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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ
JÉSSICA FONTES VELOSO
DIAGNÓSTICO MOLECULAR DA INFECÇÃO POR Ehrlichia canis EM
CÃES COM UVEÍTE BILATERAL
ILHEUS – BAHIA
2016
I
JÉSSICA FONTES VELOSO
DIAGNÓSTICO MOLECULAR DA INFECÇÃO POR Ehrlichia canis EM
CÃES COM UVEÍTE BILATERAL
Dissertação apresentada à
Universidade Estadual de Santa Cruz,
como parte das exigências para
obtenção do título de Mestre em Ciência
Animal.
Área de concentração: Clínica e
Sanidade Animal
Orientadora: Profa. Dra. Renata
Santiago Alberto Carlos
ILHÉUS – BAHIA
2016
V443 Veloso, Jéssica Fontes. Diagnóstico molecular da infecção por Ehrlichia canis em cães com uveíte bilateral / Jéssica Fontes Veloso. – Ilhéus, BA: UESC, 2016. ix, 39 f. : il.; anexo. Orientadora: Renata Santiago Alberto Carlos. Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Santa Cruz. Programa de Pós-graduação em Ciência Animal. Inclui referências.
1. Oftalmologia veterinária. 2. Cão – Doenças. 3. Glaucoma. 4.Uveíte. 5. Rickettsia. 6. Olhos – Infla-mação. l. Título.
CDD 636.08977
II
III
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho aos meus pais como retorno ao amor e o suporte
incondicional os quais recebo todos os dias da minha vida!
IV
AGRADECIMENTOS
Primeiramente agradeço a Deus, pois sem Ele nada somos e nunca
seríamos. Aos meus pais, meus grandes parceiros, agradeço por todo o amor,
suporte, incentivo e admiração. Vocês são meus maiores exemplos! Ao meu
irmão, meu namorado e toda a minha família e amigos, agradeço a presença dos
presentes e a saudade dos ausentes. Vocês são os responsáveis pelos meus
melhores momentos de descontração. Aos funcionários, que aqui venho
descrever com nomes: Givaldo, Silvina e Fabiana! Meu eterno agradecimento!!
Sem vocês minhas coletas não teriam sido completas, minhas consultas não
teriam sido corretamente realizadas e meus materiais de laboratório jamais
teriam sido tão bem cuidados e autoclavados! Foram quesito fundamental para
que este projeto acontecesse. A todos os meus mestres professores, agradeço
cada conhecimento dividido. Em especial a minha orientadora, mais que
orientadora, muito obrigada por tudo! Especialmente pela confiança, puxadas de
orelha e toda a orientação. Aos colegas de sala de aula e aos parceiros dos
laboratórios de Genética Animal e Virologia Animal, obrigada pelas dicas e por
tornarem manhãs e tardes mais curtas e divertidas. A UESC, minha eterna Casa.
Obrigada por possibilitar mais um momento de realização! Agradeço também a
Profa. Arianne Oriá e sua equipe, Deusdete e Ana Cláudia, pelas considerações,
auxilio e pela disponibilidade de tempo para me ajudar. A FAPESB e
CAPES/CNPQ agradeço pelo suporte financeiro. E, por fim, agradeço aos
amores da minha vida, os animais, principalmente ao meu filhote Pax. Faço isso
com muita satisfação por e para vocês!
V
DIAGNÓSTICO MOLECULAR DA INFECÇÃO POR Ehrlichia canis EM
CÃES COM UVEÍTE BILATERAL
RESUMO
A Erliquiose Monocítica Canina (EMC) é uma doença causada pela bactéria
Ehrlichia canis, que é transmitida através da picada do carrapato Rhipicephalus
sanguineus durante o repasto sanguíneo. A espécie E. canis tem alta prevalência
em âmbito mundial e nacional, causando altas taxas de morbidade e mortalidade
em cães domésticos. Dentre suas variadas manifestações clínicas, as alterações
oftálmicas são consideradas de grande importância, pois podem causar cegueira
permanente e ainda podem ser a única manifestação clínica da doença
sistêmica. Objetivou-se realizar nested-PCR para diagnosticar infecção por E.
canis em cães portadores de uveíte bilateral provenientes da casuística do
Hospital Veterinário da Universidade Estadual de Santa Cruz. Para tal, 66 cães
com uveíte bilateral foram submetidos a semiotécnica oftálmica e coleta de
amostra de sangue, de onde foi extraído o DNA para realização do diagnóstico
molecular. Foram positivos no teste 35 (53%) cães, sendo que 82,6% dos olhos
destes animais possuíam iridociclite, uveíte posterior ou panuveíte, enquanto
17,4% apresentavam glaucoma secundário.
Palavras-chave: Glaucoma. Uveíte infecciosa. Rickettsia. Nested-PCR. Olho.
VI
MOLECULAR DIAGNOSES OF Ehrlichia canis INFECTION IN DOGS WITH
BILATERAL UVEITIS
ABSTRACT
Canine Monocytic Ehrlichiosis (CME) is a disease caused by Ehrlichia canis,
transmitted through the bite of the tick Rhipicephalus sanguineus during blood
feeding. The species E. canis has a high national and worldwide prevalence,
causing high rates of morbidity and mortality in domestic dogs. Among variaty of
clinical manifestations in dogs, the ophthalmic diseases are considered of high
relevance, as they can cause permanent blindness and can even be the only
clinical manifestation of the infection. The objective of this study was to perform
nested-PCR to diagnose infection caused by E. canis in dogs with bilateral uveitis
from the casuistry of the Veterinary Hospital of the State University of Santa Cruz.
For this purpose, 66 dogs with bilateral uveitis were submmited to ophthalmic
semiotechnique and had a blood sample collected for DNA extraction for
molecular diagnosis. Were positive by PCR 35 (53%) dogs. In addition, 82.6% of
the eyes of these animals had iridocyclitis, uveitis or panuveitis, while 17.4% had
secondary glaucoma.
