UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE …repositorio.unicamp.br/bitstream/REPOSIP/331659/1/Fernandes_Rafael... · RAFAEL DA SILVA FERNANDES ... Orientador: prof. Dr. Ivo

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

INSTITUTO DE QUÍMICA

RAFAEL DA SILVA FERNANDES

POLÍMEROS MOLECULARMENTE IMPRESSOS COM ESTRUTURA

CAROÇO-CASCA PARA EXTRAÇÃO DE ÁCIDO ASCÓRBICO,

CAFEÍNA E VANILINA

CAMPINAS

2018

RAFAEL DA SILVA FERNANDES

POLÍMEROS MOLECULARMENTE IMPRESSOS COM ESTRUTURA

CAROÇO-CASCA PARA EXTRAÇÃO DE ÁCIDO ASCÓRBICO,

CAFEÍNA E VANILINA

Tese de Doutorado apresentada ao

Instituto de Química da Universidade

Estadual de Campinas como parte dos

requisitos exigidos para a obtenção do

título de Doutor em Ciências

Orientador: prof. Dr. Ivo Milton Raimundo Junior

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA

PELO ALUNO RAFAEL DA SILVA FERNANDES E ORIENTADA PELO PROF. DR.

IVO MILTON RAIMUNDO JUNIOR

CAMPINAS

2018

Agência(s) de fomento e nº(s) de processo(s): CAPES

ORCID: http://orcid.org/0000-0001-6797-9119

Ficha catalográfica

Universidade Estadual de Campinas

Biblioteca do Instituto de Química

Camila Barleta Fullin - CRB 8462

Fernandes, Rafael da Silva, 1988-

F391p FerPolímeros molecularmente impressos com estrutura caroço-casca para

extração de ácido ascórbico, cafeína e vanilina / Rafael da Silva Fernandes. –

Campinas, SP : [s.n.], 2018.

FerOrientador: Ivo Milton Raimundo Junior.

FerTese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de

Química.

Fer1. Polímeros de impressão molecular. 2. Caroço-casca. 3. Microesferas. 4.

Extração seletiva. 5. Adsorção. I. Raimundo Júnior, Ivo Milton, 1961-. II.

Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Química. III. Título.

Informações para Biblioteca Digital

Título em outro idioma: Molecularly imprinted polymers with core-shell structure for

extraction of ascorbic acid, caffeine and vanillin Palavras-chave em inglês:

Molecularly imprinted polymer

Core-shell

Microspheres

Selectivity extraction

Adsorption

Área de concentração: Química Analítica

Titulação: Doutor em Ciências

Banca examinadora:

Ivo Milton Raimundo Junior [Orientador]

Italo Odone Mazali

Susanne Rath

Claudete Fernandes Pereira

Maria Del Pilar Taboada Sotomayor

Data de defesa: 23-02-2018

Programa de Pós-Graduação: Química

BANCA EXAMINADORA

Prof. Dr. Ivo Milton Raimundo Junior (Orientador)

Profa. Dra. Maria Del Pilar Taboada Sotomayor (UNESP)

Profa. Dra. Claudete Fernandes Pereira (UFPE)

Prof. Dr. Italo Odone Mazali (IQ-UNICAMP)

Profa. Dra. Susanne Rath (IQ-UNICAMP)

A Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no

processo de vida acadêmica do(a) aluno(a).

Este exemplar corresponde à redação final da Tese de

Doutorado defendida pelo aluno RAFAEL DA SILVA

FERNANDES, aprovada pela Comissão Julgadora em

23 de fevereiro de 2018.

DEDICATÓRIA

A minha família, por todo amor

incondicional, dedicação, carinho e

ensinamentos. Em especial aos meus pais

(Francisco de Assis e Antônia Maria), a

minha esposa (Fernanda Karoline) e ao

meu filho (Luiz).

AGRADECIMENTOS

A Deus pela oportunidade de ter chegado onde estou, pelas pessoas que

existem na minha vida e pela força e coragem para viver longe da minha família.

Aos meus pais Francisco e Antônia, como também aos meus demais familiares

por todo amor, atenção, carinho e incentivo.

A minha esposa e amiga Fernanda, por todo amor, paciência e companheirismo.

Ao meu orientador e amigo Prof. Dr. Ivo Milton Raimundo Jr., pela orientação,

confiança e oportunidade de desenvolver este trabalho.

Aos professores Jarbas Rohwedder e Celio Pasquini, por suas respectivas

contribuições no andamento desse projeto.

Ao Prof. Dr. Boris Mizaikoff e os demais membros do Institut für Analytische und

Bioanalytische Chemie (IABC) da Universidade de Ulm/Alemanha pela orientação,

apoio científico e excelente ambiente de trabalho.

A todos os meus amigos dos grupos GIA, LQA e GEATOM, pelo apoio e amizade

ao longo do mestrado e doutorado.

Aos técnicos e demais funcionários do IQ-UNICAMP, por todo empenho, que

permitiram o desenvolvimento desse trabalho, em especial ao técnico e amigo Diego

Campaci por toda sua dedicação e eficiência no auxílio de algumas etapas.

Às instituições CNPq, INCTAA e IQ-UNICAMP, sem as quais não seria possível

desenvolver este trabalho.

Aos professores do IQ-UNICAMP e do IQ-UFRN, que contribuíram imensamente

para a minha formação profissional e pessoal.

A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela

bolsa concedida.

Ao meu amigo Sergio Ruschi por todo companheirismo criado durante esse

período dentro e fora da universidade.

RESUMO

Este trabalho descreve a síntese de três polímeros molecularmente impressos

(MIP) com estrutura caroço-casca para extração de ácido ascórbico, cafeína e vanilina

por meio de extração em fase sólida e método de incubação. Objetivando identificar,

compreender e controlar os parâmetros envolvidos na síntese dos polímeros

impressos, foram desenvolvidos diversos MIP a partir de partículas porosas e não

porosas, funcionalizadas e não funcionalizadas, em dimensões nano- e

micrométricas. Os caroços inorgânicos compostos por nano- e micromateriais foram

sintetizados com base nos métodos de Stöber e de macroemulsão de água em óleo,

respectivamente. A camada polimérica impressa (casca) foi produzida na superfície

das partículas inorgânicas (caroço) de três formas distintas, apresentando em comum

o uso de monômero funcional, agente de reticulação, iniciador e solvente porogênico,

além da molécula molde. A camada polimérica não impressa (NIP) foi fabricada

igualmente ao MIP, mas sem a presença da molécula molde. Além disso, foram

realizados cálculos teóricos das condições de espontaneidade de síntese baseado na

teoria do funcional da densidade. Os materiais sintetizados foram caracterizados por

MIR-ATR, SEM, EDX e isoterma de adsorção-dessorção. As propriedades de ligação

foram demonstradas pela capacidade de adsorção e o fator de impressão obtido com

base nas medidas de absorção UV-VIS. Além disso, as condições de síntese foram

otimizadas de modo que a eficiência de impressão e a capacidade de adsorção

fossem maximizadas. Finalmente, foi demonstrado que os métodos propostos

geraram microesferas híbridas com estrutura caroço-casca capazes de fornecer

rápida adsorção, expressiva capacidade de ligação (até 5,64 mg g-1), excelentes

fatores de impressão (até 2,37) e um número significativo de reutilizações (> 20). Dois

estudos comparativos envolvendo a extração simultânea de ácido ascórbico e ácido

cítrico, vanilina e etilvanilina, permitiram verificar a seletividade dos MIP em soluções

padrão, que apresentou um fator de impressão de até 2,27. O MIP desenvolvido para

extração de vanilina apresentou um fator de impressão de 1,34 para amostras

comerciais contendo vanilina a e etilvanilina.

ABSTRACT

This work describes the synthesis of three molecularly printed polymers (MIP)

with core-shell structure for extraction of ascorbic acid, caffeine and vanillin, by means

of solid phase extraction and incubation method. In order to identify, understand and

control the parameters involved in the synthesis of the imprinted polymers, several MIP

were developed based on porous and non-porous, functionalized and non-

functionalized particles, with nano- and micrometer dimensions. The inorganic core

comprised of nano- and micromaterials were synthesized based on the Stöber and

water-in-oil macroemulsion methods, respectively. The imprinted polymeric layer

(shell) was produced on the surface of the inorganic particles in three distinct ways,

exhibiting in common the use of functional monomer, crosslinking agent, initiator and

porogenic solvent, besides the template molecule. In addition, theoretical calculation

of spontaneity conditions for the synthesis based on the density functional theory was

performed. The synthesized materials were characterized by MIR-ATR, SEM, EDX

and adsorption-desorption isotherm. The binding properties were demonstrated by the

adsorption capacity and the imprinting factor obtained by means of UV-Vis

measurements. In addition, the synthesis conditions were optimized so that imprinting

efficiency and adsorption capacity were maximized. Finally, it was demonstrated that

proposed methods of generating hybrid microspheres with core-shell structure capable

of providing fast adsorption, expressive binding capacity (up to 5.64 mg g-1), excellent

imprinting factors (up to 2.37) and a significant number of reuse (> 20). Two

comparative studies involving the simultaneous extraction of ascorbic acid and citric

acid, vanillin and ethylvanillin allowed to verify the excellent selectivity of MIP in

standard solutions, which presented imprinting factor of up to 2.27. The MIP developed

for vanillin extraction showed imprinting factor of 1.34 for commercial samples

containing vanillin and ethylvanillin.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - 1. Número de publicações sobre polímeros impressos de 1995 a 2018 de

acordo com o mecanismo de busca Web of Science usando o termo "polímero de

impressão molecular". ............................................................................................... 23

Figura 1 - 2. Representação esquemática da decomposição do iniciador (AIBN) (I) e

passo de adição do monômero (Ácido acrílico) (II). .................................................. 29

Figura 1 - 3. Representação esquemática do passo de propagação do monômero

(Ácido acrílico). .......................................................................................................... 30


(Ácido acrílico). .......................................................................................................... 31

Figura 1 - 5. Representação esquemática do mecanismo de ativação/desativação por

polimerização RAFT. ................................................................................................. 32

Figura 1 - 6. Monômeros funcionais comuns utilizados na síntese de polímeros

impressos. ................................................................................................................. 34

Figura 1 - 7. Estruturas químicas dos agentes de reticulação. .................................. 35

Figura 1 - 8. Estrutura química de iniciadores comuns utilizados na impressão

molecular não covalente. .......................................................................................... 49

Figura 2 - 1. Ilustração esquemática da preparação do MSF@MIP. O MSF@NIP

correspondente foi preparado com a mesma rota de síntese na ausência da molécula

molde. ....................................................................................................................... 57

Figura 2 - 2. Micrografias das (a) MS, (b) MSF, (c) MSF@MIP, (d) MSF@NIP, (e) e (f)

MSF@MIP colapsado. .............................................................................................. 63

Figura 2 - 3. Os espectros de IR-ATR das (a) MSF@NIP, (b) MSF@MIP, (c) MS e (d)

MSF. .......................................................................................................................... 64

Figura 2 - 4. Interação das MSF com a ninidrina em solução alcoólica. ................... 65

Figura 2 - 5. Capacidade de adsorção do MSF@MIP e do MSF@NIP em função da

concentração de AA usando o método (a) SPE e o (b) método incubação. ............. 66

Figura 2 - 6. Recuperação de AA usando MSF@MIP reutilizado.............................. 68

Figura 2 - 7. Estudo da seletividade do MSF@MIP e do MSF@NIP para extração do

AA e do CA. .............................................................................................................. 69

Figura 2 - 8. Geometria do AA e dos monômeros otimizadas pelo método B3LYP/6-

31G (d,p), no vácuo. Na molécula de AA, quanto mais intenso a cor, menor a carga

.................................................................................................................................. 70

Figura 2 - 9. Cálculo teórico no vácuo dos possíveis sítios de ligação da molécula de

AA com diferentes monômeros. ................................................................................ 71

Figura 2 - 10. Cálculo teórico para avaliação do efeito do solvente sobre a energia

envolvida na interação entre molécula molde e monômero.. .................................... 72

Figura 2 - 11. Relação entre a distância do oxigênio e hidrogênio nos monômeros e a

espontaneidade das interações entre monômero e molécula molde..........................73

Figura 2 - 12. Estimativa energética sobre o efeito causado pela modificação do

monômero ácido metacrílico com espécies eletronegativas.......................................74

Figura 3 - 1. Esquema representativo da preparação do MIP e do NIP. ................... 79

Figura 3 - 2. Espectros de IR-ATR das (a) MS1, (b) MS1F, (c) MS1F@MIP e (d)

MS1F@NIP. .............................................................................................................. 83

Figura 3 - 3. Micrografias de (a) MS1, (b) MS1F, (c) MS2, (d) MS2F, (e) MS1@MIP,

(f) MS1F@MIP, (g) MS2@MIP, (h) MS2F@MIP, (i) MS1@NIP, (j) MS1F@NIP, (l)

MS2@NIP e (k) MS2F@NIP. .................................................................................... 84

Figura 3 - 4. Micrografias de (a) MS1@MIP colapsada e (b MIPs tradicionais sem

morfologia definida. ................................................................................................... 85

Figura 3 - 5. Capacidade de adsorção do MS1@MIP em (a) função do tempo e (b) do

pH. ............................................................................................................................. 88

Figura 3 - 6. Capacidade de adsorção do MS1@MIP e MS1@NIP em função da

concentração de vanilina usando o (a) método SPE e o (b) método da incubação. . 88

Figura 3 - 7. Capacidade de adsorção do MS2@MIP e MS2F@NIP em função da

concentração de vanilina usando o método da incubação. ....................................... 89

Figura 3 - 8. Capacidade de adsorção do (a) MS1F@MIP, MS1F@NIP, (b)

MS2F@MIP e MS2F@NIP em função da concentração de vanilina usando o método

da incubação. ............................................................................................................ 90

Figura 3 - 9. Estudo da seletividade do MS1F@MIP e do MS1F@NIP para extração

de vanilina e etilvanilina. ........................................................................................... 93


de vanilina e etilvanilina de amostras reais. .............................................................. 94

Figura 4 - 1. Espectro no infravermelho médio das NPSA, NPS, NPSA@MIP e

NPSA@NIP. ............................................................................................................ 101

Figura 4 - 2. Micrografias das NPS (a), NPSA (b), NPSA@MIP (c) e NPSA@NIP (d).

................................................................................................................................ 102

Figura 4 - 3. Medidas de tamanho de partícula e potencial zeta das NPS, NPSA,

NPSA@MIP e NPSA@NIP em suspensão obtidas por DLS. ................................. 103

Figura 4 - 4. Avaliação do solvente na capacidade de ligação. (A) 25/75 % v/v

H2O/ACN, (B) 50/50 % v/v H2O/ACN, (C) 75/25 % v/v H2O/ACN, (D) 85/15% v/v

H2O/ACN, (E) 90/10 % v/v H2O/ACN, (F), 5/95 % v/v H2O/ACN. ............................ 104

Figura 4 - 5.Capacidade de ligação do NPSA@MIP em função do tempo ............. 105

Figura 4 - 6. Capacidade de adsorção do NPSA@MIP e do NPSA@NIP em função da

concentração de cafeína usando o método da incubação. ..................................... 106

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - 1. Resumo dos diferentes métodos de preparação dos MIPs. ................. 27

Tabela 1 - 2. Lista de isotermas de adsorção com as suas respectivas equações

linearizadas e não linearizadas. ................................................................................ 48

Tabela 2 - 1. Dados obtidos a partir das medidas da área superficial, tamanho e

volume de poros e tamanho de partícula obtidas a partir do BET, BJH e MEV,

respectivamente. ....................................................................................................... 79

Tabela 2 - 2. Parâmetros das isotermas para adsorção de AA utilizando MSF@MIP e

MSF@MIP.. ............................................................................................................... 81

Tabela 3 - 1. Dados obtidos a partir das medidas da área superficial e de tamanho de

partícula. Na determinação da área superficial o método BET foi utilizado. ........... 101

Tabela 3 - 2. Parâmetros das isotermas para ajuste dos dados. .......................... 1048

LISTA DE ABREVIAÇÕES

AA Ácido ascórbico

AC Ácido cítrico

AIBN 2,2’-azobisisobutironitrilo

AM1 Austin model 1

APTES Aminopropiltrietoxisilano

APTMS Aminopropiltrimetoxisilano

ATRP Atom Transfer Radical Polymerization (Polimerização radicalar por

transferência de átomos

BET Brunauer, Emmett e Teller

BJH Brunauer, Joyner e Halenda

DFT Density Functional Theory (Teoria do funcional da densidade)

EDX Energy-dispersive X-ray spectroscopy (Espectroscopia de Raios X por

Dispersão em Energia)

EGDMA Etilenoglicol dimetacrilato

ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (Ensaio de Imunoabsorção

Enzimática)

EMQ Erro Médio Quadrático

HPC Hydroxypropyl Celulose (Hidroxipropilcelulose)

HPLC High performace liquid chromatography (Cromatografia líquida de alta

eficiência)

LC-MS Liquid Chromatography–Mass Spectrometry (Cromatografia líquida com

espectrômetro de massa)

LPE Liquid Phase Extraction (Extração em fase líquida)

MAE Microwave-assisted extraction (Extração assistida por micro-ondas)

MIP Molecularly imprinted polymer (Polímero molecularmente impresso)

MIR - ATR Mid-infrared attenuated total reflectance (Infravermelho médio com

reflectância total atenuada)

MISPE Molecularly Imprinted Solid Phase Extraction (Extração em Fase Sólida

Impressa Molecularmente)

MIT Molecularly Imprinted Technology (Tecnologia de Impressão Molecular)

NMP Nitrogen-mediated polymerization (Polimerização mediada por

nitróxido)

NMP Nitroxide-mediated polymerization (polimerização mediada por nitróxido)

NMR Nuclear magnetic resonance (Ressonância magnética nuclear)

QDs Quantum dots (Pontos quânticos)

RAFT Reversible addition-fragmentation chain transfer (Transferência

reversível de cadeia por adição-fragmentação)

SEM Scanning eletronic microscopy (Microscopia eletrônica de varredura)

SERS Surface-enhanced Raman spectroscopy (Espectroscopia Raman

amplificada por superfície)

SPE Solid Phase Extraction (Extração em Fase Sólida).

TEM Transmission eletronic microscopy (Microscopia eletrônica de

transmissão)

TEOS Tetraetoxissilano

UAE Ultrasonic Assisted Extraction (Extração Assistida por Ultrassom)

UV/VIS Ultravioleta/Visível

SUMÁRIO

PREFÁCIO ................................................................................................................ 19

CAPÍTULO 1 ............................................................................................................. 21

1. Polímero Molecularmente Impresso ................................................................ 21

1.1. Introdução ................................................................................................. 22

1.2. Métodos de Impressão Molecular ............................................................. 25

1.2.1. Síntese dos MIPs ................................................................................... 25

1.2.2. Mecanismo de Polimerização ................................................................. 28

1.2.2.1. Polimerização por Radicais Livres ................................................ 28

1.2.2.1.1. Iniciação ............................................................................... 29

1.2.2.1.2. Propagação ......................................................................... 29

1.2.2.1.3. Término ................................................................................ 30

1.2.2.2. Polimerização Radicalar Controlada............................................. 31

1.2.3. Reagentes e Condições Utilizados em Impressão Molecular................. 33

1.2.3.1. Molécula Molde ............................................................................ 33

1.2.3.2. Monômero Funcional .................................................................... 34

1.2.3.3. Agente de Reticulação .................................................................. 35

1.2.3.4. Iniciador ........................................................................................ 36

1.2.3.5. Solvente Porogênico ..................................................................... 37

1.2.4. Caracterização dos MIPs ....................................................................... 37

1.2.4.1. Caracterização Química ............................................................... 38

1.2.4.2. Caracterização Morfológica .......................................................... 39

1.2.4.3. Caracterização dos Sítios de Ligação .......................................... 39

1.2.4.3.1. Método de Incubação .......................................................... 40

1.2.4.3.2. Método MISPE ..................................................................... 40

1.2.5. Adsorção ................................................................................................ 41

1.2.5.1. Cinética de Adsorção .................................................................... 42

1.2.5.1.1. Modelo de Pseudo–Primeira Ordem .................................... 42

1.2.5.1.2. Modelo de Pseudo–Segunda Ordem ................................... 43

1.2.5.1.3. Difusão Intrapartícula ........................................................... 44

1.2.5.2. Isotermas de adsorção ................................................................. 44

1.2.5.2.1. Modelo de Langmuir ............................................................ 45

1.2.5.2.2. Modelo de Scatchard ........................................................... 46

1.2.5.2.3. Modelo de Freundlich .......................................................... 46

1.2.5.2.4. Modelo de Sips .................................................................... 47

1.2.6. Funções de erro ..................................................................................... 47

1.2.6.1. Coeficiente de Determinação (R2) ................................................ 48

1.2.6.2. Erro Médio Quadrático (EMQ) ...................................................... 49

1.2.7. Aplicações .............................................................................................. 49

1.3. Objetivos ................................................................................................... 51

CAPÍTULO 2 ............................................................................................................. 52

2. Polímeros Impressos em Superfície de Microesferas de Sílica Porosa Amino-

Funcionalizadas para Extração Seletiva de Ácido Ascórbico ................................. 52

2.1. Introdução ................................................................................................. 53

2.2. Parte Experimental ................................................................................... 55

2.2.1. Reagentes .............................................................................................. 55

2.2.2. Fabricação do MIP na Superfície das Partículas .................................... 55

2.2.2.1. Síntese de Microesferas de Sílica (MS) ........................................ 55

2.2.2.2. Funcionalização das MS (MSF) .................................................... 56

2.2.2.3. Preparação do MIP para AA ......................................................... 56

2.2.3. Caracterização ....................................................................................... 58

2.2.4. Avaliação das Características de Ligação e Capacidade de Adsorção .. 58

2.2.4.1. Estudo de Incubação .................................................................... 58

2.2.4.2. Estudo de SPE ............................................................................. 59

2.2.4.3. Reconhecimento Específico do MSF@MIP e MSF@NIP ............. 60

2.2.5. Método de Cálculo ................................................................................. 60

2.3. Resultados e Discussão............................................................................ 61

2.3.1. Síntese das MS e do MIP com Estrutura Caroço-Casca ........................ 61

2.3.2. Caracterização ....................................................................................... 62

2.3.3. Estudo de Adsorção ............................................................................... 66

2.3.4. Otimização Estrutural do Monômero e Molécula Molde ......................... 69

2.3.1. Seleção Teórica do Monômero Funcional e do Solvente ....................... 70

CAPÍTULO 3 ............................................................................................................. 75

3. Impressão Molecular Superficial em Microesferas de Sílica, Porosas e Não-

Porosas, para Extração Seletiva de Vanilina ......................................................... 75

3.1. Introdução ................................................................................................. 76


3.2.1. Reagentes .............................................................................................. 78

3.2.2. Preparação do MIP para Extração de Vanilina ....................................... 78

3.2.2.1. Síntese das MS ............................................................................ 78

3.2.2.2. Fabricação do MIP ........................................................................ 78

3.2.3. Avaliação das Características e da Capacidade de Adsorção ............... 79

3.2.3.1. Estudo de Adsorção – Método da Incubação ............................... 79

3.2.3.2. Estudo de Adsorção – SPE .......................................................... 80

3.2.3.3. Reconhecimento Específico ......................................................... 81

3.2.3.4. Aplicação em Amostras Reais ...................................................... 81

3.3. Resultados e Discussão............................................................................ 81

3.3.1. Síntese das Partículas de Sílica e do MIP com Estrutura Caroço-Casca ..

............................................................................................................... 81

3.3.2. Caracterização ....................................................................................... 82


3.3.3.1. Estudo de Recuperação ............................................................... 92

3.3.3.2. Estudo de Seletividade e Aplicação em Amostra Real ................. 92

CAPÍTULO 4 ............................................................................................................. 95

4. Síntese do MIP na Superfície de Nanopartículas de Sílica Para Extração

Seletiva de Cafeína ................................................................................................ 95

4.1. Introdução ................................................................................................. 96


4.2.1. Reagentes .............................................................................................. 97

4.2.2. Síntese de Nanopartículas de Sílica Amino-Funcionalizadas (NPSA) ... 97

4.2.3. Síntese do MIP de Superfície em Nanopartículas de Sílica Amino-

Funcionalizadas (NPSA) ................................................................................. 98

4.2.4. Caracterização ....................................................................................... 98


4.3. Resultado e Discussão ............................................................................. 99

4.3.1. Síntese das NPSA e do NPSA@MIP ..................................................... 99

4.3.2. Caracterização ..................................................................................... 100

4.3.3. Estudo da Capacidade de Adsorção .................................................... 103

CAPÍTULO 5 ........................................................................................................... 107

5. Conclusões e Perspectivas ........................................................................... 107

Referências .......................................................................................................... 111

Prefácio 19

Rafael da Silva Fernandes Tese de Doutorado – IQ/UNICAMP

PREFÁCIO

Este trabalho tem como propósito descrever a síntese e aplicação de três

polímeros impressos, com estrutura caroço-casca, para extração seletiva de ácido

ascórbico, cafeína e vanilina. Essa tecnologia foi desenvolvida em parceria com o

Instituto de Analítica e Bioanalítica da Universidade de Ulm, Alemanha, sob a

supervisão do professor Dr. Boris Mizaikoff.

