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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ PRÓ- REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR
DIVERSIDADE DE BACTÉRIAS EM NÓDULOS DE Inga vera Willd.
(LEGUMINOSAE- MIMOSOIDEAE) DO SUL DA BAHIA
HELLEN RIBEIRO MARTINS DOS SANTOS
ILHÉUS – BAHIA – BRASIL
Março de 2010
ii
HELLEN RIBEIRO MARTINS DOS SANTOS
DIVERSIDADE DE BACTÉRIAS EM NÓDULOS DE Inga vera Willd.
(LEGUMINOSAE- MIMOSOIDEAE) DO SUL DA BAHIA
Dissertação apresentada à
Universidade Estadual de Santa Cruz,
como parte das exigências para
obtenção do título de Mestre em
Genética e Biologia Molecular.
Área de concentração: Genética
e Biologia Molecular
ILHÉUS – BAHIA – BRASIL
Março de 2010
iii
HELLEN RIBEIRO MARTINS DOS SANTOS
DIVERSIDADE DE BACTÉRIAS EM NÓDULOS DE Inga vera Willd.
(LEGUMINOSAE- MIMOSOIDEAE) DO SUL DA BAHIA
Dissertação apresentada à
Universidade Estadual de Santa Cruz,
como parte das exigências para
obtenção do título de Mestre em
Genética e Biologia Molecular.
Área de concentração: Genética
e Biologia Molecular
APROVADA: 30 de março de 2010
Profa. Dra. Rachel Passos Rezende
DCB – UESC
Dr. Fábio Bueno dos Reis Júnior
CPAC - EMBRAPA
Prof. Dr. Leandro Lopes Loguércio DCB - UESC
Prof. Dr. Eduardo Gross DCAA - UESC (Orientador)
iv
DEDICATÓRIA
Aos meus pais, amigos e toda minha família que, com muito carinho e apoio,
não mediram esforços para que eu chegasse até esta etapa de minha vida, dedico.
v
AGRADECIMENTOS
A Deus, que em sua infinita sabedoria soube guiar-me tão sabiamente nesta
jornada.
A meus pais Ananias e Suzete, pelo incentivo, carinho e amor incondicional, bem
como, por acreditarem que este sonho se tornaria realidade.
A meus irmãos Diego, Kellen e Fabiana por estarem sempre presentes nesta
caminhada.
Ao professor Eduardo Gross, por sua orientação, companheirismo, paciência e
atenção dedicados a mim no desenvolvimento deste trabalho, por estar sempre
disponível, mesmo nas horas em que “tempo” era a última palavra existente em seu
vocabulário, e por ter este jeito tão especial como pesquisador, professor e amigo
que cativa a todos ao seu redor.
Aos meus queridos companheiros de laboratório, os “cientistas malucos”, Irailde,
Miguel, Ana Carolina, Raimundo, Everton, Marcos Vinícius, Caroline, James,
Lidiane, Maíra, Marcela, Lucas, Thales e Daniel, pelas muitas discussões,
conselhos, brincadeiras, e ajuda na realização deste trabalho, em especial a Ana
Carolina, Miguel e Irailde, por, juntamente com nosso orientador, se tornarem
parceiros nesta pesquisa e dedicar dias e dias a troca de informações e geração de
conhecimentos.
Às minhas companheiras de serra e montanhas, Caroline Pinheiro, Kalinka Correia e
Profa Daniela Talora, pela imensa ajuda na coleta do material de pesquisa.
Ao amigo Ércio pela disponibilização do material botânico, ao Profo André Amorim
pela identificação das árvores no local de coleta e ao Profo e co-orientador João
Carlos Dias pelo auxílio e sugestões quando necessário.
A todos os meus amigos, companheiros da vida, que por serem muitos, seria injusto
citar qualquer nome, pelo prestígio, atenção, inúmeras risadas, e por me dedicarem
tanto carinho e estarem sempre por perto.
A todos os professores, pelos ensinamentos e pelo apoio recebidos, me permitindo
crescer como estudante e pessoa.
Aos funcionários Dona Carmem e Raimundo pelo convívio e pela preciosa ajuda
quando era preciso.
Ao programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular (PPGGBM), pela
vi
oportunidade de realização deste mestrado.
A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela
concessão da bolsa.
Enfim, a todos aqueles não citados, porém importantes, que direta ou indiretamente,
contribuíram para a minha formação, agradeço.
vii
ÍNDICE
EXTRATO ............................................................................................................................ viii
ABSTRACT ......................................................................................................................... x
1.INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA .................................................................................. 01
2. REVISÃO DE LITERATURA ........................................................................................... 04
2.1 A Fixação Biológica de Nitrogênio ........................................................................
2.2 Taxonomia e Diversidade de Rizóbios .................................................................
2.3 Formação dos Nódulos e a Simbiose Rizóbio – Leguminosa ..............................
2.4 Genes relacionados à FBN ..................................................................................
2.5 Uso da taxonomia molecular para estudo de diversidade .....................................
2.6 Beta-rizóbios que nodulam leguminosas ..............................................................
2.7. O gênero Inga Mill. (Leguminosae-Mimosoideae) ................................................
3. MATERIAL E MÉTODOS ...............................................................................................
3.1. Coleta de nódulos e material botânico ...................................................................
3.2. Isolamento e cultivo dos rizóbios ............................................................................
3.3. Caracterização morfológica das colônias ...............................................................
3.4. Extração de DNA genômico ....................................................................................
3.5. Amplificação por PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) ...................................
3.6. Seqüenciamento e análises de diversidade ...........................................................
3.7. Avaliação da Influência de isolados de rizóbio selecionados sobre o
crescimento inicial de plantas de Inga edulis .........................................................
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................................................
4.1. Caracterização morfológica dos nódulos e das colônias bacterianas ....................
4.2. Análises de agrupamento dos caracteres morfológicos das colônias ....................
4.3. Extração do DNA genômico e amplificação dos genes dos isolados bacterianos..
4.4. Análises da diversidade genética ............................................................................
4.4. Experimento de inoculação de rizóbios em Inga edulis ..........................................
5. CONCLUSÃO ..................................................................................................................
6. REFERÊNCIAS ...............................................................................................................
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viii
EXTRATO
SANTOS, Hellen Ribeiro Martins dos, M.S., Universidade Estadual de Santa Cruz,
Ilhéus, Março de 2010. Diversidade de bactérias em nódulos de Inga vera Willd.
(Leguminosae - Mimosoideae) do sul da Bahia. Orientador: Eduardo Gross. Co -
orientador: João Carlos Teixeira Dias. Colaborador: Marcio Gilberto Cardoso Costa.
Poucas espécies de leguminosas arbóreas que ocorrem no estado da Bahia
foram estudadas quanto a sua nodulação e seus rizóbios simbiontes, apesar da grande importância econômica e ecológica que apresentam tanto essas plantas como tal simbiose. Espécies arbóreas como o gênero Inga, que ocorrem no bioma Mata Atlântica e nas cabrucas do sul da Bahia, representam um pouco desse potencial ainda inexplorado. Assim sendo, o presente trabalho teve como objetivo estudar a diversidade das bactérias associadas aos nódulos da leguminosa arbórea Inga vera Willd. (Leguminosae – Mimosoideae) presente em um trecho de Mata Atlântica primária do sul da Bahia. Para tanto, nódulos das raízes de 12 árvores desta espécie foram coletados na Reserva Ecológica de Serra Bonita, localizada no município de Camacã (BA), e trazidos para laboratório para isolamento e caracterização de suas bactérias simbiontes. O DNA total desses isolados foi extraído e as regiões que codificam o 16S rDNA e os genes recA, nifH e nodC amplificadas, sendo obtidas seqüências do 16S rDNA e recA. As observações morfo-anatômicas demonstraram que os nódulos radiculares de I. vera são do tipo indeterminado, raramente ramificados. Os dendrogramas UPGMA gerados pelas análises de agrupamento das características morfológicas das colônias bacterianas resultaram na formação de dois grandes grupos, um formado por colônias com coloração amarela, com produção de mucopolissacarídeos e crescimento relativamente rápido (3 – 7 dias), capazes de acidificar o meio de cultura. Outro grupo foi formado por colônias de cor branca, com a capacidade de alcalinizar o meio e de crescimento lento (8 – 12 dias), produzindo pouco ou nenhum muco. A análise das seqüências do 16S rDNA e do gene recA desses isolados, submetidas ao banco de genes para buscar alinhamentos significativos, demonstrou que o primeiro grupo era predominantemente formado por espécies de Burkholderia e o segundo grupo por espécies do gênero Bradyrhizobium. Foi evidenciada ampla diversidade genética de bactérias presentes nos nódulos de I. vera, com isolamento não só de alfarizóbios, Rhizobium e Bradyrhizobium, mas também de betarizóbios
ix
identificados como sendo Burkholderia, gênero pela primeira vez relatado como associado aos nódulos desta leguminosa arbórea. As análises de diversidade sugeriram que houve uma substancial similaridade entre alguns dos isolados bacterianos de I. vera com Burkholderia nodosa e Bradyrhizobium japonicum. No experimento em que os isolados 26A (identificado como Rhizobium tropici) e 395A (Burkholderia nodosa), provenientes dos nódulos de I. vera, foram inoculados em plântulas de I. edulis, não ocorreu nodulação.Os resultados demonstraram que os nódulos I. vera são colonizados por uma ampla diversidade de bactérias. Palavras-chave: rizóbios, leguminosas arbóreas, 16S rDNA, recA.
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ABSTRACT
SANTOS, Hellen Ribeiro Martins dos, M.S., Universidade Estadual de Santa Cruz,
Ilhéus, Março de 2010. Diversity of bacteria Inga vera Willd. (Leguminosae -
Mimosoideae) nodules on south of Bahia. Advisor: Eduardo Gross. Advisory
Committee Members: João Carlos Teixeira Dias and Marcio Gilberto Cardoso Costa.
Few species of tree legumes that occur on Bahia State were studied about their nodulation and their symbiotic rhizobia, despite of economic and ecological importance that these plants and this symbiosis represent. Tree species as Inga genus, which occur on Mata Atlantica biome and cabrucas of south of Bahia, represents some of this unexplored potential. The aim of present work was to study the diversity of nodule-associated bacteria from leguminous tree Inga vera Willd. (Leguminosae – Mimosoideae), which occur on fragment of primary Atlantic Forest on south of Bahia. Root nodules from 12 trees of this species were collected on Reserva Ecológica de Serra Bonita, localized on the Camacã municipality (BA), and brought to laboratory for symbiotic bacteria isolation and characterization. Total DNA from these bacteria was extracted and regions that codify 16S rDNA and recA, nifH e nodC genes were amplified with only 16S rDNA and recA sequences being obtained. Morpho-anatomical observations demonstrated that I. vera root nodules are of indeterminate type, rarely branched. UPGMA dendrograms generated from cluster analyses of morphological characteristics for bacteria colonies resulted on formation of two large groups, one formed by yellow colonies, with mucopolysaccharide production and relatively fast growth (3 – 7 days) that acidified the culture media. Another group was formed by white colonies, which alkalinized the media and slow growth (8 – 12 days), producing little or none mucous. The sequences analysis from 16S rDNA and recA genes from these isolates, submitted to gen banks to search for significant alignments, demonstrated that the first group were predominantly formed by Burkholderia species and the second group by Bradyrhizobium species. Wide genetic diversity of nodule bacteria from I. vera nodules were observed, not only by alfarhizobia Rhizobium and Bradyrhizobium isolation, but also with betarhizobia identified as Burkholderia genus that is for the first time reported as associated with the nodules of this legume tree. Diversity analyses suggested substantial similarity between some bacterial isolates from I. vera with Burkholderia nodosa and
xi
Bradyrhizobium japonicum. On experiment that 26A (identified as Rhizobium tropici) and 395A (Burkholderia nodosa) isolates, obtained from I. vera nodules, were inoculated on I. edulis seedlings nodulation not occurred. The results demonstrated that I. vera nodules are colonizeds by a wide diversity of bacteria.
Keywords: Rhizobia, leguminous tree, 16S rDNA, recA.
1
1. INTRODUÇÃO
O nitrogênio é considerado elemento essencial para os organismos vivos,
pois juntamente com o carbono, oxigênio e hidrogênio, está presente na composição
das mais importantes biomoléculas, tais como ATP, NADH, NADPH, clorofila, ácidos
nucléicos e proteínas. A fixação do nitrogênio atmosférico em amônia e
posteriormente em compostos orgânicos é uma parte crucial no ciclo do nitrogênio
(HARPER, 1994). A nitrogenase, enzima responsável por essa fixação, tem uma
ampla distribuição taxonômica em organismos procariotos (bactérias e
arqueobactérias). Dentre estas, os rizóbios, bactérias fixadoras de nitrogênio
simbiontes, que formam estruturas hipertróficas (nódulos) nas raízes das
leguminosas, e são conhecidos como os maiores contribuintes para esse processo
(REIS et al., 2006).
Os rizóbios são um grupo de Proteobacterias aeróbicas obrigatórias não
formadoras de endósporos, que possuem a enzima nitrogenase e na simbiose com
as leguminosas cedem amônia e absorvem fotossintatos da planta hospedeira,
estabelecendo assim uma relação mutualística (MOREIRA; SIQUEIRA, 2002). A
nitrogenase parece estar organizada em um “cluster” no cromossomo ou em
plasmídeo dependendo da espécie bacteriana, com diversos genes denominados de
nif (“nitrogen fixation”) responsáveis por codificar proteínas envolvidas diretamente
no processo da redução do nitrogênio (SPRENT, 2001). Além dos genes nif, em
certos diazotróficos tem sido relatado outros genes tais como o fix e o nod que
codificam proteínas que indiretamente desempenham função essencial na
nodulação em bactérias simbiontes.