Keywords: Glaucoma. Infectious uveitis. Rickettsia. Nested-PCR. Eye.
VII
LISTA DE FIGURAS
Figura Página
01
Imagem fotográfica da revelação do Gel na eletroforese,
apresentando o marcador molecular sinalizado com a seta
vermelha a banda 389pb, o controle positivo (C+), 13
amostras do estudo e o controle negativo (C-) ........................
25
02
Olho de cão com uveíte, apresentando: quemose de
conjuntiva (seta azul), injeção episcleral (seta verde),
neovascularização corneana (seta amarela), edema de
córnea (seta branca) e secreção purulenta (seta preta) ..........
26
03
Imagens fotográficas demonstrando: (A) e (B) teste de Olho
de cão com glaucoma secundário a uveíte, apresentando:
vasos episclerais ingurgitados (seta verde),
neovascularização corneana (seta amarela), fratura de
membrana descemet (seta branca), edema corneano difuso
(seta azul) e secreção purulenta (seta preta) .......................... 27
VIII
LISTA DE ABREVIATURAS
CCS – Ceratoconjuntivite Seca
ELISA – Ensaio de Imunoadsorção enzimática
EMC – Erliquiose Monocítica Canina
PCR – Reação em Cadeia da Polimerase
PIO – Pressão Intraocular
RIFI – Imunofluorescência Indireta
IX
SUMÁRIO
Página
1 INTRODUÇÃO .......................................................................................... 10
2 OBJETIVOS .............................................................................................. 12
2.1 Geral ................................................................................................... 12
2.2 Específicos ......................................................................................... 12
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ..................................................................... 13
3.1 Erliquiose Canina .................................................................................. 13
3.1.1 Agente Etiológico ........................................................................... 13
3.1.2Histórico e Epidemiologia da Erliquiose Canina ........................... 13
3.1.3Transmissão ..................................................................................... 15
3.1.4 Patogenia da infecção .................................................................... 15
3.1.5Técnicas de Diagnóstico ................................................................. 16
3.2 Oftalmologia .......................................................................................... 17
3.2.1 Anatomia do trato uveal ................................................................. 17
3.3 Alterações Oftálmicas na Erliquiose ................................................... 18
3.3.1 Epidemiologia ................................................................................. 18
3.3.2 Patogenia ......................................................................................... 19
4 MATERIAL E MÉTODOS .......................................................................... 21
4.1 Considerações Éticas ....................................................................... 21
4.2 Animais ............................................................................................... 21
4.3 Coleta de dados e anamnese ............................................................ 22
4.4 Semiotécnica oftálmica ..................................................................... 22
4.5 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) ......................................... 22
4.5.1 Obtenção de Amostras Biológicas ........................................... 22
4.5.2 Extração de DNA e Quantificação ............................................. 23
4.5.3 Seleção dos primers e amplificação do DNA ........................... 23
4.5.4 Eletroforese do DNA em Gel de Agarose ................................. 24
4.6 Análise dos dados ................................................................................ 24
5 RESULTADOS .......................................................................................... 25
6 DISCUSSÃO ............................................................................................. 28
7 CONSIDERAÇÕES FINAIS ...................................................................... 30
REFERÊNCIAS................................................................................................ 31
ANEXO 1 – Ficha de Oftalmologia ................................................................... 37
10
1 INTRODUÇÃO
A Erliquiose Monocítica Canina (EMC) é uma grave doença que acomete
cães de todas as idades e sem predileção por sexo. É causada por bactérias
intracelulares obrigatórias pertencentes ao gênero Ehrlichia, espécie E. canis e
é transmitida para o cão doméstico através do vetor artrópode, o carrapato
Rhipicephalus sanguineus, durante seu repasto sanguíneo (DUMLER et al.,
2001; VIEIRA et al., 2011).
Esta bactéria está disseminada por todos os continentes, porém com maior
frequência de relatos nos países de clima temperado, tropical e subtropical
(ALMOSNY; MASSARD, 2002). Mundialmente, incluindo no Brasil, a prevalência
da EMC é elevada (DAGNONE et al., 2003; LABARTHE et al., 2003;
RODRIGUEZ-VIVAS et al., 2005) sendo, no estado da Bahia, descritas
prevalências de 7,8% (CARVALHO et al., 2008), 11% (CARLOS et al., 2011), e
25,6% (GUEDES et al., 2015) por nested-PCR da população canina.
Os sinais clínicos apresentados pelos animais são inespecíficos (CASTRO
et al., 2004; NAKAGHI et al., 2008), bem como as alterações laboratoriais que
podem ser encontradas, entretanto, com isto é possível apenas fornecer
diagnóstico presuntivo da doença (CODNER et al., 1985; HARRUS et al., 1997;
NEER; HARRUS, 2006; BORIN et al., 2009). Quando não diagnosticados
precocemente e tratados, frequentemente os animais vem a óbito devido às
complicações hematológicas associadas a infecções secundárias (MOREIRA et
al., 2003).
Lesões oculares são achados comuns na infecção natural ou experimental
por E. canis variando de 15 a 100% de prevalência (HARRUS et al., 1997).
Apesar de ainda não bem elucidada a etiopatogenia da EMC sabe-se que é
possível encontrar anticorpos anti-E.canis no trato uveal (SILVA, 2006), bem
como o DNA da bactéria em amostras esfoliadas da conjuntiva (WALSER-
REINHARDT et al., 2012). Dentre as anormalidades oculares associadas com a
infecção estão uveíte anterior, posterior e panuveíte (PANCIERA et al., 2001;
MASSA et al., 2002; KOMNENOU et al., 2007; ORIÁ et al., 2008) e o glaucoma
secundário a uveíte (ORIÁ et al., 2008).