Para melhor entendimento, essa Tese foi dividida em 5 capítulos visando facilitar

a compreensão das metodologias utilizadas, bem como os resultados obtidos,

seguindo uma ordem cronológica.

O capítulo 1 contém uma introdução geral sobre polímeros impressos,

convencionais e com estrutura caroço-casca, abordando aspectos relevantes, cujo

objetivo é apresentar informações básicas relevantes, para facilitar a interpretação dos

resultados obtidos.

Nos capítulos 2 e 3 são descritas a síntese, a caracterização e a aplicação dos

polímeros impressos para ácido ascórbico e vanilina, respectivamente, a partir de

microesferas de sílica funcionalizadas, porosas e não-porosas, produzidas pelo

método da macroemulsão. Ainda nesses capítulos, são descritos o estudo

comparativo entre o método de extração em fase sólida e o método de incubação,

ambos avaliados através da espectrofotometria UV/VIS. A tecnologia de impressão

molecular descrita no capítulo 2 apresenta alguns aspectos científicos inéditos que

foram fundamentais para o desenvolvimento dos demais capítulos. O capítulo 2 é

descrito também o uso de cálculo teórico baseado na teoria do funcional da densidade

envolvendo o polímero impresso para ácido ascórbico. Os cálculos teóricos permitem

identificar a espontaneidade da interação monômero-molécula molde em diferentes

solventes, sendo possível selecionar o melhor sistema para o desenvolvimento do

polímero impresso. Além disso, o estudo teórico auxilia na compreensão de alguns

resultados experimentais obtidos

Semelhantemente aos capítulos 2 e 3, o capítulo 4 apresenta o desenvolvimento

de um polímero impresso para cafeína, a partir de nanoesferas de sílica

funcionalizada, sintetizadas com base no método de Stöber. O objetivo principal deste

Prefácio 20


capítulo 4 foi comprovar que a tecnologia utilizada para fabricação dos polímeros

impressos a partir de micropartículas (capítulos 2 e 3) é igualmente eficiente em

nanoescala. Os resultados preliminares apresentados neste capítulo indicam

aspectos promissores para este polímero em nanoescala.

. Por fim, no capítulo 5, são apresentadas as conclusões e perspectivas da Tese.

CAPÍTULO 1

1. Polímero Molecularmente Impresso

RESUMO GRÁFICO

(Adaptado de Gongke Li et. al., 2015)

Capítulo 1: Polímeros Molecularmente Impressos 22


1.1. Introdução

A tecnologia de impressão molecular (MIT, do inglês molelularly imprinted

technology) consiste no planejamento e desenvolvimento de materiais sintéticos, com

cavidades feitas sob medida, que demonstram seletividade comparada à de

receptores naturais (Alexander et al., 2006; Poma, Turner e Piletsky, 2010). O conceito

de impressão molecular surgiu com base na teoria proposta por Pauling para

descrever a formação dos anticorpos (Ye e Mosbach, 2008). Assim, com base neste

mecanismo, surgiu a ideia de produzir uma estrutura tridimensional rígida polimérica

ao redor de uma molécula molde, que tivesse a capacidade de mimetizar os materiais

biológicos, tais como as interações antígeno-anticorpo, as interações enzima-

substrato, mantendo a elevada especificidade e seletividade. Nestes sistemas, as

macromoléculas biológicas possuem locais de ligação específicos, os quais

apresentam capacidade para reterem de forma seletiva uma dada molécula, mesmo

em presença de outras com estruturas químicas muito semelhantes (Hansen, 2007).

Usualmente, estes materiais são denominados de polímeros molecularmente

impressos, ou somente pela sigla MIP que advém do inglês Molecularly Imprinted

Polymers.

Os polímeros de impressão molecular (MIP) são materiais sintéticos com sítios

de reconhecimento específicos produzidos em uma síntese polimérica, onde uma

molécula alvo é utilizada como molde (Turiel e Martín-Esteban, 2010). Para a

produção deste material são necessárias uma molécula molde, um monômero

funcional, um solvente porogênico, um iniciador e um agente de reticulação. O

processo de fabricação inicial do MIP começa com a formação do complexo entre o

monômero, portador de certos grupos funcionais, e a molécula molde, através de

interações covalentes ou não-covalentes. Subsequentemente, o agente de

reticulação, responsável pela estabilização dos sítios de ligação, e o iniciador,

responsável por iniciar a reação de polimerização, são adicionados ao sistema. Após

a polimerização, a molécula molde é removida da matriz polimérica, produzindo um

polímero com cavidades complementares à molécula molde em termos de tamanho,

forma e disposição de grupos funcionais (Roland e Bhawani, 2016). Em outras

palavras, as interações entre a molécula molde e a matriz polimérica são memorizadas



durante a impressão molecular, possibilitando o reconhecimento específico no

processo de extração da molécula alvo.

Desde 1930, quando em seu trabalho pioneiro Polyakov produziu um polímero

impresso a base de sílica para o reconhecimento específico de benzeno (Polyakov,

1930), os MIPs vêm evoluindo em aspectos relacionados à síntese, caracterização e

aplicação, o que demonstra uma maturação gradual da MIT e o amplo interesse da

comunidade científica em geral. O número de artigos científicos publicados entre os

anos de 1998 a 2017 divulgado pelo site de busca científica Web of Science (Figura 1

- 1) já ultrapassa os 3000, o que reflete diretamente o rápido e contínuo

desenvolvimento das tendências e áreas atuais.

Figura 1 - 1. Número de publicações sobre polímeros impressos de 1995 a 2017 de

acordo com o mecanismo de busca Web of Science (acesso em 06 jan. 2018) usando

o termo "molecularly imprinted polymer" no título.

Em comparação com outros sistemas de reconhecimento, como por exemplo os

anticorpos, os MIPs apresentam vantagens em relação à estabilidade, ao baixo custo,

ao reconhecimento específico e a universalidade de aplicações, tornando-se atraentes

em muitos campos, tais como purificação (Kowalski et al., 2004), separação (Iskierko

et al., 2016), pré-concentração (Sheykhaghaei et al., 2016), sensores (Shimizu e



Stephenson, 2010), catálise (Mirata e Resmini, 2015) e entrega de fármacos (Alvarez-

Lorenzo e Concheiro, 2004). Outra característica atraente da impressão molecular é

a impressão de uma ampla variedade de moléculas ou íons, incluindo cátions e ânions

(por exemplo, Ca2+, Cu2+, Pb2+, Fe3+, F- e NO3-), moléculas pequenas (por exemplo,

fármacos, pesticidas, aminoácidos, peptídeos, bases nucleotídicas, esteroides e

açúcares), moléculas orgânicas grandes e bioanalitos (por exemplo, vírus,

imunoglobulinas e eritrócitos). Além disso, os MIPs podem ser usados como materiais

feitos sob medida quando os receptores biológicos não estão disponíveis (Menger et

al., 2016).

Na impressão molecular, duas abordagens, covalente e não-covalente, são

empregadas para descrever as interações entre molécula molde e os monômeros. A

abordagem covalente foi introduzida pela primeira vez por Wulff e Sarhan (1972)

(Wulff e Sarhan, 1972), que envolve a formação de ligações covalentes reversíveis

entre a molécula molde e o monômero antes da polimerização. A vantagem óbvia

deste procedimento é que os sítios de ligação são mais homogêneos e estáveis e,

consequentemente, mais seletivos. No entanto, a cinética de ligação é lenta e a

remoção da molécula molde da matriz polimérica torna-se mais complexa, pois tanto

a formação como a clivagem da ligação covalente devem ocorrer em condições

brandas. Em contraste, Arshady e Mosbach (1981) (Arshady e Mosbach, 1981)

desenvolveram uma abordagem não-covalente que combina a molécula molde e o

monômero por interações não-covalentes, como forças eletrostáticas, forças de van

der Waals, interações iônicas ou ligações de hidrogênio. A vantagem de possuir uma

rápida cinética de ligação e remoção, além de um grande número de monômeros

capazes de interagir com uma ampla variedade de moléculas molde disponíveis no

mercado, tem tornado essa abordagem a mais utilizada na preparação dos MIPs

(Vasapollo et al., 2011). No entanto, essa abordagem apresenta como desvantagens

a baixa seletividade, que ocorre devido a heterogeneidade dos sítios de ligação e uma

maior influência da polaridade do solvente utilizado no processo de pré-polimerização.

A literatura apresenta uma terceira abordagem, que descreve um duplo modo de

ligação, onde a molécula molde e o monômero interagem covalentemente na etapa

de pré-polimerização e interagem de forma não covalente na etapa de religação. Essa

abordagem é conhecida como semi-covalente (Caro et al., 2002).



1.2. Métodos de Impressão Molecular

1.2.1. Síntese dos MIPs

Os MIPs podem ser sintetizados empregando-se várias técnicas diferentes, tais

como polimerização em massa, em suspensão, de precipitação e sobre a superfície

de partículas inorgânicas (Tabela 1 - 1). A seleção do método de impressão depende

do tamanho e da forma do MIP desejado (isto é, material denso ou microporoso, filmes

finos, nanopartículas, etc.), do tipo de molécula molde e do tipo aplicação. Por

exemplo, na preparação de amostras de alimentos, os MIPs são muitas vezes

sintetizados empregando-se o método de polimerização em massa antes de serem

enxertados em um suporte de fase sólida, enquanto que em biossensores baseados

em MIP, os filmes finos são mais comumente enxertados na superfície do sensor (Kriz

e Mosbach, 1995; Pillay et al., 2013). Para ambas aplicações, os MIPs com alta área

superficial e grande número de locais de ligação são desejáveis, enquanto a

quantidade de ligações não específicas deve ser mantida ao mínimo.

Cronologicamente, o primeiro método de polimerização empregado para

sintetizar o MIP baseou-se na polimerização em massa, seguida de moagem e

peneiramento para obter pequenas partículas de tamanho micrométrico adequadas

para utilização em aplicações cromatográficas (Zu et al., 2010). Neste processo, o

monômero funcional é espacialmente organizado em torno de uma molécula molde

na presença de um solvente orgânico. O complexo resultante da interação entre a

molécula molde e o monômero é copolimerizado com um excesso de agente de

reticulação na presença de um iniciador, sob condições térmicas ou fotoquímicas. O

bloco polimérico resultante é então moído e peneirado para produzir partículas de um

tamanho apropriado. Por fim, a molécula molde é removida da matriz polimérica

deixando sítios de ligação complementares em locais de ligações e em forma. Embora

este método seja o mais popular, por ser simples e universal, apresenta algumas

desvantagens, tais como preparação demorada e menos locais de reconhecimento

específicos, o que, consequentemente, provoca uma cinética de ligação lenta e baixa

capacidade de ligação (Wu et al., 2016).



Outro método aplicado é o da polimerização por suspensão (Mayes e Mosbach,

1996). Neste método, a polimerização ocorre dentro de gotículas de monômeros que

funcionam como mini-reatores, permitindo a produção de partículas esféricas em uma

ampla faixa de tamanho, começando em alguns micrômetros até milímetros. O

processo de síntese inicia-se com a solubilização de todos reagentes em solvente

orgânico, seguido da adição de um solvente imiscível, geralmente água ou óleo

mineral, contendo um agente tensoativo, formando uma emulsão. O controle do grau

de agitação e da quantidade de tensoativo, bem como da temperatura, torna-se

fundamental para determinar o tamanho médio e a distribuição de tamanho das

partículas. Em comparação com o método de polimerização em massa, as partículas

formadas não necessitam de moagem mecânica, apresentam tamanhos mais

uniformes e são separadas da fase imiscível com maior facilidade. No entanto, mesmo

uma pequena quantidade de água difundida na fase orgânica é suficiente para destruir

as ligações de hidrogênio entre os monômeros e as moléculas moldes. Além disso,

em situações onde monômeros e moléculas molde possuem elevada solubilidade em

água, existe a possibilidade de ocorrer partição dos constituintes reacionais da fase

orgânica com a fase aquosa, resultando em um baixo fator de reconhecimento

molecular (Martin-Esteban, 2001).

O método de polimerização por precipitação é análogo ao método de

polimerização em massa e baseia-se no crescimento de cadeias de polímero, que

precipita durante a reação quando um determinado comprimento de cadeia é atingido,

tornando-se insolúvel no solvente orgânico, com consequente precipitação. A rigidez

proporcionada pelo agente de reticulação é suficiente para impedir a coalescência das

partículas, dispensando o uso de tensoativo. As vantagens desse método consistem

na obtenção de partículas monodispersas com diâmetros inferiores a 100 nm, não

sendo necessária a fase de moagem, além de rendimentos superiores em relação à

polimerização em massa. A principal desvantagem consiste no uso de elevadas

quantidades de solvente orgânico, chegando a ser 8 vezes maior que o método de

polimerização em massa. Além disso, pode ser necessário o uso de centrífugas de

alta rotação para recolher as partículas obtidas em nanoescala (Tamayo, Casillas e

Martin-Esteban, 2003).



Tabela 1 - 1. Resumo dos diferentes métodos de preparação dos MIPs.

MIP Vantagens Desvantagens

Polimerização

em massa

- Simplicidade

- Universalidade da polimerização

- Procedimentos tediosos de

moagem e peneiramento

Polimerização

em suspensão

- Síntese altamente reprodutível

- Partículas esféricas

- Não necessidade de moagem.

- Partição dos constituintes

reacionais

- Incompatibilidade com água

Polimerização

de precipitação

- Partículas monodispersas

- Elevados rendimentos

- Elevadas quantidades de

solvente orgânico e molécula

molde

Polimerização

em superfície

- Morfologia definida

- Alta capacidade de ligação

- Rápida transferência de massa

- Processo demorado

- Sistema mais complexo

Outro método recente de preparo do MIP consiste na polimerização sobre a

superfície de partículas. Neste método, a polimerização é realizada sobre uma

partícula inorgânica, geralmente esférica (caroço), de modo que os materiais

impressos formem uma camada fina (casca) na superfície das esferas, obtendo-se

uma estrutura do tipo caroço-casca. Esse método apresenta algumas vantagens em

relação aos MIPs já descritos, tais como morfologia definida, alta capacidade de

ligação e rápida transferência de massa. Além disso, as partículas obtidas assumem

características uniformes e mecanicamente estáveis (Miao et al., 2015). No entanto,

dentre os métodos citados, esse é considerado o mais complexo, isso porque o

controle da uniformidade e do tamanho da camada polimérica ainda não está bem

estabelecido.



Os núcleos do MIP com estrutura caroço-casca podem ser compostos de

diversos materiais, tais como partículas de sílica (Cheng, Liu e Wang, 2013), partículas

magnéticas de óxido de ferro (Fan et al., 2015), partículas metálicas e pontos

quânticos (Ren e Chen, 2015). A vantagem de aplicar esferas de sílica na fabricação

do MIP com estrutura caroço-casca está associada com a fotoestabilidade, a

estabilidade química, a biocompatibilidade, a fácil modificação e ao fato da sílica ser

uma matriz inerte. Além disso, as partículas de sílica podem ser desenvolvidas com

diferentes tamanhos e porosidade. O método desenvolvido por Stöber, por exemplo,

é capaz de produzir partículas monodispersas de até 2 µm (Stöber, Fink e Bohn,

1968). No entanto, quando se objetiva sintetizar partículas em microescala, o método

de Stöber geralmente é substituído pelo método da macroemulsão. A macroemulsão

produz partículas polidispersas, não aglomeradas, porosas ou não-porosa, e que

devido ao tamanho em microescala podem ser facilmente manuseadas e recuperadas

(Darbandi, Thomann e Nann, 2005).

1.2.2. Mecanismo de Polimerização

1.2.2.1. Polimerização por Radicais Livres

A polimerização por radicais livres é o método sintético mais importante

disponível hoje para a conversão de monômeros em polímero, sendo amplamente

explorada na indústria para a produção, em escala de várias toneladas, de uma série

de plásticos comercialmente importantes. Essa polimerização ocorre através da

quebra de uma ligação dupla da unidade monomérica, convertendo-a em um radical

de propagação ativo (Daoud Attieh et al., 2017). Uma das principais vantagens desse

processo consiste no uso de condições brandas de reação, como, por exemplo,

temperatura ambiente e pressão atmosférica. Apesar de seus muitos benefícios e uso

amplamente difundido, o rápido crescimento da cadeia polimérica e a reação de

terminação irreversível impõem algumas limitações sobre o grau de distribuição do

peso molecular da estrutura polimérica. Os passos básicos na polimerização por

radicais livres são caracterizados por três estágios: iniciação, propagação e término,

podendo ser composto por mais estágios dependendo do processo (transferência de

cadeia). Em geral, a etapa de propagação é o estágio mais rápido da polimerização,



sendo o iniciador ativo durante todo o processo da polimerização (George Odian,

2004).

1.2.2.1.1. Iniciação

Esta etapa envolve a criação do centro ativo de radicais livres e geralmente

ocorre em duas etapas. A primeira é a formação de radicais livres a partir de uma

decomposição do iniciador, que pode ser térmica ou por radiação, e a segunda é a

adição de um desses radicais livres a uma molécula de monômero (Figura 1 - 2) (Su,

2013).

Figura 1 - 2. Representação esquemática da decomposição do iniciador 2,2’-

azobisisobutironitrilo (AIBN) (I) e passo de adição do monômero (ácido acrílico) (II).

1.2.2.1.2. Propagação

O segundo estágio envolve o crescimento da cadeia polimérica por adição rápida

e sequencial do monômero para o centro ativo (Figura 1 - 3). O tempo necessário para

cada adição de monômero normalmente de alguns milissegundos e, portanto,

milhares de adições podem ocorrer em poucos segundos (Su, 2013).




(ácido acrílico).

1.2.2.1.3. Término

Nesta fase, o centro ativo é destruído de forma irreversível e a propagação

cessa. A terminação ocorre através de reações de acoplamento (etapa designada

como combinação) ou transferência atômica entre cadeias ativas (etapa designada

desproporção). A combinação envolve o acoplamento entre duas cadeias em

crescimento para formar uma única molécula de polímero. A desproporção envolve a

transferência de um átomo de hidrogênio de uma cadeia polimérica em crescimento

para outra, formando diferentes grupos finais sem uma cadeia interligada (Figura 1 -

4) (Su, 2013).



Figura 1 - 4. Representação esquemática do passo de término da polimerização.

1.2.2.2. Polimerização Radicalar Controlada

A polimerização radicalar controlada tem chamado atenção por possuir potencial

para superar as limitações da polimerização por radicais livres. Embora mais flexível

em termos de pureza do reagente, condições experimentais e escolha de monômeros,

a polimerização por radicais livres apresenta como desvantagem o não controle da

massa molar do polímero sintetizado, que ocorre devido à alta reatividade dos radicais

produzidos constantemente durante o processo de polimerização.

A polimerização radicalar cessa somente quando não há mais monômeros,

podendo continuar após a adição de mais monômero, comprovando que o processo

pode ser interrompido e reiniciado a qualquer momento. Diferentemente, a

polimerização radicalar controlada (Figura 1 - 5) permite a síntese de polímeros com

dispersão e massa molar sob controle e, embora não seja um processo trivial,

possibilita no mínimo um controle parcial da massa molar e dispersão (Dragutan et al.,

2015). Atualmente, os três métodos mais eficazes de polimerização controlada

incluem polimerização mediada por nitróxido (NMP, do inglês nitroxide-mediated

polymerization), polimerização radicalar por transferência de átomos (ATRP, do inglês

Atom-transfer radical-polymerization) e transferência reversível de cadeia por adição-

fragmentação (RAFT, do inglês Reversible addition−fragmentation chain-transfer).



Figura 1 - 5. Representação esquemática do mecanismo de polimerização via

transferência reversível de cadeia por adição-fragmentação (RAFT).

Nos últimos anos, a RAFT tem sido considerada uma das técnicas mais

eficientes para o controle da polimerização radicalar, mostrando-se versátil e robusto

a diversas condições de síntese, resultando em polímero com estrutura controlada. A

versatilidade da polimerização RAFT possibilita o uso de agentes que transportam

muitos grupos finais reativos úteis, possibilitando a polimerização de diversos

monômeros que são inerentemente problemáticos em outras técnicas de

polimerização. A polimerização RAFT assemelha-se à polimerização por radicais

livres nos mecanismos básicos, ou seja, na iniciação e propagação. A minimização

das reações de terminação e de transferência é uma etapa crítica neste contexto. Na

prática, a principal diferença entre os métodos é a adição do agente RAFT (por

exemplo, ditiobenzoato) na mistura de reação inicial. A inclusão do agente RAFT

garante os passos reversíveis para ativação/desativação do radical, conforme

ilustrado na Figura 1 - 5.



1.2.3. Reagentes e Condições Utilizados em Impressão

Molecular

A síntese dos MIPs exige uma boa compreensão sobre equilíbrio químico, teoria

de reconhecimento molecular, termodinâmica e química de polímeros, a fim de

compreender os parâmetros de síntese, incluindo a molécula molde, uma vez que

podem influenciar a morfologia, as propriedades e o desempenho dos polímeros. O

desafio de projetar e sintetizar um MIP pode ser uma perspectiva desalentadora diante

do grande número de variáveis experimentais envolvidas, tais como a molécula molde,

monômero funcional, agente de reticulação, iniciador e solvente porogênico. O

conhecimento sobre as variáveis de síntese permite prever de forma racional se o

polímero será rígido, flexível ou os dois, por exemplo.

1.2.3.1. Molécula Molde

A molécula molde é o composto alvo em um processo analítico, que geralmente

é selecionada com base em sua disponibilidade, custo e funcionalidade química. Uma

molécula molde ideal deve satisfazer três requisitos: Primeiro, não deve conter grupos

envolvidos ou impedindo a reação de polimerização. Segundo, deve ser estável em

temperaturas moderadamente elevadas (> 60 °C) ou durante a exposição à luz

ultravioleta. Finalmente, deve conter grupos funcionais capazes de interagir

fortemente com os monômeros funcionais. Embora a maior parte das publicações

envolvendo MIPs utilize uma única molécula molde no sistema, um número crescente

de trabalhos que descrevem a síntese de MIP para mais de uma molécula molde tem

sido relatado (Sun et al., 2017). Além disso, dependendo do método de síntese, um

polímero fabricado usando uma única molécula molde pode extrair mais de uma

molécula presente. Geralmente, essas moléculas apresentam uma estrutura análoga

a outras estruturas (geralmente compostos de uma mesma classe), variando apenas

um grupo funcional ou posição de ligação, através de um efeito conhecido como

seletividade cruzada (Barros, Custodio e Rath, 2016). Por exemplo, Esteban e

Tamayo desenvolveram um polímero impresso para fenuron, inuron, metoxuron,

clortoluron, isoproturon, metobromuron, todos pertencentes à classe dos herbicidas



de feniluréia, para extração em baixos níveis de concentração diretamente de extratos

de amostras de vegetais (Tamayo e Martin-Esteban, 2005).

1.2.3.2. Monômero Funcional

Na Figura 1 - 6 são apresentadas as estruturas químicas moleculares dos

monômeros mais comumente usados para fabricação dos polímeros impressos.

Observa-se que como característica em comum, a maioria das moléculas possui um

grupo vinil e grupo capaz de realizar ligações de hidrogênio. A escolha cuidadosa do

monômero funcional é de extrema importância para fornecer grupos funcionais que

podem formar um complexo com a molécula molde através de interações covalentes

ou não covalentes.

Figura 1 - 6. Monômeros funcionais comumente utilizados na síntese de polímeros

impressos.

Normalmente, os monômeros são polimerizados resultando em macromoléculas

lineares que são solúveis e quimicamente compatíveis com diferentes solventes. A

razão molar entre a quantidade de monômero e de molécula molde é, geralmente,

maior que a unidade, favorecendo a formação da cavidade da molécula alvo. A força

das interações entre a molécula molde e o monômero afeta a afinidade, a estabilidade

e a seletividade. Dependendo do tipo de molécula molde, pode-se utilizar dois ou mais

monômeros para formar o complexo, resultando no aumento na capacidade de



extração e seletividade. No entanto, vale ressaltar que um excesso de monômero

pode aumentar a quantidade de sítios de ligação não específicos, promovendo a

diminuição da seletividade do MIP (Alenazi, Manthorpe e Lai, 2016).

