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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ
FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
JAMILLE ALENCAR SALES
ENTEROBACTÉRIAS E Vibrio spp. ASSOCIADOS À CARCINICULTURA DE
Macrobrachium amazonicum: UM DESTAQUE PARA A SENSIBILIDADE IN VITRO
DE Vibrio cholerae não-O1/não-O139, Vibrio vulnificus e Vibrio mimicus A
ANTIBIÓTICOS E A EXTRATOS DE Moringa oleifera
FORTALEZA - CEARÁ
2014
JAMILLE ALENCAR SALES
ENTEROBACTÉRIAS E Vibrio spp. ASSOCIADOS À CARCINICULTURA DE
Macrobrachium amazonicum: UM DESTAQUE PARA A SENSIBILIDADE IN VITRO DE
Vibrio cholerae não-O1/não-O139, Vibrio vulnificus e Vibrio mimicus A ANTIBIÓTICOS E
A EXTRATOS DE Moringa oleifera
Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado Acadêmico em Ciências Veterinárias do Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para obtenção do título de mestre em Ciências Veterinárias. Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal. Orientador: Prof. Dr. Marcos Fábio Gadelha Rocha
FORTALEZA-CEARÁ 2014
Aos meus preciosos pais, Cristina Maria de
Alencar Rocha e Raimundo Catunda Sales.
AGRADECIMENTOS
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, da Faculdade de Veterinária, da
Universidade Estadual do Ceará.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pelo apoio
financeiro.
À Coordenação de Aperfeiçoamento Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo apoio
financeiro à pesquisa.
Ao Centro Especializado em Micologia Médica (CEMM), da Universidade Federal do Ceará,
pela oportunidade de realizar toda a pesquisa.
Ao professor Marcos Fábio Gadelha Rocha pela atenção, seriedade e compromisso,
possibilitando-me desenvolver a pesquisa com êxito. Um grande exemplo como pesquisador e
orientador.
À professora Raimunda Sâmia Nogueira Brilhante, pela dedicação ao CEMM, e por sua
disponibilidade em ajudar e supervisionar as minhas atividades desenvolvidas no laboratório.
À professora Tereza de Jesus Pinheiro Gomes Pereira pelos ensinamentos, atenção e paciência
durante o mestrado.
Ao professor José Júlio Costa Sidrim, por possibilitar aos alunos o desenvolvimento de
pesquisas no CEMM, fazendo do mesmo, a base para realização deste trabalho e de muitos
outros.
À professora Rossana de Aguiar Cordeiro, pelo apoio intelectual dedicado aos alunos.
À professora Célia Maria de Sousa Sampaio por disponibilizar o laboratório para realização
de parte desta pesquisa, e pelo apoio intelectual.
Ao professor Francisco Geraldo Barbosa pela sua cooperação em fornecer os extratos da
Moringa para o desenvolvimento deste estudo.
À professora Débora Castelo Branco de Souza Collares Maia, pelo auxílio, apoio intelectual e
prático, pela orientação e amizade.
À Glaucia Morgana de Melo Guedes pela importante e grandiosa ajuda disponibilizada
durante toda a pesquisa, pelos conhecimentos, companheirismo, convivência e incrível
amizade, a qual continuarei a preservar.
À Dra. Silviane Bandeira, pelos ensinamentos, sugestões e amizade.
À Terezinha de Jesus e ao Daniel Teixeira Lima por todo suporte proporcionado para a
realização de nossas pesquisas.
Ao Manoel Paiva de Araújo Neto pelos ensinamentos, apoio e grandiosa colaboração na
realização de toda a pesquisa desenvolvida durante o mestrado.
À equipe do CEMM, pela convivência divertida e prazerosa, e pelo companheirismo. Em
especial, Yago Brito de Ponte pela disponibilidade em ajudar e acompanhar a execução desta
pesquisa.
Ao Vitor Luz e à Giovanna Riello pela sincera amizade, apoio e pelos conhecimentos e
conselhos transmitidos.
A Deus, pelo ser e pelo estar, pela vida abençoada que me foi concedida e pelas pessoas que
amo.
Aos meus pais Cristina Maria de Alencar Rocha e Raimundo Catunda Sales, pela vida, por
todo empenho e dedicação a minha formação, que, juntamente, com os ensinamentos e amor
incondicional contribuíram para pessoa que hoje sou.
À minha querida avó, Iari Alves Lima da Rocha e à minha prima-irmã Laura Irvina Alencar
de Medeiros Silveira pelos conselhos, companheirismo, apoio e por bons momentos passados
juntas.
Ao Magno Borges Rodrigues Pimentel, pelo amor, amizade, cumplicidade, companheirismo,
em suma, por tornar a minha vida mais prazerosa e simples.
Aos animais, razão da minha profissão, por inspirarem paz e por tornarem a vida tão
divertida.
RESUMO
Enfermidades bacterianas e a resistência antimicrobiana representam riscos à carcinicultura.
Logo, surge o interesse pelo potencial antimicrobiano de espécimes de Moringa oleifera na
busca de novos compostos promissores ao controle microbiano. Este estudo buscou isolar
bactérias das famílias Enterobacteriaceae e Vibrionaceae associadas à carcinicultura de
Macrobrachium amazonicum e avaliar o perfil de sensibilidade in vitro de Vibrio spp. a
antibióticos e a extratos de M. oleifera. As cepas foram obtidas de fêmeas ovígeras, e da água
do ambiente natural e da larvicultura. As bactérias foram identificadas quanto ao gênero por
testes bioquímicos. As espécies de Vibrio foram identificadas através do Vitek2 e
sorotipagem. A Concentração Inibitória Mínima (CIM) dos antibióticos: ampicilina,
azitromicina, doxiciclina, trimetoprim-sulfametoxazol, cloranfenicol, ceftazidima e
ciplofloxacino; e dos extratos etanólicos de caule, folhas, vagens e sementes, e clorofórmico
de flores de M. oleifera frente Vibrio spp. foi determinada através da Microdiluição em Caldo,
de acordo com Clinical Laboratory Standards Institute. Os gêneros de enterobactérias
obtidos foram: Enterobacter (n=11) Citrobacter (n=10), Proteus (n=2), Serratia (n=2),
Kluyvera (n=2), Providencia (n=2), Cedecea (n=1), Escherichia (n=1), Edwardsiella (n=1) e
Buttiauxella (n=1). As espécies de Vibrio identificadas foram: V. cholerae não-O1/não-O139
(n=4), V. vulnificus (n=1) e V. mimicus (n=1). Vibrio spp. apresentaram valores de CIM no
range estabelecido pelo CLSI para todos os antibióticos, exceto V. vulnificus que apresentou
perfil intermediário para ampicilina (CIM 16µg/mL). Quanto a M. oleifera, o melhor
resultado obtido foi do extrato etanólico de vagens que inibiu três cepas V. cholerae, V.
vulnificus, V. mimicus e E. coli (ATCC25922) (CIM 0,312-5mg/mL). O extrato clorofórmico
de flores foi eficaz contra todas as cepas V. cholerae e E. coli (ATCC25922) (CIM 0,625-
1,25mg/mL), e o extrato etanólico de folhas inibiu duas cepas V. cholerae, V. mimicus e E.
coli (ATCC25922) (CIM 0,078-5mg/mL). Por outro lado, os extratos de caule e sementes não
foram efetivos na inibição das cepas. Em suma, o isolamento de Enterobacter, Citrobacter e
Vibrio spp. merece destaque, pois são patógenos oportunistas. Ademais, o perfil diferenciado
de V. vulnificus reflete a importância do controle do uso de drogas na carcinicultura. Os
extratos de vagens, flores e folhas da M. oleifera apresentam potencial para o controle de
Vibrio spp., sendo importante a obtenção de compostos bioativos responsáveis pela ação
antimicrobiana.
Palavras-chave: Camarão. Enterobactéria. Vibrio. Antibióticos. Moringa
ABSTRACT
The bacterial infectious diseases and antimicrobial resistance represents risk for shrimp
farming. Thus there is interest in antimicrobial potential of specimens of Moringa oleifera in
search of promising new compounds for microbial control. This study sought to isolate
bacteria of Enterobacteriaceae and Vibrionaceae families associated with shrimp farming of
Macrobrachium amazonicum and to evaluate the in vitro susceptibility profile of Vibrio spp.
to antibiotics and to extracts of M. oleifera. The strains were obtained from ovigerous
females, from the natural environment water and hatchery water. The bacterial were identified
according to genus by biochemical tests. Vibrio species were identified through Vitek2 and
serotyping. The Minimum Inhibitory Concentration (MIC) of antibiotics: ampicillin,
azithromycin, doxycycline, trimethoprim/sulfamethoxazole, chloramphenicol, ceftazidime
and ciprofloxacin; and of ethanol extracts of stem, leaves, pods and seeds and chloroform
extract of flowers of M. oleifera against Vibrio spp. was determined by the Broth
Microdilution, according to Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI). The genera of
Enterobacteria were obtained: Enterobacter (n=11) Citrobacter (n=10), Proteus (n=2),
Serratia (n=2), Kluyvera (n=2), Providencia (n=2), Cedecea (n=1), Escherichia (n=1),
Edwardsiella (n=1) and Buttiauxella (n=1). Vibrio species identified: V. cholerae non-
O1/non-O139 (n=4), V. vulnificus (n=1) and V. mimicus (n=1). Vibrio spp. showed MIC
values within the range established by CLSI for all antibiotics, except the V. vulnificus, which
presented intermediate profile for ampicillin (MIC 16µg/mL). As M. oleifera, the best result
was obtained of ethanol extract of pods, which inhibited three strains V. cholerae, V.
vulnificus, V. mimicus and E. coli (ATCC25922) (MIC 0.312-5mg/mL). The chloroform
extract of flowers was effective against all V. cholerae strains and E. coli (MIC 0.625-
1.25mg/mL), and ethanol extract of leaves inhibited two strains V. cholerae, V. mimicus and
E. coli (ATCC25922) (MIC 0.078-5mg/mL). However, stem and seeds extracts were not
effective in inhibiting strains. In short, the isolation of Enterobacter, Citrobacter and Vibrio
spp. deserves emphasis because they are opportunistic pathogens. Furthermore, the
differentiated profile of V. vulnificus reflects the importance of controlling drug use in shrimp
farming. The extracts of pods, flowers and leaves of M. oleifera have potential for the control
of Vibrio spp. being important to obtain bioactive compounds responsible for the
antimicrobial activity.
Key-words: Prawn. Enterobacteria. Vibrio. Antibiotics. Moringa
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ......................................................................................................... 14
2 REVISÃO DE LITERATURA ................................................................................ 16
2.1 CAMARÃO- DA-AMAZÔNIA (Macrobrachium amazonicum) ............................ 16
2.2 BACTÉRIAS NA AQUICULTURA ....................................................................... 19
2.2.1 Enterobacteriaceae .............................................................................................. 20
2.2.2 Vibrionaceae ........................................................................................................ 26
2.3 TESTE DE SENSIBILIDADE IN VITRO DAS BACTÉRIAS AOS AGENTES ANTIMICROBIANOS ........................................................................................... 30
2.4 Moringa oleifera ....................................................................................................... 33
3 JUSTIFICATIVA ...................................................................................................... 36
4 HIPÓTESES CIENTÍFICAS ................................................................................... 37
5 OBJETIVOS .............................................................................................................. 38
5.1 OBJETIVO GERAL ................................................................................................. 38
5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................................... 38
6 CAPÍTULO 1 ............................................................................................................. 39
7 CAPÍTULO 2 ............................................................................................................. 54
8 CONCLUSÕES .......................................................................................................... 66
9 PERSPECTIVAS ....................................................................................................... 67
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................... 68
APÊNDICES ............................................................................................................... 77
14
1 INTRODUÇÃO
A carcinicultura é um dos setores da aquicultura que mais atrai interesses de
produtores, sendo fonte de um dos principais produtos de exportação que tem propiciado bons
índices de rentabilidade e lucratividade. Em 2003, a carcinicultura ocupou 2ª lugar na pauta
das exportações do setor primário da região Nordeste e contribuiu com US$ 226 milhões dos
US$ 427,92 milhões gerados pelas exportações do setor pesqueiro nacional.
Atualmente, o estado do Ceará vem se destacando no mercado de produção de
camarão em cativeiro, tendo contribuído em 2013 com uma produção de 40 mil toneladas do
produto, gerando um fluxo de até R$ 600 milhões em negócios. Neste contexto, vale destacar
o camarão Macrobrachium amazonicum que é amplamente explorado por pesca artesanal no
Norte e Nordeste do Brasil, e representa um elevado potencial para carcinicultura, pois é uma
espécie nativa, de ampla distribuição e se adapta bem a aquicultura intensiva ou extensiva,
devido à baixa agressividade e capacidade de crescer em reservatórios, lagoas e viveiros, além
de maior resistência a doenças.
As enfermidades infecciosas em organismos aquáticos representam um dos
principais fatores de risco para indústria aquícola que, muitas vezes, podem estar
correlacionadas à qualidade da água onde estes animais estão inseridos. Portanto, devemos
ficar em alerta para as fragilidades sanitárias que podem contribuir na contaminação da água
dos estuários.
As doenças infecciosas são geralmente ocasionadas por microrganismos
oportunistas, encontrados na água, sedimento e até mesmo na microbiota intestinal de
espécies aquáticas, inclusive do camarão. Dos microrganismos predominantes no ambiente de
cultivo de camarões, destacam-se as enterobactérias e Vibrio. Estes microrganismos fazem
parte da flora bacteriana associada à carcinicultura. No entanto, podem se tornar patógenos
oportunistas capazes de causar prejuízos econômicos ao setor e à saúde pública.
A utilização indiscriminada de antimicrobianos na carcinicultura com vistas à
profilaxia e ao controle de infecções tem favorecido a seleção de organismos resistentes no
ambiente. A resistência bacteriana tornou-se uma preocupação crescente para saúde pública
mundial, a qual justifica o interesse da comunidade científica na descoberta de novas opções
antimicrobianas com menos efeitos deletérios. Neste contexto, o nosso grupo de pesquisa tem
15
avaliado o potencial antimicrobiano de produtos da planta Moringa oleifera no controle
microbiano.
A proposta deste estudo foi isolar enterobactérias e Vibrio spp. associadas à
carcinicultura de M. amazonicum, assim como determinar o perfil de sensibilidade In vitro de
Vibrio spp. a antibióticos clássicos e a extratos de M. oleifera.
16
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 CAMARÃO- DA-AMAZÔNIA ( Macrobrachium amazonicum)
O camarão do gênero Macrobrachium (Bate, 1868), evoluiu de um ancestral
comum que migrou para águas continentais, no início do Pleistoceno, e originou 244 espécies
conhecidas atualmente, dentre as quais 46 são registradas nas Américas e 19 no Brasil (DE
GRAVE; FRANSEN, 2011; SANTOS et al., 2013). No Brasil, são encontradas três espécies
deste gênero, como: M. carcinus, M. acanthurus e M. amazonicum (VALENTI, 1985).
