medicação. Da mesma forma, não houve associação entre
o quantitativo de cada bactéria vista individualmente nas diferentes fases do
tratamento endodôntico (teste de McNemar, como descrito na Tabela 8).
90
Tabela 8: – Frequência das bactérias encontradas nos canais radiculares
em cada uma das etapas do tratamento endodôntico, número (percentual) E1 E2 E1 E2 E1 E2 E3
Treponema denticola 7 (50%)
3 (21,4%)
2 (28,6%)
2 (28,6%)
5 (71,4%)
1 (14,3%)
4 (57,1%)
Treponema socranskii 8 (57,1%)
4 (28,6%)
4 (57,1%)
2 (28,6%)
4 (57,1%)
2 (28,6%)
3 (42,9%)
Gemella morbillorum 2 (14,3%)
2 (14,3%) 2 (28,6%) 1 (14,3%) 0 (0%) 1 (14,3%) 1 (14,3%)
Tannerella forsythia 3 (21,4%)
6 (42,9%)
1 (14,3%)
5 (71,4%)
2 (28,6%)
1 (14,3%)
3 (42,9%)
Aggregatibacter actinomycetemcomitans
3 (21,4%)
3 (21,4%) 1 (14,3%) 1 (14,3%) 2 (28,6%) 2 (28,6%) 4 (57,1%)
Porphyromonas endodontalis
8 (57,1%)
3 (21,4%)
5 (71,4%)
3 (42,9%)
3 (42,9%)
0 (0%)
4 (57,1%)
Porphyromonas gingivalis
3 (21,4%)
4 (28,6%) 2 (28,6%) 3 (42,9%) 1 (14,3%) 1 (14,3%) 2 (28,6%)
Prevotella intermedia 2 (14,3%)
2 (14,3%)
1 (14,3%)
1 (14,3%)
1 (14,3%)
1 (14,3%)
0 (0%)
Prevotella tannerae 10 (71,4%)
6 (42,9%)
4 (57,1%)
3 (42,9%)
6 (85,7%)
3 (42,9%)
3 (42,9%)
Prevotella nigrescens 8 (57,1%)
6 (42,9%)
4 (57,1%)
4 (57,1%)
4 (57,1%)
2 (28,6%)
4 (57,1%)
Filifactor alocis 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 1 (14,3%)
Fusobacterium nucleatum
7 (50%)
6 (42,9%)
5 (71,4%)
4 (57,1%)
2 (28,6%)
2 (28,6%)
4 (57,1%)
Parvimonas micra 6 (42,9%)
2 (14,3%)
3 (42,9%)
1 (14,3%)
3 (42,9%)
1 (14,3%)
2 (28,6%)
E1= coleta de canal após abertura coronária / E2= coleta de canal logo após a instrumentação /
E3= coleta de canal 30 dias após a instrumentação (canal preenchido com medicação).
Não houve diferenças significativas em relação ao tempo baseline por
meio do teste Mcnemar (p<0,05).
5.3.2. Bolsa Periodontal
Os microrganismos mais frequentemente encontrados nas bolsas
periodontais, pelo método Nested-PCR, na primeira coleta foram: Treponema
denticola e Parvimonas micra (92,8%, 13/14), seguidos de Fusobacterium nucleatum
(85,7%, 12/14). Imediatamente após o preparo químico-mecânico, Fusobacterium
nucleatum (78,57%, 11/14), Treponema denticola e Parvimonas micra (71,42%,
10/14) continuaram entre os mais encontrados. Após 30 dias de medicação
intracanal, os microrganismos mais frequentemente detectados foram Tannerella
forsythia e Porphyromonas gingivalis, presentes em 100% dos casos, seguidos de
Prevotella tannerae (85,7%, 6/7), conforme os dados da tabela 9.
91
Avaliando as etapas da terapia endodôntica, não houve diminuição na
frequência total de microrganismos encontrados nas bolsas periodontais após o
PQM. Entretanto, houve uma redução estatisticamente significante entre a coleta
inicial e após uso da MIC (p < 0.05).
Quando avaliamos individualmente os microrganismos, houve
diminuição da frequência de T. forsythia (p=0,038), P. micra (p=0,012), P. gingivalis
(p=0,041) e P. intermedia (p=0,011), após o uso da MIC (p<0,05). A frequência de T.
denticola e F. nucleatum não mostrou diferenças significativas (p=0,66 e p=0,20,
respectivamente). Esses dados estão de acordo com a tabela 9.
Tabela 9: – Frequência das bactérias encontradas nas bolsas
periodontais em cada uma das etapas do tratamento endodôntico, número
(percentual)
P1= coleta da bolsa periodontal após abertura coronária / P2= coleta da bolsa periodontal logo
após a instrumentação / P3= coleta da bolsa periodontal 30 dias após a instrumentação (canal preenchido com
medicação).
P1 P2 P1 P2 P1 P2 P3
Treponema denticola 13 (92,9%) 10 (71,4%) 7 (100%) 6 (85,7%) 6 (85,7%) 4 (57,1%) 2 (28,6%)
Treponema socranskii 11 (78,6%) 6 (42,9%) 7 (100%) 5 (71,4%) 4 (57,1%) 1 (14,3%) 5 (71,4%)
Gemella morbillorum 7 (50%) 4 (28,6%) 4 (57,1%) 2 (28,6%) 3 (42,9%) 2 (28,6%) 3 (42,9%)
Tannerella forsythia 11 (78,6%) 10 (71,4%) 6 (85,7%) 5 (71,4%) 5 (71,4%) 5 (71,4%) 7 (100%)
Aggregatibacter actinomycetemcomitans
10 (71,4%) 8 (57,1%) 7 (100%) 6 (85,7%) 3 (42,9%) 2 (28,6%) 3 (42,9%)
Porphyromonas endodontalis
8 (57,1%) 4 (28,6%) 6 (85,7%) 4 (57,1%) 2 (28,6%) 0 (0%) 5 (71,4%)
Porphyromonas gingivalis
7 (50%) 10 (71,4%) 3 (42,9%) 6 (85,7%) 4 (57,1%) 4 (57,1%) 7 (100%)
Prevotella intermedia 7 (50%) 7 (50%) 4 (57,1%) 5 (71,4%) 3 (42,9%) 2 (28,6%) 0 (0%)
Prevotella tannerae 9 (64,3%) 9 (64,3%) 7 (100%) 5 (71,4%) 2 (28,6%) 4 (57,1%) 6 (85,7%)
Prevotella nigrescens 10 (71,4%) 8 (57,1%) 6 (85,7%) 6 (85,7%) 4 (57,1%) 2 (28,6%) 3 (42,9%)
Filifactor alocis 4 (28,6%) 3 (21,4%) 2 (28,6%) 1 (14,3%) 2 (28,6%) 2 (28,6%) 3 (42,9%)
Fusobacterium nucleatum
12 (85,7%) 11 (78,6%) 7 (100%) 6 (85,7%) 5 (71,4%) 5 (71,4%) 5 (71,4%)
Parvimonas micra 13 (92,9%) 10 (71,4%) 7 (100%) 6 (85,7%) 2 (28,6%) 4 (57,1%) 5 (71,4%)
92
Não houve diferenças significativas em relação ao tempo baseline por
meio do teste Mcnemar (p<0,05).
Avaliando as etapas da terapia endodôntica, houve diferença estatística
quanto à frequência total de microrganismos nas bolsas periodontais entre a
primeira coleta e a coleta pós preparo (teste de Wilcoxon, p=0,005), mas não houve
diferença na comparação com pós-medicação. Da mesma forma, não houve
associação entre o quantitativo de cada bactéria vista individualmente nas diferentes
fases do tratamento endodôntico (teste de McNemar, como descrito na Tabela 9).
5.4. Quantificação de endotoxinas Para a quantificação de LPS foram considerados os 14 dentes e as
amostras avaliadas foram: as amostras iniciais, após PQM e após medicação
intracanal dos canais radiculares e bolsas periodontais. O teste turbidimétrico LAL indicou que as endotoxinas estiveram
presentes em 100% das amostras de bolsas periodontais e dos canais radiculares e,
em todas as fases analisadas (inicial, após preparo químico-mecânico e após
medicação intracanal).
5.4.1. Canal Radicular
A média de endotoxinas encontrada nas coletas inicias dos canais
radiculares apresentou uma valor relativamente baixo (15,6 EU/mL), em comparação
à detectada nas bolsas periodontais iniciais. Após o preparo químico-mecânico, a
média apresentou um valor de 0,19 EU/mL. Foi encontrado um valor ainda mais
baixo após o uso da medicação intracanal por 30 dias (0,06 EU/mL). Esses dados
estão apresentados na tabela 10. Houve diferença estatisticamente significante nos
períodos avaliados.
A comparação da concentração de endotoxinas foi realizada entre a
coleta inicial do canal radicular, a coleta imediatamente após o preparo químico-
mecânico e a coleta do canal radicular 30 dias após a medicação intracanal, como
mostra a tabela 10. Houve diferença estatisticamente significante nos períodos
avaliados.
93
Tabela 10: Concentração de endotoxinas nos canais radiculares,
comparando Grupo I e Grupo II, nas diferentes fases do tratamento endodôntico
Inicial (n=14)
GI (n=7)
GII (n=7)
E1
E2
E1
E2
E1
E2
E3
Mediana
(mínimo e Máximo)
9,1 (2,4 -
108) B
0,127 (0,1 -
0,8) A
9,8 (5 - 108)
B
0,13 (0,1 -
0,8) A
8,7 (2,4 -
9,8) B
0,123 (0,1 -
0,3) A
0,07 (0,03-
0,09) A
Média
15,6
0,187
23,2
0,23
8,1
0,145
0,066
E1= coleta de canal após abertura coronária / E2= coleta de canal logo após a instrumentação /
E3= coleta de canal 30 dias após a instrumentação (canal preenchido com medicação). Letras diferentes indicam
valores estatisticamente diferentes (Testes de Wilcoxon, E1xE2, e Dunn, E1xE2xE3, p<0,05).
Quando comparamos a concentração de endotoxinas nos três momentos
de coleta (coleta inicial do canal radicular, coleta imediatamente após o preparo
químico-mecânico e 30 dias após a medicação intracanal), verificamos diferença
estatisticamente significante, como mostra a tabela 11.
Tabela 11: Redução de endotoxinas nos canais radiculares (%)
Redução em % Canal radicular
Coleta pós preparo
Coleta pós medicação
Endotoxinas
Total 83,1* Sessão única 86,0*
Sessão múltipla 80,3* 69,6* Nota: Redução da média de UFC em relação à sessão anterior (s2 x s1) e (s3 x s2).
* redução significativa pelo teste Mann-Whitney (p<0,05)
94
5.4.2. Bolsa Periodontal
Médias altas de endotoxinas foram encontradas nas coletas das bolsas
iniciais (648,11 EU/mL). Após o preparo químico-mecânico, a média foi de 109,65
EU/mL, sendo estatisticamente significante em relação à coleta inicial. Esses dados
estão apresentados nas tabelas 12 e 13. Após o uso da medicação intracanal, o
valor médio da concentração de endotoxinas foi de 36,5 EU/mL, mostrando
diferença estatisticamente significante, quando se comparou com a concentração
inicial de endotoxinas e a concentração de endotoxinas após o preparo químico-
mecânico, como mostram as tabelas 12 e 13.
Tabela 12: Concentração de endotoxinas nas bolsas periodontais,
comparando Grupo I e Grupo II, nas diferentes fases do tratamento endodôntico
P1= coleta da bolsa periodontal após abertura coronária / P2= coleta da bolsa periodontal logo
após a instrumentação / P3= coleta da bolsa periodontal 30 dias após a instrumentação (canal preenchido com
medicação). Nota: Letras diferentes indicam valores estatisticamente diferentes (Testes de Wilcoxon, P1xP2, e
Dunn, P1xP2xP3, p<0,05)
Inicial (n=14)
GI (n=7)
GII (n=7)
P1
P2
P1
P2
P1
P2
P3
Mediana (mínimo e Máximo)
542,5 (76 -
1890) B
88,84 (15,5
- 306) A
550 (76 -
1750) B
75,1 (15,5 -
187) A
535 (100 -
1890) C
90 (85 -
306) B
40,5 (26 -
51) A
Média
648,1
109,6
639,1
89,8
657,1
129,5
39,4
95
Tabela 13: Redução de endotoxinas (%) nas bolsas periodontais
Redução em % Bolsa periodontal
Coleta pós preparo
Coleta pós medicação
Endotoxinas
Total 98,8* Sessão única 99,0*
Sessão múltipla 98,2* 54,3* Nota: Redução da média de UFC em relação à sessão anterior (s2 x s1) e (s3 x s2).
