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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
JÚLIA TRUGILIO LOPES
CARACTERIZAÇÃO SEMINAL E AVALIAÇÃO DE DIFERENTES
PROTOCOLOS DE CRIOPRESERVAÇÃO SOBRE A QUALIDADE
ESPERMÁTICA DE CURIMATÃ COMUM (Prochilodus brevis)
FORTALEZA
2014
1
JÚLIA TRUGILIO LOPES
CARACTERIZAÇÃO SEMINAL E AVALIAÇÃO DE DIFERENTES
PROTOCOLOS DE CRIOPRESERVAÇÃO SOBRE A QUALIDADE
ESPERMÁTICA DE CURIMATÃ COMUM (Prochilodus brevis)
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade
de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará,
como requisito parcial para a obtenção do grau de
Mestre em Ciências Veterinárias.
Área de concentração: Reprodução e Sanidade
Animal.
Linha de Pesquisa: Reprodução e Sanidade de
Carnívoros, Onívoros e Aves.
Orientadora: Dra. Carminda Sandra Brito Salmito
Vanderley
FORTALEZA
2014
2
3
4
AGRADECIMENTOS
À Universidade Estadual do Ceará, que propiciou minha formação acadêmica e me
proporcionou experiências engrandecedoras e momentos memoráveis ao lado de pessoas
incríveis.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de pessoal de Nível Superior (CAPES), pela
bolsa de mestrado concedida.
À Financiadora de Estudos e Projetos (Finep) pelo apoio financeiro ao estudo em
questão.
Aos professores do Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias por terem
compartilhado seus conhecimentos dentro e fora das salas de aula, contribuindo para o meu
crescimento profissional.
Aos demais funcionários do PPGCV, em especial à querida Adriana, pela paciência
e orientação quanto ao funcionamento do programa.
Ao Dr. José Ferreira Nunes, por ter me aceitado como orientanda no início do
mestrado, por ter me orientado durante a disciplina de Iniciação à docência e por compor a
banca avaliadora da dissertação, contribuindo para que esta fosse melhorada.
Aos demais membros da branca examinadora, Dr. Wladimir Ronald Lobo Farias e
Dr. Marcelo José da Ascensão Feitosa Vieira, por prontamente aceitarem o convite para
participar da banca e pelas considerações feitas durante a defesa, que contribuíram para que a
dissertação fosse melhorada.
À Dra. Gyselle Viana Aguiar por aceitar o convite para ser membro suplente da
banca e por disponibilizar-se a viajar, caso sua presença fosse necessária.
À professora Dra. Sandra Salmito Vanderley, por ter me acompanhado e orientado
desde a graduação, passando pela monitoria e iniciação científica, por ter aberto as portas de
seu laboratório para que eu pudesse crescer pessoal e profissionalmente, minha imensa gratidão.
Ao Dr. José Maurício Maciel Cavalcante pela ajuda com a adequação da estatística
às exigências da revista a qual o artigo foi submetido.
Aos doutorandos do LBRP, Mônica Aline P. Melo Maciel, Liliane Veras Leite e
Francisco Renan A. Linhares, por compartilharem comigo suas experiências e por toda a ajuda
prestada a mim em todas as fases da minha vida científica, em especial à Liliane, que me
acompanhou mais de perto e me permitiu participar assiduamente de todos os seus
experimentos.
5
Aos meus amigos e colegas de mestrado e laboratório Larissa Teixeira Nunes,
Mayara Setúbal Oliveira, Jordana Sampaio Leite e João Paulo Silva Pinheiro, pela amizade e
companheirismo desde a graduação e pela ajuda e parceria em todas as fases do mestrado.
Aos demais colegas de mestrado, em especial ao Arthur Vinícius Lourenço Ferreira,
por compartilharem comigo as adversidades e privilégios de ser um aluno de pós-graduação.
Aos atuais e ex-alunos de iniciação científica do LBRP, Rômulo Roberto Ribeiro
Pinheiro, Maria Eduarda Magalhães de Souza, Priscila Silva de Almeida, Thais Maia Torres,
Yasmim Maia Ferreira e Renata Vieira do Nascimento, pela constante disponibilidade e
disposição para ajudar nos experimentos e pela amizade desenvolvida durante todo o nosso
trajeto juntos. Em especial ao Rômulo, por ter me acompanhado e auxiliado durante todas as
fases do projeto, minha infinita gratidão.
Aos demais componentes do Núcleo Integrado de Biotecnologia, por
compartilharem seus dias comigo, em especial à dona Iraci, pelo carinho e cuidado, e à Henna
Roberta Quinto, pela amizade desenvolvida ao longo desses anos.
Aos meus pais Crisanto Lopes de Oliveira e Joana Marli Trugilio de Almeida, pelo
imenso amor, cuidado e carinho desmedidos doados a mim durante toda a minha vida. Por me
ensinarem o valor do respeito mútuo e do amor-próprio. Por respeitarem e apoiarem minhas
escolhas e por todos os seus esforços e renúncias que me permitiram chegar até aqui.
Às minhas irmãs Letícia Trugilio Lopes e Jade Luz de Oliveira, com quem aprendi
a conviver com as diferenças e a exercitar minha paciência, pelos momentos de descontração e
alegrias vividas dentro e fora de casa.
Aos demais membros das famílias Trugilio de Almeida e Lopes de Oliveira, por
todo o carinho e apoio até aqui.
6
RESUMO
Prochilodus brevis é uma espécie de peixe reofílico, oriunda dos estados do Piauí, Ceará e Rio
Grande do Norte, com grande valor econômico e ecológico para a região Nordeste. Apesar
disso, não existem relatos de sua caracterização seminal nem da utilização da criopreservação
como forma de conservação de seus gametas masculinos. Assim, esse estudo teve como
objetivos caracterizar o sêmen de Prochilodus brevis e avaliar os efeitos de diferentes diluidores
e taxas de diluição sobre a cinética e morfologia do sêmen criopreservado. Para tanto, machos
de P. brevis foram induzidos hormonalmente à espermiação. Vinte horas após a indução, o
sêmen foi coletado e mantido em caixa térmica até o processamento das amostras. Para a
caracterização, 40 amostras seminais foram analisadas quanto ao seu volume, concentração
espermática, pH, osmolaridade, motilidade e morfologia. Para a criopreservação seminal, foram
formados dez pools de sêmen compostos por amostras seminais de três animais cada. Cada pool
foi submetido a seis tratamentos compostos pela combinação de uma solução diluente (glicose
5%), duas soluções crioprotetoras (DMSO ou metil glicol) e três taxas de diluição (1:3, 1:6, 1:9
– sêmen:diluidor). Após a diluição, o sêmen foi envasado em palhetas de 0,25 mL e mantido a
aproximadamente 4 ºC até o fim do tempo de equilíbrio. Em seguida, foi congelado em dry
shipper por 15 minutos e, posteriormente, transferidos para botijão de nitrogênio líquido (-196
ºC) onde permaneceram armazenados por no mínimo 15 dias. As palhetas foram descongeladas
em banho-maria, por 30 segundos a 25 ºC. As amostras, in natura e pós-descongeladas, foram
analisadas quanto à sua morfologia e cinética espermática utilizando o CASA. O sêmen de P.
brevis apresentou características semelhantes a outras espécies de Prochilodus, com volume
seminal=1,31 mL; pH=8,21; osmolaridade=276,18 mOsm; concentração=22,26x109 sptz/mL;
Motilidade=95,54%; espermatozoides normais=97,21%. O sêmen congelado com glicose e MG
apresentou resultados significativamente superiores (p<0,05) comparado àquele congelado
utilizando DMSO. As diluições 1:3 e 1:6 apresentaram melhores resultados para glicose + MG,
enquanto 1:9 foi melhor para glicose + DMSO. Portanto, a associação glicose + MG, numa taxa
de diluição de 1:3, é a mais indicada para a criopreservação do sêmen de Prochilodus brevis.
Palavras-chave: Curimatã comum. Congelação. Sêmen. Dimetilsulfóxido. Metil glicol.
7
ABSTRACT
Prochilodus brevis is a migrating fish species originating from the states of Piauí, Ceará and
Rio Grande do Norte, with great economic and ecological value for the Northeast region.
Nevertheless, there are no reports of its seminal characterization or use of cryopreservation as
a means to preserve their male gametes. Thus, this study aimed to characterize the semen of
Prochilodus brevis and evaluate the effects of different extenders and dilution rates on the
kinetics and morphology of cryopreserved sperm. Males of P. brevis were hormonally induced
to spermiation and, 20 hours after induction, sperm was collected and kept in cool box until the
sample processing. For sperm characterization, 40 sperm samples were assessed for volume,
sperm concentration, pH, osmolarity, motility and morphology. For semen cryopreservation,
were composed ten pools of semen consisting of three animals samples each. Each pool was
subjected to six treatments composed by the combination of a diluent solution (5% glucose),
two cryoprotectant solution (DMSO or methyl glycol) and three dilution rates (1:3, 1:6, 1:9 –
semen:diluting solution). After dilution, the semen was loaded in 0.25 mL straws and kept at
approximately 4 ° C until the end of the equilibration time. It was then frozen in dry shipper for
15 minutes and then transferred to liquid nitrogen (-196 º C) where were stored for at least 15
days. The straws were thawed in a water bath for 30 seconds at 25 ° C. The samples, fresh and
post-thawed, were analyzed for their morphology and sperm kinetics using the CASA. The
sperm of P. brevis showed similar characteristics to other Prochilodus species, with seminal
volume=1.31 mL; pH=8.21; osmolarity=276.18 mOsm; concentration=22.26x109
spermatozoa/mL; motility=95.54%; normal spermatozoa=97.21%. Sperm cryopreserved in
glucose plus MG presented significant higher results (p<0.05) compared to sperm frozen in
DMSO. The dilution ratios 1:3 and 1:6 yielded better results for glucose + MG, while 1:9 was
the better dilution for glucose + DMSO. In conclusion, the association glucose + MG, in a
dilution ratio of 1:3, is the most indicated for Prochilodus brevis sperm cryopreservation.