Do ponto de vista agronômico, ecológico e econômico, a simbiose entre
rizóbios e leguminosas é muito importante por poder dispensar parcial ou totalmente
a utilização de fertilizantes nitrogenados sintéticos, contribuindo assim para a
nutrição da planta e aumento do nitrogênio disponível no solo (REIS et al., 2006). As
bactérias fixadoras de nitrogênio podem ser simbiontes mutualísticas, como
Rhizobium, Burkholderia e Frankia, ou de vida livre, como Nostoc, Beijerinckia e
Clostridium. Algumas espécies de vida livre são freqüentemente encontradas em
associação com raízes de plantas (como, por exemplo, Azospirillum) e, devido à sua
habilidade de interferir na morfologia das raízes e crescimento das plantas, podem
2
ser consideradas rizobactérias promotoras de crescimento de plantas (RPCPs)
(BALDANI; BALDANI, 2005). As bactérias fixadoras de nitrogênio, portanto, não
pertencem a um grupo filogenético restrito. Segundo classificação a partir do
seqüenciamento do RNA ribossômico existem bactérias fixadoras de nitrogênio entre
as proteobactérias, as cianobactérias, as bactérias Gram positivas e as bactérias
verdes enxofradas (WOESE, 1987). As alfa e betaproteobactérias que se associam
com as raízes de plantas da família Leguminosae (Fabaceae) podem ser referidas,
atualmente como alfarizóbios e betarizóbios (BONTEMPS et al., 2010).
As leguminosas são a terceira maior família de plantas com flores, só sendo
superada pelas Orchidaceae e Asteraceae (MOREIRA; SIQUEIRA, 2006). Estima-se
que a família leguminosae possua aproximadamente 20.000 espécies e cerca de
700 gêneros (LEWIS et al., 2003a) e é dividida em três subfamílias:
Caesalpinoideae, Mimosoideae e Papilionoideae, as quais diferem bastante em
relação ao hábito de crescimento de suas espécies, assim como na capacidade de
formar simbiose com bactérias fixadoras de nitrogênio. A subfamília Caesalpinoideae
possui cerca de 3.000 espécies, sendo, a maioria, arbórea tropical, e é dentre as 3
subfamílias, a que engloba a maioria das espécies de leguminosas não nodulíferas
(MOREIRA; SIQUEIRA, 2006).
Mimosoideae tem aproximadamente 78 gêneros e mais de 3.000 espécies
distribuídos por todas as regiões tropicais, subtropicais e temperadas quentes do
mundo. A capacidade de formar nódulos nas plantas dessa subfamília está
confirmada para todas as cinco tribos citadas por Polhill e Raven (1981), mas nem
todos os gêneros dentro das tribos nodulam. Três gêneros importantes nesse grupo
são Acacia, Mimosa e Inga, com respectivamente, 1.500, 500 e 300 espécies,
abrangendo, portanto, a maioria das Mimosoideae até então conhecidas (MOREIRA;
SIQUEIRA, 2006; REIS JUNIOR et al, 2006).
Dentre as três subfamílias, a Papilionoideae representa um grupo mais
numeroso, com cerca de 14.000 espécies, na maioria de hábito herbáceo; apesar de
a subfamília também possuir cerca de 4.000 a 5.000 espécies arbóreas (MOREIRA;
SIQUEIRA, 2006). A maioria das espécies dessa subfamília até hoje estudadas
forma nódulos radiculares e algumas até mesmo caulinares (SPRENT, 2001).
As leguminosas apresentam uma grande diversidade anatômica e
morfológica de seus nódulos, mas basicamente, eles podem ser classificados em
3
dois tipos: os determinados e os indeterminados, os quais diferem, dentre outras
características, pela presença de um meristema permanente no ápice do nódulo,
nesse caso, classificado como indeterminado. Os diferentes tipos de nódulos
geralmente estão relacionados com a tribo a qual a planta pertence (BALDANI;
BALDANI, 2005).
Devido à importância agronômica e econômica dos rizóbios e com o
surgimento e aplicação de novas técnicas moleculares, esses microrganismos têm
sido intensivamente estudados durante as últimas décadas. Entretanto, poucas
espécies de leguminosas arbóreas que ocorrem no estado da Bahia foram avaliadas
quanto a sua nodulação e seus rizóbios simbiontes, representando assim um
potencial inexplorado, devido ao desconhecimento de suas características
silviculturais, sua produtividade e, denotadamente, sua habilidade em associar-se a
bactérias fixadoras de N2. Neste contexto, estudos mais detalhados sobre as
espécies bacterianas envolvidas nesse processo são necessários e oportunos.
Espécies arbóreas como o gênero Inga, um gênero exclusivamente
neotropical com cerca de 300 espécies arbóreas (PENNINGTON, 1997) que
ocorrem no bioma Mata Atlântica e nas cabrucas do sul da Bahia, representam uma
pequena parte desse potencial ainda a ser descoberto. Dentre as muitas espécies
do gênero, uma que se destaca pela freqüência com que é encontrada nas matas é
Inga vera Willd. Ela é uma das árvores mais típicas do gênero, formadora de matas
ribeirinhas (matas ciliares e galerias) do Brasil, sendo de pequeno porte, perenifólia,
com grande abrangência também na América Central, Colômbia, Argentina e
Uruguai. No Brasil, pode ser encontrada em quase todos os estados, sendo
indicada, principalmente, para revegetação e recuperação de áreas degradadas
(BARBEDO, 1997).
Uma vez que a simbiose do ingazeiro com rizóbios pode suprir, pelo menos
em parte, a necessidade de nitrogênio da planta, e sendo o uso desta de grande
interesse ecológico e florestal, a pesquisa com as bactérias fixadoras de nitrogênio
pode auxiliar na seleção de estirpes mais eficientes para inoculação nas
leguminosas. O presente trabalho teve, portanto, o objetivo de estudar a diversidade
das bactérias presentes nos nódulos da leguminosa arbórea Inga vera Willd.
(Leguminosae – Mimosoideae), coletados em uma mata primária do sul da Bahia.
4
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. A Fixação Biológica de Nitrogênio
A Fixação Biológica do Nitrogênio (FBN) é a conversão de nitrogênio
atmosférico (N2) em amônia (NH3). A maioria dos organismos necessita de uma
fonte de nitrogênio numa forma mais reduzida do que aquela presente na atmosfera,
para que este elemento possa ser assimilado. A exceção são os organismos
fixadores de nitrogênio, conhecidos comumente como diazotróficos. Estes
organismos possuem a enzima nitrogenase que é capaz de reduzir o N2 para a
forma inorgânica combinada NH3 (Figura 1) e que pode então se tornar disponível
para o ambiente e os organismos a eles associados.
N2 + 8H+ + 16ATP + 8e- 2NH3 + H2 + 16ADP + 16Pi
Figura 1 - Esquema da reação de fixação do nitrogênio com mediação pela nitrogenase.
A fixação do nitrogênio pode ser realizada por processos industriais, como o
Haber- Bosch, que contribui com cerca de 25% do nitrogênio fixado utilizado nos
sistemas agrícolas e florestais (MOREIRA; SIQUEIRA, 2006), e por processos
físicos como relâmpagos, combustão e vulcanismo, cuja contribuição com o total de
nitrogênio fixado é de 10%. Porém, a maior contribuição parece estar na fixação
biológica de nitrogênio, responsável por um total de 65% do total de nitrogênio fixado
anualmente. A diazotrofia, habilidade de reduzir o nitrogênio atmosférico à amônia é
uma característica exclusiva dos domínios Bacteria e Archaea (SAWADA et al.,
2003).
A primeira bactéria fixadora de N2 atmosférico foi descrita em 1889. Desde o
começo, essa descoberta gerou grande impacto e vasta literatura sobre o tema,
sendo até hoje os rizóbios, os diazotróficos mais estudados (REIS et al., 2006).
Quando se faz um comparativo entre o processo de fixação de N2
atmosférico por
via industrial e via biológica, pode-se verificar que a FBN é um processo bem mais
rentável que o indústrial, por ser um mecanismo que não exige a uma alta demanda
energética (consome somente em torno de 2,5% da energia da fotossíntese do
Nitrogenase
5
planeta), não causa impacto ambiental, além de ser um recurso renovável e passivo
de manipulação (MOREIRA; SIQUEIRA, 2006).
2.2. Taxonomia e Diversidade de Rizóbios
No século XIX, os estudos clássicos de Hellriegel e Wilfarth (1888) foram os
primeiros a estabelecer quem eram os micróbios nos nódulos das raízes que
permitiam às leguminosas obter o nitrogênio do ar. Esses microrganismos foram
isolados ainda em 1888 por Beijerinck, que os nomeou de Bacillus radicicola.
Posteriormente, foram denominados Rhizobium leguminosarum por Frank (1889).
Inicialmente, os pesquisadores consideraram o rizóbio como espécie única, capaz
de nodular todas as leguminosas.
Löhnis e Hansen (1921) sugeriram a divisão do rizóbio em dois grupos de
acordo com a taxa de crescimento em meio de cultura. O termo rizóbio de
crescimento rápido passou a referir-se às bactérias associadas com alfafa, trevo,
feijão e ervilha. As bactérias de crescimento lento foram exemplificadas pelos
rizóbios de soja e caupi. Fred et al. (1932) basearam-se nos hospedeiros e em
algumas diferenças morfológicas e fisiológicas para o reconhecimento de seis
espécies de Rhizobium: R. leguminosarum, R. trifolii, R. phaseoli, R. meliloti, R.
japonicum e R. lupini (VIEIRA, 2007).
Por muitas décadas, a caracterização de espécies de rizóbio foi baseada na
habilidade específica da bactéria em nodular a planta hospedeira. Estudos iniciais
mostraram que cada estirpe ou isolado de rizóbio tinha um determinado grupo de
hospedeiros, ou seja, nodulava certas leguminosas, mas não outras. Isso levou ao
conceito de inoculação cruzada, com as leguminosas sendo agrupadas de acordo
com o rizóbio com o qual elas formavam nódulos. Mais de 20 grupos de inoculação
cruzada foram identificados, com as bactérias do grupo do trevo, alfafa, feijão,
tremoço, ervilha e soja sendo denominadas como espécies separadas de um único
gênero, Rhizobium (ex: R. trifolii para trevo) (VIEIRA, 2007).
Recentemente, outras características têm assumido maior importância na
classificação dos rizóbios por diferentes razões. Os estudos iniciais envolveram,
principalmente, leguminosas de importância agrícola; estudos com leguminosas
menos tradicionais tornaram obscuros os limites da inoculação cruzada. A estirpe
6
bacteriana NGR234, por exemplo, originalmente isolada de Lablab purpureus, o
feijão labe-labe, nodula com 34 diferentes espécies de leguminosas e com uma
espécie não-leguminosa (Parasponia andersonii) (STANLEY; CERVANTES, 1991).
Os novos métodos taxonômicos desenvolvidos para comparar estirpes, com
base em diferentes características, resultaram em agrupamentos cada vez mais
distantes daqueles baseados na capacidade específica da bactéria para nodular a
planta hospedeira. Reconhecendo-se as limitações da infecção da planta como o
maior determinante taxonômico, outros caminhos começaram a ser trilhados para
melhor classificar os rizóbios. A taxonomia numérica reforçou as diferenças entre os
grupos de rizóbio de crescimento rápido e lento e levou à consolidação de algumas
espécies dentro de cada grupo. Em 1984, dois gêneros foram descritos, Rhizobium e
Bradyrhizobium. Três espécies foram nomeadas para o gênero Rhizobium: R. loti, R.
meliloti e R leguminosarum. O gênero Bradyrhizobium (“bradus”, grego, significando
lento) compreendeu todas as estirpes de crescimento lento e somente uma espécie
foi nomeada: B. japonicum, o microssimbionte de soja (VIEIRA, 2007).
O notável progresso na taxonomia rizobiana levou à descrição de mais de 40
novas espécies e de quatro gêneros adicionais, Allorhizobium, Azorhizobium,
Mesorhizobium e Sinorhizobium. (VIEIRA, 2007).
Através da realização de vários estudos, sabe-se hoje que muitos gêneros e
espécies de procariotos capazes de realizar a FBN estão distribuídos no ambiente e
associados às plantas. Essas associações podem variar em especificidade,
estrutura, localização e microrganismo responsável. Existe uma diversidade de
bactérias simbióticas, que são capazes de formar nódulos e pertencem
principalmente ao grupo dos rizóbios e do gênero Frankia. Há também bactérias que
colonizam os tecidos internos das plantas – denominadas de bactérias diazotróficas
endofíticas. Um terceiro grupo forma associações superficiais aos tecidos
radiculares, sobrevivem bem no solo e não são caracterizadas como espécie-
específicas, sendo denominadas de associativas (REIS et al.,2006).
A maioria das bactérias diazótróficas está posicionada na subdivisão Alfa de
Proteobactéria, sendo este o subgrupo mais estudado. Dentro desse grupo estão
também posicionadas as bactérias simbióticas dos gêneros Azorhizobium,
Bradyrhizobium, Rhizobium e Sinorhizobium, além de organismos fototróficos e
metanotróficos, tornando esta subdivisão bastante variável. Na subdivisão Beta são
7
encontrados gêneros tais como Burkholderia e Ralstonia. As Gamma
proteobactérias compõem uma menor parte das bactérias diazotróficas descritas. E
a subdivisão Delta das Proteobactérias possui, em sua maioria, bactérias
anaeróbicas obrigatórias redutoras de enxofre, incluindo espécies de Desulfovibrio e
Desulfobacter (REIS et al., 2006).
Apesar dos grandes avanços, muitos estudos estão sendo feitos para a
descoberta de novas bactérias fixadoras de nitrogênio, a fim de ampliar o
conhecimento sobre a diversidade desses microssimbiontes.
