UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE …repositorio.unicamp.br/bitstream/REPOSIP/331055/1/Peres... · MURILO VIEIRA GERALDO 3. PROF A. DRA. GLAUCIA MARIA FERREIRA DA SILVA

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS

KARINA COLOMBERA PERES

ESTUDO DO PAPEL DE TGF-β1 NO CARCINOMA DIFERENCIADO DA TIREOIDE

CAMPINAS

2018


ESTUDO DO PAPEL DE TGF-β1 NO CARCINOMA DIFERENCIADO DA TIREOIDE

Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da

Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos

para a obtenção do título de Mestra em Ciências, área de concentração

em Clínica Médica.

ORIENTADOR: LAURA STERIAN

COORIENTADOR: NATASSIA ELENA BUFALO

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO

FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA

ALUNA KARINA COLOMBERA PERES, E ORIENTADO PELA

PROFA. DRA. LAURA STERIAN.

CAMPINAS

2018

Peres, Karina Colombera, 1992-

P415 Estudo do papel de TGF-β no carcinoma diferenciado da tireoide /

Karina Colombera Peres. – Campinas, SP : [s.n.], 2018.

Orientador: Laura Sterian Ward.

Coorientador: Natassia Elena Bufalo.

Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade

de Ciências Médicas.

1. Neoplasias da glândula tireoide. 2. Marcadores moleculares. 3. Fator de

crescimento transformador beta1. I. Ward, Laura Sterian, 1956-. II. Bufalo,

Natassia Elena, 1981-. III. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de

Ciências Médicas. IV. Título.

Agência(s) de fomento e nº(s) de processo(s): FAPESP, 2015/19117-0

Ficha catalográfica

Universidade Estadual de Campinas

Biblioteca da Faculdade de Ciências Médicas

Maristella Soares dos Santos - CRB 8/8402

Informações para Biblioteca Digital

Título em outro idioma: Study of TGF-β in the differentiated thyroid carcinoma

Palavras-chave em inglês: Thyroid gland neoplasms Molecular markers

Transforming growth factor beta1

Área de concentração: Clínica Médica

Titulação: Mestra em Ciências

Banca examinadora:

Laura Sterian Ward [Orientador]

Murilo Vieira Geraldo

Glaucia Maria Ferreira da Silva Mazeto

Data de defesa: 12-01-2018

Programa de Pós-Graduação: Clínica Médica

BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE MESTRADO


ORIENTADOR: LAURA STERIAN

COORIENTADOR: NATASSIA ELENA BUFALO

MEMBROS:

1. PROFA. DRA. LAURA STERIAN

2. PROF. DR. MURILO VIEIRA GERALDO

3. PROFA. DRA. GLAUCIA MARIA FERREIRA DA SILVA MAZETO

Programa de Pós-Graduação em Clínica Médica da Faculdade de Ciências Médicas

da Universidade Estadual de Campinas.

A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora

encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.

Data: 12/01/2018

Dedico esta dissertação à minha família: Ana Lucia, Nivaldo, Luís Fernando e Davi.

Obrigada por compartilharem comigo esta jornada.

AGRADECIMENTOS

À Deus e Nossa Senhora da Aparecida. Obrigada por guiarem meus passos e por todas

as graças alcançadas.

À minha orientadora, Dra. Laura, obrigada por ter me acolhido em sua família

científica. Sou grata por tudo o que me ensinou e me ensina. É um exemplo de mulher e

pesquisadora para todos nós do Gemoca.

À minha coorientadora, Dra. Natássia, não tenho palavras para agradecer a companhia,

o suporte, os puxões de orelha... Obrigada por sempre cuidar de mim e pela sua amizade!

À minha mãe, Ana Lucia, maior exemplo de vida e amor! Obrigada por ter me apoiado

em todas as minhas escolhas. Obrigada pelo colo, pelos abraços, pelos beijos, pelos

conselhos... Obrigada por ser minha mãe! Eu te amo além dessa vida.

Ao meu pai, Nivaldo, meu exemplo de caráter. Obrigada por cuidar tão bem de nossa

família, por não negar esforços para nos fazer feliz. Você é meu super herói. Eu te amo!

Aos meus irmãos, Luís Fernando e Davi, meus meninos! Obrigada por viverem

comigo essa jornada chamada vida. Estarei ao lado de vocês para sempre. Amo muito vocês!

À minha família em geral, em especial tia Fernanda, tio Junior, Débora, tia Solange e

tio Zé, pelo carinho que têm comigo e pela minha família. Amo vocês!

Às minhas companheiras e amigas do Gemoca e do corredor (rs), Ana Paula,

Elisângela, Helen, Jacqueline, Larissa, e Viviane, obrigada pelas risadas, pelo carinho, pelo

companheirismo... Levo vocês no meu coração para sempre!

Aos amigos que fiz no Gemoca e que hoje brilham em outros lugares, Ana Beatriz,

Angélica, Fernando, Laís, Mariana, Marjory, Murilo e Raquel, obrigada por essa amizade ter

se estendido além do laboratório. Sou grata por tudo o que aprendi com vocês dentro e fora do

Gemoca.

Aos amigos que a vida me presenteou, Beatriz, Caio, Carks, Castelluber, Eduardo,

Jaqueline, Lívia, Pamela, Ramon e Vinícius, obrigada pelo companheirismo de todos esses

anos, pelas risadas intermináveis, pela torcida. Amizade para o resto da vida! Amo vocês!

Aos colegas do Laboratório de Investigação em Patologia, Dr. José Vassalo, Carol e

Paulinho, obrigada pelas portas estarem sempre abertas para nós do Gemoca e pela ajuda nas

imunoistoquímicas.

À Dra. Icléia Barreto, patologista do Departamento de Anatomia Patológica do

HC/UNICAMP, que chegou e acrescentou tanto ao nosso grupo de pesquisa. Obrigada pela

ajuda na leitura das lâminas, obrigada por ensinar tanto!

Ao Dr. Valdemar Maximo, do Instituto de Patologia Molecular e Imunologia

(Ipatimup) da Universidade do Porto (Portugal), que em tão pouco tempo me ensinou tanto.

Obrigada pela ajuda na leitura com as lâminas e por todas as histórias sobre Portugal.

Saudades, professor!

Aos colegas vizinhos do Laboratório de Genética Molecular, Citogenética, Hepatites e

Zebrafish, obrigada pelas trocas de conhecimento e pelos socorros ao longo desses dois anos.

À comissão de Pós-Graduação em Clínica Médica, pelos serviços prestados ao longo

desses dois anos de mestrado e pelo auxílio financeiro para que esses dados pudessem ser

apresentados em congressos científicos.

Aos pacientes que doando um pouco de si contribuem infinitamente para a pesquisa e

avanço do nosso país.

À Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), pelo auxílio

financeiro (bolsa de mestrado, processo 2015/19117-0) fundamental para a realização desse

projeto.

RESUMO

Nódulos tireoidianos são frequentemente identificados na prática clínica, apresentando

significativo aumento nas últimas décadas. O diagnóstico do CDT através da análise

citológica pela PAAF, apesar de apresentar alta acurácia, possui deficiências: de 15-20% das

amostras submetidas à análise citológica são classificadas como insatisfatórias/não

diagnósticas ou lesões de significado indeterminado levando o paciente a uma tireoidectomia

para esclarecer o diagnóstico. O fator de transformação do crescimento-β (TGF-β) é uma

citocina multifuncional que atua em diferentes e importantes funções biológicas e na

regulação do sistema imune. Sua sinalização ocorre através de dois receptores

transmembrana: o receptor tipo I (TβRI) e o receptor tipo II (TβRII). Diversos estudos têm

reportado a perturbação ou perda da sinalização de TGF-β1 e seus receptores no câncer, assim

como polimorfismos nestes genes são frequentemente investigados e associados a diversas

patologias. O objetivo deste trabalho foi investigar a utilidade dos genes TGFB1, TGFBR1 e

TGFBR2 como marcadores de diagnóstico e/ou prognóstico em pacientes com nódulos

tireoidianos, buscando correlacionar os resultados com características clínico-patológicas.

Para investigação dos polimorfismos de TGFB1 (rs1800469, rs1800472, rs11466321,

rs2241716, rs8110090), TGFBR1 (rs10512263, rs7850895) e TGFBR2 (rs2228048) foram

avaliados 339 pacientes com nódulos malignos e benignos da tireoide pela técnica de Taqman

SNP Genotyping e 141 amostras de tecidos normais, malignos e benignos para expressão de

RNAm dos genes supracitados por PCR quantitativa. Os polimorfismos, rs1800469 e

rs1800472, do gene TGFB1 demonstraram correlação do genótipo alterado com

características de agressividade do tumor como ausência de cápsula e metástase linfonodal ao

diagnóstico, respectivamente. O polimorfismo rs10512263 do gene TGFBR1 demonstrou

associação do genótipo alterado com ausência de invasão. A expressão gênica de TGFB1 foi

maior em tecidos malignos, assim como TGFBR1, mas não TGFBR2. Em conclusão, nossos

dados demonstram que a expressão gênica de TGFB1 pode ser uma ferramenta útil para

auxiliar no diagnóstico de nódulos benignos da tireoide e polimorfismos do gene TGFB1 e de

seu receptor TGFBR1, mas não de TGFBR2, podem auxiliar no prognóstico de pacientes com

CDT.

Palavras-chave: Neoplasias da glândula tireoide, marcadores moleculares, fator de

crescimento transformador beta 1.

ABSTRACT

Thyroid nodules are often identified in clinical practice, presenting a higher increase in the

last decades. Despite the high accuracy, the diagnosis of DTC through FNAC analysis shows

deficiencies: 15-20% of samples submitted to cytological analysis are classified as

unsatisfactory/non-diagnostic samples or lesions of undetermined significance, leading the

patient to a thyroidectomy to clarify the diagnosis. The transforming growth factor-β (TGF-β)

is a multifunctional cytokine acting on different characteristics and biological functions and

on the regulation of the immune system. Its signaling occurs through two transmembrane

receptors: type I receptor (TβRI) and type II receptor (TβRII). Several studies have reported a

disturbance or loss of TGF-β1 signaling and its receptors in cancer, as well polymorphisms in

these genes are investigated and associated with several pathologies. The aim of this work is

to investigate the utility of TGFB1, TGFBR1 and TGFBR2 genes as diagnostic and/or

prognostic markers in patients with thyroid nodules, pursuing to correlate these results with

clinical-pathological characteristics. For investigation of TGFB1 (rs1800469, rs1800472,

rs11466321, rs2241716, rs8110090), TGFBR1 (rs10512263, rs7850895) and TGFBR2

polymorphisms (rs2228048) we investigated 339 patients with malignant and benign thyroid

nodules by Taqman SNP Genotyping technique and 141 normal, malignant and benign tissue

samples were evaluated for the mRNA expression of the same genes above by qPCR. Two

polymorphisms, rs1800469 and rs1800472, of the TGFB1 gene demonstrated a correlation of

the polymorphic genotype with tumor aggressiveness characteristics such as absence of

capsule and absence of lymph node metastasis at diagnosis, respectively. The rs10512263

polymorphism of the TGFBR1 gene demonstrated association of the polymorphic genotype

with absence of invasion. The gene expression of TGFB1 was increased in malignant tissues,

as well as TGFBR1, but not TGFBR2. In conclusion, our data demonstrate that TGFB1 gene

expression may be a useful tool to aid diagnosis of benign thyroid nodules and

polymorphisms of the TGFB1 and its TGFBR1 receptor, but not TGFBR2, may help in the

prognosis of DTC patients.

Key-words: thyroid neoplasms, molecular biology, transforming growth factor beta 1.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1. Taxas brutas de incidência, estimadas para 2016, das localizações primárias (exceto

pelo não melanoma), em mulheres, no Brasil ......................................................................... 23

Figura 2. Taxas brutas de incidência, estimadas para 2016, das localizações primárias (exceto

pelo não melanoma), em homens, no Brasil ............................................................................ 24

Figura 3. Representação da sinalização celular de TGF-β1 de maneira independente e

dependente das proteínas SMADs ........................................................................................... 28

Figura 4. Estrutura do gene TGFB1 e localização dos polimorfismos rs1800469, rs8110090,

rs11466321, rs2241716 e rs180072 analisados. Modificado de Cebinelli e colaboradores ....