Keywords: Common curimatã. Freezing. Sperm. Dimethyl sulfoxide. Methyl glycol.
8
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Macho adulto de curimatã comum (Prochilodus brevis)...........................................12
9
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Média ± desvio-padrão do peso e dos parâmetros do sêmen in natura de Prochilodus
brevis.......................................................................................................................................................41
Tabela 2 – Média ± erro-padrão dos parâmetros cinéticos (Porcentagem de espermatozoides móveis –
Motilidade; Velocidade Curvilinear – VCL; Velocidade em Linha Reta – VSL; e Velocidade Média do
Percurso – VAP) e morfológicos (Porcentagem de espermatozoides normais – Morfologia) do sêmen
pós-descongelação de Prochilodus brevis em função do diluidor e taxas de diluição utilizadas..............41
10
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ANOVA – Análise de Variância
BTS – Beltsville Thawing Solution
CASA – Análise do Sêmen Assistida por Computador (Computer Assisted Sperm Analyses)
DMSO – Dimetilsulfóxido
EHC – Extrato Hipofisário de Carpa
FSH – Hormônio Folículo Estimulante (Folicle Stimulant Hormone)
GLM – Modelos Lineares Generalizados (General Linear Model)
GnRH – Hormônio Liberador de Gonadotrofinas (Gonadotrophin-Releasing Hormone)
GnRHa – Análogo do hormônio liberador de gonadotrofina (Gonadotrophin-Releasing
Hormone analogue)
hCG – Gonadotrofina Coriônica Humana (human Chorionic Gonadotrophin)
LBRP – Laboratório de Biotecnologia da Reprodução de Peixes
LH – Hormônio Luteinizante (Luteinizing Hormone)
LHRHa – Análogo do hormônio liberador de hormônio luteinizante (Luteinizing Hormone-
Releasing Hormone Analogue)
LIN – Linearidade (Linearity)
MG – Metil glicol
pH – Potencial Hidrogeniônico
SAS - Statistical Analysis System
SCA – Sperm Class Analyser
sGnRHa – Análogo do hormônio liberador de gonadotrofina de salmão (salmon’s
Gonadotrophin-Releasing Hormone analogue)
SNK – Student Newman Keus
STR – Retilinearidade (straightness)
Tab. – Tabela
UECE – Universidade Estadual do Ceará
VAP – Velocidade média do percurso (Average Path Velocity)
VCL – Velocidade Curvilinear (Curvilinear Velocity)
VSL – Velocidade Progressiva Linear (Straight Line Velocity)
11
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 12
2 REVISÃO DE LITERATURA ........................................................................................... 14
2.1 ESPÉCIE E REPRODUÇÃO .......................................................................................... 14
2.2 TAXONOMIA (FISHWISE, 2013) ................................................................................ 15
2.3 REGULAÇÃO E INDUÇÃO HORMONAL DE TELEÓSTEOS .................................. 15
2.4 O SÊMEN DE TELEÓSTEOS ........................................................................................ 18
2.5 A IMPORTÂNCIA DA CARACTERIZAÇÃO SEMINAL ........................................... 18
2.5.1 Volume ..................................................................................................................... 19
2.5.2 Osmolaridade e pH ................................................................................................... 19
2.5.3 Concentração ............................................................................................................ 20
2.5.4 Morfologia ................................................................................................................ 21
2.6 AVALIAÇÃO DA CINÉTICA ESPERMÁTICA .......................................................... 22
2.7 CRIOPRESERVAÇÃO SEMINAL ................................................................................ 23
2.7.1 Soluções diluidoras .................................................................................................. 23
2.7.2 Taxas de diluição e tempos de equilíbrio ................................................................. 25
3 JUSTIFICATIVA ................................................................................................................ 26
4 HIPÓTESES CIENTÍFICAS ............................................................................................. 27
5 OBJETIVOS ........................................................................................................................ 28
5.1 OBJETIVO GERAL ....................................................................................................... 28
6 CAPÍTULO 1 ....................................................................................................................... 29
7 CONCLUSÕES .................................................................................................................... 45
8 PERSPECTIVAS ................................................................................................................. 46
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................. 47
12
1 INTRODUÇÃO
O gênero Prochilodus possui representantes nativos nas principais bacias
hidrográficas sul-americanas e do ponto de vista ecológico é de fundamental importância para
a composição do ecossistema fluvial (TAYLOR et al., 2006).
A curimatã comum (Prochilodus brevis) é um peixe reofílico nativo da região
Nordeste, endêmico nos estados do Piauí, Ceará e Rio Grande do Norte, mas que, atualmente,
encontra-se disseminado por todo o Nordeste e parte do Sudeste (DOURADO, 1981).
Com grande valor econômico na região, principalmente no sertão norte-
riograndense (ARAÚJO; GURGEL, 2002), essa espécie tem sido ameaçada pela construção de
reservatórios de água e pela pesca excessiva, principalmente durante o período reprodutivo.
Esses fatores despertam o interesse de pesquisadores pelo estudo da biologia
reprodutiva dessa espécie. Inserido nesse contexto, o estudo das características seminais, como
volume, concentração, pH, osmolaridade, motilidade e morfologia espermáticas, surge como
necessidade básica de conhecimento, uma vez que a determinação dessas características permite
o desenvolvimento e aplicação de tecnologias para o desenvolvimento do cultivo em cativeiro
dessa espécie.
Dentre essas tecnologias, a criopreservação seminal aparece como uma área em
ascensão para a produção em aquicultura e preservação do material genético em programas de
criopreservação (CAROLSFELD et al., 2003).
Para a criopreservação do sêmen faz-se necessária a adição de uma solução
diluidora, composta por diluente(s) e crioprotetor(es), responsáveis por manter a viabilidade da
célula espermática e prevenir as crioinjúrias durante a congelação e descongelação seminal
(SALMITO-VANDERLEY et al., 2012).
Dentre os diluentes que já apresentaram bons resultados, destaca-se a glicose,
facilmente adquirida como uma solução estéril, que pode ser manipulada em campo, sem a
necessidade de estrutura laboratorial complexa (VIVEIROS et al., 2009).
Em relação aos crioprotetores, o dimetilsulfóxido (DMSO) é o agente crioprotetor
utilizado, com sucesso, na criopreservação seminal para a maioria das espécies Characiformes
da América do Sul (CAROLSFELD et al., 2003; VIVEIROS; GODINHO, 2009). Entretanto,
surge como substância crioprotetora alternativa ao DMSO, o metil glicol (MG), já testado com
bons resultados na criopreservação de sêmen de Brycon orbignyanus (MARIA et al., 2006),
Prochilodus lineatus (VIVEIROS et al., 2009), Piaractus mesopotamicus (ORFÃO et al., 2008)
e em Piaractus brachypomus (NASCIMENTO et al., 2010).
13
No processo de criopreservação, as peculiaridades de cada espécie e os diversos
aspectos do protocolo utilizado podem influenciar a qualidade do material descongelado, o que
gera a necessidade de elaboração de protocolos adaptados a cada espécie. Para isso, é necessário
padronizar etapas e parâmetros do processo de congelação (CARNEIRO et al., 2012), dentre
eles a determinação da melhor taxa de diluição (sêmen:diluidor), dos melhores diluentes e
crioprotetores, assim como da melhor combinação entre eles.
Entretanto, poucos estudos existem atualmente contemplando aspectos da biologia
reprodutiva da curimatã comum, principalmente abordando as características de seus gametas
e a aplicação de biotecnologias, como a criopreservação do sêmen.
Dessa forma, devido à situação ecológica, importância econômica e ausência de
estudos que contemplem um protocolo adequado à criopreservação seminal dessa espécie, esse
estudo teve como objetivos caracterizar o sêmen de Prochilodus brevis e avaliar a utilização de
diferentes diluidores e taxas de diluição na criopreservação do sêmen dessa espécie por meio
de análise cinética e morfológica.
14
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 ESPÉCIE E REPRODUÇÃO
Prochilodus brevis (=Prochilodus cearensis) (Figura 1), conhecida popularmente
como curimatã comum, é uma espécie de peixe teleósteo, nativa da região semiárida do Brasil
(ROSA et al., 2005; CHELLAPPA et al., 2009), com origem, sobretudo, nas bacias
hidrográficas cearenses, que atualmente, encontra-se disseminada por todo o Nordeste e parte
do Sudeste do Brasil (DOURADO, 1981).
Figura 1 – Macho adulto de curimatã comum (Prochilodus brevis) – Fonte: LBRP
Considerada uma espécie gregária, a curimatã habita as zonas mais profundas dos
corpos d’água. Na fase jovem, esses peixes alimentam-se de plâncton e, quando adultos,
apresentam regime alimentar do tipo iliófago, com ingestão de animais e vegetais (ARAÚJO,
1998).
Os adultos dessa espécie apresentam, em média, 23 a 30 centímetros de
comprimento; seu peso pode variar entre 215 a 513 gramas (NASCIMENTO et al., 2012).