Dentre estas, a espécie M. amazonicium destaca-se por ser uma espécie nativa amplamente
explorada pela pesca artesanal no Norte e Nordeste do Brasil, despertando interesse crescente
por possuir características adequadas para o cultivo comercial, tais como fácil manutenção e
reprodução em cativeiro, alta fecundidade, rusticidade, rápido crescimento e boa aceitação no
mercado consumidor por apresentar uma carne saborosa e por possuir larga distribuição,
assumindo certa importância socioeconômica para a região. No final da década de 90, esta
espécie representou 85% do pescado de camarão selvagem de água doce no Brasil (NEW et
al., 2002; MACIEL; VALENTI, 2009).
M. amazonicum é amplamente distribuído em lagos, represas, várzeas e rios nas
regiões tropicais e subtropicais da América do Sul, ocorrendo nos países Guiana, Suriname,
Guiana Francesa, Colômbia, Venezuela, Peru, Equador, Bolívia, Paraguai, Argentina e Brasil,
estando presente nas principais bacias hidrográficas sul americanas, incluindo a do Orinoco,
Amazonas, Araguaia-Tocantins, São Francisco e La Plata (Bacias do Rio Paraguai e Paraná).
No Brasil, a sua localidade típica é a bacia central do rio Amazonas na região de Manaus,
onde é abundante nas águas brancas ricas em sedimentos e sais dissolvidos. Nos lagos de
várzeas, a espécie chega a representar cerca de 80% da biomassa de macrocrustáceos
apresentando um grande potencial pesqueiro (ODINETZ-COLLART; MOREIRA, 1993).
O M. amazonicum apresenta grande resistência a doenças, maturação e
larvicultura simples, independência da água salgada na fase de crescimento (engorda), sistema
de produção compatível com pequenas propriedades e menor impacto ambiental, pois é uma
espécie nativa e estão menos sujeitos a flutuações na produção, consequente da introdução de
espécies exóticas. Possuem, ainda, características que favorecem o cultivo sustentável em
empresas que usam mão-de-obra familiar (VALENTI; TIDWELL, 2006; VALENTI et al.,
2011).
17
Nos últimos anos, vários estudos relacionados à biologia de M. amazonicum
foram desenvolvidos. Pesquisas que abordam assuntos como o crescimento relativo em
viveiros (MORAES-RIODADES; VALENTI, 2002), fecundidade e fertilidade (DA SILVA et
al., 2004) e biologia reprodutiva (SAMPAIO et al., 2007; FREIRE et al., 2012) contribuem
para o conhecimento biológico de M. amazonicum que constitui uma ferramenta básica para o
desenho de estratégias de manejo, visto que possibilita um melhor aproveitamento desse
recurso natural, evitando um estado de sobrepesca e de produtividade decrescente (RIBEIRO
et al., 2014).
Em várias regiões do país, o M. amazonicum é conhecido, popularmente, como
camarão-da-Amazônia e “camarão-sossego” ou “camarão-canela” (COELHO et al., 1982).
Caracteriza-se por apresentar um rostro longo e delgado, que ultrapassa o escafocerito,
portando 9 a 12 dentes na parte superior distribuídos irregularmente. A parte inferior do rostro
apresenta de 8 a 10 dentes. Os espécimes apresentam carapaça e abdômen lisos e
transparentes, e télson terminando em uma extremidade aguda com dois pares de espinhos na
margem posterior. Machos adultos apresentam mero, carpo e própode cobertos por espínulos
curtos, os quais nas fêmeas estes estão ausentes (Figura1) (MELO, 2003).
Cefalotórax Abdome
Rostro
Escafocerito
Quelípodes Patas ambulatórias
Pereiópodes
Télson
Figura 1- Representação esquemática da morfologia externa de M. amazonicum.
Fonte: LACAR, 2013
18
Os machos e as fêmeas de camarões palaemonídeos apresentam compleição física
semelhante até atingirem a maturidade sexual, apresentando crescimento dos quelípodes
simetricamente em relação à carapaça até a maturidade. A partir de então, observa-se
alometria ligeiramente positiva nas fêmeas e altamente positiva nos machos, onde o
cefalotórax e os quelípodes se apresentam mais desenvolvidos. A diferença de tamanho entre
sexos pode estar associada ao fato das fêmeas realizarem ecdises antes e após a desova, e,
durante, o processo de ecdise, as fêmeas aumentam de tamanho; porém, devido ao processo
reprodutivo, ocorre um elevado gasto de energia para maturação das gônadas, ocasionando
uma redução do crescimento, enquanto os machos direcionam o gasto energético ao
crescimento somático, fazendo com que se tornem maiores (AMMAR et al., 2001;
MORAES-RIODADES; VALENTI, 2002; SILVA et al., 2007).
Na reprodução, a fêmea, geralmente, sofre uma muda pré-cópula, e o macho
deposita o espermatóforo na região abdominal. Cerca de 20h após a muda, a fêmea, então,
exterioriza os óvulos, que são fecundados ao passar pela massa de espermatozoides. Os ovos
podem ser observados aderidos aos pleópodes do abdômen no dia seguinte a muda (Figura 2)
(GUEST, 1979; MACIEL; VALENTI, 2009). Os ovos apresentam, inicialmente, coloração
verde escura, e, com o passar dos dias, a coloração modifica para amarelo claro até o
momento da eclosão. A fecundidade de M. amazonicum pode variar de 500 a 7.000 ovos. O
desenvolvimento larval dura de 20 a 23 dias quando cultivados em laboratório. Após a
metamorfose, os juvenis nadam rapidamente na coluna de água, e assumem o hábito de nadar
sobre o substrato e escalar superfícies verticais. O período subsequente de crescimento
somático pode durar em média de dois meses em viveiros de aquicultura (MACIEL;
VALENTI, 2009).
Figura 2 - Fêmea ovígera de M. amazonicum. Ovos aderidos aos pleópodes da região abdominal (seta).
Fonte: LACAR, 2013
19
O cultivo de M. amazonicum realiza-se em duas fases: a larvicultura, que se
caracteriza por ser um sistema intensivo, com tanques abastecidos com água salobra e em
condições controladas de cultivo, no qual larvas desenvolvem-se até a metamorfose, em pós-
larvas; e a fase de engorda ou recria que consiste na criação de pós-larvas recém-
metamorfoseadas em viveiros de fundo natural, onde permanecem até atingirem tamanho
comercial; ou, alternativamente, em berçários por um período de 60 a 90 dias, antes de serem
levadas para os viveiros de engorda (MORAIS-VALENTI; VALENTI, 2010).
Durante a fase de larvicultura, M. amazonicum apresenta potencial para ser
cultivado em escala comercial, uma vez que apresenta alta sobrevivência e um período de
cultivo relativamente curto (MACIEL et al., 2004). A espécie pode ser estocada com altas
densidades em tanques de cultivo, utilizando água artificial ou natural onde a produtividade
pode alcançar até 70 pós-larvas/L (VETORELLI, 2008). Entretanto, a junção complexa dos
fatores ambientais, perfil microbiológico e a gestão das práticas de manejo influenciam o
sucesso da produção do ciclo larval (KENNEDY et al., 2006).
A composição da microbiota bacteriana associada aos ovos e larvas de camarão
variam entre os sistemas de incubação artificial, devido às várias medidas de tratamento de
água, alimentos artificiais e a densidade populacional. Além disso, esta prática favorece a
multiplicação de bactérias, sendo elas parte da microbiota bacteriana ou patógenos
oportunistas. Portanto, é importante compreender a microflora associada aos sistemas de
incubação, pois a interação hospedeiro-microrganismo apresenta profundas implicações na
saúde larval e no desenvolvimento de surtos de doenças (KENNEDY et al., 2006).
2.2 BACTÉRIAS NA AQUICULTURA
Na literatura científica, há registros relatando a importância dos microrganismos
para a aquicultura, tanto como probióticos, componentes da microbiota, bem como,
causadores de enfermidades em diferentes grupos de interesse do setor (GATESOUPE, 2007;
BONAMI et al., 2011). As enfermidades infecciosas em organismos aquáticos representam
um dos principais fatores de risco para indústria aquícola e, muitas vezes, podem estar
relacionadas à qualidade da água onde estes animais estão inseridos (BUGLIONE et al.,
2008).
Na Região Nordeste, principalmente, nos centros urbanos municipais, localizados
às margens dos rios, há deficiências nos serviços de saneamento básico. De certa forma, isto
contribui para a constante poluição microbiológica da água dos estuários, pois o despejo de
20
efluentes sanitários sem tratamento promove o aumento da carga microbiana que, muitas
vezes, excede a capacidade natural de diluição do ambiente aquático, afetando diretamente em
sua qualidade (MENEZES et al., 2008). Portanto, devemos ficar em alerta para as fragilidades
sanitárias que podem contribuir na contaminação das águas dos estuários.
As enfermidades infecciosas na aquicultura são, geralmente, ocasionadas por
microrganismos oportunistas incidentes na água, em sedimentos e na microbiota intestinal de
espécies aquáticas, inclusive na microbiota do ambiente de cultivo e do trato digestivo de
camarão. A presença de microrganismos entéricos patogênicos em ambientes aquáticos pode
ser uma fonte de doenças, especialmente, quando a água é utilizada para produção intensiva
(SERVAIS; PASSERAT, 2009).
Bactérias como: Escherichia spp., Salmonella spp., Shigella spp., Yersinia spp. e
Enterobacter spp. podem ser encontradas em água e no trato intestinal de animais, e são
capazes de causar infecções primárias em condições de imunossupressão (KONEMAN et al.,
2012; SINGH et al., 2015). Além destes microrganismos, as bactérias do gênero Vibrio são
comumente isoladas do ambiente de cultivo de camarão e são capazes de afetar todos os
estádios de vida do camarão, significando 100% de perda dos animais em larvicultura, além
do fato de algumas espécies de Vibrio serem agentes patogênicos zoonóticos prejudiciais à
saúde pública (COSTA et al., 2008; AUSTIN et al., 2010).
2.2.1 Enterobacteriaceae
Os membros da família Enterobacteriaceae são bacilos Gram-negativos,
anaeróbios facultativos, fermentadores de glicose e oxidase negativos. A ausência da
atividade de citocromo oxidase é uma característica importante para diferenciação das
enterobactérias de outros bacilos Gram-negativos fermentadores e não fermentadores
(MURRAY et al., 2011). Ademais, são microrganismos ubiquitários, encontrados em todo
mundo no solo, na água e na vegetação, e fazem parte da flora natural do trato gastrointestinal
de animais e do homem (KONEMAN et al., 2012). Na aquicultura, a incidência de
enterobactérias dos gêneros Escherichia, Klebsiella, Enterobacter e Citrobacter, que fazem
parte do grupo dos coliformes termotolerantes ou coliformes de origem fecal, representam um
dos principais indicadores sanitários para camarões cultivados e são utilizadas como critérios
de qualidade pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) (BRASIL, 2005;
PARENTE et al., 2011).
21
Estudos relatam a incidência de bactérias dos gêneros Enterobacter, Proteus e
Klebsiella isolados da microbiota da água da larvicultura do camarão Macrobrachium
rosenbergii (KENNEDY et al., 2006). Bem como, o isolamento de Escherichia, Citrobacter,
Enterobacter e Klebsiella isoladas de amostras de água de cultivo e do camarão Litopenaeus
vannamei (PARENTE et al., 2011). Andrade et al. (2010) relatam o isolamento de
Enterobacter, Klebsiella, Shigella e Salmonella de amostras do trato digestivo do camarão
Macrobrachium amazonicum proveniente do ambiente natural. Destas bactérias, os gêneros
Escherichia, Salmonella, Shigella e Enterobacter são mais prevalentes em casos clínicos
associados aos transtornos gastrointestinais e às infecções sistêmicas em pacientes que
consumiram água e mariscos contaminados (KONEMAN et al., 2012; SINGH et al., 2015).
Durante os anos 1990 a 2005, o Centro de Controle e Prevenção de Doenças nos
Estados Unidos registrou um total de 70 surtos envolvendo 878 casos de doenças associados
ao consumo de camarão, provocados por Escherichia coli, Salmonella enterica e Shigella
(CSPI, 2007). Contudo, a severidade das doenças ocasionadas por estes microrganismos
dependem da virulência das cepas e das condições de saúde do hospedeiro.
Os indícios iniciais, de que um microrganismo desconhecido isolado de uma
amostra clínica pertence à família Enterobacteriaceae, podem ser demonstradas em uma
preparação corada pelo método de Gram, que pode revelar células bacilares ou cocobacilares
gram-negativas curtas e arredondadas na microscopia óptica. Todavia, a diferenciação dentre
as espécies não pode ser efetuada com base apenas na coloração pelo método de Gram
(KONEMAN et al., 2012).
A morfologia característica das colônias em meio sólido, pode fornecer um
segundo indício. Tipicamente, as enterobactérias produzem colônias secas ou mucoides
relativamente grandes de coloração rosa-avermelhada em meio ágar MacConkey, meio de
cultivo diferencial para seleção e isolamento de bacilos entéricos Gram-negativos (Figura 3).
Neste meio, as espécies de Escherichia, Klebsiella e Enterobacter produzem colônias
mucoides e avermelhadas; Citrobacter, Providencia e Serratia podem aparecer, ligeiramente,
rosados dentro de 24-48h; e as espécies de Proteus, Edwardsiella e Salmonella produzem
colônias incolores ou transparentes. Em meio ágar Salmonella-Shigella (SS), bactérias Gram-
negativas podem apresentar colônias avermelhadas (Figura 3). As espécies de Salmonella
aparecem em colônias incolores, com o centro enegrecido, devido à produção de sulfeto de
hidrogênio, e as espécies de Shigella e Proteus apresentam colônias incolores, sem
enegrecimento no meio ágar SS. Entretanto, a identificação definitiva dos membros das
22
enterobactérias exige uma bateria de testes bioquímicos que expressam as características
metabólicas dos microrganismos testados (KONEMAN et al., 2012).
Existe uma variedade de testes diferenciais e numerosos esquemas disponíveis
para identificação de membros da família Enterobacteriaceae. Os testes bioquímicos
específicos, como: produção de fenilalanina desaminase, produção de urease, descarboxilação
de aminoácidos (lisina, arginina e ornitina), reação Voges-Proskauer (VP), assimilação de
citrato, produção de indol, motilidade, produção de sulfeto de hidrogênio, e utilização de
carboidratos, através do meio ágar tríplice açúcar-ferro (TSI), revelam as características
metabólicas das enterobactérias testadas e são amplamente utilizadas em laboratórios clínicos
(Figura 4) (KONEMAN et al., 2012). Para realização destes testes, é necessária uma
compreensão dos princípios bioquímicos a fim de reconhecer e corrigir qualquer
incongruência bioquímica ou falhas nas técnicas.
Figura 3 - Meios de cultivos para enterobactérias. A) Meio ágar SS, 1) colônias de Enterobacter sp. e 2) colônias de Citrobacter sp. apresentando características mucoide e coloração avermelhada (setas).
