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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ
FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
EMMANUEL TELES SALES
PARÂMETROS INFLAMATÓRIOS E IMUNOEXPRESSÃO DE TLR-2, TLR-4,
COX-2 e VEGF NA PELE DE CÃES NATURALMENTE INFECTADOS POR
Leishmania infantum
FORTALEZA – CEARÁ
2017
EMMANUEL TELES SALES
PARÂMETROS INFLAMATÓRIOS E IMUNOEXPRESSÃO DE TLR-2, TLR-4, COX-2 e
VEGF NA PELE DE CÃES NATURALMENTE INFECTADOS POR Leishmania infantum
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação
em Ciência Veterinárias da Faculdade de Veterinária da
Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial
para obtenção do título de Mestre em Ciências
Veterinárias. Área de Concentração: Reprodução e
Sanidade Animal.
Linha de pesquisa: Reprodução e sanidade de carnívoros,
onívoros, herbívoros e aves.
Orientadora: Prof.ª Dr.ª Diana Célia Sousa Nunes-
Pinheiro.
FORTALEZA – CEARÁ
2017
RESUMO
A pele é a primeira barreira mecânica de proteção contra patógenos do ambiente. Na
leishmaniose visceral canina (LVC), a infecção ocorre pelo rompimento da barreira da pele
pelo flebotomíneo infectado que inocula o protozoário Leishmania infantum. Esses agentes
infecciosos desencadeiam respostas imune e inflamatória severas no animal que podem ser
avaliadas sistemicamente e no local da infecção. Na LVC, uma resposta inflamatória é
desencadeada no sítio infeccioso por células sentinelas que liberam mediadores inflamatórios
e citocinas e induzem ao recrutamento de células inflamatórias. Neste trabalho objetivou-se
caracterizar o perfil hematológico e bioquímico e avaliar as expressões de VEGF+, COX-2+,
TLR-2+ e TLR-4+ na pele de cães naturalmente infectados por L. infantum. Para tanto, cães
soropositivos (n=33) foram divididos nos grupos assintomático (GA, n=10) e sintomático
(GS, n=23), de acordo com a presença ou ausência de alterações dermatológicas, comparados
com o grupo de animais soronegativos (GC, n=5). As principais manifestações clínicas
observadas em GS foram alopecia, onicogrifose, ceratoconjuntivite e dermatites eritematosas,
esfoliativas e ulcerativas. Amostras de sangue foram coletadas para avaliação dos parâmetros
hematológicos e bioquímicos. Biópsias da pele foram coletadas da região escapular e da ponta
de orelha, processados para histologia para avaliação do infiltrado inflamatório (ausente, leve,
moderado e intenso) e imunoistoquímica com anticorpos monoclonais anti-VEGF+, anti-
COX-2, anti-TLR-4 e anti-TLR-2 (ausente, leve, moderado e intenso). Os animais
sintomáticos para LVC apresentaram albuminemia, leucocitose e outras alterações
hematológicas compatíveis com descrições da literatura. A contagem diferencial leucocitária
apontou para uma neutrofilia e linfopenia significativas do GS quando comparadas aos
demais grupos (p < 0,05), estando esse resultado confirmado pela razão neutrófilo:linfócito,
também significativamente aumentada. Na histologia foi evidenciado infiltrado inflamatório
intenso em GS em relação ao GA e GC. As expressões de VEGF+, COX-2+ e TLR-2 estavam
aumentadas na pele de animais GS (intenso) quando comparadas a GA (moderado) e GC
(leve), enquanto que a marcação de TLR-4, não foi alterada entre os grupos avaliados. Estes
dados indicam o envolvimento de VEGF+ e COX-2, pela ativação do TLR-2, o que pode
sugerir uma relação da via de transcrição do NF-kB pelo TLR-2 e não pelo TLR-4 em
resposta a infecção por L. infantum.
PALAVRAS-CHAVE: Cães, Leishmania infantum, VEGF, COX-2, TLR-2 e TLR-4.
ABSTRACT
The skin is a mechanical barrier in the protection against environmental pathogens. In Canine
Leishmaniasis (CanL), the infection occurs through phlebotomine vectors that inoculate
Leishmania infantum through the skin. These infectious agents elicit severe immune and
inflammatory responses in the animal that can be assessed both systemically and at the site of
infection. In response to the infection, sentinel cells triggered an inflammatory response
trough the release of mediators and cytokines that induce recruitment of inflammatory cells to
the local of infection. The objective of this study was to characterize the hematological
biochemical profile and to evaluate the expression of VEGF+, COX-2+, TLR-2+ and TLR-4+
in the skin of dogs naturally infected by L. infantum. Therefore, seropositive dogs (n = 33)
were divided into asymptomatic (AG, n = 10) and symptomatic (SG, n = 23) groups,
according to the presence or absence of dermatological alterations, compared to the
seronegative group (CG, n = 5). The main clinical manifestations observed in SG were
alopecia/hypotrichosis, onychogryphosis, keratoconjunctivitis and erythematous, exfoliative
and ulcerative dermatitis. Blood samples were collected for evaluation of hematological and
biochemical parameters. Skin biopsies were collected from the scapular region and the ear tip,
processed for histology to evaluate the inflammatory infiltrate (absent, mild, moderate and
intense) and for immunohistochemistry to evaluate the expressions of VEGF+, COX-2, TLR-
4 and TLR-2 (absent, mild, moderate and intense). The symptomatic animals for LVC
presented albuminemia, leukocytosis and other hematological alterations compatible with
descriptions in literature. The differential blood count shows a significant neutrophilia and
lymphopenia in CG when compared to the other groups (p <0.05), and this result was
confirmed by the neutrophil: lymphocyte ratio, also significantly increased. In the histological
evaluation, both SG and AG presented inflammatory infiltrate. The expressions of VEGF +,
COX-2 + and TLR-2 were increased at skin from dogs SG (intense) when compared to AG
(moderate) and CG (mild), whereas TLR-4 was not detected between groups evaluated. These
data indicate the involvement of TLR-2 in CanL and suggest the NF-kB transcription factor
pathway to the VEGF + and COX-2 expressions in cutaneous immune system in response to
L. infantum. TLR-4 not participate of this event in dogs naturally infected by L. infantum.
KEY-WORDS: Dogs, Leishmania infantum, VEGF, COX-2, TLR-2 and TLR-4
LISTA DE FIGURAS
REVISÃO DE LITERATURA
Figura 1 Ciclo biológico da Leishmania spp............................................. 12
Figura 2 Neutrófilos, macrófagos, células dendríticas e monócitos em
suas diferentes respostas frente à infecção por Leishmania
spp..................................................... ...........................................
15
Figura 3 Vias de sinalização dos receptores do tipo Toll 2 e 4 em
resposta ao lipofosfoglicano (LPG) da Leishmania
spp.................................................................................................
17
Figura 4 Resposta de fase agudada e regulação da expressão hepática
das APP desencadeada pelo estimulo oriundo de desafios
diversos, tais como infecção e danos teciduais que podem
levar a inflamação.............................. ........................................
21
Figura 5 Cascata de migração neutrofílica do espaço vascular para o
sítio de infecção........................... ................................................
22
CAPÍTULO I
Figura 1 Contagem diferencial entre os leucócitos, neutrófilos,
linfócitos e monócitos nos grupos controle (GC),
assintomático (GA) e sintomático (GS). Letras (a) e (b)
denotam diferença significativa entre os grupos avaliados (p
< 0,05)...........................................................................................
40
Figura 2 Percentagem de neutrófilos imaturos nos grupos controle
(GC), assintomático (GA) e sintomático (GS) para
Leishmaniose canina. Não foram observadas diferenças
significativas entre os grupos avaliados (p < 0,05)..................
40
Figura 3 Razão entre neutrófilos e linfócitos nos grupos controle
(GC), assintomático (GA) e sintomático (GS). Letras
diferentes denotam diferença significativa entre os grupos
avaliados (p < 0,05)..................................................................... 41
Figura 4. Razão entre albumina e globulina nos grupos controle (GC),
assintomático (GA) e sintomático (GS). Letras diferentes
denotam diferença significativa entre os grupos avaliados (p
< 0,05)...........................................................................................
41
CAPÍTULO II
Figura 1 Clinical and dermatologial findings of dogs naturally
infected by L. infantum...............................................................
53
Figura 2 Histopathological and immunohistochemistry of skin dogs
naturally infected by L. infantum................................………..
54
LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO I
Tabela 1 Análise hematológica e proteica em cães naturalmente
infectados por L. infantum..........................................................
39
CAPÍTULO II
Tabela 1 Expressions of COX-2+, VEGF +, TLR-2, TLR-4 and L.
infantum on skin of dogs naturally infected with L.
infantum..........................................................................................
53
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Ac Anticorpo
AMP Peptídeos antimicrobianos
APCs Células apresentadoras de antígenos
CanL Leishmaniose canina
CCZ Centro de Controle de Zoonoses
CD4+ Células T auxiliares
CDs Células dendríticas
CEUA Comitê de Ética em Uso de Animais
CanL
CLs
Leishmaniose Visceral Canina
Células de Langerhans
DAB Diaminobenzidina
DAMPs Padrões moleculares associados ao dano celular
EDTA Anticoagulante
ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay
GM-CSF Fator Estimulador de Colônia de Monócitos e Granulócitos
HGB Hemoglobina
HE Hematoxilina-Eosina
H2O2 Peróxido de Hidrogênio
IgE Imunoglobulina E
IL Interleucina
LC Leishmaniose cutânea
LM Leishmaniose mucocutânea
LV Leishmaniose Visceral
LVC Leishmaniose Visceral Canina
moCDs Células dendríticas derivadas de monócitos
mg Miligrama
mL Mililitro
NKT Linfócitos T Natural Killer
NO Óxido nítrico
PAMP Peptídeos moleculares associados aos patógenos
PBS Phosphate Buffer Saline (Tampão salina fosfato)
PLT Plaquetas
RBC Red blood cell (Hemácias)
EROs Espécies reativas de oxigênio
TGF-β Fator de Crescimento Tumoral
TLR Receptores do tipo Toll
TNF-ɑ Fator de Necrose Tumoral
U/L Unidades por litro
WBC White blood cell (Leucócitos)
µg Microlitro
ºC Graus Celsius
% Porcentagem
SU M Á R I O
1 INTRODUÇÃO................................................................................................... 11
2 REVISÃO DE LITERATURA........................................................................... 12
2.1 LEISHMANIOSE................................................................................................. 12
2.1.1 O ciclo da Leishmania spp................................................................................. 13
2.2 RESPOSTA IMUNE CUTÂNEA À Leishmania spp......................................... 13
2.2.1 A pele.................................................................................................................. 13
2.2.2 Os mecanismos gerais de defesa da pele contra Leishmania spp.................. 14
2.2.3 Os receptores do tipo Toll na leishmaniose....................................................... 16
2.2.4 O processo inflamatório da pele ...................................................................... 20
2.3 INFILTRADO NEUTROFILICO.......................................................................
2.4 FATOR DE CRESCIMENTO ENDOTELIAL VASCULAR (VEGF) NA
INFECÇÃO POR Leishmania spp......................................................................