Embora as fêmeas sejam ligeiramente maiores que os machos, principalmente durante o período
reprodutivo, não se observa dimorfismo sexual para P. brevis (NASCIMENTO et al., 2012;
GURGEL et al., 2012).
Com relação aos seus hábitos reprodutivos, P. brevis é um peixe reofílico, também
conhecido como "peixe de piracema". As espécies com essa característica migram rio acima
durante a estação reprodutiva, que coincide com a estação chuvosa, percorrendo vários
quilômetros até as áreas de reprodução, na cabeceira dos rios (ARAÚJO, 1998; GURGEL et
al., 2012). A curimatã, no entanto, não defende território nem despende cuidados parentais
(ARAÚJO; GURGEL, 2002; NASCIMENTO et al., 2012).
15
Em cativeiro, os peixes reofílicos não reproduzem naturalmente, devido à ausência
de estímulos ambientais e hormonais, desencadeados pela piracema, sendo necessária a indução
hormonal da reprodução. Atualmente, um dos principais agentes indutores da maturação final
e liberação dos gametas, aplicados em reprodução artificial de espécies nativas brasileiras, é o
extrato hipofisário de carpa (EHC) (ZANIBONI FILHO; WEINGARTNER, 2007).
P. brevis apresenta desova anual total e seu período reprodutivo se estende de
dezembro a maio, período correspondente ao período de chuvas na região Nordeste
(NASCIMENTO et al., 2012).
2.2 TAXONOMIA (CASTRO; VARI, 2003)
Reino: Animalia
Filo: Chordata
Classe: Actinopterygii
Ordem: Cypriniformes
Família: Prochilodontidae
Gênero: Prochilodus
Espécie: Prochilodus brevis (=Prochilodus cearensis)
2.3 REGULAÇÃO E INDUÇÃO HORMONAL DE TELEÓSTEOS
Nos peixes, assim como nos mamíferos, o eixo hipotálamo-hipofisário é
responsável por reger todos os eventos endócrinos envolvidos na função gonadal, estimulando-
a ou suprimindo-a quando necessário (ALMEIDA, 2013).
Os peixes teleósteos, em sua maioria, apresentam maturação sexual do tipo sazonal.
Fatores ambientais como temperatura, fotoperíodo, propriedades da água e presença de
alimentos são percebidos pelo organismo, promovendo alterações nas atividades do eixo
hipotálamo-hipofisário que dão início à sua maturidade sexual. Desse modo, esse eixo mantém
um equilíbrio entre as atividades do sistema reprodutivo, as condições ambientais e as
condições fisiológicas do indivíduo (SCHULZ; MIURA, 2002).
16
De maneira simplificada, fatores ambientais estimulam o hipotálamo a secretar
hormônio liberador de gonadotrofina (GnRH), o qual estimula a hipófise a secretar hormônios
gonadotróficos (Hormônio Folículo Estimulante e Hormônio Luteinizante – FSH e LH), ou
gonadotrofinas. Estas atuarão nas gônadas, estimulando-as a sintetizar hormônios esteroides,
ou hormônios sexuais, que promovem a maturação final e a liberação dos gametas (ORFÃO,
2013).
É importante salientar que a influência das gonadotrofinas sobre a gônada varia ao
longo do processo de maturação, fazendo com que a gônada seja mais ou menos receptiva a
elas, cujos efeitos também variam ao longo do desenvolvimento gonadal, atuando na produção
de esteroides distintos. Do mesmo modo, a sensibilidade da gônada a esses esteroides também
se modifica ao longo do processo (HARVEY; CAROLSFELD, 1993; MENDONÇA, 2007).
Quando os peixes estão em condições de vida livre, as mudanças ambientais na
temperatura, pluviosidade e condutividade elétrica e as alterações fisiológicas ocorridas durante
a migração no período reprodutivo estimulam a liberação dos gametas e a fertilização natural.
Porém, quando esses animais estão em condições de cativeiro, muitas vezes, as condições
ambientais não são favoráveis à reprodução, especialmente quando se trata de espécies
migradoras, uma vez que o evento migratório fica impedido. Isso gera a necessidade da
utilização de meios artificiais de indução à reprodução (ORFÃO, 2013).
A reprodução induzida pode ser alcançada de duas maneiras distintas: por
manipulação dos fatores ambientais ou por meio de tratamento hormonal (KOSSOWSKI et al.,
1986; ZANIBONI FILHO; WEINGARTNER, 2007).
No primeiro caso, os fatores ambientais, principalmente temperatura e fotoperíodo,
são controlados artificialmente de modo a simular a passagem das estações do ano e,
consequentemente, a época de acasalamento da espécie em questão. Quando a simulação das
condições ambientais essenciais torna-se inviável, por razões econômicas ou práticas, a indução
hormonal torna-se a melhor alternativa, sendo considerado o único método confiável de
obtenção de gametas, podendo ser feito por meio de injeções intramusculares ou
intraperitoneais ou, mais recentemente, por implantes hormonais (PASSOS NETO, 2010).
Os primeiros trabalhos de indução hormonal à desova de peixes foram
desenvolvidos para peixes reofílicos no início da década de 1930, quando foram obtidos
resultados positivos de indução à maturação final e desova de peixes migradores a partir da
aplicação de hormônios naturais presentes na hipófise de peixes maduros (ZANIBONI FILHO;
WEINGARTNER, 2007), processo conhecido como “hipofisação”. Essa técnica continua
sendo uma das alternativas mais utilizadas para induzir a reprodução de peixes e, embora seja
17
bastante antiga, o mesmo princípio tem sido utilizado para uma grande variedade de peixes com
pouca ou nenhuma modificação devido ao fato de o mecanismo interno que regula a reprodução
ser similar para a maioria das espécies (ROTTMANN et al., 1991a).
Atualmente, na maioria dos laboratórios de reprodução de espécies migradoras,
utiliza-se como protocolo padrão a aplicação do extrato hipofisário de carpa (EHC). O EHC
atua diretamente nas gônadas por meio das gonadotropinas, induzindo a maturação final de
ovócitos e a liberação dos espermatozoides, sem qualquer influência na produção inicial desses
gametas (ORFÃO, 2013).
Nos machos, o EHC aumenta o plasma seminal mediante a hidratação testicular,
facilitando a extrusão dos espermatozoides. Em geral, são administradas doses que variam de
2 a 3 mg.kg-1 aplicada em dose única (ZANIBONI FILHO; WEINGARTNER, 2007).
A utilização do EHC tem como inconvenientes a variabilidade na sua qualidade, a
dificuldade de obtenção, a ação em um nível inferior no eixo hipotálamo-hipofisário-gonadal,
e o risco de transmissão de doenças entre o peixe doador e o receptor (CHATAKONDI et al.,
2011; DUNHAM; ARGUE, 2000). Porém, por se tratar de um produto que atua diretamente e
de forma eficiente nas gônadas, suprindo a quantidade de gonadotrofinas ausentes pelas
condições de cativeiro, ainda é o mais indicado para a reprodução de peixes migradores.
(ORFÃO, 2013).
Atualmente, alguns outros hormônios estão sendo testados nas espécies migradoras,
dentre eles o hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH) e a gonadotrofina coriônica
humana (hCG).
Hormônios liberadores de gonadotrofina são hormônios liberados pelo hipotálamo
que agem sobre a hipófise induzindo a liberação de gonadotrofinas que, por sua vez, atuam
sobre as gônadas. Os hormônios mais utilizados para indução de peixes são o análogo do
hormônio liberador de gonadotrofina de salmão (sGnRHa) e o análogo do hormônio liberador
de hormônio luteinizante de mamíferos (LHRHa) (ZOHAR; MYLONAS, 2001). Uma das
vantagens do GnRHa está no fato deste composto atuar nos mais altos níveis do eixo
hipotálamo-hipófise-gônada estimulando o peixe a produzir seu próprio hormônio
gonadotrófico (ROTTMANN et al., 1991b). Apresenta como desvantagem o tempo mais
prolongado de resposta dos peixes (ZOHAR; MYLONAS, 2001) e necessidade de ser
administrado juntamente com bloqueadores de dopamina em algumas espécies (ROTTMANN
et al., 1991b).
A gonadotrofina coriônica humana é um hormônio gonadotrófico com efeito
semelhante ao hormônio luteinizante (LH) que estimula a produção de esteroides nas gônadas
18
A principal vantagem do hCG, assim como dos demais hormônios gonadotróficos, é a de agir
diretamente sobre as gônadas, não sendo necessária a ativação da hipófise. No entanto, esse
hormônio pode desencadear resposta imune nos peixes após longos períodos de tratamento,
sendo imunoneutralizado. Como consequência, doses cada vez maiores são necessárias para
que o tratamento continue a ser efetivo (ZOHAR; MYLONAS, 2001).
2.4 O SÊMEN DE TELEÓSTEOS
A produção espermática dos peixes teleósteos é muito alta, quando comparada à de
mamíferos, devido ao grande número de divisões espermatogoniais (BILLARD, 1990a), e,
também, muito variada entre as espécies. Em algumas espécies, o macho chega a produzir 100
bilhões de espermatozoides/ano/kg do peso corporal ou mais de 1 x 109 espermatozoides/g de
testículo/dia (BILLARD, 1990b).