* redução significativa pelo teste Mann-Whitney (p<0,05)
5.5. Associações entre os microrganismos nas bolsas periodontais e canais radiculares
Para testar a hipótese nula de relação entre as espécies foi utilizado o
teste de Fischer (p<0,05). Nos casos em que essa hipótese foi descartada, ou seja,
quando houve associação entre as espécies (p<0,05), o teste de Odds ratio foi
realizado. Associações positivas seriam aquelas em que Odds ratio foi maior que 2 e
para associações negativas aquelas em que os valores de Odds ratio foram
menores que 0,5. Quando houveram células sem valores para presença e ausência
de bactérias na tabulação 2x2, o Odds ratio não pôde ser calculado e foi descrito
como “indeterminado”. Para observar a relação negativa ou positiva entre as
bactérias, foi trazido, adicionalmente, o teste de correlação de Spearman (p<0,05).
5.5.1. Canal Radicular
Algumas associações aconteceram no interior dos canais radiculares,
nas várias etapas do tratamento endodôntico. Todas as associações (com
resultados estatisticamente significantes) encontradas foram positivas, ou seja, a
presença de uma bactéria aumentou a chance de encontrar a outra. As tabelas à
seguir trazem os resultados das associações, nas diferentes fases da terapia
endodôntica.
96
Tabela 14: Associação da presença de espécies distintas no interior do canal radicular no momento pré-tratamento (N=14)
Treponema denticola
Treponema socranskii
Gemella morbillorum
Tannerella forsythia
Aggregatibacter actinomycetemcomitans
Porphyromonas endodontalis
Porphyromonas gingivalis
Prevotella intermedia
Prevotella tannerae
Prevotella nigrescens
Filifactor alocis
Fusobacterium nucleatum
Parvimonas micra
Treponema denticola 0,296
0,231
0,096 0,500
0,296
0,500
0,769
0,280
0,051 -
0,143
0,051
Treponema socranskii 0,296
0,692
0,154 0,154
0,529
0,615
0,308
0,594
0,156 -
0,296
0,121
Gemella morbillorum 0,231
0,692
0,396 0,604
0,308
0,396
0,725
0,495
0,308 -
0,769
0,165
Tannerella forsythia 0,096
0,154
0,396 0,547
0,154
0,093
0,604
0,330
0,154 -
0,500
0,385
Aggregatibacter actinomycetemcomitans
0,500
0,154
0,604
0,547
0,154
0,547
0,033
0,330
0,154 -
0,500
0,385
Porphyromonas endodontalis
0,296
0,529
0,308
0,154 0,154
0,154
0,308
0,175
0,016 -
0,704
0,471
Porphyromonas gingivalis
0,500
0,615
0,396
0,093 0,547
0,154
0,604
0,330
0,154 -
0,500
0,385
Prevotella intermedia 0,769
0,308
0,725
0,604 0,033
0,308
0,604
0,495
0,308 -
0,231
0,692
Prevotella tannerae 0,280
0,594
0,495
0,330 0,330
0,175
0,330
0,495
0,015 -
0,280
0,406
Prevotella nigrescens 0,051
0,156
0,308
0,154 0,154
0,016
0,154
0,308
0,015 -
0,296
0,121
Filifactor alocis - - - - - - - - - -
- - Fusobacterium
nucleatum
0,143
0,296
0,769
0,500 0,500
0,704
0,500
0,231
0,280
0,296 -
0,704
Parvimonas micra 0,051
0,121
0,165
0,385 0,385
0,471
0,385
0,692
0,406
0,121 -
0,704
Associação avaliada por meio do teste Exato de Fisher. Negrito significa diferenças significativas (p<0,05).
Algumas associações tiveram resultado significativo no pré-tratamento,
o que levou a explorar as associações por Odds ratio e correlação.
Tabela 15: Associações entre os microrganismos no interior dos canais radiculares no pré-tratamento (N=14)
Microrganismos Teste exato de Fisher
(Valor de p) Odds ratio 95% intervalo de
confiança Correlação de
Spearman Valor de p
Associações positivas A. actinomycetemcomitans e P.
Intermedia 0,033 indeterminado - 0,782 0,001
P. tannerae e P. nigrescens 0,016 35,000 1,743 - 702,993 0,708 0,005
P. endodontalis e P. nigrescens 0,015 indeterminado - 0,730 0,003
97
Três associações bacterianas tiveram resultados significativos: A.
actinomycetemcomitans e P.intermedia; P.tannerae e P.nigrescens; P.endodontalis
e P.nigrescens, todas positivas, tanto pela informação do Odds ratio (no caso de P
tannerae e P nigrescens) e correlações.
Tabela 16: Associação da presença de espécies distintas no interior do canal radicular após PQM (N=14)
Treponema
denticola
Treponema
socranskii
Gemella
morbillorum
Tannerella
forsythia
Aggregatibacter
actinomycetemcomitans
Porphyromonas
endodontalis
Porphyromonas
gingivalis
Prevotella inter
media
Prevotella
tannerae
Prevotella
nigrescens
Filifactor
alocis
Fusobacterium
nucleatum
Parvimona
s micra
Treponema denticola 0,176
0,604
0,385 0,547
0,547
0,176
0,604
0,615
0,055 -
0,385
0,396
Treponema socranskii 0,176
0,505
0,594 0,011
0,670
0,041
0,066
0,594
0,175 -
0,015
0,505
Gemella morbillorum
0,604
0,505
0,692 0,396
0,604
0,505
0,275
0,692
0,692 -
0,692
0,275
Tannerella forsythia 0,385
0,594
0,692 0,615
0,385
0,175
0,692
0,529
0,471 -
0,471
0,692
Aggregatibacter actinomycetemcomitans
0,547
0,011
0,396
0,615
0,547
0,176
0,033
0,385
0,385 -
0,055
0,396
Porphyromonas endodontalis
0,547
0,670
0,604
0,385 0,547
0,176
0,396
0,385
0,385 -
0,385
0,396
Porphyromonas gingivalis
0,176
0,041
0,505
0,175 0,176
0,176
0,066
0,175
0,175 -
0,175
0,066
Prevotella intermedia 0,604
0,066
0,275
0,692 0,033
0,396
0,066
0,165
0,692 -
0,165
0,275
Prevotella tannerae 0,615
0,594
0,692
0,529 0,385
0,385
0,175
0,165
0,471 -
0,471
0,165
Prevotella nigrescens 0,055
0,175
0,692
0,471 0,385
0,385
0,175
0,692
0,471 -
0,016
0,165
Filifactor alocis - - - - - - - - - -
- - Fusobacterium nucleatum
0,385
0,015
0,692
0,471 0,055
0,385
0,175
0,165
0,471
0,016 -
0,692
Parvimonas micra 0,396
0,505
0,275
0,692 0,396
0,396
0,066
0,275
0,165
0,165 -
0,692
Associação avaliada por meio do teste Exato de Fisher. Negrito significa diferenças significativas (p<0,05).
Algumas associações tiveram resultado significativo no pós PQM, o
que levou a explorar as associações por Odds ratio e correlação.
98
Tabela 17: Associações entre os microrganismos no interior dos canais radiculares pós PQM (N=14)
Microrganismos Teste exato de Fisher
(Valor de p) Odds ratio 95% intervalo de
confiança Correlação de
Spearman Valor de p
Associações positivas A. actinomycetemcomitans e T.
Socranskii 0,011 indeterminado - 0,826 0,001
P. gingivalis e T. socranskii 0,041 27,000 1,260 - 578,354 0,650 0,012
F. nucleatum e T. socranskii 0,015 indeterminado - 0,730 0,003 P. intermedia e A.
actinomycetemcomitans 0,033 indeterminado - 0,782 0,001
F. nucleatum e P. nigrescens 0,016 35,000 1,743 - 702,993 0,708 0,005
Cinco associações bacterianas tiveram resultados significativos no
momento pós PQM, todas positivas, tanto pela informação do Odds ratio (calculado
para: P.gingivalis e T.socranskii; F.nucleatum e P.nigrescens) e correlações.
Tabela 18: Associação da presença de espécies distintas no interior do canal radicular pós MIC (N=7)
Trepo
nema denticola
Trepo
nema socranskii
Geme
lla morbillorum
Tann
erella forsythia
Aggregatibac
ter actinomycetemcomitans
Porphyr
omonas endodontalis
Porphyr
omonas gingivalis
Prevotella
intermedia
Prev
otella tannerae
Prevo
tella nigrescens
Filifactor alocis
Fusoba
cterium nucleatum
Parvi
monas micra
Treponema denticola 0,114
0,492
0,371 0,029
0,371
0,286 -
0,114
0,629
0,571
0,629
0,286
Treponema socranskii 0,114
0,571
0,629 0,114
0,114
0,143 -
0,029
0,629
0,429
0,371
0,143
Gemella morbillorum 0,492
0,571
0,429 0,429
0,429
0,714 -
0,571
0,571
0,857
0,429
0,714
Tannerella forsythia 0,371
0,629
0,429 0,371
0,629
0,714 -
0,629
0,114
0,571
0,629
0,714
Aggregatibacter actinomycetemcomitans
0,029
0,114
0,429
0,371
0,371
0,286 -
0,114
0,629
0,571
0,629
0,286
Porphyromonas endodontalis
0,371
0,114
0,429
0,629 0,371
0,286 -
0,114
0,371
0,571
0,629
0,286
Porphyromonas gingivalis
0,286
0,143
0,714
0,714 0,286
0,286 -
0,143
0,714
0,286
0,714
0,048
Prevotella intermedia - - - - - - -
- - - - -
Prevotella tannerae
0,114
0,029
0,571
0,629 0,114
0,114
0,143 -
0,629
0,429
0,371
0,143
Prevotella nigrescens 0,629
0,629
0,571
0,114 0,629
0,371
0,714 -
0,629
0,429
0,629
0,714
Filifactor alocis 0,571
0,429
0,857
0,571 0,571
0,571
0,286 -
0,429
0,429
0,429
0,286
Fusobacterium nucleatum
0,629
0,371
0,429
0,629 0,629
0,629
0,714 -
0,371
0,629
0,429
0,714
Parvimonas micra 0,286
0,143
0,714
0,714 0,286
0,286
0,048 -
0,143
0,714
0,286
0,714
Associação avaliada por meio do teste Exato de Fisher. Negrito significa diferenças significativas (p<0,05).
99
Algumas associações tiveram resultado significativo no pós MIC, o que
levou a explorar as associações por Odds ratio e correlação.
Tabela 19: Associações entre os microrganismos no interior dos canais radiculares pós MIC (N=7)
Microrganismos Teste exato
de Fisher (Valor de p)
Odds ratio 95% intervalo de confiança
Correlação de Spearman Valor de p
Associações positivas T. denticola e A.
actinomycetemcomitans 0,029 indeterminado - 1,000 -
T. socranskii e P. tannerae 0,029 indeterminado - 1,000 -
P. gingivalis e P. micra 0,048 indeterminado - 1,000 -
Três associações bacterianas tiveram resultados significativos no
momento pós MIC, ou seja, sempre que havia presença de uma bactéria, havia a da
outra no par estudado, o que levou a correlação perfeita (valor unitário) e Odds ratio
indeterminado.
5.5.2. Bolsa Periodontal
Algumas associações aconteceram no interior das bolsas periodontais
nas várias etapas do tratamento endodôntico. Todas as associações (com
resultados estatisticamente significativos) encontradas foram positivas, ou seja, a
presença de uma bactéria aumentou a chance de encontrar a outra. As tabelas a
seguir trazem os resultados das associações nas diferentes etapas do tratamento
endodôntico.
