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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
TÁRSSILA MARA VIEIRA FERREIRA
EXPRESSÕES DE CD45+, CD68+ e E-CADERINA+ NA PELE DE CÃES
NATURALMENTE INFECTADOS POR Leishmania infantum
FORTALEZA – CEARÁ
2016
TÁRSSILA MARA VIEIRA FERREIRA
EXPRESSÕES DE CD45+, CD68+ e E-CADERINA+ NA PELE DE CÃES
NATURALMENTE INFECTADOS POR Leishmania infantum
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação
em Ciência Veterinárias da Faculdade de Veterinária da
Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial
para obtenção do grau de Mestre em Ciências
Veterinárias. Área de Concentração: Reprodução e
Sanidade Animal.
Linha de pesquisa: Reprodução e Sanidade de carnívoros,
onívoros, herbívoros e aves.
Orientadora: Profa. Dra. Diana Célia Sousa Nunes
Pinheiro.
FORTALEZA – CEARÁ
2016
Deus e aos meus pais, Álvaro e Maria Amélia,
Dedico.
AGRADECIMENTOS
À Deus, por estar sempre ao meu lado orientando, dando força e fortalecendo a minha fé. A
ele, agradecimentos eternos por tudo que consegui em vida.
À minha orientadora Profa. Dra. Diana Célia Sousa Nunes Pinheiro, por sua disponibilidade,
dedicação e atenção para a realização desse trabalho.
Aos amigos que fiz no Laboratório de Imunologia e Bioquímica Animal (LIBA), em especial
Behatriz Odebrecht, Belarmino Eugênio, Belise Maria e Glauco Jonas, por toda a
contribuição, quer seja me apoiando ou ajudando nesse trabalho.
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias (PPGCV) da Faculdade de
Veterinária (FAVET) da UECE, em especial aos professores, pelos conhecimentos e
experiências compartilhados.
Aos membros da banca, por prontamente aceitarem o convite para participar desse momento
tão importante para mim, e oferecerem sugestões para melhor apresentação do manuscrito.
Aos meus pais, às minhas irmãs e ao meu sobrinho Lucas, por serem essas pessoas
maravilhosas que Deus concedeu para estarem comigo nessa vida. Vocês são os meus pilares,
amo muito vocês!
À meu marido, por todo seu apoio e compreensão nos momentos que estive ausente
dedicando-me a este trabalho, bem como todo o incentivo para alcançar meus objetivos.
Às minhas cadelas (Preta, Jade, Ágata e Sharon), que são a fonte de inspiração das minhas
atividades acadêmicas e profissionais.
Às amigas e médicas veterinárias, Anna Clara Accioly e Ana Karine Rocha de Melo Leite,
pela amizade e orientações durante várias fases acadêmicas, incluindo a pós-graduação.
Sou profundamente grata a todos vocês!
RESUMO
A pele é composta por um sistema imune cutâneo responsável pela primeira linha de defesa
aos insultos ambientais e patogênicos. Na leishmaniose canina, a infecção inicia-se nesse
órgão através da picada de vetores flebotomíneos que inoculam na derme o protozoário
Leishmania infantum, parasita intracelular do sistema fagocítico mononuclear. O objetivo
deste trabalho foi avaliar a expressão de CD45+, CD68 + e E-caderina+ associando às células
sentinelas da pele e caracterizar o padrão celular inflamatório correlacionando as lesões
cutâneas de cães naturalmente infectados por L.infantum. Para tanto, cães infectados (n = 22)
por L.infantum foram divididos em grupo assintomático (AD) e grupo sintomático (SD),
baseados na presença ou ausência de alterações cutâneas. Cães não infectados (CD, n = 5)
foram incluídos como grupo controle. Amostras de biópsias de pele foram coletadas de áreas
da região escapular e do terço superior da orelha. Histologia de rotina, coloração HE e azul de
toluidina, e imuno-histoquímica com anticorpos monoclonais contra CD45+, CD68 + e E-
caderina+ foram realizadas. Todo o protocolo experimental foi submetido ao Comitê de Ética
em Uso de Animais (CEUA) da Universidade Estadual do Ceará (UECE) sob protocolo
nº6459434/2015. Alterações cutâneas como ceratoconjuntivite, onicogrifose, liquenificação,
despigmentação, alopecia, hipotricose, dermatite eritematosa, dermatite esfoliativa, dermatite
ulcerativa e dermatite crostosa foram observadas no SD, destacando-se a dermatite ulcerativa
e a alopecia. Além disso, no grupo SD, observou-se uma freqüência significativa de
infiltração celular cutânea na derme superficial e profunda em relação à AD, composta por
macrófagos, plasmócitos, linfócitos e neutrófilos. Houve maior expressão dos mastócitos em
SD com infiltrado intenso e AD quando comparado aos outros animais, enquanto CD68+,
CD45+ e E-caderina+ foram mais expressos apenas em SD. Nesse contexto, concluiu-se que as
expressões de CD45+, CD68 + e E-caderina+ caracterizam a ativação das células imunitárias
sentinelas que promovem o recrutamento do infiltrado celular, que por sua vez influencia
diretamente no aparecimento das lesões cutâneas, tais como dermatite ulcerativa e alopecia.
Por outro lado, não foi possível observar associação entre os mastócitos e a evolução clínica.
Diante disso, esses dados podem contribuir para o acompanhamento da progressão da
leishmaniose canina na pele.
Palavras-chave: Cães. Leishmania infantum. Lesões na pele. Sistema imunológico cutâneo.
Células sentinelas.
ABSTRACT
The skin is composed of a cutaneous immune system responsible for the first line of defense
to environmental and pathogenic insults. In canine leishmaniasis, infection begins in this
organ through the bite of phlebotomine vectors that inoculate the protozoan Leishmania
infantum, an intracellular parasite of the mononuclear phagocytic system. The objective of
this work was to evaluate the expression of CD45+, CD68 + and E-caderina+ by associating
with the sentinel cells of the skin and characterize the inflammatory cellular pattern
correlating the skin lesions of dogs naturally infected by L.infantum. For this, infected dogs (n
= 22) by L.infantum were divided into asymptomatic group (AD) and symptomatic group
(SD), based on the presence or absence of cutaneous alterations. Dogs non-infected (CD, n =
5) were included as control group. Samples of skin biopsies were collected from areas of the
scapular region and the upper third of the ear. Routine histology, HE staining and toluidine
blue, and immunohistochemistry with monoclonal antibodies against CD45+, CD68 + and E-
caderina+ were performed. The entire experimental protocol was submitted to the Committee
on Ethics in Animal Use (CEUA) of the State University of Ceará (UECE) under protocol
nº6459434/2015. Cutaneous alterations such as keratoconjunctivitis, onychogrifosis,
lichenification, depigmentation, alopecia, hypotrichosis, erythematous dermatitis, exfoliative
dermatitis, ulcerative dermatitis and crustal dermatitis were observed in SD, including
ulcerative dermatitis and alopecia. In addition, in the SD group, a significant frequency of
cutaneous cell infiltration in the superficial and deep dermis was observed in relation to AD,
composed of macrophages, plasma cells, lymphocytes and neutrophils. There was greater
expression of mast cells in SD with intense infiltrate and AD when compared to the other
animals, whereas CD45+, CD68 + and E-caderina+ were more expressed only in SD. In this
context, it was concluded that in CanL the expressions of CD45+, CD68 + and E-caderina+,
characterize the activation of sentinel immune cells that promote the recruitment of cellular
infiltrate, which in turn directly influences the appearance of cutaneous lesions, such as
ulcerative dermatitis and alopecia. On the other hand, it was not possible to observe
association between the mast cells and the clinical evolution. Therefore, these data may
contribute to the monitoring of the progression of canine leishmaniasis in the skin.
Keywords: Dogs. Leishmania infantum. Skin lesions. Cutanneous immune system. Sentinel
cells.
LISTA DE FIGURAS
REVISÃO DE LITERATURA
Figura 1 - A, forma promastigota; B, forma amastigota de Leishmania
spp...................................................................................................
17
Figura 2 - Cães com leishmaniose, apresentando alterações cutâneas. A,
cão com alopecia difusa; B, cão com hiperqueratose,
onicogrifose, edema de patas e alopecia difusa no
corpo...............................................................................................
18
Figura 3 - Estrutura e os componentes celulares da pele......................... 19
Figura 4 - Células imunitárias e os mediadores inflamatórios na
pele................................................................................................
21
Figura 5 - Origem e desenvolvimento de CDs a partir de precursores
hematopoiéticos..........................................................................
24
Figura 6 - Sinalização das células dendríticas para estimulação de
resposta por células T.. ................................................................
24
Figura 7 - O envolvimento de células dendríticas no controle da
infecção por Leishmania spp......................................................
30
CAPÍTULO I
Figure 1 –
Skin macroscopic lesions of dogs diagnosed with CanL. A,
dermatitis ulcerative in ear; B and D, dry exfoliative
dermatitis areas diffused by the animal body; C, dermatitis
crusted nasal region; D, diffuse alopecia; E,
keratoconjunctivitis and hypotrichosis periocular; F, diffuse
hypotrichosis; G, onychogryphosis; H, lichenification and
hyperpigmentation diffuse the animal's body..........................
50
Figure 2 - Dermatological clinical findings of dogs naturally infected by
L. infantum.................................................................................
51
Figure 3 - Histopathological and immunohistochemistry of skin dogs
naturally infected by L. infantum. Animals were categorized
according to their dermatological clinical status into
asymptomatic (AD) or symptomatic (SD). The control group
is represented by CD. Representative cutaneous cellular
infiltrates of groups were classified as none (3A), mild (3B)
and moderate (3C). CD45+ expression was classified as mild
(3D), moderate (3E) and intense (3F). CD68+ was classified as
mild (3H) and moderate (3G; 3I) expressions. E-cadherin+
was classified as none (3K), moderate (3J) and intense (3L)
expressions. L. infantum detection was classified as none
(3M), mild (3N) and moderate (3O). 200x. [Bars = 20
µm]..................................................................................................
52
CAPÍTULO II
Figura 1 - Lesões macroscópicas na orelha de cães com leishmaniose
visceral. A, orelha sem lesões; B, C, E e F, alopecia; B e D,
úlceras; C, eritema e crostas; E, liquenificação; F, úlceras,
hiperpigmentação e crostas......................................................
65
Figura 2 - Aspectos clínicos e dermatológicos da pele de orelha de cães
naturalmente infectados por Leishmania infantum ..................
67
Figura 3 - Imagens histológicas da pele da orelha de cães com
leishmaniose visceral. A e B, cães sintomáticos (SD) com
infiltrado inflamatório intenso (I.I.); C e D, cães sintomáticos
(SD) com infiltrado inflamatório moderado (I.M); E e F, cães
sintomáticos (SD) com infiltrado inflamatório discreto (I.D.);
G e H, cães assintomáticos (AD) sem infiltrado celular
infalmatório (I.C). HE 200x, A,C, E e G; AT (azul de
toluidina) 200x B, D, F e H.......................................................
68
Figura 4 - Imunohistoquímica da pele da orelha de cães com
leishmaniose. A e C, fotomicrografia dos cães assintomáticos
(AD) sem infiltrado celular (I.C.) e discreta coloração para
Leishmania infantum+, respectivamente; B e D,
fotomicrografia dos cães sintomáticos (SD) com infiltrado
inflamatório moderado (I.M) e moderada coloração para
L.infantum +, respectivamente. HE 200x, A e B;
Estreptoavidina peroxidase contra-corada com Hematoxilina
de Mayer, 200x, C e D..............................................................