O diagnóstico da erliquiose pode ser feito através de esfregaço sanguíneo,
sorologia por Imunofluorescência indireta (RIFI) ou por Ensaio de
11
Imunoadsorção Enzimática (ELISA) e técnicas moleculares como a Reação em
Cadeia da Polimerase (PCR) (ALMOSNY; MASSARD, 2002; HARRUS et al.,
2002), a qual pode detectar o DNA do agente nos tecidos e sangue (TROY;
FORRESTER, 1990). Essa técnica facilita o diagnóstico e auxilia na classificação
taxonômica além de permitir a detecção precoce da infecção e da espécie
infectante. Dentre as principais vantagens em relação aos métodos sorológicos
estão a não ocorrência de reações cruzadas, e a possibilidade de definir que a
infecção é aguda e não se trata de exposição prévia (IQBAL et al., 1994; WEN
et al., 1997; DAGNONE et al., 2001).
A uveíte é a alteração oftálmica mais descrita como consequência da EMC,
ainda assim, no Brasil, apesar de existirem estudos de prevalência da infecção
por E. canis através de testes moleculares, não há estudos de prevalência da
doença oftálmica nestes cães positivos. Visto que a uveíte quando não
diagnosticada ou tratada inadequadamente pode levar consequências graves
como cegueira nos cães acometidos, são imprescindíveis estudos de
prevalência desta alteração oftálmica em cães positivos na nested-PCR para E.
canis. Até então, estudos no Brasil e no mundo sobre a correlação entre EMC e
alterações oftálmicas têm sido realizados apenas com diagnóstico sorológico da
infecção, não possuindo relatos de uso de exame molecular nesses inquéritos
epidemiológicos.
12
2 OBJETIVOS
2.1 Geral
Realizar nested-PCR para diagnóstico da infecção por E. canis em cães
portadores de uveíte bilateral provenientes da casuística do Hospital Veterinário
da Universidade Estadual de Santa Cruz (HOSPVET-UESC).
2.2 Específicos
– Avaliar prevalência de infecção por E. canis em cães com uveíte bilateral
atendidos no HOPVET-UESC no intervalo de um ano.
– Identificar e descrever processos secundários a uveíte bilateral nos cães
positivos para E. canis em cães positivos na nested-PCR.
13
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 Erliquiose Canina
3.1.1 Agente Etiológico
A Ehrlichia canis é uma bactéria gram-negativa, pertencente a ordem
Rickettsiales, família Anaplasmataceae e gênero Ehrlichia. Existe descrição
demais quatro espécies dentro deste gênero: E. chaffeensis, E. ewingii, E. muris
e E. ruminantium, entretanto, até então, somente a E. canis foi isolada em cães
no Brasil. Esta bactéria intracelular obrigatória infecta células hematopoiéticas
maduras ou imaturas, preferencialmente do sistema fagocitário mononuclear,
como monócitos e macrófagos (DUMLER et al., 2001) e se distribui
preferencialmente para órgãos como fígado, baço e linfonodos (STILES, 2000).
3.1.2 Histórico e Epidemiologia da Erliquiose Canina
A primeira descrição da erliquiose ocorreu em um cão da raça Pastor
Alemão na Argélia, sendo denominada Rickettsia canis por Donatien e
Lestoguard em 1935 e, posteriormente reclassificada por Mashkovsky como
Ehrlichia canis em 1945. A doença somente tornou-se preocupante quando 300
cães da Armada Americana, em ação na guerra do Vietnã na década de 60,
desenvolveram uma desordem hemorrágica fatal, denominada na época
Pancitopenia Tropical Canina. Sua característica era de apresentar sinais
inespecíficos como debilidade, epistaxe, leucopenia e anemia, sendo conhecida
como a maior epizootia da época (ALMOSNY; MASSARD, 2002; MACHADO,
2004; SAITO, 2009; SILVA et al., 2010).
Atualmente a doença apresenta distribuição cosmopolita, com maior
prevalência em regiões de clima tropical e subtropical, e leva a extensiva
morbidade e mortalidade dos animais acometidos (RIKIHISA, 1999). Segundo
Costa et al. (1973) o primeiro relato brasileiro de erliquiose canina ocorreu em
Belo Horizonte – Minas Gerais. Labarthe et al. em 2003 descreveram que no
Brasil, aproximadamente 20% dos cães atendidos em clínicas veterinárias e
hospitais do Sudeste, Sul, Centro Oeste e Nordeste foram diagnosticados com
esta doença.
Através da sorologia, as prevalências encontradas em diversas áreas do
território brasileiro foram: 42,5% dos cães do Centro Oeste (SILVA et al., 2010),
14
36% no Norte do Brasil (AGUIAR et al., 2007), 4,8% no Sul do Brasil (SAITO et
al., 2008) e, no Nordeste do país percentuais de 35,6% e 32,7% foram
encontrados na Bahia (SOUZA et al., 2010; GUEDES et al., 2015) e 69,4% na
Paraíba (TANIKAWA et al., 2013). Entretanto, as prevalências da infecção
diagnosticadas através da nested-PCR apontam: 21% de positivos no Paraná
(DAGNONE et al., 2003), 30,9% em São Paulo (BULLA et al., 2004), 15% no Rio
de Janeiro (MACIEIRA, 2005) e, na região Sul Baiana são descritas prevalências
de 7,8% (CARVALHO et al., 2008), 11% (CARLOS et al., 2011), e 25,6%
(GUEDES et al., 2015) da população canina estudada.
Segundo alguns autores, não há justificativa para a diferença na
prevalência da EMC entre as diferentes regiões do país, uma vez que o vetor
está disseminado em todas estas regiões, tanto em áreas urbanas quanto rurais
(LABRUNA; PEREIRA, 2001; DANTAS-TORRES et al., 2006). Porém, Sainz e
colaboradores (2015) relatam que carrapatos não toleram temperaturas abaixo
de 6ºC e, portanto, por se reproduzirem em maior intensidade em temperaturas
mais altas, eles disseminam mais a doença a partir da estação da primavera, se
prolongando até o outono, em algumas regiões brasileiras. Este é um fator
estudado para se compreender a diferença das prevalências de EMC relatadas
pelo território brasileiro. Visto que, a região Sul do país possui inverno com
temperaturas mais rigorosas, enquanto regiões do Norte e Nordeste a possuem
de forma mais amenas, garantindo transmissão do patógeno por todas as
estações do ano, mesmo que em maior intensidade na primavera e verão que
no outono e inverno.