100
Tabela 20: Associação da presença de espécies distintas no interior da bolsa periodontal no momento pré-tratamento (N=14)
Treponema denticola
Treponema socranskii
Gemella morbillorum
Tannerella forsythia
Aggregatibacter actinomycetemcomitans
Porphyromonas endodontalis
Porphyromonas gingivalis
Prevotella intermedia
Prevotella tannerae
Prevotella nigrescens
Filifactor alocis
Fusobacterium nucleatum
Parvimonas micra
Treponema denticola 0,214
0,500
0,786 0,286
0,429
0,500
0,500
0,357
0,286
0,714
0,857
0,071
Treponema socranskii 0,214
0,500
0,547 0,011
0,385
0,500
0,500
0,275
0,176
0,330
0,396
0,214
Gemella morbillorum 0,500
0,500
0,500 0,720
0,704
0,143
0,500
0,500
0,720
0,280
0,231
0,500
Tannerella forsythia 0,786
0,547
0,500 0,670
0,385
0,096
0,500
0,725
0,330
0,176
0,033
0,786
Aggregatibacter actinomycetemcomitans
0,286
0,011
0,720
0,670
0,594
0,720
0,280
0,095
0,041
0,210
0,505
0,286
Porphyromonas endodontalis
0,429
0,385
0,704
0,385 0,594
0,296
0,704
0,063
0,406
0,594
0,165
0,429
Porphyromonas gingivalis
0,500
0,500
0,143
0,096 0,720
0,296
0,500
0,133
0,720
0,720
0,231
0,500
Prevotella intermedia 0,500
0,500
0,500
0,500 0,280
0,704
0,500
0,500
0,035
0,280
0,769
0,500
Prevotella tannerae 0,357
0,275
0,500
0,725 0,095
0,063
0,133
0,500
0,455
0,545
0,604
0,357
Prevotella nigrescens 0,286
0,176
0,720
0,330 0,041
0,406
0,720
0,035
0,455
0,210
0,495
0,286
Filifactor alocis 0,714
0,330
0,280
0,176 0,210
0,594
0,720
0,280
0,545
0,210
0,505
0,714
Fusobacterium nucleatum
0,857
0,396
0,231
0,033 0,505
0,165
0,231
0,769
0,604
0,495
0,505
0,857
Parvimonas micra 0,071
0,214
0,500
0,786 0,286
0,429
0,500
0,500
0,357
0,286
0,714
0,857
Associação avaliada por meio do teste Exato de Fisher. Negrito significa diferenças significativas (p<0,05).
Algumas associações tiveram resultado significativo no pré-tratamento, o que
levou a explorar as associações por Odds ratio e correlação.
101
Tabela 21: Associações entre os microrganismos no interior das bolsas periodontais no pré-tratamento
Microrganismos Teste exato de Fisher (Valor de
p) Odds ratio 95% intervalo
de confiança Correlação de
Spearman Valor de p
Associações positivas T. socranskii e A.
actinomycetemcomitans 0,011 indeterminado - 0,826 0,001
T. forsythia e F. nucleatum 0,033 indeterminado - 0,782 0,001 A. actinomycetemcomitans e P.
Nigrescens 0,041 27,000 1,260 - 578,354 0,650 0,012 P. intermedia e P. nigrescens 0,035 indeterminado - 0,632 0,015
Quatro associações de bactérias tiveram resultados significativos, todas
positivas, tanto pela informação do Odds ratio (no caso de A.
actinomycetemcomitans e P.nigrescens) e correlações.
Tabela 22: Associação da presença de espécies distintas no interior da bolsa periodontal pós PQM (N=14)
Treponema denticola
Treponema socranskii
Gemella morbillorum
Tannerella forsythia
Aggregatibacter actinomycetemcomitans
Porphyromonas endodontalis
Porphyromonas gingivalis
Prevotella intermedia
Prevotella tannerae
Prevotella nigrescens
Filifactor alocis
Fusobacterium nucleatum
Parvimonas micra
Treponema denticola 0,700
0,689
0,689 0,175
0,210
0,041
0,720
0,455
0,594
0,670
0,670
0,311
Treponema socranskii 0,700
0,175
0,594 0,009
0,175
0,070
0,051
0,238
0,121
0,385
0,154
0,070
Gemella morbillorum 0,689
0,175
0,311 0,406
0,689
0,689
0,720
0,126
0,594
0,011
0,330
0,210
Tannerella forsythia 0,689
0,594
0,311 0,594
0,210
0,689
0,720
0,545
0,406
0,670
0,176
0,689
Aggregatibacter actinomycetemcomitans
0,175
0,009
0,406
0,594
0,070
0,015
0,051
0,063
0,016
0,615
0,055
0,015
Porphyromonas endodontalis
0,210
0,175
0,689
0,210 0,070
0,210
0,280
0,545
0,406
0,670
0,330
0,210
Porphyromonas
gingivalis
0,041
0,070
0,689
0,689 0,015
0,210
0,280
0,095
0,175
0,670
0,670
0,041
Prevotella intermedia 0,720
0,051
0,720
0,720 0,051
0,280
0,280
0,500
0,051
0,500
0,500
0,280
Prevotella tannerae 0,455
0,238
0,126
0,545 0,063
0,545
0,095
0,500
0,343
0,231
0,275
0,005
Prevotella nigrescens
0,594
0,121
0,594
0,406 0,016
0,406
0,175
0,051
0,343
0,385
0,385
0,175
Filifactor alocis 0,670
0,385
0,011
0,670 0,615
0,670
0,670
0,500
0,231
0,385
0,453
0,330
Fusobacterium nucleatum
0,670
0,154
0,330
0,176 0,055
0,330
0,670
0,500
0,275
0,385
0,453
0,176
Parvimonas micra 0,311
0,070
0,210
0,689 0,015
0,210
0,041
0,280
0,005
0,175
0,330
0,176
Associação avaliada por meio do teste Exato de Fisher. Negrito significa diferenças significativas (p<0,05).
102
Algumas associações tiveram resultado significativo no pós PQM, o que levou
a explorar as associações por Odds ratio e correlação.
Tabela 23: Associações positivas e negativas entre os microrganismos no interior das bolsas periodontais pós PQM
Microrganismos Teste exato
de Fisher (Valor de p)
Odds ratio 95% intervalo de confiança
Correlação de Spearman Valor de p
Associações positivas T. denticola e P. gingivalis 0,041 27,000 1,260 - 578,354 0,650 0,012
T. socranskii e A. actinomycetemcomitans
0,009 indeterminado - 0,750 0,002
G. morbillorum e F.alocis 0,011 indeterminado - 0,826 0,001 A. actinomycetemcomitans e P.
Nigrens 0,015 indeterminado - 0,730 0,003
A. actinomycetemcomitans e P. gingivalis
0,016 35,000 1,743 - 702,993 0,708 0,005
A. actinomycetemcomitans e P. micra
0,015 indeterminado - 0,730 0,003
P. gingivalis e P. micra 0,041 27,000 1,260 - 578,354 0,650 0,012 P. tannerae e P. micra 0,005 indeterminado - 0,849 0,001
Oito associações bacterianas tiveram resultados significativos, todas
positivas, tanto pela informação do Odds ratio (calculado para: T.denticola e P.
gingivalis; A.actinomycetemcomitans e P.gingivalis; P.gingivalis e P.micra) e
correlações.
103
Tabela 22. Associação da presença de espécies distintas no interior da bolsa periodontal no momento pós MIC (N=7)
Treponema dentic
ola
Treponema socranskii
Gemella
morbillorum
Tannerella forsyt
hia
Aggregatibacter
actinomycetemcomitans
Porphyromonas endodon
talis
Porphyromonas gingivali
s
Prev
otella intermedi
a
Prevotella tannerae
Prevotella nigrescens
Filif
actor
alocis
Fusobacterium nucleat
um
Parvimona
s micra
Treponema denticola
0,476 0,714 - 0,714 0,476 - - 0,714 0,714
0,286 0,524 0,524
Treponema socranskii 0,476
0,286 - 0,714 0,524 - - 0,286 0,714
0,714 0,524 0,524
Gemella morbillorum 0,714 0,286
- 0,371 0,286 - - 0,571 0,629
0,371 0,714 0,286
Tannerella forsythia - - -
- - - - - - - - - Aggregatibacter
actinomycetemcomitans 0,714 0,714 0,371 -
0,286 - -
0,571 0,629
0,371 0,714 0,286
Porphyromonas endodontalis 0,476 0,524 0,286 - 0,286
- -
0,286 0,286
0,286 0,524 0,524
Porphyromonas gingivalis - - - - - -
- - - - - -
Prevotella intermedia - - - - - - -
- - - - -
Prevotella tannerae 0,714 0,286 0,571 - 0,571 0,286 - -
0,571 0,571 0,286 0,286
Prevotella nigrescens 0,714 0,714 0,629 - 0,629 0,286 - - 0,571
0,371 0,286 0,714
Filifactor alocis 0,286 0,714 0,371 - 0,371 0,286 - - 0,571 0,371
0,286 0,286
Fusobacterium nucleatum 0,524 0,524 0,714 - 0,714 0,524 - -
0,286 0,286
0,286
0,524
Parvimonas micra 0,524 0,524 0,286 - 0,286 0,524 - - 0,286 0,714
0,286 0,524
Associação avaliada por meio do teste Exato de Fisher. Negrito significa diferenças significativas (p<0,05).
Não houveram associações com resultado significativo no pós MIC, o que
levou a não explorar associações.
104
5.6 Associações entre as espécies bacterianas e níveis endotóxicos, detectados nas bolsas periodontais e canais radiculares, com os sinais e sintomas clínicos
Observamos que na comparação de todas as três variáves: UFC, LPS e
aspectos clínicos, presentes antes de se iniciar o tratamento endodôntico, nenhuma
diferença estatisticamente significante foi encontrada (tabela 23).
Tabela 23: Associação entre UFC / LPS e aspectos clínicos nas
amostras iniciais da BP e do CR
TTP BP Lesão periapical Ausência
(N=4) Presença
(N=10) = 6
(N=2) >6 (N=12) =2 (N=10) >2 (N=4)
UFC
Bolsa periodontal
Mediana 447,5 556,0 886,5 525,0 562,0 360,0 Mínimo 218,0 76,0 838,0 76,0 535,0 76,0 Máximo 1.890,0 1.750,0 935,0 1.890,0 935,0 1.890,0
Canal radicular
Mediana 8,5 9,6 6,8 9,4 9,4 8,5 Mínimo 2,4 5,0 5,0 2,4 8,7 2,4 Máximo 9,3 108,0 8,7 108,0 12,9 108,0
LPS
Bolsa periodontal
Mediana 5,3E+06 6,3E+06 1,1E+07 6,3E+06 2,8E+06 7,8E+06 Mínimo 4,4E+05 6,7E+05 5,6E+06 4,4E+05 6,7E+05 4,4E+05 Máximo 4,8E+07 3,6E+07 1,6E+07 4,8E+07 1,6E+07 4,8E+07
Canal radicular
Mediana 1,9E+03 1,3E+03 1,2E+04 1,3E+03 1,7E+03 1,3E+03 Mínimo 190 20 20 20 20 20
Máximo 3,2E+06 1,8E+05 2,4E+04 3,2E+06 2,4E+04 3,2E+06 Nota: não houve diferenças significativas, teste Mann-Whitney (p<0,05).
Da mesma forma, foi estudada a associação de bactérias estudadas com os
sinais e sintomas. Não houve diferenças significativas da presença ou ausência das
bactérias (Teste Exato de Fisher, p<0,05), tal como descrito na Tabela 24.