2.5 CICLOXIGENASE-2 (COX-2) NA INFECÇÃO POR Leishmania spp...........
22
23
24
3 JUSTIFICATIVA................................................................................................ 26
4 HIPÓTESE CIENTÍFICA.................................................................................. 27
5 OBJETIVOS........................................................................................................ 28
5.1 OBJETIVO GERAL.............................................................................................. 28
5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS................................................................................ 28
6 CAPÍTULO I - Leucocitose e albuminemia em sangue periférico de cães
naturalmente infectados por Leishmania infantum........................................
29
7 CAPÍTULO II - Parâmetros inflamatórios e expressões de TLR-2, TLR-
4, COX-2 e VEGF na pele de cães naturalmente infectados por
Leishmania infantum.........................................................................................
42
8 CONCLUSÕES................................................................................................... 55
9 PERSPECTIVAS................................................................................................. 56
REFERÊNCIAS.................................................................................................. 57
ANEXO................................................................................................................. 66
ANEXO A - COMITÉ DE ÉTICA....................................................................... 67
11
1 INTRODUÇÃO
As leishmanioses são zoonoses desencadeadas por protozoários do gênero Leishmania
spp. e possuem grande importância para a saúde pública, tanto por sua elevada incidência na
rotina veterinária como também por sua importância na clínica humana, estando o Brasil entre
os países da América Latina que apresenta maior número de casos humanos (MONTEIRO et
al., 2005). Nas zonas urbanas o cão é considerado o principal reservatório da leishmaniose
(MAIA et al., 2013) e quando acometido pela forma visceral da leishmaniose (LVC) pode
apresentar um amplo espectro de respostas, desde ausência de sintomatologia até uma
sintomatologia bastante severa, como: perda de peso, caquexia, alopecia, dermatites, diarreia,
conjuntivite, onicogrifose (FREITAS et al., 2012) podendo também levar a morte. É comum
o surgimento de dermatites ou alterações cutâneas nos animais infectados, dentre as principais
alterações observadas temos as dermatites crônicas, alopecia (principalmente na zona
periocular, pregas de pele e articulações), anomalias de cornificação, seborréia seca,
hiperqueratose, paroníquia, crostas, onicogrifose e úlceras, além de lesões no focinho e ponta
da orelha (SANTOS, 2006; PINHÃO et al, 2009; FREITAS et al., 2012) .
A instalação de agentes infecciosos em animais e seu desenvolvimento, de um modo
geral, acarretam diversas alterações inflamatórias no paciente, mediadas principalmente por
citocinas e mediadores inflamatórios controlados pela via do fator nuclear kappa beta (NF-kβ)
(VALLABHAPURAPU; KARIN, 2009). Essa via inflamatória também é estimulada no caso
de infecção pelos agentes da Leishmania spp., desde o momento da inoculação do protozoário
pelo flebotomíneo, quando células de defesa do animal entram em contato com os PAMPS do
agente infectante. O reconhecimento desses PAMPS é realizado por receptores do tipo Toll
(TLR) (MOGENSEN, 2001), que irão ativar a resposta inflamatória do NF-kβ. Essa via de
identificação por intermédio de TLR tem sido considerado um importante mecanismo de
defesa contra a leishmaniose canina (AMORIM et al, 2011). A via do NF-kβ tem sido
estudada por sua importância na promoção da transcrição de genes associados a mediadores
da resposta inflamatória, o que desencadeia a síntese de diversas citocinas pró-inflamatórias
como TNF-α, IL-1β, IL-6 e IL-8 (VALLABHAPURAPU; KARIN, 2009). Outros mediadores
liberados por esta ativação como a cicloxigenase-2 (COX-2) (TAK; FIRESTEIN, 2001) e o
fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF) (XIE et al., 2010) são ainda pouco
estudados em cães durante a infecção por Leishmania spp., mas podem ser potencialmente
importantes para o desenvolvimento e visceralização da LVC (GREGORY et al, 2008).
12
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 LEISHMANIOSE
A leishmaniose é uma zoonose grave que ocorre devido à transmissão da Leishmania
spp. que são organismos pertencentes ao reino Protista, família Trypanosomatidae, gênero
Leishmania e diversas espécies. O parasita é transmitido ao homem pelo vetor flebotomíneo,
possuindo várias formas de apresentação, sendo elas: cutânea (LC), mucocutânea (LMC) e a
forma visceral (LV) (BRASIL, 2014). A forma visceral é a mais severa, possuindo alta taxa
de mortalidade quando não tratada, sendo considerada endêmica no Brasil (WHO, 2016). São
conhecidos como agentes etiológicos da leishmaniose canina (CanL) do tipo visceral no brasil
as espécies: L. chagasi e a L. infantum, sendo ambos considerados sinonímias (DANTAS-
TORRES, 2006). O principal vetor biológico da LV são insetos, fêmeas, da ordem Diptera,
família Psychodidae, subfamília Phlebotominae gênero Phlebotomus e Lutzomyia
(SHARMA; SINGH, 2008). Os principais hospedeiros mamíferos são roedores, carnívoros e
primatas, sendo o cão (Canis familiaris) considerado o principal reservatório e fonte de
infecção doméstica da L. infantum (WHO, 2016).
Figura 1: Ciclo biológico da Leishmania spp.
Fonte: Adaptado de KAYE; SCOTT, 2011.
13
2.1.1 O ciclo da Leishmania spp.
A Leishmania spp. possui ciclo biológico heteróxeno, com uma fase dentro do trato
digestivo do flebotomíneo e outra fase no hospedeiro mamífero. A forma móvel e flagelada da
Leishmania spp. é denominada de promastigota, ela se desenvolve no intestino do
flebotomíneo em vários estágios morfológicos até se tornar a forma infectante, não replicativa
e metacíclica (Fig. 1) (KAYE; SCOOT, 2011). Essa é a forma transmitida aos mamíferos
durante o repasto sanguíneo das fêmeas, que se torna então a forma amastigota sem flagelo,
parasita intra-celular de diversas células de defesa do hospedeiro. A forma amastigota se
multiplica por divisão e infecta outras células mononucleares fagocíticas. O ciclo se completa
quando flebotomíneos ingerem as células infectadas por amastigotas de mamíferos
hospedeiros, que se transformam novamente em promastigotas no intestino e migram de volta
para a proboscida (CDC, 2016).
2.2 RESPOSTA IMUNE CUTÂNEA À Leishmania spp.
2.2.1 A pele
A pele recobre a superfície do corpo dos animais formando uma barreira física, sendo
esse um dos principais mecanismos de defesa inicial dos animais contra agentes exógenos. A
pele é constituída pela epiderme e derme, sendo a epiderme, de origem ectodérmica, formada
por epitélio estratificado pavimentoso queratinizado, que pode ser subdividida em 5 camadas:
basal, espinhosa, granulosa, lúcida e córnea. Entre os principais constituintes celulares da pele
estão os queratinócitos, células dendríticas maturas e imaturas, monócitos/macrófagos,
granulócitos, dentre outras (SIMPSON et al., 2011). Com relação aos constituintes humorais
temos as β-defensinas, proteínas do complemento, imunoglobulinas, citocinas, quimiocinas,
radicais livres e prostaglandinas (BOS et al., 2009). Estes componentes celulares e humorais
formam o sistema imune da pele (GERNER et al., 2015). As células de Langerhans estão
localizadas entre os queratinócitos, principalmente na camada espinhosa, e são originadas de
células precursoras da medula óssea e transportadas pelo sangue (NESTLE et al., 2009), e
juntamente com as células dendríticas na derme, são capazes de capturar antígenos, processá-
los e apresenta-los aos linfócitos T, sendo importante para a resposta imune cutânea
(GERNER et al., 2015). Entre os principais constituintes celulares do sistema imune da pele
estão os queratinócitos, células dendríticas maturas e imaturas, monócitos/macrófagos,
granulócitos, dentre outras. Com relação aos constituintes humorais temos as β-defensinas,
proteínas do complemento, imunoglobulinas, citocinas, quimiocinas, radicais livres e
prostaglandinas (BOS et al., 2009).
14
2.2.2 Os mecanismos gerais de defesa da pele contra Leishmania spp.
Além da barreira física, a pele também conta tanto com mecanismos de imunidade inata
quanto adaptativa. Os mecanismos de defesa inatos estão relacionados a fatores secretados por
glândulas sebáceas e sudoríparas, células sentinelas e células fagocíticas (KUPPER;
FUHLBRIGGE et al., 2004). As células sentinelas fazem uma correlação entre a resposta
imune inata e adaptativa, sendo consideradas células apresentadoras de antígeno (APCs) e
importantes tanto para a resposta a infecções como também para manutenção da tolerância
imunológica (BRANDONISIO et al., 2004).
Após a picada do flebotomíneo infectado com Leishmania spp., as primeiras células a
chegarem ao sítio, são os neutrófilos (PETERS, 2008), os quais podem contribuir direta ou
indiretamente na eliminação do parasito. Na infecção por L. amazonensis (NOVAIS et al.,
2009) e na L. braziliensis (GUIMARAES-COSTA et al., 2009), o neutrófilo pode tentar
neutralizar o parasita tanto através das armadilhas extra-celulares neutrofílicas (NET), como
fagocitose ou mesmo promovendo a destruição do parasita no interior de macrófagos
infectados. No entanto, a eficácia dos neutrófilos pode ser comprometida por diversos fatores,
como por exemplo, as proteínas da saliva do flebotomíneo que podem proteger a L. major no
momento da inoculação (CHAGAS et al., 2014). Por outro lado, o processo de apoptose dos
neutrófilos infectados por L. major pode inibir a ativação de macrófagos (SCOTT; NOVAIS,
2016) (Fig. 2). Da mesma forma que os neutrófilos influenciam a capacidade de resposta dos
macrófagos, estudos com L. major apontam que os neutrófilos também afetam as células
dentríticas tanto por promover seu recrutamento através de quimiocinas ligantes CC do tipo 3
(CCL3) como também por inativar as células dendríticas devido sua apoptose (CHARMOY et
al., 2010).
Os monócitos são recrutados da corrente sanguínea para o local de infecção por
diapedese estimulados pelas quimiocinas CCL2, produzidas pelas células no local da infecção
após sua ativação pelo fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF)(GONÇALVES et
al., 2011). Os monócitos são importantes para o controle do parasita nos momentos mais
iniciais da infecção devido a sua potente resposta com espécies reativas de oxigênio (EROs)
sobre os agentes invasores (SCOTT; NOVAIS, 2016). Na infecção experimental por L.
mexicana, foi encontrada correlação entre um maior número monócitos com maior
recrutamento de células dendríticas monocitóides e uma maior resistência ao parasito.
(HURREL et al., 2015). SCOTT e NOVAIS (2016) em seu artigo de revisão, como
demonstrado na figura 2, descrevem que os monócitos também se diferenciam em células
dendríticas que migram para os linfonodos e promovem a diferenciação de células Th0 em
15
células Th1 por IL-12. As células Th1, por sua vez, migram para o sítio primário de infecção
onde auxiliarão na destruição do parasita, tanto via aumento da produção de óxido nítrico
(ON) como no aumento de interferon gama (IFN-γ), prostaglandina E2 e do fator de necrose
tumoral beta (TGF-β) (Fig. 2) (SCOTT; NOVAIS, 2016).