1.2.3.3. Agente de Reticulação

Durante a síntese dos MIPs, os agentes de reticulação desempenham papéis

essenciais, tais como controlar a morfologia da matriz polimérica, estabilizar os sítios

de ligação do MIP e dar estabilidade mecânica à matriz polimérica para manter sua

capacidade de reconhecimento molecular. Na Figura 1 - 7 são apresentadas as

estruturas químicas moleculares de alguns agentes de reticulação mais utilizados.

Figura 1 - 7. Estruturas químicas dos agentes de reticulação.

O tipo e a quantidade de agente reticulante têm influências profundas na

seletividade e na capacidade de ligação dos MIPs. Geralmente, uma quantidade muito

baixa de agente reticulante resultará em propriedades mecânicas instáveis devido ao



baixo grau de reticulação, e uma quantidade extremamente alta do agente reticulante

reduzirá o número de sítios de reconhecimento por unidade de massa de polímero. A

literatura apresenta uma série de reticulantes compatíveis com a impressão molecular,

alguns dos quais são capazes de complexar simultaneamente a molécula molde e,

assim, atuar como monômero funcional (Yan e Ho Row, 2006).

1.2.3.4. Iniciador

O iniciador funciona como um gatilho que possibilita o início e a manutenção da

reação de polimerização. Normalmente, eles são usados em níveis baixos em

comparação com a quantidade de monômero (1% em massa). A grande maioria dos

MIPs é comumente preparada por meio de polimerização por radicais livres,

fotopolimerização e eletropolimerização, podendo ser iniciado térmica ou

fotoquimicamente para uma ampla faixa de grupos funcionais e moléculas molde

(Chen et al., 2016). Além do peróxido, os azo-compostos são amplamente utilizados

como iniciadores, sendo o 2,2’-azobisisobutironitrilo (AIBN) mais comumente utilizado,

podendo iniciar a reação de polimerização via radical livre ou termólise ou fotólise

(Figura 1 - 8).

Figura 1 - 8. Estrutura química de iniciadores comuns utilizados na impressão

molecular não covalente.



A utilização da radiação ultravioleta (UV) permite obter tempos de polimerização

bastante inferiores em relação à temperaturas moderadas (> 60ºC); no entanto, é

necessário conhecer a fotossensibilidade dos demais reagentes envolvidos na reação.

Em alguns casos, como na fabricação de MIPs para proteína, utiliza-se um iniciador

que desencadeie a reação de polimerização a uma temperatura ambiente e sem

fotólise; por exemplo, o persulfato pode produzir radicais livres na presença do ânion

bisulfito ou na presença de metais de transição (Fe2+). A remoção do oxigênio

presente no ambiente de síntese do polímero, a qual pode ser feita pela saturação

usando nitrogênio, é um passo importante para evitar a formação de um excesso de

radicais que prejudiquem o processo de polimerização e, consequentemente, a

formação dos sítios de ligação.

1.2.3.5. Solvente Porogênico

O solvente porogênico desempenha um papel importante na polimerização,

atuando não só como meio de dispersão, mas também como agente formador de

poros. O solvente, com a quantidade e a natureza adequada, fornece porosidade à

matriz polimérica alterando as propriedades e a morfologia, o que facilita a

transferência de massa do analito para os sítios de ligação. Além disso, também

influência a força de interação envolvida no complexo formado entre a molécula molde

e o monômero, especialmente se a interação for do tipo não covalente. Solventes

orgânicos apróticos e de baixa polaridade, tais como tolueno, acetonitrila e clorofórmio

são frequentemente utilizados em processos de polimerização não covalentes para

obter boas eficiência de impressão e capacidade de adsorção. A literatura apresenta

diversos resultados que comprovam que a “memória do solvente” influência o

desempenho do MIP, ou seja, um MIP apresenta melhores resultados quando

aplicados usando o mesmo solvente de síntese (Chen et al., 2016).

1.2.4. Caracterização dos MIPs

A caracterização física, química e funcional dos polímeros impressos geralmente

envolve uma variedade de técnicas analíticas. Dentre as técnicas mais utilizadas

estão a microscopia eletrônica de varredura (SEM, do inglês scanning eletronic

microscopy) e de transmissão (TEM, do inglês transmission eletronic microscopy),



adsorção-dessorção de nitrogênio, análise termogravimétrica, espectroscopia de

ressonância magnética nuclear (NMR, do inglês nuclear magnetic resonance),

espectroscopia no infravermelho médio por refletância total atenuada (MIR-ATR, do

inglês mid-infrared attenuated total reflectance), espectroscopia ultravioleta-visível

(UV-Vis), espectroscopia de raios X por dispersão em energia (EDX, do inglês energy-

dispersive X-ray spectroscopy), dentre outras (Cormack e Elorza, 2004). Os métodos

de caracterização podem ser divididos em três partes complementares:

caracterização química, morfológica e de sítios de ligação.

1.2.4.1. Caracterização Química

A etapa de pré-polimerização, onde um complexo é formado entre a molécula

molde e o monômero, é determinante para o desempenho analítico do MIP. A NMR

de hidrogênio foi introduzida nos processos de caracterização dos polímeros

impressos para investigar a extensão da interação envolvendo monômero e molécula

molde na solução de pré-polimerização. Assim, a avaliação do deslocamento de um

sinal de próton, proveniente da ligação de hidrogênio, pode ser utilizado como critério

de seleção do monômero funcional e a da molécula molde.

A espectroscopia MIR-ATR tem sido rotineiramente empregada como técnica de

caracterização dos polímeros impressos, seja ele tradicional ou com estrutura caroço-

casca. Essa técnica permite identificar uma modificação na superfície das partículas,

bem como no produto final da polimerização. Além disso, também é possível monitorar

o processo de lavagem do polímero, certificando a remoção por completo da molécula

molde. A vantagem do MIR-ATR é ser uma técnica rápida e não destrutiva, o que pode

ser extremamente útil, uma vez que algumas sínteses possuem baixo rendimento e a

quantidade de material produzida é pequena.

A EDX é uma técnica espectroscópica quantitativa que permite determinar a

composição elementar da superfície e da estrutura interna do polímero. A EDX usa

raios-X para expulsar elétrons dos orbitais internos que podem ser usados para

detectar a composição química de superfícies químicas dentro de uma profundidade

de 5 – 100 nm, dependendo da potencia utilizada, dependendo da aceleração e da

densidade utiliza. A EDX acoplada em microscópios eletrônicos é ainda mais eficiente,



uma vez que possui um poder maior de resolução, tornando o mapeamento sobre a

camada polimérica e seu núcleo, se existir, mais eficiente, obtendo resultados mais

confiáveis.

1.2.4.2. Caracterização Morfológica

A morfologia de um polímero é um aspecto importante que influencia a

estabilidade, a capacidade de adsorção e a seletividade. O estudo da morfologia traz

informações relacionadas a porosidade, como tamanho e volume dos poros, área

superficial e, em sistema caroço-casca, o tamanho e forma do caroço e a espessura

da casca polimérica. Os parâmetros relacionados a porosidade geralmente são

determinados pela isoterma adsorção-dessorção de nitrogênio, sendo a área

superficial e o volume de poros determinados usando o modelo BET (Brunauer,

Emmett e Teller) e BJH (Barret, Joyner e Halenda), respectivamente. A microscopia

eletrônica permite obter mais detalhes da superfície do polímero, determinar o

tamanho das partículas e sua dispersão morfológica. Além disso, através das

micrografias é possível estimar se o material produzido possui boa estabilidade

mecânica, uma vez que, pode ter ocorrido o colapso de algumas partículas durante o

processo de lavagem e peneiramento.

1.2.4.3. Caracterização dos Sítios de Ligação

A quantificação da intensidade e da capacidade de adsorção, bem como a

especificidade da matriz polimérica é essencial para uma compreensão do

desempenho analítico do MIP. Esses parâmetros são normalmente alcançados pela

obtenção de dados de adsorção, usando absorção no UV-VIS de soluções padrão da

molécula molde, para um polímero em um intervalo de concentração especificado,

onde as concentrações de analito (molécula molde) ligado e livre são medidas. Um

dos principais pressupostos para a análise de dados de ligação é que os dados são

coletados após o equilíbrio entre a molécula molde e o polímero. Ao caracterizar as

propriedades de ligação, existem três propriedades pertinentes: afinidade,

seletividade e cinética. A afinidade e a cinética indicam a estabilidade e intensidade

das ligações, e se o processo pode ou não ocorrer em um determinado tempo. A

especificidade discrimina qualidade dos sítios de ligação, ou seja, se monômero e



molécula molde interagem de forma adequada para produzir seletividade (Yan et al.,

2013). Normalmente, esses estudos são realizados utilizando o método de incubação

ou o método da extração em fase sólida (SPE, do inglês Solid Phase Extraction).

1.2.4.3.1. Método de Incubação

O método de incubação consiste na dispersão do polímero em uma solução (em

um tubo de centrifuga, por exemplo), orgânica ou aquosa, contendo a molécula molde

ou similar, sob agitação moderada durante um determinado período de tempo. O

tempo de incubação para a maioria dos ensaios é o tempo necessário para que 90%

da quantidade de molécula molde em solução se ligue ao polímero. Uma vez que o

equilíbrio é alcançado, o polímero é separado por filtração ou centrifugação, e o

sobrenadante é cuidadosamente removido para determinar a quantidade de molécula

molde livre e, consequentemente, a quantidade adsorvida ao polímero (Fernandes et

al., 2017). Para tal determinação, é necessário a construção de uma curva de

calibração da concentração de molécula molde versus absorção no UV-VIS, utilizando

o mesmo solvente da etapa de incubação.

1.2.4.3.2. Método MISPE

No método MISPE, os analitos contidos numa matriz aquosa são extraídos,

juntamente com os compostos interferentes, após passarem por um cartucho ou uma

coluna contendo entre 100 e 1000 mg de sorvente, que pode ser um polímero

impresso, com tamanho de partícula variando de 20 a 60 µm, fixado no tubo por meio

de dois filtros de tamanho de poros de 20 µm (Fernandes et al., 2017). As etapas

envolvidas na SPE são: o condicionamento, necessário para ativar a fase extratora,

a extração, onde analitos semi-voláteis e não voláteis são extraídos de amostras

líquidas, a limpeza (clean-up), para retirar os interferentes menos retidos que o analito,

e a eluição, que recupera o analito de interesse (Ötles e Kartal, 2016). Apesar da SPE

apresentar vantagens com relação aos métodos mais clássicos, tais como praticidade

e maior sensibilidade, esta técnica tem algumas limitações. Uma delas refere-se à

etapa de eluição do analito retido no cartucho de SPE que necessitam geralmente do

uso de solventes tóxicos. Além disso, apresenta altos custos dos cartuchos e dos

dispositivos comerciais multivias (manifolds). O método SPE quando utiliza como



sorvente um polímero impresso recebe a denominação de MISPE (do inglês,

Molecularly Imprinted Solid Phase Extraction).

1.2.5. Adsorção

A adsorção é um fenômeno superficial, presente em processos físicos, químicos

e biológicos, que surge devido a interações entre átomos, íons ou moléculas de um

adsorbato e os presentes na superfície do adsorvente. A adsorção é um processo que

ocorre quando um componente em uma fase gasosa ou líquida (adsorbato) se

acumula na superfície de um sólido ou líquido (adsorvente), formando uma película

molecular ou atômica. O processo envolve uma série de fenômenos que podem alterar

a distribuição do soluto entre as fases constituintes e nas interfaces (Weber, McGinley

e Katz, 1991). O processo é acompanhado por separação do soluto de uma fase para

outra após sua acumulação na superfície do último. Dependendo dos tipos de fases

em contato, podemos considerar este processo nos seguintes sistemas: gás-líquido,

líquido-líquido, sólido-líquido e sólido-gás.

A adsorção pode ocorrer com dois processos diferentes, nominalmente

conhecidos como quimissorção (adsorção química) e fisissorção (adsorção física). Os

dois processos são facilmente distinguíveis na maioria dos casos devido às diferenças

tanto na escala de energia de interação quanto na escala de tempo de dessorção. A

adsorção química envolve fortes interações adsorbato-adsorvente, resultando numa

alteração na forma química adsorvente. Por exemplo, as moléculas ou átomos de gás

são mantidos na superfície sólida por ligações químicas como uma monocamada. Na

quimissorção a ligação resultante é geralmente mais forte que forças de van der Waals

e é muito similar em intensidade a uma ligação covalente (Calvi et al., 2016). Além

disso, é altamente específica e ocorre apenas se houver alguma possibilidade de

ligação química entre o adsorbato e o adsorvente. Na fisissorção, a molécula

adsorvida fisicamente mantém sua identidade, pois a energia é insuficiente para

romper a ligação, embora possam ocorrer mudanças conformacionais. Como regra

geral, é um processo reversível que ocorre a uma temperatura inferior ou próxima da

temperatura crítica de uma substância adsorvida. Este tipo de adsorção não é

específica, isto é, o adsorvente não tem preferência por nenhuma molécula em

particular (Calvi et al., 2016). Termodinamicamente, na adsorção, forças atrativas



atuam de modo a permitir a adsorção sobre uma dada superfície (adsorvente), de

modo a haver sempre liberação de energia. Assim, sempre que a uma dada

temperatura a variação da energia de Gibbs relativa ao processo de adsorção for

negativa, o processo ocorrerá espontaneamente, embora nada se possa prever sobre

a cinética do processo (Ferreira et al., 2014).

1.2.5.1. Cinética de Adsorção

Quando se trata de adsorção, os aspectos termodinâmicos e cinéticos devem

ser considerados para se obter mais detalhes sobre seu desempenho e mecanismos.

A partir da análise cinética, pode-se estabelecer a taxa de adsorção do soluto e,

portanto, alcançar o equilíbrio em um período razoável. Os estudos cinéticos

produzem informações sobre o possível mecanismo de adsorção e os diferentes

estados de transição no caminho para a formação do equilíbrio adsorbato-adsorvente

e ajudam a desenvolver modelos matemáticos adequados para descrever as

interações. Para isso, são sugeridos modelos cinéticos como o de pseudo-primeira

ordem, pseudo-segunda ordem, difusão, entre outros (Liu e Shen, 2008). Uma vez

que os fatores que influenciam a cinética de adsorção são, inequivocamente,

conhecidos, é possível calcular a velocidade de adsorção, capacidade de adsorção

de um adsorvente, além de descrever o tempo necessário para adsorção.

1.2.5.1.1. Modelo de Pseudo–Primeira Ordem

A equação de Lagergren (1898) (Equação 1) é provavelmente o primeiro

exemplo conhecido descrevendo o processo cinético de adsorção em superfícies

sólidas em um sistema sólido/líquido (Tseng, Wu e Juang, 2010). Essa equação tem

sido uma das mais usadas, especialmente para cinética de pseudo-primeira ordem:

dqt

dt= k1 (qe − qt) Equação (1)

onde qe e qt (mg g-1) são as capacidades de adsorção em equilíbrio e em um tempo t

(min), respectivamente, k1 (min-1) é a constante de velocidade de adsorção de pseudo-

primeira ordem. Integrando a Equação 1 com as condições limite de qt = 0 em t = 0 e

qt = qt em t = t, obtém-se a Equação 2:



ln (qe

qe − qt) = k1t Equação (2)

a qual pode ser rearranjada para Equação 3:

log (qe − qt) = log qe − k1

2,303t Equação (3)

Os valores de k1 podem ser determinados a partir da inclinação do gráfico linear

obtido da regressão de log (qe – qt) vs t. Em alguns casos, o modelo de pseudo-

primeira ordem não se ajusta a toda faixa de tempo, sendo considerado adequado

somente para os 20 a 30 minutos iniciais de interação. O teste de validade do modelo

decorre de uma comparação entre os valores qe determinados experimentalmente e

aqueles obtidos a partir do gráfico linear de log (qe – qt) vs t. Caso haja uma

discrepância nos valores de qe, então um modelo cinético de ordem maior é

necessário para explicar a cinética de adsorção.

1.2.5.1.2. Modelo de Pseudo–Segunda Ordem

Quando a aplicabilidade do modelo de pseudo-primeira ordem torna-se

insustentável, a adsorção pode seguir a cinética de pseudo-segunda ordem (Equação

4). Esse modelo também é baseado na capacidade de adsorção e descreve a relação

do adsorbato com adsorvente em uma ampla faixa de tempo (Ho e McKay, 1999). A

cinética de pseudo-segunda ordem pode ser testada com base na equação:

dqt

dt= k2 (qe − qt)2 Equação (4)

Onde k2 (g mg-1 min-1) é o coeficiente de velocidade de adsorção. A separação das

variáveis seguida pela integração e aplicação das condições de contorno (qt = 0 em t

= 0 e qt = qt em t = t) produz a seguinte expressão linear:

t

qt=

1

k2𝑞𝑒2

+1

qet Equação (5)



A Equação 5 prevê que a relação t/qt deve ser linear em função do tempo, sendo

possível a obtenção do valor de k2 através do coeficiente linear da reta. Além disso, a

equação de pseudo-segunda ordem tem sido interpretada como um tipo especial de

cinética de Langmuir. Esta linha de interpretação assume que (i) a concentração de

adsorvente é constante no tempo e (ii) o número total de sítios de ligação depende da

quantidade de adsorbato adsorvido no equilíbrio.

1.2.5.1.3. Difusão Intrapartícula

Desenvolvido para adsorventes porosos, este modelo baseia-se na teoria de

difusão intrapartícula, derivada da Lei de Fick, que assume que a difusão do filme

líquido que cerca o adsorvente é desprezível e a difusão intrapartícula é a única taxa

que controla as etapas do processo de adsorção (Wu, Tseng e Juang, 2009). Em

muitos casos, a difusão intrapartícula pode controlar a velocidade de adsorção de um

adsorvente, que é representado pela equação descrita por Weber e Morris em 1963

(Weber e Morris, 1963) (Equação 6):

qt = ki t12 + 𝐶 Equação (6)

onde ki (mg g-1 min-1/2) é o coeficiente de velocidade de difusão intrapartícula e C é a

espessura da camada. A característica significativa desta expressão é que se o

gráfico entre qt vs t1/2 apresentar uma relação linear o processo de adsorção ocorre

por difusão intrapartícula. Além disso, através do coeficiente angular e linear é

possível obter os valores de Ki e de C, respectivamente, identificando que quanto

maior o coeficiente linear maior será o efeito da espessura da camada.

1.2.5.2. Isotermas de adsorção

A isoterma de adsorção pode ser definida como uma expressão gráfica usada

para descrever a relação, a uma temperatura constante, entre massa do soluto

adsorvido e a concentração de soluto na solução, uma vez alcançado o equilíbrio. Ao

longo dos anos, uma grande variedade de modelos matemáticos foi formulada para

descrever o processo de adsorção e, com auxílio da estatística, tem possibilitado um

melhor ajuste e, consequentemente, a obtenção dos parâmetros físico-químicos. Os



parâmetros físico-químicos, juntamente com os pressupostos termodinâmicos,

fornecem informações sobre mecanismo de adsorção, propriedades da superfície

(homogênea e heterogênea), bem como o grau de afinidade dos adsorventes

(Belhachemi e Addoun, 2011). Os modelos mais utilizados incluem as isotermas de

Freundlich, Langmuir e Sips (Langmuir – Freundlich). A modelagem é feita ajustando-

se os dados obtidos a uma variedade de isotermas e, com auxílio de um conjunto de

testes estatísticos, pode-se comparar a qualidade dos ajustes com base nos valores

do erro médio quadrático (EMQ) e coeficiente de determinação (R2).

1.2.5.2.1. Modelo de Langmuir

O modelo de Langmuir tem sido utilizado para descrever modelos que assumem

a adsorção em monocamada, ou seja, uma adsorção que ocorre em um número finito

de sítios de ligação idênticos ou equivalentes (quimissorção), sem interações

adjacentes entre as moléculas adsorvidas (atrativas ou repulsivas) (Belhachemi e

Addoun, 2011). Graficamente, esse modelo é caracterizado por apresentar um platô,

que indica a saturação dos sítios de ligação, não sendo possível a adsorção de

nenhuma outra molécula. A expressão matemática do modelo de Langmuir pode

descrever um comportamento linear (Equação 7) ou não-linear (Tabela 1 - 2), sendo

o modo linear representado por quatro equações.

qe = QmKLCe

1 + KLCe Equação (7)

Onde Ce é a concentração da solução em equilíbrio (mg L-1), Qm é a capacidade

máxima de adsorção do polímero (mg g-1) e KL é a constante relacionada à energia

livre de adsorção (L mg-1). Além disso, uma constante adimensional, comumente

conhecida como fator de separação (RL) é descrita pela Equação 8, foi desenvolvida

por Webber e Chakravorti (Weber e Chakravorti, 1974) e usada para indicar se o

processo de adsorção é favorável ou não.

RL = 1

1 + KLC0 Equação (8)



onde C0 é concentração inicial do adsorbato (mg L-1). Os processos podem ser

desfavoráveis (RL> 1), linear (RL = 1), favorável (0 <RL <1) ou irreversível (RL = 0).

1.2.5.2.2. Modelo de Scatchard

O modelo de Scatchard foi desenvolvido para avaliar o número total de sítios de

ligação e a afinidade entre as ligações entre adsorbato e adsorvente (Kowalski, 1988).

Os parâmetros podem ser obtidos a partir da regressão entre Q/Ce versus Q. A

equação de Scatchard (Equação 9) é dada:

Q

Ce=

(Qm − Q)

Kd Equação (9)

O gráfico obtido a partir da equação de Scatchard revela informações úteis a

respeito dos sítios de ligação, isso porque, se graficamente apenas uma reta for

suficiente para descrever o comportamento dos dados, um único sítio de ligação está

envolvido. No entanto, se mais de uma reta for necessária, o sistema apresenta mais

de um sítio de ligação. Além disso, através do modelo de Scatchard é possível obter

a constante de afinidade e a capacidade de máxima adsorção.

1.2.5.2.3. Modelo de Freundlich

O modelo de Freundlich descreve a adsorção como sendo um processo

reversível e não restrito à formação de monocamada que considera as interações

entre as moléculas adsorvidas na superfície do adsorvente (Belhachemi e Addoun,

2011). Este modelo pode ser aplicado a adsorção multicamada, com distribuição não

uniforme sobre uma superfície heterogênea, demonstrando que os sítios de ligação

não são homogêneos. Nesta perspectiva, a quantidade adsorvida é, na verdade, o

somatório da adsorção em todos os sítios de ligação (cada um com energia de

ligação), sendo os sítios com maior energia de ligação preenchidos primeiro. O

modelo de Freundlich é expresso matematicamente de acordo com a Equação 10:

qe = KFCe

1n Equação (10)



onde Ce é a concentração de equilíbrio do soluto na solução (mg L-1), KF é a constante

de Freundlich (constante que indica a capacidade relativa de adsorção de o

adsorvente (mg g-1)) e n é intensidade de adsorção, bem como a distribuição relativa

da energia e a heterogeneidade dos sítios adsorvidos. Por exemplo, se o valor

resultante de 1/n é menor que 1 ou perto de zero, os sítios de ligação são

heterogêneos, e se o valor de 1/n for igual ou maior que 1, a adsorção ocorre em

monocamada através dos sítios homogêneos.

1.2.5.2.4. Modelo de Sips

O modelo de Langmuir-Freundlich, conhecido também como modelo de Sips, é

derivado do comportamento limitante das isotermas de Langmuir e Freundlich (Sips,

1948). Esse modelo contorna a limitação da crescente concentração de adsorvente

associada ao modelo Freundlich. Com baixas concentrações de adsorvente, o modelo

de Sips reduz-se ao modelo de Freundlich, enquanto que em altas concentrações,

onde prevê uma capacidade de adsorção em monocamada, reduz-se ao modelo de

Langmuir. Como regra geral, os parâmetros da equação são regidos principalmente

pelas condições operacionais, como a alteração do pH, temperatura e concentração.

O comportamento não linear do modelo Sips pode ser expresso pela Equação 11:

qe = QsKsC𝑒

𝑛

1 + KsC𝑒𝑛 Equação (11)

Onde KS é constante de afinidade, n o índice de heterogeneidade e Qs a capacidade

de máxima adsorção. Se o valor de n for igual a 1, esta equação se reduzirá à equação

de Langmuir. Alternativamente, quando Ce ou KS se aproximam de 0, essa isoterma

se reduz à isoterma de Freundlich. A Tabela 1 - 2Error! Reference source not found.

contém as equações linearizadas e não-linearizadas dos modelos descritos nesta

seção.