69
Figura 5 - Alterações clínicas dermatológicas, alopecia (A) e dermatite
ulcerative (B), e o infiltrado celular inflamatório. Os índices
de correlação de Spearman (valores ρ) são mostrados nos
gráficos……………………………………………………….......
70
LISTA DE TABELAS
REVISÃO DE LITERATURA
Tabela 1 – Moléculas marcadoras expressas na superfície de células
dendríticas de cães...........................................................................
27
CAPÍTULO I
Table 1 - Hematological and biochemical analyses in asymptomatic and
symptomatic dogs naturally infected by L. infant…………………..
49
Table 2 - Expressions of CD45+, CD68+, E-cadherin+ and L.infantum on
skin dogs naturally infected with L. infantum.................................
50
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Ac Anticorpo
APCs Células apresentadoras de antígenos
CanL Canine leishmaniasis
cCDs Células dendríticas convencionais
CCZ Centro de Controle de Zoonoses
CD4+ Células T auxiliares
CD8+ Células T citotóxicas
CDs Células dendríticas
CEUA Comitê de Ética em Uso de Animais
CLs Céulas de Langerhans
DA Dermatite Atópica
DAB Diaminobenzidina
DAMPs Padrões Moleculares Associados ao Dano
DC Dendritic cells
dCDs Células dendríticas dérmicas
ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay
Flt3L Fator de transcrição (Ligante de tirosina-quinase 3 semelhante ao FMS)
GM-CSF Fator Estimulador de Colônia de Monócitos e Granulócitos
h Hora
H2O2 Peróxido de Hidrogênio
HCT Hematocrit (Hematócrito)
HE Hematoxilina-Eosina
HGB Hemoglobin (Hemoglobina)
IL Interleucina
INF-γ Interferon Gama
Kg Kilograma
LC Langerhans cells
LV Leishmaniose Visceral
LVC Leishmaniose Visceral Canina
M Molar
mg Miligrama
MHC I Complexo de histocompatibilidade principal tipo I
MHC II Complexo de histocompatibilidade principal tipo II
min Minuto
mL Mililitro
moCDs Células dendríticas derivadas de monócitos
NKT Linfócitos T Natural Killer
NO Óxido nítrico
PAMPs Peptídeos moleculares associados aos patógenos
PBS Phosphate Buffer Saline (Tampão salina fosfato)
pCDs Células dendríticas plasmocitóides
PLT Platelets (Plaquetas)
RBC Red blood cell (Hemácias)
ROS Espécies reativas de oxigênio
TGF-β Fator de Crescimento Tumoral
TLR Receptores do tipo Toll like
Tnaive Linfócito T virgem
TNF-ɑ Fator de Necrose Tumoral
TPS Total protein serum (Proteínas totais séricas)
U/L Unidades por litro
WBC White blood cell (Leucócitos)
µL Microlitro
ºC Graus Celsius
% Porcentagem
SU M Á R I O
1 INTRODUÇÃO...................................................................................... 15
2 REVISÃO DE LITERATURA............................................................ 16
2.1 LEISHMANIOSES.................................................................................. 16
2.1.1 Leishmaniose Visceral Canina.......................................................... 17
2.2 PELE....................................................................................................... 18
2.2.1 Imunidade Cutânea.............................................................................. 20
2.3 CÉLULAS DENDRÍTICAS................................................................ 23
2.3.1 Células dendríticas na espécie canina.......................................... 26
2.3.2 Células dendríticas e a relação com patologias caninas.................. 27
2.4 CÉLULAS DENDRÍTICAS E A RESPOSTA IMUNOLÓGICA
À INFECÇÃO POR LEISHMANIA SPP........................................
28
3 JUSTIFICATIVA................................................................................ 32
4 HIPÓTESE CIENTÍFICA.............................................................. 33
5 OBJETIVOS.......................................................................................... 34
5.1 GERAL.................................................................................................... 34
5.2 ESPECÍFICOS......................................................................................... 34
6 CAPÍTULO I - CD45+, CD68 + and E-cadherin+ expressions in
skin dogs naturally infected by Leishmania infantum...................
35
7 CAPÍTULO II - Relação entre infiltrado celular e lesões cutâneas
na orelha de cães naturalmente infectados por Leishmania
infantum..............................................................................................
55
8 CONCLUSÕES...................................................................................... 71
9 PERSPECTIVAS.................................................................................. 72
REFERÊNCIAS................................................................................ 73
ANEXOS............................................................................................... 81
ANEXO A – COMITÉ DE ÉTICA....................................................... 82
15
1 INTRODUÇÃO
A pele corresponde ao sítio inicial de contato com agentes patogênicos e injúrias
ambientais. Ela compreende ao revestimento externo do corpo, sendo formada por epiderme,
derme e hipoderme. As duas primeiras camadas estão envolvidas com a resposta imunológica
e manutenção da homeostase cutânea, por meio de uma variedade de células imunes
especializadas e mediadores pró-inflamatórios. Dentre essas células, estão os queratinócitos,
células linfoides inatas e adaptativas, macrófagos, mastócitos, monócitos e células dendríticas
(NESTLE et al., 2009; BELKAID & TAMOUTOUNOUR, 2016).
As células dendríticas (CDs) são células imunitárias presentes na pele (MALISSEN et
al.,2014) com capacidade de apresentar antígenos exógenos e endógenos, sendo consideradas
células apresentadoras de antígeno (APCs) clássicas (CARVALHO et al, 2006). Após o seu
contato com os micro-organismos ou substâncias associadas à infecção ou inflamação na pele,
elas apresentam os antígenos processados para células T naive nos órgãos linfoides,
modulando a resposta imune celular em Th1 ou Th2 (FREITAS & PINHEIRO, 2010;
PAPADOGIANNAKIS & KOUTINAS, 2015; SCOTT & NOVAIS, 2016). Em cães, as CDs
são importantes células apresentadoras de antígenos envolvidas em doenças dermatológicas,
doenças infecciosas e doenças parasitárias, dentre elas a leishmaniose (DAY, 1996;
FONDEVILLA et al., OLIVRY et al., 1997; AFFOLTER & MOORE, 2002; JACKSON et
al., 2004).
A leishmaniose destaca-se dentre as doenças parasitárias de alta incidência na clínica
veterinária. É uma doença endêmica, geralmente subaguda ou crônica em cães
(CIARAMELLA & CORONA, 2003), transmitida através da picada de vetores flebotomíneos
na pele, sendo causada pelo protozoário Leishmania spp., parasita intracelular encontrado em
macrófagos e CDs (SCOTT & NOVAIS, 2016). Essa enfermidade apresenta alterações
clínicas variáveis, podendo se manifestar em diferentes órgãos, dentre eles a pele.
O conhecimento das células sentinelas no estabelecimento da infecção e na defesa do
sistema imune de cães ao parasito Leishmania infantum é imprescídivel, uma vez que essas
informações poderiam ser utilizadas como ferramenta para acompanhamento da evolução
clínica da Leishmaniose Canina.
16
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 LEISHMANIOSES
As leishmanioses são doenças causadas por protozoários pertencentes ao gênero
Leishmania spp. capazes de promover um amplo espectro de manifestações clínicas, podendo
a enfermidade apresentar-se sob 5 formas clínicas: Leishmanioses tegumentares (LT),
Leishmaniose mucocutânea (LM), Leishmaniose cutânea difusa (LCD), Leishmaniose
visceral (LV) e Leishmaniose dérmica pós Kalazar (LDPK) (SCOTT & NOVAIS, 2016;
WHO, 2016). No Brasil estão presentes as espécies Leishmania amazonensis, L. braziliensis e
L. guyanensis responsáveis pela LT, e L. chagasi, sinonímia L. infantum, responsável pela LV
(BRASIL, 2014; SESA, 2016).
As leishmanioses são endêmicas em 98 países e territórios, com mais de 350 milhões de
pessoas em risco. O Brasil está entre os 10 países que concentram 75% dos casos de
leishmaniose tegumentar e entre os 6 países em que 90% dos casos de leishmaniose visceral
são encontrados (WHO, 2016). O Nordeste Brasileiro destaca-se entre as regiões com o maior
número de casos dessa enfermidade. No Estado do Ceará entre 2007 e 2016 (até setembro),
93% dos municípios notificaram casos de LV em humanos, sendo a capital Fortaleza o
município de maior quantidade de casos, possuindo uma alta prevalência para a doença
(SESA, 2016). Mundialmente, existem programas de controle epidemiológico a fim de
reduzir as taxas de letalidade e grau de morbidade bem como diminuir os riscos de
transmissão dessa enfermidade.
A leishmaniose acomete vários hospedeiros vertebrados, dentre eles o homem e o cão,
sendo este último o principal reservatório natural do parasita (ASHOK & ACHA-ORBEA,
2014). Ela é considerada uma zoonose, quando transmitida primariamente entre humanos e
animais, ou antropozoonose, se a transmissão ocorrer entre animais e secundariamente
infectar o homem (BRASIL, 2014; SESA, 2016; WHO, 2016). A transmissão ocorre através
de vetores flebotomíneos fêmeas, pertencente a familia Psychodidae e ao gênero
Lutzomya,que inoculam na derme do hospedeiro as formas promastigotas (Fig.1A),
correspondente ao estágio infectante do protozoário Leishmania spp. As promastigotas
infectantes são fagocitadas por células do sistema fagocitíco mononuclear, onde se
diferenciam na forma redonda não flagelada chamada de amastigota (Fig.1B). As amastigotas
se multiplicam até o rompimento da célula infectada, sendo capazes de infectar novas células
17
(macrófagos, monócitos, neutrófilos e células dendríticas) e se disseminarem para outros
tecidos (BRASIL, 2014; SCOTT & NOVAIS, 2016).
Figura 1- A, forma promastigota; B, forma amastigota de Leishmania spp
Fonte: BRASIL, 2014.
2.1.1 Leishmaniose Visceral Canina
A leishmaniose visceral canina (LVC) ou leishmaniose canina (CanL) é uma doença
sistêmica severa, geralmente subaguda ou crônica em cães, causada pelo agente etiológico
Leishmania (Leishmania) chagasi, sinônimo de Leishmania (Leishmania) infantum. No
Estado do Ceará, o principal vetor transmissor do parasita é o Lutzomyia longipalpis
(BRASIL, 2014).
Os cães infectados podem apresentar alterações clínicas brandas a severas, bem como
permanecer por um longo período sem sintomatologia. As alterações observadas em cães
sintomáticos são onicogrifose, esplenomegalia, linfoadenopatia, ceratoconjuntivite, coriza,
apatia, diarréia, hemorragia intestinal, edema de patas, vômito, úlceras na pele, alopecia,
hiperqueratose, paresia das patas posteriores, caquexia e/ou inanição (Fig.2) (BRASIL, 2014;
REIS et al., 2014). Essas manifestações clínicas variam amplamente em consequência dos
numerosos mecanismos patogênicos, da resposta imunológica e dos diferentes órgãos
afetados (BANETH et al., 2008).
B A
18
Figura 2 - Cães com leishmaniose, apresentando alterações cutâneas. A, cão com
alopecia difusa; B, cão com hiperqueratose, onicogrifose, edema de patas e alopecia
difusa no corpo
Fonte: elaborada pelo autor
As lesões cutâneas são comuns na CanL, visualizadas na maioria dos animais
sintomáticos e, geralmente, como uma alteração primária (Fig.2). Isso poderia ser explicado
pelo fato que a pele corresponde a porta de entrada do parasita, onde ocorre as primeiras vias
da resposta imunológica ao patógeno.