Ao final da espermatogênese, durante o período em que se encontram armazenados
nos testículos, os espermatozoides encontram-se quiescentes, protegidos pelo plasma seminal
(COSSON et al., 1999). A osmolaridade do plasma seminal dos teleósteos gira em torno de 300
mOsmol/kg e a quiescência é mantida até o momento em que o sêmen entra em contato com
uma solução hipotônica (<300 mOsmol/kg), no caso dos peixes de água doce, ou com uma
solução hipertônica (>300 mOsmol/kg), para os peixes de água salgada (COSSON, 2004).
Após a ativação, na maioria dos peixes de água doce, a motilidade espermática dura,
em média, de 30 a 40 segundos, não sendo relatada na literatura tempo de sobrevivência
superior à uma hora em espécies de fecundação externa (BILLARD; MARCEL; MATEI, 1980;
HINES; YASHOUV, 1971).
Na maioria dos peixes, os espermatozoides não possuem estrutura acrossomal, fato
compensado pela presença de um orifício para a entrada do gameta masculino no ovócito,
denominado micrópila. A micrópila permanece pouco tempo aberta, se fechando em poucos
minutos, ao hidratar-se no momento em que entra em contato com a água (NAKATANI et al.,
2001).
2.5 A IMPORTÂNCIA DA CARACTERIZAÇÃO SEMINAL
As espécies de peixes teleósteos apresentam uma grande variação das
características seminais, assim, a avaliação e descrição dessas características para cada espécie
19
são de grande importância para o desenvolvimento de programas de reprodução artificial. No
entanto, atualmente, menos de 1% de todas as espécies brasileiras de peixe possuem qualquer
descrição sobre sua biologia espermática (VIVEIROS; GODINHO, 2009).
Para a descrição de um perfil espermático, são comumente analisadas as
características físicas do sêmen, tais como volume, taxa e duração da motilidade espermática,
concentração e morfologia, (SOLIS-MURGAS, 2011); assim como pH e osmolaridade. O
conhecimento desses valores permite avaliar a qualidade do sêmen coletado e, assim, otimizar
sua utilização no processo de fertilização artificial (VIVEIROS, 2005).
2.5.1 Volume
O volume seminal é uma característica muito variável entre as diversas espécies e
até mesmo na mesma espécie, uma vez que pode ser influenciado pela estação do ano, clima,
período de repouso sexual e método de coleta (SOLIS-MURGAS, 2011).
O volume também pode variar devido à presença de tratamento hormonal, quando
é observado um aumento significativo no volume seminal (VIEIRA et al., 2011; VIVEIROS;
GODINHO, 2009).
Algumas espécies, como o Brycon orbignyanus, podem liberar um volume
relativamente grande de sêmen (>10 ml), quando comparadas ao Leporinus macrocephalus e
ao Zungaro jahu, cujo sêmen tem sido quase impossível se obter, sendo necessário realizar a
extração dos testículos para coleta intratesticular (VIVEIROS; GODINHO, 2009).
Embora não tenha um valor intrínseco biológico, o volume está diretamente ligado
à quantidade de células fecundantes que o sêmen possa conter (SOLIS-MURGAS, 2011),
remetendo à produção espermática do animal.
2.5.2 Osmolaridade e pH
O conhecimento da osmolaridade média do sêmen de peixes teleósteos é de extrema
importância na reprodução assistida, uma vez que seus espermatozoides permanecem
quiescentes na osmolaridade do plasma seminal, fator crítico aos espermatozoides, que
possuem pouco tempo de motilidade após a ativação (ALAVI; COSSON, 2006).
De acordo com Alavi e Cosson (2006), a variabilidade deste parâmetro está relacionada
com características individuais e espécie-específicas, como nos valores encontrados em
ciprinídeos (254 a 346 mOsm/Kg) e salmonídeos (232 a 322 mOsm/Kg). Para caracídeos, os
20
valores encontrados podem variar entre 313 a 320, como o encontrado para Colossoma
macropomum por Vieira et al. (2011). Já em espécies do gênero Prochilodus observa-se uma
faixa de variação de 286 a 377 mOsm (NASCIMENTO et al., 2012; GONÇALVES et al.,
2013).
O pH extracelular do sêmen de peixes, que em espécies de água doce pode variar de 6,5
a 8,5, é outro fator que controla os parâmetros da motilidade, e seus valores ótimos são
necessários, embora não suficientes, para as condições de ativação espermática. Dessa forma,
alterações do pH seminal de peixes atuam como possível mensageiro celular secundário capaz
de interferir na motilidade espermática de diferentes espécies (TABARES; TARAZONA;
OLIVEIRA, 2005).
2.5.3 Concentração
A concentração espermática expressa a quantidade de espermatozoides por mL de
sêmen (FELIZARDO et al., 2010).
A determinação desta pode ser realizada por meio de diferentes técnicas, tais como
contagem das células em câmaras volumétricas utilizando microscopia, citometria de fluxo,
espectrofotometria e determinação de valores de espermatócritos (ALAVI et al., 2008).
O método básico de determinação da concentração é a contagem das células em
câmaras volumétricas, após a fixação do material seminal. Trata-se de um método barato,
realizado utilizando apenas um microscópio ótico, equipamento disponível na maioria dos
laboratórios, e uma câmara volumétrica, como a Câmara de Neubauer. No entanto, esse tipo de
contagem demanda uma grande quantidade de tempo e pode apresentar variações de resultados
de acordo com o avaliador (FAUVEL; SUQUET; COSSON, 2010), apesar de se tratar de uma
variação aceitável (SUQUET et al., 1992).
Outro método bastante utilizado é o de espectrofotometria, que permite uma análise
mais rápida da concentração espermática por meio da observação da densidade ótica do material
a ser analisado. Todavia, para a utilização do espectrofotômetro como meio de avaliar a
concentração espermática, é necessário que haja estudos prévios que determinem o melhor
comprimento de onda para as análises das amostras e a curva de concentração espermática de
cada espécie, relacionando as contagens realizadas em câmaras volumétricas com os resultados
de densidade ótica obtidos por espectrofotometria (FAUVEL; SUQUET; COSSON, 2010).
Valores de concentração espermática são altamente variáveis entre as espécies
brasileiras de peixes e também podem sofrer variações de acordo com o peso e idade do peixe,
21
a época do ano (SILVA et al., 2009), a frequência de coleta e o volume do ejaculado (SOLIS-
MURGAS, 2011). Em espécies do gênero Prochilodus é possível observar uma variação de
17,37 a 23,40 x 109 (FELIZARDO et al., 2010; VIVEIROS et al., 2010; MARTÍNEZ et al.,
2012; NASCIMENTO et al., 2012; GONÇALVES et al., 2013)
Geralmente, uma baixa concentração espermática é seguida por um aumento no
volume seminal em peixes induzidos hormonalmente, embora este fato não seja observado em
algumas espécies como o B. orbignyanus, P. mesopotamicus e o P. brachypomus (VIVEIROS;
GODINHO, 2009).
2.5.4 Morfologia
A morfologia das células espermáticas é um fator importante na avaliação da
qualidade do sêmen, uma vez que o aumento das patologias espermáticas pode causar redução
da motilidade e do vigor espermático (COSSON et al., 1999).
Dessa forma, a avaliação morfológica dos espermatozoides de peixes pode auxiliar
na caracterização de amostras seminais, fazendo inferência sobre seu potencial fertilizante ou
de amostras congeladas de sêmen e explicando insucessos de reprodutores tidos como aptos
após análises convencionais de motilidade espermática (MILIORINI, 2006).
Alterações morfológicas nos espermatozoides podem ser causadas por diversos
fatores, dentre eles: alterações bruscas de temperatura ou osmolaridade, falhas na
espermatogênese, problemas durante a coleta e manipulação, entre outros.
De modo geral, as morfopatologias espermáticas são divididas em patologias
primárias e patologias secundárias, de acordo com os fatores que possam ter causado as
alterações (KAVAMOTO et al., 1999).
Patologias como flagelo dobrado, cabeça isolada, gota citoplasmática proximal e
distal são oriundas do processo de espermatogênese, em decorrência de causas que acometem
os reprodutores, tais como enfermidades, consanguinidade, deficiência nutricional e estresse
ambiental, sendo conhecidas como patologias primárias ou maiores. Por sua vez, patologias
como flagelo quebrado, enrolado, degenerado, macrocefalia e microcefalia são, geralmente,
associadas à coleta e manipulação do sêmen, e são classificados como patologias secundárias
ou menores (HERMAN; MITCHELL; DOAK, 1994).
Em estudos de criopreservação de sêmen de Characiformes, poucos trabalhos
avaliam a morfologia espermática como critério de definição da qualidade seminal pós-
22
descongelamento, apesar dos processos de criopreservação do sêmen atuarem como agentes
potenciais de alterações da morfologia espermática (MELO-MACIEL et al., 2012).
2.6 AVALIAÇÃO DA CINÉTICA ESPERMÁTICA
A qualidade espermática está diretamente relacionada com a motilidade dos
gametas masculinos, uma vez que esta característica constitui um pré-requisito para a
fertilização dos ovócitos (RURANGWA et al., 2004). Viveiros et al. (2011) relataram que a
taxa de motilidade do sêmen descongelado de dourado (Salminus brasiliensis) revelava o
número de espermatozoides com membranas intactas, demonstrado a íntima relação da
motilidade com a viabilidade espermática e com a capacidade fertilizante do sêmen de peixes.
Geralmente essa avaliação é feita de forma subjetiva, na qual o avaliador deve
estimar uma taxa de espermatozoides móveis numa escala de 0 a 100% (TAITSON et al., 2008).