1.2.6. Funções de erro

Atualmente, o método de regressão é a melhor maneira de selecionar a isoterma

ideal. O método de regressão envolve o passo de minimizar a distribuição de erro



entre os dados experimentais e a isoterma prevista. A distribuição de erros entre os

dados de equilíbrio experimental e as isotermas previstas é minimizada, minimizando

a função de erro. O coeficiente de determinação (R2) e o erro médio quadrático (EMQ)

são as funções de erro mais amplamente utilizadas para selecionar o modelo com

melhor ajuste. (Sreńscek-Nazzal et al., 2015).

Tabela 1 - 2. Lista de isotermas de adsorção com as suas respectivas equações

linearizadas e não linearizadas.

Isotermas Expressão

Não Linear Expressão Linear Plot

Langmuir I

qe = Qm KL Ce

1 + KL Qm

Ce

qe=

1

QmCe +

1

KL Qm Ce vs

Ce

qe

Langmuir II 1

qe= (

1

KLQm)

1

Ce+

1

Qm

1

Ce vs

1

qe

Langmuir III qe = Qm − (1

KL)

qe

Ce

qe

Ce vs qe

Langmuir IV qe

Ce= QmKL − QeKL qe vs

qe

Ce

Freundlich qe = KFCe1/n

log qe = log KF + (1

n) log Ce log Ce vs log qe

Sips qe = QsKsC𝑒

𝑛

1 + KsC𝑒𝑛 n ln (Ce) = − ln (

Qs

qe) + ln(Ks) ln (

Qs

qe) vs ln (Ce)

1.2.6.1. Coeficiente de Determinação (R2)

O coeficiente de determinação representa a porcentagem de variabilidade na

variável dependente que foi explicada pela linha de regressão. O valor do coeficiente

de determinação, calculado a partir da Equação 12, pode variar de 0 a 1.



R2 = ∑ (qest − q

exp)

2

∑ (qest − qexp

)2

+ ∑(qest − qexp)2

Equação (12)

onde qexp e qest (mg g-1) representam as capacidades de adsorção no equilíbrio

estimados pelo modelo e experimental. Os valores de R2 devem ser superiores a 0,9,

conferindo confiabilidade aos dados.

1.2.6.2. Erro Médio Quadrático (EMQ)

O EMQ é o desvio padrão dos resíduos (erros de previsão) e medem o quão

longe os pontos medidos estão da linha de regressão. Em outras palavras, avalia

como está a distribuição dos dados em torno da linha de melhor ajuste. O erro médio

quadrático é calculado pela seguinte equação:

EMQ = √∑[(qexp − qest)/qexp]2

N Equação (13)

Onde N é o número de amostras. A vantagem de utilizar essa função de erro consiste

em ter um resultado imparcial que segue uma distribuição normal. Assim, ao usar o

EMQ tem-se uma imagem completa da distribuição dos erros.

1.2.7. Aplicações

Nos últimos anos, as nanopartículas tornaram-se peças chaves no

desenvolvimento de metodologias analíticas. As modificações e combinações

envolvendo nanopartículas têm produzido materiais híbridos, com propriedades

específicas, capazes de obter resultados até então inalcançáveis. A combinação

sinérgica das propriedades das partículas com os méritos da impressão molecular

pode melhorar significativamente a seletividade em processos de extração, pré-

concentração e detecção. Os MIPs inspiram pesquisadores a melhorar as

propriedades das superfícies, introduzindo capacidade de reconhecimento e isolando

a superfície do substrato, o que, consequentemente, produz maior estabilidade. Por

exemplo, Willner e colaboradores (Riskin et al., 2008) desenvolveram um polímero



impresso na superfície de nanopartículas de ouro para determinação do explosivo

TNT usando ressonância de plasma de superfície (SPR). Em outro trabalho, Chang e

colaboradores (Chang, Ding e Li, 2013) propuseram uma via de síntese simples para

um substrato híbrido de nanopartículas de prata com polímero impresso na superfície

(caroço-casca) para detecção seletiva do ácido 4-mercaptobenzóico usando SERS

(do inglês, Surface-enhanced Raman spectroscopy). Os resultados obtidos revelaram

que o material híbrido pode ser utilizado como plataforma analítica ultra-sensível com

limites de detecção no nível femtomolar.

Os polímeros de impressão molecular magnéticos (MMIPs, do inglês Magnetic

Molecularly Imprinted Polymers) com estrutura caroço-casca, sendo o caroço

magnético, são uma espécie de ferramenta analítica poderosa que combina a

propriedade de adsorção seletiva do MIP com a separação magnética. A aplicação

destes polímeros magnéticos como sorventes permite não só a pré-concentração e

limpeza da amostra, mas também a extração seletiva do analito alvo. Assim, os MMIPs

são particularmente adequados para lidar com amostras biológicas que estão

fortemente sujeitas à interferência da matriz. Várias drogas têm sido usadas como

molécula molde para a preparação de MMIPs, como antibióticos, por exemplo. Kong

e colaboradores (Kong et al., 2012) prepararam um MIP com estrutura caroço-casca

utilizando sulfametazina como molécula molde para extração e determinação de

sulfonamidas na alimentação de aves. Esses MMIPs apresentaram características

adsorventes eficientes amostras de carne. As inúmeras publicações envolvendo MIP

demonstram a versatilidade da tecnologia de impressão molecular e baixa restrição

de uso, o que tem atraído ainda mais o interesse dos pesquisadores. Na sequência

são apresentadas outras aplicações dos MIPs.

Ton e colaboradores (Ton et al., 2012) desenvolveram biossensores baseados

em MIP para detecção rápida de antibióticos de fluoroquinolona em amostras de água

e leite através de medidas de fluorescência. Eles relataram resultados muito

promissores com limite de detecção de 0,1 nmol L-1 para enrofloxacina, que está

abaixo do limite permitido em águas subterrâneas de 0,28 nmol-1. Concluíram que o

ensaio era simples, sem etapas de centrifugação e separação demoradas. Reddy e

colaboradores (Reddy et al, 2013) usaram MIPs para criar bioconjugação nos canais



sensores de um interferômetro de polarização dupla. Eles observaram que a camada

polimérica mostrou seletividade para proteínas mesmo após interagir com amostras

de soro biológico diluídas 1:100. Eles concluíram que os MIPs desempenharam um

papel significativo no reconhecimento seletivo e tiveram potencial para a detecção de

drogas, vírus, pesticidas, toxinas e bactérias, usando medidas simples de adsorção.

Outro estudo interessante na área de novos MIPs, que catalisam a hidrólise de

substratos , foi relatado por Striegler e colaboradores (Striegler, Barnett e Dunaway,

2012). O trabalho centrou-se na hidrólise do glicósido usando microgels catalíticos

impressos com carbonatos. Em um artigo anterior, os autores mostraram que a

hidrólise de p-nitrofenil-a-D-galactopiranósido pode ser acelerada 11.000 vezes ao

longo da reação usando o MIP como catalisador. Kobayashi e colaboradores

(Sreenivasulu Reddy et al., 2002) desenvolveram um MIP baseado em Nylon-6 em

uma barra magnética para reconhecimento quiral diferencial de enantiômeros de

glutamina. A camada polimérica mostrou uma enantio-seletividade notável para a L-

glutamina. Por exemplo, a concentração de L-glutamina foi de 9,64 μmol/L e a da D-

glutamina, 24,1 μmol/L, após o equilíbrio de adsorção a partir de uma solução de 25,0

μmol/L.

1.3. Objetivos

O objetivo desta Tese é o desenvolvimento de polímeros molecularmente

impressos (MIP) com estrutura caroço-casca à base de micro e nanoesferas de sílica

funcionalizadas, porosas e não porosas, para extração seletiva de ácido ascórbico,

cafeína e vanilina usando os métodos de incubação e SPE.

CAPÍTULO 2

2. Polímeros Impressos em Superfície

de Microesferas de Sílica Porosa

Amino-Funcionalizadas para Extração

Seletiva de Ácido Ascórbico

RESUMO GRÁFICO

Capítulo 2: Polímeros Impressos em Superfície de Microesferas de Sílica Porosa Amino-Funcionalizadas para Extração Seletiva de Ácido Ascórbico 53


2.1. Introdução

O ácido ascórbico (AA), também chamado de vitamina C, é um ácido carboxílico

denominado de (5R)-[(1S)-1,2-Di-hidroxietil]-3,4-di-hidroxifuran-2(5H)-ona (C6H8O6),

tem uma massa molar de 176,1 g mol-1, ponto de fusão de 193 °C, pKa 4,72 e

solubilidade moderada em diversos solventes. O AA desempenha um papel

importante nos processos bioquímicos e na manutenção da saúde humana e está

presente em várias frutas e legumes frescos, em diferentes quantidades (5 – 150

mg/kg), atuando como um antioxidante natural que evita danos de macromoléculas

no corpo devido aos radicais livres, provenientes de espécies reativas de oxigênio e

de nitrogênio (Chambial et al., 2013). Níveis anormais de AA estão relacionados a

muitas doenças, como o resfriado comum, escorbuto, doença mental, arteriosclerose,

câncer e catarata. Além disso, o AA é essencial na síntese de colágeno para

cicatrização eficiente de feridas, na síntese dos neurotransmissores e na prevenção

do escorbuto. Portanto, a determinação de AA torna-se importante no diagnóstico de

doenças, segurança alimentar e aplicações cosméticas.

Alguns métodos tradicionais, incluindo cromatografia líquida de alta eficiência

(HPLC, do inglês high-performance liquid chromatography), eletroquímica,

eletroforese capilar e ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA, do inglês Enzyme-

Linked Immunosorbent Assay) têm sido propostos para detecção de AA (Chambial et

al., 2013). Apesar dos resultados de detecção bem-sucedidos, a maioria desses

métodos necessitam de um pré-tratamento de amostra. Nos últimos anos, estudos

têm relatado as aplicações de diversas técnicas, tais como a extração em fase líquida

(LPE, do inglês liquid phase extraction), extração em fase sólida (SPE), extração

assistida por ultrassom (UAE, do inglês ultrasonic assisted extraction) e extração

assistida por micro-ondas (MAE, do inglês microwave-assisted extraction) (Nojavan et

al., 2008). Esses métodos podem ser caros, complicados e demorados, além de não

seletivos, indicando que um método altamente seletivo, de baixo custo, e de fácil e

rápida operação é realmente necessário.



A descrição sobre o desempenho e os diversos tipos de aplicações já

mencionadas nesta tese ilustra claramente que a impressão molecular é uma

tecnologia em constante crescimento e que pode ser uma alternativa para a extração

seletiva de ácido ascórbico a partir de frutas. O domínio sobre os processos de síntese

e aplicação de um MIP é fundamental para se obter um método reprodutível,

otimizado, econômico e confiável.

Com o rápido desenvolvimento da química computacional, o uso dos cálculos

quânticos tornaram-se frequentemente utilizados para a otimização do processo de

síntese do MIP. Nos últimos anos, algumas publicações têm apresentado resultados

que demonstram a eficiência dos cálculos teóricos para compreender as interações

entre a molécula molde e o monômero antes da síntese do MIP, assegurando assim

a relação adequada entre pares de monômero-molécula molde para produzir um

polímero com elevada especificidade e seletividade (Barros, Custodio e Rath, 2016).

Nesse sentido, o cálculo da teoria do funcional da densidade (DFT, do inglês Density

Functional Theory) tem sido o mais utilizado por fornecer informações detalhadas com

maior confiabilidade (Huang e Zhu, 2015). Devido à sua maior velocidade

computacional e a sua precisão química aceitável, esse método é mais atraente

quando comparado com cálculos Hartree-Fock (Jacob et al., 2008).

A abordagem computacional é composta pela otimização separada das

conformações da molécula molde e o monômero funcional, seguido do cálculo da

energia (E) de cada molécula. O mesmo processo é repetido para o complexo entre

as duas moléculas e, finalmente, a energia de ligação (ΔE) é obtida a partir da

equação 14:

ΔE = EComplexo − EMolécula molde − EMonômero Equação (14)

Esta metodologia tem sido empregada em diversos estudos descritos na

literatura. No entanto, desde 1990 o uso da energia livre de Gibbs (ΔG) também tem

sido considerado para estimar as energias de ligação entre as duas moléculas. A

vantagem de utilizar a energia livre está na abrangência do parâmetro, uma vez que

envolve os valores de entalpia, entropia e temperatura. Além disso, ΔG é o critério

termodinâmico determinante para avaliar a espontaneidade do processo.



Diante disso, o objetivo desta etapa do trabalho foi desenvolver um novo método

de síntese de MIP com estrutura de caroço–casca, com base em microesferas de

sílica amino-funcionalizadas, para a extração seletiva de AA. Além disso, objetivou (i)

avaliar, usando os cálculos DFT de estruturas e parâmetros energéticos, se o

monômero funcional e o solvente utilizados foram os mais adequados para o

desenvolvimento do MIP para AA, (ii) identificar os possíveis sítios de ligação, (iii)

avaliar uma possível modificação do monômero funcional.

2.2. Parte Experimental

2.2.1. Reagentes

Acrilamida (AM), ácido acético, metanol, etanol, ácido cítrico (AC), monooleato

de sorbitano (Span 80) e tetraetilortosilano (TEOS) foram adquiridos da Merck. 1-

octanol, etilenoglicol dimetacrilato (EGDMA), hidroxipropilcelulose (HPC),

poli(etilenoglicol)-bloco-poli(propileno glicol)-bloco-poli(etilenoglicol) (P-123) e 2,2-

azobis(2-metilpropionitrilo) (AIBN) foram adquiridos da Sigma Aldrich. Hidróxido de

amônia (NH3, >25%) foi adquirido da VWR International. L (+) - ácido ascórbico (AA),

tolueno e acetonitrila foram adquiridos da Carlroth. (3-aminopropil)trimetoxisilano

(APTMS) e (3-aminopropil)trietoxisilano (APTES) foram adquiridos da Alfa Aesar.

Todos os reagentes foram utilizados sem purificação adicional. A água utilizada neste

estudo foi deionizada (≥ 18 MΩ cm-1) produzida utilizando um sistema de purificação

Milli-Q.

2.2.2. Fabricação do MIP na Superfície das Partículas

2.2.2.1. Síntese de Microesferas de Sílica (MS)

As MS foram sintetizadas a partir da otimização do método de co-condensação

do TEOS e APTMS em uma macroemulsão de água em óleo com base no

procedimento descrito por C.Oh e colaboradores (C.Oh et al., 2006). A fase oleosa foi

preparada dissolvendo 3,8 g de HPC em 300 mL de 1-octanol sob agitação constante

a 80 ºC durante 5 h. A solução foi arrefecida a 40 ºC e, em seguida, 10 g de Span 80,

um surfactante não iônico, foi misturado na fase óleo. A fase aquosa foi preparada



dissolvendo-se 2,52 g de P-123 em 28 mL de água deionizada. Após 30 minutos de

agitação, 0,6 mL da solução de amônia, utilizada como catalisador, foi adicionada à

fase aquosa. Depois da dissolução do P-123, a fase aquosa foi adicionada à fase óleo

e mantida sob agitação moderada. Em seguida, adicionou-se uma mistura de 32,4 g

de TEOS e 2,7 g de APTMS à emulsão para a síntese de MS porosas. A emulsão foi

agitada a 400 rpm durante 16 h, a 40 ºC. Ao término da reação, objetivando diminuir

a viscosidade, adicionou-se 100 mL de etanol à mistura e agitou-se durante mais 10

minutos. Posteriormente, a emulsão foi centrifugada a 1300 rpm (190 G) durante 14

minutos para recolher as MS porosas sintetizadas. As MS recolhidas foram re-

dispersas em etanol, utilizando-se um banho ultrassônico durante 60 minutos. Após

uma nova centrifugação, 900 rpm (90 G) durante 10 minutos, as MS foram recolhidas

e secas a vácuo durante 24 h, a 50 ºC. Por fim, o material produzido foi peneirado a

fim de coletar as MS porosas com um diâmetro maior que 20 µm.

2.2.2.2. Funcionalização das MS (MSF)

A síntese das MS produz partículas porosas e com poucos grupos amino em sua

superfície. O aumento da quantidade de grupos amino na superfície das MS foi

realizado pelo método de pós-enxerto, usando-se APTES como fonte de grupos

amino. Em primeiro lugar, as MS foram dispersas em tolueno anidro (75 mL por grama

das MS) em atmosfera inerte. Em seguida, adicionou-se o APTES (4 mL por grama

das MS) à mistura, sob agitação moderada, deixando-se sob refluxo a 120 ºC por 5 h.

Após a reação, a dispersão (MSF) foi centrifugada, lavada várias vezes com etanol e

seca a vácuo durante 24 h a 50 ºC.

2.2.2.3. Preparação do MIP para AA

Conforme ilustrado na Figura 2 - 1, o MIP com estrutura caroço–casca para

extração de AA (molécula molde) foi desenvolvido via co-polimerização, otimizando-

se o procedimento descrito por Su e colaboradores (Su et al., 2015). Inicialmente,

misturou-se 0,352 g de AA e 0,5768 g AM em 120 mL de acetonitrila e, em seguida, a

mistura foi deixada em repouso durante 5 horas para formação de um complexo entre

a molécula molde e o monômero. Na sequência, 0,400 g de MSF foram adicionados

à mistura e deixada em banho ultrassônico durante 30 minutos e, em seguida, a



mistura resultante foi colocada no escuro por mais 16 h. Depois, 7,52 mL de EDGMA

e 0,400 g de AIBN foram adicionados à mistura e homogeneamente dispersas,

utilizando-se um banho ultrassônico por 15 minutos. A mistura resultante foi

transferida para um balão de 500 mL e foram adicionados 140 mL de acetonitrila. A

mistura reacional foi submetida a refluxo sob agitação durante 6 h a 60 ºC, seguido de

2 h adicionais a 75 ºC. O MSF@MIP foi lavado várias vezes com acetonitrila, seguido

de centrifugação a 5000 rpm durante 15 minutos. Após centrifugação, a molécula

molde foi removida da matriz polimérica por meio de agitação vigorosa durante 16

horas, usando-se uma mistura de metanol/ácido acético (8:2, v/v). Finalmente, o

produto foi lavado com metanol até a neutralização e, em seguida, seco a vácuo

durante 24 h a 40 ºC. O polímero não impresso (MSF@NIP) foi sintetizado de forma

idêntica, mas sem a adição da molécula molde.

Figura 2 - 1. Ilustração esquemática da preparação do MSF@MIP. O MSF@NIP

correspondente foi preparado com a mesma rota de síntese na ausência da molécula

molde.



2.2.3. Caracterização

A morfologia e a composição das partículas foram investigadas utilizando-se um

microscópio eletrônico de varredura (SEM Quanta 3D FEG) equipado com um feixe

de íons de gálio focalizado (FIB) (FEI Corp., Eindhoven, Holanda) e um raio-X de

energia dispersiva (Detector EDX) (Apollo XV SDD, EDAX). A área superficial, o

tamanho e o volume dos poros das partículas foram determinados pela isoterma de

adsorção/dessorção de nitrogênio usando um QuadraSorb Station SI (Quantachrome

GmbH e Co. KG). As isotermas de adsorção/dessorção de nitrogênio foram coletadas

após a desgaseificação das amostras a 140 °C sob vácuo durante 3h. A área

superficial e o tamanho e volume dos poros foram calculados usando os métodos BET

e BJH, respectivamente. As medidas espectroscópicas no infravermelho (MIR-ATR)

foram realizadas utilizando-se um espectrômetro Bruker Alpha FTIR (Bruker Optics

GmbH, Ettlingen, Alemanha). Os espectros (média de 50 varreduras) foram coletados

na faixa espectral de 4000 a 400 cm-1, com uma resolução espectral de 2 cm-1. Por

fim, as quantidades de analito (molécula molde) extraída e eluída pelo MSF@MIP e

MSF@NIP foram determinadas com a ajuda de um espectrofotômetro Specord S600

UV/VIS (Analytik Jena), empregando-se uma cubeta com 10 mm de caminho óptico.

2.2.4. Avaliação das Características de Ligação e

Capacidade de Adsorção

2.2.4.1. Estudo de Incubação

Os testes de religação foram realizados em metanol à temperatura ambiente.

Para avaliar a capacidade de adsorção, 10 mg de MSF@MIP e MSF@NIP foram

adicionados separadamente em tubos de centrífuga contendo 8 mL da solução de AA

com concentrações variando de 5 a 33 mg L-1 e deixadas sob agitação durante 180

minutos. Em seguida, o MSF@MIP e MSF@NIP foram separados por centrifugação

e o sobrenadante foi analisado medindo-se a absorbância em 246 nm. A quantidade

de AA adsorvida ao MSF@MIP foi calculada a partir da diferença entre as

concentrações iniciais e finais em solução. Após a incubação, o AA foi eluído

utilizando-se 8 mL da mistura de metanol/ácido acético (8:2, v/v) e a quantidade de

AA eluída foi determinada medindo-se a absorbância em 248 nm. Para estes fins,



foram estabelecidas curvas de calibração em metanol e em metanol/ácido acético

(8:2, v/v).

A capacidade de adsorção (Q), definida como a quantidade de analito em mg

ligado por g de polímero, foi calculada pela Equação 13:

Q = (Ce − Cf

m) x V Equação 14

Onde Ce (mg L-1) e Cf (mg L-1) são as concentrações da solução de molécula molde

antes e após o processo de adsorção, respectivamente. V (L) é o volume da solução

de AA e m (g) a massa de polímero. A Equação 14 calcula a recuperação (R), definida

como a porcentagem de molécula molde recuperada após o passo de eluição, onde

Cs é a concentração na solução eluída (Ce):

R = (Cs

Ce − Cf ) x 100% Equação 15

As propriedades de reconhecimento específico do MIP foram avaliadas a partir

do fator de impressão (FI), que é definido como a razão das capacidades de adsorção

do MSF@MIP e MSF@NIP (Equação 15):

FI =QMIP

QNIP Equação 16

QMIP e QNIP são as capacidades de adsorção do MSF@MIP e MSF@NIP para AA,

respectivamente.

2.2.4.2. Estudo de SPE

A preparação do sorvente para extração de AA usando o cartucho SPE foi

realizado pesando-se uma alíquota de 100 mg do MSF@MIP e MSF@NIP em um

cartucho vazio, mantendo-se o material entre dois discos de lã de vidro. Antes da

extração, os cartuchos contendo MSF@MIP e MSF@NIP foram tratados inicialmente

com 6 mL da mistura de metanol/ácido acético (8:2, v/v) para garantir a ausência de

AA e, na sequência, condicionados com 6 mL de metanol. Posteriormente, para



avaliar a capacidade de adsorção do MSF@MIP e MSF@NIP, 25 mL de soluções de

AA em metanol com concentrações variando de 5 a 33 mg L-1 foram percolados

através dos cartuchos SPE. Em seguida, os cartuchos foram lavados com 6 mL de

acetonitrila para eliminação de interferentes. Por fim, o AA foi eluído com 25 mL da

mistura de metanol/ácido acético (8:2, v/v). As quantidades de AA extraídas e eluídas

foram determinadas como descrito no item 2.2.4.1.

2.2.4.3. Reconhecimento Específico do MSF@MIP e

MSF@NIP

Para estudar a seletividade do MSF@MIP e MSF@NIP, 10 mg desses materiais

foram transferidos para diferentes tubos de centrífuga, seguidos de 8 mL da solução

de AC e 8 mL da solução de AA em metanol, simultaneamente, com concentrações

de 28 mg L-1. Após 180 minutos, os polímeros foram separados por centrifugação e

as quantidades de AA e AC no sobrenadante foram determinadas por espectroscopia

UV-Vis. Assim como o AA, uma curva analítica, utilizando a absorbância em 246 nm,

foi construida para quantificar o AC em metanol. A seletividade foi avaliada a partir do

fator de seletividade (FS), que é definido como a razão entre o fator de impressão para

o AA e para o AC (Equação 16):

FS =FIAA

FIAC Equação 17

2.2.5. Método de Cálculo

A estratégia computacional desenvolvida baseou-se no método semi-empírico

AM11 e na DFT para localizar os complexos monômero-molécula molde mais estáveis

em diferentes solventes. O desenho estrutural e as simulações de modelagem

molecular foram realizadas usando o software Gaussian 09 e GaussView,

respectivamente (Frisch et al.,2003). Após o desenho estrutural, a geometria das

moléculas foi otimizada através do cálculo semi-empírico AM1. Na sequência, todas

1AM1 ou Austin Model 1 é um método semi-empírico para o cálculo quântico da estrutura eletrônica em

química computacional. Esses métodos substituem o maior número de cálculos possível com dados

pré-calculados embutidos no software sobre distância de ligação e outras propriedades.



as estruturas foram minimizadas para a conformação de menor energia no nível

B3LYP/6-31G (d,p)2 no vácuo, e posteriormente, na presença do solvente. A

otimização foi realizada de forma individual, ou seja, primeiro foi otimizado a estrutura

da molécula molde, depois o monômero e, por último, o complexo formado entre os

dois. Os solventes escolhidos para teste foram água, tetraidrofurano (THF),

acetonitrila (ACN), metanol (MeOH), dimetilsulfóxido (DMSO) e diclorometano (DClM).