Figura 2: Neutrófilos, macrófagos, células dendríticas e monócitos em suas diferentes
respostas frente à infecção por Leishmania spp.
Fonte: Adaptado de SCOTT; NOVAIS, 2016
Na infecção por Leishmania spp., em camundongos e humanos, as células dendríticas
tem a função de apresentar antígenos processados para células T CD4+ naive, o que
desencadeia uma diferenciação dessas células em uma resposta que pode ser tanto do tipo Th1
como Th2 de acordo com estímulos de patógenos e de citocinas liberadas, sendo a resposta
predominante de Th1, mediada principalmente por IL-12, a principal responsável pelo sucesso
da resposta celular contra o parasita (BRANDIONISIO, 2004).
Com relação as células de Langerhans (CLs), são células dendríticas residentes na
epiderme e correspondem as APCs mais abundantes da pele. No entanto, estudos têm
apontado a capacidade da L. major em inibir a resposta imune associada às CDs e CLs, isso
principalmente pelo retardo na maturação das CDs (BRANDONISIO et al., 2004) e pela
16
inibição na migração das CLs (PONTE-SUCRE, 2001). Essa sinalização foi atribuída ao
principal glicoconjugado expresso na superfície da L. major. a Lipofosfoglicano (LPG), que é
seu principal fator de virulência (PONTE-SUCRE, 2001), sendo considerado um PAMP.
Essas estruturas moleculares são indentifcadas pelos receptores de reconhecimento padrão
(PRRs) expressos nas superfícies das células sentinelas.
2.2.3 Os receptores do tipo TOLL na leishmaniose
Os PRRs são responsáveis não só pelo reconhecimento das moléculas PAMPS,
associadas à microorganismos patógenos, mas também pelo reconhecimento de padrões
moleculares associados a dano celular (DAMPS) e as moléculas relacionadas ao dano e morte
celular ou alarminas, presentes no desenvolvimento das alterações inflamatórias de curso
crônico de muitas doenças (PICCININI; MIDWOOD, 2010). Dentre os principais PRRs
estão os receptores do tipo toll (TLR), esses receptores são proteínas trans-membranares que
conferem especificidade para as células do sistema imune inato, sendo um dos principais
receptores no reconhecimento da infecção inicial e capazes de induzir potente resposta
inflamatória. (KAWAI; AKIRA, 2011). Essa família de receptores compreende do TLR1 ao
TLR11, tendo como função tanto especificidade de reconhecimento de patógenos distinta
como também produção de citocinas. Esses receptores encontram-se localizados tanto na
membrana plasmática quanto na membrana interna de macrófagos, células dendríticas e
células natural-killers (NKT), tendo expressão também em linfócitos T e B. Os receptores
intracelulares são TLR3, TLR7, TLR8 e TLR9, enquanto os receptores de membranas
plasmática são TLR1, TLR2, TLR4, TLR5 e TLR6 (KAWAI; AKIRA, 2011). Após o
reconhecimento dos antígenos os TLR, por intermédio diversas moléculas adaptativas como a
MyD88, ativam o fator nuclear kappa beta (NF-kβ) que levam informação até núcleo e
promovem a síntese de citocinas pró-inflamatórias, quimiocínas além de regular
positivamente moléculas co-estimulatórias presentes em macrófagos e células dendríticas que
irão atuar sobre a ativação das células T e no desenvolvimento das respostas do tipo Th1 ou
Th2 (ZEYTUN et al., 2010).
O glicoconjugado superficial majoritário da Leishmania spp. é o lipofosfoglicano
(LPG), este é um importante fator de virulência para a sobrevivência do parasito, ao mesmo
tempo em que é o principal componente a ser reconhecido pelos receptores Toll na defesa do
hospedeiro, principalmente pelos TLR2 e 4, que desencadearam uma resposta inflamatória ao
seu contato (FARIA et al., 2012). Uma vez reconhecidos os LPGs pelos TLR2 e 4, inicia-se a
17
ativação sequencial de MyD88 e da proteína adaptadora indutora de interferon (TRIF). O
MyD88 é um adaptador essencial para a resposta inflamatória que irá desencadear a
fosforilação do receptor de TNF associada ao fator 6 (TRAF6) que desencadeará a ativação da
via inibitória do kβ (IKK) do NF-kβ e da MAPK (proteína quinase mitogênica ativada),
ambos levando a produção de citocinas inflamatórias (Fig. 3) (KRISHNAN et al., 2007). A
sinalização pela via MyD88 pelos receptores Toll é uma das mais estudadas, ela desencadeia
uma série de eventos que levam a degradação do IKK (IkB), que resulta na translocação do
NF-kβ para dendtro do núcleo, resultando na produção de citocinas pró-inflamatórias
(KAWAI; AKIRA, 2011).
Figura 3: Vias de sinalização dos receptores do tipo Toll 2 e 4 em resposta ao
lipofosfoglicano (LPG) da Leishmania spp.
Fonte: Adaptado de KRISHNAN et al., 2007.
O NF-kβ são um grupo de proteínas que regulam a transcrição genética que codifica
várias proteínas pró-inflamatórias bem como quimiocinas e moléculas de adesão (BONIZZI;
KARIN, 2004). Essa resposta inflamatória NF-kβ desencadeado pelo reconhecimento dos
TLR têm sido considerada um dos principais mecanismos de defesa contra o protozoário da
CanL (AMORIM et al, 2011). Um dos primeiros testes in vivo para corroborar essa
importância foi realizado em camundongos com ausência de MyD88 em que foi observado
grande número de lesões cutâneas quando comparados a camundongos com presença de
MyD88 (MURAILLE, 2003). A ausência dessas moléculas MyD88, importantes para a
sinalização dos TLR, desencadearam uma forte resposta th2 com aumento dos níveis de IL-4
18
e diminuição nos níveis de IFN-Y e IL-12, sugerindo a provável importância desses
receptores para o desenvolvimento da resposta do animal contra a leishmaniose. Estudos
posteriores em camundongos infectados por L. major apontaram os TLR 2, 4 e 9 como os
prováveis mais importantes receptores para os PAMPs do protozoário (TUON, 2008).
Na leishmaniose, os efeitos da expressão de TLR2 são controversos, estudos apontam
que a ausência desse receptor em camundongos leva a uma resistência maior a L. braziliensis
quando comparados a camundongos sob as mesmas condições que com ausência do MyD88
se tornavam mais suscetíveis à infecção (VARGAS-INCHAUSTEGUI et al., 2009). Além
disso, camundongos infectados com L. major demonstraram uma interação do TLR-2 com o
LPG do parasita capaz de modular uma redução na expressão do TLR-9 em macrófagos e
uma consequente redução na resposta anti-leishmanial (SRIVASTA et al, 2013). Já quando
avaliados infecção em camundongos por L. infantum, foi observado um aumento tanto na
transcrição de TLR-2 como de TLR-4, bem como das suas citocinas associadas. Em todos os
períodos de avaliação realizados, animais infectados apresentaram transcrição do mRNA para
TLR-2 no fígado superior ao controle (CEZÁRIO et al., 2011).
Estudos em cães com o intuito de avaliar o comportamento desses TLR frente à
infecção por LV, tanto natural como experimental, ainda são recentes. Em cães naturalmente
infectados por L. infantum foi observado um aumento de TLR2 e TLR4 no baço
possivelmente associado a uma evolução da doença (MELO et al., 2014). Alguns segmentos
do trato gastro-intestinal apresentaram diferenças em suas respostas imunológicas. O jejuno
mostrou uma carga parasitária menor com aumento na expressão de TLR9, por outro lado, o
cólon teve uma carga parasitária mais elevada com aumento da expressão de TLR2 e de IL-4,
sendo observado, dessa forma, uma correlação entre aumento da expressão do TLR-2 pela
infecção de L. intantum (FIGUEIREDO et al., 2013). A importância do TLR2 também é
discutida quando estudado sistema nervoso central de cães naturalmente infectados por L.
chagasi, onde foi observado aumento na expressão desse receptor, corroborando sua provável
importância na resposta contra a leishmaniose (MELO et al., 2013).
Em cães experimentalmente infectados por L. infantum, quando avaliado a transcrição
de TLR diversos órgãos após período de tempo de 6 e de 15 meses do início da infecção, foi
observado após 6 meses uma correlação positiva da expressão de TLR4 e IL-17 no fígado
com o aumento da carga parasitária. Com relação a cargas parasitárias na pele foi observada
uma correlação positiva moderada a forte na transcrição de TLR3. Após 15 meses foram
observadas correlações positivas na pele apenas para IL-17, enquanto que a transcrição de
TLR2 e TLR9 estava regulada negativamente. Nos linfonodos, após esse mesmo período, foi
19
observada uma correlação positiva com TLR-4. (HOSEIN et al., 2015). Estudo recente com
biopsia de pele de cães naturalmente infectados por L. infantum e apresentanto alterações
dermatológicas mais leves como dermatite papular (CanL estágio I) quando comparada com
manifestações cutâneas mais severas de CanL (estágio I e II) apresentou uma frequência
significativamente maior de formação de granuloma, uma tendência a menor carga parasitária
e uma expressão significativamente menor de TLR2. Esse resultado indica uma possível
associação da leishmaniose cutânea com TLR2 (ESTEVE et al., 2015).
Em um estudo com camundongos, foi observado que os parasitas da leishmaniose
podem ser capazes de modular negativamente a ativação da resposta inflamatória, esse
mecanismo ocorre via infecção das células dendríticas pela promastigota da L. infantum
promovendo clivagem de subunidades do NF-kβ, levando a uma desaceleração na maturação
ou ativação das células infectadas pelo protozoário (NEVES et al., 2010). Esse efeito negativo
sobre o NF-kβ afetando as células dendríticas e macrófagos infectados desencadeia
diminuição na produção de citocínas e de enzimas relacionadas a produção de mediadores
inflamatórios secundários, tornando a resposta imune à leishmaniose, em especial a Th1,
menos eficiente (REINHARD et al., 2011). O NF-kβ tem participação importante também
em processos de controle anti-inflamatório, atuando diretamente na inibição da expressão de
genes pró-inflamatórios e também na modulação da expressão e ativação de citocinas diversas
como a IL-10 (TOMCZAK et al., 2006). Por outro, o NF-kβ como fator de transcrição
também tem função crucial para o processo inflamatório na síntese de citocinas dentre as
quais TNF-α, IL-1β, IL-6 e IL-8 (VALLABHAPURAPU; KARIN, 2009). Além desses
mediadores inflamatórios, o NF-kβ também tem importância na expressão da cicloxigenase-2
(COX-2) (TAK; FIRESTEIN, 2001) e também importância em processos de angiogênese e
possivelmente participação na expressão do fator de crescimento do endotélio vascular
(VEGF) (XIE et al., 2010), fator de angiogênico importante no processo inflamatório. Através
da estimulação das citocinas TNF-a e da IL-1 pelas vias de ativação do NF-kβ (TNF-α),
temos a estimulação de células endoteliais e consequente aumento da expressão de moléculas
de adesão, favorecendo à migração neutrofílica (BEHM et al., 2012).