................................................................................................................................................. 29

Figura 5. Estrutura do gene TGFBR1 e localização dos polimorfismos (rs10512263 e

rs7850890) analisados ............................................................................................................. 30

Figura 6. Estrutura do gene TGFBR2 e localização do polimorfismo (rs2228048) analisado

................................................................................................................................................. 30

Figura 7. Indivíduo homozigoto selvagem: amplificação apenas da sonda com alelo selvagem

................................................................................................................................................. 38

Figura 8. Indivíduo heterozigoto polimórfico: amplificação da sonda com alelo selvagem e

alelo polimórfico ..................................................................................................................... 38

Figura 9. Indivíduo homozigoto polimórfico: amplificação apenas da sonda com alelo

polimórfico .............................................................................................................................. 39

Figura 10. Estratificação dos indivíduos de acordo com a amplificação: o losango representa

indivíduos homozigotos selvagens, o triângulo indivíduos heterozigotos polimórficos e o

círculo indivíduos homozigotos polimórficos ......................................................................... 39

Figura 11. Distribuição genotípica do polimorfismo rs1800469 em nódulos tireoidianos

benignos e malignos ................................................................................................................ 43

Figura 12. Frequência genotípica do polimorfismo rs1800469 em nódulos tireoidianos com e

sem cápsula .............................................................................................................................. 44

Figura 13. Frequência genotípica do polimorfismo rs1800472 em nódulos tireoidianos


Figura 14. Frequência genotípica do polimorfismo rs1800472 em CPVF comparados a bócio,

mPT e CPC .............................................................................................................................. 48

Figura 15. Frequência genotípica do polimorfismo rs1800472 em nódulos tireoidianos com e

sem metástase ao diagnóstico .................................................................................................. 48









Figura 20. Frequência genotípica do polimorfismo rs10512263 em nódulos tireoidianos com

e sem invasão ........................................................................................................................... 59





Figura 23. Box plot com as médias de RNAm (UA) do gene TGFB1 em nódulos benignos e

malignos e tecido normal tireoidiano e valor de p (teste de Mann-Whitney) ......................... 66

Figura 24. Curva ROC apresentando pontos de especificidade e sensibilidade da expressão de

RNAm do gene TGFB1 em nódulos tireoidianos benignos e malignos .................................. 66

Figura 25. Box plot com as média de RNAm (UA) do gene TGFB1 entre os tipos

histológicos de nódulos tireoidianos........................................................................................ 67

Figura 26. Gráfico de correlação negativa entre tamanho de tumor e expressão de RNAm do

gene TGFB1 em tumores tireoidianos benignos e malignos: tumores menores em cm

expressam maiores quantidades de RNAm (correlação de Spearman) ................................... 68

Figura 27. Box plot com as médias de RNAm (UA) do gene TGFBR1 em nódulos benignos e


Figura 28. Curva ROC apresentando pontos de especificidade e sensibilidade da expressão de

RNAm do gene TGFBR1 em nódulos tireoidianos benignos e malignos ............................... 70

Figura 29. Box plot com as média de RNAm (UA) do gene TGFBR1 entre os tipos


Figura 30. Box plot com as média de RNAm (UA) do gene TGFBR2 em nódulos benignos e


Figura 31. Box plot com as média de RNAm (UA) do gene TGFBR2 entre os tipos


LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Sistema Bethesda para relatar interpretações de PAAF de tiroide: risco de

malignidade e conduta clínica recomendada (Adaptado de Ali SZ, Cibas ES) ...................... 25

Tabela 2. Comparação de valores de sensibilidade, especificidade, valor preditivo negativo

(VPN), VPP e custo final ao paciente de plataformas e sistemas disponíveis para auxiliar na

identificação de nódulos indeterminados ................................................................................ 27

Tabela 3. Características clínicas e anatomopatológicas dos 339 pacientes com nódulos

tireoidianos benignos e malignos avaliados para presença ou ausência de polimorfismos nos

genes TGFB1, TGFBR1 e TGFBR2. Os dados estão expressos em número absoluto e

porcentagem............................................................................................................................. 35

Tabela 4. Características clínicas e anatomopatológicas dos 127 pacientes com nódulos

tireoidianos benignos e malignos avaliados para expressão de RNAm dos genes TGFB1,

TGFBR1 e TGFBR2. Os dados estão expressos em número absoluto e porcentagem ............ 36

Tabela 5. Relação dos polimorfismos estudados dos genes TGFB1, TGFBR1 e TGFBR2 ...

................................................................................................................................................. 37

Tabela 6. Relação de ensaios para análise de expressão gênica dos genes TGFB1, TGFBR1 e

TGFBR2 ................................................................................................................................... 40

Tabela 7. Distribuição genotípica do polimorfismo rs1800469 em nódulos tireoidianos

benignos e malignos de acordo com o tipo histológico ........................................................... 43

Tabela 8. Valor de p (Teste exato de Fisher) para as comparações entre tipos histológicos de

nódulos tireoidianos para o polimorfismo rs1800469 ............................................................. 44

Tabela 9. Distribuição genotípica do polimorfismo rs1800469 de acordo com as

características clínicas e anatomopatológicas dos nódulos tireoidianos malignos analisados

................................................................................................................................................. 45


benignos e malignos e de acordo com o tipo histológico ........................................................ 47





................................................................................................................................................. 49




nódulos tireoidianos para o polimorfismo rs11466321 ........................................................... 51



................................................................................................................................................. 51


benignos e malignos e de acordo com o tipo histológico ........................................................ 53





................................................................................................................................................. 54



Tabela 20. Comparações entre tipos histológicos de nódulos tireoidianos para o polimorfismo

rs8110090 ................................................................................................................................ 56



................................................................................................................................................. 56




nódulos tireoidianos para o polimorfismo rs10512263 ........................................................... 58


características clínicas e anatomopatológicas dos nódulos tireoidianos malignos analisados.







................................................................................................................................................. 62



Tabela 29. Comparações entre tipos histológicos de nódulos tireoidianos para o polimorfismo

rs2228048 ................................................................................................................................ 64


características clínicas e anatomopatológicas dos nódulos tireoidianos analisados ................ 64

Tabela 31. Médias de expressão do RNAm do gene TGFB1 e características

anatomopatológicas exibidas pelos nódulos malignos avaliados ............................................ 68

Tabela 32. Médias de RNAm do gene TGFBR1 entre as características anatomopatológicas

exibidas pelos nódulos malignos avaliados. ............................................................................ 71

Tabela 33. Médias de RNAm do gene TGFBR2 entre as características anatomopatológicas

exibidas pelos nódulos avaliados ............................................................................................. 73

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

µL Microlitros

3’UTR Região 3’ não transcrita

A Adenina

AF Adenoma folicular

Akt Proteína quinase B

ATA do inglês, American Thyroid Association

AVC Acidente vascular cerebral

BM Bócio multinodular

BMT Bócio multinodular tóxico

BRAF do inglês, B-Raf proto-oncogene, serine/threonine kinase

BST2 do inglês, Bone marrow stromal antigen 2

C Citosina

CAT Carcinoma anaplásico da tireoide

cDNA DNA complementar

CDT Carcinoma diferenciado da tireoide

CFT Carcinoma folicular da tireoide

CMT Carcinoma medular da tireoide

co-SMAD do inglês, Commom-mediator SMAD

CPD Carcinoma pouco diferenciado

CPT Carcinoma papilífero da tireoide

CPVF Carcinoma papilífero de variante folicular

CT Câncer de tireoide

Ct do inglês, Threshold cycle

CTGF do inglês, Connective tissue growth factor

CXCL1 Quimiocina C-X-C motif ligand 1



DG Doença de Graves

DNA Ácido desoxirribonucleico

DP Desvio padrão

DPOC Doença pulmonar obstrutiva crônica

EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético

EMT Transição epitelial mesequimal

ERK Extracellular signal-regulated kinases

EUA Estados Unidos da América

FCM Faculdade de Ciências Médicas

G Guanina

GAPDH do inglês, Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

GEMOCA Laboratório de Genética Molecular do Câncer

HIF1A Fator de hipóxia induzido-1A

HRAS do inglês, HRAS proto-oncogene, GTPase

IC95% Intervalo de confiança de 95%

Ile Aminoácido isoleucina

IMC Índice de Massa Corporal

INCA Instituto Nacional do Câncer

KRAS do inglês, KRAS proto-oncogene, GTPase

LAP Peptídeo associado de latência

LIP Laboratório de Investigação em Patologia

LTBP Proteína de ligação latente do TGF-β

MAP do inglês, Mitogen-activated protein

MAPK do inglês, Mitogen-activated protein kinase

MEK do inglês, Mitogen-activated protein kinase kinase

MMP Metaloproteases de matriz

mPT Microcarcinoma papilífero da tireoide

n Número

NEM Neoplasia Endócrina Múltipla

ng Nanograma

NIFPT do inglês, Noninvasive Follicular Thyroid Neoplasm with Papillary-Like

Nuclear Features

NIS Transportador de sódio iodeto

NK Célula Natural Killer

NRAS do inglês, NRAS proto-oncogene, GTPase

OR do inglês, Odds Ratio

PAAF Punção aspirativa por agulha fina

PAX8 do inglês, Paired box 8

PBS do inglês, Phosphate-buffered saline

PCR Reação em cadeia da polimerase

PDGFB do inglês, Platelet derived growth factor subunit-β

PDM Porcentagem de densidade mamográfica

PI3K do inglês, Phosphoinositide 3-kinase

PPARγ do inglês, Peroxisome proliferator activated receptor-γ

RAF do inglês, erine/threonine kinase family

RET do inglês, Tyrosine-protein kinase receptor

RNA Ácido ribonucleico

RNAm Ácido ribonucleico mensageiro

ROC Curvas de Características de Operação do Receptor

R-SMAD do inglês, receptor-regulated SMAD

SAS do inglês, Statistical Analysis System

SNP do inglês, Single Nucleotide Polymorphism

T Timina

Tre Aminoácido treonina

Tg Tireoglobulina

TGFB1 Gene fator de transformação do crescimento-β1

TGFBR1 Gene do receptor tipo I do fator de transformação do crescimento-β1

TGFBR2 Gene do receptor tipo II do fator de transformação do crescimento-β1

TGF-β1 Proteína/citocina fator de transformação do crescimento-β1

TMA Tissue Micro Array

TNM Sistema TNM de Classificação dos Tumores Malignos

TPO Tiroperoxidase

TSH Hormônio tireoestimulante

TSH-R Receptor do hormônio tireoestimulante

TTF1 do inglês, Transcription termination factor 1

TβRI Proteína do receptor tipo I do fator de transformação do crescimento-β1

TβRII Proteína do receptor tipo II do fator de transformação do crescimento-β1

UA Unidade arbitrária

UNICAMP Universidade Estadual de Campinas

VEGF Fator de crescimento endotelial vascular

VPN Valor preditivo negativo

VPP Valor preditivo positivo

LISTA DE SÍMBOLOS

µ Micro

β Beta

™ do inglês, Trademark

® Marca registrada

γ Gama

± Mais ou menos

% Porcentagem

< Menor que

> Maior que

= Igual, igual a

+ Soma de

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................................22

2. OBJETIVOS ......................................................................................................................................33

2.1 Objetivo geral ...............................................................................................................................33

2.2 Objetivos específicos ....................................................................................................................33

2.2.1 Investigação de polimorfismos dos genes TGFB1, TGFBR1 e TGFBR2 ..............................33

2.2.2 Expressão de RNAm dos genes TGFB1, TGFBR1, e TGFBR2 .............................................33

3. METODOLOGIA ..............................................................................................................................34

3.1 Casuística .....................................................................................................................................34

3.2 Análise dos polimorfismos ...........................................................................................................36

3.3 Análise da expressão de RNAm ....................................................................................................40

3.3.1 Transcrição reversa ..............................................................................................................40

3.3.1 PCR-RT – Quantificação Relativa ........................................................................................40

3.4 Análise estatística .........................................................................................................................41

4. RESULTADOS ..................................................................................................................................42

4.1 Polimorfismos ..............................................................................................................................42

4.1.1 Gene TGFB1 .............................................................................................................................42

4.1.1.1 rs1800469 ...........................................................................................................................42

4.1.1.2 rs1800472 ...........................................................................................................................45

4.1.1.3 rs11466321 .........................................................................................................................49

4.1.1.4 rs2241716 ...........................................................................................................................52

4.1.1.5 rs8110090 ...........................................................................................................................54

4.1.2 Gene TGFBR1 ...........................................................................................................................57

4.1.2.1 rs10512263 .........................................................................................................................57

4.1.2.2 rs7850895 ...........................................................................................................................60

4.1.3 Gene TGFBR2 ...........................................................................................................................62

4.1.3.1 rs2228048 ...........................................................................................................................62

4.2 Expressão gênica .........................................................................................................................65

4.2.1 Expressão de TGFB1 ............................................................................................................65

4.2.2 Expressão de TGFBR1 ..........................................................................................................69

4.2.3 Expressão de TGFBR2 ..........................................................................................................71

5. DISCUSSÃO ......................................................................................................................................74

6. RESUMO DOS ACHADOS ..............................................................................................................82

7. CONCLUSÃO ...................................................................................................................................83

8. REFERÊNCIAS .................................................................................................................................84

22

1. INTRODUÇÃO

Nódulos tireoidianos são frequentemente identificados na prática clínica,

apresentando significante aumento de incidência nas últimas décadas, em grande parte

devido ao crescente uso de técnicas de diagnóstico por imagem (1, 2). Embora mais de

90% das lesões sejam pequenas, não palpáveis e benignas, não se tornando jamais

tumores clinicamente significativos, alguns pacientes apresentam lesões malignas, que

se beneficiariam do diagnóstico precoce (3-5). Nos Estados Unidos o câncer de tireoide

(CT) é o quinto mais comum em mulheres, com estimativa anual de 62 mil casos (6).

No Brasil, estimativas de 2016 do Instituto Nacional do Câncer (INCA) colocavam o

CT na 8ª posição entre os cânceres mais frequentes em mulheres (figura 1) e em 14ª

posição no sexo masculino (figura 2) (7). O CT é sabidamente 2-4 vezes mais incidente

em mulheres (8), com média de idade de 45 e 50 anos (9).

Figura 1. Taxas brutas de incidência, estimadas para 2016, das localizações

primárias (exceto pelo não melanoma), em mulheres, no Brasil (7).

23

Figura 2. Taxas brutas de incidência, estimadas para 2016, das localizações

primárias (exceto pelo não melanoma), em homens, no Brasil (7).

O carcinoma diferenciado da tireoide (CDT) representa mais de 95% dos

nódulos malignos derivados do epitélio folicular. O carcinoma papilífero da tireoide

(CPT) do tipo clássico ou outras variantes (folicular, células altas, esclerosante difusa,

colunar) representam mais de 80% do CDT, com maior incidência em mulheres em

idade média de 45 anos, apresentando excelente prognóstico e taxa de sobrevida em 10

anos acima de 95% (10, 11); no entanto, 20-50% dos pacientes com CPT apresentam

metástase linfonodal cervical (12, 13). O carcinoma folicular da tireoide (CFT)

representa 10% ou menos dos carcinomas diferenciados, sendo os pacientes

diagnosticados em idade avançada, geralmente em estadios mais avançados e piores tem

taxas de sobrevida (14).

Ao longo dos anos, diversas variantes microscópicas do CPT tem sido descritas.

O maior acesso da população ao sistema de saúde, o aumento do número de exames de

imagem e o grande avanço tecnológico que tem aumentado significativamente a

sensibilidade de exames como a ultrassonografia cervical, vem tornando o

microcarcinoma papílifero (mPT) uma das variantes mais comuns do CPT. Esses

tumores, menores que 1 cm, são encontrados em mais de 10% da população norte-

americana apresentando excelente prognóstico sem necessidade de intervenção cirúrgica

(15-17). Outra variante de baixo risco é a variante folicular encapsulada do CPT,

recentemente renomeada para NIFTP (18), do inglês Noninvasive Follicular Thyroid

24

Neoplasm with Papillary-Like Nuclear Features. Na ausência de invasão capsular ou

vascular estes são tumores indolentes com baixo risco de metástase local ou à distância

(19-21).