B) Meio ágar MacConkey, 3) colônias Klebsiella sp. e 4) colônias de Escherichia sp. (setas) apresentando características mucoide e coloração rosa-avermelhada.
A B
1 2 3 4
Fonte: LAPERE, 2013
23
O gênero Citrobacter inclui patógenos oportunistas Gram-negativos, oxidase-
negativos, amplamente, distribuídos no solo, na água, alimentos e no trato gastrointestinal de
animais e humanos (LAI et al., 2010; KONEMAN et al., 2012). Citrobacter spp., geralmente,
atuam como agentes contaminantes ou colonizadores em humanos, podendo causar infecções,
como bacteremias em pacientes com múltiplas comorbidades (LAI et al., 2010; RAVAL et
al., 2014), e estão associados a importantes causas de infecções nosocomiais (YAMAMOTO
et al., 2013). Em 1982, Sato e colaboradores descreveram o primeiro caso de infecção em
peixes causada por Citrobacter spp., e, em destaque, as espécies C. amalonaticus e C. freundii
podem ser isoladas da microbiota gastrointestinal de peixes e mariscos (NAWAZ et al., 2008;
LAI et al., 2010). Portanto, gastroenterites provocadas por estes microrganismos tornaram-se
importantes problemas na aquicultura intensiva devido às possibilidades de perdas
econômicas neste setor (LÜ et al., 2011).
O gênero Enterobacter, atualmente, é constituído por 19 espécies, sendo um dos
maiores gêneros dentro da família Enterobacteriaceae. Além disso, é um dos gêneros de mais
rápida expansão dentro desta família, no qual incluem 50% das novas espécies descritas nas
últimas décadas (BRADY et al., 2013). Os microrganismos deste gênero são de natureza
ubiquitária, podendo ser encontrados em fezes de humanos e animais, na água, em plantas e
em insetos, e destacam-se por serem indicadores de contaminação fecal em pescados (COSTA
et al., 2011). Ademais, são considerados patógenos oportunistas capazes de causar infecções
de origem alimentar em indivíduos imunocomprometidos, juntamente, com infecções
nosocomiais (SANDERS Jr. & SANDERS, 1997; KONEMAN et al., 2012; COONEY et al.,
Figura 4 - Características metabólicas de Klebsiella pneumoniae. A) Produção de fenilalanina desaminase negativo. B) Urease positiva. C) Controle descaboxilação de aminoácidos. D)
Descarboxilação positiva de lisina. E) Descarboxilação negativa de arginina. F) Descarboxilação negativa de ornitina. G) Reação Voges-Proskauer. H) Assimilação de citrato positiva. I) Meio SIM (produção de indol negativa, motilidade negativa, produção de H2S negativo). J) Fermentação de
carboidratos, meio TSI perfil àcido/ácido, com produção de gás.
A B C D E F G H I J
Fonte: LAPERE, 2013
24
2014). A literatura relata que Enterobacter é o oitavo patógeno mais comum nas infecções
nosocomiais nos Estados Unidos, e constitui 2,9% dos casos de bacteremias na Coréia (HUH
et al., 2014).
Presume-se que as espécies E. cloacae, E. asburiae, E. hormaechei, E. ludwigii E.
kobei e E. minipressuralis pertencem ao conhecido complexo E. cloacae baseado nas
características fenotípicas e genotípicas, e a maioria destas é de relevância clínica, em
comparação com as demais espécies associadas às fontes ambientais (BRADY et al., 2013).
São patógenos oportunistas implicados como agentes causadores, principalmente, de
infecções intra-abdominais e de bacteremias, sendo capazes de induzir a apoptose das células
do epitélio intestinal de humanos, causando destruição do tecido e propagação bacteriana
(KRZYMIŃSKA et al., 2010).
Do gênero Escherichia, a espécie E. coli, primeiramente relatada em 1885 a partir
de fezes de indivíduos saudáveis, é uma bactéria anaeróbia facultativa predominante na flora
intestinal de humanos e de animais de sangue quente. Embora a maioria dos isolados E. coli
sejam comensais intestinais inofensivos, existem várias cepas altamente adaptadas que
possuem a capacidade de causar várias doenças humanas, incluindo gastroenterite, infecções
do trato urinário, que às vezes pode evoluir para síndrome hemolítica-urêmica, e meningite
neonatal (KONEMAN et al., 2012; LIU, 2015). As cepas E. coli, responsáveis por doenças
entéricas, são nomeadas em E. coli enterotoxigênica (ETEC), E. coli enteropatogênica
(EPEC), E. coli entero-hemorrágica (EHEC), E. coli enteroagregativa (EAEC), E. coli
enteroagregativas produtoras da toxina Shiga (STEAEC), E. coli entero-invasiva (EIEC),
E.coli difusamente aderente (DAEC) e E. coli de aderência invasiva (AIEC) (LIU, 2015).
Além das 8 classes de E. coli diarreagênicas já mencionadas, existem outras classes
potenciais, como E. coli produtora da toxina distensora citoletal (CDT), e E. coli de
desprendimento de células (CDEC) que ainda não foram totalmente caracterizadas
(KONEMAN et al., 2012).
A bactéria E. coli é utilizada como um dos microrganismos indicadores de
contaminação (BRASIL, 2005). A investigação de coliformes e E. coli em alimentos é de
grande importância, pois a determinação destas bactérias avaliam a qualidade sanitária de
alimentos e água (SUWANSONTHICHAI; RENGPIPAT, 2003). Várias pesquisas investigam
a incidência de cepas E. coli isoladas da carcinicultura de M. amazonicum (REIS et al., 2004),
L. vannamei (COSTA et al., 2011; PARENTE et al., 2011) e P. monodon
(SUWANSONTHICHAI; RENGPIPAT, 2003) como uma forma de alerta para melhoria da
25
qualidade do pescado, baseado em práticas adequadas de higiene por parte dos manipuladores
e da manutenção de utensílios limpos e sanitizados.
Os membros do gênero Serratia são considerados patógenos oportunistas de
natureza ubiquitária, capazes de colonizar e sobreviver em materiais de embalagens de carne,
instrumentos hospitalares e equipamentos agrícolas, incluindo bombas de leite, e estão
envolvidos na deterioração de alimentos (RAFII et al., 2014). A espécie S. marcescens é o
membro mais importante, pois está frequentemente associada a uma variedade de infecções
humanas, sobretudo septicemias em pacientes imunocomprometidos (VOLZ et al., 2010;
KONEMAN et al., 2012).
Bactérias pertencentes aos gêneros Providencia, Buttiauxella, Proteus e Kluyvera
são isolados como parte da microbiota natural do solo, de água e do trato digestivo de animais
(CHANDER et al., 2006; KONEMAN et al., 2012). No entanto, vale destacar que Proteus e
Providencia são considerados patógenos oportunistas e podem causar infecções em humanos
(KONEMAN et al., 2012; ISOZAKI et al., 2010). A espécie P. mirabilis é mais
frequentemente responsável por 70-90% das infecções humanas, principalmente, como agente
etiológico de infecções do trato urinário e de feridas (KONEMAN et al., 2012; KUSHWAHA
et al., 2014), e a espécie P. alcalifaciens pode estar associada a doença diarreica,
particularmente, em crianças (KONEMAN et al., 2012).
O gênero Edwardsiella é composto por três espécies; entretanto apenas a espécie
E. tarda tem importância médica, pois causa enterite em pacientes imunocomprometidos
(KONEMAN et al., 2012; LIU et al., 2014). Este microrganismo está amplemente distribuído
na natureza, podendo ser isolado como componentes da flora intestinal de animais aquáticos.
Além disso, é considerado patógeno intracelular em uma ampla gama de hospedeiros, e
agente causador de edwardsiellosis na aquicultura, significando grandes perdas econômicas
para o setor (XU; ZANG, 2014; LIU et al., 2014).
Cedeceae é considerada uma enterobactéria de baixo risco. No entanto, há relatos
de casos de pneumonia e septicemia associados a este agente em pacientes que, geralmente,
apresentavam riscos às infecções oportunistas (DALAMAGA et al., 2008; LOPEZ et al.,
2014).
26
2.2.2 - Vibrionaceae
O nome Vibrionaceae foi originalmente proposto por Veron, em 1956, com a
intenção de reunir diversos bacilos Gram-negativos não entéricos, fermentadores, oxidase-
positivos e móveis através de flagelos polares. Este agrupamento foi considerado uma forma
conveniente de diferenciar esses microrganismos das cepas Enterobacteriaceae, sem implicar
necessariamente uma relação taxonômica entre as espécies inclusas (KONEMAN et al.,
2012). Em 1984, Bauman e colaboradores incluíram os gêneros Vibrio, Aeromonas,
Photobacterium e Plesiomonas na família Vibrionaceae. Entretanto, as técnicas
biomoleculares nos últimos anos revolucionaram a taxonomia microbiana que resultou em
uma restruturação desta família por linhas filogenéticas, no estabelecimento de dois novos
gêneros: Listonella e Shewanella, e de uma nova família Aeromonadaceae. O gênero
Plesiomonas está incluído na família Enterobacteriaceae (MURRAY et al., 2004;
KONEMAN et al., 2012).
De acordo com informações divulgadas pela Association of Vibrio Biologists
(AVIB, 2013) métodos para identificação de grupos ou espécie-específicos recentemente
desenvolvidos estão proporcionando novas descobertas sobre a ecologia da família
Vibrionaceae, em que o número de membros ainda está sendo expandido. Atualmente, o
número de espécies aceitas para família é de 142, distribuídas em oito gêneros: Aliivibrio (6
espécies), Catenococcus (1 espécie), Echinimonas (1 espécie), Enterovibrio (4 espécies),
Grimontia (2 espécies), Photobacterium (23 espécies), Salinivibrio (6 espécies), Vibrio (99
espécies).
O gênero Vibrio são bacilos Gram-negativos, curvos ou em forma de vírgula,
anaeróbios facultativos, fermentadores de carboidratos (glicose e sacarose), oxidase-positivos
e móveis através do flagelo polar, apresentando várias fímbrias importantes para virulência
(IGBINOSA; OKOH, 2008; KONEMAN et al., 2012). O habitat natural das espécies de
Vibrio é aquático, sendo frequentemente encontrados em águas costeiras e estuarinas, e
podem estar presentes como parte da microbiota do ambiente de cultivo de camarões
(GOPAL et al., 2005; REBOUÇAS et al., 2011).
Vibriose é causada por bactérias do gênero Vibrio e é uma das doenças infecciosas
mais prevalentes em espécies de peixes, moluscos e crustáceos, principalmente, aqueles
cultivados em ambientes marinhos e estuarinos (WOO; BRUNO, 2011). As espécies V.
cholerae, V. mimicus e V. vulnificus são conhecidas por induzir infecções severas no setor da
carcinicultura (AUSTIN et al., 2010).
27
A literatura relata o isolamento de V. cholerae, V.mimicus e V. vulnificus como
parte da microbiota da água de cultivo e do camarão L. vannamei (GOPAL et al., 2005;
REBOUÇAS et al., 2011; BANERJEE et al., 2012), bem como, parte da flora bacteriana da
água da larvicultura e do ambiente natural do camarão P. monodon (VASEEHARAM et al.,
2005). No entanto, existem poucas informações que relacionam os achados de Vibrio à
carcinicultura de M. amazonicum.
A espécie V. cholerae pode ser dividida em dois grandes grupos O1 e O139
associados à cólera epidêmica; não-O1, não-O139 conhecido como vibriões não-coléricos
(VNC) ou não toxigênicos (OTTAVIANI et al., 2009). Esta divisão é baseada nas diferenças
observadas na composição da parede celular (antígeno O somático), que constitui a base do
esquema de sorotipagem que classifica os microrganismos em mais de 200 sorogrupos
diferentes (SAKA et al., 2008; KONEMAN et al., 2012).
A realização da técnica de sorotipagem promove a diferenciação antigênica da
cepa V. cholerae na qual detecta antígenos característicos da bactéria, subdividindo-a além do
nível de espécie (MURRAY et al., 2004). Portanto, as cepas V. cholerae que não aglutinarem
na presença dos anti-soros O1 e O139, pertencem aos sorogrupos não-O1 e não-O139
(CHATTERJEE et al., 2009).
V. cholerae sorogrupos não-O1/não-O139 compõem a microbiota de águas
costeiras e estuarinas, e podem estar envolvidos nas infecções bacterianas em camarões da
espécie P. monodon destinados ao cultivo comercial (AUSTIN, 2010). Quanto à patogênese
humana destes sorogrupos, geralmente, estão relacionados aos casos esporádicos de diarreia,
enterocolite inflamatória, infecções nos tecidos moles e a casos de septicemias (SAKA et al.,
2008).
Estudos relatam, também, outras infecções causadas por V. cholerae não-O1/não-
O139, como: peritonite aguda e septicemia (FEGHALI; ADIB, 2011), diarreia
(CHATTERJEE et al., 2009), bacteremias (ALBUQUERQUE et al., 2013), septicemia e
meningites com lesões cerebrais em neonatos (ISMAIL et al., 2001; KERKETTA et al., 2002)
adquiridos após a ingestão de frutos do mar ou exposição ao ambiente aquático contaminado
(AUSTIN, 2010; FEGHALI; ADIB, 2011; BANERJEE et al., 2014). No entanto, é importante
salientar que o aparecimento da doença após a infecção por estes agentes microbianos
depende do fator imunitário do hospedeiro e da dose infecciosa do microrganismo
(OTTAVIANI et al., 2009).
28
De acordo com o Centro Nacional de Epidemiologia - CENEPI, Ministério da
Saúde, Brasil, no período de 1991 a 1999, 167.718 casos clínicos de cólera foram
documentados, e foram registrados 2009 óbitos, principalmente, na região Nordeste do país.
Região esta que contribuiu com 92,1% do total de casos do país (CENEPI, 2001). No mesmo
período, foram isoladas 76 cepas ambientais V. cholerae sorogrupos O1 e não-O1 ocorridos
em 14 estados do Norte, Nordeste, Sudeste e Sul do Brasil. Destas, 35 cepas ambientais V.
cholerae O1 e não-O1 são provenientes de esgotos, águas residuais, água de torneira, água de
poço, água corrente e rios do estado Ceará (BRAZIL et al., 2002).
V. mimicus, anteriormente classificado como V. cholerae sacarose-negativo,
habita ambientes marinho e estuarino, bem como pode ser isolado de ostras e camarões
(IGBINOSA; OKOH, 2008; KONEMAN et al., 2012). Existem poucos relatos descrevendo
esta espécie como patógeno de camarão. Entretanto, tem sido considerado como patógeno
secundário de crustáceos quando submetidos a situações de estresse em cativeiro, como alta
densidade populacional e má qualidade da água (AUSTIN, 2010).
Geng et al. (2014) relatam V. mimicus como agente etiológico de peixes de água
doce, e que foi responsável por uma epidemia de alta mortalidade (80%-100%). Os sinais
clínicos se resumem em letargia, descoloração da pele, úlceras hemorrágicas na pele, edema e
necrose em órgãos internos.