2.2.4 O processo inflamatório da pele e as proteínas de fase aguda
Uma vez que haja a inoculação do protozoário através do rompimento das barreiras
físicas da pele, com consequente ativação das diversas vias de liberação de citocinas
inflamatórias como já visto, ocorre então o processo inflamatório. Esse processo inflamatório
lesivo da pele em cães afetados pela leishmaniose pode se agravar à medida que temos o
20
alojamento e aumento da carga parasitária na pele desses animais e principalmente quando a
evolução da infecção desencadeia danos epiteliais característicos das infecções secundárias,
tais como observadas na dermatite papular (LOMBARDO et al., 2014, ORDEIX et al., 2006).
De uma forma geral, a inflamação é um mecanismo de defesa inato dos tecidos
vascularizados para eliminação de agentes estranhos ou exógenos (GRIVENNIKOV et al.,
2010). O processo inflamatório pode ser classificado como agudo ou crônico, onde, no
primeiro caso, os mecanismos de defesa celulares e vasculares atuam em um espaço curto de
duração, em que é observado um aumento da permeabilidade vascular, com migração de
leucócitos em geral, mas principalmente neutrófilos (KOLACZKOWSKA; KUBES, 2013).
Por outro lado, a inflamação crônica caracteriza-se por sua duração mais longa,
permanecendo instalada e influenciando a persistência crônica de macrófagos, angiogênese e
dano tecidual (FREIRE; VAN-DYKE, 2013).
O processo inflamatório desencadeia cinco sinais clínicos clássicos, sendo eles edema,
calor, rubor, dor e perda da função. O edema, causado pela fase exsudativa, é resultante do
aumento da pressão hidrostática devida a saída de moléculas de água e proteínas para o meio
extra-capilar. O calor e o rubor são oriundos da fase vascular, onde há hiperemia arterial
(aumento do volume sanguíneo local), essas alterações vasculares são oriundas da
vasoconstricção arterial e vasodilatação e permeabilidade venular induzidas por histaminas e
prostaglandinas. Por fim, a perda de função é decorrente do edema (principalmente em
articulações, impedindo a movimentação) e da dor (devido a compressão das fibras nervosas
locais devido ao edema, agressão direta às fibras nervosas), que dificultam as atividades
locais. A fase vascular e exsudativa resultam em grande quantidade de mediadores oriundos
do estimulo dos agentes patógenos invasores que, uma vez drenados aos linfonodos regionais,
iniciam uma resposta imune no animal (MEDZHITOV et al., 2008; ROCK et al., 2010;
FREIRE; VAN-DYKE, 2013).
No momento em que as células de defesa como monócitos e macrófagos são ativadas
em resposta ao estímulo inflamatório devido a danos teciduais ou infecções, temos uma
consequente ativação da resposta de fase aguda, onde diversas citocinas são liberadas pelas
células inflamatórias, tais como IL-6, IL-8, IL-1 e TNF-a (JAIN et al., 2011). Essa resposta de
fase aguda é um tipo mecanismo de defesa rápida e não específica contra distúrbios que
alterem a homeostasia, tanto de forma localizada como generalizada, alterações essas que
podem ser desencadeadas por inflamação, infecções, dano tecidual, neoplasia entre outros
(Fig. 4) (PETERSEN et al., 2004). O resultado dessa resposta inclui mudanças na
concentração de algumas proteínas plasmáticas denominadas de proteínas de fase aguda
21
(APP), produzidas pelo fígado. Entre as principais proteínas de fase aguda que sofrem essa
alteração temos o haptoglobina (Hp) e a proteína C-reativa (PCR) que sofrem aumento em
sua concentração sorológica e a albumina que sofre diminuição (BODE et al., 2011). Durante
esse processo inflamatório, a IL-6 induz a produção da PCR que é um importante marcador da
atividade inflamatória, estando presente em altas concentrações em até 48 horas após o início
do processo inflamatório (CRAY et al., 2009). Em cães naturalmente infectados por L.
infantum, é possível observar um aumento significativo da concentração do PCR circulante,
principalmente em cães sintomáticos (MARTINEZ-SUBIELA et al., 2002).
Figura 4: Resposta de fase agudada e regulação da expressão hepática das APP
desencadeada pelo estimulo oriundo de desafios diversos, tais como infecção e danos
teciduais que podem levar a inflamação.
Fonte: Adaptado de BODE et al., 2011.
2.3 INFILTRADO NEUTROFÍLICO
O processo inflamatório na fase celular desencadeia acúmulo de leucócitos em tecidos
infeccionados por via do recrutamento celular pelas citocinas e quimiocinas. Ambas
favorecem a ligação desses leucócitos ao endotélio com concomitante migração através do
endotélio em direção ao local da infecção. Entre os leucócitos, temos tanto neutrófilos como
monócitos migrando ao local da infecção fagocitando e destruindo agentes patógenos, no
22
entanto, também essas células podem causar dano tecidual pela liberação de enzimas e EROs
(SCHMIDT et al., 2013; KOLACZKOWSKA; KUBES, 2013).
Esse recrutamento leucocitário, mais especificamente o neutrofílico, envolve uma
cascata que compreende as seguintes etapas: ancoragem, rolamento, adesão e transmigração
para além da barreira do endotélio em direção aos tecidos afetados (Fig. 5) Essa cascata é
desencadeada graças a mudanças na superfície do endotélio resultante de estimulação por
mediadores pró-inflamatórios (TNF-α and IL-1) oriundos das células sentinelas presentes nos
tecidos quando entram em contato com agentes patógenos (PHILLIPSON; KUBES, 2011).
Para atravessar a membrana basal e o endotélio, processo que leva de 10 a 20 minutos, é
necessário o auxilio das integrinas, de moléculas de adesão pertencentes à super-familia das
imunoglobulinas, como as moléculas de adesão intercelular 1 e 2 (ICAM1 e ICAM2)
(SPRINGER, 1994), de molécula de adesão celular-vascular 1 (VCAM1) (OSBORN et al.,
1992), além de diferentes tipos de proteínas de junção como CD31, CD99, molécula de
adesão juncional (JAMs) e moléculas de adesão celular endotelial (ECAM) (MULLER,
2011).
Figura 5: Cascata de migração neutrofílica do espaço vascular para o sítio de infecção.
Fonte: Adaptado de PHILLIPSON; KUBES, 2011.
Após esse processo de diapedese, os neutrófilos permanecem predominantes como
células de defesa no local de lesão em um momento inicial que se estende por até 48 horas do
início do processo inflamatório. O papel desse infiltrado neutrofílico é central para a
resolução do processo inflamatório, mas também pode desencadear danos teciduais. Estudos
23
apontam que o agravamento e cronicidade de condições inflamatórias em diversas alterações,
tais como diabetes, artrite reumatoide ou em alguns quadros infecciosos, pode desencadear
um aumento considerável do infiltrado inflamatório neutrofilico e a um severo dano tecidual
com agravamento da condição clínica do animal acometido (BIAN et al., 2016). Dessa forma,
é importante estudar o infiltrado inflamatório em animais com doenças que podem
desencadear sintomatologia de lesões crônicas em diversos órgão e tecidos, tal como
observado na leishmaniose.
2.4 O FATOR DE CRESCIMENTO ENDOTELIAL VASCULAR (VEGF) NA INFECÇÃO
POR Leishmania spp.
O dano tecidual da pele, em animais sintomáticos, desencadeado nos processos
inflamatórios crônicos pelos diversos fatores já citados (liberação de enzimas e mediadores
por neutrófilos e macrófagos), além da ação das espécies reativas de oxigênio sobre os
agentes patógenos da pele, é contra balanceado pelo processo de resposta cicatricial que visa
reestabelecer a homeostase desses tecidos (KOLACZKOWSKA; KUBES, 2013).
É na etapa proliferativa que observamos o predomínio da angiogênese, além de
deposição da matriz extra-celular e recuperação do tecido epitelial perdido e da deposição do
tecido de granulação. Esse processo de angiogênese é resultante da liberação de mediadores
químicos pelos macrófagos, como o VEGF que irá atrair fibroblastos para o local da lesão
epitelial, para compor o tecido de granulação (BARRIENTOS et al., 2008; TELLER;
WHITE, 2011). Por fim, ocorre no local de lesão tecidual o processo de fibroblastia, que
compreende: a ativação dos fibroblastos, produção de colágeno e substituição por tecido
conjuntivo. Esse processo é essencial para a recuperação tecidual e é completamente
dependente da formação concomitante de vasos sanguíneos pela angiogênese estimulada
principalmente pelo VEGF (BAO et al., 2009; GREAVES et al., 2013).
O fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF) é uma sub-familia de fatores de
crescimento, são proteína de sinalização e são subdivididas em: VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C
e VEGF-D, sendo que apenas o VEGF-A está diretamente ligado ao papel de formação dos
vasos sanguíneos. Várias moléculas são apontadas como tento algum tipo de participação no
processo de angiogênese, tais como: TGF-α, TGF-β, HGF e IL-8 (YANCOPOULOS et al.,
2000). No entanto, apesar de ser um processo bastante complexo e com a participação de
diversas moléculas, estudos vêm apontando a importância crucial do VEGF para a
angiogênese, tanto natural como desencadeada por processos patológicos, tais como
crescimento tumoral e metástase (YANG et al., 2015), diabetes (GUPTA et al., 2013) ou
24
mesmo em infecções que possam desencadear sinais clínicos de desordem epitelial, como a
leishmaniose (FRAGA et al., 2012). Essa angiogênese observada em processos patológicos é
iniciada em resposta à hipóxia, a situações de isquemia ou ao próprio processo inflamatório
(ZAREMBER; MALECH, 2005).
Na infecção por leishmaniose estudos tem apontado que as lesões epiteliais encontradas
nos quadros clínicos podem estar associadas à hipóxia em camundongos (ARRAIS-SILVA et
al., 2005) e em humanos acometidos por leishmaniose cutânea (FRAGA et al., 2012). Estudo
recente in vitro, formas pro-mastigotas de diversas cepas de Leishmania spp., entre elas a L.
infantum e a L. donovani, demonstraram interação com fatores pró-angiogênicos como o
VEGF (ARDORE et al., 2014). Não apenas os sinais clínicos de lesão da pele na
leishmaniose estão relacionados com quadros de hipóxia, o controle in vitro dessa mesma
hipóxia no decorrer da infecção por leishmaniose foi apontado como possivelmente associado
à diminuição das porcentagens de células infectadas (COLHONE et al., 2004).
Por outro lado, a promoção da angiogênese pode também proporcionar um ambiente
favorável para o desenvolvimento da leishmaniose, tendo com base o fato de que algumas
moléculas leishmanicidas têm potenciais anti-angiogênico (GALAL et al., 2009). Existem
evidencias que também algumas formas de Leishmania spp., como a L. donovani, pode ser
capaz de ativar o fator indutor de hipóxia 1 (HIF-1) que regula a ação do VEGF no intuito de
auxiliar sua adesão e sobrevivência em macrófagos (SINGH et al., 2012).