Outro fato que deve ser levado em conta para avaliação epidemiológica é
a técnica diagnóstica utilizada. A pesquisa direta apesar de elevada
especificidade apresenta baixa sensibilidade nos resultados pois necessita de
visualização da mórula nos leucócitos, a qual é mais facilmente visualizada na
fase aguda da infecção (GUEDES et al., 2015). Os testes sorológicos por não
distinguirem infecção de exposição prévia podem apresentar resultados falso
positivos. Por outro lado, os exames moleculares, que são considerados como
técnicas de maior acurácia, podem apresentar resultados falso negativos quando
realizados a partir de amostra de sangue periférico uma vez que na fase crônica
da doença o patógeno está concentrado em macrófagos do baço (HARRUS et
al., 1998, 2004).
15
De qualquer forma, a casuística crescente torna esta infecção uma das
mais importantes doenças transmissíveis da clínica médica de pequenos
animais, principalmente pela disseminação do carrapato em território nacional
(AGUIAR, 2006).
3.1.3Transmissão
A transmissão horizontal de E. canis se dá através de diferentes espécies
de carrapatos, entretanto, esse hemoparasito usualmente é transmitido pelo
carrapato Rhipicephalus sanguineus no momento do repasto sanguíneo (COHN,
2003). A transmissão se dá por via transestadial, não havendo relatos da
transmissão do microrganismo por via transovariana no carrapato, de modo que
sua infecção se dá por ingestão de leucócitos circulantes infectados através do
repasto sanguíneo em cães na fase aguda da doença. Nas larvas e ninfas do
carrapato a E. canis se multiplica nas células epiteliais do intestino, hemócitos e
células das glândulas salivares, o que garante a manutenção da infecção do
vetor até sua fase adulta. (LEWIS et al., 1977; HARRUS et al., 1997; MACHADO,
2004; MORAES-FILHO, 2013). Uma vez inoculada, a bactéria penetra nas
células mononucleares, se multiplica nos fagolissomos celulares, se
desenvolvendo em corpúsculos iniciais e mórula (SANTARÉM, 2003).
3.1.4 Patogenia da infecção
A EMC é considerada uma doença multissistêmica de sintomatologia
complexa, variando a intensidade dos sinais clínicos conforme as fases: aguda,
subclínica ou crônica. O período de incubação é de oito a 20 dias, e a fase aguda
se inicia uma a três semanas após a infecção, durando de duas semanas a um
mês. Durante esta fase, há elevada replicação do microrganismo nas células do
sistema fagocitário mononuclear de linfonodos, baço e medula óssea, onde
também ocorre o deslocamento das células infectadas para as margens dos
pequenos vasos, o que causa vasculite. Esta fase é caracterizada pela presença
de alterações como anemia e trombocitopenia devido a destruição das plaquetas
pela grande estimulação do sistema imunológico e do processo inflamatório,
além da alteração da cascata de coagulação (HARRUS et al., 1997).
A fase subclínica pode acontecer durante seis a nove semanas, podendo
persistir por até cinco anos com o microrganismo na circulação sanguínea. Nesta
16
fase, sendo que nesta fase a característica mais frequente são os elevados
títulos de anticorpos. Nesta fase as alterações sintomatológicas e hematológicas
são semelhantes às da fase aguda, porém mais discretas (SANTARÉM, 2003).
Já a fase crônica, é caracterizada pela presença do microrganismo
intracelular e por maior envolvimento da medula óssea, o que justifica alterações
como pancitopenia, além de sangramentos espontâneos e infecção secundária.
A diferenciação das três fases da doença nos animais naturalmente infectados
pela E. canis é difícil devido à similaridade das alterações clínicas e laboratoriais
apresentadas (HARRUS et al., 1997; SANTARÉM, 2003; MOREIRA et al., 2003).
Os sinais clínicos são inespecíficos e envolvem depressão, anorexia,
pirexia, hepatoesplenomegalia, linfadenopatia, distúrbios cardiorrespiratórios,
alterações oculares, hemorragias na forma de petéquias e equimoses na pele e
nas mucosas e epistaxe (CASTRO et al., 2004; NAKAGHI et al., 2008). As
alterações laboratoriais incluem anemia, trombocitopenia, leucopenia ou
leucocitose, aumento das imunoglobulinas no sangue (NEER; HARRUS, 2006;
BORIN et al., 2009) e desenvolvimento de pancitopenia severa no estágio
crônico (CODNER et al., 1985; HARRUS et al., 1997).
3.1.5Técnicas de Diagnóstico
O diagnóstico da erliquiose canina se dá por meio de associação das
características clinico-epidemiológicas com o histórico do animal e resultados de
exames citológicos, hematológicos, bioquímicos, sorológicos e/ou moleculares.
No histórico é importante identificar se o animal reside ou esteve em regiões
endêmicas e se houve contato prévio com o carrapato.
O exame citológico é o método direto de diagnóstico mais utilizado, sendo
realizado a partir do esfregaço de sangue periférico proveniente da ponta da
orelha (ALMOSNY; MASSARD, 2002). Este exame possui a desvantagem de
apresentar frequentemente resultados falso negativos, uma vez que a
visualização das mórulas no citoplasma de células mononucleares depende da
carga parasitária e da experiência do examinador (HARRYS et al, 1997).