A patogênese em humanos está associada aos casos de gastroenterites
consequentes de infecções alimentares (AUSTIN, 2010).
A espécie V. vulnificus é isolada de ambientes marinho e estuarino de países
tropicais e subtropicais (STROM; PARANJPYE, 2000). Esta bactéria tem sido mencionada
em casos de infecções bacterianas no camarão P. monodon provocando alterações no trato
gastrointestinal e hemorragias internas (AUSTIN, 2010). Além disso, Serment-Moreno et al.
(2015) cita que dentre os patógenos encontrados em ostras, V. vulnificus é capaz de causar
septicemia primária, levando a uma taxa de mortalidade de até 55% .
V. vulnificus é uma espécie particularmente virulenta, associada a infecções de
ferida após exposição à água contaminada, e a septicemias primárias contraídas após o
consumo de ostras e crustáceos crus (STROM; PARANJPYE, 2000; AUSTIN, 2010;
KONEMAN et al., 2012). As infecções sépticas, geralmente, estão associadas a uma elevada
taxa de mortalidade (40%-60%). As infecções clínicas que predispõem à bacteremia incluem
disfunção hepática e síndromes que levam ao aumento na disposição de ferro, cirrose crônica
e hepatite (KONEMAN et al., 2012).
29
Os indícios iniciais de que um microrganismo isolado pertence ao gênero Vibrio
podem ser demonstrados através da coloração pelo método de Gram, que pode revelar células
bacilares Gram-negativas curvas na microscopia eletrônica. Outro indício pode ser
evidenciado através visualização microscópica de células curvas e móveis em meio líquido
(KONEMAN et al., 2012).
A morfologia característica das colônias em meio sólido pode fornecer um
segundo indício. Tipicamente, as espécies de Vibrio produzem colônias lisas, convexas de
consistência cremosa, branco-acinzentadas ou rosadas com bordas contínuas em meio ágar
MacConkey. Em certas ocasiões, são observadas colônias rugosas que se aderem ao ágar
(KONEMAN et al., 2012).
As colônias representativas crescidas em meios para isolamento primário devem
ser individualmente avaliadas quanto a atividade citocromo-oxidase. Com o resultado
positivo, as colônias podem ser transferidas para ágar TCBS (tiossulfato-citrato-bile-sacarose)
para identificação presuntiva da espécie através das características bioquímicas. A espécie V.
cholerae, em TCBS, forma colônias amareladas e lisas, com o centro opaco e periferias
transparentes (KONEMAN et al., 2012). As características metabólicas dos membros do
gênero Vibrio, também, auxiliam no processo de triagem (Figura 5) e identificação das
espécies (KONEMAN et al., 2012).
A B C D
Figura 5 - Triagem bioquímica utilizada para Vibrio. A) Meio SIM, indol positivo. B) Produção de urease. C e D) Perfil fermentativo, em meio fermentativo e oxidativo, com alteração da coloração do meio para amarelo, devido à produção de ácidos da
degradação fermentativa da glicose.
Fonte: LAPERE, 2013
30
Os estudos têm relacionado o isolamento de Vibrio da carcinicultura aos casos de
resistência aos antibióticos comumente empregados para o controle da população de
microrganismos (TENDENCIA; PEÑA, 2001; ZANETTI et al, 2001; ANDRADE et al.,
2010; REBOUÇAS et al., 2011; COSTA et al., 2012). O uso de antibióticos para a profilaxia
e controle de enfermidades neste setor não só favorece a seleção de bactérias resistentes no
ambiente, mudando assim a microbiota natural da água e dos sedimentos, como também
aumenta o risco de transferência de genes de resistência para patógenos que infectam seres
humanos e animais terrestres (CABELLO, 2006).
2.3 TESTE DE SENSIBILIDADE IN VITRO DAS BACTÉRIAS AOS AGENTES ANTIMICROBIANOS
A necessidade do teste de sensibilidade antimicrobiana (antibiograma) tornou-se
evidente logo depois que os antibióticos foram comercializados. Antes da Segunda Guerra
Mundial, a produção de penicilina era limitada e extremamente cara. Durante a Segunda
Guerra Mundial, outros antibióticos foram descobertos e padrões de sensibilidade contra
vários microrganismos foram estabelecidos. Devido ao seu grande interesse pelos
microrganismos do solo, Waksman descobriu a estreptomicina em 1943, e, logo depois,
descobriu-se a gramicidina e a tirocidina. Embora esses antibióticos fossem capazes de
debelar um microrganismo, logo depois surgiram cepas bacterianas resistentes, em que se fez
por mecanismos complexos, variados e não completamente conhecidos. Logo, o antibiograma
tornou-se uma necessidade prática (KONEMAN et al., 2012).
Os testes de sensibilidade são indicados para qualquer organismo que cause um
processo infeccioso que requer terapia antimicrobiana, sempre que sua sensibilidade não
possa ser predita de maneira confiável com base na identificação do organismo. São indicados
quando se acredita que o organismo causador da infecção pertence a uma espécie capaz de
demonstrar resistência aos agentes antimicrobianos normalmente usados. Os mecanismos de
resistência incluem a produção de enzimas que inativam a droga, a alteração dos alvos de
ação da droga e alteração da permeabilidade da membrana externa ou efluxo da droga. Alguns
organismos ainda possuem sensibilidade previsível a agentes antimicrobianos, e a terapia
empírica é amplamente reconhecida. Os testes de sensibilidade também são importantes nos
estudos da epidemiologia da resistência e na avaliação de novos agentes antimicrobianos
(CLSI, 2012).
31
O Clinical and Laboratory Standards Intitute (CLSI) é uma organização
internacional voluntária, credenciada pela American National Standars Institute, que
desenvolve e promove o uso de normas desenvolvidas pelo consenso, e de diretrizes dentro da
comunidade de saúde. O subcomitê de avaliação dos testes sensibilidade antimicrobiana do
CLSI analisa dados de estudos in vitro, farmacocinética/farmacodinâmica e estudos clínicos, a
fim de estabelecer métodos de testes de sensibilidade, critérios de interpretação e parâmetros
de controle de qualidade que possam ser utilizados pela comunidade médica e científica
(CLSI, 2014).
O CLSI preconiza alguns métodos laboratoriais que podem ser empregados para
predizer a sensibilidade in vitro das bactérias aos agentes antimicrobianos, como os Testes de
Sensibilidade por Diluição em Caldo de Cultura (Macrodiluição ou Microdiluição), por
Diluição em Ágar e por Difusão em Disco. Estas técnicas são bastante utilizadas em pesquisas
científicas e na clínica médica (REBOUÇAS et al., 2011; BANERJEE et al., 2012; DUTTA et
al., 2013; LÜ et al., 2014; YANO et al., 2014).
As técnicas utilizadas para determinar a sensibilidade in vitro de bactérias de
crescimento aeróbio são descritas nos documentos M07-09 (CLSI, 2012) e M02-A11 (CLSI,
2012). O documento M45-A2 (CLSI, 2010) descreve a métodos dos testes de sensibilidade
padronizados para bactérias fastidiosas, e o documento M100-S22 (CLSI, 2012) oferece
informações complementares sobre a seleção das drogas, a interpretação dos resultados e os
controles de qualidades utilizados nos testes padrão na norma M7 (CLSI, 2014).
O Teste de Microdiluição em Caldo é uma técnica que utiliza placas estéreis de 96
poços com o fundo em formato de “U”, na qual concentrações seriadas da droga serão
testadas nas condições preconizadas pelo documento do CLSI, de forma a verificar a menor
concentração capaz de inibir o crescimento do microrganismo referido como Concentração
Inibitória Mínima (CIM). Os resultados são interpretados tanto quantitativamente como
qualitativamente segundo os padrões sensível, intermediário e resistente (CLSI, 2012).
Durante os últimos 50 anos, a utilização de antimicrobianos tem aumentado
constantemente. Estes são amplamente utilizados para tratamento e prevenção de doenças
infecciosas bacterianas na clínica médica e clínica veterinária, e têm sido usados em
concentrações subterapêuticas na aquicultura como promotores de crescimento na criação de
animais (SERVAIS; PASSERAT, 2009). O uso indiscriminado de antibióticos na aquicultura
tem causado uma pressão seletiva para resistência antimicrobiana em bactérias presentes na
água e em sedimentos, levando a alterações relevantes na biodiversidade de microrganismos
32
em ambientes aquáticos, sendo extensivamente documentado em laboratórios e no campo
(CABELLO et al., 2013).
A literatura relata a incidência de isolados ambientais de cepas de Vibrio. O
estudo realizado por Costa et al. (2012) demonstrou que a maioria das cepas de Vibrio
isoladas da carcinicultura de L. vannamei apresentaram resistência à multiplas drogas, como:
penicilinas/imipenem, penicilinas/cefatonina/tetraciclina. Rebouças et al. (2011), também,
verificaram múltipla resistência de cepas Vibrio oriundas da carcinicultura deste camarão aos
antibióticos ampicilina/oxitetraciclina, ampicilina/oxitetraciclina/trimetoprim-sulfametoxazol,
e concluíram que 61,3% das cepas de Vibrio isoladas da água de cultivo de camarão L.
vannamei apresentaram resistência a pelo menos um dos antimicrobianos testados, sendo a
maioria resistente à oxitetraciclina e à ampicilina. Adicionalmente, estudo realizado por
Banerjee et al. (2012) demonstrou resistência de cepas V. mimicus, V. vulnificus e V. cholerae
oriundas da carcinicultura de L. vannamei resistentes à ampicilina, doxicilcina, tetracilcina e
trimetoprim/sulfametoxazol. Esta resistência pode ser dada ao uso inapropriado das drogas na
carcinicultura, pois, após a exposição aos antibióticos, os vibriões expostos podem adquirir
resistência antimicrobiana através da transmissão plasmidial, de modo que os genes
resistentes adquiridos por organismos em um ecossitema podem ser facilmente transferidos
entre organismos em diferentes ecossistemas. Portanto, o monitoramento do uso de
antimicrobianos pode trazer benefícios à saúde pública e à segurança alimentar associados ao
consumo de camarão (REBOUÇAS et al., 2011).
O surgimento e a disseminação de microrganismos resistentes aos
antimicrobianos disponíveis no mercado têm sido relatados há décadas, incentivando a busca
de novas fontes de substâncias com atividades antimicrobianas, como as plantas utilizadas na
medicina tradicional. As plantas são tradicionalmente usadas por populações de todos os
continentes, no tratamento de doenças desde a antiguidade, sendo fonte importante de
produtos naturais biologicamente ativos, muitos dos quais constituem modelos para a síntese
de um grande número de fármacos, revelando nestes produtos uma alta diversidade em termos
de estrutura e de propriedades físico-químico-biológicas (SIMÕES et al., 2010).
33
2.4 Moringa oleifera
M. oleifera (Lam.) é uma das espécies arbóreas pertencentes à família
Moringaceae mais conhecida e amplamente distribuída. Desenvolve-se bem em regiões
quentes, semiáridas e úmidas, em terras arenosas ou argilosas bem drenadas, e chega a tolerar
a precipitação estimada em 250 mm a 3000 mm (ANWAR et al., 2007). É uma planta nativa
da Índia e amplamente distribuída no Paquistão, Egito, Filipinas, Ceilão, Tailândia, Malásia,
Singapura, Jamaica, Nigéria, Camboja, na América Central e na América do Sul. No Brasil,
amostras podem ser encontradas na região Nordeste, principalmente, nos Estados do
Maranhão, Piauí e Ceará (CYSNE, 2006). É conhecida popularmente, como moringa, lírio
branco, quiabo-de-quina e cedro, e em algumas partes do mundo, como "árvore pilão” ou a
“árvore de rabanete de cavalo” (ANWAR et al., 2007).
A Moringa é uma árvore perene que apresenta um tronco único de pequeno porte,
possuindo caule delgado (até 10 cm), muitas vezes único, e copa aberta em forma de
sombrinha (Figura 6). O seu crescimento é bastante rápido (1,5 cm por dia), podendo atingir
12m de altura. Suas flores são amarelas, grandes em racemos pendentes, os frutos são do tipo
cápsula alada e deiscente com aspecto de vagem e marcado pelas sementes em seu interior;
estas são trialadas e oleaginosas (Figura 6) (ARORA et al., 2013). Trata-se de uma planta de
múltiplo uso, pois as folhas, frutos, flores e sementes possuem valores alimentar e medicinal
(ANWAR et al., 2007; ARORA et al., 2013).
Figura 6 - A) M. oleifera. B) Sementes de M. oleifera utilizadas para tratamento de água (seta) podendo observar a diferença de turbidez da água após a imersão das sementes. C) Vagens de M. oleifera comparadas em tamanho a uma caneta.
A B
C
Fonte: Departamento Agronomia, UEM/PR, 2014
34
A moringa é uma promissora fonte de alimento nos trópicos, pois, no final do
período seco, encontra-se vistosa com uma densa folhagem, enquanto outras plantas,
normalmente, encontram-se escassas. As folhas, flores, frutos e vagens desta árvore são
considerados como alimento vegetal de alto valor nutritivo em muitos países, particularmente
na Índia, Paquistão, Filipinas, Havaí e África (ANWAR et al., 2007). Três organizações não
governamentais, Trees for Life, Church World Service e Educational Concerns for Hunger
Organization, têm defendido o lema “alimentação natural para os trópicos” como uma forma
de incentivo para a disseminação da cultura alimentar da moringa. As folhas podem ser
comidas frescas ou cozidas, também, podem ser armazenadas como pó seco por muitos meses
sem refrigeração e sem haver perdas de valores nutritivos, e têm sido muito utilizadas no
combate da desnutrição, especialmente, de crianças e lactantes. De fato, as propriedades
nutricionais da moringa apresentam um benefício substancial na saúde em países onde a fome
é iminente (FAHEY, 2005, ANWAR et al., 2007).
Preparações de M. oleifera foram citados na literatura científica como fatores de
ação antibiótica, antitripanossomal, hipotensor, antiespasmódico, anti-úlcera, anti-
inflamatórios, hipocolesterolémica e hipoglicemiantes, bem como, possuem eficácia
considerável na purificação de água por floculação e sedimentação (AWODELE et al., 2012).
De acordo com Gallão et al. (2006), há um interesse pelo estudo de coagulantes naturais para
clarificar a água em substituição aos sais de alumínio utilizados no tratamento de água no
mundo todo. Comparado com os sais de alumínio, o óleo das sementes não altera
significamente a alcalinidade da água após o tratamento, e não causa problemas de corrosão.
