Universidade Federal da Bahia Escola de Medicina ...livros01.livrosgratis.com.br/cp067291.pdf · Escola de Medicina Veterinária ... financiamento do projeto. ... 2.1. O espermatozóide

Universidade Federal da Bahia

Escola de Medicina Veterinária

Mestrado em Medicina Veterinária Tropical

CRIOPRESERVAÇÃO DE SÊMEN CAPRINO: INFLUÊNCIA DOS DILUIDORES

DE CONGELAÇÃO, TEMPOS DE EQUILÍBRIO E CURVAS DE RESFRIAMENTO

RODRIGO FREITAS BITTENCOURT

Salvador – Bahia 2006

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Dissertação apresentada à Escola de Medicina Veterinária da Universidade Federal da Bahia, como requisito para obtenção do título de Mestre em Medicina Veterinária Tropical, na área de Reprodução Animal.

Orientador: Prof. Dr. Antônio de Lisboa Ribeiro Filho

Salvador – Bahia

2006

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Disssertação defendida e aprovada para obtenção do grau de Mestre em Medicina Veterinária

Tropical.

Salvador, 21 de Fevereiro de 2006

Comissão Examinadora:

Prof. Dr. Antonio de Lisboa Ribeiro Filho - UFBA

(Orientador)

Prof. Dr. Anselmo Domingos Ferreira Santos – Pio Décimo

Prof. Dr. Marcos Chalhoub Coelho Lima - UFBA

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À minha avó Maria Hildete Bittencourt;

Ao meu avô Soares

Aos meus pais, Parísio e Etinete Bittencourt;

Aos meus irmãos, Max e Karina Bittencourt;

À minha noiva, Marta Vasconcelos;

Dedico.

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AGRADECIMENTOS

Inicio meus agradecimentos àquele que eu nuca vi, mas conheço bastante. Com ele, compartilhei meus momentos de solidão e tristeza, mas também, os de alegria e felicidade. Com ele, e muitas vezes só com ele, participei todos os piores e os melhores momentos da minha vida; e por isso eu te agradeço meu Deus. Novamente agradeço a Parisio e Etinete Bittencourt, meus pais, pelos exemplos de vida que são, pelo carinho, amor, e por estarem sempre de meu lado, confiando e apoiando, e às vezes tentando me mostrar com toda dedicação, meus erros. Erros, que em certos momentos, por não ouvi-los, só venho a descobrir após cometê-los. Vocês são minha vida, e vos agradeço por isso. À Max e Karina Bittencourt, meus irmãos, pelo apóio, pelo amor e pelos exemplos de coragem, retribuo o amor e vos agradeço. Aos meus bichinhos, Larissa, Lara e Valéria, meu amor e minha vida, vos devoto. Dona Maria Hildete Bittencourt, minha avó, sua eterna alegria, sua força e sua vontade de viver são meus maiores exemplo de vida, meu amor e meus agradecimentos a te consigno. À Dona Ieda Bittencourt, minha tia e madrinha, por seu amor aos animais e por ter sido um das grandes responsáveis para que eu tenha seguido essa profissão que tanto amo, sagro-te meu amor e meu eterno agradecimento. Às minhas tias (ordem alfabética pra não ter briga) Ana, Conceição, Elza, Iara, Marlene, Neuza (in memorian), Norman, Rita, Solange. Aos meus tios Eduardo, Elias, Gerson, Miguel e tio Waltinho pelos momentos felizes, e de muita alegria. Aos meus primos-irmãos Augusto, Pedro, Tony (meu compadre) e Eduardinho Bittencourt, Leo e Jefinho que compartilharam comigo os melhores momentos da minha vida, e quantas estórias temos pra contar ... e você Luís Alberto, meu compadre, também está entre os meus. Às mais belas primas que alguém poderia ter, Bartira, Carol, Cristiana, Cristina, Luciana, Márcia, Mariana (comadre), Renata e Roberta. De te July, minha comadre, gosto muito e quero sempre tê-la ao meu lado. Ao meu amigo e mestre Prof. Dr. Antônio de Lisboa Ribeiro Filho, agradeço por me possibilitar conviver por tantos anos ao lado de um dos maiores nomes da Reprodução Animal do país, mas, principalmente, pela sua sabedoria, grande mestre da inteligência emocional e relações interpessoais, pela sua confiança e amizade, minha eterna gratidão. (“Se pude ver mais longe foi porque subi no ombro de gigantes” Isaac Newton) Aos meus grandes amigos da equipe de Reprodução Animal (Laboratório de Embriologia) da Universidade Federal da Bahia, Ana Karine, Ana Paula Portela, Daniela Freitas e Ricardo Guerra, como também, os calouros da equipe Alexandre, Carmo, Carol e Raul.

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Aos meus grandes amigos e irmãos do período de graduação, Bernado, Francisco Augusto e Gleison Andrade. Meus amigos e sócios da Pró-Rumens Assessoria e Consultoria Agropecuária, agradeço pela amizade e pelo apóio. Ao meu grande irmão Sidney Gonzalez pela amizade e apóio incondicional, em todos os momento em que precisei. Ao grande amigo Anselmo Santos, agradeço a amizade, a força e a extrema confiança à mim prestada. Aos meus amigos funcionários do HOSPMEV, Biri, Sena, Zaca, Washington e Vitoriano, agradeço pela ajuda e pela amizade de tantos anos. Aos meus amigos, funcionários administrativos da faculdade, Ana Íris, Lílian, Seu Manuel e aos(às) bibliotecários(as), pelo apóio e amizade. Agradeço a ajuda importante da CAPES, pela bolsa de mestrado e da FAPESB, pelo financiamento do projeto. Meus agradecimento à Tencopec e à Agrofácil Produtos Agropecuário, pelo patrocínio do projeto. Deixei por último você que com certeza está lendo essas palavras anciosas em busca das palavras que constem do teu nome. Será que achas que de ti esqueceria? Marta Freitas Vanconcelos. Nome e sobrenome do mais puro e verdadeiro amor, que à mim surgiu como um anjo. Aquele anjo que não se espera. Que não se acredita. Apesar de tê-la em minha vida depois de todos os pré-citados, a sua importância é imensurável. Com você divido momentos que nunca tive, a amizade mais sincera, o olhar mais verdadeiro, o carinho mais terno e o amor mais sublime. A sua eterna busca pela perfeição me estimula. E a sua disposição e apóio incondicional me alimenta. Assim, quero tê-la comigo sempre, através dos tempos. E que esses sejam eternos e surpreendentes, assim como você é. Minha soooogra, te adoro.

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Os meus sonhos nada mais são Do que objetivos a serem alcançados. Alguns estão a um passo, Outros, mais distantes, Além do horizonte. Distância pela qual Minhas pernas fortes me guiarão, Com paciência sim, mas com clareza. E se no caminho houver algo, Que o tempo me obste atingir Não tem problema. Meus sonhos são tão belos, Que do meu ofego, Farei descanço, E do meu suor, Farei vitória. (Autor anônimo)

Aquele que nunca descansa, Aquele que almeja, De corpo e alma ao impossível, Esse é o vencedor. (Confúcio)

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ÍNDICE LISTA DE FIGURAS X LISTA DE TABELAS XI LISTA DE ABREVIATURAS XIII RESUMO XIV SUMMARY X

V 1. INTRODUÇÃO GERAL 1 2. REVISÃO DE LITERATURA 4 2.1. O espermatozóide e a membrana plasmática 4 2.2 Criopreservação espermática e suas etapas 7 2.2.1. Curva de resfriamento do sêmen 8 2.2.2. Tempo de equilíbrio 10 2.2.3 Curva de congelação 11 2.2.4 Descongelação do sêmen 12 2.3. Diluidores de congelação 12 2.4. Crioprotetores celular 14 2.4.1 Crioprotetores penetrantes 14 2.4.2. Crioprotetores não penetrantes 16 2.4.2.1 Lecitina de soja 18 2.5. Utilização do EDTA 19 2.6. Equex STM 20 2.7. Avaliação do sêmen descongelado 21 2.7.1. Características microscópicas e morfológicas do sêmen 21 2.7.2. Teste de termoresistência 22 3. EXPERIMENTO 1: Influência do tempo de equilíbrio para a eficácia da criopreservação da célula espermática caprina Resumo 24 Abstract 24 3.1. Introdução 25

3.2. MATERIAIS E MÉTODOS 26 3.2.1. O local e os animais 26 3.2.2. Colheita e avaliação do sêmen pré-congelação 27 3.2.3. Diluição e diluidores 28 3.2.4. Resfriamento do sêmen 28

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3.2.5. Tempo de equilíbrio 28 3.2.6. Congelação do sêmen 29 3.2.7. Descongelação e avaliação espermática 29 3.2.7.1. Curva de descongelação e características microscópicas do sêmen 29 3.2.7.2. Teste de termoresistência 29 3.2.7.3. Morfologia espermática do sêmen descongelado 29 3.2.8. Delineamento e análise estatística 30

3.3. RESULTADOS E DISCUSSÕES 30 3.3.1. Características do sêmen fresco 30 3.3.2. Características microscópicas do sêmen descongelado 32 3.3.3. Características morfológicas do sêmen descongelado 34

3.4. CONCLUSÕES 35

3.5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 36 4. EXPERIMENTO 2: Utilização do EDTA, do Equex STM e da lecitina de

soja como componentes de um diluidor de congelação do sêmen caprino. Resumo 39 Abstract 39 4.1. Introdução 40

4.2. MATERIAIS E MÉTODOS 41 4.2.1. O local e os animais 41 4.2.2. Colheita e avaliação do sêmen pré-congelação 42 4.2.3. Diluição e diluidores 43 4.2.4. Resfriamento do sêmen 43 4.2.5. Tempo de equilíbrio 44 4.2.6. Congelação do sêmen 44 4.2.7. Descongelação e avaliação espermática 44 4.2.7.1. Curva de descongelação e características microscópicas do sêmen 44 4.2.7.2. Teste de termoresistência 44 4.2.7.3. Morfologia espermática do sêmen descongelado 45 4.2.8. Delineamento e análise estatística 45


4.4. CONCLUSÕES 53

4.5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 53 5. EXPERIMENTO 3: Interferência da curva de resfriamento e do tempo de equilíbrio sobre a congelabilidade do sêmen caprino Resumo 57 Abstract 57 5.1. Introdução 58 5.2. MATERIAIS E MÉTODOS 59

x

5.2.1. O local e os animais 59 5.2.2. Colheita e avaliação do sêmen pré-congelação 60 5.2.3. Diluição e diluidores 61 5.2.4. Resfriamento do sêmen 61 5.2.4.1 Curva de resfriamento lento e tempo de equilíbrio 61 5.2.4.2 Curva de resfriamento rápido e tempo de equilíbrio 62 5.2.5. Congelação do sêmen 62 5.2.6. Descongelação e avaliação espermática 63 5.2.6.1. Curva de descongelação e características microscópicas do sêmen 63 5.2.6.2. Teste de termoresistência 63 5.2.6.3. Morfologia espermática do sêmen descongelado 63 5.2.7. Delineamento e análise estatística 63


5.4. CONCLUSÕES 69

5.5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 69 6. CONSIDERAÇÕES FINAIS 72 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS GERAIS 73

xi

LISTA DE FIGURAS

1, membrana citoplasmática; 2, acrossoma; 3, membrana nuclear;Figura 1 4, núcleo; 5, capa pós-nuclear; 6, centríolo proximal; 7, filamento axial;

8, hélice motocondrial; e 9, envoltório fibroso. 4

Estrutura do axonema: O axonema é composto por 9 pares deFigura 2 microtúbulos periféricos (Subfibras A e B) e um par de microtúbulos

centrais. 5

Ilustração gráfica da peça intermediária (PI, a direita), com a membrana celular parcialmente removida e da peça principal (PP, a esquerda), com corte transversal e com a membrana celular removida, para mostrar as estruturas internas. PI com a MC, membrana celular; HM, hélice mitocondrial; CM, crista mitocondrial; A, axonema. PP com a HM, hélice mitocondrial; AJ, anel de Jensen; MC, par de microtúbulos central; MP,

Figura 3

microtúbulos periféricos; FE, fibra externa densa e a CL, coluna central. 5

Espermatozóide com corte da membrana plasmática, na região apical daFigura 4 cabeça, para visualização da suas estruturas. 6

Estruturas de membrana do espermatozóide: (1) membrana plasmática; (2) membrana acrossomal externa; (3) fluido acrossomal; (4) membrana acrossomal interna; (5) membrana nuclear; (6) núcleo; (7) anel nuclear;

Figura 5

(8) mitocôndria. 7

Na temperatura ambiente os fosfolipídios permanecem na formação bilaminar (A). Com a redução da temperatura os fosfolipídios com formações similares tendem a se agrupar em domínios que resultam na formação da estrutura cristalina (B). Concomitantemente, as proteínas são forçadas a se agregar, favorecendo o surgimento da fase hexagonal-II.

Figura 6

Esse fato resulta no aumento da permeabilidade da membrana celular. 9

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LISTA DE TABELAS: EXPERIMENTO 1: Influência do tempo de equilíbrio para a eficácia da criopreservação da célula espermática caprina.

Valores encontrados para as características microscópicas (volume, motilidade total motilidade progrssia, vigor, turbilhonamento e

Tabela 1.1

concentração) do sêmen nas sete amostras (AM). 30

Características morfológicas (defeitos maiores, defeitos menores e defeitos totais) do sêmen fresco nas sete amostras (AM) e suas respectivas

Tabela 1.2

médias (AM). 31

Médias de motilidade total (MT), motilidade progressiva (MP) e vigor para o para os espermatozóides do sêmen a fresco, e para os quatro

Tabela 1.3

tratamentos (G0,5; G1,5; G2,5; G3,5), logo após a descongelação. 32

Médias de motilidade total (MT), motilidade progressiva (MP) e vigor para o para os espermatozóides do sêmen a fresco, e para os quatro tratamentos (G0,5; G1,5; G2,5; G3,5), logo após o teste de

Tabela 1.4

Termoresistência. 33

Médias de defeitos menores (DME), defeitos maiores (DM), defeitos de acrossoma (AC) e defeitos totais (DT) para os espermatozóides do sêmen

Tabela 1.5

a fresco, e para os quatro tratamentos (G0,5; G1,5; G2,5; G3,5). 34

EXPERIMENTO 2: Utilização do EDTA e do Equex STM como componentes de um diluidor de congelação do sêmen caprino

Características microscópicas (volume, motilidade total, motilidade progressiva, vigor e concentração) do sêmen a fresco para os dois bodes e

Tabela 2.1

as médias gerais nas nove amostras (AM). 46

Características morfológicas (defeitos maiores, defeitos menores e defeitos totais) do sêmen fresco para os dois bodes (A e B) as médias

Tabela 2.2

gerias na nove amostras (AM). 47

Médias de motilidade total (MT), motilidade progressiva (MP) e vigor para o para os espermatozóides do sêmen a fresco, e para os cinco tratamentos (TRIS, TRIS+EDTA, TRIS+EQUEX, TRIS+EDTA+EQUEX

Tabela 2.3

e Bioexcell®), logo após a descongelação. 47

Médias de motilidade total (MT), motilidade progressiva (MP) e vigor para o para os espermatozóides do sêmen a fresco, e para os quatro tratamentos (TRIS, TRIS+EDTA, TRIS+EQUEX, TRIS+EDTA+EQUEX

Tabela 2.4

e Bioexcell®), logo após o teste de termoresistência 48

xiii

Médias de defeitos maiores (DM), defeitos menores (DME), defeitos de acrossoma (AC) e defeitos totais (DT) para os espermatozóides do sêmen a fresco, e para os cinco tratamentos(TRIS, TRIS+EDTA, TRIS+EQUEX

Tabela 2.5

e Bioexcell®) logo após a descongelação. 51

EXPERIMENTO 3: Interferência da curva de resfriamento e do tempo de equilíbrio sobre a congelabilidade do sêmen caprino

Valores encontrados para as características microscópicas (volume, motilidade total, motilidade progressiva, vigor, turbilhonamento e

Tabela 3.1

concentração) do sêmen a fresco nas dez amostras (AM). 64

Características morfológicas (defeitos maiores, defeitos menores e Tabela 3.2 defeitos totais) do sêmen a fresco e suas médias nas dez amostras (AM). 65

Médias de motilidade total (MT), motilidade progressiva (MP) e vigor para o para os espermatozóides do sêmen a fresco, e para os quatro

Tabela 3.3

tratamentos (CL15, CL75, CR30 e CR90), logo após a descongelação. 66

Médias de motilidade total (MT), motilidade progressiva (MP) e vigor para o para os espermatozóides do sêmen a fresco, e para os quatro tratamentos (CL15, CL75, CR30 e CR90), logo após o teste de

Tabela 3.4

termoresistência (TTR) 67

Médias de defeitos maiores (DM), defeitos menores (DME), defeitos de acrossoma (AC) e defeitos totais (DT) para os espermatozóides do sêmen

Tabela 3.5

a fresco, e para os quatro tratamentos (G0,5; G1,5; G2,5; G3,5). 68

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LISTA DE ABREVIATURAS

AC - acrossoma

AM - amostra

CD - cauda dobrada

CBRA Colégio Brasileiro de Reprodução Animal

CONC - concentração espermática

DM - defeitos maiores

DME - defeitos menores

DSS dodecil-sulfato de sódio

DT - defeitos totais

EDTA - etileno-diamino-tetra-acetato-dissódico

EQUEX Equex STM

GOT transaminase glutamato oxalacético

IA inseminação artificial

MT - motilidade total

MP motilidade progressiva

TE tempo de equilíbrio

TTR - teste de termoresistência

VIG - vigor espermático

VOL - volume

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BITTENCOURT, R.F. Criopreservação do sêmen caprino: influência dos diluidores de congelação, tempos de equilíbrio e curvas de resfriamento. Salvador, Bahia, 2006. 88p. Dissertação (Mestrado em Medicina Veterinária Tropical) - Escola de Medicina Veterinária, Universidade Federal da Bahia, 2006. RESUMO O presente trabalho foi dividido em três experimentos com o objetivo de avaliar a interfêrencia de diferentes protocolos sobre a congelabilidade do sêmen caprino. O Experimento 1 procurou estudar o efeito do período de equilíbrio, à temperatura de 5oC, sobre a eficácia da congelação do sêmen caprino. Para tanto, foram testados quatro tempos de equilíbrios diferentes: 0,5; 1,5; 2,5 e 3,5h. Nesse estudo verificou-se a existência da interferência do tempo de equilíbrio sobre a viabilidade dos espermatozóides caprinos após o processo de congelação-descongelação, tendo o período de equilíbrio de 1,5h como o melhor protocolo. No Experimento 2 objetivou-se avaliar a influência da adição do EDTA, que é um quelante de cálcio, e do emulsificante Equex STM, que tem como substância ativa o dodecil-sulfato de sódio, a um diluidor de congelação do sêmen caprino, formulado a base de Tris-gema de ovo. Também foi objetivo desse trabalho, verificar a eficácia de um diluidor comercial a base de lecitina de soja (Bioexcell®), para a criopreservação do sêmen dessa espécie. Demonstrou-se que a adição do Equex STM ao meio promoveu melhoria nos índices de viabilidade espermática pós-descongelação, em relação aos diluidores que não o continham na composição. Nesse experimento, o Bioexcell® mostrou-se ineficaz para a congelação do sêmen caprino. O Experimento 3 objetivou estudar a interferência da curva de resfriamento e tempo de equilíbrio, sobre os parâmetros espermáticos pós-descongelação na espécie caprina. Assim, foram formados quatro grupos experimentais, dois foram submetidos a uma curva de resfriamento lenta (-0,46oC/min) e os outros dois a uma curva rápida (-1,07oC/min). A esses grupos foram acrescidos diferentes tempos de equilíbrio, após à estabilização da temperatura do sêmen em 5oC. Um grupo resfriado com a curva lenta foi mantido por 15min em equilíbrio e outro por 75min. Os grupos resfriados com curva rápida foram submetidos a tempos de equilíbrio de, respectivamente, 30 e 90min. Não foram observadas diferenças estatísticas entre os grupos, em relação aos parâmetros espermáticos avaliados pós-descongelação. PALAVRAS-CHAVES: Caprinos; sêmen congelado; tempo de equilíbrio, diluidores; curvas de refriamento.

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BITTENCOURT, R.F. Criopreservação do sêmen caprino: influência dos diluidores de congelação, tempos de equilíbrio e curvas de resfriamento. Salvador, Bahia, 2006. 88p. Dissertação (Mestrado em Medicina Veterinária Tropical) - Escola de Medicina Veterinária, Universidade Federal da Bahia, 2006. SUMMARY The present study was divided in three experiments with the objective of verifying the effect of different freezing goat semen protocols. In the Experiment 1 it was studied the stabilization time influence at 5oC on the effectiveness of the freezing goat semen. For that, they were tested four different equilibration times: 0,5; 1,5; 2,5 and 3,5h. In this work, it was observed the existence of the equilibration time interference on the viability of the goat sperms after the freezing-thawing process. The 1,5h stabilization time protocol was the best one. In the Experiment 2 it was aimed to evaluate the influence of EDTA and Equex STM addition to a goat semen freezing extender, formulated with tris-egg yolk. The EDTA is a calcium chelator and the Equex STM surfactant has as active substance the sodium dodecyl sulfate. It was also aim of this study to evaluate the utilization of a soybean-based commercial extender (Bioexcell®). It was shown that the addition of Equex STM to the extender promoted improvement on the sperm viability indexes post-thawing, in relation to the extenders that didn't contain it in the composition. In this experiment, Bioexcell® was ineffective for freezing goat semen. The Experiment 3 aimed to study the interference of the cooling rate and stabilization time on the post-thawing sperm parameters in the goat species. For that, four experimental groups were formed. Two ones were submitted to a slow cooling rate (-0,46oC/min) and the other two ones to a fast cooling rate (-1,07oC/min). After the semen stabilization at 5oC, it was submitted to different equilibration times. One. One of the groups cold with the slow rate was maintained by 15min in stabilization and the other one for 75min. The groups cold with the fast rate were submitted at stabilization times of 30 and 90min, respectively. In relation to the sperm parameters evaluated post-thawing, statistical differences were not observed among the groups. KEY WORDS: Goats; frozen semen; stabilization time; extenders; freezing rate

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1. INTRODUÇÃO GERAL A Caprino-ovinocultura avançam no Brasil, respaldadas pela profissionalização das entidades de criadores e dos próprios produtores. O rebanho brasileiro de ovinos e caprinos cresceu consideravelmente nos dois últimos anos. O mercado nacional nas duas atividades encontra-se aquecido e o consumidor, parte fundamental do processo, busca, cada vez mais, por produtos e empresas que ofereçam, acima de tudo, qualidade. Já o criador tem o desafio de incrementar seu negócio. Isso deve ser feito investindo em genética e estando atento a todas as transformações do mercado que possam agregar valor à sua criação (COUTINHO, 2005). A caprinocultura tem se destacado no setor agropecuário proporcionando bom retorno econômico ao empreendedor, sendo uma atividade que apresenta enorme potencial produtivo. Segundo o IBGE (2003) o rebanho caprino efetivo do Brasil, no ano de 2003, era de 9.581.653 milhões de cabeças. Destas, quase 93% se encontram no Nordeste (8.905.773 milhões), tendo a Bahia como o principal núcleo criador desta espécie, com 3.572.318 milhões de cabeças, o que representa um pouco mais de 37% do total de caprinos criados no Brasil. Contudo, apesar do Brasil ser um dos maiores produtores de caprinos do mundo a sua produção ainda está bem abaixo da demanda do mercado interno de carne e couro dessa espécie. Por essa razão, para o abastecimento do mercado interno, o Brasil vem importando de outros países, peles e carcaças de caprinos, carne desossada, refrigerada ou congelada. A importação de carne caprina passou de US$ 833 mil em 1996 para US$ 17,1 milhões em 2000, representando um crescimento bastante significativo. No Nordeste brasileiro a capacidade instalada dos curtumes é para o processamento de 12,2 milhões de peles ao ano, no Sul do país essa capacidade gira em torno de 1,8 milhões de peles por ano (VASCONCELOS e VIEIRA, 2002). Porém, segundo COUTO (2001) a capacidade de produção dos curtumes no Nordeste e Sul do Brasil fica ociosa em, respectivamente, 37% e 50%. A exportação de peles caprina acumulada no período de 1992 a 1999 foi de US$ 25,9 milhões, a passo que a importação nesse mesmo período foi de US$ 60,5 milhões. A exportação de peles caprina em 2000 no Brasil representou US$ 0,3 milhões, ao mesmo tempo em que importou US$ 8,9 milhões. Os principais países importadores da pele caprina foram a Argentina, a Nigéria e a Itália e os principais exportadores, a Espanha, os Estados Unidos e a Itália (VASCONCELOS e VIEIRA, 2002). Esses dados demontram uma demanda crescente referente à quantidade de carcaça e peles de caprinos e ovinos no país, bem como, evidenciam o potencial da caprino-ovinocultura em fornecer retorno econômico para o investidor brasileiro. Por outro lado, o aquecimento da caprinocultura pode ser demonstrado, também, pelo crescimento da participação da atividade na balança comercial brasileira, com aumento numérico significativo dos subprodutos da espécie caprina nas pautas de exportação. O setor de couros é um exemplo claro: O número de couros caprinos exportados no período de Janeiro a Novembro de 2004 (37.113) comparado como o mesmo período em 2005 (811.072) demonstra um crescimento de 2.085,41%. E o valor, em dólares, do faturamento brasileiro com as exportações de couro caprino, cresceu de US$ 461.625 mil para US$ 3.286.475 milhões, o que representa um aumento de 611,94% (COUROBUSINESS, 2005).