Os testes sorológicos têm sido bastante empregados para pesquisa de
anticorpos anti-E.canis. Porém, apresentam a desvantagem de não
diferenciarem a doença clínica da exposição prévia, o que pode resultar em falso
positivos, uma vez que a predominância de formação de anticorpos ocorre na
17
fase subclínica da doença. Os testes mais utilizados atualmente são a Reação
de Imunofluorescência Indireta (RIFI) e o Dot Elisa (OLIVEIRA et al., 2000;
SILVA, 2001; NAKAGHI, 2004; ORIÁ, 2008). Oriá e colaboradores em 2008
utilizou o RIFI e Dot Elisa para diagnosticar cães com suspeita de EMC. A RIFI
determinou frequência de 66,67% positivos enquanto o Dot Elisa de 86,27%,
mostrando-se mais sensível além de possuir outras vantagens como baixo custo,
rapidez e a facilidade de execução.
Para minimizar as desvantagens dos testes sorológicos, desenvolveram-se
técnicas moleculares, as quais possuem maior sensibilidade e especificidade no
diagnóstico da EMC, por amplificarem o material genômico (DNA) da bactéria
(AGUIAR, 2006). A mais utilizada é a Nested Reação em Cadeia pela Polimerase
(nested-PCR) que se baseia na síntese enzimática de milhões de cópias de uma
parte da fita de DNA alvo. Através das duas etapas de amplificação, essa técnica
possibilita a identificação da espécie de Ehrlichia. Com a nested-PCR é possível
detectar o agente nos primeiros dias da infecção, mesmo antes da formação de
mórulas ou de soro conversão. A desvantagem é que com a cronicidade da
doença há redução da carga parasitária, o que pode decorrer um resultado
subestimado, sendo, portanto, mais eficaz na detecção do agente durante a
infecção ativa (LA SCOLA; RAOULT, 1997; ALVES et al., 2002; NAKAGHI et al.,
2004; MACIEIRA et al., 2005, AGUIAR, 2006).
3.2 Oftalmologia
3.2.1 Anatomia do trato uveal
A túnica média, vascular ou trato uveal se localiza entre a túnica fibrosa e
a retina, sendo a estrutura vascularizada, pigmentada e inervada. É formada pela
íris, corpo ciliar e coróide, promovendo a nutrição do olho (MILLER, 2008;
HENDRIX, 2013). A úvea anterior contempla a íris e o corpo ciliar, enquanto que
a úvea posterior, contempla a coróide. A rica vascularização e a
imunosensibilidade do trato uveal anterior faz com que esta estrutura seja mais
acometida por processos inflamatórios (HENDRIX, 2013).
A íris possui uma abertura central (pupila) que funciona como um diafragma
regulando a entrada de luz em direção à retina. Essa estrutura é responsável por
dividir através da pupila o espaço entra a córnea e a íris e entre a íris e a lente,
denominando assim câmara anterior e posterior, respectivamente. A região de
18
encontro entre a margem ciliar da íris e a córnea é denominada de ângulo
iridocorneano, que é responsável por drenar a maior porção do humor aquoso
produzido pelo corpo ciliar (HERRERA, 2008; MILLER, 2008; SAMUELSON,
2013).
O corpo ciliar é localizado posteriormente a íris. No epitélio pigmentado
desta estrutura é produzido e secretado o humor aquoso, substância
responsável por nutrir, bem como remover metabólitos da lente anterior, da
superfície interna da íris e da córnea posterior. Existe uma barreira
hematoaquosa que possui um papel importante clinicamente sobre a aparência
do humor aquoso, ela normalmente impede a entrada de proteínas de alto peso
molecular para o meio intraocular. Em algumas alterações clinicas pode haver
turbidez desse aquoso, o que reflete mudanças na barreira e aumento de níveis
proteicos (SAMUELSON, 2013). O humor aquoso é um liquido incolor que além
de desempenhar papel importante na manutenção da PIO, participa da refração
da luz (MILLER, 2008).
A coróide é a estrutura que compõe o trato uveal posterior, sua função é
vascularização externa da retina além de participar dos processos de defesa
imunitária do olho. É composto por tecido vascular que se une aos corpos ciliares
e que recobre a retina com sua face anterior, por isso as relações fisiológicas e
anatômicas entre ela e a retina são estreitas (HERRERA, 2008; SAMUELSON,
2013).
3.3Alterações Oftálmicas na Erliquiose
3.3.1 Epidemiologia
É notável a frequência de alterações oftálmicas em cães infectados
naturalmente ou experimentalmente com Ehrlichia canis. As mais comuns são:
uveíte anterior e panuveíte (MARTIN, 1999; PANCIERA et al., 2001; MASSA et
al., 2002; KOMNENOU et al., 2007; ORIÁ et al., 2008; MILLER, 2008), glaucoma
secundário a uveíte (ORIÁ et al., 2008) e neurite óptica (MARTIN, 1999; STILES,
2000; LEIVA et al., 2005). Os sinais oftálmicos mais observados são: secreção
ocular (KOMNENOU et al., 2007; ORIÁ et al., 2008), ingurgitamento e
tortuosidade dos vasos retinianos, descolamento de retina precipitados
ceráticos, flare, rubeosis iridis, miose persistente, sinéquias, edema de córnea,
hifema, congestão de vasos episclerais, (LEIVA et al., 2005; ORIÁ et al., 2008).
19
Oriá e colaboradores em 2008 realizaram investigação sorológica por
Imunofluorescência Indireta (RIFI) e por Dot-Blot ELISA (DBELIA) para E. canis
em 51 cães portadores de uveíte e encontraram elevada prevalência, de 66,67%
e 86,27%, respectivamente.
Em estudo realizado em Raleigh, capital do estado Carolina do Norte –
Estados Unidos da América (EUA) foram analisadas as causas de 102 casos de
uveíte em cães e, as doenças infectocontagiosas foram responsáveis por 17,6%
dos casos (n=18). A E. canis foi confirmada sorologicamente em sete casos,
sendo a maior causa de uveíte dentre as doenças infectocontagiosas (MASSA
et al., 2002).
Komnenou et al. (2007) avaliaram 90 cães que apresentavam alterações
oftálmicas como queixa principal e eram positivos para E. canis através do dot-
ELISA. Em 30% desses animais os problemas oftálmicos foram os únicos sinais
clínicos identificados. Todos apresentaram uveíte uni ou bilateral, e em alguns
animais houve associação com ulceração corneana, esclerite necrótica, baixa
produção de lágrima e celulite orbital primária.