2.5 A CICLOXIGENASE-2 (COX-2) NA INFECÇÃO POR Leishmania spp.
A COX é uma enzima que pode ser encontrada em três isoformas distintas, a COX-1,
COX-2 e a COX-3. A COX-1 encontra-se expressa na maior parte dos tecidos com função de
sintetizar baixos níveis de prostaglandinas e manter as funções fisiológicas normais do
organismo (SMITH et al., 1996). A COX-2 é induzida como uma resposta a estímulos pró-
inflamatórios e a citocinas, tendo como principal função a liberação de prostaglandinas.
Expressam-se em células de diversos órgãos entre os quais neurônios, células epiteliais da
região cortical do rim, células endoteliais (HARRIS, 2006) e células da epiderme submetidas
a processo inflamatório em diversas espécies, tais como camundongos (FUTAGAMI et al.,
2002) e cães (Fig. 6) (HAMAMOTO et al., 2009). Por fim, a COX-3 é apenas uma variação
da COX-1 com expressão e função de relevância ainda questionável (SCHWAB et al., 2003).
A expressão de COX-2 é regulada pelo NF-κB em resposta a diferentes estímulos pró-
inflamatórios, como lipopolissacarídeo, TNF-α e IL-1, em diferentes tipos celulares (TAK;
FIRESTEIN, 2001). O mecanismo de ação da COX ocorre pela conversão do ácido
25
aracdônico (presente na membrana plasmática) em prostaglandina G2 e posteriormente em
prostaglandina H2 que servirá então de substrato para tromboxano A2 (TxA2) e para
prostacilcinas (PGI2, PGD2, PGE2 e PGF2α). Ambas as COX do tipo 1 e 2 possuem uma
estrutura morfológica relativamente semelhante, que permite essa interação com o ácido
aracdônico, no entanto, a COX-2 possui capacidade de reconhecimento de substrato bastante
superior a COX-1, tendo ainda a capacidade de metabolizar o ácido eicosapentaenoico (EPA)
irá auxiliar na produção de mediadores anti-inflamatórios e de pró-resolução (RAJAKARIAR
et al., 2006). Apesar de estudos apontarem que tanto a COX-1 como a COX-2 tem
importância no processo inflamatório, são as prostaglandinas oriundas da COX-2 que
possuem papel importante nas fases de resolução do processo inflamatório. Nos quadros de
infecção por leishmaniose sem resolução satisfatória, ou seja, com inibição da resposta do tipo
1, temos a produção de IL-10 que desencadeia a inibição da IL-12. Além do IL-10, a PGE-2
induzida pela COX-2 em infecções também pode estar associada à inibição da produção do
IL-12 (BHATTACHARJEE et al., 2012). Dessa forma, aponta-se que a produção de PGE-2,
mediada por COX-2, pode levar a uma imunossupressão na fase aguda da leishmaniose. Essa
expressão do COX-2 em macrófagos pode ter um importante papel em desencadear o
processo de visceralização da L. donovani em camundongos (GREGORY et al, 2008).
26
3 JUSTIFICATIVA
A LVC é uma zoonose endêmica de alta incidência anual no Brasil, sendo o cão um dos
principais reservatórios. É uma infecção que naturalmente desencadeia um desequilíbrio na
resposta imunológica provocando danos teciduais secundários na pele, principalmente devido
à resposta inflamatória desencadeada pelo reconhecimento desses patógenos por receptores
Toll.
Apesar disso, ainda não existem relatos que comprovem o comportamento dos TLR-2 e
TLR-4 na pele dos cães naturalmente infectados e sua correlação com os sinais clínicos desses
animais. A resposta dos tecidos a Leishmania spp. caracteriza-se também por uma reação
inflamatória sendo importante avaliar a participação de mediadores inflamatórios como o
VEGF ou o COX-2.
27
4 HIPÓTESE CIENTÍFICA
A infecção por L. infantum desencadeia um processo inflamatório sistêmico que altera a
maturação dos neutrófilos do sangue periférico e induz um processo inflamatório no sítio
infeccioso pela participação dos receptores de reconhecimento padrão dos tipos TLR-2 e
TLR-4 com a participação da cicloxigenase-2 (COX-2) e do fator de crescimento do endotélio
vascular (VEGF) no sistema imune cutâneo.
28
5 OBJETIVOS
Objetivo Geral
Caracterizar os parâmetros hematológicos e bioquímicos e avaliar as expressões de
VEGF, COX-2, TLR-2 e TLR-4 na pele de cães naturalmente infectados por L. infantum.
Objetivos específicos
1 - Avaliar o perfil leucocitário e proteico da resposta inflamatória sistêmica de cães
naturalmente infectados por L. infantum.
2 - Estudar a expressão de TLR2, TLR4, COX-2 e VEGF na pele de cães naturalmente
infectados por L. infantum.
29
6 CAPÍTULO I – LEUCOCITOSE E ALBUMINEMIA EM SANGUE
PERIFÉRICO DE CÃES NATURALMENTE INFECTADOS POR Leishmania
infantum
Leukocytosis and albuminemia in peripheral blood of dogs naturally infected by Leishmania
infantum
Artigo submetido ao periódico: Ciência Animal
30
LEUCOCITOSE E ALBUMINEMIA EM SANGUE PERIFÉRICO DE CÃES NATURALMENTE INFECTADOS POR Leishmania infantum
(Leukocytosis and albuminemia in peripheral blood of dogs naturally infected by Leishmania
infantum)
Emmanuel Teles Sales, Gian Karlo Gama de Almeida, Ana Raquel Fontenele de Oliveira,
Amanda de Lacerda Moura, Tarssila Mara Vieira Ferreira, José Claudio Carneiro Freitas e
Diana Célia Sousa Nunes-Pinheiro*
Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias. Laboratório de Imunologia e
Bioquímica Animal. Faculdade de Veterinária. Universidade Estadual do Ceará. Av.Dr. Silas
Munguba, 1700, Campus do Itaperi, Fortaleza-CE. CEP:60.714-903.
*Autor para correspondência e-mail: [email protected]
31
Resumo
O objetivo desse estudo foi caracterizar o perfil leucocitário e protéico de cães
naturalmente infectados por Leishmania infantum. Para tanto, foram realizados exame
parasitológico de punção de medula e PCR em amostras de pele para identificação de
Leishmania spp. e avaliação de sinais clínicos e dermatológicos para categorizar e distribuir
cães em três grupos: grupo controle (GC); grupo positivo assintomático (GA) e grupo positivo
sintomático (GS). Amostras de sangue foram coletadas para avaliação dos parâmetros
hematológicos e bioquímicos. As principais manifestações clínicas observadas no GS foram
alopecia, onicogrifose, ceratoconjuntivite e dermatites eritematosas, esfoliativas e ulcerativas.
Os animais com LVC apresentaram alterações hematológicas significativas compatíveis com
descrições da literatura, com leucocitose significativa (p<0,05) do GS e do GA quando
comparados ao GC, além de anemia no GS e GA em relação ao GC. Também foi observado
hiperproteinemia, hipergamablobulinemia e hipoalbuminemia significativa em GS quando
comparado aos demais grupos (p<0,05), estando esse resultado confirmado pela razão
albumina:globunlina reduzida (p<0,05). A contagem diferencial leucocitária apontou para
uma neutrofilia e linfopenia significativas do GS quando comparadas aos demais grupos
(p<0,05), estando esse resultado confirmado pela razão neutrófilo:linfócito aumentada
(p<0,05). Ressalta-se um aumento de neutrófilos segmentados maduros, mas sem alterações
nos neutrófilos imaturos. Animais naturalmente infectados por L. infantum apresentaram
neutrofilia e albuminemia características de alterações sistêmicas associadas a um processo
inflamatório. Contudo, faz-se necessária uma investigação mais aprofundada com um maior
número de animais e com acompanhamento da LVC para avaliar a participação dos
neutrófilos imaturos neste processo.
Palavras-chave: Leishmania infantum, leishmaniose canina, leucócitos, albumina,
inflamação.
Abstract
The objective of this study was to evaluate the leukocyte and protein profile of dogs naturally
infected by Leishmania infantum. For that, a bone marrow parasitological test and PCR were
performed to identify Leishmania spp. Evaluation of clinical and dermatological signs was
used to categorize and distribute dogs in three groups: control group (CG); asymptomatic
group (AG) and symptomatic group (SG). Blood samples were collected for evaluation of
hematological and biochemical parameters. The main clinical manifestations observed in SG
were alopecia, onychogryphosis, keratoconjunctivitis and dermatitis. Leukocytosis and
32
anemia were observed in SG and AG (p <0.05) when compared to CG. In SG were detected
hyperproteinemia with hyperglobulinemia and hypoalbuminemia when compared to the other
groups (p <0.05). The differential leukocytes count indicated neutrophilia and lymphopenia in
SG when compared to AG and CG (p<0.05), and this result was confirmed by a
neutrophil:lymphocyte ratio which was increased (p<0.05). We highlight an increase of
mature segmented neutrophils in GS, but there is no change in immature neutrophils. Thus,
animals naturally infected by L. infantum presented leukocytosis with neutrophilia and
hypoalbuminemia characteristic of systemic changes associated to inflammatory process.
However, a more in-depth investigation with a larger number of animals and earlier follow-up
of CanL animals is necessary to evaluate the participation of immature neutrophils in this
process.
Keywords: Leishmania infantum, Canine leishmaniasis, leukocytes, albumin, inflammation.
1. INTRODUÇÃO
As leishmanioses são zoonoses desencadeadas por protozoários do gênero Leishmania
spp. sendo de grande importância para a saúde pública, principalmente. Nas zonas urbanas o
cão é considerado o principal reservatório da leishmaniose (MAIA et al., 2013) e quando
acometido pela forma visceral (LVC) pode apresentar um amplo espectro de respostas
(FERREIRA et al., 2016), porém os fatores que levam ao exacerbamento ou controle dessa
sintomatologia ainda não são bem conhecidos.
Durante a infecção, as células do sistema monocítico fagocitário atuam como
apresentadoras de antígenos que podem estimular uma resposta do linfócito TCD4+
(BANETH et al., 2008) com ativação de macrófagos produtores de óxido nítrico responsável
pela destruição intracelular da Leishmania spp. (IKEDA et al., 2003). Além dos macrófagos,
os neutrófilos são células de grande importância para o processo de infecção, tanto
diretamente sendo recrutadas ao sítio de infecção, podendo eliminar o parasita por fagocitose,
por liberação de espécies reativas de oxigênio e pelas armadilhas extracelulares neutrofílicas
(NETs) (KRUGER et al., 2015), como indiretamente nas funções de ativação e regulação das
células do sistema imune inato e adaptativo (MANTOVANI et al., 2009). Nas infecções por
leishmanioses em geral são especialmente importantes por serem as primeiras células a serem
recrutadas ainda nas primeiras horas após a infecção como no caso de infecção por L.
infantum (THALHOFER et al., 2011).
Estudos recentes do perfil neutrofílico em humanos diagnosticados com leishmaniose
visceral (LV) demonstraram alterações tanto na sua função como estágio de maturação, sendo
33
então potencialmente determinantes na severidade da infecção (YIZENGAW et al., 2016).