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De uma forma geral, a caprinocultura tem aumentado sua participação no agronegócio brasileiro e mundial, e pela forma que ela está crescendo, com base e seriedade, a tendência é que esse quadro se mantenha em expansão. Os principais atrativos da caprinocultura é que em uma mesma área de criação de bovinos pode-se criar uma quantidade muito maior de caprinos. Tudo isso respeitando e cumprindo um bom manejo de pastagem, cercamento apropriado e outros conceitos (COUTINHO, 2005). Os valores elevados da importação de subprodutos caprinos, para um país que é um dos seus maiores produtores, podem ser facilmente entendidos. Inicialmente, pode-se atribuir à desorganização da cadeia produtiva, as limitações na qualidade e na quantidade dos produtos à disposição das unidades de processamento. Embora, o mercado sinalize para o consumo de carne de animais jovens, abatidos com até seis meses de idade, a maioria dos animais abatidos são velhos e com carcaças de baixa qualidade e rendimento (LEITE, 2002). Para aumentar os índices de produtividade da espécie caprina torna-se necessário maximizar o seu potencial biológico, mediante programas de reprodução programada, que podem promover o melhoramento genético e como consequência dele, o aumento da eficiência produtiva dos caprinos. Porém, a baixa oferta de machos caprinos (MACHADO e SIMPLÍCIO, 1995) faz da inseminação artificial (IA) um instrumento importante para uma difusão mais eficiente do germoplasma de animais considerados melhoradores, que possam proporcionar o melhoramento genético do rebanho caprino, que no Brasil, em sua grande maioria, é caracterizado pela utilização de raças não especializadas (VASCONCELOS e VIEIRA, 2002). A IA tem um importante papel na criação de caprinos, especialmente em sistemas intensivos de produção, facilitando o controle reprodutivo e no auxílio à realização de testes de progênie mais precisos e em menor espaço de tempo (LEBOEUF et al., 2000). A prática da IA na cabra, a exemplo do que ocorre na vaca, é facilitada pela conformação anatômica da cervix, a qual, normalmente, é facilmente penetrada pela pipeta de inseminação durante a fase estrogênica do ciclo estral (SIMPLÍCIO e MACHADO, 1989). Provavelmente, o primeiro registro de inseminação artificial na cabra seja aquele reportado por BENEDIKTOV (1934) (citado por SIMPLÍCIO e MACHADO, 1989). A utilização da IA associada a congelação de sêmen, tem como a principal justificativa, o melhoramento genético dos rebanhos, pela habilidade em produzir uma grande progênie por macho, e em diversos lugares diferentes ao mesmo tempo (LEBOEUF et al., 1998), além de criar a possibilidade da manipulação e armazenamento de material genético (LEBOEUF et al., 2000). Essa característica é necessária para criar e difundir o melhoramento das raças e as

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facilidades na aplicação das recentes técnicas de genética molecular, em programas de seleção animal (LEBOEUF et al., 1998). Desde que o sêmen caprino foi congelado pela primeira vez por SMITH e POLGE (1950) e por BARKER (1957), (citados por LEBOEUF et al., 2000), e que estes reportaram que a fertilidade do sêmen congelado de caprino era muito baixa para ser considerado como de valor prático, muitas investigações têm sido desenvolvidas sobre a congelação de sêmen caprino (LEBOEUF et al., 2000). Apesar do grande número de protocolos que vem sendo testados para a congelação de sêmen caprino, os métodos de congelação (curva de resfriamento e tempo de equilíbrio) e a maioria dos diluidores usados, são provenientes de trabalhos realizados com bovinos e que tiveram bons resultados nessa espécie (LEBOEUF et al., 2000). Assim, como são carentes os estudos para o desenvolvimento de novos diluidores de congelação de sêmen caprino, bem como de protocolos de congelação (curva de resfriamento e tempo de equilíbrio), específicos para essa espécie, esse trabalho surge com o objetivo de testar diferentes aspectos do processo de criopreservação celular, entre eles: curvas de resfriamento, tempos de equilíbrio e diluidores

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2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1. O espermatozóide e a membrana plasmática O espermatozóide é uma célula altamente especializada responsável em executar a função exclusiva de fertilizar um oócito. A cabeça tem a função primordial de promover a penetração no oócito, levando toda a informação genética contida nela. A cauda contém a máquina metabólica responsável pela produção de energia e pelo mecanismo da motilidade espermática (PINEDA, 1989). O espermatozóide é usualmente dividido em cabeça, colo, peça intermediária, peça principal e peça terminal (Fig. 1) (AMANN e PICKETT, 1987).

Figura 1 – 1, membrana citoplasmática; 2, acrossoma; 3, membrana nuclear; 4, núcleo; 5, capa pós-nuclear; 6, centríolo proximal; 7, filamento axial; 8, hélice mitocondrial; e 9, envoltório fibroso. Fonte: GARNER e HAFEZ (1993)

SQUIRES et al. (1999) dividiram o espermatozóide com suas devidas funções em: a) Cabeça que inclui o núcleo, contendo o DNA (material genético), e o acrossoma, contendo enzimas. A membrana acrossomal funde-se com a membrana plasmática, diretamente sobre esta, e promove a liberação das enzimas acrossomais, que favorecem a penetração do espermatozóide na zona pelúcida do oócito. As proteínas da membrana plasmática da cabeça favorecem a ligação dos espermatozóides a receptores da zona pelúcida do oócito; b) Colo que têm a função de conectar a cabeça com a peça intermediária e é relativamente frágil; c) Peça intermediária contendo as mitocôndrias que convertem fontes de energia, como a glicose, em ATP e, este transfere energia para as organelas em todos os processos celulares. A peça intermediária também contém uma série de fibras que continuam por toda a cauda do espermatozóide e são responsáveis pela motilidade espermática e; d) Peça principal e terminal com as fibras da peça intermediária continuando pela peça principal e terminando ao

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final da peça terminal. Nessa última porção também encontra-se o ponto final da membrana plasmática. A função principal está na promoção da motilidade celular. O corpo central da peça intermediária junto com a continuação desse feixe, que se estende longitudinalmente por toda a cauda, compõe o axonema (Fig. 2). Este é composto por nove pares de microtúbulos, que circundam, radialmente, um par de microtúbulos central (arranjo 9+2). Esse arranjo de microtúbulos é recoberto pelas fibras externas densas. O axonema e essa associação de fibras densas, na peça intermediária, ainda estão envolvidos, perifericamente, por inúmeras mitocôndrias, compondo a bainha mitocondrial, que se encontra disposta em hélice (hélice mitocondrial) (Fig 1 e 3) (GARNER e HAFEZ, 1993).

Figura 2: Estrutura do axonema: O axonema é composto por 9 pares de microtúbulos periféricos (Subfibras A e B) e um par de microtúbulos centrais. Fonte : GAGNON (1995) as duas figuras da esquerda e MURDOCK (2003) a da direita.

Figura 3: Ilustração gráfica da peça intermediária (PI, a direita), com a membrana celular parcialmente removida e da peça principal (PP, a esquerda), com corte transversal e com a membrana celular removida, para mostrar as estruturas internas. PI com a MC, membrana celular; HM, hélice mitocondrial; CM, crista mitocondrial A, axonema. PP com a HM, hélice mitocondrial; AJ, anel de Jensen; MC, par de microtúbulos central; MP, microtúbulos periféricos; FE, fibra externa densa e a CL, coluna central. Fonte: PINEDA (1989).

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Recobrindo todas essas estruturas, está a membrana plasmática (SQUIRES et al., 1999), organizada em uma camada bilaminar de lipídios (Fig. 3 e 4), composta por fosfolipídios, com uma porção hidrofílica direcionada para o exterior e a hidrofóbica, direcionada para o interior dessa camada (SINGER e NICOLSON, 1972). Entremeada na camada lipídica, existem inúmeras proteínas (integrais e periféricas), que agem como bombas de íons, levando cálcio, sódio e outros íons para fora da célula, ou formam associações com células do trato reprodutivo feminino, agindo como receptores para a fusão do espermatozóide ao oócito (SQUIRES et al., 1999).

Figura 4: Espermatozóide com corte na membrana plasmática, da região apical da cabeça, para visualização da sua estrutura. Fonte: Mosaico fluido proposto por SINGER e NICOLSON (1972)

Embora as estruturas microtubulares e fibrosas sejam importantes para motilidade celular, as estruturas de membrana são mais importantes em relação aos processos que desencadeiam o choque térmico (AMANN e PICKETT, 1987). Como a membrana é importante para a manutenção do balanço iônico celular, lesões nessa estrutura podem resultar em morte celular (SQUIRES et al., 1999) As estruturas de membrana incluem a membrana plasmática, as membranas acrossomais, interna e externa, a membrana nuclear e a mitocôndria, com suas membranas internas (Fig 5). Essas membranas espermáticas, provavelmente, têm uma estrutura similar, embora difiram bioquimicamente (AMANN e PICKETT, 1987).

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Figura 5: Estruturas de membrana do espermatozóide : (1) membrana plasmática; (2) membrana acrossomal externa; (3) fluido acrossomal; (4) membrana acrossomal interna; (5) membrana nuclear; (6) núcleo; (7) anel nuclear; (8) mitocôndria. Fonte: GADELLA et al. (2001). As membranas são fluidas na temperatura corporal. Essa fluidez representa a habilidade das moléculas de fosfolipídios de se moverem lateralmente. A temperatura é um fator importante que pode alterar essa fluidez. Em geral quanto mais colesterol, menos flexível, ou menor é a fluidez da membrana. Porções da membrana, contendo taxas relativamente altas de colesterol, especialmente se os fosfolipídios são polinsaturados, provavelmente tornam-nas mais resistentes à mudança de temperatura (AMANN e PICKETT, 1987). O colesterol age estabilizando a membrana plasmática associando-se primariamente às cadeias de fosfolipídios e preenchendo os espaços existentes entre eles (SQUIRES et al., 1999). 2.2. Criopreservação espermática e suas etapas A criopreservação do sêmen dos mamíferos é caracterizada por ter uma reconhecida queda de fertilidade quando comparado com o sêmen a fresco. Isso se deve tanto por uma menor viabilidade pós-descongelação como por uma disfunção subletal que ocorre em uma parte da população dos espermatozóides submetidos ao processo. As razões dessa redução na capacidade fecundante são várias, ou afetam a proporção de sobreviventes (choque-térmico, susceptibilidade a curva de resfriamento, composição do diluidor e estresse osmótico.) ou afetam o status funcional dos sobreviventes (estabilidade da membrana plasmática, lesões oxidativas, integridade dos receptores da membrana, estrutura nuclear) (WATSON, 2000). Os problemas da criopreservação não estão relacionados com a manutenção dos espermatozóides a -196oC, pois nessa temperatura não há reações bioquímicas, mas principalmente com as alterações causadas durante o processo de resfriamento e descongelação (PARKS e GRAHAM, 1992). As crioinjúrias às várias organelas celulares são consideradas como sendo provocadas pelos dois maiores estresses do processo de criopreservação celular: a mudança na temperatura e a

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formação e dissolução do gelo e suas conseqüências. Antes do processo de criopreservação, que envolve a saída e o retorno das células a temperatura corporal, tanto o choque térmico pelo frio quanto pelo calor, devem ser incluídos como estresses potenciais a serem considerados, com igual importância que os estágios que envolvem a queda da temperatura até o ponto de congelação (WATSON, 1995). Hoje, sabe-se que a maioria das lesões espermáticas de acrossoma ocorre durante a diluição, resfriamento ou como resultado do período de equilíbrio a que é submetido o sêmen. Isso é importante para que se otimize o processamento inicial do sêmen, fazendo com que a grande maioria de espermatozóides chegue ao processo de congelação-descongelação sem alterações de acrossoma e, assim, com maiores chances de sobreviverem ilesos ao processo (OETTLÉ, 1986). 2.2.1. Curva de refriamento do sêmen As injúrias celulares podem ser causadas por alterações diretas na estrutura celular (como o rompimento de membranas), ou indiretamente por alterações nas funções celulares (como a redução de processos metabólicos). Taxas rápidas de resfriamento do espermatozóide da temperatura ambiente até 5oC, induzem a ocorrência de danos parcialmente irreversíveis caracterizados por padrão anormal de motilidade (circular ou retrógrado), rápida queda de motilidade, danos acrossomais, lesão da membrana plasmática, metabolismo reduzido e perda de componentes intracelulares (SQUIRES et al., 1999). No processo de resfriamento dos espermatozóides, alterações no arranjo laminar da membrana plasmática podem ser evidenciadas, quando esta possui em sua constituição fosfolipídios de cadeias altamente insaturadas. Alguns desses fosfolipídios podem assumir um arranjo circular (fig. 6), denominado de hexagonal-II, com as extremidades hidrofílicas internas (grupo formado pelas cabeças dos fosfolipídios) e as extremidades hidrofóbicas externas (cadeias de ácidos graxos). Para muitos lipídios essa formação da fase hexagonal-II é transitória até o início da fase cristalina e gel. Porém, para certos fosfolipídios, essa estrutura permanece durante todo o resfriamento e torna-se irreversível, impossibilitando a reorganização do arranjo bilaminar quando há o reaquecimento do espermatozóide a temperatura ambiente. Com isso, há a formação de canais hidrofílicos, que possibilitam a passagem de íons ou outras moléculas pequenas, levando assim, a um aumento prejudicial da permeabilidade da membrana (AMANN e PICKETT, 1987).

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Figura 6: Na temperatura ambiente os fosfolipídios permanecem na formação bilaminar (A). Com a redução da temperatura os fosfolipídios com formações similares tendem a se agrupar em domínios que resultam na formação da estrutura cristalina (B). Concomitantemente, as proteínas são forçadas a se agregar, favorecendo o surgimento da fase hexagonal-II. Esse fato resulta no aumento da permeabilidade da membrana celular. Fonte: AMANN e PICKETT (1987).

A proposta do resfriamento do sêmen é reduzir o metabolismo celular e a sua deterioração. Contudo o resfriamento rápido pode levar ao choque térmico e outras lesões. A curva de resfriamento vai depender do volume do sêmen diluído (volumes maiores vão resfriar mais lentamente) e da temperatura inicial da suspensão espermática (SQUIRES et al., 1999). Com isso, diversos experimentos vêm demonstrando a importância da curva de resfriamento para a prevenção da ocorrência de lesões espermáticas durante o processo de criopreservação seminal. Autores como MORAN et al. (1992) em trabalho com equinos, ressaltaram que a curva de resfriamento lenta é necessária no período em que os espermatozóides são mais sensíveis ao choque pelo frio, na faixa compreendida entre 19 e 8oC, quando podem ocorrer mudanças irreversíveis à membrana espermática, caso o resfriamento seja acelerado. Segundo FISER & FAIRFULL (1986) com o sêmen ovino ocorre algo parecido. O resfriamento rápido do sêmen pode acontecer entre as temperaturas de 30 oC a 15oC sem acarretar efeito sobre a sobrevivência espermática antes ou após a descongelação. Entretanto, taxas rápidas de refriamento de 30 oC até temperaturas inferiores a 10oC promovem queda progressiva da motilidade espermática e de acrossomas intactos antes da congelação e uma redução no percentual de células com motilidade pós-descongelação. WURGAU & LEIDL (1989) trabalhando com diversas espécies (bovinos, caprinos, ovinos, suínos e equinos) observaram a influência da velocidade de resfriamento do sêmen até a

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temperatura de 4oC, sobre a viabilidade espermática após a congelação. Esses autores concluíram que a curva de resfriamento mais lenta promoveu melhores índices de motilidade pós-descongelação, quando comparada com o resfriamento mais rápido. DEKA e RAO (1987) em estudo com caprinos identificaram uma menor incidência de lesões acrossomais, especialmente edema de acrossoma, no sêmen resfriado à taxas mais lentas, quando comparado ao ejaculado resfriado rapidamente, embora sem interferência, sobre a motilidade espermática. Entretanto, resultados diferentes foram relatados por WURGAU (1986), que não encontrou diferenças significativas, de lesões espermáticas, para o sêmen exposto à curvas rápida e lenta de resfriamento até a temperatura de 4oC. Estudos sobre a importância da curva de resfriamento para a eficácia da congelação do sêmen caprino são carentes e a maioria dos protocolos existentes se baseiam em trabalhos bem sucedidos realizado com outras espécies. 2.2.2. Tempo de Equilíbrio Segundo OETTLÉ (1986) um apropriado período de equilíbrio, assim como, adequadas taxas de diluição e resfriamento celular, são fatores fundamentais para a prevenção do surgimento de alterações patológicas durante o processo criopreservação espermática e com a otimização desses processos iniciais de pré-congelação, pode-se aumentar os índices de viabilidade espermática pós-descongelação. Porém, autores como RITAR e SALOMON (1983); SIMPLÍCIO e MACHADO (1989) e RITAR et al. (1990) citam que o período de equilíbrio pode ser uma etapa dispensável no processo de congelação do sêmen caprino. Discordando dessa afirmativa, alguns autores têm demonstrado a importância do tempo de equilíbrio para o aumento da viabilidade do sêmen caprino descongelado. WESTHUYSEN (1978) verificou percentuais de 1 a 2% de células com motilidade pós-descongelação quando não foi utilizado o tempo de equilíbrio, enquanto que para o grupo que permaneceu por 2h em equilíbrio a 5oC a motilidade espermática variou de 18 a 40%. SALOMON e RITAR (1982) citam em seu trabalho que uma metodologia alternativa a criopreservação do sêmen sem a eliminação do plasma seminal, poderia ser feita com uma diluição realizada em uma etapa, seguida do resfriamente por uma 1 a 1,5h, acompanhada, posteriormente, por um tempo de equilíbrio de apenas uma 1,5h, à temperatura de 4 a 5oC, antes da congelação.

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A maioria dos trabalhos demonstra que o período de equilíbrio ao qual o sêmen caprino deve ser submetido, previamente a congelação, vai até as 4h de estabilização à temperatura de 5oC (SINHA et al., 1992; DUTTA et al., 1996). No entanto, DEKA e RAO (1986) encontraram maiores médias (P<0,05) de motilidade espermática pós-descongelação, para o sêmen submetido a 5h de equilíbrio, quando comparado com o sêmen equilibrado por 1 ou 3h, apesar de que, o sêmen que permaneceu por 1h em equilíbrio, obteve os menores índices de alterações de acrossoma. SIVASELVAM et al. (2000) estudando dois tempos de equilíbrio (4 e 5h), observaram para o grupo de 4h os melhores índices de viabilidade espermática pós-descongelação. DUTTA et al. (1996) testando 2, 4 e 6h de tempo de equilíbrio a temperatura de 5oC obtiveram melhores taxas de motilidade, células morfologicamente normais e acrossomas íntegros, com as 4h de equilíbrio. Dados esses que corroboram os encontrados por SINHA et al. (1992) que ao testarem os mesmos tempos de equilíbrio (2, 4 e 6h), tiveram os melhores resultados após a descongelação, com o grupo que permanceu por 4h em equilíbrio. DAS e RAJKONVAR (1995) observaram que o sêmen que permaneceu por 3h em tempo de equilíbrio a 5oC, obteve melhores índices de motilidade pós-descongelação, quando comparado ao sêmen que permaneceu por uma 1 e 6h, resultados semelhantes ao obtidos em trabalho anterior (DAS e RAJKONVAR, 1993). DAS e RAJKONVAR (1994) e DAS e RAJKONVAR (1996) também obtiveram os menores índices de lesões acrossomais utilizando 3h de tempo de equilíbrio, em relação ao sêmen congelado após 1 e 6h de equilíbrio a temperatura de 5oC. BARUAH et al. (2003) não verificaram diferenças significante (P>0,05), em relação às taxas de motilidade espermática e lesões acrossomais, para as amostras de sêmen equilibradas por 0,5; 1 e 1,5h. 2.2.3. Curva de congelação Quando o sêmen é resfriado sob temperaturas abaixo de 0oC, ocorre a formação de gelo no meio extracelular, com aumento na concentração de sais, o que provoca a saída da água do meio intracelular para o extracelular, a favor do gradiente osmótico, levando o espermatozóide a uma desidratação progressiva e lesão celular (AMANN e PICKETT, 1987). Também é importante enfatizar que a curva de congelação ideal deve ser suficientemente lenta, para permitir que os espermatozóides se desidratem e, rápida o bastante para evitar que os espermatozóides fiquem expostos, por muito tempo, as altas concentrações de soluto (SNOECK, 2003).

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A velocidade de congelação do sêmen pode ser regulada pela distância a que são colocadas as palhetas do nível do nitrogênio líquido e pelo tamanho da palheta: fina (0,25mL) ou média (0,5mL). Na forma mais comum, as palhetas contendo o sêmen caprino são colocadas horizontalmente no vapor do nitrogênio líquido a 4 ou 5cm de atura da lâmina do nitrogênio líquido por 4 ou 5 min, quando então as palhetas são derrubadas no nitrogênio líquido (LEBOEUF et al., 2000). Para o sêmen envasado em palhetas de 0,5mL, usando um diluidor convencional, a curva de congelação ficará em torno de -60oC/min, quando as palhetas são colocadas no vapor de nitrogênio líquido à temperatura de -160oC (AMANN e PICKETT, 1987). 2.2.4. Descongelação do sêmen A temperatura de aquecimento utilizada na descongelação do espermatozóide está intimamente relacionada com a curva de congelação. Quando a congelação é procedido rapidamente há a formação de microcristais intracelulares, não necessariamente deletérios a célula, contudo essas células contendo microcristais devem ser aquecidas rapidamente para evitar a recristalização desses pequenos cristais em cristais maiores, que podem então, lesar a as células. Por esse fato, quando a curva de resfriamento for rápida, a taxa de aquecimento (processo de descongelação) também deve ser rápida (AMANN e PICKETT, 1987). Além disso, as taxas ideais de resfriamento e aquecimento também são influenciadas pela concentração dos ingredientes no diluidor, incluindo a concentração do glicerol (SQUIRES et al., 1999). Como as curvas de congelação utilizadas para o sêmen caprino são comumente de velocidade moderada, as curvas de descongelação são geralmente obtidas incubando-se as amostras em banho maria com a temperatura estabilizada em 37oC por 10 a 40s (DEKA e RAO, 1986; FERRARI, 1993; BARBOSA, 1999). Entretanto, alguns trabalhos têm citado que a descongelação do sêmen caprino à temperaturas mais elevadas (70oC) tem propocionado melhores taxas de viabilidade espermática pós-descongelação quando comparado aos protocolos convencionais de descongelação (37oC) (TULI et al., 1991; citado por LEBOEUF et al., 2000). Contudo, deve ser observado que a descongelação do sêmen à 37oC é mais confiável nas condições práticas da inseminação artificial e além disso, o risco de super-aquecimento, com o uso dessa temperatura, também é eliminado. 2.3. Diluidores de congelação Um grande número de diluidores tem sido estudado para a congelação de sêmen caprino como, água-de-coco (ARAÚJO e NUNES, 1991), leite de cabra (DESHPANDE e MEHTA, 1991), maltose-gema de ovo (DAS e RAJKONWAR, 1996), ácido-cítrico-frutose-gema de ovo, com ou sem tris (SINGH e PURBEY, 1996a), citrato-frutose-gema de ovo (SINGH e PURBEY, 1996b), o leite desnatado de vaca, em pó e reconstituído, citrato de sódio-glicose-gema de ovo, sacarose-EDTA, CaNa2-gema de ovo, rafinose-gema de ovo, Spermasol-gema de ovo, tris-gema de ovo, test-gema (LEBOEUF et al., 2000),

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Em geral, o diluidor apropriado deve promover uma pressão osmótica compatível com a do sêmen e essa depende dos ingredientes no meio e da taxa de eletrólitos e não-eletrólitos; balanço apropriado de elementos minerais, já que há indícios de que o nível de eletrólitos e não-eletrólitos pode ter um efeito significativo sobre a fertilidade; combinação apropriada de nutrientes, para o fornecimento adequado de energia aos espermatozóides e manutenção da motilidade; neutralização de produtos tóxicos produzidos pelos espermatozóides, como o ácido lático e, equilíbrio do pH do meio; proteção contra mudanças de temperatura, especialmente contra o frio; estabilização dos sistemas enzimáticos e integridade das membranas conferida por macromoléculas que estabilizarão as membranas e minimizarão o vazamento de íons e enzimas (AMANN e PICKET, 1987). AMANN e PICKET, (1987) também citam que a diluição do sêmen também é importante por permitir um tratamento efetivo do sêmen com antibióticos, minimizando a possibilidade de transmissão de patógenos ou de organismos potencialmente patogênicos, prolongar a sobrevivência dos espermatozóides e aumentar a vida útil do espermatozóide, proteger os espermatozóides de condições ambientais desfavoráveis, aumentar o volume do ejaculado, reduzindo os efeitos tóxicos dos subprodutos do metabolismo espermático, e possibilitar a avaliação apropriada da motilidade espermática individual, evitando, ao mesmo tempo, a aglutinação dos espermatozóides. Autores como TULI e HOLTZ (1992), que compararam a utilização de quatro tampões (Tris, TEST, TEX e BES) em um meio de congelação de sêmen caprino, contendo gema-de-ovo e glicerol, concluíram que a porcentagem de espermatozóides vivos e com motilidade progressiva foi muito superior no diluidor contendo o Tris do que aqueles que usaram um dos outros 3 tampões. CHAUHAN e ANAND (1990), também verificaram que o sêmen de caprinos congelado em diluidores a base de Tris, gema-de-ovo e 7% de glicerol, tiveram melhores resultados in vitro (motilidade) e in vivo (taxa de prenhes das cabras inseminadas), do que diluidores que não continham o Tris em sua composição. SINGH e PURBEY, 1996a, ao observarem as taxas de alterações de acrossoma no processo de congelação, verificaram que a queda na percentagem de acrossomas intactos pré e pós-congelação, foi de 88,76% para 68,90%, no diluidor que continha o Tris em sua composição, enquanto que no diluidor que não o continha a queda foi de 85,98 para 56,70%. DESHPANDE e MEHTA (1991) compararam a congelabilidade do sêmen caprino em três diluidores: citrato-frutose-gema de ovo, tris-ácido cítrico-frutose-gema de ovo e leite de cabra e observaram que a motilidade e o número de espermatozóides vivos pós-descongelação foi maior no sêmen congelado com citrato-frutose-gema de ovo. Baseado no limitado número de estudos comparando os diluidores quanto à viabilidade espermáticda pós-descongelação, a liberação da transaminase glutamato oxalacético (GOT) e a fertilidade tem sido os critérios utilizados para a avaliação e escolha dos diluidores de preferência.(LEBOEUF et al., 2000). A liberação da enzima GOT pelas células está associada às lesões de membrana (TULI e HOLTZ, 1994).