2.2 PELE
A pele corresponde ao revestimento externo do corpo responsável pela proteção do organismo aos danos ambientais (tais como radiação ultravioleta, choques mecânicos, etc.) e agentes patogênicos (como vírus, bactérias, protozoários, etc.). Ela é constituída por três camadas: epiderme, derme e hipoderme (Fig.3) (NESTLE et al., 2009; PASPARAKIS et al., 2014;
A B
19
Figura. 3 Estrutura e os componentes celulares da pele. Adaptada de PASPARAKIS et
al., 2014.
Fonte: elaborada pelo autor
A epiderme constitui a barreira mais externa do corpo, formada por um epitélio
estratificado, pavimentoso e queratinizado. Ela é subdividida em estrato basal ou germinativo
(camada inferior da epiderme responsável pela renovação celular), estrato espinhoso, estrato
granuloso, estrato lúcido (presente somente nas regiões mais espessas da pele de cães e gatos,
como coxins e plano nasal) e estrato córneo (camada mais externa). Esses estratos são
Epiderme
Microbiota comensal
Células Langerhans
Folículo piloso
LT CD8+
LT CD4+
Céls. linfóides inata
Macrófagos Cél. dendrítica
Mastócitos
LT
Membrana basal
Queratinócitos
Vaso saguíneo
Derme
Hipoderme
20
formados a partir de células que passam por processos de diferenciação e maturação contínua
da camada mais interna para a mais externa, denominadas queratinócitos.
Os queratinócitos, principais células epidérmicas, adquirem formatos e conteúdos
citoplasmáticos diferentes das células de origem à medida que se diferenciam a fim de
compor a camada superior. O estrato córneo é constituído por queratinócitos desprovidos de
organelas, conhecidos por corneócitos. Além desses, a epiderme também é constituída por
melanócitos, que produzem o pigmento melanina, e células imunitárias como células de
Langerhans (CLs) e linfócitos T CD8+ (SCOTT et al., 2001; NESTLE et al., SOUZA, 2009;
BELKAID & TAMOUTOUNOUR, 2016). A epiderme corresponde a um sítio inicial da
resposta imune do hospedeiro e de mecanismos de defesa contra injúrias ambientais e
patogênicos (MACLEOD et al.,2013).
A camada subjacente à epiderme é a derme, a qual é separada desta por uma membrana
basal que regula as trocas metabólicas e nutritivas entre elas (MALISSEN et al., 2014). Ela é
formada por tecido conjuntivo denso não modelado entremeado de uma variedade de células e
matriz extracelular abundante composta por fibras colágenas (SOUZA et al., 2009). Dentre
os componentes celulares, estão presentes células imunitárias especializadas que residem ou
circulam através da derme como células dendríticas (CDs), linfócitos T e células NKT, e,
também, macrófagos, mastócitos e fibroblastos. Além desses, possui uma ampla rede de vasos
sanguíneos e linfáticos, terminações nervosas, músculo liso (músculo eretor do pêlo) e os
anexos cutâneos (folículos pilosos, glândulas sudoríparas e sebáceas) (NESTLE et al., 2009;
BELKAID & TAMOUTOUNOUR, 2016).
A hipoderme, localizada abaixo da derme, é constituída por tecido conjuntivo e,
principalmente, tecido adiposo (MALISSEN et al., 2014). Desempenha um papel importante
na regulação da temperatura corporal, por meio do tecido adiposo (gordura) (SOUZA et al.,
2009).
2.2.1 Imunidade cutânea
A pele é um órgão de extrema importância imunológica para o animal, apresentando-
se como uma barreira da resposta imune inata e específica. A resposta imunológica é
regulada por meio de uma variedade de células imunes e mediadores pró-inflamatórios,
presentes na epiderme e na derme, que participam no controle da homeostase cutânea
(LARREGINA & MATHERS, 2006). Dentre essas células, estão queratinócitos, linfócitos,
21
basófilos, macrófagos, monócitos, mastócitos e células dendríticas desempenhando o papel de
células imunitárias na pele que reagem rapidamente ao contato antigênico (Fig.4) (NESTLE et
al., 2009; PASPARAKIS et al., 2014; BELKAID & TAMOUTOUNOUR, 2016; SCOTT &
NOVAIS, 2016).
Figura 4 - Células imunitárias e os mediadores inflamatórios na pele.
Fonte: Adaptada de PASPARAKIS et al., 2014.
EPIDER
ME
Queratinócitos
Captura antigênica
Captura antigênica Linfonodo de
drenagem
Macrófago
Macrófago
Macrófago
Mastócitos Basófilos
Linfonodo de
drenagem
Monócito
DER
ME
Neutrófilos
Células de Langerhans
Vasos linfáticos
Vasos sanguíneos
22
Os queratinócitos são considerados células efetoras pró-inflamatórias que estão
posicionados na camada mais externa do corpo, promovendo a resposta imune inicial aos
insultos ambientais e patogênicos. Eles detectam o agente nocivo invasor da pele através de
PAMPs (peptídeos moleculares associados aos patógenos), que se ligam aos TLRs (receptores
do tipo Toll like) ativando as vias de sinalização celular e desencadeando a resposta imune.
(BELKAID & TAMOUTOUNOUR, 2016). Os queratinócitos produzem peptídeos
antimicrobianos (AMPs), quimiocinas e citocinas que modulam a resposta imunológica por
meio do recrutamento e ativação de várias células (NESTLE et al., 2009).
As células T estão presentes em grande quantidade na pele, destacando-se os linfócitos
T CD4+, CD8+ e NKT. Os linfócitos T CD8+ podem ser encontrados entremeados a
queratinócitos e próximos às células de Langerhans (CLs) no estrato basal e estrato espinhoso,
e T CD4+ nas proximidades de vênulas e anexos cutâneos da derme. Essas células T cutâneas,
em sua maioria, são células de memória promotoras de resposta imune rápida e eficaz a
antígenos secundários apresentados nessa superfície, uma vez que já foram previamente
expostas a esses antígenos (infecção primária) por meio da apresentação por células
dendríticas (CDs). As células NKT, conhecidas por assassinas naturais, estão presentes na
derme. Após estímulo antigênico, estas células são capazes de modular a resposta imune
cutânea por meio das células dendríticas. As NKT produzem IFN γ, que estimulam o aumento
da produção de IL-12 pelas CDs, favorecendo o desenvolvimento de uma resposta imune
celular do tipo Th1 (BELKAID & TAMOUTOUNOUR, 2016; SCOTT & NOVAIS, 2016).
Os monócitos e macrófagos são células efetoras que pertencem ao sistema fagocítico-
mononuclear e funcionam em vingilância imunológica patrulhando a pele. Eles residem e
migram para a pele durante reações inflamatórias, dependendo do estímulo antigênico e
mediadores químicos no sítio de infecção (NESTLE, 2009; PASPARAKIS et al., 2014).
Além desses, os mastócitos participam da primeira linha de defesa na pele por meio de
mediadores próinflamatórios que são armazenados dentro dos seus grânulos citoplasmáticos,
rapidamente liberados após o contato antigênico, cujos estão relacionados ao recrutamento de
células assassinas naturais (NK) e células NKT para os locais de infecção (BELKAID &
TAMOUTOUNOUR, 2016). Mastócitos e basófilos estabelecem um equilíbrio de
mecanismos pró-inflamatórios e anti-inflamatórios por meio de citocinas que facilitam ou
atenuam respostas inflamatórias, respectivamente (PASPARAKIS et al., 2014).
As células dendríticas (CDs) destacam-se entre as células imunitárias presentes na
pele, podendo ser encontradas na epiderme e na derme (MALISSEN et al., 2014). Elas
capturam, processam e apresentam o antígeno em contato com a barreira cutânea às células T
23
a fim de desencadear a resposta imunológica a diversos agentes patogênicos. Tendo em vista
a sua importância e o fato dessas células serem o foco do nosso estudo, abordaremos adiante
maiores detalhes a cerca das mesmas.
2.3 CÉLULAS DENDRÍTICAS
As células dendríticas (CDs) são células sentinelas do sistema imunitário com a
capacidade de capturar, processar e apresentar antígenos exógenos e endógenos em tecidos
linfóides e não linfóides periféricos. Elas são células apresentadoras de antígeno clássicas
(APCs) de extrema importância para o desencadeamento da resposta imune inata e adaptativa
às infecções e as partículas antigênicas vacinais, bem como, para a manutenção da tolerância
imunológica (BRANDONISIO et al., 2004; GERNER et al., 2015).
As CDs derivam de precursoras da medula óssea, podendo amadurecer a partir de
precursores mielóide e linfóide, que se diferenciam em CDs distintas por meio de fatores de
transcrição, como o Flt3L, e citocinas regulatórias, como a GMCSF, a TGFβ1 e a IL-4 (WU
& LIU, 2007). Dentre os principais tipos de CDs existentes, destacam-se
as plasmocitóides (pCDs) e as convencionais (cCDs), sendo essas últimas subdivididas
em CDs linfonodo residentes e CDs migratórias. As cCDs podem ser provenientes da
diferenciação de monócitos, sendo denominadas mais especificamente como moCDs (células
dendríticas derivadas de monócitos) (Fig.5). As CDs são diferenciadas pela sua localização
nos tecidos, fenótipo de superfície e função (ASHOK & ACHA-ORBEA, 2014).
24
Figura 5. Origem e desenvolvimento de CDs a partir de precursores
hematopoiéticos. Flt3L, fator de transcrição; IL-4, interleucina; TGF-β1, fator de
crescimento; pCD, Célula dendrítica plasmocitóide; cCD, Célula dendrítica
convencional; M-CD, precursor de macrófago e célula dendrítica.
Fonte: elaborada pelo autor
As CDs estão presentes na pele (incluindo as Células de Langerhans - CLs - na
epiderme e, CDs dérmicas e pCDs na derme), fígado e pulmões (cCD intersticial), intestino,
baço e timo (CDs tímicas). Elas expressam marcadores de proteína diferentes em sua
superfície, cuja expressão é dependente da sua condição (homeostática, inflamatória ou
tolerogênica) (WU & LIU, 2007; DEL RIO et al., 2010; ASHOK & ACHA-ORBEA, 2014).
Estas células capturam os micro-organismos ou substâncias associadas à infecção ou
inflamação depositados nos tecidos, passam por um processo de maturação após 16 horas a 5
dias, dependendo do subconjunto de CDs (GERNER et al., 2015), e migram para as áreas
Célula precursora multipotent
PrecursorMielóide
Precursor Linfóide
Flt3L
IL-4
Monócito
TGFβ1
cCD
M-CD
pCD
GM-CSF
25
ocupadas por linfócitos T nos órgãos linfóides. Nos linfonodos de drenagem, as CDs
apresentam os antígenos processados para células T naive CD4+, modulando a diferenciação
em células T CD4+ Th1 ou Th2 mediante os estímulos patogênicos e as citocinas liberadas no
microambiente da infecção ou inflamação (Fig. 6) (SCHNARE et al., 2001; KAPSENBERG,
2003; BRANDONISIO et al., 2004).
Figura 6- Sinalização das células dendríticas para estimulação de resposta por células T.
Fonte: Adaptada de KAPSENBERG, 2003.
As populações de CDs eficientes na captura antigênica e limitadas quanto à
estimulação de células T naive são denominadas CDs imaturas. Uma vez que as mesmas
reduzem a capacidade fagocitária e são capazes de apresentar os antígenos processados aos
linfócitos, são consideradas CDs maduras (CELLA et al, 1997). O processo de maturação
consiste em vários mecanismos como: aumento da expressão do complexo principal de
histocompatibilidade (MHC) e de moléculas co-estimuladoras ou de adesão, tais como CD40,
CD80, CD86 e CD54; regulação da captura de antígeno e capacidade fagocitária; aumento da
secreção de citocinas e produção de diferentes padrões de expressão dos receptores de
quimiocinas (BRANDONISIO et al., 2004).