Também foi reportado em casos humanos de leishmaniose cutânea (LC) que os neutrófilos
teriam uma participação mais importante em influenciar o estado inflamatório sistêmico dos
pacientes, através da produção de mediadores inflamatórios, do que de destruição direta do
parasita (CONCEIÇÃO et al., 2016) e na infecção experimental de camundongos com L.
amazonense também foi investigado o papel e o perfil dos neutrófilos durante a infecção
(SOUSA et al., 2014). Neste sentido, estudos sobre o perfil leucocitário/neutrofílico e
bioquímico na inflamação sistêmica provocada em cães na leishmaniose visceral ainda não
foram relatadas. Dessa forma, o objetivo desse estudo foi caracterizar o perfil leucocitário e
protéico em cães naturalmente infectados por L. infantum.
2. MATERIAL E MÉTODOS
O protocolo experimental foi submetido ao Comitê de Ética em Uso de Animais da
Universidade Estadual do Ceará sob protocolo nº6508268/2016.
2.1. População do estudo
Amostras de sangue de 33 cães adultos provenientes do Centro de Controle de
Zoonoses em Fortaleza (Ceará, Brasil), foram incluídas nesse estudo. O diagnóstico de
Leishmniose Visceral Canina (LVC) foi baseado no teste rápido DPP LVC Bio-Manguinhos®
associado ao teste sorológico ELISA e PCR para L.infantum em amostras de pele obtidas por
biópsia. Punção aspirativa de medula óssea foi realizada para pesquisa parasitológica. Os
cães (n = 33) naturalmente infectados por L. infantum foram divididos com base na presença
ou ausência de alterações clinico-dermatológicas em: um grupo assintomático (GA, n = 10), e
grupo sintomático (GS, n = 23), sendo consideradas alterações clínicas relevantes para a
inclusão dos amimais às características da infecção, tal como: caquexia, onicogrifose,
alopecia, dermatites, ceratoconjuntivites entre outras. Cães sem manifestações clínico-
dermatológicas e que apresentaram resultados negativos nesses testes foram considerados
como sendo não infectados e incluídos como o grupo controle (GC, n = 5).
2.2. Coleta de amostras de sangue e Análises hematológica e bioquímica
Amostras de sangue (10 mL) foram coletados dos diferentes grupos através de
venopunção da jugular com seringa estéril. Desse total, 5 ml de sangue foram colocados em
tubo de coleta contendo anticoagulante EDTA (ácido etilenodiamino tetra-acético) para serem
destinados a avaliação hematológica e outros 5 mL em tubo de coleta sem anticoagulante,
para a avaliação bioquímica. As amostras foram então centrifugadas para obtenção do soro
que foram aliquotados e armazenados a -20 ° C até a análise bioquímica. Os resultados dos
34
exames hematológico e bioquímico foram comparados aos valores de referência para a
espécie canina.
As amostras de sangue coletadas em frascos com EDTA foram conduzidos ao
laboratório de Patologia Clínica da FAVET-UECE para avaliação dos parâmetros
hematológicos em aparelho de automação: contagem total de hemácias, hematócrito (HCT,
%), contagem Leucócitos totais (LT, mm³) e diferencial de leucócitos, e contagem de
plaquetas (PLT, mm³). Foram realizados esfregaços de sangue das amostras para contagem
diferencial dos leucócitos e avaliar o perfil neutrofílico desses animais.
Das amostras de soro de cães coletados em tubos sem EDTA, foram avaliados os
níveis de proteína total sérica (TPS, g/dL), albumina (Alb, g/dL) e globulina (Glob, em g/dL);
A dosagem sérica foi realizada por sistema automatizado (Konelab 60i) utilizando kits
comerciais específicos (Wiener Lab®), de acordo com a metodologia do fabricante.
2.3. Análise estatística
As análises estatísticas foram realizadas por meio do programa estatístico
computacional GraphPadPrism 7.0. Os resultados foram expressos como média ± desvio
padrão (DP). Os dados foram submetidos ao teste de Grubbs e Kolmogorov para determinar a
homocedasticidade dos dados. As alterações clínicas observadas foram expressas em
percentagem. Para as análises hematológicas e bioquímicas foram utilizados o teste de
Kruskal-Wallis seguido de teste de Dunn. Em todos os casos, significância foi definida em p
<0,05.
3. RESULTADOS e DISCUSSÃO
Entre as principais alterações sintomatológicas observadas nos cães temos:
onicogrifose em 91,3% dos animais (n=21), conjuntivite em 34,7% (n=8) além de alguma
forma de lesão dermatológica, variando de leve à severa, em 60,8% (n=14). Dentre essas
alterações dermatológicas, pudemos observar alopecia/hipotricose em 56,5% dos animais
(n=13), lesões ulcerativas em 17,3% (n=4) e dermatites em 43,4% (n=10). Também foram
observadas lesões em ponta de orelha em 21,7% dos animais (n=5). Essas alterações clínicas e
dermatológicas estão de acordo com a literatura que aponta a evolução sintomatológica à
medida que temos o aprofundamento e cronicidade da infecção (SILVA et al., 2015).
As alterações hematológicas encontram-se na Tab. 1. Os leucócitos totais (LT)
sofreram aumento significativo (p<0,05) em GA quando comparado ao controle, apontando
um quadro de leucocitose. Por outro lado, GS manteve-se semelhante ao GC, esse achado de
leucocitose em animais acometidos por LVC está respaldado em literatura prévia (JAFARI et
35
al., 2006), embora nem sempre esta alteração seja observada (FREITAS et al., 2012).
Verificou-se uma redução significativa (p<0,05) no hematócrito (HCT) nos grupos com
leishmaniose em relação ao controle. Uma alteração comumente relatada na LV é a anemia,
podendo estar inclusive relacionada com o estágio da infecção (DIAS et al., 2009). Nossos
dados apontaram também que animais com trombocitopenia significativamente (p<0,05) mais
acentuada foram encontrados no grupo GA quando comparado ao mas não ao GS. Neste
trabalho, as plaquetas em todos os grupos avaliados mantiveram-se dentro dos níveis de
normalidade da espécie. É relatado que nos quadros mais avançados da infecção por LV há
uma tendência a diminuição da contagem plaquetária (contagens inferiores a 150.000/mm³)
(DUARTE et al., 2009).
Com relação aos parâmetros proteicos, a proteína total sérica (TPS) do GS (8,34±0,72)
apresentou aumento significativo quando comparado aos demais grupos (p<0,05), bem como
a globulina estava significativamente superior no GS (6,15±1,06) (p<0,05). A albumina sérica
nos animais do GS (2,09±0,60) encontrava-se inferior (p<0,05) ao GC (3,19±0,28). Dessa
forma, o presente estudo observou um aumento dos níveis de proteína total e globulina
associado a uma diminuição nos níveis de albumina sérica. Esse aumento das proteínas totais
do plasma e presença de hiperglobulinemia é considerado uma das alterações mais comuns na
LVC, estando possivelmente associada ao aumento dos níveis de anticorpos anti-Leishmania,
principalmente em estágios mais crônicos da infecção (CIARAMELLA e CORONA, 2003).
Contudo, a hipoalbuminemia observada nos animais se deve provavelmente a migração da
albumina para o meio extravascular com formação de edema, alteração clínica bastante
comum na LVC (KUMAR et al., 2016). Nossos dados reforçam o comprometimento protéico
com a redução (p<0,05) da relação albumina:globulina nos animais do grupo sintomático
(GS) e consequentemente indicam um quadro inflamatório.
A contagem diferencial dos leucócitos do sangue periférico está representada na Fig.
1. Nossos dados demonstraram um aumento significativo na contagem de neutrófilos superior
em animais do GS em relação aos GA e GC (p<0,05). Estudos prévios sugerem que a
contagem diferencial leucocitária não varia significativamente com o estágio clínico da
infecção (AMUSATEGUI et al., 2003). Vale ressaltar que a neutrofilia era acompanhada de
linfopenia no GS quando comparado aos demais grupos. Esses achados estão de acordo com
estudos prévios em quadros característicos de leishmaniose (BOGDAN et al. 2001; JAFARI
et al., 2006). Por fim, a análise neutrofílica, realizada em todos os grupos testados, não
resultou em alterações significativas quanto ao estágio de maturação dos neutrófilos, estando
todos os grupos semelhantes quanto a contagem de neutrófilos maduros. Os neutrófilos
36
imaturos eram raros e encontravam-se dentro da normalidade para a espécie e sem diferenças
entre os grupos (Fig. 2). Foi observada, no entanto, uma tendência a um aumento na contagem
de neutrófilos segmentados e hipersegmentados em animais do GS, mas sem diferença
significativa. Para se verificar a influência da neutrofilia sobre a linfopenia foi analisada a
relação neutrófilos:linfócitos (Fig. 3) a qual estava elevada (p<0,05) no GS em relação a GC e
GA. Estes dados reforçam um quadro inflamatório na leishmaniose.
De um modo geral, a literatura sempre apontou a existência de uma alteração do perfil
leucocitário em pacientes com leishmaniose visceral (MUSUMECI et al., 1978). Além de ter
seus números totais comprometidos, é argumentado que os neutrófilos podem ter sua função
na infecção por leishmaniose diminuída devido a um bloqueio no CD10, presente na
superfície dos neutrófilos e que regulam seus processos inflamatórios e quimiotáticos
(ELGHETANY, 2002). Estudos recentes em humanos apontam a LV associada com quadro
de aumento na ativação neutrofílica, além de um aumento na frequência de neutrófilos
imaturos e uma diminuição na efetividade de suas funções, o que pode caracterizar a
importância neutrofílica na severidade da infecção (YIZENGAW et al., 2016). Em resumo,
foram observados neutrofilia e linfopenia significativa do GS quando comparado ao GA em
cães naturalmente infectados por L. Infantum. No entanto, não foram encontradas diferenças
significativas no tocante ao estágio de maturação entre os grupos. Vale ressaltar que no
presente estudo os animais não tinham histórico prévio de exames, o que dificulta o
acompanhamento por estadiamento dessas alterações leucocitárias.
4. CONCLUSÃO
Animais naturalmente infectados por L. infantum apresentaram alterações sistêmicas
características de inflamação associada a LVC. Contudo, faz-se necessária uma investigação
mais aprofundada com um maior número de animais e com acompanhamento da LVC para
avaliar a participação dos neutrófilos imaturos neste processo.
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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39
Tabela 1. Análise hematológica e proteica em cães naturalmente infectados por L. infantum
Cães sororpositivos/PCR+
Parâmetros
Cães soronegativos
(CD, n=4)
Assintomáticos
(AD, n=8)
Sintomáticos
(SD, n=25)
Leucócitos totais (x109/L) 9.1±0,9
b 13.35±3,1
a 14,2±2,6
a
HCT (%) 46,0±4,39a 37,66±3,40
b 35,38±5,27
b
PLT (x109/L) 311,00±37,9
a 178,6±124,1
b 233,3±150,9
ab
PTS (g/dL) 7,13±0,65ab
6,5±0,90b 8,45±0,74
a
Albumina (g/dL) 3,19±0,28a 2,64±0,52
ab 2,19±0,60
b
Globulina (g/dL) 3,93±0,52a 3,86±1,47
a 6,05±1,04
b
A/G 0,67±0,07a 0,71±0,13
a 0,28±0,16
b
LT: Leucócitos totais; HCT: hematócrito; PLT: plaquetas; PT: Proteínas totais do soro; PCR:
Reação em cadeia da polimerase para L. infantum. Letras diferentes na mesma linha
considerada significativa (p<0,05).