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2.4. Crioprotetores celular Agentes crioprotetores são essenciais para a criopreservação de quase todos sistemas biológicos (FAHY, 1986). A primeira descrição do uso de crioprotetores para a criopreservação é originada de MAXINOV (1908) citado por SALAMON e MAXWELL, (1995), que observou que tecidos e células de plantas suspendidas em soluções contendo glicerol parcialmente sobreviveram a congelação à 220C negativos. Esses agentes devem ser adicionados ao diluidores seminais para possibilitarem a sobrevivência dos espermatozóides durante o processo de congelação e descongelação (AMANN e PICKET, 1987). Os crioprotetores são classificados como penetrantes, quando exercem sua ação crioprotetora dentro da célula ou não penetrantes, cuja atividade de crioproteção ocorre fora da célula. 2.4.1. Crioprotetores penetrantes Entre os crioprotetores penetrantes o glicerol é o mais frequentemente utilizado como agente crioprotetor do espermatozóide caprino desde a demonstração da sua eficácia (SMITH & POLGE et al., 1950, citado por LEBOEUF et al., 2000), e têm ação tanto intracelular como extracelular na proteção das estruturas celulares (SQUIRES et al., 1999). O seu efeito protetor é atribuído a sua propriedade coligativa ou de ligação com a água (SALOMON & MAXWELL, 1995). Também aumenta o volume de canais de solventes descongelados, dilui as altas concentrações de sais (SQUIRES et al., 1999) e diminui a pressão osmótica do meio resfriado (SALAMON & MAXWELL, 1995). Outros crioprotetores penetrantes ou internos incluem os do grupo de rápida penetração, o etilenoglicol, propanodiol e o dimetil sulfóxido (DMSO), que têm menores pesos moleculares que o glicerol, e agem protegendo o espermatozóide, provavelmente, através do mesmo mecanismo que o glicerol (MOLÍNIA et al., 1994a). Estes autores estudaram a eficiência desses crioprotetores, sozinhos ou em diversas associações, na criopreservação do espermatozóide ovino. Inicialmente verificou-se a ineficácia do DMSO, como crioprotetor do espermatozóide ovino. Também foi verificado que apesar do etilenoglicol e do propanodiol, exercerem atividade crioprotetora, sobre os espermatozóides, o glicerol, sozinho, em concentração de 6%, obteve os melhores resultados tanto na motilidade pós-descongelação, quanto na percentagem de acrossomas intactos. Os autores ainda citaram que o melhor desempenho do glicerol, está ligado à existência de uma interação entre esse e a membrana plasmática do espermatozóide, o que não acontece com os outros crioprotetores penetrantes. MOLÍNIA et al. (1994a) também afirmaram que a afinidade pela água é a principal característica das substâncias utilizadas para a crioproteção das células vivas, expostas à temperaturas a baixo do ponto de congelação, e que essa estreita afinidade, é mais significativa para o glicerol, do que para os outros crioprotetores. Por último, esses autores observaram o efeito tóxico quando diferentes crioprotetores foram associados. Esse fenômeno já havia sido reportado por FAHY (1986), e no momento ele o denominou como, injúrias da congelação pela associação de crioprotetores.

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Os álcoois poliídricos ou polióis, que são, estruturalmente semelhantes ao glicerol, também, foram estudados na crioproteção do espermatozóide ovino por MOLINIA et al. (1994b), sozinhos ou associados ao glicerol. Esses autores, porém, concluíram que o glicerol, sozinho, em uma concentração de 6%, foi mais eficaz que os polióis estudados (adenitol, inositol, manitol, sorbitol e xilitol), tanto nas associações, quanto sozinhos. Existem estudos com o DMSO, propanodiol, butanodiol, amidas, álcoois do açúcar, mas nenhum desses tem mostrado maior capacidade de preservação dos espermatozóides dos mamíferos que o glicerol. As exceções estão na maior sobrevivência dos espermatozóides dos coelhos e dos elefantes, em meios contendo DMSO (WATSON, 1995). O glicerol tem sido o crioprotetor mais usado para a congelação de sêmen caprino. A concentração de glicerol usada em diferentes estudos, varia de 3% a 9%, obtendo-se os melhores resultados quando essa concentração encontra-se entre 4% a 7% do diluidor utilizado (LEBOEUF et al., 2000). A concentração de glicerol guarda relação direta com o diluidor usado. Quando se usa leite desnatado, em pó e reconstituído, recomenda-se a adição de 6 a 7% de glicerol (SIMPLÍCIO e MACHADO, 1989); outros autores têm fixado em 7% a concentração do glicerol usado (CHAUHAN e ANAND, 1990; SILVASELVAM et al., 2000 a; BISWAS et al., 2001). Isso pode ser explicado pela melhor congelabilidade do sêmen caprino em diluidores, contendo 7% de glicerol, que em concentrações mais baixas (DAS e RAJKONWAR, 1995; DAS e RAJKONWAR, 1996; SILVASELVAN et al., 2000 b; BISWAS et al., 2001), ou em concentrações mais altas (10%) desse crioprotetor (SILVASELVAM et al., 2000 b; BISWAS et al., 2001). TULI e HOLTZ (1994) observaram que a adição do glicerol em etapas, desde a temperatura ambiente (30oC) até o resfriamento (5oC) promoveu melhores taxas de espermatozóides com motilidade progressiva e de espermatozóides vivos do que quando foi adicionado o glicerol de uma só vez (a temperatura ambiente) ou após o resfriamento a 5oC. O etilenoglicol foi estudado, para a criopreservação do espermatozóide caprino, por SOUZA et al. (2002), que observaram que o etilenoglicol deu menor proteção ao espermatozóide caprino que o glicerol. SILVASELVAM et al. (2000b) ao comparar o glicerol e etilenoglicol, nas mesmas concentrações (5, 7 e 10%), baseado na motilidade pós-descongelação, concluiu que o glicerol a 7% foi o protocolo mais eficaz na crioproteção da célula espermática caprina. Esses resultado discordam dos verificados po BITTENCOURT et al. (2004), que encontraram um maior número de defeitos maiores e totais (p<0,01) para o grupo com sêmen caprino congelado em diluidor contendo o glicerol (7%) em relação ao grupo com etilenoglicol (7%), apesar da menor (P<0,0001) motilidade encontrada para o segundo grupo (51% x 10%).

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Contudo, a toxicidade dos crioprotetores ainda é um obstáculo fundamental ao potencial da crioproteção artificial completa, porém esse fenômeno ainda permanece pouco compreendido (FAHY et al., 1990). Com o conhecimento biológico e físico-químico dos efeitos dos crioprotetores, é sugerido que a toxicidade destes agentes é um fator limitante, fundamental, dentro da criobiologia. Esse fato não só faz com que esta toxicidade impossibilite o uso de níveis necessários desses aditivos, para que se consiga uma ação crioprotetora completa, mas também pelo fato dessa toxicidade ser manifestada na forma de crioinjúrias, sobre e além dos processos clássicos de crioinjúria celular. Isso acaba levando ao confundimento de quais alterações celulares foram causadas pelos efeitos tóxicos do crioprotetor ou pelos inúmeros processos da criopreservação celular que podem ocasionar danos celulares (FAHY, 1986). Entretanto, LEIBO (2003) (Comunicação Pessoal) discorda desse conceito de toxicidade celular provocada pelo crioprotetor e afirma que as lesões espermáticas são conseqüência do choque osmótico provocado pela introdução do sêmen em um meio contendo um crioprotetor, já que estes acarretam altas osmolaridades ao meio, incompatíveis com a osmolaridade seminal, que é em torno de 300 mOsmol/L (MELO, 1999; SNOECK, 2003). SNOECK (2003) verificou que a osmolaridade do seu diluidor de congelação (lactose-EDTA-gema-de-ovo) sem o crioprotetor era de 356 mOsmol/L, após a introdução do glicerol (5%) e etilenoglicol (5%), em duas soluções diferentes, a osmolaridade foi para 1110 mOsmol/L e 1230 mOsmol/L respectivamente, demonstrando que os espermatozóides podem sofrer um estresse osmótico grande em decorrência desse diferencial de osmolaridade entre o sêmen fresco e após diluição nos meios de congelação. Esse fato é conflitante com os achados de FISER e FAIRFULL (1989), que demonstraram que a motilidade pós-descongelação e a integridade acrossomal de espermatozóides de carneiros, não foram afetadas pelas mudanças osmóticas glicerol-dependentes, associadas com a diluição do sêmen. Porém, MOLÍNIA et al. (1994a) sugere que esse fenômeno provavelmente não ocorre com o etilenoglicol e o propanodiol. 2.4.2. Crioprotetores não penetrantes Os crioprotetores não penetrantes como a lactose e as lipoproteínas encontradas na gema do ovo, agem somente no compartimento extracelular. Estes crioprotetores favorecem a desidratação dos espermatozóides, reduzindo a probabilidade de formação de grandes cristais de gelo dentro das células (SQUIRES et al., 1999). Além das proteínas do leite e da gema de ovo, outras substâncias atuam como crioprotetores não penetrantes, como a albumina sérica bovina (BSA), açúcares como a frutose, trealose, lactose, manose, rafinose, polímeros sintéticos como a polivinilpirrolidona, metilcelulose e amido (JASKO, 1994; McKINNON, 1996).

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Outros dois agentes que têm mostrado possuir propriedades crioprotetoras são a glicina betaína e a prolina. Estes agentes estabilizam a membrana plasmática, provavelmente, por manterem a hidratação das proteínas de membrana (WATSON, 1995). A gema-de-ovo tem sido largamente usada como crioprotetor da membrana plasmática do espermatozóide em diversas espécies, inclusive na espécie caprina (DAS e RAJKONWAR, 1995; SILVASELVAM et al. 2000a; SILVASELVAM et al. 2000b). WATSON (1995), chegou a afirmar que ela seria o mais efetivo agente protetor do espermatozóide contra o choque térmico provocado pelo frio, prevenindo o dobramento de cauda dos espermatozóides e protegendo a motilidade espermática. WATSON e MARTIN (1975), observaram que a gema de ovo conferia certa proteção ao espermatozóide contra a queda de motilidade e sugeriu que a essa proteção ocorreria durante o resfriamento e congelação por sua interação com membrana plasmática do espermatozóide. Os lipídios presentes na gema-de-ovo são os principais responsáveis pela ação protetora sobre a membrana espermática. O componente essencial de sua ação é a interação desses lipídios na gema-de-ovo com a membrana espermática, tornando-a mais resistente durante o resfriamento (WATSON, 1995). QUINN et al. (1980) observaram que ao adicionar fosfolipídios ao sêmen centrifugado de carneiros, foi promovida uma imediata proteção contra o choque térmico, verificada pela avaliação da motilidade. Ao recentrifugarem o sêmen, este tornou-se novamente susceptível ao choque térmico. Esses autores notaram que os fosfolipídios adicionados ao sêmen e incubados por 3h a 37oC, não tinham se incorporado às membranas celulares e que a relação de fosfolipídios e colesterol no espermatozóide não foi mudada. Assim, concluíram que o efeito protetor dos fosfolipídios contra choque térmico dos espermatozóides de carneiros é devido a uma fraca interação dessas estruturas lipídicas com a membrana plasmática das células. Um problema específico na preservação do sêmen caprino tem sido o efeito prejudicial do plasma seminal na viabilidade dos espermatozóides em diluidores contendo gema-de-ovo e leite como componentes (LEBOEUF et al., 2000). Alguns autores desaprovam a utilização da gema-de-ovo em diluidores usados para a congelação de sêmen caprino, por afirmarem que a existência de fosfolipases e lisofosfolipases no sêmen caprino (produzidas pelas glândulas bulbo-uretrais) seriam catalisadores da hidrólise de lipídios presentes na gema de ovo em ácidos graxos e lisofosfolipidios, substâncias essas que seriam deletérias para o espermatozóide (SIMPLÍCIO e MACHADO, 1989). Porém, CHAUHAN e ANAND (1990) acompanharam todos os passos da congelação de sêmen caprino diluído em meio contendo gema-de-ovo, com o objetivo de verificar se essa hidrólise ocorreria. Eles observaram que em todas as etapas as 2 enzimas (fosfo e lisofosfolipases) apesar de permanecerem ativas, não desencadearam a hidrólise dos dois

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maiores lipídios da gema-de-ovo (fosfatidil colina e fosfatidil etanolamina),.presentes no diluidor. No mesmo estudo, esses autores inseminaram 26 cabras com sêmen diluído e congelado em meio composto por Tris-gema de ovo, e obtiveram 21 animais prenhes dos 26. TULI e HOLTZ (1994) observaram que a redução da motilidade progressiva e do número de espermatozóides vivos em um diluidor contendo gema de ovo em sua composição, foi menor no sêmen com o plasma seminal do que aquele cujo plasma seminal foi removido. AZERÊDO (1999) utilizou sondas fluorescentes para avaliar a integridade das membranas plasmáticas de espermatozóides caprinos na presença ou não de plasma seminal, antes e após congelação/descongelação. Após avaliar 36 ejaculados, de 3 animais, observou que o percentual de espermatozóides com membranas plasmáticas lesadas aumentou após a remoção do plasma seminal e, acentuou-se com a congelação/descongelação. Além disso, a motilidade espermática mostrou-se significativamente aumentada quando o plasma seminal estava presente, tanto antes, como após a congelação, levando-o a concluir que a remoção do plasma seminal mostrou-se prejudicial para a congelação de sêmen caprino. DASKIN e TEKIN (1996) verificaram uma maior taxa de motilidade e uma menor percentagem de lesão de acrossoma (respectivamente 47% e 25%) pós-descongelação para o sêmen congelado sem centrifugação, em meio contendo gema de ovo, que para as amostras congeladas em meio sem gema (19% e 33% para motilidade e lesão acrossomal, respectivamente). 2.4.2.1. Lecitina de soja Os aditivos de origem animal (gema-de-ovo e leite) comumente adicionados a diluidores de congelação de sêmen, representam um risco potencial para a contaminação do diluidor, caso certos contaminantes (microbianos ou outros) estejam no produto crú. Além desse fato, também há uma falta de controle da qualidade desses aditivos, devido a grande variação da composição dos mesmos (GIL et al., 2003). Assim, diluidores comerciais, com a ausência da gema de ovo e do leite em suas composições, têm se tornado disponíveis recentemente (Biociphos® and Bioexcell®, IMV, L'Aigle, France), e já com a existência de relatos da boa fertilidade alcançada para o sêmen de reprodutores bovinos e ovinos criopreservados com esses meios (GIL et al., 2003; GIL et al., 2000). GIL et al. (2003) compararam a eficácia do Bioexcell®, em relação a um diluidor convencional, a base de leite-gema de ovo, para a criopreservação do sêmen ovino. O estudo verificou índices de fertilidade semelhantes entre as ovelhas inseminadas com o sêmen congelado nos diferentes protocolos. Com isso, os autores ressaltaram que o Bioexcell®, que não contém nenhum aditivo de origem animal, pode ser uma alternativa segura quando o sêmen congelado for utilizado para a introdução de um novo material genético em um novo rebanho e, principalmente, em um outro país.

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Também, a utilização de diluidores de congelação sem a presença da gema-de-ovo e do leite anularia o efeito negativo sobre os espermatozóides caprinos, quando essas substãncias são colocadas em contato com o sêmen dessa espéce (SIMPLÍCIO e MACHADO, 1989). 2.5. Utilização do EDTA Em temperaturas reduzidas, há uma queda na síntese de ATP e todos os mecanismos fisiológicos dependentes de ATP, como a bomba de sódio-potássio, ficam comprometidos. Isso pode resultar em uma despolarização parcial da membrana plasmática, provocando a abertura dos canais de cálcio controlados por voltagem, levando, assim, ao influxo de cálcio. Esse aumento do cálcio intracelular promoveria a ativação das fosfolipases, e, assim, ocorreria a hidrólise dos fosfolipídios da membrana espermática. Tanto as alterações provocadas aos fosfolipídios, como a formação de ácidos graxos livres, acarretariam um aumento da permeabilidade da membrana mitocondrial e plasmática, o que potencializaria a morte celular (AMANN & PICKETT, 1987). Outro fator importante é a interação entre o íon de Ca2+ e os lipídios de membrana, o qual tem importante influência sobre a orientação das cabeças polares dos fosfolipídios da membrana, do grau de solubilidade e da fase de transição quando há mudança de temperatura (BAKAS et al., 1991). Assim, visando minimizar o efeito deletério do cálcio durante o processo de congelação, a partir de 1973, alguns autores passaram a empregar o etileno-diamino-tetra-acetato-dissódico (EDTA) em meios diluidores para a congelação de sêmen eqüino (MARTIN et al., 1979). A função principal do EDTA é a de quelar o cálcio no meio extracelular, diminuindo seu influxo para o meio intracelular (WATSON, 1981). Essa função é extremamente importante, principalmente no processo de resfriamento, já que a concentração de cálcio intracelular aumenta na proporção em que cai a temperatura, sendo o espermatozóide capaz de restaurar os níveis normais de cálcio até 220C ou em temperaturas superiores a esta, por um período de até duas horas. Porém o acúmulo irreversível de cálcio intracelular pode ser observado ao resfriar o espermatozóide bovino à temperaturas abaixo de 160C, estando esse acontecimento correlacionado com a ocorrência de lesões na membrana espermática (ROBERTSON & WATSON, 1986). O cálcio também tem uma importante função na ocorrência da reação acrossomal, que é reduzida na presença do EDTA (ROLDAN et al., 1994). A peroxidação dos fosfolipídios da membrana espermática é um outro fator que influencia a queda da fertilidade do sêmen congelado. Essa peroxidação pode ser prevenida através da manipulação seminal em condições anaeróbicas e através da utilização de anti-oxidantes e agentes quelantes como o EDTA (SALAMON & MAXWELL, 2000). Assim, o EDTA tem sido adicionado na composição de diluidores de centrifugação e de congelação de sêmen da espécie equina (ALGHAMDI et al., 2002, DEVIREDDY et al., 2002), de lhama (BAER et al., 1999), de bovinos e búfalos (DHAMI et al., 1993), suínos

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(NUNES et al., 2000) e de ovinos (AISEN et al., 2000). No resfriamento de sêmen caprino o EDTA foi utilizado por PURANIK et al. (1994) e por BIITTENCOURT et al. (2004). DHAMI & SAHNI (1993) observaram no sêmen de bovinos e bubalinos, uma implementação de 10-12% na taxa de motilidade espermática pós-descongelação com o diluidor que continha 0,1% de EDTA em sua composição, em relação ao diluidor que não o continha. BITTENCOURT et al. (2004) também observaram uma implementação de 10% na motilidade dos espermatozóides caprinos congelados em diluidor com 0,1% de EDTA, em relação ao diluidor que não o continha. KUO et al. (1998), ao estudar o efeito do EDTA sobre os espermatozóides, pôde observar que esse tinha a capacidade de aumentar a velocidade espermática curvilínea e a retilínea em 31 e 20% respectivamente, além de prolongar ambos os tipos de motilidade espermática em 68 e 61%, respectivamente. Esse prolongamento da motilidade pode ser explicado porque o EDTA tem a capacidade de prevenir e minimizar a perda de ATP espermático (BILODEAU et al., 2002), tão importante para a manutenção do metabolismo e motilidade espermática (GAGNON, 1995). 2.6. Equex STM Alguns trabalhos, também têm demonstrado que a introdução de substâncias emulsificantes, ao meio de congelação, como o Equex STM Paste (Nova Chemical Sales, Scituate Inc., MA, USA), que tem como princípio ativo o dodecil-sulfato de sódio (DSS), têm melhorado os índices qualitativos, sobrevivência e longevidade dos espermatozóides pós-descongelação, de cães (ROTA et al., 1997; PEÑA e LINDE-FORSBERG, 2000; PEÑA et al., 2002), equinos (MARTIN, 1987; FURST, 2002) e ovinos (MAIA et al., 2005). A função do DSS é aumentar a solubilidade dos fosfolipídios da gema de ovo, melhorando a disponibilidade e, assim, a sua capacidade de proteção à membrana plasmática dos espermatozóides contra o choque térmico e as alterações promovidas pelo processo de criopreservação (ROTA et al., 1997). O Equex STM foi testado po MAIA et al. (2005) no diluidor de congelação do sêmen ovino. Os autores compararam a congelabilidade do sêmen ovino em um diluidor a base de Tris-gema de ovo com 0%, 0,5% e com 1% de Equex STM. Esse estudo demonstrou que a adição do Equex aumentou (P<0,05) a motilidade total e progressiva do espermatozóide em relação ao meio sem detergente. No diluidor Tris a motilidade total e progressiva foram de 34% e 24%, respectivamente, enquanto que no meio Tris com 0,5% de Equex essas foram de 65% e 39% e no Tris com 1% foram 70% e 39%. Resultados que demonstraram o efeito benéfico da utilização do detergente na congelação do sêmen ovino.

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PEÑA e LINDE-FORSBERG (2000) em trabalho com cães também demontraram que o diluidor de congelação do sêmen que continha 0,5% de Equex STM promoveu melhores (P<0,05) índices de sobrevivência pós-descongelação e após o teste de termoresistência. THOMAS et al. (1992) (citado por PEÑA e LINDE-FORSBERG, 2000) e PEÑA et al. (2003) verificaram qua a sobrevivência e longevidade dos espermatozóides, tanto quanto a qualidade do movimento espermático pós-descongelação, foram significativamente superiores no diluidor contendo Equex STM, quando comparado com o mesmo diluidor sem essa substância. Em estudo realizado por PEÑA et al. (2002) objetivou-se comparar o efeito da adição de duas preparações diferentes de detergentes comerciais, Equex STM Paste e Equex Paste (Minitüb, Tiefenbach, Germany), cujo ingrediente ativo é o mesmo, o dedecil-sulfato de sódio, ao meio de congelação do sêmen canino. Os mesmos verificaram qua a sobrevivência e longevidade espermática, tanto quanto a qualidade do movimento espermático pós-descongelação, foram significativamente superiores, no diluidor contendo Equex STM. Entretanto, apesar dos bons resultados obtidos com a utilização do Equex STM Paste para a criopreservação do sêmen de outras espécies, nenhum estudo bibliográfico foi encontrado para a espécie caprina. 2.7. Avaliação do sêmen descongelado 2.7.1 Características microscópicas e morfológicas do sêmen As células espermáticas precisam estar em condições ideias para obterem uma taxa de fertilização adequada, após serem submetidas a qualquer método de preservação. Incontestavelmente, o melhor método para se testar a eficiência de uma determinada tecnologia de preservação de sêmen baseia-se nas taxas de fertilidade, obtidas após sua utilização. Apesar disso, testes laboratoriais existentes para se verificar a capacidade fertilizante das células espermáticas têm valor significativo, porém nem sempre refletem a fertilidade da amostra estudada. Dentre os testes laboratoriais podemos destacar a avaliação da motilidade total, motilidade progressiva, vigor, e morfologia do sêmen (RIBEIRO FILHO, 1996). Até o presente momento, a variável mais utilizada para estimar o percentual de espermatozóides viáveis é a avaliação subjetiva da motilidade e vigor. Embora útil e rotineiramente empregada esse método não é o ideal, pois considera apenas uma característica da célula espermática. Além disso, está sujeita à influência de alguns fatores, como a temperatura de conservação da amostra, o volume da gota, tempo entre preparo da lâmina e sua avaliação, assim como a variação intra e inter-avaliadores (ZÚCCARI, 1998). O processo de preservação de sêmen, particularmente no estado congelado, causa danos ultra-estruturais, bioquímicos e funcionais aos espermatozóides, resultando na redução da

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motilidade, viabilidade, dificultando o transporte no trato reprodutivo feminino e, conseqüentemente, prejudicando a fertilidade (LEBOEUF et al., 2000). As lesões estruturais são atribuídos à ruptura da membrana causada pela formação de cristais de gelo intracelular, que ocorre durante o processo de congelação, ou por efeitos osmóticos ou forças mecânicas do gelo extracelular durante o lento resfriamento (MAZUR, 1984). TASSERON et al. (1977) ao avaliar o sêmen descongelado de carneiros, observou danos acrossomais nos espermatozóides, que chegaram a cerca de 40%, detectado por meio de microscopia de luz, e de cerca de 70% detectado por meio de microscopia eletrônica. SANTOS (2001a), logo após a descongelação do sêmen, também encontrou altas taxas de lesões de acrossoma, em torno de (43% a 46%). A avaliação microscópica das alterações espermáticas induzidas pelo processo de criopreservação em diversas espécies tem sido extensivamente utilizada. E muitos estudos são direcionados no sentido de melhorar a visualização principalmente dos danos acrossomais (SOUZA et al., 2001), onde elevados índices de danos dessa estrutura são comuns e esperadas, após o processo de criopreservação e, embora causem infertilidade, os danos acrossômicos não interferem na motilidade, e são distribuídos igualmente entre a população de espermatozóides móveis e imóveis (SANTOS, 2001). Portanto, torna-se necessária a utilização de outros testes além da motilidade e vigor, para verificar a viabilidade espermática, já que pesquisas vem demonstrando que o emprego de um teste isoladamente, ,na maioria das vezes, é ineficaz para detectar as lesões que estão atingindo a célula. Por essa razão, os melhores resultados têm sido atingidos quando vários testes são associados (ZÚCCARI, 1998). 2.7.2. Teste de termoresistência O teste de termoresistência (TTR) foi proposto por DIMITROPOULOS (1967), para a avaliação do potencial de fertilidade das partidas de sêmen congelado de bovinos, sendo adaptado posteriormente para outras espécies. Esse teste consiste na incubação, em banho-maria, de uma amostra de sêmen descongelado, a uma temperatura e por um tempo pré-determinado, de acordo com a espécie animal. A motilidade espermática e o vigor espermático são as variáveis analisadas durante a execução do teste. O TTR obteve grande aceitação, pois submete o sêmen a condições de temperatura semelhantes à que fica exposto no trato genital de fêmeas em estro, demonstrando e testando a capacidade de resistência do sêmen pós-inseminação (BARANABÉ et al., 1981), além de possuir correlação positiva e altamente significativa com a fertilidade a campo DIMITROPOULOS (1967).