Por outro lado, o carcinoma anaplásico de tireoide (CAT) é uma forma agressiva

do CT e representa um desafio clínico e terapêutico devido à raridade da doença (<1%)

(22) e do seu alto índice de mortalidade (23, 24). É mais frequente em mulheres acima

dos 50 anos (22) e cerca de metade dos pacientes com CAT apresentam CDT anterior

ou coexistente, frequentemente associados à perda da proteína TP53 (25). Pacientes

com CAT geralmente apresentam invasão local generalizada e alta frequência de

metástases à distância nos pulmões, pleura, osso e cérebro (26). Também não se pode

deixar de mencionar o CDT que se torna pouco responsivo à terapia clássica, ou seja, os

tumores de tireoide que perdem diferenciação celular e que vem sendo descritos em

proporção estável ou talvez mesmo crescente (2).

O carcinoma medular da tireoide (CMT), embora faça parte do espectro do CT e

seja de diagnóstico diferencial obrigatório, é um tumor diferente do CDT; deriva-se das

células C neuroendócrinas e representa menos de 5% das neoplasias tireoidianas (27).

Oitenta por cento dos casos de CMT são esporádicos, observados em pacientes com

idade entre 60 e 70 anos, apresentando metástases linfonodais em metade dos pacientes

e metástase à distância em 10-20% dos casos (28); o restante dos pacientes possuem

síndromes tumorais hereditárias como Neoplasia Endócrina Múltipla (NEM) tipo 2 A

ou B, ou o carcinoma medular familiar (29). Todas as formas familiares da doença são

herdadas de forma autossômica dominante, com mutações no proto-oncogene RET,

detectável em 98% dos membros da família afetados (30, 31).

Entre os nódulos benignos, a lesão mais comum é o bócio, que consiste do

aumento da glândula tireoidiana, podendo ser endêmico, quando em áreas deficientes de

iodo, ou esporádico. Também são relativamente frequentes os adenomas foliculares

(AF) lesões de origem epitelial, bem encapsuladas, que não apresentam invasão de

tecidos adjacentes ou metástases (32).

O diagnóstico do CDT é dado através da análise citológica obtida pela punção

aspirativa por agulha fina (PAAF) guiada por ultrassom. A amostra é classificada de

acordo com as categorias do sistema Bethesda, recentemente modificado para

incorporar, entre outras novidades, o diagnóstico de NIFPT (Tabela 1). Apesar de

25

apresentar alta acurácia (95%) (33), em torno de 14% (34) dessas amostras são

classificadas na categoria IV (suspeito para neoplasia folicular), com taxa de risco de

malignidade de até 40%, ou V (suspeito para malignidade), onde a taxa de risco pode

chegar a 75% e o manejo clínico indicado, em ambas as categorias, é a cirurgia,

segundo último consenso da American Thyroid Association (ATA) (35). Após análise

histológica, apenas 25% desses nódulos, anteriormente classificados em categoria IV,

são, de fato, malignos (33, 36). De 15-20% das amostras submetidas à análise citológica

são classificadas como amostras insatisfatórias ou não diagnósticas (categoria I) ou

lesões de significado indeterminado (categoria III) e então os pacientes são orientados a

realizar um novo exame ou a fazer uma tireoidectomia para esclarecer o diagnóstico

(37).

Tabela 1. Sistema Bethesda para relatar interpretações de PAAF de tiroide: risco

de malignidade e conduta clínica recomendada (Adaptado de Ali SZ, Cibas ES). (38,

39)).

Categoria

diagnóstica

Risco de

malignidade –

NIFTP ≠ CA

Risco de

malignidade –

NIFTP = CA

Conduta clínica

(I) Não diagnóstico

ou insatisfatório

5-10% 5-10% Repetir PAAF

(II) Benigno

0-3% 0-3%

Acompanhamento

clínico

(III) Atipias de

significado

indeterminado ou

Lesão folicular de

significado

indeterminado

6-18% ~10-30%

Repetir PAAF, teste

molecular, ou

lobectomia

(IV) Suspeito para

neoplasia folicular

10-40% 25-40% Teste molecular,

lobectomia

(V) Suspeito para

malignidade

45-60% 50-75% Tireoidectomia ou

lobectomia

(VI) Maligno

94-96% 97-99%

Tireoidectomia ou

lobectomia

26

Apesar do número de mutações encontradas no CDT ser baixo, comparados a

outros tipos de tumor, essas mutações são frequentemente associadas ao seu fenótipo e

podem ser úteis no diagnóstico de nódulos indeterminados. Já existem alguns

marcadores moleculares bem estabelecidos para o CDT e que podem auxiliar no seu

diagnóstico e/ou prognóstico.

A mutação BRAF V600E está presente em 40-50% dos CPT e relacionada com

fenótipo mais agressivo da doença (40, 41). Essa mutação acarreta o aumento da

atividade da BRAF quinase, uma serina/treonina codificada pelo gene BRAF e

pertencente à via da MAPK (RAS–RAF–MEK–ERK–MAP) importante na mediação da

resposta celular a fatores de crescimento (42). Ainda no CPT, o rearranjo cromossômico

RET/PTC1 está frequentemente associado ao tipo clássico e metástases linfonodais,

enquanto que RET/PTC3 é mais comum em CPT de variante sólida (43-45). O gene

RET codifica um receptor transmembrana tirosina quinase envolvido na transdução de

sinal intracelular (46) e sua ativação estimula vias, como MAPK e PI3K, que promovem

o crescimento, proliferação, sobrevivência e diferenciação celular (47).

Em lesões foliculares o rearranjo mais frequente é o PAX8/PPARγ (48-50). É

descrito em 30-40% dos CFT (51, 52), 38% dos CPT de variante folicular (CPVF) (52)

e tem sido associado com multifocalidade e invasão vascular (49, 53). A detecção do

rearranjo em lesões foliculares na PAAF não indica por si só malignidade, já que

também é observado em AF (2-13%) (51, 52), mas sugere que a presença de invasão

vascular e/ou capsular deve ser explorada (48). Também são indicadores de prognóstico

em lesões foliculares mutações em genes da família RAS; os genes HRAS, KRAS e

NRAS estão envolvidos na proliferação, sobrevivência e apoptose celular e participam

de vias importantes para a carcinogênese tireoide como RAS/Raf/MEK/ERK e

PI3K/Akt (54, 55). Estudos recentes demonstram que mutações de RAS não são

suficientes para a modificação da conduta clínica dos nódulos tireoidianos

indeterminados (56), porém essas mutações têm-se mostrado importantes para NIFTPs.

Paulson et al (57) mostraram que mais de 50% de sua casuística com mutações nos

genes RAS eram NIFPTs e sugerem que uma lobectomia deva ser considerada como

abordagem cirúrgica para nódulos indeterminados pela PAAF e que apresentem

positividade para mutação RAS. Descrito mais recentemente, mutações no gene TERT

estão frequentemente associadas com CFT e CPVF e relacionadas a formas agressivas

27

da doença (58, 59). Combinadas com mutações como BRAF V600E aumentam as

chances de recorrência (60).

O uso de plataformas, em que se utiliza da combinação de expressão gênica e/ou

busca por mutações, não exclusivamente dos genes supracitados, pode melhorar o valor

preditivo positivo (VPP) e então ser útil para determinar a extensão da cirurgia e

intensidade do tratamento que o paciente deve receber. Grande parte dessas plataformas

apresentam ótimos valores de especificidade e valor preditivo negativo (VPN) e são,

portanto, úteis na exclusão de malignidade (tabela 2). No entanto, ainda possuem

algumas limitações e são de altíssimo custo para o paciente e para o sistema público de

saúde (tabela 3).

Tabela 2. Comparação de valores de sensibilidade, especificidade, valor

preditivo negativo (VPN), VPP e custo final ao paciente de plataformas e sistemas

disponíveis para auxiliar na identificação de nódulos indeterminados.

Sensibilidade Especificidade VPN VPP

Custo

(em dólar)

Seven-gene panel (61) 63% 99% 94% 88% -

ThyroSeq v2®

(62) 91% 92% 97% 77% $3200

Afirma (63) 92% 52% 93% 47% $475-4875

Rosetta microRNA classifier™ (64) 85% 72% 91% 59% $3000

ThyGenX® and ThyraMIR™ (65) 89% 85% 94% 74% $1675-3300

O fator de transformação do crescimento-β (TGF-β) é uma citocina

multifuncional que atua em diferentes e importantes funções biológicas como

replicação, diferenciação, migração celular, apoptose, angiogênese e regulação do

sistema imune (66, 67). Existem três isoformas homólogas (TGF-β1, TGF-β2 e TGF-

β3) em mamíferos, sendo TGF-β1 a mais expressa (67, 68). É uma proteína dimérica

extracelular produzida, principalmente, por células T regulatórias, plaquetas,

macrófagos, neutrófilos, osso, tecidos moles, células renais tubulares e também por

células neoplásicas malignas (69, 70).

TGF-β1 é sintetizado em sua forma precursora; o composto de 390 resíduos

compreende as regiões do peptídeo de sinal N-terminal, a região do peptídeo associado

de latência (LAP) e a região C-terminal que corresponde ao TGF-β1 maduro em si (71,

28

72). Esse complexo latente TGF-β/LAP se encontra ligado a outra proteína conhecida

como proteína de ligação latente do TGF-β (LTBP), e mantém o TGF-β1 em sua forma

inativa impedindo sua interação com seus receptores (73, 74). No ambiente extracelular,

esse complexo latente pode ser clivado por uma série de proteases, como por exemplo,

as metaloproteases de matriz (MMP) 2 e 9, para liberar o TGF-β1 ativo (73).

A sinalização do TGF-β1 (figura 3) acontece através de dois receptores

transmembrana de atividade serina/treonina quinase: o receptor tipo I (TβRI) e o

receptor tipo II (TβRII) (75). O TGF-β1 se liga ao receptor TβRII, e este, por sua vez,

recruta e ativa o receptor TβRI (76). A fosforilação do TβRI leva à fosforilação

downstream subsequente ativando as SMADs, proteínas citoplasmáticas e importantes

fatores de transcrição, que propagam, então, a sinalização até o núcleo (77, 78). No

entanto, a ativação dos receptores do TGF-β1também pode ocorrer por vias conhecidas

como SMAD-independentes, envolvendo vias como MAPK e Akt (79).

Figura 3. Representação da sinalização celular de TGF-β1 de maneira

independente e dependente das proteínas SMADs (80).

O gene TGFB1 está localizado no braço longo do cromossomo 19, posição 13.2,

e é constituído de 7 éxons e 6 longas regiões intrônicas (81). O éxon 1 codifica a região

5’ não transcrita (do inglês 5’UTR), o peptídeo de sinal e parte do LAP que se estende

29

até porção inicial do éxon 5; o restante do éxon 5 ao éxon 7 codifica o TGF-β1 maduro

em si (82, 83). Polimorfismos neste gene são frequentemente investigados e associados

a diversas patologias, porém seu papel no CDT ainda é pouco explorado.

O polimorfismo rs1800469 está localizado na região de regulação negativa 1 do

gene TGFB1, e poderia, assim, afetar a ligação de fatores de transcrição (84). Consiste

na troca de citosina (C) por timina (T), sendo o genótipo alterado (TT) já relacionado

com o aumento de expressão de RNAm (85, 86). Também no gene TGFB1, o

polimorfismo rs1800472 está localizado no éxon 5 e próximo ao sítio de clivagem do

LAP, o que poderia afetar a ativação do TGF-β1 (82). Consiste na troca de C por T, e

apesar de resultar na troca de aminoácidos, treonina [Tre] por uma isoleucina [Ile], não

existem estudos que reportem alterações ou distúrbios na função da proteína na presença

deste polimorfismo (87). Os outros três polimorfismos escolhidos, deste mesmo gene,

estão localizados em regiões intrônicas, que sabemos hoje serem regiões extremamente

importantes do genoma e com importantes funções na regulação do splicing alternativo

e da expressão gênica (88). O polimorfismo rs11466321 está localizado na primeira

região intrônica do gene TGFB1 e consiste na troca de T por C, o polimorfismo

rs2241716 resulta na troca de guanina (G) por adenina (A) e o polimorfismo rs8110090

a troca de A por G (89).

Figura 4. Estrutura do gene TGFB1 e localização dos polimorfismos rs1800469,

rs8110090, rs11466321, rs2241716 e rs180072 analisados. Modificado de Cebinelli e

colaboradores (87).

Os receptores de TGFB1, TGFBR1 (ou ALK5) e TGFBR2, estão localizados nas

regiões cromossômicas 9q22.33 e 3p24.1, respectivamente (90, 91). Foram selecionados

no gene TGFBR1 o polimorfismo rs10512263, um polimorfismo intrônico e resultado

30

da troca de T por C, e o polimorfismo rs7850895, polimorfismo localizado na região 3’

não transcrita (do inglês 3’UTR) do gene e troca de C por T (figura 5). Hipoteticamente,

este último polimorfismo poderia interferir na estabilidade do RNAm e na sua tradução,

pois está localizado numa região de adição da cauda Poli(A); essa cauda de 50 a 250

nucleotídeos adenina é inserida para conferir estabilidade e maior tempo de

disponibilidade ao RNAm (92). O polimorfismo rs228048 está localizado no éxon 3 do

gene TGFBR2 (figura 6) e consiste na troca de C por T, resultando em mutação

sinônima (Asp389Asp) , ou seja, sem mudança de aminoácido (89).

Figura 5. Estrutura do gene TGFBR1 e localização dos polimorfismos

(rs10512263 e rs7850890) analisados.

Figura 6. Estrutura do gene TGFBR2 e localização do polimorfismo

(rs2228048) analisado.

Diversos estudos têm reportado a perturbação ou perda da sinalização de TGF-

β1 e seus receptores no câncer (93, 94). De maneira geral, o TGF-β1 é conhecido por ter

um papel duplo na carcinogênese, agindo tanto na supressão tumoral quanto em sua

progressão. Seu efeito supressor é constantemente observado em células epiteliais

normais e carcinomas em estágio inicial, condizendo com suas funções normais de

inibição da proliferação celular e indução de apoptose. Fatores genéticos e epigenéticos,

não muito bem elucidados, fazem a inversão dessas funções, que juntamente com a

31

imunossupressão e indução da transição epitelial mesenquimal (do inglês EMT)

promovem a progressão tumoral (95, 96). Na tireoide, o TGF-β1 é secretado pelas

células tireodianas, trabalhando para a manutenção e diferenciação da célula tireoidiana

normal, e também reprimindo a expressão de tiroglobulina (Tg) e do transportador de

sódio-iodeto (NIS). Similar ao que acontece em outros tecidos, o aparecimento de

células neoplásicas perturba o funcionamento normal de TGF-β1, estas perdem a

sensibilidade ao fator inibitório da citocina, ajudando, assim, na progressão do tumor

(97-99).

