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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
LAIS THIEMI YAMANE
AVALIAÇÃO DE FORMULAÇÕES TÓPICAS CONTENDO EXTRATO ETANÓLICO
DE Acmella oleracea (L.) R.K. JANSEN (JAMBU), ASSOCIADO A ÓLEO
ESSENCIAL DE Achyrocline satureioides LAM (MACELA)
CAMPINAS 2016
LAIS THIEMI YAMANE
AVALIAÇÃO DE FORMULAÇÕES TÓPICAS CONTENDO EXTRATO ETANÓLICO
DE Acmella oleracea (L.) R.K. JANSEN (JAMBU), ASSOCIADO A ÓLEO
ESSENCIAL DE Achyrocline satureioides LAM (MACELA)
Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Ciências na área de concentração em Clínica Médica.
Orientador: Dr. Rodney Alexandre Ferreira Rodrigues
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA LAIS THIEMI YAMANE E ORIENTADO PELO PROF. DR. RODNEY ALEXANDRE FERREIRA RODRIGUES.
CAMPINAS 2016
BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE MESTRADO
LAIS THIEMI YAMANE
ORIENTADOR: RODNEY ALEXANDRE FERREIRA RODRIGUES
MEMBROS:
1. PROF. DR. RODNEY ALEXANDRE FERREIRA RODRIGUES
2. PROF. DR. SEVERINO MATIAS DE ALENCAR
3. PROFA. DRA. ANDREA APARECIDA DE ARO
Programa de Pós-Graduação em Clínica Médica da Faculdade de Ciências Médicas da
Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora
encontram-se no processo de vida acadêmica do aluno.
Data: 29 de abril de 2016
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Rodney Alexandre Ferreira Rodrigues, meu orientador, pela dedicação,
paciência, amizade, por ter me dado esta oportunidade e tornar possível a
realização deste trabalho.
Aos meus pais e meu irmão, minha base de quem eu sou hoje. Obrigada por sempre
acreditarem em mim, me apoiarem em minhas decisões e por estarem tão presentes
na minha vida me guiando com sábios conselhos.
Às minhas companheiras de laboratório, Verônica, Ilza, Leila Giarola, Carol Brintrup
e Carol Spindola, que são mais do que colegas, são amigas que sempre me
ajudaram a alcançar meu objetivo.
À Divisão de Farmacologia e Toxicologia do CPQBA pela disponibilidade do
laboratório.
À Divisão de Química Orgânica e Farmacêutica, Dr. Adilson e Dra. Marili que se
dispuseram a melhorar e realizar minhas análises.
À Divisão de Agrotecnologia, Dra. Glyn, Dr. Ílio e Benício.
À Dra. Michelle Jorge e Vanessa pela ajuda e paciência na realização no teste de
cicatrização.
À Prof. Dra. Eneida pela ajuda e por disponibilizar o equipamento de Tail Flick.
Ao Doutorando Luis Anholeto e Dra. Patrícia de Oliveira do Instituto de Biologia da
UNESP – Rio Claro que não mediram esforços para me ajudar na parte
histopatológica do trabalho.
Às minhas amigas de Faculdade Thaís, Bia, Alissa, Camila e Mará e meus amigos
de Franca Ícaro, Karine, Letti e Pri pela amizade, risadas, conselhos e por estarem
sempre comigo nessa etapa.
Ao Programa de Pós Graduação em Clínica Médica da Faculdade de Ciências
Médicas UNICAMP.
À CAPES como aluna bolsista, FAPESP e FAEPEX pelo auxílio financeiro.
RESUMO
O mercado de curativos tem crescido significativamente nos últimos 10 anos,
porém há poucos curativos que possuem as propriedades necessárias para
proteção e cura das feridas. Polímeros naturais são de especial interesse devido a
via de regra terem baixa toxicidade, alta absorção e capacidade de intumescimento,
além disso, vários compostos ativos pode ser incorporados nestes polímeros. A
hidroxietilcelulose (HEC) é um polímero solúvel em água, com baixa toxicidade,
formador de filme e derivado da celulose, portanto renovável. É muito utilizada em
vários tipos de curativos por ter propriedade hemostática. A acmella oleracea é uma
planta nativa da região da América do Sul, conhecida como Jambu, é muito utilizada
popularmente para dores de dente, por ter ação anestésica devido a presença do
espilantol. A Achyrocline satureoides também é nativa da América do Sul,
popularmente conhecida como macela, seu composto de interesse é o α-humuleno,
responsável pela ação anti-inflamatória. O objetivo deste trabalho foi associar o
extrato etanólico de Jambu e óleo essencial de macela em um filme polimérico
transdérmico, com ação anestésica e anti-inflamatória para o tratamento de feridas
na pele, em duas concentrações (Filme 10% de extrato de jambu e 1% de óleo
essencial de macela e Filme 15% de extrato de Jambu e 1,5% de óleo essencial de
macela). O extrato etanólico de jambu foi obtido das suas partes aéreas e
posteriormente tratado com carvão ativo para a retirada de pigmentos. O óleo
essencial de macela foi produzido por hidrodestilação de suas inflorescências
frescas. Os filmes foram produzidos pelo método casting, caracterizados
mecanicamente através de um analisador de texturas e avaliados por teste in vitro
de permeação cutânea em célula vertical tipo Franz com epitélio de orelha de porco
e Tape Stripping e testes in vivo de atividade antinociceptiva em camundongos (25-
40g) pelo modelo de remoção de cauda (Tail Flick) e cicatrização em ratos (150-
250g) por úlcera cutânea seguida por sua análise histopatológica. Na caracterização
mecânica, o filme placebo obteve uma maior rigidez que os filmes contendo extratos
e óleo essencial, estes se apresentaram mais maleáveis. No estudo de permeação
cutânea, observou-se pela técnica de Tape Stripping que o espilantol e α-humuleno
ficaram retidos nas camadas da pele. No estudo de cicatrização, as úlceras
cutâneas foram avaliadas por 10 dias, o filme de maior concentração obteve a maior
porcentagem de redução de ferida 62% (± 12,11), maior síntese de colágeno e
significativo espessamento da epiderme, observados na análise histopatológica. Na
determinação da atividade antinociceptiva, o filme formulado com as maiores
concentrações de ativos, apresentou tempo médio de anestesia de 83,5 min (±
28,53), superior ao controle positivo (EMLA®), um creme anestésico disponível no
mercado. Os resultados demonstraram que os filmes transdérmicos obtidos neste
estudo são promissores como anestésico e anti-inflamatório tópico.
Palavras-chave: Spilanthes oleracea, administração tópica, anestésico, anti-
inflamatório, cicatrização.
ABSTRACT
The wound dressing market has grown significantly over last10 years,
however fewer dressings have all the required properties for the purpose of wound
protection and healing. Natural polymers are of special interest due to low toxicity,
high absorption and swelling capacities moreover, various active compounds can be
incorporated in these polymers. The hydroxyethylcellulose (HEC) is a renewable
polymer, soluble in water, with low toxicity, film-forming and is widely used in various
types of dressings to have hemostatic property. Acmella oleracea is native to the
South American region, known as jambu, is very popularly used for toothaches, the
anesthetic action is due to the presence of espilantol. The Achyrocline satureoides is
also native in South America, popularly known as macela, your compound of interest
is α-humulene, responsible for the anti-inflammatory action. The objective of this
study was to associate the ethanolic extract of Jambu and macela essential oil in a
transdermal polymeric film with anesthetic and anti-inflammatory action for the
treatment of skin wounds, in two different concentrations (Film 10% jambu extract
and 1% macela essential oil and Film 15% jambu extract and 1,5% macela essential
oil). The ethanolic extract was produced by the aerial parts of jambu and then treated
with activated carbon for the removal of pigments. The macela essential oil was
produced by hydrodistillation from their fresh inflorescences. The films were
characterized using a mechanical texture analyzer and evaluated for in vitro skin
permeation test of vertical Franz cell with pig ear epithelium and Tape Stripping and
in vivo test of anti-nociceptive activity in mice (25-40g) by tail removal model (Tail
Flick) and wound healing ulcer skin in rats (150-250g) followed by their
histopathology analysis. In mechanical characterization, placebo film obtained a
higher rigidity than the film containing extracts and essential oils, these presented
more pliable. In skin permeation study was observed by tape stripping technique that
espilantol and α-humulene were retained in the skin layers. The study of wound
healing, the skin ulcers were evaluated for 10 days, the film with the highest
concentration had the highest percentage of wound reduction of 62% (±12.11),
increased collagen synthesis and significant thickening of the epidermis was
observed in histopathology analysis. In antinociceptive activity assay, the highest
concentration film had an average time of anesthesia of 83.57 (±28.53) minutes,
higher than the positive control available in the market, EMLA®. The results showed
that the transdermal films are promising as an anesthetic and anti-inflammatory.
Keywords: Spilanthes oleracea, topical administration, anesthetic, anti-
inflammatory, wound healing.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 – Desenho esquemático da pele humana espessa e fina...........................22
Figura 2 – Inflorescências de Macela.........................................................................28
Figura 3 – Estrutura química do α-humuleno.............................................................29
Figura 4 – (A) Protetor solar com extrato de macela, Bottega Verde® (Itália); (B)
Sabonete em barra com extrato de macela, EcoH® (Brasil); (C)
Shampoo, condicionador e creme de tratamento com extrato de macela,
Lowell® (Brasil).......................................................................................31
Figura 5 – Flores de Jambu........................................................................................32
Figura 6 – Estrutura química do espilantol.................................................................34
Figura 7 – Cremes antirrugas contendo extrato de jambu; (A) Anesi® (Espanha); (B)
Burt’s Bees® (Estados Unidos da América); (C) Natura® (Brasil)..........35
Figura 8 – Furador de 17 mm de diâmetro utilizado para cortar os filmes.................38
Figura 9 – (A) Pele de porco sendo dermatomizada; (B) dermatômetro....................41
Figura 10 – Célula de difusão vertical do tipo Franz; (A) Filme em contato com o
estrato córneo do epitélio de orelha de porco; (B) Célula de Franz
montada..................................................................................................42
Figura 11 – Peles fixadas em superfície de isopor com auxílio de alfinetes..............43
Figura 12 – Determinação da atividade antinociceptiva pelo modelo de Tail
Flick.........................................................................................................45
Figura 13 – Cromatografia em camada delgada do extrato de jambu tratado com
carvão ativo a 4% (JC) em comparação ao extrato bruto de Jambu (JB) e
padrão de espilantol (Pd), com destaque para a região contendo o
espilantol. (A) Revelação em 254 nm em câmara ultra violeta; (B)
Revelação em p-anisaldeído...................................................................46
Figura 14 – Cromatografia em camada delgada do óleo essencial de macela (OM)
em comparação ao padrão de α-humuleno (H), com destaque para a
região contendo o α-humuleno. Revelação em p-anisaldeído................47
Figura 15 – Ilustração do filme obtido com quitosana e extrato de Jambu associado a
óleo essencial de Macela, demonstrando que após sua secagem houve
um encolhimento da matriz.....................................................................48
Figura 16 – Formulação de PVA com extrato de Jambu e óleo essencial de Macela,
o filme permaneceu úmido após 48 horas em estufa.............................48
Figura 17 – Formulação de hidroxietilcelulose com extrato de Jambu e óleo
essencial de Macela................................................................................49
Figura 18 – Filmes cortados em 17 mm de diâmetro; FI - filme com 10% de extrato
de Jambu e 1% óleo essencial de Macela, FII - 15% de extrato de Jambu
e 1,5% de óleo essencial de Macela e FIII - filme placebo (sem adição de
extrato e óleo essencial).........................................................................49
Figura 19 – Cromatograma por CG-EM do padrão analítico comercial do
espilantol.................................................................................................51
Figura 20 – Cromatograma por CG-EM do extrato etanólico de jambu tratado com
4% de carvão ativo, com destaque para o pico do espilantol.................51
Figura 21 – Cromatograma por CG-EM do padrão analítico comercial do α-
humuleno.................................................................................................52
Figura 22 – Cromatograma por CG-EM do óleo essencial de macela, com destaque
para o pico de α-humuleno.....................................................................52
Figura 23 – Cromatograma por CLAE do padrão analítico comercial do
espilantol.................................................................................................53
Figura 24 – Cromatograma por CLAE do extrato etanólico de Jambu tratado com 4%
de carvão ativo, com destaque ao pico de espilantol..............................53
Figura 25 – Curva analítica construída a partir do padrão analítico comercial de
espilantol.................................................................................................54
Figura 26 – Curva analítica construída a partir do padrão analítico comercial de α-
humuleno.................................................................................................54
Figura 27 – Figura 27 – Cromatograma da análise por CG-EM das extrações dos
ativos da epiderme/derme. (1) α-humuleno; (2)
espilantol.................................................................................................56
Figura 28 – Porcentagem de contração de ferida em ratos, tratados com solução
salina, alantoína, filmes FI - filme com 10,0% de extrato de jambu e 1,0%
óleo essencial de macela, FII – 15,0% de extrato de jambu e 1,5% de
óleo essencial de macela e FIII - filme placebo (sem adição de extrato e
óleo essencial). *p<0,05, diferente da solução salina, análise One-way
ANOVA seguido de Tukey......................................................................57
Figura 29 – (A) tratamento com solução salina, presença de pus e sangue; (B)
tratamento com filme FII, presença de crosta sem
exsudato..................................................................................................57
Figura 30 – Cortes histológicos de pele de rato retirados da área da ferida e corados
com Tricrômio de Masson. As lâminas foram observadas por
microscopia óptica em 200 µm. (A) controle positivo, alantoína; (B)
controle negativo, filme placebo; (C) filme FI; (D) filme FII.