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O protocolo preconizado pelo Colégio Brasileiro de Reprodução Animal (CBRA) (HENRY e NEVES, 1998) para espécie caprina determina que a amostra de sêmen seja incubada, a 37oC por 5min, e então seja avaliada quanto a motilidade (%) e vigor espermático (0-5), não podendo ser esses parâmetros inferiores a 30% e 2, respectivamente. SANTOS (2001a) incubou amostras de sêmen caprino a temperatura de 37oC e avaliou os parâmetros de motilidade e vigor aos 0, 5, 60 e 120min pós-descongelação, durante 2h. Esse autor verificou que a avaliação aos 5min é o bastante para a avaliação do TTR, corroborando com os achados LA-FALCI et al. (1995) que ao avaliar esses mesmos parâmetros, nos momentos 5, 30, 60, 90 e 120min pós-descongelação, observaram que os 5min é o suficiente para o TTR do sêmen congelado da espécie caprina, embora sejam encontrados trabalhos na literatura utilizando 2h como tempo padrão para a realização do TTR para o sêmen dessa espécie (BARBOSA, 1999).

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3. EXPERIMENTO 1

Influência do tempo de equilíbrio para a eficácia da criopreservação da célula espermática caprina

Autores:

Escola de Medicina Veterinária – UFBA, Salvador-BA, 40170-110, Brasil.

Resumo Sete amostras de sêmen de um caprino adulto, colhidas com a utilização de vagina artificial, foram submetidas a criopreservação, com o objetivo de verificar a influência do tempo de equilíbrio sobre a congelabilidade do sêmen caprino. Assim, foram formados quatro grupos experimentais: G0,5; G1,5; G2,5 e G3,5 com, respectivamente, 0,5; 1,5; 2,5 e 3,5h de tempo de equilíbrio à temperatura de 5oC. Logo depois da colheita e avaliação, o sêmen foi diluído e envasado em palhetas de 0,25mL, com dose inseminante de 100 x 106 espermatozóides. Essas foram encaminhadas para o resfriamento, com uma curva média de resfriamento de -1,07oC/min, até atingirem a temperatura de 5oC. Depois desse período as amostras foram submetidas aos diferentes tempos de equilíbrio e, posteriormente, congeladas em vapor de nitrogênio líquido. A descongelação foi realizada em banho-maria a 37oC por 30s. Dentre os parâmetros espermáticos estudados, o tempo de equilíbrio de 1,5h (G1,5) foi o protocolo que obteve os melhores índices de viabilidade espermática após o processo de congelação-descongelação, quando comparado com os demais grupos avaliados. Palavras chaves: Caprino; sêmen; criopreservação; tempo de equilíbrio. Summary Seven semen samples of one adult goat were collected by artificial vagina and cryopreservated, with the objective of verifying the effect of the equilibration period on the freezability of goat semen. Then, they were formed four experimental groups: G0,5; G1,5; G2,5; G3,5 with, respectively, 0,5; 1,5; 2,5 e 3,5h of equilibration time at 5oC. After evaluation, the semen was diluted and packed in 0.25 ml straws, provided the dose of 100 million of motile spermatozoa. After this, the samples were cooled at 1,07°C/min to 5°C, submitted at the different times of equilibration and later, they were frozen in liquid vapour nitrogen. The thawing was accomplished in 37oC water bath for 30s. The equilibration period of 1,5h (G1,5) was the protocol that promoted the best indexes of sperm viability, after the process of freezing-thawing, when compared with the other studied groups. Key Words: Goat; semen; cryopreservation; stabilization time.

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3.1. Introdução

A criopreservação do sêmen dos mamíferos é caracterizada por ter uma reconhecida queda de fertilidade quando comparado com o sêmen a fresco. Isso se deve tanto por uma menor viabilidade celular pós-descongelação, como também, devido às alterações subletais que ocorrem em uma parte dos espermatozóides submetidos ao processo (WATSON, 2000). Desde que o sêmen caprino foi congelado pela primeira vez por SMITH e POLGE (1950), (citado por LEBOEUF et al., 2000), e que estes reportaram que a fertilidade pós-descongelação do sêmen dessa espécie era muito baixa para ser considerado como de valor prático, muitas investigações têm sido desenvolvidas sobre a criopreservação do sêmen caprino e todos os aspectos envolvidos no processo (LEBOEUF et al., 2000). Segundo OETTLÉ (1986) um apropriado período de equilíbrio, assim como, adequadas taxas de diluição e resfriamento celular, são fatores fundamentais para a prevenção do surgimento de alterações patológicas durante o processo criopreservação espermática. Com a otimização desses processos iniciais de pré-congelação, pode-se aumentar os índices de viabilidade espermática pós-descongelação. Porém, autores como SIMPLÍCIO e MACHADO (1989) citam que o período de equilíbrio parece ser uma etapa dispensável no processo de congelação do sêmen caprino. RITAR e SALAMON (1983) e RITAR et al. (1990) também afirmam que o sêmen caprino pode ser congelado sem a necessidade do tempo de equilíbrio, quando o ejaculado a fresco dessa espécie é processado sem a eliminação do plasma seminal. Entretanto, alguns autores têm demonstrado a importância do tempo de equilíbrio para o aumento da viabilidade do sêmen caprino descongelado. WESTHUYSEN (1978) verificou percentuais de 1 a 2% de células com motilidade pós-descongelação quando não foi utilizado o tempo de equilíbrio, enquanto que para o grupo que permaneceu por 2h em equilíbrio a 5oC a motilidade espermática variou de 18 a 40%. A maioria dos trabalhos demonstra que o período de equilíbrio ao qual o sêmen caprino deve ser submetido, previamente a congelação, vai até às 4h a temperatura de 5oC (SINHA et al., 1992; DUTTA et al., 1996). DAS e RAJKONVAR (1995) observaram que o sêmen que permaneceu por 3h em tempo de equilíbrio, obteve melhores índices de motilidade pós-descongelação, quando comparado ao sêmen que permaneceu por uma 1 e 6h, resultados semelhantes ao obtidos em trabalho anterior dos mesmos autores DAS e RAJKONVAR (1993). Os mesmos autores em outros trabalhos (DAS e RAJKONVAR, 1994; DAS e RAJKONVAR, 1996), também obtiveram os menores índices de lesões acrossomais utilizando 3h de tempo de equilíbrio, em relação ao sêmen congelado após tempos de equilíbrio maiores ou menores a temperatura de 5oC.

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Contradizendo os achados anteriores, DEKA e RAO (1986) encontraram menores taxas de alterações de acrossoma (P<0,05) nos espermatozóides submetidos a 1h de equilíbrio, quando comparado com o sêmen mantido por 3 e 5h a temperatura de 5oC. SALAMON e RITAR (1982) citam em seu trabalho que uma metodologia alternativa a criopreservação do sêmen não centrifugado, pode ser feita com a diluição realizada em uma etapa, seguida do resfriamente por uma 1 a 1,5h, acompanhada, posteriormente, por um tempo de equilíbrio de apenas uma 1,5h, à temperatura de 4 a 5oC, antes da congelação. E BARUAH et al. (2003) não verificaram diferenças significante (P>0,05), em relação às taxas de motilidade espermática e lesões acrossomais, para as amostras de sêmen equilibradas por meia, 1 e 1,5h. Assim, esse estudo surge com o objetivo de verificar a importância do tempo de equilíbrio para a congelabilidade do sêmen caprino, devido a variabilidade das informações contidas na literatura a esse respeito. Como também, observar qual deve ser o período de equilíbrio ideal, entre os testados nesse estudo, para a manutenção da viabilidade espermática, após o processo de congelação-descongelação. 3.2. Materiais e Métodos 3.2.1. O local e os animais Os procedimentos seguidos estiveram de acordo com os princípios éticos na experimentação Animal recomendados pelo COBEA (2005). Este estudo foi realizado no Hospital de Medicina Veterinária da Escola de Medicina Veterinária da Universidade Federal da Bahia (EMEV-UFBA), compreendendo os meses de Março a Maio de 2005. Todos os procedimentos de avaliação espermática, manipulação seminal, congelação, armazenamento e descongelação do sêmen foram realizados no Laboratório de Embriologia e Reprodução Animal do Hospital Veterinário da EMEV-UFBA. Para esse experimento foi utilizado um reprodutor adulto, sem raça definida. Para tanto o animal foi submetido a uma avaliação clínica, exame físico do sistema reprodutivo e exame andrológico do ejaculado. O reprodutor foi manejado de forma intensiva, com fornecimento diário de concentrado balanceado, forragem verde, sal mineral e água ad libitum. O controle sanitário foi realizado periodicamente, seguindo um esquema pré-estabelecido pelo setor.

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3.2.2. Colheita e avaliação do sêmen pré-congelação As colheitas de sêmen (sete ejaculados) foram realizadas em dias alternados, no final da tarde ou à noite, com a utilização de vagina artificial com água aquecida entre 42 a 45oC, tendo como manequim uma fêmea em estro induzido. O ejaculado era colhido em tubos graduados, protegidos da luz e da temperatura ambiente por um protetor térmico. Após a colheita a amostra de sêmen era encaminhada imediatamente para o laboratório de processamento e colocado em banho-maria, à temperatura de 37oC, quando se realizava o exame físico do ejaculado (volume, aspecto, turbilhonamento, vigor e motilidade espermática). O volume do ejaculado foi verificado por visualização direta do sêmen no tubo graduado e registrado em mililitros (mL), e o turbilhonamento (escala de 0-5) foi verificado pela observação de uma gota de sêmen sobre uma lâmina pré-aquecida em mesa aquecedora a 37oC, ao microscópio em objetiva com aumento de 100 a 200X. O vigor (escala de 0-5) e a motilidade total (0-100%), foram avaliados pela observação de uma gota de sêmen entre lâmina e lamínula em objetiva de 40X, tal como preconizado pelo Colégio Brasileiro de Reprodução Animal (CBRA) (HENRY e NEVES, 1998). Para o cálculo da concentração espermática, empregou-se a câmara de Neubauer, com sêmen diluído na proporção de 10µL para 4mL (1:400) de solução de formol-salina tamponada (HANCOCK, 1957). A mesma amostra de sêmen em formol-salina tamponada usada para cálculo da concentração foi usado para avaliação da morfologia espermática, por isso têve-se o cuidado de manter o tubo com formol salina sobre a placa aquecedora para que fossem evitadas alterações na célula espermática, provocado por choque-térmico dos espermatozóides, ao entrarem em contato com o formol. O estudo da morfologia espermática foi realizado posteriormente utilizando-se a técnica de contraste de fase (aumento de 1.000X), onde foram contadas 100 células para determinação do percentual de espermatozóides normais e anormais. As anormalidades foram classificadas segundo o CBRA (HENRY e NEVES, 1998).

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O número total de espermatozóides no ejaculado foi obtido, multiplicando-se o volume do sêmen (mL) pela concentração espermática/mL. Após os exames físicos os ejaculados foram destinados às etapas de processamento para congelação. 3.2.3. Diluição e diluidor Realizado o exame físico do ejaculado, a amostra foi pré-diluída em um tubo graduado, na proporção de uma parte de sêmen para duas partes de meio diluidor (1/3). O diluidor e o tubo foram aquecidos em banho-maria à 37oC, previamente a diluição inicial, a fim de proteger o sêmen durante a sua manipulação. Então, foram avaliadas a motilidade espermática e vigor por meio de microscopia óptica, com aumento de 200 a 400X, com o intuito de verificar possíveis alterações nas características seminais durante o processo de diluição. Após procedida a concentração espermática, por contagem em câmara de Neubauer, foi calculado o número de doses (100 milhões de espermatozóides/dose) e realizado o ajuste do volume final do diluidor a ser adicionado. Seguindo-se a diluição final, o sêmen foi envasado em palhetas de polietileno de 0,25mL. O diluidor de congelação teve como concentração final, aproximadamente, 6% de glicerol e 20% de gema de ovo. O diluidor foi preparado de acordo com ROBERTS (1986) e sofreu algumas modificações na concentração do glicerol (redução de 7 para 6%) e também foi alterado o antibiótico utilizado, substituindo-se a penicilina e estreptomicina por 13,40mg de sulfato de gentamicina (Schering-Plough S/A, São Paulo, SP). 3.2.4. Resfriamento do sêmen Feito o envase do sêmen diluído nas palhetas, estas foram encaminhadas para o resfriamento conforme BARBOSA (1999), no qual as palhetas foram colocadas horizontalmente sobre plataformas de isopor, dentro de uma geladeira de 280L, com temperatura interna estabilizada entre 4 a 5oC. Dessa forma, as amostras foram submetidas a uma curva de resfriamento de -1,07°C/min, na qual após, aproximadamente, 30min as amostras chegavam a temperatura de 5oC. Depois desse período as amostras foram submetidas aos diferentes tempos de equilíbrio (TE). 3.2.5. Tempo de equilíbrio Quando o sêmen diluído atingia a temperatura de 5oC, foram formados os quatros grupos experimentais, de acordo com o tempo de equlíbrio (TE) ao qual o sêmen seria mantido a temperatura estabilizada de 5oC. Foram eles: Grupo G0,5: Mantido por 0,5h de TE; Grupo G1,5: Mantido por 1,5h de TE; Grupo G2,5: Mantido por 2,5h de TE; Grupo G3,5: Mantido por 3,5h de TE.

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3.2.6. Congelação do sêmen Após os diferentes períodos de equilíbrio, as palhetas foram colocadas horizontalmente em vapor de nitrogênio líquido a 5cm da lâmina líquida, por 20min, dentro de uma caixa de isopor. Essa caixa com 40cm de comprimento por 32cm de altura e 20cm de largura, continha 4cm de nitrogênio em seu interior. Após os 20min em vapor, as palhetas foram mergulhadas no nitrogênio líquido e colocadas em raques devidamente identificadas e armazenadas em botijão criogênico até o momento da descongelação. A curva de congelação a que foi submetido o sêmen, em vapor de nitrogênio, foi em torno de -60oC/min (AMANN e PICKETT, 1987). 3.2.7. Descongelação e avaliação espermática As amostras foram descongeladas após 3,5 meses da congelação. 3.2.7.1. Curva de descongelação e característica microscópicas do sêmen. A curva de reaquecimento do sêmen de 700oC/min, foi obtida ao descongelar as palhetas em banho-maria a 37oC por 30s (AMANN e PICKETT, 1987). Depois de descongeladas as amostras foram avaliadas quanto a motilidade e o vigor espermático (com a colocação de uma gota de sêmen entre lâmina e lamínula pré-aquecidas a 37oC, em microscópio com aumento de 200 e 400X). 3.2.7.2. Teste de termoresistência Todas as partidas de sêmen foram submetidas ao teste de termoresistência, para a espécie caprina, como preconizado pelo CBRA (HENRY e NEVES, 1998). Para a realização do teste de termoresistência (TTR) as amostras descongeladas foram mantidas em tubos Eppendorf fechados, por 5min, em banho-maria com temperatura estabilizada em 37oC (HENRY e NEVES, 1998), quando então eram efetuadas as avaliações de motilidade total, progressiva e vigor espermático. 3.2.7.3. Morfologia espermática do sêmen descongelado Para a avaliação de danos na morfologia espermática (alterações de cabeça e cauda), foram retiradas alíquotas de 20µL de cada um dos quatro tratamentos, após a descongelação, e colocadas em tubos com 2mL de formol-salina tamponado, sendo estas posteriormente avaliadas, mediante preparação úmida entre lâmina e lamínula por meio de microscopia de contraste de fase em aumento de 1.000X. Para tanto, foram contadas 100 células espermáticas, computando e classificando individualmente as alterações encontradas, em defeitos menores e defeitos maiores, segundo BLOM (1973).

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3.2.8. Delineamento e análise estatística O delineamento estatístico foi inteiramente casualizado, onde os ejaculados foram considerados repetições (N=07) e os protocolos de processamento do sêmen (G0,5; G1,5; G2,5 e G3,5) foram considerados tratamentos (4). Os cálculos de média, desvio-padrão, análise de variância foram realizados conforme SAMPAIO (1998). Para a análise estatística das características avaliadas, foi empregado o pacote estatístico Statistical Analysis System (SAS) – versão 5.0 (1996). Para tanto, realizou-se a seguinte seqüência de análises: 1- A consistência dos dados e a análise descritiva (médias e desvio-padrão) das características de interesse ao estudo foram realizadas mediante o emprego do PROC MEANS. 2- As variáveis, defeitos maiores, defeitos menores, defeitos de acrossoma e defeitos totais; motilidade espermática total e progressiva e vigor espermático foram comparados, nos diferentes grupos (G0,5; G1,5; G2,5; G3,5), por meio do PROC GLM, utilizando-se o teste de Student – Newman – Keuls (SNK), com nível de probabilidade de cinco por cento. 3.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 3.3.1. Características do sêmen fresco Os valores médios referentes ao volume (VOL), motilidade total (MT), motilidade progressiva (MP), vigor (VIG) e concentração (CONC) do sêmen a fresco e as respectivas médias nas sete amostras encontram-se na Tab. 1.1. Tabela 1.1. Valores médios encontrados para as características microscópicas (volume, motilidade total, motilidade progressiva, vigor e concentração) do o sêmen a fresco nos sete ejaculados.

Amostras VOL MT(%) MP(%) VIG(0-5) CONC(x109/mL)

Ejaculado 1 0,80 65,00 60,00 4,00 3,81 Ejaculado 2 0,60 60,00 55,00 4,00 2,42 Ejaculado 3 0,80 65,00 60,00 4,00 2,20 Ejaculado 4 0,50 55,00 50,00 4,00 4,68 Ejaculado 5 0,40 65,00 60,00 4,00 2,90 Ejaculado 6 0,40 65,00 60,00 4,00 3,00 Ejaculado 7 0,50 65,00 60,00 4,00 4,86

Média ± S

0,57 ± 0,17 62,86 ± 3,93 57,86 ± 3,93 4,00 ± 0,00 3,41 ± 1,06

As médias encontradas para volume e motilidade espermática (0,57mL e 62,86%), foram abaixo dos valores médios preconizados pelo CBRA (HENRY e NEVES, 1998), para a

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espécie caprina, que são de 0,8 e 80%, para volume e motilidade, respectivamente. Ao mesmo tempo, as médias encontradas para o vigor (4,00) e concentração espermática (3,41 x 109/mL) foram superiores às citadas pelo CBRA (HENRY e NEVES, 1998), que são de 3,00 para o vigor e 2,00 x 109 para a concentração espermática. Comparando com esse estudo, FERRARI (1993) em seu trabalho também encontrou valores superiores para a motilidade espermática (77,00%), ao utilizar caprinos adultos da raça Saanem. No entanto, o percentual encontrado nesse experimento, para a motilidade espermática (62,86%), foi semelhante ao observado em estudo realizado por MACHADO e SIMPLÍCIO (1991), que encontraram, para caprinos adultos da raça Alpina, um percentual de 61,1% para essa característica. Porém, em relação a concentração espermática, foi verificado um valor médio bem superior (3,41 x 109/mL), que os 2,92 x 109/mL registrados por esses autores. LIMA et al. (1991) (citado por MACHADO e SIMPLÍCIO, 1995) trabalhando com caprinos da raça Saanem encontraram valores semelhantes para motilidade espermática (68,5%). Entretanto, as médias para volume do ejaculado (1,54mL) e concentração espermática (4,5 x 109/mL) foram superiores que as respectivas médias verificadas nesse experimento. Os valores para as características morfológicas, defeitos maiores (DM), defeitos menores (DME) e defeitos totais (DT) estão sumarizados na Tab. 1.3. A média de defeitos totais do sêmen a fresco verificado nesse estudo permaneceu dentro do considerado desejável (menor ou igual a 20%), para a seleção de bodes como reprodutores, segundo HERNY e NEVES (1998). E foi inferior, também, aos dados citados por AZERÊDO (1999), que encontrou 16,13% de DME, 6,85% de DM, perfazendo um total de 22,98 % de DT. SANTOS (2001) relatou 19,3 % de DT para o sêmen recém colhido de bodes da raça Alpina, valores também superiores aos do observados no presente trabalho. Tabela 1.2. Características morfológicas de defeitos maiores (DM), defeitos menores (DME) e defeitos totais (DT) do sêmen a fresco nos sete ejaculados e suas resectivas médias.

Amostras DM (%) DME (%) DT (%)

Ejaculado 1 4,50 11,50 16,00 Ejaculado 2 2,50 12,50 15,00 Ejaculado 3 3,00 15,00 18,00 Ejaculado 4 1,50 8,00 9,50 Ejaculado 5 2,50 6,50 9,00 Ejaculado 6 1,00 7,00 8,00 Ejaculado 7 1,50 8,00 9,50

Média ± S

2,36 ± 1,18 9,79 ± 3,23 17,63 ± 4,05

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3.3.2. Características microscópicas do sêmen descongelado Na Tab. 1.3 encontram-se as médias de motilidade total (MT), motilidade progressiva (MP) e vigor para o sêmen fresco e para os quatro grupos (G0,5; G1,5; G2,5; G3,5), logo após a descongelação. Todos os grupos experimentais apresentaram valores médios de motilidade progressiva e vigor, iguais ou acima dos valores mínimos recomendados para o sêmen caprino descongelado, de 30% para MP e 2 para o vigor, assim como preconizado pelo CBRA (HENRY e NEVES, 1998). Tabela 1.3. Médias de motilidade total (MT), motilidade progressiva (MP) e vigor para os espermatozóides do sêmen a fresco, e para os quatro tratamentos (G0,5; G1,5; G2,5; G3,5), logo após a descongelação.

TRATAMENTO MT (Média ± S)

MP (Média ± S)

VIGOR (Média ± S)

Sêmen a Fresco 62,85 ± 03,93 A 57,85 ± 03,93 A 4,00 ± 0,00 A

G0,5 34,28 ± 09,32 C 30,00 ± 10,00 C 3,07 ± 0,34 B

G1,5 43,57 ± 04,75 B 38,57 ± 04,75 BC 3,42 ± 0,44 AB

G2,5 41,42 ± 08,99 BC 37,14 ± 08,59 BC 3,35 ± 0,62 AB

G3,5 45,00 ± 05,77 B 40,71 ± 06,07 B 3,42 ± 0,73 AB Valores seguidos de letras maiúsculas distintas na coluna diferem entre si (P<0,05) pelo teste SNK. Logo após a descongelação foi encontrada diferença significativa, para as características de motilidade total, motilidade progressiva e vigor entre alguns grupos estudados (Tab. 1.3). Conforme a Tab. 1.3 os melhores (P<0,05) resultados para a MT foram obtidos para o sêmen a fresco. As amostras de sêmen submetidas aos protocolos G1,5; G2,5 e G3,5 não diferiram (P>0,05) entre si, ao se comparar a MT desses grupos experimentais. Os menores valores numéricos em relação a MT foram encontrados nos grupos G2,5 e G0,5. Esses grupos não apresentaram diferenças significativas entre si. E o grupo G3,5 obteve melhores (p<0,05) índices de MT e MP quando comparado ao protocolo G0,5. Os valores médios de MP pós-descongelação para o sêmen a fresco foram superiores (P<0,05) aos verificados pelos demais grupos estudados. Ao analizar-se as médias obtidas para a MP, os grupos G1,5; G2,5 e G3,5, novamente, não apresentaram diferenças significativas entre si. O grupo G0,5 que também obteve o menor resultado numérico para essa característica, foi semelhante (P>0,05), não só ao grupo G2,5 como também, ao protocolo G1,5 (Tab. 1.3). Em relação ao vigor espermático os melhores índices numéricos foram encontrados para o sêmen a fresco, que não diferiu (P>0,05) em relação aos grupos G1,5; G2,5 e G3,5.

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Na Tab. 1.4 encontram-se as médias de motilidade total (MT), motilidade progressiva (MP) e vigor para os quatro grupos (G0,5; G1,5; G2,5; G3,5), logo após o teste de termoresistência (TTR). Tabela 1.4. Médias de motilidade total (MT), motilidade progressiva (MP) e vigor para os espermatozóides dos quatro tratamentos (G0,5; G1,5; G2,5; G3,5), logo após o teste de termoresistência (TTR).