2.3. Formação dos Nódulos e a Simbiose Rizóbio – Leguminosa
Os nódulos se apresentam como estruturas hipertróficas nas raízes e,
excepcionalmente, no caule das plantas (MOREIRA; SIQUEIRA, 2002),
especialmente das leguminosas. Do ponto de vista morfo-anatômico, os nódulos
podem ser classificados em dois tipos: determinados e indeterminados. Nódulos
determinados apresentam formato globoso, devido ao limitado desenvolvimento do
meristema. Já os indeterminados são alongados, por causa da presença de um
meristema persistente localizado no seu ápice, que produz continuamente novas
células (PATRIARCA et al., 2002, GAGE et al., 2004, PRELL; POOLE, 2006).
O processo de nodulação é controlado, em grande parte, pela troca de sinais
entre a bactéria simbionte e a planta, bem como pela expressão de genes que se
fazem necessários para as alterações fisiológicas e morfológicas que possibilitam a
simbiose. Nos estádios iniciais de formação dos nódulos radiculares, a espécie
hospedeira libera sinais em sua rizosfera, identificados como compostos fenólicos
(flavonóides e betaínas) que são percebidos pelas bactérias, desencadeando a
expressão coordenada de uma série de genes de nodulação, os chamados genes
(nod), que, a depender da bactéria, podem estar localizados no DNA cromossomal
ou plasmidial. Após a sinalização, os tricomas radiculares são encurvados,
possibilitando, desta maneira, a entrada das bactérias (PATRIARCA et al., 2002,
GAGE et al., 2004). Essa sinalização induz a mitose acelerada de células
hipodérmicas pré-existentes, determinada por fatores estimulantes provenientes da
bactéria. Esse estímulo é dirigido a células localizadas nas proximidades dos pólos
do xilema da planta. No estádio inicial da divisão hipodérmica, forma-se o meristema
8
primário do nódulo. Quando a bactéria invade o tricoma radicular, o meristema
primário do nódulo induz a divisão pericíclica, próxima da região do xilema, formando
o meristema secundário do nódulo que se funde ao primário através da ramificação
do cordão de infecção. Tanto as células da planta em divisão quanto às invadidas se
fundem, e as células contendo as bactérias aumentam rapidamente de volume
ficando restritas à zona central ou à apical do nódulo, o qual cresce e se diferencia
(CARDOSO et al., 1992).
A simbiose de rizóbios e leguminosas é, geralmente, considerada como
sendo mutualística. Na verdade, simbioses de rizóbios podem ser parasíticas
(quando há formação de nódulos inefetivos) ou mutualísticas, nesse caso quando os
nódulos são efetivos (MOREIRA; SIQUEIRA, 2002). Estes últimos precisam manter
o nível de oxigênio baixo, pois a enzima responsável pela fixação de nitrogênio
(nitrogenase) é extremamente sensível a altas concentrações de O2. Para neutralizar
a incompatibilidade de fixação de N2, que é estritamente anaeróbico, e o
metabolismo dos diazotróficos que é aeróbio, esses microrganismos desenvolveram
vários mecanismos para protegerem o sítio da nitrogenase da interferência do
oxigênio, como apresentar uma razão superfície/volume celular menor, o que seria
um modo de impedir o excesso de absorção de O2. Além disso, os nódulos que
fixam nitrogênio apresentam um composto com função e composição semelhante à
hemoglobina, a leg-hemoglobina, que transporta oxigênio para os microrganismos. A
leg-hemoglobina possui uma alta afinidade pelo O2, agindo assim como um tampão,
mantendo a concentração baixa de oxigênio no meio e provendo O2 ao
microssimbionte numa taxa constante (GAGE et al., 2004; MOREIRA; SIQUEIRA,
2002; PRELL; POOLE, 2006).
2.4. Genes relacionados à FBN
Vários genes estão envolvidos no processo de fixação de nitrogênio. Tais
genes parecem estar organizados em “clusters” dentro da célula, exercendo cada
um uma função específica relacionada ao processo de fixação. Muitos são
importantes, porém os principais são os genes nif, fix e nod.
Os nif (“nitrogen fixation”) são genes requeridos para a estrutura, biossíntese
e regulação da nitrogenase e, portanto, encontrados em todos os diazotróficos.
9
Desde sua primeira descrição em Klebsiella pneumoniae (CANNON et al.,1980;
DIXON et al.,1980), tais genes já foram identificados em várias espécies de
dizotróficos associativos (ex. Azospirillum brasilense, A. lipoferum, A. amazonense)
(MOREIRA; SIQUEIRA, 2006). Os nif são organizados em várias unidades
transcricionais de regulação. Além dos genes estruturais da nitrogenase (nif HDK),
essas unidades também contêm os genes que controlam as proteínas de transporte
de elétrons (codificam para produtos envolvidos na biossíntese do co-fator Fe-Mo da
nitrogenase), e certos genes reguladores da transcrição (DIXON; KAHN, 2004).
Os genes fix, atuantes no processo da fixação de nitrogênio, são encontrados
em adição aos nif em bactérias simbióticas. E os genes nod requeridos para a
nodulação, só são encontrados em bactérias diazotróficas formadoras de nódulos,
como as do gênero Rhizobium e Bradyrhizobium que formam simbiose com as
leguminosas (MOREIRA; SIQUEIRA, 2006).
Citam-se mais de 40 genes bacterianos nod envolvidos na nodulação em
diferentes espécies de rizóbios cuja transcrição é ativada por sinais específicos da
planta (MELO; AZEVEDO, 1998, GAGE et al., 2004, PRELL; POOLE, 2006). Os
genes nod codificam aproximadamente 25 proteínas que são necessárias para a
síntese e exportação do fator Nod. O fator Nod é um lipo-oligossacarídeo sinal
constituído de um suporte de quitina, quatro a cinco unidades de N-acetilglicosamina
com um lipídeo ligado ao final não reduzido, e modificações hospedeiro-específica
neste suporte de quitina. Este lipo-oligossacarídeo sinaliza o desenvolvimento de
muitas modificações na planta no início do processo de nodulação, incluindo a
deformação de tricoma radicular, a despolarização da membrana, oscilação do
cálcio intracelular e a iniciação da divisão celular no córtex da raiz, estabelecendo
um meristema e o primórdio do nódulo (GAGE et al., 2004).
Os projetos genoma dos rizóbios têm ampliado expressivamente o
conhecimento dos genes relacionados a FBN. Dentre os diversos genomas
completos de bactérias fixadoras de N2,disponíveis atualmente na base de dados do
NCBI (National Center for Biotechnology Information), pode-se destacar os de
Rhizobium etlii, Rhizobium leguminosarum, Bradyrhizobium japonicum,
Sinorhizobium meliloti, Mesorhizobium loti, Azoarcus sp, Nostoc sp., Frankia sp.,
Ralstonia solanacearum, Cupriavidus taiwanensis, Burkholderia cenocepacia,
Burkholderia phymatum STM815, Burkholderia ambifaria, dentre outros.
10
2.5. Uso da taxonomia molecular para estudo de diversidade
A taxonomia é tida, modernamente, como sinônimo de sistemática e
tradicionalmente dividida em três partes: 1- Classificação dos organismos em grupos
taxonômicos com base na similaridade entre eles; 2-Nomenclatura das unidades
definidas na classificação; 3- Identificação dos organismos desconhecidos (COWAN,
1968; STALEY; KRIEG, 1984).
A espécie é a unidade básica da taxonomia bacteriana, definida como um
grupo de estirpes, incluindo a estirpe tipo, que dividam 70% ou mais de hibridização
DNA-DNA. Uma espécie de bactéria é uma categoria que circunscreve um grupo de
indivíduos (estirpes/isolados) coerentes genomicamente, que dividam um alto grau
de similaridade em muitos aspectos independentes, testados comparativamente sob
condições padronizadas (STACKEBRANDT et al, 2002).
A seqüência de RNA ribossomal 16S tem sido preferencialmente escolhida
para a análise molecular em procariotos, pois está presente em todos esses
organismos, além de derivar de um ancestral comum, parecer geneticamente estável
e apresentar um tamanho adequado para seqüenciamento. O fato de que o RNA
tem uma função conservada durante o agrupamento dos ribossomos e na tradução
protéica sugere uma possível semelhança estrutural entre as seqüências
nucleotídicas codificadoras dos rRNA de diferentes organismos. Essa semelhança
foi posteriormente confirmada demonstrando-se a ocorrência de mudanças de
nucleotídeos coordenadas em posições homólogas de seqüências de rRNA 16S de
origens filogenéticas diversas (WOESE, 1987; VANDAMME et al., 1996).
As moléculas de rRNA apresentam regiões extremamente conservadas entre
todos os organismos que compartilham aquela espécie de rRNA e regiões altamente
variáveis, sendo que o grau de variação nessas regiões específicas pode variar de
um táxon a outro. A presença dessas regiões variáveis oferece grandes
possibilidades para o desenho de sondas genéticas reino-específicas, gênero-
específicas e até espécie ou estirpe-específicas (WOESE, 1987).
Segundo Coenye et al (2005), os métodos genotípicos clássicos usados na
taxonomia bacteriana, como conteúdo G+C, hibridização DNA-DNA e
seqüenciamento 16S rDNA, não são significativamente influenciados por forças que
moldam o genoma dos procariotos. Entre estas forças estão os rearranjos
11
cromossômicos, aquisição de genes (transferência horizontal de genes) e deleções,
que levam a uma grande diversidade na organização e no conteúdo genômico. Uma
vantagem desta abordagem é que seqüências de DNA e produtos gênicos podem
ser comparadas em um contexto evolucionário dentro da sistemática molecular (VAN
BERKUN et al., 2000).
A história evolutiva do gene de 16S rRNA aproxima-se da história evolutiva
do genoma total, tornando-se desta forma, aceitável reconstruir relações
filogenéticas e evolucionárias entre bactérias a partir da divergência das seqüências
entre seus genes de 16S rRNA (VAN BERKUN et al., 2000). Por conta disso, a
molécula da subunidade menor do RNA ribossomal de 16S (16S rRNA) foi
estabelecida como importante marcador universal, e somado a técnicas de
seqüenciamento de DNA e softwares de análise mais acessíveis surgiu uma
taxonomia baseada em DNA, sendo impensável o estudo da diversidade e a
publicação da descrição de uma nova espécie sem a seqüência de nucleotídeos do
gene de 16S rRNA desta espécie para que assim se estabeleça sua correta posição
taxonômica dentro do grupo (YOUNG, 2000).
2.6. Beta-rizóbios que nodulam leguminosas
Estudos recentes demonstraram que espécies bacterianas pertencentes à
Classe Beta das proteobacterias podem nodular e fixar nitrogênio associando-se às
leguminosas (MOULIN et al., 2001; CHEN et al., 2003, 2005 a,b; BARRETT;
PARKER, 2005, 2006; ANDAM, et al., 2007). Esses “beta-rizóbios”, assim
atualmente chamados, apresentam, aparentemente, características semelhantes
quanto à formação dos nódulos, dos bacteróides e fixação de nitrogênio, aos das
bactérias simbiontes pertencentes à Classe Alfa das proteobacterias (os alfa-
rizóbios). Entretanto, apesar de só recentemente evidenciadas e identificadas,
existem descrições de bactérias diferentes dos alfa-rizóbios nos nódulos de
leguminosas desde 1902 (STURTZ et al., 1997), sendo descrita a espécie
Agrobacterium radiobacter (BEIJERINCK; VAN DELDEN, 1902) nas raízes de trevo.
Sturtz et al. (1997) também identificaram nos nódulos das raízes de trevo (Trifolium
pratense L.) bactérias dos gêneros: Agrobacterium, Bacillus, Bortedella,
Curtobacterium, Enterobacter, Phyllobacterium, Pseudomonas e Rhizobium.
12
A partir do ano de 2001, outros gêneros começam a ser descritos com a
capacidade de estabelecer simbiose com leguminosas. Methylobacterium,
pertencente a um ramo distinto das alfaproteobactérias é capaz de nodular
Crotalaria (SY et al., 2001). Rivas et al. (2002) descreveram estirpes de Devosia
capazes de nodular o caule da leguminosa aquática Neptunia, cuja espécie
bacteriana normalmente em simbiose é Allorhizobium umidicola. Neste trabalho os
genes nodC e nifH, envolvidos na nodulação e fixação de nitrogênio,
respectivamente, foram seqüenciados. Representantes do gênero Ochrobactrum
demonstraram capacidade de nodular leguminosa Lupinus albus (TRUJILLO et al.,
2005), e os genes nifH e nodC destas bactérias também tiveram suas seqüências
reveladas neste trabalho, mostrando grande semelhança com os genes de espécies
rizóbios. Há ainda a descrição de bactérias do gênero Phyllobacterium que nodulam
Lupinus (VALVERDE et al., 2005).
Atualmente, houve várias descrições de outras betaproteobactérias
(principalmente as do gênero Burkholderia), que possuem a capacidade de nodular
e fixar nitrogênio em associação com leguminosas e particularmente com as da
subfamília Mimosoideae (CHEN et al., 2003a, 2005a, b; BARRETT; PARKER, 2005,
2006; ELLIOTT et al., 2007).
Burkholderia é um gênero com taxonomia complexa, que inclui atualmente
mais de 50 espécies que colonizam uma grande diversidade de nichos que vão
desde o solo à água até as plantas e animais (BONTEMPS et al., 2010), nove dos
quais estão estreitamente relacionados com um grupo, conhecido como o complexo
Burkholderia cepacia (COENYE; et al., 2001). Até o presente momento, apenas
cinco espécies Burkholderia que nodulam foram descritas: Burkholderia tuberum
(Vandamme et al. 2002), B. phymatum (Vandamme et al. 2002), B. mimosarum
(Chen et al. 2006), B. nodosa (Chen et al. 2007) e B. sabiae (Chen et al. 2008).