SC = estrato córneo, EP = região da epiderme, D = da derme, C:
colágeno, FP: folículo piloso...................................................................58
Figura 31 – Cortes histológicos de pele de rato retirados da área da ferida e corados
com Hematoxilina/Eosina. As lâminas foram observadas por microscopia
óptica em dois aumentos diferentes, 90 e 40 µm. (A e B) controle
positivo, alantoína; (C e D) controle negativo, filme placebo; (E e F) filme
FI; (G e H) filme FII. SC = estrato córneo, EP = região da epiderme, D =
da derme, C: colágeno, FP: folículo piloso e a seta indica o núcleo do
fibroblasto................................................................................................59
Figura 32 – Porcentagem de animais anestesiados pelo tempo em minutos (p>0,05).
FI - filme com 10,0% de extrato de jambu e 1,0% óleo essencial de
macela, FII – 15,0% de extrato de jambu e 1,5% de óleo essencial de
macela e FIII - filme placebo (sem adição de extrato e óleo essencial).
Não houve diferença estatística significante...........................................60
Figura 33 – Duração da anestesia em minutos por tratamento. FI - filme com 10,0%
de extrato de jambu e 1,0% óleo essencial de macela e FII – 15,0% de
extrato de jambu e 1,5% de óleo essencial de macela. *p<0,05, diferente
de FI, análise One-way ANOVA seguido de Tukey................................61
LISTA DE TABELAS
Tabela 1– Espessura e massa dos filmes FI, FII e FIII (n=10)...................................50
Tabela 2 – Resistência mecânica (g ± DP) dos filmes à perfuração, relaxação e
resiliência e tempo de resistência (seg ± DP) em função da força (g)
aplicada (ASC), n=3..................................................................................50
Tabela 3 – Teor de espilantol e α-humuleno em mg/g (± DP) de filme.....................55
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
CCD: Cromatografia em Camada Delgada
CG-EM: Cromatógrafo Gasoso acoplado a um detector de Massas
CLAE: Cromatografia Gasosa de Alta Eficiência
DP: Desvio padrão
FDA: Food and Drug Administration
FI: Filme com 10% de extrato de jambu e 1% de óleo essencial de macela
FII: Filme com 15% de extrato de jambu e 1,5% de óleo essencial de macela
FIII: Filme placebo, sem adição de extrato ou óleo essencial
FP: Folículo Piloso
HE: Hematoxilina/Eosina
HEC: Hidroxietilcelulose
IL: Interleucina
JB: Extrato Bruto de jambu
JC: Extrato de jambu tratado com 4% de carvão ativo
NIST: National Institute of Standard Technology
OM: Óleo Essencial de macela
PVA: Álcool Polivinílico
SC: Estrato Córneo
TM: Tricrômio de Masson
TNF: Fator de Necrose Tumoral
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ___________________________________________________ 19
2. OBJETIVO ______________________________________________________ 20
2.1 Objetivos específicos ___________________________________________ 20
3. REVISÃO DA LITERATURA ________________________________________ 20
3.1 Nocicepção e inflamação relacionada à cicatrização de feridas ___________ 20
3.1.1 Fase inflamatória _____________________________________________ 22
3.1.2 Fase proliferativa _____________________________________________ 25
3.1.3 Remodelamento ______________________________________________ 25
3.1.4 Nocicepção _________________________________________________ 26
3.2 Estudos fitoquímico, farmacológico e toxicidade da Achyrocline satureoides
Lam. (D.C.) ______________________________________________________ 27
3.3 Estudos fitoquímico, farmacológico e toxicidade da Acmella oleracea (L.) R.K. Jansen _________________________________________________________ 31
4. JUSTIFICATIVA __________________________________________________ 35
5. MATERIAL E MÉTODOS ___________________________________________ 35
5.1 Material ______________________________________________________ 35
5.1.1 Material vegetal ______________________________________________ 36
5.2 Métodos _____________________________________________________ 36
5.2.1 Produção de extrato etanólico de jambu e tratamento com carvão ativo ___ 36
5.2.2 Produção do óleo essencial de macela ____________________________ 37
5.2.3 Produção dos filmes ___________________________________________ 37
5.2.3.1 Produção do filme de Quitosana ________________________________ 37
5.2.3.2 Produção do filme de Álcool Polivinílico __________________________ 37
5.2.3.3 Produção do filme de hidroxietilcelulose __________________________ 38
5.2.4 Propriedades físicas dos filmes __________________________________ 38
5.2.5 Determinação das propriedades mecânicas dos filmes ________________ 38
5.2.6 Monitoramento do espilantol e α-humuleno por Cromatografia Gasosa acoplada a detector de massas (CG-EM) _______________________________ 39
5.2.7 Monitoramento do espilantol por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) _________________________________________________________ 39
5.2.8 Construção da Curva Analítica a partir dos padrões comercias de Espilantol e α-humuleno ____________________________________________________ 40
5.2.9 Avaliação do teor de espilantol e α-humuleno nos filmes ______________ 41
5.2.10 Ensaio de permeação in vitro a partir de epitélio de orelha de porco _____ 41
5.2.10.1 Teste de retenção dos ativos no estrato córneo (Tape Stripping) ______ 43
5.2.10.2 Teste de retenção dos ativos na epiderme/derme _________________ 43
5.2.11 Ensaios farmacológicos _______________________________________ 43
5.2.11.1 Animais __________________________________________________ 44
5.2.11.2 Avaliação da atividade cicatrizante em ratos _____________________ 44
5.2.11.2.1 Estudos histopatológicos ___________________________________ 44
5.2.11.3 Determinação da atividade antinociceptiva em camundongos ________ 45
5.2.12 Análise estatística ___________________________________________ 46
6. RESULTADOS ___________________________________________________ 46
6.1 Rendimento do extrato de jambu tratado com carvão ativo ______________ 46
6.2 Rendimento na produção do óleo essencial de macela _________________ 47
6.3 Produção dos filmes ____________________________________________ 47
6.3.1 Filme com Quitosana __________________________________________ 47
6.3.2 Filme com Álcool Polivinílico ____________________________________ 48
6.3.3 Filme com hidroxietilcelulose ____________________________________ 49
6.4 Propriedades físicas dos filmes____________________________________ 49
6.5 Determinação das propriedades mecânicas dos filmes _________________ 50
6.6 Monitoramento do espilantol e α-humuleno por CG-EM _________________ 51
6.7 Monitoramento do espilantol por CLAE ______________________________ 53
6.8 Construção da Curva Analítica com padrões analíticos comercias de Espilantol e α-humuleno ____________________________________________________ 54
6.9 Quantificação do espilantol e α-humuleno nos filmes ___________________ 55
6.10 Ensaio de permeação in vitro a partir de epitélio de orelha de porco ______ 55
6.10.1 Teste de retenção dos ativos no estrato córneo (Tape Stripping) e epiderme/derme __________________________________________________ 55
6.11 Ensaios farmacológicos ________________________________________ 56
6.11.1 Avaliação da atividade cicatrizante em ratos _______________________ 56
6.11.1.1 Estudos histopatológicos ____________________________________ 58
6.11.2 Determinação da atividade antinociceptiva em camundongos__________ 60
7. DISCUSSÃO ____________________________________________________ 61
7.1 Produção de extrato etanólico de jambu e tratamento com carvão ativo ____ 61
7.2 Produção do óleo essencial de macela ______________________________ 62
7.3 Produção dos filmes ____________________________________________ 62
7.3.1 Produção do filme de Quitosana _________________________________ 63
7.3.2 Produção do filme de Álcool Polivinílico ____________________________ 63
7.3.3 Produção do filme de hidroxietilcelulose ___________________________ 63
7.4 Propriedades físicas dos filmes____________________________________ 64
7.5 Determinação das propriedades mecânicas dos filmes _________________ 64
7.6 Monitoramento do espilantol e α-humuleno por CG-EM _________________ 65
7.7 Monitoramento do espilantol por CLAE ______________________________ 65
7.8 Ensaio de permeação in vitro a partir de epitélio de orelha de porco _______ 66
7.8.1 Teste de retenção no estrato córneo (Tape Stripping) e epiderme/derme __ 67
7.9 Ensaios farmacológicos _________________________________________ 67
7.9.1 Avaliação da atividade cicatrizante em ratos ________________________ 67
7.9.1.1 Estudos histopatológicos _____________________________________ 68
7.9.2 Determinação da atividade antinociceptiva em camundongos __________ 69
8. CONCLUSÃO ____________________________________________________ 70
9. REFERÊNCIAS __________________________________________________ 71
ANEXO ___________________________________________________________ 81
19
1. INTRODUÇÃO
Desde o início da civilização as plantas são utilizadas para tratamento e
prevenção de enfermidades, por conterem um número enorme de compostos
com diferentes propriedades farmacológicas (1). Esta utilização se baseia
muito na sabedoria popular inserida num contexto histórico. Desta forma, o
homem sempre buscou na natureza soluções para seus males, quer fossem de
origem física ou não (2).
Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS) planta medicinal é
toda e qualquer planta contendo substâncias que possam ser usadas para
prevenir, aliviar, curar ou modificar um processo fisiológico normal ou
patológico e que possa servir como fonte de fitofármacos e seus precursores
para a síntese químico-farmacêutica. A OMS também estima que 80% da
população mundial dependem da medicina tradicional (3). No Brasil, o uso de
plantas foi disseminado principalmente pelos indígenas, onde destacam-se
jaborandi, guaraná e curare (2).
Considerando as inúmeras transformações decorrentes da evolução
humana, destacando, consequentemente, a degradação ambiental com a
escassez de recursos naturais, Schenkel et al. afirmam que as plantas
medicinais e os extratos hoje representam uma das alternativas entre as
diversas fontes de insumos necessários à existência da sociedade, tendo como
principal vantagem o fato de ser fonte renovável (4).
Os biomas Brasileiros contem mais de 20% da biodiversidade do mundo
(5), significando um celeiro de moléculas disponíveis para a terapêutica
humana, nas áreas farmacêutica, de alimentos, cosmética e veterinária (6).
Plantas medicinais e produtos naturais form incluídos no Sistema Único de
Saúde, demonstrando a importância da medicina tradicional para o país (7).
Duas espécies que são utilizadas na medicina popular e nativas do
Brasil foram utilizadas neste estudo, a Achyrocline satureoides Lam. (D.C.)
(Asteraceae) e a Acmella oleracea (L.) R.K. Jansen (Asteraceae), com o intuido
de desenvolver e avaliar uma formulação de uso tópico com propriedades anti-
inflamatória e anestésica.
20
2. OBJETIVO
Desenvolvimento e avaliação de filme contendo extrato de Acmella
oleracea (L.) R.K. Jansen e óleo essencial de Achyrocline satureoides Lam.
(D.C.) com ações anestésica e anti-inflamatória para uso tópico, obtido pelo
método casting.
2.1 Objetivos específicos
- Obtenção de extrato etanólico de Jambu a partir de suas partes aéreas
secas e moídas;
- Obtenção de óleo essencial de macela a partir de inflorescências
frescas;
- Monitoramento do teor de espilantol no extrato de jambu e α-humuleno
no óleo essencial de macela e formulações;
- Produção de um filme a base de polímeros naturais;
- Caracterização das propriedades físicas e mecânicas;
- Avaliação in vitro da permeação em epitélio de orelha de porco;.
- Avaliação in vivo da atividade cicatrizante das formulações contendo
extrato de jambu e óleo essencial de macela, em duas concentrações (Filme
10% de extrato de jambu e 1% de óleo essencial de macela e Filme 15% de
extrato de jambu e 1,5% de óleo essencial de macela) e filme placebo;
- Avaliação in vivo da atividade antinociceptiva em camundongos.
3. REVISÃO DA LITERATURA
3.1 Nocicepção e inflamação relacionada à cicatrização de feridas
A pele tem como função primária formar uma barreira protetora contra
agressões ambientais, percepção sensorial e regulação da temperatura
corporal (8). Ela recobre a superfície do corpo, sendo constituída por uma
porção epitelial de origem ectodérmica, a epiderme e uma porção conjuntiva de
21
origem mesodérmica, a derme. Abaixo e em continuidade com a derme
encontra-se a hipoderme ou tecido celular subcutâneo, que não faz parte da
pele, apenas lhe serve de união com os órgãos subjacentes (9).
O estrato córneo é a camada mais superficial da pele com espessura
muito variável, constituída por numerosas camadas de células achatadas,
queratinizadas, com uma membrana plasmática espessada. Estas células não
possuem núcleo nem organelas, mas estão preenchidas com filamentos de
queratina contidos dentro de uma matriz amorfa. As células mais distantes da
superfície da pele apresentam desmossomos, enquanto as células perto da
superfície da pele, denominadas escamas ou células córneas, perdem os
desmossomos e são descamadas (9,10).