Já os monômeros testados foram acrilamida, ácido metacrílico e metacrilamida. Para

calcular a energia livre de Gibbs, as geometrias das moléculas envolvidas foram

totalmente otimizadas. As energias (E) dos compostos em unidades atômicas

(Hartrees) foram convertidas em Kcal mol-1 multiplicando o valor por um fator de

627,51 Kcal mol-1 Hartrees-1. A partir das geometrias otimizadas, as frequências de

vibração harmônicas de cada composto foram calculadas.

2.3. Resultados e Discussão

2.3.1. Síntese das MS e do MIP com Estrutura Caroço-

Casca

Em contraste com os métodos para síntese de nanopartículas de sílica

monodispersas, o método da macroemulsão de água em óleo tem sido aplicado para

síntese de partículas em microescala (> 1 μm). Neste estudo, a macroemulsão é

composta de um surfactante não iônico (Span 80), de água, de uma fase óleo, de um

polímero (HPC) e de um copolímero (P-123). No mesmo sistema, uma fase aquosa

alcalina, contendo amônia como catalisador, foi utilizada para aumentar a taxa de

hidrólise e de condensação do TEOS e do APTMS. Embora o TEOS e APTMS sejam

solúveis na fase óleo (isto é, 1-octanol), as reações de hidrólise e de condensação

ocorrem na interface entre a fase água e a fase óleo. Com o tempo, mais e mais

moléculas de TEOS e APTMS são hidrolisadas e acumuladas na interface água/óleo,

permitindo que o sistema possa ser considerado como composto de micro-reatores,

em que a concentração de um reagente aumenta progressivamente durante a síntese.

Como consequência, as partículas de sol primárias altamente reticuladas são obtidas

2É um método híbrido contendo elementos da DFT e da teoria de Hartree-Fock. Uma de suas vantagens é que ele consegue simular espectros com sucesso (Tirado-Rives e Jorgesen, 2008).



dentro de uma gotícula água, as quais se ligam para formar partículas esféricas

secundárias, semelhante à forma e ao tamanho das gotas de água. O HPC e o Span

80 foram empregados nessa síntese com o objetivo de estabilizar a macroemulsão,

de evitar a separação das fases e de controlar a distribuição dos poros das

microesferas de sílica durante a reação. O polímero HPC também aumentou a

viscosidade do sistema, o que limitou a rápida penetração de moléculas de TEOS e

APTES pela interface água/óleo. Já o copolímero P-123 tem um papel fundamental

no controle da morfologia das micropartículas. Isso porque o copolímero, em meio

alcalino, inibe a condensação inter-gotas e a modificação da estrutura esféricas das

gotas de água na fase óleo.

A síntese das MS pelo método da macroemulsão utilizando a mistura

TEOS/APTMS produz partículas funcionalizadas. No entanto, a quantidade de grupos

amino na superfície é muito pequena, uma vez que a superfície está preenchida

predominantemente por grupos silanois. O método do pós-enxerto permitiu através da

condensação de grupos silanois e APTES o aumento dos grupos amino. Após a

síntese e funcionalização das MSF, os MIPs com estrutura caroço-casca foram

desenvolvidos na superfície MSF pela co-polimerização dos grupos amino com o

monômero funcional AM, usando EGDMA como agente de reticulação e AIBN como

iniciador. O complexo formado entre AM e AA apresenta uma forte interação não

covalente, que é essencial para o processo de impressão molecular. O AM interage

com a molécula do modelo (Figura 2 - 1) para formar um complexo através de ligação

de hidrogênio entre o oxigênio do AM e o hidrogênio do AA. Depois de interagir com

a molécula molde, os monômeros funcionais foram polimerizados pelo reticulador,

formando uma camada polimérica na superfície das MSF. Finalmente, a molécula

molde foi removida da matriz polimérica, deixando cavidades com sítios e dimensões

complementares para reconhecimento específico de AA.


A macroemulsão é uma suspensão estável de partículas de um líquido, de um

determinado tamanho, dentro de um segundo líquido imiscível. Através de medidas

de MEV foi possível observar a morfologia e o tamanho das partículas sintetizadas

usando o método da macroemulsão e sua respectiva funcionalização. As imagens de



MEV ilustradas na Figura 2 - 2 demonstram que as partículas são esféricas,

polidispersas e porosas, e que a etapa de funcionalização não as modificou

morfologicamente. Além disso, nota-se a presença de partículas colapsadas

resultante da baixa estabilidade física e da elevada agitação durante a síntese.

Figura 2 - 2. Micrografias das (a) MS, (b) MSF, (c) MSF@MIP, (d) MSF@NIP, (e) e (f)

MSF@MIP colapsado.

As micrografias das MS e MSF na Figura 2 - 2 (a) e (b), respetivamente,

apresentam tamanho acima de 2 μm e porosidade semelhante. Através das Figura 2

- 2 (c) e (d) correspondentes ao MSF@MIP e MSF@NIP, respetivamente, observa-se

a formação de uma camada polimérica rugosa na superfície das MSF com elevada

rugosidade. Através da micrografia de um MIP colapsado (Figura 2 - 2 (e) e (f)) foi

possível confirmar a produção do MIP com estrutura caroço-casca possuindo uma

camada polimérica de 1 μm. As micrografias comprovaram que MIP sem a estrutura

caroço-casca também foram formados, contudo, o uso de peneiras de 10 μm

garantiram que apenas MIP com estrutura caroço-casca fossem utilizados.

A espectroscopia MIR-ATR foi empregada para estudar as estruturas químicas

do MS, MSF, MSF@MIP e MSF@NIP. As bandas em 432, 788 e 1033 cm-1 mostrada



na Figura 2-3 são correspondentes às vibrações de alongamento O–Si–O e Si–OH, e

estiramento assimétrico Si–O–Si, respectivamente. Essas três bandas são

observadas em todos os espectros e estão associadas as MS (Figura 2-3 (c)).

Figura 2 - 3. Espectros de MIR-ATR das (a) MSF@NIP, (b) MSF@MIP, (c) MS e (d)

MSF.

O MSF@MIP (Figura 2-3 (a)) e MSF@NIP (Figura 2-3 (b)) apresentam bandas

em 1408 e 1542 cm-1 relacionadas as vibrações de deformação do grupo – C–H. Por

fim, observar-se uma banda em 1708 cm-1 correspondente as vibrações de

estiramento do grupo C=O. A banda em 1708 cm-1 é característica da MSF@MIP,

demonstrando que a estrutura do MSF@MIP e do MSF@NIP são distintas. Através

dos espectros de MIR-ATR das MS e MSF não é possível distinguir as partículas

funcionalizadas e não funcionalizadas. Para confirmar a funcionalização, utilizou-se a

ninidrina (Figura 2 - 4), um indicador que ao reagir com grupos amina produz o

surgimento de uma cor azul em meio alcoólico. Quanto mais intensa é a cor azul, mais

grupos amino estão presentes, o que indica que o método utilizado para

funcionalização se mostrou eficiente. A funcionalização também foi confirmada pelo

surgimento do sinal de nitrogênio e diminuição do sinal do oxigênio no EDX.



Figura 2 - 4. Interação das MSF com a ninidrina em solução alcoólica.

Os resultados das medidas de adsorção-dessorção de nitrogênio são

apresentados na Tabela 2 - 1. De acordo com o diâmetro dos poros das partículas

sintetizadas neste estudo, variando de 3 – 45 nm, as partículas são classificadas como

mesoporosas. Comparando-se os valores de área superficial, tamanho de poro e

volume de poro da MS (40 m2/g, 4,86 nm e 0,24 cm3/g) e MSF (31 m2/g, 3,80 nm e

0,26 cm3/g), antes e depois da funcionalização, foi possível observar que a

funcionalização não alterou significativamente as propriedades morfológicas das

partículas.

Tabela 2 - 1. Dados obtidos a partir das medidas da área superficial, tamanho e

volume de poros e tamanho de partícula obtidas a partir do BET, BJH e MEV,

respectivamente.

No caso do MSF@MIP, a camada polimérica é produzida na superfície das

MSF, deixando um espaço entre a superfície das partículas e a camada polimérica

(Figura 2 - 2 (f)), o que provavelmente promoveu um aumento na área superficial de

31 m2/g a 36 m2/g. Finalmente, observou-se que o tamanho de poro do MSF@MIP é

5 vezes maior do que o MSF@NIP, que pode ser atribuído a presença não apenas de

Partículas

Área superficial

(m2/g)

Tamanho de

poro (nm)

Volume de

poro (cm3/g)

Tamanho de

partícula (μm)

MS 40 4,86 0,24 > 2

MSF 31 3,80 0,26

MSF@MIP 36 45,86 0,50 > 10

MSF@NIP 7 9,32 0,013



poros estruturais, mas também pela aparência de espaços entre a camada polimérica

e a sílica. Além disso, a diferença de tamanho de poro entre o MIP e NIP está

associada à presença da molécula molde durante à fabricação do MIP, gerando um

material híbrido com estrutura diferente do NIP. Por fim, verifica-se que todos os

resultados obtidos pela isoterma de adsorção-dessorção de nitrogênio são

concordantes com a morfologia das partículas de sílica observadas nas micrografias.

2.3.3. Estudo de Adsorção

Para avaliar a capacidade de adsorção do MSF@MIP e MSF@NIP foram

construidas isotermas de adsorção no intervalo de concentração de 5 – 33 mg L-1

(concentrações iniciais) e os resultados são mostrados na Figura 2 - 5.

Figura 2 - 5. Capacidade de adsorção do MSF@MIP e do MSF@NIP em função da

concentração de AA usando o método (a) SPE e o (b) método incubação.

Os resultados indicaram que a capacidade de adsorção cresce rapidamente em

função do aumento da concentração de AA. A quantidade de AA adsorvida ao

MSF@MIP foi significativamente maior do que para a MSF@NIP na mesma

concentração inicial. Além disso, a saturação foi alcançada quando a concentração

inicial foi de 20 mg L-1 para ambos os métodos, mantendo-se constante nas

concentrações acima desse valor. Embora a SPE (Figura 2 - 5 (a)) e os métodos de

incubação (Figura 2 - 5 (b)) mostraram propriedades de adsorção similares, a SPE

proporcionou maior fator de impressão sendo, portanto, mais seletivo. Quando



comparado com outros tipos de polímeros impressos, o polímero MSF@MIP tem alta

eficiência devido aos sítios de ligação específicos estarem na superfície das

partículas.

Os parâmetros dos modelos obtidos a partir das três isotermas utilizadas estão

listados na Tabela 2-2. Com base nos valores de R2 e EMQ identificou-se que o

modelo com melhor ajuste aos dados experimentais foi o de Sips. Esse modelo

apresentou R2 e EMQ de 0,966 e 2,63, respectivamente.

Tabela 2 - 2. Parâmetros das isotermas para adsorção de AA utilizando MSF@MIP e

MSF@MIP.

A capacidade máxima de adsorção do polímero estimada pelo modelo de Sips

(5,19 mg g-1) foi próxima do máximo valor experimental (5,08 mg g-1), indicando que

Isotermas Parâmetros

SPE Incubação

MSF@MIP MSF@NIP MSF@MIP MSF@NIP

Langmuir

Qm (mg g-1) 7,529 2,659 6,379 2,659

RL 0,926 0,966 0,968 0,966

KL (L mg-1) 0,068 0,073 0,070 0,073

EMQ 4,818 8,136 5,562 10,59

R2 0,885 0,729 0,853 0,695

Freundlich

n 2,039 2,120 2,049 2,120

KF (mg g-1) 0,959 0,370 0,833 0,370

EMQ 6,217 9,323 6,846 10,87

R2 0,808 0,644 0,777 0,679

Sips

Qm (mg g-1) 5,190 1,838 4,167 1,937

ns 0,422 0,353 0,309 0,408

Ks (mg L-1)-1/n 0,121 0,123 0,135 0,087

EMQ 2,635 6,110 2,448 7,485

R2 0,966 0,847 0,971 0,848



a condição de extração utilizada foi satisfatória e o material desenvolvido encontra-se

entre os melhores adsorventes para extração de forma seletiva de ácido ascórbico,

uma vez que a literatura descreve adsorventes não seletivos com capacidade de

adsorção variando entre 4,21 mg g-1 (Kamran et al., 2014) e 5,71 mg g-1 (Azin

Dehmolaei e Mehdi Vadi, 2013). Por fim, o valor de n (índice de heterogeneidade)

próximo de 0,500 indica uma superfície com características homogênea e

heterogênea. A regressão obtida entre Q/Ce versus Q da equação de Scatchard

apresentou um coeficiente de determinação 0,9997 (Q/Ce = 0,5096 – 0,0833Q),

indicando que apenas uma reta descreve o comportamento dos dados e,

consequentemente, levando-se à conclusão de que o AA se liga ao polímero apenas

por um sítio na forma de dímeros (ligação de hidrogênio). Para avaliar a estabilidade

do MSF@MIP no decorrer das reutilizações, bem como os processos de lavagem do

material, cinco ciclos de adsorção/remoção foram realizados.

Os experimentos demonstraram que a recuperação do AA após a eluição não

mudou significativamente com o reaproveitamento do MSF@MIP (Figura 2-6), o que

mostra um avanço em relação ao trabalho do Kamran e colaboradores (Kamran et al.,

2014) por exemplo, uma vez que o material utilizado para extrair o AA limitou-se a três

reutilizações. Além disso, a recuperação foi mantida superior a 90%, o que sugeriu

que MSF@MIP tem boa estabilidade, não apresenta lixiviação, não perde seletividade

e mantem sua capacidade de reutilização.

Figura 2 - 6. Recuperação de AA usando MSF@MIP reutilizado.



A seletividade do MSF@MIP para AA foi avaliada em um teste com ácido cítrico

(AC), usando uma solução contendo ambos os compostos na mesma concentração.

A Figura 2-7 indica que os fatores de impressão do MSF@MIP para AA e AC são 2,30

e 0,88, respectivamente, obtendo um fator de seletividade de 2,64. Esses resultados

indicaram que o MSF@MIP exibe alta capacidade de reconhecimento específico para

AA, o que pode ser explicado com base nas diferenças estruturais entre AA e CA, que

causaram uma incompatibilidade na forma e sítios de ligação. Tais resultados indicam

a eficiência de impressão do MSF@MIP, e que o método de síntese do polímero, bem

como o processo de extração, foi executado com sucesso.

Figura 2 - 7. Estudo da seletividade do MSF@MIP e do MSF@NIP para extração do

AA e do CA.

2.3.4. Otimização Estrutural do Monômero e Molécula Molde

A otimização estrutural das moléculas é o primeiro passo para se calcular e,

consequentemente, estimar a energia livre das moléculas envolvidas no processo de

polimerização. A Figura 2-8 mostra a geometria otimizada do AA juntamente com os

monômeros, onde é possível verificar que os sítios de ligação dos monômeros

possuem características para formar ligações de hidrogênio na forma de dímero com

o AA.



Figura 2 - 8. Geometria do AA e dos monômeros otimizadas pelo método B3LYP/6-

31G (d,p), no vácuo. Na molécula de AA, quanto mais intensa a cor, menor a carga.

Observando a molécula de AA (Figura 2-8), sua estrutura química compreende

uma coleção de sítios de ligações heterogêneos capazes de formar interações de

hidrogênio com diversos monômeros funcionais, em diferentes níveis de afinidade.

Nesse sentido, para obter os locais de interação mais fortes, dividimos a molécula em

5 regiões e calculamos a energia de ligação da molécula molde com os monômeros

estudados (Figura 2-8).

2.3.1. Seleção Teórica do Monômero Funcional e do

Solvente

O primeiro passo na síntese de um MIP para AA envolve a formação de um

complexo na etapa de pré-polimerização entre o monômero e a molécula molde (AA).

O monômero que for capaz de interagir mais fortemente com a molécula molde irá

fornecer um complexo com a maior estabilidade. Na Figura 2-9, o cálculo teórico no

vácuo indica que o sítio de ligação mais favorável é a região 1 (Figura 2-8). Além disso,

dentre os monômeros estudados, apenas a 2-vinilpiridina não mostrou

espontaneidade na formação do complexo.



Figura 2 - 9. Cálculo teórico no vácuo dos possíveis sítios de ligação da molécula de AA com diferentes monômeros.

As energias de interação (energia de Gibbs) obtidas de diferentes solventes

apresentam uma diminuição em relação à interação da fase gasosa (Figura 2-10).

Esta observação foi consistente porque a solvatação das diferentes espécies também

envolveu interações intermoleculares da mesma natureza que a molécula molde e o

monômero, portanto, o solvente atuou como concorrente na formação do complexo.

A interação entre monômero e AA é realizada através de ligações de hidrogênio,

assim, um solvente não polar com uma constante dielétrica baixa é o mais

recomendado. O MIP também pode ser fabricado utilizando um solvente com elevada

constante dielétrica, no entanto, o MIP obtido terá um menor desempenho analítico.

Para solventes próticos, tais como água e metanol, pode haver liberação de íons

hidrogênio, que competirão na formação de ligações de hidrogênio entre molécula

molde e monômero e, assim, comprometer a funcionalidade do polímero. O cálculo

envolvendo o efeito do solvente foi realizado igualmente ao feito no vácuo,

considerando apenas a constante dielétrica. Devido aos baixos valores energéticos, o

monômero utilizado para os cálculos foi o ácido metacrílico.



Figura 2 - 10. Cálculo teórico para avaliação do efeito do solvente sobre a energia

envolvida na interação entre molécula molde e monômero.

A Figura 2-10 demonstra que o THF e DCIM seriam os melhores solventes para

o desenvolvimento desse MIP, e os demais solventes seriam equivalentes entre si.

Apesar do cálculo teórico indicar que o THF e DCIM seriam os melhores solventes

para síntese do MIP, as quantidades de AA utilizadas neste trabalho para desenvolver

o MIP, ultrapassam a solubilidade da molécula molde nesses solventes, ou seja, para

usar um desses solventes seria necessário usar proporções menores de AA. Por fim,

a escolha do metanol para a síntese é considerada adequada.

Ao considerar os monômeros como ligantes bidentados e avaliar as distâncias

entre oxigênio e hidrogênio nos monômeros, nota-se que a menor distância existente

é a do ácido metacrílico e, consequentemente, a menor energia. A região 1 da

molécula de ácido ascórbico, a qual mostrou ser o melhor sítio de ligação, tem a

distância entre hidrogênio e oxigênio de 2,32 Â, a qual sugere que o melhor encaixe

(interação) monômero-molécula molde ocorre usando-se ácido metacrílico. (Figura 2-

11). Diante disso, pode se afirmar que quanto maior for a diferença de tamanho nas

zonas de interação, menos favorável será a interação. Esses resultados ratificam os



dados apresentados na Figura 2-9 e indicam que a substituição da acrilamida pelo

ácido metacrílico produziria um MIP para AA com desempenho analítico melhor.

Figura 2 - 11. Relação entre a distância do oxigênio e hidrogênio nos monômeros e a

espontaneidade das interações entre monômero e molécula molde.

Na tentativa de compreender o efeito real da carga presente nos sítios de

ligação, simulou-se uma interação entre a molécula molde com um monômero

modificado (ácido metacrílico) com um elemento altamente eletronegativo. A Figura

2-12 mostra o efeito da adição do flúor, o qual substituiu um hidrogênio ligado ao

carbono, sobre a energia de interação entre molécula molde e monômero. Observa-

se que a substituição do hidrogênio pelo flúor não favorece significativamente a

interação entre molécula molde e monômero. No entanto, a interação entre monômero

e molécula molde é desfavorecida com aumento da quantidade de flúor. Isso ocorre

devido ao efeito indutivo do flúor, que tende a deslocar a densidade eletrônica à

medida que a quantidade de flúor aumenta, aumentando a distância de ligação entre

monômero e molécula molde e, consequentemente, enfraquecendo a interação.



Figura 2 - 12. Estimativa energética sobre o efeito causado pela modificação do

monômero ácido metacrílico com espécies eletronegativas.

A literatura atualmente não apresenta um trabalho relacionado ao uso de cálculos

químicos para a predição ou confirmação das melhores condições de síntese para a

produção de um polímero impresso para AA. Observando outros trabalhos na mesma

temática, apenas com uma molécula molde distinta, nota-se que o estudo sobre o efeito

solvente e o tipo de monômero são majoritários (Regan et al., 2006). Esse trabalho trouxe

como ponto inovador o estudo de diversas regiões ao entorno da molécula molde,

identificando as regiões envolvidas na interação molécula molde monômero. Além disso,

a identificação de que a energia de interação está relacionada a uma distância

intermolecular permite explorar uma série de novas moléculas como monômero funcional.

Por fim, os resultados obtidos nesta seção indicam que alguns dos reagentes

utilizados para síntese do polímero impresso para extração seletiva de ácido ascórbico

podem ser substituídos a fim de otimizar o desempenho analítico.

CAPÍTULO 3

3. Impressão Molecular Superficial em

Microesferas de Sílica, Porosas e Não-

Porosas, para Extração Seletiva de

Vanilina

RESUMO GRÁFICO

Capítulo 3: Impressão Molecular Superficial em Microesferas de Sílica, Porosas e Não-Porosas, para Extração Seletiva de Vanilina 76


3.1. Introdução

A vanilina (4-hidroxi-3-metoxibenzaldeido) é um aldeído fenólico de massa molar

igual a 152,14 g mol-1, principal componente da baunilha natural. É amplamente

utilizada como agente aromatizante em alimentos, perfumes, bebidas e produtos

farmacêuticos e pode ser obtida a partir da vagem de uma orquídea tropical (Mohamad

Yusof, Tanioka e Kobayashi, 2014). A vanilina, que já era cultivada e extraída da

Vanilla planifolia pelos astecas em meados de 1520, foi introduzida junto com o cacau

e o corante cochonilha no mercado Europeu. Devido a questões climáticas, o cultivo

dessa orquídea não foi realizado com sucesso em clima europeu e, ainda hoje, são

consideradas plantas de cultivo difícil. Acredita-se que esse insucesso está associado,

principalmente, ao fato da polinização ser realizada por insetos que não existem na

Europa. Atualmente, os principais produtores de vanilina natural são a Malásia,

México, Madagascar, Taiti e a Indonésia, todos com características tropicais.

A vanilina, além de ter um aroma atraente, traz vários benefícios à saúde por

apresentar atividade antioxidante, potencial antimicrobiano e ser um conservante de

alimentos natural (Singh et al., 2015) Essas propriedades têm proporcionado um

aumento no uso da vanilina em diversos produtos comerciais, tais como sorvete, leite,

refrigerante e açúcar, todos de baunilha, além dos sucos de frutas em caixa, com

concentração variando de 0,20 a 2000 mg L-1 (Passos e Ribeiro, 2009). Devido ao alto

custo dos extratos de baunilha naturais, a vanilina sintética tem sido frequentemente

utilizada como agente flavonoide. Os aromas artificiais de baunilha geralmente contêm

a vanilina sintética e/ou etilvanilina dissolvida em álcool, propilenoglicol e glicerina,

solventes da síntese (Jager, de, Perfetti e Diachenko, 2007).

Dados referentes as vendas globais relevaram que após o ano de 2010 cerca 15

mil toneladas de vanilina são vendidas por ano, com menos de 1% sendo extraída da

planta. O isolamento da vanilina a partir das vagens da orquídea é um processo

laborioso e dispendioso. A produção de 1kg de vanilina requer aproximadamente 500

kg da vagem de baunilha, correspondendo a polinização de 40.000 orquídeas.

Embora o custo médio de mercado da vanilina natural seja imprevisível e dependente

das condições climáticas, recentemente tem atingido valores na faixa entre R$

1.200,00 e 4.000,00 reais, em contraste com o preço médio da vanilina sintética de



R$ 15,00 por kg. Uma vez que o fornecimento das vagens de baunilha atingiu uma

espécie de platô em 2 milhões de kg, a demanda global por vanilina natural não

possibilita o uso da orquídea como única fonte (Gallage e Møller, 2015).

Os custos elevados e demanda por produtos naturais, somados aos pequenos

rendimentos da produção de vanilina natural, estimularam a pesquisa por rotas de

produção de vanilina sintética. A vanilina pode ser obtida através de vários métodos,

como a síntese química, a biotransformação, a degradação de licor residual de sulfito,

além da extração de vagens de baunilha naturais que contêm cerca de 2-3 % m/m de

vanilina. Além disso, a vanilina também foi relatada, em níveis de traços em muitas

plantas e produtos de frutas como laranja, toranja e tangerina (Goodner, Jella e

Rouseff, 2000).