A técnica convencional, baseada na observação através de microscópio óptico, é utilizada pela
maioria dos laboratórios para realizar análise seminal. Embora sujeita a distintos graus de
imprecisão, devido à subjetividade da avaliação a partir de escalas arbitrárias
(CHAMBEYRON; ZOHAR, 1990), já foi demonstrado que este método é tão confiável quanto
à análise objetiva (VIVEIROS et al., 2010).
Um dos métodos utilizados em análises objetivas da motilidade é o Computer
Assisted Sperm Analysis (CASA), um sistema automático (hardware e software Sperm Class
Analyser -SCA) utilizado para visualizar, digitalizar e analisar imagens sucessivas, gerando
informações precisas e significativas do movimento individual de cada célula e de
subpopulações de células espermáticas (AMANN; KATZ, 2004).
Com o auxílio do programa é possível avaliar a porcentagem de espermatozoides
móveis (ou taxa de motilidade), além da porcentagem de espermatozoides com velocidade
rápida, média ou lenta; assim como analisar as propriedades de trajetória e velocidade dos
espermatozoides, sendo algumas delas:
Velocidade curvilínea (VCL- μm/s), velocidade linear progressiva (VSL- μm/s),
velocidade média da trajetória (VAP- μm/s), retilinearidade (STR - %) e linearidade (LIN - %).
Em Characiformes, o CASA já foi utilizado para analisar a motilidade espermática
pós-descongelamento de pirapitinga (Piaractus brachypomus), piabanha (Brycon insignis),
curimba (Prochilodus lineatus) e tambaqui (Colossoma macropomum), (NASCIMENTO et al.,
2010; MELO, 2010; SHIMODA, 2004; VIVEIROS et al., 2010; LEITE et al., 2011).
23
2.7 CRIOPRESERVAÇÃO SEMINAL
A criopreservação do sêmen consiste na conservação, a longo prazo, dos gametas
por meio de congelamento em nitrogênio líquido.
O primeiro estudo sobre congelamento de sêmen de peixe foi realizado por Blaxter
(1953) com o objetivo de viabilizar o cruzamento de dois “tipos” de arenque (Clupea harengus)
que desovam em épocas diferentes do ano. Além deste primeiro objetivo, o uso de técnicas para
o armazenamento de sêmen de peixes justifica-se por razões ligadas a questões ambientais e
econômicas, uma vez que a utilização e a implantação de bancos genéticos, incluindo o
congelamento de sêmen, constituem soluções potenciais para minimizar perdas decorrentes da
ação do homem sobre os peixes nativos, garantindo a diversidade genética tanto para os
programas de repovoamento, como para a produção comercial (SHIMODA, 2004).
O sêmen congelado pode ser mantido em bancos de sêmen por prazo
indeterminado, o que possibilita o estabelecimento de programas de melhoramento genético
com a utilização de machos selecionados, eliminação do problema de assincronia da atividade
reprodutiva entre machos e fêmeas, redução do número de reprodutores machos mantidos na
estação de piscicultura, com consequente redução dos custos (GODINHO, 2007).
A técnica de congelamento celular pode ser dividida em três etapas: (1) As células
são submetidas a uma solução crioprotetora, que penetra na célula e substitui a maior
quantidade de água intracelular. (2) Posteriormente, a célula deve regular a osmolaridade,
ficando isotônica com o meio extracelular, o que pode causar efeitos tóxicos e impacto osmótico
nas mesmas. (3) Finalmente, diminui-se a temperatura passando pelo ponto de congelamento
da água e da solução crioprotetora (LEZCANO, 2001).
Existem vários utensílios e equipamentos para congelar as amostras de sêmen,
sendo os mais utilizados as caixas térmicas de poliestireno (rampa de congelação), dry shippers,
máquinas de congelação programada e botijões criogênicos, dentro dos quais são introduzidas
palhetas francesas plásticas ou criotubos, cujo volume pode ser de 0,25; 0,5 e 5 mL (SALMITO-
VANDERLEY et al., 2014).
2.7.1 Soluções diluidoras
Para o congelamento do sêmen faz-se necessária a adição de uma solução diluidora,
composta por diluente(s) e crioprotetor(es). O diluidor é responsável por manter a viabilidade
24
da célula espermática e prevenir as crioinjúrias durante a congelação e descongelação seminal
(SALMITO-VANDERLEY et al., 2012).
O diluente, geralmente uma solução rica em sais e/ou carboidratos, promove o
aumento do volume de sêmen, facilitando sua distribuição em doses, e atua como fonte de
energia para o espermatozoide pós-descongelado. As condições mínimas requeridas para um
diluente adequado são: isotonicidade, para que não haja ativação prévia da motilidade
espermática; estabilidade, pois suas características físico-químicas não devem ser alteradas
durante o contato com o sêmen; condutividade térmica elevada, permitindo a rápida
transferência de temperatura do meio externo para os espermatozoides; esterilidade, ou seja,
não devem vincular microrganismos potencialmente nocivos às células espermáticas; e,
finalmente, servir de carreador de crioprotetores (LEGENDRE; BILLARD, 1980).
Já foram testados, com sucesso, como diluentes de sêmen de peixe o BTS –
Beltsville Thawing Solution®) (MURGAS et al., 2007), 5% de glicose (NASCIMENTO et al.,
2010), água de coco in natura (FARIAS et al., 1999), água de coco em pó (VIVEIROS et al.,
2010; LEITE et al., 2011) entre outros.
A glicose destaca-se nesse contexto por tratar-se de uma solução de fácil aquisição,
já testada com sucesso para o sêmen de curimba (Prochilodus lineatus) (VIVEIROS et al.,
2009)
O crioprotetor, por sua vez, tem como função proteger as células espermáticas dos
efeitos deletérios provocados pela criopreservação. Devem possuir baixa toxicidade para as
células e alta solubilidade em água (BATISTA et al., 2006).
Tais crioprotetores podem ser classificados como intracelulares (permeáveis) ou
extracelulares (impermeáveis). Os crioprotetores intracelulares são indispensáveis para o
sucesso da criopreservação, pois atuam desidratando e reduzindo o ponto crioscópio no interior
das células dificultando a formação de cristais de gelo intracelulares que as danificam. Os
crioprotetores extracelulares podem ser ou não adicionados ao meio de congelamento, e
auxiliam na proteção celular recobrindo a superfície da célula e estabilizando a membrana
espermática (WATSON, 1995). Como exemplo de crioprotetores extracelulares, podem ser
citados a gema de ovo e o leite em pó, conhecidos por sua atividade estabilizadora de membrana
(VIVEIROS; GODINHO, 2009).
Entre os crioprotetores mais utilizados na criopreservação do sêmen de peixe
podem ser citados crioprotetores internos como o dimetilsulfóxido (DMSO), glicerol, metanol
e etilenoglicol usados geralmente a uma concentração de 10% (MARIA, 2005). Outra
substância crioprotetora que vem sendo utilizada é o metilglicol, relativamente não tóxico e já
25
foi testado com sucesso na criopreservação de sêmen de piracanjuba, Brycon orbignyanus
(MARIA et al., 2006), curimba, Prochilodus lineatus (VIVEIROS et al., 2009), pacu, Piaractus
mesopotamicus (ORFÃO et al., 2008) e, mais recentemente, em pirapitinga, Piaractus
brachypomus (NASCIMENTO et al., 2010).
Na maioria dos trabalhos, observa-se que a combinação dos dois agentes
(crioprotetores e diluentes) é bastante variável, o que torna muito difícil a tarefa de distinguir
qual é o fator ideal para cada espécie, já que eles atuam de forma distinta.
2.7.2 Taxas de diluição e tempos de equilíbrio
Além da composição do diluidor, outros fatores podem interferir nos resultados
obtidos após a criopreservação seminal. Dentre eles pode-se destacar a taxa de diluição e o
tempo de equilíbrio.
O tempo de equilíbrio consiste no intervalo de tempo decorrido do momento da
adição do crioprotetor ao sêmen até o momento da congelação e é considerado um fator que
exerce grande influência na qualidade do sêmen pós-descongelado (VIVEIROS et al., 2012).
Para sêmen de peixe, os tempos de equilíbrio mais comumente utilizados variam
entre 10 e 20 minutos (BILLARD; ZHANG, 2001).
A taxa de diluição, por sua vez, corresponde à proporção de sêmen em relação à
solução diluidora. De maneira que, durante a adição de diluidores o sêmen pode ser submetido
a diferentes taxas de diluição para verificar a melhor proporção entre diluente e sêmen.
A utilização de diferentes taxas de diluição permite a adaptação da concentração
espermática da amostra congelada aos objetivos práticos da criopreservação, de acordo com a
dose inseminante que se deseja obter (BOZKURT et al., 2005). A taxa de diluição ideal também
pode variar dentro de uma mesma espécie conforme o diluente utilizado para a criopreservação
seminal (LINHARES, 2012).
26
3 JUSTIFICATIVA
O Prochilodus brevis é um peixe que possui grande valor econômico e ecológico
na Região Nordeste do Brasil, entretanto vem sendo ameaçado pela pesca predatória e pela
construção de barragens nos rios, que impedem a sua migração para reprodução no ambiente
natural. Apesar disso, poucos estudos existem atualmente contemplando aspectos de sua
biologia reprodutiva, principalmente abordando as características de seus gametas e a aplicação
de biotecnologias, como a criopreservação do sêmen.
Dessa forma, e por haver grande variação das características seminais entre as
diversas espécies de peixe, esse trabalho justifica-se pela necessidade da descrição dos
parâmetros seminais dessa espécie, informações necessárias para o estabelecimento de sua
produção em aquicultura e para o desenvolvimento de tecnologias que permitam a conservação
e manutenção desse material genético.