3.3.2 Patogenia
Parte das alterações oftálmicas apresentadas em doenças sistêmicas
advém de doenças virais, bacterianas, micóticas, fúngicas, protozoárias e
parasitárias (HENDRIX, 2013). O bulbo do olho possui propriedades imunes
peculiares e por isso pode ser conhecido como um órgão imunoprevilegiado, ou
seja, um órgão com pouca probabilidade de desencadear uma resposta imune a
células estranhas. Portanto, para que não haja lesões de cunho irreversível, com
destruição dos tecidos do olho e perda de visão, a resposta imunológica deve
ser baixa e controlada. Entretanto, mesmo tendo esta característica, processos
inflamatórios são muito frequentes em estruturas internas do bulbo ocular,
principalmente no trato uveal (SILVA, 2006). Justamente devido a sua
característica de ser altamente vascularizado e imunossensível, o trato uveal é
uma estrutura bastante acometida pelo processo inflamatório instalado durante
a infecção pela bactéria intracelular E. canis (BISTNER, 1994).
A uveíte é a alteração inflamatória das estruturas do trato uveal, que pode
ser diferenciada em anterior, posterior ou panuveíte, quando: a íris e o corpo
ciliar são acometidos, quando apenas a coróide está inflamada e quando as três
20
estruturas apresentam sinais inflamatórios, respectivamente (HENDRIX,
2013).Semelhante a qualquer inflamação, a uveíte consiste em três eventos
básicos: aumento do aporte sanguíneo; aumento da permeabilidade vascular; e,
migração de leucócitos para o tecido afetado (DALMA-WEISZHAUSZ; DALMA,
2002). A manifestação oftálmica mais comum relacionada a EMC é a uveíte, que
está associada principalmente com vasculite e a hemorragia ocular de uma ou
diversas estruturas oculares (MARTIN; STILES, 1998).
A elucidação da etiologia da uveíte no cão pode ser difícil (HENDRIX,
2013). A reação inflamatória do trato uveal consequente da infecção por E. canis
é causada pela resposta imune mediada principalmente por células (resposta
celular). O patógeno induz lesão ocular devido à alta presença de diversos tipos
celulares em resposta a liberação de citocinas pró inflamatórias, que promovem
a quimiotaxia (BISTNER, 1994; SILVA, 2006), ocorrendo migração de linfócitos
T e B dos linfonodos regionais para a úvea (REARDON; PIERCE, 1981; SILVA,
2006).
A função dos imunocomplexos na uveíte se dá devido ao depósito destes
em vasos sanguíneos locais, promovendo aumento da permeabilidade vascular
e desequilíbrio das barreiras oculares. Dessa forma, o influxo de células
inflamatórias mononucleares no bulbo ocular acentua as lesões intraoculares,
preferencialmente nas estruturas do trato uveal (HARRUS et al., 2001;
HENDRIX, 2013). A inflamação de estruturas intraoculares também é acentuada
devido a ativação da cascata do ácido aracdônico associado à lesão de
membranas celulares, que aumentam as concentrações de prostaglandinas e
dos leucotrienos. As prostaglandinas são consideradas mediadores importantes
nestas inflamações, porquanto causam miose, hiperemia, alteram a
permeabilidade vascular, rompem a junção entre as células do epitélio não
pigmentado do corpo ciliar e alteram a PIO (BISTNER, 1994). Da mesma forma
ocorre com os leucotrienos, que parecem ter maior atividade de quimiotaxia
celular comparativamente às prostaglandinas, sendo mais um mecanismo de
migração celular na uveíte (HENDRIX, 2013).
A presença de infiltrado inflamatório mononuclear é a lesão histopatológica
frequentemente encontrada em diversos órgãos de cães infectados por E. canis.
Em estudos, pesquisadores têm confirmado a presença deste infiltrado em
estruturas do bulbo do olho, como: limbo, corpo ciliar, ângulo iridocorneano, íris,
21
coróide e retina. Por isso, sugere-se que essas lesões oculares não são
resultantes da ação direta do agente, mas sim de mecanismos imunopatológicos
(ELLET et al., 1973; ORIÁ, 2001; PANCIERA et al., 2001; SILVA, 2006).
Para as alterações oculares hemorrágicas, os mecanismos até então
compreendidos são: 1) através da trombocitopenia severa, alteração muito
frequente nos cães afetados (FRANK; BREITSCHWERDT, 1999); 2) devido à
liberação, por monócitos infectados, de fatores de inibição da migração
plaquetária, que alteram a hemodinâmica reduzindo o fator 3 da cascata de
coagulação, bem como reduzindo o poder de aderência das plaquetas ao
endotélio vascular lesado (HARRUS et al., 1996; FRANK; BREITSCHWERDT,
1999); 3) em resposta ao aumento da concentração de gamaglobulina sérica
(gamopatia monoclonal) que leva a hiperviscosidade sérica, e por consequência
exacerba a tendência a sangramento por interferir fisicamente nas plaquetas e
nos fatores de coagulação sanguínea, por também causar injúrias no endotélio
vascular sanguíneo e estase venosa (THOMPSON, 1995; HARRUS et al, 1998).
As alterações oculares consequentes da hiperviscosidade incluem
dilatação dos vasos sanguíneos da retina e tortuosidade, sangramento em
câmara anterior e posterior e descolamento de retina (MARTIN; STILES, 1998).
A presença de glaucoma em cães com EMC está associado aos casos de uveíte
crônica não tratada corretamente, que pode causar acúmulo de debris celulares
do processo inflamatório no ângulo iridocorneano e obstruir a rede trabecular
durante o fluxo de absorção do humor aquoso (HENDRIX, 2013).
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Considerações Éticas
Este trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais da
Universidade Estadual de Santa Cruz (protocolo 025/2013), bem como
seguiram-se as normas da Associação para Pesquisa em Visão e Oftalmologia
(ARVO).