Tipo 1 PAMPs/
Fator de polarização
Tipo 2 PAMPs/
Fator de polarização
Sinal 3 Polarização
Sinal 3 Polarização
Sinal 2
Sinal 1
Célula Th
CÉLULA DENDRÍTI
Peptídeo-
Via de polarização célula
Via de polarização célula
26
Segundo estudos realizados em camundongos, as CDs expressam em sua superfície
moléculas como: complexo principal de histocompatibilidade do tipo II (MHC II); moléculas
co-estimuladoras CD40, CD70, CD80, CD86, CD54; e marcadores CD4 ou CD8 (que são
marcadores típicos de células T encontrados nas subpopulações de cCDs presentes em órgãos
linfóides secundários). Em camundongos, o CD11c é um marcador que pode ser encontrado
em CDs imaturas e maduras. Os outros subconjuntos principais de CD residentes nos tecidos
expressam CD11b (a integrina α em cadeia de Mac1) e são agrupados em populações CD4 +
e CD4 -. Além dessas moléculas, o marcador DEC-205 e o CD103 foram expressos em vários
subconjuntos de cCDs e algumas CDs residentes na derme, respectivamente (WU & LIU,
2007; DEL RIO et al., 2010; ASHOK & ACHA-ORBEA, 2014).
As células de Langerhans (CLs) são células dendríticas residentes na epiderme,
correspondentes as APCs mais abundantes da pele. Elas apresentam uma lectina
transmembranar com especificidade de ligação a manose denominada Langerina, que pode
também ser encontrada em alguns subconjuntos de CDs dérmicas (dCDs) e CDs
CD8 + de linfonodos de drenagem (BRANDONISIO et al., 2004; NESTLE et al., 2009;
ASHOK & ACHA-ORBEA, 2014).
2.3.1 Células dendríticas na espécie canina
Em cães, CDs foram isoladas pela primeira vez em 1985 a partir dos nódulos linfáticos
e sangue periférico (GOODELL et al.,1985). Similar a outras espécies animais, CDs caninas
cultivadas caracterizam-se por células não aderentes de tamanho e forma variável com
núcleos grandes lobulados e projeções citoplasmáticas conhecidas por dendritos (que são
estruturas características das CDs distinguindo-as dos macrófagos) (IBISCH et al., 2005;
WANG et al., 2007; SUGIURA et al., 2010). Grânulos de Birbeck, que sãoestruturas
clássicas dessas células, não são observados nas CLs de cães (MOORE et al., 1996). Nas CDs
mielóides de cães já foram identificadas diversas moléculas expressas na superfície,
utilizando a análise por citometria de fluxo (Tabela 1). As moléculas de MHC II são expressas
constitutivamente na superfície das CDs dos cães. Um aumento na população dessas células e
expressão do MHC II tem sido relatado nas patologias caninas (DAY, 1997; OLIVRY et al.,
1997; JACKSON et al., 2004).
27
Tabela 1- Moléculas marcadoras expressas na superfície de células dendríticas de cães. CDs, célula
dendríticas
Tipo de CDs Marcadores Referências
Células de
Langerhans
CD1a, CD1b, CD1c, CD11c, CD80,
MHC-II e E-caderina
Moore et al., 1996; Affolter & Moore,
2002; Jiang et al., 2007; Ricklin et al.,
2010
CDs derivadas da
medula óssea
CD1a, CD1c, CD4, CD8, CD11b,
CD11c, CD40, CD45RA, CD80, CD86,
CD206, MHC-II, ICAM-1, Thy-1
Moore et al., 1996; Affolter & Moore,
2002; Weber et al., 2003; Ricklin et al.,
2010; Ricklin Gutzwiller et al., 2010
CDs derivadas de
monócitos
CD1a, CD1c, CD11b, CD11c, CD14,
CD40, CD45RA, CD80, CD83, CD86,
CD209, MHC-II, ICAM-1, TLR-3
Moore et al., 1996; Affolter & Moore,
2002; Ibisch et al., 2005; Bonnefont-
Rebeix et al., 2007; Wang et al., 2007;
Bund et al.,2010; Ricklin Gutzwiller et
al., 2010; Sugiura et al., 2010
Fonte: Elaborado pelo autor.
Em cães, as CDs maduras têm uma maior capacidade de estimular os leucócitos
alogênicos que as CDs imaturas (WEBER et al., 2003; IBISCH et al., 2005;
WIJEWARDANA et al., 2006; WANG et al., 2007; BUND et al., 2010). Além disso, CDs
derivadas da medula óssea, em comparação com moCDs, têm uma maior capacidade de
induzir uma reação leucocitária mista (RICKLIN GUTZWILLER et al., 2010).
2.3.2 Células dendríticas e a relação com patologias caninas
Segundo Ibisch e colaboradores (2005), os cães são filogeneticamente semelhantes aos
seres humanos, e apresentam semelhança quanto às doenças caninas e as doenças humanas
especialmente relacionadas à desregulação imunitária. Os cães apresentam diferentes perfis de
células Th (Th0, Th1 e Th2) que estão desregulados nas doenças alérgicas e auto-imunes, e
nas infecções parasitárias crônicas. As CDs desempenham um papel importante na
apresentação do antígeno em doenças dermatológicas (tais como as dermatites de
hipersensibilidade, pioderma, dermatite atópica e neoplasias de pele), doenças infecciosas
(como a cinomose) e doenças parasitárias (como a leishmaniose) (DAY, 1996;
FONDEVILLA et al., OLIVRY et al., 1997; AFFOLTER & MOORE, 2002;
JACKSON et al., 2004).
28
Nas patologias caninas autoimunes como anemia hemolítica auto-imune, tireoidite
auto-imune e lúpus eritematoso sistêmico, a autoimunidade está associada a uma interação
entre as células T e CDs anormais que potencialmente provoca o aparecimento da doença e
inicia os processos inflamatórios excessivos (DAY, 1999; JACKSON et al., 2004;
GERSHWIN, 2007; WILBE & ANDERSSON, 2012).
Na dermatite atópica (DA), que corresponde a uma doença inflamatória crônica da
pele, é possível identificar CDs no infiltrado mononuclear. Durante a patogênese de DA,
considera-se que as CDs não só capturam o alérgeno, mas também estimulam os principais
eventos que promovem a manifestação clínica. A reação inflamatória presente na DA
compreende uma resposta Th2, resposta aguda, e Th1, fase crônica. A mudança para a
resposta Th1 está relacionada às CDs por meio da produção de IL12 e IL18, e liberação
de citocinas próinflamatórias. Em cães, somente a resposta de Th2 inicial é tipicamente
encontrada, e em lesões crônicas o padrão de citocinas expresso pode ser variável (RICKLIN
et al., 2010).
Em doenças neoplásicas caninas, como o histiocitoma cutâneo benigno e o sarcoma
histiocítico, correspondente a neoplasia benigna origininária de CLs e proliferação neoplásica
de células dendríticas interstiticais, respectivamente, há a expressão de moléculas marcadoras
de CDs (KERLIN & HENDRICK, 1996; AFFOLTER & MOORE, 2000; AFFOLTER &
MOORE, 2002). Nessas patologias, os fatores derivados do tumor podem alterar a maturação
de CD, suprimindo assim as respostas imunitárias antitumorais ou induzindo a tolerância
imunológica a antígenos associados aos tumores (GOULART et al, WASSERMAN et al,
2012).
Na cinomose, doença altamente contagiosa de origem viral que acomete cães, há uma
imunossupressão profunda e de longa duração nos animais afetados. Durante a fase crônica da
doença, as CDs parecem servir como células hospedeiras para os estágios primários do vírus
da cinomose, promovendo a persistência viral nos órgãos linfóides (WÜNSCHMANN et al.,
2000). Este processo é assumido para inibir a diferenciação terminal das CDs, responsável
pelo desequilíbrio no repovoamento dos tecidos linfóides e diminuição da função
apresentadora de antígeno nos cães, do mesmo modo ocorre na infecção pelo vírus do
sarampo em humanos (KERDILES et al., 2006; SCHNEIDER-SCHAULIES & DITTMER,
2006). No timo, a infecção de CDs epiteliais pode resultar em maturação comprometida de
células T promovendo a liberação de células imaturas, linfócitos potencialmente auto-reativos
(WÜNSCHMANN et al., 2000).
29
Na leishmaniose visceral canina, segundo estudo realizado por SILVA e colaboradores
(2012), a infecção natural por Leishmania infantum está associada redução das células
dendríticas foliculares no baço, levando a uma desregulação da imunidade humoral e aumento
da susceptibilidade à infecção bacteriana oportunista. Além disso, o comprometimento dessas
células pode estar relacionado às alterações clínicas graves da doença. Diante disso, conhecer
as vias da resposta imunológica a esse patógeno quanto aos mecanismos relacionados à
interação com as CDs em outros tecidos contribuem para o conhecimento da patogênese dessa
enfermidade.
2.4 CÉLULAS DENDRÍTICAS E A RESPOSTA IMUNOLÓGICA À INFECÇÃO POR
LEISHMANIA SPP.
A primeira linha de defesa contra a infecção por Leishmania spp. envolve o
reconhecimento antigênico inespecífico pelas células apresentadoras de antígeno
(APCs), correspondendo a imunidade inata. Após a inoculação de promastigostas de
Leishmania spp. na derme, CDs e monócitos inflamatórios são recrutados por meio de
quimiocinas para o local da infecção, onde capturam os parasitas, e após algumas horas
tornam-se infectados. Após o contato antigênico, os monócitos inflamatórios se diferenciam
em moCDs e migram para os linfonodos regionais. No órgão linfoide, células natural killer
(NKT), residentes em estreita associação com CDs, produzem IFN-γ a fim de promover
aumento na produção de IL-12 por essas CDs. A IL-12 é essencial para a diferenciação de
células T naive em células efetoras Th1, as quais migram para o microambiente infeccioso a
fim de controlar à infecção por Leishmania spp. (Fig. 7) (BRANDONISIO et al, 2004;
ASHOK & ACHA-ORBEA, 2014). Por outro lado, a susceptibilidade à infecção
está associada à ativação de células T CD4+ Th2, que produzem níveis elevados de IL-4 e
baixos níveis de INF-γ. A IL-4 promove a diferenciação das próprias células Th2 e,
juntamente com IL-10, inibe a ativação das células Th1, enquanto o INF-γ secretado pelas
células Th1 modula a diferenciação em Th1 e inibe a proliferação das células Th2 (SCOTT &
NOVAIS, 2016).
Em camundongos infectados por Leishmania major, observou-se que as CDs no local
da inoculação capturam os parasitas, adquirindo um fenótipo maduro e, após a migração para
os linfonodos de drenagem, apresentam os antígenos de L. major para
as células T CD4 + e CD8 + através de MHCII e MHCI, respectivamente. As CDs
ativadas por meio da produção de IL-12 regulam a proliferação de Th1, produção de INF-γ e
30
capacidade parasiticida de macrófagos ativados, a fim de conter a infecção por L. major
(ASHOK & ACHA-ORBEA, 2014).
Figura. 7 O envolvimento de células dendríticas no controle da infecção por Leishmania
sp. NO, óxido nítrico; ROS, espécies reativas de oxigênio; CCR2, receptor de quimiocina.
Fonte: Adaptada de SCOTT & NOVAIS, 2016.