O gênero também tem sido isolado dos nódulos de diversas espécies de
Mimosa no Brasil, Costa Rica, Panamá, Taiwan e Venezuela (CHEN et al., 2005).
Essas betaproteobactérias têm grande versatilidade nutricional e apresentam
resistência a antibióticos produzidos por outros microrganismos, ao que se soma a
capacidade de síntese de enzimas pectolíticas, úteis na invasão dos tecidos
vegetais, e a produção de antibióticos, úteis na supressão de outros microrganismos,
conferindo-lhe vantagens competitivas (WILLENS; COLLINS, 1993).
13
Atualmente, o conhecimento sobre Mimosa nodulando beta-rizóbios incluem
Cupriavidus taiwanensis (inicialmente descrita como Ralstonia taiwanensis;
VANDAMME; COENYE, 2004) e Burkholderia spp. C. taiwanensis foi isolada de
nódulos de Mimosa pudica, M.diplotricha e M. pigra (sin. M. pellita), em Taiwan
(CHEN et al., 2001, 2003a, 2005a), de nódulos de M. pudica no norte e no sul da
Índia (VERMA et al., 2004), e algumas cepas de C. taiwanensis e uma Cupriavidus
sp. não identificada, tem sido isoladas de M. pudica e M. pigra no Panamá
(BARRETT; PARKER, 2006). Recentemente, foi reportado também espécies de
Mimosa sendo noduladas por Burkholderia phymatum (ELLIOTT et al., 2007).
Apenas quatro dos isolados de Mimosa descritos, C. taiwanensis (LMG19424 CHEN
et al., 2003b), Burkholderia sp. Br3461 e Map3-5 (CHEN ET AL., 2005a) e
Burkholderia mimosarum PAS44 (CHEN et al., 2005b, 2006), foram confirmadas
através da microscopia, utilizando imunomarcação, como sendo simbiontes de suas
espécies de hospedeiro original (ELLIOTT et al., 2007).
Apesar da grande ocorrência entre as Mimosoideae, bactérias isoladas dos
nódulos de leguminosas da subfamília Papilionoideae, como Cyclopia spp,
Aspallathus spp e Rhynchosia ferulifolia, também foram identificadas como
pertencendo ao gênero Burkholderia (ELLIOTT et al., 2007; GARAU et al., 2009),
revelando a surpreende promiscuidade de gênero no que se refere a sua interação
com as leguminosas.
Além da diversidade de espécies de Burkholderia ser relativamente alta, a
taxonomia e identificação do gênero são complexas, com novas espécies sendo
freqüentemente descritas (COENYE; et al., 2001; COENYE; VANDAMME, 2003).
Espécies estreitamente relacionadas, tais como as do complexo B. cepacia são
difíceis de identificar usando testes fenotípicos e bioquímicos convencionais, e
espécies pertencentes a outros gêneros de betaproteobacterias (incluindo
Pandoraea e Ralstonia) podem ser identificados erroneamente como espécies de
Burkholderia (COENYE; et al., 2001). Embora a análise da seqüência do gene 16S
rRNA seja parte integrante da análise taxonômica de muitos gêneros de bactérias
(VANDAMME et al., 1996), a sua utilidade no gênero Burkholderia é mais limitada,
especialmente dentro do complexo B. cepacia, onde não pode ser usado como um
meio de distinguir com precisão todas as espécies (LIPUMA et al., 1999;
MAHENTHIRALINGAM et al., 2000). Para isso, o gene recA (que codifica a enzima
14
recombinase A), tem sido amplamente aplicado na sistemática bacteriana (KARLIN;
WEINSTOCK; BRENDEL, 1995) e provou ser muito útil para a identificação das
espécies do complexo B. cepacia, com a análise filogenética da variação da
seqüência do gene que permite a discriminação de todas as nove espécies atuais
dentro deste complexo (MAHENTHIRALINGAM et al., 2000).
2.7 O gênero Inga Mill. (Leguminosae-Mimosoideae)
Inga, popularmente conhecido como ingá ou ingazeiro, é um gênero
exclusivamente neotropical com cerca de 300 espécies (PENNINGTON, 1997),
todas de porte arbóreo. O gênero pertencente à subfamília Mimosoideae das
leguminosas é facilmente diagnosticável por apresentar folhas paripinadas (os
demais gêneros do grupo apresentam folhas bipinadas), raque foliar normalmente
alada, nectários foliares entre cada par de folíolos e sarcotesta envolvendo as
sementes (QUEIROZ, 2009). Segundo Mûniz-Meléndez (1978), as sementes de
ingazeiro são vivíparas, a radícula começa seu crescimento antes da abertura do
fruto, quando esse ainda está ligado à planta-mãe e, ao cair sobre o solo, o fruto se
decompõe e as sementes continuam seus processos germinativos. A viviparidade
pode estar relacionada com o elevado teor de água após a maturação das sementes
e/ou com a baixa concentração de substâncias inibidoras presentes no fruto e ou na
própria semente (CHIN et al., 1989).
Todas as espécies de ingá produzem frutos em vagens, que podem atingir
até mais de 1 m de comprimento, dependendo da espécie, mas no geral, a maioria
das espécies possuem frutos com até cerca de 10 – 30 cm de comprimento. A
árvore pode chegar a uma altura de 15 metros, e o ingá, fruto do ingazeiro, é muito
procurado pela fauna e pelo homem por suas sementes envolvidas pela sarcotesta
branca e adocicada (PENNINGTON, 1997). O ingazeiro floresce durante os meses
de agosto e novembro e a maturação dos frutos se dá de dezembro a fevereiro
(LORENZI, 2002).
Dentre as muitas espécies do gênero, uma que se destaca pela freqüência
com que é encontrada nas matas é Inga vera Willd, conhecida popularmente como
ingá (Figura 2). Ela é uma das árvores mais típicas do gênero, formadora de matas
ribeirinhas (matas ciliares e galerias) com ampla distribuição no Brasil, sendo de
15
pequeno porte (2,5 à 5 m), perenifólia, com grande abrangência também na América
Central, Colômbia, Argentina e Uruguai (QUEIROZ, 2009). No Brasil, pode ser
encontrada em quase todos os estados, sendo muito importante por ser indicada,
principalmente, para revegetação e recuperação de áreas degradadas (BARBEDO,
1997).
Figura 2 - Foto do hábito (A) e das inflorescências (B) de Inga vera Willd. (Extraído de
LORENZI, 2002).
As leguminosas arbóreas nativas representam um potencial inexplorado,
devido ao desconhecimento de suas características silviculturais, sua produtividade
e, denotadamente, sua habilidade em associar-se a bactérias fixadoras de
nitrogênio. O interesse na utilização de ingá para recuperação de áreas degradadas
e/ou recomposição de matas ciliares, é grande. Por isso é de extrema importância
estudos que visem à descoberta da ampla diversidade de micro simbiontes
envolvidos nos processos ecológicos dessa planta.
A B
16
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Coleta de nódulos e material botânico
Amostras de nódulos foram coletadas das raízes de 12 espécimens
(árvores) de Inga vera localizadas em um fragmento de Mata Atlântica primária na
Reserva Ecológica de Serra Bonita, uma RPPN (Reserva Particular do Patrimônio
Natural) localizada no município de Camacã, sul da Bahia (Figura 3). As árvores
estavam em uma trilha no interior da mata e foram previamente identificadas pelo
Prof. Dr. André Amorim (curador do Herbário do CEPEC - Centro de Pesquisas em
Cacau, Itabuna, Bahia) e pela Profa. Dra. Daniela Talora do Departamento de
Ciências Biológicas da UESC - Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus, Bahia.
Ramos florais dessas plantas estão depositados no Herbário do CEPEC – CEPLAC
(Comissão para Implantação da Lavoura Cacaueira).
No total foram realizadas três coletas, que ocorreram nos períodos de 23 à
26 de julho de 2008, 24 à 27de outubro de 2008 e de 20 à 23 de julho de 2009, a fim
de obter uma coleção significativa dos nódulos e dos isolados bacterianos dessa
espécie de leguminosa arbórea.
Para coleta dos nódulos, a serapilheira foi removida cuidadosamente para
não danificar as raízes. Das raízes secundárias foi retirado o excesso de terra para
que os nódulos pudessem ser coletados. Como o local de coleta era distante do
Laboratório de Monitoramento Ambiental e, para que os nódulos continuassem
viáveis para o isolamento das bactérias, os mesmos foram lavados abundantemente
com água destilada para remoção do excesso de solo e impurezas, sendo as
amostras desinfestadas em etanol 95% por 30 segundos e solução de hipoclorito de
sódio 1% por 3 minutos, seguido de 8 lavagens em água destilada esterilizada. As
amostras de nódulos foram colocadas em tubos eppendorf e devidamente
identificadas com a data da coleta e o número correspondente da planta amostrada.
17
Figura 3 - Localização da Reserva Ecológica de Serra Bonita, onde foram realizadas coletas de leguminosas nodulíferas. (Reproduzido de: http://www.uiracu.org.br/serrabonita2.html)
3.2. Isolamento e cultivo dos rizóbios
Após a coleta das amostras de nódulos das leguminosas, os procedimentos
de isolamento e repique dos isolados bacterianos foram realizados no Laboratório de
Química e Fertilidade do Solo (LQFS) e no Laboratório de Monitoramento Ambiental
da UESC. Os nódulos foram retirados dos tubos Eppendorf e lavados com água
destilada esterelizada, sendo as amostras novamente desinfestadas como descrito
acima (item 3.1). Em seguida, os microrganismos foram isolados em placas de petri
contendo Meio 79 sólido indicado para cultivo de rizóbios (FRED; WAKSMAN, 1928)
e composto por (para 1 L de solução): 10g de glicose, 0,1 g de K2HPO4, 0,4 g de
KH2PO4/L, 0,2 g de MgSO4.7H2O (solução 10%), 0,1 g de NaCl (solução 10%), 0,4 g
de extrato de levedura em pó, 5 mL de solução alcoólica a 0,5% de azul de
bromotimol e 15g de ágar bacteriológico. O pH do meio foi ajustado com NaOH
(solução a 10%) para 6,8 - 7,0. O isolamento foi feito por meio de estrias compostas
para se obter colônias isoladas.
18
3.3. Caracterização morfológica das colônias
Após repique para o mesmo Meio 79 descrito no item 3.2, os isolados foram
caracterizados morfologicamente, seguindo: capacidade de alteração do pH do meio
(ácido, básico ou neutro), cor, quantidade de exopolissacarídeos produzidos (muco),
velocidade de crescimento, forma, borda e elevação da colônia, e depois agrupados
de acordo com a similaridade. Também foi realizado teste de Gram, haja vista que
todos os rizóbios são gram negativos.
Para se calcular os coeficientes de similaridade entre as colônias
bacterianas, foi construída uma matriz de presença e ausência para cada
característica morfológica observada. A análise de agrupamento utilizando o
algoritmo UPGMA (Unweighted Pair-Group Method with Arithmetical averages) e o
índice de Jaccard como coeficiente de similaridade foi realizada no programa PAST
(HAMMER et al., 2001). Esse método de agrupamento hierárquico permitiu que as
unidades fossem agrupadas por um processo que se repete em vários níveis, até se
estabelecer o dendrograma
Os isolados assim caracterizados foram armazenados em cultura pura em
tubos Eppendorf com rosca contendo meio 79 líquido e glicerina 25% (50/50 v/v)
postos em ultrafreezer Nuaire a - 80ºC.
3.4. Extração de DNA genômico
O DNA total dos rizóbios isolados a partir dos nódulos de Inga vera foi
extraído utilizando o protocolo descrito por Edwards (1991) com modificações.
Uma alçada de cada amostra isolada, foi selecionada e posta em tubo
Eppendorf contendo 1 mL de meio TY líquido (triptona 0,5%, extrato de levedura
0,3%, cloreto de cálcio 0,09% e água destilada estéril) por 24 horas, sob agitação
(180 rpm) a 28ºC visando um acréscimo na massa celular. Os tubos foram
centrifugados a 13.000 rpm para concentração das células e descarte do meio TY, e
foi acrescido 400 µL de tampão de extração (Tris HCl pH 7,5 200 mM, EDTA 250
mM, SDS 0,5%), homogeneizado em vórtex e deixado a temperatura ambiente por
cerca de 15 minutos. Em seguida, foi acrescentado 200 µL de acetato de potássio
3M homogeneizando-se a mistura. A mistura foi centrifugada por 5 min a 13.000 rpm
19
e o sobrenadante coletado e dispensado em um novo tubo, no qual foi adicionado
igual volume do sobrenadante em clorofórmio, alcool isoamílico (24:1 v:v). As
amostras foram homogeneizadas no vórtex e centrifugadas por 5 minutos a 13.000
rpm e o sobrenadante novamente coletado e transferido para novo tubo no qual foi
acrescido 0,75 do volume de isopropanol gelado e 0,25 volumes de acetato de
amônia à 10 M. As amostras foram deixadas a temperatura de -20 ºC por no mínimo
1 hora para precipitar o DNA e após centrifugadas por 15 minutos a 13.000 rpm
sendo o sobrenadante descartado. Os tubos foram lavados com etanol 70% por
duas vezes e secados a temperatura ambiente. Após todo o álcool ter evaporado, o
precipitado foi ressuspendido em 50 µL de água ultrapura (mili-Q) e estocado a -20
ºC. Para verificar a eficiência da extração, amostras do DNA foram aplicadas em gel
de agarose a 1% em 1x de tampão TAE (20 mM de Tris-Acetato, 10 mM de acetato
de sódio, 0,5 mM EDTA dissódico, pH 8,0). O rendimento e pureza do DNA extraído
foram avaliados através da estimativa em espectrofotômetro (Shimadzu, SPD-M6A)
pela razão da absorbância à 260 e 280 nm.
