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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CENTRO-OESTE, UNICENTRO -PR
Óleos essenciais no manejo de doenças em videira cv. Syrah e Rubi
TESE DE DOUTORADO
CARLA GARCIA
GUARAPUAVA-PR
2018
CARLA GARCIA
Óleos essenciais no manejo de doenças em videira cv. Syrah e Rubi
Tese apresentads à Universidade
Estadual do Centro-Oeste, como parte
das exigências da disciplina Pesquisa
Orientada, do Programa de Pós-
Graduação em Agronomia - Doutorado,
área de concentração em Produção
Vegetal.
Aprovado em 31 de Agosto de 2018
Prof. Dr. João Domingos Rodrigues
Orientador
Profª. Drª. Cacilda Márcia Duarte Rios Faria
Co-orientadora
Prof. Dr. Sergio Miguel Mazaro
Co-orientador
Prof. Dr. Leandro Alvarenga Santos
Membro da Banca
Profª. Drª. Emi Rainildes Lorenzetti
Membro da Banca
Drª. Aline José Maia
Membro da Banca
GUARAPUAVA-PR
2018
i
Catalogação na Publicação
Biblioteca Central da Unicentro, Campus Santa Cruz
Garcia, Carla
G216o Óleos essenciais no manejo de doenças em videira cv. Syrah e Rubi / Carla Garcia. – – Guarapuava, 2018.
xxii, 149 f. : il. ; 28 cm Tese (doutorado) - Universidade Estadual do Centro -Oeste, Programa
de Pós -Graduação em Agronomia, área de concentração em Produção Vegetal, 2018
Orientador: João Domingos Rodrigues Coorientadora: Cacilda Márcia Duarte Rios Faria Corientador: Sergio Miguel Mazaro Banca examinadora: Leandro Alvarenga Santos, Emi Rainildes Lorenzetti,
Bibliografia
1. Agronomia. 2. Produção vegetal . 3. Vitivinicultura. 4. Controle
alternativo. 5. Patógeno biotrófico . 6. Patógeno necrotrófico . 7. Enzimas de defesa. I. Título. II. Programa de Pós-Graduação em Agronomia.
CDD 630
ii
iii
Dedico
À minha mãe Clara Cubiça, meu pai José Clair Garcia e ao meu namorado João Paulo
dos Santos Guimarães por toda compreensão, carinho, apoio, principalmente, pelo
incentivo e perceverança, tornando possível mais essa conquista em minha vida.
iv
“Foi o tempo que dedicastes à tua rosa que a fez tão importante.”
(Antoine de Saint-Exupéry)
v
Agradecimentos
À Deus, por minha vida, por guiar meus pensamentos, pela graça de me
capacitar a tornar realidade mais essa conquista;
À minha família, principalmente, meus pais Clara Cubiça e José Clair Garcia,
minha irmã Izabelle Vitória Garcia pela confiança depositada em meus estudos.
Mãe obrigada por todos os lanchinhos levados no quarto em todos os momentos
de estudos, em especial, nos dias e noites em que passei escrevendo a tese,
obrigada por seu meu alicerce;
Ao meu namorado João Paulo dos Santos Guimarães por todo incentivo,
paciência em todos os momentos do doutorado. Obrigada por acreditar em mim,
por me dar forças para continuar nos momentos em que pensei em desistir, pelas
contribuições durante as avaliações dos experimentos, mostrando ser um
verdadeiro companheiro;
Ao meu orientador prof Dr João Domingos Rodrigues, pelas contribuições com
o desenvolvimento da pesquisa e por seus valiosos ensinamentos;
À minha co-orientadora Profª Drª Cacilda Márcia Duarte Rios Faria, por seus
ensinamentos durante os anos de graduação, mestrado, doutorado e pelo apoio e
amizade;
Ao prof Dr Sérgio Miguel Mazaro pela co-orientação, por seus ensinamentos
com as análises e, principalmente, por tirar todas as minhas dúvidas nos
momentos em que mais precisei;
Ao prof Dr Renato Vasconcelos Botelho por não medir esforços para contribuir
com o desenvolvimento da pesquisa e por seus ensinamentos durante o mestrado
e o doutorado;
Ao prof Dr Vanderlei Aparecido de Lima por todo auxílio nas análises
estatísticas;
Em especial a Drª Aline José Maia pela amizade e pelas contribuições diretas
em etapas cruciais para o desenvolvimento desta pesquisa e auxílio durante as
análises;
A Drª Carla Daiane Leite pela amizade e por sempre contribuir com meus
experimentos;
Ao prof Dr Leandro Alvarenga Santos por todas as contribuições durante o
vi
desenvolvimento do doutorado;
A todos do laboratório de Fitopatologia, em especial a Natieli Gonçalves
Chortaszko e Ana Carolina Cieslak, por nunca terem medido esforços para me
ajudar na condução dos experimentos;
Aos amigos que o doutorado me proporcionou, em especial Nati, Ana, Lari,
Karol, Fábio, Gi, Douglas, Marcos, em fim, todos que me incentivaram para
chegar até aqui;
À Universidade Estadual do Centro-Oeste, UNICENTRO, em especial ao
programa de Pós-Graduação em Produção Vegetal pela oportunidade do curso
de doutorado;
Em fim a todos aqueles que contribuíram direta ou indiretamente para que
pudesse chegar ao fim de mais essa conquista, meu muito obrigada!
vii
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS................ .................................................................................... xi
LISTA DE TABELAS .................................................................................................. xv
LISTA DE QUADROS ................................................................................................ xvi
RESUMO ......................................................................................................................... 1
ABSTRACT .................................................................................................................... 3
1 Introdução .................................................................................................................... 5
2 Referencial Teórico ...................................................................................................... 7
2.1 Viticultura....................................................................................................................7
2.1.1 Uva Vitis vinifera ..................................................................................................... 8
Cultivar Syrah/Shiraz ............................................................................................ 8 2.1.1.1
Cultivar Rubi..........................................................................................................9 2.1.1.2
Qualidade pós-colheita de uvas ............................................................................ 9 2.1.1.3
2.1.2 Míldio da videira (Plasmopara viticola) ............................................................... 11
2.1.3 Mofo cinzento da videira (Botrytis cinerea) .......................................................... 13
2.1.4 Controle do míldio e do mofo cinzento da videira ................................................ 15
Controle químico ................................................................................................ 15 2.1.4.1
Controle alternativo ............................................................................................ 16 2.1.4.2
2.1.4.2.1 Óleos essenciais................................................................................................17
2.1.4.2.1.1 Óleo essencial de Pitanga (Eugenia uniflora) .............................................. 21
2.1.4.2.1.2 Óleo essencial de Guaçatonga (Casearia sylvestris Swartz) ........................ 22
2.1.4.2.1.3 Óleo essencial de Melaleuca (Melaleuca alternifolia (Maiden & Betche)
Cheel)...............................................................................................................................23
2.1.5 Mecanismos de defesa das plantas ........................................................................ 24
Mecanismo bioquímico pré-formado: Compostos fenólicos .............................. 26 2.1.5.1
Mecanismo pós-formado estrutural: lignina ....................................................... 27 2.1.5.2
viii
Mecanismos bioquímicos pós-formados ............................................................ 29 2.1.5.3
2.1.5.3.1 Espécies reativas ao oxigênio .......................................................................... 29
2.1.5.3.1.1 Peróxido de hidrogênio (H2O2) ..................................................................... 30
2.1.5.3.1.2 Superóxido Dismutase (SOD E.C. 1.15.1.1) ................................................ 32
2.1.5.3.1.3 Catalase (CAT E.C. 1.11.1.6) ....................................................................... 33
2.1.5.3.1.4 Peroxidase (POD E.C. 1.11.1.7) ................................................................... 34
2.1.5.3.1.5 Peroxidação lipídica ......................................................................................35
2.1.5.3.1.6 Polifenoloxidase (PPO E.C. 1.10.3.2) .......................................................... 36
2.1.5.3.1.7 Fenilalanina amônia-liase (PAL E.C. 4.3.1.5) .............................................. 37
Proteínas relacionadas à patogenicidade ............................................................ 38 2.1.5.4
2.1.5.4.1 β-1,3-Glucanase (GLU E.C. 3.2.1.6) ............................................................... 39
2.1.5.4.2 Quitinase (E.C. 3.2.1.14) ................................................................................. 41
3 Referências ................................................................................................................. 42
CAPITULO I: ÓLEOS ESSENCIAIS NO CONTROLE DE MILDIO E NA
INDUÇÃO DE RESISTÊNCIA DE VIDEIRAS ‘SYRAH’ EM CASA DE
VEGETAÇÃO .............................................................................................................. 67
Resumo .......................................................................................................................... 67
CHAPTER I: ESSENTIAL OILS IN THE CONTROL OF MILD AND
INDUCTION OF RESISTANCE OF 'SYRAH' VINEES IN VEGETATION
HOUSE .......................................................................................................................... 68
Abstrat ........................................................................................................................... 68
1 Introdução .............................................................................................................. 69
2 Material e Métodos................................................................................................ 70
2.1 Local dos experimentos ............................................................................................ 70
2.2 Obtenção, composição e preparo dos tratamentos utilizados nos experimentos ...... 71
2.3 Efeito dos óleos essenciais de pitanga, guaçatonga e melaleuca no controle direto do
míldio em videiras ‗Syrah‘ ............................................................................................. 71
ix
2.4 Efeito dos óleos essenciais de pitanga, guaçatonga e melaleuca na indução de
resistência de videiras ‗Syrah‘ no controle o míldio ...................................................... 73
2.4.1 Análises bioquímicas ............................................................................................. 73
Coleta e armazenamento das amostras de videiras ‗Syrah‘ ................................ 73 2.4.1.1
2.5 Delineamento experimental e análise estatística ...................................................... 78
3 Resultados e discussão ............................................................................................... 79
3.1 Efeito dos óleos essenciais de pitanga, guaçatonga e melaleuca no controle direto do
míldio em videiras ‗Syrah‘ ............................................................................................. 79
3.2 Efeito dos óleos essenciais de pitanga, guaçatonga e melaleuca na indução de
resistência de videiras ‗Syrah‘ no controle do míldio .................................................... 88
3.2.1 Análises bioquímicas ............................................................................................. 88
3.2.2 Determinação do teor de lignina em folhas de videira tratadas com óleos essenciais
de pitanga, guaçatonga e melaleuca ............................................................................... 98
3.2.3 Área foliar, massa fresca e seca de folhas de videira ‗Syrah‘ tratadas com óleos
essenciais de pitanga, guaçatonga e melaleuca ............................................................ 100
4 Conclusão .................................................................................................................. 104
5 Referências ............................................................................................................... 105
CAPITULO II: ÓLEOS ESSENCIAIS NO CONTROLE De Botrytis cinerea
SOBRE A QUALIDADE PÓS-COLHEITA DE UVAS ‘RUBI’ ........................... 115
Resumo ........................................................................................................................ 115
CHAPTER II: ESSENTIAL OILS IN THE CONTROL OF Botrytis cinerea ON
THE POST-HARVEST QUALITY OF 'RUBI' GRAPE ....................................... 116
Abstrat ......................................................................................................................... 116
1 Introdução ................................................................................................................ 117
2 Material e Métodos .................................................................................................. 119
2.1 Obtenção dos óleos essenciais de pitanga, guaçatonga e melaleuca ...................... 119
2.2 Local dos experimentos .......................................................................................... 119
2.3 Compostos voláteis dos óleos essenciais no crescimento micelial de Botrytis cinerea
e no controle do mofo cinzento em uva ‗Rubi‘ ............................................................ 119
x
2.3.1 Compostos voláteis dos óleos essenciais na qualidade pós-colheita de uva
‗Rubi‘............................................................................................................................121
2.3.2 Efeito de compostos voláteis dos óleos essenciais na atividade de enzimas de
indução de resistência de uvas ‗Rubi‘ .......................................................................... 122
2.4 Delineamento experimental e análise estatística .................................................... 124
3 Resultados e Discussão ............................................................................................ 125
3.1 Compostos voláteis dos óleos essenciais no crescimento micelial de Botrytis cinerea
in vitro e no controle do mofo cinzento em uvas ‗Rubi‘ .............................................. 125
3.1.1 Compostos voláteis de óleos essenciais na qualidade pós-colheita de uvas
‗Rubi‘.............................................................................................................................128
3.1.2 Efeito de compostos voláteis de óleos essenciais na atividade de enzimas de
indução de resistência de uvas ‗Rubi‘ .......................................................................... 132
4 Conclusão .................................................................................................................. 140
5 Considerações Finais ............................................................................................... 141
6 Refêrencias ............................................................................................................... 142
7 ANEXOS ................................................................................................................... 149
xi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Germinação de Plasmopara viticola sob efeito direto dos tratamentos com
água, 0,12 µL mL-1
dos óleos essenciais de pitanga (OEP) (Eugenia uniflora),
guaçatonga (OEG) (Casearia sylvestris) e melaleuca (Melaleuca alternifolia) (OEM),
tween®
(0,12 µL mL-1
), acibenzolar-S-metil (ASM) e calda bordalesa (CB) nos
períodos de 2 (A), 4 (B), 12 (C) e 24 (D) horas em contato com os tratamentos (Época
1, 2016)........................................................................................................................... 80
Figura 2: Germinação de Plasmopara viticola sob efeito direto dos tratamentos com
água, 0,12 µL mL-1
dos óleos essenciais de pitanga (OEP) (Eugenia uniflora),
guaçatonga (OEG) (Casearia sylvestris) e melaleuca (Melaleuca alternifolia) (OEM),
tween®
(0,12 µL mL-1
), acibenzolar-S-metil (ASM) e calda bordalesa (CB) nos
períodos de 2 (A), 4 (B), 12 (C) e 24 (D) horas em contato com os tratamentos (Época
2, 2017)........................................................................................................................... 81
Figura 3: Viabilidade de Plasmopara viticola sob efeito direito dos tratamentos com
água, 0,12 µL mL-1
dos óleos essenciais de pitanga (OEP) (Eugenia uniflora),
guaçatonga (OEG) (Casearia sylvestris) e melaleuca (OEM) (Melaleuca alternifolia),
tween®
(0,12 µL mL-1
), acibenzolar-S-metil (ASM) e calda bordalesa (CB). Épocas 1,
2016 (A) e 2, 2017 (B). .................................................................................................. 83
Figura 4: Área abaixo da curva do progresso da doença (AACPD) do míldio
(Plasmopara viticola) em discos de folhas de videira ‗Syrah‘ tratados com água, 0,12
µL mL-1
dos óleos essenciais de pitanga (OEP) (Eugenia uniflora), guaçatonga (OEG)
(Casearia sylvestris) e melaleuca (OEM) (Melaleuca alternifolia), tween®
(0,12 µL
mL-1
), acibenzolar-S-metil (ASM) e calda bordalesa (CB). Épocas 1, 2016 (A) e 2,
2017 (B).......................................................................................................................... 83
Figura 5: Área abaixo da curva do progresso da doença (AACPD) de míldio
(Plasmopara viticola) em plantas de videira ‗Syrah‘ tratadas com água, 0,12 µL mL-1
dos óleos essenciais de pitanga (OEP) (Eugenia uniflora), guaçatonga (OEG)
(Casearia sylvestris) e melaleuca (OEM) (Melaleuca alternifolia), tween®
(0,12 µL
mL-1
), acibenzolar-S-metil (ASM) e calda bordalesa (CB). Épocas 1, 2016 (A) e 2,
2017 (B).......................................................................................................................... 84
xii
Figura 6: Atividade das enzimas superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT),
peroxidase (POD), polifenoloxidase (PPO), teores de compostos fenólicos (CF) e
peróxido de hidrogênio (H2O2), em discos de folhas de videira ‗Syrah‘ dos tratamentos
com água, 0,12 µLmL-1
dos óleos essenciais de pitanga (OEP) (Eugenia uniflora),
guaçatonga (OEG) (Casearia sylvestris) e melaleuca (OEM) (Melaleuca alternifolia),
tween®
(0,12 µL mL-1
), acibenzolar-S-metil (ASM) e calda bordalesa (CB), nas
coletas 1, 2, 3 e 4 na primeira época (2016) (A,C,E e G) e na segunda época (2017)
(B,D,F e H). .................................................................................................................... 90
Figura 7: Atividade das enzimas superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT),
peroxidase (POD), polifenoloxidase (PPO), teores de compostos fenólicos (CF) e
peróxido de hidrogênio (H2O2), em discos de folhas de videira ‗Syrah‘, dos tratamentos
com água, 0,12 µLmL-1
dos óleos essenciais de pitanga (OEP) (Eugenia uniflora),
guaçatonga (OEG) (Casearia sylvestris) e melaleuca (OEM) (Melaleuca alternifólia),
tween®
(0,12 µL mL-1
), acibenzolar-S-metil (ASM) e calda bordalesa (CB), nas
coletas 5,6,7 e 8 na primeira época (2016) (A, C, E e G) e na segunda época (2017)
(B, D, F e H). .................................................................................................................. 91
Figura 8: Efeito da média de todas as coletas, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 e 8, atividade das
enzimas superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), peroxidase (POD),
polifenoloxidase (PPO), teores de compostos fenólicos (CF) e peróxido de hidrogênio
(H2O2) defolhas de videira ‗Syrah‘, dos tratamentos com água, 0,12 µL mL-1
dos óleos
essenciais de pitanga (OEP) (Eugenia uniflora), guaçatonga (OEG) (Casearia
sylvestris) e melaleuca (OEM) (Melaleuca alternifolia), tween®
(0,12 µL mL-1
),
acibenzolar-S-metil (ASM) e calda bordalesa na primeira época (2016) (A) e na
segunda época (2017) (B). ............................................................................................. 92
Figura 9: Posições do ranqueamento (R) da média das coletas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 e 8,
dos tratamentos com água (testemunha), 0,12 µL mL-1
dos óleos essenciais de pitanga
(OEP) (Eugenia uniflora), guaçatonga (OEG) (Casearia sylvestris) e melaleuca
(OEM) (Melaleuca alternifolia), tween®
(0,12 µL mL-1
), acibenzolar-S-metil (ASM) e
calda bordalesa para época 1, 2016 (A) e época 2, 2017 (B). ...................................... 93
Figura 10: Teor de lignina de folhas de videiras ‗Syrah‘ tratadas com água
(testemunha), 0,12 µL mL-1
dos óleos essenciais de pitanga (OEP) (Eugenia uniflora),
guaçatonga (OEG) (Casearia sylvestris) e melaleuca (OEM) (Melaleuca alternifolia),
tween®
(0,12 µL mL-1
), acibenzolar-S-metil (ASM) e calda bordalesa para época 1,
2016 (A) e época 2, 2017 (B). ....................................................................................... 99
xiii
Figura 11: Área foliar (cm2) de videiras ‗Syrah‘ tratadas com 0,12 µL mL
-1 dos óleos
essenciais de pitanga (Eugenia uniflora), guaçatonga (Casearia sylvestris) e melaleuca
(Melaleuca alternifolia), tween® (0,12 µL mL
-1), acibenzolar-S-metil (ASM) e calda
bordalesa para. Épocas 1( 2016) (A) e 2 (2017) (B). .................................................. 101
Figura 12: Massas fresca (g) (épocas 1, 2016 (A) e 2, 2017 (B)) e seca (g) (épocas 1,
2016 (C) e 2,2017 (D)) de folhas de videiras ‗Syrah‘ tratadas com 0,12 µL mL-1
dos
óleos essenciais de pitanga (OEP) (Eugenia uniflora), guaçatonga (OEG) (Casearia
sylvestris) e melaleuca (OEM) (Melaleuca alternifolia), tween®
(0,12 µL mL-1
),
acibenzolar-S-metil (ASM) e calda bordalesa. ........................................................... 102
Figura 13: Forma de organização das bagas em bandejas de poliestileno contendo papel
toalha, algodão umedecido e no centro 2 cm2 de papel germitest. Em cada recipiente
referente aos seus respectivos tratamentos, foram pipetados, nesse papel, 20 µL dos
tratamentos com água e os óleos essenciais de pitanga (E. uniflora) (OEP), guaçatonga
(C. sylvestris) (OEG) e melaleuca (M. alternifolia) (OEM)......................................... 121
Figura 14: Índices de velocidade de crescimento micelial (IVCM) de Botrytis cinerea e
de mofo cinzento, sob efeito direto de compostos voláteis dos óleos essenciais de
pitanga (OEP) (Eugenia uniflora), guaçatonga (Casearia sylvestris) (OEG) e
melaleuca (OEM) (Melaleuca alternifolia) à 100%. Letras minúsculas estão
relacionadas com os tratamentos e as maiúsculas entre o tempo. .............................. 126
Figura 15: Análises de pós-colheita do teor de sólidos solúveis (°Brix,SS) (A), acidez
titulável (%, AT) (B), Ratio (relação SS/AT) (C) e teor de compostos fenólicos (mg de
ácido gálico 100g-1
de massa seca) (D) em mostro de bagas de uvas ‗Rubi‘ tratadas com
compostos voláteis dos óleos essenciais de pitanga (OEP) (Eugenia uniflora),
guaçatonga (OEG) (Casearia sylvestris) e melaleuca (OEM) (Melaleuca alternifolia)
à 100%. ......................................................................................................................... 130
Figura 16: Atividade específica da polifenoloxidase (PPO) antes (A) e após (B) a
inoculação de Botrytis cinerea em bagas de uvas ‗Rubi‘tratadas com compostos voláteis
dos óleos essenciais de pitanga (OEP) (Eugenia uniflora), guaçatonga (OEG) (Casearia
sylvestris) e melaleuca (OEM) (Melaleuca alternifolia) a 100%. ................................ 133
xiv
Figura 17: Atividade específica da fenilalanina amônio liase (PAL,) antes (A) e após
(B) a inoculação de Botrytis cenerea, em bagas de uvas ‗Rubi‘ tratadas com compostos
voláteis dos óleos essenciais de pitanga (Eugenia uniflora), guaçatonga (Casearia
sylvestris) e melaleuca (Melaleuca alternifolia) a 100%, após 1 hora e 13 dias de
contato. Letras minúsculas comparam os tratamentos e as maiúsculas o tempo de
contato. ......................................................................................................................... 135
Figura 18: Atividade específica de β-1,3-glucanase (GLU), antes (A) e após (B) a
inoculação de Botrytis cenerea, em bagas de uvas ‗Rubi‘ tratadas com compostos
voláteis dos óleos essenciais de pitanga (Eugenia uniflora), guaçatonga (Casearia
sylvestris) e melaleuca (Melaleuca alternifolia) a 100%, após 1 hora e 13 dias de
contato. Letras minúsculas comparam os tratamentos e as maiúsculas o tempo de
contato. ......................................................................................................................... 137
Figura 19: Atividade específica de quitinase após a inoculação de Botrytis cenerea em
bagas de uvas ‗Rubi‘ tratadas com compostos voláteis dos óleos essenciais de pitanga
(OEP) (Eugenia uniflora), guaçatonga (OEG) (Casearia sylvestris) e melaleuca (OEM)
(Melaleuca alternifolia) a 100%, após 1 hora e 13 dias de contato. Letras minúsculas
comparam os tratamentos e as maiúsculas o tempo de contato. ................................... 138
Figura 20: Componentes do óleo essencial de pitanga (OEP) (Eugenia uniflora)
identificados por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa (CG-EM).
...................................................................................................................................... 150
Figura 21: Componentes do óleo essencial de guaçatonga (OEG) (Casearia sylvestris)
identificados por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa (CG-EM).
...................................................................................................................................... 151
Figura 22: Componentes do óleo essencial de melaleuca (OEM) (Melaleuca
alternifolia) identificados por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de
massa (CG-EM). .......................................................................................................... 152
xv
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Eficiência e custo dos tratamentos com óleos essenciais (0,12 µL mL-1
) de
pitanga (Eugenia uniflora) (OEP), guaçatonga (OEG) (Casearia sylvestris) e
melaleuca (OEM) (Melaleuca alternifolia), tween®
(0,12 µL mL-1
), acibenzolar-S-
metil (ASM) e calda bordalesa (CB), aplicados em um volume de calda de 400L ha-1
.
........................................................................................................................................ 87
xvi
LISTA DE QUADROS
Quadro 1: Forma de coleta dos discos de folhas de videira ‗Syrah‘ tratadas com óleos
essenciais de pitanga, guaçatonga e melaleuca em casa de vegetação para analise de
indução de resistência. .................................................................................................... 74
1
GARCIA, Carla. Óleos essenciais no manejo de doenças em videira cv. Syrah e
Rubi. 2018. 171p. Tese (Doutorado em Produção Vegetal). UNICENTRO.
RESUMO
A viticultura depara-se com alguns problemas fitossanitários, como o míldio e o mofo
cinzento que interferem negativamente na produção e na qualidade das uvas e de seus
produtos comercializados. Dessa forma, foram desenvolvidos dois experimentos tendo
como objetivo de verificar o controle alternativo do míldio da videira em ‗Syrah‘ e do
mofo cinzento em uvas ‗Rubi‘. Para o primeiro experimento utilizou-se como
tratamentos a dose de 0,12 µL mL-1
dos óleos essenciais de pitanga (OEP), guaçatonga
(OEG) e melaleuca (OEM) em comparação com tween®
(0,12 µL mL-1
), acibenzolar-S-
metil (ASM, 0,005%) e calda bordalesa (1:1:100, cal:sulfato de cobre:água) (CB).
Nesse experimento avaliou-se a germinação e a viabilidade dos esporângios do
oomiceto Plasmopara vitícola, a severidade do míldio em disco de folha em condições
de laboratório e em videiras ‗Syrah‘ em casa de vegetação e determinou-se os teores de
compostos fenólicos (CF), lignina, concentração de peróxido de hidrogênio (H2O2),
atividade das enzimas superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), peroxidase (POD),
peroxidação lipídica (PL), polifenoloxidase (PPO) e a área foliar, massa fresca e seca
das folhas dessas plantas. Com isso verificou-se que os óleos essenciais apresentam
efeito fungitóxico na germinação e na viabilidade dos esporângios de P. viticola,
controlam o míldio em videiras ‗Syrah‘, ativam simultaneamente mecanismos de defesa
e melhoram o desenvolvimento dessas plantas. Para o segundo experimento adicionou-
se o OEP, OEG, OEM e testemunha com água em placas em placas de Petri, para
experimento in vitro, e nas embalagens de polietileno vedadas com bagas de uvas
‗Rubi‘. Com isso, determinou-se o efeito direto dos voláteis sobre B. cinerea, o controle
do mofo cinzento, a qualidade pós-colheita dos frutos e a atividade das enzimas
polifenoloxidase (PPO), fenilalamina amônia liase (PAL), β-1,3-glucanase (GLU) e
quitinase. Dessa forma observou-se que os voláteis do OEM apresenta efeito direto
sobre o controle do crescimento micelial de B. cinerea e os de OEP e OEM reduzem o
índice de mofo cinzento nas bagas. Os voláteis emitidos por esses óleos essenciais
melhoram a qualidade pós-colheita de uvas ‗Rubi‘, reduzem a atividade das enzimas
PPO e quitinase e aumentam da PAL e GLU. Dessa forma, pode se dizer que o OEP,
2
OEG e OEM apresentam a capacidade de agir diretamente sobre o patógeno e induzir a
resistência de plantas de videira ‗Syrah‘ e uvas ‗Rubi‘.
Palavras chaves: Vitivinicultura, Controle alternativo, patógeno biotrófico, patógeno
necrotrófico, enzimas de defesa.
3
GARCIA, Carla. Essential oils in the management of diseases in cv. Syrah and
Rubi. 2018. 171p. Thesis (PhD in Plant Production). UNICENTRO.
ABSTRACT
Viticulture is faced with some phytosanitary problems, such as mildew and gray mold,
which adversely affect the production and quality of the grapes and their marketed
products. In this way, two experiments were carried out with the objective of verifying
the alternative control of the downy mildew of 'Syrah' and the gray mold on 'Rubi'
grapes. For the first experiment, the doses of 0.12 μL mL-1
of essential oil of pitanga
(EOP), guaçatonga (EOG) and melaleuca (EOM) were used as compared to tween®
(0.12 μL mL-1
) , acibenzolar-S-methyl (ASM, 0.005%) and bordeaux misture (1: 1: 100,
lime: copper: water sulphate) (BM). In this experiment the germination and viability of
the sporangia of the oomycete Plasmopara viticola, the severity of leaf disc mildew
under laboratory conditions and 'Syrah' vines were evaluated in a greenhouse and the
phenolic compounds (PC), lignin, hydrogen peroxide (H2O2) concentration, enzyme
activity superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), peroxidase (POD), lipid
peroxidation (LP), polyphenoloxidase (PPO), and leaf area, fresh mass, leaves of these
plants. It was verified that the essential oils have a fungitoxic effect on the germination
and viability of the sporangia of P. viticola, control the mildew on 'Syrah' vines,
simultaneously activate defense mechanisms and improve the development of these
plants. For the second experiment, the OEP, OEG, OEM and control were added with
water in plates in Petri dishes for in vitro experiment, and in the polyethylene packages
sealed with berries of 'Rubi' grapes. The effect of volatiles on B. cinerea, control of gray
mold, post-harvest quality of fruits and polyphenoloxidase (PPO), phenylalanine
ammonia lyase (PAL), β-1,3-glucanase (GLU) and chitinase. In this way, it was
observed that the volatiles of the EOM have a direct effect on the control of the mycelial
growth of B. cinerea and those of EOP and EOM reduce the index of gray mold in the
berries. The volatiles emitted by these essential oils improve the post-harvest quality of
'Rubi' grapes, reduce the activity of the PPO and chitinase enzymes and increase the
PAL and GLU. Thus, it can be said that EOP, EOG and EOM have the ability to act
directly on the pathogen and induce resistance of 'Syrah' and 'Rubi' grapevine plants
4
Keywords: Vitiviniculture, Alternative control, biotrophic pathogen, necrotrophic
pathogen, defense enzymes.
5
1 INTRODUÇÃO
A viticultura brasileira interfere positivamente na economia do país, representando um
setor que se expande desde o extremo sul até o nortesde do Brasil. A expanssão está
relacionado ao desenvolvimento de pesquisas e com o avanço de novas tecnologias, que ao
envolver o manejo propiciam a abrangência da viticultura em diversas regiões. Dentre esses
locais destaca-se o Vale do submedio do Rio São Francisco, Rio Grande do Norte, Ceará, e
Norte do Paraná são caracterizados por sistemas peculiares que permitem a obtenção de dois
ciclos vegetativos e duas colheitas ao ano (CAMARGO et al., 2011).
Nos estados do Rio Grande do Sul, Santa Catarina, Paraná, São Paulo e Minas Gerais
esse sistema de cultivo é dito tradicional, apresentando ciclo anual, seguido de período de
dormência, induzido pelas baixas temperaturas do inverno e com uma colheita ao ano
(CAMARGO et al., 2011). A área de cultivo desses estados, designada para a produção de
uva representam 83,7 mil hectares e 1,1 mil vinícolas instaladas em pequenas propriedades,
com aproximadamente dois hectares destinados à família produtoras de uva (IBRAVIN,
2017).
Especificamente, destaca-se que em São Paulo a produção chega a aproximadamente
145 mil toneladas; Minas Gerais 13 mil toneladas e Paraná 66 mil toneladas (IBGE, 2017).
Esses valores mostram-se representativos perante a economia brasileira, pois os frutos podem
ser destinados principalmente à produção de vinhos ou consumidas de forma in natura, ditas
uvas finas de mesa (CAMARGO et al., 2011; DEBASTIANI et al., 2016).
As videiras cultivadas para essas finalidades pertencem, principalmente, à espécie
européia Vitis vinifera, que produz uvas finas com elevada qualidade em seus produtos
(PROTAS et al., 2006). Dentre essas cultivares está a ‗Syrah‘, que é uma planta com elevado
potencial produtivo, possuindo alta peculiaridade para produzir vinhos finos (SILVA et al.,
2010) e a ‗Rubi‘ que apresenta plantas vigorosas com produção de cachos grandes e uvas
com excelente qualidade para mesa, principalmente, por apresentar sabor suave moscatel
(PEREIRA, 1992; POMMER, 1997).