105
Tabela 24: Associação de bactérias encontradas nas bolsas periodontais e canais radiculares com sinais e sintomas clínicos
Bolsa Periodontal Canal Radicular
TTP Antes (ausência x presença)
Bolsa (<=6 x >6)
Lesão (<=2 x >2)
TTP Antes (ausência x presença)
Bolsa (<=6 x >6)
Lesão (<=2 x >2)
Treponema denticola 0,714 0,857 0,643 0,280 0,769 0,500
Treponema socranskii 0,176 0,604 0,725 0,406 0,692 0,343
Gemella morbillorum 0,720 0,769 0,133 0,495 0,725 0,604
Tannerella forsythia 0,176 0,396 0,725 0,670 0,604 0,231
Aggregatibacter actinomycetemcomitans 0,311 0,495 0,455 0,176 0,604 0,275
Porphyromonas endodontalis 0,175 0,692 0,657 0,594 0,165 0,657
Porphyromonas gingivalis 0,280 0,769 0,500 0,670 0,604 0,231
Prevotella intermedia 0,720 0,231 0,500 0,505 0,725 0,110
Prevotella tannerae 0,455 0,604 0,203 0,210 0,066 0,545
Prevotella nigrescens 0,689 0,495 0,545 0,406 0,165 0,657
Filifactor alocis 0,311 0,505 0,126 - - -
Fusobacterium nucleatum 0,066 0,725 0,604 0,720 0,769 0,133
Parvimonas micra 0,714 0,857 0,643 0,175 0,308 0,657 Não houve diferenças significativas pelo teste exato de Fisher (p<0,05)
106
6. DISCUSSÃO Apesar de existirem muitos trabalhos na literatura, estudando a microbiota
da doença periodontal (Slots, 1986; Haffajee et al., 1984; Socransky et al., 1988,
Dahlén et al.,1992; Paster et al., 2001, 2006; Colombo et al., 2009; Casarin et al.,
2013) e das infecções endodônticas, separadamente (Gomes et al., 2004,
1996a,b,c, 2004, 2007; Siqueira et al. 2003a,b 2009; Brito et al., 2012; Nóbrega et
al., 2016; Tatikonda et al., 2017), ainda são poucos os estudos que investigaram a
microbiota envolvida em lesões endo-periodontais combinadas (Kipioti et al.,1984,
Kobayahi et al., 1990; Kurihara et al., 1995; Rupf et al, 2000; Berber, 2009; Didilescu
et al., 2012; Gomes et al., 2015). Portanto, a escassa literatura sobre o tema das
lesões endodôntico-periodontais combinadas e os desafios no tratamento de casos
clínicos com perda óssea avançada foram fatores motivadores para o
desenvolvimento deste estudo. A prevalência de periodontopatógenos em infecções endodônticas é
subestimada, quando avaliada por métodos cultura dependentes, devido ao fato de
algumas espécies serem altamente exigentes com relação aos requerimentos
gasosos e nutricionais. Em contrapartida, as investigações que fizeram uso de
métodos moleculares mais sensíveis, relataram a detecção de patógenos
periodontais em polpas necróticas com lesões perirradicais associadas (Conrads et
al., 1997; Gonçalves & Mouton, 1999; Siqueira et al., 2000a; Siqueira et al., 2000b,
Berber, 2009; Gomes et al., 2015).
Desse modo, o presente trabalho procurou avaliar a suscetibilidade de
bactérias periodontopatogênicas aos procedimentos químicos-mecânicos de
desinfecção dos canais radiculares, e ao uso de uma medicação intracanal, em
canais radiculares e bolsas periodontais de dentes com lesões endo-periodontais
combinadas, através da contagem das UFC´s e Nested-PCR. Além de investigar os
efeitos do tratamento endodôntico na redução dos os níveis endotóxicos nos canais
radiculares e bolsas periodontais, através da quantificação das endotoxinas
presentes nas amostras.
107
6.1. Características clínicas das lesões endo-perio No período estudado, as bolsas periodontais mantiveram suas
características clínicas iniciais (Apêndice II), fato este devido ao curto período de
avaliação e ausência de raspagem e alisamento radicular. Normalmente, as
avaliações periodontais se dão em períodos de 45 dias, 3 meses, 6 meses, 1 ano
(Machion, 2005; Martins, 2005) e não em apenas após 30 dias. Não foi feita esta
avaliação longitudinal, porque o intuito do
trabalho foi avaliar as alterações clínicas e microbiológicas apenas no período de
uso da medicação intracanal, ou seja 30 dias.
Após 30 dias, 3, 6 e 12 meses, depois do término do tratamento
endodôntico, os pacientes serão chamados para avaliação clínica e radiográfica.
Dessa forma, serão realizados todos os testes clínicos. As características referentes
à dor, sangramento, sensibilidade à palpação e percussão serão anotados na ficha
clínica. Será também realizada a radiografia do dente avaliado e esta comparada à
radiografia inicial do tratamento. Neste momento, serão coletadas amostras
microbiológicas e endotóxicas da bolsa periodontal.
A fase mais difícil para a execução do presente trabalho foi encontrar os
casos clínicos, que se enquadrassem no perfil desejado. Foram avaliados 556
pacientes com doença periodontal severa, destes, 30 apresentavam bolsas
periodontais profundas. Apenas 14 pacientes apresentavam as características
clínicas necessárias para este estudo. Muitas vezes, o dente em questão
apresentava bolsas profundas que iam até o ápice, grande mobilidade, supuração,
casos estes já com indicação de extração, mas ainda assim, permaneciam com
certa sensibilidade pulpar. Além disso, os casos selecionados e diagnosticados
como dentes com lesão endo – pério apresentavam-se, na sua grande maioria, com
bolsas periodontais de médias a profundas e/ou com histórico de tratamento
periodontal. Esta dificuldade em selecionar os casos foi também observada por
Berber, 2009 e Gomes et al., 2015.
Características clínicas como sondagem e mobilidade, além de
características radiográficas, como perda óssea vertical, foram essenciais para
diagnosticar os dentes que apresentavam doença periodontal. Além disso,
características clínicas, como ausência de resposta pulpar aos estímulos térmicos, e
radiográficas, como atresias dos canais radiculares e lesões periapicais, foram
108
essenciais para diagnosticar que os dentes apresentavam comprometimento
endodôntico.
Em relação aos resultados do tratamento endodôntico sobre os aspectos
clínicos apresentados pelos pacientes, pudemos notar uma diminuição da
profundidade da bolsa em todos os pacientes e, consequentemente, da mobilidade.
6.2. Metodologias utilizadas Os resultados obtidos pelas coletas clínicas são altamente dependentes
da técnica utilizada para coletar as amostras. Em nosso estudo, optou-se por usar
cones de papel absorventes estéreis/apirogênicos para as coletas das bolsas
periodontais e canais radiculares, sendo essa metodologia já consolidada na
literatura (Gomes et al., 1994, 2015). Em casos de canais atrésicos, onde é grande
a dificuldade na coleta com cones de papel absorventes, prejudicando os resultados,
foram utilizadas limas de pequeno diâmetro, inseridas até o comprimento total do
dente. Os cabos foram cortados e as limas depositadas em tubos tipo Eppendorf,
contendo VMGA III. Todas as demais amostras foram obtidas, com a utilização de
cones de papel absorventes (Berber 2009, Gomes et al., 2015). Para a avaliação da eficácia do tratamento endodôntico sobre os níveis
de microrganismos, nos canais radiculares e bolsas periodontais, foram realizados a
contagem das UFC´s e o método do Nested-PCR. A escolha do Nested-PCR, como
técnica molecular para identificação bacteriana nesse estudo, baseou-se em alguns
trabalhos que confirmaram a sua maior sensibilidade, especificidade e efetividade,
quando comparada às técnicas convencionais de cultura, indicando uma microbiota
mais complexa (Gomes et al., 2005, 2006). Entretanto para o futuro, pretende-se
utilizar técnicas moleculares que permitam a detecção e quantificação de número
maior de espécies, favorecendo uma real avaliação do potencial delas com o estado
da doença (Haffajeee & Socransky, 2006; Saito et al., 2009). Além disso, o Nested-
PCR também apresenta certas limitações, como o fato de que para que um
microrganismo seja detectado, é necessário o prévio conhecimento, ao menos
parcial, de seu seqüenciamento genético, para a sintetização dos “primers” com as
características da seqüência de nucleotídeos. Apesar de utilizarmos, na maioria dos
casos, oligonucleotídeos já descritos na literatura, os ciclos de termociclagem e as
temperaturas foram totalmente adaptados à estrutura do laboratório de Microbiologia
endodôntica da FOP-UNICAMP. Fato este é devido, principalmente, às poucas
109
informações contidas nos artigos científicos, pois pequenas diferenças de
temperatura, quantidade de ciclos, proporções e quantidade de reagentes podem
interferir nos resultados.
O teste do Lisado de Amebócito Limulus (LAL), por ser um método
turbidimétrico quantitativo, têm se mostrado extremamente sensível à presença de
endotoxinas, favorecendo uma melhor avaliação das amostras, assim como
demonstrado por Martinho et al., 2010, 2011.
6.3. Microbiologia das lesões endo-periodontais Na diversidade da microbiota da cavidade bucal, A.
actinomycetemcomitans, P.gingivalis, T.forsythia e T.denticola são consideradas
verdadeiros patógenos periodontais, os quais estão envolvidos diretamente com o
início e a progressão da doença periodontal. Actinomyces sp. são considerados colonizadores primários da cavidade
bucal e são cruciais no desenvolvimento da placa bacteriana (Yeung, 1999), além
disso, têm se mostrado envolvidos nas infecções endodônticas persistentes (Kalfas
et al., 2001). A sobrevivência em ambientes desprovidos de nutrientes pode ser
devido à presença de enzimas extracelulares, por exemplo, aquelas envolvidas no
metabolismo de uréia e sucrose (Yeung, 1999). A.actinomycetemcomitans, é uma
bactéria Gram-negativa, muito frequente na periodontite agressiva localizada, sendo
uma das mais fortes bactérias associadas ao caráter destrutivo da doença
periodontal. Essa espécie esteve presente em 71,42% das amostras iniciais das
bolsas periodontais, porém após 30 dias de medicação intracanal, a espécie foi
detectada em 42,8%. Resultado contrário foi observado nos canais radiculares para
essa bactéria, uma vez que, inicialmente ao preparo químico-mecânico, ela esteve
presente em 21,4% dos casos, porém, após 30 dias de medicação, a frequência de
aparecimento dessa espécie foi 57,14%.
Os testes bioquímicos convencionais não são capazes de diferenciar,
dentro do gênero Prevotella, as espécies intermedia e nigrescens. No trabalho de
Xia et al., 2000, Prevotella tannerae também não pôde ser diferenciado das outras
duas espécies, através de testes bioquímicos. Essas espécies apenas podem ser
diferenciadas entre si, através das técnicas da biologia molecular. Segundo Bae et
al., em 1997, e Baumgartner et al., em 1999, ao aplicarem técnicas moleculares,
verificaram um predomínio de P. nigrescens em relação a P. intermedia em canais
110
radiculares necrosados. Em nosso estudo, o Nested-PCR detectou P. intermedia em
14,3% (2/14) dos casos nas amostras iniciais dos canais radiculares (E1), sendo que
essa frequência permaneceu a mesma imediatamente após o preparo químico-
mecânico. Porém, a espécie não foi encontrada em nenhum dos casos, passados os
30 dias de medicação intracanal. Isso pode ter sido explicado, devido aos efeitos da
medicação intracanal, composta pela clorexidina gel 2% e hidróxido de cálcio, por
um período de tempo prolongado, sendo capaz de se difundir através dos túbulos
dentinários e reentrâncias.
Por outro lado, observamos que as espécies Prevotella nigrescens e
Prevotella tannerae foram mais sensíveis aos procedimentos químicos-mecânicos,
detectadas, inicialmente, em 71,4% e 57% (E1), respectivamente, no interior dos
canais radiculares e em 42,8% das amostras coletadas imediatamente após o
preparo químico-mecânico (E2). Após 30 dias de medicação, Prevotella nigrescens
foi encontrada em 57% dos casos de E3, ao passo que Prevotella tannerae em
42,8%. Berber, 2009, não encontrou nenhuma das três espécies nas coletas
realizadas no interior dos canais radiculares, após medicação intracanal por 7 e 14
dias.