3.5. Amplificação por PCR (Reação em Cadeia da Polimerase)
O DNA genômico dos isolados foi amplificado usando os oligonucleotídeos
iniciadores para reação em cadeia da polimerase (PCR) indicados na tabela 1.
Tabela 1. Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para amplificação e seqüenciamento dos genes 16S rDNA, recA, nodC e nifH.
Gene Primers Sequências Tamanho do fragmento
Referência
16S 16S F 16S R
5- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 5-AAGGAGGTGATCCAGCC-3
1400 pb WEISBURG et al., 1991
recA bur 3 bur 4
5- GA(AG) AAG CAG TTCGGC AA-3 5- GAG TCG ATG ACG ATC AT-3
380 pb PAYNE et al., 2005
nodC nodCF nodCI
5-AYGTHGTYGAYGACGGTTC-3 5-CGYGACAGCCANTCKCTATTG-3
930 pb LAGUERRE et al., 2001
nifH nifHF nifHI
5-TACGGNAARGGSGGNATCGGCAA-3 5-AGCATGTCYTCSAGYTCNTCCA-3
783 pb LAGUERRE et al., 2001
Procedeu-se então a reação em cadeia da polimerase (PCR) para a
amplificação do 16S rDNA utilizando tampão 1x, MgCl2 30mM, 0,2 mM dNTP, 0,2
pmol de cada primer, 1U Taq e entre 1 e 2 ug / mL de DNA genômico, a depender
da concentração do DNA total extraído da amostra. O programa utilizado para
20
amplificação do 16S rDNA foi: 94 ºC por 4 min; 35 ciclos de 94 ºC por 30 s, 61 ºC
por 30 s e 72 ºC por 1 min e 30 s; finalizando com 10 minutos de extensão a 72 ºC.
Para a amplificação do gene recA utilizou-se as mesmas condições da reação
anterior, exceto pela concentração de MgCl2 reduzida para 20 mM.
Para os genes nodC e nifH também foi utilizado o mesmo programa descrito
anteriormente, modificando somente a temperatura de anelamento dos primers que
foi de 58 ºC para ambos os genes.
3.6. Seqüenciamento e análises de diversidade
Os produtos da amplificação foram diretamente encaminhados à Macrogen
Corp.– (Rockville, MD, EUA) para seqüenciamento. As seqüencias foram alinhadas
utilizando o programa Clustal_X 2.0 (LARKIN et al., 2007), importados para o BioEdit
4.8.4 (HALL, 1999) e manualmente corrigidos. Os contigs gerados, foram
submetidos à análise de similaridade no banco de dados GenBank através da
ferramenta Blastn para identificação das bactérias.
Para os fragmentos que foram quase completamente seqüenciados e devidamente
alinhados (1416 nucleotídeos do gene 16SrDNA e 385 nucleotídeos do recA),
efetuou-se uma análise de diversidade através do software Phylo_win (GALTIER et
al. 1996) para construção de árvores de neighbour-joining usando o parâmetro 2 de
Kimura (assume taxas diferentes entre transições (A-G, C-T) e transversões (A-C,
A-T, C-G, G-T)..para a correção da distância. O suporte dos ramos da árvore foi
estimado com bootstrap de 1000 repetições.
3.7. Avaliação da Influência de isolados de rizóbio selecionados sobre o crescimento inicial de plantas de Inga edulis
Duas linhagens, uma de alfarizóbio e outra de betarizóbio isoladas
previamente dos nódulos de Inga vera coletados na RPPN de Serra Bonita
(Camacã, Bahia) foram examinadas quanto a sua capacidade em nodular e fixar
nitrogênio em plantas de ingá de metro (Inga edulis Mart.). Sementes dessa espécie
foram utilizadas em virtude da não obtenção de sementes de Inga vera. Vale
salientar que as sementes do gênero Inga são recalcitrantes e apresentam o
comportamento de germinar ainda dentro do fruto, razão pela qual as sementes
21
desse gênero de leguminosa são de difícil obtenção e armazenamento. As sementes
de Inga edulis foram as que se encontravam disponíveis no momento da instalação
do experimento, iniciado em 01 de outubro de 2009. Elas foram coletadas de árvores
matrizes localizadas no município de Coaraci, região sul baiana, (sul 140 38’ 26,5’’/
oeste 390 32’ 50,4’’). As sementes foram trazidas para o LQFS, onde foram
selecionadas visualmente para garantir uniformidade, lavadas abundantemente em
água corrente e lavadas seis vezes com água destilada estéril, sendo logo em
seguida postas pra germinar em vasos plásticos fechados contendo papel de filtro
autoclavado e umedecido com água destilada esterilizada.
Foram instalados no total 5 tratamentos com 6 repetições cada, a saber: (i)
plantas não inoculadas e sem adubação nitrogenada (- N), (ii) plantas não
inoculadas e com adubação nitrogenada (+ N), (iii) plantas inoculadas com
Burkholderia sp. e sem adubação nitrogenada (Burk), (iv) plantas inoculadas com
Rhizobium sp. e sem adubação nitrogenada (Rhiz), (v) plantas inoculadas com uma
mistura de Burkholderia sp. e Rhizobium sp. sem adubação nitrogenada (Mix).
As plântulas com radículas emergidas (cerca de 4 dias após colocadas para
germinar) foram transplantadas para cada vaso (3 por vaso) e nos devidos
tratamentos, inoculadas com 1 mL (contendo aproximadamente 108 células) da
estirpe bacteriana apropriada. Após 14 dias de crescimento o experimento sofreu um
primeiro desbaste (para verificar se já haviam sido formados nódulos radiculares),
deixando apenas 2 plantas por vaso seguido por um desbaste final aos 30 dias,
restando apenas uma planta por vaso.
A higiene cuidadosa durante a preparação dos materiais bem como durante
o experimento foi observada a fim de prevenir a contaminação por outros rizóbios.
As plantas foram crescidas em vasos plásticos com capacidade para 3,0 dm3 os
quais foram lavados com solução de hipoclorito de sódio (1%) antes de serem
preenchidos por uma mistura (1:2 v:v) de areia lavada esterilizada e vermiculita
esterilizada. A mistura foi lavada cinco vezes com água destilada autoclavada
quente para remover qualquer presença eventual de nitrogênio no substrato. Este foi
regado periodicamente com solução nutritiva completa (Quadro 1) (HOAGLAND;
ARNON, 1950).
22
Quadro 1. Solução Nutritiva para crescimento das plantas.
COMPOSIÇÃO QUÍMICA DA SOLUÇÃO NUTRITIVA
FONTE DE NUTRIENTE
Elemento Concentração (mg.L-1)
K 234,00 KH2PO4; K2SO4
S 208,00 CaSO4 ; MgSO4 ; K2SO4
Ca 80,00 CaSO4
Mg 48,00 MgSO4
P 14,00 KH2PO4
Zn 0,01 ZnSO4
B 0,11 H3B04
Cu 0,005 CuSO4
Mn 0,11 MnSO4
Mo 0,09 Na2MoO4
N (somente para o tratamento + N)
84,00 (NH4) NO3
Fe 0,25 FeEDTA
Fonte: Hoagland e Arnon (1950) modificado.
A superfície do solo foi coberta com pedriscos autoclavados, para evitar
contaminação do solo com microrganismos presentes no ar. Os vasos foram
arranjados em blocos completamente ao acaso em casa de vegetação sob
condições naturais de temperatura e luminosidade (Figura 4). As plantas foram
coletadas após 4 meses de crescimento e separadas em raiz e parte aérea sendo
esta levada a estufa de ventilação forçada (72h a 700C) para obtenção da matéria
seca. A nodulação das raízes foi avaliada conforme Chatel e Parker (1973). As
médias da massa seca, diâmetro do coleto e altura das plantas foram submetidas à
ANOVA, seguida do teste de Tukey (a 5% de significância) utilizando o programa
STATISTICA versão 6.0.
Figura 4 – Vista geral do experimento de inoculação de rizóbios em Inga edulis (plantas com cerca de 30 dias após emergência) que foi instalado na casa de vegetação da UESC, Ilhéus, Bahia.
23
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. Caracterização morfológica dos nódulos e das colônias bacterianas
A morfologia dos nódulos amostrados nas três diferentes coletas realizadas
em 12 plantas de Inga vera localizadas na RPPN de Serra Bonita apresentou um
padrão que pode ser assim descrito: nódulos radiculares pediculados, localizados
em raízes laterais, alongados, com 0,1 mm a no máximo 10 mm de comprimento e
entre 5 a 10 mm de largura, raramente ramificados, com coloração externa que varia
do creme (nódulos jovens) ao marrom escuro (nódulos adultos), interior avermelhado
(devido possivelmente à leg-hemoglobina) apresentando crescimento indeterminado
devido a presença de um meristema persistente no ápice do nódulo (Figura 5). As
características morfológicas e anatômicas desses nódulos permitem classificá-los
como caesalpinióide (SPRENT, 2001) ou indeterminado (SPRENT, 2007), o qual é
característico da subfamília Mimosoideae.
Figura 5 – Amostras de nódulos radiculares de Inga vera coletados na Reserva Ecológica de Serra Bonita, Camacã – Bahia.
24
Conforme caracterização morfológica das colônias crescidas em meio de
cultura (Figura 6) foram avaliados um total de 85 isolados bacterianos. A maioria das
colônias bacterianas isoladas (61 %) apresentou coloração amarela, brilhante, com
bordas inteiras, produção de mucopolissacarídeos e tiveram crescimento
relativamente rápido (3 – 7 dias). Uma menor parte (23 %) das colônias possuía cor
branca, crescimento lento (8 – 12 dias), forma circular com bordas lisas e com a
capacidade de alcalinizar o meio, produzindo pouco ou nenhum muco.
Figura 6 - Placas contendo meio de cultura 79 exemplificando o crescimento dos rizóbios isolados. Influência das bactérias no pH do meio. Em A o meio acidificado (coloração amarelada) e em B alcalinizado (coloração azulada). Em C detalhe das colônias de rizóbios e em D crescimento de rizóbios em placa onde não houve modificação aparente no pH do meio (Barras das figuras A, B e D = 2 cm e em C = 1 cm).
25
Na segunda coleta, de 24 a 27 de outubro de 2008, houve a predominância
de bactérias de crescimento rápido, enquanto que na terceira coleta, ocorrida de 20
a 23 de julho de 2009, a maioria das bactérias isoladas dos nódulos apresentou
crescimento lento. As colônias restantes (cerca de 16 %) apresentaram elevado grau
de heterogeneidade, quanto à forma, com bordas lisas ou onduladas, de cor
esbranquiçada ou amarelo esbranquiçado, com pouca produção de muco ou
aparência leitosa, com capacidade de acidificação ou alcalinização do meio e
crescimento variando em média de 8 a 12 dias.
Segundo Moreira e Siqueira (2006), os gêneros de rizóbio descritos até o
momento podem ser diferenciados com base em características culturais e
morfológicas em meio 79 (FRED; WAKSMAN, 1928). Norris (1965) postulou que em
áreas tropicais havia predominância de estirpes de crescimento lento alcalinizantes
(atualmente classificadas no gênero Bradyrhizobium) e em áreas temperadas com
predominância de estirpes com crescimento rápido e acidificantes (atualmente
Rhizobium, Sinorhizobium, Mesorhizobium e Allorhizobium). Essas características
são relacionadas ao crescimento em meio com manitol, mas podem ser
generalizadas para outras fontes de carbono, ou seja, estirpes que acidificam meio
com manitol, também acidificam com outras fontes de carbono.
Tais estirpes, “rápidas acidificantes” e “lentas alcalinizantes” podem ocorrer
tanto em regiões tropicais como temperadas (MOREIRA; SIQUEIRA, 2006). Foi
verificado no presente estudo sobre diversidade de bactérias isoladas dos nódulos
de I. vera, ambos os tipos destas colônias bacterianas.
4.2. Análises de agrupamento dos caracteres morfológicos das colônias
De acordo com as análises de agrupamento dos caracteres morfológicos
dos isolados previamente identificados com gram-negativos, utilizando o algoritmo
UPGMA e o índice de Jaccard como coeficiente de similaridade, pode-se observar a
formação de 13 grupos distintos e com 100% de similaridade (Figura 7). Neste
dendograma pode- se observar uma tendência de similaridade nas características
morfológicas dos isolados provindos dos nódulos de uma mesma planta, por
exemplo, os isolados 392 G, 392 H, 392 J, 392 M, 392 N, fazendo parte de um único
grupo 100% similares.
26
A B
0 8 16 24 32 40 48 56 64 72
0,32
0,4
0,48
0,56
0,64
0,72
0,8
0,88
0,96
Sim
ilarity
33G
272A
272B
33H
273C
273D
287E
395D
395A
66A
66C
395I
392B
395C
66D
66E
272H
26I
272J
33J
33E
33F
392I
392L
26L
26O
273M
287F
287I
318A
318C
318D
395H
273F
195L
26N
33L
287G
392G
392H
392J
392M
392N
66B
26F
26H
195B
195E
318B
388L
388M
26Q
273J
273N
395E
273I
287H
96D
26G
96I
273L
26M
26A
56D
26D
388G
26J
273E
273G
273H
66F
66H
Figura 7 - Análise de agrupamento a partir da caracterização fenotípica de rizóbios isolados de nódulos de Inga vera, com o algoritmo UPGMA (unweighted pair-group method with arithmetical averages), utilizando o índice de Jaccard como coeficiente de similaridade.
Formação de 2 grandes grupos com similaridade de 32 % (A, B).