A manifestação da CanL é dependente da espécie de Leishmania spp., bem como
resposta imune do hospedeiro. A resistência à infecção em cães por L. infantum está associada
à ativação de células T CD4+ Th1, que produzem INF-γ, IL-2 e o fator de necrose tumoral
(TNF-α) e, desse modo, ativam os macrófagos para destruírem as formas amastigotas
intracelulares, via produção de óxido nítrico (VOULDOUKIS et al., 1996). A interação de L.
infantum com o sistema imunológico da pele do cão envolve os componetes celulares inatos
Migração
Macrófago infectado
• NO e ROS
• Morte parasita
monócito
Th efetora LINFONODO
CDs derivadas de monócitos
Th1 Th
Migração
31
CLs, dCDs e macrófagos, e as células imune adaptativas T CD4+ e CD8+
(PAPADOGIANNAKIS et al., 2015).
Todavia, estudos demonstraram que a Leishmania spp. apresenta uma capacidade de
driblar a resposta imune associadas às CDs . Dados sugerem que a evasão da Leishmania spp.
baseia-se na inibição da migração de CDs e retardo na sua maturação no intuito de favorecer o
estabelecimento da infecção antes do aparecimento da resposta imune (BRANDONISIO et
al., 2004). Em murinos foi visto que um lipofosfoglicano oriundo da superfície de L. major
impediu a migração de células de Langerhans, modulando a resposta imune (PONTE-SUCRE
et al., 2001).
32
3 JUSTIFICATIVA
Considerando-se que a leishmaniose visceral canina é uma enfermidade rotineira na
clínica veterinária e que em alguns animais pode ser extremamente debilitante e, em outros,
serem assintomáticos, torna-se interessante investigar os diversos mecanismos imunológicos
induzidos por essa doença.
Sabendo-se que a pele corresponde a porta de entrada de Leishmania infantum, e que
as células dendríticas presentes na pele são responsáveis por desencadear a resposta imune
inicial a esse patógeno, uma vez que são hábeis em transportar antígenos exógenos aos órgãos
linfoides, é importante estudar a relação entre esse tipo de célula e o parasita em animais
assintomáticos e sintomáticos. Ainda que, é desconhecido o papel dessa célula na
leishmaniose canina, no que diz respeito à imunidade e alteração cutânea.
Desta forma, a investigação de células dendríticas na etiopatogenia da leishmaniose
visceral canina torna-se necessária a fim de servir futuramente como uma ferramenta para o
acompanhamento tanto da progressão da doença quanto para o tratamento dessa enfermidade.
33
4 HIPÓTESE CIENTÍFICA
As expressões de CD45+, CD68 + e E-caderina+ na pele de cães em área endêmica da
região Metropolitana de Fortaleza para Leishmaniose Visceral Canina estão associadas ao
estímulo de células sentinelas, dentre elas as células dendríticas, expostas a Leishmania
infantum.
34
5 OBJETIVOS
5.1 GERAL
Identificar as células sentinelas e caracterizar as alterações cutâneas em cães naturalmente
infectados por Leishmania infantum.
5.2 ESPECÍFICOS
Avaliar as expressões de CD45+, CD68 + e E-caderina+ associando as células sentinelas
imunológicas da pele e comparar as manifestações clínico-dermatológicas na pele de cães
naturalmente infectados por L.infantum.
Caracterizar o padrão celular inflamatório e as lesões cutâneas presentes na pele da orelha
de cães naturalmente infectados por Leishmania infantum
35
6 CAPÍTULO 1 - CD45+, CD68+ AND E-CADHERINE+ EXPRESSIONS IN SKIN
DOGS NATURALLY INFECTED BY Leishmania infantum
Expressão de CD45+, CD68 + e E-cadherin+ na pele de cães naturalmente infectados por
Leishmania infantum
Artigo Submetido ao periódico Acta Scientiae Veterinariae
36
CD45+, CD68 + and E-cadherin+ Expressions in Skin Dogs Naturally Infected by
Leishmania infantum
Társsila Mara Vieira Ferreira1, Tiago Cunha Ferreira1, Fernanda Maria Aragão Ximenes
Porto2, Conceição da Silva Martins2, Belarmino Eugênio Lopes-Neto1, José Cláudio Carneiro
de Freitas1, Virgínia Cláudia Carneiro Girão2 & Diana Célia Sousa Nunes-Pinheiro1
1Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias. Universidade Estadual do Ceará. 2Programa de Pós-graduação em Ciências Morfofuncionais. Universidade Federal do Ceará. CORRESPONDENCE: D. Nunes-Pinheiro [[email protected] - FAX: +55 (85) 3101-9860]. Faculdade de Veterinária. Universidade Estadual do Ceará. Campus do Itaperi. Av. Dr. Silas Munguba, n. 1700. CEP 60.714-903. Fortaleza, CE, Brazil.
ABSTRACT
Background: In canine leishmaniasis (CanL), infection occurs by phlebotomine vectors that
inoculate the protozoan Leishmania infantum through the skin that infected macrophages and
activated dendritic cells. Dogs with CanL present variable clinical manifestations, being
common the presence of cutaneous lesions. The aim of this study was to evaluate the
expressions of CD45+, CD68+ and E-cadherin+ associating the skin sentinels cells and to
compare the clinical-dermatological manifestations in the skin of dogs naturally infected by L.
infantum.
Materials, Methods & Results: Dogs infected (n = 22) by L. infantum were divided into
asymptomatic dogs group (AD, n = 9), and symptomatic dogs group (SD, n = 13), according
criteria based on the presence or absence of skin changes. Dogs non-infected (CD, n = 5) were
included as control group. Samples of skin biopsies collected from scapular region were
processed by routine histology and labeled by immunohistochemistry with monoclonal
antibodies against CD45+, CD68+ and E-cadherin+, and were described as none, mild,
37
moderate and intense. SD presented keratoconjunctivitis, onychogrifose, lichenification,
depigmentation, alopecia, hypotrichosis, erythematous dermatitis, exfoliative dermatitis,
ulcerative dermatitis and crusted dermatitis, and the frequency these alterations was expressed
as percentage. The results were expressed as mean ± standard deviation and the hematological
and biochemical data were analyzed by Kruskal-Wallis test followed by the Dunn's test (P <
0.05). Leukocytosis (not significant), red blood cells, hematocrit and hemoglobin (P < 0.05),
total protein serum (P < 0.05), globulins (P < 0.05), albumin and A/G ratio (P < 0.01) were
altered in SD in relation to CD. Cutaneous cellular infiltration, composed by macrophages,
plasma cells, lymphocytes and neutrophils, was observed in CD. There was an increase of
expression of the markers in SD when compared to the other groups, as moderate CD68+
expression and L. infantum, and intense CD45+ and E-cadherin+ expressions.
Discussion: Cutaneous involvement is very important in CanL, as it corresponds to where is
the first interaction between the parasite and the immune system. Dermatological clinical
signs, leukocytosis, anemia, globulins levels have been reported for dogs naturally infected by
L. infantum. In this study, it was observed inflammatory infiltrate in SD that was distributed at
superficial and deep dermis, which was composed by mononuclear cells as macrophages,
plasma cells, lymphocytes and neutrophils. To characterize the immune sentinels cells in the
SD skin it was evaluated CD45+, CD68 + and E-cadherin+ expressions, and our results
revelead an increase of expression of these markers. CD45+ is one of the most abundant
molecules expressed on the white blood cell surface in various mammals, while CD68+ is a
myelomonocytic marker that seems to be retained during monocyte differentiation. In the
skin, increased numbers of CD68+ are related to dendritic epidermal cells, which can be
expressed as CD45+/CD1a-/HLA-DR+. Dendritic cells of the skin, particularly epidermal
Langerhans cells, form networks anchored to neighboring keratinocytes via E-cadherin. Thus,
CD45+, CD68+ and E-cadherin+ expressions may be related to activation of skin sentinels
38
cells in dogs naturally infected by L. infantum. Our results indicated that CanL modify the
CD45+, CD68+ and E-cadherin+ expressions, which characterize the immune sentinels cells
activation that promove the recruitment the cellular infiltrate, which was composed by
macrophages, plasma cells, lymphocytes and neutrophils. These informations may contribute
to the follow-up of CanL progression in skin.
Keywords: leishmaniasis, Leishmania infantum, cutaneous immune system, skin alterations,
immune sentinels cells, dogs.
INTRODUCTION
The skin corresponds to the outer covering of body, appearing as a mechanical
barrier to environmental and pathogenic insults, consisting of epidermis, dermis and
hypodermis. The epidermis and dermis participate in the maintenance of skin homeostasis and
have in their composition a variety of pro-inflammatory cells and mediators that initiate and
regulate the innate and acquired immune response [11,14]. Among the immune cells present
in the skin are keratinocytes, T lymphocytes and sentinel cells, as dendritic cells (DCs),
macrophages, and mast cells [2,14,23]. DCs make a link between the innate and adaptive
immune response. They have the ability to capture the pathogen Leishmania spp., and migrate
to the lymphoid organs where they present the processed antigens to naive T cells, so that
they regulate the cellular response [3,17,23].
Canine leishmaniasis (CanL) is a severe disease, usually subacute or chronic in dogs,
transmitted through the bite of female sandfly vectors in the skin, which inoculate in dermis
promastigotes forms corresponding to the infective stage of the parasite Leishmania infantum
[23]. Clinical manifestations of CanL vary widely as a result of numerous pathogenic
mechanisms of the immune response and different affected organs [1,23]. Cutaneous
39
involvement is very important in CanL, as it corresponds to where is the first interaction
between the parasite and the immune system [21]. Changes in skin of dogs with CanL are
closely related to the progress of infection and present themselves in variable forms such as
alopecia, hypotrichosis, hyperkeratosis, lichenification, erythema, exfoliative dermatitis,
crusty, ulcerative, nodular, papular or pustular [22].
The aim of this study was to evaluate the CD45+, CD68 + and E-cadherin+
expressions associating the skin immune sentinels cells and to compare the clinical-
dermatological manifestations in the skin of dogs naturally infected by L. infantum.
MATERIALS AND METHODS
Study population
Twenty seven mixed-breed adult dogs of both genders (ages ranging from 2 to 6
years) were selected. They were provided by the Zoonosis Control Center, in Fortaleza
(Ceará, Brazil), a region with a high prevalence of CanL. The experimental animals were
selected based on the results of DPP rapid test Canine Visceral Leishmaniasis1, serologic
ELISA test1 and bone marrow parasitological test. Negative animals in serological and
parasitological tests were considered not infected and used as control animals (CD, n = 5).
Dogs infected (n = 22) by L. infantum were divided into asymptomatic group (AD, n = 9), and
symptomatic group (SD, n = 13), according criteria based on the presence or absence of skin
changes. SD presents the characteristic cutaneous manifestations of CanL, including skin
lesions, onychogryphosis and keratoconjunctivitis. Blood samples were collected by jugular
venipuncture for determination of hematological2 and biochemical2,3 parameters.
40
Skin samples
The collection of skin specimens was carried out after euthanasia (Potassium chloride 10%)
of dogs with a barbituric anesthesia4. Sections of five mm skin were collected with the help of
a punch from the scapular region.
Histological analysis
Skin samples were fixed in 10% buffered neutral formalin and were embedded in
paraffin for routine histological processing. Five-micrometer sections were cut and stained
with hematoxylin and eosin (HE). The analysis of histological sections was performed under a
light microscope5 at a 200x magnification. We assessed the degree (none, mild, moderate and
intense) of cellular inflammatory infiltrate in dermis, according to the average subjective
perception of two observers.