Ainda com relação às espécies do gênero Prevotella, analisadas nesse
estudo, nas bolsas periodontais encontramos uma maior frequência de P.nigrescens
nas coletas iniciais (P1: 71,42%). Porém, passados os 30 dias de medicação
intracanal, a espécie P.tannerae foi a mais frequentemente detectada (P3: 85,7%);
enquanto que P.intermedia não foi encontrada em nenhuma das coletas periodontais
realizadas após 30 dias de medicação. Pearce et al., 2000, relataram que a
presença de P.intermedia, em bolsas periodontais, está associada à formas mais
severas de doença. O uso da medicação intracanal por 30 dias pode gerar
resultados clínicos periodontais significativamente favoráveis.
As bactérias encontradas com maior frequência nas bolsas periodontais
iniciais foram Parvimonas micra, Treponema denticola (92,8%) e Fusobacterium
nucleatum (85,7%). Todas as espécies analisadas nesse estudo, com exceção de
Parvimonas micra, foram bactérias Gram-negativas, que são fortemente associadas
à infecções periodontais destrutivas (Socransky & Haffajeee, 1998; Tanner & Izard,
2000 e Kesavalo et al., 2007). Porém, a bactéria mais prevalente nas coletas
periodontais iniciais foi a espécie Gram-positiva Parvimonas micra, seguida da
Gram-negativa Treponema denticola. A primeira, por ser uma espécie Gram-
111
positiva, é pertencente ao Complexo Laranja e têm sido pesquisada e encontrada
tanto em sítios periodontais doentes, quanto sadios, sendo considerada um
marcador de destruição periodontal (Cobb, 2002). A segunda é pertencente ao
Complexo Vermelho. A presença das bactérias que compõe o Complexo Vermelho
em biofilmes subgengivais tem uma forte associação com os sinais clínicos da
periodontite crônica, especificamente com o aparecimento de bolsas periodontais
profundas e sangramento (Socransky et al, 1998; Yoneda, 2005; Kesavalo, 2007;
Puig-Silla et al., 2016), sinais esses bastante encontrados nos pacientes que
participaram do nosso estudo.
F.nucleatum é frequentemente encontrada em canais radiculares
associados à necrose pulpar (Gomes et al., 2006; Siqueira Jr et al., 2000; Nóbrega
et al., 2016), sendo de extrema importância em infecções endodônticas primárias e
frequentemente pesquisada tanto nos casos sintomáticos (Gomes et al., 1994,
Nóbrega et al., 2016), quanto nos assintomáticos (Peters et al., 2002). Contudo, nas
amostras coletadas do interior dos canais radiculares, inicialmente ao preparo
químico-mecânico, essa espécie foi detectada em 50% dos casos, sendo pois, muito
mais prevalente nas bolsas periodontais iniciais (85,7%). A alta prevalência de
Fusobacterium nucleatum em P1 está de acordo com os resultados de Baumgartner
et al., 1992, que mostraram que essa espécie Gram-negativa age como uma ponte
de coagregação bacteriana, sendo desta forma, um dos principais microrganismos
na formação do biofilme e o mais comum presente em placas subgengivais e sítios
periodontais ativos ou inativos (Haffajee & Socransky,1994).
Segundo Socransky & Haffajee (2003), o Complexo Vermelho, formado
por Tannerella forsythia, Porphyromona gingivalis e Treponema denticola, é o mais
investigado e importante dentro das patologias periodontais. O nosso estudo
mostrou a presença de pelo menos 2 dessas bactérias em 11 das 14 amostras
iniciais das bolsas periodontais, e em todas as sete amostras avaliadas após o uso
da medicação. Duque, em 2013, obteve resultados semelhantes, uma vez que
detectou a presença de pelo menos 2 delas em 12 das 15 amostras e de pelo
menos 1 em 8 das 10 amostras avaliadas após o uso de medicações intracanais.
112
6.4. Efeito do preparo químico-mecânico e medicações intracanais
sobre os microrganismos do canal radicular e bolsa periodontal O preparo químico-mecânico deste trabalho teve como substância
química auxiliar a clorexidina gel 2%, e o agente irrigador o soro fisiológico estéril.
Como resultado, houve uma grande redução na contagem de UFCs/mL no interior
dos canais radiculares, imediatamente após este preparo. Resultados esses que
corroboram com os achados de Berber, 2005 (in vitro), Vianna et al., 2006 e 2007 (in
vivo), Berber, 2009 (in vivo), Gomes et al., 2015 (in vivo). Na maioria dos casos
deste presente estudo, culturas negativas foram encontradas logo após o preparo
químico-mecânico. Entretanto, o não crescimento de microrganismos, logo após a
instrumentação, não significa que o canal radicular esteja completamente livre de
microrganismos, e sim que possam estar em quantidade insuficiente de serem
detectados pela técnica de cultura. A clorexidina é uma bisguanida catiônica que age pela absorção na
parede celular do microrganismo, resultando na quebra dos componentes
intracelulares. Em altas concentrações a clorexidina é bactericida, por causar
precipitação e/ou coagulação de constituintes intracelulares (McDonnell & Russell,
1999). Essa substância exerce atividade antimicrobiana ótima em pH de 5.5 a 7.0
(Russel & Day, 1993).
Em geral, os estudos in vitro sugerem que o hipoclorito de sódio (NaOCl)
e a clorexidina apresentam atividade antibacteriana similares, em concentrações
também similares (Delany et al., 1982, Jeansonne & White, 1994, Gomes et al.,
2013). Em adição, a clorexidina é promissora como agente final de irrigação
(Zamany et al., 2003; Zehnder, 2006). Zamany et al.,2003, mostraram, em um
estudo clínico, que a solução de clorexidina, utilizada como irrigante final, reduziu
mais a microbiota dos canais do que o NaOCl. Algumas vantagens adicionais da
clorexidina são: característica de se reter a dentina (Rosenthal et al., 2004) e sua
propriedade biocompatível (Filho et al., 2002). Gomes et al., 2015 utilizaram, num
estudo que analisou a microbiota de dentes com lesões endo-periodontais
combinadas, antes e após o preparo químico-mecânico, a clorexidina gel 2% como
substância química auxiliar, não apenas pela suas propriedades antimicrobianas e
capacidade de adsorção às superfícies dentárias, mas também, pela ação reológica
e sua capacidade de lubrificação, facilitando a instrumentação de canais mais
113
atrésicos, característica comumente encontrada em dentes com comprometimento
endo-periodontal.
O hidróxido de cálcio, utilizado como medicação no selamento temporário
do canal, em casos de lesões endo-periodontais, encontra amplo respaldo na
literatura (Heithersay, 1975; Solomon et al., 1995; Toledo & Rosetti, 2005; Berber,
2009; Duque, 2013), uma vez que sua ação inibe exatamente essa suposta
contaminação periodontal dos canais instrumentados, via canais de comunicação
patentes (Solomon et al., 1995). Além disso, foi provada que a difusão de seus íons,
através dos túbulos dentinários, pode resultar em ação antimicrobiana nos tecidos
periodontais, se a camada protetora de cemento estiver ausente (Carrote, 2004 e
Gomes et al., 2008). Ademais, o hidróxido de cálcio também parece promover certo
aumento do pH na dentina periférica (Tronstad et al., 1981). Portanto, para alguns
raros casos de doença periodontal agressiva e prognóstico duvidoso, o uso
intracanal do hidróxido de cálcio pode ser uma alternativa, porém, cabe ressaltar que
a cura da lesão endo-periodontal dependerá mais do prognóstico periodontal do que
do endodôntico.
O objetivo do uso de uma medicação intracanal é controlar a infecção no
interior dos canais radiculares. Isto é importante, porque a cultura negativa, antes da
obturação do canal, está relacionada com o sucesso do tratamento endodôntico
(Trope et al., 1999, Wang et al., 2007). Entretanto, alguns estudos questionam a
efetividade do hidróxido de cálcio na desinfecção do canal radicular e relatam a
presença de uma microbiota residual em canais com mais de uma semana de uso
de medicação (Peters & Wesselink, 2002, Waltimo et al., 2005). Em alguns casos,
bactérias residuais crescem em número, mesmo na presença de hidróxido de cálcio
(Peters & Wesselink, 2002, Waltimo et al., 2005).
O tempo necessário para que uma medicação intracanal exerça seu efeito
ideal é muito discutido na literatura. Vários períodos de aplicação de medicação
intracanal com hidróxido de cálcio têm sido recomendados. Cvek, 1973, obteve 90%
de culturas negativas após a utilização de medicação intracanal com hidróxido de
cálcio por 3 semanas. Bystrom & Sundqvist, 1985, obtiveram 100% de culturas
negativas após 4 semanas, Reit & Dahlen, 1988, 74% após 2 semanas. O estudo de
Sjögren et al., 1991 mostrou 100% de canais livres de bactérias com o emprego de
medicação por uma semana, enquanto o de Ørstavik et al., 1991 encontraram 65%
das amostras negativas para cultura após 7 dias do emprego de hidróxido de cálcio
114
como medicação intracanal. Os resultados de Berber, 2009 mostraram que alguns
dentes apresentaram cultura negativa logo após o preparo químico-mecânico, mas
que após o uso de medicação intracanal por 14 dias algumas bactérias voltaram a
contaminar o canal radicular. A autora sugere que uma possível explicação para
esse fato seria o fato de que um baixo número de microrganismos (abaixo dos
limites de detecção pela técnica de cultura microbiológica) possa ter persistido nas
anastomoses, istmos, túbulos dentinários e que após o período de uso da
medicação, estas bactérias cresceram em quantidade, podendo ser, então,
detectadas.
Em nosso estudo, optamos pela medicação composta da associação
entre hidróxido de cálcio e clorexidina gel 2%, por um período de 30 dias e
observamos a redução no número de UFC /mL no interior dos canais radiculares em
100% dos casos. Além disso, obtivemos cultura negativa em 71,4% (5/7) dos casos.
Zancan et al., 2016, em um estudo in vitro, mostraram que maiores liberações de
íons hidroxila aconteciam após 30 dias de medicação intracanal, e que as
medicações formadas pela combinação de hidróxido de cálcio e clorexidina foram as
que apresentaram maior ação antimicrobiana. Com base nos achados da literatura,
e nos resultados do nosso estudo, acreditamos que a associação entre hidróxido de
cálcio e clorexidina gel 2%, utilizada como medicação intracanal, por um maior
período de tempo (30 dias), contribui de forma eficaz na desinfecção dos canais
radiculares necrosados, uma vez que parece assumir um papel coadjuvante,
proporcionando uma redução da microbiota abaixo dos níveis já obtidos pelo
preparo químico-mecânico, principalmente pela penetração em áreas não
alcançadas pelos instrumentos e por soluções irrigadoras (Holland et al., 1979;
Otoboni Filho, 2000).
Em um estudo in vitro, Gomes et al., 2008 avaliaram a ação
antimicrobiana de medicações intracanais: clorexidina gel 2%; clorexidina gel 2% +
hidróxido de cálcio; clorexidina gel 2 % + hidróxido de cálcio + óxido de zinco; e o
soro fisiológico estéril + hidróxido de cálcio, frente Enterococcus faecalis, Candida
albicans, Actinomyces viscosus e Porphyromonas gingivalis, presentes na superfície
radicular externa, na presença ou ausência de cemento. Como resultado, obtiveram
que a associação entre o hidróxido de cálcio e a clorexidina gel 2% foi a segunda
melhor medicação, em termos de efeitos antimicrobianos. Clorexidina gel 2% foi a
que apresentou melhor capacidade de difusão, através dos túbulos dentinários, e de
115
ação antimicrobiana. Além disso, não houveram diferenças estatisticamente
significantes entre os dentes com ausência ou presença de cemento.
Berber, 2009, realizou um estudo, in vivo, que verificou a capacidade do
uso de medicação intracanal por 7 (clorexidina gel 2%) e 14 dias (hidróxido de
cálcio, e associação entre hidróxido de cálcio e clorexidina gel 2%) em reduzir a
contagem de Unidades Formadoras de Colônias no canal radicular e na bolsa
periodontal associada, de dentes com lesões endo-perio combinadas. Os resultados
mostraram que o uso adicional de qualquer uma das medicações intracanais
utilizadas não melhorou a desinfecção dos canais radiculares e também não foram
capazes de alterar a microbiota das bolsas periodontais no período estipulado.