M. oleifera tem sido reconhecida nas terapias medicinais alternativas Ayurveda e
Unani, e, além disso, possui atributos medicinais e farmacológicos apresentando benefícios
para o tratamento ou prevenção de doenças, que podem resultar da sua administração por via
alimentar ou tópica através do preparo de extratos, óleos, emolientes, unguentos, pó e sopas
(FAHEY, 2005, ANWAR et al, 2007). A planta pode ser utilizada para tratamento de doenças
de pele, do sistema digestivo, de doenças nas articulações, tratamento da malária e icterícia,
para algumas doenças cardiovasculares, gastrointestinais e desordens hepatorenais, pois são
observadas as principais classes de metabólitos secundários em sua composição, como
alcalóides, taninos, flavonóides, esteróides, saponinas, cumarinas, quinonas e resinas, ou seja,
compostos químicos complexos que exercem funções específicas em cada ser vivo (ANWAR
et al., 2007; SOUSA et al., 2009).
35
Nas folhas, estão presentes os alcalóides, compostos nitrogenados ativos
responsáveis por várias ações biológicas, como anti-hipertensivos, antitumorais, amebicidas,
eméticas e antiinflamatórias. Verifica-se também os taninos de natureza fenólica que possuem
ações farmacológicas de anti-sépticos, antioxidantes, antídotos em intoxicação por metais
pesados, cicatrizantes, protetores, reepitalizantes e antidiarréicos. Os flavonóides, também,
são encontrados nas folhas e atuam como antioxidantes e antivirais (SOUSA et al., 2009).
As saponinas possuem ações expectorantes, diuréticas e desinfetantes das vias
urinárias, e são capazes de romper a membrana celular de microrganismos (SOUSA et al.,
2009). De acordo com Fahey (2005), pesquisadores das Universidades de Bombaim e
Travancore identificaram um composto chamado de pterigospermina, uma substância que
facilmente é dissociada em moléculas de isotiocianato de benzila, o qual possui propriedades
antimicrobianas.
De aproximadamente 250.000 espécies de planta medicinais no mundo, a moringa
representa 10% do potencial antimicrobiano, sendo uma fonte de constituintes bioativos para
o desenvolvimento de medicamentos, os quais justificam os investimentos em pesquisas com
M. oleifera que buscam formas alternativas de tratamento de infecções causadas por cepas
bacterianas patogênicas resistêntes a antibióticos (ARORA et al., 2013).
As propriedades antimicrobianas de M. oleifera têm sido atribuídas a diferentes
partes da planta, tais como as folhas, flores, sementes, vagem e caule (FERREIRA et al.,
2011; PEXOTO et al., 2011; ARORA et al., 2013; ROCHA et al., 2014).
Estudo realizado por Peixoto et al. (2011) relata o efeito inibitório dos extratos
etanólico e aquoso de folhas frente a bactérias Staphylococcus aureus, Escherichia coli,
Pseudomonas aeruginosa e Vibrio parahaemolyticus. Vieira et al. (2010) relatam que o
extrato de sementes apresentam inibição frente a S. aureus, V. cholerae e E. coli. Bem como
Arora et al. (2013) que, também, relatam o efeito inibitório de sementes frente a S. aureus e P.
putida. Recentemente, Arora & Onsare (2014) realizaram um estudo com vagens de Moringa
e verificaram efeito inibitório frente a S. aureus, E. coli, Klebsiella pneumoniae, Salmonella
sp. e Shigella que apresentavam resistência a antibióticos.
Estudo realizado por Rocha et al. (2014) verificou o potencial antimicrobiano de
extratos de caule, vagens, sementes e flores M. oleifera contra isolados de Candida spp. e
Hortaea werneckii da carcinicultura de M. amazonicum.
36
3 JUSTIFICATIVA
Até o momento, os registros sobre a microbiota bacteriana de M. amazonicum são
restritos, assim como, relatos sobre o perfil de sensibilidade de Vibrio spp. provenientes da
carcinicultura deste camarão. Portanto, o conhecimento desta microbiota e o
acompanhamento microbiológico da qualidade da água utilizada no cultivo deste camarão são
de suma importância para o desenho de estratégias de manejo apropriadas e para obtenção de
uma melhor produtividade dos organismos. Ademais, o interesse na pesquisa com M. oleifera
tem sido crescente em razão do seu potencial antimicrobiano, que por ventura poderá se tornar
um fator alternativo utilizado na profilaxia e no tratamento de certas enfermidades que
acometem a aquicultura.
37
4 HIPÓTESES CIENTÍFICAS
1. Bactérias pertencentes às famílias Enterobacteriaceae e Vibrionaceae estão presentes na
microbiota do trato digestivo de fêmeas ovígeras de M. amazonicum, e nas amostras de água
do ambiente natural e da larvicultura;
2. Há o fenômeno de resistência a antibióticos clássicos em cepas de Vibrio spp. isoladas da
carcinicultura de M. amazonicum;
3. Os extratos de caule, folhas, flores, vagens e sementes de M. oleifera apresentam atividade
antimicrobiana frente às cepas de Vibrio spp. isoladas da carcinicultura de M. amazonicum.
38
5 OBJETIVOS
5.1 OBJETIVO GERAL
Isolar bactérias das famílias Enterobacteriaceae e Vibrionaceae associadas à
carcinicultura de M. amazonicum, assim como avaliar o perfil de sensibilidade in vitro dos
isolados de Vibrio spp. diante antibióticos clássicos e a extratos de M. oleifera.
5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Isolar bactérias das famílias Entrobacteriaceae e Vibrionaceae provenientes do trato
digestivo de fêmeas ovígeras de M. amazonicum oriundas do ambiente natural, e de amostras
de água do ambiente natural e da água de cultivo de M. amazonicum na fase larval em
cativeiro;
2. Determinar os gêneros das bactérias da família Enterobacteriaceae isoladas dos tratos
digestivos de fêmeas ovígeras de M. amazonicum, e da água do ambiente natural e da
larvicultura;
3. Determinar as espécies de Vibrio isoladas dos tratos digestivos de fêmeas ovígeras de M.
amazonicum e da água da larvicultura;
4. Avaliar o perfil de sensibilidade in vitro de Vibrio spp. a antibióticos clássicos e a extratos
de caule, folhas, flores, vagens e sementes de M. oleifera.
39
6 CAPÍTULO 1
Enterobactérias e Vibrio associados ao cultivo do camarão Macrobrachium amazonicum
Enterobacteria and Vibrio associated with farming of Macrobrachium amazonicum prawn
Periódico: FEMS Microbiology Ecology – Research Article (Submetido em outubro de 2014).
40
FEMS Microbiology Ecology- Research Articles
Enterobacteria and Vibrio associated with farming of Macrobrachium amazonicum
prawn
Raimunda S.N. Brilhante1, Jamille A. Sales 2, Glaucia M. M. Guedes1, Yago B. Ponte2, Célia
M. S. Sampaio2, Tereza J. P. G. Bandeira 1,3, José L. B. Moreira1, Débora S. C. M. Castelo-
Branco1, Manoel A.N. Paiva2, Rossana A. Cordeiro1, André J. Monteiro4, José J.C. Sidrim1&
Marcos F.G. Rocha1, 2
1Department of Pathology and Legal Medicine, Postgraduate Program in Medical
Microbiology, Specialized Medical Mycology Center, Federal University of Ceará, Fortaleza,
Ceará, Brazil; 2School of Veterinary Medicine, Postgraduate Program in Veterinary Sciences,
State University of Ceará, Fortaleza, Ceará, Brazil; 3School of Medicine, Christus College –
Unichritus, Fortaleza, Ceará, Brazil and 4Department of Statistics and Applied Mathematics,
Federal University of Ceará, Fortaleza, Ceará, Brazil.
*Corresponding Author: R.S.N. Brilhante. Rua Coronel Nunes Melo, s/n, Rodolfo Teófilo.
CEP: 60.430-270. Fortaleza, CE, Brazil. Tel: 55 (85) 3366-8319, email:[email protected].
Running Title: Bacteria from M. amazonicum farming
41
Summary
The emergence of infectious diseases and the phenomenon of antimicrobial resistance in
prawn farming has driven research in this area. This study sought to isolate Enterobacteria and
Vibrio associated with Macrobrachium amazonicum farming and to evaluate the in vitro
antimicrobial susceptibility of Vibrio spp. The strains were isolated from female M.
amazonicum, water from the natural environment and hatchery water. The microorganisms
were identified according to genus by biochemical tests. Vibrio species were identified
through Vitek2 and serotyping. Susceptibility test with Vibrio spp. was performed according
to Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI). The following genera of enterobacteria
were obtained: Enterobacter (n=11), Citrobacter (n=10), Proteus (n=2), Serratia (n=2),
Kluyvera (n=2), Providencia (n=2), Cedecea (n=1), Escherichia (n=1), Edwardsiella (n=1)
and Buttiauxella (n=1). As for Vibrio, three species were identified: V. cholerae serogroup
non-O1/non-O139 (n=4), V. vulnificus (n=1) and V. mimicus (n=1). Vibrio spp. strains
showed MIC values within the range established by CLSI for all antibiotics, except the V.
vulnificus, which presented intermediate profile for ampicillin. Finally, the recovery of
Enterobacter, Citrobacter and Vibrio spp. should be emphasized because they are
opportunistic pathogens. Furthermore, the intermediate susceptibility of V. vulnificus to
ampicillin reflects the importance of monitoring drug use in prawn farming.
Introduction
The favorable climate and mastery of new technologies for prawn production make
Brazil one of the main producers in the Americas. In 2014, Brazil exported 216 metric tons of
prawn, standing out in the international export market, and the state of Ceará is a leader in
production (ABCC, 2014).
Macrobrachium amazonicum has particularly high potential for aquaculture in South
America, because it is present in the most important South American river basins, including
the Amazon, Araguaia-Tocantins, São Francisco and La Plata (Araujo & Valenti, 2007;
Maciel & Valenti, 2009). In the northern and northeastern Brazil, M. amazonicum is
important for artisanal fishing and has attracted increasing interest for having appropriate
characteristics for commercial cultivation, such as easy maintenance and breeding in
captivity, high fertility, hardiness and good acceptance in the consumer market (New et al.,
2002; Maciel & Valenti, 2009).
42
Infectious diseases in aquatic organisms are one of the main risk factors of the
aquaculture industry and are often associated with water quality (Buglione et al., 2008).
Bacteria of the Enterobacteriaceae family are one of the main indicators of poor sanitary
conditions for farmed shrimp and are used as quality control criteria by national agencies. In
this context, the study of bacteria of fecal origin in shrimp farming areas is important, since
these bacteria are considered indicators of contamination (Brazil, 2005; Parente et al., 2011).
Vibrio spp. are commonly found in coastal and estuarine waters (Ottaviani et al.,
2009). The species V. cholerae, V. mimicus, and V. vulnificus are opportunistic pathogens that
are capable of causing lethal infections in farmed shrimp, especially in the presence of
environmental stress, nutritional imbalance and predisposing lesions (Banerjee et al., 2012).
Moreover, antimicrobial resistance in these microorganisms has been observed (Rebouças et
al., 2011).
Thus, this study initially sought to isolate bacteria of the Enterobacteriaceae and
Vibrionaceae families present in the digestive tracts of ovigerous females of M. amazonicum,
samples of water from the hatchery and samples of water from the natural environment; as
well as to evaluate the in vitro antimicrobial susceptibility of isolates of Vibrio spp. against
antibiotics.
Materials and methods
- Research licensing
This study was previously approved by the Chico Mendes Institute for Conservation of
Biodiversity/Biodiversity Authorization and Information System – SISBIO, under the number
28175-1.
- Collection of the digestive tracts of M. amazonicum
Ovigerous females were collected in Sapiranga Lake (3°48’3.46” S and 38°27’30.83”
W), Fortaleza, Ceará, Brazil and sent to the Laboratory of Shrimp Farming of the State
University of Ceará. The digestive tracts of 10 females were removed by making a dorsal
transverse incision, they were placed in sterile slants containing sterile saline (0.9% NaCl),
and were treated as one single sample (Brilhante et al., 2011). Overall, 20 females were used,
yielding a total of 2 samples of digestive tract of M. amazonicum. The samples were packed
properly and transported to the Laboratory of Emerging and Reemerging Pathogens
43
(LAPERE) of the Federal University of Ceará for microbiological processing and isolation of
bacteria.
-Water collection
Duplicate aliquots of 5 mL of water from the natural environment and the water used
in the M. amazonicum hatchery were collected with sterile syringes, according to Brilhante et
al., 2011. The environmental water samples were collected in shallow areas of Sapiranga
Lake for two consecutive weeks, while those from cultivation tanks were collected from
different areas (bottom, substrate, surface and near walls). Each cultivation tank had a
capacity of 70 L, density of 20 larvae L-1 and water with 4 mg L-1 salinity. The samples were
collected weekly for two consecutive hatchery cycles of M. amazonicum maintained in the
laboratory. A total of two samples of water from the natural environment and 18 samples
from farming water were obtained. The microbiological processing and isolation of bacteria
were performed LAPERE.
- Isolation and identification of bacteria
For each sample, the culture media used for primary isolation of Enterobacteriaceae
and Vibrio species were: BHI agar (HiMedia; India), MacConkey agar (Sigma-Aldrich;
USA), and Salmonella-Shigella agar (HiMedia; India) (Koneman et al., 2012).
The digestive tracts were opened and mixed in a sterile porcelain mortar, and a
suspension with approximately 1g of the material in sterile saline was prepared. Then the
suspension was homogenized in a vortex for 3min and left at rest for 30min at 25 °C
(Brilhante et al., 2011). Aliquots of 10 µL of the supernatant of each sample were seeded into
the agar plates and incubated at 35°C for 24h.
For the processing of water samples, a volume of each sample was divided into
aliquots of 2.5 mL placed into two tubes of hemolysis. The tubes were then centrifuged at
3000rpm for 20min. After centrifugation, the supernatant was discarded and the remaining
material was transferred to a sterile test tube with sterile saline, reaching a total volume of
1000 µL. After this procedure, 1000 µL of sterile saline was added and each suspension was
homogenized in a vortex for 3min and left at rest for 30min at 25°C (Medeiros et al., 2008).
Subsequently, aliquots of 10 µL of the supernatant of each sample were seeded on BHI agar,
MacConkey agar and Salmonella-Shigella agar, and incubated at 35°C for 24-48h.
The recovered colonies grown in cultivation plates were seeded individually on
MacConkey agar and TCBS agar (BD Difco; USA) to obtain pure populations for the
44
identification process, and incubated at 35°C for 24h. The re-isolated colonies were subjected
first to Gram staining for selection of Gram-negative microorganisms, and then the
cytochrome-oxidase test was performed to obtain Gram-negative oxidase-negative
microorganisms, which include Enterobacteria, and for selection of Gram-negative oxidase-
positive microorganisms, including the genus Vibrio (Ghenghesh et al., 2008).
To identify the genera of Enterobacteriaceae, the following tests were conducted:
carbohydrate utilization, with Triple Sugar Iron (TSI) medium, citrate assimilation and
phenylalanine desaminase production, urease production, decarboxylation of amino acids
(lysine, arginine and ornithine), Voges-Proskauer reaction (VP), hydrogen sulfide production,
indole production and motility. The test results were read after 20h and biochemical
characteristics were interpreted following the identification keys of each bacterial group
(Koneman et al., 2012).