4.2 Animais
Fizeram parte desse estudo 66 cães provenientes da casuística de
atendimentos oftálmicos do Hospital Veterinário da Universidade Estadual de
22
Santa Cruz (HOSPVET/UESC), no período de agosto/2014 a agosto/2015,
portadores de uveíte bilateral, exceto um animal anoftálmico unilateral.
4.3 Coleta de dados e anamnese
Ao iniciar a consulta, foi realizada resenha, anamnese e semiotécnica
oftálmica rotineira. Os achados foram descritos em ficha apropriada (Anexo 1).
4.4 Semiotécnica oftálmica
O exame geral dos olhos foi iniciado com observação dos anexos
oftálmicos, simetria dos olhos, posicionamento na órbita e testes de ameaça,
movimento e obstáculos. Ato contínuo, com o auxílio de lanterna de luz amarela
avaliou-se reflexo pupilar direto e consensual (RPLD e RPLC, respectivamente).
O teste de Schirmer foi realizado com uso de tiras padronizadas
(Ophthalmos®), precedido por tonometria de rebote para aferição da pressão
intraocular (PIO) (TONOVET Icare®) calibrado para mensuração em cães com
desvio padrão ≤ 1,0. Estruturas como pálpebras, conjuntiva, esclera, pupila e íris
foram avaliadas com o biomicroscópio munido de lâmpada em fenda (Vision
Classe II BL IIIB / YZ30T Ramos Mejia®).
Avaliação do segmento posterior do bulbo do olho foi consignada com
utilização prévia de uma gota de colírio midriático a base de Tropicamida 1%
(Mydriacyl®), bilateralmente e que fora repetido após10 minutos para atingir
completa midríase, quando necessário. O Segmento posterior foi avaliado com
auxílio de oftalmoscópio indireto binocular (OSF 1.0 Eyetec®) e lente de
magnificação 20D (Eyetec®) seguido por oftalmoscópio direto Panoptic
(WelchAllyn®).
A integridade da córnea foi avaliada com o teste da fluoresceína
(fluoresceína strips – Ophthalmos®) e solução fisiológica estéril.
4.5 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
4.5.1 Obtenção de Amostras Biológicas
Após a avaliação oftálmica, foram coletados 4ml de sangue por punção de
veia cefálica ou jugular. O sangue coletado foi acondicionado em tubo com o
23
anticoagulante EDTA e posteriormente armazenado em freezer à temperatura
de – 20ºC até a realização da PCR.
4.5.2 Extração de DNA e Quantificação
A extração do DNA foi realizada a partir das amostras de sangue total com
o Kit Easy-DNA (Invitrogen®) conforme técnica descrita pelo fabricante
(Protocolo 2 do manual).
Os extraídos de DNA foram quantificados através do espectrofotômetro
NanoDrop® 2000 e armazenados em freezer a temperatura de – 20ºC.
4.5.3 Seleção dos primers e amplificação do DNA
Para a primeira etapa de amplificação do DNA foram selecionados os
primers ECC (5-AGAACGAACGCTGGCGGCAAGC-3) e ECB (5-
CGTATTACCGCGGCTGCTGGCA-3), que amplificam parte do gene 16S rRNA
de Ehrlichia spp. Posteriormente, para identificação da espécie Ehrlichia canis,
foram utilizados os primers ECAN (5-
CAATTATTTATAGCCTCTGGCTATAGGA-3) e HE3 (5-
TATAGGTACCGTCATTATCTTCCCTAT-3), seguindo metodologia descrita por
Murphy et al. (1998).
Para o MIX da PCR foram utilizados 5µL de DNA purificado, 0.4mM de cada
primer (ECC e ECB), 200mM de cada dNTP, 5mM de MgCl2, 1.6x de buffer para
PCR (Invitrogen®) e 2,5U de Taq DNA polimerase (Invitrogen®), obtendo um
volume total final de 25 µL. A programação utilizada no termociclador
AppliedBiosystems® ProFlex™ PCR System para identificação da sequência
genética do gênero Ehrlichia spp consistiu da desnaturação por 3 min a 94°C,
seguida de 35 ciclos de desnaturação a 94°C por 1 min, anelamento a 68°C por
2 min, e, por fim, extensão a 72°C por 2 min. Foi utilizado para a nested-PCR
1µL do amplicon resultante da primeira reação de PCR e: 0.2mM de cada
primer(ECAN5 e HE3),200mM de cada dNTP, 5mM de MgCl2, 1.6x de buffer
para PCR (Invitrogen®) e 2,5U de Taq DNA polimerase (Invitrogen®), com
obtenção de volume total final de 25 µL. A programação do termociclador para a
segunda reação consistiu de desnaturação por 3 min a 94°C, seguida de 35
24
ciclos de desnaturação a 94°C por 1 min, anelamento a 58°C por 2 min, e
extensão a 72°C por 1 min e 30s (CARLOS et al., 2011).
O controle positivo utilizado foi sangue de cão positivo para Ehrlichia canis
previamente confirmado por sequenciamento (GUEDES et al., 2015). Água
ultrapura foi utilizada como controle negativo.
4.5.4 Eletroforese do DNA em Gel de Agarose
Os produtos da PCR foram submetidos à eletroforese em Gel de Agarose
a 2% corado com SYBR®green (1µL/10mL) em tampão de corrida (Ultrapure™
TAE Buffer Gibgo®) 50X diluído. A eletroforese foi realizada a 75v/150mA
durante 40 minutos. Para determinar o produto da amplificação, foi consignado
marcador molecular 1 kb Plus DNA Ladder (Invitrogen®), sendo os resultados
visibilizados e analisados por transiluminador de luz ultravioleta (LPIX Loccus
Biotecnologia®).
4.6Análise dos dados
Os dados foram avaliados de forma descritiva.