Uma provável explicação para esses agrupamentos provindos de uma mesma
planta pode ser devido às populações bacterianas semelhantes presentes naquele
local (solo) em que a planta se estabeleceu.
Também foram isoladas a partir dos nódulos de I. vera, algumas bactérias
Gram positivas, e os caracteres morfológicos dessas colônias também foram
anotados e utilizados para construir um dendograma a partir da análise de
agrupamento (Figura 8.)
27
0 1,6 3,2 4,8 6,4 8 9,6 11,2 12,8 14,4
0,24
0,32
0,4
0,48
0,56
0,64
0,72
0,8
0,88
0,96
Sim
ilarity
388N
388O
388P
287A
287B
287C
287D
287H
388C
26B
33A
33D
26C
33B
Figura 8 - Dendograma obtido pela análise de agrupamento a partir da caracterização fenotípica de isolados bacterianos Gram positivos associados aos nódulos de Inga vera da RPPN de Serra Bonita (Camacan, BA) com o algoritmo UPGMA (unweighted pair-group method with arithmetical averages), utilizando o índice de Jaccard como coeficiente de
similaridade.
Muresu et al. (2008) observaram que o interior dos nódulos das
leguminosas podem ser colonizados tanto por diversos gêneros bacterianos
relacionados à fixação biológica de nitrogênio simbiótica, quanto por diversas
espécies de bactérias endofíticas, incluindo bactérias Gram positivas, que co-
habitam essas estruturas. Já há algumas décadas, autores como Philipson e Blair
(1957) encontraram diversas espécies bacterianas, incluindo bactérias Gram-
positivas, nas raízes e nódulos de plantas saudáveis do trevo vermelho. Sturz et al.
(1997) mostrou que a quantificação de rizóbios de nódulos do trevo vermelho,
poderia chegar a 4,3 × 109 UFC g-1 de peso fresco do nódulo, mas que, ao mesmo
tempo, 3,0 × 105 UFC g-1 de endófíticos não rizobianos, pertencentes a 12 diferentes
espécies, poderiam ser cultivados a partir dos mesmos nódulos.
28
Em nódulos de feijão, Mhamdi et al. (2005) encontraram, junto com
Rhizobium, bactérias de gênero Agrobacterium, e Mrabet et al. (2006) provaram que
estes endófitos poderiam invadir novos nódulos em conseqüência da co-inoculação
com rizóbios e afetar o desempenho na nodulação. Não se sabe ao certo a função
destas bactérias endofíticas dentro dos nódulos, todavia, Bai et al. (2003) relataram
que Bacillus subtilis e Bacillus thuringiensis pode naturalmente coabitar nódulos de
soja com Bradyrhizobium japonicum, e que estas bactérias gram-positivas podem
aumentar a produtividade das plantas em experimentos de co-inoculação.
Em vista destas evidências de prováveis funções das bactérias Gram
positivas que coabitam nódulos de leguminosas, todos os isolados de I. vera do
presente estudo, após identificados morfologicamente, foram submetidos à
criopreservação para armazenagem no Banco de Rizóbios da UESC. Futuros
trabalhos quanto à eficiência em fixar nitrogênio atmosférico bem como quanto à
capacidade de promover crescimento em plantas poderão ser realizados com o uso
do material que compõe este banco.
4.3. Extração do DNA genômico e amplificação dos genes dos isolados bacterianos
Foram realizadas extrações de DNA de todos os isolados previamente
caracterizados como Gram-negativos e cujas colônias abrangiam diferentes
morfotipos, com a finalidade de identificá-los molecularmente através do
seqüenciamento dos genes 16S rDNA, recA, nodC e nifH.
Dos 85 isolados analisados, 60 deles que se apresentaram como Gram
negativos, tiveram o DNA genômico extraído com sucesso de acordo com o
protocolo de Edwards (1991) modificado (Figura 9).
29
Figura 9 - Fotografia de gel de agarose a 1% do DNA genômico (seta) extraído de isolados bacterianos dos nódulos de Inga vera. 1. 26S; 2. 26T; 3. 273J; 4. 287C; 5. 287F; 6. 287G;
7. 287H; 8. 287I; 9. 318A; 10. 318B.
O DNA extraído foi amplificado, e o resultado mostrou a presença de
seqüências do 16S rDNA com aproximadamente 1400 pb (Figura 10), sendo que a
molécula completa contém cerca de 1540 pb de nucleotídeos. Já as seqüências do
gene recA, devido ao par de oligonucleotídeos iniciadores utilizado, apresentou o
tamanho de cerca de com 380 pb (Figura 11). Os fragmentos de 930 pb do nodC (
Figura 12) e de 783 pb do gene nifH (Figura 13) também foram amplificados, ou
seja, as bandas obtidas foram todas de tamanho esperado.
Embora a análise da seqüência do gene 16S rDNA possa identificar muitos
gêneros bacterianos, a sua utilidade no gênero Burkholderia é mais limitada,
especialmente dentro do complexo B. cepacia, onde não pode ser usado como um
meio de distinguir com precisão todas as espécies (LIPUMA et al., 1999;
MAHENTHIRALINGAM et al., 2000). Para isso, o gene recA tem sido amplamente
aplicado na sistemática bacteriana (KARLIN; WEINSTOCK; BRENDEL, 1995)
provando ser muito útil para a identificação das espécies do complexo B. cepacia,
com a análise da variação da seqüência do gene que permite a discriminação de
todas as nove espécies atuais dentro deste complexo (MAHENTHIRALINGAM et al.,
2000). Todavia esta abordagem ainda não pode ser aplicada a espécies que
estejam fora do complexo B. cepacia (PAYNE, 2005), sugerindo que a ausência de
amplificação para o gene recA em algumas amostras analisadas neste trabalho
possa ter relação com esta afirmativa, como foi observado nos resultados do gel de
30
agarose (Figura 11) contendo amostras que amplificaram para este gene (272 J;
287E; 272A; 272B; 273C; 273D), todas pertencentes ao complexo B. cepacia, e
amostras que não amplificaram (395A, 33G; 388L; 395D) pertencentes a outros
grupos de Burkholderia que foram identificados após seqüenciamento (Tabela 2).
Figura 10 - Gel de agarose a 1% com amostras amplificadas do 16S rDNA de isolados bacterianos dos nódulos de Inga vera. M: marcador molecular de 1 KB; 1. 26H; 2. 26O 3. 287G; 4. 287i; 5. 392G; 6. 392N; 7. 392J; 8. 392M; 9. 395H; 10. 195E;11. 195L; 12. 392B; 13. 318A ; 14. 318B ; C-. Controle negativo.
Figura 11 - Gel de agarose a 1% com amostras amplificadas do gene recA de isolados bacterianos dos nódulos de Inga vera. M: marcador molecular de 1 KB; 1. 395A; 2. 272 J;
3. 287E; 4. 33G; 5. 388L; 6. 395D; 7. 272A; 8. 272B; 9. 273C; 10. 273D; C-. Controle negativo.
~380 pb
~1400 pb
31
Fragmentos do gene nodC, foram amplificados para maioria dos isolados
analisados. Somente três dos 14 isolados avaliados com este gene, não
amplificaram, sendo eles o: 26A, 318C e 26G (Figura 12). Com relação ao gene nifH,
pode-se observar que de oito amostras analisadas somente o isolado 26A não
amplificou (Figura 13). Segundo Vieira (2007), os genes de nodulação e fixação de
nitrogênio em algumas espécies de rizóbio, tal como os do gênero Rhizobium se
localizam no plasmídeo, e a perda desse plasmídeo por algumas estirpes, em
decorrência por exemplo da exposição a altas temperaturas, faz com que a bactéria
perca esses genes e conseqüentemente sua habilidade para formar nódulos e fixar
nitrogênio, por isso mesmo não sendo amplificado em alguns isolados bacterianos,
como observado através destes resultados.
Figura 12 - Gel de agarose a 1% com amostras amplificadas do gene nodC de isolados bacterianos dos nódulos de Inga vera. M: marcador molecular de 1 KB; 1. 26A; 2. 195L; 3. 318C; 4. 195E; 5. 392G; 6. 26O; 7. 297G; 8. 26N; 9. 26H; 10. 392H;11. 392N; 12. 395C; 13. 26G; 14. 395H; C-. Controle negativo.
Figura 13 - Gel de agarose a 1% com amostras amplificadas do gene nifH de isolados bacterianos dos nódulos de Inga vera. M: marcador molecular de 1 KB; 1. 395H; 2. 272H;
3. 392B; 4. 26A; 5. 392J; 6. 26J; 7. 392M; 8. 318B.
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 C-
~930 pb
M 1 2 3 4 5 6 7 8
~783 pb
32
O DNA amplificado da subunidade menor do RNA ribossômico e do
fragmento do gene da recombinase seqüenciados foram então submetidos à
comparação com o banco de dados GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/),
através da ferramenta Blastn (NCBI) a qual permitiu serem identificados os gêneros
bacterianos. A grande maioria os isolados submetidos apresentaram elevado grau
de similaridade (acima de 97 %) com as seqüências desses genes bacterianos
depositadas no GenBank (Tabela 1). Dos 60 isolados seqüenciados, 35% foram
identificados como pertencentes a dois gêneros classicamente reconhecidos como
sendo nodulíferos e fixadores de nitrogênio, pertencente à Classe Alfa das
Proteobacterias: Rhizobium (Família Rhizobiaceae) e Bradyrhizobium (Família
Bradyrhizobiaceae). Também desses 60 isolados, 28% foram identificados
molecularmente como pertencentes à Classe Beta das Proteobacterias, mais
especificamente do gênero Burkholderia (Família Burkholderiaceae), que fora
previamente incluído no gênero Pseudomonas, mas que recentemente, além de
terem sido separados de Pseudomonas, foram descobertos como sendo simbiontes
de leguminosas (VIEIRA, 2007). Também foram identificados outros três gêneros
pertencentes a classe das Gamma Proteobactérias: Pectobacterium (5%) e Pantoea
(2%) ambos pertencentes a Família Enterobacteriaceae e Pseudomonas (2%)
(Família Pseudomonadaceae) associados ao nódulos de I. vera.
Os demais gêneros isolados a partir dos nódulos de I. vera ( cerca de 28%)
foram identificados como Paenebacillus e Bacillus (Classe Bacilli), bactérias Gram
positivas comumente encontradas em associação com tecidos vegetais e envolvidas
nos processos de crescimento vegetal (BAI et al., 2003).
33
Tabela 2. Isolados bacterianos obtidos dos nódulos de Inga vera coletados na RPPN de Serra Bonita. São apresentados o nº de acesso no
GenBank, o equivalente (seqüência de nucleotídeos do 16S rDNA) e a espécie mais próxima de cada isolado.
Isolado Nº de acesso
(GenBank) Equivalente mais próximo no Blast
(16S rDNA) Similari-
dade Nº de acesso (Gen Bank)
Espécie mais próxima no Blast (16S rDNA)
Similari-dade
26 A FJ527672.1 Rhizobium tropici strain rif200896 96% FJ527672.1 Rhizobium tropici strain rif200896 96%
26 B EU931557.1 Brevibacillus brevis strain ZFJ-2 99% EU931557.1 Brevibacillus brevis strain ZFJ-2 99%
26 C GQ149481.1 Bacillus cereus strain DS 99% GQ149481.1 Bacillus cereus strain DS 99%
26 G EU364701.1 Bradyrhizobium sp. SA3 strain FP1c 96% EU364712.1 Bradyrhizobium yuanmingense strain R8 99%
26 H EF569648.1 Bradyrhizobium sp. Dr12.2 99% AB300992.1 Bradyrhizobium iriomotense 99%
26 J GU120632.1 Rhizobium miluonense strain CC-BL6 99% GU120632.1 Rhizobium miluonense strain CC-BL6 99%
26 M FJ390934.1 Bradyrhizobium sp. SEMIA 6434 99% FJ025098.1 Bradyrhizobium japonicum strain SEMIA 6439 99%
26 N FJ390934.1 Bradyrhizobium sp. SEMIA 6434 99% FJ025098.1 Bradyrhizobium japonicum strain SEMIA 6439 99%
26 0 EF569648.1 Bradyrhizobium sp. Dr12.2 94% AB300992.1 Bradyrhizobium iriomotense 99%
26 S DQ068814.1 Uncultured bacterium clone f6h4 99% AB353048.1 Klebsiella oxytoca 99%
26 T GQ249225.1 Microbacteriaceae bacterium lxb-15 96% GQ249225.1 Microbacteriaceae bacterium lxb-15 96%
33 A EU741095.1 Bacillus sp. 13644B 99% AB271739.1 Bacillus pycnus 98%
33 B FJ535619.1 Bacillus sp. DCR_ME06-32 99% AM747230.1 Bacillus weihenstephanensis strain WSBC 10204 100%
33 D AM910287.1 Paenibacillus sp. R-31009 96% EF694702.1 Paenibacillus terrae isolate EH23-5 98%
33 E EU723241.1 Burkholderia tropica strain TAt-0750 97% EU723241.1 Burkholderia tropica strain TAt-0750 97%
33 F AY128104.1 Burkholderia tropica strain MTo-672 97% AY128104.1 Burkholderia tropica strain MTo-672 97%
33 G NR_027569.1 Burkholderia unamae strain MTl-641 98% NR_027569.1 Burkholderia unamae strain MTl-641 98%
33 H EU998634.1 Burkholderia sp. TS2 95% EU214612.1 Burkholderia cepacia strain yb90 99%
33 J FJ436053.1 Burkholderia tropica strain SCu-6583 98% FJ436053.1 Burkholderia tropica strain SCu-6583 99%
195 B FM173819.1 Pseudomonas sp. CL4.14 96% AM745263.1 Paenibacillus caespitis strain LMG 23879T 99%
195 E DQ354607.1 Bradyrhizobium sp. Lpsp.1b 99% DQ786800.1 Bradyrhizobium japonicum strain WmE3 99%
195 L AJ810377.1 Bradyrhizobium genosp. isolate Cs6040 99% AJ810377.1 Bradyrhizobium genosp. , isolate Cs6040 99%
272 A AB366331.1 Burkholderia sp. SBH-9 99% AM992536.1 Burkholderia cepacia 99%
272 B AB366331.1 Burkholderia sp. SBH-9 99% AM992536.1 Burkholderia cepacia 99%
272 D EF622219.1 Burkholderia tropica strain CICC 10348 96% EF622219.1 Burkholderia tropica strain CICC 10348 96%
272 G FJ769143.1 Burkholderia vietnamiensis strain M6 90% FJ769143.1 Burkholderia vietnamiensis strain M6 90%
Continua...