CD45+, CD68+ and E-cadherin+ immunohistochemistry
Sections (5 μm) were mounted on silanized glass slides and subsequently subjected
to an incubator at 36ºC. Antigen retrieval was performed using citrate buffer pH 9.0 for 30
minutes at 97ºC. The activity of endogenous peroxidase was inhibited by hydrogen peroxide
3%6 for 10 min and the slides were subjected to monoclonal antibody mouse anti-human
CD45+ (clone 2B11 + PD7/26)6, CD68+ (Clone KP1)6 monoclonal antibody and mouse anti-
human E-cadherin+ (UMR-38 clone)6 Flex incubated for 1 h at room temperature. The slides
were then washed twice in PBS and then incubated with EnVision polymer reagent (EnVision
TMþDual connection System/HRP)6 for 30 min at room temperature. Finally, diamine
benzidine (DAB)6 was applied for ten minutes. Sections were counterstained with Mayer's
hematoxylin6 for 5 min. The intensity of the staining was analyzed by light microscopy5 at
200x magnification. The expression of the markers was classified as none (-), mild (+),
41
moderate (++) and intense (+++), according to the average subjective perception of two
observers [16].
L. infantum immunohistochemistry
Cutaneous sections prepared from paraffin-embedded biopsies were cut into 5 µm
sections and mounted on silanized slides. Slides were deparaffinised in xylene, and the tissue
was rehydrated using graded alcohols. The slides were incubated in a 4% hydrogen peroxide6
solution and PBS (0.01 M, pH 7.2), followed by incubation in normal goat serum (1:100
dilution). Antibody from rabbits experimentally infected with L. infantum (1:200 dilution in
PBS), donated by the Institute of Tropical Medicine of São Paulo, was used as the primary
antibody. The slides were then incubated for 22 h at 4°C in a humid chamber. Then, the PBS
lavage was performed and the slides were incubated again in a biotin7 solution, and then
washed again with PBS and incubated with the streptavidin-peroxidase complex for 20 min at
room temperature. The reaction was carried out with the addition of 0.024% DAB6 and 0.16%
hydrogen peroxide7. Analysis of amastigote forms of L. infantum was performed by light
microscopy5 at 200x magnification. The intensity of staining was classified as none (-), mild
(+), moderate (++) and intense (+++), according to the average subjective perception of two
observers [8].
Statistical analysis
Analyses were performed using the statistical software (PRISM)8. Results were
expressed as mean ± standard deviation (SD). Prior, data were submitted to Grubbs and
Kolmogorov test to verify the presence of outliers and determine data homoscedasticity,
respectively. The clinical changes observed were expressed as a percentage. For
42
hematological and biochemical analyzes were used Kruskal-Wallis test followed by the
Dunn's test. P < 0.05 was considered significant.
RESULTS
Clinical dermatological findings are shown in Figures 1 and 2. Symptomatic dogs
(SD) have been identified keratoconjunctivitis, onychogrifose, lichenification,
depigmentation, alopecia, hypotrichosis, erythematous dermatitis, exfoliative dermatitis,
ulcerative dermatitis and crusted dermatitis (Figure 1). Among these cutaneous lesions, there
were observed a higher incidence of alopecia/hypotrichosis (92.3%) and ulcerative dermatitis
(53.8%) (Figure 2).
Hematological and serum biochemical parameters are shown in Table 1. Regarding
the white blood cell (WBC) count, AD and SD differed significantly (P < 0.05). It’s worth
highlighting the presence of leukocytosis in AD (16.89 ± 3.74) when compared to the CD
(12.60 ± 2.29), although it is not statistically significant. Red blood cells (RBC), hematocrit
(HCT) and hemoglobin (HGB) were reduced in SD when compared to CD (P < 0.05). There
was no significant difference between the groups regarding to platelets (PLT) count. Total
protein serum (TPS) levels differ (P < 0.05) between AD and SD. Globulins levels were
elevated (P < 0.05) but the albumin and A/G ratio were decreased (P < 0.01) in SD in relation
to CD.
The skin histopathological findings were showed in Figure 3. Cutaneous cellular
infiltration was identified in 54.0% (12/22) of the naturally infected dogs, being 83.3%
(10/12) in SD and 16.7% (2/12) in AD. Inflammatory infiltrate was present in AD and SD as
a mild (Figure 3B) and mild to moderate (Figure 3C), respectivelly, which was composed by
mononuclear cells as macrophages, plasma cells, lymphocytes and neutrophils. The cellular
infiltrate shown a distribution multifocal in the superficial and deep dermis.
43
The main immunohistochemical findings were showed in Table 2 and Figure 3.
There was a greater expression of the markers in SD when compared to the other groups, with
moderate L. infantum and CD68+ expressions, and intense CD45+ and E-cadherin+
expressions. It is worth noting that in AD there was a greater expression of CD45+, while in
CD it was highlighted CD68+ and E-cadherin+.
DISCUSSION
Cutaneous involvement is very important in CanL, as it corresponds to where is the
first interaction between the parasite and the immune system [21]. All dermatological clinical
signs observed for the SD have been reported for infected by L. infantum [21,22].
Furthermore, RBC, HCT and HGB were reduced; high levels of TPS and globulins, and the
decrease of albumin and A/G ratio and leukocytosis were observed in SD. These data were
described previously by others authors [5,7,15,20].
In this study, it was observed inflammatory infiltrate in SD that was distributed at
superficial and deep dermis, which was composed by mononuclear cells as macrophages,
plasma cells, lymphocytes and neutrophils. These alterations has been reported as a
characteristic of CanL [6]. In addition, the cellular infiltrate shown in the superficial and deep
dermis with multifocal distribution, consists of findings described by Reis et al. [21].
To evaluate the immune skin cells, CD45+, CD68+ and E-cadherin+ were used as
markers. Our results revelead an increase of expression of these molecules in SD when
compared to the other groups, which may be related to activation of skin sentinels cells in
dogs naturally infected by L. infantum. CD45+ is one of the most abundant molecules
expressed on the white blood cell surface in various mammals, while CD68+ is a
myelomonocytic marker that seems to be retained during monocyte differentiation. The
differential expression of CD45+ isoforms in canine leukocytes were shown to vary among
44
leukocyte phenotype and by the activation status [9]. In dogs, it was demonstrate that
leukocytes and CD45+ epithelial cells was characteristic of an immature stage [4]. In the skin,
increased numbers of CD68+ are related to dendritic epidermal cells, which can be expressed
as CD45+/CD1a-/HLA-DR+ [13]. DCs of the skin, particularly epidermal Langerhans cells
(LCs), form networks anchored to neighboring keratinocytes via E-cadherin, a component of
epithelial cell junctions that is also expressed by LCs. It has been demonstrated that E-
cadherin-mediated contacts induce DC maturation [10]. On the other hand, the expression of
cadherins have been observed during tumor progression [18]. E-cadherin+ is expressed in not
only canine cutaneous histiocytomas and mastocytomas, but also multiple other canine tumor
[12,19].
CONCLUSION
Our results indicated that CanL modify the CD45+, CD68+ and E-cadherin+
expressions, which characterize the immune sentinels cells activation that promove the
recruitment of cellular infiltrate composed by macrophages, plasma cells, lymphocytes and
neutrophils. Thus, these informations may contribute to the follow-up of CanL progression in
skin.
MANUFACTURERS
1Bio-Manguinhos. Rio de Janeiro, RJ, Brazil. 2Mindray, BC-200 Vet®, Shenzhen, China. 3Labtest®, Lagoa Santa, Minas Gerais, Brazil. 4Thiopentax ®, Itapira, São Paulo, Brazil. 5Nikon, Eclipse E200®, Minato, Tokyo, Japan. 6Dako®, Glostrup, Denmark. 7Sigma-Aldrich®. St. Louis, MO, EUA 8GraphPad Prism 5.0®, San Diego, California, USA.
45
Funding. We would like to thank the CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento
Científico e Tecnológico - "National Counsel of Technological and Scientific Development")
for the scholarship granted to the first author, and FINEP (Empresa Financiadora de Estudos e
Projetos) for financial support.
Ethical approval. All procedures, treatments and animal care were approved by the Ethical
Committee in Animal Use of the State University of Ceará, Brazil (CEUA, Protocol no.
6459434/2015).
Declaration of interest. The authors report no conflicts of interest.
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49
LEGENDS
TABLES
Table 1. Hematological and biochemical analyses in asymptomatic and symptomatic dogs
naturally infected by L. infantum.
Serum reagent dogs
Parameters
Seronegative dogs
(CD, n = 5)
Asymptomatic
(AD, n = 9)
Symptomatic
(SD, n = 13)
WBC (x109/L) 12.60 ± 2.29ab 16.89 ± 3.74a 11.44 ± 3.20b
RBC (x1012/L) 6.87 ± 0.59a 6.36 ± 1.04ab 5.31 ± 1.25b
HGB (mmol/L) 18.2 ± 2.08a 14.13 ± 2.39ab 11.72 ± 2.64b
HCT (L/L) 52.59 ± 4.73a 42.00 ± 6.60ab 35.23 ± 7.83b
MCV (fL) 76.57 ± 2.71a 66.54 ± 4.18b 66.97 ± 5.54b
MCHC (mmol/L) 34.58 ± 1.75a 33.36 ± 0.89b 33.13 ± 0.74b
PLT (x109/L) 234.00 ± 60.73 177.22 ± 67.34 254.31 ± 197.15
TPS (g/dL) 7.31 ± 0.50ab 7.29 ± 1.31b 8.54 ± 0.93a
Albumin(g/dL) 2.51 ± 0.15a 1.83 ± 0.47ab 1.37 ± 0.33b
Globulin (g/dL) 4.79 ± 0.45b 5.47 ± 1.64b 7.17 ± 1.06a
A/G 0.53 ± 0.05a 0.37 ± 0.17ab 0.20 ± 0.06b
WBC: White blood cells; RBC: red blood cells; HGB: hemoglobin; HCT: hematocrit; MCV:
mean corpuscular volume; MCHC: mean corpuscular hemoglobin concentration; PLT:
platelet. TPS: total protein serum; A/G: albumin-globulin ratio. Different letters in the same
row mean significant difference among treatments (P < 0.05).
50
Table 2. Expressions of CD45+, CD68+, E-cadherin+ and L.infantum on skin dogs naturally
infected by L. infantum.
Markers CD group AD group SD group
CD45+ + ++ +++
CD68+ ++ + ++
E-cadherin+ ++ - +++
Leishmania infantum - + ++
Study groups are represented by CD (control group), AD (asymptomatic dogs)
and SD (symptomatic dogs). Scores expression of the markers: (-) none; (+)
mild; (++) moderate and (+++) intense.
51
FIGURES
Figure 1. Skin macroscopic lesions of dogs diagnosed with CanL. A, dermatitis ulcerative in
ear; B and D, dry exfoliative dermatitis areas diffused by the animal body; C, dermatitis
crusted nasal region; D, diffuse alopecia; E, keratoconjunctivitis and hypotrichosis periocular;
F, diffuse hypotrichosis; G, onychogryphosis; H, lichenification and hyperpigmentation
diffuse the animal's body.
52
Figure 2. Dermatological clinical findings of dogs naturally infected by L. infantum.
30.8
53.8
23.1
7.7
92.3
7.7
7.7
15.4
38.5
0 20 40 60 80 100
Crusted dermatitis
Ulcerative dermatitis
Dry exfoliative dermatitis
Erythematous dermatitis
Alopecia/hypotrichosis
Depigmentation
Lichenification
Onychogryphosis
Keratoconjunctivitis
Percentage (%)
53
Figure 3. Histopathological and immunohistochemistry of skin dogs naturally infected by L.
infantum. Animals were categorized according to their dermatological clinical status into
54
asymptomatic (AD) or symptomatic (SD). The control group is represented by CD.