MP (Média ± S)

VIGOR (Média ± S)

G0,5 35,00 ± 9,12 30,00 ± 9,12 3,00 ± 0,28

G1,5 42,14 ± 4,87 38,57 ± 2,43 3,42 ± 0,18

G2,5 41,42 ± 8,99 37,14 ± 8,59 3,35 ± 0,37

G3,5 42,50 ± 4,18 38,33 ± 5,16 3,33 ± 0,68

Após o teste de termoresistência (TTR), não foi verificada diferença significativa em nenhum dos parâmetros avaliados. Os resultados obtidos nesse estudo confirmam os encontrados por WESTHUYSEN (1978) que verificou que a medida que aumentava o tempo de equilíbrio a que era submetido o sêmen, também se aumentava significativamente a motilidade espermática pós-descongelação. Confirmando esse fato, DUTTA et al. (1996) e SINHA et al. (1992) obtiveram os melhores resultados de motilidade epermática pós-descongelação, utilizando um TE de 4h (próximo ao grupo G3,5), quando comparados àqueles obtidos pelo grupo submetido a um tempo de equilíbrio menor. Também, DAS e RAJKONVAR (1993) e DAS e RAJKONVAR (1995) observaram que o sêmen que permaneceu por 3h em tempo de equilíbrio a 5oC, obteve melhores índices de motilidade pós-descongelação, em relação ao sêmen submetido a menores períodos de equilíbrio. Entretanto, esses resultados contradizem os obtidos por SALAMON e RITAR (1982) que analizando o efeito do tempo de equilíbrio sobre a congelabilidade do sêmen caprino não centrifugado, obtiveram os melhores resultados com a estabilização do sêmen por 1,5h à temperatura de 5oC, quando comparado a períodos maiores de estabilização. Ao contrário dos resultados alcançados nesse estudo, onde o sêmen congelado após 1,5h de TE (G1,5) obteve melhores taxas de motilidade pós-descongelação (P<0,05), quando comparado com o grupo estabilizado por apenas 0,5h (G0,5), no trabalho realizado por

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BARUAH et al. (2003) os mesmos não verificaram diferença (P>0,05), em relação às médias de motilidade do sêmen congelado após tempo de equilíbrio de 0,5; 1 e 1,5h à 5oC. 3.3.3. Características morfológicas do sêmen descongelado Na Tab. 1.5 encontram-se as médias de defeitos menores (DME), defeitos maiores (DM), defeitos de acrossoma (AC) e defeitos totais (DT) para o sêmen fresco e para os quatro grupos (G0,5; G1,5; G2,5; G3,5), logo após a descongelação. Tabela 1.5. Médias de defeitos menores (DME), defeitos maiores (DM), defeitos de acrossoma (AC) e defeitos totais (DT) para os espermatozóides do sêmen a fresco, e para os quatro tratamentos (G0,5; G1,5; G2,5; G3,5).

TRATAMENTO DME (Média ± S)

DM (Média ± S)

AC (Média ± S)

DT (Média ± S)

Sêmen a Fresco 09,78 ± 03,22 AB 02,35 ± 01,18 A 00,00 ± 00,00 A 12,14 ± 04,04 A

G0,5 15,71 ± 03,98 B 14,14 ± 10,89 B 11,71 ± 10,24 AB 29,57 ± 11,71 BC

G1,5 11,28 ± 05,76 AB 11,42 ± 08,20 B 08,42 ± 08,34 A 22,71 ± 10,33 B

G2,5 11,71 ± 08,11 AB 25,57 ± 06,67 C 20,42 ± 06,29 BC 37,28 ± 10,56 C

G3,5 07,00 ± 04,24 A 27,85 ± 09,44 C 24,71 ± 09,19 C 34,85 ± 08,53 BCValores seguidos de letras maiúsculas distintas na coluna diferem entre si (P<0,05) pelo teste SNK. As médias de defeitos menores, defeitos maiores e defeitos totais, observadas para todos os grupos (Tab. 1.5) ficaram acima dos valores máximos recomendados pelo CBRA (HENRY e NEVES, 1998.), para o sêmen descongelado da espécie caprina, de 20% para o número de defeitos totais e 10% de defeitos maiores. Em todos os parâmetros utilizados para avaliar o grau de lesão ocorrido na morfologia espermática, observou-se uma clara interferência do período de equilíbrio, ao qual o sêmen foi submetido. Pode-se observar que não houve diferença (P>0,05) entre os grupos G0,5 e G1,5, em nenhuma das classificações de defeitos espermáticos avaliadas (DME, DM, AC e DT). Essa semelhança também ocorreu entre os grupos G2,5 e G3,5. Nota-se que os grupos que permanceram por 0,5 (G0,5) e 1,5h (G1,5) em tempo de equilíbrio, foram semelhantes entre si (P>0,05) e obtiveram os menores índices de defeitos maiores (P<0,05), quando comparados aos grupos que permanceram por mais de 2h (G2,5 e G3,5) (Tab. 1.6). Resultados semelhantes foram encontrados por BARUAH et al. (2003) que não verificaram diferença significativa, em relação às taxas de motilidade espermática e lesões acrossomais, para as amostras de sêmen equilibradas por 0,5; 1 ou 1,5h.

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Ao se analizar as médias de defeitos de acrossoma (Tab. 1.5), observa-se que essas também foram menores para o sêmen congelado com os menores tempos de equilíbrio (G0,5 e G1,5) em relação ao sêmen mantido por 3,5h (G3,5) em equilíbrio. Ainda em relação a essa característica o grupo que permanceu por 1,5h em equilíbrio obteve os menores índices de lesões acrossomais (P<0,05), quando comparado aos grupos com períodos de equilíbrio acima de 2h (G2,5 e G3,5). Esses resultados discordam dos achados de DAS e RAJKONVAR (1994) e DAS e RAJKONVAR (1996), que obtiveram os menores índices de lesões acrossomais utilizando 3h de tempo de equilíbrio, em relação ao sêmen congelado após 1h de equilíbrio a temperatura de 5oC. No entanto, esse estudo corrobora com o experimento conduzido por DEKA e RAO (1986) que, apesar de terem obtidos maiores médias (P<0,05) de motilidade espermática pós-descongelação, para o sêmen submetido a um tempo de equilíbrio superior, a amostra que permaneceu por 1h em estabilização, obteve os menores índices de alterações de acrossoma. Apesar da semelhança (P>0,05) observada entre as médias de motilidade espermática pós-descongelação obtidas pelos grupos G1,5 e G3,5 (Tab. 1.3), esse último obteve uma maior (P<0,05) incidência de defeitos maiores e acrossomais nos espermatozóides submetidos à esse protocolo (Tab. 1.5). 3.4. Conclusões Esse estudo demonstrou a influência do tempo de equilíbrio à temperatura de 5oC, ao qual foi submetido o sêmen, sobre a morfologia espermática após o processo de criopreservação, no qual o sêmen mantido por tempos de equilíbrio superiores (G2,5 e G3,5) apresentou maiores (P>0,05) índices de defeitos maiores quando comparados ao sêmen submetido a tempos de equilíbrio inferiores (G0,5 e G1,5). O tempo de equilíbrio de 1,5h (G1,5) foi o protocolo que promoveu os melhores índices de viabilidade espermática após o processo de congelação-descongelação, o qual obteve os menores valores números para os defeitos maiores, defeitos de acrossoma e defeitos totais quando comparado com os demais grupos avaliados. 3.5. Referências Bibliográficas AMANN, R.P.; PICKETT, B.W. Principle of cryopreservation and a review of stallion spermatozoa. Equine Veterinary Science, v.7, n.3, p.145-174, 1987. AZERÊDO, G.A. de. Uso de sondas fluorescentes na avaliação da integridade de membrana plasmática de espermatozóides caprinos, submetidos à congelação na

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4. EXPERIMENTO 2

UTILIZAÇÃO DO EDTA, DO EQUEX STM E DA LECITINA DE SOJA COMO COMPONENTES DE UM DILUIDOR DE CONGELAÇÃO DO SÊMEN CAPRINO

AUTORES:


Resumo Nove amostras de sêmen de dois caprinos adultos, colhidas com a utilização de vagina artificial, foram submetidas a criopreservação, com o objetivo de verificar a eficácia do Equex STM e do EDTA, adicionados a um diluidor a base de Tris-gema de ovo, sobre a viabilidade espermática pós-descongelação. Também foi objetivo desse trabalho, avaliar a utilização de um diluidor comercial, a base de lecitina de soja (Bioexcell®), para a congelação do sêmen caprino. Assim, foram formados cinco grupos experimentais: TRIS; TRIS+EDTA; TRIS+EQUEX; TRIS+EQUEX+EDTA e Bioexcell®. Logo depois da avaliação, o sêmen foi diluído nos diferentes meios e envasado em palhetas de 0,25mL, com dose inseminante de 100 x 106 espermatozóides. Então, as amostras foram submetidas ao resfriamento, com uma curva média de -0,46°C/min, até atingirem a temperatura de 5°C, mantidas por mais 75min em tempo de equilíbrio e, posteriormente, congeladas em nitrogênio líquido. A descongelação foi realizada em banho-maria a 37oC por 30s. A adição do Equex STM aumentou significativamente a proporção de espermatozóides com motilidade total e progressiva após o teste de termoresistência, quando comparado com os grupos que não o continham. Palavras chaves: Caprinos; sêmen; criopreservação; diluidores. Summary Nine semen samples of two adult goats were collected by artificial vagina and cryopreservated, with the objective of verifying the effectiveness of the Equex STM and EDTA, added to a Tris-egg yolk extender, on the sperm viability post-thaw. It was also aim of this study, to evaluate the utilization of a soybean-based (Bioexcell®) commercial extender Then, they were formed five experimental groups: TRIS; TRIS+EDTA; TRIS+EQUEX; TRIS+EDTA+EQUEX e Bioexcell®. After evaluation, the semen was diluted in the five extenders and packed in 0.25mL straws, provided the dose of 100 million of motile spermatozoa. After this, the samples were cooled at 0,46°C/min to 5°C, submitted at 75min of equilibration time and later, they were frozen in liquid nitrogen vapour. The thawing was accomplished in 37oC water bath for 30s. The addition of Equex STM paste significantly increased (P<0,05) the proportion of spermatozoa with total and progressive motility after thermoresistance test compared with the groups without Equex. Key Word: Goats; semen; cryopreservation; extenders.

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4.1. Introdução A criopreservação do sêmen promove a elevação dos níveis de cálcio intracelular (WATSON, 2000). Esse aumento resulta em disfunção e morte celular (AMANN e PICKETT, 1987; WATSON, 2000). Assim, visando minimizar o efeito deletério do cálcio durante o processo de congelação, a partir de 1973, alguns autores passaram a empregar o etileno-diamino-tetra-acetato-dissódico (EDTA), em meios diluidores para a congelação de sêmen eqüino (MARTIN et al., 1979). A função principal do EDTA é a de quelar o cálcio no meio extracelular, diminuindo seu influxo para o meio intracelular (WATSON, 1981), inibindo assim o seu efeito deletério sobre os espermatozóides durante o processo de congelação. No resfriamento e congelação do sêmen caprino o EDTA foi utilizado por PURANIK et al. (1994) e por BIITTENCOURT et al. (2004). Esses últimos observaram uma implementação de 10% na motilidade dos espermatozóides caprinos congelados em diluidor que continha 0,1% de EDTA em sua composição, em relação ao diluidor que não o continha. Resultados semelhantes foram descritos por DHAMI e SAHNI (1993) que em trabalho com o sêmen de bovinos e bubalinos, também verificaram valores de motilidade espermática pós-descongelação 10 a 12% superiores com o diluidor que continha 0,1% de EDTA, em relação ao diluidor que não o continha. Esses autores também verificaram que a liberação da enzima lactato deidrogenase (LDH) estava relacionada com a qualidade da congelação. Estes mesmos autores observaram que ao associarem 0,1% de EDTA ao diluidor de congelação, os níveis de LDH foram bem menores, demonstrando o efeito positivo do EDTA sobre a congelabilidade do sêmen. Alguns trabalhos, também têm demonstrado que a introdução de substâncias emulsificantes, ao meio de congelação, como o Equex STM Paste (Nova Chemical Sales, Scituate Inc., MA, USA), que tem como princípio ativo o dodecil-sulfato de sódio (DSS), têm melhorado os índices qualitativos, sobrevivência, longevidade e fertilidade dos espermatozóides pós-descongelação (ROTA et al., 1997; PEÑA e LINDE-FORSBERG, 2000; PEÑA et al., 2003; MAIA et al., 2005). A função do DSS é aumentar a solubilidade dos fosfolipídios da gema de ovo, melhorando a disponibilidade e, assim, a sua capacidade de proteção à membrana plasmática dos espermatozóides contra o choque térmico e as alterações promovidas pelo processo de criopreservação (ROTA et al., 1997). MAIA et al. (2005) compararam a congelabilidade do sêmen ovino em um diluidor a base de Tris-gema de ovo com 0%, 0,5% e com 1% de Equex STM. No diluidor Tris sem o Equex as motilidades total e progressiva foram de 34% e 24%, respectivamente, enquanto que no meio Tris com 0,5% de Equex essas foram de 65% e 39% e no Tris com 1% foram 70% e 39%, respectivamente, demonstrando o efeito benéfico da utilização do detergente na congelação do sêmen ovino. PEÑA e LINDE-FORSBERG (2000) também observaram que o diluidor de congelação do sêmen canino que continha 0,5% de Equex STM promoveu melhores índices de sobrevivência pós-descongelação e maior capacidade de termoresistência.

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Assim, apesar dos bons resultados obtidos com a utilização do Equex STM Paste para a criopreservação do sêmen de outras espécies, nenhum estudo bibliográfico foi encontrado para a espécie caprina. Um grande número de diluidores têm sido estudados para a congelação de sêmen caprino como o leite desnatado de vaca, em pó e reconstituído, citrato de sódio-glicose-gema de ovo, sacarose-EDTA.CaNa2-gema de ovo, rafinose-gema de ovo, Spermasol-gema de ovo, tris-gema de ovo, test-gema de ovo (LEBOEUF et al., 2000). Porém esses aditivos de origem animal (gema-de-ovo e leite) representam um risco potencial para a contaminação do diluidor, caso certos contaminantes (microbianos ou outros) estejam no produto crú, além da falta de controle da qualidade desses aditivos pela grande variação da composição dos mesmos (GIL et al., 2003). Com isso, diluidores comerciais, com a ausência da gema de ovo e do leite em suas composições, têm se tornado disponíveis recentemente (Biociphos® and Bioexcell®, IMV, L'Aigle, France), e já com a existência de relatos da boa fertilidade alcançada para o sêmen de reprodutores bovinos e ovinos criopreservados com esses meios (GIL et al., 2000; GIL et al., 2003). GIL et al. (2003) compararam a eficácia do Bioexcell®, em relação a um diluidor convencional, a base de leite-gema de ovo, para a criopreservação do sêmen ovino. O estudo verificou índices de fertilidade semelhantes entre as ovelhas inseminadas com o sêmen congelado nos diferentes protocolos. Assim, os autores ressaltaram que o Bioexcell® pode ser uma alternativa segura quando o sêmen congelado for utilizado para a introdução de um novo material genético em um rebanho ou em um outro país. No levantamento realizado, não foi encontrado nenhum estudo com a utilização do Bioexcell® para a criopreservação do sêmen caprino. Assim, esse estudo teve como objetivo avaliar o efeito da associação do Equex STM e do EDTA a um diluidor de congelação a base de Tris-gema de ovo para a criopreservação do espermatozóide caprino assim como, verificar a eficácia de um diluidor comercial, a base de lecitina de soja (Bioexcell®), para a congelação do sêmen caprino. 4.2. Materiais e Métodos 4.2.1. O local e os animais Os procedimentos utilizados nesse estudo estiveram de acordo com os princípios éticos na experimentação Animal recomendados pelo COBEA (2005).

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Este estudo foi realizado no Hospital de Medicina Veterinária, da Escola de Medicina Veterinária da Universidade Federal da Bahia (EMEV-UFBA), compreendendo os meses de Junho a Agosto de 2005. Todos os procedimentos de avaliação espermática, manipulação seminal, congelação, armazenamento e descongelação do sêmen foram realizados no Laboratório de Embriologia Animal do Hospital Veterinário da EMEV-UFBA. A temperatura do laboratório era mantida resfriada (25-26oC), por meio do sistema de ar condicionado e controlada por termômetro de mercúrio mantido suspenso a altura da bancada onde era processado o sêmen. Foram selecionados dois reprodutores adultos, sem raça definida, após a realização da avaliação clínica, exame físico do sistema reprodutivo e estudo andrológico do ejaculado. Os dois reprodutores eram manejados de forma intensiva, com fornecimento diário de concentrado balanceado, forragem verde, sal mineral e água ad libitum. O controle sanitário era realizado periodicamente, seguindo um esquema pré-estabelecido pelo setor. 4.2.2. Colheita e avaliação do sêmen pré-congelação As colheitas de sêmen (nove ejaculados) foram realizadas em dias alternados, pela manhã, com a utilização de vagina artificial com água aquecida entre 42oC e 45oC, tendo como manequim uma fêmea em estro induzido. O ejaculado era colhido em tubos graduados, protegidos da luz e da temperatura ambiente por um protetor térmico. Após a colheita a amostra de sêmen era encaminhada imediatamente para o laboratório e colocado em banho-maria, à temperatura de 37oC, quando se realizava o exame físico do ejaculado (volume, aspecto, turbilhonamento, vigor e motilidade espermática). O volume do ejaculado foi verificado por visualização direta do sêmen no tubo graduado e registrado em mililitros (mL), e o turbilhonamento (escala de 0-5) foi verificado pela observação de uma gota de sêmen sobre uma lâmina pré-aquecida em mesa aquecedora e mantida aquecida sobre chapa aquecedora à 37oC em microscópio com aumento de 100X. O vigor (escala de 0-5) e a motilidade total (0-100%), foram avaliados pela observação de uma gota de sêmen entre lâmina e lamínula em objetiva de 40X, tal como preconizado pelo Colégio Brasileiro de Reprodução Animal (CBRA) (HENRY e NEVES, 1998). Para o cálculo da concentração espermática, empregou-se a câmara de Neubauer, com sêmen diluído na proporção de 10µL para 4mL (1:400) de solução de formol-salina tamponada (HANCOCK, 1957). A mesma amostra de sêmen em formol-salina tamponada usada para cálculo da concentração foi usado para avaliação da morfologia espermática, por isso têve-se o cuidado de manter o tubo com formol salina sobre a placa aquecedora para que fossem evitadas alterações na célula espermática, provocado por choque-térmico dos espermatozóides, ao entrarem em contato com o formol. O estudo da morfologia espermática foi realizado posteriormente utilizando-se a técnica de contraste de fase (aumento de 1.000X), onde foram contadas 100

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células para determinação do percentual de espermatozóides normais e anormais. As anormalidades foram classificadas segundo o CBRA (HERNY e NEVES, 1998). O número total de espermatozóides no ejaculado foi obtido, multiplicando-se o volume do sêmen (mL) pela concentração espermática/mL. Após os exames físicos os ejaculados foram destinados às etapas de processamento para congelação. 4.2.3. Diluição e diluidores Realizado o exame físico do ejaculado, a amostra foi dividida em cinco partes iguais e pré-diluídas em cinco tubos graduados cada um contendo 1mL de cada diluidor (TRIS, TRIS+EDTA, TRIS+EQUEX, TRIS+EQUEX+EDTA e Bioexcell®) aquecidos em banho-maria à 37oC, a fim de proteger o sêmen durante a sua manipulação. Então foram avaliadas a motilidade espermática e vigor por meio de microscopia óptica, com aumento de 200 a 400X, com o intuito de verificar possíveis alterações nas características seminais durante o processo de diluição. Após procedida a concentração espermática, por contagem em câmara de Neubauer, foi calculado o número de doses (100 milhões de espermatozóides/dose) e realizado o ajuste do volume final do diluidor a ser adicionado. Seguindo-se a diluição final o sêmen foi envasado em palhetas de polietileno de 0,25mL. O diluidor foi preparado de acordo com ROBERTS (1986) e sofreu algumas modificações na concentração do glicerol (redução de 7 para 6%) e também foi alterado o antibiótico utilizado, substituindo-se a penicilina e estreptomicina por 13,40mg de sulfato de gentamicina (Schering-Plough S/A, São Paulo, SP). Aos grupos TRIS+EDTA e TRIS+EQUEX+EDTA foi adicionado 0,1% de EDTA (Vetec Ltda, Duque de Caxias, RJ) e aos grupos TRIS+EQUEX e TRIS+EQUEX+EDTA também foi acrescentado 0,5% de Equex STM (Nova Chemical Sales, Scituate Inc., MA, USA). O diluidor comercial Bioexcell® (IMV, L'Aigle, França) também foi testado nesse experimento. 4.2.4. Resfriamento do sêmen Feito o envase do sêmen diluído nas palhetas, estas foram encaminhadas para o resfriamento conforme FÜRST (2002), no qual as palhetas foram colocadas em um tubo de ensaio de 20mL, em temperatura ambiente. Em seguida, o tubo de ensaio revestido por um refil foi colocado dentro de um recipiente plástico de 240mL, contendo 120mL de álcool absoluto. O recipiente foi então colocado na posição horizontal dentro de uma geladeira de 280L, com temperatura interna estabilizada em 4 a 5oC. Segundo FÜRST, (2002), a metodologia empregada na curva de resfriamento impôs, inicialmente, um queda de temperatura acentuada (-0,6oC/min), até alcançar os 18oC. Entre 18 e 8oC, a curva de resfriamento foi mais lenta, com uma taxa que variou entre -0,5 e -0,3oC/min. Da temperatura inicial a qual encontrava-se o sêmen diluído (aproximadamente 26oC) até chegar a temperatura de 8oC, passaram-se 35min. Depois desse período o tubo foi retirado do recipiente e mantido a temperatura da geladeira por mais 10min, com uma queda inicial de -0,8oC/min e final de -0,2oC/min até a temperatura 4 a 5oC. A taxa média de resfriamento, até atingir os 5oC, foi de -0,46oC.

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4.2.5. Tempo de equilíbrio Após os 45min de resfriamento (35min dentro do recipiente mais 10min fora do mesmo), as amostras já se encontravam com a temperatura estabilizada em 4 a 5oC. Assim, as palhetas com sêmen foram mantidas por mais 75min (1,25h), em tempo de equilíbrio à essa temperatura. 4.2.6. Congelação do sêmen Depois do período de equilíbrio as palhetas foram colocadas horizontalmente em vapor de nitrogênio líquido a 5cm da lâmina líquida do nitrogênio, por 20min, dentro de uma caixa de isopor. Essa caixa com 40cm de comprimento por 32cm de altura e 20cm de largura, continha 4cm de nitrogênio em seu interior. Após os 20min em vapor, as palhetas foram mergulhadas no nitrogênio líquido e colocadas em raques devidamente identificadas e armazenadas em botijão criogênico até o momento da descongelação. A curva de congelação a que foi submetido o sêmen em vapor de nitrogênio, durante 20min, foi em torno de -60oC/min (AMANN e PICKETT, 1987). 4.2.7. Descongelação e avaliação espermática As amostras foram descongeladas após cinco dias de efetuada a congelação. 4.2.7.1. Curva de descongelação e característica microscópicas do sêmen. A curva de reaquecimento do sêmen de 700oC/min, é obtida ao descongelar as palhetas em banho-maria a 37oC por 30s (AMANN e PICKETT, 1987), e este protocolo foi o utilizado nesse experimento. Depois de descongeladas as amostras eram avaliadas quanto a motilidade e o vigor espermático (com a colocação de uma gota de sêmen entre lâmina e lamínula pré-aquecidas a 37oC, em microscópio com aumento de 200 e 400X). 4.2.7.2. Teste de termoresistência (TTR) Todas as partidas de sêmen foram submetidas ao TTR, para a espécie caprina, como preconizado pelo CBRA (HENRY e NEVES, 1998). Para a realização do TTR as amostras descongeladas foram mantidas em tubos Eppendorf fechados por 5min, em banho-maria com temperatura estabilizada em 37oC, quando então eram efetuadas as avaliações de motilidade total, progressiva e vigor espermático, assim como realizado para o sêmen descongelado.

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4.2.7.3. Morfologia espermática do sêmen descongelado Para a avaliação de danos na morfologia espermática (alterações de cabeça e cauda), foram retiradas alíquotas de 20µL de cada um dos cinco tratamentos após a descongelação e colocadas em tubos com 2mL de formol-salina tamponado sendo estas posteriormente avaliadas, através de preparação úmida entre lâmina e lamínula por meio de microscopia de contraste de fase em aumento de 1.000X. Para tanto foram contadas 100 células espermáticas, computando e classificando individualmente as alterações encontradas, em defeitos menores e defeitos maiores (BLOM, 1973). 4.2.8. Delineamento e análise estatística O delineamento estatístico foi inteiramente casualizado, onde os ejaculados foram considerados repetições (n=09) e os protocolos de processamento do sêmen (TRIS; TRIS+EDTA; TRIS+EQUEX; TRIS+EDTA+EQUEX e Bioexcell®) foram considerados tratamentos (n=5). Os cálculos de média, desvio-padrão, análise de variância foram realizados conforme SAMPAIO (1998). Para a análise estatística das características avaliadas, foi empregado o pacote estatístico Statistical Analysis System (SAS) – versão 5.0 (1996). Para tanto realizou-se a seguinte seqüência de análises: 1- A consistência dos dados e a análise descritiva (médias e desvio-padrão) das características de interesse ao estudo foram realizadas mediante o emprego do PROC MEANS. 2- As variáveis (defeitos maiores, defeitos menores, defeitos de acrossoma e defeitos totais; motilidade espermática total e progressiva e vigor espermático) foram comparadas por meio do PROC GLM, utilizando-se o teste de Student – Newman – Keuls (SNK), com nível de probabilidade de cinco por cento. 4.3. Resultados e Discussões 4.3.1. Características do sêmen fresco Os valores referentes ao volume (VOL), motilidade total (MT), motilidade progressiva (MP), vigor (VIG) e concentração (CON) do sêmen fresco para os dois bodes, e as respectivas médias, para essas características nas nove amostras encontram-se na Tab. 2.1.