O aumento na preferência dos consumidores por sabores naturais, os elevados

custos de produção da vanilina natural e a falsificação de extratos de baunilha,

demonstram a necessidade em desenvolver novos métodos para extração da vanilina

de fontes naturais. Recentemente, fabricantes de extratos de baunilha adulteraram

esses extratos com cumarina, intensificando o sabor da baunilha (Jager, de, Perfetti e

Diachenko, 2007). A cumarina, um fitoquímico encontrado em muitas espécies de

plantas, mostrou causar hepatotoxicidade em animais e foi banida para uso como

aditivo alimentar nos EUA desde 1956. Atualmente, a literatura descreve diversos

métodos para a extração de vanilina natural a partir de diferentes matrizes e em

diferentes níveis de concentração, tais como a extração assistida por ultrassom (UAE)

e a extração em fase sólida (SPE) (Płaszczyk e Kowalski, 2017). No entanto, esses

métodos são demorados, muitas vezes complicados, com alto consumo de solvente

orgânico e dispendiosos.

Os objetivos desta etapa do trabalho são desenvolver um novo método de

síntese do MIP com estrutura de caroço – casca, com base em microesferas de sílica

amino-funcionalizadas, porosas e não porosas, para a extração seletiva de vanilina;

identificar os parâmetros que influenciam a capacidade de adsorção (porosidade,

funcionalização, pH e tempo); avaliar o desempenho do MIP e NIP na extração de

vanilina de uma amostra comercial.




3.2.1. Reagentes

Ácido acético, metanol, etanol, monooleato de sorbitano (Span 80),

tetraetilortosilano (TEOS) e vanilina foram adquiridos da Merck. 1-octanol,

hidroxipropilcelulose (HPC), poli(etilenoglicol)-bloco-poli(propileno glicol)-bloco-

poli(etilenoglicol) (P-123) e etilvanilina foram adquiridos da Sigma Aldrich. Hidróxido

de amônia (NH3, >25%) foi adquirida da VWR International. Tolueno e acetonitrila

foram adquiridos da Carlroth. (3-aminopropil)trimetoxisilano (APTMS) e (3-

aminopropil)trietoxisilano (APTES) foram adquiridos da Alfa Aesar. Todos os

reagentes foram utilizados sem purificação adicional. A água utilizada neste estudo foi

deionizada (≥ 18 MΩ cm-1) produzida utilizando um sistema de purificação Milli-Q.

3.2.2. Preparação do MIP para Extração de Vanilina

3.2.2.1. Síntese das MS

As MS porosas (MS1) utilizadas nesta seção foram desenvolvidas igualmente as

partículas porosas sintetizadas no item 2.2.2.1 deste manuscrito. No entanto, a

síntese das MS não porosas (SM2) utilizou quantidades de TEOS e APTES diferentes

das porosas. Para síntese das SM2 misturou-se 28,1 g de TEOS e 11,7 g APTMS, e

rapidamente adicionou-se à macroemulsão. As demais condições de síntese e

funcionalização foram mantidas igualmente aos itens 2.2.2.1 e 2.2.2.2,

respectivamente.

3.2.2.2. Fabricação do MIP

A Figura 3 - 1 ilustra o procedimento esquemático para a preparação do MIP

seletivo a vanilina baseando-se no método sol-gel a partir da otimização do

procedimento descrito por X.Ren e L.Chen (Ren e Chen, 2015). Inicialmente, 0,100 g

de vanilina foram dispersos em 100 mL de etanol. Em seguida, adicionou-se 5 mL de

APTES e agitou-se durante 30 minutos, seguido da adição de 10 mL de TEOS. Após

5 min, 0,190 g das MS (MS1, MS1F, MS2 e MS2F) e 5 mL de solução de amônia

concentrada foram adicionados à mistura, que foi deixada sob agitação durante 24 h

a 30 °C. Após a conclusão da síntese, os polímeros obtidos foram submetidos a três



ciclos de centrifugação (1000 rpm durante 15 minutos cada), lavagem e ressuspensão

em etanol. Em seguida, a molécula molde foi removida da matriz polimérica utilizando

extração com solvente através de uma mistura de metanol:ácido acético (8:2, v/v) sob

agitação vigorosa durante 16 h. Finalmente, o produto foi lavado com metanol até

atingir pH neutro, centrifugado e seco a vácuo durante 24 h a 40 °C. Os MIPs híbridos

desenvolvidos usando as partículas MS1, MS1F, MS2 e MS2F foram denominados

como MS1@MIP, MS1F@MIP, MS2@MIP e MS2F@MIP, respectivamente. Os

polímeros não impressos (MS1@NIP, MS1F@NIP, MS2@NIP e MS2F@NIP) foram

fabricados igualmente ao MIP, mas sem a presença da molécula molde de vanilina.

Todas as partículas sintetizadas nesta seção foram caracterizadas igualmente ao

descrito no item 2.2.3.

Figura 3 - 1. Esquema representativo da preparação do MIP e do NIP.

3.2.3. Avaliação das Características e da Capacidade de

Adsorção

3.2.3.1. Estudo de Adsorção – Método da Incubação

Os ensaios de ligação da vanilina foram realizados em metanol à temperatura

ambiente. Para avaliar a cinética de adsorção do MIP, 10 mL de uma solução de



vanilina 28 mg L-1 foram adicionados em vários tubos de centrífuga contendo 25 mg

de MIP ou NIP e deixados sob agitação durante um intervalo de tempo entre 30 e 300

minutos. Um procedimento semelhante foi realizado para avaliar a capacidade de

adsorção em função do pH. Para isso, 10 mL de uma solução de vanilina 28 mg L-1,

com pH variando de 1 a 11, foram adicionados em seis diferentes tubos de centrifuga

contendo 25 mg do polímero e deixados sob agitação durante 180 minutos. Para

avaliar a capacidade de adsorção, 25 mg do MS1@MIP, MS1F@MIP, MS2@MIP,

MS2F@MIP, MS1@NIP, MS1F@NIP, MS2@NIP e MS2F@NIPs foram adicionados

separadamente em tubos de centrífuga contendo 10 mL da solução de vanilina com

concentrações variando entre 5 – 28 mg L-1, e deixadas sob agitação durante 180

minutos. Em seguida, o MIP e o NIP foram separados por centrifugação (1300 rpm

por 10 minutos) e o sobrenadante foi analisado através da medição da absorbância

no UV em 278 nm. As quantidades de vanilina ligada ao MIP e ao NIP foram

calculadas a partir da Equação 13. Após a incubação, a vanilina foi eluída usando 10

mL da mistura de metanol/ácido acético (8:2, v/v) e a quantidade de vanilina eluída foi

determinada pela medição da absorbância no UV em 280 nm. Para este estudo,

também foram desenvolvidas curvas analíticas em metanol e metanol/ácido acético

(8:2, v/v).

3.2.3.2. Estudo de Adsorção – SPE

A preparação do sorvente para extração de vanilina foi feita igualmente a descrita

no item 2.2.4.2. Antes da extração, os cartuchos contendo os MIPs e os NIPs foram

tratados com 3 mL da mistura metanol/ácido acético (8:2, v/v) para assegurar a

ausência de qualquer analito restante e, na sequência, foram condicionados com 6

mL de metanol. Depois, para avaliar a capacidade de adsorção do MIP e do NIP, 10

mL de diferentes soluções de vanilina em metanol, com concentrações variando de 5

– 32 mg L-1, foram percoladas através dos cartuchos. Em seguida, os cartuchos foram

lavados com 3 mL de acetonitrila para a eliminação de interferentes. Por último, a

vanilina foi eluída com 10 mL da mistura de metanol/ácido acético (8:2, v/v). As

quantidades de vanilina extraída e eluída foram determinadas como descrito no item

3.2.3.1 deste manuscrito.



3.2.3.3. Reconhecimento Específico

Para estudar a seletividade do MS1F@MIP e MS1F@NIP, 10 mg desses

materiais foram transferidos para diferentes tubos de centrífuga, seguidos de 10 mL

de uma solução de vanilina e etilvanilina em metanol, simultaneamente, com

concentrações de 28 mg L-1. Após 180 minutos, os polímeros foram separados por

centrifugação e as quantidades de vanilina e etilvanilina no sobrenadante foram

determinadas por espectroscopia UV/VIS. Assim como a vanilina, uma curva analítica,

utilizando a absorbância em 272 nm, foi desenvolvida para quantificar etilvanilina em

metanol. A seletividade foi avaliada a partir do fator de seletividade (FS), que é definido

como a razão entre o fator de impressão para a vanilina e etilvanilina (Equação 16).

3.2.3.4. Aplicação em Amostras Reais

Foram adquiridos 7 amostras do extrato de baunilha em lojas de varejo e pela

internet. A preparação das amostras consistiu em uma diluição de 1:100 do extrato

em metanol para atingir uma concentração em torno de 1 µg mL-1. A determinação foi

feita utilizando-se a cromatografia líquida de ultra eficiência com espectrômetro de

massa (UHPLC-MS/MS, do inglês, Ultra-high performance liquid chromatography

tandem mass spectrometry), o qual foi operado no modo SRM (do inglês, Monitoring

of Selected Reactions) e com fonte de ionização por eletrospray no modo positivo,

com fase móvel de ácido fórmico:metanol (35:65, v/v), voltagem do cone de 28 V e

temperatura de dessolvatação de 500 ºC. Uma vez estabelecidas as condições, foram

construídas curvas analíticas para vanilina e etilvanilina na faixa de concentração de

0,5 a 10 µg mL-1. As soluções padrões foram injetadas em triplicata e partir das

equações das retas foram determinadas as concentrações dos analitos nas amostras.

Todas as amostras foram medidas antes e após a passagem pelo MIP.

3.3. Resultados e Discussão

3.3.1. Síntese das Partículas de Sílica e do MIP com

Estrutura Caroço-Casca

Após a síntese das microesferas, o polímero impresso foi desenvolvido usando-

se APTES como o monômero funcional, TEOS como agente de reticulação e amônia



como catalisador. O tempo de contato entre APTES e vanilina facilitou a formação das

interações não covalentes, que são essenciais na impressão molecular. O APTES

interage com a molécula modelo de modo que as ligações de hidrogênio no complexo

entre os grupos amino e a vanilina são formadas. Depois de interagir com a molécula

molde, os monômeros funcionais foram co-polimerizados na matriz por agente de

reticulação, estabelecendo-se assim uma camada polimérica na superfície das

microesferas. Finalmente, a molécula molde foi removida da matriz polimérica por

meio de extração usando solvente, deixando os locais de ligação com funcionalidade

complementares para religar especificamente a vanilina. Para fins de comparação,

polímeros não impressos também foram preparados utilizando um procedimento

idêntico, mas sem a adição da vanilina.

O uso de partículas porosas e não porosas, funcionalizadas ou não, para o

desenvolvimento dos MIPs, podem produzir materiais morfologicamente iguais, mas

estruturalmente diferentes. Por exemplo, o uso de partículas funcionalizadas permite

que o monômero funcional forme o complexo com a molécula molde e, por

condensação, adsorva-se quimicamente a superfície da partícula. Outro exemplo

consiste no uso de partículas não porosas, com área superficial menor, que teriam

uma menor quantidade de sítios de ligação, o que por outro lado poderiam ser sítios

mais específicos. O efeito de cada uma dessas variáveis será exposto e discutido na

sequência do texto.


As medidas de MIR-ATR foram usadas para estudar a estrutura química das

partículas de sílica, do MS1F@MIP (Figura 3 - 2 (c)) e do MS1F@NIP (Figura 3 - 2

(d)). No espectro das microesferas (Figura 3 - 2 (a) e (b)) foram observadas bandas

em 692, 790, 940 e 1010 cm-1 correspondentes às deformações Si-O-Si, vibrações de

O-Si-O, Si-OH, Si-O-Si, respectivamente. Exceto a banda em 940 cm-1, todas as

outras bandas também são observadas nos espectros do MS1F@MIP e do

MS1F@NIP. Além das bandas já mencionadas, o MS1F@MIP (c) e MS1F@NIP (d)

exibiram bandas em 1410, 1542 e 2952 cm-1 relativas a deformação angular de C –

H, ao estiramento e deformação do grupo OH da água (bandas de combinação) e ao

estiramento simétrico do grupo C – H, respectivamente. Os espectros semelhantes



entre o MS1F@MIP e MS1F@NIP, além de demostrar que o processo de lavagem foi

feito com sucesso, demonstra que a composição da matriz polimérica é idêntica. Os

espectros dos demais polímeros mostraram resultados semelhantes aos da MS1,

MS1F, MS1F@MIP e MS1F@NIP, respectivamente, e por essa razão não são

mostrados na Figura 3 - 2.

Figura 3 - 2. Espectros de MIR-ATR das (a) MS1, (b) MS1F, (c) MS1F@MIP e (d)

MS1F@NIP.

A Figura 3 - 3 mostra as micrografias dos materiais sintetizados pela

macroemulsão e pelo método sol-gel. A partir das micrografias foi possível observar a

morfologia, o tamanho e a porosidade das partículas, evidenciando que as partículas

são esféricas, polidispersas e com diferentes graus de porosidade. Na Figura 3 - 3 (a),

(b), (c) e (d) observar-se que as MS1, MS1F, MS2 e MS2F, respectivamente,

apresentaram porosidades diferentes, provando que o método proposto é eficaz para

a síntese de microesferas de sílica com porosidades diferentes. Além disso, observou-

se que a relação entre TEOS e APTES é um dos parâmetros relevantes para

determinar a porosidade e o tamanho final da partícula.



Figura 3 - 3. Micrografias de (a) MS1, (b) MS1F, (c) MS2, (d) MS2F, (e) MS1@MIP,

(f) MS1F@MIP, (g) MS2@MIP, (h) MS2F@MIP, (i) MS1@NIP, (j) MS1F@NIP, (l)

MS2@NIP e (k) MS2F@NIP.

A Figura 3 - 3 (e), (f), (g), (h), (i), (j), (k), e (l), correspondentes ao MS1@MIP,

MS1F@MIP, MS2@MIP, MS2F@MIP, MS1@NIP, MS1F@NIP, MS2@NIP e

MS2F@NIP, respectivamente, mostram a formação de uma camada polimérica na

superfície das MSP com espessura de aproximadamente de 200 nm. Ainda através

da análise morfológica, observou-se que os MIPs desenvolvidos usando-se partículas

porosas apresentaram uma camada polimérica menos áspera e homogênea com

relação ao MIP sintetizado usando partículas não porosas. Além disso, os MIPs

fabricados a partir de partículas funcionalizadas também apresentaram superfície

irregulares em relação ao uso de partículas não funcionalizadas.

As micrografias obtidas utilizando MEV evidenciaram as mudanças morfológicas

antes e após a polimerização, o que já seria suficiente para comprovar a formação do

polímero e da estrutura caroço-casca. No entanto, a partículas colapsadas do

MS1@MIP (Figura 3 - 4 (a)), resultantes da baixa estabilidade física das partículas e

da elevada agitação durante a síntese, permitiram confirmar visualmente a produção



do MIP com estrutura de caroço-casca. Na Figura 3 - 4(b), observou-se que além do

MIP com estrutura caroço-casca também são produzidos MIPs tradicionais sem

morfologia definida. No entanto, o processo de peneiramento realizado após a síntese

permitiu separar as partículas inferiores a 10 μm, garantindo que só o MIP com

estrutura caroço-casca tenha sido utilizado para a extração seletiva de vanilina.

Figura 3 - 4. Micrografias de (a) MS1@MIP colapsada e (b) MIPs tradicionais sem

morfologia definida.

Os resultados das isotermas de adsorção-dessorção de nitrogênio das amostras

são apresentados na Tabela 3 - 1. Através da avaliação das isotermas também foi

possível comprovar que a RAT é um fator determinante na porosidade e na área

superficial das microesferas de sílica. As MS1 e MS2 foram produzidas quando se

utilizou uma RAT de 0,10 e 0,50, respectivamente, e apresentaram área superficial de

80,50 e 0,63 m2/g, respectivamente.

O MS1@MIP produzido usando-se partículas porosas apresentou uma área

superficial menor que as MS1 usadas como o núcleo, o que indica que a camada

polimérica foi produzida no interior dos poros, diminuindo a área superficial de 80,58

para 5,56 m2/g. O MS1F@MIP, produzido a partir das MS1F apresentou elevada área

superficial de 64,55 m2/g, diferentemente do MSF@MIP, indicando que a

funcionalização impede a formação do polímero dentro dos poros.



Tabela 3 - 1. Dados obtidos a partir das medidas da área superficial e de tamanho de

partícula. Na determinação da área superficial o método BET foi utilizado.

Partículas Área superficial (m2/g) Tamanho de partícula (µm)

MS1 80,58

> 4

MS1F 84,07

MS2 0,63

> 1

MS2F 1,83

MS1@MIP 5,56

> 10

MS1F@MIP 64,55

MS1@NIP 45,82

MS1F@NIP 29,65

MS2@MIP 9,84

> 4

MS2F@MIP 32,48

MS2@NIP 40,51

MS2F@NIP 37,96

No caso do MS2@MIP, a camada polimérica foi produzida na superfície da MS2,

porém, a ausência de porosidade das MSNP levou ao aparecimento de um espaço

entre a superfície das MS2 e a camada polimérica, o que provocou, provavelmente, o

aumento da área superficial de 0,63 m2/g a 9,84 m2/g. Além disso, observa-se que,

exceto nos NIPs, a funcionalização não promove um aumento na área superficial.

Finalmente, observar-se que embora haja uma variação área superficial dos NIPs, os

resultados indicam que a camada polimérica dos NIPs apresentaram elevada

rugosidade e porosidade. Todos os resultados obtidos pela isoterma de adsorção-

dessorção de nitrogênio são concordantes com os resultados observados nas

micrografias.




Durante os estudos de adsorção (religamento), a cinética de adsorção, os efeitos

do pH e o método de extração foram avaliados para otimizar a capacidade de

adsorção de vanilina pelos polímeros. A capacidade de adsorção, expressa em

miligrama de vanilina por grama de polímero, demonstra numericamente quanto de

analito o polímero impresso consegue extrair da mistura ou solução. A capacidade de

adsorção e o fator de impressão são os principais fatores para se avaliar o

desempenho analítico do MIP. Quanto maior o fator de impressão e a capacidade de

adsorção mais eficiente é o MIP. Na Figura 3 - 5 (a) observa-se que a capacidade de

ligação aumentou lentamente e atingiu seu máximo após 180 minutos (10 mL de uma

solução com 28 mg L-1 de vanilina e 25 mg do MIP). Devido aos sítios de ligação

estarem localizados na superfície da partícula com estrutura caroço-casca, o tempo

de equilíbrio observado neste estudo é significativamente mais curto em comparação

com os materiais impressos convencionais para a vanilina. Além disso, deve-se notar

que após 180 minutos a capacidade de ligação não se alterou, o que indica que todos

os sítios para reconhecimento específico estão saturados com vanilina. A cinética de

ligação dos MIPs sintetizados no presente estudo seguiu um mecanismo de pseudo-

primeira ordem, apresentando uma taxa constante de 0,00827 min-1, o que indica que

a interação vanilina e matriz polimérica não é um processo tão rápido, e uma

capacidade de adsorção no equilíbrio de 5,62 mg g-1 (capacidade de adsorção

calculada).

Os estudos de adsorção em função do pH para o MS1@MIP foram realizados

no intervalo de pH entre 1 a 11. A Figura 3 - 5 (b) mostra que a quantidade máxima

de vanilina ligada ao polímero foi obtida em pH 5. Para compreender as razões que

provocaram o melhor desempenho do polímero em pH 5 é necessário considerar a

estrutura do polímero e da vanilina em função do pH. A baixa capacidade de adsorção

em valores de pH maiores que 7 pode ser explicada pela desprotonação da vanilina,

enfraquecendo a ligação de hidrogênio entre a vanilina e o polímero. Em valores de

pH entre 1 e 3, o grupo amino na superfície das MS estão completamente protonados,

também enfraquecendo as ligações de hidrogênio. Entre pH 5 e 6, tanto a vanilina

quanto o MS1@MIP existem, principalmente, na forma neutra o que possibilita uma

maior formação de ligações de hidrogênio.



Figura 3 - 5. Capacidade de adsorção do MS1@MIP em (a) função do tempo e (b) do

pH.

Após otimizar as condições de extração, as capacidades de adsorção da vanilina

investigando SM1@MIP e SM1@NIP foram avaliadas utilizando cartuchos SPE e

método de incubação, como mostrado na Figura 3 - 6 (a) e (b), respectivamente.


concentração de vanilina usando o (a) método SPE e o (b) método da incubação.

Os resultados demonstraram que a capacidade de adsorção do polímero,

usando ambos os métodos, aumenta com o aumento da concentração de vanilina, até

atingir a capacidade máxima de adsorção em uma concentração entre 28 – 32 mg L-

1. As quantidades máximas de vanilina adsorvidas pelo MS1@MIP usando o método



de incubação e de SPE foram de 5,65 e 2,59 mg g-1, respectivamente. Essas

diferenças podem resultar do fato de que o tempo de contato entre a vanilina e a

SM1@MIP são determinadas pelo tempo de percolação através do cartucho (~ 30

min), enquanto a incubação foi realizada durante 180 minutos sob agitação, o que

favorece a quantidade adsorvida. Além disso, foi mostrado durante o estudo de

seletividade, usando SM1@ MIP em comparação com SM1@NIP, que em

concentrações de vanilina superiores a 15 mg L-1 fatores de impressão de FI = 2,26 e

FI = 1,35 foram alcançados para os métodos de SPE e incubação, respectivamente.

Os experimentos usando MS2@MIP e MS2@MIP revelaram uma maior

seletividade e capacidade de adsorção, em concentrações equivalentes de vanilina,

durante estudos de incubação Figura 3 - 7. A capacidade de adsorção do MS2@MIP

foi significativamente maior que o de MS2@NIP, apresentando um fator de impressão

de 2,37. A diferença estrutural entre MS1@MIP e MS2@MIP é a porosidade do

caroço, que aparentemente afeta as propriedades da casca polimérica produzida na

superfície das MS. Como anteriormente descrito, a camada polimérica do SM1@MIP

é formada dentro os poros das MS1, o que potencialmente limita a transferência da

massa em comparação com MS2@MIP. Além disso, o SM2@MIP tem uma área de

superfície maior em comparação com o SM1@MIP, favorecendo assim a interação

com a molécula alvo.


concentração de vanilina empregando-se o método da incubação.



Os resultados da avaliação da funcionalização das partículas usadas como

casca no desenvolvimento dos polímeros podem ser observados na Figura 3 - 8. A

funcionalização das MS1 não alterou significativamente a seletividade do

SM1F@MIP, mas a funcionalização da MS produziu um polímero menos seletivo nas

mesmas condições (SM2F@MIP). Embora não tenha alterado a seletividade do

SM1F@MIP, o ganho na capacidade de adsorção foi significativo, isso porque a

quantidade adsorvida aproximadamente dobrou, ou seja, nas mesmas condições, a

funcionalização da partícula aumenta a capacidade de adsorção. Tal efeito pode estar

associado a heterogeneidade da superfície, como mostrado nas micrografias,

aumentando o número de sítios de ligação.

Na tentativa de descrever o comportamento dos dados de adsorção foram

desenvolvidos modelos matemáticos, com base nos valores de R2 e EMQ, para

identificar a isoterma com o melhor ajuste aos dados experimentais. Na Figura 3 - 8

observar-se que os polímeros com partículas não funcionalizadas se ajustaram ao

modelo de Langmuir. Como já mencionado, o modelo de Langmuir descreve uma

adsorção em monocamadas, possuindo sítios de ligação homogêneos.

Figura 3 - 8. Capacidade de adsorção do (a) MS1F@MIP, MS1F@NIP, (b)

MS2F@MIP e MS2F@NIP em função da concentração de vanilina usando o método

da incubação.

Também na Figura 3 - 8 (a) e (b) é possível observar que os polímeros fabricados

a partir de partículas funcionalizadas se ajustaram ao modelo de Sips, um modelo



intermediário entre Langmuir e Freundlich, capaz descrever superfícies parcialmente

heterogêneas e homogêneas. Correlacionando o ajuste de cada modelo com as

micrografias, é possível concluir que, assim como na morfologia, foi produzida uma

superfície heterogênea, com sítios de ligação heterogêneos.