A pele espessa cobre as palmas das mãos e solas dos pés. A epiderme
da pele espessa, cuja espessura varia de 400 a 600 µm, caracteriza-se pela
presença de todas as cinco camadas; estrato basal (germinativo), estrato
espinhoso, estrato granuloso, estrato lúcido, e estrato córneo. A pele espessa
não possui folículos pilosos, músculos eretores do pelo e glândulas sebáceas,
mas possui glândulas sudoríparas (10).
A pele fina cobre a maior parte do restante do corpo. A epiderme da pele
fina, cuja espessura varia de 75 a 150 µm, tem um estrato córneo delgado e
não possui um estrato lúcido e um estrato granuloso bem definidos. A pele fina
tem folículos pilosos, músculos eretores do pelo, glândulas sebáceas e
glândulas sudoríparas (10).
22
Figura 1 - Desenho esquemático da pele humana espessa e fina.
Fonte: Gartner, 2003 (10).
Qualquer ruptura no estrato córneo resulta em uma ferida. Ferida ou
ferimento, é uma lesão que resulta no rompimento da continuidade normal de
qualquer uma das estruturas corporais tais como a pele, agredidas por agentes
físicos, químicos ou biológicos (10).
Muitos fatores podem levar a má cicatrização como idade, ser fumante,
obesidade e doenças crônicas como diabetes e insuficiência arterial e venosa,
aumentando assim o risco de desenvolver feridas crônicas (11-13).
O processo de cicatrização ocorre em três fases: inflamação,
proliferativa, formação do tecido de granulação com deposição de matriz
extracelular e remodelamento. O reparo completo de tecidos resulta de
alternâncias sucessivas de reações anabólicas e catabólicas que têm os
leucócitos como uns de seus mais importantes protagonistas (14).
3.1.1 Fase inflamatória
A fase inflamatória se inicia imediatamente após a lesão, evocado por
ampla variedade de agentes nocivos (infecções, anticorpos ou lesões físicas).
Inicia-se o extravasamento sanguíneo que preenche a área lesada com plasma
23
e elementos celulares, principalmente plaquetas. A agregação plaquetária e a
coagulação sanguínea geram um tampão, rico em fibrina, que além de
restabelecer a hemostasia e formar uma barreira contra a invasão de
microrganismos, organiza matriz provisória necessária para a migração celular.
Com a lesão tecidual, há liberação local de histamina, serotonina e bradicinina
que causam vasodilatação e aumento de fluxo sanguíneo no local e sinais
inflamatórios como calor e rubor. A permeabilidade capilar aumenta causando
extravasamento de líquidos para o espaço extracelular, e consequente edema
e dor (15-17).
Após a saída das plaquetas de dentro do leito vascular, neutrófilos e
monócitos, em resposta aos agentes quimiotáticos, migram em direção ao leito
da ferida. Além da função de fagocitose de bactérias, fragmentos celulares e
corpos estranhos, essas células inflamatórias produzem fatores de
crescimento, que preparam a ferida para a fase proliferativa, quando
fibroblastos e células endoteliais também serão recrutados (15).
A liberação dos fatores provenientes das plaquetas, como fibronectina
ou colágeno, contribuem também para a ativação dos monócitos,
transformando-os em macrófagos que são as principais células envolvidas no
controle do processo de reparo (15).
Os macrófagos migram para a ferida após 48 - 96 h da lesão, e são as
principais células antes dos fibroblastos migrarem e iniciarem a replicação.
Têm papel fundamental no término do desbridamento iniciado pelos neutrófilos
e sua maior contribuição é a secreção de citocinas e fatores de crescimento,
além de contribuírem na angiogênese, fibroplasia e síntese de matriz
extracelular, fundamentais para a transição para a fase proliferativa (18).
O uso de um anti-inflamatório é de grande importância para uma boa
cicatrização da ferida, para reduzir o risco de infecção e futuras complicações.
Também há relatos que mediadores inflamatórios como a histamina e a
prostaglandina E2 podem estar relacionados com a inibição da síntese de
colágeno e proliferação de fibroblastos, componentes de alta importância para
cicatrização (12, 19).
Um estudo realizado por Takayama, et al. (20) comparou o efeito anti-
inflamatório de patches contendo diclofenaco de sódio, felbinac (anti-
inflamatório não esteroidal disponível no exterior) e indometacina. Foram
24
utilizados ratos Wistar macho divididos em 5 grupos de 10 animais cada, Grupo
1: controle sem fixação de patch, grupo 2: patch com 1% de diclofenaco de
sódio, grupo 3: patch com 3,5% de felbinac (anti-inflamatório não esteroidal
disponível somente no exterior), grupo 4: patch com 0,5% de felbinac e grupo
5: patch com 3,75% de indometacina. Cada grupo recebeu um patch que foi
fixado na pata direita traseira e após 2 h foi removido. Para induzir a
inflamação, foi injetado carragenina subcutânea na mesma pata que foi fixada
os patches, e o volume da pata foi medido para quantificar a inflamação. Os
resultados demonstraram que o patch de diclofenaco de sódio foi o mais efetivo
em reduzir a inflamação.
Meyer, et al. (21) observaram a eficácia da atividade anti-inflamatória de
patches de Álcool Polivinílico (PVA) e ácido poliacrílico contendo 0,2% de
extrato de Magnolia officinalis e 0,4% de extrato de Glycyrrhiza inflata. A
avaliação In vitro foi determinada através de um derivado de cultura
equivalente a pele viva denominada EpiDerm®. A EpiDerm® foi irradiada por
Ultravioleta durante 11 minutos e logo em seguida tratada com os patches.
Foram coletados 300 µl de amostra da cultura em 24 e 48 h para quantificação
de Prostaglandina E2, IL-6 e TNF-α por ELISA. Após 24 h houve uma redução
de Prostaglandina E2 de aproximadamente 86% pelo extrato de Magnolia
officinalis e 61% pelo extrato de Glycyrrhiza inflata, demonstrando-se um
potente inibidor pró-inflamatório.
O estudo destes autores comprovam a eficácia e o benefício do uso de
dispositivos de liberação transdérmica com extratos vegetais. Alguns efeitos
colaterais como ulceração, náusea e vômito são reportados em pacientes que
administram drogas anti-inflamatórias não esteroides oralmente. O uso de
patches ou filmes tópicos minimizam os efeitos colaterais e ainda evita o efeito
de primeira passagem e mantem uma liberação controlada da droga (22).
Comparados com pomadas e cremes, os filmes apresentam maior flexibilidade
de dosagem e facilidade de uso, menor potencial de irritação e maior facilidade
de fabricação. (23).
25
3.1.2 Fase proliferativa
A fase proliferativa é composta de três eventos importantes que
sucedem o período de maior atividade da fase inflamatória: neo-angiogênese,
fibroplasia e epitelização (16).
A neo-angiogênese é o processo de formação de novos vasos
sanguíneos a partir de vasos preexistentes, necessário para manter o ambiente
de cicatrização da ferida. Os novos vasos participam da formação do tecido de
granulação provisório e os mesmos suprem de nutrientes e de oxigênio o
tecido em crescimento (15, 16).
Na fibroplasia, as células mesenquimais normalmente quiescentes e
esparsas no tecido normal, são transformadas em fibroblastos e atraídas para
o local inflamatório, onde se dividem e produzem os componentes da matriz
extracelular. A função primordial dos fibroblastos é sintetizar colágeno, ainda
na fase celular da inflamação. O colágeno é o material responsável pela
sustentação e pela força tênsil da cicatriz, produzido e degradado
continuamente pelos fibroblastos. Inicialmente, a síntese de colágeno novo é a
principal responsável pela força da cicatriz, sendo substituída ao longo de
semanas, pela formação de ligações cruzadas entre os feixes de colágeno
(16).
A epitelização ocorre nas primeiras 24 a 36 h após a lesão, fatores de
crescimento epidérmicos estimulam a proliferação de células do epitélio. Na
pele os queratinócitos são capazes de sintetizar diversas citocinas que
estimulam a cicatrização das feridas cutâneas (16).
3.1.3 Remodelamento
A característica mais importante desta fase é a deposição de colágeno
de maneira organizada, por isso é a mais importante clinicamente. O colágeno
produzido inicialmente é mais fino do que o colágeno presente na pele normal,
e tem orientação paralela à pele. Com o tempo, o colágeno inicial (colágeno
tipo III) é reabsorvido e um colágeno mais espesso é produzido e organizado
ao longo das linhas de tensão (18). Há um equilíbrio de produção e destruição
das fibras de colágeno neste período, por ação da colagenase. O desequilíbrio
26
desta relação favorece o aparecimento de cicatrizes hipertróficas e queloides.
A fase de maturação dura toda a vida da ferida, embora o aumento da força
tênsil se estabilize, após um ano, em 70 a 80% da pele intacta (16).
3.1.4 Nocicepção
A lesão na pele resulta em uma sequência de sinalizações e eventos
moleculares que promovem ou impedem a cicatrização de feridas. Uma dessas
sinalizações é a dor, que pode interferir de várias maneiras na cicatrização de
feridas (11, 12).
Quando a informação da dor chega ao sistema nervoso central,
definindo o local, natureza e intensidade, são liberados mediadores
inflamatórios. A fase inflamatória envolve a migração de neutrófilos,
macrófagos e linfócitos, produzindo sintomas da inflamação durante duas
semanas. Se a inflamação persistir, a ferida se torna crônica e pode estar
associada a várias alterações patológicas (11, 24).
A nocicepção é o processo de percepção de estímulos nocivos diversos
(térmicos, mecânicos ou químicos), que são detectados por uma subpopulação
de fibras nervosas periféricas, chamadas nociceptores. A liberação constante
de mediadores inflamatórios pelo tecido lesado pode abaixar o limiar de
excitação dos nociceptores, o que resulta em dor e em estímulos que
normalmente não são dolorosos, esse processo é muito comum em pacientes
com queimaduras (11, 17).
Anestésicos tópicos ainda são muito utilizados no alívio da dor. Estes
ligam-se de maneira reversível a um local receptor específico nos poros dos
canais de Na+ (sódio) nos nervos e bloqueiam o movimento iônico através
desses poros, podendo agir em qualquer parte do sistema nervoso e em todos
os tipos de fibra bloqueando os potenciais de ação responsáveis pela
condução nervosa (17).
As moléculas de anestésico local consistem em uma parte aromática
unida por uma ligação éster ou amida a uma cadeia lateral básica. A presença
da ligação éster ou amida é importante em razão da sua suscetibilidade à
hidrólise metabólica. Os compostos que possuem amidas, assim como o
espilantol, são mais estáveis, e em geral apresentam meia-vida plasmática
27
mais longa comparada com compostos, por exemplo, que possuem ligação
química cuja função seja um éster (19).
Os anestésicos tópicos mais utilizados são a benzocaína, lidocaína,
prilocaína e suas associações. O EMLA® (Eutectic Mixture of Local Anesthetics)
é o anestésico tópico mais utilizado clinicamente para aliviar a dor da punção
venosa e biópsia, sendo composto por uma mistura eutética de 2,5% de
lidocaína e 2,5% de prilocaína. Uma mistura eutética apresenta um ponto de
fusão inferior ao ponto de fusão dos seus componentes, melhorando sua
absorção pela pele (26).
Em um estudo realizado por Berlit, et al. (27) envolvendo 121 mulheres
que passaram por cirurgia de laparoscopia ginecológica, 61 mulheres do grupo
controle receberam um patch placebo e nas outras 60 mulheres foi aplicado na
incisão patches com EMLA® logo após a cirurgia. Todos os patches dos dois
grupos foram retirados na manhã seguinte. A avaliação da dor foi feita através
de um questionário respondido pelas pacientes, com informações sobre a
descrição e intensidade da dor. Os resultados demonstraram que o EMLA® não
foi capaz de reduzir a dor depois da cirurgia de laparoscopia.
Agarwal, et al. (28) verificaram o alívio da dor entre EMLA® e diclofenaco
durante a punção venosa. Foram escolhidos 450 adultos que passariam por
procedimento endo-urológico, divididos em três grupos, cada com 150
pacientes. O grupo 1 recebeu um patch placebo, o grupo 2 foi tratado com
EMLA® e o grupo 3 com diclofenaco. A dor foi avaliada por uma escala visual
de escores de 0 a 10 (0 = sem dor e 10 = pior dor possível). Ao final do estudo
foi observado que a aplicação de EMLA® e diclofenaco, reduziram igualmente a
dor da punção venosa, porém a aplicação do EMLA® está associada com
branqueamento da pele no local, como resultado de vasoconstrição localizada
e a aplicação de diclofenaco diminuiu o edema e eritema quando comparado
com os dois outros grupos.
3.2 Estudos fitoquímico, farmacológico e toxicidade da Achyrocline
satureoides Lam. (D.C.)
A Achyrocline satureoides Lam. (D.C.) (Figura 2) é uma planta da família
Asteraceae, que compreende aproximadamente de 1500 gêneros, com 23.000
28
espécies. Conhecida popularmente como macela, marcela-do-campo, macela-
amarela, macela-miuda, macelinha ou marcela, suas inflorescências secas são
utilizadas em muitas regiões para o preenchimento de travesseiros e
acolchoados e também é tradicionalmente usada na medicina popular em
infusão ou decocto como digestivo, anti-inflamatório, antibacteriano,
antiespasmódico, antidiabético, antiasmático, antipirético, antiparasitário e
repelente. A macela é comum na América e algumas partes da África (29-31).