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Tabela 2.1. Características microscópicas (volume, motilidade total, motilidade progressiva, vigor e concentração) do sêmen a fresco para os dois bodes e as médias gerais nos nove ejaculados.

BODE A VOL MT(%) MP(%) VIG(0-5) CONC(x109/mL)

Ejaculado 1 0,80 55,00 50,00 4,00 4,12 Ejaculado 2 0,80 65,00 60,00 4,00 4,36 Ejaculado 3 0,70 55,00 50,00 4,00 3,78 Ejaculado 4 0,25 65,00 60,00 4,00 3,72 Ejaculado 5 0,50 50,00 45,00 4,00 4,76

MÉDIA 0,61 ± 0,23 58,00 ± 6,70 53,00 ± 6,70 4,00 ± 0,00 4,14 ± 0,42 BODE B VOL MT(%) MP(%) VIG(0-5) CONC(x109/mL)

Ejaculado 1 0,50 75,00 70,00 3,50 4,22 Ejaculado 2 0,30 60,00 55,00 4,00 8,72 Ejaculado 3 0,75 65,00 55,00 4,00 6,82 Ejaculado 4 0,60 60,00 55,00 4,00 6,82

MÉDIA 0,53 ± 0,18 65,00 ± 7,07 58,75 ± 7,5 3,87 ± 0,25 6,64 ± 1,84

Média Geral

(Média ± S)

0,57 ± 0,20 61,50 ± 7,40 55,55 ± 7,25 3,94 ± 0,16 5,25 ± 1,76

Os valores das médias seguidos de letras maiúsculas distintas na coluna diferem entre si (P<0,05) pelo teste SNK. Verificou-se, que as médias encontradas para volume e motilidade espermática (0,57mL e 61,11%), foram abaixo dos valores médios preconizados pelo (CBRA) (HENRY e NEVES, 1998), para a espécie caprina, que são de 0,8 e 80%, para volume e motilidade, respectivamente. Ao mesmo tempo, as médias encontradas para o vigor (3,94) e para concentração espermática (5,25 x 109 espermatozóides/mL) foram superiores às citadas pelo CBRA (HENRY e NEVES, 1998), de 3 para o vigor e 2 x 109 para a concentração espermática. Comparando com o presente estudo, SANTOS (2001) em seu trabalho, também encontrou valores superiores para a motilidade espermática (84,8%), ao utilizar caprinos adultos da raça Pardo-Alpina. No entanto, o percentual encontrado nesse experimento para a motilidade espermática (61,5%), foi semelhante ao observado em estudo realizado por MACHADO e SIMPLÍCIO (1991), que encontram, para caprinos adultos, um percentual de 61,1% para essa característica. Porém, em relação a concentração espermática, foi verificado um valor médio bem superior (5,25 x 109/mL), que os 2,92 x 109/mL registrados por esses autores. Os valores para as características morfológicas, defeitos maiores (DM), defeitos menores (DME) e defeitos totais (DT) estão sumarizados na Tab. 2.2.

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Tabela 2.2. Características morfológicas (defeitos maiores, defeitos menores e defeitos totais) do sêmen fresco para os dois bodes (A e B) e as médias gerais nos nove ejaculados.

BODE A DM (%) DME (%) DT (%) Ejaculado 1 4,5 11,5 16,0 Ejaculado 2 2,5 12.5 15,0 Ejaculado 3 3,0 15,0 18,0 Ejaculado 4 1,5 8,0 9,5 Ejaculado 5 2,5 6.5 9,0

MÉDIA 2,8 ± 1,0 10,7 ± 3,4 11,9 ± 4,0

BODE B DM DME DT Ejaculado 1 3,0 7,5 10,5 Ejaculado 2 2,0 5,5 8,0 Ejaculado 3 4,5 6,5 11,0 Ejaculado 4 1,5 7,0 8,5

MÉDIA 2,7 ± 1,3 6,6 ± 0,85 9,5 ± 1,4

Média Gerak (Média ± S) 2,7 ± 1,1 8,8 ± 3,1 10,9 ± 3,6

A média de defeitos totais do sêmen a fresco, verificado nesse estudo permaneceu dentro do considerado desejável (menor ou igual a 20%), para a seleção de bodes como reprodutores, segundo HERNY e NEVES (1998). E foi inferior aos dados citados por SANTOS (2001), que encontrou 12,1% de DME, 7,2% de DM, perfazendo um total de 19,3 % de DT. FERRARI (1993) relatou 8,9% de DT para o sêmen recém colhido de bodes da raça Anglonubiana e, assim, inferiores ao presente trabalho. 3.2. Características microscópicas do sêmen descongelado Na Tab. 2.3 encontram-se as médias de motilidade total (MT), motilidade progressiva (MP) e vigor para o sêmen fresco e para os cinco grupos (TRIS, TRIS+EDTA, TRIS+EQUEX, TRIS+EDTA+EQUEX, Bioexcell®), logo após a descongelação e na Tab. 2.4, essas variáveis após o teste de termoresistência (TTR). Tabela 2.3. Médias de motilidade total (MT), motilidade progressiva (MP) e vigor para os espermatozóides do sêmen a fresco, e para os cinco tratamentos (TRIS, TRIS+EDTA, TRIS+EQUEX, TRIS+EDTA+EQUEX, Bioexcell®), logo após a descongelação.


MP (Média ± S)

VIGOR (Média ± S)

Sêmen Fresco 61,00 ± 7,40 A 55,55 ± 7,26 A 3,94 ± 0,16 A

TRIS 38,75 ± 6,94 BC 34,37 ± 6,23 BC 3,31 ± 0,45 AB

TRIS+EDTA 35,71 ± 6,07 C 30,71 ± 6,07 C 2,92 ± 0,53 B TRIS+EQUEX 44,37 ± 4,95 B 39,37 ± 4,95 B 3,64 ± 0,37 A TRIS+EQUEX +EDTA 43,75 ± 6,40 B 39,37 ± 6,23 B 3,31 ± 0,53 AB Bioexcell® 27,14 ± 4,87 D 21,42 ± 6,23 D 2,14 ± 0,62 C Valores seguidos de letras maiúsculas distintas na coluna diferem entre si (P<0,05) pelo teste SNK.

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Todos os grupos experimentais, exceto o grupo Bioexcell®, apresentaram valores médios de motilidade progressiva e vigor, iguais ou acima dos valores mínimos recomendados para o sêmen caprino descongelado, de 30% para MP e 2 para vigor, assim como preconizado pelo CBRA (HENRY e NEVES, 1998). Tabela 2.4. Médias de motilidade total (MT), motilidade progressiva (MP) e vigor para os espermatozóides dos cinco tratamentos (TRIS, TRIS+EDTA, TRIS+EQUEX, TRIS+EDTA+EQUEX, Bioexcell®), logo após o teste de termoresistência (TTR).


MP (Média ± S)

VIGOR (Média ± S)

TRIS 35,62 ± 5,62 B 31,87 ± 5,93 B 3,08 ± 0,49 BC

TRIS+EDTA 33,57 ± 4,75 B 30,00 ± 5,00 B 2,71 ± 0,48 C

TRIS+EQUEX 43,75 ± 3,53 A 39,37 ± 4,95 A 3,81 ± 0,25 A

TRIS+EQUEX +EDTA 43,12 ± 7,03 A 38,12 ± 7,03 A 3,50 ± 0,46 AB

Bioexcell® 25,71 ± 4,49 C 20,71 ± 4,49 C 1,92 ± 0,67 D

Valores seguidos de letras maiúsculas distintas na coluna diferem entre si (P<0,0001) pelo teste SNK. Logo após a descongelação (Tab. 2.3) foi encontrada diferença significativa, para as características de MT, MP e VIGOR entre os grupos estudados. Em relação a MP e vigor os grupos TRIS, TRIS+EQUEX, TRIS+EQUEX+EDTA foram semelhantes entre si (P>0,05). Porém, o grupo TRIS foi semelhante (P>0,05) ao grupo TRIS+EDTA, para a motilidade progressiva. Entretanto, após o TTR os grupos que continham o Equex STM (TRIS+EQUEX e TRIS+EQUEX+EDTA) obtiveram valores médios, para a motilidade total e progressiva, semelhantes entre si (P>0,05) e superiores (P<0,05) em relação a todos os demais grupos experimentais. O sêmen congelado com Bioexcell® obteve os piores resultados (P<0,05) à descongelação e após o TTR, para os parâmetros MT, MP e VIGOR (Tab. 2.3 e Tab. 2.4). Nesse estudo também foi observado que logo após a descongelação três dos diluidores testados (TRIS, TRIS+EQUEX e TRIS+EQUEX+EDTA) promoveram taxas de vigor espermático semelhantes ao encontrado para o sêmen a fresco (Tab. 2.3). Os resultados obtidos nesse experimento, para a motilidade espermática, foram inferiores aos obtidos em estudo realizado por SIVASELVAM et al. (2000), que ao utilizar um diluidor a base de Tris-gema de ovo (20%) e glicerol (7%) na criopreservação de 70 ejaculados de cinco caprinos, obtiveram 54,50% de células com motilidade. Também SOUZA et al. (2002) e BITTENCOURT et al. (2004), ao avaliarem a congelabilidade do sêmen caprino, obtiveram médias de 53,1 e 51,0%, respectivamente, para a motilidade pós-descongelação, em diluidor a base de Tris-gema de ovo e glicerol (7%). Valores esses, também superiores aos observados nesse estudo.

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É importante ressaltar que o valor médio da motilidade espermática do sêmen a fresco, obtido nesse experimento, já apresentava valores baixos (61,0%), abaixo dos 86,0% observados por BITTENCOURT et al. (2004) e dos 90,9% obtidos por SOUZA et al. (2002). A taxa de degradação espermática observada nesse experimento, por exemplo, para o grupo TRIS+EQUEX+EDTA, foi de, aproximadamente, 15,6%, enquanto que para os trabalhos citados anteriormente, essa taxa foi 35,0% e 37,8%, para o primeiro e o segunto autor, respectivamente. PRESANTH e MATHAI (1996) utilizando um diluidor a base de Tris com o glicerol na mesma concentração desse estudo (6%), obtiveram 42,0% de células com motilidade, bem próximo aos resultados obtidos nesse experimento. E SANTOS (2001) ao congelar o sêmen de caprinos adultos das raças Alpina e Saanen, utilizando um diluidor Tris-gema de ovo (20%) e glicerol (4%), obteve valores inferiores ao desse experimento, para o grupo TRIS (34,37%), para a motilidade espermática pós-descongelação, de 31,9% e 26,9%, respectivamente para as duas raças. Diferentemente de BITTENCOURT et al. (2004), que obtiveram uma implementação de 10% na motilidade pós-descongelação, com adição de 0,1% de EDTA ao diluidor de congelação de sêmen caprino formulado com Tris-gema de ovo-glicerol, e de DHAMI et al. (1993) ao utilizar o EDTA nessa mesma concentração para criopreservação de sêmen bovino, os resultados obtidos nesse trabalho demonstraram que a adição do EDTA ao diluidor não promoveu aumento da taxa de motilidade espermática pós-descongelação e após o TTR. Esses achados se assemelham ao trabalho realizado por AISEN et al. (2000), que em estudo com ovinos não encontraram diferença significativa para a motilidade espermática pós-descongelação entre o grupo Tris-gema de ovo (58,5%) e o grupo que continha o EDTA associado ao diluidor (52,1%). Apesar da inexistência de relatos da utilização do Equex STM em diluidores para a criopreservação do sêmen caprino, os resultados obtidos nesse experimento com os grupos que continham essa substância, confirmam estudos anteriores realizados com outras espécies, que demonstraram o efeito positivo do detergente para a manutenção dos parâmetros espermáticos pós-descongelação (PEÑA e LINDE-FORSBERG, 2000; PEÑA et al., 2003; MAIA et al., 2005). MAIA et al. (2005) em experimento com ovinos, comparando o efeito da adição do Equex em duas concentrações (0,5% e 1%), obtiveram percentuais de 39% de espermatozóides com motilidade progressiva pós-descongelação para os dois grupos, enquanto que para o grupo sem o Equex essa motilidade foi de 24%, 15% inferior (P<0,05). Corroborando com esses resultados, pode-se verificar ao se comparar os grupos TRIS e TRIS+EQUEX (Tab. 2.3 e Tab. 2.4), que o percentual de células com motilidade progressiva após a descongelação foi 5% superior para o grupo com o detergente. Essa diferença continuou aumentando e após o TTR ela foi de 7,5% a mais para o grupo TRIS+EQUEX.

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A capacidade de manutenção da viabilidade espermática para o grupo TRIS+EQUEX, pode ser constatada ao se verificar que a média de motilidade progressiva se manteve sem queda, após o TTR (Tab. 2.4). Essas observações confirmam as conclusões de ROTA et al. (1997) e PEÑA e LINDE-FORSBERG (2000) que também demonstraram que o diluidor de congelação do sêmen canino que continha o Equex STM promoveu melhores índices de sobrevivência pós-descongelação e após TTR. Pode-se observar (Tab. 2.4) que para o parâmetro vigor espermático após o TTR houve um acréscimo discreto na sua pontuação para os dois grupos que continham o Equex. Esse dado, novamente, confirma a capacidade dessa substância em manter a viabilidade espermática por mais tempo, após o processo de criopreservação. Relatos semelhantes foram descritos por autores como THOMAS et al. (1992) (citado por PEÑA e LINDE-FORSBERG, 2000) e PEÑA et al. (2003) que verificaram qua a sobrevivência e longevidade dos espermatozóides, tanto quanto a qualidade do movimento espermático pós-descongelação, foram significativamente superiores no diluidor contendo Equex STM. Esse fato pode ser explicado porque o detergente dodecil-sulfato de sódio (DDS), que é a substância ativa do Equex STM, tem como função primordial, quando adicionado aos diluidores de congelação de sêmen, aumentar a disponibilidade dos fosfolipídios da gema de ovo. Com isso, melhora-se, a sua capacidade de proteção à membrana plasmática dos espermatozóides contra o choque térmico e todas as alterações promovidas pelo processo de criopreservação (ROTA et al, 1997). Os baixos resultados obtidos para o grupo Bioexcell® discordam dos relatos de sucesso observados em diversos trabalhos ao utilizarem esse diluidor, ou outro a base de leticina de soja, para criopreservação do sêmen de outras espécies, como ovinos (GIL et al., 2003 ) e bovinos (HINSCH et al., 1997; GIL et al., 2000; VAN WAGTENDONK et al., 2000). GIL et al. (2003), por exemplo, utilizando o Bioexcell® em trabalho com carneiros da raça Corriedale, encontraram médias de motilidade espermática pós-descongelação de 47%, valor semelhante (P>0,05) aos 46,5% verificados para o diluidor controle a base de leite-gema de ovo e superior aos 27,14 % observados nesse experimento, que estão abaixo do considerado como o mínimo recomendado para o sêmen caprino descongelado (HENRY e NEVES, 1998). 4.3.3. Características morfológicas do sêmen descongelado Na Tab. 2.5 encontram-se as médias de defeitos menores (DME), defeitos maiores (DM) , defeitos de acrossoma (AC) e defeitos totais (DT) para o sêmen fresco e para os cinco grupos (TRIS, TRIS+EDTA, TRIS+EQUEX, TRIS+EDTA+EQUEX, Bioexcell®), logo após a descongelação.

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Tabela 2.5. Médias de defeitos maiores (DM), defeitos menores (DME), defeitos de acrossoma (AC) e defeitos totais (DT) para os espermatozóides do sêmen a fresco, e para os cinco tratamentos (TRIS, TRIS+EDTA, TRIS+EQUEX, TRIS+EQUEX+EDTA e Bioexcell®).


DM (Média ± S)

AC (Média ± S)

DT (Média ± S)

Sêmen a Fresco 7,77 ± 3,53 AB 2,11 ± 1,38 A 0,05 ± 0,16 A 9,94 ± 4,33 A

TRIS 14,77 ± 8,99 B 5,77 ± 4,60 A 2,66 ± 2,82 B 20,55 ± 11,40 B

TRIS+EDTA 7,12 ± 5,02 AB 4,50 ± 2,67 A 1,25 ± 1,48 AB 10,37 ± 5,65 A

TRIS+EQUEX 8,44 ± 7,43 AB 2,44 ± 1,87 A 1,11 ± 1,36 AB 10,88 ± 8,35 A

TRIS+EQUEX+EDTA 5,50 ± 4,24 A 2,87 ± 2,53 A 0,37 ± 0,51 AB 8,37 ± 5,04. A

Bioexcell® 10,37 ± 5,31 AB 4,25 ± 2,37 A 2,50 ± 2,50 B 14,12 ± 6,77 AB

Valores seguidos de letras maiúsculas distintas na coluna diferem entre si (P<0,0001) pelo teste SNK. As médias de defeitos menores, defeitos maiores e defeitos totais, observados para a maioria dos grupos (Tab. 2.5), estiveram abaixo dos valores máximos recomendados pelo CBRA (HENRY e NEVES, 1998.), para o sêmen descongelado da espécie caprina, de 20% para o número de defeitos totais e 10% de defeitos maiores. Apenas o grupo TRIS superou um pouco essa média de defeitos totais (20,55%). Em relação as médias de defeitos menores (Tab. 2.5), os grupos sêmen a fresco, TRIS+EDTA, TRIS+EQUEX e Bioexcell® foram semelhantes entre si (P>0,05) e semelhantes aos grupos TRIS e TRIS+EQUEX+EDTA, porém esses dois últimos foram diferentes entre si (P<0,05). Apesar das diferenças nos percentuais médios de defeitos maiores encontrados para os espermatozóides congelados nos diversos grupos (Tab. 2.5), as mesmas não foram significativas. Entretanto, levando-se em consideração apenas os valores numéricos, pode-se verificar que os diluidores TRIS+EQUEX+EDTA e TRIS+EQUEX tiveram os menores percentuais de defeitos maiores. O sêmen congelado com os diluidores TRIS+EDTA; TRIS+EQUEX e TRIS+EQUEX+EDTA promoveram índices semelhantes (P>0,05) de defeitos acrossomais em relação ao sêmen a fresco. Os grupos TRIS e Bioexcell® obtiveram maiores (P<0,05) percentuais de defeitos acrossomais quando comparados ao ejaculado a fresco e foram semelhantes entre si (P>0,05) em relação a essa alteração. Cinco grupos obtiveram valores semelhantes para o número de defeitos totais (P>0,05). Esses foram o sêmen a fresco, TRIS+EDTA; TRIS+EQUEX, TRIS+EQUEX+EDTA e Bioexcell®. Porém, para o tratamento Bioexcell® não foi encontrada diferença (P>0,05) quando comparado ao grupo TRIS, que obteve o maior percentual de defeitos totais (Tab. 2.5). O melhor desempenho do grupo TRIS+EDTA em comparação ao grupo TRIS (P<0,05), para o número de defeitos totais (Tab. 2.5), está de acordo com as citações de AISEN et al. (2000).

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Esses verificaram que a adição do EDTA a um diluidor hipertônico contendo trealose, promoveu melhores índices de proteção espermática, não apenas após a descongelação, como também, após 4h de teste de termoresistência à 37oC. Os autores concluiram que, possivelmente, o EDTA com sua função de quelar o cálcio do meio diluidor, eliminou a ação inibitória desse contra a atividade protetora da trealose sobre a membrana dos espermatozóides. Discordando desses resultados, BITTENCOURT et al. (2004) verificaram que apesar da maior motilidade espermática observada para o grupo que continha o EDTA, esse apresentou, significativamente um maior índice de alterações morfológicas (defeitos maiores e defeitos totais) quando comparado com o grupo que não continha o EDTA. Sabe-se que durante a criopreservação espermática a queda de temperatura resulta em uma despolarização parcial da membrana plasmática, o que provoca a abertura dos canais de cálcio e, consequentemente, o influxo do mesmo. O aumento intracelular dessa substância está relacionado com a diminuição da viabilidade e morte celular (AMANN e PICKETT, 1987). Então, diversos estudos têm demonstrado a eficácia da utilização do EDTA, que com sua função de quelar o cálcio extracelular, impede o seu influxo e assim, inibe as lesões espermáticas provocadas por esse processo (WATSON, 1981; ROBERTSON e WATSON, 1986; DHAMI e SAHNI, 1993). Contudo, existem divergências nos resultados encontrados na literatura, com a utilização do EDTA, devido a ocorrência de alguns fenômenos, e entre eles o principal seria o fator de interação entre os componentes do meio diluidor. Isso porque o EDTA é adicionado a distintas formulações de diluidores, e nem sempre a remoção do cálcio do meio é desejável. Esse fato pode ser exemplificado pelo trabalho realizado por AISEN et al. (2005) que, investigando o efeito da associação EDTA e trealose, verificaram por ultra-microscopia e por teste hiposmótico, que o grupo que continha o EDTA obteve maiores índices de alterações da membrana dos espermatozóides, bem como, maiores níveis de peroxidação lipídica. Os autores concluíram que a ação antioxidante da trealose foi inibida pela retirada do cálcio do meio pelo EDTA, sugerindo a existência de uma interação positiva entre a trealose e o cálcio, para as cabeças polares dos fosfolipídios da membrana espermática. Mesmo que a diferença tenha sido apenas visual, pode-se observar que os diluidores que continham o Equex em sua composição (TRIS+EQUEX+EDTA e TRIS+EQUEX) apresentaram, alternadamente, os menores percentuais de defeitos maiores, menores, de acrossoma e defeitos totais (Tab. 2.5). Esses resultados, novamente confirmam os estudos anteriores observados por alguns autores, em trabalhos com cães, que verificaram que além da manutenção dos padrões de motilidade espermática pós-descongelação por mais tempo, também demonstraram a eficácia desse detergente minimizando o aparecimento de lesões da morfologia espermática (ROTA et al., 1997; PEÑA e LINDE-FORSBERG, 2000; PEÑA et al., 2003).

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Corroboraram ROTA et al. (1997) encontraram 32,4% das células espermáticas com lesões de acrossoma que foram congeladas no diluidor contendo o Equex, contra os 41,5% para o diluidor sem o mesmo (P<0,005). PEÑA et al. (2003) observaram 33% a mais de células com acrossoma intacto, após 1h de incubação à temperatura de 38oC, para o diluidor com Equex em relação ao que não o detinha. E após 7h de incubação a essa temperatura, mais de 40% das células congeladas no meio com Equex ainda se mantiveram com acrossoma intacto, enquanto que para o grupo sem o mesmo, esse percentual foi de apenas 12,7%, demonstrando assim o efeito desse detergente sobre a viabiliade e, acima de tudo, sobre a longevidade espermática pós-descongelação. 4.4. Conclusões Apesar da semelhança (P>0,05) entre os grupos TRIS, TRIS+EQUEX e TRIS+EQUEX+EDTA, em relação aos percentuais de células com motilidade total e progressiva após a descongelação, os grupos que continham o Equex demonstraram uma maior capacidade de manutenção da viabilidade e longevidade espermática. Essa afirmativa foi comprovada após o teste de termoresistência, onde ambos os grupos com Equex (TRIS+EQUEX e TRIS+EQUEX+EDTA) obtiveram os melhores (P<0,05) índices de motilidade total e progressiva, em relação aos demais diluidores. A maior viabilidade espermática observada para o grupo TRIS+EQUEX, embora sem diferença significativa (P>0,05) em relação ao grupo TRIS+EQUEX+EDTA, também pôde ser comprovada mediante a verificação do vigor espermático após o teste de termoresistência, no qual o referido grupo obteve a maior pontuação para essa característica, Nesse estudo, o diluidor comercial Bioexcell® obteve baixos índices de motilidade espermática pós-descongelação, fato esse que, nas condições em que foi realizado esse experimento, o desabilita para a criopreservação de sêmen da espécie caprina. 4.5. Referências Bibliográficas AISEN E.G..; ALVAREZ, LA H.L.; VENTURINO, A; GARDE, J.J. Effect of trehalose and edta on cryoprotective action of Ram semen diluents. Theriogenology, v.53, p.1053-1061, 2000. AISEN, E.G., QUINTANA M, MEDINA V, MORELLO H, VENTURINO A. Ultramicroscopic and biochemical changes in ram spermatozoa cryopreserved with trehalose-based hypertonic extenders. Cryobiology, v.50, n.3 , p.239-249, 2005. AMANN, R.P.; PICKETT, B.W. Principle of cryopreservation and a review of stallion spermatozoa. Equine Veterinary Science, v.7, n.3, p.145-174, 1987. AZERÊDO, G.A. de. Uso de sondas fluorescentes na avaliação da integridade de membrana plasmática de espermatozóides caprinos, submetidos à congelação na presença e ausência de plasma seminal. 1999. 71f. Dissertação (Mestrado em Veterinária).