As isotermas fornecem uma série de informações sobre os parâmetros de cada

modelo. A Tabela 3 - 2 apresenta de forma resumida todos parâmetros obtidos a partir

das isotermas de Sips e Langmuir. As capacidades de máxima adsorção foram mais

elevadas para o MS2@MIP e MS2@NIP, respectivamente. Além disso, no modelo de

Langmuir todos os polímeros apresentaram RL>1, indicando que o processo de

adsorção é favorável e próximo do linear, ou seja, a quantidade de vanilina adsorvida

pode ser otimizada. Através da equação de Scatchard conclui-se que a vanilina está

ligada ao polímero por dois sítios de ligação: um sítio de alta afinidade de ligação, com

alta energia de ligação, e outro de baixa afinidade, com baixa energia de ligação.

Tabela 3 - 2. Parâmetros das isotermas para ajuste dos dados.

Polímeros

Parâmetros – Isotermas

Langmuir

Qm RL KL EMQ R2

MS1@MIP 11,472 0,929 0,0327 4,929 0,918

MS1@NIP 10,235 0,910 0,0261 3,225 0,965

MS2@MIP 16,868 0,928 0,0154 3,191 0,974

MS2@NIP 4,775 0,954 0,0360 8,927 0,791

Sips

Qm n KS EMQ R2

MS1F@MIP 9,949 0,517 0,1140 4,128 0,915

MS1F@NIP 7,852 0,809 0,0981 2,200 0,968

MS2F@MIP 6,794 0,503 0,0732 4,209 0,951

MS2F@NIP 6,518 0,4418 0,0611 4,060 0,971



3.3.3.1. Estudo de Recuperação

A eluição da vanilina extraída com os SM1@MIP e SM2@MIP nos cartuchos

SPE correspondentes foi realizada através de uma mistura de metanol:ácido acético

(8/2, v/v), apresentando uma taxa de recuperação entre 93 e 98%. Este resultado

indica que os polímeros desenvolvidos podem ser adequados para estudos

quantitativos de vanilina extraídos de diversas matrizes. Além disso, foi mostrado que

esses cartuchos podem ser regenerados e reutilizados por pelo menos 20 vezes para

procedimentos de extração, sem prejudicar seu desempenho. Avaliando-se as taxas

de recuperação, a seletividade, o número de reutilizações e a capacidade de

adsorção, prevê-se que a extração de vanilina de diferentes matrizes seja efetiva. Por

exemplo, a extração de vanilina de vagens de orquídeas usando MIPs pode ser

realizada dentro de algumas horas.

3.3.3.2. Estudo de Seletividade e Aplicação em Amostra Real

A seletividade do MS2@MIP para vanilina foi avaliada em um teste com

etilvanilina, usando uma solução contendo ambos os compostos na mesma

concentração. A Figura 3 - 9 indica que os fatores de impressão do MS2@MIP para

vanilina e etilvanilina são 1,22 e 0,94, respectivamente, obtendo-se um fator de

seletividade de 1,29. Estes resultados indicam que o MS2@MIP exibe alta capacidade

de reconhecimento específico para vanilina, o que pode ser explicado com base nas

diferenças estruturais entre moléculas, que causaram uma incompatibilidade na forma

e sítios de ligação. Embora exista uma seletividade cruzada entre vanilina e

etilvanilina, esses resultados são satisfatórios e indicam a eficiência de impressão do

MS2@MIP, e que o método de síntese do polímero, bem como o processo de

extração, foi executado com sucesso.



Figura 3 - 9. Estudo da seletividade do MS2@MIP e do MS2@NIP para extração de

vanilina e etilvanilina.

A análise de várias amostras por espectrometria de massas permitiu identificar

que alguns extratos de baunilha, além de possuir vanilina, também continha

etilvanilina. As amostras A e B foram as únicas que apresentaram etilvanilina e vanilina

no mesmo extrato. A quantificação da amostra A revelou que a concentração de

etilvanilina e vanilina são equivalentes antes do processo de extração, e na amostra

B a concentração de etilvanilina é 9 vezes maior do que a concentração de vanilina.

Nas demais amostras (amostras C, D, E, F e G) apenas a vanilina foi encontrada e

quantificada, apresentando antes do processo de extração, uma faixa de

concentração variando de 3,26 (amostra G) até 7,34 µg mL-1 (amostra D). A

concentração de etilvanilina antes do processo de extração foi de 6,57 e 45,80 µg mL-

1 nas amostras A e B, respectivamente.

Após a quantificação das amostras usando o espectrômetro de massas, todas

soluções foram percoladas pelos cartuchos contendo o MS2@MIP, utilizando as

mesmas proporções volumétricas do item 2.2.4.2, e na sequência, a alíquota

resultante foi medidas novamente no espectrômetro de massas. A Figura 3 -10 mostra

todos os resultados obtidos em função da massa retida, ou seja, quanto de vanilina e

etilvanilina foram extraídas pelo MIP




de vanilina e etilvanilina de amostras reais.

. Nas amostras contendo apenas vanilina (C a G), a massa retida foi diretamente

proporcional a concentração de vanilina na amostra. Nas amostras A e B, embora o

polímero desenvolvido continue apresentando uma seletividade cruzada, o polímero

mostrou-se eficiente para extração de vanilina. Os resultados de seletividade

demonstraram que o desempenho analítico do MIP foi satisfatório, uma vez que, o

polímero conseguiu extrair seletivamente a vanilina na presença de etilvanilina e

demais moléculas. Além disso, quando comparado com a literatura, o MIP

desenvolvido neste trabalho apresentou melhores índices de recuperação,

capacidade de adsorção e fator de impressão. Por exemplo, no trabalho Ning e

colaboradores (Ning et al., 2014), a recuperação e a capacidade de adsorção foram

83% e 4,56 mg g-1, respectivamente, e no trabalho de Su e colaboradores (Su et al.,

2014) o fator de impressão foi de 2,56, ambos os resultados obtidos a partir de um

MIP para extração de vanilina. Como conclusão pode-se afirmar que a metodologia

de síntese e aplicação promoveram um avanço nos polímeros impressos com

estrutura caroço-casca para vanilina.

CAPÍTULO 4

4. Síntese do MIP na Superfície de

Nanopartículas de Sílica Para Extração

Seletiva de Cafeína

RESUMO GRÁFICO

4.1. Introdução

A cafeína (1,3,7-trimetil-1H-purina-2,6(3H,7H)-diona) é um alcaloide pertencente

à classe das metilxantinas capaz de estimular o sistema nervoso, e que pode ser

encontrada naturalmente em alimentos como café, chá, chocolate e bebidas derivadas

da cola (Brenelli, 2003). Além de ser consumida através de alimentos, diversos

medicamentos analgésicos, principalmente para cefaleia, contêm cafeína associada

ao paracetamol ou aos anti-inflamatórios não hormonais (Tavares e Sakata, 2012).

Estima-se que 70 % da cafeína é proveniente do café, na qual apresenta um teor

médio de 100 mg de cafeína por xícara de 240 mL. Após ser consumida, a cafeína é

rapidamente absorvida e metabolizada, atingindo um máximo na corrente sanguínea

no intervalo de 1 a 2 horas (Lieberman et al., 2016). A sua liberação ocorre em até 48

horas, principalmente pela urina, sendo que até 5% da cafeína não é metabolizada,

fazendo com que concentrações significativas da cafeína apareçam no esgoto

sanitário bruto (290 μg L-1), contribuindo diretamente para quantidade final de cafeína

em mananciais de superfícies .

O resíduo de cafeína em mananciais de superfícies geralmente encontra-se na

faixa de concentração de ng L-1 para μg L-1, de modo que a pré-concentração é uma

etapa necessária para aumentar o limite de detecção da cafeína (Al-Quaim et al.,

2017). A SPE tem sido usada para isolar e/ou pré-concentrar diferentes analitos em

amostras complexas. Embora esta técnica seja relativamente rápida e simples, são

baseadas em extrações não específicas, que muitas vezes sofre algumas

deficiências, como baixa especificidade e seletividade (Baggiani et al., 2011). Nos

últimos anos, a SPE envolvendo polímeros impressos recebeu uma série de

aplicações bem sucedidas devido à sua alta seletividade, facilidade de síntese, baixo

custo para a preparação e aplicabilidade em diferentes condições, especialmente na

presença de solventes orgânicos (Al-Quaim et al., 2017).

O uso dos MIPs combinados com SPE tem-se mostrado vantajoso,

principalmente, quando o objetivo é realizar uma extração seletiva. Além disso, o MIP

combinado com SPE permite não só a pré-concentração do analito, mas também a

remoção de outros compostos presentes na matriz de amostra (Caro et al., 2002).

Além dos MIPs tradicionais, a literatura apresenta alguns trabalhos com MIPs de

Capítulo 4: Síntese do MIP na Superfície de Nanopartículas de Sílica Para Extração Seletiva de Cafeína 97


estrutura caroço-casca para mesma finalidade, utilizando partículas em microescala

(Row e Jin, 2006). Esses polímeros para cafeína têm sido usados para pré-concentrar

(Tian et al., 2015), extrair (Theodoridis e Manesiotis, 2002) e quantificar (Alizadeh et.

al., 2010). No entanto, o uso dos MIPs com estrutura caroço-casca para extração de

cafeína usando nanopartículas ainda é uma incógnita, sendo mais utilizado como uma

espécie de sensor. Além disso, os resultados apresentados anteriormente revelam

que devido ao tempo de contato, o método de incubação produz um melhor

desempenho do MIP, em relação a SPE. Diante disso, o objetivo deste capítulo foi

desenvolver um MIP com estrutura caroço-casca para extração seletiva de cafeína

com base em sílica de Stöber, em nanoescala, adotando as mesmas metodologias de

síntese e aplicações descritas nos capítulos anteriores.


4.2.1. Reagentes

Ácido acético, clorofórmio, hidróxido de amônia (NH3, >25%) foram adquiridos

da Synth. Acetonitrila, ácido metacrílico (MAA), cafeína, persulfato de amônio (PSA),

tetraetilortosilano (TEOS) e (3-aminopropil)trietoxisilano (APTES) foram adquiridos da

Sigma Aldrich. Metanol, etanol e tolueno anidro foram adquiridos da JTBaker, Merck

e TEDIA, respectivamente. Todos os reagentes foram utilizados sem purificação

adicional e a água utilizada neste estudo foi deionizada (≥ 18 MΩ cm-1) produzida

utilizando um sistema de purificação Milli-Q.

4.2.2. Síntese de Nanopartículas de Sílica Amino-

Funcionalizadas (NPSA)

A síntese das nanopartículas de sílica (NPS) foi baseada no método de Stöber

com modificações (Stöber, Fink e Bohn, 1968). Para a síntese das partículas foram

preparadas duas soluções. A solução I foi preparada adicionando-se 230 mL de etanol

e 22 mL de amônia em um balão volumétrico. A solução II foi preparada dissolvendo

5 mL de TEOS em 20 mL de etanol. Ambas soluções foram agitadas separadamente

durante 15 minutos. Na sequência, a solução II foi adicionada a solução I e deixada

sob agitação durante 4 horas a temperatura ambiente. Após a reação, as partículas



foram submetidas a ciclos de centrifugação (3000 rpm (907 G) por 15 minutos),

lavagem e redispersão em etanol. Por fim, as partículas foram coletadas e secas em

estufa durante 12 h a 50 ºC. Na sequência, as partículas foram amino-funcionalizadas

igualmente ao descrito no item 2.2.2.2 desse manuscrito.

4.2.3. Síntese do MIP de Superfície em Nanopartículas de

Sílica Amino-Funcionalizadas (NPSA)

A preparação do MIP na superfície das NPSA para extração seletiva de cafeína

foi baseada na otimização do procedimento descrito por M. Fayazi e colaboradores.

(Fayazi et al., 2015). Inicialmente, 389 mg de cafeína foram dissolvidos em 20 mL de

clorofórmio. Na sequência, 1 mL de MAA e 300 mg de NPSA foram adicionados e

deixados sob agitação durante 5 minutos. Após esse período, foram adicionados 4 mL

de EGDMA e 100 mg de PSA. A mistura foi desgaseificada em um banho ultrassônico

durante 10 minutos e na sequência agitada sob atmosfera inerte durante 16 h a 40 ºC.

Após a síntese, o NPSA@MIP foi coletado e lavado diversas vezes com etanol para

eliminar o excesso de reagentes. Na sequência, a mistura de ácido acético/metanol

(8:2, %v/v) foi adicionada ao polímero e deixada sob agitação vigorosa durante 4 horas

para remoção da molécula molde. Finalmente, o produto foi lavado com água e seco

durante 16 horas a 50 ºC. O polímero não-impresso (NPSA@NIP) foi fabricado de

forma idêntica, mas sem a adição da molécula de cafeína.


A morfologia e o tamanho das partículas foram observados por microscopia

eletrônica de varredura usando um microscópio JEOL JSM - 360 - LV, operando a 10

kV no modo de imagem de elétrons secundários. As amostras foram analisadas sobre

um suporte de Cu/Zn, revestida com uma camada de ouro de 10 nm. O tamanho das

partículas foi determinado pelo espalhamento dinâmico de luz (DLS), utilizando um

Nanosizer da Malvern. Inicialmente, as partículas foram dispersas em água (0,05 mg

mL-1), utilizando-se ultrassom por 2 minutos. Após a sonicação, 2 mL da suspensão

foram transferidos para uma cubeta de quartzo (1 cm de caminho óptico) e a medida

foi feita com detector em um ângulo fixo de 157º e temperatura de 25 ºC. Os espectros



de absorção no infravermelho das partículas foram coletados utilizando-se um

espectrômetro da marca MB100 Bomem com resolução de 4 cm-1, na faixa de 4000 a

400 cm-1 e acumulação de 20 varreduras. Foram feitas pastilhas com KBr com

concentração de 2 % (m/m) para realização das medidas.


Neste estudo, as capacidades de adsorção do NPA@MIP e do NPA@NIP foram

avaliadas utilizando-se apenas o método da incubação. Para avaliar a capacidade de

adsorção em função do solvente utilizado, a água, a acetonitrila e diversas proporções

dos dois solventes foram testadas. Para avaliar a cinética de ligação do NPA@MIP, 2

mL de uma solução de cafeína 40 mg L-1 foi adicionada em vários eppendorf contendo

10 mg do NPA@MIP e deixados sob agitação durante um intervalo de tempo entre

0.5 – 24 h. Para avaliar a capacidade de adsorção em função da concentração de

cafeína, 10 mg do NPA@MIP e do NPA@NIP foram adicionados separadamente em

tubos eppendorf contendo 2 mL de uma solução de cafeína com concentrações

variando de 5 – 45 mg L-1 e deixados sob agitação durante 6 horas. Em seguida,

NPSA@MIP e NPSA@NIP foram separados por centrifugação e o sobrenadante foi

analisado por medidas de absorbância no UV a 267 nm, quantificando a cafeína

adsorvida ao polímero a partir da Equação 13.

4.3. Resultado e Discussão

4.3.1. Síntese das NPSA e do NPSA@MIP

As NPS foram sintetizadas através das reações de hidrólise e condensação do

TEOS em meio alcalino baseando-se no método de Stöber. No decorrer das reações

de hidrólise e condensação, a concentração do intermediário (Si(OC2H5)4-X(OH)X)

atinge a concentração de supersaturação, dando início a etapa de nucleação. A

nucleação reduz a concentração do intermediário a um nível abaixo de saturação,

interrompendo a nucleação e iniciando o crescimento das partículas. As condições de

síntese utilizadas neste trabalho foram otimizadas para que a etapa de nucleação

fosse menor que a etapa de crescimento, permitindo a produção de partículas maiores

que 100 nm. Além disso, a pré-diluição do TEOS mostrou-se fundamental para



produção partículas monodispersas e não aglomeradas, isso porque as cinéticas de

hidrólise e de condensação são mais lentas em concentrações baixas de TEOS, o que

evita o início da etapa crescimento de partícula durante a etapa de nucleação.

Após a síntese e funcionalização das NPS, o polímero impresso foi desenvolvido

usando-se clorofórmio como solvente porogênico, PSA como iniciador, ácido

metacrílico como monômero funcional e cafeína como molécula molde.

Semelhantemente ao MIP para ácido ascórbico, o grupo amina se liga ao monômero

funcional, que, consequentemente, se liga a molécula molde (Yan et al., 2014). Após

a ligação do monômero funcional com a cafeína, iniciou-se a reação de polimerização

a partir do radical formado pelo PSA. Após a polimerização, a molécula molde foi

removida da camada polimérica, deixando sítios de reconhecimento específicos para

a cafeína. Diferentemente do NPSA@MIP, o NPSA@NIP, por não possuir cafeína

durante a síntese, deve apresentar a camada polimérica com uma estrutura aleatória.


Na Figura 4 -1 observa-se o espectro de absorção na região do infravermelho

médio das partículas sintetizadas e modificadas. As bandas em 795 e 1033 cm-1, 493

e 949 cm-1 são correspondentes as vibrações Si–O–Si, O–Si–O e Si–OH,

respectivamente. Essas três bandas são observadas em todos os espectros e estão

associadas as NPS. Além disso, todos os espectros apresentam bandas em 1646 cm-

1, o qual pode ser atribuído a vibração de flexão das moléculas de H2O. O NPSA@MIP,

o NPSA@NIP e as NPSA apresentaram uma banda em 1403 cm-1, relacionada às

vibrações de deformação do grupo – C–H. Essa banda pode ser atribuída ao grupo C

– H do APTES usado na funcionalização ou ao grupo C – H do monômero usado para

fabricação da camada polimérica. Observa-se que embora o infravermelho indique

sucesso no desenvolvimento dos materiais, outras análises complementares são

necessárias para reforçar as afirmações feitas nesta seção.



Figura 4 - 1. Espectro no infravermelho médio das NPSA, NPS, NPSA@MIP e

NPSA@NIP.

Através da microscopia eletrônica de varredura (MEV) foi possível observar o

tamanho, a morfologia e a uniformidade das NPS e dos polímeros. As micrografias

(Figura 4 -2) demonstram que as condições utilizadas para a síntese da NPS ((Figura

4 -2 (a)) e para a funcionalização das NPSA ((Figura 4 -2 (a)) permitiram obter

partículas esféricas não-porosas, monodispersas e com uma leve diferença de

tamanho entre elas. Além disso, nota-se que o sistema não produziu partículas

aglomeradas, demonstrando que a pré-diluição do TEOS em etanol desempenha um

papel importante nas características finais das nanopartículas. Na (Figura 4 -2 (c) e

(d) é possível observar que o NPSA@MIP e NPSA@NIP, respectivamente,

apresentam as mesmas características morfológicas das NPSA. No entanto, através

dessas micrografias não é possível afirmar com precisão a presença de uma camada

polimérica sobre as NPSA, sendo necessárias medidas complementares para verificar

a existência ou não dessa camada (EDX e TEM).



Figura 4 - 2. Micrografias das NPS (a), NPSA (b), NPSA@MIP (c) e NPSA@NIP (d).

As medidas em suspensão por DLS permitiram avaliar o tamanho médio e a

distribuição de tamanho das partículas. Os resultados demonstraram que o tamanho

médio e a polidispersão aumentaram de 397 nm para 464 nm e de 0,061 para 0,201,

respectivamente, após a funcionalização da superfície das NPS. Acredita-se que esse

aumento no tamanho médio ocorre devido ao aumento do tamanho hidrodinâmico das

nanopartículas em água. Após a polimerização, a partícula resultante apresentou um

tamanho médio de 674 nm e polidispersão de 0,318, sendo um indicativo de que esse

aumento é resultante da formação da camada polimérica sobre as NPSA

(NPSA@MIP). O aumento da polidispersão também pode ser um indicativo da

formação de camadas poliméricas de diferentes espessuras, bem como a não

formação do NPSA@MIP em algumas partículas. Por fim, as NPSA@NIP

apresentaram tamanho médio e polidispersão menores que o NPSA@MIP e maiores

que as NPSA, o que pode comprovar a diferença de estrutural entre o MIP e NIP.



Figura 4 - 3. Medidas de tamanho de partícula e potencial zeta das NPS, NPSA,

NPSA@MIP e NPSA@NIP em suspensão obtidas por DLS.

4.3.3. Estudo da Capacidade de Adsorção

A primeira etapa do estudo de adsorção do NPSA@MIP foi avaliar qual o melhor

solvente para extrair seletivamente a cafeína de amostras ambientais. Inicialmente,

tentou-se aplicar o NPSA@MIP em meio aquoso através do método de incubação, no

entanto, a capacidade de adsorção foi muito baixa (0,18 mg g-1) quando comparado

com a literatura (Ting Tian et al., 2017). Na sequência, a extração foi realizada em

acetonitrila e a capacidade de adsorção foi consideravelmente melhor (0,59 mg g-1).

No entanto, um material que só extrai a cafeína presente em solventes orgânicos não

é analiticamente viável, uma vez que as maiores fontes de cafeína são soluções

aquosas. No intuito de otimizar a extração na presença de água, testou-se diversas

proporções volumétricas de H2O/ACN e o resultado está expresso na Figura 4 - 4.



Figura 4 - 4. Avaliação do solvente na capacidade de ligação. (A) 25/75 % v/v

H2O/ACN, (B) 50/50 % v/v H2O/ACN, (C) 75/25 % v/v H2O/ACN, (D) 85/15% v/v

H2O/ACN, (E) 90/10 % v/v H2O/ACN, (F), 5/95 % v/v H2O/ACN.

Nota-se que o aumento da razão H2O/ACN aumenta a capacidade de adsorção,

alcançando um máximo na proporção 75/25 % v/v H2O/ACN. Esse resultado pode

estar associado ao fato de que essa proporção de acetonitrila é suficiente para

condicionar o polímero (hidrofóbico) e permite a aproximação da molécula de cafeína.

Após identificar o solvente que otimiza a capacidade de adsorção do polímero,

realizou-se ensaios da cinética de adsorção do NPSA@MIP para investigar o

mecanismo envolvido entre polímero e a molécula molde. Como mostrado na Figura

4 – 5, a capacidade de adsorção aumentou lentamente, dando um salto entre 4 e 6

horas até atingir o equilíbrio após aproximadamente 8 horas, tornando-se

praticamente constante mesmo após 24 horas. Um dos motivos para um tempo de

ligação relativamente longo, porém menor que o descrito na literatura (Luo et al.,

2013), pode estar associado à ocupação das cavidades com locais de reconhecimento

na superfície do NPSA@MIP que foram rapidamente ocupadas pela molécula molde,

o que aumentou a dificuldade de ligação da cafeína aos locais interiores.



Figura 4 - 5. Capacidade de adsorção do NPSA@MIP em função do tempo.

Para estimar a capacidade de adsorção do NPSA@MIP e NPSA@NIP realizou-

se ensaios de adsorção utilizando diferentes concentrações iniciais da solução de

cafeína. A Figura 4-6 mostra que a quantidade de cafeína ligada ao NPSA@MIP e ao

NPSA@NIP aumentou com o aumento da concentração de cafeína. Além disso, a

quantidade de cafeína ligada ao NPSA@MIP foi muito superior ao NPSA@NIP,

apresentando um FI de aproximadamente 1,8, ou seja, comprovando que o material

desenvolvido é consideravelmente seletivo.

A equação de Scatchard (Equação 9) foi adotada para avaliar a capacidade de

adsorção máxima teórica e a constante de dissociação (kd). A equação da regressão

linear para o NPSA@MIP foi Q/Ce = 69,42 – 20,96Q. Calculados através da inclinação

e do coeficiente linear da regressão, os valores de Qmax e Kd foram de 3,47 mg g-1 e

de 0,05 L g-1, respectivamente, permitiram comprovar a afinidade do NPSA@MIP pela

cafeína. Além disso, observar-se que o modelo que melhor se ajustou ao conjunto de

dados foi o de Langmuir indicando uma adsorção em monocamada. Comparando

com resultados obtidos a partir do MIP usando micropartículas nota-se que o

desempenho do MIP com nanopartículas está abaixo da média, uma vez que a

capacidade máxima de adsorção e o tempo de extração obtidos por Tian e

colaboradores foi de 62 mg g-1 e 1 hora, respectivamente (Tian et al., 2015). No



entanto, vale ressaltar que o fator de impressão na mesma faixa de concentração foi

equivalente (1,91 mg g-1) e o melhor ajuste dos dados foi obtido também pelo modelo

de Langmuir.

Figura 4 - 6. Capacidade de adsorção do NPSA@MIP e do NPSA@NIP em função da

concentração de cafeína com base no método da incubação.