Importante também no sistema imune, TGF-β1 é responsável por suprimir a

atividade citotóxica dos linfócitos T e promover a diferenciação destas em células T

reguladoras, que produzem e secretam TGF-β1, assim como por promover o

recrutamento de células da imunidade inata para sítios de interesse (100). Uma das

funções mais notáveis do TGF-β1 é a diferenciação de macrófagos para o fenótipo M2,

macrófagos de atividade pró-tumorigênica (101). Mais recentemente foi demonstrado

que o mesmo ocorre com outros tipos de células imunológicas: neutrófilos expostos ao

TGF-β1 adquiriam perfil pró-tumorigênico (N2), enquanto que a inibição da sinalização

de TGF-β1 modificava o fenótipo destes para anti-tumorigênico (N1) (102). Em relação

às células natural killers (NK), TGF-β1 inibe sua maturação e portanto, prejudica a

identificação e eliminação de células tumorais por essa população de células em

específico (103). De fato, tumores primários estão frequentemente, e densamente,

infiltrados por células do sistema imune inato e adquirido (104). O recrutamento destas

células pelo TGF-β1 é capaz de modificar o microambiente tumoral e torná-lo

suscetível à progressão do tumor (100).

O receptor TβRII é o primeiro a ser recrutado para auxiliar na sinalização de seu

ligante TGF-β1, sendo essencial para a ativação do outro receptor TβRI (75). O TβRI

ativado propaga o sinal até o núcleo através da fosforilação das SMADs 2 e 3

(conhecidas como receptor-regulated SMADs ou R-SMAD), que interagem com a

SMAD 4 (common-mediator SMAD ou co-SMAD) formando um complexo capaz de

atingir o núcleo e, então, modular a transcrição de genes alvos (75). No câncer, a

ativação do receptor TβRI tem sido relacionado com a angiogênese. Em tecidos

malignos, este receptor induz a expressão de MMP que causam a degradação da matriz

extracelular e então facilita o acesso de citocinas e fatores de crescimento a seus

receptores, como o próprio TGF-β1 e o fator de crescimento endotelial vascular

32

(VEGF), que induzem o aumento da angiogênese e a invasão tumoral (105, 106). No

caso do TβRII, a perda de expressão do gene TGFBR2 está relacionada ao aumento de

expressão e recrutamento de quimiocinas associadas a um pior prognóstico no câncer,

como CXCL1 e CXCL5 (107, 108).

No CDT, a expressão de TGFB1 e seus receptores tem sido investigada ao longo

dos anos, em sua grande maioria, por análises de imunoistoquímica. Trabalhos que

reportam valores de RNAm expressos são mais recentes, mas padecem do número

relativamente pequeno de casos avaliados. Assim, neste trabalho, visamos investigar o

potencial diagnóstico e prognóstico dos genes TGFB1, TGFBR1 e TGFBR2 no CDT,

avaliando polimorfismos presentes nestes genes, assim como os níveis de expressão de

RNAm destes.

33

2. OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral

Investigar a utilidade dos genes TGFB1, TGFBR1 e TGFBR2 como marcadores

de diagnóstico e/ou prognóstico em pacientes com nódulos tireoidianos benignos e

malignos, buscando correlacionar os resultados com características clínico-patológicas.

2.2 Objetivos específicos

2.2.1 Investigação de polimorfismos dos genes TGFB1, TGFBR1 e TGFBR2:

- A distribuição genotípica destes é diferente em pacientes com nódulos

malignos ou benignos da tireoide?

- A herança de genótipos específicos destes polimorfismos modifica a

suscetibilidade para nódulos malignos ou benignos da tireoide?

- A herança de genótipos específicos destes polimorfismos se associa com algum

tipo histológico em particular?

- Essa herança se correlaciona com as características clínico-patológicas dos

pacientes?

2.2.2 Expressão de RNAm dos genes TGFB1, TGFBR1, e TGFBR2:

- É diferente entre nódulos malignos e benignos da tireoide, ou entre os tipos

histológicos analisados?

- Essa expressão se correlaciona com as características clinico-patológicas dos

pacientes?

- A herança de genótipos específicos dos polimorfismos estudados modula a

expressão destes genes e se diferenciam entre os nódulos malignos ou benignos da

tireoide?

34

3. METODOLOGIA

3.1 Casuística

Este é um estudo retrospectivo e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da

Faculdade de Ciências Médicas (FCM), da UNICAMP (CAAE:

53581416.3.0000.5404). As amostras utilizadas neste estudo são advindas do

Biorrepositório do Laboratório de Genética Molecular do Câncer (GEMOCA), da

FCM/UNICAMP. Foram utilizadas amostras de DNA e RNA já extraídas de tecido a

fresco ou parafinado.

Todos os pacientes incluídos neste projeto possuem um prontuário no qual

constam, além dos dados de identificação, a idade ao diagnóstico, sexo, uso de

medicamentos, exames realizados (incluindo ultrassom, pesquisa de corpo inteiro com

Iodo131, Raio-X e outros exames de imagem, TSH sérico, medidas de tireoglobulina

[Tg] e biópsia aspirativa) dados clínicos pré-cirúrgicos, dados referentes à cirurgia e

dados do exame anatomopatológico (medida do tumor, tipo histológico, grau de

diferenciação, presença de linfonodos metastáticos).

Para a análise dos polimorfismos foram utilizadas 339 amostras de DNA de

pacientes com nódulos benignos e malignos da tireoide, o tempo de seguimento destes

pacientes foi de 100,3±41,7 meses. Para a análise de expressão do RNAm foram

utilizadas 127 amostras de RNA de pacientes com nódulos benignos e malignos da

tireoide com tempo de seguimento de 100,9±42,9 meses e 14 amostras de tecido normal

contralateral. As características clínicas e anatomopatológicas avaliadas nas casuísticas

de polimorfismo e RNAm estão descritas nas tabelas abaixo (tabela 3 e 4,

respectivamente). Poucos pacientes exibiam dados de evolução, o que invalidou

qualquer análise de seguimento.

35

Tabela 3. Características clínicas e anatomopatológicas dos 339 pacientes com

nódulos tireoidianos benignos e malignos avaliados para presença ou ausência de

polimorfismos nos genes TGFB1, TGFBR1 e TGFBR2. Os dados estão expressos em

número absoluto e porcentagem.

Características clínicas e

anatomopatológicas

n (%)

Benignos

(n= 177)

Malignos

(n= 162)

Bócio

(n=120)

AF

(n=58)

mPT

(n=58)

CPC

(n=88)

CPVF

(n=13)

CAT

(n=03)

Idade em anos (média±DP) 52,0±14,0 43,7±12,9 42,2±11,3 40,0±13,5 50,6±18,4 79,3±1,5

Gênero Feminino 106 (89) 52 (90) 45 (76) 70 (80) 12 (92) 03 (100)

Masculino 13 (11) 06 (10) 13 (23) 18 (20) 01 (08) 00 (00)

Tamanho do tumor em cm

(média±DP) 2,31±1,4 1,80±1,0 0,64±0,2 1,89±1,0 2,20±1,4 3,26±3,2

Tireoidite Ausente 89 (74) 38 (66) 27 (47) 42 (48) 10 (77) 02 (67)

Presente 24 (20) 16 (28) 18 (31) 31 (35) 01 (08) 01 (33)

Multifocalidade Ausente - - 36 (61) 56 (67) 07 (54) 03 (100)

Presente - - 15 (27) 26 (30) 06 (46) 00 (00)

Cápsula Ausente - - 29 (49) 48 (55) 09 (69) 03 (100)

Presente - - 11 (20) 17 (19) 04 (31) 00 (00)

Invasão Ausente - - 40 (69) 45 (51) 10 (77) 01 (33)

Presente - - 15 (25) 30 (34) 03 (23) 02 (67)

Metástase ao

diagnóstico

Ausente - - 38 (66) 45 (51) 11 (85) 01 (33)

Presente - - 08 (14) 25 (28) 02 (16) 02 (67)

36

Tabela 4. Características clínicas e anatomopatológicas dos 127 pacientes com

nódulos tireoidianos benignos e malignos avaliados para expressão de RNAm dos genes

TGFB1, TGFBR1 e TGFBR2. Os dados estão expressos em número absoluto e

porcentagem.


anatomopatológicas

n (%)

Benignos

(n= 80)

Malignos

(n= 47)

Bócio

(n=54)

AF

(n=26)

mPT

(n=12)

CPT

(n=35)

Idade em anos (média±DP) 49,6±14,3 42,0±12,0 39,7,2±9,0 36,9±11,6

Gênero Feminino 47 (87) 22 (85) 11 (92) 27 (77)

Masculino 07 (13) 04 (15) 01 (08) 08 (23)


(média±DP) 2,35±1,47 1,80±1,10 0,67±0,18 1,84±0,83

Tireoidite Ausente 37 (69) 16 (62) 09 (75) 26 (74)

Presente 16 (30) 09 (38) 03 (25) 09 (26)

Multifocalidade Ausente - - 06 (50) 25 (71)

Presente - - 06 (50) 10 (29)

Cápsula Ausente - - 11 (92) 29 (83)

Presente - - 01 (08) 06 (17)

Invasão Ausente - - 08 (67) 17 (49)

Presente - - 04 (33) 18 (51)

Metástase ao

diagnóstico

Ausente - - 10 (83) 22 (63)

Presente - - 02 (17) 13 (37)

3.2 Análise dos polimorfismos

Para a identificação do perfil genético dos pacientes utilizamos a técnica

TaqMan® SNP Genoptyping (Applied Biosystems™) em placas específicas para o

equipamento 7500 Real Time PCR system (Applied Biosystems™, Foster City, EUA).

A técnica de PCR do sistema TaqMan™ (Applied Biosystems™, Foster City, EUA) é

constituída por um par de primers, com uma sonda para cada alelo. Este sistema

apresenta assays já certificados pela empresa, de modo que serão utilizados os

TaqMan® Pre-Designed SNP Genotyping Assays (Applied Biosystems™, Foster City,

EUA).

Os polimorfismos investigados estão relacionados na tabela a seguir (tabela 5), e

foram determinados a partir da revisão de literatura e pelo haplotype tagging, usando o

software HaploView via HapMap (International HapMap Project). Foram escolhidos

37

polimorfismos que apresentavam evidência na literatura e/ou não apresentavam

desequilíbrio de ligação.

Para esta técnica, foi realizada a diluição do DNA em uma concentração igual a

10ng/μL. Para evitar resultados falso-positivos utilizamos água ao invés de DNA como

controle negativo na reação. O volume final utilizado em cada solução foi de 7μl,

contendo 20ng de DNA da amostra, 3,5μl de Taqman™ Genotyping Master Mix

(concentração final 1X), 0,175μl do ensaio (sonda e primers) para a concentração de

40x (concentração final de 1x) e 1,325μl de água milli-Q. Os seguintes ciclos foram

utilizados na PCR: a fase inicial de desnaturação foi de dez minutos a 95°C, seguida por

50 ciclos de 92°C por 15 segundos, 60°C por 90 segundos. O software utilizado para a

análise foi “Sequence Detection Software”, versão 1.3 (Applied Biosystems™, Foster

City, EUA). A amplificação das sondas nos permite classificar os indivíduos como

homozigotos selvagens (figura 7), heterozigotos polimórficos (figura 8) e homozigotos

polimórficos (figura 9), como demonstrado na figura abaixo (figura 10).

Tabela 5. Relação dos polimorfismos estudados dos genes TGFB1, TGFBR1 e

TGFBR2.

Gene Polimorfismo Código Tipo Troca

TGFB1

rs1800469 C___8708473_10 Intron [G/A]

rs1800472 C___8708464_20 Éxon 5 [G/A]

rs11466321 C_175953824_10 Intron [A/G]

rs2241716 C__15873887_10 Intron [C/T]

rs8110090 C__31639699_10 Intron [A/G]

TGFBR1

rs10512263 C___1413398_10 Intron [C/T]

rs7850895 C__29248567_20 3’ UTR [T/C]

TGFBR2 rs2228048 C__16170446_10 Éxon 3 [C/T]

38

Figura 7. Indivíduo homozigoto selvagem: amplificação apenas da sonda com

alelo selvagem.

Figura 8. Indivíduo heterozigoto polimórfico: amplificação da sonda com alelo

selvagem e alelo polimórfico.

39

Figura 9. Indivíduo homozigoto polimórfico: amplificação apenas da sonda com

alelo polimórfico.

Figura 10. Estratificação dos indivíduos de acordo com a amplificação: o

losango representa indivíduos homozigotos selvagens, o triângulo indivíduos

heterozigotos polimórficos e o círculo indivíduos homozigotos polimórficos.

40

3.3 Análise da expressão de RNAm

3.3.1 Transcrição reversa

As amostras de RNA foram quantificadas por espectrofotometria Picodrop

(Picodrop, Hinxton, Reino Unido). E então, para obtenção da fita de cDNA, as amostras

foram submetidas à reação de transcrição reversa utilizando-se o kit High-Capacity

cDNA Reverse Transcription (Applied Biosystems™), de acordo com as orientações do

fabricante.

Foram utilizados para cada amostra: 2μl de Buffer RT 10X, 0,8μl de dNTP Mix

25X (100mM), 2,0μl de Randon Primers RT, 1 μl de MultiScribe™ Reverse

Transcriptase (50 U/μL), 1-2μg do RNA (volume variável de RNA conforme

quantificação) e água para um volume final de 20μl. As amostras foram amplificadas

em termociclador (Applied Biosystems™) com ciclos de 25°C por 10 minutos, 37°C

por 120 minutos, 85°C por 5 minutos. As amostras de cDNA foram diluídas para uma

concentração final de 10ng/µl.

3.3.1 PCR-RT – Quantificação Relativa

A quantificação relativa foi realizada por PCR em tempo real utilizando ensaios

de expressão gênica TaqMan™ com sondas inventariadas (tabela 6).

Tabela 6. Relação de ensaios para análise de expressão gênica dos genes

TGFB1, TGFBR1 e TGFBR2.