Ambas as cultivares mostram-se susceptíveis a doenças fungicas, sendo a ‗Syrah‘
extremamente sensível ao míldio (Plasmopara viticola Berl. & De Tony) e a ‗Rubi‘ ao mofo
cinzento (Botrytis cinerea Pers.) que ataca essas uvas na pós-colheita. Essas doenças causam
graves perdas no rendimento e na qualidade das uvas, o que resulta em interferências
6
negativas nas propriedades de seus produtos finais como vinhos, sucos, geleias e uvas de
mesa (MERZ et al., 2015; PONS et al., 2018).
O míldio da videira é considerado uma das doenças mais importantes dessa cultura
que, quando não realizado o controle, pode comprometer até 75% da produtividade, devido à
sua severidade. Essa doença pode atacar todos os órgãos da planta, porém nas folhas é que se
verificam os sintomas característicos (GESSLER et al., 2011; AMORIM et al., 2016).
O mofo cinzento pode ocorrer em diferentes tecidos da planta, podendo se desenvolver
nas folhas, ramos e, principalmente, nos cachos, o que consequentemente causa interferência
negativa sobre a qualidade pós-colheita e a comercialização desses frutos (ALMANÇA et al.,
2015; LATORRE et al., 2015).
Para o controle dessas doenças utilizam-se produtos químicos que apesar da eficiência,
acarretam em danos ao meio ambiente e à saúde humana, além de selecionar patógenos
resistentes aos princípios ativos atuais, tornando necessária a descoberta sempre de novas
moléculas para essa finalidade (PONS et al., 2018). Como forma de eliminar ou reduzir esses
impactos negativos tem-se adotado o uso de produtos alternativos que visam controlar o
patógeno, induzir a resistência da planta ou aumentar o período de prateleira de uvas de mesa
(CAMILI et al., 2007).
Dentre esses produtos destacam-se os óleos essenciais sintetizados pelo metabolismo
secundário de plantas medicinais e aromáticas. São constituídos por componenetes
complexos e por compostos voláteis, que os caracterizam com potencial para o controle de
fitopatógenos fúngicos, interferindo na fluidez das membranas de suas células causando
morte celular. Esses compostos também podem induzir a resistência de plantas hospedeira,
alterando seus componentes estruturais e bioquímicos, de forma que podem impedir ou
reduzir o desenvolvimento de doenças (BAKKALI et al., 2008; MAIA et al., 2014).
Neste contexto, o objetivo do trabalho foi verificar se os óleos essenciais de pitanga
(Eugenia uniflora L), guaçatonga (Casearia sylvestris Swartz) e melaleuca (Melaleuca
alternifolia (Maiden & Betche) apresentam efeito no controle e na indução de resistência ao
míldio (Plasmopara viticola) em videiras ‗Syrah‘. Ao mesmo tempo, também analisar se os
compostos voláteis desses óleos controlam o mofo cinzento (Botrytis cinerea), interferem na
qualidade pós-colheita de uvas ‗Rubi‘ ou ativam suas enzimas de defesa.
7
2 REFERENCIAL TEÓRICO
2.1 Viticultura
A fruticultura está entre os ramos do setor agrícola brasileiro importante para a
economia brasileira, devido ao consumo do mercado interno e às exportações. Dentre as frutas
que movimentam o Brasil destacam-se a castanha, o caju, a manga, o melão, a laranja, a
banana e a uva, que representam em média, 87,09% das exportações desse setor (SANTOS et
al., 2013; CARVALHO; CUNHA FILHO, 2015).
Com relação à viticultura, uma parcela de seus derivados, como o vinho, é destinada
ao consumo interno e externo do país, além do suco de uva concentrado e uvas de mesa. Com
isso o país se consolidou como o quinto maior produtor de bebidas do hemisfério Sul, o que
certamente acarreta em crescimento rápido dos mercados a nível mundial (CAMARGO et al.,
2011; IBRAVIN, 2017).
Atualmente, essa atividade no Brasil soma 83,7 mil hectares, podendo destacar a
produção brasileira em torno de 122 toneladas, sendo que os estados de São Paulo, Minas
Gerais e Paraná contribuem em média com 144.110; 13.523 e 66.000 toneladas,
respectivamente, além das demais localidades que se extendem desde o extremo Sul até a
região Nordeste do país. No ano de 2014, a produção destinada à elaboração de suco,
derivados e vinho totalozaram em 673,422 milhões de quilogramas de uvas, representando
46,89% da produção nacional, com 53,11% da produção foi destinada ao consumo in natura
(MELLO, 2015; IBGE, 2017; IBRAVIN, 2017).
Esses valores são altamente representativos para a economia brasileira, devido a
grande diversidade de cultivo, pois essa cultura é produzida com variações nas condições
ambientais e sistemas de cultivo, além de apresentar recursos genéticos com ampla
variabilidade, que permite uma vasta oferta de produtos. Essas características permitem o
aumento da produção de uvas destinadas à vinificação e de mesa em virtude da elevada
expectativa de mercado e ao crescente consumo (SATO; ROBERTO, 2008; CAMARGO et
al., 2011; DEBASTIANI et al., 2015).
O estado do Paraná apresenta zoneamento agroclimático que respondem a essas
características, permitindo dessa forma, a produção de uvas para vinho e para mesa,
apresentando potencial de expansão e desenvolvimento econômico com a vitivinicultura
(SATO; ROBERTO, 2008; SILVA et al., 2014).
8
A região sul do estado caracteriza-se pelo cultivo de uvas de forma tradicional,
definida por ciclos anuais, seguida de períodos de dormência induzidos pelas baixas
temperaturas do inverno. Nessa região pode-se produzir uvas destinadas a produção de vinhos
finos com alta qualidade (OLIVEIRA et al., 2017). Na região norte pode-se cultivar uvas
subtropicais, principalmente as destinadas ao consumo in natura, pois apresentam invernos
amenos e curtos, podendo apresentar dois ciclos produtivos ao ano (POMMER; MAIA,
2003).
2.1.1 Uva Vitis vinifera
A videira é pertencente à família Vitaceae, considerada umas das culturas mais antigas
da civilização mundial. Estão presentes nessa classificação as videiras originárias da Europa
(Vitis vinifera), que foram as primeiras variedades introduzidas no Brasil, representando 20%
das uvas industrializadas e finas de mesa, devido às qualidades compatíveis com as exigências
do mercado (RITSCHEL; SEBBEN, 2010; CAMARGO, 2014).
Essas videiras apresentam perspectivas de cultivo em diversas áreas, o que permite a
expansão da cultura no país. Podem ser utilizadas para a produção de vinho fino e para o
consumo in natura, devido a sua elevada capacidade de acumular antocianinas, que influencia
na alta qualidade dos produtos dessas uvas (PROTAS et al., 2006; FERRANDINO et al.,
2017). Dentre as cultivares utilizadas para essas finalidades pode-se destacar a ‗Syrah‘ para
produção de vinho fino e a ‗Rubi‘ para o consumo in natura (CAMARGO et al., 2011;
TONIETTO et al., 2012).
Cultivar Syrah/Shiraz 2.1.1.1
A cultivar Syrah apresenta duas possíveis origens, sendo em Schiraz na Pérsia ou de
Vila Siracusa na Sicília. Porém, independente de sua origem, destaca-se mundialmente na
vitivinicultura podendo apresentar diferentes nomenclaturas dependendo da região de cultivo.
Essa denominação é a mais utilizada na França, principalmente no Vale do Rhône; nos
Estados Unidos, África do Sul, Austrália e Canadá é dita ‗Shiraz‘, na Argentina é conhecida
como ‗Balsamina‘ (CAMARGO, 1994; SOUSA; MARTINS, 2002; FAVERO, 2007;
FRAGA, 2010).
Trata-se de uma planta com porte semi-ereto com fácil identificação devido a
visualização de abundantes pelos de coloração branca na extremidade do ramo. Suas folhas
jovens apresentam coloração verde clara e as adultas são penta lobadas, com seio peciolar
9
aberto. Os ramos são frágeis de coloração verde clara, com entrenós longos. Os cachos são
grandes, cilíndricos e compostos, medianamente compactos, apresentam bagas ovaladas de
tamanho considerado médio, de coloração preta, polpa fundente e sabor neutro (SOUSA,
2002; ELIAS, 2008).
Essas plantas são vigorosas e produtivas, com período curto de maturação, potencial
produtivo de 12 kg ha-1
, deixando claro que essas uvas podem ser destinadas à reserva de
grande peculariedade para produzir vinhos finos. Esses produtos do processamento, dessa
cultivar, são de coloração intensa, aromáticos e complexos, com aptidão ao envelhecimento
com alta qualidade (SILVA et al., 2010).
Dessa forma, essa cultivar apresenta alto valor econômico, porém possui elevada
suscetibilidade a varias doenças, como antracnose, mancha-das-folhas, podridões e,
principalmente, o míldio (Plasmopara viticola), que acarreta em graves perdas no rendimento
e na qualidade da uva e, consequentemente, no vinho (MERZ et al., 2015; PONS et al., 2018).
Cultivar Rubi 2.1.1.2
A uva ‗Rubi‘ destinada para o consumo in natura surgiu da mutação dita natural da
uva ‗Itália‘ que ocorreu em 1974 no Paraná. Suas características não diferem da sua cultivar
de origem, apenas a coloração de sua baga que é rosada (POMMER et al., 1997).
Suas folhas são penta lobadas, orbiculares, com seio peciolar em lira estreita, podendo
ser fechada. Os cachos são grandes, apresentam forma cilíndrico-cônica, com peso entre 400
e 600g, suas bagas são do tipo elipsóide, com textura trincante, sabor suavemente moscatel,
com teor de sólidos solúveis entre 14 e 18° Brix, a acidez é considerada baixa e a casca
apresenta espessura regular (PEREIRA, 1982; POMMER, 1997).
São plantas de alto vigor que necessitam de poda longa deixando de 8 a 12 gemas por
vara. A produtividade média é de aproximadamente 30 t ha-1
, porém com relação a pragas e
doenças apresentam baixa resistência (TERRA et al., 1998). Trata-se de uma cultura
suscetível a vários agentes fitopatogênicos, como ao P. viticola, Unicula necator e,
principalmente, o Botrytis cinerea Pers. que causa o mofo cinzento da uva e,
consequentemente, reduz o rendimento e a qualidade dessa cultura (CAMILI et al., 2007).
Qualidade pós-colheita de uvas 2.1.1.3
As uvas são frutos não climatérios, que não amadurecem após a colheita, necessitando
a permanência na planta mãe até o momento da maturação. A respiração desses frutos está
10
entre 1 e 2 mg CO2kg-1
h-1
, considerada relativamente contínua e baixa, o que faz com que
após a colheita apresentem deterioração lenta (CHITARRA; CHITARRA, 2005). Para o
armazenamento, de até três meses, o ideal são que as uvas permaneçam em câmara fria com
temperatura de 0° C e umidade relativa do ar de 90-95% com velocidade do ar de 0,2-0,3 ms-1
(DOSSAT, 1990; KADER, 1992, BENATO, 2002).
A forma de transporte e manuseio desses frutos pode interferir na sua qualidade para
comercialização acarretando em perdas nos padrões de qualidade como, aparência, textura,
aroma e sabor. Essas alterações são decorrentes da deteriorização, contaminação e
modificações na composição química da matéria que podem reduzir nutrientes e,
consequemente diminuem o valor comercial, podendo verificar de 20 a 95% de perdas na pós-
colheita de uvas (CHITARRA; CHITARRA, 2005; AUJLA, 2011).
Dessa forma são realizadas práticas para manter a qualidade desses frutos, como o
emprego de compostos orgânicos no interior de embalagens, que reduzem a contaminação por
micro-organismos e tendem a diminuir o risco de ingestão de produtos químicos (ARRUDA
et al., 2011).
Como parâmetros de relevância para verificar a qualidade pós-colheita estão os físicos,
peso e cor e os químicos como à acidez titulável (AT), o teor de sólidos solúveis, o índice de
maturação, pH e conteúdo de compostos fenólicos. A acidez titulável (AT) corresponde à
concentração de íons de hidrogênio na solução, apresentando importância significativa nas
características físicas, químicas, microbiológicas e sensoriais dos frutos, sendo fundamentais
na síntese de compostos fenólicos, lipídios e aromas voláteis (CHITARRA; CHITARRA,
1990). Essa acidez é dada pela presença de ácidos orgânicos que tendem a diminuir durante o
processo de maturação, devido à oxidação dos ácidos em decorrência da respiração (BRODY,
1996). Como valores de referencias para ‗Syrah‘ é de 102-121 meq L-1
para AT e pH de
aproximadamente 3,46 e, a ‗Rubi‘ esses valores são de 0,70% de ácido tartárico (AT) e 3,4,
respectivamente (MOTA et al., 2009; DOMINGUES NETO et al., 2016).
Os sólidos solúveis (SS) representam os compostos solúveis em água, como açúcares,
vitaminas, ácidos, aminoácidos e algumas pectinas. O teor desse parâmetro depende do
estádio de maturação em que o fruto foi colhido e, geralmente, tende a aumentar durante a
maturação pela biossíntese ou degradação de polissacarídeos. São representados por 90% de
açúcares que, predominantemente são constituídos por glicose e frutose que devem apresentar
um teor total de 14° Brix. Destaca-se que para as cultivares Syrah esse valor apresenta
variação entre 15 e 19,8 °Brix e a Rubi entre 14 e 18 °Brix (CHITARRA; CHITARRA, 1990;
DAUDT; FOGAÇA, 2008; MOTA et al., 2009; DOMINGUES NETO et al., 2016).
11
Pela relação entre esses dois parâmetros, designado ratio, determina-se o índice de
maturação, ou seja, o equilíbrio entre os sabores doce e ácido da fruta, sendo que para uva de
mesa considera-se 20:1 como padrão de qualidade, aceitabilidade do consumidor e definição
da data de colheita (SS:AT) (RIZZON; LINK, 2006; CONDE et al., 2007; MORAES et al.,
2008).
Todos esses parâmetros de qualidade pós-colheita podem ser afetados por
micorganimos, principalmente, pelo míldio (Plasmopara viticola) e pelo mofo cinzento
(Botrytis cinerea) (LATORRE et al., 2015; PONS et al., 2018).
2.1.2 Míldio da videira (Plasmopara viticola)
O oomiceto P. viticola foi descrito em 1834 pela primeira vez, por Schweintz, que o
classificou taxonomicamente como Botrytis cana, mais tarde como B. viticola. De Bary
transferiu a nomenclatura para um novo gênero dito Peronospora viticola, que em 1888 foi
redescrito para Plasmopara viticola Berl. & De Tony por Berlese e De Toni, nome utilizado
atualmente (SACCARDO, 1888).
Esse agente causal dá origem à doença conhecida como míldio da videira, que é
considerada uma das mais importantes dessa cultura, principalmente em regiões de cultivo em
que o verão é úmido (ROUXEL et al., 2014). Os relatos de danos ocasionados por essa
doença na viticultura são registrados desde 1875 e dispende grandes prejuízos, podendo
comprometer até 75% da produtividade, devido à severidade em que o patógeno ataca
principalmente os órgãos verdes das plantas (AMORIM et al., 2016; MADDALENA, 2017).
O P. viticola é um fitopatógeno biotrófico, da classe dos Oomycetes, família
Peronosporacea, que apresentam deposição de celulose na parede celular e em estado
vegetativo as células são compostas por núcleos diplóides. Apresenta hifas cenocíticas (8-10
µm de diâmetro), que crescem intracelularmente nos tecidos infectados e emitem haustórios
globosos. A reprodução assexuada ocorre nos estômatos das plantas com a emissão dos
esporangióforos com ramificações monopodiais que produzem esporângios hialinos e
ovalados. Cada esporângio origina zoósporos biflagelados, que na presença de água,
movimentam-se na superfície da folha e infecta o estômato do hospedeiro mais próximo,
emitindo seu tubo germinativo. Esses zoósporos são unicelulares e fusões protoplasmáticas de
hifas provenientes de diferentes zoósporos podem ocorrer no interior dos tecidos, originando
12
os micélios heterocarióticos. A fase sexuada ocorre, principalmente, nos tecidos foliares e é a
principal forma de sobrevivência desse patógeno (GESSLER et al., 2011; AMORIM et al.,
2016).
Essa fase permite a sobrevivência do patógeno na ausência do hospedeiro pela emissão
de oósporos. Para que ocorra a formação dessas estruturas, durante o período da primavera, os
oósporos maduros germinam e liberam os zoósporos biflagelados, desprovidos de parede
celular. Com a presença de lâmina de água sob o tecido foliar da videira, essas estruturas
infectam os estômatos. Durante esse processo, ocorre a síntese da parede celular e a hifa
penetra na abertura estomática (LAMOUR; KAMOUN, 2007).
No período do inverno, no mesofilo das folhas infectadas estão micélios do patógeno
que começam a formar suas estruturas de reprodução sexuadas, ou seja, gametângios
(oogônio e anterídio). No início, o oogônio é ausente de septos e é considerada estrutura
feminina, porque tem a capacidade de fornecer grande parte do citoplasma aos oósporos que
se desenvolvem no seu interior. Porém, o anterídio é septado e origina o tubo de fertilização,
que permite a passagem de seu material genético até a oosfera presente no oogônio, dando
origem aos oósporos, que ficaram aptos a realizarem novas infecções (BURRUANO, 2000;
DICK, 2001).
Essa doença pode atacar todos os tecidos das plantas, particularmente nas folhas onde
se observam os primeiros sintomas característicos. Nestes órgãos observa-se na face adaxial o
encharcamento do mesofilo, que se apresenta como uma mancha pálida, pequena com bordos
indefinidos de fácil visualização contra a luz, chamada também ―mancha de óleo‖. Em
condições de alta umidade observa-se na face abaxial, correspondente à face superior com
encharcamanto, eflorescência de coloração branca (―mancha mofo‖), com característica
densa, aspecto cotonoso apresentando estruturas de frutificações do patógeno, podendo
apresentar até 2500 esporos mm-1
. Com o desenvolvimento da doença, verifica-se que a
―mancha de óleo‖ fica amarelada, inicialmente circular e, posteriormente, adquire forma
indefinida. Por fim, as áreas infectadas ficam necrosadas e essas manchas tornam-se
avermelhadas. Essas últimas lesões são irregulares e podem ocupar grande parte do limbo
foliar, podendo ocasionar a desfolha precoce o que reduz a área fotossintéticamente ativa da
planta e reflete em problemas na produtividade (JERMINI et al., 2010b; GESSLER et al.,
2011; AMORIM et al., 2016).
13
A infecção por esse fitopatógeno também pode acontecer nos cachos, nos períodos que
se estendem desde o início da floração até o começo da maturação das bagas. As
inflorescências contaminadas tendem a secarem e, em seguida, cair. Quando atinge as flores
ou os frutos (fase de chumbinho), observa-se uma massa branca composta por estruturas
fúngicas sobre os cachos. Nas bagas, quando apresentam tamanho pequeno, o patógeno
impede o seu crescimento, tornando-as duras, secas e de coloração escura. O P. viticola
também pode infectar bagas que estão na metade do seu desenvolvimento e, neste caso, a
infecção ocorre via pedúnculo e o oomiceto cresce internamente. Nessas bagas verifica-se
como sintomas, murchamento, depressão e fragilidade, podendo promover a queda desses
órgãos vegetais, e também comprometer a composição química, na qualidade dessas bagas e,
consequentemente, nos produtos finais produzidos, como o vinho (JERMINI et al., 2010a;
AMORIM et al., 2016; PONS et al., 2018).
O ataque desse patógeno e a gravidade dos danos causados por essa doença
apresentam estreita interação com as condições meteorológicas, que influenciam a severidade
e a incidência do míldio da videira. Assim, para que ocorra o desenvolvimento do patógeno e
esporulação branca, característica da doença, é necessário umidade relativa do ar entre 95 e
100%, molhamento foliar de no mínimo 2 horas e temperatura de 25°C com amplitude entre
10 e 30°C (POMMER et al., 2003; GAVA et al., 2004; PIRES et al., 2010).
2.1.3 Mofo cinzento da videira (Botrytis cinerea)
O mofo cinzento tem como agente o fungo Botrytis cinerea Persoon (1974) que é a
fase teleomórfica de Botryotinia fuckeliana. Trata-se de um fungo que pode apresentar
comportamento saprofítico e necrotrófico. Esse patógeno infecta uma ampla gama de plantas
e causa perdas significativas, principalmente, em frutas frescas, como ocorre em uvas, que
despendem impactos econômicos considerados. Esses danos estão relacionados com infecções
do patógeno na pré-colheita, durante o transporte e o armazenamento dessas uvas (CAMILI et
al., 2007; DADAKOVA et al., 2015; AMORIM et al., 2016).
B. cinerea é um patógeno composto por micélios filamentosos, septados, hialinos,
ramificados com paredes celulares proeminentes, contendo quitina e elevados teores de
açúcares neutros e proteínas (CANTU et al., 2009). Na extremidade dessas estruturas estão os
escleródios, constituídos por uma proteção contra dessecação contendo melanina e beta
glucanos, que se desenvolvem e produzem os conidióforos, contendo conídios uninucleados
chamados microconídios, ou multinucleados ditos macroconídios, que irão atuar como fontes
14
de inóculos para a próxima safra. Esse comportamento também é observado para os micélios
que sobrevivem no interior dos tecidos do hospedeiro (WILLIAMSON et al., 2007;
LATORRE et al., 2015).
Em condições desfavoráveis são produzidos escleródios que são responsáveis pela
capacidade de resistência do patógeno, permitindo sua sobrevivência, dispersão e
multiplicação (FARETRA; ANTONACCI, 1987). A fase sexuada raramente ocorre, no
entanto, a formação de apotécios e ascósporos ocasionalmente acontece em condições de
laboratório (FARETRA et al., 1988).
Como sintomas, nas folhas observam-se a presença de pequenas manchas necróticas
próximos às nervuras que, em condições de alta umidade, apresentam abundante esporulação
de coloração cinza nos tecidos contaminados na face inferior desses órgãos (LATORRE et al.,
2015).
Os tecidos florais são altamente susceptíveis a esse patógeno por servirem como local
para que aconteça a esporulação, principalmente, no período da primavera. No estigma floral
ou nos primeiros estádios de desenvolvimento das bagas pode ocorrer a infecção, ficando o
patógeno em estado latente e só iniciando seu desenvolvimento na baga, onde são observados
os sintomas do mofo cinzento. Como primeiros sintomas dessa doença verificam-se na base
da baga descoloração avermelhada que progride na direção oposta (McCLELLAN; HEWITT,
1973; KELLER et al., 2003; ZOFFOLI et al., 2009).
Essa infecção também pode ocorrer no momento da colheita, de forma que se observa
a presença de uma pequena e redonda mancha necrótica de coloração marrom avermelhada na
lateral da baga, apresentando uma rachadura. Trata-se de uma forma comum de infecção,
principalmente, em locais que apresentaram chuva próxima ou durante a colheita. Esses
sintomas também podem ser visualizados quando ocorre a infecção do patógeno no tempo de
prateleira (ZOFFOLI et al., 2009).
Quando se observa a infecção nas bagas, inicialmente verifica-se a penetração do
fungo, que não altera os tecidos de proteção desse órgão, ficando em dormência. De acordo
com as condições climáticas, compostas por noites frias e úmidas seguidas de dias
ensolarados, o patógeno se desenvolve e induz a decomposição do epicarpo do fruto,
tornando-o poroso (FOURNIER et al., 2013).
Logo em seguida a essa interação entre o patógeno e o fruto, ocorre a morte dos
tecidos do hospedeiro devido à decomposição enzimática, que permite a ocorrência da
explosão oxidativa que em grande escala promove o progresso da doença, podendo ativar
mecanismos de defesa como as proteínas PR. Assim sendo, observam-se os sintomas da
15
doença, que se caracterizam pelo aparecimento de pequenas manchas, com aspecto
encharcado, com depressão e descolorido com a presença de uma massa de esporos cinza-
esverdeados, caracterizando o aspecto de mofo (GOVRIN; LEVINE, 2000; WILLIAMSON
et al., 2007; DADAKOVA et al., 2015; AMORIM et al., 2016). Essa fase de encharcamento
das bagas benefecia a colonização e a esporulação do patógeno, favorecendo a contaminação
da baga que se encontra mais próxima, permitindo a proliferação da doença no cacho.
Consequentemente ocorrem interferências negativas sobre a qualidade pós-colheita desses
frutos. Por fim, essas bagas se desidratam e mostram-se notavelmente impróprias para a
comercialização (LATORRE et al., 2015).
2.1.4 Controle do míldio e do mofo cinzento da videira
Controle químico 2.1.4.1
Para o controle do míldio são utilizados fungicidas ditos sistêmicos como tiofanato
metílico, benalaxil fosetil e azoxystrobina; fungicidas penetrantes como cymoxanil e
fungicidas imóveis como o hidróxido de cobre, oxicloreto de cobre sozinho ou em associação
com mancozebe, captana, calda bordalesa entre outros (AMORIM et al., 2016).
Dentre esses produtos, a calda bordalesa é um dos mais antigos e eficientes fungicidas
contra essa doença, principalmente, por seu baixo custo de aplicação. Porém esse cúprico
pode causar fitotoxidez nas folhas jovens e elevar os teores de cobre no solo, que em baixas
concentrações é essencial para as plantas, porém em alta pode causar interferir nas raízes das
plantas e alterar a absorção de nutrientes, causando toxicidade ao vegetal que pode se estender
ao homem e animais que consomem os frutos contaminados (ALBARELLO et al., 2013;
AMORIM et al., 2016).
Para o controle do mofo cinzento em uvas pode-se utilizar fungicidas como captana,
clorotalonil, procimidona, mancozebe, iprodiona, tiofanato metílico e pirimetanil (AMORIM
et al., 2016). A aplicação desses produtos é realizada na pré- colheita dos frutos, baseando-se
principalmente como forma de reduzir a densidade do inóculo e infecções antes da colheita.
Porém, somente esse tratamento fitossanitário efetuado a campo não é suficiente para
controlar a doença, necessitando de aplicações de produtos na pós-colheita desses frutos
(CAMILI et al., 2007; DROBY; LACHTER, 2007).
16
Apesar de eficientes, o uso de fungicidas sintéticos no controle de doenças,
principalmente para o míldio e para o mofo cinzento, trazem riscos à saúde humana, impactos
ambientais negativos, desequilíbrio biológico, alteração na ciclagem de nutrientes e da
matéria orgânica, eliminação de organismos benéficos, redução da biodiversidade, acúmulo
de resíduos nos alimentos e seleção de patógenos resistentes às moléculas atuais, tornando
necessárias sempre novas descobertas para a finalidade de controle de fitopatógenos
(BETTIOL; GHINI, 2001; KOMÁREK et al., 2010; PONS et al., 2018).
Dessa forma deve-se ressaltar que como forma de reduzir ou eliminar esses impactos
tem-se buscado medidas alternativas para os produtos químicos. Essas medidas podem
apresentar a capacidade de controlar o patógeno ou induzir a resistência da planta,
prolongando o tempo de prateleira do produto (CAMILI et al., 2007).
Controle alternativo 2.1.4.2
O controle alternativo implica na utilização de técnicas ou produtos que tendem a
reduzir a dependência por produtos químicos. Nessa prática, se aplica o conceito de
agricultura sustentável, que envolve o manejo adequado dos recursos naturais, como forma de
evitar a degradação do ambiente e, também, atender as necessidades humanas atuais e futuras
(BIRD et al., 1990; BETTIOL; GHINI, 2001).
Essa forma de cultivo visa o equilíbrio natural de pragas e doenças, por meio de
práticas promotoras da biodiversidade, rotação de culturas, elevação dos teores de matéria
orgânica do solo, adubação verde, assim como, também, a substituição de produtos sintéticos
por naturais, principalmente, de origem vegetal, que não apresentam toxicidade e sejam
eficazes (TRIPATHI; DUBEY, 2004; SEDIYAMA et al., 2015). Além do mais, devido ao
sinergismo entre seus componentes, a seleção de micro-organismos resistentes é considerada
insignificante (GARCIA et al., 2012).
Esses produtos naturais são sustentáveis devido ao modo de ação e toxicidade reduzida
em comparação aos produtos químicos, pois apresentam melhor decomposição no ambiente
(THAKORE, 2006; NEGA, 2014). Para doenças pós-colheita o emprego desses produtos
tende a ser altamente viável no controle e na redução dos riscos da ingestão de produtos
químicos (ARRUDA et al., 2011).
Dentre essas alternativas para o controle de doenças estão os óleos essenciais que são
extraídos de plantas medicinais. Esses óleos podem agir diretamente sobre os patógenos, por
ação fungicida e/ou fungistática ou podem atuar sobre as plantas hospedeiras induzindo os
17
mecanismos de resistência (MIHALIAK et al., 1991, TRIPATHI; DUBEY, 2004; GARCIA
et al., 2012).
Pereira et al. (2013) reforçam essa idéia de ação direta sobre fitopatógenos
desencadeada por óleos essenciais, pois ao utilizarem esse óleo extraído de Cymbopogon
citratus, na concentração de 1500 µL L-1
, verificaram inibição de 95% do crescimento
micelial de Colletrotrichum musae e C. gloesporioides que atacam o mamão. Maia et al.
(2014) também verificaram que o óleo essêncial de alecrim (Rosmarinus officinalis L.) na
dose de 2000 µL L-1
reduziu em 49% a severidade do míldio da videira e inibiu em 35% a
atividade da enzima catalase, o que indica a indução de resistência nessas plantas.
Além do mais, o uso de óleos essenciais pode apresentar agentes voláteis com
capacidade antimicrobiana que podem ser utilizados no interior de embalagens para a
comercialização de frutas (ZIVANOVIC et al., 2005).
Medeiros et al. (2011) afirmam que o uso de sachês contendo óleos essenciais de
orégano (Origanum vulgaris) e capim-limão (C. citratus) reduzem a presença de fungos
filamentosos e leveduras em sacos de papel utilizados no armazenamento de mangas ‗Tommy
Atkins‘, mantendo as frutas viáveis ao consumo até o sexto dia; também verificaram que
esses tratamentos não interferem nas propriedades físico-químicas desses frutos. Rodriguéz et
al. (2007) ao desenvolverem embalagem de base celulósica contendo 4% de uma mistura de
cinamaldeído, enriquecido com óleo essencial de canela (80-85% p/p) verificaram redução no
crescimento de fungos filamentosos sobre a superfície de frutos de morango refrigerados a
4°C por um período de sete dias.
2.1.4.2.1 Óleos essenciais
Os óleos essenciais são sintetizados pelo metabolismo secundário de plantas
medicinais e aromáticas, com a finalidade de protegê-las contra bactérias, vírus, fungos e
insetos, reduzindo a herbivoria de pragas. São constituídos por compostos voláteis,
substâncias lipofílicas de baixo peso molecular e componentes complexos, que os
caracterizam por apresentarem forte aroma. Geralmente apresentam baixa solubilidade em
água e instabilidade na presença de luz, calor e ar (SIMÕES; SPITZER, 1999; SAITO;
SCRAMIN, 2000; BAKKALI et al., 2008).
Os óleos essenciais podem ser sintetizados por todos os órgãos das plantas, no entanto,
são armazenados em células epidérmicas ou em tricomas glandulares. A extração desses óleos
pode ocorrer a partir de diversos métodos, que variam conforme a necessidade de
18
características específicas do produto desejado e as particularidades de cada óleo. Podendo
ser realizada por meio de arraste d‘água ou hidrodestilação, no entanto, também podem ser
utilizados outros métodos de extração como enfloração (extração de óleos essencial presente
em pétalas de flores), extração por CO2 supercrítico (utilizado na indústria) e por solventes
orgânicos apolares (não apresentam valor comercial) (SILVEIRA et al., 2012).
Independente do método de extração adotado, o conteúdo de óleo essencial extraído é
considerado quantitativamente baixo, inferior a 1% em alguns casos; podendo ser relatadas
algumas exceções, como em de botões florais de cravo, que podem render até 15%
(SERAFINI et al., 2002). A qualidade e a composição estão estreitamente relacionadas com o
clima, composição do solo, órgão da planta utilizado para extração, idade e ciclo que a planta
apresenta (MASOTTI et al., 2003; ANGIONI et al., 2006).