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5. EXPERIMENTO 3

INTERFERÊNCIA DA CURVA DE RESFRIAMENTO E DO TEMPO DE EQUILÍBRIO SOBRE A CONGELABILIDADE DO SÊMEN CAPRINO

AUTORES:


Resumo Dez amostras de sêmen de dois caprinos adultos, colhidas com a utilização de vagina artificial, foram submetidas a criopreservação com o objetivo de verificar a influência da curva de resfriamento e do tempo de equilíbrio à temperatura de 5oC, sobre a congelabilidade do sêmen caprino. Para tanto, o sêmen colhido foi avaliado, diluído em meio a base de Tris-gema de ovo e envasado em palhetas de 0,25mL, com dose inseminante de 100 x 106 espermatozóides. Posteriormente, as amostras de sêmen foram distribuídas nos diferentes protocolos de resfriamento. Os grupos CL15 e CL75 foram resfriados a uma taxa de -0,46oC/min e os grupos CR30 e CR90 foram submetidos a uma curva média de resfriamento de -1,07°C/min, até atingirem a temperatura de 5°C. Depois desse período, as amostras foram submetidas aos diferentes tempos de equilíbrio de, 15, 75, 30 e 90min, respectivamente, para os grupos CL15, CL75, CR30 e CR90. Com o fim dos respectivos protocolos, foi efetuado o processo de congelação em vapor de nitrogênio líquido. A descongelação foi realizada em banho-maria a 37oC por 30s. Esse estudo não verificou a influência da curva de resfriamento nem do período de equilíbrio à temperatura de 5oC, sobre a viabilidade do sêmen congelado da espécie caprina. Palavras chaves: Caprinos; sêmen congelado; tempo de equilíbrio; curva de resfriamento. Summary Ten semen samples of two adult goat were collected by artificial vagina and cryopreservated with the objective of verifying the effect of the cooling rate and the equilibration time at 5oC of temperature, on the freezability of goat semen. For this, the collected semen was evaluated, diluted in Tris-egg yolk extender, packed in 0.25ml straws and provided the dose of 100 million of motile spermatozoa. After that, the semen samples were cooled at the different cooling protocols. The CL15 and CL75 groups were cooled at a cooling rate of -0,46°C/min and the CR30 and CR90 ones were cooled at -1,07°C/min to 5°C. Then, the straws were submitted to the different equilibration times, 15, 75, 30 and 90min, respectively, for the CL15, CL75, CR30 and CR90 group. The freezing was accomplished in liquid nitrogen vapour and the thawing at 37oC for 30 seconds. This study didn’t verify the effect of the cooling rate nor of the equilibration time at 5oC of temperature, on the viability of the frozen goat semen. Key Words: Goats; frozen semen; equilibration time; cooling rate.

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5.1. Introdução Após o processo de criopreservação espermática há uma queda na capacidade fertilizante dos espermatozóides, provocada por fatores que reduzem a proporção de espermatozóides sobreviventes (choque-térmico, susceptibilidade a curva de resfriamento, composição do diluidor e estresse osmótico.) ou afetam o status funcional dos mesmos (estabilidade da membrana plasmática, lesões oxidativas, integridade dos receptores da membrana, estrutura nuclear) (WATSON, 2000). Os problemas da criopreservação não estão relacionados com a manutenção dos espermatozóides a -196oC, pois nessa temperatura não há reações bioquímicas, mas principalmente com as alterações causadas durante o processo de resfriamento, congelação e descongelação (PARKS e GRAHAM, 1992). As crioinjúrias às várias organelas celulares são consideradas como sendo provocadas pelos dois maiores estresses do processo de criopreservação celular: a mudança na temperatura e a formação e dissolução do gelo e suas conseqüências. Antes do processo de criopreservação, que envolve a saída e o retorno das células a temperatura corporal, tanto o choque térmico pelo frio quanto pelo calor, devem ser incluídos como estresses potenciais a serem considerados com igual importância que os estágios que envolvem a queda da temperatura até o ponto de congelação (WATSON, 1995). Sabe-se que a maioria das lesões espermáticas de acrossoma ocorre durante a diluição, resfriamento ou como resultado do período de equilíbrio a que é submetido o sêmen. Isso é importante para que se otimize o processamento inicial do sêmen, fazendo com que a grande maioria de espermatozóides chegue ao processo de congelação-descongelação sem alterações de acrossoma e assim, com maiores chances de sobreviverem ilesos ao processo (OETTLÉ, 1986). Por exemplo, taxas rápidas de resfriamento do espermatozóide da temperatura ambiente até 5oC, induzem a ocorrência de danos, parcialmente irreversíveis, caracterizados por padrão anormal de motilidade (circular ou retrógrado), rápida queda de motilidade, danos acrossomais, lesão da membrana plasmática, metabolismo reduzido e perda de componentes intracelulares (SQUIRES et al., 1999). No processo de resfriamento dos espermatozóides, alterações no arranjo laminar da membrana plasmática podem ser evidenciadas, quando esta possui em sua constituição fosfolipídios de cadeias altamente insaturadas. Alguns desses fosfolipídios podem assumir um arranjo circular, denominado de hexagonal-II, com as extremidades hidrofílicas internas e as extremidades hidrofóbicas externas. Para muitos lipídios essa formação da fase hexagonal-II é transitória até o início da fase cristalina e gel. Porém, para certos fosfolipídios, essa estrutura permanece durante todo o resfriamento e torna-se irreversível, impossibilitando a reorganização do arranjo bilaminar quando há o reaquecimento do espermatozóide a temperatura ambiente. Com isso, há a formação de canais hidrofílicos, que possibilitam a passagem de íons ou outras moléculas pequenas, levando assim, a um aumento prejudicial da

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permeabilidade da membrana, que pode provocar a morte da célular (AMANN e PICKETT, 1987). A proposta do resfriamento do sêmen é reduzir o metabolismo celular e a sua deterioração. Contudo, o resfriamento rápido pode levar ao choque térmico e outras lesões espermáticas. Essa curva de resfriamento vai depender do volume do sêmen diluído (volumes maiores vão resfriar mais lentamente) e da temperatura inicial da suspensão espermática (SQUIRES et al., 1999). Com isso, diversos experimentos vêm demonstrando a importância da curva de resfriamento para a prevenção da ocorrência de lesões espermática ocorridas no processo de criopreservação. WURGAU e LEIDL (1989) trabalhando com diversas espécies (bovinos, caprinos, ovinos, suínos e equinos) observaram a influência da velocidade de resfriamento do sêmen até a temperatura de 4oC, sobre a viabilidade espermática após a congelação. Esses autores concluíram que a curva mais lenta promoveu melhores índices de motilidade pós-descongelação, quando comparada com o resfriamento mais acelerado. DEKA e RAO (1987) trabalhando com caprinos, compararam três curvas de resfriamento e verificaram que quanto mais lenta a curva de resfriamento, menor era a incidência de lesões acrossomais após a descongelação. Apesar de autores, como WESTHUYSEN (1978), terem demonstrado em seus trabalhos a importância do período de equilíbrio à temperatura de 4 a 5oC que o sêmen caprino deve ser submetido após o resfriamento, alguns autores (RITAR e SALAMON, 1983; SIMPLÍCIO e MACHADO 1989; RITAR et al., 1990) citam que o sêmen caprino pode ser congelado sem a necessidade do tempo de equilíbrio. Assim, esse trabalho teve como objetivo avaliar o efeito da curva de resfriamento e do tempo de equilíbrio sobre a congelabilidade do sêmen caprino, comparando a eficácia de duas curvas de resfriamento, uma mais lenta e outra mais rápida, associadas à diferentes tempos de equilíbrio à temperatura de 4 a 5oC. 5.2. Materiais e Métodos 5.2.1. O local e os animais Os procedimentos experimentais utilizados estiveram de acordo com os princípios éticos na experimentação Animal recomendados pelo COBEA (2005).

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O experimento foi realizado no Hospital de Medicina Veterinária, da Escola de Medicina Veterinária da Universidade Federal da Bahia (EMEV-UFBA), compreendendo os meses de Agosto a Outubro de 2005. Todos os procedimentos de avaliação espermática, manipulação seminal, congelação, armazenamento e descongelação do sêmen foram realizados no Laboratório de Embriologia e Reprodução Animal do Hospital Veterinário da EMEV-UFBA. A temperatura do laboratório era mantida resfriada (25 a 26oC), através de sistema de ar condicionado e, controlada por termômetro de mercúrio mantido suspenso a altura da bancada onde era processado o sêmen. Foram selecionados dois reprodutores adultos, sem raça definida, após a realização da avaliação clínica, exame físico do sistema reprodutivo e estudo andrológico do ejaculado. Os dois reprodutores eram manejados de forma intensiva, com fornecimento diário de concentrado balanceado, forragem verde, sal mineral e água ad libitum. O controle sanitário era realizado periodicamente, seguindo um esquema pré-estabelecido pelo setor. 5.2.2. Colheita e avaliação do sêmen pré-congelação As colheitas de sêmen (nove ejaculados) foram realizadas em dias alternado, de manhã ou no final da tarde, com a utilização de vagina artificial com água aquecida entre 42oC e 45oC, tendo como manequim uma fêmea em estro induzido. O ejaculado era colhido em tubos graduados, protegidos da luz e da temperatura ambiente por um protetor térmico. Após a colheita a amostra de sêmen era encaminhada imediatamente para o laboratório de processamento e colocado em banho-maria, à temperatura de 37oC, quando se realizaou o exame físico do ejaculado (volume, aspecto, turbilhonamento, vigor e motilidade espermática). O volume do ejaculado foi verificado por visualização direta do sêmen no tubo graduado e registrado em mililitros (mL), e o turbilhonamento (escala de 0-5) foi verificado pela observação de uma gota de sêmen sobre uma lâmina pré-aquecida em mesa aquecedora e mantida aquecida sobre chapa aquecedora à 37oC, em microscópio com objetiva com aumento de 10X. O vigor (escala de 0-5) e a motilidade total (0-100%), foram avaliados pela observação de uma gota de sêmen entre lâmina e lamínula em objetiva de 40X, tal como preconizado pelo Colégio Brasileiro de Reprodução Animal (CBRA ) (HENRY e NEVES, 1998). Para o cálculo da concentração espermática, empregou-se a câmara de Neubauer, com sêmen diluído na proporção de 10µ para 4mL (1:400) de solução de formol-salina tamponada (HANCOCK, 1957). A mesma amostra de sêmen em formol-salina tamponada usada para cálculo da concentração foi usado para avaliação da morfologia espermática, por isso têve-se o cuidado de manter o tubo com formol salina sobre a placa aquecedora para que fossem evitadas alterações na célula espermática, provocado por choque-térmico dos espermatozóides, ao entrarem em

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contato com o formol. O estudo da morfologia espermática foi realizado posteriormente utilizando-se a técnica de contraste de fase (aumento de 1000X), onde foram contadas 100 células para determinação do percentual de espermatozóides normais e anormais. As anormalidades foram classificadas segundo o CBRA (HERNY e NEVES, 1998). O número total de espermatozóides no ejaculado foi obtido, multiplicando-se o volume do sêmen (mL) pela concentração espermática/mL. Após os exames físicos os ejaculados foram destinados às etapas de processamento para congelação. 5.2.3. Diluição e diluidores Realizado o exame físico do ejaculado, a amostra foi pré-diluída em um tubo graduado, na proporção de uma parte de sêmen para duas de meio diluidor (1/3). O diluidor e o tubo foram aquecidos em banho-maria à 37oC, previamente a diluição inicial, a fim de proteger o sêmen durante a sua manipulação. Então, foram avaliadas a motilidade espermática e vigor por meio de microscopia óptica, com aumento de 200 a 400X, com o intuito de verificar possíveis alterações nas características seminais durante o processo de diluição. Após procedida a concentração espermática, por contagem em câmara de Neubauer, foi calculado o número de doses (100 milhões de espermatozóides/dose) e realizado o ajuste do volume final do diluidor a ser adicionado. Seguindo-se a diluição final o sêmen foi envasado em palhetas de polietileno de 0,25mL. O diluidor de congelação teve como concentração final, aproximadamente 6% de crioprotetor e 20% de gema de ovo. O diluidor foi preparado de acordo com ROBERTS (1986) e sofreu algumas modificações na concentração do glicerol (redução de 7 para 6%) e os antibióticos penicilina e estreptomicina, foram substituidos pelo sulfato de gentamicina (13,40mg) (Schering-Plough S/A, São Paulo, SP). Também foi acrescentado ao meio 0,5% de Equex STM (Nova Chemical Sales, Scituate Inc., MA, USA). 5.2.4. Resfriamento do sêmen O número total de palhetas foi dividido em quatro partes iguais, para então serem submetidas aos quatro protocolos de processamento antes da congelação. Metade das amostras (dois grupos) foram resfriadas através de uma curva de resfriamento lenta e a outra metade (dois grupos) por uma curva com a taxa de resfriamento rápida. 5.2.4.1. Curva de resfriamento lento e tempo de equilíbrio Para essa curva de resfriamento as palhetas foram mantidas à temperatura do laboratório, quando então eram encaminhadas para o resfriamento lento. Este foi realizado segundo FÜRST (2002), onde as palhetas foram colocadas em um tubo de ensaio de 20mL, à temperatura ambiente. Em seguida, o tubo de ensaio revestido por um refil foi colocado dentro de um recipiente plástico de 240mL, contendo 120mL de álcool absoluto. O recipiente foi então colocado na posição horizontal dentro de uma geladeira de 280L, com temperatura interna estabilizada em 4 a 5oC. Segundo FÜRST, (2002), a metodologia empregada na curva

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de resfriamento impôs, inicialmente, um queda de temperatura acentuada (-0,6oC/min), até alcançar os 18oC. Entre 18 e 8oC, a curva de resfriamento foi mais lenta, com uma taxa que variou entre -0,5 e -0,3oC/min. Da temperatura inicial a qual encontrava-se o sêmen diluído (aproximadamente 26oC) até chegar a temperatura de 8oC, passaram-se 35min. Depois desse período o tubo foi retirado do recipiente e mantido a temperatura da geladeira por mais 10min, com uma queda inicial de -0,8oC/min e final de -0,2oC/min até a temperatura 4 a 5oC. A taxa média de resfriamento, até atingir os 5oC, foi de -0,46oC. Depois de estabilizada a temperatura das amostras, metade das palhetas permanecia por mais 15min em equilíbrio à temperatura de 4 a 5oC, formando o primeiro grupo exeprimental, CL15. A outra metade das amostras permanecia por mais 75min, formando o grupo CL75. 5.2.4.1. Curva de resfriamento rápido e tempo de equilíbrio A curva de resfriamento rápida foi realizada segundo BARBOSA (1999), onde as palhetas foram colocadas horizontalmente sobre plataformas, dentro de uma geladeira de 280L, com temperatura interna estabilizada em 4 a 5oC. Dessa forma, as amostras foram submetidas a uma curva de resfriamento de -1,07°C/min, onde após, aproximadamente, de 30min as amostras chegavam a temperatura de 5oC. Depois desse período as amostras foram submetidas à dois tempos de equilíbrio. Metade das amostras permanecia por 30min em tempo de equilíbrio à temperatura de 5oC, formando o terceiro grupo, CR30. As outras amostras eram mantidas por mais 90min, após a estabilização, o grupo CR90. 5.2.5. Congelação do sêmen Após as respectivas curvas de resfriamento e tempos de equilíbrio estavam formados os quatro grupos experimentais (CL15, CL75, CR30, CR90), que foram submetidos ao seguinte protocolo de congelação: As palhetas foram colocadas horizontalmente em vapor de nitrogênio líquido a 5cm da lâmina líquida, por 20min, dentro de uma caixa de isopor. Essa caixa com 40cm de comprimento por 32cm de altura e 20cm de largura, continha 4cm de nitrogênio em seu interior. Após os 20min em vapor, as palhetas foram mergulhadas no nitrogênio líquido e colocadas em raques devidamente identificadas e armazenadas em botijão criogênico até o momento da descongelação. A curva de congelação a que foi submetido o sêmen em vapor de nitrogênio, durante 20min, foi em torno de -60oC/min (AMANN e PICKETT, 1987).

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5.2.6. Descongelação e avaliação espermática As amostras foram descongeladas após cinco dias de efetuada a congelação. 5.2.6.1. Curva de descongelação e característica microscópicas do sêmen A curva de reaquecimento do sêmen de 700oC/min, é obtida ao descongelar as palhetas (-196oC) em banho-maria a 37oC por 30s (AMANN e PICKETT, 1987), e este protocolo foi o utilizado nesse experimento. Depois de descongeladas as amostras eram avaliadas quanto a motilidade e o vigor espermático (com a colocação de uma gota de sêmen entre lâmina e lamínula pré-aquecidas a 37oC, em microscópio com aumento de 200 e 400X). Todas as partidas de sêmen foram submetidas ao teste de termoresistência para a espécie caprina, como preconizado pelo CBRA (HENRY e NEVES, 1998). 5.2.6.2. Teste de termoresistência (TTR) Para a realização do TTR as amostras descongeladas foram mantidas em tubos Eppendorf fechados, por 5min (HENRY e NEVES, 1998), quando então foram efetuadas as avaliações de motilidade total, progressiva e vigor espermático, assim como realizado para o sêmen descongelado. 5.2.6.3. Morfologia espermática do sêmen descongelado Para a avaliação de danos na morfologia espermática (alterações de cabeça e cauda), foram retiradas alíquotas de 20µL de cada um dos quatro tratamentos após a descongelação e colocadas em tubos com 2mL de formol-salina tamponado sendo estas posteriormente avaliadas por meio de preparação úmida entre lâmina e lamínula por meio de microscopia de contraste de fase em aumento de 1.000X. Para tanto foram contadas 100 células espermáticas, computando e classificando individualmente as alterações encontradas, em defeitos menores e defeitos maiores, segundo BLOM, (1973). 5.2.7. Delineamento e análise estatística O delineamento estatístico foi inteiramente casualizado, onde os ejaculados foram considerados repetições (n=10) e os protocolos de processamento do sêmen (CL15, CL75, CR30, CR90) foram considerados tratamentos (n=4). Os cálculos de média, desvio-padrão e análise de variância foram realizados conforme SAMPAIO (1998). Para a análise estatística das características avaliadas realizou-se a seguinte seqüência de análises:

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1- A consistência dos dados e a análise descritiva (médias e desvio-padrão) das características de interesse ao estudo foram realizadas mediante o emprego do PROC MEANS. 2- As variáveis (defeitos maiores, defeitos menores, defeitos de acrossoma e defeitos totais; motilidade espermática total e progressiva e vigor espermático) foram comparadas por meio do PROC GLM, utilizando-se o teste de Student – Newman – Keuls (SNK), com nível de probabilidade de cinco por cento. 5.3. Resultados e Discussões 5.3.1. Características do sêmen fresco Os valores referentes ao volume (VOL), motilidade total (MT), motilidade progressiva (MP), vigor (VIG) e concentração (CON) do sêmen a fresco e as respectivas médias nos dez ejaculados, encontram-se na Tab. 3.1. Tabela 3.1. Valores encontrados para as características microscópicas (volume, motilidade total e motilidade progressiva, vigor e concentração) para o sêmen a fresco nas dez amostras (AM).

Amostras VOL MT(%) MP(%) VIG(0-5) CONC(x109/mL)

Ejaculado 1 0,80 50,00 45,00 4,00 4,02 Ejaculado 2 0,30 60,00 50,00 4,00 2,98 Ejaculado 3 0,80 65,00 60,00 4,00 5,64 Ejaculado 4 0,80 65,00 60,00 4,00 8,58 Ejaculado 5 0,70 75,00 70,00 4,00 8,70 Ejaculado 6 0,60 80,00 75,00 4,00 6,32 Ejaculado 7 0,70 80,00 75,00 4,00 5,60 Ejaculado 8 0,70 85,00 80,00 4,50 6,74 Ejaculado 9 0,80 75,00 70,00 4,00 8,52 Ejaculado 10 0,80 85,00 80,00 4,50 7,16

MÉDIA (Média ± S)

0,74 ± 0,07 72,00 ± 11,60 66,50 ± 12,26 04,10 ± 0,21 06,43 ± 1,94

Os valores médios encontradas para volume e motilidade espermática (0,74mL e 72,0%), foram um pouco inferiores aos valores médios preconizados pelo CBRA (HENRY e NEVES, 1998), para a espécie caprina, que são de 0,8mL e 80,0%, para volume e motilidade, respectivamente. Entretanto, as médias encontradas para o vigor (4,10) e para concentração espermática (6,43 x 109/mL) foram bem superiores às citadas pelo CBRA (HENRY e NEVES, 1998), de 3,00 para o vigor e 2,00 x 109 para a concentração espermática. Concentrações semelhantes ao desse estudo foram encontradas por AZERÊDO (1999) que, em trabalho com caprinos Saanem, verificou uma média de 6,28 x 109 de espermatozóides por mL. Porém, a concentração espermática desse trabalho, foi superior aos 2,92 x 109/mL

registrados por MACHADO e SIMPLÍCIO (1991), em trabalho com bodes Alpinos e, aos 4,5 x 109/mL observados por LIMA et al. (1991) (citado por MACHADO e SIMPLÍCIO, 1995), avaliando caprinos da raça Saanem.

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As médias de motilidade espermática verificadas (Tab. 3.1), foram um pouco superiores às observadas por MACHADO e SIMPLÍCIO (1991), que encontraram, para caprinos adultos da raça Alpina, um percentual de 69,2% e, semelhantes às médias verificadas por FERRARI (1993) trabalhando com caprinos Toggemburg, de 72,5%. Os valores para as características morfológicas, defeitos maiores (DM), defeitos menores (DME) e defeitos totais (DT), nas dez amostras, estão sumarizados na Tab. 3.2. Tabela 3.2. Características morfológicas (defeitos maiores, defeitos menores e defeitos totais) do sêmen a fresco e suas médias nas dez amostras (AM).

Amostras DM (%) DME (%) DT (%)

Ejaculado 1 12,50 06,50 19,00 Ejaculado 2 14,00 12,00 26,00 Ejaculado 3 00,50 04,50 05,00 Ejaculado 4 04,00 00,00 04,00 Ejaculado 5 00,50 04,00 04,50 Ejaculado 6 00,50 03,50 04,00 Ejaculado 7 03,50 10,00 13,50 Ejaculado 8 03,00 05,50 08,50 Ejaculado 9 09,00 02,00 11,00 Ejaculado 10 01,00 05,50 06,50

MÉDIA (Média ± S)

04,85 ± 5,13 05,35 ± 3,54 10,20 ± 7,39

Os valores médios de defeitos totais do sêmen fresco, verificado nesse estudo, permaneceu dentro do considerado desejável (menor ou igual a 20%), para a seleção de bodes como reprodutores, segundo HERNY e NEVES (1998). Pode-se notar que apenas a segunda amostra (AM 2) ultrapassou esse valor. As médias gerais de defeitos espermáticos encontrados, foram inferiores aos dados citados por BITTENCOURT et al. (2004), que encontrou 7,38% de DME, 8,25% de DM, perfazendo um total de 15,63 % de DT. Foram inferiores, também, aos percentuais observados por SANTOS (2001) que relatou 7,2; 12,1 e 19,3 % para DME, DM e DT, respectivamente, para o sêmen recém colhido de bodes da raça Alpina. 5.3.2. Características microscópicas do sêmen descongelado Na Tab. 3.3 encontram-se as médias de motilidade total (MT), motilidade progressiva (MP) e vigor para o sêmen a fresco e para os quatro grupos (CL15, CL75, CR30, CR90), logo após a descongelação.

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Todos os grupos experimentais apresentaram valores médios de motilidade progressiva e vigor iguais ou acima dos valores mínimos recomendados para os sêmen caprino descongelado, de 30% para MP e 2 para o vigor, assim como preconizado pelo CBRA (HENRY e NEVES, 1998). Tabela 3.3. Médias de motilidade total (MT), motilidade progressiva (MP) e vigor para os espermatozóides do sêmen a fresco, e para os quatro tratamentos (CL15, CL75, CR30, CR90) logo após a descongelação.


MP (Média ± S)

VIGOR (Média ± S)

Sêmen a Fresco 72,00 ± 11,59 A 66,50 ± 12,25 A 4,10 ± 0,21 A

CL15 47,00 ± 14,56 B 42,00 ± 14,56 B 3,35 ± 0,33 B

CL75 51,50 ± 10,81 B 46,50 ± 10,81 B 3,55 ± 0,15 B CR30 41,50 ± 08,18 B 36,50 ± 08,18 B 3,34 ± 0,23 B CR90 52,50 ± 11,11 B 47,50 ± 11,11 B 3,55 ± 0,15 B Valores seguidos de letras maiúsculas distintas na coluna diferem entre si (P<0,0001) pelo teste SNK. Logo após a descongelação (Tab. 3.3) não foi encontrada diferença significativa (P>0,05), para as características de motilidade total, motilidade progressiva e vigor entre os grupos estudados. BITTENCOURT et al. (2004) utilizando protocolo semelhante ao descrito para o grupo CL15 (60min para resfriamento e tempo de equilíbrio, em geladeira estabilizada a 4 a 5oC), obteve um resultado um pouco superior ao encontrado nesse estudo, de 51,0% de células com motilidade após a descongelação. SANTOS (2001), com o mesmo protocolo utilizado para o grupo CR90 (curva de resfriamento de -1,07oC/min mais 90min de equilíbrio à temperatura de 5oC), observou 31,9% e 2,8, respectivamente, para motilidade e vigor espermático. Valores inferiores quando comparados com o referido grupo (CR90) do presente experimento. Autores como MORAN et al. (1992) em trabalho com equinos, ressaltaram que a curva de resfriamento lento é necessário no período em que os espermatozóides são mais sensíveis ao choque pelo frio, na faixa compreendida entre 19 e 8oC, quando podem ocorrer mudanças irreversíveis à membrana espermática, caso o resfriamento seja acelerado. A curva lenta empregada nesse experimento (grupos CL15 e CL75), possibilitou, nesse intervalo de temperatura, taxas lentas de resfriamento que variaram de -0,5 a -0,3oC/min. No entanto, pode-se observar que não houve influência da curva de resfriamento sobre os índices de motilidade e vigor espermático (P>0,05). O grupo submetido ao resfriamento com a curva rápida (-1,07oC/min) e mantido por 90min em tempo de equilíbrio (CR90), obteve os maiores percentuais de motilidade e vigor espermático, embora sem significância (P>0,05). Resultados parecidos, na espécie caprina, foram citados por DEKA e RAO (1987) que não

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encontraram diferença entre as médias de motilidade espermática para o sêmen congelado após taxas de resfriamento que variaram de -1 a -0,21oC/min, indicando assim, que talvez, para essa espécie, não haja a influência da curva de resfriamento sobre a motilidade espermática pós-descongelação. Entretanto, pode-se verificar que, visualmente, houve uma discreta interferência do período de equilíbrio, sobre as médias de motilidade espermática, principalmente, entre os grupos submetidos à curva rápida, no qual o grupo mantido por 90min em equilíbrio (CR90), obteve 11% acima, de motilidade total e progressiva, em relação grupo que permaneceu por apenas 30min (CR30). Esses dados confimam os resultados de WESTHUYSEN (1978), que verificou que a medida que aumentavam o tempo de equilíbrio a que era submetido o sêmen, também se aumentava significativamente a motilidade espermática pós-descongelação. Os resultados do presente experimento também corroboram com SALAMON e RITAR (1982) que citaram que a estabilização do sêmen por 1,5h à temperatura de 5oC, previamente a congelação, foi o melhor protocolo para criopreservação do sêmen caprino não centrifugado. Na Tab. 3.4 encontram-se as médias de motilidade total (MT), motilidade progressiva (MP) e vigor para os quatro grupos (CL15, CL75, CR30, CR90), logo após o teste de termoresistência (TTR). Tabela 3.4. Médias de motilidade total (MT), motilidade progressiva (MP) e vigor para os espermatozóides dos quatro tratamentos (CL15, CL75, CR30, CR90), logo após o teste de termoresistência (TTR).