34
Isolado Nº de acesso
(GenBank) Equivalente mais próximo no Blast
(16S rDNA) Similari-
dade
Nº de acesso (Gen Bank)
Espécie mais próxima no Blast (16S rDNA)
Similari-dade
272 H EU399930.1 Rhizobium sp. CAF416 94% FJ405381.1 Rhizobium tropici strain CAF440 99%
272 I FN395278.1 Paenibacillus polymyxa strain FR-W3b1 98% FN395278.1 Paenibacillus polymyxa strain FR-W3b1 98%
272J AJ440714.1 Burkholderia pyrrocinia strain R13058 99% AJ440714.1 Burkholderia pyrrocinia strain R13058 99%
273 A EF634024.1 Paenibacillus polymyxa strain ISSDS-851 99% EF634024.1 Paenibacillus polymyxa strain ISSDS-851 99%
273 C AB366331.1 Burkholderia sp. SBH-9 99% AM992536.1 Burkholderia cepacia 99%
273 D CP000442.1 Burkholderia ambifaria 99% CP000442.1 Burkholderia ambifaria 99%
273 E FJ823047.1 Pectobacterium cypripedii strain gx-104 99% FJ823047.1 Pectobacterium cypripedii strain gx-104 99%
273 G FJ823047.1 Pectobacterium cypripedii strain gx-104 99% FJ823047.1 Pectobacterium cypripedii strain gx-104 99%
273 H FJ823047.1 Pectobacterium cypripedii strain gx-104 99% FJ823047.1 Pectobacterium cypripedii strain gx-104 99%
273 J DQ817187.1 Uncultured bacterium clone aaa69b07 100% GQ983053.1 Citrobacter freundii strain JXMR0908L1 99%
273 L GQ395336.1 Pantoea sp. 96% AY691543.1 Pantoea agglomerans strain ChDC YP1 16S 99%
287 C EU362611.1 Paenibacillus polymyxa isolate TN99 99% EU362611.1 Paenibacillus polymyxa isolate TN99 99%
287 E AB366331.1 Burkholderia sp. SBH-9 99% AM992536.1 Burkholderia cepacia 99%
287 F FJ981664.1 Uncultured bacterium clone OM2 100% FJ768459.1 Staphylococcus epidermidis strain MB 100%
287 G FJ390910.1 Bradyrhizobium sp. SEMIA 6374 99% FJ025100.1 Bradyrhizobium japonicum strain SEMIA 6154 99%
287 H FJ025138.1 Burkholderia sp. SEMIA 6413 99% CP001043.1 Burkholderia phymatum 98%
287 I FJ025099.1 Bradyrhizobium japonicum strain SEMIA 6396
96% FJ025099.1 Bradyrhizobium japonicum strain SEMIA 6396 96%
318 A GU118343.1 Uncultured bacterium clone Gven_I03 80% FJ025099.1 Bradyrhizobium japonicum strain SEMIA 6396 99%
318 B FJ390910.1 Bradyrhizobium sp. SEMIA 6374 99% FJ025100.1 Bradyrhizobium japonicum strain SEMIA 6154 99%
318 C EF221616.1 Bradyrhizobium sp. JR001 87% AB195988.1 Bradyrhizobium japonicum strain: MA896 99%
388C AB461817.1 Paenibacillus sp. M532 98% EF690415.1 Paenibacillus amylolyticus isolate M18-5 99%
388 G GQ288412.1 Paenibacillus sp. 74% AB073198.1 Paenibacillus popilliae 99%
388 L AF164045.2 Burkholderia tropicalis strain AB98 99% AF164045.2 Burkholderia tropicalis strain AB98 99%
388 M AF164045.2 Burkholderia tropicalis strain AB98 99% AF164045.2 Burkholderia tropicalis strain AB98 99%
392 B AB531411.1 Rhizobium sp. III-19 99% FJ025132.1 Agrobacterium rhizogenes strain SEMIA 6423 99%
392 G FJ390910.1 Bradyrhizobium sp. SEMIA 6374 100% FJ025100.1 Bradyrhizobium japonicum strain SEMIA 6154 99%
392 H AB480386.1 Bradyrhizobium sp. D218a 96% AF208515.1 Bradyrhizobium japonicum strain USDA 4 99%
392 I AB245384.1 Paenibacillus panacisoli strain Gsoil 1411 96% AB245384.1 Paenibacillus panacisoli strain: Gsoil 1411 96%
Continua...
35
Isolado Nº de acesso
(GenBank) Equivalente mais próximo no Blast (16S rDNA)
Similari-dade
Nº de acesso (Gen Bank)
Espécie mais próxima no Blast (16S rDNA)
Similari-dade
392 J FJ390910.1 Bradyrhizobium sp. SEMIA 6374 99%* FJ025100.1 Bradyrhizobium japonicum strain SEMIA 6154 99%
392 L AB245384.1 Paenibacillus panacisoli 96% AB245384.1 Paenibacillus panacisoli strain: Gsoil 1411 96%
392 M FJ390910.1 Bradyrhizobium sp. SEMIA 6374 100% FJ025100.1 Bradyrhizobium japonicum strain SEMIA 6154 99%
392 N FJ025100.1 Bradyrhizobium japonicum strain SEMIA 6154
72% FJ025100.1 Bradyrhizobium japonicum strain SEMIA 6154 72%
395 A AM284971.1 Burkholderia nodosa strain R-25485T 99% AM284971.1 Burkholderia nodosa strain R-25485T 99%
395 C GU120632.1 Rhizobium miluonense strain. CC-BL6 94% GU120632.1 Rhizobium miluonense strain. CC-BL6 94%
395 D DQ986324.1 Burkholderia sp. SJ98 98% AY277699.1 Candidatus Burkholderia verschuerenii 98%
395 H FJ390910.1 Bradyrhizobium sp. SEMIA 6374 99% FJ025100.1 Bradyrhizobium japonicum strain SEMIA 6154 99%
* Tamanho do fragmento do 16S rDNA sequenciado de aproximadamente 1400 pb.
36
4.4. Análises da diversidade genética
A diversidade taxonômica genética dos isolados seqüenciados de I. vera foi
avaliada tomando como base os genes 16S rDNA e recA. Para a construção do
dendograma de diversidade, os isolados foram separados e os contigs alinhados de
acordo com a classe ao qual pertenciam (alfa e betaproteobactérias). Além disso,
foram adicionados como linhagens de referência cinco espécies de bactérias para os
alfarizóbios (Rmiluo - Rhizobium miluonense, Azorhizob - Azorhizobium sp.,
Methylobac - Methylobacterium sp., Bradjap - Bradyrhizobium japonicum e Brad -
Bradyrhizobium sp.) e 2 espécies para os betarizóbios (Cupr - Cupriavidus
taiwanensis e Burk - Burkholderia nodosa) para os dendogramas gerados a partir
das seqüências do 16S rDNA. Três espécies referências do gênero Burkholderia
(Burknodosa - Burkholderia nodosa, Burktropica - Burkholderia tropica e Burkcepacia
- Burkholderia cepacia) foram adicionadas as análises de diversidade feitas a partir
das seqüências parciais do gene recA.
No dendograma correspondente às alfaproteobactérias (Figura 14) foi
observada a formação de 2 clusters distintos e com boa sustentação, um com as
espécies do gênero Rhizobium e o outro com as de Bradyrhizobium. O primeiro
cluster foi formado por 2 isolados, o 26J (99% de similaridade com Rhizobium
miluonense CCBL6), corroborado pela proximidade com a linhagem de referência e
com um suporte de 95%, e pelo isolado 392B (Rhizobium sp. III-19), que de acordo
com a seqüência de nucleotídeos do 16S rDNA, esta mais próxima do grupo das
alfaproteobactérias pertencentes ao gênero Agrobacterium, mais precisamente à
espécie Agrobacterium rhizogenes, com 99% similaridade com a mesma (Tabela 2).
O segundo cluster, foi formado por 11 bactérias do gênero Bradyrhizobium,
formando 2 subgrupos distintos (Figura 14). Foi observado que grande parte dos
isolados deste gênero (54%) formaram um grupo maior com os isolados 395H,
318B, 287G, 392J, 392G e 392M apresentando um bootstrap de 100%, confirmando
o seqüenciamento do 16S rDNA (Tabela 2), no qual todos estes isolados são 99%
semelhantes e pertencentes à mesma linhagem de Bradyrhizobium sp. SEMIA 6374,
o qual foi isolado dos nódulos de Arachis pintoi (MENNA et al., 2009). Pode-se
observar também que os isolados que estavam bastante próximos dentro desses
37
subgrupos geralmente foram obtidos dos nódulos coletados de uma mesma planta
como, por exemplo, os isolados 26M e 26N ambos 99% semelhantes a
Bradyrhizobium sp. SEMIA 6434, isolado de Inga sp. (MENNA et al., 2009), e os
isolados195E e 195L mais próximos da linhagem de referência Bradyrhizobium
japonicum.
392G
392M
395H
318B43
43
287G
392J
Brad
90
43
67
Bradjap
195E
195L
76
99
92
26H
95
26N
50
26M
54
Methylobac
100
Azorhizob
392B
26J
Rmiluo95
100
88
NJ 1392 sites K2P 1000 repl.0.01
Figura 14 – Dendograma gerado pelo método de neighbour-Joining usando as seqüências do 16S rRNA de alfaproteobactérias isoladas dos nódulos de I. vera. Valores de bootstrap
(1000 repetições) são indicados acima e abaixo dos ramos.Seqüências com 0,01% de dissimilaridade. Os isolados de I. vera são indicados pelos números seguidos de letras. Já as estirpes tipos são: Rmiluo = Rhizobium miluonense; Azorhizob = Azorhizobium sp; Methylobac = Methylobacterium sp.; Bradjap = Bradyrhizobium japonicum; Brad = Bradyrhizobium sp.
38
No dendograma correspondente às betaproteobactérias (Figura 15), pode-
se observar o agrupamento de isolados que pertencem a espécies estreitamente
relacionadas formadoras do complexo Burkholderia cepacia (COENYE;
VANDAMME, 2003) representadas pelos isolados 273D (Burkholderia ambifaria) e
272A, 272B, 273C e 287E, todas altamente similares à espécie Burkholderia cepacia
(como foi observado na Tabela2). Todavia, o isolado 395D (similaridade de 98% com
Burkholderia sp. SJ98) possivelmente representa uma nova espécie do gênero
Burkholderia, haja vista que sua seqüência ficou distante de todas as outras
linhagens do grupo como pode ser observado no dendograma de diversidade do
gene 16S rDNA (Figura 15) e corroborada no dendograma do gene recA (Figura 16).
Além disso, sua similaridade de seqüência para o gene recA é baixa comparada com
as demais espécies depositadas no banco de dados. Uma caracterização adicional,
incluindo a hibridização DNA-DNA e taxonomia numérica, certamente seria
necessária para esclarecer a sua correta identificação, representando um isolado
com grande potencialidade para estudos futuros visando à descoberta da espécie.
Outros agrupamentos incluiram Burkholderia tropicalis com os isolados
388M e 388L, os quais foram obtidos de nódulos coletados da mesma planta na
RPPN de Serra Bonita. O isolado 395A apresentou estreita relação com
Burkholderia nodosa (Burk) uma linhagem de referência para essa espécie, a qual é
comprovadamente nodulífera de diversas espécies de leguminosas arbóreas
brasileiras (CHEN et al, 2007).
Recentes trabalhos vêm demonstrando que diversas espécies de
Burkholderia possuem a capacidade de nodular e fixar nitrogênio em associação
com leguminosas, particularmente com as da subfamília Mimosoideae (CHEN et al.,
2003a, 2005a, b; BARRETT; PARKER, 2005, 2006; ELLIOTT et al., 2007). A maioria
desses estudos foi realizado com beta-rizóbios que nodulam leguminosas do gênero
Mimosa, dentre eles: Cupriavidus taiwanensis (inicialmente descrita como Ralstonia
taiwanensis; VANDAMME; COENYE, 2004) e Burkholderia spp. C. taiwanensis foi
isolada de nódulos de Mimosa pudica, M. diplotricha e M. pigra (sin. M. pellita), em
Taiwan (CHEN et al., 2001, 2003a, 2005a), e de nódulos de M. pudica no norte e no
sul da Índia (VERMA et al., 2004). Algumas estirpes de C. taiwanensis e uma
Cupriavidus sp. não identificada, foram isoladas de M. pudica e M. pigra no Panamá
(BARRETT; PARKER, 2006). Recentemente, foi reportado também espécies de
39
Mimosa sendo noduladas por Burkholderia phymatum (ELLIOTT et al., 2007).