Essa composição pode apresentar de 20 a 60 componentes em variadas concentrações.
Porém, apresentam dois ou três componentes majoritários, que são os responsáveis pelas
propriedades biológicas desencadeadas pelo óleo essencial. Esses componentes abrangem
dois grupos de origem biossintética: os terpenos ou terpenoides como principais, além de
compostos aromáticos (CROTEAU et al., 2000; BETTS, 2001; BOWLES, 2003;
PICHERSKY et al., 2006).
Os hidrocarbonetos são compostos que, quando oxigenados, são denominados
terpenoides. Apresentam um conjunto de moléculas com estrutura baseada em um número
definido de unidades isoprênicas, composto por metil-buta-1,3-dieno, conhecido como
isopreno, contendo cinco carbonos (TONGNUANCHAN; BENJAKUL, 2014). Como
principais tem-se os monoterpenos (C10) compostos por duas unidades de isoprenos e os
sesquiterpenos constituídos por três unidades (C15). Os monoterpenos compõem 90% dos
óleos essenciais e permitem grande variedade de estruturas que são representados por mentol,
citronel, carveol, timol, entre outros. Os sesquiterpenos possuem diversidade em suas
estruturas de acordo com a vasta extensão da cadeia de hidrocarbonetos. As moléculas que
fazem parte desse último grupo descrito são o farnesol, carotol, isabol, cedrol e etc
(BAKKALI et al., 2008).
Os compostos aromáticos são derivados dos fenilpropanoides e são encontrados em
menor frequência que os terpenos. Dentre as moléculas que representam esses compostos
tem-se os eugenois, fenóis, derivados de metoxi, entre outros. As vias de biossíntese de
terpenos e compostos aromáticos ocorrem separadamente nos vegetais, porém em casos raros
podem ocorrer de forma conjunta (BAKKALI et al., 2008).
19
Os óleos essenciais apresentam potencial de atuarem no controle direto de
fitopatógenos fúngicos, e na indução de resistência de plantas alterando seus componentes
estruturais e bioquímicos, de forma que impedem ou reduzem o desenvolvimento de doenças
(AMSTRONG, 2006; MAIA et al., 2014).
A ação direta sobre fungos é decorrente das propriedades lipofílicas dos óleos
essenciais que permitem a penetração em células eucarióticas através da parede celular que
como consequência interrompe o fluxo de elétrons das membranas citoplasmáticas. Com isso,
podem diminuir o potencial da membrana das mitocôndrias e prejudicam os teores de lipídios,
proteínas e ácidos nucléicos das células (ARNAL-SCHNEBELEN et al., 2004). Também
podem interferir nos canais iônicos de cálcio e outros íons, que irão reduzir o gradiente de pH
e a síntese de ATP. Essas alterações resultam na perda de radicais, citocromo C, íons de
cálcio e proteínas, que provocam a morte celular por apoptose e necrose (VERCESI et al.,
1997; YOON et al., 2000; AMSTRONG, 2006).
Além disso, a exposição a esses óleos pode induzir danos no DNA mitocondrial que,
consequentemente, irão ocasionar mutações que alteram a respiração celular e inibem a
expressão de proteínas de transporte de elétrons. Isso resulta-se no acúmulo de espécies
reativas ao oxigênio (EROs) que produzem radicais livres e causam danos nas células, através
da oxidação de lipídios, proteínas e DNA. Quando os microrganismos apresentam fase de
crescimento logarítmico (células em desenvolvimento) mostram-se sensíveis a indução dessas
alterações na mitocôndria (BAKKALI et al., 2005). Também nessas organelas os compostos
fenólicos presentes nos óleos essenciais, são oxidados ao terem contato com as EROs,
principalmente na presença de ferro, cobre, zinco, manganês ou magnésio, o que aumenta o
potencial de danos acarretados nas células (JIMENEZ DEL RIO; VELEZ-PARDO, 2004;
AZMI et al., 2006).
Em microscopia eletrônica de varredura verificou-se que o óleo essencial extraído de
tomilho (Thymus eriocalyx) causou alterações morfológicas em hifas de Aspergilus niger,
devido às mudanças na membrana plasmática e destruição de mitocôndrias. Constatou-se
também redução no crescimento micelial do patógeno em consequência da elevada espessura
da parede celular em razão das modificações nas reações enzimáticas nessa estrutura celular
(RASOOLI et al., 2006). Camele et al. (2012) extraíram os compostos fenólicos carvacrol e
timol a 250 ppm e citral 150 ppm, presentes nos óleos essenciais de Verbena
officinalis (gervão), Thymus vulgaris (tomilho-de-inverno) e Origanum vulgare (orégano),
verificando total inibição do crescimento micelial de Phytophthora citrophtora. Esse fato,
possivelmente está associado com a capacidade dos compostos fenólicos carvacol e timol
20
de alterarem as enzimas quitinase e α-β glucanase presentes na parede celular do fungo
(SOKOVIĆ et al., 2009). Esse efeito do citral pode estar associado com os resultados
verificados por Luo et al. (2002), que observaram que em Aspergillus flavus esse composto
penetra na parede celular, causando danos irreversíveis na membrana plasmática e no
DNA, com consequente redução da germinação de esporos.
Soylu et al. (2010) ao analisarem em microscopia eletrônica de varredura o
comportamento do patógeno Botrytis cinerea, agente causal da podridão cinzenta do tomate,
sob o efeito das doses de 12,8 µg mL-1
em contato direto com o fungo e 0,2 µg mL-1
dos
compostos voláteis dos óleos essenciais de manjerona (Origanum syriacum), levanda
(Lavandula stoechas) e alecrim (Rosmarinus officinalis), verificaram alterações degenerativas
na morfologia de suas hifas, observando visíveis vesículas no interior da parede celular, com
células enroladas em decorrência a ausência de citoplasma ou redução de organelas. Todos
esses fatos resultaram na supressão do crescimento micelial do fitopatógeno com ausência
completa na formação de conídios.
Com relação à ativação de respostas de defesa em plantas contra doenças
desencadeada por óleos essenciais, pode-se estar relacionada com a capacidades que seus
constituintes majoritários apresentam como comportamento elicitor (MAZARO et al., 2008).
Esses elicitores são reconhecidos pelas plantas que identificam os padrões moleculares
associados a patógenos (PMAP) através de receptores presentes na membrana plasmática
ditos como reconhecimento de padrões (RPR), o que resulta em uma imunidade desencadeada
por PMAP (IDP) (LIU et al., 2016). No momento em que ocorre a interação elicitor-receptor,
as proteínas G aumentam a afinidade por trifosfato de guanosina (GTP), substituindo a sua
ligação do difosfato de guanosina (DTP) por GTP. Com isso, ocorre a interação com outras
proteínas da membrana plasmática que atuam como canais de íons, as fosfodiesterases e as
fosfolipases. Como consequência tem-se a formação do complexo: proteína G-receptor-
elicitor-proteínas da membrana, que irão adquirir a capacidade de difundir o sinal, induzindo a
atividade de proteínas intracelulares especificas (BOWLES, 1990; EBRAHIM et al., 2011).
Para que ocorra a transdução de sinal no interior da célula é necessário a fosforilação
das proteínas citoplasmáticas por quinases. Esse fato, leva à estimulação de uma membrana
oxidase envolvida na geração do íon superóxido, iniciando a explosão oxidativa (síntese de
espécies reativas ao oxigênio-EROs), a biossíntese do ácido jasmônico e/ou do etileno,
apoptose celular e indução direta da transcrição genética, resultado na ativação de
mecanismos de defesa na planta (GILL; TUJELA, 2010).
21
Dentre os óleos essenciais que apresentam a capacidade de desencadear essas
características estão o de pitanga (Eugenia uniflora L.), guaçatonga (Casearia sylvestris
Swartz) e melaleuca (Melaleuca alternifolia (Maiden & Betche) Cheel) (MAZARO et al.,
2008; PEZZI, 2014; SOUZA et al., 2015; LUIZ, 2017).
2.1.4.2.1.1 Óleo essencial de Pitanga (Eugenia uniflora)
A Eugenia uniflora L. pertence à família Myrtaceae, é nativa do Brasil, encontrada na
floresta Atlântica e seu cultivo se estende desde o estado de Minas Gerais até o Rio Grande do
Sul. Atualmente é adaptada em várias partes do mundo, principalmente, nas regiões tropicais
e subtropicais. É conhecida popularmente como pitangueira, planta arbustiva que produz
frutos comestíveis que possuem sabor adocicado e adstringente (BRUN; MOSSI, 2007;
COSTA et al., 2013; THAMBI et al., 2013). Suas folhas, no início do desenvolvimento, são
de coloração rosa, que com o passar do tempo ficam verde escura e quando trituradas, exalam
uma fragrância característica de pitanga (MESQUITA et al., 2017).
Dessas folhas é extraído o óleo essencial, caracterizado por aspecto viscoso, com forte
odor e coloração amarela. O rendimento do óleo pode ser de 0,65% com 4 horas de extração,
porém esses valores podem apresentar alterações de acordo com a forma de cultivo da planta,
época de colheita, forma de extração e tipo de solo (BECKER et al., 2017).
Independente da forma de extração e o cultivo dessas plantas, os sesquiterpenos
sempre se destacam como os principais constituintes do óleo essencial (SILVA, 2012).
Apresentam como componentes majoritários o furanodieno (17,9%), espatulenol (10,72%), Z-
cariofileno (9,85%), biciclogermacrene (6,65%), germacrene A (6,59%) e linolool (5,76%).
Também é composto por trans-β-ocimene, cis-β-ocimene, cariofileno, allo-Aromadendrene,
β-copaene, α-muroleno, (+) - δ-cadineno, espatulenol, viridiflorol, isolongifolene, 9,10-
dehydro-, a-epi-cadinol e cis-dihydro-a-copaene-8-ol (THAMBI et al., 2013).
Costa et al. (2000) também ressaltam que o óleo essencial de pitanga apresenta em
maior concentração os sesquiterpenos, representando 60% de seus constituintes, nessa
porcentagem 17,6% são oxigenados, obtendo como composto majoritário o óxido de
cariofileno (5,4%) e 42,4% hidrocarbonetos sesquiterpenoides como beta cariofileno (14,8%)
e alfa humuleno (10,9%). Os monoterpenos representam 28%, sendo 9,6 oxigenados e 18,2%
hidrocarbonetos, dentre esses, observaram que 6,1% corresponde a alfa terpineol, 5,5% ao
limoneno, 5,6% ao alfa uraxena e 3,9% sabineno.
22
Esses compostos e suas respectivas concentrações são responsáveis pela ação
antimicrobiana, principalmente antifúngica do óleo essencial de pitanga. Esse fato ocorre,
principalmente, pela presença de compostos fenólicos, alcaloides e taninos que podem inibir,
principalmente, a proliferação e o desenvolvimento de fungos (AURICCHIO; BACCHI,
2003; RODRIGUES et al., 2010; VICTORIA et al., 2012). Campos et al. (2015) verificaram
que a concentração de 12 µL desse óleo essencial reduziu em aproximadamente 9% o índice
de velocidade de crescimento micelial de Sclerotinia sclerotiorum, agente causal da podridão
branca da haste na soja, deixando clara sua atividade antifúngica.
O óleo essencial pode ser caracterizado também por apresentar potencial para ativação
de rotas metabólicas que induzem a resistência de plantas (MAZARO et al., 2008). Essa
capacidade está relacionada com a sua composição: hidrocarbonetos terpênicos, álcoois
simples e terpênicos, aldeídos, cetonas, fenóis, ésteres, éteres, óxidos, peróxidos, furanos,
ácidos orgânicos, lactonas, cumarinas, até compostos contendo enxofre (DEWICK, 1997).
Esses compostos podem atuar como elicitores, como observado por Mazaro et al. (2008), que
ressaltam que o óleo essencial de pitanga induziu em aproximadamente 80% a fitoalexina
gliceolina em cotilédones de soja, destacando a capacidade desse composto em ativar a
resistência de plantas.
Dessa forma, o óleo essencial pode ser utilizado no desenvolvimento de produtos ou
sua aplicação isolada para exercer sua função antimicrobiana (BECKER et al., 2017) ou
indutora de resistência de plantas contra doenças que acarretam em perdas na produtividade e
qualidade de seus produtos (MAZARO et al., 2008).
2.1.4.2.1.2 Óleo essencial de Guaçatonga (Casearia sylvestris Swartz)
A Cacearia sylvestris Sw. pertence a ordem Malpighiales família Salicaceae,
apresenta ampla distribuição geográfica e em território brasileiro se desenvolve em diversas
florestas e regiões (LORENZI, 1992). É conhecida popularmente como guaçatonga,
guaçatunga, guaçatunga-preta, vaçatunga, vaçatonga, cafezeiro-do-mato, chá-de-frade e pau-
de-lagarto (TININIS et al., 2006).
Essa planta pode apresentar de 4 a 6 metros de altura com tronco de 20 a 30 cm de
diâmetro. Suas folhas são assimétricas, lanceoladas glabas ou ásperas, com glândulas visíveis
por transparência em todo o limbo. As flores possuem coloração esverdeada e seus frutos são
cápsulas septícidas com sementes envolvidas por arilo vermelho (SCAVONE et al., 1979;
LORENZI, 1992).
23
A extração do óleo essencial é realizada nas folhas e pode apresentar rendimento de
0,62% a 1,12% (CASTELLANI et al., 2006). Como principais compostos presentes nesse
óleo estão os terpenos, taninos e sesquiterpenos, que podem apresentar 86,6%, constituídos
por germacrene D ou bicyclogermacrene e β-cariofileno, sendo que como componentes
majoritários mostam-se o α-zingibereno (48,31%) seguido do E- caryophyllene (14,27%),
γ-muurolene (5,16%), viridifloreno (5,07%) e acoradieno (4,11%). Os monoterpenos
também constituem esse óleo, porém representam apenas 4,7% e desses em maior
concentração é de β-pineno (2,0%) (SCHNEIDER et al., 2006; TININIS et al., 2006;
BECKER et al., 2008; SILVA et al., 2008; FERREIRA et al., 2011).
Esses compostos, principalmente o germacreno, podem ocasionar efeito antifúngico,
podendo agir diretamente sobre os fitopatógenos (ALMEIDA, 2005). Pezzi (2014) relatou
que ao utilizar o óleo essencial de guaçatonga na concentração de 2,5%, verificou inibição de
100% no crecimento micelial de Alternaria alternata, Alternaria radicinea, Alternaria
brassicicola e Botrytis sp. Oberlies et al. (2002) e Cruz et al. (2015) também verificaram ação
antimicrobiana de guaçatonga sobre Aspergillus niger e Fusarium oxysporum,
respectivamente.
O óleo essencial de guaçatonga também pode agir como antioxidante das espécies
reativas de oxigênio podendo impedir o desenvolvimento de tumores em animais ou pode
expressar-se como citotóxico sobre células tumorais (BAYALA et al., 2014; FELIPE et al.,
2014).
2.1.4.2.1.3 Óleo essencial de Melaleuca (Melaleuca alternifolia (Maiden & Betche)
Cheel)
A Melaleuca alternifolia (Maiden & Betche) Cheel pertence à ordem Myrtales e
família Myrtaceae. É conhecida internacionalmente como ―Tea Tree‖ (árvore de chá) e sua
origem é na Austrália. É uma planta arbórea com até 33 m de altura, ramificada, a casca é
espessa, podendo corresponder de 15 a 20% do volume do caule. As flores apresentam
estames com cinco feixes opostos, as pétalas, que são brancas, de 3 a 4 mm de comprimento.
Os frutos são cilíndricos, as sementes são assimétricas, castanhas avermelhadas e suas folhas
são simples, estreitas com comprimento de 4 a 12 cm, com coloração verde opaca (LONG;
LAKELA, 1971; GODFREY; WOOTEN, 1981; WOODALL, 1982; CHIANG; WANG,
1984; LANGELAND; BURKS, 1998).
24
Nas folhas ocorre a formação de glândulas responsáveis pela síntese do óleo essencial
dessas plantas. Em folhas imaturas há formação dessas estruturas que continuam a ser
sintetizadas com o decorrer do desenvolvimento desses órgãos, porém param a produção
antes da expansão total da folha, pois nesse período observa-se redução por unidade de área, à
medida que a folha já se encontra expandida (LIST et al., 1995).
O óleo essencial é o principal produto dessas plantas. Em sua região de origem
concentram-se os principais produtores, que fornecem cerca de 400 t ano-1
de planta para
vários países que realizam a comercialização desse óleo essencial. A China também produz,
porém, em menor escala quando considerado a nível mundial. A comercialização desse
produto tem a finalidade de atender a indústria de cosméticos, farmacêutica, de limpeza, entre
outas. Essa grande demanda está relacionada com suas propriedades medicinais, pelo fato de
apresentar ação bactericida e antifúngica contra diversos patógenos humanos, assim, utilizado
em formulações tópicas (RIEDL, 1997; GUSTAFSON et al., 1998; CASTRO et al., 2005).
O óleo essencial apresenta alta concentração de monoterpenos, como o 4-terpineol que
é o componente responsável por suas propriedades medicinais e antimicrobianas (VIEIRA et
al., 2004). A principal via metabólica desse terpeno está relacionada ao ácido mevalônico
(WEBB et al., 2013). Outras substâncias também compõe esse óleo, como cineol (4,22-
4,36%), terpinoleno (1,5-5%), α-terpineno (5-13%), γ-terpineno (30%), α-terpineol (1,5-8%),
limoneno (0,5-4%), sabineno (3,5%), aromadendreno (7%), globulol (3%), viridiflorol (1,5%)
e α-pineno (1-6%) (JESUS et al., 2007).
Efeitos antimicrobianos, principalmente antifúngicos foram observados por Souza et
al. (2015) que verificaram que o óleo essencial de melaleuca na concentração de 1% inibiu em
99% e 20% o crescimento micelial de Cercospora beticola Sacc. e a severidade da
cercosporiose da beterraba, em teste in vivo, respectivamente. Esse efeito também foi
observado por Medice (2007) que verificou redução de 88,6% na severidade da ferrugem
asiática da soja (Phakopsora pachyrhizi), ao testar esse óleo essencial na dose de 0,06%.
Os efeitos do óleo essencial de melaleuca também podem ser observados como
indutores de resistência. Luiz (2017) visualizou, por meio de microscopia de fluorescência, o
acúmulo de compostos fenólicos, considerado um mecanismo bioquímico pré-formado, em
folhas de morangueiro tratadas com uma nanomulsão de óleo essencial de melaleuca a 0,4% e
inoculadas com Xanthomonas fragariae e também redução de aproximadamente 98,8% na
severidade da mancha angular nessas plantas.
2.1.5 Mecanismos de defesa das plantas
25
As plantas estão constantemente sob ameaças de infecções ocasionadas por
fitopatógenos, que apresentam mecanismos variados e moléculas efetoras que tentam garantir
a colonização nesse hospedeiro. Dessa forma, pode-se dizer que há uma batalha entre esses
dois organismos que tentam a sobrevivência, o patógeno projeta seus compostos químicos que
tentam infectar a planta e a planta, por meio de seus mecanismos estruturais e bioquímicos
tenta se proteger (FEYS; PARKER; 2000, BARROS et al., 2010; AMORIM et al., 2011).
A proliferação e o desenvolvimento desses fitopatógenos dependem dos mecanismos
desencadeados pela planta. Quando a resposta é positiva à infecção pelo patógeno, trata-se de
uma planta suscetível, ou seja, apresenta falha ao identificar a presença do patógeno ou em
ativar mecanismos de defesa, o que, consequentemente, fará com que desenvolva a doença.
Caso ocorra o contrário a essas respostas em relação à presença do patógeno, diz-se que a
planta é resistente (DEMPSEY; KLESSIG, 1995).
Dessa forma, as plantas apresentam suas próprias defesas (defesa pré-formada) contra
agentes externos que possivelmente possam afetar de forma negativa o seu crescimento e
desenvolvimento. Esses mecanismos podem atuar como barreiras físicas ou bioquímicas, que
independem da presença de invasores sobre a planta e podem desencadear a produção de
substâncias tóxicas ou não atrativas ao patógeno. Como barreira estrutural, existem as ceras,
cutículas, parede celular espessa, tricomas, adaptações dos estômatos e fibras vasculares.
Como bioquímicas, os compostos fenólicos, alcaloides, glicosídeos, fitotoxinas, inibidores
protéicos e enzimas hidrolíticas (VIEIRA; VALLE, 2006; PASCHOLATI et al., 2008;
ROMEIRO, 2008).
As plantas também apresentam mecanismos que estão comumente em estado latente,
ditos pós-formados, que podem ser ativados por fatores exógenos. Dessa forma, os vegetais
desencadeiam sinais complexos que tentam promover o atraso da penetração do patógeno
(modificações estruturais), como a lignificação, formação de papila, halo, camada de cortiça,
formação de tiloses e deposição de goma; e bioquímicos como o reconhecimento do patógeno
pelo hospedeiro, síntese de fitoalexinas, espécies reativas de oxigênio (EROs) e proteínas
relacionadas à patogênese (PR) (APOSTOL et al., 1989; HEO et al., 1999; PASCHOLATI et
al., 2008; ARAUJO; MENEZES, 2009; BARROS et al., 2010; FAULIN, 2010).
Todos esses mecanismos podem induzir a resistência dita adquirida (SAR) ou induzida
(ISR), dois termos que indicam mecanismos semelhantes, porém com situações distintas. As
plantas, após a exposição a um agente indutor, ativa seus mecanismos de defesa, que podem
ser locais ou sistêmicos. Dessa forma, utiliza-se o termo ―adquirido‖, quando o indutor ou
elicitor que desencadeou essa resposta foi o agente patogênico, que também requer como
26
molécula de sinalização um composto fenólico e ácido salicílico. Correlacionada com o início
dessa indução, as plantas expressam as proteínas relacionadas à patogênese (PR). O termo
―induzido‖ refere-se quando esse agente é benéfico, por exemplo, podendo ser um patógeno
avirulento, alguma molécula ou produto aplicado sobre a planta. Essa indução apresenta como
sinalizadores da rota o ácido jasmônico e o etileno (STICHER et al., 1997; DEMPSEY et al.,
1999; MORRISSEY; OSBOUM, 1999). Porém, para Pieterse et al. (2005) essas rotas podem
se entrecruzar, assim, pode-se dizer apenas indução de resistência.
Outra forma de defesa das plantas é por genes de resistência (R) que são eficientes na
detecção de patógenos específicos pelo reconhecimento de proteínas de avirulência (AVR)
codificadas por esses micro-organismos. Essa resistência está associada à necrose das células
da planta no local da infecção, chamada de reação de hipersensibilidade (HR), desencadeada,
principalmente, por peróxido de hidrogênio (ELLIS; PRYOR, 2000; FEYS; PARKER, 2000).
Mecanismo bioquímico pré-formado: Compostos fenólicos 2.1.5.1
Os tecidos das plantas apresentam substâncias com capacidade antimicrobiana que
estão envolvidas na resistência contra fitopatógenos. Normalmente estão em altas
concentrações mesmo que a planta não esteja em contato com o agressor. Porém, quando
ocorre a infecção, tornam-se altamente tóxicas. Dentre essas substâncias pré-formadas
bioquímicas estão os alcaloides, lactonas, terpenóides e os compostos fenólicos (AMORIM et
al., 2011; SHALABY; BENJAMIN, 2015).
Os compostos fenólicos envolvem um amplo grupo de substância que apresentam anel
aromático contendo hidroxila. São classificados de acordo com o número de fenóis presentes
na célula, podendo ser fenóis simples ou polifenóis. De modo geral, são solúveis em água,
pois ocorrem na forma de glicosídeos e são localizados nos vacúolos celulares (SCHWAN-
ESTRADA et al., 2008; FERREIRA; PINHO, 2012).
A síntese desses compostos é realizada pelos metabolismos primário e secundário das
plantas, ocorrendo pelas vias do ácido chiquímico e fenilpropanóide através da atividade da
enzima fenilalanina amônia-liase (PAL) que utiliza o ácido cinâmico como substrato
(DIXON; PAIVA, 1994).
Dentre esses compostos fenólicos estão os ácidos clorogênico, ácido protocatecóico,
catecol, floridizina e arbutina. O ácido clorogênico é um éster de ácido caféico e de ácido
quínico, que está presente em diversas partes da planta, podendo ser oxidado pela enzima
polifenoloxidase e originar quinonas altamente tóxicas aos fitopatógenos, pois atuam em
27
processos enzimáticos de bactérias e fungos. Esse ácido também pode agir como composto
intermediário no metabolismo de compostos fenólicos insolúveis associados à resistência da
planta, como a lignina. O ácido protocatecóico e o catecol são compostos incolores, solúveis
em água e tóxicos a conídios em fase de germinação. A floridizina e a arbutina são
glicosídeos fenólicos que, pela ação da atividade da polifenoloxidase também são oxidados e
convertidos a ο-quinonas instáveis e fungitóxicas (GOODMAN et al., 1986; SCHWAN-
ESTRADA et al., 2008).
Diante desses fatos, fica claro que as principais funções atribuídas aos compostos
fenólicos são o efeito tóxico direto sobre micro-organismos ou na indução de resistência
estrutural contra esses fitopatógenos e no fortalecimento da parede celular pela deposição de
lignina (ANDREASSON; LAITH, 2017).
Redução de compostos fenólicos foi verificada em feijão infectado por Bacillus
cereaus, devido à lignificação nessas plantas, visto que esses compostos fenólicos são
utilizados como substrato pela enzima peroxidase na síntese de lignina (KUHN;
PASCHOLATI, 2010). Doehlemann et al. (2008) também verificaram aumento da
concentração de ácido hidroxicinâmico livres em folhas de milho infectadas por Ustilago
maydis, comprovando que nessa infecção o patógeno atua na síntese de lignina, tentando
promover sua própria proliferação (TANAKA et al., 2014). Andreasson; Laith (2017) ao
aplicarem extrato de beterraba em plantas de batata relataram aumento da concentração de
compostos fenólicos nas plantas induzindo a resistência. Os autores verificaram redução nas
lesões ocasionadas por Phytophthora infestans e menor produção de esporângios pelo
patógeno.
Mecanismo pós-formado estrutural: lignina 2.1.5.2
Os fatores estruturais pré-formados tem a finalidade de atuarem como barreiras físicas,
impostas pela própria anatomia da planta. Essas estruturas impedem ou retardam a entrada e a
colonização de patógenos nos tecidos vegetais, que, consequentemente, resulta na restrição ou
no impedimento do desenvolvimento de doenças (AMORIM et al., 2011). Dessa forma
destaca-se a parede celular, que comumente está presente nas células vegetais
(MALINOVSKY et al., 2014; MIEDES et al., 2014).
A parede celular é essencial para as células e tecidos vegetais, e de extrema
importância na defesa das plantas. Para que o patógeno consiga infectar o hospedeiro é
necessário que ocorra a degradação dessa estrutura que também apresenta compostos
28
antimicrobianos, que são liberados durante esse processo (VORWERK et al., 2004; CANTU
et al., 2008; HEMATY et al., 2009).
No início do desenvolvimento das plantas, as células são caracterizadas por
apresentarem parede celular primária, constituída basicamente por polímeros de carboidratos,
classificados como celulose, hemicelulose, pectinas e glicoproteínas ricas em hidroxiprolina.
De acordo com o crescimento vegetal e a sua total expansão, a parede celular precisa ser
reforçada, formando-se a parede secundária, composta principalmente por celulose,
hemiceluloses (xilanos) e lignina (CARPITA; MAcCANN, 2000; COSGROVE, 2005;
SARKAR et al., 2009).
A lignina é um polímero fenólico, amórfico, constituído de unidades de fenilpropano
que, em conjunto com a segregação de polissacarídeos de celulose, proporciona maior
resistência mecânica para as células vegetais (ALBERSHEIM et al., 2011). Esse fato ocorre
devido à ativação de mecanismos da planta, dentre esses estão o de manutenção da
integridade da parede celular, que é ativado por patógenos, ferimentos ou estresses bióticos e
abióticos, que resultam na liberação de moléculas de sinalização, ditas padrões moleculares
associados a danos. O reconhecimento de todos esses processos ativa proteínas quinases, que
resultam na lignificação da parede celular (VORWERK et al., 2004; CANTU et al., 2008;
DODDS; RATHJEN, 2010; MACHO; ZIPFEL, 2014; MALINOVSKY et al., 2014).
Para que ocorra a lignificação verifica-se a indução de expressão de genes da via de
fenilpropanoide, que sintetizam os monolignois. Para que esse processo seja realizado é
necessário a atividade de diversas enzimas, como a fenilalanina amônia-liase (PAL).
Transcorrida a síntese, os monolignois são transportados para a parede celular, onde são
oxidados por peroxidases em radicais de monolignol, que por meio de ligações químicas
formam unidades de guaiacil (G) e siringil (S), presentes no polímero de lignina (BOERJAN
et al., 2003; RALPH e tal., 2004; ZHAO; DIXON, 2011).
Com essa deposição de lignina na parede celular impede-se a propagação de enzimas e
toxinas sintetizadas pelo patógeno para a célula hospedeira e da mesma forma, impossibilita a
passagem de água e nutrientes da planta para o invasor, tornando-se limitado o
desenvolvimento do fitopatógeno e induzindo a resistência da planta (SMITH et al., 2007;
BARROS et al., 2010).
Esse fato foi evidenciado por Couto et al. (2009), que sugerem o aumento da síntese
de lignina em plantas de algodão tratadas com acibenzolar-S-metil, pois além da redução da
severidade da murcha do fusário (Fusarium oxysporum f.sp. vasinfectum) verificaram
aumento na atividade da enzima peroxidase que atua na biossíntese de lignina.
29
Porém efeito contrários são observados quando o teor de lignina está reduzido, pois as
plantas ficam mais suscetíveis ao ataque de patógenos, além das modificações na deposição
desse composto na parede celular pode alterar as interações entre a planta e o patógeno
(MIEDES et al., 2014; BENNETT et al., 2015).
Mohr; Cahill (2007) e Quentin et al. (2009) relataram que as infecções ocasionadas
pelas bactérias Pseudomonas syringae pv. tomato e Xantomonas campestres em Arabidopsis,
resultaram no aumento da expressão de genes de síntese e deposição de lignina.
Mecanismos bioquímicos pós-formados 2.1.5.3
2.1.5.3.1 Espécies reativas ao oxigênio
As espécies reativas de oxigênio (EROs) são sintetizadas como subprodutos do
metabolismo aeróbio das plantas, decorrentes aos processos realizados na fotossíntese e na
respiração, no qual o oxigênio molecular (O2) é metabolizado e transformado em água (H2O).
Como principais organelas responsáveis por gerar esses produtos são os cloroplastos, os
peroxissomas e as mitocôndrias, que também apresentam uma eficiente maquinaria
antioxidante. Porém é inevitável alterações na homeostase dessas EROs, quando a planta
passa por períodos de estresse biótico e abiótico e, principalmente, quando ocorre a sua
interação com moléculas elicitoras e com patógenos, que acabam gerando uma explosão
oxidativa (DRAPER, 1997; VRANOVÁ et al., 2002; APEL; HIRT, 2004; FOYER;
NOCTOR, 2005; SINGH; TUTEJA, 2010; LEHMANN et al., 2015).
Para que esse fenômeno aconteça devido à aplicação de moléculas elicitoras ou com a
presença de toxinas fúngicas liberadas por fitopatógenos são necessárias diversas alterações
dos mecanismos celulares. Primeiramente ocorre a sua ligação a receptores de natureza
protéica presentes na membrana plasmática ou no interior da célula vegetal. Em seguida se
inicia alterações no metabolismo celular, como a ativação de proteínas G, aumento do fluxo
de íons na membrana plasmática, atividades de enzimas e síntese de mensageiros secundários.
As proteínas G interagem com o receptor e aumentam a afinidade por guanina trifosfato
(GTP), tornando-a ativa; dessa forma, ocorre a interação com outras proteínas da membrana
celular, principalmente as fosfolipases, fosfodiesterases e como canais de íons. A abertura
desses canais altera o potencial trans-membrana e ocasiona alcalinização extracelular, devido
à entrada de íons H+
e Ca2+
e a saída de K+
e Cl-. Com a entrada de Ca
2+ ocorre a ativação
30
desses EROs que podem agir diretamente na defesa ou sinalizar outras reações (DIXON et
al., 1994; LEITE et al., 1997; CAVALCANTI et al., 2005).