Representative cutaneous cellular infiltrates of groups were classified as none (3A), mild (3B)
and moderate (3C). CD45+ expression was classified as mild (3D), moderate (3E) and intense
(3F). CD68+ was classified as mild (3H) and moderate (3G; 3I) expressions. E-cadherin+ was
classified as none (3K), moderate (3J) and intense (3L) expressions. L. infantum detection was
classified as none (3M), mild (3N) and moderate (3O). 200x. [Bars = 20 µm].
55
7. CAPÍTULO 2 – RELAÇÃO ENTRE INFILTRADO CELULAR E LESÕES
CUTÂNEAS NA ORELHA DE CÃES NATURALMENTE INFECTADOS POR
Leishmania infantum
Relationship between cellular infiltrate and cutaneous lesions in the ear of dogs naturally
infected with Leishmania infantum
56
Relação entre infiltrado celular e lesões cutâneas na orelha de cães naturalmente 1
infectados por Leishmania infantum 2
3
Relationship between cellular infiltrate and cutaneous lesions in the ear of dogs naturally 4
infected with Leishmania infantum 5
6
Társsila Mara Vieira Ferreira1, Stephanie Caroline Bezerra Souza1, Camila de Oliveira 7
Campos2, Emmanuel Teles Sales1, Camila Goersh Barroso1, Belarmino Eugênio Lopes Neto1, 8
Conceição da Silva Martins3, Virgínia Cláudia Carneiro Girão3, Diana Célia Sousa Nunes-9
Pinheiro1* 10
11 1Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias. Laboratório de Imunologia e 12
Bioquímica Animal. Faculdade de Veterinária. Universidade Estadual do Ceará. Av.Dr. Silas 13
Munguba, 1700, Campus do Itaperi, Fortaleza-CE. CEP:60.714-903. 14 2Centro de Controle de Zoonoses/CCZ, Fortaleza-Ceará. 15 3Programa de Pós-graduação em Ciências Morfofuncionais. Universidade Federal do Ceará. 16
Rua Delmiro de Farias, s/n, Rodolfo Teófilo, Fortaleza-CE. CEP: 60430-170. 17
18
*Autor para correspondência e-mail: [email protected] 19
20
21
RESUMO 22
23
A pele corresponde ao sítio de entrada de muitos agentes patogênicos, dentre eles o 24
protozoário Leishmania infantum. A invasão desse patógeno ocorre por meio da picada de 25
vetores flebotomíneos, que inoculam na derme as formas promastigotas infectantes. A 26
infecção induz a uma resposta imune cutânea, resultando no recrutamento de células imunes e 27
liberação de mediadores inflamatórios o que pode levar ao desenvolvimento de alterações na 28
pele. O objetivo desse estudo foi caracterizar o padrão celular inflamatório e as lesões 29
cutâneas presentes na orelha de cães naturalmente infectados por L. infantum. Para tanto, cães 30
(n=18) naturalmente infectados por L. infantum foram subdivididos, com base na presença ou 31
ausência de alterações clinico-dermatológicas na orelha, em dois grupos: um grupo 32
assintomático (AD, n = 6), sem lesões cutâneas; e grupo sintomático (SD, n = 12), com lesões 33
57
cutâneas. Cinco cães não infectados (CD) foram incluídos como controle. As amostras de 34
biópsias de pele foram coletadas do terço superior da orelha e processadas por histologia de 35
rotina, coradas por HE e azul de toluidina. A dermatite ulcerativa e alopecia foram as 36
dermatopatias mais frequentes nos cães. A maioria dos fragmentos apresentou intensidade 37
inflamatória discreta a moderada com distribuição multifocal do infiltrado celular na derme 38
superficial e profunda, composto principalmente por macrófagos, plasmócitos e linfócitos. 39
Observaram-se correlações e influências positivas moderadas do processo inflamatório sobre 40
a alopecia e dermatite ulcerativa, respectivamente. Presença discreta dos mastócitos foi 41
observada nos cães naturalmente infectados, havendo maior expressão de mastócitos em SD 42
com infiltrado intenso e AD sem infiltrado celular. Nesse contexto, concluiu-se que na 43
leishmaniose canina, o infiltrado celular inflamatório influencia diretamente no aparecimento 44
de lesões cutâneas na pele, tais como dermatite ulcerativa e alopecia, contudo não foi 45
observada associação entre os mastócitos e a evolução clínica dessa enfermidade. Então, faz-46
se necessário estudar a participação dos mediadores liberados pelos mastócitos no 47
microambiente avaliado. 48
49
Palavras-chave: Leishmaniose visceral canina, aspectos dermatológicos, pele da orelha, 50
sistema imunológico cutâneo, inflamação. 51
52
ABSTRACT 53
54
The skin corresponds to the entry site of many pathogens, among them the protozoan 55
Leishmania infantum. The invasion of this pathogen occurs through the bite of phlebotomine 56
vectors, which inoculate the dermis with infective promastigotes. The infection induces a 57
cutaneous immune response, resulting in the recruitment of immune cells and the release of 58
inflammatory mediators, which may lead to the development of alterations in the skin. The 59
objective of this study was to characterize the inflammatory cellular pattern and cutaneous 60
lesions present in the ear of dogs naturally infected with L. infantum. For this, dogs (n = 18) 61
naturally infected by L. infantum were subdivided, based on the presence or absence of 62
clinical-dermatological alterations in the ear, in two groups: an asymptomatic group (AD, n = 63
6), without cutaneous lesions; and symptomatic group (SD, n = 12), with cutaneous lesions. 64
Five uninfected dogs (CD) were included as controls. Skin biopsy samples were collected 65
from the upper third of the ear and processed by routine histology, stained by HE and 66
toluidine blue. Ulcerative dermatitis and alopecia were the most frequent dermatopathies in 67
58
dogs. Most of the fragments presented mild to moderate inflammatory intensity with 68
multifocal distribution of the cellular infiltrate in the superficial and deep dermis, composed 69
mainly of macrophages, plasma cells and lymphocytes. Correlations and moderate positive 70
influences of the inflammatory process on alopecia and ulcerative dermatitis, respectively, 71
were observed. Discrete presence of mast cells was observed in naturally infected dogs, with 72
increased expression of mast cells in SD with intense infiltrate and AD without cell infiltrate. 73
In this context, it was concluded that in canine leishmaniasis, inflammatory cell infiltrate 74
directly influences the appearance of cutaneous skin lesions, such as ulcerative dermatitis and 75
alopecia, but no association was observed between the mast cells and the clinical evolution of 76
this disease. Therefore, it is necessary to study the participation of mediators released by mast 77
cells in the evaluated microenvironment. 78
79
Keywords: Canine visceral leishmaniasis, dermatological aspects, ear skin, cutaneous 80
immune system, inflammation. 81
82
1. Introdução 83
84
A pele corresponde a primeira barreira de defesa física e imunológica à entrada de 85
substâncias ambientais e microorganismos potencialmente prejudicais ao organismo. Ela é 86
formada por três camadas: epiderme, derme e hipoderme. A epiderme e a derme são 87
constituídas por células imunes especializadas. Na epiderme estão presentes os queratinócitos, 88
onde também são encontradas células de Langerhans, enquanto na derme residem ou circulam 89
as células dendríticas dérmicas, os mastócitos, os macrófagos, e as células linfóides inatas e 90
adaptativas, as quais migram através de vasos sanguíneos e linfáticos. Essas células 91
compreendem o sistema imune cutâneo, responsável por iniciar e regular a resposta 92
imunológica a fim de restaurar e manter a homeostase da pele (Nestle et al., 2009; Pasparakis 93
et al., 2014; Belkaid & Tamoutounour, 2016). 94
Esse tecido está em constante agressão pelos antígenos exógenos que podem 95
desregular a resposta imunológica e levar ao desenvolvimento de reações inflamatórias. A 96
invasão dos antígenos na pele causa dano tecidual, promovendo a ativação das células 97
residentes na epiderme, como os queratinócitos e as células de Langerhans, através do 98
reconhecimento de padrões moleculares associados ao dano (DAMPs) e proteínas 99
moleculares associadas aos patógenos (PAMPs). A interação entre os PAMPs e os receptores 100
toll-like (TLRs) expressos nessas células estimulam a liberação de citocinas, incluindo o fator 101
59
de necrose tumoral (TNF-ɑ) e quimiocinas pró-inflamatórias, as quais promovem o 102
recrutamento de células efetoras para o sítio da infecção. Então, um processo inflamatório se 103
estabelece no local promovendo alterações teciduais (Nestle et al., 2009; Freitas & Pinheiro, 104
2010; Pasparakis et al., 2014; Scott & Novais, 2016). 105
Lesões cutâneas podem ser identificadas em diversas patologias caninas, dentre elas 106
a leishmaniose canina. Nessa enfermidade, o envolvimento cutâneo possui grande 107
importância uma vez que a infecção inicia-se nesse órgão através da picada de vetores 108
flebotomíneos. Esses agentes transmissores promovem dano à barreira cutânea por meio da 109
injeção intradérmica da probóscide a fim de inocular as formas promastigotas correspondente 110
ao estágio infectante do protozoário L. infantum, cujo é parasita intracelular do sistema 111
fagocítico monouclear (Papadogiannakis & Koutinas, 2015; Scott & Novais, 2016). 112
Tendo em vista a importância da pele como porta de entrada do patógeno L. infantum 113
e as manifestações clínicas dermatológicas nos cães com leishmaniose, esse estudo visa 114
caracterizar o padrão celular inflamatório e as lesões cutâneas presentes na orelha de cães 115
naturalmente infectados por L. infantum. 116
117
2. Materiais e métodos 118
119
O protocolo experimental foi submetido ao Comitê de Ética em Uso de Animais 120
(CEUA) da Universidade Estadual do Ceará (UECE) sob protocolo nº6459434/2015. 121
122
2.1. Animais 123
Amostras de biópsias de pele de 23 cães adultos capturados pelo Centro de Controle 124
de Zoonoses em Fortaleza (Ceará, Brasil), foram incluídas nesse estudo. O diagnóstico de 125
Leishmniose Visceral Canina (LVC) foi baseado no teste rápido DPP LVC Bio-Manguinhos® 126
associado ao teste sorológico ELISA. Punção aspirativa de medula óssea foi realizada para 127
pesquisa parasitológica. Cães sem manifestações clínico-dermatológicas e que apresentaram 128
resultados negativos nesses testes foram considerados como sendo não infectados e incluídos 129
como o grupo controle (CD, n = 5). Dezoito cães naturalmente infectados por Leishmania 130
infantum foram subdivididos, com base na presença ou ausência de alterações clinico-131
dermatológicas na orelha, em: grupo assintomático (AD, n = 5), sem lesões cutâneas; e grupo 132
sintomático (SD, n = 13), com lesões cutâneas, incluindo alopecia, descamação, eritema, 133
edema, despigmentação, hiperqueratose, liquenificação, úlceras e crostas. Amostras de sangue 134
60
foram coletadas por venopunção jugular para avaliação hematológica, considerando a 135
ausência de coinfecção por hemoparasitas nesses animais. 136
137
2.2. Histopatologia 138
Os cães foram anestesiados (Sedomin® - Konig e Thiopentax® - Cristalia) e 139