Figura 2 – Inflorescências de macela. Fonte: Retta (29).
Estudos realizados por Demo et al. (33) demonstraram que 10 µl do óleo
essencial de macela inibiu o crescimento dos micro-organismos Bacillus
cereus, Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus, Enterococcus faecalis e
Proteus mirabilis, comprovando sua atividade antibacteriana (32). Outro estudo
do mesmo gênero constatou que o óleo essencial de macela inibiu o
crescimento da bactéria Paenibacillus larvae.
Baldissera, et al. (34) comprovaram a ação hepatoprotetora do óleo
essencial de macela livre e nanoencapsulado. Ratos Wistar fêmeas foram
infectados com Trypanosoma evansi, os ratos sem tratamento apresentaram
inflamação generalizada e necrose hepática, os ratos tratados por via oral com
1,5 mL/Kg de óleo essencial livre e microencapsulado, não apresentaram
necrose hepática e a inflamação foi diminuída.
O mesmo grupo de estudos constatou que esses dois tratamentos
evitaram o aumento de leucócitos, linfócitos e monócitos totais, demonstrando
a atividade anti-inflamatória do óleo essencial. E também reduziram o nível de
29
glicose, possibilitando o decréscimo do número de Tripanosomas na corrente
sanguínea, mas não a eliminação do parasita (35).
Os compostos presentes no óleo essencial já foram identificados como
α-pineno e os isômeros β-cariofileno e α-cariofileno (ou α-humuleno), sendo os
dois últimos os compostos majoritários presentes no óleo essencial de plantas
do Brasil (29).
O α-humuleno (Figura 3) é um sesquiterpeno com ação anti-inflamatória
comprovada por Fernandes, et al., (36) onde foi capaz de suprimir o edema de
pata induzido por carragenina na dose de 50 mg/Kg por via oral em
camundongos. Foi testada também a atividade antialérgica pela sensibilização
de camundongos por ovoalbumina, o α-humuleno foi capaz de reduzir o
edema de pata em dose de 50 mg/Kg por via oral.
Figura 3 – Estrutura química do α-humuleno. Fonte: Biblioteca Nist.
A toxicidade do extrato aquoso de macela estudada por Sabini, et al.
(37) determinou a dose letal 50% (DL50), dose letal para 50% dos animais,
camundongos Balb/c machos e fêmeas. Foram aplicadas por via intraperitoneal
as doses de 50, 100, 250, 500 e 700 mg/Kg, nas doses entre 50 e 250 mg/Kg/
os animais não obtiveram mudança de comportamento, já nas doses de 500 e
700 mg/Kg houve 50 e 83,33% de mortalidade, com sintomas de fraqueza e
hipotermia.
Em teste de toxicidade aguda em camundongos, Rivera, et al. (38)
administraram uma dose única de extrato aquoso em doses de 30, 60, 90, 180
e 300 mg/kg oral e intraperitoneal. Por via oral não houve nenhum sinal de
30
toxicidade, mas por via intraperitoneal nas doses de 180 e 300 mg/kg, 33 e
66% dos animais apresentaram uma branda coceira, respectivamente.
Em ensaio de dose máxima tolerável, os ratos receberam uma dose
crescente de 1, 3 até 5 g/Kg de extrato aquoso de macela, em um intervalo de
2 h. Não foram observados sinais de toxicidade. Após 14 dias de tratamento,
não houve alteração de peso do fígado, rim, esôfago, estômago, duodeno e
intestino grosso. A dose utilizada foi muito maior que a dose da infusão
administrada no uso popular (39).
Fachinetto, et al. (30) verificaram atividade antiproliferativa e citotóxica
desta espécie através do ciclo celular de Allium cepa. Foram testadas 2
concentrações de infusão de macela, 5 mg/mL (dose utilizada no preparo de
chá medicinal) e 20 mg/mL. Os resultados obtidos neste trabalho
demonstraram que os extratos aquosos de marcela inibiram significativamente
a divisão celular, em ambas as concentrações estudadas.
O uso da macela é aparentemente seguro pela sua utilização
generalizada desde os tempos antigos, tendo em conta que nunca foi
associada à toxicidade ou comprometeu a saúde dos usuários, devido a esses
resultados a macela foi adicionada como droga oficial no Formulário de
Fitoterápicos da Farmacopeia Brasileira 1º edição (29).
Além de ser usado como fitoterápico, os extratos de macela são
utilizados em diversas formulações cosméticas devido a sua ação antioxidante
e clareadora, como em shampoo, condicionador, creme de tratamento para
cabelos, protetor solar, sabonetes, clareadores de cabelo e aromatizadores de
ambiente (31). Os produtos com macela não estão restritos ao Brasil, há
produtos fabricados por indústria italiana, a Bottega Verde®. Alguns desses
produtos podem ser vistos na imagem a seguir na Figura 4.
31
Figura 4 – (A) Protetor solar com extrato de macela, Bottega Verde® (Itália); (B)
Sabonete em barra com extrato de macela, EcoH® (Brasil); (C) Shampoo,
condicionador e creme de tratamento com extrato de macela, Lowell® (Brasil). Fonte: Site das empresas Bottega Verde, EcoH e Lowell.
3.3 Estudos fitoquímico, farmacológico e toxicidade da Acmella oleracea
(L.) R.K. Jansen
A Acmella oleracea (L.) R.K. Jansen (Figura 5) com sinonímia Spilanthes
acmella L. Murray, assim como a macela, pertence a família Asteraceae é
comumente conhecida como jambu, agrião-bravo, agrião-do-Pará, jambu-assú,
agrião-do-norte, botão-de-ouro, agrião-do-Brasil, erva-maluca, jaburama e
jambuaçú. É uma erva típica da região norte do Brasil, mas também se
encontra amplamente distribuída nos trópicos e sub-trópicos, especialmente na
Índia, Venezuela, África, Indonésia e Malásia (39, 40).
Na medicina popular o jambu é consumido na comida ou chá para dor
de dente, feridas na boca, pela sua ação anestésica, analgésico, antipirético,
anti-inflamatório, antioxidante, anti-hipertensivo, antifúngico, antimalárico,
diurético e vasorelaxante (41).
32
Figura 5 – Flores de jambu Fonte: http://webdrm.cpqba.unicamp.br/cpma/fotos/544.jpg
Estudos realizados por Chakraborty, et al. (42) demonstraram que o
extrato aquoso de Acmella oleracea em doses de 100, 200 e 400 mg/kg, por
via oral em ratos, suprimiu o edema da pata induzida por carragenina,
comprovando a atividade anti-inflamatória do extrato. Nos modelos de remoção
de cauda (Tail Flick) e de contorção abdominal induzido por ácido acético, o
extrato aquoso produziu um efeito analgésico significativo.
Outro estudo feito por Chakraborty, et al., (43) foi avaliada a atividade
anestésica local em Cavia porcellus. Os animais foram tricotomizados em
quatro lugares diferentes do seu dorso, onde foram aplicadas injeções
subcutâneas de lidocaína 2%(controle positivo), solução salina 0,9% (controle
negativo) e extrato aquoso de jambu nas concentrações de 10 e 20%. Para
medir o grau de anestesia, foram dadas picadas de alfinete a cada 5 minutos
por meia hora. A contração localizada da pele, acompanhada de grunhido, foi
considerado como a resposta normal e quando o animal não conseguiu
responder, quer por espasmos do músculo ou grunhido após uma picada de
alfinete, uma resposta negativa foi registrada. Os extratos de jambu obtiveram
um efeito anestésico de 70,4% e 87,0% nas concentrações de 10 e 20%,
respectivamente.
Nomura, et al. (31) comprovaram a atividade antinociceptiva do extrato
etanólico em doses de 10, 30 e 100 mg/Kg por via intraperitoneal em
camundongos no teste de antinocicepção induzido por formalina, todas as
doses reduziram a fase inflamatória de nocicepção. Em indução com
cinamaldeído e capsaicina, nas doses 30 e 100 mg/Kg intraperitoneal em
33
camundongos, reduziu o tempo de nocicepção de capsaicina em 65% (dose
de 30 mg/Kg) e em 69% (dose de 100 mg/Kg), e 50% (dose de 30 mg/Kg) e
70% (dose de 100 mg/Kg) em indução por cinamaldeído. O mesmo grupo de
pesquisa também estudou a hiperalgesia por calor induzida por capsaicina, na
dose de 100 mg/Kg via intraperitoneal. O extrato se mostrou capaz de bloquear
totalmente a hiperalgesia.
O extrato etanólico de jambu teve sua ação diurética comprovada por
Yadav, et al., a dose de 500 mg/Kg foi administrada por via oral em ratos, após
5 h foi coletado o volume total de urina e avaliada a perda de eletrólitos. A ação
do extrato etanólico de jambu se demonstrou similar à ação do diurético
furosemida, esclarecendo o possível uso popular como anti-hipertensivo (44).
Soares, et al. (45) relataram a atividade antitumoral do extrato etanólico
de jambu nas doses 250, 500 e 1000 µg/mL adicionados em cultura de células
tumorais. A dose de 250 µg/mL não obteve efeito significativo após 48 h de
incubação, mas as doses de 500 e 1000 µg/mL obtiveram uma redução
significante no número de células, indicando uma resposta dose-dependente.
Com os resultados foi possível calcular a IC50, concentração do extrato que
induz 50% de lise ou morte celular, de 513 µg/mL e 24 h.
A ação imunomodulatória foi estudada por Savadi, et al. (46) com extrato
etanólico de Jambu na dose de 500 mg/Kg por via oral em camundongos.
Macrófagos do peritônio foram isolados nos dias 5, 10 e 15 após o tratamento
com extrato de jambu, os resultados demonstraram um aumento significativo
na contagem de macrófagos e o número máximo foi encontrado no 15º dia.
Essas atividades são atribuídas aos compostos bioativos, cumarinas
(escopoletina), triterpenóides, óleos essenciais (limoneno e β-cariofileno)
aminoácidos, fitoesteróis, compostos fenólicos (ácido vanílico, ácido trans-
ferúlico e ácido trans-isoferúlico) e N-alquilamidas. Um dos compostos
responsáveis pelas atividades farmacológicas é o espilantol, cujo sinônimo é
afinina (Figura 6), a alquilamida mais abundante no extrato de Jambu (45, 47-
49).
34
Figura 6 – Estrutura química do espilantol. Fonte: Biblioteca Nist
Wu, et al. (50) isolou espilantol presente no extrato de jambu, sua
pesquisa demonstrou que o espilantol suprimiu significativamente a produção
de NO (óxido nítrico) e a produção de citocinas inflamatórias IL-1β, IL-6 e TNF-
α, sem citotoxicidade significativa. Também inibiu a expressão da COX2 (Ciclo-
oxigenase-2), reduzindo a progressão da resposta inflamatória. O espilantol
também foi capaz de aumentar a liberação do ácido gama-aminobutírico
(GABA) no cérebro de camundongos. Esses resultados sugerem um possível
mecanismo de ação do espilantol como analgésico e anti-inflamatório (51).
A toxicidade do extrato etanólico de jambu foi estudada por Nomura et
al. (41) nas concentrações de 5, 50, 500 e 5000 mg/Kg por via intraperitoneal
em camundongos. As doses de 5, 50, 500 mg/Kg não demonstraram nenhum
sinal ou sintoma de toxicidade ou morte, já a dose de 5000 mg/Kg causou
alterações respiratórias e convulsão.
Chackraborty, et al. (42) e Sharma, et al. (52), também não observaram
qualquer efeito colateral, mudança de comportamento ou mortalidade em 3000
mg/kg de extrato aquoso e 2000 mg/Kg de extrato etanólico administrado por
via oral em ratos.
Assim como a macela, o jambu também é utilizado na composição de
cosméticos antirrugas que pode substituir a toxina botulínica, pois não
necessitam de aplicação de injeção. Os produtos com extrato de jambu não se
limitam ao Brasil, são comercializados no mundo todo como, por exemplo, a
empresa Francesa Gattefosse® que depositou uma patente de um antirrugas
contendo espilantol (53). Alguns produtos contendo extrato de jambu estão
ilustrados na Figura 7.
35
Figura 7 – Cremes antirrugas contendo extrato de jambu; (A) Anesi®
(Espanha); (B) Burt’s Bees® (Estados Unidos da América); (C) Natura® (Brasil). Fonte: Site das empresas Anesi®, Burt’s Bees® e Natura®.
4. JUSTIFICATIVA
O desenvolvimento de uma formulação com ação anestésica e anti-
inflamatória é de grande importância para a cicatrização de feridas. O jambu e
a macela já tem comprovação de várias atividades farmacológicas, mas não há
nenhum estudo em literatura sobre a atividade cicatrizante de ambas, sendo
assim plantas medicinais promissoras para a realização deste estudo.
5. MATERIAL E MÉTODOS
5.1 Material
Todos os reagentes e solventes utilizados foram de grau analítico,
hidroxietilcelulose, quitosana, padrão de α-humuleno pureza 96% (Sigma
Aldrich, Missouri, Estados Unidos), padrão de espilantol 88,5% de pureza
(Chromadex, Califórnia, Estados Unidos) glicerina, álcool polivinílico (Vetec
Química Fina, Rio de Janeiro, Brasil), carvão ativo (Carbomafra, Curitiba,
Brasil), terra diatomácea, ácido acético glacial, Tween 80, etanol, hexano,
36
acetato de etila e metanol (Synth, São Paulo, Brasil), Transcutol® (Etoxidiglicol,
Gattefossé, Lyon, França) mistura eutética de 2,5% lidocaína e 2,5% prilocaína
(EMLA® creme, AstraZeneca, São Paulo, Brasil) e alantoína (Fagron, Hong
Kong, China).