Esses mecanismos modificam o estado funcional do oxigênio molecular (O2),
ocorrendo a inversão do giro dos elétrons não pareados que forma o oxigênio singleto (1O2),
que irá originar várias formas de moléculas reduzidas e quimicamente reativas (VRANOVÁ
et al., 2002). O oxigênio singleto (1O2) sofre ação de enzimas e é convertido em radical
superóxido (O2-) e, em seguida, em peróxido de hidrogênio (H2O2) e radical hidroxila (OH
-)
(WOJTASZEK, 1997; HANCOCK et al., 2001).
Os EROs podem apresentar diferentes funções nas plantas, podendo serem expressos
como fatores prejudiciais, protetores ou sinalizadores. Esses fatos dependem do equilíbrio de
síntese e da atividade de enzimas antioxidantes. Dessa forma, essas moléculas podem
danificar as células da planta, ocorrendo a peroxidação de lipídios; pode proteger quando
ocorre a reação de hipersensibilidade (HR), ou seja, a morte celular no local onde ocorreu a
infecção por patógenos, assim como também podem fortalecer a parede celular das plantas e
regular diversos caminhos de sinalização hormonal. Quando se expressam como sinalizadores
pode ocorrer à expressão gênica de genes de defesa da planta, de forma que podem interagir
em conjunto com outras moléculas sinalizadoras como o ácido salicílico (AS) e o óxido
nítrico (NO) (GRATAO et al., 2005; TORRES et al., 2006; GILL; TUTEJA, 2010).
2.1.5.3.1.1 Peróxido de hidrogênio (H2O2)
O peróxido de hidrogênio se destaca como substrato para os EROs por ser uma
molécula estável, ausente de carga, moderadamente reativa e com meia-vida considerada
longa (1ms). Essas características permitem atuação em processos fisiológicos, como
senescência, fotorrespiração, fotossíntese, movimento estomático e ciclo celular. Porém,
evidencia-se a capacidade dessa molécula em desencadear efeitos de indução de resistência
das plantas (NOCTOR; FOYER, 1998; MITTLER et al., 2004; BHATTACHRJEE, 2005;
SOARES; MACHADO, 2007).
Na indução de resistência contra fitopatógenos, o peróxido de hidrogênio atua na
síntese de fitoalexina e no reforço da parede celular, aumentando as interligações com
hidroxiprolina e glicoproteínas ricas em prolina à matriz de polissacarídeos ou intensifica a
síntese de lignina pela atividade da peroxidase. Atua também como sinalizador, tanto para a
ativação de genes de resistência, quanto para se comunicar com células vizinhas e restringir o
desenvolvimento do patógeno, podendo ocorrer à reação de hipersensibilidade, ou seja, morte
31
celular; pode também agir diretamente sobre o invasor apresentando alta toxicidade, tentando
eliminá-lo. Esses fatores são a resposta da indução de resistência adquirida (SAR) e são
emitidos no local da lesão e de forma sistêmica na planta (DEMPSY; KLESSIG, 1995;
RESENDE et al., 2003; QUAN et al., 2008).
Salienta-se que o peróxido de hidrogênio também apresenta a capacidade de ser
ativado por determinado estresse oxidativo, por exemplo, com a aplicação de um determinado
elicitor e, desencadeando resistência a determinado patógeno quando iniciar a infecção
(NEILL et al., 2002). Todos os efeitos evidenciados dessa molécula dependem da sua
concentração, do local de síntese, do estádio de desenvolvimento da planta e das exposições
anteriores a diferentes estresses (PETROV; VAN BREUSEGEM, 2012).
Arabidopsis thaliana é utilizada como modelo para estudos sobre o peróxido de
hidrogênio na sinalização da interação de plantas com patógenos. Há relatos que com a
aplicação de elicitores e de agente patogênicos ocorre a síntese dessa molécula e também
sinalização na indução de expressão de genes de defesa das plantas (DESIKAN et al., 1996,
DESIKAN et al., 1998; CLARKE et al., 2000).
Plantas de feijoeiro apresentaram aumento na concentração de peróxido de hidrogênio
duas horas após a aplicação de extrato de néctar floral e que, decorridas 24 horas redução de
infecção pela bactéria Pseudomonas syringae (DURAN-FLORES; HEIL, 2014). Asselbergh
et al. (2007) verificaram aumento na concentração dessa molécula em plantas de tomate
suscetíveis a Botrytis cinerea, favorecendo a infecção, pois esse patógeno é necrotrófico e se
desenvolve na região da reação de hipersensibilidade; porém, em plantas resistentes esse caso
não foi verificado, pois o peróxido de hidrogênio disponível na célula ativou genes de
resistência da planta.
Em plantas de bananeiras resistentes e infectadas por Mycospharella fijiensis, agente
causal do mofo da banana, apresentam maior teor de peróxido de hidrogênio em relação às
suscetíveis deixando clara a importância dessa molécula na sinalização e ativação dos
mecanismos de defesa das plantas (FERNANDES; VIEIRA JÚNIOR, 2011).
Com relação ao efeito tóxico do peróxido de hidrogênio sobre micror-organismos,
Joseph et al. (1998) relataram redução no desenvolvimento de Pseudomonas abelmoschi (Ell
& Ev.) em plantas de Hibiscus esculentus L. e Vigna sinensis ssp. na presença de 0,003x105
M de H2O2. Esse fato também foi verificado por Beltraán-Garcia et al. (2009) que ressaltaram
total inibição do crescimento micelial de Mycosphaerella fijiensis (patógeno que infecta a raiz
da bananeira), em contato com 30 m mol L-1
dessa molécula por um período de 120 minutos.
32
Diante desses fatos, as plantas apresentam mecanismos que regulam a concentração de
EROs, que em excesso acarretam em danos às células como a peroxidação de lipídios
(JAMBUNATHAN, 2010). Dessa forma, observam-se as atividades das enzimas
antioxidantes que permitem uma homeostase do sistema celular, como a superóxido
dismutase (SOD), catalase (CAT), peroxidase (POD) e polifenoloxidase (PPO) (BARBOSA
et al., 2014).
2.1.5.3.1.2 Superóxido Dismutase (SOD E.C. 1.15.1.1)
As SODs são metalo-enzimas extremamente fundamentais na evolução dos seres vivos
devido à proteção contra o superóxido. São as primeiras defesas da planta ativadas contra os
EROs, catalizando a dismutação dos radicais de O2-, gerando H2O2 e O2, nos cloroplastos,
mitocôndrias, citosol e nos peroxissomos. Essa ação dessas enzimas reduzem o risco de
formar radicais hidroxilas (OH-) altamente tóxicos para as células vegetais (MITTLER, 2002;
BRATTACHARJEE, 2010; MILER, 2012).
Essas enzimas podem realizar ligações com metais, o que as classifica de acordo com
esses cofatores metálicos. Podem estar ligadas ao cobre e ao zinco (Cu/Zn-SOD),
encontradas, principalmente, no citosol e no estroma dos cloroplastos; ao manganês (Mn-
SOD), presentes na matriz mitocondrial e ao ferro (Fe-SOD) localizadas também no estroma
dos cloroplastos. As variações dessas izoenzimas dependem de cada planta e também da
quantidade presente nas células (BOWLER et al., 1992; GILL; TUJETA, 2010).
As SODs são altamente estáveis e apresentam como principal função realizar a
catalização da dismutação do superóxido (O2-) em oxigênio (O2) e peróxido de hidrogênio
(H2O2), em uma velocidade 1010
vezes maior que a reação espontânea (RESENDE et al.,
2003; MIAO; CLAIR, 2009). Estudo recente revela que a SOD presente no núcleo celular
regula a expressão de vários genes de respostas oxidativas, conhecidos por fornecer
resistência ao estresse da oxidação e de replicação e reparo aos danos ocorridos no DNA. Essa
pesquisa ressalta que a SOD também apresenta a importante função como fator de transcrição
nuclear para controlar a resposta geral ao estresse oxidativo (TSANG et al., 2014).
A atividade da SOD está estreitamente relacionada com a indução de resistência das
plantas. Esse fato foi comprovado por Sellamuth et al. (2013) ao verificarem que a aplicação
de 66,7 μL L-1
de óleo de tomilho em frutos de abacate induziu a atividade dessa enzima no
quarto dia após a inoculação de Colletotrichum gloeosporioides, agente da antracnose, em
relação ao tratamento testemunha. Os autores ressaltam o fato desse óleo reduzir em
33
aproximadamente 92% a antracnose nos frutos, correlacionando o efeito elicitor ativando
respostas de defesa e antioxidante dos frutos, obtendo como consequência redução da doença.
Morangos infectados por fungo Mycosphaerella fragariae (micosferela), também
apresentaram aumento no nível de concentração da SOD no segundo dia após a inoculação do
fitopatógeno, em relação ao tratamento testemunha. Dessa forma, essa elevação na atividade
da enzima está relacionada com o nível de produção de O2- resultado da infecção, presentes
principalmente em materiais resistentes a essa doença (EHSANI-MOGHADDAM et al.,
2006).
2.1.5.3.1.3 Catalase (CAT E.C. 1.11.1.6)
A catalase é uma enzima que contém grupo heme tetramérica e é considerada
indispensável na catalisação da dismutação direta do peróxido de hidrogênio em oxigênio e
água. De acordo com a expressão gênica de plantas de tabaco essas enzimas são classificadas
em três classes: I as que são expressas em tecidos fotossintéticos e são reguladas pela luz; II
estão em maiores níveis nos tecidos vasculares; e III são abundantes em sementes e mudas
jovens de plantas, devido a sua atividade ser importante na remoção do H2O2 sintetizado
durante a degradação do ácido graxo (WILLIKENS et al., 1995).
O mecanismo de ação antioxidante é mediado por um resíduo de histidina e de
asparagina, que permitem a entrada do peróxido de hidrogênio no sítio ativo da CAT. Com
isso, ocorre a transferência de um dos átomos de hidrogênio do H2O2 a partir de um átomo de
oxigênio para o outro, que ocorre a polimerização e extensão a uma ligação O-O.
Posteriormente, essa ligação tem uma cisão heterolítica e forma a molécula de água. O outro
átomo de oxigênio combina-se com o ferro (Fe) do grupo heme da enzima e forma Fe (IV)
=O, que reage com uma segunda molécula de H2O2, removendo um O2, retornando o Fe ao
estado de oxidação inicial da enzima (Fe (III)) (DOUNCE, 1983; SWITALA; LOEWEN,
2002; KATO et al., 2004; ZAMÓCHÚ et al., 2008; ALFONSO-PRIETO, 2009).
Dessa forma, essa enzima é a principal via de degradação do H2O2; portanto, a
inibição da CAT resulta no acúmulo dessa molécula, que atua no mensageiro secundário na
indução de genes relacionados à patogênese. Ocorre a ativação da indução de resistência
adquirida, principalmente, quando há infecção por fitopatógenos fungicos nas plantas, pois
essa molécula inibe o crescimento do fungo na área infectada (CHEN et al., 1993;
GAYATRIDEVI et al., 2012).
34
Esse fato foi verificado por Maia et al. (2014) que observaram que o óleo essencial de
alecrim (Rosmarinus officinalis) nas concentrações de 1000 e 2000 µL L-1
, reduz a atividade
da enzima catalase o que, consequentemente, resultou na inibição de 35 e 33% na severidade
da mancha das folhas (Pseudocercospora vitis) em plantas de videira ‗Isabel‘. Segundo
Torres et al. (2006) essa inibição da catalase, possivelmente, está relacionada com o acúmulo
de peróxido de hidrogênio, o que, aumenta a produção de EROs e reduzem a severidade de
doenças em plantas.
2.1.5.3.1.4 Peroxidase (POD E.C. 1.11.1.7)
As peroxidases são glicoproteínas com massa molecular de aproximadamente 40 kDa;
também são hemoproteínas que apresentam múltiplos genes responsáveis por sua síntese, pois
são enzimas importantes durante todo o ciclo das plantas (PASSARDI et al., 2004).
Essas enzimas são divididas em três classes, as das classes I e II são intracelulares e as
da classe III são agregadas na parede celular ou no meio circundante. Todas consistem em
uma ferriprotoporfirina IX como grupo protético e dez hélices α, e as de classe III
adicionalmente possuem mais três hélices α extras, quatro pontes dissulfeto e alguns
aminoácidos altamente conservados como arginina distal e histidina, que são essenciais para
que aconteça a atividade catalítica da enzima envolvendo trocas de elétrons e protóns
(WELINDER, 1992; SCHULLER et al., 1996).
As PODs apresentam diversidade de oxidar substratos, o que destaca sua importância
em ampla gama de processos fisiológicos. Esse destaque está relacionado com a catalização
da redução do H2O2, na qual utilizam diversas moléculas doadoras, como auxinas,
metabólitos secundários, compostos fenólicos, realizando sua oxidação em resposta a
infecções ocasionadas por patógenos; alongamento e reticulação da parede celular,
precursores de lignina o que caracteriza sua importância na defesa das plantas contra
fitopatógenos (FRY, 1986; CONVERSO; FERNANDEZ, 1995; HIRAGA et al., 2001).
Essa defesa está relacionada com a formação da parede celular secundária, que
envolve a reticulação de monômeros fenólicos pela oxidação do guaiacol, do ácido e do álcool
hidroxicinâmico, que originam as subunidades de suberina e lignina, respectivamente. A POD
oxida o H2O2 e gera radicais de monolignol fenoxi que se pareiam espontaneamente e formam
polímeros de ligninas que são depositados na parece celular (HIRAGA et al., 2001; BLEE et
al., 2003).
35
O fortalecimento da parede celular também pode ocorrer quando a POD oxida
domínios fenólicos e resíduos de tirosina de proteínas estruturais da parede, como
glicoproteínas ricas em hidroxiprolina. Essas macromoléculas sofrem ligações cruzadas,
reforçando as ligações e formando moléculas maiores e mais complexas que são depositadas
na superfície extracelular. Dessa forma, restringe-se a invasão de patógenos atuando na
resistência da planta contra infecções e como mediadores da síntese de EROs, que podem agir
como antimicrobianos. Dessa forma, a ativação dessas enzimas ocorre quando a membrana
plasmática das células apresenta danos, causados por ruptura mecânica ou por ação de
enzimas preoteolíticas (FRY, 1986; WOJTASZEK, 1997; KAWANO; MUTO, 2000;
HIRAGA et al., 2001; SCHWAN-ESTRADA et al., 2008).
Esses fatos podem ser comprovados pelos resultados obtidos por Andrade et al. (2013)
que verificaram que plantas de tomateiro infectadas por Pseudomonas syrungae pv. tomato,
agente da pinta bacteriana, e tratadas por ácido jasmônico induziram a atividade da POD em
seis e 12 dias após a inoculação do patógeno, o que resultou em redução de 28% da doença
nessas plantas. Nagdze et al. (2012) ressaltaram que o aumento da atividade dessa enzima
confere a resistência de batatas à podridão mole ocasionada por Pectobacterium atrosepticum,
P. carotovorum subsp. brasiliensis e Dickeya spp.
2.1.5.3.1.5 Peroxidação lipídica
Os EROs, além de apresentar efeitos contra fitopatógenos, também podem apresentar
ação citotóxica contra a própria planta, quando os sistemas enzimáticos antioxidantes não se
mostram efetivos, como a supressão da atividade das enzimas superóxido dismutase, catalase
e peroxidase. Esses danos celulares são decorrentes da oxidação dos componentes celulares
como tióis, cofatores enzimáticos, proteína, nucleotídeos, lipídios, ácidos graxos
poliinsatutados. Todos esses processos são avaliados como indicador ao estresse oxidativo
celular, dito peroxidação lipídica (SCANDALIOS, 1994; GILLER; SIGLER, 1995;
ROMERO et al., 1998; LIMA; ABDALLA, 2001).
Esse processo apresenta três estádios designados como início, propagação e término,
que envolvem reações que excluem com átomos de hidrogênios e, em seguida, podem incluir
radicais como hidroxila (OH-), alcoxil (RO
-), peroxil (ROO
-) e, possivelmente o HO2
(dioxidamide) (GUTTERIDGE, 1995; CATALÁ, 2006).
Esse procedimento tende a ocorrer na membrana plasmática devido a sua composição
por fosfolipídios contendo principalmente ácidos graxos poli-insaturados. Essas moléculas
36
são altamente suscetíveis à peroxidação, devido à remoção do átomo de hidrogênio de um
grupo metileno (-CH2-) formando CH-. Esse procedimento é facilitado pelo enfraquecimento
das ligações C-H no carbono próximo de uma dupla ligação no ácido graxo. Essa reação
inicial de OH- com os ácidos graxos poli-insaturados produz um radical lipídico (L
-), que
reage com o oxigênio molecular e origina o radical peroxílico lipídico (LOO-), que
consequentemente reage com o ácido graxo adjacente produzindo o hidroperóxido lipídico
(LOOH) (CATALÁ, 2006). O LOOH pode ser reduzido por metais como o ferro que irá
sintetizar o radical alcoxilo lipídico (LO-). Tanto o LO
- quanto o LOO
- podem estimular a
reação em cadeia da peroxidação lipídica, abstraindo átomos de hidrogênios (BUETTNER,
1993).
Esse processo interfere na estrutura física da membrana plasmática, ocasionando
mudanças na sua fluidez e permeabilidade a diferentes solutos, alterações no transporte de
íons e inibição de processos metabólicos (CATALÁ, 2009). Esses efeitos são decorrentes a
ausência ou baixa atividade de enzimas antioxidantes, fato relatado por Kazemi et al. (2010)
que observaram que o aumento da atividade das enzimas catalase, peroxidase de guaiacol e de
ascorbato reduzem a peroxidação lipídica em plantas de canola, tratadas com ácido salicílico e
óxido nítrico.
2.1.5.3.1.6 Polifenoloxidase (PPO E.C. 1.10.3.2)
As polifenoloxidases são enzimas que possuem centro dinuclear de cobre que se
encontra ligado por seis ou sete resíduos de histidina e apenas uma altamente conservada de
cisteína. A maioria das PPOs permanecem inativas intracelularmente e compartimentalizadas
dentro dos tilacoides dos cloroplastos e nos vacúolos e uma pequena parte pode ser
encontrada na região extracelular da parede (VAUGHN et al., 1988).
Essa enzima apresenta a capacidade de inserir o oxigênio em uma posição orto- a um
grupo hidroxila existente em um anel aromático, o que, na sequencia realiza a oxidação de
difenol em uma quinona correspondente, que ao passarem por polimerização não enzimáticas
com aminoácidos ou proteínas, formam pigmentos de coloração marrom, vermelho e preto,
que são os responsáveis pelo escurecimento dos tecidos (UNDERHILL; CRITCHLEY, 1995;
MAYER, 2006).
Para analisar a atividade dessa enzima são utilizados composto fenólicos que derivam
do catecol. Dessa forma, permite-se verificar as funções dessa enzima, como o seu
envolvimento na cicatrização de ferimentos, no controle dos níveis de oxigênio nos
37
cloroplastos e na defesa das plantas contra fitopatógenos (COSTABEL et al., 1995;
SAMMERVIR; SOMMERHALTER, 2015).
Essas quinonas apresentam comportamento extremamente tóxico aos micro-
organismos, mostrando-se melhores que os compostos fenólicos originais. Quinonas limitam
o desenvolvimento de fitopatógenos nos sítios de infecção por acelerar a taxa de morte celular
localizada ou gerar um ambiente tóxico ao invasor, inibindo assim, o seu desenvolvimento
(PETER, 1989). Podem reduzir a biodisponibilidade de proteínas para o patógeno
desencadeando a formação de barreiras fenólicas na parede celular (LI; STEFFENS, 2002).
Dessa forma, pode-se dizer que o aumento da atividade da PPO resulta em altas concentrações
de produtos tóxicos de oxidação, o que confere elevado grau de resistência à infecção
(AGRIOS, 2005; ZHENG-CUIMING et al., 1999).
Latha et al. (2009) observaram máxima atividade dessa enzima em plantas de tomate
tratadas com extrato de Zimmu sp. e infectadas por Alternaria solani, e, com isso, redução de
aproximadamente 69% do índice da pinta preta. Pereira et al. (2008) também observaram
aumento na atividade de PPO em 72 horas após a aplicação de ASM e filtrado do micélio de
Rhizophus sp., o que resultou na redução da murcha-de-verticilio do cacaueiro (Verticillium
dahliae).
2.1.5.3.1.7 Fenilalanina amônia-liase (PAL E.C. 4.3.1.5)
A fenilalanina amônia-liase é uma enzima do metabolismo secundário das plantas e
está relacionada às reações que ocorrem com os compostos fenólicos. Essa proteína
secundária contém cofator de 4-metildieno-imidazol-5-ona (MIO) no seu sitio ativo para
catálise, uma hélice com dois segmentos estruturais adicionais como uma extensão móvel N-
terminal, que possivelmente ancora a enzima com outros componentes celulares estando
presente no seu centro ativo um domínio de blindagem que provavelmente controla a sua
atividade (CALABRESE et al., 2004; RITTER; SCHULZ, 2004; ZHANG; LIU, 2014).
É uma enzima que apresenta massa molecular entre 306 e 330 kDa, constituída por
quatro subunidades com massas moleculares de aproximadamente 83 kDa. Comumente são
encontradas nos cloroplastos, principalmente, nas membranas dos tilacoídes, embora não
apresente atividade em cloroplastos de células do mesofilo (SCHWAN-ESTRADA et al.,
2008).
Trata-se de uma enzima proveniente da rota dos fenilpropanoides, que absorve cerca
de 30-40% do carbono orgânico biosférico e acaba fazendo parte de polímeros de lignina
38
predominantes nas paredes celulares. A PAL é a enzima que inicia essa rota, sendo
responsável pela desaminação do aminoácido L-fenilalanina e consequentemente, resultando
na sua transformação em ácido trans-cinâmico e amônia (SCHWAN-ESTRADA et al., 2008;
ZHANG; LIU, 2014).
Essa rota apresenta uma via central na qual o aminoácido sofre a ação das enzimas
PAL, 4-hidroxilase de cinamato (C4H) e 4-cumarato ligase de coenzima A (4CL) originando
o ácido hidroxicinâmico, que será utilizado na segunda via, dita de ramificação específica.
Como resultado obtém-se a síntese de monolignois que serão utilizados na deposição de
ligninas na parede celular, cumarinas, ácidos benzoicos, estirbenos, flavonoides e
isoflavonoides. Esse fato é reforçado por Wang et al. (2014) que ressaltam ser a PAL de
extrema importância na síntese de ligninas, pois está relacionada com a via biosintética de
monolignol. Essa afirmação está de acordo com os resultados obtidos por Cass et al. (2015)
que observaram que a redução na atividade da PAL, consequentemente, reduz a deposição de
lignina, o que acarreta plantas mais susceptíveis a patógenos fúngicos.
Mazaro et al. (2015) relatam ativação da PAL em acerola após 48 horas de aplicação
do ácido salicílico, o que resultou na melhor qualidade pós colheita desses frutos, retardando a
sua maturação e redução da incidência de podridões. Fato similar foi observado por Borsatti
et al. (2015), ao utilizarem esse mesmo tratamento em amoras-pretas verificando alterações
na rota dos fenilpropanóides, devido à atividade da PAL e de compostos do metabolismo
secundário desses frutos.
Proteínas relacionadas à patogenicidade 2.1.5.4
As proteínas relacionadas à patogenicidade, também ditas proteínas-PRs, são ácidas,
de baixo peso molecular, solúveis em ácidos e resistentes a proteases. O comportamento
dessas proteínas está relacionado com a sua localização, que pode ser no meio extracelular,
aquelas que atuam diretamente sobre o patógeno no local da infecção ou as que estão
pressentes nos vacúolos e exercem efeito de defesa após a descompartimentalização das
células (STICHER et al., 1997).
As proteínas-PRs possuem um peptídeo-sinal na região N-terminal, responsável pela
translocação através da membrana do retículo endoplasmático para o vacúolo ou para o
espaço intercelular (BOL et al., 1990). São proteínas com tamanhos moleculares que variam
de 5 a 75 kDa e que apresentam características físico-químicas específicas adaptadas aos seus
locais de ações e de confinamentos (SELS et al., 2008).
39
Essas proteínas são relativamente resistentes à ação proteolítica de proteases
endógenas e das enzimas exógenas tripsina, quimiotripsina, papina, pronase e proteinase K.
Consequentemente, permanecem ativas após a descompartimentalização das células, devido à
plasmólise dos vacúolos e lisossomos durante a reação de hipersensibilidade, necrosamento
celular ou injúria, quando são liberadas para os espaços intercelulares, que apresentam pH e
proteases ácidas (PIERPONT et al., 1981; VAN LOON, 1982; ANTONIW; WHITE, 1983;
MARTINS, 2008).
As proteínas-PRs são ativadas nas plantas em algumas situações patológicas ou em
casos correlacionados. Dentre esses eventos estão o ataque de parasitas como insetos
fitófagos, nematoides e herbívoros; as interações compatíveis de plantas susceptíveis a
patógenos com virulência; de plantas resistentes a patógenos avirulentos; ou plantas
incompatíveis que não atuam como hospedeiras com micro-organismos não patogênicos
(MARTINS, 2008)
Como essas PRs abrangem várias proteínas, Van Look et al. (2006) propuseram uma
classificação dividindo-as em famílias que vão de PR-1 a PR-17. Estando na ordem de:
antifúngicas; β-1,3-glucanase; quitinase tipo I, II, IV, V, VI, VII; quitinase tipo I, II;
taumatina; inibidor de proteinase; endoproteinase; quitinase tipo III; peroxidase; ribonuclease;
quitinase tipo I; defensina; tionina; proteína de transferência de lipídios, oxalato oxidase
(germinação); oxalato oxidase e proteínas não identificadas. Dentre essas proteínas destacam-
se as PR-2 que correspondem as β-1,3 glucanases e as PR-11 que englobam as quitinases,
devido as suas contribuições para alterações da integridade dos patógenos (VAN LOON et al.,
2006; DELAUNOIS et al., 2014).
2.1.5.4.1 β-1,3-Glucanase (GLU E.C. 3.2.1.6)
As glucanases (GLU) ou β-1,3-glucanases apresentam tamanhos de 30-40 kDa, com
isoformas ácidas e básicas. Essas enzimas são classificadas em duas classes principais a I e a
II, sendo que a sua maioria estão na classe I, que são básicas e estão localizadas no vacúolo
celular e as demais são ácidas e são secretadas no espaço extracelular. As GLU de classe I são
caracterizadas por conter um peptídio N-terminal e uma sequência final C-terminal curta com
glicolilato, que é comumente referida como uma extensão responsável pela localização dessas
enzimas, as outras são desprovidas dessas sequências e, dessa forma, estão no meio
extracelular (WESSELS; SIETSMA, 1981; HAM et al., 1991; MAUCH; STAEHELIN, 1989;
40
LINTHORST, 1991; CORDERO et al., 1994; SIMMONS, 1994; KLARRZYNSKI et al.,
2000)
Essas enzimas podem atuar na fisiologia das plantas, em processos como divisão e
alongamento celular, amadurecimento de frutos, germinação do pólen e do tubo polínico,
fertilização, embriogênese somática, germinação de sementes e indução à resistência das
plantas (HESLOP-HARRISON, 1964; MASUDA; WADA, 1967; ROGGEN;
STANLEY1969; HEYN, 1976; HINTON; PRESSEY, 1980; NEALE. et al. 1990; ORI et al.,
1990; MEIKLE et al., 1991; YIM, 1998; HELLEBOID et al., 2000; MOROHASHI;
MITSUSHIMA, 2000; BUCHNER et al., 2002; AKIYAMA et al., 2004).
Esta indução está relacionada com a capacidade que essas enzimas apresentam de
catalisar a clivagem das ligações β-1,3-glucosídicas em β-1,3-glucano, sendo que essa última
molécula é considerada um dos principais componentes das paredes celulares de vários
fungos fitopatogênicos. Dessa forma, as GLU são de extrema importância nos mecanismos de
defesas das plantas, pois apresentam capacidade de hidrolisar as paredes fúngicas. Podem
apresentar efeito indireto na resistência das plantas, atuando como elicitores de
oligossacarídeos, que provocam a síntese de outras proteínas PRs ou antifúngicos de baixo
peso molecular como as fitoalexinas (KEEN; YOSHIKAWA, 1983; KAUFFMANN et al.,
1987; HAM et al., 1991; LINTHORST, 1991; CORDERO et al., 1994; GARFOOT et al.,
2017).
Essa sinalização pode ser devido à presença de β-1,3- glicóis, o que explicaria
resultados de indução de reações de defesa em plantas de tabaco (KLARZYNSKI et al.,
2000), de Arabidopsis (MÉNARD et al., 2004) e de videira (AZIZ et al., 2003, 2007)
promovendo resistência a fitopatógenos. Deve-se também mencionar que essas enzimas
podem remodelar a parede celular do hospedeiro, reforçando-a contra a infecção
(MARTINEZ-ESTESO et al., 2009).
Tavares et al. (2009) relataram que o aumento da atividade de GLU em plantas de
mamoeiro tratadas com ASM, apresentavam redução da podridão de raiz (Phytophythora
palmivora) dessas plantas. Bertoncelli Júnior et al. (2016) também observaram que o aumento
da atividade dessa enzima em plantas de beterraba tratadas com ácido salicílico, reduziu o
tombamento das plantas ocasionado por Fusarium sp..
41
2.1.5.4.2 Quitinase (E.C. 3.2.1.14)
As quitinases são classificadas em duas categorias, as endoquitinases e as
exoquitinases. As primeiras apresentam multímeros solúveis de baixo peso molecular de N-
acetilglucosamina, tais como quitotrose, quitotetraose e o dímero de di-acetilquitibioses. As
exoquitinases são divididas em duas subclasses, as quitobioses, que catalisam a liberação de
di-acetilquitobiose da extremidade da microfibrila de quitina e a β-1,4-N-
acetilglucoseaminidase, que realiza a clivagem de produtos oligômeros de endoquitinases e
quitobiosidases com a síntese de monômeros de N-acetilglucosamina (COHEN-KUPIEC;
CHET, 1998; EBRAHIM et al., 2011).
Essas enzimas são classificadas em sete classes de acordo com as suas estruturas
primárias. As de classe I apresentam domínio de ligação de quitina rico em cisteína e são
subdivididas em Ia e Ib, que incluem as quitinases ácidas e alcalinas, respectivamente. As de
classe II são encontradas em fungos e bactérias e apresentam propriedades ácidas. As de
classe III apresentam lisozima e sua atividade está mais relacionada com as quitinases de
bactérias. As classes de IV à VII estão relacionadas à patogênese (TSUKAMOTO et al.,
1984; YEH et al., 2000; SHIH et al., 2001; SUAREZ et al., 2001)
Essas quitinases são enzimas que catalisam a clivagem de ligação entre os carbonos 1
e 4 de dois monômeros de acetil-D-glucosamina de quitina. São amplamente distribuídas na
natureza, podendo ser encontradas na parede celular de fungos e plantas e, também, nos
vacúolos e no meio extracelular. As que são encontradas nas plantas apresentam a capacidade
de degradar a quitina presente em fungos e podem bloquear o crescimento de hifas, podendo
apresentar atividade antimicrobiana (SCHLUMBAUM et al., 1986; BROEKAERT et al.,
1988; BARBER et al., 1989; NEUHAUS et al., 1996; VAN LOON, 2006).
As quitinases não apresentam nenhuma função fisiológica nas plantas, porém
juntamente com as glucanases, desencadeiam o sistema de defesa contra fitopatógenos
fúngicos (ABELES et al., 1970; PEGG, 1988; MAUCH; STAEHELIN, 1989). O aumento da
atividade da quitinase em plantas de eucalipto tratadas com ASM resulta na redução da
severidade da ferrugem ocasionada por Puccinia psidii (BOAVA et al., 2010). Gouvea et al.