No presente trabalho nenhum efeito antimicrobiano foi notado,
clinicamente, nas bolsas periodontais no período estudado. Antes e após a utilização
da medicação intracanal, a contagem das UFC´s se manteve estável. Fato este
pode ser explicado, talvez, pela presença de túbulos dentinários diminuídos, em
razão da doença periodontal, dificultando a difusão da medicação intracanal através
dos mesmos. Sendo assim, a única comunicação existente entre a bolsa periodontal
e o canal radicular foi o forame apical. O que no caso não seria suficiente para uma
mudança notável na microbiota da bolsa periodontal. Outro fator que pode ter
interferido é a não manipulação da bolsa periodontal, ou seja, nenhum tratamento,
como por exemplo, raspagem e alisamento radicular, foram realizados na bolsa
periodontal associada ao dente avaliado, dificultando, também, a ação da medicação
intracanal nos microrganismos da bolsa periodontal. Porém, não podemos dizer que
não houve modificação na microbiota periodontal, pois houve uma diminuição nos
níveis de endotoxinas.
6.5. Quantificação de endotoxinas dos canais radiculares e das bolsas periodontais
Os microrganismos avaliados nesse estudo foram, em sua maioria,
anaeróbios Gram-negativos. A escolha por esses microrganismos foi devido à
presença dos fatores de virulência, principalmente as endotoxinas, e sua importância
dentro das doenças pulpares e periodontais. Trabalhos mostram que esses
microrganismos, na maioria das vezes, são responsáveis pelo início e progressão
das doenças endodônticas e periodontais, uma vez que o desenvolvimento de
ambas as patologias pode ser o resultado do desequilíbrio entre os fatores de
116
virulência bacteriana e fatores específicos dos hospedeiros (Seltzer & Farber, 1994;
Nissan et al., 1995; Nelson-Filho et al., 2002; Oliveira et al., 2005; Pereira, 2011;
Herrera et al., 2016).
A concentração de endotoxinas encontradas inicialmente nas bolsas
periodontais foi bastante alta, com uma média de 648,1 EU/mL. Essa concentração
já era esperada, devido à maior prevalência de bactérias Gram-negativas em sítios
periodontais doentes (Paster et al., 2000; Mineoka et al., 2008; Liu et al., 2012;
Suzuki et al., 2014; Puig-Silla et al., 2016). Além disso, essa alta concentração
confirma o potencial de destruição óssea, favorecendo a destruição periodontal e
manutenção das lesões periapicais (Nissan et al., 1995; Nakane, 1995; Nelson Filho,
2002; Rangel-Frausto, 2005).
Em casos de polpa necrosada, as concentrações de endotoxinas são
extremamente altas, o que se justifica pela maior presença de bactérias Gram-
negativas (Jacinto et al., 2005; Martinho e Gomes, 2008). Além disso, estudos
recentes tem demonstrado a presença desse importante fator de virulência em 100%
dos casos de dentes com necrose pulpar (Herrera et al., 2015; Marinho et al., 2015;
Herrera et al., 2016), dados que são confirmados em nosso trabalho, uma vez que
endotoxinas foram encontradas em 100% dos casos nos canais radiculares
necrosados, mostrando uma média de 15,6 EU/mL. Duque, 2013, quantificou os
níveis de endotoxina em bolsas periodontais e canais radiculares, de dentes com
envolvimento periodontal crônico e polpa vital, e encontrou valores praticamente
nulos no interior dos canais radiculares. A autora sugere que isso poderia ser
justificado pela condição de vitalidade do tecido pulpar.
É possível que mesmo que as bactérias sejam removidas do canal
radicular, durante o preparo químico-mecânico, endotoxinas capazes de manter ou
induzir periapicopatias possam permanecer. Dessa forma, objetivo do tratamento
endodôntico não deve se restringir apenas à morte e eliminação dos
microrganismos, mas também, deve exercer ação contra os subprodutos tóxicos
bacterianos, sendo essa ação favorecida pelo uso de medicação intracanal. A
importância do Ca(OH)2 na inativação do LPS já é bem aceito e discutido na
literatura (Safavi & Nichols, 1993; Silva et al, 2002; Nelson Filho et al., 2002;
Signorreti, 2009; Marinho et al., 2015). Em nosso estudo, após o preparo químico-
mecânico, a concentração dos níveis endotóxicos no interior dos canais radiculares
apresentou uma média de 0,187 EU/mL, ao passo que esses níveis foram
117
praticamente nulos nos dentes que receberam a medicação intracanal por 30 dias
(0,06 EU/mL), o que confirma os achados da literatura.
A concentração de endotoxinas, após o uso da medicação intracanal, nas
bolsas periodontais, foi mais baixa quando comparada aos valores iniciais e após o
preparo químico-mecânico. Provavelmente, essa diminuição foi devido ao preparo
químico-mecânico, realizado anteriormente, capaz de desobstruir os túbulos
dentinários, facilitando a difusão dos íons OH- e Ca+, além de favorecer a ação dos
mesmos nos tecidos periodontais doentes, conforme sugeriu Solomon et al., 1995.
Da mesma forma, Gomes et al., 2009 mostraram que a medicação composta pela
associação entre hidróxido de cálcio e clorexidina gel 2% pode se difundir através
dos túbulos dentinários, principalmente na ausência de cemento, o que favorece o
aumento do pH na dentina periférica (Tronstad et al, 1981).
Os resultados do estudo de Berber, 2009, mostraram que o uso de
medicação intracanal, no período estipulado pelo trabalho (7 e 14 dias), não foi
capaz de reduzir a carga microbiana nas bolsas periodontais dos dentes com lesões
endo-periodontais combinadas, porém, não avaliou se a mesma foi eficaz em reduzir
os níveis endotóxicos. A utilização de uma medicação intracanal é considerada, por
Abbott & Salgado 2009, essencial para o tratamento endodôntico. Associado à isso,
o canal radicular pode funcionar como um compartimento de liberação lenta para
difusão de medicações para o periodonto, na tentativa de se difundirem em direção
à superfície radicular externa. Da mesma forma que esses autores, nosso estudo
mostrou que o uso da medicação intracanal é capaz não só de exercer sua ação nos
microrganismos, como também nos seus subprodutos tóxicos, podendo resultar em
um efeito antimicrobiano complementar à terapêutica periodontal.
Acreditamos, diante disso, que o uso da medicação intracanal composta
pelo hidróxido de cálcio e clorexidina gel 2%, por um período maior de tempo, pode
resultar em parâmetros periodontais positivos e favoráveis. Por isso, sugerimos que
mais estudos clínicos sejam realizados em longo prazo, a fim de confirmarem os
achados microbiológicos e endotóxicos, assim como a eficácia do tratamento
endodôntico sobre o periodonto, particularmente do uso da medicação intracanal.
Além disso, técnicas modernas utilizando o Next Generation Sequencing muito
auxiliará na detecção de microrganismos de difícil cultivo, incultiváveis e mesmo de
filotipos.
118
6.6. Associações entre os microrganismos nas bolsas periodontais e canais radiculares, e Associações entre as espécies bacterianas e níveis endotóxicos, detectados nas bolsas periodontais e canais radiculares, com os sinais e sintomas clínicos
Foi encontrado associações estatisticamente positivas entre a presença
de sinais e sintomas de origem endodôntica e periodontal e algumas espécies
bacterianas, e também entre as espécies. Tal fato é capaz de favorecer a
patogenicidade da microbiota presente nestes dois sítios, que com seus fatores de
virulência, podem gerar o aparecimento de sinais e sintomas de origem pulpar/
periapical e periodontal. Entretanto, nenhuma associação estatisticamente
significante foi observada entre a presença de LPS e aspectos clínicos, nos canais
radiculares e bolsas periodontais. Mas isso não significa que o LPS não está
relacionado com sintomatologias clínicas. Como se sabe, a bioatividade do LPS
acarreta em liberação de mediadores inflamatórios, tais como TNF-alfa, IL-1, IL-6 e
IL-8, o que desencadeia um desequilíbrio no processo de remodelação óssea,
aumentando a reabsorção, observada radiograficamente como uma imagem
radiolúcida (i.e.lesão periapical) (Martinho et al. 2010, 2014).
Novos estudos, envolvendo um número maior de dentes com lesões endo-
periodontais combinadas, deverão ser desenvolvidos para estudar mais
detalhadamente a microbiota destes sítios e as associações entre os
microrganismos; e entre os microrganismos e seus fatores de virulência com os
aspectos clínicos apresentados pelos pacientes.
119
7. CONCLUSÃO Baseado nos diversos métodos utilizados neste estudo e nos resultados
obtidos pode-se concluir que:
Os canais radiculares e bolsas periodontais apresentaram-se
contaminados por potentes periodontopatógenos, sendo a espécie Prevotella
nigrescens a mais frequentemente encontrada nos canais radiculares, em todas as
etapas do tratamento endodôntico. Nas bolsas periodontais, a espécie Parmivonas
micra foi a mais frequente;
Os canais radiculares e bolsas periodontais, dos dentes com
sensibilidade pulpar negativa e bolsas periodontais associadas, apresentaram
reduções significativas na Contagem das Unidades Formadoras de Colônias (UFC´s)
após o preparo químico-mecânico e o uso da medicação intracanal;
O preparo químico-mecânico e o uso da medicação intracanal por 30
dias foram altamente eficazes em reduzir os níveis endotóxicos nos canais
radiculares e nas bolsas periodontais associadas;
Embora a redução microbiana nas bolsas periodontais, após o uso da
medicação intracanal por 30 dias, não tenha sido tão significativa, seu uso se
mostrou bastante eficaz em reduzir os níveis endotóxicos;
Associações estatísticas positivas foram observadas entre a presença
de sinais e sintomas de origem endodôntica e periodontal e algumas espécies
bacterianas, e também entre as espécies.
Nenhuma associação estatisticamente significante foi observada entre
a presença de LPS e aspectos clínicos, nos canais radiculares e bolsas periodontais;
120
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153
APÊNDICE 1
154
155
156
157
158
APÊNDICE 2
Dados clínicos dos 14 dentes incluídos nesse estudo
Casos
Dentes
Grupo
Idade
Sexo
Percussão/Palpação
Mobilidade
Inicial
Bolsa inicial (mm)
Inserção clínica (mm)
Coroa
Bolsa após medicação (mm)
Mobilidade após MIC
Bolsa após 30 dias obturação (mm)
Mobilidade após 30 dias obturação
1 24 Sessão única
57 F +/- 3 M 10 10 R - - M 7 2
2 27 Ca(OH)2 + CHX
57 F -/- 3 D 8 15 R D 13 3 Exodontia
Exodontia
3 46 Sessão única
60 M +/- 2 D 6 6 R - - D 7 2
4 26 Ca(OH)2 + CHX
58 M +/- 2 M 6 8 R M 6 2 M 5 1
5 41 Sessão única
54 M +/- 2 L 8 8 H - - L 7 2
6 25 Sessão única
53 F +/- 2 P 7 7 R - - P 6 2
7 23 Sessão única
55 F +/- 3 M 13 16 H - - M 11 3
8 47 Ca(OH)2 + CHX
67 F -/- 3 D 12 15 R D 13 3 Exodontia
Exodontia
9 13 Sessão única
60 F +/- 3 V 13 15 H - - V 11 3
10 27 Sessão única
54 F +/- 3 D 13 15 R - - D 10 3
11 47 Ca(OH)2 + CHX
33 F +/- 3 M 11 11 R M 10 3 M 9 3
12 16 Ca(OH)2 + CHX
35 F -/-
3 M 12 12 R M 10 3 M 9 3
13 34 Ca(OH)2 + CHX
40 F -/- 3 L 10 10 H L 9 3 L 7 2
14 11 Ca(OH)2 + CHX
45 F +/- 3 P 13 12 H P 11 3 P 10 3
159
APÊNDICE 3 EXTRAÇÃO DO DNA
(250 / QIAamp DNA mini kit – cat. Nº 51306)
OBS: não precisa manter kit na geladeira, mas se for manter refrigerado
deve esperar ficar na temperatura ambiente para usar.
Quando deixa na geladeira, o reagente 1 (ATL) fica com precipitados
brancos de dificultam pipetagem.