Para isto, o desenvolvimento de um protocolo de congelação para o sêmen desta
espécie, testando diferentes soluções criodiluidoras, tempos de equilíbrio e taxas de
descongelação, também se mostra justificável, como alternativa para a manutenção das
populações e utilização de doses seminais criopreservadas na produção em larga escala desse
animal.
27
4 HIPÓTESES CIENTÍFICAS
• As características seminais de P. brevis obedecem aos padrões já registrados
para a família dos Characiformes.
• A qualidade seminal, pós descongelamento, de P. brevis é influenciada pelo
diluidor utilizado e pela taxa de diluição (sêmen:diluidor), havendo interação entre essas duas
variáveis.
28
5 OBJETIVOS
5.1 OBJETIVO GERAL
Caracterizar o sêmen de curimatã comum e avaliar os efeitos de diferentes
diluidores e taxas de diluição na criopreservação do sêmen de Prochilodus brevis.
5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Descrever as características seminais de Prochilodus brevis, mantidos em cativeiro;
• Avaliar o efeito da associação de diferentes crioprotetores à solução de glicose sobre a
qualidade do sêmen criopreservado de P. brevis;
• Comparar o efeito de diferentes diluidores sobre a cinética e a morfologia espermáticas
do sêmen pós-descongelado de P. brevis;
• Avaliar o efeito de diferentes taxas de diluição sobre a cinética e a morfologia
espermática do sêmen criopreservado de P. brevis;
• Verificar a existência de interação entre o diluidor e a taxa de diluição sobre a qualidade
do sêmen pós-descongelado de P. brevis.
29
6 CAPÍTULO 1
Avaliação de diferentes diluidores e taxas de diluição na criopreservação seminal de
Prochilodus brevis
Evaluation of different diluents and dilution ratios on Prochilodus brevis sperm
cryopreservation
Periódico: Revista Brasileira de Reprodução Animal (Submetido em 25 de maio de 2014).
30
Avaliação de diferentes diluidores e taxas de diluição na criopreservação seminal de
Prochilodus brevis
Evaluation of different diluents and dilution ratios on Prochilidus brevis sperm
cryopreservation
J.T. Lopes1; J.P.S. Pinheiro1, L.T. Nunes1, R.R. Ribeiro-Pinheiro2, M.E.M. Souza1, P.S.
de Almeida2, R.V. Nascimento2; C.C. Campello1, C.S.B. Salmito-Vanderley1,2,3
1Faculdade Veterinária, Universidade Estadual do Ceará, Fortaleza, Ceará, Brasil. 2Centro de
Ciências da Saúde, Universidade Estadual do Ceará, Ceará, Brasil.
3Correspondência: Av. Dr. Silas Munguba, 1700, Campus do Itaperi, Fortaleza-CE. CEP:
60714-903Telefone: 3101 9851. Fax: 3101 9840. E-mail: [email protected].
Resumo
Este estudo objetivou caracterizar o sêmen de Prochilodus brevis e avaliar os efeitos de
diferentes diluidores e taxas de diluição sobre a cinética e morfologia do sêmen criopreservado.
Inicialmente, amostras seminais de P. brevis (n=40) foram analisadas quanto ao volume, pH,
osmolaridade, concentração, motilidade e morfologia espermáticas. Para a criopreservação, o
material coletado foi distribuído em dez pools de sêmen (n=10), submetidos a seis tratamentos
compostos pela combinação de glicose 5%, dois crioprotetores (DMSO ou MG) e três taxas de
diluição (1:3, 1:6 ou 1:9 – sêmen:diluidor). As amostras, in natura e pós-descongeladas, foram
analisadas quanto à sua morfologia e cinética espermática utilizando o CASA. O sêmen de P.
brevis apresentou características semelhantes a demais espécies de Prochilodus. O sêmen
congelado com glicose e MG apresentou resultados significativamente superiores (p<0,05)
comparado àquele congelado utilizando DMSO. As diluições 1:3 e 1:6 apresentaram melhores
resultados para glicose + MG, enquanto 1:9 foi melhor para glicose + DMSO. Portanto, a
31
associação glicose + MG, numa taxa de diluição de 1:3, é a mais indicada para a criopreservação
do sêmen de Prochilodus brevis.
Palavras-chave: Curimatã comum. Congelação. Sêmen. Dimetilsulfóxido. Metil glicol.
Abstract
This study aimed to characterize Prochilodus brevis sperm and evaluate the effects of different
diluents and dilution ratios on kinetics and morphology of cryopreserved sperm. Initially, sperm
samples of P. brevis (n = 40) were assessed for volume, pH, osmolality, spermatic
concentration, motility and morphology. For cryopreservation, the collected material was
distributed in ten pools of semen (n=10), submitted to six treatments composed by a
combination of glucose 5% with two cryoprotectants (DMSO or MG) and three dilution ratios
(1:3, 1:6 or 1:9 – sperm:diluent). In natura and post-thawed samples were assessed for
spermatic morphology and kinetics using CASA. The sperm of P. brevis showed similar
characteristics to other Prochilodus species. Sperm cryopreserved in glucose plus MG
presented significant higher results (p<0,05) compared to sperm frozen in DMSO. The dilution
ratios 1:3 and 1:6 yielded better results for glucose + MG, while 1:9 was the better dilution for
glucose + DMSO. In conclusion, the association glucose + MG, in a dilution ratio of 1:3, is the
most indicated for Prochilodus brevis sperm cryopreservation.
Keywords: Common curimatã. Freezing. Sperm. Dimethyl sulfoxide. Methyl glycol.
Introdução
A curimatã comum (Prochilodus brevis) é um peixe reofílico, nativo do nordeste
brasileiro e de grande valor econômico nessa região (Araújo e Gurgel, 2002). Por se tratar de
uma espécie migratória, a curimatã comum tem sido ameaçada pela construção de reservatórios
32
de água, que impedem a sua migração para reprodução no ambiente natural, e pela pesca
excessiva, principalmente durante o período reprodutivo (Nascimento et al., 2012).
Entretanto, poucos estudos existem atualmente contemplando aspectos da biologia
reprodutiva de P. brevis, principalmente abordando as características de seus gametas e a
aplicação de biotecnologias, como a criopreservação do sêmen, uma área em ascensão para a
produção em aquicultura e preservação do material genético de diferentes espécies (Carolsfeld
et al., 2003).
Para a criopreservação do sêmen faz-se necessária a adição de soluções diluidoras,
compostas por diluentes e crioprotetores, responsáveis por manter a viabilidade da célula
espermática e prevenir as crioinjúrias durante a congelação e descongelação seminal (Salmito-
Vanderley et al., 2012).
Dentre os diluentes que já apresentaram bons resultados, destaca-se a glicose, facilmente
adquirida como uma solução estéril, que pode ser manipulada em campo, sem a necessidade de
estrutura laboratorial complexa (Viveiros et al., 2009).
Quanto aos crioprotetores, o dimetilsulfóxido (DMSO) é o agente crioprotetor utilizado,
com sucesso, na criopreservação seminal da maioria das espécies Characiformes sul americanas
(Carolsfeld et al., 2003). Outro crioprotetor, alternativo ao DMSO, é o metil glicol (MG), já
testado com bons resultados na criopreservação de sêmen de Prochilodus lineatus (Viveiros et
al., 2009) e Piaractus brachypomus (Nascimento et al., 2010), entre outros.
No processo de criopreservação, as peculiaridades de cada espécie e os diversos
aspectos do protocolo utilizado podem influenciar a qualidade do sêmen descongelado, o que
gera a necessidade de elaboração de protocolos adaptados a cada espécie. Para isso, é necessário
padronizar etapas e parâmetros do processo de congelação (Carneiro et al., 2012), dentre eles a
determinação da melhor taxa de diluição (sêmen:diluidor), dos melhores diluentes e
crioprotetores, assim como da melhor combinação entre eles.
33
Dessa forma, esse estudo teve como objetivos caracterizar o sêmen de Prochilodus
brevis e avaliar a utilização de diferentes diluidores e taxas de diluição na criopreservação do
sêmen dessa espécie por meio de análise cinética e morfológica.
Material e métodos
O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética para o Uso de Animais da UECE com a
seguinte numeração: 12776936-6. O experimento foi realizado no Laboratório de Biotecnologia
da Reprodução de Peixes (LBRP) da Universidade Estadual do Ceará, em Fortaleza, Ceará,
Brasil.
Utilizou-se um total de 55 machos de curimatã comum, pertencentes ao plantel de
reprodutores do LBRP, que foram pesados e induzidos hormonalmente à espermiação, por via
intracelomática, com dose única de extrato hipofisário de carpa comum (Cyprinus carpio)
(EHC) na proporção de 3 mg/Kg de peso animal. Após 18 horas da indução hormonal, os
animais foram sedados com solução à base de óleo de cravo (Eugenol; União Vegetal
Suplementos Nutricionais Ltda), até que fosse evidenciada sua perda de equilíbrio. Atingindo
este estado, o animal foi submetido à coleta de sêmen.
Para a coleta, orifício genital dos machos foi enxuto com papel toalha, a fim de evitar
contaminação por água, sangue, fezes ou urina. A espermiação foi realizada por meio de uma
leve pressão abdominal no sentido anteroposterior, o sêmen foi coletado em tubos graduados
de polietileno e mantido em caixa térmica com gelo, a aproximadamente 4 ºC, até que fosse
analisado e processado.