(2009) também relataram que a elevada atividade dessa enzima em frutos de mamão tratados
com ASM reduziu o mofo cinzento (B. cinerea).
42
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67
CAPITULO I: ÓLEOS ESSENCIAIS NO CONTROLE DE MILDIO E NA INDUÇÃO
DE RESISTÊNCIA DE VIDEIRAS ‘SYRAH’ EM CASA DE VEGETAÇÃO
RESUMO
O oomiceto, Plasmopara viticola, agente causal do míldio da videira, causa perdas nos
vinhedos. Para minimizar os impactos acarretados por esta doença utilizam-se agroquímicos,
que apesar de eficientes ocasionam problemas ambientais e à saúde humana. Nesse sentido, o
presente trabalho teve como objetivo verificar o potencial dos óleos essenciais de pitanga
(OEP), guaçatonga (OEG) e melaleuca (OEM) (0,12 µL mL-1
), os tratamentos padrões com
tween®
(0,12 µL mL-1
), acibenzolar-S-metil (ASM, 0,005%) e calda bordalesa (1:1:100,
cal:sulfato de cobre: água) (CB) e a testemunha com água, no controle do míldio e na indução
de resistência de videira ‗Syrah‘. Dessa forma, avaliou-se a germinação, a viabilidade dos
esporângios do oomiceto P. viticola em condições in vitro; a severidade do míldio em disco
de folha em condições de laboratório e em mudas videiras ‗Syrah‘ em casa de vegetação.
Nessas plantas foram avaliados os teores de compostos fenólicos, lignina, concentração de
peróxido de hidrogênio (H2O2), atividade das enzimas superóxido dismutase (SOD), catalase
(CAT), peroxidase (POD), a peroxidação lipídica, a polifenoloxidase (PPO) e a área foliar,
massa fresca e seca das folhas dessas plantas. De acordo com os resultados, verificou-se que
os óleos essenciais apresentaram efeito fungitoxico na germinação e na viabilidade dos
esporângios de P. viticola, reduziram a área abaixo da curva do progresso do míldio em disco
de folha e em plantas de videira em casa de vegetação. Quanto aos parâmetros relacionados à
indução de resistência, verificou-se que os óleos essenciais apresentam potencial para atuarem
como elicitores de ativação dos mecanismos de defesa de videiras ‗Syrah‘. Dessa forma,
destaca-se que o OEP, OEG e OEM apresentam efeito direto sobre o P. viticola, controlam o
míldio da videira em ‗Syrah‘ e induzem a resistência dessas plantas contra essa doença.
Palavras chave: Plasmopara viticola, pitanga, guaçatonga, melaleuca
68
CHAPTER I: ESSENTIAL OILS IN THE CONTROL OF MILD AND INDUCTION
OF RESISTANCE OF 'SYRAH' VINEES IN VEGETATION HOUSE
ABSTRAT
The oomycete, Plasmopara viticola, causal agent of vine downy mildew, causes losses in the
vineyards. To minimize the impacts caused by this disease are used agrochemicals, which,
although efficient, cause environmental problems and human health. In this sense, the present
work had as objective to verify the potential of the essential oil of pitanga (EOP), guaçatonga
(EOG) and melaleuca (EOM) (0.12 μL mL-1
), the standard treatments with tween® (0.12 μL
mL-1
), acibenzolar-S-metil (ASM, 0.005%) and bordeaux mixture (1: 1: 100, lime: copper
sulphate: water) (BM) and water control, non-control of mildew and resistance induction of
'Syrah' vine. In this way, the germination, the viability of the sporangia of the oomycete P.
viticola was evaluated in in vitro conditions; the severity of leaf disc mildew under laboratory
conditions and 'Syrah' vines under greenhouse conditions. In these plants, the levels of
phenolic compounds, lignin, hydrogen peroxide concentration (H2O2), enzyme activity
superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), peroxidase (POD), lipid peroxidation,
polyphenoloxidase (PPO) and leaf area, fresh and dry mass of the leaves of these plants.
According to the results, it was verified that the essential oils had a fungitoxic effect on the
germination and viability of P. viticola sporangia, reduced the area below the curve of leaf
disc mildew and on grapevines in the house of vegetation. Regarding the parameters related to
the induction of resistance, it was verified that the essential oils present the potential to act as
elicitors of activation of the mechanisms of defense of 'Syrah' vines. Thus, EOP, EOG and
EOM have a direct effect on P. viticola, control the vine's mildew on 'Syrah' and induce the
resistance of these plants against this disease.
Keywords: Plasmopara viticola, pitanga, guaçatonga, melaleuca
69
1 INTRODUÇÃO
A vitivinicultura encontra-se em expansão no Brasil, devido à diversidade de cultivo e
de condições ambientais, o que proporciona variabilidade nos produtos finais produzidos com
a uva. Essas características permitem o desenvolvimento de cultivares destinada à produção
de vinhos finos de alta qualidade, como a ‗Syrah‘, por tratar-se de plantas vigorosas,
produtivas e com aptidão ao envelhecimento dessas bebidas (CAMARGO et al., 2011;
SILVA et al., 2010; OLIVEIRA et al., 2017)
A ‗Syrah‘ apresenta como entrave ao seu desenvolvimento a susceptibilidade há varias
doenças, como ao míldio, ocasionado por Plasmopara viticola. O ataque desse patógeno
acarreta em danos em todas as partes verdes da planta, principalmente nas folhas, que
apresentam os sintomas típicos. Nesses órgãos verifica-se na região adaxial, uma mancha
pálida conhecida como ―mancha de óleo‖. Na face abaxial, correspondente a essa face
superior uma eflorescência de coloração branca (―mancha mofo‖), com característica densa,
aspecto cotonoso apresentando estruturas de frutificações do patógeno. Com o
desenvolvimento da doença ocorre à desfolha precoce e, consequentemente, a redução da área
fotossintética ativa, resultando em quedas na produtividade e qualidade dos vinhos (JERMINI
et al., 2010; GESSLER et al., 2011; AMORIM et al., 2016).
Para o controle dessa doença são utilizados fungicidas sintéticos, que apesar de
eficientes, causam riscos à saúde humana e desiquilíbrios ambientais (KOMÁREK et al.,
2010). Entretanto, como forma de reduzir ou eliminar esses impactos, tem-se buscado
produtos alternativos, como a aplicação de óleos essenciais, como os extraídos de plantas de
pitanga (Eugenia uniflora), guaçatonga (Casearia sylvestris) e de melaleuca (Melaleuca
alternifolia), por apresentarem compostos voláteis, terpenos e terpenoides (PICHERSKY,
2006; BAKKALI et al., 2008; SHALABY; BENJAMIN, 2015).
Esses compostos podem atuar diretamente sobre o patógeno alterando o potencial e a
fluidez de suas membranas, como verificado por COSTA et al. (2010) que a concentração de
62,5 g mL-1
do óleo essencial de pitanga inibe a levedura Paracoccodoides brasiliensis. O
óleo essencial de guaçatonga também apresenta resultado de ação direta sobre patógenos,
apresentando inibição de 100% de crescimento micelial de Alternaria alternata, A.
radicinea, A. brassicicola e Botrytis sp., quando utilizado na dose de 2,5% (PEZZI, 2014).
Esses efeitos antimicrobianos também foram observados com a concentração de 1% do
óleo essencial de melaleuca que reduziu em 99% o crescimento micelial de Cercospora
beticola e 20% a severidade da cercosporiose de beterraba (SOUZA et al., 2015).
70
Além disso, os componentes majoritários desses óleos essenciais podem também
induzir a resistência de plantas, alterando seus componentes estruturais e bioquímicos
(ARMSTRONG, 2006; MAIA et al., 2014). Dentre essas alterações estão à concentração de
compostos fenólicos com capacidade antimicrobiana e a deposição de lignina com a
finalidade de atuar como barreira física que impede ou retarda a entrada de patógenos
(AMORIM et al., 2011).
Também se observa a síntese de espécies reativas de oxigênio (EROs) que apresentam
a capacidade de se expressarem como fatores prejudiciais, protetores ou sinalizadores,
dependendo do equilíbrio da síntese das enzimas antioxidantes superóxido dismutase, catalase
e peroxidase. Como principal substrato desses EROs, destaca-se o peróxido de hidrogênio
(H2O2), que pode atuar sobre a planta induzindo respostas de defesa ou desencadear efeito
tóxico diretamente sobre o invasor. Porém, ocasionalmente se essas enzimas antioxidantes
não desempenharem suas atividades pode-se verificar efeito citotóxico dos EROs, ocorrendo a
peroxidação lipídica devido às lesões nas membranas celulares (QUAN et al., 2008; SINGH;
TUTEJA, 2010).
Outra forma de alteração bioquímica nas plantas é a atividade da enzima
polifenoloxidase, que em alta concentração participa da biossíntese de quinonas, que
apresentam comportamento extremamente tóxico aos micro-organismos (MAYER, 2006).
Dessa forma, o objetivo do trabalho foi verificar se os óleos essenciais de pitanga
(Eugenia uniflora), guaçatonga (Casearia sylvestris) e melaleuca (Melaleuca alternifolia)
apresentam efeitos diretos sobre Plasmopara viticola e se alteram os mecanismos de defesa
em mudas de videiras ‗Syrah‘ no controle do míldio.
2 MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Local dos experimentos
Os testes in vitro foram realizados nos laboratórios de Fitopatologia e de Análise de
Pós-Colheita de Frutas e Hortaliças, os in vivo em casa de vegetação, pertencentes ao
Departamento de Agronomia, da Universidade Estadual do Centro-Oeste (UNICENTRO).
71
2.2 Obtenção, composição e preparo dos tratamentos utilizados nos experimentos
Os óleos utilizados nos experimentos foram cedidos pela Universidade Tecnológica
Federal do Paraná (UTFPR) - Campus Dois Vizinhos, oriundo da Empresa Garden City,
indústria de óleos essenciais Eireli, localizada em Ibiúna-SP. Essa Universidade também
disponibilizou a cromatografia dos óleos que foi realizada pela Embrapa Floresta, no
laboratório de produtos florestais não madeiráveis (Anexos).
Esses óleos foram utilizados na concentração de 0,12 µL mL-1
misturado no mesmo
volume (0,12 µL mL-1
) do emulsificante Tween® 20 e em seguida diluídos água. Dessa forma
os tratamentos utilizados nos experimentos foram testemunha (água), os óleos essênciais de
pitanga (OEP), guaçatonga (OEG) e de melaleuca (OEM), twenn® (0,12 µL mL
-1), o indutor
de resistência acibenzolar-S-metil (ASM 0,005%) (Bion®
) e calda bordalesa (1:1:100,
cal:sulfato de cobre:água). Todos esses tratamentos e os experimentos descritos a seguir,
foram realizados nas épocas 1 (2016) e 2 (2017).
2.3 Efeito dos óleos essenciais de pitanga, guaçatonga e melaleuca no controle direto
do míldio em videiras ‘Syrah’
Foi realizado teste de germinação de esporângios de P. viticola. Para época 1 (2016)
do experimento, utilizou-se folhas de videira com sintomas típicos de míldio coletadas no
pomar da UTFPR- Campus Dois Vizinhos e encaminhadas em material plástico contendo
algodão umedecido para o laboratório de Fitopatologia da UNICENTRO. Para a época 2
(2017), foram adotados esses mesmos procedimentos, porém o inoculo era proveniente de
uma propriedade particular da cidade de Guarapuava-PR. Logo em seguida, adicionou-se
sobre as folhas 100 mL de água destilada, autoclavada e contendo 20 µL de tween® 20. Com
alça de Drigalski, realizou-se o esfregaço sobre o crescimento do patógeno para a liberação
dos esporângios. Essa suspensão foi padronizada na concentração de 8,9x104 esporângios mL
-
1, em câmara de Neubauer (hemocitômetro).
Alíquota de 40 µL da suspensão de esporângios com 40 µL dos tratamentos foram
transferidas para as cavidades individuais de placas de teste ELISA. Nesse ensaio a dose dos
óleos essenciais foi de 0,24 µL mL-1
, pois ocorre diluição na presença da suspensão do
patógeno (RESENDE et al., 1997). Em seguida, as placas foram mantidas em câmara de
crescimento (BOD) no escuro a 25°C, cada placa correspondendo aos períodos de 2, 4, 12 e
24 horas de incubação. Para que ocorresse a paralização da germinação dos esporângios,
72
foram adicionados 20 µL do corante azul de lactofenol em cada cavidade, correspondente a
cada horário previamente destinado para avaliação. Em microscópio óptico de objetiva
invertida foram contabilizados aleatoriamente a porcentagem de esporângios germinados,
considerando nessa condição, aqueles que apresentaram a liberação de zoósporos.
Para verificar a viabilidade dos esporângios de P. viticola, ao final do experimento em
casa de vegetação, para cada uma das épocas 1 (2016) e 2 (2017) (descritas posteriormente),
foram coletadas em sacos de papel, as folhas de videira utilizadas para a avaliação de
severidade do míldio. Em seguida foram transportadas para o laboratório de Fitopatologia e
acondicionadas em câmara úmida, no escuro a 25°C, para que ocorresse a esporulação do P.
viticola. Passadas 24 horas realizou-se a raspagem com alça de Drigalsk sob a eflorescência
presentes nessas folhas e padronizou-se a suspensão em 1x104 esporângios mL
-1. Em seguida,
adicionou-se 80 µL dessa suspensão nas cavidades individuais da placa de teste ELISA.
Posteriomente as placas foram acondicionadas em câmara de crescimento climatizada (BOD)
no escuro a 25°C. Após 24 horas adicionaram-se 20 µL de azul de lactofenol de algodão para
paralisar a germinação dos esporângios. Para avaliar a viabilidade adotou-se a mesma
avaliação do teste de germinação já descrita.
Para verificar o efeito dos tratamentos em experimentos in vivo, foram realizados teste
em discos de folhas e em plantas de videira ‗Syrah‘. Para esse primeiro ensaio, foram
utilizadas folhas sadias de videira ‗Syrah‘ desinfestadas superficialmente com hipoclorito de
sódio a 1% por dez segundos, secas em temperatura ambiente, e em seguida, com furador de 5
cm realizou-se cortes obtendo-se os discos foliares. Posteriormente, esses discos
permaneceram mergulhados por 1 minuto em cada tratamento e, em seguida, foram
distribuídos sobre espumas umedecidas contidas em caixas tipo ―gerbox‖ e armazenados em
sala climatizada a 25±1°C com fotoperíodo de 12 horas.
Transcorridas 24 horas, inoculou-se a suspensão de 8,9 x104 esporângios mL
-1 de P.
viticola sobre os discos de folha, que novamente foram acondicionadas na sala climatizada.
Após 48horas da inoculação, avalou-se, diariamente, por cinco dias a severidade do míldio de
acordo com escala diagramática adaptada (BUFFARA et al., 2014). Esses dados foram
transformados em área abaixo da curva do progresso da doença (AACPD) (CAMPBELL;
MADDEN, 1990).
Para o segundo ensaio, utilizaram-se mudas de videira ‗Syrah‘ enxertadas sobre o
porta-enxerto ‗Paulsen 1103‘, plantadas em vasos com capacidade de 1L contendo solo e
mantidas em casa de vegetação sob irrigação por aspersão. Passado um ano foram podadas e
adubadas com adubo orgânico de esterco bovino curtido, em 10/09/2016.
73
Em 21/09/2016 quando as plantas apresentavam estádio fenológico 9 (2-3 folhas
separadas do pâmpano e lançamento de 2-4 cm, segundo a escala fenológica proposta por
Eichhonrn; Lorenz (1997)) iniciaram-se, as aplicações semanais dos tratamentos (realizadas
sempre após as 18 horas) para a primeira época (2016) se estenderam até 02/01/2017. Nessa
mesma data as plantas foram podadas e dia 26/01/2017 novamente iniciaram-se as aplicações
até 14/03/2017, referente à segunda época (2017).
Para a primeira época realizou-se a inoculação da suspensão de P. viticola de 9,2x108
esporângios mL-1
(inóculo proveniente da cidade de Dois Vizinhos-PR, devido a ausência do
patógeno em Guarapuava-PR decorrente as condições climáticas desfavoráveis ao P. viticola,
em condições de campo) em 16/12/2016 e na segunda época essa suspensão foi de 1x104
esporangios mL-1
(inóculo proveniente da cidade de Guarapuava-PR) em 01/03/2017. O
início das avaliações da severidade de míldio ocorreu nos primeiros sintomas das doenças,
sendo para a primeira época em 27/12/2016 e para a segunda em 09/03/2017, ambas foram
realizadas diariamente por cinco dias, em cinco folhas previamente marcadas, com dois
avaliadores treinados e adotando-se a escala diagramática de Buffara et al. (2014).
Os dados da severidade foram tabulados e, em seguida, transformados em área abaixo
da curva do progresso da doença (AACPD) (CAMPBELL; MADDEN, 1990).
2.4 Efeito dos óleos essenciais de pitanga, guaçatonga e melaleuca na indução de
resistência de videiras ‘Syrah’ no controle o míldio
2.4.1 Análises bioquímicas
Coleta e armazenamento das amostras de videiras ‘Syrah’ 2.4.1.1
Nas plantas de videiras tratadas em casa de vegetação foram coletados dois discos de
folhas de 5 cm de diâmetro de cada planta. Para a primeira época do experimento (2016) essa
coleta foi realizada após 13 aplicações dos tratamentos e para a segunda (2017) foram após
oito aplicações. Essa diferença de dias, entre as épocas, foi decorrente da falta de inóculo de
P. viticola na região de Guarapuava, devido às condições ambientais desfavoráveis ao
desenvolvimento da doença no período de setembro a dezembro. Essas coletas foram
realizadas de acordo com o quadro 1.
74
Quadro 1: Forma de coleta dos discos de folhas de videira ‗Syrah‘ tratadas com óleos
essenciais de pitanga, guaçatonga e melaleuca em casa de vegetação para analise de indução
de resistência.
Coletas Época 1 (2016) Época 2 (2017) Descrição
1 Após 13
aplicações dos
tratamentos
Após 8 aplicação dos
tratamentos
Coleta de material e
em seguida,
novamente,
aplicação dos
tratamentos
2 24hAA 24HAA 24 horas após a
aplicação dos
tratamentos
INOCULAÇÃO DE Plasmopara vitícola
3 4hAI 4hAI 4 horas após a
inoculação
4 24hAI 24hAI 24 horas após a
inoculação
5 48hAI 48hAI 48 horas após a
inoculação
6 96hAI 96hAI 96 horas após a
inoculação
7 11 dias após a
inoculação
9 dias após a
inoculação
Pimeiro dia de
avaliação de míldio
8 16 dias após a
inoculação
14 dias após a
inoculação
5 dias após a
primeira avaliação
de míldio
Esses discos foliares foram armazenados em papel alumínio, refrigerados em gelo e,
em seguida, acondicionadas em freezer a -20°C até o preparo de extratos para as análises
bioquímicas referentes à indução de resistência dessas plantas. Um disco foi utilizado como
extrato enzimático e o outro cortado ao meio para determinação da concentração de peróxido
de hidrogênio (H2O2) e a outra metade para peroxidação lipídica.
Os discos de folhas coletados e refrigerados foram pesados e, em seguida, macerados
em almofariz com nitrogênio líquido e homogeneizados mecanicamente em 4 mL de tampão
75
fosfato de potássio 50 mM (pH 7) contendo 0,1 mM de EDTA. Essa solução foi transferida
para tubo tipo eppendorf contendo 0,0003g de polivinilpirrolidona (PVP) e centrifugado a
15000g durante 40 minutos a 4°C.
O extrato enzimático foi obtido do sobrenadante dessa centrifugação, que em seguida,
foi armazenado em freezer -20°C (KAR; MISHRA, 1976), até a realização das análises de
determinação de compostos fenólicos, conteúdo protéico, atividade das enzimas superóxido
dismutase (SOD), catalase (CAT), peroxidase (POD) e polifenoloxidase (PPO).
Para determinação de compostos fenólicos totais, utilizou-se 50 µL do extrato obtido
dos discos de folhas de videira ‗Syrah‘ colocado em tubos de ensaio cobertos com papel
aluminio para proteger da luz. Em seguida, adicionou-se 2,5 mL de Folin Ciocateau e 2 mL
de carbonato de cálcio. Posteriormente, essa solução foi deixada em repouso em ambiente
escuro por um período de duas horas e, em seguida, realizou-se a leitura em
espectrofotômetro com comprimento de onda de 740 nm. Os resultados foram comparados
com a curva padrão e expressos em mg de ácido gálico 100g-1
de massa seca (AOAC, 1992).
Para a determinação do conteúdo proteico total foi utilizado 100 µL do extrato
enzimático adicionado sob agitação em 2,5 mL do reagente Bradford. Passados 5 minutos foi
efetuada a leitura em espectrofotômetro com comprimento de onda de 595 nm. A
concentração de proteínas, expressa em mg por mL de amostra (mg proteína. mL-1
), foi
determinada utilizando-se curva-padrão de concentrações de albumina de soro bovino (ASB)
de 0 a 0,5 mg mL-1
, obtida pelo método de Bradford (BRADFORD, 1976).
Para a determinação da atividade específica da enzima superóxido dismutase (SOD)
(E.C. 1.15.1.1) preparou-se solução contendo 125 mL de tampão fosfato de potássio à 0,105
M e pH7,8; 250 µL de EDTA à 0,1mM; 15 mg de nitrobluetetrazólio (NBT); 13 mL de
metionina a 0,25 M pH7,8; 1 mL de rifoflavina 0,01M e, em seguida, o volume foi
completado para 250 mL com água destilada (GIANNOPOLITIS; REIS, 1977).
Em placas de cultivo de células contendo 24 poços e com fundo chato e capacidade
máxima para 3,5 mL foram adicionadas 20 µL do extrato enzimático e 3 mL dessa solução.
Esse procedimento foi realizado em duas placas, porém uma ficou exposta à luz por 10
minutos e a outra no escuro, dita como controle. Posteriormente, ambas, foram lidas em
espectrofotômetro a 560 nm.
Para a quantificação da atividade específica de SOD, expressa em U µg proteína-1
,
multiplicou-se a porcentagem de inibição pelo volume da amostra e, em seguida, dividiu-se
pela multiplicação de 50% pela concentração de proteína total da amostra (µg µL-1
). Com isso
verificou-se a formação de formazona proveniente da redução do NBT na presença de luz.
76
Dessa forma, pode-se dizer que 1 unidade de SOD representa 50% de inibição da fotoredução
do NBT (GIANNOPOLITIS; REIS, 1977).
A atividade específica da catalase (CAT) (E.C. 1.11.1.6) foi determinada pelo
complexo estável formado pela reação de molibtato de amônio com o peróxido de hidrogênio,
de acordo com o método de Góth (1991) adaptado por Tomanková et al. (2006). Para isso
incubou-se em banho maria a 38°C, 100 µL do extrato enzimático com 500 µL da mistura de
reação contendo 60 mM de peróxido de hidrogênio em tampão fosfato de potássio 60 mM pH
7,4 por 2 minutos. Passado esse período adicionou-se 500 µL de molibdato de amônio (32,4
mM) para deter o consumo de peróxido de hidrogênio pela enzima presente no extrato.
Para cada amostra foi preparado um branco pela adição de molibdato de amônio à
mistura de reação, omitindo o período de incubação. O complexo de coloração amarela de
molibtado e peroxido de hidrogênio foi medido em espectrofotômetro com comprimento de
onda de 405 nm. A diferença entre a absorbância do branco e a amostra incubada indicou a
quantidade de peróxido de hidrogênio utilizado pela enzima catalase. A concentração de H2O2
foi determinada utilizando-se o coeficiente de extinção de є = 0,0655 mM-1
cm-1
.
A atividade específica da peroxidase (POD) (E.C. 1.11.1.7) foi determinada de acordo
com metodologia de Urbanek et al. (1991). Dessa forma, adicionou-se 100 µL de extrato
enzimático em 2,9 mL de solução contendo tampão acetato de sódio 50 Mm pH 5,2 e
peróxido de hidrogênio 20 mM. Em seguida, essa solução foi incubada em banho maria por
10 minutos em temperatura de 30°C. Posteriormente, foi efetuada a leitura em
espectrofotômetro à 480 nm, determinando-se a conversão do guaiacol em tetraguaicol. A
atividade da POD foi expressa em U A mgp-1
min-1
, ou seja, uma unidade dessa enzima foi
definida como a mudança de 1,0 unidade de absorbância (480nm) por miligrama de proteína
solúvel por minuto.
Para determinação da atividade específica da enzima polifenoloxidase (PPO) (E.C
1.10.3.2) utilizou-se como substrato enzimático a solução contendo 25 mM de catecol
homogenizada em 50 mL de tampão fosfato de potássio a 0,1M, pH 6,0. Adicionou-se 200 µL
do extrato enzimático com 2,8 mL dessa solução em tubos de ensaio que, em seguida, foram
colocados por 10 minutos em banho maria com temperatura de 30°C. Posteriormente,
realizou-se a leitura em espectrofotômetro com comprimento de onda de 410 nm,
determinando-se a oxidação do catecol em quinona e a atividade da enzima expressa em U A
mgp-1
min-1
(GAUILLARD, 1993).
77
A determinação da concentração de peróxido de hidrogênio (H2O2) foi adaptada da
metologia de Loreto; Vilikova (2001). Dessa forma, foram pesados metade do disco de folha,
macerado em 1,5 mL de tricloroacético (TCA) à 1% e centrifugado a 15000 g por 15 minutos.
Desse centrifugado foram retirados 0,5 mL do sobrenadante que foi transferido para
tubos de ensaio e, em seguida, adicionado 0,5 mL de iodeto de potássio a 1M. Por fim,
realizou-se a leitura em espectofotrômetro com comprimento de onda de 390 nm. Os
resultados foram comparados com a curva de calibração do peróxido de hidrogênio (H2O2) e
expressos em µmolg-1
de massa fresca (MF).
Para a peroxidação lipídica, a metodologia adotada foi descrita por Health; Packer
(1968), citados por Rama; Prasad (1998). Dessa forma, as amostras de discos de folha foram
maceradas em 1 mL de ácido tricloroacético (TCA) à 0,1% com 20% de polivinilpirrilidona
(PVPP), em seguida, centrifugado a 10000 g por 5 minutos, retirado 0,5 mL do sobrenadante
transferindo-o para eppendorf contendo 1 mL da solução de 20% de ácido tricloroacético
(TCA) mais 0,5% de ácido thiobarbitúrico (TBA). Posteriomente, essa solução foi colocada
em banho maria a 95°C por 30 minutos.
Passado esse período, a solução foi rapidamente resfriada em gelo e transferida 1,4 mL
para outro eppendorf que, posteriormente, centrifugado novamente e, por fim, realizada as
leituras em espectrofotômetro nos comprimentos de ondas de 532 e 600 nm.
Nos cálculos subtraiu-se a absorbância do sobrenadante de comprimento de onda de
532 nm do valor obtido de 600 nm, por fim, utilizou-se como coeficiente de extinção molar de
155 mM-1
cm-1
.
Para a determinação do teor de lignina, no último dia de avaliação do míldio da
videira, foram retiradas as folhas, determinadas sua massa fresca em balança de precisão, área
foliar no medidor de superfície foliar, e massa seca também pelo peso das folhas após serem
secadas em estufa de circulação de ar à 50°C por um período de quatro dias. Em seguida,
essas folhas, foram trituradas em moinho e armazenadas em sacos plásticos identificados, em
local seco.
Foram confeccionados pacotes de 10 cm2 de tecido TNT (tecido não tecido), que em
seguida, foram pesados e colocados em estufa a 105°C por 14 horas. Passado esse tempo, as
embalagens foram novamente pesadas e adicionados 0,25g de amostra das folhas secas e
moídas. Posteriormente, esse material foi colocado em um recipiente contendo ácido sulfúrico
à 72% e a cada uma hora adicionado mais ácido até completar o volume final de 30 mL por
amostra, totalizando 3 horas de reação.
78
Posteriormente, as amostras foram retiradas do recipiente, lavadas em água destilada e
colocadas em estufa a 60°C por 2 horas e, em seguida, a temperatura foi elevada para 105°C,
na qual as amostras permaneceram por 12 horas (método adaptado de ―Klason‖) (ROHELLA,
1996). Por fim, foram pesadas em balança de precisão, demonstrando o peso final de lignina
expresso em mg-1
g-1
MF-1
.
2.5 Delineamento experimental e análise estatística
Para os experimentos de efeito direto dos tratamentos sobre a germinação, viabilidade,
controle do míldio em discos de folhas e em mudas de videiras ‗Syarh‘, lignina, área foliar,
massa fresca e seca o delineamento experimental foi inteiramente casualizado com sete
tratamentos e cinco repetições. Os dados foram analisados no programa estatístico Sisvar,
sendo submetidos à análise de variância e, em seguida, pelo teste Tukey ao nível de 5% de
probabilidade (FERREIRA, 2011).
Para as análises bioquímicas delineamento experimental também foi inteiramente
casualizado com sete tratamentos, cinco repetições e em todos os ensaios as amostras foram
analisadas em duplicada. Porém, para facilitar a interpretação dos resultados utilizou-se a
estatística multivariada. Dessa forma os dados obtidos foram primeiramente passados pela
análise de fatores (dados não apresentados) e em seguida, os que apresentavam
comunalidades superior a 0,70 foram submetidos à análise de componentes principais (ACP).
Esses testes estatísticos foram realizados no software Statistica 7.0 (STATSOFT, 2004).
79
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 Efeito dos óleos essenciais de pitanga, guaçatonga e melaleuca no controle direto
do míldio em videiras ‘Syrah’
De acordo com os resultados de germinação verificou-se que todos os óleos essenciais
apresentaram efeito fungitóxico sobre a germinação de P. viticola, não apresentando
diferenças estatísticas entre si, nos períodos de 2, 4 e 12 horas na época 1 e para 2, 12 e 24
horas na época 2. Ressaltando-se que nos demais períodos o OEG e OEM mostram-se
similares estatisticamente e o OEP mostou-se semelhante aos tratamentos padrões (Figuras 1
e 2).
Pode-se destacar que o óleo essencial de melaleuca (OEM) para os tempos de 2, 4, 12
e 24 horas na época 1 (2016) apresentou resultados de controle direto do patógeno superiores
aos obtidos pela calda bordalesa (CB) (Figura 1, A, B, D e E). Na época 2 (2017), os tempos
de 2, 4 e 12 horas também não diferiram da CB, somente 24 horas foram superiores ao padrão
(Figura 2, E). Com relação ao tratamento testemunha verificou-se que na primeira época o
OEM proporcionou redução de 92, 89, 93 e 86% e na segunda (2017), 73, 75, 81 e 88%,
respectivamente (Figuras 1 e 2).
80
Figura 1: Germinação de Plasmopara viticola sob efeito direto dos tratamentos com água,
0,12 µL mL-1
dos óleos essenciais de pitanga (OEP) (Eugenia uniflora), guaçatonga (OEG)
(Casearia sylvestris) e melaleuca (Melaleuca alternifolia) (OEM), tween®
(0,12 µL mL-1
),
acibenzolar-S-metil (ASM) e calda bordalesa (CB) nos períodos de 2 (A), 4 (B), 12 (C) e 24
(D) horas em contato com os tratamentos (Época 1, 2016).
d
aba a
abb
c
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Testemunha OEP OEG OEM Tween ASM CB
Germ
ina
çã
o (
%)
Óleos essenciais (0,12 µL mL-1)
2 H
c
ab aba
b ab
c
0
10
20
30
40
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60
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80
90
100
Testemunha OEP OEG OEM Tween ASM CB
Ger
min
açã
o (
%)
Óleos essenciais (0,12 µL mL-1)
4 H
c
a aa
a
b
b
0
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20
30
40
50
60
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80
90
100
Testemunha OEP OEG OEM Tween ASM CB
Ger
min
açã
o (
%)
Óleos essenciais (0,12 µL mL-1)
12 H
f
cd
aab
cd
de
d
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Testemunha OEP OEG OEM Tween ASM CB
Ger
min
ação
(%)
Óleos essenciais (0,12 µL mL-1)
24 H
81
Figura 2: Germinação de Plasmopara viticola sob efeito direto dos tratamentos com água,
0,12 µL mL-1
dos óleos essenciais de pitanga (OEP) (Eugenia uniflora), guaçatonga (OEG)
(Casearia sylvestris) e melaleuca (Melaleuca alternifolia) (OEM), tween®
(0,12 µL mL-1
),
acibenzolar-S-metil (ASM) e calda bordalesa (CB) nos períodos de 2 (A), 4 (B), 12 (C) e 24
(D) horas em contato com os tratamentos (Época 2, 2017).
b
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Óleos essenciais (0,12 µL mL-1)
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Óleos essenciais (0,12 µL mL-1)
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Testemunha OEP OEG OEM Tween ASM CB
Ger
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%)
Óleos essenciais (0,12 µL mL-1)
12 H
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Testemunha OEP OEG OEM Tween ASM CB
Ger
min
açã
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%)
Óleos essenciais (0,12 µL mL-1)
24 H
82
Com relação à viabilidade dos esporângios de P. viticola retirados das folhas
infectadas no ultimo dia de avaliação do míldio em casa de vegetação, verificou-se que os
óleos essenciais não apresentaram diferença estatística com a calda bordalesa. Sendo que para
a época 1 (2016), os tratamentos com OEP, OEG e EOM proporcionaram redução da
germinação em 94,7; 93,1 e 96,1% do P. viticola e a CB 88,7% (Figura 3A), e para a segunda
época, os resultados foram de 82,6; 83,7; 84,9 e 77,95%, repectivamente, em relação ao
tratamento testemunha (Figura 3B).