Gene Assay

TGFB1 Hs00998133_m1

TGFBR1 Hs00610320_m1

TGFBR2 Hs00234253_m1

As reações foram feitas em triplicata, utilizando para cada reação: 6,0μl de

TaqMan Gene Expression PCR Master Mix (concentração final de 2x), 0,3μl do ensaio

(sonda e primers), 1,7μl de água milli-Q e 4μl de cDNA, totalizando volume final de

12,0 μl. Os seguintes ciclos foram utilizados na PCR: 50°C por 2 minutos, 95°C por 10

minutos, 45 ciclos de 95°C por 15 segundos e 60°C por 1 minuto. Pela análise do Ct no

programa 7500 System SDS Software (Applied Biosystems, Foster City, EUA) e o

41

cálculo 2-ΔΔCt

(109), foram obtidos os valores de fold-change que refletem a expressão

do gene alvo no tecido. Os resultados da expressão de RNAm foram comparados

tomando esta expressão como uma variável quantitativa (medida em Unidades

Arbitrárias – UA).

A quantificação relativa descreve a diferença de expressão do gene alvo no

tecido de interesse em relação ao controle. O GAPDH foi escolhido como gene controle

endógeno e o tecido controle utilizado foi o tecido tireoidiano normal.

3.4 Análise estatística

As análises estatísticas foram realizadas pelos softwares SAS System for

Windows (Statistical Analysis System), versão 9.4 (SAS Institute Inc, 2002-2008, Cary,

NC, USA) e MedCalc® for Windows, versão 17.9.7 (MedCalc Software, 1993-2017,

Ostend, Belgium).

Para descrever o perfil da amostra, segundo as variáveis em estudo, foram feitas

tabelas de frequência das variáveis categóricas com valores de frequência absoluta (n) e

percentual (%), e estatísticas descritivas das variáveis numéricas com valores de média,

desvio padrão, valores mínimo e máximo, e mediana.

Para avaliação da relação entre as variáveis categóricas, a conclusão clínica,

polimorfismos ou expressão gênica foi utilizado o teste Qui-quadrado, e quando

necessário o teste exato de Fisher. Para avaliação da relação entre as variáveis

categóricas e as variáveis numéricas foram utilizados os testes de Mann-Whitney e

Kruskal-Wallis. Para avaliação da relação entre as variáveis numéricas foi utilizado o

coeficiente de correlação Spearman. Para avaliação do potencial diagnóstico da

expressão de RNAm foi utilizado o teste de Curva ROC.

Foi realizado o teste de equilíbrio de Hardy-Weinberg para as amostras de

polimorfismos e todos os polimorfismos analisados estavam em equilíbrio (p>0,05)

O nível de significância adotado para este estudo foi de 5%.

42

4. RESULTADOS

4.1 Polimorfismos

Foi realizada a genotipagem de 339 pacientes com nódulos tireoidianos, sendo

177 casos benignos e 162 malignos. Estes pacientes foram seguidos por uma média de

100,3±41,7 meses. A idade média dos pacientes foi de 45,8±14,6 anos e 85% eram do

sexo feminino.

A média de idade de pacientes com nódulos benignos foi de 49,3±14,1 anos e

dos pacientes com nódulos malignos de 42,4±14,2 anos (p<0,0001). O teste exato de

Fisher mostrou que existe diferença na distribuição de homens e mulheres nos grupos

malignos e benignos (p=0,0228), com um OR de 0.4885 sugerindo que mulheres teriam

menor chance de terem tumores malignos.

Em relação às características anatomopatológicas do tumor, tumores benignos

eram maiores que os tumores malignos (2,12±1,30 versus 1,47±1,15, p<0,0001). A

porcentagem de nódulos malignos associados com tireoidite foi maior que a de benignos

(p=0,0078). Características de agressividade como multifocalidade foi presente em

apenas 29% dos casos, invasão em 31% e metástase ao diagnóstico em 23%, contudo

um terço dos nódulos malignos eram encapsulados.

4.1.1 Gene TGFB1

4.1.1.1 rs1800469

Cerca de 40% dos indivíduos genotipados para o polimorfismo rs1800469 eram

homozigotos selvagens para o genótipo GG, 46% heterozigotos polimórficos (AG) e

14% homozigotos polimórficos (AA). As frequências genotípicas foram similares entre

nódulos malignos e benignos (figura 11), assim como entre os tipos histológicos (tabela

7), não se correlacionando com nenhum tipo histológico analisado (tabela 8).

43

Figura 11. Distribuição genotípica do polimorfismo rs1800469 em nódulos

tireoidianos benignos e malignos (teste exato de Fisher).

Tabela 7. Distribuição genotípica do polimorfismo rs1800469 em nódulos

tireoidianos benignos e malignos de acordo com o tipo histológico.

Tipo histológico

n (%)

Genótipos

GG AG+AA

Benignos

Bócio

(n=118) 46 (39) 72 (61)

AF

(n=58) 26 (45) 32 (55)

Total 72 63

Malignos

mPT

(n=56) 23 (41) 33 (59)

CPC

(n=88) 35 (40) 53 (60)

CPVF

(n=13) 04 (31) 09 (69)

CAT

(n=03) 01 (33) 02 (67)

Total 104 97

0

20

40

60

80

100

Benignos Malignos

41 39

59 61

rs1800469

GG AG+AA

p=0,8239

44

Tabela 8. Valor de p (Teste exato de Fisher) para as comparações entre tipos

histológicos de nódulos tireoidianos para o polimorfismo rs1800469.

Versus CDT CPVF CPC mPT AF Bócio

Bócio 1,0000 0,7653 1,0000 0,8686 0,5153 -

AF 0,5037 0,5359 0,6082 0,7090 -

mPT 0,8648 0,5469 1,0000 -

CPC - 0,7615 -

CPVF - -

CDT -

Legenda: CDT carcinoma diferenciado (CPC+CPVF).

Em relação às características clínicas (tabela 9), foi observada fraca correlação

entre a presença de pelo menos um alelo polimórfico (AG+AA) e o sexo feminino

(p=0,0414). Para características anatomopatológicas, a frequência dos genótipos

alterados foi maior em tumores não encapsulados, onde portadores dos genótipos AG ou

AA possuíam 3 vezes mais chance de terem tumores tireoidianos sem cápsula (OR

3.232, IC95%: 1.366 - 7.647, p=0,0097) (figura 12). Contudo, essa associação não se

repetiu na análise por alelo (A versus G, p=0,0610).

Figura 12. Frequência genotípica do polimorfismo rs1800469 em nódulos

tireoidianos com e sem cápsula (teste exato de Fisher).

0

20

40

60

80

100

Sem cápsula Com cápsula

35

63 65

37

rs1800469

GG AG+AA

p=0,0097

45


características clínicas e anatomopatológicas dos nódulos tireoidianos malignos

analisados.


anatomopatológicas

n (%)

Genótipos

Valor de p OR

(IC95%) GG AG+AA

Idade (média±DP) 45,8±14,4 46,1±14,8 0,8731 -

Gênero Feminino 108 (38) 178 (62)

0,0414 1.935

(1.056-3.545) Masculino 27 (54) 23 (46)


(média±DP) 1,8±1,3 1,8±1,3 0,8071 -

Tireoidite Ausente 86 (42) 120 (58)

0,5224 - Presente 34 (37) 57 (63)

Multifocalidade Ausente 43 (43) 58 (57)

0,2020 - Presente 14 (30) 32 (70)

Cápsula Ausente 31 (35) 58 (65)

0,0097 3.232

1.366 - 7.647 Presente 19 (63) 11 (37)

Invasão Ausente 43 (46) 51 (54)

0,2147 - Presente 17 (33) 33 (66)

Metástase ao

diagnóstico

Ausente 38 (40) 56 (60) 0,8445 -

Presente 16 (43) 21 (57)

Teste exato de Fisher, exceto *teste de Mann-Whitney.

4.1.1.2 rs1800472

Em relação ao polimorfismo rs1800472, 90,3% dos indivíduos analisados eram

homozigotos selvagens (GG) e 9,7% heterozigotos polimórficos (AG); nenhum

indivíduo apresentou o genótipo homozigoto polimórfico AA. Na figura 13 estão

representadas as distribuições destes genótipos entre nódulos benignos e malignos da

tireoide. Novamente, observamos que não há diferenças quanto à distribuição dos

genótipos e o diagnóstico de malignidade ou benignidade do nódulo tireoidiano

(p=0,3605).

A tabela 10 monstra a distribuição genotípica de acordo com o tipo histológico

analisado e a tabela 11 as comparações possíveis entre eles. Foi estatisticamente

significante a comparação entre CPVF e bócio (p=0,0137), a frequência do genótipo

alterado AG no CPVF (38%) foi maior do que no bócio (10%), com OR de 5.521

46

sugerindo que indivíduos com o genótipo alterado AG possuem 5 vezes mais chances

de terem um nódulo maligno do tipo CPT de variante folicular (IC95%: 1.555-19.603).

Também foram interessantes as comparações entre CPVF e mPT (p=0,0022) e CPVF e

CPC (p=0,0048); contudo, devido ao baixo n amostral, estas análises apresentaram

altíssimos valores de intervalo de confiança (OR 16.250, IC95%: 2.683-98.435 e OR

8.542, IC95%: 2.124-34.348, respectivamente) sugerindo tratar-se de dados pouco

confiáveis, talvez relacionados a uma amostragem específica (figura 14).



0

20

40

60

80

100

Benignos Malignos

89 92

11 8

rs1800472

GG AG

p=0,3605

47


tireoidianos benignos e malignos e de acordo com o tipo histológico.

Tipo histológico

n (%)

Genótipos

GG AG

Benignos

Bócio

(n=118) 106 (90) 12 (10)

AF

(n=58) 50 (86) 08 (14)

Total 156 20

Malignos

mPT

(n=58) 56 (97) 02 (03)

CPC

(n=88) 82 (93) 06 (07)

CPVF

(n=13) 08 (62) 05 (38)

CAT

(n=03) 03 (100) 00 (00)

Total 149 13




Bócio 1,0000 0,0137 0,4623 0,1479 0,4617 -

AF 0,6172 0,0526 0,2497 0,0941 -

mPT 0,2219 0,0022 0,7103 -

CPC - 0,0048 -

CPVF -

CDT -


48

Figura 14. Frequência genotípica do polimorfismo rs1800472 em CPVF

comparados a bócio, mPT e CPC (teste exato de Fisher).

Entre as características clínicas e anatomopatológicas (tabela 12), houve uma

fraca correlação entre o genótipo alterado (AG) e a presença de metástase (p=0,0469). O

genótipo AG foi mais frequente em pacientes que apresentaram metástase no momento

do diagnóstico, inferindo ao paciente 3 vezes mais chances de metástase do que

pacientes portadores do genótipo homozigoto selvagem GG (OR 3.461, IC95%: 1.078 -

11.114) (figura 15).


tireoidianos com e sem metástase ao diagnóstico.

0

20

40

60

80

100

CPVF Bócio mPT CPC

62

90 97 93

38

10 3 7

rs1800472

GG AG

0

20

40

60

80

100

Com meta Sem meta

81 94

19 6

rs1800472

GG AG

p=0,0137

p=0,0022

p=0,0048

p=0,0469

49

Tabela 12. Distribuição genotípica do polimorfismo rs1800472 de acordo com

as características clínicas e anatomopatológicas dos nódulos tireoidianos malignos

analisados.


anatomopatológicas

n (%)

Genótipos

Valor de p OR

(IC95%) GG AG

Idade (média±DP) 45,7±14,5 48,5±15,2 0,2182* -


0,6091 - Masculino 45 (92) 06 (08)


(média±DP) 1,78±1,3 1,85±1,0 0,2108* -


0,5274 - Presente 84 (92) 07 (08)


0,1956 - Presente 41 (87) 06 (13)


0,7256 - Presente 30 (94) 02 (06)


0,5454 - Presente 45 (90) 05 (10)

Metástase ao

diagnóstico

Ausente 89 (94) 06 (06) 0,0469

3.461

1.078 - 11.114 Presente 30 (81) 07 (19)


4.1.1.3 rs11466321

O genótipo selvagem (AA) do polimorfismo rs11466321 foi frequente em 92%

dos indivíduos avaliados, contra 7,4% e 0,60% dos genótipos polimórficos (AG e GG).

Similar aos polimorfismos anteriores, não demonstrou diferença na frequência dos

genótipos entre nódulos benignos e malignos da tireoide (figura 16).

A tabela 13 mostra a distribuição dos genótipos entre os tipos histológicos

avaliados. Mais uma vez, não houve diferenças significativas os tipos histológicos

quanto ao perfil genotípico (tabela 14).

50





Tipo histológico

n (%)

Genótipos

AA AG+GG

Benignos

Bócio

(n=119) 112 (94) 07 (06)

AF

(n=58) 52 (90) 06 (10)

Total 164 13

Malignos

mPT

(n=58) 54 (93) 04 (07)

CPC

(n=88) 80 (91) 08 (09)

CPVF

(n=13) 11 (85) 02 (15)

CAT

(n=03) 03 (100) 00 (00)

Total 148 14

0

20

40

60

80

100

Benignos Malignos

93 91

7 9

rs11466321

AA AG+GG

p=0,6921

51




Bócio 0,3158 0,2169 0,4238 0,7517 0,3584 -

AF 1,0000 0,6326 0,7828 0,7426 -

mPT 0,5774 0,3015 0,7637 -

CPC - 0,6134 -

CPVF - -

CDT -


Em relação às características clínicas e anatomopatológicas do tumor (tabela 15),

novamente, a distribuição dos genótipos AA, AG e GG não foi diferente em relação à

idade ou gênero dos pacientes, nem como ao tamanho do tumor, presença/ausência de

tireoidite, multifocalidade, cápsula, invasão e metástase ao diagnóstico.



analisados (Teste exato de Fisher, exceto *teste de Mann-Whitney).


anatomopatológicas

n (%)

Genótipos

Valor de p

AA AG+GG

Idade (média±DP) 46,1±14,7 44,2±12,8 0,4736


0,2671 Masculino 45 (92) 06 (08)


(média±DP) 1,78±1,3 1,82±0,9 0,2570


0,5053 Presente 82 (90) 09 (10)


1,0000 Presente 43 (91) 04 (09)


0,7231 Presente 29 (91) 03 (09)


0,1345 Presente 43 (86) 07 (14)

Metástase ao

diagnóstico

Ausente 89 (94) 06 (06) 0,2902

Presente 32 (86) 05 (14)

52

4.1.1.4 rs2241716

De forma similar, a frequência genotípica do polimorfismo rs2241716 não foi

diferente entre os nódulos benignos e malignos (figura 17). Em nossa casuística, a

frequência do genótipo selvagem (CC) foi de 94,3% e dos alelos polimórficos (CT e

TT) de 5,1% e 0,60%, respectivamente.