Vibrio species were obtained first by screening through glucose fermentation, urease
production, indole production and motility tests (Koneman et al., 2012). The reading was
performed after 20h, and the biochemical profile for Vibrio was interpreted following the
identification keys in accordance with Noguerola & Blanch, 2008. Subsequently, the strains
were identified through Vitek2 (bioMérieux; USA) using cards for Gram-negative bacilli.
The V. cholerae strains isolated were also subjected to the agglutination test with
antisera specific for serogroup O1 and O139 (PROBAC; Brazil). The strains that showed no
agglutination with these antisera were considered strains of V. cholerae non-O1/non-O139
serogroups (Chatterjee et al., 2009).
- In vitro susceptibility test of Vibrio spp.
Antimicrobial minimum inhibitory concentrations (MIC) were determined through the
Broth Microdilution method as described by the Clinical Laboratory Standards Institute,
document M07-A9 (CLSI, 2012), using the test conditions for Vibrio species described in
document M45-A2 (CLSI, 2010). The drugs used were selected based on the document M45-
A2 (CLSI, 2010): ampicillin, azithromycin, doxycycline, trimethoprim-sulfamethoxazole,
chloramphenicol, ceftazidime and ciplofloxacin (Sigma Chemical Corporation; USA).
Escherichia coli (ATCC25922) Staphylococcus aureus (ATCC29213) strains were included
as quality control for the tests, according to document M100-S22 (CLSI, 2012). Susceptibility
tests were performed in 96-well plates at a total volume of 200µL, incubated at 35°C and read
after 20h (CLSI, 2010). All assays were performed in duplicate, and each strain was included
in the inoculum control and drug control. The MIC for the drugs was considered as the lowest
45
concentration able to inhibit 100% bacterial growth, except for trimethoprim-
sulfamethoxazole, whose MIC was defined as the minimum concentration capable of
inhibiting 80% of bacterial growth, when compared to the growth control well (document
M07-A9, CLSI, 2012). The results were interpreted according to the document M45-A2
(CLSI, 2010) and the strains were classified as S (susceptible), I (intermediate) and R
(resistant).
- Statistical analysis
Analysis of variance with post hoc Fisher's LSD test were used to analyze CFU counts
obtained from different samples and collection sites, as well as to compare the recovery rate
of Enterobacteriaceae and Vibrio spp. from each site. P-values lower or equal to 0.05
indicated significant conclusions.
Results
In this study, 33 strains of Enterobacteriaceae were isolated, 16 from the hatchery
water, 12 from the digestive tract of M. amazonicum and 5 from lake water. The recovery of
enterobacteria was statistically more common (P=0.0002) from samples from the digestive
tract of M. amazonicum and water from natural environment, when compared to hatchery
water. No other statistically significant conclusions were observed in this study, concerning
CFU counts and recovery rate of the analyzed bacteria. In addition, 6 strains of Vibrio were
isolated in hatchery water (n=5) and the digestive tract (n=1) (Table 1).
The following genera of enterobacteria were obtained from the hatchery water:
Citrobacter (n=9), Serratia (n=2), Proteus (n=2), Escherichia (n=1), Kluyvera (n=1), and
Buttiauxella (n=1). Two genera were found in the lake water samples: Enterobacter (n=4) and
Cedecea (n=1). Finally, five genera were found in the digestive tracts: Enterobacter (n=7),
Providencia (n=2), Citrobacter (n=1), Kluyvera (n=1) and Edwardsiella (n=1) (Table1).
Of the identified species of Vibrio, V. cholerae serogroups non-O1/non-O139 (n=4)
and V. vulnificus (n=1) were isolated from hatchery water and V. mimicus (n=1) was isolated
from the digestive tract of prawns (Table 1).
The MIC values obtained through the in vitro susceptibility tests performed with
Vibrio spp. are described in Table 2. Interpretation of MIC values, according to document
M45-A2 (CLSI, 2010), demonstrated that V. cholerae non-O1/non-O139 and V. mimicus were
susceptible to all tested antibiotics. The strain of V. vulnificus, on the other hand, presented
intermediate profile to ampicillin, with an MIC of 16 µg mL-1. Briefly, the antibiotics
46
azithromycin, doxycycline and trimethoprim-sulfamethoxazole presented MIC values against
the strains of V. cholerae non-O1/non-O139 ranging from 0.25 to 1µg mL-1, from 0.031 to
0.062µg mL-1 and from 0. 0156/0.297 to 0.125/2.37 µg mL-1, respectively. Chloramphenicol
presented an MIC of 0.5 µg mL-1 against all tested strains. In addition, ceftazidime presented
MIC values of 1µg mL-1 against V. mimicus and 0.5 µg mL-1 against V. vulnificus, and
ciprofloxacin showed MIC of 0.001 µg mL-1 against the two mentioned species. All tested
drugs presented MIC values in the range stated in document M100-S22 (CLSI, 2012) against
the quality control strains, E. coli (ATCC25922) and S. aureus (ATCC29213).
Discussion
Information on the isolation of enterobacteria and Vibrio species from M. amazonicum
farming is limited. On the other hand, studies that report the isolation of bacteria from farming
of Litopenaeus vannamei, Macrobrachium rosenbergii and Penaeus monodon are more
common in the literature (Anderson et al., 1989; Vaseeharan et al., 2005; Kennedy et al.,
2006; Parente et al., 2011). Vibrio species such as V. mimicus, V. vulnificus and V.
alginolyticus were isolated as part of the microbiota of the digestive tract and the water of L.
vannamei farming (Rebouças et al., 2011).
Andrade et al., 2010 reported the recovery of enterobacteria, Enterobacter spp. E. coli
and Salmonella spp. from M. amazonicum from the natural environment. However, there are
no studies reporting the presence of Vibrio and enterobacteria in M. amazonicum kept in
captive conditions. Therefore, considering the potential use of this prawn for commercial
cultivation and the scarcity of data on the bacterial microbiota of M. amazonicum, the idea of
this study emerged.
Microorganisms belonging to the Enterobacteriaceae family are widely distributed in
nature, being found in water and in the intestinal tracts of humans and animals (Koneman et
al., 2012). In this study, we recovered several genera of enterobacteria from M. amazonicum
farming, of which the genera Citrobacter (n=9) and Enterobacter (n=7) were most common
in hatchery water and in the digestive tracts of prawns, respectively. In environmental water,
the predominant genus was also Enterobacter (n=4).
The bacteria Citrobacter and Enterobacter are opportunistic pathogens that belong to
the group of the fecal coliforms and can be isolated from environmental samples. The
literature reports that Enterobacter species are found in water samples and clinical specimens
and can cause infections of the skin and digestive tract of immunocompromised humans
(Sanders Jr & Sanders, 1997). In turn, Citrobacter species can be isolated from polluted water
47
and the digestive tract of fish, and they are associated with gastroenteritis in aquatic
organisms kept under cultivation conditions (Lü et al., 2011). Furthermore, Citrobacter spp.
have been linked to episodes of bacteremia in immunocompromised humans (Lai et al.,
2010). It is worth noting that bacteria of these genera have also been isolated from L.
vannamei shrimp and cultivation water (Parente et al., 2011).
There are reports in the literature of isolation of Vibrio species as part of the bacterial
flora of the cultivation environment of aquatic organisms, including prawns intended for
human consumption (Vaseeharam et al., 2005; Rebouças et al., 2011; Banerjee et al., 2012).
However, there is little information on Vibrio in M. amazonicum farming. In this study,
strains of the V. cholerae serogroup non-O1/non-O139 obtained from the hatchery water
represented the four out of six Vibrio isolates.
The serogroups non-O1/non-O139 are considered non-cholera Vibrio, because they
have no virulence factors associated with epidemic cholera (Igbinosa & Okoh, 2008).
However, the recovery of non-cholera Vibrio species in this study is important due to the
pathogenicity of these organisms to human health. Among the possible problems are cases of
acute peritonitis, meningitis, severe diarrhea and acute septicemia caused by V. cholerae non-
O1/non-O139 reported in some countries, which are commonly associated with patients who
consumed seafood or had contact with contaminated water (Anderson et al., 2004; Lukinmaa
et al., 2006; Chatterjee et al., 2009; Feghali &Adib, 2011).
In this study, the species V. vulnificus and V. mimicus were also recovered. The
finding of V. vulnificus from hatchery water is relevant because it is a pathogenic species that
causes skin infections, and, depending on the clinical evolution, it can lead to rapid
progression to septic shock, causing death (Austin, 2010). In addition, these two species can
cause damage in shrimp farming, because they are associated with infections of the digestive
tract of P. monodon shrimp (Jayasree et al., 2006). The finding of V. mimicus in the digestive
tract of M. amazonicum in this study is also important because it is a pathogen of shellfish. In
humans, this microorganism can cause gastroenteritis and severe diarrhea (Austin, 2010).
The prophylactic use of antimicrobial agents in aquaculture can favor the selection of
resistant pathogens (Cabello et al., 2013). Literature reports the occurrence of resistant Vibrio
species to at least one antibiotic in samples from water and L. vannamei and also the
predominance of intermediate susceptibility to ampicillin among these strains (Rebouças et
al., 2011). In this study, we found that Vibrio strains isolated from hatchery water and the
digestive tract of M. amazonicum were susceptible to the tested antibiotics, and only the strain
48
V. vulnificus presented an intermediate profile to ampicillin. Yano et al., 2014 also isolated
Vibrio species from captive L. vannamei and P. monodon that presented susceptibility to the
tested antibiotics. Ampicillin has been referred to as the least effective antibacterial drug
against Vibrio strains isolated from farmed shrimps (Vaseeharan et al., 2005; Díaz et al.,
2006). It is important to highlight that the continuous and inappropriate use of antimicrobials
leads to the emergence of resistant strains, reflecting the pattern of use of these drugs
(Tendencia & Peña, 2002).
In conclusion, the recovery of the bacteria Enterobacter, Citrobacter and Vibrio spp.
deserves special attention because they are important opportunistic pathogens. Furthermore,
the intermediate susceptibility of V. vulnificus to ampicillin reflects the importance of
monitoring drug use in prawn farming.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the Coordination Office for the Improvement
of Higher Education Personnel (AEI-0052-000650100/11).
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Collection site
Prawn Water Total
Hatchery Lake
Microorganisms n % n % n % n %
Buttiauxella sp. - - 1 2.56 - - 1 2.56 Cedecea sp. - - - - 1 2.56 1 2.56 Citrobacter spp. 1 2.56 9 23.08 - - 10 25.64 Edwardsiella sp. 1 2.56 - - - - 1 2.56 Enterobacter spp. 7 17.95 - - 4 10.26 11 28.21 Escherichia sp. - - 1 2.56 - - 1 2.56 Kluyvera spp. 1 2.56 1 2.56 - - 2 5.13 Proteus spp. - - 2 5.13 - - 2 5.13 Providencia spp. 2 5.13 - - - - 2 5.13 Serratia spp. - - 2 5.13 - - 2 5.13 Vibrio cholerae non-O1/non-O139 - - 4 10.26 - - 4 10.26 Vibrio mimicus 1 2.56 - - - - 1 2.56 Vibrio vulnificus - - 1 2.56 - - 1 2.56
Total 13 33.33 21 53.85 5 12.82 39 100
Table 1- Bacteria isolated from Macrobrachium amazonicum and water from lake and hatchery tank
53
Vibrio spp. MIC (µg mL -1)
Ampicillin Azithromycin Doxycycline Trimethoprim/Sulfamethoxazole Chloramphenicol Ceftazidime Ciprofloxacin
Vibrio cholerae 4 0.5 0.062 0.0156/0.297 0.5 - - Vibrio cholerae 4 0.25 0.031 0.031/0.59 0.5 - - Vibrio cholerae 4 0.5 0.031 0.125/2.37 0.5 - - Vibrio cholerae 4 1 0.062 0.062/1.187 0.5 - - Vibrio vulnificus 16 0.25 0.031 0.031/0.59 0.5 0.5 0.001 Vibrio mimicus 0.125 1 0.031 0.125/2.37 0.5 1 0.001 E. coli (ATCC25922) 2 - 0.5 0.5/9.5 4 0.125 0.004 S. aureus (ATCC29213) - 2 - - - - -
Table 2- Minimum Inhibitory Concentration (MIC) of antibiotics against Vibrio spp. strains isolated from hatchery water and the digestive tract of Macrobrachium amazonicum.
54
7 CAPITULO 2
Vibrio cholerae não-O1/não-O139, Vibrio vulnificus, Vibrio mimicus associados ao cultivo do
camarão Macrobrachium amazonicum são inibidos pelos extratos de Moringa oleifera
Vibrio cholerae non-O1/non-O139, Vibrio vulnificus, Vibrio mimicus from farming of
Macrobrachium amazonicum prawn are inhibited by Moringa oleifera extracts
Periódico: Tropical Animal Health and Production – Regular Articles (Submetido em outubro de 2014)
55
Tropical Animal Health and Production – Regular Articles
Vibrio cholerae non-O1/non-O139, Vibrio vulnificus, V. mimicus from farming of
Macrobrachium amazonicum prawn are inhibited by Moringa oleifera extracts
Raimunda Sâmia Nogueira Brilhante, Jamille Alencar Sales, Celia Maria de Souza Sampaio,
Francisco Geraldo Barbosa, Manoel Paiva de Araújo Neto, Glaucia Morgana de Melo
Guedes, Lucas Pereira de Alencar, Yago Brito de Ponte, Tereza de Jesus Pinheiro Gomes
Bandeira, José Luciano Bezerra Moreira, Débora Souza Collares Maia Castelo-Branco,
Rossana de Aguiar Cordeiro, José Júlio Costa Sidrim, Marcos Fábio Gadelha Rocha
R. S. N. Brilhante (Corresp), D. S. C. M. Castelo-Branco, R. A. Cordeiro, J. J.C. Sidrim,
M. F.G. Rocha, G. M. M. Guedes, T. J. P. G. Bandeira, J. L. B. Moreira.
Department of Pathology and Legal Medicine, Postgraduate Program in Medical
Microbiology, Specialized Medical Mycology Center, Federal University of Ceará, Fortaleza,
Ceará, Brazil. Rua Coronel Nunes Melo, s/n, Rodolfo Teófilo. CEP: 60.430-270. Fortaleza,
CE, Brazil. E-mail: [email protected].
M. F.G. Rocha, J. A. Sales, L. P. Alencar, C. M. S. Sampaio, M.A.N. Paiva, Y. B. Ponte.
School of Veterinary Medicine, Postgraduate Program in Veterinary Sciences, State
University of Ceará, Fortaleza, Ceará, Brazil
F.G. Barbosa
Department of Organic and Inorganic Chemistry, Federal University of Ceará, Fortaleza,
Ceará, Brazil.