Esses resultados colaboram com o controle do míldio nessas plantas, pois de acordo
com a viabilidade dos zoósporos é que se tem a capacidade de infecção do patógeno
(TRÖSTER et al., 2017). Sendo assim, a inibição da germinação dos esporângios resulta na
redução do número de propágulos infectivos do P. viticola, diminuindo infecções secundárias
no ciclo da doença, o que, colabora com o controle míldio na videira (ROSETO et al., 2014).
d
ab abc a abc abc
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Testemunha OEP OEG OEM Tween ASM CB
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Óleos essenciais (0,12 µL mL-1)
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Testemunha OEP OEG OEM Tween ASM CB
Germ
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%)
Óleos essenciais (0,12 µL mL-1)
B
83
Figura 3: Viabilidade de Plasmopara viticola sob efeito direito dos tratamentos com água,
0,12 µL mL-1
dos óleos essenciais de pitanga (OEP) (Eugenia uniflora), guaçatonga (OEG)
(Casearia sylvestris) e melaleuca (OEM) (Melaleuca alternifolia), tween®
(0,12 µL mL-1
),
acibenzolar-S-metil (ASM) e calda bordalesa (CB). Épocas 1, 2016 (A) e 2, 2017 (B).
Em discos de folhas de videiras ‗Syrah‘, verificou-se que, para a área abaixo da curva
do progresso da doença (AACPD) o OEG e OEM não houve diferença estatística com ASM e
CB, para duas épocas (2016 e 2017) (Figuras 4, A, B). Ressaltando-se que esses tratamentos
reduziram a AACPD do míldio da videira em 83,1; 83 e 87,23% para primeira época (2016) e
para a segunda (2017) 91; 86,7 e 88,95%, respectivamente, em relação ao tratamento
testemunha (Figuras 4, A e B).
Figura 4: Área abaixo da curva do progresso da doença (AACPD) do míldio (Plasmopara
viticola) em discos de folhas de videira ‗Syrah‘ tratados com água, 0,12 µL mL-1
dos óleos
essenciais de pitanga (OEP) (Eugenia uniflora), guaçatonga (OEG) (Casearia sylvestris) e
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Óleos essenciais (0,12 µL mL-1)
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Testemunha OEP OEG OEM Tween ASM CB
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D
Óleos essenciais (0,12 µL mL-1)
B
84
melaleuca (OEM) (Melaleuca alternifolia), tween®
(0,12 µL mL-1
), acibenzolar-S-metil
(ASM) e calda bordalesa (CB). Épocas 1, 2016 (A) e 2, 2017 (B).
Resultados semelhantes aos obtidos com a AACPD do míldio da videira em discos de
folhas foram verificados na época 1 (2016) em plantas acondicionadas em casa de vegetação,
verificando-se que os OEP, OEG e OEM não apresentaram diferença estatística da CB,
constatando-se redução em relação ao tratamento testemunha de 91,5; 90,5; 94,5 e 92,2%,
respectivamente (Figura 5A). Porém, para a época 2 (2017) observou-se redução de 80,1;
32,2; 61,4 e 39,6% para os tratamentos com OEP, OEG, OEM e CB, respectivamente,
destacando-se que o OEP apresentou resultados estatisticamente semelhantes ao ASM, que
reduziu em 76,3% a AACPD nessas videiras (Figura 5B).
Figura 5: Área abaixo da curva do progresso da doença (AACPD) de míldio (Plasmopara
viticola) em plantas de videira ‗Syrah‘ tratadas com água, 0,12 µL mL-1
dos óleos essenciais
de pitanga (OEP) (Eugenia uniflora), guaçatonga (OEG) (Casearia sylvestris) e melaleuca
b
a aa
ab ab
a
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Testemunha OEP OEG OEM Tween ASM CB
AA
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Óleos essenciais (0,12 µL mL-1)
A
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Testemunha OEP OEG OEM Tween ASM CB
AA
CP
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Óleos essenciais (0,12 µL mL-1)
B
85
(OEM) (Melaleuca alternifolia), tween®
(0,12 µL mL-1
), acibenzolar-S-metil (ASM) e calda
bordalesa (CB). Épocas 1, 2016 (A) e 2, 2017 (B).
Os efeitos antimicrobianos desencadeados pelo OEP está relacionado à sua
composição química, ricamente composta por sesquiterpenos, como o calamen-10-0na
(20,2%) e, principalmente, germacreno (6,24%) (Anexo, Figura 20) que é caracterizado por
apresentar efeito antifúngico (ALMEIDA, 2005). Magina et al. (2009) também verificaram
a presença de cariofileno no óleo essencial de pitanga, porém em concentração diferente aos
obtidos nesse trabalho. Essa diversidade de composição química está relacionada ao clima,
condições sazonais, geofráficas, período de colheita a técnica de extração dos óleos
essenciais (GOBBO; LOPES, 2009).
O óleo essêncial de citronela (Cymbopogon nardus) que também possui em sua
composição calamenene (SHERER et al., 2009) apresenta efeito fungicida sobre brusone
(Pyricularia grisea) do arroz (PERINI et al., 2011). Esses componentes podem inibir
completamente a proliferação de fungos, como relatado por Costa et al. (2010) que
verificaram que a concentração do OEP a 62,5 µg mL-1
reduziu em 100% o
desenvolvimento de Paracoccidoides brasiliensis. CAMPOS et al. (2015) também verificou
que a concentração de 12µL de OEP reduz em aproximadamente 9% o índice de velocidade
de crescimento micelial de Sclerotinia sclerotiorum, agente causal da haste na soja,
destacando sua atividade antifúngica sobre fitopatógenos.
O OEG também apresenta elevada concentração de sesquiterno como γ-muroleno
(19,55) (Anexo, Figura 21) que colabora fortemente para a sua ação antifúngica (DUARTE,
2006). Esse componente está presente no óleo essencial extraído de Myrcia splendens que
desencadeia efeito antimicrobiano sobre bactérias gram positivas e negativas (DILMA et al.,
2012). O óleo essencial de eucalipto apresenta muroleno em sua composição (MACHADO
et al., 2013) e Piati et al. (2013) verificaram que as concentrações de 0,25, 0,5 e 1%
reduzem o crescimento micelial, a esporulação e a germinação de esporos de Penicillium
digitatum. Cruz et al. (2015) e Batista et al. (2017) ressaltam esse efeito do óleo essencial de
guaçatonga na redução do crescimento micelial de Fusarium oxysporum e Rhizoctonia sp.,
respectivamente.
Dentre os constituintes do OEM o 1,8 cineol se destaca com a porcentagem de 72,31
(Anexo, Figura 22). Esse composto é caracterizado como monoterpeno e mostra-se como
importante constituinte para inibir microorganismos agindo diretamente sobre o patógeno
(ARAHIO et al. 2011). O óleo essencial de alecrim (Rosmarinus officinalis) apresenta esse
componente majoritário e a dose de 4000 µL L-1
reduz em 21% o crescimento micelial de
86
Elsinoe ampelina e em condições de campo, diminui em 91% a AACPD da antracnose de
videira ‗Cabernet Sauvignon‘ (GARCIA et al., 2017).
Medice (2007) verificou que a concentração de 0,06% do óleo essencial de
melaleuca reduz em 88,6% a severidade da ferrugem asiática da soja (Phakopsora
pachyrhizi). Esse efeito antifúngico também foi observado com a dose de 1% que dimunuiu
em 20% a severidade da cercosporiose da beterraba e em 99% o crescimento micelial de
Cercospora beticola Sacc.
Esses efeitos proporcionados pelos óleos essenciais de pitanga, guaçatonga e
melaleuca, também estão relacionados por se tratarem de moléculas lipídicas, que
conseguem facilmente atravessar as membranas celulares dos micro-organismos
(SACCHETTI et al., 2005, TURINA et al., 2006).
Nas células eucariontes, como em fungos, os óleos essenciais diminuem o potencial
transmembranas, prejudicando os teores lipídicos, protéicos e de ácidos nucléicos das células
(ARNAL-SCHNEBELEN et al., 2004). Também podem ocasionar a redução da síntese de
ATP, devido às interferências ocorridas nos canais iônicos que diminuem o gradiente de pH.
Essas alterações resultam na perda de radicais, citocromo C, íons de cálcio e proteínas,
provocando a morte celular por apoptose e necrose (VERCESI et al., 1997; YOON et al.,
2000; ARMSTRONG, 2006).
A exposição a esses óleos essenciais podem induzir danos mitocondriais que
envolvem seu DNA e as suas membranas. Como consequência tem-se a ocorrência de
mutações que alteram a respiração celular e inibem a expressão de proteínas de transporte de
elétrons e resultam no acúmulo de espécies reativas ao oxigênio (EROs), que produzem
radicais livres, causam danos nas células, através da oxidação de lipídios, proteínas e DNA.
Quando os microrganismos apresentam fase de crescimento logarítmico (células em
desenvolvimento) mostram-se sensíveis à indução dessas alterações na mitocôndria
(BAKKALI et al., 2008). Também nessas organelas, os compostos fenólicos presentes nos
óleos essenciais, são oxidados ao terem contato com os EROs, principalmente na presença de
ferro, cobre, zinco, manganês ou magnésio, o que aumenta o potencial de danos acarretados
nas células (JIMENEZ DEL RIO; VELEZ-PARDO, 2004; AZMI et al., 2006).
Também pode-se ressaltar que além dessa eficiência dos óleos em controlar o míldio
da videira, o custo de aplicação desses produtos mostram-se inferiores ao ASM. Verifica-se
que Tween® e a CB apresentam valores mais acessíveis que os óleos essenciais (Tabela 2).
Porém o uso de produtos sintéticos pode ocasionar a seleção de micro-organismo, alteração na
ciclagem de nutrientes, eliminação de organimos benéficos, redução da biodiversidade,
87
cantaminação do solo, da água, e de seres humanos, podendo acarretar em desenvolvimento
de tumores ou até mesmo ser letal (KOMÁREK et al., 2010; ANDREAZZA et al., 2013).
Destaca-se que o tween® apresenta redução de, aproximadamente, 47% de sua
eficiência entre as épocas 1 e 2 (Tabela 2). Além de não apresentar efeito de controle do
míldio em videiras em condições de campo (MAIA et al., 2014), demonstrando sua baixa
estabilidade sobre essa doença.
O uso do cobre, presente na CB, é permitido na viticultura orgânica devido à falta de
alternativas de produtos que controlem o míldio, entretanto essas aplicações podem ser
banidas futuramente (TRÖSTER et al., 2017). Esse fato está atrelado as contaminações de
água subterrânea e do solo como relatado por Casali et al. (2008) em vinhedos da Serra
Gaúcha aumento do teor de cobre nas camadas de 20-40 cm do solo. O aumento do teor de
cobre nos tecidos das plantas alteram as propriedades das membranas celulares que afetam o
transporte de íons, ocasionando desiquilíbrios de nutrientes e, principalmente, eleva os teores
de elementos potenciamente tóxicos (JANICKA-RUSSAK et al., 2008; CAMBROLLÉ et al.,
2013).
Esses fatos ocasionam alterações fisiológicas nas videiras como, redução de pigmentos
fotossintetizantes que diminuem o crescimento e desenvolvimento das plantas,
principalmente, devido à redução do sistema radicular. Também observam-se fitotoxidez nas
folhas mais jovens, escassa germinação do polén que resulta em baixa fertilização das flores e
queda de bagas (ROSA et al., 2014; TAIZ; ZEIGER, 2013, AMORIN et al., 2016; MELO et
al., 2016).
Tabela 1: Eficiência e custo dos tratamentos com óleos essenciais (0,12 µL mL-1
) de pitanga
(Eugenia uniflora) (OEP), guaçatonga (OEG) (Casearia sylvestris) e melaleuca (OEM)
(Melaleuca alternifolia), tween®
(0,12 µL mL-1
), acibenzolar-S-metil (ASM) e calda
bordalesa (CB), aplicados em um volume de calda de 400L ha-1
.
Tratamentos Eficiência Época 1 Eficiência Época 2 Custo ha-1
Testemunha - - -
OEP 80,1% 78,99% R$ 28,75*
OEG 78,03% 28,21% R$ 28,75*
OEM 87,02% 59,21% R$ 28,75*
Tween®
62,07% 15,75% R$ 4,75
ASM 60,65% 74,90% R$ 169,60
CB 81,71% 30,20% R$ 2,85 *custo de R$50,00 para 100 mL de cada óleo essencial
88
Nesse sentido os tratamentos com OEP, OEG e OEM apresentassem efeito direto
sobre a germinação de P. viticola e a AACPD do míldio da videira ‗Syrah‘ nos
experimentos em discos de folhas e em plantas em casa de vegetação. Pode-se destacar que
para os experimentos in vivo, os tratamentos com esses óleos essenciais apresentaram
comportamento semelhante ou inferior aos controles químicos com ASM e CB. Dessa
forma, fica claro a eficiência, o potencial, o elevado benefício e o baixo custo de aplicação
nos vinhedos do OEP, OEG e OEM por apresentarem efeito negativo direto sobre P.
viticola.
3.2 Efeito dos óleos essenciais de pitanga, guaçatonga e melaleuca na indução de
resistência de videiras ‘Syrah’ no controle do míldio
3.2.1 Análises bioquímicas
Os dados referente atividade específica das enzimas, superóxido dismutase (SOD),
catalase (CAT), peroxidase (POD) e polifenoloxidase (PPO), a peroxidação lipídica e aos
teores de compostos fenólicos (CF) e peróxido de hidrogênio (H2O2) foram avaliados pela
análise de componentes principais (ACP). Todas essas variáveis passaram pela análise de
fatores (AF) que definiu quais desses atributos iriam compor a ACP, de acordo com os
valores de comunalidades. Os dados que apresentaram comunalidades inferior a 0,70 (70%)
não foram mantidos para posterior análise de componentes principais (ACP).
A soma dos componentes 1 e 2, presentes nas figuras 6 e 7, resultam a porcentagem de
variabilidade, em que os dados explicam a ACP. Dessa forma, observaram-se esse percentual
para as coletas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 e 8 de, 87, 83%; 82,52%; 90,35%; 98,54%; 98,17%; 84,48%;
81% e 87,83% para a primeira época (2016) e 100%; 87,37%; 87,53%; 93,92%; 90,33%;
84,51%; 95,09% e 86,25% para segunda época (2017), respectivamente.
De acordo com os resultados observou-se que o OEP aumentou os teores de H2O2 e de
CF, elevou a atividade das enzimas SOD e CAT e verificou-se PL na coleta 4 na época 1
(Figuras 6, A, B, C, D, 7, B, C, D, E, F e H).O OEG também aumentou o teor de H2O2 e a
atividade de POD (Figuras 6, B, C e D, 7, B e E).
De acordo com todas as coletas realizadas e nas duas épocas de desenvolvimento dos
experimentos observou-se que o OEM destacou-se na indução elevada de todas as variáveis
analisadas. Verificou-se aumento nos teores de CF e de H2O2, também as atividades das
89
enzimas SOD, CAT, POD, PPO e a PL. Destacando-se que esse tratamento apresentou efeito
negativo direto sobre o patógeno e, de acordo com esses dados bioquímicos, também sobre a
planta, o que resultou em redução da AACPD do míldio em casa de vegetação (Figuras 5, A,
B, 6, B, C, D, F, G, H, 7, C e D).
O tween® induziu a atividade de SOD, CAT, POD e PPO, aumentou o teor de CF e
observou-se PL (Figuras 6, C, D, E, F, 7, E, F e H). Porém, de acordo com os dados de
eficiência desse produto para o controle do míldio, destaca-se sua baixa estabilidade entre as
épocas de avaliação da doença (Tabela 2).
O ASM apresentou efeito indutor sobre os teores de H2O2 e CF e sobre as enzimas
SOD, CAT, POD e PPO (Figuras 6 A, C, D, E, F, G, H, 7, A, B, D, E e H).
Para o tratamento com CB observou-se aumento do teor de CF, da atividade das
enzimas SOD, CAT, POD e PPO e PL (Figura 6, A, E, F, G, H, 7, A, C, E, G).
O tratamento testemunha, também apresentou resultados superiores para todas as
variáveis avaliadas (Figuras 6 e 7), porém não foram suficientes para reduzir a AACPD do
míldio em ambas as épocas de experimento (Figuras 5 A e B).
90
Figura 6: Atividade das enzimas superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), peroxidase
(POD), polifenoloxidase (PPO), teores de compostos fenólicos (CF) e peróxido de hidrogênio
(H2O2), em discos de folhas de videira ‗Syrah‘ dos tratamentos com água, 0,12 µLmL-1
dos
óleos essenciais de pitanga (OEP) (Eugenia uniflora), guaçatonga (OEG) (Casearia
sylvestris) e melaleuca (OEM) (Melaleuca alternifolia), tween®
(0,12 µL mL-1
),
A B
DC
E
F
G
H
91
acibenzolar-S-metil (ASM) e calda bordalesa (CB), nas coletas 1, 2, 3 e 4 na primeira
época (2016) (A,C,E e G) e na segunda época (2017) (B,D,F e H).
Figura 7: Atividade das enzimas superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), peroxidase
(POD), polifenoloxidase (PPO), teores de compostos fenólicos (CF) e peróxido de hidrogênio
(H2O2), em discos de folhas de videira ‗Syrah‘, dos tratamentos com água, 0,12 µLmL-1
dos
óleos essenciais de pitanga (OEP) (Eugenia uniflora), guaçatonga (OEG) (Casearia
sylvestris) e melaleuca (OEM) (Melaleuca alternifólia), tween®
(0,12 µL mL-1
),
A B
CD
E F
GH
92
acibenzolar-S-metil (ASM) e calda bordalesa (CB), nas coletas 5,6,7 e 8 na primeira época
(2016) (A, C, E e G) e na segunda época (2017) (B, D, F e H).
De acordo com a atividade média das oito coletas, de todas as enzimas avaliadas e os
teores de H2O2 e com CF, verificou-se que a soma dos componentes 1 e 2, resultaram em
89,26% para época 1 e 86,95% para época 2, ou seja, esses percentuais de variabilidade em
que são explicados os dados de ACP (Figuras 8, A e B).
Para a época 1 (2016) verificou-se a formação de três grupos de tratamentos. O
primeiro composto por OEP e tween®
, o segundo por testemunha e ASM, e o terceiro,
alocado no quarto quadrante, por OEM e OEG. Os tratamentos do primeiro grupo
aumentaram os teores de H2O2. O ASM e a testemunha induziram a atividade da enzima
SOD, CAT e POD. Os demais tratamentos como CB, OEM e OEG apresentam os menores
valores dessas variáveis (Figura 8, A).
Na época 2, também observaram-se a formação de três grupos, no primeiro, segundo
e terceiro quadrante. Ressalta-se que o primeiro grupo é constituído pela testemunha e
ASM; o segundo, por OEM e OEG e; o terceiro, por tween®
e OEP. Os tratamentos do
segundo grupo induzem elevada atividade da enzima SOD e, os do terceiro grupo aumentam
os teores de CF. Para os demais tratamentos observam-se os menores valores para SOD, CF,
CAT e PPO (Figura 8, B).
Figura 8: Efeito da média de todas as coletas, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 e 8, atividade das enzimas
superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), peroxidase (POD), polifenoloxidase (PPO),
teores de compostos fenólicos (CF) e peróxido de hidrogênio (H2O2) defolhas de videira
‗Syrah‘, dos tratamentos com água, 0,12 µL mL-1
dos óleos essenciais de pitanga (OEP)
(Eugenia uniflora), guaçatonga (OEG) (Casearia sylvestris) e melaleuca (OEM) (Melaleuca
alternifolia), tween®
(0,12 µL mL-1
), acibenzolar-S-metil (ASM) e calda bordalesa na
primeira época (2016) (A) e na segunda época (2017) (B).
A B
93
Também, de acordo com a média de todas as coletas, realizou-se ranqueamento das
posições dos tratamentos por escores. Verificou-se, que para a época 1, a ordem dos
tratamentos, que mais induziram as variáveis avaliadas foram a testemunha, ASM, CB,
OEG, OEM, tween®
e OEP; para a época 2, OEM, OEG, tween®
, OEP, CB, testemunha e
ASM (Figuras 9, A e B).
Figura 9: Posições do ranqueamento (R) da média das coletas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 e 8, dos
tratamentos com água (testemunha), 0,12 µL mL-1
dos óleos essenciais de pitanga (OEP)
(Eugenia uniflora), guaçatonga (OEG) (Casearia sylvestris) e melaleuca (OEM) (Melaleuca
alternifolia), tween®
(0,12 µL mL-1
), acibenzolar-S-metil (ASM) e calda bordalesa para
época 1, 2016 (A) e época 2, 2017 (B).
Os resultados da época 1, nos mostram que o tratamento testemunha se destaca em
relação aos demais na ativação de mecanismos de defesa. Esse fato é possível, devido ao
efeito elicitor desencadeado por patógenos. A parede celular do oomiceto P. viticola é
constituída, principalmente, por β-glucanas, e a estrutura desses polímeros apresenta a
capacidade de atuação como atividade elicitora que ativa os mecanismos de defesa das
plantas (BARTNICKI-GARCIA, 1968; PASCHOLATI et al., 2008; FESEL; ZUCCARO,
2016).
Esses elicitores são reconhecidos por receptores presentes na membrana plasmática
das células das plantas, ditos como reconhecimento de padrões (RP), que identificam os
padrões moleculares associados a patógenos (PMAP), o que irá resultar numa imunidade
desencadeada por PMAP (LIU et al., 2016). No momento em que ocorre a interação
elicitor-receptor, as proteínas G aumentam a afinidade por trifosfato de guanina (GTP),
substituindo a sua ligação do difosfato de guanina (DTP) por GTP. Em seguida, ocorre a
BA
94
interação com outras proteínas da membrana plasmática que atuam como canais de íons, as
fosfodiesterases e as fosfolipases. Com isso, forma-se o complexo: proteína G-receptor-
elicitor-proteínas da membrana, que irão adquirir a capacidade de difundir o sinal,
induzindo a atividade de proteínas intracelulares especificas (BOWLES, 1990; EBRAHIM
et al., 2011).
Para que ocorra a transdução de sinal no interior da célula é necessário a fosforilação
de proteínas citoplasmáticas por quinases, que leva à estimulação de uma oxidase de
membrana envolvida na geração do íon superóxido, iniciando a explosão oxidativa (síntese
de espécies reativas ao oxigênio-EROs), a biossíntese do ácido jasmônico e/ou do etileno,
apoptose celular e indução direta da transcrição genética (GILL; TUJELA, 2010).
Todos esses processos, possivelmente, foram desencadeados nessas plantas,
principalmente, com relação à explosão oxidativa. Todavia, não mostraram-se suficientes
para reduzir a AACPD do míldio da videira no tratamento testemunha (Figura 5). Esse fato,
está relacionado aos resultados obtidos por Polesani et al. (2010) que observaram que em
experimento realizado com espécies de videira resistente (Vitis reparia) e suscetível (Vitis
vinifera), verificaram a ativação de mecanimos de defesa em ambas as espécies, porém, em
V. vinifera a transdução de sinal é reduzida e apresenta interação compatível ao patógeno.
Deve-se considerar que a transdução de sinal é mediada pelos fluxos de cálcio na
membrana plasmática. Esse elemento citosólico apresenta variações de indução por
diferentes polímeros de glucanase, ou seja, os fluxos iônicos apresentam alterações
conforme a estrutura da β-glucana. Dependendo da intensidade da despolarização da
membrana plasmática tem-se maior indução de resistência (GAUTHIER et al., 2014). Esse
fato, justifica a ausência de mesmo comportamento da testemunha na época 2, pois os
inóculos utilizados para os experimentos foram provenientes de cidades distintas, o que,
possivelmente, interferiu na estrutura de β-glucana de P. viticola.
Patógenos biotróficos possuem a capacidade de sequestrar a via de sinalização do
ácido abscísico (ABA) para favorecer a infecção, com isso, tem-se carbono nas células
disponível ao oomiceto, beneficiando seu crescimento e o suprimento das respostas de
defesa do hospedeiro. Outro fato que também pode ter colaborado com esse efeito, foi à
capacidade que patógenos com alta esporulação apresentam em superar a resistência das
plantas (HAYES et al., 2010; DELMOTTE et al., 2013).
Nos resultados referentes à OEP, OEG, OEM, tween®
, ASM e CB verificou-se efeito
direto sobre P. viticola e ativação dos mecanismos de defesa de videira ‗Syrah‘.
95
Observando-se elevados teores de CF e H2O2 e atividade das enzimas SOD, CAT, POD e
PPO.
Esses resultados, possivelmente, estão relacionados aos comportamentos elicitores
dos constituintes desses tratamentos. Como o calamemem-10-ona do OEP (Anexo, Figura
20), OEG γ-muroleno (Anexo, Figura 21) e o OEM o 1,8 cineol (Anexo, Figura 22).
Esses elicitores apresentam a capacidade de ativar mecanismos de defesa, de forma
semelhante aos desencadeados pelos patógenos, como já descrito. Com as alterações na
membrana plasmática das células vegetais, modifica-se o potencial transmembrana,
ocasionando a alcanilização extracelular, devido à entrada de H+ e Ca
2+ e a saída de K
+ e Cl
-
. Essa entrada de Ca2+
permite a ativação das espécies reativas de oxigênio (EROs) (DIXON
et al., 1994; LEITE et al., 1997; CAVALCANTI et al., 2005).
Dentre os radicais formados pelas EROs, destaca-se o H2O2, por ser estável, ausente
de carga, moderadamente reativo e com meia-vida considerada longa (1ms). Essas
propriedades permitem à atuação, dessa molécula, em vários processos fisiológicos,
principalmente, a capacidade de desencadear mecanismos de resistência de plantas
(MITTLER et al., 2004; SOARES; MACHADO, 2007).
Os tratamentos com OEP, OEG, OEM e o indutor ASM apresentaram a capacidade
de elevar os teores desse radical, o que provavelmente colaborou com o controle do míldio.
O H2O2 atua na síntese de fitoalexinas, no reforço da parede celular intensificando as
interligações de hidroxiprolina e glicoproteínas ricas em prolina à matriz de polissacarídeos
e no aumento de síntese da lignina com a atividade de peroxidase. O H2O2 mostra-se como
uma molécula de extrema importância, além de desencadear esses processos, também
transmite sinais que podem ativar genes de resistência, sinalizadores entre células vizinhas
para que ocorra a reação de hipersensibilidade e, ainda, possui a capacidade de apresentar
alta toxicidade ao invasor, agindo diretamente sobre o patógeno tentando eliminá-lo
(DEMPSY; KLESSIG, 1995; QUAN et al., 2008; PETERSEN et al., 2009).
Deve-se considerar que o tratamento testemunha na segunda coleta (época 2) (Figura
6, D) apresentou elevada concentração de H2O2. Porém, todos esses efeitos evidenciados
desse radical dependem da sua concentração, do local de síntese, do estádio de
desenvolvimento da planta e das exposições anteriores a diferentes estresses (PETROV;
VAN BREUSEGEM, 2012). Esses fatores, possivelmente interferiram na ausência de
efetividade dessa molécula no tratamento testemunha.
Essas EROs, apesar de todas essas características, quando em concentração elevadas
nas células, tornam-se prejudiciais, ocasionando a peroxidação lipídica (JAMBUNATHAN,
96
2010). Nessa situação, ocorre a formação de lipoperóxidos, que são moléculas oxidativas
que podem mostrar-se destrutivas às células, devido a ação direta sobre os ácidos graxos
insaturados dos fosfolipídios presentes nas membranas (VERMA; DUBEY, 2003; FIORI,
2011).
Esse processo, nas membranas, enfraquece as ligações CH no carbono próximo de
uma dupla ligação no ácido graxo, removendo o átomo de hidrogênio de um grupo metileno
(CH2). Essa reação inicial de OH- com os ácidos graxos poli-insaturados produzem um
radical lipídico (L-), que reage com o oxigênio molecular e origina o radical peroxílico
lipídico (LOO-) que, consequentemente, reage com o ácido graxo adjacente e produz o
hidroperóxido lipídico (LOOH) (CATALÁ, 2006). Tanto o LO- quanto o LOO
- podem
estimular a reação em cadeia da peroxidação lipídica, abstraindo átomos de hidrogênios
(BUETTNER, 1993).
Com isso, tem-se a ruptura da integridade da membrana plasmática, que enfraquece o
tecido vegetal e favorece a infecção pelo patógeno (ANDERSON et al., 1991). As plantas
tratadas com OEP, OEG, OEM, CB e as testemunhas apresentaram peroxidação lipídica (PL).
Destaca-se que na coleta 6 da época 1, (Figura 6, C) observou-se que todos esses óleos
essenciais, induziram maiores teores de H2O2 e elevada PL. Porém, mesmo com esses valores,
em todos esses tratamentos, exceto a testemunha, a PL não favoreceu no desenvolvimento do
míldio nessas videiras ‗Syrah‘.
As plantas que receberam a aplicação desses tratamentos, com exceção da
testemunha, possivelmente, conseguiram utilizar de forma eficiente o H2O2 na via de
sinalização, mantendo-se a concentração desse radical em uma faixa ideal (GONZÁLEZ-
BOSCH, 2017). Dessa forma, mantiveram o equilíbrio entre a geração de EROs e as vias de
eliminação desses radicais, denominadas como sistemas de processamento de espécies
reativas de oxigênio (MITTLER, 2017; NOCTOR et al., 2017). Com isso, verificou-se a
redução do míldio nessas plantas, provavelmente, pela ativação das enzimas,
principalmente, SOD, CAT e POD que apresentam a capacidade de minimizar os efeitos
tóxicos das EROs (MITTLER et al., 2004; BAXTER et al., 2014).
Com relação à atividade da SOD o OEM induziu em maior proporção a atividade
dessa enzima antes da inoculação de P. viticola. Descando-se elevada indução, juntamente
com OEP e OEG na coleta 3 (época 1) (Figura 6, C), ou seja, após 4 hAI, demonstrando a
ativação dos mecanismos de indução de resistência.
Essa enzima tem como principal função catalisar a dismutação do superóxido (O2-)
em oxigênio (O2) e em H2O2 (MIAO; CLAIR, 2009), possivelmente, presentes nas células
97
das plantas nos períodos de elevada ativação da SOD. Além disso, a SOD presente no
núcleo da célula regula a expressão de genes de respostas oxidativas conhecidos por
fornecer resistência ao estresse da oxidação e de replicação e, também, os de reparo aos
danos ocasionados no DNA. Com isso, pode-se dizer que essa enzima apresenta importante
comportamento relacionado ao fator de transcrição nuclear a respostas geral ao estresse
oxidativo (TSANG et al., 2014).