A distribuição genotípica também não foi diferente entre os tipos histológicos

analisados, como mostra a tabela 16, não se correlacionando com nenhum tipo de

nódulo benigno ou maligno (tabela 17). Considerando as características clínicas e

anatomopatológicas (tabela 18) apresentadas pelos tumores analisados, este

polimorfismo se correlacionou apenas com o gênero dos pacientes (p=0,0492), onde

92% dos indivíduos do sexo masculino eram homozigotos selvagens.

0

20

40

60

80

100

Benignos Malignos

94 95

6 5

rs2241716

CC CT+TT

p=0,6445

53


tireoidianos benignos e malignos e de acordo com o tipo histológico.

Tipo histológico

n (%)

Genótipos

CC CT+TT

Benignos

Bócio

(n=119) 111 (93) 08 (07)

AF

(n=58) 55 (95) 03 (05)

Total 166 11

Malignos

mPT

(n=58) 53 (91) 05 (09)

CPC

(n=88) 85 (97) 03 (07)

CPVF

(n=13) 13 (100) 00 (00)

CAT

(n=03) 03 (100) 00 (00)

Total 154 08




Bócio 0,2323 1,0000 0,3605 0,7602 1,0000 -

AF 0,6691 1,0000 0,6820 0,7167 -

mPT 0,1419 0,5764 0,2655 -

CPC - 1,0000 -

CPVF -

CDT -


54



analisados.


anatomopatológicas

n (%)

Genótipos

Valor de p OR

(IC95%) CC CT+TT

Idade (média±DP) 46,1±14,7 45,1±11,2 0,8349*


0,0492 0.3545

(0.1281-0.9809) Masculino 45 (92) 06 (08)


(média±DP) 1,80±1,3 1,50±1,3 0,1171*


1,0000

Presente 86 (95) 05 (05)


0,3801

Presente 44 (94) 03 (06)


0,2848

Presente 30 (94) 02 (06)


0,0957

Presente 50 (100) 00 (00)

Metástase ao

diagnóstico

Ausente 92 (97) 03 (03) 1,0000

Presente 36 (97) 01 (03)


4.1.1.5 rs8110090

A frequência dos genótipos AA (selvagem), AG e GG (polimórficos) do

polimorfismo rs8110090 em nossa casuística foi de 86,6%, 12,6% e 0,86%,

respectivamente. Essa frequência foi similar entre nódulos benignos e malignos, como

demonstrado na figura 18. Entre os tipos histológicos (tabela 19) também não houve

diferença e nenhuma comparação foi estatisticamente significante (tabela 20).

Considerando as características clínicas e anatomopatológicas do tumor (tabela

21), a distribuição genotípica deste polimorfismo foi muito similar entre as variáveis

analisadas.

55





Tipo histológico

n (%)

Genótipos

AA AG+GG

Benignos

Bócio

(n=119) 100 (84) 19 (16)

AF

(n=58) 52 (90) 06 (10)

Total 152 25

Malignos

mPT

(n=58) 49 (84) 09 (16)

CPC

(n=88) 79 (90) 09 (10)

CPVF

(n=13) 12 (92) 01 (08)

CAT

(n=03) 03 (100) 00 (00)

Total 143 19

0

20

40

60

80

100

Benigno Maligno

86 88

14 12

rs8110090

AA AG+GG

p=0,5231

56

Tabela 20. Comparações entre tipos histológicos de nódulos tireoidianos para o

polimorfismo rs8110090.


Bócio 0,2313 0,6905 0,3047 1,0000 0,3655 -

AF 1,0000 1,0000 1,0000 0,5813 -

mPT 0,3173 0,6762 0,4413 -

CPC - 1,0000 -

CPVF - -

CDT -




analisados.


anatomopatológicas

n (%)

Genótipos

Valor de p

AA AG+GG

Idade (média±DP) 46,5±14,4 42,9±15,3 0,1088*


0,3640 Masculino 47 (92) 04 (08)


(média±DP) 1,75±1,2 2,0±1,3 0,2218*


1,0000 Presente 80 (88) 11 (12)


0,5838 Presente 43 (91) 04 (09)


0,1805 Presente 31 (97) 01 (03)


0,2994 Presente 46 (92) 04 (08)

Metástase ao

diagnóstico

Ausente 81 (85) 14 (15) 0,3950

Presente 34 (92) 03 (08)


57

4.1.2 Gene TGFBR1

4.1.2.1 rs10512263

Para o polimorfismo rs10512263, o genótipo selvagem (CC) foi presente em

66,7% dos indivíduos genotipados, enquanto que os genótipos polimórficos CT e TT

representaram 11,3% e 22%, respectivamente. Novamente, a frequência genotípica foi

similar entre nódulos benignos e malignos (figura 19), assim como entre os tipos

histológicos (tabela 22), não se associando com nenhum tipo histológico em específico

(tabela 23).



0

20

40

60

80

Benignos Malignos

69 66

31 33

rs10512263

CC CT+TT

p=0,0173

58



Tipo histológico

n (%)

Genótipos

CC CT+TT

Benignos

Bócio

(n=118) 76 (64) 42 (36)

AF

(n=57) 44 (77) 13 (23)

Total 120 55

Malignos

mPT

(n=57) 37 (65) 20 (35)

CPC

(n=87) 57 (65) 30 (35)

CPVF

(n=13) 10 (77) 03 (23)

CAT

(n=03) 02 (67) 01 (33)

Total 106 54




Bócio 0,7750 0,5409 0,8835 1,0000 0,1175 -

AF 0,2047 1,0000 0,1424 0,2150 -

mPT 0,8612 0,5229 1,0000 -

CPC - 0,5362 -

CPVF -

CDT -


Como demonstrado na tabela 24, a frequência de mulheres com o genótipo

alterado (35%) foi maior que a de homens (20%; p=0,0490). Este polimorfismo também

se associou com invasão (figura 20), onde 43% dos nódulos sem invasão possuíam pelo

menos um alelo polimórfico (CT ou TT) contra 22% dos nódulos com invasão capsular,

vascular ou linfática, sugerindo que os genótipos polimórficos confiram um fator

protetor (OR 0.3715, IC95%: 0.1698 - 0.8127, p=0,0173).

59


tireoidianos com e sem invasão (teste exato de Fisher).



analisados.


anatomopatológicas

n (%)

Genótipos

Valor de p OR

(IC95%) CC CT+TT

Idade (média±DP) 45,2±14,4 47,5±14,9 0,2268*


0,0490 2.129

1.021 - 4.439 Masculino 40 (80) 10 (20)


(média±DP) 1,9±1,3 1,6±1,2 0,1507*


0,0838

Presente 67 (74) 24 (26)


0,7076

Presente 32 (70) 14 (30)


0,1345

Presente 15 (48) 16 (52)


0,0173 0.3715

0.1698 - 0.8127 Presente 39 (78) 11 (22)

Metástase ao

diagnóstico

Ausente 56 (60) 38 (40) 0,1652

Presente 27 (73) 10 (27)


0

20

40

60

80

Sem invasão Com invasão

57

78

43

22

rs10512263

CC CT+TT

p=0,7263

60

4.1.2.2 rs7850895

Mais de 85% dos indivíduos genotipados para o polimorfismo rs7850895 eram

homozigotos selvagens para o genótipo TT, enquanto 14% possuíam o genótipo

alterado CT. Nenhum individuo apresentou o genótipo homozigoto polimórfico CC.

A frequência genotípica deste polimorfismo mais uma vez não foi diferente entre

nódulos malignos e benignos, como demonstrado na figura 21. A distribuição

genotípica entre os tipos histológicos também não apresentou diferenças como podemos

observar nas tabelas 25 e 26.



0

20

40

60

80

100

Benignos Malignos

85 85

15 15

rs7850895

TT CT

p=1.0000

61



Tipo histológico

n (%)

Genótipos

TT CT

Benignos

Bócio

(n=118) 102 (86) 17 (14)

AF

(n=58) 49 (84) 09 (16)

Total 151 26

Malignos

mPT

(n=57) 51 (89) 06 (11)

CPC

(n=88) 72 (82) 16 (18)

CPVF

(n=13) 12 (92) 01 (08)

CAT

(n=03) 02 (67) 01 (33)

Total 137 24




Bócio 0,7088 1,0000 0,4506 0,6343 0,8241 -

AF 1,0000 0,6762 0,8231 0,5813 -

mPT 0,3513 1,0000 0,2435 -

CPC - 0,6905 -

CPVF - -

CDT -


Considerando as características clínicas e anatomopatológicas do tumor, não

foram observadas diferenças na frequência genotípica para média de idade e gênero dos

pacientes, ou tamanho do tumor, presença/ausência de tireoide, multifocalidade,

cápsula, invasão e metástase ao diagnóstico (tabela 27).

62



analisados.


anatomopatológicas

n (%)

Genótipos

Valor de p

TT CT+CC

Idade (média±DP) 46,4±14,2 43,7±16,4 0,2345*


1,0000 Masculino 43 (86) 07 (14)


(média±DP) 1,8±1,3 1,9±1,3 0,3032*


0,5964 Presente 76 (84) 15 (16)


0,8067 Presente 38 (86) 08 (14)


0,3984 Presente 28 (90) 03 (10)


0,4579 Presente 41 (82) 09 (18)

Metástase ao

diagnóstico

Ausente 81 (85) 14 (15) 0,7933

Presente 31 (84) 06 (16)


4.1.3 Gene TGFBR2

4.1.3.1 rs2228048

No último polimorfismo analisado, 96% dos indivíduos eram homozigotos

selvagens (CC), 4% eram heterozigotos polimórficos (CT) e nenhum indivíduo

apresentou o genótipo homozigoto polimórfico TT. Na figura 22, observamos que a

frequência dos genótipos foi similar entre nódulos benignos e malignos, assim como

entre os tipos histológicos (tabela 28), não havendo nenhuma correlação entre os tipos

histológicos analisados (tabela 29). Para o AF não foi realizado teste estatístico, pois

nenhum dos indivíduos possuía o genótipo alterado e isto poderia influenciar no

resultado do teste.

Com relação às características clínicas e anatomopatológicas do tumor, este

polimorfismo não demonstrou diferenças na distribuição genotípica e, portanto, não se

associou com nenhuma característica analisada.

63





Tipo histológico

n (%)

Genótipos

CC CT

Benignos

Bócio

(n=118) 112 (95) 06 (05)

AF

(n=57) 57 (100) 00 (00)

Total 169 06

Malignos

mPT

(n=57) 55 (96) 02 (04)

CPC

(n=87) 85 (98) 03 (02)

CPVF

(n=13) 11 (85) 02 (15)

CAT

(n=03) 02 (67) 01 (33)

Total 153 08

0

20

40

60

80

100

Benignos Malignos

97 95

3 5

rs2228048

CC CT

p=0,5883

64

Tabela 29. Comparações entre tipos histológicos de nódulos tireoidianos para o

polimorfismo rs2228048.


Bócio 1,0000 0,1809 0,7354 1,0000 -- -

AF -- -- -- -- -

mPT 1,0000 0,1543 1,0000 -

CPC - 0,1227 -

CPVF - -

CDT -

Legenda: CDT carcinoma diferenciado (CPC+CPVF). -- n insuficiente para realizar estatística.


as características clínicas e anatomopatológicas dos nódulos tireoidianos analisados.


anatomopatológicas

n (%)

Genótipos

Valor de p

CC CT

Idade (média±DP) 45,7±14,4 53,2±17,7 0,1333*


1,0000 Masculino 48 (96) 02 (04)


(média±DP) 1,8±1,2 1,7±1,7 0,4774*


0,2281 Presente 85 (93) 06 (07)


1,0000 Presente 44 (96) 02 (04)


0,6755 Presente 30 (97) 01 (03)


1,0000 Presente 48 (96) 02 (04)

Metástase ao

diagnóstico

Ausente 90 (95) 05 (05) 1,0000

Presente 35 (95) 02 (05)


65

4.2 Expressão gênica

Para análise da expressão de RNAm dos genes TGFB1, TGFBR1 e TGFBR2

foram selecionadas 141 amostras de tecido tireoidiano, sendo 80 benignos, 47 malignos

e 14 tecidos normais contralaterais. O tempo médio de seguimento desses pacientes foi

de 100,9±42,9 meses e a idade média ao diagnóstico de 43,6±13,7 anos.

A média de idade dos pacientes com nódulos benignos foi maior que dos

nódulos malignos, sendo essa diferença estatisticamente significante (p=0,0002). O sexo

feminino foi predominante tanto no grupo benigno quanto no maligno. Tumores

tireoidianos benignos eram maiores que os tumores malignos (p=0,0087). Tireoidite foi

presente em 31% dos nódulos benignos e apenas 24% dos nódulos malignos. Os

nódulos malignos eram em sua maioria unifocais (70%), não encapsulados (86%), sem

presença de invasão capsular, vascular ou linfática (53%) e sem diagnóstico de

metástase no momento do diagnóstico (67%).

Considerando as características clínicas de acordo com o tipo histológico,

pacientes com bócio eram mais velhos que pacientes com AF (p=0,0091). Entre as

características anatomopatológicas, bócios eram maiores em diâmetro do que AF, e

apenas 30% apresentavam tireoidite. No grupo maligno, como esperado, o CPT tinha

tamanho médio maior que os mPT e apresentavm características de agressividade como

ausência de cápsula em 83% dos casos, invasão em 51% e presença de metástase ao

diagnóstico em 37%.

4.2.1 Expressão de TGFB1

As médias de RNAm do gene TGFB1 (figura 23) foram maiores em nódulos

malignos (2,320±1,410 UA) quando comparados aos benignos (1,080±0,740 UA,

p<0,0001) e ao tecido normal (0,990±0,250 UA, p<0,0001), mas não em tecidos

benignos quando comparados ao tecido normal (p=0,8443).

Para avaliar o potencial diagnóstico do gene TGFB1 foi realizada a curva ROC

com os valores de expressão do RNAm em tecidos benignos e malignos (figura 24).

Com um cut-off de 1,365, a expressão de TGFB1 foi capaz de identificar os nódulos

benignos com uma especificidade de 72%, VPN de 98%, sensibilidade de 77% e VPP

de 13%, dando ao teste uma acurácia de 82% (p<0,0001).