56
Summary
Based on a previous study of our group with M. oleifera against fungi associated with prawn
farming, we investigated the in vitro antimicrobial potential of extracts of stem, leaves,
flowers, pods and seeds of this plant against Vibrio spp. from hatchery water and the prawn
Macrobrachium amazonicum. The ethanol extracts of stem, leaves, pods and seeds and
chloroform extract of flowers of M. oleifera were tested against V. cholerae serogroups non-
O1/non-O139 (n=4), V. vulnificus (n=1) and V. mimicus (n=1). Escherichia coli
(ATCC25922) was used as quality control. Vibrio species were obtained from specimens of
ovigerous females from the natural environment and water samples from prawn hatchery. The
Minimum Inhibitory Concentration (MIC) was determined by broth microdilution method.
The best result was obtained with the ethanol extract of pods, which inhibited three strains of
the V. cholerae, V. vulnificus, V. mimicus and E. coli, with MIC values ranging from 0.312 to
5 mg/mL. The chloroform extract of flowers was effective against all V. cholerae strains
(MIC 0.625-1.25 mg/mL) and E. coli (MIC 1.25 mg/mL). The ethanol extract of leaves
inhibited two strains of the V. cholerae, V. mimicus and E. coli, with MIC ranging from 0.078
to 5 mg/mL. However, the ethanol extracts of stem and seeds showed low effectiveness in
inhibiting the growth of these strains. In short, the extracts of pods, flowers and leaves of M.
oleifera have potential for the control of Vibrio spp. Further studies are necessary to isolate
the bioactive compounds responsible for this antimicrobial activity.
Introduction
The cultivation of shrimp can be threatened by diseases caused by Vibrio species,
which can result in up to 100% mortality, 24 hours after the appearance of infection (Costa et
al. 2008). Vibrio cholerae, Vibrio mimicus and Vibrio vulnificus are opportunistic pathogens
capable of causing lethal infections in farmed crustaceans when there are stressful
environmental conditions, nutritional imbalance and predisposing lesions (Banerjee et al.
2012). Moreover, antimicrobial resistance in these microorganisms has been observed
(Rebouças et al. 2011).
The emergence of antibiotic resistant bacteria has driven research to find new
compounds with antimicrobial properties in plants used in traditional medicine, such as
Moringa oleifera (Lam.) (Chuang et al. 2007; Vieira et al. 2010; Arun & Rao 2011; Rocha et
al. 2011; Prosad & Elumalai 2011; Rocha et al. 2014; Arora & Onsare 2014).
57
M. oleifera is a well-known and widely distributed tree species, belonging to the
family Moringaceae (Anwar et al. 2007). In Brazil it can be found in the Northeast, mainly in
the states of Maranhão, Piauí and Ceará (Cysne 2006). The antimicrobial properties of M.
oleifera have been attributed to different parts of the plant, such as leaves, flowers, seeds,
pods and stems (Ferreira et al. 2011; Pexoto et al. 2011; Arora et al. 2013; Rocha et al. 2014).
The literature reports the antimicrobial potential of Moringa against bacteria (Vieira et al.
2010) and fungi (Rocha et al. 2014) isolated from shrimp farming.
Thus, the objective of this study was to evaluate the in vitro antimicrobial potential of
extracts of stem, leaves, flowers, pods and seeds of M. oleifera against Vibrio species isolated
from hatchery water and Macrobrachium amazonicum prawn.
Materials and Methods
-Extracts
The extracts were obtained from specimens of M. oleifera grown in Fortaleza, Ceará,
Brazil, and provided by the Laboratory of Applied Phytochemistry, Federal University of
Ceará. Stem, leaves, pods and seeds were dried in a heated chamber at 40°C and then
subjected to three successive extractions by cold maceration with ethanol at intervals of 24h,
originating the ethanol extracts, while flowers were dried at 40°C and then subjected to three
successive extractions by cold maceration with chloroform at intervals of 24h, originating the
chloroform extract. After filtration, the respective solvents were evaporated under reduced
pressure in a rotary evaporator, leaving only the concentrated constituents extracted from the
plant parts (Rocha et al. 2011).
- Strains of Vibrio spp.
V. cholerae serogroups non-O1/non-O139 (n=4), V. mimicus (n=1) and V. vulnificus
(n=1), belonging to the bacterial collection of the Laboratory of Emerging and Reemerging
Pathogens (LAPERE) of Ceará Federal University, were used in this study. These strains
were obtained through the collection of specimens of ovigerous M. amazonicum females from
Sapiranga Lake (3°48’3.46” S and 38°27’30.83” W), Fortaleza, Ceará, Brazil, and samples of
hatchery water from M. amazonicum farming, during the larval development stage, at the
Laboratory of Shrimp Farming of the State University of Ceará.
58
- In vitro susceptibility test
The in vitro susceptibility test with extracts of M. oleifera was performed following
the method described by Rocha et al. (2011), with some modifications. Initially, each extract
was dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO Sigma-Aldrich; USA) and then diluted in
Müeller-Hinton broth (Difco; USA). In previous tests with strains of Vibrio spp., we verified
that DMSO alone at concentrations up to 5% was not able to inhibit the growth of these
strains. Thus, the concentration of DMSO in the susceptibility test did not exceed 5%, to
assure that results refer to the action of each extract tested (Rocha et al. 2011).
The Minimum Inhibitory Concentration (MIC) of M. oleifera extracts against strains
of Vibrio spp. was determined through the broth microdilution method as standardized by the
Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI), based on the document M07-A9 (CLSI 2012).
The MIC was considered the lowest concentration of the extracts able to inhibit 50% of
bacterial growth compared to the control growth (Rocha et al. 2014). The strain Escherichia
coli (ATCC25922) was included as quality control. The initial concentration of each extract
used was 20 mg/mL and the range of concentrations evaluated in the susceptibility test was
from 0.01 to 5 mg/mL. The microdilution assays were performed in 96 well plates with a final
volume of 200 µL, incubated at 35°C and read after 20h, according to the document M45-A2
(CLSI 2010). The inocula were prepared at 0.5 McFarland turbidity (108 CFU/mL), and then
diluted with Müller-Hinton broth so that each well after inoculation presented approximately
5x105 CFU/mL. All assays were performed in duplicate, and for each strain growth control
and sterility control of the culture medium were included (CLSI 2012). The reading was
performed with a spectrophotometer (Epoch Microplate spectrophotometer – Biotek; USA) at
590 nm and the obtained absorbance values were corrected by the absorbance obtained for
each tested extract alone. Only extracts that inhibited the control strain (E. coli ATCC25922)
were considered as having antimicrobial effectiveness against Vibrio spp. Chloramphenicol
(Sigma Chemical Corporation, USA) was used as standard antibiotic, as recommended by
document M100-S22 (CLSI 2012).
-Research licensing
This study was previously approved by the Chico Mendes Institute for Conservation of
Biodiversity/Biodiversity Authorization and Information System – SISBIO, under the number
28175-1.
59
Results
The ethanol pod extract showed the best inhibitory activity against isolates from the
hatchery water samples, with MIC values ranging from 0.3125 to 1.25 mg/mL for three
strains of V. cholerae non-O1/non-O139 (3/4) and MIC 5 mg/mL for V. vulnificus. This
extract also showed inhibitory effect against V. mimicus from the digestive tract of M.
amazonicum and E. coli (ATCC25922), with MIC values of 1.25 mg/mL and 2.5 mg/mL,
respectively (Table 1).
The chloroform extract of flowers was effective against all strains of V. cholerae non-
O1/non-O139, with MIC values ranging from 0.625 to 1.25 mg/mL, as well as against E. coli
strain (ATCC25922) (MIC 1.25 mg/mL) (Table 1).
The ethanol extract of leaves, in turn, had inhibitory activity against two strains of V.
cholerae non-O1/non-O139 (2/4), with MIC values of 0.078 and 0.625 mg/mL, and also
presented MIC value of 5 mg/mL against V. mimicus and E. coli (Table 1).
The ethanol extract of stem and seeds showed low effectiveness in inhibiting the
growth of Vibrio spp. strains, as well as no effect against E. coli, as shown in Table 1. The
assay performed with the standard antibiotic, chloramphenicol, against the control strain E.
coli (ATCC25922) presented MIC value within the range established in the document M100-
S22 (CLSI 2012) (Table1).
Discussion
Almost all parts of the M. oleifera have multiple industrial and medical uses (Fahey
2005). The pharmacological potential of this plant has been described in the literature, in
particular the antimicrobial activity of the extracts of pods, flowers, leaves, stem and seeds
(Peixoto et al. 2011; Onsare et al. 2013; Arora & Onsare 2014; Rocha et al. 2014). Thus, this
study aimed to verify the antimicrobial activity of M. oleifera against Vibrio species,
considering that these microorganisms are opportunistic zoonotic pathogens and can cause
economic losses to shrimp farming and public health problems, as well (Austin 2010).
The results of this study demonstrate the antibacterial activity of extracts from
different parts of M. oleifera against Vibrio strains isolated from prawn hatchery water and
from M. amazonicum. The antibacterial activity of the extracts of leaves, flowers and pods has
been reported in other studies against Gram-negative bacteria (Anwar et al. 2007; Peixoto et
al. 2011; Arora & Onsare 2014). In addition, the antimicrobial activity of M. oleifera extracts
has also been observed against Candida species isolated from M. amazonicum farming in
previous study (Rocha et al. 2014).
60
The extracts of pods, flowers and leaves of M. oleifera showed to be more effective,
when compared to the other extracts. The ethanol extract of pods presented the best presented
inhibitory activity against species of Vibrio spp., and it was the only one capable of inhibiting
V. vulnificus. The growth of the E. coli strain (ATCC25922) was also inhibited by this extract.
Arora & Onsare (2014) verified the effectiveness of the pod extract of M. oleifera against the
Gram-negative bacteria Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli
and Salmonella typhimurium. However, there are few reports regarding the inhibitory effect
of extracts of M. oleifera against Vibrio species. The study performed by Peixoto et al.
(2011), demonstrated the inhibitory effect of leaf extract against V. parahaemolyticus.
Literature reports on the antimicrobial effects of M. oleifera extracts against V. cholerae, V.
vulnificus and V. mimicus, as shown in this study, are even scarcer, hence, these findings are
among the important strengths of this research.
Some studies on the history of traditional medicine demonstrated the effectiveness of
preparations made of leaves, pods, flowers and seeds against microorganisms that cause
human infections (Fahey 2005). Therefore, studies with V. mimicus, V. vulnificus and V.
cholerae non-cholera serogroup are important, because these bacteria inhabit estuarine and
marine environments and have often been associated with sporadic cases of diarrhea, sepsis
and infections, after ingestion of seafood or exposure to contaminated aquatic environment
(Igbinosa & Okoh 2008; Ottaviani et al. 2009; Austin 2010).
In a previous study by Rocha et al. (2014), the chloroform extract of flowers presented
antifungal activity against Candida spp. and Hortaea werneckii isolated from M. amazonicum
farming. Based on the observation of this antimicrobial action, we tested the chloroform
extract of flowers against Vibrio species from the same environment. The chloroform extract
of flowers also inhibit Vibrio strains from M. amazonicum cultivation water and the control
strain. According to Anwar et al. (2007), the antibacterial property of M. oleifera flowers has
been attributed to a substance called pterygospermin (Das et al. 1957). In addition to this
compound, other substances, such as benzyl glucosinolates and their cognate isothiocyanate
isolates of M. oleifera also have antimicrobial properties against bacteria (Fahey 2005).
Therefore, it is worth noting the need to investigate the bioactive compounds of plants that
exhibit antimicrobial activity.
The low antimicrobial effectiveness of extracts of seeds and stem of M. oleifera found
in this study also has been demonstrated by other authors (Jabeen et al. 2008; Arora et al.
2013; Rocha et al. 2014). Probably, this low antimicrobial effectiveness can be associated
61
with inherent factors of Vibrio spp. which decrease or neutralize the activity of the bioactive
compounds contained in the seeds and stem of M. oleifera (Singh et al. 2013).
Thus, the ethanol extracts of pods and leaves and the chloroform extract of flowers of
M. oleifera presented potential to control Vibrio spp., although further research is necessary to
determine the bioactive compounds responsible for this antimicrobial activity.
Acknowledgement
This work was supported by grants from the Coordination Office for the Improvement
of Higher Education Personnel (AEI-0052-000650100/11).
Conflict of interest: The authors declared no conflict of interest.
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Table 1 –Minimum inhibitory concentration (MIC) values Moringa oleifera extracts against Vibrio spp. recovered from hatchery water and Macrobrachium amazonicum prawn.
Source Species MIC (mg/mL) MIC (µg/mL)
Extracts
Hatchery water
Ethanol Stem Ethanol Leaves Chloroform Flowers Ethanol Pods Ethanol Seeds Chloramphenicol
Vibrio cholerae n.i 0.078 1.25 0.3125 5 0.5
Vibrio cholerae n.i 0.625 0.625 n.i n.i 0.5
Vibrio cholerae n.i n.i 0.625 1.25 n.i 0.5
Vibrio cholerae 2.5 n.i 0.625 0.3125 2.5 0.5
Vibrio vulnificus n.i n.i n.i 5 n.i 0.5
Prawn Vibrio mimicus 1.25 5 n.i 1.25 n.i 0.5
Escherichia coli
ATCC25922 n.i 5 1.25 2.5 n.i 4
66
8 CONCLUSÕES
1. As principais enterobactérias isoladas da microbiota associada à carcinicultura de M.
amazonicum pertencem aos gêneros Enterobacter e Citrobacter;
2. As espécies V. cholerae não-O1/não-O139, V. vulnificus e V. mimicus fazem parte da
microbiota relacionada à carcinicultura de M. amazonicum;
3. As cepas de Vibrio spp. isoladas das amostras de água da larvicultura e do trato digestivo
de M. amazonicum apresentaram valores de CIM no range estabelecido pelo CLSI para todos
os antibióticos, exceto V. vulnificus que apresentou o perfil intermediário para ampicilina;
4. Os extratos de vagens, flores e folhas de M. oleifera apresentam potencial para o controle
de V. cholerae não-O1, não-O139, V. mimicus e V. vulnificus.
67
9 PERSPECTIVAS
O conhecimento da flora bacteriana associada à carcinicultura de M. amazonicum
é de grande importância, pois auxilia na compreensão da dinâmica microbiana, que é
essencial para prevenção de doenças, na elaboração de dietas adequadas, na otimização dos
sistemas de produção e investigação das condições ambientais onde estes animais estão
inseridos. Este trabalho contribui com dados relevantes sobre a composição da microbiota
bacteriana que compõe o trato digestório e o ambiente de cultivo em cativeiro de M.
amazonicum.
O monitoramento do perfil de sensibilidade de cepas de Vibrio oriundas do
ambiente de cultivo de M. amazonicum é bastante escasso, sendo limitado o número de
trabalhos nessa área. Ademais, a sensibilidade dos isolados de Vibrio aos antibióticos
utilizados, em destaque o perfil diferenciado da cepa V. vulnificus frente à ampicilina,
contribuem com informações adicionais referentes às cepas provenientes da carcinicultura do
camarão M. amazonicum, aumentando o conhecimento biológico de cultivo do camarão, e
reflete a importância do monitoramento do uso de drogas na carcinicultura.