5.1.1 Material vegetal
Os materiais vegetais foram semeados e cultivados no campo
experimental do Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e
Agrícolas (CPQBA)/UNICAMP, localizado no município de Paulínia, SP. As
exsicatas destas espécies estão depositadas no herbarium do
CPQBA/UNICAMP, número 1349 (jambu) e números 10, 146, 783, 793, 784 e
785 (macela), cujos códigos desta última representam diferentes genótipos.
Esse projeto foi autorizado pelo Conselho de Gestão do Patrimônio Genético,
protocolo 010232/2014-1.
5.2 Métodos
5.2.1 Produção de extrato etanólico de jambu e tratamento com carvão
ativo
As partes aéreas do jambu foram secas em estufa com ventilação
forçada por 48 h a 40 ºC até massa constante e posteriormente moída em
moinho de facas. O extrato etanólico de jambu foi produzido por maceração
dinâmica em 3 extrações de 1 hora e 30 minutos cada empregando-se a
proporção planta : solvente etanol 96º GL (1:5, m/v) (44). As três frações foram
reunidas e filtradas sob vácuo em funil de Büchner com papel de filtro. O
extrato bruto foi tratado com carvão ativo de acordo com técnica descrita por
Freitas (54). Neste tratamento, o extrato bruto foi pesado em um balão de
fundo redondo e a partir dessa massa foram acrescentados 4% de carvão
ativo, proporção esta maximizada anteriormente. A mistura extrato bruto e
carvão ativo foi tratada em banho aquecido a 40 °C com agitação constante
durante uma hora. O extrato foi filtrado com terra diatomácea (Celite®), o
37
carvão retido foi lavado com 100 mL etanol e extrato foi concentrado em
rotaevaporador (modelo R-215, Büchi) sob vácuo a 40 °C e em seguida
liofilizado (liofilizador modelo Sentry, VirTis, Pensilvânia, Estados Unidos) até
massa constante. Depois de liofilizado o extrato seco foi pesado e armazenado
em freezer.
5.2.2 Produção do óleo essencial de macela
O óleo essencial foi obtido a partir de inflorescências frescas em
aparelho tipo Clevenger por hidrodestilação, realizada pelo período de 2 h. O
óleo foi separado da água em um funil de separação, seguido do uso de sulfato
de sódio anidro P.A. para eliminar traços residuais de água. O óleo foi
armazenado em freezer até seu uso (55).
5.2.3 Produção dos filmes
Em todas as formulações foi adicionado extrato de jambu tratado com
carvão ativo, óleo essencial de macela e os adjuvantes Tween 80®, Glicerina e
Transcutol® em diferentes concentrações. Todos os géis obtidos foram
depositados em placas de Nylon, 40 g por placa e secas em estufa por 24 h à
40 ºC.
5.2.3.1 Produção do filme de Quitosana
O gel foi preparado a partir da dissolução de 1g de quitosana em 100 mL
solução ácida diluída (ácido acético glacial, 1%) e agitada até completa
homogeneização com o auxílio de Ultra Turrax®.
5.2.3.2 Produção do filme de Álcool Polivinílico
A solução a 3% de PVA foi preparada, sob aquecimento, a 100ºC e
agitação constante durante 48 h. A mistura foi resfriada até temperatura
ambiente e filtrada em funil de Büchner.
38
5.2.3.3 Produção do filme de hidroxietilcelulose
Foi preparada uma solução aquosa de 2,5% de hidroxietilcelulose, sob
aquecimento, a 55°C ± 2°C e agitação constante até a solução formar um gel
translúcido. A mistura ficou em repouso até atingir temperatura ambiente.
5.2.4 Propriedades físicas dos filmes
Após secos, os filmes foram retirados das placas e cortados com um
furador de 17 milímetros de diâmetro (Figura 8), tamanho compatível com os
testes propostos. Os filmes foram pesados em balança analítica (Mettler
Toledo, São Paulo, Brasil) e sua espessura foi medida com paquímetro digital
(modelo Cal II, Tesa, Renens, Suíça) em cinco pontos diferentes, foi calculada
a média e o desvio padrão das medidas.
Figura 8 - Furador de 17 mm de diâmetro utilizado para cortar os filmes.
5.2.5 Determinação das propriedades mecânicas dos filmes
As propriedades mecânicas dos filmes foram avaliadas usando um
analisador de texturas Stable Micro Systems (modelo TA-TX Enhanced,
Godalming, Reino Unido) equipado com célula de carga de 5 Kg. O filme livre
de bolhas de ar ou imperfeições físicas foi recortado com área de 6 cm2 (2x6
cm). Para avaliar a perfuração, relaxação e resiliência, foi utilizado um
dispositivo composto de um corpo de prova esférico com 0,25 mm de diâmetro.
O filme foi colocado entre duas placas perfuradas, as quais foram firmemente
fixadas à plataforma do equipamento. Durante a medida, a amostra foi
39
tensionada á uma taxa de 2 mm/s para uma distância de 5 cm, antes de
retornar ao ponto de partida. Todas as medidas foram feitas em triplicata (56).
5.2.6 Monitoramento do espilantol e α-humuleno por Cromatografia
Gasosa acoplada a detector de massas (CG-EM)
O monitoramento do espilantol foi realizado inicialmente pela
comparação do fragmentograma do composto de interesse com os
fragmentogramas disponíveis no banco de dados do National Institute of
Standard Technology (NIST®) do software de análise MSD ChemStation da
Agilent® com concordância mínima de 90%, como descrito por Freitas (54) e
posteriormente frente a um padrão comercial pelo método do padrão externo.
O método utilizado para monitoramento dos compostos espilantol e α-
humuleno foi proposto por Freitas, utilizando um cromatógrafo gasoso acoplado
a detector de massas (CG-EM, Hewlett Packard 5890, série II, detector seletivo
de massas Hewlett Packard 5970 EI 70 eV) equipado com coluna de sílica
fundida WCOT, HP5-MS, marca Agilent de dimensões 30 m x 0,25 mm DI, 0,25
μm de espessura de fase estacionária. As condições de análise empregada
foram: temperatura de injeção: 220°C, temperatura do detector: 250°C,
programa de temperatura: 60-240°C, (3°C/min), com divisor de amostra na
razão 1:40, gás de arraste He 0,7 bar, 1 mL/min. O extrato e óleo essencial, 15
mg, foram dissolvidos em 1 mL de metanol e mantidos em freezer -18ºC até o
momento da análise (54). A identificação e quantificação do composto α-
humuleno foi feita pelo método de padrão externo, com a utilização de padrão
analítico comercial.
5.2.7 Monitoramento do espilantol por Cromatografia Líquida de Alta
Eficiência (CLAE)
As análises foram realizadas em sistema Alliance LC-DAD Waters
composto por bomba quaternária 2695, detector de arranjo de diodos 2996 e
software Empower®.
A separação cromatográfica ocorreu em uma coluna Luna CN 250 x 4,6
mm com partículas de 5 µm (30 ºC), utilizando como fase móvel uma mistura
40
de água e acetonitrila 70:30 (v/v) numa vazão de 1,0 mL/min. A quantificação
do espilantol foi feita a 254 nm mediante a construção de numa curva de
calibração na faixa de 6 a 600 µg/mL. Volume de injeção de 20,0 µL.
5.2.8 Construção da Curva Analítica a partir dos padrões comercias de
Espilantol e α-humuleno
Para a construção da curva analítica do espilantol, pesou-se 6,08mg do
padrão analítico em um balão volumétrico de 10,0 mL e solubilizou-se em
Metanol grau cromatográfico, obtendo uma solução estoque de 608 µg/mL. As
diluições foram realizadas com pipeta volumétrica em balões volumétricos
obtendo concentrações de 304; 152; 121,6; 60,8; 12,16 e 6,08 µg/mL.
Para o α-humuleno pesou-se 10,02 mg do padrão analítico em um balão
volumétrico de 25,0mL e solubilizou-se em metanol grau cromatográfico,
obtendo uma solução estoque de 400,8 µg/mL. As diluições foram feitas da
mesma forma que o a do espilantol, obtendo concentrações de 200,4; 100,2;
80,16; 40,08; 8,016 e 4,0 µg/mL.
A curva analítica do espilantol foi construída por CLAE e a do α-
humuleno por CG-EM, métodos mais adequados para os respectivos
compostos.
O limite de detecção e quantificação foram determinados após a
realização de três curvas analíticas com soluções de espilantol e α-humuleno
nas faixas de concentração descrita acima (54).
O limite de detecção e de quantificação foram calculados de acordo com
as equações a seguir.
Equação 1 : LD = (DPa x 3)/ IC
Onde: LD é o limite de detecção estimado, DPa é o desvio padrão da
intersecção com o eixo y das três curvas de calibração e IC é a inclinação da
curva de calibração.
Equação 2: LQ = (DPa x 10)/ IC
41
Onde: LQ é o limite de quantificação estimado, DPa é o desvio padrão
da intersecção com o eixo y das três curvas de calibração e IC é a inclinação
da curva de calibração.
5.2.9 Avaliação do teor de espilantol e α-humuleno nos filmes
A avaliação foi feita pelo método descrito por Freitas (54) no qual os
filmes foram pesados em balança analítica e adicionou-se metanol na
proporção de 1,0% m/m, a mistura foi levada ao ultrassom por 10 min.
Alíquotas de 1,0 mL foram retiradas e o teor de espilantol e α-humuleno foram
determinados por CLAE e CG-EM descritos nos itens 5.2.7 e 5.2.6
respectivamente.
5.2.10 Ensaio de permeação in vitro a partir de epitélio de orelha de porco
As orelhas de porco foram adquiridas de um abatedouro certificado
(Abatedouro Angelelli Ltda, Piracicaba-SP) logo após o sacrifício dos animais, e
foram transportadas em tampão fosfato (pH 7,4). Com o auxílio de um bisturi,
foi feito um corte ao longo da orelha e posteriormente a pele foi descolada da
cartilagem subjacente (57). A pele foi dermatomizada na espessura de 500 µm
pelo dermatômetro marca Nouvag® modelo TCM 300 e o excesso de pelo
removido com o auxílio de uma máquina de barbear (Figura 9).
(A) (B)
42
Figura 9 – (A) Pele de porco sendo dermatomizada; (B) dermatômetro.
O experimento de permeação com os filmes propostos através do
epitélio de orelha de porco foi realizado em uma célula de difusão vertical do
tipo Franz com área de permeação de 0,6 cm2 e volume de aproximadamente
4,5 mL. O epitélio foi posicionado com o lado conjuntivo sobre compartimento
receptor e com o estrato córneo voltado para o compartimento doador. O filme
foi colocado em contato com o estrato córneo do epitélio em condição de dose
finita, como ilustrado na Figura 10 (A) (58). O sistema câmara doadora, filme,
epitélio e câmara receptora foram afixados com o auxílio de uma garra de
metal. A câmara receptora foi preenchida com uma solução de tampão fosfato
70% e metanol 30%, este foi testado previamente para melhor permeação na
pele (Figura 10 B) (59). O experimento foi realizado com repetições em
sextuplicata.
(A) (B)
Figura 10 - Célula de difusão vertical do tipo Franz; (A) Filme em contato com o
estrato córneo do epitélio de orelha de porco; (B) Célula de Franz montada.
Os ensaios de permeação foram realizados durante um período de 24 h,
à temperatura controlada de 32 ºC, e sob agitação constante. Foram retiradas
alíquotas de 300 μL da câmara receptora durante as 8 primeiras h, as 12 h e as
24 h, o mesmo volume de solução tampão e metanol foi reposto na câmara
receptora (60). As amostras foram analisadas por cromatografia gasosa
acoplada a um detector de Massas (CG-EM) por método desenvolvido em
nosso grupo de pesquisa.
43
5.2.10.1 Teste de retenção dos ativos no estrato córneo (Tape Stripping)
Tape Stripping é uma técnica utilizada para remover a última camada da
pele, o estrato córneo. Ao final do ensaio de permeação, as células foram
desmontadas e cuidadosamente a pele foi retirada, lavada com água destilada
para remover o excesso de formulação e seca com papel toalha. A pele foi
fixada em uma superfície de isopor com auxílio de alfinetes (Figura 11),
deixando a parte permeada livre. Pedaços de fita (Scotch® Magic tape 3M)
foram usados para cobrir a área permeada. A primeira fita foi aplicada sobre a
pele e removida e em seguida descartada para evitar comprometer a análise, já
que é sabido que há um excesso de formulação retida na pele. As outras 15
fitas anexadas a pele foram extraídas em um tubo tipo Falcon contendo 5 mL
de metanol e mantido à 4°C por 24 h. Após 24 h a solução foi filtrada com filtro
0,45 µm (GE Healthcare®, Estados Unidos) e analisada em CG-EM (61).
Figura 11 - Peles fixadas em superfície de isopor com auxílio de alfinetes.