66

Figura 23. Box plot com as médias de RNAm (UA) do gene TGFB1 em nódulos

benignos e malignos e tecido normal tireoidiano e valor de p (teste de Mann-Whitney).

Figura 24. Curva ROC apresentando pontos de especificidade e sensibilidade da

expressão de RNAm do gene TGFB1 em nódulos tireoidianos benignos e malignos.

As médias de RNAm do gene TGFB1 entre os tipos histológicos analisados

estão graficamente apresentadas na figura abaixo. Não foram estatisticamente

significantes as comparações entre bócio e AF (p=0,6587), CPT e mPT (p=0,8453), mas

sim entre CPT e bócio (p<0,0001), CPT e AF (p<0,0001), mPT e bócio (p=0,0015) e

mPT e AF (p=0,0030).

0

20

40

60

80

100

TGFB1

0 20 40 60 80 100

100-Specificity

Se

nsitiv

ityp<0,0001

p=0,8443

1,080±0,740 0,990±0,250 2,320±1,410

Expressão RNAm

TGFB1

p<0,0001

67

Figura 25. Box plot com as média de RNAm (UA) do gene TGFB1 entre os

tipos histológicos de nódulos tireoidianos.

Em relação às características anatomopatológicas dos nódulos, as médias de

RNAm foram discretamente maiores em tumores com tireoidite, multifocais, não

encapsulados, com invasão e sem metástase (tabela 31), contudo essas diferenças não

foram estatisticamente significantes. Por outro lado, a expressão de TGFB1 demonstrou

associação com tamanho do tumor (p=0,0486). A correlação de Spearman mostrou uma

correlação negativa (R= -0,1768), onde quanto maior a expressão de TGFB1 menores

são os tumores tireoidianos (figura 26).

Expressão RNAm

TGFB1

1,110±0,780 1,010±0,680 2,480±1,570 2,270±1,370

68

Tabela 31. Médias de expressão do RNAm do gene TGFB1 e características

anatomopatológicas exibidas pelos nódulos malignos avaliados.

Características

anatomopatológicas

n (%)

Média±DP Valor de p*

Tireoidite Ausente 1,425±1,070

0,0770 Presente 1,830±1,460

Multifocalidade Ausente 2,310±1,500

0,7407 Presente 2,340±1,250

Cápsula Ausente 2,375±1,400

0,3243 Presente 2,020±1,520

Invasão Ausente 2,270±1,145

0,8146 Presente 2,380±1,690

Metástase ao

diagnóstico

Ausente 2,360±1,600 0,7407

Presente 2,230±0,950

*Teste de Mann-Whitney.

Figura 26. Gráfico de correlação negativa entre tamanho de tumor e expressão

de RNAm do gene TGFB1 em tumores tireoidianos benignos e malignos: tumores

menores em cm expressam maiores quantidades de RNAm (correlação de Spearman).

R= -0,1768

69

4.2.2 Expressão de TGFBR1

A média de RNAm do gene TGFBR1 também foi maior em tecidos malignos

quando comparados aos benignos (p=0,0002), mas não quando comparados aos tecidos

normais (p=0,0848); tecidos benignos também não se diferenciaram de normais

(p=0,3839) (figura 27).

A análise da curva ROC demonstrou que a expressão de TGFBR1 é capaz de

identificar, mais uma vez, os nódulos benignos com uma especificidade de 85% e VPN

de 97%. Apesar de baixos valores de sensibilidade (47%) e VPP (14%), a acurácia total

do teste foi de 70% (p=0,0001) (figura 28).

As médias de RNAm entre os tipos histológicos estão demonstradas na figura

29. Foram significativas as diferenças entre AF e bócio (p=0,0276), mPT e bócio

(p=0,0027), mPT e AF (p=0,0007), CPT e AF (p=0,0005), mas não entre CPT e bócio

(p=0,0545) e CPT e mPT (p=0,3732).

Figura 27. Box plot com as médias de RNAm (UA) do gene TGFBR1 em

nódulos benignos e malignos e tecido normal tireoidiano e valor de p (teste de Mann-

Whitney).

Expressão RNAm

TGFBR1

p=0,0848

p=0,3839

p=0,0002

0,950±0,690 0,990±0,250 2,400±2,370

70

Figura 28. Curva ROC apresentando pontos de especificidade e sensibilidade da

expressão de RNAm do gene TGFBR1 em nódulos tireoidianos benignos e malignos.

Figura 29. Box plot com as média de RNAm (UA) do gene TGFBR1 entre os


0

20

40

60

80

100

TGFBR1

0 20 40 60 80 100

100-Specificity

Se

nsitiv

ity

Expressão RNAm

TGFBR1

1,065±0,700 0,700 ±0,600 2,200 ±1,450 2,450 ±2,630

71

A expressão de TGFBR1 foi discretamente maior em tumores sem tireoidite

concomitante, multifocais, não encapsulados, com invasão e com metástase, contudo,

novamente, não foram estatisticamente significantes (tabela 32). Também não houve

correlação com tamanho do tumor (p=0,1348).

Tabela 32. Médias de RNAm do gene TGFBR1 entre as características

anatomopatológicas exibidas pelos nódulos malignos avaliados.

Características

anatomopatológicas

n (%)



0,9302 Presente 1,370±1,500


0,3680 Presente 2,765±2,670


0,4075 Presente 2,280±3,070


0,3516 Presente 2,660±2,600

Metástase ao

diagnóstico

Ausente 1,940±1,990 0,1828



4.2.3 Expressão de TGFBR2

Considerando o gene TGFBR2, a maior expressão foi encontrada em tecidos

normais. Essa expressão foi estatisticamente significante quando comparada a tecidos

benignos (p=0,0002) e malignos (p<0,0001). Não houve diferença estatística

comparando nódulos malignos com benignos (p=0,9741) (figura 30), sendo assim não

foi realizada análise de curva ROC.

72

Figura 30. Box plot com as média de RNAm (UA) do gene TGFBR2 em

nódulos benignos e malignos e tecido normal tireoidiano e valor de p (teste de Mann-

Whitney).

A expressão de TGFBR2 nos tipos histológicos de nódulos tireoidianos é

reportada na figura 31. Foram estatisticamente significantes apenas as comparações

entre AF e bócio (p=0,0003) e mPT e AF (p=0,0055), mas não entre CPT e mPT

(p=0,0811), CPT e AF (p=0,0641), CPT e bócio (p=0,6000) e mPT e bócio (p=0,9934).

As médias de expressão desse gene estavam discretamente aumentadas em

tumores com tireoidite concomitante, unifocais, não encapsulados, sem invasão e sem

metástase ao diagnóstico. No entanto, essa diferença não foi estatisticamente

significante como observado na tabela abaixo (tabela 33). Não houve também

correlação com o tamanho do tumor e a expressão de TGFBR2 (p=0,4098).

Expressão RNAm

TGFBR2

0,620±0,700 0,970±0,260 0,530±0,410

p<0,0001 p=0,0002

p=0,9741

73

Figura 31. Box plot com as média de RNAm (UA) do gene TGFBR2 entre os


Tabela 33. Médias de RNAm do gene TGFBR2 entre as características

anatomopatológicas exibidas pelos nódulos avaliados.

Características

anatomopatológicas

n (%)



0,0784 Presente 0,665±0,515


0,9363 Presente 0,500±0,355


0,1886 Presente 0,360±0,265


0,1725 Presente 0,480±0,425

Metástase ao

diagnóstico

Ausente 0,540±0,425 0,8731



Expressão RNAm

TGFBR2

0,770±0,800 0,310±0,240 0,640±0,390 0,490±0,410

74

5. DISCUSSÃO

Evidências na literatura tornam o TGF-β1 e seus receptores objetos de grande

interesse para pesquisas em câncer. Este é o primeiro estudo, de nosso conhecimento, a

avaliar a influência de polimorfismos concomitante à expressão gênica e das proteínas

de TGF-β1, TFβRI e TFβRII em tumores da tireoide. Com exceção do polimorfismo

rs1800472, do gene TGFB1, nenhum outro polimorfismo desse gene ou dos genes

TGFBR1 e TGFBR2 foi reportado na literatura no CDT, de nosso conhecimento.

O polimorfismo rs1800469 é o mais investigado do gene TGFB1 e tem sido

relacionado com uma série de patologias e neoplasias. Este polimorfismo está

localizado numa região de regulação negativa do gene, e associado com diferença na

expressão gênica e concentrações plasmática de TGF-β1 na presença do alelo alterado T

(84, 86, 110). Shah e col. lançaram a hipótese de que o alelo T resulta na perda da

regulação negativa, o que elevaria os níveis do RNAm e prejudicaria a ligação de

fatores de transcrição como fator de hipóxia induzido-1A (HIF1A) (85). Os últimos

trabalhos em câncer têm mostrando resultados ainda controversos. Enquanto que no

estudo caso-controle de Yang e col. (111) os genótipos alterados CT e TT demonstraram

diminuir o risco para câncer endometrial (regressão logística CT+TT versus CC

p=0,0093, OR 0.66 IC95%: 0.48-0.90), no trabalho de Wang e col. (112) os autores

demonstraram pela análise univariada que a herança dos genótipos alterados aumentava

em 76% a chance de metástase em pacientes com tumores cerebrais primários (CT+TT

versus CC p=0,04, OR 1.76 IC95%: 1.12-3.15). Nossos dados não demonstram

associação deste polimorfismo com a suscetibilidade aos nódulos tireoidianos malignos

ou benignos, mas parece existir uma relação com características de agressividade da

doença: os genótipos alterados foram mais frequentes em nódulos não encapsulados

(65%) em relação aos nódulos com cápsula (37%), diferença que o teste exato de Fisher

mostrou ser importante (p=0,0097). Além do mais, o OR indica que a chance do

paciente ter um nódulo não encapsulado é 3 vezes maior se possuir genótipos alterados

de rs1800469 (OR 3.232, IC95%: 1.366-7.647). Tumores tireoidianos encapsulados,

como NIFPTs, por exemplo, possuem menos chances de desenvolveram metástases e

são, geralmente, tumores de boa evolução.

Em relação ao polimorfismo rs1800472, os dados na literatura ainda são

controversos. Este polimorfismo está localizado em uma região cromossômica

importante para a ativação do TGF-β1, a apenas 15 aminoácidos de distância do ponto

75

de clivagem do LAP (peptídeo associado de latência), podendo afetar direta ou

indiretamente a conformação desse peptídeo (82). A troca de uma citosina por uma

timina leva também à troca do aminoácido treonina por uma isoleucina na porção 263

do gene TGFB1, contudo não existem evidências de que tais trocas causem alterações

nas concentrações de TGF-β1, por isso, a hipótese corrente é de que este polimorfismo

poderia estar envolvido somente na ativação da proteína (82). Em 2014, esse

polimorfismo foi correlacionado com otoesclerose em população húngara pela análise

de regressão logística (p=0,015) (113), mas já havia sido previamente associado a essa

patologia em outras populações europeias (82) e numa população tunisiana (114). Este

polimorfismo também foi proposto em associação com osteoporose, contudo, um estudo

realizado em larga escala reunindo quase 29 mil amostras de pacientes de 10 centros

europeus diferentes investigou 5 polimorfismos do TGFB1, incluindo rs1800472 e

rs1800469, mas não encontrou evidências da relação dos genótipos desses

polimorfismos, nem de haplótipos, com densidade óssea e risco de fratura (115). Em

câncer, esse polimorfismo já foi investigado em câncer de bexiga, onde a frequência dos

genótipos não foi diferente entre os 1020 pacientes e 1094 indivíduos controle

(p=0,2200), da mesma forma que não se associou com a progressão do tumor ou

recidiva (116). E, entre todos os polimorfismos analisados pelo nosso grupo, este foi o

único que já havia sido anteriormente estudado em tumores tireoidianos; os autores

encontraram risco para nódulos tireoidianos do tipo papilífero na presença do genótipo

alterado (117). Em nossos dados existe uma correlação do genótipo heterozigoto

polimórfico (AG) com o tipo histológico de CPVF, entretanto, devido ao baixo n

amostras desse tipo histológico em particular, os valores de intervalo de confiança

foram muito elevados. Além disso, demonstramos a relação deste polimorfismo com

características de agressividade do tumor: o genótipo AG se correlacionou com a

presença de metástase ao diagnóstico aumentando em mais de 3 vezes o risco do

paciente ter uma metástase (OR 3.461, IC95%: 1.078 - 11.114, p=0,0469).

Encontramos na literatura apenas um estudo com o polimorfismo rs11466321.

Avaliando pacientes com doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), os autores

encontraram associação deste polimorfismo com o fenótipo da via área (p=0,02,

ajustado para idade, sexo, peso e anos de tabagismo) (118). Mudanças na composição,

conteúdo e organização dos componentes celulares e moleculares das vias aéreas são

definidas como remodelamento das vias aéreas, e essas mudanças podem contribuir

76

diretamente para o estreitamento das vias respiratórias ou prejudicar a contração do

músculo liso das áreas respiratórias (119). Tem-se particular interesse pelo papel de

TGF-β1 em doenças relacionadas à função pulmonar pois células epiteliais brônquicas

geralmente secretam fatores de crescimento, como o TGF-β1, de forma autócrina (120).

Este, por sua vez, induz a proliferação de fibroblastos, aumenta a produção de colágenos

e outras proteínas de matriz extracelular, assim como diminui a degradação deste

colágeno (121), tornando-o importante para doenças como enfisema pulmonar e DPOC.

Em nossa casuística não encontramos diferenças em sua frequência genotípica em

nódulos tireoidianos malignos e benignos, entre os tipos histológicos ou correlação com

dados clínicos e anatomopatológicos dos nódulos analisados.

Outro polimorfismo intrônico analisado foi o rs2241716 que consiste na troca de

uma guanina por uma adenina (84). Wan e col. não constataram diferenças na

frequência genotípica de rs2241716 em portadores de câncer familiar de bexiga e

indivíduos controle na população chinesa (122), achado similar aos nossos em pacientes

com nódulos benignos e malignos da tireoide. Já Lee e col. encontraram associação do

menor alelo T e a porcentagem de densidade mamográfica (PDM), um importante fator

auxiliar de predição ao câncer de mama, em um estudo realizado com mais de 2 mil

mulheres chinesas (123). Mulheres sem filhos e portadoras do alelo alterado T tinham

em média PDM 8,55% maior do que mulheres com o alelo normal (p=0,0003, ajustado

para idade e IMC) (123). Muito provavelmente esse achado se deve ao grande n

amostral do estudo, muito superior ao nosso (n=339) e ao de Wan e col. (n=214). Outros

estudos, também em população asiática, que se propuseram a investigar este

polimorfismo em hipertensos (124) e pacientes com DPOC (125) não reportaram seus

achados, pois o polimorfismo estava em desequilíbrio de ligação na população de

estudo.