40
Figura 1. Contagem diferencial entre os leucócitos, neutrófilos, linfócitos e monócitos nos
grupos controle (GC), assintomático (GA) e sintomático (GS). Letras (a) e (b) denotam
diferença significativa entre os grupos avaliados (p < 0,05).
Figura 2. Percentagem de neutrófilos imaturos nos grupos controle (GC), assintomático (GA)
e sintomático (GS) para Leishmaniose canina. Não foram observadas diferenças significativas
entre os grupos avaliados (p < 0,05).
41
Figura 3. Razão entre neutrófilos e linfócitos nos grupos controle (GC), assintomático (GA) e
sintomático (GS). Letras diferentes denotam diferença significativa entre os grupos avaliados
(p < 0,05).
Figura 4. Razão entre albumina e globulina nos grupos controle (GC), assintomático (GA) e
sintomático (GS). Letras diferentes denotam diferença significativa entre os grupos avaliados
(p < 0,05).
42
7 CAPÍTULO II – Inflammatory parameters and expressions of TLR-2, TLR-4
COX-2 and VEGF in the skin of dogs naturally infected by Leishmania infantum.
Parâmetros inflamatórios e expressões de TLR-2, TLR-4, COX-2 e VEGF na pele de cães
naturalmente infectados por Leishmania infantum
Artigo submetido ao periódico: Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia
43
Inflammatory parameters and expressions of TLR-2+, TLR-4+, COX-2+ and VEGF+ in
the skin of dogs naturally infected by Leishmania infantum
[Parâmetros inflamatórios e expressões de TLR-2, TLR-4, COX-2 e VEGF na pele de cães
naturalmente infectados por Leishmania infantum]
E.T. Sales1, T.M.V. Ferreira
1, F.M.A.X. Porto
2, V.C.C. Girão
2,
D.C.S. Nunes-Pinheiro1*
1Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias – FAVET-UECE – Fortaleza-CE
2Programa de Pós-graduação em Ciências Morfofuncionais – FM-UFC – Fortaleza-CE
*Autor para correspondência (corresponding author) e-mail: [email protected]
ABSTRACT
The aim of this study was to investigate the VEGF, COX-2, TLR-2 and TLR-4 expressions in
skin of dogs naturally infected by L. infantum. Therefore, seropositive dogs (n = 33) were
divided into asymptomatic (AG, n = 10) and symptomatic (SG, n = 23) groups, according to
the presence or absence of dermatological alterations, compared to the non-infected dogs
(CG, n = 5) included as control group. Skin biopsies were collected from the scapular region
and the ear tip, processed for routine histology and labeled by immunohistochemistry with
monoclonal antibodies against VEGF+, COX-2
+, TLR-2
+ and TLR-4
+. The main clinical
manifestations observed in SG were alopecia/hypotrichosis, onychogryphosis,
keratoconjunctivitis and dermatitis. It was evidenced intense inflammatory infiltrate in SG in
relation to AG. Increases in the expression of VEGF+, COX-2
+, TLR-2
+ on the skin of SG
(intense) animals were observed when compared to AG (moderate) and CG (mild), whereas
TLR-4+ marking was not altered between the groups evaluated. These data indicate the
involvement of VEGF+ and COX-2
+ by the activation of TLR-2
+, which may suggest a
relationship of the transcription pathway of NF-kB by TLR-2+ but not by TLR-4
+ in response
to L. Infantum.
Keywords: Leishmania infantum, CanL, Inflammatory mediators, Toll-like receptors, Skin.
RESUMO
O objetivo deste estudo foi avaliar as expressões de VEGF, COX-2, TLR-2 e TLR-4 na pele de
cães naturalmente infectados por L. infantum. Para tanto, cães soropositivos (n=33) foram
44
divididos nos grupos assintomático (GA, n=10) e sintomático (GS, n=23), de acordo com a
presença ou ausência de alterações dermatológicas, comparados com o grupo de animais
soronegativos (GC, n=5). Biópsias da pele foram coletadas da região escapular e da ponta
de orelha, processados para histologia e himunohistoquímica com anticorpos monoclonais
contra VEGF+, COX-2
+, TLR-2
+ and TLR-4
+. As principais manifestações clínicas
observadas em GS foram alopecia, onicogrifose, ceratoconjuntivite e dermatites
eritematosas, esfoliativas e ulcerativas. Foi evidenciado infiltrado inflamatório intenso em
GS em relação ao GA. Foram observados aumento nas expressões de VEGF+, COX-2+ e
TLR-2 na pele de animais GS quando comparados a GA e GC, enquanto que a marcação de
TLR-4, não foi alterada entre os grupos avaliados. Estes dados indicam o envolvimento de
VEGF+ e COX-2, pela ativação do TLR-2, o que pode sugerir uma relação da via de
transcrição do NF-kB pelo TLR-2 e não pelo TLR-4 em resposta a infecção por L. infantum.
Palavras-chave: Leishmania infantum, LCan, Mediadores inflamatórios, Receptores tipo toll,
Pele.
INTRODUCTION
The canine visceral leishmaniasis (LVC), caused by Leishmania infantum infection in dogs
through the inoculation by phlebotomine vector (Who, 2016), can trigger a broad spectrum of
symptomatological manifestations ranging from sub-clinical or asymptomatic status to the
development of systemic desease and severe clinical- dermatological alterations (Ferreira et
al., 2016). In this context, the skin has a great importance in the defense against canine
leishmaniasis (CanL) in general, since it is where the first interactions and immunological
responses of the host against the parasite occur (Reis et al., 2009). Among the main defense
mechanisms of the skin, we have the cellular constituents defenses, such as: keratinocytes,
mature and immature dendritic cells, monocytes / macrophages, granulocytes, among others
(Simpson et al., 2011).
These local defense cells of the dog come into contact with the pathogen-associated molecular
pattern (PAMPS) of the infecting agent, and the recognition of these PAMPS is performed by
Toll-like receptors (TLR) (Kawasaki and Kawai, 2014), which will activate the Inflammatory
response. The response triggered by TLRs was reported as an important defense mechanism
against LVC (Amorim et al, 2011). The recognition of the exogenous antigens by the TLR
activates, through several adaptive molecules like MyD88, the nuclear factor kappa beta (NF-
kβ) sinalization pathway which carries information to the nucleus and promotes the synthesis
45
of pro-inflammatory cytokines (such as TNF-α, IL-1β, IL- 6 and IL-8), chemokines, besides
acting in the regulation of defense cells, such as macrophages and dendritic cells (Kawasaki
and Kawai, 2014), which in turn will act on the activation of T cells and the development of
Th1 or Th2 responses (Scott and Novais, 2016).
However, the importance of several of these mediators released by this activation pathway
such as cyclooxygenase-2 (COX-2) (Tak and Firestein, 2001) and vascular endothelial growth
factor (VEGF) (XIE et al., 2010) are yet poorly understood in dogs during L. infantum
infection, but may be potentially important for the establishment and visceralization of the
LVC due to inhibition of defensive cell activity (Gregory et al., 2008; Fraga et al., 2012; DAS
et al., 2014). Thus, the objective of the present study was to evaluate the expression of
VEGF+, COX-2
+, TLR-2
+ and TLR-4
+ in the skin of dogs naturally infected by L. infantum.
MATERIALS AND METHODS
Skin samples Thirty-three adult dogs, of different races and both genders, ages ranging
between 2 and 8 years, were selected for the present study. They were provided by the
Zoonosis Control Center, in Fortaleza / Ceará, a region with a high prevalence of CanL. The
experimental animals were selected based on the results of DPP rapid test CVL Bio-
Manguinhos®, serologic ELISA test (Bio-Manguinhos, Brazil, 2011), parasitological test of
bone marrow puncture and PCR of skin tissue samples. Negative animals in serological and
parasitological tests were considered uninfected and used as control group (CG, n = 5). Dogs
infected (n = 33) by L. infantum were divided into asymptomatic group (AG, n = 10), and
symptomatic (SG, n = 23), according to criteria based on presence or absence of clinical and
dermatological changes. Animals from the symptomatic group were divided into symptomatic
group without skin lesion (SG- n = 9) lesion and symptomatic group with skin lesion (SG+ n
= 14). The clinical alterations common to L. infantum were: onychogryphosis,
keratoconjunctivitis, cachexia and dermatitis. The skin biopsies were performed on the
dorsum and the ear tip of the dogs and the blood samples were collected by jugular
venipuncture.
This study was approved by the Ethical Committee in Animal Use of the State University of
Ceará, Brazil (CEUA, Protocol no. 6508268/2016).
Skin samples were collected after euthanasia (potassium chloride 10%) from previously
anesthetized dogs (Thiopental - Thiopentax ®, Cristalia). Sections of five mm skin were
46
collected from the scapular region and the ear tip of dogs with the help of a dermatological
punch. After collection, the skin samples were transported and fixed in 10% buffered neutral
formalin, stored in 70% alcohol and finally embedded in paraffin for routine histological
processing. For histological analysis, the paraffin blocks were cut into five-micrometer
sections and stained with hematoxylin and eosin (HE). The analysis of the histological
sections was performed under a light microscope (Nikon Eclipse E200MV) at a 200x
magnification. The degree of cellular inflammatory infiltrate (absent, mild, moderate and
intense) was classified according to the average subjective evaluation of two different
observers.
The immunohistochemical evaluations were conducted in paraffin embebed skin sections
(5μm) mounted on silanized glass slides and subsequently subjected to an incubator at 36ºC.
Antigen retrival was performed using citrate buffer at pH 9.0 for 30 minutes at 97 ° C.
Endogenous peroxidase activity was inhibited by 3% hydrogen peroxide (DAKO) for 10 min
and the slides were subjected to monoclonal antibody anti-VEGF+ (clone VG1, Dako-
M7273), COX-2+ (clone CX-294, Dako-M3617-1), monoclonal antibody and mouse anti-
human TLR-4+ (clone sc-10741) and TLR-2+ incubated for 1 h at room temperature. The
slides were then washed twice in PBS and then incubated with EnVision polymer reagent
(EnVision TMþDual connection System/HRP, Dako) for 30 min at room temperature, then
applied DAB (Dako) for ten minutes. Sections were counterstained with Mayer's hematoxylin
for 5 min. The intensity of the staining was analyzed by light microscopy (Leica DM2000) at
200x magnification. The expression of the markers was subjectively classified as none (-),
mild (+), moderate (++) and intense (+++) according to the subjective evaluation of two
different observers (Oliveira et al., 2014).