5.2.10.2 Teste de retenção dos ativos na epiderme/derme
Logo após o Tape Stripping, a pele foi cortada com uma tesoura em
volta da área delimitada pela difusão, esta foi cortada em pequenos pedaços
para aumentar a área de superfície de contato. Os pedaços foram colocados
em tubo tipo Falcon contendo 5 mL de metanol e mantido à 4°C por 24 h. Após
24 h a solução foi filtrada com filtro Millex® Milipore, 45 µm e analisada em CG-
EM (61).
5.2.11 Ensaios farmacológicos
44
5.2.11.1 Animais
Os animais foram obtidos do CEMIB-UNICAMP (Centro de Bioterismo,-
UNICAMP, Campinas, Brasil), estes foram mantidos sob um ambiente de clima
controlado 22±3 °C em ciclos claro-escuro de 12 h, com água e ração marca
Nuvlab.
Os ensaios in vivo foram aprovados pela Comissão de Ética no uso de
Animais da Unicamp sob número de protocolo 3342-1, conforme anexo.
5.2.11.2 Avaliação da atividade cicatrizante em ratos
O experimento foi desenvolvido de acordo com a metodologia descrita
por Jorge (62). Foram utilizados neste experimento ratos Wistar machos (250 a
300 g), divididos em seis grupos, de quatro animais cada, denominados grupo
1 – Solução salina 0,9% (0,5 mL/animal, controle negativo), grupo 2 – alantoína
(100 mg/animal, controle positivo), grupo 3 - filme com 10% de extrato de
jambu e 1% de óleo essencial de macela (FI), grupo 4 - filme com 15% de
extrato de jambu e 1,5% de óleo essencial de macela (FII) e grupo 5 – Filme
placebo (veículo), sem adição de extrato ou óleo essencial (FIII). Após a
anestesia por tiopental, o dorso dos animais foi tricotomizado e esterilizado
com Etanol 70%. Úlceras cutâneas medindo em média 1,0 cm2 foram
excisionadas e tratadas topicamente durante 10 dias com aplicações diárias
dos filmes e ocluídas com bandagem de gaze não aderente (Cicatrisan®,
Sanfarma) e Micropore Nexcare®, 3M) para garantir que o filme permanecesse
no local de aplicação. Para maior controle, foi mantido um animal por gaiola. As
úlceras cutâneas foram analisadas diariamente por meio de fotos e através
destas foi calculada a porcentagem de redução da área inicial da lesão, por
meio do programa ImageJ®.
5.2.11.2.1 Estudos histopatológicos
Ao final do experimento os animais foram sacrificados por
aprofundamento de anestesia (Tiopental) e foram retiradas amostras de pele
(epiderme, derme e hipoderme) do mesmo local de tratamento. Estas foram
45
retiradas de 4 grupos, alantoína, FI, FII e FIII, colocadas em solução de
formalina a 10% e coradas por Tricrômio de Masson e Hematoxilina/Eosina. As
lâminas coradas foram analisadas por microscopia óptica.
5.2.11.3 Determinação da atividade antinociceptiva em camundongos
A determinação da atividade antinociceptiva foi realizada pelo modelo de
remoção da cauda (Tail Flick) conforme descrito por Freitas (54).
Camundongos Swiss machos (25 a 40g, n=7/grupo) foram contidos em cilindro
de acrílico mantendo a porção distal da cauda (10 cm) livre e em contato com
um foco de luz a 55 °C, demonstrado na Figura 12. O tempo necessário para
remoção da cauda (latência) foi considerado como resposta aversiva ao calor.
O valor basal de cada animal foi anotado antes do início do experimento e
somente os que atingiram valor basal de até 4 s foram considerados para o
experimento. Para evitar lesões térmicas, foi estabelecido o tempo máximo de
10 s para contato com a fonte de calor (cut-off). Os animais foram divididos em
4 grupos: grupo 1- filme FI, grupo 2 – filme FII, grupo 3 – filme FIIIl e grupo 4 -
EMLA® (mistura eutética de prilocaína 2,5% e lidocaína 2,5%) 150 mg/animal
(controle positivo). O filme foi aplicado a 2 cm da base da cauda do animal por
5 min, após sua remoção, a cauda foi exposta ao foco de luz na mesma região
onde o filme foi aplicado e o teste foi iniciado após sua remoção. As outras
medidas foram feitas a cada 15 min até cada animal atingir o seu valor basal de
estímulo. A analgesia foi definida como um aumento no tempo necessário para
remoção da cauda, pelo menos 50% maior que o valor de linha basal
observado.
46
Figura 12 - Determinação da atividade antinociceptiva pelo modelo de Tail
Flick.
5.2.12 Análise estatística
Todos os resultados foram submetidos a análise de variância de uma
única via (ANOVA) e Tukey, considerando-se como nível crítico p<0,05 para
que seja considerada diferença significante entre os grupos controle e tratados,
as análises foram feitas com o pacote estatístico GraphPad Prism®, (GraphPad
Software, Inc.).
6. RESULTADOS
6.1 Rendimento do extrato de jambu tratado com carvão ativo
O rendimento médio do extrato seco de jambu tratado com carvão ativo
(4%) foi de 3,7% ± 0,5. O extrato de jambu após tratamento com carvão ativo
(4%) foi avaliado através de Cromatografia em camada delgada, sendo
comparado com o padrão analítico de espilantol e o extrato bruto de jambu de
partida. A fase móvel empregada foi n-hexano:acetato de etila 70:30 (v/v), e o
resultado do CCD encontra-se ilustrado na Figura 13.
(A) (B)
47
Figura 13 – Cromatografia em camada delgada do extrato de jambu tratado
com carvão ativo a 4% (JC) em comparação ao extrato bruto de jambu (JB) e
padrão de espilantol (Pd), com destaque para a região contendo o espilantol.
(A) Revelação em 254 nm em câmara ultravioleta; (B) Revelação em p-
anisaldeído.
6.2 Rendimento na produção do óleo essencial de macela
O óleo essencial de macela apresentou um rendimento abaixo dos
valores descritos em literatura, que foi de 0,04%. Assim como o jambu, o óleo
essencial de macela foi avaliado através de Cromatografia em camada delgada
em comparação ao padrão de α-humuleno em fase móvel n-hexano:acetato de
etila 70:30 (v/v) (Figura 14).
Figura 14 – Cromatografia em camada delgada do óleo essencial de macela
(OM) em comparação ao padrão de α-humuleno (H), com destaque para a
região contendo o α-humuleno. Revelação em p-anisaldeído.
6.3 Produção dos filmes
6.3.1 Filme com Quitosana
48
Todas as formulações obtidas foram feitas pelo método casting. A
formulação inicialmente desenvolvida com Quitosana apresentou-se
heterogênea, com ondulações e reduziu de tamanho após 24 h em estufa. A
concentração dos componentes empregados no filme foi variada, mas os
resultados foram os mesmos apresentados para todos os testes, desta forma, a
sequência dos estudos baseada na formulação contendo Quitosana foi
abandonada.
Figura 15 - Ilustração do filme obtido com quitosana e extrato de jambu
associado a óleo essencial de macela, demonstrando que após sua secagem
houve um encolhimento da matriz.
6.3.2 Filme com Álcool Polivinílico
A formulação de filme obtida com o uso do PVA (3%) permaneceu úmida
e viscosa após as 24 h em estufa; visto isso a placa retornou para a estufa por
mais 24 h. Apesar do filme permanecer 48h em estufa, ainda manteve uma
umidade residual e por essa razão esta formulação foi descartada dos estudo
sequenciais.
49
Figura 16 - Formulação de PVA com extrato de jambu e óleo essencial de
macela, o filme permaneceu úmido após 48 h em estufa.
6.3.3 Filme com hidroxietilcelulose
A formulação de HEC permaneceu homogênea, secou após as 24 h em
estufa e apresentou um bom aspecto visual, por essas razões esta formulação
foi escolhida para dar continuidade ao estudo, como se pode observar na
Figura 17.
Figura 17 - Formulação de hidroxietilcelulose com extrato de jambu e óleo
essencial de macela.
6.4 Propriedades físicas dos filmes
Após o corte dos filmes com o furador, os mesmos se apresentaram
homogêneos e íntegros, com um aspecto brilhante como ilustrado na Figura
18.
50
Figura 18 - Filmes cortados em 17 mm de diâmetro; FI - filme com 10,0% de
extrato de jambu e 1,0% óleo essencial de macela, FII – 15,0% de extrato de
jambu e 1,5% de óleo essencial de macela e FIII - filme placebo (sem adição
de extrato e óleo essencial).
As medidas de espessura (mm) e massa (g) dos filmes, estão
apresentadas na Tabela 1, com suas médias e desvios padrões.
Tabela 1- Espessura (mm ± DP) e massa (g ± DP) dos filmes FI, FII e FIII
(n=10).
Filmes Espessura (mm) Massa (g)
FI 0,9292 ± 0,12 0,2509 ± 0,01
FII 0,9308 ± 0,08 0,2506 ± 0,01
FIII 0,7166 ± 0,12 0,1791 ± 0,04
6.5 Determinação das propriedades mecânicas dos filmes
Os resultados obtidos da determinação da resistência mecânica dos
filmes à perfuração, relaxação e resiliência, bem como o tempo de resistência a
cada medida de força em função do tempo estão representados pela área sob
a curva (ASC), e encontram-se dispostos na Tabela 2.
Tabela 2 - Resistência mecânica (g ± DP) dos filmes à perfuração, relaxação e
resiliência e tempo de resistência (s ± DP) em função da força (g) aplicada
(ASC), n=3.
Perfuração Relaxação Resiliência
Filmes
Força (g) ASC (g/s) Força (g) ASC (g/s) Força (g) ASC (g/s)
F I 53,2 ± 1,6 286,7 ± 8,4 15,1 ± 1,1 40,3 ± 2,1 10,2 ± 5,3 29,8 ± 14,2 F II 41,3 ± 8,6 393,2 ± 118,5 23,9 ± 3,5 55,2 ± 7,5 21,5 ± 5,6 50,8 ± 11,2 F III 2887,2± 254,3 11376,0±936,0 101,8 ± 3,6 136,7 ± 28,0 77,6 ± 21,2 116,0 ± 19,1
51
6.6 Monitoramento do espilantol e α-humuleno por CG-EM
Os cromatogramas dos padrões analíticos de espilantol e α-humuleno
estão ilustrados nas Figuras 19 e 21, respectivamente, e os extratos de jambu
tratado com carvão ativo e óleo essencial de macela, ilustrados nas Figuras 20
e 22, respectivamente.
Figura 19 – Cromatograma por CG-EM do padrão analítico comercial do
espilantol.
5 .0 0 1 0 .0 0 1 5 .0 0 2 0 .0 0 2 5 .0 0 3 0 .0 0 3 5 .0 0 4 0 .0 0 4 5 .0 0 5 0 .0 0 5 5 .0 0
1 0 0 0 0 0
2 0 0 0 0 0
3 0 0 0 0 0
4 0 0 0 0 0
5 0 0 0 0 0
6 0 0 0 0 0
7 0 0 0 0 0
8 0 0 0 0 0
T ime -->
A b u n d a n c e
T IC : P d -J1 .D \ d a ta .ms
5 .0 0 1 0 .0 0 1 5 .0 0 2 0 .0 0 2 5 .0 0 3 0 .0 0 3 5 .0 0 4 0 .0 0 4 5 .0 0 5 0 .0 0 5 5 .0 0
1 0 0 0 0 0
2 0 0 0 0 0
3 0 0 0 0 0
4 0 0 0 0 0
5 0 0 0 0 0
6 0 0 0 0 0
7 0 0 0 0 0
8 0 0 0 0 0
9 0 0 0 0 0
T im e -->
A b u n d a n c e
T IC : J1 4 0 5 -1 .D \ d a ta .m s
Abundância
Abundância
Tempo (Min)
Tempo (Min)
52
Figura 20 – Cromatograma por CG-EM do extrato etanólico de jambu tratado
com carvão ativo (4%), com destaque para o pico do espilantol.
Figura 21 – Cromatograma por CG-EM do padrão analítico comercial do α-
humuleno.
Figura 22 – Cromatograma por CG-EM do óleo essencial de macela, com
destaque para o pico de α-humuleno.
5 .0 0 1 0 .0 0 1 5 .0 0 2 0 .0 0 2 5 .0 0 3 0 .0 0 3 5 .0 0 4 0 .0 0 4 5 .0 0 5 0 .0 0 5 5 .0 00
5 0 0 0
1 0 0 0 0
1 5 0 0 0
2 0 0 0 0
2 5 0 0 0
3 0 0 0 0
3 5 0 0 0
4 0 0 0 0
4 5 0 0 0
5 0 0 0 0
5 5 0 0 0
6 0 0 0 0
T im e -->
A b u n d a n c e
T IC : P d -M 4 .D \ d a ta .m s
5 . 0 0 1 0 . 0 0 1 5 . 0 0 2 0 . 0 0 2 5 . 0 0 3 0 . 0 0 3 5 . 0 0 4 0 . 0 0 4 5 . 0 0 5 0 . 0 0 5 5 . 0 00
5 0 0 0 0 0
1 0 0 0 0 0 0
1 5 0 0 0 0 0
2 0 0 0 0 0 0
2 5 0 0 0 0 0
3 0 0 0 0 0 0
3 5 0 0 0 0 0
4 0 0 0 0 0 0
T im e -->
A b u n d a n c e
T I C : O M -4 . D \ d a t a . m s
Abundância
Abundância
Tempo (Min)
Tempo (Min)
53
6.7 Monitoramento do espilantol por CLAE
Os cromatogramas do padrão analítico comercial de espilantol e extrato
de jambu tratado com carvão ativo, obtidos por CLAE, estão apresentados nas
Figuras 23 e 24, respectivamente.