Foram selecionadas para os experimentos, as amostras não contaminadas e que exibiam
motilidade ≥80%, após a ativação com água do tanque.
Experimento 1:
34
Para a caracterização seminal, foram realizadas quatro coletas, utilizando 10 animais em
cada (n=40). As amostras in natura foram destinadas às seguintes análises:
a) Volume do ejaculado (mL) – aferido por meio de tubos graduados;
b) Osmolaridade seminal – mensurada pela deposição de 100 µL de sêmen de cada
animal em osmômetro digital de refrigeração Peltier (Roebling, Alemanha).
c) pH seminal (0-14) – obtido por meio da utilização de fitas de pH (MERCK-
Alemanha), umedecidas com 10 µL de sêmen de cada animal;
d) Motilidade espermática – expressa pela porcentagem de espermatozoides
móveis, estimada em escala arbitrária de 0 – 100%, por meio de análise em microscopia ótica
(400x), após a ativação de 2 µL de sêmen com 100 µL de água do tanque;
e) Concentração espermática – estimada por meio de contagem das células em
câmara de Neubauer por meio de microscopia ótica (400x), após a fixação destas em solução
de citrato formolizado a 4% na proporção de 1:4000 (sêmen:fixador).
f) Morfologia espermática – analisada por meio da observação de esfregaços de
sêmen corados com rosa bengala (1:10 – corante:sêmen). As leituras foram realizadas com
auxílio de microscópio ótico de contraste de fase (Nikon® H550S, ECLIPSE 50i, Japan). O
exame consistiu na observação da presença de morfoanomalias de cabeça (microcefalia e
macrocefalia) e cauda, de acordo com a classificação usada por (Galo et al., 2011), de 100
espermatozoides por lâmina, duas lâminas por animal.
Experimento 2 - Criopreservação:
Foram realizadas duas coletas, a partir das quais foram formados dez pools de sêmen,
no total, compostos de três animais cada.
Cada pool (n=10) foi submetido a seis tratamentos, resultantes da combinação do
diluente glicose 5% (Fresenius Kabi Brasil Ltda), associado aos crioprotetores DMSO (Vetec
35
Química Fina Ltda, Rio de Janeiro, Brasil) ou metil glicol (Vetec Química Fina Ltda, Rio de
Janeiro, Brasil), ambos a 10%, nas taxas de diluições de 1:3, 1:6 ou 1:9 (sêmen:diluidor).
Cada tratamento foi envasado em duas palhetas francesas de 0,25 mL, totalizando 120
palhetas (10 pools x 6 tratamentos x 2 palhetas replicadas). Após envase, as palhetas foram
vedadas com álcool polivinílico e mantidas sob refrigeração (4 ºC) por 15 minutos. Em seguida,
as palhetas foram congeladas em dry shipper por 15 minutos e, posteriormente, transferidas
para um botijão de nitrogênio líquido a -196 °C. Após 15 dias, o sêmen foi descongelado em
banho-maria a 25 °C por 30 s.
Para as análises das amostras, uma alíquota de cada pool in natura e pós-descongelação
foi fixada para a análise da morfologia espermática. A confecção dos esfregaços foi realizada
utilizando o mesmo procedimento descrito para o experimento 1.
Outra alíquota dos pools foi utilizada para a avaliação da cinética espermática do sêmen
in natura e pós-descongelado. Para tanto, sobre uma câmara de Makler, 1 µL de sêmen foi
homogeneizado com 100 µL de solução ativadora (NaCl 50 mM – 100mOsm), e submetido
imediatamente à análise.
As análises foram realizadas utilizando o sistema de análise seminal auxiliada por
computador (CASA), por meio do software Sperm Class Analyser (SCA, Microptics –
Barcelona - Espanha, versão 3.2). Foram analisados os seguintes parâmetros: percentual de
espermatozoides móveis (Motilidade - %), velocidade curvilinear (VCL - μm/s), velocidade em
linha reta (VSL - μm/s) e velocidade média do percurso (VAP - μm/s).
Análise estatística
Os dados foram inicialmente submetidos aos testes de Shapiro-Wilk e Bartlett para
verificação da normalidade da distribuição dos resíduos e homogeneidade de variâncias entre
os tratamentos, respectivamente. Quando confirmado o atendimento das exigências para
realização da análise de variância (ANOVA), esta foi então executada com auxílio do
36
procedimento GLM do Programa SAS (2002), considerando um delineamento experimental
inteiramente casualizado em arranjo fatorial 2 × 3 (crioprotetores x diluições) e a interação entre
crioprotetor e diluição. Quando algum dos efeitos principais ou interação demonstrou ser
significativa, o teste de Student-Newman-Keuls (SNK) foi aplicado para comparação das
médias. Nos casos em que não houve atendimento das exigências para realização da ANOVA,
mesmo após transformação de dados (logarítmica, radicial ou angular), foi aplicado o teste não
paramétrico de Kruskal-Wallis. Diferenças foram consideradas significativas quando p<0,05 e
os resultados foram apresentados como média ± erro padrão das médias.
Resultados
As características seminais e o peso dos animais utilizados no presente estudo estão
contidos na Tab. 1.
A análise cinética e morfológica das amostras in natura a serem criopreservadas
forneceu os seguintes valores (médias ± desvio padrão): 98,56 ± 0,24% de espermatozoides
móveis; VCL=108,27 ± 6,76 µm/s; VSL=45,80 ± 1,92 µm/s; VAP=84,49 ± 4,65 µm/s; e 94,80
± 0,63% de espermatozoides morfologicamente normais.
Para todos os parâmetros cinéticos avaliados, o sêmen congelado utilizando a glicose
associada ao MG apresentou resultados superiores (p<0,05), quando comparado às amostras
criopreservadas com o DMSO, independentemente da taxa de diluição. Entretanto, não foi
observada diferença (p>0,05) nas taxas de espermatozoides morfologicamente normais, que
variou de 75,95 ± 1,32 a 84,05 ± 2,10% (Tab. 2).
Com relação às taxas de diluição, quando houve diferença entre elas (p<0,05), a
proporção 1:3 tendeu a apresentar os melhores resultados quando o diluidor utilizado foi glicose
+ MG, apesar de não ter havido diferença (p>0,05) entre 1:3 e 1:6. Contudo, quando o sêmen
37
foi congelado utilizando glicose + DMSO, os melhores resultados foram alcançados com a
diluição 1:9 (Tab. 2).
Desse modo, os melhores resultados foram alcançados com a utilização do MG
associado às taxas de diluição 1:3 e 1:6, seja para taxa de motilidade espermática (41,04 ± 6,11
e 43,05 ± 6,75%, respectivamente), VCL (67,65 ± 2,88 e 65,01 ± 1,68 µm/s, respectivamente),
VSL (34,17 ± 2,72 e 32,77 ± 1,11 µm/s, respectivamente) e VAP (53,20 ± 4,18 e 48,72 ± 0,99
µm/s, respectivamente) (Tab. 2).
Além disso, foi observado um efeito significativo da interação entre o diluidor e a taxa
de diluição nos parâmetros VCL (p<0,0142) e VSL (p<0,0015).
Discussão
O presente estudo observou os efeitos de diferentes crioprotetores e taxas de diluição
sobre a qualidade seminal de curimatã comum, analisadas por meio de parâmetros cinéticos e
morfológicos do sêmen pós-descongelado. Inicialmente, buscou-se caracterizar o sêmen in
natura dessa espécie, visando conhecer melhor o material a ser trabalhado, já que as
características do sêmen in natura podem estar relacionadas à qualidade seminal após a
criopreservação. Isso faz com que a avaliação dessas características seja indispensável na rotina
de reprodução artificial de qualquer espécie (Solis-Murgas et al., 2011).
Apesar de não terem sido encontrados na literatura trabalhos descrevendo as
características seminais de P. brevis, foram obtidos, nesse estudo, valores próximos aos
encontrados para outras espécies do gênero Prochilodus, cujos valores estão compreendidos
entre: 254 a 1400 g – peso corporal; 1,05 a 1,09 mL – volume seminal; 286 a 337 mOsm –
osmolaridade seminal; 17,37 a 19,2.109 espermatozoides/mL – concentração espermática; 89 a
99,8% de espermatozoides móveis – motilidade; e aproximadamente 90% de espermatozoides
morfologicamente normais – morfologia (Kavamoto et al., 1999; Felizardo et al., 2010;
38
Viveiros et al., 2010; Martínez et al., 2012; Nascimento et al., 2012; Gonçalves et al., 2013). O
pH seminal também encontrou-se dentro do esperado para peixes de água doce, que varia de
6,5 a 8,5 (Tabares et al., 2005).
Entretanto, deve-se ressaltar que tais características podem ser influenciadas por muitos
fatores, tais como: espécie, estado nutricional, idade e peso do animal, tipo e dosagem da
indução hormonal, clima, período do ano, frequência de coleta, entre outros (Solis-Murgas et
al., 2011).
No tocante aos resultados obtidos a partir do sêmen descongelado, foi evidente o
decréscimo da qualidade seminal em comparação ao sêmen fresco (p<0,05), revelando que,
assim como esperado, o processo de criopreservação provoca danos que afetam o desempenho
das células espermáticas (Martínez e Pardo-Carrasco, 2013).