eutanasiados (Cloreto de Potássio a 10%) , em seguida amostras de tecido da pele do terço 140
superior da orelha (Moura et al., 2008), íntegra ou com lesões, foram colhidas utilizando uma 141
tesoura esterilizada. Quanto aos cães do grupo controle, o local biopsiado foi anestesiado com 142
lidocaína a 2% e realizada a colheita do fragmento da orelha. 143
As amostras foram coletadas e fixadas em formalina tamponada a 10%, e 144
posteriormente processadas em equipamento histotécnico automático (Leica TP1020, United 145
States) seguindo-se desidratação, diafanização e inclusão em parafina. Os blocos de parafina 146
contendo os fragmentos de tecido de pele foram cortados em micrótomo na espessura de 5 μm 147
e montados em lâminas de vidro. Posteriormente, os cortes histológicos foram corados pelas 148
técnicas rotineiras de Hematoxilina e Eosina (HE) para análise das alterações histológicas e 149
Azul de Toluidina para identificação dos mastócitos. A análise das lâminas histológicas foi 150
realizada sob um microscópio óptico (Nikon Eclipse E200MV, Tokyo, Japan) nas objetivas 151
de 10x e 20x. Avaliamos o grau de infiltração celular (ausente, discreta, moderada e intensa) 152
na derme e o tipo do infiltrado, bem como a intensidade de coloração de mastócitos (ausente, 153
discreta, moderada e intensa), de acordo com a percepção subjetiva média de dois 154
observadores. 155
156
2.3. Imunohistoquímica L. infantum 157
Secções cutâneas preparadas a partir de biópsias embebidas em parafina foram 158
cortadas em secções de 5 μm e montadas em lâminas silanizadas. As lâminas foram 159
desparafinadas em xileno, e o tecido foi rehidratado utilizando álcoois graduados. As lâminas 160
foram incubadas numa solução de peróxido de hidrogénio a 4% e PBS (0,01 M, pH 7,2), 161
seguido por incubação em soro de cabra normal (diluição 1: 100). Utilizou-se como anticorpo 162
primário o anticorpo de coelhos experimentalmente infectado com L. infantum (diluição 1: 163
200 em PBS 0,01 M), doado pelo Instituto de Medicina Tropical de São Paulo. As lâminas 164
foram então incubadas durante 22 h a 4 ° C numa câmara húmida. Em seguida, realizou-se a 165
lavagem com PBS e as lâminas foram incubadas novamente numa solução de biotina, e 166
depois lavadas novamente com PBS e incubadas com o complexo estreptavidina-peroxidase 167
durante 20 min à temperatura ambiente. A reacção foi realizada com a adição de 0,024% de 168
61
diamino-benzidina (DAB) e 0,16% de peróxido de hidrogénio. A análise de formas 169
amastigotas de L. infantum foi realizada por microscopia óptica (Leica DM2000, United 170
States) com aumento de 200x. A intensidade da coloração foi classificada como nenhuma, 171
leve, moderada e intensa, de acordo com a percepção subjetiva média de dois observadores 172
(Freitas et al., 2013). 173
174
2.5. Análise estatística 175
As análises foram realizadas por meio do programa estatístico computacional 176
GraphPadPrism 5.0. Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão, adotando 177
um nível de significância de p < 0,05. As alterações clínicas observadas foram expressas em 178
porcentagem. O infiltrado inflamatório e as alterações clínicas dermatológicas de maior 179
incidência foram classificados em escores: 0 (ausente), 1 (discreto), 2 (moderado) e 3 180
(intenso), para aplicação do teste de correlação de Spearman (ρ). 181
182
4. Resultados e Discussão 183
184
Os achados clínicos dermatológicos na orelha são mostrados nas Figuras 1 e 2. Entre 185
as lesões cutâneas, dermatite ulcerativa e alopecia foram as dermatopatias mais frequentes nos 186
cães, observadas em 44,4% (8/18) e 61,1% (11/18) dos animais respectivamente (Fig. 2). 187
Todos os sinais clínicos dermatológicos observados para SD foram relatados para cães 188
infectados por L. infantum (Reis et al., 2009; Saridomichelakis & Koutinas, 2014). 189
A maioria dos fragmentos de orelha dos cães SD apresentou intensidade inflamatória 190
moderada a intensa (Fig.3C e 3A, respectivamente). A reação inflamatória foi caracterizada 191
por um infiltrado celular com distribuição multifocal na derme superficial e profunda 192
composto por células mononucleares como macrófagos, plasmócitos e linfócitos. Neutrófilos 193
e hemácias extravasculares também foram observados nesse cenário. Foram detectadas 194
amastigostas de L. infantum imunomarcadas em SD e AD (Fig. 4). Esses achados consistem 195
com estudos realizados previamente associando o parasitismo cutâneo e o padrão inflamatório 196
na derme da orelha de cães com leishmaniose visceral (dos-Santos et al., 2004; Giunchetti et 197
al., 2006; Figueiredo et al., 2010; Menezes-Souza et al. 2012). 198
Também verificamos correlações (ρ = 0.31 e ρ = 0.33) e influências positivas 199
moderadas (y = 0.57 + 0.4x e y = 0.34 + 0.24x) do processo inflamatório sobre a alopecia e 200
dermatite ulcerativa, respectivamente (Fig. 5). A infecção da pele por L. infantum promove o 201
recrutamento de células inflamatórias, que por sua vez liberam mediadores que podem estar 202
62
envolvidos com o desenvolvimento das alterações cutâneas. Desse modo, a infiltração celular 203
dérmica pode ser identificada em maior intensidade em cães com infecção clínica, ou seja, 204
que apresentam lesões dermatológicas em decorrência do progresso da infecção (Giunchetti et 205
al., 2006; Moreira et al. 2013, Papadogiannakis & Koutinas, 2015). 206
Quanto à presença de mastócitos, foi observada uma intensidade de coloração 207
discreta nos cães naturalmente infectados (Fig. 3) quando comparado ao CD (dado não 208
mostrado) (Menezes-Souza et al., 2012). Por outro lado, SD com infiltrado intenso (Fig. 3B) e 209
AD sem infiltrado celular (Fig. 3H) apresentaram uma maior expressão de mastócitos em 210
relação aos outros animais (Fig. D e F). Resultado contraditório evidenciando uma maior 211
expressão dessas células foi relatado em outro estudo (Calabrese et al.,2010). 212
Os mastócitos estão localizados ao redor dos pequenos vasos na pele e atuam como 213
células sentinelas contribuindo efetivamente na resposta imune inata à parasitas. Na 214
leishmaniose cutânea, a expressão tecidual dos mastócitos pode variar em detrimento do perfil 215
de citocinas no microambiente da infecção e espécies diferentes de Leishmania spp. (Tuon et 216
al., 2008; Romão et al., 2009; Menezes-Souza et al., 2012). Eles estão entre as primeiras 217
células que interagem com o protozoário Leishmania spp., liberando mediadores 218
inflamatórios que estimulam a inflamação e citocinas que modulam a imunidade mediada por 219
células específica ao patógeno. Nesse contexto, os padrões de citocinas liberados pelos 220
mastócitos variam de acordo com o seu estímulo de ativação (Kritas et al., 2013; Rodríguez & 221
Wilson, 2014). 222
223
5. Conclusão 224
225
Na leishmaniose canina, o infiltrado celular inflamatório influencia diretamente no 226
aparecimento de lesões cutâneas na pele, tais como dermatite ulcerativa e alopecia, contudo 227
não foi observada associação entre mastócitos e a evolução clínica dessa enfermidade. Desse 228
modo, faz-se necessário estudar a participação dos mediadores liberados pelos mastócitos no 229
microambiente avaliado. 230
231
6. Referências bibliográficas 232
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321
322
66
323
Figura 1. Lesões macroscópicas na orelha de cães com leishmaniose visceral. A, orelha sem 324
lesões; B, C, E e F, alopecia; B e D, úlceras; C, eritema e crostas; E, liquenificação; F, 325
úlceras, hiperpigmentação e crostas. 326
327
A
C
B
E F
D
67
Figura 2. Aspectos clínicos e dermatológicos da pele de orelha de cães naturalmente 328
infectados por Leishmania infantum . 329
330
33,3
44,4
11,1
5,6
61,1
5,6
5,6
5,6
0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0
Dermatite crostosa
Dermatite ulcerativa
Dermatite esfoliativa seca
Deratite eritematosa
Alopecia
Hiperpigmentação
Liquenificação
Edema
Porcentagem (%)
68
331
Figura 3. Imagens histológicas da pele da orelha de cães com leishmaniose visceral. A e B, 332
cães sintomáticos (SD) com infiltrado inflamatório intenso (I.I.); C e D, cães sintomáticos 333
(SD) com infiltrado inflamatório moderado (I.M); E e F, cães sintomáticos (SD) com 334
infiltrado inflamatório discreto (I.D.); G e H, cães assintomáticos (AD) sem infiltrado celular 335
infalmatório (I.C). HE 200x, A,C, E e G; AT (Azul de Toluidina) 200x B, D, F e H. 336
SD
com
I.I.
SD
com
I. M
. S
D c
om I.
D.
AD
sem
I. C
.
AT HE
A B
C D
E F
G H
69
337 Figura 4. Imunohistoquímica da pele da orelha de cães com leishmaniose. A e C, 338
fotomicrografia dos cães assintomáticos (AD) sem infiltrado celular (I.C.) e discreta coloração 339
para Leishmania infantum+, respectivamente; B e D, fotomicrografia dos cães sintomáticos 340
(SD) com infiltrado inflamatório moderado (I.M) e moderada coloração para L.infantum +, 341
respectivamente. HE 200x, A e B; Estreptoavidina-peroxidase contra-corada com 342
Hematoxilina de Mayer, 200x, C e D. 343
344
SD com I.M. AD sem I.C.
Leis
hman
ia+
H
E A B
C D
70
345
Figura 5. Alterações clínicas dermatológicas, alopecia (A) e dermatite ulcerative (B), e o 346
infiltrado celular inflamatório. Os índices de correlação de Spearman (valores ρ) são 347
mostrados nos gráficos. 348
349
0 1 2 3 40
1
2
3
4
Infiltrado inflamatório
Alop
ecia
0 1 2 3 40
1
2
3
4
Infiltrado inflamatório
Der
mtit
e ul
cera
tiva
ρ=0.31
ρ=0.33
(A)
(B)
71
8 CONCLUSÕES
A infecção de cães por Leishmania infantum modifica as expressões CD45+, CD68 +
e E-caderina+ na pele, caracterizando a ativação das células imunitárias sentinelas que
promovem o recrutamento do infiltrado celular inflamatório, o qual influencia diretamente no
aparecimento de lesões cutâneas, tais como dermatite ulcerativa e alopecia. Contudo não foi
observada associação entre os mastócitos e a evolução clínica dessa enfermidade.
Espera-se que esse trabalho possa contribuir para o acompanhamento da progressão
da infecção por Leishmania infantum na pele de cães.
72
9 PERSPECTIVAS
Os resultados obtidos neste trabalho ressaltam a importância das células sentinelas no
controle da infecção por Leishmania infantum bem como a relação com o aparecimento das
lesões cutâneas, contudo é necessário estudos com novos marcadores a fim de identificar os
subtipos dessas células, e entender mais claramente a participação de cada uma na patogênese
da leishmaniose canina. Além disso, é importante estudar os mediadores liberados pelos
mastócitos no microambiente avaliado a fim de esclarecer o seu envolvimento no processo
inflamatório cutâneo.
Por outro lado, observamos a necessidade de estudos relacionados as células
sentinelas no tratamento da leishmaniose canina e na imunização dos cães, já que elas
regulam a resposta imune inicial à infecção.
73
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ANEXO
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ANEXO A – COMITÉ DE ÉTICA