1- Agitar a amostra e pegar 300µl do VMGA (se tiver pouco vmga, diluir
com água ultra-pura / miliQ estéril). Quando for usar eppendorf com o swab (raspa
da biofilmemãe ou isoladas) vai acrescentar 500-400µl de água ultra-pura / miliQ
estéril, centrifugar bem e pegar 300 µl. Depois vai guardar o resto da água com o
swab , e não descartar!
2- Centrifugar a 8000 rpm / 5min.
3- Remover sobrenadante, com bastante cuidado para não aspirar as
células também. Não precisa remover todo líquido sobrenadante, pois assim evita-se
remover parte do pelet.
4- Adicionar 180µl de ATL (1) e 20µl de Proteinase K (2).
5- Agitar e incubar a 56ºC por 30 min.
6- Adicionar 200µl de AL (3).
7- Agitar e incubar a 70ºC por 10 min.
8- Adicionar 200µl de etanol (álcool etílico) 100%.
9- Agitar e transferi para tubos com filtros/colunas do Kit (QIAamp Mini
Spim Collum).
10- Centrifugar a 8000 rpm / 1 min.
11- Transferir o filtro para outro tubo vazio do kit ou jogar líquido fora e
reaproveitar mesmo tubo/coluna.
12- Adicionar 500µl de AW1 (4).
13- Centrifugar 8000 rpm / 1 min.
14- Transferir o filtro para outro tubo vazio do kit ou jogar líquido fora e
reaproveitar mesmo tubo/coluna.
15- Adicionar 500µl do AW2 (5).
16- Centrifugar a 13000 rpm / 3 min
160
17- Transferir o filtro para um eppendorf normal de 1,5 ml com tampa.
18- Adicionar 100µl de AE (6) – é o eluente.
19- Aguardar 3 min.
20- Centrifugar a 8000 rpm / 1 min
21- Descartar filtro e Guardar seu DNA extraído a -20ºC. (vai ter 100µl)
DILUIÇÃO DE PRIMER
-Q, esse volume
dependerá de cada síntese. Deve-se verificar no rótulo do tubo do primer, ou
naquele documento que vem junto, o valor indicativo da quantidade de nm (canto
direito abaixo da OD). Esse valor será a quantidade de água que deverá será
utilizada para diluição do primer e assim vai ficar uma concentração de 1000 pMol
(essa é a solução estoque). Para preparar a solução de uso, cuja concentração
requerida é de 25 pMol, faz-se necessário uma diluição 1:40, ou seja, diluir 1 µl de
primer estoque e 39 µl de água ultra pura/miliQ estéril. (USP)”
EXEMPLO:
Solução Estoque (1000 pMol)
- Se estiver escrito no rótulo do primer “28,31 nm”
- Acrescenta “28,31 uL” de água Mili-Q estéril agita bem, centrifuga
rapidamente apenas para concentrar o líquido no fundo do tubo e armazenar em -
20ºC.
Solução de Uso (25 pMol)
- Diluir 1:40 = 1ul do estoque + 39 ul de água Mili-Q estéril
C1 x V1 = C2 x V2
1000 x 1ul = 25 x ?
? = 40 (quer dizer que pegando 1 ul da solução estoque, para ter a
solução final de uso a 25pMol, o volume total deve ser 40ul, então colocar 39ul de
água)
- Se quiser fazer uma quantidade maior de primer, é só aumentar
proporcionalmente.
Ex: 5 ul de estoque + 195 ul de água
C1 x V1 = C2 x V2
1000 x 5 = 25 x ?
161
? = 200 (para uma solução de uso de 200 ul, deve pegar 5 ul do estoque
+ 195 ul de água)
DNTPs
Acrescentar 10 uL de cada (A, T, C, G) em 360 uL de água MiliQ estéril
(100mM DNTPs Set, PCR Grade / Invitrogen, Cat Nº 10297117)
ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE
*Pequeno: 0,63 g de agarose (0,7%) / 0,9 g agarose (1%) / 1,8g agarose
(2%)
90 ml de TAE 1X ou TBE 1X
2 µl de solução de brometo de etídio ( 10mg/ml) ou se for usar Sybr
Safe vai colocar 9 µl para 90 mL de TAE
*Grande: 3x o médio
1 – Pesar (no copinho de café descartável) na balança de precisão de
acordo com a concentração do gel (0,7%, 1% ou 2%)
2 – Misturar a agarose com 90 ml do tampão (TAE ou TBE) em Becker e
aquecer em microondas até ficar transparente (+- 1min: deixa um pouco, tira para
mexer e voltar p microondas, até desaparecer partículas)
3 – Passar conteúdo para o Becker contaminado com brometo e
acrescentar 2uL do brometo de etídio.
CUIDADO É MUITO TÓXICO!!!
Dissolver 0,2 g de brometo de etídio em 20 ml de água destilada/MiliQ
Manter em temperatura ambiente e proteger da luz.
Invitrogen já vende solução pronta.
4 – Misturar e verter na bandeja.
Importante: Encaixar bem as borrachas para vedar as extremidades e
colocar o pente.
5 –Observar se tem bolhas para remover e esperar esfriar/endurecer (+-
30 min)
162
6 – Remover as borrachas e pentes.
7 – Levar a bandeja com o gel para dentro da cuba e acrescentar tampão
se necessário, até cobrir todo gel.
Importante: o tampão da cuba deve ser o mesmo usado no gel (TAE ou
TBE)
8 – Aplicar 4 ul da amostra + 2ul do corante (loading dye) em cada poço.
Essa mistura é feita em um pedaço de parafilm, e não dentro do
eppendorf.
9 – Fechar cuba e Ligar fonte de eletroforese
+- 90 V / +-40 minutos. Observar no visual a posição do corante pra ter
noção de onde a banda está!
Obs: Quando vai fazer purificação a partir da banda, deve fazer receita
dobrada (brometo tb é 2x) para os poços ficarem maior. No gel 2% o brometo não
dobra.
163
APÊNDICE 4 Espécies bacterianas encontradas nas coletas dos canais radiculares e bolsas periodontais.
164
165
166
167
168
169
APÊNDICE 5
QUANTIFICAÇÃO DE ENDOTOXINAS
Determinação da concentração de endotoxinas (Teste Turbidimétrico -
ensaio de LAL)
O teste turbidimétrico (BioWhitaker, Inc., Walkersville, MD, EUA) foi
utilizado para medir as concentrações de endotoxinas presentes nos canais
radiculares e bolsas periodontais. Para isso, foi utilizado a técnica do Lisado de
Amebócito Limulus (LAL).
- Preparo dos Reagentes: Todos os reagentes foram retirados da
geladeira para atingir a temperatura ambiente antes do uso.
Para calcular as concentrações desconhecidas de endotoxina nas
amostras cada ensaio turbidimétrico de LAL deve apresentar uma curva padrão
válida.
Por causa da grande concentrações sobre os quais os valores de
endotoxina podem ser determinados, é possível ajustar o intervalo quantitativo de
qualquer ensaio, ajustando a concentração de padrões de endotoxina padrões.Um
mínimo de três padrões são necessários.
O ensaio PYROGENT-5000 é realizado podendo variar de 0,01 EU / ml a
100 EU / ml. No entanto, esses valores padrões podem variar em função das
necessidades específicas do produto.
- Preparo das amostras: Todas as amostras de endotoxina que foram
coletadas dos canais radiculares e das bolsas periodontais, foram suspensas em 1
mL de água LAL e agitados em vortex durante 60 segundos. A água LAL foi
considerada como o branco para todos os testes.
- Preparo da curva padrão: Como um parâmetro para o cálculo da
quantidade de endotoxinas das amostras, uma curva padrão foi representada
graficamente utilizando com uma concentração conhecida de endotoxinas (100 EU /
ml), e as suas diluições com as seguintes concentrações finais (ou seja, 0,01, 0,10,
1, 10 UE / mL)
1. Prepare uma solução contendo 10 EU / ml de endotoxina, adicionando
0,1 ml do estoque de 100 EU / ml de endotoxinas em 0,9 ml de água reagente LAL.
170
Esta solução deve ser vigorosamente agitada em vórtice, durante pelo menos 1
minuto antes de prosseguir.
2. Transferir 0,1 mL da UE 10 / ml de solução de endotoxina em 0,9 ml de
agua LAL. A água deve estar em um recipiente adequado com etiqueta 1 EU / ml. A
solução deve ser vigorosamente agitada em vórtice, durante pelo menos 1 minuto
antes de prosseguir.
3. Transferir 0,1 mL da UE 1 / ml de solução de endotoxina em 0,9 ml de
reagente de LAL. A água deve estar em um recipiente adequado com etiqueta com
rótulo 0,10 EU / ml. Esta solução deve ser vigorosamente agitadas durante pelo
menos 1 minuto antes de prosseguir.
4. Transferir 0,1 mL da UE 0.10 / ml de solução de endotoxina em 0,9 ml
de LAL. A água deve estar em um recipiente adequado com etiqueta com rótulo 0,01
EU / ml. esta solução deve ser vigorosamente agitada em vórtice, durante pelo
menos 1 minuto antes de prosseguir.
Após preparo da curva padrão, preparamos a biofilmeque será lido no
leitor. A microbiofilmede 96 poços (Corning Costar, Cambridge, MA), será preparada
da seguinte maneira:
1. Dispensar cuidadosamente 100 µL de água apirogênica LAL em todos
os poços
2. Dispensar cuidadosamente 100 µL da diluição seriada nos primeiros
poços (como mostra o esquema)
3. Dispensar cuidadosamente 100 µL das amostras nos outros poços
(como mostra o esquema) 4. Evitar a formação de bolhas!
Todas as amostras e as reações foram distribuídas e realizadas em
duplicata, para validar o ensaio.
Essa curva era então realizada da seguinte forma: Eram colocados
0,9mL de agua LAL em 4 tubos de ensaio apirogênicos. Em seguida, o frasco
contendo a endotoxina, em uma concentração de 100EU/mL, era vortexado e,
0,1mL colocado no primeiro tubo de ensaio que sera também vortexado. Esse
procedimento é repetido até o ultimo tubo de ensaio. Cada tubo de ensaio vai
apresentar uma concentração de endotoxinas pré estabelecida e, essa diluição
seriada é a curva padrão do ensaio.
O teste foi realizado de acordo com as instruções do fabricante. Após
preenchimento da microplaca, ela é inserida em um leitor de placas (Ultramark,
171
BioRad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EUA), a 340 nm, em um bloco de
aquecimento a 37 º C e mantida a esta temperatura durante todo o ensaio. Essa
biofilmeé pré incubada por mais ou menos 10 minutos. Depois, como uma pipeta
multicanal, distribuir 100 µL do Reagente PYROGENT 5000 em todos os poços,
começando pela primeira coluna. Esse reagente deve ser colocado o mais rápido
possível, evitando a formação de bolhas. O leitor é fechado e a leitura começa a ser
realizada. Uma vez que o valor da absorvância média dos padrões foi diretamente
proporcional à concentração de endotoxinas apresenta, a concentração de
endotoxina é determinada a partir da curva padrão
172
APÊNDICE 6
Valores da concentração de Endotoxinas (pg/mL) dos pacientes em todas
as fases do tratamento
Paciente Bolsa Periodontal
inicial
Bolsa Periodontal
final
Bolsa Periodontal
após a medicação
Canal Radicular
inicial
Canal Radicular
final
Canal Radicular
após a medicação
1 1750 75,1 - 9,8 0,1 -
2 1890 85 46 2,4 0,279 0,04
3 550 40,5 - 12,9 0,779 -
4 935 306 51 8,7 0,115 0,093
5 838 187 - 4,99 0,1 -
6 120 15,5 - 7,9 0,09 -
7 515 173 - 108 0,279 -
8 535 90 43 9,3 0,1 0,07
9 75,6 54,8 - 8,9 0,132 -
10 625 82,5 - 9,9 0,13 -
11 562 90 26,3 9,4 0,123 0,026
12 360 88 9,9 8,4 0,14 0,08
13 218 158 39 8,5 0,11 0,086
14 100 89,68 40,5 9,8 0,15 0,07
173
ANEXOS Anexo 1 – Comitê de Ética
174
ANEXO 2 –
Termo de consentimento livre e esclarecido específico para a pesquisa
As informações contidas neste prontuário foram fornecidas pela orientadora Profª. Drª.