O potencial antimicrobiano da M. oleifera frente às cepas Vibrio spp. desperta o
interesse na investigação dos compostos bioativos promissores para o controle antimicrobiano
em vários seguimentos da área de produção e saúde animal. Esta planta vem sendo
considerada como uma alternativa à utilização de drogas antimicrobianas na carcinicultura,
atuando na prevenção de doenças e no controle da flora de ambientes de cultivo, de forma a
favorecer para crescente produtividade dos organismos aquáticos e causar menos efeitos
deletérios na produção.
68
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Lelliottia nimipressuralis comb. nov. and Lelliottia amnigena comb. nov., respectively, E. gergoviae and E. pyrinus into Pluralibacter gen. nov. as Pluralibacter gergoviae comb. nov. and Pluralibacter pyrinus comb. nov., respectively, E. cowanii, E. radicincitans, E. oryzae and E. arachidis into Kosakonia gen. nov. as Kosakonia cowanii comb. nov., Kosakonia radicincitans comb. nov., Kosakonia oryzae comb. nov. and Kosakonia arachidis comb. nov., respectively, and E. turicensis, E. helveticus and E. pulveris into Cronobacter as Cronobacter zurichensis nom. nov., Cronobacter helveticus comb. nov. and Cronobacter pulveris comb. nov., respectively, and emended description of the genera Enterobacter and Cronobacter. Systematic and Applied Microbiology, v.36, p. 309-319, 2013. BRAZIL, J.M.V.; ALVES, R.M.; RIVERA, I.N.G.; RODRIGUES, D.P.; KARAOLIS, D.K.R.; CAMPOS, L.C. Prevalence of virulence-associated genes in clinical and environmental Vibrio cholerae strains isolated in Brazil between 1991 and 1999. FEMS Microbiology Letters, v. 215, p.15-21. 2002. BRASIL. Ministério da Saúde. Agencia Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução nº 357 de 17 de março de 2005. Brasília: ANVISA, 2005. BUGLIONE, C.C.; PEDROTTI, F.; VIEIRA, F.N. Avaliação de bacteriana e Lactobacillus plantarum frente à infecção experimental por Vibrio harveyi em pós-larvas de Litopenaeus vannamei. Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science, v.45, p.40-45, 2008. CABELLO, F.C. Heavy use of prophylactic antibiotics in aquaculture: a growing problem for human and animal health and for the environment. Environmental Microbiology, v.8, p.1137-1144, 2006. CABELLO, F. C.; GODFREY, H. P.; TOMOVA, A.; IVANOVA, L.; DÖLZ, H.; MILLANAO, A.; BUSCHMANN, A. H. Antimicrobial use in aquaculture re-examined: its relevance to antimicrobial resistance and to animal and human health. Environmental Microbiology, v.15, p.1917-1942, 2013. CENTER FOR SCIENCE IN THE PUBLIC INTEREST. Closing the Gops in our Federal Food-Safety Net, 28p. Washington: Center for Science in the Public Interest, 2007, p. 1-6. CENTRO NACIONAL DE EPIDEMIOLOGIA- Fundação Nacional de Saúde, Ministério da Saúde. Boletim Epidemiológico, v.1, p.1-9, 2001. CHANDER, Y.; GOYAL, S.M.; GUPTA, S.C. Antimicrobial resistance of Providencia spp. isolated from animal manure. The Veterinary Journal, v.172, p.188-191, 2006. CHATTERJEE, S.; GHOSH, K.; RAYCHOUDHURI, A.; CHOWDHURY, G.; BHATTACHARYA, M. K.; MUKHOPADHYAY, A. K.; RAMAMURTH Y, T.; BHATTACHARYA, S. K.; KLOSE, K. E.; NANDY, R. K. Incidence, virulence factors and clonality among clinical strains of Non-O1, Non-O139 Vibrio cholerae isolates from hospitalized diarrheal patients in Kolkata, India. Journal of Clinical Microbiology, v.47, p.1087-1095, 2009. CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE. Methods for Antimicrobial Dilution and Disk Susceptibility Testing of Infrequently Isolated or Fastidious Bacteria; Approved Guideline - Second Edition. CSLI document M45-A2, 2010.
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APÊNDICES APÊNDICE A - Processo de execução laboratorial para isolamento e caracterização metabólica de enterobactérias e Vibrio.
Isolamento primário
Coloração de Gram Repique: Ágar MacConkey Ágar SS
Coletas
Ágar BHI Ágar MacConkey Ágar SS
Bactérias Gram-negativas
Teste de oxidase
Oxidase negativo ENTEROBACTÉRIAS
Oxidase positivo Vibrio
Provas bioquímicas: TSI
Fenilalanina Citrato
Descarboxilase (lisina, arginia, ornitina)
Vogues-Proskauer Indol
Motilidade H2S
Triagem bioquímica: OFglicose
Urease Indol
Motilidade
Identificação Vitek2
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APÊNDICE B – Material utilizado durante o período de coleta e identificação de microrganismos
Figura 7- A) Fêmea M. amazonicum. B) Trato digestivo de M. amazonicum composto por a) esôfago, b)estômago, c) intestino e d) reto.
A B
Figura 8- Fita teste reativo para oxidase (NewProv, Brasil). a) Controle positivo, Pseudomonas aeruginosa (ATCC27853). b) Vibrio, oxidase-positivo. c) Controle negativo, Escherichia coli (ATCC25922).
d)Enterobacter, oxidase-negativo.
b a
d c
a
b c d
Fonte: LACAR, 2013
Fonte: LAPERE, 2013
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APÊNDICE C - Testes utilizados para avaliar as características metabólicas das enterobactérias, de acordo com Koneman et al., (2012)
1. Teste utilização de carboidratos (ágar TSI)
Princípio: Fermentação de carboidratos presentes no meio e produção de sulfeto de hidrogênio (H2S).
Procedimento: Inoculação com agulha na base e fazer estria na inclinação.
Condições de incubação: 35ºC por 18 a 24h
Interpretação dos resultados:
a. Produção de gás: Nota-se pela ocorrência de quebras ou espaçamento no meio de cultura.
b. Inclinação ácido/fundo ácido (A/A): Ocorreu a fermentação da glicose e da sacarose.
c. Inclinação alcalina/fundo ácido (K/A): Só a glicose foi fermentada
d. Inclinação alcalina/fundo ácido preto (K/AH2S): Fermentação da glicose e produção de sulfeto de hidrogênio.
e. Inclinação alcalina/fundo alcalino (K/K): Não ocorreu fermentação de carboidratos.
a/b c d e
Fonte: www.microclinica.ufsc.br. Acesso em 2013.
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2. Utilização de citrato Princípio: Algumas bactérias conseguem obter energia de outra maneira que não pela fermentação de carboidratos, usando o citrato como a única fonte de carbono. A detecção da utilização de citrato é dada pela formação de subprodutos alcalinos. Os meio utilizados para esta prova devem ser desprovidos de proteínas e carboidratos como fontes de carbono.
Procedimento: a partir de uma colônia isolada, inocula-se em uma estria única na superfície inclinada do tubo ágar citrato.
Condições de incubação: 35ºC por 24 a 48 horas
Interpretação dos resultados:
Um teste positivo é representado pelo aparecimento de uma cor azul-escura dentro de 24-48h, indicando que o microrganismo teste foi capaz de utilizar o citrato contido no meio, com a formação de produtos alcalinos. Um teste positivo também pode ser lido sem a cor azul se houver crescimento visível de colônias ao longo da linha da estria de inoculação.
Controle:
Positivo: Klebsiella Negativo: E.coli
Fonte: LAPERE, 2013.
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3. Produção de fenilalanina desaminase
Princípio: Detecção do ácido fenilpirúvico no meio teste depois do crescimento do microrganismo suspeito.
Procedimento: O meio ágar inclinado é inoculado com uma única colônia do microrganismo teste, em estria. Após a incubação, são adicionadas 4 a 5 gotas do reagente cloreto férrico a 10% diretamente na superfície do ágar. Ao adicionar o reagente, faz se uma rotação do tubo para desprender as colônias da superfície.
Condições de incubação: 35ºC por 18-24 horas.
Interpretação dos resultados: O teste é positivo se houver o aparecimento de uma cor verde visível com após adição de uma solução e cloreto férrico a 10%.
Controle:
Positivo: Proteus Negativo: E. coli
Fonte: LAPERE, 2013.
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4. Produção de urease
Princípio: Determinar a capacidade do microrganismo de hidrolisar a uréia através da produção da enzima urease. A amônia liberada pela hidrólise da amina reage em solução formando carbonato de amônio, resultando na alcalinização e em aumento do pH do meio.
Procedimento: A superfície do ágar inclinado é inoculada por um colônia pura do microrganismo, e semeada por estria.
Condições de incubação: 35ºC por 18-24 horas
Interpretação dos resultados: A coloração rosada de todo meio indica alcalinização e hidrólise da uréia. Ausência da hisrólise da uréia, o meio permanece de cor amarelada original.
Controle
Positivo: Klebsiella Negativo: E. coli
Fonte: LAPERE, 2013.
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5. Descarboxilação de aminoácidos
Princípio: bactérias que produzem enzimas descarboxilases capazes de reagir com a aporção carboxila (COOH) dos aminoácidos presente no meio, formando aminas de reação básicas. Esta reação é denominada de descarboxilação. Os produtos amina específicos são: Lisina � Cadaverina; Ornitina � Putrescina; Arginina � Citrulina. A conversão da arginina em citrulina é uma reação de diidrolase, em que o grupo NH2 é removido do aminoácido.
Procedimento: Inocular uma colônia isolada do microrganismo teste, e inocular em tubos contendo o meio ágar com aminoácido a ser testado. É importante utilizar um tubo controle, contendo meio ágar e desprovido de aminoácido. Sobreponha aos tubos, uma camada de óleo mineral estéril, cobrindo cerca de 1 cm da superfície.
Condições de incubação: 35ºC por 18-24 horas
Interpretação dos resultados: A conversão do tubo controle para uma cor amarela indica que o microrganismo esta viável e que o ph do meio foi diminuído o suficiente para ativar as enzimas descarboxilases. A reversão do tubo contendo o aminoácido para a cor azul-púrpura indica um teste positivo, devido à formação de aminas alcalinas pela reação da descarboxilase.
Controles:
Klebsiella – Lisina (positivo); Ornitina (negativo); Arginina (negativo).
E. coli – Ornitina (positivo); Lisina (positivo); Arginina (negativo).
A B
Cont Lis Orn Arg Orn Lis Arg Cont
Fonte: LAPERE, 2013.
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6. Reação de Voges-Proskauer
Princípio: Determinar a capacidade dos microrganismos produzirem acetoína (acetil metil carbinol) como produto final de uma reação de degradação fermentativa de glicose. Na presença de oxigênio atmosférico e de hidróxido de potássio a 40%, a acetoína é convertida em diacetil, e o α-naftol serve como catalisador para a produção de um complexo vermelho.
Procedimento: Inocular um tubo de meio líquido com uma colônia pura do microrganismo. Após o período de incubação, hidróxido de potássio a 40% e, em seguida, α-naftol a 5%. Agitar levemente o tubo para expor o meio ao oxigênio e deixar permanecer em repouso por 15min.
Condições de incubação: 35º C por 18-24 horas
Interpretação dos resultados: Uma reação positiva é representada pelo desenvolvimento de uma cor rosa/vermelha no meio após 15 minutos ou mais após a adição dos reagentes indicando a presença de diacetil, o produto de oxidação da acetoína.
Controle
Positivo: Klebsiella Negativo: E.coli
Fonte: LAPERE, 2013.
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7. Produção de sulfeto, indol e motilidade (Meio SIM)
Princípio: O meio SIM possibilita avaliar a motilidade e a produção do indol e do H2S. A motilidade é avaliada quando há deslocamento de bactérias através de flagelos, cujo número e localização variam entre as diferentes espécies. Quanto ao indol, benzilpirrol, é um dos produtos da degradação metabólica do aminoácido triptofano. Portanto, as bactérias que produzem a enzima triptofanase são capazes de hidrolisar e desaminar o triptofano, com produção de indol, ácido pirúvico e amônia. O teste de indol se baseia na formação de um complexo vermelho quando o indol reage com o grupo aldeído do p-dimetilaminobenzaldeído. Este é um composto químico ativo nos reagentes de Kovac. A avaliação para produção de H2S, o meio SIM é mais sensível por ser semi-sólido, ausente de carboidratos e contém ferro peptonizado como indicador.
Procedimento: Introduzir agulha com a colônia até o fundo do tubo sem mexer e incubar. Após o período de incubação em estufa bacteriológica, acrescentar 110 gotas do reagente de Kovac.
Condições de incubação: 35ºC por 18-24 horas
Interpretação dos resultados: O teste de motilidade é interpretado por exame macroscópico do meio à procura de uma zona difusa de crescimento projetada a partir da linha de inoculação. A motilidade deve ser interpretada primeiramente. A detecção de sulfeto de hidrogênio pela produção de sulfitos insolúveis de metais pesados é visto como um precipitado enegrecido no meio. Finalmente, o aparecimento da cor vermelha na interface do reagente com o meio após a adição do reativo de Kovac, o teste é positivo para produção de indol.
Controle
E. coli: Motilidade (positivo); produção de H2S (negativo); Indol (positivo); Klebsiella: Motilidade (negativo); produção de H2S (negativo); Indol (negativo)
A B C
Figura: A) Produção de H2S (positivo); Indol (negativo). B) Indol (positivo);
motilidade (positiva). C) Indol (negativo); motilidade (negativo). Fonte: LAPERE, 2013.
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8. Teste fermentativo-oxidativo
Princípio: os microrganismos sacarolíticos degradam a glicose por fermentação ou por oxidação. O meio OF (Hugh e Leifson) é utilizado para detecção de ácidos formados na degradação oxidativa ou fermentativa da glicose.
Procedimento: São necessários dois tubos para o teste OF, cada um deles inoculado com o microrganismo desconhecido, usando uma agulha reta e perfurando o meio a caminho do fundo do tubo. Um tubo de cada par é recoberto com uma camada de 1cm de óleo mineral.
Condições de incubação: 35ºC examinar de 24-48h.
Interpretação dos resultados: o microrganismo que apresentar um metabolismo fermentativo, os dois tubos apresentam o meio com coloração amarelada. O microrganismo que apresenta o metabolismo oxidativo, o tubo com óleo apresenta o meio com coloração inalterada, excluindo a exposição ao oxigênio. Ácido (amarelo) só é observado na porção superior do tubo sem o óleo, indicando que o microrganismo é capaz de oxidar a glicose, porém não fermenta glicose. Aquele microrganismo que não altera a coloração do meio dos dois tubos apresenta um metabolismo não-sacarolítico.
Controle:
Fermentador de glicose: E. coli Oxidador de glicose: Pseudomonas aeruginosa Não-sacarolíticas: espécies de Moraxella
Fonte: LAPERE, 2013.
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