MP (Média ± S)

VIGOR (Média ± S)

CL15 40,55 ± 14,56 36,66 ± 13,69 3,38 ± 0,33

CL75 49,50 ± 10,39 44,50 ± 10,39 3,50 ± 0,00 CR30 38,50 ± 08,18 34,00 ± 08,43 3,25 ± 0,26 CR90 47,00 ± 07,88 41,00 ± 07,37 3,45 ± 0,15 A semelhança (P>0,05) para as carcterísticas motilidade total, progressiva e vigor espermático, entre os protocolos testados, mantiveram-se após o TTR, embora a superioridade numérica, nesse caso, tenha mudado para o grupo CL75. 5.3.3. Características morfológicas do sêmen descongelado Na Tab. 3.5 encontram-se as médias de defeitos menores (DME), defeitos maiores (DM), defeitos de acrossoma e defeitos totais (DT) para o sêmen fresco e para os quatro grupos (CL15, CL75, CR30, CR90), logo após a descongelação.

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Tabela 3.5. Médias de defeitos maiores (DM), defeitos menores (DME), defeitos de acrossoma (AC) e defeitos totais (DT) para os espermatozóides do sêmen a fresco, e para os quatro tratamentos (CL15, CL75, CR30, CR90).


DM (Média ± S)

AC (Média ± S)

DT (Média ± S)

Sêmen a Fresco 05,35 ± 03,54 04,85 ± 05,13 00,00 ± 00,00 10,20 ± 07,39

CL15 04,15 ± 03,23 04,15 ± 02,51 00,15 ± 00,33 08,45 ± 05,46

CL75 06,65 ± 04,50 04,75 ± 02,72 00,40 ± 00,56 11,80 ± 06,56 CR30 06,15 ± 04,73 05,25 ± 02,38 00,35 ± 00,47 11,70 ± 05,97 CR90 03,70 ± 04,24 04,30 ± 03,04 00,10 ± 00,31 08,10 ± 05,72

As médias encontradas de defeitos menores, defeitos maiores e defeitos totais, para todos os grupos (Tab. 3.5), ficaram abaixo dos valores recomendados pelo CBRA (HENRY e NEVES, 1998), para o sêmen descongelado da espécie caprina, de 20% para o número de defeitos totais e 10% de defeitos maiores. Não foi verificada diferença significativa (P>0,05) para os percentuais de defeitos espermáticos entre os grupos experimentais, assim como, entre esses e o sêmen a fresco (Tab.5). Esse fato revela a eficácia dos protocolos utilizados, para a manutenção das características morfológicas dos espermatozóides, após o processo de congelação-descongelação. Pode-se observar que, para os grupos congelados após curva lenta (CL15 e CL75), o aumento do tempo de equilíbrio tendeu numericamente a promover um acréscimo do número de patologias espermáticas. Para o sêmen submetido a uma curva de resfriamento mais rápida (CR30 e CR90) ocorreu o contrário. O aumento do período de equilíbrio tendeu a minimizar o surgimento de alterações na morfologia celular. Assim, apesar da inexistência de significância o sêmen congelado com o protocolo de curva rápida mais 90min de equilíbrio (CR90), obteve os menores índices de alterações morfológicas pós-descongelação. Esses resultados contradizem DEKA e RAO (1987), que identificaram uma menor incidência de lesões acrossomais, especialmente edema de acrossoma, no sêmen resfriado à taxas mais lentas, quando comparado ao ejaculado resfriado rapidamente, embora sem interferência, sobre a motilidade espermática. Entretanto, dados semelhantes aos encontrados nesse experimento, foram relatados por WURGAU (1986), que não encontrou diferenças significativas, de lesões espermáticas, para o sêmen exposto à curvas rápida e lenta de resfriamento, até a temperatura de 4oC.

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Em relação ao tempo de equilíbrio, BARUAH et al. (2003) não verificaram diferença significante, em relação às taxas de motilidade espermática e lesões espermáticas, para as amostras de sêmen equilibradas por 0,5; 1 e 1,5h. Esses resultados corroboram com os observados no presente estudo (Tab. 3.5). 5.4. Conclusões Esse estudo não verificou a influência da curva de resfriamento sobre a viabilidade do sêmen congelado da espécie caprina. Também, não foi observada a interferência do tempo de equilíbrio à temperatura de 5oC, sobre os parâmetros espermáticos estudados. No entanto, é necessária a realização de novos estudos, com um maior número de repetições e com a padronização dos tempos de equilíbrios, entre os protocolos testados, para verificar a influência da curva de resfriamento, sobre a congelabilidade do sêmen caprino. 5.5. Referências Bibliográficas AMANN, R.P.; PICKETT, B.W. Principle of cryopreservation and a review of stallion spermatozoa. Equine Veterinary Science, v.7, n.3, p.145-174, 1987. AZERÊDO, G.A. de. Uso de sondas fluorescentes na avaliação da integridade de membrana plasmática de espermatozóides caprinos, submetidos à congelação na presença e ausência de plasma seminal. 1999. 71f. Dissertação (Mestrado em Veterinária). Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias da Universidade Estadual Paulista – Jaboticabal-SP. BARBOSA, L. P. Avaliação de diferentes diluidores e métodos de congelação de sêmen, em programas de inseminação artificial em caprinos da raça Alpina. 1999. 71f. Dissertação (Mestrado em Medicina Veterinária). Universidade Federal de Viçosa – Viçosa-MG. BARUAH, C.K.; BISWAS, R.K.; DEKA, B.C.; BORGOHAIN, B.N. Effect of glycerol equilibration periods on quality of frozen semen in Beetal x Assam local crossbred goats. Indian Veterinary Journal, v.80, n.8, p.763-765, 2003. BITTENCOURT, RF; RIBEIRO FILHO, A. DE L.; SANTOS, AD.F.; FURST, R; TEIXEIRA, RB.S.; CHALHOUB, M.;. PORTELA, AP.; ALVES, S.G.G.; ALMEIDA, AK.; GUIMARÃES, J.D. Utilização de glicerol ou etilenoglicol como crioprotetores na congelação de sêmen caprino. Ciência Animal Brasileira, v.5, n.1, 2004. BLOM, E. The ultrastructure of some characteristic sperm defects and a proposal for a new classification of the bull spermiogram. Nordic Veterinary Medicine, v. 25, p. 383 – 391, 1973.

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6. CONSIDERAÇÕES FINAIS Nas condições de realização deste trabalho, e dentro das finalidades a que foi proposto, pode-se concluir que: O tempo de equilíbrio à temperatura de 5oC, ao qual o sêmen foi submetido, teve influência sobre a viabilidade espermática após o processo de criopreservação, onde o sêmen mantido por mais tempo em estabilização, apresentou maiores índices de defeitos espermáticos, especialmente, defeitos maiores, quando comparado ao ejaculado que permanceu por períodos menores em equilíbrio. Dentre os tempos de equilíbrio testados, o de 1,5h foi o protocolo que promoveu os melhores resultados gerais, em relação aos parâmetros espermáticos avaliados pós-descongelação. Os diluidores que continham o detergente Equex STM em sua composição, demonstraram uma maior capacidade de manutenção da viabilidade e longevidade espermática, verificada através dos melhores índices de células com motilidade total e progressiva após o teste de termoresistência, em relação aos diluidores que não o continham. O diluidor comercial Bioexcell®, obteve taxas de motilidade espermática abaixo dos valores mínimos preconizados pelo Colégio Brasileiro de Reprodução Animal, para o sêmen caprino descongelado, demonstrando assim, a sua inaptidão para a criopreservação de sêmen da espécie caprina. Não foi observada a interferência da curva de resfriamento, rápida ou lenta, sobre a viabilidade do sêmen congelado da espécie caprina. Os diferentes períodos de equilíbrio, associados às curvas rápidas e lentas, também não influenciaram as características espermáticas avaliadas após a descongelação. Há a necessidade de realização de novos estudos, com um maior número de repetições e com a padronização dos grupos experimentais, onde as curvas de resfriamentos testadas, devem ser associadas à tempos de equilíbrios semelhantes, e assim, verificar, sem interferência do período de equilíbrio, a verdadeira influência da curva de resfriamento sobre a congelabilidade do sêmen caprino.

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7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS GERAIS AISEN E.G.; ALVAREZ, LA H.L.; VENTURINO, A; GARDE, J.J. Effect of trehalose and edta on cryoprotective action of Ram semen diluents. Theriogenology, v.53, p.1053-1061, 2000. AISEN, E.G.; QUINTANA M.; MEDINA V.; MORELLO H.; VENTURINO A. Ultramicroscopic and biochemical changes in ram spermatozoa cryopreserved with trehalose-based hypertonic extenders. Cryobiology, v.50, n.3 , p.239-249, 2005. ALGHAMDI, A.S.; TROEDSSON, M.H.T.; XUE, J.L.; CRABO, B.G. Effect of seminal plasma concentration and various extenders on postthaw motility and glass wool-Sephadex filtration of cryopreserved stallion semen. American Journal of Veterinary Research. v.63, n.6, p.880-885, 2002. AMANN, R.P.; PICKETT, B.W. Principle of cryopreservation and a review of stallion spermatozoa. Equine Veterinary Science, v.7, n.3, p.145-174, 1987. ARAÚJO, A.A. de; NUNES, J.F. Utilização da água de côco in natura com adição de ovo como diluidor de congelação de sêmen caprino. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE REPRODUÇÃO ANIMAL, 9, 1991, Belo Horizonte. Anais... Belo Horizonte: Colégio Brasileiro de Reprodução Animal. 1991. v.2, p.435. AZERÊDO, G.A. de. Uso de sondas fluorescentes na avaliação da integridade de membrana plasmática de espermatozóides caprinos, submetidos à congelação na presença e ausência de plasma seminal. 1999. 71f. Dissertação (Mestrado em Veterinária). Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias da Universidade Estadual Paulista – Jaboticabal-SP. BAER, L.VON; HELLEMANN, C.; VON BAER, L.. Cryopreservation of llama (Lama glama) semen. Reproduction in Domestic Animals, v.34, n.2, p.65-96, 1999. BAKAS, L.S.; DISALVO, E.A. Effect of Ca2+ on the cryoprotective action of trehalose. Cryobiology, n.28, p.347-353, 1991. BARBOSA, L. P. Avaliação de diferentes diluidores e métodos de congelação de sêmen, em programas de inseminação artificial em caprinos da raça Alpina. 1999. 71f. Dissertação (Mestrado em Medicina Veterinária). Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade Federal de Viçosa – Viçosa-MG. BARNABE, V.H.; BARNABE, R.C.; VISITIN, J.A. Estudo comparativo entre as provas rápidas e lenta de termo resistência para avaliação de sêmen congelado. Revista Brasileira de Reprodução Animal, v. (3-4), p.7-11, 1981. BARUAH, C.K.; BISWAS, R.K.; DEKA, B.C.; BORGOHAIN, B.N. Effect of glycerol equilibration periods on quality of frozen semen in Beetal x Assam local crossbred goats. Indian Veterinary Journal, v.80, n.8, p.763-765, 2003.

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ANEXOS EXPERIMENTO 1 Tabela 1.6- Análise de variância – Comparação da motilidade espermática total do sêmen a fresco e logo após a descongelação, entre os diferentes tratamentos.

Fonte de variação

Graus de liberdade

Soma de quadrados

Quadrados médios F P

Total 34 4.568,57 Tratamentos 4 3.132,85 783,21 16,37 0,0001 Erro 30 1.435,71 47,85 CV = 15,22 Teste estatístico SNK Tabela 1.7 – Análise de variância – Comparação da motilidade espermática progressiva do sêmen a fresco e logo após a descongelação, entre os diferentes tratamentos.

Fonte de variação

Graus de liberdade

Soma de quadrados


Total 34 4.474,28 Tratamentos 4 2.981,42 745,35 14,98 0,0001 Erro 30 1.492,85 49,76 CV = 17,26 Teste estatístico SNK Tabela 1.8 – Análise de variância – Comparação do vigor espermático do sêmen a fresco e logo após a descongelação, entre os diferentes tratamentos.

Fonte de variação

Graus de liberdade

Soma de quadrados


Total 34 10,68 Tratamentos 4 3,18 0,79 3,19 0,0270 Erro 30 7,50 0,25 CV = 14,46 Teste estatístico SNK Tabela 1.9 – Análise de variância – Comparação da motilidade espermática total após o teste de termoresistência do sêmen descongelado, entre os diferentes tratamentos.

Fonte de variação

Graus de liberdade

Soma de quadrados


Total 26 1.474,07 Tratamentos 3 258,00 86,00 1,63 0,2107 Erro 23 1.216,07 52,87 CV = 18,09 Teste estatístico SNK (Devido as parcelas perdidas, apenas 27 das 35 observações puderam ser utilizadas para a avaliação estatística)

83

Tabela 1.10 – Análise de variância – Comparação da motilidade espermática progressiva após o teste de termoresistência do sêmen descongelado, entre os diferentes tratamentos.

Fonte de variação

Graus de liberdade

Soma de quadrados


Total 26 1.451,85 Tratamentos 3 339,94 113,31 2,34 0,0995 Erro 23 1.111,90 48,34 CV = 19,35 Teste estatístico SNK (Devido as parcelas perdidas, apenas 27 das 35 observações puderam ser utilizadas para a avaliação estatística) Tabela 1.11 – Análise de variância – Comparação do vigor espermático após o teste de termoresistência, entre os diferentes tratamentos.

Fonte de variação

Graus de liberdade

Soma de quadrados


Total 26 4,66 Tratamentos 3 0,76 0,25 1,50 0,2421 Erro 23 3,90 0,16 CV = 12,57 Teste estatístico SNK (Devido as parcelas perdidas, apenas 27 das 35 observações puderam ser utilizadas para a avaliação estatística) Tabela 1.12 – Análise de variância – Comparação dos defeitos maiores do sêmen a fresco e do sêmen descongelado, entre os diferentes tratamentos.

Fonte de variação

Graus de liberdade

Soma de quadrados


Total 34 5.023,67 Tratamentos 4 3.096,17 774,04 12,05 0,0001 Erro 30 1.927,50 64,25 CV = 49,26 Teste estatístico SNK Tabela 1.13 – Análise de variância – Comparação dos defeitos menores do sêmen a fresco e do sêmen descongelado, entre os diferentes tratamentos.

Fonte de variação

Graus de liberdade

Soma de quadrados


Total 34 1.180,40 Tratamentos 4 281,68 70,42 2,35 0,0767 Erro 30 898,71 29,95 CV = 49,30 Teste estatístico SNK Tabela 1.14 – Análise de variância – Comparação dos valores médios de lesão de acrossoma, do sêmen a fresco e do sêmen descongelado, entre os diferentes tratamentos

Fonte de variação

Graus de liberdade

Soma de quadrados


Total 34 4.479,88 Tratamentos 4 2.687,60 671,90 11,25 0,0001 Erro 30 1.792,28 59,74 CV = 59,19 Teste estatístico SNK

84

Tabela 1.15 – Análise de variância – Comparação do valores médios de espermatozóides com defeitos totais no sêmen a fresco e no sêmen descongelado, entre os diferentes tratamentos.

Fonte de variação

Graus de liberdade

Soma de quadrados


Total 34 5.559,04 Tratamentos 4 2.889,25 722,31 8,12 0,0001 Erro 30 2.669,78 89,99 CV = 34,53 Teste estatístico SNK Experimento 2 Tabela 2.6 – Análise de variância – Comparação da motilidade espermática total do sêmen a fresco e logo após a descongelação, entre os diferentes tratamentos.

Fonte de variação

Graus de liberdade

Soma de quadrados


Total 46 6.842,55 Tratamentos 5 5.242,50 1.048,50 26,87 0,0001 Erro 41 1.600,04 39,02 CV = 14,64 Teste estatístico SNK (Devido as parcelas perdidas, apenas 47 das 54 observações puderam ser utilizadas para a avaliação estatística) Tabela 2.7 – Análise de variância – Comparação da motilidade espermática progressiva do sêmen a fresco e logo após a descongelação, entre os diferentes tratamentos.

Fonte de variação

Graus de liberdade

Soma de quadrados


Total 46 6.692,55 Tratamentos 5 5.197,56 1.039,51 28,51 0,0001 Erro 41 1.494,99 36,46 CV = 16,03 Teste estatístico SNK (Devido as parcelas perdidas, apenas 47 das 54 observações puderam ser utilizadas para a avaliação estatística) Tabela 2.8 – Análise de variância – Comparação do vigor espermático do sêmen a fresco e logo após a descongelação, entre os diferentes tratamentos.

Fonte de variação

Graus de liberdade

Soma de quadrados


Total 45 23,37 Tratamentos 5 14,78 2,95 13,77 0,0001 Erro 40 8,58 0,21 CV = 14,25 Teste estatístico SNK (Devido as parcelas perdidas, apenas 46 das 54 observações puderam ser utilizadas para a avaliação estatística)

85

Tabela 2.9 – Análise de variância – Comparação da motilidade espermática total após o teste de termoresistência do sêmen descongelado, entre os diferentes tratamentos.

Fonte de variação

Graus de liberdade

Soma de quadrados


Total 37 2.563,81 Tratamentos 4 1.650,42 412,60 14,91 0,0001 Erro 33 913,39 27,67 CV = 14,33 Teste estatístico SNK (Devido as parcelas perdidas, apenas 38 das 54 observações puderam ser utilizadas para a avaliação estatística) Tabela 2.10 – Análise de variância – Comparação da motilidade espermática progressiva após o teste de termoresistência do sêmen descongelado, entre os diferentes tratamentos.

Fonte de variação

Graus de liberdade

Soma de quadrados


Total 37 2.686,84 Tratamentos 4 1.649,78 412,44 13,12 0,0001 Erro 33 1.037,05 31,42 CV = 17,31 Teste estatístico SNK (Devido as parcelas perdidas, apenas 38 das 54 observações puderam ser utilizadas para a avaliação estatística) Tabela 2.11 – Análise de variância – Comparação do vigor espermático após o teste de termoresistência, entre os diferentes tratamentos.

Fonte de variação

Graus de liberdade

Soma de quadrados


Total 35 23,18 Tratamentos 4 15,86 3,96 16,80 0,0001 Erro 31 7,31 0,23 CV = 15,97 Teste estatístico SNK (Devido as parcelas perdidas, apenas 36 das 54 observações puderam ser utilizadas para a avaliação estatística) Tabela 2.12 – Análise de variância – Comparação dos defeitos maiores do sêmen a fresco e do sêmen descongelado, entre os diferentes tratamentos.

Fonte de variação

Graus de liberdade

Soma de quadrados


Total 50 436,14 Tratamentos 5 88,60 17,72 2,29 0,0611 Erro 45 347,54 7,72 CV = 76,19 Teste estatístico SNK (Devido as parcelas perdidas, apenas 51 das 54 observações puderam ser utilizadas para a avaliação estatística) Tabela 2.13 – Análise de variância – Comparação dos defeitos menores do sêmen a fresco e do sêmen descongelado, entre os diferentes tratamentos.

Fonte de variação

Graus de liberdade

Soma de quadrados


Total 50 2.202,15 Tratamentos 5 593,85 118,77 3,32 0,0122 Erro 45 1.608,30 35,74 CV = 68,13 Teste estatístico SNK (Devido as parcelas perdidas, apenas 51 das 54 observações puderam ser utilizadas para a avaliação estatística)

86

Tabela 2.14 – Análise de variância – Comparação dos valores médios de lesão de acrossoma, do sêmen a fresco e do sêmen descongelado, entre os diferentes tratamentos

Fonte de variação

Graus de liberdade

Soma de quadrados


Total 50 189,91 Tratamentos 5 49,42 9,88 3,17 0,0156 Erro 45 140,48 3,12 CV = 133,49 Teste estatístico SNK (Devido as parcelas perdidas, apenas 51 das 54 observações puderam ser utilizadas para a avaliação estatística) Tabela 2.15 – Análise de variância – Comparação do valores médios de espermatozóides com defeitos totais no sêmen a fresco e no sêmen descongelado, entre os diferentes tratamentos.

Fonte de variação

Graus de liberdade

Soma de quadrados


Total 50 3.331,42 Tratamentos 5 859,46 171,89 3,13 0,0165 Erro 45 2.471,95 54,93 CV = 59,47 Teste estatístico SNK (Devido as parcelas perdidas, apenas 51 das 54 observações puderam ser utilizadas para a avaliação estatística) Experimento 3 Tabela 3.6 – Análise de variância – Comparação da motilidade espermática total do sêmen a fresco e logo após a descongelação, entre os diferentes tratamentos.

Fonte de variação

Graus de liberdade

Soma de quadrados


Total 49 11.204,50 Tratamentos 4 5.317,00 1.329,25 10,16 0,0001 Erro 45 5.887,50 130,83 CV = 21,62 Teste estatístico SNK Tabela 3.7 – Análise de variância – Comparação da motilidade espermática progressiva do sêmen a fresco e logo após a descongelação, entre os diferentes tratamentos.

Fonte de variação

Graus de liberdade

Soma de quadrados


Total 49 1.1158,00 Tratamentos 4 5.128,00 1.282,00 9,57 0,0001 Erro 45 6.030,00 134,00 CV = 24,21 Teste estatístico SNK

87

Tabela 3.8 – Análise de variância – Comparação do vigor espermático do sêmen a fresco e logo após a descongelação, entre os diferentes tratamentos.

Fonte de variação

Graus de liberdade

Soma de quadrados


Total 49 6,20 Tratamentos 4 3,82 0,95 18,10 0,0001 Erro 45 2,37 0,05 CV = 6,42 Teste estatístico SNK Tabela 3.9 – Análise de variância – Comparação da motilidade espermática total após o teste de termoresistência do sêmen descongelado, entre os diferentes tratamentos.

Fonte de variação

Graus de liberdade

Soma de quadrados


Total 38 4.358,97 Tratamentos 3 801,75 267,25 2,63 0,0654 Erro 35 3.557,22 101,63 CV = 22,92 Teste estatístico SNK (Devido as parcelas perdidas, apenas 50 das 39 observações puderam ser utilizadas para a avaliação estatística) Tabela 3.10 – Análise de variância – Comparação da motilidade espermática progressiva após o teste de termoresistência do sêmen descongelado, entre os diferentes tratamentos.

Fonte de variação

Graus de liberdade

Soma de quadrados


Total 38 4.243,58 Tratamentos 3 641,08 213,69 2,08 0,1211 Erro 35 3.602,50 102,92 CV = 25,94 Teste estatístico SNK (Devido as parcelas perdidas, apenas 50 das 39 observações puderam ser utilizadas para a avaliação estatística) Tabela 3.11 – Análise de variância – Comparação do vigor espermático após o teste de termoresistência, entre os diferentes tratamentos.

Fonte de variação

Graus de liberdade

Soma de quadrados


Total 38 2,08 Tratamentos 3 0,35 0,11 2,35 0.0888 Erro 35 1,73 0,04 CV = 6,56 Teste estatístico SNK (Devido as parcelas perdidas, apenas 50 das 39 observações puderam ser utilizadas para a avaliação estatística) Tabela 3.12 – Análise de variância – Comparação dos defeitos maiores do sêmen a fresco e do sêmen descongelado, entre os diferentes tratamentos.

Fonte de variação

Graus de liberdade

Soma de quadrados


Total 49 503,22 Tratamentos 4 7,82 1,95 0,18 0,9488 Erro 45 495,40 11,00 CV = 71,20 Teste estatístico SNK

88

Tabela 3.13 – Análise de variância – Comparação dos defeitos menores do sêmen a fresco e do sêmen descongelado, entre os diferentes tratamentos.

Fonte de variação

Graus de liberdade

Soma de quadrados


Total 49 725,50 Tratamentos 4 63,80 15,95 1,08 0,3754 Erro 45 661,70 14,70 CV = 73,74 Teste estatístico SNK Tabela 3.14 – Análise de variância – Comparação dos valores médios de lesão de acrossoma, do sêmen a fresco e do sêmen descongelado, entre os diferentes tratamentos

Fonte de variação

Graus de liberdade

Soma de quadrados


Total 49 8,00 Tratamentos 4 1,15 0,28 1,89 0,1289 Erro 45 6,85 0,15 CV = 195,07 Teste estatístico SNK Tabela 3.15 – Análise de variância – Comparação do valores médios de espermatozóides com defeitos totais no sêmen a fresco e no sêmen descongelado, entre os diferentes tratamentos.

Fonte de variação

Graus de liberdade

Soma de quadrados


Total 49 1.886,62 Tratamentos 4 121,70 30,42 0,78 0,5468 Erro 45 1.764,92 39,22 CV = 62,31 Teste estatístico SNK

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