Em relação à CAT observou-se elevada indução desencadeada pela testemunha,
pelos tratamentos padrões com tween®
, ASM e CB. Somente o OEP, comparação à OEG e
OEM, aumentou a atividade dessa enzima nas coletas 2 e 3 (Figura 6 D e E, época 1 e 2),
demonstrando estresse oxidativo na planta, 24 horas após a aplicaçãos dos tratamentos e 4
horas após a inoculação do patógeno.
A CAT é a principal via de degradação do H2O2; portanto, a inibição da atividade
dessa enzima resulta no acúmulo desse radical e a sua ativação elimina o excesso dessa
molécula que em alta concentração pode ocasionar a peroxidação lipídica (CHEN et al.,
1993; GAYATRIDEVI et al., 2012; MITTLER, 2017). Possivelmente nos tratamentos com
OEG e OEM os teores de H2O2 não estavam elevados ao ponto de ocasionar danos
celulares.
Novamente, a testemunha e os tratamentos padrões se destacam na indução da POD.
Para as coletas 2 e 8 (época 2) (Figura 6, B e 7, F) verificou-se que OEG e OEP
apresentaram esse mesmo comportamento.
A POD tem como função realizar a oxidação do H2O2 gerando radicais de
monolignol fenoxi que se pareiam espontaneamente e forma polímeros de lignina que são
depositados na parece celular. Dessa forma, ocorre o fortalecimento da parede celular e
restringe-se a invasão de patógenos, induzindo a resistência dessas plantas (HIRAGA et al.,
2001; BLEE et al., 2003). Essa via de síntese de lignina, provavelmente, foi ativada pelo
tratamento com CB que apresentou aumento de 130% e 3% na deposição de lignina (Figura
8).
Em relação aos CF destaca-se a sua presença normalmente nas plantas, mesmo na
ausência de patógenos, porém na presença desse invasor, tornam-se altamente tóxicos. Essa
toxicidade pode ocorrer através de sua oxidação pela enzima PPO que irá originar as
quinonas. Essas substâncias atuam nos processos enzimáticos de bactérias e fungos
ocasionando alta toxidez a esses micro-organismos (SCHWAN-ESTRADA et al., 2008;
SHALABY; BENJAMIN, 2015).
98
Os CF também podem atuar como intermediários na síntese de lignina,
desempenhando papel importante na resistência estrutural de plantas contra fitopatógenos
através dessa deposição de lignina (ANDREASSON; LAITH, 2017). Todos esses fatos
possivelmente foram desencadeados pelos tratamentos aplicados nas videiras ‗Syrah‘,
principalmente, o OEM que na coleta 1 (época 2) (Figura 6, B) já proporcionou aumento do
teor de CF e na coleta 2 (época 2) (Figura 6, D) induziu a atividade da PPO, antes da
inoculação de P. viticola.
De acordo com os resultados obtidos, reafirmou-se que a videira ‗Syrah‘ é sensível
ao míldio, pois se observou a ativação de mecanismos de defesa no tratamento testemunha,
porém insuficientes para reduzir a doença. A aplicação dos óleos essenciais de pitanga
(OEP), guaçatonga (OEG) e melaleuca (OEM) também intensificaram esses mecanismos e,
em contrapartida, atuaram diretamente sobre P. viticola, reduzindo sua germinação e,
consequentemente, controlaram o míldio.
3.2.2 Determinação do teor de lignina em folhas de videira tratadas com óleos
essenciais de pitanga, guaçatonga e melaleuca
Para a deposição de lignina observou-se que na época 1 (2016), os tratamentos com
OEG, OEM e CB proporcionaram aumento na concentração de lignina de 137,7; 131,6 e
130% nas videiras ‗Syrah‘ em relação à testemunha (Figura 8, A). Entretanto, na época 2
(2017) esses valores foram de 9; 2 e 3% (Figura 8, B), destacando-se que o teor de lignina no
tratamento testemunha na segunda safra foi 137% maior que a testemunha da primeira safra
(Figuras 10, A, B).
99
Figura 10: Teor de lignina de folhas de videiras ‗Syrah‘ tratadas com água (testemunha),
0,12 µL mL-1
dos óleos essenciais de pitanga (OEP) (Eugenia uniflora), guaçatonga (OEG)
(Casearia sylvestris) e melaleuca (OEM) (Melaleuca alternifolia), tween®
(0,12 µL mL-1
),
acibenzolar-S-metil (ASM) e calda bordalesa para época 1, 2016 (A) e época 2, 2017 (B).
Para época 1 as plantas tratadas com OEG, OEM, ASM e CB apresentaram menor
área foliar e massa fresca e seca que a testemunha (Figuras 11, A, C e 12, A), porém o teor
de lignina mostram-se elevados. Esses dados demonstram que a ativação da atividade da
enzima POD e/ou da PPO atuam como responsáveis pela deposição de lignina em folhas de
videira (CAVALCANTI et a., 2007; ALAGAR et al., 2010).
Para que ocorra a lignificação das células deve ocorrer expressão gênica para a
síntese de monolignois que são transportados para a parede celular e oxidados pela POD em
radicais de monolignol, que por intermédio de ligações químicas formam unidades de
guaiacil e seringil, presentes no polímero de lignina (BOERJAN et al., 2003; RALPH et al.,
2004; ZHAO; DIXON, 2011). As PPOs atuam de modo complementar a esse processo,
b b
a a
b
a a
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
Testemunha OEP OEG OEM Tween ASM CB
mg
-1g
-1M
F-1
Óleos essenciais (0,12 µL mL-1)
A
a
cd
ba
cd
a
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
Testemunha OEP OEG OEM Tween ASM CB
mg
-1g
-1M
F-1
Óleos essenciais (0,12 µL mL-1)
B
100
participando da síntese de melanina a partir de difenois oxidados em quinonas, que se ligam
de forma espontânea na parede celular, formando uma barreira fenólica (LI; STEFFENS,
2002; ALAGAR et al., 2010). Dessa forma, todos esses processos impedem a propagação de
enzimas e toxinas no hospedeiro, limitando o desenvolvimento do patógeno e induzindo a
resistência das plantas (SMITH et al., 2007; BARROS et al., 2010).
Levando-se em consideração o desenvolvimento das plantas na época 2, ressalta-se
que o tratamento testemunha apresenta elevados teores de lignina. Esse fato, possivelmente, é
o resultado de todo o processo enzimático ativado na época 1, para impedir o
desenvolvimento de P. viticola, que porém mostrou-se ineficaz, ressaltando a susceptibilidade
dessas plantas a esse patógeno. Silva et al. (2017) ressaltam que apenas a inoculação do
patógeno pode promover o aumento do teor de ligninas em plantas de tomateiro. Esse fato,
possivelmente, está relacionado com o reconhecimento do patógeno pelo hospedeiro que
desencadeiam reações do sistema de defesa, tentando impedir a penetração ou a restrição da
colonização do invasor (RESENDE et al., 2007; LUCAS et al., 2012).
Os demais tratamentos, principalmente o OEM e a CB, proporcionaram elevada
lignificação, aumento no desenvolvimento dessas plantas e controle do míldio da videira
(Figura 5). Silva et al. (2017) também observaram que aplicações de óleos essenciais de
Cymbopogon sp. (citronela) e Cymbopogon citratus (capim-limão) inibiram o
desenvolvimento de Pseudomonas syringae in vitro e in vivo, também promoveram aumento
no teor de lignina em plantas de tomate, proporcionando o controle da pinta bacteriana.
Lorenzetti et al. (2018) também ressaltam que o extrato bruto obtido de plantas de alecrim (R.
officinalis) induz a atividade da POD em plantas de soja, o que, segundo os autores, aumenta
os teores de lignina, dificultando a infecção por Macrophomina phaseolina.
3.2.3 Área foliar, massa fresca e seca de folhas de videira ‘Syrah’ tratadas com óleos
essenciais de pitanga, guaçatonga e melaleuca
Os tratamentos com OEP e OEG reduziram em 90,6 e 92,3%, repectivamente, a área
foliar das videiras ‗Syrah‘, na época 1 (2016). Os tratamentos com OEM e ASM foram
estatisticamente semelhantes, sendo que ambos reduziram em aproximadamente 87% a área
foliar em relação ao tratamento testemunha (Figura 11, A).
Na época 2 (2017) o ASM foi o tratamento que proporcionou maior área foliar com,
aumento de 257,1% em relação à testemunha. O OEP, OEG e OEM aumentaram em 170,6;
158,1 e 81,1%, respectivamente, também em relação a testemunha (Figura 11, B).
101
Os tratamentos reduziram a massa fresca e seca das folhas de videira ‗Syrah‘ na época
1 (Figuras 12, A e C). Para a época 2, destaca-se que o ASM que aumentou em 223% a massa
fresca e os tratamento com OEP, OEG e OEM em 147,5; 158,5 e 90%, respectivamente, em
relação ao tratamento testemunha (Figura 12, B). Para massa seca esses valores foram de
267,5; 171,6; 214,8 e 202,7%, respectivamente (Figura 12, D).
Figura 11: Área foliar (cm2) de videiras ‗Syrah‘ tratadas com 0,12 µL mL
-1 dos óleos
essenciais de pitanga (Eugenia uniflora), guaçatonga (Casearia sylvestris) e melaleuca
(Melaleuca alternifolia), tween® (0,12 µL mL
-1), acibenzolar-S-metil (ASM) e calda
bordalesa para. Épocas 1( 2016) (A) e 2 (2017) (B).
a
cd dc bc c
d
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
Testemunha OEP OEG OEM Tween ASM CB
Áre
a f
oli
ar
(cm
2)
Óleos essenciais (0,12 µL mL-1)
A
e
b cd
d
c
a
e
0
200
400
600
800
1000
1200
Testemunha OEP OEG OEM Tween ASM CB
Áre
a f
oli
ar
(cm
2)
Óleos essenciais (0,12 µL mL-1)
B
102
Figura 12: Massas fresca (g) (épocas 1, 2016 (A) e 2, 2017 (B)) e seca (g) (épocas 1, 2016
(C) e 2,2017 (D)) de folhas de videiras ‗Syrah‘ tratadas com 0,12 µL mL-1
dos óleos
essenciais de pitanga (OEP) (Eugenia uniflora), guaçatonga (OEG) (Casearia sylvestris) e
melaleuca (OEM) (Melaleuca alternifolia), tween®
(0,12 µL mL-1
), acibenzolar-S-metil
(ASM) e calda bordalesa.
Para a época 1 verificou-se que os tratamentos reduziram a área foliar, massa fresca e
seca em relação à testemunha. Com esses resultados verifica-se que os óleos essenciais e os
a
cc
bb b
c
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Testemunha OEP OEG OEM Tween ASM CB
Ma
sssa
fre
sca (
g)
Óleos essenciais (0,12 µL mL-1)
A
e
bc bd cd
a
e
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Testemunha OEP OEG OEM Tween ASM CB
Ma
ssa
fre
sca (
g)
Óleos essenciais (0,12 µL mL-1)
B
a
b bb b b
b
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
Testemunha OEP OEG OEM Tween ASM CB
Ma
ssa
seca
(g
)
Óleos essenciais (0,12 µL mL-1)
C
dabc ab
c bca
d0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
Testemunha OEP OEG OEM Tween ASM CB
Ma
sssa
sec
a (
g)
Óleos essenciais (0,12 µL mL-1)
D
103
tratamentos padões apresentam efeito residual nas plantas e, também, pode-se relacionar esses
dados à ativação dos mecanismos de defesa desencadeados nessas plantas, com isso ocorre
consumo de energia e fotoassimilados para esse processo, reduzindo esses recursos para o
crescimento da planta (GAYLER et al., 2007). Armijo et al. (2016) também ressaltam que
quando há interação compatível entre a videira e P. viticola, os genes relacionados a
fotossíntese e ao metabolismos primário são afetados de forma negativa, mantendo-se apenas
30% desses ativos. Dessa forma, ressalta-se a suceptibilidade dessas plantas em contato com o
patógeno reduzindo o desenvolvimento das plantas.
Na época 2 observa-se efeito contrário da época 1, pois a testemunha apresenta
desenvolvimento reduzido em relação aos demais tratamentos. Esse fato está relacionado com
a elevada severidade do míldio nesse tratamento (Figura 5), pois o P. viticola pode despender
prejuízos de até 75% da produtividade. Dentre os problemas que colaboram com essa
porcentagem tem-se a queda do rendimento, devido a desfolha proporcionada pelo
desenvolvimento da doença, que não se limita em apenas em um ciclo da cultura, mas sim,
em efeitos acumulativos no decorrer do desenvolvimento do vinhedo (MATASCI et al., 2008;
MADDALENA, 2017).
Diante do exposto pode-se dizer que OEP, OEG e OEM apresentam efeito direto sobre
P. viticola e ativam mecanismos de defesa em videiras ‗Syrah‘, o que resulta na ausência de
redução do desenvolvimento dessas plantas nas próximas épocas de cultivo.
104
4 CONCLUSÃO
O OEP, OEG e OEM reduzem a germinação e a viabilidade dos esporângios de
P. viticola;
Controlam o míldio em discos de folhas e em mudas de videira ‗Syrah‘;
Ativam mecanismos de defesa de plantas de videira ‗Syrah‘;
Melhoram o desenvolvimento dessas plantas para as próximas épocas de
cultivo.
105
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than we thought?.Trends Plant Science, v. 16, n. 4, p. 227-233, 2011.
115
CAPITULO II: ÓLEOS ESSENCIAIS NO CONTROLE DE Botrytis cinerea SOBRE A
QUALIDADE PÓS-COLHEITA DE UVAS ‘RUBI’
RESUMO
Uvas ‗Rubi‘ apresentam alta qualidade de seus frutos, porém mostram-se sucetiveis ao mofo
cinzento (Botrytis cinerea). Neste sentido, o presente trabalho tem o objetivo de verificar o
potencial dos compostos voláteis presentes no óleo essencial de pitanga (OEP), guaçatonga
(OEG) e melaleuca (OEM) no controle de Botrytis cinerea in vitro e do mofo cinzento em
frutos. Para verificar o efeito direto desses compostos voláteis sobre B. cinerea foram
aplicados 20 µL de cada óleo, em papel germitest e, em seguida, fixado na tampa de placa de
Petri e, então, avaliou-se o crescimento micelial do patógeno. Quanto ao potencial sobre os
frutos, no centro de bandejas de polietileno contendo as bagas colocou-se também papel
germitest com a mesma concentração dos tratamentos e avaliou-se a incidência do mofo
cinzento em bagas de uvas ‗Rubi‘, os teores de sólidos solúveis (SS), acidez titulável (AT) o
ratio (relação SS/AT) e a indução de resistência, de acordo com a atividade das enzimas
polifenoloxidase (PPO), fenilalanina amônio liase (PAL), β-1,3-glucanase (GLU) e quitinase.
De acordo com os resultados observou-se que os compostos voláteis liberados pelos óleos
essenciais reduziram os índices de velocidade de crescimento micelial de B. cinerea e de
doença do mofo cinzento. Os tratamentos com voláteis de OEP e OEG ativaram mecanismos
de indução de resistência desses frutos. Dessa forma, ressalta-se que OEP, OEG e OEM
liberam compostos que apresentam a capacidade de agir diretamente sobre B. cinerea e,
também, induzem a resistência de uvas ‗Rubi‘ reduzindo o mofo cinzento nessas uvas.
Palavras chave: Compostos voláteis, polifenoloxidase, fenilalanina amônio liase, β-1,3-
glucanase, quitinase.
116
CHAPTER II: ESSENTIAL OILS IN THE CONTROL OF BOTRYTIS CINEREA ON
THE POST-HARVEST QUALITY OF 'RUBI' GRAPE
ABSTRAT
'Rubi' grapes have a high quality of their fruits, but are shown to be succesful to gray mold
(Botrytis cinerea). In this sense, the present work has the objective of verifying the potential
of the volatile compounds present in the essential oil of pitanga (EOP), guaçatonga (EOG)
and melaleuca (EOM) in the control of Botrytis cinerea in vitro and gray mold in fruits. To
verify the direct effect of these volatile compounds on B. cinerea, 20 μL of each oil was
applied on germitest paper and then fixed in the lid of Petri dish and then the mycelial growth
of the pathogen was evaluated. Regarding the potential on the fruits, in the center of
polyethylene trays containing the berries was also placed germitest paper with the same
concentration of the treatments and evaluated the incidence of gray mold in berries of 'Rubi'
grapes, the soluble solids contents (SS), titratable acidity (TA), the ratio (SS /TA ratio) and
induction of resistance, according to the activity of the polyphenoloxidase (PPO),
phenylalanine ammonium lyase (PAL), β-1,3-glucanase (GLU) and chitinase enzymes.
According to the results it was observed that the volatile compounds released by the essential
oils reduced the rates of mycelial growth rate of B. cinerea and of gray mold disease. The
treatments with volatile EOP and EOG activated mechanisms of resistance induction of these
fruits. Thus, EOP, EOG and EOM release compounds that have the ability to act directly on
B. cinerea and also induce the resistance of 'Rubi' grapes by reducing the gray mold in these
grapes.
Keywords: Volatile compounds, polyphenoloxidase, phenylalanine ammonia lyase, β-1,3-
glucanase, chitinase
117
1 INTRODUÇÃO
Videiras da espécie Vitis vinifera apresentam capacidade de acumular compostos
como ácidos orgânicos, principalmente, o tartárico e o málico que interferem nas propriedades
organolépticas dos frutos; e compostos fenólicos, como fenóis e antocianinas que favorecem
na qualidade de seus frutos, principalmente, aqueles destinados ao consumo in natura
(FRAIGE et al., 2014; FERRANDINO et al., 2017). Dentre as cultivares de videira
designadas à essa finalidade está a ‗Rubi‘, que originou-se de uma mutação somática da
‗Itália‘, que se destaca por ser planta vigorosa, com cachos grandes, e por apresentar
produtividade média de 30 t ha-1
, porém, com relação a pragas e doenças possuem baixa
resistência (POMMER et al., 1997; TERRA et al., 1998)
A susceptibilidade da videira ‗Rubi‘ as doenças, principalmente, ao mofo cinzento
(Botrytis cinerea) faz com que ocorra redução em sua produtividade e na qualidade pós-
colheita desses frutos, devido aos danos desse patógeno que podem ocorrer na pré-colheita,
durante o transporte ou no armazenamento das uvas (CAMILI et al., 2007). Nas folhas
apresenta como sintoma manchas necróticas próxima às nervuras, que em condições de alta
umidade apresentam esporulação cinza na face inferior da folha (LATORRE et al., 2015). Os
tecidos florais podem ser infectados, porém, não apresentam sintomas, somente na baga se
observa na sua base descoloração avermelhada que progride em direção oposta. Quando a
infecção ocorre no momento da colheita observa-se a presença de rachadura na baga, local
onde também se encontra mancha necrótica de coloração avermelhada lateral (ZOFFOLI et
al., 2009).
São utilizados produtos químicos para o controle dessa doença, como mancozebe,
clorotalonil, tiofanato-metílico, procimidona, entre outros, que segundo a agência nacional de
vigilância sanitária (ANVISA) apresentam classificação toxicológica que se extende desde
baixa até extremamente tóxico para a saúde humana e para o ambiente. Como forma de
eliminar ou ao menos reduzir esses impactos, tem-se buscado produtos alternativos que visam
o controle de doenças e tendem a atender as necessidades de limitar os riscos de ingestão e
contaminação desses compostos químicos (ARRUDA et al., 2011).
Dentre esses produtos alternativos está a o uso de óleos essenciais como os de pitanga
(Eugenia uniflora), guaçatonga (Cacearia sylvestris) e melaleuca (Melaleuca alternifolia),
principalmente por apresentarem compostos antimicrobianos. Os óleos essenciais dessas
plantas são extraídos das folhas, o de pitanga apresenta dentre os componentes majoritários o
118
furanodieno (17,9%) e linalol (5,76%), o de guaçatonga o cariofileno (86,6%) e pineno (2%),
o de melaleuca cineol (36%), limoneno (4%) e pineno (6%) (JESUS et al., 2007; FERREIRA
et al., 2011; THAMBI et al., 2013), esses compostos apresentam propriedades antibacterianas,
antifúngicas ou de atuarem como elicitores na ativação de mecanismos de defesa (MAIA et
al., 2014; SOUZA et al., 2015).
Dessa forma, o trabalho teve como objetivo analisar se os compostos voláteis
presentes nos óleos essenciais de pitanga, guaçatinga e melaleuca apresentam ação
antifúngica sobre B. cinerea, controla o mofo cinzento, induz resistência e interfere na
qualidade pós-colheita de bagas de uvas ‗Rubi‘.
119
2 MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Obtenção dos óleos essenciais de pitanga, guaçatonga e melaleuca
Os óleos essenciais de pitanga (OEP), guaçatonga (OEG) e de melaleuca (OEM)
utilizados nos experimentos foram cedidos pela Universidade Tecnológica Federal do Paraná
(UTFPR) - Campus Dois Vizinhos. Todos são oriundos da Empresa Garden City (Ibiúna-SP)
que também disponibilizou a cromatografia dos óleos (Anexo), realizada pela Embrapa
Floresta (Colombo-PR).
2.2 Local dos experimentos
Os experimentos foram realizados no laboratório de Fitopatologia e as análises das
enzimas no laboratório de Análises de Pós-Colheita de Frutas e Hortaliças do Departamento
de Agronomia da Universidade Estadual do Centro Oeste (UNICENTRO).
2.3 Compostos voláteis dos óleos essenciais no crescimento micelial de Botrytis cinerea
e no controle do mofo cinzento em uva ‘Rubi’
O meio de cultura BDA (Batata-Ágar-Dextrose) autoclavado por 20 minutos a 120°C
sob pressão de 1 atm foi vertido em placas de Petri e, em seguida, foi adicionado um disco de
1,5 cm de diâmetro de micélio de B. cinerea no centro de cada placa. Do lado oposto ao meio
de cultura, ou seja, na tampa, foi colocado fita duplaface para fixar 1 cm2 de papel germitest
contendo 20 µL dos tratamentos com água, OEP, OEG e OEM à 100%. Em seguida, as placas
foram acondicionadas em sala climatizada com temperatura de 25°C e fotoperíodo de 12
horas. Com o intuito de avaliar o tempo de contato dos compostos voláteis presentes nos
tratamentos com o patógeno, parte do experimento ficou em contato por 1 hora e outra por 96
horas (período necessário para que o patógeno presente no tratamento testemunha crecesse em
toda a placa de Petri).
Após 24 horas da instalação do experimento, avaliou-se diariamente o crescimento
micelial pelo diâmetro da colônia, até que o tratamento testemunha crescesse em toda a placa,
totalizando, 4 avaliações. Esses dados foram utilizados no cálculo do índice de velocidade de
crescimento micelial (IVCM), conforme a fórmula: IVCM=∑(D-Da)/N, sendo D= diâmetro
médio atual da colônia; Da= diâmetro médio da colônia do dia anterior e N= número de dias
após a inoculação (ARAÚJO et al., 2008).
120
Os cachos das uvas ‗Rubi‘,enxertadas sobre IAC-766 no ciclo do ano de 2015 (safra
Julho/Agosto) foram colhidos dia 07/07 em vinhedo comercial com espaçamento 3 x 6
metros, conduzidas em latada com poda longa realizada em Junho, deixando-se 5 gemas e a
poda longa Temporã em Novembro com 10 a 12 gemas. Essa propriedade está localizada no
município de Marialva (PR) e o clima da região é classificado como CFa, segundo Köppen e
as coordenadas do local são :23°27'49,86"S, 51°47'18,74" O e altitude de 614m. O solo é
classificado como latossolo e nitossolo vermelho e eutroférrico com textura muito argilosa e
relevo de plano a ondulado (SANTOS, 2006).
Logo após a colheita seguiu-se a recomendação do regulamento técnico de identidade
e qualidade para a classificação de uvas de mesa. Dessa forma esses frutos foram
acondiciondos em caixas de papelão ondulado, aberta com capacidade de 12 kg. Em seguida
foram transportadas de forma refrigerada para a cidade de Guarapuava (PR) (284 km) e
acondicionadas em câmara fria (1±2°C e 95%UR) por 19 dias, quando estas uvas foram
selecionadas para a condução dos experimentos.
Essa seleção foi baseada na ausência de qualquer sintoma de doença fúngica e danos
nas bagas. Em seguida separaram-se quatro bagas por cacho e foram colocadas, cinco dessas
estruturas (parcela experimental) em bandejas de poliestileno, previamente desinfestadas com
hipoclorito de sódio a 1%, contendo papel toalha no fundo com algodão umedecido e no
centro 2 cm2 de papel germitest com uma alíquota de 20 µL de OEP, OEG, OEM (todos a
100%) e a testemunha com água (Figura 23). Posteriormente, essas bandejas foram fechadas
com saco plástico para manter a umidade e acondicionadas em sala climatizada a 25°C. Parte
do experimento deixou-se o papel germitest com os tratamentos por 1 hora dentro das
embalagens e outra por 13 dias, período necessário para o desenvolvimento e avaliação do
mofo cinzento nas uvas (Figura 13).
121
Figura 13: Forma de organização das bagas em bandejas de poliestileno contendo papel
toalha, algodão umedecido e no centro 2 cm2 de papel germitest. Em cada recipiente referente
aos seus respectivos tratamentos, foram pipetados, nesse papel, 20 µL dos tratamentos com
água e os óleos essenciais de pitanga (E. uniflora) (OEP), guaçatonga (C. sylvestris) (OEG) e
melaleuca (M. alternifolia) (OEM).
Após 24 horas foi realizada a coleta de duas bagas para a análise de enzimas, que em
seguida, foram acondicionadas em freezer a -20°C. Posteriormente foi inoculada suspensão de
B. cinerea na concentração de 2,2 x 105 conídios mL
-1 nas demais bagas. Após seis dias
iniciaram-se as avaliações diárias do índice de doença (%) do mofo cinzento, de acordo com a
escala de nota de Camili et al. (2007), por cinco dias. No último dia de avaliação, duas bagas
de cada parcela experimental foram transferidas para freezer a -20°C para determinação de
compostos fenólicos e análise da atividade enzimática, as demais foram utilizadas nas análises
pós-colheita.
2.3.1 Compostos voláteis dos óleos essenciais na qualidade pós-colheita de uva ‘Rubi’
As bagas destinadas às análises de pós-colheita foram trituradas em liquidificador e a
partir desse mosto determinou-se o teor de sólidos solúveis (SS), acidez titulável (AT) e
―ratio‖, relação SS/AT.
O teor de sólidos solúveis (SS) foi determinado por refratometria utilizando-se
refratômetro digital portátil PR 100-ATAGO e o resultado expresso em °Brix. A acidez
titulável foi verificada por titulação do mosto em solução padronizada de NaOH obtendo-se
122
como ponto final dessa análise pH 8,2 e seu resultado apresentado em porcentagem de ácido
tartárico. Para isso, utilizou-se a seguinte fórmula:
AT=V*f*100/P*c
V: quantidade, em mL, da solução de hidróxido de sódio utilizada na titulação;
F: fator da solução de NaOH;
P: a quantidade, em g, de amostra usada no procedimento e;
c : correlação para a solução de NAOH.
O ―ratio‖ (relação SS/AT) foi calculado pelos resultados da relação de sólidos solúveis
(SS) obtidos pela acidez titulável (AT) (INSTITUTO ADOLF LUTZ, 1985).
Para determinação do teor de compostos fenólicos utilizou-se 1g de casca das bagas
das uvas ‗Rubi‘ que foram maceradas mecanicamente em almofariz e, em seguida, adicionou-
se 6 mL de etanol 80% e agitou-se em mesa agitadora por 30 minutos à 200g. Transcorrido
esse tempo foi incubada por 30 minutos a 60°C em banho maria e centrifugada por 15
minutos a 3000g (ROSSI, 1965). Foram colocados 50 µL desse substrato em tubos de ensaio
protegidos da luz e, posteriormente, adicionou-se 2,5 mL do reagente de Folin Ciocateau e 2
mL de carbonato de cálcio. Essa solução ficou armazenada em temperatura ambiente no
período de duas horas e, logo após, realizou-se a leitura em espectrofotômetro com
comprimento de onda de 740 nm. Os resultados foram comparados com a curva padrão de
ácido gálico e expressos em mg de ácido gálico 100g-1
de massa seca (AOAC, 1992).
2.3.2 Efeito de compostos voláteis dos óleos essenciais na atividade de enzimas de
indução de resistência de uvas ‘Rubi’
As uvas ‗Rubi‘ foram coletadas 24 horas após ficar em contato com os tratamentos e
no último dia de avaliação do índice de doença de mofo cinzento. Em seguida foram
descascadas e suas cascas armazenadas em freezer a -20°C. Posteriormente foram pesadas 1g
de casca e maceradas em almofariz com 0,15g de micropérolas de vidro, 0,1g de resina
Dower 1-X8 e 0,5g de PVPP. Em seguida foi adicionado 4 mL de tampão borato de sódio
0,1M (pH 8,8) composto por EDTA 1mM, dithiothreitol (DTT) 1mM e ácido ascórbico
50mM. Posteriormente foi centrifugado a 15000g durante 40 minutos a 4°C.
O extrato enzimático foi obtido do sobrenadante dessa centrifugação que, em seguida,
foi armazenado em freezer -20°C até a determinação do teor de proteínas totais, atividade
específica da polifenoloxidase (PPO), fenilalanina amônio liase (PAL), quitinase e β-1,3-
glucanase (GLU).
123
O teor de conteúdo proteico total das cascas de uvas ‗Rubi‘ foi determinado com a
utilização de 100 µL do extrato enzimático adicionado sob agitação em 2,5 mL do reagente
Bradford e 5 minutos depois, foi efetuada a leitura em espectrofotômetro com comprimento
de onda de 595 nm. A concentração de proteínas, expressa em mg por mL de amostra (mg
proteína.mL-1
), foi determinada utilizando-se curva-padrão de concentrações de albumina de
soro bovino (ASB) (BRADFORD, 1976).
Para a determinação da atividade da enzima polifenoloxidase (PPO) (E.C. 1.10.3.2)
utilizou-se como substrato enzimático solução contendo 25 mM de catecol homogeneizada
em 50 mL de tampão fosfato de potássio a 0,1 M pH 6,0. Adicionou-se 200 µL do extrato
enzimático com 2,8 mL dessa solução em tubos de ensaio que, em seguida, foram colocados
por 10 minutos em banho-maria com temperatura de 30°C. Posteriormente realizou-se a
leitura em espectrofotômetro com comprimento de onda a 410 nm que determinou a oxidação
do catecol em quinona e a atividade da enzima foi expressa em U A mgp-1
min-1
(GAUILLARD, 1993).
Foram utilizados três tubos para a determinação da atividade da enzima fenilalanina
amônio liase (PAL) (E.C. 4.3.1.5). No primeiro (tubo- amostra) foi pipetado 100 µL de
extrato enzimático com 400 µL de tampão TRIS e 500 µL de L-fenilalanina. No segundo
(tubo-controle), 100 µL de amostra com 900 µL de tampão TRIS e no terceiro (tubo-branco),
500 µL de tampão TRIS com 500 µL de L-fenilalanina. Em seguida foram incubados em
banho-maria à 40°C por 1 hora. Transcorrido esse período realizou-se a leitura em
espectrofotômetro com comprimento de onda de 290 nm (RODRIGUES et al., 2006). A
atividade dessa enzima foi avaliada de acordo com a diferença de absorbância resultante da
conversão da fenilalanina em ácido trans-cinâmico (HYODO et al., 1978).
Para a determinação da atividade da enzima β-1,3-glucanase (GLU) (E.C. 3.2.1.6) foi
adicionado 500 µL do extrato enzimático com 300 µL de acetato de sódio 50 mM, pH 5,0 e
200 µL de substrato enzimático composto pelo reagente CM-Curdlan-RBB 2 mg mL-1
. Em
seguida, essa reação foi incubada a 40°C por 2 horas e interrompida com a adição de 200 µL
de HCl 2N e resfriada em gelo por 10 minutos.
Posteriormente, os tubos foram centrifugados por 5 minutos a 10.000g para a remoção
do substrato insolúvel não hidrolisado e, por fim, realizou-se a leitura em espectrofotômetro
com comprimento de onda de 600 nm, mensurando-se os oligômeros de glucanas corados
pelo reagente CM-Curdlan-RBB (Metodogia de WIRTH; WOLF (1990), descrita por
GUZZO; MARTINS, 1996).