25
5 RESULTADOS
Dos 66 animais com uveíte bilateral, 35 (53%) foram positivos para E. canis
através da nested-PCR (figura 01). Dos 69 olhos dos animais positivos,
57(82,6%) olhos possuíam iridociclite, uveíte posterior ou panuveíte, enquanto
12 (17,4%) apresentavam glaucoma secundário.
Figura 01. Imagem fotográfica da revelação do Gel na eletroforese, apresentando o
marcador molecular sinalizado com a seta vermelha a banda 389pb, o controle positivo (C+), 13 amostras do estudo e o controle negativo (C-).
Fonte: Arquivo Pessoal.
Dentre os sinais oftálmicos que foram visibilizados nos animais com apenas
uveíte, arrolam-se: secreção purulenta, fotofobia, blefaroespasmo, quemose,
hiperemia conjuntival, injeção de vasos episclerais; neovascularização, ulcera e
edema de córnea, miose persistente e redução (CCS) ou aumento (epífora) da
produção lacrimal. Todos os animais com uveíte (figura 02) exibiram mais de 2
sinais concomitantes, além da redução da PIO.
26
Figura 02– Olho de cão com uveíte, apresentando: quemose de conjuntiva (seta azul),
injeção episcleral (seta verde), neovascularização corneana (seta amarela), edema de córnea (seta branca) e secreção purulenta (seta preta).
Fonte: Arquivo Pessoal.
Dentre os sinais oftálmicos que foram visibilizados nos animais que
apresentaram glaucoma secundário, citam-se: secreção purulenta, buftalmia,
hiperemia conjuntival, vasos episclerais ingurgitados, neovascularização,
pigmentação, ulcera e edema de córnea, fratura de descement, midríase
irresponsiva ou com reflexos diminuídos, além de redução da produção lacrimal
(CCS). Todos os animais com glaucoma secundário a uveíte (figura 03) exibiram
mais de 2 sinais concomitantes, além de pressão intraocular elevada ou
próximos dos limites máximos de normalidade para a espécie.
27
Figura 03 – Olho de cão com glaucoma secundário a uveíte, apresentando: vasos
episclerais ingurgitados (seta verde), neovascularização corneana (seta amarela), fratura de membrana descemet (seta branca), edema corneano difuso (seta azul) e secreção purulenta (seta preta).
Fonte: Arquivo Pessoal.
28
6 DISCUSSÃO
No presente estudo o critério de inclusão estabelecido foi de animais
diagnosticados com uveíte bilateral, uma vez que esta é a apresentação mais
relatada da enfermidade ocular quando da presença de infecção por E. canis
(LEIVA et al., 2005; KOMNENOU et al., 2007).
Trabalhos relacionados a prevalência da E. canis na população canina
avaliada por nested-PCR em regiões do Sul da Bahia, demonstram incidência
de 7,8% (CARVALHO et al., 2008), 11% (CARLOS et al., 2011) e 25,6%
(GUEDES et al., 2015). Diferentemente destes estudos, no presente trabalho
foram submetidos a diagnóstico molecular apenas amostras de cães com uveíte
bilateral e encontrado valor mais elevado de prevalência, correspondente a 53%
dos animais avaliados. Este valor se aproxima dos encontrados por Oriá e
colaboradores (2008), que encontraram 66,67% de positividade por teste
imunofluorescência indireta (RIFI). Estes mesmos autores também encontraram
88,27% de positividade através do ensaio imunoenzimático (ELISA).
A diferença dos percentuais relatados e encontrados neste estudo pode ser
explicado porquanto a técnica molecular apesar de garantir maior sensibilidade
quando a doença está na fase aguda, garantindo que os animais positivos estão
cursando com EMC, ela pode não identificar pacientes com a doença na fase
crônica devido à baixa carga parasitária circulante. Os testes sorológicos não
distinguem entre pré exposição e infecção ativa, o que comumente determina
prevalências mais altas em estudos, nem sempre indicando que o animal está
com a doença em curso (MASSA et al., 2002; KOMNENOU et al., 2007; ORIÁ et
al., 2008; GUEDES et al., 2015).
Os sinais oftálmicos visibilizados nos animais do presente estudo, como
blefaroespasmo, fotofobia, epífora, edema corneano e miose persistente já
haviam sido descritos por outros autores em animais com EMC (KOMNENOU et
al., 2007; ORIÁ et al., 2008). E, além desses, a presença de secreção purulenta
e injeção episcleral também já foram descritos (ORIÁ et al., 2008).
De acordo com Oriá e colaboradores (2008) o glaucoma secundário pode
ocorrer em cães com uveíte devido a EMC em decorrência de obstrução da rede
trabecular pelo aumento da celularidade em câmara anterior ou por formação de
sinéquias que obstruem a drenagem adequada do humor aquoso. Dentre os
29
casos de glaucoma secundário diagnosticados no presente estudo, alguns
animais apresentaram valores de PIO dentro da normalidade. Tal achado pode
ser decorrente da intensificação da drenagem do humor aquoso pela via uveo-
escleral e/ou pela redução de sua produção pelo corpo ciliar inflamado. Com a
cronicidade da enfermidade essa via de compensação tende a se desequilibrar
a tal ponto que a PIO ultrapassa os valores de normalidade (ORIÁ et al., 2004;
PLUMMER et al., 2013).
30
7 CONSIDERAÇÕES FINAIS
O teste nested-PCR foi considerado satisfatório para o diagnóstico dos
animais infectados por E. canis, garantindo, nestes animais, a presença do
agente circulante em seu organismo. Essa técnica garante alta especificidade
em relação à espécie infectante, o que favorece o diagnóstico diferencial quando
há dúvida. É uma técnica relativamente rápida, de resultados confiáveis, mas
que necessita de equipamentos próprios e de alto valor para implantação.
Esse estudo confirma que a maioria dos animais diagnosticados com uveíte
bilateral são positivos para infecção por E. canis, sendo essa doença infecciosa
necessária para compor o diagnóstico diferencial dessa alteração oftálmica.
31
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ANEXO 1 – Ficha de Oftalmologia
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