Figura 23 – Cromatograma por CLAE do padrão analítico comercial do
espilantol.
Figura 24 – Cromatograma por CLAE do extrato etanólico de jambu tratado
com carvão ativo (4%), com destaque ao pico de espilantol.
Tempo (Min)
Tempo (Min)
54
6.8 Construção da Curva Analítica com padrões analíticos comercias de
Espilantol e α-humuleno
As curvas analíticas construídas para a quantificação do espilantol e do
α-humuleno, estão ilustradas nas Figuras 25 e 26.
Figura 25 – Curva analítica construída a partir do padrão analítico comercial de
espilantol.
Figura 26 – Curva analítica construída a partir do padrão analítico comercial de
α-humuleno.
y = 69204x - 241328R² = 0,9997
0
5000000
10000000
15000000
20000000
25000000
30000000
35000000
40000000
45000000
0 100 200 300 400 500 600 700
Áre
a
[] μg/mL
y = 12519x - 28464R² = 0,9996
0
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
0 20 40 60 80 100 120
Áre
a
[] μg/mL
55
O limite de detecção e quantificação foram calculados através das
equações 1 e 2 apresentadas anteriormente. O limite de detecção é 0,26 μg/mL
para o espilantol e 0,04 μg/mL para o α-humuleno e o limite de quantificação
0,86 μg/mL para o espilantol e 0,31 μg/mL para o α-humuleno.
6.9 Quantificação do espilantol e α-humuleno nos filmes
Foi feita a quantificação dos compostos espilantol e α-humuleno nos
filmes de HEC, empregando-se o método do padrão externo. A partir das
curvas analíticas de cada composto, foram calculados os teores de espilantol e
α-humuleno nos filmes, usando-se a equação de regressão linear. Os valores
dispostos na Tabela 3 foram corrigidos pela pureza dos padrões de espilantol
(88,5%) e α-humuleno (96%) declarados pelo fabricante.
Tabela 3 – Teor de espilantol e α-humuleno em mg/g (± DP) de filme.
Filmes Espilantol (mg/g) α-humuleno
FI 1,1 ± 0,15 2,8 ± 0,5
FII 2,3 ± 0,65 3,9 ± 0,2
6.10 Ensaio de permeação in vitro a partir de epitélio de orelha de porco
As alíquotas coletadas (8 primeiras h, 12 e 14 h) foram analisadas em
CG-EM e em nenhuma delas foi detectado os componentes espilantol ou α-
humuleno. Assim, foram realizados os testes de Tape Stripping e de retenção
doas ativos na derme e epiderme.
6.10.1 Teste de retenção dos ativos no estrato córneo (Tape Stripping) e
epiderme/derme
O teste de Tape Stripping demonstrou que o α-humuleno e o espilantol
permearam na epiderme/derme. A Figura 27 ilustra um cromatograma oriundo
da análise por CG-EM das extrações dos ativos da epiderme/derme.
56
Figura 27 – Cromatograma da análise por CG-EM das extrações dos ativos da
epiderme/derme. (1) α-humuleno; (2) espilantol.
6.11 Ensaios farmacológicos
6.11.1 Avaliação da atividade cicatrizante em ratos
O filme FII obteve a maior porcentagem de contração da ferida, que foi
de 62,4% (± 12,1), com significância estatística entre ele e a solução salina,
enquanto que o filme FI obteve uma porcentagem de contração de ferida de
56,7% (± 10,2). As três formulações foram mais eficazes que o controle positivo
alantoína, que foi de 44,8% (± 12,2), e inclusive o filme placebo que apresentou
contração de 47,2% (± 6,5). O tratamento com solução salina, como esperado,
apresentou a menor porcentagem de contração que foi de 41,0% (± 4,3), dados
estes apresentados na Figura 28.
Abundância
Tempo
57
0
20
40
60
80SalinaAlantoínaFIFIIFIII
*
Tratamentos
% d
e C
on
tração
de f
eri
da
Figura 28 – Porcentagem de contração de ferida em ratos, tratados com
solução salina, alantoína, filmes FI - filme com 10,0% de extrato de jambu e
1,0% óleo essencial de macela, FII – 15,0% de extrato de jambu e 1,5% de
óleo essencial de macela e FIII - filme placebo (sem adição de extrato e óleo
essencial). *p<0,05, diferente da solução salina, análise One-way ANOVA
seguido de Tukey.
Após 10 dias de tratamento com solução salina, os animais estavam
irritados, apresentando vermelhidão, exsudato e pus nas feridas. Por outro
lado, os animais tratados com a alantoína e também aqueles tratados com as
formulações de HEC e os ativos, assim como o filme controle, apresentaram
um comportamento mais dócil e também se constatou a formação de tecido de
granulação sem pus (Figura 29).
Figura 29 - (A) tratamento com solução salina, presença de pus e sangue; (B)
tratamento com filme FII, presença de crosta sem exsudato.
58
6.11.1.1 Estudos histopatológicos
A análise histopatológica realizada por microscópio óptico (Leica DM
750, Illinois, Estados Unidos) acoplado a uma câmera digital (Leica ICC50HD,
Illinois, Estados Unidos) comprovou que o tratamento com o filme denominado
FI (Figuras 30 C e 31 E e F) e o filme FII (Figuras 30 D e 31 G e H)
apresentaram maior distribuição de fibras colágenas (C), coloração azul
arroxeado nas lâminas coradas por Tricrômio de Masson (TM) e rosa intensa
com Hematoxilina/Eosina (HE), em relação ao controle positivo (Figuras 30 A e
31 A e B) e o filme placebo (Figuras 30 B e 31 C e D), também apresentaram
grande quantidade de fibroblastos, sendo visível somente seu núcleo como
indicado pelas setas na Figura 31. Em relação ao espessamento da epiderme
(EP), o filme placebo apresentou o menor espessamento, enquanto que nos
demais tratamentos foi possível observar um maior espessamento da
epiderme.
Figura 30 - Cortes histológicos de pele de rato retirados da área da ferida e
corados com Tricrômio de Masson. As lâminas foram observadas por
59
microscopia óptica em 200 µm. (A) controle positivo, alantoína; (B) filme
placebo, filme FIII; (C) filme FI; (D) filme FII.
SC: estrato córneo, EP: epiderme, D: derme, C: colágeno, FP: folículo piloso.
60
Figura 31 – Cortes histológicos de pele de rato retirados da área da ferida e
corados com Hematoxilina/Eosina. As lâminas foram observadas por
microscopia óptica em dois aumentos diferentes, 90 e 40 µm. (A e B) controle
positivo, alantoína; (C e D) filme placebo, filme FIII; (E e F) filme FI; (G e H)
filme FII.
SC: estrato córneo, EP: epiderme, D: derme, C: colágeno, FP: folículo piloso e
a seta indica o núcleo do fibroblasto.
6.11.2 Determinação da atividade antinociceptiva em camundongos
Na Figura 32 é possível verificar o máximo efeito ocorrido em cada um
dos tratamentos, pela porcentagem de animais anestesiados, em função do
tempo em minutos. O filme denominado FI obteve uma porcentagem menor de
animais anestesiados em relação ao controle, porem apresentou maior tempo
de anestesia comparado com o filme FII e o controle EMLA®, ilustrado na
Figura 33. O filme placebo, como o esperado, não apresentou atividade
antinociceptiva (dados não apresentados).
5 15 30 45 60 75 90 105 120 135 0
50
100
FIFIIEMLA
Tempo (min)
% E
MP
Figura 32 - Porcentagem de animais anestesiados pelo tempo em minutos
(p>0,05). FI - filme com 10,0% de extrato de jambu e 1,0% óleo essencial de
macela, FII – 15,0% de extrato de jambu e 1,5% de óleo essencial de macela e
FIII - filme placebo (sem adição de extrato e óleo essencial). Não houve
diferença estatística significante.
61
0
50
100
150
* FIIFI
EMLA®
Tratamentos
Du
ração
da a
neste
sia
(m
in)
Figura 33 – Duração da anestesia em minutos por tratamento. FI - filme com
10,0% de extrato de jambu e 1,0% óleo essencial de macela e FII – 15,0% de
extrato de jambu e 1,5% de óleo essencial de macela. *p<0,05, diferente de FI,
análise One-way ANOVA seguido de teste de Tukey.
7. DISCUSSÃO
7.1 Produção de extrato etanólico de jambu e tratamento com carvão ativo
O carvão ativo é amplamente utilizado em processos industriais por sua
habilidade de absorver um grande número de substâncias, como componentes
orgânicos, metais pesados e substâncias coloridas, ser biocompatível e atóxico
(63). Na área fitoquímica, é utilizado para retirada de clorofila e outros
compostos coloridos que possam interferir em ensaios colorimétricos e também
no isolamento de alguns bioativos (64-67).
Estudo anterior realizado por Freitas (54) revelou que a remoção de
compostos coloridos no extrato etanólico bruto de jambu, em maior parte as
clorofilas, aumentou o teor de espilantol em relação ao extrato bruto original,
mesmo com a diminuição da massa do extrato, pois na somatória dos
constituintes totais houve eliminação de grande parte dos pigmentos e
consequentemente aumento da porcentagem de espilantol. O controle analítico
do composto espilantol, realizado com o etanol da lavagem do carvão ativo
62
retido na filtragem, revelou que houve um arraste deste composto sem afetar a
cor final, portanto, a lavagem do carvão ativo retido, com etanol, aumentou o
rendimento do espilantol no extrato seco. Não há outros relatos na literatura
sobre o rendimento do extrato de jambu tratado com carvão ativo.
7.2 Produção do óleo essencial de macela
A produção de óleo essencial de macela por hidrodestilação obteve um
rendimento abaixo da média descrita em literatura, de 0,4 a 0,2%. A
composição e o rendimento do óleo essencial podem mudar de acordo com o
período de colheita do material vegetal e fertilização do solo com elementos
como o fósforo e a qualidade do material empregado, variando muito de autor
para autor. A composição do óleo essencial também é afetada de acordo com
a região de cultivo/coleta; no Brasil e Uruguai os compostos mais abundantes
são o α-pineno e α-humuleno e na Argentina o β-cariofileno e α copaeno (29).
7.3 Produção dos filmes
Sistemas transdérmicos apresentam algumas vantagens em relação a
formas farmacêuticas convencionais por evitar o metabolismo hepático de
primeira passagem, melhorando a biodisponibilidade do fármaco e reduzindo a
frequência da dose (68).
Para melhorar as propriedades dos filmes e facilitar a solubilização do
extrato de jambu e óleo essencial, foram utilizados adjuvantes, pois os mesmos
são importantes na área farmacotécnica. A Glicerina foi empregada como
plastificante, o Tween® 80 foi utilizado como emulsificante e o Transcutol®
como solubilizante e facilitador da penetração dos ativos na pele (69-71).
O Transcutol® é um derivado de óxido de etileno muito utilizado em
produtos cosméticos e farmacêuticos de uso oral, tópico, transdérmico e
injetável. Ultimamente tem sido muito utilizado em formulações tópicas por ter
baixa toxicidade, solubilizar ativos que não são solúveis em solventes
orgânicos, como etanol e por facilitar a penetração de diferentes compostos
ativos pela pele e absorção local (71).
63
7.3.1 Produção do filme de Quitosana
A Quitosana é um polímero obtido pela reação de desacetilação parcial
da quitina oriunda do exoesqueleto de crustáceos; é amplamente usada em
sistemas de liberação controlada como géis, membranas e microesferas devido
as suas propriedades de formação de filme; por ser biodegradável, inócua,
biocompatível, ter atividade antimicrobiana e cicatrizante e por último, por
absorver exsudatos (70). Por esses motivos a quitosana é um polímero
adequado para ser utilizado no tratamento de feridas e queimaduras e foi eleita
uma das candidatas neste estudo.
O filme de quitosana obtido neste estudo permaneceu heterogêneo e
retraiu-se após 24 h de secagem em estufa. Leceta, et al. (72) observaram que
a resistência à tração do filme de quitosana diminuiu com o aumento da adição
de glicerina. A baixa resistência mecânica observada nos filmes obtidos com o
emprego da quitosana, somados ao emprego da glicerina, além do uso dos
extratos cujos compostos ativos estão presentes, pode ter resultado em uma
incompatibilidade e desestabilização da formulação.
7.3.2 Produção do filme de Álcool Polivinílico
O PVA é um polímero biodegradável, solúvel em água, com boas
propriedades mecânicas, resistência química, fácil preparo, tem propriedade
adesiva e propriedade formadora de filme (71). É muito utilizado em
membranas de diálise, curativo, pele artificial e administração transdérmica de
drogas (23).
A formulação contendo PVA não secou após 48 h em estufa, isso pode
ser devido a sua extrema sensibilidade à água e capacidade de inchamento por
hidratação, levando à instabilidade das suas propriedades físico-químicas (23).