Com relação à morfologia espermática de peixes, não existem valores de referência pré-
estabelecidos para julgar o material espermático apto ou não à fertilização. Os índices de
anormalidades morfológicas dos espermatozoides descongelados no presente estudo, que
variaram de 15,95 a 24,05%, encontram-se dentro do recomendado para bovinos e equinos
(30%) e apenas pouco acima do recomendado para ovinos e suínos (20%) pelo Colégio
Brasileiro de Reprodução Animal (CBRA, 2013). Os resultados de anormalidade encontrados
na presente pesquisa assemelham-se aos de Felizardo et al. (2010), que variaram de 20,66 a
30,82% para sêmen criopreservado de P. lineatus.
Os valores encontrados para as velocidades (VCL, VSL e VAP) no sêmen pós-
descongelado, independente do tratamento, foram superiores aos obtidos para P. lineatus por
Viveiros et al. (2010), que encontrou VCL=49,1 µm/s; VSL=24,3 µm/s e VAP=36,0 µm/s.
Bons resultados referentes a esses parâmetros são de notável importância, uma vez que existe
uma correlação positiva das velocidades espermáticas com a taxa de fertilização, especialmente
39
da velocidade curvilinear de acordo com os resultados encontrados para P. lineatus e
Colossoma macropomum (Viveiros et al., 2010; Carvalho, 2013).
Com relação aos diluidores utilizados, foi observado que, apesar de o DMSO ser um
crioprotetor amplamente testado e apresentar bons resultados em diversas espécies de
Characiformes (Godinho e Viveiros, 2011), o sêmen criopreservado com DMSO alcançou,
nesse estudo, resultados de motilidade espermática significativamente inferiores quando
comparado ao MG, corroborando com resultados encontrados por outros autores, como por
Viveiros et al. (2009) para P. lineatus, cuja motilidade espermática foi ≥93% e ≤50% para MG
e DMSO, respectivamente; e por Carneiro et al. (2012) para C. macropomum, que apresentou
motilidade espermática de 57% e 23% utilizando MG e DMSO, respectivamente.
Apesar de apresentar toxicidade menor do que alguns crioprotetores, como o glicerol,
já foi relatado que o DMSO apresenta elevada toxicidade e que concentrações ou tempos de
equilíbrio elevados desse crioprotetor podem provocar redução significativa na qualidade do
sêmen de peixes. Assim, o tempo de equilíbrio utilizado após a diluição seminal pode ter sido
demasiado, fazendo com que as células ficassem superexpostas à ação tóxica dos crioprotetores,
ou pode não ter sido suficiente para que o crioprotetor penetrasse adequadamente nas células,
diminuindo sua capacidade protetora (Bedore, 1999). Alguns autores sugerem ainda que o
tempo de equilíbrio é desnecessário (Nascimento et al., 2012).
A diferença estatística entre as taxas de diluição, que evidenciaram a tendência de
melhores resultados utilizando as proporções 1:3 e 1:6 como taxa de diluição para o diluidor
glicose + MG, pode estar relacionada à sensibilidade dos espermatozoides dessa espécie ao
crioprotetor, já que, nessas diluições, as células espermáticas entram em contato com uma
quantidade menor dele. Isso demonstra que os espermatozoides de diferentes espécies
apresentam variados graus de sensibilidade a diferentes crioprotetores (Peñaranda et al., 2009).
40
Além disso, é possível que a interação diluente + crioprotetor tenha sido mais efetiva
entre glicose e MG do que entre glicose e DMSO, assim como o observado por Viveiros et al.
(2009), fazendo com que, mesmo com uma menor proporção sêmen:diluidor, a proteção aos
espermatozoides fosse eficiente. Essa eficiência, no entanto, foi menor quando se utilizou a
associação glicose + DMSO, levando à necessidade de uma maior quantidade de diluidor para
a obtenção de melhores resultados, observados quando se utilizou a diluição 1:9. Tais hipóteses
são reforçadas pela presença de uma forte interação do diluidor com o as taxas de diluição,
observada no presente estudo, em especial nos parâmetros VCL (p<0,0142) e VSL (p<0,0015).
O estado funcional das células descongeladas é resultado de injúrias acumuladas durante
todo o processo de congelação, de modo que os danos celulares de diversos graus de severidade
podem ser induzidos por diferentes mecanismos e variáveis em cada fase da criopreservação
(Medeiros et al., 2002). Além das variáveis testadas nesse estudo, outras podem interferir nos
resultados pós-descongelação, tais como concentração e toxicidade dos crioprotetores
(Peñaranda et al., 2009), a taxa de resfriamento, tempo e método de adição dos crioprotetores,
métodos de envase, condições de congelação, tempo de descongelação, método de análise da
motilidade (Salmito-Vanderley et al., 2012).
A redução de alguns valores encontrados para os parâmetros avaliados nesse estudo,
não se traduzem, necessariamente, em baixa capacidade fertilizante, uma vez que a alta
velocidade individual de alguns espermatozoides dentro de um ejaculado pode ser suficiente
para se obter boas taxas de fertilização (Haugland et al., 2009). Tal fato foi observado no
trabalho de Menezes et al. (2008), que alcançou 76% de taxa de fertilização com 20% de
motilidade espermática de sêmen criopreservado de C. macropomum.
41
Conclusões
O sêmen in natura de Prochilodus brevis possui características que se enquadram no
padrão encontrado para diferentes espécies do gênero Prochilodus. Dentre os tratamentos
empregados nesse estudo, a associação de glicose a 10% de metil glicol, numa taxa de diluição
de 1:3, é a mais indicada para a criopreservação do sêmen de curimatã comum. No entanto,
mais estudos devem ser realizados, visando aprimorar os resultados e encontrar um protocolo
de criopreservação que mais se adeque à espécie.
Agradecimentos
Ao Departamento Nacional de Obras contra as Secas, pelos animais doados; à
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior e à Financiadora de Estudos e
Projetos, pelo apoio financeiro.
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44
Tabela 1. Média ± desvio-padrão do peso e dos parâmetros do sêmen in natura de Prochilodus
brevis.
Parâmetro Média ± D.P.
Peso animal (g) 477,68 ± 88,13
Volume seminal (mL) 1,31 ± 0,64
pH 8,21 ± 0,27
Osmolaridade (mOsm) 276,18 ± 23,70
Concentração (x109 sptz/mL) 22,26 ± 9,34
Motilidade total (%) 95,54 ± 3,63
Espermatozoides morfologicamente normais (%) 97,21 ± 1,46
Tabela 2 Média ± erro-padrão dos parâmetros cinéticos (Porcentagem de espermatozoides móveis – Motilidade;
Velocidade Curvilinear – VCL; Velocidade em Linha Reta – VSL; e Velocidade Média do Percurso – VAP) e
morfológicos (Porcentagem de espermatozoides normais – Morfologia) do sêmen pós-descongelação de
Prochilodus brevis em função do diluidor e taxas de diluição utilizadas.
Parâmetro
Diluição
Crioprotetor 1:3 1:6 1:9
Motilidade (%) MG 41,04 ± 6,11Aa 43,05 ± 6,75Aa 41,26 ± 4,51Aa
DMSO 11,36 ± 1,48Bb 13,16 ± 1,73Bb 23,98 ± 2,86Ab
VCL (µm/s) MG 67,65 ± 2,88Aa 65,01 ± 1,68Aba 59,01 ± 2,57Ba
DMSO 35,91 ± 1,45Ab 35,90 ± 0,98Ab 38,53 ± 1,33Ab
VSL (µm/s) MG 34,17 ± 2,72Aa 32,77 ± 1,11Aba 27,78 ± 1,65Ba
DMSO 15,28 ± 2,03Bb 16,41 ± 1,56Bb 22,26 ± 1,62Ab
VAP (µm/s) MG 53,20 ± 4,18Aa 48,72 ± 0,99Aba 44,07 ± 2,17Ba
DMSO 24,50 ± 1,58Bb 25,39 ± 1,26Bb 31,27 ± 1,44Ab
Morfologia (%) MG 80,30 ± 1,05Aa 79,55 ± 1,81Aa 75,95 ± 1,32Aa
DMSO 84,05 ± 2,10Aa 79,70 ± 3,25Aa 78,45 ± 1,88Aa
A, B Letras maiúsculas distintas representam diferenças significativas entre as diluições, dentro de um mesmo
parâmetro (p<0,05) a, b Letras minúsculas distintas representam diferenças significativas entre os diluidores, dentro de um mesmo
parâmetro (p<0,05)
45
7 CONCLUSÕES
O sêmen in natura de Prochilodus brevis possui, assim como esperado,
características físico-químicas que se enquadram no padrão encontrado para diferentes espécies
do gênero Prochilodus.
A associação do diluente glicose (5%) ao crioprotetor metil glicol (10%), numa taxa
de diluição de 1:3, é a mais indicada para a criopreservação do sêmen de curimatã comum, por
apresentar os melhores resultados após o descongelamento seminal.
46
8 PERSPECTIVAS
Usar o conhecimento acerca das características espermáticas de P. brevis para
melhorar seu manejo reprodutivo e subsidiar o desenvolvimento de novas pesquisas sobre a
reprodução dessa espécie.
Aprimorar o protocolo sugerido por meio desse estudo, visando atingir melhores
resultados de cinética e morfologia espermática.
Realizar novas pesquisas, observando outros parâmetros para avaliação da
qualidade seminal como tempo de equilíbrio, duração da motilidade, vitalidade espermática,
integridade do DNA e testes de fertilização, buscando compreender melhor os fatores que
interferem na capacidade fecundante do sêmen descongelado de Prochilodus brevis.
Difundir os resultados dessa pesquisa, com o propósito de possibilitar a adaptação
e utilização da biotecnologia do sêmen para a produção dessa espécie em estações de psicultura.
47
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