Brenda Paula Figueiredo de Almeida Gomes e/ou pela aluna de mestrado Rafaela Casadei Chapola,
objetivando convidar e formar acordo, por escrito, mediante o qual o indivíduo, parte integrante da
pesquisa, autoriza sua participação, com pleno conhecimento da natureza dos procedimentos e
riscos a que se submeterá por livre arbítrio e sem qualquer coação.
I. TÍTULO DA PESQUISA
"Lesões endo-periodontais combinadas: caracterização microbiológica e endotóxica".
II. PROPOSIÇÃO GERAL
Identificar, por Nested PCR, a microbiota dos canais radiculares e bolsas periodontais de dentes com polpa necrosada, comprometimento periapical, sangramento gengival e bolsas periodontais, verificar a suscetibilidade desses microrganismos ao preparo químico-mecânico e ao uso de medicação intracanal, através da contagem das Unidades Formadoras de Colônias (UFC´s), e quantificar as endotoxinas e citocinas antes e após o preparo químico-mecânico (PQM) e uso de medicamentos intracanais (MI).
III. JUSTIFICATIVA
Estudos sobre medicação intracanal e soluções irrigadoras fazem parte da linha de
pesquisa do laboratório de Microbiologia aplicada à Endodontia, da FOP-UNICAMP, desta maneira
haverá uma continuidade na linha de pesquisa. A atividade antimicrobiana da clorexidina gel,
hidróxido de cálcio e da associação de ambos, utilizados como medicação intracanal, já foi testada
em nosso laboratório por métodos in vitro, com resultados satisfatórios quanto à ação antibacteriana
no interior de túbulos dentinários, necessitando, portanto, ser avaliada clinicamente. Esse trabalho
mostra a ação antibacteriana de substâncias químicas auxiliares ao preparo mecânico na luz do canal
radicular e em toda a extensão dos túbulos dentinários in vitro. Esse assunto faz parte da linha de
pesquisa do Laboratório de Microbiologia aplicada à Endodontia de nossa disciplina, que foi montado
graças ao financiamento da FAPESP. Dessa maneira, o presente trabalho promoverá uma
continuidade na linha de pesquisa.
Este estudo possibilitará testar in vivo, o potencial antimicrobiano destas substâncias no
interior do canal radicular e através dos túbulos dentinários, em bolsas periodontais, além de
identificar patógenos de origem periodontal no interior dos canais radiculares através do método
Nested PCR.
IV. PROCEDIMENTO DO EXPERIMENTO
Seleção dos pacientes
175
Serão selecionados 14 indivíduos da Clínica de Especialização de Periodontia da Faculdade
de Odontologia de Piracicaba (FOP), Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). A faixa etária
será entre 18 a 65 anos, independentemente do gênero. Os voluntários serão confirmados através da
presença de perda óssea do dente envolvido detectado radiograficamente, acompanhado ou não de
sinais e sintomas, e clinicamente pelo teste térmico confirmando uma sensibilidade pulpar negativa.
Alguns critérios deverão ser respeitados:
a) Presença de bolsa periodontal com profundidade de sondagem maior ou igual a 6 mm em mais de uma face.
b) Indivíduos que não fizeram uso de antibióticos sistêmicos e/ou locais nos últimos 3 meses.
c) Indivíduos que estão sob tratamento periodontal por mais de 1 ano.
Aspectos clínicos e radiográficos
Para cada indivíduo serão anotados na anamnese: idade, sexo, estado pulpar, profundidade da bolsa periodontal, inserção clínica, mobilidade dental, presença de edema dos tecidos periodontais, história de medicação, achados radiográficos, presença ou não de cáries, restaurações e coroas metálicas, assim como presença ou ausência de dor. Também serão anotados dados da história médica e história dentária.
Serão realizados testes para verificar dor à percussão, à palpação e mobilidade dental, além
da realização de uma sondagem periodontal e do teste térmico para confirmação de necrose pulpar.
Uma radiografia periapical será realizada para avaliar o comprometimento da doença periodontal.
Como critérios de exclusão, teremos dentes abertos, com cárie comunicante à câmara pulpar,
com trincas, calcificados, reabsorção externa e os casos que não for possível acessar todo o
comprimento do canal radicular. Pacientes portadores de doenças sistêmicas (como por exemplo,
diabetes melitus e AIDS) e com história de antibioticoterapia recente e uso de antifúngicos também
não participarão deste trabalho.
Os pacientes assinarão um Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) elaborado
de acordo com as normas do Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Odontologia de
Piracicaba - UNICAMP.
Coleta de amostras
Amostras para análise de endotoxinas e análise microbiológica, que habitam as bolsas
periodontais e canais radiculares dos pacientes selecionados, serão feitas antes e depois da
instrumentação dos canais radiculares e durante as trocas de curativo (30 dias), com auxílio de cones
de papel absorvente estéril introduzidos no comprimento de trabalho pré-estabelecido, permanecendo
nesta posição por 60 segundos, o que não afetará em nada a saúde dos mesmos, já que é um
procedimento corriqueiro no tratamento endodôntico (secagem do canal radicular, antes da colocação
de medicação no interior dos canais radiculares, e obturação se faz da mesma maneira). A coleta das
amostras dos canais radiculares será realizada sob fluxo contínuo de nitrogênio.
176
Os canais radiculares serão desinfectados seguindo uma técnica de instrumentação
adequada e um potente agente antimicrobiano (clorexidina gel 2%).
Os 14 pacientes serão divididos em 2 grupos:
Grupo I: (n=7) - Sessão única, sem uso de medicação intracanal. Em sequência, será
colocada uma camada de aproximadamente 2 mm de Coltosol, aplicação de ácido fosfórico
37% por 15 segundos, adesivo Single Bond 3M® (3M Dental Products, St Paul, USA) e
aproximadamente 3 mm de resina fotopolimerizável Z 250 (3M Dental Products, St Paul,
USA).
Grupo II: (n=7, MIC por 30 dias) - os canais deste grupo serão secos com cones de papel e
preenchidos com Ca(OH)2 + CHX-gel 2 % (2:1). Em sequência, será colocada uma camada
de aproximadamente 2 mm de Coltosol, aplicação de ácido fosfórico 37% por 15 segundos,
adesivo Single Bond 3M® (3M Dental Products, St Paul, USA) e aproximadamente 3 mm de
resina fotopolimerizável Z 250 (3M Dental Products, St Paul, USA).
Após as coletas das amostras, o dente em questão será tratado e restaurado pelo
mesmo operador. Além disso, será feito pela Área de Endodontia, um acompanhamento de todos os
tratamentos realizados neste experimento, durante, no mínimo, 4 anos, e os pacientes serão
encaminhados à clínica da FOP-UNICAMP para a finalização de um tratamento periodontal
adequado. Para o tratamento endodôntico, não há método alternativo, pois há a necessidade de uma
instrumentação dos canais radiculares eficiente, auxiliada por uma substância química antimicrobiana
de comprovada ação contra os microrganismos encontrados no interior dos canais. Além da utilização
de uma medicação intracanal que melhore ainda mais esta desinfecção, serão realizadas três coletas
microbiológicas do canal radicular e da bolsa periodontal, durante a sessão de tratamento
endodôntico. Dessa forma, os voluntários não terão que se deslocar à faculdade apenas para a
concretização da pesquisa. Essas coletas serão divididas em duas sessões odontológicas,
semelhante a qualquer outro tratamento endodôntico, finalizando com a obturação e selamento do
dente envolvido.
No laboratório de Microbiologia da disciplina de Endodontia da FOP, os recipientes com
o material colhido do canal radicular serão processados adequadamente para que se obtenha a
identificação dos microrganismos.
V. DESCONFORTO OU RISCOS ESPERADOS
Não terá nenhum risco de vida ou mudança no seu atendimento convencional, já realizado
diariamente nesta Faculdade. O processo é indolor pois a região estará sob anestesia local. Se o
individuo sentir dor, esta provavelmente não será devido à coleta de amostra e sim a persistência da
infecção nos canais radiculares e/ ou nos tecidos periapicais.
Durante todo o tratamento de canal e coleta de bactéria serão utilizados luvas e óculos de
segurança para proteção do operador e do individuo.
Se houver dor fora dos dias marcados para o tratamento, o individuo receberá uma
assistência imediata dos responsáveis pela pesquisa, assim o mesmo deverá entrar em contato,
177
através dos telefones locais descritos à seguir: (0xx19) 2106 5215 (laboratório de Endodontia);
(0xx19) 99183-8578 (celular da pesquisadora Rafaela Casadei Chapola).O paciente também poderá
ser atendido no Plantão de Emergência da FOP-UNICAMP, que funciona normalmente de segunda à
sexta-feira, de 8:00 às 12:00 hs e de 13:30 às 17:30 hs.
Para qualquer informação ou esclarecimento sobre o tratamento, o paciente poderá entrar em
contato com os pesquisadores através dos telefones citados acima e e-mail: [email protected] e
[email protected]. O paciente tem toda a liberdade de pedir esclarecimentos sobre a
metodologia antes e durante a pesquisa, podendo ou não concordar em participar da mesma. Caso
recuse, não haverá prejuízo ao seu tratamento, o qual será prosseguido normalmente.
Uma cópia deste termo (TCLE) será entregue ao voluntário, portanto o mesmo terá em mãos
telefones e endereços para contato.
Apesar dos resultados clínicos e microbiológicos serem divulgados publicamente para fins
acadêmicos e científicos, será preservada a privacidade do indivíduo quanto aos dados confidenciais
que possam a ser envolvidos na pesquisa.
VI. BENEFÍCIOS E VANTAGENS DIRETAS DO EXPERIMENTO
Os benefícios esperados afetam indiretamente os voluntários, pois estarão relacionados com
o desenvolvimento de um tratamento endodôntico mais eficaz e seguro, com o conhecimento dos
microrganismos envolvidos nesses casos.
VII. Possibilidades de inclusão em grupo controle ou placebo
Não há grupo controle ou placebo. VIII. Métodos alternativos para obtenção da informação ou tratamento da condição
Não serão utilizados métodos alternativos.
IX. INFORMAÇÕES
O voluntário tem a garantia de que receberá respostas a qualquer pergunta ou
esclarecimento a respeito dos procedimentos, riscos, benefícios e outros assuntos relacionados à
pesquisa.
Os resultados da pesquisa ficarão à disposição dos sujeitos envolvidos, sendo
preservada a identidade dos mesmos.
A pesquisa não acarretará ônus ao individuo. Não haverá necessidade de deslocamentos ou
procedimentos adicionais para coleta de amostra, além das necessárias para o tratamento
endodôntico convencional
X. RETIRADA DO CONSENTIMENTO
O voluntário tem a liberdade de retirar seu consentimento a qualquer momento e deixar de
participar do estudo e assim do grupo de amostra, este não será penalizado e não haverá prejuízo ao
seu tratamento, o qual será prosseguido normalmente.
178
XI. CONSENTIMENTO INFORMADO
Eu,
__________________________________________________________________________certifico
que tenho lido as informações acima e suficientemente esclarecido (a) de todos os itens pela Profª.
Drª. Brenda Paula Figueiredo de Almeida Gomes e/ou Rafaela Casadei Chapola, estou plenamente
de acordo com a realização do experimento. Assim, eu autorizo a execução da pesquisa, exposta
acima, em mim.
Piracicaba, ______ de __________________ de 2015.
Nome: ______________________________________________
RG:_______________________________
Assinatura:
_____________________________________________________________________________
ATENÇÃO: A sua participação em qualquer tipo de pesquisa é voluntária. Em caso de dúvida
quanto aos seus direitos como voluntário da pesquisa, escreva para o Comitê de Ética em Pesquisa da FOP –
UNICAMP, endereçado a Av. Limeira, 901 – Caixa Postal 52, CEP 13414-903, fone/fax (19) 2106-5349, e-mail
[email protected], na cidade de Piracicaba/SP. Site: WWW.fop.unicamp.br/cep
____________________________________
Assinatura do Pesquisador