O polimorfismo rs8110090, também localizado em região intrônica, consiste na

troca de uma adenina por uma guanina (89). Não existem estudos na literatura que

reportem dados deste polimorfismo em câncer, contudo este já foi estudado em

pacientes com fibrose cística, não demonstrando associações com a variação da função

pulmonar (126), e em pacientes operados para melanoma a fim de investigar o papel do

gene TGFB1 na cicatrização da excisão do tumor (127). A análise multivariada

demonstrou associação deste polimorfismo e o resultado da cicatrização em dois

diferentes momentos, o primeiro avaliando a vascularidade, tamanho e pliabilidade

77

(característica de fragilidade da pele) (p=0,0002) e no segundo momento, com avaliação

adicional da pigmentação (p=0,0002); os autores concluíram que o alelo alterado G

esteve associado com piores resultados de cicatrização (127). Nossos dados

demonstraram baixa frequência do alelo G (0,07) em tumores tireoidianos e, portanto,

não se associou com nenhum parâmetro analisado.

No gene TGFBR1, receptor tipo I de TGF-β1, foram investigados dois

polimorfismos: rs10512263 e rs7850895. Em relação ao rs7850895, encontramos

apenas um estudo que reporta a genotipagem deste polimorfismo em judeus asquenazes

com câncer colorretal, contudo a frequência do heterozigoto polimórfico (única variante

polimórfica encontrada) não diferiu em casos (4,2%) e controles (4,4%) (128). Em

nossa amostra, a frequência do heterozigoto foi maior (15%), mas também não

diferenciou benignos e malignos (p=1,000). Para o polimorfismo rs10512263 Chen e

col. encontraram associação do genótipo heterozigoto em população chinesa com câncer

gástrico sugerindo aumento de suscetibilidade à doença (CT versus CC, regressão

logística ajustada para idade, sexo e tabagismo p=0,033, OR 1.29, IC95%: 1.02–1.62);

essa associação não se repetiu considerando apenas o homozigoto polimórfico (TT

versus CC, p=0,673) ou a soma dos genótipos alterados (CT+TT versus CC, p=0,072)

(129). Em outro estudo com mulheres chinesas de etnia Han, na análise individual a

diferença entre os genótipos de rs10512263 só foi diferente no teste de qui-quadrado

(p=0,0059), mas não na regressão logística no modelo dominante (CT+TT versus CC,

p=0,6240). Autores também realizaram uma análise binária, chamada CART, que

identifica subgrupos de amostras com potencial de risco: mulheres que herdavam os

genótipos alterados de rs10512263 (CT/TT) e o genótipo selvagem do polimorfismo

rs6478974, outro polimorfismo intrônico de TGFBR1, tinham chance 7 vezes maior de

terem câncer endometrial (OR = 7.86, IC95%: 3.42–18.07, p<0,0001) (111). Entretanto,

um grupo de pesquisa do Reino Unido mostrou dados diferentes: o menor alelo T esteve

associado com proteção ao câncer de mama em mulheres britânicas com câncer de

mama (OR 0.87, IC95%: 0.81-0.95, p=0,001) (130). Em nódulos tireoidianos, nossos

dados não demonstram relação deste polimorfismo com suscetibilidade, contudo os

genótipos alterados foram mais frequentes em nódulos sem invasão (43%) quando

comparados ao grupo de nódulos com invasão capsular, vascular ou linfática (22%),

sugerindo também um efeito protetor (OR 0.3715, IC95%: 0.1698 - 0.8127, p=0,0173).

As diferenças desses resultados muito provavelmente se devem ao diferente background

78

genético das populações estudadas. Considerando-se a elevada heterogeneidade da

população brasileira, este dado merece maior investigação pois tem potencial

importância clínica, se comprovado.

O último polimorfismo investigado, rs2228048 do gene TGFBR2, não

demonstrou correlação com nenhum parâmetro avaliado. O genótipo homozigoto

selvagem foi presente em 97 e 95% dos nódulos benignos e malignos, respectivamente.

Ikeda, H. encontrou por sequenciamento direto 29% dos prolactinomas investigados

com substituição de base C por T (131), similar ao estudo de Lim e col. (132) que

encontraram frequência de 28% do alelo alterado T nos controles, mas somente em 25%

entre os casos de pacientes com acidente vascular cerebral (AVC) isquêmico e em

18,5% em pacientes com AVC hemorrágico também pela técnica de sequenciamento

direto. A frequência do alelo T foi maior e estatisticamente significante em pacientes

hemorrágico que em controles (OR 1.70, IC95%: 1.20-2.42, p = 0,003), sendo associado

ao aumento de risco para a doença, mas não comparando o grupo isquêmico e controles

(OR 1.12, IC95%: 0.79−1.59, p=0,53) (132). Este polimorfismo já havia sido

previamente associado à prevalência de doença renal crônica em população japonesa

(133). Não existem, até o momento, estudos que relatem a função deste polimorfismo.

Em diversos tipos celulares o TGF-β1 é responsável pelo controle da

proliferação celular que se dá, principalmente, pelo controle do ciclo celular e pela

indução da morte celular programada através da transcrição de genes pró-apoptóticos

mediada pelas SMADs (134-136). Na tireoide, a sinalização de TGF-β1 controla a

função e diferenciação das células foliculares tireoidianas através da regulação

transcricional de genes como PAX8 e TTF1, fatores de transcrição tireoide específicos,

que por sua vez, controlam a transcrição de genes que codificam moléculas importantes

para o funcionamento da célula tireoidianas como a tireoglobulina (Tg), a tiroperoxidase

(TPO), o transportador de sódio iodeto (NIS) e o receptor do hormônio tireoestimulante

(TSH-R) (137, 138).

Não é novidade dizer que a expressão de TGF-β1 se encontra aumentada em

células malignas. De fato, isso tem sido demonstrado em variados tipos de tumor e

extensamente relacionado com a progressão destes. Os primeiros trabalhos com

avaliação da expressão de TGF-β1 em tecidos tireoidianos datam a década de 90 (139,

140). Em 1999, Kimura e col. evidenciaram, por análise imunoistoquímica, a maior

expressão de TGF-β1 em CDT e bócios comparados ao tecido normal tireoidiano (141)

79

e desde então uma série de dados vêm sendo publicados a fim de melhor delinear o

papel do gene TGFB1 e de seus receptores TGFBR1 e TGFBR2.

Em um estudo piloto, Brace e col. realizaram a quantificação do RNAm de

TGFB1 e TGFB2 por PCRq em 23 amostras de bócios e 24 CPT. As médias de RNAm

foram maiores nos papilíferos do que nos bócios considerando TGFB1 (p<0,0001), mas

não TGFB2 (p=0,4735) (142). Kajdaniuk e col. foram o primeiro grupo a investigar

simultaneamente a expressão de TGFB1 e seus receptores TGFBR1 e TGFBR2 por PCR

em Tempo Real no tecido tireoidiano. Usando 6 CPT, 27 bócios multinodulares

atóxicos (BMA), 22 bócios multinodulares tóxicos (BMT) e 8 tecidos com a doença

autoimune de Graves (DG), os autores encontraram diferenças entre CPT e BM

(p=0,015) e CPT e DG (p=0,001) para o gene TGFB1, sempre com o tecido maligno

apresentando maior expressão do que os benignos, e CPT e BMT (p=0,0118) e CPT e

DG (p=0,0019) para o gene TGFBR2,sendo que para este último, a maior expressão foi

encontrada no tecido benigno (143). Os autores também realizaram a quantificação de

TGFB1 no sangue desses pacientes e concluíram que essa expressão não refletia o

processo patológico que ocorre na glândula (143). Os dados encontrados por nós vão de

encontro aos disponíveis na literatura: encontramos maior expressão de TGFB1 no

tecido neoplásico maligno comparado ao tecido benigno (2,320±1,410 versus

1,080±0,740 UA, p<0,0001) e ao tecido normal (2,320±1,410 versus 0,990±0,250 UA,

p<0,0001), e mostramos com os valores de especificidade (72%) e VPN (98%)

encontrados na curva ROC que este gene pode ser útil para auxiliar na exclusão de

malignidade dos nódulos indeterminados. Demonstramos também, pela correlação de

Spearman, que a expressão de TGFB1 é maior em tumores de menor diâmetro

(p=0,04486, correlação negativa R= -0.1768); de fato, dentre os tipos histológicos

analisados, os mPT foram os que apresentaram as maiores de médias de expressão de

RNAm.

Recentemente Eloy e col., a fim de avaliar a relação de TGF-β1 com

agressividade tumoral, propuseram uma divisão dos tumores tireoidianos malignos

como carcinomas bem delimitados, para aqueles sem características infiltrativas e

metástase linfonodal, e carcinomas pobremente delimitados, para os que apresentavam

tais características (infiltração e metástase linfonodal). Usando tal critério, os autores

evidenciaram, por análise imunoistoquímica, que a expressão citoplasmática de TGF-β1

era menor no centro dos carcinomas bem delimitados e essa expressão aumentava à

80

medida que os tumores demonstravam evidências de invasão (144), reforçando a

hipótese de que este gene seja importante para a progressão do tumor e sua

agressividade.

Em relação aos receptores, o TGFBR1 também demonstrou maior expressão de

RNAm nos tecidos malignos em comparação aos benignos, contudo a análise de

potencial diagnóstico revelou uma acurácia não satisfatória (72%). Já para o receptor do

tipo II (TGFBR2) foi evidenciada perda de expressão do RNAm em tecidos malignos e

benignos em relação ao tecido normal. Os dados de literatura apontam para uma

participação da sinalização de TGF-β1, assim como seus receptores e as proteínas

SMADs, nas neoplasias humanas (93, 94). Hachim e col., de fato, constataram menor

expressão de RNAm dos receptores TGFBR1 e TGFBR2 no câncer de mama

comparado ao tecido normal adjacente (no caso de TGFBR1 não obtiveram

significância estatística), assim como na avaliação imunoistoquímica, sendo a expressão

de TβR1 positiva em 100% dos tecidos benignos, mas apenas em 71% dos malignos

com presença de invasão e 66% dos carcinomas in situ e a expressão de TβR2 em

100%, 75% e 67%, respectivamente, nos 3 grupos (145). A diferença entre os resultados

encontrados pelo nosso grupo e o de Hachim e col. (145), considerando o receptor I,

pode ser explicada pelo padrão de expressão da proteína TβR1 que encontramos no

tecido tireoidiano, além do fato do tipo de tecido analisado (mama e tireoide) ter

diferentes particularidades. Nossa análise imunoistoquímica superficial demonstrou

acentuada expressão de TβR1 nos vasos dispostos no tumor tireoidiano e fraca

expressão desta proteína no próprio tecido (dados não demonstrados). Este padrão não

foi reportado em outros estudos, de nosso conhecimento. Lazzereschi e col. já haviam

previamente constatado a diminuição da expressão de RNAm de TGFBR2, pela técnica

de Northern Blot, em tumores malignos da tireoide como CPT, CFT e CAT em relação

à tecidos normais adjacentes e adenomas (146). Essa perda de expressão de TGFBR2 no

epitélio resulta no aumento da expressão de quimiocinas como CXCL1 e CXCL5 e do

gene BST2 (bone marrow stromal antigen 2) e diminuição da expressão de CXCL12 e

genes como PDGFB e CTGF; quimiocinas e genes frequentemente associados com pior

prognóstico em diferentes neoplasias (108).

Apesar de não apresentaram diferenças estatisticamente significantes, notamos

elevada expressão de RNAm de TGFBR1 em nódulos malignos não encapsulados, com

presença de invasão e presença de metástase linfonal. A presença de TGFBR1 tem sido

81

relacionada com o aumento da angiogênese em tumores de mama e pâncreas, e nossa

hipótese é que o mesmo deve acontecer nos tumores tireoidianos, já que a sinalização

ativada de TGF-β1 promove a expressão das metaloproteases de matriz que causam a

degradação da matriz extracelular e, consequentemente, facilita o acesso de fatores de

crescimento como VEGF e TGF-β1, resultando no aumento da angiogênese e invasão

tumoral.

Embora as características de agressividade e progressão tumoral que estreitam a

relação tumor e TGF-β1 não sejam frequentes em nossa casuística, nossos dados

suportam a participação de TGF-β1 e dos receptores TβRI e TβRII no processo

patológico que ocorre na glândula durante a transformação maligna. Evidências na

literatura sugerem que não somente a via do TGF-β1, mas também interações desta via

com células do sistema imune e outras proteínas presentes no microambiente tumoral

modulam o comportamento da célula neoplásica (147).

82

6. RESUMO DOS ACHADOS

O gene TGFB1 demonstrou associação de dois polimorfismos (rs1800469 e

rs1800472) com características de agressividade do tumor como ausência de cápsula e

metástase linfonodal ao diagnóstico e o genótipo alterado. Sua expressão gênica foi

maior em tecidos malignos, demonstrando satisfatório potencial diagnóstico (acurácia

de 82%), assim como tumores de menor diâmetro apresentavam maiores quantidades de

RNAm.

No gene TGFBR1, o polimorfismo rs10512263 demonstrou associação do

genótipo alterado com ausência de invasão. Tumores malignos apresentavam maior

expressão de RNAm.

No gene TGFBR2 foi constatada a perda de expressão de RNAm no tecido

maligno e benigno comparado ao tecido normal.

83

7. CONCLUSÃO

A expressão gênica de TGFB1 pode ser uma ferramenta útil para auxiliar no

diagnóstico de nódulos benignos da tireoide.

Polimorfismos do gene TGFB1 e de seu receptor TGFBR1, mas não de

TGFBR2, podem auxiliar na caracterização de tumores mais ou menos agressivos,

auxiliando na determinação do prognóstico de pacientes com CDT. Contudo, mais

estudos com um maior número amostral e seguimento prolongado dos pacientes são

necessários para confirmar esses dados.

84

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ANEXO

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE …repositorio.unicamp.br/bitstream/REPOSIP/331055/1/Peres... · MURILO VIEIRA GERALDO 3. PROF A. DRA. GLAUCIA MARIA FERREIRA DA SILVA