124
Para a análise da atividade da quitinase (E.C. 3.2.1.14) utilizou-se 100 µL de substrato
para quitinase com tampão acetato de sódio e 100 µL de extrato enzimático que ficaram
incubados por 1 hora em banho-maria com temperatura de 50°C. Após esse período foi
centrifugado a 7000g por 10 minutos e o sobrenadante foi retirado e realizada a sua leitura em
espectrofotômetro a 595 nm que determinou os oligômeros de quitina corados pleo substrato
para quitinase (metodologia desenvolvida por MOERSCHBACHER (1988) e descrito por
GUZZO; MARTINS (1996)).
2.4 Delineamento experimental e análise estatística
O delineamento experimental de todos os experimentos descritos neste trabalho foram
inteiramente casualizado, em esquema fatorial 3 x 2 (3 tipos de óleos essenciais em 2 tempos
de exposição) com quatro repetições, instalado em duplicatas. Dessa forma, os resultados
apresentados são referentes à média dos dois experimentos de cada análise.
Os dados foram submetidos à análise de variância (teste F), sendo as médias
comparadas pelo teste Tukey ao nível de 5% de probabilidade, utilizando o programa
estatístico Sisvar (FERREIRA, 2011).
125
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 Compostos voláteis dos óleos essenciais no crescimento micelial de Botrytis cinerea
in vitro e no controle do mofo cinzento em uvas ‘Rubi’
Com relação ao índice de velocidade de crecimento micelial (IVCM) de B. cinerea
verificou-se interação entre os óleos essenciais e o tempo de contato com os tratamentos.
Ressalta-se que o OEM reduziu em 43,1 e 68,8%, respectivamente, em relação à testemunha
para os tempos de exposição de 1 e 96 h (Figura 14). Destaca-se também que na comparação
entre esses tempos, 1 e 96 h, para o OEM ocorreu redução de 48,3% do IVCM (Figura 14, A).
Com relação ao índice de doença (ID) do mofo cinzento observou-se que o OEM
induziu em 21,2% e o OEP e OEG reduziram em 45,7 e 43,1%, respectivamente, em relação
ao tratamento testemunha (Figura 14, B).
126
Figura 14: Índices de velocidade de crescimento micelial (IVCM) de Botrytis cinerea e de
mofo cinzento, sob efeito direto de compostos voláteis dos óleos essenciais de pitanga (OEP)
(Eugenia uniflora), guaçatonga (Casearia sylvestris) (OEG) e melaleuca (OEM) (Melaleuca
alternifolia) à 100%. Letras minúsculas estão relacionadas com os tratamentos e as
maiúsculas entre o tempo.
Os compostos voláteis presentes nos óleos essenciais sintetizados pelas plantas,
apresentam substâncias com elevado potencial para a prevenção e controle de infecções
patogênicas (MARI et al., 2016). Isso é possível devido a capacidade de adsorção dos
compostos voláteis na cutícula do tecido vegetal que pode desencadear efeito direto sobre o
micro-organimos ou ativar mecanismos de defesa (HIMANEN et al., 2010 ; QUINTANA-
RODRIGUEZ et al., 2015).
Esse fato pode se remeter aos compostos voláteis presentes no OEP, OEG e OEM. No
que diz respeito aos componentes presentes em pitanga, Marques (2014) verificou que o
extrato etanólico na dose de 1,0% inibe em 40% o crescimento micelial de Sclerotinia
sclerotum, devido as alterações marcantes nas hifas desse patógeno, observando aumento nos
bBbB
bB
aB
bAbA bA
aA
0
1
2
3
4
5
6
Testemunha OEP OEG OEM
IVC
M
Compostos voláteis de óleos essenciais (100%)
1 hora
96 horas
A
b
a a
b
0
5
10
15
20
25
Testemunha OEP OEG OEM
Índ
ice d
e d
oen
ça (
%)
Compostos voláteis de óleos essenciais (100%)
B
127
vacúolos observados em corte transversal e elevado número de peroxissomos e de
mitocôndrias no citoplasma.
Esse efeito inibitório no crescimento fúngico pode estar diretamente relacionado com
a degeneração das hifas. Essas alterações são decorrentes da coagulação citoplasmática, da
intensa vacuolização e da perda da integridade da membrana plasmática (PÂRVU et al., 2013;
SHÃO et al., 2013). Bakkali et al. (2008) também ressaltam que os óleos essenciais podem
acarretar citotoxicidade, fototoxicidade, mutagenicidade citoplasmática e nuclear,
carcinogenicidade e propriedades antimutagênicas. Essas alterações morfológicas,
possivelmente, ocorreram no B. cinerea em contato com os compostos voláteis de OEP, OEG
e OEM.
Quando as plantas entram em contato com algum patógeno, naturalmente, emitem
compostos voláteis ricos em monoterpenos e sesquiterpenos. Videiras resistentes ao
Plasmopara viticola liberam, principalmente muroleno, cariofileno e germacreno B, como
forma de proteção (LAZAZZARA et al., 2018). Esses compostos são encontrados no OEP e
em OEG que possivelmente foram os responsáveis pela redução do mofo cinzento nas bagas
de uva ‗Rubi‘. Segundo Lazazzara et al. (2018) o cariofileno, também presente no OEP,
apresenta volatilização lenta, o que permite a formação de envelopes de proteção sobre o
tecido vegetal. Possivelmente foi essa a forma de proteção proporcionada pelo OEP nos frutos
de uva.
Os terpenos que compõem os óleos essenciais são reconhecidos por interferirem nas
membranas mitocondriais dos micro-organismos causando morte microbiana
(GERSHENZON; DUDAREVA, 2007; BAKKALI et al., 2008). Lorenzetti et al. (2011)
observaram que os voláteis do OEM inibem em aproximadamente 80% o crescimento
micelial de B. cinerea. Wei et al. (2018) também observaram a sensibilidade desses patógenos
em contato com o OEM e, verificaram que a associação com o ar quente causa danos e
redução no crescimento micelial de suas hifas.
Esse acontecido também foi relatado por Li et al. (2017) que observaram que o OEM
(2 mL) danifica severamente as mitocôndrias de B. cinerea, resultando em irregularidades e
perda da matriz mitocondrial. Relataram aumento na permeabilidade dessa membrana,
evidenciando, no interior das células, a redução do conteúdo de trifosfato de adenosina (ATP)
e sua elevada concentração no meio extracelular. As altas concentração de OEM diminuem as
atividades das enzimas mitocondriais e do ácido tricarboxílico afetando as desidrogenases
málica e succinato, ATPase, entre outras, que permitem o aumento acentuado de espécies
reativas ao oxigênio (EROs) nas mitocôndrias de B. cinerea.
128
A presença dessas EROs nas células fúngicas causam a peroxidação lipídica que tende
a ocorrer na membrana plasmática removendo o grupo metileno (CH2) formando CH que
enfraquece a ligação dupla próxima ao ácido graxo. Dessa forma, ocosiona mudanças na
fluidez dessa estrutura celular alterando o transporte de íons e inibição dos processos
catabólicos (CATALÁ, 2006 e 2009).
No caso do B. cinerea os compostos voláteis presentes nos óleos essenciais são mais
eficazes do que o contato direto com esses óleos. Essa afirmação foi relatada por Soylu et al.
(2010) que observaram que os voláteis dos óleos essenciais de orégano (Oreganum syriacum)
(0,2 µg mL-1
), alecrim (Rosmarinus officinalis) (1,6 µg mL-1
) e lavanda (Lavandula stoechas)
(1,6 µg mL-1
) inibem completamente o crescimento de B. cinerea. Benato et al. (2018)
também ressaltam que os constituintes voláteis do óleo essencial de canela (Cinnamomun
zeylanicum) reduz o ICVM de Penicilium digitatum, agente causal do bolor verde da laranja.
A dose de 0,5g L-1
dos óleos essenciais de canela e capim-limão (Cynbopogon citratus)
mostraram-se efetivas no controle da doença nos frutos, observando que o óleo essencial de
C. citratus reduziu em 53% a AACPD em relação à testemunha.
Medeiros et al. (2011) adicionaram sachês contendo óleo essencial de orégano (O.
vulgaris) e capim-limão (C. citratus) no interior de sacos de papel utilizados no
armazenamento de mangas. Verificaram efeito direto dos compostos voláteis desses óleos
essenciais no controle in vitro de Alternaria alternata e Colletotrichum gloeosporioides.
Ressaltando também a redução de micro-organismos filamentosos sobre os frutos.
Munhuweyi et al. (2018) verificaram que a adição de óleo essencial de canela contendo
cariofileno, também encontrado no OEP, em micropartículas de embalagens para frutos
controla o desenvolvimento de B. cinerea.
Esses fatos foram observados no presente trabalho para o controle do mofo cinzento
em uva, quando foi utilizado OEP e OEG. Para LOU et al. (2017) o efeito inibidor de
patógenos aumenta com a presença de agentes antimicrobianos no interior e embalagens
tradicionais como de polietileno. Porém, para o OEM não ocorreu diferenças com a
testemunha, o que, possivelmente, está relacionado com a sua volatilização, que nesse caso,
pode ter sido afetada reduzindo seus componentes que atuam diretamente sobre B. cinerea. O
manuseio do óleo essencial, a temperatura ou a volatilização natural podem ter sido as
responsáveis pela obtenção desses resultados (BARBOSA et al., 2017).
3.1.1 Compostos voláteis de óleos essenciais na qualidade pós-colheita de uvas ‘Rubi’
129
Para a pós-colheita das uvas ‗Rubi‘ os dados não apresentaram interação entre
tratamento e o tempo de contato. Observou-se que para o teor de sólidos solúveis (SS) o OEP
e o OEM aumentaram essa variável em 20 e 27,1%, respectivamente, em relação ao
tratamento testemunha (Figura 15, A). Para acidez titulável (AT), o OEP, OEG e OEM
aumentaram em 5, 5,5 e 6% e para o ratio (relação SS/AT), o aumento foi de 59; 52 e 37%,
respectivamente, todos em relação ao tratamento testemunha (Figuras 15, B e C).
A concentração de compostos fenólicos foi reduzida em 19,1 e 16,9%,
respectivamente, pelos tratamentos com OEG e OEM, porém verificou-se que o OEM não
apresentou diferença estatística com a testemunha, que também mostrou-se similar ao OEP
que induziu em 3,4% quando comparados entre si (Figura 15, D).
130
Figura 15: Análises de pós-colheita do teor de sólidos solúveis (°Brix,SS) (A), acidez
titulável (%, AT) (B), Ratio (relação SS/AT) (C) e teor de compostos fenólicos (mg de ácido
gálico 100g-1
de massa seca) (D) em mostro de bagas de uvas ‗Rubi‘ tratadas com compostos
voláteis dos óleos essenciais de pitanga (OEP) (Eugenia uniflora), guaçatonga (OEG)
(Casearia sylvestris) e melaleuca (OEM) (Melaleuca alternifolia) à 100%.
b
aab
a
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Testemunha OEP OEG OEM
Só
lid
os
So
lúv
eis
( B
rix
)
Compostos voláteis óleos essenciais (100%)
A
b
a aa
3,2
3,25
3,3
3,35
3,4
3,45
3,5
3,55
Testemunha OEP OEG OEM
Áci
dez
Tit
ulá
vel
Compostos voláteis óleos essenciais (100%)
B
b
a aa
0
10
20
30
40
50
60
70
Testemunha OEP OEG OEM
Rat
io (
SS
/AT
)
Compostos voláteis (100%)
C
ab a
c bc
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
Testemunha OEP OEG OEM
mg
de
áci
do
gá
lico
10
0g
-1 p
eso
seco
Compostos voláteis óleos essenciais (100%)
D
131
O contato dos compostos voláteis presentes nos OEP, OEG e OEM melhoraram a
qualidade pós-colheita das uvas ‗Rubi‘. Devido a obtenção desses resultados pode-se dizer
que esses óleos essenciais apresentam elevado potencial para serem adicionados nas
embalagens para comercialização desses frutos. Deve-se levar em consideração que a forma
de armazenamento é que irá determinar a qualidade em que essas uvas de mesa irão chegar
até o consumidor (RASULOV, 2017).
Diante disso, observou-se que os voláteis dos OEP e OEM elevaram os teores de
sólidos solúveis (SS), o que representa o aumento de açúcar disponível no fruto, indicando
sabor adocicado (DOMINGUES NETO et al., 2016). Esses valores mostram-se inferiores
aos exigidos, conforme a Intrução Normativa/SARC n°001 (BRASIL, 2002). Isso pode estar
relacionado com as condições climáticas na fase de maturação da uva. Nesse período foram
observados precipitações elevadas, o que prejudica o amadurecimento desses frutos. O
acúmulo de água no solo por longos períodos retarda o amadurecimento dos frutos e,
também, pode diluir o mosto, causando desequilíbrios na sua composição, como verificados
para SS nessas uvas avaliadas (CHITARRA e CHITARRA, 2005; WESTPHALEN;
MALUF, 2000).
Para acidez titulável (AT) os voláteis de todos os óleos essenciais aumentaram, ou
seja, as uvas estavam menos ácidas que as do tratamento testemunha. Possivelmente, esse
fato está relacionado com o uso dos ácidos presentes nas bagas para o processo respiratório
ou a migração de bases que os neutralizam e por fim proporcionam o aumento do pH (ABE
et al., 2007).
Esses tratamentos também elevaram os valores do ratio (relação SS/AT), indicando
aumento do equilíbrio entre os sabores doces e ácidos da uva. Essa relação entre SS/AT
determina o ―flavor‘ (sabor) dos frutos, que quanto maior o valor, melhor será a qualidade
da uva e maior será sua aceitabilidade no mercado (CHITARRA; CHITARRA, 2005;
CONDE et al., 2007; MORAES et al., 2008).
O OEP induziu elevado teor de compostos fenólicos, porém não apresentou
diferença estatística com a testemunha. As plantas apresentam normalmente elevadas
concentrações desses compostos, explicando os resultados obtidos no mostro das bagas do
tratamento testemunha (SHALABY; BENJAMIN, 2015), porém esses compostos na
testemunha foram insuficientes para inibir o desenvolvimento de B. cinerea nas bagas. Essa
indução desencadeada pelo OEP está relacionada com a capacidade dos compostos
132
fenólicos apresentarem efeito tóxico sobre micro-organismos ou atuarem na deposição de
lignina para o fortalecimento da parede celular desses frutos (ANDREASSON; LAITH,
2017).
Além dessas funções, os compostos fenólicos são importantes para a saúde humana.
Previnem a arteriosclerose, diabetes, doenças neurodegenerativas, inibem o crescimento de
células cancerígenas, são anti-inflamatórios, analgésicos, gastroprotetores e anti-
microbianos (LEE et al., 2006; ASADI et al., 2010; VU et al., 2012; CETIN-KARACA;
NEWMAN, 2015; LAJILI et al., 2016). Também desempenham papel importante na
proteção das células, inibindo ou sequestrando espécies reativas de oxigênio, transferindo
elétrons para radicais livres, ativando enzimas antioxidantes e inibindo enzimas oxidases
(DUMITRIU et al., 2015).
Medeiros et al. (2011) observaram resultados diferentes e, ressaltam que os voláteis
dos óleos essenciais de capim-limão e orégano, presentes em sachês nas embalagens de
manga, estabilizaram e reduziram, respectivamente, os SS dos frutos e com relação a AT, os
autores verificaram aumento. Sonker et al. (2015) verificaram que voláteis do óleo essencial
de Artemisia nilagirica aumentam o tempo de prateleira em 9 dias de uvas, destacando que
esse tratamento não apresenta efeito fitotóxico e não altera as propriedades das substâncias
dos frutos. Esses resultados nos mostram que cada óleo essencial apresenta compostos
diferenciados que podem desencadear respostas distintas, dependendo do fruto.
3.1.2 Efeito de compostos voláteis de óleos essenciais na atividade de enzimas de
indução de resistência de uvas ‘Rubi’
Com relação à atividade da enzima polifenoloxidase (PPO) não houve interação entre
os fatores e, observou-se que sua atividade foi inibida em 51,6 e 47,7% pelos tratamentos com
os compostos voláteis de OEG e OEM, respectivamente, antes da inoculação do patógeno, B.
cinerea (Figura 16, A). A atividade depois dessa inoculação também foi inibida por todos os
óleos essenciais, mas significativamente, pelo OEM em 78,9% em relação ao tratamento
testemunha (Figura 16, B).
133
Figura 16: Atividade específica da polifenoloxidase (PPO) antes (A) e após (B) a inoculação
de Botrytis cinerea em bagas de uvas ‗Rubi‘tratadas com compostos voláteis dos óleos
essenciais de pitanga (OEP) (Eugenia uniflora), guaçatonga (OEG) (Casearia sylvestris) e
melaleuca (OEM) (Melaleuca alternifolia) a 100%.
Comumente são verificadas alterações na atividade da PPO em uvas durante o
armazenamento, podendo estar relacionada com a senescência dos tecidos das bagas, que
consequentemente reduzem a qualidade dos frutos (CENCI, 1994). Em uvas ‗Rubi‘, Freitas et
al. (2008) verificaram elevada atividade da PPO, indicando rápida deteriorização dessas uvas.
Isso foi observado no tratamento testemunha, porém os voláteis dos óleos essenciais avaliados
reduziram a atividade dessa enzima antes e após a inoculação de B. cinerea, indicando
elevada peculariedade das bagas (Figura 14).
Os tratamentos com voláteis de OEG e OEM reduziram o teor de compostos fenólicos
(Figura 13, D ) nas células dessas uvas. Esse fato dificulta a atividade da PPO, pois, essa
enzima promove a oxidação enzimática desses compostos formando quinonas. Dessa forma, a
presença desses substratos enzimáticos tornam os frutos sucetíveis à reação desencadeada pela
a
ab
b
b
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0,12
0,14
0,16
Tratamento OEP OEG OEM
Ati
vid
ad
e es
pec
ific
a (
UA
mgp
-1)
Compostos voláteis de óleos essenciais (100%)
A
a
abab
b
0
0,005
0,01
0,015
0,02
0,025
Testemunha OEP OEG OEM
Ati
vid
ad
e e
specif
ica (
UA
mgp
-1)
Compostos voláteis de óleos essenciais (100%)
B
134
PPO que resulta no escurecimento do tecido da baga. Inicialmente as quinonas podem
rapidamente condensarem, formando pigmentos insolúveis e escuros denominados melaninas,
ou reagirem, de forma não enzimática, com aminoácidos, proteínas ou outros compostos
(MENOLLI et al., 2008; ZHANG et al., 2016).
O escurecimento dos frutos acarreta em efeitos negativos na coloração e no sabor das
bagas de uva (GHASEMZADEH et al., 2016). Para Zimdars et al. (2017) a intensidade dos
impactos na extensão da deterioração da cor depende da atividade das enzimas também
secretadas por B. cinerea. Nesse caso, os compostos voláteis dos óleos essenciais reduziram a
atividade dessa enzima, indicando que os frutos apresentam maior qualidade em relação à
testemunha. Ghasemzadeh et al. (2016) e Terefe et al. (2016) também ressaltam que a redução
ou na inativação de PPO os frutos mostram-se como frescos e de alta qualidade.
Para os resultados da atividade da enzima PAL verificou-se que as coletas antes e após
a inoculação de B. cinerea nas uvas ‗Rubi‘ apresentaram interação entre os fatores.
Ressaltando-se que na coleta antes da inoculação do patógeno os tratamentos com os óleos
essenciais já induziram a atividade de PAL, observando-se aumento de 99,7; 298,7 e 115,6%
para o OEP; OEG e OEM, respectivamente, no período de 1h das uvas em contato com os
compostos voláteis desses óleos. Com relação aos 13 dias, o OEP e o OEG aumentaram a
atividade da PAL em 916,1 e 109,1%, respectivamente, porém o OEM inibiu em 100% a sua
atividade, em relação ao tratamento testemunha. Quando se comparou o tempo de contato de
1 hora e 13 dias para as uvas tratadas com OEP observou-se aumento de 384,5% na atividade
dessa enzima, quando as uvas ficaram por tempo maior de exposição aos compostos voláteis
desse óleo essencial, sendo que para o OEG nessa mesma comparação, relatou-se que a
atividade da PAL dobrou em 1 hora e para o OEM foi de 100% (Figura 17, A).
Com relação a coleta após a inoculação do patógeno verificou-se que o OEP e OEG
reduziram a atividade da PAL, sendo que o OEM não apresentou diferença estatística com a
testemunha. Porém, observou-se que para 13 dias, o OEM induziu a atividade dessa enzima
em 6000 vezes em relação ao tempo de exposição de 1 h com os tratamentos (Figura 17, B).
135
Figura 17: Atividade específica da fenilalanina amônio liase (PAL,) antes (A) e após (B) a
inoculação de Botrytis cenerea, em bagas de uvas ‗Rubi‘ tratadas com compostos voláteis dos
óleos essenciais de pitanga (Eugenia uniflora), guaçatonga (Casearia sylvestris) e melaleuca
(Melaleuca alternifolia) a 100%, após 1 hora e 13 dias de contato. Letras minúsculas
comparam os tratamentos e as maiúsculas o tempo de contato.
A enzima PAL é proveniente da via dos fenilpropanoides que utilizam cerca de 40%
do carbono orgânico biosférico na síntese de lignina depositada na parede celular (ZHANG;
LIU, 2014). De acordo com essa observação, pode-se dizer que a indução dessa enzima,
estimulada pelo OEP antes da inoculação de B. cinerea favoreceu a redução do mofo cinzento
nas bagas, devido à deposição de lignina na parede celular das bagas, que formou uma
barreira estrutural e, consequentemente, ocasionou a resistência das células dos frutos à
entrada do patógeno.
De acordo com os resultados verificados pelos voláteis do OEM verificou-se
comportamento semelhante ao da testemunha, ou seja, indução da atividade da PAL apenas
aB
aB
aA
aA
bB
aA
bB
bB0
0,0005
0,001
0,0015
0,002
0,0025
0,003
0,0035
Testemunha OEP OEG OEM
UA
bs-1
min
-1m
gp
rot
Compostos voláteis de óleos essenciais (100%)
1 Hora
13 Dias
A
aA
bAbA
bBbB bA bA
aA
0
1
2
3
4
5
6
Testemunha OEP OEG OEM
UA
bs-1
min
-1m
gp
rot
Compostos voláteis de óleos essenciais (100%)
1 Hora
13 Dias
B
136
após o contato com o patógeno. Assim, verifica-se que os estímulos para síntese de lignina
foram tardios para dificultar a infecção de B. cinerea nesses frutos.
A rota de ativação de síntese da lignina via PAL resulta na formação de monolignois
que serão utilizados na deposição de lignina na parede celular. A restrição da atividade dessa
enzima dimunui a concentração de lignina nas células, como consequência, o fruto mostra-se
suscetível ao patógeno fúngico (CASS et al., 2015).
Para Danner et al. (2008), a redução da área lesionada em pêssego infectados por
Monilinia fruticola está relacionada à atividade da PAL. Além de proporcionar a resistência
da parede celular através da desaminação de L-fenilalanina em ácido transcinâmico, essa
enzima proporciona, como consequência desse processo, a síntese de fitoalexinas e fenóis que
também dificultam a entrada de fungos nos tecidos (GHOLIZADEH; KOHNEHROUZ,
2010).
Mazaro et al. (2015) ressaltam que a ativação da PAL reduz a incidência de podridões
em acerola. Borsatti et al. (2015) também reforçam essa informação, relatam que alterações
na rota dos fenilpropanóides devido a atividade dessa enzima induz a resistência de amoras-
pretas aos patógenos.
Os resultados da atividade da β-1,3-glucanase antes da inoculação de B. cinerea não
apresentaram interação entre os fatores. Destaca-se que o OEM induziu a atividade em 27,7%
em relação ao tratamento testemunha (Figura 18, A).
A coleta realizada após a inoculação do patógeno apresentou interação entre os
fatores, destacando-se que não foram observadas diferenças estatísticas entre os tratamentos
quando as uvas ficaram por 1h em contato com seus compostos voláteis. Porém, com 13 dias
o OEM induziu a atividade da GLU em aproximadamente 20 mil vezes quando comparada
sua atividade nas bagas com 1 h em contato com esse óleo essencial (Figura 18, B).
137
Figura 18: Atividade específica de β-1,3-glucanase (GLU), antes (A) e após (B) a inoculação
de Botrytis cenerea, em bagas de uvas ‗Rubi‘ tratadas com compostos voláteis dos óleos
essenciais de pitanga (Eugenia uniflora), guaçatonga (Casearia sylvestris) e melaleuca
(Melaleuca alternifolia) a 100%, após 1 hora e 13 dias de contato. Letras minúsculas
comparam os tratamentos e as maiúsculas o tempo de contato.
As cascas de uvas ‗Rubi‘ não apresentaram atividade da enzima quitinase antes da
inoculação de B. cinerea. Porém, após o contato com o patógeno relatou-se interação entre os
fatores tratamento e tempo de exposição. Após a inoculação verificou-se que, com relação ao
tratamento com OEG, houve redução de 97,9% na atividade da quitinase com o tempo de
exposição nas bandejas de 1 h, e o OEM em 76,5% em 13 dias, ambos em relação ao
tratamento testemunha (Figura 19).
b
b
b
a
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
Testemunha OEP OEG OEM
µG
lu.m
in-1
mgp
rote
ína
-1
Compostos voláteis óleos essenciais (100%)
A
aA aA aA aBbA bA bA
aA
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Testemunha OEP OEM OEM
µG
lu.m
in-1
mg
pro
teín
a-1
Compostos voláteis óleos essenciais (100%)
1 Hora
13 Dias
B
138
Figura 19: Atividade específica de quitinase após a inoculação de Botrytis cenerea em bagas
de uvas ‗Rubi‘ tratadas com compostos voláteis dos óleos essenciais de pitanga (OEP)
(Eugenia uniflora), guaçatonga (OEG) (Casearia sylvestris) e melaleuca (OEM) (Melaleuca
alternifolia) a 100%, após 1 hora e 13 dias de contato. Letras minúsculas comparam os
tratamentos e as maiúsculas o tempo de contato.
Os compostos voláteis do OEM foi o tratamento que elevou a atividade de β-1,3-
glucanase nas bagas de uvas ‗Rubi‘, porém essa indução não foi suficiente para reduzir o
índice do mofo cinzento nas bagas. Essa enzima catalisa a clivagem das ligações β-1,3-
glucosídicas em β-1,3-glucanos que é considerada um dos principais componentes da parede
celular de fungos fitopatogênicos. Com isso a GLU hidrolisa as paredes desses micro-
organismos que atuam como elicitores de oligossacarídeos na ativação dos mecanismos de
defesa do fruto (KEEN; YOSHIKAWA, 1983; GARFOOT et al., 2017).
Todo esse mecanismo desencadeado por esse tratamento, possivelmente, não foi eficaz
devido ao fato da parede celular de B. cinerea ser composta por quitinas (ROMANI, 2011).
Nesse caso os tratamentos deveriam ter induzido a atividade da quitinase para que houvesse a
degradação de quitinas e liberação de oligossacarídeos que atuariam como elicitores
(PASCHOLATI et al., 2008).
Esse fato é possível por causa da catalização de clivagem que as quitinases realizam
entre o carbono 1 e 4 de dois monômeros de acetil-D-glucosamina de quitina. Também essas
enzimas podem bloquear o crescimento das hifas, apresentando atividade antimicrobiana
(NEUHAUS et al., 1996; VAN LOON, 2006).
Sellemathu et al. (2013) ressaltam que vapores utilizados do óleo essencial de tomilho
(Thymus vulgaris L.) reduz a antracnose (Colletrotrichum gloeosporioides) em frutos de
abacate. Segundo os autores, esse fato é possível, devido à ação elicitora, desses compostos
aA
abAcA
bAaB
aA aA aA
0
1
2
3
4
5
6
Testemunha OEP OEG OEM
UA
bs.
µgp
rotm
L-1
Compostos voláteis óleos essenciais (100%)
1 Hora
13 Dias
139
voláteis, em ativar respostas bioquímicas nesses frutos. Bill et al. (2016) também enfatizam
que a fumigação desse óleo essencial de tomilho (96 µL L-1
) em abacates diminui a
antracnose durante o armazenamento dos frutos em consequência da elevada expressão gênica
da atividade da enzima β-1,3-glucanase.
Dessa forma, ressalta-se que os compostos voláteis volatilizados de OEP, OEG e OEM
são eficazes para favorecerem a qualidade pós-colheita de uvas ‗Rubi‘. Porém, o OEP se
destaca por também reduzir o índice de mofo cinzento nas bagas devido à ativação dos
mecanismos de defesa da via fenilpropanoides com a atividade elevada da PAL. Com isso,
pode-se sugerir o emprego desse tratamento no interior de embalagens de polietileno para a
comercialização dessas uvas. Todas essas características respondem ao que Sisvakumar;
Bautista-Bãnos (2014) ressaltam que embalagens dos frutos devem conter fungicidas naturais
com intuito de reduzir o uso de moléculas sintéticas e tóxicas ao ser humano. Por isso pode-se
enfatizar que os voláteis do OEP não apenas atuam como fungicidas, mas também como
indutores de resistência.
140
4 CONCLUSÃO
Volateis emitidos por OEP, OEG e OEM apresentam efeito fungitóxico sobre B.
cinerea;
OEP também induz a resistência de uvas ‗Rubi‘ contra o B. cinerea;
OEM apresentam potencial para o controle do mofo cinzento, porém estudos devem
ser realizados para otimizar esse efeito.
141
5 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Os tratamentos com OEP, OEG e OEM apresentam efeito fungitóxico sobre o P.
viticola reduzindo a germinação e a viabilidade dos esporângios. Esse fato soma-se ao
comportamento elicitor dos constituintes químicos desses óleos essenciais que ativam
mecanismos de defesas de videiras ‗Syrah‘ cultivadas em casa de vegetação. Como
consequência tem-se o controle do míldio, do desenvolvimento dessas plantas nas próximas
épocas de cultivo e esses óleos essenciais são de baixo custo para aplicação.
Compostos voláteis emitidos por OEP, OEG e OEM apresentam efeito fungitóxico sobre
o B. cinerea. Porém destaca-se o tratamento com OEP que mantém seus efeitos também no
controle e na ativação dos mecanismos de defesa de uvas ‗Rubi‘, além de mostrar-se efetivo
na qualidade pós-colheita desses frutos. No entanto vale-se ressaltar que novos estudos
devem-se ser realizados sobre volatilização do OEM, para que sejam otimizados seus efeitos
no controle do mofo cinzento e na indução de resistência.
Dessa forma, pode-se dizer que o OEP controla o míldio e o mofo cinzento, ativa
mecanismos de defesa de videiras ‗Syrah‘ e uvas ‗Rubi, melhorando a qualidade pós-colheita
dessas bagas, mantém sua eficiência entre as épocas de cultivo e é de baixo custo para
aplicação.
142
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149
7 ANEXOS
150
1- Ε -β-Cinemo 5- α-Gurjuneno 9- A-Germagreno B
2- α-Cubeno 6- Ε-Carofileno 10- Silfiperferol-6-em-5-ona
3- α-Ciclosativeno 7- Curzereno 11- Germacrona
4- β-Elemeno 8- σ-Amorfeno 12- Calamen-10-ona
Figura 20: Componentes do óleo essencial de pitanga (OEP) (Eugenia uniflora)
identificados por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa (CG-EM).
151
1-σ-Elemeno 5- Ε-Cariofileno 9-α-Zingibereno
2-Cubeno 6-β-Gorjuneno 10- σ-Amorfeno
3-α-Copeno 7-α-Humureno 11-Germacreno B
4-β-Elemeno 8-γ-Muroleno 12-α-Caninol
Figura 21: Componentes do óleo essencial de guaçatonga (OEG) (Casearia sylvestris)
identificados por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa (CG-EM).
152
1-α-Thujineno
2-1,8-Cineol
3-α-Terpineol
Figura 22: Componentes do óleo essencial de melaleuca (OEM) (Melaleuca alternifolia)
identificados por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa (CG-EM).