CAPÍTULO 6

5. Conclusões e Perspectivas

Capítulo 5: Conclusões e Perspectivas 108


Nesta Tese foi desenvolvida uma nova metodologia de fabricação de polímeros

impressos com estrutura caroço-casca, utilizando sílica como suporte, para extração

seletiva de ácido ascórbico, cafeína e vanilina. A metodologia permitiu a obtenção de

materiais morfologicamente diversificados, com flexibilidade e características bem

definidas, capazes de serem adaptados a diversos sistemas. Por exemplo, o capítulo

2 trouxe a síntese e aplicação do MIP para ácido ascórbico a partir de sílica porosa e

funcionalizada. Embora as microesferas de sílica tenham sido produzidas por um

método de síntese simples e bem definido, a combinação dessas partículas com a

tecnologia de impressão molecular ainda era uma incógnita. A metodologia utilizada

para fabricação do MIP, bem como os métodos de caracterização adotados, permitiu

obter e identificar, respectivamente, um material com tamanho médio superior a 10

µm, composto por um caroço e uma casca de até 1 µm de espessura. Diante dos

dados já descritos na literatura, a espectroscopia MIR-ATR e EDX apenas

confirmaram que o polímero havia sido fabricado com sucesso.

Após a caracterização, a avaliação do desempenho analítico do MIP para ácido

ascórbico, foi baseada na capacidade de adsorção, seletividade, recuperação e

número de reutilizações. Os resultados mais relevantes foram obtidos utilizando o

método de SPE com índices de recuperação superiores a 90%, capacidade de

adsorção máxima de 5,09 mg g-1 e fator de impressão de 2,30, podendo ser reutilizado

por mais de 20 vezes sem perder significativamente o desempenho analítico.

As metodologias de síntese, caracterização e aplicação utilizadas para a

fabricação do MIP para AA foram levemente modificadas e utilizadas para o

desenvolvimento de um novo MIP para vanilina descrito no Capítulo 3. Os aspectos

como porosidade, pH, tempo de extração e funcionalização, não explorados no

capítulo anterior, foram estudados neste capítulo. Além disso, uma amostra real foi

utilizada a fim de testar a seletividade do MIP para vanilina. A otimização permitiu

identificar as condições ideais de aplicação do polímero, que para a vanilina são

necessários 180 minutos com pH 5 para se obter a máxima capacidade extração do

polímero. Após a otimização do tempo e do pH, o desempenho analítico dos polímeros

com partículas porosas e não porosas, com ou sem funcionalização, sintetizados de

forma inédita, foram avaliados e revelaram que o grau de porosidade e

funcionalização são fundamentais para melhorar o desempenho do MIP. A porosidade



das partículas foi controlada pela razão TEOS/APTES e, como resultado, observou-

se que os MIPs para vanilina fabricados a partir de partículas não porosas

(MS2@MIP) foram mais seletivos (FI=2,37). Já a funcionalização das partículas

produziu um aumento na capacidade de extração, mas consequentemente diminuiu a

seletividade (FI=1,89). Os índices de recuperação e reutilização foram semelhantes

aos obtidos para o MIP para ácido ascórbico.

O estudo da seletividade em soluções padrão de vanilina e etilvanilina

demonstraram uma seletividade cruzada do polímero, ou seja, uma pequena

quantidade de etilvanilina também é extraída pelo polímero. A análise de várias

amostras por espectrometria de massas revelou a concentração de vanilina e

etilvanilina em alguns extratos de baunilha, variando de 3,26 até 7,34 µg mL-1 e de

6,57 até 45,80 µg mL-1, respectivamente. Os estudos permitem concluir que o

polímero desenvolvido é capaz de extrair a vanilina (20% massa retida) de matrizes

complexas contendo etilvanilina, mesmo quando a concentração de etilvanilina é

superior.

No Capítulo 4, o domínio da tecnologia de impressão molecular expandido para

nanoescala demonstrou que a fabricação dos MIPs é possível em diversas condições

e faixas de tamanho. Os polímeros impressos e não impressos apresentaram

tamanhos médios de 594 e 674 nm, respectivamente, e foram sintetizados usando um

iniciador que funciona à temperatura ambiente e sem o uso de radiação UV, o que

tornou o processo de síntese ainda mais simples. Os resultados preliminares

revelaram a obtenção de um polímero seletivo e com excelente estabilidade

mecânica. No entanto, a capacidade de adsorção (3,47 mg g-1) e o tempo de extração

(entre 6 e 8 horas) estão distantes da média descrita na literatura.

Por fim, o cálculo teorico aplicado aos reagentes envolvidos no processo de

síntese descrito no capítulo 2, com base na teoria do funcional da densidade, permitiu

a otimização das estruturas e, consequentemente, permitiu também identificar os

possíveis sítios de ligação no ácido ascórbico, qual seria o melhor monômero e

solvente (com base na energia de interação), e identificar o efeito da carga e tamanho

de ligação na interação entre monômero e molécula molde. Os monômeros estudados

mostraram possuir interações energeticamente favoráveis com o AA, exceto a 2-



vinilpiridina. Pode-se concluir que moléculas com a ausência de grupos similares aos

contidos em um agente quelante, os quais são capazes de interagir por dois ou mais

grupos, não são energeticamente favoráveis como monômero para interagir com o

AA. Ainda nessa espécie de quelante, quanto melhor encaixe, ou seja, quanto mais

próximo estiverem os grupos, mais favorável é a interação. Como conclusão, pode-se

criar diversos monômeros fixando-se apenas o grupo vinil e o grupo quelante. Pode-

se inferir, com base nos cálculos teóricos que o polímero descrito no Capítulo 2 terá

um melhor desempenho analítico se for substituída a acrilamida pelo ácido

metacrílico.

O levantamento bibliográfico desta TESE apresentou diversos métodos de

síntese e aplicação dos polímeros impressos em diferentes escalas. No entanto, os

métodos utilizados nesta Tese apresentam um avanço significativo em nível mundial,

uma vez que são inovadores e promissores, e o conhecimento adquirido é

fundamental para o desenvolvimento de outros materiais para extração seletiva. Como

perspectiva, pretende-se em etapas futuras aprofundar-se no desenvolvimento de

novos polímeros impressos, utilizando materiais luminescentes e magnéticos, para

aplicações bioanalíticas. Pretende-se também utilizar a análise por injeção em fluxo

no intuito de automatizar e, consequentemente, analisar amostras de rotina em grande

escala. Ainda como perspectiva, utilizar a química computacional para prever e

compreender outras etapas do processo de fabricação dos MIPs.

Referências 111


6. Referências

ALENAZI, N. A.; MANTHORPE, J. M.; LAI, E. P. C. Selectivity enhancement in molecularly

imprinted polymers for binding of bisphenol A. Sensors (Switzerland), v. 16, n. 10, p. 1697,

14 out. 2016.

ALEXANDER, C. et al. Molecular imprinting science and technology: a survey of the literature

for the years up to and including 2003. Journal of Molecular Recognition, v. 19, n. 2, p. 106–

180, mar. 2006.

ALVAREZ-LORENZO, C.; CONCHEIRO, A. Molecularly imprinted polymers for drug delivery.

Journal of Chromatography B, v. 804, n. 1, p. 231–245, maio 2004.

ARSHADY, R.; MOSBACH, K. Synthesis of substrate selective polymers by host guest

polymerization. Macromolecular Chemistry and Physics, v. 182, n. 2, p. 687–692, jan. 1981.

BARROS, L. A.; CUSTODIO, R.; RATH, S. Design of a new molecularly imprinted polymer

selective for hydrochlorothiazide based on theoretical predictions using Gibbs free energy.

Journal of the Brazilian Chemical Society, v. 27, n. 12, p. 2300–2311, 2016.

BELHACHEMI, M.; ADDOUN, F. Comparative adsorption isotherms and modeling of

methylene blue onto activated carbons. Applied Water Science, v. 1, n. 3–4, p. 111–117, 27

dez. 2011.

BRENELLI, E. C. S. A extração de cafeína em bebidas estimulantes - Uma nova abordagem

para um experimento clássico em química orgânica. Quimica Nova, v. 26, n. 1, p. 136–138,

jan. 2003.

CALVI, A. et al. Recognizing physisorption and chemisorption in carbon nanotubes gas

sensors by double exponential fitting of the response. Sensors (Switzerland), v. 16, n. 5, p.

731, 19 maio 2016.

CARO, E. et al. Non-covalent and semi-covalent molecularly imprinted polymers for selective

on-line solid-phase extraction of 4-nitrophenol from water samples. Journal of

Chromatography A, v. 963, n. 1–2, p. 169–178, 19 jul. 2002.

CHAMBIAL, S. et al. Vitamin C in disease prevention and cure: An overview. Indian Journal

of Clinical Biochemistry, v. 28, n. 4, p. 314–328, 1 out. 2013.

CHANG, L.; DING, Y.; LI, X. Surface molecular imprinting onto silver microspheres for surface

enhanc24 June 2013ed Raman scattering applications. Biosensors and Bioelectronics, v.

50, p. 106–110, dez. 2013.

CHEN, L. et al. Molecular imprinting: perspectives and applications. Chem. Soc. Rev., v. 45,

n. 8, p. 2137–2211, 2016.

CHENG, W.; LIU, Z.; WANG, Y. Preparation and application of surface molecularly imprinted

silica gel for selective extraction of melamine from milk samples. Talanta, v. 116, p. 396–402,

2013.

CORMACK, P. A. G.; ELORZA, A. Z. Molecularly imprinted polymers: Synthesis and

characterisation. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the

Biomedical and Life Sciences, v. 804, n. 1, p. 173–182, maio 2004.

Referências 112


DAOUD ATTIEH, M. et al. Enzyme-Initiated Free-Radical Polymerization of Molecularly

Imprinted Polymer Nanogels on a Solid Phase with an Immobilized Radical Source.

Angewandte Chemie - International Edition, v. 56, n. 12, p. 3339–3343, 13 mar. 2017.

DARBANDI, M.; THOMANN, R.; NANN, T. Single quantum dots in silica spheres by

microemulsion synthesis. Chemistry of Materials, v. 17, n. 23, p. 5720–5725, 2005.

DRAGUTAN, I. et al. Recent advances in metathesis-derived polymers containing transition

metals in the side chain. Beilstein Journal of Organic Chemistry, v. 11, p. 2747–2762, 28

dez. 2015.

FAN, J.-P. et al. Preparation and characterization of molecular imprinted polymer

functionalized with core/shell magnetic particles (Fe3O4@SiO2@MIP) for the simultaneous

recognition and enrichment of four taxoids in Taxus×media. Chemical Engineering Journal,

v. 279, p. 567–577, nov. 2015.

FAYAZI, M. et al. Preparation of molecularly imprinted polymer coated magnetic multi-walled

carbon nanotubes for selective removal of dibenzothiophene. Materials Science in

Semiconductor Processing, v. 40, p. 501–507, dez. 2015.

FERNANDES, R. S. et al. Molecularly imprinted core–shell hybrid microspheres for the

selective extraction of vanillin. Anal. Methods, v. 9, n. 19, p. 2883–2889, 2017.

GALLAGE, N. J.; MØLLER, B. L. Vanillin-bioconversion and bioengineering of the most

popular plant flavor and its de novo biosynthesis in the vanilla orchid. Molecular Plant, v. 8,

n. 1, p. 40–57, jan. 2015.

GOODNER, K. L.; JELLA, P.; ROUSEFF, R. L. Determination of vanillin in orange, grapefruit,

tangerine, lemon, and lime juices using GC - olfactometry and GC - MS/MS. Journal of

Agricultural and Food Chemistry, v. 48, n. 7, p. 2882–2886, jul. 2000.

HANSEN, D. E. Recent developments in the molecular imprinting of proteins. Biomaterials,

v. 28, n. 29, p. 4178–4191, out. 2007.

HO, Y. S.; MCKAY, G. Pseudo-second order model for sorption processes. Process

Biochemistry, v. 34, n. 5, p. 451–465, jul. 1999.

HUANG, Y.; ZHU, Q. Computational Modeling and Theoretical Calculations on the Interactions

between Spermidine and Functional Monomer (Methacrylic Acid) in a Molecularly Imprinted

Polymer. Journal of Chemistry, v. 2015, p. 1–9, 2015.

ISKIERKO, Z. et al. Molecularly imprinted polymers for separating and sensing of

macromolecular compounds and microorganisms. Biotechnology Advances, v. 34, n. 1, p.

30–46, jan. 2016.

JAGER, L. S. DE; PERFETTI, G. A.; DIACHENKO, G. W. Determination of coumarin, vanillin,

and ethyl vanillin in vanilla extract products: liquid chromatography mass spectrometry method

development and validation studies. Journal of Chromatography A, v. 1145, n. 1–2, p. 83–

88, mar. 2007.

JARDIM, W. et al. Cafeína em Águas de Abastecimento Público no Brasil. 1ed. ed. São

Carlos: [s.n.].

KONG, X. et al. Synthesis and characterization of the core-shell magnetic molecularly

imprinted polymers (Fe₃O₄@MIPs) adsorbents for effective extraction and determination of

Referências 113


sulfonamides in the poultry feed. Journal of chromatography. A, v. 1245, p. 8–16, 6 jul. 2012.

KOWALSKI, K. Dynamics of the Scatchard model for ligand-receptor binding. Mathematical

Biosciences, v. 89, n. 2, p. 225–230, jun. 1988.

KOWALSKI, P. et al. Validated capillary electrophoretic method for the analysis of ivermectin

in plasma after intragastric administration in pigs and horses. Biomedical Chromatography,

v. 18, n. 5, p. 302–310, jun. 2004.

KRIZ, D.; MOSBACH, K. Competitive amperometric morphine sensor based on an agarose

immobilised molecularly imprinted polymer. Analytica Chimica Acta, v. 300, n. 1–3, p. 71–

75, jan. 1995.

LIU, Y.; SHEN, L. From Langmuir kinetics to first- and second-order rate equations for

adsorption. Langmuir, v. 24, n. 20, p. 11625–11630, 21 out. 2008.

LUO, X. et al. Preparation of water-compatible molecularly imprinted polymers for caffeine with

a novel ionic liquid as a functional monomer. Journal of Applied Polymer Science, v. 127,

n. 4, p. 2884–2890, fev. 2013.

MAMO, S. K.; GONZALEZ-RODRIGUEZ, J. Development of a molecularly imprinted polymer-

based sensor for the electrochemical determination of triacetone triperoxide (TATP). Sensors

(Switzerland), v. 14, n. 12, p. 23269–23282, 5 dez. 2014.

MARTIN-ESTEBAN, A. Molecularly Imprinted Polymers: New Molecular Recognition Materials

for Selective Solid-Phase Extraction of Organic Compounds. Fresenius Journal of Analytical

Chemistry, v. 370, n. 7, p. 795–802, 1 ago. 2001.

MAYES, A. G.; MOSBACH, K. Molecularly Imprinted Polymer Beads: Suspension

Polymerization Using a Liquid Perfluorocarbon as the Dispersing Phase. Analytical

Chemistry, v. 68, n. 21, p. 3769–3774, jan. 1996.

MENGER, M. et al. MIPs and aptamers for recognition of proteins in biomimetic sensing.

Biosensors, v. 6, n. 3, p. 35, 18 jul. 2016.

MIAO, S. S. et al. Core–Shell Magnetic Molecularly Imprinted Polymers as Sorbent for

Sulfonylurea Herbicide Residues. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 63, n. 14,

p. 3634–3645, 2015.

MIRATA, F.; RESMINI, M. Molecularly Imprinted Polymers for Catalysis and Synthesis. In: [s.l:

s.n.]. p. 107–129.

MOHAMAD YUSOF, N. N.; TANIOKA, E.; KOBAYASHI, T. Molecularly imprinted polymer

particles having coordinated hydrogen bonding in covalent-imprinting for efficient recognition

towards vanillin. Separation and Purification Technology, v. 122, p. 341–349, fev. 2014.

NOJAVAN, S. et al. Extraction and quantitative determination of ascorbic acid during different

maturity stages of Rosa canina L. fruit. Journal of Food Composition and Analysis, v. 21,

n. 4, p. 300–305, jun. 2008.

OH, C. et al. New approach to the immobilization of glucose oxidase on non-porous silica

microspheres functionalized by (3-aminopropyl)trimethoxysilane (APTMS). Colloids and

Surfaces B: Biointerfaces, v. 53, p. 225–232, 2006.

ÖTLES, S.; KARTAL, C. Solid-Phase Extraction (SPE): Principles and applications in food

samples. Acta Scientiarum Polonorum, Technologia Alimentaria, v. 15, n. 1, p. 5–15, 30

Referências 114


mar. 2016.

PASSOS, M. L.; RIBEIRO, C. P. Innovation in Food Engineering: New Techniques and

Products. 1ed. ed. [s.l: s.n.].

PILLAY, V. et al. A Review of Polymeric Refabrication Techniques to Modify Polymer

Properties for Biomedical and Drug Delivery Applications. AAPS PharmSciTech, v. 14, n. 2,

p. 692–711, 30 jun. 2013.

POLYAKOV, M. V. Adsorption properties and structure of silica gel. Zhurnal Fizieskoj

Khimii/Akademiya SSSR, v. 2, p. 799–805, 1930.

POMA, A.; TURNER, A. P. F.; PILETSKY, S. A. Advances in the manufacture of MIP

nanoparticles. Trends in Biotechnology, v. 28, n. 12, p. 629–637, dez. 2010.

REN, X.; CHEN, L. Preparation of molecularly imprinted polymer coated quantum dots to

detect nicosulfuron in water samples. Analytical and Bioanalytical Chemistry, v. 407, n. 26,

p. 8087–8095, 2015.

RISKIN, M. et al. Imprinting of molecular recognition sites through electropolymerization of

functionalized Au nanoparticles: Development of an electrochemical TNT sensor based on ??-

donor-acceptor interactions. Journal of the American Chemical Society, v. 130, n. 30, p.

9726–9733, jul. 2008.

ROLAND, R. M.; BHAWANI, S. A. Synthesis and Characterization of Molecular Imprinting

Polymer Microspheres of Piperine: Extraction of Piperine from Spiked Urine. Journal of

Analytical Methods in Chemistry, v. 2016, p. 1–6, 2016.

SCREENIVASULU REDDY, P. et al. Molecular imprinted Nylon-6 as a recognition material of

amino acids. European Polymer Journal, v. 38, n. 3, p. 521–529, mar. 2002.

SHEYKHAGHAEI, G. et al. Synthesis of molecularly imprinted polymer nanoparticles for

selective extraction and pre-concentration of protriptyline by ultrasound-assisted extraction

method in human plasma. Analytical Methods, v. 8, n. 11, p. 2413–2419, 2016.

SHIMIZU, K. D.; STEPHENSON, C. J. Molecularly imprinted polymer sensor arrays. Current

Opinion in Chemical Biology, v. 14, n. 6, p. 743–750, dez. 2010.

SINGH, P. et al. Vanillin production in metabolically engineered Beta vulgaris hairy roots

through heterologous expression of Pseudomonas fluorescens HCHL gene. Industrial Crops

and Products, v. 74, p. 839–848, nov. 2015.

SIPS, R. On the structure of a catalyst surface. The Journal of Chemical Physics, v. 16, n.

5, p. 490–495, maio 1948.

SREŃSCEK-NAZZAL, J. et al. Comparison of Optimized Isotherm Models and Error Functions

for Carbon Dioxide Adsorption on Activated Carbon. Journal of Chemical and Engineering

Data, v. 60, n. 11, p. 3148–3158, 12 nov. 2015.

STÖBER, W.; FINK, A.; BOHN, E. Controlled growth of monodisperse silica spheres in the

micron size range. Journal of Colloid and Interface Science, v. 26, n. 1, p. 62–69, jan. 1968.

STRIEGLER, S.; BARNETT, J. D.; DUNAWAY, N. A. Glycoside hydrolysis with sugar-

templated microgel catalysts. ACS Catalysis, v. 2, n. 1, p. 50–55, 6 jan. 2012.

SU, W.-F. Principles of Polymer Design and Synthesis. Berlin, Heidelberg: Springer Berlin

Heidelberg, 2013. v. 82

Referências 115


SU, X. et al. Synthesis and characterization of core-shell magnetic molecularly imprinted

polymers for solid-phase extraction and determination of Rhodamine B in food. Food

chemistry, v. 171, p. 292–297, 2015.

SUN, C. et al. The multi-template molecularly imprinted polymer based on SBA-15 for selective

separation and determination of panax notoginseng saponins simultaneously in biological

samples. Polymers, v. 9, n. 12, p. 653, 28 nov. 2017.

TAMAYO, F. G.; CASILLAS, J. L.; MARTIN-ESTEBAN, A. Highly selective fenuron-imprinted

polymer with a homogeneous binding site distribution prepared by precipitation polymerisation

and its application to the clean-up of fenuron in plant samples. Analytica Chimica Acta, v.

482, n. 2, p. 165–173, abr. 2003.

TAMAYO, F. G.; MARTIN-ESTEBAN, A. Selective high performance liquid chromatography

imprinted-stationary phases for the screening of phenylurea herbicides in vegetable samples.

Journal of Chromatography A, v. 1098, n. 1–2, p. 116–122, 9 dez. 2005.

TAVARES, C.; SAKATA, R. K. Caffeine in the Treatment of Pain. Revista Brasileira de

Anestesiologia, v. 62, n. 3, p. 387–401, 2012.

TON, X.-A. et al. Direct fluorimetric sensing of UV-excited analytes in biological and

environmental samples using molecularly imprinted polymer nanoparticles and fluorescence

polarization. Biosensors & bioelectronics, v. 36, n. 1, p. 22–8, [s.d.].

TSENG, R.-L.; WU, F.-C.; JUANG, R.-S. Characteristics and applications of the Lagergren’s

first-order equation for adsorption kinetics. Journal of the Taiwan Institute of Chemical

Engineers, v. 41, n. 6, p. 661–669, nov. 2010.

TURIEL, E.; MARTÍN-ESTEBAN, A. Molecularly imprinted polymers for sample preparation: A

review. Analytica Chimica Acta, v. 668, n. 2, p. 87–99, jun. 2010.

VASAPOLLO, G. et al. Molecularly imprinted polymers: Present and future prospective.

International Journal of Molecular Sciences, v. 12, n. 9, p. 5908–5945, 14 set. 2011.

WEBER, T. W.; CHAKRAVORTI, R. K. Pore and solid diffusion models for fixed-bed

adsorbers. AIChE Journal, v. 20, n. 2, p. 228–238, mar. 1974.

WEBER, W. J.; MCGINLEY, P. M.; KATZ, L. E. Sorption phenomena in subsurface systems:

Concepts, models and effects on contaminant fate and transport. Water Research, v. 25, n.

5, p. 499–528, maio 1991.

WEBER, W. J.; MORRIS, J. C. Kinetics of Adsorption on Carbon from Solution. Journal of

Sanitary Engineering, v. 89, n. 89, p. 31–60, 1963.

WU, F. C.; TSENG, R. L.; JUANG, R. S. Initial behavior of intraparticle diffusion model used in

the description of adsorption kinetics. Chemical Engineering Journal, v. 153, n. 1–3, p. 1–8,

nov. 2009.

WU, N. et al. A novel surface molecularly imprinted polymer as the solid-phase extraction

adsorbent for the selective determination of ampicillin sodium in milk and blood samples.

Journal of Pharmaceutical Analysis, v. 6, n. 3, p. 157–164, jun. 2016.

WULFF, G.; SARHAN, A. Über die Anwendung von enzymanalog gebauten Polymeren zur

Racemattrennung. Angew. Chem., v. 84, n. 8, p. 364–364, abr. 1972.

YAN, H. et al. Hybrid molecularly imprinted polymers synthesized with 3-

Referências 116


aminopropyltriethoxysilane-methacrylic acid monomer for miniaturized solid-phase extraction:

A new and economical sample preparation strategy for determination of acyclovir in urine.

Journal of Chromatography A, v. 1346, p. 16–24, 2014.

YAN, H.; HO ROW, K. Characteristic and Synthetic Approach of Molecularly Imprinted

Polymer. Int. J. Mol. Sci, v. 7, n. 5, p. 155–178, 29 jun. 2006.

YAN, Z. et al. Thermodynamic and kinetic specificities of ligand binding. Chemical Science,

v. 4, n. 6, p. 2387, 2013.

YE, L.; MOSBACH, K. Molecular Imprinting: Synthetic Materials As Substitutes for Biological

Antibodies and Receptors †. Chemistry of Materials, v. 20, n. 3, p. 859–868, fev. 2008.

ZU, B. et al. Preparation of molecularly imprinted polymers via atom transfer radical “bulk”

polymerization. Journal of Polymer Science, Part A: Polymer Chemistry, v. 48, n. 3, p.

532–541, 1 fev. 2010.

Documents

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE …repositorio.unicamp.br/bitstream/REPOSIP/331659/1/Fernandes_Rafael... · RAFAEL DA SILVA FERNANDES ... Orientador: prof. Dr. Ivo