For L. infantum immunohistochemistry, skin biopsy sections were prepared from paraffin-
embedded were cut and mounted as previous described. Silanized slides were deparaffinised
in xylene, and the tissue was rehydrated using graded alcohols. The slides were incubated in a
4% hydrogen peroxide solution and PBS (0.01 M, pH 7.2), followed by incubation in normal
goat serum (1:100 dilution). Antibody from rabbits experimentally infected with L. infantum
(1:200 dilution in 0.01 M PBS) was used as the primary antibody. (Kindly donated by the
Institute of Tropical Medicine of São Paulo). The slides were then incubated for 22 h at 4°C
in a humid chamber. Then, the PBS lavage was performed and the slides were incubated again
in a biotin solution, and then washed again with PBS and incubated with the streptavidin-
peroxidase complex for 20 min at room temperature. The reaction was carried out with the
47
addition of 0.024% diamino-benzidine and 0.16% hydrogen peroxide. Analysis of amastigote
forms of L. infantum was performed by light microscopy (Leica DM2000) at 200x
magnification. The intensity of staining was classified as none (-), mild (+), moderate (++)
and intense (+++), according to the average subjective perception of two observers (Freitas et
al., 2013).
Results were expressed as mean ± standard deviation (SD). The clinical changes observed
were expressed as a percentage. Histology and immunohistochemist date were presented in
scores absent, mild, moderate or intense.
RESULTS AND DISCUSSION
Clinical and dermatological findings can be observed in Fig. 1. The main symptomatic
changes observed in dogs were onychogryphosis (91.3%, n = 21), conjunctivitis (34.7%, n =
8), and some form of dermatological injury (60.8%, n = 14). Among these dermatological
changes (mild to severe), alopecia/hypotrichosis (56.5%, n = 13), ulcerative lesions (17.3%, n
= 4) and dermatitis (43.4%, n = 10), as well as lesions at the ear tip (21.7%, n = 5). These
clinical and dermatological alterations are in accordance with the literature that indicates the
symptom evolution with the deepening and chronicity of the CanL (Silva et al., 2015). Thus,
the development of the characteristic symptoms of CanL are related to the appearance of
dermatitis or cutaneous alterations, such as those observed in this study, that has been used for
molecular investigations in the skin from dogs naturally infected by L. infantum (Ferreira et
al., 2016).
In the dorsal region of the dog and at the ear tip, the presence of inflammatory cellular
infiltrate of the naturally infected animals (60.6%, 20/33) was present in AG (40%, 4/10) and
SG (73% , 9%; 17/23). Among the symptomatic animals (SG), the presence of inflammatory
infiltrate was observed in animals without skin lesion (SG-, 55.5%, 5/9) or with skin lesion
(SG+, 100%, 14/14). A milder to moderate degree of inflammatory infiltrate was observed
predominantly in AG (66.6%; Fig. 2B), mild to moderate in a more recurrent form in SG-
(55%; Fig. 2C) and of moderate to severe grade in SG + (100%, Fig. 2D). In general, the
inflammatory infiltrate observed in these animals was distributed from the most superficial to
the inner most areas of the dermis and was composed by mononuclear cells as neutrophils,
macrophages and lymphocytes. These data are in agreement with literature (Esteve et al.,
2015).
48
The major findings of immunohistochemistry are shown in Table 1 and Figure 2. All groups
presented expressions for COX-2 and VEGF, however in SG+ (Fig. 2H, 2L) the expressions
were intense when compared to AG (Fig. 2F and 2J) and SG (Fig. 2G, 2K), ranging from mild
to moderate expressions. Toll like receptors (TLR) on the other hand, behaved in different
ways. In this study, TLR-4 was practically absent in all the samples evaluated, while TLR-2
expression was ranging from mild to moderate in skin of dogs AG (Fig. 2N) and SG- (Fig..
2O) in relation to CD (Fig.. 2P). TLR-2 was concentrate mainly in the peripheral regions of
the epithelium or around blood vessels in AG and SG, and multifocal and intensely
distributed throughout the epithelium in SG+, with expression more evident at the
inflammatory infiltrate. In the present study, moderate to intense COX-2 labeling was
observed at the ear tip and flank of both SG- and SG + animals.
The COX-2 importance in leishmaniasis, as well as its pathways of activation was studied in
experimental models. This data corroborates with researches that studied hosts infected by L.
donovani, suggesting that proteases secreted by the parasite play an important role in
inflammatory response inducing the increase of COX-2 expression and consequently in the
production of prostaglandins that will inhibit proinflammatory cytokine levels as IL-12, as
well as the production of nitric oxide in infected macrophages (DAS, 2014). In the infection
by L. mexicana it was verify the inhibition of Th1 response through the MAP kinase pathway
of TLR-4 that increase of COX-2 expression and consequently increase the PGE-2
production, and decrease of IL-12 production in macrophages of the infected mice
(SHWEASH, 2011).
Likewise, VEGF expression was more strongly observed in symptomatic animals with skin
lesions (SG+), and this result is consistent with studies in the skin of infected mice by L.
amazonense, whose injuries may be associated with an environment of hypoxia (ARRAIS-
SILVA, 2005). In the present study, VEGF is strongly expressed in the more chronic stages of
the lesions (SG+). The state of hypoxia in tissues can affect the production of cytokines and
the action of macrophages, as well as stimulating the expression of angiogenic factors
(Colhone et al., 2004). These findings are in agreement with studies in the skin of humans
affected by tegumentary leishmaniasis, where it is evident the presence of signs of
dysregulation in the process of angiogenesis with an intense labeling in the expression of
VEGF in the skin of symptomatic patients (Fraga et al., 2012). Another study also suggests
that infection by L. major increase the expression of both VEGF and its receptor (VEGFR)
with significant changes in vascular and lymphatic structure at the site of infection
49
(Weinkopff et al., 2016). We believe that in the dogs infected by L. infantum, VEGF has an
important role in the inflammatory response, since it is observed a proportional increase of its
expression with the worsening of the clinical picture.
In this context, this article sought to elucidate the involvement of TLR-2 and TLR-4 pathways
activation to release the inflammatory mediators, COX-2 and VEGF, since studies on the
expression of TLR-4 and its function in dogs are still quite limited. Our results point to the
absence of TLR-4 marking in the skin dogs naturally infected by L. infantun. Despite the fact
that studies point to the importance of TLR-4 in the control of L. major in mice (Kropf et al.,
2004), our data are in agreement with the literature that until then did not showed detection of
this receptor in skin dogs (Wassef et al., 2004). On the other hand, the expression of high
levels of TLR-4 mRNA in the peripheral blood leukocytes of these animals is pointed
(Asahina et al., 2003), which motivated us to investigate the behavior of this receptor in
inflammatory infiltrates in LVC. However, even in the samples with more severe
inflammatory infiltrates (SG+), it was not possible to observe significant expressions of TLR-
4 in both the flank and the ear tip.
In our study, TLR2 expression was shown to be proportionally more intense in skin samples
with more prominent infiltrate and parasite load. This finding is in agreement with studies on
the skin of dogs affected by LVC, where greater expression of this receptor is observed in
animal with increased of chronicity and parasitic load. (Steeve et al., 2015). The TLR-2
increase expression in the chronic stages of LVC may indicate its direct involvement with the
infection. TLR2 is a direct receptor for lipofosfoglycan (LPG), the main constituent of several
Leishmania species, and it has been pointed out that its interaction with LPG triggers a
decrease in the response against L. major in experimental models (Srivastava et al., 2013).
However, the role of the TLR2 response in CanL is still poorly understood.
CONCLUSION
Based on our results, we can indicate the involvement of TLR-2 in CanL and suggest the NF-
kB transcription factor pathway to the VEGF+ and COX-2 expressions in cutaneous immune
system in response to L. infantum. TLR-4 not participate of this event in dogs naturally
infected by L infantum.
50
ACKNOWLEDGEMENT
To Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico (FUNCAP),
CAPES and FINEP for the financial support to this work.
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53
Table 1. Expressions of COX-2+, VEGF
+, TLR-2, TLR-4 and L. infantum on skin of dogs
naturally infected with L. infantum.
Markers CG AG SG- SG+
COX-2+ + ++ ++ +++
VEGF+ + + ++ +++
TLR-4+ - - - -
TLR-2+ + ++ ++ +++
L. infantum - + ++ ++
Study groups are represented by CG (control group), AG (asymptomatic groups), SG-
(symptomatic group without skin lesions) and SG+ (symptomatic group with skin lesions).
Scores expression of the markers: (-) none; (+) mild; (++) moderate and (+++) intense.
Figure 1. Clinical and dermatologial findings of dogs naturally infected by L. infantum.
28
12
56
64
32
84
20
0 20 40 60 80 100
Ear tip lesion
Lichenification
Alopecia/hypotrichosis
Dermatitis
keratoconjunctivitis
onychogryphosis
Cachexia
Porcentagem (%)
54
Figure 2. Histopathological and immunohistochemistry of skin dogs naturally infected by L.
infantum. Animals were categorized according to their dermatological clinical status into
asymptomatic (AG), symptomatic without skin lesion (SG-) or symptomatic with skin lesion
(SG+). The control group is represented by CG. Representative cutaneous cellular infiltrates
of groups were classified as none (A), mild (B), moderate (C) and intense (D). COX-2+
expression was classified as mild (E), moderate (F; G) and intense (H). VEGF+ was classified
as mild (I; J) and moderate (K) and intense (L) expressions. TLR-2+ was classified as mild
(M), moderate (N; O) and intense (P) expressions. L. infantum detection was classified as
none (Q), mild (R) and moderate (S; T). 200x magnification.
55
8 CONCLUSÕES
Baseado em nossos dados, pode-se concluir que os animais naturalmente infectados por
L. infantum caracterizam-se por leucocitose com neutrofilia, com razão neutrófilo:linfócito
reduzida, hipoalbuminemia com razão albumina:globulina reduzida cujas alterações
sistêmicas são características de inflamação. Contudo, faz-se necessária uma investigação
mais aprofundada com um maior número de animais e com acompanhamento da LVC para
avaliar a participação dos neutrófilos imaturos neste processo.
Conclui-se também neste estudo o envolvimento de TLR-2 e as expressões de VEGF e
COX-2 no sistema imune cutâneo em resposta a L. infantum possivelmente associados a
ativação do fator de transcrição NF-kB. O receptor TLR-4 não participa deste evento.
56
9 PERSPECTIVAS
É de suma importância o entendimento do comportamento da leishmaniose,
principalmente nas suas áreas endêmicas. Cães positivos para LVC oferecem um potencial de
estudo muito grande e que, portanto, abrem caminhos para diversos estudos tais como a
investigação da imunomarcação tecidual, investigação do papel das células sentinelas como
macrófagos e células dendríticas, avaliação da expressão de moléculas de adesão, dentre
outros, sempre tendo em vista subsídios para o tratamento, acompanhamento e melhora do
animal.
Os resultados obtidos neste trabalho ressaltam a importância do estudo da pele e sua
resposta imunológica no controle e desenvolvimento da infecção por L. infantum, bem como a
relação com o aparecimento das lesões cutâneas. Verifica-se a importância de estudos com
novos marcadores a fim de identificar os subtipos dessas células, e entender mais claramente a
participação dos mesmos na patogênese da leishmaniose visceral canina.
57
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ANEXO
67
ANEXOS A – COMITÉ DE ÉTICA
