UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias de Jaboticabal

Curso de Agronomia---- Disciplina de Bioquímica I

AULA PRÁTICA – Curva de Titulação dos aminoácidos

Introdução

Quando um aminoácido é titulado, sua curva de titulação indica a reação de cada grupo funcional com o íon hidrogênio.

Tomamos como exemplo o aminoácido alanina. Se partirmos de pH bem ácido (em torno de 1) as moléculas desse aminoácido se apresentarão sob a forma catiônica mostrada na figura abaixo. Nessa forma iônica todos os grupos que podem receber hidrogênio estão ligados esse átomo.

Se formos adicionando gradativamente quantidade pequenas de NaOH sobre a solução de alanina, medindo a cada adição o pH e se construirmos um gráfico relacionando o pH da solução em função do número de equivalente de OH adicionados, obteremos uma curva como três regiões definidas: AB, BC e CD, conforme demonstrado na figura 1. Essas regiões representam as transformações iônicas que a molécula de alanina pode sofrer pela alteração do pH a que são submetidas a partir da adição de equivalentes em OH adicionados a um meio extremamente ácido.

Figura 1 – Curva de Titulação da alanina – mostrando as formas iônicas do aminoácido e os valores de pKa dos grupos ionizáveis e pI do aminoácido. pK1 = 2,35 pK2 = 9,69 pI = 6,02

A região AB apresenta uma região de tamponamento e um ponto de inflexão onde encontraremos

50% da alanina totalmente protonada e 50% de alanina sem o próton do grupo carboxila, o pH nesse ponto representa o pK1 do aminoácido.

Na região BC pode ser observado o ponto de inflexão em pH = 6,02 que representa o ponto isoelétrico (pI) do aminoácido. Nesse ponto 100% das moléculas de alanina encontram-se sem o próton da carboxila, portanto pI é o pH onde a carga elétrica da molécula é nula.

Continuando a adição do NaOH, encontraremos uma nova região CD com uma área de e um novo ponto de inflexão (pK2), onde 50% da alanina encontram-se sem o próton do grupo carboxila e sem o próton do grupo amina, portanto na forma aniônica, com carga elétrica negativa. A titulação é finalizada quando toda a alanina (100%) encontra-se totalmente sem próton nos dois grupamentos ionizáveis da molécula (amina e carboxila).

A titulação de um aminoácido permite encontrar os pKa’s e o seu ponto isoelétrico, o que é característico de cada molécula. A determinação da forma iônica dos aminoácidos é importante em processos técnicos de separação e purificação dessas moléculas. Além disso, a forma iônica de um aminoácido é fundamental para a estrutura e atividade biológica das proteínas (polímeros de aminoácidos), principalmente aqueles aminoácidos que possuem grupo da cadeia lateral ionizável, além do grupamento amino e carboxila descritos acima.

Objetivo

Construir a curva de titulação e determinar o pK1, o pK2 e o ponto isoelétrico (pI) do aminoácido Glicina.

A

B

C

D

Material

1 pHmetro (um por bancada – dois grupos compartilharão)

1 agitador magnético (um por bancada – dois grupos compartilharão)

Papel absorvente macio para limpar o eletrodo de pH.

1 barra magnética para agitação

1 pisseta com água deionizada.

1 frasco para descarte da água de lavagem do eletrodo.

1 becker de 50 mL para receber a solução de glicina e ser titulada.

1 pipeta de 20 mL e pipetador.

1 pipetador automático de 1,000 µL.

1 caixa com ponteiras para pipetas automáticas de 1.000 µL.

1 frasco contendo solução de glicina 0,02 M.

1 frasco contendo 1 mL de ácido clorídrico 1 M.

1 frasco contendo 50 mL de NaOH 0,1 M.

Indicador de pH Procedimento 1. Colocar a barra magnética em um becker de 50 mL. 2. Utilizando a pipeta de 20 mL, transferir 20 mL da solução de glicina para o becker de 50 mL (contendo a

barra). 3. Colocar o becker sobre o agitador magnético e regular a velocidade da barra magnética (não muito

forte). 4. Adicionar 1 mL de HCl para que a glicina assuma sua forma totalmente protonada (acida) e cinco gotas

do indicador (vermelho de metila ou azul de bromotimol) 5. Limpar a sonda de pH com água deionizada. 6. Colocar a sonda de pH no becker. CUIDAR PARA NÃO BATER A SONDA NA BARRA EM

MOVIMENTO. 7. Anotar o valor do pH 8. Adicionar 1 mL de NaOH 0,1 M, esperar misturar e medir o pH. 9. Anotar em uma tabela o valor pH em função do volume de NAOH adicionando. 10. Repetir o item anterior até que o pH chegue ao valor de 12. 11. Antes de descartar a solução voltar o pH dela para a neutralidade (6,5 a 7,5) pela adição de acido

clorídrico. Bibliografia

Mastroeni, M e Gern Regina.M.M – Bioquímica Práticas adaptadas São Paulo, Ed Atheneu, 2008.

Cambell MK. Bioquímica. 3ª ed. Porto Alegre: Artmed, 2000. Relatório deve ser elaborado considerando os itens abaixo 1 - Introdução (descrever o que é uma curva de titulação de aminoácidos ou um ácido fraco, a importância de se conhecer as formas iônicas de uma molécula de aminoácido e a classificação do aminoácido Glicina descrevendo quantos e quais grupamentos ionizáveis essa molécula possui). Descrever o uso dos indicadores de pH. 2 – Objetivo (já descrito nesse protocolo) 3 – Metodologia (descrever resumidamente o material usado e o procedimento da aula pratica) 4 – Resultado e Discussão – descrever os resultados obtidos através da construção de uma tabela relacionando o pH observado após o volume de NaOH adicionado.

A partir dessa tabela (obtida na aula) construa o gráfico da titulação da glicina (volume de NaOH usado no eixo x e pH observado no eixo y).

Correlacione a cor da solução dada pelo indicador durante a titulação

Usando o gráfico construído determine os valores de pK1 e pK2. Coloque na figura as formas iônicas em cada região do gráfico construído.

Faça uma tabela dos valores observados e compare os valores da literatura (olhe no livro de bioquímica em tabelas que descrevem as características dos aminoácidos). Os valores observados e os da literatura ficaram próximos?

Calcule o pI usando a regra matemática e os dados de pK obtidos na aula, compare com o pI informado na literatura.

Conclua se seu grupo conseguiu construir a curva de titulação da glicina de modo adequado para que fosse possível calcular os valores de pK1, o pK2 e o ponto isoelétrico (pI) do aminoácido Glicina. Para que deve ser usado o indicador e porque.

5 – Referências bibliográficas (citar as fontes de consulta para esse relatório usando regras da ABNT, se não souberem favor ir à biblioteca e consultar um profissional).