7.3.3 Produção do filme de hidroxietilcelulose
64
A hidroxietilcelulose é um polímero não iônico obtido por expansão da
celulose em NaOH e tratamento com óxido de etileno; é abundante, renovável,
solúvel em água, biocompatível, possui baixa toxicidade, é capaz de
formar filmes e é muito utilizada em vários tipos de curativos por ter
propriedade hemostática (73-75).
O filme de hidroxietilcelulose, neste estudo, permaneceu homogêneo,
com boa aparência física, maleável e resistente, por esses motivos este filme
foi escolhido para seguir com os estudos.
7.4 Propriedades físicas dos filmes
As propriedades físicas e de homogeneidade dos filmes podem ser
observadas na Tabela 1 e Figura 18, respectivamente. As massas e
espessuras condizem com os filmes produzidos por Freitas (54) apesar de
quando comparamos os polímeros usados nos dois estudos, verifica-se que
foram utilizados polímeros diferentes (quitosana x hidroxietilcelulose), além do
fato que Freitas usou o dobro da massa depositada nas placas. Isto é
compreensível tendo em vista que a porcentagem de polímero empregada por
Freitas ter sido menor quando comparada a este estudo; desta forma houve
uma compensação, de maneira que as propriedades de espessura e massa se
equivalessem.
7.5 Determinação das propriedades mecânicas dos filmes
As propriedades mecânicas dos filmes estão relacionadas
principalmente com a capacidade dos polímeros para formar ligações em
cadeias, tornando a sua separação difícil quando sujeitos a forças mecânicas
(56). Os resultados obtidos, ilustrados na Tabela 2, demonstram que o filme
placebo foi mais resistente à perfuração, resiliência e relaxação, uma vez que
não houve adição de extrato de óleo e, consequentemente, o filme se tornou
mais rígido.
A formulação denominada FI resistiu a uma força maior, mas por um
tempo menor quando comparada com a formulação FII, este resultado pode
65
ser devido a quantidade maior de extrato e óleo essencial na formulação FII, de
modo que esta se tornou mais maleável, mas não tão resistente.
Assim, pode-se concluir que a presença de extrato de jambu e óleo
essencial de macela melhoraram suas características viscoelásticas de
deformação e relaxamento molecular. Quando comparado com outro estudo
com filmes feitos com álcool polivinílico (56), os filmes contendo extrato e óleo
essencial também foram mais maleáveis e mais fáceis de cobrir a ferida.
7.6 Monitoramento do espilantol e α-humuleno por CG-EM
A cromatografia gasosa é utilizada para a separação de compostos
voláteis, isto é, os analitos a serem separados devem apresentar uma razoável
pressão de vapor à temperatura de separação. Foi à primeira técnica a ser
acoplada com o espectrômetro de massas por causa da facilidade do manuseio
do efluente gasoso do cromatógrafo (76). É uma ferramenta muito útil na
identificação de compostos de origem vegetal graças à disponibilidade de
bibliotecas espectrais (73).
A análise do óleo essencial de macela e extrato de jambu por CG-EM já
foi realizada com sucesso por outros autores, portanto essa técnica foi
escolhida para realizar este estudo (34,40, 78). Em relação ao monitoramento
do espilantol, a técnica por CG-EM foi utilizada até a aquisição do padrão
analítico comercial, que é de alto custo.
A identificação do espilantol e α-humuleno foram feitas através da
comparação dos cromatogramas dos extratos e óleo essencial e padrões
analíticos comerciais (Figuras 19, 20, 21 e 22).
7.7 Monitoramento do espilantol por CLAE
A CLAE é uma técnica de separação que passou a ser um dos métodos
analíticos mais utilizados para fins qualitativos e quantitativos. As razões para
esse crescimento estão relacionadas à sua adaptabilidade para determinações
quantitativas com boa sensibilidade e a possibilidade de separar espécies não
voláteis e termicamente instáveis (79).
66
O monitoramento do espilantol por CLAE foi o mais adequado,
mostrando ser um método sensível, preciso e exato (40), outros autores já
utilizaram este método para a quantificação e isolamento do espilantol (52, 80,
81).
7.8 Ensaio de permeação in vitro a partir de epitélio de orelha de porco
A célula de Franz é muito utilizada para avaliar a permeabilidade de
compostos pela pele (82).
Estudos demonstraram que a pele de porco é um ótimo modelo animal
para a realização de ensaio de permeação, por ser similar à pele humana,
apresentando assim como esta, folículos capilares, vasos sanguíneos,
epiderme grossa, derme papilar e abundante tecido adiposo subcutâneo e
elástico (12).
Em um estudo de permeação em pele de orelha de porco feito por
Folzer, et al. (73) foram avaliados três tipos de formulações contendo
diclofenaco, patch, gel e também solução. Após 24 h a porcentagem de
diclofenaco permeado pelo patch (80,4%) foi quase o dobro em relação ao gel
(45,5%) e a solução (44%). O uso de excipientes que controlam a liberação do
ativo no patch, como por exemplo, solvente ou polímeros, resultam em uma
melhor e mais consistente liberação ao longo do tempo.
Ao final do ensaio de permeação, as alíquotas coletadas foram
analisadas por CG-EM para determinar e quantificar o espilantol e α-humuleno.
Em todos os tempos de coleta não foi identificada a presença destes
compostos.
Algumas substâncias podem ser impedidas de serem liberadas de uma
formulação devido à incompatibilidade ou à baixa solubilidade no líquido
receptor (84), mas isso não ocorreu com o espilantol e α-humuleno, pois em
testes prévios com membrana sintética de celulose esses ativos foram
detectados nas alíquotas retiradas do líquido receptor (dados não
apresentados). Desta maneira, por ter apresentando resultado negativo no
teste de permeação, foram realizados testes de retenção no estrato córneo e
epiderme/derme.
67
7.8.1 Teste de retenção no estrato córneo (Tape Stripping) e
epiderme/derme
As técnicas de retenção no estrato córneo e epiderme/derme são
amplamente utilizadas para estudar a cinética e a penetração de fármacos na
pele, permitindo determinar a localização e a distribuição de substâncias no
estrato córneo e epiderme/derme. O Tape Stripping foi proposto pelo FDA em
1998 como técnica investigativa utilizada tanto na pesquisa quanto em estudos
de biodisponibilidade tópica e bioequivalência (85, 86).
Foram aplicadas 16 fitas adesivas, sendo a primeira descartada por
conter excesso de formulação. Caron et al. (87) afirmam que as 10 primeiras
fitas representam 90% da concentração do fármaco presente no estrato córneo
e as 10 fitas subsequentes contribuem com menos de 5%, portanto 15 fitas
seriam o suficiente para a remoção completa ou grande parte do estrato
córneo.
Os compostos estudados foram retidos na mesma camada
epiderme/derme, como se pode observar na Figura 27. Este resultado é
desejável, pois o alvo de interesse é a pele.
7.9 Ensaios farmacológicos
7.9.1 Avaliação da atividade cicatrizante em ratos
A cicatrização cutânea é de grande interesse para a saúde pública pelo
fato de afetar um grande número de pacientes, reduz a qualidade de vida,
prolonga o tempo de internação e consequentemente gera mais despesas de
saúde. Além disso, as informações na literatura sobre o potencial de agentes
tópicos na cicatrização de feridas na pele é limitada. Baseado na medicina
popular, estudos demonstraram uma melhoria no processo de cicatrização com
o uso de produtos naturais, estes têm sido uma fonte importante de agentes
terapêuticos (88, 89).
68
Em feridas abertas há um grande risco indesejável de infecção, o uso de
antibióticos para prevenção e tratamento de infecções, tem diminuído
gradualmente sua eficácia pelo aumento da resistência bacteriana por essas
drogas (74).
Como descrito anteriormente, o uso de anti-inflamatório é de grande
importância para uma boa cicatrização, a inflamação excessiva reduz a
proliferação dos fibroblastos, síntese de matriz extracelular e angiogênese (89).
O espilantol e o α-humuleno já possuem comprovação desta atividade (36, 42),
mas ainda não foi estudada sua atividade cicatrizante. A Figura 28 ilustra a
porcentagem de contração da ferida em teste de cicatrização in vivo.
Um estudo comparativo realizado com pomada de extrato de Hibiscus
rosa demostrou que em 10 dias a ferida contraiu cerca de 75%, enquanto que o
controle positivo, pomada de nitrofurazona, contraiu em média apenas 45%
(90), o que demonstra que o emprego de plantas medicinais é uma ótima
alternativa medicamentosa. Outro estudo realizado com extrato etanólico e óleo
essencial de Murraya koenigii, uma planta utilizada na medicina asiática,
comprovou que a contração da ferida administrada com óleo essencial foi de
36%, a tratada com extrato etanólico foi de 67% e a pomada padrão utilizada
obteve 37% no décimo dia de tratamento (91). Estes estudos comprovam que
produtos de origem natural tem grande potencial terapêutico.
De acordo com os resultados obtidos podemos afirmar que os filmes
foram mais eficientes que o controle positivo alantoína, até mesmo o filme
placebo. Portanto foi utilizada uma solução salina como controle negativo já
que a HEC é muito utilizada em curativos e macroscopicamente obteve uma
maior porcentagem de contração de ferida.
7.9.1.1 Estudos histopatológicos
O processo de cicatrização envolve interações entre uma variedade de
tipos celulares, citocinas, fatores de crescimento e moléculas de matriz
extracelular (MEC) (89). Quando o tecido é lesado, os fibroblastos próximos se
proliferam, migram para a ferida e produzem grandes quantidades de matriz
rica em colágeno, que ajuda a isolar e a reparar o tecido lesado (92). Os
69
fibroblastos localizam-se em íntima associação com feixes de colágeno,
colocando-se paralelamente ao eixo da fibra (10).
O colágeno é uma proteína resistente, firme e muito abundante,
constituindo cerca de 20% de todas as proteínas do corpo (10), este tem uma
função bem estabelecida na cicatrização da ferida, é o principal componente
que reforça e suporta o tecido extracelular (88). As fibras colágenas podem ser
visualizadas nitidamente nas Figuras 30 e 31.
Em apenas 10 dias de tratamento, os tratamentos com os filmes FI e FII
foram benéficos para a regeneração e reorganização das estruturas da pele
quando comparados com o filme placebo e alantoína, isso se confirma pelo
arranjo regular das fibras colágenas e o espessamento da epiderme nas
Figuras 30 e 31. O estudo realizado por Nagappan (91) com extrato etanólico e
óleo essencial de Murraya koenigii, demonstrou que apenas no 14º dia foi
possível observar a presença de colágeno em análise histopatológica, isso
sugere que o extrato de jambu e o óleo essencial de macela auxiliam na
deposição de colágeno e diminuem o tempo do processo de cicatrização. Além
disso, não foi encontrada nenhuma evidência de dano no tecido, inflamação ou
fibrose, o que indica que as formulações tem um grande potencial cicatrizante.
7.9.2 Determinação da atividade antinociceptiva em camundongos
A determinação da atividade antinociceptiva do extrato de jambu no
modelo de Tail Flick já foi relatado por Chakraborty et al. (42) por administração
intraperitoneal. Freitas (54) também estudou a atividade antinociceptiva dos
filmes de quitosana contendo extrato de jambu, o filme que obteve o melhor
resultado foi o de 10% extrato de jambu tratado com 4% de carvão ativo,
superando a anestesia do EMLA®.
O anestésico tópico EMLA® foi escolhido como controle positivo por ser
o anestésico tópico mais utilizado clinicamente, além de ter uma duração média
de anestesia de 90 minutos após a aplicação (26). De acordo com os
resultados obtidos (Figura 28), o filme 15% de extrato de jambu tratado e 1,5%
de óleo volátil de macela superou a duração de anestesia do EMLA®, com
apenas 5 minutos de aplicação e oclusão, o que comprova uma rápida
70
absorção do composto de interesse (espilantol) presente na formulação. A
diferença de resultado obtido por Freitas pode ter ocorrido devido ao polímero
utilizado, a quitosana.
8. CONCLUSÃO
A produção do extrato etanólico de jambu por maceração dinâmica e seu
tratamento com carvão ativo foi empregada com sucesso, uma vez que o
espilantol permaneceu presente nos extratos, ou seja, não decompôs. A
técnica de hidrodestilação utilizada para a produção de óleo essencial de
macela também se mostrou eficaz por extrair efetivamente o α-humuleno.
Os filmes produzidos com HEC e os adjuvantes Glicerina, Tween®80 e
Trancutol® foram os que obtiveram melhor aspecto físico e compatibilidade
entre si.
Nas propriedades físicas e mecânicas os filmes demonstraram ser
homogêneos e maleáveis, facilitando sua aplicação na pele e sendo portanto
factíveis em procedimentos como curativos.
O monitoramento dos extratos, óleo essencial e filmes por CG-EM foi de
grande importância para comprovar a presença do espilantol e α-humuleno. A
quantificação por CLAE possibilitou mensurar o teor do espilantol nos filmes.
No ensaio de permeação in vitro o espilantol e o α-humuleno
permaneceram retidos nas camadas da pele. Este resultado foi desejável, já
que o alvo de interesse é a pele.
Nos estudos de atividade cicatrizante e antinociceptiva, a formulação de
maior concentração dos ativos, foi a que obteve o melhor resultado de redução
da ferida e síntese de colágeno e maior tempo de nocicepção quando
comparado ao produto comercial empregado.
71
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ANEXO
Aprovação do Comitê de Ética Animal.