Apenas quatro dos isolados de Mimosa descritos, C. taiwanensis LMG19424 (CHEN
et al., 2003b), Burkholderia sp. Br3461 e Map3-5 (CHEN ET AL., 2005a) e
Burkholderia mimosarum PAS44 (CHEN et al., 2005b, 2006), foram confirmadas
através da microscopia, utilizando imunomarcação, como sendo simbiontes de suas
espécies de hospedeiro original (ELLIOTT et al., 2007). Vale ressaltar, entretanto
que um trabalho recentemente realizado com diversas espécies de Mimosa nativas
do Brasil demonstrou que esse gênero de leguminosas é preferencialmente
nodulado por diversas espécies de Burkholderia (BONTEMPS, 2010).
287E
272B
273C100
272A
100
273D
100
287H
395A
Burk
388L
388M
100
100
88
100
80
395D
89
Cupr
NJ 1411 sites K2P 1000 repl.0.005
Figura 15 – Dendograma gerado pelo método de Neighbour-Joining usando as seqüências parciais do gene 16S rRNA de betaproteobactérias. Valores de Bootstrap (1000 repetições) são indicados acima e abaixo dos ramos. Seqüências com 0,005% de dissimilaridade. Os isolados de I. vera são indicados pelos números seguidos de letras. Já as estirpes tipos são: Cupr = Cupriavidus taiwanensis; Burk = Burkholderia nodosa.
40
A estrutura topológica do dendograma baseado no seqüenciamento do gene
recA (Figura 16) foi bastante congruente com o do gene 16S rDNA, formando 3
subgrupos bem sustentados com valores de bootstrap superiores à 90%. As
seqüências parciais dos genes para recA dos isolados 395A e 33E se alinharam e
aproximaram muito da estirpe Burkholderia nodosa já identificada e isolada dos
nódulos de Mimosa scabrella (CHEN et al. 2005). O isolado 33J apresentou grande
homologia da seqüência do gene recA com a linhagem referência Burkholderia
tropica. Os isolados 272J, 273C, 272A, 33G e 33H compuseram um grupo com
seqüências relativamente similares as do complexo cepacia, como foi também
observado na análise do seqüenciamento do gene 16S rDNA (Tabela 2). É
importante notar a separação no dendograma para o gene recA do isolado 395D
(Burkholderia sp.) das demais linhagens, o que reforça a hipótese de que esse
isolado venha a ser provável candidato a uma nova espécie, como corroborado
pelos resultados no dendograma das seqüências do 16SrDNA acima mostrada
(Figura 15).
33H
33G
272A
53
273C
82
Burkcepaci
52
272J
70
395D
33J
Burktropic100
Burknodosa
395A
33E92
39
100
100
NJ 376 sites K2P 1000 repl.0.01
Figura 16 – Dendograma gerado pelo método de Neighbour-Joining usando as seqüências do recA de betaproteobactérias. Valores de Bootstrap (1000 repetições) são indicados acima e abaixo dos ramos. Seqüências com 0,01% de dissimilaridade Os isolados de I. vera
são indicados pelos números seguidos de letras. Já as estirpes tipos são: Burknodosa - Burkholderia nodosa, Burktropica - Burkholderia tropica e Burkcepacia - Burkholderia cepacia.
41
O estudo da diversidade de bactérias nos nódulos de I. vera, revelado no
presente trabalho, mostrou que grande parte dos nódulos eram colonizados por alfa
e betaproteobactérias. Deste modo, cada um desses dois grupos aqui definidos, é
possível que represente um complexo de espécies estreitamente relacionadas e com
características ecológicas muito semelhantes. Interessantemente, esse é o primeiro
relato de betarizóbios associados aos nódulos de uma espécie de leguminosa
arbórea da Tribo Ingeae. Entretanto, pelo número de isolados de Bradyrhizobium
identificados em I. vera esse gênero parece ser o preferencialmente nodulante nesta
espécie de arbórea.
Analisando a filogenia das leguminosas (WOJCIECHOWSKI, 2003), mais
especificamente a da subfamília Mimosoideae, pode-se observar que, apesar de
espécies do gênero Inga e Mimosa pertencerem a tribos diferentes, Ingeae e
Mimoseae respectivamente, elas são noduladas pelo mesmo gênero de bactérias
(Burkholderia), sugerindo que a diversidade dentro dos betarizóbios pode ser muito
maior do que o esperado quando são analisados diferentes hospedeiros para um
mesmo gênero bacteriano. O presente estudo, também fornece evidências de que,
conforme anteriormente afirmado por Chen et al. (2008), microssimbiontes
geneticamente diferentes podem ser isolados de um único gênero ou espécie
vegetal. No caso de I. vera , por exemplo, os isolados 395A (Burkholderia nodosa) e
395H (Bradyrhizobium sp.) foram isolados de nódulos coletados de uma mesma
planta. Entretanto, vale salientar que existe certa especificidade entre hospedeiro e
microssimbionte na interação rizóbio / leguminosa (HOFFMANN ,2007), e que pode
ser explicada tanto pela troca de sinais, possibilitando o reconhecimento entre as
espécies envolvidas, bem como a expressão de genes que se fazem necessários
para as alterações fisiológicas e morfológicas que auxiliam no funcionamento dessa
simbiose mutualística.
42
4.5. Experimento de inoculação de rizóbios em Inga edulis
Ao longo do experimento de inoculação de uma alfa e outra
betaproteobactéria em plantas de Inga edulis, foi avaliado o crescimento inicial
destas plantas através de dois parâmetros: altura e diâmetro do coleto. É importante
esclarecer que o uso dessa espécie deveu-se ao fato da não obtenção de sementes
de I. vera em tempo hábil para execução do experimento de inoculação.
Foram feitas 4 medidas em diferentes datas (aos 30, 50, 80 e 110 dias após
emergência das plântulas) tanto do diâmetro do coleto, quanto da altura das plantas
(Figuras. 17 e 18, respectivamente). Com isso, pode-se constatar que até aos 50
dias de crescimento não foram observadas diferenças estatisticamente significativas
no crescimento das plantas. Isso se deveu, possivelmente, ao fato de que a semente
de I. edulis apresenta grande conteúdo em reservas nutricionais em seus
cotilédones, os quais sustentam o crescimento inicial dessa espécie.
30 50 80 110
Dias após emergência
2
3
4
5
Dia
mâm
etro
do c
ole
to (c
m)
Rhiz
Burk
Mix
+ N
- N
Figura 17 - Resposta do crescimento em diâmetro do coleto das plantas de Inga edulis inoculadas com os isolados 26A (Rhizobium tropici - Rhiz) e 395A (Burkholderia nodosa -
Burk) e mistura de ambos (Mix) comparados com a das plantas não inoculadas (- N) e fertilizadas com nitrato de amônia (+ N) ao longo de 110 dias. As barras correspondem ao erro padrão (n = 6).
43
Posteriormente, a partir dos 80 dias após emergência das plântulas,
observou-se um aumento tanto do diâmetro do coleto como na altura das plantas do
tratamento fertilizado com nitrato de amônia (+N) que refletiu um crescimento
significativamente maior dessas plantas em comparação as dos demais tratamentos,
as quais se mantiveram com crescimento estagnado ao longo deste período. Ainda
com relação ao acompanhamento na altura das plantas (Figura. 18), verificou-se que
no decorrer dos 110 dias de crescimento, o tratamento controle com adubação
nitrogenda (+N) apresentou um crescimento maior estatisticamente significativo em
relação aos demais tratamentos, passando em média de 13 cm aos 30 dias para
cerca de 23 cm aos 110 dias de crescimento. As plantas dos demais tratamentos se
mantiveram praticamente com a mesma média de altura (13 à 15 cm) entre os 30
até os 110 dias após emergência.
30 50 80 110
Dias após emergência
8
12
16
20
24
Altu
ra (
cm
)
Rhiz
Burk
Mix
+ N
- N
Figura 18 - Resposta do crescimento em altura das plantas de Inga edulis inoculadas com os isolados 26A (Rhizobium tropici - Rhiz) e 395A (Burkholderia nodosa - Burk) e mistura de ambos (Mix) comparados com a das plantas não inoculadas (- N) e fertilizadas com nitrato de amônia (+ N) ao longo de 110 dias. As barras correspondem ao erro padrão (n = 6).
44
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Rhiz Burk Mix N N
Bio
massa (
g/p
lan
ta)
Raiz Parte aérea
Após 120 dias de crescimento, as plantas foram colhidas e a biomassa
(massa seca da raiz e da parte aérea) comparada entre os tratamentos. Nas raízes
das plantas de todos os tratamentos, inclusive naquelas inoculadas com as
proteobactérias, não foi evidenciado nenhum sinal de nodulação. Isso explica o fato
de que os tratamentos inoculados com os isolados 26A e 395A não apresentaram
diferenças estatísticas quanto ao crescimento inicial de Inga edulis (Figura. 18)
quando comparados com o controle (plantas não inoculadas e não fertilizadas com
nitrato de amônia). É importante salientar que essa espécie de arbórea responde
bem à adubação nitrogenada, o que pode ser comprovado pela diferença
estatisticamente maior na biomassa produzida pelas plantas fertilizadas com o
nitrato de amônia (Figura. 19). Estas plantas apresentaram na média 9 g de
biomassa total produzida, valor muito superior (mais de 4 vezes maior) do que os
demais tratamentos, os quais em média resultaram em 2 g de massa seca total por
planta (Figura. 19).
Figura 19 - Produção total de biomassa das plantas de Inga edulis inoculadas com os isolados 26A (Rhizobium tropici - Rhiz) e 395A (Burkholderia nodosa - Burk) e mistura de ambos (mix) comparados com a das plantas não inoculadas (- N) e fertilizadas com nitrato de amônia (+ N) ao longo de 110 dias. As barras correspondem ao erro padrão (n = 6).
45
Outro fato observado que é interessante salientar é que a proporção de
raízes produzidas pelas plantas dos tratamentos inoculados e controle sem
adubação foi bem maior que o investido na parte aérea da planta, comportamento
este reconhecidamente comum para plantas submetidas à privação de nitrogênio
(SOUZA; FERNANDES, 2006).
De acordo com Long (1996), os sinais que mediam a interação entre as
plantas e os rizóbios são conhecidos: a planta exsuda flavonóides que, percebidos
pelo rizóbio, induzem-no a ativar os genes nod, sendo que vários destes codificam
enzimas responsáveis pela biossíntese dos fatores Nod, que são lipo-
oligossacarídeos. Estes lipo-oligossacarídeos são sinais para as plantas, que, na
sua presença, ativam genes que codificam proteínas responsáveis pelo processo de
nodulação. Uma estirpe de Rhizobium, por exemplo, pode infectar somente algumas
espécies de leguminosas, o que é chamado de especificidade
hospedeiro/específica, relatada em estudos prévios que afirmam que Rhizobium
leguminosarum biovar viciae nodula ervilha e que R. leguminosarum biovar trifolii
nodula trevo (REIS et al. 2006). Esse fato pode ter ocorrido com os isolados
selecionados para inocular as sementes de I. edulis, que provieram dos nódulos de
I. vera e que não nodularam a primeira. Aparentemente, a associação efetiva entre
os isolados 26A (Rhizobium tropici - Rhiz) e 395A (Burkholderia nodosa - Burk) e a
leguminosa hospedeira, I. edulis, não ocorreu e, conseqüentemente, não houve
fixação do nitrogênio atmosférico e sua transformação na amônia necessária ao
crescimento da planta.
Outra evidência que aponta para a inefetividade do isolado 26A em nodular a
leguminosa hospedeira, foi a de que, estranhamente, não ocorreu a amplificação do
gene nodC neste isolado, como pode ser observado no gel da amplificação da
Figura 12. Vale ressaltar que, os genes da nodulação de Rhizobium se encontram
no plasmídeo, e a perda desse plasmídeo por algumas estirpes, em decorrência por
exemplo da exposição a altas temperaturas, faz com que a bactéria perca sua
habilidade para formar nódulos (VIEIRA, 2007).
Todos os isolados bacterianos identificados neste trabalho, atualmente,
constituem o Banco de Rizóbios da UESC. Eles poderão fornecer inóculos para as
leguminosas nodulíferas de interesse ecológico e agronômico.
46
5. CONCLUSÃO
Pode ser verificado através deste trabalho que os nódulos radiculares de
Inga vera são do tipo indeterminado, raramente ramificados.
Na caracterização morfológica das colônias bacterianas isoladas a partir dos
nódulos de I. vera, foi observado que a maior parte (61 %) apresentou coloração
amarela, brilhante, com bordas inteiras, produção de mucopolissacarídeos e tiveram
crescimento relativamente rápido (3 – 7 dias).
Foi demonstrada ampla diversidade genética dos isolados presentes nos
nódulos de Inga vera, formados não só por alfaproteobacterias, principalmente
espécies de Bradyrhizobium, mas também por betaproteobacterias identificadas
como sendo Burkholderia, gênero pela primeira vez relatado como associado aos
nódulos desta leguminosa arbórea.
A partir de experimentos realizados em casa de vegetação, constatou-se
que os isolados 26A (Rhizobium tropici) e 395A (Burkholderia nodosa), provenientes
dos nódulos de I. vera, ao serem inoculados em plântulas de Inga edulis não
resultaram na formação de nódulos.
47
6. REFERÊNCIAS
ANDAM, C. P.; MONDO, S. J.; PARKER, M. A. Monophyly of nodA and nifH genes
across Texan and Costa Rican populations of Cupriavidus nodule symbionts.
Applied and Environmental Microbiology, n. 73, p. 4686– 4690, 2007.
BAI, Y.; ZHOU, X.; SMITH, D. Enhanced soybean plant growth due to coinoculation
of Bacillus strains with Bradyrhizobium japonicum. Cropy Sciense, n. 43, p. 1774–
1781, 2003.
BALDANI, J. I.; BALDANI, V. L. D. History on the biological nitrogen fixation research
in graminaceous plants: special emphasis on the Brazilian experience. Anais da
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